## UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA DARI JAMUR LAUT YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Callyspongia sp.
Seseni Bastian 1) , Henki Rotinsulu 1) , Fatimawali 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Marine organisms such as sponges often live in association  with marine fungi that can produce antimicrobial compounds. This study aims to determine the antimicrobial activity of marine fungi  isolatedfrom  with  Callyspongia  sp.,  sponge  obtained  from  Manado  Bay  against  the microorganisms of Staphylococcus aureus bacteria, Escherichia coli and Candida albicans fungi. The isolated sample was then extracted by maceration and fractionation using acetone and ethyl acetate solvents. Testing of antimicrobial activity using agar diffusion method. The measured parameter is the magnitude  of  the  inhibitory  diameter  formed  around  the  disc  paper.  The  results  showed  that  ethyl acetate extracts of fungi associated with Callyspongia sp., sponge have antimicrobial activity against S.  aureus  and  C.  albicans  is  categorized  as  strong  and  antimicrobial  activity  against.  E.  coli  is categorized as moderate.
Keywords : Activity , Callyspongia sp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans.

## ABSTRAK
Organisme  laut  seperti  spons  seringkali  hidup  berasosiasi  dengan  jamur  laut  yang  dapat menghasilkan senyawa antimikroba. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antimikroba dari isolat jamur yang berasosiasi dengan spons Callyspongia sp. yang diperoleh dari Teluk Manado terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan jamur Candida albicans . Sampel  diperoleh  kemudian  diekstraksi  secara  maserasi  dan  fraksinasi  menggunakan  pelarut  aseton dan  etil  asetat.  Pengujian  aktivitas  antimikroba  menggunakan  metode  difusi  agar.  Parameter  yang diukur  adalah  besarnya  diameter  daya  hambat  yang  terbentuk  di  sekitar  kertas  cakram.  Hasil penelitian menunjukkan ekstrak etil asetat dari jamur yang berasosiasi dengan spons Callyspongia sp. memiliki  aktivitas  antimikroba  terhadap S.  aureus dan C.  albicans dikategorikan  kuat  dan  aktivitas antimikroba E. coli dikategorikan sedang.
Kata Kunci : Antimikroba, Callyspongia sp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans .

## PENDAHULUAN
Mikroorganisme  dan  lingkungan laut  khususnya  jamur  yang  berasal  dari laut,  telah  terbukti  mejadi  sumber  dari metabolit  sekunder  bioaktif  baru.  Banyak metabolit  yang  memiliki  struktur  kimia yang  unik  dan  aktivitas  biologi  yang menarik,  seperti  sitotoksitas  terhadap  sel kanker, aktivitas antimikroba, penghambatan  beberapa  aktivitas  enzim dan sebagainya (Namikoshi, 2006).
Callyspongia sp.  merupakan  salah satu  jenis  spons  yang  banyak  tumbuh  di perairan  Indonesia.  Spesies  ini  adalah salah  satu  biota  laut  yang  memiliki kandungan  sebagai  metabolit  sekunder diantaranya  steroid,  alkoloid,  flavonoid, dan  terpenoid yang  nantinya  dapat dimanfaatkan  sebagai  bahan  baku  obat (Mun’im dan sekarini, 2005).
Jamur  merupakan  mikroorganisme heterotrof,  bereproduksi  secara  seksual dan/atau aseksual, struktur vegetatif berupa  sel  tunggal  atau  berfilamen menyatakan  bahwa  simbiosis  mikroba dengan  spons  dapat  berlangsung  di  dalam sitoplasma  sel  tubuh  spons,  di  sisi  dalam tubuh spons dan di bagian luar tubuh spons (Harti, 2015).
Potensi  jamur  yang  berasal  dari biota  laut  ( marine-derived  fungi )  sebagai antibiotika sudah dikenal sejak
ditemukannya  cephalosporin  C,  yang diisolasi dari jamur
Acremonium
chyrsogenum pada  tahun  1946  di  perairan Sardinia.  Namun,  penelitian  terhadap marine-derived  fungi baru  berkembang sejak  10  tahun  terakhir  (Suciati et  al ., 2014).  Beberapa  penelitian  yang  telah dilakukan  terkait  aktivitas  antimikroba jamur  endofit  pada  spons  diantaranya senyawa xestodekalakton dari jamur Penicillium cf. montanense M.  yang
berasosiasi  dengan  spons Xestospongia exigua dilaporkan  memiliki  aktivitas antimikroba (Edrada et al ., 2002).
Penelitian  lain  menyatakan  roquefortin  C, leucinostatins  dan  equisetin  dari  jamur Penicillium sp ., Paecilomyces sp ., Fusariumsp .  yang  berasosiasi  dengan spons Tethya aurantium memiliki aktivitas antimikroba  (Wiese et  al .,  2011).  Α-piron merupakan  senyawa  antikanker  yang diperoleh dari jamur Paecilomyces illacinus yang  berasosiasi  dengan  spons
Petrosiasp . (Elbandy et al .,2009). Handayani et  al .,  (2012)  melaporkan bahwa  spons Petrosia  sp .  memiliki aktivitas sitotoksik.
Upaya pengobatan terhadap penyakit  infeksi  telah  banyak  dilakukan.
Penanganan  yang  umum  dilakukan  adalah penggunaan antimikroba. Tetapi, penggunaan  antimikroba  secara  tidak rasional  baik  dalam  dosis  maupun  jangka waktu penggunaan dapat memicu terjadinya  resistensi  terhadap  antimikroba (Kemenkes RI, 2011).

