pISSN : 2355-9942, eISSN:2656-792X Terakreditasi Nasional, Dirjen Pendidikan Tinggi, Riset, dan Teknologi
Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset dan Teknologi RI S.K. No. 105/E/KPT/2022 Received: 13 Agustus 2022, Accepted: 6 Juni 2023 Published online: 22 Juni 2023 DOI: https://doi.org/10.35508/nukleus.v10i1.7948 https://ejurnal.undana.ac.id/index.php/nukleus/article/view/7948

## PENGARUH PENAMBAHAN BEBERAPA LEVEL GLUTATHIONE DALAM PENGENCER AIR KELAPA KUNING TELUR TERHADAP KUALITAS SEMEN SAPI ANGUS
(The effects of adding some levels of glutathione in egg yolk coconut water on the quality of angus bull semen)
Desiderius Salvator Agung 1 , Aloysius Marawali 2* , Kirenius Uly 2 , F.M.S. Telupere 2 1 Mahasiswa Program Studi Peternakan, Fakultas Peternakan, Kelautan dan Perikanan, Universitas Nusa Cendana
2 Fakultas Peternakan, Kelautan dan Perikanan, Universitas Nusa Cendana, Jl. Adisucipto Penfui Kota Pos 104 Kupang 8500 Telp (038) 881580. Fax (0380) 881674
* Correspondent author, email: aloysiusmarawali21@gmail.com

## ABSTRAK
Tujuan  penelitian  untuk  mengetahui  pengaruh  penambahan  beberapa  level  glutahione  dalam  pengencer  air kelapa kuning telur (AK-KT) terhadap kualitas semen sapi angus selama penyimpanan. Materi yang digunakan adalah  semen  segar  dari  satu  ekor  sapi  angus  berumur  3  tahun  yang  memiliki  kualitas  baik.  Semen  yang berkualitas baik diencerkan dengan pengencer AK-KT dengan penambahan glutathione pada level : 0 % (P0), 0,1% (P1), 0,2% (P2), dan 0,3% (P3). Setelah pengenceran semen disimpan pada suhu 3-5oC. Evaluasi semen pasca pengenceran dilakukan setiap 24 jam penyimpanan terhadap motilitas, viabilitas, abnormalitas dan daya tahan  hidup  spermatozoa.  Data  penelitian  dianalisis  dengan  sidik  ragam  dan  dilanjutkan  dengan  uji  Duncan. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  penambahan  level  glutathione  0,2%  (P2)  mempunyai  kualitas  terbaik (P<0,05)  dibandingkan  dengan  perlakuan  lainnya,  yaitu  dengan  motilitas  (47,00±2,09%),  viabilitas (57,64±3,08%),  abnormalitas  (6,20±1,29%)  dan  daya  tahan  hidup  (4,00±0,00  hari).  Disimpulkan  bahwa penambahan level glutathione 0,2%  dalam pengencer AK-KT memberikan pengaruh terbaik dan lebih efektif dalam mempertahankan kualitas semen cair sapi angus hingga hari ke empat penyimpanan.
Kata-kata kunci: air kelapa, kuning telur, glutathione, semen, sapi angus

## ABSTRACT
The purpose of this study was to determine the effect of adding several levels of glutathione in egg yolk coconut water dilution (EY-CW) on the quality of angus bull semen during storage. The material used is fresh semen from one 3 years old angus bull that has good quality. Good quality semen was dilut with EY-CW diluent with the addition of glutathione at the levels of 0% (T0), 0.1% (T1), 0.2% (T2), and 0.3% (T3). After dilution, the semen stored at 3-5oC. Evaluation of semen after dilution was carried out every 24 hours of storage for motility, viability, abnormalities and survival of spermatozoa. The research data were analyzed with  analysis of variance and continued with the Duncan test.  The results showed that the addition of 0.2% glutathione level (T2) had the best quality (P<0.05) compared to other treatments, namely motility (47.00±2.09%), viability (57.64±3.08%), abnormality  (6.20±1.29%)  and  survival  (4.00±0.00  days). It  was  concluded  that  the  addition  of  a  glutathione level of 0.2% in the AK-KT diluent provided the best and more effective influence in maintaining the quality of angus bull liquid semen until the fourth day of storage.
Keywords: coconut water, egg yolk, glutathione, semen, angus  bull

## PENDAHULUAN
Teknologi  inseminasi  buatan  (IB)  telah secara luas dilakukan, tetapi tingkat keberhasilan kebuntingannya  masih  tergantung  pada  kualitas semen,  disamping  faktor  manusia  seperti
peternak dan inseminator. Upaya mempertahankan  kualitas  semen  dilakukan pengenceran  semen  menggunakan  beberapa bahan pengencer. Beberapa masalah
pengenceran  dan  terutama  penyimpanan  semen sudah  dapat  diatasi  dengan  melakukan pembekuan semen. Namun selama penerapannya,  ada  beberapa  kendala  dalam penggunaan semen beku antara lain keterbatasan perrsediaan  nitrogen  cair  serta  mahalnya prasarana  penyimpanan  semen  beku.  Alternatif untuk  mengatasi  kendala  tersebut  adalah penggunaan semen cair.
Kualitas semen cair ditentukan oleh bahan pengencer  yang  digunakan.  Ada  beberapa  jenis bahan  pengencer  semen  alami  (organik)  yang bisa  dijadikan  bahan  pengencer  alternatif  salah satunya  adalah  air  kelapa  muda.  Air  kelapa muda memiliki kandungan karbohidrat, mineral, vitamin  dan  protein.  Hal  ini  menyebabkan  air kelapa  muda  banyak  digunakan  sebagai pengencer  semen.  Kandungan  bahan-bahan  di dalam  air  kelapa  muda  dapat  menyediakan kebutuhan  fisik  serta  kimiawi  spermatozoa sehingga  kualitas  spermatozoa  tetap  terjaga (Sulabda  dan  Puja,  2010).  Air  kelapa    mampu memberikan  sumber  energi  untuk  spermatozoa (Mere, 2016), akan tetapi air kelapa tidak dapat melindungi  spermatozoa  pada  temperatur rendah,  sehingga  butuh  penambahan  kuning telur  yang  berfungsi  selaku  anti  kejutan  suhu dingin (Pillet et al ., 2011).
Konsentrasi spermatozoa untuk satu dosis semen  cair  adalah  5  juta  spermatozoa dibandingkan  dengan  semen  beku  dengan konsentrasi  25-30  juta  spermatozoa  per  dosis, sehingga  penggunaan  semen  cair  lebih  banyak ternak  betina  yang  dapat  diinseminasi  per ejakulasi.  Daya  fertilitas  semen  cair  sedikit menurun  dengan  bertambah  lamanya  waktu penyimpanan  (Triwulanningsih et  al .,  2003). Situmorang et  al .  (1999)  menyatakan  bahwa
tingkat  kebuntingan  menurun  setelah  lama penyimpanan  semen  cair  lebih  dari  empat  hari. Salah  satu  penyebabnya  ialah  adanya  radikal bebas dalam jumlah yang berlebihan yang dapat merusak  membran  plasma  spermatozoa.  Selain penambahan bahan pengencer guna mendukung kehidupan spermatozoa, salah satu metode yang dapat dilakukan dalam mempertahankan kualitas semen  cair  adalah  dengan  menambahkan antioksidan  pada  bahan  pengencer.  Antioksidan adalah senyawa yang dapat memperlambat atau mencegah  terjadinya  kerusakan  membran plasma  spermatozoa  yang  disebabkan  oleh radikal  bebas  dengan  cara  menangkal  aktivitas radikal  bebas  atau  memutus  rantai  reaksi oksidasi  yang  disebabkan  oleh  radikal  bebas (Miryanti et  al .,  2011).  Glutathione  merupakan salah  satu  jenis  antioksidan  yang  dapat digunakan.Triwulanningsih et al . (2009) menyatakan  penambahan  glutathione  dalam pengencer  semen  dapat  mengurangi  kerusakan pada membran plasma spermatozoa semen cair, efek racun yang disebabkan oleh adanya reactive oxygen  species  (ROS)  yang  berakibat  pada rendahnya  fertilitas.  Penambahan  glutathione sebagai  antioksidan  ke  dalam  pengencer  air kelapa  muda  diharapkan  dapat  mengurangi kerusakan membran plasma spermatozoa akibat radikal  bebas,  sehingga  dapat  memperkecil penurunan  kualitas  spermatozoa  baik  viabilitas, motilitas  dan  daya  tahan  hidup  semen  cair. Penambahan  glutathione  ke  dalam  pengencer semen  telah  dilaporkan  oleh  Rizal  (2004)  pada semen  cair  domba  garut.  Tujuan  penelitian  ini adalah untuk mengetahui pengaruh penambahan beberapa  level  glutahione  dalam  pengencer  air kelapa  kuning  telur  (AK-KT)  terhadap  kualitas semen sapi angus selama penyimpanan.

