## VALIDASI  PENETAPAN  KADAR  KUERSETIN  EKSTRAK  ETANOL  DAUN KEMANGI ( Ocimum sanctum L.) SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
Validation of Determination of Quercetin Content of Ethanol Extract of Basil Leaves (Ocimum sanctum L) by High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Penulis / Author (s)
Evi Kurniawati 1 1 Institut Ilmu Kesehatan Bhakti Wiyata Kediri, Indonesia Tri Puji Lestari 1
Esti Ambar Widyaningrum 1
Penulis Koresponden  : Evi Kurniawati e-mail korespondensi: evi.kurniawati@iik.ac.id
DOI: https://doi.org/10.32382/mf.v20i1.458 ARTICLE INFO ABSTRACT / ABSTRAK Keywords: One of the Indonesian plants that has medicinal properties is the basil  plant  (Ocimum  sanctum  L).  There  are  several  active substances  contained  in  basil  leaves,  such  as  the  flavonoid compound quercetin, which is known to be found in basil. Quercetin has several very useful biological activities such as antibacterial, anticancer,  antiviral,  and  anti-inflammatory.  Determination  of quercetin  content  in  basil  leaves  requires  a  valid  method.  The selection of an analytical method that has good specificity, linearity, accuracy and precision is a very important aspect in order to obtain acceptable  results.  The  aim  of  this  research  is  to  validate  the determination of quercetin levels contained in the ethanol extract of basil  leaves  (Ocimum  sanctum  L)  using  high-performance  liquid chromatography (HPLC). The HPLC system used is the Shimadzu DGU-20A5R type with a Uv-Vis detector at a wavelength of 374 nm. The stationary phase used was a C18 column with a mobile phase of a mixture of methanol: aqua bi destillate in a ratio of 59:41 which flowed  isocratically  at  a  rate  of  1.2  mL/minute.  Assay  validation parameters  include  selectivity,  linearity,  precision,  and  accuracy tests. The research results showed that the quercetin method was validated  with  all  parameters  meeting  the  requirements.  The linearity  test  produces  a  correlation  value  (r)  =  0.9919,  good selectivity, precision produces an RSD of less than 2% and accuracy produces  a  recovery  percentage  in  the  range  of  98-102%.  The average quercetin content in the ethanol extract of basil leaves is 12.70% w/w.
Basil leaves
Quercetin HPLC
Validation of Methode
Kata Kunci:
Daun kemangi Kuersetin KCKT Validasi metode

## Media Farmasi
https://ojs3.poltekkes-mks.ac.id/index.php/medfar/

## Open access article
Salah satu tanaman Indonesia yang berkhasiat sebagai obat adalah tumbuhan  kemangi  (Ocimum  sanctum  L).  Terdapat  beberapa kandungan zat aktif dalam daun kemangi seperti senyawa flavanoid kuersetin diketahui terdapat dalam kandungan kemangi. Kuersetin memiliki beberapa aktivitas biologi yang sangat bermanfaat seperti antibakteri,  antikanker,  antivirus,  dan  antiinflamasi.  Penentuan kadar  kuersetin  dalam  daun  kemangi  membutuhkan  metode  yang valid. Pemilihan metode analisis yang memiliki spesifitas, linieritas, akurasi dan presisi yang baik merupakan aspek yang sangat penting agar diperoleh hasil yang dapat diterima. Tujuan dari penelitian ini adalah  untuk  melakukan  validasi  penetapan  kadar  kuersetin  yang terkandung dalam ekstrak etanol daun kemangi (Ocimum sanctum L) secara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Sistem KCKT yang  digunakan  adalah  tipe  Shimadzu  DGU-20A5R  dengan detektor Uv-Vis pada panjang gelombang 374 nm. Fase diam yang digunakan adalah kolom C 18 dengan fase gerak campuran methanol :  aqua  bidestilata  pada  perbandingan  59:41  yang  dialirkan  secara isokratik  pada  laju  1,2  mL/menit.  Parameter  validasi  metode penetapan kadar kuersetin meliputi uji selektivitas, linieritas, presisi dan  akurasi.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  metode  KCKT yang  digunakan  tervalidasi  yang  ditunjukkan  dengan  semua parameter  uji  memenuhi  syarat  yang  ditetapkan.  Uji  linieritas menunjukkan nilai korelasi (r) = 0,9919, selektivitas baik, presisi menghasilkan  RSD  kurang  dari  2%  dan  akurasi  menghasilkan persen  rekoveri  pada  kisaran  98-102%.  Rata-rata  kandungan kuersetin dalam ekstrak etanol daun kemangi adalah 12,70% b/b.

