BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed Volume 2, Nomor 3 (2020): 382 - 391 E-ISSN: 2714-8564
Pengaruh Penambahan Prebiotik Inulin dan Fruktooligosakarida (FOS) terhadap Pertumbuhan Probiotik Bifidobacterium sp. Bb2E

## Azma Nurizqi Isnasari, Dyah Fitri Kusharyati, Oedjijono
Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Jalan dr. Suparno 63 Purwokerto 53122. email: azma.isna23@gmail.com
Rekam Jejak Artikel:
Diterima  : 13/10/2020 Disetujui  : 12/12/2020

## Abstract
Human  health  is  very  closely  related  to  the  condition  of  the  human  digestive  tract  since  the beginning  of  life.  The  diversity  of  microorganisms  found  in  the  human  digestive  tract  is  very diverse,  consisting  of  300-500  different  species  of  bacteria  to  increase  the  working  power  of nutrition. Prebiotics such as inulin and FOS and probiotics such as Bifidobacteria are aspects that can be added for the increase of nutrition. Optimal bacterial growth can be seen  in the bacterial growth  curve.  The  research  problems  were  how  the  effect  of  prebiotic  inulin  and  FOS  on  the growth  of Bifidobacterium sp.  Bb2E,  the  amount  of  incubation  time  needed  to  support  the growth  of Bifidobacterium sp.  Bb2E,  and  how  the  interaction  between  prebiotic  types  and incubation times on the growth of Bifidobacterium sp. BB2E. The purposes of this study were to study the effect of prebiotic inulin and FOS on the growth of Bifidobacterium sp. Bb2E, to know the  optimal  incubation time of Bifidobacterium sp. Bb2E, and to  know the interaction between prebiotic types and incubation times on the growth of Bifidobacterium sp. BB2E. This research was  conducted using a  completely randomized  design  (CRD)  with factorial patterns. The  main parameter  measured  was  the  population  of Bifidobacterium sp.  Bb2E,  and  the  additional parameters  measured  were  the  pH  level  and  the  value  of  lactic  acid  titrated.  The  independent variable  discussed  in  this  study  is  prebiotic  estimation  on  the  medium,  while  the  dependent variable  considered  is  the  population  of Bifidobacterium sp.  BB2E.  The  results  of  this  study showed  that  the  addition  of  inulin  and  fructooligosaccharide  prebiotic  at  different  incubation times had a significant effect on the growth of Bifidobacterium sp. Bb2E. The best treatment was a combination of inulin + FOS at incubation time of 18 hours with an optical density value was 1,794 and a total population density was 2,44x10 10 CFU/mL. Keywords: Bifidobacterium sp. Bb2E, FOS, inulin, prebiotic, probiotic

## Abstrak
Kesehatan manusia sangat erat kaitannya dengan kondisi saluran pencernaan manusia sejak awal kehidupannya.  Diversitas  mikroorganisme  yang  terdapat  dalam  saluran  pencernaan  manusia sangat  beragam,  yaitu  berkisar  300-500  spesies  bakteri  berbeda.  Penambahan  beberapa  aspek dalam nutrisi diperlukan untuk meningkatkan daya kerja nutrisi. Prebiotik seperti inulin dan FOS serta probiotik seperti Bifidobacteria adalah aspek yang dapat ditambahkan untuk meningkatkan nutrisi.  Pertumbuhan bakteri yang optimal dapat diketahui berdasarkan pada kurva pertumbuhan bakteri.  Permasalahan  penelitian  yang  muncul  yaitu  bagaimana  pengaruh  prebiotik  inulin  dan FOS  terhadap  pertumbuhan Bifidobacterium sp.  Bb2E,  berapa  waktu  inkubasi  yang  diperlukan untuk mendukung pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E, dan bagaimana interaksi antara jenis prebiotik  dan  waktu  inkubasi  terhadap  pertumbuhan Bifidobacterium sp.  Bb2E.  Tujuan  dari penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  pengaruh  prebiotik  inulin  dan  FOS  terhadap pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E, mengetahui waktu inkubasi optimal Bifidobacterium sp. Bb2E, dan mengetahui interaksi antara jenis prebiotik dan waktu inkubasi terhadap pertumbuhan Bifidobacterium sp.  Bb2E.  Penelitian  ini  dilakukan  menggunakan  rancangan  percobaan Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan  pola  faktorial.  Parameter  utama  yang  diukur  yaitu jumlah populasi Bifidobacterium sp. Bb2E, sedangkan  parameter pendukung  yang  diukur  yaitu nilai pH dan kadar asam laktat tertitrasi. Variabel bebas yang diamati dalam penelitian ini adalah penambahan  prebiotik  pada  medium,  sedangkan  variabel  terikat  yang  diamati  yaitu  jumlah populasi dari Bifidobacterium sp. Bb2E. Hasil penelitian ini menunjukkan penambahan prebiotik inulin  dan  FOS  dengan  waktu  inkubasi  berbeda  berpengaruh  nyata  terhadap  pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E. Hasil terbaik yang dapat meningkatkan pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E yaitu kombinasi prebiotik inulin+FOS dan waktu inkubasi 18 jam dengan nilai optical density sebesar 1,794 dan jumlah kepadatan populasi sebanyak 2,44x10 10 CFU/mL. Kata kunci: Bifidobacterium sp. Bb2E, FOS, inulin, prebiotik, probiotik.

## PENDAHULUAN
Kesehatan  manusia  sangat  erat  kaitannya  dengan kondisi saluran pencernaannya. Ciri-ciri saluran pencernaan  yang  baik  yaitu  memiliki  kemampuan  dalam mencerna  dan  menyerap  makanan,  memiliki  fungsi  imun yang  baik,  serta  keseimbangan  mikroorganisme  yang sesuai.  Saluran  pencernaan  dapat  mencegah  infeksi mikroorganisme  patogen  karena  memiliki  respon  memori terhadap  antigen  dan  dapat  membedakan  antigen  asing dengan antigen yang berasal dari dalam tubuhnya (Hegar, 2017).
