Desain Vaksin Berbasis Epitop dengan Pendekatan Bioinformatika untuk Menekan Glikoprotein Spike SARS-CoV-2
Epitope-Based Vaccine Design with Bioinformatics Approach to

## Suppress Spike Glycoprotein of SARS-CoV-2
M. Afrizal Firmansyah, Aris Susilo, Septina D. Haryanti, Rina Herowati* Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi email: 24185668a@mhs.setiabudi.ac.id, rinaherowati@setiabudi.ac.id*
(tanggal diterima: 02-09-2021 , tanggal disetujui: 04-10-2021)

## INTISARI
Vaksinasi menjadi salah satu kunci pencegahan penyebaran Covid-19. Rekayasa teknologi berbasis pelemahan virus  perlu diterapkan dalam pengembangan vaksin. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan rancangan vaksin berbasis epitop yang memiliki resiko reaksi alergi yang lebih rendah, aman, dan murah.
Rancangan  vaksin  diawali  dengan  pengambilan  data  sekuens  SARS-CoV-2,  analisis filogenetika,  prediksi  antigenisitas  protein,  dan  identifikasi  epitop  sel  T.  Selanjutnya  dilakukan konservasi epitop dan prediksi imunogenitas, serta analisis penambatan molekuler untuk melihat interaksi antara epitop dengan alel. Tahapan berikutnya dilakukan prediksi epitop sel B, prediksi population coverage , konstruksi dan visualisasi desain vaksin, analisis struktur dan validasi, analisis interaksi antara vaksin dengan TLR 3 dan TLR 4, serta evaluasi imunogenitas desain vaksin. Semua tahap dilakukan menggunakan webserver yang sesuai.
Desain vaksin yang dihasilkan memiliki antigenitas 0,5134, tidak toksik, dan tidak bersifat alergen. Parameter fisika kimia memenuhi syarat kecuali BM yang kurang dari 40 KDa. Hasil desain vaksin  diprediksi  memiliki population  coverage 95,14%  untuk  populasi  Indonesia.  Hasil  prediksi imunogenitas desain vaksin menunjukkan peningkatan IgM dan IgG hingga hari ke-35.
Kata kunci : desain vaksin; coronavirus; epitop; glikoprotein Spike
ABSTRACT
Vaccination  is  one  of  the  main  prevention  of  the  spread  of  Covid-19.  Technological engineering based on virus attenuation has been applied in vaccine development. This study aims to obtain an epitope-based vaccine design with low risk of allergic reactions, safe, and inexpensive.
The design of the vaccine  was conducted by  the collection of SARS-CoV-2 sequence data, phylogenetic analysis, prediction of protein antigenicity, and identification of CD 8+ T cell epitopes. Furthermore,  epitope conservation and immunogenicity  prediction, as well as molecular  docking analysis were carried out to see the interaction between epitopes and alleles. The next step was B cell  epitope  prediction,  population  coverage  prediction,  construction  and  visualization  of  vaccine design, structural analysis and validation, interaction analysis between vaccines with TLR 3 and TLR 4, and evaluation of vaccine design immunogenicity. All stages were carried out using the appropriate webserver.
The  designed  vaccine  had  an  antigenicity  of  0.5134,  not  toxic,  and  not  allergenic.  The physicochemical parameters met the requirements except for the molecular weight which was less than 40 KDa. The designed vaccine was predicted to have a population coverage of 95.14% for the Indonesian population. The results of the immunogenicity prediction of the vaccine design showed an increase of IgM and IgG until day 35.
Keyword : vaccine design; coronavirus; epitope; Spike glycoprotein

## 1. PENDAHULUAN
Dunia  saat  ini  memerangi  pandemi  global  yang  muncul  pada  akhir  tahun 2019  dan  kemudian  berkembang  pesat.  Sekelompok  kasus  pneumonia  dengan etiologi  yang  tidak  diketahui  dilaporkan  di  Wuhan,  ibukota  Provinsi  Hubei  di Republik  Rakyat  Cina.  Penyebab  wabah  ini  adalah  virus  corona  baru  yang  diberi nama severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2) . Kondisi klinis yang  terkait  dengan  virus  corona  baru  ini  disebut  sebagai coronavirus  disease (Covid-19) . World  Health  Organization (WHO)  pada  11  Maret  2020 mengkategorikan wabah Covid-19 sebagai pandemi.(1) Pengembangan vaksin yang aman dan efektif terhadap SARS-CoV-2 sangat penting  untuk  menghambat  penyebaran  Covid-19.  Saat  ini  telah  ada  beberapa vaksin  Covid-19  yang  digunakan,  yang  dirancang  dengan  strategi  yang  berbeda- beda,  yaitu  vaksin  mRNA,  vaksin  vektor  virus,  vaksin whole-pathogen  inactivated virus , vaksin subunit, dan vaksin virus particle like . (2) Rekayasa teknologi dalam vaksin  berbasis  pelemahan  virus  juga  telah  digunakan  dalam  pengembangan genetika  arah-balik  untuk  virus  corona  termasuk  SARS-CoV  dan  MERS-CoV. Metodologi  ini  memungkinkan  terjadi  penghapusan  protein  amplop.  Penggunaan vaksin  yang  dilemahkan  mempunyai  beberapa  resiko  seperti  terjadinya  kembali virulensi  dan  cedera  jaringan  yang  memicu  terjadinya  perkembangan  infeksi sekunder yang lebih parah (3). Vaksin DNA yang telah dicoba baik pada manusia maupun  hewan  menunjukkan  beberapa  kelemahan  terutama  pada  masalah penghantaran sehingga mengurangi tingkat imunogenisitas vaksin DNA (4).
Berbagai penelitian menunjukkan bahwa vaksin mRNA, vaksin DNA, vaksin inaktif  ataupun  vaksin  yang  dilemahkan  yang  memiliki  risiko  reaksi  yang  tidak diinginkan.  Vaksin  sub  unit  merupakan  pengembangan  vaksin  yang  dibuat  dari bagian  tertentu  mikroorganisme  yang  imunogenik.  Vaksin  sub  unit  memiliki kelebihan dibandingkan vaksin dengan metode yang lain yaitu reaksi alergi yang rendah,  aman,  dan  pengembangan  metode  yang  murah.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mendapatkan  desain  vaksin  berbasis  epitop  yang  dapat  bermanfaat  bagi perkembangan vaksin di Indonesia.

