Lipolytic-screening of Bacillus genera as Biocontrol candidate In Coffee Plantation
Ema Ervina*, Cristina Nugroho Ekowati, Sumardi, Emantis Rosa
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung Jalan. Prof. Soemantri Brojonegoro, Bandar Lampung, 35145 *Email: emajung.03@gmail.com

## ABSTRACT
Problem  in  decreasing  coffee  production  was  caused  by  plant  pests  attack.  Countermeasures using pesticides and disinfectants are not effective because they have long effects and ruining the environment also pest resistance. It is necessary to prevent a more environmentally friendly way by utilizing a natural enemy in the form of a microorganism, the genus Bacillus. Lipase can hydrolyze  lipids  so  that  it  can  be  used  to  degrade  lipid  substrates  that  compile  the  body structure  of  pests  and  diseases.  This  research  aims  to  detect  the  lipolytic  activity  of  Bacillus isolates  from  coffee  plantations.  The  results  of  this  research  obtained  3  isolates  of  Bacillus namely T1, T2, and T3 which have differences in cell configuration and variations in the location of endospores. Furthermore, Bacillus isolates were detected lipolytic activity by growing isolates on lipase selective medium. Isolates that have the largest lipolytic activity are T2 isolate codes with an average index of 6.01 and the lowest lipolytic activity, namely, isolate T1 codes with an average index of 4.58.
Keywords: bacillus, soil, lipolytic activity

## PENDAHULUAN
Kopi  termasuk  tanaman  hasil  perkebunan yang  memiliki  nilai  ekonomi  tinggi  baik  di pasar nasional maupun internasional. Namun, produksi kopi di Indonesia mengalami  penurunan  terus  mengalami fluktuasi. Menurut  Badan  Pusat  Statistik (2017),  produksi  kopi  mengalami  penurunan sebesar  13,84%  pada  tahun  2015  dan sebesar  4,95%  pada  tahun  2017. Menurut Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian (2015), penurunan produksi kopi ini salah  satunya  disebabkan  oleh  serangan Organisme  Pengganggu  Tanaman  (OPT), yaitu hama dan penyakit.
Penanggulangan terhadap permasalahan tanaman  kopi  menggunakan  pestisida  dan desinfektan  dinilai  efektif.  Namun  dalam jangka  panjang  hal  ini  dapat  merugikan lingkungan  dan  siklus  biogeokimia.  Oleh karena itu, diperlukan pendekatan pencegahan  yang  lebih  ramah  lingkungan. Pengendalian  biologi  dapat  dijadikan  solusi,
yaitu  dengan  memanfaatkan  agen  atau musuh alami yang dapat menekan pertumbuhan hama atau penyakit.
Menurut  Mampallil et  al .,  (2017),  genus Bacillus diketahui  banyak  digunakan  sebagai agen pengendali hayati. Selain itu, pemanfaatan Bacillus sebagai agen biokontrol  juga  dapat  mengurangi  biaya pertanian dengan menekan kebutuhan pestisida  dan  pupuk.  Hal  ini  dikarenakan Bacillus menghasilkan  endospora,  beberapa spesies  menghasilkan  toksin  dan  enzim ekstraseluler yang berfungsi untuk mendegradasi  struktur  tubuh  hama  maupun penyakit.
Adanya  aktivitas  lipolitik  pada Bacillus dapat digunakan sebagai agent untuk mendegradasi  struktur  tubuh  serangga  hama maupun penyakit yang mengandung substrat lipid.  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan untuk  mendeteksi  aktivitas  lipolitik  isolat Bacillus dari tanah perkebunan kopi.

