Juni 2022, Vol. 9 No. 1: 92 – 100
pISSN : 2355-9942, eISSN:2656-792X
Terakreditasi Nasional, Dirjen Pendidikan Tinggi, Riset, dan Teknologi Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset dan Teknologi RI S.K. No. 105/E/KPT/2022 Received: 5 November 2021, Accepted: 11 Juni 2022 Published online: 30 Juni 2022
Doi: https://doi.org/10.35508/nukleus.v9i1.5490 https://ejurnal.undana.ac.id/index.php/nukleus/article/view/5490

## PENGARUH LAMA EKUILIBRASI TERHADAP KUALITAS SEMEN BEKU BABI DUROC DALAM PENGENCER TRIS-MODIFIKASI DENGAN PENAMBAHAN KRIOPROTEKTAN
(Effect of equilibration time on frozen sement quality of the duroc pig  in tris diluents  modification With the addition of cryoprotectants)
Biqshierz V.W. Koelima * , Henderiana L.L. Belli, Johny N. Kihe, Wilmientje M. Nalley
Program Studi Peternakan, Fakultas Peternakan, Kelautan, dan Perikanan, Universitas Nusa Cendana Jln. Adisucipto, Penfui, Kupang, Nusa Tenggara Timur, Indonesia 850001
* Correspondent author, email : biqshierzkoelima146@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian bertujuan menguji pengaruh lama waktu ekuilibrasi terhadap kualitas semen beku babi duroc dalam pengencer tris-kuning telur (T-KT) modifikasi dengan penambahan krioprotektan ekstraseluler. Semen dikoleksi dua kali seminggu menggunakan metode massage dari dua ekor pejantan duroc berumur ±2,5 tahun, sehat dan sudah terlatih dalam penampungan semen. Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap dengan 3 perlakuan  dan  4  kali  ulangan  yaitu  P1:  waktu  ekuilibrasi  1  jam,  P2:  waktu  ekuilibrasi  2  jam,  P3:  waktu ekuilibrasi  3  jam  pada  suhu  5°C.  Parameter  yang  diamati  adalah  motilitas,  viabilitas,  abnormalitas,  membran plasma  utuh  (MPU)  dan  recovery  rate  (RR).  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  motilitas,  viabilitas, abnormalitas,  MPU  dan  RR  nyata  lebih  tinggi  (P<0,05)  pada  ekuilibrasi  2  jam  (25,63±3,15%,  55,86±5,41%, 4,92±0,53%,  56,69±5,64%,  36,61±4,49%)  dibandingkan  dengan  ekuilibrasi  1  dan  3  jam  (20,00±3,54%, 39,28±9,89%,  7,93±0,76%,  40,21±9,39%,  28,57±5,05%)  dan  (15,00±4,08%,  32,19±7,0%,  8,41±0,70%, 32,71±7,07%,  21,43±5,83%).  Disimpulkan  motilitas  spermatozoa  babi  duroc  dalam  pengencer  tris-modifikasi pasca ekuilibrasi 2 jam mencapai 64,375% dan 25,63% pasca thawing, tetapi tidak mencapai standar motilitas spermatozoa ≥40% untuk inseminasi buatan.
Kata-kata kunci: ekuilibrasi, babi duroc, semen beku

## ABSTRACT
The purpose of this study was to test the influence of the equilibration time on the frozen semen quality of duroc pig  in  modified  tris-egg  yolk  with  the  addition  of  extracellular  cryoprotectants.  Semen  is  collected  twice  per week using massage methods from two duroc males aged ±2.5 years which in good health and have been trained in  semen  colection.  The  design  used  is  a  completely  randomized  design  with  4  tests  and  3  treatments  T1: equilibration time of 1 hour, T2: equilibration time of 2 hours, T3: equilibration time of 3 hours at a temperature of  50C.  Observed  parameters  were  motility,  viability,  abnormality,  MPU,  and  recovery  rate  (RR).  The  results showed  that  motility,  viability,  abnormalities,  MPU,  and  RR  were  higher  (P<0.05)  at  2  hours  of  equilibration (25.63±3.15%,  55.86±5.41%,  4.92±0.53%,  56.69±5.64%,  36.61±4.49%)  compared  to  1  and  3  hours (20.00±3.54%,  39.28±9.89%,  7.93±0.76%,  40.21±9.39%,  28.57±5.05%)  and  (15.00±4.08%,  32.19±7.0%, 8.41±0.70%, 32.71±7.07%, 21.43±5.83%). It was concluded the  motility of duroc pig spermatozoa in the  tris- modified diluents after 2 hours of equilibration reached 64.375% and 25.63% post thawing, but did not reach the requirement of 40% spermatozoa motility for artificial insemination. It was concluded that the sperm motility of Duroc pig in tris-modified diluent after 2 hours of equilibration reached 64.375% and 25.63% post thawing, but did not reach the standard of 40% spermatozoa motility for artificial insemination.
Keywords: equilibration, duroc pig, frozen semen