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  telah  dilaksanakan pada  bulan  Maret  sampai  bulan  Juni  2018 di  Laboratorium  Farmakognosi,  Fitokimia dan  Laboratorium  Mikrobiologi  Farmasi Universitas Sam Ratulangi.

## Jenis Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan menggunakan metode eksperimental laboratorium yang akan menguji aktivitas antimikroba mikroorganisme yang diisolasi dari spons Callyspongia sp.

## Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian ini yaitu masker, sarung tangan, gunting,  snorkel,  fins,  kantong  plastik, kamera  bawah  laut,  wadah  kaca,  pisau, Erlenmeyer (pyrex), corong, rotary evaporator, timbangan  digital,  gelas  ukur (pyrex),  gelas  kimia  (pyrex),  cawan  petri, corong  pisah  (pyrex),  autoklaf,  pinset, spatula, pembakar spritus, magnetic stirrer ,  pipet  tetes,  mikro  tub,  batang pengaduk, Laminar  air  flow, rak  tabung reaksi,  tabung  reaksi,  lemari  pendingin, inkubator, cakram ( paper disc) , mikropipet, vial, jangka sorong, jarum ose, jas lab.
Bahan-bahan yang digunakan yaitu spons Callyspongia sp.,  bakteri  uji Staphylococcus  aureus ATCC  25923, Escherichia  coli ATCC  25922,  Jamur  Uji Candida  albicans ATCC  1231,  etanol, aquadest,  etil  asetat,  aseton, Potato
Dextros  Agar , Nutrient  Agar ,  Glukosa,
Polypeptone, MgSO 4 .7H 2 O, Yeast Extract , KH 2 PO 4 ,  Sukrosa, Starch , Malt  Extract , Ebios , larutan H 2 SO 4 1%, larutan
BaCl 2 1,75%, larutan NaCl 0,9%,
kloramfenikol paperdisc ,  label,  spidol permanen, tissue,  aluminium  foil ,  kertas saring, kapas.

## Pengambilan Sampel
Sampel spons diambil dari perairan Teluk  Manado  menggunakan  alat  bantu ( Scuba  Diving ).  Sampel  difoto  dengan kamera  bawah  laut  dan  diambil  lalu dimasukkan  ke  dalam ziper  bag dan disimpan dalam cooling box berisi  es batu untuk dibawa ke Laboratorium Farmakognosi  dan  Fitokimia    Program Studi Farmasi Universitas Sam Ratulangi.

## Isolasi  dan  Purifikasi  Jamur  yang Berasosiasi dengan Spons
Isolasi  jamur  dilakukan  dengan cara  sampel  dibersihkan  dengan  aquades kemudian dipotong kecil-kecil menggunakan  gunting  dan  pinset  dan dimasukkan  ke  dalam  media  PDA  yang telah  disiapkan.  Sampel  ditanam    di  atas media  PDA  dengan  tiga  titik  pusat  yang berbentuk  segitiga.  Cawan    petri  yang berisi  sampel  ditutup  dan  direkatkan menggunakan parafilm, kemudian diinkubasi pada suhu ruangan selama 7x24 jam.  Setelah  didapatkan  isolat  jamur, dilakukan  pemurnian  dengan  cara  isolat jamur  diinokulasikan  ke  media  PDA  yang baru,  kemudian  diinkubasi  pada  suhu ruangan  selama  14x24  jam.  Selanjutnya diidentifikasi morfologi secara makroskopik  untuk  menghasilkan  isolat jamur murni.

## Kultur Cair
Kultur  cair  dilakukan  dengan  cara biakan  jamur  murni  yang  telah  diperoleh diinokulasikan  ke  dalam  labu  erlenmeyer yang  berisi  (2  gram  glukosa,  0,5  gram polypeptone , 0,05  gram  MgSO 4 .7H 2 O, 0,2 gram yeast extract , 0,1 gram  KH 2 PO 4, dan 0,1  gram    agar  ditambahkan  100  ml aquades).  Labu  tersebut  kemudian  diaduk menggunakan  alat shaker pada  suhu  27 0 C dengan  kecepatan  120  rpm  selama  3x24 jam  untuk  memperoleh  bibit  kultur. Setelah  didapatkan  bibit  kultur,  kemudian dipindahkan  sebanyak  3  ml  ke  media produksi  yang  berisi  (4,5  gram  sukrosa, 4,5  gram starch ,  1,5  gram ekstrak  malt , 0,45 Ebios , 0,75 gram KH 2 PO 4 , dan 0,075 MgSO 4 .7H 2 O  dalam  150  ml  aquades). Labu tersebut kemudian diaduk menggunakan  alat shaker pada  suhu  27 0 C
dengan  kecepatan  120  rpm  selama  7x24 jam.

