## Menara Perkebunan 2011, 79(1), 23-29
Optimasi produksi diasilgliserol dari crude palm oil menggunakan lipase spesifik 1,3-gliserida dari Rhizopus oryzae TP-2
Optimation of diacylglycerol production from crude palm oil using specific lipase of 1,3-glyceride from Rhizopus oryzae TP-2
SUHARYANTO *) , TRI-PANJI & Urip PERWITASARI
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jl. Taman Kencana No.1 Bogor 16151, Indonesia
Diterima tgl 9 Nopember 2010/Disetujui tgl 7 Pebruari 2011

## Abstract
Modern  lifestyle  caused  the  increasing  prevalence  of obesity  that  precedes  degenerative  disease  such  as  coronary cardiovascular  disease,  hypercholesterolemia,  stroke,  and diabetes mellitus. Use of healthy oil in the daily food diet could reduce the risk of the disease. One of healthy oils that proved to be  useful  for  human  health  is  diacylglycerol  (DAG). Unfortunately, production of DAG in Indonesia is hampered by the relatively high price of the lipase enzyme. To overcome the provision  of  costly  imported  lipase  in  producing  DAG,  a research  was  conducted  by  employing  crude  extract  of  lipase enzyme  from  an  indigenous  mold  namely Rhizopus  oryzae TP-2.  Crude  extract  of  lipase  enzyme  from  mycelium  culture filtrate  was  freeze  dryed  and  used  for  crude  palm  oil  (CPO) bioconversion  through  glycerolysis  at  various  process condition.    The  objective  of  this  research  was  to  determine optimum  variable  of  temperature,  incubation  time,  amount  of substrate and pH in producing DAG from CPO using lipase of R.  oryzae TP-2.  The  reseach  result  showed  that  lipase  from R. oryzae TP-2  was proved to be specific at  position of 1,3- glyceride  as  indicated  by  glycerolysis  products  i.e  DAG/TAG ratio 0.48 higher than that of FFA/TAG  ratio 0.06. Optimum conditions  for  glycerolysis  were  at  temperature  37 o C,  pH  7, 3  g  of  CPO  substrate,  and  18  hours  of  incubation  time.  DAG yield by this optimum condition reach as much as 20.76 % w/w . The lipase derived from this experiment produced DAG better than  that  of  using  imported  commercially  lipase  enzyme  of Rhizomucor meihei .
[ Keywords: Fatty acid, lipase enzyme, vegetable oil, Rhizopus oryzae , glycerolysis]

## Abstrak
Gaya  hidup  modern  telah  menyebabkan  meningkatnya kasus  kegemukan  yang  berdampak  timbulnya  berbagai penyakit  degeneratif  seperti  jantung  koroner,  hiper- kolesterolemia,  stroke  dan  diabetes  mellitus.  Penggunaan minyak sehat ( healthy oil ) sebagai menu diet sehari-hari dapat mengurangi  faktor  risiko  penyakit  tersebut.  Salah  satu  jenis minyak  sehat  yang  terbukti  berdampak  positif  pada  kesehatan manusia  adalah  diasilgliserol  (DAG).  Sayangnya,  produksi DAG  di  Indonesia  terkendala  oleh  mahalnya  enzim  lipase spesifik  1,3-gliserida  yang  masih  harus  diimpor.  Untuk mengatasi mahalnya enzim lipase impor dalam produksi DAG dari  CPO,  penelitian  penggunaan  ekstrak  kasar  lipase  dari kapang  lokal Rhizopus  oryzae TP-2  telah  dilakukan.  Ekstrak kasar  lipase  dari  filtrat  kultur  miselium R.  oryzae TP-2
dikeringbekukan  dan  digunakan  untuk  biokonversi  CPO melalui  proses  gliserolisis  pada  berbagai  kondisi  reaksi. Penelitian  bertujuan  menetapkan  peubah  suhu,  waktu,  jumlah substrat dan pH optimum dalam produksi DAG menggunakan lipase  dari R.  oryzae TP-2.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  enzim  lipase R.  oryzae TP-2  bersifat  spesifik 1,3-gliserida  yang  ditunjukkan  oleh  nisbah  DAG/TAG,  yaitu 0,48  lebih  besar  dari  nisbah  ALB/TAG  yaitu  sebesar  0,06. Kondisi optimum untuk gliserolisis CPO adalah waktu inkubasi selama 18 jam, suhu reaksi 37°C, jumlah substrat CPO 3 g, dan pH  reaksi  7.    Hasil  DAG    pada  kondisi  optimum  gliserolisis adalah 20,76 %. (b/b). Lipase R. oryzae TP-2 yang digunakan dalam penelitian ini menghasilkan DAG lebih tinggi dari pada lipase impor asal Rhizomucor meihei.
[Kata  kunci:  Asam  lemak,  enzim  lipase,  minyak  nabati, Rhizopus oryzae, gliserolisis]

