ISSN 2354-6565

## PENETAPAN KADAR FLAVONOID METODE AlCl
3 PADA EKSTRAK METANOL KULIT BUAH KAKAO ( Theobroma cacao L.)

## Dyah Nur Azizah, Endang Kumolowati, Fahrauk Faramayuda
Kelompok Keahlian Biologi Farmasi,  Fakultas Farmasi Universitas Jenderal Achmad Yani Jl. Terusan Jenderal Sudirman PO BOX 148 Cimahi dna.dyahnurazizah99@gmail.com

## ABSTRAK
Kakao ( Theobroma cacao L.) merupakan  salah  satu  komoditas unggulan di  Indonesia. Selama ini  kulit  buah  kakao  hanya  merupakan  limbah  yang  kurang    dimanfaatkan.  Penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa ekstrak metanol kulit buah kakao memiliki senyawa metabolit sekunder seperti flavonoid dan tanin. Flavonoid merupakan salah  satu golongan senyawa  yang terbukti  dapat  digunakan  sebagai  antioksidan,  antikanker,  dan  antidepresan.  Tujuan  penelitian ini adalah untuk mengetahui kadar flavonoid dengan metode kolorimetri menggunakan pereaksi AlCl 3 dari  ekstrak  metanol  kulit  buah  kakao.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  ekstrak metanol kulit buah kakao memiliki senyawa metabolit sekunder yaitu alkaloid, polifenol, tanin, saponin,  kuinon,  monoterpenoid,  dan  seskuiterpenoid.  Kadar  flavonoid  yang  ditunjukkan dengan menggunakan metode AlCl 3 adalah sebesar 0,2371±0,0004 %. Dari penelitian ini dapat disimpulkan  bahwa  ekstrak  metanol  kulit  buah  kakao  memiliki  kadar  flavonoid  sebesar 0,2371±0,0004 %.
Kata kunci : Theobroma cacao L., flavonoid, AlCl 3 .

## ABSTRACT
Cocoa  ( Theobroma  cacao  L .)  is  one  of  the  leading  commodity  in  Indonesia.  During  this  time only  the  rind  cocoa  waste  underutilized.  Previous  research  states  that  the  methanol  extract  of cocoa  fruit  rind  has  a  secondary  metabolites  such  as  flavonoids  and  tannins.  Flavonoids  are  a class of compounds that are proven to be used as an antioxidant, anticancer, and antidepressant. The  purpose  of  this  study  was  to  determine  the  levels  of  flavonoids  with  colorimetric  method using  reagents  AlCl 3 of  methanol  extract  of cocoa  fruit.  The  results  showed  that  the  methanol extract  of  cocoa  fruit  rind  has  a  secondary  metabolites  are  alkaloids,  polyphenols,  tannins, saponins, quinones, monoterpenoid, and sesquiterpenoids. Level of flavonoids are indicated by using  AlCl 3 is  equal  to  0.2371  ±  0.0004  %.  From  this  study  it  can  be  concluded  that  the methanol extract of the fruit rind cocoa flavonoids levels of 0.2371 ± 0.0004%.
Key word : Theobroma cacao L., flavonoid, AlCl 3 .

## PENDAHULUAN
Kakao  ( Theobroma  cacao L.)  merupakan salah  satu  komoditas  unggulan  di  Indonesia. Kulit  buah  kakao  merupakan  limbah  utama dari  pengolahan  biji  kakao  yaitu  mencapai 70% dari keseluruhan buah, mengandung  air sekitar  85%,  serat  kasar  27%,  dan  protein 8%,  ada  juga  yang  menyebutkan  bahwa setiap  ton  biji  kakao  kering  menghasilkan hasil  ikutan  10  ton  kulit  buah  kakao  segar (Purnama,  2004).  Selain  buahnya  yang
memiliki  manfaat  sebagai  antidepresan, antikanker dan antioksidan, kulit buah kakao juga  memiliki  manfaat  sebagai  antioksidan karena mengandung theobromin sekitar 0,4% b/b  dan  kalium  3-4%  b/b  dalam  bahan kering,  campuran  dari  flavonoid  yang terpolimerasi  atau  terkondensasi  meliputi antosianidin, katekin, leukoantosianidin yang kadang berikatan dengan glukosa, monosakarida dan polisakarida yang meliputi pektin,  gom,  dan  selulosa  (Listyannisa,
2012).
Penelitian  sebelumnya,  diketahui  bahwa telah  dilakukan  isolasi  terhadap  senyawa flavonoid  dari  kulit  buah  kakao  yang memiliki  aktivitas  antioksidan.  Dengan demikian  dapat  ditentukan  kadar  flavonoid yang  terkandung  dalam  kulit  buah  kakao tersebut  (Listyannisa,  2012).  Flavonoid merupakan  salah  satu  senyawa  antioksidan golongan  fenolik  alam  yang  terbesar  dan terdapat  dalam  semua  tumbuhan,  sehingga dapat  dipastikan  terdapat  flavonoid  pada setiap telaah ekstrak tumbuhan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan  flavonoid  pada  kulit  buah  kakao. Metode  penetapan  kadar  flavonoid  yang digunakan adalah metode kolorimetri menggunakan pereaksi AlCl 3 .