## 2. METODE PENELITIAN 2.1. ALAT DAN BAHAN
Peralatan yang digunakan adalah komputer dengan prosesor Intel ® Core™ i7 3770 @ 3,40 GHz, RAM 8.00 GB Dual-Channel DDR3 @ 665MHz. Perangkat lunak yang  digunakan  adalah  MEGA-X. Database dan webserver yang  digunakan ditunjukkan pada tabel 1. Bahan yang digunakan adalah sekuens protein spike SARS- CoV-2 yang didapatkan dari database NCBI dan Uniprot.

## 2.2. CARA KERJA
Pengambilan Data Sekuens SARS-CoV-2 dan Analisis Filogenetika Data sekuens SARS-CoV-2 diambil dari database UniProt dan NCBI. Fungsi, struktur, dan evaluasi sekuens didasarkan pada uji sekuens homolog menggunakan BLASTp, kemudian dilakukan Multiple Sequence Allignment dan analisis filogenetika
menggunakan  perangkat  lunak  MEGA-X  untuk  mengetahui  mutasi-mutasi  yang terjadi pada virus SARS-Cov 2. (5,6).
Tabel 1. Database dan webserver yang digunakan
Database/webserver Alamat Website NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Uniprot https://www.uniprot.org/ BLASTp https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins VaxiJen 2.0 http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html NetCTL 1.2 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/ IEDBAR http://tools.iedb.org/mhci Tepitool IEDB http://tools.iedb.org/tepitool/ HDOCK http://hdock.phys.hust.edu.cn/ http://tools.iedb.org/population/ trRosetta https://yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta/ ProtParam https://web.expasy.org/protparam/ AllerTOP v. 2.0 https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/ SOPMA https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html GalaxyRefine2 http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type=REFINE2 Swiss-Model https://swissmodel.expasy.org/assess ERRAT https://saves.mbi.ucla.edu/ PyDock https://life.bsc.es/pid/pydockweb C-IMMSIM https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index.php?page=1
Prediksi Antigenitas Sekuens Protein
Sekuens  yang  telah  didapat  dilakukan  analisa  antigenitas  dengan menggunakan webserver VaxiJen 2.0  dengan pengaturan nilai ambang ( threshold ) 0,4 untuk meningkatkan akurasi prediksi untuk model vaksin. (7) Prediksi Epitop dan Analisis Penambatan Molekuler antara Epitop dan Alel Webserver NetCTL  1.2  digunakan  untuk  mengidentifikasi  epitop  sel-T dengan  pengaturan  ambang  0,95  untuk  mempertahankan  sensitivitas  dan spesifisitas. Webserver ini  memperluas  prediksi  untuk  12  super-tipe Major Histocompatibility  Complex kelas  I  (MHC-I)  dan  menyatukan  prediksi  pengikatan peptida MHC-I, pembelahan terminal-C proteasom dengan efisiensi pengangkutan TAP,  dan  diprediksi  afinitasnya  terhadap  MHC-I  menggunakan  program  IEDBAR. Epitop dengan nilai IC 50 <200 nm dilakukan pengujian antigenitas dengan threshold 0,4. (7)
Prediksi epitop sel T CD4+ dilakukan menggunakan webserver Tepitool IEDB. Prediksi dilakukan menggunakan metode IEDB Recommended dan kriteria seleksi epitop menggunakan metode 7 alel. Ukuran epitop hasil prediksi diatur sepanjang 15 mer. Lima epitop teratas berdasarkan nilai kuartil dipilih untuk dianalisis lebih lanjut.  Epitop  hasil  prediksi  kemudian  diprediksi  nilai  antigenisitasnya menggunakan  server  Vaxijen  2.0  dengan  nilai  threshold  0,4.  Epitop  dengan  nilai antigenisitas di atas threshold digunakan untuk analisis lebih lanjut.(8) Analisis  penambatan  molekuler  epitop  dan  alel  menggunakan webserver HDOCK. Alel HLA-A 11*01 dan HLA DPA 1*01 dianggap sebagai protein reseptor
sedangkan  epitop  sebagai  ligand.  Hasil  penambatan  molekuler  disajikan  sebagai skor  negatif  dalam  kcal/mol,  menyatakan  nilai  afinitas  pengikatan  antara  ligan dengan reseptor. (9)
Prediksi Epitop Sel B
Prediksi  epitop  sel  B  bertujuan  untuk  mengidentifikasi  antigen  potensial yang  akan  menimbulkan  imunitas  humoral.  Deteksi  epitop  sel  B  dilakukan menggunakan webserver IEDB  untuk  mengidentifikasi  antigenisitas  sel  B.  Epitop dengan  panjang  12  mer  dipilih  untuk  analisis  imunogenitas,  antigenitas,  dan toksisitas. (10,11)
Prediksi Population Coverage
Berdasarkan  nilai  afinitas  tertinggi  terhadap  MHC-I  dan  MHC-II  diambil masing-masing 5 epitop untuk diprediksi population coverage . Population coverage menghitung fraksi individu  yang diprediksi merespons set epitop yang diberikan berdasarkan  frekuensi  genotip  HLA  dan  berdasarkan  data  pengikatan  MHC dan/atau  pembatasan  sel  T. Population  coverage dianalisis  untuk  populasi  di Indonesia.(12)
Konstruksi Vaksin Dan Visualisasi 3d Desain Vaksin Epitop yang telah didapatkan dari MHC-I atau Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) atau  CD  8+,  MHC-II  atau Cell  T  Helper (CTH)  atau  CD  4+,  dan  sel  B  kemudian dirangkai  dengan 5 epitop CTL, 5 epitop CTH, dan 3 Sel B. Adjuvan  yang dipakai adalah  50S Ribosomal  Protein L7/L12 sequencing  adjuvan yang  diambil  dari database Uniprot. Rangkaian adjuvan dan epitop kemudian divisualisasi 3D dengan webserver trRosetta sebagai kandidat desain vaksin. (13,14) Analisis Struktur Primer, Sekunder, Tersier, dan Validasi Analisis struktur primer dimulai dengan analisis Blastp untuk mengetahui persamaan desain vaksin dengan protein manusia. Selanjutnya dilakukan analisis sifat  fisikokimia  desain  vaksin  dengan webserver ProtParam,  diuji  alergenitas dengan AllerTOP 2.0, dan antigenitas dengan VaxiJen 2.0. Analisis struktur sekunder dan konstruksi desain vaksin dilakukan dengan SOPMA. (15–17)
Analisis  struktur  tersier  dilakukan  dengan webserver GalaxyRefine2 untuk memodifikasi 3D struktur. Ramachandran Plot Analysis menggunakan Swiss-Model dilakukan untuk menganalisis kualitas struktur, dan untuk validasi struktur desain vaksin digunakan webserver ERRAT. (18,19) Analisis Interaksi antara Vaksin dengan TLR 3 dan TLR 4
Analisis  penambatan  molekuler  epitop  dan  alel  menggunakan  webserver HDOCK.  Protein  TLR  3  dan  TLR  4  dianggap  sebagai  protein  reseptor  sedangkan desain  vaksin  sebagai  ligand.  Hasil  docking  disajikan  sebagai  skor  negatif  dalam kkal/mol,  karena  afinitas  pengikatan  ligan  dengan  reseptornya  dihitung  sebagai nilai  negatif  (8).  Analisa  desolvation  dan  Elektrostatis  menggunakan  web  server PyDock.  (20)