## PENDAHULUAN
Berdasarkan  data  dari World  Health Organization (WHO)  obat-obatan  tradisional masih  digunakan  pada  80%  negara  anggota WHO  yang  tersebar  diseluruh  dunia (World Health  Organization ,  2019 )  .  Sampai  saat  ini obat  tradisional  masih  banyak  digunakan  oleh masyarakat Indonesia, karena dianggap berkhasiat  dan  harganya  relatif  lebih  murah (Marwati & Amidi, 2018). Salah satu tumbuhan yang  berkhasiat  sebagai  obat  adalah  tumbuhan kemangi  ( Ocimum  sanctum L).    Tanaman kemangi  dilaporkan  memiliki  berbagai  khasiat seperti anti-hiperlipidemia, hipoglikemik, ansiolitik, hipotensi, anti-inflamasi dan antimikroba. Semua khasiat tanaman kemangi ini sangat  dimungkinkan  karena  keberadaan senyawa  fitokimia  yang  memiliki  aktivitas fisiologis,  antara  lain  alkaloid,  flavonoid, glikosida,  saponin,  triterpenoid,  dan  tannin ( Chaudhary et al. , 2020 ).
Kemangi mengandung berbagai flavonoid  yang  berkontribusi  terhadap  sifat antioksidan  dan  anti-inflamasi.  Beberapa flavonoid  penting  yang  ditemukan  dalam kemangi  adalah  apigenin,  luteolin,  kaempferol, dan  kuercetin  ( Thakur  &  Thapa,  2023 ). Garg (2021) melaporkan  bahwa  jenis  flavonoid  yang signifikan  terkandung  dalam  tanaman  kemangi adalah  berupa kuersetin yang mengindikasikan adanya aktivitas antioksidan yang tinggi.
Terdapat  beberapa  metode  yang  dapat digunakan  dalam  melakukan  penetapan  kadar kuersetin.  Salah  satunya  adalah  metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). KCKT digunakan  untuk  identifikasi  dan  kuantifikasi kadar senyawa dalam proses pengembangan obat dan  telah  digunakan  di  seluruh  dunia  sejak beberapa dekade (Chawla & Ranjan, 2016 ). Garg ( Garg,  2021 )  melaporkan  penetapan  kadar kuersetin dalam kemangi menggunakan metode KCKT,  akan  tetapi  belum  dilakukan  validasi metode  penetapan  kadarnya.  Demikian  juga Sukmawati et  al. (2019) menyatakan  bahwa metode  KCKT  dapat  digunakan  untuk melakukan  penetapan  kadar  kuersetin  yang terdapat dalam ekstrak etanol daun miana, akan tetapi belum dilakukan validasi metode uji yang lengkap,  hanya  dilakukan  pada  uji  linieritas. Kuersetin  yang  terdapat  dalam  teh  hijau  dapat ditentukan  kadarnya  dengan  metode  KCKT menggunakan kolom C 18 sebagai fase diam, dan campuran  akuabides:metanol:asam  fosfat  5% (49:50:1,  v/v)  yang  dialirkan  pada  1  mL/menit sebagai  fase  gerak.  Panjang  gelombang maksimum yang digunakan adalah 370 nm, akan tetapi waktu retensi masih cukup lama yaitu pada 15,495  menit    ( Dwiyoga,  2012 ).  Di  sisi  lain, penentuan  kadar  kuersetin  dalam  ekstrak tanaman  menggunakan  metode  yang  lain  telah dilakukan.  Diantaranya  penetapan  kadar  daun sirsak  dengan  metode  KLT-Densitometri  yang telah  tervalidasi  pada  parameter  selektivitas,
linieritas,  presisi  dan  akurasi (Adelima et  al. , 2016 ).  Penetapan  kadar  kuersetin  juga  dapat dilakukan  dengan  metode  spektrofotometri  Uv- Vis. Diantaranya penelitian yang dilakukan oleh Sudjarwo et  al. (2022) yang  melakukan penetapan  kadar  kuersetin  dalam  ekstrak  daun belimbing wuluh dengan
metode Spektrofotometer  Uv-Vis  yang  tervalidasi  pada parameter  selektivitas,  linieritas,  LOD,  LOQ, presisi  dan  akurasi.  Validasi  metode  analitik adalah  proses  yang  ditetapkan  melalui  studi laboratorium untuk memastikan bahwa karakteristik kinerja metode memenuhi persyaratan  yang  ditetapkan  untuk  tujuan penggunaannya.  Parameter  dalam  validasi metode  meliputi  akurasi,  presisi,  spesifisitas, batas  deteksi,  batas  kuantifikasi,  linieritas, rentang,  dan  ketahanan  ( Harmita,  2004 ). Penetapan  kadar  zat  dalam  matriks  yang kompleks  seperti  dalam  ekstrak  daun  kemangi memerlukan  metode  yang  selektif  dan  valid. Salah satu metode tersebut adalah kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), yang telah digunakan secara  luas  untuk  mengidentifikasi  dan menetapkan  kadar  senyawa  aktif  yang  terdapat dalam  suatu  tanaman  Dengan  melakukan validasi ini, diharapkan dapat memperoleh hasil pengukuran  yang  akurat,  sensitif,  spesifik dan reprodusibel ( Azis & Lawan, 2020 ).
Berdasarkan  uraian  diatas  diperlukan penelitian  terkait  validasi  penetapan  kadar kuersetin  dengan  parameter  uji  selektivitas, linieritas, presisi dan akurasi. Metode yang telah tervalidasi  diharapkan  akan  dapat  digunakan untuk  penetapan  kadar  kuersetin  dalam  ekstrak etanol daun kemangi ( Ocimum sanctum L) secara akurat, sensitif, spesifik dan reprodusibel.

