Optimasi Starter Dalam Memproduksi Inulinase Dan Identifikasi Khamir Inulinolitik BAN - 1

## Dari Umbi Dahlia ( Dahlia variabilis Willd)
Wijanarka 1) ; Endang Kusdiyantini 2) dan Hermin 3)
1) Lab. Mikrobiologi; 2) Lab. Biokimia dan 3) Lab. Genetika. Dan Staf Pengajar FMIPA- Jurusan Biologi Universitas Diponegoro Semarang. Contact person Hp. 08179526187 Email: Wied_bio_undip@telkom.net

## ABSTRACT
Inulinolitic yeast isolated from dahlia tuber ( Dahlia variabilis Willd) of Bandungan-Ambarawa, was found to produce inulinase enzyme (E.C.3.2.1.7).  Under tested fermentation condition, BAN-1 inulinase isolate showed enzymatic activity in dose dependent manner to the starter concentration. A maximum enzymatic   activity   of   0.582   IU   was   produced   by   adding   starter   concentration   10%.  Based   on morphological, physiological and biochamichal evaluation it was indentified that   the BAN-1 isolate is Pichia sp.
Key words : Inulinase; Pichia sp, Dahlia variabilis Willd

## Pendahuluan
Produksi gula secara nasional masih tergantung pada gula tebu dan gula cair dari   pati   sehingga   belum   memenuhi   tingkat   konsumsi   gula   di   Indonesia.   Hal   ini terbukti   dengan impor gula oleh pemerintah, berupa gula cair dan gula kristal tiap tahun rata-rata 2  juta ton (Manggunwidjaya, l993). Keadaan inilah yang mendorong upaya   mencari   aneka   jenis     bahan   untuk   digunakan   sebagai   pemanis,   hingga kemudian   banyak   diproduksi   pemanis   sintetis   (berbahaya   untuk   kesehatan)   dari pada pemanis alami . Pemanis alami mempunyai peluang pasar yang baik untuk dikembangkan   pengadaanya.     Keberadaannya   memiliki   prospek   yang  menantang untuk digarap baik dalam budidaya sumber tanaman pemanisnya maupun industri pengolahannya.   Sumber   gula   baru   sebagai   alternative   untuk   mengurangi ketergantungan terhadap gula tebu perlu dicari dan fruktosa merupakan salah satu alternative yang penting. Selanjutnya fruktosa ini dapat dibuat pemanis alami yang dikenal   sebagai HFS ( High   Fructose   Syrup ).   Pemanis   alami   seperti HFS ( High Fructose   Syrup   = Sirup   fruktosa)     memiliki   peluang   pasar   yang   baik   untuk dikembangkan pengadaannya.
Upaya  mengatasi  masalah   ini,   akhir-akhir  ini   perhatian   dipusatkan  terhadap sumber pemanis alami hasil biosintesis dari mikroorganisme dengan alasan mudah dimanipulasi   genetik   dan   murah   operasionalnya.   Sumber   pemanis   alami   (inulin) tersebut   dapat   berasal   dari   umbi   dahlia   ( Dahlia   variabilis Willd)   dengan   bantuan khamir ( yeast ) inulinolitik.  Inulin adalah polisakarida yang terkandung dalam umbi dahlia, chicory, Jerusalem artichoke dan lain-lain.  Struktur kimia inulin adalah linier, polimer dari 2,1 linkage fruktosa yang ujungnya   berupa residu sukrosa. Fruktosa yang   menyusun   inulin   dapat   dihidrolisis   dengan   asam   maupun   secara   enzimatis (Haraguchi et   al .,   l990;   Ertan et   al .,2003).   Khamir   inulinolitik   mempunyai   enzim inulinase   (2,1 β- D-fructafructanohydrolyse   E.C.3.2.1.7)   yang   mampu   mengubah inulin menjadi fruktosa sebagai bahan dasar pembuatan HFS .

