## Livestock and Animal Research
Accredited by Directorate General of Strengthening for Research and Development No. 10/E/KPT/2019
Open Access Livest. Anim. Res. , July 2020, 18(2): 171-189
p-ISSN 2721-5326 e-ISSN 2721-7086 https://doi.org/10.20961/lar.v18i2.42956

## Original Article
Efek pemberian ekstrak pituitari sapi terhadap peningkatan jumlah folikel ovarium dan konsentrasi estradiol pada tikus putih (Rattus norvegicus)
Indah Kesuma Siregar 1 , Tongku Nizwan Siregar 2 , Muslim Akmal 3 , Sri Wahyuni 4 , Nazaruddin 5 , Hafizuddin 2 , *
1 Program Studi Magister Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh, 23111
2 Laboratorium Reproduksi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh, 23111
3 Laboratorium Histologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh, 23111
4 Laboratorium Anatomi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh, 23111
5 Laboratorium Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh, 23111 *Correspondence: hafizuddin_umar@unsyiah.ac.id
Received: February 26 th , 2020; Accepted: May 14 th , 2020; Published online: July 17 th , 2020

## Abstrak
Tujuan: Penelitian  ini  bertujuan  mengetahui  pengaruh  pemberian  ekstrak  pituitari  terhadap peningkatan jumlah folikel dan konsentrasi estradiol pada tikus putih.
Metode: Dalam penelitian ini digunakan 10 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) betina dewasa, galur wistar, berumur 3-4 bulan dengan bobot badan antara 200-250 g yang dibagi atas 2 kelompok. Pada kelompok kontrol, tikus diinjeksi dengan hormon PMSG (PG 600, Intervet, Boxmeer, Holland) 5 IU secara  intraperitoneal.  Pada  kelompok  perlakuan,  tikus  diinjeksi  dengan  ekstrak  pituitari  secara intraperitoneal selama 3 hari yakni 1,0; 0,5; dan 0,3 ml. Empat hari setelah perlakuan awal, sampel darah  dikoleksi  langsung  dari  jantung  untuk  pemeriksaan  konsentrasi  estradiol,  kemudian tikus-tikus tersebut dikorbankan dengan cara dislokasio cervicalis untuk pemeriksaan mikroskopis ovarium.  Penghitungan  terhadap  jumlah  folikel  dilakukan  dengan  menggunakan  mikroskop cahaya.  Penghitungan  konsentrasi  estradiol  darah  dilakukan  dengan  teknik  enzyme-linked immunosorbent  assay  (ELISA).  Data  jumlah  folikel  dan  konsentrasi  estradiol  dianalisis menggunakan uji T.
Hasil: Jumlah folikel primer, sekunder, tertier, dan CL pada kelompok  PMSG vs ekstrak pituitari masing-masing  adalah  3,0+1,58  vs  4,4+3,97;  5,4+1,52  vs  6,4+3,91;  dan  9,2+4,32  vs  4,4+3,51  buah, sedangkan  konsentrasi  estradiol  pada  kelompok  PMSG  vs  ekstrak  pituitari  adalah  62,4+12,9  vs 58,8+11,8 pg/ml. Hasil penelitian menunjukkan  jumlah folikel pada setiap kategori dan konsentrasi estradiol tidak memperlihatkan perbedaan secara signifikan (P>0,05) antar kelompok perlakuan. Kesimpulan: Dari  hasil  penelitian  disimpulkan  bahwa  ekstrak  pituitari  dapat  meningkatkan aktivitas folikulogenesis dan konsentrasi estradiol pada tikus putih ( Rattus norvegicus ).
Kata Kunci: Ekstrak pituitary; PMSG; Folikel, Estradiol; Tikus putih ( Rattus norvegicus ).

## Abstract
Objective: This study aims to determine the effect of pituitary extract administration on increasing follicle counts and estradiol concentrations in white rats.
Methods: In  this  study,  10  adult  female  white  rats (Rattus  norvegicus) ,  Wistar  strains,  aged  3-4 months with body weights between 200-250 g were divided into 2 groups. Control group was given 5  IU  PMSG  (PG  600,  Intervet,  Boxmeer,  Holland)  intraperitoneal  manner,  whereas  the  treatment group  was  given  the  pituitary  extract  with  descending  doses  of  1.0;  0.5;  and  0.3  ml,  respectively. Four days after early treatments, the rats were sacrificed with dislocation cervicalis. Blood collecting for the examination of estradiol concentration and ovarium collecting for microscopic examination were collected when rats were sacrificed. Blood was collected from the heart. Follicles number was counted  with  the  luminous  microscope  and  estradiol  concentration  was  measured  with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Data of follicles number and estradiol concentration were analysed with T test.
Results: The follicles number of primary, secondary, tertiary, and CL in PMSG group vs pituitary extract, respectively was 3.0+1.58 vs 4.4+3.97; 5.4+1.52 vs 6.4+3.91; and 9.2+4.32 vs 4.4+3.51 pcs. The amount of estradiol concentration in PMSG groups vs extract pituitary was 62.4+12.9 vs 58.8+11.8. The  results  of  this  research  indicate  that  the  number  of  follicles  for  each  category  and  estradiol concentration were not significant differences (P>0.05) inter treatment groups.
Conclusions: The result from this research, it could be concluded that pituitary extract of cattle on increased of folliculogenesis activity and estradiol concentration of rats (Rattus norvegicus) .
Keywords: Pituitary extract; PMSG; Follicle; Estradiol; Rats (Rattus norvegicus)

