## PENDAHULUAN
Apel  merupakan  salah  satu  buah  yang mudah  terserang  oleh  hama  dan  penyakit diantaranya kapang, bakteri, virus, mikoplasma,  dan  nematoda,  serta  beberapa disebabkan oleh patogen yang belum diketahui.  Kerusakan  yang  disebabkan  oleh patogen menyebabkan penurunan hasil produksi  di  perkebunan.  Kerugian  yang disebabkan  oleh  patogen  sangat  bervariasi, bergantung  pada  kemampuan  patogen  dalam menyerang tanaman. [1]
Usaha  budidaya  tanaman  seringkali mendapat hambatan dari organisme pengganggu  tanaman  (OPT).  Organisme pengganggu tanaman dapat merusak,
mengganggu  kehidupan,  atau  menyebabkan kematian pada tumbuhan. Salah satu organisme pengganggu tanaman adalah kapang.  Kapang  patogen  merupakan  masalah utama  pada  perkebunan  yang  menyebabkan penurunan produksi dan menyebabkan kerusakan pada jaringan tanaman. Terdapat 70 penyakit  tanaman  yang  disebabkan  oleh kapang patogen yang diantaranya menyebabkan  busuk  akar,  bintik  daun,  hawar daun, hawar kuncup, busuk buah, bintik buah, kanker, dan busuk pascapanen [1].
Tujuan  penelitian  ini  untuk  mengetahui prevalensi kapang patogen penyebab penyakit pada  batang  tanaman  apel  di  Gabes,  Dusun Junggo, Desa Tulungrejo, Kecamatan
Bumiaji,  Kota  Batu  dan  mengidentifikasi
Prevalensi dan Identifikasi Berdasarkan Sekuen ITS Kapang Patogen Batang
Tanaman Apel Var. Anna (Malus sylvestris (L.) Mill.) di Kota Batu
Ilham Rizqy Isnain 1)* , Suharjono 1)
1) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang
Alamat Korespondensi : Ilham Rizqy Isnain kiky.isnain@gmail.com

## ABSTRAK
Penurunan jumlah pohon apel produktif mengakibatkan rendahnya daya saing apel di dalam negeri. Berkurangnya jumlah tanaman apel produktif salah satunya disebabkan oleh kapang patogen. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi  spesies  kapang  patogen  yang  menyerang  batang tanaman apel berdasarkan sekuen ITS. Sampel diambil dari perkebunan Gabes, Dusun Junggo, Desa Tulungrejo Kecamatan Bumiaji, Kota Batu. Kapang diisolasi dari lima batang bergejala penyakit dan dimurnikan, diuji patogenisitas terhadap bibit tanaman apel, isolasi DNA, dan identifikasi molekular. Berdasarkan hasil penelitian gejala AN3 banyak ditemui pada perkebunan organik dengan prevalensi 59,6 , sedangkan gejala AN5  merupakan gejala penyakit yang paling sedikit dengan prevalensi  1,69. Isolat AN5.2 teridentifikasi sebagai Neofusicoccum parvum yang menyebabkan penyakit busuk kering dan  berakibat  kematian  pada  batang,  sedangkan  isolat  AN3.2  teridentifikasi  sebagai  Aureobasidium pullulans.
Kata  kunci:  Aureobasidium  pullulans,  identifikasi  molekular,  kapang  patogen,  Malus  sylvestris  Mill., Neofusicoccum parvum

## ABSTRACT
Decreasing  number  of  productive  apple  trees  lead  to  the  low  competitiveness  of  domestic apples. Number of productive apple crop caused by pathogenic fungal. This research aims to identified species  of  pathogens  with  symptoms  disease  that  are  found  apple  plantation  base  on  ITS  sequens. Sampels  was  taken  from  organic  plantation  located  on  Gabes,  Junggo,  Tulungrejo  Village,  Bumiaji District, Batu City. Samples taken from stem having symptoms of illness. Pathogenic fungal isolated to patogenisity  test  against  apple  plant  seed,  DNA  isolation,  then  molecular  identification.  Based  on result, AN3 mostly symptoms found of both with the prevalency of 59.6, while AN5 the least symptoms amount found with the prevalency 1.69. AN5.2 identified as Neofusicoccum parvum that causes dry rot and lead to death in the trunk, while AN3.2 were identified as Aureobasidium pullulans.
Keyword:  Aureobasidium  pullulans,  Malus  sylvestris  Mill.,  molecular  identification,  Neofusicoccum parvum, pathogenic fungal
spesies  kapang  patogen  berdasarkan  sekuen ITS.

## METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian.
Penelitian  dilakukan  pada  Bulan  Februari  – Juni  2014.  Sampel  tanaman  apel  diambil  dari perkebunan  Gabes,  Dusun  Junggo,  Desa Tulungrejo,  Kecamatan  Bumiaji,  Kota  Batu. Sampel dianalisis di Laboratorium Mikrobiologi,  Uji  Patogenisitas  dilakukan  di Glass  House,  Isolasi  dan  amplifikasi  DNA kapang  patogen  dilakukan  di  Laboratorium Biologi  Molekuler  dan  Seluler,  Jurusan Biologi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan  Alam,  Universitas  Brawijaya, Malang.  Sekuensing  DNA  kapang  patogen dilakukan di First Base, Malaysia.