## Materi dan Metode
Mikroorganisme.  Isolat khamir inulinolitik BAN-1  hasil isolasi  dari umbi dahlia ( Dahlia variabilis Willd) asal Bandungan – Ambarawa. Cara kerja screening untuk
mendapatkan   isolate   tersebut   dengan   menggunakan   inulin   murni   sebagai   satu- satunya sumber karbon (Ertan et al ., 2003).
Kultivikasi medium. Komposisi medium untuk produksi enzim (Byun and Nahm, l978) yaitu : Inulin (Sigma) 1%; (NH4) 2 HPO 4 0,5% ; MgSO 4 .7H 2 O 0,05%;   FeSO 4 0,015%; agar 2% dan pH medium 5,0.  Medium di autoklaf pada suhu 121 o C selama 20 menit. Setelah diinokulasi, Erlenmeyer di rotary shaker pada suhu 28 o C dengan kecepatan 150 rpm.
Enzyme Assay. Sebanyak 0,1 ml larutan enzim  dicampur dengan subtrat inulin 0,1%   dalam larutan bufer sodium asetat pH 5. Selanjutnya diinkubasi   selama 30 menit pada suhu 50 o C. Gula reduksi yang terbentuk ditentukan dengan metode DNS (Chaplin, l994; Xiao, et al ., 1998; Park dan Yun, 2001). Aktivitas inulinase ditentukan berdasarkan   sejumlah   1  mol   gula   reduksi   (fruktosa)   yang   dibebaskan   permenit pada kondisi tertentu.
Identifikasi khamir inulinolitik  Identifikasi khamir BAN-1 sebagai isolat terpilih ditentukan   berdasarkan   pengamatan   morfologi   dan   uji   fisiologi/biokimia   (Barnett, l983; Kurzman dan Fell, l998).

## Hasil dan Pembahasan
Kondisi   fermentasi   yang   dilakukan   dalam   penelitian   ini   yaitu       konsentrasi sumber C 0,75 % inulin,  waktu inkubasi  24 jam, konsentrasi nitrogen 0,25%,    pH medium     5,0     dan   variasi   konsentrasi   inokulum   (5%,   0,75%   dan   10%)   terhadap aktivitas inulinase isolat   BAN- 1.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan, ternyata semakin besar konsentrasi starter   yang   ditambahkan   pada   medium   fermentasi   maka   produksi   enzim     juga semakin besar (Tabel 1).   Hal ini ditandai dengan besarnya peningkatan aktivitas enzim. Isolat BAN-1 pada konsentrasi starter 10% menghasilkan aktivitas 0,582 IU. Peningkatan ini  diakibatkan jumlah inokulum yang ditambahkan semakin besar (5% sampai   10%)     dan   kultur   yang   ditambahkan   juga     sudah   dalam   keadaan   aktif, sehingga fase lag yang akan ditempuh semakin pendek. Dengan demikian, karena enzim ini dihasilkan pada saat fase log maka akan segera terlialisir. Menurut Aziz dan Sukara  (l990) bahwa   jumlah sel yang ditambahkan akan mempengaruhi fase yang akan terbentuk, disamping karakteristik metabolitnya.  Hasil aktivitas inulinase dari isolate BAN-1 lebih 5 kali lipat dari Zygosaccharomyces fermentatii yang pernah diteliti   oleh   Wijanarka et   al .  (2002)  dimana  hanya   mampu  menghasilkan  aktivitas sebesar 0,11 IU/ml.
Tabel   1.   Optimasi   konsentrasi   starter   (   5%,   7,5%   dan   10%)   terhadap   aktivitas inulinase isolat  BAN – 1
Table 1.  Optimation of Starter concentration (5%, 7,5% and 10%) on Isolate BAN-1 inulinase activity Jenis isolat Starter (%) R1 (IU/ml) R2 (IU/ml) Rata-rata (IU/ml) BAN - 1 5 0,322 0,322 0,322 7,5 0,476 0,579 0,528 10 0,613 0,515 0,582*
Dari   hasil   penelitian,   diketahui   bahwa   isolat   khamir     BAN-1     (Gambar   1) penghasil   inulinase   yang   diindentifikasi   memiliki   ciri-ciri   morfologi   dan   biokimia seperti tercantum pada Tabel 2 dan Tabel 3.
Tabel 2. Hasil Pengamatan Morfologi Khamir BAN-1 Tabel 2. Morphological examination of BAN-1 yeast
Pengamatan Keterangan Bentuk sel (MEB) Bulat   sampai   elips,   sel   terdapat   dalam   bentuk tunggal   atau   berpasangan   atau   dalam   rantai pendek. Ukuran sel (MEB) P (2-4) x L (2-10) μm Pertunasan (MEB) Multipolar Miselium palsu dan miselium sejati (Corn Meal Agar = CMA) Membentuk pseudomycelium yang bercabang baik, tetapi   tidak   menghasilkan   hifa   sejati   ( true mycelium ). Penampakan koloni (Yeast extract Malt Agar = YMA) Putih agak krem, permukaan halus, tekstur seperti mentega, kusam, tepi lurus tetapi menjadi bergerigi pada koloni tua, tengah koloni menggunung. Penampakan koloni (Yeast extract Malt Broth = YMB) Membentuk sedimen dan pelikel. Spora seksual Askospora   berbentuk   bulat.   Askus   tidak   mudah pecah   dan   terlihat   pada   hari   kedua   pada   YMB. Umumnya satu askospora dihasilkan dalam setiap askus. Ditemukan konjugasi antar sel.

