## Artikel Penelitian
Karakterisasi Fraksi Aktif Antioksidan Dari Biji Gandaria ( Bouea macrophylla )
Maidah Nopiana 1 , Erica Mutiara Putri 1, Annastaya Novariyani 1 , Iip Pahrudin 1 , Candra Junaedi 1 , Tarso Rudiana 2 * 1 Program Studi Farmasi, Fakultas Sains, Farmasi dan Kesahatan, Universitas Mathla'ul Anwar, Pandeglang, Banten, Indonesia, 42273
2 Program Studi Kimia, Fakultas Sains, Farmasi dan Kesahatan, Universitas Mathla'ul Anwar, Pandeglang, Banten, Indonesia,
42273 INFO ARTIKEL ABSTRAK Article History Received 01 October 2022 Revised 28 Desember 2022 Available online 29 March 2023
* Penulis korespondensi: tarso.rudiana@gmail.com
Gandaria  ( Bouea  macrophylla )  plants  contain  antioxidant  compounds  that  can reduce free radicals. Free radicals are one of the causes of various degenerative diseases.  The  purpose  of  this  study  was  to  determine  the  fraction  that  had  the highest antioxidant activity, and to determine the secondary metabolites contained in the most active fraction of B. macrophylla seeds based on LCMS/MS analysis. Maceration of B. macrophylla seeds with ethanol solvent. Ethanol maserate was concentrated and fractionated by liquid-liquid extraction method  using n -hexane, ethyl acetate and ethanol as solvents. Antioxidant activity was measured by the free radical scavenger method with 1,1-diphenyl-2-picrylhidrazil as a source of radicals and  characterization  of  the  secondary  metabolites  contained  in  the  most  active fraction using a Liquid Chromatography-Mass Spectrometer. B. macrophylla seed ethanol extract has a % yield of 31.75%. The ethyl acetate fraction of B. macrophylla seeds has the highest mass compared to other fractions and has strong antioxidant activity with an IC 50 value of 2.95 ppm. The ethyl acetate fraction of B. macrophylla seeds contains tannins, phenolic, flavonoid dan alkaloid compounds. Based on the results  of  the  identification  of  secondary  metabolites  by  LC-MS/MS,  the  ethyl acetate fractions of B. macrophylla seeds contained phenylalalnine compounds.
Keywords: antioxidant; Bouea macrophylla ; DPPH; fraksi;
Tanaman  gandaria  ( Bouea  macrophylla )  mempunyai  kandungan  senyawa antioksidan yang dapat meredam radikal bebas. Radikal bebas merupakan salah satu penyebab timbulnya berbagai penyakit degeneratif. Tujuan dari penelitian ini yaitu mengetahui fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan yang paling tinggi, dan menentukan senyawa metabolit sekunder yang terkandung pada fraksi teraktif biji B.  macrophylla berdasarkan  analisis  LCMS/MS.  Maserasi  biji B.  macrophylla dengan pelarut etanol. Maserat etanol dipekatkan dan difraksinasi dengan metode ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut n- heksana, etil asetat dan etanol. Aktivitas antioksidan diukur dengan metode free radical scavenger dengan 1,1-diphenyl-2- picrylhidrazil sebagai sumber radikal serta karakterisasi metabolit sekunder yang terkandung  pada  fraksi  teraktif  biji B.  macrophylla dengan  menggunakan Liquid Chromatography-Mass Spectrometer . Ekstrak etanol biji B. macrophylla memiliki % rendemen sebesar  31,75 %.  Fraksi etil asetat biji B. macrophylla memiliki masa paling tinggi dibandingkan  dengan fraksi lain serta memiliki aktivitas antioksidan yang  sangat  kuat  dengan  nilai  IC 50 sebesar  2,95  ppm.  Fraksi  etil  asetat  biji B. macrophylla mengandung  senyawa  tanin,  fenolik,  flavonoid  dan  alkaloid. Berdasarkan  hasil  identifikasi  senyawa  metabolit  sekunder  dengan  LC-MS/MS