## PENDAHULUAN
Ternak  babi  salah  satu  komoditas  ternak penghasil  daging  yang  memiliki  potensi  besar
untuk dikembangkan. Masyarakat Nusa Tenggara  Timur  (NTT)  umumnya  masih
menerapkan sistem pemeliharaan yang tradisional,  sehingga  produktifitas  dan  kualitas produk yang dihasilkan masih tergolong rendah. Salah  satu  upaya  peningkatan  produktivitas  dan perbaikan  kualitas  genetik  adalah  menerapkan teknologi  inseminasi  buatan  (IB).  Inseminasi buatan  pada  ternak  babi  masih  menggunakan semen  cair,  namun  menghadapi  kendala  dalam permintaan  disebabkan  babi  pejantan  yang dipelihara  terbatas.  Antisipasi  akan  kondisi tersebut  perlu  dilakukan  preservasi  maupun kriopreservasi semen.
Masalah yang sering timbul dalam proses kriopreservasi semen adalah spermatozoa mengalami  cold  shock.  Perubahan  kondisi intraseluler  akibat  pengeluaran  cairan  yang berhubungan  dengan  pembentukkan  kristal- kristal  es  mengakibatkan  kerusakan  bahkan kematian  spermatozoa.  Mengatasi  masalah dalam  proses  kriopreservasi  dapat  dilakukan dengan  cara  menambahkan  pengencer  dan krioprotektan  yang  tepat  dengan  menggunakan metode yang tepat.
Salah satu bahan pengencer semen adalah tris  kuning  telur  yang  berfungsi  sebagai penyangga  atau  buffer,  menstabilkan  pH, mempertahankan tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit, melindungi spermatozoa  dari  kejutan  dingin  (cold  shock) yang  merupakan  larutan  yang  mengandung fruktosa dan asam sitrat (Hoesni, 1997). Gliserol merupakan  krioprotektan  intraseluler  karena dapat  masuk  kedalam  sel  spermatozoa  untuk mengikat  sebagian  air  bebas  sehingga  dapat mencegah pembentukan kristal-kristal es
(Azizah  dan  Arifiantini,  2009).  Penggunaan gliserol  dalam  proses  pembekuan  semen  babi adalah  3%  (Okazaki et  al .,  2009).  Sementara gula  merupakan  krioprotektan  esktraseluler  dan sebagai  substrat  sumber  energi,  sehingga  dapat melindungi dan mempertahankan kualitas spermatozoa  dalam  proses  pembekuan.  Gula yang  biasa  digunakan  adalah  dextrose,  rafinosa, trehalosa, dan sukrosa pada semen domba garut (Rizal et al ., 2006).
Metode yang turut memengaruhi keberhasilan  kriopreservasi  semen  babi  adalah waktu ekuilibrasi. Waktu ekuilibrasi merupakan waktu yang dibutuhkan oleh spermatozoa untuk menyesuaikan atau beradaptasi dengan pengencer, sehingga dapat meminimalisir bahkan  mencegah  terjadinya  kerusakan  maupun kematian  spermatozoa  (Bearden et  al .,  2004). Waktu  ekuilibrasi  2  jam  pada  suhu  3-50  C dengan konsentrasi gliserol 4% mampu mempertahankan  kualitas  semen  beku  babi dengan  motilitas  pasca  thawing  yang  diperoleh adalah  42,60±1,34%  (Bebas  &  Gorda,  2020) sedangkan  Yusuf et  al .  (2017)menya  takan bahwa  waktu  ekuilibrasi  2  jam  menghasilkan nilai motilitas pasca thawing sebesar 30,00±4,47%.
Berdasarkan gambaran permasalahan tersebut  maka  dilakukan  penelitian  dengan tujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  lama  waktu ekuilibrasi  terhadap  kualitas  semen  beku  babi duroc  dalam  pengencer  tris-modifikasi  dengan penambahan krioprotektan.

## METODE PENELITIAN

## Materi Penelitian
Penelitian  menggunakan  semen  segar yang berasal dari ternak babi duroc jantan sehat dengan kisaran umur 2,5 tahun.

## Metode
Penelitian dirancang menggunakan rancangan  rancangan  acak  lengkap  (RAL) dengan  tiga  (3)  perlakuan  dan  empat  (4) ulangan.  Perlakuan  yang  diaplikasikan  adalah P1=  waktu  ekuilibrasi  satu  1  jam,  P2=  waktu ekuilibrasi  2  jam  dan  P3=  waktu  ekuilibrasi  3 jam.

## Persiapan Bahan Pengencer
Persiapan  kuning  telur,  cangkang  telur dibersihkan  menggunakan  alkohol,  kulit  telur
dipecahkan,  telur  sudah  pecah  dituangkan  ke atas  kertas  saring  kemudian  miringkan  agar putih  telur  diserap  oleh  kertas  saring  dan pecahkan  selaput  vitelin  pada  kuning  telur  dan masukan kedalam gelas ukur, setelah itu kuning telur siap digunakan.
Persiapan  pengencer  tris,  bahan  yang digunakan  terdiri  dari  tris  (Hydroxymethyl Aminomethane)  sebanyak  3,63  %,  asam  sitrat 1,99  %,  dan  fruktosa  0,50  %  dilarutkan  dalam 100  mL  aquabidest.  Kemudian  20  mL  kuning telur  dilarutkan  dalam  80  mL  pengencer  tris, selanjutnya ditambahkan antibiotik penicillin 1,6 mL dan streptomycin 1,4 mL dan minyak zaitun sebanyak 12%.
Pengencer  tris-kuning  telur  yang  telah disiapkan  ditambahkan  sukrosa  2  gram  dan gliserol 4% lalu dihomogenkan.

## Tahap Evaluasi Semen Segar
Pemeriksaan  semen  dilakukan  secara makroskopis  dan  mikroskopis  yang  bertujuan untuk mengetahui kualitas semen yang dihasilkan sebagai uji layak atau tidaknya untuk dilanjutkannya  ke  tahap  pembekuan  semen. Evaluasi  semen  segar  secara  makroskopis meliputi  volume,  warna,  konsistensi  dan  pH. Sementara evaluasi secara mikroskopis meliputi: motilitas,  viabilitas,  abnormalitas,  konsentrasi spermatozoa, dan keutuhan membran plasma.

