Menara Perkebunan 2023, 91(2), 161 – 168 http://dx.doi.org/10.22302/iribb.jur.mp.v91i2.552 p-ISSN: 0125-9318/ e-ISSN: 1858-3768
Accreditation Number: 164/E/KPT/2021
Viabilitas mikroba selulolitik pada media berbasis pod dan pulp kakao
(Theobroma cacao)
Cellulolytic microbial viability on cocoa (Theobroma cacao) pod and pulp-based media
Nisfatin SHOFIANA 1) , Titi Candra SUNARTI 2) & Anja MERYANDINI 1,3)*
1) Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB University, Dramaga Bogor 16680
2) Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB University, Dramaga, Bogor 16680
3) Pusat Penelitian Bioteknologi, IPB University, Dramaga, Bogor 16680
Diterima tgl 21 Sep 2023 / Perbaikan tgl 19 Okt 2023 / Disetujui tgl 30 Okt 2023

## Abstract
Cocoa  ( Theobroma  cacao )  production  in Indonesia is increasing from year to year. The high production  of  cocoa  has  an  impact  on  increasing cocoa  pod  and  pulp  waste.  Cocoa  pod  contains lignocellulose,  while  cocoa  pulp  contains  many sugars.  The  composition  of  cocoa  pod  and  pulp allows the cellulolytic microbe to grow. This study aims to perform microbial selection from fermented cocoa  and  sugar  cane  can  grow  in  the  cocoa  pod and pulp-based media. The selection method using the CMC 1%, pod 1%, pulp 1%, and pod 0.5%+pulp 0.5%  media.  Then,  the  analysis  of  reducing  sugar was  conducted  using  DNS  method,  while  the  total sugar analysis using phenol-H 2 SO 4 method. Sugars from hydrolysis were analyzed quantitatively using TLC. The results of microbial selection on CMC 1%, pod %, pulp 1%, and pod 0.5%+pulp 0.5% media obtained Paenibacillus polymyxa TBT 3.2 that have the largest cellulolytic index on the pod 1% media. Isolates TBT 3.2 grown on pod 1% medium produce reducing sugar is 4.965 mg/mL at 30 hours sampling with highest total sugar at 6 hours sampling is 9.789 mg/mL. The types of sugars identified using the TLC are mannose, galactose, glucose, and cellobiose.
[Keywords: DNS, galactose, cellobiose, cellulose]

## Abstrak
Produksi kakao ( Theobroma cacao ) di Indonesia semakin  meningkat  dari  tahun  ke  tahun.  Produksi kakao  yang  tinggi  berdampak  pada  meningkatnya limbah pod dan pulp kakao. Pod kakao mengandung lignoselulosa,  sedangkan pulp kakao  banyak mengandung  gula.  Komposisi  dari pod dan pulp kakao ini memungkinkan mikroba selulolitik dapat tumbuh. Penelitian ini bertujuan melakukan seleksi mikroba asal fermentasi kakao dan tebu yang dapat tumbuh  pada  media  berbasis pod dan pulp kakao. Metode  seleksi  dilakukan  menggunakan  media CMC  1%, pod 1%, pulp 1%,  dan pod 0,5%+ pulp 0,5%.  Kemudian,  analisis  gula  reduksi  dilakukan menggunakan metode DNS, sedangkan analisis total gula menggunakan metode fenol-H 2 SO 4 . Gula hasil hidrolisis  dianalisis  secara  kuantitaf  menggunakan KLT. Hasil seleksi mikroba pada media CMC 1%, pod 1%, pulp 1%,  dan pod 0,5%+ pulp 0,5% diperoleh  isolat Paenibacillus  polymyxa TBT  3.2 yang  memiliki  indeks  selulolitik  terbesar  pada media pod 1%.  Isolat TBT  3.2  yang  ditumbuhkan pada  media pod 1%  menghasilkan  gula  reduksi sebesar 4,965 mg/mL pada jam ke-30 dengan total gula  tertinggi  pada  jam  ke-6,  yaitu  9,789  mg/mL. Jenis  gula  yang  teridentifikasi  menggunakan  KLT berupa manosa, galaktosa, glukosa, dan selobiosa.
[Kata kunci: DNS, galaktosa, selobiosa, selulosa]

## *) Penulis korespondensi: ameryandini@apps.ipb.ac.id
0125-9318/ 1858-3768 ©2023 Authors
This is an open access article under the CC BY-NC-SA license ( https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ ) Menara Perkebunan is DOAJ indexed Journal and accredited as Sinta 2 Journal ( https://sinta.kemdikbud.go.id/journals/profile/3125 )
How to Cite: Shofiana, N., Sunarti, T.C., & Meryandini, A. (2023). Viabilitas mikroba selulolitik pada media berbasis pod dan pulp kakao
( Theobroma cacao L.). Menara Perkebunan, 91 (2), 161-168. http://dx.doi.org/10.22302/iribb.jur.mp.v91i2.552
Viabilitas mikroba selulolitik pada media berbasis pod dan pulp kakao ( Theobroma cacao L.)………………….. (Shofiana et al.)

