POTENSI KEMOPREVENTIF EKSTRAK ETANOLIK KULIT JERUK KEPROK ( Citrus reticulata ) PADA KARSINOGENESIS SEL HEPAR TIKUS GALUR SPRAGUE DAWLEY TERINDUKSI  DMBA

## CHEMOPREVENTIF POTENCY OF ETHANOLIC EXTRACT OF Citrus reticulata ON DMBA INDUCED RAT LIVER CELL CARCINOGENESIS
Edy Meiyanto *, Diah Ayu Putri K.W, Perdana Adhi N, Andita Pra Darma, Muthi Ikawati Cancer Chemoprevention Research Center Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta meiyan_e@ugm.ac.id

## ABSTRAK
Salah  satu  titik  tangkap  strategi  penemuan  agen  kemopreventif  kanker  khususnya  kanker hepar  adalah  melalui  penghambatan  proliferasi  dan  penekanan  ekspresi  onkogen  c-Myc . Tangeretin, nobiletin, dan hesperidin adalah beberapa senyawa aktif dari kulit jeruk keprok ( Citrus reticulate )  dilaporkan  memiliki  efek  antiproliferatif  pada  berbagai  sel  kanker  secara  in  vitro.  Hasil penelitian ini dapat bermanfaat untuk mengetahui efek ekstrak etanolik kulit C. reticulata terhadap proliferasi  dan  penekanan  ekspresi  c-Myc  pada  sel  hepar  tikus  betina  galur  Sprague  Dawley berumur 40 hari terinduksi 7,12 Dimetilbenz[a]antrasen (DMBA). Tikus dikelompokan menjadi lima kelompok: (a) DMBA, tikus diinduksi DMBA secara peroral (p.o.), dengan dosis 20 mg/kgBB dalam minyak  jagung,  sebanyak  10  kali  selama  lima  minggu(b)  kontrol  pelarut  CMC-Na,  (c)  kontrol ekstrak  dosis  1500  mg/KgBB,  (d)  DMBA+ekstrak  750  mg/kgBB,dan  (e)  DMBA+ekstrak 1500 mg/kgBB. Ekstrak dilarutkan dengan CMC-Na 0,5% dan diberikan setiap hari, dimulai minggu kelima  setelah  pemberian  DMBA.  Tikus  dikorbankan  saat  awal  minggu  kesepuluh  setelah pemberian  DMBA.  Organ  hepar  diisolasi  dan  diawetkan  dengan  buffer  formalin  untuk  analisis proliferasi  dan  imunohistokimia  c-Myc.  Analisis  antiproliferasi  dilakukan  dengan  metode  AgNOR dan  hasil  menunjukan  bahwa  ekstrak  etanolik  kulit C.  reticulata dosis  750  mg/KgBB  memiliki potensi  tinggi  dalam  menghambat  proliferasi  dan  menekan  ekspresi  onkogen  c-Myc.  Hasil  ini menunjukkan  bahwa  ekstrak  etnolik  kulit Citrus  reticulata dapat  menghambat  proliferasi  pada  sel hepar tikus akibat pemberian DMBA melalui efek antiproliferasi dan penekanan ekspresi c-Myc.
. Kata kunci : Citrus reticulata, antiproliferatif, DMBA, AgNOR, c-Myc.

