## POTENSI  INHIBITOR  KATEPSIN  DARI  DUA  SPESIES DAN SATU HIBRID KULIT  IKAN PATIN  DALAM  MENGHAMBAT  AKTIVITAS KATEPSIN IKAN  PATIN  SIAM
Potency of Cathepsin Inhibitor from Two Species and One Hybrid of Catfish Skin on Inhibition of Cathepsin Activity of Siam Catfish
Tati Nurhayati 1* , Ekowati Chasanah 2 , dan Saeful Bahri 1
1 Departemen  Teknologi  Hasil Perairan,  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan,  Institut  Pertanian  Bogor. Jl. Lingkar Akademik, Kampus  IPB Darmaga Bogor
2 Balai  Besar  Penelitian  dan  Pengembangan  Pengolahan Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan  dan  Perikanan,  KKP. Jl.K.S.  Tubun  Petamburan VI, Jakarta  Pusat  10260 *  Korespondensi  Penulis:  nurhayati7870@yahoo.com
Diterima: 3 Maret 2013 Disetujui:  25 Oktober 2013

## ABSTRAK
Proses  kemunduran  mutu  ikan  dapat  disebabkan  oleh  adanya  aktivitas  enzim  terutama  enzim proteolitik,  salah  satunya  adalah  katepsin  yang  merupakan  kelompok  protease  sistein.  Protease sistein  merupakan  kelompok  enzim  pendegradasi  protein.  Untuk  mencegah  terjadinya  proteolisis yang  destruktif  yang  berakibat  pada  besarnya losses ikan  segar,  inhibitor  untuk  katepsin  sangat dibutuhkan.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  potensi  kulit  ikan  patin  Siam,  Jambal, dan  Pasupati  sebagai  sumber  inhibitor  katepsin,  serta  memekatkan  dan  mengkarakterisasi inhibitor  katepsin  yang  diperoleh.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  ketiga  jenis  kulit  ikan patin  memiliki  aktivitas  penghambatan  terhadap  katepsin,  tetapi  yang  memiliki  penghambatan terbaik  adalah  yang  berasal  dari  ikan  patin  jenis  Siam  dengan  nilai  persentase  penghambatan sebesar  74,67%.  Hal  ini  diduga  karena  kesesuaian  substrat  dengan  inhibitornya  Pemekatan menggunakan  ammonium  sulfat  70%  menunjukkan  adanya  peningkatan  aktivitas  penghambatan spesifik  sebesar  1,4479  U/mg  dengan  kelipatan  pemurnian  sebesar  2,77  kali.  Inhibitor  enzim katepsin  tersebut  secara  optimum  bekerja  pada  suhu  40  °C  dan  pH  8.
KATA KUNCI: ikan patin, katepsin, inhibitor protease, karakterisasi

## ABSTRACT
Fish  deterioration  can  be  caused  by  the  activity  of  enzyme,  especially  proteolytic  enzymes, one  of  which  is  chatepsin  classified  as  cysteine  proteases.  Cysteine  proteases  are  a  group  of enzymes  that  degrade  proteins.  To  prevent  destructive  proteolysis  and  minimizing  fish  losses, cathepsin inhibitors is urgently needed. The purpose of this study was to determine Siam, Jambal, and  Pasupati  skin  as  a  potential  source  of  cathepsin  inhibitors.  The  study  was  also  intended  to concentrate  and  characterize  the  obtained  cathepsin  inhibitors.  The  three  catfish  skin  have inhibitory activity against cathepsin, however the result showed that the best inhibitor was derived from Siam catfish skin with inhibition percentage of  74.67%. It is presumably due to the suitability of the enzyme with the inhibitor. Concentration using 70% ammonium sulphate showed an increase in the specific inhibitory activity of 1.4479 U/mg with purification fold of 2.77 times. Inhibitors of the chatepsin  enzyme  exhibited  optimum  activity  at  40  °C  and  pH  8.
KEYWORDS: catfish, cathepsin, protease inhibitors, characterization