## ALCHEMY : JOURNAL OF CHEMISTRY
menunjukkan  fraksi  etil  asetat  biji B.  macrophylla mengandung  senyawa phenylalalnine .
Kata kunci: antioksidan; Bouea macrophylla ; DPPH; faction

## 1. Pendahuluan
Dalam kehidupan sehari-hari,  kita  tidak  jauh dari senyawa  radikal  bebas.  Sumber  pembentuk  radikal bebas  yang terdapat di lingkungan kita diantaranya polusi udara, makanan yang dibakar dan digoreng, dan paparan berlebih sinar violet yang bersumber dari matahari. Radikal bebas berbahaya bagi tubuh karena dapat mengikat elektron yang terdapat pada sel melalui reaksi oksidasi [1]. Penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas salah satunya yaitu penyakit degeneratif.
Penyakit  degeneratif  ialah  penyakit  tidak  menular  yang  berlangsung  kronis  seperti  penyakit  jantung,  hipertensi, diabetes, obesitas dan lainnya [2]. Pengobatan back to nature sudah menjadi trend di dunia kesehatan. Tanaman gandaria Bouea macrophylla mengandung senyawa  yang dapat berperan sebagai meredam radikal bebas yang dikenal dengan istilah antioksidan [3].
B.  macrophylla mengandung alkaloid,  terpenoid,  golongan fenol,  flavonoid,  kuinon  tanin dan  saponin.  Ekstrak  etil asetat batang B. macrophylla memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC 50 sebesar 4,89 µg/mL [4], mengandung senyawa naringenin dan luteolin [5], Lauric dietolamide dan loganin [6], fustin [7]. Ekstrak metanol buah B. macrophylla memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC 50 sebesar 16,29 mg/mL [8] dan ekstrak jus buah B. macrophylla sebesar 36,3 mg/mL [9].
Tanaman B. macrophylla berpotensi sebagai sumber antioksidan alami [4]. Antioksidan yang berperan diantaranya senyawa metabolit sekunder. Senyawa metabolit sekunder dalam tanaman tersebar hampir sama pada bagian jaringan tanaman  seperti  pada  daun,  buah,  bunga,  biji,  akar  dan  batang.  Ekslorasi  senyawa  metabolit  sekunder  dan  aktivitas antioksidan pada  biji B. macrophylla belum banyak dilakukan sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut.

## 2. Alat, bahan dan Metode

## 2.1 Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  terdiri  dari  alat  gelas  laboratorium,  vakum rotary  evaporator (Heidolf), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), LCMS/MS (ACQUITY UPLC® BEH C18 column). Bahan yang digunakan diantaranya biji B. macrophylla, DPPH ( 1,1-difenil-2-pikrilhidrasil ) (Merck), Kuersetin (Sigma Aldrict), akuades, asam klorida (Merck), pita magnesium, reagen Wagner, reagen Mayer, ferri clorida 1%, isoamil alkohol, Pelarut ( n -heksana, etil asetat dan etanol) grade teknis terdestilasi.

## 2.2 Preparasi, Ekstraksi dan Fraksinasi Biji B. macrophylla
Biji B. macrophylla dikumpulkan dari Desa Majau, Kecamatan Saketi, Kabupaten Pandeglang, Provinsi Banten yang berasal dari 1 pohon. Biji B. macrophylla dipisahkan dari buah matang, biji B. macrophylla disortasi dicuci pada air mengalir dan dirajang. Biji B. macrophylla dikeringkan dan dihaluskan menggunakan grinder dan diayak menggunakan mesh 60.
Sampel halus biji B. macrophylla (800 g) dimaserasi dengan menggunakan pelarut etanol selama 5x24 jam. Pelarut diganti setiap 1x24 jam dengan etanol yang baru kemudian disaring. Maserat yang diperoleh selanjutnya dipekatkan dengan vakum rotary evaporator .
Ekstrak pekat etanol biji B. macrophylla dilarutkan dengan etanol:air (2:8) dengan perbandingan sampel dan pelarut 1:1 (b/v). Larutan diekstraksi cair-cair dengan pelarut n -heksana kemudian dipisahkan. Residu dipraktisi dengan pelarut etil asetat dan dipisahkan. Fraksi yang didapatkan diantaranya fraksi n- heksana, etil asetat dan residu etanol-air. Masing- masing fraksi dipekatkan dengan vakum rotary evaporator.

