ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 12 (1) (2009) : 7 – 13
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Penentuan Konsentrasi Optimum Oat Spelts Xylan pada Produksi Xilanase pari Aspergillus niger dalam Media PDB ( Potato Dextrose Broth )
Nies Suci Mulyani a* , Muhammad Asy’ari a , Heru Prasetiyoningsih a
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: niessuci@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o

## A b s t r a c t
Keywords:
Aspergillus niger , Xilanase, Oat Splet Xylan The  xylanase  enzyme  can  hydrolyze  xylan  into  xylose  which  can  be  utilized  for  the manufacture of xylose sugar. The xylanase enzyme can be isolated from Aspergillus niger and  the  increased  production  of  xylanase  requires  an  inducer  of  oat  spelts  xylan.  This study  aim  was  to  determine  optimum  concentration  of  oat  spelts  xylan  on  xylanase production  and  character  of  xylanase  isolation  result.  Production  of  xylanase  on  PDB (Potato Dextrose Broth) medium with addition of oat spelts xylan concentration variation of  0.0%;  0.8%;  1.0%;  1.2%  and  1.4%  to  determine  the  optimum  concentration  of  oat spelled  xylan.  Furthermore,  xylanase  production  with  optimum  concentration  of  oat spelts  xylan  was  conducted  in  which  xylanase  was  purified by  fractionation  method  of ammonium  sulfate  stratified  and  dialysis  and  activity  test  using  DNS  method  and  the protein  content  was  tested  by  using  Lowry  method.  The  characterization  of  xylanase enzyme  was  including  temperature,  pH  and  incubation  time.  It  was  obtained  that  the optimum concentration of oat spelts xylan was 1,2%, the xylanase enzyme activity was 469,49 unit/mg protein. The highest activity of the isolated xylanase enzyme in F5 was 10280,840 unit/mg protein and worked optimally at 40 ° C, pH 4,5, incubation time 28 min and specific activity at optimum condition was 11829,159 units/mg protrein

## A b s t r a k
Kata kunci: Aspergillus niger , Xilanase, Oat Splet Xylan Enzim  xilanase  dapat  menghidrolisis  xilan  menjadi  xilosa  yang  dapat  dimanfaatkan untuk  pembuatan  gula  xilosa.  Enzim  xilanase  dapat  diisolasi  dari Aspergillus  niger dan peningkatan  produksi  xilanase  membutuhkan  suatu  induser  yaitu oat  spelts  xylan . Penelitian bertujuan untuk menentukan konsentrasi optimum oat spelts xylan terhadap produksi xilanase dan karakter xilanase hasil isolasi. Produksi xilanase pada media PDB ( Potato  Dextrose  Broth )  dengan  penambahan  variasi  konsentrasi oat  spelts  xylan yaitu 0,0%;  0,8%;  1,0%;  1,2%  dan  1,4%  untuk  mengetahui  konsentrasi  optimum oat  spelts xylan .  Selanjutnya  dilakukan  produksi  xilanase  dengan  konsentrasi  optimum oat  spelts xylan ,  xilanase  dimurnikan  dengan  metode  fraksinasi  amonium  sulfat  bertingkat  dan dialisis  dan  uji  aktivitas  menggunakan  metode  DNS  dan  uji  kadar  protein  dengan menggunakan metode Lowry . Karakterisasi enzim xilanase meliputi suhu, pH dan waktu inkubasi.  Hasil  penelitian  diperoleh  konsentrasi  optimum  oat  splet  xylan  yaitu  1,2% dengan  aktivitas  enzim  xilanase  sebesar  469,490  Unit/mg  protein.  Diperoleh  aktivitas tertinggi enzim xilanase hasil isolasi pada F5 yaitu sebesar 10280,840 Unit/mg protein dan  bekerja  optimum  pada  kondisi  suhu  40°C,  pH  4,5,  waktu  inkubasi  28  menit  dan aktivitas spesifik pada kondisi optimum sebesar 11829,159 Unit/mg Protrein.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 12 (1) (2009) : 7 – 13
1. Pendahuluan Aspergillus niger
merupakan salah satu mikroorganime  yang  mampu  menghasilkan  enzim xilanase secara ekstraseluler dengan berat molekul 22,0- 46,5  kDa,  aktif  pada  suhu  24-30oC  dan  pH  4,5-6  [1]. Xilanase  merupakan  enzim  yang  memiliki  kemampuan menghidrolisis xilan menjadi xilosa.
Xilosa  dapat  diaplikasikan  ke  beberapa  proses industri, salah satunya produksi gula xilosa. Gula xilosa banyak  digunakan  untuk  konsumsi  penderita  diabetes dan  untuk  campuran  pasta  gigi  yang  berfungsi memperkuat  gusi.  Beragamnya  kegunaan  gula  xilosa tersebut,  maka  perlu  dilakukan  inovasi  produksi  xilosa dengan  mengoptimalkan  produksi  enzim  xilanase  [2]. Enzim  xilanase  bersifat  induktif,  sehingga  untuk memperoleh  produk  yang  maksimal,  dibutuhkan  suatu induser sebagai pemicu produksi enzim xilanase. Induser yang digunakan adalah oat spelts xylan .
Berdasarkan  penelitian  Raghukumar ,  dkk. [3]  yang telah  melakukan  isolasi  enzim  xilanase  dari Aspergillus niger menggunakan  media  pertumbuhan  dengan penambahan  induser  yang  berbeda-beda  yaitu  bagas tebu,  ampas  gandum  dan oat  spelts  xylan sehingga diperoleh data unit aktifitas dari masing-masing sumber induser sebagai berikut bagas tebu 1356, ampas gandum 958 dan oat spelts xylan 1624 Unit/Liter.
Penelitian  tersebut  menunjukkan  bahwa  unit aktivitas xilanase terbesar pada penambahan induser oat spelts  xylan namun  tidak  dilakukan  penentuan konsentrasi  optimum  penambahan oat  spelts  xylan , sehingga  diharapkan  dengan  dilakukannya  variasi konsentrasi induser oat spelts xylan diperoleh konsentrasi optimum pada produksi enzim xilanase.

