Isolasi Senyawa 3β-asetoksi-lup-20(29)-en-2  - ol dan Uji Antioksidan dari Tumbuhan Kepulauan Aru ( Sonneratia ovata Backer)
Fatmawati Inneke Putri, Taslim Ersam dan Sri Fatmawati Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS)
Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia
e-mail : paktichem@gmail.com
Abstrak — Sonneratia ovata Backer merupakan salah satu tanaman  yang  berasal  dari  Kota  Dobo,  Kepulauan  Aru. Senyawa  3β-asetoksi-lup-20(29)-en-2α-ol  (1)  berupa  serbuk putih  dengan  titik  leleh  200-201 o C  berhasil  diisolasi  dari ekstrak  metanol  kulit  batang Sonneratia  ovata  Backer . Senyawa  tersebut  difraksinasi  menggunakan  metode Kromatografi  Cair  Vakum  (KCV)  dan  Kromatografi Kolom  Gravitasi  (KKG).  Senyawa  murni  diidentifikasi menggunakan  spektroskopi  IR, 1 H-NMR,  dan 13 C-NMR. Uji  bioaktivitas  antioksidan  dilakukan  dengan  metode DPPH.  Fraksi  dari  senyawa  (1)  menunjukan  prosentase penghambatan sebesar 20,91  0,006 %.
Kata  Kunci — Sonneratia  ovata Backer;  Antioksidan; Isolasi; Bahan alam; DPPH radikal.

## I. PENDAHULUAN
ndonesia  merupakan  negara  yang  kaya  akan  sumber daya  alam  dan  juga  terdiri  dari  banyak  pulau  dari sabang  sampai  merauke.  Pada  setiap  pulau  terdapat kekayaan  hayati  yang  belum  banyak  diketahui  manfaat dan fungsinya. Eksplorasi kekeyaan hayati belum secara maksimal  di  Indonesia  bagian  Timur.  Disana  terdapat banyak  tumbuhan  yang  memiliki  banyak  manfaat  tetapi kurangnya sumber daya manusia menyebabkan manfaatnya  kurang  tereksplorasi.  Beberapa  macam tumbuhan  yang  ada  di  Provinsi  Maluku  yaitu  kakurang hijau, kakurang putih, col pante, genus Sonneratia , gaya baru,  dan  lain-lain.  Salah  satu  tumbuhan  yang  ada  di Kota  Dobo,  Kepulauan  Aru,  Provinsi  Maluku  yang memiliki  banyak  manfaat  salah  satunya  yaitu  genus Sonneratia. Genus Sonneratia ini  memiliki  banyak  8 spesies [1].
Salah  satu  spesies  dari Sonneratia yang  sudah  banyak diteliti  manfaat  dan  komponen  senyawanya  yaitu Sonneratia  caseolaris. Sonneratia  caseolaris ,  biasa dikenal oleh orang Indonesia dengan Pedada. Sonneratia caseolaris merupakan  pohon  kecil  yang  memiliki  daun berbentuk  elip,  lebar,  serta  berbunga  warna  merah.  Di negara-negara  lain  sudah  banyak  penelitian  yang menjelaskan  tentang  manfaat  dari  Sonneratia  caseoralis. Menurut  Wu,  dkk  (2009),  senyawa  yang  diperoleh  dari buah Sonneratia  caseoralis dan Sonneratia  ovata yang diteliti  bisa  menjadi  dasar  kemotaksonomi  spesies  dari genus Sonneratia dan  beberapa  senyawanya  aktifitas sitotoksik [2].
Telah  dilakukan in  vivo pada  tikus  yang  diinduksi dengan alloxan dan  hasilnya  menunjukan  bahwa  buah Pedada  ( Sonneratia  caseolaris )  dapat  digunakan  untuk mengobati  penyakit  diabetes  pada  konsentrasi  tertentu
[3].  Tiwari,  dkk  (2010)  telah  mendapatkan  3  senyawa bioaktif, yaitu β-sitosterol-3-O-β-D-glukopiranosida, asam oleanolat, dan luteolin yang  berhasil isolasi ekstrak metanol  buah Sonneratia  caseolaris ,  yang  memiliki aktifitas  inhibitor  enzim  α-glukosidase  dan  anti hiperglisemik  [4].  Dari  penelitian  sebelumnya,  senyawa asam  maslinat  yang  berasal  dari  buah Sonneratia caseolaris memiliki  aktifitas  inhibitor  enzim  α- glukosidase [5] dan dua senyawa flavon hasil isolasi dari daun Sonneratia caseolaris yaitu luteolin dan luteolin 7- O-β-glukosida yang memiliki aktifitas antioksidan [6].
Spesies-spesies  dalam  satu  genus  memiliki  afinitas kimia  yang  sama.  Afinitas  kimia  ini  adalah  kemampuan untuk membentuk suatu senyawa kimia yang identik atau khas.  Dengan  banyaknya  manfaat  dan  kandungan senyawa  pada Sonneratia  caseolaris ,  sehingga  ada peluang  bahwa Sonneratia  ovata Backer  juga  memiliki kesamaan dalam hal kandungan senyawa dan aktivitasnya.  Oleh  karena  itu,  akan  dilakukan  penelitian untuk  mengisolasi  senyawa  metabolit  sekunder  dari Sonneratia  ovata Backer  dari  Kota  Dobo,  Kepulauan Aru, Provinsi Maluku dan diuji aktivitas antioksidannya.

