! !
Profil Interleukin-4 dan Interferon Gamma pada Mencit galur Balb/c Pasca Vaksinasi Ekstrak Kelenjar saliva Anopheles sundaicus s.l. dan Diinfeksi Plasmodium berghei -ANKA
Profile of Interleukin-4 and Interferon- γ of Balb/c Mice after Salivary Gland Extrac of Anopheles sundaicus s.l. Vaccination  and
Infected by Plasmodium berghei -ANKA
Ali Machrus 1.*) , Adrial 2) , Yunita Armiyanti 3) , Hidayat Teguh Wiyono 1) , & Kartika Senjarini 1) 1 JurusanBiologi FMIPA Universitas Jember
2 Fakultas Kedokteran Universitas Padang
3 Fakultas Kedokteran Universitas Jember
* ) E-mail: a5krus@yahoo.co.id
!

## ABSTRACT
Malaria infection is initiated when sporozoites are inoculated into a vertebrate host via the salivary glands of an Anopheles mosquito.  During Anopheles bite,    the  salivary  glands  release  components  that  include vasomodulator  and  immunomodulators.  The  salivary  components  of  vectors  have  important  role  in transmission of pathogen. Therefore, if these components were injected repeatedly into a vertebrate host, it can stimulate  host  immune  system  and  inhibit  the  transmission  of  the  pathogen  into  the  host.  This  could  be observed the increasing level of  IFN- γ and decreasing level of IL-4 in mice model  of malaria after vaccination with  salivary gland ekstract (SGE) from An sundaicus s.l. It has also been proven that this mechanisms was related with pathogen of malaria. This was supported by the reduction of parasitemie rate in those mice model after infection by P. Berghei.
Keywords: An sundaicus s.l., IFN- γ , IL-4,immunomodulators, salivary gland, TBV

## PENDAHULUAN
Malaria merupakan salah satu penyakit infeksi parasit yang  disebabkan  oleh Plasmodium dan  ditularkan oleh  nyamuk Anopheles betina.  Penularan  ini  terjadi ketika  nyamuk Anopheles betina  melakukan blood feeding. Infeksi  ini  menyebabkan  masalah  kesehatan dunia.  Lebih  dari  3  milyar  manusia  yang  tinggal  di daerah  endemik    dan  diperkirakan  350  sampai  500 juta  setiap  tahun  beresiko  menderita  malaria (Lavazec,  2007).  Lebih  dari  3  juta  orang  meninggal tiap  tahun  akibat  malaria  sehingga  menempatkan malaria  sebagai  peringkat  ke  delapan  yang memberikan kontribusi pengurangan populasi manusia (Donovan et al. , 2007).
Indonesia  adalah  salah  satu  negara  endemis malaria,  walaupun  telah  dilakukan  program penatalaksanaan    malaria    sejak  tahun  1959,    namun hingga  akhir 2011  kasus penyakit  malaria  masih  tinggi.  Angka  penderita malaria  dibeberapa  propinsi  bagian  timur  Indonesia masih diatas rata-rata nasional yaitu >2,4% (DepKes, 2011).  Hal  ini  terjadi  karena  permasalahan  yang berkaitan dengan malaria sangat komplek. Salah satu dari permasalahan tersebut yang paling utama adalah meningkatnya  kasus  resistensi  parasit  terhadap klorokuinon dan sulfadoksin-piremetamin
(BAPPENAS,  2010;  Zein,  2005;  Kemenkes  RI, 2011),  serta  timbulnya  resistensi  vektor  terhadap insektisida  (Ramirez et  al. ,  2009).  Oleh  karena  itu perlu  dilakukan  langkah-langkah  baru  dalam pencegahan terhadap malaria yaitu dengan mengembangkan  vaksin  malaria.  Mengingat  hingga saat ini belum ditemukan vaksin yang efektif terhadap malaria, maka diperlukan terobosan baru pengembangan  vaksin  yang  dapat  menghambat transmisi  patogen  ke  dalam  tubuh  host  yaitu Transmission  Blocking  Vaccine (TBV)  berbasis saliva.
