EVALUASI  AKTIVITAS ANTIOKSIDATIF  EKSTRAK DAUN BELUNTAS ( Pluchea indica )  BERDASARKAN PERBEDAAN RUAS DAUN
(EVALUATION OF ANTIOXIDATIVE ACTIVITY FROM BELUNTAS LEAVES EXTRACT
( Pluchea indica Less ) BASED ON DIFFERENCE OF LEAF SEGMENT)
Paini Sri Widyawati 1) , C. Hanny Wijaya 2) , Peni Suprapti Hardjosworo 3) , Dondin Sajuthi 4)
1) Fakultas Teknologi Pertanian - Unika Widya Mandala Surabaya Alamat :  Jl Dinoyo 42-44 Surabaya,  Email : wiwiedt@gmail.com
2) Ilmu dan Teknologi Pangan  Fakultas  Teknologi Pertanian  IPB
3) Fakultas Peternakan  IPB
4) Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB

## Abstract
Beluntas  (Pluchea  indica  Less)  is  a  herb  that  commonly  used  as  traditional medicine  and  food.   Its  leaves have  many  biological  activities, because they  contain various  phenolic  compounds.  The  phenol  concentration  of  beluntas  leaves  depends on leaf segment, earth condition, fertilizer and environmental stress.  This research is focused  to  determine  antioxidant  activity  of  three  groups  of    beluntas  leaf  segments that  includes 1-3, 4-6 and > 6.  They were ground, dried at ambient temperature for 7 days, maserated by petroleum eter (1:4 b/v) at ambient temperature for 24 hours and soxhlet  extracted  by  methanol  (1:15  b/v)  at  65 o C  for  3  hours.  The  result  shows  that the  extract  contains  phytochemical  compounds  such  as  tannin,  sterol,  phenol hydroquinone  and  flavonoid.  This  extract  has  antioxidant  activity  to  scavenging  free radical DPPH (2,2-phenyl-1-picrylhydrazyl). The extract of 1-3 beluntas leaf segment was  more  potential  antioxidant  source  than  4-6  and  >  6  beluntas  leaf  segments, because it had the least IC 50 (inhibitor concentration) and the highest total phenol and total flavonoid. The IC 50 , total phenol and flavonoid  total of  it were 3.71 mg/L,  234.65 mg GAE/100 g samples and 2163.59 mg QE/ 100 g samples, respectively.
Key words :  antioxidant activity, beluntas (Pluchea indica Less), phytochemical, total phenol, total flavonoid

## Abstrak
Beluntas  ( Pluchea  indica  Less )  adalah  tanaman  herba  yang  umumnya digunakan  sebagai obat tradisional dan pangan (lalapan). Daun beluntas mempunyai beberapa aktivitas biologi karena mengandung berbagai senyawa fenolik. Konsentrasi fenol dalam daun beluntas sangat bergantung pada ruas daun, kondisi tanah, tingkat kesuburan dan stress lingkungan. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan dari ketiga kelompok dari ruas daun beluntas yang meliputi : 1-3, 4-6 dan >6. Daun beluntas yang sudah dipetik dari pekarangan, dikeringkan pada suhu 27 o C selama 7 hari, dimaserasi dengan petroleum eter (1:4 b/v) pada suhu kamar selama 24  jam  dan  diekstraksi  soxhlet  denga  metanol  (1:15  b/v)  pada  suhu  65 o C  selama  3 jam.Hasil menunjukkan bahwa ekstrak mengandung senyawa fitokimia seperti :  tanin, sterol,  fenol  hidrokuinon  dan  flavonoid.  Ekstrak  ini  mempunyai  aktivitas  antioksidan menangkap radikal bebas DPPH (2,2-phenyl-1-picrylhydrazyl). Ekstrak dari ruas daun beluntas  1-3  yang  paling  berpotensi sebagai  sumber  antioksidan  dari  ruas  daun  4-6 dan  >6,    sebab  ekstrak  tersebut  mempunyai  nilai  IC 50 (konsentrasi  penghambatan) paling kecil dan kadar fenol total dan flavonoid total tertinggi. Nilai  IC 50 , total fenol dan
total flavonoid dari ekstrak ruas daun beluntas 1-3 masing-masing sebesar  3.71 mg/L, 234.65  mg  GAE  (gallic  acid  equivalent)/100  g  berat  sampel  kering  dan  2163.59  mg QE (Quercetin equivalent)/100 g berat sampel  kering.
Kata Kunci:  aktivitas antioksidan, beluntas ( Pluchea indica Less ), fitokimia, fenol total, flavonoid total dan DPPH (2,2-fenil-1-pikrilhidrazil).

## PENDAHULUAN
Radikal  bebas,  seperti  anion superoksida  (O 2 - • ),  radikal  hidroksil (•OH)  dan  hidrogen  peroksida    (H 2 O 2 ) dapat  memicu  kerusakan  biomolekul potensial dalam makhluk hidup, seperti : lemak,  protein  dan  asam  nukleat,  yang berakibat  munculnya  berbagai  macam penyakit degeneratif. Keberadaan radikal bebas ini pada proses pengolahan pangan dapat mempengaruhi  kualitas,  stabilitas  dan keamanan pangan  (Chludil dkk. 2008) Antioksidan adalah senyawa yang  berada  pada  konsentrasi  lebih rendah dari substratnya secara signifikan dapat menunda atau
mencegah  oksidasi  (Moein  dkk.    2007). Senyawa  ini  dapat  menghentikan  reaksi radikal  bebas.    Usaha  pencarian antioksidan  alami  terus  dilakukan  untuk menggantikan  antioksidan  sintetis  yang masih diragukan akan tingkat keamanannya (Orhan dkk. 2009).
Beluntas  ( Pluchea  indica  Less )
merupakan  tanaman  perdu  kelompok Asteraceae yang telah dikenal masyarakat  sebagai  lalapan  dan  obat tradisional  (Ardiansyah  dkk.    2003). Berbagai  penelitian  telah  menyebutkan bahwa  beluntas  mengandung  senyawa lignan,  seskuisterpen,  fenilpropanoid, benzoid,  monoterpen,  triterpen,  sterol dan  alkana  (Luger  dkk.  2000),  akar mengandung  stigmasterol  (+ β -sitosterol), stigmasterol glikosida (+ β -sitosterol- glikosida), 2-(prop-1-unil)-5-(5,6- dihidroksi  heksa-1,3-diunil)-thiofena  dan (-)-katekin (Biswas dkk. 2005), sedangkan daun mengandung hidrokuinon,  tanin,  alkaloid  dan  sterol (Ardiansyah dkk. 2003), flavonol,
seperti : mirisetin, kuersetin dan kaemferol (Andarwulan dkk. 2008). Senyawa fenolik, terutama flavonoid  berfungsi  melindungi  tanaman dari  herbivora  dan  penyakit  (Hagerman 2002).  Senyawa  ini  dapat  menangkap radikal  bebas,  mereduksi,  mendonorkan atom  hidrogen  dan  meredam  oksigen singlet  (Kumaran  dan    Karunakaran 2007).  Potensial  antioksidan  flavonoid tergantung  pada  karakteristik  struktur seperti: jumlah dan pola substitusi gugus hidroksil  dan  jumlah  gugus  hidroksil yang  tersubstitusi  glikosida  (Amic  dkk. 2003).  Kadar  fenolik  pada  daun  sangat dipengaruhi  oleh  tingkat  umur  daun, kondisi  tanah,  pemberian  pupuk  serta stress  lingkungan  baik  secara  fisik, biologi  maupun kimiawi (Kahkonen dkk. 2001).
Metode  analisa  DPPH  secara luas digunakan untuk menentukan potensi  ekstrak  tanaman  berdasarkan kemampuan  menangkap  radikal  bebas. DPPH  merupakan  radikal  bebas  sintetis yang  stabil  yang  dapat  mewakili  radikal bebas  sesungguhnya.  Senyawa  ini berwarna  ungu  jika  dilarutkan  dalam pelarut  metanol  (Huang  dkk.  2005).
Penggunaan metanol dapat menstabilkan radikal DPPH dibandingkan pelarut lain, seperti: etanol dan  n-butanol  (Sharma  dan  Bhat  2009). Selain  itu  radikal  DPPH  dapat  larut hanya dalam media pelarut organik (Kim dkk. 2002).
Kemampuan  menangkap  radikal bebas  DPPH  sampel  didasarkan  pada kemampuan  mereduksi  radikal  bebas yang ditandai dengan penurunan intensitas  warna  larutan  ungu,  karena DPPH  menangkap  atom  hidrogen  dari senyawa  fenolik  sehingga  terbentuk senyawa  difenil  pikrilhidrasin  berwarna
kuning  yang  stabil  (Chang    dkk.  2007; Kim  dkk.  2002).  Dekolorisasi  radikal
DPPH  dapat  terdeteksi  pada λ 515-517 nm (Hasan dkk. 2009). Penelitian  ini  bertujuan  untuk mempelajari aktivitas
antioksidatif ekstrak  daun  beluntas    dari  3  kelompok ruas daun beluntas, yaitu ruas daun 1-3,
4-6  dan  >6,  melalui  pengujian  fitokimia, total fenol total flavonoid dan kemampuan  menangkap  radikal  bebas DPPH (1,1-difenil-2–pikrilhidrazil).

## METODOLOGI Bahan Penelitian
Bahan  baku  yang  digunakan adalah  daun  beluntas  yang  diperoleh dari  daerah  Dramaga,  Bogor.  Bahan kimia  untuk  analisis  terdiri  atas  : petroleum eter metanol akuades pereaksi Dragendoft  Mayer dan Wagner klorofor,  asam  gallat  (Riedel-de  Haen), kuersetin  dan  1,1-difenil-2-pikrilhidrasil, dll

## Metode Penelitian
Proses  Penyiapan  Ekstrak  Daun Beluntas
Daun beluntas pada penelitian ini dikelompokkan  menjadi  3,  yaitu  :  ruas daun  1-3,    4-6  dan  >6  (Gambar  1).
Pengelompokan didasarkan
pada perbedaan  warna  dan  tekstur  daun.
Masing-masing ruas diekstraksi menurut modifikasi metode Biswas dkk. (2005) Daun beluntas yang telah dikeringkan  pada  suhu  kamar  selama  7 hari  ditepungkan  dengan  ukuran  40 mesh,  lalu  dianalisis  kadar  air  dan fitokimianya.  Kemudian  tepung  daun kering  tersebut  dimaserasi  dengan petroleum  eter  (1:4  b/v)  pada  suhu kamar  selama  24  jam.  Residu  yang sudah dipisahkan dari pelarutnya dengan  cara  disaring  dikeringkan  pada suhu  kamar  ( ± 15  menit).  Selanjutnya residu  yang  sudah  kering  diekstrak dengan metanol (1:15b/v) menggunakan ekstraksi  soxhlet  pada  suhu  65 o C selama 3 jam. Pelarut metanol diuapkan dengan  rotary  evaporator.  Ekstrak  yang
diperoleh  disimpan  pada  suhu  4 o C  dan gelap sampai analisa berikutnya.
Analisis meliputi kadar air ditentukan  berdasarkan    metode  AOAC 925.45 (1999), analisa fitokimia dilakukan berdasarkan metode Harborne
(1996) yang meliputi: alkaloid, flavonoid, fenolik,  triterpenoid,  sterol,  saponin  dan tanin.

## Analisa Alkaloid
1  gram  sampel  digiling  dengan pasir  sambil  dibasahi  dengan  5  ml kloroform  yang  berisi  3  tetes  ammonia. Tambahkan  lagi  5  ml  kloroform  yang berisi 5 tetes ammonia, kemudian saring ke dalam tabung reaksi. Ekstrak kloroform ditambahkan 10 tetes H 2 SO 4 2 M  dan  divorteks,  kemudian  dipisahkan lapisan asamnya ke dalam tabung reaksi lain.  Lapisan  tersebut  diteteskan  pada spot  plate dan  ditambahkan  3  pereaksi Dragendoft,  Mayer  dan  Wagner,  uji keberadaan  alkaloid  positif  jika    timbul endapan  dengan    warna  berturut-turut sebagai berikut : merah jingga, putih dan coklat.
Deteksi Senyawa Flavonoid dan Fenolik
Sebanyak  0.1  gram  sampel ditambahkan    metanol  sampai  semua sampel terendam, kemudian dipanaskan. Larutan  dipipet  dan  diteteskan  pada  2 spot  plate masing-masing  5  tetes.  Pada spot  plate pertama  ditambahkan  NaOH 10%  (b/v),  timbulnya  warna  merah menandakan  positif  senyawa  fenol hidrokuinon.  Pada spot  plate kedua ditambahkan  1  tetes  H 2 SO 4 pekat, timbulnya  warna  merah  menandakan positif senyawa flavonoid.

## Deteksi Triterpenoid dan Sterol
Sebanyak  0,1  gram  sampel ditambahkan etanol dan dipanaskan lalu disaring.
Filtrat diuapkan
dan ditambahkan  eter.  Lapisan  eter  yang terbentuk  dipipet  dan  diteteskan  pada spot plate lalu ditambahkan pereaksi LB
(3  tetes  asetat  anhidrat  dan  1  tetes H 2 SO 4 ).  Adanya  triterpenoid  ditandai dengan  timbulnya  warna  merah  atau ungu,  sedangkan  adanya  sterol  ditandai dengan adanya warna hijau.
Deteksi Flavonoid, Saponin dan Tanin Sebanyak  0,1  gram  sampel dimasukkan  dalam  gelas  piala  lalu ditambahkan  10  ml  air  panas  dan didihkan  selama  5  menit.  Kemudian masing-masing 3 ml larutan dimasukkan ke  dalam  2  tabung  reaksi.  Tabung pertama  dimasukkan  serbuk  Mg  dan beberapa  tetes  HCl  pekat  dan  amil alkohol.
Campuran dikocok dan dibiarkan  memisah,  adanya  flavonoid ditunjukkan  adanya  warna  merah  coklat pada  lapisan  amil  alkohol.  Pada  tabung reaksi  kedua  dilakukan  pengocokan secara  vertikal  selama  10  detik  dan dibiarkan selama 10 menit. Adanya busa yang stabil menunjukkan adanya saponin,  sedangkan  sisa  campuran didihkan  lagi  selama  10  menit  lalu disaring.  Filtrat    ditambahkan  dengan beberapa  ml  larutan  FeCl 3 1  %  (b/v). Timbulnya  warna  biru  tua  atau  hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.

## Penentuan  Rendemen
Ekstrak  daun  beluntas  yang diperoleh ditentukan rendamennya dengan tujuan  untuk mengetahui tingkat keefektifan metode ekstraksi. Rendamen yang  diperoleh  ditentukan  berdasarkan metode  gravimetri  berdasarkan  metode Ljubuncic et  al .  (2005),  dengan  cara membandingkan  berat  ekstrak  daun beluntas  terhadap  berat  sampel  yang digunakan,  sehingga  diperoleh  persen ekstrak (b/b).

## Kadar  Total Fenol
Kadar  total  fenol  ditentukan berdasarkan  metode  Kumar  dkk.  (2008) dan  Jayasri  dkk.  (2009).  1  ml  sampel ditambahkan  4  ml  larutan  natrium karbonat  (75g/L)  kemudian  divorteks dan  ditambahkan  0,2  ml  reagen  Folin- ciocalteus  fenol.  Selanjutnya  campuran
ditambahkan akuades hingga volume 10 ml  dan  divorteks  kembali.  Setelah sampel  dibiarkan    selama  1  jam  diukur pada λ 760  nm.  Kadar  fenol  total dinyatakan ekuivalen asam gallat (GAE).

