## INHIBITION ACTIVITY OF XANTHINE OXIDASE OF ETHANOL EXTRACT OF AVOCADO LEAVES WITH IN VITRO METHOD
Deden Winda Suwandi, Farid Perdana

## Fakultas MIPA-Universitas Garut, Jl.Jati No. 42B, Tarogong, Garut
Korespondensi: Deden Winda Suwandi (deden@uniga.ac.id)

## ARTICLE HISTORY
Received: 29 Mei 2017 Revised: 6 Juni 2017                     Accepted: 19 Juni 2017

## Abstract
Hyperuricemia is a condition characterized by excessive levels of uric acid in the blood because  the production  of  uric  acid  in  the  body exceeds  the  normal  level which can lead to gout in the form of deposition of monosodium urate crystals. One of the drugs used to treat gout was allopurinol with the mechanism of inhibiting the activity of xanthine oxidase. Avocado is one of the plants that contain flavonoids that  people  use  for  traditional  medicine.  From  previous  studies  reported  that flavonoids can potentially lower blood uric acid levels by inhibiting the activity of xanthine  oxidase.  Due  to  the  flavonoids  contained  in  avocado  leaves  then investigated if the ethanol extract of leaves of avocado can inhibit  the activity of xanthine  oxidase.  The  ethanol  extract  of  avocado  leaves  made  by  maceration. Inhibition of xanthine oxidase activity by the ethanol extract of avocado leaves in vitro was determined by a decrease in the production of uric acid that is monitored by a spectrophotometer at (λ) 293 nm with xanthine as a substrate. Rated speed were  then  used  to  calculate  the  value  of  the  activity.  IC50  is  then  determined. Allopurinol used as a comparison. The results showed the ethanol extract of leaves of  avocado  is  able  to  inhibit  xanthine  oxidase  activity  with  IC50  65.55  ppm  is weaker compared with allopurinol IC50 of 0.59 ppm.
Key words: Hyperuricemia, avocado leaves, xanthine oxidase.

## AKTIVITAS PENGHAMBATAN XANTIN OKSIDASE EKSTRAK ETANOL DAUN ALPUKAT ( Persea americana MILL ) SECARA IN VITRO

## Abstrak
Hiperurisemia  merupakan  keadaan  berlebihnya  kadar  asam  urat  dalam  darah disebabkan  oleh  ketidak  seimbangan  antara  produksi  dan  ekskresi  asam  urat dalam  tubuh.  Kondisi  ini  dapat  menimbulkan  penyakit  gout  yang  ditandai pengendapan  kristal  monosodium  urat.  Salah  satu  obat  yang  digunakan  untuk menurunkan  kadar  asam  urat  adalah  allopurinol  dengan  cara  menghambat aktivitas xantine oxidase sebagai enzim pembentuk asam urat. Penggunaan obat tradisional seperti tumbuhan alpukat yang mengandung flavonoid diduga memiliki aktivitas  antihiperurisemia  karena  dilaporkan  bahwa  senyawa  flavonoid  dapat menurunkan  kadar  asam  urat  darah  dengan  cara  menghambat  aktivitas  xantin oksidase. Telah dilakukan penelitian terhadap ekstrak etanol daun alpukat dalam menghambat  aktivitas  xantin  oksidase  sehingga  bisa  digunakan  sebagai  obat
penyakit gout. Aktivitas penghambatan enzim xantin oksidase oleh ekstrak etanol daun alpukat secara invitro ditentukan melalui penurunan produksi asam urat yang diukur  dengan  alat  spektrofotometer  pada  (λ)  293  nm  dengan  xantin  sebagai substrat. Ekstrak etanol daun alpukat dapat menghambat enzim xantin oksidase pada  pada  konsentrasi  40;  60;  80;  100  dan  120  ppm  dengan  persen penghambatan  sebesar  27,97;  51,98;  64,07;  71,15  dan  77,54  %.  Aktivitas penghambatan xantin oksidase ekstrak daun alpukat ditentukan dengan nilai IC50, dimana hasilnya menunjukkan ekstrak etanol daun alpukat mampu menghambat aktivitas  xantin  oksidase  dengan  IC50  65,55  ppm  yang  lebih  lemah  bila dibandingkan dengan IC50 allopurinol yaitu sebesar 0,59 ppm.
Kata kunci: Hiperurisemia, daun alpukat, penghambatan xantin oksidase.

