Efektivitas Ekstrak Daun Macaranga tanarius dalam Menginaktifasi

## EFEKTIVITAS EKSTRAK DAUN Macaranga tanarius DALAM MENGINAKTIFASI

## VIRAL NERVOUS NECROSIS IKAN KERAPU TIKUS
Saparuddin 1* , A. Ridwan 2 , Z. Arham 3
1 Program Studi Pendidikan Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Sembilanbelas November, Kolaka
2 Jurusan Biologi Fakultas Sekolah Ilmu dan Tek nologi Hayati Institut Teknologi Bandung
3 Jurusan Matematika dan Pengetahuan Alam Fakultas Tarbiyah  Institut Agama Islam  Negeri (IA IN) Kendari
1* e-mail : saparuddin_pbio@usn.ac.id

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengekstraksi  senyawa  kimia  yang  terkandung  dalam  daun Macaranga  tanarius dan  menguji  efektivitasnya  dalam  menghambat  virus  Viral  Nervous Necrosis  (VNN)  pada  ikan  kerapu  tikus  ( Cromileptes  altivelis )  secara invivo melalui parameter hematologi yang meliputi jumlah leukosit, eritrosit, dan trombosit. Proses ekstraksi dilakukan  menggunakan  pelarut  etanol  dengan  perendaman  selama  72  jam.  Berdasarkan hasil uji yang dilakukan melalui pemberian pakan pada ikan kerapu tikus dengan variasi berat ekstrak daun Macaranga tanarius yang berbeda diketahui bahwa ekstrak  daun Macaranga tanarius efektif  menaikkan  jumlah  eritrosit  dan  menurunkan  jumlah  leukosit  serta memberikan  perbedaan  yang  signifikan  dengan  kelompok  kontrol.  Jumlah  eritrosit  tertinggi diperoleh pada perlakuan ke-4 (3,73 x 10 6 sel/ml), sedangkan jumlah leukosit terendah pada perlakuan ke-4 (7,8 x 10 5 sel/ml).
Kata  Kunci :  Macaranga  tanarius,  Ikan  kerapu  tikus,  VNN,  Ekstrak  etanol,  Parameter hematologi

## ABSTRACT
This study aims to extract of the chemical compounds contained in the leaves of Macaranga tanarius and  test  their  effectiveness  in  impede  of  Viral  Nervous  Necrosis  (VNN)  virus  in humpback grouper ( Cromileptes altivelis ) by invivo through hematologic parameters including leukocyte  count,  erythrocytes  and  platelets.  The  extraction  process  was carried  out  using ethanol  solvent  with  immersion  for  72  hours.  Based  on  the  results  of  the  tests  conducted through feeding on humpback grouper with weight variations different of macaranga tanarius leaf extract, it is known that macaranga tanarius leaf extract effectively increase the amount of  erythrocytes  and  decrease  the  leukocyte  count  and  give  significant  difference  with  the control group. The highest amount of erythrocytes was obtained at the 4 th treatment (3.73 x 10 6 cells/mL), while the lowest leukocyte count was in the 4 th treatment (7.8 x 10 5 cells /mL).
Keywords: Macaranga tanarius , humpback grouper, VNN, extract of ethanol, hematological parameters

