Skrining  Bakteri  Penghasil  Enzim  β-Siklodekstrin  Glukosil Transferase (β-CGTase) dari Tanah Jatinangor
Tina Rostinawati * , Hilda Shinta Lestari
Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran, Jl. Raya Bandung-Sumedang KM 21 Jatinangor 45363

## Abstrak
Siklodekstrin merupakan oligosakarida yang bernilai tinggi serta memiliki manfaat dalam bidang farmasi, pangan, dan kosmetik. Dari ketiga jenis siklodesktrin yang paling banyak digunakan dalam bidang farmasi adalah β-siklodekstrin. Produksi β-siklodekstrin dihasilkan oleh enzim β-Siklodekstrin Glukosil Transferase (β-CGTase) dengan mengubah pati menjadi β-siklodekstrin. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh bakteri penghasil enzim β-CGTase dari tanah Jatinangor dan pati yang memberikan aktivitas enzim terbaik. Metode yang digunakan dalam skrining menggunakan media Horikoshi dengan indikator fenolftalein. Hasil positif ditandai dengan adanya yellow hollow zone di sekitar pertumbuhan bakteri. Dari hasil skrining sampel tanah beberapa daerah di Jatinangor diperoleh 5 isolat bakteri yang menghasilkan β-CGTase. Kelima bakteri tersebut diidentifikasi merupakan genus Bacillus. Untuk pati yang memberikan aktivitas CGTase terbesar adalah pati sagu. Pengujian aktivitas enzim dari isolat terbesar (Bacillus TRU) dengan menggunakan pati sagu memberikan aktivitas sebesar 26,23 U/mL .
Kata kunci: CGTase, β-CGTase, β-siklodekstrin, bacillus

## 1. Pendahuluan
Siklodekstrin (CD) telah digunakan dalam berbagai industri seperti industri  farmasi, pangan, dan kosmetik. Penggunaan siklodekstrin dalam industri farmasi sangat bermanfaat  sebagai  kompleks  untuk  meningkatkan kelarutan dalam air dari obat-obat yang kurang larut air, seperti prostaglandin dan piroxicam. Siklodekstrin juga memiliki  manfaat  untuk  menstabilkan  obat,  menutupi rasa  dan  bau  yang  tidak  enak  [1,  2].  Siklodesktrin tergolong oligosakarida termodifikasi yang bernilai $20- $500 untuk tiap kilogramnya pada tahun 2002 [3].
Siklodekstrin  tersusun  atas  6,7,8  unit  glukosa melalui  ikatan  α-(1,4)  membentuk  struktur  melingkar seperti  kue  donat.  Siklodekstrin  memiliki  cincin  luar bersifat  polar  (hidrofil)  sedangkan  bagian  dalamnya rongga yang bersifat nonpolar (hidrofob). Siklodekstrin tersusun  atas  6,7,8  unit  glukosa  melalui  ikatan  α-(1,4) membentuk  struktur  melingkar  seperti  kue  donat. Siklodekstrin  memiliki  cincin  luar  bersifat  polar (hidrofil)  sedangkan  bagian  dalamnya  rongga  yang bersifat nonpolar (hidrofob).
Berdasarkan jumlah unit glukosanya siklodekstrin dibedakan menjadi tiga jenis yaitu α-CD (6 unit), β-CD (7 unit), dan γ-CD (8 unit). Jenis β-CD dan γ-CD lebih