## Pendahuluan
Produk  olahan  CPO  klasifikasi  khusus  seperti specialty  fats , confectionery  fat, dan  minyak  sehat ( healthy oil ) memiliki harga jauh lebih tinggi dibanding- kan dengan minyak makan ( cooking oil ) atau shortening . Salah  satu  jenis  minyak  sehat  adalah  diasilgliserol (DAG).  Meningkatnya  prevalensi  kegemukan  akibat tingginya  konsumsi  minyak  makan  di  berbagai  negara yang  memicu  penyakit  jantung  koroner,  stroke,  hiper- kolesterolemia  dan  diabetes  mellitus  telah  mendorong konsumsi  minyak  sehat  seperti  DAG  (Yasunaga et  al ., 2001).  Menurut  Yasunaga et  al .  (2001),  DAG dimetabolisme secara efisien oleh tubuh sebagai sumber energi sehingga mencegah akumulasi lemak dalam badan ( body  fat ).  Selain  itu  DAG  juga  dapat  menurunkan low density lipoprotein (LDL), trigliserida (TG) dan inhibitor plasminogen.  Selain  sebagai  minyak  sehat,  campuran DAG dan monoasilgliserol (MAG) juga dapat digunakan untuk surfaktan makanan (Andarwulan et al ., 2008) dan bahan anti mikroba (Nuraida et al ., 2008). Diasilgliserol dapat diproduksi secara kimiawi dari minyak atau lemak nabati  dengan  gliserol  pada  suhu  tinggi  (240-260 o C) menggunakan  katalis  anorganik  seperti  natrium hidroksida,  kalium  hidroksida,  atau  kalsium  hidroksida. Namun,  teknik  tersebut   memiliki  kelemahan,     yaitu
*) Penulis korespondensi: suharyanto_biotek@yahoo.com
Optimasi produksi diasilgliserol dari crude palm oil menggunakan lipase … ( Suharyanto et al.)
pemakaian  energi  yang  cukup  tinggi,  terbentuknya produk samping hasil reaksi peroksidasi dan polimerisasi yang  bersifat  toksik  bagi  kesehatan  manusia,  serta produk yang diperoleh berwarna gelap (Elisabeth et al ., 1999).
Selain itu, proses suhu tinggi akan merusak senyawa- senyawa minor dalam CPO seperti tokoferol, tokotrienol dan karoten. Untuk mengatasi hilangnya senyawa minor dalam  produksi  MAG  dan  DAG,  Hasanuddin et  al. (2003)  mengembangkan  proses  etanolisis  pada  suhu ruang.    Namun,  proses  pemecahan  ikatan  ester    pada minyak  dengan  proses  kimia  berlangsung  secara  acak sehingga  produk  DAG  murni  sulit  diperoleh. Penggunaan  CPO  untuk  produksi  DAG  memiliki keunggulan  karena  ketersediaan  CPO  di  Indonesia melimpah,  memiliki  kandungan  asam  lemak  tak  jenuh tunggal  (asam  oleat)  yang  tinggi  sehingga  cocok  untuk minyak  goreng,  mengandung  nutrisi  penting  seperti  β- karoten, vitamin E, dan tokotrienol.
Alternatif  lain  dalam  produksi  DAG  adalah  dengan proses gliserolisis enzimatik menggunakan lipase sebagai biokatalisator. Pemanfaatan enzim lipase sebagai katalis memiliki  beberapa  keuntungan,  yaitu  spesifitas  yang tinggi,  kondisi  operasional  pada  suhu  dan  tekanan  yang cukup  rendah,  biaya  pengolahan  limbah  yang  relatif lebih  murah,  dan  produk  yang  dihasilkan  lebih  aman. Lipase  berdasarkan  sifat  spesifitasnya  dibagi  dua  jenis yaitu non spesifik dan spesifik. Lipase non spesifik akan menghidrolisis  triasilgliserol  (TAG)  pada  ketiga  posisi ikatan  ester  sehingga  dihasilkan  asam-asam  lemak  dan gliserol. Lipase spesifik akan menghidrolisis ikatan ester pada  posisi  1,3    sehingga  hasil  yang  terbentuk  adalah asam  lemak,  monoasilgliserol  (MAG)  dan  diasilgliserol (DAG).    Lipase  banyak  ditemukan  di  alam,  baik  pada hewan,  tumbuhan,  maupun  mikroorganisme.  Sejumlah fungi  seperti Penicillium sp., Rhizomucor sp.  dan Aspergillus  niger diketahui  aktif  menghasilkan  lipase dalam substrat CPO (Ibrahim et al. , 1991). Harga lipase komersial  dari  fungi    relatif  mahal  karena  teknik produksi,  ekstraksi,  dan  isolasi  yang  cukup  rumit (Elisabeth et al . 1999).
Untuk  mengatasi  masalah  tersebut  diperlukan  suatu metode dalam memproduksi lipase dengan murah. Salah satunya  dengan  memfermentasikan  mikroba  tertentu yang mampu menghasilkan lipase. Tri-Panji et al . (2008) telah  memfermentasikan  CPO  dengan Neurospora sitophila dan  mampu  memproduksi  lipase  spesifik  1,3- gliserida. Kapang  lokal  jenis  ini  juga  dikenal  aman karena biasa digunakan dalam pembuatan oncom merah. Kapang lokal lain yang juga aman adalah Rhizopus yang dikenal  sebagai  jamur  tempe  kedelai.  Hasil  percobaan pendahuluan diketahui bahwa lipase dari Rhizopus lebih aktif  dari  pada  lipase  asal N.  sitophilla .  Penelitian bertujuan  untuk  menetapkan  kondisi  optimum  produksi DAG dengan ekstrak kasar lipase kapang lokal Rhizopus oryzae TP-2.

