## Isolation and Selection of Sulfuric Acid Bacteria from Kejayan
River as Bio-oxidation Agents
Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Asam Sulfat dari Sungai Kejayan sebagai Agen Bio-oksidasi
Fahimatul Ulya
Institut Teknologi dan Sains Nahdlatul Ulama Pasuruan, Jl. Raya Warung Dowo, Pohjentrek - Kab. Pasuruan , Jawa Timur, 67714, Indonesia
* Corresponding author: fahim.ulya@gmail.com
Diterima 28 Mei 2022 dan disetujui 30 Juni 2022

## Abstrak
Penanganan  masalah  lingkungan  yang  tercemar  oleh  logam  dapat  dilakukan  menggunakan metode Bio-oksidasi yang dianggap lebih ramah lingkungan dan lebih ekonomis. Bakteri penghasil asam  sulfat  dari  proses  oksidasi  sulfur  menjadi  asam  sulfat  merupakan  salah  satu  agen  Bio- oksidasi, bakteri ini mampu diisolasi dari area masam atau yang bersifat asam. Sungai Kejayan Pasuruan  dialiri  oleh  berbagai  limbah  industri  yang  mengandung  logam  serta  bersifat  asam. Penelitian ini bertujuan mendapatkan bakteri penghasil asam sulfat dari sungai Kejayan. Isolasi dan  seleksi  bakteri  penghasil  asam  sulfat  dari  tanah  sungai  Kejayan  menggunakan  medium tiosulfat. Isolat murni diperoleh menggunakan metode streak plate tipe goresan kuadran. CuFeS 2 digunakan pada proses Bio-oksidasi, kadar asam sulfat diukur menggunakan metode turbidimetri, serta  kadar  [Cu]  dan  [Fe]  pada  media  biooksidasi  diuji  menggunakan  AAS  ( Atomic  Absorption Spectroscopy) . Isolat K.2 terseleksi sebagai bakteri penghasil asam sulfat dengan perolehan kadar sulfat [SO 4 2 ] tertinggi 13,9 ppm pada jam ke-48. Bakteri ini berpotensi sebagai agen biooksidasi logam Cu dan Fe.
Kata Kunci: Bakteri Asam Sulfat, Biooksidasi, Limbah Asam.

## Abstract
Biooxidation method is connsidered more environmentally friendly and more economical to be able to overcome environmental problems polluted by metals. Sulfuric acid-producing bacteria is one of the biooxidizing agents, these bacteria can be isolated from acidic soil or acidic areas. The Kejayan Pasuruan River is drained by various industrial acidic wastes that contain metals. This study aims to obtain sulfuric acid-producing bacteria from the Kejayan river. Isolation and selection of sulfuric acid-producing  bacteria  from  Kejayan  river  soil  using  thiosulfate  medium.  Pure  isolates  were obtained using the streak plate quadrant. In the biooxidation process using CuFeS 2 , sulfuric acid levels were measured using the turbidimetric method, the levels of [Cu] and [Fe] in the biooxidation medium  were  tested  using  AAS  (Atomic  Absorption  Spectroscopy).  K.2  isolate  was  selected  as sulfuric acid producing bacteria with the highest sulfate concentration [SO 4 2- ] 13.9 ppm at 48 hours. These bacteria have the potential as biooxidizing agents for Cu and Fe metals. Keywords: Sulfuric acid-producing bacteria, Biooxidation, Acidic waste.
Jurnal Pembelajaran dan Biologi Nukleus is Licensed Under a CC BY SA Creative Commons Attribution-Share a like 4.0 International License . https://doi.org/10.36987/jpbn.v8i2.2928

