## Research Articles
Optimasi  penggunaan High  Performance  Liquid  Chromatography (HPLC)  untuk  analisis  asam  askorbat  guna  menunjang  kegiatan Praktikum Bioteknologi Kelautan
Novi Angraini 1* , Putri Desmaniar 2
1 Jurusan Ilmu Kelautan, FMIPA Universitas Sriwijaya, Sumatera Selatan, Indonesia
2 Program Studi Ilmu Farmasi, FMIPA Universitas Sriwijaya, Sumatera Selatan, Indonesia

## Received 08 April 2020; Accepted 21 Mei 2020; Published 4 Juni 2020
Keyword:
HPLC; Mangrove;
Ascorbic Acid; Marine Biotechnology ABSTRACT: Marine Biotechnology Practicum is one of the practicums in the Department  of  Marine  Sciences,  FMIPA  Universitas  Sriwijaya.  One  of  the materials  available  is  extract  analysis  by  HPLC.  Extracts  derived  from  marine products such as mangroves will be analyzed for their antioxidant content by HPLC. HPLC with the reverse phase method can be used to determine ascorbic acid  as  an  antioxidant  in  marine  product  samples.  This  method  was  applied using a C18 column of 150 mmL x 46 mmi.d and detected at a wavelength of 264  nm  with  a  mobile  phase  of  0.1%  acetic  acid  and  60:  40  methanol.  This method  will  support  the  activities  of  Marine  Biotechnology  Practicum  at  the Department of Marine Sciences FMIPA in topic of the extract content analysis material  by  HPLC.  @2020  Published  by  UP2M,  Faculty  of  Mathematics  and Natural Sciences, Sriwijaya University
Kata Kunci:
HPLC; Mangrove; Asam Askorbat; Bioteknologi Kelautan ABSTRAK: Praktikum Bioteknologi Kelautan merupakan salah satu praktikum yang  ada  di  Jurusan  Ilmu  Kelautan  FMIPA  Universitas  Sriwijaya.  Salah  satu materi yang ada adalah analisis ekstrak dengan HPLC. Ekstrak yang berasal dari produk laut seperti mangrove akan dianalisis kandungan antioksidannya dengan HPLC. HPLC dengan metode fase terbalik dapat digunakan untuk menentukan asam askorbat sebagai salah satu antioksidan pada sampel produk laut. Metode ini diaplikasikan dengan menggunakan kolom C18 ukuran 150 mmL x 46 mmi.d dan dideteksi pada panjang gelombang 264 nm dengan fase gerak campuran asam asetat 0.1 % dan metanol 60 : 40. Metode ini akan menunjang kegiatan Praktikum Bioteknologi Kelautan yang ada pada Jurusan Ilmu Kelautan FMIPA Unsri pada materi analisis kandungan ekstrak dengan HPLC. @2020 Published by UP2M, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University

## Jurnal Penelitian Sains
Journal Home Page: http://ejurnal.mipa.unsri.ac.id/index.php/jps/index
∗ Corresponding author. E-mail address: angraininovi311@gmail.com
2597-7059 Online, 1410-7058 print/ @2020 Published by UP2M, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University

## PENDAHULUAN
Laboratorium  Bioekologi    Kelautan merupakan  salah  satu  laboratorium  yang  ada  di bawah  Jurusan  Ilmu  Kelautan  FMIPA  Unsri.  Di dalam buku Tata Kelola Laboratorium Bioekologi Laut  tahun  2017  dituangkan  beberapa  mata praktikum yang berkaitan dengan ilmu bioekologi yang  dilakukan  di  laboratorium  ini.  Salah  satu praktikum  yang  dilakukan  adalah  praktikum bioteknologi  kelautan.  Bioteknologi  Kelautan merupakan  salah  satu  teknik  pemanfaatan  biota laut untuk kebutuhan pembuatan atau modifikasi produk,  memperbaiki  kualitas  genetik  dari tumbuhan atau hewan
laut
serta mengembangkan (merekayasa) organisme untuk kebutuhan tertentu termasuk perbaikan lingkungan.  Jadi  praktikum  ini  bertujuan  untuk melatih  mahasiswa  dalam  mengembangkan teknologi  penemuan-penemuan  baru  yang berasal  dari  produk-produk  laut  seperti  adanya kandungan  antioksidan  pada  beberapa  produk laut  untuk  digunakan  sebagai  salah  satu  bahan tambahan sediaan obat atau kosmetik. Dari  segi pengembangan teknologi digunakan alat laboratorium  kategori  III  untuk  proses  analisis yaitu HPLC.
High  Performance  Liquid  Chromatography (HPLC)  atau  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi (KCKT) adalah salah satu instrument yang dipakai untuk teknik analisis pemisahan secara kualitatif, kuantitatif,  pemisahan/isolasi  dan  pemurnian. Kromatografi pertama kali ditemukan oleh Tsweet pada  tahun  1903,  dimana  Tsweet  berhasil melakukan pemisahan pigmen dari daun dengan menggunakan  kolom  berisi  kapur  (CaSO4). Tsweet  juga  menciptakan  istilah  kromatografi untuk  menggambarkan  daerah  berwarna  yang bergerak menuju bawah kolom.
Adanya  proses  adsorpsi  dinamis  dimana molekul  analit  akan  bergerak  melewati  celah berpori merupakan prinsip dasar HPLC. Material kolom  (fase  diam)  akan  berinteraksi  dengan komponen  sampel  sehingga  terjadi  pemisahan. Lamanya  waktu  interaksi  (retention  time) dipengaruhi oleh kekuatan interaksi dari material kolom dan komponen sampel.
HPLC menggunakan dua fase kerja yaitu fase gerak  (mobile  phase)  dan  fase  diam  (stationary phase).  Fase  gerak  berupa  cairan  atau  pelarut yang  berfungsi  untuk  membawa  komponen
campuran menuju detektor sedangkan fase diam adalah fase tetap didalam kolom berupa partikel dengan pori yang kecil dan memiliki area surface tinggi [1,8].