## Kadar Total Flavonoid
Kadar  total  flavonoid  ditentukan berdasarkan metode Kumar dkk. (2008). 1  ml  sampel  dimasukkan  dalam  labu takar  10  ml  yang  berisi  4  ml  akuades dan  ditambahkan 0,3 ml larutan  NaNO 2 5% (b/v). Sesudah 5  menit ditambahkan  0,3  ml  larutan  AlCl 3 10% (b/v), lalu sesudah  6 menit ditambahkan 2  ml  larutan  1  mol/L  NaOH  dan diencerkan hingga volume 10 ml dengan akuades.  Absorbansi  larutan  diukur pada λ 510  nm.  Kadar  flavonoid    total dinyatakan ekuivalen kuersetin (QE).
Kemampuan Menangkap Radikal Bebas DPPH Aktivitas antioksidan sampel diukur  berdasarkan  modifikasi  metode Aicha    dkk.  (2006).  1  ml  sampel  pada berbagai  variasi  konsentrasi  dalam pelarut  metanol  ditambahkan  3  ml larutan  DPPH  (60 µ M)  dan    metanol hingga volume 10 ml. Absorbansi larutan diukur  pada λ 517  nm  setelah  30  menit menggunakan spektrofotometer UV–Vis. Kemampuan menghambat radikal bebas DPPH  dinyatakan  dengan  rumus  :  % penghambatan  =  (A0-At)/A0      x    100%, Keterangan  :    A0  adalah  absorbansi kontrol  pada  saat  t  =  0  detik  dan    At adalah  absorbansi  antioksidan  pada saat  t = 30 detik.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tingkat  ketuaan  daun  beluntas menentukan kadar fitokimia, oleh karena itu  dilakukan  pengelompokkan  daun menjadi  3,  yaitu  :  ruas  daun    1-3,    4-6 dan    >6.  Pembagian    didasarkan  pada perbedaan  kenampakan  daun  (warna dan tekstur). Semakin tua daun warnanya semakin  hijau  tua  dan teksturnya semakin keras karena jaringan /selulosanya semakin banyak.
Gambar 1.  Pengelompokan daun beluntas yang diteliti (1-3 ruas, 4-6 ruas dan lebih dari 6 ruas)
Kadar Air Ketiga  kelompok  sampel  yang sudah  dikeringkan  pada  suhu  kamar ditepungkan untuk mendapatkan partikel  40  mesh.  Perlakukan  ini dimaksudkan untuk memperluas permukaan  kontak  antara  partikel daun dengan pelarut sehingga hasil ekstraksi yang diperoleh maksimal. Berdasarkan Matricardi dkk.
(2009)  bahwa  reduksi  ukuran  partikel pada  biji  kacang  tanah  menunjukkan efek  yang  positif  terhadap  ekstraksi. Ukuran  partikel  semakin  kecil  akan menyebabkan peningkatan luas permukaan  dan  jumlah  sel  yang  rusak yang berakibat peningkatan konsentrasi minyak yang dihasilkan. Selama ekstraksi  difusi  yang  terjadi  pada
partikel  relatif  kecil,  sehingga  jumlah minyak  yang  terekstrak  sebanding dengan luas permukaan partikel. Penurunan  ukuran  partikel  dari  3,35- 4,75  mm  menjadi    0,86-1,19  mm,  total minyak  yang  dihasilkan  meningkat sebesar 36%- 82%.
Menurut  Pileno  dkk.  (2007) bahwa  reduksi  ukuran  partikel  pada  biji kopi  secara  signifikan  berpengaruh positif  terhadap  fenol  yang  terekstrak. Reduksi ukuran partikel yang berlebihan  menyebabkan  terbentuknya fenomena  pelapisan  dan  cara  yang disukai oleh pelarut sehingga membatasi efisiensi pembasahan pelarut terhadap sampel dan menurunkan efisiensi ekstraksi. 1-3 4-6 > 6
14.57 14.01 15.38 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 1-3 Segment 4-6 Segment > 6 Segment Samples M o is tu re C o n te n t (% )
Gambar 2.  Kadar kelembaban dari tiap jenis daun
Penentuan  kadar  air  tepung daun  beluntas  ditentukan  dengan  oven vakum  suhu  70 o C,  hal  ini  dilakukan dengan pertimbangan untuk meminimalkan  kesalahan  kadar  air yang terukur karena hilangnya sejumlah senyawa  volatil  (kelompok  terpen), seperti  :  boehmeril  asetat,  HOP-17 (21)-en  3 β -asetat,  linaloil  glukosida,
linaloil apiosil glukosida, linaloil hidroksi glukosida, plusheosida C, cuauhtermone, 3-(2’-3’-diasetoksi- 2’metil-butiril),  plucheol  A,  plucheol  B, plucheosida A, plucheosida
B, plucheosida E dan pterocarptriol (Traithip 2005), seskuisterpen, monoterpen  dan  triterpen  (Luger  dkk. 2000). Kadar  air  sampel  daun beluntas mengalami  penurunan  seiring  dengan
bertambahnya usia/ketuaan daun, karena  terjadi  peningkatan  jumlah komponen daun (jaringan/serat). Penyimpangan  kadar  air  pada  ruas  >6 disebabkan  adanya  penyerapan  air kembali oleh jaringan/serat pada tepung  daun  yang  kering.  Selama proses  pengeringan  kadar  air  daun beluntas mengalami
penurunan sehingga  terjadi  pengkerutan  ukuran pori  dan  distribusi  ukuran  pori  saling mendekat  (Haeggkvist  dkk.  1998). Kemampuan  adsorbsi  air  oleh  selulosa atau serat  disebabkan  adanya  interaksi antara  gugus  hidroksil  dengan  molekul air  dari  udara  (Svedas  1998).   Menurut Sembiring  dan  Sinaga  (2003)  bahwa kemampuan adsorbsi air oleh adsorben ditentukan  adanya  pori  yang  dapat meningkatkan
luas permukaan
absorben.
Table 1  Total fitokimia dari tiap jenis daun beluntas Compounds Jenis daun (ruas) 1-3 4-6 > 6 Saponin - - - Tannin ++++ +++ ++ Triterpenoid - - - Sterol ++++ +++ ++ Flavonoid +++ ++ + Phenol hydroquinon + - - Alkaloid - - - Ket. : +  menunjukkan intensitas warna, semakin banyak tanda positif menunjukkan semakin kuat warna Fitokimia  yang  terdeteksi  pada ekstrak daun beluntas meliputi:
senyawa  tanin,  sterol,  flavonoid  dan fenol hidrokuinon, namun dengan intensitas  yang  berbeda  (Tabel  1). Keberadaan  senyawa  tanin,  sterol, flavonoid  dan  fenol  hidrokuinon  pada ekstrak  daun  beluntas  masing-masing ditunjukkan  oleh  warna  biru  tua  atau hijau  kehitaman,  hijau,  merah  dan merah  (Harbone,  1996).  Hal  ini  sesuai dengan  pendapat  Ardiansyah  dkk.
(2003) bahwa daun beluntas mengandung senyawa fitokimia, seperti:  fenol  hidrokuinon,  sterol  dan tanin.  Menurut  Traithip  (2005)  bahwa senyawa  fitokimia  yang  terdapat  pada ekstrak  etanolik  dan  fraksi-fraksinya dari daun beluntas terdiri atas senyawa flavonoid dan polifenol.
Komposisi dan konsentrasi senyawa fitokimia mengalami perubahan selama pertumbuhan
tanaman.  Daun  yang  lebih  muda mempunyai  kandungan  fitokimia  paling tinggi  (Bergquist  dkk.  2005),  hal  ini terkait  dengan  fungsi  dari  senyawa metabolit sekunder tersebut, yaitu untuk pertahanan melawan herbivora, patogen,  insekta,  bakteri,  jamur  dan virus (Saffan dan El-Mousallamy 2008).  Selain  itu  senyawa  fitokimia dalam  daun  biasanya  ditemukan  dalam struktur  bebas  atau  terikat  secara glikosida, dengan bertambahnya tingkat ketuaan daun banyak ditemukan dalam struktur  glikosida  yang  terdapat  pada membran  sel.  Senyawa  ini  membentuk struktur yang kompleks dengan karbohidrat (glukosa, xilosa dan arabinosa) (Schaller, 2003; Boukes dkk., 2008).
Gambar 3.  Kadar rendemen dari tiap jenis daun beluntas

## Rendemen
Gambar  3  menunjukkan  bahwa rendemen terbesar diperoleh dari kelompok  ruas  daun  1-3  >  4-6  >  >6. Data  ini  seiring  dengan  peningkatan intensitas  warna  pada  uji  fitokimia. Rendamen ditentukan setelah melewati ekstraksi  pelarut  dan  soxhlet  serta penghilangan residu pelarut. Rendamen yang diperoleh telah mengalami  proses  penghilangan  lemak ( defatted ), karena pada ekstraksi pelarut  digunakan  petroleum  eter.
Rendamen  yang  diperoleh  sangat ditentukan oleh tingkat kelarutan senyawa  metabolit  sekunder  pada pelarut  yang  digunakan.    Kelarutan senyawa sangat ditentukan oleh kepolaran,  momen  dipol,  polarisabilitas dan ikatan hidrogen.
Pada  ekstraksi  soxhlet  dipilih metanol daripada etanol, hal ini
dilakukan dengan
pertimbangan metanol  dapat  mengekstrak  senyawa fitokimia lebih banyak sehingga aktivitas  antioksidan  yang  dihasilkan lebih  tinggi  (Akroum  dkk.  2009). Menurut  Yu  Lin  dkk.  (2009)  bahwa metanol  dapat  mengekstrak  senyawa dengan  berat  molekul  rendah,  tingkat kepolaran sedang sebab sifat kelarutannya  yang  luas.  Penggunaan pelarut  yang  berbeda  pada  ekstraksi daun  beluntas  dapat  mengubah  profil senyawa  fenolik  yang  terdapat  dalam sampel  (Kahkonen dkk. 2001).

## Total Fenol
Hasil  uji  total  fenol  menyatakan bahwa  semakin  muda  daun  kadar  total fenol    semakin  besar,  hal  ini  terkait dengan  fungsi  fenol  bagi  tanaman sebagai  pertahanan    (Saffan  dan  El- Mousallamy  2008).  Menurut Kahkonen
dkk.  (2001)  bahwa  perbedaan  tingkat kematangan  buah  berpengaruh  pada profil  fenolik,  biasanya  senyawa  fenolik terkonsentrasi  pada  buah  yang  masih muda daripada buah yang  tua, kecuali antosianin. Schaller (2003) dan  Boukes dkk. (2008) berpendapat bahwa senyawa  fenol  yang  ditemukan  pada buah,  bunga,  daun  dan biji  mempunyai
struktur  yang  beragam  dalam  kondisi bebas  atau  terikat  secara  glikosida.
Semakin  tua  umur  daun  struktur glikosida  lebih  banyak  terkonsentrasi. Hampir 2-10 kali lipat senyawa metabolit  sekunder  (sterol)  ada  dalam struktur  asil  glikosida  yang  terdapat dalam membran sel.
Gambar 4.  Total phenol tiap jenis daun beluntas
Pada  pengujian  dengan  folin ciocalteus  diperoleh  hasil  yang  sangat dipengaruhi  oleh  struktur  kimianya. Senyawa fenol yang mempunyai gugus fungsi  hidroksil  yang  banyak  atau dalam  kondisi  bebas  akan  dihasilkan kadar  total  fenol    yang  tinggi  (Deore dkk. 2009). Hal ini disebabkan
kompleks  warna  ungu  yang  terdeteksi didasarkan pada reaksi transfer elektron dalam larutan alkali dari fenolik ke senyawa kompleks asam fosfotungstat /fosfomolibdat (Huang dkk. 2005).

## Total Flavonoid
Gambar 5.  Structure of  Standar compounds (a) quercetin
(b) (+)-catechin (c) ferulic acid
Gambar 6.  Total flavonoid  dari tiap jenis daun beluntas
b c a
Pengujian  total  flavonoid  pada berbagai  tingkat  ruas  daun  beluntas menunjukkan bahwa kadar total flavonoid ruas 1-3 > ruas  4-6 > ruas >6 pada  berbagai  senyawa  standar  (asam ferulat, (+)-katekin dan kuersetin)
(Gambar  5).  Total  flavonoid    ketiga sampel  menunjukkan    bahwa  kadar total  flavonoid  daun  beluntas  dengan menggunakan  standar  kuersetin  > asam  ferulat  >  (+)-katekin  (Gambar  6). Struktur  senyawa  standar  menentukan reaktivitas  terhadap  reagen  AlCl 3 dan
NaNO 2 dalam  kondisi  basa  kuat (NaOH), yang ditandai dengan terbentuknya  kompleks  warna  antara orange hingga merah. Kuersetin dipilih sebagai standar karena  termasuk  senyawa  flavonol yaitu  flavonoid  yang  paling  efektif menangkap  radikal  bebas  (radikal hidroksil,  superoksida  dan    peroksil)
(Tapas  dkk.  2008)  serta  menghambat berbagai  reaksi  oksidasi  (Soeksmanto dkk. 2007), karena dapat menghasilkan radikal  fenoksil  yang    terstabilkan  oleh efek resonansi  dari  cincin  aromatis  (Yu Lin dkk. 2009).
Hal  ini  disebabkan  senyawa flavonol  mempunyai  struktur  (katekol) orthodihidroksi  pada  cincin  B,  ikatan rangkap pada atom C2-3 yang terkonjugasi  dengan  gugus  fungsi  C4- okso,    gugus  OH  pada  C3  di  cincin  C dan  gugus  OH  pada  C5  di  cincin  A (Lugasi  dkk.  2003;  Tapas  dkk.  2008). Kombinasi  gugus  C3-OH  dan  C5-OH dengan C4-karbonil dan ikatan rangkap C2-C3  dapat  meningkatkan  aktivitas penangkap  radikal  bebas  (Amic  dkk. 2003).

## Kemampuan Menangkap Radikal Bebas DPPH
Gambar  7.  Aktivitas menangkap radikal bebas DPPH dari tiap jenis daun beluntas
Hasil  pengujian  kemampuan menangkap  radikal  bebas  DPPH  dari ketiga  kelompok  ekstrak  daun  beluntas diperoleh  bahwa  ekstrak  daun  ruas  1- 3>  4-6>  >6  (Gambar  7).    Hal  ini ditunjukkan  dari    kemampuan  masing- masing ekstrak dalam mereduksi warna ungu dari radikal bebas DPPH  menjadi larutan  yang  berwarna  kuning  yang terdeteksi  pada λ 517  nm.    Semakin besar  potensi  ekstrak  daun  beluntas menangkap  radikal  bebas    DPPH semakin  besar  konsentrasi  radikal DPPH  yang  tereduksi.  Penurunan warna  ungu  disebabkan  radikal  DPPH menangkap atom hidrogen yang didonorkan oleh senyawa fenolik sehingga  terbentuk  senyawa  difenil pikrilhidrasin  berwarna  kuning  yang stabil (Chang dkk. 2007; Kim dkk. 2002).
Kapasitas  menangkap  radikal bebas  DPPH  sebagian  besar  terkait dengan  gugus  hidroksil  dari  senyawa fenol  (Nakiboglu  dkk.  2007).  Aktivitas menangkap radikal bebas DPPH dipengaruhi oleh  polaritas dari medium reaksi,  struktur  kimia  dari  penangkap radikal  dan  pH  campuran  reaksi (Sharma dan  Bhat  2009).
Aktivitas antioksidan fenolik sangat  ditentukan  oleh  struktur  kimia, jumlah  dan  posisi  gugus  hidroksil  dan metil  pada  cincin.  Molekul  tersubstitusi gugus hidroksil semakin banyak semakin kuat menangkap radikal bebas DPPH karena kemampuan mendonorkan  atom  hidrogen  semakin besar  (Yu  Lin  dkk.  2009).  Struktur aglikon mempunyai
aktivitas antioksidan  lebih  tinggi  dibandingkan dengan struktur glikosida (Li dkk. 2009).
y = 602.92x + 0.0985
R 2 = 0.9991 y = 248.76x + 0.1286 R 2 = 0.9943 y = 114.52x + 8.8096 R 2 = 0.9734 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 1 2 3 4 5 6 Total Fenol (ppm) In h ib it io n o f D P P H F re e R a d ic a l (% ) 1-3 Segments 4-6 Segments > 6 Segments Linear (4-6
Gambar 8. Hubungan antara Total Phenol and Penghambatan radikal DPPH
y = 848.04x + 6.5364 R 2 = 0.9875 y = 743.56x + 0.0985 R 2 = 0.9991 y = 295.43x - 0.1286 R 2 = 0.9943 -500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 0 1 2 3 4 5 6 Total Flavonoid (ppm) In h ib it io n o f D P P H F re e R a d ic a l (% ) 1-3 Segments 4-6 Segments > 6 Segments

## Gambar 9. Hubungan antara Total Flavonoid and penghambatan radikal DPPH
Ada korelasi positif antara kadar total  fenol  dan  total  flavonoid    dengan kemampuan  menangkap  radikal  bebas DPPH ketiga sampel (Gambar 8 dan 9). Daun  beluntas  yang  masih  muda mempunyai  aktivitas  antiradikal  lebih tinggi  dibandingkan  daun  yang  sudah tua.  Kemampuan  menangkap  radikal
bebas merupakan salah satu mekanisme  aksi  utama  antioksidan yang  ditunjukkan  oleh  fitokimia  fenolik.
Oleh karena itu ekstrak sampel rempah-rempah yang mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi
cenderung    mempunyai  kadar  fenol total yang tinggi pula (Shan dkk. 2005).
Gambar  10. Nilai  IC 50 tiap jenis daun beluntas
Berdasarkan  Gambar  10  dapat terlihat  bahwa  nilai  IC 50 ketiga  sampel tersebut  sebagai  berikut:  ruas  daun  1-3 sebesar  3,71  mg/L,  ruas  4-6  sebesar 6,85  mg/L  dan  ruas  >6    sebesar  49,62 mg/L.    IC 50 adalah  ukuran  keefektifan suatu  senyawa  dalam  menghambat fungsi  biologis  atau  biokimia.  Ukuran  ini mengindikasi  banyaknya  senyawa  yang dibutuhkan  untuk  menghambat  proses biologis  menjadi  setengahnya  (50%). Semakin  rendah  nilai  IC 50 nya  maka semakin  besar  potensinya  sebagai antioksidan (Kosuar dkk. 2004).

## KESIMPULAN
Ekstrak  daun  beluntas  ketiga kelompok  dari  ruas  daun  beluntas  yang meliputi  :  1-3,  4-6  dan  >6  mempunyai aktivitas  menangkap  radikal  bebas DPPH.  Ekstrak  daun  beluntas  ini mengandung    senyawa  fitokimia  seperti tanin,  sterol,  fenol  hidrokuinon  dan flavonoid.
Ekstrak  daun  beluntas  dari    ruas daun 1-3 yang paling berpotensi sebagai sumber antioksidan ditandai dengan nilai IC 50 nya  paling  kecil  yaitu  3,71  mg/L dibandingkan  ruas  4-6  dan  >6  yang masing-masing  sebesar  6,85  mg/L    dan 49,62  mg/L.  Kadar  total  fenol  dan  total flavonoid  daun  beluntas  ruas  daun  1-3 yaitu    234.65  mg  GAE/100  g  berat sampel kering  dan 2163,59 mg QE/ 100 g berat sampel kering.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih  kepada  DP2-M  Dirjen  DIKTI  atas biaya  yang  diberikan  melalui  dana Penelitian Hibah Bersaing 2008.