## PENDAHULUAN
Superovulasi  diartikan  sebagai  upaya merangsang
pertumbuhan dan perkembangan  folikel-folikel  pada  ovarium menjadi  folikel-folikel  yang  siap  ovulasi  dan jumlahnya  lebih  banyak  dari  normal  [1]. Prinsip  superovulasi  adalah  peningkatan derajat  ovulasi  yang  berpengaruh  pada peningkatan  fertilisasi  dan  jumlah  anak  per kelahiran.
Superovulasi
meningkatkan jumlah  folikel  dan  korpus  luteum  (CL)  yang merupakan sumber
hormon-hormon reproduksi.  Oleh  karena  itu,  superovulasi diharapkan mampu
meningkatkan hormon-hormon  reproduksi  yang  berperan dalam  peningkatan  folikulogenesis  dan konsentrasi estrogen.
Hormon  yang  paling  sering  digunakan untuk  tujuan  superovulasi  adalah pregnant mare’s serum  gonadotropin  (PMSG)  dan follicle  stimulating  hormone (FSH).  Kedua hormon tersebut masing-masing mempunyai kelebihan  dan  kekurangan.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  bila  dibandingkan dengan  penggunaan  PMSG,  respon  ovarium terhadap  hormon  FSH  biasanya  lebih  baik karena  lebih  banyak  menghasilkan  ovulasi, jumlah folikel anovulasi lebih sedikit, embrio yang  dapat  diperoleh  lebih  banyak,  dan kualitas  embrio  lebih  baik.  Akan  tetapi, kelemahan dari FSH adalah hormon tersebut
sulit  diperoleh  di  pasar  domestik,  harganya relatif  mahal,  dan  pemberiannya  harus dilakukan secara berulang sehingga
mengakibatkan hewan stres [2]. Rendahnya respons
superovulasi dengan  PMSG  diduga  berhubungan  dengan panjangnya  masa  sirkulasi  PMSG  sehingga menghasilkan  perkembangan  folikel  yang berlebihan, nimfomania (berahi yang terus-menerus),  dan  kegagalan  ovulasi. Folikel  yang  gagal  mengalami  ovulasi tersebut akan meningkatkan sekresi estrogen. Sekresi estrogen yang tinggi mempunyai efek yang  merugikan  terhadap  perkembangan embrio [3].
Terbatasnya jumlah folikel yang mengalami  ovulasi  pada  setiap  siklus  estrus pada  hewan  disebabkan  terbatasnya  jumlah hormon gonadotropin yang disekresikan oleh pituitari  anterior.  Hormon  gonadotropin yang  dimaksud  adalah  hormon  FSH  yang bertanggungjawab untuk inisiasi dan perkembangan folikel yang akan ovulasi [4].
Pituitari  sapi  merupakan  limbah  rumah potong  hewan  (RPH)  yang  mengandung hormon-hormon  gonadotropin.  Dari  hasil penelitian  Isnaini  et  al.  [5]  diketahui  bahwa pituitari  sapi  sedikitnya  mengandung  10 macam  hormon  diantaranya  adalah  FSH, luteinizing hormone (LH), growth hormone (GH), luteotropic  hormone (LTH), adrenocorticotropic hormone (ACTH), thyroid somatotropic hormone
Siregar et al (2020) Livest. Anim. Res. 18(2): 171-179
(TSH),  dan prolactin hormone yang  dihasilkan oleh  lobus  anterior  pituitari.  Berdasarkan kenyataan  di  atas,  terbuka  peluang  bahwa ekstrak  pituitari  sapi  dapat  digunakan sebagai preparat alternatif untuk superovulasi  menggantikan  hormon  FSH yang  diekspresikan  dengan  munculnya respons  superovulasi  yang  diindikasikan dengan  peningkatan  folikulogenesis  dan konsentrasi estradiol.
Beberapa penelitian terakhir menunjukkan  bahwa  ekstrak  pituitari  sapi mampu menginduksi berahi dan meningkatkan  efisiensi  reproduksi  kambing [6].  Pemberian  ekstrak  pituitari  sapi  pada hewan  betina  telah  berhasil  menginduksi peningkatan jumlah embrio pada tikus putih [7].  Hal  tersebut  membuktikan  bahwa  kadar FSH  dalam  ekstrak  pituitari  sapi  tergolong cukup  tinggi  dan  mempunyai  efektivitas yang  sama  dengan  gonadotropin  dalam menginduksi superovulasi pada tikus.
Ekstrak  hipofisa  sapi  terbukti  lebih  efektif meningkatkan  volume  sperma  ikan  jika dibandingkan dengan ekstrak hipofisa kerbau dan  domba.  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa kadar  FSH  dalam  ekstrak  pituitari  sapi  lebih tinggi  dibandingkan  ekstrak  pituitari  kerbau dan domba [8].
Indikator  untuk  mengukur  keberhasilan ekstrak  pituitari  sapi  selama  ini  dilakukan dengan  mengobservasi  gejala  klinis,  jumlah embrio,  dan  jumlah  anak  per  kelahiran  [6,7]. Observasi  yang  lebih  mendalam  perlu dilakukan dengan melihat aktivitas peningkatan
folikulogenesis
secara mikroskopis  dan  pengukuran  konsentrasi estradiol.  Hasil  pengamatan  folikulogenesis secara  mikroskopis  dan  konsentrasi  estradiol merupakan  acuan  dasar  yang  tepat  dalam penggunaan  ekstrak  pituitari  sapi  sebagai preparat superovulasi yang bernilai ekonomis dan praktis dengan tingkat keberhasilan yang tinggi. Oleh karena itu, perlu penelitian untuk mengetahui  pengaruh  pemberian  ekstrak pituitari terhadap peningkatan jumlah folikel dan konsentrasi estradiol pada tikus putih.

