## Bakteri Pendegradasi Solar Dari Sedimen Perairan Dalam Skala Laboratorium (In Vitro)
Bagus Enggal Prakoso * , Widianingsih, Sunaryo Jurusan Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia *Corresponding author, e-mail :  bagusenggalprakoso1997@gmail.com
ABSTRAK: Pelabuhan Tanjung Mas adalah sebuah pelabuhan yang mengalami berbagai aktivitas seperti bongkar muat, aktivitas pelayaran, kapal bersandar dan lain-lain. Aktivitas antropogenik yang ada di area pelabuhan umumnya menyebabkan banyaknya jumlah minyak solar yang tumpah ke laut dan kemudian terakumulasi ke dalam sedimen dalam jangka waktu yang panjang. Jika hal ini terus  terjadi  maka  akan  mengganggu  kehidupan  biota  demersal  dan  ekosistem  di  Pelabuhan Tanjung  Mas.  Oleh  karena  itu,  perlu  dilakukan  upaya  biodegradasi  minyak  solar  menggunakan bakteri  yang ramah lingkungan dan tepat. Tujuan penelitian ini dilakukan yaitu mendapatkan isolat bakteri  sedimen  yang  mampu  mendegradasi  minyak  solar  dan  mengetahui  tingkat  kemampuan isolat bakteri untuk mendegradasi minyak solar. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli sampai dengan Oktober 2019 dengan metode purpossive sampling, metode pour plate, metode gravimetri dan Standard Plate Count. Bakteri isolat yang didapat dari hasil isolasi sedimen kemudian diseleksi kembali menggunakan media SMSSe dan prosentase minyak solar 2%. Pada seleksi awal dengan prosentase  minyak  solar  2%  didapatkan  2  isolat  bakteri  yang  mampu  tumbah  baik  pada  media SMSSe dan 2% prosentase minyak solar, yaitu bakteri dengan kode isolat ISL 2 dan ISL 3. Kedua isolat bakteri hasil seleksi awal kemudian diidentifikasi dengan uji molekuler. Hasil dari uji molekuler menyatakan  bahwa kedua  isolat  bakteri  dengan kode ISL  2  dan  ISL  3  berasal  dari spesies  yang sama, yaitu Vibrio alginolyticus. Isolat bakteri Vibrio alginlyticus yang didapat kemudian diuji daya degradasinya dengan menggunakan 2 prosentase minyak solar yang berbeda, yaitu prosentase 5% dan  10%  dengan  2  pengulangan.  Pada  hasil  uji  degradasi  menyatakan  bahwa  bakteri  Vibrio alginolyticus  dapat  mendegradasi  minyak  solar  yang  ditambahkan  pada  media  SMSSe.  Bakteri Vibrio  alginolyticus  hasil  isolasi  mampu  mendegradasi  minyak  solar  hingga  0,8085  mL  (80,85%) pada prosentase awal 10% minyak solar (1 mL) dengan periode 14 hari (H14).
Kata kunci: Bakteri; Sedimen; Biodegradasi; Minyak Solar; Tanjung Mas
Bacteria of Solar Degradation from Water Sediments in the Laboratory Scale (In Vitro)
ABSTRACT: Tanjung Mas Port is a port that experiences a variety of activities such as loading and unloading, shipping activities, leaning ships, and others. Generally, anthropogenic activity in the port area  causes  large  amounts  of  diesel  oil  that  spills  into  the  sea  and  then  accumulates  into  the sediment  over  a  long  period.  If  this  continues,  it  will  disrupt  the  lives  of  demersal  biota  and  the ecosystem in Tanjung Mas Harbor. Therefore, it is necessary to do biodegradation of diesel oil using environmentally friendly and appropriate bacteria. The purpose of this study was to obtain bacterial sediment isolates that can degrade diesel oil and determine the ability of bacterial isolates to degrade diesel  oil.  This research was conducted from July  to  October  2019  using  the  purposive  sampling method,  pour  plate  method,  gravimetric  method,  and  Standard  Plate  Count.  Bacteria  isolates obtained  from  the  results  of  sediment  isolation  were  then  reselected  using  SMSSe  media  and  a percentage  of  2%  diesel  oil. In  the  initial  selection with  a  percentage  of  2%  diesel  oil,  2  bacterial isolates were able to grow well on SMSSe media and 2% percentage of diesel oil, namely bacteria with isolate code ISL 2 and ISL 3. The two bacterial isolates from the initial selection were identified by molecular testing. The results of the molecular test stated that the two bacterial isolates with the code  ISL  2  and  ISL  3  came  from  the  same  species,  namely  Vibrio  alginolyticus.  The  Vibrio alginolyticus bacterial isolate obtained was then tested for its degradation power using 2 different percentages of diesel oil, namely 5% and 10% with 2 repetitions. The results of the degradation test stated that the Vibrio alginolyticus bacteria could degrade the diesel oil added to the SMSSe medium.
The isolated Vibrio alginolyticus bacteria can degrade diesel oil up to 0.8085 mL (80.85%) at the initial percentage of 10% diesel oil (1 mL) with a period of 14 days (H14).

## Keywords: Bacteria; Sediment; Biodegradation; Diesel Oil; Tanjung Mas

## PENDAHULUAN
Pelabuhan  Tanjung  Mas  adalah  sebuah  pelabuhan  di  Kota  Semarang,  Jawa  Tengah  yang berfungsi  sebagai  pusat  atau  simpul  transportasi  dengan  skala  lokal  sampai  skala  internasional. Pada  lokasi  ini  sering  ditemukan  berbagai  aktivitas  pelabuhan  seperti  bongkar  muat,  aktivitas pelayaran, kapal bersandar, dan lain-lain. Pelabuhan Tanjung Mas sebagai salah satu pelabuhan strategis  di  Indonesia  mengalami  kenaikan  arus  kedatangan  kapal  tiap  tahunnya  (Firdaus et  al., 2013).
