Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra
# Korespondensi:  Departemen  Budidaya,  Fakultas  Kelautan  dan Perikanan,  Institut  Pertanian  Bogor.  Kampus  IPB  Darmaga,  Jalan Agatis,  Babakan,  Kec.  Dramaga,  Kota  Bogor,  Jawa  Barat  16128. Tel.  +  62  251  8622909 E-mail:  siflounder@gmail.com;  dedidj@ipb.ac.id

## PENGARUH  PENAMBAHAN  ASAM  HUMAT  PADA  PAKAN  MENGANDUNG  KADMIUM  (Cd) DARI  KERANG  HIJAU  TERHADAP  BIOELIMINASI  Cd,  STATUS  KESEHATAN,  DAN PERTUMBUHAN  IKAN  KAKAP  PUTIH  Lates  calcarifer
Rasidi *),**)# ,  Dedi  Jusadi *) ,  Mia  Setiawati *) ,  Munti  Yuhana *) ,  Muhammad  Zairin  Jr. *) ,  dan  Ketut  Sugama **)
*) Departemen Budidaya, Fakultas Kelautan dan Perikanan, Institut Pertanian Bogor Kampus IPB  Darmaga, Jalan Agatis, Babakan, Kec. Dramaga, Kota Bogor, Jawa  Barat 16128
**) Pusat Riset Perikanan Gedung BRSDMKP II, Jl.  Pasir Putih II, Ancol Timur, Jakarta 14430 E-mail: siflounder@gmail.com; dedidj@ipb.ac.id
(Naskah diterima: 13 Agustus 2019; Revisi final: 28 Januari 2020; Disetujui publikasi: 28 Januari 2020)

## ABSTRAK
Asam humat (AH) terdiri atas AH alami (AHA) dan sintetik (AHS), namun efektivitasnya sebagai feed additive pada pakan ikan kakap putih belum dikaji. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui efektivitas penambahan AH pada pakan yang mengandung kadmium (Cd) dari kerang hijau Perna viridis terhadap status kesehatan dan pertumbuhan ikan  kakap putih, Lates calcarifer. Percobaan  dirancang menggunakan  rancangan acak lengkap (RAL) dengan lima perlakuan dan tiga ulangan. Perlakuan terdiri atas lima pakan uji mengandung AH yang berbeda, yaitu 0; 1.600; 10.000; dan 20.000 mg.kg -1 (AHA) dan sebagai pembanding menggunakan AHS  sebesar  1.600  mg.kg -1 pakan.  Benih  ikan  kakap  putih  (4,18  ±  0,25  g)  dipelihara  dalam  akuarium ukuran 80 cm x 35 cm x 28 cm yang diisi air laut dengan sistem resirkulasi selama 70 hari. Ikan diberi pakan uji sesuai perlakuan tiga kali sehari sampai kenyang. Hasil penelitian menunjukkan penambahan AH baik jenis AHA maupun AHS pada pakan dapat menurunkan akumulasi Cd dalam daging, ginjal, dan hati; kedua jenis AH tersebut mampu mengeliminasi Cd di dalam daging ikan. Pada dosis 1.600 mg.kg -1 kedua jenis AH tersebut mampu meningkatkan performa pertumbuhan dan kelangsungan hidup ikan, namun pada dosis AHA  >  1.600  mg.kg -1 pertumbuhannya  relatif  menurun.  Pola  respons  pertumbuhan  ikan  bersesuaian dengan parameter hematologi, enzim pencernaan, dan status antioksidan di hati ikan. Kesimpulan penelitian ini,  penambahan  asam  humat  pada  dosis  yang  sama  (1.600  mg.kg -1 )  pada  pakan,  AHS  lebih  efisien dibandingkan AHA dalam hal meningkatkan pertumbuhan. Penambahan AH dari jenis asam humat alami dan sintetik dalam pakan uji dapat meningkatkan status kesehatan dan mengeliminasi Cd di dalam daging ikan.  Penambahan  AHA  pada  dosis  tinggi  pada  pakan  memberikan  respons  negatif  terhadap  status kesehatan, kelangsungan hidup, dan kinerja pertumbuhan ikan kakap putih.
KATA KUNCI: asam humat; kakap putih Lates calcarifer; kerang hijau Perna viridis; logam berat Cd; pakan;  pertumbuhan
ABSTRACT: The effects of humic acid addition in reducing cadmium (Cd) concentration in green mussel used for feed and improving the health status and growth performance of Asian seabass, Lates calcalifer. By: Rasidi, Dedi Jusadi, Mia Setiawati, Munti Yuhana, Muhammad Zairin Jr., and Ketut Sugama
Humic acids (HAs) are available in natural and synthetic forms. HA has potential applications in aquaculture, yet its effectiveness as a feed additive in Asian seabass, Lates calcarifer has not well studied. The purpose of this study was to asses the effectiveness of the addition of natural and synthetic humic acids to reduce cadmium (Cd) concentration in green mussels Perna viridis used for Asian seabass feed and evaluate the fish health status and growth performance. The experiment was designed using a completely randomized design (CRD) with five treatments and three replications. Five test feeds containing different levels of humic acid, i.e., 0; 1,600; 10,000; and 20,000 mg natural humic acid kg - 1 feed. As a comparison, a test feed was added with 1,600 mg synthetic humic acid kg -1 feed. Asian seabass juveniles
(4.18 ± 0.25 g) were cultivated in seawater aquarium equipped with a recirculation system for 70 days. Fifteen aquaria of 80 cm x 35 cm x 28 cm were used as the culture tanks. The fish were fed with the experimental diet three times every day at the satiation level. The results showed that the addition of both HAs (natural, AHA and synthetic, AHS) in feed could reduce Cd level in the fish meat, kidneys, and liver. At a dose of 1,600 mg.kg -1 , both HAs were able to improve the growth performance and survival of fish. However, at doses > 1,600 mg.kg -1 , fish growth was relatively suppressed. Fish growth response patterns were concomitant with the hematological parameters, digestive enzymes, and antioxidant status in fish liver. This study concludes that the addition of AHS at 1,600 mg.kg- 1 feed is more efficient in terms of increasing growth compared with the same AHA level. The addition of HA, either natural and synthetic humic acid in the feed, can improve the health status of Asian seabass and eliminate Cd in the fish meat. The addition of AHA at higher doses (> 1,600 mg.kg -1 feed) might cause a negative response to health status, survival, and growth performance of Asian seabass.