## MATERI DAN METODE
Dalam penelitian    ini digunakan 10 ekor
tikus putih ( Rattus norvegicus ) betina dewasa, galur wistar, berumur 3-4 bulan dengan bobot badan  antara  200-250  g.  Sebelum  perlakuan, tikus diaklimatisasi selama 7 hari di kandang hewan coba Laboratorium Reproduksi Fakultas  Kedokteran  Hewan  Universitas Syiah  Kuala.  Tikus  diberi  pakan  serta  air minum secara ad libitum .

## Prosedur penelitian
Tikus dibagi atas 2 kelompok, masing-masing  5  ekor  untuk  kelompok kontrol  dan  5  ekor  untuk  kelompok perlakuan.  Pada  kelompok  kontrol,  tikus diinjeksi  dengan  hormon  PMSG  (PG  600, Folligon™, Intervet, Boxmeer, dan Holland) 5 IU  secara  intraperitoneal  antara  pukul 13.00-14.00 WIB.    Pada kelompok perlakuan, tikus  diinjeksi  dengan  ekstrak  pituitari  sapi secara intraperitoneal selama 3 hari berturut-turut  dengan  dosis  menurun  yakni 1,0;  0,5;  dan  0,3  ml.  Empat  hari  setelah perlakuan awal, tikus-tikus tersebut dikorbankan  dengan  cara dislocatio  cervicalis.
Sampel darah dikoleksi langsung dari jantung pada  saat  tikus  dipanen.  Setelah  koleksi darah,  dilakukan  pengambilan  ovarium untuk pemeriksaan mikroskopis.

## Prosedur ekstraksi
Penelitian  ini  menggunakan  pituitari sapi  lokal  Aceh.  Ekstrak  pituitari  dibuat berdasarkan  metode  yang  diterapkan  Isnaini et  al.  [5].  Pituitari  sapi  dikoleksi  dari  Rumah Potong  Hewan  Kota  Banda  Aceh.  Pituitari hasil  koleksi  dimasukkan  dalam  termos  dan segera  dibawa  ke  laboratorium  untuk disimpan  dalam freezer sampai  jumlahnya mencukupi.  Jika  sudah  terkumpul,  pituitari dibersihkan dari jaringan ikat dan dipisahkan dari  selaput  luar.  Setelah  itu,  pituitari  diiris kecil-kecil  (±1  mm)  dan  ditumbuk  sampai halus,  kemudian  ditambahkan  aquades sebanyak  10  ml  untuk  setiap  gram  pituitari dan  selanjutnya  disaring  dengan  kertas saring. Larutan yang diperoleh disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 20 menit, kemudian supernatannya
diambil.
Supernatan  hasil  sentrifugasi  merupakan ekstrak  pituitari  dan  disimpan  dalam freezer sebelum digunakan.

## Pemeriksaan konsentrasi estradiol
Prosedur  analisis  konsentrasi  estradiol pada  penelitian  ini  dilakukan  menggunakan teknik enzymelinked  immunosorbent  assay (ELISA)  menggunakan  kit  estradiol  (DRG International Inc., USA).

## Pemeriksaan  dan  pengumpulan  data  secara mikroskopis
Masing-masing  spesimen  ovarium  yang mengandung  folikel  dan  CL  akan  dipotong secara  membujur,  lalu  difiksasi  dengan larutan  BNF  10%.  Selanjutnya  dilakukan proses  pembuatan  preparat  histologis  dan diwarnai  dengan  Hematoksilin-Eosin  (HE) [9].