## Tabel 3. Uji Fisiologi/Biokimia Isolat 1
Table 3. Physiological/biochemical Test for Isolate 1
UJI ISOLAT 1 Fermentasi (Yeast Extract Peptone = YEP) Positif: glukosa (w), galaktosa (w), sukrosa (w), melibiosa, rafinosa, trehalosa Negatif: maltosa, laktosa Asimilasi C (Yeast Nitrogen Base = YNB) Positif: Glucose, Galactose, L-Sorbose, Sucrose, Maltose, Melezitose, Inulin, Soluble starch, D-Xylose, L-Arabinose, D-Arabinose, D-Ribose, L-Rhamnose,   Glycerol,   Erythritol,   Ribitol   (Adonitol),   Dulcitol (Galactitol),   D-Mannitol,   D-Glucitol   (D-Sorbitol),  -Methyl-D- Glucoside,   Glucono-  -Lactone,   2-Ketogluconic   Acid,   5-Ketogluconic Acid, Succinic Acid, Citric Acid, Inositol, N-acetyl-D-glucosamine Negatif: Cellobiose,   Trehalose,   Lactose,   Mellibiose,   Raffinose,
Methanol,   Ethanol,   Salicin,   D-L-Lactic   Acid,   D-Glucuronic   Acid,   D- Galacturonic Acid, Arbutin, Paraffin oil, D-glucosamine, Hexadecane. Asimilasi N (Yeast Carbon Base = YCB) Positif :   amonium   sulfat,   kalium   nitrat,   natrium   nitrit,   L-Lysine, Cadaverine, Creatine Negatif :   Ethylamine-HCl,   Creatinine,   D-Glucosamine,   Imidazole, Tyrosine, Caseine, Hypoxanthine, N-acetyl-D-glucosamine.
Pembentukan enzim urease
( Christensen’s Urea
Agar = CUA) Negatif
Pertumbuhan pada suhu 27 o C ( Yeast extract Malt Agar =
YMA)
Positif
Pertumbuhan pada suhu 37 o C ( Yeast extract Malt Agar =
YMA)
Negatif
Pertumbuhan pada medium 60%
sukrosa ( Christensen’s Urea Agar = YEPA)
Positif
Berdasarkan   karakter   morfologi   dan   hasil   uji   fisiologi/biokimia   yang   diamati disimpulkan bahwa khamir BAN-1   tersebut    adalah Pichia sp1 (Gambar 1) E.C. Hansen emend. Kurtzman.
Gambar 1. Morfologi Isolat BAN-1 ( perbesaran 400 x) Figure 1. Isolate BAN-1 morphology (magnification 400x)

## Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan konsentrasi starter yang terbaik adalah   10%   dengan   aktivitas   enzim   sebesar   0,582   IU.     Sedangkan   karakter morfologi   dan   hasil   uji   fisiologi/biokimia   yang   diamati   disimpulkan   bahwa   isolat khamir BAN-1 adalah Pichia sp .

## Ucapan Terimakasih
Penulis/ Peneliti mengucapkan banyak terima kasih  kepada Program Insentif Riset Terapan-Menristek Tahun Anggaran 2007 yang telah mendanai sehingga dapat terlaksananya penelitian ini.

