## BIOACCUMULATION OF IRON (Fe) IN Bacillus JA1,
Sporosarcina JA4, AND Lysinibacillus JB2
Afianita Dian Rahmawati, Enny Zulaika*
Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Analitika Data, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Teknik Kimia, Keputih, Kec. Sukolilo, Kota Surabaya, Jawa Timur *Email: ennyzulaika123@gmail.com ; enny@bio.its.ac.id

## ABSTRACT
Carbonatogenic  bacteria  can  produce  calcium  carbonate  (CaCO3).  Steel  reinforcement  of concrete  is  mainly  made  of  a  mixture  of  carbon  (C)  and  ferrous  (Fe)  elements.  Fe  is classified as heavy metal, when in high concentrations it is toxic to bacteria. The purpose of this  study  was  to  determine  the  bioaccumulation  of  carbonatogenic  bacteria  to  Fe.  The isolates used in this study were Bacillus JA1, Sporosarcina JA4, and Lysinibacillus JB2. All isolates were subcultured on nutrient agar slant media. Cultures were made on minimal salt medium:  nutrient  broth  (95%:5%)  with  24  hours  incubation.  Bioaccumulation  test  using minimal  salt  medium:  nutrient  broth  (95%:5%)  containing  ferrous  5  ppm  and  10  ppm. Accumulated ferrous concentration was measured using atomic absorption spectrophotometry. The result of this research is that the bioaccumulation of ferrous by the isolates after 2 hours of incubation is greater than 1 hour of incubation. Bacillus JA1 has the highest  bioaccumulation  ability  which  was  9,19  ppm  after  2  hours  exposure  of  10  ppm ferrous and its ferrous bioaccumulation efficiency was 91,85%.
Keywords: Bioaccumulation; Carbonatogenic; Ferrous; MSM-NB.

## PENDAHULUAN
Pencemaran  logam  berat  merupakan permasalahan  lingkungan  yang  sampai saat  masih  membutuhkan  penangangan rehabilitasi  yang  serius  (Tangahu  et  al, 2011).  Logam  berat  memiliki  berat  lebih dari  5  g/cm 3 (Kurniawan  dan  Mustikasari, 2019),  pada  konsentrasi  tinggi,  logam berat  memiliki  efek  toksik  bagi  organisme hidup, termasuk bakteri (Igiri et al., 2018). Di  alam    terdapat  lebih  60  unsur  yang termasuk  logam  berat,  salah  satunya adalah  Fe  atau  besi    (Kurniawan  dan Mustikasari,  2019).  Fe  bersifat  padat, korosif, memiliki titik lebur rendah dan 5% jumlah total di alam merupakan komponen kerak  bumi.  Fe  termasuk  logam  berat esensial,  yaitu  dalam  jumlah  tertentu dibutuhkan  oleh  tubuh  dan  akan  bersifat racun apabila dikonsumsi secara berlebihan (Irhamni et al., 2017).
Pemulihan kontaminan logam berat dapat dilakukan
dengan mekanisme bioremediasi, yaitu suatu metode
pemulihan  menggunakan  agen  hayati untuk  menghilangkan  atau  menurunkan kadar  logam  berat  tersebut  (Priadie, 2012). Bakteri dapat dimanfaatkan sebagai  agen  hayati  untuk  melakukan bioremediasi  sebab  bakteri  akan  mencari cara untuk  bertahan  hidup,  salah  satunya dengan  mekanisme  bioakumulasi  dan atau  bioadsorbsi  (Irawati  et  al.,  2017). Bakteri  resistensi  logam  berat  termasuk logam  Fe  dapat  melakukan  bioakumulasi (Kurniawan  dan  Ekowati,  2016),  logam berat  sebagai  penerima  elekron  pada mekanisme  respirasi  sel.  Selain  itu, bakteri  dapat  memproduksi  polisakarida ekstraselular  yang  berfungsi  sebagai tempat bioadsorsi atau membentuk metalotheonein  yaitu  suatu  protein  yang akan mengkelat logam untuk detoksifikasi dan regulasi ion logam di dalam sel (Sonia dan  Arashiro,  2018).  Penelitian  bertujuan untuk  mengetahui  kemampuan  bakteri Bacillus JA1, Lysinibacillus JB2,  dan Sporosarcina JA4  mengakumulasi  logam besi (Fe).