## 2.3 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode Free Radical Scavenger
Ekstrak biji B. macrophylla dilarutkan dalam metanol  dan dibuat deret konsentrasi. Masing-masing larutan sampel sebanyak 5 mL ditambahkan DPPH 0,002% sebanyak 5 mL. Larutan diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. Larutan diukur absorbansinya pada Panjang gelombang 515 nm. Kuersetin sebagai kontrol positif diukur dan dianalisis dengan metode yang sama Nilai IC 50 dihitung melalui persamaan garis linier dari grafik hubungan antar konsentrasi dengan % peredaman DPPH. Besarnya % inhibisi DPPH dihitung dengan rumus:
%inhibisi = absorbansi blanko − absorbansi sampel absorbansi blanko × 100% (1)
Konsentrasi sampel dan persen penghambatan masing-masing diplot pada sumbu x dan y yang selanjutnya ditentukan persamaan regresi linearnya. Persamaan yang didapatkan digunakan untuk menghitung nilai IC 50 ( Inhibitor consentration 50%) [10].

## 2.4 Skrining Fitokimia
Identifikasi fitokimia berdasarkan [11] meliputi identifikasi flavonoid, alkaloid dengan pereaksi Wagner dan Mayer, saponin, tanin, fenolik dan triterpenoid/steroid.

## 2.5 Karakterisasi Fraksi dengan LC-MS/MS
Sebanyak 1 mg fraksi teraktif biji B. macrophylla dilarutkan dalam 20 µL metanol. Larutan fraksi kemudian diinjeksikan pada LC-MS/MS sebanyak 10 µL melalui kolom C-18 oktadesil silica (ODS) dengan laju alir 0.2 mL/menit, metode ionisasi ESI, dan detector MS tipe QTOF. Fasa gerak digunakan campuran pelarut asetonitril 0,1% dengan air 0,1% dengan sistem elusi isokratik. Interpretasi data dilakukan menggunakan software masslynx dan library MONA, serta massbank [6].