## II. METODOLOGI PENELITIAN

## Uji Pendahuluan
Serbuk  kayu  batang Sonneratia  ovata Backer  masing- masing  sebanyak  25  gram  dimasukkan  ke  dalam  4  vial (300ml),  kemudian  dimaserasi  dengan  pelarut  yang memiliki  kepolaran  yang  berbeda-beda  (n-heksana, metilen  klorida,  etil  asetat,  dan  metanol)  masing-masing 200  ml  selama  1  x  24  jam.  Hasil  maserasi  disaring  dan filtratnya  dipekatkan  dengan vacuum  rotary  evaporator. Setelah  itu,  dilakukan  monitoring  semua  hasil  ekstrak pada  1  plat  KLT  menggunakan  eluen  100%  metanol. Pada 4 ekstrak tersebut dilakukan uji antioksidan dengan metode  DPPH.  Berdasarkan  hasil  kromatogram  pada KLT,  maserasi  menggunakan  metanol  menunjukan banyaknya  senyawa  yang  terdapat  pada  ekstrak  metanol dan  hasil  uji  antioksidan  dengan  metode  DPPH  pada ekstrak metanol diperoleh nilai IC 50 sebesar 4,73  g/mL, sehingga  maserasi  sampel  selanjutnya  menggunakan pelarut metanol.

## Ekstraksi
Serbuk  kering  dari  kulit  batang  (1,5  kg)  tersebut dimaserasi dengan 7  L  metanol selama 3  x  24 jam  pada suhu  ruang.  Setelah  itu  dilakukan  penyaringan  sehingga diperoleh ekstrak cair dan residu. Setiap 1 x 24 jam, hasil ektrak cair dilakukan monitoring KLT untuk memastikan
I
bahwa semua senyawa sudah terekstrak. Kemudian hasil maserasi  dipekatkan  dengan  menggunakan vacuum rotary  evaporator hingga  diperoleh  ekstrak  metanol pekat (153 gram).

## Fraksinasi dan Pemurnian
Prosedur  Penelitian  yang  digunakan  adalah  prosedur standar  isolasi  bahan  alam  dengan  variasi  kenaikan kepolaran pelarut. Fraksi metanol difraksinasi menggunakan kromatografi cair vakum (KCV) dengan 2 kali  pengulangan  masing-masing  sebanyak  35  gram menggunakan  eluen  100%  n-heksana,  100%  etil  asetat dan  100%  metanol.  Hasil  KCV  dimonitoring  dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan eluen EA : n-heksana (1:4) v/v. Fraksi yang memiliki Rf yang sama digabungkan  dan  dipekatkan  dengan  menggunakan vacuum rotary evaporator sehingga menjadi 5 fraksi (F1- F5).  Fraksi  gabungan  F2-F4  (3,6  gram)  difraksinasi dengan KCV ke-2 menggunakan eluen 100% n-heksana, metilen klorida : n-heksana (1:49, 1:19, 7:93, 3:17, 7:13) v/v,  dan  100%  etil  asetat.  Hasil  KCV  dimonitoring dengan  KLT  menggunakan  eluen  EA  :  n-heksana  (1:4). Fraksi  yang  memiliki  Rf  yang  sama  digabungkan  dan dipekatkan  dengan  menggunakan vacuum  rotary evaporator sehingga  menjadi  5  fraksi  (G1-G5).  Fraksi G5  (1,6  gram)  difraksinasi  dengan  KCV  ke-3 menggunakan  eluen  100%  n-heksana,  etil  asetat  :  n- heksana (1:19, 1:9, 3:17, 7:13) v/v dan 100% etil asetat. Hasil  KCV  dimonitoring  dengan  KLT  menggunakan eluen  EA  :  n-heksana  (1:4).  Fraksi  yang  memiliki  Rf yang  sama  digabungkan  dan  dipekatkan  dengan menggunakan vacuum  rotary  evaporator sehingga menjadi 5  fraksi  (H1-H5).  Fraksi  gabungan  H2-H3  (600 mg)  difraksinasi  dengan  kromatografi  kolom  gravitasi (KKG) menggunakan eluen 100% n-heksana, etil asetat : n-heksana (1:19, 1:9, 3:17, 1:4, 1:3) v/v, 100% etil asetat dan  100%  metanol.  Hasil  KKG  dimonitoring  dengan KLT  menggunakan  eluen  EA  :  n-heksana  (1:3).  Fraksi- fraksi  yang  memiliki  Rf  yang  sama  digabungkan  dan dipekatkan  dengan  menggunakan vacuum  rotary evaporator sehingga  menjadi  11  fraksi  (I1-I11).  Fraksi gabungan I6-I7 (173 mg) difraksinasi dengan KKG ke-2 menggunakan  eluen  100%  n-heksana,    etil  asetat  :  n- heksana (1:19, 7:93, 1:9, 3:17, 1:4) v/v, 100% etil asetat dan  100%  metanol.  Hasil  KKG  dimonitoring  dengan KLT  menggunakan  eluen  EA  :  n-heksana  (1:3)  v/v. Fraksi  yang  memiliki  Rf  yang  sama  digabungkan  dan dipekatkan  dengan  menggunakan vacuum  rotary evaporator sehingga  menjadi  6  fraksi  (J1-J6).  Fraksi gabungan  I5  (166  mg)  difraksinasi  dengan  KCV  ke-4 menggunakan  eluen  100%  n-heksana,  etil  asetat  :  n- heksana (1:99, 3: 97, 4:96, 1:19, 7:93, 1:9, 11:89, 13:87, 1:4,  2:3)  v/v,  100%  etil  asetat  dan  100%  metanol.  