Jurnal Ilmu dan Industri Peternakan pISSN 2355-0732, eISSN 2716-2222 http://journal.uin-alauddin.ac.id/index.php/jiip/index Volume 9 Nomor 2: 161-176, Desember 2023 DOI: https://doi.org/10.24252/jiip.v9v2. 40465
Efektivitas Kombinasi Ekstak Buah Merah ( Pandanus conoideus Lamk ) dan Air Kelapa Hijau Terhadap Kualitas Semen Sapi Bali Selama Simpan Dingin
Effectiveness of Red Fruit Extract (Pandanus conoideus Lamk) and Green Coconut Water Combination on Semen Quality of Bali Bull  During Cold Storage
Mohamad Ervandi 1 *, Susan Mokoolang 2 , Widiastuti Ardiansyah 2 dan Suci Ananda 3
1 Program Studi Manajemen Sumber Daya Hayati, Universitas Muhammadiyah Gorontalo
Jalan Prof. Dr. Mansoer Pateda, Pentadio Timur, Telaga Biru, Gorontalo 97181, Indonesia
2 Program Studi Peternakan, Universitas Muhammadiyah Gorontalo Jalan Prof. Dr. Mansoer Pateda, Pentadio Timur, Telaga Biru, Gorontalo 97181, Indonesia
3 Program Studi Peternakan, Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar Jalan H.M. Yasin Limpo No 36, Gowa Sulawesi Selatan 92113, Indonesia *Korespondensi E-mail: ervandi_husain@yahoo.co.id
Diterima 1 Agustus Mei 2023; Disetujui 1 Desember 2023

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  mengetahui  evektivitas  kombinasi  ekstak  buah  merah ( Pandanus conoideus Lamk ) dan air kelapa hijau terhadap kualitas semen sapi bali selama  simpan  dingin.  Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium  Lapang Program  Studi  Peternakan  Fakultas  Sains  dan  Teknologi  Universitas Muhammadiyah Gorontalo.  Semen yang digunakan berasal dari 2 ekor sapi bali umur  2-3  tahun  ditampung  2  kali  seminggu  .  Rancangan  penelitian menggunakan  Rancangan  Acak  Kelompok  (RAK)  dengan  4  Perkuan  dan  10 ulang    yang  terdiri  P0  (kontrol)  =  CEP-2  +  kuning  telur  10%,  P1  =  pengencer ekstrak  buah  merah  +  air  kelapa  +  kuning  telur  15%.  P2  =  pengencer  ekstrak buah merah + air kelapa + kuning telur 15%+ fruktosa 1 mg/ml. P3 = pengencer ekstrak buah merah + air kelapa + kuning telur 15% + fruktosa 2 mg/ml. Data yang  dihasilkan  akan  dianalisis  dengan  menggunakan  Analisis  Ragam . Hasil penelitian menunjukkan bahwa motilitas dan viabilitas terbaik pada P0 (42,41 ± 1.72%) dan (40,10 ± 1.12%) serta abnormalitas yang rendah <10% yang bertahan sampai hari ke-8 penyimpanan, kemudian disusul P2 (43,19 ± 1.34%) dan (47,22 ± 1.12%) serta abnormalitas dibawah  <14%. Setelah itu disusul P1 (42,26 ± 1.40%) dan (45,28 ± 1.19) serta  P3 (42,16 ± 1.37%) dan (43,44± 1.17%) masing-masing P1 dan P3 memiliki abnormalitas dibawah <14%. Kesimpulannya ketiga pengencer P1,  P2  dan  P3  mampu  mempertahankan  motilitas,  viabilitas  dan  abnormalitas sampai hari ke-5 setelah penyimpanan sehingga penggunaan kombinasi ekstrak buah merah dan air kelapa pada semen cair dapat digunakan untuk pelaksanaan IB di lapangan.
Kata kunci: Air Kelapa, Efektivitas, Ektrak Buah Merah, Kualitas Semen, Sapi Bali .

## ABSTRACT
The purpose of this study was to determine the effectiveness of the combination of  red  fruit  extract  ( Pandanus  conoideus  Lamk )  and  green  coconut  water  on  the quality of Balinese cattle semen during cold storage. This research was conducted at  the  Field  Laboratory  of  the  Animal  Husbandry  Study  Program,  Faculty  of Science  and  Technology  Muhammadiyah  University  of  Gorontalo.  Semen  used came  from  2 Balinese  cows  aged 2-3  years  accommodated  2  times  a  week.  The research design used a Randomized Group Design (RAK) with 4 conditions and 10 repetitions consisting of P0 (control) = CEP-2 + 10% egg yolk, P1 = diluent of red fruit extract + coconut water + 10% egg yolk. P2 = red fruit extract diluent + coconut water + egg yolk 10% + fructose 1 mg/ml. P3 = red fruit extract diluent + coconut  water  +  egg yolk  10%  +  fructose  2 mg/ml. The  data  generated  will  be analyzed  using  Analysis  of  Variance.  The  results  showed  that  the  best  motility and viability in P0 (42.41 ± 1.72%) and (40.10 ± 1.12%) and low abnormality <10% which lasted until the 8th day of storage, then followed by P2 (43.19 ± 1.34%) and (47.22 ± 1.12%) and abnormality below <14%. After that followed by P1 (42.26 ± 1.40%) and (45.28 ± 1.19) and P3 (42.16 ± 1.37%) and (43.44 ± 1.17%) each P1 and P3 had abnormalities below <14%. In conclusion, the three diluents P1, P2 and P3 were able to maintain motility, viability and abnormality until the 5th day after storage so that the use of a combination of red fruit extract and coconut water in liquid semen can be used for the implementation of IB in the field.
Keywords : Coconut Water, Effectiveness, Red Fruit Extract, Semen Quality, Bali Bull.