## DAFTAR PUSTAKA
Aicha, N. Ines, I. Ines, B. Mohamed, B.S. Jamila, H.S. Jemni, B.C. Mohamed, N. Daniel, B. Leila , G. dan Kamel, G. 2006. A Comparative Evaluation of  Mutagenic,  Antimutagenic  and Scavenging  Radicals  Activity  of
Essential  Oil  from  Pituranthos
Chloranthus. SIPAM 362-371. Akroum,  S.  Satta,  D.  dan  Lalaoui,  K. 2009.,  Antimicrobial,  Antioxidant, Cytotoxic Activities and Phytochemical  Screening  of  Some Algerian  Plants. European  Journal of  Scientific  Research 31(2):  289-
295. Amic,  D.  Davidovic-Amic,  D.  Besˇlo,  D. dan    Trinajstic,  N.  2003.,  Structure radical scavenging activity relationships  of  flavonoids. Croatia Chemical Acta 76 : 55–61.
Andarwulan,  N.  Batari,  R.  Sandrasari, D.A. dan  Wijaya, H. 2008., Identifikasi  senyawa  flavonoid  dan kapasitas antioksidannya pada ekstrak  sayuran  indigenous  Jawa Barat. Di dalam : Half Day Seminar on Natural Antioxidants: Chemistry, Biochemistry and Technology ;
Bogor, 16 September 2008. Bogor:
Biopharmaca  Research  Center-
SEAFAST Center IPB.
[AOAC] Association  of Official  Analytical Chemist  925.45.  1999. Official methods  of  analysis  of  association of  official  analytical  chemists . Edition  ke-15.  USA  :  Kenneth Helrich. Chapter 44.1.03.  p.2. Ardiansyah.  Nuraida,  L.  Andarwulan,  N. 2003.,  Aktivitas  antimikroba  daun beluntas ( Pluchea indica Less ) dan stabilitas aktivitasnya pada berbagai  konsentrasi  garam  dan tingkat    pH. Jurnal  Teknologi  dan Industri Pangan 14(2) : 90-97. Bergquist, S.A.M. Gertsson, U.E. Knuthsen,  P.  dan  Olsson,  M.E.
2005.,  Flavonoids  in  baby  spinach ( spinacia  oleracea  l. ):  changes during  plant  growth  and  storage. Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry 53: 9459  -9464.
Biswas,  R.  Dasgupta,  A.  Mitra,  A.  Roy, S.K. Dutta, P.K. Achari, B. Dastidar,
S.G.  dan  Chatterjee,  T.K.  2005., Isolation, purification and characterization of four pure compounds from the root extract of
Pluchea  indica  Less and  the potentiality  of  the  root  extract  and the pure compounds for antimicrobial  activity. European
Bulletin  of  Drug  Research 13  :  63- 70.
Boukes,  G.J.  Venter,  M.V.D.  dan Oosthuizen,  V.  2008.  Quantitative and qualitative analysis of sterols/sterolins  and  hypoxoside contents  of  three Hypoxis (African potato)  spp.  African  Journal  of Biotechnology 7 (11): 1624-1629. Chang,  H.Y.  HO,  Y.L.  Sheu,  M.J.  Lin, Y.H.  Tseng, M.C. Wu, S.H. Huang, G.J.  dan  Chang,  Y.S.    2007.,
Antioxidant and Free  Radical Scavenging  Activities  of Phellinus merrillii Extracts. Botanical  Studies 48: 407-417.
Chludil,  H.D.      Corbino,  G.B.  dan Leicarh,  S.R.  2008.,  Soil  Quality Effects  on Chenopodium  album Flavonoid  Content  and  Antioxidant Potential. Journal  of
Agricultural  and  Food  Chemistry. 56: 5050–5056. Deore,  S.L.  Khadabadi,  S.S.  Baviskar, B.A. Khadabadi, S.S. Khangenbam,  R.A.  Koli,  U.S. Daga, N.P. Gadbail, P.A. dan Jain,
P.A. 2009.,  In  vitro  Antioxidant Activity  and  Phenolic  Content  of Croton  caudatum . International Journal  of  Chemical  Technology Research 1(2):174-176.
Haeggkvist,  M.  dan  Li,  T.Q.  1998., Effects  of  Drying  and  Pressing  on the  Pore  Structure  in the  Cellulose ®bre  Wall  Studied  By  1H  and  2H NMR  Relaxation. Cellulose 5:  33- 49.
Hagerman, A.E. Riedl, K.M. Jones, G.A. Sovik, K.N. Ritchard, N.T. Hartzfeld,
P.W. dan Riechel, T.L. 2002., High Molecular Weight Plant Polyphenolics (Tannins) as Biological  Antioxidants. Journal  of
Agricultural  and  Food  Chemistry 46:1887-1892.
Harbone,  J.B.  1996., Metode  Fitokimia . Padmawinata    K,  Soediro  I, penerjemah,  Bandung  :  Institut Teknologi Bandung.
Hasan,  S.M.  R.  Jamila,  M.  Majumder, M.M.    Akter,  R.  Hossain,  M.M. Mazumder,  M.E.H.  Alam,  M.A. Jahangir,  R.  Rana,  M.S.  Arif,  M. dan  Rahman,  S.  2009.,    Analgesic and  Antioxidant  Activity  of  the Hydromethanolic Extract of Mikania scandens ( L.) Willd. Leaves. American Journal of
Pharmacology  and  Toxicology .  4 (1): 1-7. Huang,  D.  Ou,  B.  dan  Prior,  R.L.  2005., The  Chemistry  behind  Antioxidant Capacity Assays. Journal of Agricultural  and  Food  Chemistry 53:1841-1856.
Jayasri,  M.A. Mathew, L. dan  Radha, A. 2009.,  A  report  on  the  antioxidant activity  of  leaves  and  rhizomes  of Costus pictus D. Don . International Journal  Integrative  Biology 5(1)  : 20-26. Kahkonen, M.P. Hopia, A.I. dan Heinonen.  2001.,  Berry  Phenolics and  Their  Antioxidant  Activity.
Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry 49: 4076-4082. Kim, D.O. Lee, K.W. Lee, H.J. Lee, C.Y. 2002., Vitamin C Equivalent Antioxidant  Capacity  (VCEAC)  of Phenolic  Phytochemicals. Journal of Agricultural and Food Chemistry
50: 3713  -3717.
Kosuar,  M.B.  Dorman,  H.J.D.  Basuer,
K.H.C.  dan  Hiltunen  R.  2004., Screening of Free Radical Scavenging  Compounds  in  Water Extracts  of  Mentha  Sampels  Using a Postcolumn Derivatization Method. Journal of Agricultural and
Food Chemistry 52:5004-5010. Kumar, S. Kumar, D. Manjusha, Saroha, K.  Singh,  N.  dan  Vashishta,  B. 2008.,  Antioxidant  and  free  radical scavenging  potential  of Citrullus colocynthis  (l.) schrad.  methanolic
fruit  extract. Acta  Pharmacology 58 : 215–220.
Kumaran,  A.  dan  Karunakaran,  R.J. 2007.,  In  vitro  antioxidant  activities of  methanol  extracts  of  five Phyllanthus  species  from  India. LWT 40 : 344–352.
Li, C. Du, H. Wang, L.S.Shu, Q.Y. Zheng, Y.  Xu,  Y.  Zhang,  J.J.  Zhang,  J.
Yang,  R.  dan  Ge,  Y. 2009., Flavonoid Composition and Antioxidant  Activity  of  Tree  Peony (Paeonia  Section  Moutan)  Yellow
Flowers. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57: 8496–8503. Luger,  P.  Weber,  M.  Dung,  N.X.Ngoc, P.H.,  Tuong,  D.T.  dan  Rang,  D.D. 2000., The crystal structure of hop- 17(21)-en-3 β -yl  asetat  of Pluchea pteropoda Hemsl.  from  Vietnam. Crystal  Res  Technology 35(3)  : 355-362.
Magalhaes,  L.M.    Segundo,  M.A.    Reis,
S.  Lima,  J.L.F.C.  dan  Rangel, A.O.S.S. 2006.,  Automatic  method for  the  determination  of  folin- ciocalteu  reducing  capacity  in  food products. Journal  of  Agricultural and  Food  Chemistry 54:  5241- 5246.
Matricardi,  M.    Hesketh,  R.  dan  Farrell, S.  2009.,  Effect  of  operating conditions on static/dynamic extraction  of  peanut  oil  using supercritical carbon
dioxide. http://www.Supercritical.com/public ations/peanutoilextraction  by  SF/  1
November 2009
Moein,  S.  Farzami,  B.  Khaghani,  S.
Moein, M.R. dan Larijani, B. 2007., Antioxidant properties and prevention  of  cell  cytotoxicity  of Phlomis  Persica  Boiss . DARU 15(2) : 83.
Nakiboglu,  M.  Urek,  R.O.  Kayali,  H.A. dan  Tarhan,  L.  2007.,  Antioxidant capacities  of  endemic sideritis sipylea and origanum  sipyleum from  turkey. Food  Chemistry 104: 630–635.
Orhan, I. Kartal, M. Asaker, M.A.  Senol,
F.S.  Yilmaz,  G.  Sener,  B.  2009., Free  radical  scavenging  properties and  phenolic  characterization  of some edible plants. Food
Chemistry 114 : 276–281.
Pinelo,  M.  Tress,  A.G.  Pedersen,  M.
Amous, A. dan Meyer, A.S. 2007., Effect  of  Cellulases,  solvent  type and particle size distribution on the extraction  of  chlorogenic  acid  and other  phenols  from  spent  coffee grounds. American Journal of Food
Technology 2(7):641-651. Tapas,  A.  Sakarkar,  D.M.  dan  Kakde, R.B. 2008., Flavonoids as nutraceuticals:  a  review. Tropical Journal of Pharmaceutical Research 7(3) : 1089-1099. Traithip,  A.  2005., Phytochemistry  and antioxidant  activity  of  Pluchea indica. [Thesis]  Mahidol  University. Thailand. Saffan,  S.E.S.  dan  El-Mousallamy,
A.M.D.  2008.  Allelopathic  effect  of Acacia raddiana leaf extract on the phytochemical contents of germinated Lupinus  termis Seeds. Journal of Applied Sciences Research , 4(3): 270-277. Schaller,  H.  2003.  Review  the  role  of sterols in plant growth and development. Progress  in  Lipid
Research, 42 (2003) 163–175. Sembiring,  M.T.  dan  Sinaga,  T.S.  2003.
Arang aktif (Pengenalan dan
Proses  Pembuatannya),  hal  1-9.
USU digital library, Sumatera Utara.
Shan,  B.  Cai,  Y.  Z.  Sun,  M.  dan  Corke,
H.  2005.,  Antioxidant  capacity  of 26
spice extracts and characterization  of  their  phenolic constituents. Journal of Agricultural and  Food  Chemistry 53:  7749-
 7759.
Sharma,  O.P.  dan  Bhat,  T.K.  2009.,
Analytical methods dpph antioxidant  assay  revisited. Food Chemistry . 113: 1202–1205.
Soeksmanto, A. Hapsari, Y. dan Simanjuntak,  P.  2007.,  Antioxidant content  of  parts  of  mahkota  dewa, Phaleria macrocarpa [Scheff] Boerl. ( Thymelaceae ). Bioversitas ISSN: 1412-033X. 8 (2): 92-95. Svedas, V. 1998., Cellulose-water vapour  interaction  investigated  by spectrometric and ultra high frequency  methods. Journal  of Physical  D:  Applied  Physical 31 : 1752-1756.
Yu  Lin,  H.  Kuo,  Y.H.  Lin,  Y.L.  dan Chiang,  W.  2009.,    Antioxidative effect  and  active  components  from leaves of lotus ( Nelumbo nucifera ). Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry 57: 6623–6629.
EVALUASI  AKTIVITAS ANTIOKSIDATIF  EKSTRAK DAUN BELUNTAS ( Pluchea indica )  BERDASARKAN PERBEDAAN RUAS DAUN
(EVALUATION OF ANTIOXIDATIVE ACTIVITY FROM BELUNTAS LEAVES EXTRACT
( Pluchea indica Less ) BASED ON DIFFERENCE OF LEAF SEGMENT)
Paini Sri Widyawati 1) , C. Hanny Wijaya 2) , Peni Suprapti Hardjosworo 3) , Dondin Sajuthi 4)
1) Fakultas Teknologi Pertanian - Unika Widya Mandala Surabaya Alamat :  Jl Dinoyo 42-44 Surabaya,  Email : wiwiedt@gmail.com
2) Ilmu dan Teknologi Pangan  Fakultas  Teknologi Pertanian  IPB
3) Fakultas Peternakan  IPB
4) Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB

## Abstract
Beluntas  (Pluchea  indica  Less)  is  a  herb  that  commonly  used  as  traditional medicine  and  food.   Its  leaves have  many  biological  activities, because they  contain various  phenolic  compounds.  The  phenol  concentration  of  beluntas  leaves  depends on leaf segment, earth condition, fertilizer and environmental stress.  This research is focused  to  determine  antioxidant  activity  of  three  groups  of    beluntas  leaf  segments that  includes 1-3, 4-6 and > 6.  They were ground, dried at ambient temperature for 7 days, maserated by petroleum eter (1:4 b/v) at ambient temperature for 24 hours and soxhlet  extracted  by  methanol  (1:15  b/v)  at  65 o C  for  3  hours.  The  result  shows  that the  extract  contains  phytochemical  compounds  such  as  tannin,  sterol,  phenol hydroquinone  and  flavonoid.  This  extract  has  antioxidant  activity  to  scavenging  free radical DPPH (2,2-phenyl-1-picrylhydrazyl). The extract of 1-3 beluntas leaf segment was  more  potential  antioxidant  source  than  4-6  and  >  6  beluntas  leaf  segments, because it had the least IC 50 (inhibitor concentration) and the highest total phenol and total flavonoid. The IC 50 , total phenol and flavonoid  total of  it were 3.71 mg/L,  234.65 mg GAE/100 g samples and 2163.59 mg QE/ 100 g samples, respectively.
Key words :  antioxidant activity, beluntas (Pluchea indica Less), phytochemical, total phenol, total flavonoid

## Abstrak
Beluntas  ( Pluchea  indica  Less )  adalah  tanaman  herba  yang  umumnya digunakan  sebagai obat tradisional dan pangan (lalapan). Daun beluntas mempunyai beberapa aktivitas biologi karena mengandung berbagai senyawa fenolik. Konsentrasi fenol dalam daun beluntas sangat bergantung pada ruas daun, kondisi tanah, tingkat kesuburan dan stress lingkungan. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan dari ketiga kelompok dari ruas daun beluntas yang meliputi : 1-3, 4-6 dan >6. Daun beluntas yang sudah dipetik dari pekarangan, dikeringkan pada suhu 27 o C selama 7 hari, dimaserasi dengan petroleum eter (1:4 b/v) pada suhu kamar selama 24  jam  dan  diekstraksi  soxhlet  denga  metanol  (1:15  b/v)  pada  suhu  65 o C  selama  3 jam.Hasil menunjukkan bahwa ekstrak mengandung senyawa fitokimia seperti :  tanin, sterol,  fenol  hidrokuinon  dan  flavonoid.  Ekstrak  ini  mempunyai  aktivitas  antioksidan menangkap radikal bebas DPPH (2,2-phenyl-1-picrylhydrazyl). Ekstrak dari ruas daun beluntas  1-3  yang  paling  berpotensi sebagai  sumber  antioksidan  dari  ruas  daun  4-6 dan  >6,    sebab  ekstrak  tersebut  mempunyai  nilai  IC 50 (konsentrasi  penghambatan) paling kecil dan kadar fenol total dan flavonoid total tertinggi. Nilai  IC 50 , total fenol dan
total flavonoid dari ekstrak ruas daun beluntas 1-3 masing-masing sebesar  3.71 mg/L, 234.65  mg  GAE  (gallic  acid  equivalent)/100  g  berat  sampel  kering  dan  2163.59  mg QE (Quercetin equivalent)/100 g berat sampel  kering.
Kata Kunci:  aktivitas antioksidan, beluntas ( Pluchea indica Less ), fitokimia, fenol total, flavonoid total dan DPPH (2,2-fenil-1-pikrilhidrazil).

