Jurnal Pharmascience, Vol 2, No. 2, Oktober 2015, hal: 71 - 79 ISSN-Print. 2355 – 5386 ISSN-Online. 2460-9560 http://jps.ppjpu.unlam.ac.id/

## Research Article

## Isolasi Bakteri Dari Tanah Gambut Penghasil Enzim Protease

## Dede Mahdiyah
Akademi Kebidanan Sari Mulia Banjarmasin Email: mahdiyahdede@yahoo.co.id

## ABSTRAK
Tanah  gambut  terbentuk  dari  hasil  dekomposisi  bahan-bahan  organik  dalam keadaan  anaerob.  Tanah  gambut  memiliki  karakteristik  fisika  dan  kimia  yang  dapat mempengaruhi  tingkat  kesuburan  gambut.  Mikroorganisme  pada  tanah  gambut beranekaragam  dan  memiliki  peranan  penting  sebagai  dekomposer,  penyedia  unsur hara  bagi  tanaman,  penghasil  enzim.  Peranan  enzim  sangat  penting  bagi  industri makanan,  obat,  pertanian,  dan  peternakan.  Salah  satu  enzim  yang  tersebar  luas  dan peranananya  cukup  baik  dalam  industri  adalah  protease.  Protease  merupakan biokatalisator  untuk  reaksi  pemecahan  protein.  Enzim  ini  akan  mengkatalisis  reaksi hidrolisis,  yaitu  reaksi  yang  melibatkan  unsur  air  pada  ikatan  spesifik  substrat. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  bakteri  dari  tanah  gambut  penghasil protease. Metode penelitian yang dilakukan adalah pengambilan sampel tanah gambut, isolasi  bakteri  dari  tanah  gambut  menggunakan  media Nutrient  Agar (NA)  dengan melalui teknik pengenceran dari 10 -1 sampai 10 -7 pada media NaCl 0,9%, setelah itu uji protease  menggunakan  media  NA  dan  susu  skim  1%,  untuk  identifikasi  bakteri menggunakan teknik pewarnaan Gram. Diperoleh hasil dari teknik isolasi bakteri dari tanah  gambut  sebanyak  180  isolat  yang  tumbuh  baik  dengan  suhu  inkubasi  37 o C selama  24  jam.  Isolat  yang  potensial  sebagai  penghasil  protease  sebanyak  lima  isolat yaitu  isolat  3TG,  4TG,  5TG,  6TG,  dan  7TG  yang  ditunjukkan  dengan  adanya  zona bening  disekitar  koloni  selama  48  jam.  Kelima  isolat  tersebut  berdasarkan  morfologi koloni yaitu memiliki bentuk bulat, bulat tidak beraturan, elevasi cembung, cekung dan datar, warna koloni putih, krem, kuning, kuning transparan dan orange. Berdasarkan uji  pewarnaan  Gram  kelima  isolat  tersebut  empat  isolat  merupakan  bakteri  Gram positif dan satu isolat yaitu 7TG termasuk Gram negatif.
Kata Kunci: Isolasi, Bakteri, Tanah Gambut.

## ABSTRACT
Peat soil is formed from the decomposition of organic materials in anaerobic state. Peat  soil  has  physical  and  chemical  characteristics  that  can  affect  the  level  of  fertility  of peat.  Microorganisms  in  diverse  peat  soil  and  has  an  important  role  as  decomposers, provider  of  nutrients  for  plants,  producing  enzymes.  The  role  of  the  enzyme  is  very important  for  the  food  industry,  medicine,  agriculture,  and  livestock.  One  enzyme  is widespread and the have role quite well in the industry is a protease. Protease is catalisator
biologyst  to  the  reaction  of  protein  breakdown.  This  enzyme  catalyzes  the  hydrolysis reaction,  the  reaction involving  water  element  on  a  substrate  specific  binding.  This  study aimed  to  isolated  the  bacteria  from  producing  peat  soil  protease.  Research  methodology were peat soil sampling, isolation of bacteria from peat using media Nutrient Agar (NA) by the  technique  of  dilution  from  10-1  to  10-7  in  0.9%  NaCl  media,  after  the  test  protease using NA and media skim milk 1%, for the identification of bacteria using Gram staining technique.  The  results  obtained  from  the  isolation  of  bacteria  from  the  peat  soil  of  180 isolates that grow well with incubation temperature of 37oC for 24 hours. Isolates potential as  a  producer  of  protease  five  isolates  that  isolates  3TG,  4TG,  5TG,  6TG,  and  7TG indicated  by  a  clear  zone  around  the  colony  for  48  hours.  Fifth  isolates  were  based  on morphology  of  the  colonies  which  have  a  spherical  shape,  irregular  round,  elevation convex, concave and flat, colony color white, beige, yellow, transparent yellow and orange. Gram  staining  test  is  based  on  the  five  isolates,  four  isolates  are  Gram-positive  bacteria and one isolate that 7TG including Gram negative.
Keywords: bacteria, isolate, peat soil.