## METODE
Pengumpulan Sampel Sampel bakteri diisolasi dari tanah perkebunan  kopi  di  daerah  Sumberejo, Tanggamus,  Lampung.  Sampel  diambil  5-10 cm  dibawah  permukaan  tanah  yang  berada dibawah  kanopi  tanaman  kopi.  Selanjutnya sampel diisolasi di Laboratorium Mikrobiologi, Universitas Lampung.
Isolasi dan Pemurnian Isolat Bacillus
Sampel  tanah  sebanyak  1  gram  dimasukkan ke  dalam  9  ml  larutan  pengencer  garam fisiologis  steril  0,85%  dalam  tabung  reaksi steril. Suspensi dihomogenkan menggunakan vortex  mixer kemudian  dipanaskan  pada waterbath dengan  suhu  85  C  selama  15 menit.  Kemudian  dibuat  seri  pengenceran sampai  10 -6 .  Sebanyak  1  ml  suspensi  dari pengenceran  10 -4 sampai  10 -6 iinokulasikan pada  media Nutrient  Agar menggunakan metode pour  plate  agar. Selanjutnya  media yang  telah  diinokulasi,  cawan  diinkubasi secara  terbalik  pada  suhu  ruang  selama  24 jam.
Koloni  bakteri  yang  berbeda  dimurnikan dengan  metode streak  plate  agar pada medium Nutrient  Agar .  Koloni  yang  terpisah pada  medium,  dimurnikan  kembali  pada media Nutrient  Agar miring.  Isolat  yang tumbuh  pada  media  miring  adalah  isolat murni.
Identifikasi Isolat Bacillus Dalam  buku Bergey’s Manual  of  Systematic Bacteriology marga Bacillus memiliki  warna koloni  putih  susu  atau  krem,  berbentuk batang,  bersifat  Gram  positif,  dan  memiliki endospora berbentuk oval atau bulat.
Uji Lipolitik Isolat Bacillus
Aktivitas  lipolitik  isolat Bacillus dideteksi melalui  uji  kualitatif  menggunakan  media selektif  lipase  dengan  komposisi  bahan  per liter yaitu olive oil steril 5 %, Tween-80 2,5%, NaCl  5  g,  CaCl 2 .2H 2 O  0,1  g,  metil  merah 0,01%,  pepton  10  g,  dan Nutrient  Agar (Bestari dan Suharjono, 2015). Isolat Bacillus berumur  24  jam  diinokulasikan  dengan metode  titik  pada  media  selektif  lipase. Selanjutnya  diinkubasi  pada  suhu  ruang selama  24-48  jam  dengan  posisi  cawan terbalik.  Setelah  inkubasi,  diamati  dan  diukur
zona hidrolisis (zona jernih) yang terbentuk di sekitar koloni.
Penentuan  indeks  lipolitik  (IL)  dihitung menggunakan  rumus  menurut  Nurdin  dkk., 2015:
Bioassay  Isolat Bacillus terhadap  larva Plutella xylostella Berdasarkan Metode Uji Daya Bunuh (Salaki, 2011)
Dimasukkan  10  ekor  larva  ke  dalam  wadah dan  diberi  pakan  daun  sawi  yang  sudah diolesi  suspensi  isolat Bacillus dengan konsentrasi  1  x  10 8 sel/ml.  Kemudian  wadah ditutup  dan  diberi  lubang  udara  secukupnya. Pengamatan  bioassay  awal  ini  dilakukan selama  48  jam.  Diamati  perubahan  perilaku dan  fisik  dari  larva  sebelum  dan  sesudah infeksi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  isolasi  bakteri  dari  tanah  perkebunan kopi,  diperoleh  3  jenis  isolat.  Berdasarkan pengamatan secara mikroskopis menunjukkan bentuk sel batang, Gram positif, dan  memiliki  endospora  berbentuk  oval. Perbedaan  setiap  isolat  terdapat  pada konfigurasi  sel  yaitu  isolat  T1  (batang, diplobacil), isolat  T2 (batang,  monobacil) dan isolat  T3  (batang,  diplobacil).  Selain  itu terdapat  variasi  letak  endospora  yaitu  isolat T1 (terminal,  sub terminal  dan  sentral),  isolat T2  (sentral)  dan  T3  (terminal  dan  sentral). Berdasarkan  karakteristik  tersebut,  isolat yang  diperoleh  masuk  ke  dalam  Marga Bacillus sesuai dengan ciri-ciri yang disebutkan  dalam  buku Bergey’s Manual  of Systematic Bacteriology .
Ketiga  isolat Bacillus mampu  mendegradasi media  selektif  lipase  dengan  menunjukkan zona hidrolisis di sekitar koloni. Pada metode ini,  tween  80  digunakan  untuk  mendeteksi lipase karena mengandung ester asam oleat. Bacillus akan  menghidrolisis  tween  80 menjadi  asam  mono-oleat.  Asam  mono-oleat ini  akan  berikatan  dengan  kalsium  (dari CaCl 2 .2H 2 O)  sehingga  terbentuk  kekeruhan warna  di  sekitar  koloni.  Pada  penelitian  ini digunakan  metil  red  sebagai  pH  indikator (Gambar  1).  Pada  kondisi  tersebut,  terjadi penurunan  pH  dari  7  (pH  media)  menuju  pH yang  lebih  asam  dan  menghasilkan  warna dari  orange  menjadi  kuning  di  sekitar  koloni. Peningkatan  keasaman  ini  dikarenakan  oleh pelepasan  asam  lemak  hasil  degradasi  lipid (Ramnath dkk., 2017).
Berdasarkan hasil perhitungan yang diperoleh,  isolat Bacillus dengan  kode  T2 memiliki  nilai  indeks  lipolitik  terbesar  yaitu 6,01. Sedangkan, isolat yang memiliki indeks lipolitik  terkecil  yaitu  kode  T1  dengan  indeks 4,58 (Gambar 2).
Menurut  data  tersebut,  setiap  isolat  memiliki kemampuan  lipolitik  dan  memiliki  potensi sebagai  agen  pengendali  hayati  karena mampu  mendegradasi  substrat  lemak  yang biasanya banyak terdapat pada membran sel larva  dan  midgut  hama  tanaman kopi.  Enzim lipase  sangat  penting  untuk  proses  awal infeksi pada degradasi kutikula serangga. Hal ini dikarenakan lapisan kutikula pada
serangga  terdiri  dari  campuran  lipid,  alkena, ester dan asam lemak (Showket et al ., 2017).
Gambar  2.  Rata-rata  aktivitas  lipolitik  isolat