## PENDAHULUAN
Kawasan  khusus  industri  PT.  PIER  berada  di  Kecamatan  Rembang  Kabupaten Pasuruan, area ini telah menyediakan infrastruktur yang memadai termasuk pengolahan limbah (Kominfo, 2021). Selain kawasan industri tersebut, terdapat wilayah Kabupaten Pasuruan yang diperuntukkan sebagai pembangunan industri, sehingga aliran sungai di sekitarnya terdampak oleh limbah yang dihasilkan. Sungai Kejayan merupakan salah satu sungai  yang  terdampak  oleh  limbah  industri  sekitar.  Limbah  industri  dan  domestik umumnya merupakan pencemar logam berat pada sungai (Yudo, 2018) . Salah satu industri yang memberikan dampak lingkungan yang disebabkan oleh limbah  di  sungai  Kejayan  adalah  industri  yang  bergerak  di  bidang  penyamakan  kulit. Terdapat  3  tahapan  utama  dalam  proses  penyamakan  kulit,  salah  satunya  adalah pengasaman  ( picling )  yang  bertujuan  agar  kulit  tidak  bengkak  saat  direaksikan  dengan obat penyakan, proses ini bersifat asam dengan pH sekitar 3,0-3,5. Selain proses tersebut masih banyak lagi proses penyamakan yang menggunakan bahan kimia berbahaya bagi lingkungan.  Secara  umum  nilai  pH  limbah  campuran  tiap  proses  penyamakan  kulit adalah 3,6 (Fachria et al ., 2020).
Proses penyamakan kulit melibatkan berbagai aktivitas fisik, kimiawi dan biologi. Cemaran  mikroba  pada  lingkungan  limbah  penyamakan  kulit  merupakan  dampak aktivitas biologi, berbagai mikroba dapat hidup di area tersebut terutama mikroba yang mampu bertahan hidup pada kondisi lingkungan tercemar dan pH rendah. Ulya et al.,
(2018) mampu mengisolasi bakteri pengoksidasi CuFeS 2 dan FeS yang juga menghasilkan asam sulfat dari tanah masam Kalimantan. Umumnya bakteri pengoksidasi logam Fe dan S yang meghasilkan asam sulfat berasal dari limbah pertambangan (Vargas et al ., 2020) (Lopes et al ., 2020) (Ahn et al ., 2019) (Mubarok et al ., 2017) (Zhao et al ., 2013) (Lindström et  al .,  1992) dan  area  kawah  (Praminati et  al .,  2018)  serta  bakteri  yang  digunakan umumnya adalah Acidithiobacillus ferrooxidans (Zhao et al ., 2013) (Liu et al ., 2017). Ulya et al .,  (2018) membuktikan  bahwa  selain  pada  area  pertambangan  dan  kawah  dapat ditemukan bakteri penghasil asam sulfat dengan karakter tanah pertumbuhannya bersifat asam. Bakteri pengoksidasi logam Fe dan S ini adalah agen pada proses biooksidasi yang merupakan proses pengolahan limbah logam ramah lingkungan dan lebih ekonimis. Selama ini penelitian pemanfaatan limbah industri penyamakan kulit umumnya terbatas  pada  bakteri  penghasil  enzim  protease (Said  &  Likadja,  2012) .  Isolasi  bakteri penghasil asam sulfat selama ini dilakukan pada area-area pertambangan dan area dengan keasaman sangat rendah, namun isolasi bakteri penghasil asam sulfat dari area sungai yang terdampak limbah industri penyamakan kulit belum dilakukan. Maksud dan tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan bakteri lokal penghasil asam sulfat dari tanah area sungai Kejayan sebagai agen biooksidasi.

## METODE

## Pengambilan Sampel dan Pembedahan P. pardalis
Tanah pinggiran sungai Kejayan Kabupaten Pasuruan digunakan sebagai sampel dalam  penelitian  ini.  Pengambilan  sampel  tanah  dilakukan  pada  dua  titik  sebagai variabel.  Sampel  dimasukkan  dalam  plastik ziplock steril  dan  disimpan  pada  suhu  5 0 C untuk langsung dikerjakan di laboratorium.

## Media Bakteri
Media  pertumbuhan  Isolat  bakteri  menggunakan  hasil  modifikasi Ulya et  al .,
(2018) yakni medium thiosulfat dengan kandungan Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O 7,85g, MgCl 2 .6H 2 O 0,1g, KH 2 PO4 3g, CaCl 2 .2H 2 O 0,13g, NH 4 Cl 0,1g, FeCl 2 .4H 2 O 0,014g dan glukosa 5g dalam  1000mL,  pH  larutan  4,2  (adjust  dengan  HCl  pekat),  dan  untuk  medium  agar tiosulfat dilakukan penambahan 15g/L bacto agar.

## Isolasi dan Pemurnian Bakteri
Pengenceran terhadap  dua  jenis  tanah  (titik  A,  titik  B)  merupakan  tahap  awal dalam  isolasi  bakteri,  dimulai  dengan  menimbang  masing-masing  sebanyak  1g  tanah diencerkan  dalam  9mL  aquades  steril  (10 0 ),  kemudian  satu  seri  pengenceran  10 -1 –10 -5 dibuat  dari  larutan  10 0 .  Sebanyak  100µL  masing-masing  pengenceran  dilakukan spreading/pour  plate pada  medium  agar  thiosulfat  yang  mengandung  antifungi  dan diinkubasi pada suhu 32 0 C sampai teramati pertumbuhan koloni bakteri. Tahap selanjutnya adalah pemurnian isolat, koloni bakteri yang tumbuh titik-titik terpisah dipindah ke media agar tiosulfat baru dan dilakukan pemurnian dengan metode streak plate tipe goresan kuadran sampai diperoleh isolat murni.

