## IDENTIFIKASI ETIOLOGI DIARE AKUT PADA ANAK DENGAN TEKNOLOGI GABUNGAN REAKSI RANTAI POLIMERASE DAN SPEKTROMETRI MASSA DI RUMAH SAKIT PENYAKIT INFEKSI PROF. DR. SULIANTI SAROSO
Tony Soetanto 1 , Ina Susianti Tima 2
1 RSPI Prof Dr Sulianti Saroso, 2 Departemen Patologi Klinik FKUI/RSCM
Abstrak  : PCR –electrospray  ionization  mass  spectrometry (PCR-ESI/MS),  suatu  peralatan  baru  yang  mampu mendeteksi  hampir  semua  mikroorganisme  patogen,  namun  belum  pernah  digunakan  di  Indonesia.  Tujuan penelitian ini untuk memperoleh pengalaman dengan PCR/ESI-MS dan panel food borne pathogen, mengetahui kelebihan  dan  kelemahan  teknologi  ini.  Rancangan  penelitian  potong  lintang,  menggunakan  spesimen  dari poliklinik  anak,  dilakukan  dari  bulan  juli  2012  hingga  desember  2012,  dan  akhirnya  24  spesimen  diperiksa dengan PCR/ESI-MS. Karakteristik diare terdiri dari 12 dengan lendir, 3 diare berdarah dan 20 hanya diare cair saja. Pada sebagian besar kasus dijumpai lebih dari satu bakteri. Bakteri E. coli FDA29 ditemukan pada kasus disertai  demam  dan  sakit  perut,  namun  tidak  ada  pada  kasus  tanpa  kelainan  tersebut.  Jenis  bakteri  dengan PCR/ESI-MS  berbeda  dengan  kultur.  Metoda  ini  dapat  mendeteksi  bakteri  dalam  waktu  24  jam  dan  sangat bermanfaat  pada  wabah.  Berdasarkan  kemampuan  metoda  ini    untuk  mendeteksi  beberapa  bakteri  dari  satu spesimen,  tampaknya  biayanya  tidak  lebih  mahal  dibanding  kultur.  Metoda  ini  sangat  bermanfaat  untuk surveilans dalam hal menemukan kesamaaan antara penyebab penyakit dan pejamu.
Kata kunci : Diare, PCR-ESI/MS

## ETIOLOGY IDENTIFICATION OF ACCUTE DIARRHEA IN CHILDREN USING THE COMBINED POLYMERASE CHAIN REACTION AND MASS SPECTROMETRY IN INFECTIOUS DISEASE HOSPITAL PROF DR SULIANTI SAROSO
Abstract  : PCR –electrospray  ionization  mass  spectrometry  (PCR-ESI/MS),  a  new  equipment  that  can  detect almost  all  human  patogenic  microorganism,  but  never  used  before  in  Indonesia.The  aim  of  this  study  to    get experience  wit h PCR/ESI-MS  and    panel  food  borne  pathogen,  to    know  the  profile  of  bacteria  that  caused diarhea  by    PCR/ESI-MS,  and  know  the    advantage  and  handicapped  of    this  equipment.Study  design  was descriptive  cross  sectional,  using  specimen  from  Child  ambulatory  clinic,  was  done  from  July  2012  until December 2012 and finally 24 was examined with PCR/ESI-MS. Clinical characteristic consist of fever 9 (37,5%), vomiting 17 (70.8%)and abdominal pain 11 (45.8%).  Mayority (75%) got diarhea from 3-5 daily. Characteristic of diarhea, 12 cases with mucus, 3 cases bloody diarhea and 20 cases only liquid faeces. In most cases, we found multiple bacteria . Bacteria E. coli FDA29 was detected on cases with fever and abdominal pain but not found in cases without those manifestation. Type of bacteria in this study was different with cultur result. This method can detect bacteria in 24 hours, and very useful in outbreak, and if we calculate the cost and the ability of this metod to detect several bacteria from single specimen, it seems nearly the same. It seems that this method will be very useful for surveilans ie to find similarity between agent and host.
Keywords: diarrhea, PCR/ESI-MS
Korespondensi : Dr. Tony Soetanto, SpPK RSPI Prof. Dr. Sulianti Saroso Jakarta,Jl.Baru Sunter Permai Raya Jakarta Utara  14340 Phone : 021-6506559 Fax: 021-6401411 Email: tonyrspiss@gmail.com

## PENDAHULUAN
Diare  didefinisikan  sebagai  buang  air besar  cair  atau  lembek  dengan  frekuensi lebih dari 3 kali sehari, dengan atau tanpa darah  dan  atau  lendir  dalam  tinja 1 .
Penyakit  diare  merupakan  penyebab kematian  nomor  dua  pada  anak  usia balita,  dan  tiap  tahunnya,  760  000  anak meninggal  akibat  diare.  Serangan  diare akan mengurangi pemasukan  nutrisi yang diperlukan  untuk  pertumbuhan  anak. Penyakit      diare  merupakan  salah  satu penyebab  utama  malnutrisi  anak,  dan sebaliknya  anak  dengan  malnutrisi  lebih mudah terserang diare 2 .
