## Konstruksi Protein Transcription Activator-Like Effector (TALE) 1 dan 2 dengan Target Sekuen DNA strain HPV Tipe 16 dan 18
Agatha Mia Puspitasari 1) , Widodo 2)
1), 2) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya. 2015. Email : agathamia93@gmail.com 1 ) , widodo@ub.ac.id 2 )

## ABSTRAK
Kanker  serviks  dapat  disebabkan  oleh  infeksi  virus  HPV  tipe  16  dan  18  namun  dapat  dihindari dengan  melakukan  deteksi  awal  atau  screening  pada  wanita.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendesain protein Transcription Activator-Like Effector (TALE) sebagai detektor dari HPV 16 dan 18 dengan cara mencari  sekuen  target  DNA  HPV  16  dan  18  beserta  konstruksi  protein  TALE  tersebut.  Metode  yang dilakukan  adalah  analisa  sekuen  target  HPV  16  dan  18  dengan  software  MEGA,  konstruksi  protein TALE  pada  plasmid  pSB1C3,  PCR,  Golden  Gate  Cloning,  dan  elektroforesis.  TALE  yang  dikonstruksi adalah  2  macam  protein  TALE,  yaitu  TALE  1  dan  TALE  2,  yang  memiliki  susunan  basa  DNA  yang berbeda.  Konstruksi  TALE  dilakukan  dengan  Golden  Gate  Cloning  menggunakan  GATE  Assembly  Kit. Sekuen target DNA diperoleh dari hasil alignment software MEGA yang terdiri dari 14 bp pada masing- masing TALE dengan  Timin (T) pada ujung-ujung sekuen. Kemudian  konstruksi  TALE diperoleh dari tim Freiburg yang  memiliki 6 bagian yang dapat mengkode  protein TALE. Hasil yang didapatkan  dari konstruksi adalah pita DNA sebesar 3kbp pada gel agarosa melalui elektroforesis.

## Kata kunci: HPV 16,  HPV 18,  kloning, TALE 1, TALE 2

## ABSTRACT
Cervical  cancer  is  caused  by  infection  of  HPV  types  16  and  18.  However,  it  could  be  prevent  by screening and early detection. This research was aimed to design a Transcription Activator-Like Effector (TALE)  protein  as  a  detector  for  HPV  16  and  18  by  screened  for  specific  DNA  target  sequences.  DNA target of HPV types 16 and 18 was analyzed by MEGA 5.1 software, pSB1C3 plasmid was used for TALE constructing  protein  followed  by  PCR  analysis,  Golden  Gate  Cloning  using  GATE  Assembly  Kit,  and agarose  gel  electrophoresis.  Constructed  two  TALE  protein  were  TALE  1  &  TALE  2  which  contained different spesific target sequences. DNA target sequences of HPV types 16 and 18 were obtained by DNA alignment using MEGA 5.1 software resulting 14 bp for each TALEs contained timine (T) in each target sequences.  Then  the  TALE  construction  were  acquired  from  Freiburg  team  that  had  6  parts,  coding sequences  for  building  the  TALE  protein.  The  result  from  TALE  protein  construction  was  showed  by several bands emerged in electrophoresis gel agarose in 3 kbp.
Key words: Cloning, HPV 16, HPV 18, TALE 1, TALE 2

## PENDAHULUAN
Kanker serviks menduduki peringkat 2 sebagai  penyakit  kanker  yang  paling  sering terjadi  pada  wanita  di  Indonesia,  khususnya kisaran  umur  15  sampai  44  tahun  [1].  Kanker serviks  dapat  dihindari  dengan  melakukan deteksi  awal  atau  screening  pada  wanita  yang belum mengalami gejala awal terbentuknya sel
kanker  serviks.  Proses  deteksi  Pap  smear menghabiskan  biaya  yang  cukup  mahal  dan tidak nyaman pada pasien karena dapat terjadi pendarahan  saat  pengambilan  sel  di  mulut rahim [2].
Oleh karena itu diperlukan satu teknik yang  praktis,  nyaman,  dan  memiliki  akurasi tinggi,  yaitu  teknik  pengenalan  spesifik sekuens DNA strain HPV tipe 16 dan 18 untuk
mendeteksi kanker serviks. Kemampuan suatu protein  efektor  agar  dapat  menarget  secara spesifik pada sekuen DNA tertentu merupakan suatu  permasalahan  yang  harus  diteliti  lebih lanjut [3]. TALE atau Transcription Activator- Like  Effectors  merupakan  protein  efektor bakteri  Xanthomonas  sp.  untuk  modulasi transkripsi  gen  pada  tumbuhan  inang  untuk membantu  kolonisasi  dari  bakteri  [4].  Daerah sentral atau tengah pada protein terdiri dari 34 pasang  sekuen  asam  amino  yang  dibutuhkan untuk  mengenali  DNA  tertentu  dan  kemudian berikatan [5]. Sekuens DNA HPV tipe 16 dan 18  dapat  digunakan  sebagai  DNA  target  yang dapat  berikatan  dengan  TALE.  Menurut  Gau [6], TALE dapat digunakan sebagai salah satu alat  bioteknologi  untuk  berikatan  dengan sekuen  DNA  target  tertentu.  Berdasarkan beberapa teori dasar diatas, dapat disimpulkan bahwa  diperlukan  suatu  deteksi  dini  untuk kanker  serviks  dengan  penggunaan  protein TALE  dimana  protein  ini  dapat  berikatan secara  spesifik  pada  sekuen  target  DNA  pada HPV  tipe  16  dan  18.  Hal  ini  menunjukkan pentingnya  konstruksi  atau  pembuatan  TALE yang  selanjutnya  dapat  menjadi  referensi untuk  alat  deteksi  kanker  serviks  dengan  cara sintetik biologi.