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1 Ekstraksi dan Fraksinasi
Sampel  biji B.  macrophylla dipisahkan  dari  buah  yang  matang.  Buah  yang  matang  berwarna  kuning.    Biji B. macrophylla disortasi basah, dirajang dan dicuci pada air mengalir untuk memisahkan daging buah yang menepel pada biji. Biji B. macrophylla dikeringkan untuk mengurangi kadar air. Sampel kering kemudian dihaluskan diayak menggunakan mesh 60. Sampel dihaluskan bertujuan untuk memperbesar kontak antara permukaan partikel sampel dengan pelarut dan mempermudah penetrasi pelarut ke dalam sampel sehingga dapat menarik senyawa-senyawa metabolit sekunder  dari simplisia lebih banyak [12].
Biji B. macrophylla dimaserasi dengan etanol. Maserat dipekatkan sehingga didapatkan rendemen sebesar 31,75 %. Indriani et al (2018) melakukan ekstraksi terhadap bji B. macrophylla dengan pelarut etanol namun hanya menghasilkan rendemen  sebesar  17,8  %  [13].  Besarnya  rendemen  yang  dihasilkan  pada  penelitian  ini  disebabkan  karena  proses maserasi yang dilakukan secara optimal. Waktu maserasi dilakukan selama 5x24 jam. Proses maserasi dihentikan sampai maserat tidak berwarna sehingga dimungkinkan senyawa sudah terekstrak semua.
Ekstrak etanol biji B. macrophylla difraksinasi dengan metode ekstraksi cair-cair dengan pelarut n -heksana, dan etil asetat. Massa fraksi dari masing-masing diperoleh fraksi n -heksana sebesar 1,22 g; fraksi eil asetat 68,54 g, dan fraksi etanol-air sebesar 3,27 g. Perbedaan massa pada masing-masing fraksi, dikarenakan perbedaan polaritas dan kelarutan senyawa  dalam  pelarut,  sesuai  dengan  prinsip like  dissolve  like .  Penggunaan  pelarut  yang  bertingkat  berdasarkan perbedaan kepolaran dapat menghasilkan rendemen yang berbeda-beda, hal tersebut diakibatkan oleh kelarutan senyawa metabolit sekunder pada masing-masing pelarut. Pelarut organik dibedakan menjadi pelarut polar dan nonpolar. Tingginya konstanta dielektrik menyebabkan suatu pelarut akan bersifat semakin polar [14].
Fraksi etil asetat memiliki massa paling besar hal ini menunjukkan bahwa pada ekstrak etil asetat mengandung jumlah senyawa  paling  banyak.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pada  sampel  biji B.  macrophylla banyak  mengandung  senyawa semipolar seperti tanin, flavonoid termetilasi, flavonoid aglikon, dan beberapa senyawa alkaloid [4].

## 3.2 Aktivitas Antioksidan Fraksi B. macrophylla
Masing-masing fraksi biji B. macrophylla diuji kemampuan meredam radikal bebas DPPH. Hasil analisis antioksidan disajikan pada table 1.
Tabel 1 . Hasil analisis antioksidan Sampel Nilai IC 50 (ppm) n -heksana 3,04 Etil asetat 2,95 Etanol-air 21,50 Kuersetin 5,35
Nopiana et al / ALCHEMY: JOURNAL OF CHEMISTRY, 11 : 1 (2023) 35-40
Fraksi etil asetat biji B. macrophylla memiliki nilai aktivitas terbaik dibandingkan dengan fraksi lain. Fraksi etil asetat mengandung banyak senyawa antioksidan. Suatu fraksi/esktrak memiliki aktivitas sangat aktif apabila memiliki nilai IC 50 kurang dari 50 ppm [10], sehingga berdasarkan penggolangan tersebut, semua fraksi biji B. macrophylla termasuk pada aktivitas sangat aktif.

## 3.3 Karakterisasi Senyawa Metabolit Sekunder Fraksi Teraktif
Metabolit sekunder yang terdapat pada fraksi etil asetat biji Bouea macrophylla berdasarkan hasil uji skrining fitokimia berupa flavonoid, tanin, fenolik, dan alkaloid pada uji mayer serta negatif untuk saponin dan alkaloid (Tabel 2).
Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia Pengujian Pereaksi Pengamatan Hasil Saponin Akuades + HCl Tidak timbul busa - Tanin FeCl 3 Timbulnya warna hitam kehijauan + Alkaloid Wagner Mayer Tidak ada endapan coklat Tidak ada endapan putih - + Fenolik FeCl 3 Timbulnya warna ungu + Flavonoid HCl + Mg Timbulnya warna jingga pada lapisan isoamil alkohol +
Karakterisasi senyawa dari fraksi etil asetat biji B. macrophylla menggunakan LC-MS/MS dengan menggunakan kolom pemisahan C-18 (1.8µm 2.1 x 50 mm) (ACQUITY UPLC®BEH C18) dengan kecepatan alir 0,2 mL/menit. Kromatogram LC-MS/MS diolah menjadi bentuk mass array. Mass array adalah matriks data tiga dimensi yang mengandung informasi massa akurat dari puncak terdeteksi, waktu retensi, dan intensitas puncak. Kromatogram fraksi etil asetat biji B. macrophylla ( Gambar 1 ) terdapat beberapa puncak yang terdeteksi namun hanya ada satu peak pada puncak 2,69 yang terdeteksi berdasakan massbank dan ion pragmennya.
Gambar 1. Kromatogram dari fraksi etil asetat biji B. macrophylla
Puncak pada kromatogram terdeteksi 15 puncak dimana hanya terdeteksi pada waktu retensi 2,69 menit. Puncak lain tidak terdeteksi karena tidak ada data yang sama pada data base dan online library. Puncka pada waktu retensi 2,69 menit kemudian dianalisis dan diubah menjadi MS 1 dan MS 2 yang ditunjukkan pada Gambar 2 .
Gambar 2. Data MS 1dan MS 2 Waktu Retensi (2,69)
Data MS 1dan MS 2 dari waktu retensi (2,69) diperoleh massa tunggal 120 (m/z). Bedasarakan data base dan online library (https://massbank.eu/MassBank/Search, https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/spectra/browse?query=&text=C8H10N4O2&size=10, dan http://www.chemspider.com/) diperoleh formula C 9 H 11 NO 2 dengan senyawa yang disarankan adalah phenylalanine ( Gambar 3 ).