## I. LATAR BELAKANG
Indonesia  memiliki  lahan  gambut terluas di antara negara tropis, yaitu sekitar 21  juta  ha,  yang  tersebar  terutama  di Sumatera,  Kalimantan  dan  Papua  (BB Litbang SDLP 2008). Setiap tahunnya luas gambut  ini  mengalami  penurunan  karena pembukaan lahan untuk kebutuhan manusia.  Kondisi  lahan gambut  di Indonesia  telah  banyak  yang  rusak. Kerusakan  tersebut  umumnya  karena kebakaran  pada  lahan  gambut  itu  sendiri. Kebakaran  lahan  hutan  gambut  99,9% disebabkan  oleh  manusia,  baik  disengaja maupun  akibat  kelalaiannya.  Penyebab kebakaran  karena  manusia  antara  lain konversi  lahan  seperti  pembukaan  lahan untuk  areal  perkebunan,  pertanian,  dan pembangunan jembatan.
Gambut  merupakan  tanah  yang terbentuk dari bahan organik pada fisiografi  cekungan  atau  rawa,  akumulasi
bahan  organik  pada  kondisi  jenuh  air, kondisi anaerob yang menyebabkan proses perombakan bahan organik berjalan sangat lambat,  sehingga  terjadi  akumulasi  bahan organik  yang  membentuk  tanah  gambut (Muslihat  2003).  Gambut  memiliki  sifat khas yang jarang diketahui oleh masyarakat  awam,  yaitu  tidak  dapat kembali  ke  bentuk  semula  dan  seperti spons  yang  dapat  menyerap  air  sebanyak mungkin namun jika sudah kering kemampuan  itu  akan  hilang.  Tanah gambut  terbentuk  dari  akumulasi  sisa-sisa tanaman  purba  yang  mati  dan  sebagian mengalami perombakan, mengandung minimal 12-18% C-Organik dengan ketebalan  minimal  50  cm,  tanah  gambut juga  terbentuk  dari  hasil  dekomposisi bahan-bahan  organik  dalam  keadaan anaerob (Hakim et al ., 1986).
Tanah  mengandung  bermacam- macam  mikroba  meliputi  berbagai  spesies
bakteri,  gangang,  cendawan  dan  lain-lain. Bakteri  dan  fungi  sangat  berperan  aktif dalam  memecah  bahan-bahan  organik sehingga  banyak  ditemukan  di  tanah gambut,  karena  tanah  gambut  terbentuk dari hasil dekomposisi bahan-bahan organik  dalam  keadaan  anaerob.  Aktivitas mikroba diperlukan untuk menjaga ketersediaan  unsur  hara  penting  bagi tanaman  yaitu  nitrogen.  Nitrogen  akan diubah  kedalam  bentuk  amoniak  menjadi nitrit  dan  nitrit  menjadi  nitrat  oleh  bakteri nitrifikasi (Darjamuni, 2003).
Tanah gambut juga bersifat masam, kemasaman  gambut  ini  dipengaruhi  oleh kandungan  asam  asam  organik  yang terdapat pada koloid gambut. Dekomposisi bahan  organik  pada  kondisi  anaerob menyebabkan terbentuknya senyawa fenolat dan karboksilat yang menyebabkan tingginya  kemasaman  gambut.  Selain  itu kandungan  unsur  hara  yang  terdapat  pada gambut  juga  menyebabkan  banyaknya mikroorganisme  yang  hidup  disana  dan memiliki  peranan  seperti  kemampuan proteolitik,  selulolitik,  dan  juga  penambat nitrogen.