## PENDAHULUAN
Proses kemunduran mutu ikan disebabkan oleh adanya aktivitas  enzim terutama  enzim proteolitik yang  secara  alami  terdapat  dalam  ikan.  Enzim tersebut bekerja menguraikan protein menjadi pepton, peptida, dan asam amino. Proses hidrolisis protein
oleh suatu protease misalnya katepsin, kalpain, dan kolagenase,mengakibatkan  akumulasi  metabolit, perubahan  cita  rasa  dan  pelunakan  tekstur, terbentuknya  komponen  volatil,  serta  tersedianya asam amino sebagai sumber makanan bakteri, yang akhirnya menimbulkan kebusukan.
Diantara ketiga jenis protease yang terlibat dalam kemunduran mutu ikan, katepsin merupakan enzim yang paling bertanggung jawab terhadap kemunduran mutu  ikan  (Huss,  1995).  Katepsin  ditemukan  di lisosom  serat  daging  dan  di  sel  fagosit.  Lisosom merupakan  organel  intraseluler  yang  banyak mengandung enzim  hidrolitik  dan  berperan dalam pencernaan dalam sel. Beberapa tipe katepsin telah diidentifikasi  berdasarkan  pada  kandungan  asam amino yang berbeda di sisi aktifnya. Katepsin B (EC 3.4.22.2) dan katepsin L (EC 3.4.22.15) merupakan proteinase  sistein  yang  paling  penting  dalam kemunduran tekstur daging. Aktivitasnya berbeda- beda tiap fraksi daging dan spesies ikan. Aktivitas optimum  dilaporkan  pada  suhu  40–50  °C  dan aktivitasnya  menurun  dengan  penurunan  suhu. Katepsin  secara  umum  bekerja  pada  pH  3–4  dan beberapa katepsin juga mempunyai aktivitas tinggi pada pH 6–6,5 (Kolodziejska & Sikorski, 1996; Aoki et al., 2000).
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa terdapat korelasi  yang  erat  antara  aktifnya  enzim  katepsin dengan laju kemunduran mutu ikan, baik pada bagian daging  ikan  (Salamah et  al., 2010),  jeroan  ikan (Nurhayati et al., 2010 a ), maupun kulit ikan (Nurhayati et al., 2010 b ). Enzim tersebut tidak aktif pada saat ikan dalam kondisi segar (fase pre rigor ) karena pada kondisi  tersebut  inhibitor  katepsin  bekerja  untuk menghambat  kerja  enzim  katepsin.  Ketika  ikan memasuki fase rigor mortis aktivitas enzim katepsin meningkat dan sangat aktif ketika ikan berada pada fase awal post rigor.  Pada kondisi ini inhibitor katepsin mengalami  denaturasi  akibat  pH  yang  rendah sehingga  tidak  bisa  menghambat  kerja  enzim katepsin. pH rendah merupakan pH optimum untuk aktivitas enzim katepsin (Huss, 1995).
Salah satu cara untuk menghambat kemunduran mutu ikan adalah dengan menghambat kerja enzim proteolitik  menggunakan  senyawa  inhibitor  alami termasuk yang berasal dari kulit ikan patin. Inhibitor katepsin diekstrak dengan baik pada saat ikan berada pada awal kematian atau fase pre rigor (Nurhayati & Salamah, 2009). Nurhayati & Salamah (2009) juga melaporkan hasil penelitiannya bahwa ikan bandeng yang  disimpan  pada  suhu chilling tanpa  ditambah inhibitor  katepsin  alami  yang  berasal  dari  ikan bandeng akan mengalami kemunduran mutu lebih cepat setelah melewati rigor mortis (ketika pH ikan 5) dibandingkan yang ditambahkan inhibitor katepsin alami tersebut. Nurhayati et al. (2011) juga melaporkan bahwa inhibitor katepsin alami dapat diaplikasikan pada  ikan  dari  jenis  yang  berbeda  dengan  asal inhibitornya.
Inhibitor protease juga mempunyai manfaat untuk menghambat penurunan kekuatan gel. Hasil penelitian
Morrissey et  al. (1996)  m enunjukkan  bahwa penambahan inhibitor protease seperti sistatin pada surimi  dapat  mengurangi  penurunan kekuatan  gel melalui  penghambatan  protease  sistein  endogen. Inhibitor  spesifik  dari  protease  sistein  sangat dibutuhkan  untuk  mencegah  terjadinya  proteolisis yang destruktif. Hasil penelitian yang telah dilakukan (Nurhayati et al., 2013) menunjukkan bahwa bagian daging  ikan  patin  ( Pangasianodon  hypopthalmus) mengandung inhibitor protease. Informasi yang didapat dari penelitian ini memerlukan kajian lebih lanjut, oleh karena itu penelitian tentang ekstraksi inhibitor enzim katepsin dari kulit ikan patin perlu dilakukan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi dari tiga jenis ikan patin sebagai bahan baku inhibitor kat epsi n  dengan  c ara  m engekstraksi  dan mengkarakterisasi inhibitor katepsin dari kulit ikan patin terpilih.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah  ikan  patin  jenis  siam  ( Pangasianodon hypopthalmus) ,  jambal  ( Pangasius  djambal ),  dan pasupati ( Pangasius sp.) dengan berat ±350 g per ekor dan ukuran panjang 30–40 cm, yang diambil bagian kulitnya pada kondisi segar. Bahan kimia yang digunakan  untuk  ekstraksi  adalah  buffer  tris  base (Applichem) HCl 0,1 M pH 7,4 dan akuades, untuk pemekatan adalah ammonium sulfat (NH 4 ) 2 SO 4 teknis, untuk  uji  aktivitas  katepsin  dan  inhibitor  katepsin adalah  hemoglobin  (Sigm a),  buf fer  tris  base (Applichem) HCl 0,1 M pH 7,4, tirosin (Applichem), akuades, asam trikloro asetat (TCA) 5% (Merck), folin (Merck),  dan  HCl  1  N,  sedangkan  untuk  uji  kadar protein digunakan pereaksi Bradford, bovine serum albumin (BSA) Applichem.
Peralatan yang digunakan pada penelitian antara lain  spektrofotometer  UV-VIS  RS  UV-2500  dari LaboMed  Inc,  sentrifus suhu  dingin  (Himac  CR7), inkubator  (Thermoline  tipe  42000  incubator),  dan homogenizer .