Menurut data Badan Pusat Statistik Provinsi Jawa Tengah tahun 2017, jumlah kapal yang ada di  Pelabuhan  Nusantara  mengalami  kenaikan  pada  tahun  2009  sebesar  830  unit  kapal  menjadi 1.166 unit kapal pada tahun 2014. Jumlah kapal tanker yang ada juga mengalami kenaikan yang cukup pesat pada tahun 2011 yaitu dari 138 unit kapal di tahun 2009 menjadi 212 unit. Total kapal pada  tahun  2009  yaitu  2.474  unit kapal  dan terus  mengalami  peningkatan  sampai  dengan  tahun 2014  yaitu  sebesar  2.590  unit  kapal.  Peningkatan  jumlah  kapal  berdampak  pada  semakin banyaknya jumlah minyak yang tumpah ke lautan. Tumpahan minyak yang ditemukan di kawasan pelabuhan  ini  biasanya  berasal  dari  proses  mobilisasi  kapal  dan  kecelakaan  kapal.  Salah  satu contoh  kecelakaan  kapal  yang  baru  saja  terjadi  di  Pelabuhan  Tanjung  Mas,  Semarang  yaitu kecelakaan kapal tongkang menabrak crane bongkar muat di Terminal Peti Kemas Semarang. Minyak yang masuk ke perairan akan mengalami dekomposisi kemudian masuk ke sedimen. Menurut Pratama (2018), endapan minyak di sedimen dapat terjadi akibat adanya aktivitas dari kapal seperti mobilisasi, pembuangan air pendingin kapal dan kebocoran kapal yang kemudian minyak tersebut masuk ke perairan dan mengendap di sedimen. Endapan minyak di sedimen menyebabkan kerusakan  ekosistem  laut.  Campuran  minyak  mentah  dan  dispersan  atau  perbandingan  masing- masing dapat menyebabkan peningkatan toksisitas di beberapa spesies fitoplankton.
Upaya yang bisa digunakan untuk menanggulangi tumpahan minyak di laut yaitu bioremediasi. Bioremediasi  adalah  proses  pendegradasian  bahan  organik  berbahaya  secara  biologis  menjadi senyawa lain yang tidak berbahaya. Salah satu contoh agen bioremediasi adalah bakteri. Menurut Nasikhin et al (2013), ada beberapa jenis bakteri yang memiliki kemampuan untuk mendegradasi senyawa hidrokarbon salah satunya yaitu bakteri yang berasal dari genus Vibrio . Pada beberapa penelitian  sebelumnya  diketahui  bahwa  terdapat  beragam  jenis  genus  bakteri  yang  memiliki kemampuan degradasi secara signifikan. Nurjanah (2018), mengatakan bahwa bakteri dari genus Bacillus ,  genus Klebsiella ,  genus Enterobacter dan  genus Citrobacter juga  memiliki  tingkat  daya degradasi terhadap minyak solar yang signifikan.
Tujuan  dari  penelitian  yaitu  untuk  mendapatkan  dan  mengidentifikasi  isolat  bakteri  yang mampu mendegradasi minyak solar pada sedimen laut kawasan Pelabuhan Tanjung Mas Semarang serta mengetahui daya degradasi isolat bakteri terhadap minyak solar.

## MATERI DAN METODE
Materi  penelitian  yang  akan  digunakan  adalah  sampel  sedimen  dari  perairan  Pelabuhan Tanjung  Mas  Semarang.  Pengambilan  sampel  sedimen  dilaksanakan  pada  1  Juli  2019.  Lokasi pengambilan sampel berada di Pelabuhan Tanjung Mas. Pelabuhan Tanjung Mas terletak di utara Kota Semarang tepatnya di Jalan Coaster No. 10, Tanjung Mas, Semarang Utara, Jawa Tengah.
Metode sampling yang digunakan yaitu purposive sampling method di 3 lokasi yang berada di kawasan PT Pelindo 3 Pelabuhan Tanjung Mas, Semarang. Koordinat lokasi pengambilan sampel ditentukan berdasarkan 3 tempat yang memiliki aktivitas berbeda yaitu tempat mobilisasi nelayan, pelabuhan bongkar muat dan pelabuhan tempat kapal penumpang bersandar.
Parameter  perairan  yang  diamati meliputi suhu, salinitas,  kadar  oksigen terlarut, kecerahan perairan dan kecepatan arus. Alat yang digunakan pada saat pengambilan sampel sedimen meliputi
Journal of Marine Research Vol 9, No.4 November 2020, pp. 453-463
grab sampler jenis ekman bottom , termometer raksa, refraktometer, DO meter, kertas pH, secchi disk dan bola duga. Pengukuran parameter perairan dilakukan dengan tujuan mendapatkan kualitas perairan.
Metode yang digunakan untuk isolasi bakteri yaitu dengan menggunakan metode pour plate . Media yang digunakan adalah Stone Mineral Salt Solution Extract Yeast padat dengan penambahan prosentase  minyak  solar  (v/v)  (Yunita et  al., 2015).  Komposisi  bahan  media  Stone  Mineral  Salt Solution  Extract  Yeast  yaitu  CaCO 3 5g;  NH 4 NO 3 2,5g;  Na 2 HPO 4 .7H 2 O  1g;  KH 2 PO 4 0,5g; MgSO 4 .7H 2 O 0,5g;  MnCl 2 .7H 2 O  0,2g;  Ekstrak Yeast 0,01%    dilarutkan  dalam  1000 mL  air suling/ aquades.  Kemudian,  media  tersebut  ditambahkan  minyak  solar  dengan  prosentase  tertentu  (v/v) sebagai sumber karbon, mengatur pH menjadi 6,8-7 dengan menggunakan NaOH 1% atau HCl 1% (Mijaya et al ., 2019).