Dewasa  ini  industri  enzim  telah berkembang  pesat  dan  menempati  posisi penting  dalam  bidang  industri.  Kesadaran masyarakat  terhadap  masalah  lingkungan yang  semakin  tinggi  serta  adanya  tekanan dari  para  ahli  dan  pecinta  lingkungan menjadikan teknologi  enzim sebagai  salah
satu alternatif untuk menggantikan berbagai  proses  kimiawi  dalam  bidang industri  (Falch  1991).  Enzim  merupakan katalisator  pilihan  yang  diharapkan  dapat mengurangi  dampak  pencemaran  dan pemborosan  energi  karena  reaksinya  tidak membutuhkan energi tinggi, bersifat spesifik, dan tidak beracun (Aunstrup et al . 1979).
Enzim protease merupakan biokatalisator  untuk  reaksi  pemecahan protein.  Enzim  ini  akan  mengkatalisis reaksi hidrolisis, yaitu  reaksi yang melibatkan  unsur  air  pada  ikatan  spesifik substrat.  Karena  itu,  enzim  ini  termasuk dalam  enzim  utama  golongan  hidrolase. Protease ialah enzim yang sangat kompleks,  mempunyai  sifat  fisiko  kimia dan  sifat  katalitik  yang  sangat  bervariasi. Protease dapat dihasilkan secara ekstraseluler dan intraseluler dan mempunyai peranan penting dalam metabolisme  sel  dan  keteraturan  proses dalam sel (Ward et al ., 2009).
Dalam  dasa  warsa  terakhir  ini terjadi  peningkatan  lebih  pesat  dalam pemakaian  enzim  karena  sifatnya  yang efisien, selektif, mengkatalisis reaksi tanpa produk  samping  dan  ramah  lingkungan. Salah  satu sumber  protease  adalah mikroba. Protease mikroba dapat diklasifikasikan  sebagai  protease  serin (E.C. 3.4.21), protease sulfhydril (E.C.3.4.22),  protease  asam  (E.C.3.4.23)
dan metaloprotease (E.C.3.4.24). Beberapa mikroorganisme  yang  telah  diketahui sebagai  penghasil  protease  untuk  aplikasi komersial  adalah  Bacillus,  Lactobacillus, Pyrococcus, Termonospora Rhizopus, Mucor,  Endothia  and  Aspergillus  (Rao,  et al.,  1998;  Ward  et  al.,  2009).  Begitu pentingnya  enzim  ini  sehingga  perlu mencari  enzim  dari  mikroba  dengan habitat  yang  berbeda  sehingga  diharapkan enzim  yang  dihasilkan  memiliki  karakter yang  unik  untuk  memenuhi  kebutuhan industri  baik  industri  produk  pertanian, kimia dan medis. Salah satu sumber enzim ini  adalah  mikroba  dari  tanah  gambut Banjarmasin. Mikroorganisme yang
beraneka  ragam  ditemukan  di  tanah gambut dapat diaplikasikan untuk kepentingan  penelitian  yaitu  mencari potensi  mikroba  tersebut  dalam  berbagai aspek  seperti  kesehatan,  obat,  pertanian dan  lain  sebagainya.  Oleh  karena  itu penting  dilakukan  isolasi  mikroba  dari tanah gambut yaitu bakteri untuk didientifikasi  dari  segi  morfologi  yang kemudian  akan  dilanjutkan  pada  tahap proteolitik, dan potensi senyawa antimikroba.

