## AKTIVITAS INHIBITOR ENZIM PENGUBAH ANGIOTENSIN (ACE) DAN ANTIOKSIDAN PEPTIDA KOLAGEN DARI TERIPANG GAMA
(Stichopus variegatus)
The Activity of Angiotensin Converting Enzyme (ACE) Inhibitor and Collagen Peptide Antioxidant from Gama Sea Cucumber (Stichopus variegatus)
M. Habbib Khirzin 1 , Sukarno 1 , N.D. Yuliana 1 , Yusro Nuri Fawzya 2* , dan Ekowati Chasanah 2
1 Departemen  Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi  Pertanian, IPB Kampus IPB  Dramaga,  Bogor, Indonesia
2 Balai  Besar  Penelitian  dan  Pengembangan  Pengolahan  Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan  dan  Perikanan, Jl. K.S. Tubun  Petamburan  VI,  Jakarta Pusat, Indonesia
* Korespondensi  Penulis:  nurifawzya@gmail.com
Diterima: 8 April 2015; Disetujui: 27 Mei 2015

## ABSTRAK
Teripang  merupakan  salah  satu  echinodermata  yang  memiliki  kandungan  protein  tinggi  dan sekitar  70%  dari  proteinnya  merupakan  kolagen.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui aktivitas  inhibitor Angiotensin  Converting  Enzyme (ACE)  dan  antioksidan  dari  peptida  kolagen teripang  Gama  ( Stichopus  variegatus ).  Ekstraksi  kolagen  dilakukan  menggunakan  asam  asetat 0,5  M.  Peptida  kolagen  diperoleh  melalui  hidrolisis  kolagen  menggunakan  enzim  pepsin  dengan konsentrasi  0,1  U/g  kolagen,  selama  0;  30;  60;  90;  120;  180;  dan  240  menit.  Aktivitas  inhibitor ACE dan antioksidan  peptida  kolagen diuji dengan metode spektroskopi.  Kolagen yang dihasilkan memiliki  rendemen  16,40%  dengan  berat  molekul  130,33  kDa.  Aktivitas  inhibitor  ACE  tertinggi dihasilkan  dari  proses  hidrolisis  selama  180  menit  dengan  penghambatan  sebesar  82,31%, sedangkan  aktivitas  antioksidan  tertinggi  dihasilkan  oleh  peptida  kolagen  dari  hidrolisis  kolagen selama  120  menit  dengan  nilai  IC 50 1,9  mg/ml.
KATA KUNCI: teripang, Stichopus variegatus, peptida kolagen, inhibitor ACE, antioksidan

## ABSTRACT
Sea cucumber is  one of echinoderms containing  a high level  of   protein, in which 70% of the protein consists of collagen.The aim of this study was to determine the ACE inhibitor and antioxidant activities of collagen peptide obtained from Gama sea cucumbers (Stichopus variegatus). Collagen was extracted using 0.5 M acetic acid. It was then hydrolized by 0.1 U/g collagen for 0; 30; 60; 90; 120;  180;  240  min  to  produce  collagen  peptides.  The  ACE  inhibitor  and  antioxidant  activities  of collagen peptides were determined by spectroscopy method. The results showed that the collagen had 16.40% yield with the molecular weight of 130.33 kDa. The highest ACE inhibitor activity was produced  by the  peptide  from hydrolisis  process for 180 min.  with the  inhibition  of 82.31%; while the highest antioxidant activity was obtained from 120 min. hydrolysis time with the IC 50 of 1.9 mg/ ml.
KEYWORDS: sea  cucumber,  Stichopus  variegatus,  collagen  peptide,  ACE  inhibitor, antioxidant