Sampel  sedimen  basah  pada  tiap  stasiun  diambil  seberat  1g  dan  ditambahkan  kedalam medium  SMSSe  cair  dengan  kandungan  prosentase  minyak  solar  sebesar  2%  (v/v).  Sampel sedimen  kemudian  di shaker selama  3x24  jam  (3  hari)  dengan  kecepatan  120  rpm.  Sampel kemudian diisolasi dengan metode pengenceran hingga 10 -5 dengan menggunakan NaCl fisiologis steril dan dibiakkan dalam  lempeng agar SMSSe dengan minyak solar 2% (v/v) pada suhu 35°C untuk  dilakukan Total  Plate  Count (TPC).  Pada  tahap  penyeleksian  ini  diharapkan  menghasilkan bakteri yang memiliki daya degradasi terhadap minyak solar.
Pada identifikasi spesies bakteri dilakukan uji molekuler untuk mengetahui jenis spesies apa saja  yang  telah  didapat  dari  hasil  pemurnian  dengan  menggunakan  gen  16S  rRNA.  Pada  uji molekuler ada beberapa tahapan yang dilakukan yaitu, Ekstraksi DNA, Amplifikasi, Elektroforesis, DNA sequencing dan  analisa  filogenetik.  Uji  Molekuler  digunakan  untuk  mengidentifikasi  isolat bakteri dari hasil penelitian yang didapat dan sebelumnya telah melalui tahap seleksi pada medium SMSSe dengan tambahan prosentase minyak solar.
Tahap  ekstraksi  DNA, supernatant yang  mengandung genome DNA  diambil  dengan  cara mencampurkan  3-4  goresan  kecil  sampel  bakteri  dengan  larutan  20µL  ddH 2 O  dan  1mL  0,5% Saponin  PBS  1X  lalu  diamkan  di  dalam microtube pada  suhu  4 ℃ selama  semalam.  Sampel kemudian dihomogenkan dengan menggunakan Centrifuge pada kecepatan 12.000 RPM selama 10  menit  dan  buang supernatant .  Kemudian  sampel  kembali  dicampurkan  dengan  100µL  ddH 2 O dan 50µL 20% Chelex 100 serta dihomogenkan. Sampel dipanaskan hingga mendidih selama 10 menit dan Centrifuge sampel pada 12.000 RPM tiap 5 menitnya. Terakhir centrifuge kembali pada kecepatan 12.000 RPM  selama 10 menit, pindahkan dan simpan supernatant yang mengandung genome DNA ke dalam microtube baru.
Amplifikasi  digunakan  untuk mereplikasi  rantai DNA  yang  telah  didapat  dari  hasil  ekstraksi. Amplifikasi DNA dilakukan secara in vitro dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR), proses  amplifikasi  DNA  melibatkan  manipulasi  suhu  untuk  memulai  prosesnya.  Berikut  adalah proses  amplifikasi  DNA,  Denaturasi  (suhu  90 ℃ )  selama  3  menit,  20-40  siklus  Annealing  (55 ℃ ) selama 1 menit, dan ekstensi primer (72 ℃ ) selama 7 menit (Handoyo et al , 2000). Pada amplifikasi DNA  bakteri,  primer  yang  digunakan  adalah  primer  27F Forward  Strand (5`-AGAGTTTGATCMT GGCTCAG-3`)  dan  primer  1492R Reverese  Strand ( 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')  16S rRNA (Fredriksson et al. , 2013).
Elektroforesis DNA dilakukan untuk mengetahui panjang rantai DNA. Elektroforesis dilakukan dengan memasukkan sampel supernatant genome DNA ke dalam gel elektroforesis dan diberi daya listrik yang telah disesuaikan 50 - 60 µA, 50-60 µA atau 45-55 µA selama kurang lebih 3 jam. Sampel gel kemudian  divisualisasi  dengan  alat Biobase  Gel  System untuk  mengamati gel  band yang terbentuk.  Proses  DNA  sequencing  dan  analisa  filogenetik  dilakukan  menggunakan  software MEGA6 . Sekuen DNA yang telah didapat selanjutnya diolah kembali menggunakan software Mega6 untuk melakukan alignment rantai DNA. Proses alignment rantai DNA dilakukan dengan memotong noise pada kedua forward dan reverse rantai sekuen kemudian pilih metode alignment sequences with  muscle dan  keduanya  digabungkan  hingga  menjadi  satu  rantai  sekuen  yang  sama.  Pada pembuatan  pohon  filogenetik,  pilih  opsi  model  Tamamura-Nei  model  dan  menggunakan  metode neighbor joining tree . Tamamura-Nei method merupakan model yang umum dipilih untuk membuat pohon  filogenetik.  Menurut  Dharmayanti  (2011),  metode neighbor  joining  tree dapat  memberikan estimasi panjang cabang sangat baik antar masing-masing sekuen DNA.
Journal of Marine Research Vol 9, No.4 November 2020, pp. 453-463
Pada pembuatan pohon filogenetik ini diuji secara statistik menggunakan metode bootstrap replications sebanyak  1000  kali  pengulangan.  Penggunaan  metode bootstrap ini  bertujuan  untuk meningkatkan nilai kepercayaan pada topologi pohon filogenetik, dengan kata lain semakin tinggi nilai bootstrap replication maka semakin tinggi nilai kepercayaannya (Ubaidillah, 2009).
