Penetapan Kadar Asiatikosida Ekstrak Etanol 70 % Pegagan ( Centella asiatica ) menggunakan Metode LC–MS
Zulkarnaen * , Alifia Putri F**, Oktavia Eka P***

## ABSTRAK
Asiatikosida  merupakan  komponen  utama  dalam    tanaman  pegagan (Centella  asiatica) yang mempunyai  khasiat  obat  terutama  sebagai  antiinflamasi  yaitu wound  healing .  Pembuatan  obat  herbal pegagan diperlukan penetapan kadar. Proses penetapan kadar harus dilakukan standarisasi untuk menjamin keseragaman  kandungan  zat  aktif  sehingga  keamanan,  khasiat,  dan  mutu  obat  herbal  dapat  terjamin. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  kadar  asiatikosida  pada  ekstrak  etanol  70  %  pegagan  dengan menggunakan  metode liquid  chromatography–mass  spectra (LC-MS  ).  Pembuatan  ekstrak  pegagan menggunakan metode maserasi dengan pelarut  etanol 70 %. Uji kualitatif asiatikosida ekstrak etanol 70 % pegagan  menggunakan  kromatografi  lapis  tipis  (KLT).    Kemudian  penetapan  kadar  asiatikosida menggunakan metode LC-MS  termasuk validasi metode yaitu: linearitas, akurasi, presisi, selektivitas, LOD, dan LOQ. Penelitian ini menunjukkan Rf asiatikosida ekstrak pegagan pada uji KLT sebesar 0,2750. Kadar asiatikosida  dengan  metode  LC-MS  sebesar  0,232  %.  Semua  parameter  validasi  dalam  penetapan  kadar asiatikosida,  linearitas  mempunyai  nilai  korelasi  hubungan  (r)  0,999  dengan  LOD  65,6361  ppb  dan  LOQ 218,7869 ppb. Akurasi (% recovery) 99,2867–105,5843 %, dan presisi (% koefisien variasi) 0,0613 – 0,2245 %.
Kata kunci: Asiatikosida, Centella asiatica, LC-MS, Pegagan .
Determination of Levels asiatikosida 70 % Ethanol Extract of Gotu Kola ( Centella asiatica ) using LC–MS

## ABSTRACT
Asiaticoside is a major component in gotu kola ( Centella asiatica) , having mainly therapeutic action as a wound  healing.  Making  gotu  kola  for  herbal  medicine  required  standardization  process  to  ensure  the uniformity of active substances, thus the safety, efficacy, and quality can be maintain. This reseach aimed to determine  the  levels  of  asiaticoside  in  70  %  ethanol  extract  of  gotu  kola  by  using  liquid  chromatography– mass spectra (LC-MS ). Gotu kola was extracted by maceration process using 70 % ethanol. Next, qualitative test  on asiaticoside of gotu kola extract was performed using thin layer chromatography (TLC). Then, the level of asiaticoside in gotu kola extract was assayed using LC-MS including validation methods there are linearity,  accuracy,  precision,  selectivity,  LOD,  and  LOQ.  The  results  of  this  study  showed  Rf  value  of asiaticoside on TLC test was 0.2875. Asiaticoside levels with LC-MS  method was 0,232 %. As well as the parameters of the assay validation in asiaticoside, the linearity of the relationship has a correlation value (r) with  LOD  0.999  ppb  and  LOQ  65.6361  218.7869  ppb.  Accuracy  (%  recovery)  99.2867  -  105.5843%,  and precision (% coefficient of variation) 0.0613 - 0.2245%.
Keywords: Asiaticoside, Centella asiatica , LC-MS, Gotu kola.