## Seleksi Bakteri
Satu ose isolat murni yang didapat diinokulasikan ke dalam media tiosulfat cair dan diinkubasi dalam shaker pada suhu ruang selama 24 jam dengan kecepatan 125rpm. Di  akhir masa inkubasi dilakukan  uji  kandungan  tiosulfat.  Isolat  terpilih untuk  proses Bio-oksidasi selanjutnya adalah yang dapat menurunkan kadar tiosulfat.

## Uji Kadar Tiosulfat
Pengecekan  kadar  tiosulfat  menggunakan  metode  titrasi  iodometri  modifikasi (Kamil et al ., 2008) . Sebanyak 10 mL larutan iodin 0,025 N ditambah aquades 10 mL, 5 mL sampel dan 2 mL HCl 6 N kemudian ditetesi indikator amilum dan dititrasi dengan Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O  0,025  N  hingga  warna  biru  memudar  dan  hilang.  Kadar  ion  tiosulfat (S 2 O 3 2- ) dihitung menggunakan rumus:
[S 2 O 3 2- ] (mg/L) = [(𝐴𝑥𝐵)−(𝐶𝑥𝐷)𝑥 1,121.10 5 𝑚𝐿 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 Keterangan, A: Volume larutan iodin yang terpakai (mL) B: Normalitas larutan iodin C: Volume Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O yang terpakai D: Normalitas larutan Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O

## Biooksidasi CuFeS2
25  mL preculture dengan  komposisi  media  CuFeS 2 5,85  g/L  (pengganti Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O 7,85 g/L), CaCl 2 .2H 2 O 0,13 g/L, KH 2 PO 4 3 g/L, FeCl 2 .4H 2 O 0,014g/L, NH 4 Cl 0,1 g/L, MgCl 2 .6H 2 O 0,1 g/L dan glukosa 5 g/L. Satu ose bakteri dimasukkan dalam media preculture dan dishaker, setelah 24 jam 5 mL inokulum dimasukkan pada 100 mL media oksidasi (komposisi sama dengan media preculture) dan diinkubasi 150 rpm pada suhu 37 0 C selama 24 jam, media kontrol (abiotik) adalah tanpa penambahan inokulum.  Tahap  ini  dilakukan  pengecekan  kadar  asam  sulfat,  OD  dan  pH  serta  uji
konsentrasi  Cu  dan  Fe  total  pada  filtrat.  Pengecekan  OD  media  menggunakan  kertas saring whattman no.1 dan diukur absorbansinya menggunakan spektofotometer VWR UV-1600PC di λ 600 nm.

## Uji Kadar Asam Sulfat
Kadar  asam  sulfat  pada  media  biooksidasi  diukur  menggunakan  metode  turbidimetri, larutan  standar  sulfat  yang  digunakan  adalah  K 2 SO 4 dengan  konsentrasi  0-10  mM. Sampel uji adalah media biotik maupun abiotik disaring dengan kertas Whattman no. 41, dan  disentrifugasi  dingin  dengan  kecepatan  6000  rpm  selama  20  menit.  Sedangkan sampel kontrol (blangko) menggunakan 1 mL dH 2 O.
Satu mL reagen conditioning (150 g NaCl, 60 mL HCl pekat, 100 mL gliserol, 200 mL etanol 95% dalam 1 L dH 2 O) ditambah 0,06 g BaCl 2 dan mL sampel kemudian divortex 30 detik, setelah itu absorbansinya diukur dengan spektrofotometer VWR UV- 1600PC pada λ 420 nm. Kadar asam sulfat yang dihasilkan isolat dalam sampel dihitung rumus.
[SO 4 2- ] = [A] – [B]
Keterangan
[A] :  Kadar [SO 4 2- ] pada sampel biotik [B] : Kadar [SO 4 2- ] pada sampel abiotik

## Cat Gram Bakteri
Suspensi bakteri diambil secara aseptis dan diletakkan di atas object glass lalu difiksasi untuk karakterisasi gram bakteri, lalu ditetesi cat gram A ( crystal violet ) diamkan selama 1 menit, dicuci menggunakan aquades dan dikeringkan. Langkah selanjutnya ditetesi cat gram B (mordan lugol’s iodine) dibiarkan selama 1 menit, dicuci menggunakan aquades dan  dikeringkan.  Cat  gram  C  (alkohol)  kemudian  diteteskan  sebagai  cat  peluntur  dan dibiarkan selama 15 detik dan dicuci dengan aquades. Selanjutnya ditetesi cat gram D (safranin) dibiarkan selama 1 menit dibilas menggunakan aquades dan dikeringkan. Hasil pengecatan gram diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran kuat serta ditetesi minyak imersi.
Identifikasi  gram  bakteri  juga  menggunakan  cat  gram  KOH  3%.  KOH  3% diteteskan  pada  object  glass,  ditambahkan  isolat  bakteri  dan  diaduk  selama  1  menit. Erkmen (2021) Bakteri gram negatif akan menyebabkan suspensi menjadi kental seperti lendir

