## POTENSI  SEL  T  MOBIL  HER2  SPESIFIK  MODIFIKASI  CRISPR  / CAS9  PD-1  /  PD-L1  PEMBLOKIRAN  SEBAGAI  INOVASI  TERAPI UVEAL MELANOMA
Mukhammad Arif Hadi Khoiruddin 1 , Yusi Windya Febriyanti 2 , Nafia Amalia 3
1,2,3 Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember
1 e -mail : arifhakz08@gmail.com

## Abstract
Uveal Melanoma (UM) is the primary intraocular tumor most commonly found in adults. The combination of therapy,  Brachytherapy,  surgery,  Tranpupillary  Thermal  Therapy  (TTT),  Proton  Beam  Theraphy  has  not produced satisfactory results. The discovery of HER2 receptors expressed by UM cells can be used as a specific antigen  target  for  the  treatment  of  CAR  T-celss.  However,  the  effectiveness  of  CAR  T-cell  immunotherapy  in tumors results in immunosuppressive T cells caused by an increase in Programmed cell Death Ligand-1 (PD- L1). This literature review demonstrates the success of HER2-specific CART T Cells as UM therapeutic efforts capable of eliminating tumor cells. In addition, CRSPR / Cas9 PD-1 / PD-L1-blocking modified HER2-specific CAR  T  cells  can  be  a  gene  innovation  in  UM  sufferers.  Further  clinical  trials  are  needed  to  prove  the effectiveness of CRISPR / Cas9 PD-1 / PD-L1-Blocking modified HER2-specific CAR T Cells in the treatment of UM patients.
Keywords: Uveal melanoma, CAR T cell, reseptor HER

## Abstrak
Uveal  Melanoma  (  UM  )  adalah  tumor  intraocular  primer  yang  paling  sering  ditemukan  pada  orang  dewasa. Kombinasi  terapi,  Brachiterapi,  pembedahan, Tranpupillary  Thermal  Therapy (TTT), Proton  Beam  Theraphy belum menghasilkan hasil yang memuaskan. Penemuan reseptor HER2 yang diekspresikan oleh sel UM dapat digunakan sebagai target antigen spesifik untuk terapi CAR T-celss. Akan tetapi, efektivitas imunoterapi CAR T- cells pada tumor menimbulkan imunosupresif sel T yang diakibatkan oleh peningkatan Programmed cell Death Ligand- 1  (  PD-L1).  Tinjauan  literature  ini  menunjukkan  keberhasilan  CART  T  Cells  HER2- specific sebagai upaya  terapi  UM  yang  mampu  melakukan  eliminasi  sel  tumor.  Selain  itu,  HER2- specific CAR  T  cells termodifikasi  CRISPR/Cas9  PD-1/PD-L1- blocking dapat  menjadi  inovasi  gen  pada  penderita  UM.  Diperlukan uji klinis lebih lanjut untuk membuktikan efektivitas CAR T Cells HER2- specific termodifikasi CRISPR/Cas9 PD-1/PD-L1- Blocking dalam rangka terapi pasien UM.

## Kata kunci
: Uveal melanoma, CAR T cell, reseptor HER

## PENDAHULUAN
Uveal Melanoma ( UM ) adalah tumor intraokular  primer  yang  paling  sering ditemukan  pada  orang  dewasa 1-3 .  UM paling  sering  muncul  dari  melanosit koroid  (85%  -90%),  tetapi  juga  dapat timbul dari iris (3% -5%) dan ciliary body (5%  -8%) 1,4,5 .      UM  sering  terdiagnosis pada  pasien  usia    antara  55-60  tahun. Insidensi UM adalah 5 dari 1.000.000 dan setiap  tahunnya  terdiagnosis  1.500  kasus baru  di    amerika  dan  eropa 3,6,7 . Meskipun  pasien  UM  biasanya  memiliki
gejala  seperti  penglihatan  kabur, visual field defect , metamorphopsia, atau photopsia,  30%  pasien  UM  bersifat asimptomatik  dan  terdeteksi  secara  tidak sengaja  setelah  pemeriksaan  mata  rutin 8 . Pasien  dengan  UM  memiliki  prognosis yang  buruk  karena  uveal  melanoma memiliki kecenderungan yang tinggi untuk bermetastasis pada organ organ lain seperti hepar  (89%),  paru-paru  (29%),  tulang (17%), kulit dan jaringan subcutan (12%), serta kelenjar (11%)
sehingga meningkatkan  angka  mortalitas  pasien 9 . Selain  itu  beban  biaya  yang  ditimbulkan
sebesar $106.100 atau
hampir 1,503,769,000.00 10-11 .  Akan  tetapi  dengan pembiayaan  yang  cukup  besar  tersebut tidak  bisa  menjamin  kesembuhan  pasien sepenuhnya 12 .
