Potensi Antibakteri dari Ekstrak Etanol Spons Agelas cavernosa
Andhika Dwi Aristyawan, Noor Erma Sugijanto, Suciati* Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya
*Corresponding author: suciati@ff.unair.ac.id

## Abstract
Background : Sponges from the genus Agelas have been reported to have antimicrobial activity, however there is no  report  on  the  antimicrobial  activity  of  Agelas  cavernosa. Objective :  The  aim  of  the  current  study  is  to investigate  the  antibacterial  activity  of  the  ethanolic  extract  of  marine  sponge  A.  cavernosa. Methods :  The antibacterial  activity  of  the  extract  was  determined  by  using  microdilution  method  against  Escherichia  coli ATCC  25922,  Staphylococcus  aureus  ATCC  6538,  Pseudomonas  aeruginosa  ATCC  27853.  P- iodonitrotetrazolium  chloride  reagent  was  added  to  visualize  the  presence  of  living  organism. Results :  The ethanolic extract of sponge A. cavernosa inhibited the growth of  all bacteria tested, with the highest inhibition against Pseudomonas aeruginosa at MIC 150 ppm. Conclusion : The ethanolic extract of A. cavernosa showed moderate antibacterial activity.
Keywords : antibacterial agent, microdilution, sponge, Agelas cavernosa
Abstrak Pendahuluan : Beberapa spons dari genus Agelas telah dilaporkan memiliki aktivitas antimikroba, namun belum ada  laporan  tentang  aktivitas  antimikroba  dari Agelas  cavernosa . Tujuan :  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol dari spons Agelas cavernosa . Metode : Aktivitas antibakteri pada ekstrak  ditentukan  dengan  menggunakan  metode  mikrodilusi  terhadap Escherichia  coli ATCC  25922, Staphylococcus  aureus ATCC  6538  dan Pseudomonas  aeruginosa ATCC  27853.  Pereaksi  warna p- iodonitrotetrazolium  chloride ditambahkan  dalam  sumuran  untuk  memvisualisasikan  adanya  bakteri  hidup. Hasil :  ekstrak  etanol  dari  spons A. cavernosa menghambat  pertumbuhan  ketiga  bakteri  uji  dengan  aktivitas antibakteri tertinggi pada Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dengan MIC 150 ppm. Kesimpulan : Ekstrak ethanol A. cavernosa menunjukkan aktivitas antibakteri.
Kata kunci : antibakteri, mikrodilusi, spons, Agelas cavernosa

## PENDAHULUAN
Di  Indonesia  penyakit  infeksi  merupakan  salah satu  masalah  kesehatan  yang  penting  (Kemenkes  RI, 2011). Setiap tahunnya dilaporkan sembilan juta orang meninggal karena penyakit infeksi, banyak diantaranya anak-anak  berusia  di  bawah  lima  tahun  mengalami infeksi  hingga  menyebabkan  cacat  seumur  hidup (WHO,  2018).  Adanya  bakteri  yang  resisten  terhadap beberapa  jenis  antibiotika  yang  dikenal  dengan  istilah superbugs semakin  memperparah  kasus  infeksi, misalnya  pada Eschericia  coli , Klebsiella  pneumoniae dan Staphyloccus aureus (NIH, 2014). Oleh karena itu diperlukan  adanya  penemuan  antibiotika  baru  yang diharapkan  dapat  mengatasi  permasalahan  ini.  Salah satu  sumber  alternatif  dalam  penemuan  antibiotika adalah  bahan  alam  baik  dari  tanaman  maupun  biota laut.
Indonesia memiliki sumber daya alam bahari yang besar.  Terdapat  beraneka  ragam  sumberdaya  alam hayati  laut  yang  meliputi  300  jenis  karang,  lebih  dari 200 jenis ikan serta beberapa jenis spons (Mokodompit dkk.,  2015).  Senyawa  denan  berbagai  bioaktivitas, anatara lain: antivirus, antibakteri, antikanker, antileukimia, antiinflamasi, insektisida, dan antihelmintik  telah  ditemukan  dari  spons  (Kim,2012). Hal  ini  membuat  spons  menjadi  salah  satu  hewan  laut yang  menarik  untuk  diteliti  karena  berpotensi  besar untuk  dikembangkan  dalam  bidang  pengobatan  salah satunya sebagai antibakteri (Abubakar dkk.,2011).