## PENDAHULUAN
Radikal  bebas,  seperti  anion superoksida  (O 2 - • ),  radikal  hidroksil (•OH)  dan  hidrogen  peroksida    (H 2 O 2 ) dapat  memicu  kerusakan  biomolekul potensial dalam makhluk hidup, seperti : lemak,  protein  dan  asam  nukleat,  yang berakibat  munculnya  berbagai  macam penyakit degeneratif. Keberadaan radikal bebas ini pada proses pengolahan pangan dapat mempengaruhi  kualitas,  stabilitas  dan keamanan pangan  (Chludil dkk. 2008) Antioksidan adalah senyawa yang  berada  pada  konsentrasi  lebih rendah dari substratnya secara signifikan dapat menunda atau
mencegah  oksidasi  (Moein  dkk.    2007). Senyawa  ini  dapat  menghentikan  reaksi radikal  bebas.    Usaha  pencarian antioksidan  alami  terus  dilakukan  untuk menggantikan  antioksidan  sintetis  yang masih diragukan akan tingkat keamanannya (Orhan dkk. 2009).
Beluntas  ( Pluchea  indica  Less )
merupakan  tanaman  perdu  kelompok Asteraceae yang telah dikenal masyarakat  sebagai  lalapan  dan  obat tradisional  (Ardiansyah  dkk.    2003). Berbagai  penelitian  telah  menyebutkan bahwa  beluntas  mengandung  senyawa lignan,  seskuisterpen,  fenilpropanoid, benzoid,  monoterpen,  triterpen,  sterol dan  alkana  (Luger  dkk.  2000),  akar mengandung  stigmasterol  (+ β -sitosterol), stigmasterol glikosida (+ β -sitosterol- glikosida), 2-(prop-1-unil)-5-(5,6- dihidroksi  heksa-1,3-diunil)-thiofena  dan (-)-katekin (Biswas dkk. 2005), sedangkan daun mengandung hidrokuinon,  tanin,  alkaloid  dan  sterol (Ardiansyah dkk. 2003), flavonol,
seperti : mirisetin, kuersetin dan kaemferol (Andarwulan dkk. 2008). Senyawa fenolik, terutama flavonoid  berfungsi  melindungi  tanaman dari  herbivora  dan  penyakit  (Hagerman 2002).  Senyawa  ini  dapat  menangkap radikal  bebas,  mereduksi,  mendonorkan atom  hidrogen  dan  meredam  oksigen singlet  (Kumaran  dan    Karunakaran 2007).  Potensial  antioksidan  flavonoid tergantung  pada  karakteristik  struktur seperti: jumlah dan pola substitusi gugus hidroksil  dan  jumlah  gugus  hidroksil yang  tersubstitusi  glikosida  (Amic  dkk. 2003).  Kadar  fenolik  pada  daun  sangat dipengaruhi  oleh  tingkat  umur  daun, kondisi  tanah,  pemberian  pupuk  serta stress  lingkungan  baik  secara  fisik, biologi  maupun kimiawi (Kahkonen dkk. 2001).
Metode  analisa  DPPH  secara luas digunakan untuk menentukan potensi  ekstrak  tanaman  berdasarkan kemampuan  menangkap  radikal  bebas. DPPH  merupakan  radikal  bebas  sintetis yang  stabil  yang  dapat  mewakili  radikal bebas  sesungguhnya.  Senyawa  ini berwarna  ungu  jika  dilarutkan  dalam pelarut  metanol  (Huang  dkk.  2005).
Penggunaan metanol dapat menstabilkan radikal DPPH dibandingkan pelarut lain, seperti: etanol dan  n-butanol  (Sharma  dan  Bhat  2009). Selain  itu  radikal  DPPH  dapat  larut hanya dalam media pelarut organik (Kim dkk. 2002).
Kemampuan  menangkap  radikal bebas  DPPH  sampel  didasarkan  pada kemampuan  mereduksi  radikal  bebas yang ditandai dengan penurunan intensitas  warna  larutan  ungu,  karena DPPH  menangkap  atom  hidrogen  dari senyawa  fenolik  sehingga  terbentuk senyawa  difenil  pikrilhidrasin  berwarna
kuning  yang  stabil  (Chang    dkk.  2007; Kim  dkk.  2002).  Dekolorisasi  radikal
DPPH  dapat  terdeteksi  pada λ 515-517 nm (Hasan dkk. 2009). Penelitian  ini  bertujuan  untuk mempelajari aktivitas
antioksidatif ekstrak  daun  beluntas    dari  3  kelompok ruas daun beluntas, yaitu ruas daun 1-3,
4-6  dan  >6,  melalui  pengujian  fitokimia, total fenol total flavonoid dan kemampuan  menangkap  radikal  bebas DPPH (1,1-difenil-2–pikrilhidrazil).

## METODOLOGI Bahan Penelitian
Bahan  baku  yang  digunakan adalah  daun  beluntas  yang  diperoleh dari  daerah  Dramaga,  Bogor.  Bahan kimia  untuk  analisis  terdiri  atas  : petroleum eter metanol akuades pereaksi Dragendoft  Mayer dan Wagner klorofor,  asam  gallat  (Riedel-de  Haen), kuersetin  dan  1,1-difenil-2-pikrilhidrasil, dll

## Metode Penelitian
Proses  Penyiapan  Ekstrak  Daun Beluntas
Daun beluntas pada penelitian ini dikelompokkan  menjadi  3,  yaitu  :  ruas daun  1-3,    4-6  dan  >6  (Gambar  1).
Pengelompokan didasarkan
pada perbedaan  warna  dan  tekstur  daun.
Masing-masing ruas diekstraksi menurut modifikasi metode Biswas dkk. (2005) Daun beluntas yang telah dikeringkan  pada  suhu  kamar  selama  7 hari  ditepungkan  dengan  ukuran  40 mesh,  lalu  dianalisis  kadar  air  dan fitokimianya.  Kemudian  tepung  daun kering  tersebut  dimaserasi  dengan petroleum  eter  (1:4  b/v)  pada  suhu kamar  selama  24  jam.  Residu  yang sudah dipisahkan dari pelarutnya dengan  cara  disaring  dikeringkan  pada suhu  kamar  ( ± 15  menit).  Selanjutnya residu  yang  sudah  kering  diekstrak dengan metanol (1:15b/v) menggunakan ekstraksi  soxhlet  pada  suhu  65 o C selama 3 jam. Pelarut metanol diuapkan dengan  rotary  evaporator.  Ekstrak  yang
diperoleh  disimpan  pada  suhu  4 o C  dan gelap sampai analisa berikutnya.
Analisis meliputi kadar air ditentukan  berdasarkan    metode  AOAC 925.45 (1999), analisa fitokimia dilakukan berdasarkan metode Harborne
(1996) yang meliputi: alkaloid, flavonoid, fenolik,  triterpenoid,  sterol,  saponin  dan tanin.

## Analisa Alkaloid
1  gram  sampel  digiling  dengan pasir  sambil  dibasahi  dengan  5  ml kloroform  yang  berisi  3  tetes  ammonia. Tambahkan  lagi  5  ml  kloroform  yang berisi 5 tetes ammonia, kemudian saring ke dalam tabung reaksi. Ekstrak kloroform ditambahkan 10 tetes H 2 SO 4 2 M  dan  divorteks,  kemudian  dipisahkan lapisan asamnya ke dalam tabung reaksi lain.  Lapisan  tersebut  diteteskan  pada spot  plate dan  ditambahkan  3  pereaksi Dragendoft,  Mayer  dan  Wagner,  uji keberadaan  alkaloid  positif  jika    timbul endapan  dengan    warna  berturut-turut sebagai berikut : merah jingga, putih dan coklat.
Deteksi Senyawa Flavonoid dan Fenolik
Sebanyak  0.1  gram  sampel ditambahkan    metanol  sampai  semua sampel terendam, kemudian dipanaskan. Larutan  dipipet  dan  diteteskan  pada  2 spot  plate masing-masing  5  tetes.  Pada spot  plate pertama  ditambahkan  NaOH 10%  (b/v),  timbulnya  warna  merah menandakan  positif  senyawa  fenol hidrokuinon.  Pada spot  plate kedua ditambahkan  1  tetes  H 2 SO 4 pekat, timbulnya  warna  merah  menandakan positif senyawa flavonoid.

## Deteksi Triterpenoid dan Sterol
Sebanyak  0,1  gram  sampel ditambahkan etanol dan dipanaskan lalu disaring.
Filtrat diuapkan
dan ditambahkan  eter.  Lapisan  eter  yang terbentuk  dipipet  dan  diteteskan  pada spot plate lalu ditambahkan pereaksi LB
(3  tetes  asetat  anhidrat  dan  1  tetes H 2 SO 4 ).  Adanya  triterpenoid  ditandai dengan  timbulnya  warna  merah  atau ungu,  sedangkan  adanya  sterol  ditandai dengan adanya warna hijau.
Deteksi Flavonoid, Saponin dan Tanin Sebanyak  0,1  gram  sampel dimasukkan  dalam  gelas  piala  lalu ditambahkan  10  ml  air  panas  dan didihkan  selama  5  menit.  Kemudian masing-masing 3 ml larutan dimasukkan ke  dalam  2  tabung  reaksi.  Tabung pertama  dimasukkan  serbuk  Mg  dan beberapa  tetes  HCl  pekat  dan  amil alkohol.
Campuran dikocok dan dibiarkan  memisah,  adanya  flavonoid ditunjukkan  adanya  warna  merah  coklat pada  lapisan  amil  alkohol.  Pada  tabung reaksi  kedua  dilakukan  pengocokan secara  vertikal  selama  10  detik  dan dibiarkan selama 10 menit. Adanya busa yang stabil menunjukkan adanya saponin,  sedangkan  sisa  campuran didihkan  lagi  selama  10  menit  lalu disaring.  Filtrat    ditambahkan  dengan beberapa  ml  larutan  FeCl 3 1  %  (b/v). Timbulnya  warna  biru  tua  atau  hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.

## Penentuan  Rendemen
Ekstrak  daun  beluntas  yang diperoleh ditentukan rendamennya dengan tujuan  untuk mengetahui tingkat keefektifan metode ekstraksi. Rendamen yang  diperoleh  ditentukan  berdasarkan metode  gravimetri  berdasarkan  metode Ljubuncic et  al .  (2005),  dengan  cara membandingkan  berat  ekstrak  daun beluntas  terhadap  berat  sampel  yang digunakan,  sehingga  diperoleh  persen ekstrak (b/b).

## Kadar  Total Fenol
Kadar  total  fenol  ditentukan berdasarkan  metode  Kumar  dkk.  (2008) dan  Jayasri  dkk.  (2009).  1  ml  sampel ditambahkan  4  ml  larutan  natrium karbonat  (75g/L)  kemudian  divorteks dan  ditambahkan  0,2  ml  reagen  Folin- ciocalteus  fenol.  Selanjutnya  campuran
ditambahkan akuades hingga volume 10 ml  dan  divorteks  kembali.  Setelah sampel  dibiarkan    selama  1  jam  diukur pada λ 760  nm.  Kadar  fenol  total dinyatakan ekuivalen asam gallat (GAE).

## Kadar Total Flavonoid
Kadar  total  flavonoid  ditentukan berdasarkan metode Kumar dkk. (2008). 1  ml  sampel  dimasukkan  dalam  labu takar  10  ml  yang  berisi  4  ml  akuades dan  ditambahkan 0,3 ml larutan  NaNO 2 5% (b/v). Sesudah 5  menit ditambahkan  0,3  ml  larutan  AlCl 3 10% (b/v), lalu sesudah  6 menit ditambahkan 2  ml  larutan  1  mol/L  NaOH  dan diencerkan hingga volume 10 ml dengan akuades.  Absorbansi  larutan  diukur pada λ 510  nm.  Kadar  flavonoid    total dinyatakan ekuivalen kuersetin (QE).
Kemampuan Menangkap Radikal Bebas DPPH Aktivitas antioksidan sampel diukur  berdasarkan  modifikasi  metode Aicha    dkk.  (2006).  1  ml  sampel  pada berbagai  variasi  konsentrasi  dalam pelarut  metanol  ditambahkan  3  ml larutan  DPPH  (60 µ M)  dan    metanol hingga volume 10 ml. Absorbansi larutan diukur  pada λ 517  nm  setelah  30  menit menggunakan spektrofotometer UV–Vis. Kemampuan menghambat radikal bebas DPPH  dinyatakan  dengan  rumus  :  % penghambatan  =  (A0-At)/A0      x    100%, Keterangan  :    A0  adalah  absorbansi kontrol  pada  saat  t  =  0  detik  dan    At adalah  absorbansi  antioksidan  pada saat  t = 30 detik.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tingkat  ketuaan  daun  beluntas menentukan kadar fitokimia, oleh karena itu  dilakukan  pengelompokkan  daun menjadi  3,  yaitu  :  ruas  daun    1-3,    4-6 dan    >6.  Pembagian    didasarkan  pada perbedaan  kenampakan  daun  (warna dan tekstur). Semakin tua daun warnanya semakin  hijau  tua  dan teksturnya semakin keras karena jaringan /selulosanya semakin banyak.
Gambar 1.  Pengelompokan daun beluntas yang diteliti (1-3 ruas, 4-6 ruas dan lebih dari 6 ruas)
Kadar Air Ketiga  kelompok  sampel  yang sudah  dikeringkan  pada  suhu  kamar ditepungkan untuk mendapatkan partikel  40  mesh.  Perlakukan  ini dimaksudkan untuk memperluas permukaan  kontak  antara  partikel daun dengan pelarut sehingga hasil ekstraksi yang diperoleh maksimal. Berdasarkan Matricardi dkk.
(2009)  bahwa  reduksi  ukuran  partikel pada  biji  kacang  tanah  menunjukkan efek  yang  positif  terhadap  ekstraksi. Ukuran  partikel  semakin  kecil  akan menyebabkan peningkatan luas permukaan  dan  jumlah  sel  yang  rusak yang berakibat peningkatan konsentrasi minyak yang dihasilkan. Selama ekstraksi  difusi  yang  terjadi  pada
partikel  relatif  kecil,  sehingga  jumlah minyak  yang  terekstrak  sebanding dengan luas permukaan partikel. Penurunan  ukuran  partikel  dari  3,35- 4,75  mm  menjadi    0,86-1,19  mm,  total minyak  yang  dihasilkan  meningkat sebesar 36%- 82%.
Menurut  Pileno  dkk.  (2007) bahwa  reduksi  ukuran  partikel  pada  biji kopi  secara  signifikan  berpengaruh positif  terhadap  fenol  yang  terekstrak. Reduksi ukuran partikel yang berlebihan  menyebabkan  terbentuknya fenomena  pelapisan  dan  cara  yang disukai oleh pelarut sehingga membatasi efisiensi pembasahan pelarut terhadap sampel dan menurunkan efisiensi ekstraksi. 1-3 4-6 > 6
14.57 14.01 15.38 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 1-3 Segment 4-6 Segment > 6 Segment Samples M o is tu re C o n te n t (% )
Gambar 2.  Kadar kelembaban dari tiap jenis daun
Penentuan  kadar  air  tepung daun  beluntas  ditentukan  dengan  oven vakum  suhu  70 o C,  hal  ini  dilakukan dengan pertimbangan untuk meminimalkan  kesalahan  kadar  air yang terukur karena hilangnya sejumlah senyawa  volatil  (kelompok  terpen), seperti  :  boehmeril  asetat,  HOP-17 (21)-en  3 β -asetat,  linaloil  glukosida,
linaloil apiosil glukosida, linaloil hidroksi glukosida, plusheosida C, cuauhtermone, 3-(2’-3’-diasetoksi- 2’metil-butiril),  plucheol  A,  plucheol  B, plucheosida A, plucheosida
B, plucheosida E dan pterocarptriol (Traithip 2005), seskuisterpen, monoterpen  dan  triterpen  (Luger  dkk. 2000). Kadar  air  sampel  daun beluntas mengalami  penurunan  seiring  dengan
bertambahnya usia/ketuaan daun, karena  terjadi  peningkatan  jumlah komponen daun (jaringan/serat). Penyimpangan  kadar  air  pada  ruas  >6 disebabkan  adanya  penyerapan  air kembali oleh jaringan/serat pada tepung  daun  yang  kering.  Selama proses  pengeringan  kadar  air  daun beluntas mengalami
penurunan sehingga  terjadi  pengkerutan  ukuran pori  dan  distribusi  ukuran  pori  saling mendekat  (Haeggkvist  dkk.  1998). Kemampuan  adsorbsi  air  oleh  selulosa atau serat  disebabkan  adanya  interaksi antara  gugus  hidroksil  dengan  molekul air  dari  udara  (Svedas  1998).   Menurut Sembiring  dan  Sinaga  (2003)  bahwa kemampuan adsorbsi air oleh adsorben ditentukan  adanya  pori  yang  dapat meningkatkan
luas permukaan
absorben.
Table 1  Total fitokimia dari tiap jenis daun beluntas Compounds Jenis daun (ruas) 1-3 4-6 > 6 Saponin - - - Tannin ++++ +++ ++ Triterpenoid - - - Sterol ++++ +++ ++ Flavonoid +++ ++ + Phenol hydroquinon + - - Alkaloid - - - Ket. : +  menunjukkan intensitas warna, semakin banyak tanda positif menunjukkan semakin kuat warna Fitokimia  yang  terdeteksi  pada ekstrak daun beluntas meliputi:
senyawa  tanin,  sterol,  flavonoid  dan fenol hidrokuinon, namun dengan intensitas  yang  berbeda  (Tabel  1). Keberadaan  senyawa  tanin,  sterol, flavonoid  dan  fenol  hidrokuinon  pada ekstrak  daun  beluntas  masing-masing ditunjukkan  oleh  warna  biru  tua  atau hijau  kehitaman,  hijau,  merah  dan merah  (Harbone,  1996).  Hal  ini  sesuai dengan  pendapat  Ardiansyah  dkk.
(2003) bahwa daun beluntas mengandung senyawa fitokimia, seperti:  fenol  hidrokuinon,  sterol  dan tanin.  Menurut  Traithip  (2005)  bahwa senyawa  fitokimia  yang  terdapat  pada ekstrak  etanolik  dan  fraksi-fraksinya dari daun beluntas terdiri atas senyawa flavonoid dan polifenol.
Komposisi dan konsentrasi senyawa fitokimia mengalami perubahan selama pertumbuhan
tanaman.  Daun  yang  lebih  muda mempunyai  kandungan  fitokimia  paling tinggi  (Bergquist  dkk.  2005),  hal  ini terkait  dengan  fungsi  dari  senyawa metabolit sekunder tersebut, yaitu untuk pertahanan melawan herbivora, patogen,  insekta,  bakteri,  jamur  dan virus (Saffan dan El-Mousallamy 2008).  Selain  itu  senyawa  fitokimia dalam  daun  biasanya  ditemukan  dalam struktur  bebas  atau  terikat  secara glikosida, dengan bertambahnya tingkat ketuaan daun banyak ditemukan dalam struktur  glikosida  yang  terdapat  pada membran  sel.  Senyawa  ini  membentuk struktur yang kompleks dengan karbohidrat (glukosa, xilosa dan arabinosa) (Schaller, 2003; Boukes dkk., 2008).
Gambar 3.  Kadar rendemen dari tiap jenis daun beluntas

## Rendemen
Gambar  3  menunjukkan  bahwa rendemen terbesar diperoleh dari kelompok  ruas  daun  1-3  >  4-6  >  >6. Data  ini  seiring  dengan  peningkatan intensitas  warna  pada  uji  fitokimia. Rendamen ditentukan setelah melewati ekstraksi  pelarut  dan  soxhlet  serta penghilangan residu pelarut. Rendamen yang diperoleh telah mengalami  proses  penghilangan  lemak ( defatted ), karena pada ekstraksi pelarut  digunakan  petroleum  eter.
Rendamen  yang  diperoleh  sangat ditentukan oleh tingkat kelarutan senyawa  metabolit  sekunder  pada pelarut  yang  digunakan.    Kelarutan senyawa sangat ditentukan oleh kepolaran,  momen  dipol,  polarisabilitas dan ikatan hidrogen.
Pada  ekstraksi  soxhlet  dipilih metanol daripada etanol, hal ini
dilakukan dengan
pertimbangan metanol  dapat  mengekstrak  senyawa fitokimia lebih banyak sehingga aktivitas  antioksidan  yang  dihasilkan lebih  tinggi  (Akroum  dkk.  2009). Menurut  Yu  Lin  dkk.  (2009)  bahwa metanol  dapat  mengekstrak  senyawa dengan  berat  molekul  rendah,  tingkat kepolaran sedang sebab sifat kelarutannya  yang  luas.  Penggunaan pelarut  yang  berbeda  pada  ekstraksi daun  beluntas  dapat  mengubah  profil senyawa  fenolik  yang  terdapat  dalam sampel  (Kahkonen dkk. 2001).