## ABSTRACT
One  of  the  strategies  in  the  discovery  of  the  cancer  chemoprevention  agent  especially  the liver  cancer  is  inhibition  of  proliferation  and  suppression  of  the  expression  of  c-Myc  oncogene. Tangeretin, nobeletin and hesperidin are some active compounds from tangerine ( Citrus reticulate ) peel that has been reported their anti-proliferative effect on various cancer cells in vitro . The study can be useful for determining the effects of ethanolic extract of C. reticulate peel on prolifetaion and suppression of c-Myc expression in the liver cells of strains of Sprague Dawley female rat induced 7,12-dimethylbenz[a]anthracene  (DMBA).  Rats  aged  40  days  divided  into  5  groups:  (a)  DMBA, DMBA-induced  rat  at  a  dose  of  20  mg/KgBW  in  corn  oil  given  10  times  in  5  weeks  per  oral,  (b) control  of  the  CMC-Na  solvent,  (c)  control  of  the  extract  at  a  dose  of  1500  mg/KgBW,  (d)  DMBA with  the  extract  at  a  dose  of  750  mg/KgBW  and  DMBA  with  the  extract  at  a  dose  of 1500 mg/KgBW. The extract that dissolved in CMC-Na 0.5% administered daily, started in the fifth week after DMBA was given and at the beginning of the tenth week, the rats were sacrificed. Liver was  isolated  and  preserved  using  buffered  formalin  for  proliferation  and  immuno-histochemical analysis  of  c-Myc.  The  analysis  was  conducted  by  AgNOR  method.  The  results  showed  that ethanolic  extract  of C.  reticulate peel  at  a  dose  of  750  mg/KgBW  has  higher  potency  to  inhibite proliferation of MDBA-induced liver cells  and  to suppress the expression of c-Myc oncogene than other  dose  level.  This  result  indicated  that  the  ethanolic  extract  of C.  reticulata peel  can  inhibit proliferation cell in rat liver induced by DMBA by antiproliferation effects and suppression of c-Myc expression.
Keyword : Citrus reticulata, antiproliferatif, DMBA, AgNOR, c-Myc.

## PENDAHULUAN
Penemuan  ekstrak  etanolik  kulit  jeruk keprok ( C. reticulata ) sebagai agen kemopreventif  menarik  untuk  dikaji.  Tanaman jeruk  banyak  mengandung  senyawa  flavonoid diantaranya  hesperidin,  naringin  dan  flavonoid polimetoksi  seperti  tangeretin  dan  noblitein (Nogata et  al .,  2006).  Senyawa  flavonoid  telah banyak  diteliti  manfaatnya  untuk  peningkatan kesehatan  dan  pencegahan  penyakit  kanker (Moriguchi et  al .,  2003).  Dengan  demikian  kulit jeruk  keprok  dapat  digunakan  sebagai  agen kemopreventif pada sel kanker hepar.
Proses  perkembangan  sel  kanker  terdiri dari  4  tahap,  yaitu  inisiasi,  promosi,  progresif dan  metastasis,  hal  tersebut  dapat  terjadi karena  adanya  paparan  zat  karsinogenik seperti  DMBA.  DMBA  merupakan  senyawa karsinogen  yang  dapat  membentuk  metabolit reaktif dan menyebabkan DNA adduct pada sel hepar  (Izzotti et  al., 1999). DNA  adduct akan memacu terjadinya mutasi genetik dan abnormalitas gen. Selanjutnya dapat menyebabkan  terjadinya  perubahan  fisiologi seluler. Overekspresi onkogen N-ras dan c-Myc oleh senyawa karsinogen merupakan abnormalitas  genetik  yang  sering  terjadi  pada kanker  hepar  (Kawajiri,  1993).  Aktivasi  melalui enzim  tersebut  dapat  dihambat  oleh  senyawa- senyawa flavonoid seperti flavone, hidroksiflavon  dan  galangin  (Zhai et  al., 1998). Oleh karena itu, senyawa flavonoid diperkirakan  dapat  menghambat  overekspresi N-ras dan c-Myc sehingga tingkat proliferasi sel dapat diturunkan.
Penelitian mengenai kandungan flavonoid dalam kulit jeruk keprok menunjukkan kemajuan  yang  positif  sebagai  sumber  bahan penghambat  pertumbuhan  sel  kanker.  Suatu hasil penelitian menyatakan bahwa ekstrak kulit jeruk  keprok  mempunyai  efek  antiproliferatif dan  dapat  menginduksi  apoptosis  pada  sel kanker  lambung  manusia  (Kim et  al., 2005). Hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa  di  dalam kulit  jeruk  keprok terdapat  senyawa  flavonoid yang  berkhasiat  dalam  pencegahan  penyakit kanker.
Penelitian  ini  bertujuan  membuktikan khasiat  kulit  jeruk  keprok sebagai  agen kemopreventif yang berperan dalam pencegahan penyakit kanker melalui uji efeknya terhadap penghambatan proliferasi dan penekanan  ekspresi  c-Myc.  Hasil  penelitian  ini dapat dijadikan landasan mengenai penggunaan kulit jeruk keprok sebagai alternatif pencegahan penyakit kanker hepar.