* Program Studi Farmasi, FKUB
** Laboratorium Farmakognosi dan Fitoterapi, FKUB
***  Laboratorium Farmasetika, FKUB

## PENDAHULUAN
Herbal  telah  banyak  dikembangkan sebagai  pengobatan  di  negara  berkembang termasuk  indonesia.  Menurut  World  Health Organization  (WHO),  80  %  masyarakat    di dunia  masih  menggunakan  herbal  dan pengobatan  tradisional.  Di  Indonesia pemanfaatan  tanaman  sebagai  obat  sudah mulai  berkembang  pesat  seiring  dengan pemikiran back  to  nature.  S alah  satu tanaman  yang  sering  dijadikan  obat  adalah pegagan. 1
Pegagan ( Centella asiatica )  merupakan tanaman  yang  banyak  ditemukan  di Indonesia.  Secara  turun  temurun  herba pegagan berkhasiat sebagai obat penyembuh  luka,  radang,  reumatik,  asma, wasir,  tuberkulosis,  lepra,  disentri,  demam, dan  penambah  darah.  Fungsi  lain  dari pegagan adalah sebagai obat penenang dan antidepresan. 2 Di  Indonesia,  pegagan banyak  terdapat  di  beberapa  tempat,  yaitu Cibodas,  Cianjur,  Banjaran,  Cicurung,  Bali, Bengkulu,  Manoko,  Ciwidey,  Sumedang, Majalengka,  Gunung  Putri,  Ungaran, Smukren,  Boyolali,  Karang  anyar,  Cilember, dan lain-lain. 3
Asiatikosida  merupakan  komponen utama  dari  pegagan  yang  termasuk golongan  saponin  triterpen.  Studi  ilmiah menunjukkan  bahwa  asiatikosida  berfungsi sebagai  neuroprotektif  untuk  terapi  penyakit Parkinson  yaitu  melawan  neurotoksisitas yang  diinduksi  oleh  1-methyl-4-phenyl- 1,2,3,6-tetrahydropyridine  (MPTP). 4 Bagian pegagan  yang  mengandung  asiatikosida terdapat  pada  daun  (82,6  %),  batang  (15,9
%),  dan  akar  (1,5  %),  sehingga  digunakan sebagai herba. 5
Untuk  mendapatkan  senyawa  kimia yang  diinginkan  dalam  suatu  tanaman diperlukan  proses  ekstraksi. 6 Ekstraksi adalah  proses  untuk  memisahkan  bagian senyawa  aktif  tanaman  yang  berfungsi
sebagai  obat  menggunakan  pelarut  selektif melalui  prosedur  tertentu.  Proses  ekstraksi yang  umum  dilakukan  adalah  maserasi, perkolasi, infusa, digesti, dekoksi, refluk, dan soxhlet.  Dari  berbagai  ekstraksi  tersebut, dipilih  maserasi  karena  lebih  mudah  dan dapat  menjaga  kandungan  senyawa tanaman  yang  tidak  tahan  panas. 6 Dalam pembuatan  obat  herbal  sangat  diperlukan proses  standardisasi.  Salah  satunya  adalah proses penentuan kadar zat aktif. Proses ini dilakukan  untuk  menjamin  keseragaman kandungan  zat  aktif  sehingga  keamanan, khasiat,  dan  mutu  obat  herbal  dapat terjamin. 7 Proses analisis kadar asiatikosida ekstrak pegagan menggunakan metode LC- MS. 8 Parameter  validasi  yang  diuji  yaitu akurasi,  presisi,  selektifitas,  linearitas,  limit deteksi, dan limit kuantitasi. 9

## BAHAN DAN METODE

## Ekstraksi Pegagan
Sebanyak  400  g  pegagan  (diperoleh dari  Balai  Materia  Medica,  Batu)  direndam dalam etanol 70 % teknis 2 liter (1:5). Setiap kali  perendaman  selama  24  jam  disertai pengadukan dengan overhead stirrer selama 30  menit  dengan  kecepatan  500  rpm. Perendaman  dilakukan  sebanyak  lima  kali. Penguapan  pelarut  menggunakan  rotavapor dan vacuum drying pada suhu 40 0 C. Identifikasi  Senyawa  Asiatikosida  dalam Ekstrak Pegagan Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Larutan  standar  asiatikosida  1  mg/1  ml metanol  dan  ekstrak  pegagan  30  mg/3  ml metanol ditotolkan ke plat silika gel sebanyak 0,5  µl,  kemudian  dieluasi  menggunakan eluen kloroform:asam asetat glacial:metanol:air  (60:32:12:8).  Setelah tereluasi  sampai  tanda  batas  jarak  tempuh eluen  disemprot  dengan  anisaldehida  asam sulfat dan dipanaskan pada hot plate 100 0 C selama  10  menit.  Kemudian  noda  dilihat secara visual dan dengan UV 365 nm.

