## Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Annona muricata Linn. terhadap Peningkatan Jumlah B220 pada Mus musculus
Dewi Parlinaningrum *) , Sri Widyarti **) , Muhaimin Rifa’i **)
*) Mahasiswa S1 Biologi
**) Laboratorium Struktur dan perkembangan Hewan, Program Studi S1 Biologi, Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang
Korespondensi: Sri Widyarti swid@ub.ac.id

## ABSTRAK
Imunomodulator  merupakan  bahan  yang  dapat  mengembalikan  ketidakseimbangan  sistem imun.  Daun  sirsak  (Annona  muricata)  mempunyai  senyawa-senyawa  aktif  yang  berperan  sebagai  agen imunomodulator,  salah  satunya  flavonoid.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mengetahui  pengaruh  ekstrak etanol  daun  sirsak  terhadap  peningkatan  jumlah  sel  B220  pada  mencit .  Daun  sirsak  diekstrak menggunakan metode maserasi dan mesin rotatori evaporator. Selanjutnya ekstrak daun sirsak diberikan pada  4  kelompok  mencit  secara  oral  dengan  dosis  0,  25,  50,  dan  100  mg/kg  BB  setiap  hari  selama  2 minggu.  Setelah  perlakuan,  dilakukan  dislokasi  pada  mencit,  kemudian  sel-sel  limfositnya  diisolasi  dari bone  marrow  dan  dilakukan  perhitungan  jumlah  sel  dengan  flowcytometry  dan  haemocytometer.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  pemberian  ekstrak  etanol  daun  sirsak  (A.  muricata)  menunjukkan pengaruh signifikan terhadap peningkatan jumlah sel B220 sebesar 123 % dari 32.56 x 10 6 menjadi 72.7 x 10 6 pada dosis 50 mg/kg BB.
Kata kunci: ekstrak etanol, daun sirsak, sel B220

## ABSTRACT
Imunomodulator is  material that can restore the immune system  imbalances. Leaves of soursop leaves  (Annona  muricata)  has  active  compounds  that  act  as  immonomodulatory  agents,  such  as flavonoids.  The  purpose  of  this    research  was  to  determine  the  influence  of  ethanol  extract  of  soursop leaves  against  an  increasing  number  of  B220  cells.  Soursop  leaves  extraction  using  maceration  methods and machine rotatori evaporator. These extract was given to 4 groups of mice orally a dose of  0, 25, 50, and  100  mg/kg/BW  each  day  for  2  weeks.  After  treatment,  mice  was  sacrified,  lymphocytes  cells  of  the organ bone marrow was isolated and performed the calculations the number of cells with flowcytometry and haemocytometer. The results showed that administering ethanol extracts of leaves of the soursop (A. muricata) show the real impact of the increasing number of B220 cells as much 123 % (from 32.56 x 10 6 cells become 72.7 x 10 6 ).
Keywords: extract ethanol, A. muricata, B220 cells

## PENDAHULUAN
Imunomodulator merupakan suatu senyawa yang dapat meningkatkan mekanisme pertahanan  tubuh  baik  secara  spesifik  maupun non spesifik. Pertahanan non spesifik terhadap antigen  ini  disebut  paraimunitas  dan  zat bersangkutan disebut penginduksi paraimunitas.  Induktor  semacam  ini  biasanya tidak  atau  sedikit  sekali  kerja  antigennya, bahkan sebagian bekerja sebagai mitogen yaitu menaikkan  proliferasi  sel  yang  berperan  pada imunitas.  Sel  target  dari  imunomodulator adalah makrofag, granulosit, limfosit T dan B, karena  induktor  paraimunitas  ini  terutama menstimulasi  mekanisme  pertahanan  seluler. [1].
Daun  sirsak  (A.  muricata)  mempunyai kandungan  senyawa  antara  lain  alkaloid, flavonoid,  saponin,  steroid/triterpenoid  dan asetogenin.  Penelitian  membuktikan  bahwa secara  laboratoris  senyawa  flavonoid  dapat meningkatkan produksi IL-2 dan meningkatkan  proliferasi  dan  diferensiasi limfosit sel T, sel B dan sel NK [2].
