## ALCHEMY : JOURNAL OF CHEMISTRY

## Artikel Penelitian
Isolasi Fungi Tanah Muara Mangrove Desa Katialada Gorontalo dan Skrining Aktivitas Antibakteri terhadap Pseudomonas aeruginosa
A H Prakoso 1 , M Z Arifin 2 , S A Tauladani 2,3 , G A Muharam 4 , Asia 5 , Bawon Triatmoko 1 , A S Nugraha 1 * 1 Drug Utilisation Discovery Research Group, Fakultas Farmasi, Universitas Jember
2 Politeknik Kelautan dan Perikanan Bitung
3 Australian National Centre for Ocean Resources and Security (ANCORS), University of Wollongong
4 Balai Pendidikan dan Pelatihan Perikanan Aertembaga
5 Politeknik Kelautan dan Perikanan Bone INFO ARTIKEL ABSTRAK Riwayat Artikel Diterima 22 April 2022 Direvisi 25 Juni 2022 Tersedia online 29 Maret 2023
*Email penulis korespondensi: arisatia@unej.ac.id
Pseudomonas  aeruginosa is  a  bacterial  pathogen  that  causes  various  kinds  of infections. The use of antibiotics is usually done to treat the infection. However, Pseudomonas  aeruginosa has  various  resistance  abilities  that  can  avoid  the efficacy of antibiotics. The emergence of drug resistance events encourages the need for the discovery of new antibiotic drugs, one of which comes from fungal secondary  metabolites.  Soil  fungi  from  mangrove  ecosystems  have  not  been studied much. Interestingly, these soil fungi have unique adaptive responses. This response  also  affects  the  secondary  metabolites  it  contains.  Knowing  this information, mangrove soil samples were cultured on fungi media which were then tested  against Pseudomonas  aeruginosa through  an  antagonist  test  and microdilution test. Three fungal cultures with yeast characteristics were obtained and each of the secondary metabolite ethyl acetate extracts of these three fungi had antibacterial activity. The antibacterial activity was indicated by the % inhibition parameter. The terpenoid content in fungal cultures may be responsible for the antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa . This research is an initial screening of the search for new antibiotic candidates, so further research study such as isolation and species determination needs to be done.
Keywords: Antibacterial, Pseudomonas aeruginosa, Mangroves soil fungi
Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri patogen penyebab berbagai macam infeksi. Penggunaan antibiotik biasa dilakukan untuk mengobati infeksi tersebut. Namun,  bakteri Pseudomonas  aeruginosa memiliki  beragam  kemampuan resistensi  yang  mampu  menghindari  efikasi  antibiotik.  Munculnya  kejadian resistensi obat mendorong kebutuhan terhadap penemuanantibiotik baru, salah satu sumbernya berasal dari metabolit sekunder fungi. Fungi tanah dari ekosistem mangrove masih belum banyak diteliti. Menariknya, fungi tanah tersebut memiliki respon adaptasi yang unik. Respon tersebut juga berpengaruh terhadap metabolit sekunder  yang  dikandungnya.  Mengetahui  informasi  tersebut,  sampel  tanah mangrove dikultur pada media fungi yang selanjutnya diujikan terhadap bakteri Pseudomonas  aeruginosa melalui  uji  antagonis  dan  uji  mikrodilusi.  Tiga  fungi berciri  khamir  berhasil  terkulturkan  dengan  masing  masing  ekstrak  etil  asetat menunjukkan aktivitas antibakteri. Aktivitas antibakteri masing-masing ekstrak etil asetat  ditunjukkan  dengan  parameter  %  penghambatan  dengan  hasil  60.5%, 31.9%,  dan  51.0%.  Uniknya,  kandungan  terpenoid  fungi  mampu  berkontribusi sebagai  antibakteri  terhadap Pseudomonas  aeruginosa .  Aktivitas  antibakteri ketiga kultur merupakan skrining awal kandidat antibiotik baru sehingga penelitian
lanjutan  seperti  determinasi  spesies,  pengujian  IC50,  beserta  isolasi  senyawa pada ekstrak perlu dilakukan.
Kata Kunci: Antibakteri, Pseudomonas aeruginosa , Fungi tanah Mangrove