## Pendahuluan
Pirai  atau  gout  merupakan  penyakit  metabolik  yang  ditandai  oleh  episode  artritis akut berulang  karena adanya endapan kristal monosodium urat pada sendi-sendi dan jaringan  sekitarnya .1 Penyakit  ini  terjadi  biasanya  karena  adanya  peningkatan  kadar asam urat dalam darah hingga di atas normal (hiperurisemia). Hiperurisemia merupakan suatu  keadaan  yang  ditandai  oleh  berlebihnya  kadar  asam  urat  dalam  darah  karena produksi asam urat dalam tubuh melebihi kadar normal atau disebabkan oleh asupan makanan yang kaya akan asam nukleat seperti  usus, biji-bijian, seafood, dan makanan berasal  dari  yeast  yang  merupakan  sumber  purin  tinggi.  Purin  sendiri  merupakan prekursor bagi biosintesis asam urat dengan katalis enzim xantin oksidase. 2
Pengobatan penyakit gout salah satunya adalah dengan menurunkan kadar asam urat darah dengan cara mengurangi produksi asam urat. Alopurinol adalah contoh obat yang  bekerja  menghambat  pembentukan  asam  urat  melalui  penghambatan  aktivitas enzim  xantin  oksidase .3 Selain  allopurinol,  penelitian  sudah  banyak  melaporkan  dari bahan alam yang memiliki aktivitas antihiperurisemia yang selain secara empiris terbukti berkhasiat menurunkan kadar asam urat dalam darah, terbukti juga secara ilmiah dapat mengobati hewan yang hiperurisemia. 4
Penggunaan obat dari bahan alam lebih aman karena memiliki efek samping yang relatif lebih kecil jika digunakan secara tepat. 5 Salah satu tumbuhan obat yang banyak digunakan  secara  empiris  terutama  untuk  mengobati  penyakit  reumatik  adalah tumbuhan alpukat terutama bagian daunnya.
Berdasarkan latar belakang diatas masalah yang dapat diidentifikasi adalah apakah daun  alpukat  memiliki  aktivitas  antihiperurisemia  melalui  penghambatan  enzim  xantin oksidase dalam memproduksi asam urat.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  aktivitas  daun  alpukat  sebagai antihiperurisemia    melalui  penghambatan  enzim  xantin  oksidase  dalam  memproduksi asam  urat  secara  in  vitro  serta  menentukan  nilai  IC50  sebagai  konsentrasi  efektif sebagai antihiperurisemia.

## Metode

## Determinasi tumbuhan
Tumbuhan  alpukat  dideterminasi  di  Laboratorium  Taksonomi,  Jurusan  Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran.

## Pembuatan ekstrak
Simplisia kering diekstraksi dengan etanol 70% (3 x 24 jam) secara maserasi pada suhu  kamar.  Pelarut  kemudian  diuapkan  dengan  rotary  evaporator  pada  suhu  50 0 C hingga diperoleh ekstrak kental.

## Penapisan fitokimia
Penapisan  fitokimia  dilakukan  terhadap  ekstrak  kental  untuk  mengetahui  adanya kandungan senyawa metabolit sekunder seperti golongan senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, kuinon dans teroid/triterpenoid.