## Tahap Pengenceran Semen
Semen  hasil  hasil  koleksi  yang  sudah dievaluasi,  diencerkan  dalam  pengencer  dasar tris-kuning  telur  dengan  perbandingan  1:1. Pengenceran  semen  dilakukan  dengan  cara menambahkan semen secara sedikit demi sedikit secara  perlahan  melewati  dinding  tabung  berisi larutan  pengencer.  Kemudian  tabung  digoyang secara  perlahan  agar  semen  dalam  larutan pengencer tercampur homogen. Setelah pengenceran,  dilakukan  holding  time  selama  2 jam  pada  suhu  250C  sampai  270C.  Setelah holding  time  selama  2  jam,  selanjutnya disentrifus  selama  15  menit  dengan  kecepatan 2000  rpm  untuk  memisahkan  supernatant  dan pellet.

## Tahap Pembekuan
Semen  hasil  sentrifus  (pellet)  diencerkan kembali  dengan  pengencer  dasar  tris-kuning telur ditambah dengan krioprotektan gliserol 4% dan  minyak  zaitun  10%,  kemudian  dikemas (packaging)  ke  dalam  straw  berukuran  0,5  mL dengan  konsentrasi  500x106  sel/mL.  Setelah dikemas,  semen  diberi  label  sesuai  dengan perlakuan.  Selanjutnya  diekuilibrasi  pada  suhu dingin  3-50C  selama  1  jam,  2  jam  dan  3  jam. Setelah diekuilibrasi semen dievaluasi motilitas, viabilitas,  abnormalitas,  dan  MPU.  Setelah  itu semen  diuapkan  pada  permukaan  N2  cair berjarak  10  cm  selama  10  menit,  dan  disimpan dalam container N2 cair.

## Tahap Pencairan Kembali (Thawing)
Setelah 24 jam penyimpanan, semen beku dievaluasi  kembali.  Penentuan  kualitas  semen hasil pembekuan diketahui dengan cara melakukan pencairan kembali (thawing). Proses thawing  yang  dilakukan  dalam  penelitian  ini
adalah  1)  siapkan  waterbath,  lalu  masukan  air hangat  pada  waterbath,  2)  pastikan  suhu  air dalam  waterbath  mencapai  37oC  dan  selalu stabil,  yang  dilihat  dengan  menggunakan thermometer, 3) mengeluarkan straw dari dalam container  N2  cair,  4)  kemudian  langsung celupkan  straw  dalam  waterbath  selama  30 detik,  5)  selanjutnya  dievaluasi  motilitas, viabilitas,  abnormalitas,  dan  membran  plasma utuh.

## Variabel Penelitian
Variabel  penelitian  yang  diteliti  dalam penelitian  ini  meliputi:  1)  Motilitas  adalah gerakan  individual  progresif  kedepan  yang dinilai  segera  setelah  penampungan  dan  dapat dijadikan sebagai ukuran kemampuan membuahi.  Persentase  motilitas  merupakan perbandingan jumlah spermatozoa yang bergerak  aktif  dengan  total  jumlah  spermatozoa yang teramati dalam beberapa lapang pandangan.
2)
Viabilitas spermatozoa merupakan evaluasi semen yang bertujuan untuk menentukan  spermatozoa  yang  hidup.  3) Abnormalitas  spermatozoa,  yakni  spermatozoa yang  abnormal  seperti  spermatozoa  yang  tidak memiliki ekor, spermatozoa yang tidak memiliki kepala, kepala kecil, kepala ganda, kepala besar, ekor  bercabang  dan  ekor  melingkar.  4) Membran  plasma  utuh  ditentukan  dengan menghitung persentase spermatozoa yang memiliki  membran  plasma  utuh  dengan  metode hypoosmotic  swelling  test.  Larutan  HOST dibuat  dengan  menggunakan  bahan  0,9  g fruktosa  0,49  g  natrium  sitrat  yang  dilarutkan dalam  100  mL  aquabidest.  Sebanyak  20  mL larutan  hypoosmotic  swelling  test  ditambahkan dengan 0,2 mL semen, kemudian dihomogenkan.  Untuk  mengamati  keutuhan membran  plasma  utuh  dibuat  preparat  ulas tipis pada  objek  glass,  dan  dievaluasi  menggunakan mikroskop.  5)  Recovery  rate  (RR)  adalah kemampuan  spermatozoa  setelah  pembekuan dengan membandingkan persentase spermatozoa motilitas  pada  semen  segar  dengan  pasca thawing. Syarat semen yang digunakan memiliki kriteria : motilitas  ≥ 75%, konsentrasi ≥ 200 x 106 sel/mL dan abnormalitas ≤ 20% (Johnson et al ., 2000).