## Proses parafinisasi jaringan (embedding)
Masing-masing  spesimen  ovarium  yang terdapat folikel dan CL akan dipotong secara membujur.  Irisan  penampang folikel  dan CL dimasukkan ke dalam tissue cassete, selanjutnya  dilakukan  proses  pembuatan sediaan histologi yang dimulai dengan proses dehidrasi. Dehidrasi dilakukan untuk penarikan  air  dari  dalam  jaringan  dengan merendam secara berurutan di dalam larutan alkohol  bertingkat  dengan  konsentrasi  (70, 80, 90, 95, absolut I, absolut II, dan absolut III) % masing-masing selama 90 menit, sedangkan  pada  alkohol  absolut  dengan waktu  lebih  kurang  30  menit  pada  suhu kamar.  Jaringan  yang  terdehidrasi  dengan baik  akan  memperlihatkan  warna  jaringan lebih tua dan mengeras. Selanjutnya dilakukan proses penjernihan ( clearing ). Penjernihan
bertujuan untuk mengeliminir  dari  sisa-sisa  bahan  atau  air yang  mungkin  masih  terdapat  dalam jaringan  yaitu  dengan  larutan  xilol  I,  xilol  II, dan xilol III, diharapkan mampu menjernihkan  jaringan  dan  mengisi  dengan sempurna  bagian-bagian  jaringan  yang  telah terambil  airnya.  Waktu  yang  dibutuhkan masing-masing  selama  45  menit  pada  suhu kamar  dengan  menggunakan  xilol  I,  xilol  II, dan  xilol  III. Clearing yang  baik  akan memperlihatkan jaringan tembus pandang/bening.  Setelah  proses  penjernihan selesai  dilakukan,  selanjutnya  dilakukan proses  infiltrasi  yang  bertujuan  untuk menggantikan  celah  yang  terisi  xilol  dengan
parafin yaitu dengan cara merendam jaringan menggunakan  larutan  campuran  xilol  dan parafin,  kemudian  dilanjutkan  ke  dalam larutan  parafin  I,  parafin  II,  dan  parafin  III masing-masing  selama  45  menit  pada  suhu 60 º C.  selanjutnya  jaringan  dibenamkan  di dalam  parafin  cair,  kemudian  didinginkan pada  suhu  kamar  sehingga  menjadi  blok parafin.

## Pemotongan (sectioning)
Jaringan  blok  parafin  yang  telah  siap untuk  disayat  dimasukkan  ke  penjepit  ( block holder )  mikrotom,  selanjutnya  dilakukan penyayatan  secara  longitudinal  setebal  5  µm dengan  menggunakan rotary  microtome .
Dilakukan sayatan serial,
kemudian dipindahkan  ke  atas  permukaan  air  dengan suhu 38-40 º C dalam penangas air. Irisan yang telah  terentang  sempurna  diambil  dengan objek glass sediaan yang telah diolesi dengan albumin  gliserin,  kemudian  dikeringkan dengan  alat  pengering  sediaan  pada  suhu 38-40 º C. Selanjutnya objek glass sediaan yang sudah  ada  jaringan  (sediaan  histologi) disimpan dalam inkubator pada suhu 38-40 º C untuk  penyempurnaan  penempelan  dengan posisi horizontal selama 24 jam.

## Pewarnaan (staining)
Sayatan  yang  telah  menempel  pada objek  glass  sediaan  dengan  baik  dan  telah diberi  label  disusun  dalam  rak  sediaan kemudian  dilakukan  perendaman  dengan xilol  sebanyak  dua  tahapan  (deparafinisasi), dengan  waktu  masing-masing  lima  menit. Selanjutnya dilakukan proses rehidrasi secara bertingkat dengan persentase alkohol (absolut  I,  absolut  II,  95,  90,  80,  dan  70)  % masing-masing selama 5 menit dan dilanjutkan  dengan  merendam  sediaan dalam  air  mengalir  sampai  benar-benar bersih.  Sediaan  dibilas  dengan  air  destilasi. Sediaan  yang  telah  jernih  siap  untuk dilakukan pewarnaan HE [9]. Proses selanjutnya  adalah  penarikan  air  dengan menggunakan  alkohol  bertingkat  dengan konsentrasi  (70,  80,  90,  95,  absolut  I,  dan absolut II) %. Proses penjernihan menggunakan  xilol  sebanyak  tiga  kali perendaman,  dengan  waktu  masing-masing selama 5 menit. Sediaan histologi selanjutnya
ditutupi  dengan  gelas  penutup  yang  diberi perekat entellan.
Tipe  folikel  digolongkan  berdasarkan perbedaan-perbedaan  yang  terlihat  dari gambaran  morfologi  yang  teramati.  Jumlah folikel dihitung dari berbagai tahap folikulogenesis.  Penghitungan  jumlah  folikel dan  CL  dilakukan  pada  20  sayatan  ovarium yang  berasal  dari    sayatan  serial  dengan interval  5.  Masing-masing  sayatan  diambil lima  luas  lapang  pandang,  kemudian dihitung rata-ratanya. Penghitungan terhadap  jumlah  folikel  dilakukan  dengan menggunakan mikroskop cahaya [10].

