Menara Perkebunan , 2006, 74(1), 1-9
Ekspresi fenotipe gen APETALA1 kakao ( TcAP1 ) pada eksplan tembakau
Phenotypic expression of cacao APETALA1 (TcAP1) in tobacco explant
Tetty CHAIDAMSARI 1) , SAMANHUDI 2) , Asmini BUDIANI 1) , Roedhy POERWANTO 3) & Djoko SANTOSO 1*)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia,  Bogor 16151, Indonesia
2) Fakultas Pertanian - Universitas Sebelas Maret, Surakarta 57126, Indonesia
3) Fakultas Pertanian – Institut Pertanian Bogor,  Bogor, Indonesia

## Summary
APETALA1  (AP1) is  one  of  flowering identity  genes  that  determines  the  formation  of sepal  and  petal  tissues.  An AP1 homologue  was cloned  from  cacao  flowers  by  bio-techniques coupled  with  bio-informatics.  Examination  of phenotypic  expression  was  conducted  with transgenesis  of  the 35S-TcAP1 construct  using leaf  disk  technique  of  tobacco  leaf  explants mediated  by Agrobacterium  tumefaciens .  PCR specific  to TcAP1 demonstrated  that  the technique  is  effective  in  introducing  the 35S- TcAP1 construct  into  tobacco  plant  cells.  RT- PCR  with  total  RNA  from  the  leaves  of    the transgenic tobacco plantlets showed that expression levels of the TcAP1 events varied. The variation of the transcript levels was comparable to  the  morphological  phenotype  of  the  tobacco plantlets  grown in  vitro .  The  cultures  expressing TcAP1 at  moderate  levels,  have  developed  into intact plantlets and set up flowers in vitro .
[ Key words :  Early flowering, Nicotina tabacum , in vitro , Theobroma cacao L]
*) Penulis korespondensi, Tel.+62-251-324048 E-mail:djsantoso@yahoo.com

## Ringkasan
APETALA1 ( AP1 )  diketahui  merupakan salah  satu  gen  identitas  pembungaan  yang mengendalikan  terbentuknya  jaringan  sepal  dan petal.  Homolog AP1 telah  diklon  dari  organ bunga  kakao  ( TcAP1 )  dengan  kombinasi bio- techniques dan bio-informatics . Pengujian ekspresi fenotipe TcAP1 dilakukan dengan trans- genesis  konstruk  konstitutif  35S- TcAP1 meng- gunakan  teknik leaf  disk eksplan  daun  tembakau dan mediasi Agrobacterium tumefaciens . Pengujian  PCR  spesifik TcAP1 menunjukkan bahwa  teknik  tersebut  cukup  efektif  dalam mengintroduksikan  konstruk  35S- TcAP1 ke dalam sel tanaman tembakau. RT-PCR dari daun planlet tembakau transgenik membuktikan bahwa tingkat  ekspresi TcAP1 tersebut  bervariasi. Perbedaan  level  ekspresi TcAP1 ini  memberikan pengaruh  yang  nampak  sebanding  terhadap perkembangan  morfologis  planlet  tembakau in vitro .  Kultur yang mengekspresikan TcAP1 pada level sedang mampu beregenerasi menjadi planlet sempurna dan membentuk bunga in vitro .
Chaidamsari et al.

## Pendahuluan
APETALA1 adalah  gen  penyandi  faktor transkripsi  yang  dengan  atau  tanpa  gen pembungaan lainnya, berperan dalam transisi perkembangan vegetatif ke pembungaan (Pelaz et al. , 2001; Pena et al. ,
2001;  Putterill  e t  al. ,  2004).  Homolog  gen APETALA1 telah  berhasil  diklon  dari  organ bunga  kakao.  Pendekatan  bioinformatika yang  dikombinasikan  dengan  beberapa teknik  biologi  molekuler  terbukti  dapat digunakan untuk mengisolasi gen pembungaan  kakao full  length APETALA1 . Pendekatan  kloning  gen  relatif  lebih sederhana  daripada  cara  yang  umumnya digunakan,  misalnya  melalui  penapisan ( screening pustaka  cDNA).  Dengan  primer heterologous  yang  dirancang  berdasarkan sekuen  homolog  gen APETALA1 dari berbagai  spesies  yang  dapat  diakses  dari bank gen ( genebank ) melalui situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov atau http:// www.ebi.uk,  cDNA  homolog APETALA1 dapat  disintesa  dari  RNA  total  bunga  kakao dan  diamplifikasi  dengan  teknik  RT-PCR (Santoso, 2004).