## Bahan dan Metode

## Bahan
Minyak  untuk  produksi  DAG  adalah  CPO  dari Pabrik  Kelapa  Sawit  (PKS)  Kertajaya,  PTPN  VIII, Banten  dan  tripalmitin  (Sigma). Rhizopus  oryzae TP2 untuk  produksi  lipase  adalah  isolat  koleksi  Balai Penelitian  Bioteknologi  Perkebunan  Indonesia  (BPBPI) yang dipelihara pada PDA miring dan diremajakan setiap tiga minggu.
Kondisi  kultur  dan  penyiapan    lipase  spesifik  1,3- gliserida
Kultur  kapang Rhizopus  oryzae TP2  dalam potato dextrose  agar (PDA)  miring  berumur  3-4  hari ditambahkan akuades steril 3 mL kemudian spora dikerik dan divorteks hingga diperoleh suspensi spora. Suspensi spora  diinokulasikan  dalam  200  mL  medium potato dextrose  broth (PDB)  yang  mengandung  CPO  2  %  dan diinkubasi  pada  suhu  ruang  (27-30 o C)  selama  lima  hari sambil  dikocok  dengan  kecepatan  75  rpm.  Setelah  lima hari, miselium dan spora dipisahkan dengan penyaringan menggunakan  kertas  saring  kasar  dan  filtrat  diambil sebagai  ekstrak  kasar  lipase.  Filtrat  dikeringbekukan ( freeze  dried )  untuk  mempertahankan  kestabilan  lipase. Sebanyak 7 g serbuk ekstrak enzim kasar diperoleh dari 500  mL  filtrat  yang  dikeringbekukan.  Serbuk  lipase kemudian  disimpan  dalam freezer sampai  diperlukan untuk bahan percobaan selanjutnya.