## II. BAHAN DAN METODE

## A. Pengambilan Sampel
Sampel  tanah  gambut  diambil  di  lokasi daerah gambut yaitu daerah di
Banjarmasin Kalimantan Selatan.
B. Isolasi Bakteri Dari Tanah

## Gambut
Isolasi    bakteri    dari  tanah    gambut dilakukan    dengan    cara    tanah  di timbang  sebanyak    2    Gr    kemudian dimasukkan  ke  dalam  Erlenmeyer   yang berisi    NaCl  0,9%    lalu  dilakukan pengenceran  dari  10 -1 sampai  dengan
10 -7 .  Pada  tiga  pengenceran  terakhir disebar pada  media  agar Nutrient   Agar
(NA)    dan    diinkubasi    pada    suhu    37oC selama  24  jam.   Setelah    itu,  dilakukan pengamatan  dan  di  hitung  jumlah  koloni yang tumbuh.

## C. Uji Protease
Aktivitas  proteolitik  isolat  diuji  dengan menggunakan  medium  agar  +  susu  skim 1%.  Isolat  ditumbuhkan  pada  media kultur cair di inkubator bergoyang selama semalam.  Sebanyak  15  µL  isolat  dari kultur  cair  diteteskan  ke  paper  disk. Kemudian paper disk tersebut di letakkan di  atas  media  agar  +  susu  skim  lalu diinkubasi  selama  24  jam.  Nisbah  antara diameter  zona  jernih  terhadap  diameter koloni  (indeks  proteolitik  =  IP).  Isolat dengan  IP  ≥  3,0  dipilih  dan  disimpan pada  suhu  4 0 C  untuk  digunakan  pada  uji selanjutnya  (Cappucino  &  Sherman 2001).
D. Identifikasi bakteri penghasil

## protease
Isolat bakteri yang telah berhasil diisolasi dan  memiliki  kemampuan  proteolitik diidentifikasi berdasarkan morfologi koloni dan morfologi sel.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Hasil
Isolasi  Mikroorganisme  dari  Tanah Gambut. Berdasarkan hasil isolasi bakteri dari  tanah  gambut  diperoleh  isolat  bakteri yang  ditumbuhkan  pada  media Nutrient Agar (NA)  sejumlah  180  isolat  dengan lama  pertumbuhan  bakteri  selama  24  jam ditumbuhkan  dalam  inkubator  pada  suhu 37 O C (Gambar 1).
(a)                         (b)                     (c)
Gambar  1.  (a)  isolat  bakteri  hasil  isolasi dengan  teknik  pengenceran  dari  10 -1 sampai dengan 10 -7 , (b) isolat bakteri hasil teknik gores empat, (c) isolat bakteri yang sudah dimurnikan.
Aktivitas  Proteolitik. Isolat  bakteri  yang telah  berhasil  diisolasi  diuji  kemampuan proteolitiknya pada media agar+susu  skim 1%.  Dari  hasil  uji  diperoleh  lima  bakteri yang potensial sebagai penghasil protease, isolat tersebut yaitu isolat 3TG, 4TG, 5TG, 6TG  dan  7TG  hal  ini  terlihat  dengan
adanya  zona  bening  disekitar  isolat (Gambar 2).
Gambar  2.    isolat  bakteri  hasil isolasi  dari tanah  gambut  yang  mampu  menghasilkan enzim protease.

## Identifikasi  bakteri  penghasil  protease.
Lima  bakteri  yang  potensial  penghasil protease  diidentifikasi  secara  morfologi koloni  dan  morfologi  sel  dengan  teknik pewarnaan Gram (Tabel 1).
Tabel  1.  Karakter  morfologi koloni  dan  morfologi  sel  bakteri  hasil isolasi  dari  tanah  gambut  penghasil protease.
Karakter Isolat Bakteri Morfologi Koloni Bentuk Bulat Tepian Licin, bergerigi, berombak Elevasi Cembung, cekung, datar Warna Putih, krem, kuning, orange, kuning  transparan dan ungu Morfologi Sel Bentuk Sel Batang Warna Sel Merah dan ungu