Modalitas  terapi  seperti  Brachiterapi, pembedahan, Tranpupillary Thermal
Therapy (TTT), Proton  Beam  Theraphy tetap
menunjukkan hasil kurang memuaskan. brachiterapi banyak
menimbulkan  banyak  efek  samping 1,5.13 . Resiko  komplikasi  sebesar  25,3%  dan 50,3%  akan  menimbulkan  beberapa  efek samping  lain  diantaranya  retinopati  ( 16,8%  ),  mokolupati  (  38,5%  ),  optik neuropati  ismkemik  (  25,2%  ),  retinal detachment ( 18,9% ), vitreous hemorrhage  (  17,5%  ),  tumor  vaskulopati (21%).    Selain  itu      terapi  pembedahan juga menimbulkan beberapa efek samping diantaranya  retinal  detachment  (  21%  ), hipertensi  okular  (  21%  ),  submacular hemorrhage  (  16%  )  dan  repeat vitreoretinal surgery ( 44-70% ) 11 . TTT ( Transpupillary  thermal  therapy  )  juga menimbulkan    efek  samping  irish  atrofi 36%, peripheral  focal  lens  opacity 24%, obstruksi  vascular  2%.    Proton  Beam Therapy  juga  menimbulkan  efek  samping diantaranya gangguan pendengaran ( 25% ), penurunan kognitif  sebesar 1,9/tahun 14 . Seiring  dengan  kemajuan  teknologi berbasis  imunoterapi,  penemuan  metode CAR  T-Cells    telah  membukakan  jalan menuju  era  baru  terapi  kanker  dengan hasil  yang  meyakinkan  dan  memberikan harapan  besar 15 .  Selain  itu,  penemuan reseptor HER2 yang diekspresikan oleh sel tumor  UM  bisa  digunakan  sebagai  target antigen  spesifik  untuk  terapi  CAR  T-cells dalam UM sehingga mampu menjadi suatu inovasi  pengobatan  terbaru  untuk  UM 16 . Akan  tetapi  salah  satu  tantangan  utama untuk  efektivitas  imunoterapi  CAR  T- cells  pada  tumor  berupa  keadaan imunosupresif  sel  T  yang  diinduksi  oleh sel  tumor  yang  diakibatkan  oleh peningkatan Programmed  cell  Death Ligand- 1 (PD-L1) 17 . Ikatan antara PD- L1 dengan Programmed  cell  Death- 1  (PD-1) akan menghambat aktivasi, proliferasi, dan
kelangsungan  hidup  sel  T 17,18 .  Salah  satu strategi  untuk  menurunkan  ekspresi  PD-1 adalah  dengan  melakukan  rekayasa genetika  menggunakan  CRISPR/Cas9 yang  mampu  mendelesi  gen  pdcd-1 sehingga  dapat  menghambat  ikatan  antara PD-1  dan  PD-L1.  Akibatnya.  terjadi peningkatan efek antitumor CAR T- Cells pada terapi UM 19 .

## METODE
Penulisan tinjauan pustaka ini mengguanakan  metode Prefferd  Reprting Items  for  Systemic  Reviews  and  Meta Analyses (PRISMA).  PRISMA  adalah suatu  tinjauan  pustaka  yang  didasarkan atas  fakta-fakta  dan  pengambilan  studi pustaka secara acak. Penulis menggunakan search  engine berupa  Pubmed,  Science Direct,  Google  Schoolar,  Nature  dengan kata  kunci:  “Uveal  Melanoma,  CAR  T Cells,  HER2,  CRISPR/Cas9,  PD-1/PD- L1”.  Judul  dan  abstrak  akan  menjalani proses  pemindaian  untuk  mengeksklusi jurnal  ilmiah  yang  bersifat  tidak  relevan dengan kata kunci. Dalam tinjauan pustaka ini, kami menggunakan jurnal ilmiah yang membahas  tentang  mekanisme  dan  aspek klinis  dari  CAR  T  Cells  dalam  terapi Uveal  Melanoma.  Jurnal  ilmiah  akan menjalani  proses  eksklusi  jika  tahun penerbitan melebihi 10 tahun. Terdapat 77 jurnal  ilmiah  yang  sesuai  dengan  topik yang  dibahas,  namun  hanya  46  jurnal yang memenuhi kriteria inklusi yang telah ditetapkan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## CAR T Cells menarget reseptor spesific
The  human  epidermal  growth  factor receptor  (HER)  berperan  sentral  dalam patogenesis beberapa kanker pada manusia 20 .  HER  mengatur  pertumbuhan sel,  kelangsungan  hidup,  dan  diferensiasi melalui  jalur  transduksi  sinyal  ganda  dan dalam proliferasi serta diferensiasi seluler. HER  terdiri  dari  empat  macam  yaitu: HER-1, HER-2, HER-3, dan HER-4, juga
disebut  ErbB1,  ErbB2,  ErbB3,  dan ErbB4 21 .  Banyak  peneliti  menunjukkan adanya ekspresi
HER2
selama perkembangan  uveal  melanoma  dan metastasis  berbeda  dengan  melanosit normal.  Peningkatan  ekspresi  HER2 muncul  pada  8  dari  10  pasien  dengan melanoma metastasis 16 .