Setelah mendapatkan isolat bakteri yang mampu mendegradasi minyak solar pada prosentase 2%, isolat bakteri Vibrio alginolyticus diuji daya degradasinya dengan menggunakan dua prosentase minyak solar yang berbeda, yaitu prosentase 5% dan 10% yang ditambahkan pada medium SMSSe cair (v/v). Isolat bakteri yang telah dimurnikan sejumlah 10 −5 sel/mL, diambil 1 mL lalu ditambahkan ke  dalam  medium  SMSSe  cair  yang  mengandung  minyak  solar  5%  dan  10%    secara  terpisah. Bakteri hasil kultur diinkubasi pada suhu ruang dan digoyang di atas shaker dengan kecepatan 120 rpm selama 7x24 jam (7 hari) dan 14x24 jam (14 hari). Estimasi kepadatan bakteri dilakukan pada hari ke-7 dan 14 dengan metode Standart Plate count (SPC) untuk menghitung jumlah koloni bakteri. Analisa degradasi minyak dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui sisa minyak dari hasil degdradasi. Pada tahapan ini, minyak sisa hasil degdradasi diamati jumlah prosentasenya. Medium hasil  sisa  degradasi  dicampurkan  pelarut n - Hexane sebanyak  15  mL  ke  dalam  10mL  media, pencampuran  ini  bertujuan  agar  hasil  sisa  minyak  degradasi  larut  bersama  dengan  pelarut  dan terpisah dengan medium cairnya. Setelah dicampur pelarut, minyak hasil sisa dipisahkan dengan mediumnya menggunakan corong pemisah. Minyak yang telah dicampur pelarut tersebut kemudian disaring  dengan  kertas  saring  yang  telah  dioles ± 0,5g  Na 2 SO 4 pada  permukaannya,  kemudian larutan sampel dipanaskan pada titik didih pelarut n-Hexane yakni 60 0 C untuk memisahkan pelarut dan minyak dengan proses penguapan menggunakan alat destilator. Labu alas bulat setelah proses dan sebelum proses destilasi dihitung beratnya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Lokasi  pengambilan  sampel  sedimen  berada  di  3  stasiun  berbeda  di  kawasan  Pelabuhan Tanjung Mas, Semarang. Stasiun 1 berada pada koordinat 06°56'59,92" S 110°25'08,19" E. Lokasi stasiun  1  berada  di  alur  pelayaran  dari  dan  menuju  Kolam  Pelabuhan.  Kolam  Pelabuhan  sering digunakan  untuk  tempat  bersandar  kapal.  Stasiun  2  berada  pada  koordinat  06°56'50,88"  S 110°25'15,85" E. Stasiun ini terletak di antara Pelabuhan Dalam 1 dan Terminal Nusantara. Aktivitas manusia yang umum ada pada stasiun ini yaitu kegiatan naik turun penumpang dan bongkar-muat barang  terutama  kayu.  Stasiun  3  berada  pada  koordinat  06°56'27,86"  S  110°25'16,30"  E  dan berlokasi di dekat Semarang Container Terminal . Pada lokasi ini, kegiatan bongkar muat peti kMas merupakan kegiatan yang dominan ada pada Container Terminal (Gambar 1).
Gambar 1. Peta Lokasi Pengambilan Sampel Tanjung Mas Semarang
Journal of Marine Research Vol 9, No.4 November 2020, pp. 453-463
Dari  hasil  pengukuran  parameter  perairan  diperoleh  data  salinitas,  pH,  kecerahan,  arus, Dissolved oxygen , suhu dan kedalaman.  Salinitas yang diukur bernilai sama pada tiap stasiun yaitu 30  ppt.  Nilai  pH  pada  tiap  stasiun  juga  bernilai  sama  yaitu  7.  Kecerahan  perairan  pada  lokasi pengambilan sampel berkisar antara 91.25 cm hingga 161,5 cm. Kecepatan arus memiliki sedikit perbedaan yakni berkisar 0,1 m/s hingga 0,12 m/s. Setiap stasiun memiliki kadar oksigen terlarut ( Dissolved oxygen ) yang bervariasi yakni berkisar antara 5,83 mg/L hingga 6,83 mg/L. Suhu perairan saat pengambilan sampel tidak berbeda jauh pada setiap stasiunnya yakni berkisar antara 27,8°C hingga 29,9°C. Kedalaman pada setiap stasiun meimiliki perbedaan yakni berkisar antara 5 meter hingga 11 meter (Tabel 1). Data parameter perairan yang didapat memiliki kemiripan dengan hasil penelitian Wulandari et  al. (2014),  suhu,  salinitas,  pH  dan  arus  secara  berturut-turut  berkisar  28- 32°C, 31-32,5 ppt, 6,7-7,9, 0,0222 - 0.1985 m/detik. Kadar oksigen terlarut (DO) memiliki nilai yang lebih tinggi yaitu berkisar 7,1-8,3 ppm.
Isolat  bakteri  dengan  kode  ISL  2  dan  ISL  3  diketahui  mampu  tumbuh  dan  mendegradasi minyak solar pada medium SMSSe cair yang telah ditambahkan 2% prosentase minyak solar (v/v). Isolat bakteri hasil seleksi kemudian diidentifikasi melalui pengamatan makroskopik dan mikroskopik untuk  mengetahui  jenis  gram  dan  karakteristik  bentuk  koloninya.  Setelah  dilakukan  pengamatan, diketahui  kedua  bakteri  tersebut  merupakan  jenis  bakteri  gram  negatif  karena  hasil  pewarnaan menunjukkan warna merah (Tabel 2).

## Tabel 1. Parameter fisika kimia di lokasi penelitian
Parameter Stasiun 1 2 3 Salinitas (ppt) 30 30 30 pH 7 7 7 Kecerahan (cm) 161,5 91,25 112,95 Arus (m/s) 0,1 0,12 0,1 DO (ppm) 5,83 6,83 6,64 Suhu (°C) 29.4 27.8 29.9 Kedalaman (m) 5 7 11 Tabel 2. Morfologi Bakteri
Pengamatan Karakteristik Kode Isolat ISL 2 ISL 3 Makroskopik Ukuran Koloni Kecil Kecil Bentuk Koloni Bulat Bulat Tepi Koloni Berombak Rata/utuh Warna Koloni Putih Putih Elevasi Koloni Timbul/Melengkung Datar Mikroskopik Pewarnaan Gram Negatif Negatif Bentuk Sel Batang Batang
Uji molekuler dilakukan untuk mengetahui jenis spesies dari isolat bakteri yang didapatkan dari proses seleksi awal. Pada tahap visualisasi gel elektroforesis dalam uji molekuler diketahui bahwa jumlah  pasangan  basa  DNA  pada  isolat  ISL  2  dan  ISL  3  berkisar  1500  bp.  Keterangan  nomor  1 merupakan hasil visualisasi isolat dengan kode ISL 2, nomor 2 merupakan isolat dengan kode ISL 3 (Gambar 2).