## B. Pembahasan
Berdasarkan hasil yang diperoleh dari teknik isolasi dengan media NA sebanyak 180  isolat  bakteri  tumbuh  dengan  baik pada  suhu  37 o C  selama  24  jam.  hasil yang  diperoleh  sesuai  dengan  pendapat
Tate (2000) bahwa pada tanah masam (pH <7,0),  populasi  mikroba  dalam  tanah berkisar  10 4 per  gram  tanah  artinya banyak mikroorganisme tumbuh baik pada tanah  gambut  yang  memiliki  potensi untuk  bidang  pertanian,  farmakologi maupun  industri  lainnya.  Isolat  yang diperoleh  dari  hasil  isolasi  tanah  gambut diberikan nama dengan isolat nomor isolat dan  sampel  yaitu  isolat  1TG  (Tanah Gambut).
Mikroorganisme adalah sumber enzim  yang  paling  banyak  digunakan dibandingkan dengan tanaman dan hewan. Sebagai  sumber  enzim,  mikroorganisme lebih menguntungkan karena pertumbuhannya  cepat,  dapat  tumbuh pada  substrat  yang  murah,  lebih  mudah ditingkatkan  hasilnya  melalui  pengaturan kondisi pertumbuhan dan rekayasa genetik, serta mampu menghasilkan enzim yang ekstrim (Akhdiya, 2003). Pada tanah yang  memiliki  karakteristik  asam  seperti lahan  gambut,  maka  mikroba  yang  ada adalah  mikroba  kelompok  asidofilik  yang memegang  peranan  penting  dalam  proses dekomposisi  berbagai  bahan  organik. Bakteri penambat N mempunyai kemampuan  menambat  nitrogen  bebas (N2)  yang  berasal  dari  udara  dan merubahnya  menjadi  amonia  (NH3)  yang kemudian  diubah  menjadi  asam  amino yang  akan  digunakan  oleh  tanaman  untuk tumbuh  dan  berkembang  (Alexander,
1977).  Selain  nitrogen,  keberadaan  fosfat di  tanah  hanya  sedikit  yang  dapat digunakan  oleh  tanaman  secara  langsung. Jumlah  P  yang  sangat  rendah  karena terikat  menjadi  Fe-fosfat  dan  Al-fosfat pada  tanah  masam  atau  Ca3(PO4)2  pada tanah  basa  (Cunningham  dan  Kuiack, 1992).  Bakteri  selulolitik  juga  berperanan penting, karena mampu merombak senyawa organik yang mengandung selulosa  menjadi  senyawa  yang  lebih sederhana  sehingga  dapat  dimanfaatkan oleh tanaman.
Kemampuan  proteolitik  bakteri  yang diisolasi  dari  tanah  gambut  ditunjukkan dengan  zona  bening  yang  terbentuk disekitar  koloni  yang  menggunakn  media NA  dan  susu  skim  1%.  Sebanyak  lima isolat yang memiliki kemampuan proteolitik  dengan  kemampuan  indek proteolitik (IP) 3 atau lebih dari 3. Adanya protease ekstraseluler bakteri menyebabkan  kandungan  protein  pada media  NA  terhidrolisis  menjadi  peptida dan asam  amino. Zona bening merupakan indikator  bahwa  isolat  bakteri  mampu memanfaatkan protein pada media sebagai sumber  nutrisinya  (Badriyah  dan  Ardyati, 2013).
Bakteri  memiliki  aktivitas  proteolitik yang  tinggi  pada  fase  logaritmik  karena sel  berada  dalam  kondisi  optimum  untuk metabolisme dan perkembangbiakan (Yunita,  2012).  Hasil  riset  yang  lain