* Departemen Biologi Farmasi Email: tinarostinawati@gmail.com
sering  digunakan  karena  toksisitasnya  yang  yang  lebih rendah  daripada  α-CD.  Dalam  bidang  farmasi  β-CD digunakan  karena  β-CD  mudah  membentuk  kompleks dengan  senyawa  lain.  Kelarutan  β-CD  yang  paling rendah  menyebabkan  kompleks  tersebut  bersifat  lebih stabil dan mudah dipisahkan dari air. Penggunaan γ-CD juga  sedang  banyak  dikembangkan  karena  γ-CD memiliki  diameter  rongga  yang  paling  besar  sehingga molekul berukuran besar dapat masuk [2].
Siklodesktrin  dihasilkan  dari  degradasi  pati menggunakan enzim Siklodekstrin Glukosil Transferase (CGTase). CGTase merupakan eksoenzim yang mampu mengubah  pati  menjadi  siklodekstrin  melalui  reaksi transglikosilasi  intramolekuler.  CGTase  bekerja  pada ikatan  α(1-4)  glikosidik  dan  mengubahnya  menjadi ikatan siklik [5, 6].
Enzim  CGTase  diproduksi  oleh  berbagai  macam bakteri  yaitu  Bacillus,  Thermoanaerobacterium,  dan Brevibacterium.  Produksi  siklodekstrin  secara  alami paling  banyak  dihasilkan  oleh  bakteri  Bacillus  dengan enzim ekstraseluler CGTase. Pencarian sumber penghasil  enzim  CGTase  banyak  dilakukan  terhadap mikroorganisme  yang  hidup  di  tanah.  Mikroorganisme
Rostinawati dan Lestari: Skrining Bakteri Penghasil Enzim β-Siklodekstrin Glukosil Transferase (β-Cgtase) dari Tanah Jatinangor
terbesar  yang  ada  dalam  tanah  adalah  bakteri.  Bakteri dapat  hidup  dalam  tanah  karena  tersedianya  kebutuhan nutrisi seperti air, mineral, dan karbon [6, 7, 8].
Dalam  pencarian  bakteri  penghasil  β-CGTase digunakan  media spesifik Horikoshi  yang  mengandung indikator  fenolftalein.  Bakteri  penghasil  enzim  β- CGTase  akan  mengubah  pati  menjadi  siklodekstrin. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya yellow hollow zone di  sekitar  koloni  bakteri  menunjukkan  adanya aktivitas β-CGTase. Kesesuaian bentuk dari fenolftalein dengan  rongga  β-CD  yang  menyebabakan  fenolftalein dalam  media  Horikoshi  masuk  ke  dalam  rongga  β-CD [9].  Produksi  siklodekstrin  berasal  dari  pati.  Jenis  pati yang  berbeda  dapat  mempengaruhi  hasil  siklodekstrin yang terbentuk akibat aktivitas CGTase [10].
Mengingat manfaat yang dimiliki oleh siklodekstrin  sebagai  kompleks  bernilai  tinggi  yang sangat  bermanfaat  dalam  bidang  farmasi  maka  perlu dilakukan  penelitian  ini.  Penelitian  dilakukan  untuk pencarian  bakteri  penghasil  enzim  CGTase.  Penelitian akan  dilakukan  melalui  tahapan  pengumpulan  sampel tanah, skrining bakteri penghasil β-CGTase, dan diakhiri dengan  pengujian  aktivitas  β-CGTase  dengan  variasi sumber pati.