DNA  amplikon  hasil  RT-PCR  tersebut terbukti  merupakan  homolog APETALA1 . Setelah  diklon  dengan  vektor-T,  sekuen keseluruhan  dari  DNA  hasil  PCR  tersebut, sekitar  900  pb,  dapat  ditentukan  dengan primer universal M13. Analisis Blast ( Basic Local Alignment Search Tool )  menunjukkan bahwa  sekuen  cDNA  tersebut  memiliki tingkat  homologi  yang  tinggi  dengan  gen APETALA1 dari  beberapa  spesies  tanaman (Claveri  &    Notredame,  2003;  Santoso, 2004). Untuk lebih memastikan identitas dan fungsinya,  homolog  gen APETALA1 dari kakao tersebut ( TcAP1 ), perlu diuji ekspresi dan  pengaruhnya  terhadap  perkembangan
organ reproduktif tanaman. Pengujian sema- cam  ini  biasanya  dilakukan  menggunakan tanaman  model Arabidopsis (Chaidamsari et  al. ,  2006).  Namun  karena  menumbuhkan tanaman Arabidopsis di  daerah  atau  ling- kungan  tropis  sangat  sulit,  maka  pengujian dilakukan  dengan  menggunakan  eksplan tanaman tembakau in vitro . Dengan teknik transformasi standar leaf disk ,  konstruk  ekspresi  gen TcAP1 di  intro- duksikan  ke  dalam  sel  tanaman  tembakau melalui Agrobacterium tumefaciens . Setelah inokulasi,  kultur  eksplan  diseleksi  pada medium  padat  yang  mengandung  dua  anti- biotika  penyeleksi  dan  anti A. tumefaciens, lalu  dilanjutkan  dengan  regenerasi  pada medium  yang  sama  dengan  antibiotika penyeleksi yang sama. Pengamatan terhadap perkembangan  eksplan  menunjukkan  bahwa eksplan transgenik yang membawa konstruk TcAP1 secara  morfologi  berbeda  dengan eksplan kontrol non-trangenik.

## Bahan dan Metode

## Modifikasi dan transformasi genetik
Konstruk  ekspresi  pada  tanaman  dari gen TcAP1 dibuat  dengan  meligasikan promoter  konstitutif  35S  CaMV  di  ujung 5’ dan  terminator  Nos  di  ujung  3’  dari  gen tersebut.  DNA  untuk  ligasi  ini  sebelumnya dipotong dengan enzim endonuklease restriksi  yang  sesuai.  Untuk  keperluan transformasi, secara umum konstruk tersebut diposisikan  di  antara  batas  kanan  (RB)  dan batas  kiri  (LB)  dari  vektor  transformasi biner.  Vektor  rekombinan  yang  diperoleh dimasukkan  ke  dalam  sel A.  tumefaciens , galur  AGL0  kompeten  dengan  cara  elektro- forasi  (Chaidamsari,  2006).  Untuk  menye-
Ekspresi fenotipe gen APETALA1 kakao…
leksi  dan  mengkonfirmasi A.  tumefaciens yang  positif  membawa  konstruk  ekspresi TcAP1 dilakukan  PCR koloni dengan primer spesifik TcAP1 pada beberapa koloni bakteri yang tumbuh pada medium seleksi . Transformasi  genetik TcAP1 ke  dalam sel tanaman  model dilakukan  dengan  teknik leaf  disk yang  dimodifikasi  dari  Saint et  al . (1994) sebagaimana diuraikan dalam Santoso et  al. (2000). A.  tumefaciens yang membawa  konstruk  35S- TcAP1 ditumbuh- kan  dalam  medium  cair  Luria–Bertani  (LB) yang mengandung kanamisin 25 ppm selama 24 – 48 jam pada suhu 28 o C dengan pengo- cokan  150  rpm  dalam  keadaan  gelap. Setelah  diencerkan  100  –  1000  kali  dengan medium yang sama, A.  tumefaciens tersebut dikulturkan  kembali  selama  sekitar  tiga  jam pada kondisi yang sama. Potongan-potongan eksplan  daun  tembakau,  (diameter  0,5  – 1,0  cm)  diinkubasi  selama  15  menit  dengan kultur cair A. tumefaciens dengan pengenceran sepuluh kali. Ko-kultivasi pada medium  MS  padat  yang  mengandung acetosyringon  100  ppm  dilakukan  selama dua  hari.  Setelah  itu  dilakukan  seleksi  pada medium MS padat dengan timentin 100 ppm atau  cefotaxime  250  ppm  dan  25  ppm kanamisin.