## METODE PENELITIAN

## Materi Penelitian
Materi  penelitian  ini  adalah  semen  segar yang ditampung dari satu ekor sapi angus  yang telah  mencapai  dewasa  kelamin  dengan  umur ternak  sapi  adalah  3  tahun  dan  dalam  kondisi sehat.  Sapi  tersebut  dipelihara  dalam  kandang individu  yang  dilengkapi  dengan  tempat  pakan dan  minum.  Pakan  hijauan  diberikan  10%  dari berat badan dan konsentrat 0,5 kg/ekor/hari dan air minum diberikan secara ad libitum.

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  metode eksperimen  dengan  rancangan  acak  lengkap
(RAL)  dengan  4  perlakuan  dan  5  ulangan. Perlakuan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah : P0: AK-KT 100%,  P1: AK-KT 100% + G 0,1%, P2: AK-KT  100% + G 0,2%,  dan P3 : AK-KT  100% + G 0,3%.

## Tahap Persiapan Pengencer
Persiapan Kuning Telur. Kerabang telur dibersihkan dengan menggunakan kapas beralkohol  70%.  Setelah  itu  telur  dipecahkan pada bagian lancipnya atau sudut yang runcing. Tuangkan  semua  putih  telur  dan  pisahkan  dari kuningnya. Kuning telur yang masih terbungkus dengan  selaput  vitelinnya  diletakkan  di  atas
kertas  saring,  kemudian  dimiringkan  berputar sehingga semua putih telur dapat terserap habis. Pecahkan  selaput  vitelinnya,  masukkan  kuning telur  ke  dalam  gelas  ukur.  Kuning  telur  siap digunakan sesuai dengan kebutuhan.
Persiapan  Air  Kelapa .  Air  kelapa  yang digunakan  merupakan  air  dari  buah  kelapa muda.  Kelapa  yang  sudah  dipetik  setelah  itu dipotong  bagian  atas  dan  dasar  lalu  diberi lubang  kecil  pada  bagian  atas  kelapa  dengan menggunakan  pinset  agar  dapat  diambil  air kelapanya sesuai kebutuhan.
Persiapan  Glutathione .  Glutathione ditumbuk  menggunakan  penggerus  obat  hingga halus.  Setelah  halus,  glutathione  diletakkan  di atas alluminium foil untuk ditimbang menggunakan neraca analitik. Level glutathione ditimbang  sesuai  perlakuan  lalu  dimasukkan  ke dalam  masing  masing  tabung  perlakuan.  Level glutathione  0,1%    ditimbang  dalam  jumlah  0,1 g/mL.  Level glutathione 0,2%  ditimbang  dalam jumlah  0,2  g/mL.  Level  glutathione  0,3% ditimbang dalam jumlah 0,3 g/mL.
Pencampuran  Bahan  Pengencer  Air Kelapa  dan  Kuning  Telur. Air  kelapa  yang telah  diperoleh  disimpan  di  dalam  gelas  piala yang  sebelumnya  telah  dilakukan  pengukuran pH menggunakan kertas lakmus, selanjutnya air kelapa muda dan dengan kuning telur dicampur lalu dihomogenkan menggunakan alat stirrer dan spin bar. Pengencer air kelapa dan kuning telur siap digunakan.
Pencampuran  Bahan  Pengencer  Air Kelapa  Kuning  Telur  dan  Glutathione . Masing-masing  tabung  yang  telah  diisi  dengan pengencer  air  kelapa  muda  kuning  telur  lalu ditambahkan  antioksidan  glutathione  masing masing untuk P1: 0,1%, P2: 0,2%, P3:0,3% dan P0 tanpa glutathione, selanjutnya diaduk hingga homogen. Pengencer siap untuk digunakan.
Penambahan  Antibiotik  Pennicilin  dan Streptomycin. Teteskan antibiotik penicillin 0,5 mL  dan  streptomycin  0,4  mg/mL  ke  setiap tabung  yang  berisi  pengencer  kemudian  tabung digoyangkan  agar  tercampur  hingga  homogen lalu pengencer siap digunakan.

