## ANTICANCER ACTIVITY OF CURCUMINOIDS AGAINST B16-F10 MELANOMA CELL LINES
Sandra Amalia Riyadi 1* , Fajar Fauzi Abdullah 2 , Fitri Fadhilah 3 , Nurul Assidiqiah 1
1 Program Studi Kimia Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Jl. Padasuka Atas No 233 Padasuka, Kecamatan Cimenyan, Kabupaten Bandung, Jawa Barat 40192 Indonesia
2 Program Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Garut, Jl. Jati No. 42B, Kecamatan Tarogong Kaler, Kabupaten Garut, Jawa Barat 44151 Indonesia
3 Program Studi Analis Kesehatan Sekolah Tinggi Analis Bakti Asih Bandung Jl. Padasuka Atas No 233 Padasuka, Kecamatan Cimenyan, Kabupaten Bandung, Jawa Barat 40192 Indonesia
*Corresponding author: Sandra Amalia Riyadi (sandraamalia@staba.ac.id)
ARTICLE HISTORY Received: 22 November 2021 Revised: 14 July 2022 Accepted:  27 July 2022

## Abstract
Curcuminoids  are  the  active  ingredient  of  the Curcuma  Longa plant  consist  of  three components  namely  curcumin,  demethoxycurcumin,  and  bisdemethoxycurcumin.  The three of component significanly different on methoxy subtituent, and capable of giving various biological activities. Curcumin in recent years has become one of the targets of research  development  as  an  anticancer  agent  carried  out  on  several  cancer  cells. However, the ability of curcumin as an anticancer is very limited due to the low solubility of curcumin in water which affects the low absorption of curcumin compound by cells in the human body. Therefore, it is very necessary to do further research to evaluate the anticancer  activity  of  other  curcumin  compounds  demethoxycurcumin  and bisdemethoxycurcumin.  Dried  Curcuma  rhizome  maseration  at  room  temperature  for 3x24 hours then collect filtrate and evaporate with rotary evaporator to obtain ethanolic extract of Curcuma. Ethanol extract was partionated with n-hexane, ethyl acetate and n- buthanol.  Ethyl  acetate  fraction  was  evaporated  and  separated  with  various  isolation method. Furthemore, characterized coumpounds were tested anticancer activity through B16-F10 cell lines with resazurine reduction method. The result of the anticancer activity of  three  compounds  shows  significant  inhibition  activity,  bisdemethoxycurcumin  has higher IC 50 value 16.20 µg/mL then followed by demethoxycurcumin with IC 50 value 22.59 µg/mL and the lowest IC 50 value 152.71 µg/mL comes from curcumin.
Key words: anticancer, bisdemethoxycurcumin, curcumin, demethoxycurcumin

## AKTIVITAS ANTIKANKER KURKUMINOID TERHADAP SEL MELANOMA B16-F10

## Abstrak
Kurkuminoid  berasal  dari  rimpang  kunyit  ( Curcuma  Longa  L. )  yang  memiliki  ketiga komponen  utama  penyusunnya  diantaranya  kurkumin,  demetoksikurkumin  dan bisdemetoksikurkumin. Secara struktur ketiganya hanya berbeda pada subtituen gugus metoksi,  namun  mampu  memberikan  efek  biologis  yang  berbeda.  Kurkumin  dalam beberapa  tahun  kebelakang  menjadi  salah  satu  target  pengembangan  penelitian sebagai  agen  antikanker  yang  dilakukan  terhadap  beberapa  sel  kanker.  Namun, kemampuan  kurkumin  sebagai  antikanker  menjadi  sangat  terbatas  akibat  rendahnya kelarutan  kurkumin  dalam  air,  yang  mempengaruhi  rendahnya  penyerapan  senyawa kurkumin  oleh  sel  dalam  tubuh.  Maka  dari  itu  menjadi  sangat  perlu  dilakukannya penelitian lebih lanjut untuk melihat aktivitas antikanker dari senyawa kurkumin lainnya yaitu  demetoksikurkumin  dan  bisdemetoksikurkumin.  Rimpang  kunyit  yang  telah dikeringkan  kemudian  dimaserasi  dengan  etanol  selama  3x24 jam  kemudian  maserat yang diperoleh diuapkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak pekat etanol. Selanjutnya dilakukan partisi dengan pelarut n -heksan, etil asetat, dan n -butanol. Fraksi etil asetat kemudian dipekatkan dan dilakukan berbagai jenis metode pemisahan sehingga  didapatkan  ketiga  senyawa  kurkuminoid.  Selanjutnya,  isolat  yang  sudah terkarakterisasi  di  lakukan  uji  sitotoksik  terhadap  sel  B16-F10  dengan  menggunakan metode  reduksi  resazurin.  Hasil  penelitian  menunjukkan  adanya  perbedaan  aktivitas penghambatan  yang  signifikan  diantara  ketiga  isolat.  Bisdemetoksikurkumin  memiliki aktivitas  penghambatan  tertinggi  dengan  nilai  IC 50 16,20  µg/mL.  Setelah  itu, demetoksikurkumin  dengan  nilai  IC 50 22,59  µg/mL  dan  yang  terakhir  adalah  kurkumin dengan nilai IC 50 152,71 µg/mL.