## PENDAHULUAN
Peningkatan  populasi  ternak  potong  khususnya  ternak  sapi  bali  sejauh  ini  sudah banyak  dilakukan  dengan  penerapan  teknologi  dibidang  reproduksi  ternak  salah  satunya adalah  Inseminasi  Buatan  (IB)  untuk  mempercepat  dan  memperbanyak  keturunan  secara efisien.  IB    merupakan  salah  satu  teknologi  yang  telah  terbukti  dapat  meningkatkan populasi ternak dan juga meningkatkan kualitas genetik khususnya ternak sapi di Indonesia (Yekti, et al ., 2018 ; Ervandi, et al., 2020; Istiqomah, dkk., 2023).
Namun  demikian,  yang  terjadi  saat  ini  pelaksanaan  IB  hanya  tergantung  pada ketersediaan  semen  beku  disebabkan  karena  tidak  semua  daerah  memiliki  nitrogen  cair karena  ketersediaan  nitrogen  cair  untuk  media  penyimpanan  semen  beku    yang  sulit didapat  dan  harganya  sangat  mahal  (Ervandi,  dkk.,  2022).  Susilawati,  dkk  (2016) menyatakan  bahwa  penggunaan  semen  beku  dalam  program  IB  terdapat  permasalahan yaitu  kurang  lebih  30%  spermatozoa  mati  pada  saat  pembekuan  serta  fertilitas  rendah.
Untuk  itu,  penggunaaan  semen  cair  berbahan  alami  dapat menjadi  solusi  alternatif  untuk bisa diaplikasikan didaerah pedesaan yang sulit akan ketersedian nitrogen cair.  Semen cair
memiliki  kelebihan  yaitu  tidak  rumit  dalam  proses  pembuatanya,  mudah  dilaksanakan pada  daerah  yang  tidak  ada  nitrogen  cair  persentase  motilitas  rata-rata  masih  diatas  40% dan kemampuan fertilitasnya yang tinggi (Dacosta, et al., 2016). Evektivitas semen cair lebih baik dibandingkan semen beku sehingga semen cair lebih sering digunakan (Kasminickham, et al., 2011).
Berbagai  bahan  pengencer  telah  ditemukan  dalam  perkembangan  oleh  beberapa peneliti  sebelumnya  dengan  teknik  pengenceran  semen  cair,  yang  berbahan  dasar  alami seperti  air  kelapa,  sari  wortel,  sari  buah  tomat,  kuning  telur,  madu,  filtrat  jambu  biji (Sumadiasa, et  al .,  2015  ;  Astuti,  2018  ;  Malik,  dkk.,  2018  ;  Marawali,  dkk.,  2019).  Namun kualitas  semen  yang  dihasilkan  rata-rata  bertahan  selama  rentan  3-4  hari.  Untuk  itu diperlukan pengencer kombinasi berbahan alami seperti buah merah dan air kelapa  yang mampu bertahan dalam jangka waktu yang lama dan menjaga kualitas semen tetap terjaga serta daya fertilitasnya tetap tinggi.
Sari buah merah mengandung αtokoferol, β-karoten, asam oleat, asam linoleat, asam linolenat, vitamin C, kalsium, fosfor, dan besi (Tethool, dkk., 2021 ; Nurcholisa, et al., 2021).
Tabatabaei, et al., (2011) melalui pemberian antioksidan seperti tokoferol, β-karoten maupun asam askorbat mampu memberikan perlindungan terhadap sel spermatozoa dari kerusakan morfologi  sel  yang  dapat  menyebabkan  abnormalitas  pada  sel  spermatozoa  dengan  cara mencegah efek buruk radikal bebas terhadap sel spermatozoa.
Air kelapa memiliki kandungan biokimiawi seperti glukosa, protein, lemak, vitamin C serta  antioksidan  yang  dapat  dijadikan  sebagai  bahan  pengencer  semen  untuk menggantikan  pengencer  yang  menggunakan  bahan  baku  sintetis  yang  tidak  menutup kemungkinan terpapar residu kimiawi yang bersifat reduktif bagi spermatozoa (Salim, dkk., 2019).  Beberapa  karbohidrat  sederhana,  mineral,  dan  zat-zat  lain  dalam  pengencer diperlukan  oleh  spermatozoa  dapat  dipenuhi  dari  air  kelapa  (Muhammad,  dkk.,  2019). Dengan  demikian  dapat  diperoleh  sebuah  terobosan  baru  untuk  menggantikan  bahan pengencer seman cair sintetis ke bahan pengencer berbasis bahan alami.
Berdasarkan pemikiran diatas, maka  penelitian untuk menguji  Efektivitas Kombinasi Ekstak  Buah  Merah  ( Pandanus  Conoideus  Lam )  dan  Air  Kelapa  Hijau  Terhadap  Kualitas Semen Sapi Bali Selama Simpan Dingin.

## MATERI DAN METODE

## Materi
Penelitian ini menggunakan semen sapi yang dikoleksi dari pejantan sapi bali berumur sekitar  2-3  tahun  yang  diperoleh  dari  Laboratorium  Lapang  Terpadu  Universitas Muhammadiyah Gorontalo. Semen yang digunakan memiliki kriteria motilitas massa ≥ ++, motilitas individu ≥ 70%. Frekuensi penampungan semen dua kali seminggu.

## Metode
Rancangan  penelitian  menggunakan  Rancangan  Acak  Kelompok  (RAK)  dengan  4 Perkuan  dan  10  ulang.  Pengelompokan  berdasarkan  waktu  penampungan  semen  yang berbeda. Sedangkan perlakuan terdiri dari : P0 (kontrol) = CEP-2 + kuning telur 10%. P1 = pengencer ekstrak buah merah + air kelapa + kuning telur 15%. P2 = pengencer ekstrak buah merah  +  air  kelapa  +  kuning  telur  15%+  fruktosa  1  mg/ml.  P3  =  pengencer  ekstrak  buah merah + air kelapa + kuning telur 15% + fruktosa 2 mg/ml.

## Pengencer Semen

## Pengencer Kombinasi Air Ekstrak Buah Merah dan Air Kelapa
Bahan  pengencer  ekstrak  buah  merah  dimana  buah  merah  ditimbang  100  gr, ditambahan  aquades  300  ml,  selanjutnya  dibelender  selama  5  menit,  kemudian  diamkan selama  2,5  jam  agar  cairan  mengendap  setelah  itu  disaring  menggunakan  kain  saring, penyaring dilakukan sebanyak 2 kali. Penyaring kedua menggunakan kertas saring sehingga diperoleh  ekstrak  buah  merah,  kemudian  dikombinasi  dengan  air  kelapa  hijau  yang berumur  7-8  bulan  sebelum  ditambahkan  dipanaskan  terlebih  dahulu  pada  suhu  50 0 C kurang lebih 20 menit agar dapat menonaktifkan enzim pada air kelapa (Muhammad, dkk., 2019) tidak lupa ditambahan fruktosa 10 dan 20 mg/ml, antibiotik peniciln 1 mg/ml, sorbitol g/L, streptomycin sulfate 1 mg/ml dan gentamicin 0,05 g/ml. Setelah pengencer kombinasi ekstrak  buah  merah  +  air  kelapa  dibuat,  untuk  penggunaan  selanjutnya  ditambahkan kuning telur sebagai pelindung membran. Bahan tambahan kuning telur akan ditambahkan ke pengencer ekstak  buah merah dengan konsentrasi 100%. Kemudian di stirer selama 30 menit  setelah  itu  disentrifius  dengan  kecepatan  1500  rpm  selama  30  menit.  Pengencer ekstrak buah merah + air kelapa dengan bahan tambahan kuning telur 15% disimpan dalam refrigerator suhu 3-5°C kemudian pengencer ekstrak buah merah+ air kelapa+kuning telur 15% siap untuk digunakan.