## METODOLOGI PENELITIAN Bahan Tanaman dan Preparasi Ekstrak
Jeruk  keprok  ( C.  reticulata )  diperoleh pada  bulan  Maret  tahun  2008  dari  Kali  Soro, Tawangmangu, Jawa  Tengah  dan telah dideterminasi  di  Laboratorium  Farmakognosi Bagian Biologi Farmasi Fakultas Farmasi UGM.
Sebanyak 494 gram serbuk dimaserasi dengan etanol  96%.  Fraksi  etanol  yang  diperoleh dipekatkan  dengan rotary  vaccum evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.

## Hewan Uji
Hewan  uji  yang  digunakan  adalah  tikus ( Rattus  norvegicus )  betina  galur Sprague Dawley yang  berumur  40  hari  dengan  berat badan  70-92  gram  yang  diperoleh  dari  Unit Pengembangan Hewan Percobaan, Universitas Gadjah Mada.

## Bahan Kimia
7,12-dimetilbenz[a]antrazena/DMBA (Sigma Chem. CO, St. Louis, MO) untuk induksi kanker, corn  oil sebagai  pelarut  DMBA, aquadest (Asia Lab), CMC-Na,  reagen AgNOR sebagai  pewarna  pengecatan  histopatologi, etanol  96%  (Merck,  Darmstadt), buffer formalin 10%  (Asia  Lab,  Yogyakarta)  sebagai  larutan fiksasi organ, paraffin, minyak imersi.

## Pemeriksaan Kandungan Flavonoid
Pemeriksaan kandungan flavonoid menggunakan  kromatografi  lapis  tipis.  Ekstrak yang  telah  diperoleh  dilarutkan  dalam  metanol p.a. kemudian  ditotolkan pada  gase diam silika gel  60-F254  (Merck,  Darmstadt).  Identifikasi flavonoid  dengan  fase  gerak  campuran  etil asetat-metanol-air (100:13,5:10). Flavonoid dideteksi  pada  sinar  tampak,  UV  254,  dan  UV 366 dengan pereaksi semprot sitroborat.

## Uji Karsinogenesis
Desain
penelitian ini merupakan modifikasi dari Tasminatun tahun 2005 . Hewan uji  dibagi  menjadi  5  kelompok,  masing-masing terdiri  dari  6  ekor  tikus.  Sebelum  digunakan, tikus  diadaptasikan  selama  3  hari  dan  hanya mendapat  pakan  dan  minum  secukupnya. Kelompok  A,  yaitu  kelompok  perlakuan  DMBA, diinduksi  DMBA  dalam corn  oil dengan  dosis 20 mg/kgBB p.o. sebanyak 10 kali selama satu bulan.  Kelompok  B,  yaitu  kelompok  kontrol pelarut  CMC-Na  dan  kelompok  C  adalah kelompok kontrol  ekstrak  dosis  1500  mg/kgBB. Kelompok D dan E, yaitu kelompok DMBA+ekstrak (750 dan 1500 mg/kgBB), diberi ekstrak  etanolik  kulit C.  reticulata yang disuspensikan  kedalam  CMC-Na  0,5%  setiap hari  selama  1  minggu  (dimulai  minggu  kelima setelah  pemberian  DMBA).  Setelah  pemberian DMBA  yang  terakhir,  semua  tikus  diberi  pakan hingga  akhir  pengamatan.  Memasuki  minggu ke-9,  tikus  diberi  perlakuan  ekstrak  selama 1minggu, selanjutnya dilakukan nekropsi. Organ  hepar  diisolasi  dan  diawetkan  dengan buffer formalin untuk analisis proliferasi.
Pengamatan  Proliferasi  Sel  dengan  AgNOR ( Argyrophillic Nucleolar Organizer Regions ) Preparat  histologi  diimersikan  dalam buffer  sodium  sitrat  (pH  6,0),  diinkubasi  di
dalam autoclave pada  suhu  120°C  (tekanan 1,1-1,2  bar)  selama  20  menit,  didinginkan sampai  suhu  37 C,  kemudian  diimersikan  ke dalam  larutan  pengecatan  perak  yang  terdiri dari  1  bagian  volume  gelatin  2%  dalam  asam formiat  1%  dan  2  bagian  larutan  perak  nitrat 25%  dalam  suhu  37 C,  selama  13  menit (Derenzini et  al .,  2003).  Pengamatan  jaringan dilakukan dengan mikroskop cahaya (Olympus, Japan).