## METODE PENELITIAN

## Subkultur Pada Nutrient Agar Miring
Komposisi  media  nutrient  agar  (NA)  per liter  adalah  28  g  NA powder Himedia ® , dilarutkan  dengan  akuades  sampai  1000 ml,  disterilkan  menggunakan  autoklaf (121°C,  15  menit).  Sebanyak  10  ml dituang  ke  dalam  tabung  reaksi  secara aseptis  dan  diletakkan  dengan  posisi miring  supaya  membentuk  NA miring . Didiamkan  24  jam  untuk  melihat  apakah media  terkontaminasi  atau  tidak  (Harley dan  Prescott,  2002).  Isolat Bacillus JA1, Sporosarcina JA4,  dan Lysinibacillus JB2 diambil  satu  ose  dan  diinokulasikan secara  aseptik  pada  media  NA  miring dengan  metode  goresan  kontinyu  (Basha et  al.,  2018).  Kultur  diinkubasi  pada  suhu ruang  selama  24  jam,  keberhasilan subkultur  ditandai  dengan  adanya  koloni yang  tumbuh  disepanjang  goresan  jarum ose (Harley dan Prescott, 2002).

## Pembuatan Larutan Stok Logam Fe
Logam Fe yang digunakan adalah FeCl 3 .6H 2 O.  Larutan  stok  dibuat  dengan konsentrasi 500 ppm (mg/L). Sebanyak 50 mg  FeCl 3 .6H 2 O  dimasukkan  ke  dalam labu  ukur  dan  ditambah  akuades  sampai dengan  100  ml,  disterilisasi  dengan autoclave (121 o C, 15 menit). Larutan stok logam Fe disimpan di botol gelap.

## Penentuan Umur Perlakuan
Umur kultur untuk perlakuan bioakumulasi berpedoman  pada  kurva  pertumbuhan tanpa  pemaparan  logam  Fe  di  media minimal salt medium: nutrient broth 95% : 5% (MSM-NB)  yaitu ketika kultur berumur 24  jam.  MSM  dibuat  dengan  komposisi
(per  liter):  NaCl  10  g,  Na 2 HPO 4 5  g, KH 2 PO 4 2  g,  MgSO 4 .7H 2 O  0,2  g; disterilisasi  dengan  autoclave  (121 o C,  15 menit) (Prabhakaran et al., 2014).
Sebanyak  10  ose  isolat  diinokulasikan secara  aseptis  ke  dalam  50  ml  medium MSM-NB  dan  diinkubasi  selama  24  jam pada  suhu  ruang  di  atas  rotary  shaker (100  rpm).  Kultur  starter  sebanyak  20  ml diinokulasilan  ke dalam  90  ml MSM-NB  + FeCl 3 .6H 2 O dengan konsentrasi Fe 5 ppm
dan 10 ppm. Sebagai kontrol adalah kultur tanpa  logam  Fe.  Kultur  yang  telah terpapar Fe diinkubasi selama 1 jam dan 2 jam  di  atas  rotary  shacker  (100  rpm), dilakukan  secara  duplo  (Pamungkas  dan Zulaika, 2015)