## PENDAHULUAN
Dalam  beberapa  tahun  terakhir,
VNN dilaporkan sebagai penyebab penyakit  mematikan  ikan  kerapu  tikus.
Pemberian  pakan  dengan  ikan  rucah menyebabkan  ikan  kerapu  tikus  terinfeksi VNN  (Rizka et  al., 2013).  VNN  akan menyerang  organ  otak  dan  secara  cepat menyerang  reseptor  ikan  kerapu  tikus kemudian  menyebar  ke  otak  melalui sirkulasi darah. (Chi, 2006).
Keberadaan  VNN  dalam  tubuh ikan kerapu tikus ditandai dengan munculnya beberapa  gejala seperti warna tubuh  menjadi  gelap,  berenang  sambil berputar-putar, tubuh ikan menukil kebawah, menabrak dinding kolam, penutupan  selaput  mata,  mengalami  buta dan pelemahan syaraf, serta menyebabkan ikan menjadi mati (Yanuhar,
2011).  Selain  itu,  ikan  yang  terinfeksi menyebabkan  perbedaan  pada  jumlah leukosit,  eritrosit,  dan    trombosit  (Lagler et al., 1977 ).
Irianto (2005) menyatakan
bahwa pemeriksaan darah ikan merupakan  faktor  sangat  penting  dalam membantu  diagnosis,  prognosis,  dan terapi.  Namun  sejauh  ini  pemeriksaan darah  ikan  kerapu  tikus  dari  aspek hematologi belum banyak
yang
melaporkan.
Sehingga untuk
mengetahui  status  ikan  terinfeksi,  maka perlu  dilakukan  pemeriksaan  karakteristik darah,  yang  nantinya  dapat  digunakan sebagai  solusi  penanganan  VNN  pada ikan  kerapu  tikus.  Dimana  berdasarkan
studi  literatur,    cara  penanganan  infeksi VNN  pada  budidaya  ikan  kerapu  tikus hingga saat ini belum ditemukan.
Berdasarkan  uji invitro ,  ekstrak etanol daun Macaranga tanarius dilaporkan  memiliki  efektivitas  yang  baik dalam  menghambat  perkembangan  virus pada  ikan.  Daun Macaranga  tanarius mengandung senyawa kimia yang bersifat fenolik  seperti  senyawa  flavonoid,  tannin, terpenoid  dan  lignan  (Lim et  al., 2008).
Senyawa flavonoid (quercetin, morin, rutin, dan  hesperidin)  memiliki  kemampuan secara invitro untuk  menghambat  siklus replikasi  virus  yaitu  pada  tahap  adsorpsi dan  penetrasi    (Calvalho et  al., 2013).
Senyawa tanin dapat menghambat pertumbuhan virus immunodeciency
human  (HIV)  dan  virus  herpes  simpleks
(HSV) (Lee et al ., 2000).
Dalam penelitian ini kami melaporkan efektivitas ekstrak etanol daun Macaranga  tanarius dalam menginaktifasi virus  VNN  pada  ikan  kerapu  melalui pemberian  pakan  yang  selanjutnya  diuji secara invivo melalui parameter hematologi.  Berdasarkan  studi  literatur yang  kami  lakukan,  uji  secara invivo dari senyawa  kimia  yang  terkandung  dalam daun Macaranga tanarius khususnya pada ikan kerapu tikus belum dilaporkan.

## METODE PENELITIAN Pembuatan Ekstrak
Pembuatan  ekstrak  daun M.  tanarius diawali  dengan  pengeringan  pada  suhu ruang dan dilanjutkan dengan
penghalusan.  Serbuk  halus  kemudian direndam  dengan  menggunakan  etanol 80% selama 72 jam yang  disertai dengan pengadukan.  Ekstrak  daun Macaranga tanarius diuapkan  dengan  evaporator pada suhu 65 o C hingga berbentuk pasta.

## Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  ikan  kerapu  tikus  ( C. altivelis) dengan  berat  badan  rata-rata 824,4  +  156,23  g.  Hewan  uji  tersebut diperoleh  dari    petani  budidaya  dengan diberikan  pakan  ikan  rucah  selama pemeliharaannya.  Menurut  Rizka et  al.,
(2013)  bahwa  pemberian  pakan  dengan ikan rucah akan terinfeksi VNN. Hewan uji diseleksi  sesuai  dengan  gejala-gejala klinik  yang  disebabkan  oleh  VNN  yaitu warna tubuh menggelap, berenang berputar-putar, tubuh ikan menukil kebawah,  ikan  menabrak  dinding  kolam, penutupan  selaput  mata,  mengalami  buta dan  pelemahan  syaraf  dan  ikan  mati (Yanuhar, 2011).

