## Efek Fotodinamik Laser Dioda Merah Dengan Eksogen

## Metilen Biru Pada Biofilm Staphylococcus aureus
Suryani Dyah Astuti *1,2, , Rafika Fitria Puspasari 1 , and Samian 1 , Wahyu Intan Pertiwi 3 1 Departement of Physics, Faculty Science and Technology-Universitas Airlangga, Surabaya – Indonesia 60115
2 Biophysics and Medical Physics Research Group, Faculty of Sciences and Technology, Universitas Airlangga, Surabaya-Indonesia 60115
3 Magister of Biomedical Engineering, Faculty Science and Technology-Universitas Airlangga, Surabaya – Indonesia 60115
e-mail: * 1 suryanidyah@fst.unair.ac.id, 2 rafika.fitria21@gmail.com,
3 samian@fst.unair.ac.id , 4 wahyu.intan.pertiwi-2019@fst.unair.ac.id

## Abstrak
Biofilm  adalah  kumpulan  mikroorganisme  yang  menempel  pada  suatu  permukaan dengan  membentuk  matriks  Extracellular  Polymeric  Substance  (EPS)  sehingga  bakteri mampu bertahan dari ancaman fisis, kimiawi, atau biologis. Biofilm bekerja dengan menolak aktivitas  sistem  imun  dan  menciptakan  resistensi  terhadap  antibiotik  yang  menyebabkan biofilm  resistan  terhadap  agen  antimikroba  seperti  antibiotik,  desinfektan,  dan  germisida. Permasalahan  resistansi  akibat  biofilm  membutuhkan  penanganan  yang  lebih  tepat,  salah satunya  dengan  metode  fotodinamik  inaktivasi.  Fotodinamik  inaktivasi  adalah  metode penghambatan aktivitas metabolisme sel yang memanfaatkan interaksi antara cahaya dengan molekul  fotosensitiser  sehingga  menyebabkan  kematian  sel  bakteri.  Metilen  biru  merupakan fotosensitiser eksogen yang dapat menghasilkan oksigen singlet apabila terkena oksigen dan cahaya  menghasilkan  ROS  yang  mereduksi  biofilm.    Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui dosis energi yang efektif untuk mereduksi biofilm Staphylococcus aureus dengan penambahan  metilen  biru  sebagai  fotosensitizer.  Perlakuan  dibagi  menjadi  4  kelompok, kelompok kontrol tanpa ada perlakuan apapun, kelompok kontrol positif dengan penambahan fotosensitiser metilen biru, perlakuan laser, dan perlakuan laser dengan penambahan metilen biru. Perlakuan laser memiliki variasi pemaparan sebesar 60 detik (10,96 J / cm2), 120 detik (21,92 J / cm2), 180 detik (32,88 J / cm2), 240 detik (43,84 J / cm2), dan 300 detik ( 54,80 J / cm2). Reduksi biofilm diukur menggunakan ELISA reader dan dianalisis dengan uji ANOVA faktorial.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  fotoinaktivasi  dengan  metilen  biru  5  μM selama  5  menit  mampu  mereduksi  biofilm  bakteri  sebesar  %.  Treatmen  dengan  laser  diode merah  dengan  rapat  energi  penyinaran  54,80  J/cm2  selama  5  menit  menghasilkan  reduksi biofilm sebesar 69,11%  dan 92,01% untuk perlakuan laser diode merah dengan penambahan fotosensitiser metilen biru 5 μM. Sehingga kombinasi laser dengan fotosensitiser metilen biru optimal untuk mereduksi biofilm Staphylococcus aureus.