## Bioakumulasi
Kultur yang telah dipapar logam Fe sesuai waktu  pemaparan  ditambah  10  tetes HNO 3 ,  dipanaskan  100ºC  selama  10 menit.  Dilakukan  filtrasi  menggunakan kertas whatman nomor 42 untuk memisahkan  bakteri  dengan  filtratnya.. Konsentrasi  Fe  diukur  dengan  AAS ( Atomic  Absorption  Spectrophotometry ), panjang  gelombang  248,3  nm  (Farisna dan Zulaika,  2015). Konsentrasi Fe pada filtrat  merupakan  konsentrasi  logam  Fe sisa  yang  tidak  diakumulasi  oleh  bakteri. Konsentrasi yang diakumulasi bakteri dan efisien  akumulasinya  dihitung  dengan formula:
R = K 0 – K S
E = (R/K 0 ) x 100%
Keterangan : R  : Konsentrasi Fe yang diakumulasi bakteri E  : Efisiensi bioakumulasi Fe K 0 : Konsentrasi awal Fe tanpa bakteri K S : Konsentrasi akhir Fe pada filtrat
Konsentrasi  bioakumulasi  Fe  pada  isolat dan efesiensinya dianalisis dengan Analysis  of  Varian (Anova) two-way ,  taraf kepercayaan α: 5%. Adanya perbedaan di uji  signifikansinya  dengan  uji  beda  nyata terkecil (BNT).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Kultur Starter
Starter untuk  bioakumulasi  logam  Fe mengacu  pola  pertumbuhan  pada  fase eksponensial  di  media  MSM  :  NB  (95%  : 5%)  sampai  24  jam,  yang  dicapai  pada OD  0,6  -  0,7  (Gambar  1).  Berdasarkan Prescott  et  al.,  (2008),  bakteri  akan membelah  dengan  laju  yang  konstan  dan
massa  menjadi  dua  kali  lipat  dengan  laju yang sama ketika memasuki fase eksponensial.  Selain  itu,  enzim  dan senyawa metabolit yang dibutuhkan untuk pembelahan  sel  sudah  tersedia  sehingga pembelahan  sel  dapat  berjalan  secara maksimal.
Gambar 1. Kurva pertumbuhan isolat pada media MSM-NB (95% : 5%)
Berdasarkan penelitian Farisna dan Zulaika,  (2015),  fase  eksponensial  starter untuk bioakumulasi logam Fe berada pada jam  ke  12  setelah  inkubasi.  Hal  tersebut terjadi  karena  media  pertumbuhan  isolat yang  digunakan  adalah  NB  saja,  dimana media  tersebut  kaya  nutrisi  karena mengandung  pepton  dan  ekstrak  daging sebagai sumber karbon bagi pertumbuhan
isolat.  Namun,  medium  NB  yang  memiliki kandungan  pepton  dapat  membiaskan bioakumulasi  logam  Fe  pada  bakteri sebagai  bioakumulator  logam,  karena gugus  fungsi  amina  dan  karboksil  pada pepton  akan  berikatan  dengan  Fe, sehingga  bioakumulasi  oleh  bakteri  tidak berjalan  optimal  (Zhou  et  al.,  2010).  Hal tersebut dibuktikan pada penelitian Farisna  dan  Zulaika  (2015), terjadi penurunan konsentrasi Fe pada media NB sebelum  diinokulasi  bakteri,  yaitu  dari  50 ppm menjadi 9,5 ppm.