## PENDAHULUAN
Teri pang  m erupakan  salah  sat u  jenis echinodermata  yang  diketahui  memiliki  berbagai bioaktivitas yang bermanfaat untuk kesehatan. Hal ini  dikarenakan  teripang  kaya  akan  berbagai
kandungan  zat  gizi  maupun  senyawa  bioaktif. Kandungan proteinnya yang tinggi dalam jumlah dan kualitas,  berpengaruh  dalam  m enjaga  tingkat trigliserida dalam serum darah maupun sistem imun tubuh (Bordbar et  al., 2011). Dari  total  kandungan protein  tersebut,  sekitar  70%-nya  adalah  kolagen.
Kolagen merupakan salah satu jenis protein struktural penyusun  komponen  kulit,  gigi,  tulang,  otot,  dan ram but.  Hidrolisis  kolagen  secara  enzim atis menghasilkan hidrolisat yang mengandung peptida kolagen. Produk ini dilaporkan memiliki bioaktivitas yang bermanfaat untuk kesehatan. Wijesekara et al. (2011) dan Qian et al. (2008) mengungkapkan bahwa peptida  kolagen  memiliki  aktivitas  penangkapan radikal bebas (antioksidan) dan penghambatan enzim pengubah angiotensin atau angiotensin converting enzyme  inhibitor ( ACE  inhibitor ). ACE  merupakan enzim  peptidyl-dipeptidase  yang  mengkatalisis perubahan substrat angiotensin I menjadi angiotensin II. Perubahan ini menyebabkan penyempitan pembuluh darah sehingga tekanan darah menjadi meningkat (hipertensi).  Senyawa  ACE  inhibitor  yang  banyak digunakan di antaranya adalah captopril dan elanapril (Jimsheena et  al., 2010).  Sementara  itu  Vo et  al. (2011) yang meneliti peptida gelatin dari ikan nila dan Zhang et  al. (2013)  yang  melakukan  eksplorasi terhadap hidrolisat kolagen bovine melaporkan bahwa peptida juga memiliki aktivitas penghambatan ACE karena mampu berikatan dengan sisi aktif enzim ACE dan membentuk molekul kompleks dengan substrat.
Aktivitas antioksidan peptida telah dilaporkan oleh beberapa peneliti, di antaranya adalah Fan et al. (2012) yang melaporkan adanya aktivitas antioksidan pada peptida dari ikan Tilapia ( Oreochromis niloticus) hasil hidrolisis menggunakan berbagai protease. Demikian pula Zhou et al. (2012)  yang  menemukan  adanya aktivitas  antioksidan  pada  peptida  kolagen  dari teripang Stichopus japonicus , sedangkan  aktivitas antioksidan peptida dari kerang hijau ( Mytilus edulis ) dilaporkan oleh Wang et al. (2013).
Beberapa penelitian lainnya terkait dengan kolagen atau peptida kolagen teripang, di antaranya adalah hidrolisat kolagen teripang Stichopus hermanii sebagai bahan  pelembab  kulit  (Andirinasti,  2012);  peptida kolagen  teripang Apostichopus  japonicus dan Cucumaria  japonica yang  mempunyai  bioaktivitas sebagai  antitumor,  antikoagulan,  antiradang  dan penyem buh  luka  ( Popov et  al .,  2013);  dan karakterisasi pepsin-solubilized  collagen dari Bohadschia spp (Siddiqui et al., 2013).
Kecenderungan  masyarakat  untuk  kembali  ke bahan alami karena dinilai lebih aman dibandingkan obat-obat  yang  umumnya  berasal  dari  senyawa sintetik, mendorong banyaknya penelitian eksplorasi bahan alam termasuk teripang untuk mendapatkan senyawa  aktif  sebagai  bahan  obat.  Penelitian  ini dimaksudkan untuk mendapatkan informasi mengenai bioaktivitas  peptida  kolagen  dari  teripang  Gama ( Stichopus  variegatus )  sebagai  inhibitor  ACE  dan antioksidan.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan  baku  utama  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  teripang  Gama  ( Stichopus variegatus ) yang didapat dari Balai Besar Perikanan Budidaya Laut Lampung. Beberapa bahan pendukung yang  digunakan  yaitu  Tris-HCl,  etanol,  EDTA ( Etylene  diamine  tetraacetate ),  NaOH,  asam asetat,  NaCl,  akrilamida,  bis-akrilamida,  SDS ( Sodium  Deodecyl  Sulphate ),  TEMED  ( N,N,N ’ ,N ’ - Tetramethylethylenediamine ),  APS  ( Ammonium persulphate ),  glisin, commassive  blue ,  gliserol, merkaptoetanol,  metanol,  DPPH  ( 2,2-Diphenyl-1- Picrilhydrazyl ), asam askorbat, HHL ( Hippuryl-Histidyl- Leusine ), ACE  ( Angiotensin-I  converting  enzyme ), captopril, BSA ( Bovine Serum Albumin ), bufer borat, etil asetat, dan aquabides.

## Metode

## Ekstraksi kolagen
Ekstraksi kolagen didasarkan pada metode Park et al. (2012) dengan beberapa modifikasi. Keseluruhan proses ekstraksi dilakukan pada suhu 4 o C. Teripang segar  dicuci  kemudian  dipotong  kecil-kecil  dan ditimbang sebanyak 100 gram. Teripang direndam dalam 1000 ml aquades kemudian diaduk ( stir ) selama 30  menit.  Tahapan  ini  dilakukan  sebanyak  2  kali. Selanjutnya teripang direndam dalam 200 ml alkohol 50%  selama  30  menit  kemudian  dicuci  dengan aquades untuk menetralkan pH. Teripang direndam dalam 1000 ml Tris-HCl 0,1 M dan 4 mM EDTA selama semalam.  Selanjutnya,  teripang  dicuci  dengan aquades dan direndam dalam 1000 ml NaOH 0,1 M selama 2 hari. Teripang kembali dicuci dengan aquades kemudian direndam dalam 1000 ml asam asetat 0,5 M  selama  2  hari.  Tahapan  selanjutnya  yaitu penyaringan dengan kain saring kemudian ke dalam filtrat ditambahkan NaCl dengan konsentrasi 1 M dan didiamkan  selama  semalam.  Suspensi  kemudian disentrifuse selama 60 menit 10.000 g . Pelet kolagen yang didapatkan kemudian dilarutkan dalam asam asetat 0,5 M dan didialisis dengan bufer asetat 0,1 M selama semalam. Bufer diganti secara berkala dan terakhir diganti dengan aquades. Kolagen kemudian dibekukan dan dikeringkan dengan freeze dryer.

## Hidrolisis dan karakterisasi peptida kolagen

## Hidrolisis kolagen
Hidrolisis kolagen didasarkan pada metode Zhang et  al. (2013)  dengan  sedikit  modifikasi.  Sampel
Aktivitas  Inhibitor  Enzim  Pengubah  Angiotensin  (ACE)  dan  Antioksidan..........(M.  Habbib  Khirzin  et  al.)
kolagen sebanyak 1 gram dilarutkan ke dalam 100 ml  buffer  pH  2,0  dan  diinkubasi  pada  suhu  37 o C selama 15 menit. Selanjutnya, 0,1 U enzim pepsin ditambahkan ke dalam sampel kemudian diinkubasi selama 0; 30; 60; 90; 120; 180; dan 240 menit. Reaksi dihentikan  dengan  pemanasan  sampel  pada  air mendidih  selama  5  menit,  kemudian  didinginkan. Sampel dinetralkan dengan NaOH 1 M dan disentrifuse selama  15  menit  10.000  g.  Supernatan  yang mengandung peptida kolagen, sebagian dibekukan dan sebagian lagi dikeringkan dengan freeze dryer . Supernatan  (peptida  kolagen)  yang  dibekukan digunakan  untuk    analisis  derajat  hidrolisis  (DH), sedangkan  peptida kolagen kering beku  untuk analisis ACE inhibitor dan antioksidan.

