## Isolasi dan Identifikasi Bakteri Pembentuk Biofilm dari Tambak Udang Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Payau Jepara untuk Menghilangkan Amoniak

## Ria Azizah TN*, Ita Riniatsih, Delianis Pringgenis, Chrisna Adhi Suryono dan Suryono
Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. Soedarto, SH. Kampus UNDIP Tembalang, Semarang 50275 Email : riaazizahtn@yahoo.co.id

## Abstract
Brackish water shrimp aquaculture activities often result in organic waste from excess of unconsumed foodstuff and biological waste from shrimp biological waste. The high organic contents increase the levels of ammonia, which is toxic to shrimp and many other aqua lives. One of the most widely used organic material biodegradation system as biofilters, biofilm has not yet seen many uses in shrimp aquafarm waste management. This study aims to isolate and screen  biofilm-forming  primary  bacteria  with  abilities  to  degrade  ammoniacal  nitrogen compounds. The processes involved in this study are location survey, wooden and fiber panel installation,  planting  of  panel  in  the  ponds,  isolation  of  bacteria  by  dispersion  method, purification of  primary  bacteria  by  scratch  method.  Ammoniacal  nitrogen  degradation  test was performed by Microwell Plate Chromatogram Assay and UV-Vis Spectrophotometry. The analysis of the bacteria isolates found 66 primary bacteria with biofilm formation abilities. Based on  qualitative  analysis,  20  isolates  displayed  potential  in  degrading  ammoniacal  nitrogen compound and 7 isolates showed low (<10%) capacity in degrading ammoniacal nitrogen.
Key words: biofilm-forming primary bacteria, ammoniacal nitrogen, degradation

## Abstrak
Kegiatan budidaya udang di tambak akan menghasilkan limbah organik yang berasal dari sisa pakan yang tidak termakan maupun kotoran udang. Kandungan bahan organik yang tinggi akan meningkatkan kandungan amonia yang bersifat  toksik bagi udang dan biota air lainnya. Salah satu sistem biodegradasi bahan organik yang telah banyak digunakan sebagai bioﬁlter  namun  belum  dimanfaatkan  dalam  pengolahan  limbah  organik  tambak  udang adalah  bioﬁlm.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  mengisolasi  dan  skrining  bakteri  primer pembentuk bioﬁlm yang mampu mendegradasi senyawa amonia nitrogen. Untuk  mencapai tujuan tersebut, maka beberapa tahap penelitian yang telah dilakukan adalah survei lokasi tambak udang, pemasangan panel bahan kayu dan ﬁber,  penanaman panel dalam badan air tambak, mengisolasi bakteri dengan metode  sebaran, puriﬁkasi bakteri primer pembentuk bioﬁlm dengan metode goresan. Uji oksidasi amonium nitrogen dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif  dengan  metode Micro  well  plate  chromatogram  assay dan  UV-Vis Spektrofotometer.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  hasil  isolasi  diperoleh  sebanyak  66 isolat  bakteri  primer  pembentuk  bioﬁlm.  Berdasarkan  uji  kualitatif  diperoleh  20  isolat  yang memiliki potensi mendegradasi senyawa amoniurn nitrogen. Namun hasil uji kuantitatif bakteri seleksi  pendegradasi  amonium  nitrogen  menunjukkan  7  isolat  yang  memiliki  kemampuan rendah (< 10%) mendegradasi amonium nitrogen.
Kata kunci: bakteri primer pembentuk bioﬁlm, amonia nitrogen, degradasi

## PENDAHULUAN
Kegiatan budidaya udang di tambak menghasilkan  limbah  organik  baik  yang berasal  dari  sisa  pakan  yang  tidak termakan  maupun  kotoran  udang  serta plankton  yang  mati  (Suwoyo et  al., 2014). Sisa  pakan  dan  bahan  organik  berbentuk limbah  tersebut  dalam  industri  tambak udang dapat mencapai 60% dari total porsi pengeluaran usaha  budidaya udang dan hilang  begitu  saja  untuk  dibuang  ke perairan  di  sekitarnya.  Selain  kehilangan ongkos yang tinggi, limbah organik dapat mencemari  lingkungan  perairan  tambak maupun  lingkungan  pantai  sekitamya. Kandungan  bahan  organik  yang  tinggi akan meningkatkan kandungan ammonia yang bersifat toksik bagi udang dan biota air  lainnya.  Batas  kandungan  ammonia tertinggi  dalam  perairan  tambak  udang adalah 0,1 mg/l sedangkan batas tertinggi kandungan total bahan organik adalah 60 mg/1  (Hendrawati et  al., 2014)  Untuk mempercepat  penurunan  kandungan bahan  organik  dan  ammonia  yang beracun  tersebut  saat  ini  para  petani tambak  telah  menggunakan    bakteri pengurai. Akan tetapi, hasilnya tidak selalu baik  karena  bakteri  pengurai  (probiotik) membutuhkan  kondisi  dan  nutrisi  tertentu untuk mempertahankan keberadaannya.