Keanekaragaman  mikroorganisme  yang  terdapat dalam saluran pencernaan  manusia sangat beragam,  yaitu berkisar  300-500  spesies  bakteri  yang  berbeda.  Bakteri dalam kolon manusia yang bersifat menguntungkan antara lain  Bifidobacteria,  Streptococcus,  dan  Lactobacillus. Bakteri  yang  bersifat  merugikan  diantaranya  adalah Clostridia dan Staphylococcus (Setiarto et al., 2016).
Kualitas  makanan  yang  baik  dengan  kandungan nutrisi  yang  tepat  dapat  menjaga  kesehatan  tubuh. Penambahan  beberapa  aspek  dalam  nutrisi  diperlukan untuk  meningkatkan  daya  kerja  nutrisi.  Prebiotik  dan probiotik  adalah  aspek  yang  dapat  ditambahkan  pada nutrisi.  Probiotik  didefinisikan  sebagai  strain  dari mikroorganisme  yang  telah  terseleksi  dan  memenuhi syarat  menjadi  probiotik,  dan  apabila  diberikan  dalam jumlah  yang  tepat  dapat  memberikan  keuntungan  bagi inangnya  (Markowiak  &  Katarzyna,  2017).  Prebiotik merupakan komponen nutrisi yang tidak dapat dicerna dan menghasilkan  pengaruh  menguntungkan  bagi  inang dengan  cara  menstimulir  pertumbuhan  mikroorganisme dalam  saluran  pencernaan  sehingga  terjadi  peningkatan kesehatan  inang (Vrese & Marteau, 2008).
Bifidobacteria adalah  salah  satu  strain  probiotik yang  banyak  dikembangkan  karena  menguntungkan  bagi kesehatan  manusia.  Keberadaan  bakteri  ini  menjadi  salah satu  indikator  tingkat  kesehatan  saluran  pencernaan manusia  (Collins  &  Gibson,  1999).  Bifidobacteria merupakan  salah  satu Bakteri  Asam  Laktat  (BAL)  yang memiliki  kemampuan  mengkatalisis  polimer-polimer karbohidrat dan  memanfaatkannya sebagai sumber  energi (Ganzle & Follador, 2012). Sumber nutrisi probiotik dapat diperoleh  melalui  pemberian  prebiotik  (Setiarto et  al., 2017).
Inulin  dan  fruktooligosakarida  (FOS)  merupakan senyawa prebiotik yang umum digunakan sebagai sumber nutrisi bagi probiotik.  Inulin  dan FOS secara alami dapat ditemukan  pada  berbagai  macam  sayur  dan  buah  seperti bawang  merah, bawang putih, gandum dan pisang.  Inulin dan  FOS  dapat  difermentasi  oleh  bakteri  probiotik  dan menghasilkan  produk  berupa  asam  laktat  dan  asam karboksilat  rantai  pendek  lainnya  (Setiarto et  al., 2017). Berdasarkan  uraian  di  atas,  masalah  yang  muncul  yaitu bagaimana  pengaruh  prebiotik  inulin  dan  FOS  terhadap pertumbuhan Bifidobacterium sp.  Bb2E,  berapa  waktu inkubasi yang diperlukan untuk mendukung pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E, dan bagaimana interaksi antara jenis prebiotik  dan  waktu  inkubasi terhadap pertumbuhan Bifidobacterium sp.  Bb2E.  Tujuan  dari  penelitian  ini adalah mengetahui pengaruh penambahan prebiotik inulin dan  FOS  dengan  waktu  inkubasi  berbeda  terhadap pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E.

## MATERI DAN METODE
Pemurnian dan rekultur (Usmiati & Juniawati, 2011)
Isolat Bifidobacterium sp. Bb2E diambil sebanyak satu ose secara aseptis, kemudian diinokulasikan kedalam medium MRSB 10 mL dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu  37 o C.  Hasil  inkubasi  dimurnikan  dengan  cara diambil  sebanyak  satu  ose  secara  aseptis  lalu  dilakukan goresan  kuadran  pada  medium  MRSA  dan  dinkubasi selama  24  jam  pada  suhu  37 o C.  Koloni  tunggal  yang didapat  kemudian  diambil  satu  ose  secara  aseptis  dan dilakukan  goresan  pada  medium  MRSA  tabung  miring sebagai  kultur  aktif.  Aktivasi  kultur  dilakukan  sebanyak dua kali pengulangan.

## Konfirmasi isolat dan pembuatan stok kultur
Konfirmasi  kultur  dilakukan  melalui  pewarnaan Gram  dan  uji  katalase.  Pewarnaan  Gram  dilakukan menggunakan  gelas  objek  yang  telah  dibersihkan menggunakan  alkohol  dan  dikeringkan.  Kultur  aktif diambil sebanyak satu ose secara aseptis dan diletakkan di atas  gelas  objek.  Akuades  ditambahkan  sedikit  supaya kultur tidak terlalu padat. Gelas objek kemudian difiksasi di  atas  api  Bunsen  untuk  mematikan  sel  tanpa  merusak struktur  sel  tersebut.  Gelas  objek  yang  telah  difiksasi ditetesi  dengan  pewarna  violet  kristal  dan  didiamkan selama  satu  menit.  Gelas  objek  kemudian  dibilas  dengan akuades dengan posisi gelas objek miring, lalu diteteskan
larutan  Lugol’s iodine dan  didiamkan  selama  satu  menit. Gelas objek dibilas dengan akuades dengan posisi miring, lalu  dibilas  dengan  alkohol  96%  selama  sepuluh  detik. Gelas  objek  dibilas  menggunakan  akuades  dengan  posisi miring,  kemudian  diteteskan  pewarna  safranin  dan didiamkan  selama  45  detik.  Gelas  objek  dibilas  dengan akuades kembali pada posisi miring, kemudian dikeringkan  dengan  tisu.  Gelas  objek  kemudian  diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x. Sel terwarnai menunjukkan Gram positif dan sel terwarnai merah  menunjukkan Gram  negatif. Bentuk sel  juga dapat dilihat  di  bawah  mikroskop  cahaya  dengan  perbesaran 400x (Jagadeeshwari, 2019).