## Penentuan derajat hidrolisis
Derajat hidrolisis kolagen ditentukan berdasarkan metode Silvestree et al. (2013) dengan pengendapan Trichloroacetic acid (TCA) 20% untuk menghasilkan 10% fraksi protein terlarut dan 10% fraksi tidak larut. Sebanyak 500 µl sampel peptida kolagen beku yang telah dicairkan (dibiarkan pada suhu ruang) ditambah dengan 500 µl TCA 20% kemudian dihomogenkan dan diinkubasi  pada  suhu  4 o C  selama  30  menit. Selanjutnya campuran disentrifuse 3000 g selama 20 menit. Kandungan protein terlarut dan protein total dianalisis berdasarkan metode Lowry et al. (1951). Bovine  serum  albumin (BSA)  digunakan  sebagai standar. Derajat hidrolisis dihitung dengan rumus:
DH (%) =

## Penentuan pola peptida kolagen
Kol agen  dan  pepti da  dianal isis  polanya menggunakan  SDS-PAGE  berdasarkan  metode Laemmli (1970). Gel pemisah dan gel penahan yang digunakan yaitu 10 dan 4%. Sebanyak 10 mg sampel dilarutkan  dalam  0,5  m l  SDS  10%  kemudian diinkubasi pada suhu 85 o C selama 1 jam. Sampel ditambah buffer dan dipanaskan  pada suhu 95 o C selam a  5  m enit.  Selanjutnya,  15  µl  sam pel dimasukkan  ke  dalam  sumur  dan  elektroforesis dijalankan ( “running” ) pada tegangan 35 V, 15 mA selama 6 jam. Sebagai penanda protein digunakan marker broad  range protein ladder dari  Thermo scientific. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan staining solution selama  1 jam  kemudian difiksasi dengan destaining solution selama semalam.

## Uji aktivitas peptida kolagen

## Uji ACE inhibitor
Uji ACE inhibitor didasarkan pada metode Arihara et  al. (2001).  Sebanyak  50 µl  sampel  (15  mg/ml) ditambah 125 µl buffer substrat (7,6 mM HHL dan 608 mM NaCl dalam 10 ml buffer borat pH 8,3). Campuran diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  15  menit. Selanjutnya, 50 µl enzim ACE 50 mU/ml ditambahkan pada campuran kemudian diinkubasi selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 200 µl HCl 1 N. Campuran divortex, ditambah dengan 1140 µl etil asetat  kemudian  disentrifuse  10.000  g selama  10 menit.  Supernatan  sebanyak  1000  µl  diambil  dan dikeringkan pada suhu 95 o C selama 90 menit. Asam hipurat yang terbentuk dilarutkan ke dalam 1000 µl aquabides.  Absorbansi  diukur  pada  panjang gelombang 228 nm menggunakan spektro UV-vis dan sebagai kontrol positif digunakan captopril . Persen penghambatan ACE ditentukan dengan rumus :
(%) penghambatan  =
Keterangan : A (Absorbansi kontrol) B (Absorbansi blanko kontrol)
C (Absorbansi sampel) D (Absorbansi blanko sampel)

## Uji aktivitas antioksidan
Aktivitas antioksidan diuji berdasarkan metode Li et  al. (2006).  Sebanyak  10  mg  sampel  dilarutkan dalam metanol PA kemudian dibuat seri konsentrasi dari 100; 200; 400; 800 ppm. Selanjutnya, 160 µl dari tiap seri konsentrasi sampel ditambah dengan 40 µl DPPH (0,3 mg/ml) kemudian diinkubasi pada ruang gelap pada suhu ruang selama 30 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 517 nm dan sebagai kontrol positif digunakan asam askorbat. Konsentrasi sampel dan persen penghambatan diplot ke dalam kurva regresi linier dan nilai inhibition concentration 50 (IC 50 ) dihitung dalam mg/ml. Persen penghambatan dihitung dengan rumus :
(%) penghambatan  =
Keterangan : A (Absorbansi kontrol negatif)
B (Absorbansi blanko)
C (Absorbansi sampel) D (Absorbansi kontrol sampel)
Protein terlarut 10% TCA x 100
Total kandungan protein
(A-B)-(C-D) x 100% (A-B) (A-B)-(C-D) x 100%
(A-B)
Gambar 1. (a) teripang segar; (b) kolagen teripang. Figure 1. (a) Fresh sea cucumber; (b) collagen of sea cucumber.

## Analisis data
Data  hasil  penelitian  dianalisis  menggunakan analisis keragaman (ANOVA) pada taraf 5% dan uji lanjut  Duncan  untuk  mengetahui  pengaruh  waktu hidrolisis  terhadap  aktivitas ACE  inhibitor dan antioksidan peptida kolagen.

