PENGARUH WAKTU PERENDAMAN SEBELUM SONIKASI TERHADAP KADAR ASIATIKOSIDA PADA EKSTRAK DAUN PEGAGAN AIR ( HYDROCOTYLE VULGARIS L.) SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
ARMON FERNANDO 1 , FADHILATUN KHOIRIYAH 2
Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau, Pekanbaru, 1,2 armonfernando@stifar-riau.ac.id 1
Abstract: Pegagan air (Hydrocotyle vulgaris L.) is one of the plants used as medicine, one of the contents of pegagan air (Hydrocotyle vulgaris L.) is asiaticoida. Asiaticosides are  known having antioxidant and neuroprotective activities. This research aims at finding out the effect of immersion time before sonication of pegagan air (Hydrocotyle vulgaris L.) toward the leaf extract on asiaticoside levels. Extractions parameters used are immersion time and sonication time.  The  asiaticoside  level  was  analyzed  using  high  performance  liquid  chromatography  by column C-18, the mobile phase of methanol : water (70:30), flow rate of 1 ml/min and detected at wavelength 206 nm. Calibration curves were made by using a series of concentrations of 2- 14  ppm  with  a  regression  equation  y  =  11656x  +  142673.  Optimum  asiaticoside  levels  in pegagan air (Hydrocotyle vulgaris L.) leaf extract were obtained at the time of immersion for two hours with sonication time for 15 minutes. The asiaticoside level obtained in the extract of pegagan air (Hydrocotyle vulgaris L.) leaf was 0,1699 mg/10 mg extract with a percentage of 1.6842%.
Keywords : Pegagan air, Asiaticoside, Immersion, Sonication, HPLC.
Abstrak: Pegagan  air  ( Hydrocotyle  vulgaris L.)  merupakan  salah  satu  tanaman  yang dimanfaatkan  sebagai obat, salah  satu kandungan senyawa pegagan air ( Hydrocotyle  vulgaris L.)  adalah  asiatikosida.  Asiatikosida  diketahui  memiliki  aktivitas  antioksidan  dan neuroprotektif.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan  pengaruh  waktu  perendaman sebelum  sonikasi  ekstrak  daun  pegagan  air  ( Hydrocotyle  vulgaris L.)  terhadap  kadar asiatikosida.  Parameter  ekstraksi  yang  digunakan  adalah  waktu  perendaman  dan  waktu sonikasi.  Kadar  asiatikosida  dianalisis  menggunakan  kromatografi  cair  kinerja  tinggi  dengan menggunakan  kolom  C-18, fase  gerak  metanol:air  (70:30),  laju  alir  1  ml/menit  dan  dideteksi pada panjang gelombang 206 nm. Pembuatan kurva kalibrasi dilakukan dengan menggunakan seri konsentrasi 2-14 ppm dengan persamaan regresi y = 11656x + 142673. Kadar asiatikosida yang optimum pada ekstrak daun pegagan air ( Hydrocotyle vulgaris L.) diperoleh pada waktu perendaman  selama  2  jam  dengan  waktu  sonikasi  selama  15  menit.  Kadar  asiatikosida  yang diperoleh  pada  ekstrak  daun  pegagan  air  ( Hydrocotyle  vulgaris L.)  ialah  0,1699  mg/10  mg ekstrak dengan persentase sebesar 1,6842%.
Kata kunci : Pegagan air, Asiatikosida, Perendaman, Sonikasi, HPLC

## A. Pendahuluan
Pegagan  ( Centella  asiatica )  merupakan  tanaman  liar  yang  tumbuh  di  berbagai  tempat seperti di daerah-daerah lembab, rawa dan pinggiran sawah. Tanaman ini banyak dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai tanaman obat karena memiliki beberapa khasiat, diantaranya sebagai antioksidan,  antidemam,  antidiuretik,  penyembuh  luka,  rematik,  penambah  nafsu  makan, melancarkan peredaran darah, hepatoprotektor dan meningkatkan daya ingat (Widowati et al ., 1992).  Tumbuhan  pegagan  air  ( Hydrocotyle  vulgaris L.)  secara  umum  dijelaskan  memiliki kandungan  senyawa  yang  tidak  jauh  berbeda  dengan  tumbuhan  pegagan  secara  umum ( Centella asiatica (L) Urban). Tumbuhan pegagan ( Centella asiatica (L) Urban) mengandung senyawa  berupa  triterpenoid,  saponin,  flavonoid,  tanin,  steroid  dan  glikosida,  sedangkan pegagan  air  ( Hydrocotyle  vulgaris L.)  mengandung  senyawa  metabolit  berupa  flavonoid, fenolik dan terpenoid (Endah, 2003).
