## ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ENZIMATIK KANDIDAT PROBIOTIK DARI SALURAN PENCERNAAN IKAN-IKAN EKONOMIS RAWA DANAU PANGGANG

## ISOLATION AND ENZYMATIC ACTIVITY TEST OF PROBIOTIC CANDIDATE FROM DANAU PANGGANG SWAMP ECONOMICAL FISHES DIGESTIVE TRACT
1) Rini Marlida dan 2) Elrifadah
1,2) Fakultas Pertanian Universitas Achmad Yani Banjarmasin Email: rinimarlida@uay.ac.id

## ABSTRAK
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  mengisolasi  kandidat  probiotik diperoleh  dari saluran  cerna ikan  ikan rawa  ekonomis  yang  berasal  dari  perairan  Danau  Panggang dan menguji aktivitas enzim amilase, protease dan lipase.  Ikan yang dijadikan sampel adalah gabus  haruan,  papuyu,  dan  sepat  siam  masing-masing  mewakili  golongan  karnivora, omnivora dan herbivora.  Media yang digunakan adalah media selektif mengandung pati, minyak zaitun dan susu skim. Kandidat probiotik yang berhasil diisolasi, tumbuh dengan baik dan memiliki aktivitas enzimatik dari gabus haruan adalah adalah 11 isolat, papuyu 12  isolat,  dan  sepat  siam  12  isolat.  Sampel  C3GHDP  memiliki  aktivitas  amilolitik tertinggi,  I3PDP4  memiliki  aktivitas  lipolitik  tertinggi,  dan  D4SSDP1  serta  H3PDP memiliki aktivitas proteolitik tertinggi.  Di antara semua isolat G1PDP sp memiliki ketiga aktivitas enzimatik tertinggi.
Kata kunci : probiotik, enzim, ikan rawa, Danau Panggang

## ABSTRACT
Aim of this research were isolation of probiotics candidate from digestive tract of Danau  Panggang  swamp  fishes  and amylolitic,  proteolytic,  and  lipolyticenzyme  activity test.  Sample  fishes  were  snake  head  ( Channa  striata ),  climbing  perch  ( Anabas testudineus ),  and  Siamese  gouramy  ( Trichogaster  pectoralis )  as  a  refresentatif  sample from  carnivorous,  omnivorous,  and  herbivorous  fish.    Medium  containing  starch,  skim milk  and  olive  oil  used  as  selective  media.  Result  of  this  research  was  successfully isolated  probiotic  candidate  whom  grow  well  and  had  enzyme  activity  from C.  Striata obtained 11 isolate, 12 isolate from A. testudineus and T. pectoralis respectively. Higher amilolytic activity was C3GHDP, I3PDP4 had a higher lipolytic activity,  D4SSDP1 and H3PDP had a higher proteolytic activity.  Among those isolate G1PDP sp had a amilolytic, proteolytic and lipolytic activity.
Key words :  probiotic,enzyme, swamp fishes, Danau Panggang