## Analisis data
Data  jumlah  folikel  dan  konsentrasi estradiol  dianalisis  menggunakan  uji  T menggunakan program SAS® versi 9.4.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik  masing-masing  tahapan perkembangan  folikel  dari  hasil  penelitian disajikan  pada  Gambar  1.  Folikel  yang diamati  adalah  folikel  primer,  sekunder,  dan tertier.  Rata-rata  jumlah  folikel  primer, sekunder,  tertier,  dan  CL  tikus  putih  yang mengalami  induksi  dengan  PMSG  dan ekstrak  pituitari  disajikan  pada  Tabel  1. Jumlah  folikel  pada  setiap  kategori  dan  CL tidak memperlihatkan perbedaan yang signifikan (P>0,05) antar
kelompok perlakuan.
Ovarium tikus dilapisi oleh satu lapisan epitel yang disebut epitel germinativum yang berbentuk  pipih  hingga  kuboid.  Di  bagian profundal lapisan epitel terdapat jaringan ikat yang  disebut  tunika  albuginea.  Ovarium
merupakan  sumber  folikel  tempat  ovum dibentuk.  Ovarium  tikus  terbagi  atas  dua bagian  yaitu  korteks  yang  berada  di superfisial dan bagian medula yang berada di bagian  profundal.  Pada  bagian  korteks banyak ditemukan
berbagai tahap
perkembangan  folikel  yang  memiliki  ukuran bervariasi. Masing-masing
folikel mengandung  satu  oosit.  Berdasarkan  tahap perkembangannya, folikel dikategorikan menjadi  tiga  tahap  yaitu;  folikel  primer, folikel sekunder, dan folikel tertier atau antral [11].  Selama  perkembangan,  folikel  akan mengalami  pertumbuhan  yang  melibatkan perubahan-perubahan  pada  sel  folikel  (sel granulosa),  oosit  primer,  dan  stroma  di sekitar  folikel.  Pada  bagian  medulla  terdiri dari  jaringan  ikat  longgar  dan  banyak ditemukan  pembuluh  darah  serta  saraf.  Hal yang sama juga dilaporkan [12]. Karakteristik ovarium tikus
secara
mikroskopis
memperlihatkan adanya suatu proses perkembangan folikel yang sangat dinamis.
Hafez and Hafez [13] mengatakan bahwa perkembangan  dan  maturasi  folikel  terjadi dengan adanya folikel primordial merupakan folikel  yang  pertama  kali  ditemukan  pada hewan  setelah  lahir  dengan  jumlah  tertentu pada  setiap  spesies.  Folikel  tersebut  ditandai dengan  oosit  yang  dikelilingi  oleh  satu  lapis sel pregranulosa yang berbentuk pipih,  yang berkembang di bagian korteks ovarium [14].
Folikel  primer  ditandai  dengan  adanya perubahan  bentuk  dari  satu  lapis  sel pregranulosa  yang  berbentuk  pipih  menjadi sel  granulosa  yang  berbentuk  kuboid  [15]. Perkembangan  folikel  primordial  menjadi folikel  primer  terjadi  pada  saat  hewan mencapai pubertas [13].
Tabel 1. Respons superovulasi tikus putih yang diinduksi dengan PMSG dan ekstrak pituitari
Kriteria Perlakuan PMSG Ekstrak Pituitari Folikel Primer 3,0+1,58 a 4,4+3,97 a Folikel Sekunder 5,4+1,52 b 6,4+3,91 b Folikel Tertier 6,4+2,19 c 4,4+3,51 c Korpus Luteum 9,2+4,32 d 7,4+1,52 d Estradiol (pg/ml) 62,4+12,9 e 58,8+11,8 e
a,b,c,d,e Superskrips yang sama pada baris yang sama memperliharkan perbedaan yang tidak signifikan (P>0.05).
a b c
d
Gambar  1. Kategori  perkembangan  folikel  tikus.  a,  folikel  primer;  b,  folikel  sekunder;  c,  folikel  tertier;  d, korpus luteum
Folikel sekunder ditandai dengan terbentuknya  dua  atau  lebih  lapisan  sel-sel granulosa  dan  telah  terbentuk  sebuah membran  (zona  pelusida)  yang  mengelilingi oosit  [14].  Oosit  dan  sel  granulosa  berperan dalam  proses  pembentukan  zona  pelusida yang mengandung glikoprotein yang berperan
pada proses perlekatan spermatozoa pada oosit [16]. Folikel sekunder juga  dikelilingi  oleh  lapisan  sel  yang  tidak beraturan  yang  berasal  dari  diferensiasi sel-sel  epiteloid  dari  fibroblas.  Sel-sel epiteloid  tersebut  akan  membentuk  sel  teka interna  dari  folikel.  Folikel  sekunder  dengan sel teka interna disebut folikel preantral [15]. Pada  akhir  tahap  perkembangan  folikel sekunder,  sel  granulosa  bertambah  dan memproduksi  cairan  yang  disebut  liquor folikuli dan ditimbun di antara sel-sel folikel sehingga  terbentuk  rongga  disebut  antrum folikuli  yang  berisi  cairan  folikel  yang mengandung beberapa makromolekul seperti glikosaminoglikan,  protein,  dan  hormon steroid  seperti  estrogen,  progresteron,  dan androgen [16].
Folikel  tertier  (folikel  antral)  ditandai dengan terbentuknya lebih dari lima lapis sel granulosa  yang  mengelilingi  oosit,  antrum folikuli  semakin  meluas,  sel  teka  eksterna menyusun diri mengitari folikel, dan sel yang mengitari  zona  pelusida  mulai  membentuk korona radiata [14]. Diameter folikel semakin meningkat  akibat  adanya  proliferasi  sel granulosa  dan  sel  teka,  serta  pembentukan antrum  folikuli  yang  semakin  membesar karena produksi cairan folikuli yang semakin meningkat  pula  sehingga  oosit  terdesak  ke bagian  tepi  folikel.  Dinding  folikel  semakin menipis  dan  akan  menjadi  stigma  yang nantinya akan robek pada  saat ovulasi.  Pada kondisi inilah, folikel yang terbentuk disebut dengan folikel de Graaf [13].
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan bahwa