## Metode
Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu preparasi bahan baku yang meliputi pengambilan kulit ikan patin, ekstraksi enzim katepsin (Dinu et al ., 2002), ekstraksi inhibitor katepsin (An et al .,1995 yang dimodifikasi), pemekatan (Ustadi et al ., 2005) yang dimodifikasi, dan karakterisasi inhibitor yang meliputi penentuan suhu dan pH optimum (Nurhayati et al., 2013).  Pengujian  aktivitas  enzim  katepsin  dan
aktivitas  inhibitor  enzim  katepsin  mengacu  pada metode  Dinu et  al. (2002),  dan  uji  kadar  protein mengacu  pada  metode  Bradford  (1976)  yang dimodifikasi.  Tahapan    penelitian  disajikan  pada Gambar 1.
Ekstraksi enzim katepsin (Dinu et al., 2002)
Ekstraksi  dilakukan  dengan  preparasi  sampel untuk memperoleh ekstrak kasar protease katepsin. Proses ekstraksi menggunakan ikan patin Siam yang sudah berada pada fase post rigor (sekitar12–15 jam penyimpanan pada suhu ruang). Daging ikan diambil dan  disuspensikan  dal am   ak uades  dengan perbandingan daging ikan dan akuades sebesar 1:1, lalu dihomogenisasi pada suhu 0–4°C.
Ekstrak daging hasil homogenisasi disentrifugasi pada 600 xg selama 10 menit dan supernatan yang diperoleh kemudian disentrifugasi lagi pada 10.000 xg selama 10 menit. Pelet yang dihasilkan dari hasil sentrifugasi kemudian dilarutkan dalam 0,1 M buffer tris-HCl pH  7,4 dengan jumlah  yang  sama  seperti
jumlah akuades tadi dan disentrifugasi pada 4.000 xg selama 10  menit.  Hasil supernatan  (ekstrak kasar protease katepsin) yang diperoleh merupakan substrat untuk pengujian aktivitas inhibitor katepsin.
Ekstraksi inhibitor katepsin (An et al., 1995 yang dimodifikasi Rusyadi, 2010 )
Ekstraksi dilakukan terhadap bagian kulit patin (Siam, Jambal, dan Pasupati). Kulit ikan dipreparasi dari ikan patin yang masih berada pada fase pre rigor (sesaat setelah dimatikan). Sebanyak 100 g sampel dihomogenisasi  dengan  100  ml  akuades  dingin (dibawah 4°C), selanjutnya disentrifugasi dingin pada kecepatan 5.000 xg selama 30 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan buffer McIlvaine’s pH 5,5 (dibuat  dari  0,2  M  sodium  fosfat  dan  0,1  M  asam sitrat) dengan jumlah yang sama dengan supernatan. Kemudian  diinkubasi  selama  10  menit  pada  suhu 80°Cselanjutnya  disentrifugasi  kem bali  pada kecepatan 7.000 xg selama 15 menit. Supernatan diambil dan disimpan pada suhu dingin. Hasil ekstraksi
Gambar 1 Diagram alir produksi inhibitor katepsin. Figure 1.  Flow diagram of the production of cathepsin inhibitor.
Kulit ikan patin segar/ Skin of fresh catfish