## Pendahuluan
Produksi  buah  kakao  di  Indonesia  menurut Badan  Pusat  Statistik  pada  tahun  2022  mencapai 667.300  ton  (Data  Indonesia  2023).  Tingginya produksi buah kakao mengakibatkan meningkatnya limbah dari buah kakao tersebut karena pemanfaatan buah  kakao  terbatas  pada  biji.  Limbah  dari  buah kakao dapat berupa pod dan pulp kakao. Pod kakao merupakan  bagian  mesokarp  buah  kakao  yang mencakup kulit terluar sampai daging buah sebelum biji.  Menurut  Kilama  et  al . (2019), pod kakao berkisar 74% dari berat total buah kakao yang akan dibuang selama proses pengolahan kakao dan dapat menyebabkan  masalah  lingkungan.  Sel  endokarp yang melekat pada lapisan luar epidermis kulit biji membentuk pulp buah. Pulp mengandung 82–87% air  dan  8–14  %  gula  yang  sangat  baik  untuk pertumbuhan mikroba pelaku fermentasi (Kadow et al . ,  2013 ). Salah  satu  metode  alternatif  dalam mengurangi  limbah pod dan pulp kakao,  yaitu menggunakan mikroba selulolitik (Putri et al., 2023; Putri et al . , 2019; Kurniawati et al., 2016).
Selulosa  merupakan  komponen  utama  dinding sel  tumbuhan.  Selulosa  tidak  mudah  didegradasi secara  kimia  atau  mekanis  dan  erat  berasosiasi dengan  lignin  dan  hemiselulosa.  Selulosa merupakan  polisakarida  dengan  ikatan  β-1,4 glukosidik  yang  dihubungkan  melalui  ikatan hidrogen dan gaya van der Waals (Li et al ., 2020). Degradasi  selulosa  dapat  dilakukan  oleh  enzim selulase  yang  tersusun  atas  endoglukanase, eksoselobiohidrolase,  dan  β-glukosidase.  Selo- oligosakarida yang dihasilkan dari proses degradasi selulosa  dapat  dimanfaatkan  sebagai  senyawa prebiotik,  sedangkan  selobiosa  dan  glukosa digunakan  oleh  mikroba  sebagai  sumber  karbon dalam pembentukan energi dan bioetanol.
Penelitian mengenai pemanfaatan pod dan pulp kakao di Indonesia hingga kini masih belum banyak dilakukan,  padahal  kandungan  selulosa  dalam  pod kakao sebanyak 74% (Daud et al., 2013).  Menurut Nisa & Putri (2014), selulosa dari pod kakao dapat digunakan sebagai bahan pembuatan CMC. Fauzi et al . (2012)  menunjukkan  bahwa pod kakao  dapat dimanfaatkan  untuk  pembuatan  bioetanol fuel grade . Selain pod kakao, limbah pulp kakao dapat digunakan untuk pembuatan bioetanol menggunakan  bantuan  khamir  (Kristiani  et  al ., 2013).  Pemanfaatan  limbah pulp kakao  juga  dapat digunakan sebagai herbisida untuk beberapa gulma berdaun  lebar  (Pujisiswanto,  2011).  Hasil-hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa pemanfaatan limbah pod dan pulp kakao memiliki potensi besar dalam menunjang kehidupan manusia. Penelitian ini bertujuan melakukan seleksi mikroba asal fermentasi kakao dan tebu yang dapat tumbuh pada media berbasis pod dan pulp kakao.

## Bahan dan Metode

## Persiapan substrat pod dan pulp kakao
Buah  kakao  diperoleh  dari  kebun  rakyat  di Leuwikopo  Bogor.  Preparasi  media  dilakukan dengan  membelah  buah  kakao  yang  sudah  masak. Kemudian,  kulit  ( pod )  dan pulp kakao  dipisahkan dari bijinya. Pod dan pulp kakao dipotong lembaran ukuran 1x1 cm 2 , lalu dikeringkan dalam oven pada suhu  60 o C  selama  3  hari.  Potongan pod dan pulp yang  sudah  kering  dihaluskan  dan  diayak menggunakan  saringan  80  mesh.  Bubuk pod dan pulp lolos digunakan sebagai media seleksi mikroba yang akan digunakan.

