Eksplorasi Bakteri yang Berasosiasi dengan Karang Lunak sebagai Alternatif Sumber Senyawa Bioaktif: Uji Hayati Antibakteri

## Esti Harpeni
Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung

## Abstract
Soft  coral  has  a  significant  function  in  the  ecology of  coral  reef  which  produces secondary metabolites.  One  of  very  serious  problems  with  coral  reef  ecosystem  related  to  secondary metabolite  improvement  was  coral  supply because of  need  of  many  soft  corals producing  a  little amount of secondary metabolites. The purposes of this research were to isolate and to select soft coral bacteria that have ability to produce antibacterial having been used to inhibit Escherichia coli and Staphylococcus aureus . The research was conducted from March 31 th to November 2 nd , 2005 by  using  description  method.  Sampling  was  carried  out  at  Pulau  Tegal  Waters  on  two  different coral  genera,  namely Briareum and Sinularia at  three  different  sites.  Laboratory  studies  were performed at Environment and Healthy Monitoring Fish Laboratory at Lampung Marine Agricultural. The results  showed that five of 125 isolates  obtained had potential of producing antibacterial that have been used to inhibit E.coli and S. aureus . The coral ability to inhibit E.coli and S. aureus was indicated  by  inhibition  zone  around  soft  coral  bacteria  colonies.  Morphology  and  biochemistry characterization  of  potentially  inhibiting  isolates  against E.  coli and S.  aureus resulted  in  strains Staphylococcus  sp . (isolate code B1I10), Plesiomonas sp . (isolate code B1I11), Actinobacillus sp . (isolate  code  B2I6), Actinomyces  sp .  (isolate  code  B1II4),  and Aerococcus  sp .  (isolate  code S1III2).
Keywords : secondary metabolite, bacteria, association, soft coral, inhibition zone

## Pendahuluan
Indonesia sebagai negara megabiodiversitas terbesar kedua di dunia setelah Brazil memiliki keanekaragaman hayati yang sangat melimpah, termasuk di dalamnya berbagai produk hayati laut. Keanekaragaman ini memberikan kontribusi yang besar bagi kekayaan sumber plasma nutfah di Indonesia khususnya dan di dunia umumnya.
Saat  ini  produk  hayati  merupakan  struktur  utama  dalam  perkembangan  dunia farmasi  dan  agrokimia  yang  tidak  dapat  dipungkiri  (Proksch,  2000).  Meskipun  sudah banyak  usaha  untuk  mengarakterisasi  produk  hayati,  semuanya  baru  terbatas  pada tanaman  tingkat  tinggi.  Belakangan  ini  perhatian  mulai  banyak  ditujukan  kepada  produk hayati  laut  sebagai  struktur  kimia  yang  unik  dengan  aktivitas  biologisnya  (senyawa bioaktif).
Sumber-sumber  senyawa  bioaktif  banyak  ditemukan  di  lautan  seperti  pada organisme  laut,  termasuk  karang  lunak.    Keberadaan  senyawa  bioaktif  pada  organisme laut  diindikasikan  erat  kaitannya  dengan  mikroorganisme  yang  berasosiasi  dengannya. Keberadaan  mikroorganisme  di  laut  sangat  melimpah  jumlahnya,  bahkan  permukaan karang  lunak  yang  dilapisi  oleh  lendir/mukus  sering  kali  dikolonisasi  oleh  bakteri  atau mikroorganisme lain (Paul et al ..,1986; Coffroth, 1990). Mukus yang terdapat pada karang lunak  berfungsi  sebagai  penyangga  pertumbuhan  bakteri  dengan  cara  membentuk substrat untuk bakteri heterotrofik. Karang lunak diketahui menghasilkan senyawa bioaktif dengan  jenis,  konsentrasi,  serta  fungsi  yang  amat  beraneka  ragam  antar  spesies. Menurut  Sammarco  dan  Coll  (1990),  senyawa  bioaktif  pada  organisme  laut  berperan penting  dalam  ekologi  karang  lunak  tersebut,  terutama  untuk  perlindungan  terhadap predator, kompetisi ruang hidup, reproduksi, antifouling , dan antimikroba.