## Evaluasi Imunogenitas Desain Vaksin
Evaluasi  imunogenitas  dilakukan  dengan webserver C-IMMSIM.  IMMSIM akan  memprediksi  desain  vaksin  dalam  meningkatkan  dan  menghasilkan  respon imun seperti kadar imunoglobulin, jumlah sel NK, sel T, sel B, dan makrofag. (21,22)

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Data Sekuens SARS-CoV-2 dan Analisis Filogenetika
Data sekuens yang digunakan adalah bagian dari protein spike virus (Tabel 2).  Evaluasi  sekuens  homolog  menggunakan webserver BLASTp  dilakukan  untuk membandingkan sebuah sekuens protein dengan sekuens protein dari database (5). Multiple Sequence Alignment dengan perangkat lunak MEGA-X dilanjutkan dengan analisis  filogenetika  untuk  mengetahui  kekerabatan  virus  SARS-CoV-2  dan perbedaan mutasi pada protein Spike (6).
Tabel 2. Data Sekuens Protein Spike SARS-CoV-2
No Nama Sekuens ID Sekuens Bank Data 1 Chain C, spike glycoprotein 6WPT NCBI 2 Spike D614G [Expression vector SARSCoV2SD614G] QTA38988.1 NCBI 3 Spike E484K [Expression vector SARS-CoV-2-S-E484K] QRZ20975.1 NCBI 4 Spike glycoprotein [Civet SARS CoV 007/2004] AAU04646.1 NCBI 5 Spike N501Y [Expression vector SARSCoV2SN501Y] QTA38987.1 NCBI 6 Spike P681H [Expression vector SARSCoV2SP681H] QTA38989.1 NCBI 7 Spike protein [Bat SARS CoV Rm1/2004] ABD75332.1 NCBI 8 Spike_SARS2 P0DTC2.1 Uniprot

