EFFECTS OF CONTAMINATION DETERGENT (LAS) ON THE EXPRESSION OF INOS IN KIDNEY COMMON CARP ( Cyprinus carpio L.)
Pengaruh Kontaminasi Detergen (LAS) Terhadap Ekspresi iNOS pada Ginjal Cranial Ikan Mas ( Cyprinus carpio. L)

## Ruku R Borut*
Study Program of Aquaculture, Faculty Of Fisheries And Marine Science Pattimura University, Jl. Mr. Chr. Soplanit Kampus Poka, Ambon, 97234
*Corresponding author e-mail: rukubdp75@gmail.com / ratufish@yahoo.co.id
Received:  December 2013 Published: January 2014

## ABSTRACT
This  research  aims  to  know  the  expression  of  iNOS  in  the  kidney  of  fish  contamination  of  LAS  ( linear alkylbenzene  sulfonat ).  Expression  of  iNOS  observations  of  renal  cells  cranial  common  carp  by  using immunohistochemical  methods  show  that  distribution  in  the  cytoplasma  and  iNOS  cell  nucleus.  Expression  of iNOS in the head kidney tissue distribution carp tubules and other networks is uneven. Expression of iNOS on a network of tubules occurs in cells on the outside. On other network distribution unevenly iNOS expression. Expression of iNOS in the head kidney tissues of common carp found in the control group and treatment group LAS contamination during 48 hours of observation. Expression of iNOS in the control group or normal ranges from 4.25-5.5 % of cells, treatment A (0,01 mg/L LAS) 10.5-15.75 % cell, treatment B (0,02 mg/L LAS) 9.75- 22.25  % cell, treatment C (0,03 mg/L  LAS) 10.75-21.00 %, treatment D (0,04 mg/L LAS) 14.5-18.00 % cell and treatment E (0,05 mg/L LAS) 13.00-18.00 % cell. Standard deviation on the control ranges from 2,08 up 3.4 while in group treatment ranged  1 to 1.25
Keywords : LAS , Expression of iNOS, Cyprinus carpio L.