## METODE

## Desain, tempat dan waktu
Penelitian  yang  dilakukan  merupakan penelitian  non  eksperimental  laboratoris. Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium  Analisis Makanan  dan  Minuman  (Amami)  dan Laboratorium Instrument Institut Ilmu Kesehatan Bhakti  Wiyata  Kediri  pada  bulan  November 2022 – Maret 2023.

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini, antara lain Daun kemangi ( Ocimum sanctum L)  yang  diperoleh  dari  Kecamatan  Mantup, Kabupaten  Lamongan  yang  masih  segar,  hijau serta tidak berlubang, etanol 96%, baku standar kuersetin, metanol pro KCKT, aquabidestilata.
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini antara  lain  seperangkat  alat  kromatografi  cair kinerja  tinggi  (KCKT)  (Shimadzu  DGU-
20A5R),  kolom  C 18 ,  membran  filter  0,45  µm, neraca  analitik  (Metler  Toledo),  kertas  saring, labu  ukur,  gelas  ukur,  beaker  glass,  batang pengaduk.

## Langkah-Langkah Penelitian Determinasi Tanaman
Determinasi  tanaman  ditujukan  untuk mengetahui  kebenaran  dari  tanaman  yang  akan digunakan  sebagai  bahan  uji.  Determinasi tanaman  kemangi  ( Ocimum  sanctum L) dilakukan di Institut Ilmu Kesehatan Bhaktiwiyata, Kota Kediri, Jawa Timur. Persiapan Sampel Daun kemangi dicuci untuk
menghilangkan kotoran yang mungkin menempel pada sampel. Kemudian sampel daun kemangi  yang  sudah  dicuci  dirajang  dan dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung  selama  1  minggu  untuk  mendapatkan simplisia  kering.  Setelah  sampel  mengering, digiling  dan  disaring  hingga  menjadi  serbuk halus.  Ekstraksi  dilakukan  dengn  metode maserasi,  dengan  cara  merendam  serbuk simplisia daun kemangi sebanyak 100 g kedalam pelarut  etanol  96%  sebanyak  1500  mL  sampai simplisia  terendam,  dibiarkan  dalam  wadah bejana  tertutup  selama  3  hari,  terlindung  dari paparan  langsung  sinar  matahari  dan  dilakukan pengadukan  secara  berkala.  Residu  dari  proses maserasi  diremaserasi  kembali  dan  ekstrak etanol  cair  yang  dihasilkan  dicampur  dengan hasil penyaringan maserasi pertama. Residu dari remaserasi  dilarutkan  kembali  dengan  cairan penyari  etanol  96%  yang  baru  sebanyak  1200 mL,  kemudian  hasil  penyaringan  digabungkan dan diuapkan untuk mendapatkan ekstrak etanol kental.
Identifikasi Senyawa Flavonoid
Flavonoid diidentifikasi dengan
menggunakan uji Shinoda. Ditimbang sebanyak 1-gram ekstrak, dilarutkan dalam etanol p.a dan disaring. 2 mL arutan ekstrak etanol dimasukan ke  dalam  tabung  reaksi.  Larutan  pembanding kuersetin  dan  larutan  sampel  masing-masing ditambahkan asam klorida pekat (HCl) sebanyak dua  tetes.  Kemudian  ditambahkan  serbuk magnesium  (Mg)  lalu  dikocok  dan  ditunggu sampai  terjadi  reaksi  perubahan  warna.  Jika terjadi perubahan warna menjadi jingga, merah, dan hijau ekstrak dinyatakan positif mengandung flavonoid ( Lisi et al. , 2017 ). Pembuatan  Larutan  Baku  Induk  dan  Baku Pembanding Kuersetin
Baku  kuersetin  ditimbang  sebanyak  25 mg  dan  dilarutkan  dalam  labu  ukur  25  mL dengan  metanol  sampai  tanda  batas  hingga diperoleh  konsentrasi  1000  ppm.  Larutan  baku induk dipipet sebanyak 2,5 mL dilarutkan dalam
labu ukur 25 mL hingga tanda dengan metanol supaya diperoleh larutan baku pembanding 100 ppm (Sukmawati et al. , 2019) Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Larutan baku standar kuersetin 100 ppm dipipet hingga 2 mL ke dalam labu ukur 25 mL dan  diencerkan  dengan  pelarut  metanol  hingga tanda  batas  sehingga  larutan  memiliki konsentrasi  8  ppm.  Larutan  yang  disiapkan diukur  dengan  spektrofotomer  UV-Vis  pada rentang  Panjang  gelombang  300-400  nm. Kemudian  diperoleh  panjang  gelombang maksimum  kuersetin  yang  dapat  digunakan untuk penelitian.