Sejak  tahun  1995,  terjadi  kecenderungan  kurangnya  perhatian  dalam  pencarian senyawa  baru  dari  sumber-sumber  tradisional  seperti  makroalga,  moluska,  tunikata,
oktokoral.    Demikian  pula,  jumlah  publikasi  tahunan  senyawa  bioaktif  dari  binatang sponge laut relatif stabil.
Di  sisi  lain,  senyawa  bioaktif  dari  mikroorganisme  berkembang  cukup  pesat,  yang disebabkan  oleh  adanya  dugaan  bahwa  sejumlah  senyawa  bioaktif  yang  diperoleh  dari alga  dan  binatang  avertebrata  laut  lainnya,  juga  dihasilkan  oleh  mikroorganisme  yang berasosiasi dengannya (Fenical, 1993; Pietra, 1997; Bernan et al. , 1997; Faulkner et al. , 2000;  Jensen  and  Fenical,  2000).  Meskipun  masih  terlalu  dini  untuk  menentukan kepastiannya,  dapat  dikatakan  bahwa  senyawa  bioaktif  yang  dihasilkan  oleh mikroorganisme  mungkin  berbeda  dengan  senyawa  bioaktif  yang  dihasilkan  oleh  inang avertebrata.
Hambatan  utama  dalam  pengembangan  hampir  semua  produk  hayati  laut  dari golongan  avertebrata  laut  yang  saat  ini  tengah  mengalami  proses  evaluasi  dan pengembangan di bidang industri farmasi adalah masalah pasokan. Masalah kebanyakan senyawa  bioaktif  yang  berasal  dari  avertebrata  laut,  termasuk  karang  lunak,  adalah jumlahnya  yang  sangat  sedikit,  kadang  hanya  kurang  dari  10 -6 %  dari  berat  basah (Proksch et  al. ,  2002).    Di  samping  itu,  telah  terbukti  sangat  sulit,  bahkan  kadang  tidak mungkin,  menyediakan  sejumlah  besar  senyawa  bioaktif  dari  avertebrata  laut  karena jumlahnya yang terbatas dalam organisme penghasil, atau karena jumlah organisme yang terbatas, atau karena masalah geografi, musim, bahkan variasi seksual.
Sejalan  dengan  meningkatnya  kesadaran  masyarakat  tentang  ekosistem  terumbu karang  lunak,  maka  pemanfaatan  karang  lunak  sebagai  sumber  senyawa  bioaktif dipandang  dapat  menyebabkan  suatu  kerusakan  dan  mengganggu  keseimbangan ekosistem  terumbu  karang  lunak.  Hal  ini  terjadi  karena  untuk  mendapatkan  jumlah senyawa  bioaktif  yang  cukup  dibutuhkan  sejumlah  besar  karang  lunak  sehingga  akan sangat  tidak  menguntungkan  terutama  dalam  upaya  perlindungan  dan  pemanfaatan ekosistem terumbu karang yang lestari.
Dengan  mengarakterisasi  bakteri  yang  menghasilkan  senyawa  bioaktif  yang berperan  dalam  proses interaksi  ekologis  akan  diperoleh  alternatif  senyawa  bioaktif  dari ekosistem  terumbu  karang  yang  selama  ini  dihasilkan  oleh  karang  lunak.  Hal  ini  dapat digunakan sebagai alternatif strategi dalam perlindungan ekosistem terumbu karang.