## 2. Metode Penelitian

## Bahan
Aspergillus  niger diperoleh  dari  Jurusan  Biokimia Universitas Diponegoro, Semarang. Media pertumbuhan Aspergillus niger yaitu PDB ( Potato Dextrose Broth ) (gL-1): 200-kentang,  10-dekstrosa.  Isolat  jamur  sebanyak  1 jarum ose diinokulasi ke dalam 100 mL media PDB, dan difermentasikan selama 72 jam dengan kecepatan shaker 250  rpm  pada  suhu  ruang.  Induser oat  spelts  xylan (SIGMA),  xilosa,  larutan  DNS  ( Dinitrosalicyclic  acid ), natrium  hidroksida,  sodium  potassium  tartrat,  BSA ( Bovine Serum Albumin ), Folin-ciocalteau , TCA ( Trichloracetic Acid ), amonium sulfat, Barium (II) klorida, larutan bufer asetat, reagen Lowry .

## Metode Penelitian Penentuan Kurva Pertumbuhan
Isolat Aspergillus niger sebanyak 10 mL diinokulasikan  ke  dalam  100  mL  media  PDB  dan difermentasikan  dalam  shaker  dengan  kecepatan  250 rpm  pada  suhu  ruang,  kemudian  sampel  diambil  setiap 24  jam  sekali.  Kurva  pertumbuhan Aspergillus  niger diukur  dengan  metode  berat  kering.  Penentuan  waktu fermentasi optimum dilakukan dengan mengkorelasikan
perubahan  berat  kering  dengan  waktu  pertumbuhan Aspergillus niger .

## Produksi Xilanase dengan Variasi Konsentrasi Oat spelts xylan
Sebanyak  5  mL  starter  diinokulasikan  ke  dalam  50 mL  media  PDB  lalu  difermentasi  dalam  shaker  dengan kecepatan 250 rpm pada suhu ruang. Setelah jam ke-24 (berdasarkan kurva pertumbuhan), fermentasi dihentikan  untuk  penambahan  induser oat  spelts  xylan sebanyak 5 mL dari konsentrasi (0,0%; 0,8%; 1%; 1,2%; dan  1,4%)  w/v,  kemudian  difermentasi  lagi  di  dalam shaker pada suhu ruang sampai jam ke-72.
Hasil  fermentasi  kemudian  disaring  dan  diperoleh biomassa dan filtrat. Biomassa dikeringkan dengan oven pada  suhu  ±  80oC  sedangkan  filtrat  disentrifus  dengan kecepatan  4000  rpm  selama  15  menit,  kemudian dipisahkan  antara  supernatan  dan  endapan  [4]. Supernatan  merupakan  enzim  ekstrak  kasar  untuk penentuan aktivitas spesifik xilanase sehingga diperoleh konsentrasi  optimum oat  spelts  xylan yang  dapat menghasilkan  enzim  xilanase  dengan  aktivitas  spesifik tertinggi.