## Penentuan Fase Gerak dan Laju Alir
Penentuan  fase  gerak  dan  laju  alir dilakukan  menggunakan  larutan  baku  standar kuersetin 8 ppm. Kemudian dilakukan pengujian terhadap fase gerak metanol : aquabidestilata (59 :  41;  55  :  45;  dan  54:46  v/v)  serta  laju  alir  1 mL/menit  dan  1,2  mL/menit.  Pengujian  ini dilakukan  untuk  memperoleh  perbadingan  fase gerak dan laju alir dengan waktu retensi tercepat dan laju alir terluas.
Validasi Metode Analisis Uji Selektivitas
Selektivitas ditentukan dengan mengamati kromatogram kuersetin dan menghitung  nilai  resolusi  puncak  kuersetin dengan  puncak  zat  lain  yang  ikut  terdeteksi ( Husnia  &  Budiarti,  2021 ).  Nilai  untuk memenuhi  persyaratan  uji  selektivitas  yaitu minimal  daya  resolusi  sebesar  1,5 (Latimer, 2019 ).

## Uji Linieritas
Uji  linieritas  diperoleh  dengan  kurva kalibrasi pengukuran AUC kromatogram larutan baku  kuersetin  8,  10,  12,  14,  dan  16  ppm menggunakan  sistem  KCKT  yang  telah ditentukan sebelumnya. Setelah itu dibuat kurva kalibrasi dengan membandingkan AUC kromatogram  sumbu  y  terhadap  konsentrasi larutan  baku  kuersetin  sebagai  sumbu  x, kemudian  dihitung  persamaan  garis  regresi  dan koefisien  korelasinya.  Uji  linieritas  dikatakan baik atau hubungan linier jika koefisien korelasi r pada analisis regeresi linier y = bx + a yaitu r mendekati 1 ( Latimer, 2019 ).

## Uji Presisi
Larutan  kuersetin  pada  konsentrasi 100%  disaring  menggunakan  membran  filter 0,45 µm. Kemudian diinjeksikan sebanyak 20 µL ke alat KCKT. Replikasi dilakukan sebanyak 6 kali.  Selanjutnya  menghitung  nilai  %RSD  atau %KV ( Latimer, 2019 ).

## Uji Akurasi
Uji  akurasi  dilakukan  dengan  metode penambahan  baku  atau  metode  adisi  standar. Larutan  sampel  ditetapkan  kadar  kuersetinnya kemudian  ditambahkan  kuersetin  baku  dengan kadar  80%,  100%  120%  dari  kadar  kuersetin yang  telah  ditetapkan  dalam  larutan  sampel. Masing-masing konsentrasi direplikasi sebanyak 3 kali dan dihitung persen rekoverinya (Latimer,
2019 ).

## Penetapan Kadar Kuersetin
Penatapan  kadar  kuersetin  dilakukan sebanyak 3 kali replikasi. Pertama dibuat larutan sampel  induk  dengan  cara  ekstrak  etanol  daun kemangi  ditimbang  sebanyak  25  mg  kemudian dilarutkan dalam labu ukur 25 mL dengan larutan metanol  hingga  tanda  batas.  Kemudian  dibuat larutan  sampel  kerja  dengan  dipipet  2,5  mL untuk  masing-masing  replikasi  kemudian ditambahkan dengan metanol dalam labu ukur 25 mL  hingga  tanda.  Dilakukan  penyaringan  pada masing-masing  replikasi  larutan  sampel  kerja dengan  membran  filter  0,45  µm  lalu  disonikasi selama  20  menit.  Kemudian  injeksikan  20  µL larutan  pada  sistem  KCKT  pada  kondisi  suhu ruang  dengan  fase  gerak,  metanol  pro  KCKT: aquabidestilata  pada  panjang  gelombang  sesuai pengukuran ( Sukmawati et al ., 2019 ).

## Pengolahan dan analisis data
Data  penelitian  berupa  kromatogram, metode  analisis  dinyatakan  valid  jika  hasil  uji tiap  parameter  validasi  memenuhi  persyaratan. Kadar kuersetin dihitung menggunakan persamaan  regresi  linier  yang  merupakan korelasi  antara  konsentrasi  dengan  nilai  AUC ( Area Under Curve ) yang diperoleh dari larutan sampel.  Nilai  AUC  pada  kromatogram  sampel dimasukkan  ke  dalam  persamaan  regresi  linier sebagai y dan nilai x dapat dihitung sebagai kadar kuersetin.