## Seleksi mikroba
Sebanyak 23 isolat mikroba yang diperoleh dari fermentasi kakao dan tebu yang merupakan koleksi laboratorium Bioprospeksi Mikrob Pusat Penelitian Bioteknologi  IPB,  diremajakan  pada  media yeast- peptone-glucose ( YPG)  padat  dan  diinkubasi  pada suhu  ruang  selama  24  jam.  Isolat-isolat  tersebut diseleksi  pada  media  CMC  1% ( 1g  CMC;  0,02g MgSO 4 .7H 2 O;  0,075g  KNO 3 ;  0,05g  K 2 HPO 4 ; 0,002g  FeSO 4 .7H 2 O;  0,004g  CaCl 2 .2H 2 O;  0,2g ekstrak  khamir,  2,3  g  agar-agar  bakto,  dan  0,1g glukosa ), dan dilanjutkan pada media pod 1%, pulp 1%, pod 0,5%+ pulp 0,5%  yaitu  dengan menggantikan CMC dengan pod atau pulp .
Seleksi  pada  media  CMC :    Sebanyak  1  ose isolat mikroba berusia 24 jam diinokulasikan pada media  CMC  1%  padat,  kemudian  diinkubasi  pada suhu ruang selama 24 jam. Diameter koloni mikroba diukur.  Cawan  berisi  isolat  kemudian  digenangi dengan reagen merah kongo selama 15 menit, lalu dibilas menggunakan NaCl 0,2 M sebanyak 3 kali dan ditunggu hingga kering. Diameter zona bening kemudian  diukur.  Nilai  indeks  potensial  dihitung mengikuti  Downie  et  al . (1994)  dengan menggunakan rumus berikut:
Indeks = !"#$%&%' )*+# ,%+"+- . !"#$%&%' /*0*+" !"#$%&%' /*0*+"
Isolat dengan nilai indeks potensial yang tertinggi akan dipilih untuk karakterisasi selanjutnya.
Seleksi  pada  substrat pod dan pulp kakao: Sebanyak  4  isolat  mikroba  terpilih  berdasarkan indeks  selulolitik  yang  tinggi  diambil  1  ose,  lalu diinokulasikan pada 3 macam media berbeda, yaitu media YPG  (1  g  ekstrak  khamir,  2  g  pepton,  2  g glukosa, 2,3 g bubuk agar-agar bioteknologi dan 100 mL akuades) dengan penambahan pod 1%, pulp 1%, dan pod 0,5%+ pulp 0,5%.  Isolat  diinkubasi  pada suhu ruang (30 °C) selama 24 jam. Kemudian koloni yang  terbentuk  diukur  diameternya, dan cawan di-
Menara Perkebunan 2023, 91(2), 161 – 168
rendam  dengan  reagen  merah  konngo  selama  15 menit.  Isolat  dibilas  menggunakan  NaCl  0,2  M sebanyak  3  kali,  lalu  dikeringkan.  Diameter  zona bening diukur dan didokumentasikan dalam bentuk foto. Percobaan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Indeks  potensial  dihitung  menggunakan  rumus sebagai berikut:
Indeks = !"#$%&%' )*+# ,%+"+- . !"#$%&%' /*0*+"
!"#$%&%' /*0*+"
Isolat dengan nilai indeks potensial yang tertinggi yang berarti memiliki kemampuan untuk menggunakan pod atau pulp kakao untuk tumbuh akan dipilih untuk karakterisasi selanjutnya.