Hasil KCV  dimonitoring  dengan  kromatografi  lapis  tipis (KLT)  menggunakan  eluen  EA  :  n-heksana  (1:3)  v/v. Fraksi  yang  memiliki  Rf  yang  sama  digabungkan  dan dipekatkan  dengan  menggunakan vacuum  rotary evaporator sehingga  menjadi  6  fraksi  (K1-K6).  Fraksi gabungan  I4,  J2  dan  K2  (247  mg)  difraksinasi  dengan KKG  ke-3  menggunakan  eluen  100%  n-heksana,    etil asetat : n-heksana  (3:97,  1:19, 7:93, 1:9, 1:3) v/v, 100% etil  asetat  dan  100%  metanol.  Hasil  KKG  dimonitoring dengan  KLT  menggunakan  eluen  EA  :  n-heksana  (1:3) v/v.  Fraksi-fraksi  yang  memiliki  Rf  yang  sama digabungkan  dan  dipekatkan  dengan  menggunakan
vacuum  rotary  evaporator sehingga  menjadi  4  fraksi (L1-L4).  Fraksi  L2  berupa  gel  berwarna  putih  bening (156  mg),  kemudian  dilarutkan  dalam  metanol membentuk  endapan  putih  dan  disaring  menghasilkan endapan berupa serbuk putih sebanyak 35 mg. Fraksi L2 dilakukan Fraksi L2 direkristalisasi dengan menggunakan  pelarut  etil  asetat  dan  n-heksana.  Hasil rekristalisasi  dinamakan  Senyawa (1) ,  uji  kemurnian dilakukan  uji  KLT  tiga  eluen,  uji  KLT  dua  dimensi  dan uji titik leleh.

## Pengujian Spektrofotometer IR
Senyawa (1) yang  berhasil  diisolasi  diambil  1  mg. Ditambahkan KBr dan digerus sampai sampai homogen. Campuran  ini  dibuat  pelet  dengan  ketebalan  ±  1  mm. Pelet berisi sampel ini kemudian diukur serapannya pada bilangan  gelombang  400-4000  cm -1 .  Spektrum  yang terbentuk  menunjukkan  serapan  bilangan  gelombang terhadap  transmiatan  (%T).  Spektrofotometer  IR  yang digunakan adalah spektrofotometer IR Shimadzu.

## Pengujian Spektrometer NMR
Analisis  spektrometer  NMR  dilakukan  menggunakan peralatan  spektrometer  NMR  AGILENT  500  MHz. Sampel  sebanyak  10  mg  dilarutkan  dalam  pelarut kloroform (CDCL 3 ). Larutan sampel kemudian diinjeksikan  ke  dalam  tabung  injection  dan  dianalisis untuk mengetahui spektra 1 H-NMR (500 MHz) dan 13 C- NMR (125 MHz).

## Pengujian Antioksidan dengan Metode DPPH
Larutan sampel dibuat dengan cara 10 mg sampel yang akan  diuji  dilarutkan  ke  dalam  1  mL  MeOH.  Larutan sampel  sebanyak  33  µL  dimasukan  ke  dalam tube yang terlindungi  oleh  cahaya  dan  ditambah  dengan  1  mL larutan  DPPH.  Pada  campuran  dilakukan vortex  mixer dan  diinkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  20  menit. Aktivitas  antioksidan  bisa  diamati  dengan  adanya perubahan  warna  larutan  dari  ungu  menjadi  kuning  dan dapat  diukur  absorbansinya  pada  λ  517  nm.  Larutan blanko  dibuat  dengan  cara  1  mL  DPPH  dilarutkan  ke dalam 33 µL MeOH.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## Uji Pendahuluan
Uji  pendahuluan  dilakukan  untuk  mengetahui  pelarut yang  baik  untuk  mengekstrak  sampel  kulit  batang  dari Sonneratia  ovata Backer.  Maserasi  masing-masing  25 gram dalam 4 vial (300 ml) dengan menggunakan pelarut yang  berbeda-beda  ( n -heksana,  metilen  klorida,  etil asetat, dan metanol masing-masing 200 ml) selama 1x24 jam.  Tujuan  digunakan  4  macam  pelarut  yaitu  untuk mengetahui  pelarut  yang  dapat  mengekstrak  banyak senyawa-senyawa yang ada di dalam sampel. Setelah itu, dilakukan  penyaringan  agar  filtrat  terpisahkan  dari  sisa sampelnya.  Filtrat  kemudian  di  pekatkan  dengan menggunakan vacuum  rotary  evaporator. Semua  hasil ekstraksi  dimonitoring  dalam  1  plat  KLT  dengan menggunakan eluen 100% metanol, untuk melihat profil noda  pada  senyawa  dilakukan  dengan  menyemprotkan serium sulfat ke  noda lalu dipanaskan dalam oven. Pada kromatogram hasil KLT pada ekstrak n-heksana, metilen klorida  dan  etil  asetat  terlihat  hanya  ada  noda  di  bagian atas  (bersifat  lebih  non  polar)  sedangkan  pada  ekstrak
metanol  terlihat  noda  di  bagian  atas  dan  bawah  yang tebal pada noda.