## Bacillus
Namun  efektivitas  isolat  sebagai  biokontrol maupun  biodegradasi  tidak  hanya  ditentukan oleh besarnya indeks enzimatik saja. Supaya menjadi agen biokontrol maupun biodegradasi  yang  efektif,  perlu  adanya konsorsium  dengan  mikroorganisme  lain yang memiliki ativitas enzimatik yang lainnya. Maka  perlu  dilakukannya  uji  lanjut  untuk membuktikan  kemampuan  degradasi  isolat terhadap substrat lemak.
Berdasarkan  uji  bioassay  terhadap  10  ekor larva Plutella  xylostella dengan  perlakuan diberi  pakan  daun  sawi  yang  telah  diolesi suspensi  isolat Bacillus menunjukkan  tingkat kematian larva yang signifikan (Tabel 1).
Berdasarkan  data  tersebut,  larva  yang mengalami  kematian  tertinggi  yaitu  yang diberi  perlakuan  dengan  isolat Bacillus kode T3. Namun, seluruh isolat memiliki kemampuan  untuk  mematikan  larva Plutella xylostella .  Kematian  setiap  larva  ditandai dengan adanya perubahan dari bergerak atif, tubuh  berwarna  hijau  dan  memakan  daun dengan  cepat  menjadi  bergerak  pasif,  warna tubuh menjadi kekuningan hingga kehitaman, berhenti  makan  hingga  mengalami  lisis  pada struktur tubuhnya.
0 1 2 3 4 5 6 7 T1 T2 T3 in d e ks lip o litik Kode Isolat
Gambar 1. Uji kualitatif lipolitik isolat Bacillus sp. (a) Zona jernih; (b) koloni bakteri
Tabel 1. Bioassay isolat Bacillus terhadap larva

