## ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PENGHASIL PROTEASE YANG DISKRINING DARI TERASI

## NOVI ARFARITA
Faculty of Agriculture, University of Islam Malang-UNISMA Email: arfarita@yahoo.com

## ABSTRACT
Terasi is a traditional fermented shrimp paste of Indonesia popularly used as an important ingredient in many Indonesian cuisines, and further screened for their protease-producing bacteria.  A  total  of  117  bacterial  isolates  were  retrieved    from  4  terasi  samples.  When inoculatedusing skim milk agar, 71 isolates (~61%) produced distinct clear zones implying their proteolytic activity. A bacterial isolate  namely Bacillus S2-3 wasselected for further study  due  to  its  widest  clear  zones  when  thebacterial  cells  and  culture  supernatant  were used.  This  strain  could  grow  up  to  60 o C  with  a  broad  pH  range  of  5  –  9.  The  optimal growth condition was at pH 6 and 37 o C. The enzyme activity was also characterized using azocasein method. The optimal pH of  bacterialenzymes was  between 6 and 7 whereas the optimal temperature of BacillusS2-3 proteases was 22 – 24 o C. For thermostability, the S2-3 enzymes  remained  active  up  to  2h  at  40  and  50 o C.  The  results  ofbiochemical  tests, BacillusS2-3  was  identified  as  Bacillussubtilis,  later  explored  it  is  potential  for  the purposes for  food industry.
Key word : Terasi, Identified, Bacteri, Protease
PENDAHULUAN
Protease terjadi secara alami padasemua organisme. Enzim ini terlibat dalam banyak fungsi dari tingkat sel sampai ke tingkat organ dan organisme, dari pencernaan sederhana  protein  makanan  sampai  proses metabolisme  yang  melibatkan  pengaturan tingkat  tinggi.  Protease  terdapat  pada  seluruh organisme  untuk  dipergunakan  diberbagai proses metabolisme dan juga menentukan masa protein  lain  yang  berperan  pada  proses fisiologis penting seperti hormon, antibodi, atau enzim  lainnya.  Secara  umum,  protease  ekstra seluler  mengkatalisis  hidrolisis  protein  besar menjadi  molekul  yang  lebih  kecil  untuk penyerapan  berikutnya  oleh  sel  sedangkan protease  intraselular  memainkan  peran  penting dalam regulasi metabolisme (Rao et. al. , 1998). Protease  adalah  salah  satu  grup  enzim paling  penting  dibidang  industri.  Sebagian besar  protease  digunakan  dalam  deterjen. Penggunaan  protease  sebagai  alternatif  bahan kimia telah terbukti berhasil dalam meningkatkan  kualitas  kulit  dan  mengurangi pencemaran  lingkungan  diindustri  kulit.  Salah satu  kegunaan  utama  protease  adalah  dalam industri  makanan.  Protease  digunakan  untuk melunakkan protein daging, terutama kolagenase. Protease lain yang banyak digunakan  adalah  rennin,  yang  memecah protein susu dan menyebabkan mereka
mengental,  membentuk  dasar  keju.  Protease juga  digunakan  untuk  untuk  menjernihkan  bir dan  untuk  memperbaiki  tekstur  adonan  dalam pembuatan  roti(emulsifier).  Selain  itu,  enzim proteolitik  telah  digunakan  untuk  waktu  yang lama dalam berbagai bentuk terapi. Penggunaannya  dalam  aplikasi  biomedis  yang penting  didasarkan  pada  beberapa  studi  klinis telah  menunjukkan  manfaat  dalam  onkologi, kondisi  peradangan,  kontrol  reologi  darah,  dan regulasi kekebalan tubuh (Bains, 1998).
Sebuah  kenyataan  protease  secara fisiologis  diperlukan  oleh  organisme  untuk hidup, sehingga tentunya protease bisa ditemukan  di  mana-mana,  seperti  tanaman, hewan  dan  mikroorganisme.    Mikroorganisme merupakan  sumber  enzim  yang  sangat  baik karena  keragaman  biokimia  yang  luas  dan ketahanan enzim mikroorganisme untuk manipulasi  genetik.  Produksi  protease  dari mikroba  berjumlah  sekitar  40%  dari  total penjualan  enzim  di  seluruh  dunia  (Godfrey  & Barat,  1996;  Walsh,  2002).  Protease  dari sumber mikroba lebih disukai di sektor industri dari  pada  enzim  dari  sumber  tanaman  dan hewan  karena  enzim  dari  mikroba  memiliki hampir  semua  karakteristik  yang  diinginkan untuk aplikasi bioteknologi. Kebanyakan protease  komersial  diproduksi  dari  bakteri, terutama yang bersifat netral dan basa. Bakteri- bakteri  tersebut  termasuk  ke  dalam  genus
Bacillus diantaranya B.macerans, B.licheniformis, dan B.subtilis . Bakteri Bacillus adalah produsen yang baik untuk menghasilkan protease ekstra seluler karena ketahanan mereka pada  suhu  tinggi  dan  rentang  pH  yang  luas (Olajuyigbe  &  Ajele,  2005;  Nagata  & Matsumura, 1986).
Terasi  merupakan  salah  satu  produk fermentasi  khas  Indonesia  yang  dilakukan dengan  penggaraman  dan  bahan  dasar  yang terbuat  dari  udang  dan  atau  ikan  berupa  pasta padat  kering.  Terasi  berfungsi  sebagai  bumbu karena  adanya  asam  glutamat  dan  rasa  spesifik (Surono  &  Hosono,  1994).  Terasi,    biasanya biasanya  dalam  bentuk  batangan  berwarna gelap.  Warna  dan  aroma  terasi  bervariasi tergantung pada masing-masing desa memproduksinya.  Rentang  warna  dari  warna ungu  kemerahan-lembut  sampai  coklat  gelap. Terasi memiliki aroma tajam, sehingga sebelum ditambahkan  ke  bumbu  makanan,  sering dipanggang di atas api. Aroma tajam dikurangi dengan  metode  memasak  atau  memanggang (Suprapti,2002).
Akan  tetapi  infomasi  tentang  mikroba atau mikroorganisme yang terlibat dalam proses fermentasi  terasi,  terutama  bakteri  penghasil proteasen yang sangat terbatas. Dalam studi ini, kami bertujuanuntuk mengisolasi dan mengidentifikasi  strain  bakteri  yang  mampu menghasilkan  protease  dari  beberapa  sampel terasi.  Selain  itu,  beberapa  karakteristik mendasar  dari  strain  bakteri  potensial  juga diobservasi.

