## ISOLASI, SELEKSI BAHAN  PEMBAWA  DAN  FORMULASIINOKULUM
Thiobacillus spp.
Isolation,  Carriers Selection and Inoculum Formulation of Thiobacillus spp.
Fahrizal Hazra II daD EDDY  Widyati 21
1) Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan,  Fakultas Pertanian IPB,  Kampus IPB  Darmaga-Bogor 2) Peneliti pada Pusat Penelitian dan Pengembangan Hutan dan Konservasi Alam, JI. Raya Gunung Batu - Bogor.

## ABSTRACT
One of problems in international trading of coal is  high content of suljur.  B iodesuljuration of coal using Thiobacillus spp is recognized as the most environmentally friendly to reduce the content.  This research was aimed to collect and to isolate Thiobacillus spp from coal,  acid mine drainage,  ex-coal mining soil and agriculture soil,  on selected media.  Colonies growing on the media were re-isolated for further characterization to find the most similar to Thiobacillus spp.  In  this experiment,  the selected  isolate  (5, J 0,  20,  50,  and J 00  ml)  was  cultured  in  100  g  of coal  dust,  rice  husk  charcoal,  wood charcoal,  and activated  charcoal,  to find  an  appropriate  inoculum for  coal  desulJuration.  To  observe  their  survival  rate,  they  were  re- isolated onto  10 ml Thiobacillus  broth  medium.  The  re-isolations  were  observed at the 7, 14,  21  and 28 days  of incubation. The  results  showed that  ThiobaciIlus  spp  was found only  in  acid mine  drainage.  After characterization,  the  isolates  were strongly similar to  Thiobacillusferrooxidans.  The most proper inoculum was  100 ml culture ofThiobacillus in  100 g rice husk charcoal.  It had 100% survival rate after 20 days  cultured in that carrier.
Key  word: Thiobacillus spp., acid mine drainage,  inoculum formulation.

## PENDAHULUAN
Batubara  yang  ditambang  di  beberapa  lokasi  di Indonesia  mempunyai  kandungan  sulfur  yang  tergolong tinggi.  Hal  ini  akan  memberikan  dampak  negatif terhadap Iingkungan,  antara  lain  ketika  dibakar  akan  melepaskan sulfur ke  udara.  Apabila  sulfur tersebut  berreaksi  dengan oksigen  di  udara  akan  menjadi  sulfur  dioksida  yang merupakan  salah  satu  gas  penyebab  hujan  asam. Oleh karen a  itu  perlu  dilakukan  upaya  untuk  menurunkan kandungan  sulfur dalam  batubara tersebut.  Salah  satu  cara untuk  mengatasi  masalah  ini  adalah  dengan  memanfaatkan kerja  dari Thiobacillus  spp  yang  mampu  menurunkan kandungan  sulfat  dalam  batubara  melalui  proses  oksidasi menjadi bentuk sulfat (Brock and Medigan,  1991).
Thiobacillus spp merupakan  bakteri yang hidup secara aerob,  suka  kondisi  asam (acidophilic)  dan  menggunakan sumber energi  dari  oksidasi  sulfur dan  sumber karbon  dari CO 2 (kemolitotrof) (Soepandi,  1991).  Disamping oksidasi sulfur  beberapa  kelompok Thiobacillus  juga  mampu menggunakan  sumber  energi  dari  proses  oksidasi  ferro menjadi  ferri. Karena  sumber  energi  dan  karbon  yang diperlukan  seperti  tersebut  di  atas, thiobacillus  dapat ditemukan  pada  tanah  bekas  tambang  batubara,  pada batubara,  pada  air  asam  tambang,  pada  tanah  pertanian
Tabel I. Komposisi  Medium  Cair dengan Garam  Ferro (gil)
Bahan K2HP04 (NH4)2S04 Ca(N03)2 MgS04. 7 H20 KCI FeS04  7 H20 Sumber:  Nurseha (2000) Medium 1 pH 3.5 0.05 0.15 0.01 0.50 0.05 1.00
yang mempunyai kandungan besi tinggi, pada tanah gambut dan  pada  tanah  sui fat  masam  (Widyati,  2003). Hasil eksplorasi  mikrob  yang  bermanfaat  (Hazra,  2005)  dapat dikoleksi  dan  digunakan  sesuai  dengan  kegunaannya  serta dapat  dikembangkan  untuk  proses-proses  bioremediasi. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat Thiobacillus  spp.  dan  formulasi  inokulum  untuk biodesulfurisasi batubara.