## Plutella xylostella
Hal ini dikarenakan pada proses infeksi pada serangga,  adanya  aktifitas  lipolitik  pada Bacillus dinilai  mampu  mendegradasi menyusun struktur serangga. Lipase merupakan  enzim  yang  memulai  proses degradasi  kutikula  pada  infeksi  serangga hama.  Lipase  akan  mendegradasi  epikutil dengan  merusak  ikatan  ester  lipoprotein, lemak dan lilin pada kutikula. Aktivitas lipolitik pada Bacillus meningkatkan  mortalitas  pada larva. Selain itu, masuknya kristal protein dari isolat Bacillus ke  dalam  midgut  larva sehingga terjadinya ketidakseimbangan osmotik  dalam  tubuh  dan  menyebabkan  sel lisis.  Melanisasi  pada  tubuh  larva  dapat disebabkan karena degradasi protein hemolymf dan terjadi melanisasi internal pada tubuh  larva.  Selain  itu,  perubahan  warna pada  tubuh  larva  dikarenakan  kerja  enzim yang  dihasilkan  oleh  mikroorganisme  dan menyerang  tubuh  larva  (Indriyanti et  al ., 2017).

## KESIMPULAN
Dari  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan dapat  disimpulkan  isolat Bacillus yang memiliki  aktivitas  lipolitik  terbesar  adalah kode  isolat  T2  dengan  rata-rata  indeks  6,01 dan  aktivitas  lipolitik  terendah  yaitu  kode isolat T1 dengan rata-rata indeks 4,58.

## DAFTAR PUSTAKA
Badan  Pusat  Statistik.  (2017). Statistik Indonesia .  Badan  Pusat  Statistik. Indonesia.
Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian.
(2015).
Teknologi
Pengendalian  Hama  dan  Penyakit Tanaman Kopi . Jakarta: IAARD Press.
Bestari,  Chandra,  N  &  Suharjono.  (2015).  Uji Kualitatif  Isolat  Bakteri  Lipolitik  dari Limbah  Cair  Pabrik  Pengolahan  Ikan Kecamatan Muncar,
Banyuwangi. Jurnal Biotropika , 3(3).
Inadriyanti,  D.R.,  Indah,  B.D.,  Ning,  S.,
Bambang,  P.  (2017).  Mortalitas  dan Kerusakan  Jaringan  pada  Setiap Gejala Infeksi Larva Oryctes rhinoceros L. Akibat Perlakuan Cendawan Metarhizium anisoplia . Unnes Journal Life Science . 6 (1).
Mampallil,  J.L.,  Faizal,  M.H.,  and  Anith,  K.N.
(2017).  Bacterial  Bioagents  for  Insect Pest Management. Journal of Entomology and Zoology Student. 5(6), 2237-2244.
Nurdin,  G.M.,  Mubarik,  N.S.,  dan  Sudirman, L.I.  (2015).  Selection  of  chitinolytic bacteria as biocontrol of
Colletotrichum capsici. Malaya J Microbiol. 12(1), 35-42.
Ramnath,  L.,  Sithole,  B.,  Govinden,  R.
(2017). Identificationpf lipolytic
enzyme isolated from bacteria indigenous to Eucalyptus wood species  for  application  in  the  pulping industry. Journal Biotechnology Report. 15,114-124
Showket,  A.D.,  Bashir,  A.R.,  Ajaz,  A.K. 2017.  Insect  pest  management  by entomopathogenic  fungi. Journal  of Entomology  and  Zoology  Studies. 5(3), 1185-1190.
Kode Isolat Jumlah Larva Awal Kondisi Akhir Larva (Setelah 48 jam) Hidup Lemas Mati T1 10 2 2 6 T2 10 3 - 7 T3 10 - - 10