Pemanfaatan  limbah  organik  untuk budidaya  sel  protein  tunggal,  seperti Spirulina telah banyak dilakukan akhir-akhir ini. Beberapa peneliti seperti Sumantri et al. (2010)  telah  memanfaatkan  mikroalgae untuk  pengolahan  air  limbah  cair  yang mengandung ammonia tinggi. Azizah et al . (1998)  telah  membudidayakan  Spirulina dengan menggunakan limbah cair. Hal ini dilakukan karena Spirulina dapat menyerap  ammonia  yang  terionisasi  atau ammonium  (NH4)  sebagai  nutrisi  untuk meningkatkan pertumbuhannya (Danesi et al .,  2002).  Namun  muncul  banyak kekhawatiran  pada  tingkat  keamanan penyediaan pangan dengan memanfaatkan  limbah, yaitu kontaminasi zat beracun dan bakteri patogen. Untuk itu perlu  dilakukan  upaya  upaya  dalam menurunkan  kandungan  bahan  organik yang  terkandung  dalam  limbah  organik dan  berupaya  memanfaatkan  limbah untuk kebutuhan manusia dengan aman.
Komunitas  bakteri  pada  bioﬁlm  ini dipercaya  akan  merubah  bahan-bahan organik  melalui  proses  amoniﬁkasi  dan nitriﬁkasi. Aplikasi bioﬁlm ini akan menurunkan  kadar  ammonia  dalam limbah  organik  tambak  udang  dan  akan meningkatkan  kadar  nitrat  didalamnya. Dalam  penerapannya  perlu  dilakukan ujicoba  penumbuhan  bioﬁlm  dengan menggunakan media berpermukaan yang luas sehingga dapat menampung pertumbuhan  bioﬁlm  lebih  padat  dan dapat  meningkatkan  biokonversi  limbah organik  tambak  udang.  Ketebalan  bioﬁlm menunjukkan padatnya komunitas mikroorganisme  penyusunnya  (Stanley et al .,  2005).  Untuk  itu  ujicoba  dengan menggunakan  substrat  yang  memiliki permukaan luas seperti
ﬁber bergelombang.  Tujuan  penelitian  ini adalah  melihat  aktifitas  bakteri  terhadap adanya biofilm pada tambak udang.

## MATERI DAN METODE
Materi  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  bakteri  pembentuk biofilm yang di substrat kayu dan fiber yang ditanam  pada  BBPBAP  (Balai  Besar Pengembangan  Budidaya  Air  Payau) Jepara. Bioﬁlm ditumbuhkan dengan cara merendam  kayu  dan  ﬁber  masing-masing sebanyak  2  set  di  area  pertambakan BBPBAP  (Balai  Besar  Pengembangan Budidaya Air Payau) Jepara.