Kata kunci—3-5 kata kunci, Algoritma A, algoritma B, kompleksitas

## Abstract
Biofilm is a collection of microorganisms that attach to a surface by forming a matrix  of  Extracellular  Polymeric  Substance  (EPS)  so  that  bacteria  can  survive
physical, chemical, or biological threats. Biofilms work by rejecting the activity of the immune  system  and  creating  resistance  to  antibiotics  that  cause  biofilms  to  be resistant  to  antimicrobial  agents  such  as  antibiotics,  disinfectants,  and  germicides. Resistance problems due to biofilms require more precise handling, one of them is the photodynamic  method  of  inactivation.  Photodynamic  inactivation  is  a  method  of inhibiting  cell  metabolic  activity  that  utilizes  the  interaction  between  light  and photosensitic molecules, causing bacterial cell death. Methylene blue is an exogenous photosensitiser  that  can  produce  singlet  oxygen  when  exposed  to  oxygen  and  light produces  ROS  which  reduces  biofilm.  This  study  aims  to  determine  the  effective energy dosage for reducing Staphylococcus aureus biofilm by adding methylene blue as  photosensitizer.  The  treatment  was  divided  into  three  groups,  the  control  group without  any  treatment,  the  control  group  with  methylene  blue  photosensitizer,  laser treatment group, and  methylene  blue and  laser treatment groups. The  laser treatment group has variation of exposure time 60s (10.96 J / cm2), 120s (21.92 J / cm2), 180s (32.88 J / cm2), 240s (43.84 J / cm2), and 300s (54.80 J / cm2). Biofilm reduction was measured  using  an  ELISA  reader  and  analyzed  using  factorial  ANOVA.  The  results showed  that  photoinactivation  with  5  M  methylene  blue  for  5  minutes  reduced bacterial biofilms by 58.34%. Treatment with a red laser diode with a radiation energy density  of  54.80  J/cm 2 for  5  minutes  resulted  in  biofilm  reduction  of  69.11%  and 92.01%  for  red  laser  diode  treatment  with  the  addition  of  5  μM  methylene  blue photosensitiser. So that the  laser combination with  methylene  blue photosensitiser  is optimal for reducing Staphylococcus aureus biofilm.
Keywords— photoinactivation, red diode laser, Staphylococcus aureus biofilm, methylene blue

## 1. Pendahuluan
Penyakit  infeksi  menjadi  masalah kesehatan yang harus diperhatikan terutama  di  negara  berkembang.  Penyakit infeksi  yang  menyerang  manusia  salah satunya disebabkan oleh bakteri Staphylococcus  aureus yang  termasuk dalam  jenis  bakteri  gram  positif . Infeksi yang disebabkan oleh bakteri Staphylococcus  aureus diantaranya  bisul, jerawat, pneumonia, meningitis, dan arthritits  (Firmansyah,  2015).  Bakteri Staphyloccocus  aureus dapat  mengalami resistensi  terhadap  antibiotik,  sehingga mampu  hidup  meski  diberi  antibiotik. Selain  itu  bakteri  memiliki  kemampuan membentuk biofilm sehingga meningkatkan
resistansi terhadap antibiotik. Biofilm adalah
kumpulan mikroorganisme  yang  menempel  pada suatu  permukaan  dengan  membentuk matriks Extracellular Polymeric Substance (EPS)  (Donlan,  2002)  yang  menyebabkan biofilm secara alami resistan terhadap agen antimikroba seperti antibiotik, desinfektan, dan  germisida      (Gunardi et  al .,  2007  ).
Adanya  biofilm  mengakibatkan  bakteri mampu  bertahan  dari  ancaman  fisis, kimiawi,  atau  biologis.  Biofilm  bekerja dengan menolak aktivitas sistem imun dan menciptakan  resistensi  terhadap  antibiotik (Stephens, 2002).
Resistensi terhadap antibiotik merupakan  salah  satu  karakteristik  dari biofilm. Penyebab adanya resistansi karena penggunaan  antibiotik  yang  kurang    tepat serta  adanya  sifat  alami  biofilm  sehingga antibiotik  tidak  dapat  mereduksi  bakteri. Resistansi  bakteri  terhadap  antibiotik menjadi  salah  satu  masalah  serius  dalam dunia  kesehatan.  Data Cancer  for  Disease Prevention menyebutkan  bahwa  13.300
pasien  meninggal  akibat  infeksi  bakteri yang resisten (Setiawati, 2015).