## Kultur jaringan
Kultur jaringan untuk regenerasi planlet tembakau  dilakukan  dengan  metode  standar melalui  organogenesis.  Potongan  eksplan daun  steril  dikulturkan  pada  medium  MS padat  yang  mengandung  BAP  0,5  ppm (Murashige  &  Skoog,  1962).  Kultur  di- inkubasi  pada  suhu  26  –  28 o C  dengan  lama penyinaran  16  jam  per  hari.  Subkultur  ke medium segar dilakukan setiap 4 – 6 minggu sekali.  Kultur  eksplan  transgenik  dilakukan
dengan  metode  dan  kondisi  yang  sama dengan  non-transgenik  kecuali  komposisi medium.  Untuk  seleksi  dan  kultur  eksplan transgenik,  ke  dalam  medium  tumbuhnya ditambahkan  antibiotika  penyeleksi  yang sesuai,  yaitu  kanamisin  25  ppm  dan cefotaxime 250 ppm. Perkembangan morfo- logi  planlet  diamati  dua  kali  seminggu selama masa percobaan.

## Polymerase chain reaction (PCR)
PCR  dilakukan  untuk  mengetahui  ke- beradaan  gen  target.  Dalam  hal  ini  untuk mengetahui  apakah  planlet  transgenik  yang diregenerasikan  dari  eksplan  yang  telah diinokulasi dengan A. tumefaciens pembawa konstruk  35S- TcAP1 .  Campuran  pereaksi PCR  mengandung  DNA  cetakan  ( template ) sebanyak 1 – 10 ng, keempat dNTP masing- masing  0,2 µ M,  sepasang  primer  DNA spesifik TcAP1 masing-masing  sebanyak 20  –  100  nM,  Polimerase  DNA  Taq  1  –
2,5  Unit.  Reaksi  dilakukan  dengan  volume
25  atau  50 µ L  dan  program  termal  sebagai berikut:  denaturasi  pada  suhu  94 o C  selama 30  detik,  pemasangan  penempelan  pada suhu  50 o C  selama  30  detik,  ekstensi  pada suhu  72 o C  selama  dua  menit,  dan  ulangan 35  siklus.  Hasil  PCR  diperiksa  meng- gunakan  gel  agarosa  konsentrasi  0,7  –  1% yang telah diberi etidium bromida (Sambrook et al. , 1989).

## Reverse Transcriptase (RT)-PCR
Untuk  analisis  RT-PCR  dilakukan  satu rangkaian   percobaan  yang    terdiri   dari preparasi  mini  RNA  total,  sintesis  utas pertama cDNA dan PCR menggunakan utas tunggal  cDNA  sebagai  cetakan.  RNA  total diisolasi  dari  daun  tembakau  dengan  kit
Chaidamsari et al.
