Peningkatan Kadar Glucagon Like Peptide -1(GLP-1) Pada Tikus Model Diabetes setelah Pemberian diit Resistant Starch Tipe 3 Pati Singkong ( Manihot Esculanta Crantz )
Increased Plasma GLP-1 Levels after Resistant Starch Type 3 From Cassava Starch
( Manihot Esculanta Crantz ) Diet on Diabetic  Rat
Elly Nurus Sakinah
Laboratorium Farmakologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember Jalan Kalimantan No.37, Jember, Indonesia, 68121 e-mail korespondensi: ellyns.fk@unej.ac.id

## Abstrak
Diabetes  Melitus  (DM)  merupakan  penyakit  akibat  berkurangnya  produksi    insulin  atau  akibat  tubuh  tidak mampu  menggunakan  insulin  secara  efektif,  sehingga  terjadi  peningkatan  konsentrasi  gula  dalam  darah (hiperglikemia). Prevalensi DM diperkirakan mencapai 7,7% atau 439 juta orang pada tahun 2030, dan Indonesia menempati urutan keempat setelah Amerika, Cina dan India. Salah satu upaya untuk memperbaiki kadar gula darah  dan  kadar  insulin  adalah  melalui  stimulasi  efek Glucagon-like  peptide-1 (GLP-1).  Tujuan  penelitian  ini adalah untuk mengetahui efek pati tahan cerna tipe 3 (RS3) pati singkong dalam meningkatkan kadar GLP-1. Penelitian ini merupakan true experimental menggunakan hewan coba tikus wistar jantan (Rattus novergicus) sebagai model diabetes dengan memberi diet tinggi lemak dan injeksi streptozotocin (STZ) dosis rendah. Hewan coba dikelompokkan menjadi 4 kelompok secara acak (1) kontrol negatif dan (2) diet pati singkong, (3) diet RS3 pati  singkong,  (4)  kontrol  positif.  Dilakukan  pemeriksaan  kadar  gula  darah  pada  awal  penelitian  dan  setelah pemberian induksi STZ untuk menentukan kondisi diabetes (gula darah > 200mg/dL).perlakuan diberikan selama 4 minggu. Pada akhir penelitian, tikus diambil darahnya untuk dilakukan pemeriksaan kadar glukosa darah dan kadar GLP1 menggunakan ELISA. Analisis statistik menunjukkan penurunan bermakna kadar gula darah (p<0.05) dan peningkatan bermakna kadar GLP-1 setelah pemberian RS3 pati singkong. Hal ini menunjukkan bahwa RS3 pati singkong berpotensi sebagai terapi nutrisi pada penyekit diabetes mellitus.
Kata kunci : RS3 pati singkong, GLP-1, Gula darah, Diabetes Mellitus

## Abstract
Diabetes  mellitus  (DM)  occur  when  human  body  is  unable  to  produce  enough  insulin  and/or unable  to use  insulin  effectively,  resulting  in  an  increase  of  blood  sugar  levels  (hyperglycemia). Indonesia  has  ranks fourth  after  United  States,  China  and  India  in  the  prevalence  of  DM. Controling blood sugar and insulin levels can be done through the stimulation effect of Glucagon- like peptide-1 (GLP-1). The goal of this study was to determine the effects of resistant starch type 3 (RS3) from cassava starch in increasing plasma GLP-1 levels. This reasearch use male mouse (Ratttus novergicus) as a diabetic model by providing a high-fat diet (HFD) for one  mounth  than combine  with  intraoperitonel injection of  low dose  streptozotocin (STZ).  The  mouse  then grouped into  4  groups  randomly  (1)  normal  or  negative  control,  (2)  cassava  starch  diet,  (3)  RS3  diet,  (4) positive control. Blood  sugar  levels  were  measured before and  after  STZ injection to  determine the  diabetic conditions  (blood  sugar  >  200  mg  /dL).  After  4  weeks  of  dietary  administration  blood sugar   and   plasma GLP-1  levels  were  examined  using  ELISA.  Statistical  analysis  showed decreased in  blood  sugar  levels and increased  in  plasma  GLP-1  levels  after  one  mounth  of  RS3 diet. This research shows that RS3 from cassava starch has a potential role as a nutritional therapy on diabetes mellitus condition.