Asiatikosida  merupakan  salah  satu  senyawa  aktif  yang  terkandung  dalam  pegagan, disamping  masih  banyak  senyawa-senyawa  lain.  Senyawa  asiatikosida  bersifat  polar  karena adanya  ikatan  glikosida  antara  molekul  gula  dengan  gugus  benzene  (Pramono,  1992).
Berdasarkan  penelitian  sebelumnya  telah  dilakukan  uji  kandungan  pemeriksaan  penapisan fitokimia dari tumbuhan segar pegagan air ( Hydrocotyle vulgaris L.) yang menunjukkan hasil adanya  senyawa  metabolit  sekunder  pada  bagian  akar  dan  batang  hanya  diperoleh  flavonoid. Sedangkan pada bagian daun diperoleh flavonoid, fenolik dan terpenoid (Arhas, 2017). Selain itu  hasil  yang  didapatkan  secara  spesifik  terhadap  kandungan  metabolit  sekunder  pada golongan triterpenoid dari perhitungan kadar asiatikosida pada herba pegagan air ( Hydrocotyle vulgaris L.)  yaitu  dengan  kadar  sebesar  2,63%  (Arredha,  2016).  Bagian  pegagan  yang mengandung  asiatikosida  terdapat  pada  daun  (82,6%),  batang  (15,9%)  dan  pada  akar  (1,5%) (Kim et al ., 2004).
Metode  ekstraksi  perendaman  adalah  metode  ekstraksi  yang  dapat  menjaga  kandungan senyawa  tanaman  yang  tidak  tahan  panas  (Handa et  al .,  2008).  Menurut  Kim et  al (2009) menyatakan bahwa asiatikosida dapat diekstraksi menggunakan pelarut air, metanol dan etanol pada  parameter  suhu  yang  berbeda-beda,  kadar  asiatikosida  tertinggi  terdapat  dalam  ekstrak etanol  pada  suhu  78ºC  yaitu  17,7  mg/g  yang  di  maserasi  selama  5  jam,  sedangkan  dalam ekstrak metanol yaitu 8,2 mg/g yang di maserasi selama 24 jam. Penelitian lain menunjukkan bahwa ekstraksi asiatikosida yang dimaserasi menggunakan pelarut etanol 70% dan ditetapkan kadar  dengan  LC-MS  diperoleh  kadar  sebesar  0,232%    (Zulkarnaen et  al ,  2016).  Metode ekstraksi  maserasi  ini  membutuhkan  waktu  yang  relatif  lebih  lama  agar  sampel  dapat diekstraksi secara optimum.
Metode ekstraksi  sonikasi merupakan metode ekstraksi  yang memanfaatkan gelombang ultrasonik  yang  dapat  mempercepat  waktu  kontak  antara  sampel  dan  pelarut.  Ada  tiga parameter  utama  pada  metode  ultrasonikasi  yaitu  intensitas,  waktu  dan  frekuensi  gelombang ultrasonik  (Sondari,  2016).  Ekstraksi  pegagan  dengan  pelarut  etanol  yang  di  sonikasi  selama 30 menit didapatkan kadar sebesar 3,14 mg/g dengan pengukuran KCKT (Kwon et al ., 2011). Sedangkan  pada  penelitian  lain  didapatkan  kadar  asiatikosida  dengan  menggunakan  sonikasi sebesar 7,43% dengan menggunakan pelarut etanol 70% dan waktu sonikasi selama 15 menit (Febriyanti et  al .,  2016).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  waktu perendaman  sebelum  sonikasi  terhadap  kadar  asiatikosida  pada  ekstrak  daun  pegagan  air ( Hydrocotyle  vulgaris L.)  yang  tumbuh  didaerah  Taman  Karya  Kecamatan  Tampandengan menggunakan metode  KCKT.