Penelitian  ini  menggunakan  B220  yang hanya diekspresikan pada sel B dan subset dari sel-sel  bone  marrow  yang  termasuk  precursor sel  B.  Antigen  B220  merupakan  satu  bentuk dari  bentuk  molekuler  CD45[3].  Antigen mencit  CD45R  (B220)  mengekspresikan limfosit  B  yang  seluruhnya  berkembang  dari fase  pertama  pro-B  dan  sampai  down- regulated  akhir  diferensiasi  sel  plasma.
Terlepas  dari  sel  B,  CD45R  mengekspresikan subset kecil sel denritik[4].
Hasil  dari  penelitian  ini  diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat  terkait  manfaat  kandungan  daun sirsak  dalam  memberikan  pengaruh  terhadap sistem  imun,  dan  memberikan  informasi kepada  masyarakat  terkait  dosis  daun  sirsak yang  tepat  jika  digunakan  sebagai  obat sehingga  dapat  dijadikan  acuan  penelitian selanjutnya

## METODE PENELITIAN
Tempat penelitian. Penelitian ini dilakukan di laboratorium  Struktur  dan  Perkembangan Hewan  dan  Laboratorium  Biologi  Molekuler dan Seluler Jurusan Biologi, Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Universitas Brawijaya, Malang.
Hewan  coba.  Penelitian  ini  menggunakan mencit  (Mus  musculus)  galur  SWISS,  betina, umur 8 minggu dalam keadaan sehat (bergerak aktif,  bulu  tidak  rontok),  tidak  ada  kelainan anatomis.  Hewan  coba  aklimatisasi  selama  1 minggu.
Ekstraksi  daun  sirsak.  Sirsak  diperoleh  dari perumahan  Bantaran  Kota  Malang,  Jawa Timur.  Daun  sirsak  diekstraksi  menggunakan metode  maserasi  dalam  etanol  95%  sebagai berikut. Daun sirsak dihaluskan dimasukkan ke dalam  beker  glass  dengan  etanol  95% perbandingan  (1:3).  Direndam  dan  didiamkan pada  suhu  kamar  selama  3  x  24  jam  dengan sesekali diaduk. Disaring dengan kertas saring Whatman  No.  40  dan  pelarut  yang  diperoleh (yang mengandung bahan aktif) dievaporasi/diuapkan dengan rotatori evaporator  pada  suhu  50-60 0 C.  Sisa  pelarut yang masih tersisa dioven hingga bahan benar- benar  tidak  mengandung  pelarut.  Ekstrak ethanol  yang  didapatkan  dilarutkan  dengan NaCMC 0.5 %.
Perlakuan. Mencit dibagi menjadi 4 kelompok  perlakuan:  kelompok  I  (25  mg/kg BB), kelompok II (50 mg/kg BB, kelompok III (100  mg/kg  BB  dan  kelompok  kontrol (NaCMC  0.5  %).  Sediaan  ekstrak  diberikan secara oral setiap hari selama 14 hari.
Isolasi  limfosit.    Bone  marrow  diambil  dari kaki  bagian  depan  dan  kaki  bagian  belakang, kemudian  dicuci  dalam  PBS  steril  dan dibersihkan  dari  kulit,  daging  dan  lemak  yang menempel.  Isolasi  limfosit  bone  marrow
dilakukan  dengan  metode  aspirasi.  Suspensi sel  ditambahkan  PBS  steril  hingga  5  ml, kemudian  disentrifugasi  pada  kecepatan  2500 rpm  selama  5  menit  pada  4 o C.  Pellet  yang diperoleh  disuspensikan  dengan  1  ml  PBS, diambil  200  µL  kembali  dimasukkan  dalam microtube  yang  sudah  berisi  1  ml  PBS, disentrifugasi  kecepatan  2500  rpm  selama  5 menit 4 0 C.