## Pengencer CEP-2+ Kuning Telur 10%
Pengencer CEP-2+ kuning telur 10% yang telah dikembangkan oleh  Verberckmoes at al., (2004) terdiri dari  NaCl 15 mmol/l, KCl 7 mmol/l, CaCl 2 (H 2 O)2 3 mmol/l, MgCl 2 (H 2 O)6 4  mmol/l,  NaHCO 3 11,9  mmol/l,  NaH 2 PO4  8  mmol/l,  KH 2 PO4  20  mmol/l,  Fruktosa  55 mmol/l,  Sorbitol  1  g/l,  BSA  2  g/l,  Tris  133,7  mmol/l,  gentamicin  0,05  g/l,  asam  sitrat  42 mmol/l.  Bahan-bahan  diperoleh  dan  dibuat  aliquot.  Osmolaritas  pengencer  sebesar  320 mOsm, dengan pH sedikit asam yaitu 6,6.

## Peubah Penelitian
Peubah  yang  diamati  adalah  motilitas,  viabilitas  dan  abnormalitas  sesuai  dengan perlakuan yang ada.

## Motilitas Spermatozoa
Motilitas spermatozoa diamati dengan meneteskan semen pada object glass , kemudian ditutup dengan cover glass , selanjutnya diamati di bawah mikroskop pada perbesaran 10 X 40 (Kusumawati, dkk., 2018). Menghitung motilitas spermatozoa berdasarkan rumus (Hafez and Hafez, 2008 ; Susilawati, 2011).
M = [(Y - X) / Y] x 100%
Keterangan: X = Spermatozoa tidak motil
Y = Konsentrasi total spermatozoa

## Viabilitas Spermatozoa
Viabilitas diamati dengan pewarnaan dengan eosin-negrosin . Semen diteteskan ke objeck glass .  Setelah  dihomogenkan,  Usap  menggunakan objeck  glass .  Mengeringkan  preparat menggunakan  pemanas  sampai  kering.  Mikroskop  digunakan  untuk  memeriksa  objek dengan pembesaran 10 X 40. Spermatozoa berwarna terang dianggap hidup serta merah tua dianggap  mati.  Jumlah  spermatozoa  hidup  dapat  dihitung  dari  200  pengamatan  sel spermatozoa serta hasilnya dinyatakan pada persentase (Hafez and Hafez, 2008 ; Susilawati, 2011).
𝑋 = 𝑎 𝑏 𝑥 100%
Keterangan : X = daya tahan hidup spermatozoa
a = jumlah spermatozoa hidup b = total spermatozoa diamati

## Abnormalitas Spermatozoa
Preparat  untuk  pengamatan  abnormalitas  seperti  preparat  pengamatan  hidup-mati yang diamati bentuk morfologinya. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop pemesaran 10 x  40. Hitung  jumlah  spermatozoa abnormal  dari  200  sel  spermatozoa,  hasilnya dinyatakan dalam persentase (Hafez and Hafez, 2008 ; Susilawati, 2011).
𝑦 = 𝑐 𝑑 𝑥 100%
Keterangan : y = abnormalitas spermatozoa c = jumlah spermatozoa abnormal,
d = jumlah spermatozoa diamati

## Analisis Data
Data  yang  dihasilkan  akan  dianalisis  dengan  menggunakan  Analisis  Ragam.
Selanjutnya  ababila  diantara  perlakuan  menunjukkan  perbedaan  nyata  atau  sangat  nyata, akan dilanjutkan dengan Uji Jarak Berganda Duncan (Duncan’s Multiple Range Test). Apabila perlakuan  pengencer  terbaik  antara  (CEP-2+Kuning  Telur  10%)  dan  (EBM+AK+ KT+Fruktosa) kemudian diuji menggunakan Pearson’s Chi Squar e dengan nilai harapan 40%
(Sudarwati, dkk., 2019).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik Semen Segar Sapi Bali
Kualitas  semen  segar  sapi  bali  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini  memiliki  motilitas diatas 70%. Kualitas semen segar yang diperoleh disajikan pada Tabel 1.
Pemeriksaan  semen  segar  secara  makroskopis  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini disajikan    pada  (Tabel  1)  didapatkan  rataan  volume  semen  sapi  bali  7,21  ±  0,66  ml  lebih tinggi dari hasil penelitian Fazrien, dkk., (2020) ;  Nabilla, dkk., (2018) yaitu  6,9±0,78 ml dan 6,44±0,23  ml.  Garner  dan  Hafez  (2008)  meyatakan  bahwa  volume  semen  sapi  dalam  satu ejakulasi yaitu sebesar 5-8 ml. Warna semen sapi bali yang dihasilkan  yaitu krem, hasil ini dikatagorikan baik dan juga normal. Susilawati, (2013) ; Feradis, (2010)  menyatakan bahwa semen  normal  berwarna  putih  kekuningan  (krem)  atau  putih  susu,  derajad  kekeruhan tergantung  pada  konsentrasi  spermatozoa.  Derajad  keasaman  (pH)  semen  sapi  bali  6,31  ± 0,06 lebih rendah dari hasil Yekti, dkk., (2018) ;  Dzulqarnain, dkk., (2022) 6,63 ± 0,08 dan 6,42 ± 0,23.
Tabel. 1. Kualitas Semen Segar Sapi Bali
Parameter Rataan ± SD Makroskopis Volume (ml) 7,21 ± 0,66 Warna Krem pH 6,31 ± 0,06 Aroma Khas Konsistensi Kental Mikroskopis Motilitas Massa 2+ Motilitas Individu (%) 74,50 ± 2,68 Viabilitas (%) 89,28 ± 2,48 Abnormalitas (%) Konsentrasi (10 7 /ml) 4,21 ± 0,26 1551,29 ± 26,90
Kualitas semen segar sapi bali memiliki konsisitensi kental. Ismaya, (2014) menyatakan bahwa konsistensi semen dapat diketahui dengan cara menggoyangkan tabung berisi semen secara  perlahan-lahan  dengan  memprediksikan  konsentrasi  spermatozoa  yaitu  1.000-2.000 juta/ml semen. Sudarmono, et al., (2015) meyatakan bahwa semen yang baik  memiliki poin penting  yang  harus  diperhatikan  yaitu  kondisi  semen  setelah  penampungan  pada  ternak sapi memiliki pH 6,45-6,57, konsentrasi 1223,7-1961,8, sedangkan motilitas individu 70% dan gerakan  massa  2+.  Secara  mikroskopis  rataan  motilitas  yang  dihasilkan  dikatagorikan menjadi dua yaitu motilitas massa dan motilitas individu. Motilitas massa sapi bali yaitu 2+, sedangkan motilitas individu 74,50 ± 2,68%.
Rataan  motilitas  massa  dan  individu  ini  tergolong  baik  dan  sudah  sesuai  standar. Susilawati  (2013)  menyatakan  bahwa  motilitas  semen  diatas  70%  lebih  bertahan  hidup dibanding  rendah  dibawah  70%.  Rataan  viabilitas  dan  abnormalitas  semen  sapi  bali mencapai 89,28 ± 2,48% dan 4,21 ± 0,26%. Persentase viabilitas dan abnormalitas semen segar sapi bali masih dalam kisaran normal dan tergolong tinggi sesuai dengan pendapat Garner dan  Hafez  (2008)  ;  Susilawati,  (2011)  bahwa  viabilitas  tergolong  baik  minimal  80%  dan abnormalitas semen tidak boleh melebih 20%. Berdasarkan pengamatan karakteristik semen segar  sapi  bali  dalam  penelitian  ini  memenuhi  syarat  kualitas  untuk  diproses  ketahap selanjutnya.