## Tahap Penampungan Semen
Semen  ditampung  satu  kali  seminggu dengan  menggunakan  metode  vagina  buatan. Sebelum  melakukan  penampungan,  vagina buatan terlebih dahulu siapkan air panas bersuhu 50  -55oC,  kemudian  masukkan  pada  klep  yang ada  di  vagina  buatan.  Setelah  air  penuh  tutup klep.  Setelah  itu  masukkan  udara  melalui  klep
yang  disediakan.  Beri  pelicin  (vaselin)  pada bagian  muka  vagina  buatan.  Kemudian  periksa suhu  bagian  dalam  dari  vagina  buatan  dengan menggunakan  thermometer.  Bila  berada  pada suhu  42oC – 44oC  penampungan  dapat dilakukan.  Pasang  tabung  penampung  pada  sisi yang lain dari vagina buatan dan lindungi tabung penampung  agar  tidak  terkena  sinar  matahari secara  langsung.  Jika  vagina  buatan  telah  siap, penampungan semen dapat dilakukan.
Siapkan  sapi  betina  (pemancing)  pada kandang  jepit  yang  telah  disediakan,  kemudian dekatkan sapi jantan. Tarik tali kekang pejantan supaya  berada  di  belakang  betina.  Biarkan  sapi jantan  mencumbui  sapi  betina.  Pada  saat  sapi jantan  menaiki  sapi  betina  pertama  kali,  cegah penis untuk masuk ke dalam alat kelamin betina dengan  jalan  memegang  preputiumnya.  Pada saat  itu  juga  petugas  yang  memegang  tali kekang menarik pejantan ke arah belakang agar turun  dari  tubuh  betina.  Usaha  menurunkan pejantan  dari  tubuh  betina  disebut  false  mount. Setelah  melakukan  false  mount,  pejantan  akan lebih  bernafsu  untuk  kembali  menaiki  betina. Pada  saat  sapi  jantan  menaiki  sapi  betina  lagi, pegang preputiumnnya dan arahkan penisnya ke dalam  vagina  buatan.  Bila  terasa  ada  gerakan ejakulasi,  maka  lepaskan  vagina  buatan bersamaan dengan turunnya sapi jantan dari sapi betina.  Jika  semen  terlihat  pada  tabung penampung,  lakukan  gerakan  angka  delapan agar  semua  semen  hasil  ejakulasi  dapat  turun dan  tertampung  dalam  tabung  penampung semen.  Kemudian  semen  yang  diperoleh  dapat langsung  dibawa  ke  laboratorium  untuk dilakukan pemeriksaan kualitas semen.

## Tahap Evaluasi  Semen Segar
Semen  yang  diperoleh  dilakukan pemeriksaan secara makroskopis dan miksroskopis.  Pemeriksaan  secara  makroskopis meliputi  :  warna,  volume, bau,  konsistensi,  pH. Pemeriksaan  secara  mikroskopis  meliputi: gerakan  massa  spermatozoa,  konsentrasi, motilitas, viabilitas dan abnormalitas.

## Tahap  Pengenceran  dan  Penyimpanan Semen
Semen  diencerkan  dengan  pengencer  air kelapa kuning telur yang disuplementasi dengan glutathione  sesuai  perlakuan.  Semen  yang  telah diencerkan,  disimpan  pada  suhu  3-5oC  dan dilakukan  evaluasi  setiap  24  jam  terhadap motilitas, viabilitas, dan abnormalitas spermatozoa.

## Variabel Penelitian
Adapun  variabel  yang  diteliti  adalah: motilitas  spermatozoa  merupakan  persentase spermatozoa yang bergerak progresif pada suatu lapang pandang. Motilitas spermatozoa ditentukan  melalui  pengamatan  spermatozoa  di bawah  mikroskop  cahaya  dengan  pembesaran 10x40. Penilaiannya adalah dengan memberikan angka berkisar antara 0 - 100% dengan skala 5% (Arifiantini, 2012).  Dilakukan penilaian pada 5 lapang  pandang  yang  berbeda.  Viabilitas spermatozoa  diketahui  dengan  mengamati preparat  hasil  pewarnaan  differensial  (eosin- negrosin) menggunakan mikroskop. Spermatozoa hidup mempunyai kepala berwarna putih  sebaliknya  yang  mati  berwarna  merah (Arifiantini,  2012).  Perhitungan  viabilitas dilakukan  pada  10  lapang  pandang  yang berbeda.  Perhitungan  abnormalitas  dilakukan
dengan  cara  menempatkan  preparat  hasil pewarnaan differensial di bawah mikroskop dan diamati menggunakan pembesaran lensa 10×40, sebanyak  200  sel  spermatozoa.  Abnormalitas dapat  terjadi  pada  bagian  kepala  maupun  ekor spermatozoa  (Arifiantini,  2012).  Daya  tahan hidup  spermatozoa  yang  diamati  adalah kemampuan  spermatozoa  untuk  bertahan  hidup selama  persentase  motilitas  spermatozoa  masih berada  di  atas  persentase  motilitas  yang  layak untuk  inseminasi  buatan  yaitu  lebih  dari  40% gerakan progresif.

## Analisis Data
Data  yang  diperoleh  dianalisis  dengan sidik ragam dan  dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan software  IBM  SPSS  Statistics  25 for windows.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Motilitas Spermatozoa
Motilitas  atau  daya  gerak    spermatozoa merupakan  salah  satu  parameter  utama  yang digunakan  pada  penilaian  kualitas  semen. Persentase  motilitas  adalah  gambaran  dari
aktifitas  spermatozoa  yang  progresif  dan berkorelasi  sangat  erat  dengan  fertilitas (Pamungkas  dan  Anwar,  2013).  Rerata  nilai motilitas  spermatozoa  sapi  angus  dari  setiap perlakuan dapat dilihat pada Tabel 1.