## Ekstraksi dan Fraksinasi
Pada  akhir  hari  ketujuh  setelah proses  fermentasi,  dilakukan  ekstraksi pada  campuran  miselium  jamur  dan  broth dengan  menggunakan  200  ml  aseton. Dilakukan Ekstraksi pada campuran miselium jamur dan broth dengan menggunakan  aseton.  Ekstraksi  dilakukan dengan  menggunakan shaker pada  suhu ruangan dengan kecepatan 150 rpm selama 5  menit.  Selanjutnya  dipisahkan  antara fase  air  dan  aseton    menggunakan  corong pisah  dan  kertas  saring.  Setelah  didaptkan filtrat  dari  hasil  penyaringan  kemudian diuapkan dengan rotary evaporator.
Setelah  didapatkan  ekstrak  kental dari hasil evaporasi, dimasukkan ke dalam corong  pisah  dan  ditambahkan  pelarut  etil asetat sebanyak 200 ml setelah itu dikocok dalam  corong  pisah  sampai  homogen. Dibiarkan  sampai  terbentuk  dua  lapisan. Masing-masing  lapisan  ditampung  pada wadah  yang  berbeda.  Lapisan  H 2 O kemudian  difraksinasi  lagi  menggunakan pelarut etil asetat sebanyak 200 ml. Hal ini dilakukan  sebanyak  tiga  kali.  Selanjutnya fraksi  etil  asetat  dikumpulkan  kemudian pelarut  diuapkan  menggunakan rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kasar yang  akan  digunakan  untuk  uji  aktivitas antimikroba.

## Pembuatan Larutan Uji
Dibuat  larutan  uji  dengan  cara ditimbang  ekstrak  kasar  jamur  dari  spons Callyspongia sp. sebanyak 1 mg, kemudian  dilarutkan  dalam  200  μl  CMC sehingga menghasilkan konsentrasi larutan uji sebesar 250 μg/50 μl (Ortez, 2005).

## Pengujian Aktivitas Antimikroba
Metode yang digunakan dalam penelitian  ini  yaitu  metode  difusi  agar ( disc diffusion Kirby and Bauer ). Aktivitas penghambatannya diuji terhadap Staphylococcus  aureus ATCC  25923 (bakteri  Gram  positif), Eschrichia  coli ATCC  25922  (bakteri  Gram  negatif)  dan Candida  albicans ATCC  1231  (jamur), yang  digunakan  sebagai  mikroorganisme uji.  Pada  pengujian  aktivitas  antimikroba ini,  cakram  ( paper  disc) yang  digunakan berukuran  6  mm.  Suspensi  mikroba kemudian  diinokulasikan  ke  dalam  media dan dihomogenkan. Kemudian media yang telah  diinokulasi  mikroba  dituangkan  ke dalam  cawan  petri  dan  tunggu  sampai media  memadat.  Masing-masing  cawan petri  diberi  label  dan  nomor  sampel  yang sesuai.  Sampel  yang  telah  ditentukkan konsentrasinya  (250μg/50μl)  ditotolkan pada masing-masing cakram dengan menggunakan mikropipet. Letakkan kertas cakram  yang  telah  ditotolkan  sampel  uji dengan  pinset  kedalam  cawan  petri  lalu diinkubasi  selama  1  x  24  jam  (Ortez, 2005).

