## FAGE LITIK SPESIFIK Escherichia coli PADA LIMBAH CAIR PASAR TRADISIONAL DI KOTA BANDA ACEH

## Iswadi
Program Studi Pendidikan Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Syiah Kuala, Darussalam 23111, Banda Aceh Email: iswadi_yusuf@unsyiah.ac.id

## ABSTRAK
Perubahan kondisi lingkungan  dan  perilaku pasien dalam mengkonsumsi antibiotik menyebabkan beberapa bakteri patogen menjadi  resisten. Peningkatan resistensi bakteri terhadap antibiotik mendorong aplikasi fage sebagai biokontrol untuk mereduksi bakteri patogen. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi fage litik pada limbah cair pasar  tradicional yang  mampu melisis bakteri Escherichia coli. Metode  plak  assay  digunakan  dalam  mendeteksi  fage  litik  pada  limbah  cair. Hasil assay  fage  dari  sampel  limbah  cair  pasar  tradisional  di  Kota  Banda  Aceh  memperlihatkan  tidak terdeteksi adanya fage litik spesifik E.coli, hal ini diperlihatkan oleh tidak adanya pembentukan zona bening pada media double layer (plak assay negatif).

## Kata Kunci: Fage litik, Escherichia coli, Limbah Cair

## ABSTRACT
Changes  in  environmental  conditions  and  behavior  in patients  taking  antibiotics  causes  some pathogenic  bacteria  become  resistant.  Increased  bacterial  resistance  to  antibiotics  encourages applications  as  biocontrol  phage  to  reduce  pathogenic  bacteria.  This  research  aims  to  detect  lytic phage  on  liquid  waste traditional  market in  lysizing Escherichia  coli bacteria.  Plaque  assay  method was used in detecting lytic phage in wastewater. The Phage assay results from samples of wastewater traditional markets in Banda Aceh showed that specific lytic phage of E. coli was not detected; it is shown by the absence of clear zone formation on double-layer media (plaque assay negative).
Keywords: Lytic Phage, Escherichia coli, Wastewater

## PENDAHULUAN
iare menjadi penyakit  gastroenteritis akut  dan  persisten  yang  menjadi salah satu penyebab paling umum morbiditas dan  mortalitas  di  Indonesia,  meskipun banyak laporan menyebut kan bahwa  Indonesia telah mencapai kemajuan pesat dalam pemberantasan diare. Prevalensi diare tertinggi di  Indonesia  pada  tahun  2007  adalah Provinsi Aceh  dengan angka tertinggi  18,9% [1].
Escherichia coli merupakan salah satu penyebab diare yang merupakan permasalahan kesehatan bagi masyarakat  di  Indonesia  meskipun  pada umumnya baru terindikasi  pada  kejadian luar biasa [2]. Hasil pengujian polaresistensi terhadap beberapa jenis antibiotik  secara in  vitro menunjukkan bahwa Escherichia coli mengalami resistensi terhadap antibiotik jenis  -
laktam ,    aminoglukosida,  golongankuinolon, dan  beberapa jenis antibiotik  yang  umum digunakan lainnya [3]. Kemudian Suardana, dkk.  (2014) menyimpulkan bahwa hampir semua isolat Escherichia coli yang diisolasi dari feses ayam memperlihatkan sifat resitensi terhadap metisilin  dan  penisilin  G  dan  sebagian lainnya menunjukkan sifat resistensi terhadap sulfa metoxazole-trimetoprim, doksisiklin hidroklorida dan streptomisin [4]. Perubahan kondisi lingkungan dan perilaku pasien dalam mengkonsumsi antibiotik menyebabkan beberapa bakteri patogen menjadi resisten. Peningkatan resistensi bakteri terhadap
antibiotik mendorong aplikasi fage sebagai biokontrol untuk mereduksi bakteri patogen.
Fage litik adalah suatu metode alami  dan  non toksik untuk mereduksi dan mengontrol pertumbuhan bakteri patogen manusia,  karena fage adalah bagian dari  gastrointestinal  dan ekosistem lingkungan. Fage dapat diisolasi dari limbah,  tinja, tanah,  air,  jaringan tubuh  yang  terserang penyakit atau produk dari pabrik susu. Sumber fage  yang  paling baik  dan  paling umum digunakan untuk mereduksi bakteri patogen adalah fage  yang  berasal dari hábitat inangnya. Berdasarkan laporan Ongunseitan et  al (1992), fage umum ditemukan  di  lingkungan terutama pada sampel limbah cair, yaitu sebesar 3,16x10 6
fage dalam  1  mL  air. Limbah merupakan hábitat bakteri fekal  (coliform)  dan  diduga  di dalam limbah mengandung banyak galur fage bakteri koliform  yang  beragam.  Beberapa fage telah diaplikasikan sebagai biokontrol pencemaran  air  dan  makanan,  namun belum banyak dilakukan di Indonesia [5]. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi fage litik pada limbah cair  pasar tradicional yang mampu melisis bakteri Escherichia coli, dan diharapkan dapat diaplikasikan sebagai biokontrol pencemaran air dan makanan sehingga dapat mencegah penyakit diare tanpa menggunakan terapi antibiotik. METODE PENELITIAN Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi  Program  Studi Pendidikan Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Syiah Kuala Darussalam Banda Aceh. Sampel limbah cair diperoleh dari Pasar Lamnyong Baru,  Pasar Peunayong dan Pasar  Kampong Baro Kota  Banda  Aceh. Penelitian ini memiliki beberapa tahapan utama yaitu:

## Peremajaan Bakteri Escherichia coli
Bakteri  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah Escherichia coli koleksi  Fakultas Kedokteran  Universitas  Syiah  Kuala Banda Aceh. Peremajaan dilakukan secara berkala pada media NA. Sebanyak satu lup bakteri Escherichia coli digoreskan  pada  media  agar miring  NA  secara  aseptik,  kemudian  diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam, disimpan pada suhu ruang dan diremajakan setiap dua bulan.
Isolasi Fage Pengambilan dan Filtrasi Sampel Sampel  untuk  isolasi  fage dikumpulkan  dari limbah  cair  Pasar  Lamnyong  Baru  Gampong Rukoh  Kecamatan  Syiah  Kuala Banda  Aceh, Pasar Peunayong dan Pasar Kampong Baro Kota Banda  Aceh yang disentrifugasi  pada  kecepatan
1052 x g selama 25  menit dan diulang dua kali. Escherichia coli digunakan  sebagai  detektor keberadaan  fage  spesifik.    Sebanyak  5mL  dari sel  pada  fase  logaritmik dari  bakteri  yang dibiakkan di dalam Nutrient Broth (NB), 10 mL
sampel  air  dan  50  mLNB  dicampurkan. Campuran    tersebut  diinkubasi  di  dalam inkubator  yang  diatur  pada  suhu  37  °C  selama 48  jam.  Setelah    masa  inkubasi  berakhir, suspensi  dijernihkan  dengan  sentrifugasi1052  x g selama 25 menit dan dua ulangan. Selanjutnya disaring menggunakan membran selulosa dengan  ukuran  pori  0,22  µm.  Suspensi  yang diperkirakan  mengandung  fage  disimpan  pada suhu 4 °C.
Asai Fage. Uji plak dua lapis agar (Adams 1959)  dilaksanakan  sebagai  berikut.  Sebanyak 100 µL suspensi fage ditambahkan ke dalam 100 µL kultur Escherichia coli yang telah diinkubasi satu malam pada NB dan dicampur dengan 7 mL agar lembut (NB yang mengandung 0,7 % agar). Campuran  agar  lembut  tersebut  dituang  ke  atas lempengan Nutrient  Agar(NA)  dan  kemudian diinkubasi  satu  malam  pada  suhu  37°C  dan diamati pembentukan plak.
Pemurnian Fage. Pemurnian fage dilakukan dengan mengadopsi metode Goodridge et  al (2003). Plak  tunggal  dengan  ciri-ciri tersendiri yang berasal dari plak assay dipindahkan  dengan  menggunakan  pipet  Pasteur ke dalam tabung, kemudian dicampurkan dengan 2 – 3  mL  pelarut  Ringers  konsentrasi  25%. Suspensi  fage  dihomogenkan  dan  dibiarkan selama  5 – 10  menit  pada  suhu  ruang.  Suspensi tersebut kemudian disentrifugasi dengan kecepatan  1052  x  g,  suhu  4°C selama  25  menit dan  diulang  dua  kali.  Supernatan  difiltrasi