RNeasy  dari  QIAGEN  GmbH  (Hilden, Germany)  menggunakan  100  mg  contoh daun  dari  kultur in  vitro .  Kualitas  dan kuantitas RNA  total  yang diperoleh  ditentu- kan  dengan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang  230,  260  dan  280  nm,  juga dengan elektroforesis gel agarosa.
Sintesis  utas  pertama  cDNA  dilakukan dengan  kit  dari  Invitrogen  (CA,  USA). Reaksi  berlangsung  dengan  volume  50 µ L pada  suhu  42 o C  selama  50  menit  dan dengan  RNA  total  sebanyak  1 µ g.  Tahapan lainnya  dilakukan  sebagaimana  diuraikan dalam Instruction  Manual yang  diberikan bersama  dengan  kit.  Sebanyak  1 µ L  hasil sintesis  utas  pertama  cDNA  ini  digunakan sebagai template dalam  reaksi  PCR.  Reaksi PCR  dilakukan  dengan  kondisi  dan  cara sebagaimana  diuraikan  di  atas.  Sedangkan primer  yang  digunakan  dirancang  dari sekuen TcAP1 dengan  ukuran  amplikon sekitar 400 pb.

## Hasil dan Pembahasan
Pengalaman  sebelumnya  membuktikan bahwa metode transformasi genetik tanaman sebagaimana  diuraikan  dalam  Bahan  dan Metode, memiliki efektivitas yang baik pada tanaman  tembakau.  Pada  percobaan  ini, sekali  lagi  transfer  DNA  ke  dalam  sel tanaman tembakau  terbukti. Hasil pengujian PCR  spesifik TcAP1 menggunakan  cetakan DNA genomik planlet tembakau transgenik, memberikan  amplikon  DNA  dengan  ukuran sesuai  dengan  jarak  kedua  primer  spesifik yang  digunakan.  Adapun  ketebalan  ampli- kon  tersebut  bervariasi  dan  secara  umum tidak  setebal  kontrol  positifnya  yaitu plasmid rekombinan yang membawa konstruk  35S- TcAP1 (Gambar  1).  Variasi
intensitas  amplikon  ini  kemungkinan  terkait dengan  kualitas  ataupun  kuantitas  DNA cetakan. Kemungkinan masih adanya kontaminan  yang  dapat  menghambat  reaksi PCR  menyebabkan  amplifikasi  tidak  ber- langsung  optimal.    Kemungkinan  lainnya adalah  di  dalam  larutan  DNA  templat, terutama  yang  dari  tanaman  tembakau, terdapat  kontaminan  RNA  dalam  jumlah yang  bervariasi.  Dengan  demikian  planlet tembakau  transgenik  yang  mengekspresikan RNA TcAP1 memberikan  amplikon  yang lebih  banyak  dari  pada  yang  ekspresinya lemah.  Apapun  kemungkinannya,  data  ini jelas  menunjukkan  bahwa  dengan  cara transformasi  sebagaimana  diuraikan  dalam Bahan  dan  Metode,  konstruk TcAP1 telah masuk  ke  dalam  menjadi  planlet.  Setelah konstruk  35S- TcAP1 terakuisisi  masuk    ke dalam genom tembakau, pemeriksaan selanjutnya    adalah   menguji    apakah gen
Gambar  1.  Pengujian  PCR  spesifik TcAP1 terhadap  DNA  genomik  planlet tembakau.  Lajur  1,  2,  3  dan  4–8 secara  berurutan  adalah  marker DNA, DNA tembakau non- transgenik,  plasmid  rekombinan dan DNA tembakau transgenik.
Figure 1. PCR examination of transgenic tobacco using TcAP-specific primers. Lanes  1,2,3  and  4-8  are  DNA ladder,  non  transgenic  control, recombinant  plasmid  and  trans- genic tobacco respectively.