Penghitungan  sel.  Pellet  diresuspensikan dengan  1  ml  PBS  steril.  Homogenat  sebanyak 100µl diambil dan dimasukkan dalam microtube  baru.  Disentrifugasi  kembali  pada kecepatan  2500  rpm  4 O C  selama  5  menit, kemudian supernatan dibuang. Pellet kemudian diinkubasi dengan antibodi anti B220 + antimouse.  Selanjutnya  dimasukkan  dalam kuvet  flowcytometer  dan  ditambahkan  400µl PBS  steril.  Kuvet  dipasang  pada  nozzle  BD FACS Calibur TM flow cytometer.Jumlah absolut sel diperoleh melalui hasil perhitungan flowcytometry dan hasil perhitungan haemocytometry (1).  R1 nilai persentasi gated kecil  (flow  cytometry),  R2  nilai  persentase gated  besar  (flow  cytometry), ∑ sel  organ limfoid  perhitungan  sel  pada  organ  limfoid menggunakan haemocytometer
∑ Absolut Sel = (R1/R2 x 100%) x ( ∑ sel organ limfoid) x (%R1)

## Analisis  data.  Penelitian  ini  menggunakan
Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan  uji ANOVA selang kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Perhitungan  jumlah  relatif  sel  B220 dengan  flowcytometer  menunjukkan  terjadi penurunan  pada  mencit  dengan  perlakuan  25 dan  100  mg/kg  BB.  Namun  pada  perlakuan dosis  50  mg/kg  BB,  jumlah  sel  B220 mengalami kenaikan (Gambar 1).
Jumlah  relatif.  Sel  B220 + pada  mencit kontrol  sebesar  52.345%,  pada  mencit  yang diberikan  perlakuan  dosis  25  mg/kg  BB cenderung  terjadi  penurunan  jumlah  relatif  sel B220  sebesar  9.3  %  namun  tidak  signifikan (p>0.05)  yakni  menjadi  43.03  %.  Penurunan jumlah  relatif  sel  B220 juga  terjadi  pada perlakuan dosis 100 mg/kg BB sebesar 13.6 % secara signifikan (p<0.05) menjadi 38.7 %. Hal berbeda terjadi pada perlakuan dosis 50 mg/kg BB  yang  cenderung  mengalami  kenaikan jumlah  relatif  sel  B220 + sebesar  4.7  %  namun tidak signifikan (p>0.05) menjadi 57.04 %.
B220  hanya  diekspresikan  pada  sel  B dan  subset  dari  sel-sel  bone  marrow  yang termasuk  precursor  sel  B.  Antigen  B220 merupakan  satu  bentuk  dari  bentuk  molekuler CD45[3].  Antigen  mencit  CD45R  (B220) mengekspresikan  limfosit  B  yang  seluruhnya berkembang  dari  fase  pertama  pro-B  dan sampai  down-regulated  akhir  diferensiasi  sel plasma. Terlepas dari sel B, CD45R mengekspresikan subset kecil sel dendritik[4].
Gambar  1.  Persentase  Jumlah  Relatif  Sel  B220 + hasil  analisa  Flowcytometry  Pada masing-masing perlakuan (K= Kontrol, P=perlakuan)
Penelitian  lain  membuktikan  bahwa secara  laboratoris  senyawa  flavonoid  dapat meningkatkan produksi IL-2 dan meningkatkan  proliferasi  limfosit.  Proliferasi limfosit  T  yang  dirangsang  oleh  antigen, terutama  diatur  oleh  pengaruh  IL-2  terhadap reseptor  IL-2  yang  dimiliki  pada  permukaan selnya.  Selain  itu,  IL-2  juga  merangsang proliferasi  dan  diferensiasi  sel  B  dan  NK[2]. Penambahan bahan yang bersifat inunostimulator  dapat  meningkatkan  respon pada  limfosit  dan  merangsang  pembelahan  sel sehingga  terjadi  proliferasi  [1].  Flavonoid memiliki efek imunostimulan dengan memacu produksi  IL-2  yang  meningkatkan  proliferasi [5].
B220  atau  CD45R  adalah  antigen  yang diekspresikan  oleh  sel  B,  subset  sel  T  (sel naive)  dan  monosit  yang  berfungsi  sebagai isoform  pada  CD45  yang  mengandung  ekson A.  Pada  mencit,  seluruh  sel  yang  pada  jalur perkembangan  sel  B  akan  mengekspresikan molekul  permukaan  CD45R,  baik  pada  sel progenitor,  sel  pro-B  pada  sumsum  tulang
belakang  hingga  sel  B  mature  pada  sirkulasi perifer dan sel B teraktivasi [6].