## HASIL DAN BAHASAN

## Ekstraksi Kolagen
Ekstraksi  kolagen  merupakan  proses  yang membutuhkan  waktu  lama  karena  sekali  proses ekstraksi membutuhkan waktu 7–10 hari. Perbedaan kondisi lingkungan dan jenis teripang yang digunakan menyebabkan hasil penelitian yang didapatkan kurang optimal sehingga dilakukan modifikasi dari metode Park et  al. (2012).  Kolagen  teripang  Gama  yang diekstrak dengan metode asam ( acid soluble collagen ) memberikan hasil rendemen sebesar 16,40% (berat kering atau bk).  Abedin et  al. (2013); Park et  al. (2012);  dan  Liu et  al. (2011)  melaporkan  bahwa kolagen  teripang  yang  diekstrak  menggunakan metode PSC ( Pepsin Soluble Collagen ) menghasilkan rendemen berturut-turut sebesar 21,3% (bk); 26,6% (bk); dan 20,8% (bk). Gambar teripang segar  dan kolagennya disajikan pada Gambar 1.

## Hidrolisis dan Karakterisasi Peptida Kolagen

## Derajat hidrolisis
Derajat hidrolisis dapat dijadikan sebagai indikator keberhasilan  proses  hidrolisis.  Persentase  derajat hidrolisis peptida kolagen teripang Gama disajikan
pada Gambar 2. Persentase derajat hidrolisis yang didapat dari hasil penelitian yaitu mulai dari waktu 0; 30; 60;  90; 120; 180;  dan 240 menit berturut-turut sebesar  0;  21,39;  36,29; 44,79;  54,61;  54,54;  dan 54,23%. Derajat hidrolisis tertinggi didapat dari waktu inkubasi 120 menit yaitu sebesar 54,61%. Semakin lama  waktu  hidrolisis,  maka  semakin  meningkat persen derajat hidrolisisnya. Akan tetapi, setelah 120 menit reaksi berjalan stabil dan tidak ada peningkatan yang signifikan. Kondisi konstan ini  diduga karena substrat telah habis dipotong oleh enzim sehingga jumlah peptida yang dihasilkan tetap dan enzim telah jenuh terhadap substrat.
Peningkatan  derajat  hidrolisis  disebabkan  oleh peningkatan peptida dan asam amino yang terlarut dalam TCA akibat pemutusan ikatan peptida selama hidrolisis. Selain faktor tersebut, konsentrasi enzim, waktu hidrolisis, serta jenis enzim juga menyebabkan terjadinya  perbedaan  persen  derajat  hidrolisis (Haslaniza et al., 2010). Derajat hidrolisis meningkat lebih cepat pada 2 jam pertama, setelah itu semakin melambat. Kecepatan peningkatan derajat hidrolisis yang  semakin  menurun  dapat  disebabkan  oleh adanya penghambatan proses hidrolisis substrat oleh produk  yang  dihasilkan  selama  proses  hidrolisis (Ovissipour et al., 2010). Penggunaan enzim pepsin untuk hidrolisis daging ikan tuna (Qian et al. , 2008), dan  ikan  salmon  (Kim  &  Byun,  2012)  dilaporkan menghasilkan  hidrolisat  dengan  derajat  hidrolisis sebesar 78,82% dan 49,12%.
Enzim  pepsin  merupakan  kelompok aspartic protease, yaitu enzim yang memiliki sisi aktif berupa asam aspartat. Pepsin juga termasuk dalam kelompok endopeptidase yang memutus ikatan peptida spesifik pada  bagian  tengah  rantai  polipeptida.  Pepsin merupakan satu dari tiga jenis enzim pemecah protein (proteolitik) dalam saluran pencernaan, di samping tripsin dan  -kemotripsin (Kim & Byun, 2012).
Gambar 2. Derajat hidrolisis kolagen teripang.
Figure 2. Hydrolysis degree of collagen from sea cucumber.
Waktu hidrolisis (menit)/ Hydrolisis time (minutes)
% in h ib is i/ % in h ib it io n
Keterangan/ Note : Konsentrasi  Captopril/ Captopril  concentration :  1  mg/ml Konsentrasi  sampel/sample  concentration  :  15  mg/ml 0  menit/ 0  minute :  tanpa  enzim/ without  enzyme

## Pola peptida kolagen
Kolagen  teripang  Gama  yang  masih  utuh  dan peptidanya dianalisis berat molekulnya menggunakan instrumen  SDS-PAGE.  Pola  elektroforesisnya disajikan pada Gambar 3. Konsentrasi protein yang digunakan adalah 10 mg/ml dengan perbandingan sampel dan bufer sampel sebesar 4:1. Hasil analisis menunjukkan bahwa kolagen teripang gama memiliki berat molekul sebesar 130,33 kDa, yang merupakan
rantai triple helix dan termasuk kolagen tipe I. Saito et  al. (2002)  menyebutkan  bahwa  kolagen  tipe  I biasanya  tersusun  dari  heterolog  rantai  1 dan  2 membentuk triple  helix (  1 ) 2  2, di  mana  komponen berat molekul tinggi  dan  merupakan dimer dan trimer dari rantai  .
Menurut  Zhong et  al. (2015),  penambahan  2- merkaptoetanol tidak memberikan perbedaan yang signifikan karena kolagen teripang tidak mengandung
Gambar 3. Pola hidrolisis kolagen oleh enzim pepsin dengan aktivitas 0.1 U (M = marker, K = kolagen tanpa hidrolisis).
Figure 3. Hydrolisis pattern of collagen by pepsin enzyme with unit activity 0.1U (M = marker, K = Collagen without hydrolysis treatment).
asam amino sistein sehingga tidak ada ikatan disulfida yang  terputus.  Ditinjau  dari  aspek  berat  molekul, teripang  Gama  (130,33  kDa)  menunjukkan  berat molekul  rantai  1 yang  serupa  dengan Stichopus monotuberculatos (137  kDa;  Zhong et  al., 2015), Stichopus japonicus (135 kDa; Cui et al., 2007), dan Parastichopus californicus (138 kDa; Liu et al., 2010).
Kolagen teripang yang telah dihidrolisis dengan enzim pepsin menghasilkan peptida-peptida dengan berat molekul yang lebih rendah. Waktu hidrolisis yang semakin lama menghasilkan peptida dengan ukuran yang lebih kecil. Kolagen yang terpotong dari 30 menit hingga 240 menit sebagian besar menghasilkan 3 fraksi peptida dengan berat molekul yang bervariasi. Peptida yang pertama memiliki berat molekul antara 91,91–95,03  kDa,  peptida  kedua  memiliki  berat molekul antara 42,06–47,14 kDa sedangkan peptida ketiga memiliki berat molekul antara 24,1–29,55 kDa.
Pol a  potongan  peptida  yang  dihasil kan berhubungan  erat  dengan  jenis,  konsentrasi  dan spesifisitas  enzim terhadap substrat yang digunakan. Enzim pepsin yang termasuk jenis protease aspartat, bekerja  secara  spesifik  terhadap  asam  amino fenilalanin,  tirosin,  dan  triptofan.  Secara  umum, peptida yang dihasilkan masih tergolong besar karena berat molekulnya berkisar dari 24 kDa hingga 95 kDa. Menurut Zhang et al. (2013) di dalam kolagen hanya terdapat sedikit situs pemotongan yang sesuai dengan sisi aktif enzim pepsin sehingga potongan peptida yang dihasilkan berukuran besar.