Beberapa spons dari genus Agelas telah dilaporkan memiliki  aktivitas  antibakteri.  Ekstrak  etanol  spons Agelas  nakamurai menunjukkan  aktivitas  antibakteri terhadap Mycobacterium  smegmatis dengan  zona hambat  22  mm  (50  mg/disc).  Diketahui  metabolit
sekunder  yang  ikut  berperan  terhadap  aktivitas antibakteri  tersebut  yaitu  Agelasine  A-F  dan  alkaloid bromopirol  (Yamazaki  dkk.,  2015).  Ekstrak  metanol dari  spons Agelas  clathrodes dlaporkan  memiliki aktivitas  antibakteri  yang  bersifat  bakterisida  terhadap Escherichia  coli , Mycobacterium  smegmatis dan bersifat  bakteriostatik  terhadap Staphylococcus  aureus dengan  menggunakan  metode  dilusi.  Senyawa  yang bertanggung  jawab  sebagai  antibakteri  pada A. clathrodes adalah  Agelasidine  (Medeiros  dkk.,  2006). Spons Agelas  cornifera juga  dilaporkan  memiliki aktivitas antibakteri terhadap beberapa bakteri pathogen  antara  lain Pseudomonas  aeruginosa , Salmonella  thypi , Aeromonas  hydrophila ,  dan Vibrio harveyi (Haris  dkk., 2013).
Berdasarkan kajian aktivitas antibakteri dari spons genus Agelas ,  belum  ditemukan  adanya  laporan aktivitas antibakteri dari spons Agelas cavernosa . Oleh karena  itu  penulis  tertarik  untuk  meneliti  aktivitas antibakteri  dari  spons Agelas  cavernosa yang  diambil dari sekitar pulau Barrang Lompo, Makassar, Sulawesi Selatan.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Sampel  berupa  spons  diambil  dari  perairan  di sekitar  pulau  Barrang  Lompo,  Makassar,  Sulawesi Selatan  pada  tanggal  17  Mei  2014.  Pengambilan sampel  ini  dilakukan  dengan  cara scuba  diving pada kedalaman  10  –  12  m  di  bawah  permukaan  air  laut. Sampel  kemudian  dibekukan  pada  suhu  -20°C  hingga dilakukan  analisa.  Identifikasi  sampel  dilakukan  di Laboratorium  Ekologi  Institut  Teknologi  Surabaya secara  mikroskopis.  Sampel  spons  diidentifikasi sebagai Agelas cavernosa .
Bahan  kimia  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  etanol  (Merck,  p.a),  asam  sulfat  (Merck), barium  klorida,  dimetilsulfoxid  (DMSO),  larutan kristal  violet,  larutan  lugol,  larutan  safranin,  pereaksi warna  INT p  -  iodonitrotetrazolium  chloride , siprofloksasin pharmaceutical  grade (kontrol  positif untuk bakteri), nutrient broth , dan larutan normal salin (0,9% NaCl).
Bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC  6538  dan Pseudomonas  aeruginosa ATCC 27853  yang  diperoleh  dari  Unit  Layanan  Pengujian, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga.
Alat
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah ultrasonik, rotary  evaporator , Laminary  Air  Flow
Cabinet (LAF),  inkubator, freeze  dryer, autoklaf, 96- well microplate, mikroskop, dan spektrofotometer.

## Ekstraksi
Spons  beku  dikeluarkan  dari  freezer  dan diletakkan  pada  suhu  ruangan  hingga  es  mencair,  lalu spons  basah  ditimbang  (709  g).  Permukaan  spons dibersihkan dengan cara dibilas menggunakan aquades untuk  menghilangkan  pengotor  mekanis,  seperti bintang  laut,  batu  karang  kecil,  dan  kerang.  Ukuran spons diperkecil  dengan cara dipotong-potong (ukuran sekitar  1cm).  Spons  selanjutnya  dikeringkan  dengan freeze  dryer .  Spons  kering  selanjutnya  dihaluskan dengan  blender  dan  diperoleh  serbuk  kering  spons sebanyak 99,5 g.