## HASIL Rendemen Ekstrak
Tabel 1.  Rendemen Ekstrak Berat Simplisia Kering (gram) Berat Ekstrak Kental (gram) Rendemen Ekstrak (%) 100 23,42 23,42

## Identifikasi Flavonoid
Tabel 2. Hasil Identifikasi Flavonoid Keterangan Warna Kesimpulan Standar Kuersetin Sampel Merah Jingga Positif Positif
Panjang Gelombang Maksimum Kuersetin
Gambar 1. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Kuersetin
Optimasi Fase Gerak dan Laju Alir Tabel 3. Optimasi Fase Gerak dan Laju Alir Komposisi Fase Gerak (Metanol : Aquabides, v/v) Laju Alir (mL/menit) tR (menit) Luas Area Keterangan 59:41 55:45 54:46 1,0 1,0 1,0 10,912 16,140 - 8791 9377 - - - Tidak terdeteksi 59:41 55:45 54:46 1,2 1,2 1,2 5,654 8,017 8,859 103534 90831 84291 Optimum - - Pada  uji  optimasi  yang  telah  dilakukan diperoleh  hasil  bahwa  fase  gerak  dengan perbandingan metanol : aquabides (59:41), serta laju alir 1,2 ml/menit adalah yang paling optimum
hal ini dikarena pada perbandingan fase gerak dan laju alir tersebut diperoleh waktu retensi tercepat dengan nilai luas area yang paling besar. Uji Kualitatif Tabel 4. Hasil Uji Kualitatif Keterangan Waktu Retensi Standar Kuersetin Sampel 5,381 5,503 Uji Selektivitas Tabel 5. Hasil Uji Selektivitas Puncak Waktu retensi (tR) Lebar Puncak (W) Resolusi (Rs) Efisiensi Kolom (N) Selektivitas (α) Senyawa Lain Kuersetin 1,327 5,607 0,52 3,75 2,14 - 2137 - 4,33 - Syarat - - >1,5 2000 >1
Gambar 2. Kromatogram Kuersetin dalam Ekstrak Etanol Daun Kemangi
Uji Linieritas
Tabel 6. Hasil Uji Linieritas Baku Kuersetin Konsentrasi (ppm) Waktu Retensi Luas Area 8 10 12 14 16 5.411 5.185 5.153 5.151 5.100 118953 160989 196308 255374 320916
Dari konsentrasi dan luas area yang diukur kemudian diplotkan pada kurva regresi dan dihasilkan a = 88552.3,  b = 24920.2x, r 2 = 0,9839, r = 0,9919 Gambar 3. Kurva Baku Kuersetin Uji Presisi Tabel 7. Hasil Uji Presisi y = 24920.2x - 88552.3 R² = 0.9839 R = 0.9919 0 100000 200000 300000 400000 0 5 10 15 20 Lu as Ar ea Konsentrasi (ppm) Kadar (µg/mL)
Replikasi Luas Area 12,48 1 2 3 4 5 6 216897 217533 219287 220776 214271 214947
60
Keterangan:
Pada uji presisi diketahui didapatkan nilai %RSD yang memenuhi persyaratan yakni <2%.

## Uji Akurasi
Tabel 8. Hasil Uji Akurasi Konsentrasi Replikasi Hasil Terukur Perolehan Kembali (%) Syarat (%) 10,24 ppm (80%) 1 2 3 10,16 ppm 10,17 ppm 10,13 ppm 99,21% 99,31% 98,92% 98-102 12,48 ppm (100%) 1 2 3 12,25 ppm 12,28 ppm 12,35 ppm 98,15% 98,39% 98,95% 98-102 15,24 ppm (120%) 1 2 3 15,13 ppm 15,17 ppm 15,19 ppm 99,27% 99,54% 99,67% 98-102
Keterangan :  Pada  hasil  uji  akurasi  diketahui  bahwa  pada  masing-masing  konsentrasi  memenuhi  syarat % recovery yakni pada rentang 98%-102%.
Penetapan Kadar Kuersetin dalam ekstrak Etanol Daun Kemangi
Tabel 9. Penetapan Kadar Kuersetin Ekstrak Daun Kemangi. Replikasi Luas Area Kadar (µg/mL) Rerata kadar (µg/mL) RSD 1 2 3 227898 228779 228175 12,69 12,73 12,70 12,70 0,164% SD 2271.987 Rata-rata 217285.5 %RSD 1.045% Syarat <2%