Flavonoid  dapat  meningkatkan  aktivitas IL-2  dan  proliferasi  limfosit.  Proliferasi limfosit akan mempengaruhi sel CD4, kemudian  sel  Th1  teraktivasi.  Flavonoid  juga dimungkinkan  dapat  memicu  proliferasi  dan diferensiasi  sel  T  dan  sel  B  yang  diduga melalui  produksi  sitokin  IL-2,  IL-4,  dan  IL- 1[7].  Flavonoid  jenis  flavonol  dapat  menjadi imunostimulan yang dapat memacu peningkatan IL-2.[8]. Ekstrak daun sirsak mampu memberikan pengaruh juga terhadap jumlah sel T CD4 dan sel  T  CD8,  tidak  jauh  berbeda  pada  pengaruh ekstrak  daun  sirsak  terhadap  sel  B220  yakni ada yang mampu meningkatkan jumlah sel dan mampu  menurunkan  jumlah  sel  tersebut  jika dibandingkan dengan kontrol, Hal ini menunjukkan  bahwa  ekstrak  daun  sirsak mampu  mempengaruhi  produksi  sel  limfosit, baik sel T maupun sel B[10].
Senyawa  flavonol  glikosida  adalah glikoprotein dari tumbuhan yang dapat bersifat sebagai  mitogen  yang  mampu  menginduksi mitosis pada sel-sel timus sehingga meningkatkan transkripsi (IFN- γ ) dan (TGF- β ) sehingga  terjadi  peningkatan  sitokin-sitokin dan  IL-2  dapat  dirangsang  dengan  adanya faktor  costimulator  atau  mitogen.  Sel  yang terpapar mitogen akan menstimulasi transkripsi mRNA IL-2 dalam waktu 4 jam dan maksimal  12 jam,  kemudian  pembentukan  IL- 2 dimulai dan sel berproliferasi [9].

## KESIMPULAN
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak  etanol  daun  sirsak  dosis  25,  50,  dan 100  mg/kg  BB  belum  menunjukkan  adanya peningkatan jumlah sel B220 secara efektif.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Widianto,  M.  2011.  Imunomodulator. www.scribd.com /doc/92831441/ft- immunomodulator .  Diakses  tanggal  15 Juni, 2012.
[2]    Saifulhaq,  M.  2009.  Pengaruh  pemberian Ekstrak  Buah  Mahkota  Dewa  Dosis Bertingkat  Terhadap  Proliferasi  Limfosit Lien  pada  Mencit  BALB/C.  Biomedika 1.2.33
[3]  Cell  Science.  2012.  B220. http://www. copewithcytokines.de/. Diakses tanggal 27
Juni, 2012.
[4] Biotec, M. 2012. CD45R (B220)
Antibodies Mouse. wwwmilterylbiotec. com. Diakses tanggal 20 Juni, 2012 [5]  Middleton,  E.,  Kandaswami  C.,  dan
Theoharides  T.C.  2000.  The  Effect  of
Plant  Flavonoids  on  Mammalian  Cells: Implications for Inflamation, Heart
Disease  and  Cancer.  Pharmacological Reviews, 52 (4):673-751
[6]   Abbas A.K. 2005. Immunity to tumours In
Celluler  and  Moleculer  Immunology.  WB Saunders Co. ed. 5 th edition. Philadelphia.
[7]  Azizah,  N.F.  2011.  Efek  Pemberian Tappak  Liman  terhadap  Hematopoeisis Mencit model Anemia. Thesis. Universitas Brawijaya. Malang.
[8]  Lyu,  S.Y.  dan  Park,  W.B.  2005. Production  of  Cytokine  and  NO  by  RAW 264.7  Macropaghes  and  PBMC  in  vitro incubation  with  flavonoids.  Arch.  Pharm. Res. 28: 573-581
[9]  Peters,  B.,  Schneider-Stock  R,  Boltze  C, Jäger  V,  Epplen  J,    Landt  O,  Rys  J,  dan Roessner  A.  2003.  Elevated  telomerase activity,  c-MYC-,  and  hTERT  mRNA expression:  association  with  tumour progression  in  malignant  lipomatous tumours. J Pathol, 199:517-525.
[10]  Dewi.  L.K.  2013.  Pengaruh  Pemberian Ekstrak  Etanol  Daun  Sirsak  (Annona muricata  Linn.)  terhadap  Peningkatan Jumlah  Sel  T  CD4  dan  CD8  pada  Mencit
(Mus musculus). Biotropica. Vol 1. No.1.