## Uji Kadar Cu dan Fe
Kadar Cu dan Fe total yang terlarut pada media biooksidasi dicek menggunakan metode AAS (A tomic Absorption Spectroscopy ).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil
Sampel  tanah  sungai  Kejayan  terdiri  dari  dua  jenis  yaitu  tanah  dinding  sungai  pada kedalaman  5-10  cm  dari  permukaan  tanah  (titik  A),  dan  tanah  pinggiran  sungai  pada kedalaman 5-10 cm dari permukaan tanah (titik B). Kedua jenis tanah tersebut kemudian
dilakukan  pengenceran  dan  diratakan  pada  media  agar  tiosulfat  dengan  metode  pour plate.
Pada titik A dan B teramati mulai tumbuh koloni bakteri pada hari ke 3, Koloni bakteri tersebut dimurnikan kembali dengan metode streak plate tipe goresan kuadran, dari hasil tersebut didapat 6 isolat murni, 2 isolat dari titik A dan 4 isolat dari titik B. Isolat-isolat murni tersebut dicek kadar tiosulfat sebagai tahap seleksi selanjutnya. Kurva pertumbuhan dan kultivasi isolat murni menggunakan media cair tiosulfat. Isolat yang dapat  menurunkan  kadar  tiosulfat  diseleksi  untuk  tahap  selanjutnya,  Tiosulfat  (S 2 O 3 2- ) diasumsikan mengalami oksidasi menjadi sulfat (SO 4 2- ) walaupun dalam konsentrasi yang sangat rendah sehingga konsentrasi tiosulfat akan terus menurun pada kadar tertentu jika bakteri  tersebut  dapat  melakukan  oksidasi  tiosulfat.  Asumsi  lainnya  tiosulfat  diduga sebagai senyawa metastabil yang mengalami dekomposisi pada sistem leaching.
Gambar 1. Hasil isolasi bakteri metode streak plate tipe goresan kuadran
Dari  uji  kadar  tiosulfat  didapat  hanya  ada  1  isolat  (isolat  K.2)  yang  terseleksi untuk tahap selanjutnya. Langkah pertama pada proses Biooksidasi terhadap isolat K.2 adalah    pembuatan  media preculture (media  adaptasi)  dan main  culture menggunakan CuFeS 2 5,85 g/L sebagai ganti Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O 7,85g.  Isolat K.2 diinkubasi selama 24 jam dalam media preculture kemudian dipindahkan ke dalam media main culture.
Tabel 1. Kadar tiosulfat terukur pada seluruh isolat selama 7 hari
Isolat Penurunan kadar  [S 2 O 3 2- ] (mg/L) K.1 0 K.2 0,019 K.3 0,001 K.4 0,001 K.5 0 K.6 0,002
Pada kurva pertumbuhan yang ditunjukkan oleh gambar 2, isolat K.2 mengalami fase stasioner pada hari ke-3 hingga ke-5, fase kematian pada hari ke-6. Tahap ini juga
dilakukan pengecekan kadar keasaman (pH) terhadap media main culture . Berdasarkan gambar  3  kurva  pH  masa  biooksidasi,  isolat  R.1  dapat  terus  menurunkan  pH  media menjadi 3,5 pada hari ke-9 sedangkan pada isolat R.4 pH terendah dicapai pada hari ke- 8 namun pada hari ke-10 mengalami sedikit kenaikan pH menjadi 4,51 maka isolat R.1 yang terseleksi untuk diuji kadar sulfat (SO 4 2- ) serta uji kadar Cu dan Fe menggunakan metode AAS .
Gambar 2. Kurva pertumbuhan isolat pada media biooksidasi
Uji kadar sulfat (SO 4 2- ) pada media abiotik (kontrol, tidak mengandung isolat K.2) dan media biotik (mengandung isolat K.2) mengacu pada larutan standar sulfat K 2 SO 4 dengan konsentrasi 0-10 mM. Gambar 3 menunjukkan bahwa pada kondisi biotik (series 2)  terukur  hampir  lebih  tinggi  dibanding  kondisi  abiotik  (series  1),  hal  tersebut  juga sebanding dengan pH yang terukur pada media biooksidasi (gambar 4).
Gambar 3. Kadar sulfat [SO 4 2- ] pada media biotik dan abiotik 0,034 0,042 0,068 0,082 0,083 0,083 0,075 0,07 0,05 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 OD waktu (hari) 7,6 11,3 7,1 8,02 8,57 9,68 10,86 11,89 12,23 12,57 13,03 13,9 5 8 11 14 17 0 6 12 18 24 30 36 42 48 [SO 4 2- ] (ppm ) waktu (jam) Series1 Series2
Pengecekan kadar sulfat dilakukan tiap enam jam sekali selama 48 jam. Pada jam ke-0 terukur sebesar 8,2 ppm, dan terus meningkat hingga jam ke-48 sebesar 13,9 ppm. Selaras dengan pH yang terukur pada jam ke-0 adalah 4,8 untuk kontrol dan 4,78 untuk abiotik yang kemudian tergambar terus menurun hingga jam ke-84 pada media biotik dan mengalami  sedikit  peningkatan  pada  jam  ke-96  hingga  jam  ke-120.  Sedangkan  pada media  kontrol  pH  yang  terukur  hampir  konstan  di  angka  4,5.  Hal  tersebut  dapat diasumsikan bahwa penurunan pH dapat disebabkan oleh adanya kenaikan kadar asam sulfat (H 2 SO 4 ) yang dihasilkan oleh isolat K.2. kadar sulfat tertinggi diperoleh pada jam ke-48 sebesar 13,9 ppm.
Gambar 4. pH media biotik dan abiotik
Berdasarkan gambar 5 diketahui nilai kadar [Cu] total tertinggi diperoleh pada jam ke-24 sebesar 0,34 ppm, sedangkan [Fe] total tertinggi 0,09 ppm pada jam ke-36 dan 48.  Dalam  media  Biooksidasi  senyawa  CuFeS2  mengalami  dekomposisi  melibatkan proses  pelepasan  dan  penangkapan  beberapa  ion  yang  tergambar  pada  persamaan (Mubarok et al., 2017) : CuFeS 2 + O 2 + 2H 2 SO 4 → Fe
2+ + Cu 2+ + 2SO 4 2- + 2S + 2H 2 O ................................ (1)
Gambar 5. Kadar [Cu] dan [Fe] total pada media biooksidasi
4,8 4,5 4,5 4,45 4,45 4,36 3,32 3,34 3,58 3 3,3 3,6 3,9 4,2 4,5 4,8 5,1 0 20 40 60 80 100 120 pH waktu (Jam) kontrol K.2 0,19 0,22 0,34 0,3 0,27 0,08 0,082 0,083 0,09 0,09 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 -2 8 18 28 38 48 ppm waktu (jam) [Cu] [Fe]
Berdasarkan  pengecatan  gram  yang  dilakukan  pada  isolat  K.2  menunjukkan warna  kemerahan,  hal  tersebut  mengindikasikan  bahwa  isolat  adalah  bakteri  gram negatif. Penggunaan KOH 3% juga menghasilkan suspensi kental seperti lendir, hal ini membuktikan bahwa isolat K.2 adalah bakteri gram negatif.