## Gambar 1. Diagram Alir HPLC
Fase  gerak  ditampung  dalam  resorvoir. Botol kaca merupakan jenis reservoir yang paling umum digunakan. Dari reservoir, fase gerak akan dialirkan secara terus menerus dengan kecepatan alir  yang  tetap  oleh  pompa.  Pengaturan kecepatan  alir  fase  gerak  dilakukan  dengan menggunakan  program  dalam  HPLC.  Kemudian sampel  diinjeksikan  melalui  injektor  dan  akan terbawa oleh fase gerak menuju kolom. Didalam kolom  akan  terjadi  proses  pemisahan  dimana komponen  sampel  akan  ditahan  oleh  fase  diam kemudian  akan  larut  oleh  fase  gerak  yang  terus menerus  dialirkan  sehingga  melewati  kolom untuk  menuju  ke  detektor.  Detektor  akan mendeteksi  adanya  komponen  sampel  didalam kolom dan menghitung kadarnya sehingga keluar dalam bentuk angka pada layar komputer.
Hutan  mangrove  adalah  hutan  yang terdapat  di  daerah  pesisir  yang  sangat dipengaruhi  oleh  pasang  surut  air  laut.  Spesies pohon dan semak yang mampu hidup pada   air asin  atau  payau  merupakan  tanaman  yang mendominasi  hutan  mangrove.  Di  masyarakat, hutan  mangrove  dikenal  juga  sebagai  hutan payau  atau  hutan  bakau.  Ternyata  keduanya berbeda.  Hutan  bakau  adalah  hutan  yang  diisi oleh genus Rhizopora sedangkan hutan mangrove diisi  oleh  banyak  genus  dan  jenis  tumbuhan lainnya.  Hutan  mangrove  mempunyai  peranan penting  dalam  menjaga  garis  pantai  untuk menghindari  pengikisan  (abrasi)  serta  dapat meredam hantaman gelombang besar (tsunami).
Asam  Askorbat  (L-Ascorbic  Acid)  adalah nutrisi yang penting dan dibutuhkan oleh manusia dan  hewan  karena  memiliki  aktivitas  sebagai vitamin C [2,7].  Asam  askorbat terbentuk secara
alami dalam tubuh jika terjadi pertemuan didalam sel  dan  mengalami  perubahan  bentuk  karena adanya pengaruh pH.
Termasuk  kedalam  golongan  vitamin antioksidan,  vitamin  C  mempunyai  kemampuan untuk  menangkal  berbagai  radikal  bebas ekstraselular  [3,9].  Karakteristik  vitamin  C  yaitu sangat mudah teroksidasi oleh panas, cahaya dan logam  sehingga  apabila  dipanaskan  terlalu  lama akan menyebabkan vitamin C mudah rusak.
Menurut [3], kandungan vitamin C di alam banyak  ditemukan  pada  berbagai  jenis  sayuran dan buah-buahan seperti lemon, jeruk nipis, apel, dan  nenas.  Tubuh  seseorang  membutuhkan vitamin  C  sampai  1000  mg  atau  lebih  setiap harinya dari dosis yang dianjurkan berkisar 60-90 mg  perhari  [3,4].  Seseorang  yang  mengalami kekurangan kandungan vitamin C akan menderita bibir pecah-pecah atau sariawan dan menyebabkan tubuh menjadi lemas. Akan tetapi kelebihan  kandungan  vitamin  C  di  dalam  tubuh juga  dapat  menyebabkan  gangguan  yaitu  tubuh akan menjadi kurus dan pucat [3].
Kadar asam askorbat pada berbagai produk dapat diketahui dengan beberapa metode analisis anatara lain dengan metode titrasi, metode DPPH dengan  spektrofotometer  Uv-Vis  dan  dengan metode  HPLC.  Metode  yang  paling  sering digunakan  adalah  metode  titrasi  dan  metode DPPH dengan spektrofotometer Uv-Vis [5,10].