Chimeric Antigen Receptor T Cells ( CAR T Cells )
Selama beberapa dekade, terapi kanker hanya  mengandalkan  operasi,  kemoterapi, dan  radioterapi.  Dalam  beberapa  tahun terakhir,
konsep imunoterapi
dikembangkan
sebagai
alternatif pengobatan  baru  berbagai  jenis  kanker. Salah  satu  metode  yang  menjanjikan adalah  transfer  sel  T  yang  direkayasa secara  genetika  dengan  mengekspresikan Chimeric  Antigen  Receptor (CAR),  yang
kemudian  disebut  sebagai  CAR  T  Cells (Gambar  1A) 22 .  CAR  T  Cells  tersebut mampu  mengenali  antigen  spesifik  pada permukaan  sel  tumor.  Metode  CAR  T Cells  memanfaatkan  sel  T  yang  diisolasi dari  darah  pasien  atau  donor,  kemudian diaktifkan  dan  direkayasa  secara  genetika untuk  mengekspresikan  reseptor  CAR. Setelah  itu,  sel  T  yang  telah  direkayasa akan  dikembangkan  jumlahnya  secara ex vivo dan  tahap    akhir  menjadi  produk berupa  infus 22 .  CAR  sendiri  merupakan reseptor  sintetis  yang  diekspresikan  oleh sel  T.  Reseptor  CAR  dalam  sel  T  terdiri dari single-chain  variable  fragment
(scFv), domain transmembran, dan bagian intraseluler berupa immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs). Fragmen  scFv  sendiri  bertindak  sebagai tumor-  associated  antigens  receptor (TAAs)  atau  reseptor  antigen  yang diekspresikan oleh sel-sel tumor 23 .
Gambar 1 . A. Proses Rekayasa Genetik CAR T Cells, B. Struktur CAR T-cells 22
CAR  secara  spesifik  dapat  berikatan dengan  antigen  spesifik  permukaan  sel kanker 22 .  Ikatan  yang  dibentuk  antara reseptor  CAR  dan  TAA  ini  akan menghasilkan sinyal transduser pada sel T melalui  reseptor  CD3ξ  atau  Fc.  Proses pengiriman sinyal ini meningkatkan fungsi efektor  sel  T  sebagai  penghancur  sel kanker 24 .
CAR  T  Cells  mampu  mengenali  secara
spesifik  antigen  yang  dipresentasikan  oleh sel  tumor.  Ketika  reseptor  CAR  secara spesifik  mengikat  TAA,  sel  T  akan diaktifkan  melalui  fosforilasi  ITAM sehingga  sel  T  mengeluarkan  sitokin  yang akan terus berproliferasi dan menunjukkan efek sitotoksik pada sel tumor. Immunoreceptor  chimeric secara  aktif menunjukkan  efek  sitotoksik  melalui  2 jalur,  yaitu  (1)  sekresi  granul  perforin  dan
granzyme  dan  (2)  aktivasi  reseptor  sinyal yang  menginduksi  kematian  sel  melalui Fas/Fas-ligand (Fas-L) atau TNF/TNF-R 25 . Tranduksi  sinyal  multireseptor  pada  CAR T-cells meningkatkan amplifikasi, produksi  sitokin,  dan  efek  sitotoksik  pada sel T, dan mengurangi antigen-induced cell death (AICD)  atau  kematian  sel  yang diinduksi  oleh  antigen  pada  studi  dan penelitian secara in vitro maupun in vivo 26 .
Sel T yang dimodifikasi ini meningkatkan  proliferasi  dan  sekresi sitokin dari sel Th1, termasuk IL-2, IFN- γ, IL-12,  dan  TNF 27 . IL-12  yang  diinduksi oleh  CAR    T-cells  menginduksi  aktivitas sel  T  sitotoksik 28 . Sitokin  transgenik  lain seperti IFN-γ yang disekresikan oleh CAR T-cells  berkontribusi  sebagai  antigen independen  yang  akan  menghancurkan  sel tumor 29 .
Gambar 2. Mekanisme Kerja CAR T Cells 22
melalui  mekanisme  pensinyalan  IFN-γR, reseptor IFN-on pada membran sel tumor Kemajuan  terapi  CAR  T  Cells  terlihat dalam keberhasilannya mengatasi leukemia  dan  limfoma,  sehingga  semakin banyak  penelitian  yang  berfokus  pada pengujian  terapi  ini  pada  kasus  tumor seperti UM 30-32 .