Uji  katalase  dilakukan  dengan  cara  kultur  aktif diambil sebanyak satu ose secara aseptis dan diletakkan di atas  objek  gelas  yang  telah  dibersihkan  dengan  alkohol. Reagen  H 2 O 2 diteteskan  sebanyak  dua  sampai  tiga  tetes, kemudian dilakukan pengamatan terhadap gelembung gas. Katalase  positif  ditandai  dengan  terbentuknya  gelembung gas pada gelas objek dan katalase negatif ditandai dengan tidak  terbentuknya  gelembung  gas  pada  gelas  objek (Fardiaz, 1990).
Pembuatan  stok  kultur  dibuat  dari  kultur  aktif yang  telah  terkonfirmasi  sebagai  anggota  genera Bifidobacteria,  yaitu  termasuk  dalam  kelompok  bakteri Gram  positif  dan  hasil  negatif  pada  uji  katalase  (Usmiati &  Juniawati,  2011).  Kultur  aktif  diambil  sebanyak  satu ose,  kemudian  digoreskan  pada  MRSA  tabung  miring sebanyak  dua  tabung.  Stok  kultur  tersebut  diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C.
Pembuatan  medium  MRSB  dengan  penambahan prebiotik (Modifikasi Setiarto et al., 2017)
Medium  MRSB  dengan  penambahan  FOS  dibuat dengan  cara  melarutkan  2  g  FOS  pada  MRSB  hingga volumenya  menjadi  200  mL  untuk  konsentrasi  1%, kemudian  dihomogenkan  dan  disterilisasi  menggunakan autoklaf  pada  suhu  121 o C  dengan  tekanan  2  atm  selama 15  menit.  Medium  MRSB  dengan  penambahan  inulin dibuat  dengan  cara  melarutkan  2  g  inulin  pada  MRSB hingga volumenya menjadi 200 mL untuk konsentrasi 1%, kemudian  dihomogenkan  dan  disterilisasi  menggunakan autoklaf  pada  suhu  121 o C  dengan  tekanan  2  atm  selama 15  menit.  Medium  MRSB  dengan  penambahan  FOS  dan inulin  dibuat  dengan  cara  melarutkan  2  g  FOS  pada MRSB hingga volumenya menjadi 200 mL dan 2 g inulin
pada  MRSB  hingga  volumenya  menjadi  200  mL  untuk konsentrasi  1%,  kemudian  dihomogenkan  dan  masing- masing  disterilisasi  menggunakan  autoklaf  pada  suhu 121 o C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit.
Pembuatan kurva standar kepadatan populasi (Modifikasi Yohan et al., 2018).
Kurva standar dibuat untuk mendapatkan persamaan  regresi  yang  digunakan  dalam  penghitungan jumlah  populasi Bifidobacterium sp.  Bb2E.  Pembuatan kurva  standar  dilakukan  berdasarkan  pengukuran  nilai absorbansi dengan metode spektrofotometri dan menghitung  total  koloni  dengan  metode  TPC.  Persamaan yang  dihasilkan  yaitu  y = ax + b dengan  y adalah jumlah populasi  berdasarkan  metode  TPC  dan  x  adalah  nilai absorbansi. Spektrofotometer diatur panjang gelombangnya pada 600 nm. Nilai absorbansi dipilih pada pengaturan mode pembacaan. Blanko akuades dimasukkan  terlebih  dahulu  untuk  kalibrasi,  selanjutnya dilakukan  pengukuran  absorbansi.  Sebanyak  3  mL medium  MRSB  diambil  dan  dituang  ke  dalam  tabung kuvet spektrofotometer untuk pembacaan nilai absorbansi untuk tiap pengenceran. Pengukuran absorbansi dilakukan berdasarkan  hukum  Lambert-Beer  yang  dimasukkan  ke dalam  bahasa  program  arudino  pada  spektrofotometer. Penghitungan  jumlah  total  koloni  dilakukan  dengan  cara sebanyak  1  mL Bifidobacterium sp.  Bb2E  diinokulasikan pada cawan MRSA dengan metode Pour Plate (PP) secara duplo  untuk  tiap  pengenceran.  Cawan  MRSA  tersebut diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 o C. Jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan dinyatakan dalam log CFU/mL dan  dimasukkan  ke  dalam  persamaan  regresi  yang  sudah diperoleh  dari  kurva  standar  (Modifikasi  Setiarto et  al., 2017).

## TPC = Jumlah koloni x   x
Keterangan:
P   : Pengenceran
PP : Pour Plate
Pengukuran dilakukan sebanyak enam pengenceran  berbeda  dengan  metode  pengenceran bertingkat  untuk  mendapatkan  nilai  presisi  sebesar 99,35%.
Pembuatan  kurva  pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E (Wahyuningsih & Zulaika, 2019)
Kurva pertumbuhan dibuat dengan cara menginokulasikan 1 mL  kultur Bifidobacterium sp. Bb2E ke  dalam  medium  MRSB  hingga  volumenya  menjadi  20
mL.  Kepadatan  populasi  diukur  menggunakan  metode spektrofotometri dengan panjang  gelombang 600 nm  dari jam ke-0  hingga  jam  ke-28 dengan  interval  waktu 2 jam. Nilai  absorbansi  yang  didapat  dimasukkan  ke  dalam persamaan regresi hasil kurva standar  untuk mencari nilai CFU/mL.