## Perlakuan
Sebanyak 25 ekor ikan kerapu  tikus  yang terinfeksi  VNN  dibagi  ke  dalam  5 kelompok  jaring  apung.  Setiap  kelompok berisi  5  ekor  ikan  dengan  lima  kali ulangan.  Perlakuan  1,  2,  3  dan  4 masing-masing diberikan ekstrak daun M.
tanarius dicampur  dengan  pakan  ikan komersil berturut-turut 2 g, 3 g, 4 g dan 5 g.  Ikan  kontrol  hanya  diberikan  pakan komersil.

## Pengambilan Sampel Darah
Sampel  darah  diambil  pada  hari  ke-0, hari-10, hari  ke-20  dan  hari  ke-30 setelah pemberian pakan 2 kali/hari. Pengambilan sampel  darah  menggunakan syringe melalui vena caudalis dekat ekor di antara sisik  ikan  kerapu  tikus.  Sampel  darah dihisap  perlahan  sebanyak    3  mL  setiap ekor,  kemudian  dipindahkan  ke  dalam tabung  hampa  udara  yang  telah  dibasahi terlebih dahulu dengan antikoagulan.

## Penghitungan Jumlah Eritrosit
Sampel  darah  ikan  dihisap  dengan  pipet toma  eritrosit  hingga  tanda  0,5  dengan aspirator.  Selanjutnya,  larutan  Heyem dihisap hingga tanda 101. Diteteskan pada hemositometer  yang    terpasang  kaca penutup.  Penghitungan  menggunakan mikroskop pada 5 kotak kecil hemositometer.  Jumlah  eritrosit  per  mL darah adalah jumlah sel x 10000.

## Penghitungan Jumlah Leukosit
Sampel  darah  ikan  dihisap  dengan  pipet leukosit hingga tanda 0,5 dengan aspirator.    Selanjutnya,  larutan  turk dihisap hingga mencapai tanda 11. Cairan dalam pipet diteteskan ke dalam hemositometer  yang  terpasang  kaca penutup. Perhitungan menggunakan mikroskop pada 4 kotak besar perhitungan leukosit.  Jumlah  leukosit  per  mL  darah adalah jumlah sel x 50.

## Penghitungan Jumlah Trombosit
Sampel  darah  ikan  dihisap  dengan  pipet berskala  sampai  0,5.  Selanjutnya  cairan Rees  Ecker  dihisap  hingga  mencapai
tanda  101.  Cairan  di  teteskan  ke  dalam hemositometer  yang  terpasang  kaca penutup. Penghitungan dilakukan menggunakan  mikroskop  pada  seluruh bidang  besar  tengah.  Jumlah  leukosit  per mL darah adalah jumlah trombosit x 2000.

## Analisis Data
Pengaruh ekstrak etanol daun M. tanarius
melalui  data  hematologi  ikan  kerapu  tikus dianalisis  secara  sidik  ragam  (ANOVA). Jika  analisis  menunjukkan  berpengaruh nyata atau F hitung > F tabel , maka dilanjutkan dengan  menggunakan  Uji  Beda  Nyata Terkecil  (BNT)  pada  taraf  kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Parameter hematologi yang diukur meliputi  jumlah  eritrosit,  jumlah  leukosit, dan  jumlah  trombosit  dengan  dosis perlakuan  pemberian  ekstrak  etanol  daun
M. tanarius yang dicampur dengan pakan ikan komersil yaitu kontrol (tanpa ekstrak),
P 1 (2 gr), P 2 (3 gr), P 3 (4 gr) dan P 4 (5 gr)
dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Rata-rata jumlah eritrosit, jumlah leukosit dan  jumlah  trombosit  ikan  kerapu  tikus  setelah  30 hari  pemberian  ekstrak  etanol  daun M.  tanarius. Huruf yang sama (a, ab, b, dan c) pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata (P<0,05)
Dosis Eritrosit Leukosit Trombosit (10 6 sel/ml)  (10 6 sel/ml)  (10 5 sel/ml Kontrol
1.11 ± 0.15 a 2.12 ± 0.31 a 1.45 ± 0.18 a
P 1 ( 2 gr )   2.04 ± 0.88 ab 1.58 ± 0.58 b 1.81 ± 0.18 a
P 2 ( 3 gr )   2.91 ± 1.51 bc 0.99 ± 0.49 c 1.37 ± 0.25 a
P 3 ( 4 gr )   3.14 ± 1.48 c 0.91 ± 0.48 c 1.44 ± 0.58 a
P 4 (5 gr )  3.73 ± 2.04 c 0.78 ± 0.57 c 1.65 ± 0.43 a