## Pengamatan  dan  Pengukuran  Zona Hambat
Pengamatan dilakukan setelah 1x24  jam  masa  inkubasi.  Zona  bening merupakan  petunjuk  kepekaan  mikroba terhadap bahan antimikroba yang digunakan sebagai bahan uji yang dinyatakan  dengan  lebar  diameter  zona hambat  (Vandepite,  2005).  Diameter  zona hambat  diukur  kemudian  dikategorikan kekuatan daya antimikrobanya berdasarkan  penggolongan  Davis  dan Stout (1971).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi  dan  Purifikasi  Jamur  yang Berasosiasi dengan Spons
Sampel yang telah disiapkan kemudian  dibersihkan  dengan  aquades untuk menghilangkan kotoran dan mikroorganisme  epifit,  sehingga  koloni yang tumbuh pada media isolasi merupakan  koloni  simbion  (Arnold et  al ., 2000). Selanjutnya penanaman jamur yang berasosiasi dengan spons dilakukan dengan  cara  dipotong  berukuran  kecil kemudian  ditanam  di  atas  media  PDA yang  telah  disipakan  dan  diinkubasi.
Inkubasi merupakan suatu teknik perlakuan bagi mikroorganisme yang telah diinokulasikan pada media padat atau cair, kemudian  disimpan  pada  suhu  tertentu untuk  dapat  melihat  pertumbuhannya. Media  isolasi  diinkubasi  selama  7x24  jam pada suhu ruangan dan dipantau setiap hari untuk memeriksa pertumbuhan mikroorganisme koloni dari spons.
Koloni  jamur  berasosiasi  yang  tumbuh diamati  perbedaan  karakterisitik  secara makroskopik.Pada  penelitian  ini  setelah 7x24  jam,  isolat  jamur  yang  tumbuh terlihat  seperti  benang-benang  halus  yang berwarna  putih.  Selanjutnya  pemurnian isolat  jamur  yang  tumbuh  dilakukan dengan  cara  diinokulasikan  menggunakan jarum  ose  ke  media  PDA  yang  baru  dan diinkubasi  selama  14x24  jam  pada  suhu ruangan. Hal ini bertujuan untuk memisahkan  koloni-koloni  jamur  agar didapatkan isolat jamur dengan karakteristik  secara  makroskopik  yang mempunyai morfologi yang sama sehingga dapat disebut sebagai isolat murni jamur.

## Kultur Cair
Dalam  penelitian  ini,  isolat jamur  dari  dikultivasi  sebanyak  dua  kali dengan  periode  yang  berbeda.  Kultivasi
pertama dilakukan selama 3x24 jam untuk memperoleh  bibit  kultur.  Setelah  hari ketiga  dari  kultivasi  pertama,  selanjutnya kultivasi kedua dilakukan selama 7x24 jam untuk  memproduksi  senyawa  dari  bibit kultur. Kultivasi dilakukan pada media cair dengan  metode shaker pada  suhu  27 0 C dengan  kecepatan  150  rpm,  hal  ini bertujuan agar semua nutrisi yang dikandung dalam medium dapat digunakan oleh  jamur  secara  optimal  sebagai  bahan untuk  proses  metabolismenya  sehingga senyawa  antimikroba  dapat  dihasilkan dengan optimal.

## Ekstraksi dan Fraksinasi
Setelah  didapatkan  hasil  produksi dari  kultur  cair,  tahap  selanjutnya  yang dilakukan adalah ektraksi. Hasil kultur cair diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut aseton. Proses ekstraksi yang bertujuan untuk memisahkan  atau  menyari  senyawa  aktif yang  ada  di  dalam  sampel,  sehingga adanya  suatu  proses  pemisahan  dua  atau lebih  komponen  yang  terkandung  dalam sampel,  oleh  suatu  pelarut  (Suryanto, 2012). Proses ekstraksi ini tidak dilakukan dengan  metode  ekstraksi  panas  karena dikhawatirkan ada golongan senyawa yang tidak  tahan  panas.  Maserasi  adalah  proses pengekstrakan simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokkan atau  pengadukan  pada  suhu  ruangan. Metode  ini  termasuk  ekstraksi  dengan prinsip  metode  pencapaian  konsentrasi pada  kesetimbangan  (Depkes  RI,  2000). Tujuan  pemilihan  metode  maserasi  karena merupakan  metode  yang  paling  sederhana dan  sangat  banyak  digunakan.  Cara  ini sesuai,  baik  untuk  skala  kecil  maupun skala industri. Sampel diekstraksi menggunakan  metode  maserasi  dengan
cara  sampel  direndam  dengan  pelarut aseton  dan  diaduk  menggunakan  alat shaker pada suhu ruangan selam ± 5 menit. Kemudian dipartisi dan filtratnya diuapkan dan diperoleh ekstrak kental.
Ekstrak kental yang diperoleh kemudian  difraksinasi  dengan  pelarut  etil asetat.  Fraksinasi  merupakan  metode pemisahan  campuran  menjadi  beberapa fraksi yang berbeda susunannya.
Fraksinasi  diperlukan  untuk  memisahkan golongan utama kandungan  yang satu dari golongan  utama  yang  lainnya  (Harborne, 1987).  Dalam  penelitian  ini,  fraksinasi dilakukan dengan metode FCC (Fraksinasi Cair-Cair).  Hal  ini    bertujuan  untuk memisahkan  dan  memurnikan  kandungan tertentu  yang  terdapat  dalam  sampel berdasarkan perbedaan kepolaran (DepKes RI,  2000).  Dalam  fraksinasi  cair-cair terjadi  perpindahan  solut  dari  satu  fasa  ke fasa  yang  lain.  Pada  fraksinasi  cair-cair, fasa  yang  digunakan  adalah  dua  cairan yang  tidak  saling  bercampur,  biasanya digunakan air dan pelarut organik (Harborne, 1987).
Pada penelitian ini, fraksinasi dilakukan  menggunakan  corong  pisah. Fraksinasi  dilakukan  sebanyak  tiga  kali dengan  pelarut  etil  asetat.  Fraksinasi dilakukan  dengan  cara  ekstrak  cair dimasukkan  ke  dalam  corong  pisah  dan dicampur dengan pelarut etil asetat, setelah itu  dikocok.  Hal  ini  bertujuan  agar kandungan  kimia  yang  terkandung  dalam sampel  secara  selektif  dapat  ditarik  oleh pelarut  yang  digunakan.  Setelah  dikocok, didiamkan beberapa menit sehingga terbentuk dua fraksi secara terpisah. Fraksi etil asetat berada di lapisan atas dan fraksi H 2 O  (air)  berada  di  lapisan  bawah.  hal  ini disebabkan  karena  massa  jenis  air  lebih tinggi  dari  pada  massa  jenis  etil  asetat. Selanjutnya,  fraksi  yang  sudah  terpisah
ditampung dalam wadah yang berbeda dan perlakuan  yang  sama  dilakukan  sebanyak tiga  kali.  Kemudian  F1,  F2  dan  F3 digabung  dan  diuapkan  menggunakan Rotary  evaporator sehingga  diperoleh ekstrak  kasar  untuk  pengujian  aktivitas antimikroba.