Permasalahan resistansi akibat biofilm  membutuhkan  penanganan  yang lebih  tepat,  salah  satunya  dengan  metode fotodinamik inaktivasi. Fotodinamik inaktivasi  adalah  metode  penghambatan aktivitas metabolisme sel yang memanfaatkan  interaksi  antara  cahaya dengan  molekul  fotosensitiser  sehingga menyebabkan kematian sel bakteri. Hal ini dimanfaatkan  untuk  menghancurkan  sel target dengan cara oksidasi yang menyebabkan  lisis  sel  dan  inaktivasi protein  membran  (Pereira et.  al., 2018). Photodynamic  Inactivation (PDI) memiliki  tiga  komponen  utama,  yakni cahaya, fotosensitiser serta oksigen (Rusydi,  2015).  Fotosentiser  adalah  suatu molekul  yang  bersifat  peka  terhadap cahaya.  Interaksi  antara  cahaya  dengan fotosensitiser terjadi jika adanya kesesuaian  antara  panjang  gelombang serap fotosensitiser dan panjang gelombang  sumber  cahaya.  Interaksi antara  keduanya  mampu  menyebabkan elektron  pada  fotosensitiser  tereksitasi sehingga  menyebabkan  ketidakstabilan. Elektron  yang  tidak  stabil  memiliki kecenderungan  untuk  kembali  ke  kondisi semula. Jika molekul fotosensitiser berinteraksi  dengan  oksigen  menyebabkan terbentuknya  ROS  ( Reactive  Oxygen Species) yang  mampu  memicu  kematian sel bakteri.
Fotosensitiser  dibagi  menjadi  2 yaitu  fotosensitiser  endogen  dan  eksogen. Secara alamiah, bakteri mempunyai senyawa  porfirin  sebagai  fotosensitiser endogen  yang  peka  terhadap  cahaya. Penelitian Papageorgiou (2000)
menunjukkan    bahwa  penyinaran  cahaya dengan spektrum panjang gelombang yang sesuai dengan spektrum serap
fotosensitiser  porfirin  serta  dosis  energi penyinaran yang tepat mampu menyebabkan  fotoinaktivasi  sel  bakteri.. Sedangkan  fotosensitiser  eksogen  adalah molekul yang berupa bahan metal, organik atau  logam  yang  ditambahkan.  Nugraha (2006)  melaporkan  bahwa  penggunaan fotosensitiser  eksogen  harus  memiliki toksisitas  rendah  dalam  keadaan  tanpa cahaya.  Salah  satu  fotosensitiser  eksogen yang  umumnya  digunakan  di  bidang kedokteran adalah metilen biru.
Metilen biru merupakan fotosensitiser eksogen yang dapat menghasilkan  oksigen  singlet  apabila terkena  oksigen  dan  cahaya.  Aisa et  al.,
(2009)  menyatakan  bahwa  metilen  biru efektif  untuk  mereduksi  bakteri  gram positif  dan  gram  negatif.  Metilen  biru menjadi  agen  pewarnaan  jaringan  vital, penawar racun terhadap nitrit/anilin, antiseptik,  anti  rematik  dan  mempunyai toksisitas  rendah.  Toksisitas  suatu  zat dapat  diketahui melalui nilai MLC ( Minimum  Lethal  Concentration) ,  yaitu konsentrasi  terendah  zat  toksik  yang mampu  membunuh  spesies  uji  pada kondisi  yang  telah  ditetapkan.  Pada penelitian  Phoenix  (2003)  menyatakan bahwa  metilen  biru  yang  diuji  dalam kondisi  gelap  menunjukkan  nilai  MLC sebesar  10  µM.    Hasil  penelitian  D. Melgoza (2009) menunjukan bahwa spektrum  absorbansi  metilen  biru  berada pada  panjang  gelombang  200  nm  hingga 700  nm  dengan  puncak  absorbansi  pada panjang gelombang 665 nm.
Laser  dioda  merah  menjadi  salah satu sumber cahaya yang memiliki panjang gelombang  yang  sesuai  dengan  panjang gelombang  serap  dari  metilen  biru.  Laser dioda  merah  memiliki  spektrum  panjang gelombang  antara  620-750  nm,  sehingga sesuai dengan spektrum serap metilen biru.
Berkas  cahaya  keluaran  laser  dioda bersifat koheren, monokromatis dan sejajar ( collimation) (Csele,  2004).  Penelitian Pratiwi  (2014)  juga  menyatakan  bahwa metilen  biru  mampu  mengabsorbsi  cahaya laser dengan panjang gelombang maksimal 661  nm  sehingga    sesuai  jika  diaplikasan dengan laser dioda merah.