PMSG dan ekstrak pituitari mempunyai  kemampuan  yang  sama  dalam menginduksi  folikulogenesis  pada  tikus putih.  Pendapat  tersebut  didukung  oleh Hafizuddin et al. [7] yang melaporkan bahwa tidak ada perbedaan kemampuan PMSG dan ekstrak  pituitari  sapi  dalam  menghasilkan embrio pada mencit. Meskipun tidak terdapat perbedaan  jumlah  folikel  yang  dihasilkan antar  dua  kelompok  perlakuan  tetapi  jika dilihat  secara  terperinci  terbukti  bahwa jumlah  folikel  tertier  yang  dihasilkan  hasil induksi  dengan  PMSG  cenderung  lebih banyak dibandingkan dengan ekstrak pituitari  sedangkan  folikel  primer  dan sekunder  cenderung  lebih  banyak  pada kelompok  ekstrak  pituitari  dibandingkan kelompok  PMSG.  Hormon  PMSG  dapat menimbulkan  reaksi  biologi  berupa  reaksi superovulasi. Mekanisme kerja PMSG sebagai agen  superovulasi  dalam  menstimulasi perkembangan  folikel  tambahan  lainnya diantaranya  melalui  beberapa  cara  yaitu folikel kecil direkruit dan dipercepat pertumbuhannya menjadi folikel yang berkembang, jumlah folikel preantral ditingkatkan, pertumbuhan folikel antral baik yang  kecil  maupun  yang  besar  ditingkatkan sehingga  proporsi  folikel  antral  yang mengalami atresi akan menurun, folikel atresi (stadium  ringan)  akan  diselamatkan  kembali supaya  dapat  tumbuh  berkembang  dan berovulasi  [17].  Kondisi  tersebut  juga kemungkinan  disebabkan  pada  kelompok PMSG  lebih  banyak  folikel  primer  dan sekunder yang tumbuh menjadi folikel tertier karena  PMSG  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah PG-600 yang terdiri dari 400  IU  PMSG  dan  200  IU  hCG.  Tingginya kandungan hCG menyebabkan folikel sekunder  dapat  bertransformasi  menjadi
folikel  tertier.  Hormon  LH  (hCG)  membantu proses  folikulogenesis  pada  folikel  sekunder karena  folikel  sekunder  telah  mempunyai reseptor untuk LH [18,19].
Kemampuan ekstrak pituitari menginduksi  folikulogenesis  membuktikan pernyataan  Isnaini  et  al.  [5]  bahwa  pituitari mengandung hormon FSH dan LH. Bukti lain dilaporkan  bahwa  PMSG  dan  ekstrak pituitari mempunyai kemampuan yang sama dalam  menginduksi  kelahiran  kembar  pada kambing [6,20,21].
Jumlah folikel dan CL pada penelitian ini tidak  dapat  dijadikan  sebagai  rujukan  hasil superovulasi  pada  tikus.  Hal  ini  disebabkan jumlah  folikel  dan  CL  yang  dihitung  hanya pada ovarium kanan. Namun demikian, data yang disajikan dapat dijadikan perbandingan kemampuan  PMSG  dan  ekstrak  pituitari sebagai preparat superovulasi. Secara normal kadar  hormon  estradiol  yang  dihasilkan sangat  tergantung  pada  jumlah  folikel ovarium. Jika perkembangan folikel berlangsung  normal  maka  akan  dihasilkan kadar hormon yang normal juga. Sebaliknya, jika  selama  proses  pertumbuhan  dan perkembangan folikel mengalami peningkatan,  maka  folikel  menjadi  matang yang akan mempengaruhi peningkatan kadar hormon estradiol yang terbentuk [22].
Konsentrasi  estradiol  pada  hari  ke-4 setelah  perlakuan  awal  memperlihatkan perbedaan  yang  tidak  signifikan  (P>0,05) seperti  yang  disajikan  pada  Tabel  1. Meskipun  tidak  berbeda  secara  statistik, tetapi bila dilihat secara terperinci konsentrasi estradiol  lebih  tinggi  pada  kelompok  PMSG dibandingkan  dengan  kelompok  ekstrak pituitari. Hormon
PMSG mempunyai aktivitas  seperti  FSH  dan  sedikit  LH  yang mampu  menstimulasi  pertumbuhan  dan pematangan  folikel  di  dalam  ovarium,  dapat meningkatkan  steroidogenesis  pada  ovarium yang  sebagian  besar  adalah  estrogen, androgen,  dan  progesteron  [23].  Kondisi tersebut  kemungkinan  juga  disebabkan  pada kelompok  PMSG  lebih  banyak  terbentuk folikel  tertier  sehingga  sekresi  estradiol menjadi  lebih  tinggi.  Folikel  de  Graaf  yang berisi  sel  telur  akan  memproduksi  hormon estrogen yang berperan dalam kejadian estrus
dengan  tanda-tanda  yang  jelas  secara fisiologis [24-26].
Konsentrasi estradiol pada kedua kelompok lebih tinggi dibandingkan
konsentrasi  estradiol  normal  tikus  pada  hari yang  sama  yakni  46,65+3,31  pg/ml  [27].
Peningkatan tersebut mendukung
pembuktian
bahwa ekstrak pituitari
mengandung  hormon  FSH  yang  dapat digunakan sebagai agen superovulasi.
Peningkatan  konsentrasi  estrogen  setelah superovulasi sesuai dengan laporan Riesenberg  et  al.  [28]  dan  Andriyanto  et  al. [29].  Konsentrasi  puncak  estrogen  pada  sapi potong  dara  yang  diinduksi  superovulasi dengan hCG adalah 46,0+11,0 pg/ml. Konsentrasi  puncak  diperoleh  60  jam  setelah pemberian hCG yakni ketika sapi memperlihatkan  gejala  estrus.  Peningkatan konsentrasi
estrogen dihasilkan dari peningkatan
pertumbuhan folikel.
Veiga-Lopez  et  al.  [30]  melaporkan  terdapat korelasi  yang  kuat  antara  konsentrasi estrogen pada saat berahi dengan jumlah CL. Konsentrasi  estrogen  sebelum  superovulasi lebih rendah dari 5 pg/ml, meningkat menjadi 13,6+2,1  pg/ml  pada  sapi  yang  memiliki  satu CL  dan  14,3+7,9  pg/ml  pada  sapi  yang memiliki dua atau tiga CL.