## PEMBAHASAN
Determinasi  tanaman  bertujuan  untuk membuktikan  bahwa  tanaman  yang  digunakan adalah  benar  tanaman  sampel  penelitian.  Pada hasil determinasi  menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan sebagai sampel penelitian benar daun  kemangi  dengan  nama  latin Ocimum sanctum L. Simplisia  daun  kemangi  ( Ocimum Sanctum L.)  ditimbang  sebanyak  100  gram diesktraksi  menggunakan  metode  maserasi dengan pelarut etanol 96% total sebanyak 4000 mL. Metode ekstraksi maserasi menjadi pilihan karena senyawa target pada penelitian ini adalah flavonoid  yang  bersifat  termolabil.  Dengan memilih metode maserasi maka diharapkan akan dapat  menjaga  senyawa  target  dari  kerusakan karena  metode  ini  tidak  menggunakan pemanasan.  Selain  itu,  metode  maserasi  juga relatif mudah dilakukan, karena hanya dilakukan proses  perendaman  dan  pengadukan  pada  suhu kamar  ( Kurniawati et  al .,  2023 ).  Pelarut  pada penelitian ini menggunakan etanol 96%, menurut Manoppo et  al. (2019) penggunaan  etanol sebagai pelarut dikarenakan sifatnya yang polar serta  universal.  Selain  itu  senyawa  metabolit kuersetin yang akan diambil dari simplisia daun kemangi  juga  bersifat  polar  sehingga  proses ekstraksi menggunakan pelarut polar.
Berat  ekstrak  yang  diperoleh  sebesar 23,42-gram  dengan  persentase  rendemen 23,42%.  Nilai  tersebut  dikatakan  baik  karena lebih  dari  10%, Dewatisari et  al .,  (2018) menyatakan  bahwa  nilai  rendemen  yang  tinggi menunjukkan  banyaknya  komponen  bioaktif yang terkandung di dalamnya.
Senyawa  flavonoid  yang  terkandung dalam ekstrak etanol daun kemangi diidentifikasi menggunakan  uji  shinoda.    Adanya  kandungan flavonoid  dalam  ekstrak  ditandai  dengan terjadinya  perubahan  warna  larutan  baku pembanding  kuersetin  dan  sampel  setelah dilakukan  penambahan  reagen  Mg  dan  HCl pekat, dari hijau menjadi merah. Reagen ini akan mereduksi  inti  benzopiron  pada  flavonoid  yang ditandai dengan perubahan warna menjadi merah atau  merah  jingga  ( Asra et  al. ,  2019 ).  Hal  ini sesuai  dengan  penelitian  yang  dilaporkan ( Kristanti et  al. ,  2008 )  yang  memperlihatkan adanya perubahan larutan menjadi jingga, merah, dan  hijau  tergantung  pada  jenis  flavonoid  yang terkandung  di  dalamnya,  dan  penelitian Garg (2021) yang  menyatakan  bahwa  kuersetin merupakan  salah  satu  jenis  flavonoid  yang terkandung dalam tanaman kemangi.
Dalam  penelitian  ini  dilakukan  optimasi terlebih  dahulu,  untuk  mengetahui  panjang gelombang  maksimum,  laju  alir,  serta
perbandingan fase gerak yang paling baik untuk digunakan  dalam  penelitian.    Penelusuran Panjang gelombang dilakukan pada rentang 300- 450 nm dengan menggunakan spektrofotometer Uv-Vis,    dan  didapatkan  panjang  gelombang maksimum  kuersetin  sebesar  374  nm.  Hasil  ini hampir  mendekati  penelitian  sebelumnya  yang dilakukan  oleh Husnia  &  Budiarti  (2021) dan Sumbe et  al. (2021) .Pengukuran  panjang gelombang  maksimal    ditujukan  untuk mendapatkan  kepekaan  analisis  yang  maksimal sehingga  perubahan  untuk  setiap  konsentrasi dapat  terukur  dengan  seksama (Gandjar  &

## Rohman, 2014)
Pada  optimasi  penentuan  laju  alir  serta perbandingan  fase  gerak  ini  setelah  di running masing-masing  pengujian  selama  15  menit diperoleh  hasil  bahwa  pada  laju  alir  1,2 mL/menit  dengan  fase  gerak  methanol  : aquabidestilata  (59:41,  v/v)  lebih  optimum dengan waktu retensi yang lebih cepat dan area kromatogram  terluas.  Hasil  tersebut  seperti penelitian  sebelumnya  oleh Husnia  &  Budiarti (2021) yang  menunjukkan  bahwa  semakin banyak  metanol  yang  digunakan  dalam perbandingan  fase  gerak  maka  waktu  retensi serta luas area yang diperoleh semakin baik. Ini dapat terjadi karena kuersetin memiliki kelarutan yang  lebih  baik  terhadap  metanol  sehingga kuersetin berinteraksi kuat terhadap metanol . Uji kualitatif pada penelitian ini diketahui bahwa waktu retensi sampel adalah 5,381 menit sementara  waktu  retensi  pada  standar  adalah pada 5,503 menit. Hasil tersebut dapat dikatakan bahwa waktu retensi antara sampel dan standar memenuhi persyaratan yakni masih relatif sama. Dengan hasil tersebut juga dapat dinyatakan pada sampel  ekstrak  daun  kemangi  terdapat kandungan kuersetin di dalamnya.
Uji presisi ditentukan dengan menghitung nilai Relative  Standart  Deviation (%RSD)  atau koefisien variasi (% KV) menghitung persentase RSD  pada  luas  puncak  kromatogram  yang dihasilkan  larutan  uji.  Metode  analisis  pada penelitian  ini  memiliki  nilai  RSD  1,045%  . Menurut Harmita  (2004) suatu  metode dinyatakan  memiliki  ketelitian  tinggi  jika  nilai RSD  yang  diperoleh  <  2%.  Hasil  tersebut menandakan bahwa metode uji yang digunakan dapat memberikan hasil yang hamper sama jika dilakukan pengukuran berulang dalam satu kali seri pengukuran.
Akurasi  menyatakan  keterdekatan  hasil penukuran  dengan  hasil  yang  sebenarnya. Metode akurasi yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  metode  adisi  standar.  Parameter validasi  dinyatakan  dengan  menentukan  persen perolehan  kembali  atau %  recovery pada
konsentrasi 80%, 100%, dan 120%. Berdasarkan nilai %recovery yang  didapatkan  maka  dapat dikatakkan  pada  uji  akurasi  sesuai  syarat  yang ditetapkan Latimer (2019) yaitu 98- 102%.
Pada  uji  linieritas  dapat  diketahui  dari perolehan  kurva  baku  yang  telah  ditentukan sebelumnya.  Dimana  nilai  linieritas  dapat diamati  dari  perolehan  koefisien  korelasi  (r) sebesar  0,9919  yang  mana  nilai  tersebut memenuhi syarat linieritas yakni mendekati 1.
Uji  selektivitas  dilakukan  dengan menghitung  nilai  resolusi  atau  r  dari kromatogram satu dengan kromatogram terdekat.  Dalam  penelitian  ini  diperoleh  bahwa nilai  resolusi  antara  dua  kromatogram  adalah 2,14  yang  mana  nilai  untuk  memenuhi persyaratan  uji  selektivitas  yaitu  minimal pemisahan resolusi sebesar 1,5 ( Latimer, 2019) . Maka  dari  itu  pada  uji  selektivitas  ini  dapat dinyatakan memenuhi persyaratan.
Uji kuantitatif dilakukan bertujuan untuk mengetahui  kadar  kuersetin  yang  terkandung dalam  sampel  ekstrak  daun  kemangi.  Uji kuantitatif  dilakukan  dengan  menginjeksikan sampel ke dalam sistem KCKT sebanyak 3 kali replikasi  kemudian  luas  area  yang  diperoleh dihitung menggunakan rumus persamaan regresi y = 24920,2x – 88552,3 sehingga dapat diperoleh kadarnya.  Hasil  rata-rata  sampel  yang  telah dihitung diperoleh kadar kuersetin untuk sampel ekstrak  daun  kemangi  ( Ocimum  sanctum L) adalah sebesar 12,70 µg/mL.