## Hidrolisis pod kakao oleh isolat terpilih
Isolat mikroba terpilih ditumbuhkan pada media pod 1% dengan suplementasi glukosa 0,1%. Setiap 3 jam sekali selama 30 jam dilakukan pengambilan inokulum  untuk  diukur  total  gula,  gula  pereduksi, dan jumlah koloni. Total gula diukur menggunakan metode  fenol-H 2 SO 4 (Dubois  et  al ., 1989), sedangkan  gula  pereduksi  menggunakan  metode DNS  (Miller,  1959).  Koloni  mikroba  dihitung menggunakan metode total plate count (TPC).
Perhitungan  koloni  mikroba  menggunakan metode  TPC.  Sebanyak  1  mL  sampel  diencerkan dengan  9  mL  NaCl  fisiologis  hingga  pengenceran 10 -4 dan  10 -5 .  Pada  pengenceran  10 -4 dan  10 -5 diambil sebanyak 100 µL untuk ditumbuhkan pada media YPG padat dengan cara disebar menggunakan batang penyebar, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu  37  °C.  Kemudian,  jumlah  koloni  diantara  25 hingga 250 dihitung dalam satuan log CFU/mL.
Karakterisasi produk hidrolisat dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Isolat  mikroba  yang  ditumbuhkan  pada  media pod kakao  diambil  pada  jam  ke-30  dengan konsentrasi substrat pod 1%, 3%, dan 5%. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 15 menit.  Larutan  standar  yang  digunakan,  yaitu manosa,  galaktosa,  xilosa,  glukosa,  dan  selobiosa dengan masing-masing konsentrasi 1000 ppm.
Plat KLT ditandai menggunakan pensil 2B pada batas awal penotolan (1 cm dari tepi bawah plat) dan batas akhir elusi (1 cm dari tepi atas plat). Plat TLC Silica gel 60 F254I (Merck) dimasukkan ke dalam
oven 80 °C selama ± 5 menit. Kemudian, sebanyak 25 totol standar dan 20 totol sampel ditotolkan pada batas awal dengan jarak masing-masing 1 cm, lalu ditunggu  hingga  kering.  Plat  KLT  dimasukkan  ke dalam chamber  glass yang  telah  berisi  eluen  (n- butanol  :  asam  asetat  :  akuades  dengan  per bandingan 2:1:1) hingga pergerakan eluen mencapai batas  akhir  elusi.  Plat  KLT  dikeringkan menggunakan hair  dryer ,  kemudian  disemprot dengan  pewarna  DAP.  Plat  KLT  dikeringkan kembali menggunakan hair dryer . Plat yang sudah kering dimasukkan ke dalam oven 100 °C selama 15 menit  untuk  memunculkan  noda  (Reiffova  & Nemcova,  2006).  Hasil  KLT  didokumentasikan dalam  bentuk  foto  dan  dihitung  nilai  Rf-nya menggunakan rumus berikut :
Nilai Rf = 1#'#/ 2#+- !"&%$345 6%+2#7# 1#'#/ 2#+- !"&%$345 3%0#'4&

## Hasil dan Pembahasan

## Pod dan pulp kakao
Preparasi  media pod dan pulp kakao  dimulai dengan mencari buah kakao yang telah masak. Buah kakao  masak  memiliki  ciri-ciri  antara  lain  :  kulit buah berubah warna dari hijau menjadi kuning atau dari merah menjadi jingga tua, tangkai buah kering, dan jika buah diguncang akan menghasilkan bunyi. Buah yang telah masak dipisahkan antara pod dan pulp dari  bijinya. Pod kakao  yang  sudah  kering mengandung  hemiselulosa  23.36%,  selulosa 24.51%,  dan  lignin  30.46%  (Rambat  et  al . , 2015). Serbuk pod dan pulp kakao disaring menggunakan saringan  80  mesh  untuk  memperoleh  selulosa  dan meningkatkan luas permukaan substrat.
Serbuk pod dan pulp kakao  tidak  larut  dalam media  YPG.  Serbuk pod kakao  berwarna  coklat muda,  sedangkan  serbuk pulp kakao  berwarna coklat  kekuningan  (Gambar  1).  Pada  media  padat, serbuk pod kakao  berwarna  lebih  gelap  daripada serbuk pulp kakao, sedangkan pod dan pulp kakao akan  mengendap  pada  media  cair.  Mikroba  dapat tumbuh  dengan  mudah  pada  media  padat  dari pod dan pul p kakao. Pada kultur pod dan pulp kakao cair, pertumbuhan  mikroba  teramati  pada  bagian  atas endapannya. Endapan yang telah terdegradasi oleh mikroba  akan  berwarna  coklat  terang,  sedangkan substrat pod dan pulp tetap berwarna coklat gelap.
Gambar 1. Serbuk kakao ukuran 80 mesh asal pod (a) dan pulp (b); isolat TBT 3.2 pada media pod kakao (c) Figure   1. The 80 mesh dry cocoa powder from the pods (a) and pulp (b); TBT3.2 isolate on the pods media (c)
a b
c
Viabilitas mikroba selulolitik pada media berbasis pod dan pulp kakao ( Theobroma cacao L.)………………… (Shofiana et al.)

## Seleksi mikroba selulolitik pada media CMC
Sebanyak 23 isolat mikroba yang diisolasi dari fermentasi kakao dan tebu ditumbuhkan pada media CMC  1%+YPG.  Seleksi  ini  dilakukan  untuk memperoleh isolat unggul yang dapat mendegradasi selulosa.  Hasil  seleksi  menunjukkan  bahwa  isolat 2P8, 3B2, 4B1, dan TBT 3.2 (Tabel 1, Gambar 2) memiliki indeks selulolitik terbesar.
Zona  bening  dapat  teramati  setelah  dilakukan pewarnaan  dengan  merah  kongo  dan  dibilas menggunakan NaCl 0,2 M. Merah kongo berikatan dengan  polisakarida  yang  terdapat  dalam  substrat membentuk  warna  merah.  Zona  bening  yang terbentuk pada media disebabkan oleh terdegradasinya selulosa menjadi selo-oligosakarida atau  selobiosa  sehingga  terbentuk  zona  berwarna bening  atau  merah  pudar.  Semakin  besar  diameter zona  bening  yang  terbentuk  menunjukkan  bahwa semakin banyak enzim yang mendegradasi substrat (Downie  et  al . ,  1994).  Isolat  2P8,  3B2,  4B1,  dan TBT  3.2  memiliki  indeks  selulolitik  terbesar  yang menunjukkan bahwa isolat-isolat tersebut memiliki kemampuan untuk menghasilkan enzim pendegradasi  selulosa  lebih  tinggi  dibandingkan dengan isolat mikroba lainnya.