## Optimasi produksi DAG
Kondisi  optimum  produksi  DAG  dalam  medium gliserolisis  ditetapkan  secara  bertahap  meliputi  peubah waktu,  jumlah  substrat,  suhu  dan  pH.  Penetapan  waktu optimum  gliserolisis  dilakukan  pada  suhu  ruang  (28- 30 o C) dengan substrat tripalmitin 2 g,  pH 7, dan ekstrak kasar lipase 10 μL. Pemilihan tripalmitin sebagai substrat bertujuan untuk melihat spesifitas lipase yang dihasilkan oleh Rhizopus  oryzae TP-2.  Ekstrak  kasar  lipase disiapkan  dengan  melarutkan  serbuk  enzim  hasil pengeringan  beku  (0,05  g)  ke  dalam  1  mL  bufer  Tris- HCl  pH  7.  Penentuan  waktu  optimum  gliserolisis dilakukan  dengan  variasi  waktu  selama    3,  6,  24  dan 30 jam. Setelah reaksi gliserolisis selesai, sampel diambil dan dianalisis kadar TAG, DAG, MAG dan asam lemak bebas  (ALB).  Secara  teoretis  jika  nilai  perbandingan DAG/TAG  lebih  besar  dari  ALB/TAG  maka  lipase tersebut  spesifik  1,3-gliserida  (Tri-Panji et  al .,  2008). Waktu  optimum  produksi  DAG  digunakan  untuk penentuan  substrat  optimum  gliserolisis.    Penentuan substrat optimum dilakukan dengan variasi jumlah CPO sebanyak 1, 2, 3 dan 10 g. Penentuan pH optimum reaksi gliserolisis dilakukan dengan variasi pH 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 dan 8,0 dengan kondisi waktu dan konsentrasi substrat
Menara Perkebunan 2011, 79(1), 23-29
optimum.  Setelah  waktu,  konsentrasi  substrat,  dan  pH optimum  dari  reaksi  gliserolisis  diketahui,  tahap selanjutnya  adalah  penentuan  suhu  optimum.  Reaksi gliserolisis  dilakukan  lebih  tinggi  dari  suhu  ruang  yaitu 37 o C, 42 o C, dan 50 o C.

## Perbandingan keefektifan lipase lokal dan impor
Kondisi  optimum  gliserolisis  tersebut  selanjutnya digunakan  untuk  membandingkan  keefektifan  lipase isolat R.  oryzae TP-2  dengan  lipase  komersial  dari Rhizomucor  meihei (Sigma).  Larutan  lipase  disiapkan dengan melarutkan serbuk kering beku lipase (0,05 g) ke dalam  1mL  bufer  Tris  HCl  pH  7,0.  Reaksi  gliserolisis dilakukan  selama  18  jam,  suhu  reaksi  37 o C,  substrat CPO  3  g,  lipase  10  μL  gliserol  0,8  g,  pelarut  heksana 40 mL, bufer Tris-HCl pH 7,0 sebanyak 50 mL. Kontrol negatif berupa medium gliserolisis dengan kondisi yang sama  dengan  sampel,  namun  tidak  ditambah  dengan ekstrak enzim.

## Analisis TAG, DAG, MAG, dan ALB
Fraksi masa komponen TAG, DAG, MAG, dan ALB dari  reaksi  gliserolisis  dianalisis  dengan  metode  kroma- tografi  lapis  tipis  (KLT).  Lempeng  yang  digunakan adalah lempeng silika gel G 60.  Sebanyak 10 µL contoh ditotolkan  sedikit  demi  sedikit  ke  dalam  lempeng tersebut  dan  dielusikan  dengan  campuran  petroleum benzene:dietileter:asam asetat glasial (90:10:1). Lempeng  KLT  yang  sudah  dielusikan  dibiarkan mengering  terlebih  dahulu,  kemudian  visualisasi  noda dilakukan  dengan  menggunakan  uap  iodine.  Kristal iodine  dituangkan  ke  dalam  cawan  Petri  hingga  rata. Lempeng  KLT  yang  sudah  kering  diletakkan  di  atas cawan  Petri  selama  dua  menit  (hingga  terlihat  noda cokelat).  Noda  yang  terlihat  langsung  diberi  tanda menggunakan  pensil.  Noda  yang  terlihat  dijiplak menggunakan kertas HVS 80 g lalu ditimbang bobotnya. Fraksi masa komponen dihitung dengan persamaan:

## Hasil dan Pembahasan

## Optimasi waktu gliserolisis
Dalam  optimasi  waktu  gliserolisis,  percobaan  juga sekaligus mempelajari spesifisitas lipase yang dihasilkan oleh R.  oryzae TP2  menggunakan  tripalmitin  sebagai substrat.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  produk gliserolisis memiliki nisbah DAG/TAG sebesar 0,48 dan nisbah  ALB/TAG  sebesar  0,06.  Oleh  karena  itu  diduga kuat  lipase  yang  dihasilkan  oleh Rhizopus  oryzae TP2 merupakan  lipase  yang  spesifik  1,3.  Hal  tersebut  juga diperkuat  oleh  jumlah  MAG  dan  ALB  yang  tidak
semakin  tinggi,  dan  tidak  terbentuknya  gliserol  dengan pertambahan waktu inkubasi. Putranto et al . (2006)  telah mengidentifikasi  gen  lipase  dari Rhizopus  oryzae yang diharapkan  dapat  diklon  untuk  produksi  DAG.  Gen lipase  spesifik  1,3-gliserida  dari  tanaman  jarak  telah berhasil  diklon  oleh  Xiaohua et  al .  (2004).  Data  pada Gambar  1  menunjukan  bahwa  DAG  yang  diperoleh meningkat  waktu  inkubasi  3  jam,  6  jam,  dan  24  jam DAG  kemudian  turun  pada  jam  ke-30.    Peningkatan DAG  pada  inkubasi  jam  ke-6  sampai  jam  ke-24  relatif kecil.    Hal  tersebut  terjadi  karena  DAG  yang  sudah terbentuk dihidrolisis kembali oleh lipase menjadi MAG dan  ALB.  Jumlah  TAG  juga  menurun  setelah  tiga  jam, sampai dengan 24 jam inkubasi dan kembali meningkat pada  jam  ke-30.  Peningkatan  nilai  TAG  terjadi  karena kerja  dari  enzim  ini  dua  arah,  selain  menghidrolisis lipase  juga  dapat  melakukan  esterifikasi  (Turner et  al ., 2008).  ALB  yang  terbentuk  langsung  diesterifikasi kembali  membentuk  TAG.  Waktu  gliserolisis  optimum dipilih  selama  24  jam  dengan  pertimbangan  menghasil- kan DAG paling tinggi dan jauh lebih singkat dari pada yang  dilaporkan  Tri-Panji et  al. (2008)  menggunakan enzim  lipase  asal Neurospora  sitophila yaitu  10  hari. Namun, bila diperlukan peningkatan kapasitas produksi, waktu  inkubasi  kemungkinan  bisa  dipersingkat  hingga enam  jam.

## Optimasi jumlah substrat
Hasil penelitian menunjukkan bahwa dengan substrat 1,  2,  3,  dan  10  g  CPO  dapat  dikonversi  menjadi  DAG berturut-turut  sebesar  17,17;  16,15;  16,54  dan  3,75  %. Nilai  optimum  untuk  variasi  substrat  dipilih  3  g  karena jumlah  DAG  yang  terbentuk  (16,54  %)  jika  dikalikan dengan  konsentrasi  substrat  (3  g)  menghasilkan  bobot DAG  yang  paling  besar  (Gambar  2).  Gliserolisis menggunakan  substrat  CPO  menghasilkan  persentase DAG  lebih  kecil  dibandingkan  dengan  gliserolisis menggunakan  tripalmitin  sebagai  substrat.  Hal  tersebut mungkin disebabkan bervariasinya asam lemak penyusun trigliserida  CPO.  Oleh  karena  lipase  adalah  spesifik terhadap  jenis  asam  lemak  tertentu,  maka  hasil  DAG yang  diperoleh  dengan  substrat  CPO  lebih  kecil (Elisabeth et al . 1998).