## Daftar Pustaka
Allains,   J.J.,    Kammou   S.,   Blanc   P.,   Girard   C.and   Baratti.   J.1986.   Isolation   and Characteristic   of   Bacterial   Strains   with   Inulinase   Activity.  Appl.   Environ. Microbiol. 52 (50 : 1086-1090).
________;   Hoyos-Lopez   G.,   Kammoun   S.   and   Baratti.   J.  1987.   Isolation   and Characterization of Thermophilic Bacterial Strains with Inulinase Activity. Appl. Environ. Microbiol. 53 (5): 942 –945
Baltz. R.H. l996. Strain Improvement. Di dalam Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Demain, A,I., and Solomon, N.A. (Ed). American Society for Microbiology. Washington.
Barnett,   J.A.,   Oayne   R.W.   and   Yarrow.   D.   1990.   Yeasts:   Characteristics   and Identification. 2 nd Edition. Cambridge Univ. Press. Cambridge
Bajpai,   P.   and   Margaritis   A.   1987.   Characterization   of   Moleculer   Sieve-Bound Inulinase. J. Ferment Technol. 65 (2): 239 – 247.
Bucke.C.   l988.   Enzymes   in   Fructose   Manufacture.   Dalam.   Enzymes   and   food Processeing. Applied. Science. Pub. Ltd.
Byun, S.M. and Nahm B.H. 1987. Production of Fructose from Jerusalem artichoke by Enzymatic Hydrolysis J. Food sci. 43: 1871 – 1873.
Chaplin, M.F. and Kennedy J.F.. 1994. Carbohydrat Analysis; A Practical Approach.
2 nd Edition. Oxford University Press. Oxford.
Cruegur,   W.   and     Crueger   A..   1984.     Biotechnology:   A   Texbook   o   Industral Microbiology. Thomas (Ed)  Sinauer Associated, Inc. Sunderland, M.A 01375.
De Lenheer, L. and Hoebregs, H.. 1994. Inulin. Megazyme International Ireland Ltd. Ireland.
Deutscher, M. l990. Guide To Protein Purification. Methods In Enzymology  Vol. 182.
Academic Press. Inc.  Boston. Toronto. Tokyo.
Doty, T. and Vaninen. 1979 The Properties, Manufacture and Uses as an Industrial Raw Material. Dalam : C.G. Birch dan K.J. Parker (ed) Sugar : Science and Technology Appl. Sci Publ. London
Dixon, M and  Webb E. 1979. Enzymes. Logman Group Ltd London
Hartiko, H. l994. Biologi Organisme Termofilik. PAU-Bioteknologi UGM. Jogyakarta.
Holz, G and Saunders G. l985.  Genetic Modification of Industrial Microorganisms. Didalam   Comprehensive   Biotechnology.   The   Principles,   Application   and Regulation   of   Biotechnology   in   Industry,   Agryculture   and   Medicine.   Moo- Young, M (Ed) Pergamon Press.
Javadekar,   VS,   Siva   Raman   H.   and   Gokhale   D.   1995.   Industrial   Yeast   Strain improvement   :     Construction   of   a   Highly   Flocculent   Yeast   With   a   Killer Character by Protoplast Fusion. Jour. Indst. Microbiology 15 : 94-102
Kockova,   A  and   Kratochilova   L..   1990.   Yeast   and   Yeast   Like   Organism.   UCH.
Publishers. France. Pp. 6 – 7, 42 – 51.
Kreger-van   Rij,   N.J.W.   1984.   The   yeast,   A  Taxonomic   Study.   Third   revised   and Enlarged Ed., Elsevier sci. publ. B.v., Amsterdam.
Kurtzman, C.P. and Fell, J.W.. 1998. The yeasts: A taxonomic study . 4 th ed. Elsevier Science Publisher B.V., Amsterdam.
Lutony, T.L. 1993. Tanaman sumber Pemanis. Penebar Swadaya, Jakarta.
Matsushima,   R.   and   Baltz   R.H.   l986.   Protoplas   Fusion In Manual   of   Industrial Microbiology and Biotechnology. Demain, A.L. and Solomon, N.A. American Society for Microbiology. Washington DC.
Mayes,   P.A.,   Daryl   K.G.,   Victor   W.R.and   David   W.M.   l987.  Biokimia   Harper Terjemahan. Iyan Darmawan. Penerbit  Buku Kedokteran EGC. Jakarta.