## Pembahasan
Sungai Kejayan merupakan area yang dialiri limbah dari berbagai industri sekitar. Proses yang terjadi selama di industri melibatkan proses kimia dan biologi, bahan-bahan mineral yang terkandung di dalamnya menghasilkan tingkat keasaman pada dinding tanah sungai Kejayan Pasuruan. Bakteri yang dapat hidup di daerah tersebut mengindikasikan bahwa tahan terhadap lingkungan ekstrim (pH rendah) serta tahan terhadap logam hasil limbah industri. (Lingga & Afriyansyah, 2020) menyatakan bahwa resistensi bakteri terhadap Cu asal  sedimen  laut  yang  terpapar  logam  berat  dapat  dimanfaatkan  sebagai  agen bioremediasi  cemaran  logam  berat  di  lingkungan  perairan.  Hal  tersebut  menunjukkan karakteristik  bakteri  yang  resisten  terhadap  lingkungan  ektrim  tempat  asalnya  dapat dijadikan sebagai agen bioremediasi atau biooksidasi. Sehingga isolat bakteri K.2 yang berhasil  diiisolasi  dari  sungai  kejayan  mengindikasihan  bahwa  resisten  terhadap lingkungan dengan keasaman tinggi.
Karakteristik sel bakteri serta mekanisme seluler yang terjadi dalam sel bakteri dapat  menjadi  faktor  penentu  terhadap  kemampuannya  dalam  bertahan  hidup  atau beradaptasi pada lingkungan ekstrim. Isolat K.2 memiliki karakteristik yang dapat hidup di lingkungan asam (sungai Kejayan), serta dapat beradaptasi dalam media Bio-oksidasi yang mengandung logam Cu dan Fe yang ditunjukkan oleh gambar 2.
Substrat  utama  yang  digunakan  dalam  media  isolasi  dan  pertumbuhan  adalah Natrium Tiosulfat (Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O), senyawa tiosulfat umum digunakan sebagai substrat dikarenakan  secara  energi  sangat  menguntungkan  bagi  bakteri  pengoksidasi  sulfur menjadi  sulfat  sesuai  drngan  ketersediaan  jumlah  zat pengoksidasinya  (Pokorna  & Zabranska, 2015) yang ditunjukkan oleh persamaan 2, serta sifatnya yang mudah larut dalam air dibanding dengan senyawa sulfur lain dan lebih stabil terhadap rentang pH, serta  dalam  proses  degradasinya  membentuk  koloidal  sulfur (Robertson  &  Kuenen, 2006b ).  Sehingga  pada  media  cair  pertumbuhan  isolat  K.2  teramati  kekeruhan  seiring pertambahan waktu inkubasi. Proses konversi tiosulfat menjadi sulfat melibatkan sistem multi enzim, penurunan pH juga terjadi akibat pembentukan produk intermediet yang bersifat asam. Sehingga pada media biotik yang menunjukkan karakter penurunan pH dan penurunan kadar tiosulfat didapat pada isolat K.2.
S 2 O 3 2- + H 2 O + 2O 2 → 2SO 4 2- + 2H + .................................................................... (2)
Berdasarkan  komposisi  garam  mineral  pada  media  isolasi  dan  pertumbuhan, isolat  K.2  merupakan  bakteri  kemolitoautotrof.  Kelompok  bakteri  ini  diketahui merupakan  kelompok  organisme  yang  mengubah  senyawa  sulfur  pada  tanah  dan sedimen (Robertson  &  Kuenen,  2006b) .  Bakteri  kemolitoautotrof  umumnya memanfaatkan  energi  yang  berasal  dari  senyawa  sulfur  anorganik  tereduksi,  dalam penelitian  ini  yakni  senyawa  Natrium  Tiosulfat  (Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O).  CO 2 umumnya digunakan sebagai sumber karbon dalam pertumbuhannya (Pokorna & Zabranska, 2015) , namun sumber karbon utama yang digunakan untuk isolat K.2 adalah senyawa glukosa.