Pada proses sekuensing DNA, data sekuen hasil molekuler yang berupa primer reverse dan forward dikoreksi ( alignment ) sehingga noise pada rantai DNA berkurang. Pemotongan noise pada rantai DNA sekuen dilakukan pada software MEGA6 dengan cara memotong dan mengoreksi rantai DNA sekuen tersebut. DNA sekuen yang telah dikoreksi kemudian dianalisa pohon filogenetiknya dengan  pengulangan/ Bootstrap  Replication sebanyak  1000  kali.  Pembuatan  pohon  filogenetik spesies menggunakan 16 data spesies terdekat dan 1 spesies dari genus Salmonella sp. sebagai data pembanding.
Journal of Marine Research Vol 9, No.4 November 2020, pp. 453-463
Gambar 2. Hasil Visualisasi Elektroforesis
Tabel 3. Identifikasi molekuler
Identifikasi BLAST Isolat Spesies Strain Query Cover Homologi Kode akses ISL 2 Vibrio alginolyticus NBRC 15630 100% 99,58% NR_122050.1 ISL 3 Vibrio alginolyticus NBRC 15630 100% 99,58% NR_122050.1
Gambar 3. Hasil Analisis Filogenetik Mega6
Hasil  analisa  sekuen  pada  uji  molekuler  dari  sekuen  DNA  isolat  bakteri  ISL  2  dan  ISL  3 menunjukkan bahwa jenis spesies kedua bakteri memiliki kemiripan hingga 99,58% dengan spesies bakteri Vibrio  alginolyticus .  Bakteri Vibrio  alginolyticus diketahui  merupakan  bakteri  yang  dapat mendegradasi minyak  solar,  hal  ini juga  diperkuat  dari  hasil  penelitian  yang dilakukan  Imron  dan
ISL2 ISL3 Vibrio alginolyticus Vibrio campbellii Vibrio harveyi Vibrio hangzhouensis Vibrio astriarenae Vibrio plantisponsor Vibrio cidicii Vibrio sinaloensis Vibrio brasiliensis Vibrio coralliilyticus Vibrio mediterranei Vibrio halioticoli Vibrio penaeicida Vibrio tapetis Vibrio parahaemolyticus Vibrio proteolyticus Salmonella enterica 250 bp 1000 bp 500 bp 750 bp 1500 bp
Titah (2018), yang menyatakan bahwa bakteri spesies Vibrio alginolyticus mempunyai kemampuan untuk  mendegradasi  minyak  solar  pada  prosentase  tertentu.  Analisis  filogenetik  digunakan  untuk mengetahui kekerabatan masing-masing isolat dengan bakteri lain yang ada di BLAST berdasarkan urutan  DNA.  Hasil  identifikasi  kedua  isolat  dijelaskan  dalam  tabel  6  dan  pohon  filogenetik divisualisasikan pada Gambar 3.
Isolat  bakteri Vibrio alginolyticus dari  hasil  isolasi  dan  seleksi  kemudian  diuji  kemampuan degradasinya  terhadap  minyak  solar.  Media  tumbuh  bakteri  yang  digunakan  pada  uji  degradasi minyak,  yaitu  SMSSe  dengan  dua  prosentase  berbeda,  5%  dan  10%.  Periode  isolasi  pada  uji minyak, yaitu 7 hari dan 14 hari. Jumlah kepadatan awal bakteri Vibrio alginolyticus , yaitu sebanyak 0,00054.  10 5 CFU/mL. Vibrio  alginolyticus ditumbuhkan  ke  dalam  media  SMSSe  dengan  minyak solar prosentase  5% dan 10%.
Hasil pertumbuhan kedua isolat dihitung pada hari ke 7 dan ke 14. Kepadatan bakteri Vibrio alginolyticus ulangan pertama pada prosentase 5% mengalami penurunan dari 1,4 x 10 5 CFU/mL pada hari ke 7 menjadi 1,1 x 10 5 CFU /mL. Jumlah kepadatan bakteri Vibrio alginolyticus ulangan pertama dengan prosentase minyak solar 10%, yaitu 6,1x10 5 CFU/mL pada hari ke 7 dan 0,5 x 10 5 CFU/mL pada hari ke 14 (Tabel 4).
Bakteri Vibrio  alginolyticus ulangan  ke-dua  dengan  prosentase  minyak  solar  5%,  jumlah bakteri  sebanyak  1,5x10 5 CFU/mL  pada  hari  ke  7  dan  0,5x10 5 CFU/mL  pada  hari  ke  14. Pertumbuhan  bakteri  juga  mengalami  penurunan  pada  prosentase  minyak  solar  10%  hari  ke  14 yang semula berjumlah 6,9 x 10 5 CFU/mL menjadi 0,7x10 5 CFU/mL (Tabel 4).
Tabel 4. Pertumbuhan isolat bakteri pada prosentase minyak solar 5% dan 10%
Prosentase solar (%) Kepadatan hari ke-0 Kepadatan hari ke-7 Kepadatan hari ke-14 5 54 140000 110000 5 54 150000 50000 Rerata 145000 80000 Standar deviasi 7071,0678 42426,4069 10 54 610000 50000 10 54 690000 70000 Rerata 650000 60000 Standar deviasi 56568,5425 14142,1356
Pertumbuhan  bakteri  pada  kedua  prosentase  beranekaragam.  Jumlah  sel  bakteri Vibrio alginolyticus mengalami peningkatan seiring bertambahnya prosentase minyak solar. Bakteri Vibrio alginolyticus diketahui dapat mendegradasi minyak pada konsentrasi tertentu. Menurut Nasikhin dan Shovitri  (2013),  degradasi  minyak  dapat  diduga  dengan  mengetahui  pengurangan  atau penambahan jumlah sel mikroba tiap satuan waktu. Pertumbuhan bakteri Vibrio alginolyticus pada ke-dua  pengulangan  mengalami  kenaikan  pada  hari  ke  7  dan  penurunan  pada  hari  ke  14. Berdasarkan fase pertumbuhan, hari ke 7 merupakan fase eksponensial (fase dimana pertumbuhan bakteri sangat tinggi) sedangkan hari ke 14 merupakan fase kematian (fase dimana pertumbuhan bakteri sangat rendah).