## Produksi Xilanase dengan Konsentrasi Optimum Oat spelts xylan
Sebanyak 10 mL starter diinokulasikan ke dalam 100 mL media PDB, kemudian difermentasi ke dalam shaker dengan  kecepatan  agitasi  250  rpm  pada  suhu  ruang. Setelah  jam  ke-24  (berdasarkan  kurva  pertumbuhan), fermentasi  dihentikan  untuk  penambahan  10  mL konsentrasi  optimum oat  spelts  xylan 1,2%,  fermentasi dilanjutkan  sampai  waktu  optimum.  Kontrol  negatif diperlakukan  sama  dengan  tidak  ada  penambahan oat spelts xylan .

## Isolasi dan Pemurnian Xilanase Ekstraksi
Hasil  fermentasi  disaring  hingga  diperoleh biomassa dan filtrat. Filtrat disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 30 menit. Kemudian dipisahkan antara supernatan  dan  endapan  [4].  Supernatan  yang merupakan  enzim  ekstrak  kasar  untuk  penentuan aktivitas spesifik xilanase.

## Fraksinasi Bertingkat dengan Garam Amonium Sulfat
Enzim  ekstrak  kasar  yang  diperoleh  dilakukan pemurnian  dengan  fraksinasi  bertingkat  ammonium sulfat.  Amonium  sulfat  ditimbang  sesuai  dengan kebutuhan untuk masing-masing tingkat kejenuhan : 0- 20% (F1), 20-40% (F2), 40-60% (F3), 60-80% (F4), dan 80-100% (F5) dapat dilihat pada tabel ammonium sulfat.
Amonium  sulfat  untuk  tingkat  kejenuhan  0-20% dimasukkan kedalam ekstrak kasar sedikit demi sedikit, sambil diaduk. Pengadukan dilakukan dengan menggunakan  magnetic  stirer  dalam  penangas  es. Campuran  kemudian  didiamkan  selama  2  jam  dalam keadaan dingin (dimasukkan dalam lemari es), kemudian disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm selama 15 menit sehingga  diperoleh  endapan  dalam  fraksi  0-20%  dan filtratnya. Endapan yang diperoleh disuspensi dengan 10
mL  bufer  asetat  0,1  M  pH  5.  Masing-masing  endapan yang  disuspensi  tersebut  merupakan  larutan  protein enzim F1. Filtrat yang diperoleh untuk tingkat kejenuhan 0-20%,  difraksinasi  kembali  untuk  tingkat  kejenuhan 20-40%,  diperlakukan  sama  untuk  tingkat  kejenuhan 40-60%,  60-80%  dan  80-100%.  Endapan  yang diperoleh dari tiap-tiap fraksi merupakan F1, F2, F3, F4 dan F5 [4].

## Dialisis
Dialisis  dilakukan  dengan  menggunakan  membran selofan  yang  telah  direbus  selama  30  menit.  Selofan berisi  suspensi  hasil  akhir  fraksinasi  sebanyak  10  mL direndam  dalam  bufer  asetat  0,001  M  pH  5  dalam keadaan dingin dan tiap 2 jam sekali bufer diganti serta diuji  kandungan  amonium  sulfat  pada  larutan  diluar selofan  dengan  menggunakan  barium  klorida,  dialisis dilanjutkan hingga tidak terbentuk endapan putih.

## Penentuan Aktivitas Xilanase
Sebanyak 0,1 ml enzim hasil fraksinasi ditambah 0,4 mL bufer asetat 0,1 M dan 0,5 ml substrat oat spelts xylan , diinkubasi pada suhu 40oC selama 30 menit, kemudian ditambah  larutan  DNS  sebanyak  1  mL,  dan  dipanaskan dalam  air  mendidih  selama  10  menit,  selanjutnya dibiarkan  sampai  dingin.  Pengukuran  absorbansi  pada panjang gelombang optimum xilosa dengan spektrofotometer UV-Vis [5].

## Penentuan Kadar Protein
Sebanyak  0,1  mL  larutan  protein  enzim  hasil fraksinasi (EK, F1, F2, F3, F4 dan F5) ditambah dengan 2 mL  larutan Lowry C,  diinkubasi  pada  suhu  optimum (40 0 C)  selama  30  menit  sambil  sesekali  dikocok. Selanjutnya  ditambah  dengan  0,2  mL Lowry D  dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian diukur  absorbansinya  dengan  spectrophotometer  UV- VIS [6].

## Karakterisasi Enzim Penentuan suhu optimum
Uji  aktivitas  enzim  xilanase  dilakukan  pada  pH  5, waktu  inkubasi  30  menit  dan  variasi  suhu,  yaitu  40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C dan 45°C.