Hal  tersebut  menunjukan  bahwa  senyawa-senyawa pada sampel terekstrak dengan baik dalam metanol (yang bersifat  polar  dan  yang  non  polar),  karena  pelarut metanol  merupakan  pelarut  universal  yang  dapat mengekstrak  semua  golongan  senyawa  metabolit sekunder.
Kulit  batang Sonneratia  ovata Backer  mula-mula dikeringkan  pada  suhu  ruang  yang  bertujuan  untuk menghilangkan  kadar  air  dalam  sampel.  Kemudian sampel  dihaluskan  dengan  menggunakan  alat  giling sehingga  berbentuk  serbuk,  hal  tersebut  agar  luas permukaan  sampel  menjadi  lebih  besar  dan  diperoleh serbuk  kering  sebanyak  1,5  kg.  Sampel  kering  (1,5  kg) dimaserasi dengan 7 L metanol selama 3 x 24 jam dalam suhu  ruang.  Setiap  1  x  24  jam,  dilakukan  penyaringan untuk  memisahkan  antara  serbuk  dengan  filtrat.  Pada hasil  filtrat  yang  diperoleh  setiap  1  x  24  jam dimonitoring  dengan  KLT  untuk  mengetahui  semua senyawa  sudah  terekstrak  atau  belum.  Kemudian,  hasil maserasi  dipekatkan  dengan  menggunakan vacuum rotary  evaporator sehingga  diperoleh  ekstrak  pekat berbentuk pasta berwarna coklat tua sebanyak 153 gram. Metode  Maserasi  dipilih  dalam  penelitian  ini  karena memiliki kelebihan yaitu praktis, waktu yang diperlukan lebih  singkat,  tidak  menggunakan  proses  pemanasan sehingga  tidak  menyebabkan  senyawa  terdekomposisi dan digunakan untuk sampel dalam jumlah banyak.

## Fraksinasi dan Pemurnian
Ekstrak  pekat  metanol  dilakukan  fraksinasi  pertama dengan  kromatografi  cair  vakum  (KCV)  dengan  2  kali pengulangan dengan masing-masing ekstrak sebanyak 35 gram  menggunakan  eluen  secara  berurutan  mulai  dari 100% n -heksana,  100%  etil  asetat  dan  100%  metanol. Tujuan  dilakukan  2  kali  pengulangan  agar  waktu  yang dibutuhkan  lebih  efektif  dan  silika  kolom  yang digunakan  lebih  efisien.  Metode  KCV  dipilih  karena jumlah  sampel  yang  banyak  dan  masih  banyaknya  noda pada sampel. Hasil KCV diperoleh vial sebanyak 29 vial (@300  mL)  dan  selanjutnya  dimonitoring    KLT  dengan eluen etil asetat : n-heksana (1:4) v/v. Fungsi monitoring KLT yaitu untuk mengetahui pola noda pada hasil KCV agar  dapat  digabungkan  sesuai  denga  Rf  yang  relatif sama.  Tujuan  menggunakan  eluen  diatas  untuk melakukan  proses  pemisahan  senyawa  sesuai  dengan sifat  kepolaran  senyawanya.  Pada  kromatogram  KLT yang memiliki Rf relatif sama digabungkan menjadi satu fraksi. Penggabungan fraksi menjadi 5 fraksi, yaitu fraksi F1  (385,2  mg),  F2  (448  mg),  F3  (1,7939  gram),  F4 (1,4124  gram),  dan  F5  (4,9648  gram).  Fraksi  F2-F4 menunjukan  pola  noda  yang  hampir  sama  sehingga digabung. Fraksi gabungan F2-F4 (3,6 gram) difraksinasi dengan  metode  KCV  ke-2  dengan  eluen  100% n - heksana,  metilen  klorida  : n -heksana  (1:49,  1:19,  7:93, 3:17,  7:13)  v/v,  dan  100%  etil  asetat.  Metode  KCV  ini dipilih  karena  masih  banyak  terdapat  noda.  Hasil  KCV ke-2  diperoleh  sebanyak  44  vial  (@100  mL)  dan selanjutnya  dimonitoring  KLT  dengan  eluen  etil  asetat  : n -heksana  (1:4)  v/v.  Variasi  eluen  dengan  peningkatan kepolaran  dari  eluen  non  polar  sampai  polar  agar  hasil pemisahannya  antar  noda  baik  sesuai  dengan  sifat kepolaran  senyawa  yang  ada  pada  sampel.  Pada kromatogram  KLT  hasil  KCV  ke-2  yang  memiliki  Rf