Menurut  Yetti  (2016),  bakteri Vibrio merupakan  salah  satu  bakteri  sedimen  laut  yang  dapat mendegradasi rantai karbon dari senyawa Polyaromatic Hydrocarbons (PAHs). Hal ini disebabkan karena bakteri dapat memecah rantai karbon dengan bantuan enzim monooksigenase dan enzim dioksigenase  untuk  menghasilkan  nutrisi  yang  kemudian  dimanfaatkan  bagi  pertumbuhan (Hasyimuddin et al. , 2016).
Menurut  Umroh  (2011),  penurunan  sel  bakteri  dapat  disebabkan  karena  berkurangnya kandungan nutrien N dan P di dalam sampel, nutrien ini dimanfaatkan bakteri sebagai sumber nutrisi untuk pertumbuhan. Berdasarkan fase pertumbuhan, hari ke 7 merupakan fase eksponensial (fase dimana pertumbuhan bakteri sangat tinggi) sedangkan hari ke 14 merupakan fase kematian (fase dimana  pertumbuhan  bakteri  sangat  rendah).  Pertumbuhan  bakteri  pada  kedua  prosentase beraneka ragam.
Journal of Marine Research Vol 9, No.4 November 2020, pp. 453-463
Jumlah  sel  bakteri  mengalami  peningkatan  seiring  bertambahnya  prosentase  minyak  solar. Hal  ini  disebabkan  karena  bakteri  memanfaatkan  unsur  karbon  yang  ada  dari  minyak  solar  dan ekstrak yeast. Menurut Nashikin dan Shovitri (2013), karbon merupakan elemen paling dasar untuk seluruh bentuk kehidupan dan karbon dibutuhkan dalam jumlah yang lebih besar dari pada elemen- elemen lain.
Histogram  degradasi  minyak  (Gambar  4)  dan  grafik  korelasi  waktu  pemaparan  dan  daya degradasi (Gambar 5) diketahui jumlah minyak sisa degradasi menurun berbanding lurus dengan lama periode uji degradasi. Nilai R Square pada histogram degradasi minyak memiliki nilai 0,9549 di prosetase 10% dan 0,9847 di prosentase 5%. Nilai R Square yang baik yaitu jumlahnya mendekati angka  1  atau  dapat  dikatakan  dapat  mewakili  100%  data  yang  digunakan.  Pada  nilai R  Square degradasi  minyak  prosentase  10%  dapat  mewakili  95,49%  dari  data  yang  digunakan  dan  pada prosentase 5% sebesar 98,47%.
Hasil  pengamatan  dari  uji  degradasi  pada  inkubasi  selama  7  hari  dan  14  hari  menunjukan bahwa semua isolat yang diuji mampu mendegradasi minyak solar dengan hasil prosentase yang berbeda.  Pada  periode  7  hari,  bakteri  ulangan  pertama  mampu  mendegradasi  minyak  pada prosentase 5% (0,5 mL) sebesar 26,08%, prosentase 10% (1 mL) sebesar 28,39% dari jumlah total minyak. Pada periode 14 hari, bakteri pada ulangan pertama mampu mendegradasi minyak pada prosentase 5% (0,5 mL) sebesar 56,88%, prosentase 10% (1 mL) sebesar 71,61% dari jumlah total prosentase minyak awal.
Isolat  bakteri Vibrio  alginolyticus ulangan  ke-dua  memiliki  perbedaan  besaran  prosentase minyak yang terdegradasi, pada periode 7 hari prosentase 5% (0,5 mL) sebesar 38,4%, prosentase 10% (1 mL) sebesar 19,15% dari jumlah total prosentase minyak awal. Pada periode 14 hari bakteri Vibrio  alginolyticus ulangan  ke-dua  mampu  mendegradasi  minyak  pada  prosentase  5%  (0,5  mL) sebesar 49,18%, prosentase 10% (1 mL) sebesar 80,85% dari jumlah total prosentase minyak awal.
Uji One-Way ANOVA dilakukan pada pertumbuhan bakteri hasil seleksi prosentase 2% minyak solar.  Pada  hasil  uji  analisa  One-Way  ANOVA  didapatkan  nilai  Sig.  pengulangan  pertama  yaitu 0,482 dan pada pengulangan ke-dua sebesar 0,816 pada data pertumbuhan prosentase 2%. Pada uji  normalitas  diketahui  kedua  ulangan  memiliki  nilai  Sig.  >0,05  maka  data  berdistribusi  normal. Menurut  Oktaviani et  al. (2014),  apabila  nilai  Sig.  pada  uji  normalitas  bernilai  >0,05  maka  data berdistribusi normal.
Pada hasil uji homogenitas diperoleh nilai signifikansi (Sig)  sebesar 0,173.  Nilai signifikansi (Sig)  yang  diperoleh  0,173  >  0,05  maka  ke-dua  data  pengulangan  bersifat  homogen  sehingga asumsi  homogenitas  dalam  uji one-way ANOVA  tepenuhi.  Uji  ANOVA  dilakukan  untuk  melihat perbedaan rata-rata pertumbuhan bakteri pada prosentase 2%. Nilai signifikansi (Sig) yang didapat pada ANOVA, yaitu 0,319 > 0,05 maka pertumbuhan antar ke-dua pengulangan adalah sama atau tidak ada perbedaan. Apabila nilai signifikansi (Sig) yang didapat <0,05 maka ada perbedaan rata- rata pertumbuhan pada tiap pengulangannya.