## Validasi  Metode    dan  Penetapan  Kadar
Asiatikosida
Kondisi operasi yang dilakukan sebagai berikut: autosampler (merk  = thermo scientific , type  =  accela ,  suhu  =  10 o C, volume  injeksi  2  l),  UPHLC  dengan gradient  (merk  = thermo  scientific,  type  = accela , fase gerak = air + 0,1 asam format, asetonitril  +  asam  format),  kolom  = hypersil gold (50  x  2,1  x  1,9  µM)),  MSMS  (merk  = TSQ quantum acces max (triple quadrupole).
1. Linearitas
400 ppb, 600 ppb, 800 ppb, 1000 ppb, 2000 ppb,  dan  4000  ppb  larutan  standar asiatikosida  diambil  dari  100  ppm  larutan baku  induk  asiatikosida.  Kemudian  diukur kromatogramnya  untuk  mendapatkan  nilai koefisien korelasi.
2. LOD dan LOQ Dihitung  berdasarkan  kurva  linearitas dengan  rumus  LOD  =  3  (Sy/x)/b,  LOQ  =  3 (Sy/x)/b. 3. Selektifitas 1000 ppb, 750 ppb, 500 ppb larutan standar asiatikosida diukur dengan pengulangan tiga kali, kemudian dilihat kemampuan memisahkan dan retention time.
4. Akurasi
1000 ppb, 750 ppb, 500 ppb larutan standar asiatikosida diukur dengan pengulangan tiga
kali, kemudian dihitung % recovery.
5. Presisi
1000 ppb, 750 ppb, 500 ppb larutan standar asiatikosida diukur dengan pengulangan tiga kali, kemudian dihitung % Koefisien Variasi.
6. Penetapan Kadar
50 mg ekstrak kental dalam 5 ml metanol pro HPLC,  diambil  sebanyak  200  µl  dan dilarutkan  dengan  metanol  1  ml,  difilter dengan syringe filter 0,2 µl PTFE, kemudian diinjeksikan  20  µl.  Diulangi  sebanyak  tiga kali.

## HASIL
Maserasi  400  g  serbuk  simplisia  herba pegagan  dengan  pelarut  2  liter  (1:5)  dalam lima  kali  proses  peremdaman  didapatkan meserat sebanyak 6720 ml dan total ekstrak kental  yang  didapatkan  sebesar  81,5525  g dengan  prosentase  rendemen  20,39  %.  Uji KLT  menunjukkan  bahwa  noda  senyawa asiatikosida  ekstrak  terdapat  pada  Rf  = 0,2750  dan  standar  asiatikosida  terletak pada  Rf  =  0,2875,  menurut Wagner  (1996), noda  senyawa  asiatikosida  terletak  pada rentang 0,2–0,35. Hasil tersebut menunjukkan  senyawa  asiatikosida  secara kualitatif  terdapat  pada  ekstrak  etanol 70 % pegagan  sehingga  bisa  dilakukan  uji kuantitatif.  Hasil  uji  KLT  dapa  dilihat  pada Gambar 1.
Gambar 1. Hasil uji KLT senyawa asiatikosida ekstrak pegagan
Untuk  menetapkan  kadar  asiatikosida diperlukan  proses  validasi  metode  untuk menjamin keseragaman kandungan zat aktif sehingga keamanan, khasiat, dan mutu obat herbal  dapat  terjamin.  Pada  uji  linearitas didapatkan  persamaan  regresi  linier    Y  = 123.6x - 343.7 dengan koefisien korelasi (r)
=  0,999.  Syarat  minimum  untuk  linearitas adalah 0,996, sehingga data yang diperoleh sudah linier. Kurva linearitas dari persamaan garis tersebut terdapat pada Gambar 2.
