DOI: 10.24198/jit.v18i1.15329
Unpad Press                                                                                                                    Available online at http://jurnal.unpad.ac.id/jurnalilmuternak
Viabilitas  Oosit  Domba  Pasca  Vitrifikasi  menggunakan  Kombinasi  Ethilen Glikol dan Dimetil Sulfoksida dengan Dua Level Konsentrasi yang Berbeda
T. Gita 1a , R. Widyastuti 2 , M. R. A. A. Syamsunarno 3
1 Program Studi Kedokteran Hewan, Fakultas Kedokteran, Universitas Padjadjaran
2 Laboratorium Reproduksi dan Inseminasi Buatan, Departemen Produksi Ternak, Fakultas Peternakan, Universitas Padjadjaran
3 Departemen Ilmu Kedokteran Dasar, Fakultas Kedokteran, Universitas Padjadjaran a Email: tyagita.hartady@gmail.com

## Abstrak
Vitrifikasi  merupakan  metode  kriopreservasi  untuk  membekukan  sel  secara  cepat,  tanpa  disertai terbentuknya kristal es. Vitrifikasi dilakukan dengan menggunakan krioprotektan yang memiliki toksitas rendah  sehingga  oosit  dapat  mempertahankan  viabilitasnya.  Dimetil  sulfoksida  (DMSO)  dan ethylene glycol  (EG) merupakan  krioprotektan  intraseluler  dengan  toksisitas  rendah  sehingga  kombinasi  kedua krioprotektan  tersebut  diharapkan  dapat  meningkatkan  viabilitas  oosit  pasca  vitrifikasi.  Tujuan  dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi viabilitas oosit pasca vitrifikasi dengan menggunakan kombinasi DMSO  dan  EG  pada  konsentrasi  yang  berbeda.  Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium  Riset  dan Bioteknologi,  Fakultas  Peternakan,  Universitas  Padjadjaran  periode  September  2016-Desember  2016. Penelitian  menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap  dengan  dua  kelompok  perlakuan,    yaitu  media vitrifikasi dengan dua konsentrasi yang berbeda: 15% DMSO+15% EG dan media 17% DMSO+17%EG. Setelah  seminggu  penyimpanan,  maka  dilakukan  proses warming untuk  mengevaluasi  viabiltias  oosit pasca  vitrifikasi.  Hasil  Penelitian  menunjukkan bahwa  viabilitas  oosit  yang  divitrifikasi  dengan menggunakan 17%  DMSO+17%EG  nyata  lebih  tinggi  apabila  dibandingkan  dengan  15% DMSO+15%EG.
Kata kunci: vitrifikasi, Dimetil sulfoksida, Ethylen glikol, viabilitas oosit
Sheep  Oocyte  Viability  after  Vitrification  using  Two  Level  Different Concentration Combination of Ethylene Glycol and Dimethyl Sulfoxida

## Abstract
Vitrification is a cryopreservation method to freeze cell rapidly without ice crystallization. Vitrification is done  using  cryoprotectant  with  a  low  toxicity  so  the  oocyte  is  able  to  maintain  its  viability.  Dimethyl sulfoxide  (DMSO)  and  ethylene  glycol  (EG)  are  intracellular  cryoprotectants  with  low  toxicity  so  the combination  of  both  cryoprotectants  is  expected  to  increase  post-vitrification  oocyte  viability. The objectives of this study were to evaluate the viability of post-vitrification oocytes by using a combination cryoprotectant  of  EG  and  DMSO  at  different  concentrations.  The  research  was  conducted  at  Research and Biotechnology Laboratory, Faculty of Animal Husbandry, Padjadjaran University period September 2016-December 2016. The study used the Complete Randomized Design with two treatment groups, two vitrification medias with two different concentrations, 15% DMSO+15% EG and 17% DMSO+17%EG. After a week of storage, a warming process was performed to evaluate the viability of post-vitrification oocytes.  The  results  showed  that  the  viability  of  the  vitrified  oocytes  using  17%  DMSO+17%  EG  was significantly higher when compared with 15% DMSO + 15% EG.
Keyword: vitrification, Dimethyl sulfoxide, Ethylene glycol, viability of oocytes