## Ekstraksi inhibitor katepsin/
Extraction cathepsin inhibitor
Pengukuran aktivitas inhibitor  katepsin dan kadar protein/ Determination of enzyme inhibitor activity,
and protein concentration
Inhibitor protease kasar/
Crude extract of protease inhibitor
Presipitasi/ Precipitation ammonium sulfat 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% kejenuhan / ammonium sulphates of 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% saturation
Pengukuran aktivitas inhibitor,
dan kadar protein/ Determination of inhibitor activity and protein concentration Karakterisasi suhu optimum dan pH optimum/ Characterization of optimum temperature and pH
Inhibitor semi murni/
Semi purified inhibitor
berupa  ekstrak  kasar  inhibitor  katepsin  kemudian dianalisis aktivitasnya.
Pemekatan Inhibitor Katepsin ( Ustadi et al., 2005 yang dimodifikasi)
Inhibitor katepsin yang mempunyai penghambatan tertinggi  terhadap  katepsin  kemudian  dipekatkan untuk  meningkatkan  aktivitasnya.  Ekstrak  kasar inhibitor  kat epsin  di pekatkan  m enggunakan ammonium sulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ) dengan variasi tingkat kejenuhan 30, 40, 50, 60,70, dan 80%mengikuti tabel teknik  presipitasi  ammonium   sulfat  (Bollag  & Edelstein,  1991).  Pengendapan  dilakukan  dengan menambahkan  garam ammonium sulfat ke dalam supernatan (ekstrak kasar inhibitor katepsin) sedikit demi sedikit. Campuran didiamkan selama semalam pada suhu sekitar 4°C, selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12.000 x g selama 30 menit.  Endapan dan supernatan dianalisis aktivitas inhibitor enzim katepsin dan konsentrasi protein.

## Karakterisasi inhibitor katepsin (Nurhayati et al., 2013)
Karakterisasi inhibitor katepsin dilakukan terhadap endapan hasil pemekatan dengan ammonium sulfat. Karakterisasi  meliputi  penentuan  suhu  dan  pH optimum. Analisis yang  dilakukan adalah aktivitas inhibitor katepsin.
Analisis aktivitas inhibitor katepsin (Dinu et al., 2002)
Uji  ini  ditentukan  dengan  mengukur  derajat penghambatan  dari  aktiv itas  enzim  katepsin menggunakan substrat hemoglobin. Uji ini dimulai dengan mereaksikan ekstrak inhibitor 0,1 ml dengan katepsin 0,1 ml selama 30 menit pada suhu inkubasi 37°C. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml dari larutan substrat hemoglobin 2% (w/v) dan diinkubasi kembali pada 37°C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 ml TCA 5% (w/v).  Campuran disaring dan hasil reaksi ditambah dengan 1 ml pereaksi folin, kemudian campuran diukur dengan spektrofotometer pada  =750 nm.
Pengukuran  ini  dilakukan  bersamaan  dengan pengukuran  larutan blanko dan larutan standar dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel, hanya untuk larutan blanko larutan enzim digantikan dengan akuades  dan  untuk  larutan  standar,  larutan  enzim digantikan dengan tirosin. Bersamaan dengan itu juga dilakukan uji aktivitas katepsin tanpa penambahan inhibitor  dengan  menggunakan  enzim  katepsin sebanyak  0,1  ml.  Aktiv itas  inhibitor  dihitung berdasarkan perbedaan aktivitas enzim katepsin yang ditambah dengan inhibitor dan yang tanpa inhibitor.
Aktivitas enzim katepsin dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
UA = x P x
Keterangan/ Note :
UA/mL = jumlah  tirosin  yang  dihasilkan  per  ml enzim per menit P = faktor pengenceran T = waktu inkubasi (10 menit) Persentase penghambatan = 1 – x 100%
Satu unit inhibitor katepsin adalah jumlah inhibitor katepsin yang mampu menghambat aktivitas protease katepsin sebesar 50% pada kondisi pengujian.

## Analisis kadar protein (Bradford 1976 yang dimodifikasi)
Konsentrasi  protein  ditentukan  menggunakan metode Bradford dengan bovine serum albumin (BSA) sebagai  standar.  Persiapan  pereaksi  Bradford dilakukan dengan cara melarutkan 5 mg coomassie brilliant blue G-250 dalam 2,5 ml etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan dengan 5 ml asam fosfat 85% (v/v). Jika telah larut dengan sempurna, maka ditambahkan akuades hingga 250 ml dan disaring dengan kertas saring Whatman no. 1 dan diencerkan 5 kali sesaat sebelum digunakan.
Konsentrasi  protein  ditentukan  dengan  cara memasukkan 0,1 ml enzim ke dalam tabung reaksi, kemudian  ditambahkan  5  ml  pereaksi  Bradford, diinkubasi  selama  5  menit  dan  diukur  dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Demikian pula untuk larutan standar dilakukan sama seperti  larutan  sampel  dengan  mengganti  larutan sampel dengan BSA pada konsentrasi antara 0,11 – 1,0 mg/ml.