Keywords: Resistant starch type 3, cassava starch, GLP-1, Blood Sugar, Diabetes Mellitus

## Pendahuluan
Diabetes  Melitus  (DM)  merupakan  penyakit  yang terjadi akibat  berkurangnya produksi   insulin atau akibat  tubuh  tidak  mampu  menggunakan  insulin secara  efektif,  sehingga  terjadi  peningkatan konsentrasi  gula  didalam  darah  (hiperglikemia). Prevalensi  DM  pada  tahun  2030    mencapai  7,7% atau 439 juta orang pada tahun 2030, dan Indonesia menempati urutan keempat setelah Amerika, Cina dan  India  (IDF,  2015).  Salah  satu  penyebab komplikasi  diabetes  adalah  pola  konsumsi  yang tidak seimbang dan asupan karbohidrta serta lemak berlebih.  Penelitian  membuktikan  bahwa  selain dengan  obat  agen  hipoglikemik,  salah  satu  upaya untuk memperbaiki kadar glukosa darah dan kadar insulin adalah melalui stimulasi efek Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) (Leon, 2006).
GLP-1  merupakan  hormon  peptida  yang  terdapat didalam  saluran  cerna  yang  dapat  menstimulasi sekresi insulin dari kelenjar pankreas, memiliki efek proteksi terhadap sel β -pankreas, serta menghambat  sekresi  hormon  glukagon  sehingga dapat  mengontrol  kadar  glukosa  darah  (Holst, 2007). Pada penderita DM tipe 2 terjadi penurunan sekresi  GLP-1  dibanding  dengan  orang  sehat. Sekresi  GLP-1  dapat  distimulasi  segera  setelah mengkonsumsi  makanan  yang  mengandung karbohidrat dan protein. Produksi GLP-1 juga dapat ditingkatkan  melalui  peningkatan  jumlah  asam lemak rantai pendek ( short chain fatty acid /SCFA) yang  merupakan  hasil  fermentasi  komponen karbohidrat tanaman yang tidak dapat dicerna atau Resistant Starch (RS) (Keenan et al, 2015).
RS  adalah  bagian  dari  pati  yang  tahan  terhadap hidrolisis enzim pencernaan amilase sehingga sulit dicerna di dalam usus halus. Di dalam kolon, fraksi pati ini kemudian difermentasi oleh mikroflora usus sehingga menghasilkan asam lemak rantai pendek (Herawati,  2011).  Penelitian  menunjukkan  bahwa konsumsi  makanan  yang  mengandung  RS  dapat memperbaiki  metabolisme  glukosa  dan  resistensi insulin (Bodinham et al, 2014; Keenan et al, 2015). RS tipe 3 (terbentuk karena proses pengolahan dan pendinginan) dari kacang-kacangan dapat menjadi salah satu modalitas pencegahan diabetes meliitus. RS tipe 4 (dihasilkan  dari proses modifikasi secara kimiawi) menghambat terjadinya  resistansi insulin dan  menurunkan  postprandial  glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP; incretin) pada tikus diabetes (Tachibe et al, 2009; Shimotoyodome et al, 2014). Konsumsi  RS  meningkatkan  ekspresi  gen glucagon  like-peptide-1  (GLP-1)  pada  usus  dan plasma, serta meningkatkan toleransi glukosa pada tikus diabetes yang diinduksi dengan streptozotocin (Shimada , 2009).