Kelenjar saliva nyamuk Anopheles telah terbukti mengandung  zat  anti  koagulan,  vasodilator, antihistamin dan imunomodulator (Titus et al ., 2006; Dhar et  al. ,  2003).  Zat-zat  ini  berperan  untuk memudahkan vektor nyamuk untuk melakukan blood feeding dengan  demikian  secara  tidak  langsung  juga memudahkan infeksi parasit ke tubuh inang.
Anti  koagulan  dalam  saliva  terbukti  mencegah pembekuan  darah,  sehingga  dapat  memudahkan nyamuk untuk blood feeding . Vasodilator meningkatkan  diameter  pembuluh  darah  sehingga memudahkan  sirkulasi  darah  dan  mencegah vasokontriksi,  sehingga blood  feeding lebih  efisien (Dhar et  al. ,  2003).  Selain  itu  terdapat    komponen imunomodulator  yang  mempengaruhi  keberhasilan
transmisi  parasit  ke  dalam  tubuh  host.  Faktor imunomodulator  tersebut  bersifat  imunosupresif dengan  menekan  respon  imun  nonspesifik  ( innate immunity )  dan  mengubah  respon  imun  spesifik ( adaptive  immunity )  kearah  Th2  sehingga  lebih menguntungkan bagi nyamuk untuk melakukan blood feeding dan  memudahkan  transmisi  parasitnya.  Oleh karena  itu,  faktor  imunomodulator    merupakan  salah satu  kandidat  potensial  untuk  pengembangan  TBV malaria.  Ekplorasi  terhadap  respon  imun  berkaitan dengan  ekstrak  kelenjar  saliva  (SGE)  yang merupakan  langkah  penting  untuk  pengembangan vaksin  tersebut. Anopheles  sundaicus s.l.  merupakan salah  satu  vektor  potensial  di  Indonesia  dan  belum diteliti  aktifitas  kelenjar  salivanya.  Tujuan  penelitian ini  adalah  untuk  mengetahui  pengaruh  pemberian vaksin  model  SGE  nyamuk An.  sundaicus s.l. terhadap  profil  IL-4  dan  IFN- γ hewan  coba  mencit galur  BALB/c    berkaitan  dengan  infeksi  malaria melalui parasit Plasmodium berghei-ANKA .

## METODE
Rearing Anopheles sundaicus s.l. An sundaicus s.l. diperoleh dari hasil Rearing dilakukan  pada  kedua  hasil  koleksi  yaitu larva  dan  nyamuk.  Koleksi  larva  dilakukan  dengan cara mengambil larva secara langsung yang berada di habitatnya.  Dengan  menggunakan  gayung  dengan pegangan  panjang  agar  dapat  menjangkau  larva  di tempat  yang  jauh.  Larva  yang  terperangkap  pada gayung  tersebut  diambil  dengan  pipet  karet  untuk dipindahkan  pada  botol  plastik.  Larva  kemudian dikembangkan  di  laboratorium  untuk  ditumbuhkan menjadi nyamuk dewasa (Gerberg, 1970; Mool et al., 2008).  Koleksi  nyamuk  dilakukan  pada  malam  hari ketika nyamuk keluar untuk mencari makan. Dengan menggunakan  aspirator  menangkap  setiap  nyamuk yang  menempel  pada  hewan  atau  pada  daun  dan selanjutnya disimpan pada kandang nyamuk.
Larva yang sudah menjadi kepompong dipindahkan  ke  kandang  untuk  bermetamorfosis menjadi  nyamuk  dewasa.  Makanan  nyamuk disesuaikan dengan fase pertumbuhan dan perkembangan  nyamuk.  Larva  nyamuk  diberi makanan  pelet  ikan  yang  banyak  mengandung protein.  Nyamuk  jantan  diberi  makanan  yang mengandung  sukrosa  10%,  sedangkan  bagi  nyamuk betina  disediakan  hewan  untuk  diisap  darahnya. Nyamuk  dewasa  hasil rearing dapat  langsung  di isolasi  kelenjara  saliva  atau  dipelihara  untuk kembangbiakkan (Gerberg, 1970; Moll et al., 2008).