## 1. Pendahuluan
Kejadian resistensi antibiotik telah banyak dijumpai secara global. Salah satu jenis bakteri yang mampu menyebabkan resistensi adalah Pseudomonas aeruginosa (PA). Pada tahun 2019, dunia mengalami peningkatan resistensi PA sebesar 15-30% di beragam instalasi kesehatan [1]. Bakteri PA merupakan bakteri aerobik gram negatif, berbentuk rod atau batang yang menyebabkan beragam macam infeksi pada manusia [2]. Infeksi yang dimaksud adalah infeksi nasokomial dengan beragam  manifestasi  klinik,  mulai  dari  pneumonia  hingga  infeksi  saluran  kemih  [3].  Pada  penelitian  FORLAB  Infeksi Indonesia 2018, telah ditelusuri isolat PA pada 4.873 pasien yang terdiri atas 3.245 sensitif karbapenem (67%) dan 1.628 resisten terhadap karbapenem (33%) [4]. Faktanya, PA resisten karbapenem telah menjadi perhatian besar WHO sejak 2017 dan menjadi prioritas kritis dalam penemuan antibiotik [5]. PA memiliki banyak kemampuan infeksi yang kuat pada individu dengan gangguan imun, keserbagunaan yang dinamis dan ekstrem terhadap berbagai macam kondisi lingkungan, serta  seperti  yang  disebutkan  sebelumnya,  kebal  terhadap  antibiotik  karbapenem.  Kemampuan-kemampuan  tersebut menjadikan PA sebagai mikroorganisme tangguh untuk diobati dalam pengobatan modern  [2]. Umumnya, pengobatan penyakit yang disebabkan PA bisa diatasi dengan pemberian antibiotik, baik monoterapi maupun terapi kombinasi. Namun, regimen tersebut menjadi halangan besar pengobatan akibat kemampuan PA yang mampu bertahan dan  menghindari efikasi antibiotik. Ditambah lagi penggunaan antibiotik berlebih selama pengobatan dapat mengakibatkan munculnya strain multi-drug  resistant  Pseudomonas  aeruginosa yang  menyebabkan  penggunaan  antibiotik  menjadi  tidak  efektif  [6]. Meningkatnya kejadian resistensi obat mendorong kebutuhan terhadap penemuan obat baru.  Secara historis, senyawa antibiotik merupakan turunan dari produk bahan alam [7]. Produk bahan alam seperti fungi dilaporkan memiliki banyak aktivitas  dalam  dunia  pengobatan.  Dari  22.500  senyawa  biologis  aktif,  40%  di  antaranya  diproduksi  oleh  fungi  [8]. Penemuan tersebut mengindikasikan bahwa fungi merupakan kandidat obat baru yang menjanjikan.
Pencarian fungi poten sebagai penghasil antibiotika memerlukan banyak pertimbangan, salah satu pertimbangannya adalah habitat atau letak fungi tumbuh. Tanah merupakan rumah untuk beragam mikroorganisme. Di tanah, variasi biotik dan  abiotik  yang  luas  membuat  mikroorganisme  penghuni  melakukan  adaptasi  seperti  mengembangkan  kemampuan bertahan hidup. Produksi antibiotik merupakan salah satu strategi kompetitif dalam beradaptasi [9]. Beberapa senyawa antibiotik seperti penisilin, griseofulvin, fumigalin, sefalosporin, dan ceftobiprole ditemukan pada fungi tanah [10]. Fungi tanah juga diketahui menghasilkan metabolit sekunder sebagai enhancer antiobiotik meropenem, yaitu aspergilomarasmin [11]. Uniknya perbedaan karakteristik tanah mampu mempengaruhi diversitas dan kelimpahan fungi tanah [12]. Salah satu ekosistem tanah yang masih sedikit diteliti namun memiliki peluang akan kelimpahan temuan adalah ekosistem mangrove [13]. Ekosistem mangrove memiliki diversitas hayati yang teradaptasi oleh salinitas, tanah pesisir yang cenderung anoksik, kelembaban dan temperatur tinggi, kecepatan angin tinggi, serta gelombang laut [14]. Kondisi lingkungan yang ekstrem mengindikasikan adanya respon adaptasi mikroorganisme unik yang tinggal dalam ekosistem tersebut.
Keunikan  ekosistem  mangrove  menjadi  hunian  bagi  fungi terrestrial dan marine yang  kemudian  disebut  dengan manglicolous  fungi .  Sebanyak  625  mangrove  fungi  terestimasi  dijumpai  secara  global,  dan  mayoritas  fungi  tersebut terlaporkan berasal dari Asia Tenggara [14]. Pada penelitian studi genomik di ekosistem mangrove Laut Merah, banyak komunitas fungi ditemukan. Genus Aspergillus banyak dijumpai pada ekosistem mangrove [15]. Fungi Aspergillus dikenal kaya  akan  metabolit  antimikrobial  seperti  asam  helvonat,  aspergillin, claviformin ,  dan  fumagillin  [16].  Penelitian  lain mengungkapkan, lingkungan marine seperti pada ekosistem mangrove kaya akan metabolit fungi golongan alkaloid dan terpenoid [17], [18]. Keunikan ekosistem mangrove mendorong penelitian ini untuk menelusuri karakteristik isolat  fungi tanah mangrove  sebagai  upaya  dalam  pencarian kandidat  obat  baru.  Penelusuran karakteristik  yang  dimaksud  dalam penelitian ini memiliki tujuan: (i) Mengkultur dan mengidentifikasi morfologi fungi tanah muara mangrove pada laboratorium, (ii) Mengetahui aktivitas antibakteri dari isolat fungi tanah muara yang berhasil dikultur terhadap bakteri PA, (iii) Skrining golongan senyawa terpenoid dan alkaloid yang diduga bertanggung jawab dalam aktivitas antibakteri, (iv) Menjadi acuan dasar isolasi senyawa dan determinasi spesies fungi yang berkompeten pada penelitian selanjutnya.

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1. Bahan
Sampel  tanah  muara  mangrove  Desa  Katialada  Gorontalo  (koordinat  Google  Maps  0°50'56.7"N  122°54'00.1"E, 0.849072, 122.900025), sterile water for injection dan aqua demineralisata (HYDROBATT), air laut, NaCl fisiologis 0,9% (Widatra Bhakti), Potato Dextrose Agar (PDA) (HIMEDIA), Potato Dextrose Agar with Chloramphenicol (PDAC) (HIMEDIA),
Potato Dextrose Broth (PDB) (HIMEDIA), Mueller Hinton Agar (MHA) (Merck), Mueller Hinton Broth (MHB) (HIMEDIA), bakteri uji Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. DMSO (Merck), CaCl 2 (Sigma-Aldrich), MgCl 2 (Brotaco), BaCl 2 (Merck), H 2 SO 4 96% (Fluka), etil asetat teknis, etanol 70% teknis, gentamisin sulfat injeksi 40 mg/mL, lempeng silika gel kromatografi lapis tipis F 254 (Merck), reagen Dragendorff, vanillin (Merck), Diklorometana pa (Emsure), dan etil asetat pa (Emsure).

## 2.2. Preparasi Media
Media untuk kultur jamur adalah PDA, PDAC dan PDB, sedangkan MHA dipakai untuk peremajaan (kultur) bakteri uji. Pada pengujian mikrodilusi, Cation-Adjusted MHB (CAMHB) digunakan sebagai basis suspensi bakteri uji [19]. Media- media  tersebut  dibuat  dengan  cara;  PDA,  menimbang  9,75  g  serbuk  PDA  dan  dilarutkan  dalam  250  mL  aqua demineralisata;  PDAC,  menimbang  9,75  g  serbuk  PDAC  dan  dilarutkan  dalam  250  mL  aqua  demineralisata;  PDB, menimbang 4,8 g serbuk PDB dan dilarutkan dalam 200 mL aqua demineralisata; MHA, menimbang 8,5 g serbuk MHA dan dilarutkan dalam 250 mL aqua demineralisata; CAMHB, menimbang 1,05 g serbuk MHB, dilarutkan dalam 50 mL aqua demineralisata. Media MHB kemudian ditambahkan kation Mg 2+ dari MgCl 2 dan Ca 2+ dari CaCl 2 . Sebanyak 225 µL MgCl 2 dan 450 µL CaCl 2 ditambahkan ke dalam MHB. Media disterilkan dengan panas basah menggunakan autoklaf pada suhu 121 ℃ selama 15 menit.