Penelitian  Pereira et  al., (2018) menunjukan  bahwa  metilen  biru  dengan konsentrasi 0,1 mg/L yang dikombinasikan dengan  laser  dioda  merah  (660  nm) mampu  mereduksi  bakteri E.  coli sebesar 99,1%. Del et al. (2005) melaporkan terapi fotodinamik  yang  menggunakan  sumber cahaya  laser  dioda  dengan  fotosensitiser metilen  biru  memiliki  potensi  untuk perawatan  penyakit  kanker  atau  non kanker  pada  toksisitas  rendah  sehingga tidak  menimbulkan  efek  samping.  Pada penelitian Heineck et al., (2015)
menyatakan  bahwa  laser  dioda  (45  J/cm 2 ) dengan fotosensitiser eksogen metilen biru mampu
mereduksi biofilm
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
sebesar 57%.
Berdasarkan permasalahan tersebut,  maka  penelitian  ini  dilakukan untuk  mengetahui  efisiensi  fotodinamik terapi menggunakan laser diode merah dan fotosensitiser metilen biru terhadap biofilm Staphyloccoccus  aureus sebagai target.  Pada  penelitian  ini  digunakan variasi rapat energi pemaparan laser.

## 2. Bahan dan Metode
Penelitian  ini  menggunakan  bakteri  gram positif Staphylococcus  aureus ATCC 25923  yang  diperoleh  dari  Balai  Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya. Bakteri  dikultur  menggunakan Tryptone Soy Broth (TSB) hingga memperoleh nilai Optical  Density (OD)  595nm  sebesar  0,5.
Kultur  ditambah  sukrosa  2%  lalu  diambil sebanyak  100  µM  ditempatkan  pada micro-well plate dan diinkubasi selama 48 jam.  Fotosensitiser  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  larutan  metilen  biru dengan variasi konsentrasi 0 µM, 5 µM, 10 µM,  dan  20  µM.  Konsentrasi  metilen  biru yang  digunakan  sebagai  fotosensitiser sebesar  5  µM  dengan  melakukan  uji antibiofilm  metode  difusi.  Sumber  cahaya yang  digunakan  adalah  laser  dioda  merah (658,00±0,05) nm, intensitas berkas
(182,00±0,01) mWcm -2 dengan luas berkas  (0,20±0,01)  cm 2 .  Perlakuan  dibagi menjadi  4  kelompok,  kelompok  kontrol tanpa  ada  perlakuan  apapun,  kelompok kontrol positif dengan penambahan fotosensitiser metilen biru, perlakuan laser, dan  perlakuan  laser  dengan  penambahan metilen  biru.  Perlakuan  laser  memiliki variasi  pemaparan  sebesar  60  detik  (10,96 J/cm 2 ),  120  detik  (21,92  J/cm 2 ),  180  detik (32,88 J/cm 2 ), 240 detik (43,84 J/cm 2 ), dan 300  detik  (54,80  J/cm 2 ).  Reduksi  biofilm diukur menggunakan ELISA reader.
Persentase reduksi biofilm dihitung melalui konversi nilai OD hasil pembacaan ELISA  reader menjadi  Log  cfu/ml.  Uji statistik dengan uji SPSS ANOVA faktorial dan uji Tukey pada p <0,05.
3. Hasil dan Pembahasan
Laser dioda merah yang digunakan dalam  penelitian  ini  memiliki  diameter berkas  keluaran  sebesar  (0,50±0,01)  cm pada  jarak  1  cm  dari  target,  diameter berkas  laser  ini  sesuai  dengan  diameter microwell-plate .  Hasil  karakterisasi  suhu laser  diperoleh  sebesar  (29,30±0,245). Kestabilan suhu laser harus dikarakterisasi untuk menunjukkan bahwa penyebab  kematian  bakteri S.aureus bukanlah  suhu  yang  tinggi,  melainkan akibat dari adanya ROS. Hasil karakterisasi laser dioda merah menunjukkan  panjang  gelombang  puncak sebesar  658  nm  dengan  stabilitas  daya waktu  setelah  600  detik  pada  jarak (1,00±0,05) cm dengan daya
(36,53±0,005) mW .