## Isolasi kelenjar saliva
Isolasi  SG  dilakukan  pada Anopheles betina  yang diawali  dengan  cara  menganastesi  dengan  kloroform beberapa detik, selanjutnya nyamuk betina diletakkan pada wadah berisi larutan  NaCl  0,1%.  Satu persatu nyamuk  betina  diambil  diletakkan  pada  kaca  benda yang  ditetesi  dengan  PBS    untuk  disolasi  kelenjar saliva  dengan  cara microdissection dibawah
mikroskop.  Kelenjar  saliva  yang  telah  diisolasi disimpan  dalam  suhu  -20°C  sampai  diperlukan. Jumlah  kelenjar  saliva An.  sundaicus s.l. . yang digunakan  dalam  penelitian  ini  berjumlah  1500  ekor ( Bishop et al., 2006).

## Preparasi vaksin model
Ekstraksi  kelenjar  saliva  nyamuk    sebagai  vaksin model    SGE    dilakukan  dengan  teknik freez  and thaw .Selanjutnya  dilakukan    homogenisasi  dengan mikropistil dan water sonication sampai protein saliva pecah.  Protein  saliva  disentrifuge  selama  5  menit dengan  kecepatan  14.000  rpm  pada  suhu  4 ° C,  untuk mendapatkan  pelet    dan  supernatan  yang  akan digunakan  untuk  vaksinasi.  Supernatan  dan  pelet masing-masing  ditambahkan  PBS  hingga  2500 µ l selanjutnya  disimpan  pada  suhu  -20 ° C  hingga digunakan.

## Preparasi mencit
Mencit  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini Mus musculus BALB/c  hasil  perkembang  biakan  yang dilakukan di laboratorium yang berumur 6-8 minggu. 45  e  kor  mencit  sebelum  digunakan  diaklimatisasi selama  2  mingguhingga  mencapai  berat  25-30  gr. Selanjutnya  mencit  dibagi  menjadi  3  kelompok, bagian  pertama  sebagai  kelompok  kontrol,  bagian kedua  sebagai  kelompok  pelet  dan  bagian  ketiga sebagai kelompok supernatan.

## Injeksi vaksin model SG
Injeksi vaksin model SG dilakukan melalui subkutan bagian  femur  dengan  dosis  100 µ l/ekor  yang dilakukan sebanyak 3 kali dengan interval 2 minggu. Sebelum  vaksin  model  SG  dinjeksikan,  vaksin ditambahkan  adjuvan  aluminium  hidroksida  dengan perbandingan  1:1.  Sedangkan  kelompok  kontrol diinjeksi  dengan  campuran  PBS  dan  Adjuvan aluminium  hidroksida  dengan  perbandingan  yang sama  yaitu  1:1  dan  dosis  yang  sama.  Setelah  semua mencit  divaksin  semua,  2  minggu  kemudian  mencit- mencit  tersebut  diinjeksi  dengan P.  Berghei. Perhitungan  derajat  parasitemia  dilakukan  setelah  24 jam infeksi P berghei hingga 6 hari , sedangkanpengamatan respon imun dilakukan 24 jam sebelum vaksinasi, 7 hari  setelah vaksinasi ke1, ke 2, 24 jam pasca infeksi parasit dan 6 hari pasca infeksi parasit
Preparasi Plasmodium  berghei
Infeksi  parasit  pada  hewan  coba  dilakukan  dengan mengambil darah mencit donor yang memiliki derajat parasit >15% melalui kardiak. Sebanyak 10 µ l darah dari  mencit  donor  yang  diletakkan    pada heparin vacumtainer dicampur  990 µ l  dan  diinjeksikan  pada hewan coba sebanyak 200 µ l.

## Penghitungan derajat parasitemia
Derajat  parasitemia  pada  mencit  yang  telah  diinfeksi P  berghei dihitung  setelah  24  jam  yang  diawali
! !
dengan  menggambil  darah  melalui  ekor.  Darah  yang keluar  dari  ekor  diteteskan  pada  objek  glass  untuk dibuat apusan. Apusan difiksasi dengan metanol dicat dengan  gymsa  dan  diamati  pada  mikroskop  dengan pembesaran  400x.  Derajat  parasit  diperoleh  dengan menghitung  jumlah  parasit  tiap  1000  eritrosit  yang dinyatakan dengan persen.