## 2. Metode

## 2.1 Pengambilan Sampel Tanah
Sampel  tanah  diambil  dari  beberapa  daerah  di Jatinangor  seperti  Arboretum  Universitas  Padjadjaran, taman  sekitar  Unpad,  Kiara  Payung,  halaman pemukiman,  hutan  bambu,  sawah  daerah  Caringin  dan Sayang, daerah hutan Unwim, dan BGG. Sampel tanah diambil 1 cm dari permukaan tanah dan dimasukkan ke dalam botol vial steril.

## 2.2 Skrining bakteri penghasil enzim β-CGTase

## Pembuatan Suspensi Bakteri
Sebanyak  0,5  gram  tanah  dimasukkan  ke  dalam tabung  reaksi,  kemudian  ditambahkan  media  Nutrien Broth steril sebanyak 5 ml. Suspensi bakteri diinkubasi 37 o C 18-24 jam.

## Pembuatan Medium Horikoshi
Medium  Horikoshi  terdiri  dari  pati  (2%),  pepton (0,5%),  ekstrak  ragi  (0,5%),  MgSO 4 (0,02%),  K 2 HPO 4 (0,1%),  agar  (1,5%),  fenolftalein  (0,03%),  metil  jingga (0,01%), dan Na 2 CO 3 (1,5%). Pati, pepton, ekstrak ragi, magnesium  sulfat,  dikalium  hidrogen  fosfat,  dan  agar dibuat  dalam  satu  erlenmeyer.  Setiap  bahan  dilarutkan dalam  aquades  hangat  satu  persatu,  kemudian disterilisasi  dengan  autoklaf  suhu  121°C.  Erlenmeyer
yang  kedua  berisi  natrium  karbonat  yang  disterilisasi terpisah.  Kemudian  erlenmeyer  berisi  medium  pertama ditambahkan natrium karbonat steril sehingga diperoleh pH  10.  Setelah  medium  agak  hangat  ditambahkan indikator fenolftalein dan metil jingga dan diaduk hingga rata