## Kualitas Semen Setelah Perlakuan
Rataan  Motilitas  Individu  semen  sapi  bali  setelah  perlakuan  tersaji  pada  Tabel  2.
Motilitas  individu  sapi  bali  memperlihatkan  daya  tahan  motilitas  individu  tertingi  pada pengencer P0 mencapai 8 hari dengan nilai 42,41 ± 1.72%, sedangkan pengencer P2 dengan nilai  motilitas    43,19  ±  1.34%  disusul  pengencer  P1  dan  P3  masing-masing  nilai  motilitas 42,26 ± 1.40% dan 42,16 ± 1.37% dengan rata-rata daya tahan motilitasnya hanya mencapai 5 hari.
Hasil analisis ragam menunjukkan perlakuan berbeda sangat Nyata (P<0,01) terhadap motilitas individu sapi bali pada hari ke- 5 sampai hari ke- 8 simpan. Uji Beda Nyata Terkecil diperoleh  hasil  perkuan  pengencer  P0  yang  terbaik  yaitu  42,41  ±  1.72%  sampai  hari  ke-  8. Hasil  ini  tidak  jauh  berbeda  dengan  Susilawati,  dkk.,  (2015)  penggunaan  pengencer CEP2+kuning telur 10% pada sapi Bali dapat bertahan hingga hari ke 7-8 dengan persentase motilitas sebesar 45,75±2,06%. Sedangkan untuk perlakuan P1, P2, dan P3 motilitas bertahan hingga  hari  ke-  5  masa  simpan.  Hal  tersebut  kemungkinan  disebabkan  karena  kombinasi ekstrak buah merah dan air kelapa mengandung tokoferol, β-karoten , kuning telur dan fruktosa dapat  memberikan  perlindungan  terhadap  membran  sel  spermatozoa  dari  kerusakan morfologi  sel  yang  dapat  menyebabkan  penurunan  kualitas  dan  mencegah  efek  buruk radikal  bebas  pada  sel  spermatozoa  selama  proses  pendiginan.  Hasil  ini  sesuai  pendapat Tabatabaei, et al., (2011) melalui pemberian antioksidan seperti tokoferol, β-karoten maupun asam askorbat mampu memberikan perlindungan terhadap sel spermatozoa dari kerusakan morfologi  sel  yang  dapat  menyebabkan  abnormalitas  pada  sel  spermatozoa  dengan  cara mencegah efek buruk radikal bebas terhadap sel spermatozoa.
Air kelapa memiliki kandungan biokimiawi seperti glukosa, protein, lemak, vitamin C serta  antioksidan  yang  dapat  dijadikan  sebagai  bahan  pengencer  semen  untuk menggantikan  pengencer  yang  menggunakan  bahan  baku  sintetis  yang  tidak  menutup kemungkinan terpapar residu kimiawi yang bersifat reduktif bagi spermatozoa (Salim, dkk., 2019). Selain itu, air kelapa mengandung zat-zat esensial seperti gula monosakarida, vitamin, mineral, dan asam amino yang dapat memperthankan motilitas sampai hari ke 3 (Yohana, et al., 2014). Susilawati (2011) menjelaskan bahwa fruktosa adalah gula dasar dari seminal.
Tabel 2. Rataan Motilitas Individu Sapi Bali Pada Berbagai  Kombinasi  Pengencer  Selama Pendinginan
Perlakuan Rata-rata Motilitas (%) ± SD H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 P0 (CEP-2 + KT 10%) 72,42 ± 1.24 65,55± 1.24 62,70 ± 0.92 59,51 ± 0.72 55,64 ± 0.82 b 50,03 ± 0.51 b 46,98 ± 1.10 b 42,41 ± 1.72 b 32,30 ± 0.21 b P1 (EBM+AK+KT 15%) 70,64 ± 1.81 65,54 ± 0.76 63,32 ± 0.78 51,14 ± 0.43 42,26 ± 1.40 a 23,06 ± 0.42 a 14,78 ± 0.21 a 10,28 ± 0.20 a 9,32 ± 0.00 a P2 (EBM+AK+KT 15%+ Fruk 1 mg/ml) 70,43 ± 1.21 64,5 ± 0.42 62,17 ± 0.54 53,57 ± 0.08 43,19 ± 1.34 a 27,21 ± 0.14 a 16,29 ± 0.11 a 13,41 ± 0.26 a 11,21± 0.00 b P3 (EBM+AK+KT 15%+ Fruk 2 mg/ml) 69,41 ± 1.21 67,4 ± 0.43 63,2 ± 0.54 45,61 ± 1.06 42,16 ± 1.37 a 20,28 ± 0.43 a 12,9 ± 0.21 a 10,51 ± 0.26 a 9,10± 0.00 a