Moat, A.G. and J.W. Foster, l988.  Microbial Physiology. John Wiley and Sons Inc., New York.
Nagy I.Z., C. Palagyi, Vagvolgyi and  L. Fernczy. 1994. Genomic Comparison among Wild-type and Mutant Strains of P. rhodozyma . FEMS Microbiology. Lett. 123:
315-318
Panji, C. l985. Penuntun Praktikum  Bioindustri. PAU IPB. Bogor.
Park, J.P and Yun J.W. 2001.Utilization of Chicory roots for Microbial Endoinulinase Production.Letters In Applied Microbiology. 2001 (33): 183 – 187
Park,   S.,   Jeong,   H.Y.,   Kim   H.S.,   and   Yang   M.S.   2001.   Enhanced   Production   of Aspergillus ficuum Endoinulinase in Saccharomyces cerevisiae By Using the SUC 2 Deletion Mutation.  Enzyme and Microbial Technology Vol. 29
Pessoa A. and Vitolo M. 1999.   Inulinase From Kluyveromyces marxianus: Culture Medium Composition and Enzyme Extraction.  Journal Chemical Eng. Vol. 16.
Perkins,S.   l984.   Biotechnology:   A   New   Industrial   Revolision.   Orbis   Publishing. London.
Rouwenhorst, R.J.; Visser L.E. van Derbaan A.A. Scheffer W.A. and van Dijken J.P.. 1988. Production, Distribution and Kinetic Properties of Inulinase in Continous Culture   of Kluyveromyces   marxianus CBS   6556.   Appl   environ.   Microbiol. 54(5): 1131 -  1137.
________; W.S. Ritmeester; W.A. Scheffer and J.P. van Dijken. 1990a. Localization of Innulinase and Invertase in Kluyveromyces sp.. Appl. Environ. Microbiol. 56 (11) : 3329 – 3336.
________;   Hensing   M.   Verbakel   J.   Scheffer   W.A.   and   van   Dijken   J.P..  1990b. Structure   and   Properties   of   the   Extracellular   Inulinase   of Kluyveromyces marxianus CBS 6556. Appl. Environ. Microbiol. 56 (11) : 3337 – 3345.
Rukmana,   R.   2000.   Dahlia:   Prospek   Agribisnis   dan   Teknik   Budi   Daya.   Penerbit Kanisius. Jogyakarta.
Santiago, C.M. l982. Protoplast   Fusion A New Tecnique for Genetic Manipulation and Breeding of Industrial Microorganisme. I.C. Biotech. 5: 435-440
Tjokroadikoesoemo,  P.S. 1986. HFS dan Industri Ubi Kayu Lainnya.  Penerbit PT. Gramedia, Jakarta.
Wijanarka. Arina, T.L dan Emi Y. 2001. Seleksi Khamir dan Optimasi Produksi Enzim Inulinase   Dari   Tanah   Sekitar   Umbi   Ketela   Rambat   ( Ipomoea   batatas )   di Daerah Bandungan Ambarawa. Penelitian BBI Dosen Muda 2001.
----------, Sri P. 2002. Isolasi Bakteri Termofilik Dalam Menghasilkan Enzim Inulinase Termostabil     Dari   Tanah   Sekitar   Umbi   Dahlia   ( Dahlia sp)   di   Daerah Bandungan Ambarawa. Penelitian Dosen Muda, 2002.
Hermin, P.S., Wijanarka, Endang  K dan Hermin P. 2003. Peningkatan Biosintesis Karotenoid   pada Phaffia   rhodozyma melalui   Fusi   Protoplas   dalam   Upaya Diversifikasi Pakan Buatan pada Sektor  Akuakultur. Penelitian Dasar, 2003.
Wijanarka,   Kusdiyantini   E.   dan   Hermin   P.S.   2004.  Fusi   Protoplas   Interspesifik Kluveromyces   marxianus dan Torulospora   pretoriensis Authotonuos   Untuk Produksi Enzim Inulinase Termostabil.  Penelitian Dasar, 2004.
Wijanarka , Arina   T.L.   dan   Hermin   P.S.   2004.   Fusi   Protoplas   Khamir   Inulinolitik Kluveromyces   marxianus dan Torulospora   pretoriensis Isolat   Lokal   Serta Aplikasinya Pada HFS.  Penelitian Terapan, 2005.
Xiao, R., M. Tanida and S. Takao.  1998. Inulinase from Crysosporium pannorum J.
Ferment. Technol. 66 (5) : 244 – 248
_________;   Tanida   M.   and   Takao   S.   1989.   Purification   and   Some   Properties   of Endoinulinase from Crysosporium pannorum J. Ferment. Bioeng 67 (4): 244