## BAHAN DAN METODE Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Sampelterasi  dikumpulkan  daritiga  wilayahdi PulauJawa  yaitu  di  daerah  Cirebon, Tuban  dan Malang, kemudian digunakan untuk mengisolasi  bakteri  penghasil  protease.  Dalam tahap  ini,  digunakan  10  gram  terasi  yang ditambahkan  ke  dalam    90  ml  larutan  pepton 0,1%  steril  dan  dihomogenkan  dalam  sebuah stomacher . Larutan dengan tingkat pengenceran yang  sesuai  kemudian  diambil  10  µl  dan
dilakukan metode spread plate agar pada media kaseinagar,  diinkubasi  pada  357°C  selama  24 jam.  Koloni  yang  menunjukkan  zona  bening kemudian  dipilih  dan  streak  ulang  sampai didapatkan  kultur  murni.  Satu  strain  terbaik yang  ditandai  dengan  zona  bening  yang  jelas serta  mempunyai  diameter  tertinggi  kemudian diamati  sifat  morfologi  dan  fisiologisnya,  yaitu termasuk  bentuk  sel  dengan  pewarnaan  Gram, dan kondisi pertumbuhan (aerobik atauanaerobik).  Uji  biokimia  menggunakan API50Chkit (bioMerieux, Inc).

## Optimalisasi Kondisi Pertumbuhan Bakteri
Sebanyak 0.2 ml kultur cair bakteri ditransferke dalam  100  ml  media  NB  (NutientBroth)  yang mengandung  0,1%  kasein  dan  kemudian diinkubasi    pada  37º  C  dengan  dishaker  pada 150  rpm  selama  3  hari.  Pertumbuhan  bakteri diamati  setiap  12  jam  dengan  mengukur  OD pada 600 nm.