## Uji Aktivitas Antimikroba
Pengujian  aktivitas  antimikroba ekstrak dari jamur yang berasosiasi dengan spons Callyspongia sp. diuji pada Staphylococcus  aureus ATCC  25923 untuk  mewakili  bakteri  golongan  Gram positif, Eschrichia  coli ATCC  25922 untuk  mewakili  bakteri  golongan  Gram negatif dan Candida albicans ATCC 1231 mewakili  golongan  jamur.  Penggunaan mikroba uji ini bertujuan untuk mengetahui  bahwa  apakah  ekstrak  kasar dari  jamur  berasosiasi  memiliki  aktivitas sebagai antimikroba serta apakah mempunyai spektrum diperluas yaitu dapat membunuh  bakteri  Gram  positif,  Gram negatif  dan  jamur  atau  mempunyai spektrum  sempit  yaitu  hanya  dapat membunuh  salah  satu  dari  bakteri  Gram positif,  Gram  negatif  atau  jamur.  Dalam pengujian,  menggunakan  metode  difusi agar. Metode difusi dilakukan dengan cara disc  diffusion (difusi  cakram)  yaitu  kertas cakram yang berisi agen antmikroba untuk menentukan aktivitas antimikroba. Metode difusi  cakram  dipilih  karena  memiliki kelebihan  dapat  digunakan  untuk  senyawa non  polar,  cepat,  mudah  dan  sederhana (Valgas et  al .,  2007).  Kertas  cakram  yang berisi  agen  antimikroba  diletakkan  di permukaan  media  agar  yang  sebelumnya telah  diinokulasi  mikroorganisme  uji. Agen  antimikroba  akan  berdifusi  dari kertas  cakram  menuju  media  agar  dan melakukan  penghambatan  pertumbuhan
mikroorganisme  yang  diuji.  Area  jernih mengindikasikan adanya
hambatan pertumbuhan  mikroorganisme  oleh  agen antimikroba  pada permukaan media agar.
Dalam pengujian, hasil yang diperoleh  yaitu  terbentuknya  zona  hambat disekeliling cakram  yang berukuran 6 mm yang ditandai dengan area bening. Hal  ini menunjukkan  bahwa  adanya  kepekaan mikroba  terhadap  ekstrak  jamur  yang diisolasi  dari  spons  genus Callyspongia serta antibiotik kolamfenikol yang digunakan sebagai kontrol positif.
Pengujian  ini  dilakukan  sebanyak  3  (tiga) kali  pengulangan  dengan  tujuan  untuk lebih  mengakuratkan  hasil  pengujian  yang diperoleh. Kemampuan penghambatan pertumbuhan  mikroba  uji  dipresentasikan oleh  terbentukanya  zona  bening  pada pengujian  aktivitas  antimikroba.  Jamur yang berasosiasi dengan spons Callyspongia mampu mengahasilkan senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid,  terpenoid,  steroid,  flavonoid,
kuinon, fenol, dan lain sebaginya.
Senyawa-senyawa  ini  sebagian  besar mempunyai  potensi  sebagai  senyawa bioaktif (Tan dan Zou, 2001).
Hasil  pengukuran  diameter  zona hambat  dari  ekstrak  jamur  yang  diisolasi dari  spons  genus Callyspongia dilakukan hanya pada satu konsentrasi yaitu konsentrasi  250μg.  Dalam  pengujian  ini digunakan  kontrol  positif  dan  negatif. Penggunaan  kontrol  positif  berfungsi sebagai  kontrol  dari  zat  uji,  dengan membandingkan  diameter  daerah  hambat yang terbentuk (Dwijendra, 2014).
Sedangkan  tujuan  penggunaan  kontrol negatif  agar  dapat mengetahui  ada tidaknya pengaruh pelarut terhadap pertumbuhan  mikroba  uji,  sehingga  dapat dipastiikan bahwa aktivitas yang ditunjukkan  oleh  ekstrak  ialah  senyawa
yang  terkandung  dalam  sampel  bukan berasal dari pelarut yang digunakan.
Diameter  zona  hambat  diukur secara horizontal dan vertikal menggunakan  jangka  sorong.  Rata-rata hasil  pengukuran  diameter  zona  hambat disajikan pada Tabel 1.