## METODE PENELITIAN
Alat  Penelitian. Timbangan  analitik (Sartorius  BL  210S),  mikroskop,  kaca  objek dan  kaca  penutup,  krus  silika,  kompor pengarang  (Akebono),  tanur  (Thermolyne), perangkat  alat  gelas,  mortir  dan  stamper, rotary evaporator (Dragon LAB RE-10 Pro), penangas  air  (JEIO  TECH  BW-20E),  alat destilasi,  oven  (Memmert),  desikator,  alat soxhlet,  mikropipet,  rak  tabung  reaksi  kecil, sentrifugator, Spektrofotometri Uv-Vis (Shimadzu Uv-1700 Pharmaspec), inkubator, dan stopwatch. Perlengkapan  perlindungan diri (sarung tangan steril, masker, jas lab).
Bahan  Uji. Kulit  buah  kakao  yang diperoleh  dari  perkebunan  rakyat  di  Desa Rajamandala. Cipatat, Jawa Barat.
Bahan Kimia. Toluen P, etanol, akuades, kertas saring, quersetin, metanol pro analisis, etanol pro analisis (Merk), aluminium klorida (AlCl 3 ),  kalium  asetat  (CH 3 COOK),  kalium hidroksida  (KOH),  asam  klorida  (HCl), spirtus,  kloralhidrat,  pereaksi  Dragendorf, pereaksi  Mayer,  ammonium  hidroksida (NH 4 OH) encer, kloroform, serbuk Magnesium,  amil  alkohol,  pereaksi  besi  (III) klorida,  natrium  sulfat  (Na 2 SO 4 ),  larutan gelatin  1%,  eter,  pereaksi  vanillin-asam sulfat  10%,  pereaksi  Lieberman-Bouchard, kertas  saring,  kertas  saring  bebas  abu,    dan aluminium foil.
Penyiapan  Simplisia. Buah  kakao  yang sudah  masak  dipanen  yang  ditandai  dengan
mulai  menguningnya  buah  saat  dipetik. Sebelum dilakukan pengolahan, buah dideterminasi  terlebih  dahulu  di  Herbarium Sekolah  Ilmu  dan  Teknologi  Hayati  ITB. Buah  dicuci,  lalu  dibiarkan  dahulu  selama  5 hari  untuk  memudahkan  pelepasan  biji  dari kulit  buahnya.  Kulit  buah  kakao  kemudian dirajang,    dikeringkan  dengan  cara  diangin- angin selama satu  minggu. Simplisia kemudian  digiling  dan  disimpan  dalam wadah plastik yang bersih dan diberi silika.
Karakteristik Simplisia. Dilakukan pemeriksaan  karakteristik  simplisia  meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik simplisia, kadar sari, kadar abu dan kadar air dari simpisia. Penapisan Fitokimia. Penapisan
fitokimia  simplisia  dan  ekstrak  meliputi pemeriksaan  golongan  senyawa  alkaloid, flavonoid,  kuinon,  tanin  dan  polifenol, saponin,  steroid  dan  triterpenoid,  serta monoterpenoid dan seskuiterpenoid.
Ekstraksi. Pembuatan  ekstrak  dilakukan dengan  menggunakan  alat  soxhlet  dengan melarutkan  300  g  simplisia  dengan  1,2  L  – 1,5  L  pelarut  metanol.  Ekstrak  yang diperoleh  kemudian  dipekatkan  dengan penguap  hampa  putar  ( rotavapor )  sampai diperoleh  ekstrak  pekat  lalu  diuapkan  diatas penangas  air  sehingga  menjadi  ekstrak kental.
Penetapan  Kadar Flavonoid Metode Kolorimetri – AlCl 3 .
1. Pembuatan Kurva Standar Quersetin
Quersetin  ditimbang  sebanyak  25  mg dimasukkan  kedalam  labu  ukur  25  ml, kemudian  ditambahkan  etanol  80% sampai  25  ml  (larutan  induk  1000 μg/ml).  Kemudian  dibuat  serangkaian larutan  standar  20  μg/ml,  40  μg/ml,  60 μg/ml, 80 μg/ml dan 100 μg/ml. Dipipet masing-masing  sejumlah  0,5  ml  dari larutan  standar  ditambah  dengan  1,5  ml etanol  95%,  0,1  ml  aluminium  klorida (AlCl 3 )  10%,  0,1  ml  kalium  asetat  1  M dan  ditambahkan  akuades  2,8  ml. Setelah  itu  diinkubasi  selama  30  menit pada suhu 25 o C. Serapannya diukur pada λ 434,2 nm menggunakan spektrofotometer Uv-Vis. Kemudian dibuat kurva kalibrasi dengan
menghubungkan  nilai  serapan  sebagai koordinat  (Y)  dan  konsentrasi  larutan standar sebagai absis (X).