## Aktivitas Proteolitik
Untuk  menguji  aktivitas  proteolitik,  sebanyak 15  μl  cairan  supernatan  yang  mengandung enzim diteteskan pada piringan kertas steril dan diinkubasikan  pada  cawan  petri  berisi  SMA (Skim  Milk  Agar).  Cawan  petri  kemudian diinkubasi  pada  37ºC  selama  12  jam. Aktivitas enzim  proteolitik  diamati  dengan  mengukur zona bening. Kondisi pertumbuhan bakteri juga diamati  dalam  kisaranp  H5  –  9  dan  pada  suhu yang bervariasi antara 22-60º C.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dengan  menggunakan  susu  skim  agar,  koloni yang  mampu  menghasilkan  zona  bening  yang jelas  diisolasi  secara  acakdan  kemudian dimurnikan  dengan  di  streak  pada  cawan  petri yang bersisi NA (Nutrient Agar). Dari 117 isolat bakteri  yang  diisolasi,  71  isolat  mampu menghasilkan zona bening yang jelas (Tabel 1). Aktivitas  proteolitik  mereka  selanjutnya  diuji menggunakan  teknik  inkubasi  spot.  Satu  isolat yaitu  S2-3  menunjukkan  aktivitas  tertinggi kemudian  dipilih  untuk  digunakan  lebih  lanjut dalam penelitian ini.
Tabel 1.Distribusi isolat bakteri yang didapatkan dari empat sampel bakteri . Sampel Lokasi Total strain yang didapatkan Jumlah bakteri penghasil protease (%) 1 Branded (Mamasuka), Jawa Barat 26 15 (58) 2 Cirebon –  Jawa Barat 32 19 (59) 3 CookingTrasi – Malang- Jawa Timur 24 12 (50) 4 Tuban – Jawa Timur 35 25 (71) Total 117 71 (69%)
Strain  bakteri  ini  adalah  Gram  positif (Gambar  1.a)  dan  mampu  tumbuh  di  bawah kondisi  anaerob.    Berdasarkan  API  profil biokimia  dengan  menggunakan  beberapa  uji biokimia  dan  menggunakan  API  kit  diketahui bahwa  bakteri  S2-3  diklasifikasikan  sebagai

## Bacillussubtilis.
Hubungan  antara  pertumbuhan  strain S2-3  dan  produksi  protease  ditentukan  dan diamati  pada  kultur  cair  (NB)  dan  dipantau setiap  12  jam  dengan  mengukur  OD  pada 600nm  serta  adanya  zona  beningcawan  petri yang  merisi  susu  skim  agar.  Hasil  penelitian menunjukkan bahwa produksi protease bergantung pada pertumbuhan bakteri. Strainbakteri  ini  dapat  tumbuh  hingga  60ºC dengan  kisaran  pH  yang  luas  yaitu  dari  5  -  9. pH  optimal  bagi  pertumbuhan  isolat  S2-3 adalah 6 sedangkan suhu optimum adalah suhu kamar (22 - 30ºC) (Gambar 2).
Pengaruh  berbagai  suhu  pada  aktivitas proteolitik  dari Bacillus  subtilis S2-3  diamati dengan  mengukur  diameter  zona  bening  (cm 2 ) dan  dimonitor  setiap  12  jam  (Gambar  3.b). Suhu  optimum  untuk  aktivitas  proteolitik Bacillus  subtilis S2-3  adalah  pada  suhu  kamar dan  aktivitas  proteolitik  terendah  pada  suhu
60ºC.  Kegiatan  proteolitik  pada  temperatur yang  berbeda  juga  cenderung  mengikuti pertumbuhan sel (Bandingkan Gambar 2 dan 3). Namun,  kegiatan  proteolitik  awal  (0  h)  adalah yang  tertinggi.  Gambar  3  menunjukkan  bahwa diameter  zona  bening Bacillus  subtilis S2-3 dipantau  pada  0  h  (jam  ke-0)  adalah  yang tertinggi.  Mungkin,  itu  disebabkan  oleh  waktu inkubasisupernatan pada piringan kertas. Padahal, waktu inkubasi untuk pengamatan lain adalah  12  jam.yang  kemungkinan  dalam  kurun waktu 12 jam tersebut terjadi dinamika aktivitas proteolitik yang tidak teramati.
Pengaruh  berbagai  pH  pada  aktivitas proteolitik  dari Bacillus  subtilis S2-3  diamati dengan  mengukur  diameter  zona  bening  dan dimonitor  setiap  12  jam  (Gambar  3.a).  PH optimum  aktivitas  proteolitik  untuk  bakteri  ini adalah 6. Aktivitas proteolitik pada pH 7, 8 dan 9  tidak  jauh  berbeda.  Kegiatan  proteolitik terendah adalah pada pH 5. Dengan pengamatan pertumbuhan sel pada berbagai pH, kegiatan  proteolitik  yang  cenderung  mengikuti pertumbuhan  sel  (lihat  Gambar  2  dan  3). Tingkat pertumbuhan Bacillus subtilis strain S2- 3 adalah sejajar dengan aktivitas proteolitik.
(a) (b) Gambar 2. (a) Pertumbuhan sel Bacillus  subtilis strain S2-3 pada kisaran pH 5-9  (diinkubasipada suhu 37ºC) dandiukurpadaOD 600 selama 60 jam (h)pada media kultur cair (NB). (b) Pertumbuhan sel Bacillus    subtilis strain  S2-3  pada  kisaran  suhu20-60  ºC  (pH  6)  dan  diukur  pada padaOD 600 selama 60 jam (h)  pada media kultur cair (NB).
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 0 12 24 36 48 60 Time (h) O D 6 0 0 Room temperature 37ºC 45ºC 52ºC 60ºC