relatif  sama  digabungkan  menjadi  5  fraksi,  yaitu  G1 (751,4 mg), G2 (401 mg), G3 (122 mg), G4 (301,1 mg), dan  G5  (1,641  gram).  Fraksi  G5  menunjukan  pola  noda yang lebih sederhana karena jumlah  nodanya yang tidak terlalu  banyak,  sehingga  fraksi  G5  dipilih  untuk  proses fraksinasi selanjutnya. Fraksi G5 (1,641 gram) dilakukan fraksinasi  metode  KCV  ke-3  dengan  eluen  100% n - heksana, etil asetat : n -heksana (1:19, 1:9, 3:17, 7:13) v/v dan  100%  etil  asetat.  Hasil  KCV  ke-3  diperoleh  vial sebanyak  57  vial  (@100  mL)  dan  dimonitoring  KLT dengan  eluen  etil  asetat  : n -heksana  (1:4)  v/v.  Pada kromatogram  KLT  hasil  KCV  ke-3  yang  memiliki  Rf relatif sama digabungkan menjadi 5 fraksi,yaitu H1 (132 mg), H2 (371,4 mg), H3 (261,5 mg), H4 (326,8 mg), dan H5  (594,3  mg).  Pada  hasil  KLT  gabungan  menunjukan bahwa fraksi H2 dan H3 memiliki pola noda yang hampir sama  sehingga  kedua  fraksi  itu  digabung.  Fraksi gabungan  H2-H3  (632,9  mg)  dilakukan  fraksinasi selanjutnya dengan metode kromatografi kolom gravitasi (KKG)  dengan  eluen  100% n -heksana,  etil  asetat  : n - heksana  (1:19,  1:9,  3:17,  1:4,  1:3)  v/v,  100%  etil  asetat, dan  100%  metanol.  Metode  KKG  ini  dipilih  karena jumlah  noda  yang  tidak  terlalu  banyak  dan  jarak  antar noda  yang  berdekatan.  Hasil  KKG  I  diperoleh  sebanyak 126  vial  (@50  mL)  dan  selanjutnya  dimonitoring  KLT dengan  eluen  etil  asetat  : n -heksana  (1:3)  v/v.  Pada kromatogram  KLT  hasil  KKG  ke-1  yang  memiliki  Rf relatif  sama  digabungkan  menjadi  11  fraksi,  yaitu  I1 (227,4 mg), I2 (65,5 mgr), I3 (163,7 mg), I4 (109,3 mg), I5 (166,8 mg), I6 & I7 (173,7 mg), I8 (50,7 mg), I9 (57,1 mg), I10 (66,2 mg), dan I11 (114,7 mg). Pada hasil KLT gabungan  menunjukan  bahwa  fraksi  I6  dan  I7  memiliki pola  noda  yang  hampir  sama  sehingga  kedua  fraksi  itu digabung.  Fraksi  gabungan  I6-I7  (173  mg)  dilakukan fraksinasi  dengan  KKG  ke-2  dengan  eluen  100% n - heksana,  etil  asetat  : n -heksana  (1:19,  7:93,  1:9,  3:17, 1:4)  v/v,  100%  etil  asetat,  dan  100%  metanol.  Metode KKG  ini  dipilih  karena  jumlah  noda  hanya  3  dan  jarak antar  noda  yang  berdekatan.  Hasil  KKG  ke-2  diperoleh sebanyak  74  vial  (@  25  mL)  dan  selanjutnya dimonitoring  KLT  dengan  eluen  etil  asetat  : n -heksana (1:3)  v/v.  Diawali  dengan  eluen  100% n -heksana  agar senyawa  yang  bersifat  non  polar  ikut  bersama  eluen tersebut.  Pada  kromatogram  KLT  hasil  KKG  ke-2  yang memiliki  Rf  relatif  sama  digabungkan  menjadi  6  fraksi, yaitu J1 (61,4 mg), J2 (18,6 mg), J3 (64 mg), J4 (57 mg), J5  (16,6  mg),  dan  I6  (53,9  mg).  Fraksi  J2  menunjukan noda  tunggal  tapi  masih  berekor  dan  jumlahnya  yang sangat  sedikit.  Oleh  karena  itu,  dilakukan  fraksinasi kembali pada fraksi I5 karena memiliki noda yang sama dengan  J2  dibuktikan  dengan  KLT.  Fraksi  I5  (166  mg) dilakukan  fraksinasi  dengan  metode  kromatografi  cair vakum  (KCV)  ke-4  dengan  eluen  100% n -heksana,  etil asetat  : n -heksana  (1:99,  3:  97,  4:96,  1:19,  7:93,  1:9, 11:89,  13:87,  1:4,  2:3)  v/v,  100%  etil  asetat  dan  100% metanol. Metode KCV ini dipilih karena jarak antar noda yang berjauhan. Hasil KCV ke-4 diperoleh sebanyak 229 vial (@50 mL)  dan dimonitoring KLT dengan eluen etil asetat  : n -heksana  (1:3)  v/v.  Pada  kromatogram  KLT hasil  KCV  ke-4  yang  memiliki  Rf  relatif  sama digabungkan  menjadi  6  fraksi,yaitu  K1  (204,5  mg),  K2 (119,1  mgr),  K3  (13,5  mg),  K4  (43,9  mg),  K5  (0,0809 gram),  dan  K6  (53,5  mg).  Fraksi  K2  menunjukan  noda tunggal  yang  memiliki  ekor  yang  cukup  panjang.  Fraksi
I4,  J2  dan  K2  memiliki  noda  yang  sama  dan  dibuktikan dengan  dilakukan  KLT.  Fraksi  I4,  J2,  dan  K2  (247  mg) dilakukan  fraksinasi  dengan  KKG  ke-3  dengan  eluen 100% n -heksana, etil asetat : n -heksana (3:97, 1:19, 7:93, 1:9,  1:3)  v/v,  100%  etil  asetat  dan  100%  metanol. Metode KKG ini dipilih karena jarak antar noda dengan ekor yang sangat berdekatan.  Hasil KKG ke-3 diperoleh sebanyak  76  vial  (@  25mL)  dan  dimonitoring  KLT dengan  eluen  etil  asetat  : n -heksana  (1:3)  v/v.  Pada kromatogram  KLT  hasil  KKG  ke-3  yang  memiliki  Rf relatif  sama  digabungkan  menjadi  4  fraksi,yaitu  L1 (248,5  mg),  L2  (156,2  mg),  L3  (31,9  mg),  dan  L4  (34 mg).