Suatu makanan dapat dijadikan sebagai sumber RS jika makanan tersebut mempunyai kandungan pati terutama  amilosa  yang  cukup  tinggi.  Singkong memiliki kadar pati 86.21% dan kadar amilosa 24.5- 31%. Sebagai perbandingan, Beberapa umbi seperti ganyong  mempunyai kadar pati 90%  dan amilosa 31.3-38.9%. Kentang mempunyai kadar pati 65.80% dan kadar amilosa 25 %. Kimpul mempunyai kadar pati  85.68%  dan  kadar  amilosa  21.21%.  Singkong memiliki  kandungan  pati  dengan  indeks  glisemik lebihrendah  (48%)  dibandingkan  dengan  jagung (54%),  barley  (61%)  dan  quinoa  (70%)  (  Hidayat, 2006).  RS  tipe  3  (terbentuk  karena  proses pengolahan dan pendinginan) dapat menjadi salah satu modalitas pencegahan diabetes mellitus.

## Metode Penelitian
Desain  penelitian  yang  digunakan  adalah quasy experimental  post-test  only  control  group  design. Penelitian dilakukan pada bulan Februari-April 2017 di  Laboratorium  Fisiologi  Fakultas  Kedokteran Universitas  Jember  dan  Laboratorium  Biokimia Fakultas  Kedokteran  Universitas  Jember.  Populasi penelitian  ini  adalah  tikus  putih  jantan strain Wistar. 16 ekor tikus wistar jantan, dibagi menjadi empat kelompok yaitu KN, K- (DM), P1 (DM + diet pati  singkong),  dan  P2  (DM  +  RS  Tipe  3).  Kriteria inklusi adalah tikus dengan berat  badan (BB)  150- 200 gram, tikus jantan, umur 2-3 bulan, sehat fisik ditandai dengan nafsu makan baik dan berperilaku baik dan normal. Kriteria eksklusi pada penelitian ini adalah  tikus  yang  selama  penelitian  tidak  mau makan,  diare,  dan  mati  sebelum  maupun  selama penelitian berlangsung. Perhitungan menggunakan aplikasi perhitungan sampel G Power versi 3.1 dan didapatkan jumlah sampel 16 ekor dengan 4 ekor di tiap kelompok.
Pati  singkong  kuning  diekstraksi  patinya  dengan cara: umbi dikupas, dicuci, dihancurkan, diekstraksi dengan  air  (umbi:air  =  1:4),  disaring,  diendapkan selama 24 jam, dan dikeringkan dengan oven (suhu 40 0 C),  dan  terakhir  disaring  dengan  saringan  100 mesh.  Pembentukan  RS  Tipe  3  dilakukan  dengan metode autoclaving-cooling yang  dikemukakan Lehmann et  al. (2002).  Sebanyak  20  gram  pati singkong  kuning  dalam  labu  Erlenmeyer  300  ml yang  disuspensikan  dalam  akuades  (20%  b/b). Sampel  kemudian  dipanaskan  pada  suhu  tinggi dalam  autoklaf  121 0 C  selama  1  jam.  Pasta  pati didinginkan  pada  suhu  ruanagan  selama  2  jam, dibekukan pada suhu -20 0 C, terakhir dikeringkan di dalam oven bersuhu 60 0 C. RS Tipe 3 yang terbentuk kemudian digiling dan diayak 60 mesh.
Pembuatan tikus model DMT2 yaitu pemberian diet tinggi lemak / (HFD) dengan pemberian kuning telur
bebek  0,01  mg/kgBB  (Ariantari,  2010).  Empat minggu  setelah  pemberian  diet,  tikus  dipuasakan semalam, hewan kemudian dinjeksikan STZ dengan dosis  rendah  (35mg/kgBB  dalam  0.1M,  pH  4.5) secara intraperitonial (Srinivasan, 2005). Kemudian ditunggu  1  minggu  dan  diukur  kadar  GDP  untuk mengonfirmasi  keadaan  diabetes  pada  hewan coba. Hewan coba diberikan diet sesuai kelompok dan air minum secara ad libitum selama 4 minggu.