## Gambar 1. Diagram Filogenetika
Hasil analisis filogenetika (gambar 1) menunjukkan sekuens yang dianalisis mempunyai kedekatan atau kekerabatan karena menempati cabang yang terdekat dengan  sekuens  standar  (pembanding).  Perangkat  lunak  Mega-X  berguna  untuk pengambilan  kesimpulan  hubungan  evolusi  dari  sekuens-sekuens  yang  homolog dan memperkirakan keragaman evolusi netral dan selektif di antara sekuens. Hasil analisis  diketahui  dari  tampilan  diagram  pohon  filogenetik  serta  hubungan kekerabatan yang ditunjukkan oleh jarak terdekat terhadap 8 sekuens. (23)
Dari  8  sekuens  didapatkan  3  kelompok,  1  sekuens  menjadi  standar dan  2 kelompok  sekuens  adalah  hasil  mutasi  dari  sekuens  standar.  Sekuens  standar adalah sekuens rantai C glikoprotein spike ( ID 6WPT). Sekuens ini terbagi menjadi dua  kelompok  yaitu  kelompok  dengan  perbedaan  sekuens  0,0109  (kedekatan sekuens  0,4607–0,4555)  dan  kelompok  dengan  perbedaan  sekuens  0,008–0,007 (kedekatan 0,4705).(6)

## Prediksi Antigenitas Sekuens Protein
Hasil prediksi antigenitas sekuens protein dengan VaxiJen 2.0 ditunjukkan pada  tabel  2.  VaxiJen  2.0  merupakan webserver yang  memprediksi  antigenitas sekuens protein(24). Sekuens dengan nilai antigenitas tertinggi  ( ID AAU04646.1) dipilih menjadi kandidat desain vaksin berbasis epitop (Tabel 3). Antigenitas akan memicu tingginya titer antibodi untuk melawan infeksi(25).
Tabel 3. Hasil Antigenitas Sekuens Protein
No ID Sekuens Nilai Antigenitas No ID Sekuens Nilai Antigenitas 1 P681H 0,4618 5 D614G 0,4583 2 6WPT 0,4587 6 E484K 0,4591 3 AAU04646.1 0,4803 7 N501Y 0,4602 4 ABD75332.1 0,4281 8 P0DTC2 0,4646
Prediksi Epitop dan Analisis Penambatan Molekuler antara Epitop dan Alel Hasil  identifikasi  epitop  sel-T  dengan webserver NetCTL  dan  hasil penambatan  molekuler  terhadap  MHC-1  ditunjukkan  pada  tabel  3.  Epitop  yang didapat  dari  setiap  supertipe  kemudian  dilakukan  uji  antigenitas  dengan menggunakan  VaxiJen  2.0,  4  epitop  dengan  antigenitas  tertinggi  setiap  supertipe dipilih untuk dilihat afinitas dan imunogenitasnya. Epitop dengan IC 50 <200 nm dan imunogenitas yang positif dilanjutkan dengan analisis penambatan molekuler untuk prediksi  afinitas.  Diperoleh  13  epitop  dengan  kriteria  IC 50 <200  nm  dan imunogenitas bernilai positif. (26).
Tiga  belas  epitop  yang  telah  didapatkan  diprediksi  strukturnya  dengan PEPFOLD dan dilakukan analisis penambatan molekuler terhada alel HLA-A 11*01 menggunakan webserver H-DOCK. Lima epitop dengan afinitas tertinggi digunakan dalam desain vaksin (Gambar 2).
Tabel 4. Antigenitas Epitop MHC-I dan Prediksi Afinitas terhadap Alel
Epitop Alel Antigenitas Energi ikatan (kcal/mol) QYIKWPWYV HLA-A*68:02,  HLA-A*24:02,  HLA-A*23:01, HLA-C*14:02 0,04571 -261,38 AEIRASANL HLA-B*44:02,  HLA-B*44:03,  HLA-B*40:02, HLA-B*40:01 0,09707 -210,93 QIAPGQTGV HLA-A*02:06, HLA-A*68:02, 0,00537 -195,75 GQTGVIADY HLA-A*30:02, HLA-B*15:25, HLA-B*15:01 0,25816 -192,73 GVIADYNYK HLA-A*30:01, HLA-A*68:01, HLA-A*11:01 0,04571 -173,86 DEIFRSDTL HLA-B*18:01 0,09307 -172,31 YEQYIKWPW HLA-B*40:02,  HLA-B*44:03,  HLA-B*44:02, HLA-B*18:01 0,06574 -158,37 WPWYVWLGF HLA-B*35:01,  HLA-B*53:01,  HLA-B*07:02, HLA-B*56:01 0,21624 -149,76 ATSTGNYNY HLA-A*11:01,  HLA-A*01:01,  HLA-A*29:02, HLA-A*30:02, HLA-B*15:25 0,21624 -146,40 VRFPNITNL HLA-B*27:05,  HLA-C*14:02,  HLA-C*12:03, HLA-C*07:02, HLA-C*07:01, HLA-C*06:02 0,32733 -146,15 RVVVLSFEL HLA-A*02:06,  HLA-C*15:02,  HLA-C*03:04, HLA-C*03:02 0,21624 -145,67 YECDIPIGA HLA-B*50:01, HLA-B*40:02 0,1748 -135,07 TSTGNYNYK HLA-A*68:01, HLA-A*11:01, HLA-A*30:01 0,02930 -133,03
Gambar 2. Interaksi antara desain vaksin (kuning) dan  reseptor HLAA11*01 (biru)
Tahapan yang sama juga dilakukan terhadap epitop MHC-II. Epitop MHC-II dengan  ukuran  15  peptida  dan  memiliki  afinitas  di  bawah  <50  nm  dipilih  untuk dilanjutkan dengan penilaian antigenitas. Didapatkan 6 epitop dengan antigenitas tertinggi  yang  dilanjutkan  ke  analisis  penambatan  molekul  terhadap  alel  MHC-II yaitu  HLA-DPA  1*01  (tabel  5).  Diperoleh  5  epitop  dengan  afinitas  tertinggi  yang merupakan kandidat vaksin berbasis epitop (Gambar 3).
Tabel 5. Antigenitas Epitop MHC-II dan Prediksi Afinitas terhadap Alel
Epitop Alel Antigenitas Energi ikatan (kcal/mol) MFIFLLFLTLTSGSD HLA-DPA1*01, DPB1*04:01, HLA- DPA1*01:03, DPB1*02:01, HLA- DPA1*02:01, DPB1*05:01, HLA- DPA1*03:01, DPB1*04:02, HLA- DRB1*04:01,  HLA-DRB1*04:05,  HLA- DRB1*11:01 0,6167 -264,53 AYFVGYLKPTTFMLK HLA-DPA1*02:01,  DPB1*01:01,  HLA- DPA1*02:01, DPB1*05:01 0,7088 -258,58 LYLTQDLFLPFYSNV HLA-DPA1*01:03,  DPB1*02:01,  HLA- DPA1*02:01, DPB1*05:01 0,4189 -257,25 GYQPYRVVVLSFELL HLA-DPA1*01, DPB1*04:01, HLA- DPA1*01:03, DPB1*02:01, HLA- DPA1*02:01, DPB1*01:01 1,0740 -219,76 RVVVLSFELLNAPAT HLA-DPA1*01, DPB1*04:01, HLA- DPA1*01:03, DPB1*02:01, HLA- DPA1*02:01, DPB1*01:01, HLA- DPA1*02:01, DPB1*05:01, HLA- DRB1*01:0 0,7089 -216,39 DEIFRSDTLYLTQDL HLA-DRB1*04:01,  HLA-DRB3*01:01, HLA-DPA1*02:01, DPB1*01:01 0,3818 -210,94
Gambar 3. Interaksi antara desain vaksin (jingga) dan  reseptor HLAA11*01 (hijau)