## KESIMPULAN
Metode analisis penetapan kadar kuersetin  pada  ekstrak  etanol  daun  kemangi ( Ocimum sanctum L.) menggunakan alat KCKT dengan  fase  diam  kolom  C 18 dan  fase  gerak methanol:aquabidestilata  (59:41,  v/v)  pada  laju alir  1,2  mL/menit  memiliki  validitas  yang  baik dan tepat. Kadar kuersetin dalam daun kemangi yang diperoleh sebesar 12,70 µg/mL .

## SARAN
Pengembangan  metode  penetapan  kadar kuersetin  dalam  ekstrak  etanol  daun  kemangi ( Ocimum  sanctum L.)  masih  perlu  dilakukan untuk  memaksimalkan  kadar  kuersetin  yang diperoleh.  Salah  satu  yang  disarankan  adalah melakukan pengembangan metode KCKT secara gradien.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Institut  Ilmu  Kesehatan  Bhakti  Wiyata  Kediri atas  pendanaan  penelitian  hibah  internal,  dan Galih Pandu Santoso (Mahasiswa Program Studi S1  Farmasi    Institut  Ilmu  Kesehatan  Bhakti
Wiyata  Kediri)  yang  telah  memb  proses pelaksanaan  penelitian  sehingga  penelitian  ini dapat terlaksana dengan baik.