Penyakit  akibat  makanan  ( foodborne disease ) merupakan  penyakit yang sering
ditemukan  dan  merupakan  ancaman kesehatan  masyarakat  di  seluruh  dunia, disertai  morbiditas  tinggi.  Penyakit  akibat makanan  dapat    mengancam    jiwa, terutama  pada  anak  anak  di  negara sedang berkembang, bahkan dapat mengakibatkan cacat permanen 2 .
Deteksi  bakteri  patogen  di  dalam makanan  merupakan  hal  penting  untuk memastikan  keamanan  rantai  makanan. Secara  tradisional  digunakan  metoda biakan yang  didasarkan pada pemasukan spesimen  ke  dalam  media  nutrisi  untuk memperbanyak  kuman,  sehingga  dapat dilihat pertumbuhannya. Cara konvensional ini sederhana, mudah diadaptasikan  dan  umumnya  tidak mahal.
Meskipun
kepekaannya bagus, pemeriksaannya memerlukan banyak tenaga  terlatih  dan  hasilnya  tergantung pertumbuhan mikroorganisme dalam berbagai  media  biakan  seperti  media enrichment, selektif dan identifikasi.
Kelemahannya,  proses  ini  memerlukan waktu beberapa hari. 3,4
PCR –electrospray ionization mass spectrometry (PCR-ESI/MS),  merupakan pendekatan    baru  dengan  kemampuan mendeteksihampir semua mikroorganisma patogen  terhadap  manusia    secara langsung  dari isolate mikroba  maupun spesimen klinis, dan mampu
mengidentifikasi  secara  genetika  suatu kuman  patogen  yang  belum  diketahui susunan  asam  aminonya.  Keistimewaan teknologi ini mencakup penggunaan electrospray ionization-mass spectrometry pada  produk  PCR  yang  menghasilkan gradien  elektrik  karena  perbedaan  berat molekul.  Bank  data  disusun  dari  kuman yang  telah  diketahui  sebelumnya  dan seluruh genomnya telah diketahui, sehingga memungkinkan identifikasi secara lebih cepat dan mudah dibandingkan melakukan sekuensing asam deoksi ribonukleat (DNA). 4,5
Rumah Sakit Penyakit Infeksi Prof. DR. Sulianti  Saroso  telah  dilengkapi  peralatan dengan teknologi Reaksi
Berantai
Polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR)  yang  dikombinasikan dengan  teknologi  dispersi  elektro  ionisasi dan  spektrometri  massa  untuk    membaca keseluruhan populasi mikroorganisme yang ditemukan. Panel PCR/ESI-MS yang
digunakan  dalam  penelitian  ini  meliputi panel  untuk  memeriksa  bakteri  yang sering dijumpai pada keracunan makanan, dan mampu membedakan tujuh kelompok utama subspecies  Salmonella  enteric : Kelompok  I (Enterica), Kelompok  II (Salamae), Kel  ompok  IIIA (Arizonae),
Kelompok  IIIB (Diarizonae), Kelompok  IV (Houtenae), Kelompok V (Bongori), Kelompok  VI (Indica) dan  Kelompok  VII (Unknown). Selain itu juga dapat mengidentifikasi
Salmonella enterica subspeciesenterica (Kelompok  I)  menjadi beberapa serotype clusters , seperti Newport,  enteritidis,  typhimurium,  typhi, paratyphi,  Saintpaul,  Heidelberg ,  dan lainnya.  Panel  juga  dirancang  untuk deteksi spesies E. coli dan membedakan
E.  coli O55:H7  dan  O157:H7  dari E.  coli lainnya, serta menemukan spesies Shigella ( boydii,  dysenteriae,  flexneri dan sonnei )  maupun  spesies listeria dan membedakan Listeria monocytogenes dari spesies listeria lain. 5
Mengingat  peralatan ini baru pertama kali digunakan  di  Indonesia,  dipandang  perlu untuk  melakukan  uji  coba  teknologi PCR/ESI-MS  dan  panel food  borne pathogen .  Diharapkan  melalui  penelitian ini dapat diketahui kelebihan dan kelemahan  teknologi  baru  tersebut,  serta kemungkinan  penerapannya  dalam  hal diagnostik maupun surveilans.

## METODOLOGI PENELITIAN
Rancangan penelitian ini adalah deskriptif dengan desain penelitian potong lintang.Lokasi  pengambilan  spesimen  di poli  anak  Rumah  Sakit  Penyakit  Infeksi Prof. Dr.Sulianti Saroso. Tempat pemeriksaan spesimen di Instalasi Laboratorium Klinik Rumah Sakit Penyakit  Infeksi  Prof.  Dr.  Sulianti  Saroso. Pelaksanaan  penelitian  dilakukan  sejak juli  2012  hingga  desember  2012.  Subyek penelitian merupakan pasien anak dengan diare  akut  yang  berobat  jalan  ke  Rumah Sakit  Penyakit  Infeksi  Prof.  Dr.  Sulianti Saroso. Kriteria masuk yaitu pasien rawat jalan  di  poli  anak,  kunjungan  pasien merupakan  kunjungan  pertama,  pasien anak  usia  >  5  tahun,  frekuensi  diare > 3, lama  diare  <  3  hari  dan  pasien  /  orang tua/wali setuju mengikuti penelitian
dengan menandatangani formulir pesetujuan ( informed consent ).