1      2        3        4       5       6       7      8
bp 400 350

## Ekspresi fenotipe gen APETALA1 kakao…
tersebut  terekspresi  di  dalam  sistem  inang yang  baru.  Pengujian  ini  bisa    dilakukan  di tingkat  molekuler,  morfologis,  atau  kom- binasinya.  Ekspresi  gen TcAP1 dalam  sel tanaman  tembakau  diharapkan  dapat  meng- hasilkan protein faktor transkripsi yang aktif sehingga  memberikan  pengaruh  positif  ter- hadap perkembangan morfologis dari planlet yang  mengekspresikannya.  Hasil  pengamat- an perkembangan tembakau transgenik, dua- tiga  bulan  setelah  transformasi  disajikan pada  Gambar  2.  Paling  tidak  ada  dua fenotipe  morfologis  yang  penampakan-nya berbeda  dengan  adanya  transgen TcAP1 . Pertama  adalah  planlet  transgenik  yang memiliki daun terbelah (Panel B). Tipe yang kedua  memiliki  struktur  seperti  kuntum bunga  yang  bergerombol  (Panel  C).  Pada Arabidopsis ,  aktivitas AP1 dalam  mem- pengaruhi  perkembangan  tanaman  terjadi
melalui  proses  prenilisasi  (Yalovsky et  al ., 2000).
Penampakan  fenotipe  yang  bervariasi ini  kemungkinan  terkait  dengan  level ekspresi  transgen TcAP1 .  Hal  semacam  ini terjadi dengan ekspresi ektopik dari AGAMOUS pada  tanaman  model Arabi- dopsis  thaliana (Kitahara et  al. ,  2004; Chaidamsari et  al. ,  2006).  Planlet tembakau yang  memiliki  daun  terbelah  kemungkinan mengekspresikan TcAP1 pada  level  sedang, atau  yang  cukup  sekedar  memberikan dampak perubahan morfologis yang sedang- sedang  saja.  Sementara  pada  kultur  trans- genik  yang  menghasilkan  struktur  seperti “dompolan”  kuntum  bunga,  kemungkinan karena  ekspresi  yang  tinggi  dari TcAP1 . Sebagaimana  disebutkan  bahwa  gen  pem- bungaan AP1 menginduksi  ekspresi  gen LEAFY (Putterill et al. , 2004). Overekspresi
Gambar 2. Morfologi kultur planlet tembakau setelah transformasi genetik. Panel A, B dan C masing-masing adalah  planlet   kontrol non-trangenik,  transgenik umur  2,5  bulan   dengan  helai  daun  terbelah (perubahan ringan), dan struktur mirip kuncup bunga (perubahan berat).
Figure 2. Tobacco   plantlets    regenerated   after  the  genetic   transformation. Panels A, B  and C are  non- transgenic plantlet, 2.5-month-old transgenic  plantlets with splitted  leaf (minor change), and with infloresence like structure (severe change) respectively.
A B C
Chaidamsari et al.
TcAP1 menyebabkan ekspresi NtLFY terinduksi  yang  pada  akhirnya  memberikan perkembangan morfologis yang unik tersebut.  Sementara  itu,  pecobaan  ekspresi ektopik dari gen AtLFY mampu menginduksi terbentuknya  struktur  seperti  bunga  pada kultur eksplan in vitro (Wagner et al. , 2004). Sementara  itu LEAFY yang  merupakan pengendali  transisi  dari  perkembangan vegetatif  ke  pembungaan  juga  menginduksi gen AP1 (Wagner et  al. ,  1999).  Saling induksi  inilah  yang  mungkin  menjadi pemicu  terbentuknya  struktur  mirip  bunga meskipun dalam kultur in vitro . Untuk  membuktikan  bahwa  perubahan morfologis  tersebut  terkait  dengan  tingkat ekspresi  transgen TcAP1 ,  dilakukan  peng- ujian RT-PCR menggunakan primer spesifik TcAP1 terhadap  transkrip  masing-masing kultur  planlet  tersebut.  Hasil  pengujian ekspresi (Gambar 3) mengindikasikan