Pembuatan  inokulum  bakteri  untuk  fermentasi (Modifikasi Setiarto et al., 2017)
Inokulum  dibuat  dengan  cara  mengambil  1  ose kultur Bifidobacterium sp.  Bb2E  dan  dimasukkan  ke dalam 10 mL MRSB, kemudian diinkubasi selama 18 jam pada  suhu  37 o C.  Kepadatan  populasi  dibuat  menjadi  10 8

## CFU/mL.
Pengaruh penambahan prebiotik inulin dan FOS pada waktu  inkubasi  yang  berbeda  terhadap  jumlah populasi Bifidobacterium sp. Bb2E Sebanyak 1 mL Bifidobacterium sp. Bb2E dengan kepadatan  populasi  10 8 CFU/mL  (mengacu  pada  cara kerja  bagian  5)  diinokulasikan  ke  dalam  medium  MRSB dengan  penambahan  prebiotik  (berdasarkan  cara  kerja bagian  3)  hingga  volume  MRSB  menjadi  10  mL. Kepadatan  populasinya  sesuai  dengan  unit  percobaan. Pengukuran kepadatan populasi dilakukan pada jam ke 14, 16, 18, 20, dan 22 dengan  metode spektrofotometri (pada cara  kerja  bagian  4).  Hasil  yang  didapatkan  dimasukkan ke  dalam  persamaan  regresi  yang  sudah  diperoleh  dari kurva standar (Artanti, 2009).
Penelitian dilakukan secara eksperimental menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan pola faktorial. Perlakuan terdiri atas dua faktor, yaitu jenis prebiotik  dan  waktu  inkubasi.  Faktor  pertama  terdiri  atas empat  taraf,  yaitu  kontrol,  inulin,  FOS,  dan  inulin+FOS. Faktor kedua terdiri atas lima taraf  yaitu 14 jam, 16 jam, 18  jam,  20  jam,  dan  22  jam.  Masing-masing  perlakuan dilakukan  pengulangan  sebanyak  tiga  kali,  sehingga diperoleh  60  unit  percobaan.  Pengukuran  pH  dilakukan pada  jam  ke  14,  16,  18,  20,  dan  22  sesuai  dengan  unit percobaan  (AOAC,  1995).  Pengukuran  nilai  asam  laktat dilakukan  dengan  cara  mengambil  sebanyak  10  mL  dari tiap unit percobaan dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer. Indikator PP ditambahkan untuk uji total asam sebanyak 3 tetes. Sampel dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N hingga terjadi perubahan warna menjadi merah. Pengukuran nilai asam laktat dilakukan pada jam ke 14, 16, 18, 20, dan 22 (Setiarto et al., 2017).
Persentase asam laktat =
Keterangan: Persentase asam laktat: Total asam laktat (% v/v)
V1 : Volume NaOH sebagai titran (mL) N : Normalitas NaOH sebagai titran (N) BE : Bobot ekuivalen asam laktat (90.08) FP : Faktor pengenceran V2
: Jumlah contoh yang dititrasi (mL)

## Analisis Data
Data kepadatan populasi yang diperoleh dianalisis menggunakan  analisis  ragam  pada  tingkat  kepercayaan 95%.  Hasil  percobaan  menunjukkan  bahwa  perlakuan berbeda nyata, sehingga dilanjutkan dengan uji beda nyata jujur (BNJ) pada tingkat kesalahan 5%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kultur  murni Bifidobacterium sp.  Bb2E  ditandai dengan  munculnya  koloni  tunggal  pada  medium  MRSA yang berwarna putih susu, tepi koloni rata, dan elevasinya convex .  Hal  ini  sesuai  dengan  pernyataan  Indrato et  al . (2017) bahwa karakteristik makromorfologi Bifidobacteria  adalah  memiliki  warna  koloni  putih  susu hingga krem, bentuk koloni bulat, dan elevasinya convex. Hasil pengujian menunjukkan bahwa isolat Bifidobacterium sp. Bb2E memiliki sifat Gram positif dan katalase  negatif.  Bakteri  dengan  Gram  positif  memiliki lapisan  peptidoglikan  yang  lebih  tebal  jika  dibandingkan dengan  bakteri  Gram  negatif  (Puspita,  2016).  Bentuk  sel isolat Bifidobacterium sp.  Bb2E  menunjukkan  dominan batang pendek dan bentuk curved . Menurut Martinez et al.
(2013),  Bifidobacteria  memiliki  bentuk  sel  pleomorfik, seperti  batang, curved ,  dan bifurcated Y.  BAL  secara umum  memiliki  katalase  negatif.  Hasil  uji  katalase  isolat Bifidobacterium sp.  Bb2E  yaitu  negatif  karena  tidak muncul  gelembung  setelah  ditetesi  oleh  reagen  H 2 O 2 . Dewi  (2018)  menyatakan  bahwa  isolat Bifidobacterium sp. Bb2E memiliki karakteristik Gram positif dan katalase negatif
Menurut  Sharah et  al. (2015),  fase  pertumbuhan yang dimiliki oleh bakteri secara umum ada 4,  yaitu fase lag  (fase  adaptasi),  fase  log  (fase  logaritmik),  fase stasioner,  dan  fase  kematian.  Isolat Bifidobacterium sp. Bb2E  mengalami  fase  adaptasi  dari  jam  ke-0  hingga  jam ke-6, fase logaritmik dari jam ke-8 hingga jam ke-20, dan mengalami fase stasioner pada jam  ke-22 hingga jam ke- 26.  Yuliana  (2008)  menyatakan  bahwa  faktor  yang
berpengaruh  dalam  penentuan  lama  fase  adaptasi  dari suatu  bakteri  yaitu  jumlah  sel  yang  diinokulasikan, kondisi  fisiologis  dan  morfologis  dari  bakteri  tersebut, serta  medium  pertumbuhanya.  Khoiriyah  &  Ardiningsih (2014) menyatakan bahwa fase adaptasi dipengaruhi oleh faktor  lingkungan  seperti  pH,  suhu,  dan  nutrisi.  Fase adaptasi  menunjukkan  peningkatan  sel  yang  cukup lambat.