Gambar 1 : Karakterisasi Laser Dioda Merah. Gambar yang ditambahkan adalah stabilitas daya laser
Berdasarkan  hasil  berkas  keluaran laser dapat dihitung dosis pemaparan  laser  dengan  lama waktu
penyinaran.
Hasil perhitungan  dapat  dilihat  pada
Tabel 4.1
Tabel  4.1  Hasil  Perhitungan  dosis pemaparan laser dioda merah
Panja
ng Gelom bang (nm) Daya Laser (mW) Luas Pena mpa ng (cm 2 ) Waktu (s) Rapat Energi (J/cm 2 ) (658,0 0± 0,05) (36,53 0  ± 0,05) (0,2 0  ± 0,01 ) 60 ± 0,05 10,96 120 ± 0,05 21,92 180 ± 0,05 32,88 240 ± 0,05 43,84 300 ± 0,05 54,80
Melalui  uji  antibakteri  dengan  metode difusi,  diperoleh  bahwa  metilen  biru dengan  konsentrasi  5  µM  menunjukkan zona  hambat  sebesar  (7,0±0,5)  mm.  Zona hambat yang dihasilkan metilen biru 5 µM lebih  kecil  daripada  konsentrasi  metilen biru  yang  lain.  Oleh  karena  itu,  dalam penelitian  ini  konsentrasi  metilen  biru yang digunakan dalam penelitian sebesar 5 µM.

## Gambar 1. Absorbansi metilen
biru
Hasil  penelitian  Whang  et.  al., (2009) menunjukan rentang spektrum UV- Vis  metilen  biru  berkisar  antara  panjang gelombang 350 nm hingga 800 nm dengan absorbansi maksimum pada 668 nm. Hasil penelitian  Patel  (2009)  juga  menunjukan bahwa  spektrum  metilen  biru  berada  pada kisaran panjang gelombang 200 nm hingga 700  nm  dengan  puncak  gelombang  pada 665  nm.  Hasil  uji  absorbansi  metilen  biru dalam  penelitian  ini  menunjukan  puncak absorbansi  metilen  biru  pada  panjang gelombang  663  nm.  Besar  energi  yang dapat  mengeksitasi  foton  berdasarkan panjang gelombang  metilen  biru (663 nm) dapat dihitung melalui persamaan sebesar  1,872  eV.  Laser  merah
dalam  penelitian  ini  memiliki  puncak panjang gelombang pada (658,0±0,05) nm dengan persentase aborbansi sebesar :
T = exp(− 𝐴 )
= 0,653
𝑀𝑎𝑘𝑎 , % 𝐴 = (1 − 𝑇 ) 100% = (1 − 0,653) 100%
= 34,70% Jadi persentase absorbansi metilen biru sebesar 34,70%
Besar  energi  laser  dihitung  sehingga diperoleh  energi  laser  sebesar  1,886  eV. Energi  laser  pada  penelitian  ini  digunakan untuk  mengeksitasi  metilen  biru  ke keadaan singlet tereksitasi sehingga memicu terjadinya proses fotokimia. Penelitian  ini  dilakukan  menjadi  4 kelompok  perlakuan,  yaitu  kelompok kontrol tanpa perlakuan apapun, kelompok perlakuan dengan penambahan fotosensitiser,  pemaparan  laser  saja  dan kelompok  perlakuan  dengan  pemaparan laser  serta  penambahan  fotosensitiser.
