Karakterisasi Protease asal Kapang Endofit Fusarium sp. JE-DP4a
Characterization of Protease from Endophytic Fungi Fusarium sp. JE-DP4a
Aerma Hastuty *) , Irma Herawati, Megga Ratnasari Pikoli Pusat Riset Biologi-BRIN, Cibinong Science Center, Jl. Raya Jakarta-Bogor, KM. 46, 16911 *E-mail: mima_hdy@yahoo.com

## ABSTRACT
Protease is a catalytic enzyme that catalyzes a proteolysis process and breaks down a protein into smaller polypeptides or  amino acids. Endophytic fungi can produce bioactive compounds, one of which is protease enzymes. The papaya leaf endophytic fungi used in this study was Fusarium sp. strain  JE-DP4a.  This  study  was  conducted  to  determine  the  characterization  of  protease  from endophytic fungi Fusarium sp. strain JE-DP4a with variations in incubation temperature of 30, 37, and  44 o C  and  pH  variation  of  5.5-8.  Measurement  of  protease  enzyme  activity  using  a spectrophotometer UV-Vis at 280 nm. Based on the research results, the highest protease activity produced  at  a  temperature  of  44 o C  is  53.78  U/mL,  and  specific  activity  is  17.31  U/mg  protein. Protease  activity  at  pH  7  shows  the  highest  was  46.72  U/mL.Thus  it  is  ably  concluded  that  the protease produced by Fusarium sp. strain JE-DP4a belongs to the neutral protease group.
Keywords: Protease, Fusarium sp. strain JE-DP4a, Endophyte, Fungi.

## PENDAHULUAN
Protease  (E.C.  3.4.11-24)  merupakan  enzim katalitik yang memiliki peranan dalam menghidrolisis ikatan peptida protein kemudian memecahnya  menjadi  polipeptida  atau  asam amino bebas (Alnahdi 2012, Souza et al . 2017). Protease,  merupakan  salah  satu  dari  tiga kelompok enzim industri terbesar, menyumbang sekitar  60%  dari  penjualan  enzim  di  seluruh dunia (Rupali 2015). Keberadaan protease dapat ditemukan  pada  tanaman,  hewan  dan  mikroba yang  meliputi  bakteri,  kapang,  alga  dan  virus (Mahajan  &  Badgujar  2010).  Namun  pada dekade ini, pencarian dan pemanfaatan protease banyak dilakukan dengan memanfaatkan mikroba  salah  satunya  adalah  kapang  endofit. Protease  yang  dihasilkan  dari  kapang,  banyak digunakan  dalam  aplikasi  industri  pembuatan keju,  penjernihan  bir,  pengubah  protein makanan dan hidrolisat protein.
Pemanfaatan  mikroba  endofit,  khususnya kapang  endofit,  sudah  mulai  dilakukan  dalam produksi  protease  dikarenakan  mikroba  dapat tumbuh dengan cepat dan membutuhkan ruang yang  sangat  terbatas  untuk  pertumbuhannya (Sharma et al . 2015), serta biaya produksi yang rendah  dibandingkan  dengan  enzim  dari tumbuhan dan  hewan  (Zaferanloo et al . 2014). Meskipun  demikian,  beberapa  tanaman  yang memiliki  kemampuan  dalam  menghasilkan protease masih digunakan.
Tanaman Carica  papaya L.,  memiliki potensi untuk menghasilkan protease diantaranya yaitu papain yang berasal dari getah
pepaya.  Selain  itu,  getah  pepaya  banyak mengandung sistein  endopeptidase,  glisil endopeptidase, sistein proteinase, inhibitor serin protease,  glutaminyl  cyclase  caricain,  dan chymopapain  (Azarkan et al . 2006, Huet et al . 2006). Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari karakterisasi ekstrak kasar protease  yang  dihasilkan  oleh  kapang  endofit Fusarium sp. JE-DP4a yang diisolasi dari daun pepaya.  Pemilihan  kapang  endofit  dalam penelitian  ini  dikarenakan  penelitian  tentang kapang  endofit  asal  tanaman  pepaya  yang memiliki  aktivitas  protease  belum  banyak dilakukan.