Perhitungan  besar  sampel  yaitu  pasien diare  anak  dan  rawat  jalan  pada  tahun 2011 sejumlah 1315 kasus dari keseluruhan  pasien  (46510).  Sehingga prevalensi diare anak   2011=  1315/46510 x 100 = 2,83 %.
Penelitian  ini  memakai  besar  sample untuk  prevalensi  dengan  presisi  5% sehingga  didapatkan  sampel  sebanyak 43.
Bahan  penelitian  meliputi  spesimen feses  kasus  diare.  Pengambilan  bahan dilakukan  melalui  hapusan  rektal,  saat penderita  datang  berobat.  Media  trasport yaitu media Carry Blair dan disimpan pada suhu – 80 0 C.
Pemeriksaan  menggunakan  teknologi PCR/  ESI-MS dengan  panel food  borne pathogen  diawali  dengan  ekstraksi  asam nukleat  dari  spesimen,  secara  otomatis. Selanjutnya  dilakukan  proses  PCR  multi primer,  untuk  amplifikasi  secara in  vitro, fragmen  gen  tertentu  yang  terletak  di antara  pasangan  oligonukleotida  primer spesifik.  Pada  prinsipnya,  teknologi  PCR terdiri  atas  3  tahap  reaksi  berbeda  dalam satu  siklus.Ketiga  tahap  tersebut  meliputi denaturasi, annealing ,  dan  polimerisasi. Pengumpulan  data menggunakan seluruh data  subyek  penelitian  dibuat  dalam bentuk  tabulasi  untuk  dianalisa  secara deskriptif.

## HASIL PENELITIAN
1. Deskripsi  epidemiologi  diare  akut pada  anak  dilihat  dari  manifestasi klinis dan karakteristik diare
a. Jumlah  &  jenis  kelamin  subyek penelitian.
Selama  periode  penelitian  ini  telah didapat  sebanyak  43  kasus  diare  anak akut  yang  berobat  ke  poli  anak  rawat Rumah  Sakit  Penyakit  Infeksi  Prof.  Dr. Sulianti  Saroso  di  Jakarta,  antara  bulan juli  2012  dan  bulan  desember  2012. Namun  hanya  24  spesimen  yang  selesai dianalisa  dengan  PCR/ESI-MS.  Sembilan belas  spesimen  gagal  diperiksa,    karena peralatan  PCR/ESI-MS  di  seluruh  dunia dihentikan  operasionalnya,  dalam  rangka penyempurnaan teknologinya, dan
peralatan  pengganti  diperkirakan  tiba  di RSPI Sulianti Saroso tahun 2015. Mengingat  keterbatasan  waktu  penelitian, diputuskan  hanya  24  spesimen  yang diikutkan dalam penelitian ini.
Berdasarkan  jenis  kelamin,  subyek yang selesai diperiksa terdiri dari 10 anak laki laki dan 14 anak perempuan.
b.  Keluhan pasien berdasarkan anamnesis
Karakteristik keluhan pasien yang meliputi demam  ,  sakit  perut,  mual  dan  muntah, dapat dilihat pada diagram 1
Diagram 1. Karakteristik Keluhan Subyek
c. Frekuensi diare pada subyek penelitian
Pada  diagram  2  dapat  dilihat  distribusi frekuensi  diare  pada  subyek  penelitian, yang terbagi dalam rentang diare per hari antara 1-5, 6-10, dan diatas 10. Berdasarkan frekuensi diare terlihat bahwa  frekuensi  diare  mayoritas  subyek kurang atau sama dengan 5.
Diagram 2. Frekuensi diare

## d.  Karakteristik  diare  pada  subyek penelitian
Karakteristik  diare    pada  subyek penelitian, yang mencakup adanya  lendir, darah,  atau  cair.  Mayoritas  subyek penelitian  mendeskripsikan  diare  sebagai cair,  disusul  lendir,  sementara  darah
0 10 20 30 DEMAM SAKIT PERUT MUNTAH KARAKTERISTIK KELUHAN SUBYEK YA TIDAK 18 5 1 FREKUENSI DIARE < 5 6 -- 10 > 10
hanya
dikeluhkan 3
subyek.
Selengkapnya  dapat  dilihat  pada  diagram 3.

## Diagram 3. Karakteristik diare
3.  Pola  kuman  penyebab  diare  akut anak dengan teknologi PCR/ESI-MS
a. Jumlah Bakteri per subyek penelitian
Pada penelitian ini, ditemukan bakteri penyebab  diare  pada  17  spesimen,  dan tidak  ditemukan  kuman  pada  7  kasus.
Mayoritas  jumlah  bakteri  per  subyek hanya  satu,  namun  ada  yang  lebih  dari satu, bahkan pada satu subyek ditemukan delapan  bakteri.  Selengkapnya    dapat dilihat pada diagram 4.