## Pengambilan plasma
Pengambilan  plasma    diawali  dengan  pengambilan darah  melalui  ekor  dengan  menganastesi  mencit dengan  menggunakan xylasin dan ketamine dengan perbandingan  1:10.  Setiap  100 µ l  campuran xylasin dan ketamine selanjutnya  diencerkan  dengan  PBS sebanyak  200 µ l.  Untuk  menganastesi  setiap  mencit dibutuhkan  100 µ l  campuran  yang  sudah  diencerkan tersebut.  Jika  mencit  sudah  dalam  keadaan  lemas, selanjutnya  memotong  bagian  ujung  ekor  dengan menggunakan  gunting  steril.  Jika  ujung  ekor  sudah berdarah pipa kapiler dapat didekatkan kearah tetesan darah  tersebut.  Untuk  mempercepat  pengambilan darah  dapat  dilakukan  dengan  mendorong  pangkal ekor kearah ujung ekor. Darah yang keluar ditampung dalam ependorf ,  dan  selanjutnya    diinkubasi  pada suhu 37 0 C selama 30 menit. Setelah diinkubasi darah disentrifuge    pada  kecepatan  13.000  rpm  pada  suhu 27 ° C  selama  10  menit.    Plasma  yang  sudah  terpisah dengan  sel    darah  diambil  dengan  mikropipet  dan dipindahkan  pada ependorf baru.  Setelah  diperoleh, plasma disimpan pada suhu -20 ° C sampai siap untuk uji  elisa.  Pengambilan  plasma  dan  pemindahan kedalam ependorf dilakukan di laminar air flow.
Pengukuran  kadar  IL-4  dan  IFN- γ melalui  uji elisa Pengukuran  kadar  IL-4  dan  IFN- γ plasma  mencit dilakukan secara individu dan populasi pada tiap-tiap kelompok  perlakuan.  Sampel  yang  berupa  plasma selanjutnya  diuji  dengan Uji  Enzyme  linked Immunosorbent  Assay (ELISA)  untuk  mengetahui kadar IFN- γ dan IL-4.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  pengujian  pada  individu  menunjukkan  adanya peningkatan  kadar  IL-4  pada  kelompok  pelet  pasca vaksinasi  ke-2,  namun  menunjukkan  penurunan setelah  vaksinasi  ke-3  apabila  dibandingkan  dengan kelompok  kontrol.  24  jam  pasca  infeksi  kadar  IL-4 menunjukkan peningkatan sementara itu 6 hari pasca infeksi menunjukkan penurunan kembali. Keadaan ini berbeda dengan kelompok kontrol yang menunjukkan masih  tingginya  kadar  IL-4  pada  hari  ke  6  pasca infeksi.
Kelompok  supernatan  menunjukkan  kadar  IL-4 yang  jauh  lebih  kecil  bila  dibandingkan  dengan kelompok pelet dan kontrol. Kondisi ini terjadi ketika sebelum  vaksinasi  dan  sesudah  vaksinasi  dilakukan bahkan setelah infeksi parasit kadar IL-4 masih tetap
kecil.  Bila  dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol, kadar  IL-4  pada  kelompok  supernatan  memiliki  pola yang  menunjukkan  peningkatan  kadar  IL-4  setelah vaksinasi.  Namun  hari  ke  6  pasca  infeksi  parasit, kadar  IL-4  pada  kelompok  supernatan  menjadi  turun bila dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 1).
Gambar  1.    Hasil  pengukuran  kadar  IL-4  plasma darah pada uji individu seekor  mencit sebelum  dan  sesudah  diimunisasi vaksin  SGE An.  sundaicus s.l.  dengan metode  elisa.  K=  Kelompok  Kontrol, P=  kelompok  Pelet,  S=  kelompok supernatan
Hasil  ini  didukung  dengan  hasil  pengujian  pada populasi,  kadar  IL-4  dari  populasi  mencit  baik  pada kelompok  perlakukan    maupun  kelompok  kontrol yang  juga  menunjukkan  profil  yang  sama  dengan hasil  uji  individu.  Pada  kelompok  perlakukan terutama  pada  kelompok  pelet  menunjukkan  kadar IL-4 yang tinggi pada awal vaksinasi, namun setelah vaksinasi  ke  2  kadar  IL-4  menunjukkan  penurunan, sedangkan  pada  kelompok  kontrol  justru  mengalami peningkatan (Gambar2).