Eksploitasi  karang  lunak  sebagai  sumber  senyawa  bioaktif  yang  dilakukan  terus- menerus akan merugikan  ekosistem terumbu karang karena untuk memenuhi kebutuhan industri  dibutuhkan  karang  lunak  dengan  jumlah  yang  sangat  besar  dengan  perolehan senyawa  aktif  yang  relatif  kecil.   Pencarian  alternatif  bagi  senyawa  bioaktif  yang  selama ini banyak diperoleh dari karang lunak sudah menjadi kebutuhan yang sangat mendesak untuk  menyelamatkan  ekosistem  pesisir  yang  sangat  produktif  ini.  Oleh  karena  itu, pencarian  senyawa  bioaktif  alternatif  dari  ekosistem  terumbu  karang  yang  ramah lingkungan  telah  menjadi  pekerjaan  rumah  yang  harus  segera  dicarikan  pemecahannya secara multidisiplin dan serius.
Senyawa bioaktif yang disintesis oleh bakteri yang berasosiasi dengan karang lunak merupakan produk hayati laut ( marine natural products ) yang dapat merupakan  alternatif bagi sumber senyawa bioaktif baru. Penelusuran biologis menggunakan teknik agar difusi akan dilakukan sebagai skrining terhadap bakteri yang berasosiasi dengan karang lunak sehingga  akan  menghasilkan  data  dasar  mengenai  bakteri  yang  berpotensi  untuk dikembangkan  sebagai  sumber  senyawa  bioaktif.    Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengisolasi  dan  menyeleksi  bakteri  yang  berasosiasi  dengan  karang  lunak,  yang potensial  menghasilkan  senyawa  bioaktif  penghambat  bakteri Escherichia  coli dan Staphylococcus aureus .

## Materi dan Metode
Penelitian  dilaksanakan  dari  tanggal  31  Maret  hingga  20  Juni  2005.  Pengambilan contoh  dilakukan  di  perairan  Pulau  Tegal,  Lampung.  Penanganan  contoh  dilakukan  di Laboratorium Lingkungan dan Kesehatan Ikan, Balai Budidaya Laut, Lampung.
Pengambilan contoh karang lunak dilakukan di tiga stasiun yang ditentukan dengan jarak masing-masing 10, 20, dan 30 meter dari garis pantai dengan penyelaman SCUBA,
dan contoh selanjutnya dimasukkan ke dalam erlenmeyer steril dan dimasukkan ke dalam cool box untuk dibawa ke laboratorium sebagai preparasi contoh. Sebanyak 15,0 g Bacto-agar ; 5,0 g Bacto-peptone ; 1,0 g yeast extract ; dan 19,5 mg feri  fosfat  dimasukkan  ke  dalam  labu  erlenmeyer  yang  kemudian  dituangi  air  laut  steril hingga mencapai  volume 1l. Labu erlenmeyer tersebut kemudian dipanaskan di  atas hot plate hingga  mendidih  dan  homogen.  Nilai  pH  ditentukan  7,5  hingga  7,6  dan  kemudian media  tersebut  disterilisasi  menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121  C  dengan  tekanan  1 atm selama 20 menit.
Metode  yang  digunakan  dalam  mengisolasi  bakteri  adalah  metode spread  plating (penaburan). Contoh  karang lunak dari masing-masing stasiun ditempatkan pada cawan petri steril yang berisi air laut steril. Untuk memperoleh pengenceran 10 -1 , masing-nasing contoh karang lunak diambil 10 g, dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer yang berisi 90 ml air laut steril lalu dikocok hingga homogen. Dari pengenceran 10 -1 diambil 1 ml contoh air  menggunakan  pipet  steril,  yang  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  9  ml  air  laut  steril untuk memperoleh pengenceran 10 -2 . Dari pengenceran tersebut, masing-masing diambil 1  ml  contoh  air  menggunakan  pipet  steril  dan  dimasukkan  ke  dalam  masing-masing cawan petri steril yang telah berisi media Zobell 2216E steril sebanyak 15 ml. Cawan petri tersebut selanjutnya dibungkus dengan plastik pembungkus dan diinkubasikan selama 2 x 24 jam pada suhu kamar.