## Penentuan waktu inkubasi optimum
Uji  aktivitas  enzim  xilanase  dilakukan  pada  suhu optimum, pH 5 dan variasi waktu inkubasi, yaitu 24, 26, 28, 30, 32, 34 dan 36 menit.

## Penentuan pH Optimum
Uji  aktivitas  enzim  xilanase  dilakukan  pada  suhu optimum, waktu inkubasi optimum dan variasi pH bufer, yaitu pH 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6 dan 6,5.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Kurva  pertumbuhan Aspergillus  niger adalah  kurva yang  memberikan  informasi  mengenai  fase-fase pertumbuhan  yang  terjadi  pada Aspergillus  niger yang
selanjutnya  akan  digunakan  untuk  menentukan  waktu penambahan induser dan produksi xilanase (Gambar 1).
Gambar 1. Grafik kurva pertumbuhan Aspergillus niger
Berdasarkan  grafik,  jam  0-24  adalah  fasa  lag, Aspergillus  niger lebih  berusaha  menyesuaikan  diri dengan  lingkungan  dan  medium  baru  agar  dapat digunakan  sebagai  nutrisi  untuk  pertumbuhannya.  Jam ke-24 merupakan awal fasa logaritmik dan selama  fasa logaritmik sel membelah diri dengan maksimal, karena nutrisi makanan yang tersedia masih sangat banyak.
Setelah jam ke-72 Aspergillus niger mengalami fasa stasioner dan fasa kematian, hal ini terjadi karena nutrisi makanan sudah mulai berkurang dan adanya metabolit- metabolit  lain  yang  bersifat  racun  dapat  menghambat pertumbuhan  sel  sehingga  kecepatan  pertumbuhan  sel Aspergillus niger mulai menurun.
Dari data yang diperoleh, diketahui waktu yang tepat saat  pemanenan  sel Aspergillus  niger adalah  jam  ke-72 dan waktu penambahan induser oat spelts xylan yaitu jam ke-24.
Produksi Xilanase dengan Variasi Konsentrasi Oat spelts xylan
Produksi enzim xilanase pada variasi konsentrasi oat spelts xylan 0,0%; 0,8%; 1,0%; 1,2% dan 1,4% bertujuan untuk  mengetahui  konsentrasi  induser oat  spelts  xylan optimum dalam memproduksi enzim xilanase.
Starter diinokulasikan ke dalam media PDB ( Potato Dextrose  Broth ),  difermentasi  dan  setelah  jam  ke-24 fermentasi  dihentikan  untuk  penambahan  induser oat spelts xylan . Kemudian difermentasi kembali sampai jam ke-72.  Hasil  fermentasi  disaring  untuk  memisahkan biomassa  dengan  filtrat.  Biomassa  dikeringkan  dengan oven  pada  suhu  ±80°C  dan  filtrat  yang  dihasilkan disentrifus untuk memisahkan enzim ekstrak kasar dari sel dan medianya agar dapat ditentukan aktivitas spesifik enzim xilanase [4].
Gambar 2. Grafik penentuan sel kering pada berbagai variasi konsentrasi oat spelts xylan .
Enzim xilanase yang dihasilkan oleh Aspergillus niger merupakan  enzim  ekstraseluler  yang  bersifat  induktif, sehingga  untuk  memperoleh  produk  yang  maksimal, dibutuhkan suatu induser oat spelts xylan sebagai pemicu produksi  enzim  xilanase  agar  produksi  enzim  xilanase meningkat [2].
Gambar 3. Grafik penentuan aktivitas spesifik enzim xilanase pada berbagai variasi konsentrasi oat spelts xylan .
Konsentrasi 0,0% (tidak ada penambahan oat spelts xylan ) sel Aspergillus niger dapat tumbuh dengan baik, ini menunjukkan bahwa sel tersebut mampu memanfaatkan sumber karbon glukosa dan nutrisi-nutrisi yang terdapat dalam  media  dengan  maksimal.  Karena  tidak  ada penambahan oat  spelts  xylan pada  jam  ke-24,  sel  tetap memanfaatkan nutrisi yang ada untuk pertumbuhannya.
Konsentrasi oat  spelts  xylan 0,8%,  sel Aspergillus niger mengalami penurunan jumlah biomassa sel, karena penambahan oat  spelts  xylan pada  jam  ke-24  sel  harus beradaptasi  dengan oat  spelts  xylan ,  sehingga  sel  harus mengeluarkan enzim xilanase agar dapat menghidrolisis oat  spelts  xylan menj adi  monomer-monomernya  untuk dapat dimakan oleh sel. Karena sel harus memproduksi enzim xilanase, pertumbuhan sel mengalami perlambatan  sehingga  jumlah  sel  sedikit  dan  aktivitas xilanase juga kecil, yaitu 76,314 Unit/mg protein.
Konsentrasi oat  spelts  xylan 1,0%  dan  1,2% mengalami  peningkatan  sehingga  jumlah  sel  yang terbentuk  juga  meningkat  dan  aktivitas  spesifik  juga meningkat. Pada konsentrasi 1,4% jumlah sel mengalami penurunan  yang  sangat  drastis,  hal  ini  terjadi  karena
konsentrasi yang tinggi dalam media mengharuskan sel sejak  awal  bekerja  keras  mengeluarkan  enzim  xilanase untuk  digunakan  menghidrolisis oat  spelts  xylan agar dapat  dicerna  oleh  sel,  sehingga  sel  mengalami perlambatan pertumbuhan.
Aktivitas  spesifik  xilanase  tertinggi  pada  berbagai variasi  konsentrasi oat  spelts  xylan terdapat  pada penambahan  konsentrasi  1,2%  yaitu  469,490  Unit/mg protein.  Hal  ini  terjadi  karena  semakin  banyak konsentrasi oat  spelts  xylan yang  ditambahkan  maka Aspergillus  niger akan  mensekresikan  xilanase  lebih banyak  untuk  menghidrolisis  xilan  menjadi  xilosa  agar dapat digunakan untuk metabolisme sel.