Tabel  1 . Hasil  pengkuran  rata-rata diameter zona hambat antimikroba ekstrak jamur  yang  berasosiasi  dengan  spons Callyspongia sp.  terhadap  bakteri S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 dan jamur C. albicans ATCC 1231. perlakuan Rata-Rata Diameter Zona Hambat SA EC CA EEA 11,6 9,66 14,00 K (+) 14,16 12,50 20,00 K (-) 0,00 0,00 0,00 Keterangan: EEA  : Ekstrak Etil Asetat K (+)  : Kontrol Positif K (-)  : Kontrol Negatif SA : Staphylococcus aureus EC : Escherichia coli CA : Candida albicans
Perhitungan  rata-rata  uji  daya hambat ekstrak jamur laut yang berasosiasi dengan  Spons Callyspongia sp.  mengikuti Ahmad A. Adam (2014), rata-rata diameter  daya  hambat  ekstrak  jamur  yang berasosiasi dengan spons Callyspongia sp. terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus yaitu  sebesar  11,16,  sedangkan  antibiotik kloramfenikol  (30μg/ml)  sebesar  14,16. Kontrol  negatif  tidak  memperlihatkan adanya daya hambat. Rumus luas lingkaran  yaitu  Luas ꞊ π x r 2 , dengan  π ꞊ 3,14  dan  r  ꞊  jari-jari  atau  diameter lingkaran dibagi dua. Rereata jari-jari zona hambat  ekstrak  jamur  yang  berasosiasi dengan  spons Callyspongia sp.  adalah
5,58.  Dengan  demikian  luas  zona  bening yang  dihasilkan  yaitu  3,14  x  5,58  ꞊ 17,5212  mm.  Rerata  jari-jari  zona  hambat antibiotik  kloramfenikol  (30μg/ml)  yaitu 7,08.  Dengan  demikian  Luas  zona  bening yang  dihasilkan  yaitu  3,14  x  7,08  ꞊ 22,2312  mm.  Perbandingan  efektivitas ekstrak  kasar  dari  jamur  berasosiasi terhadap antibiotik kloramfenikol (30μg/ml) dalam
menghambat pertumbuhan S.  aureus dapat  dihitung berdasarkan  rumus  V1  :  M1  ꞊  V2  :  M2, dengan V merupakan luas zona bening dan M  merupakan  konsentrasi  ekstrak.  Jadi 17,5212  :  M1  ꞊  22,2312  :  30  μg/ml, sehingga  17,5212  :  M1  ꞊  0,74104  dan menghasilkan  M1  ꞊  23,644.  Dengan demikian  konsentrasi  ekstrak  kasar  jamur yang berasosiasi dengan spons
Callyspongia
sp. (250μg/ml) yang menghambat  pertumbuhan  bakteri S. aureus dengan  rerata  diameter  11,16 setara dengan konsentrasi antibiotik kloramfenikol 23,644 μg/ml.
Rata-rata  diameter  daya  hambat ekstrak  jamur  yang  berasosiasi  dengan spons Callyspongia sp.  terhadap  bakteri Escherichia  coli yaitu  sebesar  9,66 sedangkan antibiotik kloramfenikol (30μg/ml)  sebesar  12,50.  Rerata  jari-jari zona hambat ekstrak jamur yang berasosiasi dengan spons Callyspongia sp. adalah  4,83.  Dengan  demikian  luas  zona bening yang dihasilkan yaitu 3,14 x 4,83 ꞊ 15,1662  mm.  Rerata  jari-jari  zona  hambat antibiotik  kloramfenikol  (30μg/ml)  yaitu 6,25.  Dengan  demikian  Luas  zona  bening yang dihasilkan yaitu 3,14 x 6,25 ꞊ 19,625 mm.  Perbandingan  efektivitas  ekstrak kasar jamur berasosiasi terhadap antibiotik kloramfenikol (30μg/ml) dalam menghambat  pertumbuhan E.  coli dapat dihitung berdasarkan rumus V1 : M1 ꞊ V2
:  M2..  Jadi  15,1662  :  M1  ꞊  19,625  :  30
μg/ml, sehingga 15,662 : M1 ꞊ 0,6541 dan menghasilkan  M1  ꞊  23,1863.  Dengan demikian  konsentrasi  ekstrak  kasar  jamur berasosiasi dengan spons Callyspongia sp.
(250μg/ml) yang
menghambat pertumbuhan  bakteri E.  coli dengan  rerata diameter  9,66  setara  dengan  konsentrasi antibiotik kloramfenikol 23,944 μg/ml.