Penelitian ini digunakan Media Zobell 2216E, pembuatan dengan cara ditimbang 15,0 gr Bacto-agar, 5,0 gr Bacto- peptone, 1,0 gr yeast ekstrak dan 19,5 mg Feri  fosfat,  dimasukkan  ke  dalam  labu Erlenmeyer  ditambahkan  air  laut  steril hingga  mencapai  volume  1  liter.  Pada Labu  erlenmeyer  tersebut  diletakkan magnetic  stirrer,    dipanaskan  di  atas  hot plate hingga mendidih dan homogen. pH ditentukan hingga 7,5 - 7,6 dan kemudian media  tersebut  disterilisasikan  dengan menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121°C dengan  tekanan  1  atm  selama  20  menit. (Nofiani dan Sapar, 2009)
Metode yang akan digunakan untuk mengisolasi  bakteri  adalah  metode Pour plate (Agar  tuang).  Kayu  dan  ﬁber
berukuran 1 m x 50 m yang sudah diambil dari  lokasi  tambak  ditempatkan  pada cawan  petri  steril  yang  berisi  air  laut  steril. Sampel  digojok  dan    diambil  10  ml  dari masing-masing  sampel,  dimasukkan  ke dalam labu  erlenrneyer yang berisi 90 ml air laut  steril,  dikocok  hingga  homogen  dan diperoleh    pengenceran  10 -1 .  Selanjutnya dari pengenceran 10 -1 diambil 1 ml contoh air  dengan    menggunakan  pipet  steril, yang dimasukkan ke dalam 9 ml aquadest steril    dan  diperoleh  pengenceran  10 -2 . Pengenceran hingga diperoleh pengenceran  10 -3 ,  10 -4 dan  10 -5 .  Masing- masing  diambil  1  ml  contoh  air  dengan menggunakan pipet steril dan  dimasukkan ke dalam masing-masing cawan petri steril. Selanjutnya di tambahkan  ke dalamnya 15 ml media Zobell dengan suhu sekitar 45°C yang telah dicairkan  sebelumnya dengan menggunakan pemanas. Selanjutnya cawan  petri  tersebut  dibungkus  dengan kertas  pembungkus  dan  diinkubasikan selama 2 x 24 jam.  (Purkan. 2016)
Uji  oksidasi  senyawa  amonium nitrogen dilakukan dengan menggunakan metode  Micro-well-plate  chromatogram assay (Zhao et al., 2013). Dalam media cair Zobel  2216E  ditambahkan  senyawa (NH4)2SO4,  472  g;  KH2PO4,  7.25  g; Na2HPO4,  11.32  g;  CH3COONa,  80  g; MgSO4, 200 g; CaC12, 20 g; NaHCO3, 85 g per liter akuades. Lalu tambahkan elemen A  dan  B  (dibuat  pH  akhir  sekitar  8.0)  dan disterilkan  dengan  autoklaf.  Kemudian masukkan  dalam  tiap  sumur  mikroplate media  sebanyak  200  µl  dan  20  µl  kultur bakteri  uji  dan  diinkubasikan  dalam  suhu ruang  selama  24  jam.  Perubahan  warna media  cair  diamati  untuk  mengetahui perubahan wama yang terjadi.
Ditimbang  2,5  gram  Bacto-peptone,
0,5  gram  yeast  ekstrak  dan  19,5  mg  Feri fosfat,  kemudian  dimasukkan  ke  dalam labu  Erlenmeyer  yang  kemudian  dituangi air  laut  steril  hingga  mencapai  volume  1 liter. Nilai pH ditentukan hingga 7,5 - 7,6 dan kemudian  dipersiapkan  beberapa  gelas erlenmeyer  Pyrex  25  m  untuk  dituangi volume  masing-masing  sebesar  10  ml  dari media  cair  tersebut,  lalu  disterilisasikan dengan  menggunakan  autoklaf  pada suhu 121°C dengah tekanan 1 atm selama 20  menit.  Setelah  dingin,  ke  dalam  labu
erlenmeyer tersebut ditambahkan Amonia Nitrogen  ditentukan  konsentrasi  100  ml/l. Selanjutnya  tiap  isolat  bakteri  bioﬁlm diinokulasi ke dalam tabung reaksi tersebut dan  di  inkubasikan  pada  suhu  kamar dengan digoyang (shaker) selama 48 jam.
Oksidasi Amonia Nitrogen diukur menggunakan UV spektrofotometer
dengan λ = 550 nm dengan interval 24 jam. Pengamatan pertumbuhan dilakukan dengan  Vis  spektrofotometri  λ  =  600  dan menimbang  berat  biomass  sel  bakteri setelah disentrifugasi.