(Tang et al ., 2009) menyatakan bahwa jenis bakteri pengoksidasi sulfur kemolitoautotrof memperoleh energi dari oksidasi senyawa sulfur tereduksi namun tidak dapat mengikat molekul CO 2 .
Pewarnaan  gram  pada  isolat  K.2 menunjukkan  jenis  bakteri  gram  negatif. Hal tersebut  sejalan  dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh (Saavedra et  al .,  2020) dengan menggunakan bakteri Acidithiobacillus ferrooxidans yang merupakan bakteri gram negatif sebagai bakteri pengoksidasi besi. Bakteri tersebut telah umum digunakan sebagai agen biooksidasi  dan  bioremediasi  pada  lingkungan  tercemar  logam  ataupun  lingkungan ekstrim  seperti  kondisi  lingkungan  dengan  keasaman  rendah. (Pokorna  &  Zabranska, 2015) juga  menyatakan  bahwa  bakteri  pengoksidasi-sulfur  dikenal  sebagai  bakteri kemolitoautotrof  tak  berwarna    pengoksidasi-sulfur  ( colorless  sulfur-oxidizing  bacteria ) dengan karakteristik sebagai bakteri gram negatif. Kata sifat “tak berwarna” menandakan kurangnya  fotopigmen  yang  dimiliki  oleh  golongan  bakteri  ini (Robertson  &  Kuenen, 2006a)
Pada  media  Bio-oksidasi,  kandungan  substrat  Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O  diganti  dengan CuFeS 2 5,85  g/L.  Isolat  K.2  dianggap  telah  mampu  beradaptasi  dengan  substrat  yang mengandung  sulfur  (senyawa  sulfur  tereduksi),  sehingga  nantinya  proses  biooksidasi dapat  mendekomposisi  CuFeS 2 berdasarkan  persamaan  reaksi  (3)  melalui  pengukuran kadar Cu dan Fe total. Berdasarkan gambar 3 pada kondisi biotik (mengandung isolat K.2)  kadar  sulfat  [SO 4 2- ]  lebih  tinggi  dibanding  pada  kondisi  abiotik  (tidak  ada  isolat K.2/kontrol) dengan diiringi nilai pH keduanya (gambar 4) yang menunjukkan bahwa pH kondisi biotik lebih rendah dibanding kondisi abiotik (kontrol). CuFeS 2 + O 2 + 2H 2 SO 4 → Fe 2+ + Cu 2+ + 2SO 4 2- + 2S + 2H 2 O ................................ (3)
Dekomposisi  CuFeS 2 menghasilkan  sulfur  (S 0 )  dengan  melibatkan  H + sebagai oksidator/donor elektron dan senyawa sulfat bertindak sebagai aseptor elektron pada sisi reduksi di siklus metabolisme sulfur (Robertson & Kuenen, 2006a). Ion Fe 2+ selanjutnya akan dioksidasi oleh bakteri menjadi Fe 3+ . S 0 akan dioksidasi menjadi H + dan SO 4 2- , hal inilah yang diasumsikan pada kenaikan kadar SO 4 2- di lingkungan biotik dibandingkan dengan lingkungan abiotik yang menyebabkan pH kondisi biotik lebih rendah dibanding abiotik. Selain sulfur (S 0 ) dekomposisi CuFeS 2 juga menghasilkan Cu dan Fe. (Zhu et al ., 2019) melaporkan  bahwa  penambahan  material  karbon  mampu  memepercepat  proses dekomposisi.
CuFeS 2 baik dalam media bioleaching ataupun media kimia (tanpa adanya bakteri pengoksidasi  sulfur).  Berdasarkan  kadar  [Cu]  dan  [Fe]  total  pada  media  biooksidasi terlihat  proses  dekomposisi  terhadap  Cu  dan  Fe  berjalan  lambat  dan  tidak  terlalu signifikan mengalami kenaikan. Hal ini mengindikasikan bahwa isolat K.2 tetap mampu melakukan  Bio-oksidasi  pada  CuFeS 2 meski  tanpa  penambahan  material  karbon  pada media Bio-oksidasi. Sehingga isolat K.2 berpotensi sebagai agen Bio-oksidasi terhadap logam Cu dan Fe.