Kata kunci: antikanker, bisdemetoksikurkumin, demetoksikurkumin, kurkumin

## Pendahuluan
Kurkuminoid  merupakan  komponen  aktif  dari  kunyit  ( Curcuma  longa  L. )  yang berperan  sebagai  pemberi  warna  kuning.  Kurkuminoid  terdiri  atas  tiga  kandungan senyawa aktif diantaranya kurkumin (1,7-bis(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1,6-heptadiena-
3,5-dion) ( Gambar 1 .a), demetoksikumin (1-(4-hidroksi3-metoksifenil)-7-(4-
hidroksifenil)-1,6-heptadiena-3,5-dion)) ( Gambar 1 .b), dan bisdemetoksikurkumin (1,7- bis(4-hidroksifenil)-1,6-heptadiena-3,5-dion)) ( Gambar 1 .c). 1
(a)
(b)
(c)
Gambar  1. Struktur  kurkumin  (a),  demetoksikurkumin  (b),  dan  bisdemetoksikurkumin (c). 2
Perbedaan struktur dari ketiga senyawa kurkumin ini sangat berpengaruh terhadap aktivitas  biologis  diantaranya  aktivitas  antitumor,  antikanker,  antioksidan  dan antiinflamasi. 3 Adanya  rantai  aril  yang  terikat  dengan  suatu  gugus  fungsi  diketo,  dua gugus rangkap dan satu gugus metilen yang aktif merupakan dugaan sisi aktif dari ketiga senyawa kurkumin tersebut ( Gambar 2 ). 4
Gambar 2. Sisi aktif dari struktur senyawa kurkumin. 4
Kurkumin  merupakan  senyawa  yang  sudah  banyak  diteliti,  dan  telah  diketahui potensinya sebagai antikanker dan antitumor selama beberapa tahun terakhir. 5,6 Secara struktur kurkumin memiliki dua cincin fenil yang tersubtitusi oleh gugus fungsi hidroksil dan  metoksi  yang  dihubungkan  oleh  7  karbon  keto-enol linker ,  dari  studi  hubungan struktur dan aktivitas dinyatakan bahwa adanya donor elektron dari hidrogen koplanar dan satu bagian dari β-diketon sangat mempengaruhi terhadap aktivitas antiandrogenik sebagai treatment pengobatan  kanker  prostat. 7 Penelitian  yang  lain  dijelaskan  bahwa penambahan kurkumin terhadap terhadap  sel  MCF-7  dapat menurunkan  viabilitas  sel dan  ekspresi  m-RNA,  P-gp  dan  BCRP,  dibandingkan  dengan  tidak  ditambahkan kurkumin.  Dengan  begitu  kurkumin  dapat  meningkatkan  sensitivitas  sel  terhadap tamoksifen. 8 Pada  beberapa  studi  lainnya,  kurkumin  memiliki  keterbatasan  dalam penggunaan  sebagai  obat  diantaranya  rendahnya  kelarutan  kurkumin  dalam  air  serta rendahnya daya serap terhadap sel. 4 Quitschke et al pada penelitiannya memperlihatkan demetoksikurkumin lebih stabil didalam darah jika dibandingkan dengan kurkumin. Pada penelitian  yang  dilaporkan  oleh  Chen  et  al  diketahui  bahwa  demetoksikurkumin  yang dikombinasikan  dengan cisplatin  secara  signifikan  mampu melemahkan proliferasi sel A549 yang menunjukkan aktivitas yang lebih baik dari modifikasi kurkumin-cisplatin dan bisdemetoksi-cisplatin. 11,12 Gupta  et  al  dalam  artikelnya  menyatakan  bahwa bisdemetoksikurkumin  lebih  aktif  sifat  sitotoksitasnya  dari  demetoksikurkumin  dan kurkumin terhadap sel kanker ovarium, serta melindungi saraf dan endotel sel dari beta- amyloid-induced stres oksidatif yang menyebabkan Induksi yang dimediasi oleh NRF2 heme oxygenase-1. 9 Meskipun kurkumin, demetoksikurkumin, dan bisdemetoksikurkumin  berbeda  dalam  struktur  kimianya  dan  hanya  berkaitan  dengan
Vol. 13; No. 2; Juli 2022 Halaman 152 -163
substitusi  metoksi,  ketiga  senyawa  tersebut  menunjukkan  perbedaan  yang  signifikan pada  aktivitas  antitumor  dan  antiinflamasi  yang  dipengaruhi  oleh  substituen  metoksi yang  terlibat  dalam  aktivitas  ini.  Penelitian  telah  menunjukkan  bahwa  ikatan  hidrogen antara  gugus  -OH  fenolik  dan  gugus  metoksi  dalam  kurkumin  mempengaruhi  energi ikatan O – H dan abstraksi atom hidrogen oleh radikal bebas, yang menunjukkan efek pembersihan radikal  bebas  yang  lebih  baik  dari bisdemetoksikurkumin. 13 Penggunaan ketiga senyawa kurkumin menjadi salah satu alternatif pengobatan kanker serviks yang telah dilaporkan dari beberapa penelitian, salah satunya oleh Riki et al yang melakukan pengujian sitotoksik senyawa kurkumin, demetoksikurkumin, dan bisdemetoksikurkumin tanaman temulawak terhadap lini sel kanker serviks. 10 Dari hasil penelitiannya, diketahui bahwa  nanopartikel  ekstrak  senyawa  kurkumin  tersebut  dapat  menghambat pertumbuhan sel HeLa dengan konsentrasi sebesar 2 dan 62,5 ppm.