Isolasi  Kapang  Patogen  dan  Uji Patogenisitas.  Sampel  diambil  dari  batang tanaman  apel  yang  memiliki  gejala  penyakit. Batang tanaman apel diiris pada bagian antara permukaan  jaringan  sehat  dan  yang  terserang penyakit  dengan  luas  permukaan  0,25  cm 2
kemudian
disterilisasi
permukaan
menggunakan  etanol  70  %  dan  dibilas aquades.  Sampel  ditiriskan  dan  ditanam  pada media PDA kemudian diinkubasi selama  ±72 jam.
Kultur biakan kapang patogen yang telah murni  diinfeksikan  pada  bagian  yang  telah disayat  kemudian  dibalut  dengan  plastik parafilm.  Tanaman  kontrol  ditumbuhkan tanpa  diberi  perlakuan  kapang  patogen. Tanaman  diamati  dan  disiram  setiap  hari  [3]. Gejala  penyakit  yang  muncul  dibandingkan dengan  gejala  penyakit  yang  telah  ditemukan pada  perkebunan  apel,  dan  kapang  yang tumbuh  dibandingkan  dengan  kultur  yang telah diisolasi [4].
Identifikasi  Kapang  secara  Fenotipik dan Molekular. Kapang diidentifikasi fenotip dengan  cara  makroskopis  dan  mikroskopis. Karakterisasi  kapang  makroskopis  dengan mengamati  warna,  bentuk,  permukaan,  dan morfologi  koloni.  Analisis  fenetik  (kemiripan karakter  antar  isolat)  dilakukan  dengan menggunakan  NTSYSpc  2.0  (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis
Systems) [5].
Isolasi DNA kapang dilakukan menggunakan  metode  modifikasi  Doyle  dan Doyle  (1987).  Sampel  DNA  diuji  kuantitatif menggunakan spektrofotometri dan uji kualitatif  menggunakan  teknik  elektroforesis.
Sampel DNA digunakan untuk cetakan dalam amplifikasi daerah ITS dengan PCR. Komposisi  PCR  menggunakan  primer  ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) dan ITS4 (5’-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)  masing- masing konsentrasi 10 pmol, 1 µL DNA, 2 µL ddH 2 O,  5  µL  PCR  mix  (i-Taq TM )  [6]. Amplifikasi daerah ITS dilakukan menggunakan  alat  PCR  Thermal  cycler dengan  program  denaturasi  awal  selama  tiga menit  pada  suhu  95  ºC,  denaturasi  selama setengah  menit  pada  suhu  94  ºC,  tahap annealing  selama  20  detik  pada  suhu  55  ºC, dan  tahap  ekstensi  selama  1  menit  pada  suhu 71  ºC  sebanyak  35  siklus,  kemudian ditambahkan  ekstensi  akhir  pada  suhu  72  ºC [7]. Hasil amplifikasi dielektroforesis pada gel agarosa  1,5  %.  Purifikasi  dan  sekuensing amplikon  sekuen  ITS  kapang  patogen dilaksanakan  di  First  Base,  Malaysia.  Sekuen dianalisis  secara  online  pada  Genebank ( www.ncbi.nlm.nih ) dan program MEGA 5.1.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  Isolasi  dan  Uji  Patogenisitas Kapang Patogen. Ditemukan lima tipe gejala penyakit  yang  berbeda  pada  batang  tanaman apel di perkebunan Gabes. Gejala AN3 paling banyak ditemui dengan prevalensi 59,6 % dari 354  pohon  yang  terdapat  di  perkebunan.  Hal ini menggambarkan bahwa lebih dari setengah perkebunan organik terjangkit penyakit dengan  gejala  yang  sama.  Pada  kebun anorganik, gejala AN2 paling banyak ditemui dengan  prevalensi  8,72  %  dari  436  pohon (Tabel 4). Diperoleh 15 isolat kapang patogen dari perkebunan  apel  organik  dan  anorganik Gabes.  Sebanyak  45  bibit  tanaman  apel  yang diinfeksikan dengan isolat patogen yang telah ditemukan  memperlihatkan  respon  yang berbeda-beda  terhadap  patogen  tersebut. Sebanyak  21  bibit  tanaman  selain  kontrol tidak menunjukkan gejala penyakit (sehat), 19 bibit  tanaman  menunjukkan  gejala  penyakit namun  tidak  sama  dengan  gejala  penyakit yang telah ditemukan sebelumnya, dan 5 bibit tanaman  yang  telah  diinfeksikan  dari  dua isolat  berbeda  yakni  AN3.2  dan  AN5.2 menujukkan  gejala  yang  sama  dengan  gejala penyakit  sebelumnya  yang  diperoleh  dari perkebunan  Gabes.  Isolat  AN3.2  dan  AN5.2 merupakan  kapang  patogen  yang  keduanya terdapat pada kebun organik dan anorganik.