Hasil data perlakuan dilakukan perhitungan  log  cfu/ml  yang  ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2 : Grafik log cfu/ml terhadap waktu pemaparan Perlakuan dibagi menjadi 4 kelompok,  kelompok  kontrol  tanpa  ada perlakuan  apapun,  kelompok  kontrol positif  dengan  penambahan  fotosensitiser metilen biru, perlakuan laser, dan perlakuan laser dengan penambahan metilen  biru.  Perlakuan  laser  memiliki variasi  pemaparan  sebesar  60  detik  (10,96
J/cm 2 ),  120  detik  (21,92  J/cm 2 ),  180  detik (32,88 J/cm 2 ), 240 detik (43,84 J/cm 2 ), dan 300  detik  (  54,80  J/cm 2 ).  Perlakuan  yang paling  potensial  untuk  meningkatkan reduksi biofilm S. aureus adalah perlakuan pemaparan  laser  dengan  rapat  energi sebesar  54,80  J/cm 2 mereduksi  69,11% untuk  kelompok  perlakuan  laser,  92,01% untuk  kelompok  perlakuan  metilen  biru yang  diaktivasi  oleh  laser  pemaparan selama  300  detik.  Hasil  analisis  faktorial ANOVA  menunjukan  nilai  signifikasi kelompok  perlakuan  dengan  fotosensitiser saja,  laser  saja  dan  kelompok  perlakuan dengan  laser  penambahan  fotosensitiser adalah  0,000.  Nilai  signifikasi  dari  ketiga kelompok  kurang  dari  0,05  maka  terdapat perbedaan yang signifikan diantara kelompok perlakuan.
Gambar 3 : Grafik hubungan persentase reduksi biofilm Stapylococcus aureus terhadap waktu pemaparan laser Gambar  3  menjelaskan  bahwa
besar reduksi  biofilm S.aureus disebabkan fotoinaktivasi dengan kelompok perlakuan pemaparan  laser  dengan  penambahan metilen  biru  yang  mampu  mereduksi biofilm S. aureus sebesar 92,01%.
Mekanisme  fotoinaktivasi  diawali  dengan proses  fotofisika  yaitu  proses  absorbsi cahaya oleh  fotosensitiser. Cahaya dengan panjang gelombang sesuai dengan
absorbansi  fotosensitiser  akan  diserap sehingga menyebabkan fotosensitiser keadaan singlet tereksitasi menuju fotosensitiser  keadaan  triplet  tereksitasi. Fotosensitiser  keadaan  triplet  tereksitasi dapat  bereaksi  dengan  molekul  oksigen keadaan dasar melalui dua reaksi fotokimia  yang  berbeda.  Reaksi  fotokimia tipe  I  terjadi  saat  fotosensitiser  keadaan triplet  tereksitasi  mengoksidasi  substrat dengan cara mentransfer elektron sehingga menghasilkan molekul fotosensitiser tereduksi. Molekul  fotosensitiser tereduksi bereaksi  dengan  oksigen  menghasilkan anion  soperoksida  radikal.  Radikal  ini bereaksi  dengan  oksigen  membentuk oskigen reaktif ( Reactive Oxygen Species), termasuk  hidroksil  radikal  dan  hidrogen peroksida  melalui  reaksi  fenton.  Hidroksil radikal  mudah  berdifusi  melalui  membran dan  merusak  sel  (Astuti,  2011).  Reaksi fotokimia  tipe  II,  fotosensitiser  keadaan triplet  langsung  bereaksi  dengan  oksigen keadaan dasar triplet menyebabkan molekul  oksigen  tereksitasi  dari  keadaaan triplet  ke  keadaan  oksigen  tereksitasi singlet  sehingga  oksigen  singlet  dapat bereaksi  dengan  bahan  molekul.  oksigen menjadi  sitotoksik  yang  akhirnya  bereaksi dengan  biomolekul  seperti  asam  nukleat, protein,  lipid  dan  membran.  Irradiasi  dari sensitiser yang terlokalisasi pada membran menyebabkan  membran  lisis  dan  memicu lisisnya sel / organela sehingga mengakibatkan  inaktivasi  sel  yang  pada penelitian  ini  dibuktikan  oleh  peningkatan persentase reduksi biofilm.