## 2. Pembuatan  Larutan  Uji  Ekstrak Metanol
Ekstrak  metanol  kulit  buah  kakao diambil  5,0  g  kemudian  ditambah  25  ml metanol.  Kemudian  diaduk  selama  24 jam  menggunakan  alat  pengaduk  pada kecepatan  200  rpm,  kemudian  disaring dan  filtrat  yang  diperoleh  ditambah metanol sampai 25 ml.

## 3. Penentuan Kadar Flavonoid
Larutan blanko dibuat dengan mengganti larutan  standar  dengan  etanol  0,5  ml. Ditambah dengan 1,5 ml etanol 95%, 0,1 ml  aluminium  klorida  (AlCl 3 )  10%,  0,1 ml  kalium  asetat  1  M  dan  ditambahkan akuades  2,8  ml.    Setelah  itu  diinkubasi selama  30  menit  pada  suhu  25 o C.  Setiap pengukuran serapan dibandingkan terhadap blanko. Larutan uji berisi 1,0 ml ekstrak metanol dipipet, kemudian ditambah etanol sampai 10 ml dalam labu ukur. Sejumlah 0,5  ml  larutan  kemudian  ditambah dengan  1,5  ml  etanol  95%,  0,1  ml aluminium  klorida  (AlCl 3 )  10%,  0,1  ml kalium  asetat  1  M  dan  ditambahkan akuades  2,8  ml.    Setelah  itu  diinkubasi selama  30  menit  pada  suhu  25 o C. Serapannya  diukur  pada  λ  434,2  nm menggunakan  spektrofotometer  Uv-Vis. Pengujian  dilakukan  secara  triplo.Kadar flavonoid  dapat  dihitung  menggunakan rumus :
𝐹 = 𝑐 𝑥 𝑉 𝑥 𝑓 𝑥 10 −6
𝑚 𝑥100%
Keterangan : F  : jumlah flavonoid metode AlCl 3 c : kesetaraan Quersetin (μm/ml)
V  : volume total ekstrak f : faktor pengenceran
m  : berat sampel (g)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik  Simplisia. Pemeriksaan karakteristik  simplisia  meliputi  pemeriksaan makroskopik  dan  mikroskopik,  penetapan kadar  abu,  kadar  sari  dan  kadar  air  dari
simplisia.
Pemeriksaan makroskopik
merupakan  pemeriksaan  organoleptik  (Tabel 1). Tabel 1. Pemeriksaan  Makroskopik  Kulit  Buah dan Simplisia Kakao Jenis Pemeriksaan Keterangan Warna Kulit  Buah  :  kuning kecoklatan Simplisia : coklat kehitaman Bau Bau khas Rasa Pahit Ukuran Buah Panjang : ± 18 cm Lebar : ± 9 cm Pemeriksaan mikroskopik dilakukan dengan bantuan mikroskop binocular menggunakan  pelarut  kloralhidrat  dengan perbesaran  100  kali.  Hasil  pemeriksaan mikroskopik  pada  kulit  buah  kakao  segar menunjukkan  bagian  epikarp  yang  terdiri dari sel-sel batu (Gambar 1). Sedangkan hasil pemeriksaan mikroskopik pada serbuk simplisia  kulit  buah  kakao  menunjukkan fragmen  pengenal  lainnya  yaitu  rambut penutup (Gambar 2).