## Aplikasi HER2-CAR T Cells pada UM
Sebuah  penelitian  yang  dilakukan  oleh Forsberg er  al berhasil  membuat  desain konstruksi  CAR  T  Cells  HER2- Specific yaitu  CAR  T  Cells  dengan  scFv  yang disesuaikan  terhadap  target  HER2  dalam luciferin  sehingga  mampu  mengkode CD28  transmembrane,  dan  aktivasi CD3zeta.  Percobaan  ini  dilakukan  dengan dosis  tunggal  CAR  T  Cells  sebesar  5x10 5 sel yang diberikan secara infus intravena 16

## PD-1/PD-L1 Penyebab Imunosupresif
Salah  satu  tantangan  utama  efektivitas imunoterapi  CAR  T-cells  pada  GBM berupa  keadaan  imunosupresif  yang menekan kemampuan antitumor inang 33,34 . Sel  tumor  mampu  menginduksi  jalur regulasi  endogen  yang  secara  langsung menghambat  fungsi  efektor  sel  T.  Jalur regulasi  endogen  penghambat  ini  berupa aktivasi PD-1 33 . PD-1 merupakan reseptor yang diekspresikan pada permukaan sel T dan  memainkan  peran  penting  dalam mengatur  sistem  kekebalan  tubuh  dengan menekan  aktivitas  sel  T  efektor.  Pada manusia,  PD-1  ditranskripsikan  oleh  gen pdcd1.  Sebagai  reseptor,  PD-1  memiliki dua ligan yaitu PD-L1 (B7-H1) dan PD-L2 (B7-DC)  yang  ekspresikan    di  permukaan sel  tumor.  Ketika  PD-1  berikatan  dengan ligan-ligannya,  ia  akan  menginduksi terjadinya apoptosis sel T efektor dan sel T regulatori (Treg) 34
Gambar 3. Mekanisme Penekanan Efek Toksisitas Sel T oleh PD-1/PD-L1
37
Dalam microenvironment sel  tumor, PD-1  dan  PD-L1  melakukan  peran  vital dalam  perkembangan    dan  kelangsungan hidup  sel  tumor 35 .  PD-1  memiliki komponen immunoreceptor tyrosine- based  switch  motif (ITSM)  dalam intraselnya  and immunoreceptor  tyrosine- based  inhibitory  motif (ITIM)  di  ujung sitoplasmiknya.  Ikatan  antara  PD-L1 dengan  PD-1  menghasilkan  fosforilasi tirosin  pada  sitoplasma  PD-1  yang selanjutnya  akan  merekrut  SHP-2  (SRC Homology 2 Domain  Containing  protein Tyrosine  Phosphatase 2)  yang  letaknya dekat  dengan  reseptor  sel  T.  Ikatan  PD-1 PD-L1  menghambat aktivasi reseptor sel- sel  kinase  proksimal,  yang  menghasilkan depresi  pada    fosforilasi  ZAP-70  dan dimediasi  oleh  Lck 36 .  Pensinyalan PI3K/Akt  adalah  target  penting  dari  jalur PD-1  seperti  yang  tertera  pada  gambar  5. PD-1  menyebabkan downregulation Ras dan Bcl-xL yang mempengaruhi proliferasi  dan  kelangsungan  hidup  sel. Selain  itu,  peningkatan  BATF  juga  dapat mengganggu  fungsi  efektor  sel  T.  PD-1 juga  berperan  dalam  menghambat  jalur phosphat idylinositol 3-kinase (PI3K)/ Akt yang  selanjutnya  menghambat  aktivasi PI3K. Pensinyalan
PD-1
juga
memengaruhi  metabolisme  seluler  dengan menghambat  glikolisis  dan  mendorong oksidasi  asam  lemak.  Semua  efek  ini menyebabkan  sel  T  tidak  mampu berproliferasi, kehilangan fungsi efektornya,  dan  mengalami  kelelahan hingga menjadi sel yang disfungsi 37 .
Modifikasi  CAR  T  Cells  dengan CRISPR/Cas9  untuk  menargetkan  PD- 1/PD-L1
Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, ikatan PD-1 dan PD-L1 dapat menginduksi  apoptosis  sel  T  dan  dapat menekan  efek  imunitas.  Secara  fisiologi, beberapa  jaringan  manusia  yang  normal dapat  mengekspresikan  PD-L1  dalam jumlah kecil. Sebaliknya, pada saat terjadi tumor  atau  keganasan  protein  PD-L1 diekspresikan secara berlebih pada permukaan  sel  tumornya,  seperti  yang ditunjukkan  pada  imunohistokimia  UM. Proses  ikatan  PD-1  dan  PD-L1  pada  sel tumor  dapat  menjadi  penanda  prognosis yang  buruk  dalam  terapi.  Untuk  itu, diperlukan  modifikasi  rekayasa  genetika untuk  menekan  ekspresi  gen  pdcd-1 dengan  tujuan  supaya  tidak  terbentuk ikatan PD-1/PD-L1.