Beberapa  penelitian  lain  terkait fotodinamik  pada  bakteri  fase  planktonik maupun  biofilm  dengan  variasi  dosis energi  serta  penambahan  fotosensitiser eksogen  antara  lain;  penelitian  Astuti et. al., (2016)  yang  menunjukan  pemaparan laser  dioda  biru  (405  nm)  pada  jarak  1,5
cm  dari  target  dan  waktu  pemaparan  75 detik  dengan  dosis  energi  25  J/cm 2 serta penambahan  klorofil  (0,2  mg/ml)  sebagai fotosensitiser  eksogen  dapat  mereduksi bakteri Streptococcus mutant sebesar 74%. Penelitian  Astuti et.  al., (2016)  efisiensi pemaparan laser CNC ( Computer Numerical  Control) selama  75  detik dengan  penambahan  fotosensitiser  klorofil dapat  mereduksi  biofilm Staphylococcus aureus sebesar  22,28%  Pada  penelitian Heineck et.  al., (2015)  menunjukkan biofilm Aggregatibacter  actinomycetemcomitans dengan  penambahan  fotosensitiser  metilen biru konsentrasi 100 µM yang telah diberi pemaparan  laser  dioda  merah  (665  nm) selama  5  menit  dengan  dosis  energi sebesar  75  J/cm 2 menghasilkan  reduksi sebesar  99,85%.  Penelitian  sebelumnya menunjukan  persentase  reduksi  yang berbeda-beda bergantung pada fase bakteri,  fotosensitiser,  jenis  bakteri,  dan rapat  energinya.  Berdasarkan  uji  viabilitas bakteri, menunjukkan bahwa klorofil tidak bersifat  toksik  dan  tidak  mempengaruhi viabilitas  bakteri,  sedangkan  melalui  uji antibiofilm dengan metode difusi menunjukkan bahwa fotosensitiser metilen biru    memiliki  tingkat  toksisitas  yang rendah.  Perbedaan  jenis  bakteri  juga mempengaruhi efektifitas fotodinamik inaktivasi, perbedaan struktural dinding sel antara  bakteri  gram  positif  dan  negatif, serta  perbedaan  permeabilitas  relatif  dari membran  bakteri  gram  positif  sebagai fasilitator masuknya fotosensitiser sedangkan  membran  eksternal  kompleks gram  negatif  bekerja  sebagai  penghalang masuknya fotosensitiser.

## 4. Kesimpulan
Pemaparan  menggunakan  laser  dioda merah (658,00 ± 0,05) nm yang
menginaktivasi  metilen  biru  dalam  proses fotoinaktivasi  mampu  mereduksi  biofilm Staphylococcus  aureus .  Perlakuan  laser memiliki variasi pemaparan sebesar (10,96 J/cm 2 ),  (21,92  J/cm 2 ),  (32,88  J/cm 2 ), (43,84  J/cm 2 ),  dan  (54,80  J/cm 2 )  sebagai aktifator  metilen  biru  untuk  fotinaktivasi biofilm Staphylococcus  aureus pada  rapat energi  54,80  J/cm 2 dengan  pemaparan waktu  sebesar  (300±0,05)  detik  yang mampu  mereduksi  biofilm Staphylococcus aureus hingga 92,01%

## Acknowledgment
The  authors  gratefully  acknowledge  the financial funding from Directorate General Higher Education of Indonesia as National Innovations  Research  Incentive  Program Batch I (Gant No. 07/INS- 1/PPK/E4/2018).

## Referensi
1. Ackerman, P. L. (1988). Determinants of individual differences during skill acquisition: Cognitive abilities and information processing. Journal of Experimental Psychology: General, 117 (3), 288-318.
2. Astuti,  S.  D.,  &  Arifianto,  D. (2016).  Efficacy  of  CNC-Diode Laser  Combine  with  Chlorophylls to Eliminate Staphylococcus aureus Biofilm
3. Astuti, S. D., Zaidan, A., Setiawati, E.  M.,  &  Suhariningsih.  (2016). Chlorophyll
mediated
photodynamic  inactivation  of  blue laser on Streptococcus mutans. AIP Conference  Proceedings , 1718 . https://doi.org/10.1063/1.4943353
4. Bevington, Philips R.and Robinson D.  Keith.  2003. Data  Reduction And Error Analysis For The Physical Sciences Third Ed. Americas. New York.
5. Chambers,  Henry  F.  2001. The Changing
Epidemiology of Staphylococcus  Aureus  . 7(2):178–
82.