Fase  selanjutnya  setelah  adaptasi  yaitu  fase logaritmik.  Fase  ini  ditunjukkan  dengan  meningkatnya pertumbuhan  sel  bakteri  secara  signifikan.  Sel  bakteri pada  fase  ini  memiliki  laju  membelah  diri  dan metabolisme  yang  cepat  serta  konstan  (Sharah et  al., 2015).  Isolat  perlakuan  diambil  pada  fase  eksponensial karena  memiliki  laju  pertumbuhan  spesifik  (µ)  yang konstan (Wahyuningsih & Zulaika, 2018). Inokulum pada jam  ke-18  dipilih  untuk  digunakan  karena  pada  jam tersebut  memiliki  nilai  µ  terbesar  kedua  dan  berada  pada fase  akhir  eksponensial.  Fase  ketiga  yang  dapat  teramati menggunakan  kurva  pertumbuhan  berdasarkan  nilai
absorbansi  yaitu  fase  stasioner.  Jumlah  populasi  sel  pada fase  ini  tetap  karena  jumlah  sel  yang  mati  setara  dengan jumlah sel yang hidup (Sharah et al., 2015). Khoiriyah & Ardiningsih (2014) menyatakan bahwa pada fase stasioner pertumbuhan  menurun  karena  menipisnya  sumber  nutrisi dan bakteri mulai membentuk metabolit sekunder.
Prebiotik  seperti  inulin  dan  FOS  telah  banyak digunakan  untuk  optimalisasi  pertumbuhan  berbagai macam  probiotik  seperti  genera  Lactobacillus  dan Bifidobacteria. Pemberian kombinasi prebiotik juga dapat dilakukan  untuk  mendapatkan  formula  terbaik  untuk setiap  jenis  bakteri  yang  spesifik.  Menurut  Kadlec  & Jakubec  (2014),  kombinasi  prebiotik  untuk  probiotik bersifat  sangat  spesifik,  dapat  menunjukkan  perbedaan hasil  meskipun  masih  dalam  satu  genera  bahkan  satu spesies.
Hasil  analisis  ragam  (Tabel  1.)  menunjukkan bahwa penambahan prebiotik dan waktu inkubasi berbeda memberikan pengaruh nyata (F>0,01) terhadap pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E.
Tabel 1.  Hasil  Analisis  Ragam  Pengaruh  Penambahan  Prebiotik  Inulin  dan  FOS  serta  Waktu  Inkubasi  Berbeda  terhadap Pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E. Sumber Keragaman (SK) Derajat Bebas (db) Jumlah Kuadrat (JK) Kuadrat Tengah (KT) F Hitung F Tabel 0,05 0,01 Perlakuan 19 8,5296 0,4489 215,0105** 1,85 2,39 Prebiotik (P) 3 0,8703 0,2901 138,9475** 2,84 4,31 Waktu inkubasi (W) 4 7,5058 1,8764 898,7174** 2,61 3,83 P x W 12 0,1534 0,0128 6,1239** 2,00 2,66 Galat 40 0,0835 0,0021 Total 59 8,6131
Keterangan : ** = Berpengaruh sangat nyata
Hasil  uji  BNJ  (Tabel  2.)  menunjukkan  bahwa perlakuan  penambahan  FOS  1%  +inulin  1%  memiliki kepadatan  yang  paling  tinggi  dengan  nilai  1,5637  dan berbeda  nyata  dengan  perlakuan  kontrol  maupun perlakuan  penambahan  inulin  1%.  Kepadatan  terendah didapat oleh perlakuan penambahan FOS 1% (1,2982) dan tidak  berbeda  nyata  dengan  perlakuan  kontrol  (1,3067). Interaksi  antara  penambahan  prebiotik  dengan  waktu inkubasi  berbeda  yang  menghasilkan  kepadatan  populasi tertinggi yaitu perlakuan penambahan FOS 1%+inulin 1% dengan  waktu  inkubasi  22  jam  (tidak  berbeda  nyata dengan  perlakuan  penambahan  FOS  1%+inulin  1%
dengan  waktu inkubasi 20 jam) dan sangat berbeda nyata dengan  perlakuan  kontrol.  Perlakuan  penambahan  FOS 1%  dengan  waktu  inkubasi  22  jam  dan  perlakuan penambahan  inulin  1%  dengan  waktu  inkubasi  22  jam juga  memiliki  kepadatan  populasi  lebih  tinggi  jika dibandingkan  dengan  perlakuan  kontrol  dan  untuk perlakuan  penambahan  FOS  1%  dengan  waktu  inkubasi 22  jam  tidak  berbeda  nyata  dengan  perlakuan  kontrol untuk  waktu  inkubasi  yang  sama.  Hal  ini  membuktikan bahwa  penambahan  prebiotik  dengan  waktu  inkubasi berbeda  berpengaruh  dalam  meningkatkan  pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E. Prebiotik terbaik  yang mampu
dimanfaatkan  oleh Bifidobacterium sp.  Bb2E  yaitu kombinasi  inulin  1%+FOS  1%  yang  berarti  hipotesis penelitian nomor 1 ditolak.  Waktu  inkubasi  yang optimal untuk  pertumbuhan Bifidobacterium sp.  Bb2E  yaitu  pada jam  ke-18  karena  memiliki  laju  pertumbuhan  tertinggi untuk  setiap  perlakuan  yang  berarti  hipotesis  nomor  2 diterima.  Interaksi  antara  penambahan  prebiotik  dengan waktu inkubasi berbeda terbaik yaitu perlakuan penambahan  inulin 1%  +FOS 1% dengan  waktu inkubasi 18  jam  yang  berarti  hipotesis  nomor  3  ditolak. Konsentrasi  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  untuk
setiap  prebiotik  sama,  yaitu  1%.  Menurut  Artanti  (2009), Perbedaan  respon  tiap  strain  terjadi  karena  perbedaan pengkodean gen dalam sistem metabolik yang berpengaruh terhadap nilai aktivitas prebiotik. Pemanfaatan prebiotik oleh BAL membutuhkan keberadaan  sistem  transportasi  dan  hidrolisis  yang spesifik.  Genera  Bifidobacteria  memiliki  spesifitas berbeda  terhadap  fruktan,  tidak  hanya  dalam  hal kemampuan  fermentasi,  juga  dalam  hal  kemampuan menginduksi enzim yang terletak berbeda (intraseluler dan ekstraseluler) (Rossi, 2005).