bahwa  terdapat  hubungan  positif  antara tingkat perubahan morfologis planlet transgenik  dengan  tingkat  ekspresi  transgen TcAP1 .  Pada   sample  dari  tembakau  non-
transgenik,  tidak  diperoleh  pita  DNA  hasil RT-PCR. Sementara itu pada sampel planlet transgenik  dan  kontrol  positif,  PCR  meng- gunakan  templat  rekombinan  35S- TcAP1 , diperoleh  hasil  RT-PCR  yang  relatif  kuat. Adanya  diferensiasi  intensitas  pita  DNA hasil  PCR  diduga  kuat  terkait  dengan perbedaan level transkrip gen target, TcAP1 . Dalam beberapa hal, RT-PCR termasuk cara yang  mudah  untuk  menguji  tingkat  ekspresi gen yang telah diketahui sekuen nukleotida- nya, misalnya gen TcAG (Chaidamsari et al. , 2006)  dan  gen LEAFY  COTYLEDON 2 ( LEC2 ) Arabidopsis (Stone et al. , 2001). Berfungsinya TcAP1 di  dalam  sistem interaksi  dan  ekspresi  di  tembakau,  dapat dijelaskan  secara  empiris  maupun  melalui analisis  kemiripan  sekuen  gen  pembungaan antar  spesies  tanaman.  Sebagai  salah  satu keluarga  gen MADS-BOX, AP1 dari berbagai  spesies  tanaman,  memiliki  tingkat kemiripan  sekuen  yang  tinggi,  termasuk antara TcAP1 dengan NtAP1 .  Secara empiris,  fungsionalitas  ini  dapat  dikaitkan dengan  ekspresi  transgen  di   dalam  inang
Gambar 3. Hasil RT-PCR spesifik TcAP1 dengan RNA total  daun  planlet tembakau. Lajur 1, 2 dan 7 adalah penanda bobot molekul  kontrol   negatif   planlet non-transgenik, dan  kontrol positif rekombinan 35S- TcAP1 . Lajur 3-6  adalah  dari  tembakau  transgenik  dengan perubahan morfologis ke kanan semakin kuat
Figure 3.   Result of RT-PCR specific to TcAP1  using  total  RNA  from  tobacco leaves. Lanes 1, 2 and 7 are DNA ladder, negative control of  non-transgenic, and  positive control of  35S-TcAP1 DNA. Lanes 3-6 are from transgenic plantlets with morphological changes more severe to the right.
1        2           3          4          5          6         7 349 400 bp

## Ekspresi fenotipe gen APETALA1 kakao…
yang  baru.    Ekspresi  gen  pembungaan AP1 dan LEAFY dari Arabidopsis pada  tanaman yang  secara  kekerabatan  cukup  jauh,  jeruk, memberikan  pengaruh  terhadap  perkem- bangan bunganya (Pena et al. , 2001). Tanaman  jeruk  memiliki  masa  TBM ( juvenile )  yang  panjang.  Organ  reproduktif- nya tidak terbentuk hingga tanaman berumur antara  6  dan  20  tahun,  tergantung  spesies- nya. Konstruksi konstitutif dari gen AtLEAFY atau AtAP1 ,  yang  merupakan penginduksi  pembungaan  pada Arabidopsis , telah ditransformasikan dan diekspresikan di kecambah  jeruk.  Kedua  jenis  jeruk  trans- genik  menghasilkan  bunga fertile dan  buah dini  pada  tahun  pertama.  Selanjutnya, ekspresi AP1 tersebut  sama  efisiensinya dengan LFY dalam  inisiasi  bunga,  tidak berdampak  abnormalitas  pada  perkem- bangannya.  Kedua  jenis  tanaman  transgenik tersebut  juga  tetap  berbunga  pada  tahun- tahun berikutnya, dan respons pembungaan- nya  dipengaruhi  oleh  faktor  lingkungan. Selain  itu,  bibit  biji  yang  berasal  dari tanaman  transgenik  memiliki  masa  TBM