## Skrining Bakteri Penghasil Enzim β-CGTase
Medium  horikoshi  dituang  ke  dalam  cawan  petri dan dibiarkan hingga memadat. Kemudian sebanyak 20 µL suspensi tanah dimasukkan ke atas media dan disebar menggunakan spreader .  Cawan  diinkubasi  pada  37 o C selama 24-48 jam. Adanya koloni bakteri dengan yellow hollow  zone menunjukkan  adanya  bakteri  penghasil enzim β-CGTase.

## Isolasi Koloni bakteri
Satu  ose  dari  setiap  koloni  bakteri  yang memberikan yellow  hollow  zone digoreskan  pada medium  Horikoshi  dan  diinkubasikan  pada  suhu  37ᵒC selama  24-48  jam.  Terbentuknya yellow  hollow  zone menunjukkan  bakteri  menghasilkan  enzim  β-CGTase. Isolasi dilakukan hingga diperoleh isolat bakteri tunggal.

## Pembuatan Master Plate Bakteri
Isolat  bakteri  yang  positif  memberikan yellow hollow zone digoreskan ke nutrient agar untuk dijadikan master plate dan diinkubasikan pada suhu 37ᵒC selama 18-24 jam.

## Pengujian Aktivitas Enzim β-CGTase dari Isolat
Pengujian  aktivitas  enzim  CGTase  diuji  dengan metode difusi agar dengan cara perforasi dengan tahapan sebagai  berikut.  Satu  ose  bakteri  dari  masterplate disuspensikan dengan NaCl dan diaduk. Suspensi bakteri sebanyak  1  ml  diambil  dengan  mikropipet  dan dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  berisi  10  mL medium Horikoshi (tanpa agar dan indikator fenolftalein-metil jingga). Kemudian dinkubasikan pada suhu 37ᵒC selama 24 jam. Media yang digunakan adalah agar  Horikoshi-fenolftalein  dengan  komposisi  yang sama  dengan  media  skrining.  Media  disterilisasi  di autoklaf dengan suhu 121ᵒC. Setelah agak hangat media dituang ke cawan petri dan dibiarkan hingga memadat.
Suspensi  bakteri  uji  yang  telah  diinkubasi  selama 24  jam  diambil  sebanyak  1  mL  dan    dimasukkan  ke dalam  tabung  sentrifugasi,  kemudian  disentrifugasi 10.000  rpm  selama  10  menit.  Supernatan  diambil sebanyak  50  uL  dan  dimasukkan  ke  dalam  agar Horikoshi  yang  telah  dilubangi.  Cawan  diinkubasi selama  24  jam  pada  suhu  37ᵒC.  Aktivitas  enzim  β- CGTase ditunjukkan dengan terbentuknya yellow hollow zone . Semakin besar zona yang terbentuk maka semakin
Rostinawati dan Lestari: Skrining Bakteri Penghasil Enzim β-Siklodekstrin Glukosil Transferase (β-Cgtase) dari Tanah Jatinangor
besar aktivitas enzim CGTase yang dimiliki bakteri uji. Pengujian ini dilakukan dengan kelima isolat bakteri.

## 2.3 Identifikasi Bakteri

## Pewarnaan Gram
Gelas  objek dibersihkan  dengan  alkohol  70%  dan diberi aquades, kemuadian dipanaskan di atas nyala api. Diambil secara aseptik 1 ose suspensi bakteri, diratakan pada  kaca  objek  dan  difiksasi  di  atas  nyala  api. Kemudian  ditetesi  dengan  zat  warna  karbol  gentian violet dan didiamkan selama 1 menit, lalu dicuci dengan air  mengalir  dan  dikeringkan.  Selanjutnya  ditetesi dengan lugol dan dibiarkan selama 1 menit, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian dicuci dengan  alkohol  96%  selama  3  detik,  dicuci  dengan  air mengalir dan dikeringkan. Setelah itu ditetesi dengan air fuchsin  selama  30  detik,  kemudian  dicuci  dengan  air. Preparat  dikeringkan  dan  atasnya  diberi  satu  tetes minyak  emersi.  Preparat  diamati  dengan  mikroskop. Bakteri  gram  positif  akan  berwarna  ungu  dan  bakteri gram negatif akan berwarna merah.