## Diagram 4. Jumlah bakteri per subyek penelitian

## b. Jenis bakteri yang ditemukan
Jenis bakteri yang dijumpai pada penelitian ini seluruhnya berjumlah 29 jenis bakteri, hampir semuanya E. coli kecuali 3 bakteri yang bukan E.coli , dan selengkapnya dapat dilihat pada tabel 1.

## Tabel 1.  Berbagai jenis bakteri pada penelitian ini
Bakteri n  Bakteri n  Bakteri n  Bakteri n  Bakteri n E coli 1827-9 1 E coli Dec12a 1 E coli ECOR6 1 Salmonella Enterica subsp Enterica serovar Havana PRLSW9 1 E coli ATCC8739 2 E coli 89.0609 1 E coli DEC1a 1 E coli ED1a 1 Enterobacter cloacae 1 E coli IAI1 2 E coli A9619-2 1 E coli DH10B 1 E coli FDA269 1 K oxytoca 1 E coli O 157 not H7 2 E coli B170 1 E coli E2348/69 1 E coli K-12 substr MG1655 1 E coli HS 2 E coli SC373/2 2 E coli B2F1 1 E coli ECOR28 1 E coli LT-91 1 E coli 277-84 2 E coli ECOR38 3 E coli Dec11a 1 E coli ECOR48 1 E coli1758-70 1 E coli 5306-56 2 TD 7

## c. Profil bakteri berdasarkan karakteristik klinis pasien.
Profil  bakteri  yang  ditemukan  dengan  teknologi  PCR-ESI/MS  dan  dikelompokkan berdasarkan  karakteristik  klinis  pasien.  Pada  tabel  2  di  bawah  ini,  terlihat  bahwa  bakteri E. coli FDA  269  merupakan  satu  satunya  bakteri  yang  ditemukan  pada  kelompok  kasus demam, sakit perut, atau muntah.
0 10 20 30 LENDIR DARAH CAIR KARAKTERISTIK DIARE YA TIDAK
Tabel 2. Profil bakteri berdasarkan karakteristik klinis . Demam (+) Demam (-) Sakit perut (+) Sakit perut (-) Muntah (+) Muntah (-) E coli HS E coli HS E coli 277-84 E coli HS E coli HS TD (2) TD (2) TD (4) E coli SC373/2  TD (2) TD (5) E coli 1827-9 (3) E coli 1827-9 E coli 277-84 E coli 5306-56 E coli 277-84 E coli 277-84 E coli 5306-56 E coli 277- 84(1) E coli SC373/2  E coli 89.0609 E coli 5306-56 E coli ATCC8739 E coli ATCC8739 E coli 5306-56 E coli FDA269 1 E coli ATCC8739 E coli 89.0609 E coli ECOR38 E coli ECOR28 (2) E coli A9619-2 E coli ECOR6 E coli DEC1a E coli A9619-2 E coli ECOR6 E coli ECOR38 E coli ATCC8739(2) E coli O 157 not H7 E coli DH10B E coli ATCC8739 E coli O 157 not H7 E coli FDA269 1 E coli B170 E coli 1827-9 E coli E2348/69 E coli B170 E coli SC373/2 E coli IAI1(2) E coli B2F1 E coli 5306-56 E coli ECOR28 E coli B2F1 Salmonella 2 (2) Enterobacter cloacae E coli Dec11a E coli HS E coli ECOR38 (3) E coli Dec11a E coli Dec12a E coli ATCC8739 E coli ECOR48 E coli Dec12a E coli DEC1a E coli1758-70 E coli ED1a E coli DEC1a E coli DH10B E coli A9619-2  E coli IAI1 (2) E coli DH10B E coli E2348/69 E coli B170 E coli K-12 substr MG1655 E coli E2348/69 E coli ECOR38 E coli B2F1 E coli O 157 not H7 E coli ECOR28 E coli ECOR48 E coli Dec11a Salmonella 2 E coli ECOR38 (2) E coli ECOR6 E coli Dec12a Enterobacter cloacae E coli ECOR48 E coli ED1a E coli LT-91 E coli ED1a E coli K-12 substr MG1655 K oxytoca E coli FDA269 1 E coli LT-91 E coli IAI1(2) E coli O 157 not H7 (2) E coli K-12 substr MG1655 E coli SC373/2 (2) E coli LT-91 E coli1758-70 E coli O 157 not H7 Salmonella 2 (2) E coli SC373/2 K oxytoca E coli1758-70 Enterobacter cloacae K oxytoca Catatan
TD : tidak ditemukan bakteri
1 : Ditemukanpada demam, sakit perut dan muntah.
2
: Enterica subsp Enterica serovar Havana PRLSW9

## d.Pola kuman berdasarkan karakteristik diare
Pola kuman berdasarkan karakteristik diare terlihat dalam tabel 3.