## Seleksi isolat terpilih pada substrat pod dan pulp kakao
Isolat mikroba yang memiliki indeks selulolitik terbesar dilakukan seleksi kembali pada media pod dan pulp. Konsentrasi media yang digunakan, yaitu pod 1%, pulp 1%,  dan pod 0,5%+ pulp 0,5%. Konsentrasi  ini  disesuaikan  dengan  substrat  CMC 1%  yang  berfungsi  sebagai  kontrol.  Hasil  seleksi menunjukkan  isolat  TBT  3.2  menghasilkan  zona bening terbesar pada ketiga media berbeda (Tabel 2, Gambar 3).
Isolat 2P8, 3B2, dan 4B1 memiliki kemampuan mendegradasi selulosa pada pod kakao lebih rendah dibandingkan  dengan  isolat TBT  3.2.  Hal  tersebut dapat disebabkan oleh konsentrasi lignin yang tinggi pada substrat pod .  Lignin adalah senyawa kompleks dari  unit-unit  aromatik syringil (S), guaiacyl (G), dan p-hydroxyphenyl (H)  yang  tergabung  melalui keterkaitan  antarunit,  dimana  keterkaitan  β-O-4’ yang  paling  melimpah  (45-94%  dari  total keterkaitan antarunit) (Aminah et al . , 2019; Munk et al . ,  2015;  Vanholme  et  al ., 2010) . Selain  itu, komposisi pulp yang  banyak  mengandung  gula digunakan mikroba untuk pertumbuhannya sehingga tidak dihasilkan enzim ekstraseluler untuk mendegradasi selulosa.
Tabel 1. Indeks selulolitik dari berbagai isolat mikroba pada media CMC 1% Table 1. Cellulolytic index of various microbial isolates on 1% CMC media
Kode Isolat Isolate code Indeks selulolitik Cellulolytic index Kode Isolat Isolate code Indeks selulolitik Cellulolytic index 0P1 0,179 2P7 0,154 0P2 0,179 2P8 0,364 1P3 0,120 2P9 0,154 1P4 0,000 2P10 0,000 1B2 0,000 2B1 0,286 1B3 0,000 2B3 0,167 2P1 0,042 3B1 0,100 2P2 0,296 3B2 0,462 2P3 0,214 4B1 0,386 2P4 0,000 4B2 0,111 2P5 0,000 TBT 3.2 0,712 2P6 0,185
Gambar 2. Pertumbuhan beberapa isolat pada media CMC 1%
Figure    2. Growth of several isolates on 1% CMC media
Menara Perkebunan 2023, 91(2), 161 – 168
Tabel 2. Indeks selulolitik pada media pod dan pulp kakao
Table 2. Cellulolytic index on pod media and cocoa pulp
Kode Isolat Isolate code Jenis Substrat Type of substrate Pod 1% Pulp 1% Pod 0,5%+ Pulp 0,5% 2P8 0,000 ± 0,00 0,112 ± 0,05 0,103 ± 0,18 3B2 0,000 ± 0,00 0,044 ± 0,04 0,208 ± 0,09 4B1 0,092 ± 0,16 0,000 ± 0,00 0,191 ± 0,04 TBT 3.2 1,574 ± 0,39 1,251 ± 0,18 1,061 ± 0,14
Gambar 3.  Pertumbuhan isolat TBT 3.2 pada media yang mengandung pod kakao 1%
Figure   3. Growth of TBT 3.2 isolate on media containing 1% cocoa pods
Gambar 4. Grafik hubungan antara kurva pertumbuhan dan produksi gula Paenibacillus polymyxa TBT 3.2 pada media pod 1% pH 7 yang diinkubasi pada suhu ruang
Figure   4. Graph of the relationship between the growth curve and sugar production of Paenibacillus polymyxa TBT 3.2 on 1% pH 7 pod media incubated at room temperature
6,5 7 7,5 8 8,5 9 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Ju m la h ko lo ni / Co lo ny n um be r (l og C FU mL -1 ) Ko ns en tr as i g ul
a/ Sugar c onc ent rat ion (m g mL -1 ) Waktu (jam) Time (hour) Gula Pereduksi
Total Gula
Jumlah Koloni
Viabilitas mikroba selulolitik pada media berbasis pod dan pulp kakao ( Theobroma cacao L.)………………… (Shofiana et al.)
Kenaikan  jumlah  koloni  menunjukkan  bahwa Paenibacillus  polymyxa TBT  3.2  mengalami pertumbuhan  dengan  menggunakan pod kakao sebagai  sumber  karbonnya.  Jumlah  gula  pereduksi diawal  inkubasi  berasal  dari  suplementasi  glukosa 0,1% pada media kultur sehingga sel dapat tumbuh. Kemudian, sel mikroba akan mendegradasi selulosa yang  terdapat  pada pod kakao  menjadi  gula-gula sederhana,  seperti  selobiosa  dan  glukosa.  Glukosa hasil merupakan sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri.
Gula pereduksi merupakan gula yang memiliki gugus  aldehid  atau  keton  bebas  sehingga  dapat mereduksi suatu senyawa, seperti glukosa, fruktosa, manosa,  maltosa,  dan  laktosa  (Astuti  &  Rustanti, 2014).Total gula merupakan jumlah gula pereduksi dan  non  pereduksi  yang  terdapat  pada  media. Pengukuran total gula menggunakan metode fenol- H 2 SO 4 . Metode fenol-H 2 SO 4 adalah metode analisis karbohidrat yang paling mudah dan akurat. Metode ini  digunakan  untuk  mengukur  gula  dalam  bentuk oligosakarida,  proteoglikan,  glikoprotein,  dan glikolipid.  Total  gula  mengalami  fluktuasi  pada setiap  jam,  kondisi  ini  diduga  akibat  adanya degradasi selulolitik dari pod oleh bakteri. Kenaikan total gula terjadi pada jam ke-3, 6, 12, 18, dan 24 dengan  puncaknya  pada  jam  ke-6  sebesar  9,789 mg/mL,  sedangkan  konsentrasi  total  gula  terkecil pada jam ke-15, yaitu sebesar 5,335 mg/mL. Calvo et  al . (2021)  menemukan  kadar  total  gula  yang menurun antara 55 – 64% selama proses fermentasi 8 hari, sedangkan Indrayati et al . 2021 mengamati penurunan  konsentrasi  total  gula  selama  12  hari fermentasi.  Perbedaan  hasil  penelitian  ini disebabkan singkatnya waktu pengamatan sehingga proses  yang  terjadi  adalah  aktifnya  mikroba mendegradasi  selulosa  sehingga  banyak  terbentuk gula-gula sederhana. Hal tersebut ditunjang dengan data jumlah koloni yang juga meningkat, yaitu 6,602 log  CFU/mL  pada  awal  inkubasi  dan  terus meningkat menjadi 8,491 log CFU/mL pada jam ke- 30.
Penurunan total gula yang terjadi pada jam ke-9, 15,  dan  21  disebabkan  oleh  gula-gula  sederhana hasil  degradasi  selulosa  digunakan  oleh  mikroba untuk  tumbuh.  Pada  jam  ke-24  total  gula  terus mengalami  penurunan  hingga  jam  ke-30  yang menunjukkan bahwa jumlah selulosa dan gula-gula lainnya semakin berkurang karena telah terdegradasi sebelumnya.