menunjukan  bahwa  aktivitas  protease yang dihasilkan oleh bakteri yang tertinggi  terlihat  pada  fase  stasioner  yaitu seiring  dengan  pertumbuhan  sel  (Baehaki dan  Budiman,  2011).  Penelitian  lain  pada produksi  protease  bakteri  didapatkan bakteri  dengan  waktu  produksi  protease optimum (48 jam) adalah Bacillus subtilis PE-11  (Adinarayana et  al ,  2003)  dan Bacillus licheniformis Lbbl-11 (Olajuyigbe  and  Ajele  2008),  hal  ini sesuai  dengan  hasil  penelitin  yang dilakukan  bahwa  ke  lima  isolat  yang menghasilkan zona bening disekitar koloni  tumbuh  optimum  pada  waktu  48 jam isolat tersbut adalah isolat 3TG, 4TG, 5TG, 6TG dan 7TG.
Berdasarkan uji karakteristik morfologi  koloni  dan  sel,  ke  lima  isolat tersebut memiliki bentuk bulat, bulat tidak beraturan,  berombak,  memiliki  warna koloni  putih,  krem,  kuning,  orange,  dan kuning transparan. Hasil dari uji Gram ke lima isolat tersebut yaitu isolat 3TG, 4TG, 5TG,  dan  6TG  termasuk  Gram  positif berbentuk batang dan isolat 7TG termasuk Gram negatif berbentuk batang.
Protease  merupakan  enzim  perombak protein.  Oleh  karena  itu,  contoh  tanah untuk  keperluan  isolasi  bakteri  proteolitik diambil  dari  tempat-tempat  yang  banyak mengandung protein seperti rumah pemotongan  hewan,  tambak,  dan  tempat pembuangan  susu  rusak  serta  tanah
gambut  yang  kaya  akan  bahan  organik. Sebanyak  lima  isolat  bakteri  diperoleh dari  tanah  gambut.    Isolasi  dilakukan dengan  menggunakan  medium yang mengandung  kasein,  yang  merupakan substrat  yang  baik  untuk  mengisolasi bakteri  penghasil  enzim  protease  dan menginduksi  sintesis  enzim  protease alkalin  (Ward  1983;  Fujiwara  dan Yamamoto  1987).  Selain  itu,  protease  jua merupakan enzim kontitutif atau indusibel parsial. Enzim kontitutif selalu tersedia di dalam  sel  mikroba  dalam  jumlah  yang relatif  konstan,  sedangkan  enzim  induktif disintesis  bila  ada  induksi  substrat  dalam medium. Sintesis enzim induktif meningkat seiring peningkatan konsentrasi substrat terutama bila susbtratnya merupakan satu-satunya sumber karbon (Lidya dan Djenar, 2000).
Aktivitas  enzim  protease  dipengaruhi oleh  banyak  faktor  yairu  suhu,  pH, konsentrasi media, waktu inkubasi. aktivitas  protease  semakin  meningkat dengan  bertambahnya  suhu  sampai  suhu optimum  tercapai,  setelah  itu  kenaikan lebih  lanjut  akan  menyebabkan  aktivitas protease  menurun.  Pada  suhu  yang  lebih rendah dari suhu optimum, aktivitas enzim juga rendah, hal ini disebabkan rendahnya energi  aktivasi  yang  tersedia.  Energi tersebut  dibutuhkan  untuk  menciptakan kondisi  tingkat  kompleks  aktif,  baik  dari molekul  enzim  maupun  dari  molekul
substrat.  Perubahan  pH  yang  ekstrim, enzim  dapat  mengalami  denaturasi  akibat gangguan  terhadap  berbagai  interaksi  non kovalen  yang  menjaga  kestabilan  struktur 3  dimensi  enzim  (Hames  dan  Hooper, 2000).  Vazquez et  al. (2008)  melaporkan protease Psudoalteromonas sp strain P96-
47  yang  berasal  dari  laut  Antartik memiliki pH optimum 7 - 9. Protease dari bakteri  laut Alteromonas sp  strain  O-7 memiliki  pH  optimum  10  (Miyamoto et al. ,  2002).  Hasil  dari  penlitian  yang diperoleh  menunjukkan  bahwa  ke  lima isolat  tersebut  mampu  menghasilkan protease  karena  pengaruh  media  yang digunakan, pH media, dan suhu pertumbuhan optimum.