## Pewarnaan Spora
Bakteri  disuspensikan  dengan  NaCl  di  tabung reaksi.  Ditambahkan  karbon  fuksin  sebanyak  1:1  ke dalam  suspensi  bakteri.  Tabung  dipanaskan  di  dalam penangas air bersuhu 80ᵒC selama 10 menit. Kaca obyek yang  bersih  diolesi  suspensi  bakteri  yang  sudah dipanaskan. Olesan digenangi dengan H 2 SO 4 1% selama 2 detik lalu dicuci dengan air. Olesan digenangi dengan pewarna biru metilen selama 5 menit. Zat yang berlebih dibilas dengan air suling lalu dikeringkan dengan kertas saring. Kaca obyek ditetesi dengan  minyak emersi lalu diamati  di  bawah  mikroskop.  Spora  akan  berwarna merah dan badan vegetatif berwarna biru.

## 2.4 Pengujian dengan reaksi biokimia

## Uji Katalase
Diambil  secara  aseptik  1  ose  suspensi  bakteri, diratakan pada kaca objek dan difiksasi di atas nyala api. Kemudian ditambahkan 2-3 tetes larutan H2O2 3% pada permukaan  kaca  obyek.  Jika  terjadi  reduksi  H 2 O 2 akan terlihat adanya gelembung O 2 di atas kaca obyek.

## Uji Motilitas
Masing-masing  isolat  bakteri  diinokulasi  pada medium SSM ( Semi Solid Medium ) pada tabung reaksi secara  aseptik  dan  tusukan  pada  agar  tegak  kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Uji akan bernilai  positif  ditunjukkan  dengan  melebarnya  bekas
tusukan  pada  media  yang  merupakan  indikasi  bakteri tersebut bersifat motil.

## Uji hidrolisis karbohidrat
Bakteri  digoreskan  pada  media  agar  yang mengandung  1%  pati.  Media  diinkubasi  selama  18-24 jam  pada  suhu  37oC.  Cawan  hasil  inkubasi  ditetesi dengan larutan Iodium. Zona berwarna bening di sekitar bakteri  menunjukkan  bakteri  positif  menghidrolisis karbohidrat.

## Uji Glukosa, Laktosa, Maltosa, Sakarosa, Manosa
Uji gula-gula menggunakan larutan berisi glukosa, laktosa,  maltosa,  sakarosa,  manosa  dengan  indikator fenol merah. Ke dalam media uji gula-gula dimasukkan isolat bakteri dan diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37oC. Apabila warna  medium berubah  menjadi kuning berarti bakteri tersebut membentuk asam dari fermentasi.

## 2.5 Pengujian aktivitas pembentukan β-Siklodekstrin
Reagen  PHP  terdiri  dari  4  ml  fenolftalein  (4mM fenolftalein  dalam  etanol)  dilarutkan  dengan  100  mL Na 2 CO 3 125mM.  Enzim  β-CGTase  sebanyak  100  µL diinkubasi  dengan  pati  10%  dalam  10  mL  buffer  Tris- HCl (pH 7). Setiap 2, 4, 8, 12, 24 jam diambil 1 mL dan ditambahkan  100  µL  HCl  1,2  N.  Sebanyak  0,5  mL diambil,  ditambahkan  reagen  PHP  2  mL  dan  divortex. Absorbansi diukur dengan  pada 550 nm [11].