## PENDAHULUAN
Kecamatan Danau
Panggang merupakan  agroekosistem  rawa  terbesar di  Kalimantan  Selatan,  mempunyai  luas area  380,62  km 2 atau  sekitar  13,74  % dari  luas  Kabupaten  Hulu  Sungai  Utara (Natalia et  al ,  2006).  Plasma  nutfah ikan-ikan rawa bernilai ekonomis merupakan  sumber  utama  hasil  perairan rawa Danau Panggang. Ikan-ikan tersebut  meliputi  ikan  gabus  haruan ( Channa striata ), papuyu ( Anabas testudineus ) dan sepat siam ( Trichogaster pectoralis ).
Penelitian  ini  berkontribusi  pada upaya  percepatan  budidaya  ikan-ikan rawa di  Propinsi  Kalimantan  Selatan. Mengingat  ikan  rawa  sebagian  besar masih  masuk  dalam  kategori  ikan  liar ( wildfish ). Ikan liar sangat membutuhkan domestikasi sebelum memasuki ranah budidaya dan
keberhasilan domestikasi sangat ditentukan  oleh  penanganan  pada  setiap fase  kehidupan  ikan.    Seluruh  siklus kehidupan  ikan  merupakan  mata  rantai yang tidak boleh terputus. Fase terpenting  dalam  kehidupan  ikan  adalah fase  larva,  terutama  berkaitan  dengan peralihan dari penggunaan pakan
endogen  ke  pakan  eksogen,  juga  masih lemahnya kondisi larva di awal perkembangan  daur  hidup  (Marlida 2015).
Salah satu potensi mikroorganisme perairan  rawa  yang  dapat  menunjang keberhasilan  budidaya  species  baru adalah  sebagai  probiotik.  Isolasi  dan seleksi  kandidat  probiotik  merupakan faktor penting yang menentukan keberhasilan aplikasi probiotik di bidang akuakultur  (Nayak et  al .  2010).Sun et al. (2010) menjelaskan bahwa bakteriprobiotik akan memberikan pengaruh  yang  tidak  baik  bagi  inang apabila  tidak  cocok  dengan  lingkungan saluran  cerna.  Menurut  Ghosh et  al (2007),  meskipun  beberapa  probiotik komersial  sudah  bias  diterapkan  pada lingkungan akuakultur, namun kemampuannya  bertahan  dengan  nilai optimum pada milieu usus masih kurang efektif (Ghosh et al . 2007).
Tahap  awal  penelitian  adalah mengisolasi dan menguji aktivitas enzimatik bakteri kandidat probiotik dari saluran  pencernaan  ikan-ikan  rawa ekonomis seperti ikan gabus haruan yang mewakili  ikan  karnivora,  ikan  papuyu yang  mewakili  ikan  omnivora,  dan  ikan sepat siam mewakili ikan herbivora.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat  dan  bahan  yang  dipergunakan dalam  penelitian  ini  terdiri  dari  sampel ikan  yaitu  gabus  haruan,  papuyu,  dan sepat  siam  diambil  dari  lokasi  rawa lebak Danau Panggang. Sampel kemudian  ditempatkan  ke  dalam cool box untuk  selanjutnya  dibawa  ke laboratorium  untuk  dianalisis  secara mikrobiologi.

## Analisis Data

## Pengambilan Sampel
Sampel  ikan  yaitu  gabus  haruan, papuyu,  dan  sepat  siam  diambil  dari lokasi  rawa  lebak  Danau  Panggang. Sampel kemudian ditempatkan ke dalam cool  box untuk  selanjutnya  dibawa  ke laboratorium  untuk  dianalisis  secara mikrobiologi.
Isolasi Bakteri
Sampel sebanyak 10 g diencerkan  dengan  90  mL  cairan fisiologis  (NaCl  0,85%).    Proses  isolasi dilakukan  dengan  media  selektif,  yakni media  TSA  ( Tripticase  Soy  Agar ),  yang mengandung pati untuk bakteri
amilolitik, susu untuk bakteri proteolitik, dan minyak  zaitun  untuk  bakteri lipolitik.  Pengenceran  berseri  dilakukan dari  10 -2 sampai      10 -4 dengancara mengambil  0,1  ml  bahan  yang  telah digerus  dan  dimasukan  ke  dalam eppendorf sebagai pengenceran pertama, selanjutnya  dari  eppendorf  pertama diambil sebanyak 0,1 ml untuk pengenceran kedua, demikian seterusnya hingga pengenceran ke empat. Inokulum dikultur dengan metode cawan sebar  pada  media  TSA  ( Tripticase  Soy Agar ).     Inokulum  yang  dikultur  berasal dari  pengenceran  kedua,  ketiga  dan keempat.    Kultur  dibuat  secara  duplo. Kultur  diinkubasi  pada  suhu  29 o C selama 24 jam, kemudian diamati koloni bakteri yang tumbuh.
Koloni  tunggal  yang  tumbuh  pada media  kultur  dan  memiliki  profil  yang berbeda  diambil  dengan  jarum  ose  dan digoreskan  di  media  TSA  steril  pada cawan  petri  dengan  metode  gores kuadran,  kemudian  diinkubasi  kembali pada  suhu  29 o C  selama  24  jam  untuk mendapatkan  isolat  tunggal  yang  murni. Metode pemurnian ini dilakukan berulang-ulang  dengan  metode  yang sama  hingga  diperoleh  koloni  bakteri
yang tunggal dan seragam.  Isolat murni dipindahkan  ke  tabung  reaksi  berisi media  TSA  steril,  untuk  disimpan sebagai  stok  isolat  bakteri  kandidat probiotik dan digunakan untuk pengujian selanjutnya.
Prosedur  isolasi  mikrob  yang mempunyai aktivitas amilolitik, proteolitik, dan lipolitik dilakukan dengan  metode  selektif,  yang  mengacu pada metode yang dilakukan pada hewan terestrial  seperti      petunjuk  Hungate (1966),      serta      mengkombinasikannya dengan  prosedur    isolasi  mikrob  dari saluran pencernaan ikan  seperti  metode yang  dilakukan  oleh   Nakayama et al . (1994) dan Hoshino et al .  (1997).