Gambar 2. Kurva linearitas larutan standar asiatikosida
Uji  batas  deteksi  dan  batas  kuantitasi dilakukan  untuk  mengetahui  batas  deteksi dan  kuantitasi  terendah  dari  sampel  yang masih  dapat  menghasilkan  data  dengan akurasi dan presisi yang baik. Batas deteksi yang  diperoleh  dari  hasil  pengujian sebesar
65,6361  ppb  dan  batas  kuantitasi  218,7869 ppb.  Data  mengenai  uji  batas  deteksi  dan batas kuantitasi dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil uji batas deteksi dan batas kuantitasi
Uji selektifitas dilakukan untuk mengetahui  spesifisitas  dari  metode  yang digunakan  dalam  menganalisis  senyawa asiatikosida  ekstrak  egagan.  Uji  selektifitas pada  metode  ini  sudah  terwakili  oleh detektor  yang  digunakan  dan  kemampuan
dalam  mendeteksi  senyawa  asiatikosida pada retention time yang hampir sama yaitu 3,37–3,38 serta pemisahan asiatikosida dari pengotor.  Data  mengenai  uji  selektifitas dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Kromatogram asiatikosida ekstrak pegagan
Syarat  uji  akurasi  pada  penelitian  ini adalah  nilai  %  perolehan  kembali  atau % recovery =  80–110  %.  Hasil  penelitian menunjukkan %  recovery sampel  2  adalah 105,584 %, sampel 3 adalah 99,287 %, dan sampel 4 adalah 100,703 %. Hasil uji akurasi dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Hasil rata-rata uji akurasi Syarat  hasil  uji  presisi  adalah prosentase  simpangan  baku  relatif  atau koefisien  variasi  (KV)  dengan  nilai  sama dengan  atau  kurang  dari  2,0  %.  hasil  uji presisi  dapat  dilihat  pada  Tabel  3.  Kadar asiatikosida  ekstrak  pegagan  dalam
penelitian  ini  sebesar  0,232  %.  Hasil
perhitungan kadar ditampilkan pada Tabel 4.
Tabel 3. Hasil rata-rata uji presisi
Tabel 4. Hasil perhitungan kadar asiatikosida
PEMBAHASAN Penetapan  kadar  asiatikosida  pada ekstrak pegagan dilakukan untuk mendapatkan  kadar  asiatikosida  yang  akan dijadikan  dasar  penetapan  dosis  ekstrak pegagan dengan tujuan terapi wound healing karena  asiatikosida  merupakan  kompenen utama  yang  mempunyai  aktivitas  anti inflamasi.  Dalam  proses  penetapan  kadar perlu dilakukan standarisasi untuk menjamin keseragaman  kandungan  zat  aktif  sehingga keamanan,  khasiat,  dan  mutu  obat  herbal dapat terjamin. Uji kualitatif diperlukan untuk penetapan kadar, identifikasi dan memastikan  adanya  senyawa  asiatikosida pada ekstrak pegagan. Menurut Septyaningsih  (2010),  uji  kualitatif  yang dapat dilakukan adalah pemilahan  fitokimia dengan uji busa saponin pada tabung dan uji
KLT.  Uji  KLT  lebih  dipilih  karena  uji  tabung hanya  dapat  mengidentifikasi  golongan senyawa,  sedangkan  uji  KLT  dapat mengidentifikasi  senyawa  marker  yang diinginkan.
10 Standarisasi  dalam  proses