## Prediksi Epitop Sel B
Hasil prediksi epitop sel B menggunakan 6 metode ditunjukkan pada tabel 6. Diperoleh 112 epitop sel B dengan panjang peptida 6–12 mer. Epitop sel B dengan panjang 12 mer dipilih untuk desain vaksin. Diperoleh 5 epitop dengan panjang 12 mer, dengan data antigenitas, toksisitas, dan alerginitas ditunjukkan pada tabel 7.

## Tiga epitop dengan antigenitas tertinggi akan menjadi epitop dalam desain vaksin.
(26)
Tabel 6. Hasil Prediksi Epitop Sel B Metode Hasil Bepipred Linear Epitope Prediction Antigenitas epitop sel B antara 0,186-0,623 ( threshold 0,500). Epitop pada sekuen 500-516 diprediksi memiliki antigenitas terbaik (0,623). Emini Surface Accessibility Prediction Surface Accessibility 0,036-6,939 ( threshold 1.000), Epitop pada sekuens  896–901 diprediksi memiliki Emini Surface Accessibility
Prediction terbaik (6,939). Chou and Fasman Beta-Turn Prediction Epitop pada sekuens 458–464 ( threshold 0,997) diprediksi memiliki putaran Beta  terbaik (1,371) Karplus and Schulz Flexibility Prediction Epitop pada sekuens 664–670 diprediksi memiliki  fleksibilitas terbaik (1,124) Kolaskar and Tongaonkar Antigenicity Epitop pada sekuens 1209–1215 diprediksi memiliki  antigenitas terbaik (1,253) dengan threshold 1,039 Parker Hydrophilicity
Epitop pada sekuens 1236–1242 diprediksi memiliki hidrofilisitas terbaik (7,743) dengan threshold 1,256

## Tabel 7. Sel B Epitop
Epitop Antigenitas Toksisitas Alerginitas PIDVRDLPSGFN 1,5139 Non Toksik Non Alergen RNFFSPQIITTD 0,2816 Non Toksik Non Alergen TLIHAEQLTPAW 0,6664 Non Toksik Non Alergen TGVIADYNYKLP 0,9990 Non Toksik Non Alergen VSATKLNDLCFS 2,2210 Non Toksik Non Alergen
Prediksi Population Coverage
MHC-I dan MHC-II dengan afinitas tertinggi diambil masing-masing 5 epitop yang kemudian diprediksi population coverage , untuk menghitung fraksi individu yang  diprediksi  merespons  set  epitop  yang  diberikan  berdasarkan  frekuensi genotip  HLA  dan  berdasarkan  data  pengikatan  MHC  dan/atau  pembatasan  sel  T. Dilakukan  kalkulasi population  coverage menggunakan  kombinasi  MHC  I  dan  II untuk populasi di Indonesia. Frekuensi ekspresi tipe HLA yang berbeda bervariasi pada  etnis  yang  berbeda  karena  molekul  MHC  sangat  polimorfik.  Polimorfisme ekstrim  membatasi  proporsi  populasi  manusia  yang  dapat  merespon  antigen tertentu.  Jadi,  suatu  peptida  yang  berfungsi  sebagai  epitop  sel-T  dalam  suatu populasi  dengan  susunan  HLA  tertentu  mungkin  tidak  efektif  pada  populasi  lain dengan distribusi alel HLA yang berbeda sehingga mendapatkan desain vaksin yang maksimal  dalam  satu  populasi.  Diperoleh population  coverage untuk  Indonesia adalah 95,14%. (12).
Konstruksi Vaksin dan Visualisasi 3D Desain Vaksin Epitop yang telah didapatkan dari MHC-I atau Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) atau  CD  8+,  MHC-II  atau Cell  T  Helper (CTH)  atau  CD  4+,  dan  sel  B  kemudian dirangkai seperti pada gambar 5 dengan 5 epitop CTL, 5 epitop CTH, dan 3 Sel B. Adjuvan yang dipakai adalah β-Defensin, sekuens adjuvan diambil dari bank data
protein Uniprot. Rangkaian adjuvant dan epitop kemudian divisualisasi 3D dengan websever sebagai kandidat desain vaksin.
Gambar 4. Hasil Population Coverage di Indonesia
Analisis Struktur Primer, Sekunder, Tersier, dan Validasi Analisis Blastp untuk mengetahui persamaan vaksin dengan protein Homo sapiens . Hasil  menunjukkan  tidak  adanya  persamaan  lebih  dari  23%  dengan  beberapa protein manusia. Desain vaksin memiliki antigenitas 0,5134, tidak toksik, dan tidak bersifat alergen.