## Uji Aktivitas Peptida Kolagen

## Uji aktivitas ACE inhibitor
Uji  aktiv itas  ACE  inhibitor  bertujuan  untuk mengetahui aktivitas penghambatan peptida kolagen terhadap enzim ACE yang dinyatakan dalam bentuk persen penghambatan. Aktivitas penghambatan ACE peptida  kolagen  di saji kan  pada  G am bar   4. Berdasarkan hasil penelitian dapat diketahui bahwa sampel peptida kolagen hasil hidrolisis selama 0; 30; 60; 90; 120; 180; dan 240 menit, memiliki persentase penghambatan  ACE  berturut-turut  sebesar  29,23; 63,59; 67,93; 77,00; 78,58; 82,31; dan 80,49% (hasil dari  dua  kali  ulangan).  Hasil  penelitian  tersebut mengindikasikan  bahwa  semakin  lam a  waktu hidrolisis, persentase penghambatan peptida kolagen terhadap  ACE  semakin  meningkat.  Akan  tetapi, setelah 180 menit persentase penghambatan ACE mengalami penurunan. Penurunan ini diduga karena peptida terpotong menjadi lebih kecil sehingga peptida yang semula aktif mengalami penurunan aktivitas.
Perbedaan  lama  waktu  hidrolisis  memberikan pengaruh  yang  berbeda  secara  nyata  (P<0,05) terhadap persen penghambatan ACE yang dihasilkan. Uji lanjut Duncan menunjukkan masing-masing waktu hidrolisis berbeda nyata satu sama lain (Gambar 4). Kontrol positif yang digunakan dalam penelitian ini adalah captopril . Captopril dengan konsentrasi 1 mg/ ml  memiliki  persen  penghambatan  ACE  sebesar
Gambar 4. Aktivitas ACE inhibitor peptida kolagen. Figure 4. ACE inhibitor activity of collagen peptide.
Waktu hidrolisis (menit)/ Hydrolisis time (minutes)
% in h ib is i/ % in h ib it io n Keterangan/ Note : Konsentrasi  Captopril/ Captopril  concentration :  1  mg/ml Konsentrasi  sampel/sample  concentration  :  15  mg/ml 0  menit/ 0  minute :  tanpa  enzim/ without  enzyme
90,32%. Apabila dibandingkan dengan kontrol positif, peptida kolagen memiliki persen penghambatan yang lebih  rendah.  Hal  ini  dikarenakan  sampel  peptida kolagen masih dalam bentuk peptida kasar ( crude ).
Aktivitas  penghambatan  ACE  peptida  kolagen diduga karena tingginya residu asam amino hidrofobik seperti prolin, alanin dan asam amino alifatik seperti glisin.  Menurut  Kapel et  al. (2006)  peptida  yang memiliki  prolin  atau  residu  aromatis  pada  ujung terminal-C dan residu asam amino hidrofobik pada ujung terminal-N memiliki aktivitas penghambatan ACE yang potensial. Peptida bioaktif biasanya mengandung 3–20 residu asam amino dengan berat molekul yang rendah. Menurut  Wijesekara et al. (2011) aktivitas penghambatan  ACE  memiliki  2  mekanisme  yaitu bersifat  kompetitif  dan  nonkompetitif.  Inhibitor kompetitif mampu masuk ke dalam molekul protein ACE  dan  berinteraksi  dengan  sisi  aktif  enzim sedangkan inhibitor nonkompetitif bekerja dengan cara bergabung  dengan  m olekul  enzim   ACE  dan membentuk dead-end complex , terlepas dari apakah molekul substrat berikatan atau tidak.
Beberapa  penelitian  lain  melaporkan  hal  yang serupa. Vo et al. (2011), menemukan bahwa gelatin kulit ikan nila yang dihidrolisis dengan enzim pepsin sel am a  4  jam   m enghasilk an  persent ase penghambatan terhadap ACE sebesar 45%. Hidrolisis kolagen  sapi  (Zhang et  al. ,  2013),  dan  kolagen teripang (Du et al .,  2013) dengan jenis enzim  dan waktu  hidrolisis  yang sama,  menghasilkan  persen penghambatan terhadap ACE masing-masing sebesar 70 dan 74%.