## Gambar 3. Struktur phenylalanine
Senyawa  phenylalanine  merupakan  asam  amino.  Senyawa  ini  merupakan  prekursor  senyawa  metabolit sekunder seperti senyawa-senyawa fenolik dan turunan.  Senyawa golongan fenolik terbentuk dari  turunan phenylalanine dengan menghilangkan gugus amin dan juga membutuhkan senyawa dari reaksi jalur asam malonat [15]. Phenylalanine dapat menaikan  aktivitas  antioksidan,  hal  ini  sejalan  dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh  Szewczyk  et  al.  (2021)  yang menyatakan bahwa fenilalanin yang disuplementasikan pada sel kultur Ginkgo biloba L. dapat meningkatkan kandungan asam fenolik total secara signifikan dan meningkatkan aktivitas antioksidan [11]. Tingginya aktivitas antioksidan pada fraksi etil asetat biji B. macrophylla disebabkan oleh senyawa flavonoid, fenolik dan kontribusi dari senyawa phenylalanine .

## 4. Kesimpulan
Fraksi etil asetat biji B. macrophylla memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat dengan nilai IC 50 sebesar 2,95 ppm. Fraksi etil asetat biji B. macrophylla mengandung senyawa flavonoid, fenolik, alkaloid dan phenylalanine .

## Ucapan Terima Kasih
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Direktorat  Jenderal  Pembelajaran  dan  Kemahasiswaan  Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset dan Teknologi RI atas bantuan dana penelitian melalui Program Kreativitas Mahasiswa skema Riset Eksakta (PKM-RE) tahun 2022.