Sementara  itu  24  jam  pasca  infeksi  kadar  IL-4 pada  kelompok  pelet  menunjukkan  peningkatan  dan memiliki  kadar  yang  lebih  tinggi  dari  kelompok kontrol, namun setelah 6 hari pasca infeksi kadar IL-4 kembali menurun dan memiliki kadar IL-4 yang lebih rendah dari kelompok kontrol.
Kelompok supernatan masih menunjukkan kadar yang  sama  dengan   hasil   uji  individu
yaitu  lebih  rendah  bila  dibandingkan  dengan kelompok  kontrol  tetapi  menunjukkan  profil  yang berbeda  yaitu    menunjukkan  penurunan  kadar  IL-4 setelah  vaksinasi  ke  3.  Profil  ini  juga  memberikan gambaran yang sama dengan kelompok pelet. Namun setelah,  infeksi  parasit  menunjukkan  peningkatan sedikit  kadar IL-4 tetapi masih lebih rendah kadarnya bila  dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol  dan pelet.  Kondisi  terus  bertahan  hingga  hari  ke  6  pasca
infeksi.  Dengan  demikian  bila  dilihat  dari  hasil  uji populasi, kelompok supernatan memiliki  profil yang sama  dengan  kelompok  pelet  tetapi  memiliki  kadar yang berbeda.
Gambar 2. Hasil pengukuran kadar IL4 plasma darah pada populasi mencit sebelum dan sesudah diimunisasi vaksin SGE An. sundaicus s.l. dengan  metode  elisa.  K=  Kelompok Kontrol, P= kelompok Pelet, S= kelompok supernatan
Kadar    IFN- γ hasil  uji  individual  secara umum  menunjukkan  bahwa  terjadinya  peningkatan pada  kelompok  perlakuan  bila  dibandingkan  dengan kelompok  kontrol.  Peningkatan  ini  terjadi  khususnya setelah  pemberian  vaksinasi  model  dengan  kelenjar saliva. Kadar IFN- γ yang paling tinggi terdapat pada kelompok  supernatan.  Begitu  juga  pada  kelompok pelet,  walaupun  memiliki  kadar  IFN- γ yang  sama dengan  kelompok  kontrol  pada  awal  vaksinasi, namun  pasca  vaksinasi  ke  3  justru  kadar  IFN- γ mengalami  peningkatan  yang  sangat  tinggi.  Hal  ini ditunjukkan pada Gambar 3.
Gambar  3.  Hasil  pengukuran  kadar  IFN- γ plasma darah  pada  individu  mencit  sebelum dan  sesudah  diimunisasi  vaksin  SGE An. sundaicus s.l. dengan metode elisa.
K=  Kelompok  Kontrol,  P=  kelompok Pelet, S= kelompok supernatan
Hasil  uji  populasi  terhadap  kadar  IFN- γ juga menunjukkan  tren  hasil  yang  sama  dengan  hasil  uji individual.  Sebelum  vaksinasi  kadar  IFN- γ pada kelompok  kontrol  dan  kelompok  perlakuan  sangat rendah.  Pada  kelompok  perlakuan  kadar  IFN- γ menunjukkan  peningkatan,  terutama  dua  minggu setelah  vaksinasi  dan  kadar  ini  terus  meningkat hingga  enam hari setelah infeksi parasit. Sedangkan pada  kelompok  kontrol  kadar  IFN- γ hingga  dua minggu  pasca  vaksinasi  masih  tetap  rendah.  Profil kadar  IFN- γ hasil  uji  populasi  dapat  dilihat  pada Gambar 4.
Tingginya  kadar IL-4 setelah  vaksinasi  model SGE pada  kelompok pelet dimungkinkan merupakan bentuk  respon  imun  primer  terhadap  protein imunomodulator  yang  terdapat  pada  kelenjar  saliva. Pada saat komponen saliva pertama kali diinjeksikan ke dalam tubuh inang, maka sebagai reaksinya tubuh akan  membentuk  zat  anti.  Bila  zat  tersebut  adalah ekstrak  kelenjar  saliva  yang  memiliki  komponen komplek  seperti  vasomodulator  dan    komponen imunomodulator,  maka  tubuh  akan  membentuk  zat anti  terhadap  komponen  saliva  tersebut.  Hasil penelitian  ini  mengindikasikan  bahwa  komponen dalam  saliva  tersebut  mempunyai  kemampuan  untuk mensupresi  perkembangan  sel  Th1  dan  memodulasi respon imun ke arah Th2.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  hasil  yang sama  dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh Donovan, 2007.