## Bioakumulasi
Isolat Bacillus JA1, Sporosarcina JA4, dan Lysinibacillus JB2  dapat  mengakumulasi logam  Fe.  Bioakumulasi  Fe  oleh  isolat setelah  2  jam  inkubasi  lebih  besar daripada 1 jam inkubasi. Terdapat perbedaan  bioakumulasi  Fe  dan  efisiensi bioakumulasi pada isolat terhadap konsentrasi Fe 5 ppm dan 10 ppm kecuali pada Lysinibacillus JB2. Sedangkan waktu inkubasi  1  jam  dan  2  jam,  tidak  berbeda nyata  antar  isolat  terhadap  bioakumulasi Fe dan efisiensi bioakumulasinya. Bioakumulasi  Fe  yang  tertinggi  terdapat pada Bacillus JA1,  yaitu  9,19  ppm  pada pemaparan 10 ppm dan efisiensi bioakumulasinya 91,85 % (Tabel 1).
Tabel 1. Bioakumulasi Fe dan efisiensi bioakumulasi oleh isolat
No Isolat Pemaparan Fe (ppm) Konsentrasi Bioakumulasi (ppm) Efisiensi Bioakumulasi (%) 1 Jam 2 Jam 1 Jam 2 Jam 1. Bacillus JA1 5 4,50 a ± 0,54 4,30 a ± 0,13 89,90 ± 10,89 85,90 ± 2,69 10 8,59 b ± 0,40 9,19 b ± 0,21 85,90 ± 3,96 91,85 ± 2,05 2. Sporosarcina JA4 5 4,24 a ± 0,20 4,23 a ± 0,11 84,80 ± 3,96 84,60 ± 2,26 10 7,93 b ± 0,95 8,93 b ± 0,18 79,30 ± 9,48 89,25 ± 1,77 3. Lysinibacillus JB2 5 4,35 a ± 0,10 4,38 a ± 0,06 87,00 a ± 1,98 87,60 a ± 1,13 10 7,88 b ± 0,03 8,39 b ± 0,30 78,80 b ± 0,28 83,90 b ± 2,97 *Angka yang didampingi huruf berbeda pada kolom yang sama, berbeda signifikan (p < 0,05).
Pada  penelitian  Farisna  dan  Zulaika, (2015), diperoleh bioakumulasi Fe tertinggi  pada Bacillus DA11,  yaitu  27,97
ppm  pada  pemaparan  Fe  33,6  ppm  dan efisiensi bioakumulasi
83,25%.
Berdasarkan  penelitian  Pamungkas  dan Zulaika  (2015),  perbedaan  konsentrasi pemaparan  Fe  mempengaruhi  jumlah  Fe
yang  diakumulasi  oleh  masing-masing isolat.  Hal  tersebut  berkaitan  dengan perbedaan  kebutuhan  Fe  masing-masing isolat.  Bakteri  membutuhkan  ion  logam supaya  proses  aktivasi  seluler,  seperti transport  elektron  selama  oksidasi  dapat berjalan efisien (Cappucino dan Sherman, 2014).
Bacillus JA1, Sporosarcina JA4,  dan Lysinibacillus JB2  merupakan  bakteri Gram  positif.  Gugus  karboksil  pada dinding  sel  bakteri  Gram  positif  berperan sebagai  tempat  pengikatan  kation  logam di  permukaan  sel  (Fomina  dan  Gadd, 2014). Beberapa bakteri mampu
mengeluarkan Extracellular
Polymeric Substances (EPS)  berupa  polisakarida yang disekresikan keluar dinding sel, pada gugus  hidoksilnya  dapat  mengikat  Fe. Selain itu, beberapa bakteri dapat mensintesis  metallothionein,  yaitu  suatu protein sebagai respons terhadap peningkatan  paparan  logam  (Das  et  al., 2016).  Mekanisme  yang  lain  adalah bakteri mempresipitasikan Fe untuk menurunkan konsentrasinya menjadi kompleks yang tidak larut sehingga dapat mengurangi bioavailabilitas dan toksisitasnya.  Jalur  mekanisme  logam  Fe di dalam sel bakteri supaya tidak meracuni sel  diatur  oleh  senyawa  yang  disebut siderofor (Saha et al., 2016). Bioakumulasi logam oleh bakteri dapat dipengaruhi oleh temperatur,  pH,  biomassa,  kemampuan toleransi  bakteri  terhadap  logam,  dan waktu  paparan  logam  (Shaaban  et  al., 2015).

## KESIMPULAN
Semua  isolat  resisten  terhadap  Fe  dan dapat  mengakumulasi  Fe.  Bioakumulasi setelah  2  jam  inkubasi  lebih  besar daripada  1  jam  inkubasi . Isolat Bacillus JA1 mempunyai kemampuan bioakumulasi  Fe  tertinggi,  yaitu  9,19  ppm pada  pemaparan  10  ppm  dengan  waktu inkubasi  2  jam  dan efisiensi bioakumulasi 91,85 %.