CRISPR/Cas9  saat  ini  merupakan metode  rekayasa  genetika  termutakhir. Rekayasa  genetika  CRISPR/Cas9  mampu diterapkan  pada  sel  T.    Penelitian  yang dilakukan  oleh  Rupp et.  al menunjukkan silencing gen penghasil PD-1 (pdcd1) pada
CAR T Cells melalui metode
CRISPR/Cas9  mampu  meningkatkan  efek anti-tumor 38 .  Dalam  hal  ini  metode CRISPR/Cas9  PD-1/PD-  L1- Blocking ditargetkan  untuk  mengganggu  produksi PD-1 dalam sel T manusia.
Gen  pdcd-1  yang  akan  menjadi  target terletak di kromosom 2q37 dan mengandung  6  ekson 39 .  Proses  rekayasa gen  pdcd1  dengan  CRISPR/Cas9  dimulai dengan melakukan pengambilan darah dari pasien  atau  donor.  Selanjutnya  dilakukan isolasi  sel  T  limfosit  dari  darah  tersebut. Setelah 7-10 hari akan didapatkan kloning sel  T.  Sel  T  yang  didapat  ini  kemudian dimodifikasi  dengan  CAR  untuk  menjadi CAR  T  Cells,  selanjutnya  dilakukan modifikasi menggunakan CRISPR/Cas9 40 Dalam  metode  CRISPR/Cas9,  terdiri dari  beberapa  komponen  yang  berperan penting,  yaitu guide RNA  (gRNA),  dan endonuklease  cas9 39 .  Penargetan  sekuens DNA pada sel manusia akan dipandu oleh sekuens  pendek  RNA  yang  selanjutnya akan  dilakukan  pemotongan  oleh  DNA endonuklease  melalui Double  Strand Breaks (DSBs)  dengan  efisiensi  dan spesifitas  yang  tinggi 38 .  Komponen  Cas9 sendiri  berfungsi  untuk  mengenali  sekuens spesifik pada double  strand. DNA melalui
pengenalan  oleh  gRNA  pada  sekuens target  di  DNA  sel.  Cas9  memiliki  2 domain utama  yaitu  HNH  yang  berfungsi untuk  memotong  rantai  DNA  yang menjadi  komplemen  dari  sekuens  gRNA dan RuvC yang bertanggung jawab dalam pemotongan rantai DNA nontarget 38,39 .
Masing-masing  komponen  CRISPR/
Cas9  akan  di  masukkan  ke  dalam  vektor agar memudahkan proses transfeksi, dalam hal  ini  vektor  yang  digunakan  berupa lentivirus.  Selanjutnya  gRNA  akan mengkodekan  target  gen  pdcd-1  dan masuk ke dalam DNA sel T melalui proses endositosis. Di dalam nukleus, gen pdcd-1 yang  dibawa  oleh  gRNA  akan  berikatan dengan komplemen gennya. Setelah proses ikatan terjadi, gRNA memicu pemotongan DNA  akibat  aktivitas  protein  Cas9 endonuklease 41 .  Cas9  endonuklease  akan melakukan pemotongan pada basa nukeotida 5′- CGACTGGCCAGGGCGCCTGT-3  dan akan  segera  menghasilkan  DSBs. DSBs yang  dihasilkan  akan  diperbaiki  oleh mekanisme  endogen  seluler  seperti error- prone nonhomologous end
joining (NHEJ) 42,43 .  NHEJ  dapat  memicu terjadinya  insersi  atau  delesi  dan frameshift  mutation kecil  dan  sembarang pada  DNA  yang  terpotong 44 .  Mutasi  ini bersifat  heterogenik  dan  tidak  akan menimbulkan  abnormalitas  yang  berarti pada
DNA sel inang 45
Gambar 4. Mekanisme Penekanan Efek Toksisitas Sel T oleh PD-1/PD-L1 45

## Peningkatan  Potensi  Antitumor  pada CAR T Cells Termodifikasi
Salah  satu  peneltian  yang  dilakukan oleh  Rupp et  al berhasil  melakukan pengujian  efek  peningkatan  potensi antitumor  CAR  T  Cells  yang  telah dimodifikasi menggunakan CRISPR/Cas9. Untuk  menentukan  efek  dari  defisiensi PD-1  pada  fungsi  sel  T,  Rupp et  al menguji  pada  CAR  T  Cells  Anti-D19 dengan reseptor rekayasa invitro gangguan tersebut  dapat  menyebabkan  degradasi pdcd1 yang ditunjukkan
dengan menurunnya pengekspresian PD-1 dibandingkan dengan menurunnya pengekspresian PD-1
dibandingkan dengan kelompok control 46 .