## Total Fenol
Hasil  uji  total  fenol  menyatakan bahwa  semakin  muda  daun  kadar  total fenol    semakin  besar,  hal  ini  terkait dengan  fungsi  fenol  bagi  tanaman sebagai  pertahanan    (Saffan  dan  El- Mousallamy  2008).  Menurut Kahkonen
dkk.  (2001)  bahwa  perbedaan  tingkat kematangan  buah  berpengaruh  pada profil  fenolik,  biasanya  senyawa  fenolik terkonsentrasi  pada  buah  yang  masih muda daripada buah yang  tua, kecuali antosianin. Schaller (2003) dan  Boukes dkk. (2008) berpendapat bahwa senyawa  fenol  yang  ditemukan  pada buah,  bunga,  daun  dan biji  mempunyai
struktur  yang  beragam  dalam  kondisi bebas  atau  terikat  secara  glikosida.
Semakin  tua  umur  daun  struktur glikosida  lebih  banyak  terkonsentrasi. Hampir 2-10 kali lipat senyawa metabolit  sekunder  (sterol)  ada  dalam struktur  asil  glikosida  yang  terdapat dalam membran sel.
Gambar 4.  Total phenol tiap jenis daun beluntas
Pada  pengujian  dengan  folin ciocalteus  diperoleh  hasil  yang  sangat dipengaruhi  oleh  struktur  kimianya. Senyawa fenol yang mempunyai gugus fungsi  hidroksil  yang  banyak  atau dalam  kondisi  bebas  akan  dihasilkan kadar  total  fenol    yang  tinggi  (Deore dkk. 2009). Hal ini disebabkan
kompleks  warna  ungu  yang  terdeteksi didasarkan pada reaksi transfer elektron dalam larutan alkali dari fenolik ke senyawa kompleks asam fosfotungstat /fosfomolibdat (Huang dkk. 2005).

## Total Flavonoid
Gambar 5.  Structure of  Standar compounds (a) quercetin
(b) (+)-catechin (c) ferulic acid
Gambar 6.  Total flavonoid  dari tiap jenis daun beluntas
b c a
Pengujian  total  flavonoid  pada berbagai  tingkat  ruas  daun  beluntas menunjukkan bahwa kadar total flavonoid ruas 1-3 > ruas  4-6 > ruas >6 pada  berbagai  senyawa  standar  (asam ferulat, (+)-katekin dan kuersetin)
(Gambar  5).  Total  flavonoid    ketiga sampel  menunjukkan    bahwa  kadar total  flavonoid  daun  beluntas  dengan menggunakan  standar  kuersetin  > asam  ferulat  >  (+)-katekin  (Gambar  6). Struktur  senyawa  standar  menentukan reaktivitas  terhadap  reagen  AlCl 3 dan
NaNO 2 dalam  kondisi  basa  kuat (NaOH), yang ditandai dengan terbentuknya  kompleks  warna  antara orange hingga merah. Kuersetin dipilih sebagai standar karena  termasuk  senyawa  flavonol yaitu  flavonoid  yang  paling  efektif menangkap  radikal  bebas  (radikal hidroksil,  superoksida  dan    peroksil)
(Tapas  dkk.  2008)  serta  menghambat berbagai  reaksi  oksidasi  (Soeksmanto dkk. 2007), karena dapat menghasilkan radikal  fenoksil  yang    terstabilkan  oleh efek resonansi  dari  cincin  aromatis  (Yu Lin dkk. 2009).
Hal  ini  disebabkan  senyawa flavonol  mempunyai  struktur  (katekol) orthodihidroksi  pada  cincin  B,  ikatan rangkap pada atom C2-3 yang terkonjugasi  dengan  gugus  fungsi  C4- okso,    gugus  OH  pada  C3  di  cincin  C dan  gugus  OH  pada  C5  di  cincin  A (Lugasi  dkk.  2003;  Tapas  dkk.  2008). Kombinasi  gugus  C3-OH  dan  C5-OH dengan C4-karbonil dan ikatan rangkap C2-C3  dapat  meningkatkan  aktivitas penangkap  radikal  bebas  (Amic  dkk. 2003).

## Kemampuan Menangkap Radikal Bebas DPPH
Gambar  7.  Aktivitas menangkap radikal bebas DPPH dari tiap jenis daun beluntas
Hasil  pengujian  kemampuan menangkap  radikal  bebas  DPPH  dari ketiga  kelompok  ekstrak  daun  beluntas diperoleh  bahwa  ekstrak  daun  ruas  1- 3>  4-6>  >6  (Gambar  7).    Hal  ini ditunjukkan  dari    kemampuan  masing- masing ekstrak dalam mereduksi warna ungu dari radikal bebas DPPH  menjadi larutan  yang  berwarna  kuning  yang terdeteksi  pada λ 517  nm.    Semakin besar  potensi  ekstrak  daun  beluntas menangkap  radikal  bebas    DPPH semakin  besar  konsentrasi  radikal DPPH  yang  tereduksi.  Penurunan warna  ungu  disebabkan  radikal  DPPH menangkap atom hidrogen yang didonorkan oleh senyawa fenolik sehingga  terbentuk  senyawa  difenil pikrilhidrasin  berwarna  kuning  yang stabil (Chang dkk. 2007; Kim dkk. 2002).
Kapasitas  menangkap  radikal bebas  DPPH  sebagian  besar  terkait dengan  gugus  hidroksil  dari  senyawa fenol  (Nakiboglu  dkk.  2007).  Aktivitas menangkap radikal bebas DPPH dipengaruhi oleh  polaritas dari medium reaksi,  struktur  kimia  dari  penangkap radikal  dan  pH  campuran  reaksi (Sharma dan  Bhat  2009).
Aktivitas antioksidan fenolik sangat  ditentukan  oleh  struktur  kimia, jumlah  dan  posisi  gugus  hidroksil  dan metil  pada  cincin.  Molekul  tersubstitusi gugus hidroksil semakin banyak semakin kuat menangkap radikal bebas DPPH karena kemampuan mendonorkan  atom  hidrogen  semakin besar  (Yu  Lin  dkk.  2009).  Struktur aglikon mempunyai
aktivitas antioksidan  lebih  tinggi  dibandingkan dengan struktur glikosida (Li dkk. 2009).
y = 602.92x + 0.0985
R 2 = 0.9991 y = 248.76x + 0.1286 R 2 = 0.9943 y = 114.52x + 8.8096 R 2 = 0.9734 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 1 2 3 4 5 6 Total Fenol (ppm) In h ib it io n o f D P P H F re e R a d ic a l (% ) 1-3 Segments 4-6 Segments > 6 Segments Linear (4-6
Gambar 8. Hubungan antara Total Phenol and Penghambatan radikal DPPH
y = 848.04x + 6.5364 R 2 = 0.9875 y = 743.56x + 0.0985 R 2 = 0.9991 y = 295.43x - 0.1286 R 2 = 0.9943 -500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 0 1 2 3 4 5 6 Total Flavonoid (ppm) In h ib it io n o f D P P H F re e R a d ic a l (% ) 1-3 Segments 4-6 Segments > 6 Segments

## Gambar 9. Hubungan antara Total Flavonoid and penghambatan radikal DPPH
Ada korelasi positif antara kadar total  fenol  dan  total  flavonoid    dengan kemampuan  menangkap  radikal  bebas DPPH ketiga sampel (Gambar 8 dan 9). Daun  beluntas  yang  masih  muda mempunyai  aktivitas  antiradikal  lebih tinggi  dibandingkan  daun  yang  sudah tua.  Kemampuan  menangkap  radikal
bebas merupakan salah satu mekanisme  aksi  utama  antioksidan yang  ditunjukkan  oleh  fitokimia  fenolik.
Oleh karena itu ekstrak sampel rempah-rempah yang mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi
cenderung    mempunyai  kadar  fenol total yang tinggi pula (Shan dkk. 2005).
Gambar  10. Nilai  IC 50 tiap jenis daun beluntas
Berdasarkan  Gambar  10  dapat terlihat  bahwa  nilai  IC 50 ketiga  sampel tersebut  sebagai  berikut:  ruas  daun  1-3 sebesar  3,71  mg/L,  ruas  4-6  sebesar 6,85  mg/L  dan  ruas  >6    sebesar  49,62 mg/L.    IC 50 adalah  ukuran  keefektifan suatu  senyawa  dalam  menghambat fungsi  biologis  atau  biokimia.  Ukuran  ini mengindikasi  banyaknya  senyawa  yang dibutuhkan  untuk  menghambat  proses biologis  menjadi  setengahnya  (50%). Semakin  rendah  nilai  IC 50 nya  maka semakin  besar  potensinya  sebagai antioksidan (Kosuar dkk. 2004).

## KESIMPULAN
Ekstrak  daun  beluntas  ketiga kelompok  dari  ruas  daun  beluntas  yang meliputi  :  1-3,  4-6  dan  >6  mempunyai aktivitas  menangkap  radikal  bebas DPPH.  Ekstrak  daun  beluntas  ini mengandung    senyawa  fitokimia  seperti tanin,  sterol,  fenol  hidrokuinon  dan flavonoid.
Ekstrak  daun  beluntas  dari    ruas daun 1-3 yang paling berpotensi sebagai sumber antioksidan ditandai dengan nilai IC 50 nya  paling  kecil  yaitu  3,71  mg/L dibandingkan  ruas  4-6  dan  >6  yang masing-masing  sebesar  6,85  mg/L    dan 49,62  mg/L.  Kadar  total  fenol  dan  total flavonoid  daun  beluntas  ruas  daun  1-3 yaitu    234.65  mg  GAE/100  g  berat sampel kering  dan 2163,59 mg QE/ 100 g berat sampel kering.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih  kepada  DP2-M  Dirjen  DIKTI  atas biaya  yang  diberikan  melalui  dana Penelitian Hibah Bersaing 2008.