## DAFTAR PUSTAKA
Basha,  S.,  Lingamgunta,  L.  K.,  Kannali, J.,Gajula,  S.  K.,  Bandikari,  R.,
Dasari,  S.,  &  Balaji,  V.  K.  (2018). Subsurface endospore-forming
bacteria possess bio-sealant
properties. Scientific  reports, 8:  1- 13.
Cappucino,  J.  G.,  &  Sherman,  N.  (2014). Microbiology  a Laboratory  Manual.
10th edition . USA: Pearson Education, Inc.
Das,  S.,  Dash,  H.  R.,  Chakraborty,  J.
(2016). Genetic basis and importance of metal resistant genes in bacteria for bioremediation  of  contaminated environments  with  toxic  metal pollutants. Appl Microbiol Biotechnol , 100: 2967-2984.
Farisna,  S.  T.,  &  Zulaika,  E.  (2015). Potensi Bacillus Sebagai  Bakteri Siderofor  dan  Bioremoval  Logam Besi  (Fe). Tugas  Akhir .  Jurusan Biologi.  Fakultas  Matematika  dan Ilmu  Pengetahuan  Alam.  Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya. Fomina,  M.,  &  Gadd,  G.  M.  (2014). Biosorption:  current  perspectives on concept, definition, and application. Bioresour Technol , 160: 3-14. Harley,  J.  P.,  &  Prescott,  L.  M.  (2002). Laboratory Exercises in Microbiology,  Fifth  Edition. USA:
The McGraw-Hill Companies.
Igiri,  B.  E.,  Okoduwa,  S.  I.  R.,  Idoko,  G. O.,  Akabuogo,  E.  P.,  Adeyi,  A.  O., & Ejiogu, I.  K. (2018). Toxicity and Bioremediation  of  Heavy  Metals
Contaminated Ecosystem from Tannery  Wastewater:  A  Review. Journal of Toxicology, 1-16.
Irawati,  W.,  Parhusip,  A.  J.  N.,  Christian, S.,  &  Yuwono,  T.  (2017).  The potential  capability  of  bacteria  and yeast strains isolated from Rungkut Industrial  Sewage  in  Indonesia  as bio  accumulators  and  biosorbents of  copper. Biodiversitas ,  18(3): 971-977.
Irhamni.,  Pandia,  S.,  Purba,  E.,  &  Hasan, W.  (2017).  Serapan  Logam  Berat Esensial  dan  Non  Esensial  pada Air  Lindi  TPA  Kota  Banda  Aceh dalam  Mewujudkan  Pembangunan Berkelanjutan. Jurnal Serambi
Engineering , 2(3): 134 – 140.
Kurniawan,  A.,  &  Ekowati,  N.  (2016).
Review: Mikoremediasi Logam
Berat. Jurnal Bioteknologi &
Biosains Indonesia , 3(1): 36-45.
,  &  Mustikasari,  D.  (2019). Review: Mekanisme Akumulasi Logam  Berat  Di  Ekosistem  Pasca tambang Timah. Jurnal Ilmu Lingkungan , 17(3): 408-415. Pamungkas,  A.,  &  Zulaika,  E.  (2015). Viabilitas Azotobacter pada Medium  yang  Terpapar  Logam Besi  (Fe). Jurnal  Sains  dan  Seni
ITS , 4(1): 2337-3520.
Prabhakaran, P., Sureshbabu, A.,
Rajakumar, S., & Ayyasamy, P. M. (2014).  Bioremediation  of  Crude
Oil  in  Synthetic  Mineral  Salts
Medium  Enriched  with  Aerobic
Bacterial  Consortium. International Journal  of  Innovative  Research  in Science, Engineering, and Technology , 3(2): 1-7.
Prescott,  L.  M.,  Harley,  J.  P.,  &  Klein,  D.
A.  (2008).  Microbiology,  Seventh Edition. New York: McGraw-Hill.
Priadie,  B.  (2012).  Teknik  bioremediasi sebagai  alternatif  dalam  upaya pengendalian pencemaran air. Jurnal  Ilmu  Lingkungan ,  10(1):  38- 48.
Saha,  M.,  Sarkar,  S.,  Sarkar,  B.,  Kumar,
B., Bhattacharjee, S., & Tribedi, P. (2016). Microbial siderophores and
their potential applications: a review. Environ Sci Pollut Res , 23: 3984 –3999.
Shaaban,  M.  T.,  Ibrahim,  H.  A.  H.,
Abouhend, A. S., &  El-Moselhy, K. M.  (2015).  Removal  of  Heavy Metals  from  Aqueous  Solutions Using  Multi-Metals  and  Antibiotics Resistant  Bacterium  Isolated  from The  Red  Sea,  Egypt. American Journal of Microbiological Research, 3(3): 93-106. Sonia,  M.,  &  Arashiro,  T.  (2018).  Lead absorption mechanisms in bacteria as strategies for lead bioremediation. Applied Microbiology and Biotechnology , 1-
8.
Tangahu, B. V., Abdullah, S. R. S.,  Basri, H.,  Idris,  M.,  Anuar,  N.,  & Mukhlisin,  M.  (2011).  A  review  on heavy  metals  (As,  Pb,  and  Hg) uptake by plants through phytoremediation. Int J Chem Eng , 1 -31.
Zhou,  J.  C.,  Wang,  X.,  Xue,  M.,  Xu,  Z., Hamasaki, T., Yang, Y., Wang, K., & Dunn, B. (2010). Characterization of gold nanoparticle binding to microtubule filaments. Materials  Science  and Engineering , 30: 20 –26.