Beberapa  studi  telah  dilakukan  dan  fokus  kepada  modifikasi  struktur  kurkumin dengan  tujuan  untuk  meningkatkan  aktivitas  biologis  dari  senyawa  kurkumin  dan pencarian aktivitas biologis yang lebih spesifik terhadap sel kanker lainnya. 14 Pencarian aktivitas  biologis  lainnya  dari  senyawa  kurkuminoid  sangat  diperlukan  mengingat senyawa kurkuminoid memiliki aktivitas sitotoksik yang sangat baik, tidak beracun, serta merupakan senyawa aktif komponen utama yang berasal dari bahan alam yaitu kunyit sehingga  aman  untuk  dikonsumsi  secara  teratur. 15 Sampai  saat  ini  belum  adanya penelitian yang mengkaji bagaimana aktivitas senyawa kurkuminoid terhadap sel kanker kulit melanoma B16-F10 membuat peneliti ingin mengkaji aktivitas sitotoksik  senyawa kurkuminoid secara in vitro dengan metode reduksi resazurin.
Melanoma  metastasis  merupakan  jenis  kanker  kulit  yang  paling  berbahaya  dan mampu berkembang cepat menyebar ke bagaian tubuh lainnya. 17,18 Beberapa penelitian telah mengkaji senyawa bahan alam yang memiliki aktivitas penghambatan terhadap sel kanker kulit melanoma B16-F10 diantaranya penelitian yang dilakukan oleh Palomeque et al bahwa ekstrak metanol tanaman C. aequipetala mampu menginduksi sel pada G1 siklus  sel  serta  mampu  menginduksi  fragmentasi  DNA  dan  meningkatkan  aktivitas caspase-3 . 16 Pada penelitian lainnya suatu senyawa nanomicellar -kurkumin secara in vitro mampu menghambat sel kanker melanoma B16-F10, serta ekstrak etanol tanaman A. nallamalayana diketahui mampu mereduksi viabilitas sel kanker kulit manusia A357 serta sel kanker kulit metastasis B16-F10. 19,20 Pada penelitian ini akan mengkaji aktivitas penghambatan dari senyawa kurkumin, demetoksi kurkumin dan bisdemetoksikurkumin terhadap sel kanker kulit melanoma B16-F10 yang dinyatakan dalam 50% kemampuan penghambatan sel secara in vitro . Sehingga mampu menjadi dasar peneltian selanjutnya untuk mempelajari pengaruh penghambatan terhadap sel kanker kulit melanoma B16- F10 secara in vivo.

## Metode

## Alat
Neraca  digital,  CO 2 Incubator (Thermo  Scientific), Biological  Safety  Cabinet (BSC), centrifuge , mikroskop, hemocytometer , Multimode  Reader . Rotary  evaporator (Buchi), Kolom  Kromatografi,  Spektrofotometer  UV-VIS  (Shimadzu  1800),  FTIR  (Thermo Fischer).

## Bahan
Rimpang Kunyit 10 Kg , Biologix 1.5 ml Conical Bottom Autoclavable DNA & RNA Free Micro Centrifuge Tubes , Falcon™ 50 mL Conical Centrifuge Tubes , Multi well Culture Plate  96  well  Microplate  Sterile  Biologix, Gibco™  RPMI  1640  Medium , Gibco™  PBS buffers, Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich , Ethanol Absolute for Analysis Merck 2.5 L , Trypan blue (C.I. 23850) Merck, Cisplatin Dankos , B16-F10 (ATCC® CRL- 6475™)
Cell ,  dan Invitrogen™  PrestoBlue™  Cell  Viability  Reagent .  Etil  Asetat  (Merck),  n- Heksana  (Merk),  n-Butanol  (Merck),  Plat  Kromatografi  Lapis  Tipis  Silika  Gel  F  254 (Merck), Silica Gel 60 (Merck), Kloroform (Merck), Etanol (Merck).

