Copyright (c) 2022 ILTEK : Jurnal Teknologi
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License

## PENGEMBANGAN METODE PENENTUAN NITRIT DAN NITRAT DALAM DAGING SEGAR DAN PRODUK DAGING OLAHAN SECARA SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
Firman Shantya Budi 1 , Havizul 2
1.Program Studi Pendidikan Guru Madrasah Ibtidaiyah, Fakultas Tarbiyah dan Ilmu Pendidikan, Institut Agama Islam Negeri Pontianak
2. Program Studi Tadris Matematika Fakultas Tarbiyah dan Ilmu Pendidikan, Institut Agama Islam Negeri Pontianak Email : firman_chem07@yahoo.com

## ABSTRAK
Validasi metode analisis nitrit dan nitrat dalam daging segar dan produk daging olahan secara spektrofotometri UV-Vis  dengan  pereaksi  sulfanilamida  dan  N-naftiletilendiamina  (NEDA)  telah  dilakukan.  Tujuan  dari  penelitian  ini adalah  untuk  mendapatkan  metode  analisis  nitrit  dan  nitrat  pada  kondisi  optimum  yang  memenuhi  parameter.  Nitrat direduksi menjadi nitrit menggunakan reduktor serbuk Zn. Optimasi metode analisis dilakukan sebelum validasi. Tahap selanjutnya  metode  divalidasi  dengan  pendekatan spiking buta  nol  berdasarkan  parameter  validasi  meliputi  linieritas, sensitivitas, batas deteksi, batas kuantifikasi, ketelitian dan ketepatan. Metode diaplikasikan untuk penentuan nitrit dan nitrat dalam daging segar dan produk daging olahan (sosis, daging asap dan kornet). Absorbansi senyawa azo mencapai optimum  pada  panjang  gelombang  541  nm.  Sementara  itu,  hasil  validasi  menunjukkan  linieritas  standar  nitrit  pada rentang  0,1  –  0,8  mg/L  (R 2 =  0,9995)  dengan  absorptivitas  molar  sebesar  5,37 × 10 4 L  mol -1 cm -1 .  Batas  deteksi  dan kuantifikasi  masing-masing  sebesar  0,021  dan  0,063  mg/L  dengan  %RSD  analisis  nitrit  dan  nitrat  masing-masing sebesar 0,56 dan 1,73%. Persentase perolehan kembali analisis nitrit dan nitrat masing-masing antara  85 – 99% dan 82 – 100%. Konsentrasi nitrit dan nitrat yang ditentukan dalam daging masing-masing antara 0,60 – 14,79 mg/kg dan 0,68 –  8,39  mg/kg.  Hasil  tersebut  menginformasikan  bahwa  nitrit  dan  nitrat  yang  ada  dalam  sampel  berasal  dari  proses eksogen dan endogen.
Kata kunci : nitrit, nitrat, validasi, spektrofotometri UV-Vis

## ABSTRACT
Validation  of  nitrite  and  nitrate  analysis  methods  in  fresh  meat  and  meat  product  by  UV-Vis spectrophotometry  using  sulfanilamide  and  N-naftyletilendiamine  (NEDA)  reagent  was  studied. The  purpose  of  this study was to obtain a method of analysis of nitrite and nitrate at optimum conditions according to the parameters. Zinc powder was used as reducing agent to reduce nitrate to nitrite. The method was optimized in advance before validation. The  method  was  validated  by  zero  blind  spiking  approach  based  on  various  validation  parameters  such  as  linearity, sensitivity, limit of detection, limit of quantification, precision and accuracy. The method  was applied for determining nitrite and nitrate in fresh meat and meat products (sausage, smoked beef and cornet). The azo compound absorbance reached the optimum level at 541 nm. Meanwhile, the validation results showed linearity nitrite standard in the range from 0.1 – 0.8 mg / L (R 2 = 0.9995) with molar absorptivity 5.37 × 10 4 L mole -1 cm -1 . The limit of detection and limit of quantification  of  the  proposed  method  were  0.021  and  0.063  mg/L  respectively  with  %RSD  of  nitrite  and  nitrate analysis were 0.56 and 1.73%, respectively. The percent recovery of nitrite and nitrate were 85 – 99% and 82 – 100%, respectively.  The  range  of  nitrite  and  nitrate  concentration  were  0.60  –  14.79  mg/kg  dan  0.68  –  8.39  mg/kg, respectively. These  results  inform  that  the  nitrite  and  nitrate  present  in  the  sample  originate  from  exogenous  and endogenous processes.
Keywords : nitrite, nitrate, validation, UV-Vis spectrophotometry ed