## 2.3. Preparasi Sampel Tanah
Sampel tanah muara mangrove diambil pada kedalaman 10 cm di atas permukaan tanah. Cuplikan tanah diambil dan disuspensikan dengan 10 mL air steril, kemudian dihomogenkan dengan bantuan vortex shaker selama 3 menit. Suspensi sampel tanah kemudian disentrifugasi (500 rpm) selama 10 menit. Sebanyak 100 µL supernatan hasil sentrifugasi diambil dan disebar dengan bantuan spreader di atas media PDA untuk mengkultur fungi dari sampel tanah. Media PDA tersebut diinkubasi pada suhu 28 ℃ selama 7 hari.

## 2.4. Identifikasi Sampel Fungi
Jumlah sampel fungi ditentukan berdasarkan hasil kultur preparasi tanah muara.  Koloni yang tumbuh dipisahkan secara visual ke media PDA berbeda berdasarkan morfologi seperti bentuk, tekstur dan warna. Koloni yang dipisahkan selanjutnya diinkubasi pada suhu 28 ℃ selama 7 hari. Selama proses inkubasi, koloni dipastikan memiliki konsistensi morfologi  sehingga  didapat  koloni  tunggal.  Koloni  tunggal  kemudian  dipastikan  merupakan  fungi  dengan  cara mengkulturkan  pada  media  PDAC  dan  diinkubasi  pada  suhu  28 ℃ selama  7  hari.  Koloni  yang  masih  dapat  tumbuh merupakan fungi. Fungi yang tumbuh pada PDAC dipindah ke PDA dan disebut dengan isolat fungi. Isolat fungi dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x untuk melihat jenis fungi. Jenis yang dimaksud adalah kapang atau khamir.

## 2.5. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji Pseudomonas aeruginosa
Suspensi bakteri uji digunakan pada uji antagonis dan uji mikrodilusi. Pada uji kontak, suspensi PA dibuat dengan cara  mengambil  sejumlah  koloni  bakteri  kultur  pada  media  MHA  kemudian  disuspensikan  dalam  tabung  reaksi  yang berisikan NaCl fisiologis 0,9%. Untuk pengujian mikrodilusi, sejumlah koloni bakteri PA diambil dari kultur media MHA dan dicampurkan  ke  dalam  10  mL  media  CAMHB,  lalu  diencerkan  100  kalinya.  Kedua  jenis  suspensi  tersebut  diukur absorbansinya hingga didapat nilai absorbansi 0.08 – 0,13 pada panjang gelombang 625 nm. Rentang absorbansi tersebut sesuai dengan standar McFarland 0,5.

## 2.6. Uji Antagonis
Uji antagonis yang dilakukan menggunakan metode agar plug diffusion, mengacu pada penelitian Kibthiyah dkk [20]. Isolat fungi media PDA berumur 7 hari dicetak menjadi plug atau cakram dengan pembuat sumuran berdiameter 6,3 mm. Cakram isolat fungi kemudian dikontakkan dengan suspensi bakteri uji PA yang sebarkan di atas media MHA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ℃ . Zona bening di sekitar cakram diukur menggunakan jangka sorong.

## 2.7. Fermentasi dan Ekstraksi Metabolit Sekunder Fungi
Submerged Fermentation dilakukan menggunakan metode batch . Lima plug atau cakram isolat fungi berdiameter 6,3 mm dimasukkan ke dalam 200 mL media PDB yang selanjutnya diinkubasi pada suhu 28 ℃ selama 14 hari dalam shaker incubator 125 rpm. Setelah 14 hari, hasil fermentasi disaring dan ditampung untuk selanjutnya diekstraksi menggunakan partisi cair-cair dua fase sebanyak 3x replikasi. Hasil fermentasi merupakan fase air yang kemudian ditambahkan dengan etil asetat dengan perbandingan 1:1 dalam corong pisah. Partisi cair-cair dilakukan selama 15 menit tiap replikasi. Fase etil asetat hasil partisi diambil, ditampung dalam mangkok untuk menguapkan pelarut sehingga ekstrak metabolit sekunder (ekstrak uji) didapatkan. Ekstrak uji kemudian ditampung ke dalam vial dan dihitung rendemennya.

## 2.8. Skrining Kandungan Kimia
Proses skrining dilakukan dengan kromatografi lapis tipis. Golongan yang dideteksi adalah alkaloid dan terpenoid. Sebanyak  4  µL  ekstrak  isolat  fungi  ditotolkan  pada  lempeng  silika  gel  F 254 dan  dielusi  menggunakan  fase  gerak diklorometana : metanol (9,5 : 0,5). Setelah lempeng jenuh, deteksi golongan dilakukan menggunakan penampak noda semprot. Deteksi golongan alkaloid dilakukan dengan menyemprotkan reagen Dragendorff, sedangkan deteksi terpenoid dilakukan dengan menyemprotkan reagen Vanilin-H 2 SO 4 pada lempeng yang kemudian dihangatkan di atas hotplate 70 ℃ . Adanya golongan alkaloid pada ekstrak isolat ditunjukkan dengan munculnya noda jingga pada lempeng yang telah disemprot, sedangkan terpenoid akan menunjukkan warna ungu.