## METODE

## Mikroorganisme
Mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Fusarium sp.  JE-DP4a  merupakan  kapang endofit  yang  diisolasi  dari  daun  tanaman  pepaya ( Carica papaya L.).

## Isolasi Kapang Endofit
Isolasi  kapang  endofit  dilakukan  menggunakan media Malt  Extract  Agar (MEA)  dengan  komposisi (g/L): 30 g ekstrak malt, 5 g pepton dan 15 g agar. Daun  pepaya  terlebih  dahulu  dicuci  bersih menggunakan  air  mengalir,  kemudian  dipotomg- potong  dengan  ukuran  5  x  5  cm.  Potongan  bagian daun  disterilisasi  menggunakan  metode surface sterilization mengacu  pada  Hashim et  al .  (2021) dengan sedikit modifikasi. Potongan daun dimasukkan  kedalam  larutan  chlorox  3%,  selama  1 menit,  kemudian  dipindahkan  kedalam  larutan alkohol  70%,  selama  5  menit,  kemudian  dibilas menggunakan  akuades  steril  selama  5  menit. Potongan  daun  yang  telah  disterilisasi,  dikeringkan menggunakan  kertas  tisu  steril,  kemudian dipotong-
potong dengan ukuran 1×1 cm menggunakan gunting atau scapel steril,  kemudian  diletakkan  diatas permukaan media MEA dan diinkubasi selama 7 hari pada suhu 28 o C.

## Pengujian Aktivitas Protease secara Kualitatif
Pengujian  dilakukan  dengan  menggunakan  media Skim Milk Agar (SMA) dan diinkubasi selama 7 hari pada  suhu  30 o C.  Adapun  komposisi  media  SMA (g/L) yaitu 28 g susu skim, 5 g tryptone , 2,5 g yeast extract , 1 g dekstrosa, 15 g agar. Keberadaan aktivitas proteolitik ditandai dengan terbentuknya zona jernih pada sekitar koloni kapang.

## Produksi Enzim Protease
Produksi  protease  dilakukan  menggunakan  media Czapek- dox +  kasein  dengan  komposisi  (g/L)  30  g sukrosa,  1  g  K 2 HPO 4 ,  0,01  g  FeSO 4 .7H 2 O,  0,5  g MgSO 4 .7H 2 O,  0,5  g  KCl,  3  g  NaNO 3 ,  dan  10  g kasein.  Isolat  kapang  yang  telah  diisolasi  di  media MEA,  diinkubasi  selama  7  hari,  kemudian  bagian hyphal tip dicetak bentuk bulatan menggunakan cork borer atau  sedotan  steril.  Sebanyak  20  bulatan diinokulasikan  dalam  200  mL  media  produksi  dan diinkubasi  selama  7  hari  dalam shaker  incubator (30 o C,  120  rpm).  Ekstrak  enzim  dilakukan  melalui
pemisahan antara
filtrat dan supernatan menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama  15  menit.  Supernatan  yang  dihasilkan merupakan  ekstrak  kasar  enzim  (Yusriah  & Kuswytasari, 2013 dengan modifikasi).