## Pendahuluan
Daya  hidup  oosit  terbatas  mengingat setelah  oosit  diovulasikan  akan  mengalami degradasi  sehingga  jika  dibiarkan  untuk  waktu yang  terlalu  lama  pasca  ovulasi,  menyebabkan
oosit  tidak  akan  dapat  difertilisasi.  Oosit  yang berasal  dari  ovarium  sapi  pada  suhu  37 o C selama  8  jam  telah  terbukti  akan  mengalami penurunan  performa  pada  tahap  pembelahan maupun  tahap  blastosis  (Yang et  al., 1990). Untuk  mencegah  kerusakan  oosit,  diperlukan teknologi  penyimpanan  oosit  agar  daya fertilitasnya  dapat  diperpanjang.  Kriopreservasi sudah  lama  dilakukan  sebagai  upaya  untuk menyimpan  sekaligus  mengawetkan  oosit  dari betina  dewasa  untuk  jangka  waktu  yang  lama (Gook,  2011).  Dengan  kryopreservasi,  oosit akan  mengalami  dorman  dan  dihambat metabolismenya dalam kurun waktu yang sudah ditentukan  tanpa  mematikan  sel.  Oosit  dapat melanjutkan  perkembangannya  kembali  setelah dilakukan proses warming .
Vitrifikasi merupakan  salah  satu  metode  kriopreservasi dengan  menggunakan  waktu  yang  sangat  cepat dan  konsentrasi  krioprotektan  yang  tinggi sehingga  tidak  terbentuk  kristal  es  baik intraseluler maupun ekstraseluler (Silber, 2017). Kondisi  demikian  tentunya  akan  mengurangi kerusakan  sel  akibat  proses  kriopreservasi sehingga  sel  dapat  dipertahankan  kelangsungan hidupnya (Djuwita, 2001).
Proses vitrifikasi memerlukan krioprotektan  sebagai  pelindung  sel  selama proses  pembekuan.  Ethylen  glikol  (EG)  dan dimetil  sulfoksida  (DMSO)  sudah  digunakan sebagai  kryoprotektan  bertahun-tahun  dan terbukti  dapat  digunakan  dalam  vitrifikasi  sel telur dan embrio sapi (Vajta et al., 1998). Sudah dilaporkan  dalam  studi  yang  dilakukan  oleh Newton  dan  Subramoniam  (1996),  bahwa  EG memiliki  dampak  sitotoksik  yang  rendah terhadap  embrio,  sedangkan  studi  yang dilakukan  Kartberg et  al., 2008  menyebutkan bahwa  DMSO  tidak  menyebabkan  kerusakan membrane  sel  dan  kematian  pada  embrio. Namun  sangat  disayangkan,  karena  terbatasnya penelitian  tentang  konsentrasi  optimal  DMSO jika  dikombinasikan  dengan  EG  untuk digunakan sebagai media vitrifikasi.
Berdasarkan  uraian  tersebut,  maka tujuan  dari  pe nelitian  ini  adalah  untuk mengevaluasi  viabilitas  oosit  pasca  vitrifikasi dengan menggunakan kombinasi DMSO dan EG dengan  dua  level  konsentrasi  yang  berbeda. Melalui  penelitian  ini,  diharapkan:  1).  Dapat
dievaluasi efektifitas vitrifikasi dengan menggunakan  media  yang  mengandung  variasi DMSO  dan  EG,  serta  2)  Dapat  diketahui perbandingan kuantitas dan kualitas oosit dalam konsentrasi media vitrifikasi yang diujikan.

## Materi dan Metode
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Riset  dan  Bioteknologi,  Fakultas  Peternakan, Universitas  Padjadjaran  periode  September 2016-Desember 2016.

## Bahan
Oosit  yang  diperoleh  dari  ovarium domba  lokal  yang  dipotong  di  tempat pemotongan  hewan  (TPH)  setempat,  NaCl fisiologis 0,9%, fetal bovine serum (FBS), tissue culture  media 199  (TCM  199), follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH),  dimethyl  sulfoxide ( DMSO),  ethylene glycol (EG), sukrosa, Na Bicarbonat, Phosphate Buffer Saline (PBS). Koleksi oosit menggunakan hemistraw ( home  made ) saat  vitrifikasi, kemudian diamati dengan mikroskop stereo dan inverted .

## Media yang digunakan
Media  maturase  oosit  yang  digunakan adalah  media  TCM199  (Sigma,  USA)  yang ditambahkan FBS 10%, 10 IU/ml pregnant mare serum  gonadotrophin (PMSG)  (Intergonan, Intervet  Deutschland  GmbH),  10  IU/ml human chorionic  gonadotrophin (hCG)  (Chorulon, Intervet  international  B.V.  Boxmeer-Holland) dan 50 µg/ml gentamycin (Sigma, USA). Media yang  digunakan  untuk  equilibrasi  oosit  adalah 8,5%  v/v  DMSO  +  8,5%  v/v  EG  dalam  media dasar PBS yang telah ditambahkan dengan FBS 20%.  Media  vitrifikasi  yang  digunakan  adalah 17%  v/v  DMSO  +  17%  v/v  EG  +  0.65  M sukrosa  dalam  media  dasar  PBS  yang  telah ditambahkan dengan FBS 20%.