## PENDAHULUAN
Zat pengawet yang berasal dari garam nitrit dan nitrat berguna untuk menstabilkan warna merah daging, mencegah pembusukan, menghambat beberapa pertumbuhan  mikroorganisme  anaerobik  dan  dapat berkontribusi terhadap cita rasa produk (Mazumdar, et al.,  2022).  Garam  nitrit  dan  nitrat  yang  digunakan sebagai  zat  pengawet  makanan  yaitu  natrium/kalium nitrit  (NaNO 2 /KNO 2 )  dan  natrium/kalium  nitrat (NaNO 3 /KNO 3 ). Konsumsi makanan yang mengandung  nitrit  dan  nitrat  dalam  konsentrasi  yang melebihi ambang batas dapat membahayakan kesehatan  manusia  karena  nitrit  dan  nitrat  dapat membentuk senyawa N-nitrosamin yang bersifat toksik di  dalam  tubuh.  Oleh  karena  itu,  perlu  adanya monitoring  dan  kontrol  terhadap  nitrit  dan  nitrat  di dalam  makanan.  Berdasarkan  permenkes  Republik Indonesia  nomor  1168/menkes/per/X/1999, penggunaan nitrit  dan  nitrat  pada  produk  daging  olahan  yang diizinkan masing-masing dengan batas maksimum 125 mg/kg  dan  500  mg/kg  (Nur  &  Suryani,  2012). The Joint  Expert  Committee  on  Food  Additives (JECFA) telah  menentapkan  asupan  harian  makanan  atau acceptable  daily  intake (ADI)  untuk  nitrit  dan  nitrat masing-masing 0 – 0,07 mg/kg berat badan dan 0 – 3,7 mg/kg berat badan (Mazumdar, et al., 2022).
Metode analisis kuantitatif  nitrit dan  nitrat yang telah  dilakukan  meliputi  metode  sensor  polimer kolorimetri  (Garcia,  et  al.,  2022),  sensor  elektrokimia berdasarkan  nanopartikel  (Dorovskikh,  et  al.,  2022), kromatografi  ion  kapiler  (D'Amore,  et  al.,  2019), diffused  reflectance  ultraviolet (DRUV)  (Luiz,  et  al., 2012) , elektroforesis  kapiler  (Ming  &  Zhen,  2018), voltametri  siklik  (Thomas,  et  al.,  2012),  kromatografi cair  kinerja  tinggi  (KCKT)  (Tahboub,  2008)  dan (Iammarino, et al., 2013) dan spektrofotometri UV-Vis (Nagaraj,  et  al.,  2008),  (Merino,  2009)  dan (Malingappa & Yarradoddappa, 2011) . Metode KCKT, elektroforesis  kapiler  dan  voltametri  siklik  cukup sensitif,  namun  metode tersebut  memiliki  keterbatasan seperti  sulit,  memerlukan  waktu  yang  cukup  lama  dan peralatan yang canggih serta mahal. Metode spektrofotometri  UV-Vis  memiliki  keunggulan  yaitu sensitif terhadap analit dalam konsentrasi kecil ( trace ), selektif, cepat, reagen murah, non karsinogenik, mudah larut  dalam  air,  reliabel  dan  reprodusibel  (Malingappa & Yarradoddappa, 2011) .
Dalam penelitian ini dilakukan analisis nitrit dan nitrat  dalam  daging  segar  dan  produk  daging  olahan secara  spektrofotometri  UV-Vis  menggunakan  reagen sulfanilamida  yang  kemudian  dikopling  dengan  N- naftiletilendiamin  (NEDA)  membentuk  senyawa  azo yang  berwarna  merah  ungu.  Metode  spektrofotometri UV-Vis  belum  pernah  diaplikasikan  untuk  analisis nitrit dan nitrat pada sampel daging segar. Keberadaan nitrit  dan  nitrat  tidak  hanya  berasal  dari  bahan tambahan  pangan  tetapi  juga  dapat  berasal  dari  proses degradasi  protein  dalam  daging  segar.  Faktor-faktor
yang  dapat  menyebabkan  terjadinya  degradasi  protein meliputi  penyimpanan,  proses  pemanasan  pada  suhu tinggi  dan  aktifitas  mikroba  (Mazumdar,  et  al.,  2022) . Nitrat  tidak  bereaksi  dengan  reagen  kromogenik tersebut  sehingga  analisis  nitrat  dilakukan  dengan mereduksi  nitrat  menjadi  nitrit  menggunakan  serbuk seng  (Zn).  Sebelum  proses  reduksi  nitrat,  nitrit  yang terdapat  didalam  ekstrak  terlebih  dahulu  direaksikan dengan  sulfanilamid  dan  NEDA  untuk  membentuk senyawa azo. Cara tersebut dilakukan untuk menghindari  kompetisi  reduksi  antara  nitrit  dan  nitrat. Penggunaan  serbuk  Zn  lebih  aman,  mudah  diperoleh dan murah (Merino, 2009)
Metode  analisis  nitrit  dan  nitrat  secara spektrofotometri  UV-Vis  yang  akan  digunakan  dalam penelitian  ini  perlu  dioptimasi  untuk  mendapatkan kondisi  optimum  selama  proses  analisis.  Metode  yang telah dioptimasi selanjutnya divalidasi dengan menggunakan  pendekatan spiking buta  nol  ( zero  blind spiking  method )  berdasarkan  parameter  validasi  yang meliputi  linieritas,  sensitivitas,  batas  deteksi,  batas kuantifikasi, ketelitian (presisi) dan ketepatan (akurasi) yang  dinyatakan  sebagai  persen  perolehan  kembali (Khanage,  et  al.,  2013).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengaplikasikan  metode  yang  telah  dioptimasi  dan divalidasi  untuk  analisis  nitrit  dan  nitrat  secara spektrofotometri  UV-Vis  dalam  daging  segar  dan berbagai produk daging olahan.