## KEYWORDS: Asian seabass Lates calcarifer; feed; green mussel, Perna viridis; growth performance; humic acid
Salah satu alternatif pemanfaatan kerang hijau yang mengandung logam berat adalah sebagai bahan baku pakan  ikan.  Jika  kerang  hijau  tersebut  dapat dimanfaatkan  sebagai  bahan  baku  pakan,  maka diharapkan  permintaan  kerang  hijau  akan  semakin meningkat  pada  masa  depan.  Meningkatnya permintaan  kerang  hijau  diperlukan  peningkatan produksinya, dengan potensi lahan yang masih terbuka luas  untuk  pengembangan  budidaya  kerang  hijau sehingga produksinya dapat ditingkatkan (Rajagopal et  al.,  2006;  Radiarta  et  al.,  2011).  Pengembangan budidaya kerang hijau mempunyai manfaat ekologis sebagai  biofilter  perairan  yang  tercemar.  Selain  itu, teknologi budidayanya juga relatif sederhana dan tanpa input  pakan  sehingga  lebih  ekonomis.  Selanjutnya dampak yang diharapkan, keberlanjutan usaha budidaya kerang hijau dapat berlanjut. Solusi atas pemanfaatan kerang hijau yang mengandung logam berat diyakini sebagai salah satu jalan untuk meningkatkan produksi kerang hijau di Indonesia.
Pemanfaatan  kerang  hijau yang  mengandung  Cd sebagai  bahan baku  pakan  memungkinkan Cd  akan terakumulasi  dalam  tubuh  ikan  dan  dapat  bersifat toksik.  Oleh  karena  itu,  diperlukan  upaya  untuk mereduksi  toksisitas  Cd  tersebut.  Salah  satu alternatifnya dengan menambahkan asam humat (AH) dalam  pakan  ikan.  Asam  humat  memiliki  gugus fungsional  dan  aromatik  yang  berpotensi  untuk membentuk  ikatan  kompleks  dengan  logam  berat sehingga digunakan sebagai agen chelator logam berat (Klocking, 1992). Berdasarkan proses pembuatannya, AH terdiri atas asam humat alami (AHA) dan sintetik (AHS). AHS telah digunakan untuk mengeliminasi Cd pada ikan nila (Osman et al., 2009). Penambahan AHA pada pakan juga telah dilakukan untuk mengeliminasi logam berat Pb pada ikan nila (Marlinda, 2016; Robin et al., 2017). Selain sebagai chelator logam berat, AH juga bermanfaat dapat meningkatkan status kesehatan saluran pencernaan, meningkatkan gambaran darah, dan pertumbuhan  (Yoruk et  al., 2004; Yýlmaz  et  al.,

## PENDAHULUAN
Ikan kakap putih Lates calcarifer merupakan salah satu  komoditas  budidaya  laut  yang  prospektif dikembangkan. Produksi budidaya ikan kakap putih di Indonesia rata-rata selama tahun 2012-2016 sebesar 6.097 ton atau 10,70% produksi dunia sebesar 56.933 ton (FAO, 2019). Kementerian Kelautan dan Perikanan (KKP)  menargetkan  peningkatan  produksi  budidaya ikan kakap putih pada tahun 2019 sebesar 6.471 ton (DJPB,  2016).  Peningkatan  target  produksi  tersebut akan  meningkatkan  kebutuhan  pakan  dan  bahan bakunya. Bahan baku utama pakan khususnya tepung ikan  yang  selama  ini  masih  tergantung  impor  akan berdampak pada kenaikan harga pakan.
Ketergantungan terhadap penggunaan tepung ikan perlu dikurangi salah satunya dengan memanfaatkan kekerangan  sebagai  bahan  baku  pakan  untuk mensubstitusi  tepung  ikan.  Berdasarkan  penelitian terdahulu, kerang hijau Perna viridis telah dimanfaatkan sebagai bahan baku pakan untuk beberapa jenis ikan (Mohanta  et  al.,  2013;  Vidacovic,  2015),  yang mengindikasikan  kerang  hijau  dapat  dijadikan alternatif sumber protein pakan ikan. Namun sesuai dengan sifat hidupnya sebagai nonselektif filter feeder, kekerangan seringkali mengandung logam berat salah satunya kadmium (Cd) (Riani et al., 2018).
Kadmium berasal dari industri baterai, pelapisan logam  dan  plastik  yang  masuk  ke  perairan,  melalui rantai  makanan  akan  terakumulasi  dalam  tubuh kekerangan.  Berdasarkan  penelitian  pendahuluan diketahui  kandungan  Cd  pada  daging  kerang  hijau sebesar  0,08  mg.kg -1 .  Batas  baku  mutu  Cd  dalam produk  kekerangan  menurut  standar  FAO  <  0,05 mg.kg -1 (Bosch et al., 2016). Kandungan Cd pada kerang hijau  tersebut  telah  melewati  baku  mutu,  sehingga akan bersifat toksik jika dikonsumsi baik oleh manusia maupun hewan. Cd diketahui dapat menyebabkan os- teoporosis,  anemia,  dan  gangguan  saluran  ginjal (Jaishankar et al., 2014).
2018). Berdasarkan penelitian terdahulu penambahan asam fulvat sintetik pada pakan dengan dosis optimal sebesar  1,5%-2%  dapat  meningkatkan  pertumbuhan ikan loach, Paramisgurnus dabryanus (Gao et al., 2017).
Berdasarkan  penelitian  terdahulu  yang menggunakan  AHA  (kadar  AH  sebesar  4,92%), diperoleh  dosis  penambahan  AHA  sebesar  1.600 mg.kg -1 pakan  yang  menghasilkan  performa pertumbuhan  terbaik,  namun  dosis  tersebut  belum mampu mengeliminasi Cd dalam  daging ikan kakap putih (Rasidi et al., 2019). Oleh karena itu, diperlukan penelitian  lanjutan  penambahan  AHA  dengan  dosis yang  semakin  tinggi.  Peningkatan  dosis  AHA  yang semakin meningkat diharapkan dapat diperoleh hasil yang efektif dibandingkan dengan menggunakan AHS. Tujuan  penelitian  ini  untuk  mengetahui  efektivitas penambahan AH pada pakan yang mengandung Cd dari kerang hijau Perna viridis terhadap status kesehatan dan pertumbuhan ikan kakap putih, Lates calcarifer.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilakukan dari bulan Desember 2018 sampai dengan April 2019 di Laboratorium Riset Ikan Hias  Laut,  Balai  Riset  Budidaya  Ikan  Hias  Depok. Analisis sampel dilakukan di beberapa laboratorium di lingkungan  Institut Pertanian Bogor  (IPB), Bogor; Instalasi  Riset  Kesehatan  Ikan,  Depok;  dan Laboratorium  Pusat  Kajian  Stres  Oksidatif  dan Hipoksia,  Fakultas  Kedokteran  Univeritas  Indonesia (FKUI), Salemba, Jakarta.
Asam humat (AH) yang digunakan terdiri atas dua jenis yaitu  asam humat  alami (AHA)  (Humakos)  dan asam  humat  sintetik  (AHS)  (Sigma  Aldrich)  sebagai pembanding.  Asam  humat  alami  yang  digunakan mempunyai kadar asam humat sebesar 4,92% (Rasidi et al., 2019), sedangkan AHS (Sigma Aldrich) dengan tingkat  kemurnian  97%  (sesuai  label  produk). Percobaan dirancang dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan lima perlakuan dengan tiga ulangan. Masing-masing perlakuan terdiri atas: pakan tanpa  tambahan  AH  sebagai  pakan  kontrol  (0  AH), pakan  dengan  penambahan    asam  humat  sintetik sebesar  1.600  mg.kg -1 pakan  (1.600  AHS),  pakan dengan penambahan asam humat alami (AHA) masing- masing  sebesar  1.600;  10.000;  dan  20.000  mg.kg -1 pakan (1.600 AHA; 10.000 AHA; dan 20.000 AHA).