## Keterangan : Superskrip pada baris dan kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01) antar perlakuan
Hasil  menunjukkan  bahwa,  spermatozoa  yang  disimpan  dalam  CEP2+kuning  telur 10%  mampu  menyediakan  lingkungan  yang  baik  bagi  spermatozoa  dan  melindungi membran  sehingga  permeabilitas  membran  tetap  normal  (Juniandri,  dkk.,  2014  ;  Ervandi, dkk.,  2020).  Kuning  telur  dalam  jumlah yang  seimbang dapat  menjaga  membrane  sel  dari kerusakan  ketika  pemerosesan  dan  penyimpanan  disuhu  dingin  dan  dapat  menjadi krioproktektan  ekstraseluler  karena  mengandung  lesitin  dalam  jumlah  yang  cukup (Sholikah, dkk., 2022  ;  Ervandi,  dkk.,  2013).  Kuning  telur  sebagai  bahan  kriproktektan ekstraseluler  berfungsi  sebagai  media  penyedia  makanan,  sumber  energy  dan  pelindung semen  dari cold  shock (Widiastuti, dkk., 2018).  Penambahan  kuning  telur  pada  pengencer CEP2  mampu  melindungi  spermatozoa  dari  ROS,  melindungi  integritas  membran  dan mempertahankan  keutuhan  ultrastruktur  membran  spermatozoa  (Ducha, et  al., 2013). Susilawati  (2011)  BSA  dan  kuning  telur  sebagai  komponen  makromelekul  yang  berperan dalam  melindungi  permeabilitas  dan  integritas  selubung  lipoprotein  penyusun  membran spermatozoa. Menurut Kurniawan, dkk.,(2013), motilitas spermatozoa terjadi karena adanya gerakan pada mikrorubulus yang dipacu oleh energy yang diproduksi di mitokondria yang menghasilkan ATP dan ADP.

## Tabel  3.  Rataan  Viabilitas  Spermatozoa  Sapi  Bali  Pada  Berbagai  Kombinasi  Pengencer Selama Pendinginan
Perlakuan Rata-rata Viabilitas Spermatozoa  (%) ± SD H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 P0 (CEP-2 + KT 10%) 71,62 ± 1.11 68,61± 1.10 66,36 ± 0.13 58,60 ± 0.36 54,17 ± 0.57 b 47,33 ± 0.12 b 45,60 ± 1.13 b 40,10 ± 1.12 b 37,14 ± 0.19 b P1 (EBM+AK+KT 15%) 70,33 ± 1.48 66,19 ± 0.17 65,32 ± 0.26 53,19 ± 0.10 45,28 ± 1.19 a 30,53 ± 0.20 a 25,37 ± 0.13 a 16,62 ± 0.30 a 10 ± 0.01 a P2 (EBM+AK+KT 15%+ Fruk 1 mg/ml) 70,42 ± 1.13 66,27 ± 0.42 65,36 ± 0.40 53,63 ± 0.12 47,22 ± 1.12 a 37,16± 0.07 a 27,53 ± 0.13 a 17,41 ± 0.03 a 12± 0.03 a P3 (EBM+AK+KT 15%+ Fruk 2 mg/ml) 70,31 ± 1.15 65,16 ± 0.48 64,12 ± 0.25 50,44 ± 1.10 43,44± 1.17 a 33,17 ± 0.36 a 22,13 ± 0.10 a 13,16 ± 0.13 a 9 ± 0.00 a

## Keterangan : Superskrip pada baris dan kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01) antar perlakuan
Rataan viabilitas  semen sapi bali setelah perlakuan tersaji pada Tabel 3. Viabilitas sapi bali memperlihatkan kemampuan daya tahan hidup tertinggi pada pengencer P0 mencapai 8 hari  dengan  nilai  40,10  ±  1.12%,  sedangkan  pengencer  P2  dengan  nilai  viabilitas  47,22  ± 1.12% disusul pengencer P1 dan P3 masing-masing nilai viabilitas 45,28 ± 1.19% dan 43,44± 1.17% dengan rata-rata daya tahan hidup spermatozoa mencapai 5 hari. Hasil analisis ragam menunjukkan  perlakuan  berbeda  sangat  Nyata  (P<0,01)  terhadap  daya  tahan  hidup spermatozoa sapi bali pada hari ke- 5 sampai hari ke- 9 simpan.
Hasil  ini  kemungkinan  disebabkan  karena  sifat fruktosa,  BSA, dan sorbitol yang terkandung dalam pengencer CEP-2 + kuning telur 10% ditambah lagi adanya kuning telur yang mengandung zat lipoprotein dan lesitin dapat mempertahankan kestabilan pH semen dan  juga  melindungi  spermatozoa  dari cold  shok pada  spermatozoa  sapi  bali  dengan  lama simpan mencapai 8 hari. Hasil ini lebih rendah dari penelitian Ducha, dkk., (2013) pengencer CEP-2 + kuning telur 10% mampu mempertahankan viabilitas spermatozoa sampai hari ke 8 dengan persentase 85,53± 6,83% masa penyimpanan.
Fruktosa  termasuk  sumber  energi  yang  sangat  baik  bagi  spermatozoa  dikarenakan jalur  metobolisme  yang  lebih  pendek  yaitu  melalui  proses  fruktoliasis  (Muhammad,  dkk., 2018).  Kombinasi  sari  buah  merah  dan  air  kelapa  dapat  mempertahankan  daya  hidup sepermatozoa  sapi  bali  sampai  hari  ke-5  masa  simpan.  Tabatabaei, et  al., (2011)
mengemukakan  bahwa  sari  buah  merah  mengandung  αtokoferol,  β-karoten,  asam  oleat, asam  linoleat,  asam  linolenat,  vitamin  C,  kalsium,  fosfor,  dan  besi.  Penggunaan air  kepala ( Cocos nucifera ) memiliki keunggulan  yaitu tidak berakibat toxic pada spermatozoa, bersifat buffering, dari segi biaya murah, praktis dan efektif  (Cardoso et al., 2005).
Kuning  telur  mengandung  asam  amino  dan  berperan  menjaga  interitas  selubung lipoprotein membrane sepermatozoa (Aboagla dan Terada, 2004). Senyawa lipoprotein yang terdapat dalam kuning telur berperan melindungi spermatozoa dari cold shock (Tarig et al., 2017). Sedangkan untuk perlakuan P1, P2, dan P3 viabilitas bertahan hingga hari ke- 5 masa simpan  dan  mengalami  penurunan.  Hal  ini  kemungkinan  penurunan  tersebut  disebabkan terjadinya  kerusakan  membrane  plasma  akibat  pengaruh cold  shock selama  penyimpanan pada suhu rendah (Pereira, et al., 2010) dan juga  disebabkan viabilitas spermatozoa selama penyimpanan disebabkan oleh meningkatnya jumlah spermatozoa rusak akibat kekurangan energy (Solihati, dkk., 2008).
Rataan  abnormalitas    semen  sapi  bali  setelah  perlakuan  tersaji  pada  Tabel  4. Spermatozoa  yang  mempunyai  penyimpangan  morfologi  berbeda  dari  spermatozoa  yang normal  disebut  abnormal  dan  akan  mempengaruhi  tingkat  fertilisasi.    Abnormalitas spermatozoa  sapi  bali  yang  memberikan  hasil  terbaik  pada  pengencer  P0  mulai  dari  ke-1 hingga  hari  ke-9,  kemudian  P2  disusul  P1  dan  P3.  Hasil  analisis  ragam  menunjukkan perlakuan  berbeda  sangat  Nyata  (P<0,01)  terhadap  abnormalitas  spermatozoa  sapi  bali selama simpan dingin. Rataan abnormalitas spermatozoa dikatagorikan normal. Arifiantini, dkk.,  (2005)  menyatakan  bahwa    semen  berkualitas  baik  memiliki  5-15%  spermatozoa abnormal, berbeda dengan pendapat, Ihsan (2009) spermatozoa abnormal tidak boleh lebih dari 20% untuk dapat dimanfaatkan untuk IB dan jika abnormal >20% maka daya fertilitas akan  berkurang.  Apabila  dilihat  dari  keseluruhan  perlakuan  P0,P1,  P2  dan  P3  bahwa peresentase  abnormalitas  penelitian  ini  masih  diaktogorikan  sangat  baik  karena  dibawah 20% hingga hari ke-9.
Abnormalitas  spermatozoa  merupakan  penyimpangan  morfologi  pada  kerangka normal  spermatozoa  (Adnyani  dkk.,  2018).  Struktur  sel  yang  menyimpang  atau  abnormal dapat  mengganggu  pembuahan  serta  menimbulkan  hambatan  pada  saat  fertilisasi  dan tingkat  implantasi  maupun  kebuntingan  akan  menurun  (Afiati  dkk.,  2015).  Abnormalitas rendah dimasing-masing perlakuan kemungkinan disebabkan karena adanya zat lipoprotein dan lesitin yang terkandung dalam kuning telur yang mampu mempertahankan  dan juga
melindungi  integritas  selubung  membrane  plasma  semen  dari cold  shock sehingga  dapat menekan kerusakan pada membrane plasma spermatozoa sapi bali.
Tabel  4.  Rataan  Abnormalitas  Spermatozoa  Sapi  Bali  Pada  Berbagai  Kombinasi  Pengencer Selama Pendinginan
Perlakuan Rata-rata Abnormalitas Spermatozoa  (%) ± SD H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 P0 (CEP-2 + KT 10%) 4,21 ± 0.10 b 4,31± 1.13 b 4,81± 0.19 b 5,60 ± 0.13 b 5,33 ± 0.21 b 5,51 ± 0.14 b 6,00 ± 1.66 b 7,13± 1.23 b 8,67± 0.15 b P1 (EBM+AK+KT 15%) 7,10 ± 0.32 a 7,22 ± 0.13 a 8,31 ± 0.44 a 9,65 ± 0.18 a 10,26 ± 1.20 a 11,53 ± 0.20 a 12,36 ± 0.22 a 13,88 ± 0.21 a 13.30 ± 0.74 a P2 (EBM+AK+KT 15%+ Fruk 1 mg/ml) 7,06 ± 0.14 a 7,82± 0.72 a 7,90± 0.11 a 8,76 ± 0.33 a 9,19 ± 0.55 a 10,42± 0.13 a 12,19 ± 0.11 a 13,10 ± 1.10 a 13,22± 0.77 a P3 (EBM+AK+KT 15%+ Fruk 2 mg/ml) 7,31 ± 0.59 a 7,82 ± 0.21 a 8,13 ± 0.17 a 9,66 ± 1.18 a 10,66± 0.54 a 12,83 ± 1.75 a 13,14± 0.12 a 13,260 ± 0.15 a 13,51 ± 0.55 a