Serbuk spons kering diekstraksi dengan menggunakan  etanol  96%  dengan  bantuan  ultrasonik selama  3  x  10  menit  tiap  ekstraksi.  Filtrat  dipisahkan dari  residu  dengan  cara  disaring.  Residu  diekstraksi kembali  sebanyak  3  kali  dengan  metode  yang  sama. Total  volume  etanol  yang  digunakan  untuk  ekstraksi adalah  2  L.  Semua  filtrat  dikumpulkan  dan  diuapkan dengan rotary  evaporator pada  suhu  40°C  sehingga diperoleh ekstrak kental sebanyak 7,5 g.

## Uji antibakteri
Uji  aktivitas  antibakteri  dilakukan  secara in  vitro dengan  metode  mikrodilusi  menggunakan  3  macam bakteri  yaitu:  adalah Escherichia  coli ATCC  25922, Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC  27853.  Adapun  pelaksanaan  uji antibakteri ini dibagi dalam 3 tahap.

## Penyiapan bakteri uji
Bakteri  dibiakkan  pada  media  nutrient  agar  (NA) pada  suhu  37°C  selama  24  jam.  Kemudian  dilakukan pembuatan suspensi bakteri uji dengan cara mengambil biakan bakteri dan dilarutkan dalam larutan salin (0,9% NaCl)  secara  aseptik.  Tingkat  kekeruhan  suspensi dibandingkan  dengan  standard  0,5  McFarland  secara visual  dan  dilakukan  pengukuran  absorban  dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang  625  nm,  rentang  absorbansi  yang diperbolehkan  adalah  0,08  –  0,13  yang  setara  dengan 1-2 x 10 8 CFU/mL (Clinical and Laboratory Standards Institute,  2009)  untuk  uji  dilusi.  Kemudian  dipipet sebanyak  100  μl  dan  ditambahkan  media  dilusi ( nutrient  broth )  hingga  10  ml  sehingga  diperoleh suspensi  mikroba  dengan  jumlah  koloni  1-2  x  10 6 CFU/ml  (Wiegand  dkk.,  2008).  Suspensi  bakteri  ini yang  selanjutnya  digunakan  untuk  uji  aktivitas,  dan harus  digunakan  tidak  lebih  dari  30  menit  setelah pembuatan (Andrews, 2006).

## Penyiapan sampel uji
Larutan  uji  disiapkan  dengan  delapan  macam konsentrasi larutan uji yaitu 2000, 1000, 500, 400, 300, 200,  100,  dan  50  ppm.  Konsentrasi  sampel  ini selanjutnya  akan  menjadi  separuhnya  di  dalam microplate, yaitu menjadi 1000, 500, 400, 150, 100, 50 dan  25  ppm.  Semua  larutan  uji  dibuat  dalam  5% DMSO.  Sebagai  kontrol  positif  digunakan  larutan siprofloksasin  50  ppm  dan  kontrol  negatif  digunakan 5% DMSO. Konsentrasi sampel uji, kontrol positif dan kontrol  negatif  akan  menjadi  separuhnya  di  dalam microplate karena dilakukan pengenceran 1:1.

## Penentuan konsentrasi hambat minimum (KHM)
Konsentrasi hambat minimum merupakan konsentrasi terkecil dari sampel yang dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri.  Pada  penelitian  ini digunakan  modifikasi  metode  mikrodilusi  (Ellof, 1998). Sebanyak 50 µ L  larutan uji dengan konsentrasi berurutan  dari  besar  ke  kecil  dimasukkan  ke  dalam sumuran  pertama  hingga  delapan.  Pada  sumuran sembilan  ditambahkan  50 µ L  larutan  kontrol  positif, sumuran berikutnya dimasukkan 50 µ L larutan kontrol negatif, dan sumuran sebelas dimasukkan 50 µ L media dan  pada  sumuran  kedua  belas  dimasukkan  100 µ L media  sebagai  kontrol  media  (Gambar  1).  Selanjutnya pada  masing  masing  sumuran  ditambahkan  50 µ L suspensi bakteri uji.