## Analisis Data
Analisis  data  menggunakan  sidik  ragam, dilanjutkan  dengan  uji  jarak  berganda  Duncan bila  perlakuan  berbeda  nyata  (P<0,05)  sesuai petunjuk Steel dan Torrie (1995).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Kualitas Semen Segar Babi Duroc
Karakteristik  semen  segar  babi  duroc yang  diperoleh  dari  penelitian  ini  dapat  diilhat pada  Tabel  1.  Rataan  Volume  Semen  yang diperoleh    adalah    167±19,84  mL.  Volume semen  yang  diperoleh  berbeda  dengan  hasil pengamatan  yang  dilakukan  oleh  Sumardani et al .,  (2008)  berkisar  200-250  mL;  serta Waluwanja et  al .,  (2019)  240-320  mL.  Lebih lanjut bahwa hasil penelitian ini seperti nampak
pada  Tabel  1,  tidak  berbeda  jauh  dengan  hasil penelitian  yang    dilakukan  oleh  Sumardani et al ., (2008), yakni warna putih susu-krem, derajat keasaman  7,4  dan  Waluwanja et  al .,  (2019), melaporkan  semen  berwarna  putih  dengan  pH 6,78±0,13.  Perbedaan  hasil  yang  diperoleh dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor  antara  lain variasi  umur,  tingkat  rangsangan,  frekuensi ejakulasi  serta  kualitas  pakan  Sangma et  al ., (2020).
Tabel 1. Kualitas semen segar babi duroc
Variabel Rerata±SD Volume semen (mL) 167.5±19.84 Warna semen Putih Susu-Krem pH semen 6.55±0.17 Motilitas sperma (%) 70±0.00 Viabilitas sperma (%) 85.07±5.87 Konsentrasi sperma (10 6 sel/mL) 367±84.94 Abnormalitas sperma (%) 3.62±0.53 MPU sperma (%) 86.02±5.93 Pengamatan  mikroskopis  spermatozoa segar babi duroc diketahui motilitas spermatozoa  70±0.00%,  viabilitas  85.07±5.87, konsentrasi spermatozoa 367±84.94x106 sel/mL, dan abnormalitas spermatozoa 3.62±0.53%.  Hasil  ini  sesuai  dengan  pendapat Patmawan et  al .  (2020)  yang  menunjukkan bahwa persentase motilitas spermatozoa ≥ 50%, konsentrasi spermatozoa  ≥  200 juta  sel/mL  dan abnormalitas spermatozoa ≤ 20%, namun sedikit berbeda  dari  hasil  penelitian  Waluwanja et  al . (2019) melaporkan motilitas 77,0±2,73%, viabilitas 82,26±2,61%,
konsentrasi 346±34,97x106 sel/mL dan abnormalitas mencapai 3,7±0,68%.
Rataan nilai membran plasma utuh (MPU) yang  dihasilkan  adalah  86.02±5.93%.  Hasil  ini tergolong  normal,  karena  Solihati et  al .  (2018)
menyatakan  bahwa  semen  yang  memenuhi kriteria    dengan    motilitas    minimal  60-90%, abnormalitas  spermatozoa  kurang  dari  15%  dan membran plasma utuh diatas 60% akan diproses lebih lanjut untuk proses pengenceran semen.
Pengaruh Waktu Ekuilibrasi terhadap
Motilitas Semen Beku Babi Duroc
Nilai motilitas spermatozoa pasca pengenceran  dalam  penelitian  ini  adalah 68.75±2.5  %  dan  pasca  ekuilibrasi  berkisar antara  61.875±1.25-64.375±3.75%.  Hal  ini mengindikasikan  pengencer  yang  digunakan mampu  melindungi semen babi ketika disimpan pada  suhu  ruang  (27-28oC)  sehingga  kematian spermatozoa  tidak  terlalu  tinggi  pada  proses ekuilibrasi.
Tabel 2. Rataan motilitas spermatozoa semen beku babi duroc (%)
Perlakuan (jam) Pasca pengenceran Pasca ekuilibrasi Pasca thawing P1 68.75±2.5 a 64,375 ± 3,75 a 20,00 ± 3,54 ab P2 68.75±2.5 a 64,375 ± 3,75 a 25,63 ± 3,15 b P3 68.75±2.5 a 61,875 ± 1,25 a 15,00 ± 4,08 a
Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata (P<0,05)
Hasil  analisis  statistik  memperlihatkan bahwa  perbedaan  lama  waktu  ekuilibrasi berbeda sangat nyata (P<0,01) terhadap motilitas  semen  babi  duroc  pasca  thawing.
Persentase  motilitas  tertinggi  25.63±3.15% pasca  thawing  diperoleh  pada  P2  (ekuilibrasi  2 jam)  diikuti  dengan  P1  (ekuilibrasi  1  jam) sebesar 20.00±3.54% dan nilai terendah terdapat
pada P3 (ekuilibrasi 3 jam) sebesar 15.00±4.08%. Hasil ini masih belum  memenuhi ketentuan  standar  nasional  Indonesia  (SNI), yakni  nilai  motilitas  pasca  thawing  ≥40%.  Hal ini  diduga  karena,  pengencer  yang  digunakan belum  sempurna  melindungi  spermatozoa  dari pengaruh cold shock, sehingga tingkat kematian spermatozoa sangat tinggi.
Hasil  uji  lanjut  Duncan  menunjukkan bahwa  bahwa  perlakuan  P2  (2  jam  ekuilibrasi) berbeda  nyata  (P<0,05)  dengan  perlakuan  P1 dan  P3  dan  perlakuan  P1 Hal  ini  diduga  karena spermatozoa sudah beradaptasi secara sempurna dengan  pengencer.  Gliserol  sudah  berdifusi secara  sempurna  ke  dalam  sel  spermatozoa menyebabkan  konsentrasi  elektrolit  ekstra  dan intra  sel  seimbang  sehingga  pembentukan kristalisasi es dapat dicegah.  Hal ini juga diduga karena  adanya  penambahan  sukrosa  yang merupakan  sumber  energi  bagi  spermatozoa. Surachman et  al .  (2008)  melaporkan  bahwa sukrosa  dalam  pengencer  dapat  berfungsi sebagai  krioprotektan  ekstraseluler  sehingga melindungi  membran  plasma  sel  dari  kerusakan secara mekanis yang mungkin terjadi saat proses pendinginan  atau  pembekuan.  Salamon  dan Maxwell (2000) menyatakan bahwa keseimbangan  konsentrasi  elektrolit  ekstra  dan intra  sel  sangat  dibutuhkan  spermatozoa  pada proses  pembekuan  semen  untuk  menghindari terjadinya  pembetukan  kristal  es  dan  mencegah terjadinya  cold  shock  yang  berlebihan.    Hasil penelitian ini hampir sama dari yang dilaporkan