Tabel 2. Hasil BNJ Pengaruh Penambahan Prebiotik Inulin dan FOS serta Waktu Inkubasi Berbeda terhadap Pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E.
Data Optical Density P1 1,3067 c P2 1,2982 c P3 1,5185 b P4 1,5637 a W1 0,9533 d W2 1,0380 c W3 1,6004 b W4 1,7550 a W5 1,7621 a P1W1 0,8480 jk P1W2 0,9477 i P1W3 1,4453 f P1W4 1,6627 de P1W5 1,6297 e P2W1 0,7727 k P2W2 0,8577 j P2W3 1,4070 f P2W4 1,7410 bc P2W5 1,7127 cd P3W1 1,0800 h P3W2 1,1413 gh P3W3 1,7547 bc P3W4 1,8003 b P3W5 1,8160 ab P4W1 1,1127 h P4W2 1,2053 g P4W3 1,7947 b P4W4 1,8160 ab P4W5 1,8900 a
Angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada BNT  5%
Keterangan:
P1: MRSB kontrol W1: Inkubasi jam ke-14 P2: MRSB+FOS 1% W2: Inkubasi jam ke-16 P3: MRSB+Inulin 1% W3: Inkubasi jam ke-18 P4: MRSB+FOS 1%
+Inulin 1% W4: Inkubasi jam ke-20
W5: Inkubasi jam ke-22
Penambahan  prebiotik  dengan  waktu  inkubasi berbeda  secara  keseluruhan  mampu  mempengaruhi pertumbuhan Bifidobacterium sp.  Bb2E  (Gambar  1.). Fermentasi prebiotik sangat dipengaruhi  oleh  enzim  yang dihasilkan  oleh  probiotik  untuk  dapat  memecah  prebiotik tersebut  menjadi  komponen  yang  lebih  sederhana. Menurut  Setiarto  (2017),  probiotik  seperti  Lactobacillus dan  Bifidobacteria  mampu  menghasilkan  enzim  β- fruktofuranosidase  yang  dapat  memecah  inulin  dan  FOS menjadi  fruktosa  yang  kemudian  menjadi  SCFA  yang esensial.  Lopes et  al .  (2016)  menyatakan  bahwa fermentasi  berbagai  macam  karbohidrat  bergantung  dari sistem  enzimatik  yang  dimiliki  oleh  bakteri.  Enzim  β- fruktofuranosidase  akan  menghidrolisis  gugus  fruktosa pada  bagian  terminal  posisi  β-2,1  yang  berperan  dalam metabolism  fruktan.  Faktor  yang  berhubungan  dengan polisakarida  yang  mempengaruhi  proses  fermentasi diantaranya yaitu struktur sakarida (ikatan glikosidik) dan derajat polimerisasi (panjang rantai).
Bifidobacterium sp. Bb2E mengalami pertumbuhan paling optimal dengan penambahan kombinasi  prebiotik  inulin+FOS  dalam  medium  MRSB, sedangkan  penambahan  FOS  pada  medium  MRSB  untuk pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E memiliki pertumbuhan  yang  paling  lambat  jika  dibandingkan dengan  kontrol.  Menurut  Setiarto  (2016),  FOS  memiliki DP yang lebih rendah dari inulin, karena FOS merupakan hasil  hidrolisis  parsial  dari  inulin.  Medium  dengan penambahan  FOS  lebih  cepat  dimanfaatkan  oleh probiotik.  Lopes et  al. (2016)  menyatakan  bahwa  setiap prebiotik  memiliki  spesifitas  sendiri  untuk  tiap  genera bahkan  spesies  probiotik.  Optimalisasi  pertumbuhan
probiotik  perlu  dilakukan  penelitian  secara  spesifik  pula untuk mengetahui prebiotik terbaik untuk spesies tersebut. Kombinasi  prebiotik  seperti  inulin+FOS  menunjukkan hasil  pertumbuhan Bifidobacterium sp.  Bb2E  tertinggi dari  awal  hingga  akhir.  Hal  ini  membuktikan  bahwa prebiotik  sangat  berpengaruh  terhadap  pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E.
Perlakuan kontrol dan penambahan FOS 1% pada jam  ke-22  sudah  memasuki  fase  stasioner,  namun  untuk perlakuan  penambahan  inulin  1%  dan  penambahan  FOS 1%+inulin  1%  masih  dalam  fase  eksponensial  akhir karena  kepadatannya  masih  bertambah  meskipun  tidak signifikan  (Gambar  1.).  Menurut  Nuraida et  al. (2011), selain  derajat  polimerisasi  dan  ikatan  glikosidik, konsentrasi prebiotik yang ditambahkan juga mempengaruhi  pertumbuhan  probiotik.  Setiarto  (2017) menyatakan bahwa pertumbuhan probiotik semakin  cepat jika konsentrasi prebiotik yang diberikan semakin banyak. Probiotik  memasuki  fase  stasioner  apabila  sumber  nutrisi yang  digunakan untuk  metabolisme sudah  mulai  menipis. Konsentrasi  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  untuk setiap  prebiotik  sama,  yaitu  1%.  Menurut  Artanti  (2009), Perbedaan  respon  tiap  strain  terjadi  karena  perbedaan pengkodean gen dalam sistem metabolik yang berpengaruh terhadap nilai aktivitas prebiotik. Pemanfaatan prebiotik oleh BAL membutuhkan keberadaan  sistem  transportasi  dan  hidrolisis  yang spesifik.  Genera  Bifidobacteria  memiliki  spesifitas berbeda  terhadap  fruktan,  tidak  hanya  dalam  hal kemampuan  fermentasi,  juga  dalam  hal  kemampuan menginduksi enzim yang terletak berbeda (intraseluler dan ekstraseluler) (Rossi, 2005).