## PENDAHULUAN
Ikan  merupakan  organisme  akuatik  yang selalu  dihadapkan  pada  adanya  stressor (penyebab  stress)  baik  di  perairan  alami maupun  dalam  kondisi  budidaya.  Stressor lingkungan  terutama  meliputi  kondisi  kimia perairan  yang  kurang  baik,  seperti  adanya bahan  pencemar  yang  merupakan  stressor lingkungan  (Iwama  dkk.,  2003).  Salah  satu bahan  pencemar  yang  saat  ini  banyak ditemukan  di  perairan  umum  adalah  LAS ( linear alkylbenzene sulfonat ) yang merupakan  bahan  aktif  dalam  produk detergen (Anonim, 2004).
Detergen  merupakan  surfaktan  yang sangat  luas  penggunaannya  baik  untuk keperluan  rumah  tangga  maupun  industri (Bateman et al ., 1986 dalam Sudiana, 2004). Jenis surfaktan yang paling banyak digunakan  dalam  detergen  adalah  tipe anionik  dalam  bentuk  sulfat  (SO 4 2– )  dan
sulfonat  (SO 3– )  (Schleheck et  al .,  2000 dalam Sudiana,  2004).  Berdasarkan  rumus struktur kimianya, detergen golongan sulfonat  dibedakan  menjadi  dua  jenis (Grayson, 1983 dalam Sudiana, 2004), yaitu jenis  rantai  bercabang  sebagai  contoh Alkil Benzene  Sulfonat (ABS),  dan  jenis  rantai lurus Linear  Alkil  Sulfonat (LAS).  Kedua jenis  senyawa  tersebut  di  lingkungan  terus meningkat,  hal  tersebut  sejalan  dengan penggunaan detergen yang makin meningkat (Kirk  dan  Othmer,  1979 dalam Sudiana, 2004).
Ikan  dapat  menunjukkan  reaksi  terhadap perubahan fisik air maupun terhadap adanya senyawa pencemar yang terlarut dalam batas konsentrasi  tertentu  (Mark,  1981 dalam Sudarmadi,  1993).  Ikan  mas (Cyprinus carpio L .) dapat  digunakan  sebagai  hewan uji  hayati  karena  sangat  peka  terhadap perubahan  lingkungan  (Sudarmadi,  1993). Di  Indonesia  ikan  yang  termasuk  famili
Cyprinidae ini  termasuk  ikan  yang  populer dan  paling  banyak  dipelihara  rakyat,  serta mempunyai nilai ekonomis. Ikan mas sangat peka  terhadap  faktor  lingkungan  pada  umur lebih  kurang  tiga  bulan  dengan  ukuran  8-12 cm (Sudarmadi, 1993).
Ginjal  adalah  tempat  utama  dari  polutan lingkungan  penyebab  toksisitas,  dengan konsekuensi  fungsi  ginjal  yang  terganggu akan  berpotensi  mengancam  kehidupan. Dengan  demikian  penting  untuk  memahami mekanisme  seluler  yang  mendasari  fungsi ginjal  normal  dan  menentukan  polutan nephrotoksik yang mempengaruhinya. Kontribusi penting pada pengetahuan tentang  fungsi  ginjal  dan  nephrotoksisitas polutan  telah  dilakukan  oleh  para  peneliti menggunakan pendekatan komparatif dengan hewan-hewan akuatik (Miller, 1997)
Respon  seluler  terhadap  stress  eksternal di  perairan  dapat  ditunjukkan  oleh  ginjal ikan  mas  ( Cyprinus  carpio.  L )  karena  dapat memicu  timbulnya  iNOS.  Akibat  dari paparan dalam jangka panjang suatu stressor antara lain penurunan pertumbuhan, resistensi  penyakit,  keberhasilan  reproduksi, pernapasan dan kemampuan renang (Barton, 1997 dalam Iwama  dkk.,  1999).  Oleh karena  itu  pendeteksian  dini  keberadaan suatu  stressor  di  perairan  sangat  penting, untuk sedini mungkin dapat dilakukan upaya rehabilitasi  terhadap  lingkungan  perairan yang  tercemar  dengan  perubahan  yang terjadi  dalam  ekspresi  iNOS  selanjutnya dapat  dijadikan  biomarker,  yang  merupakan sistem  peringatan  dini  adanya  paparan polutan  dan  indikasi  adanya  perubahan kondisi lingkungan perairan.

## METODOLOGI

## a. Alat dan bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  adalah  DO meter  type  oxi315i  merk  WTW;  pH  meter type  ad140ph  merk  ama-digit;  timbangan analitik tipe AA-250 merk Denver Instrument  Company;  timbangan  analitik tipe XL-3100 merk Denver Instrument; botol sampel;  dan  perlengkapan  bedah.inkubator
55-63 o C;  hot  plate;  pinset;  pipet  tetes,  kotak preparat,  waterbath  suhu  95 o C;  pembuat blok;  freezing  mikrotom;  pisau  mikrotom dan  Bunsen.  Sedangkan  untuk  analisis imunohistokimia  iNOS  alat  yang  digunakan adalah mikropipet 1000μL, 100μL, 20μL dan spuit; mikroskop Fluorescent Nikon Optiphot-2.
Bahan  yang  digunakan  adalah  jaringan ginjal cranial ikan  mas;  slide;  cover  slide; 4%  paraformaldehid  dalam  PBS  ( phosphate buffered  saline );  ethanol  bertingkat  (70%, 80%, 90%, dan absolute); xylol dan parafin. Sedangkan  untuk  analisis  imunohistokimia iNOS bahan yang digunakan adalah PBS pH 7,4 (pembuatan PBS dengan mencampurkan 8 mM Na 2 HPO 4 ; 1,4 mM KH 2 PO 4 ; 140 mM NaCl; 2,7 mM KCl; dan ditepatkan pada PH 7,4  dengan  menggunakan  NaOH);  aquades; 3% H 2 O 2 dalam PBS; 5% FBS (Fetal Bovine Serum); antibodi primer (antibodi polyclonal anti-iNOS);  antibodi  sekunder  (goat  anti rabbit  IgG  berlabel  biotin);  DAB  (diamono benzidine);  mayer’s  hematoxilen  dan entellan.