Bahan baku utama pakan berupa daging kerang hijau diperoleh dari Cilincing, Jakarta Utara. Daging kerang dikeringkan dan dibuat menjadi tepung. Tepung daging kerang hijau dan bahan baku pakan lainnya kemudian dianalisis proksimat, selanjutnya dilakukan formulasi pakan sesuai dengan perlakuan masing-masing dengan dosis penambahan AH yang berbeda (Tabel 1). Pakan
dan  ikan  uji  kemudian  dianalisis  proksimat menggunakan metode standar (AOAC, 1984); selain itu, dianalisis kandungan logam berat Cd menggunakan metode  atomic  absorption  spectrofotometry  (AAS). Analisis  kandungan  asam  humat  pada  pakan  uji dilakukan  menggunakan  spektrofotometri  di  Pusat Litbang Bioindustri, Bogor.
Ikan uji berupa benih ikan kakap putih (bobot rata- rata awal 4,18 ± 0.25 g) diperoleh dari Balai Budidaya Laut  (BBL) Lampung.  Ikan  uji diaklimatisasi  terlebih dahulu sebelum diberi perlakuan pada akuarium selama 15 hari di Balai Riset  Ikan Hias, Depok. Selanjutnya dilakukan pemuasaan selama 24 jam. Ikan diseleksi, ditimbang,  dan  dimasukkan  ke  dalam  akuarium berukuran 80 cm x 35 cm x 28 cm berisi air laut 61,6 L.  Air  laut  diperoleh  dari  Seaworld  Ancol,  Jakarta. Penebaran ikan dilakukan sebanyak 25 ekor/akuarium. Ikan  dipelihara  selama  70  hari  dengan  pemberian pakan  uji  diberikan  sampai  kenyang  (at  satiation). Frekuensi pemberian pakan sebanyak tiga kali sehari pada pukul 08.00, 12.00, dan 16.00 WIB. Penyiponan dilakukan setiap hari, kemudian dilakukan pergantian air sebanyak 30% setiap dua hari. Penambahan air pada tandon resirkulasi dilakukan setelah penyiponan.
Pengukuran kualitas air secara in situ menggunakan alat multiparameter water quality merk YSI 556. Hasil pengukuran kualitas  air untuk  suhu berkisar  antara 28,22°C-29,30°C; oksigen terlarut berkisar antara 5,42- 6,29  mg.L -1 ;  pH  berkisar  antara  7,74-8,35;  salinitas berkisar  antara  26,98-27,70  mg.L -1 .  Kadar  amonia berkisar  antara  0,034-0,210  mg.L -1 ,  nitrit  berkisar antara 0,045-0,370 mg.L -1 ; nitrat berkisar antara 2,45- 3,10 mg.L -1 ; logam berat Cd berkisar antara 0,002-0,004 mg.L -1 .
Pada  awal  dan  akhir  pemeliharaan  dilakukan penimbangan  bobot  ikan  untuk  mengetahui pertumbuhannya. Jumlah pakan yang dihabiskan dicatat untuk  mengetahui  tingkat  konsumsi  pakan,  yang berguna  untuk  menghitung  konversi  pakan,  serta retensi protein. Setelah penimbangan selesai, diambil lima ekor ikan dari setiap akuarium untuk keperluan analisis lebih lanjut di laboratorium. Parameter yang diamati meliputi kelangsungan hidup, bobot ikan, laju pertumbuhan spesifik, jumlah konsumsi pakan, retensi protein, dan konversi pakan. Analisis di laboratorium meliputi proksimat pakan dan ikan, logam Cd di pakan dan ikan, gambaran darah (Hb, Hc, dan sel darah merah (SDM)), enzim pencernaan dan enzim oksidatif.
Parameter hematologis yang diukur meliputi he- moglobin (Hb), hematokrit (Hc), dan sel darah merah (SDM). Data hematologi tersebut kemudian dijadikan dasar dalam perhitungan mean corpuscular hemoglobin (MCH), berdasarkan Blaxhall & Daisley (1973).
Tabel 1. Komposisi, proksimat, logam berat Cd, dan kadar asam humat pada pakan untuk uji pertumbuhan ikan dengan perbedaan penambahan dosis asam humat (0; 1.600; 10.000; dan 20.000 mg.kg -1 )
Table 1. Ingredient, proximate, heavy metal Cd, and humic acid content in feed for fish growth test with additional different dosage of humic acid (0; 1,600; 10,000; and 20,000 mg.kg -1 )
Keterangan (Note):
*) Gross energy (GE) dihitung berdasarkan konversi NRC (2002) yaitu 5,64 kkal/g protein; 9,44 kkal/g lemak; dan 4,11 kkal/g BETN (Gross energy (GE) calculated based in conversion NRC (2002): 5.64 kcal/g; 9.44 kcal/g lipid; and 4.11 kcal/g NFE)
**) Analisis Cd menggunakan metode atomic absorption spectrofotometry (AAS) (Analysis Cd used atomic absorption spectrofotometry (AAS) method)
0 HA (kontrol/control ) 1.600 AHS 1,600 AHS 1.600 AHA 1,600 AHA 10.000 AHA 10,000 AHA 20.000 AHA 20,000 AHA Tepung ikan (Fish meal ) 260 260 260 260 260 Tepung kedelai Soy bean meal  (SBM) 115 115 115 115 115 Tepung daging dan tulang Meat and bone meal  (MBM) 115 115 115 115 115 Tepung terigu (Wheat flour ) 130 128.4 128.4 120 110 Tepung kerang hijau Green mussel meal  (GSM) 350 350 350 350 350 Minyak ikan (fish oil ) 10 10 10 10 10 Campuran mineral Mineral mix 5 5 5 5 5 Campuran vitamin Vitamin mix 10 10 10 10 10 Binder 5 5 5 5 5 Asam humat sintetik (AHS) Synthetic humic acid 0 1.6 0 0 0 Asam humat alami (AHA) Natural humic acid 0 0 1.6 10 20 Jumlah 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Protein kasar Crude protein  (%) 48.52 47.07 47.8 47.69 48.69 Lemak kasar (Crude lipid ) (%) 6.22 6.14 6.11 6.22 6.36 Karbohidrat Carbohydrat  (%) 19.66 19.26 21.03 23.46 23.33 Kadar abu (Ash content ) (%) 13.54 13.32 13.18 13.33 13.34 Kadar air Moisture content  (%) 11.23 13.18 10,135 7.86 7.26 Gross  energi  (kkal/100 g)* Gross energy (kcal/100 g) 413.17 402.60 413.70 424.11 430.54 Energi (kkal/%protein) Protein (kcal/%protein) 8.52 8.55 8.65 8.89 8.84 ** Logam berat Cd Heavy metal Cd  (mg.kg -1 ) 0.10 0.11 0.12 0.13 0.13 Asam humat (mg.kg -1 ) ttd 0.37 0.023 0.14 0.30
Komposisi proksimat pakan (Proximate composition )
Bahan Ingredients (g kg -1 ) Penambahan dosis asam humat (Dosage humic acid addition ) (mg kg -1 )
Hasil analisis (Result analysis )
Pengambilan sampel dari saluran pencernaan untuk analisis kelimpahan total dan jenis bakteri, dan enzim pencernaan. Kelimpahan bakteri total dihitung dengan menggunakan  metode  total  plate  count  (TPC)  pada media  TSA  yang ditambahkan  NaCl  (SNI  01-2332.3- 2006).  Identifikasi  spesies  bakteri  dilakukan  secara biokimiawi  (Benson,  2001).  Pengukuran  aktivitas enzim protease diukur mengikuti prosedur menurut Walter (1984), aktivitas enzim amilase (Bernfeld, 1955), dan  aktivitas  enzim  lipase  (Linfield  et  al.,  1984). Pengukuran enzim oksidatif dan antioksidan meliputi kadar  enzim  malonealdehyde  (MDA),  katalase  (CAT), superoxida dismutase (SOD), dan glutathione peroxidase (GPx) pada organ hati ikan kakap putih. Pengukuran MDA dilakukan dengan menggunakan metode uji asam tiobarbiturat  (TBA)  secara  spektrofotometri  (Wills, 1987).  Aktivitas  enzim  SOD  dan  GPx  diukur menggunakan  metode  spektofotometri  dengan berpedoman pada standar operasional prosedur dari kit komersial (Randox). Pemeriksaan aktivitas enzim katalase dilakukan dengan spektrofotometri mengacu pada Muradian et al. (2002).