Yusuf et al . (2017) bahwa motilitas spermatozoa babi  pasca  thawing  dengan  waktu  ekuilibrasi  2 jam dalam pengencer BTSg (Beltsville Thawing Solution dengan gliserol 4%) dan MIIIgT (MIII dengan  gliserol  4%  dan  trehalose  100  nM) menunjukkan  motilitas  yang  relatif  sama  yaitu 24,17±9,17% dan 26,67±8.16%.
Rendahnya  rataan  nilai  motilitas  yang rendah  terdapat  pada  P1  yakni  20.00±3.54%, diduga  karena  ekuilibrasi  1  jam  relatif  terlalu singkat  sehingga  spermatozoa  belum  secara sempurna beradapasi dengan pengencer. Hal ini mengakibatkan pada saat pembekuan spermatozoa mudah mengalami cold shock yang menyebabkan  motilitas  spermatozoa  menurun drastis.  Sementara  3  jam  ekuilibrai  yang menghasilkan motilitas terendah yakni 15.00±4.08%,  diduga  karena  waktu  ekuilibrasi yang relatif lama yang mengakibatkan munculnya  sifat  toksik  dari  gliserol.  Dampak munculnya  sifat  toksik  dari  gliserol  akan mempengaruhi  nilai  motilitas  yang  rendah  dan pada prosesnya ada kerusakan struktur membran plasma  dan  organel-organel  sel  sehingga metabolisme  energi  terhambat,  asupan  energi yang tidak ada akan mengakibatkan spermatozoa mati (Febriani et al . 2014).
Pengaruh Waktu Ekuilibrasi terhadap
Viabilitas Semen Beku Babi Duroc Rataan viabilitas spermatozoa semen beku babi duroc disajikan dalam Table 3.
Tabel 3. Rataan viabilitas spermatozoa semen beku babi duroc (%)
Perlakuan (jam) Pasca pengenceran Pasca ekuilibrasi Pasca thawing P1 85.41±5.33 a 84.55±5.47 a 39.28±9.89 ab P2 85.41±5.33 a 84.54±6.04 a 55.86±5.4 b P3 85.41±5.33 a 82.64±3.30 a 32.19±7.03 a
Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata (P<0,05)
Nilai viabilitas spermatozoa pasca pengenceran  dalam  penelitian  ini  adalah 85.41±5,33%,    pasca  ekuilibrasi  berkisar  antara 82,64±3,30-84.55±5.47%  dan  pasca  thawing 32.19±7.03-55.86±5.41%
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa  perbedaan  lama  waktu  ekuilibrasi berbeda tidak nyata (P>0,05) terhadap viabilitas semen  babi  duroc  pasca  pengenceran  dan  pasca ekuilibrasi,  namun  berbeda  sangat  nyata (P<0,01)  pasca  thawing.  Toelihere  (1993) mengemukakan  bahwa  secara  umum  pengencer mengandung sumber energi untuk kelangsungan
hidup  spermatozoa,  unsur  penyangga,  tidak bersifat meracuni spermatozoa, dapat melindungi  spermatozoa  dari  pengaruh  buruk proses preservasi maupun proses kriopreservasi.
Rataan  viabilitas  tertinggi  yang  diperoleh pada P2 55.86±5.41% diduga wakttu ekuilibrasi 2  jam,  spermatozoa  mampu  beradaptasi  secara baik  dengan  pengencer,  serta  gliserol  sudah masuk  kedalam  sel  spermatozoa  sehingga konsentrasi  elektrolit  ekstra  dan  intra  sel  sudah seimbang,  dampaknya  pembentukan  kristalisasi es dapat dihindari dan dicegah. Menurut Azizah dan  Arifiantini  (2009),  bahwa  gliserol  dapat
mengikat  sebagain  air  bebas  dalam  sel spermatozoa sehingga tidak terjadinya pembentukan kristalisasi es, jika waktu ekuilibriumnya  sudah mencapai  sempurna dengan  konsentrasi  gliserol  yang  optimal. Adanya penambahan sukrosa sebagai krioprotektan  ekstraseluler  juga  memberikan dampak yang mampu mempertahankan viabilitas spermatozoa babi pasca thawing.
Penurunan  rataan  nlai  viabilitas  yang terjadi  pada  perlakuan  P1  yakni  39.28±9.89%, disebabkan tidak terjadinya proteksi spermatozoa yang optimal oleh gliserol terhadap cekaman  dingin,  mungkin  gliserol  belum terdifusi  secara  optimal  ke  dalam  sel  serta spermatozoa  belum  mampu  memaksimalkan pemanfataan sukrosa sebagai sumber energi. Hal ini  mengakibatkan  pengencer  belum  mampu mengurangi  pengaruh  cold  shock  yang  terjadi selama  proses  pembekuan  dan  konsentrasi intraseluler spermatozoa menjadi tidak seimbang,  akibatnya  kadar  air  dalam  sel spermatozoa  meningkat  dan  pada  proses pembekuan  terbentuk  kristal-kristal  es  yang dapat  merusak  selubung  lipoprotein  dinding  sel spermatozoa (Han et al ., 2005).