## HASIL DAN BAHASAN

## Penghambatan Inhibitor Katepsin dari Tiga Jenis Kulit Ikan Patin
Tahap ini diawali dengan ekstraksi enzim katepsin dari daging ikan patin Siam yang berada pada fase pos t  rigor .  E nzim   katepsin  yang  dihasil kan mempunyai  aktiv itas  0,6  U/ml.  Untuk  ekstraksi inhibitor katepsin, kulit ikan yang masih sangat segar digunakan  m engacu  pada  teor i  yang  telah
(Abs. sampel - abs.blanko)
(Abs. standar - abs. blanko) 1
T (Aktivitas katepsin dengan inhibitor) (Aktivitas katepsin tanpa inhibitor)
disampaikan pada bagian pendahuluan. Persentase penghambatan  enzim  katepsin  oleh    inhibitor  dari 3 jenis kulit ikan patin terhadap katepsin ikan patin Siam disajikan pada Gambar 2.
Ekstrak inhibitor dari kulit ikan patin jenis Siam mampu menghambat enzim katepsin  tertinggi yaitu sebesar 74,67% dibandingkan dengan jenis Jambal dan Pasupati yaitu masing-masing sebesar 61,17% dan 65,00% (Gambar 2). Persentase penghambatan enzim katepsin oleh inhibitor yang tinggi pada kulit ikan patin Siam kemungkinan disebabkan oleh adanya kesesuaian antara substrat (enzim katepsin) dengan inhibitornya.  Hal ini sesuai dengan prinsip kerja enzim
Gambar 2. Penghambatan enzim katepsin oleh inhibitor dari kulit 2 spesies dan 1 hibrid kulit ikan patin terhadap katepsin ikan patin siam.
Figure 2. Cathepsin inhibition by inhibitor from 2 species and 1 hybrid of catfish different catfish skins against the cathepsin of siam patin.
atau  inhibitor  enzim  yaitu  mereka  bekerja  secara spesifik  sehingga  makin  sesuai  substratnya  akan semakin tinggi aktivitasnya.

## Pemekatan menggunakan Ammonium Sulfat
Ekstrak  kasar  inhibitor  katepsin  dari  ikan  patin jenis Siam yang diperoleh dipekatkan dengan teknik presipi tasi  berdasark an  teori  salti ng  out, menggunakan ammonium sulfat dengan konsentrasi kejenuhan  30%  sampai  80%.  Tujuan  pemekatan dengan  am m onium   sulf at   ini  adal ah  untuk menghilangkan  sebagian  protein  pengotor  yang
100 Konsentrasi Ammonium Sulfat (% kejenuhan)/ Ammonium Sulphates Concentration (% saturation) Pen gh amb atan / Inh ib ition (%) 98 96 94 92 90 88 86 84 82 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Siam
Jambal Pasupati 74.67 61.17 65.00 Jenis Ikan Patin/ Type of Patin Pen gh amb atan / Inh ib ition (%)
Gambar 3. Penghambatan katepsin oleh inhibitor kulit ikan patin setelah pengendapan ammonium sulfat, endapan, supernatan.
Figure 3.
Cathepsin  inhibition  by  inhibitor  after  ammonium  sulphates  precipitation pellet,
supernatan.
terdapat pada ekstrak kasar inhibitor katepsin tersebut sehingga  inhibitor  akan  mempunyai  persentase penghambatan yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak kasar.  Persentase  penghambatan  katepsin  oleh inhibitor dari kulit ikan patin siam dan kadar proteinnya setelah  pengendapan  dengan  ammonium  sulfat disajikan pada Gambar 3 dan Gambar 4.
Persentase penghambatan katepsin oleh inhibitor pada bagian endapan mengalami peningkatan pada penggunaan  konsentrasi  ammonium  sulfat  yang semakin  meningkat  dan  mem iliki  persentase penghambatan  katepsin optimum pada penggunaan ammonium sulfat dengan  tingkat kejenuhan 70%. Presipitasi protein menggunakan ammonium sulfat dapat menyebabkan dehidrasi lingkungan mikro dari molekul protein. Ion-ion dari garam, seperti ion sulfat (SO 4 2- ) akan menarik dan mengikat molekul air dari koloid protein. Persentase penghambatan katepsin oleh inhibitor yang lebih rendah pada penggunaan ammonium sulfat dengan tingkat kejenuhan rendah disebabkan oleh proses salting in (Suhartono, 1989). Suhartono (1989) dan Rosenberg (1996) menyatakan bahwa penggunaan ammonium sulfat dengan tingkat kejenuhan  rendah  menyebabkan  ion-ion  ini  akan mengisi lingkungan molekul protein sehingga protein melarut. Penggunaan ammonium sulfat dengan tingkat kejenuhan yang  tinggi menyebabkan  peningkatan muatan listrik yang akan menarik molekul  air dari koloid protein sehingga interaksi hidrofobik diantara sesama molekul protein akan menurunkan kelarutan protein  sehingga  t erjadi salting  out yang menyebabkan protein terpresipitasi dan mengendap. Persentase  penghambatan  enzim  katepsin  oleh inhibitor  pada  bagian  supernatan  menunjukkan adanya penurunan dengan semakin meningkatnya
Gambar 4. Kadar protein terlarut setelah pengendapan ammonium sulfat, endapan, supernatan.
Figure 4. Dissolved protein content of cathepsin inhibitor after ammonium sulphates precipitation pellet, supernatan.
kadar ammonium sulfat (Gambar 3). Hal ini disebabkan oleh semakin menurunnya protein inhibitor pada bagian supernatan  akibat  penggunaan  ammonium  sulfat dengan tingkat kejenuhan yang semakin tinggi.
Peningkatan persentase penghambatan katepsin oleh  inhibitor  pada  endapan  sejalan  dengan peningkatan kadar protein.  Ini menunjukkan bahwa protein  yang  terendapkan  adalah  berupa  inhibitor katepsin.  Kadar  protein  yang  m enurun  pada supernat an  juga  sejalan  dengan  penurunan persentase  penghambatan  katepsin  oleh  inhibitor (Gambar 4).
Berdasarkan Gambar 3 dan 4 diperoleh informasi bahwa  ekstrak  kasar  inhibitor  katepsin  dapat dipekatkan secara optimum dengan menggunakan ammonium sulfat 70% kejenuhan. Hasil ini sesuai dengan penelitian Rusyadi (2010) yang menunjukkan bahwa adanya peningkatan persentase penghambatan inhibitor  enzim  katepsin  endapan  pada  beberapa tingkat konsentrasi ammonium sulfat dan mencapai aktivitas optimum pada endapan dengan konsentrasi ammonium sulfat 70%.