## BAHAN DAN METODE
Isolasi Thiobacillus spp.
Sampel  batubara,  air asam  tambang (Galian  Pit  Barat dan Timur/GBB dan  GPT)  dan  tanah bekas tambang batubara  diambil  dari  lokasi  penambangan  batubara  PT Bukit  Asam  (Sumatera  Selatan),  sedangkan  tanah  sawah diambil  dari  Subang  dan  Cianjur  (Jawa  Barat). Dari sampel-sampel  tersebut  selanjutnya  diisolasi  pada  media selektif untuk  bakteri Thiobacillus  spp.  dengan  komposisi yang  disajikan  pada  Tabel  I,  di  mana  terdapat  perbedaan kandungan  garam  ferro  (Nurseha,  2000). Setelah  semua bahan  dicampur  selanjutnya  dilakukan  sterilisasi  dengan otoklaf pada suhu  121 DC  tekanan I atm selama 15  menit.
Medium 2 pH 3.5 0.50 3.00 0.01 0.50 0.10 10.00 Medium 3 pH 2.5 0.50 3.00 0.01 0.50 0.10 3000 Hazm,  F. dan E. Widyati. 2007. Isolas,  seleksi karir dan formulasi  inokulum Thiobacillus spp./. Tanah  Lingk.,  9 (2):71-76
Setelah  media  siap  selanjutnya  diambil  sam pel  tanah sebanyak  10  gram  sedangkan  sampel  air  diambil  10  ml kemudian  dimasukkan  ke  dalam  90  ml  larutan  fisiologis steril  (0,85%  NaCI)  dan  dikocok  selama  15  menit. Kemudian campuran tersebut didiamkan  untuk  memisahkan endapannya. Tahapan  selanjutnya  diambil  I  ml  dari masing-masing  larutan  dan  dimasukkan  ke  dalam  masing- masing media di atas.  Kultur tersebut kemudian diinkubasi pada  shaker  dengan  kecepatan  250  rpm  pada  suhu  kamar. Pertumbuhan  thiobacillus  ditandai  dengan  berubahnya wama medium  menjadi kuning karat.
Karakterisasi dan seleksi isolat
Karakterisasi isolat yang dilakukan meliputi pewamaan  Gram. Pewamaan  ini  digunakan  untuk menentukan sifat dinding sel  bakteri  dan  bentuk sel  bakteri. Karakter  lain  yang  dipelajari  pada  penelitian  ini  adalah  pH tempat  bakteri  tersebut ditemukan,  kebutuhan  akan  mineral ferro  dan  nitrogen. Data  yang  didapat  selanjutnya dibandingkan  dengan  sifat-sifat  bakteri Thiobacillus pada Iiteratur.
Seleksi  isolat  dilakukan  melalui  pertumbuhan  bakteri pada  media  yaitu  dilakukan  pengukuran  kerapatan  sel bakteri  dengan  menghitung  kerapatan  optik (optical density) dengan  spektrofotometer. Optical  density diukur dengan  nilai  absorbansi  pada  panjang  gelombang  yang menunjukkan  nilai  absorbansi  maksimum. Pengukuran dilakukan tiap hari selama  12  hari  inkubasi.
Formulasi inokulum
Untuk  memudahkan  aplikasi  di  lapangan  maka  perlu dilakukan  pembuatan  inokulum. Inokulum  merupakan
isolat  bakteri  yang  dikultivasikan  pada  media  pembawa (karier),  sehingga  perlu  dilakukan  seleksi  karir yang paling tepat  bagi  bakteri  terse but. Pada  penelitian  ini  dicoba beberapa  karir  yaitu  arang  sekam,  arang aktif,  arang kayu, serta  serb uk  batubara.  Kemudian  setiap  bahan  pembawa terse but ditambahkan  dengan  isolat dengan dosis (v/w) 5%, 10%,  20%,  50%,  dan  100%. Untuk  mengetahui kemampuan  hidup  bakteri  pada  bahan  pembawa  maka setiap 5 hari  dilakukan  isolasi  ulang (re-isolasi) sampai  hari ke  20  dan  ditumbuhkan  pada  medium  cairo  Untuk  satu perlakuan  dilakukan  re-isolasi  pada  9  tabung  reaksi. Pengamatan  pertumbuhan  dilakukan  dengan  menghitung jumlah  tabung  yang  berubah  wama  menjadi  kuning  karat (+) pada hari ke-7,  14, 21, dan 28 setelah reisolasi, sehingga diperoleh  persentase  kemampuan  hidupnya  (survival  rate) dengan rumus (Widyati, 2006) sebagai berikut:
Survival rate = Jumlah tabung positif/total tabung l[ 100%