## Prosedur
a.  Preparasi Sampel
Rimpang  kunyit  basah  yang  didapatkan  dari  Pasar  Ujung  Berung  Bandung sebanyak  10  Kg,  dikeringkan  dengan  oven  selama  2  jam  pada  suhu  50-60  ºC kemudian dihancurkan sehingga didapatkan serbuk rimpang kunyit kering sebanyak 5,1 Kg.
b.  Maserasi dan Partisi Sampel
Rimpang kunyit kering 5,1 Kg kemudian ditambahkan etanol 70% dan dimaserasi selama 3x24 jam. Filtrat kemudian disaring dan dikumpulkan lalu dipekatkan dengan rotary  evaporator sampai  didapatkan  ekstrak  pekat  etanol  kunyit.  Ekstrak  pekat etanol  kunyit  yang telah  didapatkan kemudian  ditambahkan  air:  etanol  (9:1)  yang kemudian dipartisi dengan berbagai pelarut berdasarkan kepolaran yaitu n -heksan, etil asetat, dan n -butanol.
c.  Isolasi Kurkuminoid
Ekstrak pekat etil asetat yang didapatkan kemudian di analisis pola noda dengan menggunakan plat KLT, dan dipisahkan dengan kromatografi kolom menggunakan fase gerak campuran pelarut kloroform: metanol (95:5) dan fase diam silika secara isokratis.
d.  Karakterisasi Isolat
Isolat  yang  didapatkan  kemudian  dianalisis  dengan  KLT  menggunakan  sprayer H 2 SO 4 10% dalam etanol, sehingga muncul noda berwarna kuning. Pola noda akan muncul dengan nilai Rf yang berbeda.
e.  Aktivitas Antikanker
Penentuan  aktivitas  antikanker  dilakukan  dengan  metode  reduksi  resazurin. 21 Sampel dibuat stok sampel sebesar 2000.00 µg/ml menggunakan pelarut etanol 2% kemudian siapkan 8 microtube 1,5 mL, yang kemudian dibuat 8 variasi konsentrasi dari  1000  -  7,81  µg/ml.  Disiapkan  kontrol  positif,  Cisplatin  1,59  µg/ml  (nilai  IC 50 Cisplatin  terhadap  Sel  B16-F10)  dan  disiapkan  kontrol  negatif  berupa  media  dan juga kontrol pelarut isolat yaitu etanol. Well plate yang telah berisi sel dikeluarkan dari inkubator. Diberi label pada plate , lalu dibuang media setelah itu ditambahkan 100 μL masing-masing sampel, kontrol positif, kontrol negatif, dan kontrol pelarut diinkubasi  kembali  selama  48  jam.  Kemudian  ditentukan  nilai  %  inhibisi  setiap konsentrasi:
% Inhibisi = 𝐴𝑏𝑠 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓−𝐴𝑏𝑠 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝐴𝑏𝑠 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 X 100 %
Keterangan: Abs Kontrol Negatif: Absorbansi Media+Sel Abs Sampel: Absorbansi Sampel Setelah  diketahui  nilai  %  Inhibisi  setiap  konsentrasi,  selanjutnya  diolah  dengan Microsoft  Excel.  Kemudian  didapatkan  grafik  linieritas  sehingga  dipenuhi persamaan.
Y = bx + a
Keterangan: Y  : Variabel akibat (% Abs) b  : Koefisien regresi/kemiringan
x  : Variabel Faktor Akibat (Nilai IC 50 ) a  : Konstanta
Setelah  didapatkan  kurva  dan  persamaan  regresi  linear  %  Inhibisi,  selanjutnya ditentukan absorbansi target nilai IC 50 Target IC 50 = 50% x Abs Kontrol negatif Setelah diketahui absorbansi target nilai IC 50, ditentukan % Absorbansi target nilai IC 50 sebagai konstanta Y dalam persamaan regresi linear.
% Abs (Y) = 𝐴𝑏𝑠 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝑇𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡 𝐼𝐶50 𝐴𝑏𝑠 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 X 100
Keterangan: Abs Kontrol: Absorbansi Kontrol Negatif (Media+sel) Nilai IC 50 sebagai konstanta X yang belum diketahui nilainya, dimasukkan ke dalam persamaan regresi linear agar nilainya dapat diketahui
Nilai IC 50 (X) = 𝑌−𝑎 𝑏

## Hasil
Tabel  1 .  Hasil  Karakterisasi  Nilai Rf Isolat  KLT  Silika  GF  254  dengan  Fase  Gerak
Kloroform : Metanol (9:1) Isolat Nilai Rf (cm) K1 (kurkumin) 0,76 K2 (demetoksikurkumin) 0,57 K3 (bisdemetoksikurkumin) 0,26
Gambar 3. Hasil visualisasi UV 254 dan 365 serta sebelum dan sesudah dikarakterisasi oleh H 2 SO 4 10% dalam etanol 254 nm
365 nm Visual sebelum sesudah sebelum sesudah sebelum sesudah
K1 K2 K3
Gambar  4. Gambaran  lini  sel  B16-F10  sebelum  diberikan  perlakuan  (A),  setelah diberikan kontrol cisplatin 1,59 µg/ml (B), setelah diberikan kurkumin 7,81 µg/mL  (C),  setelah  diberikan  demetoksikurkumin  7,81  µg/mL  (D),  dan diberikan isolat bisdemetoksikurkumin 7,81 µg/mL (E).
Gambar 5 . Pengaruh perlakuan isolat kurkuminoid terhadap sel B16-F10 dengan variasi konsentrasi isolat 1000; 500; 250; 125; 62,50; 31,25; 15,63 dan 7,81 µg/ml dalam  etanol  terhadap  kontrol  cisplatin  1,59  µg/ml,  kontrol  negatif  berupa media dan juga kontrol pelarut isolat yaitu etanol.