## Produksi Inhibitor Katepsin
Produksi dilakukan berdasarkan hasil terbaik dari penelitian tahap awal yaitu menggunakan kulit ikan patin jenis Siam yang diekstrak pada suhu inkubasi 80 °C dan pemekatan menggunakan ammonium sulfat 70% kejenuhan.
Ekstrak kasar inhibitor katepsin yang dihasilkan dari  kulit ikan  patin mempunyai  aktivitas  0,2  U/ml dengan konsentrasi protein 0,2450 mg/ml sehingga aktivitas spesifiknya sebesar 0,8163 U/mg. Ekstrak kasar  selanjutnya  dipekatkan  dengan  ammonium
Konsentrasi Ammonium Sulfat (% kejenuhan)/ Ammonium Sulphates Concentration (% saturation)
Kad a r Prot ein/ Pro tein C on ten t (mg/ ml) 0.30 0 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
sulfat 70% (w/v). Endapan yang dihasilkan dilarutkan dengan buffer Mcllvaine’s 0,1 M pada pH 5,5. Endapan tersebut mempunyai aktivitas sebesar 0,6 U/ml dengan konsentrasi protein 0,2650 mg/ml sehingga aktivitas spesifik endapan tersebut adalah 2,2642 U/mg. Hasil ini menunjukkan peningkatan kelipatan pemurnian sebesar  2,77  kali.  Ustadi et  al. (2005)  telah melakukan pemekatan  inhibitor katepsin dari telur ikan glassfish tuna dengan menggunakan teknik yang sama  dengan  penelitian  ini.  Dengan  pemekatan menggunakan amonium sulfat 40 – 80% kejenuhan, inhibitor katepsin dari telur ikan glassfish tuna tersebut yang semula memiliki aktivitas spesifik 3,97 U/mg menjadi meningkat sebanyak 3,38 kali. Rangkuman tahapan  ekstraksi  i nhibi tor  k atepsi n  hingga pemekatan disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Tahap  ekstraksi dan pemekatan inhibitor katepsin kulit ikan patin siam Table 1. Stage of extraction and precipitation of cathepsin inhibitor from catfish skin