## KESIMPULAN
Bakteri pengoksidasi sulfur atau penghasil asam sulfat dapat diisolasi pada area bukan  pertambangan.  Pada  tanah  sungai  Kejayan  Pasuruan  ditemukan  bakteri  yang menghasilkan asam sulfat dengan kadar tertinggi 13,9 ppm pada jam ke-48. Bakteri ini
berpotensi  sebagai  agen  Bio-oksidasi  logam  Cu  dan  Fe.  Rekomendasi  untuk  tahap selanjutnya adalah  sequensing  isolat  K.2,  BLAST  NCBI  dan Phylogenetic tree sehingga nantinya dapat diidentifikasi secara menyeluruh.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahn, J., Wu, J., Ahn, J., & Lee, J. (2019). Comparative investigations on sulfidic gold ore  processing:  A  novel  biooxidation  process  option. Minerals  Engineering ,
140 (April). https://doi.org/10.1016/j.mineng.2019.105864
Erkmen, O. (2021). Laboratory Practices in Microbiology (1st editio). Academic Press.
Fachria,  R.,  Ramdan,  H.,  &  Aryantha,  I.  (2020).  Efektivitas  pengolahan  limbah  cair industri  penyamakan  kulit  Sukaregang  Garut  dengan  adsorben  karbon  aktif  dan ijuk. Jurnal  Pengelolaan  Lingkungan  Berkelanjutan  (Journal  of  Environmental Sustainability  Management) , 3 (3),  379–388.  https://doi.org/10.36813/jplb.3.3.379- 388
Kamil, I., Ini, S., Untuk, D., Sebagian, M., Menjadi, P., Teknik, S., Kimia, D. T., Teknik, F.,  &  Indonesia,  U.  (2008). Pemanfaatan  Bakteri  Thiobacillus  thioparus  untuk Mendegradasi Kandungan Sulfur dalam Gas Alam .
Kominfo,  A.  (2021). Gambaran  Umum  Kabupaten  Pasuruan  2021 .  09  Agustus. https://www.pasuruankab.go.id/pages-29-gambaran-umum-kabupaten-pasuruan- 2021
Lindström, E. B., Gunneriusson, E., & Tuovinen, O. H. (1992). Bacterial oxidation of refractory  sulfide  ores  for  gold  recovery. Critical  Reviews  in  Biotechnology , 12 (1–2), 133–155. https://doi.org/10.3109/07388559209069190
Lingga, R., & Afriyansyah, B. (2020). Identification Of Cu Resistant Bacteria From Tin Mining-Affected Sea Sediment. Jurnal Pembelajaran Dan Biologi Nukleus , 6 (2), 112– 119. https://doi.org/10.36987/jpbn.v6i2.1666
Liu, H. chang, Xia, J. lan, Nie, Z. yuan, Liu, L. zhu, Wang, L., Ma, C. yan, Zheng, L.,
Zhao, Y. dong, & Wen, W. (2017). Comparative study of S, Fe and Cu speciation transformation  during  chalcopyrite  bioleaching  by  mixed  mesophiles  and  mixed thermophiles. Minerals Engineering , 106 , 22–32.
https://doi.org/10.1016/j.mineng.2017.01.013
Lopes, A. R., Madureira, D., Diaz, A., Santos, S., Vila, M. C., & Nunes, O. C. (2020). Characterisation of bacterial communities from an active mining site and assessment of  its  potential  metal  solubilising  activity. Journal  of  Environmental  Chemical Engineering , 8 (6), 104495. https://doi.org/10.1016/j.jece.2020.104495