## Optimasi suhu gliserolisis
Optimasi  suhu  gliserolisis  dilakukan  dengan menggunakan  waktu  dan  konsentrasi  substrat  optimum (inkubasi  selama  24  jam  dan  jumlah  substrat  3  g)  dan variasi  suhu  di  atas  suhu  ruang.  Hasil  DAG  tertinggi adalah  14  %    yang  diperoleh  pada  suhu  reaksi  42 o C (Gambar 3).  DAG yang diperoleh pada suhu 37 o C lebih sedikit  dibandingkan  dengan  DAG  yang  diperoleh pada  suhu  42 o C.  Sampai  batas  tertentu,  suhu  dapat mempercepat laju reaksi enzim.  Peningkatan suhu reaksi menjadi  50 o C  menghasilkan  DAG  kurang  dari  14  %. Menurut Daniel et al . (1995) penurunan aktivitas enzim
Fraksi masa komponen x (%) = Berat komponen x (g)
Berat komponen total (g)
X 100%
Optimasi produksi diasilgliserol dari crude palm oil menggunakan lipase … ( Suharyanto et al.)
Gambar 1. Produksi DAG dan kandungan TAG, MAG serta FFA pada berbagai waktu dengan substrat tripalmitin pada suhu ruang (28-30 o C)
Figure 1.  DAG production and content of TAG, MAG and FFA at various times with tripalmitin substrate at room temperature (28-30 o C)
Gambar 2. Produksi DAG dan kandungan TAG, MAG serta FFA hasil gliserolisis dengan variasi jumlah substrat CPO selama 24 jam dan suhu ruang (28-30 o C)
Figure 2. DAG  production  and  content of TAG, MAG  and  FFA from gliserolisis with variation in amount of  CPO as substrate for 24 hours at room temperature (28-30 o C)
Gambar 3.  Produksi DAG dan kandungan TAG, MAG serta FFA variasi suhu menggunakan substrat CPO (3 g) dan inkubasi selama 24 jam
Figure 3.  DAG production and content of TAG, MAG and FFA at various temperatures with CPO as substrate (3 g) and during 24 hours  incubation
Fra ksi m assa k om po ne n (% b/ b) Fra cti on o f m ass co m po ne nt (% w /w ) Waktu gliserolisis ( Duration of glyserolysis ), jam/ hour
DAG TAG MAG FFA Pe rs en Per cen tage (% ) jumlah substrat Amount of substrate TAG DAG MAG FFA Fra ksi m assa k om po ne n (% b/ b) Fra cti on o f m ass co m po ne nt (% w /w ) Suhu ( Temperature ),°C DAG TAG MAG FFA
Menara Perkebunan 2011, 79(1), 23-29
pada  suhu  tinggi  disebabkan  antara  lain  oleh  perubahan struktur  molekul  protein  dan  proses  autolisis.  Enzim yang  dihasilkan  oleh Rhizopus tidak  termostabil dikarenakan kapang ini  hidup pada suhu ruang.
Jika  waktu  inkubasi  diperpendek  menjadi  18  jam, jumlah  DAG  yang  didapat  menjadi  20,76  %  pada  suhu 37 o C,  15,78  %  pada  42 o C,  dan  14,23  %  pada  50 o C (Gambar  4).  Waktu  inkubasi  yang  diperpendek  dapat memperbesar  konsentrasi  DAG  diduga  karena  reaksi hidrolisis  CPO  lebih  lanjut  menjadi  MAG  dan  ALB dapat dikurangi. Hal ini akan memudahkan dalam proses pemisahan. Oleh sebab itu suhu gliserolisis 37 o C dipilih untuk  percobaan  selanjutnya.  Menurut  McNeilla  GP  & RG Bergera (1993) gliserolisis pada suhu 30-40 o C akan menyebabkan  sebagian  besar  asam  lemak  jenuh terkumpul pada fraksi MAG sehingga fraksi DAG akan berpeluang  mengandung  asam  lemak  tak  jenuh  yang lebih  tinggi.  Pahn et  al .  (1991)  melaporkan  bahwa gliserolisis  minyak  zaitun  dengan Chromobacterium viscosum optimum pada suhu 37 o C. Suhu optimum yang diperoleh  dalam  penelitian  ini  lebih  rendah  dari  pada suhu optimum yang dilaporkan Andarwulan et al . (2008) yaitu  60 o C  menggunakan  bahan  baku  RBDPO  ( refined bleach deodorised palm oil ) dengan proses enzimatis dan 120 o C dengan katalis alkali (Haryati et al ., 2008).

## Optimasi  pH
Setelah waktu, konsentrasi substrat, dan suhu reaksi gliserolisis dalam produksi DAG diketahui   (18 jam, 3 g, 37 o C),  percobaan  dilanjutkan  untuk  memperoleh  pH optimum.    Variasi  pH  diuji  di  atas  dan  di  bawah  pH netral (5; 6; 6,5; 7,5; dan 8). Dari semua variasi pH yang dilakukan tidak   diperoleh  kondisi  pH   optimum   yang melebihi  pH  7  (Gambar  5).  Reaksi  enzimatis  sangat dipengaruhi oleh pH. Konformasi enzim akan berubah
karena  adanya  peralihan  H + yang  menyebabkan perubahan  ionisasi  asam-asam  amino  penyusun  enzim (Price & Stevens, 1996).  Aktivitas lipase R. oryzae TP-2 adalah  pada  kisaran  pH  5,0-8,0.  Dalam  penelitian  ini kondisi reaksi dipilih pada pH 7,0 dengan pertimbangan reaktan tidak perlu ditera kembali.