## B. Metodologi Penelitian
Alat-alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  beker  gelas  (pyrex),  erlemeyer, gelas  ukur,  pipet  tetes,  tabung  reaksi,  plat  tetes,  timbangan  analitik  (Shimadzu ® ),  batang pengaduk,  spatel,  perkamen,  aluminium  foil, thermometer ,  botol  gelap,  corong,  seperangkat alat  destilasi  (Eyela  OBS-2100  R),  pipet  mikro  (Nesco ® ), rotary  evaporator (Bunchi ® ),sonikator  (Krisbow ® ),  spektrofotometer  UV-Vis  (Shimadzu ® ),  penyaring  sampel PTFE 0,2 µm, seperangkat  alat Kromatografi Cair Kinerja  Tinggi (Shimadzu ® ). Bahan-bahan yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  daun  pegagan  air  ( Hydroccotyle  vulgaris L.), etanol,  karbon  aktif,  kloroforn  amoniak,  kloroform,  asam  asetat  anhidrat,  asam  sulfat  pekat, asam  klorida  pekat,  besi  (III)  klorida,  pereaksi  mayer,  logam  Mg,  metanol  pro  analisis, metanol for liquid chromatography , aquabidestillata.

## C. Hasil dan Pembahasan
Ekstraksi  pegagan  air  dilakukan  dengan  menggunkan  metode  perendaman  dan  sonikasi manggunakan  pelarut  etanol.  Asiatikosida  memiliki  ketahanan  yang  rendah  terhadap  panas (Alupului et  al .,  2009).  Pemilihan  metode  ekstraksi  perendaman  karena  dianggap  sebagai metode yang cocok untuk zat-zat yang tidak tahan pemanasan maupun yang tahan pemanasan, sedangkan  metode  sonikasi  dipilih  karena  menggunakan  panas  yang  rendah  pada  proses ekstraksi  yaitu  pada  suhu  40ºC  sehingga  kemungkinan  senyawa  asiatikosida  rusak  bisa dihindari.  Pada  sonikasi  juga  menggunakan  gelombang  ultrasonik  yang  akan  menggetarkan serbuk simplisia saat proses ekstraksi yang dapat membantu difusi pelarut kedalam dinding sel tumbuhan (Ashley et al ., 2011).
Sebanyak  3,3  kg  sampel  segar  daun  pegagan  air  dikeringkan,  dihaluskan  dan  diperoleh simplisia  kering  sebanyak  220  gram  dengan  persen  rendemen  6,667%.  Sampel  yang  telah dihaluskan  diambil  sebanyak  10  gram  dan  di  rendam  dengan  pelarut  etanol  sebanyak  50  ml dengan  variasi  waktu  selama  1  jam,  2  jam  dan  3  jamperendaman,  kemudian  masing-masing disonikasi  dengan  variasi  waktu  15  menit  dan  30  menit,  kemudian  filtrat  yang  di  peroleh dipekatkan  dengan  alat rotary  evaporator dan  diperoleh  %  rendemen  ekstrak  etanol  daun pegagan  air pada variasi  waktu  1 jam 15 menit (11,542%), 1 jam 30 menit (15,080%), 2 jam 15 menit (11,793%), 2 jam 30 menit (9,363%), 3 jam 15 menit (10,453%) dan 3 jam 30 menit (15,304%).