## DAFTAR PUSTAKA
Aicha, N. Ines, I. Ines, B. Mohamed, B.S. Jamila, H.S. Jemni, B.C. Mohamed, N. Daniel, B. Leila , G. dan Kamel, G. 2006. A Comparative Evaluation of  Mutagenic,  Antimutagenic  and Scavenging  Radicals  Activity  of
Essential  Oil  from  Pituranthos
Chloranthus. SIPAM 362-371. Akroum,  S.  Satta,  D.  dan  Lalaoui,  K. 2009.,  Antimicrobial,  Antioxidant, Cytotoxic Activities and Phytochemical  Screening  of  Some Algerian  Plants. European  Journal of  Scientific  Research 31(2):  289-
295. Amic,  D.  Davidovic-Amic,  D.  Besˇlo,  D. dan    Trinajstic,  N.  2003.,  Structure radical scavenging activity relationships  of  flavonoids. Croatia Chemical Acta 76 : 55–61.
Andarwulan,  N.  Batari,  R.  Sandrasari, D.A. dan  Wijaya, H. 2008., Identifikasi  senyawa  flavonoid  dan kapasitas antioksidannya pada ekstrak  sayuran  indigenous  Jawa Barat. Di dalam : Half Day Seminar on Natural Antioxidants: Chemistry, Biochemistry and Technology ;
Bogor, 16 September 2008. Bogor:
Biopharmaca  Research  Center-
SEAFAST Center IPB.
[AOAC] Association  of Official  Analytical Chemist  925.45.  1999. Official methods  of  analysis  of  association of  official  analytical  chemists . Edition  ke-15.  USA  :  Kenneth Helrich. Chapter 44.1.03.  p.2. Ardiansyah.  Nuraida,  L.  Andarwulan,  N. 2003.,  Aktivitas  antimikroba  daun beluntas ( Pluchea indica Less ) dan stabilitas aktivitasnya pada berbagai  konsentrasi  garam  dan tingkat    pH. Jurnal  Teknologi  dan Industri Pangan 14(2) : 90-97. Bergquist, S.A.M. Gertsson, U.E. Knuthsen,  P.  dan  Olsson,  M.E.
2005.,  Flavonoids  in  baby  spinach ( spinacia  oleracea  l. ):  changes during  plant  growth  and  storage. Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry 53: 9459  -9464.
Biswas,  R.  Dasgupta,  A.  Mitra,  A.  Roy, S.K. Dutta, P.K. Achari, B. Dastidar,
S.G.  dan  Chatterjee,  T.K.  2005., Isolation, purification and characterization of four pure compounds from the root extract of
Pluchea  indica  Less and  the potentiality  of  the  root  extract  and the pure compounds for antimicrobial  activity. European
Bulletin  of  Drug  Research 13  :  63- 70.
Boukes,  G.J.  Venter,  M.V.D.  dan Oosthuizen,  V.  2008.  Quantitative and qualitative analysis of sterols/sterolins  and  hypoxoside contents  of  three Hypoxis (African potato)  spp.  African  Journal  of Biotechnology 7 (11): 1624-1629. Chang,  H.Y.  HO,  Y.L.  Sheu,  M.J.  Lin, Y.H.  Tseng, M.C. Wu, S.H. Huang, G.J.  dan  Chang,  Y.S.    2007.,
Antioxidant and Free  Radical Scavenging  Activities  of Phellinus merrillii Extracts. Botanical  Studies 48: 407-417.
Chludil,  H.D.      Corbino,  G.B.  dan Leicarh,  S.R.  2008.,  Soil  Quality Effects  on Chenopodium  album Flavonoid  Content  and  Antioxidant Potential. Journal  of
Agricultural  and  Food  Chemistry. 56: 5050–5056. Deore,  S.L.  Khadabadi,  S.S.  Baviskar, B.A. Khadabadi, S.S. Khangenbam,  R.A.  Koli,  U.S. Daga, N.P. Gadbail, P.A. dan Jain,
P.A. 2009.,  In  vitro  Antioxidant Activity  and  Phenolic  Content  of Croton  caudatum . International Journal  of  Chemical  Technology Research 1(2):174-176.
Haeggkvist,  M.  dan  Li,  T.Q.  1998., Effects  of  Drying  and  Pressing  on the  Pore  Structure  in the  Cellulose ®bre  Wall  Studied  By  1H  and  2H NMR  Relaxation. Cellulose 5:  33- 49.
Hagerman, A.E. Riedl, K.M. Jones, G.A. Sovik, K.N. Ritchard, N.T. Hartzfeld,
P.W. dan Riechel, T.L. 2002., High Molecular Weight Plant Polyphenolics (Tannins) as Biological  Antioxidants. Journal  of
Agricultural  and  Food  Chemistry 46:1887-1892.
Harbone,  J.B.  1996., Metode  Fitokimia . Padmawinata    K,  Soediro  I, penerjemah,  Bandung  :  Institut Teknologi Bandung.
Hasan,  S.M.  R.  Jamila,  M.  Majumder, M.M.    Akter,  R.  Hossain,  M.M. Mazumder,  M.E.H.  Alam,  M.A. Jahangir,  R.  Rana,  M.S.  Arif,  M. dan  Rahman,  S.  2009.,    Analgesic and  Antioxidant  Activity  of  the Hydromethanolic Extract of Mikania scandens ( L.) Willd. Leaves. American Journal of
Pharmacology  and  Toxicology .  4 (1): 1-7. Huang,  D.  Ou,  B.  dan  Prior,  R.L.  2005., The  Chemistry  behind  Antioxidant Capacity Assays. Journal of Agricultural  and  Food  Chemistry 53:1841-1856.
Jayasri,  M.A. Mathew, L. dan  Radha, A. 2009.,  A  report  on  the  antioxidant activity  of  leaves  and  rhizomes  of Costus pictus D. Don . International Journal  Integrative  Biology 5(1)  : 20-26. Kahkonen, M.P. Hopia, A.I. dan Heinonen.  2001.,  Berry  Phenolics and  Their  Antioxidant  Activity.
Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry 49: 4076-4082. Kim, D.O. Lee, K.W. Lee, H.J. Lee, C.Y. 2002., Vitamin C Equivalent Antioxidant  Capacity  (VCEAC)  of Phenolic  Phytochemicals. Journal of Agricultural and Food Chemistry
50: 3713  -3717.
Kosuar,  M.B.  Dorman,  H.J.D.  Basuer,
K.H.C.  dan  Hiltunen  R.  2004., Screening of Free Radical Scavenging  Compounds  in  Water Extracts  of  Mentha  Sampels  Using a Postcolumn Derivatization Method. Journal of Agricultural and
Food Chemistry 52:5004-5010. Kumar, S. Kumar, D. Manjusha, Saroha, K.  Singh,  N.  dan  Vashishta,  B. 2008.,  Antioxidant  and  free  radical scavenging  potential  of Citrullus colocynthis  (l.) schrad.  methanolic
fruit  extract. Acta  Pharmacology 58 : 215–220.
Kumaran,  A.  dan  Karunakaran,  R.J. 2007.,  In  vitro  antioxidant  activities of  methanol  extracts  of  five Phyllanthus  species  from  India. LWT 40 : 344–352.
Li, C. Du, H. Wang, L.S.Shu, Q.Y. Zheng, Y.  Xu,  Y.  Zhang,  J.J.  Zhang,  J.
Yang,  R.  dan  Ge,  Y. 2009., Flavonoid Composition and Antioxidant  Activity  of  Tree  Peony (Paeonia  Section  Moutan)  Yellow
Flowers. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57: 8496–8503. Luger,  P.  Weber,  M.  Dung,  N.X.Ngoc, P.H.,  Tuong,  D.T.  dan  Rang,  D.D. 2000., The crystal structure of hop- 17(21)-en-3 β -yl  asetat  of Pluchea pteropoda Hemsl.  from  Vietnam. Crystal  Res  Technology 35(3)  : 355-362.
Magalhaes,  L.M.    Segundo,  M.A.    Reis,
S.  Lima,  J.L.F.C.  dan  Rangel, A.O.S.S. 2006.,  Automatic  method for  the  determination  of  folin- ciocalteu  reducing  capacity  in  food products. Journal  of  Agricultural and  Food  Chemistry 54:  5241- 5246.
Matricardi,  M.    Hesketh,  R.  dan  Farrell, S.  2009.,  Effect  of  operating conditions on static/dynamic extraction  of  peanut  oil  using supercritical carbon
dioxide. http://www.Supercritical.com/public ations/peanutoilextraction  by  SF/  1
November 2009
Moein,  S.  Farzami,  B.  Khaghani,  S.
Moein, M.R. dan Larijani, B. 2007., Antioxidant properties and prevention  of  cell  cytotoxicity  of Phlomis  Persica  Boiss . DARU 15(2) : 83.
Nakiboglu,  M.  Urek,  R.O.  Kayali,  H.A. dan  Tarhan,  L.  2007.,  Antioxidant capacities  of  endemic sideritis sipylea and origanum  sipyleum from  turkey. Food  Chemistry 104: 630–635.
Orhan, I. Kartal, M. Asaker, M.A.  Senol,
F.S.  Yilmaz,  G.  Sener,  B.  2009., Free  radical  scavenging  properties and  phenolic  characterization  of some edible plants. Food
Chemistry 114 : 276–281.
Pinelo,  M.  Tress,  A.G.  Pedersen,  M.
Amous, A. dan Meyer, A.S. 2007., Effect  of  Cellulases,  solvent  type and particle size distribution on the extraction  of  chlorogenic  acid  and other  phenols  from  spent  coffee grounds. American Journal of Food
Technology 2(7):641-651. Tapas,  A.  Sakarkar,  D.M.  dan  Kakde, R.B. 2008., Flavonoids as nutraceuticals:  a  review. Tropical Journal of Pharmaceutical Research 7(3) : 1089-1099. Traithip,  A.  2005., Phytochemistry  and antioxidant  activity  of  Pluchea indica. [Thesis]  Mahidol  University. Thailand. Saffan,  S.E.S.  dan  El-Mousallamy,
A.M.D.  2008.  Allelopathic  effect  of Acacia raddiana leaf extract on the phytochemical contents of germinated Lupinus  termis Seeds. Journal of Applied Sciences Research , 4(3): 270-277. Schaller,  H.  2003.  Review  the  role  of sterols in plant growth and development. Progress  in  Lipid
Research, 42 (2003) 163–175. Sembiring,  M.T.  dan  Sinaga,  T.S.  2003.
Arang aktif (Pengenalan dan
Proses  Pembuatannya),  hal  1-9.
USU digital library, Sumatera Utara.
Shan,  B.  Cai,  Y.  Z.  Sun,  M.  dan  Corke,
H.  2005.,  Antioxidant  capacity  of 26
spice extracts and characterization  of  their  phenolic constituents. Journal of Agricultural and  Food  Chemistry 53:  7749-
 7759.
Sharma,  O.P.  dan  Bhat,  T.K.  2009.,
Analytical methods dpph antioxidant  assay  revisited. Food Chemistry . 113: 1202–1205.
Soeksmanto, A. Hapsari, Y. dan Simanjuntak,  P.  2007.,  Antioxidant content  of  parts  of  mahkota  dewa, Phaleria macrocarpa [Scheff] Boerl. ( Thymelaceae ). Bioversitas ISSN: 1412-033X. 8 (2): 92-95. Svedas, V. 1998., Cellulose-water vapour  interaction  investigated  by spectrometric and ultra high frequency  methods. Journal  of Physical  D:  Applied  Physical 31 : 1752-1756.
Yu  Lin,  H.  Kuo,  Y.H.  Lin,  Y.L.  dan Chiang,  W.  2009.,    Antioxidative effect  and  active  components  from leaves of lotus ( Nelumbo nucifera ). Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry 57: 6623–6629.
EVALUASI  AKTIVITAS ANTIOKSIDATIF  EKSTRAK DAUN BELUNTAS ( Pluchea indica )  BERDASARKAN PERBEDAAN RUAS DAUN
(EVALUATION OF ANTIOXIDATIVE ACTIVITY FROM BELUNTAS LEAVES EXTRACT
( Pluchea indica Less ) BASED ON DIFFERENCE OF LEAF SEGMENT)
Paini Sri Widyawati 1) , C. Hanny Wijaya 2) , Peni Suprapti Hardjosworo 3) , Dondin Sajuthi 4)
1) Fakultas Teknologi Pertanian - Unika Widya Mandala Surabaya Alamat :  Jl Dinoyo 42-44 Surabaya,  Email : wiwiedt@gmail.com
2) Ilmu dan Teknologi Pangan  Fakultas  Teknologi Pertanian  IPB
3) Fakultas Peternakan  IPB
4) Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB

## Abstract
Beluntas  (Pluchea  indica  Less)  is  a  herb  that  commonly  used  as  traditional medicine  and  food.   Its  leaves have  many  biological  activities, because they  contain various  phenolic  compounds.  The  phenol  concentration  of  beluntas  leaves  depends on leaf segment, earth condition, fertilizer and environmental stress.  This research is focused  to  determine  antioxidant  activity  of  three  groups  of    beluntas  leaf  segments that  includes 1-3, 4-6 and > 6.  They were ground, dried at ambient temperature for 7 days, maserated by petroleum eter (1:4 b/v) at ambient temperature for 24 hours and soxhlet  extracted  by  methanol  (1:15  b/v)  at  65 o C  for  3  hours.  The  result  shows  that the  extract  contains  phytochemical  compounds  such  as  tannin,  sterol,  phenol hydroquinone  and  flavonoid.  This  extract  has  antioxidant  activity  to  scavenging  free radical DPPH (2,2-phenyl-1-picrylhydrazyl). The extract of 1-3 beluntas leaf segment was  more  potential  antioxidant  source  than  4-6  and  >  6  beluntas  leaf  segments, because it had the least IC 50 (inhibitor concentration) and the highest total phenol and total flavonoid. The IC 50 , total phenol and flavonoid  total of  it were 3.71 mg/L,  234.65 mg GAE/100 g samples and 2163.59 mg QE/ 100 g samples, respectively.
Key words :  antioxidant activity, beluntas (Pluchea indica Less), phytochemical, total phenol, total flavonoid

## Abstrak
Beluntas  ( Pluchea  indica  Less )  adalah  tanaman  herba  yang  umumnya digunakan  sebagai obat tradisional dan pangan (lalapan). Daun beluntas mempunyai beberapa aktivitas biologi karena mengandung berbagai senyawa fenolik. Konsentrasi fenol dalam daun beluntas sangat bergantung pada ruas daun, kondisi tanah, tingkat kesuburan dan stress lingkungan. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan dari ketiga kelompok dari ruas daun beluntas yang meliputi : 1-3, 4-6 dan >6. Daun beluntas yang sudah dipetik dari pekarangan, dikeringkan pada suhu 27 o C selama 7 hari, dimaserasi dengan petroleum eter (1:4 b/v) pada suhu kamar selama 24  jam  dan  diekstraksi  soxhlet  denga  metanol  (1:15  b/v)  pada  suhu  65 o C  selama  3 jam.Hasil menunjukkan bahwa ekstrak mengandung senyawa fitokimia seperti :  tanin, sterol,  fenol  hidrokuinon  dan  flavonoid.  Ekstrak  ini  mempunyai  aktivitas  antioksidan menangkap radikal bebas DPPH (2,2-phenyl-1-picrylhydrazyl). Ekstrak dari ruas daun beluntas  1-3  yang  paling  berpotensi sebagai  sumber  antioksidan  dari  ruas  daun  4-6 dan  >6,    sebab  ekstrak  tersebut  mempunyai  nilai  IC 50 (konsentrasi  penghambatan) paling kecil dan kadar fenol total dan flavonoid total tertinggi. Nilai  IC 50 , total fenol dan
total flavonoid dari ekstrak ruas daun beluntas 1-3 masing-masing sebesar  3.71 mg/L, 234.65  mg  GAE  (gallic  acid  equivalent)/100  g  berat  sampel  kering  dan  2163.59  mg QE (Quercetin equivalent)/100 g berat sampel  kering.
Kata Kunci:  aktivitas antioksidan, beluntas ( Pluchea indica Less ), fitokimia, fenol total, flavonoid total dan DPPH (2,2-fenil-1-pikrilhidrazil).

## PENDAHULUAN
Radikal  bebas,  seperti  anion superoksida  (O 2 - • ),  radikal  hidroksil (•OH)  dan  hidrogen  peroksida    (H 2 O 2 ) dapat  memicu  kerusakan  biomolekul potensial dalam makhluk hidup, seperti : lemak,  protein  dan  asam  nukleat,  yang berakibat  munculnya  berbagai  macam penyakit degeneratif. Keberadaan radikal bebas ini pada proses pengolahan pangan dapat mempengaruhi  kualitas,  stabilitas  dan keamanan pangan  (Chludil dkk. 2008) Antioksidan adalah senyawa yang  berada  pada  konsentrasi  lebih rendah dari substratnya secara signifikan dapat menunda atau
mencegah  oksidasi  (Moein  dkk.    2007). Senyawa  ini  dapat  menghentikan  reaksi radikal  bebas.    Usaha  pencarian antioksidan  alami  terus  dilakukan  untuk menggantikan  antioksidan  sintetis  yang masih diragukan akan tingkat keamanannya (Orhan dkk. 2009).
Beluntas  ( Pluchea  indica  Less )
merupakan  tanaman  perdu  kelompok Asteraceae yang telah dikenal masyarakat  sebagai  lalapan  dan  obat tradisional  (Ardiansyah  dkk.    2003). Berbagai  penelitian  telah  menyebutkan bahwa  beluntas  mengandung  senyawa lignan,  seskuisterpen,  fenilpropanoid, benzoid,  monoterpen,  triterpen,  sterol dan  alkana  (Luger  dkk.  2000),  akar mengandung  stigmasterol  (+ β -sitosterol), stigmasterol glikosida (+ β -sitosterol- glikosida), 2-(prop-1-unil)-5-(5,6- dihidroksi  heksa-1,3-diunil)-thiofena  dan (-)-katekin (Biswas dkk. 2005), sedangkan daun mengandung hidrokuinon,  tanin,  alkaloid  dan  sterol (Ardiansyah dkk. 2003), flavonol,
seperti : mirisetin, kuersetin dan kaemferol (Andarwulan dkk. 2008). Senyawa fenolik, terutama flavonoid  berfungsi  melindungi  tanaman dari  herbivora  dan  penyakit  (Hagerman 2002).  Senyawa  ini  dapat  menangkap radikal  bebas,  mereduksi,  mendonorkan atom  hidrogen  dan  meredam  oksigen singlet  (Kumaran  dan    Karunakaran 2007).  Potensial  antioksidan  flavonoid tergantung  pada  karakteristik  struktur seperti: jumlah dan pola substitusi gugus hidroksil  dan  jumlah  gugus  hidroksil yang  tersubstitusi  glikosida  (Amic  dkk. 2003).  Kadar  fenolik  pada  daun  sangat dipengaruhi  oleh  tingkat  umur  daun, kondisi  tanah,  pemberian  pupuk  serta stress  lingkungan  baik  secara  fisik, biologi  maupun kimiawi (Kahkonen dkk. 2001).
Metode  analisa  DPPH  secara luas digunakan untuk menentukan potensi  ekstrak  tanaman  berdasarkan kemampuan  menangkap  radikal  bebas. DPPH  merupakan  radikal  bebas  sintetis yang  stabil  yang  dapat  mewakili  radikal bebas  sesungguhnya.  Senyawa  ini berwarna  ungu  jika  dilarutkan  dalam pelarut  metanol  (Huang  dkk.  2005).
Penggunaan metanol dapat menstabilkan radikal DPPH dibandingkan pelarut lain, seperti: etanol dan  n-butanol  (Sharma  dan  Bhat  2009). Selain  itu  radikal  DPPH  dapat  larut hanya dalam media pelarut organik (Kim dkk. 2002).
Kemampuan  menangkap  radikal bebas  DPPH  sampel  didasarkan  pada kemampuan  mereduksi  radikal  bebas yang ditandai dengan penurunan intensitas  warna  larutan  ungu,  karena DPPH  menangkap  atom  hidrogen  dari senyawa  fenolik  sehingga  terbentuk senyawa  difenil  pikrilhidrasin  berwarna
kuning  yang  stabil  (Chang    dkk.  2007; Kim  dkk.  2002).  Dekolorisasi  radikal
DPPH  dapat  terdeteksi  pada λ 515-517 nm (Hasan dkk. 2009). Penelitian  ini  bertujuan  untuk mempelajari aktivitas
antioksidatif ekstrak  daun  beluntas    dari  3  kelompok ruas daun beluntas, yaitu ruas daun 1-3,
4-6  dan  >6,  melalui  pengujian  fitokimia, total fenol total flavonoid dan kemampuan  menangkap  radikal  bebas DPPH (1,1-difenil-2–pikrilhidrazil).

## METODOLOGI Bahan Penelitian
Bahan  baku  yang  digunakan adalah  daun  beluntas  yang  diperoleh dari  daerah  Dramaga,  Bogor.  Bahan kimia  untuk  analisis  terdiri  atas  : petroleum eter metanol akuades pereaksi Dragendoft  Mayer dan Wagner klorofor,  asam  gallat  (Riedel-de  Haen), kuersetin  dan  1,1-difenil-2-pikrilhidrasil, dll

## Metode Penelitian
Proses  Penyiapan  Ekstrak  Daun Beluntas
Daun beluntas pada penelitian ini dikelompokkan  menjadi  3,  yaitu  :  ruas daun  1-3,    4-6  dan  >6  (Gambar  1).
Pengelompokan didasarkan
pada perbedaan  warna  dan  tekstur  daun.
Masing-masing ruas diekstraksi menurut modifikasi metode Biswas dkk. (2005) Daun beluntas yang telah dikeringkan  pada  suhu  kamar  selama  7 hari  ditepungkan  dengan  ukuran  40 mesh,  lalu  dianalisis  kadar  air  dan fitokimianya.  Kemudian  tepung  daun kering  tersebut  dimaserasi  dengan petroleum  eter  (1:4  b/v)  pada  suhu kamar  selama  24  jam.  Residu  yang sudah dipisahkan dari pelarutnya dengan  cara  disaring  dikeringkan  pada suhu  kamar  ( ± 15  menit).  Selanjutnya residu  yang  sudah  kering  diekstrak dengan metanol (1:15b/v) menggunakan ekstraksi  soxhlet  pada  suhu  65 o C selama 3 jam. Pelarut metanol diuapkan dengan  rotary  evaporator.  Ekstrak  yang
diperoleh  disimpan  pada  suhu  4 o C  dan gelap sampai analisa berikutnya.
Analisis meliputi kadar air ditentukan  berdasarkan    metode  AOAC 925.45 (1999), analisa fitokimia dilakukan berdasarkan metode Harborne
(1996) yang meliputi: alkaloid, flavonoid, fenolik,  triterpenoid,  sterol,  saponin  dan tanin.