## Pengujian Aktivitas Protease secara Kuantitatif
Pengukuran  aktivitas  protease  dilakukan  selama  7 hari  dan  mengacu  pada  metode  Chow  &  Peticolas (1948)  yang  telah  dimodifikasi.  Sebanyak  0,5  mL bufer fosfaf 0,2 M, pH 7,0 ditambahkan dalam 2 mL substrat kasein 1% (b/v), kemudian diinkubasi selama 10  menit  pada  suhu  37 o C.  Setelah  itu  ditambahkan ekstrak kasar enzim sebanyak 0,5 mL dan diinkubasi selama  30  menit.  Selanjutnya  reaksi  dihentikan dengan  penambahan  2,5  mL  asam  trikloroasetat (TCA) 5% dan diinkubasi selama 20 menit dalam ice bath agar  enzim  tidak  terdenaturasi,  kemudian disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Aktivitas enzim ditentukan dengan menentukan kadar  tirosin  menggunakan  Spektrofotometer  UV- Vis  pada  λ280  nm.  Satu  unit  aktivitas  protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghidrolisis  kasein  untuk  menghasilkan  1  µg tirosin  tiap  menit  (Huang et  al .  2006).  Aktivitas protease dihitung menggunakan rumus:
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑒  ( 𝑈 𝑚𝐿 ) µ𝑚𝑜𝑙 𝑇𝑦𝑟𝑜𝑠𝑖𝑛 ×(A) (B) ×(C)×(D) (1)
A= Total volume (mL) uji B= Waktu inkubasi (menit) sebagai definisi per Unit C= Volume enzim yang digunakan (mL) D= Volume kuvet (mL)
Aktivitas  spesifik  protease  yang  dihasilkan  oleh Fusarium sp.  JE-DP4a  dihitung  menggunakan rumus:
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑆𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑘  ( 𝑈 𝑚𝑔 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 ) = (A) (B) (2)
A= Unit aktivitas protease (U/mL) B= Kadar protein (mg/mL)

## Optimasi  pH  dan  Suhu  Terhadap  Aktivitas Protease
Metode  pengukuran  mengacu  pada  (Chow  & Peticolas 1948) yang telah dimodifikasi. Optimasi pH terhadap aktivitas protease dilakukan pada variasi pH 5,5  ‒  8.  Sementara  itu,  optimasi  suhu  dilakukan dengan  variasi  suhu  30,  37  dan  44 o C.  Pengukuran aktivitas dilakukan selama 7 hari .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengujian Aktivitas Protease secara Kualitatif Berdasarkan hasil penelitian mengenai pengujian  aktivitas  protease  secara  kualitatif, diketahui  bahwa Fusarium sp.  JE-DP4a memiliki aktivitas proteolitik (Gambar 1).
Gambar  1.  Pengujian  aktivitas  protease Fusarium sp  JE-DP4a  secara kualitatif.
Skim  milk yang  digunakan  sebagai  substrat dalam  pengujian  aktivitas  protease  memiliki kandungan  kasein  yang  berfungsi  sebagai substrat dalam kerja aktivitas protease sehingga kasein  akan  terhidrolisis  menjadi  senyawa peptida  dan  asam  amino  yang  sifatnya  larut dalam medium.
Protein kasein terdiri dari fosfoprotein yang dapat berikatan dengan kalsium dan membentuk garam  kalsium  kalseinat  sehingga  dapat menghasilkan  warna  putih  (Choirunissa et  al . 2017).  Jika  kasein  terhidrolisis  oleh  protease, maka  warna  putih  yang  terbentuk  akan menghilang  dan  menyebabkan  warna  medium menjadi bening. yang menyebabkan terbentuknya zona jernih di sekitar koloni.
Pengujian Aktivitas Protease secara
Kualitatif
Protease  atau  dikenal  juga  sebagai  peptidase atau  proteinase  merupakan  enzim  proteolitik. Aktivitas  protease  dari Fusarium sp.  JE-DP4a memperlihatkan aktivitas tertinggi berada pada hari  ke-7  yaitu  sebesar  27,867  U/mL  (Gambar 2).  Aktivitas  protease  terjadi  dikarenakan
adanya  proses  hidrolisis  kasein  oleh  enzim proteolitik menjadi peptida dan asam amino.
Gambar 2. Aktivitas protease Fusarium sp. JE- DP4a
Gambar  3.  Pengaruh  suhu  terhadap  aktivitas protease  (A)  dan  aktivitas  spesifik (B) dari Fusarium sp. JE-DP4a
Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Protease Pengujian aktivitas protease pada berbagai suhu dilakukan  untuk  mengetahui  suhu  optimum aktivitas  protease  dari Fusarium sp.  JE-DP4a. Berdasarkan  hasil  penelitian  diketahui  bahwa aktivitas  protease  tertinggi  dapat  dihasilkan pada suhu 44 o C  yaitu sebesar 53,78 U/mL dan aktivitas  spesifik  sebesar  17,31  U/mg  protein (Gambar 3).
Aktivitas  enzim  tersebut  dapat  dikatakan cukup tinggi bila dibandingkan dengan kapang endofit Penicillium sp. yang memiliki aktivitas protease  sebesar  2,426  U/mL  (Yusriah  & Kuswytasari  2013).  Namun  aktivitas  protease dari Fusarium sp  JE-DP4a  lebih  rendah  bila dibandingkan  dengan Alternaria  alternata EL-
17  yang  diisolasi  dari  tanaman Cupressus tulurosa D.Don. yang memiliki aktivitas sekitar
56 U/mL pada suhu optimum 27 o C (Agrawal et al . 2016).
Sementara  itu,  pada  suhu  30 o C  dan  37 o C, aktivitas protease yang dihasilkan yaitu sebesar 41,56  U/mL  dan  46,44  U/mL  dengan  aktivitas spesifik sebesar 13,38 U/mg  protein dan 14,95 U/mg protein.
Aktivitas spesifik protease ini memiliki nilai lebih rendah bila dibandingkan dengan aktivitas sperisik  dari A.  alternata yang  diisolasi  dari tanaman Eremophilia longifolia dengan aktivitas spesifik protease sebesar 69,86 BAEE (N-a-benzoyl  arginine  ethyl  ester)  U/mg  pada suhu optimum 37 o C (Zaferanloo et al . 2014).
Suhu  merupakan  salah  satu  faktor  yang  dapat mempengaruhi  kerja  enzim  dan  merupakan suatu  fenomena  yang  kompleks.  Aktivitas protease  yang  berlangsung  pada  suhu  rendah dapat  memperlambat  kerja  enzim,  sedangkan pada suhu yang lebih tinggi dari suhu optimum dapat menyebabkan denaturasi enzim sehingga akan  terjadi  penurunan  aktivitas  enzim. Menurut  (Noviyanti et  al .  2012),  tinggi rendahnya aktivitas protease sangat dipengaruhi oleh tinggi rendahnya suhu. Hal ini disebabkan karena adanya energi aktivasi yang dibutuhkan untuk meningkatkan sistem komplek aktif suatu molekul enzim maupun molekul substrat.

## Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Protease
Aktivitas  enzim  sangat  dipengaruhi  oleh  pH karena  ion  hidrogen  dapat  mempengaruhi aktivitas  dan  struktur  dimensi  enzim,  sehingga dapat meningkatkan atau menurunkan kecepatan  aktivitas  suatu  enzim.  (Yusriah  & Kuswytasari  2013),  menyatakan  bahwa  setiap enzim  memiliki  pH  optimum  yang  dapat mempengaruhi  struktur  tiga  dimensi  menjadi lebih kondusif dalam mengikat substrat.
Berdasarkan  hasil  penelitian,  aktivitas protease tertinggi berlangsung pada pH 7 yaitu sebesar 46,72 U/mL (Gambar 4), sehingga dapat dikatakan bahwa protease yang dihasilkan oleh Fusarium sp.  JE-DP4a  merupakan  protease kelompok  netral.  Pendapat  ini  didukung  oleh pendapat  dari  Nascimento  &  Martin  (2004), yang  melaporkan bahwa pH optimum protease berada  pada  pH  7-8,5  (netral).  Penurunan aktivitas  protease  dari Fusarium sp.  JE-DP4a dapat disebabkan karena adanya perubahan ion substrat dan enzim. Pendapat ini didukung oleh pendapat  Nirmala et  al .  (2021),  yang menyatakan bahwa perubahan ion substrat dan enzim  dapat  terjadi  pada  residu  asam  amino
yang berfungsi dalam mempertahankan struktur enzim  aktif  yang  terdapat  pada  struktur  tersier dan kuartener.
Gambar  4.    Pengaruh  pH  terhadap  aktivitas protease  dari Fusarium sp.  JE- DP4a Berdasarkan kelompoknya, protease
dibedakan  dalam  tiga  kelompok  yaitu  protease asam,  netral  dan  basa  atau  alkali.  Peneliti  lain melaporkan bahwa protease alkali berada pada kisaran pH 9-13 dan protease asam berada pada kisaran 2-6 (Chandrasekaran et al . 2015, Souza et al . 2015).
Zaferanloo et al . (2014), melaporkan dalam penelitiannya  bahwa  enzim  protease  kapang endofit aktif dalam kisaran pH yang luas, yaitu pH  3-9.  Agrawal et  al .  (2016),  melaporkan bahwa  kapang  endofit Alternaria  alternata mampu  menghasilkan  enzim  protease  dalam berbagai  kisaran  pH  yaitu  pH  3-12.  Selain  itu, Aspergilus  flavus memiliki  aktivitas  protease tertinggi pada pH 4 (Muthulakshmi et al . 2011), Aspergillus  niger PAM18A  pada  pH  9 (Ramadhani et al . 2015), Penicillium chrysogenum dan Aspergillus  niger pada  pH  9 (Sonia & Gupta 2015) .