## Karakteristik produk hidrolisat dengan KLT
Uji  kromatografi  lapis  tipis  bertujuan  melihat jenis  sakarida  yang  dihasilkan  dari  degradasi selulosa. Hasil percobaan ditunjukkan pada gambar 5.  Nilai  Rf  dari  standar  gulanya,  yaitu  manosa (0,625),  galaktosa  (0,562),  xilosa  (0,662),  glukosa (0,6), dan selobiosa (0,5). Hasil elusi menunjukkan bahwa pada konsentrasi pod kakao 1% gulanya tidak dapat  teridentifikasi,  sedangkan  pada  konsentrasi 3% dan 5% teramati jenis gula yang sama dengan nilai Rf antara 0,4 – 0,625. Nilai Rf tersebut berarti gula  yang  dihasilkan  dapat  berupa  manosa, galaktosa, glukosa, dan selobiosa.
Gula-gula  sederhana  yang  dihasilkan  dari degradasi pod kakao ini dapat dimanfaatkan sebagai sumber  bioetanol.  Rahman  et  al . (2023) menggunakan microwave untuk  menyiapkan  pod kakao  sebagai  media  untuk  produksi  bioethanol. Pemanfaatan microwave pada  suhu  180  °C memberikan komposisi glukosa dan xilosa tertinggi. Isolat  khamir  dapat  ditambahkan  pada  hasil hidrolisat pod kakao  oleh  isolat  TBT  3.2  untuk difermentasi lebih lanjut.
Gambar 5. Kromatografi lapis tipis pod kakao pada jam ke-30 dengan berbagai konsentrasi. Keterangan: man = manosa, gal = galaktosa, xyl = xilosa, glu = glukosa, selo = selobiosa, 1 = pod 1%, 3= pod 3%, 5 = pod 5%
Figure   5. Thin layer chromatography of cocoa pods at 30  hours  with  various  concentrations.  Note: man = manose, gal = galactose, xyl = xylose, glu  =  glucose,  selo  =  celelobioea,  1  =  pod 1%, 3= pod 3%, 5 = pod 5%