yang  sangat  pendek,  membuktikan  bahwa fenotipe  yang  terekspresi  tersebut  bersifat stabil dan menurun ( inheritance ). Hasil-hasil ini membuka peluang baru dalam pemuliaan ( genetic  improvement )  tanaman  tahunan (Pena et al. , 2001). Perkembangan in  vitro selanjutnya  dari planlet  tembakau  transgenik  menegaskan bahwa TcAP1 yang  diekspresikan  secara konstitutif  pada  level  sedang  (yang  sesuai) mempercepat  pembungaan  pada  planlet  uji tersebut.    Pada  subkultur  yang  kedua  atau pada  umur  planlet  sekitar  3,5  bulan,  pada ujung  planlet  terbentuk  kuncup  bunga tembakau  (Gambar  4).  Pembungaan  dini  ini terjadi  pada  planlet  yang  daunnya  nampak sedikit  terbelah  atau  yang  ekspresi TcAP1 terjadi  pada  level  yang  sedang.  Sementara itu, pada kultur transgenik yang ekspresinya TcAP1 tinggi  belum  terjadi  perubahan pertumbuhan  lanjutan.  Dalam  keadaan  dan cara  subkultur  yang  baku,  pembungaan tembakau in  vitro ini  hampir  tidak  pernah terjadi.  Atas dasar  hasil  pengamatan  ini  dan apa yang dilaporkan oleh Pena et al. (2001),
Gambar 4. Planlet   tembakau 3,5 bulan in vitro . Panel A  adalah  tembakau   kontrol   non-transgenik, dan B adalah tembakau transgenik 35S- TcAP1 yang berbunga secara dini.
Figure 4.  Tobacco    plantlets  of  3.5-month-old in vitro . Panel A  is  non-transgenic tobacco, and B is early, flowering transgenic   tobacco of 35S-TcAP1.
B A
Chaidamsari et al.
dapat  dikatakan  bahwa  interaksi  antara faktor  transkripsi AP1 dengan  faktor  atau protein pembungaan terkait lainnya, memiliki  spesifisitas  yang  relatif  luas. AP1 dari spesies tanaman tingkat rendah Arabidopsis dapat  berfungsi  menginduksi pembungaan  pada  spesies  tanaman  tahunan seperti  jeruk,  demikian  sebaliknya AP1 dari spesies  tanaman  tahunan  kakao  dapat berfungsi  pada  spesies  yang  lebih  kecil seperti tembakau. Sementara itu kultur yang mengoverekspresikan TcAP1 secara  konsti- tutif,  level  ekspresinya  terlalu  tinggi,  tidak dapat beregenerasi menjadi planlet sempurna (gambar tidak ditunjukkan).
Hasil  penelitian  molekuler  tentang  gen TcAP1 dan  pengujian  fungsinya  ini  mem- buka  peluang  perbaikan  sifat  agronomis tanaman  tahunan.    Dengan  mengover- ekspresikan  gen APETALA  1 pada  tanaman tahunan  target,  diharapkan  dapat  membuat tanaman  tersebut  berbunga  lebih  cepat. Dengan  demikian  masa  TBM  (tanaman belum  menghasilkan)  tanaman  tersebut menjadi  lebih  pendek.  Overekspresi  dapat dilakukan  melalui  transgenesis  dengan  gen AP1 dari  spesies  tanaman  model  seperti Arabidopsis  thaliana (Pena et  al .,  2001) ataupun tanaman tahunan seperti Theobroma cacao sebagaimana  dilaporkan  melalui tulisan ini.

## Kesimpulan
Transformasi  eksplan  daun  tembakau dengan konstruk 35S- TcAP1 melalui Agrobacterium  tumefaciens ,  memberikan tingkat  ekspresi TcAP1 dan  perubahan morfologis yang bervariasi. Ekspresi konstitutif TcAP1 pada level sedang mampu menginduksi  pembungaan in  vitro pada planlet  tembakau  transgeniknya.  Sedangkan
ekspresinya  yang  terlalu  tinggi  menyebab- kan  proses  regenerasi  terganggu  sehingga planlet sempurna tidak terbentuk.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini dibiayai oleh Proyek Riset Unggulan Terpadu Internasional (RUTi) dari Kementerian  Negara  Riset  dan  Teknologi  – Indonesia, tahun anggaran 2003 – 2005.