## Analisis Data
Pengamatan proliferasi sel dengan mengkuantifikasi  terhadap  titik-titik  AgNOR dengan cara mAgNOR, yaitu dengan perhitungan  jumlah  seluruh  titik  hitam  pada minimal  100  sel  kemudian  dirata-rata  dengan cara membagi jumlah seluruh titik hitam dengan jumlah sel yang diamati (Derenzini et al ., 2000). Analisis  data  menggunakan  analisis  statistik dengan  metode one-way  ANOVA dengan  tes Tukey taraf  kepercayaan  95%  (P<0,05). Ekspresi c-Myc diamati secara kualitatif dengan melihat adanya warna coklat pada sitoplasma.

## HASIL
Ekstraksi  dan  Pemeriksaan    Kandungan Flavonoid
Sebanyak  494  gram  serbuk  kering diekstraksi,  didapatkan  1  kilogram  ekstrak kental  sehingga  diperoleh  rendemen  sebesar 2,15  %.  Reaksi  flavonoid  dengan  sitroborat
menghasilkan warna kuning pada sinar  tampak (Schneider,  1985).  Deteksi  flavonoid  dalam ekstrak mununjukkan hasil yang positif.
Tabel 1 – Identifikasi Flavonoid dideteksi dengan sitroborat No hRf Sinar tampak UV 254 UV 365 1 72 Kuning lemah Pemadaman Fluoresensi biru-ungu
Keterangan: hasil elusi ekstrak etanolik kulit jeruk keprok dengan cara Kromatografi Lapis Tipis menggunakan fase diam silika 60 F 254 dan fase gerak etil-asetat:metanol:air (100:13,5:10)