Selain  itu  pada  pengjian  secara in  vivo efek silencing gen  pdcd1  pada  CAR  T
Cells  dilakukan  pada  tikus  yang  diinjeksi secara subkutan. Hasil penelitian secara in vivo ini menunjukkan CRISPR/Cas9  yang menargetkan  lokus  pdcd1  efisien  dalam proses silencing gen  pdcd  1  dalam mengekspresikan PD-1. Hal ini menunjukkan  bahwa  terjadi  peningkatan efektivitas  anti-tumor  pada  percobaan. Hasil  tersbut  membuat    Forsberg et al melakukan penelitian sejenis dengan target HER2 yang berada pada UM. Forsberg et al  mendapat  hasil  serupa  dimana  terjadi penurunan  yang  signifikan  terhadap kelompok kontrol seperti yang ditunjukkanpada  gambar  5 16 .Hasil  ini tentunya  menjadi dasar  teori  baru  tentang potensi  CAR  T  Cells  yang  dimodifikasi dengan CRISPR/Cas9 dalam
meningkatkan  kemampuan  anti-  tumor sebagai upaya eradikasi UM.
Gambar 5. Hasil perbandingan Penggunaan CAR T Cells Her2- Specific dengan terapi konvensional 16

## KESIMPULAN
Sebuah  penelitian  telah  membuktikan keberhasilan CAR T Cells HER2- Specific sebagai  upaya  terapi  UM  yang  mampu melakukan  eliminasi  sel  tumor.  Akan tetapi,  efektivitas  terapi  CAR  T  Cells  ini menimbulkan  keadaan  imunosupresi  yang disebabkan  oleh  peningkatan  ikatan  PD- 1/PD-L1  pada  sel  tumor  sehingga dibutuhkan suatu rekayasa genetika berupa CRISPR/Cas9
untuk mengganggu produksi  PD-1.  Hal  ini  ditunjukkan dengan  efek  yang  signifikan  terhadap penurunan  ekspresi  PD-1  oleh  pdcd-1 sehingga efek imunosupresif yang ditimbulkan oleh terapi CAR T Cells dapat dihilangkan.  Oleh  karena  itu,  HER2- Specific CAR  T  Cells  termodifikasi CRISPR/Cas9 PD-1/PD-L1- Blocking dapat  menjadi  inovasi  terapi  gen  pada penderita  UM,  yang  nantinya  diharapkan dapat  meningkatkan  angka  harapan  hidup pasien.  Akan  tetapi,  hal  ini  masih diperlukan  uji  klinis  lebih  lanjut  untuk membuktikan  efektivitas  CAR  T  Cells HER2- Specific termodifikasi CRISPR/Cas9  PD-1/PD-  L1- Blocking dalam rangka terapi pasien UM.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Kranz  B  A,  Dave  N,Komatsubara  K M,  Marr  B  P,  Carvajal  R  D.  Uveal
Melanoma  :  Epidemiology,  Etiology, and Treatment of Primary Disease.Clinical Ophthalmology. 2017. 11:279-289
2. Singh A D, Turell M E, Topham A K. Uveal  Melanoma  :  trends  in incidence,  treatment,  and  survival. Ophtalmology .2011.118:1881-1885
3. Damato E M, Damato B E. Detection and time to treatment uveal melanoma in United Kingdom : an Evaluation of 2.384
patients. Ophtalmology .2012.119(8):
1582-1589
4. Damato  B.  Progress  in  management of  patients with Uveal Melanoma: the 2012 ashton
lecturer. eye(land) . 2012.26(9).1157-1172
5. Komatsubara  K  M.  Carvajal  R  D. Immunotherapy  for  the  treatment uveal  melanoma  :  current  status  and emerging therapies. Curr
Oncol
Rep. 2017.19:45
6. Park S J. Oh C M. Kim B W. Woo S J.  Coo  H.  Park  K  H.  National  wide incidence  of  ocular  melanoma  in south  korea  by  using  the  National Cancer  Registry  Database  (  1999- 2011). Invest  Opthalmol  Vis  Sci . 2015.56(8):4719-4724
7. Shields  C  L.  Kaliki  S.  Livesey  M. Association of ocular and
oculodermal  melanocytosis  with  the rate  of  uveal  melanoma  metastasis  : analysis  of  7872  consecutive  eye. JAMA  Ophtalmol .  2013.131(8):993-

## 1003
8. Turell M, Saunthararajah Y, Triozi P. Recent  advances  in  prognostication for  uveal  melanoma. Ophtalmol  Int. 2012:45-48
9. Kuk D, Shoushtari A N, Barker C A. Prognosis  of  mucosal,  uveal,  acral, con  acral  cutaneous  and  unknown primary  melanoma  from  the  first metastasis. Oncologist .  2016.  21(7)  : 848-854