Gambar  4.  Hasil  pengukuran  kadar  IFN- γ plasma darah pada populasi mencit sebelum dan sesudah  diimunisasi  vaksin  SGE An. sundaicus s.l.  dengan  metode  elisa.  K= Kelompok Kontrol, P= kelompok Pelet, S= kelompok supernatan
Namun  reaksi  pertama  tubuh  terhadap  protein saliva  tidaklah  terlalu  kuat.  Tubuh  belum  memiliki
! !
memori  untuk  mengatasinya.  Tetapi  pasca  vaksinasi kedua,  ketiga  dan  seterusnya,  tubuh  dapat  membuat zat  anti  lebih  cepat.  Terbentuknya  antisaliva  yang lebih  besar  dan  lebih  cepat  diduga  menyebabkan peran sel Th-2 menjadi berkurang, sehingga kadar IL- 4 menjadi berkurang.
Penurunan    kadar  IL-4  setelah  pemberian vaksinasi  ke  dua    dan  ke  tiga,  akan  memberikan sinyal  positif  bagi  aktivasi  makrofag.  Makrofag sebagai  APC  akan  mensekresi  IL-12  dan  IFN- γ . Sitokin  yang  dihasilkan  oleh  APC  juga  dapat mengaktivasi  sel  NK,  sel  NKT,  CD8  dan  juga  sel gamma delta T untuk memproduksi IFN- γ yang lebih besar  untuk  perkembangan  sel  Th0  menjadi  sel  Th1. Selanjutnya  sel  Th1  akan  mensekresi  IFN- γ untuk mengaktivasi  makrofag  dan  seterusnya.Makrofag yang  diaktivasi    akan  melepaskan  radikal  bebas seperti  NO,  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 ),  O 2 singlet, OH-  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan  parasit (Gambar 5).
Gambar 5. Grafik derajat parasitemia pada kelompok kontrol,  supernatan  dan  pelet  dengan menggunakan  kelenjar  saliva An sundaicus s.l. K= Kelompok Kontrol, P=  kelompok  Pelet,  S=  kelompok supernatan

## KESIMPULAN
Dari  hasil  penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa secara  kuantitatif  telah  terjadi  perbedaan  kadar  IL-4 dan  IFN- γ pada  hewan  coba  mencit  Balb/c,  sesudah vaksinasi dengan menggunakan vaksin model SGE An sundaicus s.l.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  vaksin model  SGE An  sundaicus s.l.  mampu  memodulasi respon  imun  inang  dari  subsetTh2  ke  arah  subset Th1.Kondisi  ini  memberikan  pengaruh  negatif terhadap  perkembangan  parasit  malaria  yang dibuktikan  dengan  penurunan  derajat  parasit  pada kelompok  perlakuan.  Kadar  IL-4  pada  kelompok perlakuan  menurun  bila  dibanding  dengan  kelompok yang  tidak  divaksin  (kelompok  kontrol).  Sementara
itu    pada  kelompok  perlakuan  kadar  IFN- γ memiliki kecenderungan meningkat bahkan setelah infeksi.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahlfors  H.    2009. Interleukin-4  induced  leukocyte differentiation . Universitatis Turkuensis. Medica – Odontologica.
Andrade, BB, Teixeira, CR, Barral, A & Barral-netto M. 2005.  Haematophagous Arthropod Saliva and Host  Defense  System:  a  tale  of  tear  and  blood. Annals  of  the  Brazilian  Academy  of  Sciences . 77(4): 665-693.