## 2.9. Uji Mikrodilusi
Uji mikrodilusi mengacu pada protokol CLSI 2012 [19] dan menggunakan standar konsentrasi ekstrak isolat 50 µg/mL [21].  Pengujian  mikrodilusi  pada  penelitian  membutuhkan  kelompok  perlakuan,  kontrol  negatif  ekstrak,  kontrol  positif, kontrol negatif gentamisin, kontrol ekstrak, kontrol DMSO, kontrol gentamisin, dan kontrol media dalam microplate 96-well . Masing-masing kelompok diletakkan dalam pola  sumuran yang telah ditentukan. Kelompok perlakuan berisikan 50 µL ekstrak uji dalam DMSO 1% + 50 µL suspensi bakteri dalam CAMHB; Kontrol negatif ekstrak berisikan 50 µL DMSO 1% dalam media CAMHB + 50 µL suspensi bakteri dalam CAMHB; Kontrol positif berisikan 50 µL gentamisin + 50 µL suspensi bakteri dalam CAMHB; Kontrol negatif gentamisin berisikan 50 µL media CAMHB + 50 µL suspensi bakteri dalam CAMHB; Kontrol ekstrak berisikan 50 µL ekstrak uji dalam DMSO 1% + 50 µL media CAMHB; Kontrol DMSO berisikan 50 µL DMSO 1% dalam media CAMHB + 50 µL media CAMHB; Kontrol gentamisin berisikan 50 µL gentamisin + 50 µL media CAMHB; Kontrol media berisikan 100 µL Media CAMHB. Seluruh prosedur dilakukan secara aseptis di bawah Laminar Air Flow . Microplate yang  telah  diberi  perlakuan  diinkubasi  pada  suhu  37 ℃ selama  18  jam  pada shaker  incubator 125  rpm. Selanjutnya, absorbansi setiap kelompok uji diukur dengan microplate reader pada panjang gelombang 625 nm .
2.10. Analisis Data
Data absorbansi setiap kelompok uji digunakan untuk menghitung persen penghambatan bakteri berdasarkan rumus
%Penghambatan = (1 − ((Abs C-Abs D)) ((Abs A- Abs B)) × 100%
(1)
Dimana Abs adalah absorbansi, A adalah kontrol (negatif/gentamisin), B adalah kontrol (DMSO 1%/media CAMHB), C adalah larutan (perlakuan ekstrak uji/kontrol positif), dan D adalah kontrol (ekstrak/gentamisin)

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1. Morfologi Isolat Fungi
Kultur dengan salinitas tinggi merupakan kultur yang mampu beradaptasi dengan tekanan osmotik yang tinggi. Tidak semua mikroorganisme dapat tumbuh pada kondisi garam tinggi, artinya salinitas mampu mempengaruhi pertumbuhan dan  produksi  metabolit  sekunder  yang  unik  [23].  Preparasi  sampel  tanah  yang  dilanjutkan  dengan  proses  identifikasi menghasilkan tiga isolat fungi dengan morfologi visual yang berbeda. Masing-masing isolat fungi diberi kode IS1, IS2, dan IS3. Ketiga isolat merupakan kultur fungi yang dibuktikan dengan tumbuhnya koloni dengan morfologi serupa pada media PDAC. Kloramfenikol di dalam media PDAC merupakan antibiotik yang mampu mengeliminasi bakteri melalui mekanisme kerja penghambatan subunit 50S yang mengakibatkan kegagalan sintesis protein [24]. Selain menggunakan media PDAC, isolat dibuktikan lagi dengan pengamatan mikroskopis yang menunjukkan ciri-ciri dari khamir ( yeast ). Khamir merupakan jenis fungi yang memiliki karakteristik bentuk sel yang oval atau membulat, adanya budding (sel parent membelah diri secara aseksual menghasilkan sel anak identik yang lebih kecil), serta pada kondisi dan jenis tertentu menunjukkan struktur pseudohyphae [25]. Penampakan morfologi makroskopis dan mikroskopis IS1, IS2, dan IS3 berturut turut ditunjukkan pada Gambar 1, Gambar 2, dan Gambar 3 .
Gambar 1. Morfologi makroskopis (kiri) dan mikroskopis (tengah), serta pseudohypae (kanan) IS1
Morfologi  makroskopis  dari  ketiga  isolat  merupakan  hasil pengindraan  mata  dari  isolat fungi  di  atas media  PDA. Karakteristik  masing-masing  isolat  fungi  dapat  dijumpai  pada  tabel  1.  Berbeda  dengan  IS2  dan  IS3  yang  hanya menampakkan sel soliter khamir berbentuk bulat hingga oval, IS1 memiliki struktur khamir secara umum dan pseudohyphae yang jelas setelah melakukan perbesaran mikrograf. Pseudohyphae merupakan sel hifa semu dengan salah satu ujung membulat, ujung lainnya memanjang, tidak bersekat, dan tidak terpisah saat sitokinesis [26]. Struktur ini biasa terbentuk saat  nutrisi  di  sekitar  fungi  rendah,  menyebabkan  fungi  beradaptasi  untuk  melakukan foraging (pencarian  makan menyeluruh) [27]. Terlihatnya struktur pseudohyphae memerlukan identifikasi lebih lanjut, sebab pemanjangan sel serupa juga ditemui pada struktur sel actinomycetes (aktinobakteria). Aktinobakteria merupakan bakteri gram positif yang memiliki struktur menyerupai  hifa  panjang  dengan  percabangan yang  memiliki  septa  (sekat)  [28].  Dengan  membandingkan  ciri tersebut, IS1 merupakan pseudohyphae dari fungi dibuktikan dengan tidak ditemukannya sekat pada sel. Perlakuan kultur sebelumnya pada PDAC juga memvalidasi hanya kultur fungi yang dapat bertahan hidup.
Tabel 1 . Karakteristik tiga isolat fungi Kode Isolat Jenis Fungi Ciri Makroskopis Ciri Mikroskopis IS1 Khamir Warna koloni putih pucat, bertekstur kasar dan kering Pseudohyphae , dengan sel oval ditemui di sekitarnya IS2 Khamir Warna koloni kuning pucat, bertekstur lembek dan basah Sel individu berbentuk bulat hingga oval, tidak ditemui pseudohyphae IS3 Khamir Warna koloni kuning, bertekstur lembek dan basah Sel individu berbentuk bulat hingga oval. Nampak sel budding dan tidak ditemui pseudohyphae