## Efektivitas  lipase  lokal  dan  komersial  untuk  produksi DAG
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak lipase  spesifik  1,3-gliserida  dari  isolat  fungi  lokal  lebih efektif  dalam  produksi  DAG  jika  dibandingkan  dengan kontrol  positif  yang  menggunakan  lipase  impor  dengan spesifisitas sejenis (Gambar 6). Gliserolisis CPO dengan kondisi  optimum  (waktu  inkubasi  18  jam,  suhu  reaksi 37 o C, substrat CPO 3 g, dan pH reaksi 7)  menghasilkan 20,76  %  DAG.  Proses  gliserolisis  minyak  sawit  untuk menghasilkan  MAG  dan  DAG  dengan  lipase  Lipozyme IM  impor  telah  dipelajari  oleh  Elisabeth et  al .  (1999). Dengan lipase impor yang diproduksi dengan Rh. miehei , DAG yang dihasilkan adalah sekitar 16 %. Harga lipase impor  dari  fungi Rh.  miehei (Lipozyme  IM)  yang diproduksi  oleh  perusahaan  Novo,  Nordisk  Bioindustry Inc,  Denmark  sekitar  30  juta  rupiah  per  kg  (Sigma, 2008).  Tri-Panji et al . (2008) menggunakan lipase isolat lokal Neurospora  sitophila dengan  kondisi  optimum waktu  gliserolisis  10  hari,  suhu  40 o C,  pH  6,  dan    2  g CPO  memperoleh  DAG  sebesar  29  %.  Hasil  ini menunjukkan bahwa lipase dari isolat fungi lokal sangat prospektif untuk menunjang industri minyak sehat dalam negeri  berbahan  baku  CPO.  Kajian  perbesaran  skala percobaan,  pengembangan  teknologi  produksi  dan perhitungan  tekno-ekonomi  produksi  minyak  sehat  dari CPO  dengan  isolat  fungi  lokal  penghasil  lipase  perlu dilakukan.

## Gambar 4.  Produksi DAG dan kandungan TAG, MAG serta FFA variasi suhu reaksi menggunakan substrat CPO (3 g) dan inkubasi selama 18 jam
Figure 4.    DAG production and content of TAG, MAG and FFA at various temperature reaction using 3 g  CPO as substrate for 18 hours incubation time
Fra ksi m assa k om po ne n (% b /b ) Fra cti on o f m ass co m po ne nt (% w /w ) Suhu (Temperature) ,°C DAG TAG MAG FFA
Optimasi produksi diasilgliserol dari crude palm oil menggunakan lipase … ( Suharyanto et al.)
Gambar 5. Optimasi gliserolsis untuk produksi DAG pada suhu 37°C, selama 18 jam dengan 3 g substrat CPO  dalam berbagai variasi pH
Figure 5.  Optimization of glycerolysis with pH variation at 37 °C, using 3 g CPO as substrate for 18 hours in various seting of pH
Gambar 6. Perbandingan produk biokonversi CPO dengan lipase spesifik 1,3-gliserida dari fungi lokal ( R. oryzae TP-2 ) dan lipase impor ( Rh. meihei )
Figure 6.  Comparison of CPO bioconversion product  using specific 1,3- lipase diglyceride from local fungi (R. oryzae TP-2) and imported lipase (Rh. meihei)

## Kesimpulan
Lipase  dari  isolat R.  oryzae TP-2  bersifat  spesifik 1,3-gliserida.  Ekstrak  kasar  lipase  yang  telah  dikering- bekukan dapat digunakan untuk proses biokonversi CPO menghasilkan  20,76  %  DAG.  Kondisi    optimum  untuk gliserolisis  CPO  dengan  lipase R.  oryzae TP-2  yaitu dengan menggunakan jumlah substrat sebanyak 3 g, suhu reaksi pada 37 o C, pH netral dan inkubasi selama 18 jam.

## Ucapan Terima Kasih
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  atas  bantuan pendanaan  dari  DIPA  2009  melalui  Balai  Besar Penelitian  dan  Pengembangan  Bioteknologi  dan Sumberdaya  Genetik  Pertanian,  Kementerian  Pertanian sehingga penelitian ini dapat terlaksana dengan baik.