## Jumlah Eritrosit
Eritrosit  adalah  cakram  bikonkaf  tidak berinti  yang  berdiameter  +  8  µm,  tebal bagian  tepi  2  µm  dan  ketebalan  bagian tengah  menjadi  1  µm.  Komponen  utama eritrosit  adalah  hemoglobin  protein  yang mengangkut  sebagian  besar  oksigen  (O 2 ) dan  sebagian  kecil  fraksi  karbon  dioksida (CO 2 ). Menurut Kabata (1985) dan Bijanti,
(2005)  bahwa  eritrosit  diporduksi  pada organ hematopoitik, yang terdapat di ginjal dan  limpa.  Jika  organ  ini  tidak  dapat memproduksi  darah  untuk  mengganti darah yang diinfeksi oleh mikroorganisme, maka jumlah eritrosit yang dapat berfungsi dengan  baik  makin  berkurang.  Hal  ini sesaui  dengan  hasil  penelitian  Esteban, (2001)  dan  Dugenci et  al (2003)  bahwa jumlah eritrosit menurun setelah terinfeksi mikroorganisme.  Data  hasil  penelitian menunjukkan  peningkatan  kadar  eritrosit pada  semua  perlakuan  ekstrak  daun M.
tanarius sampai  pengukuran  hari  ke-30
(Gambar 1).
Gambar  1 .  Rata-rata  jumlah  eritrosit    ikan  kerapu tikus selama 30 hari pemberian ekstrak etanol daun M. tanarius . Huruf yang sama (a, ab, b, dan c) pada kolom  yang  sama  menunjukkan  tidak  beda  nyata (P<0,05)
Semakin  tinggi  perlakuan  dosis  ekstrak
daun Macaranga  tanarius, maka  jumlah eritrosit  ikan  kerapu  tikus  semakin  tinggi bila  dibandingkan  dengan  perlakuan kontrol.  Jumlah  eritrosit  paling  tinggi ditemukan pada perlakuan ke-4,
selanjutnya pada perlakuan ke-3, ke-2 dan ke-1  dengan  jumlah  secara  berturut-turut 3,73 x 10 6 sel/ml; 3,14 x 10 6 sel/ml; 2,91 x 10 6 sel/ml; 2,04 x 10 6 sel/ml; dan 1,11 x 10 6
sel/ml.  Jumlah  eritrosit  tertinggi  pada perlakuan  ke-4  tersebut  menunjukkan jumlah  eritrosit  normal  ikan  laut.  Hal  ini sesuai dengan hasil penelitian Andayani et al (2008)  bahwa  jumlah  eritrosit  normal ikan  laut  antara  3,45 –  4,45  x  10 6 sel/ml.
Pemberian ekstrak daun M. tanarius yang didalamnya terkandung senyawa flavonoid memberikan  kenaikan  jumlah  eritrosit setelah  terinfeksi  VNN.  Karena,  flavonoid merupakan senyawa polifenol yang berperan  sebagai  antivirus.  Senyawa flavonoid  dapat  menghambat  proses replikasi  virus  pada  tahap  adsorpsi  dan tahap  penetrasi  dengan  cara  mengikat partikel  virus  secara  irreversibel  dan menghambat  glikoprotein  virus  untuk proses  infeksi  (Calvalho et  al., 2013).
Penghambatan senyawa flavonoid
terhadap  replikasi  VNN  pada  sel  darah ikan  kerapu  tikus  dapat  mengurangi jumlah sel yang terinfeksi dan jumlah VNN.
Seiring  dengan  berkurangnya  jumlah  sel yang  terinfeksi  dan  jumlah  VNN  pada  sel darah,  maka  organ  hematopoitik  pada ginjal  dan  limpa  dapat  memproduksi eritrosit untuk menggantikan sel-sel eritrosit  yang  terinfeksi  VNN  hingga
meningkat kearah jumlah eritrosit normal.