## Analisis  Data
Data  kelangsungan  hidup,  bobot  ikan,  laju pertumbuhan spesifik, jumlah konsumsi pakan, retensi protein dan  konversi pakan, enzim  pencernaan dan enzim  oksidatif  dianalisis  menggunakan  uji  sidik ragam  dengan  taraf  kepercayaan  95%.  Jika  ada
perbedaan  nyata  dilakukan  uji  lanjut  dengan menggunakan uji Duncan menggunakan program IBM SPSS  versi  21.0.  Kelimpahan  bakteri  dan  gambaran darah (Hb, Hc, dan SDM) dianalisis secara deskriptif.

## HASIL DAN BAHASAN
Ikan yang diberi pakan dengan penambahan asam humat (AH) dengan dosis yang berbeda berpengaruh nyata terhadap kinerja pertumbuhan dan kelangsungan hidup  ikan  jika  dibandingkan  dengan  ikan  kontrol selama 70 hari pemeliharaan (Tabel 2).
Kinerja pertumbuhan pada ikan yang diberi pakan dengan  penambahan  AH  meningkat  dibandingkan dengan  ikan  kontrol,  hal  ini  menunjukkan  bahwa penambahan  AH  dalam  pakan  dapat  meningkatkan pemanfaatan nutrien pakan. Kinerja pertumbuhan dan tingkat  pemanfaatan  pakan  yang  meningkat  terkait dengan  aktivitas  enzim pencernaan,  retensi  nutrien pakan, dan konversi pakan. Berdasarkan jenis AH yang ditambahkan,  AHA  dan  AHS  pada  dosis  yang  sama sebesar  1.600  mg.kg -1 dalam  pakan memberikan respons  positif  terhadap  pertumbuhan.  Hasil  ini menunjukkan  bahwa  sesuai  dengan  penelitian sebelumnya  penambahan  dosis  AHA  sebesar  1.600 mg.kg -1 dalam  pakan  menghasilkan  kinerja pertumbuhan  yang  terbaik  pada  ikan  kakap  putih (Rasidi  et  al.,  2019).  Namun  demikian  jika dibandingkan dengan jenis AH yang ditambahkan pada dosis  yang  sama  penambahan  AHS  pada  pakan
Tabel 2. Bobot awal (W 0 ), bobot akhir (W t ), jumlah konsumsi pakan (JKP), retensi protein (RP), kelangsungan hidup (KH), laju pertumbuhan spesifik (LPS), dan rasio konversi pakan (RKP) dengan perbedaan penambahan dosis asam humat (0; 1.600; 10.000; dan 20.000 mg.kg -1 pakan)
Table 2. Initial weight (W 0 ), final weight (W t ), feed consumption (AFC), protein retention (RP), survival rate (SR), specific growth rate (SGR), and feed conversion ratio (FCR) with addition of different dosages of humic acid (0; 1,600; 10,000; and 20,000 mg.kg -1 feed)
Keterangan: Angka-angka pada baris yang sama yang diikuti huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05)
Note: Number  in  the  same  row  follows  by  different  characters  meaning  significantly  different  (P<0.05) 0 HA (kontrol/control ) 1.600 AHS 1.600 AHS 1.600 AHA 1.600 AHA 10.000 AHA 10.000 AHA 20.000 AHA 20.000 AHA Bobot awal (Initial weight ) (g) 4.10 ± 0.24 a 4.09 ± 0.34 a 4.06 ± 0.04 a 4.06 ± 0.12 a 4.01 ± 0.02 a Bobot akhir (Final weight ) (g) 7.63 ± 0.39 a 10.90 ± 0.69 b 10.05 ± 0.14 b 8.77 ± 0.59 b 7.77 ± 0.19 a
Jumlah konsumsi pakan (g.ikan -1 )
Feed consumption  (g.fish -1 )
13.15 ± 0.85 c 11.18 ± 0.39 bc 12.75 ± 0.20 ab 12.21 ± 1.26 ab 10.59 ± 0.96 b Retensi pakan (Protein retention ) (%) 7.13 ± 2.10 a 17.61 ±  1.02 c 14.87 ±  2.91 bc 12.87 ± 1.63 b 11.94 ± 1.36 b Sintasan (Survival rate ) (%) 76.00 ± 4.00 a 94.67 ± 4.61 c 86.67 ± 2.31 bc 78.67 ± 6.11 ab 77.33 ± 6.11 a
Laju pertumbuhan spesifik (%.hari -1 )
Specific growth rate (%.days -1 )
0.76 ± 0.02 a 1.35 ± 0.06 e 1.29 ± 0.12 d 1.13 ± 0.02 c 0.95 ± 0.04 b Rasio konversi pakan Feed conversion ratio 3.89 ± 1.02 a 1.65 ± 0.10 c 2.34 ± 0.07 bc 2.60 ± 0.30 b 2.82 ± 0.50 b
Penambahan dosis AH/HA dosage addition  (mg.kg -1 )
Parameter
Parameters
mengakibatkan  pertumbuhan  ikan  lebih  tinggi dibandingkan  ikan  yang  diberi  pakan  dengan penambahan AHA. Perbedaan respons pertumbuhan tersebut dalam dalam penelitian ini dapat dilihat dari ikan yang mengonsumsi pakan 1.600 AHS bersesuaian dengan nilai-nilai parameter yang diamati yang lebih baik dibandingkan dengan 1.600 AHA (Tabel 2). Hal ini  diduga  disebabkan  terkait  spesifikasi  gugus fungsional dan kemampuan masing-masing jenis AH dalam  fungsinya  sebagai  chelator  logam  berat,  dan meningkatkan pemanfaatan nutrien pakan. Respons positif juga ditunjukkan pada penelitian terdahulu yang menggunakan  AHS  secara  signifikan  meningkatkan pertambahan bobot ikan swordtails (Xiphophorus hel- leri) (Meinelt et al., 2008).