## Aktivitas antioksidan
Aktivitas antioksidan  peptida  kolagen  disajikan pada  Gambar  5. Nilai IC 50 didefinisikan  sebagai konsentrasi hidrolisat (sampel) yang dibutuhkan untuk menghambat 50% radikal bebas DPPH. Berdasarkan hasil  penelitian  dapat  diketahui  nilai  IC 50 peptida kolagen dari 0; 30; 60; 90; 120; 180; dan 240 menit berturut-turut yaitu 3,67; 3,31; 2,72; 2,51; 1,90; 2,12 dan  2,19  m g/m l.  Hasil  peneli tian  tersebut mengindikasikan  bahwa  semakin  lam a  waktu hidrolisis, maka nilai  IC 50 semakin  menurun. Akan tetapi, setelah 120 menit perbedaannya tidak terlalu signifikan.  Perbedaan  lam a  waktu  hidrolisis memberikan pengaruh yang nyata (p< 0,05) terhadap nilai IC 50 yang dihasilkan.
Uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa masing- masing waktu hidrolisis berbeda nyata satu sama lain, kecuali waktu hidrolisis selama 180 menit dan 240 menit (Gambar 5). Semakin rendah nilai IC 50 , maka semakin tinggi aktivitas penangkalan radikal bebas DPPH oleh sampel. Kontrol positif yang digunakan sebagai pembanding dalam penelitian ini adalah asam askorbat (vitamin C). Nilai IC 50 asam askorbat yaitu 0,01  mg/ml. Apabila dibandingkan  dengan  kontrol positif, nilai IC 50 dari peptida kolagen masih jauh lebih tinggi, sekitar 200–350 kali. Salah satu penyebabnya diduga karena peptida kolagen yang dihasilkan masih dalam bentuk kasar, berupa hidrolisat kolagen yang mengandung beberapa peptida dengan bobot molekul yang berbeda (91,91–95,03 kDa; 42,06–47,14 kDa dan 24,1–29,55 kDa) seperti tampak pada Gambar 3.
Waktu hidrolisis (menit)/ Hydrolisis time (minutes)
IC 5 0 ( mg /ml )
Keterangan/ Note : 0  menit/ 0  minute :    tanpa  enzim/ without  enzyme
IC 50 vit.C  = 0.01 mg/ml
Gambar 5. Aktivitas penghambatan radikal bebas DPPH peptida kolagen. Figure 5. DPPH free radical inhibition activity of collagen peptide.
Aktivitas antioksidan peptida kolagen dipengaruhi oleh beberapa faktor, di antaranya adalah : komposisi, struktur  dan  hidrofobisitas  asam  amino  penyusun peptida (Kim et al ., 2001; Li et al ., 2007), jenis enzim penghidrolisis  kolagen  (Qian et  al., 2008)  yang menentukan ukuran dan sekuen peptida, dan bobot molekul peptida (Yang et al ., 2008; Gómez-Guillén et al. , 2010; Wang et al ., 2013). Kim et al. (2001), menyatakan bahwa kandungan asam amino hidrofobik yang  tinggi  di  dalam  peptida  dapat  meningkatkan kelarutannya di dalam lemak, sehingga meningkatkan akt iv itas  ant ioksi dasinya.  Hidrolisis  gelatin menggunakan enzim alkalase menghasilkan peptida gelatin yang memiliki aktivitas antioksidan lebih tinggi dibandingkan dengan penggunaan enzim kolagenase, pepsin, tripsin, chymotripsin, papain maupun neutrase (Qian et al ., 2008). Sementara itu Fan et al. (2012) melaporkan bahwa aktivitas penghambatan radikal bebas DPPH hidrolisat protein dari tulang ikan tilapia menggunakan enzim tripsin menunjukkan nilai IC 50 sebesar  1,92  mg/ml,  setelah  melalui  ultrafiltrasi dengan cut  off <  1kDa (Fan et al. ,  2012). Nilai  ini sekitar 2,8 kali lebih tinggi dibandingkan kontrol positif glutathione yaitu sebesar 0,69 mg/ml. Hasil penelitian Wang et al . (2013) terhadap peptida kolagen murni dari  tulang  ikan croceine  croaker ( Pseudosciaena crocea) yang dihidrolisis menggunakan enzim tripsin dan pepsin, menunjukkan aktivitas penghambatan radikal bebas DPPH yang kuat, dengan nilai IC 50 0,283 mg/ml pada konsentrasi yang sama dengan vitamin C,  yaitu  5  mg/ml.  Peptida  kolagen  dengan  bobot molekul 463,4070 Da ini memiliki urutan asam amino Gly-Phe-Pro-Ser-Gly.

## KESIMPULAN
Aktivitas penghambatan ACE tertinggi  terdapat pada peptida kolagen yang dihasilkan dari hidrolisis kolagen  selama  180  menit,  yaitu  sebesar  82,31% pada konsentrasi  15 mg/ml. Aktivitas    antioksidan paling kuat dihasilkan dari waktu hidrolisis 120 menit, dengan  nilai  IC 50 sebesar  1,92  mg/ml.  Namun demikian,  aktivitas  penghambatan  ACE  maupun aktivitas antioksidan peptida kolagen ini masih lebih rendah  dibandingkan  dengan  kontrol  positif,  yaitu masing-masing captopril dan vitamin C.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Balai Besar Penelitian dan  Pengembangan  Pengolahan Produk  dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Jakarta  Pusat  atas  sponsor  yang  telah  diberikan dengan dana APBN tahun 2014/2015.