Microplate diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama sekitar  24  jam  dan  diamati  terjadinya  kekeruhan  yang menandakan adanya pertumbuhan  bakteri. Selanjutnya pada setiap  lubang microplate ditambahkan 20 μl  INT (p  –  iodonitrotetrazolium  chloride) yang  telah dilarutkan  sebanyak  0,2  mg/ml  aquades  steril. 96-well microtiter plates diinkubasi kembali selama 10-60  menit  pada  suhu  37°C  (Ellof,  1998).  Apabila pada  lubang plate terjadi  kekeruhan  dan  disertai dengan  perubahan  warna  menjadi  merah  setelah penambahan  pereaksi  warna  INT  maka  menandakan adanya pertumbuhan bakteri.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji  aktivitas  antibakteri  ekstrak  etanol A. cavernosa dilakukan  terhadap  bakteri  Gram  positif yaitu Staphylococcus aureus serta bakteri Gram negatif Pseudomonas  aeruginosa dan Escherichia  coli. Bakteri P.  aeruginosa digunakan  karena  termasuk dalam  bakteri  patogen  yang  dapat  menyebabkan penyakit  pneumonia,  infeksi  saluran  kemih,  infeksi saluran pernafasan, sepsis, dan fibrosis kistik (Alhazmi,
2015),  sedangkan  bakteri  yakni Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus bakteri  ini  ditemukan  sebagai kontaminan  makanan  yang dijual  secara tidak  higienis sehingga  sering  menyebabkan  penyakit  saluran  cerna dan  diare  (Tan  dkk.,  2014).  Sebelum  digunakan  uji, semua  bakteri  uji  diidentifikasi  terlebih  dahulu menggunakan  pewarnaan  Gram  untuk  memastikan bahwa bakteri telah sesuai. Koloni bakteri Gram positif akan  berwarna  ungu  dan  koloni  bakteri  Gram  negatif akan berwarna merah. Perbedaan warna ini dikarenakan perbedaan struktur dinding sel bakteri dan perbedaan kandungan asam teiokat antara bakteri Gram positif  dan  bakteri  Gram  negatif.  Bakteri  Gram  positif memiliki peptidoglikan yang mengandung asam teiokat sehingga  dapat  menghindari  dekolorisasi  warna  kristal violet  oleh  alkohol.  Sebaliknya  untuk  bakteri  Gram negatif  tidak  memiliki  asam  teiokat  sehingga mengalami  dekolorisasi  warna  kristal  violet  oleh alkohol  dan  terbentuk  warna  merah  pada  pewarnaan dengan safranin (Forbes dkk., 2013). Hasil pengamatan menunjukkan  bakteri S.aureus berwarna  ungu  dan berbentuk  seperti  bola  yang  tersusun  berkelompok. Bakteri E.coli berwarna  merah  dan  berbentuk  batang pendek.  Bakteri P.aeruginosa berwarna  merah  dan berbentuk  basil-basil.  Hasil  ini  menunjukkan  bakteri yang digunakan sudah sesuai.
Pada  penelitian  ini  uji  aktivitas  antibakteri dilakukan  dengan  metode  mikrodilusi  karena  metode ini  dapat  memberikan  hasil  30  kali  lebih  sensitif dibandingkan dengan  metode difusi. Selain  itu  metode mikrodilusi dapat digunakan untuk analisis semikuantitatif  hingga  kuantitatif  sehingga  dapat menentukan  KHM,  tidak  mahal,  dan  sampel  yang digunakan  relatif  sedikit  dibandingkan  dengan  metode makrodilusi  (Ellof,  1998).  Pada  penelitian  ini ditambahkan  larutan  pereaksi  warna  INT  yang bertujuan  untuk  mengetahui  adanya  bakteri  hidup secara  visual  pada  setiap  sumuran  yang  ditandai dengan  adanya  warna  merah.  Reaksi  warna  ini  terjadi berdasarkan  transfer  elektron  dari  NAD+  menjadi NADH  yang  dikatalisa  oleh  TDH  ( Threonine dehydrogenase ) yang berasal dari bakteri. Selama masa aktif  pertumbuhan  bakteri,  elektron  ditransfer  dari NADH  ke  INT  dan  terjadi  proses  reduksi  membentuk kristal  formazan  yang  berwarna  merah (Angeh, 2006). Sehingga  bila  terjadi  pertumbuhan  bakteri  pada  uji mikrodilusi ini akan timbul warna merah pada masing- masing  lubang microplate yang  masih  ditumbuhi  oleh bakteri.