Pada penelitian ini, meningkatnya penambahan AH pada pakan uji berkorelasi positif dengan kelimpahan mikrobiota di usus ikan (Tabel 3). Menurut Ringo et al.  (2006),  jenis  pakan  yang  masuk  dalam  sistem pencernaan akan memengaruhi kelimpahan dan jenis mikrobiota dalam saluran pencernaan. Penambahan AH memberikan keuntungan secara tidak langsung sebagai prebiotik,  karena  mikrobiota  di  dalam  saluran pencernaan dapat memanfaatkan asam humat sebagai sumber energi seperti karbon, N, dan P (Stevenson, 1994).  Selanjutnya  Islam  et  al.  (2005)  menyatakan bahwa asam humat mampu menstabilkan mikrobiota di  usus.  Berdasarkan  Tabel  3  dapat  diketahui mikrobiota yang dominan diperoleh tiga jenis bakteri. Ketiga  jenis  bakteri  dominan  tersebut  berpotensi sebagai probiotik. Menurut penelitian terdahulu, Ba-
cillus sp. berperan dalam proses pencernaan yang dapat menghasilkan enzim pencernaan yang meningkatnya retensi protein dan sistem imun sehingga berdampak pada  pertumbuhan  ikan  yang  semakin  meningkat (Widanarni et al., 2015).
Kelimpahan  dan  jenis  bakteri  dominan  yang ditemukan di  usus ikan uji diduga  berdampak pada aktivitas  enzim  pencernaan.  Aktivitas  enzim pencernaan  berbeda  nyata  antara  ikan  yang  diberi perlakuan penambahan AH dan ikan kontrol, namun tidak  berbeda  nyata  antar  ikan  yang  diberi  pakan dengan penambahan AHA maupun AHS (P>0,05) (Tabel 4). Meningkatnya kelimpahan mikrobiota ini diduga berdampak pada meningkatnya enzim pencernaan di usus ikan yang merupakan indikator kemampuan dalam mencerna dan memanfaatkan pakan yang diberikan. Pakan  dengan  penambahan AH  dapat  dimanfaatkan lebih baik sehingga lebih efisien dibandingkan pakan kontrol. Tingkat pemanfaatan pakan dapat dilihat dari nilai  konversi  pakan  yang  semakin  menurun  yang menunjukkan  pakan  yang  dikonsumsi  lebih  efisien dimanfaatkan  untuk  pertumbuhan.  Hasil  ini  sesuai dengan penelitian sebelumnya pada ikan loach yang diberi pakan dengan penambahan asam fulvat dalam pakan  uji  mampu  memperbaiki  pemanfaatan  pakan sehinggga  pertumbuhan  ikan  dan  efisiensi  pakan meningkat (Gao et al., 2017).
Penambahan AH baik jenis alami maupun sintetis dalam pakan uji mampu menurunkan Cd di dalam or- gan  hati  dan  ginjal;  Cd  dalam  daging  ikan  tidak
Tabel 3. Kelimpahan total mikrobiota  di usus ikan dan identifikasi bakteri,  enzim pencernaan dari usus ikan yang diberi pakan dengan perbedaan penambahan dosis asam humat (0; 1.600; 10.000; dan 20.000 mg.kg -1 pakan)
Tabel 3. Total plate count of fish intestine microbiota and identification of species bacteria in fish intestine, enzyim digestion, with additionc of different dosages of humic acid (0; 1,600; 10,000; and 20,000 mg.kg -1 feed)
Keterangan (Note): 1) Bakteri Gram positif/negative (Bacteria Gram positive/negative);  = dominan
(dominant); nd= tidak dominan ditemukan (not dominant found)
0 HA (kontrol/control ) 1.600 AHS 1.600 AHS 1.600 AHA 1.600 AHA 10.000 AHA 10.000 AHA 20.000 AHA 20.000 AHA Kelimpahan total mikrobiota TPC microbiota  (log CFU.mL -1 g -1 ) 1.56 ± 0.43 2.18 ± 0.44 2.86 ± 0.12 2.89 ± 0.32 3.13 ± 0.33 Gram positif/negatif Gram positive/negative  (gram +/-) 1) + + + + + Bacillus  sp. √ 2) √ √ nd nd Stapyllococcus  sp.-1 nd 3) √ √ √ √ Stapyllococcus  sp.-2 nd √ √ √ √
Penambahan AH (HA addition ) (mg kg -1 ) Identifikasi spesies bakteri
Identification of species bacteria
Parameter
Parameters
terdeteksi  (<  0,005  mg.kg -1 );  sedangkan  di  dalam daging ikan kontrol masih terdeteksi Cd sebesar 10,11 ± 0,40  µg.kg -1 (Tabel  4).  Dengan  demikian penambahan  AH  pada  pakan  uji  dapat  mencegah akumulasi  Cd  di  dalam  daging  ikan  sehingga  aman dikonsumsi manusia. Hal ini disebabkan AH melalui gugus karboksilat dan fenol yang mampu membentuk ikatan  kompleks dengan  Cd.  Ikatan yang  terbentuk lebih stabil sehingga toksisitasnya juga berkurang, dan mengurangi  kemungkinan  penyerapan  logam  oleh jaringan sehingga tidak terakumulasi di dalam daging ikan.  Selanjutnya  Cd  tersebut  akan  dieksresikan bersama feses (Osman et al., 2009). Hasil penelitian ini  sesuai  dengan  penelitian  sebelumnya  yang menggunakan  AH  dalam  air  mampu  mengeliminasi logam berat Cd (Kamunde & MacPhail, 2011). Demikian juga  pada  penambahan  AH  melalui  pakan  dapat mengeliminasi logam berat Pb pada ikan nila (Marlinda, 2016; Robin et al., 2017).
Status kesehatan ikan dapat diamati dari gambaran darahnya meliputi hemoglobin (Hb), hematokrit (Hc),
dan jumlah sel darah merah (SDM). Pada penelitian ini ikan  yang  diberi  pakan  dengan  penambahan  AH mempunyai  gambaran  darah  yang  lebih  tinggi dibandingkan dengan ikan kontrol (Tabel 6).