## DAFTAR PUSTAKA
Abedin, M.D.Z., Karim, A.A., Latif, A.A., Gan, C.Y., Ghazali,
F.C., Zaman, W., Hossain, M.D.M., Ahmed, F., Absar, N.,  &  Sarker,  M.D.Z.I.  (2013).  Physicochemical  and biochemical  properties  of  pepsin  solubilized  collagen isolated  from  the  integrument  of  sea  cuc umber ( Stichopus vastus ). Journal of Food Processing and Preservation . Andirinasti,  W.A.  (2012). Uji  manfaat  ekstrak  kolagen kasar  dari  Teripang  Stichopus  hermanii  sebagai bahan  pelembab  k ulit .  Tesis.  Fak ultas  MIPA, Universitas  Indonesia.
Arihara, K., Nakashima, Y., Mukai, T., Ishikawa, S., & Itoh,
M.  (2001).  Peptide  inhibitor  for  angiotensin-I converting  enzyme  from  enzymatics  hydrolisates  of porcine  skeletal  muscle  proteins. Meat  Science, 57 , 319–324.
Bordbar,  S., Anwar,  F.,  &  Nzamid,  S.  (2011).  High-value components  and  bioactives  from  sea  cucumbers  for functional foods—A review. Mar. Drugs , 9 , 1761–1805. Cui, F.X., Xe, C.H., Li, Z.J., Zhang, Y.Q., Dong, P., Fu, X.Y., &  Gao,  X.  (2007).  Characterization  and  subunit composition  of  collagen  from  the  bodywall  of  sea cucumber Stichopus japonicus . Food Chemistry, 100 , 1120–1125.
Du, L., Fang, M., Wu H., Xie J., Wu, Y., Li, P., Zhang, D., Huang, Z., Xia, Y., Zhou, L., & Wei, D. (2013). A novel angiotensin-I  converting  enzyme  inhibitory  peptide from Phascolosoma  esculenta water  soluble  protein hydrolysate. Journal of Functional Food, 5, 475–483. Fan, J., He, J., Zhuang Y., & Sun, L. (2012).  Purification and  identification  of  antioxidant  peptides  from enzymatic   hydrolysates  of  tilapia  ( Orec hromis niloticus ) frame protein. Molecules, 17 , 12836–12850. Gimenez,  B., Aleman, A.,  Montero, P., & Gomez-Guillen, M.C.  (2009).  Antioxidant  and  functional  properties  of gelatin  hydrolysates  obtained  from  skin  of  sole  and squid. Food  Chemistry,  114 ,  976–983.
Ghufran,  H.  &  Kordi,  K.  (2010). Cara  gampang membudiday akan teripang . Lily Publisher. Yogyakarta.
Haslaniza, H., Askat, M.Y., Wan., Aida, W.M., & Mamot, S. (2010).The  effec t  of  enzyme  conc entration, temperature  and  incubation  time  of  nitrogen  content and  degree  of  hydrolysis  of  protein  precipitate  from c oc k le  ( Anadara granos a )  meat  wash  water. International  Food  Research  Journal, 17 ,  147–152. Jimsheena,  V.K.  &  Gowda,  L.R.  (2010). Arachin  derived peptides  as  selec tive  angiotensin  I-c onverting enzyme  (ACE)  inhibitors:  Struc ture-ac tivity relationship. Peptides, 31 ,  1165–1176. Kapel,  R.,  Rahou,  E.,  Lecouturier,  D.,  Guillochon,  D.,  & Dhulster,  D.  (2006).  Charac terization  of  an antihypertensive  peptide  from  an  alfalfa  white  protein hydrolysates  produced  by  continuous  enzymatic membrane reactor. Process Biochemistry, 41 ,  1961– 1966.
Kim,  S.R.  &  Byun,  H.G.  (2012).  The  novel  angiotensin  I converting  enzyme  inhibitory  peptide  from  rainbow
Aktivitas  Inhibitor  Enzim  Pengubah  Angiotensin  (ACE)  dan  Antioksidan..........(M.  Habbib  Khirzin  et  al.)
trout  muscle  hydrolysates. Fisheries  Aquaculture Science, 15 (3),  183–190.
Laemmli,  U.K.  (1970).  Cleavage  of  structural  protein during  the  assembly  of  the  head  of  bacteriophage T4. Nature, 227 , 680–685
Li, B., Chen, F., Wang, X., Ji, B. & Wu, Y. (2007). Isolation and  identific ation  of  antioxidative  peptides  from porc ine  c ollagen  hydrolysate  by  c onsec utive chromatography  and  electrospray  ionization-mass spectrometry. Food  Chemistry, 102 (4),  1135–1143. Li, Y., Li, X., Lee, U.K., Kang, J.S., Choi, D.H., & Son, B.W. (2006).  A  new  radic al  sc avenging  anthracene glycoside,  asperfavin  ribofuranoside,  and  polyketides from  a  marine  isolate  of  the  fungus microsporum .
Chemistry.  Pharmaceutical  Buletin , 54 (6),  882–883. Liu,  Z.,  Alexandria,  C.M.,  Oliveira.,  &  Su,  Y.C.  (2010). Purification  and  c harac terization  of  pepsin solubilized  collagen  from  skin  and  connective  tissue of  giant  red  sea  c uc umber  ( Paras tic hopus californicus ). Journal of  Agriculture Food Chemistry , 58,  1270–1274.
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., & Randal, R.J. (1951). Protein  Measurement  with  The  Folin  Phenol Reagent .  Department  of  pharmacology,  Washington University  School  of  Medicine,  St.  Louis,  Misssouri.