## Pengamatan Proliferasi Sel Hepar dengan Teknik Pewarnaan AgNOR
Metode  ini  memperkirakan  pembelahan sel  dengan  mengkuantifikasi  protein  NORs ( Nucleolar
Organiser Regions ) yang mengindikasikan  aktivitas  proliferasi  kultur  sel atau  sebuah  tumor  (Derenzini et  al ,  2003). Gambaran  preparat  AgNOR  organ  hepar menunjukkan bahwa jumlah black dot kelompok DMBA lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah kelompok  tanpa  perlakuan  (Gambar  4a  dan 4b).  Hasil  ini  menunjukkan  adanya  aktivitas proliferasi  yang  berlebihan  pada  kelompok DMBA dibandingkan kelompok tanpa perlakuan.  Adanya aktivitas proliferasi sel  yang berlebih  pada  kelompok  DMBA  dimungkinkan terjadinya karsinogenesis pada hepar tikus.
(a) (b) (c) (d) (e)
Gambar  1 – Efek  penghambatan  proliferasi  sel  hepar  tikus  terinduksi  DMBA  oleh  ekstrak  etanolik  kulit C.  reticulata . Pengukuran  proliferasi  sel  dilakukan  dengan  pewarnaan  menggunakan  perak  nitrat.  Aktivitas  proliferasi  ditunjukkan  oleh jumlah black dot yang  terdapat pada sel (ditunjukkan dengan tanda panah). Gambar di atas menunjukkan sel hepar tikus kelompok:  DMBA  (a),  kontrol  pelarut  CMC-Na  0,5  %    (b),  kontrol  ekstrak  dosis  1500  mg/kg  BB  (c),  DMBA+ekstrak  750 mg/kgBB (d) dan DMBA+ekstrak 1500 mg/kgBB (e) pada mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000x. Preparat histologi jaringan diimersikan dalam buffer sodium sitrat (pH 6,0) kemudian diinkubasi di dalam autoclave pada suhu 120°C (tekanan 1,1-1,2 bar).
Gambar 2 – Efek penurunan jumlah blackdot sel hepar tikus akibat pemberian ekstrak kulit jeruk keprok . Kuantifikasi black dot pada sel hepar yang menunjukkan penurunan persentase jumlah black dot karena pemberian ekstrak (purata blackdot + SD) diperoleh dengan menghitung 100 sel tiap lapang pandang dengan perbesaran 1000x, sebanyak 10 lapang pandang yang  berbeda.  Semua  kelompok  perlakuan  menunjukkan  perbedaan  signifikan  dengan  kelompok  DMBA  dengan  taraf signifikansi dengan p < 0,05.
Jumlah black dot pada kelompok perlakuan  DMBA+ekstrak  (750  dan  1500 mg/kgBB)  lebih  sedikit  dibandingkan  jumlah black dot kelompok DMBA (Gambar 1a, 1d, dan 1e).  Penurunan  jumlah black  dot menunjukkan bahwa  ekstrak  dapat  menurunkan  tingkat proliferasi  sel  hepar.  Penurunan  jumlah black dot bersifat  tergantung  dosis.  Analisis  statistik dengan  menggunakan  uji one-way  ANOVA memberikan  perbedaan  skor  mAgNOR  secara signifikan  antara  kelompok  DMBA  dengan DMBA+ekstrak  1500  mg/kgBB  (Gambar  2). DMBA+ekstrak  1500  tidak  berbeda  signifikan terhadap  terhadap  kontrol  pelarut  dan  kontrol ekstrak (P > 0,05).
Peningkatan proliferasi sel dan terjadinya overekspresi  onkogen  merupakan  alasan  yang menjadikan penyakit kanker sangat mematikan. Pentingnya  penekanan  ekspresi  onkogen  dan penghambatan  proliferasi  sel  pada  penyakit kanker telah menjadi target pencegahan kanker (Kawajiri, 1993). Salah satu metode yang dapat digunakan  untuk  mendeteksi  ekspresi  onkogen adalah dengan Immunohistokimia.