## Uji Aktivitas Enzimatik
Pengujian  ini  bertujuan  untuk mengukur  besarnya  aktivitas  proteolitik, lipolitik,  dan  amilolitik  dari  masing- masing  isolat  melalui  uji  hidrolisis karbohidrat, protein, dan lemak.  Bakteri kandidat  probiotik  ditumbuhkan  pada media  SWC  yang  masing-masing  telah ditambahkan  pati  sebanyak  2  %  (v/w) untuk uji amilolitik, susu skim sebanyak 2  %  (v/w)  untuk  uji  proteolitik,  dan minyak zaitun sebanyak 2 % (v/v) untuk uji  lipolitik. Kemampuan  menghidrolisis
protein  ditandai  dengan  adanya  zona bening di sekeliling isolat yang ditumbuhkan  pada  media  agar  dengan penambahan  susu  skim.      Hidrolisis lemak  ditandai  dengan  adanya  warna kehijauan  pada  media  agar  dengan penambahan  minyak  zaitun,  setelah permukaan  media  digenangi  kopper sulfat  (CuSO 4 )  jenuh.    Kemampuan menghidrolisis karbohidrat ditandai dengan  terbentuknya  zona  bening  di sekeliling  koloni  yang  tumbuh,  setelah media digenangi dengan reagen  Kalium iodida (KI) 1 %.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kandidat probiotik  yang diisolasi dipilih berdasarkan pertumbuhan dominan,  perbedaan  karakter  morfologi koloni  yang  meliputi  warna,  dan  bentuk koloni,  serta  kemampuan  tumbuh  pada media.    Hasil  isolasi  diperoleh  11  isolat dari  saluran  pencernaan  ikan  gabus haruan,  12  isolat  dari  ikan  papuyu,  dan 12 isolat dari ikan sepat siam.
Isolat  dengan  aktivitas  enzimatik terbaik, yakni C3GHDP, I3PDP4,
D4SSDP1, H3PDP, dan G1PDP sp selanjutnya  diambil  untuk  uji  lanjutan
yakni uji pembentukan biofilm,
kemampuan  tumbuh  dalam  milieu  asam dan basa, patogenitas, dan  pertumbuhan.
Tabel 1.  Aktivitas enzimatik bakteri kandidat probiotik dari saluran cerna ikan-ikan rawa Danau Panggang
No. Ikan Sampel Kode Aktivitas Enzimatik Amilolitik (mm) Proteolitik (mm) Lipolitik (mm) 1. Gabus Haruan A1 GHDP 2 - - A2GHDP2 13 2 2 A3GHDP2 2 - - A4GHDP sp 2 2 - B1GHDP sp 20 8 3 B2GHDP 10 10 - B3GHDP2 2 2 2 B4GHDP 1 - - C1GHDP 11 2 2 C2GHDP 10 2 2 C3GHDP 40 5 2 C4GHDP 2 - - 2. Ikan Sepat Siam D1SSDP1 2 - -- D2SSDP4 18 8 5 D3SSDP sp 5 - 2 D4SSDP sp 25 13 - E1SSDP sp - 2 - E2SSDP - 1 1 E3SSDP 2 2 - E4SSDP2 - 2 1 F1SSDP sp 5 2 2 F2SSDP 10 12 5 F3SSDP1 8 3 - F4SSDP2 2 - - 3. Ikan papuyu G1PDP sp 25 12 5 G2PDP 11 8 2 G3PDP2 5 5 1 G4PDP4 2 - - H1PDP1 - 5 - H2PDP2 2 5 - H3PDP 5 13 2 H4PDP sp 5 10 - I1PDP sp 2 2 3 I2PDP 8 2 10 I3PDP4 8 - 12 I4PDP4 1 2 5 Sumber : Pengolahan Data Primer