Bannister,  Lawrence  H  &  Sherman,  I  W.  2009. Plasmodium.  In:  Encyclopedia  of  Life  Sciences (ELS) . John Wiley & Sons, Ltd:Chichester. BAPPENAS.  2010. Laporan  Pencapaian  Tujuan Pembangunan Milenium Di Indonesia . Kementerian Perencanaan Pembangunan Nasional/Badan Perencanaan Pembangunan Nasional (BAPPENAS).
Berlin,  Renteria, L., Thomas , P., Eisele, Keating, J., Mark A., & James, Wesson, D.M. 2010. Antibody Response Against Anopheles albimanus (Diptera: Culicidae)  Salivary  Protein  as  a  Measure  of Mosquito  Bite  Exposure  in  Haiti .  Entomological Society of America . 0022- 2585/10/1156 Ð 1163$04.00/0 BISHOP  JV.,    2006. Salivary  Gland  Extracts  of Culicoides Sonorensis Inhibit Murine Lymphocyte Proliferation And No Production By Macrophages. Colorado
Cattopadhyay,  R.,  &  Kumar,S.  2009.  Malaria vaccine:  Lates  Update  and  Challenges  Ahead. Indian  Journal  of  Experimental  Biology .vol.  47. Pp 527-536
Chan M. 2009. World Malaria Report.. World Health Organization
Coutinho-Abreu  I.V  &  Ortigao  MR.  2010.
Transmission  Blocking  Vaccines  To  Control Insect-Borne  Diseases. Mem  Inst  Oswaldo  Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 105 (1): 1-12,
Depkes  RI,  2008. Pedoman  Penatalaksanaan Malaria  di  Indonesia .  Direktur  Jenderal Pengendalian Penyakit dan Penyehatan Lingkungan.
Dhar  R  &  Kumar  N,  2003.  Role  Of  Mosquito Salivary Glands .Current Science , Vol. 85 (9) . Donovan    M.J.,    Messmore,A.S.,    Scrafford,  D.A., Sacks, D.L.,  Kamhawi, S., & Dowell M.A. 2007. Uninfected  Mosquito  Bites  Confer  Protection against Infection with Malaria Parasites . American Society for Microbiology Vol. 75(5): 2523–2530 Endaryanto  A.,Harsono,  A., Prospek  Probiotik Pencegahan  Alergi  Melalui  Induksi  Aktif Toleransi  Imunilogi .Ilmu  Kesehatan  Anak  .  FK. Unair.
Fontaine A., Diouf, I.,  Bakkali, N., Missé, D., Pagès, F.,  Fusai,  T.,  Rogier,  C.,  &  Almeras,  L.  2011. Implication  of  Haematophagous  Arthropod
Salivary  Proteins  in  Host-Vector  Interactions . Parasites & Vectors . 4;187
Gerberg  ,E.J.  1970. Mosquito  Rearing  and
Experiment techniques
Harijanto  P.N.  2000.  Malaria  epidemiologi,
Patogenesis, Manifestasi Klinis
dan
Penangannya. Jakarta:EGC
James  A.    2003.  Blocking  Malaria  Parasite  Invasion Of  Mosquito  Salivary  Gland. The  Journal  of Experimental Biology 206, 3817-3821 3817. Jones, K.. 2012. Intra Peritonial (IP) Injection In Rat and Mice SOP. UBC Animal care Guidelines.
Kemenkes  RI,  2011. Epidemiologi  Malaria  Di Indonesia . Triwulan 1. Buletin Kesehatan Jendela Data dan Informasi Kesehatan..
Kemenkes,  RI,,  2011. Epidemilogi  Malaria  di Indonesia. Buletin Triwulan 1.
Kementrian  Kesehatan  RI.  2007. Indonesia  Health Profile 2005. Jakarta. 351.770 212. Langhorne, J., 2005. Immunology and Immunopathogeneis  of  malaria. Springer-Verlag. Berlin. 72-152360.
Lavazec, C. &  Bourgouin, C.  2008. Mosquito-based
Transmission Blocking Vaccines For Interrupting Plasmodium Development. Microbes and Infection 10.  845e849.
Lingtom,  Y.M.,  Harbach,  R.,  Seng,  C.M.,  Anthony, T.G., &  Matusop, A., 2001 . Morphological and molecular  identity  of
Anopheles  (Cellia)
sundaicus s.l.. (Diptera: Culicidae), the nominotypical member of a malaria vector species complex in Southeast Asia. Systematic Entomology 26, 357-366. Malaguarnera. L & Musumeci, S., 2002. The immune response  to  Plasmodium  falciparum  malaria. The Lancet Infectious Diseases. Vol 2.