## Pengujian hambatan xantin oksidase secara In vitro
Metode penentuan hambatan xantin oksidase berdasarkan metode penelitian yang ditulis oleh Xu fan et al., 2014. Pertama-tama menyiapkan zat uji, Pembanding (kontrol positif) dan kontrol negatif. Disini dilakukan dengan membandingkan absorbansi asam urat  yang  terbentuk  antara  larutan  uji  (xantin  +  sampel  uji  +  xantin  oksidase)  dengan absorbansi  kontrol  negatif  (xantin  +  xantin  oksidase)  serta  absorbansi  kontrol  positif (xantin  +  allopurinol  +  xantin  oksidase).  Disini  diukur  dengan  spektrofotometri  pada panjang gelombang 293 nm. Allopurinol (100 μg/mL) dipakai sebagai pembanding untuk uji  pengh ambatan  xantin  oksidase.  Larutan  pengujian  terdiri  dari  300  μL  dari  50  mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), 100 μL dari larutan uji dalam DMSO, 100 μL larutan enzim  (0.2  units/mL  xantin  oxidase  dalam  buffer  phosphate)  dan  100  μL  aquadest. Larutan  pengujian  di  atas  diinkubasi  pada  37°C  selama  15  menit  dalam  inkubator. Selanjutnya, larutan substrat 200 μL (0.15 mM xantin) ditambahkan pada larutan uji dan diinkubasi  pada  37°C  selama  30  menit.  Kemudian  reaksi  dihentikan    dengan penambahan  200  μL  0.5  M  HCl.  Absorbansi  diukur  menggunakan  spektrofotometer UV/VIS  dengan  memakai  blanko  larutan  enzim  dalam  buffer    fosfat.  Sebagai  kontrol digunakan 100 μL DMSO yang mengandung asam urat. 6