## Jumlah Leukosit
Leukosit  pada  ikan  teleostei  merupakan salah  satu  bagian  dari  sistem  pertahanan tubuh  yang  bersifat  non-spesifik  (Uribe et al., 2011).  Menurunya  jumlah  leukosit disebut leukopenia sedangkan meningkatnya  jumlah  leukosit  disebut leukositosis.  Leukosit  yang  diproduksi akan tinggi jika terdapat infeksi virus pada tubuh  ikan  dan  terdapat  upaya  dari  tubuh ikan tersebut untuk melawan (Azar, 2013). Hasil  pengamatan  jumlah  leukosit  ikan kerapu tikus pada hari ke-0 yang terinfeksi VNN  sangat  tinggi  dari  normal  sebesar
2,12  x  10 6 sel/ml.  Hal  ini  sesuai  dengan hasil  penelitian  Azhar  (2013)  bahwa jumlah leukosit ikan kerapu tikus setelah di uji  tantang  dengan V.  Algynolitikus meningkat  sebesar  9,23  x  10 6 sel/ml.
Peningkatan  jumlah  leukosit  ini  terkait dengan  kinerja  sistem  imun  ikan  dalam mereduksi infeksi VNN.
Gambar  2 :  Rata-rata  jumlah  leukosit  ikan  kerapu tikus selama 30 hari pemberian ekstrak etanol daun M. tanarius. Huruf  yang sama (a, ab, b, bc, dan c) pada  kolom  sama  sama  menunjukkan  tidak  beda nyata (P<0,05)
Data hasil penelitian menunjukkan penurunan kadar leukosit ikan kerapu tikus pada  semua  kelompok  perlakuan  ekstrak etanol  daun Macaranga  tanarius kecuali perlakuan kontrol . Jumlah leukosit terendah  terdapat  pada  perlakuan  ke-4 selanjutnya perlakuan ke-2; ke-3 dan ke-1 dengan jumlah secara berturut-turut 0,78 x 10 6 sel/mL;  0,99  x  10 6 sel/mL;  0,91  x  10 6
sel/mL; dan 1,58 x 10 6 sel/mL (Gambar 2).
Jumlah  leukosit  terendah  pada  perlakuan ke-4 tersebut menunjukkan jumlah leukosit ikan laut mendekati normal. Hal ini sesuai dengan  hasil  penelitian  Andayani et  al,
(2008) bahwa  jumlah leukosit normal ikan laut  antara  0,65  -  0,76  x  10 6 sel/mL.
Senyawa  flavonoid  yang  terkandung dalam  ekstrak  daun Macaranga  tanarius
yang  mampu  memberikan  penurunan jumlah  leukosit  setelah  terinfeksi  VNN. Karena,  senyawa  flavonoid  terutama quercetin dan hesperidin aktif menghambat replikasi virus dan mengganggu  sintesis  asam  nukleat  virus (Formica  dan  Regelson,  1995).  Aktifitas senyawa  flavonoid  yang  menghambat replikasi virus pada sel darah ikan kerapu tikus  berdampak  pengurangan  jumlah  sel yang terinfeksi dan jumlah VNN, sehingga jumlah  leukosit  akan  menurun  seiring dengan  berkurangnya  jumlah  sel  yang terinfeksi dan  jumlah  VNN pada sel darah ikan kerapu tikus.