Pada akhir penelitian, tikus diambil darahnya untuk dilakukan  pemeriksaan  kadar  glukosa  darah  dan kadar GLP1 menggunakan ELISA. Data yang didapat disajikan  dalam  bentuk  tabel  dan  diolah  dengan menggunakan  analisis  statistik one  way ANOVA dengan dengan tingkat kepercayaan 95% (α=0,05) kemudian  bila  didapatkan  signifikansi  dilanjutkan dengan uji beda

## Hasil Penelitian
Pada  awal  penelitian  rata-rata  kadar  gula  darah puasa (GDP) setelah induksi stz dosis rendah adalah 151,31.  Pemberian  perlakuan  selama  4  minggu menyebabkan  tikus  mengalami  penurunan  kadar gula darah saat puasa sehingga terdapat penurunan rata-rata Kadar GDP pada tikus di akhir penelitian. Penurunan  tertinggi  terjadi  pada  kelompok  P1 sebesar  105  mg/dL  (55,1  %).  Data  lengkap  dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel  1.  Data  rata-rata  Kadar  Gula  Darah  Puasa
Hewan Coba Kelompok GDP awal (mg/dL) GDP akhir (mg/dL) Penurunan (%) K - 84 81 3.4 P1 191 85 55.1 P2 159 93 41.6 K+ 172 113 34.6
Hasil  uji  normalitas Kolmogorov-Smirnov pada kelompok  gula  darah  puasa  awal  maupun  akhir didapatkan  bahwa  data  pada  keempat  kelompok tersebut  berdistribusi  normal.  Selanjutnya  data dapat  diuji  dengan  statistik  parametrik.  Pada  uji anova  didapatkan  perbedaan  bermakna  pada kelompok  GDP  awal  dengan  kelompok  GDP  akhir (p=0,030).
Perbandingan  Kadar  GDP  baik  awal  maupun  akhir dari  masing-masing  kelompok  lebih  jelas  dapat dilihat pada gambar 1.
Gambar 1. Perbandingan Kadar Gula Darah Puasa (GDP) awal dan akhir penelitian
Setiap tikus pada seluruh kelompok diperiksa kadar GLP-1  plasma  setelah  mendapat  perlakuan. Selanjutnya  dibandingkan  antara  masing-masing kelompok. Kadar GLP-1 diperiksa dengan menggunakan  metode  spektrofotometri  dan dinyatakan  dengan  satuan  mg/dl.  Data  lengkap dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Rata-rata kadar GLP-1 hewan coba
Kelompok  Rata-rata Kadar GLP-1 K - 0.0822841630 +  0.0003115 P1 0.0825047470 + 0.0001655 P2 0.0817752835 + 0.0001197 K+ 0.0818360138 + 0.0001861
Hasil  uji  normalitas Kolmogorov-Smirnov pada kelompok  awal  maupun  akhir  didapatkan  bahwa data  pada  kelima  kelompok  tersebut  berdistribusi normal.  Selanjutnya  data  dapat  diuji  dengan statistik parametrik. Hasil uji ANOVA menunjukkan terdapat perbedaan yang bermakna kadar rata-rata GLP-1  antara  kelompok  RS3  pati  singkong  dengan pati singkong (P= 0.000), RS3 pati singkong dengan K+ (P= 0.000) sedangkan antara kelompok RS3 pati singkong  dengan  kelompok  kontrol  normal  (K-) tidak  terdapat  perbedaan  yang  bermakna  (P= 0,121).

## Pembahasan
Pada  penelitian  ini  tikus  wistar  jantan  mendapat pakan standar untuk kelompok kontrol /normal (K- ).  Sedangkan  pada  kelompok  perlakuan  terbagi
84 191 159 172 81 85 93 113 50 100 150 200 250 K- P1 P2 K+ Rat a- rat a Kad ar G u la D ar ah Pu as a Axis Title GDP awal GDP akhir
dalam  tiga  kelompok  yakni  kelompok  DM  dengan diet  RS3  pati  singkong  (P1),  DM  dengan  diet  pati singkong (P2) dan DM dengan pakan standard (K+). Setelah perlakuan selama 4 minggu diperoleh hasil bahwa pemberian pakan diet RS3 pati singkong dan pati  singkong  masing-masing  dapat  menurunkan kadar gula darah tikus wistar jantan sehingga sama dengan  tikus  normal  sedangkan  pada  tikus  DM dengan  pakan  standard  tampak  kadar  gula  darah yang tetap tinggi hingga akhir penelitian. Terdapat perbedaan  penurunan  kadar  gula  darah  antara kelompok diet RS3 pati singkong dan pati singkong tetapi  tidak  signifikan  secara  statistik.  Penurunan kadar gula darah pada kelompok tikus DM dengan diet RS3 pati singkong disertai dengan peningkatan kadar  GLP-1  dalam  plasma  sedangkan  pada  tikus DM dengan diet pati singkong tidak disertai dengan peningkatan  kadar  GLP-1  bahkan  tampak  lebih rendah  dibandingkan  dengan  tikus  DM  dengan pakan standard.