## 2.6 Pengukuran aktivitas CGTase dari isolat superior
Larutan pati sebanyak 0,6 % dicampurkan ke dalam 0,05 M dapar asetat (PH=5,5). Larutan diambil sebanyak 0,45  mL  dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi. Kemudian  ditambahkan  enzim  sebanyak  50  µL  dan diinkubasi  sealam  10  menit  pada  suhu  37ᵒC.  Larutan diambil  sebanyak  50  µL  dan  ditambahkan  0,8  mL campuran  iodin  0,01  M  dalam  kalium  iodida  0,25  M. Kemudian  ditambahkan  aquades  2  mL  sedikit  demi sedikit.  Untuk  kontrol  dibuat  dengan  perlakuan  yang sama  tanpa diinkubasi.  Aborbansi diukur pada panjang gelombang 660 nm [3].
Aktivitas enzim (U/mL) = (Ro – R)/Ro x D x 100 dimana Ro = absorbansi kontrol; R = absorbansi sampel enzim dan diinkubasi; D = faktor pengenceran.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1 Hasil Pengambilan Sampel Tanah
Sampel  tanah  diambil  dari  beberapa  daerah  di Jatinangor  seperti  Arboretum  Unpad,  taman  sekitar Unpad,  Kiara  Payung,  hutan  bambu  dekat  daerah
Rostinawati dan Lestari: Skrining Bakteri Penghasil Enzim β-Siklodekstrin Glukosil Transferase (β-Cgtase) dari Tanah Jatinangor
pemukiman, sawah daerah Caringin dan Sayang, daerah hutan Unwim, dan BGG. Sampel tanah diambil 1 cm dari permukaan  karena  dari  bakteri  penghasil  enzim  β- CGTase merupakan bakteri aerob.
Gambar 1. Hasil  pengumpulan  sampel  tanah  beberapa daerah di Jatinangor

## 3.2 Skrining bakteri penghasil enzim β-CGTase
Skrining  bakteri  penghasil  enzim  β-CGTase menggunakan medium  Horikoshi  dan indikator fenolftalein-metil jingga. Hasil positif bakteri penghasil enzim β-CGTase ditandai dengan adanya yellow hollow zone  di sekitar pertumbuhan  bakteri.  Enzim  β-CGTase merupakan enzim ekstraseluler yang memiliki aktivitas transferase  dimana  mampu  mengubah  pati  menjadi  β- siklodekstrin. Adanya kesesuaian antara fenolftalein dan rongga  dalam  β-siklodekstrin  ini  yang  menyebabkan fenolftalein  dari  media  tertarik  dan  masuk  ke  dalam rongga  siklodekstrin.  Fenolftalein  dalam  keadaan  basa akan kehilangan ion H + dan menghasilkan warna merah fuchsin  pada  media  agar.  Fenolftalein  yang  kehilangan ion  H+  kemudian  berikatan  dengan  gugus  hidroksil rongga  dari  β-siklodekstrin.  Fenolftalein  yang  tertarik menyebabkan tidak adanya fenolftalein di media sekitar pertumbuhan bakteri.
Tabel 1 .  Hasil  skrining  bakteri  penghasil    enzim  β-CGTase dari daerah di Jatinangor
Daerah Pengambilan Sampel Koloni Bakteri Penghasil Enzim β- CGTase Arboretum farmasi Unpad - Arboretum biologi Unpad - Arboretum tanaman angka - Taman rumput Unpad + Kiara payung - Hutan bambu - Sawah daerah Caringin - Pepohonan Sayang Jatinangor - Sawah Sayang Jatinangor + Hutan  Pepohonan Jatinangor + BGG + Pepohonan rindang -
Keterangan: (+) = terbentuk koloni dengan yellow hollow zone ; (-) = tidak terbentuk koloni dengan yellow hollow zone
Park  dkk  (1989)  telah  melakukan  uji  modifikasi dengan  menambahkan  indikator  metil  jingga  sehingga warna kuning ( yellow hollow zone ) yang tampak berasal dari  metil  jingga  dalam  suasana  basa.  Penambahan indikator  metil  jingga  juga  untuk  dapat  membedakan adanya  bakteri  penghasil  asam.  Pada  medium  yang hanya  mengandung  indikator  fenolftalein  saja,  jika terdapat  bakteri  penghasil  asam  (yang  belum  tentu menghasilkan  β-CGTase)  maka  fenolftalein  akan menjadi  bening  dalam  suasana  asam.  Dengan penambahan metil jingga maka dapat dibedakan bakteri penghasil  asam  akan  merubah  warna  media  menjadi merah (metil jingga dalam suasana asam), sehingga tidak terbentuk  yellow  hollow  zone  [9].  Hasil  pengujian keduabelas  sampel  tanah  yang  diuji  dengan  medium Horikoshi  terdapat  4  lokasi  daerah  yang  memberikan hasil positif dengan data pada Tabel 1. Hasil koloni yang terbentuk dapat  dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Koloni  bakteri  penghasil  β-  CGTase;  (A)  hasil dari  tanah  Taman  rumput  Unpad;  (B) hasil dari tanah  Sawah  Sayang  Jatinangor;  (C)  hasil  dari tanah hutan  pepohonan Jatinangor; (D) hasil dari tanah BGG.