## KESIMPULAN
Fusarium sp.  JE-DP4a  memiliki  aktivitas protease  tertinggi  pada  suhu  44 o C  yang merupakan  suhu  optimum  yaitu  sebesar  53,78 U/mL  dengan  aktivitas  spesifik  sebesar  17,31 U/mg  protein  dan  pH  optimum  7  dengan aktivitas protease sebesar 46,72 U/mL, sehingga dapat  disimpulkan  bahwa  protease  yang dihasilkan oleh Fusarium sp. JE-DP4a tergolong kedalam kelompok protease netral.

## DAFTAR PUSTAKA
Agrawal  PK,  Rajput  K  &  Chanyal  S.  2016. Optimization  of  Protease  Production  by Endophytic  Fungus, Alternaria  alternata Isolate  from  gymnosperm  tree- Cupressus torulosa D.Don.. World Journal of
Pharmacy  and  Pharmaceutical  Sciences . 5 (7): 1034-1054.
Alnahdi  HS.  2012.  Isolation  and  Screening  of Extracellular  Proteases  Produced  by  New
Isolated Bacillus sp.. Journal  of  Applied Pharmaceutical Science . 2 (9): 071-074.
Azarkan  M,  Dibiani  R,  Goormaghtigh  E, Raussens V, & Bayens-Volant D. 2006. The Papaya  Kunitz-Type Trypsin Inhibitor  is  A Highly Stable β-sheet glycoprotein. Biochimica  et  Biophysica  Acta  (BBA)-
Proteins and Proteomic . 1764 : 1036-1072. Chandrasekaran S, Kumaresan SSP &
Manavalan  M.  2015.  Production  and Optimization  of  Protease  by  Filamentous Fungus  Isolated  from  Paddy  Soil  in Thiruvarur  District  Tamilnadu. Journal  of Applied  Biology  &  Biotechnology . 3 (06):
066-069 .
Choirunissa HN, Sari RY, Hastuti US & Witjoro
A.  2017.  Identifikasi  dan  Uji  Kemampuan Hidrolisis  pada  Bakteri  Amilolitik  dan Proteolitik  yang  Diisolasi  dari  Wadi, Makanan  Khas  Kalimantan  Tengah. Jurnal Bionature . 18 (2): 99-109.
Chow  BF  &  Peticolas  M-A.  1948.  A  rapid Method for The Determination of Proteolytic Activities of Enzyme
Preparations. Journal  General  of  Physic , 32 (1): 17-24.
Hashim SN, Ghazali SZ, Sidik NJ, Chia-Chay T
&  Saleh  A.  2021.  Surface  Sterilization Method  for  Reducing  Contamination  of
Clinacanthus Nutans Nodal Explants Intended  for  in-vitro  culture. E3S  Web  of Conferences . 306 : 01004.
Huang  G,  Tiejing  Y,  Po  H  &  Jiaxing  J.  2006. Purification  and  Characterization  of  A Protease From Thermophilic Bacillus strain HS08. African  Journal  of  Biotechnology . 5 (24): 2433–2438.
Huet  J,  Looze  Y,  Bartik  K,  Raussens  V, Wintjens R & Boussard P. 2006. Structural Characterization  of  The  Papaya  Cysteine Proteinases  at  Low  pH. Biochemical  and Biophysical  Research  Communications . 341 : 620-626.
Mahajan RT & Badgujar SB. 2010. Biological Aspects of Proteolytic Enzymes: A Review Purification of NGAL View Project Wound Healing  Agents  of Plant Origin. Journal of Pharmacy Research . 3 (9): 2048-2068.
Muthulakshmi  C,  Gomathi  D,  Kumar  DG,
Ravikumar G, Kalaiselvi M & Uma C. 2011.
Production, Purification and