Markus,  Neurath,  Finotto,  S.  Laurih  &  Glimcher. 2002.  The  Role  of  Th1/Th2  Polarization  in Mucosal Immunity . Natural Medicine . Vol. 8.
Mattthew.    2011. Pro-inflamatori  Cytokine  Respon Against  Plasmodium  Falciparum-  Induction, Dynamic  And  Protective  Role  Os  Interferon- Gamma In Malaria. Radboud University Nijmegen.  Printed  by  Ipskamp  Drukkers  B.V., Enschede.
Moll,  K,  Ljungstrom,  I,  Perlmann,  HScherf,  A  & Wahlgren.  2008. Methods  in  Malaria  Research. Virginia.
Moorthy,VS.,  Michael  F.G.,  Adrian,V.S.H . 2004. Malaria  Vaccine  Developments Lancet  Review : 363: 150–56.
Okie,  S.  2005,  Betting on  a  Malaria  Vaccine ..  New
England Journal Medicine 353;18.
Perlmann,    H.,  Kumar  S.,  Vinetz  M.  Josep.,  Marika, K.,  Luis,  &  M.,Perlmann,  P.  1995.  Celluler Mechanisms In The Immune Respone To Malaria In  Plasmodium  vinckei-Infected  Mice. Infection and Immunity . Vol. 63(10): 3987–3993. Perlmann, P & Troye M. 2002. Malaria and immune system  in  human. Malaria  Immunology.  Chem Immunol. Vol 80:  229–242.
Ramirez,  JL.,  Garver,  LS.  &    Dimopoulus,  G.  2009.
Challenges  and  Approaches  for    Mosquito Targeted  Malaria  Control . Curr  Mol  Med .Vol.9(2):116-130.
Reid,  J.A.  1966.  A  Note  On  Anopheles  Subpictus Grass1 And Ludlow (Diptera : Culicidae). J. Med. Ent . Vol. 3( 3-4): 327-331.
Sharma  S.  &    Phatak  S.  2008.  Malaria  Vaccine  A Current  Perspective. J  Vector  Borne  Dis 45,  pp. 1–20.
Smith,  B.,  and  Ceusters,  W. Malaria  Diagnosis  and the Plasmodium Life Cycle : the BFO Perspective. University at Buffalo, NY.USA.
Tatontos,  E.Y.,  Inayati,  N.,  &  Ariami,  P.  2009.
Identifikasi  Ulang  Spesies  Nyamuk  Vektor Malaria  Di  Kabupaten  Lombok  Barat. Jurnal Kesehatan Prima Vol 3 (1). Taylor,  2008. Evaluation  of  the  Vaccine  Potential  of Malarial TCTP . Tesis. School of Applied Science Science,  Engineering  and  Technology  Portfolio. RMIT University.
Titus,  R.G.,  Bishop,  J.V.  &  Mejia,  J.S.  2006.  The Immunomodulatory  Factors  of  Arthropod  Saliva and  the  Potential  for  these  Factors  to  Serve  as Vaccine Targets to Prevent Pathogen Transmission. Parasite  immunology ,  2000:22: 319-331.
Valenzuela J.G., Garfield, M., Rowton, E.D., & Van M.  Pham,VM.  2004.    Identification  of  The  Most Abundant  Secreted  Proteins  from  The  Salivary Glands  of  The  Sand  Fly  Lutzomyia  Longipalpis, Vector  of  Leishmania  Chagasi . The  Journal  of Experimental Biology 207:3717-3729.
Waitayakul,  A.,  Somsri,  S.,  Sattabongkot,  J., Looareesuwan,  Cui,  L.,  &  Udomsangpeth,  R. 2006.  Natural  Human  Respon  To  Saliva  Gland Protein  Of Anopheles Mosquitoes  In  Thailand.
Acta Tropica 98: 66-73.
Yoeli, M., Most, H., and Bone, G., 1965. The natural of  plasmodium  berghei  in  the  field  and  under experimental condition. NIAID. 024-23.