Penambahan AH ada pakan mampu meningkatnya nilai-nilai gambaran darah, hal ini diduga AH berperan dalam  menekan  toksisitas  Cd  sehingga  proses pembentukan sel darah merahnya tetap berlangsung (Osman et al., 2009). Hal ini disebabkan penambahan AH  mampu  meningkatkan  mineral  Fe  yang berkontribusi  dalam  pembentukan  SDM  sehingga jumlah SDM meningkat. Meningkatnya Fe dalam darah akan  berkontribusi  dalam  meningkatnya  jumlah oksigen yang dapat diikat oleh ion Fe, semakin banyak ion Fe dapat mengikat oksigen akan bertambah Hb dalam  SDM.  MCH  merupakan  salah  satu  indikator untuk mengetahui jumlah Hb dalam sel darah merah. Pada penelitian ini, nilai hematologi darah ikan masih berada pada kisaran normal ikan kakap putih (Ander- son et  al.,  1996).  Hasil penelitian  ini  sesuai  dengan penelitian sebelumnya pada pemanfaatan asam humat
Tabel 4. Aktivitas  enzim  pencernaan  dari  usus  ikan  yang  diberi  pakan  dengan  perbedaan penambahan dosis AH selama 70 hari pemeliharaan
Tabel 4. Digestive enzim activity in fish intestine with addition of different dosages of humic acid for 70 days cultivation
Keterangan: 1) Angka-angka pada baris yang sama yang diikuti oleh huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05)
The  numbers  in  the  same  row  follows  by  different  characters  meaning  significantly  different  (P<0.05)
Tabel 5. Kadar Cd di organ (hati, ginjal, dan daging) ikan kakap putih yang diberi pakan dengan perbedaan penambahan dosis AH selama 70 hari pemeliharaan
Tabel 5. Cd  content  ini  fish  organ  (liver,  kidney,  and  fishmeat)  in  fish  with  addition  of  different dosages of humic acid after 70 days cultivation period
0 HA (kontrol/control ) 1.600 AHS 1.600 AHS 1.600 AHA 1.600 AHA 10.000 AHA 10.000 AHA 20.000 AHA 20.000 AHA Protease (IU.mL -1 ) 0.87 ± 0.0 a 2.45 ± 0.5 b 2.63 ± 0.38 b 2.22 ± 0.75 b 1.75 ± 0.2 b Amilase (IU.mL -1 ) 0.08 ± 0.03 a 0.14 ± 0.01 b 0.24 ± 0.07 b 0.31 ± 0.07 b 0.10 ± 0.01 a Lipase (µmol menit -1 /minute -1 ) 1.32 ± 0.4 a 3.01 ± 0.2 b 7.03 ± 0.90 b 7.64 ± 0.1 b 7.42 ± 0.32 b
Penambahan AH (HA addition ) (mg kg -1 ) Parameter Parameters
Keterangan (Note): *) Angka-angka pada baris yang sama yang diikuti oleh huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05) (The numbers in the same row follows by different characters  meaning  significantly  different  (P<0.05))
**) ttd = tidak terdeteksi (not detected) 0 HA (kontrol/control ) 1.600 AHS 1.600 AHS 1.600 AHA 1.600 AHA 10.000 AHA 10.000 AHA 20.000 AHA 20.000 AHA Hati (Liver ) 34.43 ± 2.42 c 11.41 ± 1.52 a 15.95 ± 3.19 b 11.79 ± 1.06 a 11.43 ± 1.63 a Ginjal (Kidney ) 10.88 ± 1.01 c 4.67 ± 0.87 a 6.27 ± 1.62 b 5.23 ± 0.68 b 4.97 ± 0.44 a Daging (Meat ) 10.11 ± 0.40 ttd **) ttd ttd ttd Dosis AH (mg kg- 1 ) pakan AH dosage (mg kg -1 ) feed Cd pada organ ikan
CD in fish organs (µg.kg -1 )
mampu meningkatkan gambaran darah pada ikan sil- ver catfish, Rhamdia quelen (Da Costa et al., 2015) dan ikan rainbow trout (Yýlmaz et al., 2018).
Hasil pengukuran parameter uji untuk mengetahui tingkat  stres  oksidatif  meliputi  peroksidase  lemak Malonaldehyde (MDA) dan enzim antioksidan meliputi katalase  (CAT),  superoxida  dismutase  (SOD),  dan gluthatione peroxidase (GPx) pada hati ikan kakap putih disajikan pada Tabel 7. Ikan yang diberi pakan dengan penambahan AH mampu menurunkan stres oksidatif ditandai  dengan  kadar  MDA  yang  menurun dibandingkan dengan kontrol. Hal ini sesuai dengan menurunnya  akumulasi  Cd  di  hati  ikan  uji  akibat
penambahan AH pada pakan (Tabel 5). Peran AH melalui gugus  fungsi  karboksil  yang  mengkhelat  ion  Cd sehingga toksisitasnya menurun dan tingkat stresnya juga  menurun.  Namun  dengan  meningkatnya  dosis AHA  sampai  dengan  20.000  mg.kg -1 pakan menunjukkan  kadar  MDA  meningkat  lagi.  Menurut Hseu & Yang (2002), penambahan AH pada dosis yang berlebih dapat menyebabkan stres oksidatif yaitu tidak seimbangnya produksi oksigen reaktif dan hidrogen peroksida  dengan  enzim  antioksidan  dalam  sel. Peningkatan peroksidasi lemak disebabkan karena sel kekurangan enzim antioksidan, seperti SOD dan GPx. SOD akan mengonversi oksigen reaktif menjadi H 2 O 2
Tabel 6. Nilai  hemoglobin  (Hb),  hematokrit  (Hc),  sel  darah  merah  (SDM),  mean  corpuscular  hemoglobin (MCH), dan Fe dalam darah pada ikan uji dengan perbedaan penambahan dosis asam humat (0; 1.600; 10.000; dan 20.000 mg.kg -1 pakan)
Table 6. Value of hemoglobin (Hb), hematokrit (Hc), red blood cell (RBC), mean hemoglobin corpuscular (MCH), and Fe in whole fish blood with additional different dosage of humic acid (0; 1,600; 10,000; and 20,000 mg.kg -1 feed)
Keterangan: 1) Anderson et al. (1996); 2) Angka-angka pada baris yang sama yang diikuti oleh huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05)
Note: The  numbers  in  the  same  row  follows  by  different  characters  meaning  significantly  different  (P<0.05)
Tabel 7. Aktivitas  peroksidase  lemak,  Malonaldehyde  (MDA),  enzim  Katalase  (CAT)  dan  Superoksida
Dismutase  (SOD),  Gluthatione  Peroksidase  (GPx)  di  hati  ikan  kakap  putih  yang  diberi  pakan dengan perbedaan dosis dan jenis AH selama 70 hari pemeliharaan.