## METODE PENELITIAN
Sekuen target DNA dari strain HPV 16 dan 18.  Sekuen  target  yang  digunakan  adalah sekuen  DNA  dari  strain  HPV  tipe  16  dan  18. Sekuen yang dipilih adalah whole genome dari kedua  tipe  tersebut.  Kemudian  dilakukan alignment pada kedua sekuen tersebut. Setelah itu  dilakukan  analisis  dimana  dicari  14  basa yang  sama  yang  terdapat  pada  kedua  sekuen HPV  16  dan  18.  Ketentuan  dari  14  basa  ini adalah harus memiliki timin atau T di ujung – ujung  basanya.  Kemudian  14  basa  pertama yang ditemukan akan disebut sebagai TALE 1 dan 14 basa selanjutnya adalah TALE 2.
Desain  TALE  1  dan  TALE  2  dari  Biobrick part  dan  GATE  Assembly  Kit.  Setelah mendapatkan  2  target  sekuen  yang  disebut TALE  1  dan  TALE  2,  dilakukan  konstruksi plasmid  yang  dapat  berikatan  dengan  kedua sekuen target tersebut. Pada 14 basa yang telah ditentukan,  akan  dicari  kode  Biobrick  part yang  diperoleh  dari  DNA  Distribution  kit dengan  96-well,  iGEM.  Pada  14  basa  tersebut akan  dibagi  menjadi  6  pos  atau  6  bagian.
Setelah  itu  dicari  enzim  restriksi  yang  akan digunakan  untuk  pembuatan  TALE  1  dan TALE  2.  Part  ini  berbentuk  plasmid  dan coding  sequence,  sehingga  perlu  dipotong dengan  EcoRI  atau  XbaI  dan  SpeI  atau  PstI sebelum digunakan untuk rekonstruksi plasmid TALE  1  dan  TALE  2.  Selain  itu,  part-part tersebut  juga  dapat  diperoleh  dari  GATE Assembly  Kit  yang  memiliki  96-well  plate berisi  plasmid-plasmid  yang  mengkode  dua basa  sekuen  target  DNA  HPV  16  dan  18. Metode  yang  digunakan  pada  konstruksi TALE ini adalah Golden Gate Cloning.
Golden Gate Cloning.  Part  -  part  yang terdapat  pada  GATE  Assembly  Kit  dikloning dengan metode one single restriction-digestion (Golden  Gate  Cloning)  menggunakan  PCR. Pada  PCR  tube  dimasukkan  keenam  plasmid masing-masing  1  µl,  expression  vector  atau plasmid  backbone,  yaitu  pSB1C3  sebanyak  1 µl,  T4  ligase  buffer  (10x)  2  µl,  T4  ligase  (60 U)  1  µl,  enzim  EcoRI  1,5  µl,  dan  dH 2 O sebanyak  8,5  µl  sehingga  total  larutan  yang terdapat  pada  PCR  tube  mencapai  20  µl. Progam siklus PCR adalah sebagai berikut:
Tabel 1. Progam PCR Siklus Temperatur, Waktu 1-13 37 0 C, 5 menit 20 0 C, 5 menit 14 50 0 C, 10 menit 15 80 0 C, 10 menit
Transformasi.  Sel  bakteri  Eschericia  coli strain  DH5 α diambil  dan  diletakkan  pada  es 4 0 C, kemudian diambil 50 µl dan ditambahkan 1  µl  plasmid,  di  mix  gentle.  Kemudian diletakkan  dalam  es  selama  5-10  menit. Setelah itu dimasukkan waterbath 42 0 C selama 2  menit.  Disimpan  dalam  es  selama  1  menit kemudian  diletakkan  pada  suhu  ruang  2-3 menit.  Ditambah  media  SOC  cair  200  µl,  lalu diaklimatisasi (heat & shaker) pada suhu 37 0 C,
250 rpm selama 24 jam.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisa  Sekuen  Target  DNA  HPV  16  dan 18.  Pencarian  sekuen  target  HPV  ini  dipilih dari  whole  genome  yang  sudah  dilakukan alignment  dengan  software  MEGA  5.1. Sekuen  yang  telah  dialignment  kemudian dicari  14  basa  yang  sama  dengan  basa  Timin
atau T pada kedua ujungnya. Terdapat 2 letak sekuen  target  yaitu  di  bagian  kiri  dan  kanan yang  disebut  sebagai  TALE  1  dan  TALE  2 berturut-turut.  TALE  1  ditemukan  pada  hasil alignment  basa  ke  7106  hingga  7119, sedangkan  TALE  2  dari  basa  ke  7851  hingga 7864.  TALE 1 memiliki urutan target sekuens sebagai berikut: TTAAAGGAAAAGTT.
Sedangkan  TALE  2  memiliki  urutan  target sekuens sebagai berikut:
TTAGGCACATATTT. Pemilihan target sekuen  didasarkan  pada  daerah  conserve dimana  sekuen  tersebut  dimiliki  oleh  whole genome strain HPV tipe 16 dan 18.
Penggabungan  monomer  dari  domain ikatan  DNA  dapat  disisipkan  ke  dalam  vektor kloning  dari  faktor  transkripsi  TALE  (TAL- TF)  atau  TAL  efektor  nuklease  (TALEN) dalam konstruksi protein TALE. Efisiensi dari faktor  transkripsi  TAL  (TAL-TF)  dan  TAL efektor  nuklease  (TALEN)  tetap  dalam keadaan  yang  konstan  apabila  sekuen  target terdiri  dari  13  dan  20  bp  [7].    Hal  ini menunjukkan  bahwa    untuk  mengkonstruksi suatu  TALE  dibutuhkan  sekitar  13  hingga  20 bp pada sekuen targetnya.