## Pembahasan
Saluran
pencernaan ikan merupakan  tempat  utama  masuknya makanan,  dan  proses  penyerapannya. Kolonisasi sejumlah bakteri pada saluran cerna  memiliki  peran  yang  sangat penting  dalam  hidrolisis  pakan  dan memodulasi  kesehatan  ikan.    Seleksi kandidat  probiotik  dilakukan  dengan tujuan  untuk  mendapat bakteri  probiotik yang  dapat  digunakan  untuk  budidaya ikan-ikan  rawa  melalui  perbaikan  nilai nutrisi  dan  daya  cerna  pakan  serta kualitas air.
Bakteri  probiotik yang  diisolasi pada  penelitian  ini  adalah  bakteri  yang mempunyai aktivitas amilolitik,
proteolitik,  dan  lipolitik.    Menurut  hasil penelitian  Kar  &  Gosh  (2008),  bahwa pada gastrointestinal  tract ikan Labeo rohita dan Channa  punctatus juga ditemukan sejumlah besar bakteri penghasil enzim seperti amilolitik, proteolitik,  dan  celolitik.  Bakteri-bakteri tersebut  meningkatkan  daya  cerna  dan penyerapan nutrient pada usus.
Bakteri memilikikemampuan menyesuaikan  diri  pada  milieu  yang kaya  akan  molekul  kompleks  dengan cara  mensekresikan  enzim  yang  disebut
enzim exogenous .  Enzim exogenous tersebut akan membantu enzim endogenous inang  untuk  menghidrolisis nutrien  pakan  seperti  memecah  atau menguraikan rantai panjang karbohidrat, protein  dan  lemak  penyusun  pakan. Pemecahan  molekul-molekul  kompleks ini  menjadi  molekul  sederhana  akan mempermudah  pencernaan  pakan  dan penyerapan  nutrien pakan dalam  saluran pencernaan  ikan.  Probiotik  tidak  hanya melakukan mekanisme aksi dalam sistem  imun  tetapi  juga  memiliki  peran protektif yaitu secara langsung membloking  mikroba-mikroba  patogen dan  meningkatkan  integritas  mukosa melalui stimulasi sel epitelial (Gourbeyre et al . 2011).
Kandidat  probiotik yang  berhasil diisolasi  dari  saluran  cerna  ikan-ikan rawa memiliki aktivitas enzimatik seperti C3GHDP dari gabus haruan yang memiliki kemampuan mendegradasi pati dapat  digunakan  untuk  mensubtitusi tepung ikan dengan tepung lainnya yang mengandung karbohidrat dalam komposisi  bahan pakan.  Demikian  juga kandidat probiotik D4SSDP1 dan H3PDP yang masing-masing berasal dari ikan  sepat  siam  dan  papuyu  sebagai penghasil enzim protease, dapat
digunakan untuk memaksimalkan pemanfaatan  protein,  serta  I3PDP4  dari ikan papuyu yang mampu menghidrolisis  lemak dengan  baik dapat digunakan  untuk  pemanfaatan  lemak dalam  komposisi  pakan  dan  penghasil energy  selain  protein.    Sedangkan G1PDP sp memiliki  kemampuan  yang bagus dalam  mendegradasi ketiga enzim dapat  digunakan  untuk  menghidrolisis pakan dan meningkatkan nilai nutrisi.
Pada  hasil  penelitian  terdapat penemuan  penting  kandidat  probiotik yang  berasal  dari  ikan-ikan  rawa yang akan  digunakan  untuk  ranah  budidaya dan percepatan budidaya ikan-ikan rawa.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  isolasi  kandidat probiotik  dari  ikan-ikan  rawa ekonomis di  Danau  Panggang berhasil  diisolasi, tumbuh  dengan  baik  dan  memiliki aktivitas  enzimatik  dari  gabus  haruan adalah adalah 11 isolat, papuyu 12 isolat, dan  sepat  siam  12  isolat.    Sampel C3GHDP  memiliki  aktivitas  amilolitik tertinggi,  I3PDP4  memiliki  aktivitas lipolitik  tertinggi,  dan  D4SSDP1  serta
H3PDP  memiliki  aktivitas  proteolitik tertinggi.    Di  antara  semua  isolat G1PDP sp memiliki  tiga  aktivitas enzimatik tertinggi.