## Jumlah Trombosit
Trombosit  atau  keping-keping darah
berperan penting dalam proses
pembekuan  darah.  Roberts  dan  Richards (1978)  menyatakan  bahwa  trombosit mengeluarkan  tromboplastin  yaitu  enzim yang  membuat  polimeri  dan  fibrinogen yang berperan  penting dalam pembekuan darah.
G ambar 3  : Rata-rata jumlah trombosit ikan kerapu tikus selama 30 hari pemberian ekstrak etanol daun M. tanarius. Huruf yang sama (a, ab, b, dan c) pada kolom  yang  sama  menunjukkan  tidak  beda  nyata (P<0,05)
Hasil  yang  ditunjukkan  memperlihatkan bahwa jumlah trombosit pada ikan kerapu tikus  tidak  ada  perbedaan  yang  signifikan antar  perlakuan  setelah  diberikan  ekstrak etanol daun Macaranga tanarius.
Kenyataan ini menunjukkan bahwa jumlah trombosit ikan kerapu tikus tidak terpengaruh  oleh  adanya  pemberian ekstrak  etanol  daun Macaranga  tanarius.
Hal  ini  diduga  karena  infeksi  VNN  tidak menyebabkan  pendarahan  pada  organ ikan  kerapu  tikus,  tetapi  VNN  lebih  cepat menyerang  organ  otak  dan  langsung meyerang  reseptor  sel-sel  saraf  ikan sehingga  dapat  mempengaruhi  perilaku ikan kerapu tikus.

## KESIMPULAN
Pemberian
ekstrak etanol daun
Macaranga  tanarius melalui  pemberian pakan  mampu  menginaktivasi  VNN  pada ikan  kerapu  tikus,  ditandai  dengan meningkatnya jumlah eritrosit, dan menurunnya  jumlah  leukosit  mendekati jumlah normal leukosit ikan.