## Gambar 5. Rangkaian Desain Vaksin
Desain  vaksin  memiliki  berat  molekul  29,581  KDa.  Berat  molekul  desain  vaksin memiliki berat molekul dibawah standard untuk berat vaksin subunit yaitu 40-50
KDa. Terlalu rendahnya berat molekul didasarkan pada rendahnya berat molekul adjuvan  yang  digunakan  dalam  desain  vaksin.  Struktur  desain  vaksin  diprediksi stabil dengan instability index 14,96 dan theoretical pI 8,52. Prediksi waktu paruh pada mammalian reticulocytes secara in vitro lebih dari 30 jam, yeast in vivo lebih dari 20 jam, dan Escherichia coli , in vivo lebih dari 10 jam. Nilai Grand Average of Hydropathicity (GRAVY) adalah 0,153. (27) Hasil analisis struktur sekunder menggunakan SOPMA, menunjukkan bahwa struktur  vaksin  rancangan  terdiri  dari  24,46%  α-helix,  29,50% extended  strand , 4,32%  β-turn,  dan  41,73% random  coil .  Analisis  struktur  tersier  menggunakan Ramachandran  plot menunjukkan  vaksin  rancangan  memiliki  94,20%
Ramachandran  Favoured ,  0,36% Ramachandran  outliers , Mol  Probability 1,81, Rotamer  Outliers 0%,  RMSD  0,426,  0,0 Poor  Rotamer ,  dan  Z-score  -6,26.  Validasi struktur  menggunakan  Procheck  model  desain  vaksin  menunjukkan  0  error  dan model score 77,89% dalam analisa ERRAT.
Gambar 6 Sekuens Desain Vaksin
Gambar 7. Struktur 3D, Zeta score ,  dan Ramachandran plot dari Desain Vaksin Analisis Interaksi antara Vaksin dengan TLR 3 dan TLR 4
Interaksi  antara  desain  vaksin  dengan  sistem  imun  TLR  3  dan  TLR  4 dilakukan  dengan  HDOCK  untuk  melihat  kekuatan  ikatan,  sedangkan  untuk mengetahui  energi  desolvasi  dan  energi  elektrostatik  digunakan  PyDock. Penggunaan  TLR  3  dan  TLR  4  dikarenakan  protein  tersebut  dapat  menginduksi sistem imun setelah rekognisi virus.

## Evaluasi Imunogenitas Desain Vaksin
Analisis  sistem  imun  digunakan  untuk  mengetahui  desain  vaksin  dalam menimbulkan imunitas di dalam tubuh. Analisis desain vaksin memiliki peningkatan antibodi yang baik. Desain vaksin menunjukkan antibodi yang bertahan sampai 20
hari. Observasi sistem imun mengindikasikan desain vaksin dapat menjadi kandidat dalam pengembangan vaksin.(21)
Tabel 8. Energi ikatan desain vaksin terhadap TLR3 dan TLR4
Parameter Energi Ikatan (kkal/mol) TLR 3 TLR 4 Energi ikatan -363,71 -324,86 Energi desolvasi -211,71 -206,15 Energi elektrostatik -4,2 -3,6
Antigen mengalami peningkatan pada hari ke-5, dan mulai menurun hari ke- 20  artinya  tubuh  merespon  vaksin  sebagai  antigen  ditandai  dengan  peningkatan Imunoglobulin M (Ig M) dan Imunoglobulin G (Ig G) meningkat signifikan pada hari ke  20  dengan  titer  1000000  (gambar  8a).  Peningkatan  titer  Ig  M  dan  Ig  G menunjukkan vaksin memberikan pertahanan alami terhadap tubuh terhadap virus COVID-19.(21)
Gambar  8. Evaluasi Imunogenitas Desain Vaksin
(a) Kadar antigen , (b) Kadar sitokin
Respon imun humoral diawali dengan limfosit B menjadi satu populasi sel plasma yang akan melepaskan antibodi spesifik ke dalam darah. Sel B aktif terus mengalami  peningkatan  sampai  hari  ke  35  sehingga  sel  B  dalam  plasma  (PLB) mengalami  puncak  peningkatan  pada  hari  ke-20  dengan  populasi  600  mm 3 dan mengalami penurunan tetapi PLB masih tetap tinggi di hari ke-35 dengan populasi 300  mm 3 .  Sel  B  akan  dibantu  dengan  TH  ( T-helper ) dan  TR  ( T-regulatory ) untuk menyeimbangkan produksi antibodi dan menghasilkan antibodi yang dibutuhkan. Sel TH dan Sel TR mengalami peningkatan TH dengan populasi 18000 sel/mm 3 pada hari ke 35 dan 40 sel/mm 3 , Peningkatan TH dan TR memberikan produksi antibodi yang dibutuhkan oleh tubuh. Sel TC ( T Cytotoxic ) dengan populasi 1100 sel/mm 3 menghasilkan granul toksik yang mengandung enzim yang menginduksi kematian
sel target. Setelah aktivasi, sel B dan sel T meninggalkan sel-sel memori, yang akan mengingat setiap patogen spesifik yang dihadapi, dan mampu memberikan respon yang kuat dan cepat jika patogen terdeteksi lagi. (28)
Sel dendritik (DC) dan makrofag yang dihasilkan desain vaksin memiliki hasil yang  minim.  Sel  Dendritik  berfungsi  dalam  mengajarkan  sel-sel  imun  untuk menghasilkan  antibodi  sedangkan  makrofag  menghancurkan  sel  yang  rusak. Populasi  DC  hanya  di  kisaran  10  sel/mm 3 sedangkan  makrofag  mengalami peningkatan sampai hari ke-35 dengan populasi di kisaran 30 sel/mm 3 (29). Desain vaksin menghasilkan sitokin yang baik pada tipe IL-4, IL-12, TNF-α, IL-10, IL-6, IFN, b, IL-18, dan IL-23 (gambar 10b). Sedangkan IFN-γ dan TGF-β memberikan sinyal buruk  karena  vaksin  menimbulkan  hasil  berlebih.  Kelebihan  IFN-γ  dan  TGF-β memberikan efek samping demam hingga radang setelah vaksinasi. (28)