## Gambar 1. Kumpulan sel batu

## Gambar 2. Rambut penutup
Karakteristik  simplisia  yang  meliputi penetapan kadar abu, kadar sari dan kadar air dilakukan untuk mengetahui kualitas simplisia  sehingga  kriteria  umum  kualitas simplisia yang digunakan untuk penelitian ini dapat  terpenuhi  (Tabel  2).  Berdasarkan  hasil penetapan kadar abu, kadar abu larut air lebih besar  dibanding  kadar  abu  tak  larut  asam. Kadar abu larut air menunjukkan adanya abu
fisiologis  seperti  alkali  dan  alkali  tanah seperti  magnesium,  natrium  dan  kalsium dalam  bentuk  trioksida  yang  terdapat  dalam simplisia.  Sedangkan  kadar  abu  tak  larut asam  menunjukkan  banyaknya  abu  non fisiologis  seperti  silika,  tanah  dan  pasir dalam simplisia. Berdasarkan hasil penetapan kadar sari diketahui bahwa senyawa metabolit  sekunder  yang  terkandung  dalam simplisia  lebih  banyak  tersari  ke  dalam pelarut  air  dibandingkan  dengan  pelarut etanol. Seangkan berdasarkan hasil penetapan kadar air diketahui bahwa simplisia  memenuhi  persyaratan  kadar  air dibawah 10% (Depkes RI, 1985).
Tabel 2. Karakterisasi Simplisia
Jenis Karakterisasi Keterangan Penetapan Kadar Abu : Kadar Abu Total 7,4109±0,1030%v/b Kadar Abu Larut Air 4,8542±0,1177%b/b Kadar  Abu  Tak  Larut Asam 0,454 ±0,0420 %b/b Penetapan Kadar Sari : Kadar Sari Larut Air 22,6917±0,3883%b/b Kadar Sari Larut Etanol 5,206 ±0,2649%b/b Penetapan Kadar Air 5,2068±0,2649%v/b
Penapisan  Fitokimia. Hasil  penapisan fitokimia  dari  simplisia  menunjukkan  hasil yang sama dengan ekstrak metanol kulit buah kakao.  Keduanya  mengandung  senyawa metabolit sekunder berupa alkaloid, flavonoid, tannin, polifenol, saponin, monoterpenoid  dan  seskuiterpenoid  juga senyawa kuinon (Tabel 3).
Tabel 3. Hasil Penapisan Fitokimia Golongan Senyawa Simplisia Ekstrak Metanol Alkaloid + + Flavonoid + + Tanin + + Polifenol + + Saponin + + Kuinon + + Steroid dan Triterpenoid - - Monoterpenoid dan Seskuiterpenoid + +
Penetapan  Kadar  Flavonoid  Metode Kolorimetri  –  AlCl 3 . Prinsip  penetapan kadar  flavonoid  metode  aluminium  klorida adalah  terjadinya  pembentukan  kompleks
antara  aluminium  klorida  dengan  gugus  keto pada atom C-4 dan gugus hidroksi pada atom C-3 atau C-5 yang bertetangga dari golongan flavon dan flavonol.
Senyawa  yang  digunakan  sebagai  standar pada  penetapan  kadar  flavonoid  ini  adalah quersetin, karena quersetin merupakan flavonoid  golongan  flavonol  yang  memiliki gugus  keto  pada  atom  C-4  dan  juga  gugus hidroksil  pada  atom  C-3  dan  C-5  yang bertetangga.
Gambar 3.  Pembentukan senyawa kompleks quersetin-alumunium klorida
Pengukuran  serapan  panjang  gelombang maksimum  dilakukan  pada  rentang  sekitar 400-800 nm. Panjang  gelombang maksimum yang  dihasilkan  adalah  434,5  nm  pada konsentrasi  60  μg/ml,  panjang  gelombang maksimum  tersebut  kemudian  digunakan untuk  mengukur  serapan  kurva  kalibrasi  dan sampel  ekstrak  metanol  kulit  buah  kakao. Dari  kurva  kalibrasi  diperoleh  persamaan regresi  linier  yaitu  y  =  0,0056x  +  0,0068 dengan  nilai  koefisien  kolerasi  (r)  =  0,9993. Nilai r yang mendekati 1 menunjukkan kurva kalibrasi  linier  dan  terdapat  hubungan  antara konsentrasi  larutan  quersetin  dengan  nilai serapan.
Pada penetapan kadar flavonoid, penambahan  kalium  asetat  adalah  untuk mendeteksi adanya gugus 7-hidroksil sedangkan  perlakuan  inkubasi  selama  30 menit  yang  dilakukan  sebelum  pengukuran dimaksudkan  agar  reaksi  berjalan  sempurna, sehingga  memberikan  intensitas  warna  yang maksimal.  Penetapan  kadar  flavonoiddari ekstrak  metanol  kulit  buah  kakao  dilakukan secara  troplo  dan  didapatkan  adalah  sebesar 0,2371±0,0004 % (Tabel 4).
Tabel 4.  Hasil pengukuran kadar flavonoid metode AlCl 3 Serapan Konsentrasi (μg/ml) Kadar Flavonoid 0.2749 47.8750 0.2368 0.2756 48.0000 0.2374 0.2753 47.9464 0.2372 Rerata Kadar Flavonoid 0.2371 SD 0.0004 % SD 0.1276