Rataan  nilai  viabilitas  terdapat  pada  P3 yakni  32.19±7.03%  relarif  sangat  rendah dibandingkan  dengan  perlakuan  P1  dan  P2,  hal ini  mengindikasikan  waktu  ekuilibrasi  yang relatif  lama  yang  mengakibatkan  munculnya
sifat  toksik  dari  gliserol  dan  dari  penumpukan zat  sisa  metabolisme.  Pernyataan  ini  didukung oleh  Suharman  (2016),  menyatakan  bahwa waktu  ekuilibrasi  yang  lama  mengakibatkan terjadinya  penumpukan  asam  laktat  dan  zat-zat sisa  metabolisme  yang  berakibat  toksik  bagi spermatozoa,  munculnya  sifat  toksik  dari gliserol  dan  terbentuknya  perioksida  lipid menyebabkan  kerusakan  struktur  membran spermatozoa.  Ekuilibrasi  yang  terlalu lama  juga menyebabkan zat radikal bebas yang berasal dari metabolisme  spermatozoa  menumpuk  dalam larutan  semen,  sementara  fosfolipid  membran sel spermatozoa sangat rentan terhadap serangan radikal bebas (Solihati et al ., 2018).
Pengaruh Waktu Ekuilibrasi terhadap
Abnormalitas Semen Beku Babi Duroc
Rataan abnormalitas spermatozoa semen beku  babi  duroc  disajikan dalam  Table  4.  Hasil analisis statistik memperlihatkan bahwa pengaruh  perbedaan  waktu  ekuilibrasi  tidak memberikan  pengaruh  nyata  (P>0,05)  antar perlakuan  terhadap  abnormalitas  semen  babi duroc  pasca  pengenceran  dan  pasca  ekuilibrasi dan  berbeda  sangat  nyata  (P<0,01)  pasca thawing.  Nilai  abnormalitas  spermatozoa  pasca pengenceran  dalam  penelitian  ini  adalah 3,19±0,19%  dan  pasca  ekuilibrasi  berkisar antara 4,03±0,42–4,82±0,40%.
Tabel 4. Rataan abnormalitas semen beku babi duroc (%)
Perlakuan (jam) Pasca pengenceran Pasca ekuilibrasi Pasca thawing P1 3,19 ± 0,19 a 4,82 ± 0,40 a 7,93 ± 0,76 b P2 3,19 ± 0,19 a 4,03 ± 0,42 a 4,92 ± 0,53 a P3 3,19 ± 0,19 a 4,26 ± 0,71 a 8,41 ± 0,70 b
Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata (P<0,05)
Hal  itu  disebabkan  karena  pemberian gliserol  pada  level  optimal  mampu  mengurangi peningkatan  abnormalitas  yang  terjadi  akibat peroksidasi lipid secara bersamaan.
Krioprotektan  yang  umum  digunakan  pada pembekuan  semen  mamalia  adalah  gliserol. Gliserol  ini  dikenal  sebagai  krioprotektan intraseluler (Holt, 2000). Gliserol dapat melindungi  sel  spermatozoa  pada  bagian  dalam pada  saat  pembekuan  dari  kristal  es  yang merusak spermatozoa.
Persentase abnormalitas tertinggi 8,41±0,70%  pasca  thawing  terdapat  pada perlakuan  P3  dan  diikuti  oleh  perlakuan  P1
sebesar  7,93±0,76%  dan  nilai  rerata  terendah terdapat pada perlakuan P2 sebesar 4,92 ± 0,53. Yulianti (2006) menyatakan bahwa peningkatan jumLah spermatozoa yang mengalami abnormalitas  diakibatkan  oleh  pengaruh  fisik pada  saat  perlakuan  dimana  spermatozoa  saling bergesekan satu sama lain sehingga menyebabkan  abnormalitas  sekaligus  kematian. Toelihere (1993) menyatakan bahwa abnormalitas  spermatozoa  dapat  terjadi  karena tekanan yang keras, pemanasan yang berlebihan dan  kontaminasi  dengan  air,  urine  atau  kuman dan bahan antiseptik.
Pengaruh Waktu Ekuilibrasi terhadap Membran  Plasma  Utuh  Semen  Beku  Babi Duroc
Rataan  membran  plasma  utuh  (mpu) spermatozoa  semen  beku  babi  duroc  disajikan dalam Table 5.
Berdasarkan  data  Tabel  5,  terlihat  jelas bahwa  penurunan  nilai  membran  plasma  utuh dari  pasca  pengenceran    hingga  ke  pasca ekuilibrasi  relatif  sangat  rendah.  Hal  ini  diduga karena  pengencer  tris  kuning  telur  yang dimodifikasi  dengan  minyak  zaitun  mampu melindungi spermatozoa dari pengaruh cekaman dingin  ketika  melewati  suhu  ruang  (27-28oC) saat proses holding time dan pada saat melewati
suhu  ekuilibrasi  (3-5oC).  Pernyataan  ini didukung  oleh  Garner  &  Hafez  (2000)  yang melaporkan    bahwa  semen    yang    mengandung asam  sitrat  berguna  bagi  spermatozoa  dan natrium sitrat berfungsi sebagai larutan penyangga  dalam  pengencer  kuning  telur. Menurut  Waluwanja et  al .  (2019),  bahwa pengencer  yang  mengandung  minyak  zaitun mampu  melindungi  spermatozoa  dari  pengaruh radikal  bebas,  dikarenakan  minyak  zaitun mengandung senyawa aktioksidan yakni senyawa  golongan  polifenol  seperti  oleuropein dan tyrosol serta hydroxytyrosol berperan dalam melindungi membran plasma.
Tabel 5. Rataan membran plasam utuh semen beku babi duroc
Perlakuan (jam) Pasca pengenceran Pasca ekuilibrasi Pasca thawing P1 86,45 ± 5,91 a 85,49 ± 5,53 a 40,21 ± 9,39 a P2 86,45 ± 5,91 a 86,28 ± 6,30 a 56,69 ± 5,64 b P3 86,45 ± 5,91 a 87.67 ± 3,31 a 32,71 ± 7,07 a
Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata (P<0,05)