Tabel 3.  Profil bakteri berdasarkan sifat diare . Lendir (+) Lendir (-) Darah (+) Darah (-) Cair (+) Cair (-) E coli HS E coli HS TD (3) E coli HS (2) E coli HS (2) E coli 277-84 (2) TD (3) TD (5) E coli 277-84 TD (7) E coli ECOR38 E coli 277-84 E coli 1827-9 (2) E coli 277-84 E coli SC373/2 E coli 1827-9(2) E coli SC373/2 E coli 277-84 (2) E coli SC373/2 E coli 5306-56 TD (5) E coli SC373/2 E coli ATCC8739 E coli 5306-56 E coli 89.0609 E coli 1827-9 Salmonella 2 E coli ECOR38 E coli 89.0609 E coli A9619-2 E coli 5306- 56(2) E coli FDA269 E coli A9619-2 E coli ATCC8739 E coli 89.0609 E coli SC373/2 (2) E coli ATCC8739 E coli ATCC8739 E coli A9619-2 Salmonella 2 E coli B170 E coli B170 E coli ATCC8739 (2) Enterobacter cloacae E coli B2F1 E coli B2F1 E coli B170 E coli Dec11a E coli Dec11a E coli B2F1 E coli Dec12a E coli Dec12a E coli Dec11a E coli DEC1a E coli DEC1a E coli Dec12a E coli E2348/69 E coli E2348/69 E coli DEC1a E coli ECOR38 E coli ECOR38(3) E coli DH10B E coli ECOR38 E coli E2348/69 E coli ECOR38 E coli ECOR28 E coli ECOR48 E coli ECOR48 E coli ECOR38(2) E coli ECOR6 E coli ECOR6 E coli ECOR48 E coli ED1a E coli ED1a E coli ECOR6 E coli IAI1(2) E coli FDA269 E coli ED1a E coli K-12 substr MG1655 E coli IAI1(2) E coli FDA269 E coli LT-91 E coli K-12 substr MG1655 E coli IAI1(2) E coli O 157 not H7(2) E coli LT-91 E coli K-12 substr MG1655 E coli1758-70 E coli O 157 not H7(2) E coli LT-91 Salmonella 2 E coli1758-70 E coli O 157 not H7(2) K oxytoca Salmonella 2 (2) E coli1758-70 Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae K oxytoca K oxytoca Catatan TD : tidak ditemukan bakteri
2 : Enterica subsp Enterica serovar Havana PRLSW9
3.Korelasi antara pemberian antibiotika empiris  dan  deteksi  bakteri  dengan PCR/ESI-MS
Pada  diagram  5  mengenai  kesesuaian antara  pemberian  antibiotika  empirik  oleh klinikus  dan  penemuan  bakteri,  ternyata masih  terdapat  perbedaan  sebesar  83,3 %  antara  pasien  tanpa  antibiotik  empirik namun ditemukan bakteri, dan perbedaan 58,3    %  antara  pasien  dengan  antibiotik namun ditemukan bakteri.

## Catatan
1 : tidak ditemukan bakteri
2
: ditemukan bakteri

## Diagram 5. Kesesuain Pemberian Antibiotik Empirik Dengan Penemuan Bakteri

## PEMBAHASAN
Metoda  konvensional  untuk    deteksi dan  identifikasi  bakteri  patogen  memakai biakan  kuman  yang  diikuti  identifikasi morfologi dan profil biokimia. Pemeriksaan dengan cara kultur memerlukan  waktu  antara  24 –  72  jam dan  selalu  ada  kemungkinan  gagal
apabila  kuman  sulit  atau  tidak  dapat dikultur. 6
Penggunaan  reaksi  rantai  polimerase akan mengamplifikasi DNA sasaran hingga  satu  juta  kali  dalam  waktu  kurang dari  satu  jam,  dengan  kepekaan  hingga satu  bakteri  patogen  saja.  Hal  ini mengakibatkan  PCR  memiliki  kelebihan dibanding kultur dan metoda konvensional lainnya dalam hal spesifisitas, sensitivitas, kecepatan,  akurasi  dan  kemampuan mendeteksi  asam  nukleat  dalam  jumlah sangat sedikit di dalam spesimen. Saat ini mulai  dikembangkan  teknologi  PCR/ESI- MS  menggunakan  primer  cakupan  luas yang  diarahkan  pada conserved  regions dari  genom  bakteri  yang  digabungkan dengan Electrospray  Ionization  Time-Of- Flight (ESI-TOF) dan spektrometri massa, untuk  mendeteksi  dan  mengidentifikasi berbagai patogen tanpa sekuensing asam nukleat.  Kepekaan  dan  resolusi  tinggi memungkinkan spektrometri massa membedakan  berbagai  spesies  mikroba berdasarkan variasi subselular. Metodanya mencakup analisis DNA berdasarkan  perbedaan  massa  diantara rantai rantai DNA dengan komposisi basa berbeda.    Awalnya,      suatu  daerah  DNA yang  berbeda  antar  spesies  maupun subspecies , diamplifikasi dan diidentifikasi massa  amplikon.  Massa  dari  tiap  basa DNA  sudah  diketahui,  sehingga  dapat dicari  jumlah  basa  amplikon.  Komposisi maupun jumlah basa, selanjutnya dibandingkan  dengan  bank  data  untuk identifikasi kuman. Bank data disusun dari kuman  yang  telah  diketahui  sebelumnya dan  seluruh  genomnya  telah  diketahui, sehingga memungkinkan identifikasi secara lebih cepat dan mudah dibandingkan sekuensing DNA. Kelebihannya dibanding sekuensing, karena    PCR-MS  dapat  menganalisa spesimen  yang  mengandung  campuran bakteri,  pemrosesan  lebih  sederhana, lebih  cepat  dan    dapat  mengekstraksi DNA  tanpa  harus  memurnikan  isolasi koloni terlebih dahulu. 8,9