## Daftar Pustaka
Chaidamsari, T., Samanhudi, H. Sugiarti, D.  Santoso,  G.C.  Angenent  &    R.A.  de Maagd  (2006).  Isolation  and characterization of  an AGAMOUS homologue  from  cocoa.
Plant Sci., 170, 968-975.
Claveri, J.M. & C. Notredame (2003).
Bioinformatics  For  Dummies.  2 nd ed.,  Wiley
Publishing, Inc., New York, pp 215-238.
Kitahara  K.,  Y.  Hibino,  R.  Aida,  S.  Matsumoto (2004).  Ectopic  expression  of  the  rose
AGAMOUS-like
MADS-box genes 'MASAKO  C1  and  D1'  causes  similar homeotic transformation of sepal and petal in Arabidopsis and sepal in Torenia. Plant Sci., 166, 1245-1252.
Murashige,  T.  &  F.  Skoog  (1962).  A  revised medium  for  rapid  growth  bioassays  with tobacco  tissue  culture. Physiol.  Plant., 15,
473-497.
Pelaz,  S.,  C.  Gustafson-Brown,  S.E.  Kohalmi, W.L.  Crosby  &  M.  F.  Yanofsky  (2001) APETALA1 and SEPALLATA3 interact  to promote flower development. The Plant J.,
26, 385-394.
Pena,  L., M.  Martín-Trillo,  J.  Juárez,      J.A.  Pina,
L. Navarro & J.M. Martínez-Zapater ( 2001).

## Ekspresi fenotipe gen APETALA1 kakao…
Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALA1 genes in citrus reduces their generation time. Nature Biotechnol., 19, 263-267.
Putterill,  J.,  R.  Laurie  &  R.  Macknight  (2004).  It's time  to  flower:  the  genetic  control  of flowering time. BioEssays , 26, 1-11.
Saint,  S.L.,  K.K.  Oduro  &  D.B.  Furtek    (1994) Genetic  transformation  of  cocoa  leaf  cells using Agrobacterium  tumefaciens.  Plant Cell Tiss. & Org. Cult., 37, 243-251.
Sambrook.  J,  EF  Fritsch  &  T  Maniatis  (1989)
Molecular  Cloning,  a  Laboratory  Manual, Book  1  and  2 ,  2 nd ed.  New  York,    Cold Spring Habor Laboratory.
Santoso,  D.,  F.I.  Cugito  &  H.  Minarsih  (2000).
Development  of  tobacco  plant  cells  in  the presence  of  kanamycin  at  various  levels  for transgenesis. Menara  Perkebunan, 68, (1), 21-28.
Santoso,  D.  (2004). Molecular  and  genetic engineering  studies  toward  improvement  of
cacao  bean  production. RUTi  Annual  Report 2004 . IBRIEC, Bogor, 54p.
Stone,  S.L.,  L.W.  Kwong,  K.M.  Yee,  J.  Pelletier, L.C. Lepiniec, R.L. Fischer, R.B. Goldberg & J.J.  Harada  (2001). LEAFY  COTYLEDON2 encodes a B3 domain transcription factor that induces  embryo  development. PNAS, 98,
11806-11811.
Wagner, D., R.W. M. Sablowski & .M. Meyerowitz (1999). Transcriptional activation of
APETALA1 by LEAFY . Science, 285, 582- 584.
Wagner,  D.,  F.  Wellmer,  K.  Dilks,  D.  William, M.R.Smith,  P.P.  Kumar,      J.L.  Riechmann, A.J. Greeland &     E.M. Meyerowitz (2004). Floral induction in tissue culture: a system for the  analysis  of LEAFY -dependent  gene regulation. The Plant J., 39, 273-282.
Yalovsky, S., M. Rodríguez-Concepción, K. Bracha, G.  Toledo-Ortiz  &  W.  Gruissem  (2000). Prenylation  of  the  floral  transcription  factor APETALA1 modulates  its  function .  Plant Cell, 12, 1257-1266.