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa  perbedaan  waktu  ekuilibrasi  berbeda sangat  nyata  (P<0,01)  terhadap  keutuhan membran  plasma  spermatozoa  babi  duroc  pasca thawing.  Persentase  membran  plasma  utuh tertinggi  56,69±5,64%  pasca  thawing  terdapat pada P2 diikuti dengan P1 sebesar 40,21±9,39% dan  nilai  terendah  terdapat  pada  P3  sebesar 32,71±7,07%.
Rataan  persentase  membran  plasma  utuh yag  tertinggi  diperoleh  dari  perlakuan  P2  yakni 55.86±5.41%, hal ini diduga karena spermatozoa sudah  beradaptasi  secara  sempurna  dengan pengencer, serta gliserol sudah masuk  ke dalam sel  spermatozoa  sehingga  telah  terjadinya proteksi spermatozoa yang optimal oleh gliserol terhadap  cekaman  dingin  sehingga  konsentrasi elektrolit  ekstra  dan  intra  sel  sudah  seimbang, dampaknya  pembentukan  kristalisasi  es  dapat dihindari  dan  dicegah.  Viswanath  &  Shanon (2000),  melaporkan  sukrosa  dalam  pengencer dapat berfungsi sebagai krioprotektan ekstraseluler  sehingga  melindungi  membran plasma  sel  dari  kerusakan  secara  mekanis  yang mungkin  terjadi  saat  proses  pendinginan  atau pembekuan,  mengeluarkan  air  yang  berlebihan dari dalam  sel  serta sebagai  sumber  energi  bagi spermatozoa.
Rendahnya  rataan  keutuhan  membran plasma spermatozoa pasca thawing yang peroleh pada  perlakuan  P1  40,21  ±  9,39%,  diduga
karena  belum  terjadinya  proteksi  spermatozoa yang  optimal  oleh  gliserol  terhadap  cekaman dingin,  akibat  gliserol  belum  menyerap  secara optimal kedalam sel spermatozoa serta spermatozoa  belum  mampu  memanfaatkan sukrosa  sebagai  sumber  energi  dan  sebagai krioprotektan ekstraseluler secara sempurna. Hal ini  mengakibatkan  konsentasi  elektrolit  ekstra dan  intra  sel  akibatnya  kadar  air  dalam  sel spermatozoa  meningkat  dan  pada  proses pembekuan  terbentuk  kristal-kristal  es  yang dapat  merusak  selubung  lipoprotein  dinding  sel spermatozoa (Azizah & Arifiantini., 2009).
Rendahnya  rataan  keutuhan  membran plasma  utuh  yang  terdapat  pada  spermatozoa babi yang memperoleh perlakuan P3 32.19±7.03%,  diakibatkan  karena  lamanya relatif lamanya masa waktu ekuilibrasi sehingga menyebabkan terjadinya pemupukan asam laktat dan  zat-zat  sisa  metabolisme  yang  berakibat toksik  bagi  spermatozoa  dan  terbentuknya peroksidasi lipid menyebabkan kerusakan membran  plasma  spermatozoa  (Suharman, 2016).
Pengaruh  Waktu  Ekuilibrasi  terhadap  Nilai Recovery Rate Semen Beku Babi Duroc
Recovery  rate  (RR)  adalah  kemampuan spermatozoa setelah pembekuan dengan membandingkan persentase spermatozoa motilitas  pada  semen  segar  dengan  pasca
thawing.  Berdasarkan  hasil  analisis  statistik, perbedaan  lama  waktu  ekuilibrasi  berpengaruh sangat  nyata  (P<0,01)  terhadap  recovery  rate spermatozoa babi duroc pasca thawing. Persentase  recovery  rate  tertinggi  36.61±4.49% pasca  thawing  terdapat  pada  P2  diikuti  dengan P1  sebesar  28.57±5.05%  dan  P3  sebesar 21.43±5.83%.  Hal  ini  diduga  karena  selama  2 jam  ekuilibrasi,  spermatozoa  sudah  mampu menyesuaikan  diri  dengan  pengencer,  gliserol sudah  penetrasi  kedalam  sel  spermatozoa sehingga  konsentrasi  elektrolit  ekstra  dan  intra sel  seimbang.  Dengan  adanya  penambahan sukrosa  sebagai  krioprotektan  ekstraseluler, karena sukrosa yang merupakan salah satu jenis karbohidrat golongan disakarida sangat berperan sebagai  sumber  energi  bagi  spermatozoa  serta mampu  melindungi  spermatozoa  dari  kerusakan secara  mekanin  yang  mungkin  terjadi  pada proses  kriopreservasi  semen.  Menurut  Salamon dan  Maxwell  (2000),  gula  dalam  keadaan  beku
berbentuk seperti kaca (glass) yang tidak tajam, sehingga  tidak  merusak  sel  spermatozoa  secara mekanik.
Rendahnya  nilai  recovery  rate  yang mendapat  perlakuan  P1  28.57±5.05%,  diduga karena  spermatozoa  belum  adaptasi  secara sempurna  dengan  pengencer,  kriopretektan gliserol  dan  sukrosa.  Hal  ini  mengakibatkan spermatozoa mudah mengalami cold shock serta terjadinya pembentukan kristalisasi es. Rendahnya  nilai  recovery  rate  pada  P3 21.43±5.83%  hal  ini  diduga  karena  lamanya waktu  ekuilibrasi  sehingga  mempengaruhi munculnya  toksiksitas  dari  gliserol  sehingga mempengaruhi  nilai  motilitas  yang  rendah  dan pada  prosesnya  adanya  kerusakan  struktur membran  plasma  dan  organel-organel  sel sehingga  metabolisme  energi  terhambat,  asupan energi  yang  tidak  ada  akan  mengakibatkan spermatozoa mati (Febriani et al ., 2014).