## Metode Pengambilan Sampel Koleksi Ovarium dan Koleksi Oosit
Metode  koleksi  oosit  yang  digunakan pada penelitian ini adalah sesuai dengan metode
yang  digunakan  oleh  Widyastuti  dan  Rasad (2015).  Ovarium  dicuci  dengan  media  koleksi, setelah  itu  dipotong  untuk  mendapatkan  oosit. Oosit  yang  didapat  kemudian  dicuci  dengan NaCl fisiologis 0,9% sebanyak 2 kali, sedangkan pencucian terakhir dengan media maturasi TCM 199.  Objek  penelitian  adalah  oosit  yang mempunyai  sel-sel  kumulus  komplek  lebih  dari dua lapis dengan sitoplasma homogen.

## Proses Maturasi Oosit
Proses  maturasi  oosit  yang  digunakan pada penelitian ini adalah sesuai dengan metode yang  digunakan  oleh  Widyastuti et  al .,  2017a. Oosit  dimaturasi  secara in  vitro dalam  media maturasi selama 24 jam. Oosit dicuci sebanyak 3 kali  dengan  media  dPBS,  kemudian  oosit dipindahkan  ke  dalam  100 µ L drop media pematangan  yang  dibuat  pada petridish steril lalu  ditutup  dengan  mineral  oil.  Setiap drop media  pematangan  berisi  sekitar  yaitu  10  oosit. Selanjutnya  oosit  diinkubasi  selama  24-26  jam dalam inkubator pada suhu 38,5°C, 5% CO 2 dan kelembaban 95%. Selanjutnya dilakukan evaluasi  terhadap  kematangan  oosit.  Tingkat kematangan  oosit  dievaluasi  dengan  melihat munculnya  polar  body  pertama.  Selanjutnya dilakukan  vitrifikasi  pada  oosit  yang  telah matang.
Metode Vitrifikasi dan Warming (pencairan) Oosit
Proses vitrifikasi (simpan beku) dan warming Oosit
Oosit  yang  telah  matang  divitrifikasi dengan menggunakan carrier hemistraw ( home- made ).    Oosit  diequilibrasi  selama  10  menit  di dalam  larutan  equilibrasi,  kemudian  dipaparkan ke  dalam  medium  vitrifikasi  selama  30  detik. Selanjutnya  oosit  di load ke  dalam hemistraw . Alat  ini  kemudian  dipaparkan  secara  langsung ke  dalam liquid  nitrogen (LN 2 )  dan  kemudian disimpan di dalam tanki LN 2 sebelum dilakukan warming kembali.    Semua  proses  vitrifikasi tersebut dilakukan di suhu ruang.
Oosit  dicairkan  kembali  dengan  cara memasukkan carrier ( hemistraw )  ke  dalam  3 serial  media  pencairan  yang  berbeda;  0.5  M sukrosa,  0.25  M  sukrosa  dan  0.15  M  sukrosa. Setelah warming , oosit dikultur dalam incubator CO 2 selama 3-4 jam untuk melihat apakah oosit hidup (viabilitas) atau mati (lisis) (Widyastuti et al ., 2017b).

## Evaluasi Viabilitas Oosit
Evaluasi  viabilitas  oosit  domba  setelah vitrifikasi  dilakukan  dengan  mengkultur  secara in  vitro pada  media  kultur  selama  3  jam  untuk melihat re-ekspansi sel-sel, keutuhan sitoplasma, dan  kondisi  zona  pelusida  (Winangun et  al ., 2017).

## Analisa Statistik
Penelitian  ini  menggunakan  metode eksperimental  laboratorium.  Perlakuan  yang dicobakan  adalah  vitrifikasi  oosit  domba, menggunakan  media  vitrifikasi  dengan  dua konsentrasi  yang  berbeda . Data  dianalisa dengan  menggunakan SPSS  software  versi  16 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Persentase oosit hidup  setelah  vitrifikasi- warming dianalisa dengan  t-student  test,  perbedaan  signifikan apabila P<0,05.