## 3.2. Skrining Aktivitas Antibakteri dengan Uji Antagonis
Uji antagonis dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya aktivitas antibakteri  dari tiga isolat fungi yang didapatkan. Adanya aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekitar cakram isolat. Senyawa aktif yang disekresi fungi akan menyebar di atas permukaan media yang telah diberi bakteri uji, sehingga pertumbuhan dan kelangsungan hidup bakteri uji dapat terganggu serta menghasilkan zona bening akibat interaksi dengan senyawa aktif yang memiliki aktivitas antibakteri [29]. Pengukuran zona bening dilakukan sebanyak tiga kali replikasi di sisi yang berbeda lalu parameter diameter  zona  bening  merupakan  rata-ratanya.  Hasil  uji  antagonis  isolat  terhadap  bakteri  PA  disajikan  pada  tabel  2. Berdasarkan diameter zona bening, IS1 memiliki zona bening terbesar, dilanjutkan oleh IS3 dan IS2. IS1 mungkin memiliki metabolit sekunder yang banyak atau poten dalam melawan bakteri uji PA dibandingkan dengan isolat fungi lainnya.
Gambar 2. Morfologi makroskopis (kiri) dan mikroskopis (kanan) IS2
Gambar 3. Morfologi makroskopis (kiri) dan mikroskopis (kanan) IS3
Tabel 2 . Hasil uji antagonis Kode Isolat Diameter Zona Bening IS1 12,05 mm IS2 8,35 mm IS3 11,38 mm

## 3.3. Fermentasi dan Ekstraksi Metabolit Sekunder
Produksi metabolit sekunder fungi dan mikroorganisme lainnya umumnya dimulai pada saat awal fase log dan tidak lagi bertambah pada fase stasioner [30]. Beberapa jenis fungi lain juga dapat memproduksi metabolit sekunder di awal atau akhir fase stasioner sebagai respon berkurangnya nutrisi pada lingkungan tumbuh [31]. Mengetahui variasi tersebut, fermentasi pada penelitian ini dihentikan di awal fase stasioner sebagai asumsi metabolit telah dihasilkan. Fase stasioner fungi bervariasi tergantung spesies, tetapi umum dimulai di hari ke-14 periode kultur [32]. Di hari ke-14, media fermentasi menunjukkan perubahan warna dan kekeruhan media, serta munculnya endapan dan formasi pellicle. Perubahan tersebut merupakan ciri khas fungi jenis khamir yang berhasil difermentasi [33]. Perolehan rendemen isolat disajikan pada tabel 3. IS1 menghasilkan rendemen metabolit sekunder terbesar, dilanjutkan dengan IS3 dan IS2.
Tabel 3. Perolehan ekstrak hasil fermentasi Kode Isolat Bobot Ekstrak (g) % Rendemen (%g/mL) IS1 0,167 0,090 IS2 0,065 0,034 IS3 0,082 0,045

## 3.4. Skrining Kandungan Kimia

## 3.4.1. Deteksi Golongan Alkaloid
Reagen  Dragendorff  mampu  membentuk  kompleks  bismut-alkaloid  dengan  variasi  warna  tampak  kuning-jingga, merah kehitaman, atau merah muda-ungu tergantung dari spesies atau genus penghasil alkaloid [34]. Pada ketiga ekstrak isolat fungi, tidak ditemukan adanya noda kejinggaan pada lempeng KLT (gambar 2). Golongan alkaloid tidak dijumpai pada ekstrak metabolit sekunder hasil fermentasi ketiga isolat.
Gambar 2. Hasil deteksi alkaloid dengan reagen Dragendorff pada IS1 (1), IS3 (2), dan IS2 (3)
Hasil negatif pada skrining dapat didasarkan dari dua kemungkinan. Kemungkinan pertama, polaritas alkaloid yang beragam dari polar hingga non-polar [35]. Fase air pada proses ekstraksi partisi cair-cair perlu diskrining dalam penelitian selanjutnya karena mungkin alkaloid yang dihasilkan isolat fungi bersifat polar. Kemungkinan kedua, tidak semua fungi menghasilkan alkaloid. Banyak jenis alkaloid fungi ditemukan pada jenis mold atau kapang seperti genus Claviceps [36]. Penelitian lain juga menyebutkan fungi golongan mold atau kapang seperti genus Boletus , Fusarium , dan Psylocibe , dalam kondisi fermentor khusus (pH 5-6 dipertahankan) dapat menghasilkan alkaloid dalam jumlah besar [37]. Ketiadaan fungi jenis  mold  atau  kapang  yang  berhasil  diisolasi  dan  fermentor  khusus,  mungkin  menjadi  penyebab  tidak  terdeteksinya alkaloid pada proses skrining.
1 2
3

## 3.4.2. Deteksi Golongan Terpenoid
Golongan  terpenoid  dapat  terdeteksi  menggunakan  reagen  Vanilin-H 2 SO 4 dibuktikan  dengan  munculnya  noda berwarna  ungu,  biru,  ataupun  hijau  [38].  Ketiga  sampel  isolat  fungi  menunjukkan  noda-noda  ungu  terpenoid  setelah disemprot reagen Vanilin-H2SO4 (Gambar 3). Noda ungu yang terpisah dan berbeda posisi menunjukkan jenis terpenoid yang berbeda. Berdasarkan fase gerak yang digunakan, noda yang nampak atau tertinggal di bagian bawah lempeng memiliki sifat polar. Mengetahui informasi tersebut, beberapa terpenoid yang dikandung ketiga ekstrak isolat fungi bersifat polar.
Gambar 3. Hasil deteksi terpenoid dengan reagen Vanilin-H 2 SO 4 pada IS1 (1), IS3 (2), dan IS2 (3)