## Daftar Pustaka
Andayani,  S.,  Marsoedi.,  Sanoesi,E., Wilujeng.  A.  E.,  dan  H.  Suprastiani. 2008. Profil  Hematologi  Beberapa Ikan  Air  Tawar  Budidaya .  Jurusan MSP,  Fakulstas    Perikanan  dan Kelautan, UB Malang.
Angka S. L, GT Wongkar, Karwani. 1985.
Blood  Picture  and  Bacteria  Isolated From  Ulcered  and  Crooked-Black Clarias  Batrachus .  Symposium  On Pract.  Measure  for  Preventing  and Controlling  FishDisease.  BIOTROP.
17 P.
Azhar.  F., Pengaruh  Pemberian  Probiotik dan  Prebiotik  Terhadap  Performan Juvenile Ikan Kerapu Bebek (Cromileptes  altivelis). Laboratorium Kesehatan  Ikan.  Institut  Pertanian Bogor . Bogor16680.
Bastiawan, D., A. Wahid., M.  Alifudin, dan I.  Agustiawan.  2001.  Gambaran Darah Lele dumbo (Clarias spp.)yang Diinfeksi Cendawan
Aphanomyces  sppada  pH  yang Berbeda. Jurnal penelitian Indonesia
7 (3) : 44-47.
Bijanti, R.  2005. Hematologi Ikan : Teknik Pengambilan Darah dan Pemeriksaan Hematologi Ikan. Bagian  ilmu  kedokteran  hewan veteriner. Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas Airlangga.
Carvalhoa, C., Botelhoa, C., Ferreiraa,  H., Ferreiraa, M. R., Santosa, M., Diazb, T., Oliveirab,  J.  A., Soares-Martinsc, M.,  Almeidab,  A.,    Silva  Júnior. 2013.  . In  vitro  inhibition  of  canine distemper  virus  by  flavonoids  and phenolic acids: Implications of structural  differences  for  antiviral design .  Laboratório  de  Virologia Animal  (LVA),  Departamento  de
Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brazil.
Chi,    S.  C.  2006. Piscine  Nodavirus Infections  in  Asia.  First  International
Symposium on Viral Nervous Necrosis of Fish International Conference Center , Hiroshima, November 28 to December 1, 2006.
Dugencie,  S.  K.,  Arda,  N  and  A.  Canda. 2003.  Some  Medicinal  Plants  as Immunostimulant  for  fish. Journal  of ethnopharmacology . 88 : 99-106. Esteban, M.  A., Cuesta, A., Betuna,  J and J. Meseguer. 2001. Immunomodullatory effects oddietary intake of chitin on Gilthead Seabream  (Sparus  aurata  L) Innate
Immunesystem . J. Fish and Shellfish Immunology. 11 : 303-313.
Fange, R. 1994. Blood Cell, Haemopoiesis and  Lymphomyeloid  tissues  in  fish. Journal of fish and shellfish Immunology. 10 : 234-244.
Formica,  J.V.,  Regelson,  W.,  1995. Review  of  biology  of  quercetin  and related  bioflavanoids .  Food  and Chemical Toxicology. 33 . 1061 –1080
Hesser  EF.  1960. Methods  for  Routine Fish  Hematology .  Progressive  Fish Culturist. Irianto Agus. 2005. Patologi Ikan
Teleostei .  Gadjah  Mada  University Press, Yogyakarta.
Kabata, Z. 1985. Parasites and Disease of Fish  Cultured  in  the  Tropics .  Taylor and Frandhis Ltd. London. 318p.
Lagler KF, Bardach JE, RR Miller, Passino DRM. 1977. Ichthyology. John Willey and  Sons .  Inc.  new  York-London. Hlm 506.
Lee,  M.  H.,    Jwo-Farn  Chiou.,  Kun-Ying Yen.,  Yang,  L.L.,  2000. EBV  DNA polymerase inhibition of tannins from Eugenia  uniflora. Graduate  Institute of  Pharmacognosy  Science,  Taipei Medical  College,  250  Wu-Hsing Street, Taipei 110, Taiwan
Lim,  T.Y.,    Lim,  Y.Y.,  C.M.  Yule,  C.M.,
2008. Evaluation  of  antioxidant, antibacterial and anti-tyrosinase activities of four Macaranga species. School of Science, Monash University  Sunway  Campus,  Jalan Lagoon  Selatan,  Bandar  Sunway,
46150  Petaling  Jaya,  Selangor, Malaysia.
Rizka R P, Yanuhar U, Suryanto A M. 2013 . Perubahan  Struktur  Jaringan  Mata dan  Otak  pada  Larva  Ikan  Kerapu Tikus  (C.  altivelis)  Yang  Terinfeksi Viral Nervous (VNN) Dengan Pemeriksaan Scanning Electro Microscope (SEM). Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya. Malang. Siakpere,  O.K.  1985. Haematological Characteristics of Clarias Fisheriensis.S.J Fish Biology. 27 (3).
259-264 .
Uribe C, Folch H Enriquez R, dan Moran G. 2001. Innate  and  adaptive  immunity in  teleost  fish:  a  riview. Veterinari Medicina 56 (10) : 484-503.
Yanuhar,  U.  2011. The  Function  of Receptor Protein Humpback Grouper    Cromileptes    altivelis    in Expression and Proliferation of CD4 and CD8    cells in Defence Immunity  of  Viral  Nervous  Necrotic Infection.  International  Journal  of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics. 1 (2).