6. Csele,  Mark.  2004.  Fundamentals of  Light  Sources  and  Lasers.  A Jhon Wiley & Sons, Inc.
7. Del,  A.,  Santos,  C.,  Oliveira,  D., Santesso,  D.,  Couto,  H.,  Batista, D., Baptista, M. S. (2005).
Methylene  blue  in  photodynamic therapy :  From  basic  mechanisms to clinical applications Rozane de F ´, 1000 .
8. Donlan,  R.  M.  (2002).  Biofilms : Microbial  Life  on  Surfaces, 8 (9), 881–890.
9. Gossweiner, L.I. 2005. The Science of  Phototeraphy:  An  Introduction , Springer: USA
10. Hamblin,  Michael,  Massachusetts
General Hospital, and Massachusetts  General  Hospital. 2004. NIH Public Access . (June):436–50.
11. Heineck,  L.,  Araujo,  R.,  Mateus, T.,  Tiemy,  I.,  Cláudio,  L.,  Simões, M., Saba-chujfi, E. (2015). Aggregatibacter actinomycetemcomitans biofilm can  be  inactivated  by  methylene blue-mediated photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy , 12 (1),
131–135.
https://doi.org/10.1016/j.pdpdt.201
4.10.002
12. Juzenas  P, Juzeniene  A, Kaalhus O, Iani
V, Moan J. 2002.
Noninvasive fluorescence
excitation spectroscopy during application  of  5-aminolevulinic acid  in  vivo.  Department  of Biophysics,The Norwegian  Radium Hospital, Oslo, Norway.
13. Niemz,  Markolf  H.  2007. Laser
Tissue  Interactions  Fundamentals and Application Third Englarged Edition . Springer : Germany. 14. Nitzan,  Y.,  Shporen,  E.,  &  Malik, Z. (2004). ALA induced photodynamic  effects  on  Gram positive and negative bacteria.
15. Papageorgiu P et al., 2000.
Phototherapy  with  Blue  (415  nm) and  Red  (660  nm)  Light  in  The Treatment of Acne Vulgaris , British Journal of Dermatology.
16. Parida,  P.  K.,  Surianarayanan,  G., Alexander,  A.,  Saxena,  S.  K.,  & Santhosh,  K.  (2013).  Diode  Laser
Turbinate Reduction in the
Treatment of Symptomatic Inferior Turbinate Hypertrophy. Indian Journal  of  Otolaryngology  and Head and Neck Surgery , 65 (SUPPL2), 350–355. https://doi.org/10.1007/s12070-
012-0515-8
17. Patel, N. B. (2009). Targeted
Methylene Blue-Containing Polymeric Nanoparticle Formulations for Oral Antimicrobial Photodynamic Therapy Master ’ s Thesis Dissertation Presented By Niraj Patel Advisor : Mansoor M . Amiji
, PhD to The Bouve ’ Graduate
School of Health Sciences , (July), 1–32.
18. Pereira,  N.  M.,  Feitosa,  L.  S., Navarro, R. S., Kozusny-Andreani,
D. I., & Carvalho, N. M. P. (2018). Use  of  photodynamic  inactivation for  in  vitro  reduction  of  prevalent bacteria  in  Fournier’s  Gangrene.
International  Braz  J  Urol , 44 (1),
150–155. https://doi.org/10.1590/S1677- 5538.IBJU.2017.0312 19. Phoenix,  D.  A.  (2003).  The phototoxicity  of  phenothiazinium derivatives against Escherichia coli and  Staphylococcus  aureus, 39 , 17–22.
https://doi.org/10.1016/S0928-
8244(03)00173-1
20. Prasad, Paras N. 2003. Introduction to  Biophotonics .  New  Jersey:  John Wiley & Son, Inc.
21. Usacheva,  M.  N.,  Teichert,  M.  C., &  Biel,  M.  A.  (2001).  Comparison of the Methylene Blue and Toluidine  Blue  Photobactericidal Ef  ®  cacy  Against  Gram-Positive and Gram-Negative Microorganisms, 173 (February),
165–173.
22. Whang, Thou-jen, Hsien-yu Huang,  Mu-tao  Hsieh,  and  Jyun-
jen  Chen.  2009.  “Laser-Induced Silver  Nanoparticles  on  Titanium Oxide
for
Photocatalytic
Degradation  of  Methylene  Blue.”
4707–18.