## PEMBAHASAN
Salah  satu  senyawa  dalam  kulit C. reticulata yang  mempunyai  efek  kemopreventif adalah  flavonoid.  Mekanisme  pencegahan kanker oleh senyawa flavonoid meliputi antiproliferasi, cell cycle arrest , dan  penekanan ekspresi  onkogen  tertentu  (Ren et  al .,  2003). Hal tersebut didukung dengan penelitian secara in  vitro  yang  menunjukkan  ekstrak  kulit  jeruk Keprok ( C. reticulata ) mempunyai efek antiproliferasi dan dapat menginduksi apoptosis pada  sel  kanker  lambung  SNU-668  (Kim et al ., 2005). Dalam penelitian ini ekstrak etanolik kulit C.  reticulata mempunyai  kandungan  flavonoid yang telah dibuktikan dengan pereaksi sitroborat.
Kandungan polimetoksi flavonoid tangeretin dan nobiletin dalam kulit jeruk keprok sangat  tinggi.  Tangeretin  dilaporkan  dapat menghambat  invasi  dan  metastasis  pada  sel HL-60  (Bracke et  al .,  1994),  selain  itu  nobiletin juga  bersifat  antiproliferatif  pada  sel  kanker skuamosa  (Kandawaswami et  al .,  1991). Tangeretin juga dapat menghambat pertumbuhan  sel    fase  G1  pada  sel  kanker COLO 205 (Pan et al., 2002). Dalam penelitian ini pemberian ekstrak selama 7 hari menunjukkan hasil bahwa kandungan senyawa yang terdapat dalam ekstrak dapat menghambat proliferasi pada sel hepar
terinduksi DMBA (Gambar 1d dan 1e). Wardani et  al., 2008  juga  meyebutkan  bahwa  ekstrak etanolik  kulit C.  reticulata mampu  menekan ekspresi  c-Myc  pada  hepar  tikus  terinduksi DMBA.
Salah satu mekanisme penurunan insidensi  kanker  pada  sel  hepar  setelah pemberian  ekstrak  kemungkinan  disebabkan oleh  suatu  senyawa  aktif  yang  terkandung  di dalam  ekstrak.  Senyawa  di  dalam  ekstrak etanolik  kulit  jeruk C.  reticulata yang  diduga mempunyai  efek  tersebut  adalah  senyawa golongan flavonoid terutama golongan polimetoksiflavon  (Walle,  2007).  Terjadinya penurunan  proliferasi  dan  penurunan  ekspresi c-Myc dimungkinkan karena kandungan flavonoid  tangeretin  dan  nobiletin.  Hal  tersebut merujuk  pada  penelitian  Nugroho et  al (2008) yang  menyebutkan  bahwa  kedua  senyawa tersebut  mampu  berinteraksi  dengan  ligan  c- Src  yang  merupakan up  stream dalam pembentukan  c-Myc.  Namun  dalam  penelitian ini  keberadaan  tangeretin  dan  nobiletin  dalam ekstrak belum diketahui kadarnya. Oleh karena itu  perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut mengenai hal tersebut.
Prospek ekstrak etanolik kulit C. reticulata dapat digunakan sebagai suppressing agent pada  karsinogenesis  karena  dapat menghambat proliferasi dan mempunyai kemampuan menekan ekspresi onkogen c-Myc (Wardani et al., 2008). Penelitian ini menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanolik  kulit C. reticulata mempunyai  potensi  kemopreventif yang  besar  dalam  menghambat  pertumbuhan kanker  hepar.  Hasil  penelitian  ini  dapat dijadikan  landasan  menganai  penggunaan  kulit C.  reticulata sebagai  bahan  kemopreventif  dan dapat juga dipergunakan untuk pengembangan penelitian-penelitian selanjutnya mengenai terapi kanker hepar.

## KESIMPULAN
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa pemberian  ekstrak  etanolik  kulit  jeruk  keprok dapat menekan karsinogenesis melalui penghambatan proliferasi dan penekanan ekspresi  c-Myc  pada  sel  hepar  tikus  terinduksi DMBA,  sehingga  kulit  jeruk  keprok  dapat dijadikan bahan kemopreventif.