## Tabel 1. Pengaruh perlakuan terhadap motilitas spermatozoa
Hari ke Perlakuan (%) P-Value P0 P1 P2 P3 0 79,50 ± 2,09 a 79,50 ± 2,09 a 79,50 ± 2,09 a 79,50 ± 2,09 a 1,000 1 69,00 ± 4,18 b 68,50 ± 3,79 b 73,00 ± 2,09 b 51,50 ± 6,75 a 0,000 2 57,50 ± 3,53 b 60,00 ± 3,53 bc 65,50 ± 1,11 c 36,00 ± 6,75 a 0,000 3 43,00 ± 4,47 b 48,00 ± 4,47 b 56,00 ± 2,23 c 26,50 ± 7,82 a 0,000 4 32,50 ± 2,50 b 36,50 ± 3,79 b 47,00 ± 2,09 c 16,00 ± 4,18 a 0,000 5 21,00 ± 2,23 b 28,00 ± 4,10 c 37,00 ± 1,11 d 8,00 ± 3,25 a 0,000
a,b,c,d Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan perbedaan nyata (P < 0,05)
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan persentase motilitas spermatozoa setelah pengenceran  (hari  ke-0)  pada  setiap  perlakuan berbeda  tidak  nyata  (P>0,05)  terhadap persentase  motilitas  spermatozoa  sapi  angus, namun  pada  hari  pertama  sampai  hari  ke  lima penyimpanan menunjukkan  persentase motilitas spermatozoa  berbeda  nyata  (P<0,05)  antar perlakuan. Perlakuan P2 mampu mempertahankan  rataan  motilitas  spermatozoa lebih tinggi yaitu pada hari pertama 73,00±2,09 %, hari ke dua 65,50±1,11%, hari ke tiga 56,00 ±2,23%,  hari  ke  empat  47,00  ±2,09%  dan  hari
ke  lima  37,00  ±1,11%  dibandingkan  dengan perlakuan  P0  (kontrol)  yang  tidak  ditambahkan glutathione.  Tingginya  persentase  motilitas spermatozoa  dibandingkan  kontrol  (P0)  diduga terjadi  karena  adanya  glutathione  sebagai antioksidan  yang  dapat  mencegah  terjadinya reaksi peroksida lipid oleh radikal bebas. Hal ini didukung  oleh  Holt  (2000)  yang  menyatakan bahwa glutathione berfungsi mencegah terjadinya  peroksidasi  lipida  membran  sel spermatozoa  selama  proses  pengolahan  semen, sehingga  dapat  mempertahankan  motilitas  dan integritas  membran  plasma  sel.  Hasil  ini  tidak
berbeda  jauh  dengan  hasil  penelitian  yang dilakukan  oleh  Triwulanningsih et  al .  (2003) yang melaporkan persentase motilitas spermatozoa pada sapi FH  dalam pengencer tris sitrat  yang  ditambahkan  glutathione  sebanyak 0,5  mM  mampu  mempertahankan  motilitas spermatozoa  sebesar  48,75±11,47%  pada penyimpanan hari ke empat.
Persentase  motilitas  spermatozoa  dapat dipertahankan  mencapai  40%  masing-masing perlakuan dicapai pada hari berbeda dimana P0 dan  P1  motilitas  spermatozoa  sebesar  43,00  ± 4,47%  dan  48,00 ±  4,47%  dicapai  pada  hari  ke tiga. Sebaliknya P2 dan P3 dicapai pada hari ke empat  dan  pertama  dengan  motilitas  sebesar 47,00  ±  2,09%  dan  51,50  ±  6,75%  (Tabel  1). Keadaan  ini  diduga  karena  adanya  glutathione pada  perlakuan  P2  (glutathione    0,2%)  sebagai antioksidan  dapat  mempertahankan  motilitas serta  mencegah  kerusakan  spermatozoa  akibat radikal bebas. Glutathione merupakan antioksidan  primer  yang  berfungsi  mencegah terjadinya  pembentukan  radikal  bebas  serta mengubah  radikal  bebas  yang  telah  terbentuk menjadi senyawa yang kurang memiliki dampak negatif  (Kusumaningrum et  al .,  2007). Perlakuan P3 menunjukkan persentase motilitas lebih rendah secara nyata (P<0,05) dari P0, P1, dan  P2.  Persentase  motilitas  pada  P3  terlihat hanya  bertahan  pada  hari  pertama  dengan persentase motilitas spermatozoa 51,50 ± 6,75%. Memasuki  hari  kedua  persentase  motilitas  P3 berada  di  bawah  40%  dengan  nilai  36,00  ± 6,75%. Hasil ini menunjukkan bahwa penambahan  level  glutathione  0,3%  ke  dalam pengencer  AK-KT  berdampak  negatif  atau toksik  bagi  spermatozoa  karena  level  yang terlalu banyak sehingga menurunkan persentase motilitas  spermatozoa.  Hal  ini  didukung  oleh pernyataan  Uysal  dan  Bucak  (2007)  bahwa penambahan  konsentrasi  glutathione  yang berlebih  dapat  menimbulkan  efek  negatif  atau efek  toksik  yang  dapat  menyebabkan  kematian spermatozoa.
Reaksi  yang  ditimbulkan  oleh  radikal bebas  pada  membran  plasma  sel  terutama  pada asam  lemak  tak  jenuh  akan  membentuk  radikal bebas  baru,  yang  jika  bertemu  dengan  molekul lain  akan  terjadi  lagi  reaksi  dan  membentuk radikal baru juga sehingga terjadi reaksi berantai dan  reaksi  itu  akan  berhenti  ketika  membran plasma  sel  telah  rusak  atau  dihentikan  dengan menambahkan  antioksidan.  Upaya  untuk meminimalkan  kerusakan  spermatozoa  oleh radikal  bebas  adalah  dengan  penambahan
antioksidan ke dalam pengencer (Amtiran et al ., 2020). Pemberian glutathione dapat menstabilkan  struktur  membran  dengan  cara meminimalkan  pembentukan  hasil  peroksida dalam  reaksi  peroksidasi  lipid  sehingga kerusakan  membran  dapat  dicegah  dan  nilai motilitas  dapat  dipertahankan  (Fitrianti,  2013). Glutathione  mampu  menetralisir  kerja  radikal bebas  hidroksil  yang  sangat  reaktif.  Radikal hidroksil  dapat  merusak  tiga  jenis  senyawa penting  untuk  mempertahankan  integritas  sel, yakni  asam  lemak,  khususnya  asam  lemak  tak jenuh; DNA yang merupakan perangkat genetik sel;  dan  protein  yang  memegang  bebagai  peran sebagai  enzim,  antibodi,  pembentuk  maktriks, sitoskeleton (Suryohudoyo, 2000).

## Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Viabilitas Spermatozoa
Viabilitas merupakan daya hidup spermatozoa sebagai indikator kualitas spermatozoa (Sukmawati et al ., 2014). Viabilitas dihitung  dengan  melihat  jumlah  spermatozoa yang hidup dan mati menggunakan media eosin- negrosin.  Spermatozoa  hidup  ditandai  dengan spermatozoa  tidak  menyerap  warna  merah (bening  atau  putih),  sedangkan  spermatozoa mati akan terlihat penyerapan warna merah ungu dari  eosin-negrosin.  Rerata  nilai  viabilitas spermatozoa  sapi  angus  dari  setiap  perlakuan dapat  dilihat  pada  Tabel  2.  Pada  data  tersebut terlihat  adanya  penurunan  persentase  viabilitas spermatozoa,  tetapi  penurunan  masing  masing perlakuan tidak sama.
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan persentase  viabilitas  spermatozoa  sapi  angus setelah  pengenceran  (hari  ke-0)  pada  setiap perlakuan  berbeda tidak  nyata  (P>0,05),  namun pada  hari  pertama  sampai  hari  ke  lima penyimpanan menunjukkan persentase viabilitas spermatozoa  berbeda  nyata  (P<0,05)  antar perlakuan.  Berdasarkan   Tabel  2 terlihat  bahwa persentase viabilitas spermatozoa dalam pengencer  AK-KT  dengan  penambahan  0,2% glutathione  pada  perlakuan  P2  lebih  baik dibandingkan  dengan  penambahan  0,1%  dan 0,3% glutathione perlakuan P1 dan P3 serta pada perlakuan  P0  tanpa  penambahan  glutathione. Persentase viabiltas spermatozoa pada perlakuan P2 mampu bertahan sampai hari ke lima dengan nilai  50,73  ±  5,54%  lebih  tinggi  dibandingkan dengan P0: 34,12 ± 1,95 %, P1: 38,20 ± 3,05 %, dan  P3  :  26,76  ±  9,27  %.  Hal  ini  disebabkan karena  peranan  glutathione  yang  mampu melindungi  spermatozoa  dari  kerusakan  akibat
radikal bebas hasil metabolisme sel spermatozoa sehingga  dapat  mempertahankan  daya  hidup spermatozoa lebih lama.
Hasil  penelitian  memperlihatkan  bahwa kadar  antioksidan  dalam  pengencer  dapat mempengaruhi viabilitas spermatozoa, sehingga dengan  penambahan  antioksidan  glutathione
dalam  pengencer  AK-KT  dapat  melindungi spermatozoa  dari  kerusakan  oksidatif  sehingga berpengaruh pada kelangsungan hidup spermatozoa. Nilai viabilitas berkorelasi dengan kemampuan  fertilisasi  spermatozoa,  jika  nilai viabilitas tinggi maka kemampuan fertilitas akan tinggi (Blegur et al .,2020).
Tabel 2. Pengaruh perlakuan terhadap viabilitas spermatozoa
Hari ke Perlakuan (%) P-Value P0 P1 P2 P3 0 85,16 ± 1,80 a 85,33 ± 1,53 a 86,65 ± 1,32 a 85,61 ± 1,31 a 0,427 1 76,68 ± 3,45 b 78,10 ± 2,14 b 82,21 ± 2,40 b 66,27 ± 8,69 a 0,001 2 67,29 ± 5,25 b 70,51 ± 2,50 bc 75,77 ± 2,69 c 51,55 ± 9,08 a 0,000 3 55,93 ± 8,05 b 57,01 ± 5,57 bc 66,75 ± 3,40 c 41,97 ± 10,64 a 0,001 4 45,69 ± 6,13 b 46,32 ± 3,40 b 57,64 ± 3,08 c 34,30 ± 10,64 a 0,000 5 34,12 ± 1,95 ab 38,20 ± 3,05 b 50,73 ± 5,54 c 26,76 ± 9,27 a 0,000
a,b,c Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P < 0,05)
Menurut  Hidayaturrahmah  (2007)  yang mengatakan  bahwa  viabilitas  spermatozoa dipengaruhi oleh kebutuhan akan nutrisi. Nutrisi akan  digunakan  oleh  spermatozoa  untuk dijadikan energi sehingga jika kebutuhan nutrisi spermatozoa berkurang maka viabilitas spermatozoa  akan  menurun.  Dalam  penelitian ini  digunakan  pengencer  AK-KT  yang  dapat menyediakan  sumber  energi  (karbohidrat), mengandung bahan-bahan yang dapat melindungi spermatozoa selama proses penyimpanan  dan  bersifat  buffer  untuk mencegah  perubahan  pH  yang  membunuh spermatozoa  akibat  terbentuknya  asam  laktat. Air  kelapa  muda  mengandung  glukosa  dan fruktosa  yang  juga  terdapat  dalam  semen (Sulmartiwi et  al .,  2011).  Menurut  Toelihere (1993),  penyimpanan  spermatozoa  memerlukan fruktosa  yang  dimanfaatkan  sebagai  sumber energi  bagi  spermatozoa  dan  air  kelapa  muda merupakan  bahan  pengencer  yang  mempunyai kandungan  fruktosa.  Kuning  telur  mengandung banyak protein, vitamin yang larut dalam air dan minyak  sehingga  ideal  digunakan  sebagai pengencer  (Fahrullah,  2012).  Kuning  telur  juga mengandung glukosa yang lebih suka digunakan oleh sel-sel spermatozoa sapi untuk metabolismenya  dari  pada  fruktosa  yang terdapat  di  dalam  semen  (Toelihere,1993). Kuning  telur  berfungsi  untuk  melindungi spermatozoa  dari  kejutan  suhu  dingin  karena mengandung lipoprotein dan lesitin.
Berdasarkan  data  pada  Tabel  2  dapat dilihat bahwa ketersediaan antioksidan
glutathione  yang  cukup  dalam  pengencer  AK- KT dapat mempertahankan viabilitas spermatozoa. Hal ini dukung oleh Syarifuddin et al . (2012) yang menyatakan bahwa penambahan glutathion  dalam  pengencer  semen,  baik  dalam bentuk  semen  cair  dingin  maupun  semen  beku dapat mempertahankan daya hidup dan motilitas spermatozoa  karena  glutathion  dapat  mencegah terjadinya  kerusakan  membran  plasma  dan kematian spermatozoa akibat terjadinya peroksidasi  lemak  membran.  Ditambahkan Triwulanningsih et  al .  (2009)  bahwa  adanya penambahan glutathione dalam medium pengencer  akan  mencegah  timbulnya  radikal bebas  yang  muncul  selama  proses  pembuatan dan  penyimpanan  semen  cair,  sehingga memperpanjang daya hidup semen cair.
Selama  pengamatan  terjadi  penurunan persentase  viabilitas  spermatozoa  pada  setiap perlakuan.  Hal  ini  dapat  terjadi  oleh  berbagai faktor yaitu secara alamiah sel akan mengalami kematian,  spermatozoa  mengalami  stres  pada saat  pengenceran  dan  spermatozoa  mengalami penurunan  kualitas  dan  jumlah  spermatozoa mati  lebih  banyak  setelah  penyimpanan  selama penyimpanan terjadi  (Yani  dan  Nuryadi,  2001). Kematian  sel  spermatozoa  dapat  terjadi  jika tidak ada perlindungan antioksidan (Mittal et al ., 2010).