(A) (B) (C) (D) (E) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.63 7.81 % In h ib is i Konsentrasi Isolat (µg/mL) % Inhibisi Terhadap Sel B16-F10 Kurkumin Demetoksikurkumin
Bisdemetoksikurkumin
Tabel 2. Nilai IC 50 isolat kurkumin, demetoksikurkumin, bisdemetoksikurkumin terhadap kontrol cisplatin 1,59 µg/ml.
Isolat Nilai IC 50 (µg/ml) SD* Kurkumin 152,71 1,65 Demetoksikurkumin 22,59 1,90 Bisdemetoksikurkumin 16,20 5,16 *n = 5

## Pembahasan
Kurkuminoid  merupakan  kandungan  utama  kunyit  yang  memiliki  komponen  utama diantaranya kurkumin 1,7-bis(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1,6-heptadiena-3,5-dion,
demetoksikumin
1-(4-hidroksi3-metoksifenil)-7-(4-hidroksifenil)-1,6-heptadiena-3,5-
dion, dan bisdemetoksikurkumin 1,7-bis(4-hidroksifenil)-1,6-heptadiena-3,5-dion. Isolat yang dihasilkan dikarakterisasi kualitatif dengan KLT menggunakan fase diam silika gel yang  bersifat  polar  dan  fase  gerak  kloroform:metanol  (dengan  perbandingan  9:1). Berdasarkan Gambar  3, ketiga  isolat  menunjukkan  adanya  perbedaan  migrasi  yang dapat  dilihat  pada  nilai Rf K3  0.26, Rf K2  0.57,  dan Rf K1  0.76  yang  dikarakterisasi sebagai  bisdemetoksikurkumin,  demetoksikurkumin,  dan  kurkumin.  Hal  ini  sesuai dengan penelitian yang dilakukan Revathy et al ., tahun 2011 yang melakukan uji KLT isolat murni dari kurkuminoid yaitu kurkumin, demetoksikurkumin, dan bisdemetoksikurkumin dengan nilai Rf setiap senyawa secara berurutan yaitu 0.75, 0.55, dan 0.27. 22 Kurkumin memiliki 2 gugus metoksi, demetoksikurkumin 1 gugus metoksi, sedangkan  bisdemetoksikurkumin  tidak  memiliki  gugus  metoksi.  Akibatnya  kepolaran bisdemetoksikurkumin  menjadi  lebih  tinggi  (rendahnya  nilai Rf )  karena  tidak  adanya gugus  metoksi. 23 Sehingga  bisa  disimpulkan  bahwa  kurkumin  bersifat  nonpolar, demetoksikurkumin bersifat semi polar, dan bisdemetoksikurkumin bersifat polar.
Pengujian  aktivitas  antikanker  yang  dilakukan  berguna  untuk  mengetahui  potensi antikanker  dari  ketiga  struktur  kurkuminoid  yaitu  kurkumin,  demetoksikurkumin,  dan bisdemetoksikurkumin  dalam  menghambat  suatu  proliferasi  sel  B16-F10  dengan berbagai  variasi  konsentrasi.  Pemilihan  konsentrasi  isolat  berdasarkan  pada  Metode Serial  Dilusi,  seperti  penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan  oleh  Diani et  al .,  tahun 2015. 24 Serial  dilusi  merupakan  sebuah metode pengenceran  bertahap  dari  suatu  zat dalam  larutan  dengan  perbandingan  pengenceran  1:2  (w/v).  Pembanding  yang digunakan pada pengujian antikanker ini adalah cisplatin dengan konsentrasi 1,59 µg/ml (nilai IC 50 cisplatin terhadap sel B16-F10). Cisplatin merupakan suatu obat kemoterapi yang sudah lama diketahui. Cisplatin bekerja sebagai anti kanker dengan cara mengikat guanin yang merupakan salah satu penyusun DNA sel dan melakukan apoptosis pada sel  yang  sehat  maupun  sel  kanker  itu  sendiri. 25 Cisplatin  sebagai  kontrol  positif digunakan untuk mengetahui nilai IC 50 terhadap proliferasi sel B16-F10. Preparasi sel dilakukan melalui beberapa tahapan seperti menghidupkan kembali sel yang sebelumnya ditidurkan kemudian ditumbuhkan hingga mencapai konfluen 70-80%. Gambar  4 merupakan  morfologi  sel  dari  morfologi  sel  B16-F10  yang  sudah  diberi perlakuan, sel B16-F10 merupakan sel adeherent yang dapat diamati pada permukaan media  tumbuh.  Jika  sel  mati  maka  akan  terlihat  terlepas  dari  permukaan  media tumbuhnya, terdegradasi dan tidak saling menempel. Berdasarkan Gambar 4 terlihat sel yang  mati  pada  konsentrasi  7,81  µg/mL,  dengan  perbesaran  yang  sama  yang merupakan  morfologi  sel  setelah  diberi  perlakuan  kontrol  positif,  dapat  dilihat  secara visual bahwa aktivitas senyawa demetoksikurkumin dan bisdemetoksikurkumin memiliki aktivitas yang lebih baik dibandingkan dengan cisplatin.