## Analisa Alkaloid
1  gram  sampel  digiling  dengan pasir  sambil  dibasahi  dengan  5  ml kloroform  yang  berisi  3  tetes  ammonia. Tambahkan  lagi  5  ml  kloroform  yang berisi 5 tetes ammonia, kemudian saring ke dalam tabung reaksi. Ekstrak kloroform ditambahkan 10 tetes H 2 SO 4 2 M  dan  divorteks,  kemudian  dipisahkan lapisan asamnya ke dalam tabung reaksi lain.  Lapisan  tersebut  diteteskan  pada spot  plate dan  ditambahkan  3  pereaksi Dragendoft,  Mayer  dan  Wagner,  uji keberadaan  alkaloid  positif  jika    timbul endapan  dengan    warna  berturut-turut sebagai berikut : merah jingga, putih dan coklat.
Deteksi Senyawa Flavonoid dan Fenolik
Sebanyak  0.1  gram  sampel ditambahkan    metanol  sampai  semua sampel terendam, kemudian dipanaskan. Larutan  dipipet  dan  diteteskan  pada  2 spot  plate masing-masing  5  tetes.  Pada spot  plate pertama  ditambahkan  NaOH 10%  (b/v),  timbulnya  warna  merah menandakan  positif  senyawa  fenol hidrokuinon.  Pada spot  plate kedua ditambahkan  1  tetes  H 2 SO 4 pekat, timbulnya  warna  merah  menandakan positif senyawa flavonoid.

## Deteksi Triterpenoid dan Sterol
Sebanyak  0,1  gram  sampel ditambahkan etanol dan dipanaskan lalu disaring.
Filtrat diuapkan
dan ditambahkan  eter.  Lapisan  eter  yang terbentuk  dipipet  dan  diteteskan  pada spot plate lalu ditambahkan pereaksi LB
(3  tetes  asetat  anhidrat  dan  1  tetes H 2 SO 4 ).  Adanya  triterpenoid  ditandai dengan  timbulnya  warna  merah  atau ungu,  sedangkan  adanya  sterol  ditandai dengan adanya warna hijau.
Deteksi Flavonoid, Saponin dan Tanin Sebanyak  0,1  gram  sampel dimasukkan  dalam  gelas  piala  lalu ditambahkan  10  ml  air  panas  dan didihkan  selama  5  menit.  Kemudian masing-masing 3 ml larutan dimasukkan ke  dalam  2  tabung  reaksi.  Tabung pertama  dimasukkan  serbuk  Mg  dan beberapa  tetes  HCl  pekat  dan  amil alkohol.
Campuran dikocok dan dibiarkan  memisah,  adanya  flavonoid ditunjukkan  adanya  warna  merah  coklat pada  lapisan  amil  alkohol.  Pada  tabung reaksi  kedua  dilakukan  pengocokan secara  vertikal  selama  10  detik  dan dibiarkan selama 10 menit. Adanya busa yang stabil menunjukkan adanya saponin,  sedangkan  sisa  campuran didihkan  lagi  selama  10  menit  lalu disaring.  Filtrat    ditambahkan  dengan beberapa  ml  larutan  FeCl 3 1  %  (b/v). Timbulnya  warna  biru  tua  atau  hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.

## Penentuan  Rendemen
Ekstrak  daun  beluntas  yang diperoleh ditentukan rendamennya dengan tujuan  untuk mengetahui tingkat keefektifan metode ekstraksi. Rendamen yang  diperoleh  ditentukan  berdasarkan metode  gravimetri  berdasarkan  metode Ljubuncic et  al .  (2005),  dengan  cara membandingkan  berat  ekstrak  daun beluntas  terhadap  berat  sampel  yang digunakan,  sehingga  diperoleh  persen ekstrak (b/b).

## Kadar  Total Fenol
Kadar  total  fenol  ditentukan berdasarkan  metode  Kumar  dkk.  (2008) dan  Jayasri  dkk.  (2009).  1  ml  sampel ditambahkan  4  ml  larutan  natrium karbonat  (75g/L)  kemudian  divorteks dan  ditambahkan  0,2  ml  reagen  Folin- ciocalteus  fenol.  Selanjutnya  campuran
ditambahkan akuades hingga volume 10 ml  dan  divorteks  kembali.  Setelah sampel  dibiarkan    selama  1  jam  diukur pada λ 760  nm.  Kadar  fenol  total dinyatakan ekuivalen asam gallat (GAE).

## Kadar Total Flavonoid
Kadar  total  flavonoid  ditentukan berdasarkan metode Kumar dkk. (2008). 1  ml  sampel  dimasukkan  dalam  labu takar  10  ml  yang  berisi  4  ml  akuades dan  ditambahkan 0,3 ml larutan  NaNO 2 5% (b/v). Sesudah 5  menit ditambahkan  0,3  ml  larutan  AlCl 3 10% (b/v), lalu sesudah  6 menit ditambahkan 2  ml  larutan  1  mol/L  NaOH  dan diencerkan hingga volume 10 ml dengan akuades.  Absorbansi  larutan  diukur pada λ 510  nm.  Kadar  flavonoid    total dinyatakan ekuivalen kuersetin (QE).
Kemampuan Menangkap Radikal Bebas DPPH Aktivitas antioksidan sampel diukur  berdasarkan  modifikasi  metode Aicha    dkk.  (2006).  1  ml  sampel  pada berbagai  variasi  konsentrasi  dalam pelarut  metanol  ditambahkan  3  ml larutan  DPPH  (60 µ M)  dan    metanol hingga volume 10 ml. Absorbansi larutan diukur  pada λ 517  nm  setelah  30  menit menggunakan spektrofotometer UV–Vis. Kemampuan menghambat radikal bebas DPPH  dinyatakan  dengan  rumus  :  % penghambatan  =  (A0-At)/A0      x    100%, Keterangan  :    A0  adalah  absorbansi kontrol  pada  saat  t  =  0  detik  dan    At adalah  absorbansi  antioksidan  pada saat  t = 30 detik.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tingkat  ketuaan  daun  beluntas menentukan kadar fitokimia, oleh karena itu  dilakukan  pengelompokkan  daun menjadi  3,  yaitu  :  ruas  daun    1-3,    4-6 dan    >6.  Pembagian    didasarkan  pada perbedaan  kenampakan  daun  (warna dan tekstur). Semakin tua daun warnanya semakin  hijau  tua  dan teksturnya semakin keras karena jaringan /selulosanya semakin banyak.
Gambar 1.  Pengelompokan daun beluntas yang diteliti (1-3 ruas, 4-6 ruas dan lebih dari 6 ruas)
Kadar Air Ketiga  kelompok  sampel  yang sudah  dikeringkan  pada  suhu  kamar ditepungkan untuk mendapatkan partikel  40  mesh.  Perlakukan  ini dimaksudkan untuk memperluas permukaan  kontak  antara  partikel daun dengan pelarut sehingga hasil ekstraksi yang diperoleh maksimal. Berdasarkan Matricardi dkk.
(2009)  bahwa  reduksi  ukuran  partikel pada  biji  kacang  tanah  menunjukkan efek  yang  positif  terhadap  ekstraksi. Ukuran  partikel  semakin  kecil  akan menyebabkan peningkatan luas permukaan  dan  jumlah  sel  yang  rusak yang berakibat peningkatan konsentrasi minyak yang dihasilkan. Selama ekstraksi  difusi  yang  terjadi  pada
partikel  relatif  kecil,  sehingga  jumlah minyak  yang  terekstrak  sebanding dengan luas permukaan partikel. Penurunan  ukuran  partikel  dari  3,35- 4,75  mm  menjadi    0,86-1,19  mm,  total minyak  yang  dihasilkan  meningkat sebesar 36%- 82%.
Menurut  Pileno  dkk.  (2007) bahwa  reduksi  ukuran  partikel  pada  biji kopi  secara  signifikan  berpengaruh positif  terhadap  fenol  yang  terekstrak. Reduksi ukuran partikel yang berlebihan  menyebabkan  terbentuknya fenomena  pelapisan  dan  cara  yang disukai oleh pelarut sehingga membatasi efisiensi pembasahan pelarut terhadap sampel dan menurunkan efisiensi ekstraksi. 1-3 4-6 > 6
14.57 14.01 15.38 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 1-3 Segment 4-6 Segment > 6 Segment Samples M o is tu re C o n te n t (% )
Gambar 2.  Kadar kelembaban dari tiap jenis daun
Penentuan  kadar  air  tepung daun  beluntas  ditentukan  dengan  oven vakum  suhu  70 o C,  hal  ini  dilakukan dengan pertimbangan untuk meminimalkan  kesalahan  kadar  air yang terukur karena hilangnya sejumlah senyawa  volatil  (kelompok  terpen), seperti  :  boehmeril  asetat,  HOP-17 (21)-en  3 β -asetat,  linaloil  glukosida,
linaloil apiosil glukosida, linaloil hidroksi glukosida, plusheosida C, cuauhtermone, 3-(2’-3’-diasetoksi- 2’metil-butiril),  plucheol  A,  plucheol  B, plucheosida A, plucheosida
B, plucheosida E dan pterocarptriol (Traithip 2005), seskuisterpen, monoterpen  dan  triterpen  (Luger  dkk. 2000). Kadar  air  sampel  daun beluntas mengalami  penurunan  seiring  dengan
bertambahnya usia/ketuaan daun, karena  terjadi  peningkatan  jumlah komponen daun (jaringan/serat). Penyimpangan  kadar  air  pada  ruas  >6 disebabkan  adanya  penyerapan  air kembali oleh jaringan/serat pada tepung  daun  yang  kering.  Selama proses  pengeringan  kadar  air  daun beluntas mengalami
penurunan sehingga  terjadi  pengkerutan  ukuran pori  dan  distribusi  ukuran  pori  saling mendekat  (Haeggkvist  dkk.  1998). Kemampuan  adsorbsi  air  oleh  selulosa atau serat  disebabkan  adanya  interaksi antara  gugus  hidroksil  dengan  molekul air  dari  udara  (Svedas  1998).   Menurut Sembiring  dan  Sinaga  (2003)  bahwa kemampuan adsorbsi air oleh adsorben ditentukan  adanya  pori  yang  dapat meningkatkan
luas permukaan
absorben.
Table 1  Total fitokimia dari tiap jenis daun beluntas Compounds Jenis daun (ruas) 1-3 4-6 > 6 Saponin - - - Tannin ++++ +++ ++ Triterpenoid - - - Sterol ++++ +++ ++ Flavonoid +++ ++ + Phenol hydroquinon + - - Alkaloid - - - Ket. : +  menunjukkan intensitas warna, semakin banyak tanda positif menunjukkan semakin kuat warna Fitokimia  yang  terdeteksi  pada ekstrak daun beluntas meliputi:
senyawa  tanin,  sterol,  flavonoid  dan fenol hidrokuinon, namun dengan intensitas  yang  berbeda  (Tabel  1). Keberadaan  senyawa  tanin,  sterol, flavonoid  dan  fenol  hidrokuinon  pada ekstrak  daun  beluntas  masing-masing ditunjukkan  oleh  warna  biru  tua  atau hijau  kehitaman,  hijau,  merah  dan merah  (Harbone,  1996).  Hal  ini  sesuai dengan  pendapat  Ardiansyah  dkk.
(2003) bahwa daun beluntas mengandung senyawa fitokimia, seperti:  fenol  hidrokuinon,  sterol  dan tanin.  Menurut  Traithip  (2005)  bahwa senyawa  fitokimia  yang  terdapat  pada ekstrak  etanolik  dan  fraksi-fraksinya dari daun beluntas terdiri atas senyawa flavonoid dan polifenol.
Komposisi dan konsentrasi senyawa fitokimia mengalami perubahan selama pertumbuhan
tanaman.  Daun  yang  lebih  muda mempunyai  kandungan  fitokimia  paling tinggi  (Bergquist  dkk.  2005),  hal  ini terkait  dengan  fungsi  dari  senyawa metabolit sekunder tersebut, yaitu untuk pertahanan melawan herbivora, patogen,  insekta,  bakteri,  jamur  dan virus (Saffan dan El-Mousallamy 2008).  Selain  itu  senyawa  fitokimia dalam  daun  biasanya  ditemukan  dalam struktur  bebas  atau  terikat  secara glikosida, dengan bertambahnya tingkat ketuaan daun banyak ditemukan dalam struktur  glikosida  yang  terdapat  pada membran  sel.  Senyawa  ini  membentuk struktur yang kompleks dengan karbohidrat (glukosa, xilosa dan arabinosa) (Schaller, 2003; Boukes dkk., 2008).
Gambar 3.  Kadar rendemen dari tiap jenis daun beluntas

## Rendemen
Gambar  3  menunjukkan  bahwa rendemen terbesar diperoleh dari kelompok  ruas  daun  1-3  >  4-6  >  >6. Data  ini  seiring  dengan  peningkatan intensitas  warna  pada  uji  fitokimia. Rendamen ditentukan setelah melewati ekstraksi  pelarut  dan  soxhlet  serta penghilangan residu pelarut. Rendamen yang diperoleh telah mengalami  proses  penghilangan  lemak ( defatted ), karena pada ekstraksi pelarut  digunakan  petroleum  eter.
Rendamen  yang  diperoleh  sangat ditentukan oleh tingkat kelarutan senyawa  metabolit  sekunder  pada pelarut  yang  digunakan.    Kelarutan senyawa sangat ditentukan oleh kepolaran,  momen  dipol,  polarisabilitas dan ikatan hidrogen.
Pada  ekstraksi  soxhlet  dipilih metanol daripada etanol, hal ini
dilakukan dengan
pertimbangan metanol  dapat  mengekstrak  senyawa fitokimia lebih banyak sehingga aktivitas  antioksidan  yang  dihasilkan lebih  tinggi  (Akroum  dkk.  2009). Menurut  Yu  Lin  dkk.  (2009)  bahwa metanol  dapat  mengekstrak  senyawa dengan  berat  molekul  rendah,  tingkat kepolaran sedang sebab sifat kelarutannya  yang  luas.  Penggunaan pelarut  yang  berbeda  pada  ekstraksi daun  beluntas  dapat  mengubah  profil senyawa  fenolik  yang  terdapat  dalam sampel  (Kahkonen dkk. 2001).

## Total Fenol
Hasil  uji  total  fenol  menyatakan bahwa  semakin  muda  daun  kadar  total fenol    semakin  besar,  hal  ini  terkait dengan  fungsi  fenol  bagi  tanaman sebagai  pertahanan    (Saffan  dan  El- Mousallamy  2008).  Menurut Kahkonen
dkk.  (2001)  bahwa  perbedaan  tingkat kematangan  buah  berpengaruh  pada profil  fenolik,  biasanya  senyawa  fenolik terkonsentrasi  pada  buah  yang  masih muda daripada buah yang  tua, kecuali antosianin. Schaller (2003) dan  Boukes dkk. (2008) berpendapat bahwa senyawa  fenol  yang  ditemukan  pada buah,  bunga,  daun  dan biji  mempunyai
struktur  yang  beragam  dalam  kondisi bebas  atau  terikat  secara  glikosida.
Semakin  tua  umur  daun  struktur glikosida  lebih  banyak  terkonsentrasi. Hampir 2-10 kali lipat senyawa metabolit  sekunder  (sterol)  ada  dalam struktur  asil  glikosida  yang  terdapat dalam membran sel.
Gambar 4.  Total phenol tiap jenis daun beluntas
Pada  pengujian  dengan  folin ciocalteus  diperoleh  hasil  yang  sangat dipengaruhi  oleh  struktur  kimianya. Senyawa fenol yang mempunyai gugus fungsi  hidroksil  yang  banyak  atau dalam  kondisi  bebas  akan  dihasilkan kadar  total  fenol    yang  tinggi  (Deore dkk. 2009). Hal ini disebabkan
kompleks  warna  ungu  yang  terdeteksi didasarkan pada reaksi transfer elektron dalam larutan alkali dari fenolik ke senyawa kompleks asam fosfotungstat /fosfomolibdat (Huang dkk. 2005).

## Total Flavonoid
Gambar 5.  Structure of  Standar compounds (a) quercetin
(b) (+)-catechin (c) ferulic acid
Gambar 6.  Total flavonoid  dari tiap jenis daun beluntas
b c a
Pengujian  total  flavonoid  pada berbagai  tingkat  ruas  daun  beluntas menunjukkan bahwa kadar total flavonoid ruas 1-3 > ruas  4-6 > ruas >6 pada  berbagai  senyawa  standar  (asam ferulat, (+)-katekin dan kuersetin)
(Gambar  5).  Total  flavonoid    ketiga sampel  menunjukkan    bahwa  kadar total  flavonoid  daun  beluntas  dengan menggunakan  standar  kuersetin  > asam  ferulat  >  (+)-katekin  (Gambar  6). Struktur  senyawa  standar  menentukan reaktivitas  terhadap  reagen  AlCl 3 dan
NaNO 2 dalam  kondisi  basa  kuat (NaOH), yang ditandai dengan terbentuknya  kompleks  warna  antara orange hingga merah. Kuersetin dipilih sebagai standar karena  termasuk  senyawa  flavonol yaitu  flavonoid  yang  paling  efektif menangkap  radikal  bebas  (radikal hidroksil,  superoksida  dan    peroksil)
(Tapas  dkk.  2008)  serta  menghambat berbagai  reaksi  oksidasi  (Soeksmanto dkk. 2007), karena dapat menghasilkan radikal  fenoksil  yang    terstabilkan  oleh efek resonansi  dari  cincin  aromatis  (Yu Lin dkk. 2009).
Hal  ini  disebabkan  senyawa flavonol  mempunyai  struktur  (katekol) orthodihidroksi  pada  cincin  B,  ikatan rangkap pada atom C2-3 yang terkonjugasi  dengan  gugus  fungsi  C4- okso,    gugus  OH  pada  C3  di  cincin  C dan  gugus  OH  pada  C5  di  cincin  A (Lugasi  dkk.  2003;  Tapas  dkk.  2008). Kombinasi  gugus  C3-OH  dan  C5-OH dengan C4-karbonil dan ikatan rangkap C2-C3  dapat  meningkatkan  aktivitas penangkap  radikal  bebas  (Amic  dkk. 2003).