## Produksi Xilanase dengan Konsentrasi Optimum Xilan
Produksi  xilanase  dilakukan  dengan  tujuan  untuk mendapatkan enzim xilanase dalam jumlah yang cukup banyak.  Produksi  dilakukan  dengan  menumbuhkan starter pada  media PDB  dan menambahkan  induser oat spelts  xylan 1,2%  pada  jam  ke-  24  dan  pemanenan dilakukan pada jam ke- 72. Tahap ini diperoleh xilanase ekstrakseluler  yang  masih  bercampur  dengan  protein- protein  lain  sehingga  perlu  dilakukan  isolasi  dan pemurnian untuk mendapatkan enzim xilanase murni.

## Isolasi dan Pemurnian Enzim Xilanase Ekstraksi
Isolasi  xilanase  dilakukan  dengan  tujuan  untuk memisahkan  enzim  xilanase  dari  protein-protein  lain. Karena  xilanase  merupakan  enzim  ekstrakseluler  maka untuk  mendapatkannya  enzim  disentrifugasi.  Prinsip sentrifugasi  berdasarkan  adanya  gaya  sentrifugal  pada partikel,  dimana  pada  kecepatan  sentrifugasi  sama molekul  dengan  berat  molekul  yang  lebih  besar  akan mengendap terlebih dahulu [7]. Endapan merupakan sisa komponen-komponen  media  dan  sel Aspergillus  niger , sedangkan  supernatan  merupakan  enzim  ekstrak  kasar yang  terdiri dari  protein  enzim dan protein non  enzim. Enzim  ekstrak  kasar  yang  diperoleh  selanjutnya dilakukan  pemurnian  untuk  mendapatkan  enzim xilanase murni dengan proses fraksinasi bertingkat.

## Fraksinasi Bertingkat dengan Garam Amonium Sulfat
Fraksinasi  bertingkat  amonium  sulfat  merupakan salah  satu  cara  pengendapan  protein  menggunakan tingkat kejenuhan garam amonium sulfat yang berbeda- beda,  sehingga  akan  diperoleh  endapan  protein  yang berbeda-beda terhadap konsentrasi garam [8].
Fraksinasi  diikuti  dengan  sentrifugasi  untuk memisahkan endapan dengan supernatan. Endapan yang diperoleh  merupakan  protein  enzim.  Pada  tahap fraksinasi  amonium  sulfat  bertingkat  diperoleh  fraksi- fraksi  enzim  dengaan  tingkat  kejenuhan  F1  (0-20%), F2(20- 40%), F3(40-60%), F4(60-80%), F5(80- 100%) yang kemudian diikuti pemurnian lebih lanjut.

## Dialisis
Dialisis  yaitu  proses  pemisahkan  partikel-partikel protein  dengan  ukuran  besar  dari  partikel  amonium sulfat  yang  berukuran  kecil  melalui  membran  selofan. Proses  dialisis  berdasarkan  pada  prinsip  difusi,  yaitu
adanya  perbedaan  konsentrasi  larutan  bufer  asetat antara di dalam (0,1 M) dan di luar membran (0,001 M). Molekul  yang  berukuran  kecil  yaitu  garam  amonium sulfat bersama bufer asetat akan keluar melalui pori-pori membran  selofan  sedangkan  protein  yang  berukuran lebih besar akan tetap berada di dalam membran.
Adanya  kandungan  amonium  sulfat  pada  larutan bufer  di  luar  membran  pada  proses  dialisis  dapat diidentifikasi  dengan  barium  klorida.  Jika  dengan penambahan  barium  klorida  pada  larutan  bufer  diluar membran  masih  menghasilkan  endapan  putih,  maka larutan  tersebut  masih  mengandung  amonium  sulfat yaitu endapan berwarna putih [9].