## 4. KESIMPULAN
Desain vaksin yang dihasilkan memiliki antigenitas 0,5134, tidak toksik, dan tidak  bersifat  alergen.  Parameter  fisika  kimia  memenuhi  syarat  kecuali  BM  yang kurang  dari  40  KDa.  Hasil  desain  vaksin  diprediksi  memiliki population  coverage 95,14%  untuk  populasi  Indonesia.  Hasil  prediksi  imunogenitas  desain  vaksin menunjukkan peningkatan IgM dan IgG hingga hari ke-35.

## 5. UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis menyampaikan terima kasih kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi atas Dana Hibah Program Kreativitas Mahasiswa Bidang Riset Eksakta 2021.

## 6. DAFTAR PUSTAKA
[1].   Ge H, Wang X, Yuan X, Xiao G, Wang C, Deng T, et al. The epidemiology and clinical  information  about  COVID-19.  Eur  J  Clin  Microbiol  Infect  Dis. 2020;39(6):1011–9. doi: 10.1007/s10096-020-03874-z
[2].   Pormohammad A, Zarei M, Ghorbani S, Mohammadi M, Razizadeh MH, Turner DL, et al. Efficacy and Safety of COVID-19 Vaccines: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Clinical Trials. Vaccines. 2021;9(467):1–21. doi: 10.3390/vaccines9050467
[3].   Bande F, Arshad SS, Hair Bejo M, Moeini H, Omar AR. Progress and challenges toward  the  development  of  vaccines  against  avian  infectious  bronchitis.  J Immunol Res. 2015;2015. doi: 10.1155/2015/424860
[4].   Flingai S, Czerwonko M, Goodman J, Kudchodkar SB, Muthumani K, Weiner DB. Synthetic DNA vaccines: Improved vaccine potency by electroporation and co- delivered  genetic  adjuvants.  Front  Immunol.  2013;4(NOV):1–10.  doi: 10.3389/fimmu.2013.00354
[5].   Ingrid  Lobo.  Basic  Local  Alignment  Search  Tool  (BLAST).  Nat  Educ. 2008;1(1):215.
[6].   Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, Tamura K. MEGA X: Molecular evolutionary genetics  analysis  across  computing  platforms.  Mol  Biol  Evol. 2018;35(6):1547–9. doi: 10.1093/molbev/msy096
[7].   Vita  R,  Mahajan  S,  Overton  JA,  Dhanda  SK,  Martini  S,  Cantrell  JR,  et  al.  The Immune  Epitope  Database  (IEDB):  2018  update.  Nucleic  Acids  Res. 2019;47(D1):D339–43. doi: 10.1093/nar/gky1006
[8].   Wang  H,  Zhang  Y,  Huang  B,  Deng  W,  Quan  Y,  Wang  W.  Development  of  an Inactivated  Vaccine  Candidate,  BBIBP-CorV,  with  Potent  Protection  against SARS  CoV-2.  Cell.  2020  ;  182  (August)  :  713–721.  DOI: 10.1016/j.cell.2020.06.008
[9].   Yan Y, Tao H, He J, Huang SY. The HDOCK server for integrated protein–protein docking.  Nat  Protoc  [Internet].  2020;15(5):1829–52.  Available  from: http://dx.doi.org/10.1038/s41596-020-0312-x.
[10].  Larsen JEP, Lund O, Nielsen M. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res. 2006;2(1):2. doi: 10.1186/1745-7580-2-2
[11].  Jespersen  MC,  Peters  B,  Nielsen  M,  Marcatili  P.  BepiPred-2.0:  Improving sequence-based  B-cell  epitope  prediction  using  conformational  epitopes. Nucleic Acids Res. 2017;45(W1):W24–9. DOI: 10.1093/nar/gkx346
[12].  Bui  HH,  Sidney  J,  Dinh  K,  Southwood  S,  Newman  MJ,  Sette  A.  Predicting population  coverage  of  T-cell  epitope-based  diagnostics  and  vaccines.  BMC Bioinformatics. 2006;7:1–5. DOI: 10.1186/1471-2105-7-153
[13].  Yang  J,  Anishchenko  I,  Park  H,  Peng  Z,  Ovchinnikov  S,  Baker  D.  Improved protein  structure  prediction  using predicted  interresidue  orientations.  Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(3):1496–503. doi: 10.1073/pnas.1914677117
[14].  Abraham Peele K, Srihansa T, Krupanidhi S, Ayyagari VS, Venkateswarulu TC. Design  of  multi-epitope  vaccine  candidate  against  SARS-CoV-2:  a  in-silico study.  J  Biomol  Struct  Dyn  [Internet].  2020;39(10):1–9.  Available  from: https://doi.org/10.1080/07391102.2020.1770127