Gambar 1.   Kepadatan  Populasi  Berdasarkan  Pengukuran  Absorbansi  Isolat Bifidobacterium sp.  Bb2E  dengan Penambahan Prebiotik dan Waktu Inkubasi Berbeda
Pertumbuhan Bifidobacterium sp.  Bb2E  juga dipengaruhi  oleh  nilai  pH  (Gambar  2.)  dan  kadar  asam laktat  (Gambar  3.).  Fermentasi  prebiotik  oleh  probiotik akan  menghasilkan  SCFA,  dimana  dengan  diproduksinya SCFA  sebagai  hasil  fermentasi  maka  akan  menurunkan nilai pH dan asam laktat. Menurut Al Faridhi et al. (2013), bakteri  asam  laktat  akan  memfermentasi  prebiotik  dan menghasilkan peningkatan jumlah produk asam laktat dan asam-asam  organik  berantai  pendek  seperti  asam  asetat, butirat propionat sehingga pH medium akan turun.
Derajat  keasaman  dapat  mendukung  kepadatan populasi Bifidobacterium sp.  Bb2E.  Semakin  tinggi kepadatan  populasinya,  semakin  cepat  dan  banyak  laju fermentasinya,  sehingga  SCFA  yang  semakin  banyak mengakibatkan  terjadinya  penurunan  pH  medium. Perlakuan penambahan FOS 1%+inulin 1% memiliki nilai pH  terendah  pada  waktu  inkubasi  jam  ke-22  yaitu  5,16,
sedangkan  untuk  waktu  inkubasi  yang  sama,  perlakuan penambahan  FOS  1%  memiliki  pH  5,52.  Hal  ini  juga berkorelasi dengan berpengaruhnya penambahan prebiotik dalam  medium  untuk  pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E.  Bifidobacteria  memiliki  sifat  heterofermentatif, dimana  aktivitas  metabolismenya  memanfaatkan  jalur  6- fosfoglukonat/fosfoketolase  dan  mampu  menghasilkan asam  laktat  beserta  produk  sampingannya  seperti  asam asetat,  CO2,  asam  butirat,  etanol,  mannitol  dan  beberapa senyawa  lainnya.  Produktivitas  asam  laktat  tidak  setinggi bakteri  asam  laktat  yang  bersifat  homofermentatif  karena dapat  menghasilkan  asam  laktat  dua  kali  lebih  banyak dibandingkan  dengan  bakteri  heterofermentatif  (Surono, 2004).
Gambar 2.   Pengaruh  pH  terhadap  Isolat Bifidobacterium sp.  Bb2E  dengan  Penambahan  Prebiotik  dan  Waktu  Inkubasi Berbeda
Kadar asam  laktat tertinggi pada akhir inkubasi yaitu sebesar 1,36 ditunjukkan oleh perlakuan penambahan  inulin  1%+FOS  1%  dan  kadar  asam  laktat terendah  pada  akhir  inkubasi  didapat  oleh  perlakuan kontrol  sebesar  1,14  (Gambar  3.).  Menurut  Nurjannah et al. (2017),  asam  laktat  (C3H6O3)  merupakan  hasil metabolit  primer  dari  fermentasi  yang  merupakan  jenis asam  yang  mudah  terdisosiasi  menjadi  ion  H + dan
CH3CHOHCOO - ,  sehingga  semakin  tinggi  konsentrasi asam  laktat  akan  menghasilkan  konsentrasi  ion  H + yang semakin  tinggi  sehingga  pH  akan  semakin  rendah. Fermentasi  asam  laktat  dengan  memanfaatkan  prebiotik akan  menghasilkan  ATP.  ATP  berperan  penting  dalam proses  pertumbuhan  karena  merupakan  sumber  energi dalam  aktivitas  sel,  salah  satunya  adalah  pertumbuhan (Artanti, 2009).
Gambar 3.   Pengaruh  Kadar  Asam  Laktat  terhadap  Isolat Bifidobacterium sp.  Bb2E  dengan  Penambahan  Prebiotik  dan Waktu Inkubasi Berbeda
Seluruh  senyawa  prebiotik  yang  masuk  dalam saluran  pencernaan  manusia  akan  mengalami  fermentasi oleh  bakteri  di  usus  besar  melalui  beberapa  jalur metabolisme  untuk  fermentasi  prebiotik.    Produk  utama dari  fermentasi  inulin  adalah  butirat  sedangkan  produk utama  dari  fermentasi  FOS  adalah  asam  asetat  dan  asam laktat.  Banyaknya  asam  laktat  yang  terbentuk  sebagai hasil  metabolisme  prebiotik  berkaitan  dengan  semakin meningkatnya  jumlah  populasi  BAL  yang  menggunakan prebiotik  tersebut  sebagai  sumber karbon  untuk pertumbuhannya (Setiarto, 2017).

## SIMPULAN
Simpulan dari penelitian kali ini yaitu penambahan  prebiotik  inulin  dan  fruktoooligosakarida (FOS)  dalam  medium  dapat  meningkatkan  pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E.,  waktu  inkubasi  18  jam merupakan waktu optimal untuk meningkatkan pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E, dan penambahan prebiotik  kombinasi  FOS  1%+inulin  1%  dengan  waktu inkubasi 18 jam menghasilkan pertumbuhan Bifidobacterium sp. Bb2E tertinggi.