Pada  hasil  kromatogram  KLT,  fraksi  L2  menunjukan noda  tunggal  yang  masih  berekor.  Hal  itu  menunjukkan bahwa  senyawa  yang  ada  pada  fraksi  L2  belum  murni, sehingga  dilakukan  rekristalisasi.  Sebelum  kristalisasi, dilakukan  uji  kelarutan  pada  fraksi  L2  menggunakan beberapa  pelarut.  Hasilnya,  fraksi  L2  tidak  larut  dalam metanol  dan n -heksana,  larut  sebagian  dalam  etil  asetat dan  larut  sempurna  dalam  kloroform  dan  etil  asetat panas.
Sesuai dengan prinsip rekristalisasi, yaitu pelarut yang digunakan  adalah  pelarut  yang  tidak  melarutkan sempurna  pada  suhu  ruang  dan  dapat  melarutkan sempurna pada suhu tinggi. Oleh karena itu, rekristalisasi fraksi  L2  menggunakan  2  pelarut  yaitu  etil  asetat  panas (yang dapat melarutkan sempurna) dan n-heksana dingin (tidak  melarutkan).  Kristal  yang  terbentuk  disaring vakum  dan  dicuci  dengan  n-heksana.  Fungsi  pencucian dengan n-heksana yaitu untuk melarutkan pengotor yang masih terjebak dalam kristal.
Kristal  L2  yang  diperoleh  kristal  berwarna  putih dengan  massa  sebanyak  17  mg.  Uji  kemurnian  dengan dilakukan  uji  tiga  eluen,  uji  KLT  dua  dimensi  dan  uji titik leleh. Uji tiga eluen dilakukan dengan menggunakan eluen  yang  berbeda  sehingga  didapatkan  3  posisi  yang berbeda yaitu noda diatas, ditengah dan dibawah dengan eluen  etil  asetat  : n -heksan  (2:3)  v/v,  etil  asetat  : n heksana  (1:3)  v/v,  etil  asetat  : n-heksana (1:9) v/v.  Hal tersebut untuk membuktikan bahwa senyawa telah murni karena  pada  posisi  yang  berbeda  tetapi  noda  yang muncul  tetap  noda  tunggal.  Uji  KLT  dua  dimensi dilakukan  pada  plat  KLT  ukuran  5x5cm  dengan menggunakan  dua  macam  eluen  yang  berbeda  yang masing-masing  eluen  dapat  membawa  noda  diposisi tengah. Pada hal ini, eluen yang digunakan 1:3 etil asetat : n -heksana dan 7 : 93 etil asetat : metilen klorida. Eluen tersebut digunakan supaya hasil KLT mendapatkan noda yang  tepat  ada  di  tengah  untuk  mengetahui  kemurnian dari  senyawa  tersebut,  apakah  masih  ada  noda  lain disekitarnya.  Hasil  uji  KLT  dua  dimensi  menunjukkan bahwa kristal L2 sudah murni karena sudah tidak adanya noda  lain  selain  noda  kristal  L2.  Uji  titik  leleh menggunakan  alat  ukur Fisher  John  Melting dan diperoleh  titik  leleh  dari  kristal  L2  sebesar  200-201 o C. Fraksi L2 disebut senyawa (1) .  Senyawa (1) menunjukan senyawa  murni  karena  senyawa  dikatakan  murni  jika rentang titik lelehnya  1 o C.

## Penentuan Struktur
Senyawa (1) berupa  serbuk  putih  sebanyak  17  mg dengan  titik  leleh  200-201 o C.  Analisa  selanjutnya menggunakan  spektrofotometer  FTIR.  Pada  hasil spektrum  Inframerah  (IR)  dari  senyawa (1) (Gambar  1.)
menunjukkan serapan-serapan yang khas untuk beberapa gugus  fungsi.  Pada  bilangan  gelombang  3446,91  cm -1 menunjukan  adanya  gugus  hidroksi  (O-H).  Sedangkan gugus  CH  alifatik  (sp 3 )  ditunjukkan  dengan  adanya serapan  bilangan  gelombang  2870,17  dan  2943,47  cm -1 . Pada  bilangan  gelombang  1689,70  cm -1 menunjukkan adanya  gugus  karbonil  (C=O)  [7].  Pada  hasil  spektrum IR  tidak  terdapat  beberapa  serapan  pada  bilangan gelombang  antara  1370-1600  cm -1 yang  menunjukan adanya  C=C  aromatik.  Oleh  karena  itu,  senyawa (1) diperkirakan  antara  kerangka  triterpen  dan  steroid, didukung  dengan  afinitas  kimia  dari Sonneratia  ovata Backer  yang  menghasilkan  senyawa-senyawa  tersebut. Hal  tersebut  diperkuat  dengan  membandingkan  serapan bilangan  gelombang  dari  salah  satu  senyawa  triterpen yaitu  senyawa  asam  betulinat (42) dengan  senyawa (1) . Serapan  bilangan  gelombang  senyawa  asam  betulinat (42) yaitu  pada  bilangan  gelombang  3446  cm -1 (-OH), 1685  cm -1 (C=O),  2924  dan  2862  cm -1 (CH 3 alifatik) (Shahlaei  dkk.,  2013).  Setelah  dibandingkan,  terdapat kesamaan  pola  pada  serapan  bilangan  gelombang  antara senyawa (1) dengan  senyawa  triterpen.  Selanjutnya, dilakukan uji 1 H-NMR dan 13 C-NMR untuk menentukan struktur senyawa (1) .