## PROSEDUR PENELITIAN

## Alat dan bahan penelitian
Daging  sapi  segar,  produk  daging  olahan berbagai jenis dan merk (sosis, kornet, sosis curah dan daging  asap),  air  deionisasi,  natrium  nitrit  (NaNO 2 ), kalium nitrat (KNO 3 ), sulfanilamida, N- naftiletilendiamina dihidroklorida (NEDA.2HCl), buffer  amonia  pH  9,  buffer  asetat  pH  6,  serbuk  Zn, asam  klorida  (HCl)  37%, kalium  heksasianoferat(II) (K 4 [Fe(CN) 6 ].3H 2 O), seng asetat (Zn(CH 3 COO) 2 .2H 2 O).  Semua  bahan  kimia  yang digunakan  berstandar analytical  grade dan  diproduksi oleh Merck .  spektrofotometer  UV-Vis  (GBC  Cintra 2020 V4131).
Preparasi  sampel  daging  segar  dan  produk  daging olahan
Sebanyak  50  g  daging  segar  dan  produk daging olahan dengan berbagai jenis dan merk masing- masing ditambahkan 50  mL air deionisasi  hangat (50- 60 o C) dan dihomogenisasikan selama 5  menit dengan blender. Khusus untuk sampel daging segar, campuran ditempatkan pada waterbath yang mempunyai suhu 70 o C  selama  5  menit.  Campuran  kemudian  masing- masing  ditambahkan  4  mL  larutan  K 4 [Fe(CN) 6 ].3H 2 O 0,25  mol  L -1 dan  Zn(CH 3 COO) 2 1,00  mol  L -1 . Campuran  diaduk  kemudian  disentrifugasi  selama  10 menit  pada  4000  rpm  pada  suhu  kamar.  Supernatan disaring  dengan  kertas  saring Whatman No.42. Volume  campuran  diencerkan  sampai  100  mL  dengan air deionisasi.
Analisis  nitrit  dalam  daging  segar  dan  produk daging olahan

## Pembuatan kurva standar nitrit
Larutan  kerja  nitrit  100  mg/L  dipipet  sebanyak 0,5;  1;  2;  3  dan  4  mL.  Masing-masing  larutan diencerkan  sampai  100  mL.  Sejumlah  20  mL  alikuot dengan  berbagai  konsentrasi  ditambahkan  2  mL larutan sulfanilamida 1% dan 10 mL buffer amonia pH 9.  Campuran  dibiarkan  selama  5  menit  pada  suhu kamar.  Selanjutnya  ditambahkan  2  mL  larutan  NEDA 0,1% dan diencerkan sampai  batas volume. Campuran dibiarkan  selama  30  menit    di  tempat  yang  gelap kemudian  diukur  absorbansinya  pada  541  nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

## Penentuan  konsentrasi  nitrit  dalam  daging  segar dan  produk daging olahan
Sejumlah  20  mL  sampel  daging  segar  dan produk daging olahan  masing-masing ditambahkan 10 mL  buffer  amonia  pH  9  dan  2  mL  larutan sulfanilamida 1%. Campuran dibiarkan selama 5 menit pada  suhu  kamar.  Selanjutnya  ditambahkan  2  mL larutan  NEDA  0,1%  dan  diencerkan  sampai  100  mL.
Campuran  dibiarkan  selama  30  menit  di  tempat  yang gelap kemudian diukur absorbansinya pada 541 nm.
Analisis  nitrat  dalam  daging  segar  dan  produk daging olahan
Penentuan  konsentrasi  nitrat  dalam  daging  segar dan produk daging olahan
Sejumlah  20  mL  sampel  daging  segar  dan produk  daging  olahan  masing-masing  Erlenmeyer ditambahkan  2  mL  larutan  sulfanilamida  1%. Campuran dibiarkan selama 5 menit pada suhu kamar. Selanjutnya  ditambahkan  2  mL  larutan  NEDA  0,1%. Untuk  mereduksi  nitrat  menjadi  nitrit,  campuran tersebut  ditambah  10  mL  buffer  asetat  pH  6  dan  100 mg  serbuk  Zn.  Campuran  dikocok  selama  5  menit dengan  menggunakan shaker .  Hasil  pengocokan disentrifugasi  selama  10  menit  pada  4000  rpm. Supernatan  yang diperoleh ditambahkan 10  mL  buffer amonia  pH  9  dan  diencerkan  sampai  100  mL. Campuran  dibiarkan  selama  30  menit  di  tempat  yang gelap  kemudian  diukur  absorbansinya  pada  541  nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ion nitrit yang terdapat dalam sampel direaksikan  dengan  sulfanilamida  yang  mengandung gugus amino (–NH 2 ) berupa amina primer yang dalam suasana asam dapat membentuk ion benzenadiazonium kemudian  ion  tersebut  dikopling  dengan  agen pengkopling  NEDA  membentuk  senyawa  azo  yang berwarna merah ungu. Mekanisme reaksi pembentukan senyawa  azo  dapat  ditunjukkan  pada  gambar  1.  Hasil pengukuran  diperoleh  absorbansi  optimum  dari senyawa  azo  pada  panjang  gelombang  optimum  541 nm.  Spektra  absorpsi  senyawa  azo  yang  terbentuk ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2. Spektra absorpsi senyawa azo