penetapan  kadar  yaitu  melakukan  validasi metode  untuk  mendapat  metode  yang terbaik  dalam  analisis  kadar  asiatikosida dalam  ekstrak  pegagan.  Parameter  yang dilihat  adalah  linearitas,  akurasi,  presisi, selektifitas,  LOD,  dan  LOQ.  Penetapan kadar  asiatikosida  dilakukan  dengan instrument  LC–MS    karena    dapat mendeteksi  senyawa  lebih  spesifik  yakni berdasarkan  berat  molekul  suatu  senyawa serta waktu analisis yang cukup singkat. 8 Hal yang  pertama  kali  dilakukan  adalah pembuatan  ekstrak  pegagan  dengan menggunakan  metode  maserasi.  Maserasi bertujuan  untuk  memisahkan  senyawa  aktif tanaman yang berfungsi obat serta menjaga kandungan  senyawa  yang  tidak  tahan panas. 6 Pada  proses  ini  digunakan  pelarut etanol 70 % karena bersifat polar yang dapat menarik senyawa organik, tidak toksik, serta titik  didih  cukup  rendah  79 o C  sehingga mudah untuk dihilangkan ketika larut dengan senyawa  organik. 11 Maserasi  dilakukan selama  24  jam  (diulang  empat  kali)  dan dilakukan pengadukan menggunakan
overhead  stirrer untuk  medapatkan  maserat yang  optimal.  Campuran  disaring  untuk memisahkan  filtrat  dan  ampas,  kemudian dirotavapor  untuk  menghilangkan  pelarut serta  dilakukan vacuum  drying untuk menghilangkan  kandungan  air  dalam ekstrak. 6 Hasil  yang  didapatkan  dari  proses maserasi  400  g  serbuk  simplisia  herba pegagan  dengan  pelarut  2  liter  (1:5)  dalam lima  kali  proses  peremdaman  didapatkan meserat sebanyak 6720 ml dan total ekstrak kental  yang  didapatkan  sebesar  81,5525  g dengan persen rendemen 20,39 %. Hasil ini sejalan  dengan  penelitian  Harwoko  (2014), yaitu  hasil  ekstraksi  ekstrak  etanol  70  % pegagan  sebesar  20,66  %.  Uji  kualitatif senyawa  asiatikosida  ekstrak  etanol  70% pegagan  dilakukan  dengan  uji  KLT    karena dapat  mengidentifikasi  dan  memastikan senyawa marker (bukan golongan senyawa) yang  diinginkan  yaitu  senyawa  asiatikosida yang terkandung dalam ekstrak pegagan. Uji KLT  menggunakan  eluen  kloroform:asam asetat glacial:metanol:air (60:32:12:8), pembuatan  penampak  noda  anisaldehid asam  sulfat            (anisaldehid  0,5  ml,  asam asetat  glacial  10  ml,  metanol  85  ml,  dan asam  sulfur  5  ml),  eluen  dan  penampak noda  tersebut  digunakan  untuk  identifikasi asiatikosida. 12 Pembuatan  eluen  harus sangat  tepat  karena  akan  mempengaruhi kepolaran  eluen  dan  mempengaruhi pemisahan  senyawa    yang  terkandung dalam  ekstrak. 8 Penampak  noda  harus dibuat baru  untuk memberikan warna noda yang  optimal.  Setelah  plat  KLT  tereluasi secara  sempurna  maka  disemprot  dengan penampak  noda  anisaldehid  asam  sulfat yang  dibuat  dan  dipanaskan  dengan hot plate pada  suhu  100 0 C  selama  7-10  menit untuk  melihat  noda  berwarna  cokelat keunguan sampai ungu secara visual. Selain itu,  juga  dilihat  dengan  sinar  UV  365  untuk melihat  noda  berwarna  ungu  kebiruan, kemudian  dapat  dihitung  Rfnya. 12 Uji kualitatif  dengan  KLT    dilihat  dari  deteksi
noda dan nilai Rf. Uji kualitatif dengan KLT, dua  senyawa  dikatakan  identik  jika mempunyai  nilai  Rf  yang  sama  jika  diukur pada kondisi KLT (fase diam dan fase gerak) yang  sama.  Pada  penelitian  ini  didapatkan nilai  Rf  standar  asiatikosida  adalah  0,2875 dan  Rf  senyawa  asiatikosida  dalam  ekstrak adalah  0,2750,  sedangkan  rentang  Rf asiatikosida  menurut  literatur  adalah  0,2  – 0,35. 12 Hasil  ini  menunjukkan  adanya senyawa asiatikosida pada ekstrak pegagan sehingga  dapat  dilakukan  uji  penetapan kadar  asiatikosida  pada  ekstrak  pegagan. Langkah  selanjutnya  adalah  penetapan kadar asiatikosida ekstrak pegagan menggunakan  metode  LC–MS.  Validasi metode dilakukan untuk memastikan metode tersebut  akurat  dan  dapat  digunakan sebagai metode penetapan kadar, sehingga kadar  yang  dihasilkan  konsisten  dan  dapat dipercaya.  Pada  proses  ini  sampel  diambil 200  l  dilarutkan  dalam  1  ml  metanol, kemudian  difiltrasi  dengan  menggunakan filter  0.2  m  untuk  meminimalkan  adanya pengotor  yang  terdeteksi  oleh  detektor. 8