Gambar 1. Spektrum IR senyawa (1)
Penentuan  struktur  selanjutnya  menggunakan  data spektrum 1 H-NMR  dan 13 C-NMR  dengan  menggunakan pelarut  CDCl 3 .  Pada  data  pergeseran  kimia  proton  ( 1 H- NMR)  diperoleh  informasi  tentang  lingkungan  kimia, jumlah  dan  jenis  proton,  sedangkan  pada  pergeseran kimia  karbon  ( 13 C-NMR)  hanya  memperoleh  informasi tentang jumlah dan jenis karbon. Data 13 C-NMR senyawa (1) (Tabel 1.) menunjukkan bahwa senyawa (1) memiliki minimal  32  atom  karbon.  Pada  pergeseran  kimia  68,6 dan  79,1  ppm  menunjukan  adanya  2  atom  karbon  yang berikatan  tunggal  dengan  atom  oksigen  (C-O).  Adanya gugus  karbonil  (C=O)  ditunjukkan  dengan  adanya pergeseran kimia pada 179,8 ppm yang diperkuat dengan serapan bilangan gelombang 1689,70 cm -1 pada spektrum IR.  Pada  pergeseran  kimia  109,4  dan  150,8  ppm memperlihatkan  adanya  2  atom  karbon  yang  berikatan rangkap  (C=C).  Terdapat  delapan  gugus  metil  yang ditunjukkan  dengan  adanya  sinyal  karbon  pada pergeseran kimia pada 14,8; 15,4; 16,1; 16,2; 18,4; 19,5; 20,9; dan 29,8 ppm. Pada sinyal karbon pada pergeseran kimia 18,4; 25,64; 27,5; 28,1; 30,6; 32,2; 34,4; 38,8; dan 49,4  ppm  menunjukkan  adanya  gugus  metilen  [7]. Berdasarkan  dari  jumlah  karbon 13 C-NMR  dan  hasil  IR maka dapat diperkirakan senyawa (1) memiliki kerangka triterpen  dengan  memiliki  gugus  karbonil  dan  gugus hidroksi.  Beberapa  contoh  senyawa  triterpen  yang memiliki  gugus  tersebut  yaitu  asam  olenolat (6) ,  asam
maslinat (7) corosolic  acid (32) ,  asam  3-O-acetilursolat (33), asam  ursolat (41) ,  asam  betulinat (42) ,  dan  lupenil asetat (43) . Data 1 H-NMR digunakan untuk menentukan struktur senyawa (1) secara keseluruhan.
Data 1 H-NMR senyawa (1) (Tabel 1.) pada pergeseran kimia  0,82  (6H, s ),  0,75  (6H, s ),  0,93  (6H, s ),  dan  1,68 (3H, s )  menunjukkan adanya tujuh metil singlet . Adanya proton  pada  karbon  yang  berikatan  rangkap  (C=C) ditunjukkan  dengan  adanya  pergeseran  kimia  4,73  ppm (2H, s ). Juga terdapat proton pada karbon yang berikatan dengan  atom  oksigen  ditunjukkan  dengan  adanya pergeseran  kimia  3,18  ppm  (dd,  5;  4,7  Hz).  Selain  itu, terdapat  sinyal  proton  khas  untuk  gugus  hidroksi  pada pergeseran kimia 2,62 (1H, s )[7].
Berdasarkan analisis data IR, 1 H dan 13 C-NMR di atas maka dapat disimpulkan bahwa senyawa L2 (1) memiliki kesamaan  struktur  dengan  senyawa  3β-asetoksi-lup- 20(29)-en-2α-ol  [9]  yang  ditunjukkan  pada  Tabel  1. Berdasarkan data tersebut, terdapat dua pergeseran kimia (  C ) yang sedikit berbeda antara senyawa (1) dengan 3β- asetoksi-lup-20(29)-en-2α-ol  yaitu  pada  C-3  (79,1 dengan  85  ppm)  dan  C-31  (179,8  dengan  172,4  ppm), tetapi secara keseluruhan data pergeseran kimia senyawa (1) memiliki  kemiripan  dengan  data  senyawa  3β- asetoksi-lup-20(29)-en-2α-ol,  sehingga  dapat  disarankan bahwa senyawa (1) adalah 3β-asetoksi-lup-20(29)-en-2α- ol.
Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Sonneratia  ovata Backer dan fraksi L
Asam galat (Asam 3,4,5-trihidroksibenzoat) digunakan sebagai  kontrol  positif.  Uji  DPPH  ini  dilakukan  dengan menambah  33  L  ekstrak  dengan  1  mL  larutan  DPPH yang  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  kamar  selama  20 menit.  Selama  reaksi  antara  DPPH  dengan  antioksidan, larutan  DPPH  yang  awalnya  berwarna  ungu  akan berubah  menjadi  berwarna  kuning.  Hal  tersebut  karena terjadinya  donor  radikal  hidrogen  dari  senyawa antioksidan  ke  DPPH.  Reaksi  tersebut  menyebabkan adanya delokalisasi elektron pada DPPH sehingga terjadi penurunan  absorbansi  larutan  yang  diukur  dengan spektrosfotometer UV-Vis dengan λ 517 nm.
Prosentase  penghambatan  asam  galat  sebesar  96,41% dengan  nilai  IC 50 sebesar  2,01  g/mL  (Gambar  2.).  IC 50 yaitu konsentrasi minimum sampel untuk bisa menghambat  radikal  DPPH  sebanyak  50  %.    Setelah dilakukan  isolasi  senyawa (1) dari  fraksi  L,  maka dilakukan  uji  aktivitas  antioksidan  pada  fraksi  L,  yang memungkinkan terdapat senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan  yang  aktif.  Hasil  fraksi  L2  memiliki prosentase  penghambatan  sebesar  20,91  0,006%.  Hal itu  menunjukkan  bahwa  fraksi  L  dan  senyawa (1)
aktivitas  antioksidannya  kurang  aktif,  sehingga  tidak memiliki nilai IC 50 (Gambar 3.).
Gambar 2. Aktivitas Penghambatan radikal DPPH dari asam galat (Kontrol +) dengan memiliki nilai IC 50 dari ekstrak metanol sebesar 2,01  g/mL
Gambar 3. Aktivitas Penghambatan radikal DPPH dari Asam galat (kontrol positif) dan fraksi L dengan konsetrasi 319,46  g/mL

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dihasilkan senyawa triterpenoid yaitu 3β-asetoksi-lup-20(29)-en-2α- ol (1) berupa serbuk warna putih dengan titik leleh 200- 201 o C dari ekstrak metanol kulit batang Sonneratia ovata Backer  yang  berasal  dari  Kota  Dobo,  Kepulauan  Aru, Provinsi  Maluku.  Aktivitas  antioksidan  menggunakan metode  DPPH  menunjukkan  fraksi  dari  senyawa (1) hanya memiliki prosentase penghambatan 20,91  0,006 %,  sehingga  dapat  disimpulkan  senyawa (1) memiliki aktivitas antioksidan yang kurang aktif.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  berterima  kasih  kepada  tim  penelitian Laboratorium  Kimia  Bahan  Alam  dan  Sintesis  dan Jurusan Kimia FMIPA ITS, serta semua pihak yang turut membantu dalam penyelesaian jurnal ilmiah ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Mao, L., & Foong, S. Y. (2013). Tracing ancestral biogeography of  Sonneratia  based  on  fossil  pollen  and  their  probable  modern analogues. 133-143.
[2] Wu,  S.-B.,  Wen,  Y.,  Li,  X.-W.,  Zhao,  Y.,  &  Hu,  J.-F.  (2009). Chemical  constituents  from  the  fruits  of  Sonneratia  caseolaris. Biochemical Systematics and Ecology , 1-5.
[3] Jariyah,  Widjanarko,  S.  B.,  Yunianta,  &  Estiasih,  T.  (2014). Hypoglycemic effect of Pedada (Sonneratia caseolaris) Fruit. 31- 40.
[4] Tiwari,  A.  K.,  Viswanadh,  V.,  Gowri,  P.  M.,  Ali,  A.  Z., Radhakrishnan, S., Agawane, S. B., et al. (2010). Oleanolic acid - an  a-Glucosidase  inhibitory  and  antihyperglycemic  active compound from the fruits of Sonneratia caseolaris. 19-23.
[5] Hou,  W.,  Li,  Y.,  Zhang,  Q.,  Wei,  X.,  Peng,  A.,  Chen,  L.,  et  al. (2009).  Triterpene  acids  isolated  from  Lagerstroemia  speciosa leaves as alpha-glucosidase inhibitors. 614-618.
[6] Sadhu,  S.  K.,  Ahmed,  F.,  Ohtsuki,  T.,  &  Ishibashi,  M.  (2006). Flavonoids from Sonneratia caseolaris. 264-265.
[7] Rouessac, F., & Rouessac, A. (1994). Chemical Analysis "Modern Instrumentation  Methods  and  Techniques"  Second  Edition. England: John Wiley & Sons Ltd.
[8] Shahlaei,  M.,  Ghanadian,  S.  M.,  Ayatollahi,  A.  M.,  Mesaik,  A. M.,  Abdalla,  O.  M.,  Afsharypour,  S.,  et  al.  (2013).  Molecular modeling,  structure  activity  relationship  and  immunomodulatory properties  of  some  lupeol  derivatives. Med  Chem  Res ,  22:1795- 1803.
[9] Rungsimakan,  S.,  &  Rowan,  M.  G.  (2014).  Terpenoids, flavonoids and caffeic acid derivatives from Salvia viridis L. cvar. Blue Jeans. Phytochemistry , 177-188.