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa Thiobacillus spp hanya dapat diisolasi dari  air asam tam bang GPB (gaJian pit barat)  dan  GPT  (galian  pit  timur)  PT.  Bukit  Asam  yang ditumbuhkan  pada  medium  3  (Tabel  2).  Medium  3  ini memiliki  kandungan  garam  ferro  paling  tinggi  bila dibandingkan  dengan  medium  lainnya  (Tabel  I).  Diduga Medium  3  mempunyai  kondisi  yang  paling  mendekati kondisi  air  asam  tambang  GPT  dan  GPB. Hal  ini  sesuai dengan  hasil  penelitian  Widyati  dan  Kresno  (2007),  lokasi GPB  dan  GPT memiliki  kandungan  sulfat, Fe dan Mn yang tinggi.
Tabel 2.  Sampel yang Digunakan dalam  Isolasi  Beserta Media yang  Digunakan
Sampel Galian Pit Barat (GPB) Galian  Pit Timur (GPT) Tanah bekas tambang Tanah Cianjur Tanah Subang Batubara Medium  1 Medium 2 Medium 3
+
+
Keterangan: +; terjadi perubahan wama menjadi kuning kecoklatan,  -; wama tidak berubah
Pertumbuhan  bakteri Thiobacillus spp ditandai dengan perubahan  wama  media  dari  kuning  pucat  menjadi  kuning karat  (Gambar  I). Perubahan  wama  media  tersebut
disebabkan  karena  terbentuknya  besi  fern  (Fe 3 ) karena dioksidasinya  besi  ferro  (Fe 2 +) oleh  bakteri  (Nurseha, 2000).
Gambar 1.  Isolat yang Berhasil Diisolasi pada Medium M-3  (Kontrol : paling kiri).

## Untuk  mengetahui  pertumbuhan  sel  bakteri
Thiobacillus spp.  ini dapat diukur dengan berdasarkan nilai absorbansi  pada  panjang  gelombang  yang  menunjukkan nila!  absorbansi  maksimum  (Gambar 2). Pengukuran dilakukan tiap hari selama 12 hari inkubasi.  Dari Gambar 2 terlihat bahwa perumbuhan bakteri Thiobacillus spp. Terdiri
0.9 0.8 'iii 0.7 C ftI 0.6 • € 0 0.5 en .a ftI 0.4 •  • ;g 0.3 • Z 0.2 0.1 0 0 2 3 4 • 5
dari  4  fase  yaitu;  fase  ancang-ancang (lag-phase) yang terjadi  pada  hari  ke-O  sampai  hari  ke-3,  fase  eksponensial (log-phase) pada  hari  ke-4  sampai  hari  ke-7,  fase  konstan (Jase  stasioner) hari  ke-7  sampai  hari  ke-l0, -dan fase kematian (hari ke-ll dan seterusnya).
• •  • • • • • 6 7 8 9 10 11 12

## Waktu  Pengukuran (hari)
Gambar 2.  Kurva pertumbuhan Thiobacillus spp.
Salah  satu  cara  karakterisasi bakteri Thiobacillus  spp adalah  dengan  pewarnaan  Gram. Pewarnaan  yang digunakan pada penelitian ini  adalah pewarnaan diferensial yaitu  pewarnaan  Gram  yang  dapat  membedakan  bakteri Gram positif dan  bakteri  Gram  negatif.  Hasil  pewarnaan
bakteri Thiobacillus spp.  Menunjukkan  bakteri gram p.egatif,  berbentuk  batang.  Bakteri Thiobacillus spp. merupakan  bakteri  Gram  negatif  yang  dicirikan  dengan warna merah muda dengan pewarnaan Gram.
Formulasi inokulum Thiobacillus spp (F.  Hazra)
Gambar 3.  Pewamaan Gram Bakteri Thiobacillus spp. (Sel Bakteri Bewama Merah, Berbentuk Batang dan Berantai Pendek)
Tabel3.  Karakterisasi Bakteri Kondisi pH Suhu lingkungan pertumbuhan Pewamaan Gram Bentuk sel Sumber energi
Kebutuhan oksigen
Sumber Nitrogen