## Penentuan Aktivitas, Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik Xilanase
Aktivitas spesifik adalah jumlah unit aktivitas enzim per  mg  protein  pada  kondisi  optimum.  Aktivitas  enzim biasanya  digunakan  untuk  menunjukkan  banyaknya enzim  yang  berperan  dalam  suatu  reaksi  enzimatis. Untuk mengetahui  aktivitas  spesifik  xilanase dilakukan penentuan unit aktivitas dan kadar protein xilanase.
Defini  satu  unit  aktivitas  xilanase  adalah  aktivitas xilanase  yang  dapat  menghasilkan  1  mg  xilosa  pada kondisi optimum [10]. Penentuan unit aktivitas xilanase dengan mereaksikan enzim hasil isolasi dengan oat spelts xylan sebagai substrat dan bufer asetat, yang selanjutnya diinkubasi  menghasilkan  produk  xilosa  yang  dapat dihitung dengan menggunakan metode
DNS (Dinitrosalicylic
acid).
Absorbansinya
dibaca menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang  optimum  xilosa.  Absorbansi  yang  diperoleh kemudian diplotkan terhadap kurva standar xilosa untuk mengetahui  besarnya  unit  aktivitas  yang  terdapat  pada ekstrak kasar dan tiap fraksi.
Penentuan  kadar  protein  pada  tiap-tiap  fraksi diukur dengan menggunakan metode Lowry yaitu analisa kuantitatif berdasarkan pembentukan kompleks berwarna  biru  hasil  reaksi  antara  ion  Cu2+  dengan nitrogen  dari  rantai  peptida  dalam  suasana  basa  dan reduksi  fosfomolibdat  fosfotungstat  pada  reagen  Folin Ciocalteau oleh rantai samping asam amino dan triptofan menjadi heteropolimolibdenum berwarna biru [11] yang dapat  diukur  absorbansinya  pada  panjang  gelombang optimum  BSA  dengan  menggunakan  spektrofotometer UV-Vis.
Gambar  4.  menunjukkan  bahwa  aktivitas  spesifik xilanase  tertinggi  pada  F5,  yaitu  sebesar  10280,840 Unit/mg protein.
Gambar 4. Grafik Aktivitas Spesifik Xilanase dari Hasil Isolasi Aspergillus niger pada Tiap Fraksi

## Karakterisasi Xilanase
Karakterisasi  enzim  xilanase  meliputi  suhu,  waktu inkubasi  dan  pH.  Fraksi  yang  digunakan  untuk karakterisasi adalah F5 dengan aktivitas terbesar.

## Penentuan Suhu Optimum
Suhu  optimum  yaitu  suhu  yang  paling  tepat  bagi suatu  reaksi  yang  menggunakan  enzim  tertentu  untuk menghasilkan suatu produk [8].
Gambar 5. Grafik Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Spesifik Xilanase dari Aspergillus niger
Dari  hasil  penelitian,  diperoleh  bahwa  aktivitas spesifik xilanase tertinggi diperoleh pada suhu optimum 40 o C. Bertambahnya suhu sampai dengan suhu optimum menyebabkan  terjadinya  kenaikan  kecepatan  reaksi enzim  karena  bertambahnya  energi  kinetik  yang mempercepat gerak enzim dan substrat. Energi tersebut akan  menaikkan  benturan  antara  molekul-molekul sehingga  memperbesar  peluang  keduanya  untuk bereaksi  membentuk  kompleks  enzim  substrat  yang lebih  stabil  dan  produk  yang  terbentuk  juga  akan semakin banyak sehingga aktivitas enzim bertambah.
Suhu  di  bawah  suhu  optimum  aktivitas  spesifik xilanase  kecil  karena  kurangnya  energi  untuk  bereaksi menyebabkan  kemampuan  gerak  enzim  dan  substrat menjadi kecil sehingga kompleks enzim- substrat yang terbentuk  hanya  sedikit  dan  produk  xilosa  yang dihasilkan sedikit.
Suhu  di  atas  suhu  optimum,  kenaikan  suhu menyebabkan turunnya aktivitas spesifik xilanase hal ini terjadi  karena  enzim  merupakan  suatu  protein  yang dapat terdenaturasi pada suhu tinggi. Denaturasi adalah perubahan konformasi enzim akibat adanya perenggangan  ikatan  hidrogen  yang  bersifat  reversibel pada  struktur  tersier  xilanase.  Perenggangan  tersebut akan  mempengaruhi  sisi  aktif  enzim  xilanase  untuk berikatan  dengan  substrat,  sehingga  kompleks  enzim substrat  yang  terbentuk  sedikit  dan  produk  xilosa  yang dihasilkan sedikit.