## Pengaruh Perlakuan terhadap  Abnormalitas Spermatozoa
Salah  satu  indikator  penting  diketahui dalam  menentukan  kualitas  spermatozoa  adalah
persentase  abnormalitas  spermatozoa,  karena struktur  sel  yang  abnormal  akan  menyebabkan terjadinya  gangguan  ketika  fertilisasi  (Afiati et al .,  2015).  Rerata  persentase  abnormalitas spermatozoa  sapi  angus  dari  setiap  perlakuan dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Pengaruh perlakuan terhadap abnormalitas spermatozoa.
Hari ke Perlakuan (%) P-Value P0 P1 P2 P3 0 5,44 ± 1,29 a 5,64 ± 1,64 a 5,26 ± 1,16 a 5,28 ± 1,16 a 0,965 1 5,73 ± 1,70 a 5,94 ± 1,50 a 5,41 ± 1,09 a 5,55 ± 1,07 a 0,934 2 5,77 ± 1,51 a 6,12 ± 1,73 a 5,69 ± 1,17 a 5,66 ± 1,26 a 0,953 3 6,22 ± 1,97 a 6,49 ± 1,59 a 6,13 ± 1,36 a 6,33 ± 1,03 a 0,985 4 6,58 ± 1,90 a 6,55 ± 1,65 a 6,20 ± 1,29 a 6,46 ± 1,07 a 0,977 5 6,80 ± 1,82 a 6,79 ± 1,65 a 6,52 ± 1,37 a 6,69 ± 1,22 a 0,990
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang tidak nyata (P  > 0,05)
Hasil  analisis  statistik  pada  semua perlakuan  menunjukkan  perbedaan  yang  tidak nyata (P>0,05)  pada  waktu  pengamatan  hari  ke 0  sampai  dengan  hari  ke  5.  Rataan  persentase abnormalitas  spermatozoa  sapi  angus  dalam pengencer AK-KT dengan penambahan glutathione mengalami kenaikan seiring dengan lama  waktu  penyimpanan.  Terjadinya  kenaikan persentase  abnormalitas  spermatozoa  diduga selain  karena  waktu  proses  pembentukkan spermatozoa  yang  tidak  sempurna  dalam  tubuli seminiferi  juga  disebabkan  karena  kerusakan yang  disebabkan  akibat cara  pengkoleksian  dan proses  pengenceran  semen  serta  pembuatan ulasan  untuk  pengamatan.  Ihsan  (2012) menyatakan  bahwa  pengencer  dan  pembuatan preparat  ulas  yang  kasar  dapat  menyebabkan kerusakan  pada  spermatozoa.  Meningkatnya angka  abnormalitas  dapat  juga  disebabkan karena  adanya  peroksidasi  lipid  (Suyadi et  al ., 2015). Semakin lama waktu penyimpanan maka semakin  tinggi  persentase  abnormalitas  yang disebabkan oleh stress dingin dan ketidakseimbangan  tekanan  osmotik  akibat  dari proses metabolik yang terus berlangsung selama penyimpanan    pada  suhu  5OC  (Yani    dan Nuryadi, 2001).
Data  Tabel  3  dapat  dilihat  kenaikan persentase  abnormalitas  spermatozoa  yang terjadi tidak terlalu drastis dan tergolong rendah, dimana pada pengamatan hari ke 0 hingga pada hari  ke  lima  setelah  penyimpanan  pada  suhu dingin  menunjukkan  persentase  abnormalitas spermatozoa  dalam  kisaran  normal  kurang  dari 20% yaitu berkisar antara 5,41 ± 1,29 – 6,80 ± 1,82%.  BSN  (2017)  menyatakan  bahwa abnormalitas  spermatozoa  kurang  dari  20% masih  dapat  digunakan  untuk  inseminasi.
Rendahnya  persentase  kenaikan  abnormalitas spermatozoa  sapi  angus  dalam  penelitian  ini diduga  karena  terdapat  kandungan  zat  nutrisi dalam  pengencer  AK-KT  yang  mampu mencegah peningkatan abnormalitas akibat suhu dingin.  Hal ini  didukung  oleh pendapat  Effendi et  al .  (2015)  yang  mengatakan  bahwa  kuning telur  mengandung  lesitin  dan  lipoprotein  yang berfungsi  mempertahankan  integritas  selubung lipoprotein spermatozoa dan mencegah terjadinya kejutan suhu dingin (cold shock).
Hasil  penelitian  ini  terlihat  bahwa persentase kenaikan abnormalitas pada perlakuan  P1,  P2,  dan  P3  lebih  rendah dibandingkan  dengan  perlakuan  P0  (kontrol). Hal  ini  diduga  karena  adanya  kandungan antioksidan glutathione pada perlakuan P1,P2,dan  P3  yang  dapat  mengurangi  dan mengatasi kerusakan spermatozoa akibat radikal bebas  sehingga  dapat  menekan  kenaikan  angka abnormalitas yang terjadi. Siswanto et al . (2015) menyatakan  bahwa  penambahan  antioksidan pada pengencer semen dapat menekan produksi reactive oxygen spesies berlebih sehingga dapat mempertahankan kualitas spermatozoa.
Jenis  abnormalitas  yang  dijumpai  selama penelitian adalah abnormalitas sekunder, berupa kepala  dan  ekor  terpisah  dan  ekor  melingkar. Menurut  Firdausi et  al .  (2014)  kerusakan  pada spermatozoa bisa diakibatkan ketika pembuatan ulasan pada object glass, sehingga abnormalitas yang  terbentuk  yaitu  spermatozoa  dengan  ekor yang patah atau kepala tanpa ekor. Susilawati et al . (2016) menambahkan abnormalitas sekunder terjadi ketika proses pendinginan atau pembekuan  dan  ketika  preparasi  membuat preparat.
Pengaruh  Perlakuan  terhadap    Daya  Tahan Hidup Spermatozoa
Daya  tahan  hidup  spermatozoa  yang dimaksud  adalah  kemampuan  spermatozoa untuk tetap bergerak dalam kurun waktu tertentu setelah penyimpanan in vitro (Hine et al ., 2014).
Daya  tahan  hidup  spermatozoa  (hari)  diukur dengan  lama  spermatozoa  bisa  bertahan  dalam penyimpanan  dengan  persentase  motilitas minimal 40% (Blegur et al .,2020).  Daya tahan hidup  spermatozoa  setiap  perlakuan  pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 4.

## Tabel 4. Pengaruh perlakuan terhadap daya tahan hidup spermatozoa
Perlakuan Daya Tahan Hidup (Hari) P0 3,00±0,00 b P1 3,20±0,44 b P2 4,00±0,00 c P3 1,40±0,54 a P-Value 0,000
Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa  perlakuan  berpengaruh  nyata  (P  <0,05) terhadap  daya  tahan  hidup  spermatozoa. Perlakuan  P2  menunjukkan  daya  tahan  hidup spermatozoa lebih lama yaitu lama penyimpanan 4 hari, diikuti perlakuan P1 : 3,20 hari, P0 : 3,00 hari,  dan  P3  :  1,40  hari.  Hal  ini  kemungkinan karena  ketiadaan  dan  perbedaan  level  unsur pelindung  di  dalam  pengencer  sehingga  daya tahan  hidup  spermatozoa  setiap  perlakuan  yang disimpan  pada  suhu  rendah  berbeda  selama penyimpanan.
Hasil penelitian ini menunjukkan perlakuan P2 dapat mempertahankan daya hidup lebih  lama  hingga  4  hari  dibandingkan  P0  dan P1  yaitu  3  hari  dan  3,20  hari.  Hal  ini  diduga karena  P0  tidak  memiliki  unsur  pelindung seperti  antioksidan  sehingga  tidak  dapat mencegah terjadinya kerusakan yang diakibatkan  oleh  radikal  bebas.  Daya  tahan hidup  spermatozoa  pada  perlakuan  P1  lebih rendah  dibandingkan  P2  disebabkan  oleh penambahan  level  0,1%  glutathione  dalam pengencer  yang  belum  optimal  sehingga perlindungan  terhadap  spermatozoa  tidak optimal.  Menurut  Syariffudin et  al .  (2012) penambahan  glutathione  yang  kurang  sesuai mengakibatkan  peningkatan  reactive  oxygen species (ROS) selama kultur in vitro yang dapat menyebabkan  rusaknya  sel  spermatozoa. Pengencer  AK-KT  yang  ditambahkan  0,2% glutathione  pada  perlakuan  P2  mampu mengurangi kerusakan akibat radikal bebas. Hal ini didukung oleh Triwulanningsih et al . (2009) yang  menyatakan  bahwa  adanya  penambahan
glutathione  dalam  medium  pengencer  akan mencegah  radikal  bebas  yang  muncul  selama proses pembuatan dan penyimpanan semen cair, sehingga  memperpanjang  daya  hidup  semen cair. Antioksidan merupakan senyawa yang bisa memperlambat terjadinya kerusakan diakibatkan oleh radikal bebas dengan jalan memutus rantai reaksi  oksidasi  yang  disebabkan  oleh  radikal bebas (Miryanti et al ., 2011).
Pada  perlakuan  pengencer  AK-KT  yang ditambahkan  glutathione  daya  tahan  hidup spermatozoa terendah terlihat pada perlakuan P3 dengan lama penyimpanan 1,40 hari. Rendahnya daya  tahan  hidup  spermatozoa  pada  P3  dapat disebabkan  oleh  adanya  asam  laktat  sisa metabolisme  sel  yang  megakibatkan  terjadi penurunan  pH  dan  kondisi  ini  dapat  bersifat racun  terhadap  spermatozoa  yang  kemudian berakibat pada rendahnya daya gerak spermatozoa hingga terjadi kematian. Rhoyan et al .  (2014)  menyatakan  bahwa  rendahnya persentase  daya  tahan  hidup  dapat  disebabkan oleh  adanya  aktifitas  metabolisme  spermatozoa yang  membentuk  asam  laktat  dalam  media pengencer.  Asam  laktat  yang  berlebihan  pada pengencer  dapat  menyebabkan  perubahan  pH yang  dapat  menimbulkan  efek  racun  dan kematian  yang  tinggi  bagi  spermatozoa (Widjaya,  2011).  Rendahnya  daya  tahan  hidup spermatozoa  pada  P3  juga  diduga  karena penambahan  level  glutathione  0,3%  dalam pengencer  AK-KT  justru  menyebabkan  toksik bagi  spermatozoa  sapi  angus  sehingga  tidak dapat mempertahankan daya hidup spermatozoa yang lebih lama.

## SIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  disimpulkan bahwa  penambahan  glutathione  0,2%    dalam pengencer  AK-KT  memberikan  pengaruh
terbaik dan lebih efektif dalam mempertahankan kualitas semen sapi angus.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lanjutan  untuk melihat fertilitas   spermatozoa  dari  penggunaan
glutation  0,2%  dalam  pengencer  AK-KT terhadap angka konsepsi sapi angus.

## DAFTAR PUSTAKA
Aerens  CD,  Ihsan  MN,  Isnaini  N.  2012.
Perbedaan  Kuantitatif  dan  Kualitatif Semen Segar Pada Berbagai Bangsa Sapi Potong. Malang.
Afiati  F,  Yulnawati  MR,  Arifiantini  RI.  2015. Abnormalitas spermatozoa domba dengan frekuensi  penampungan  berbeda.  Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon, 1(4) : 930- 934.
Amtiran DE, Hine TM, Uly K. 2020. Pengaruh penambahan  vitamin  e  dalam  pengencer tris-kuning telur terhadap kualitas spermatozoa babi duroc. Jurnal Peternakan  Lahan  Kering,  2(4)  :  1111- 1118.
Arifiantini  RI.  2012.  Teknik  Koleksi  dan Evaluasi Semen pada Hewan. PT Penerbit IPB Press, Bogor.
Blegur J, Nalley WM, Hine TM. 2020. Pengaruh Penambahan  virgin  coconut  oil  dalam pengencer  tris  kuning  telur  terhadap kualitas  spermatozoa  sapi  bali  selama preservasi  (infiluence  addition  virgin coconut oil in tris egg yolk on the quality of bali bull spermatozoa during preservation). Jurnal Nukleus Peternakan, 7(2) : 130-138.
BSN  (Badan  Standarisasi  Nasional).  2017.  SNI 4869-1:2017.  Semen  Beku-Bagian  1: Sapi.  Badan  Standarisasi  Nasional. Jakarta.
Ducha N, Susilawati T, Aulanni’am, Wahjuningsih  S.  2013.  Motilitas  dan viabilitas  spermatozoa  sapi  limousin selama  penyimpanan  pada  refrigerator dalam pengencer cep-2 dengan suplementasi kuning telur. Jurnal Kedokteran Hewan, 7(1) : 5-8.
Effendi  FI,  Wahjuningsih  S,  Ihsan  MN.  2015.
Pengaruh  pengencer  tris  aminomethane kuning  telur  yang  disuplementasi  sari kulit  manggis  (garcinia  mangostana)
terhadap  kualitas  semen  sapi  limousin selama  penyimpanan  suhu  dingin  50C. Jurnal  Ilmu-Ilmu  Peternakan    25(3)  :  69- 79.
Fahrullah. 2012. Pengaruh penggunaan probiotik komersial  sebagai  bahan  curing  pada pembuatan  telur  itik  asin.  Skripsi.
Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin. Makassar.
Feradis.  2010.  Bioteknologi  Reproduksi  pada Ternak. Alfabeta : Bandung.
Firdausi  PA,  Susilawati  T,  Wahyuningsih  S. 2014.  Kualitas  semen  sapi  limousin selama pendinginan menggunakan pengencer  cep-2  dengan  penambahan berbagai  konsentrasi  santan.  Ternak Tropika  Journal  of  Tropical  Animal Production, 15(1) : 21-30.
Fitrianti  I.  2013.  Pengaruh  glutathione  dalam pengencer  dasar  tris  aminomethane kuning  telur – glycerol  terhadap  kualitas semen  kambing  boer  setelah  pembekuan cepat. Skripsi. Universitas Brawijaya.
Garner DL, Hafez ESE. 2000. Spermatozoa and Seminal  Plasma.  Reproduction  in  Farm Animals, 96-109.
Hidayaturrahmah.  2007.  Waktu  motilitas  dan viabilitas spermatozoa ikan mas (cyprinus carpio  l)  pada  beberapa  konsentrasi larutan  fruktosa.  Journal  of  Bioscientiae, 4(1), 9-18.
Hine  TM,  Burhanuddin,  Marawali  A.  2014. Efektivitas  air  buah  lontar  dalam mempertahankan  motilitas,  viabilitas  dan daya  tahan  hidup  spermatozoa  sapi  bali. Jurnal Veteriner 15 (2) : 263-273.
Holt  WV.  2000.  Basic  Aspects  Of  Frozen Storage  Of  Semen.  Animal  Reproduction Science, 62(1-3) : 3-22.
Ihsan  MN.  2012.  Penggunaan  telur  itik  sebagai pengencer  semen  kambing.  Ternak
Tropika  Journal  of  Tropical  Animal Production, 12(1) : 10-14.
Kartusudjana  R.  2001.  Ciri-ciri  atau  tanda keabnormalitasan  pada  semen  kambing peranakan ettawa (PE). Jakarta: Departemen Pendidikan Nasional, 15(7) : 78 – 83. Kusumawati ED, Krisnaningsih ATN, Romadlon RR. 2016. Kualitas spermatozoa  semen  beku  sapi  simental dengan  suhu  dan  lama  thawing  yang berbeda.  Jurnal  Ilmu-Ilmu  Peternakan, 26(3) : 38-41. Kusumaningrum
DA, Situmorang P,
Triwulanningsih  E,  Sianturi  RG.  2007. Penambahan  plasma  semen  sapi  dan  anti oksidan  gluthatione  untuk  meningkatkan kualitas  semen  beku  kerbau  lumpur (Bubalus  bubalis).  Seminar  Nasional Teknologi  Peternakan  Dan  Veteriner, 188-194.
Mere CYL. 2016. Air kelapa dan air buah lontar sebagai  modifikasi  pengencer  alternatif pada  semen  babi  landrace.  Skripsi. Fakultas  Kedokteran  Hewan,  Universitas Nusa Cendana.
Miryanti YIP, Sapei L, Budiono K, dan Indra S.