## Karakterisasi Isolat
3.37 Gram negatif Batang pendek Shaker 250 rpm
Berdasarkan  hasil  karakterisasi  bila  dibandingkan dengan hasil karakterisasi thiobacillus  oleh  Robertson  and Kuenen (tanpa  tahun)  (Tabel  3)  bahwa  bakteri  yang terisolasi  mempunyai  karakter  sangat  dekat  dengan Thiobacillus ferrooxidans  yaitu  memiliki  em-em  hidup pada  kisaran  pH  1,3  - 4,5,  bersifat  Gram  negatif, mempunyai  sel  berbentuk batang  atau  tongkat.  Selain  itu bakteri ini menggunakan  hasil  oksidasi  dari  Fe 2 + dan reduksi  sulfur sebagai sumber energinya, serta amonium, dan nitrat  sebagai  sumber  nitrogennya,  selain  itu  sangat membutuhkan oksigen untuk kehidupannya.
Untuk  mengetahui  kemampuan  hidup  bakteri  pada karimya  dapat  dihitung  melalui  persentase  kemampuan hidup (survival rate)  setelah ditanam pada karier kemudian dire-isolasi  pada  medium  yang  sama  (Tabel  4). Tabel4 menunjukkan  bahwa  thiobaeillus  tidak  dapat  hidup  pada medium  dengan  bahan  pembawa  arang  kayu  (AK)  dan arang aktif(AA).  Sebaliknya bakteri dapat tumbuh dengan baik  pada  media  dengan  bahan  pembawa  arang  sekam. Pada bahan pembawa ini  bakteri masih dapat hidup  ketika

## Thiobacillus ferrooxidans  (Robertson and  Kuenen)
1.3  - 4.5 24-33°C Gram negatif
Tongkat pendek, rantai pendek  (bentuk tunggal atau berpasangan), ujung membulat
Oksidasi dari Fe 2 + dan reduksi sulfur
Aerob obligat
Amonium, nitrat
direisolasi hari ke-20 dan masih bertahan sampai hari ke-28 setelah inkubasi (48 hari setelah dibuat inokulum).  Dengan demikian  arang  sekam  merupakan  media  pembawa  yang paling  sesuai  untuk  formulasi  inokulum  desulfurasi batubara.
Pada  penelitian ini didapatkan  data  bahwa  meskipun Thiobacillus  spp  yang  terisolasi  merupakan  mikrob  yang bersifat  litotrof  yang  tidak  dapat  hidup  ketika  pada lingkungan  temp at  hidupnya  terdapat  bahan  organik temyata  dapat  ditumbuhkan  pada  media  arang  sekam. Arang  sekam  merupakan  bahan  organik  karena  sekam merupakan limbah kulit padi.  Hasil ini  sesuai dengan hasil penelitian Baeelar-Nieolou dan Johnson (1999) mengatakan ba.h.wa Thiobacillus  ferrooxidans  mampu  menggunakan karbon  organik  seeara  terbatas.  Dengan  demikian  hal  ini makin  menguatkan bahwa isolat  thiobaeillus yang berhasil diisolasi sangat dekat sifat-sifatnya dengan T. Ferrooxidans.  Hal ini diduga  karena karbon organik pada arang  bersifat  innert  setelah  diarangkan  sebingga  menjadi tidak tersedia bagi bakteri.
Tabel4. Survival Rate Bakteri Pada Bahan Pembawa
"ari Isolasi 5 10 15 20 Bahan Pembawal Konsentrasi Isolat % (v/w) Survival rate(%) hari Ke- Survival rate(%) hari Ke- Survival rate(%) hari Ke- Survival rate(ele) hari Ke- 7 14 21 28 7 14 21 Arang Sekam (AS) 5 0 10 11.1 20 0 50 55.5 100 55.5 Arang Aktif (AA) 5 0 10 0 20 0 50 0 100 0 ArangKayu (AK) 5 0 10
0
20 0
50 0 100 0
Serbuk Batubara
(SB)
5 0 10 0
20 0
66.6 66.6 66.6 55.5 55.5 77.7 55.5 55.5 77.7 99.9 100 100 88.8 100 100 o o o o o
o 0 0 0 o 0 0 0 o 0 0 0 o 0 11.1 0 o 55.5 88.8 0
o o o o o
o o o o o o o o o o o o o o 0 22.2 22.2 66.6 88.8
o o o o o 50 33.3 77.7 88.8 88.8 o o o o o 100 0 0 77.7 88.8
o o o o 77.7 o o o o o o o o o o
o o Il.l 55.5 100
o o o o o o o o o o
o 0 o 0 o
0
Il.l 22.2 o 22.2
Tabel 4  menunjukkan  bahwa  fonnula  inokulum  yang paling  baik  adalah  konsentrasi  100  ml  isolat  dalam  100  , gram arang  sekam. Hasil  penghitungan  survival  rate menunjukkan  bahwa  thiobacillus  tidak  dapat  bertahan ketika  dipelihara  pada  arang  sekam  lebih  dari  20  hari. Tabel4 menunjukkan bahwa setelah dibiakkan 20 hari pada arang sekam hanya  II  - 33% isolat yang masih hidup.  Hal ini menunjukkan bahwa inokulum paling baik diaplikasikan sebelum  15 hari setelah pembuatan.