## man   gal    xyl   glu    selo       1         3        5
Menara Perkebunan 2023, 91(2), 161 – 168

## Kesimpulan
Paenibacillus  polymyxa TBT  3.2  merupakan isolat  mikroba  terbaik  yang  memiliki  indeks selulolitik terbesar baik pada media CMC 1%, pod 1%,  maupun pulp 1%  dengan  indeks  selulolitik tertinggi  pada  substrat pod kakao.  Gula  pereduksi hasil  degradasi pod kakao  terus  meningkat  setiap jam  dengan  puncaknya  pada  jam  ke-30.  Namun, total  gula  mengalami  fluktuasi  dengan  konsentrasi tertinggi  pada  jam  ke-6  dan  konsentrasi  terendah pada  jam  ke-15.  Identifikasi  gula  dengan  KLT diperoleh  hasil  degradasi pod kakao  berupa  gula manosa,  galaktosa,  glukosa,  dan  selobiosa. Penelitian selanjutnya dapat dilakukan menggunakan co-culture untuk memanfaatkan gula pereduksi yang dihasilkan seperti untuk pembuatan bioethanol.

## Daftar Pustaka
Akram,  S.  R.,  Sunarti,  T.  C.,  &  Meryandini,  A. (2019).  Characteristic  of  dextran  producing bacteria isolated from sugar cane ( Saccharum  officinarum L.). Jurnal  Ilmu Pertanian  Indonesia , 24 (2),  160  –  167. https://doi.org/10.18343/jipi.24.2.160
Aminah, N. S., Isma, C., & Kristanti, A. N. (2019). Skopoletin  suatu  senyawa  fenilpropanoid dari  ekstrak  etil  asetat  umbi  jalar  ( Ipomoea batatas L.). Jurnal  Kimia  Riset , 3 (2),  116- 121   https://doi:10.20473/jkr.v3i2.12061
Astuti, I. M., Rustanti N. (2014). Kadar protein, gula total, total padatan, viskositas dan nilai pH es krim  yang  disubstitusi  inulin  umbi  gembili ( Dioscorea  esculenta ). Journal  of  Nutrition
College , 3 (3), 331-336. https://doi.org/10.14710/jnnc/v3i3.6584
Black,  J.  G.,  Black,  L.J.  (2015). Microbiology Principles  and  Explorations  (  No.Ed.  9) . John Wiley & Sons Inc.
Calvo, A. M., Botina, B. L., García, M.C., Cardon, W.  A.,  Montenegro,  A.  C.  &  Criollo,  J. (2021). Dynamics of cocoa fermentation and its  efect  on  quality. Scientifc  Reports,
11 ,16746 https://doi.org/10.1038/s41598- 021-95703-2
Zawawi,  D.,  Kassim,  A.  S.  M.,  Aripin,  A.  M., Awang,  H.  &  Hatta,  M.  Z.  M.  (2013). Chemical composition and morphological of cocoa  pod. Australian  Journal  of  Basic  & Applied Science , 7 (9), 406-411.
Downie,  B.,  Hilhorst,  H.  W.  M.  &  Bewley,  J.  D. (1994). A New assay for quantifying endo-β-
D-mannanase activying using congo red dye. Pyhtochemistry , 36 , 829-835.
Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P.  A.,    &  Smith  F.  (1956).  Colorimetric method  for  determination  of  sugars  and related  substances. Analytical  Chemistry , 28 (3),
350-356. https://doi.org/10.1021/ac60111a017
Fauzi,  A.  R.,  Haryadi,  D.,  &  Priyanto,  S.  (2012). Pengaruh  waktu  fermentasi  dan  efektivitas adsorben  dalam  pembuatan  bioetanol fuel grade dari  limbah pod kakao  ( Theobroma cacao ). Jurnal Teknologi Kimia dan Industri,
1 (1), 179-185.
Indrayati,  S.,  Rahmadani,  S.  Y.,    Periadnadi., & Nurmiati.  (2021)  Potensi  mikrobiota indigenous  pulp  tiga  varietas  kakao ( Theobroma Cacao L.) sebagai starter dalam fermentasi  biji  kakao. Jurnal  Biopropal Industri , 12 (1), 19-32. https://doi.org/10.36974/jbi.v12i1.6459
Kilama, G., Lating, P. O., Byaruhanga, J., & Biira, S. (2019). Quantification and