## KESIMPULAN
Karakteristik  dari  simplisia  kulit  buah kakao, yaitu kadar abu total sebesar 7,4109 ± 0,1030  %  b/b,  kadar  sari  laurt  air  sebesar 22,6917  ±  0,3883  %  b/b,  kadar  sari  larut etanol  sebesar  5,2068  ±  0,2649  %  b/b  dan kadar air sebesar 5,2068 ± 0,2649 % v/b.
Hasil  penapisan  fitokimia  menunjukkan bahwa  simplisia  dan  ekstrak  metanol  kulit buah  kakao  mengandung  senyawa  alkaloid, flavonoid,  polifenol,  tanin  katekat,  tanin galat,  saponin,  kuinon,  monoterpenoid,  dan seskuiterpenoid.
Kadar  flavonoid  golongan  flavon  dan flavonol  pada  ekstrak  metanol  kulit  buah kakao  yang  ditunjukkan  dengan  metode aluminium klorida
adalah sebesar
0,2371±0,0004 %.

## DAFTAR PUSTAKA
Chang,  C.C.,  Yang,  M.H.,  Wen,  H.M.,  dan Chernn  J.C.,  2002,  Estimation  of  Total Flavonoid  Content  in  Propolis  by  Two Complementary  Colorimetric  Methods,
Journal of Food and Drug Analysis. 178- 182.
Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia,
1978, Materia Medikia Indonesia Jilid IV,
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta.  327. Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia, 1985, Cara Pembuatan Simplisia, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta. 10-11. Listyannisa,  A.,  2012,  Isolasi  Senyawa
Antioksidan  dari  Kulit  Buah  Coklat (Theobroma  cacao  L.),  Skripsi,  Program Studi  Farmasi,  Fakultas  Matematika  dan Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Universitas Jenderal Achmad Yani, Cimahi.
Purnama,  I.N.,  2004,  Kajian  Potensi  Isolat Kapang Pemecah Ikatan Tanin Pada Kulit Buah  Kakao (Theobromti  cacao  L.), Skripsi ,  Program  Studi  Nutrisi  dan Makanan  Ternak,  Departemmen  Ilmu Nutrisi  dan  Makanan  Ternak,  Fakultas Peternakan,  Institut  Pertanian  Bogor,
Bogor.
Saifudin,  A.,  Rahayu,  V.,  dan  Teruna,  H.Y.,
2011, Standarisasi  Bahan  Obat  Alam, Graha Ilmu, Yogyakarta. 4,26-27.
Sudiarto,  Soeharto,  S.,  Febrina,  Shinta., 2010,  Efek  Quercetin  terhadap  Kadar Adipocyte-Fatty  Acid  Binding  Protein,
Jurnal  Fakultas  Kedokteran Universitas Brawijaya , Malang.