## KESIMPULAN
1. Thiobacillus spp.  dapat diisolasi  dari  air asam  tambang yl!Dg  memiliki  kandungan  besi  ferro  yang  tinggi, bndungan C-organik yang rendah, pH rendall.
2. Isolat  bakteri  yang  didapat  mempunyai  ciri-ciri  yang sangat  dekat  dengan Thiobacillus  ferrooxidans yaitu hidup pada kisaran pH  1,3  - 4,5,  menggunakan sumber C dari CO 2 udara  (inorganik),  sumber  energi  dari oksidasi sulfur dan besi.
28
o 11.1 11.1 55.5
100 o o o o o o o o o o o
o o 88.8
77.7
7 14 21 28 7 14 21 28 o o o o o o o o o o o o o o o
o o o o o
o o o o 77.7 o o o o o
o o o o o
o o o o o
o
11.1 11.1 55.5 100 o 11.1 11.1 55.5 100 o o o o o
0 0 0 o 0 0 0 0 0 o 0 0 11.1 11.1 0 o o o o o
o o o o 77.7
o o o o o o o o o o o o o o o
o o o o o
o 0 o 0 o 0 o 0 o 11.1
o o o o o o o o o o o o o o o
o o o o o
o o o o o
o o o o o
o o o 33.3
o o o o o
o o o o o
o o o o o
3.  Fonnulasi  inokulum  terbaik  adalah  100 ml isolat pada bahan pembawa (karir)  100 gram arang sekam.
4. Inokulum  dapat  diaplikasikan  paling  baik  maksimum 15  hari  setelah  pembuatan  yang  disimpan pada suhu kamar.

## DAFTAR PUSTAKA
Bacelor-Nicolau,  P.,  and  D.  B.  Johnson.  1999.  Lounching of  piryte  by  acidophi1lie  iron  oxidating-bacteria.  J Apple/ Env. Microbial. 65(2) 585-590.
Brock.  T.  D.  and  M.  T. Madigan.  1991.  Biology  of Microorganism, 6 th Edition. Prentice-Hall International Inc., USA.
Hazra,  F.  2005.  Eksplorasi mikrob pengguna metanol dari tanah  dan  kotoran  ternak  sebagai  protein  sel tunggal. J.  Tanah dan Lingkungan 7(2):71-75.
Formulasi inokulum Thiobacillus spp (F. Hazra)
Nurseha.  2000.  Isolasi  danUji  Aktivitas  Bakteri Asidofilik
Pengoksidasi  Besi  dan  Sulfur  dari  Ekosistem  Air
Hitam.  Tesis.  Program  Pasca Sarjana.  IPB.  Bogor.
Robertson
and
Kuenen.
Characteristic of
Thiobacillus.http://microbewiki.kenyon.edulindex.php Ithiobacillus#c1assification. [diakses 10 Agustus 2007].
Soepandi,  G.  1991.  Studi  Kinetika  Desulfurisasi  Batubara dengan  Larutan  Kaporit. Lembaga  Penelitian  ITB. Bandung.
Widyati,  E.  2003.  Isolasi dan  Seleksi  Bakteri  Pengasimilasi Sulfur  Untuk  Remediasi  Lahan  Terpolusi.  Laporan Tahunan  Pusat  Litbang  Hutan  dan  Konservasi  Alam. Bogor. (Tidak dipubiikasikan).
_ _ _ _ .  2006.  Bioremediasi  Tanah  Bekas  Tambang
Batubara  dengan Sludge Industri  Kertas  Untuk Memacu Revegetasi  Laban.  Disertasi.  Program Pasca Sarjana. IPB.  Bogor.