Ovissipour,  M.,  Benj ak ul,  S.,  Safari,  R.,  &
Motamedzadegan,  A.  (2010).  Fish  protein hydrolysates production  from  yellowfin  tuna Thunnus albac ores head  using  alc alase  and  protamex.
International  Aquatic  Research, 2 ,  87–95.
Park,  S.Y.,  Hee,  K.L.,  Seogjae,  L.,  Hyeong,  C.H.,  Somi, K.C.,  &  Moonjae,  C.  (2011). Pepsin  solubilized collagen (PSC)  from  red  sea  cucumber  ( Stichopus japonicus )  regulates  c ell  c yc le  and  fibronectin synthesis  in  HaCaT  cell  migration. Food  Chemistry , 11 , 032.
Popov, A., Artyukov, A., Krivoshapko, O., & Kozlovskaya, E.
(2013).  Biological  activities  of  collagen  peptides obtained  by  enzymic  hydrolysis  from  far-eastern holothurians. American  Journal  of  Biomedical  and Life  Sciences.  1 (1):  17–26.  Retrieved  from  http:// www.sciencepublishinggroup.com/j/ajbls.
Qian,  Z.J.,  Jung,  W.K.,  Byun,  H.G.,  &  Kim,  S.K.  (2008). Protective effect of an antioxidant peptide purified from gastrointestinal  digest  of  oyster, Crassostrea  gigas agains  free  radical  induc ed  DNA  damage. Bioresource  Technology, 99 ,  3365–3371.
Saito,  M.,  Kunisaki,  N.,  Urano.,  &  Kimura,  S.  (2002). Collagen  as  the  major  edible  component  of  sea cucumber  ( Stichopus  japonicus ). Journal  of  Food Science, 67 , 4.
Siddiqui,  Y.D., Arief,  E.M.,  Yusoff, A.,  Suzina,  A.H.,  and Abdullah,  S.Y.  (2013).  Isolation  of  pepsin-solubilized collagen  (PSC)  from  crude  collagen  extracted  from body  wall  of  sea  cucumber  ( Bohadschia  spp .). Int  J Pharm  Pharm  Sci., 5 (2),  555–559.
Silvestre,  M.P.C.,  Morais,  H.A.,  Silva,V.D.,  Silva,  M.R.,  & Grau. (2013). Degree of hydrolysis and peptide profile of  whey  proteins  using  pancreatin. Journal  Brazilian Society and  Food Nutrition. Sp., 38 (3),  278–290. Vo, T.S., Ngo, D.H., Kim, J.A., Ryu, B., & Kim, S.K. (2011). An  antihypertensive  peptide  from  tilapia  gelatin diminishes  free  radical  formation  inmurine  microgial cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry . 59 , 12193–12197.
Wang, B., Li, L., Chi, C.F., Ma, J.H., Luo, H.Y., & Xu, Y.F. (2013).  Purification  and  characterization  of  a  novel antioxidant peptide derived from blue mussel ( Mytillus edulis )  protein  hydrolysates. Food  Chemistry.  138, 1713–1719.
Wang, B.,  Wang, Yu-Mei,  Chi, Chang-Feng,  Luo, Hong- Yu,  Deng,  Shang-Gui,    &    Ma,  Jian-Yin.  (2013). Isolation  and  Characterization  of  Collagen  and Antioxidant  Collagen  Peptides  from  Sc ales  of Croceine  Croaker  ( Pseudosciaena  crocea ). Mar Drugs , 11 (11),  4641–4661. doi:   10.3390/ md11114641
Widodo,  A.  2011. Budidaya  teripang,  khasiat  dan  cara olah  untuk   pengobatan. Pustak a  Baru  Press. Yogyakarta.
Wijesekara,  I.,  Qian,  Z.J.,  Ryu,  B.,  Ngo,  D.H.,  Kim,  S.K.
2011. Purific ation and identific ation of antihypertensive  peptides  from  seaweed  pipefish ( Sy ngnathus s c helegeli ) musc le protein hydrolysates. Food Research International , 44 , 703– 707.
Yang, J., Ho, H., Chu, Y., & Chow, C. (2008). Characteristic and antioxidant activity of retorted gelatin hydrolysates from  cobia  ( Rachycentron  canadum )  skin. Food Chemistry ,  110(1),  128–136.
You,  L.,  Zhao,  M.,  Regenstein,  J.M.,  &  Ren,  J.  (2010).
Purification and identification  of antioxidative peptides from  loach  ( Misgurnus  anguilicaudatus )  protein hydrolysates  by  consecutive  chromatography  and elec trosray  ionization-mass  spectrometry. Food Research  International, 43,  1167–1173.
Zhang, Y., Olsen, K., Grosi, A., & Otte, J. (2013). Effect of pretreatment  on  enzymes  hydrolysis  of  bovine collagen  and  formation  of  ACE-inhibitory  peptides. Food Chemistry , 141, 2343–2354.
Zhang, J., Zhang, H., Wang, L., Ghuo, X., Wang, X., & Yao, H. (2009). Antioxidant activities of the rice endosperm protein  hydrolysates  identific ation  of  the  active peptide. European Food Research Technology , 229, 709–719
Zhong, M., Chen, T., Hu, C., & Ren, C. (2015).  Isolation and  characterization  of  collagen  from  body  wall  of sea  cucumber Stichopus  monotuberculatus .  Paper accepted in Journal of Food Science .
Zhou, X., Wang, C. & Jiang, A. (2012). Antioxidant peptides isolated from sea cucumber Stichopus japonicus.Eur Food Res Technol., 234 ,  441–447.