Proses  ekstraksi  DNA  pada  penelitian ini  dilakukan  secara  otomatis,  diawali dengan  pemecahan  dinding  sel  dengan alat Plex-id  bead  beater ,  dilanjutkan dengan ekstraksi asam nukleotida ( Plex-id sample  preparation ),  pemindahan  hasil
Tanpa antibiotik empirik 1 2 Antibiotik empirik 1 2
ekstraksi ( Plex-id
fluid handler ), amplifikasi  dengan Plex-id  thermocycler , dan  terakhir  deteksi  mikroorganisme memakai Plex-id  analyzer .  Pada  setiap pemeriksaan  disertakan  kontrol  internal positif  dan  negatif  untuk  menyingkirkan kemungkinan adanya inhibitor atau kontaminan.  Proses  ekstraksi  dapat  juga dilakukan  secara  manual,  dan  hasilnya dianalisa dengan Plex-id analyzer.
Berdasarkan perhitungan jumlah sampel,  direncanakan  jumlah  subyek sebesar  empat  puluh  tiga  anak  dengan diare  akut,  namun  hanya  24  spesimen subyek  penelitian  yang  dapat  dianalisa dengan  PCR/ESI-MS.  Dua  puluh  empat subyek  penelitian  tersebut,  terdiri  dari  10 (41.7%)  anak  laki  laki  dan  14  (58.3%) anak perempuan.
Manifestasi  klinis  yang  dijumpai  pada subyek penelitian, meliputi muntah sebanyak  17  kasus,  diikuti  sakit  perut  11 kasus  dan  demam  sebanyak  9  kasus. Sebagian besar  subyek (75%)  menderita diare  dengan  frekuensi  antara  <5  kali  per hari,  disusul  20,8%  antara  6-10  per  hari dan  hanya  satu  subyek  (4,16%)  dengan frekuensi  diare  lebih  dari  sepuluh  kali  per hari.  Karakteristik  diare    pada  subyek penelitian  terdiri  dari  diare  berbentuk  cair sebanyak  20  kasus,    lendir  20  kasus  dan darah hanya   3 kasus.
Pada  penelitian  ini,  ditemukan  bakteri penyebab  diare  pada  17  spesimen,  dan tidak  ditemukan  kuman  pada  7  kasus. Jumlah    bakteri    yang  ditemukan  pada satu  spesimen,  bervariasi  antara  satu bakteri  sebesar  33.3  %,  dua  bakteri  dan empat  bakteri  yang  masing  masing sebesar  12.5%,  serta  tiga  bakteri  dan enam  bakteri  yang  berjumlah  4.2%. Mikroba yang ditemukan hampir semuanya didominasi E. Coli , kecuali tiga kasus  yang  berbeda  yaitu Enterobacter cloacae,    Enterica  serovar  Havana ,  dan Klebsiella oxytoca . Tidak ditemukan bakteri  pada  7  spesimen  dapat  berarti tidak  ada  bakteri,  namun  tidak  tertutup kemungkinan  adanya  bakteri  yang    tidak terdeteksi.  Hal  ini  dimungkinkan    karena cakupan    panel food  borne pathogen terbatas pada bakteri enteric pathogen, E. Coli,  Salmonella,  Shigella  dan  Listeria , berdasarkan  primernya  terhadap mutS (DNA  mismatch  repair  protein),  mdh
(malate  dehydrogenase),  prfA  (peptide chain  release  factor) dan iap  (  invasion associated protein).
Selain itu kemungkinan adanya virus sebagai penyebab  diare  tidak  dapat  disingkirkan meskipun  hanya  anak  usia  di  atas  lima tahun  yang  dimasukkan  sebagai  subyek dalam penelitian ini. Bakteri yang dijumpai berbeda  dengan  bakteri  hasil  kultur, karena  memakai  nomenklatur  molekular. Diperlukan suatu penelitian lanjutan untuk mengetahui  kesesuaian  teknologi  ini dengan  kultur  konvensional,  sehingga bermanfaat untuk penatalaksanaan pasien.Teknologi ini akan sangat bermanfaat  pada  surveilans  dan  kejadian luar  biasa,  deskripsi  bakteri  lebih  rinci dapat  hubungan  kausal  antara  bakteri pada  makanan  penyebab  diare  dan bakteri yang dideteksi pada pasien.