## Kondisi optimum pembentukan senyawa azo
Diazotasi  melibatkan  reaksi  antara  larutan  nitrit dengan  sulfanilamida  dalam  kondisi  asam  membentuk ion  benzenadiazonium.  Optimasi  dilakukan  dengan variasi  waktu  diazotasi  (0,5  –  20  menit).  Waktu optimum  yang  diperlukan  untuk  reaksi  diazotasi sebelum penambahan reagen NEDA yaitu 5 menit.
Pengukuran  waktu  kestabilan  senyawa  azo dilakukan  pada  rentang  waktu  10  –  140  menit  dengan interval 10 menit. Kestabilan senyawa azo terjadi  pada rentang waktu antara 30-80 menit setelah penambahan reagen  NEDA.  Pengukuran  lebih  lanjut  pada  waktu lebih  dari  80  menit  terjadi  penurunan  absorbansi larutan. Hal  ini disebabkan  ada kemungkinan senyawa azo  tersebut  mengalami  dekomposisi  atau  terurai sehingga  intensitas  warnanya  menurun  akibatnya absorbansi  juga  menurun  (Rohman  &  Gandjar,  2007). Oleh  karena  itu,  pengukuran  senyawa  azo  tersebut harus  dilakukan  pada  rentang  waktu  antara  30  –  80 menit setelah penambahan reagen NEDA.
Optimasi  pengaruh  pH  dilakukan  dengan mereaksikan  larutan  standar  nitrit  0,40  mg/L  dengan larutan  sulfanilamid  1%,  larutan  buffer  dengan  variasi pH 5 (buffer asetat), pH 7 (buffer fosfat), pH 9 dan pH 11 (buffer amonia) kemudian dikopling dengan larutan larutan  NEDA  0,1%.  Pada  medium  asam  gugus  azo sangat  mudah  mengalami  protonasi  sedangkan  pada medium  basa  gugus  azo  tidak  mengalami  protonasi. Penggunaan larutanbuffer pH 9 memberikan absorbansi optimum dalam analisis nitrit dan nitrat.
Larutan  standar  nitrit  0,1;  0,2;  0,4;  0,6  dan  0,8 mg/L  direaksikan  dengan  larutan  sulfanilamida  1%, buffer  amonia  pH  9  dan  larutan  NEDA  pada konsentrasi  0,1;  0,3;  0,5  dan  1,0%.  Linieritas  yang paling  baik  (memiliki  koefisien  korelasi  paling  tinggi) dihasilkan dari pengujian dengan menggunakan NEDA 0,1%  sehingga  larutan  NEDA  0,1%  digunakan  dalam analisis nitrit dan nitrat.
Rasio  mol  dioptimasi  dengan  memvariasikan volume  larutan  sulfanilamid  1%  dan  NEDA  0,1% masing-masing  dimulai  dari  0,5  –  3,5  mL  dengan volume  total  untuk  kedua  reagen  tersebut  berjumlah  4 mL. Absorbansi optimum terjadi pada fraksi rasio mol ion  benzenadiazonium  terhadap  NEDA  sebesar  0,5 (Gambar  3).  Volume  yang  digunakan  yaitu  memiliki rasio  1  :  1  dengan  penggunaan  masing-masing  2  mL larutan sulfanilamida dan NEDA. Konstanta kestabilan senyawa (K f ) yang diperoleh sebesar 8,1 × 10 13 L mol - 1 .  Reaksi  melibatkan  reaksi  substitusi  elektrofilik aromatik  antara  ion  benzenadiazonium  dengan  NEDA pada  posisi  para  membentuk  senyawa  azo  melalui penggabungan  (kopling)  diazo  (Gambar  1).  Dari mekanisme  reaksi  tersebut  dapat  diketahui  bahwa senyawa azo terbentuk pada rasio mol 1 : 1 yaitu dari 1 mol ion benzenadiazonium dengan 1 mol NEDA.
Larutan standar nitrat 10 mg/L direduksi dengan serbuk  Zn  pada  variasi  pH  4;  5;  6;  6,5;  7  dan  7,5  dan waktu  reaksi  selama  5  menit.  Nitrit  yang  terbentuk direaksikan  dengan  larutan  sulfanilamida  1%,  buffer amonia  pH  9  dan  larutan  NEDA  0,1%.  Absorbansi optimum  terjadi  pada  penggunaan  buffer  pH  6  karena reduksi  nitrat  dengan  menggunakan  serbuk  Zn  yang dilakukan  pada  pH  6  tidak  membentuk  gas  NO (persamaan 1)
Larutan standar nitrat 10 mg/L direduksi dengan serbuk  Zn  pada  pH  6  selama  variasi  waktu reaksi  0,5; 1;  1,5;  2;  3;  5;  10;  15  dan  30  menit.  Waktu  reaksi optimum  yang  diperlukan  untuk  mereduksi  nitrat menjadi  nitrit  yaitu  dari  3  –  5  menit.  Pada  kondisi waktu  reaksi  tersebut,  tidak  terjadi  kenaikan  maupun penurunan  absorbansi  yang  signifikan.  Hal  ini disebabkan  ion  nitrit  yang  terbentuk  tidak  mengalami perubahan  menjadi  gas  NO  akibat  proses  reduksi lanjutan. Namun semakin lama waktu reaksi yaitu dari 10  –  30  menit  terjadi  penurunan  absorbansi.  Hal  ini disebabkan  semakin  lama  ion  nitrat  bereaksi  dengan serbuk  Zn  maka  ada  kecenderungan  ion  nitrit  yang terbentuk  dari  hasil  reduksi  nitrat  mengalami  reduksi lanjutan  membentuk  gas  NO  karena  serbuk  Zn memiliki  permukaan  yang  baik  untuk  terjadinya transfer  elektron  di  dalam  fase  larutan  (Woollard  & Indyk, 2014) sesuai dengan persamaan 2.
Pengaruh  massa  reduktor  serbuk  Zn  :  20  mL larutan  standar  nitrat  10  mg/L  direduksi  dengan menggunakan variasi massa serbuk Zn yaitu 10, 25, 50, 75,  100,  125  dan  150  mg  pada  pH  6  dengan  waktu reaksi  5  menit.  Absorbansi  optimum  terjadi  pada penggunaan  100  mg  serbuk  Zn.  Hal  ini  disebabkan seiring  dengan  bertambahnya  massa  serbuk  Zn  maka kemampuan serbuk Zn untuk mereduksi nitrat menjadi nitrit  semakin  besar.  Bertambahnya  konsentrasi  nitrit
541 nm; 0,50718 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 350 450 550 650 750 Ab so rb an si (A)
Panjang Gelombang (nm)
hasil  reduksi  akan  meningkatkan  konsentrasi  senyawa azo yang terbentuk. Terjadi penurunan absorbansi pada penggunaan  serbuk  Zn  pada  massa  lebih  dari  100  mg. Hal  ini  disebabkan  sisa  serbuk  Zn  yang  tidak  terlibat selama  proses  reduksi  nitrat  menjadi  nitrit  dapat mereduksi asam nitrit yang terbentuk dari hasil reduksi nitrat  membentuk  gas  NO  sebagaimana  ditunjukkan
persamaan reaksi 2. Terbentuknya gas NO menyebabkan berkurangnya konsentrasi nitrit di dalam larutan  sehingga  konsentrasi  senyawa  azo  yang terbentuk  juga  mengalami  penurunan.  Reduksi  nitrat menjadi  nitrit  yang  dilakukan  pada  kondisi  optimum akan  mencegah  pembentukan  gas  NO  yang  dapat menurunkan nilai absorbansi (Persamaan 2)
Oksidasi : Zn (s) → Zn 2+ (aq) +  2e E o = -0,762 V Reduksi : NO 3 - (aq) +  3H + (aq) +  2e → HNO 2(aq) +  H 2 O (l) E o = +0,940 V
Zn (s) + NO 3 - (aq) + 3H + (aq) → Zn 2+ (aq) + HNO 2(aq) + H 2 O (l) E o = +0,178 V…. (1)
Oksidasi : Zn (s) → Zn 2+ (aq) +  2e
E o = -0,762 V Reduksi : 2HNO 2(aq) +  2H + (aq) +  2e → 2NO (g) +  2H 2 O (l) E o = +0,984 V
Zn (s) + 2HNO 2(aq) + 2H + (aq) → Zn 2+ (aq) + 2NO (g) +2H 2 O (l) E o = +0,222 V…. (2)