characterization  of  cocoa  pod  husks  for electricity  generation  in  Uganda. Energy, Sustainability and Society, 9 , 22. https://doi.org/10.1186/s13705-019-0205-4
Kadow, D., Bohlmann J, Phillips, W., & Lieberei, R. (2013).  Identification  of  main  fine  flavour components  in  two  genotypes  of  the chocolate  tree  ( Threoboma cacao L.). Journal of Applied Botany Food Quality, 86 , 90-98.    https://doi.org/10.5073/JABFQ. 2013.086.013
Kurniawati,  N.,  Meryandini,  A.  &  Sunarti,  T.C.
(2016).  Introduction of actinomycetes starter on  coffee  fruits  fermentation  to  enhance quality of coffee pulp. Emirates Journal of Food  and  Agriculture , 28 (3),  188-195. https://doi:EJFA-2015-05-192
Lopak, S. S., Meryandini, A. & Sunarti, T. C. (2020). Dietary  fibre  production  from  cassava  pulp fibre using Actinomycetes cellulase. International Food Research Journal , 27 (4), 702-711.
Meryandini, A., Basri, A., & Sunarti, T. C. (2019).
Peningkatan kualitas biji kakao ( Theobroma cacao )  melalui  fermentasi  menggunakan Lactobacillus sp.  dan Pichia  kudriavzevii . Jurnal  Biologi  dan  Bioteknologi  Indonesia ,
6 (1), 11-19. https://doi.org/10.29122/jbbi.v6i1.3048
Viabilitas mikroba selulolitik pada media berbasis pod dan pulp kakao ( Theobroma cacao L.)…………………. (Shofiana et al.)
Miller,  G.  L.  (1959).  Use  of  dinitrosalicylic  acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical  Chemistry , 31 (3),  426-428. https://doi.org/10.1021/ac60147a030
Munk, L., Sitarz, A. K., Kalyani, D. C., Mikkelsen, J.  D.,  &  Meyer, A.  S.  (2015).  Can  laccases catalyze  bond  cleavage  in  lignin?.
Biotechnology Advances 33 (1),13–24. http://doi:10.1016/j.biotechadv.2014.12.008
Nisa,  D.,  Putri,  W.  D.  R.  (2014).  Pemanfaatan selulosa  dari  kulit  buah  kakao  ( Theobroma cacao L.)  sebagai  bahan  baku  pembuatan CMC  ( Carboxymethyl  Cellulose ). Jurnal Pangan dan Agroindustri, 2 (3), 34-42.
Pujisiswanto,  H.  (2011).  Pengaruh  fermentasi limbah  cair  pulp  kakao  terhadap  tingkat keracunan dan pertumbuhan beberapa gulma berdaun  lebar. Jurnal  Penelitian  Pertanian Terapan , 12 (1), 13-19.
Putri, E., Rukayadi, Y., Sunarti, T.C. & Meryandini, A.  (2019).  Cellulolytic  and  xylanolytic Actinomycetes selection to degrade lignocellulosic  biomass  of  robusta  coffee pulp  ( Coffea  canephora ). IOP  Conference Series:  Earth  and  Environmental  Science ,
299 ,  2-11.  https://doi.org/10.1088/1755- 1315/299/1/012014
Putri, E., Rukayadi, Y., Sunarti, T.C. & Meryandini,
A.  (2023).  Increase  in  polyphenolic substances  from  fermented  robusta  coffee pulp  (Coffea  canephora  L.)  by  using indigenous Actinomycetes . Hayati Journal of
Biosciences , 30 (3), 457-465. https://doi.org/10.4308/hjb.30.3.457-465
Rahman, S. A., Meryandini, A., Juanssilfero, A. B & Fahrurrozi. (2023). Cocoa Pod Husk (CPH) for  biomass  on  bioethanol  production. International  Journal  on  Advance  Science Engineering Information Technology , 13 (3), 828-836.
Rambat,  Aprilita,  N.  H.,  &  Rusdiarso,  B.  (2015). Aplikasi  limbah  kulit  buah  kakao  sebagai media  fermentasi  asam  laktat  untuk  bahan baku  bioplastik. Jurnal  Kimia  Kemasan , 37 (2), 103-110.
Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., &  Boerjan,  W.  (2010).  Lignin  biosynthesis and structure. Plant Physiology , 153 (3), 895– 905. https://doi:10.1104/pp.110.155 119