Pemisahan dan pemurnian isolat bakteri dilakukan dengan metode goresan ( streak method ). Dari masing-masing cawan petri pada tiap pengenceran diambil beberapa koloni bakteri  yang  menampakkan  morfologi  yang  berbeda.  Selanjutnya,  masing-masing  koloni bakteri  tersebut  digoreskan  pada  permukaan  media  Zobell  2216E  steril  pada  masing- masing  cawan  petri  yang  telah  disiapkan.  Selanjutnya,  cawan  petri  diinkubasikan  pada suhu  kamar  selama  2  x  24  jam  dan  diamati  pertumbuhannya.  Apabila  masih  terdapat campuran bakteri pada cawan petri tersebut, maka dilakukan pemisahan kembali dengan metode goresan hingga diperoleh kultur murni pada masing-masing cawan petri.
Kultur   murni  isolat  bakteri  dipindahkan  ke  dalam media  agar  miring  Zobell  2216E pada  tabung  reaksi  dengan  teknik  goresan.  Pemindahan  dan  pemeliharaan  kultur dilakukan tiap empat minggu sekali dengan cara mentransfer kultur murni ke dalam media agar miring yang baru.
Seleksi  dilakukan  dengan  mengusapkan  masing-masing  isolat  bakteri  uji ( Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus )    pada  permukaan  media  Zobell  2216E secara  merata  menggunakan cotton  bud steril.  Selanjutnya,  isolat  ditetesi  dengan  10  µl isolat bakteri karang lunak. Media tersebut diinkubasikan pada suhu 30°C selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan melihat diameter zona hambatan pertumbuhan bakteri di sekeliling  koloni  bakteri  karang  lunak.  Zona  hambatan  yang  terbentuk  diukur menggunakan  jangka  sorong  dengan  ketelitian  0,05  mm.  Hasil  positif  diperoleh  dengan menyeleksi koloni bakteri yang menghasilkan zona hambatan terhadap strain bakteri uji.
Karakterisasi  morfologi  dan  biokimia  isolat  bakteri  karang  lunak  potensial penghambat Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus dilakukan  sebagai  berikut. Pengamatan  morfologi  sel  dilakukan  dengan  mengamati  bentuk  dan  hasil  pewarnaan gram. Pewarnaan  gram  untuk melihat  isolat  termasuk ke  dalam  Gram  positif atau  Gram negatif.  Pergerakan  bakteri  diamati  dengan  melakukan  penanaman  isolat  pada  medium semipadat dengan komposisi 0,3 % agar.
Uji pembentukan indol dilakukan untuk melihat kemampuan mikroorganisme dalam mendegradasi  asam  amino  triptofan  yang  akan  menghasilkan  indol.  Medium  tripton diinokulasi  dengan  koloni  bakteri  dan  diinkubasi  pada  suhu  35  °C  selama  24  jam. Setengah ml reagen Kovac dituangkan ke dalam tabung biakan. Hasil uji dianggap positif bila  terjadi  pembentukan  warna  merah  pada  lapisan  alkohol  yang  menunjukkan keberadaan indol.
Tabung  medium  ‘Sitrat-Koser’  diinokulasi  dengan  biakan  murni  dan  diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 °C.  Hasil uji positif ditunjukkan dengan adanya kekeruhan.
Uji  katalase  merupakan  salah  satu  uji  untuk  melihat  kemampuan  dalam mendegradasi H 2 O 2 menjadi  air dan  oksigen dengan perantaraan  enzim katalase. Uji ini
dilakukan  dengan  menambahkan  0,5  ml  10  %  H 2 O 2 pada  medium.  Hasil  uji  dianggap positif bila terlihat pembentukan gelembung udara di sekitar koloni.
Penguraian  asam  amino  yang  mengandung  sulfur  menunjukkan  adanya pembentukan  H 2 S  oleh  bakteri.  Ion  Fe  dalam  media  biakan  bereaksi  dengan  H 2 S menghasilkan senyawa berwarna hitam.  Media yang digunakan adalah TSIA.