## Kemampuan Menangkap Radikal Bebas DPPH
Gambar  7.  Aktivitas menangkap radikal bebas DPPH dari tiap jenis daun beluntas
Hasil  pengujian  kemampuan menangkap  radikal  bebas  DPPH  dari ketiga  kelompok  ekstrak  daun  beluntas diperoleh  bahwa  ekstrak  daun  ruas  1- 3>  4-6>  >6  (Gambar  7).    Hal  ini ditunjukkan  dari    kemampuan  masing- masing ekstrak dalam mereduksi warna ungu dari radikal bebas DPPH  menjadi larutan  yang  berwarna  kuning  yang terdeteksi  pada λ 517  nm.    Semakin besar  potensi  ekstrak  daun  beluntas menangkap  radikal  bebas    DPPH semakin  besar  konsentrasi  radikal DPPH  yang  tereduksi.  Penurunan warna  ungu  disebabkan  radikal  DPPH menangkap atom hidrogen yang didonorkan oleh senyawa fenolik sehingga  terbentuk  senyawa  difenil pikrilhidrasin  berwarna  kuning  yang stabil (Chang dkk. 2007; Kim dkk. 2002).
Kapasitas  menangkap  radikal bebas  DPPH  sebagian  besar  terkait dengan  gugus  hidroksil  dari  senyawa fenol  (Nakiboglu  dkk.  2007).  Aktivitas menangkap radikal bebas DPPH dipengaruhi oleh  polaritas dari medium reaksi,  struktur  kimia  dari  penangkap radikal  dan  pH  campuran  reaksi (Sharma dan  Bhat  2009).
Aktivitas antioksidan fenolik sangat  ditentukan  oleh  struktur  kimia, jumlah  dan  posisi  gugus  hidroksil  dan metil  pada  cincin.  Molekul  tersubstitusi gugus hidroksil semakin banyak semakin kuat menangkap radikal bebas DPPH karena kemampuan mendonorkan  atom  hidrogen  semakin besar  (Yu  Lin  dkk.  2009).  Struktur aglikon mempunyai
aktivitas antioksidan  lebih  tinggi  dibandingkan dengan struktur glikosida (Li dkk. 2009).
y = 602.92x + 0.0985
R 2 = 0.9991 y = 248.76x + 0.1286 R 2 = 0.9943 y = 114.52x + 8.8096 R 2 = 0.9734 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 1 2 3 4 5 6 Total Fenol (ppm) In h ib it io n o f D P P H F re e R a d ic a l (% ) 1-3 Segments 4-6 Segments > 6 Segments Linear (4-6
Gambar 8. Hubungan antara Total Phenol and Penghambatan radikal DPPH
y = 848.04x + 6.5364 R 2 = 0.9875 y = 743.56x + 0.0985 R 2 = 0.9991 y = 295.43x - 0.1286 R 2 = 0.9943 -500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 0 1 2 3 4 5 6 Total Flavonoid (ppm) In h ib it io n o f D P P H F re e R a d ic a l (% ) 1-3 Segments 4-6 Segments > 6 Segments

## Gambar 9. Hubungan antara Total Flavonoid and penghambatan radikal DPPH
Ada korelasi positif antara kadar total  fenol  dan  total  flavonoid    dengan kemampuan  menangkap  radikal  bebas DPPH ketiga sampel (Gambar 8 dan 9). Daun  beluntas  yang  masih  muda mempunyai  aktivitas  antiradikal  lebih tinggi  dibandingkan  daun  yang  sudah tua.  Kemampuan  menangkap  radikal
bebas merupakan salah satu mekanisme  aksi  utama  antioksidan yang  ditunjukkan  oleh  fitokimia  fenolik.
Oleh karena itu ekstrak sampel rempah-rempah yang mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi
cenderung    mempunyai  kadar  fenol total yang tinggi pula (Shan dkk. 2005).
Gambar  10. Nilai  IC 50 tiap jenis daun beluntas
Berdasarkan  Gambar  10  dapat terlihat  bahwa  nilai  IC 50 ketiga  sampel tersebut  sebagai  berikut:  ruas  daun  1-3 sebesar  3,71  mg/L,  ruas  4-6  sebesar 6,85  mg/L  dan  ruas  >6    sebesar  49,62 mg/L.    IC 50 adalah  ukuran  keefektifan suatu  senyawa  dalam  menghambat fungsi  biologis  atau  biokimia.  Ukuran  ini mengindikasi  banyaknya  senyawa  yang dibutuhkan  untuk  menghambat  proses biologis  menjadi  setengahnya  (50%). Semakin  rendah  nilai  IC 50 nya  maka semakin  besar  potensinya  sebagai antioksidan (Kosuar dkk. 2004).

## KESIMPULAN
Ekstrak  daun  beluntas  ketiga kelompok  dari  ruas  daun  beluntas  yang meliputi  :  1-3,  4-6  dan  >6  mempunyai aktivitas  menangkap  radikal  bebas DPPH.  Ekstrak  daun  beluntas  ini mengandung    senyawa  fitokimia  seperti tanin,  sterol,  fenol  hidrokuinon  dan flavonoid.
Ekstrak  daun  beluntas  dari    ruas daun 1-3 yang paling berpotensi sebagai sumber antioksidan ditandai dengan nilai IC 50 nya  paling  kecil  yaitu  3,71  mg/L dibandingkan  ruas  4-6  dan  >6  yang masing-masing  sebesar  6,85  mg/L    dan 49,62  mg/L.  Kadar  total  fenol  dan  total flavonoid  daun  beluntas  ruas  daun  1-3 yaitu    234.65  mg  GAE/100  g  berat sampel kering  dan 2163,59 mg QE/ 100 g berat sampel kering.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih  kepada  DP2-M  Dirjen  DIKTI  atas biaya  yang  diberikan  melalui  dana Penelitian Hibah Bersaing 2008.

## DAFTAR PUSTAKA
Aicha, N. Ines, I. Ines, B. Mohamed, B.S. Jamila, H.S. Jemni, B.C. Mohamed, N. Daniel, B. Leila , G. dan Kamel, G. 2006. A Comparative Evaluation of  Mutagenic,  Antimutagenic  and Scavenging  Radicals  Activity  of
Essential  Oil  from  Pituranthos
Chloranthus. SIPAM 362-371. Akroum,  S.  Satta,  D.  dan  Lalaoui,  K. 2009.,  Antimicrobial,  Antioxidant, Cytotoxic Activities and Phytochemical  Screening  of  Some Algerian  Plants. European  Journal of  Scientific  Research 31(2):  289-
295. Amic,  D.  Davidovic-Amic,  D.  Besˇlo,  D. dan    Trinajstic,  N.  2003.,  Structure radical scavenging activity relationships  of  flavonoids. Croatia Chemical Acta 76 : 55–61.
Andarwulan,  N.  Batari,  R.  Sandrasari, D.A. dan  Wijaya, H. 2008., Identifikasi  senyawa  flavonoid  dan kapasitas antioksidannya pada ekstrak  sayuran  indigenous  Jawa Barat. Di dalam : Half Day Seminar on Natural Antioxidants: Chemistry, Biochemistry and Technology ;
Bogor, 16 September 2008. Bogor:
Biopharmaca  Research  Center-
SEAFAST Center IPB.
[AOAC] Association  of Official  Analytical Chemist  925.45.  1999. Official methods  of  analysis  of  association of  official  analytical  chemists . Edition  ke-15.  USA  :  Kenneth Helrich. Chapter 44.1.03.  p.2. Ardiansyah.  Nuraida,  L.  Andarwulan,  N. 2003.,  Aktivitas  antimikroba  daun beluntas ( Pluchea indica Less ) dan stabilitas aktivitasnya pada berbagai  konsentrasi  garam  dan tingkat    pH. Jurnal  Teknologi  dan Industri Pangan 14(2) : 90-97. Bergquist, S.A.M. Gertsson, U.E. Knuthsen,  P.  dan  Olsson,  M.E.
2005.,  Flavonoids  in  baby  spinach ( spinacia  oleracea  l. ):  changes during  plant  growth  and  storage. Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry 53: 9459  -9464.
Biswas,  R.  Dasgupta,  A.  Mitra,  A.  Roy, S.K. Dutta, P.K. Achari, B. Dastidar,
S.G.  dan  Chatterjee,  T.K.  2005., Isolation, purification and characterization of four pure compounds from the root extract of
Pluchea  indica  Less and  the potentiality  of  the  root  extract  and the pure compounds for antimicrobial  activity. European
Bulletin  of  Drug  Research 13  :  63- 70.
Boukes,  G.J.  Venter,  M.V.D.  dan Oosthuizen,  V.  2008.  Quantitative and qualitative analysis of sterols/sterolins  and  hypoxoside contents  of  three Hypoxis (African potato)  spp.  African  Journal  of Biotechnology 7 (11): 1624-1629. Chang,  H.Y.  HO,  Y.L.  Sheu,  M.J.  Lin, Y.H.  Tseng, M.C. Wu, S.H. Huang, G.J.  dan  Chang,  Y.S.    2007.,
Antioxidant and Free  Radical Scavenging  Activities  of Phellinus merrillii Extracts. Botanical  Studies 48: 407-417.
Chludil,  H.D.      Corbino,  G.B.  dan Leicarh,  S.R.  2008.,  Soil  Quality Effects  on Chenopodium  album Flavonoid  Content  and  Antioxidant Potential. Journal  of
Agricultural  and  Food  Chemistry. 56: 5050–5056. Deore,  S.L.  Khadabadi,  S.S.  Baviskar, B.A. Khadabadi, S.S. Khangenbam,  R.A.  Koli,  U.S. Daga, N.P. Gadbail, P.A. dan Jain,
P.A. 2009.,  In  vitro  Antioxidant Activity  and  Phenolic  Content  of Croton  caudatum . International Journal  of  Chemical  Technology Research 1(2):174-176.
Haeggkvist,  M.  dan  Li,  T.Q.  1998., Effects  of  Drying  and  Pressing  on the  Pore  Structure  in the  Cellulose ®bre  Wall  Studied  By  1H  and  2H NMR  Relaxation. Cellulose 5:  33- 49.
Hagerman, A.E. Riedl, K.M. Jones, G.A. Sovik, K.N. Ritchard, N.T. Hartzfeld,
P.W. dan Riechel, T.L. 2002., High Molecular Weight Plant Polyphenolics (Tannins) as Biological  Antioxidants. Journal  of
Agricultural  and  Food  Chemistry 46:1887-1892.
Harbone,  J.B.  1996., Metode  Fitokimia . Padmawinata    K,  Soediro  I, penerjemah,  Bandung  :  Institut Teknologi Bandung.
Hasan,  S.M.  R.  Jamila,  M.  Majumder, M.M.    Akter,  R.  Hossain,  M.M. Mazumder,  M.E.H.  Alam,  M.A. Jahangir,  R.  Rana,  M.S.  Arif,  M. dan  Rahman,  S.  2009.,    Analgesic and  Antioxidant  Activity  of  the Hydromethanolic Extract of Mikania scandens ( L.) Willd. Leaves. American Journal of
Pharmacology  and  Toxicology .  4 (1): 1-7. Huang,  D.  Ou,  B.  dan  Prior,  R.L.  2005., The  Chemistry  behind  Antioxidant Capacity Assays. Journal of Agricultural  and  Food  Chemistry 53:1841-1856.
Jayasri,  M.A. Mathew, L. dan  Radha, A. 2009.,  A  report  on  the  antioxidant activity  of  leaves  and  rhizomes  of Costus pictus D. Don . International Journal  Integrative  Biology 5(1)  : 20-26. Kahkonen, M.P. Hopia, A.I. dan Heinonen.  2001.,  Berry  Phenolics and  Their  Antioxidant  Activity.
Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry 49: 4076-4082. Kim, D.O. Lee, K.W. Lee, H.J. Lee, C.Y. 2002., Vitamin C Equivalent Antioxidant  Capacity  (VCEAC)  of Phenolic  Phytochemicals. Journal of Agricultural and Food Chemistry
50: 3713  -3717.
Kosuar,  M.B.  Dorman,  H.J.D.  Basuer,
K.H.C.  dan  Hiltunen  R.  2004., Screening of Free Radical Scavenging  Compounds  in  Water Extracts  of  Mentha  Sampels  Using a Postcolumn Derivatization Method. Journal of Agricultural and
Food Chemistry 52:5004-5010. Kumar, S. Kumar, D. Manjusha, Saroha, K.  Singh,  N.  dan  Vashishta,  B. 2008.,  Antioxidant  and  free  radical scavenging  potential  of Citrullus colocynthis  (l.) schrad.  methanolic
fruit  extract. Acta  Pharmacology 58 : 215–220.
Kumaran,  A.  dan  Karunakaran,  R.J. 2007.,  In  vitro  antioxidant  activities of  methanol  extracts  of  five Phyllanthus  species  from  India. LWT 40 : 344–352.
Li, C. Du, H. Wang, L.S.Shu, Q.Y. Zheng, Y.  Xu,  Y.  Zhang,  J.J.  Zhang,  J.
Yang,  R.  dan  Ge,  Y. 2009., Flavonoid Composition and Antioxidant  Activity  of  Tree  Peony (Paeonia  Section  Moutan)  Yellow
Flowers. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57: 8496–8503. Luger,  P.  Weber,  M.  Dung,  N.X.Ngoc, P.H.,  Tuong,  D.T.  dan  Rang,  D.D. 2000., The crystal structure of hop- 17(21)-en-3 β -yl  asetat  of Pluchea pteropoda Hemsl.  from  Vietnam. Crystal  Res  Technology 35(3)  : 355-362.
Magalhaes,  L.M.    Segundo,  M.A.    Reis,
S.  Lima,  J.L.F.C.  dan  Rangel, A.O.S.S. 2006.,  Automatic  method for  the  determination  of  folin- ciocalteu  reducing  capacity  in  food products. Journal  of  Agricultural and  Food  Chemistry 54:  5241- 5246.
Matricardi,  M.    Hesketh,  R.  dan  Farrell, S.  2009.,  Effect  of  operating conditions on static/dynamic extraction  of  peanut  oil  using supercritical carbon
dioxide. http://www.Supercritical.com/public ations/peanutoilextraction  by  SF/  1
November 2009
Moein,  S.  Farzami,  B.  Khaghani,  S.
Moein, M.R. dan Larijani, B. 2007., Antioxidant properties and prevention  of  cell  cytotoxicity  of Phlomis  Persica  Boiss . DARU 15(2) : 83.
Nakiboglu,  M.  Urek,  R.O.  Kayali,  H.A. dan  Tarhan,  L.  2007.,  Antioxidant capacities  of  endemic sideritis sipylea and origanum  sipyleum from  turkey. Food  Chemistry 104: 630–635.
Orhan, I. Kartal, M. Asaker, M.A.  Senol,
F.S.  Yilmaz,  G.  Sener,  B.  2009., Free  radical  scavenging  properties and  phenolic  characterization  of some edible plants. Food
Chemistry 114 : 276–281.
Pinelo,  M.  Tress,  A.G.  Pedersen,  M.
Amous, A. dan Meyer, A.S. 2007., Effect  of  Cellulases,  solvent  type and particle size distribution on the extraction  of  chlorogenic  acid  and other  phenols  from  spent  coffee grounds. American Journal of Food
Technology 2(7):641-651. Tapas,  A.  Sakarkar,  D.M.  dan  Kakde, R.B. 2008., Flavonoids as nutraceuticals:  a  review. Tropical Journal of Pharmaceutical Research 7(3) : 1089-1099. Traithip,  A.  2005., Phytochemistry  and antioxidant  activity  of  Pluchea indica. [Thesis]  Mahidol  University. Thailand. Saffan,  S.E.S.  dan  El-Mousallamy,
A.M.D.  2008.  Allelopathic  effect  of Acacia raddiana leaf extract on the phytochemical contents of germinated Lupinus  termis Seeds. Journal of Applied Sciences Research , 4(3): 270-277. Schaller,  H.  2003.  Review  the  role  of sterols in plant growth and development. Progress  in  Lipid
Research, 42 (2003) 163–175. Sembiring,  M.T.  dan  Sinaga,  T.S.  2003.
Arang aktif (Pengenalan dan
Proses  Pembuatannya),  hal  1-9.
USU digital library, Sumatera Utara.
Shan,  B.  Cai,  Y.  Z.  Sun,  M.  dan  Corke,
H.  2005.,  Antioxidant  capacity  of 26
spice extracts and characterization  of  their  phenolic constituents. Journal of Agricultural and  Food  Chemistry 53:  7749-
 7759.
Sharma,  O.P.  dan  Bhat,  T.K.  2009.,
Analytical methods dpph antioxidant  assay  revisited. Food Chemistry . 113: 1202–1205.
Soeksmanto, A. Hapsari, Y. dan Simanjuntak,  P.  2007.,  Antioxidant content  of  parts  of  mahkota  dewa, Phaleria macrocarpa [Scheff] Boerl. ( Thymelaceae ). Bioversitas ISSN: 1412-033X. 8 (2): 92-95. Svedas, V. 1998., Cellulose-water vapour  interaction  investigated  by spectrometric and ultra high frequency  methods. Journal  of Physical  D:  Applied  Physical 31 : 1752-1756.
Yu  Lin,  H.  Kuo,  Y.H.  Lin,  Y.L.  dan Chiang,  W.  2009.,    Antioxidative effect  and  active  components  from leaves of lotus ( Nelumbo nucifera ). Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry 57: 6623–6629.