Rerata jari-jari zona hambat ekstrak jamur  yang  berasosiasi  dengan  spons Callyspongia sp.  adalah  7,00.  Dengan demikian luas zona bening yang dihasilkan yaitu 3,14 x 7,00 ꞊ 21,98 mm. Rerata jari- jari  zona  hambat  antibiotik  kloramfenikol (30μg/ml)  yaitu  10,00.  Dengan  demikian Luas  zona  bening  yang  dihasilkan  yaitu 3,14  x  10,00  ꞊  31,4  mm.  Perbandingan efektivitas  ekstrak  kasar  jamur  berasosiasi terhadap antibiotik kloramfenikol (30μg/ml) dalam menghambat pertumbuhan C.  albicans dapat  dihitung berdasarkan  rumus  V1  :  M1  ꞊  V2  :  M2. Jadi  21,98  :  M1  ꞊  31,4  :  30  μg/ml, sehingga  21,98  :  M1  ꞊  1,0467  dan menghasilkan  M1  ꞊  20,993.  Dengan demikian  konsentrasi  ekstrak  kasar  jamur berasosiasi dengan spons Callyspongia sp.
(250μg/ml)
yang menghambat
pertumbuhan  bakteri C.  albicans dengan rerata  diameter  14,00  setara  dengan konsentrasi antibiotik kloramfenikol
20,999 μg/ml.
Penggolongan kekuatan daya antimikroba  menurut  Davis  and  Stout (1971), yaitu  jika diameter zona bening < 5 mm dikategorikan lemah, zona bening 5- 10 mm dikategorikan sedang, zona bening 10-20  mm  di  kategorikan  kuat  dan  zona bening  >  20  mm  dikategorikan  sangat kuat.  Berdasarkan  penggolongan  daya antimikroba  menurut  Davis  and  Stout (1971),  maka  rata-rata  diameter  daya antimikroba  ekstrak  jamur  berasosiasi dengan spons genus Callyspongia terhadap
bakteri Escherichia  coli (9,66  mm) tergolong  kategori  sedang. Sedangkan pada bakteri Staphylococcus aureus (11,16
mm)  dan  jamur Candida  albicans yaitu (20,00  mm)  tergolong  kategori  kuat.  Hal ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak  jamur endofit  dari  spons Callyspongia sp. memiliki  aktivitas  antimikroba  yang  lebih peka pada bakteri Gram postitif, dibandingkan bakteri Gram negatif. Hal ini dikarenakan S.  aureus merupakan  bakteri Gram  positif dimana, jenis  dari bakteri  ini memiliki dinding sel yang lebih sederhana dibandingkan bakteri Gram negatif sehingga senyawa antimikroba lebih mudah  masuk  ke  dalam  sel  bakteri.
Menurut  Pelczar  (1998)  menyatakan bahwa  bakteri  Gram  positif  memiliki dinding sel yang lebih banyak peptidoglikan, sedikit lipid dan dinding sel mengandung  polisakarida  (asam  teikoat). Kerusakan  sel  bakteri  tersebut  akan menyebabkan  terhambatnya  biosintesis enzim-enzim  spesifik  yang  diperlukan dalam suatu reaksi metabolisme.
Sedangkan  bakteri  Gram  negatif  lebih banyak mengandung lipid, sedikit peptidoglikan  dan  memiliki  membran  luar berupa  bilayer  yang  berfungsi  sebagai pertahanan selektif untuk senyawa- senyawa yang keluar dan masuk dalam sel bakteri.  Sedangkan  pada  jamur Candida albicans memiliki daya hambat pertumbuhan  mikroba  yang  baik  pada jamur  dengan  rata-rata  diameter  zona hambat yaitu 20,00 mm.
Interpretasi  zona  hambat  dari  hasil kultur  yang  diuji  dikatakan  resisten  jika diameter  zona  hambat  ≤  10  mm, intermediet  jika  zona  hambat  11-15  mm, dan  dikatakan  rentan  jika  diameter  zona hambat ≥ 16 mm. Dengan demikian dapat dikatakan  bahwa S.  aureus dan E.  coli
resisten  terhadap  ekstrak  jamur  yang berasosiasi dengan spons Callyspongia sp. dan C.  albicans intermediet  terhadap ekstrak jamur berasosiasi.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang telah  dilakukan  dapat  disimpulkan  bahwa isolat jamur yang berasosiasi dengan spons Callyspongia sp.  yang  diperoleh  dari Teluk  Manado  memiliki  daya  antimikroba yang dikategorikan sedang terhadap bakteri E. coli dan daya antimikroba yang dikategorikan  kuat  terhadap  bakteri S. aureus dan jamur C. albicans.