## Karakterisasi Inhibitor Katepsin

## Suhu optimum
Suhu optimum inhibitor enzim katepsin dari kulit ikan patin Siam adalah 40°C. Hasil ini sama dengan suhu optimum inhibitor katepsin yang diekstraksi dari daging  ikan  patin  Siam  (Nurhayati et  al., 2013). Inhibitor protease katepsin memiliki % penghambatan maksimum pada  suhu tertentu karena  inhibitor  ini diyakini adalah molekul protein. Persen penghambatan tersebut akan meningkat seiring dengan peningkatan suhu sehingga mencapai suhu optimum. Kenaikan suhu  lebih  lanjut  akan  menyebabkan  penurunan penghambatan.  Persen  penghambatan  inhibitor katepsin  pada  suhu  yang  berbeda  disajikan  pada Gambar 5.
Gambar 5. Pengaruh suhu terhadap persen penghambatan inhibitor katepsin dari kulit ikan patin yang telah dipekatkan dengan ammonium sulfat 70% kejenuhan.
Figure 5. Effect of temperature on inhibitory activity  of cathepsin inhibitor from catfish skin precipitated by ammonium sulphates 70% saturation.
Suhu/ Temperature (°C) Pen gh amb atan / Inh ib ition (%) Kelipatan
Pemurnian (kali)/ Purification Fold (times) Ekstraksi/ Extraction Ektrak kas ar/ Crude extract 0.200 0.245 0.816 1.000 Pemekatan menggunakan (NH 4 ) 2 SO 4 70%/ Precipitation using (NH4) 2 SO4 70% Endapan yang dilarutkan dalam buffer/ Pellet dissolved by b uffer 0.600 0.265 2.642 2.770 Tahap/ Stage Produk/ Product Konsentrasi Protein/ Protein Concentration (mg/ml) Aktivitas/ Activity (U/ml) Aktivitas Spesifik/ Specific Activity (U/mg)
Gambar 6. Pengaruh pH terhadap persen penghambatan inhibitor dari kulit ikan patin  yang diendapkan dengan ammonium sulfat 70% kejenuhan.
Figure 6. Effect of pH on inhibitoryactivity  of cathepsin inhibitor from catfish skin which was precipitated by ammonium sulphates 70% saturation.

## pH optimum
Setelah pengendapan dengan ammonium sulfat 70%, inhibitor katepsin memiliki pH optimum 8. Semua reaksi enzim dipengaruhi oleh pH medium tempat terjadinya reaksi. Setiap enzim memiliki pH optimum yang  khas,  yaitu  pH  yang  menyebabkan  aktivitas maksimal. Perubahan persen penghambatan inhibitor protease terhadap aktivitas katepsin  dapat terjadi akibat adanya perubahan ionisasi pada gugus ionik inhibitor  pada  sisi  aktifnya  maupun  sisi  lain  yang secara tidak langsung mempengaruhi sisi aktif. Gugus ionik berperan dalam menjaga konformasi sisi aktif dalam  mengikat  substrat  (enzim).  Data  mengenai pengaruh pH terhadap  persentase penghambatan inhibitor katepsin disajikan pada Gambar 6.
Inhibitor katepsin ini memiliki pH optimum berada pada kisaran pH 7–9 (Gambar 6) yang menunjukkan bahwa ekstrak inhibitor katepsin termasuk inhibitor protease alkalin atau bersifat  basa. Penelitian lain menunjukkan bahwa inhibitor protease seperti sistatin mempunyaipenghambatan pada kisaran pH alkalin. Penelitian Ustadi et al. (2005) menunjukkan bahwa ekstrak  inhibitor  protease  dari  telur  ikan glassfish mempunyai aktivitas penghambatan yang tinggi pada kisaran pH 7–9 dan optimum pada pH 8. Penelitian oleh Li et al. (2008)  menunjukkan bahwa  inhibitor sistein  protease  dari  plasma  ikan  chum  salmon menunjukkan aktivitas penghambatan pada pH 6–9 dan optimum pada pH 7.

## KESIMPULAN
Kulit ikan patin siam berpotensi sebagai bahan baku inhibitor enzim katepsin pada daging ikan patin
siam,  jambal  dan pasupati.  Penghambatan  enzim katepsin tertinggi dicapai oleh inhibitor  dari kulit ikan patin Siam.  Penambahan ammonium sulfat dengan tingkat  kejenuhan  70%  ke  dalam  ekstrak  kasar inhibitor mampu meningkatkan kemurnian sebesar 2,77  kali.  Inhibitor  katepsin  tersebut  memiliki penghambatan optimum pada suhu  40 o C dan pH 8.