Uji  pembentukan  asam  dari  glukosa  merupakan  uji  untuk  mendeterminasi kemampuan  bakteri  uji  dalam  mendegradasi  dan  memfermentasikan  karbohidrat  yang ditunjukkan oleh terbentuknya gas. Koloni biakan murni ditanam ke dalam tabung medium fermentasi  karbohidrat,  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  35  °C  selama  2  hingga  4  hari. Reaksi  positif  ditunjukkan  oleh  adanya  perubahan  warna  indikator  (bromokresol  ungu) pada medium, yaitu warna ungu ke arah kuning.
Uji  pertumbuhan  dalam  kondisi  aerob  dan  anaerob  dilakukan  untuk  melihat kemampuan  bakteri  uji  menggunakan  O 2 untuk  respirasi  sel.  Pertumbuhan  bakteri  di permukaan  agar  menunjukkan  pertumbuhan  aerob,  sedangkan  pertumbuhan  di  dasar tabung menunjukkan pertumbuhan anaerob.
Uji  reduksi  ini  digunakan  untuk  mendeterminasi  kemampuan  bakteri  dalam mereduksi nitrat menjadi nitrit yang ditunjukkan dengan terbentukkya warna merah. Uji ini bertujuan  untuk  meneliti  produksi  enzim  amilase  dan  aktivitas hidrolitik.  Uji  ini  bertujuan untuk mendeteksi fermentasi gkukosa dan produksi asam dengan pH 4,5 atau kurang. Uji ini  dilakukan  untuk  melihat  kemampuan  dalam menghasilkan  produk  akhir  yang  bersifat nonasam  atau  netral  dari  asam  organik  seperti  asimetil  karbinol  yang  merupakan  hasil metabolisme  glukosa.  Biakan  murni  diinokulasi  ke  dalam  tabung  medium  cair  VP  dan diinkubasi pada susu 35 °C selama 48 jam. Sejumlah 1 ml biakan ditambah 0,2 ml larutan 40%  KOH  dan  dikocok,  kemudian  ditambah  0,6  ml  larutan  alfanaftol,  dikocok  dan diinkubasikan selama 2 hingga 4 jam. Warna merah jambu menunjukkan reaksi positif. Uji dilakukan  untuk  meneliti  produksi  enzim  proteolitik  gelatinase.  Uji  ini  bertujuan  untuk meneliti produksi enzim urease. Hasil uji dikatakan positif bila menunjukkan warna merah dan negatif jika tidak berwarna.
Dokumentasi terhadap contoh karang lunak dilakukan dengan pengambilan gambar menggunakan underwater  camera .  Kemudian,  dilakukan  identifikasi  terhadap  contoh karang lunak yang diperoleh.
Data  penelitian  ini  dianalisis  secara  deskriptif  pada  uji  kualitatif  daya  hambat ( biaassay antibakteri) indigeneous strain  bakteri  karang  lunak  terhadap  strain  bakteri  uji Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus. Kedua  strain  bakteri  uji  tersebut  diambil berdasarkan atas pertimbangan patogenitasnya terhadap manusia.

## Hasil dan Pembahasan
Hasil  identifikasi  karang  lunak  menunjukkan  bahwa  karang  lunak  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  berasal  dari  genus Briareum dan Sinularia .  Pemilihan genus  karang lunak  ini  memperhatikan  pertimbangan  jumlahnya  di  perairan  Pulau  Tegal,  Lampung, yang  masih  relatif  banyak  bila  dibandingkan  dengan  genus  karang  lunak  yang  lain. Dengan  pertimbangan  ini  pula  diharapkan  didapatkan  lebih  banyak  isolat  bakteri  yang berasosiasi dengan karang lunak sebagai kandidat potensial penghasil senyawa bioaktif.