10. Blum E S, Yang J, Komatsubara K M, Carvajal R D. Clinical management of uveal  and  conjuctival  melanoma. Oncology .2016. 30:29-48
11. Mariani  P,  Piperno-Neumann  S, Servois  V.  Surgical  management  of liver matastases from uveal melanoma :  16  years  experience  at  the  institute curie. Eur  J  Surg  Oncol .  2009.35: 1192-1197
12. Shields  C  L,  Kaliki  S,  Furuta  M, Fulco  E,  Alarcon  C,  Shields  J  A. American  Joint  committee  on  cancer classification  of  uveal  melanoma  ( anatomic  stage  )  predict  prognosis  in 7.731  patients  :the  2013  zimmerman lecturer. Ophtalmology. 2013.122(6):1180-1186
13. Kaliki  S,  Shields  C  L.  Uveal Melanoma:  relatively  rare  but  deadly cancer. Eye 2016.:1-17
14. Moriarty  J  P,  Borah  B  J,  Foote  R  L,
Pulido  J  S,Shah  N  D.  Cost-
Effectiveness of Proton Beam Therapy for Intraocular Melanoma. Plos One. 2015. 10(5):1-14
15. Morgan  RA,  Johnson  LA,  Davis  JL, Zheng  Z,  Woolard  KD.  Recognition of  Glioma  Stem  Cells  by  Genetically Modified T Cells Targeting EGFRvIII and  Development  of  Adoptive  Cell Therapy for Glioma. H um Gene Ther. 2012. 23:1043-1053
16. Forsberg  E  M  V,  Linberg  M  F, Jespersen  H,  Alsen  S,  Bagge  R  O, Donia  M,  Svane  I  M,  Nilsson  O,  Ny L,  Nilsson  L  M,Nilsson  J  A.  HER2
CAR  T  cells  eradicate  uveal melanoma  and  T  cells  therapy-
resistant human melanoma in Interleukin-2(  IL-2  )  transgenic
NOD/SCID  Il-2  receptor  knockout mice. American Association
for
Cancer Research Journal. 2019
17. Topalian  S  L.  Safety,  Activity,  and immune  correlates  of  Anti-PD-1 antibody  in  cancer. The  New  England Journal  of  Medicine. 2012.366:2443- 2554
18. Su S. CRISPR-Cas9 mediated efficient  PD-1  distruption  on  human primary  T-Cells  from  cancer  patient. Sci rep. 2016
19. Chew  W  L.  Immunity  to  CRISPR- Cas9  and  Cas12  Therapeutic. Wiley interdiscip rev syst boil Med. 2018.10 20. Woodman  S  E.  Metastatic  Uveal Melanoma:  Biology  and  Emerging Treatments. National
Institure of health. 2012 21. Iqbal  N,  Iqbal  N.  Human  Epidermal Growth Factor Receptor  2 (HER2) in Cancers: Overexpression and
Therapeutic  Implications. Molecular biology Int. 2014 22. Yu  S,  Li  A,  Liu  Q,  Li  T.  Chimeric antigen  receptor  T  cells:  a  novel therapy  for  solid  tumors. J  Hematol Oncol. 2017.10(1):78
23. Magee  M  S,  Snook  A  E.  Challenges to chimeric antigen receptor (CAR)-T cell  Therapy  for  cancer. Discov Med. 2014.18(100):265-271
24. Scholler  J,  Brady  T  L,  Binder-Scholl G,  Hwang  W  T.  Decade-long  safety and  function  of  retroviral-modified chimeric  antigen  receptor  T  cells. sci transl Med. 2012.4(132)
25. Park  JH,  Geyer  MB,  Brentjens  RJ.
CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies:  interpreting  clinical outcomes  to  date.  Blood.  2016; 127(26):33120-20.
26. Wang Z, Wu Z, Liu Y, Han W. New development in CAR-T cell therapy. J Hematol Oncol. 2017; 10(1):53.
27. Curran KJ, Seinstra BA, Nikhamin Y, Yeh  R,  et  al.  Enhancing  antitumor
efficacy  of  chimeric  antigen  receptor
T  cells  through  constitutive  CD40L expression. Mol Ther. 2015;
23(4):769-78.
28. Kerkar  SP,  Muranski  P,  Kaiser  A, Boni A, et al. Tumor-specific CD8+ T cells  expressing  IL-12  eradicate established cancers in lymphodepleted hosts. Cancer Res. 2010; 70(17):6725- 6734
29. Textor A, Listopad JJ, Perez C, et al. Efficacy  of  CAR  T-cell  therapy  in large  tumors  relies  upon  stromal targeting by IFNγ. Cancer Res. 2014; 74(23):6796-805.