Pada uji degradasi minyak solar prosentase 5% dan 10%, nilai mean/rerata minyak solar sisa degradasi mengalami penurunan kadar minyak seiring dengan berjalannya waktu (periode) isolasi, pernyataan ini juga didukung oleh hasil uji Tukey HSD ( Honestly Significant Difference ), yaitu nilai signifikansi periode hari ke-0 hingga hari ke-7 sebesar 0,003 (<0,05), hari ke-0 hingga ke-14 sebesar 0,00 (<0,05) dan hari ke-7 hingga ke-14 sebesar 0,01 (<0,05). Uji Tukey HSD menjelaskan bahwa pada  periode  hari  ke-0  hingga  ke-14  memiliki  perubahan/pengurangan  prosentase  yang  secara signifikan. Nilai dunnett t yang diperoleh, yaitu pada periode hari ke-0 hingga hari ke-7 sebesar 0,003 (<0,05), pada hari ke-0 hingga ke-14 sebesar 0.00 (<0,05) dan pada hari ke-7 hingga ke-14 sebesar 0,007  (Tabel  4.12).  Pada  hasil  uji dunnett  t menyatakan  pengurangan  prosentase  minyak  solar terbesar  berada  pada  periode  hari  ke-0  hingga  ke-14,  hal  ini  dikarenakan  bakteri  memiliki  waktu yang lebih lama untuk melakukan proses degradasi.
Pada hasil uji degradasi minyak solar dilakukan juga dilakukan uji Paired Sample T test . Hasil uji Paired Sample T test kepadatan bakteri hari ke-0 dan hari ke-7 memiliki nilai signifikansi (Sig.) 0,018 (<0,05), maka terdapat perbedaan jumlah secara signifikan antara kepadatan bakteri hari ke- 0 dengan hari ke-7. Perbedaan signifikan ini terjadi karena ada lonjakan pertumbuhan kepadatan bakteri pada uji degradasi hari ke-7. Lonjakan pertumbuhan kepadatan bakteri diduga terjadi karena isolat bakteri berada pada tahap eksponensialnya.
Journal of Marine Research Vol 9, No.4 November 2020, pp. 453-463
Gambar 4. Histogram Rerata Degradasi Minyak
Gambar 5. Grafik Korelasi Waktu Pemaparan Dan Daya Degradasi
Uji Paired Sample T test kepadatan bakteri hari ke-0 dan hari ke-14 memiliki nilai signifikansi Sig.  0,002  (<0,05)  maka  ada  perbedaan  kepadatan  bakteri Vibrio  alginolyticus secara  signifikan pada hari ke-0 dan hari ke-14. Hasil uji Paired Sample T test pada kepadatan hari ke-7 dan ke-14 memiliki nilai sig. 0,049 (<0,05), maka terdapat perbedaan secara signifikan pada hari ke-7 dan ke- 14. Pada hasil uji hari ke-7 dan ke-14 kepadatan bakteri cenderung berkurang, hal ini dikarenakan bakteri telah memasuki fase kematian.
Pada hasil uji Paired T test minyak sisa degradasi hari ke-0 dan ke-7 memiliki nilai signifikan senilai 0,14 (Sig. <0,05), maka terdapat perbedaan signifikan pada jumlah minyak sisa hari ke-0 dan hari ke-14. Pada Paired T test minyak sisa degradasi hari ke-0 dan ke-14 memiliki nilai signifikan 0,012  (Sig.  <0,05),  maka  terdapat  pengurangan  minyak  sisa  degradasi  secara  signifikan  pada periode hari ke-7 hingga hari ke-14. Uji Paired T test prosentase minyak sisa degradasi periode 7 hari  hingga  14  hari,  nilai  signifikan  0,034  (Sig.  <0,05).  Hasil Paired  T  test hari  ke  7  hingga  14 menyatakan bahwa terdapat perbedaan secara signifikan jumlah minyak sisa terdegradasi dari hari ke-7 hingga hari ke-14. Pada uji Test of Between –Subject Effect Nilai signifikansi interaksi
R² = 0.9549 R² = 0.9847 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 H0 H7 H14 M iny ak S isa De g rad asi Sample Prosentase 10% Prosentase 5% Linear (Prosentase 10%) Linear (Prosentase 5%) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0.5 1.5 2.5 3.5 M iny ak S isa De g rad asi H0                                H7                               H14
Minyak Sisa Degradasi 5% Minyak Sisa Degradasi 10% Linear (Rerata 5%) Linear (Rerata 10%)
prosentase awal dan periode sebesar 0,093 (Sig. >0,05), maka prosentase awal dan periode tidak memiliki interaksi.
Hasil  dari  uji  degradasi  yang  telah  dilakukan  menyatakan  bahwa  isolat  bakteri Vibrio alginolyticus miliki kemampuan untuk mendegradasi minyak solar pada prosentase tertentu, hal ini juga  diperkuat  oleh  pernyataan  dari  Imron  dan  Titah  (2018),  yang  menyatakan  bahwa Vibrio alginolyticus merupakan salah satu bakteri yang mampu mendegradasi minyak solar. Variasi dari jumlah  besaran  minyak  solar  yang  terdegradasi  diduga  akibat  rendahnya  jumlah  volume  minyak solar yang digunakan dan letak atau posisi tabung reaksi pada alat shaker .