Tabel 1. Prevalensi gejala penyakit batang tanaman apel pada kebun organik dan anorganik
Lokasi Kebun Jumlah Pohon Gejala Jumlah Pohon dengan Gejala Penyakit Persentase Gejala Penyakit (%) Organik 354 AN1 9 2,54 AN3 211 59,60 AN5 6 1,69 Anorganik 436 AN1 15 3,44 AN2 38 8,72 AN3 27 6,19 AN4 36 8,26 AN5 11 2,52 Spesies  Kapang  Patogen  Penyebab Penyakit pada Tanaman Apel. Hasil analisis sekuen ITS menunjukkan bahwa isolat AN3.2 merupakan Aureobasidium pullulans sedangkan isolat AN5.2 merupakan
Neofusicoccum  parvum    dengan  masing- masing similaritas 100 %. Isolat AN5.2 secara molekular teridentifikasi sebagai Neofusicoccum  parvum  yang  juga  telah diketahui  sebagai  patogen  yang  seringkali menyerang batang tanaman.
Neofusicoccum parvum diketahui merupakan  patogen  pada  batang  dan  dapat menyebabkan  kerusakan  serius  terhadap tanaman  [8]  [9].  Aureobasidium  pullulans merupakan kapang patogen pada tanaman apel yang menyebabkan russet (kering
kecokelatan) pada buah di beberapa perkebunan New York. Aureobasidium pullulans menyebabkan kerusakan pada jaringan  buah  yakni  permukaan  buah  terlihat melepuh, berkerak, dan pada beberapa bagian buah mengalami keretakan [10].

## KESIMPULAN
Gejala  AN3  banyak  ditemui  pada perkebunan  organik  dan  anorganik  dengan prevalensi  59,6  dan  6,19  %  sedangkan  gejala AN5  paling  sedikit  dengan  prevalensi  1,69 dan  2,52  %.  Isolat  AN3.2  dan  AN5.2 merupakan  kapang  patogen  yang  keduanya terdapat  pada  kebun  organik  dan  anorganik. Isolat  AN3.2  merupakan  Aureobasidium pullulans sedangkan isolat AN5.2 teridentifikasi Neofusicoccum parvum.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  Dosen  pembimbing  dan  penguji  atas bimbingan  dan  saran-saran  yang  telah diberikan,  serta  Bapak  Arif  Budiono  selaku pemilik perkebunan apel.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Jonsson  ,  A.H.  2007.  Organic  apple production  in  Sweden:  Cultivation and  cultivars.  Swedish  University  of Agricultural Sciences, Balsgard. Thesis.
[2] Sandskar, B. 2003. Apple scab
(Venturia  inaequalis)  and  pests  in organic orchards. Diss. (Samanfatning/summary) Alnarp: Sveriges lantbruksuniv., Acta Universitatis agriculturae Sueciae.
Agria, 1401-6249: 378.
[3] Agrios,  G.N.  2005.  Plant  Pathology- Fifth  Edition.  Departemen  of  Plant. Pathology. University of Florida. United States of America.
[4] Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. & Phan H.T. 2008. Diagnostic manual for plant diseases in Vietnam. ACIAR Monograph  No.  129,  210  pp.  ACIAR: Canberra.
[5] Rohlf, F.J. 1998. NTSYSpc:Numerical Taxonomy  and  Multivariate  Analysis System  Version  2.0  User  Guide. Applied Biostatistics Inc.
[6] White,  T.  J.,  T.  Bruns.,  S.  Lee.,  & J.Taylor. 1990. Amplification and direct sequencing  of  fungal  ribosomal  RNA genes  for  phylogenetics.  dalam  PCR protocols:  a  guide  to  methods  and applications. (Ed). Innis , M. A., D. H. Gelfand.,  J.  J.  Sninsky.,  &  T.  J.  White, Academic Press. San Diego.
[7] Lestari, F.W. 2012. Identifikasi filogenetik  kapang  patogen  dari tanaman  apel  di  Kota  Batu.  Jurusan Biologi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu
Pengetahuan Alam. Universitas
Brawijaya: Malang. Skripsi.
[8] Úrbez-Torres  J.R.  2006.  Identification and  distribution  of  Botryosphaeria spp. associated with grapevine
cankers  in  California.  Plant  Disease 90: 1503–1490.
[9] Úrbez-Torres  J.R.  2011.  The  status  of Botryosphaeriaceae  species  infecting grapevines.
Phytopathologia Mediterranea 50: S5–S45.
[10]  Goffinet M.C., Burr T.J., & Heidenreich M.C.  2002.  Anatomy  of  apple  russet
caused  by  the  fungus  Aurobasidium pullulans.  Department  of  Holticultural Sxiences  and  Department  of  Plant
Pathology. Agricultural Experiment Station,  Cornell  University,  Geneva, New York.