## Validasi Metode Analisis

## Linieritas
Absorbansi  larutan  standar  nitrit  0,1;  0,2;  0,4; 0,6 dan 0,8 mg/L diukur dan dibuat sebanyak 3 ulangan pada hari  yang  berbeda ( interday ). Setelah  memproses data pengukuran (Tabel 1)  melalui perhitungan regresi kurva standar  nitrit (Gambar  4) diperoleh dengan nilai slope ,  intersep,  koefisien  korelasi  (R 2 )  dan  parameter optikal  lainnya  dirangkum  dalam  Tabel  2.  Persamaan regresi  linear  yang  diperoleh  dapat  digunakan  untuk menentukan konsentrasi nitrit yang berasal dari reduksi standar nitrat (Tabel 3).

## Batas deteksi dan batas kuantifikasi
Batas  deteksi  dan  batas  kuantifikasi  ditentukan dengan pendekatan  yang didasarkan pada  nilai standar deviasi  intersep  dan slope persamaan  regresi  linier. Berdasarkan  hasil  perhitungan  diperoleh  nilai  batas deteksi  dan  batas  kuantifikasi  masing-masing  sebesar 0,021 mg/L dan 0,063 mg/L.

## Ketelitian

## Analisis nitrit
Ketelitian  ditentukan  berdasarkan  parameter keterulangan (repeatability) dan presisi antara menggunakan  standar  nitrit  dengan  konsentrasi terendah,  menengah dan tertinggi dalam rentang kurva standar.  Konsentrasi  nitrit  terendah,  menengah  dan tertinggi  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  masing masing 0,1; 0,4 dan 0,8 mg/L. Keterulangan ditetapkan selama  3  kali  pengulangan  dalam  hari  yang  sama ( intraday ) sedangkan presisi antara ditetapkan selama 3 kali pengulangan dalam 3 hari yang berbeda ( interday ). Hasil  perhitungan  menunjukkan  rata-rata  %RSD  atau koefisien  variasi  untuk  presisi intraday dan  presisi interday masing-masing sebesar 0,69% dan 0,42%.

## Analisis nitrat
Konsentrasi  nitrat  terendah,  menengah  dan tertinggi  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  masing masing  2;  10  dan  20  mg/L.  Hasil  perhitungan menunjukkan  bahwa  analisis  presisi intraday dan interday pada  konsentrasi  standar  nitrat  10  dan  20 mg/L  memiliki  ketelitian  yang  tinggi  dan  baik  karena menghasilkan  nilai  %RSD  yang  kurang  dari  2%. Namun  analisis  presisi intraday dan interday pada konsentrasi  standar  nitrat  2  mg/L  memiliki  ketelitian yang tidak baik. Hal ini disebabkan absorbansi rata-rata nitrit  yang  dihasilkan  dari  reduksi  nitrat  menghasilkan konsentrasi  nitrat  yang  berada  dibawah  nilai  batas kuantifikasi yaitu 0,063 mg/L.