Identiﬁkasi  bakteri  pada  beberapa isolat murni yang memiliki daya degradasi dilakukan  menurut  Bergey’s  Manual  of Systematic  Bacteriology  (Sneath et  al ., 1986)  didasarkan  pada  uji  pewarnaan gram, uji motilitas dan uji biokirnia.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  isolasi  dan  puriﬁkasi  bakteri primer pembentuk bioﬁlm dari subtrat  kayu dan  ﬁber  yang  ditanam  pada  tambak. Hasil  isolasi  bakteri  dari  subtrat  kayu  dan ﬁber  diperoleh  66  isolat  bakteri  primer pembentuk  bioﬁlm  (Tabel  1  dan  Tabel  2). Koloni bakteri primer pembentuk bioﬁlm di lingkungan  tambak  memiliki  keragaman yang  sangat  tinggi.  Dilihat  dari  wama koloni,  terlihat  bahwa  koloni  bakteri  yang behasil  diisolasi  berwama  putih,  kuning, merah muda, ungu, dan ungu tua. Apabila dilihat  dari  bentuk  morfologinya  bakteri koloni berbentuk bulat, bulat bergelombang  dan  bulat  bergerigi. Sidharta (2000) melaporkan bahwa berdasarkan morfologi bahwa ada sekitar 80% bakteri laut yang diketahui berbentuk batang  dan  bersifat  gram  negative. Pleomorﬁsme  umum  terjadi  pada  bakteri laut  dibandingkan  bakteri  sungai,  danau, dan  tanah.  Lebih  lanjut  Sidharta  (2000) melaporkan  bahwa  sekitar  seperlima bakteri  batang  dari  laut  berbentuk kumparan  helicoid, sehingga  sering diklasiﬁkasikan sebagai Vibrio atau Spirulina. Bakteri laut bergerak secara aktif, antara 75-85% sediaan murni yang diamati memiliki  flagel.  Diperkirakan  kemampuan bergerak  ini  sebagai  hasil  adaptasi kehidupan perairan.
Jenis-jenis Pseudomonas,  Vibrio,  Flavobacterium, Achromobacter dan Bacterium
merupakan jenis terbanyak yang dijumpai di laut.
Bakteri akan membentuk lapisan ﬁlm, yang  pada  keadaan  tertentu  menjadi pelapis luar cat antifouling, sehingga tidak berpengaruh terhadap organisme fouling. Secara  perlahan  bakteri  akan  merombak senyawa penyusun pelapis atau cat. Di sisi lain, bakteri juga mencegah organisme lain yang  lebih  besar  untuk  tinggal  bersama melalui antibiotik yang dihasilkannya. Total bakteri  primer  pembentuk  bioﬁlm  yang dihasilkan  dari  subtrat  ﬁber  sebanyak  29 isolat,  sedangkan  total  bakteri  primer pembentuk  bioﬁlm  yang  dihasilkan  dari subtrat  kayu  sebanyak  37  isolat.  Banyak penelitian  yang  melaporkan  keberhasilan mengisolasi  bakteri  primer  pembentuk bioﬁlm  dari  permukaan  benda  hidup
maupun  benda  mati.  Merina et  al .  (2010) melaporkan bahwa bakteri primer
pembentuk bioﬁlm pada permukaan daun sea grass Halodule pinifolia didominasi oleh jenis  bakteri Bacillus  pumilus ,  disamping jenis  bakteri  lainnya  seperti  genus Pseudomonas sp., Staphylococcus sp. dan E.  Coli. Sedangkan  Kolari et  al. (2001) melaporkan bahwa bakteri primer pembentuk bioﬁlm pada permukaan mesin keﬂas juga didominasi oleh species Bacillus sp.  Gao et  al .    (2012)  melaporkan  bahwa jenis bakteri pembentuk bioﬁlm pada ﬁlter aerasi  tambak  udang  dari  bamboo didominasi  oleh  jenis Bacteroidetes,
Alphaproteobacteria  Denitromonas.