Tabel 1. Rata-rata Rendemen Ekstrak Pegagan Air ( Hydrocotyle vulgaris L.) Lama perendama n Waktu sonikasi Ulangan Bobot sampel (g) Bobot ekstrak (g) Rendemen (%) Rerata (%) 1 jam 15 menit 1 10,0040 1,3434 13,428 11,542 2 10,0010 1,0139 10,137 3 10,0015 1,1063 11,061 30 menit 1 10,0051 1,2746 12,739 15,080 2 10,0033 1,6602 16,596 3 10,0028 1,5911 15,906 2 jam 15 menit 1 10,0010 1,1293 11,291 11,793 2 10,0008 1,0485 10,484 3 10,0055 1,3613 13,605 30 menit 1 10,0029 0,8248 8,245 9,369 2 10,0000 0,8919 8,919 3 10,0008 1,0944 10,943 3 jam 15 menit 1 10,0038 1,0181 10,177 10,453 2 10,0044 1,1349 11,344 3 10,0018 0,9839 9,837 30 menit 1 10,0022 1,3036 13,033 15,304 2 10,0039 1,4736 14,730 3 10,0019 1,8154 18,150
Setelah  didapatkan  ekstrak  kental  daun  pegagan  air,  selanjutnya  dilakukan  skrining fitokimia. Skrining fitokimia dilakukan untuk menganalisis kandungan metabolit sekunder dari tumbuhan.  Hasil  yang  diperoleh  pada  ekstrak  daun  pegagan  air  ( Hydrocotyle  vulgaris L.) positif mengandung senyawa flavonoid, fenolik dan terpenoid.
Tabel 2. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Daun Pegagan Air ( Hydrocotyle vulgaris L.) N o Kandungan kimia Pereaksi Hasil Pengamatan 1 Alkaloid Mayer Tidak bereaksi (-) 2 Flavonoid Logam Mg + HCl (p) Bereaksi (+) 3 Fenolik FeCl 3 1% Bereaksi (+) 4 Steroid Lieberman-Bouchard Tidak beraksi (-) 5 Terpenoid Lieberman-Bouchard Bereaksi (+) 6 Saponin Air Tidak bereaksi (-)
Analisis  dilakukan  menggunakan  alat  KCKT  dengan  kolom  C18  fase  terbalik, menggunakan  detektor  UV  dengan  panjang  gelombang  206  nm.  Fase  gerak  yang  digunakan ialah campuran metanol:air dengan perbandingan 70:30 dengan laju alir 1 ml/menit, fase gerak ini  dipilih  karena  terdapat  satu  puncak  yang  dominan  dan  parameter-parameter  yang  telah memenuhi persyaratan. Sedangkan laju alir 1 ml/menit dipilih karena waktu retensi yang lebih cepat sehingga dapat mengefesiensi waktu analisis. Dalam penelitian ini dibuat larutan standar asiatikosida  dengan  konsentrasi  2  ppm, 4 ppm,  6 ppm,  8 ppm,  10  ppm,  12  ppm  dan  14 ppm dan  diperoleh  persamaan  regresi  linear  y  =  11656x  + 142673  dengan  koefisien  korelasi  (r)  = 0,9982.  Dari  data  tersebut  uji  linearitas  memberikan  nilai  hubungan  yang  baik  antara
konsentrasi  dan  respon,  sehingga  kurva  yang  diperoleh  dapat  memenuhi  persyaratan.  Uji  ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan standar dalam mendeteksi analit (Chan, 2004).