## Ketepatan
Ketepatan  dalam  metode  ini  ditentukan  sebagai persentase  perolehan  kembali.  Untuk  analisis  nitrit, larutan  sampel  ditambah  dengan  larutan  standar internal  nitrit  0,3;  0,5  dan  0,7  mg/L  sedangkan  untuk analisis nitrat, sampel ditambah dengan larutan standar internal  nitrat  2,  5  dan  10  mg/L.  Hasil  yang  diperoleh menunjukkan  persentase  perolehan  kembali  nitrit  dan nitrat  dalam  daging  segar  dan  produk  daging  olahan masing-masing  antara  85  –  99%  dan  82  –  100% (Gambar  5  dan  6).  Nilai  persentase  perolehan  kembali yang termasuk dalam rentang akurasi juga mengindikasikan  bahwa  komposisi  matriks  (daging segar dan produk daging olahan) tidak menginterferensi  secara signifikan dalam analisis  nitrit dan nitrat (Luiz, et al., 2012).
+ +

## Tabel 1. Metode linieritas
Konsentrasi nitrit (mg/L)
Absorbansi , λ maks = 541 nm Rata-rata Hari I Hari II Hari III 0,1 0,1311 0,1337 0,1349 0,1332 0,2 0,2332 0,2375 0,2395 0,2367 0,4 0,4799 0,4805 0,4795 0,4799 0,6 0,7141 0,7163 0,7140 0,7148 0,8 0,9323 0,9359 0,9335 0,9339
Tabel 2. Parameter optikal penentuan nitrit dan nitrat dengan sulfanilamida + NEDA
Parameter Karakteristik Warna Merah ungu λ max (nm) 541 Stabilitas (menit) 30 – 80 Konstanta Kestabilan (K f ) (L mol -1 ) 8,1 × 10 13 Rentang hukum Beer (mg/L) 0,1 – 0,8 Absorptivitas molar (L mol -1 cm -1 ) 5,37 x 10 4 LOD (mg/L) 0,021 LOQ (mg/L) 0,069 RSD analisis nitrit dan nitrat (%) 0,56 dan 1,73 Persentase recovery nitrit dan nitrat (%) 85 – 99 dan 82 – 100
Persamaan regresi
Koefisien korelasi (R 2 ) Slope Intersep 0,9995 1,1667
0,0081
Gambar 3. Hubungan fraksi rasio mol antara ion benzenadiazonium dengan NEDA terhadap absorbansi senyawa azo 0,5; 0,5064 0,49 0,492 0,494 0,496 0,498 0,5 0,502 0,504 0,506 0,508 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 Ab so rb an si
Gambar 4. Kurva standar nitrit
Tabel 3. Data hasil penentuan konsentrasi nitrit hasil reduksi standar nitrat
[NO 3 - ] standar (mg/L), V= 20 mL Absorbansi , λ maks = 541 nm Rata- rata [NO 2 - ] (mg/L) hasil reduksi, V= 100 mL [NO 3 - ] (mg/L) yang tereduksi, V= 100 mL Hari I Hari II Hari III 2 0,0613 0,0640 0,0605 0,0621 0,0463 0,0463 5 0,2887 0,2447 0,2653 0,2662 0,2212 0,2212 10 0,5559 0,5431 0,5467 0,5486 0,4633 0,4633 15 0,8646 0,8446 0,8590 0,8561 0,7268 0,7268 20 * 0,5087 0,5099 0,5108 0,5098 0,4300 0,4300 0,8600 0,8600 [NO 2 - ]  hasil reduksi = [NO 3 - ]  yang tereduksi
(5) [NO 3 - ] yang tereduksi =  0,4300 mg/L x fp(100/50) = 0,8600 mg/L
Keterangan : fp  = faktor pengenceran (dalam metode faktor pengenceran = 2) *  = dianalisis dengan proses pengenceran