Hasil  uji  bakteri  primer  pembentuk bioﬁlm  pendegradasi  amonium  nitrogen secara   kualitatif.   Dari   hasil    uji   tersebut
Tabel 1. Isolat Bakteri Primer pembentuk biofilm dari substrat fiber
No  Kode Isolat Bentuk Warna Tekstur 1. FA1.1 Bulat Gelombang Orange, Pinggir bening Cembung 2. FA 1.2 Bulat Orange pucat, pinggir putih Cembung 3. FA 1.3 Bulat Gelombang Putih gading Cembung 4. FA 1.4 Bulat Putih gading, pinggir bening Cembung 5. FA 1.5 Bulat Putih kebiruan, putih Cembung 6. FA 1.6 Bulat Gelombang Bening Datar 7. FA 1.7 Bulat Kuning pucat, berinti Cembung 8. FA 1.8 Bulat Putih gading, pinggir bening Cembung 9. FA 1.9 Bulat Gelombang Kuning pucat Cembung 10. FA 1.10 Bulat Gelombang Kuning pucat Cembung 11. FA 1.11 Bulat Putih susu Cembung 12. FA 1.12 Bulat Orange pucat Cembung 13. FA 1.13 Bulat Gelombang Bening berinti Cembung 14. FA 1.14 Bulat Putih susu, pinggir putih Cembung 15. FB 2.1 Bulat Kuning, pinggir bening Cembung 16. FB 2.2 Bulat Putih gading Cembung 17. FB 2.3 Bulat Kuning, pinggir bening Cembung 18. FB 2.4 Bulat Gelombang Kuning, pinggir bening Cembung 19. FB 2.5 Bulat Putih gading bening Cembung 20. FB 2.6 Bulat Putih merah jambu Cembung 21. FB 2.7 Bulat Putih pinggir bening, berinti Cembung 22. FB 2.8 Bulat Putih gading berinti Cembung 23. FB 2.9 Bulat Putih gading, pinggir bening Cembung 24. FB 2.10 Bulat Putih susu berinti Cembung 25. FB 2.11 Bulat Kuning, pinggir bening Membukit 26. FB 2.12 Bulat Orange tua, tepi bening Cembung 27. FB 2.13 Bulat Orange pucat, tepi bening Cembung 28. FB 2.14 Bulat Kuning pucat bening Cembung 29. FB 2.15 Bulat Orange tua Cembung
Tabel 2 . Isolat Bakteri Primer pembentuk biofilm dari substrat kayu
No  Kode Isolat Bentuk Warna Tekstur 1. KA 1.1 Bulat Putih susu, bening Cembung 2. KA 1.2 Bulat Kuning Cembung 3. KA 1.3 Bulat Kuning gading Cembung 4. KA 1.4 Bulat Bening Cembung 5. KA 1.5 Bulat Ungu tua Cembung 6. KA 1.6 Bulat Putih gading Cembung 7. KA 1.7 Bulat Putih susu Cembung 8. KA 1.8 Bulat Putih susu Cembung 9. KA 1.9 Bulat Putih susu Cembung 10. KA 2.1 Bulat Putih susu Cembung 11. KA 2.2 Bulat kecil Putih gading Cembung 12. KA 2.3 Bulat Putih, tepi bening Cembung 13. KA 2.4 Bulat Putih berlapis bening Cembung 14. KA 2.5 Bulat Orange Cembung 15. KA 2.6 Bulat Merah tua Cembung 16. KA 2.7 Bulat Merah Cembung 17. KA 2.8 Bulat Bening Cembung 18. KB 1.1 Bulat Merah tua Cembung 19. KB 1.2 Bulat Kuning gading Cembung 20. KB 1.3 Bulat Bening, putih pucat Cembung 21. KB 1.4 Bulat Kuning, putih Cembung 22. KB 1.5 Bulat Bening Membukit 23. KB 1.6 Gerigi, berkerut Putih susu, kuning Cembung 24. KB 1.7 Bulat Kuning, tepi putih Kawah 25. KB 1.8 Bulat Putih gading Cembung 26. KB 1.9 Bulat Bening kekuningan Cembung 27. KB 1.10 Bulat Bening mengkilap Cembung 28. KB 1.11 Bulat kecil Bening Cembung 29. KB 1.12 Bulat Bening keputihan Cembung 30. KB 1.13 Bulat Putih susu Cembung 31. KB 1.14 Bergelombang Merah jambu pucat Cembung 32. KB 2.1 Bulat Putih Cembung 33. KB 2.2 Bulat Putih gading Cembung 34. KB 2.3 Bulat Kuning gading Cembung 35. KB 2.4 Bulat Putih gading Cembung 36. KB 2.5 Bulat Putih gading Cembung 37. KB 2.6 Bulat Putih gading Cembung diperoleh  20  isolat  yang  memiliki  potensi mengoksidasi senyawa Amonium Nitrogen.