## Keterangan : Superskrip pada baris dan kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01) antar perlakuan
Susilwati (2011) mengemukkan bahwa lipoprotein dan lesitin mampu mempertahakan dan  juga  merlindungi  membrane  spermatozoa  pada  proses  penyimpanan.  Peningkatan abnormalitas  terjadi  pada  P1,  P2,  dan  P3  kemungkinan  disebankan  karena  semakin  lama semen  disimpan  semakin  berkurang  ketersediaan  makanan  bagi  spermatozoa  sehingga terjadi  ketidak  seimabangan  teknan  osmotik  akbiat  dari  proses  metabolik  yang  terus belangsung  selama  proses  penyimpanan  (Manehat,  dkk.,  2021).  Herdis  (2006)  menyatakan bahwa  proses  pengolahan  dan  penyimpanan  akan  menyebabkan  perubahan  fisik  pada semen yang mempengaruhi motilitas spermatozoa.

## KESIMPULAN
Pengencer  CEP2+  KT  10%  memiliki  kualitas  lebih  tinggi  dengan  lama  simpan mencapai  8  hari  dengan  motilitas  individu  dan  viabilitas  42,41±1.72% dan  40,10±1.12% dengan abnormalitas <10 %. Kemudian disusul pengencer P2, P1 dan P3 baik tanpa fruktosa maupun  penambahan  fruktosa  mampu  mempertahankan  motilitas,  viabilitas  dan abnormalitas  sampai  hari  ke-5  setelah  penyimpanan  sehingga  penggunaan  kombinasi
ekstrak  buah  merah  dan  air  kelapa  pada  semen  cair  dapat  digunakan  untuk  aplikasi pelaksanaan IB di lapangan.