## Saran
-

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terimakasih  disampaikan kepada  Kemenristekdikti  melalui  DIPA Direktorat Riset dan Pengabdian Masyarakat Direktorat Jenderal
Penguatan  Riset  dan  Pengembangan Kementrian Riset, Teknologi, dan Pendidikan  Tinggi  No.042,06-0/2017 untuk  Hibah  Penelitian  Dasar  Unggulan Perguruan Tinggi.

## DAFTAR PUSTAKA
Ghosh S, SinhaA, SahuC, 2007.  Dietary probiotic supplementation in growth and health of  live-bearing ornamental fishes. Aquacult Nutr 13 : 1 – 11.
Gourbeyre  P,  DeneryS,  BodinierM.  2011.  Probiotics,  prebiotics,  and  synbiotics:  impact on the gut immune system and allergic reactions. J. Leukocyte Biol . 89 : 685 – 695.
Hoshino  T,  Ishizaki  K,  Sakamoto  T,  Kumeta  H,  Yumoto  I,  Matsuyama  H,  Ohgiya  S. 1997.  Isolated of Pseudomonas sp. of  fish  intestine excretion an active protease at low temperature. Lett  Appl Microbiol 25 : 70 – 72.
Hungate  R.  1966.    The  Rumen  and  Its  Microbes.    London  and  New  York:  Academic Press.
Kar N, Ghosh K. 2008.  Enzyme producing bacteria in the gastrointestinal tracts of Labeo rohita (Hamilton) and Channa punctatus (Bloch). Turk. J. Fish. Aquat. Sci . 8 : 115 – 120.
Marlida,  R.,  2015.    Fisiologi  pencernaan  ikan  papuyu  ( Anabas  testudineus Bloch)  pada awal  perkembangan  daur  hidup. dalam Prosiding  Seminar  Nasional,  Strategi Pemanfatan  lahan  rawa  dalam  mendukung  kedaulatan  pangan  17-18  Maret  2015. Hal 314-322.
Nakayama  A,  Yano  Y,  YoshidaK.  1994.    New  method  for  isolating  Barophiles  from intestinal  contents  of  deep  sea  fishes  retrieved  from  the  abyssal  zone. Appl  Env Microbiol 60 (11): 4210 – 4212.
Natalia,  L,  Suhardono,  A.Priadi,  2006.    Kerbau  rawa  di  Kalimantan  Selatan: Permasalahan, penyakit dan usaha pengendalian.
Nayak SK. 2010. Probiotic and immunity. Fish and Shellfish Immunology . 29: 2-14. Sun YZ, Yang HL, Ma RL, Lin  WY, 2010.  Probiotic applications of two dominant gut Bacillus strains  withantagonistic  activity  improved  the  growth  performance andimmune responses of grouper Epinephelus coioides . Fish  & Shellfish Immunol . 29: 803 – 809.
Verschuere  L,  Rombaut  G,  Sorgeloos  P,  Verstraete  W.    2000.    Probiotic  bacteria  as biological  control  agents  in  Aquaculture. Microbiolgical  and  Molecular Biology Review , 64: 655-671.