Pada uji sitotoksik dengan metode reduksi resazurin, tingkat kematian sel B16-F10 akibat perlakuan sampel dapat diketahui secara kalorimetri berdasarkan nilai absorbansi yang diperoleh. Hal ini dapat dilihat secara visual dari perubahan warna yang terjadi. Sel yang masih hidup akan mereduksi resazurin menjadi resofurin yang memberi pewarnaan merah muda dan berpendar. Semakin kecil konsentrasi senyawa uji yang diberikan pada suspensi  sel,  menyebabkan  warna  larutan  semakin  berwarna  merah  muda  dan berpendar,  hal  ini  dapat  diamati  dari  semakin  besar  nilai  absorbansi  yang  diperoleh, yang berarti semakin banyak sel yang hidup. Pada Gambar 5 semakin tinggi konsentrasi sampel maka semakin rendah absorbansinya sehingga semakin tinggi % inhibisinya.
Berdasarkan tabel  2 dapat  diketahui  nilai  IC 50 dari  setiap  isolat  murni  kurkumin, demetoksikurkumin,  dan  bisdemetoksikurkumin  secara  berurutan  yaitu  152,71  µg/ml, 22,59 µg/ml, dan 16,20 µg/ml. Nilai IC 50 merupakan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel sebesar 50 % dari total populasi sel. Sebagai contoh nilai IC 50 kurkumin  sebesar  152,71  µg/mL  memiliki  arti  bahwa  pada  konsentrasi  152,71  µg/mL dapat  menghambat  50%  dari  total  populasi  sel  B16-F10  yang  hidup  dan  berjumlah kurang  lebih  12.000  sel.  Jika  dilihat  secara  visual,  warna  larutan  yang  terjadi  adalah warna ungu, artinya hanya 50% sel hidup yang mereduksi resazurin menjadi resofurin. Semakin  kecil  nilai  IC 50 semakin  tinggi  aktivitas  penghambatan  senyawa  uji  tersebut. Suatu  bahan  uji memiliki  aktivitas  biologis  apabila  memiliki  aktivitas sitotoksik  dengan nilai  IC 50 <30  µg/mL.  Berdasarkan  hasil  penelitian,  dapat  diketahui  bahwa demetoksikurkumin dan bisdemetoksikurkumin memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan sel kanker kulit melanoma B16-F10. Hal ini terlihat dari nilai konsentrasi IC 50 kedua isolat tersebut dibawah 100 µg/mL.
Sifat  kimia  dari  molekul  kurkumin  memberikan  banyak  kesimpulan  tentang  sifat interaksinya dengan target protein, yang membuat senyawa dapat digunakan sebagai antiinflamasi, antioksidan, antikanker. Gugus diketon kurkumin merupakan gugus yang bertanggung  jawab  terhadap  penekanan  aktivitas  nuclear  factor  κB/NF-κB. 26 Secara struktur,  karena  tiga  kurkuminoid  memiliki  gugus  diketon  yang  serupa,  efek  toksisitas harus secara teoritis serupa, namun keberadaan  gugus metoksi dapat mempengaruhi kerapatan  elektron  pada  gugus  diketo.  Oleh  karena  itu,  sifat  antioksidan  ketiga kurkuminoid  juga  dipengaruhi  oleh  adanya  gugus  metoksi.  Posisi  efek  kelompok fungsional dan ikatan juga mempengaruhi perilaku senyawa. 9
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  dilakukan,  pengaruh  substitusi  metoksi  dapat dilihat dari nilai IC 50 setiap senyawa, dimana semakin bertambah gugus metoksi maka nilai  IC 50 semakin  kecil,  hal  ini  menunjukkan  bahwa  gugus  metoksi  memberikan pengaruh  dalam  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker  kulit  melanoma  B16-F10  dan kehilangan  gugus  metoksi  membuat  potensinya  menjadi  meningkat.  Diantara  ketiga isolat, bisdemetoksikurkumin memiliki aktivitas penghambatan tertinggi dengan nilai IC 50 16,20 µg/mL. Setelah itu, demetoksikurkumin dengan nilai IC 50 22,59 µg/mL dan yang terakhir adalah kurkumin dengan nilai IC 50 152,71 µg/mL. Apabila dihubungkan antara struktur kimia isolat kurkumin, demetoksikurkumin,  dan bisdemetoksikurkumin dengan sifat aktivitas antikankernya terdapat perbedaan aktivitas yang signifikan diantara ketiga senyawa. Senyawa kurkumin memiliki gugus metoksi pada kedua gugus aromatis yaitu kiri dan kanan.