Kemampuan
mengoksidasi isolat ditunjukkan  dengan  adanya  perubahan wama pada medium. Selanjutnya dari ke- 20  bakteri  seleksi  tersebut  akan  dilakukan re-skrining dengan melakukan uji kuantitatif.
Dengan
menggunakan indikator  media,  Zhao et  al.  ( 2013) menemukan  7  isolat  bakteri  yang  mampu mengoksidasi  amonia    nitrogen.  Hasil  uji bakteri primer pembentuk bioﬁlm pengoksidasi  amonium  nitrogen  secara
kuantitatif  alam  medium  minimal  yang diperkaya  dengan  100  ppm  nitrogen ammonia  (Tabel  3).  Dari  tabel  tersebut dapat  dilihat  bakteri  isolat  bioﬁlm  memiliki kemampuan  kecil  di  dalam  mengoksidasi senyawa  tersebut.  Hasil  penelitian  uji oksidasi bakteri pembentuk bioﬁlm menunjukkan  bahwa  isolat-isolat  bakteri tersebut  tidak  memiliki  atau  memiliki kemampuan  mengoksidasi  yang  sangat rendah  jika  dibandingkan  dengan  hasil- hasil  penelitian  terdahulu.  Bakteri  primer pembentuk     bioﬁlm        hanya      mampu

## Tabel 3. Hasil Uji kuantitatif
No  Isolat NH4 + -N Oksidasi NH4 + -N (%) 1. FA 1.2 102 -1,98 2. FA 1.5 100 0,00 3. FA 1.6 99 0,99 4. FA 1.10 97 2,97 5. FA 1.14 101 -0,99 6. FB 2.2 101 -0,99 7. FB 2.13 100 0,00 8. FB 2.15 102 -1,98 9. KA 1.3 97 2,97 10. KA 1.7 96 3,96 11. KA 1.9 100 0,00 12. KB 1.1 100 0,00 13. KB 1.3 100 0,00 14. KB 1.10 94 5,94 15. KB 1.11 100 0,00 16. KB 1.12 93 6,93 17. KB 1.13 99 0,99 18. KB 2.2 101 -0,99 19. KB 2.4 102 -1,98 20. KB 2.5 100 0,00
mengoksidasi senyawa Amonium Nitrogen kurang  dari  10    persen.  Hasil  penelitian terdahulu yang dilakukan oleh     Zhao et al . (2013)  dari  bakteri    yang  diisolasi  dari limbah buangan rumah sakit menunjukkan kemampuan mengoksidasi senyawa NH4+- N  sebesar  46-84  %.  Oksidasi  senyawa amonia menjadi nitrit merupakan langkah awal  didalam  proses  penurunan  nitrogen secara  biologi.  Sehingga  bakteri  bioﬁlm yang dihasilkan dalam studi ini tidak dapat digunakan  sebagai  pengolah  nitrogen organik  dalam  perairan  tambak.  Dalam beberapa tahun  terakhir ini, penggunaan proses  BNR  (Biological  Nutrient  Removal) secara baru dengan teknik SHARON (single high  ammonia  removal  over  nitrite)  dan ANAMMOX (anaerobic ammonium oxidation)  telah  diteliti  secara  luas  dan mendalam (Schmidt et al , 2003; Ahn, 2006).
Bakteri Nitrosomonas eutropha mempunyai kemampuan  melakukan  nitriﬁkasi  dan denitriﬁkasi bersamaan (Zhou et al., 2013).

## KESIMPULAN
Pada
penelitian ini dapat
disimpulkan bahwa bakteri primer
pembentuk  bioﬁlm  yang  diisolasi  dari subtrat  kayu  dan  ﬁber  diperairan  tambak
Jepara  tidak  dapat  dijadikan  sebagai kandidat  bioremediator  senyawa  amonia nitrogen di tambak karena hanya memiliki kemampuan  kecil  di  dalam  mengoksidasi senyawa ammonia nitrogen.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahn,  Y.H.,  2006.  Sustainable  nitrogen elimination biotechnologies: A Review. Process. Biochem, 41: 1709-1721 Azizah,  R.,  Pujiastuti,  J.,  Widianingsih,
Supriyantini,  E.  &  Hermawan,  I.  1998. Pemanfaatan Air Limbah
Pertambakan  sebagai  Media  Kultur Spirulina sp.    Laporan  Penelitian Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Universitas  Diponegoro, 24 halaman.