Pada  penelitian  ini,  hampir  semua bakteri yang ditemukan merupakan Escherichia  coli .  Meskipun  tanpa  uji kepekaan,  sebaiknya  pemberian  terapi empirik  pada  anak  dengan  diare  akut diarahkan  pada  jenis  antibiotik  yang diperkirakan mampu menghambat pertumbuhan  atau  mematikan E.  coli seperti golongan sefalosporin, amoksisilin, atau trimetoprim – sulfametoksazol.
Apabila  dilihat  jenis  bakteri  yang ditemukan  berdasarkan  pengelompokkan keluhan  subyek,  ternyata  bakteri E.  coli FDA29 hanya dijumpai pada subyek dengan  keluhan  demam,  sakit  perut  atau muntah,  dan  tidak  ditemukan  pada  kasus tanpa  adanya  salah  satu  karakteristik klinis tersebut. Sementara E. coli IAI1 dan E.  coli  ECOR28 ditemukan  pada  kasus demam dan muntah, namun juga dideteksi  pada  kasus  tanpa  sakit  perut, dan  tampaknya  kurang  berkaitan  dengan keparahan penyakit. Berdasarkan pengelompokkan  menurut  sifat  diare, ditemukan  bakteri E.  coli  277-84 dan E coli  SC373/2 pada  kasus    diare  disertai lendir  dan    diare  berdarah,    namun  tidak dijumpai pada klasifikasi diare cair. Selain itu,  spesimen  yang  tidak  terdeteksi bakteri,  lebih  banyak  pada  kasus  diare tanpa  lendir  dan  diare  tanpa  darah, namun  justru  lebih    banyak  pada  kasus diare cair dibanding diare tidak cair. Hal ini diduga  karena  karakteristik  cair  dan  tidak cair  tidak  merepresentasikan  derajat
diare,  dan  tidak  ada  penjabaran  kriteria cair  atau  tidak  cair  dalam  kuesioner, sehingga responden rancu dalam membedakannya. Penelitian lanjutan perlu  dilakukan  untuk  mengelaborasi patogenitas bakteri tersebut di atas.
Apabila    dilihat  kesesuaian  antara rencana  pemberian  antibiotik  empirik  dan penemuan  bakteri,  ternyata  hanya  9 kasus atau 37.5% yang sesuai.
Persentase  terbesar  justru  pada  ketidak sesuaian  antara  penemuan  bakteri  dan pemberian antibiotik empirik yang mencapai  62.5%.  Berdasarkan  hal  ini, dapat  disimpulkan  bahwa  penemuan mikroba  penyebab  diare  masih  sangat menentukan  penanganan  pasien  yang tepat.
Pada  penelitian  ini,  seluruh  proses pemeriksaan dari ekstraksi hingga pembacaan,  apabila  digabungkan  hanya memerlukan  waktu  kurang  dari  24  jam, dan  jauh  lebih  cepat  dibanding  kultur. Selain  itu,  metoda  PCR-ESI/MS  mampu mengidentifikasi berbagai mikroorganisme dalam spesimen tunggal. Awalnya teknologi  ini  dianggap  mahal  karena memerlukan  biaya  investasi  pengadaan alat  dan  ruangan  molekular,  disamping biaya pemeriksaan spesimen  antara lima puluh  hingga  seratus  dolar  per  tes. Namun,  penemuan  bakteri  lebih  dari  satu per spesimen bahkan ada yang 8 kuman, dengan pemeriksaan tunggal, membalikkan asumsi tersebut. Biaya yang dikeluarkan  tidak  lebih  mahal  dibanding melakukan  pemeriksaan    dengan  metoda PCR  konvensional  maupun  kultur  berkali kali  agar  dapat  mendeteksi  bakteri  yang sama  dengan  PCR-ESI/MS,  selain  waktu periksa  yang  jauh  lebih  cepat.    Sama halnya  dengan  pemeriksaan  laboratorium lainnya,  biaya  akan  meningkat  apabila memerlukan  lebih  dari  satu  jenis  panel atau  jumlah  spesimen  terbatas.Kelebihan lainnya,  teknologi  ini  mampu  mendeteksi berbagai  bakteri  dalam  waktu  24  jam, sesuatu  yang  sangat  diperlukan  dalam penanganan kejadian luar biasa. 9
Keterbatasannya, teknologi PCR- ESI/MS
bersifat semikuantitatif, memerlukan intensitas organisme tertentu agar dapat diidentifikasi, serta dipengaruhi
jumlah  primer  dan    yang  dipakai  dan komposisi  database.  Selain  itu,  karena kepekaannya,metoda deteksi spektrometri massa  dapat  terkontaminasi  apabila  tidak menggunakan  reagen  sangat  murni  dan bebas DNA.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh dalam  penelitian  ini,  yaitu  24  subyek penelitian  yang  memenuhi  kriteria  dan pembahasan  yang  telah  dilakukan  dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut:
1. Manifestasi  klinis  yang  dijumpai  pada subyek penelitian, meliputi muntah, sakit perut,  dan  demam.  Sementara  diare berbentuk  cair  merupakan  karakteristik diare  terbanyak, disusul diare lendir dan darah.  Mayoritas  frekuensi  diare  pada subyek  penelitian,  berkisar  antara  1-  5 kali per hari.