Table 7. Activity of lipid peroxidase, Malonealdehyde (MDA), enzym Catalase (CAT) and Superoksida Dismutase (SOD),  Gluthatione  Peroksidase  (GPx)  from  liver  fish  fed  feed  with  different  humic  acid  addition (0,1600,10000 and 20000 mg Kg -1 feed)
0 HA (kontrol/control ) 1.600 AHS
1.600 AHS 1.600 AHA 1.600 AHA 10.000 AHA 10.000 AHA 20.000 AHA 20.000 AHA Hemoglobin (g.dL -1 ) 4.4-5.6 5.6-6.0 5.2-6.6 5.0-6.8 5.0- 6.6 6.0-9.5 Hematokrit (%) 13.1-17 20.8-22.9 21.70-22.9 20.0-20.8 22.0-23.4 26.0-40.0 Sel darah merah (x10 6 sel.mm 3 ) Red blood cell (x10 6 cell.mm 3 ) 1.26-1.97 2.13-2.55 2.1-2.31 1.52-2.23 1.9-2.23 1.70-5.20 Mean hemoglobin corpuscular  (pg) 28..43–34.92 23.53–26.32 22.51-29.60 27.80-30.91 22.42-34.74 16.7-20.6 Fe darah (Fe blood ) (mg.L -1 ) 48.76±1.63 a 68.32±1.75 b 66.36±1.66 b 72.15±1.13 c 75.66±1.07 d Parameter Parameters Kisaran normal 1)
Normal range 1) Penambahan asam humat (mg.kg -1 pakan)
Humic acid addition (mg.kg -1 feed) 0 HA (kontrol/control ) 1.600 AHS 1.600 AHS 1.600 AHA 1.600 AHA 10.000 AHA 10.000 AHA 20.000 AHA 20.000 AHA MDA (nmol mL -1 ) 58.7 ± 1.08 c 28.27 ± 2.10 a 33.40 ± 2.56 b 56.66 ± 1.79 c 57.32 ± 1.74 c CAT (U mL -1 ) 0.08 ± 0.01 a 0.27 ± 0.02 a 0.29 ± 0.01 a 0.09 ± 0.03 a 0.07 ± 0.03 a SOD (U mL -1 ) 43.14 ± 2.8 a 48.01 ± 1.93 b 45.09 ± 2.18 b 53.65 ± 2.69 c 52.91 ± 1.89 c GPx (U mL -1 ) 0.49 ± 0.05 a 0.80 ± 0.08 b 0.71 ± 0.17 b 0.59 ± 0.09 a 0.56 ± 0.04 a
Parameter Parameters Dosis AH dalam pakan AH dosage in feed  (mg.kg -1 )
Keterangan: 1) Angka-angka pada baris yang sama yang diikuti oleh huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata ada taraf uji 95% (uji selang berganda Duncan)
Note: The  numbers  in  the  same  row  follows  by different  characters  meaning  significantly  different  results  at  the  95% test  level  (Duncan’s  multiple  interval  test)
yang kemudian oleh GPx akan dikonversi menjadi H 2 O (Muradian et al., 2002). Ikan yang mengonsumsi pakan dengan penambahan AH, aktivitas enzim antioksidan (CAT, SOD, dan GPx) lebih tinggi dibandingkan kontrol. Hal  ini  mengindikasikan  penambahan  AH  berperan dalam meningkatkan status antioksidan. Kedua jenis AH ini mempunyai spesifikasi yang berbeda, perbedaan keduanya  terletak  pada  jumlah  gugus  fungsi  dan aromatik. AHS lebih banyak mengandung gugus fenol dibandingkan  AHA  yang  lebih  banyak  mengandung gugus karboksilatnya (Pompe et al., 1996; Datta et al., 2001).  Gugus  fungsi  yang  terdapat  pada  AHS  yang sebagian  besar  terdiri  atas  gugus  fenolik  (-OH), bersifat  reaktif  terhadap  ion  logam  esensial  seperti Zn  dan  Mn,  kemampuan  ini  meningkatkan  enzim antioksidan yang diperlukan untuk melawan radikal bebas (Zheng & Shiow 2001).

## KESIMPULAN
Pada dosis asam humat yang sama (1.600 mg.kg -1 pakan),  AHS  lebih  efisien  dibandingkan  AHA  dalam meningkatkan pertumbuhan ikan. Penambahan AH dari jenis asam humat alami dan sintetik dalam pakan uji, keduanya dapat meningkatkan status kesehatan dan mengeliminasi Cd di dalam daging ikan. Penambahan AHA  dosis  tinggi  pada  pakan  memberikan  respons negatif  terhadap  status  kesehatan,  kelangsungan hidup, dan kinerja pertumbuhan ikan kakap putih.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kepala Pusat  Pendidikan,  Badan  Riset  dan  Sumber  Daya Manusia  Kelautan  dan  Perikanan,  Kementerian Kelautan  dan  Perikanan  yang  telah  memberikan beasiwa dan bantuan dana penelitian; Kepala Balai Riset Budidaya  Ikan  Hias,  Depok  yang  telah  memberikan izin dan sarana untuk melakukan penelitian. Teknisi dan  laboran  yang  telah  membantu  pelaksanaan penelitian ini.

## DAFTAR  ACUAN
Anderson,  I.G.,  Schaumuller,  L.F.,  &  Kramer,  H.L. (1996). A preliminary study on the hematology of freshwater-reared  seabass/barramundi  Lates calcarifer. Asian Fisheries Sci., 9, 101-107.
Association  of  Official  Analytical  Chemists  [AOAC]. (1984).  Official  methods  of  analysis.  15th  Ed. Helrich, K. (Ed.). Arlington: AOAC.
Benson, H.J. (2001). Benson’s microbiological appli- cations: Laboratory manual in general microbiol- ogy. 8th Ed. New York: McGraw-Hill, xi + 478 pp.
Blaxhall,  P.C.  &  Daisley,  K.W.  (1973).  Routine haematological methods for use with fish blood. Journal of Fish Biology, 5(6), 771-781.
Bernfeld, P. (1955). Amylases á and â: Method Enzymol.,
1, 149-158.
Bosch, A.C., O’Neill, B., Sigge, G.O., Kerwath, S.E., & Hoffman, L.C. (2016). Heavy metals in marine fish meat and consumer health: A review. J. Sci. Food & Agric., 96, 32-48.
Da  Costa, S.T.,  Gressler, L.T.,  Sutili,  F.J., Loebens,  L., Lazzari,  R.,  &  Baldisserotto,  R.  (2015).  Effect  of humic acid on survival, ionoregulation and hema- tology  of  the  silver  catfish,  Rhamdia  quelen (Siluriformes:  Heptapteridae), exposed  to  differ- ent pHs. Zoologia, 32(3), 215-224.
Datta, A., Sanyal, S.K., & Saha, S. (2001). A study on natural  and  synthetic  humic  acids  and  their complexing  ability  towards  cadmium.  Plant  and Soil, 235(1), 115-125.
Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya [DJPB]. (2016). Data  Teknis  Direktorat  Jenderal  Perikanan Budidaya. Jakarta (ID): DJPB.
Food Agriculture Organization of The United Nations [FAO].  (2019).  Fishery  Statistics.  Diunduh  pada tanggal 10 Oktober 2019. http://www.fao.org/fish- ery/statistics/software/fishstatj/en.
Gao,  Y.,  Jie,  H.,  Zhuliu,  H.,  Zhiwei,  L.,  Zhao,  B.,  Yi, M., Jeong-Yeol, L., &  Zhangjie, C. (2017). Effects of fulvic acid on growth performance and intesti- nal  health  of  juvenile  loach  Paramisgurnus dabryanus. Fish Shellfish Immunol., 62, 47-56.