30. L.  Porter,  B.L.  Levine,  M.  Kalos,A Bagg,  C.H.  June,  Chimeric  antigen receptor  modified  T  cells  in  chronic lymphoid  leukemia,  N.  Engl.  J.  Med. 2011. 365 (8). 725–733.
31. J.N. Kochenderfer, W.H. Wilson, J.E. Janik,  M.E.  Dudley,  M.  Stetler- Stevenson,  S.A.  Feldman,  et  al., Eradication  of  B-lineage  cells  and regression  of  lymphoma  in  a  patient treated  with  autologous  T  cells genetically  engineered  to  recognize CD19, Blood 11. 2010. 4099–4102.
32. Riegler  LL,  Jones  GP,  Lee  DW. Current approaches in the grading and management  of  cytokine  release syndrome  after  chimeric  antigen receptor  T-cell  therapy.  Therapeutics and  Clinical  Risk  Management. 2019:15 323–335 .
33. Topalian  SL,  Hodi  FS,  Brahmer  JR, Gettinger  SN,  Smith  DC,  McDermott DF,  Powderly  JD,  Carvajal  RD, Sosman  JA,  Atkins  MB,  Leming  PD, Spigel  DR,  Antonia  SJ,  et  al.  Safety, activity,  and  immune  correlates  of anti-PD-1 antibody in cancer. N Engl J Med. 2012; 366: 2443-54.
34. Chen  DS,  Irving  BA,  Hodi  FS. Molecular  pathways:  next  generation immunotherapy-inhibiting programmed death ligand
1 and  programmed  death-1.  Clin Cancer Res. 2012; 18: 6580-7.
35. Patsoukis N, Brown J, Petkova V, Liu
F,  Li  L,  Boussiotis  VA.  Selective effects  of  PD-1  on  Akt  and  Ras pathways regulate molecular
components  of  the  cell  cycle  and inhibit T cell proliferation. Sci Signal. 2012; 5: ra46.
36. Sheppard  K  A,  Fitz  L  J,  Lee  J  M, Benander  C,  George  J  A,  Wooters  J, Qiu Y, Jussif J M, Carter L, Wood C R, Chaudhary D. PD-1 inhibits T- cell receptor  induced  phosphorylation  of the  ZAP70/CD3zeta  signalosome  and downstream  signaling  to  PKCtheta. FEBS Lett. 2004; 574: 37-41
37. Parry  RV,  Chemnitz  JM,  Frauwirth KA,  Lanfranco  AR,  Braunstein  I, Kobayashi SV, Linsley PS, Thompson CB,  Riley  JL.  CTLA-4  and  PD-1 receptors  inhibit  T-cell  activation  by distinct  mechanisms.  Mol  Cell  Biol. 2015; 25: 9543-53.
38. Hu  J,  Sun  C,  Bernatchez  C,  et  al.  T cell  homing  therapy  for  reducing regulatory  T  cells  and  preserving effector  T  cell  function  in  large  solid tumors . Clin Cancer Res. 2018.
39. Oestreich  KJ,  Yoon  H,  Ahmed  R, Boss  JM.  NFATc1  regulates  PD-1 expression  upon  T  cell  activation.  J Immunol. 2008; 181: 4832-9.
40. Fuguo  jiang  and  Jennifer  A.  Doudna.
CRISPR/Cas9 Structures and Mechanisms.  2017.  Annu.  Rev. Biophys. 46:505-29.
41. Garneau JE, Dupuis M` E, Villion M, Romero  DA,  Barrangou  R,  et  al. 2010.  The  CRISPR/Cas  bacterial immune system cleaves bacteriophage and  plasmid DNA. Nature 468(7320):67–71
42. Gasiunas  G,  Barrangou  R,  Horvath P,  Siksnys  V.  2012.  Cas9–crRNA ribonucleoprotein  complex  medi- ates  specific  DNA  cleavage  for adaptive  immunity  in  bacteria. PNAS 109(39):E2579–86
43. Jinek  M,  Chylinski  K,  Fonfara  I,
Hauer  M,  Doudna  JA,  Charpentier E. 2012. A programmable dualRNA– guided DNA
endonuclease  in  adaptive  bacterial immunity. Science 337(6096):816– 21
44. Chen H, Choi J, Bailey S. 2014. Cut site  selection  by  the  two  nuclease domains  of  the  Cas9  RNA- guidedendonuclease. J.  Biol.  Chem. 289(19):13284–94
45. Zhang  C,  Peng  Y,  Hublitz  P. Genetic  abrogation  of  immune checkpoints in antigen-specific cytotoxic  T-  lymphocyte  as  a potential  alternative  to  blockade immunotherapy. Scientific  Repors . 2018. 8:5549.