Mubarok,  M.  Z.,  Winarko,  R.,  Chaerun,  S.  K.,  Rizki,  I.  N.,  &  Ichlas,  Z.  T.  (2017). Improving gold recovery from refractory gold ores through biooxidation using iron- sulfur-oxidizing/sulfur-oxidizing mixotrophic bacteria. Hydrometallurgy , 168 , 69–75. https://doi.org/10.1016/j.hydromet.2016.10.018
Pokorna, D., & Zabranska, J. (2015). Sulfur-oxidizing Bacteria in Environmental Technology Sulfur-oxidizing bacteria in environmental technology . February . https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2015.02.007
Robertson, L. A., & Kuenen, J. G. (2006a). The Colorle ss Sulfur Bacter i a . 985–1011.
Robertson,  L.  A.,  &  Kuenen,  J.  G.  (2006b). The  Genus  Thiobacillus . 5 ,  812–827. https://doi.org/DOI: 10.1007/0-387-30745-1_37
Saavedra,  A.,  Aguirre,  P.,  &  Gentina,  J.  C.  (2020).  Biooxidation  of  Iron  by Acidithiobacillus ferrooxidans in  the Presence of D-Galactose:  Understanding Its Influence on the Production of EPS and Cell Tolerance to High Concentrations of Iron. Frontiers in Microbiology , 11 (April), 1–9. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00759
Said,  M.  I.,  &  Likadja,  J.  C.  (2012).  Isolasi  dan  Identifikasi  Bakteri  yang  Berpotensi sebagai Penghasil Enzim Protease pada Industri Penyamakan Kulit PT.Adhi Satria abadi (ASA), Yogyakarta. Jurnal Ilmu Dan Teknologi Pertenakan , 2 (9), 121–128.
Tang, K., Baskaran, V., & Nemati, M. (2009). Bacteria of the sulphur cycle : An overview of microbiology  ,  biokinetics  and  their  role  in  petroleum  and  mining  industries . 44 ,  73–94. https://doi.org/10.1016/j.bej.2008.12.011
Ulya, F., Prijambada, I. D., & Wiratni. (2018). Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Pengoksidasi CuFeS2 dan FeS dari Tanah Sulfat Masam Kalimantan . Universitas Gadjah Mada.
Vargas,  T.,  Estay,  H.,  Arancibia,  E.,  &  Díaz-Quezada,  S.  (2020).  In  situ  recovery  of copper  sulfide  ores:  Alternative  process  schemes  for  bioleaching  application.
Hydrometallurgy , 196 , 105442. https://doi.org/10.1016/j.hydromet.2020.105442
Yudo,  S.  (2018).  Kondisi  Pencemaran  Logam  Berat  Di  Perairan  Sungai  Dki  Jakarta. Jurnal Air Indonesia , 2 (1), 1–15. https://doi.org/10.29122/jai.v2i1.2275
Zhao, X., Wang, R., Lu, X., Lu, J., Li, C., & Li, J. (2013). Bioleaching of chalcopyrite by  Acidithiobacillus  ferrooxidans. Minerals  Engineering , 53 ,  184–192. https://doi.org/10.1016/j.mineng.2013.08.008
Zhu, P., Liu, X., Chen, A., & Liu, H. (2019). Comparative study on chalcopyrite bioleaching with assistance of different carbon materials by mixed moderate thermophiles . 29 , 1294–1303. https://doi.org/10.1016/S1003-6326(19)65036-3
How To Cite This Article, with APA style : Ulya F. (2022). Isolatin and Selection of Sulfuric Acid Bacteria from Kejayan River as Bio-oxidation  Agents. Jurnal  Pembelajaran  dan  Biologi  Nukleus ,  8(2),  419-429. https://doi.org/10.36987/jpbn.v8i2.2928.