Hasil isolasi bakteri yang berasosiasi dengan karang lunak ( Briareum dan Sinularia ) di  perairan  Pulau  Tegal,  Lampung,  disajikan  dalam  Tabel  1  dan  Gambar  1.    Tabel tersebut menunjukkan bahwa jumlah total isolat bakteri yang berasosiasi  dengan karang lunak adalah 125 isolat.
Tabel 1. Hasil isolasi bakteri yang berasosiasi dengan karang lunak
Genus Karang Lunak Jumlah Isolat Briareum 83 Sinularia 42 Total 125
Gambar 1. Koloni bakteri yang tumbuh pada media Zobell 2216E Figure 1. Bacterial collony grown on Zobell 2216E media
Hasil  uji  hayati  antibakteri  (Tabel  2  dan  Gambar  2)  yang  dilakukan  dengan melawankan  strain indigeneous dengan  strain  uji Escherichia  coli dan Staphylococcus aureus , menunjukkan bahwa hanya 4 % (5 isolat) dari jumlah total isolat  yang diperoleh (125 isolat) memiliki potensi menghasilkan senyawa antibakteri, khususnya bakteri E. coli dan S.  aureus .  Hal  ini  dilihat  dari  kemampuan  bateri  karang  lunak  (strain indigeneous ) dalam menghambat strain uji E. coli dan S. aureus . Kemampuan penghambatan terhadap strain  uji  kedua  bakteri  tersebut  ditunjukkan  oleh  zona  hambatan  di  sekeliling  koloni bakteri karang lunak.
Tabel 2.  Hasil  uji  penghambatan  (kualitatif)  bakteri  karang  lunak  terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
Table  2.  Qualitative  inhibition  test  of  soft  corral  bacteria  on Escherichia  coli and Staphylococcus aureus
Genus Karang Lunak Jumlah Isolat Jumlah Isolat Potensial Persentase (%) Briareum 83 4 4,82 Sinularia 42 1 2,38 Total 125 5 4,00
Gambar 2. Hasil uji penghambatan (kualitatif) bakteri  karang lunak terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus (kiri: hasil negatif, kanan: hasil positif)
Figure  3.  Qualitative  inhibition  test  of  soft  corral  bacteria  on Escherichia  coli and Staphylococcus aureus (left: negative, right: positive)
Tiga  dari  keempat  isolat  bakteri  karang  lunak  dari  genus Briareum mampu menghambat  pertumbuhan  bakteri  uji S.  aureus ,  yaitu  isolat  dengan  kode  B1I10,  B2I11 dan  B2I6.  Sementara  itu,  satu  isolat  bakteri  karang  lunak  dari  genus Briareum mampu menghambat  pertumbuhan  bakteri  uji E.  coli ,  yaitu  isolat  berkode  B1II4.  Isolat  dengan kode S1III2 dari genus Sinularia mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji S. aureus. Bakteri  yang  berasosiasi  dengan  karang  lunak  yang  potensial  menghasilkan  senyawa bioaktif  antibakteri  memiliki  karakteristik  fisik  yang  dapat  diamati  secara  visual,  yaitu memiliki  pigmen  tubuh  yang  mencolok  (Radjasa et  al. ,  1999).  Pigmen  pada  bakteri  ini menampakkan  warna  seperti  kuning,  oranye,  merah  muda,  ungu,  hitam, dan  biru.  Hasil pengukuran zona hambatan pertumbuhan bakteri di sekeliling koloni bakteri karang lunak dengan menggunakan jangka sorong dengan ketelitian 0,05 mm tersaji dalam Tabel 3.