2011.  Ekstraksi  antioksidan  dari  kulit buah  manggis  (Garcinia  mangostana  L.). J. Repository. Universitas Katolik
Parahyangan Bandung.
Mittal P, Gupta V, Kaur G, Garg AK, Singh A.
2010. Phytochemistry
and pharmacological  activities  of  Psidium guajava. IJPSR, 1(9), 9-19.
Pamungkas  FA,  Anwar.  2013.  Daya  Tahan hidup  spermatozoa  kambing  boer  dalam pengencer tris kuning telur yang disimpan pada  temperatur  berbeda.  Seminar Nasional  Peternakan  dan  Veteriner. Bogor,  4-5  Agustus  2013.  Bogor (Indonesia). Pusat Penelitan dan Pengembangan Peternakan. Hlm. 331-338
Pillet  E,  Duchamp  G,  Batellier  F,  Beaumal  V,
Anton  M,  Desherces  S,  Schmitt  E, Magistrini M. 2011. Egg yolk plasma can replace  egg  yolk  in  stallion  freezing extenders.  Theriogenology,  75(1)  :  105- 114.
Rhoyan  YH,  Lestari  TD,  Setiawan  R.  2014.
Kualitas  semen  cair  dingin  domba  garut pada  tiga  jenis  larutan  pengencer.  Jurnal Ilmu Ternak, 14(1) : 63-67
Rizal M. 2004. Pengaruh Penambahan glutation ke  dalam  pengenceran  tris  terhadap
kualitas  semen  cair  domba  garut.  Buletin Peternakan, 27(2) : 63-72.
Siswanto, Suyadi, Susilorini TE. 2015. Pengaruh penambahan  ekstrak  bawang  merah (allium  cepa  )  dalam  pengencer  terhadap kualitas  semen  kambing  peranakan etawah  (pe)  selama  penyimpanan  suhu ruang. J. Repository. Fakultas Peternakan Univ.Brawijaya. Hal :1-9 Situmorang  P,  Triwulanningsih  E,  Lubis  A, Caroline  W,  Sugiarti  T.  1999.  Teknologi penyimpanan  semen  pada  suhu  5  0C. Edisi  Khusus.  Kumpulan  Hasil-Hasil Penelitian Peternakan APBN TA, 2000.
Sukmawati  E,  Arifiantini  RI,  Purwantara  B.
2014.  Daya  tahan  spermatozoa  terhadap proses  pembekuan  pada  berbagai  jenis pejantan unggul. JITV 19(3):168-175.
Sulabda  IN,  Puja  IK.  2010.  Pengaruh  subsitusi air  kelapa  muda  dengan  pengencer  sitrat kuning  telur  terhadap  motilitas  dan persentase  hidup  spermatozoa  anjing. Buletin Veteriner Udayana (2)2: 109-17.
Sulmartiwi  L,  Ainurrohmah  E,  Mubarak  AS. 2011.  Pengaruh  konsentrasi  air  kelapa muda  dan  madu  dalam  nacl  fisiologis terhadap  motilitas  dan  lama  hidup spermatozoa  ikan  patin.  Jurnal  Ilmiah Perikanan dan Kelautan, 3(1) : 67-72.
Suryohudoyo P. 2000. Oksidan, antioksidan dan radikal  bebas.  Di  Dalam:  Kapita  Selekta Ilmu  Kedokteran  Molekuler.  Jakarta:  CV Sagung Seto. Hlm, 31-47.
Susilawati  T.  2011.  Tingkat  keberhasilan inseminasi  buatan  dengan  kualitas  dan deposisi  semen  yang  berbeda  pada  sapi peranakan ongole. Ternak Tropika Journal of  Tropical  Animal  Production,  12(2)  : 15-24.
Susilawati T, Wahyudi FE, Anggraeni I, Isnaini N,  Ihsan  MN.  2016.  Penggantian  bovine serum  albumin  pada  pengencer  Cep-2 dengan  serum  darah  sapi  dan  putih  telur terhadap kualitas semen cair sapi limousin selama  pendinginan.  Jurnal  Kedokteran Hewan-Indonesian  Journal  of  Veterinary Sciences, 10(2) : 98-102.
Suyadi TE, Susilorini AL. 2015. Kualitas semen kambing peranakan etawah dalam pengencer  tris  terhadap  kualitas  semen kambing  peranakan  etawah.  Jurnal  Ilmu Ternak dan Veteriner 3(4): 22-24.
Syarifuddin A, Dewi Indira Laksmi D, Bebas I. 2012.  Efektivitas  penambahan  berbagai konsentrasi  glutathion  terhadap  daya
hidup dan motilitas spermatozoa sapi bali post thawing. Indonesia Medicus Veterinus, 1(2) : 173-185.
Toelihere  MR.  1993.  Inseminasi  Buatan  pada Ternak. Penerbit Angkasa. Bandung. Hal, 52, 57.
Triwulanningsih  E,  Situmorang  P,  Sugiarti  T, Sianturi  RG,  Kusumaningrum  DA.  2009. Efektifitas  Penambahan  glutathione  pada pengencer laktosa dan air kelapa terhadap viabilitas  semen  cair/dingin  (chilled) kerbau  lumpur  (Bubalus  bubalis).  Balai Penelitian Ternak. Bogor.
Triwulanningsih  E,  Situmorang  P,  Sugiarti  T,
Sianturi  RG,  Kusumaningrum  DA.  2003. Pengaruh  penambahan  glutathione  pada medium  pengencer  sperma  terhadap
kualitas semen cair (chilled semen). JITV, 8(2) : 91-97.
Uysal  O,  dan  Bucak  MN.  2007.  Effects  of oxidized  glutathione,  bovine  serum albumin,  cysteine  and  lycopene  on  the quality of frozen-thawed ram semen. Acta Veterinaria Brno, 76(3) : 383-390.
Widjaya  N.  2011.  Pengaruh  pemberian  susu skim  dengan  pengencer  tris  kuning  telur terhadap  daya  tahan  hidup  spermatozoa sapi  pada  suhu  penyimpanan  50C.  Jurnal Penelitian Ilmu Peternakan, 9(2) : 72 – 76.
Yani  A,  Nuryadi  TP.  2001.  Pengaruh  tingkat substitusi  santan  kelapa  pada  pengencer santan  kelapa  terhadap  kualitas  semen kambing peranakan etawa. J Biosains,1(1) : 12-5.