## b. Metode Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  metode eksperimen  dengan  eksplorasi  laboratorium berdasarkan  kajian  kimia  dan  molekuler. Rancangan percobaan yang digunakan adalah  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL), dengan  perlakuan  dosis  kontaminasi  linear alkylbenzene  sulfonat  (LAS):  0.01  mg/L, 0.02  mg/L,  0.03  mg/L,  0.04  mg/L,  0.05 mg/L  dan  kontrol.    Peubah  yang  diamati adalah inducible  nitric  oxide  synthase (iNOS)  yang  terdapat  dalam  jaringan  ginjal ikan  mas  ( Cyprinus  carpio L.),  dengan waktu  pengamatan  mengacu  pada  prosedur penelitian  toksisitas  yaitu  selama  48  jam. Prosedur penelitian yang dilakukan meliputi: pengambilan  ikan,  aklimatisasi,  perlakuan LAS, isolasi jaringan ginjal cranial ikan mas dan  pengamatan  peningkatan  iNOS  pada ginjal cranial ikan mas.  Pendeteksian iNOS pada  jaringan  ginjal cranial ikan  mas dilakukan  dengan  metode  imunohistokimia (Ramos-Vara, 2005).
c. Analisis Data
Data inducible  nitric  oxide  synthase (iNOS)  dalam  jaringan  ginjal  cranial  ikan mas  akan  di  interpretasi  secara  deskriptif yaitu  dengan  menghitung  jumlah  sel  yang terekspresi (ditandai dengan warna kecokelatan)  setiap  100  sel  pada  suatu lapang pandang dengan menggunakan mikroskop  Fluorescent  Nikon  Optiphot-2 pada  perbesaran  200x,  400x  dan  1000x  dan dinyatakan dalam persen (%), untuk mengetahui  apakah  terdapat  peningkatan ekspresi  iNOS  pada  ginjal cranial ikan  mas dapat  dipicu  oleh linear  alkylbenzene sulfonat (LAS). Hasil ini akan menjadi dasar dalam penggunaan iN OS sebagai biomarker keberadaan  LAS  di  lingkungan  perairan budidaya maupun alami.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## a.  inducible  nitric  oxide  synthase
(iNOS)
Pada  hasil  pengamatan  ekspresi  iNOS terhadap  sel-sel  ginjal cranial ( head  kidney ) ikan  mas  ( Cyprinus  carpio L.)  dengan menggunakan  metode    imunohistokimia, menunjukkan bahwa iNOS terdistribusi pada sitoplasma  dan  inti  sel.  Warna  coklat  dalam sitoplasma dan inti pada sel yang mengekspresi iNOS diamati dengan menggunakan  mikroskop  Fluorescent  Nikon Optiphot-2 pada pembesaran 1000 x.
Ekspresi  iNOS  pada head  kidney ikan mas  terdistribusi  pada  jaringan  tubulus  dan jaringan  lainnya  secara  tidak  merata.  Pada jaringan  tubulus  ekspresi  iNOS  terjadi  pada sel  di  bagian  luar.  Pada  jaringan  lainnya ekspresi iNOS terdistribusi tidak merata.
Ekspresi  iNOS  dalam  jaringan head kidney ikan  mas  ditemukan  pada  kelompok kontrol dan kelompok perlakuan kontaminasi LAS selama 48 jam pengamatan.  Ekspresi  iNOS  pada  kelompok kontrol atau normal (K) berkisar 4.25-5.5 % sel,  perlakuan  A  (kontaminasi  0,01  mg/L LAS)  10.5-15.75  %  sel,  perlakuan  B (kontaminasi 0,02 mg/L LAS) 9.75-22.25  % sel,  perlakuan  C  (kontaminasi  0,03  mg/L
LAS) 10.75-21.00 %, perlakuan D (kontaminasi 0,04 mg/L  LAS) 14.5-18.00 % sel dan perlakuan E (kontaminasi 0,05 mg/L LAS)  13.00-18.00  %  sel.    Standar  deviasi pada kontrol berkisar antara ± 2,08 sampai ± 3,4  sedangkan  pada  kelompok  perlakuan berkisar antara ± 1.00 sampai ± 1.25 dapat di lihat pada gambar 1.
(a)