Parameter  validasi  yang  dilakukan  meliputi linearitas,  limit  deteksi  (LOD)  dan  limit kuantitasi  (LOQ),  selektifitas,  akurasi,  dan presisi. 9 Linearitas  merupakan  kemampuan metode  analisis  dalam  memberikan  respon yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi  analit  dalam  sampel.  Dalam penelitian  ini  dibuat  larutan  standar asiatikosida    400  ppb,  600  ppb,  800  ppb, 1000  ppb,  2000  ppb,  dan  4000  ppb.  Hasil yang  didapatkan  adalah  persamaan  regresi linier  Y  =  123.6x  -  343.7  dengan  koefisien korelasi  (r)  =  0,999.  Dari  data  tersebut  uji linearitas  memberikan  nilai  hubungan  yang baik  antara  konsentrasi  dan  respon, sehingga  kurva  yang  diperoleh  dapat memenuhi pesyaratan atau linier. 9
Penetapan  batas  deteksi  (LOD)  dan  batas kuantitasi  (LOQ).  Batas  deteksi  merupakan jumlah  terkecil  analit  dalam  sampel  yang dapat  dideteksi  yang  masih  memberikan
respon  bermakna  dibanding  dengan blangko. Batas kuantitasi merupakan jumlah terkecil  analit  dalam  sampel  yang  masih dapat  memenuhi  persyaratan  akurasi  dan presisi. 9 Hasil dari uji batas deteksi dan batas kuantitasi  masing-masing  secara  berurutan adalah  sebagai  berikut  65,6361  ppb  dan 218,7869  ppb.  Selektifitas  merupakan kemampuan  untuk  mengukur  senyawa marker  yang  diinginkan  secara  tepat  dan seksama  dengan  adanya  komponen  lain dalam  matriks  sampel  seperti  pengotor  dan produk  degradasi.  Selektifitas  ditunjukkan dengan adanya daya pisah antara senyawa yang diinginkan dengan senyawa lain. Cara memperoleh  selektifitas  bisa  dengan menggunakan  detektor  selektif,  terutama untuk  senyawa-senyawa  yang  terelusi secara  bersama-sama. 8 Pada  penelitian  ini senyawa asiatikosida dapat terpisah dengan baik  dari  senyawa-senyawa  lainnya  dengan menggunakan  detektor mass  spectrometry
(MS),  sehingga  metode  dapat  mengukur senyawa  marker  yang  diinginkan  dengan tepat  dan  seksama.  Uji  akurasi  dilakukan untuk mengetahui kedekatan hasil penetapan  yang  diperoleh  dengan  hasil sebenarnya.  Nilai  akurasi  dihitung  dari  nilai perolehan kembali (% recovery) dengan cara konsentrasi  sampel  +  baku  yang  diperoleh dikurangi dengan konsentrasi sampel (tanpa larutan  baku)  yang  diperoleh  kemudian dibagi  konsentrasi  larutan  baku  yang ditambahkan  dan  dikalikan  dengan  100  %. Uji  akurasi  dilakukan  pada  tiga  konsentrasi dengan pengulangan tiga kali pada masing- masing  konsentrasi.  Pengulangan  dilakukan untuk  membuktikan  apakah  detektor  dapat mengukur  dengan  baik  pada  konsentrasi yang berbeda beda. Pada penelitian ini nilai persentase  perolehan  kembali  sebagai berikut: sampel 2 rata-rata % R = 105,5843 %, sampel 3 rata-rata % R = 99,2867 %, dan sampel  4  rata-rata  %  R  =  100,7034  %.