## 3.3 Pengujian koloni bakteri yang menghasilkan enzim β-CGTase
Setiap  koloni  berbeda  yang  menghasilkan yellow hollow zone diuji lagi ke dalam medium Horikoshi untuk memastikan setiap koloni tersebut positif menghasilkan enzim  β-CGTase,  dimana  dalam  4  cawan  terdapat beberapa koloni yang diuji kembali dengan cara digores pada medium Horikoshi. Hasil gores dari setiap  koloni yang terbentuk dapat dilihat pada Gambar 3.
Rostinawati dan Lestari: Skrining Bakteri Penghasil Enzim β-Siklodekstrin Glukosil Transferase (β-Cgtase) dari Tanah Jatinangor
Gambar  3. Koloni  bakteri  penghasil  β-CGTase;  (A)  Isolat TRU (Taman Rumput Unpad); (B) isolat SSJ1 (Sawah Sayang Jatinangor); (C) isolat SSJ2; (D) isolat HPJ (Hutan Pepohonan Jatinangor) 1; (E) isolat HPJ2; (F) isolat BGG (Bandung Giri Gahana) 1, (G) isolat BGG2, (H) kontrol negatif

## 3.4 Pengujian aktivitas enzim β-CGTase dari beberapa isolat dari beberapa isolat
Pengujian  ini  dilakukan  untuk  memperoleh  isolat superior  yang  memiliki  aktivitas  enzim  β-CGTase terbesar.  Media  pengujian  menggunakan  media  yang sama  yaitu  media  Horikoshi  dengan  indikator fenolftalein-metil jingga. Suspensi bakteri ditumbuhkan ke  dalam  media  Horikoshi  cair  dan  diinkubasi  24  jam. Enzim  β-CGTase  merupakan  ekstraseluler  enzim  yang dikeluarkan  dari  tubuh  bakteri.  Hasil  inkubasi
disentrifugasi  dan  supernatan  yang  mengandung  crude enzim dimasukkan ke dalam lubang perforasi. Semakin besar diameter yellow hollow zone yang terbentuk maka semakin  besar  aktivitas  enzim  tersebut.  Dari  hasil pengujian  kelima  isolat  diperoleh  hasil  isolat  bakteri TRU  memiliki  aktivitas  enzim  β-CGTase  terbesar dengan diameter zona yang terbentuk paling lebar yaitu 1,42 cm. Hasil pengujian semua isolat dapat dilihat pada Gambar 4
Gambar 4. Diameter yellow hollow zone dari isolat; (A) isolat TRU;  (B)  isolat  SSJ1;  (C)  isolat  SSJ2;  (D)  isolat
HPU1; (E) isolat BGG1; (F) kontrol negatif.
3.5 Pengujian aktivitas enzim β-CGTase dengan variasi pati
Siklodesktrin dihasilkan dari pati dengan enzim β- CGTase.  Perbedaan  pati  yang  digunakan  dapat mempengaruhi  banyaknya  hasil  siklodekstrin  yang dihasilkan.  Setelah  diperoleh  lima  isolat  bakteri  yang menghasilkan  enzim  β-CGTase  maka  selanjutnya digunakan  variasi  pati  untuk  memperoleh  produksi siklodekstrin yang terbesar.
Tabel 2. Diameter yellow hollow zone dari aktivitas enzim β- CGTase Isolat bakteri Diameter yellow hollow zone (cm) Rata-Rata (cm) I II III TRU 1,67 0,97 1,62 1,42 SSJ 1 1,08 1,03 1,06 1,06 SSJ 2 HPU 1 0,97 1,38 0,95 1,24 0,97 1,08 0,96 1,23 BGG 1 1,26 1,29 1,25 1,27
Pengujian kelima isolat menggunakan media yang sama dengan  skrining  dan  digunakan  variasi  pati  yaitu  pati jagung, pati sagu, dan pati tapioka. Dari hasil pengujian diperoleh hasil dimana penggunaan pati sagu menghasilkan diameter yang paling besar dengan isolat bakteri  TRU.  Isolat  TRU  inilah  yang  menjadi  isolat superior penghasil enzim β-CGTase dengan penggunaan pati sagu. Hasil pengamatan dapat dilihat pada Gambar 5 dan Tabel 3.
Rostinawati dan Lestari: Skrining Bakteri Penghasil Enzim β-Siklodekstrin Glukosil Transferase (β-Cgtase) dari Tanah Jatinangor
3.6 Pengujian  aktivitas  pembentukan  β-Siklodekstrin dari isolat superior Bacillus TRU
Isolat  superior  Bacillus  TRU  digunakan  untuk pengukuran aktivitas pembentukkan β-siklodekstrin dan pengukuran  aktivitas  enzimnya.  Pengujian  aktivitas pembentukan β-siklodekstrin dilakukan dengan pengukuran  penurunan  absorbansi  fenolftalein  pada panjang  gelombang  550  nm  [11].  Terbentuknya  β- siklodekstrin  berasal  dari  hasil  pemecahan  pati  oleh  β- CGTase.
Gambar  5. Diameter  yellow  hollow  zone  dari  kelima  isolat dengan variasi pati (Untuk setiap cawan dari atas searah jarum jam yaitu pati sagu, jagung, tapioka)
Produk  β-siklodekstrin  yang  terbentuk  berikatan dengan  fenolftalein  sehingga  setiap  jamnya  absorbansi fenolftalein juga semakin turun (Gambar 6a). Dari setiap data  absorbansi  setiap  jam  dapat  diukur  persen penurunan  absorbansinya,  semakin  besar  persen penurunan absorbansi fenolftalein maka semakin banyak β-siklodekstrin yang terbentuk (Gambar 6b)
(A)
(B)
Gambar  6. Penurunan  absorbansi  fenolftalein  selama  waktu inkubasi  enzim  (A);  dan  persen  penurunan absorbansi sampel sebanding dengan pembentukan β-CD (B). Isolat TRU  dibiakkan  dalam  media  horikoshi  cair dengan pati sagu dan diinkubasi selama 24 jam suhu dan diukur aktivitasnya. Pengukuran dengan
spektrofotometri  berdasarkan  interaksi  antara  pati dengan  iodin.  Pati  yang  tidak  terpecah  oleh  enzim CGTase akan berikatan dengan iodin dan absorbansinya diukur  pada  panjang  gelombang  660  nm.  Pengukuran aktivitas  enzim  pada  sampel  dibandingkan  dengan kontrol  yang  berasal  dari  pengukuran  pati-iodin  saat tidak  bereaksi  dengan  enzim  CGTase.  Hasil  aktivitas isolat Bacillus TRU sebesar 26,23 U/mL.