## SARAN
Perlu diperhatikan sterilisasi selama  penelitian  di  dalam  Laboratorium dan pengamatan perlakuan harus dilakukan lebih  dari  1  x  24  jam  masa  inkubasi,  agar dapat diketahui metabolit yang terkandung dalam  ekstrak  jamur  berasosiasi  bersifat bakterisida atau bakteriostatik.

## DAFTAR PUSTAKA
Adam,  A.  A.,  2014.  Aktivitas  Antibakteri
Ekstrak Kasar Tunikata Polycapra aurata terhadap Streptococcus  mutans . Dentire Journal . 2(3) .
Arnold, A. E., Maynard, Z., Gilbert, G. S., Coley, P. D., Kursat, T. A. 2000. Are Tropycal Fungal Endophytes Hyperdiverse. Ecology  Latters . 3(3) :267-274.
Davis,  W.W.  and  Stout,  T.R.  1971. Disc Plate Methods of Microbiological Antibiotik Assay .
Microbiology.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000. Parameter Standard Umum Ekstrak Tanamn Obat . Direktorat Jenderal Pengawasan  Obat  dan  Makanan, Jakarta. Dwijendra, I. M. 2014. Aktivitas Antibakteri  dan  Karakterisasi Senyawa Fraksi Spons Lamellodysidea  herbacea  yang Diperoleh  dari  Teluk  Manado [skripsi].  Program  Studi  Farmasi FMIPA Universitas Sam Ratulangi, Manado.
Edrada,  R.  A.,  Heubes,  M.,  Brauers,  G.,
Wray, V., Berg, A., Grafe, U., et al .  2002.  Online  Analysis  of Xestodecalactones  A-C,  Novel Bioactive  Metabolites  from  the Fungus Penicillium cf. Montanense and Their Subsequent  Isolation  From  the Sponge Xestospongia  exigua . Journal Natural Product .
(65) :188-192.
Elbandy, M., Shinde, P. B., Hong, J., Bae,
K.  S.,  Kim,  M.  A.,  Lee,  S.  M., and  Jung,  J.  H.  2009.  α-Pyrones and  Yelow  Pigments  from  the Sponge-derived Fungus Paecilomyces  lilacinus .  Bulletin of  the  Korean  Chemical  Society.
(30) :188-192.
Handayani,  D., et  al .  2012.  Isolation  of
Citotoxic Compunds from Marine  Sponge Petrosia sp. JPB Perikanan . 7(1) :69-76.
Harborne,  J.  B.  1987. Metode  Fitokimia . Edisi ke-2. ITB. Bandung.
Harti, A.S. 2015. Mikrobiologi Kesehatan .
Penerbit Andi, Yogyakarta.
Kementrian Kesehatan RI. 2011. Pedoman Umum  Penggunaan  Antibiotik .
Kementrian  Kesehatan  Republik Indonesia.
Mun’  im,  E.  H.  Dan  Sekarini,  R.  2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam  Spons  Callyspongia  sp. dari  Kepulauan  Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian . 3(2) :127-133. Namikoshi,  M.  2006.  Biologically  Active
Natural  Products  from  Marine Fungi. In  Biomaterials  from Aquatic and Terrestrial Organism. Publishers:  Enfield, USA Ortez, J. H. 2005. Disk Diffusion testing in manual of antimicrobial susceptibility  testing.  Marie  B. Coyle (Coord.  Ed).  American society for Microbiology,
America.
Suciati,  Alrosyidi,  A.  F.,  Erma  N.  2014.
Isolasi dan Skrining Antimikroba Jamur Endofit dari Spong Indonesia. Planta Huada . 2(2) :40-
43.
Suryanto,  E.  2012. Fitokimia  Antioksidan . Putra Media Nusantara, Surabaya.
Tan,  R.  X.  And  Zou,  W.  X.  2001. Endophytes:  a  Rich  Source  of Functional  Metabolites. Natural Product Reports . 18 , p. 448-459. Valgas, C., Souza, S. M. D., Smania, E. F.
A.  and  Artu,  S.  2007.  Screening Methods to Determine
Antibacterial  Activity  of  Natural Products. Brazilian  Journal  of Microbiology . 38, p. 369-380.
Wiese, J., Brigit, O., Martina, B., Rolf, S., Johanes, F. I. 2011. Phylogenetic Identification  of  Fungi  Isolated from  the  Marine  Sponge Tethya aurantium and  Identificationof Their  Secondary  Metabolites. Marine Drugs . 59 (3) :579-585.