Perolehan  kembali  yang  dipersyaratkan untuk  konsentrasi  100  ppb–1  ppm  adalah
80–110  %,  sehingga  hasil  untuk  uji  akurasi telah  memenuhi  persyaratan  uji. 9 Presisi adalah  ukuran  yang  menunjukkan  derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata- rata  jika  prosedur  diterapkan  secara berulang  pada  sampel-sampel  yang  diambil dari  campuran  yang  homogen.  Presisi  atau keseksamaan  diukur  sebagai  simpangan baku  atau  simpangan  baku  relatif  (koefisien variasi).  Pada  penelitian  ini  didapatkan  nilai uji  presisi  sebagai  berikut:  penambahan konsentrasi  larutan  baku  0,5  ppm  %  KV  = 0,0613  %,  penambahan  konsentrasi  larutan baku 0,75 ppm % KV = 0,1197, penambahan konsentrasi  larutan  baku  1  ppm  %  KV  = 0,2245. Kriteria presisi diberikan jika metode memberikan  simpangan  baku  relatif  atau koefisien  variasi  2  %  atau  kurang.  Hasil  ini menunjukkan  bahwa  uji  presisi  sudah memenuhi  persyaratan  uji  (USP  32,  2009). Hasil dari parameter validasi metode analisis yang  telah  dilakukan  secara  keseluruhan memenuhi  persyaratan  yang  ditetapkan untuk  penetapan  kadar  asiatikosida  ekstrak pegagan.  Hasill  tersebut  menunjukkan bahwa metode analisis dan penetapan kadar asiatikosida dapat dinyatakan konsisten dan dapat dipercaya atau valid.  Pada penelitian ini  dapat  dihitung  kadar  asiatikosida  pada ekstrak pegagan menggunakan metode LC– MS  dengan  replikasi  sebanyak  tiga  kali sebesar  0,232 %.

## DAFTAR PUSTAKA
1. World  Health  Organization. Traditional medicine. (online).  2003.  Diakses  28 Februari 2013. from:http://www.who.int/mediacentre/fac tsheets/fs134/en .
2. Musyarofah  N,  Susanto  S,  Aziz  SA, Kartosono  S.  Respon  Tanaman Pegagan  ( Centella  asiatica L.  Urban) terhadap  Pemberian  Pupuk  Alami  di
Bawah  Naungan .  Bul  Agron .  2007.
35(3): 217 – 224.
3. Nurjanah  N.  Studi  Karakter  agronomi pada  17  Aksesi  Pegagan (Centella
asiatica  ( L .)  Urban). Skripsi . Bogor: Program Studi Agronomi IPB. 2008.
4. Orhan  IE. Centella  asiatica  ( L. )  Urban: from  Traditional  Medicine  to  Modern Medicine with Neuroprotective Potential.
Review Article . Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2012. 5. Kim WJ, Kim JD, Veriansyah B, Kim J, Oh SG, Tjandrawinata RR. Extraction of Asiaticoside  from  Centella  asiatica  : Effects  of  solvents  and  extraction methods. Korea: Institute of Science and Technology.  Supercritical  Fluid  Lab. 2004
6. Handa  SW,  Khanuja  SPS,  Longo  G, Rakesh  DD. Extraction  Technologies for  Medicinal  and  Aromatic  Plants. Trieste: International Centre For Science
And High Tchnology. 2008.
7. Chaturvedi  M,  Manish  K,  Amit  S, Alimuddin  S.  Recent  Development  in
Novel Drug Delivery Systems of Herbal
Drugs .  International  Journal  of  Green Pharmacy . 2011. 5(2): 87-95.
8. Gandjar  IG,  Rohman  A. Kimia  Farmasi Analisis .  Yogyakarta:  Pustaka  Pelajar.
2007.
9. USP  32–NF  27. United  States
Pharmacopeia  and  The  National Formulary. Rockville  (MD):  The  United
States  Pharmacopeial  Convention. 2009.
10. Septyaningsih D. Isolasi dan Identifikasi Komponen  Utama  Ekstrak  Biji  Buah
Merah  ( Panduus  conoideus Lamk ) . Skripsi . Surakarta: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Sebelas Maret Surakarta. 2010.
11. Ramadhan  AE,  Phaza  HA.  Pengaruh Konsentrasi  Etanol,  Suhu  dan  Jumlah
Stage  pada  Ekstraksi  Oleoresin  Jahe
(Zingiber officinale Rosc) Secara Batch. Skripsi.  Semarang:  Jurusan  Teknik Kimia  Fakultas  Teknik  Universitas Diponegoro Semarang. 2010.
12. Wagner H, Bladt S. Plant Drug Analysis:
A Thin Layer Chromatograpy. Atlas. 2 nd
Edition.  Munchen:  Springer.  1996.  p
152. 300. 359. 13. Rahman  MN.  Aktivitas  Antibakteri Senyawa Hasil Biotransformasi Kurkumin  oleh  Mikrob  Endofit  Asal Kunyit.  Skripsi.  Bogor:  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan
Alam Institut Pertanian IPB. 2009.