## IV. KESIMPULAN
Lima isolat yang berhasil diisolasi dari tanah  gambut  menggunakan  media  NA memiliki  kemampuan  proteolitik  yang dibuktikan  dengan  terbentuknya  zona bening  disekitar  koloni  pada  media  NA dan  susu  skim  1%.  Isolat  tersebut  adalah 3TG,  4TG,  5TG,  6TG,  dan  7TG  yang termasuk  Gram  positif    bentuk  sel  batang (3TG, 4TG, 5TG, 6TG)  dan Gram  negatif bentuk sel batang untuk isolat 7TG.

## DAFTAR PUSTAKA
Adinarayana  K,  Sllaiah  P,  Prasad  DS.
2003. Production and partial characterization of thermostable serine  alkaline  protease  from  a
newly  isolated  Bacillus  subtilis  PE- 11. AAPS PharmSciTech . 4:E56-64. Adinogroho  WC,  Suharjo  BH,  Labueni  S,
Surydiputra. 2005. Panduan Pengendalian Kebakaran Hutan dan Lahan Gambut . Bogor. WIIP. Akhdiya A. 2003. Isolasi Bakteri
Penghasil  Enzim  Protease  Alkalin Termostabil. Buletin Plasma Nutfah .
Vol.9 (2):38-44.
Aunstrup, K.O., O. Andressen, E.A. Falch, and  T.K.  Nielsen.  1979.  Production of  microbial  enzymes. In .  Pepples,
H.J and D. Perlman ( Eds .).
Microbial Technology . Vol. 1. Academic Press Inc., New York.
Badriyah IB dan Ardyati T. 2013. Deteksi Aktivitas  Proteolitik  Isolat  Bakteri Asal  Ampas  Tahu  Pada  Substrat Bekatul. Jurnal  Biotropika Vol.  1 (3): 109-113.
Baehaki A, Rinto, Budiman A. 2011.Isolasi dan Karakterisasi
Protease  dari  Bakteri  Tanah  Rawa
Indralaya  Sumatera  Selatan.    J . Teknol.  dan  Industri  Pangan ,  Vol. XXII (1):37-42. Cappuccino  JG  and  Sherman.  2001.
Microbiology:
A Laboratory
Manual . Addison-Wesley: USA. Cunningham  JE.  and  C  Kuiack.  1992. Production  Of  Citric  and  Oxalic Acid  and  Solubilization  of  Calsium Phosphateby Penicillium bilail .
Appl.  Environ.  Microbial. 58:1451-
1458
Darjamuni, 2003. Siklus Nitrogen di Laut , Program Study Pengelolaan
Sumberdaya  Pesisir  dan  Lautan Program  Pasca  Sarjana  Institut Pertanian Bogor.
Falch,  E.A.  1991.  Industrial  enzyrres developments  in  production  and application. Biotech. Adv . 9:643-658. Fujiwara,  N.  and  K.  Yamamoto.  1987. Production  of  alkaline  protease  in low  cost  medium  by  alkalophilic Bacillus sp.  and  properties  of  the enzyme. J.  Fenrment.  Technol . 65(3):345-348.
Hakim,  N,  Nyakpa,  MY,  Lubis,  AM, Nugroho,  SG,  Saul,  R,  Diha,  A,
Hong,  &  GB,Bailey,  1986, Dasar- Dasar Ilmu Tanah , Penerbit Universitas Lampung Hames BD, Hooper NM. 2000, Biochemistry:  The  Instant  Notes .
Ed.ke-2. Hongkong:Springer-Verlag. Lidya  &  Djenar.  2000. Dasar  Bioproses Direktorat  Pembinaan  dan  Fenolinin dan Pengabdian Masyarakat Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Departemen Pendidikan
Nasional: Jakarta.
Miyamoto K, Tsujibo H, Nukui E, Itoh H,
Kaidzu Y, Inamori Y. 2002.
Isolation  and  characterization  of  the genes encoding two metalloproteases
(MprI  and  MprII)  from  a  marine bacterium, Alteromonas sp. strain O-
7. Biosci Biotecnol Biochem
66(2):416-21.
Muslihat  L.  2003.  Teknik  pengukuran tanah  gambut  di  lapangan  dan  di laboratorium.Bogor. Buletin  Teknik Pertanian . 8:69.
Olajuyigbe  FM,  Ajele  JO.  2008.  Some properties  of  extracelullar  protease from  Bacillus  licheniformis  Lbbl-1 isolated  from  ’iru’,  a  traditionally fermented African locust bean condiment. Glob.  J.  Biotechnol.
Biochem . 3 (1): 42-46.
Rao  MM,  Tanksale  AM,  Gatge  MS,
Desphande VV. 1998. Molecular and biotechnological
aspects
of
microbial  proteases. Microbiol.  And Mol. Biol. Rev . 62(3):597-635.
Vázquez  SC,  Hernández  E,  Cormack
WPM.  2008.  Extracellular  proteases from the Antarctic marine Pseudoalteromonas sp. P96-47
strain. Revista Argentina de Microbiologia 40:63-71.
Ward, O.P. 1983. Proteinases. In Fogarty,
W.M.  (Ed.).  Microbial  Enzymes  and
Biotechnolgy. Applied
Science
Publishers. London. p. 251-290.
Ward  OP,  Rao  MB,  Kulkarni  A.  2009.
Proteases
production.
Appli.Microbiol. Industrial 495-511.
Yunita,  S.  P.  2012.  Skrining  dan  Uji Aktivitas  Enzim  Protease  Bakteri dari  Limbah  Rumah  Pemotongan Hewan.  Biologi. Jurnal  Skripsi Fakultas Sains dan Teknologi.
Universitas Airlangga..