## (b)
Gambar 1. Ekspresi iNOS dalam Jaringan Ginjal Cranial Ikan Mas Pada Kontaminasi LAS (% Sel) a) waktu 24 jam b) waktu 48 jam
Pengamatan ekspresi iNOS dalam penelitian  ini  dengan  menggunakan  teknik pemulasan  imunohistokimia  menunjukkan bahwa  iNOS  dalam  sel  ginjal cranial ikan mas  terdistribusi  pada  sitoplasma  maupun nukleus/inti  sel.    Hal  ini  didukung  dengan pernyataan Cronstein et al (1993), Kendall et al (2000)  Newton  (2000),  bahwa  iNOS merupakan  molekuler  intraseluler  yang ditemukan  di  dalam  sitosol,  mitokondria, retikulum endoplasma, dan nukleus eukariot. Dalam  synthase  NO  (NOS),  ekspresi  iNOS dihasilkan  oleh  stimulasi  beragam  cytokiner ataupun  infeksi  bacteria.  Nathan  (1992). memperlihatkan  bahwa  adenosin,  yang menjadi nukleosida endogenus, punya sejumlah  aksi  biologis  terhadap  beragam sel dan  dapat  memodulasi  beragam  fungsi  sel
Ruku R Borut / Ind. J. Chem. Res , 2014, 1, 99 - 103
yang  terlibat  dalam  respon  inflamasi. (Cronstein et al , 1991, 1993).
Berdasarkan rangsangan LAS ini melalui suatu sistem sinyal transduksi akan menstimulasi  suatu  bahan  kimia  sel  yang
didalam  dikenal  sebagai second  messenger . Di  dalam  sitoplasma  akan  terjadi  suatu reaksi berantai biokimia, yang menyebabkan terjadi  fosforilasi  berbagai  protein,  yang menginduksi  berbagai  proses  biokimia  dan fisiologis  seperti  motolitas,  pembelahan  sel, ekspresi  gen  dan  metabolisme  seluler.  Hal ini di dukung pendapat Carafoli et al, (1990), Dedman  &  Kaetzel  (1998)  bahwa second messenger terdapat  pada  berbagai  lokasi  di sel  mulai  dari  matriks  sel,  molekul  adesi,  di dalam membran sel, dalam organela sel, inti sel dan sitoplasma dalam bentuk yang terikat dengan  reseptor  protein  maupun  dalam kondisi  bebas  berperan  dalam  homeostatis sel.
Ekspresi  iNOS  pada  ginjal cranial ikan mas  terjadi  di  jaringan  Tubulus  dan  di jaringan  lain  menunjukkan  bahwa  pada dasarnya  peningkatan  ekspresi  iNOS  dapat diekspresi  oleh  semua  sel.    Menurut Cronstein et al (1991, 1993), Nathan (1992) bahwa  iNOS  adalah  enzim  NOS  yang terdapat  di  seluruh  sel,  berperan  penting dalam peningkatan sel selama dalam kondisi stres.