## DAFTAR PUSTAKA
Aboagla,  E.  M.  E.,  and  Terada,  T.  2004.  Effects  of  suplementation  of  trehalosa  extender containing  egg  yolk  with  sodium  dodecyl  sulfate  on  the  freezability  of  goat spermatozoa. Theriogenology, 45, 513 – 520.
Adnyani,  N.  L.  A.,  Sumardani,  N.  L.  G.   dan    Sarini,  N.  P.    2018.  pengaruh  lama  thawing pada  uji  kualitas  semen  beku  sapi  bali  produksi  UPT  BIBD  Baturiti  sebelum idistribusikan. Jurnal Peternakan Tropika , 6(3), 626-636.
Afiati,  F.,  Yulnawati,  M.  R.,  dan    Arifiantini,  R.  I. 2015.  Abnormalitas  spermatozoa  domba dengan frekuensi penampungan berbeda. Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon , 1(4), 930- 934.
Arifiantini, L., Yusuf, T.L. dan  Graha, N.  2005 . Longivitas dan recovery rate pasca thawing semen  beku  sapi  Friesian  Holstein  menggunakan  bahan  pengencer  yang  berbeda. Buletin Peternakan , 2(2), 57-61.
Astuti,  M.  E.  2018.  Pengaruh  penambahan  sari  buah  tomat  ( Solanum  lycopersicum )  sebagai pengencer  alami  terhadap  kualitas  penyimpanan  spermatozoa  sapi  bali  ( Bos sondaicus ). Bionature , 18(2), 129-139.
Azzahra,  F.  Y.,  Setiatin,  E.T.  dan    Samsudewa,  D.  2016.  Evaluasi  motilitas  dan  persentase hidup semen segar sapi PO Kebumen pejantan muda. Jurnal Sain Peternakan Indonesia , 11(2), 99-107.
Cardoso,  R.C.S.,  Silva,  A.R.  and  Silva,  L.D.M.  2005.  Use  of  the  powdered  coconut  water (ACP-106  ®)  for  cryopreservation  of  canine  spermatozoa. Animal  Reproduction ,  2(4), 257–262.
Dacosta,  N.,  Susilawati,  T.,  Isnaini,  N.  dan    Ihsan,  M.N.    2016.  Effect  of  different  dilution materials  usage  on  Indonesia  peranakan  ongole  bull  sperm  quality  during  cooling process. Indo American Journal of Pharmaceutical Scinc es, 3(4), 379-385.
Ducha, N., Susilawati, T., Aulannia’am, Wahjuningsih, S.  dan  Pangestu, M.  2013. Motilitas dan  viabilitas  spermatozoa  sapi  limousin  selama  penyimpanan  pada  refrigerator dalam pengencer CEP-2 dengan suplementasi kuning telur . Jurnal Kedokteran Hewan , 7(1),  5-8.
Dzulqarnain,  A.,  Saili,  T.,  dan  Rusdin,  M.  2022.  Kualitas  spermatozoa  sapi  bali  setelah preservasi  menggunakan  pengencer  tris  kuning  telur  dan  madu  dengan  level berbeda. Jurnal Ilmiah Peternakan Halu , 4(3),  236-242.
Ervandi,  M.,    Ihsan,  M.  N.,  Wahjuningsih,  S.,  Yekti,  A.P.A.    and  Susilawati,  T.    2020. Relationship  between  body  condition  score  on  the  service  per  conception  and conception rate of BX cows. Jurnal Ilmu-Ilmu Peternakan , 30(1), 80-85.
Ervandi,  M.,  Ardiansyah,  W.,  Reppi,  T.,  Mokoolang,  S.,  Korompot,  I.  dan  Pomolango,  R. 2022.  edukasi  masyarakat  peternak  dalam  pemanfaatan  teknologi  IB  untuk
Efektivitas Kombinasi Ekstak Buah Merah
mendukung  produksi  bibit  sapi  bali. HUIDU:  Jurnal  Pengabdian  Masyarakat Geoscience , 1(2), 73-79.
Ervandi, M., Ihsan, M. N., Wahjuningsih, S.  and  Susilawati, T.  2020. Pregnancy  rate and reproductive disorders examination of inseminated brahman cross by rectal palpation and ultrasonography. American Journal of Animal and Veterinary Sciences, 15(1), 73-80. Evandi,  M.,  Susilawati,  T.,  dan  Wahyuningsih,  S.  2013.  Pengaruh  pengencer  yang  berbeda terhadap kualitas spermatozoa sapi hasil sexing dengan gradien albumin (Putih Telur). Jurnal Ilmu Ternak dan Veteri ner, 18(3), 177-184.
Fazrien, W. A., Herwijanti, E., dan Isnaini, N. 2020. Pengaruh Perbedaan Individu terhadap Kualitas  Semen  Segar  dan  Beku  Pejantan  Unggul  Sapi  Bali. Jurnal  Sains  Peternakan, 18(1), 60-65.
Feradis. 2010. Bioteknologi Reproduksi pada Ternak . Alfabeta. Bandung Hafez, E.S.E., and Hafez, B. 2008. Follicullogenesis, Egg Maturation, and Ovulation. Reproduction in  Farm  Animal .  Edited  by  B.  Hafez,  and  E.S.E.  Hafez    7 th Edition.  Blackweell Publishing. USA
Herdis, M. Surachman, Rizal, M., Budiono, A., and Yulnawati. 2006. Pengaruh penambahan trehalosa dalam pengencer tris terhadap kualitas semen cair domba garut ( Ovis aries ). Jurnal Ilmiah Biologi Biosfera , 23 (1), 24 – 30.
Ihsan, N.M. 2009. Bioteknologi Reproduksi Ternak . UB Press. Malang Ismaya.  2014. Bioteknologi  Inseminasi  Buatan  pada  Sapi  dan  Kerbau .  Gadjah  Mada  University Press. Yogyakarta.
Istiqomah, H. N., Ervandi, M., Korompot, I., Repi, T., dan  Buhang, I.S. 2023. Kualitas semen beku sapi bali ( Bos sondaicus ) pada lama thawing yang berbeda di Dinas Pertanian Provinsi Gorontalo. Jurnal Ilmu dan Industri Peternakan , 9(1),  20-30.
Juniandri.,  Susilawati, T. ,  dan Isnaini, N. 2014.  Perbandingan  pengencer andromed  dan CEP-2    terhadap  kualitas    spermatozoa    sapi    hasil  sexing  dengan  sentrifugasi gradient densitas  percoll. Jurnal  Veteriner , 15(2), 252-262.
Kasimanickam,  R.,  Kasimanickam,  V.,  Tibary,  A.,  and  Pelzer,  K.  2011.  Effect  of  semen extenders  on  sperm  parameters  of  ram  semen  during  liquid  storage  at  4°C. Small Rumin Res. 99, 208-213.
Kurniawan,  I.Y.,  Basuki,  F.,  dan  Susilawati,  T.  2013.  Penambahan  air  kelapa  dan  gliserol pada  penyimpanan  sperma  terhadap  motilitas  dan  fertilitas  spermatozoa  ikan  mas ( Cyprinus carpio L ). Journal of Aquaculture Management and Technology , 2 (1), 51-65