## Desain  Rekombinan  Protein  TALE  1  dan
TALE  2  dengan  Plasmid  pSB1C3.  Pada prinsipnya,  14  basa  sekuen  target  yang  sudah ditemukan  kemudian  dibagi  menjadi  6  pos tanpa  mencakup  ujung-ujung  timin.  Sehingga pada  TALE  1  akan  didapatkan  desain  seperti dibawah ini:

## Gambar 1. Desain TALE 1
Pada  gambar  diatas  terlihat  nomor  1 hingga  nomor  6  yang  merupakan  pos-pos dimana pada setiap nomor akan dibentuk oleh satu part yang spesifik. Jadi singkatnya, setiap dua  kode  basa  pada  tiap-tiap  pos  akan  diikat oleh protein yang terdapat pada satu part yang spesifik.  Part-part  ini  sudah  didesain  spesifik untuk  mengikat  dua  basa  pada  sekuen  target. Setiap  dua  basa  pada  sekuen  target  akan dikode  oleh  part  direpeat  tertentu  yang spesifik.  Setiap  sekuen  target  yang  telah diperoleh  memiliki  6  pos  yang  berisi  2  basa pada  setiap  posnya.  Setiap  pos  akan  dikode dengan  satu  macam  direpeat  yang  spesifik. Pada  penelitian  ini  digunakan  dua  sumber
direpeat,  yaitu  GATE  Assembly  Kit  dari  tim Freiburg  dan  DNA  Distribution  Kit  dari iGEM.  Berikut  adalah  daftar  part  yang digunakan untuk konstruksi protein TALE 1:
Tabel  2.  Kode  part  yang  digunakan  dalam
konstruksi TALE 1 Pos ke- Kode Biobricks Letak di DNA Distribution Kit Letak di GATE Assembly Kit 1 BBa_K747012 4I 1E 2 BBa_K747016 6A 3A 3 BBa_K747042 12E 6G 4 BBa_K747048 14A 7A 5 BBa_K747064 18A 9A 6 BBa_K747091 24G 12H

## Keenam  part  yang  terletak  di  GATE
Assembly  Kit  diatas  kemudian  akan  digabung pada satu vektor atau plasmid backbone, yaitu pSB1C3 dengan metode Golden Gate Cloning. Pada  penelitian  ini  digunakan  dua  sumber yang  berbeda  karena  dari  DNA  Distribution Kit  ditujukan  untuk  analisa  ukuran  coding sequence  yang  digunakan  untuk  konstruksi protein  TALE.  Sedangkan  part  dari  GATE Assembly  Kit  digunakan  untuk  konstruksi protein  TALE  1  dan  TALE  2.  Sedangkan berikut adalah desain dari TALE 2:

## Gambar 2. Desain TALE 2
Tabel  3.  Kode  part  yang  digunakan  dalam
konstruksi TALE 2 Pos ke- Kode Biobricks Letak di DNA Distribution Kit Letak di GATE Assembly Kit 1 BBa_K747012 4I 1E 2 BBa_K747026 8E 4G 3 BBa_K747036 10I 6A 4 BBa_K747052 14I 8A 5 BBa_K747076 20I 9E 6 BBa_K747095 9 11H
Hasil  Konstruksi  TALE  1  dan  TALE  2. Pada  masing-masing  TALE  akan  dikonstruksi dengan  keenam  jenis  part  yang  sudah ditentukan  sebelumnya,  EcoRI,  dan  pSB1C3
sebagai  plasmid  backbone.  Berikut  adalah hasil dari konstruksi TALE 1 dan TALE 2:
Gambar  3.  Hasil  konstruksi  TALE  1  (T1-1; T1-2;  T1-3)  dan  TALE  2  (T2-1; T2-2;  T2-3)  dengan  masing- masing 3 perulangan
Berdasarkan teori, jumlah total ukuran masing-masing part yang memiliki satu coding sequence  adalah  sekitar  2070  bp.  Sedangkan TALE  memiliki  6  coding  sequence  dimana masing-masing  coding  sequence  tersebut berukuran 220 bp. Sehingga apabila dijumlahkan,  TALE  memiliki  kurang  lebih 3000  bp  dimana  pada  gambar  16  terlihat adanya  pita  pada  T1-2;  T2-1;  dan  T2-2  pada marker  3000  bp.  Hal  ini  menunjukkan keberhasilan  konstruksi  dari  TALE  1  dan TALE  2  meskipun  hanya  terlihat  pita  tipis pada marker 3 kbp.
Konstruksi TALE menggunakan metode  assembly  dari  Golden  Gate  Cloning dimana  pada  metodenya  terdapat  tahapan pemotongan  dan  penggabungan  atau  ligasi secara langsung dalam satu PCR. Golden Gate Cloning  merupakan  suatu  metode  one  single restriction-ligation reaction yang dapat menggabungkan  banyak  fragment-fragment sekuen  dalam  satu  vector  atau  plasmid backbone  dengan  efisiensi  yang  tinggi  dan hanya dalam satu reaksi [8].

## KESIMPULAN
Konstruksi dari protein TALE 1 dan 2 dapat diperoleh dari penggabungan 6 part pada masing-masing  TALE  menggunakan  GATE Assembly  Kit  dengan  metode  Golden  Gate Cloning.  Hasil  dari  konstruksi  TALE  1  dan  2 adalah  adanya  pita  DNA  sebesar  3kbp  pada gel agarosa melalui elektroforesis.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian  ini  didukung  oleh  tim iGEM  2014  dan  Bpk.  Widodo,  S.Si.,  M.Si., Ph.D.Med.Sc. selaku dosen pembimbing.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Sherris, Jacqueline, Cristina Herdman, dan  Christopher  Elias.  2001.  Beyond Our  Borders:  Cervical  Cancer  in  the developing  world.  West  J  Med 175:231-233. [2] Singh  S,  Badaya  S  .2012.  Factors Influencing uptake of Cervical Cancer Screening  among  Women  in  India:  A Hospital based Pilot Study. J Community Med Health Educ 2:157.
[3] Scott, James N. F., Adam P. Kupinski, dan  Joan  Boyes.  2014.  Targeted genome  regulation  and  modification using transcription activator-like effectors.  FEBS  Journal  281:  4583- 4597. [4] Boch J., Bonas U. 2010. Xanthomonas  AvrBs3  family-type  III effectors:  discovery  and  function.
Annu Rev Phytopathol; 48:419–436.
[5] Kay  S,  Hahn  S,  Marois  E,  Wieduwild R, Bonas U. 2009. Detailed analysis of the  DNA  recognition  motifs  of  the
Xanthomonas type III effectors AvrBs3  and  AvrBs3Deltarep16.  Plant
J. 59:859–871.
[6] Gau J, Wolf A, Reschke M, Bonas U, Posch  S,  et  al.  2013.  Computational Predictions  Provide  Insights  into  the Biology of TAL Effector Target Sites.
PloS Comput Biol 9(3): e1002962.
[7] Boch  J.,  Heidi  Scholze,  Sebastian Scchornack, Angelika Landgaf,
Simone  Hahn,  Sabine  Kay,  Thomas Lahaye,  Anja  Nickstadt,  Ulla  Bonas. 2009.  Breaking  the  Code  of  DNA Binding  Specificity  of  TAL-Type  III Effectors. Science 326, 1509.
[8] Werner  Stefan,  Carola  Engler,  Ernst Weber, Ramona Guetzner & Sylvestre Marillonnet. 2012. Fast track assembly of  multigene  constructs  using  Golden Gate  cloning  and  the  MoClo  system, Bioengineered, 3:1, 38-43.