## Hasil dan Pembahasan

## Determinasi simplisia
Tumbuhan segar dideterminasi di Laboratorium Taksonomi Jurusan Biologi FMIPA Universitas  Padjadjaran.  Hasil  determinasi  menunjukkan  bahwa  tumbuhan  yang digunakan adalah tumbuhan Alpukat ( Persea americana Mill).
Ekstrak  etanol  daun  alpukat  (1  kg)  dimaserasi  dengan  etanol  70%  (3  x  24  jam) menghasilkan ekstrak kental sebanyak 112 gram atau rendemen ekstrak adalah 11,2 %. Ekstrak kental yang diperoleh berwarna hijau kecoklatan, berbau khas gula dan berasa pahit.
Tabel 1 .Hasil Penapisan Simplisia, Ekstrak Etanol Daun Alpukat (Persea americana Mill)
Keterangan: (+) = Terdeteksi; (-) = Tidak terdeteksi Hasil penapisan fitokimia di atas menunjukkan bahwa pada simplisia, ekstrak etanol daun alpukat terdeteksi adanya senyawa golongan alkaloid, flavonoid, saponin, kuinon, tanin, dan steroid/triterpenoid.
Metabolit Sekunder Hasil Penapisan Simplisia Ekstrak  Etanol Alkaloid + + Flavonoid + + Tanin + + Kuinon + + Saponin + + Steroid/Triterpenoid + +
Pada  pengujian  aktivitas  penghambatan  xantin  oksidase  dilakukan  untuk  melihat mekanisme kerja sediaan uji terhadap penurunan kadar asam urat darah yang dilakukan secara  in  vitro.  Pengujian  aktivitas  penghambatan  xantin  oksidase,  pertama-tama dilakukan  penetapan  panjang  gelombang  maksimum  dengan  mengukur  absorbansi pada larutan kontrol positif yang mengandung substrat xantin 0,15 mM,  larutan buffer phosfat pH 7,5 konsentrasi 0,05 M yang diinkubasi pada suhu 25 0 C  selama 10 menit, selanjutnya ditambahkan enzim xantin oksidase, dan diinkubasi kembali pada suhu 25 0 C selama 30 menit, setelah itu reaksi dihentikan dengan penambahan HCl 1 N. Campuran larutan tersebut kemudian diukur absorbansinya pada variasi panjang gelombang 290- 300  nm.  Hasilnya  diperoleh  absorbansi  yang  paling  optimal  adalah  pada  panjang gelombang  maksimum  293  nm  dengan  nilai  absorbansi  (A)  0,579.  Hasil  pengukuran absoransi dan penetapan panjang gelombang maksimum dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 . Kurva penetapan panjang gelombang maksimum
Selanjutnya,  dilakukan  pengujian  terhadap  penurunan  kadar  asam  urat  dengan mengukur  absorbansi  larutan  uji  dan  larutan  pembanding  allopurinol  pada  pajang gelombang  293  nm.  Efek  penghambatan  allopurinol  terhadap  penghambatan  enzim xantin oksidase ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Nilai Absorbansi dan Persen Inhibisi Allopurinol terhadap Xantin Oksidase pada 293 nm.
Konsentrasi (ppm) Serapan (A) Inhibisi (%) 2,5 0,288 50,26 5 0,233 59,76 10 0,117 79,79 20 0,048 91,71
Selanjutnya  untuk  melihat  efek  penghambatan  sediaan  uji  ekstrak  etanol  daun alpukat  terhadap  penghambatan  enzim  xantin  oksidase,  maka  dilakukan  pengujian terhadap  penghambatan  enzim  xantin  oksidase  secara  in  vitro,  dimana  hasilnya ditunjukkan pada Tabel 3.
290; 0,557 291; 0,563 292; 0,575 293; 0,579 294; 0,575 295; 0,571 296; 0,559 0,555 0,56 0,565 0,57 0,575 0,58 0,585 288 290 292 294 296 298 300 302 Absorban
Tabel 3. Nilai Absorbansi dan Persen Inhibisi Xantin Oksidase Ekstrak Etanol Daun
Alpukat Konsentrasi (ppm) Serapan (A) Inhibisi (%) 40 0,417 27,97 60 0,278 51,98 80 0,208 64,07 100 0,167 71,15 120 0,13 77,54
Pada table 2 dan 3 diatas, menunjukkan pengujian aktivitas penghambatan xantin oksidase,  dimana,  allopurinol  dengan  konsentrasi  20  ppm  menunjukkan  hasil  persen inhibisi paling tinggi, dengan nilai penghambatan sebesar 91,71 %. Hal ini menunjukkan bahwa  allopurinol  yang  biasa  digunakan  secara  klinik  untuk  mengobati/menurunkan asam  urat  dalam  darah,  efektif  menghambat  pembentukan  asam  urat  dengan mekanisme  kerja  penghambatan  aktivitas  enzim  xantin  oksidase.  Allopurinol  memiliki struktur  yang  mirip  dengan  xantin  yang  merupakan  substrat  xantin  oksidase  dalam sintesis  asam  urat.  Dalam  tubuh,  Allopurinol  akan  bersaing  dengan  xantin  untuk mengikat  sisi  aktif  enzim  xantin  oksidase  dan  bereaksi  menjadi  oksipurinol  yang  juga bekerja  sebagai  penghambat  enzim  xantin  oksidase.  Dimana,  xantin  oksidase merupakan salah satu enzim yang ada dalam tubuh manusia yang bertanggung jawab dalam sintesis asam urat dari substrat purin. 7
Demikian juga dengan ekstrak etanol daun alpukat, secara in vitro diuji aktivitasnya sebagai  penghambatan  xanin  oksidase.  Dimana,  persen  inhibisi  yang  paling  tinggi ditunjukkan  pada  konsentrasi  120  ppm  dengan  nilai  77,54  %.  Hal  ini  menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun alpukat juga memiliki aktivitas menurunkan kadar asam urat melalui mekanisme kerja penghambatan enzim xantin oksidase.
Berdasarkan hasil pengujian in vitro ini terbukti bahwa ekstrak etanol daun alpukat dapat menurunkan kadar asam urat darah melalui penghambatan aktivitas enzim xantin oksidase, meskipun potensinya jauh dibawah allopurinol. Pada penelitian sebelumnya, senyawa  kimia  alami  yang  terkandung  pada  berbagai  spesies  tanaman  dilaporkan mengandung senyawa kimia seperti flavonoid memiliki aktivita antihiprurisemia dengan mekanisme  kerja  sebagai  inhibitor  beberapa  enzim  termasuk  xantin  oksidase, siklooksigenase dan lipooksigenase. 7
Selanjutnya,  untuk  melihat  potensi  kerja  penghambatan  enzim  xantin  oksidase, maka ditentukan nilai IC 50 sebagai nilai konsentrasi obat yang dapat menghambat 50% pembentukan asam urat. Hasilnya dapat dilihat pada tabel 4.
Tabel 4 . Nilai konsentrasi inhibisi (IC 50 ) allopurinol dan ekstrak daun alpukat pada panjang gelombang maksimum 293 nm
Pada penelitian ini, allopurinol memiliki daya inhibisi tertinggi dibandingkan dengan daun alpukat. Allopurinol memiliki nilai IC 50 0,59 ppm, artinya allopurinol memiliki daya hambat perubahan xantin menjadi asam urat oleh enzim xantin oksidase hingga 50 % aktivitasnya atau kadar asam uratnya, yaitu pada konsentrasi 0,59 ppm. Nilai tersebut lebih  baik  jika  dibandingkan  dengan daya  inhibisi  ekstrak  daun  alpukat  yang memiliki IC 50 65,55 ppm. Ini berarti bahwa potensi daun alpukat dalam menurunkan kadar asam
No Nama Zat Aktif IC 50 1 Allopurinol 0,59 ppm 2 Esktrak Daun Alpukat 65,55 ppm
urat  atau  menghambat  enzim  xantin  oksidase  lebih  lemah  dibandingkan  dengan allopurinol.