Gambar 1. Kurva Kalibrasi Standar Asiatikosida
Tabel 3. Data Hasil Kalibrasi Standar Asiatikosida
Konsentrasi (ppm) Luas Area 2 167617 4 185896 6 215685 8 234619 10 258284 12 283308 14 306063
Analisis  kualitatif  dilakukan  dengan  menggunakan  alat  KCKT.  Tahap  ini  dilakukan untuk  memastikan  ada  atau  tidaknya  senyawa  asiatikosida  yang  terkandung  dalam  ekstrak daun  pegagan  air,  dengan  membandingkan  waktu  retensi  antara  standar  asiatikosida  dengan sampel. Hasil yang diperoleh untuk waktu retensi sampel ialah 4,702, sedangkan waktu retensi untuk  standar  asiatikosida  ditambah  sampel  ialah  4,909.  Selanjutnya  untuk  uji  kuantitatif dilakukan pada masing-masing ekstrak berdasarkan lama perendaman dan waktu  sonikasinya, masing-masing ekstrak ditimbag sebanyak 10 mg dan di larutkan dengan metanol sebanyak 10 ml dan diinjeksikan kedalam sistem KCKT. Diperoleh luas area untuk masing-masing ekstrak, kemudian  luas  area  tersebut  di  rata-ratakan  dan  dihitung  kadar  terukur  dari  hasil  persamaan regresi  linear  yang  diperoleh.  Hasil  yang  diperoleh  melebihi  rentang  luas  area  yang  terdapat pada  persamaan  regresi,  sehingga  dilakukan  pengenceran  untuk  memperkecil  luas  area tersebut. Dilakukan dengan mengencerkan konsentrasi awal yaitu 1000 ppm menjadi 500 ppm, sehingga  didapatkan  hasil  untuk  lama  perendaman  1  jam  dengan  waktu  sonikasi  15  menit adalah  1,5196%  dan  30  menit  1,4621%,  sedangkan  lama  perendaman  2  jam  dengan  waktu sonikasi 15 menit 1,6842% dan 30 menit 1,4839% dan lama perendaman 3 jam dengan waktu sonikasi 15 menit adalah 1,5969% dan 30 menit 1,3868%, seperti yang tertera pada tabel 4.
Tabel 4. Hasil Kadar Asiatikosida Tumbuhan Pegagan Air ( Hydrocotyle vulgaris L.)
Lama perendam an Waktu sonikasi Ulanga n Luas area Kada r teruk ur (µg/ ml) Kadar asiatikosida (%) 1 jam 15 1 241391 153,3 8 1,5196 2 241943 3 212860 Rata- rata 232064
30 1 218956 147,5 66 1,4621 2 225373 3 241697 Rata- rata 228675 2 jam 15 1 253042 169,9 41 1,6842 2 239546 3 232557 Rata- rata 241715 30 1 219969 149,7 54 1,4839 2 250027 3 219856 Rata- rata 229950 3 jam 15 1 217768 161,1 71 1,5969 2 244912 3 247132 Rata- rata 236604 30 1 233933 139,9 91 1,3868 2 224288 3 214561 Rata- rata 224260
Dari  hasil  pengamatan  dilakukan  analisis  ANOVA  satu  arah.  Hasil  suatu  pengujian dikatakan  memberikan  efek  jika  pada  analisis  statistik  yang  digunakan  terdapat  perbedaan yang  signifikan  (p<0,05).  Pengujian  ANOVA  dilakukan  untuk  melihat  ada  atau  tidaknya pengaruh  perendaman  dan  sonikasi  terhadap  kadar  asiatikosida.  Pada  pengaruh  lama perendaman dengan waktu sonikasi terhadap kadar asiatikosida diperoleh nilai F sebesar 0,191 dengan  nilai  p  sebesar  0,829,  karena  nilai  p  0,829  >  0,05  maka  dapat  diartikan  bahwa  tidak terdapat pengaruh  lama perendaman dengan waktu sonikasi terhadap kadar asiatikosida.

## D. Penutup
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan  bahwa  ekstraksi  yang  optimum  adalah pada  2  jam  perendaman  dengan  waktu  sonikasi  selama  15  menit,  didapatkan  kadar  sebesar 0,1699  mg/10  mg  ekstrak  dengan  persentase  sebesar  1,6842%.  Dilakukan  uji  statistik menggunakan  ANOVA  satu  arah  dan  didapatkan  hasil  0,829>0,05,  maka  dapat  diartikan bahwa  tidak  terdapat  pengaruh  secara  signifikan  pada  lama  perendaman  sebelum  sonikasi terhadap kadar asiatikosida.

## Daftar Pustaka
Alupului,  A.,  Calinescu,  I.,  Lavric,  V.,  2009, Ultrasonics  vs  Microwave  Extraction Intensification of Active Principles from Medicinal Plants . AIDIC Conference Series 09, 1-8 DOI: 103303/ ACOS0909001.