## DAFTAR PUSTAKA
An,  H.,  Peters,  M.Y.,  Seymour, T.A.,  and  Morissey,  M.T.
1995.  Isolation  and  activation  of chatepsin  L-inhibitor complex  from  pacific  whiting  ( Merlucciusproductus ).
J.Agric.Food  Chem. 43:  327–330.
Aoki,  T.,  Yamashita,  T.,  and  Ueno,  R.  2000.  Distribution of  cathepsins  in  red  and  white  muscles  among  fish species. J. Fish.  Sci. 66(4): 776–782.
Bollag D.M. and Edelstein S.J. 1991. Protein Methods . A John  W illey  &  Sons  Inc.  Publication
Bradford,  M.M.  1976.  A  rapid  and  sensitive  method  for quantification  of  microgram  quantities  of  protein utilizing  the  princ iple  of  protein  dye  binding. Anal.Biochem. 72:  234–254.
Dinu, D., Dumitru, I,F., and Neichifor, M.T. 2002. Isolation and  characterization  of  two  chatepsin  from  muscle of Carrassius auratus gibelio. Roumanian Biotechnol. Lett. 7(3): 753–758.
Huss, H.H. 1995. Quality and Quality  Changes in Fresh Fish . Food and Agriculture Organization of the United Nations,  Rome.  348  p.
Li,  D.K.,  Lin,  H.,  and  Kim,  S.M.  2008.  Purification  and characterization  of  sistein  protease  inhibitor  from chum  salmon  ( Oncorhynchusketa )  plasma. J.  Agric. Food  Chem. 56:  106–111.
Kolodziejska,  I.  and  Sikorski,  Z.E.  1996.  Neutral  and alkaline  musc le  proteases  of  marine  fish  and invertebrates  -A  review. J.  Food  Biochem. 20:  349– 363.
pH Pen g ha m ba tan / Inh ib it io n (% )
Morrissey, M.T., Hartley, P.S., and An, H. 1996. Proteolytic ac tivity  in  pac ific  whiting  and  effec t  of  surimi processing. J. Aquatic Food Product.Technol. 4(4): 5– 18.
Nurhayati,  T.  dan  Salamah,  E.  2009.  Penghambatan kemunduran  mutu  ikan  bandeng  ( Chanos  chanos )
dengan  melibatk an  inhibitor  protease  alami. Laporan  Penelitian .  Institut  Pertanian  Bogor,  Bogor. 70 p.
Nurhayati,  T.,  Salamah,  E.,  dan  Fentiana,  N.  2010 a . Peranan  enzim  protease  jeroan  ik an  bandeng ( Chanos  chanos )  dalam  proses  kemunduran  mutu ik an. Pros iding  Seminar  Nasional  Pengolahan Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan .  p.  25–34. Nurhayati,  T.,  Salamah,  E.,  Irfan,  M.,  dan  Nugraha,  R. 2010 b .  Aktivitas enzim katepsin dan kolagenase pada kulit ikan bandeng ( Chanos chanos , Forskal) selama periode  kemunduran  mutu. Akuatik. 4(1):  30–34. Nurhayati, T., Salamah, E., Komariah, T., dan Apriland, A. 2011.    Peranan  inhibitor  katepsin  dari  ikan  patin ( Pangasius  hyphopthalmus )  untuk  menghambat
kemunduran  mutu  ikan  bandeng  ( Chanos  chanos Forskal). JPHPI XIV. (1): 49–55.
Nurhayati, T., Rusyadi, S., Suwandi, R., and Nugraha, R.
2013.  Purification  and  characterization  of  acathepsin inhibitor  from  catfish  ( Pangasius sp.)  of  Indonesian water. IFRJ. 20(2):  941–946.
Rosenberg, I.M. 1996. Protein Analysis and Purification: Benchtop  technique .  Birkhauser,  Boston.  520  p.
Rusyadi,  S.  2010. Purifikasi  dan  Karakterisasi  Inhibitor Kateps in  dari  Ik an  Bandeng  (Chanos   c hanos Forskal)  dan  Ikan  Patin  (Pangasius  sp.). Tesis. Sekolah  Pasc asarjana,  Institut  Pertanian  Bogor, Bogor. 56 p.
Salamah,  E.,  Nurhayati,  T.,  and  Rustamaj i.  2010.
Aktivitas  enzim  katepsin  dan  kolagenase  pada  ikan bandeng  ( Chanos   c hanos )  selama  periode kemunduran  mutu. Logika. 7(2):  73–79. Suhartono,  M.T.  1989. Enzim  dan  Bioteknologi .  PAU Bioteknologi  IPB,  Bogor.
Ustadi,  Kim,  K.Y.,  and  Kim,  S.M.  2005.  Purification  and identification  of  a  protease  inhibitor  from  glassfish ( Liparistanakai ) eggs. J.Agric. Food Chem. 53: 7667– 7672.