2. Pada  penelitian  ini  ditemukan  29  jenis bakteri dan hampir semuanya
didominasi E.  Coli ,  kecuali  tiga  kasus yang berbeda yaitu E. cloacae, Salmonella  Enterica  subsp  Enterica serovar Havana, dan Klebsiella
oxytoca. Jumlah bakteri per subyek penelitian  umumnya  lebih  dari  satu. Bakteri E.  coli  FDA29 merupakan  satu satunya  bakteri  yang  ditemukan  pada kasus  demam,  sakit  perut  dan  muntah namun  tidak  ditemukan  pada  kasus tanpa  manifestasi  klinis  tersebut.  Jenis bakteri  yang  didapat  dengan  PCR/ESI- MS  berbeda  dengan  kultur,  dan  lebih bermanfaat  untuk  surveilans  maupun kejadian luar biasa.
3. Persentase  kesesuaian  antara  terapi antibiotik  secara  empirik  dan  ada tidaknya  kuman  dengan  PCR/ESI-MS ternyata  lebih  sedikit  dibanding  yang tidak sesuai. Hal ini menunjukkan masih pentingnya deteksi mikroorganisme dalam penatalaksanaan diare.
4. Teknologi  ini  terbukti  jauh  lebih  cepat dibanding kultur, dapat mendeteksi lebih dari  satu  bakteri  per  spesimen  dengna deskripsi  lebih  spesifik,  dan  bermanfaat untuk surveilan.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lanjutan untuk  mengetahui  korelasi  antara  bakteri yang dideteksi dengan teknologi PCR/ESI-MS  dengan  biakan mikrobiologi, agar dapat diaplikasikan secara klinis.
Memberikan  masukan  bagi  penentu kebijakan untuk dapat melakukan penerapan  dan  pengkajian  lebih  lanjut teknologi PCR/ESI-MS pada surveilan dan kejadian  luar  biasa  akibat  penyakit makanan.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  WHO.    Diarrhoeal  disease,  WHO  fact sheet  330(internet).  2013  (cited  2015 Jan)  Available  from:  http:  //www. who.int/mediacentre/factsheets/fs330/e n/#content
2.  Betts  R,  Blackburn  C.  Detecting Pathogens  in  Food.  In  Blackburn  C, McClure  P.    Foodborne  pathogens Hazards, risk analysis and control.  1 st ed. Cambridge : Woodhead ; 2002.p.13-45.
3.  Detection,  Identifi  cation,  and  Analysis of  Foodborne  Pathogens.  In  Campos GL,  Joaquin  V,  Suarez  M,  Urda  MA, Alonso  VL.  Microarray  Detection  and
Characterization
of
Bacterial
Foodborne  Pathogens.  Guilermo  :
SpringerBriefs  in  Food,  Health,  and Nutrition;  2012.p.13-32.
4.  Wolk  DM,  Kaleta  EJ,  Wysocki  VH. Review  PCR –Electrospray  Ionization
Mass  Spectrometry.  The  Potential  to Change Infectious Disease Diagnostics in Clinical and Public Health Laboratories  .  JMD  2012  ;  7(4)  :  295- 304.
5.  Abbott  Food-Borne  Bacteria  E  coli, Salmonella, Shigella, and Listeria
Assay Kit. 2010 Abbott Molecular, Inc
6.  Velusamy  V,  Arshak  K,  Korotstynska O,  Oliwa  K,  Adley  C.  An  overview  of foodborne  pathogen  detection:  In  the
perspective  of  biosensors.  Biotech Advances 2010; 28: 232 –54.
7.  Pierce  SE,    Bell  RL,  Hellberg  RS, Cheng CM, Chen KS, Williams-Hill DM, et  all.  Detection  and  Identification  of Salmonella  enterica,  Escherichia  coli, and Shigella spp. via PCR-Electrospray Ionization  Mass  Spectrometry:  Isolate Testing and Analysis of Food Samples.
Appl. Environ. Microbiol. 2012;
78(23):8403 –8411.
8.  Shen JL,  Wang F,  Housley R, Carolan
H, Yasuda I , Burrows E, et all.  Rapid Identification and Differentiation of Non- O157 Shiga Toxin –Producing Escherichia  coli  Using  Polymerase Chain Reaction Coupled to Electrospray Ionization Mass
Spectrometry.    Foodborne  Pathog  Dis. 2013; 10(8) : 1-7.
9.  Wolk  DM,  Kaleta  EJ,  Wysocki  VH. Review  PCR –Electrospray  Ionization Mass  Spectrometry  The  Potential  to Change Infectious Disease Diagnostics in Clinical and Public Health
Laboratories.    JMD. 2012; 14(4): 295- 304. 10. Cunha  BA,  Schoch  PE,  Bottone  EJ, Rex JH, Stollo S. Antibiotic Susceptibillity Profiles and Initial Therapy of Isolates Pending
Suceptibility  Results.  In  :  Cunha  BA. Antibiotic  Essentials.  10 th ed.  London  :
Jones  &  Barlett  Learning.  2011.p.183- 247.