## Hasil dan Pembahasan
Penelitian  tentang  vitrifikasi  oosit dengan  berbagai  macam  metode  sudah dilakukan  di  banyak  studi  untuk  mengetahui seberapa  jauh  oosit  dapat  bertahan  hidup.
Vitrifikasi  bertujuan  untuk  mencegah  proses pengkrisatalan es dalam sel akibat adanya cairan intra dan ekstraselular dalam proses pembekuan. Pengkristalan  es  dalam  sel  akan  menyebabkan sel  mudah  pecah  dan  akhirnya  menjadi  lysis. Maka dari itu, diperlukan medium penyimpanan sel yang mampu menghindari proses pengkristalan  es  tersebut  terjadi.    Oleh karenanya,  medium  penyimpanan  sel  adalah salah  satu  faktor  krusial  dalam  mempengaruhi daya  tahan  oosit  selama  proses  vitrifikasi berlangsung. Dalam  penilitian  ini,  digunakan kombinasi  DMSO  dan  EG  sebagai  medium penyimpanan  oosit  selama  proses  vitrifikasi berlangsung,  Viabilitas  oosit  setelah  vitrifikasi- warming  dapat  dilihat  pada  Tabel  1.

## Tabel 1. Data Viabilitas atau Persentase Hidup Oosit Pasca Vitrifikasi-Warming
Secara  statistik,  dapat  diamati  bahwa dari  55  oosit  yang  diujikan,  terdapat  28  oosit yang mampu bertahan dalam media kriopreservasi  mengandung  15%  DMSO+15% EG.  Sedangkan  dalam  media  vitrifikasi  yang mengandung  17%  DMSO+17%  EGdiperoleh hasil  21  dari  31  oosit  yang  diujikan  mampu bertahan  hidup.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa viabilitas  oosit  dalam  krioprotektan  17% DMSO+17%EG  atau  lebih  tinggi  2.34% dibandingkan dengan 15%EG+15% DMSO.
Dalam  media  17%  DMSO+17%  EG, konsentrasi  baik  DMSO  dan  EG,  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  satu  media  pembanding lainnya,  sehingga  yang  masuk  ke  dalam  oosit lebih  banyak  dan  lebih  mampu  meningkatkan permeabilitas  membran  sel  dan  mempermudah EG, yang memiliki berat molekul rendah, masuk ke  dalam  sel  oosit.  Ketika  keduanya  sudah masuk  ke  dalam  oosit,  hal  ini  akan menyebabkan  lebih  banyak  cairan  intra  dan ekstraseluler  tertarik  keluar,  sehingga  proses pengkristalan  akibat  pembekuan  dapat  ditekan. Sampai  sejauh  ini,  belum  ada  studi  yang membandingkan  kombinasi  DMSO  dan  EG dengan  dua  konsentrasi  yang  berbeda  terhadap oosit  domba.  Penelitian  yang  sudah  ada  hanya membahas  viabilitas  oosit  mamalia  yang dilakukan  oleh  Pamungkas  (2010)  dan  oosit manusia oleh Chen et al ., 2010).
Pada  prinsipnya,  DMSO  dan  EG merupakan  larutan  hipertonik  yang  akan menyebabkan adanya perbedaan tekanan osmotik  dalam  jaringan,  sehingga  cairan  intra dan  extraselular  akan  keluar  dan  digantikan dengan  DMSO  dan  EG.  Setelah  diekuilibrasi dalam waktu yang singkat, volume cairan dalam sel  akan  kembali  seperti  sedia  kala  tanpa  harus merusak  struktur  sel.  Dengan  demikian,  potensi pembentukan  es  dalam  sel  akan  berkurang, struktur  sel  tidak  mudah  pecah  akibat
pembekuan, derajat pengerutan sel akan dibatasi, konsentrasi  elektrolit  dalam  dan  luar  sel  akan relatif rendah (FAO).
EG sudah banyak dipakai dalam metode vitrifikasi  karena  memiliki  berat  molekul  yang rendah  dan  juga  cenderung  kurang  toksik terhadap  oosit  mamalia  ataupun  manusia  (Zhu, S.E., et  al. 1993).  DMSO  dapat  penetrasi  ke dalam  sel,  membentuk  lapisan  kaca  dan meningkatkan laju permeabilitas ketika digabungkan  dengan  EG.  DMSO  merupakan krioprotektan  permeabel  lambat  yang  jika digabungkan dengan EG dapat saling melengkapi dalam meningkatkan daya hidup sel seperti yang telah dilakukan oleh Mukaida et al. (2003) terhadap embrio.
Namun, ketepatan konsentrasi keduanya saat  digunakan  sebagai  media  vitrifikasi  akan mempengaruhi  daya  hidup  oosit.  Belum diketahui pasti apakah jika konsentrasi keduanya ditingkatkan  akan  memberikan  efek  yang  lebih baik  atau  tidak.  Maka  dari  itu,  diharapkan  ada studi  lebih  lanjut  untuk  menjawab  pertanyaan tersebut.