O O H 3 CO HO OCH 3 OH _ _
Gambar 6. Struktur kimia kurkumin
Vol. 13; No. 2; Juli 2022 Halaman 152 -163
Secara teoritis gugus metoksi bersifat sebagai gugus pendorong elektron sehingga dapat  menyumbangkan  elektron  pada  cincin  aromatis.  Adanya  resonansi  pada  cincin aromatis membuat dorongan elektron dari metoksi akan meningkatkan rapatan elektron cincin  aromatis  (benzena).  Hal  ini  menyebabkan  cincin  benzena  menjadi  lebih elektronegatif  sehingga  atom  C  karbonil  menjadi  lebih  elektropositif.  Oleh  karena  itu, senyawa  kurkumin  berinteraksi  (daya  tarik-menarik)  lemah  dengan  guanin  karena molekul guanin bersifat elektronegatif (nukleofilik). Hal ini dapat dibuktikan dari Nilai IC 50 yang  cukup  besar  yaitu  152,71  µg/ml.  Karena  adanya  dua  gugus  metoksi  sifat  dari kurkumin adalah nonpolar.
Senyawa  demetoksikurkumin  mengalami  kehilangan  satu  gugus  metoksi  tepatnya pada gugus aromatis sebelah kanan
O O H 3 CO HO OH _ +
Gambar 7. Struktur kimia demetoksikurkumin
Kehilangan satu gugus metoksi, menyebabkan elektron donor pada cincin aromatis berkurang, akibatnya kerapatan elektron pada cincin aromatis sebelah kanan melemah dan mengakibatkan cincin aromatis menjadi lebih elektropositif. Oleh karena itu interaksi (daya  tarik-menarik)  senyawa  demetoksikurkumin  dengan  molekul  guanin  semakin meningkat.  Hal  ini  dapat  dibuktikan  dari  Nilai  IC 50 yang  semakin  menurun  yaitu  22,59 µg/ml. Karena kehilangan satu gugus metoksi pada salah satu gugus aromatis, maka demetoksikurkumin bersifat semipolar.
Senyawa bisdemetoksikurkumin mengalami kehilangan kedua gugus metoksi pada kedua gugus aromatis
O O HO OH + +
Gambar 8. Struktur kimia bisdemetoksikurkumin
Kehilangan  kedua  gugus  metoksi,  menyebabkan  tidak  ada  sama  sekali  elektron donor pada cincin aromatis, akibatnya kerapatan elektron pada kedua cincin aromatis melemah  dan mengakibatkan kedua  cincin  aromatis menjadi  lebih  elektropositif.  Oleh karena  itu  interaksi  (daya  terik-menarik)  senyawa  bisdemetoksikurkumin  dengan molekul  guanin  lebih  meningkat  daripada  senyawa  demetoksikurkumin.  Hal  ini  dapat dibuktikan dari Nilai IC 50 yang semakin menurun yaitu 16,20 µg/ml. Karena kehilangan dua gugus metoksi dari kedua gugus aromatis, maka sifat bisdemetoksikurkumin bersifat polar.

## Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian analisis uji sitotoksik isolat kurkumin, demetoksikurkumin,  dan  Bisdemetoksikurkumin  terhadap  sel  B16-F10  secara in  vitro , dapat  disimpulkan  bahwa  terdapat  perbedaan  aktivitas  sitotoksik  yang  signifikan
diantara  ketiga  senyawa  murni.  Kurkumin  dengan  nilai  IC 50 152,71  µg/mL, Demetoksikurkumin dengan nilai IC 50 22,59 µg/mL, dan Bisdemetoksikurkumin dengan nilai IC 50 16,20 µg/ml. Diantara ketiga senyawa murni, Bisdemetoksikurkumin memiliki aktivitas penghambatan tertinggi dengan nilai IC 50 16,20 µg/mL.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini di danai oleh hibah Penelitian Dosen Pemula dari KEMENDIKBUD- RISTEK pendanaan Tahun 2021.

## Daftar Pustaka
1. Parsai S, Keck R, Skrzypczak-Jankun, Ewa Jankun J. Analysis of the anticancer activity of curcuminoids, thiotryptophan and 4-Phenoxyphenol Derivatives. Oncol Lett. 2014;7(1):17 –22.
2. Yuan  Shan  C,  Iskandar  Y.  Study  kandungan  kimia  dan  aktivitas  farmakologi tanaman kunyit (Curcuma longa L.). Farmaka. 2018;16(2):547 –555.
3. Nagahama  K,  Utsumi  T,  Kumano  T,  Maekawa  S,  Oyama  N,  Kawakami  J. Discovery of a new function of curcumin which enhances its anticancer therapeutic potency. Sci Rep. 2016;6(1):1 –14.
4. Mbese  Z,  Khwaza,  Vuyolwethu  Khwaza  Aderibigbe  BA.  Curcumin  and  its derivatives as potential therapeutic agents in prostate, colon and breast cancers. Molecules. 2019;24(23).
5. Adiwidjaja J, McLachlan AJ, Boddy A V. Curcumin as a clinically-promising anti- cancer agent: pharmacokinetics and drug interactions. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2017;13(9):953 –72.
6. Hassanalilou T, Ghavamzadeh S, Khalili L. Curcumin and gastric cancer: a review on mechanisms of action. J Gastrointest Cancer. 2019;50(2):185 –92.
7. Arwansyah,  Arwansyah  Ambarsari,  Laksmi  Sumaryada  TI.  Simulasi  docking senyawa  kurkumin  dan  analognya  sebagai  inhibitor  reseptor  androgen  pada kanker prostat. Curr Biochem. 2014;1(1):11 –2.