## KESIMPULAN
Dari hasil penelitian disimpulkan bahwa ekstrak  pituitari  sapi  mampu  meningkatkan aktivitas  folikulogenesis  pada  tikus  putih yang  diindikasikan  dengan  peningkatan jumlah folikel dan konsentrasi estradiol.

## KONFLIK KEPENTINGAN
Penulis  menyatakan  tidak  ada  konflik kepentingan  dengan  pihak  manapun  terkait materi yang ditulis dalam naskah ini.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Arum,  W.  P.,  T.  N.  Siregar,  dan  J.  Melia. 2013. Efek pemberian ekstrak hipofisa sapi terhadap  respons  superovulasi  sapi  aceh.
J. Med. Vet . 7:71-74. doi:10.21157/j.med.vet.v7i2.2932.
2. Putro,  P.  P.  1995.  Teknik  superovulasi untuk  transfer  embrio  pada  sapi.  Buletin FKH. UGM . 14:1-20.
3. Amiruddin,  A.,  T.  N.  Siregar,  T. Armansyah,  H.  Hamdan,  dan  M.  Rifki. 2013.    Level  steroid      sapi    aceh    yang diinduksi  dengan  pregnant  mare’s  serum gonadotropin (PMSG) dan follicle stimulating  hormone  (FSH).  J.  Kedokt. Hewan.  7:120-124.  doi:10.21157/j.ked.he- wan.v7i2.923
4. Siregar,  T.  N.,  H.  Hafizuddin,  M.  Akmal, D.  A.  Arman  Sayuti,  J.  Melia,  T. Armansyah,  S.  Syafruddin,  B.  Panjaitan, dan D. L. Adani. 2016. Follicle dynamics of Aceh cattle during estrous cycle. Glob. Vet . 17:424-429. doi:10.5829/idosi.gv.2016.424.429.
5. Isnaini,  N.,  S.  Wahjuningsih,  dan  G. Ciptadi.  1999.  In  vitro  maturasi  oosit  sapi dalam  TCM199  yang  disuplementasi dengan  ekstrak  hipofisa  sapi.  J.  Saintek .
7:75-85.
6. Siregar, T. N., I. K. Siregar, T. Armansyah, dan A. Sayuti. 2013. Tampilan reproduksi kambing  lokal  hasil  induksi  superovulasi dengan  ekstrak  pituitary  sapi.  J.  Vet . 14:91-98.
7. Hafizuddin, H., S. Suryani, Y. Yusmadi, T. Siregar,  dan  T.  Armansyah.  2010.  Respon superovulasi  mencit  dengan  ekstrak hipofisis:  Suatu  upaya  menemukan  agen superovulasi  dengan  biaya  murah.  Pros. Sem.Nas. Pet. Berkelanj. 4:52-56.
8. Oka, A. 2005. Penggunaan ekstrak hipofisa ternak  untuk  merangsang  spermiasi  pada ikan  (Cyprinus  carpio  L.).  Majalah  Ilmiah Peternakan . 8:1-8.
9. Kiernan, J. 2015. Histological and histochemical methods: theory and practice . Scion Publishing Limited, Banbury, UK.
10. Rosadi, B., M. A. Setiadi, D. Sajuthi, dan A. Boediono.  2011.  Preservasi  ovarium  dan pengaruhnya  terhadap  morfologi  folikel domba. J. Vet . 12:91-97.
11. Ross,  M.  H.  and  W.  Pawlina.  2016. Histology: a text and atlas: with correlated cell  and  molecular  biology.  Wolters Kluwer Health, Philadelphia, USA.
12. Kimura,  J.,  M.  Sasaki,  H.  Endo,  and  K. Fukuta. 2004. Anatomical and histological
characterization of the female reproductive  organs  of  mouse  deer (Tragulidae). Placenta . 25:705-711.
doi:10.1016/j.placenta.2004.02.009.
13. Hafez,  E.  S.  E.,  and  B.  Hafez.  2000. Reproduction  in  farm  animals . Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, US.
14. Cushman,  R.  A.,  V.  S.  Hedgpeth,  S.  E. Echternkamp,  and  J.  H.  Britt.  2000. Evaluation of numbers of microscopic and macroscopic  follicles  in  cattle  selected  for twinning.  J.  Anim.  Sci . 78:1564-1567. doi:10.2527/2000.7861564x.
15. Scaramuzzi,  R.  J.,  D.  T.  Baird,  B.  K. Campbell,  M.  A.  Driancourt,  J.  Dupont,  J. E. Fortune, R. B. Gilchrist, G. B. Martin, K. P. McNatty, A. S. McNeilly, P. Monget, D. Monniaux, C. Viñoles, and R. Webb. 2011. Regulation  of  folliculogenesis  and  the determination  of  ovulation  rate  in ruminants. Reprod. Fertil. Dev . 23:444-467. doi:10.1071/rd09161.
16. Mescher,  A.  L.  2018.  Junqueira’s  ba sic histology  text  and  atlas . McGraw-Hill Education, New York, US.