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  dari  penelitian  di  atas,  dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak  etanol daun  alpukat  memiliki  aktivitas  penghambatan  xantin  oksidase,  terutama  pada konsentrasi 120 ppm sebesar 77,54 % serta memiliki nilai IC50 sebesar 65,55 ppm.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada  pimpinan  universitas  garut  khususnya dekan fakultas MIPA yang sudah sepenuhnya mendukung terlaksananya penelitian ini.

## Daftar Pustaka
1.  Katzung B.G., Masters, S.B. & Trevor, A.J. 2012. Basic & Clinical Pharmacology, 12 Ed., New York: McGraw-Hill.
2.  Abdullahi, W., Hamzah, R.U., Jigam, A.A., Yahya, A., Kabiru, A.Y., Muhammad, A., Sakpe,  S.,  Adefolalu,  F.S.,  Isah,  M.C.  &  Kolo,  M.Z.  2012.  Inhibitory  activity  of xanthine oxidase by fractions Crateva adansonii, J. of Acute Disease, 126-129.
3. Gilman, A.G., Rall, T.W. & Nies, A. S., Taylor, P. 2012. Goodman and Gilman’s the pharmacological basis of therapeutics, 12th Ed., New York. McGraw-Hill.
4.  Sumiwi, S.A., 2014. Antihyperuricemia Screening Of Mimosa Pudica L. Herb Extract Through Its Analgesics And Antiinflammatory Activity Assay. New Bionatura, 16(2)..
5.  Kristiani,  R.D.,  Rahayu,  D.  dan  Subarnas,  A.  Aktivitas  Antihiperurisemia  Ekstrak Etanol  Akar  Pakis  Tangkur  (Polypodium  Feei)  Pada  Mencit  Jantan,  2013,  J. Bionatura, Vol. 15, No. 3, Halaman 174 – 177.
6.  Xu Fan, Zhao  Xueqian,  Yang Lingli, Wang Xiuhua, and Zhao Jing., 2014, A New Cycloartane-Type Triterpenoid Saponin Xanthine Oxidase Inhibitor from Homonoia riparia Lour, journal molecules, 19, 13422-13431.
7.  Nguyen M.T., Awale S., Tezuka Y.,Tran Q.L.,Watanabe H. And Kadota S., 2004., Xanthin  Oxidase  Inhibitory  Activity  of  Vietnamese  Medicinal  Plants,  Biol.  Pharm. Bull. 27 (9) 1414-1421.