## DAFTAR REFERENSI
Association  of  Official  Analytical  Chemist  (AOAC).,
1995, Official  Methods  of  Analysis  of  the Association  of  Official  Analytical  Chemist .  Inc., Arlington, Virginia
Collins,  M.  D.,  &  Gibson  G.  R.,  1999,  Probiotics, Prebiotics,  and  Synbiotics:  Approaches  for Modulating the Microbial Ecology of the Gut. The American  Journal  of  Clinical  Nutritions ,  69  : 1052S-1057S.
Fardiaz,  S.,  1990, Penuntun  Praktek  Mikrobiologi Pengolahan Pangan. Program Studi Ilmu Pangan . Program  Pasca  Sarjana.  Bogor:  Institut  Pertanian Bogor.
Ganzle,  M.  G.  &  R.  Follador,  2012,  Metabolism  of Oligosaccharides  and  Starch  in  Lactobacilli. Frontiers in Microbiology , 3(340): 1-15.
Hegar,  B.,  2017,  Kesehatan  Saluran  Cerna  pada  Awal Kehidupan untuk Kesehatan pada Masa Mendatang. Jurnal  Kedokteran  Indonesia ,  5(2): 73-77.
Indrato, A.F., Sulistyarsi, A. & Ardhi, M.W., 2017, Isolasi Bakteri  Probiotik  dari  Usus  Ikan  Lele  Untuk Fermentasi  Yoghurt  Sebagai  Bahan  Modul Berbasis  Riset  dan  Keterampilan  Proses  Sains. In Prosiding Seminar Nasional SIMBIOSIS , 2 : 315- 328.
Jagadeeshwari, P. A. T., 2019, Correlation of Direct Gram Smear Findings with Bacterial Isolation in Sputum of  Patients. Indian  Journal  of  Applied  Research , 9(11) : 68-69.
Lopes, S.M.S., Francisco, M.G., Higashi, B., de Almeida, R.T.R., Krausová, G., Pilau, E.J., Gonçalves, J.E., Gonçalves,  R.A.C.  &  de  Oliveira,  A.J.B.,  2016, Chemical  Characterization  and  Prebiotic  Activity of Fructo-Oligosaccharides
From Stevia Rebaudiana  (Bertoni)  Roots  and  In  Vitro Adventitious Root Cultures. Carbohydrate polymers , 152 : 718-725.
Khoiriyah  H,  &  Ardiningsih  P.,  2014,  Penentuan  Waktu
Inkubasi Optimum terhadap Aktivitas Bakteriosin Lactobacillus Sp. RED. Jurnal Kimia Khatulistiwa , 3(4) : 14-20. Markowiak,  P.  &  Katarzyna  S.,  2017,  Effects  of
Probiotics,  Prebiotics,  and  Synbiotics  on  Human Health. Nutrients , 9(1021) : 1-30.
Martinez,  F.A.C.,  Eduardo,  M.B.,  Attilio,  C.,  Paul  D.  C.,
&  Ricardo,  P.S.O.,  2013.  Bacteriocin  Production By
Bifidobacterium Spp. A Review. Biotechnology Advances , 31 : 482-488.
Nuraida,  L.,  Nur  R.  M.,  Didah  N.  F.,  &  Hana,  2011, Metabolisme  Prebiotik  Oleh  Kandidat  Probiotik Isolat  ASI  sebagai  Dasar  Pengembangan  Produk Sinbiotik. Jurnal  Teknol.  dan  Industri  Pangan , 21(2) : 156-163.
Nurjannah,  L.,  Suryani.,  Achmadi,  S.  S.,  &  Azhari,  A., 2017.  Produksi  Asam  LaktatOleh Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus dengan  Sumber Karbon Tetes Tebu. JTIP Indonesia , 9(1) 1-9.
Rossi,  M.,  Corradini,  C.,  Amaretti,  A.,  Nicolini,  M., Pompei,  A.,  Zanoni,  S.  &  Matteuzzi,  D.,  2005, Fermentation of Fructooligosaccharides and Inulin by  Bifidobacteria:  A  Comparative  Study  of  Pure and  Fecal  Cultures. Applied  and  environmental microbiology , 71 (10) : 6150-6158.
Setiarto,  R.  H.  B.,  Nunuk  W.,  Iwan  S.,  &  Rina  M.  S., 2016,    Pengaruh  Variasi  Konsentrasi  Inulin  pada Proses Fermentasi oleh Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus . Biopropal Industri , 8(1): 1-17.
Setiarto,  R.  H.  B.,  Nunuk  W.,  &  Nimas  A.  R.,  2017, Optimasi  Konsentrasi  Fruktooligosakarida  untuk Meningkatkan  Pertumbuhan  Bakteri  Asam  Laktat Starter  Yoghurt. Jurnal  Veteriner ,  18(3)  :  428- 440.
Sharah,  A.,  Karnila,  R.,  &  Desmelati,  2015,  Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat yang di Isolasi dari Ikan Peda Kembung ( Rastrelliger Sp.) , JOM : 1-8. Surono,  I.S.,  2004. Probiotik  Susu  Fermentasi  dan Kesehatan . Jakarta:Tri Cipta Karya.
Usmiati,  S.  &  Juniawati,  2011,  Karakteristik  Dadih Probiotik Menggunakan Kombinasi Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, dan Bifidobacterium  longum Selama  Penyimpanan. Journal of Nutrition and Food, 6(1) : 1-12.
Vrese, D., & Marteau S., 2008, Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics. Food  Biotechnology,  Advances  in Biochemical Engineering: 1-66.
Wahyuningsih,  N.  &  Zulaika,  E.,  2019,  Perbandingan Pertumbuhan  Bakteri  Selulolitik  pada  Media Nutrient  Broth  dan  Carboxy  Methyl  Cellulose. Jurnal Sains dan Seni ITS , 7 (2): 36-38.
Yohan, Y., Astuti, F., & Wicaksana, A., 2018, Pembuatan
Spektrofotometer Edukasi untuk Analisis
Senyawa  Pewarna  Makanan. Chimica  et  Natura Acta , 6 (3) : 111-115 .