Saat  ini  peneliti  banyak  mengembangkan  analog GLP-1 atau obat yang mampu menghambat enzim Dipenyl Peptidase (DPP) yang mendegradasi GLP-1 di  dalam  plasma  sebagai  obat  Diabetes  Mellitus karena  obat  jenis  ini  tidak  mengakibatkan  efek hipoglikemia  seperti  yang  ditunjukkan  oleh  obat diabetes sebelumnya. Semakin banyak GLP-1 yang diproduksi dan disekresikan ke dalam plasma maka semakin besar GLP-1 yang tidak terdegradasi oleh enzim  DPP  sehingga  semakin  besar  rangsangan yang  diterima  oleh  sel  B  pankreas  dalam menghasilkan  insulin  sehingga  penurunan  gula  di dalam  darah  dapat  lebih  optimal.  (Nurul,  2011) Dalam penelitian ini RS3 pati singkong pati singkong terbukti  mampu  menurunkan  kadar  gula  darah sekaligus meningkatkan kadar GLP-1.
Peningkatan  kadar  GLP-1  pada  tikus  DM  dengan diet  RS3  pati  singkong  terjadi  oleh  karena  setelah menjadi  RS3  pati  singkong,  pati  singkong  tidak dicerna  oleh  enzim  pencernaan  di  dalam  saluran pencernaan tikus sehingga sulit diserap oleh epitel usus halus. Di dalam kolon, fraksi RS3 pati singkong pati  singkong  ini  kemudian  menjadi  media pertumbuhan bagi flora normal usus dalam hal ini adalah  bakteri  asam  laktat  yang  memfermentasi RS3  pati  singkong  menjadi  asam  lemak  rantai pendek  (SCFA).  Asam  lemak  rantai  pendek  ini kemudian  memicu  sel  L  dalam  lumen  usus  tikus untuk menghasilkan GLP-1. Sebagaimana diketahui GLP-1  memiliki  peran  besar  (80%)  dalam peningkatan respon insulin sehingga sekresi GLP-1 yang    lebih  banyak  menyebabkan  kadar  GLP-1 dalam  plasma  juga  meningkat  dan  memicu  sel  B- pankreas untuk menghasilkan insulin lebih banyak dan  mengakibatkan  penurunan  kadar  gula  darah.
(Herawati, 2010; Anderson, 2006; D. L. Topping et al. 2003).

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwa  RS3  pati  singkong  terbukti  dapat menurunkan kadar gula darah serta meningkatkan kadar GLP-1 pada tikus model diabetes mellitus tipe 2 selama perlakuan selama 4 minggu sehingga RS3 pati  singkong  terbukti  dapat  menjadi  modalitas terapi  yang  baru  dalam  pengobatan  penyakit diabetes mellitus tipe 2.

## Ucapan Terimakasih
Penelitian  ini  didanai  DIPA  Universitas  Jember Tahun Anggaran 2016 nomor SP.DIPA- 042.01.2.400922/2016 Tanggal 07 Desember 2015.

## Daftar Pustaka
Anderson  JW. 2006. Diabetes  Mellitus:  Medical nutrition therapy. Dalam: Shils ME, Shike M, Ross AC, Caballero B, Cousins RJ, editor. Modern Nutrition in Health and Disease. Edisi  ke-10.  Philadelphia:  Lippincot Williams and Wilkins. hal.1043- 64
Ariantari, N.P., S.C. Yowani dan D.A. Swastini. 2010. Uji Aktivitas Penurunan Kolesterol Produk Madu Herbal yang Beredar di Pasaran Pada Tikus Putih Diet Lemak Tinggi. Jurnal Kimia 4(1): 15-19.