Bakteri  yang  mampu  mendegradasi  senyawa  hidrokarbon  dapat  disebut  sebagai  bakteri hidrokarbonoklastik. Vibrio alginolyticus dapat memanfaatkan minyak solar sebagai sumber karbon untuk  pertumbuhan  dan  reproduksi.  Sumber  karbon  pada  minyak  solar  dapat  digunakan  untuk metabolisme  bakteri,  tetapi  minyak  solar  juga  dapat  menjadi  racun  bagi  mikroorganisme  karena pada prosentase tertentu efeknya yang menghacurkan membran sel. Proses degradasi minyak solar oleh bakteri hidrokarbonoklastik dapat terjadi karena bakteri memiliki enzim yang mampu memecah rantai  karbon.  Bakteri  hidrokarbonoklastik  dapat  mengoksidasi  senyawa  hidrokarbon  afiatik  dan aromatik dengan menggunakan beberapa jenis enzim untuk memecah rantai karbon, yaitu enzim monooksigenase dan dioksigenase (Hasyimuddin et al. , 2016).
Enzim  monooksigenase memiliki  peranan  untuk mengoksidasi  senyawa  hidrokarbon  alifatik menjadi asetil Ko-A yang kemudian dapat dimanfaatkan pada proses katabolisasi siklus asam nitrat, sedangkan  enzim  dioksigenase  memiliki  peran  untuk  membentuk  senyawa  catechol  atau  cis-cis muconate  dan  mendegradasinya  menjadi  suksinat,  piruvat  atau  asetil  Ko-A  yang  kemudian dimanfaatkan pada proses katabolisasi siklus asam nitrat (Nasikhin dan Shovitri, 2013).

## KESIMPULAN
Setelah melakukan isolasi, didapat 2 isolat bakteri dengan kode isolat ISL 2 dan ISL 3. Kedua isolat  bakteri  berhasil  diidentifikasi  sebagai  bakteri Vibrio  alginolyticus .  Bakteri Vibrio  alginolyticus memiliki  kemampuan  untuk  mendegradasi  minyak  solar  pada  prosentase  5%  dan  10%  dengan periode inkubasi 7 hari dan 14 hari. Bakteri Vibrio alginolyticus hasil isolasi mampu mendegradasi 19,15%  hingga  80,85%  minyak  solar.  Keberadaan  bakteri Vibrio  alginolyticus pada  sedimen  di perairan  Pelabuhan  Tanjung  Mas  mampu  membantu  proses  degradasi  minyak  solar  dari  aktivitas pelabuhan.

## DAFTAR PUSTAKA
Dharmayanti,  I.N.L.P.  2011.  Filogenetika  Molekuler:  Metode  Taksonomi  Organisme  Berdasarkan Sejarah Evolusi. Wartazoa 1(21): 1-10.
Firdaus, S.R., Saputro, S. & Satriadi, A. 2013. Studi Pengerukan Alur Pelayaran Pelabuhan Tanjung Mas, Semarang. Jurnal Oseanografi , 2(3):274-279.
Fredriksson,  N.J.,  Hermansson,  M.  & Willen,  B.M.  2013.  The  Choice Of  PCR  Primers  Has Great Impact  On  Assessments  Of  Bacterial  Community  Diversity  And  Dynamics  In  A  Wastewater Treatment  Plant.  University  of  Gothenburg,  Gothenburg,  Sweden. PLoS  ONE .  DOI: 10.1371/journal.pone.0076431.
Handoyo,  D.  & Rudiretna, A. 2000. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (Pcr). Pusat Studi Bioteknologi, Universitas Surabaya.sss
Imron, M.F & Titah, H.S. 2018. Optimization of Diesel Biodegradation by Vibrio Alginolyticus Using Box-Behnken  Design.  Environmental  Engineering  Research,  23(4):374-382.  DOI  : 10.4491/eer.2018.015..
Mijaya,  M.R.S.,  Yanti,  N.A.,  Ardiansyah  &  Muhiddin,  N.H.  2019.  Isolasi  dan  Seleksi  Bakteri Pendegradasi Solar Dari Pelabuhan Penyeberangan Kendari – Wawonii, Sulawesi Tenggara. BioWallacea: Journal of Biological Research , Vol. 6 (2):995-1006 DOI: 10.33772/BioWallacea. v6i2.8825.
Nasikhin, R. & Shovitri, M. 2013. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Pendegradasi Solar dan Bensin dari  Perairan  Pelabuhan  Gresik. Jurnal  Sains  dan  Seni  ITS, 2(2):E84-E88.  DOI: 10.12962/j23373520.v2i2.3626
Journal of Marine Research Vol 9, No.4 November 2020, pp. 453-463
Nurjanah, I. 2018. Uji Potensi Bakteri Pendegradasi Minyak Solar Di Perairan Pelabuhan Tanjung Perak  Surabaya.  Fakultas  Sains  Dan  Teknologi  Universitas  Islam  Negeri  Sunan  Ampel Surabaya.
Oktaviani,  M.A.  &  Notobroto,  H.B.,  2014.  Perbandingan  tingkat  konsistensi  normalitas  distribusi metode kolmogorov-smirnov, lilliefors, shapiro-wilk, dan skewness-kurtosis. Jurnal Biometrika dan Kependudukan , 3(2):127-135.
Pratama,  M.P.  2018.  Analisis  Hubungan  Kandungan  Minyak  Pada  Sedimen  Dan  Kelimpahan Makrozoobenthos Di Perairan Selat Baru Kabupaten Bengkalis Provinsi Riau. Universitas Riau, Pekanbaru.
Ubaidillah,  R.  &  Sutrisno,  H.  2009.  Pengantar  Biosistemik:  Teori  dan  Praktikum.  LIPI  Press,
Jakarta.
Umroh. 2011. Bioremidiasi Pencemaran Minyak Di Sedimen Pantai Balongan, Indramayu Dengan Menggunakan Bakteri Alcanivorax Sp. TE-9 Skala Laboratorium. Akuatik . 5(2):23-31 Wulandari, S.Y., Yusuf, M. & Muslim. 2014. Kajian Konsentrasi Dan Sebaran Parameter Kualitas Air Di  Perairan  Pantai  Genuk,  Semarang. Buletin  Oseanografi  Marina .  3(1):9-19.  DOI: 10.14710/buloma.v3i1.11213.