## 3.7 Identifikasi Bakteri
Dari kelima isolat yang positif menghasilkan enzim β-CGTase  didentifikasi  genus  bakterinya  melalui pewarnaan  gram,  pewarnaan  spora,  dan  uji  biokimia. Hasil  identifikasi  kelima  isolat  diketahui  kelimanya merupakan  genus  Bacillus  yang  ditandai  dengan  hasil Gram positif bentuk basil, memiliki spora, aerob, motil,
(β-Cgtase) dari Tanah Jatinangor
dapat  mengfermentasi  karbohidrat,  dan  menghasilkan enzim katalase. Hasil identifikasi bakteri ada pada Tabel 4.

## 4. Kesimpulan
Hasil skrining sampel tanah dari beberapa daerah di Jatinangor  menunjukkan  bahwa  kelima  isolat  tersebut merupakan bakteri genus Bacillus . Penggunaan pati sagu memberikan aktivitas β-CGTase paling besar.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terima  kasih  kepada  Direktorat  Jenderal Pendidikan  Tinggi  Kementerian  Pendidikan  dan Kebudayaan Republik Indonesia sebagai penyedia dana penelitian  melalui  Penelitian  Terapan  Unggulan Perguruan Tinggi 2017.

## Daftar Pustaka
1. Loftsson T. Cyclodextrin in Pharmaceuitcal Formulation.
A Report For Nordic Industrial Fund ., 1998, 2 -35 2. Yunianto PK, Rahayu B, Wahyuntari. Pengaruh PH dan Suhu  Terhadap  Produksi  β-Siklodekstrin  Glikosil Transferase  (β-CGTase)  oleh  Bacillus  sp  BK-1. Jurnal Sains dan Teknologi , 2000, 2 :27-28.
3. Rosso.  Optimation  of  Batch  Culture  Condition  for
Cyclodextrin Glucanotransferase Production From
Bacillus Circulan DF9R. Biomed Central . 2002, 1-8.
4. Mangunwidjaja, D., A.Sugiri, M. Gatot, Amran. Produksi Siklodekstrin  dari  Pati  dengan  CGTase  Paenibacillus Macerans Imobil . 2000, 232-233.
5. Dwidjoseputro  D. Dasar-Dasar  Mikrobiologi. Jakarta , 2005, Penerbit Djambatan. 179-184.
6. Soeka,  Y.S.,  E.  Naiola,  J.  Sulistyo.  2007.  Aktivitas Antimikroba  Flavonoid-Glikosida  Hasil  Sintesis  Secara Transglikosilasi Enzimatik. Berita Biologi . 8 : 455.
Tabel 3. Diameter yellow hollow zone dari aktivitas enzim β-CGTase
Jenis Pati Isolat bakteri Diameter yellow hollow zone (cm) Rata-rata (cm) I II III Pati Jagung TRU 2,87 2,78 2,56 2,74 SSJ 1 1,69 1,62 1,68 1,66 SSJ 2 1,60 1,41 1,46 1,49 HPU 1 2,19 2,01 1,83 2,07 BGG 1 2,83 2,35 2,58 2,59 Pati Sagu TRU 2,88 2,60 2,89 2,79 SSJ 1 1,54 1,51 1,54 1,53 SSJ 2 1,49 1,52 1,45 1,49 HPU 1 2,09 2,19 2,10 2,11 BGG 1 2,56 2,55 2,66 2,59 Pati Tapioka TRU 3,25 2,36 2,53 2,71 SSJ 1 1,55 1,57 1,50 1,54 SSJ 2 1,56 1,53 1,54 1,51 HPU 1 1,93 2,01 1,76 1,90 BGG 1 2,10 2,09 2,19 2,13

## Tabel 4. Hasil identifikasi bakteri
Ciri-ciri Hasil Pengamatan Isolat bakteri TRU SSJ 1 SSJ 2 HPJ 1 BGG Warna koloni putih krem Putih krem Putih krem Putih krem Putih krem Bentuk koloni bulat Bulat bulat Bulat bulat Pewarnaan gram + + + + + Bentuk Spora basil + basil + basil + basil + basil + Aerob + + + + + Motil + + + + + Katalase + + + + + Fermentasi Glukosa + + - + + Fermentasi Laktosa - - - - - Fermentasi Maltosa - - - - - Fermentasi Sakarosa - - - - - Fermentasi Manosa - - - - -
Rostinawati dan Lestari: Skrining Bakteri Penghasil Enzim β-Siklodekstrin Glukosil Transferase
(β-Cgtase) dari Tanah Jatinangor
7. Perry, J. and J.T. Stanley. 1997. Microbiology Dynamics and Diversity . Soundas College Publishing. USA. 632.
8. Ong,  R.M.,  K.M.  Goh,  N.M.  Mahadi,  O.  Hassan, R.N.Z.R.A.  Rahman,  R.  Illias.    2008.  Cloning Extracelluler  Expression  and  Characterization  of  A Predominant  β-CGTase  from  Bacillus  sp  G1  in  E.  coli. Microbiol. Biotechnol . 35 : 1705-1707
9. Park,  S.C.,  Park,  H.H.  and  Kim,  S.H.  1989.  A  Rapid Screening  Method  for  Alkaline  b-  Cyclodextrin Glucanotransferase Using Phenolphthalein-Methyl
Orange  Containing  Solid  Media. Agriculural  Biological Chemistry , 53: 1167-1169.
10. Yap  PW,  Ariff  AB,  Woo  KK,  Hii  SL,  Production  of Cyclodextrin  Glycosyltransferase  (CGTase)  by  Bacillus lehensis  S8  using  Sago  Starch  as  Carbon  Source,  J.  of Biol. Sci., 2010, 10(7), 676-681.
11. Goel and Nene. 1995. Modification in the Phenolphtalein Method  for  Spectrophotometric  Estimation  of  Beta Cyclodextrin. Starch . 399-400