[15].  Mahram  A,  Herbordt  MC.  Fast  and  accurate  NCBI  BLASTP.  2010;73. doi.org/10.1145/1810085.1810099
[16].  Dimitrov I, Bangov I, Flower DR, Doytchinova I. AllerTOP v.2 - A server for in silico prediction of allergens. J Mol Model. 2014;20(6). doi: 10.1007/s00894- 014-2278-5
[17].  Bjellqvist B, Hughes GJ, Pasquali C, Paquet N, Ravier F, Sanchez J ‐C, et al. The focusing  positions  of  polypeptides  in  immobilized  pH  gradients  can  be predicted from their amino acid sequences. Electrophoresis. 1993;14(1):1023–31. doi: 10.1002/elps.11501401163.
[18].  Heo L, Park H, Seok C. GalaxyRefine: Protein structure refinement driven by side-chain  repacking.  Nucleic  Acids  Res.  2013;41(Web  Server  issue):384–8. doi: 10.1093/nar/gkt458.
[19].  Farhani  I,  Nezafat  N,  Mahmoodi  S.  Designing  a  Novel  Multi-epitope  Peptide Vaccine  Against  Pathogenic  Shigella  spp.  Based  Immunoinformatics Approaches.  Int  J  Pept  Res  Ther  [Internet].  2019;25(2):541–53.  Available from: http://dx.doi.org/10.1007/s10989-018-9698-5
[20].  Jiménez-García B, Pons C, Fernández-Recio J. pyDockWEB: A web server for rigid-body  protein-protein  docking  using  electrostatics  and  desolvation scoring. Bioinformatics. 2013;29(13):1698–9. DOI:
10.1093/bioinformatics/btt262
[21].  Rapin  N,  Lund  O,  Bernaschi  M,  Castiglione  F.  Computational  immunology meets bioinformatics: The use of prediction tools for molecular binding in the simulation of the immune system. PLoS One. 2010;5(4). doi.org/10.1371/journal.pone.0009862
[22].  Kroger  AT,  Sumaya  C  V.,  Pickering  LK,  Atkinson  WL.  General Recommendations  on  Immunization  Recommendations.  Recomm  Reports. 2011;60(2):61–85.
[23].  Kumar  S,  Tamura  K,  Jakobsen  IB,  Nei  M.  MEGA2:  Molecular  evolutionary genetics  analysis  software.  Bioinformatics.  2002;17(12):1244–5.  DOI: 10.1093/bioinformatics/17.12.1244
[24].  Flower DR, Doytchinova I, Zaharieva N, Dimitrov I. Immunogenicity Prediction by VaxiJen: A Ten Year Overview. J Proteomics Bioinform. 2017;10(11):298– 310. DOI: 10.4172/jpb.1000454
[25].  Naz  A,  Shahid  F,  Butt  TT,  Awan  FM,  Ali  A,  Malik  A.  Designing Multi-Epitope Vaccines  to  Combat  Emerging  Coronavirus  Disease  2019  (COVID-19)  by Employing Immuno-Informatics Approach. Vol. 11, Frontiers in Immunology. 2020. doi.org/10.3389/fimmu.2020.01663
[26].  Rakib  A,  Sami  SA,  Mimi  NJ,  Chowdhury  MM,  Eva  TA,  Nainu  F,  et  al. Immunoinformatics-guided design of an epitope-based vaccine against severe acute  respiratory  syndrome  coronavirus  2  spike  glycoprotein.  Comput  Biol Med [Internet]. 2020;124(May):103967. Available from: https://doi.org/10.1016/j.compbiomed.2020.103967
[27].  Deléage G. ALIGNSEC: viewing protein secondary structure predictions within large  multiple  sequence  alignments.  Bioinformatics.  2017;33(24):3991–2. doi.org/10.1093/bioinformatics/btx521
[28].  Tahir ul Qamar M, Rehman A, Tusleem K, Ashfaq UA, Qasim M, Zhu X, et al. Designing  of  a  next  generation  multiepitope  based  vaccine  (MEV)  against SARS-COV-2:  Immunoinformatics  and  in  silico  approaches.  PLoS  One [Internet]. 2020;15(12
December 2020):1–25. Available from:
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0244176
[29].  Dar  HA,  Waheed  Y,  Najmi  MH,  Ismail  S,  Hetta  HF,  Ali  A,  et  al.  Multiepitope Subunit Vaccine Design against COVID-19 Based on the Spike Protein of SARS-
CoV-2: An in Silico Analysis. J Immunol Res. 2020;2020. doi.org/10.1155/2020/8893483