## 3.5. Uji Aktivitas Antibakteri Metode Mikrodilusi
Mikrodilusi  dilakukan  untuk  mengetahui  %  penghambatan  ekstrak  etil  asetat  isolat  fungi  terhadap  bakteri  uji  PA. Perolehan % penghambatan gentamisin terhadap bakteri uji disajikan pada tabel 4. Hasil akhir persentase penghambatan direpresentasikan dengan rerata penghambatan ± CV. Nilai CV menunjukkan kedekatan hasil dari suatu seri pengukuran (presisi). Menurut FDA, kriteria penerimaan cell-based assay adalah ± 25% [39]. CLSI merekomendasikan untuk setiap kontrol positif yang digunakan memiliki % penghambatan ≥ 80%. Apabila % penghambatan yang didapa t tidak sesuai, penambahan  kation  Ca 2+ dan  Mg 2+ perlu  disesuaikan.  Kontrol  positif  gentamisin  pada  penelitian  ini  menghasilkan  % penghambatan  yang  sesuai  (98,5%),  sehingga  tidak  perlu  melakukan  penyesuaian  kadar  kation  pada  media  yang digunakan.
Tabel 4. Perolehan % penghambatan kontrol dan ekstrak isolat fungi Jenis Perlakuan Rerata Penghambatan Pertumbuhan Bakteri (%) ± SD (%) CV (%) Kontrol positif gentamisin 98,5 ± 0,5 0,5 Kontrol negatif ekstrak (DMSO) 12,7 ± 1,0 7,5 Ekstrak IS1 60,5 ± 2,4 4,0 Ekstrak IS2 31,9 ± 1,6 5,1 Ekstrak IS3 51,0 ± 7,2 14,1
DMSO  memiliki  nilai  persentase  penghambatan  yang  berarti.  DMSO  yang  digunakan  dalam  penelitian  mampu menghambat  12,7%  pertumbuhan  bakteri  PA.  Untuk  penelitian  selanjutnya,  ada  baiknya  melakukan  penyesuaian konsentrasi DMSO. Konsentrasi DMSO 1% pada penelitian ini masih memiliki nilai hambat yang relatif besar sebagai kontrol negatif, sehingga direkomendasikan untuk menurunkan konsentrasi DMSO di bawah 1%. Namun, dalam pengujian ekstrak penelitian ini, persentase penghambatan yang didapat merupakan potensi ekstrak tanpa pengaruh DMSO. Ditinjau dari rumus yang digunakan, persentase penghambatan ekstrak sudah dikurangi dengan penghambatan DMSO.
Aktivitas penghambatan PA tertinggi dimiliki oleh ekstrak isolat 1 (IS1), dilanjutkan isolat 3 (IS3) dan isolat 2 (IS2). Besarnya % penghambatan setiap ekstrak mungkin ada kaitannya dengan rendemen metabolit sekunder yang dihasilkan. IS1 memiliki nilai rendemen dan penghambatan terbesar, sehingga ada kemungkinan dalam pembuatan konsentrasi 50 µg/mL, terdapat banyak senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri. IS1 dan IS3 memiliki persentase penghambatan di
atas 50%, artinya dugaan nilai IC 50 ekstrak etil asetat fungi tanah muara IS1 dan IS3 ada di bawah konsentrasi 100 µg/mL. Dari hasil tersebut perlu dilakukan isolasi lebih lanjut untuk mengetahui senyawa yang berperan dalam aktivitas antibakteri [21].  Selanjutnya,  berdasarkan  hasil  skrining  kandungan  kimia  ekstrak,  ketiga  ekstrak  fungi  mengandung  senyawa golongan terpenoid. Aktivitas antibakteri ekstrak diduga berasal dari golongan terpenoid.
Terpenoid  banyak  ditemukan  pada  tumbuhan,  tetapi  beberapa  spesies  fungi  mampu  memproduksinya.  Uniknya, terpenoid dari fungi lingkungan marine memiliki banyak variasi bioaktivitas, beberapa di antaranya berperan sebagai agen sitotoksik,  antibakteri,  antifungi,  antiviral,  anti-inflamasi,  dan  inhibitor  enzim  [18],  [36].  Mekanisme  terpenoid  sebagai antibakteri sangat bervariasi. Mekanisme yang telah dipelajari adalah mengganggu fungsi membran bakteri, menyebabkan membran lisis mengeluarkan bagian penting dari bakteri yang menyebabkannya mati [40]. Satu senyawa dari metabolit sekunder fungi bisa saja memiliki lebih dari satu aktivitas [18]. Bisa pula memiliki aktivitas serupa namun di berbeda subjek uji. Sebagai contoh, terpenoid ophiobolin U (dari golongan sesterterpenes ) berhasil diekstraksi dari marine fungi Aspergillus ustus dan  memiliki  aktivitas antibakteri  terhadap E. coli dan S.  aureus [41]. Tidak  hanya  sebatas  pada sesterterpens , golongan meroterpenoids juga diketahui memiliki aktivitas sebagai antibakteri pada strain Staphylococcus aureus [18]. Penelitian ini bersifat skrining awal sehingga untuk mengetahui senyawa dan mekanisme antibakteri yang sesungguhnya, perlu dilakukan penelitian lanjutan.

## 4. Kesimpulan
Tiga isolat fungi tanah muara mangrove berhasil dikultur dan menunjukkan karakteristik fungi khamir ( yeast ). Ketiga isolat fungi memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri PA dibuktikan dengan hasil uji antagonis dan mikrodilusi. Dari hasil uji mikrodilusi, aktivitas antibakteri terbesar dimiliki oleh IS1 dilanjutkan dengan IS3 dan IS2. Kandungan terpenoid yang dikandung dalam ketiga ekstrak isolat fungi mungkin berperan penting dalam aktivitas antibakteri. Menariknya lagi, IS1 dan IS3 memiliki % penghambatan di atas 50%, artinya nilai IC 50 kedua ekstrak tersebut ada di bawah 100 µg/mL. Penelitian lanjutan seputar isolasi dan determinasi ketiga spesies fungi perlu dilakukan sebagai upaya pencarian antibiotik baru.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih ditujukan kepada Drug Utilisation Discovery Research Group , Fakultas Farmasi, Universitas Jember, dan Politeknik Kelautan dan Perikanan Bitung atas dukungan fasilitas penelitian antibakteri.