## DAFTAR PUSTAKA
Adelima,  S.,  Darmawati,  Asri.,  Sudjarwo.,
(2016) Validasi Metode KLT- Densitometri  untuk  Penetapan  Kadar Kuersetin  dalam  Sediaan  Sirup  Daun
Sirsak (Annona muricata Linn.) , Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, 5(2), pp. 15–19. Asra, R., Azni, NR., Rusdi., Nessa., (2019) Uji aktivitas antioksidan ekstrak etanol fraksi heksan,  fraksi  etil  asetat  dan  fraksi  air daun  kapulaga  (Elettaria  cardamomum (L.)  Maton) ,  Journal  of  Pharmaceutical and Sciences, 2(1), pp. 30–37. Azis,  A.  and  Lawan,  G.R.  (2020) Pengaruh ekstrak kentos kelapa (cocos nucifera L.) terhadap  penurunan  immobility  time sebagai  antidepresan  pada  mencit  (mus musculus) ,  Jurnal  kesehatan  yamasi makassar,  4(1),  pp.  1–8.  Available  at: http://.
Chaudhary, A., Sharma, S., Mittal, A., Gupta, S. &  Dua,  A.,  (2020) Phytochemical  and antioxidant profiling of Ocimum sanctum , Journal of Food Science and Technology, 57(10),  pp.  3852–3863.  Available  at: https://doi.org/10.1007/s13197-020- 04417-2. Chawla,  G.  and  Ranjan,  C.  (2016) Principle, Instrumentation,  and  Applications  of
UPLC:  A  Novel  Technique  of  Liquid Chromatography , Open Chemistry
Journal,  3(1),  pp.  1–16.  Available  at: https://doi.org/10.2174/18748422016030 10001. Dewatisari, W.F., Rumiyanti, L. and
Rakhmawati,  I.  (2018). Rendemen  dan
Skrining  Fitokimia  pada  Ekstrak  Daun Sanseviera sp ., Jurnal Penelitian Pertanian  Terapan,  17(3),  p.  197. Available at: https://doi.org/10.25181/jppt.v17i3.336.
Dwiyoga, A.R.H. (2012) Optimasi dan validasi Metode  penetapan  kadar  kuersetin menggunakan  kromatografi  cair  kinerja tinggi  (KCKT)  fase  terbalik  dalam  teh hijau . Universitas Sanata Dharma. Gandjar,  I.G.  and  Rohman,  A.  (2014) Kimia Farmasi  Analisis .  Yogyakarta:  Pustaka Pelajar.
Garg, P. (2021) HPLC Estimation of Flavanoid (quercetin) of leaves and stem extracts of
Ocimum sanctum and Tinospora cordifolia , The Journal of Phytopharmacology, 10(4), pp. 220–224.
Available at:
https://doi.org/10.31254/phyto.2021.104 01.
Harmita  (2004) Petunjuk  pelaksanaan  validasi metode  dan  cara  perhitungannya ,
Majalah Ilmu Kefarmasian, 1(3), pp. 117–
135. Husnia,  F.H.  and  Budiarti,  A.B.  (2021) Pengembangan Metode Analisis Kuersetin  dalam  Ekstrak  Etanol  Buah Leunca (Solanum nigrum L.) Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi , Media Farmasi, 17(2), p. 108. Available at: https://doi.org/10.32382/mf.v17i2.2209. Kristanti,  A.N.,  Aminah,  N.S.,  Tanjung,  M.  &
Kurniadi, B., (2008) Buku Ajar Fitokimia .
Surabaya: Airlangga University Press. Kurniawati,  E.,  Fitria,  F.  and  Saputra,  C.A.P.
(2023) Pengaruh  metode  ekstraksi terhadap  aktivitas  antioksidan  kentos kelapa (Cocos nucifera l) dengan metode DPPH ,  Jurnal  Dunia  Farmasi,  7(3),  pp. 173–184.
Latimer, G. (2019) Official Methods of Analysis of AOAC International .
Lisi,  A.K.F.,  Lisi,  F.,  Runtuwene,  M.R.J.  & Wewengkang, D.S., (2017) Uji fitokimia dan  aktivitas  antioksidan  dari  ekstrak metanol  bungan  soyogik  (Saurauia bracteosa  DC.) ,  PHARMACONJurnal Ilmiah  Farmasi-UNSRAT,  6(1),  pp.  53– 61.
Manoppo, C.J., Yudistira, A. and Wewengkang,
D.S. (2019) Aktivitas antimikroba ekstrak dan  fraksi  tunikata    (Polycarpa  aurata) yang  dikoleksi  di  selat  lembeh,  bitung terhadap Escherichia coli, Staphylococcus  aureus  dan  Candida
albicans , Pharmacon, 8(1), pp. 243–251. Marwati  and  Amidi  (2018) Pengaruh  budaya, persepsi  dan  kepercayaan  masyarakat terhadap  keputusan  pembelian  obat herbal , Jurnal Ilmu Manajemen, 7(2), pp. 168–180. Sudjarwo, Rovitasari, R. and Prihatiningtyas, S. (2022) Penetapan Kadar Kuersetin dalam Sediaan  Sirup  Daun  Belimbing  Wuluh (Averrhoa  bilimbi)  dengan  Metode Spektrofotometri UV , Camellia, 1(2), pp. 61–68.
Sukmawati, Widiastuti,  Harti and Miftahuljanna (2019) Analisis  kadar  kuersetin  pada ekstrak etanol daun miana (Plectranthus scutellarioides  (L.)  R.Br.)  secara  HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ,  As-Syifa,  11(1),  pp. 38–44.
Sumbe, R., Gawade, A., Kuchekar, A. & C.L, B., (2021) Development and validation of Uv Visible  Spectrophotometric  method  for estimation of quercetin in Tagetes erecta extract , International Journal of Scientific
Research,  12(1),  pp.  40465–40468. Available at: https://doi.org/10.24327/ijrsr.2021.1201. 5703.
Thakur,  A.  and  Thapa,  D.  (2023) Holy  basil (Ocimum  Sanctum)-A  comprehensive review of traditional uses, phytochemical composition,  medicinal  properties  and future directions , Just Agriculture, 3(11), pp. 136–151. Available at: https://www.researchgate.net/publication
/372556755.
World Health Organization (2019) WHO global report on traditional and complementary medicine 2019 .
Open  Access  This  article  is  licensed  under  a  Creative  Commons Attribution  4.0  International  License,  which  permits  use,  sharing, adaptation, distribution, and reproduction in any medium or format, as long  as  you  give  appropriate  credit  to  the  original  author(s)  and  the source, provide a link to the Creative Commons license, and indicate if
changes were made. The images or other third-party material in this article are included in the article’s Creative Commons license unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons license and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this license, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.