## b. Kualitas Air
Hasil  pengukuran  parameter  kualitas  air selama  48  jam  menunjukkan  kondisi  yang tidak  fluktuatif.  Suhu  berkisar  antara  22,1- 22,8 o C, oksigen terlarut 6,09-6,63 mg/L dan pH  7,52-7,80.  Data  parameter  kualitas  air
menunjukkan  kondisi  perairan  yang  stabil pada  suhu  dan  pH,  sedangkan  pada  oksigen terlarut  menunjukkan  kondisi  perairan  yang cenderung menurun.
Hasil  pengukuran  parameter  kualitas  air
selama  penelitian  pada  kelompok  kontrol dan  perlakuan  adalah  suhu  berkisar  antara 22,1-22,8 o C,  Oksigen  terlarut  5,50-6,63 mg/L dan pH 7,4-7,8 (table 1).
Kisaran  parameter  kualitas  air  pada Tabel 1 tersebut di atas berada dalam kondisi optimum  bagi  kehidupan  dan  pertumbuhan ikan  mas.    Susanto  (1987)  menyatakan bahwa lingkungan perairan yang ideal untuk ikan mas di jaringan yang berketinggian 150 -600  m  di  atas  permukaan  laut  dengan  suhu air  berkisar  antara  20  –  35 o C.    Selanjutnya (Sutisna dan Sutarmanto, 1995) menjelaskan bahwa  kandungan  oksigen  terlarut  sebesar  5 ppm  optimal  bagi  pembenihan  ikan  mas. CO 2 berkisar antara 10 -100 ppm, kandungan amoniak kurang dari 1 ppm, pH air berkisar antara 6,7 – 8,2.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  ditarik kesimpulan  :  kontaminasi  LAS  (0.01  mg/L selama  48  jam  sudah  dapat  memicu peningkatan  ekspresi  iNOS  pada  sitoplasma dan  inti  sel  dalam  jaringan  ginjal  ikan  mas ( Cyprinus carpio L.).

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim,  2004, Detergen .  Badan  Pengawas Obat  dan  Makanan  Republik  Indonesia. Deputi  Bidang  Pengawasan  Produk
Tabel 1. Data Parameter Suhu, DO dan pH selama 48 Jam
Terapetik dan NAPZA. www.pom.go.id.htm. 23 Juli 2007.
Cronstein  BN,  Eberle  MA,  Gruber  HE,
Levin  RI,  1991,  Methotrexate  inhibits neutrophil  function  by  stimulating adenosine release from connective tissue cells. Proc Natl Acad Sci USA 88:2441- 2445.
Cronstein BN, Naime D, Ostad E, 1993, The antiinflammatory mechanism of
methotrexate. Increased adenosine release  at  inflamed  sites  diminishes leukocyte  accumulation  in  an  in  vivo model  of  inflammation. J.  Clin  Invest 92:2675-2682.
Iwama,  G.K,  2008, Stress  in  Fish.  Institute
for Marine Biosciences, National Research  Council  of  Canada , Nova Scotia . http://www-heb.pac.dfo- mpo.gc.ca/pdf. 28 februari 2008.
Iwama,  G.K.;  L.O.B.  Afonso;  A.  Todgham;
P. Ackerman dan K. Nakano, 2003, Are Hsps  Suitable  for  Indicating  Stressed States  in  Fish? The  Journal  of Experimental Biology 207:15-19. Iwama,  G.K.;  L.O.B.  Afonso  dan  M.M. Vijayan, 2004a, Stress in Fish. AquaNet Workshop  on  Fish  Walfare .  September 27,  2004.  http://aquanet.ca/  iwama/pdf.
15 Agustus 2007.
Iwama,  G.K.;  P.T.  Thomas;  R.B.  Forsyth dan  M.M.  Vijayan,  2004b, Heat  Shock Protein Expression in Fish. SpringerLink
Journal 8: Abstrak.
Kendall  HK,  Haase  HR,  Li  H,  Xiao  YG, Bartold  PM,  2000),  Nitric  oxide synthase  type-II  is  synthesized  by human  gingival  tissue  and  cultured human gingival fibroblasts,
J.
Periodontal Res 35:194- 200.
Nathan C., 1992,  Nitric oxide as a secretory product  of  mammalian  cells. FASEB  J.,
6:3051-3064.
Nathan  CF,  Hibbs  JB,  1991,    Role  of  nitric oxide synthesis in macrophage
antimicrobial activity. Curr Opin
Immunol 3:65-70.
Newton,  2000, Molecular  mechanism  of Glucocorticoid  Action  :  What  is important?. Thorax 55:603-613.
Sudiana,  I  Made,  2004, Peran  Komunitas Mikroba Lumpur Aktif dalam Perombakan  Detergen  Alkil  Sulfonat Linear dan Benzena Alkil Sulfonat Pusat Penelitian Biologi-LIPI. Bogor.
Indonesia
Sutisna,  D.  H.    dan    R.  Sutarmanto,    1995,
Pembenihan  Ikan  Air  Tawar .  Kanisius. Jogyakarta. 135 hal