17. Dott, H., M. F. Hay, D. Cran, and R. Moor. 1979.  Effect  of  exogenous  gonadotrophin (PMSG) on the antral follicle population in the  sheep.  Reproduction . 56:683-689. doi:10.1530/jrf.0.0560683.
18. Yung,  Y.,  S.  Aviel-Ronen,  E.  Maman,  N. Rubinstein,  C.  Avivi,  R.  Orvieto,  and  A. Hourvitz. 2014. Localization of luteinizing hormone  receptor  protein  in  the  human ovary.  Mol.  Hum.  Reprod . 20:844-849. doi:10.1093/molehr/gau041.
19. Zoheir, K. M. A., G. I. Harisa, A. A. Allam, L. Yang, X. Li, A. Liang, A. A. Abd-Rabou, and  A.  H.  Harrath.  2017.  Effect  of  alpha lipoic  acid  on  in vitro  development  of bovine  secondary  preantral  follicles.
Theriogenology . 88:124-130. doi:10.1016/j.theriogenology.2016.09.013.
20. Zulkarnain,  Sutiyono,  dan  E.  T.  Setiatin. 2015.  Pemanfaatan  ekstrak  hipotalamus kambing  sebagai  upaya  optimalisasi kesuburan  kambing  kejobong  betina.  J.
Vet . 16:343-350. 21. Siregar,  T.  N.  2011.  Teknologi  manipulasi ovulasi secara imunologik untuk pelestarian  sapi  aceh  dan  peningkatan kesejahteraan    ekonomi    peternak . Banda
Siregar et al (2020) Livest. Anim. Res. 18(2): 171-179
Aceh. 22. Barrett, K. E.,    S. M. Barman, H. L. Brooks, and J. X.-J. Yuan. 2019. Ganong's review of medical physiology .
McGraw-Hill Education, San Francisco, US.
23. Zhang,  L.,  X.  Zhang,  Y.  Lu,  L.  Li,  and  S. Cui.  2017.  MiRNA-143  mediates  the proliferative  signaling  pathway  of  FSH and  regulates  estradiol  production.  J. Endocrinol . 234:1-14. doi:10.1530/JOE-16-0488. 24. Narulita, E., J. Prihatin, K. Anam, dan F. A.
R.  H.  Oktavia.  2017.  Perubahan  kadar estradiol dan histologi uterus mencit (Mus musculus) betina dengan induksi
progesteron sintetik. BIOSFERA .
34:117-122.  doi:10.20884/1.mib.2017.34.3.4-
87.
25. Shaw,  N.,  S.  Histed,  S.  Srouji,  J.  Yang,  H. Lee,  and  J.  Hall.  2010.  Estrogen  negative feedback  on  gonadotropin  secretion: evidence  for  a  direct  pituitary  effect  in women.  J.  Clin.  Endocrinol.  Metab . 95:1955-1961. doi:10.1210/jc.2009-2108.
26. Grassi, S., A. Frondaroli, M. Scarduzio, C. V.  Dieni,  G.  Brecchia,  C.  Boiti,  and  V.  E.
Pettorossi.  2012.  Influence  of  sex  and estrous cycle on synaptic responses of the medial  vestibular  nuclei  in  rats:  role  of circulating  17β -estradiol.  Brain.  Res.  Bull . 87:319-327. doi:10.1016/j.brainresbull.2011.11.008.
27. Mitak, M., T. Gojmerac, B. Mandić, and Ž.
Cvetnić. 2001. Changes in serum concen tration  of  17β -estradiol  in  female rats  during  estrous  cycle  after  treatment with  atrazine  and  zearalenone.  Vet.  Med . 46:145-148. doi:10.17221/7868-VETMED.
28. Riesenberg, S., S.  Meinecke-Tillmann, and B.  Meinecke.  2001.  Estradiol-17beta  and progesterone  in  the  peripheral  blood plasma  of  goats  following  superovulation with a single dose of pFSH, hMG or eCG.
Small Ruminant Res . 40:73-82.
doi:10.1016/s0921-4488(00)00212-1.
29. Andriyanto,  Amrozi,  M.  Rahminiwati,  A. Boediono, and W. Manalu. 2017. Optimum dose  and  time  of  pregnant  mare  serum gonadotropin injections in Kacang goats to increase endogenous secretion of estrogen and  progesterone  without  superovulation response.
Small Ruminant Res .
149:147-153.  doi:10.1016/j.smallrumres.20-
17.02.005.
30. Veiga-Lopez, A., A. Gonzalez-Bulnes, J. A. F. Tresguerres, V. Dominguez, C.
Ariznavarreta,  and  M.  J.  Cocero.  2006. Causes,  characteristics  and  consequences of  anovulatory  follicles  in  superovulated sheep.  Domest.  Anim.  Endocrin . 30:76-87. doi:10.1016/j.domaniend.2005.06.001.