Danesi,  E,D,G.,  C  de  O  Rangel-Yagui,  de Carvalho,  J.C.M.  &  Sato.  S.  2002.  An investigation  of  effect  of  replacing nitrate  by  urea  in  the  growth  and production  of  chlorophyll  by Spirulina platensis . Biomass  and  Bioenergy. 23 (4):261-269
Gao,  X.Y.,  Xu,  Y.,  Liu,  Y.,  Liu,  Y.  &  Liu,  Z.P. 2012.  Bacterial  diversity,  community structure and function associated with bioﬁlm  development  in  a  biological aerated ﬁlter in a recirculating marine
aquaculture system. Marine Biodiversity . 42(1): 1-11
Hendrawati,  H.,  Prihadi,  T.H.  &  Rohmah,
N.N.,  2008.  Analisis  kadar  phosfat  dan N-nitrogen (amonia, nitrat, nitrit) pada tambak  air  payau  akibat  rembesan lumpur lapindo di Sidoarjo, Jawa Timur. Jurnal Kimia VALENSI , 1(3).
Kolari, M., Nuutinen, J. & Salkinoja-Salonen,
M.S.  2001.  Mechanisms  of  bioﬁlm formation in paper machine by Bacillus species:  the  role  of  Deinococcus geothermalis. J . Industrial Microbiology
& Biotechnology , 27:343-351.
Sneath,  P.H.A.,  Mair,  N.S.,  Sharpe,  M.E.  & Holt,  J.G. 1986 . Bergey's  manual  of systematic bacteriology , vol. 2 . Williams & Wilkins, Baltimore, Md
Merina, M., Lipton, A.P. & Wesley, S.G. 2011.
Isolation, characterization and  growth of  bioﬁlm  forming  bacteria Bacillus purnilus from  the  seagrass, Halodule pinifolia of Kanyakumari coast. Indian J . Mar. Sci. 40(3):  443-448 Nofiani, R. & Sapar, A., 2009. Characteristics of  Antimicrobial  Activity  of Eucheuma
cottonii Doty-Associated Bacteria Extracts. Jurnal  Pengolahan  Hasil Perikanan Indonesia , 12(2).
Purkan,  P.,  Nurmalyya,  S.  &  Hadi,  S.,  2016.
Resistance  Level  of Pseudomonas stutzeri Against  Mercury  And  Its  Ability In  Production  Of  Mercury  Reductase Enzyme. Moleku l. 11(2):230-238
Schmidt, I., Sliekers, O., Schmid, M., Bock, E., Fuerst, J., Kuenen, J.G.,  Jetten, M.S.M. &  Strous,  M.  2003.  New  concepts  of microbial treatment processes  for the nitrogen removal in wastewater, FEMS Microbiol. Rev. 27:481-492.
Sidharta,  B.R.  2000.  Sifat-sifat  Bakteri  Laut;
Pengantar Mikrobiologi Kelautan. Yogyakarta; Universitas Atmajaya: 1-13 Stanley,  C.,  Lau,  K.,  Thiyagarajan,  V., Cheung, S.C.K & Qian, P.Y. 2005. Roles of bacterial community composition in bioﬁlms  as  a  mediator  for  larval settlement of three marine invertebrates. Aquat.  Microb.  Ecol . 38:41-51
Sumantri,  I.,  Sumarno  &  Aﬁati,  N.  2010. Pengolahan  limbah  cair  pupuk  kadar amoniak tinggi dengan proses gabungan mikroalgae  dan  nitriﬁkasi- denitriﬁkasi autotroﬁk. Proseding Seminar Nasional Sains dan Teknologi. Universitas  Wahid  Hasyim.  Semarang: B35-40 uwoyo,  H.S.,  Undu,  M.C.  and  Makmur,  M.,
2014, December. Laju Sedimentasi Dan Karakterisasi  Sedimen  Tambak  Super Intensif  Udang  Vaname  ( Litopenaeus vannamei ).  In  Prosiding  Forum  Inovasi Teknologi Akuakultur (pp. 327-339).
Zhao,C.,  Song,  W,.  Wei,  J.  &  Li,  B.  2013. Rapid Screening of Ammonia Oxidizing Bacteria  in  the  Sewage. Int.  J.  Biosci. Biochem. Bioinfor. 3(2)