## Daftar Pustaka
[1] J.  P.  Horcajada et  al. ,  “Epidemiology  and  treatment  of  multidrug -resistant  and  extensively  drug-resistant Pseudomonas  aeruginosa  infections,” Clin.  Microbiol.  Rev. ,  vol.  32,  no.  4,  2019,  doi:  10.1128/CMR.00031- 19/ASSET/3CDB73D6-9097-4D7E-A591-80EBAD992610/ASSETS/GRAPHIC/CMR.00031-19-T004H.JPEG.
[2] M. G. Wilson and S. Pandey, Pseudomonas Aeruginosa . StatPearls Publishing, 2020.
[3] P. Pachori, R. Gothalwal, and P. Gandhi, “Emergence of antibiotic resistance P seudomonas aeruginosa in intensive care unit; a critical review,” Genes and Diseases , vol. 6, no. 2. Chongqing University, pp. 109 – 119, Jun. 01, 2019, doi: 10.1016/j.gendis.2019.04.001.
[4] D.  Dahesih,  Y.  P.  Dewi,  A.  K.  Sugainli,  and  I.  Parwati, SURVEILANS  BAKTERI  RESISTAN  MULTI  OBAT  dan KEPEKAANNYA  TERHADAP  ANTIBIOTIK  di  RUMAH  SAKIT  INDONESIA  TAHUN  2018 .  Departemen  Patologi Klinik  dan  Kedokteran  Laboratorium  Fakultas  Kedokteran  Kesehatan  Masyarakat  dan  Keperawatan  Universitas Gadjah Mada, 2019.
[5] Z. Brei jyeh, B. Jubeh, and R. Karaman, “Resistance of gram -negative bacteria to current antibacterial agents and approaches to resolve it,” Molecules , vol. 25, no. 6. MDPI AG, Mar. 02, 2020, doi: 10.3390/molecules25061340.
[6] Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T . J. Lin, and Z. Cheng, “Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies,” Biotechnology Advances , Elsevier Inc,  vol. 37, no. 1., pp. 177 – 192, Jan. 01, 2019, doi: 10.1016/j.biotechadv.2018.11.013.
[7] B. R. da Cunha, L. P. Fonseca, and C. R. C. Calado, “Antibiotic discovery: Where have we come from, where do we go?,” Antibiotics , MDPI AG , vol. 8, no. 2, Jun. 01, 2019, doi: 10.3390/antibiotics8020045.
[8] A. L. Demain and E. Martens, “Production of valuable compounds by molds and yeasts,” J. Antibiot. (Tokyo). , vol. 70, no. 4, pp. 347 – 360, Apr. 2017, doi: 10.1038/ja.2016.121.
[9] N. Chandra and S. Kumar, “Antibiotics and Antibiotics Resistance Genes in Soils,” Antibiot. Antibiot. Resist. Genes Soils; Soil Biol. , vol. 51, no. November, pp. 1 – 18, 2017, doi: 10.1007/978-3-319-66260-2.
[10] C. L. Ventola, “The antibiotic resistance crisis: causes and threats.,” P T J. , vol. 40, no. 4, pp. 277 – 83, 2015, doi: Article.
[11] A. L. Demain and E. Martens, “Production of valuable compounds by molds and yeasts,” J. Antibiot. (Tokyo). , vol.
70, no. 4, pp. 347 – 360, 2017, doi: 10.1038/ja.2016.121.
[12] S. Tančić Živanov et al. , “Fungal Diversity as Influenced by Soil Characteristic,” Zemdirbyste , vol. 104, no. 4, pp. 305 – 310, 2017, doi: 10.13080/z-a.2017.104.039.
[13] D. Sanka Loganathachetti, A. Poosakkannu, and S. Muthuraman, “Fungal community assemblage of different soil compartmen ts  in  mangrove  ecosystem,” Sci.  Reports  2017  71 ,  vol.  7,  no.  1,  pp.  1 – 9,  Aug.  2017,  doi: 10.1038/s41598-017-09281-3.
[14] H. Thatoi, B. C. Behera, and R. R. Mishra, “Ecological role and biotechnological potential of mangrove fungi: A review,” Mycology , vol. 4, no. 1, pp. 54 – 71, 2013, doi: 10.1080/21501203.2013.785448.
[15]  M. F. Simões et al. , “Soil and Rhizosphere Associated Fungi in Gray Mangroves (Avicennia marina) from the Red Sea  - A  Metagenomic  Approach,” Genomics,  Proteomics  Bioinforma. ,  vol.  13,  no.  5,  pp.  310 – 320,  2015,  doi: 10.1016/j.gpb.2015.07.002.
[16]  A.  A.  Al- Fakih  and  W.  Q.  A.  Almaqtri,  “Overview  on  antibacterial  metabolites  from  terrestrial  Aspergillus  spp,” Mycology , Taylor and Francis Ltd vol. 10, no. 4., pp. 191 – 209, Oct. 02, 2019, doi: 10.1080/21501203.2019.1604576.
[17] T. Willems, M. L. De Mol, A. De Bruycker, S. L. De Maeseneire, and W. K. Soetaert, “Alk aloids from marine fungi: Promising antimicrobials,” Antibiotics , vol. 9, no. 6, pp. 1 – 27, 2020, doi: 10.3390/antibiotics9060340.
[18] M. Jiang, Z. Wu, H. Guo, L. Liu, and S. Chen, “A review of terpenes from marine - derived fungi: 2015 2019,” Mar. Drugs , vol. 18, no. 6, pp. 2015 – 2019, 2020, doi: 10.3390/md18060321. [19]  Clinical and Laboratory Standards Institute, Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard — Ninth Edition , vol. 32, no. 2. 2012.
[20] M. Kibthiyyah, B. Triatmoko, and A. S. Nugraha, “Penelusuran dan Isolasi Fungi Tanah Muara Pelabuhan Besuki Serta Skrining Aktivitas Antibakteri Terhadap Pseudomonas aeruginosa ATTCC 27853,” JPSCR J. Pharm. Sci. Clin. Res. , vol. 6, no. 2, p. 128, 2021, doi: 10.20961/jpscr.v6i2.44275.