## Kesimpulan
Dari  studi  yang  telah  dilakukan  dapat disimpulkan bahwa 17% DMSO+17% EG dapat meningkatkan  viabilitas  oosit    pasca  vitrifikasi jika  dibandingkan    dengan  15%  DMSO+15% EG.

## Daftar Pustaka
Chen, ZQ., Ming, T.X., and Nielsen, H.I. 2010. Maturation  arrest  of  human  oocytes at  germinal  vesicle  stage.  Journal  of Human Reproduction Science (3):153-7. doi: 10.4103/0974- 1208.74161.
Djuwita,  I.  2001.  Kajian  morfologis  dan  fungsi biologis oosit domba setelah Media Vitrifikasi Jumlah oosit Persentase oosit hidup (n) pasca vitrifikasi Warming (%) 15% DMSO+15% EG 55 28 (50,00 ± 3,55% a ) 17% DMSO +17% EG 31 21 (75,00 ± 5,89% b) Keterangan: Superscrip a,b berbeda nyata pada kolom yang sama
kriopreservasi dengan metode vitrifikasi. Disertasi. Sekolah Pascasarjana  Institut  Pertanian  Bogor,
Bogor. 104 hlm.
FAO.  Basic  Principles  of  Cryopreservation. Fao.org.
Gook,  D.A.  2011.  History  of  oocyte cryopreservation. Reproduction Biomed  Online. 23(3):281-9.  doi: 10.1016/j.rbmo.2010.10.018. Epub 2010 Nov 12.
Kartberg  AJ 1, Hambiliki  F , Arvidsson  T , Stavreus-Evers A , Svalander P . 2008.
Vitrification  with  DMSO  protects embryo  membrane  integrity  better than  solutions  without  DMSO.
Reprod  Biomed  Online. 17(3):378- 84.
Mukaida,  T.,  Takahashi,  K.,  Kasai  M. et  al .
2003.  Blastocyst  cryopreservation: ultrarapid vitrification using cryoloop technique. Reprod BioMed Online; 6: 221–225. Newton S.S., Subramoniam T. 1996. Cryoprotectant  toxicity  in  penaeid prawn embryos. Cryobiology.
33:172–177.
Pamungkas,  F.  A.  2010.  Pemanfaatan  Metode Vitrifikasi untuk Kriopreservasi Oosit Mamalia. Wartazoa. .20 (20).
Silber,  S.  2017.  Chapter  13  Human  Ovarian Tissue  Vitrification. Methods  in Molecular  Biology .  1568:177-194. doi: 10.1007/978-1-4939-6828-2_13.
Vajta, G ., Holm, P ., Kuwayama, M ., et al . 1998.
Open Pulled Straw (OPS) vitrification:  a  new  way  to  reduce cryoinjuries  of  bovine  ova  and
embryos. Molecular  Reproduction and Development.
51(1):53-8.
Widyastuti dan Rasad. 2015. Tingkat kematangan inti oosit sapi setelah 24 jam presevasi ovarium. Agripet : Vol (15) No.2 : 72-78.
Widyastuti,  R.,  M.R.A.A  .Syamsunarno,  T. Saili,  A.  Boediono.  2017a.  Oocyte quality  and  subsequent  in  vitro maturation  of  sheep  oocyte-cumulus complex  from  ovary  with  presence and  absence  of  corpus  luteum. Proceedings  of  The  Veterinary Medicine  International  Conference . Surabaya.  KnE  Life  Sciences  3  (6): 166-174.
Widyastuti  R,  Khoirinaya  C,  Ridlo  MR,
Syamsunarno MRAA. 2017b.
Perbandingan  Viabilitas  Oosit  pasca Vitrifikasi  pada  Konsentrasi  Sukrosa yang  berbeda.  Majalah  Kedokteran Bandung: 49(4): 252-258 Winangun  K,  Widyastuti  R,  Syamsunarno MRAA. 2017. Perbandingan viabilitas oosit  domba  pasca  vitrifikasi  dengan menggunakan hemistraw dan cryotop. Jurnal Agripet:17 (2): 75-80. Yang NS, Lu KH, Gordon I. 1990. In vitro fertilization (IVF) and culture (IVC) of bovine oocytes from ovaries storage. Theriogenology , 33:352. Zhu  SE 1, Kasai  M , Otoge  H , Sakurai  T , Machida  T .  1993.  Cryopreservation of  expanded  mouse  blastocysts  by vitrification  in  ethylene  glycol-based solutions.
J Reprod Fertil. May;98(1):139