Arhas,  R.,  2017,  Uji  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Etanol  Daun,  Batang,  dan  Akar  Herbal Pegagan Air ( Hydrocotyl vulgaris L . ) , Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau, Pekanbaru Arredha, M, P., 2016, Penentuan Kadar Asiatikosida Herba Pegagan Air( Hydrocotyle vulgaris L . )Asal Riau Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), Skripsi , Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau, Pekanbaru.
Ashley,  K.,  Andrews,  R.N.,  Cavazosa,  L.,  &  Demange,  M.,  2001,Ultrasonic  xtraction  as  a sample preparation technique for elemental analysis by atomic spectrometry, Journal of Analytical Atomic Spectrometry 16:1147-1153.
Chan, C.C., Lee Y.C., Zhang, X.M, Lam, H., 2004,Analytical Method ValidationandI
nstrument Performance Verification., WileyInterscience  A.,  John  Wiley  andSons,  Inc., Publication.
Djamal,  R.,  1998, Prinsip-Prinsip  Dasar  Isolasi  dan  Identifikasi ,  Universitas  baiturrahmah, Padang.
Endah L., M. M. Herminati, Y. Hety  I., 2003, Pegagan Meningkatkan Daya Ingat, Membuat Awet Muda, Menurunkan Gejala Stress, Meningkatkan Stamina , Jakarta: Penebar Swya. Febriyanti,  A.  P.,  Iswarin,  S.  J.,  dan  Digjayanti,  T.,  2016,  Perbandingan  Kadar  Asiatikosida Dalam  Ekstrak  Etanol  70%  Pegagan  ( Centella  asiatica (L)Urban)  Dengan  Metode Ekstraksi Maserasi Dan Sonikasi Secara LC-MS, JF FIK UINAM , 4 (2) : 54-57. Handa, S.W., Khanuja, S.P.S., Longo, G., Rakesh, D.D., 2008, ExtractionTechnologies for
Medicinaland Aromatic Plants , Trieste : InternationalCentre  For  Science  and  High Technology.
Kim,  W.J.,  Kim,  J.D.,  Veriansyah,  B.,  Kim,  J.,  Oh,  S.G.,  Tjandrawinata,  R.R.,  2004, Extraction  of  Asiaticoside  from Centella  asiatica :  Effects  of  Solvents  and  Extraction Methods, Korea : Institute of Science and Technology , Supercritical Fluid Lab.
Kim,  W.J.,  Kim,  J.,  Veriansyah,  B.,  Kim,  J.D.,  Lee,  Y.W.,  Oh,  S.G.,  Tjandrawinata,  R.R.,
2009,  Extraction  of  Bioactive  Components  from Centella  asiatica Using  Subcritical Water, Journal of supercritical Fluid .48: 211-216.
Kwon,  H.J.,  Park,  J.H.,  Kim,  G.T.,  Park,  Y.D.,  2011,  Determination  of  Madecassoside  and Asiaticoside  Content  of  C. asiatica Leaf  and  C. Asiatica -Containing  Ointment  and Dentifrice by HPLC-Couple  Pulsed Amperometric Detection, Microchemical Journal . Pramono,  S.,  1992.,  Profil  Kromatogram  Ekstrak  Herba  Pegagan  yang  Berefek  Anti Hipertensi, Warta Tumbuhan Obat Indonesia I (2) : 37-39.
Sondari,  D.,  2016,  Studi  Awal  Pengaruh  Metode  Ekstraksi  Terhadap  Rendemen  dan  Kadar Asiatikosida dari Centella Asiatica (L) URB, Jurnal Sains Materi Indonesia , 17 , Widowati,  L.,  Pudjiastuti,  P.,  Indrari,  D.,  Sundari,  D.,  1992,  Beberapa  Informasi  Khasiat Keamanan  dan  Fitokimia  Tanaman  Pegagan  ( Centella  asiatica (L.)  Urban), Warta Tumbuhan Obat Indonesia , I (2) : 39-42.