## Penentuan Waktu Inkubasi Optimum
Waktu  inkubasi  adalah  waktu kontak  antara  enzim dengan  substrat  untuk  membentuk  kompleks  enzim- substrat  yang  akhirnya  terbentuk  produk.  Hasil penelitian  menunjukkan  aktivitas  spesifik  diperoleh waktu inkubasi optimum yaitu 28 menit dengan aktivitas sebesar 11666,667 Unit/mg protein.
Gambar 6. Grafik Pengaruh Waktu Inkubasi Terhadap Aktivitas Spesifik Xilanase dari Aspergillus niger .
Waktu inkubasi di bawah waktu inkubasi optimum, aktivitas  spesifik  xilanase  rendah,  hal  ini  disebabkan belum semua sisi aktif enzim berikatan dengan substrat, sehingga  kompleks  enzim-substrat  yang  terbentuk masih sedikit dan produk xilosa yang dihasilkan sedikit.
Waktu  inkubasi  di  atas  waktu  inkubasi  optimum terjadi  penurunan  aktivitas  spesifik  xilanase.  Hal  ini disebabkan karena adanya inhibisi reaksi enzimatis oleh produk  yang  terbentuk  yaitu  P-D  xilosa  yang  memiliki kemiripan  bentuk  dengan  substrat  (xilan).  Inhibisi produk  dapat  terjadi  dengan  cara  inhibitor  akan berikatan  dengan  enzim  membentuk  kompleks  enzim- inhibitor. Adanya reaksi inhibisi ini menyebabkan produk P-D  xilosa  yang  terbentuk  sedikit  sehingga  aktivitas spesifik xilanase menjadi turun.

## Penentuan pH Optimum
pH optimum adalah pH yang paling tepat bagi suatu reaksi  yang  menggunakan  enzim  tertentu  untuk menghasilkan  produk  [8].  Aktivitas  spesifik  xilanase terbesar pada pH 4,5 yaitu 8235, 294 Unit/mg protein.
Pada pH 4,5, OH - dari lingkungan akan menarik H+ dari  gugus  -COOH  sehingga  bersifat  nukleofilik.  Enzim
mengalami  penurunan  aktivitas  pada  saat  pH  di  atas maupun di bawah pH optimum.
Gambar 7. Grafik Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Spesifik Xilanase dari Aspergillus niger
pH  lebih  rendah  dari  pH  optimumnya,  suasana lingkungan  enzim  berubah  sangat  asam  (kadar  H + meningkat), maka terlalu banyak ion-ion H+ yang akan mengelilingi xilanase dan kemudian ion-ion H + tersebut akan  tertarik  pada  gugus  -NH 2 pada  xilanase  dan membentuk  NH 3 +,  akibatnya  xilanase  dalam  keadaan kation.  Xilanase  dalam  keadaan  ini  disebut  mengalami protonasi. Selain itu, ion H+ dari gugus - COOH pada sisi aktif  Glu106  akan  lebih  sukar  lepas  karena  lingkungan enzim  bersifat  sangat  asam,  sehingga  komplek  enzim substrat tidak terbentuk.
pH lebih tinggi dari keadaan optimumnya, suasana lingkungan enzim akan menjadi sedikit basa (ada sedikit kadar  OH - ),  ion-ion  OH - yang  mengelilingi  enzim xilanase  tersebut  akan  berinteraksi  dengan  daerah- daerah positif yang terdapat dalam enzim xilanase yaitu ion-ion H + pada gugus -COOH yang merupakan sisi aktif xilanase, akibatnya enzim xilanase dalam keadaan anion. Enzim  xilanase  dalam  keadaan  ini  mengalamai deprotonasi [12]. Selain itu banyaknya ion  - OH - dalam lingkungan  dapat  menggangu  reaksi  enzimatis  karena ion  OH - merupakan  nukleofil  yang  dapat  berinteraksi dengan  substrat.  Jika  ion  OH - dari  lingkungan  yang bereaksi dengan substrat maka produk yang diharapkan tidak terbentuk.
Aktivitas Xilanase pada Kondisi Optimum (Suhu 40 o C, pH 4,5 dan Waktu Inkubasi 28 menit)
Penentuan  aktivitas  spesifik  enzim  xilanase  pada kondisi  optimum  menunjukkan  ada  peningkatan dibanding aktivitas spesifik sebelum optimum. Aktivitas spesifik  xilanase  tertinggi  tetap  pada  F5  yaitu  11829 Unit/mg  protein  dan  sebelum  kondisi  optimum  yaitu sebesar 10280,840 Unit/mg protein pada F5.
Peningkatan  nilai  aktivitas  spesifik  xilanase  pada kondisi  optimum  ini  disebabkan  karena  konformasi enzim terbentuk sedemikian rupa sehingga sisi aktif dari xilanase  tepat dan mampu  mengadakan  kontak dengan substrat.  Akibatnya,  kompleks  enzim-substrat  yang terbentuk  menjadi  maksimal,  sehingga  produk  yang
dihasilkan  menjadi  banyak  dan  aktivitas  spesifiknya menjadi lebih besar [13].
Gambar 8. Grafik Aktivitas Spesifik Xilanase dari Hasil
Isolasi Aspergillus niger Tiap Fraksi pada Kondisi
Optimum