Hseu, Y.C. & Yang, H.L. (2002). The effects of humic acid-arsenate complexes on human red blood cells. Environmental Research, 89(2), 131-137.
Islam, K.M.S., Schuhmacher, A., & Gropp, J.M. (2005). Humic acid substances in animal agriculture. Paki- stan Journal of Nutrition, 4(3), 126-134.
Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B.B., & Beeregowda, K.N. (2014). Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdis Toxic, 7(2), 60-72.
Kamunde, C. & MacPhail, R. (2011). Effect of humic acid during concurrent chronic waterborne expo- sure of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) to cop- per, cadmium and zinc. Ecotox Environment Safety, 74, 259-269.
Klöcking, R. (1992). Humic substances in the global environment  and  implications  in  human  health. Monopoli, 129 pp.
Linfield, W.M., O’Brien, D,J., Serota, S., & Barauskas, R.A.  (1984).  Lipid-lipase  interaction  I.  Fat  split- ting with Candida rugosa. JAOCS, 61(6), 1067-1071.
Marlinda, S. (2016). Humic acids addition for use in diets of  tilapia  Oreochromis  niloticus  which  contained heavy metals from green mussel Perna viridis. Tesis.
Sekolah  Pasca  Sarjana,  Institut  Pertanian  Bogor, 138 hlm.
Meinelt, T., Schreckenbach, K., Pietrock, M., Heidrich,
S., & Steinberg, C.E.W. (2008). Humic substances - Part 1: Dissolved humic substances (HS) in aquac- ulture and ornamental fish breeding. Environmen- tal Science and Pollution Research, 15(1), 17-22.
Mohanta,  K.N.,  Subramanian,  S.,  &  Korikanthimath,
V.S. (2013). Evaluation of different animal protein sources in formulating the diets for blue gourami, Trichogaster Trichopterus fingerlings. J. Aquac. Res. Development, 4(2), 7 pp.
Muradian, K.K., Utko, N.A., Fraifeld, V., Mozzhukhina,
T.G.,  Pishel,  I.N.,  &  Litoshenko,  A.Y.  (2002).  Su- peroxide dismutase, catalase and glutathione per- oxidase  activities  in  the  liver  of  young  and  old mice: Linear regression and correlation. Archives of Gerontology and Geriatrics, 35(3), 205-214.
National  Research  Council  [NRC].  (2002).  Nutrient requirements of fish and shrimp. Washington D.C. (U.S.): National Academy Press, 114 pp.
Osman, H.A., Ibrahim, T.B., Ali, A.T., & Derwa, H.I.M. (2009). Field application of humic acid against the effect  of  cadmium  pollution  on  cultured  tilapia Oreochromis  niloticus.  World  Applied  Sci.  J.,  6(11), 1569-1575.
Pompe,  S.,  Bubner,  M.,  Denecke,  M.A.,  Reich,  T., Brachmann, Á., Geipel,  G., & Nitsche,  H. (1996). A  comparison  of  natural  humic  acids  with  syn- thetic humic acid model substances/ : Character- ization  and  interaction  with  uranium  (VI). Radiochimica Acta, 74, 1-6.
Rajagopal, S., Venugopalan, V,P., Van Der Velde G., & Jenner, H.A. (2006). Greening of the coasts: A re- view of the Perna viridis success story. Aquatic Ecol- ogy, 40, 273-297.
Radiarta, I N., Saputra, A., & Ardi, I. (2011). Analisis spasial  kelayakan  lahan  budidaya  kerang  hijau (Perna viridis) berdasarkan kondisi lingkungan di Kabupaten  Cirebon,  Jawa  Barat.  Jurnal  Riset Akuakultur, 6(2), 169-352.
Rasidi,  Jusadi,  D.,  Setiawati,  M.,  Yuhana,  M.,  Zairin,
Jr.M.,  & Sugama,  K. (2019).  Effect  of humic  acid addition to feeds with heavy metal cadmium con- tamination  from  green  mussels  on  growth  per- formance of Asian seabass. Biotropia, 26(3), 214- 216.
Ringo,  E.,  Spertad,  S.,  Myklebus,  R.,  Refstie,  S.,  & Krogdahl,  A.  (2006).  Characterisation  of  the
microbiota  associated  with  intestine  of  Atlantic cod  (Gadus  morhua  L.).  The  effect  of  fish  meal, standard soybean meal and a bioprocessed soy- bean meal. Aquaculture, 261(3), 829-841.
Riani,  E.,  Cordova,  M.R.,  &  Arifin,  Z.  (2018).  Heavy metal pollution and its relation to the malforma- tion  of  green  mussels  cultured  in  Muara  Kamal waters, Jakarta Bay, Indonesia. Mar. Pollution Bull., 133, 664-670.
Robin, Supriyono, E., Nirmala, K., Harris, E., Affandi, R.,  &  Jusadi,  D.  (2017).  Bio-elimination  of  lead (Pb)  from  the  organs  of  red  tilapia  (Oreochromis sp.) using Gliricidia sepium compost as a feed ad- ditive. AACL Bioflux, 1(10), 38-47.
Stevenson,  F.J.  (1994).  Humus  chemistry-genesis, composition, reactions. New York: John Wiley & Sons, 443 pp.
Walter,  H.E.  (1984).  Method  with  haemoglobin, casein,  and  azocoll  as  substrate.  in:  Bergmeyer (Ed.).  Methods  of  enzymatic  analysis.  3th  Ed. Weinheim (JE): Verlag Chemie.
Widanarni, Nopitawati, T., & Jusadi D. (2015). Screen- ing  of  probiotic  bacteria  candidates  from gastrointestine  tract  of  pasific  white  shrimp Litopeneaus  vannamei  and  their  effect  on  the growth performance. Research journal of Microbiol- ogy, 10(4), 145-157.
Wills, E.D. (1987). Evaluation of lipid peroxidation in lipid and biological  membran. Biochemical Toxi- cology. New York: John Wiley & Sons.
Vidacovic, E. (2015). Fungal and mussel protein sources in  fish  feed.  Dissertation.  Swedish  University  of Agricultural Sciences.
Yoruk, M.A., Gul, M., Hayirli, A., & Macit, M. (2004). The  effects  of  supplementation  of  humate  and probiotic on egg production and quality param- eters during the late laying period in hens. Poul- try Science, 83, 84-88.
Yýlmaz, S., Ergun, S., Çelik, E.S., & Yigit, M. (2018). Effects  of  dietary  humic  acid  on  growth  perfor- mance, haematoimmunological and physiological responses  and  resistance  of  rainbow  trout, Oncorhynchus mykiss to Yersinia ruckeri. Aquac. Res., p.  1-12.  https://doi.org/10.1111/;  https://doi.org/ 10.1111/ are.13798.
Zheng, W. & Shiow, Y.W. (2001). Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs. Jour- nal Agricultural Food Chemistrry, 49(11), 5165-5170.