Kusumawati, E. D., Rahadi, S., Santoso, S.  dan  Yulianti, D.L. 2018. Pengaruh lama thawing yang berbeda pada suhu 25°c terhadap kualitas semen beku sapi ongole. Jurnal Ilmu dan Teknologi Peternakan Tropis , 6(1), 119-123.
Malik, A., Fauzi,R., Zakir, M.I. dan Sakiman, S. 2018. Subtitusi madu asli pengganti gliserol dalam  pembekuan  pada  kualitas  pasca-thawing  spermatozoa  sapi  bali. Acta Veterianria Indonesian , 5(2), 98-104.
Manehat.,  Dethan,  F.  D.  dan  Tahuk,  A.A.  2021.  Motilitas,  viabilitas,  abnormalitas spermatozoa  dan  pH  semen  sapi  bali  dalam  pengencer  sari  air  tebu-kuning  telur yang  disimpan  dalam  waktu  yang  berdeda. Journal  Of  Tropic  Animal  Science  And Technology , 3(2), 76- 90.
Marawali, A., Abdullah, M.S., dan  Jalaludin, J. 2019. Efektivitas suplementasi filtrat jambu biji dalam pengencer air kelapa-kuning telur terhadap kualitas semen cair sapi bali. Jurnal Veteriner , 20(1), 20-29.
Mbaye, M.M., El Khalfi B., Addoum, B., Mar ,P.D., Saadani, B., Louanjli. N., and  Soukri, A. 2019. The effect of supplementation with some essential oils on the mobility and the vitality of human sperm. Hindawi e Scientific World Journal , 9 (1), 1-6.
Muhammad, D., Isnaini, N., Kuswati, Yekti, A. P. A.,  Aryogi, Lutfi,M.,  Lukman, H.Y.  dan Susilawati,  T.    2019.  Pengaruh  berbagai  formulasi  pengencer  dasar  air  kelapa terhadap  kualitas  semen  cair  sapi  PO  (Peranakan  Ongole)  selama  simpan  dingin. Jurnal Ilmu-Ilmu Peternakan, 29 (1), 1 – 8
Muhammad, D., Isnaini, N.,  Kuswati, Yekti, A. P. A.  Aryogi, Lutfi, M.,  Sunarto L. A. dan Susilawati, T.  2018. Pengaruh  Penambahan  Fruktosa dalam Pengencer Air Kelapa Hijau  Terhadap  Motilitas    Spermatozoa  Sapi  PO  (Peranakan  Onggole). Jurnal  Sain Peternakan Indonesia, 13 (4), 318-324
Nabilla, A., Arifiantini, R. I., dan  Purwantara, B. 2018. Kualitas semen segar sapi bali umur produktif  dan  non-produktif  serta  penentuan  konsentrasi  krioprotektan  dalam pengencer tris kuning telur. Jurnal Veteriner ,  19(2), 242–250.
Nurcholisa,  A.,  Furqonb,  Arifiantini, R. I.  and    Salamony,  S.  M.   2021.  Supplementation  of pandanus  conoideus  oil  in  cryopreservation  diluents  for  maintaining  the  semen quality of ongole grade bull. Tropical Animal Journal , 44(2), 146-151
Salim, M.A., Ihsan, M. N.,  Isnaini, N., dan Susilawati, T.  2019. Kualitas semen cair kambing boer  berbahan  pengencer  air  kelapa  muda  varietas  viridis  setelah  simpan  dingin. Jurnal Ilmu dan Teknologi Peternakan Topis ,  6(1), 78-84
Sholikah, N., Susilowati, S., Tribudi. Y.A., , dan Sulistyowaty,  D. 2022. Kualitas semen cair kambing  boer  dalam  pengencer  air  kelapa  muda  dengan  penambahan  sari  kedelai. Jurnal Veteriner , 23(2), 202-210.
Solihati, N., Idi, R., Rasad, S.D., Rizal, M. dan  Fitriati, M.  2008. Kualitas spermatozoa cauda epididimis sapi peranakan Ongole (PO) dalam pengencer susu, tris dan sitrat kuning telur pada penyimpanan 4-5°C. Animal Production , 10(1), 22-29. Sudarwati,  H.,  Natsir,  M.H.  dan  Nurgiatiningsih,  V.M.  A.    2019. Statistika  dan  Rancangan Percobaan  Penerapan  Dalam  Bidang  Peternakan .  Universitas  Brawijaya  (UB  Prees). Malang.
Sumadiasa,  I.  L.,  Susilawati,  T.,  Ciptadi,  G.,  and  Isnaini,  N.  2015.  The  potency  of  guava filtrate ( psidium guajava linn ) for preservation of bali bull spermatozoa. IOSRJournal of Agriculture and Veterinary Science , 8 (5), 51-57. Susilawati, T. 2011 . Spermatology . Universitas Brawijaya (UB Press). Malang. Susilawati, T. 2013. Pedoman Inseminasi Buatan pada Ternak. UB Press. Malang
Susilawati, T., Wahyudi, F. E.,  Anggraeni, I.,  Isnaini, N., dan Ihsan, M.N.  2015. Penggantian bovine  serum  albumin  pada  pengencer  cep-2  dengan  serum  darah  sapi  dan  putih telur  terhadap  kualitas  semen  cair  sapi  limousin  selama  pendinginan. Jurnal Kedokteran Hewan , 10 (1), 98-102
Susilawati,  T.,  Isnaini,  N.,  Yekti,  A.  P.  A.,  Nurjannah,  I.,  Errico,  E.,  dan  Dacosta.  2016. Keberhasilan inseminasi buatan menggunakan semen beku dan semen cair pada sapi Peranakan Ongole. Jurnal Ilmu-Ilmu Peternakan , 26 (3), 14–19.
Efektivitas Kombinasi Ekstak Buah Merah
Tabatabaei,  S.,  Batavani,  R.  and    Ayen,  E.    2011.  Effects  of  vitamin  c  addition  to  chicken semen on sperm quality during  in vitro storage of semen. Journal Veterinary Research Forum , 2(2), 103-11.
Tarig, A. A., Wahid, H., Rosnina, Y., Yimer, N., Goh, Y. M., Baiee, F. H.,  and Ebrahimi, M. 2017. Effect of different concentrations of soybean lecithin and virgin coconut oil in Tris-based  extender  on  the  quality  of  chilled  and  frozen-thawed  bull  semen. Veterinary World, 10(6), 672–678.
Tethool, A.N.,  Ollong, A. R., dan Koibur, J. F.   2021. Pengaruh sari buah merah ( Pandanus conoideus  lam )  terhadap  abnormalitas  spermatozoa  ayam  kampung. Jurnal  Ilmu Peternakan dan Veteriner Tropis (Journal of Tropical Animal and Veterinary Science) . 11(2), 92 – 98
Yekti,  A.P.A,  Kusumawati,  E.  D.,  Kuswati,  Ridhowi,  K.,  Sudarwati,  Isnaini,  N.,  and Susilawati,  T.  2018.  Succesfull  of  artificial  insemination  by  using  chilled  semen  on brahman cross cows . Proceedings of the 1st International Conference in One Health (ICOH 2017), 221–226.
Yohana, T.,  Ducha, N., dan Rahardjo. 2014. Pengaruh pengencer sintetis dan alami terhadap motilitas  spermatozoa  sapi  brahman  selama  penyimpanan  dalam  suhu  dingin. Lentera Bio , 3(3) , 261–265.