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  penelitian  diperoleh  konsentrasi optimum oat spelts  xylan 1,2%  dengan aktivitas  spesifik xilanase  sebesar  469,490  Unit/mg  protein  dan  hasil isolasi  enzim  xilanase  diperoleh  aktivitas  spesifik xilanase  tertinggi  pada  F5  sebesar  10280,840  Unit/mg protein.  Karakterisasi  xilanase  hasil  isolasi  diperoleh kondisi  optimum  pada  suhu  40°C,  waktu  inkubasi  28 menit,  pH  4,5  dan  aktivitas  spesifik  F5  pada  kondisi optimum sebesar 11829,159 Unit/mg protein.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  A. Sunna, G. Antranikian, Xylanolytic Enzymes from Fungi and Bacteria, Critical Reviews in Biotechnology, 17 (1997) 39-67.
[2]  Nur  Richana,  Produksi dan  prospek  enzim  xilanase dalam  pengembangan  bioindustri  di  Indonesia, Buletin AgroBio, 5 (2002) 29-36.
[3]  Chandralata  Raghukumar,  Usha  Muraleedharan,  V. R.  Gaud,  R.  Mishra,  Xylanases  of  marine  fungi  of potential use for biobleaching of paper pulp, Journal of  Industrial  Microbiology  and  Biotechnology,  31 (2004) 433-441.
[4]  S.P. Colowick, C. Guthrie, G.R. Fink, M.I. Simon, J.N. Abelson,  Methods  in  Enzymology,  Academic  Press, 1991.
[5]  JH  Paul,  Isolation  and  characterization  of  a Chlamydomonas L-asparaginase, Biochemical Journal, 203 (1982) 109-115.
[6]  Robert A. Copeland, Methods for Protein Analysis: A Practical  Guide  for  Laboratory  Protocols,  Springer US, 2013.
[7]  Yuehai Song, Gang Wei, Rongchun Xiong, Structure and  properties  of  PbO2 – CeO2  anodes  on  stainless steel, Electrochimica Acta, 52 (2007) 7022-7027.
[8]  M. Wirahadikusumah, Biokimia: Protein, Enzim dan Asam Nukleat, Penerbit ITB, Bandung, 1989.
[9]  G.  Svehla,  Vogel  -  Buku  Teks  Analisis  Anorganik Kualitatif  Makro  dan  Semimikro,  edisi  5  ed.,  PT. Kalman Media Pusaka, Jakarta, 1985.
[10] UA  Okafor,  VI  Okochi,  BM  Onyegeme-Okerenta,  S Nwodo-Chinedu, Xylanase production by Aspergillus  niger  ANL  301  using  agro-wastes, African Journal of Biotechnology, 6 (2007).
[11]  John  Magruder  Clark,  Robert  L.  Switzer, Experimental Biochemistry, W. H. Freeman, 1977.
[12] Frédéric  de  Lemos  Esteves,  Virginie  Ruelle,  Josette Lamotte-Brasseur,  Birgit  Quinting,  Jean-Marie Frère,  Acidophilic  adaptation  of  family  11  endo- β - 1,4-xylanases:  Modeling  and  mutational  analysis, Protein Science : A Publication of the Protein Society, 13 (2004) 1209-1218.
[13] Albert L Lehninger, Dasar-dasar biokimia, Erlangga, Jakarta, 1990.