Bodinham, CL; Smith L; Thomas EL; Bell JD; Swann JR, Costabile A; Russell-Jones D; Umpleby AM,  Robertson  MD.  2014.  Efficacy  of increased resistant starch consumption in human  type  2  diabetes.  Endocrine connection (2014)3: 75-84
David  L.  Topping,  et  al.  2003.  Resistant  Starch  as Prebiotic  and  Synbiotic:  Statebof  the  art.
Proceeding    Of  The  Nutrition  Society.  62: 171-176.
De  León,  D.D.,  Crutchlow,  M.F.,  Ham,  J.Y.N.  and
Stoffers,  D.A.,  2006.  Role  of  glucagon-like peptide-1  in  the  pathogenesis  and treatment  of  diabetes  mellitus. The international journal of biochemistry & cell biology , 38 (5-6), pp.845-859.
Herawati,  H.,  2011.  Potensi  pengembangan produk  pati  tahan  cerna  sebagai  pangan
fungsional. Jurnal Penelitian dan Pengembangan  Pertanian , 30 (1),  pp.31-
39.
Hidayat, B., Widodo, Y.R. and Wirawati, C.U. 2006. Pengaruh  Jenis  Ubi  Kayu  terhadap
Karakteristik  Tepung  Ubi  Kayu  (Cassava
Flour) yang Dihasilkan. Laporan Penelitian Hibah Kompetisi Pemda Propinsi Lampung Tahun Anggaran .
Holst,  J.J.,  2007.  The  physiology  of  glucagon-like peptide  1. Physiological  reviews , 87 (4), pp.1409-1439.
IDF, D.A.G. 2015. Update of mortality attributable to  diabetes  for  the  IDF  Diabetes  Atlas: Estimates  for  the  year  2013. Diabetes research  and  clinical  practice , 109 (3), p.461.
Keenan,  M.J.,  Zhou,  J.,  Hegsted,  M.,  Pelkman,  C., Durham, H.A., Coulon, D.B. and Martin, R.J. 2015. Role of Resistant Starch in Improving Gut  Health,  Adiposity,  and  Insulin Resistance – . Advances  in  Nutrition , 6 (2), pp.198-205.
Lehmann  U.,  G.Jacobash,  dan  D.Schmiedl.  2002. Characterization  of  Resistant  Starch  Type III from Banana (Musa acuminate). Journal of Agricultural and Food Chemistry ; 50(18): 5236-5240.
Shimada,  M.,  Mochizuki,  K.  and  Goda,  T.  2009. Feeding rats dietary resistant starch shifts the  peak  of  SGLT1  gene  expression  and histone  H3  acetylation  on  the  gene  from the upper jejunum toward the ileum. Journal  of  agricultural  and  food chemistry , 57 (17), pp.8049-8055.
Shimotoyodome,  A.,  Suzuki,  J.,  Fukuoka,  D.,
Tokimitsu,  I.  and  Hase,  T.  2009.  RS4-type resistant  starch  prevents  high-fat  diet- induced obesity via increased hepatic fatty acid oxidation and decreased postprandial
GIP in C57BL/6J mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism , 298 (3), pp.E652-E662.
Srinivasan K., B.Viswanad, A.Lydia, C.L.Kaul, dan P. Ramarao.  2005.  Combination  of  high-fat diet-fed  and  low  dose  streptozotocin- induced  ype  2  diabetes  rat  model  and pharmacological screening.
Pharmacological Research 52: 313-320.
Tachibe, M., Kato, R., Sugano, S., Kishida, T. and Ebihara,  K.  2009.  Hydroxypropylated Tapioca  Starch  Retards  the  Development of Insulin Resistance in KKAy Mice, a Type 2  Diabetes  Model,  Fed  a  High‐Fat Diet. Journal of food science , 74 (7).