## Aplikasi
Metode  yang  sudah  dioptimasi  dan  divalidasi  dapat diaplikasikan  untuk  analisis  nitrit  dan  nitrat  yang terdapat dalam daging segar dan produk daging olahan. Saat  proses  reduksi  berlangsung,  spesies  asam  nitrit yang  terbentuk  dari  nitrit  dengan  asam  akan  lebih mudah  mengalami  reduksi  dari  pada  spesies  nitrat. Kemudahan  suatu  spesies  untuk tereduksi  berdasarkan nilai  potensial  reduksi  standar,  dimana  nilai  potensial reduksi standar spesies asam nitrit lebih besar dari pada nilai  potensial  reduksi  standar  nitrat.  Grafik  kompetisi reduksi  antara  nitrit  dan  nitrat  di  dalam  sampel
ditunjukkan  pada  Gambar  7.  Untuk  menghindari kompetisi  reduksi  antara  nitrit  dan  nitrat,  maka  nitrit yang terdapat dalam ekstrak sampel tersebut direaksikan  dengan  larutan  sulfanilamida  1%  dan dikopling  dengan  larutan  NEDA  0,1%  membentuk senyawa  azo.  Sama  seperti  analisis  nitrit,  nitrat  yang terkandung  di  dalam  ekstrak  sampel  tidak  bereaksi dengan  larutan  sulfanilamida  1%  dan  NEDA  0,1% sehingga  nitrat  direduksi  menjadi  nitrit  dengan menggunakan serbuk Zn pada pH 6 dalam waktu reaksi 5 menit serta ditambahkan buffer amonia pH 9.
y = 1,1563x + 0,0141 R² = 0,9996 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Ab so rb an si [NO2 -] (mg/L)
Gambar 5. Persentase perolehan kembali nitrit dalam daging segar dan produk daging olahan
Gambar 6. Persentase perolehan kembali nitrat dalam daging segar dan produk daging olahan
Gambar 8 menunjukkan bahwa konsentrasi nitrit dan  nitrat  yang  terdapat  dalam  sampel  untuk  setiap jenis  (daging  segar,  sosis,  daging  asap  dan  kornet) masing-masing  berada  pada  rentang  0,60  –  14,79 mg/kg  dan  0,68  –  8,39  mg/kg.  Konsentrasi  nitrit  yang terbesar  dan  terkecil  masing-masing  terdapat  dalam
sampel  sosis  sapi  1  (14,79  mg/kg)  dan  sosis  curah  2 (0,60  mg/kg)  sedangkan  konsentrasi  nitrat  yang terbesar  dan  terkecil  masing-masing  terdapat  dalam sampel  kornet  (8,39  mg/kg)  dan  daging  segar  (0,68 mg/kg).
75% 80% 85% 90% 95% 100% Daging segar Kornet Sosis curah 2 Sosis sapi 3 Sosis Sapi 2 Sosis sapi 1 Daging asap Sosis curah 1 94% 89% 87% 92% 98% 87% 93% 92% 96% 96% 92% 85% 99% 96% 92% 94% 91% 91% 85% 97% 86% 85% 85% 95% % Perolehan Kembali Sampel + standar nitrit 0,7 mg/L Sampel + standar nitrit 0,5 mg/L
Sampel + standar nitrit 0,3 mg/L
0% 20% 40% 60% 80% 100% Daging segar Kornet Sosis curah 2 Sosis sapi 3 Sosis Sapi 2 Sosis sapi 1 Daging asap Sosis curah 1 90% 82% 89% 100% 99% 99% 86% 91% 83% 87% 86% 99% 98% 99% 87% 91% 83% 87% 93% 99% 93% 94% 94% 93% % Perolehan Kembali Jen is Samp el Sampel + standar nitrat 10 mg/L Sampel + standar nitrat 5 mg/L
Sampel + standar nitrat 2 mg/L
Gambar 7. Kompetisi reduksi antara nitrit dan nitrat di dalam sampel
Gambar 8. Kadar nitrit dan nitrat dalam daging segar serta produk daging olahan
Sampel daging segar yang telah dianalisis menunjukkan  adanya  nitrat  dengan  konsentrasi  0,68 mg/kg  sedangkan  nitrit  tidak  terdeteksi.  Hasil  analisis tersebut  sama  dengan  hasil  analisis  nitrit  dan  nitrat yang  telah  dilakukan  Iammarino  dan  Taranto  (2012), dimana  hasil  analisis  nitrit  dan  nitrat  menggunakan kromatografi  ion  yang  dilakukan  pada  200  sampel daging  segar  diperoleh  konsentrasi  nitrat  dari  10,2 sampai  36,5  mg/kg  sedangkan  nitrit  tidak  terdeteksi. Terbentuknya  nitrat  pada  sampel  daging  segar disebabkan  oleh  degradasi  protein  dalam  daging  yang meliputi  paparan  udara  dan  aktifitas  mikroba.  Reaksi degradasi  protein  dalam  daging  terjadi  melalui  2 tahapan  yaitu  pembentukan  oksida  nitrit  dan  oksidasi oksida  nitrit.  Reaksi  yang  terjadi  dapat  ditunjukkan pada persamaaan reaksi 3 (Merino, 2009).
(1) L-arginin + O 2 L-citrulin + NO
(2) NO  +  Hb 2+ O 2 NO 3 - +    Hb 3+
….( 3 )
Hasil  analisis  nitrit  dan  nitrat  terhadap  semua  sampel menunjukkan  nilai  konsentrasi  nitrit  dan  nitrat  berada dibawah  batas  maksimum  yang  diijinkan  pemerintah yaitu  125  mg/kg  untuk  nitrit  dan  500  mg/kg  untuk nitrat.