## Daftar Pustaka
Andarwulan  N,  P  Hariyadi,  T  Haryati  &  Anggirasti  (2008). Optimization of palm oil based emulsifier using enzimatic process. Dalam: Prosiding Seminar Tahunan MAKSI 2008. Bogor, Masyarakat Perkelapa-Sawitan Indonesia (MAKSI) & SEAFAST Center, IPB. p.189-190.
Daniel  RM,  HS  Toogood  &  PL  Bergquist  (1995). Thermostable proteases. Biotechnol Gen Engineer Rev 13,
51-100.
Elisabeth  J,  A  Jatmika  &  OP  Sitanggang  (1999).  Optimasi proses  gliserolisis  enzimatik  pada  minyak  sawit  untuk meningkatkan monogliserida. J Penelitian Kelapa Sawit 7
(3), 173-185.
Haryati  T,  N  Andarwulan,  P  Hariyadi  &  Achmad  Zaelani (2008). Optimization of mono and diacylglycerol palm oil based  emulsifier  using  response  surface  methodology.
Fra ksi m assa k om po ne n (% b/ b) Fra cti on o f m ass co m po ne nt (% w /w ) pH DAG TAG
tanpa lipase (K-)          lipase komersial (K+)        lipase hasil isolasi without lipase (K-) commercial lipase (K+) lipase resulted from isolation
Menara Perkebunan 2011, 70(1), 23-29
Dalam: Prosiding Seminar Tahunan MAKSI 2008. Bogor, Masyarakat  Perkelapa-Sawitan  Indonesia  (MAKSI)  & SEAFAST Center, IPB.  p 191-192.
Hasanuddin  A,  Mappiratu  &  GS  Hutomo  (2003).    Pola perubahan mono dan diasilgliserol dalam reaksi etanolisis minyak sawit mentah. J Tekn  Indust Pangan 14 (3), 241- 247.
Ibrahim  CO,  Noor  NJ  &  D  Ibrahim  (1991).  Isolation  and identification  of  an  exogenous  lipase  producing  fungi using palm oil medium. J Biosci 2, 56-59.
McNeilla GP &  RG Bergera (1993). Enzymatic glycerolysis of palm  oil  fractions  and  a  palm  oil  based  model  mixture: Relationship  between  fatty  acid  composition  and monoglyceride yield. Food Biotechnol 7 (1), 75 – 87.
Nuraida  L,  D  Anggraini,  I  S  Mintarti  &  T  Haryati  (2008). Kajian  aktivitas  antimikroba  monoasilgliserol  dan  mono- diasilgliserol  dari  minyak  kelapa  dan  minyak  inti  sawit. Dalam: Prosiding Seminar Tahunan MAKSI 2008 . Bogor,
Masyarakat  Perkelapa-Sawitan  Indonesia  (MAKSI)  & SEAFAST Center, IPB. p 204-214.
Pahn SC, SR Joon, K  Jae-Jin (1991). Continuous glycerolysis of  olive  oil  by Chromobacterium  viscosum lipase
immobilized  in  liposome  in  reversed  micelles. Biotechnol  Bioengin 38 (10), 1159–1165.
Putranto  RA,  D  Santoso,  Tri-Panji,  Suharyanto  &  A.Budiani (2006).  Karakterisasi  gen  penyandi  lipase  dari  kapang Rhizopus  oryzae  TP-2 dan Absidia  corymbifera.  Menara Perkebunan 74(1), 23-32.
Tri-Panji,  Suharyanto  &  Nining  Arini  (2008).  Lipase  spesifik 1,3-gliserida  dari  fungi  lokal  untuk  biokonversi  CPO menjadi  diasilgliserol. Menara  Perkebunan ,  2008,  76(1), 11-22.
Turner  C,  JW  King,  T  Mckeon    (2008).  Selected  uses  of enzymes  with  criticalfluids.  Diunduh  dari  http://pearl1. lanl.gov/external/c-cde/scf/pubs/king/190_enzyme_review .pdf  [18 Februari 2008]
Xiaohua  H,  CTurner,  G  Q  Chen,  Jiann-Tsyh  Lin  & TA  McKeon  (2004).  Cloning  and  characterization  of  a cDNA encoding diacylglycerol acyltransferase from castor bean. Lipid 39 (4), 311-318.
Yasunaga  K,  Y  Katsuragi  &  T  Yasukawa  (2001).  Nutritional characteristics  of  diacylglycerol .  In:  Proc  Internat  Palm Oil  Congress  Food  Technology  &  Nutrition  Conf , Malaysia 20-22 August 2001. p149-155.