## UCAPAN TERIMAKASIH
DP2M  DIKTI  yang  telah  membantu    mendanai penelitian ini melalui program PKM 2008

## DAFTAR PUSTAKA
Bracke,  M.,  Bruyneel,  E.A.,  Vermeulen,  S.J.,  Vennekens,  K.,  Marck,V.V. and Mareel,  M.M.  1994. ‘Citrus flavonoid effect on tumor invasion and metastasis’, Food Technol, vol. 48, pp. 121 –142
Derenzini,  M.,  Trere,  D., O’Donohue,  M.  F. and ,  Ploton,  D.  2003.  Interphase  Nucleolar  Organiser Regions  in  Tumour  Pathology.  Crocker,  J  and  Murray,  P.G  (editor), Molecular  Biology  in  Cellular Pathology . John Wiley & Sons Ltd, Chichester
Wardani,  D.A.P.K.,  Nugroho,  P.A.,  Darma,  A.P.,  Ikawati,  M.,  Riyanto,  S., and Meiyanto.,  2008, Potensi  Kemopreventif  Ekstrak  Etanolik  Kulit  Jeruk  Keprok  ( Citrus  reticulata )  pada  Sel  Kanker Hepar  Tikus  Galur  Sprague  Dawley  Terinduksi  7,12-dimetilbenz[a]antrasena  Melalui  Penekanan Ekspresi  c-Myc, Prosiding  Kongres  Ilmiah  ISFI  XVI  2008 ,  ISBN:  978-979-95107,  Ikatan  Sarjana Farmasi Indonesia
Izzotti,  Alberto,  Camoirano,  Anna,  Cartgilia,  C.,  Grubbs, and Clinton  J.  1999. ‘Patterns  of  DNA Adduct  Formation  in  Liver  and  Mammary  Epithelial  Cells  of  Rats  Treated  with  7,12- Dimethylbenz[a]anthracene,  and  Selective  Effects  of  Chemopreventive  Agents ’, J.Can.  Res ,  vol. 59, pp. 4285-4290
Kandawaswami,  C.,  Perkins,  E.,  Soloniuk,  D.S.,  Drzewiecki,  G. and Middleton,  E.,Jr.  1991. Antiproliferative effects of citrus flavonoids on a human squamous cell carcinoma  in  vitro , Cancer Lett, vol. 56, pp. 147 –152
Kawajiri,  K.,  Nakachi,  K.,  Imai,  K.,  Watanabe,  J and Hayashi,  S  (1993)  The  CYP1A1  gene  and cancer susceptibility. Crit Rev Oncol Hematol 14:77 –87
Kim, M.J., Park, H.J., Hong, M.S.,  Park, H.J., Kim, M.S., and Leem, K.H., 2005. Citrus Reticulata Blanco Induces Apoptosis in Human Gastric Cancer Cells SNU-668, Nutrition and Cancer , vol. 51, no.1, pp. 78 –82
La Rosa, F.A., 1994, Differential Regulation of the c-Myc Oncogene Promotor by the NF-kB Rel Family of Transcription Factor, Molecular and Cellular Biology ,1039 –1044
Moriguchi, T., Kitai, M., Hasegawa, S., and Omur, M. 2003. ‘Molecular approach to citrus flavonoid and limonoid biosynthesis ’, Food, Agriculture & Environment , vol. 1, no. 1, pp. 22 –25
Nogata,  Y.,  Sakamoto,  K.,  Shiratsuci,  H.,  Ishii,  T.,  Yano,  M and Ohta,  H.  2006. ‘Flavonoid Composition of Fruit Tissues of Citrus Species ’, Biosci.Biotechnol.Biochem , vol. 70, no.1, pp. 178- 192
Pan, M. H., Chen, W. J., Shiau, S. Y. L., Ho, C. T., and Lin, J. K. 2002. Tangeretin Induced Cell Cycle G1 Arrest through Inhibiting Cyclin Dependent Kinases 2 and 4 Activities as well as Elevating Cdk  Inhibitor  p21  and  p27  in  Human  Colorectal  Carcinoma  Cell, Carcinogenesis, vol.  23,  no.  10, pp. 1677 –1684
Nugroho, P.A.., Wardani, D.A.P.K, Darma, A.P., Riyanto, S., and Meiyanto, E., 2008., Penelusuran Mekanisme  Penekanan  Ekspresi  N-RAS  Ekstrak  Etanolik  Kulit  Jeruk  Keprok  ( C.  reticulata ) Sebagai Agen Kemopreventif Melalui Docking Molekuler Pada Protein Target C-Src dan CYP1A2, Prosiding Kongres Ilmiah ISFI XVI 2008 , ISBN : 978-979-95107, Ikatan Sarjana Farmasi Indonesia
Ren,  W.,  Zhenhua,  Q.,  Hongwei,  W.,  Lei,  Z., and Li,  Z.  2003.  Flavonoids:  Promising  Anticancer Agents, Medicinal Research Reviews , vol. 23, no. 4, pp.519 –534
Walle,  T.,  2007,  Methoxylated  flavones,  a  superior  cancer    chemopreventive  flavonoid subclass? ,Seminars in Cancer Biology , vol. 17, 354 –362
Zhai,  S.,  Dai,  R.,  Friedman,  F.  K., and Vestal,  R.  E.,  1998,  Comparative  inhibition    of  human Cytochromes  P4501A1  and  1A2  by  flavonoids, The  American  Society  for  Pharmacology  and Experimental Therapeutics vol. 26, no. 10, 989 –992