## (a) (b)
Gambar 3.  Aktivitas proteolitik supernatan Bacillus subtilis S2-3 (dalam cm 2 ) pada kisaran pH 5-9 diinkubasi pada 37°C (a) dan pada kisaran suhu 20-60 ºC (pH 6) (b) yang diamati setiap 12 jam pada cawan petri yang bersisi Agar Kasein.
Terasi  telah  lama  digunakan  sebagai bumbu  dalam  banyak  masakan  Indonesia.  Saat ini,  berbagai  bentuk  terasi  telah  diproduksi meskipun  dengan  cara  tradisional,  yaitu  oleh keluarga  nelayan  lokal  di  desa-desa  pesisir. Oleh  karena  itu,  kemungkinan  bahwa  kualitas terasi tidak konsisten karena mikroba memfermentasi  secara  alami  dan  proses produksi dilakukan secara konvensional. Dalam produksi  terasi,  akan  menjadi  penting  untuk karakterisasi mikroba konsorsium yang terkandung  di  dalamnya  serta  mengoptimalkan proses  produksi  dan  keseragaman  kualitasnya. Ini  akan  membantu  dalam  pengembangan produk agar kualitas produk dapat dikendalikan dan  ditingkatkan.  Dengan  penekanan  pada mikroba fermentasi alami, ini mungkin merupakan  sumber  baru  dan  potensi  beberapa metabolit  yang  berguna  seperti  enzim  yang dapat  digunakan  dalam  industri  bioteknologi. Dalam  penelitian  ini,  penemuan Bacillus subtilis dalam  terasi  menunjukkan  aktivitas proteolitik  yang  tinggi  sekarang.  Isolatbakteri ini  diharapkan untuk digunakan sebagai kultur starter  murni  dalam  pembuatan  industri makanan misalnya keju.

## DAFTAR PUSTAKA
Bains, W. (1998) Biotechnology from A to Z (2 nd edition).  Oxford  University  Press,  pp. 146-314.
Chantawannakul,  P.,  Oncharoen,  A.,  Klanbut, K.,  Chukeatirote,  E.  danLumyong,  S. (2002
Characterization of proteases of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally  fermented  soybean  in
Northen  Thailand.  ScienceAsia  28: 241-245.
Godfrey,  T.  dan  West,  S.  (  1996)    Industryal enzymology, second edition. Macmillan Publishers Inc.
New
York.  p.3.
Nagata, M. dan  Matsumura, T.  (1986)  Action of the bacterial neutral protease, dispase on  cultured  cells  and  its  application  to fluid  suspension  culture  with  a  review on  biomedical  application  of  this protease.    The  Japanese  Journal  of Experimental Medicine 56, 297-307.
Olajuyigbe,    F.M.    danOjele,  J.O.    (2005) Production  dynamics  of  extracellular protease from Bacillus species. African Journal of Biotechnology  4, 776-779. Rao,  M.B.,  Tanksale,  A.P.,  Ghatge,  M.S.  dan Deshpande,  V.V.  (1998)  Molecular  and biotechnological  aspects  of  microbial proteases.  Microbiol.  Mol.  Biol.  Rev. 62: 597-635.
Suprapti,  L.   (2002) MembuatTerasi .   Kanisius Yogyakarta, Indonesia.  p. 28-40.
Surono,  I.S.  danHoson,  A.  (1994)    Microflora and  their  enzyme  profile  in “Terasi” starter.  Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry  58, 1167-1169.
Walsh, G.  (2002) Proteins: Biotechnology and biochemistry. John  Wiley  and  Sons. p.425.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 12 24 36 48 60 Time (h) Sq u a r e o f d ie m e te r o f c le a r z o n e (c m 2 ) pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 0 50 100 150 200 250 0 12 24 36 48 60 Time (h) Sq u a re o f d ia m e te r o f c le a r z o n e (c m 2 ) Room temperature 37ºC 45ºC 52ºC 60ºC