Characterization of Protease by Aspergillus Flavus Under  Solid  State  Fermentation. Jordan Journal of Biological Sciences . 4 (3):
137-148. Nascimento  AWC  &  Martins  MLL.  2004. Production and Properties of An Extracellular  Protease  from  Thermophilic Bacillus sp. Brazilian Journal of Microbiology . 35 : 91-96.
Nirmala D, Yudha P, & Cahyanto D. 2021. The Effect Of Ph And Incubation Time on Rude
Protease  Enzymes  Activity  of Bacillus Mycoides from Anchovy Isolates
( Stolephorus sp.). IOP  Conference  Series: Earth  and  Environmental  Science . 679 (1): 012075.
Noviyanti  T,  Ardiningsih  P  &  Rahmalia  W. 2012.  Pengaruh  Temperature  Terhadap Aktivitas  Enzim  Protease  dari  Daun Sansakng  ( Pycnarrhena  cauliflora Diels). Jurnal Kimia Khatulistiwa . 1 (1): 31-34. Ramadhani  P,  Rukmini  MGI  &  Pujiyanto  S.
2015.  Produksi  Enzim  Protease  dari Aspergillus  niger PAM18A  dengan  variasi pH  dan  Waktu  Inkubasi. Jurnal  Biologi . 4 (2): 25-34.
Rupali  D.  2015.  Screening  and  Isolation  of
Protease  Producing  Bacteria  From  Soil Collected from Different Areas of
Burhanpur Region (MP) India. International
Journal  Current  Microbiology  and  Apply Science . 4 (8): 597-606.
Sharma  AK,  Sharma  V,  Saxena  J,  Yadav  B, Alam  A  &  Prakash  A.  2015.  Isolation  and
Screening of Extracellular Protease Enzyme from Bacterial And Fungal Isolates of Soil. International Journal of Scientific Research in Environmental Sciences . 3 (9): 334-340. Sonia  S  &  Gupta  S.  2015.  Optimization  of Protease  Production  from  Fungi  Isolated From Soil. International Journal of Applied Biology  and  Pharmaceutical  Technology . 6 (3): 149-153.
Souza PM, de Assis Bittencourt ML, Caprara C
C, de Freitas M, de Almeida  RPC, Silveira D,  Fonseca  YM,  Filho  EXF,  Junior  AP  & Magalhães  PO.  2015.  A  Biotechnology Perspective of Fungal Proteases. In Brazilian  Journal  of  Microbiology . 46 (2): 337-346.
Souza PM, Werneck G, Aliakbarian B, Siqueira
F,  Filho  EXF,  Perego  P,  Converti  A,
Magalhães  PO  &  Junior  AP.  2017. Production, Purification and Characterization  of  An  Aspartic  Protease from Aspergillus  foetidus . Food  and
Chemical Toxicology . 109 : 1103-1110. Yusriah & Kuswytasari ND. 2013. Pengaruh pH dan  Suhu  Terhadap  Aktivitas  Protease Penicillium sp. Jurnal  Sains  dan  Seni Pomits . 2 (1): 48-50.
Zaferanloo B, Quang TD, Daumoo S, Ghorbani, MM,  Mahon  PJ  &  Palombo  EA.  2014. Optimization  of  Protease  Production  by Endophytic  Fungus, Alternaria  Alternata , Isolated  from  an  Australian  native  plant. World  Journal  of  Microbiology  and Biotechnology . 30 (6): 1755-1762.
134                                                 Karakterisasi Protease asal Kapang …                (Hastuty, dkk)