## KESIMPULAN
Analisis  nitrit  secara  spektrofotometri  UV-Vis dengan  menggunakan  sulfanilamida  sebagai  sumber amina  dan  NEDA  sebagai  agen  pengkopling  dapat membentuk  senyawa  azo.  Hasil  validasi  metode analisis  nitrit  dan  nitrat  secara  spektrofotometri  UV- Vis  dengan  pendekatan spiking buta  nol  ( zero  blind spiking  method )  memberikan  nilai  linieritas  (R 2 = 0,9995),  sensitivitas  (ε  =  5,37  x  10 4 L  mol -1 cm -1 ), batas  deteksi  (LOD  =  0,021  mg/L),  batas  kuantifikasi (LOQ  =  0,063  mg/L),  ketelitian  (rata-rata  %RSD analisis  nitrit  dan  nitrat  masing-masing  sebesar  0,56 dan  1,73%)  dan  persentase  perolehan  kembali  analisis nitrit dan nitrat masing-masing antara 85 – 99% dan 82
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Sampel tanpa
reduksi Sampel + reduksi tanpa standar nitrat Sampel + reduksi + standar nitrat 2 mg/L Sampel + reduksi + standar nitrat 5 mg/L Sampel + reduksi + standar nitrat 10 mg/L 0,8708
0,5924 0,6174 0,7599 0,7842 0,5599 0,3281 0,3452
0,4384 0,501 Ab so rb an si Sosis sapi 1 Sosis sapi 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Sosis Curah 1 Sosis Curah 2 Sosis Sapi 1 Sosis Sapi 2 Sosis Sapi 3 Daging Asap Kornet Daging Segar 3,08 0,6 14,79 9,46 11,64 3,92 0 0 1,86 8,06 0 0 0 3,25 8,39 0,68 Ko n sen tr as i n it ri t d an n it rat (mg /k g) Jenis Sampel Konsentrasi Nitrit Konsentrasi Nitrat
–  100%.  Konsentrasi  nitrit  dan  nitrat  yang  terdapat dalam sampel untuk setiap jenis (sosis, daging asap dan kornet) berada pada rentang 0,60 – 14,79 mg/kg  untuk nitrit dan 0,68 – 8,39 mg/kg untuk nitrat.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  Direktorat  Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) melalui program Beasiswa Unggulan yang telah mendanai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
D'Amore,  T.  et  al.,  2019.  Development  and  validation of  an  analytical  method  for  nitrite  and  nitrate determination  in  meat  products  by  capillary  ion chromatography  (CIC). Food  Analytical  Methods, Volume 12, pp. 1813-1822.
Dorovskikh, S. I., Klyamer, D. D., Fedorenko, A. D. & Morozova,  N.  B.,  2022.  Electrochemical  sensor based  on  iron  (III)  phthalocyanine  and  gold nanoparticles for nitrite detection in meta products. Sensors, 22(15), p. 5780.
Garcia,  M.  G.  et  al.,  2022.  Easy  nitrite  analysis  of processed  meat  with  colorimetric  polymer  sensor and  a  smartphone  app. Applied  Materials  & Interfaces, Volume 14, pp. 37051-37058. Iammarino,  M.,  Taranto,  A.  D.  &  Cristino,  M.,  2013. Endogenous  levels  of  nitrites  and  nitrates  in  wide consumption  foodstuff  :  Results  of  five  years  of official  controls  and  monitoring. Food  Chem, Volume 140, pp. 763-771.
Khanage,  S.  G.,  Mohite,  P.  B.  &  Jadhav,  S.,  2013. Development  and  validation  of  UV-Visible spectrophotometric  method  for  simultaneous determination  of  eperisone  and  paracetamol  in solid dosage form. Adv Pharm Bull, 3(2), pp. 447- 451.
Luiz,  V.  H.  M.,  Pezza,  L.  &  Pezza,  H.  R.,  2012. Determination  of  nitrite  in  meat  products  and water  using  dapsone  with  combined  spot test/diffuse reflectance on filter paper. Food Chem, 134(4), pp. 2546-2551.
Malingappa, P. & Yarradoddappa, V.,  2011. Quantification  of  nitrite/nitrate  in  food  stuff samples  using  2-aminobenzoic  acid  as  a  new amine  in  diazocoupling  reaction. Food  Analytical Methods, 4(1), pp. 90-99.
Mazumdar, R. et al., 2022. Simultaneous determination of  nitrite  and  nitrate  in  meat  and  meat  products using  ion  -exchange  chromatography. Food Research, 6(3), pp. 145-152.
Merino,  L.,  2009.  Development  and  validation  of  a method for determination of residual nitrite/nitrate in  foodstuff  and  water  after  zinc  reduction. Food Analytical Method, Volume 2, pp. 212-220.
Ming,  L.  X.  &  Zhen,  M.  L.,  2018.  Simultaneous determination  of  nitrate  and  nitrite  in  vegetables and  meat  products  by  high  performance  capillary electrophoresis. Food  science, 39(12),  pp.  301- 307.
Nagaraj, P., Prakash, J. S., Shivakumar, A. & Shrestha, A. K., 2008. Sensitive spectrophotometric methods for  the  assessment  of  nitrite  in  water  sample. Environmental Monitoring and Assesment, Volume 147, pp. 235-241.
Nur,  H.  H.  &  Suryani,  D.,  2012.  Analisis  kandungan nitrit  dalam  sosis  pada  distributor  sosis  di  kota Yogyakarta tahun 2011. Kesmas UAD, Volume 6, pp. 1-74.
Rohman,  A.  &  Gandjar,  I.  G.,  2007. Kimia  Analisis Farmasi. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Tahboub,  Y.  R.,  2008.  Determination  of  nitrite  and nitrate  in  cell  culture  medium  by  reversed-phase high-performance  liquid  chromatography  with simultaneous  UV-VIS  and  fluorescence  detection. Jordan Journal of Chemistry, 3(1), pp. 69-75. Thomas,  D.  et  al.,  2012.  Sensitive  determination  of nitrite  in  food  samples  using  voltammetric techniques. Food  Analytical  Methods, Volume  5, pp. 752-758.
Woollard,  D.  C.  &  Indyk,  H.  E.,  2014.  Colorimetric determination  of  nitrate  and  nitrite  in  milk  and milk  powders  –  use  of  vanadium  (III)  reduction. International Dairy Journal, 35(1), pp. 88-94.