8. Sianipar  EA,  Louisa  M,  Wanandi  SI.  Kurkumin  meningkatkan  sensitivitas  sel kanker  payudara  terhadap  tamoksifen  melalui  penghambatan  ekspresi  P- glikoprotein  dan  breast  cancer  resistance  protein.  J  Farm  Galen  (Galenika  J Pharmacy). 2018;4(1):1 –11.
9. Gupta  AP,  Khan  S,  Manzoor  MM,  Yadav  AK,  Sharma  G,  Anand  R,  et  al. Anticancer curcumin:  natural  analogues  and  structure-activity relationship.  Stud Nat Prod Chem. 2017;54(1).
10. Riki,  Ambarsari  L,  Nurcholi  W.  Potensi  antikanker  nanopartikel  ekstrak kurkuminoid temulawak terhadap sel line kanker serviks. Indones Nat Res Pharm J. 2017;2(1):1 –10.
11. Quitschke  WW.  Differential  solubility  of  curcuminoids  in  serum  and  albumin solutions:  implications  for  analytical  and  therapeutic  applications.  BMC Biotechnol. 2008;8:1 –17.
12. Chen Y, Hong C, Chen X, Qin Z. Demethoxycurcumin increases the sensitivity of cisplatin-resistant non-small lung cancer cells to cisplatin and induces apoptosis by activating the caspase signaling pathway. Oncol Lett. 2020;20(5):1 –8.
13. Manami T, Kuroda K, Ramamoorthy, Ayyalusamy Yasuhara K. Modulation of raft domains  in  a  lipid  bilayer  by  boundary-active  curcumin.  Chem  Commun. 2014;50(26):3427 –30.
14. Zhao  S,  Chao  P,  Ye  Y, Zhao  L,  Yumeng W.  Recent  advances  of  analogues  of curcumin for treatment of cancer. Eur J Med Chem. 2019;180(319):524 –35.
15. Ding  L,  Ma  SM,  Lou  H,  Sun  L,  Ji  M.  Synthesis  and  biological  evaluation  of curcumin derivatives with water-soluble groups as potential antitumor agents: an in vitro investigation using tumor cell lines. Molecules. 2015;20(12):21501 –14.
16. Uscanga A, Benavides, Pablo Zapata- Alonso SS, et al. Inhibitory effect of cuphea aequipetala extracts on murine b16f10 melanoma in vitro and in vivo. Biomed Res Int. 2019;
17. Mardani R, Hamblin MR, Taghizadeh M, et al. Nanomicellar-curcumin exerts its therapeutic effects via affecting angiogenesis, apoptosis, and t cells in a mouse model of melanoma lung metastasis. Pathol Res Pract. 2020;216(9):153082.
18. ATCC. Product human cell lines [internet]. 2020. Available from: https://www.atcc.org/Products/Cells_and_Microorganisms/Cell_Lines/Human.as px
19. Tomeh MA, Hadianamrei R, Zhao X. A review of curcumin and its derivatives as anticancer agents. Int J Mol Sci. 2019;20(5).
20. Purushotham  G,  Padma  Y,  Yusuf  N,  Raju  RRV.  In  vitro  evaluation  of  anti- proliferative,  anti-inflammatory  and  pro-apoptotic  activities  of  the  methanolic extracts of andrographis nallamalayana ellis on a375 and b16f10 melanoma cell lines. 3 Biotech. 2016;6(2):1 –11.
21. Sharma N, Arya G, Kumari R, Gupta N, Nimesh S. Evaluation of anticancer activity of  silver  nanoparticles  on  the  a549  human  lung  carcinoma  cell  lines  through alamar blue assay. Bio-Protocol. 2019;9(1).
22. Revathy  S,  Elumalai  S,  Benny  M,  Antony  B.  Isolation  ,  purification  and identification  of  curcuminoids  from  turmeric  (  curcuma  longa  l  .)  by  column chromatography.  J  Exp  Sci  [Internet].  2011;2(7):21 –25.  Available  from: jexpsciences.com/article/download/7767/3965
23. Kautsari  SN,  Purwakusumah  ED,  Nurcholis  W.  Profil  kromatografi  lapis  tipis ekstrak  kunyit  (curcuma  longa  linn)  segar  dan  simplisia  dengan  variasi  metode ekstraksi. Media Farm. 2020;16(1):65.
24. Diani  N,  Swantara  I,  Mahardika  I.  Aktivitas  antikanker  isolat  toksik  dari  ekstrak metanol  spons  genus  haliclona  grant,  1836  terhadap  sel  hela.  CAKRA  Kim (Indonesian E-Journal Appl Chem. 2015;3(2):39 –44.
25. Dasari  S,  Tchounwou  P.  Cisplatin  in  cancer  therapy: molecular  mechanisms  of action. Eur J Pharmacol. 2014;10(5):740:364-78.
26. Eirini C, Litina D. Curcumin analogues and derivatives with anti-proliferative and anti-inflammatory activity: Structural characteristics and molecular targets. Expert Opin Drug Discov. 2019;14(8):821 –42.