Gambar 1. Penempatan sampel uji dan kontrol pada microplate (Ilustrasi setelah penambahan INT). Keterangan:
1: Sampel konsentrasi 1000 ppm
2: Sampel konsentrasi 750 ppm
3: Sampel konsentrasi 500 ppm
4: Sampel konsentrasi 200 ppm
5: Sampel konsentrasi 100 ppm
6: Sampel konsentrasi 75 ppm
7: Sampel konsentrasi 50 ppm (MIC)
8: Sampel konsentrasi 25 ppm
9: Kontrol + siprofloksasin
10: Kontrol -, 2,5% DMSO
11: Kontrol pertumbuhan
12: Kontrol Media
Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan  (Tabel  1) bahwa  ekstrak  etanol Agelas  cavernosa dapat menghambat  pertumbuhan Pseudomonas  aeruginosa dengan  KHM  sebesar  150  ppm, Escherichia  coli dengan KHM sebesar 200 ppm, Staphylococcus aureus dengan  KHM  sebesar  250  ppm.  Berdasarkan  pustaka, aktivitas  antibakteri  dapat  dibagi  menjadi  4  golongan berdasarkan  harga  KHM  yakni  KHM  <100  ppm (tergolong  kuat),  KHM  100-500  ppm  (tergolong sedang),  KHM  500-1000  ppm  (tergolong  rendah), KHM  >1000  ppm  (tergolong  tidak  aktif)  (Silva  dkk., 2015).  Berdasarkan  hal  tersebut  dapat  dinyatakan bahwa  ekstrak  spons A.  cavernosa memiliki  aktivitas antibakteri  yang  sedang  terhadap  ketiga  bakteri tersebut.  Beberapa  faktor  yang  mempengaruhi  proses uji  aktivitas  antibakteri  antara  lain  konsentrasi  bakteri yang  ditambahkan  pada  agar  (jumlah  inokulum), adanya  patogen  kontaminasi),  suhu  pertumbuhan, waktu  inkubasi  dan  kandungan  nutrien  (Bauer  dkk., 1996).  Selain  itu  faktor  penting  yang  juga  harus diperhatikan  untuk  mencapai  hasil  yang  baik  adalah galur  mikroba  uji  yang  digunakan  karena  pada  galur yang berbeda terdapat perbedaan tingkat kepekaan.
Tabel 1 . Hasil uji aktivitas antibakteri Sampel Hasil Pewarnaan E. coli S. aureus P. aeruginosa 1000 ppm 500 ppm 250 ppm 200 ppm ✓ 150 ppm ✓ ✓ 100 ppm ✓ ✓ ✓ 50 ppm ✓ ✓ ✓ 25 ppm ✓ ✓ ✓ Kontrol + Kontrol - ✓ ✓ ✓ Kontrol tumbuh ✓ ✓ ✓ MIC 200 ppm 250 ppm 150 ppm Keterangan:
✓ menunjukkan adanya warna merah pada sumuran
Uji  dilakukan  dengan  tiga  kali  replikasi  masing  masing  dilakukan  secara quadruplo

## KESIMPULAN
Ekstrak etanol 96 % spons Agelas cavernosa yang diambil  dari  utara  pulau  Barrang    Lompo,  Makassar memiliki aktivitas antibakteri terhadap E. coli , S.aureus dan P.  aeruginosa dengan  aktivitas  tertinggi  terhadap bakteri P. aeruginosa dengan KHM sebesar 150 ppm.

## DAFTAR PUSTAKA
Abubakar,  H.,  Wahyudi  A.  T.  &  Yuhana,  M.  (2011).
Skrining  Bakteri  yang  Berasosiasi  dengan  Spons
Jaspis sp. Sebagai Penghasil Senyawa Antimikroba. Ilmu Kelautan ; 16; 35-40. Alhazmi,  A.  (2015). Pseudomonas  aeruginosa - Pathogenesis and Pathogenic Mechanisms. International Journal of Biology; 7; 44 – 67.
Andrews,  J.  M.  (2006).  Determination  of  Minimum Inhibitory Concentration. Journal of Antimicrobial Chemotherapy ; 48; 5-16.
Angeh,  J.  E.  (2006).  Isolation  and  Characterization  of
Antibacterial  Compounds. Thesis ;  University  of Pretoria, South Africa.
Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C. & Turek, M. (1996).  Antibiotic  Susceptibility  Testing  by  a Standardized  Single  Diskmethod. American Journal of Clinical Pathology ; 45; 493-498.
Clinical  and  Laboratory  Standards  Institute.  (2009) . Performance  Standard  for  Antimicrobial  Disk Susceptibility  Test;  Approved  Standard.10 th ed. Pennsylvania.
Eloff,  J.  N.  (1998).  A  Sensitive  and  Quick  Microplate
Method  to  Determine  the  Minimal  Inhibitory Concentration  of  Plant  Extracts  for  Bacteria. Planta Medica; 64; 711-713.
Forbes, B. A., Sahm, D. F. & Weissfeld, A. S. (2007). Bailey  and  Scott’s:  Diagnostic  Microbiology. Virginia: Mosby Inc.
Haris,  A.,  Arniati  &  Werorilangi,  S.  (2013).  Uji Antibakteri Patogen Ekstrak Sponge Menggunakan Metode High Troughput Screening (HTS) dengan Indikator MTT (3-[4,5-
dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide). Laporan penelitian; Universitas Hasanudin, Makassar.
Kementerian  Kesehatan  Republik  Indonesia.  (2011).
Peraturan  Menteri  Kesehatan  Republik  Indonesia
Nomor  2406/MENKES/PER/XII/2011  Tentang Pedoman Umum Penggunaan Antibiotik . Jakarta:
Kemenkes RI.
Kim, S. K. (2012). Marine Pharmacognosy: Trends and
Applications. New York: CRC Press.
Medeiros,  A.  M.,  Lourenco,  A.,  Tavares,  M.  R., Joao, M.,  Curto,  M.,  Savluchinske,  F.  &  Roseiro,  C. (2006).  Agelasidine  A  from Agelas  clathrodes . Journal of  Biosciences; 61; 472-476.
Mokodompit,  A.,  Boekoesoe,  L.  &  Mustapa,  M.  A. (2015).  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Etanol Spons  Laut  (Porifera:Demospongiae)  terhadap Bakteri  Staphylococcusaureus  dan Escherichia coli . Laporan  penelitian; Universitas  Negeri Gorontalo, Gorontalo.
National Institutes of Health, United States Department of  Health  and  Human  Services.  (2014).  Stop  the Spread  of  Superbugs : Help  Fight  Drug-Resistant Bacteria. https://newsinhealth.nih.gov/2014/02/stop-spread- superbugs. Accessed: 21 Juni 2018.
Silva,  N.  M.  M.,  Silva,  I.  S.  M.,  Pires,  R.  F.  S.,
Vasconcelos,  T.  L.  C.,  Viana,  M.  D.  M., Campessato,  E.  A.,  Conserva,  L.  M.,  Rocha.,  E. M.  M.,  Araujo,  E.C.,  Araujo,  Jr.J.X.  &  Bastos, M.L.A. (2015). In Vitro Evaluation of Antimicrobial, Antioxidant, dan Larvicidal Activities  from  Extract  of Zeyheria  tuberlusa (Vell)  Bur.  (Biognoniace). Journal  of  Chemical and Pharmaceutical Research; 7; 319-328.
Tan,  S.  L.,  Lee,  H.  Y.,  Mahyudin,  N.  A.  (2014).
Antimicrobial  Resistance of Escherichia coli and Staphylococcus  aureus Isolated  from  Food Handler's Hands. Food Control ; 44; 203-207. Wiegend, I., Hilpert, K. & Hancock, R.  E.  W. (2008). Agar and Broth Dilution Method to Determine the Minimal  Inhibitory  Concentration  (MIC)  of Antimicrobial  Substances. Nature  Protocols;  3; 163-175.
World  Health  Organization.  (2018).  Antimicrobial Resistance . http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/
en/ . Accessed: 28 Maret 2018.
Yamazaki, H., Abdjul, D.  B., Kanno, S. I., Takahashi, O.,  Kirikosho,  R.,  Ukai,  K.  &  Namikoshi,  M. (2015).  Structures  and  Biological  Evaluations  of Agelasines  Isolated  from  the  Okinawan  Marine Sponge Agelas  nakamurai . Journal  of  Natural Products; 79; 1149-1154.