## SIMPULAN
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh  dalam penelitian  disimpulkan  :  Disimpulkan  motilitas spermatozoa  babi  duroc  dalam  pengencer  tris- modified  pasca  ekuilibrasi  2  jam  mencapai
64,375% dan 25,63% pasca thawing, tetapi tidak mencapai  standar  motilitas  spermatozoa  ≥40% untuk inseminasi buatan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terimakasih  yang  tulus  disampaikan kepada Kepala  Laboratorium Yayasan Williams dan  Laura  bersama  staf  dan  teknisi  yang  telah
memfasilitasi  seluruh  pelaksanaan  penelitian meliputi  materi  penelitian,  bimbingan  teknis, fasilitas laboratorium dan penginapan.

## DAFTAR PUSTAKA
Azizah,  Arifiantini  R.  2009.  Kualitas  semen beku  kuda  pada  pengencer  susu  skim dengan konsentrasi gliserol yang berbeda. Jurnal Veteriner 10(2): 63-70.
Bearden H, Fuquay J, Willard S. 2004. Applied Animal  Reproduction  (6th  ed.).  Pearson Prentice Hall.
Bebas  W,  Gorda  W.  2020.  Kadar  krioprotektan gliserol  dan  dimethylsulfoxide  terbaik pada  pengencer  astaxanthin  fosfat  kuning telur  bebek  terhadap  kualitas  semen  beku babi. Jurnal Veteriner 21(1): 115-123. Febriani  G,  Hamdan,  Melia  J.  2014.  Pengaruh waktu ekuilibrasi terhadap kualitas semen kerbau  lumpur  (Bubalus  bubalis)  Setelah thawing. Jurnal Medika  Veterinaria 8(1): 1-4.
Garner  D,  Hafez  E.  200).  Spermatozoa  and Seminal  Plasma.  In  B.  Hafez  &  E.  Hafez (Eds.), Reproduction in farm animals (7th ed.). Lippincott Williams & Wilkins.
Han X, Niu Z, Liu F, Yang C. 2005. Effects  of diluents,  cryoprotectants,  equilibration time and thawing temperature on cryopreservation of duck semen.
International  Journal  of  Poultry  Science 4(4): 197-201.
Hoesni  F.  1997.  Pengaruh  kadar  kuning  telur dalam berbagai pengencer terhadap kualitas spermatozoa domba pasca pembekuan. Tesis . Program Pasca Sarjana Universitas Padjadjaran. Bandung.
Holt W. 2000. Basic aspects of frozen storage of semen. Animal  Reproduction  Science 62(1-3). 3-22.
Johnson,  L.,  Weitze,  K.,  Fiser,  P.,  &  Maxwell, W. (2000). Storage of boar semen. Animal Reproduction Science 62(1-3): 143-172.
Okazaki T, Abe S, Shimada M. 2009. Improved conception rates in sows inseminated with cryopreserved  boar spermatozoa  prepared with  a  more  optimal  combination  of osmolality  and  glycerol  in  the  freezing extender. Journal  Animal  Science 80(2): 121-129.
Patmawan  EF,  Gaina  CD,  Foeh  ND.  2020. Morfologi abnormalitas spermatozoa babi landrace dan babi duroc dengan pewarnaan carbofuchsin. Jurnal Veteriner
Nusantara 3(2): 113-119.
Rizal  M,  Herdis,  Boediono  A,  Aku  A,
Yulnawati.  2006.  Peranan  beberapa  jenis gula  dalam  meningkatkan  kualitas  semen beku  domba  garut. Jurnal  Ilmu  Ternak Dan Veteriner 11(2): 123-130.
Salamon  S,  Maxwell  W.  2000.  Storage  of  Ram Semen. Animal  Reproduction  Science 62(1-3): 77-111.
Sangma T, Ahmed K, Choudhury M, Zaman G,
Ahmed N, Das A. 2020. Characteristics of fresh  crossbred  hampshire  boar  semen. Haryana Veterinarian 59(1): 98-101. Solihati  N,  Rasad  SD,  Setiawan  R,  Nurjanah  S. 2018.  Pengaruh  Kadar  Gliserol  Terhadap Kualitas  Semen  Domba  Lokal. Jurnal Biodjati 3(1): 63.
Steel  RGD,  Torrie  JH.  1995.  Prinsip  dan Prosedur  Statistik:  Suatu  Pendekatan Biometrik.  Sumantri  B.  (penerjemah).
Gramedia Pustaka Utama, Jakarta Suharman H. 2016. Kualitas semen beku domba garut  (Ovis  Aries)  pada  penambahan
sukrosa  dalam  pengencer  semen  tris kuning  telur. Jurnal  Ilmu-Ilmu  Hayati 16(1): 31-38.
Sumardani  N,  Tuty  L,  Siagian  P.  2008. Viabilitas spermatozoa babi dalam pengencer bts (beltsville thawing solution) yang dimodifikasi pada penyimpanan  berbeda. Jurnal  Media Peternakan 31(2): 81-86.
Surachman  M,  Herdis,  Yulnawati,  Rizal  M, Maheshwari H. 2008. Kualitas semen cair asal  epididimis  kerbau  belang  dalam bahan pengencer andromed yang mendapat  penambahan  sukrosa. Media Peternakan 32(2): 88-94.
Toelihere  MR.  1993.  Inseminasi  Buatan  pada Ternak. Penerbit Angkasa.
Viswanath  R,  Shanon  P.  2000.  Storage  of bovine  semen  in  liquid  frozen  state. Animal Reproduction Science 62(1-3): 23-
53.
Waluwanja  Y,  Nalley  WM,  Hine  TM,  Ully  K.
2019.  Efektivitas  berbagai  konsentrasi minyak zaitun ekstra virgin oleum olivae) dalam  pengencer  sitrat  kuning  telur terhadap  kualitas  semen  cair  babi  duroc.
Jurnal Nukleus Peternakan 6(2): 55-62. Yulianti ER. 2006. Pengaruh beberapa pengencer  dengan  waktu  ekuilibrasi  yang berbeda terhadap kualitas semen kambing boer sebelum pembekuan. Skripsi. Fakultas Peternakan UB Malang.
Yusuf  T,  Arifiantini  R,  Dapawole  R,  Nalley WM.  2017.  Kualitas  semen  beku  babi dalam pengencer komersial yang disuplementasi  dengan  trehalosa. Jurnal Veteriner 18(1): 69-75.