## Daftar Pustaka
[1] Verrananda,  I.  M.,  Victoria,  Y.  F.,  Febrina,  L.,  Rijai,  L.  (2016).  “Identifikasi Metabolit  Sekunder  dan  Aktivitas Antioksidan Ekstrak Bunga Tapak Dara ( Catharanthus roseus ).” (Prosiding Seminar Kefarmasian Ke-4) , 20 – 21.
[2] Handajani, A., Roosihermiatie, B., & Maryani, H. (2010). “ Faktor-Faktor yang Berhubungan dengan Pola Kematian pada Penyakit Degeneratif  di Indonesia." Jurnal Buletin Penelitian Sistem Kesehatan . 13 (1), 42 – 45.
[3] Rudiana, T., Suryani, N., Indriatmoko, D. D., Yusransyah, Amelia, A., Noviany, & Hadi, S. (2019). “Characterization of Antioxidative Fraction of Plant Stem Bouea macrophylla Griff .” Journal of Physics: Conference Series , 1341 (7). https://doi.org/https://doi.org/10.1088/1742-6596/1341/7/072008
[4] Sitepu R., Nurdiani, R., & Rollando, R. (2020). “Aplikasi Metode Bioautografi dalam Penelusuran Daya Antibakteri Ekstrak Pegagan ( Centella Asiatica (L.) .” Jurnal Katalisator , 5 (1), 32.
[5] Rudiana, T., Herisman, D., Stiani, S. N., Yusransyah, Suryani, N., Yohanes, R., et al. (2021). “The Analysis of The Secondary Metabolite Compounds And Antioxidant Activity of Ethyl Acetate Extracts From The Stems of Bouea macrophylla griff .” AIP Conference Proceedings , 2370 (060015), 1 – 6. https://doi.org/https://doi.org/10.1063/5.0062482
[6] Rudiana, T., Suryani, N., Indriatmoko, D.D., Yusransyah, Y., Hardiyanto, M.A., Yohanes, R., Hadi, S. (n.d.). “The Anticancer Activity Of Phytoconstituents Of The Stem Of Bou ea Macrophylla.” 14(December) , 1955 – 1964.
[7] Fathoni, A., Rudiana, T., & Adawiah. (2019). “Characterization and Antioxidant Assay of Yellow Frangipani Flower ( Plumeria alba ) Extract .” Jurnal Pendidikan Kimia , 11 (1), 1 – 7. https://doi.org/http://jurnal.unimed.ac.id/2012/index.php/jpk
[8] Rudiana, T., Fitriyanti, F., & Adawiah, A. (2018). “ Aktivitas Antioksidan dari Batang Gandaria ( Bouea macrophylla griff ).” EduChemia , 3 (2), 195 – 205.
[9] Hanifa, D., & Susilawati, Y. (15 C.E.). “Review Artikel: Potensi Tanaman Gandaria ( Bouea macropylla griff ) Sebagai Obat Herbal y ang Beraktivitas Antioksidan.” Farmaka , 3 , 143 – 42.
[10] Anggraito, Y. U., Susanti, R., Iswari, R. S., Yuniastuti, A., Lisdiana., Nugrahaningsih, W. H., Habibah, N. A., & Bintari, S.  H.  (2018). Metabolit  Sekunder  Dari  Tanaman .  Semarang:  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam Universitas Negeri Semarang.
[11] Szewczyk, A., Kwiecień, I., Grabowski, M., Rajek, K., Cavò, E., Taviano, M. F., & Miceli, N. (2021). “Phenylalanine Increases  The  Production  of  Antioxidant  Phenolic  Acids  in  Ginkgo  Biloba  Cell  Cultures .” Molecules , 26 (16). https://doi.org/https://doi.org/10.3390/molecules26164965
[12] Indriani, V., Tobing, N. E. K. P., Rijai, L. (2018). “Formulasi Self -Nanoemulsifying Drug Delivery System (Snedds) Ekstrak  Biji  Ramania  ( Bouea  Macrophylla  Griff )  dengan  Asam  Oleat  (Oleic  Acid)  s ebagai  Minyak  Pembawa.” Mulawrman Pharmaceutical Conference (November 2018): , 20 – 21.
[13] Verdiana, Melia, I Wayan Rai Widarta, I Dewa Gede,  and M. P. (2018). “Gelombang Ultrasonik Terhadap Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kulit Buah Lemon ( Citrus Limon (Linn .) Burm F .).” Jurnal Ilmu Dan Teknologi Pangan , 7 (4),
213 – 222.
[14] Molyneux, P. (2004). The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicryl- Hydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity . 26 (4), 211 – 219.
[15] Lolean, L.A., Fatimawali, F. & Citraningtyas, G. (2013). “Uji Aktivitas Antioksidan Kandungan Fitokimia Jus Buah Gandaria ( Bouea macrophylla ).” Pharmacon , 2 (2), 1 – 8.