[21] P. Cos, V. AJ, B. DV, and M. L, “Anti - infective potential of natural products: how to develop a stronger in vitro ‘proof - of- concept,’” J. Ethnopharmacol. , vol. 106, no. 3, pp. 290 – 302, Jul. 2006, doi: 10.1016/J.JEP.2006.04.003.
[22] G. R. Savitri, B. Triatmoko, and A. S. Nugraha, “Skrining Fitokimia dan Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak dan Fraksi Tumbuhan Anyang- Anyang (Elaeocarpus grandiflorus J. E. Smith.) terhadap Escherichia coli,” JPSCR J. Pharm. Sci. Clin. Res. , vol. 5, no. 1, p. 22, 2020, doi: 10.20961/jpscr.v5i1.32206.
[23] M.  Venkatachalam,  L.  Gérard,  C.  Milhau,  F.  Vinale,  L.  Dufossé,  and  M.  Fouillaud,  “Salinity  and  Temperature Influence Growth and Pigment Production in the Marine-Derived Fungal Str ain Talaromyces albobiverticillius 30548,” Microorganisms , vol. 7, no. 1, Jan. 2019, doi: 10.3390/MICROORGANISMS7010010.
[24] G. Kapoor, S. Saigal, and A. Elongavan, “Action and resistance mechanisms of antibiotics: A guide for clinicians,” Journal of Anaesthesiology Clinical Pharmacology , vol. 33, no. 3. Wolters Kluwer -- Medknow Publications, pp. 300 – 305, Jul. 01, 2017, doi: 10.4103/joacp.JOACP_349_15.
[25] G. A. Marzluf, “Introduction to Mycology,” in Methods for General and Molecular Microbiology , ASM Press, 2014, pp. 925 – 928.
[26] J. Kim and M. D. Rose, “Stable Pseudohyphal Growth in Budding Yeast Induced by Synergism between Septin Defects  and  Altered  MAP- kinase  Signaling,” PLoS  Genet. ,  vol.  11,  no.  12,  p.  1005684,  2015,  doi: 10.1371/journal.pgen.1005684.
[27] A. Gontar, M. J. Bottema, B. J. Binder, and H. Tronnolone, “Characterizing the shape patterns of dimorphic yeast pseudohyphae,” R. Soc. Open Sci. , vol. 5, no. 10, Oct. 2018, doi: 10.1098/rsos.180820.
[28] Q. Li, X. Chen, Y. Jiang, and C. Jiang, “Morphological Identification of Actinobacteria,” in Actinobacteria - Basics and Biotechnological Applications , InTech, 2016.
[29] M. K.A.A.R, T. M.M.J, N. A. I., N. S., and D. I., “Screening of Antibacterial Activity of Endophytic Fungi Isolated From Differ ent Leaf Ages of Curcuma Mangga Using Different,” Int. J. Res. Med. Heal. Sci. , vol. 4, no. 9, 2015.
[30] D.  Thirumurugan,  A.  Cholarajan,  S.  S.  S.  Raja,  and  R.  Vijayakumar,  “An  Introductory  Chapter:  Secondary Metabolites,” in Secondary Metabolites - Sources and Applications , InTech, 2018.
[31]  S. M. Abdel-Aziz, M. M. Abo Elsoud, and A. A. H. Anise, Microbial Biosynthesis: A Repertory of Vital Natural Products . Elsevier Inc., 2017.
[32]  C. Roullier et al. , “Time dependency of chemodiversity and biosynthetic pathways: AnLC-MS metabolomic study of Marine- Sourced penicillium,” Mar. Drugs , vol. 14, no. 5, 2016, doi: 10.3390/md14050103.
[33] S. Phale, “Yeast: Characteristics and Economic Significance,” J. Bioprocess. Biotech. , vol. 08, no. 05, pp. 8 – 10, 2018, doi: 10.4172/2155-9821.1000337.
[34] L. Peter, “Chemical Investigations of the Alkaloids from the Plants of the Family Elaeocarpaceae Author ALKALOIDS FROM THE PLANTS OF THE FAMILY ELAEOCARPACEAE Peter L . Katavic , BSc ( Hons ) School of Science / Natural Pro duct Discovery ( NPD ) Faculty of Science ,” 2006.
[35] H. Kristanti and W. A. S. Tunjung, “DETECTION OF ALKALOID, FLAVONOID, AND TERPENOID COMPOUNDS IN BREAD (Artocarpus communis Forst.) LEAVES AND PULPS,” KnE Life Sci. , vol. 2, no. 1, p. 129, Sep. 2015, doi:
10.18502/KLS.V2I1.131.
[36] D. Jakubczyk and F. Dussart, “Selected fungal natural products with antimicrobial properties,” Molecules , vol. 25, no. 4. MDPI AG, Feb. 18, 2020, doi: 10.3390/molecules25040911.
[37]  Z. A. Mahmood, S. W. Ahmed, I. Azhar, M. Sualeh, M. T. Baig, and S. M. S. Zoha, “Bioactive alkaloids produced by fungi I. Updates on alkaloids from the species of the genera Boletus, Fusarium and Psilocybe,” Pak. J. Pharm. Sci. , vol. 23, no. 3, pp. 349 – 357, 2010.
[38]  Z. Jiang, C. Kempinski, and J. Chappell, “Extraction and Analysis of Terpenes/Terpenoids,” Curr. Protoc. Plant Biol. , vol. 1, no. 2, pp. 345 – 358, Mar. 2016, doi: 10.1002/cppb.20024.
[39] D. Pifat, “Confidence of Measuring Response Assay,” 2003.
[40]  A. C. Guimarães et al. , “Antibacterial activity of terpenes and terpenoids present in essential oils,” Molecules , vol. 24, no. 13, 2019, doi: 10.3390/molecules24132471.
[41]  A. M. Elissawy, M. El- Shazly, S. S. Ebada, A. N. B. Singab, and P. Proksch, “Bioactive terpenes from mar ine-derived fungi,” Mar. Drugs , vol. 13, no. 4, pp. 1966 – 1992, 2015, doi: 10.3390/md13041966.