## Iswadi
menggunakan  dengan  filter  berpori  0,22 µm, untuk selanjutnya disimpan sebagai stok fage.
Preparasi Persediaan Fage. Sebanyak 10 µL kultur Escherichia coli (10 8 CFU mL -1 )  umur satu malam dan  100  µL  fage  (10 8 PFU  mL -1 ) dicampur dengan  50  mLNB  dan diinkubasi  di dalam inkubator pengocok yang  diatur  pada kecepatan  120  rpm,  suhu  37  °C  selama  9jam. Suspensi diinkubasi dengan tambahan waktu 10 menit  dan  dikocok  pada  suhu  37  °C.  Suspensi kemudian disentrifugasi  pada  1052  x  g selama 25  menit dan  diulang dua kali.  Supernatannya disaring dengan saringan berpori  0,22  µm. Suspensi fage disimpan pada suhu 4 °C [6]. Kuantifikasi Fage. Kuantifikasi fage diukur dengan  cara  menghitung jumlah plak yang  terbentuk  (PFU  mL -1 ),  penentuannya dilakukan berdasarkan metode Foschino et  al.
(1995). Stok fage diencerkan sampai dengan 10 10 , kemudian dari masing-masing pengenceran tersebut diambil 100µL ditambahkan dengan  100µL  kultur bakteri E. coli yang  telah diinkubasi selama  9  jam  pada media NB. Suspensi diinkubasi selama 15 menit pada  suhu  37  °C.  Sebanyak  7  mL soft  agar bersuhu 42 °C dicampurkan, selanjutnya dituang ke media NA, diinkubasi pada 37 °C selama 24 jam,  diamati pembentukan plak  dan  dihitung jumlahnya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan fase  logaritmik dari bakteri inang dilakukan dengan melakukan penentuan kurva pertumbuhan. Metode turbidimetri (pengukuran jumlah sel bakteri berdasarkan kekeruhan)  digunakan untuk  análisis  jumlah sel bakteri inang,  dimana Optical Density (OD) berbanding lurus dengan jumlah sel [7].
Metode turbidimetri memiliki kelebihan,
yaitu cepat,  tidak destruktif,  dan  tidak mahal. Kurva pertumbuhan bakteri inang Escherichia coli ditampilkan pada Gambar 1.
Gambar 1. Kurva Pertumbuhan Bakteri E. coli
Sampel  untuk  isolasi  fage  dikumpulkan dari  limbah  cair  Pasar  Lamnyong  Baru Gampong  Rukoh  Kecamatan  Syiah  Kuala,
PasarPeunayongdanPasar  Kampong Baro Kota Banda Aceh. Hasil asai fage dari sampel limbah cair pasar-pasar tradisional tersebut memperlihatkan  tidak  terdeteksi  adanya  fage litik spesifik Escherichia coli, hal ini diperlihatkan  oleh  tidak  adanya  pembentukan zona  bening  pada  media double  layer (plak
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0 1 2
3 4 5 6 7 8 9
O p ti cal D en si ty (600 n m )
assay negatif)  (Gambar  2). Salah  satu indikator bahwa  di  dalam cairan limbah  yang  digunakan sebagai sampel tidak ditemukan mengandung bakteri Escherichia coli yang  merupakan inang bagi fage yang dideteksi adalah tidak ditemukannya zona pada saat plak assay. Namun demikian,  pernyataan ini belum dapat diterima sepenuhnya,  mengingat pada saat kegiatan penelitian dilaksanakan sedang berlangsung musim hujan dengan intensitas tinggi. Gambar 2. A, B, dan C Menunjukkan Hasil Plak Assay Negatif Kemudian,  fage merupakan  virus  yang menginfeksi bakteri dan hanya akan bereplikasi ketika menginfeksiinangnya. Pertumbuhan inang sangat mempengaruhi pembentukan plak, apabila pertumbuhan inang tidak merata akan mempengaruhi kemampuan infeksi fage dari satu sel ke sel lainnya. Pembentukan plak tidak
dapat berlangsung jika hanya beberapa sel terdekat saja dapat diinfeksi. Penggunaan media pendukung pertumbuhan  bakteri yang  lambat dapat  menyebabkan penurunan ukuran ledakan sel  yang  terinfeksi dan memungkinkan plak yang  terbentuk  juga akan berukuran sangat kecil sehingga tidak terdeteksi.

## KESIMPULAN

## Fagelitik yang  mampu melisis bakteri
Escherichia coli tidak terdeteksi  pada limbah cair  pasar  tradisional.  Tidak terdeteksinya fage
tersebut dapat dipengaruhi oleh musim hujan dengan intensitas tinggi atau plak  yang terbentuk berukuran sangat kecil.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Pusat  Data  dan  Informasi Kemenkes  RI. 2011.  SituasiDiare  di  Indonesia. Buletin Jendela  Data  dan  Informasi Kesehatan, 2(2): 1-18. [2] Hannif,  Mulyani NS., dan Kuschithawati S. 2011. FaktorResikoDiareAkut pada Balita. Berita Kedokteran Masyarakat,  27(1):  10- 17. [3] Noviana H. 2004. Pola Kepekaan Antibiotika Escherichia coli yang  Di isolasi dari Berbagai Spesimen Klinis. Jurnal Kedokteran Trisakti, 23(4): 122-126. [4] Suardana  IW,  Utama  IH,  Putiningsih  PAS, dan  Rudiyanto  MD.  2014.  Uji Kepekaan Antibiotika Isolat Escherichia coliO157:H7  Asal Feses Ayam. Buletin Veteriner Udayana, 6(1): 19-27. [5] Ongunseitan  OA,  Sayler  GS,  Miller  RV. 1992.  Aplication  of  DNA  probes  to analysis of bacteriofage distribution A B C
patterns  in  the  environment. Appl  Environ Microbiol 58:2046-2052.
[6] Goodridge  L,  Gallaccio  A,  Griffiths  WM. 2003.  Morphological,  host  range,  and genetic  characterization  of  two  colifages. ApplEnviron Microbiol 69: 5364-5371.
[7] Setya  RA  dan  Putra  SR.  2010.  Identifikasi Biohidrogen  secara  Fermentatif dengan Kultur Campuran Menggunakan Glukosa sebagai Substrat. Skripsi.  Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Sepuluh
November.
[8] Volk  AW  dan  Wheeler  MF.  1988. MikrobiologiDasar, Jilid I. Jakarta:
PenerbitErlangga.