Tabel 3.  Hasil pengukuran zona hambatan
Table 3. Measurement of inhibotory zone
Kode Isolat Karang Lunak Hasil Pengukuran (cm) B1I10 0,86 B1I11 1,26 B2I6 2,36 B1II4 2,60 S1III2 2,50
Hasil  karakterisasi  morfologi  dan  biokimiawi  5  isolat  bakteri  yang  potensial menghambat  bakteri  uji E. coli dan S.  aureus berdasarkan atas standar  prosedur  dalam Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Lay, 1994) disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4.  Hasil karakterisasi morfologi dan biokimiawi isolat bakteri potensial penghambat Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
Table  4.  Morphological  and  biochemical  characteristics  of  bacterial  isolate  capable  of inhibiting Escherichia coli and Staphylococcus aureus
Kode Isolat Karang Lunak Hasil Karakterisasi B1I10 Staphylococcus sp. B1I11 Plesiomonas sp. B2I6 Actinobacillus sp. B1II4 Actinomyces sp. S1III2 Aerococcus sp.

## Kesimpulan
Isolat  bakteri  yang  dapat  diisolasi  dari  jaringan  karang  lunak  ada  125  isolat. Sebanyak  4%  dari  total  isolat  bakteri  yang  berasosiasi  dengan  karang  lunak  potensial menghasilkan senyawa bioaktif antibakteri, khususnya bakteri E. coli dan S. aureus. Isolat bakteri  karang  lunak  yang  terkarakterisasi  mampu  menghasilkan  senyawa  bioaktif (antibakteri) adalah Staphylococcus sp., Plesiomonas sp., Actinobacillus sp., Actinomyces sp., dan Aerococcus sp.

## Daftar Pustaka
Bernan, V.S., M. Greenstein, and W.M. Maise. 1997. Marine microorganisms as a source of new natural products. Adv. Appl. Microbiol. 43: 57-90.
Coffroth,  M.J.  1990.  The  function  and  fate  of  mucous  sheets  produced  by  reef coelenterates. Proc. The 6 th Int. Coral Reef Symp. Australia 2: 15-20
Faulkner,  D.J.,  M.K.  Harper.,  M.G.  Haygood.,  C.E.  Salomon,  and  E.W.  Schmidt.  2000. Symbiotic  Bacteria  in  Sponges:  Sources  of  Bioactive  Substances.  In:  Fusetani,  N (Ed). Drugs from the Sea, Basel: Karger. 107-119.
Fenical, W. 1993. Chemical studies of marine bacteria: developing a new source. Chem. Rev. 93: 1673-1683.
Jensen, P.R., and W. Fenical. 2000. Marine Microorganisms and Drug Discovery: Current Status  and  Future  Potential.  In:  Fusetani,  N  (Ed).  Drugs  from  the  Sea,  Basel: Karger. 6-29.
Lay,  B.  W.  1994.  Analisis  Mikroba  di  Laboratorium.  PT  RajaGrafindo  Persada,  Jakarta.
155 hlm.
Paul, J.H., M.E. DeFlaun, and W,H, Jeffrey. 1986. Elevated levels  of microbial  activity in the coral surface microlayer. Mar. Ecol. Prog. Ser. 33: 29-40.
Pietra, F. 1997. Secondary metabolites from marine microorganisms- bacteria, protozoa, algae and fungi-achievements and prospectives. J. Nat. Prod. 14: 453-464.
Proksch.  2000.  Bioactive  natural  products  from  marine  invertebrates  and  associated microorganisms.  Proceeding  International  Symposium  on  Marine  Biotechnology, Jakarta. Pp 6-14.
Proksch,  P.,  R.A.  Edrada,  and  R  Ebel.  2002.  Drugs  from  the  Seas  Current  Status  and Microbiological Implications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 125-134.
Radjasa,  O.K.,  Sabdono,  A.,  and  Suharsono.  1999.  The  growth  inhibition  of  marine biofilm-forming  bacteria  by  the  crude  extract  of  soft  coral Sinularia sp.  J.  Coastal. Development 2: 329-334.
Sammarco, P.W. and J. C. Coll 1990. Lack of predictability in terpenoid  function: Multiple roles and integration with related adaption in soft corals. J. Chem. Ecol . (16) 1: 273- 289.