## METODE PENELITIAN

## Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah bahan- bahan pro analisis seperti L-Ascorbic Acid (Merck) sebagai standar, Etanol 70 %, Acetic Acid Glasial (Merck),  Metanol  p.a  (Merck),  Aquabidest  dan Aquadest.
Alat  yang  digunakan  yaitu  seperangkat  alat HPLC  (Shimadzu),  Rotary  Evaporator  (Stuart), Neraca  analitik  (Nimbus,  ADAM),  seperangkat alat vakum, kertas saring whatman 0,45 µm, dan peralatan gelas laboratorium kimia (Iwaki Pyrex).

## Prosedur Penelitian
Pembuatan  Ekstrak  Mangrove Rhizopora apiculata
Pembuatan  ekstrak  dilakukan  dengan menghaluskan  mangrove Rhizopora  apiculata dengan menggunakan mesin penghalus
kecepatan  sedang.  Serbuk  mangrove  kemudian dimaserasi dengan pelarut etanol 70 % selama 1 x 24  jam.  Maserat  kemudian  disaring  dengan menggunakan  kertas  saring  lalu  di  evaporasi dengan rotary evaporator pada suhu dibawah 60 o C  sehingga  diperoleh  ekstrak  mangrove  dalam bentuk pasta.

## Pembuatan  Fase  Gerak  Dan  Larutan Pengencer
Fase  gerak  yang  dipakai  merupakan campuran asam asetat 0.1 % dan metanol dengan perbandingan 60:40 (v/v) [10]. Pembuatan asam asetat  0.1  %  dilakukan  dengan  memipet  asam asetat  glacial  sebanyak  0.5  mL  dimasukkan kedalam  labu  ukur  500  mL  diencerkan  dengan aquabidest sampai tanda batas lalu homogenkan. Larutan  pengencer  adalah  campuran  metanol aquabidest 70:30 (v/v) dibuat dengan mencampurkan  70  mL  metanol  dan  30  mL aquabidest  lalu  dihomogenkan.  Fase  gerak  dan larutan  pengencer  kemudian  disaring  dengan kertas saring whatman 0.45 µm.

## Pembuatan  Larutan  Induk  Asam  Askorbat Dan Larutan Standar
Pembuatan  larutan  induk  asam  askorbat dilakukan dengan menimbang standar L-Ascorbic Acid sebanyak 50 mg lalu dimasukkan ke dalam labu  takar  100  mL,  larutkan  dengan  larutan pengencer,  cukupkan  sampai  tanda  batas  dan homogenkan  (konsentrasi  larutan  induk  500 ppm).  Dari  larutan  induk  500  ppm  diencerkan menjadi  beberapa  konsentrasi  larutan  standar yaitu 300 ppm, 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan 0 ppm.  Selama proses penelitian, larutan induk dan larutan standar disimpan pada suhu ± 4 o C.

## Persiapan Larutan Uji
Timbang  ±0.5  gram  ekstrak  mangrove, masukkan  ke  labu  ukur  25  mL  lalu  larutkan dengan  larutan  pengencer  sebanyak  20  mL. Lakukan  ultrasonic  selama  15  menit  kemudian tambahkan larutan pengencer sampai tanda batas dan  homogenkan.  Selanjutnya  saring  fitrat menggunakan  saringan  dengan  membrane  filter ukuran 0,45µm, diameter 13 mm. Sampel siap di injeksikan.
Prosedur Analisa Kadar Asam Askorbat Larutan  standard  dan  larutan  uji  masing- masing  sebanyak  20  L  diinjeksikan  dengan menggunakan syringe 50  L ke dalam alat HPLC. Kondisi alat HPLC pada saat analisa diatur sebagai berikut:
Kolom : Shimpack VP ODS C18 Fase gerak :  Asam  asetat  0.1  %  dan metanol perbandingan 60:40 Kecepatan Alir : 1.0 mL/menit
Detektor
: Uv dengan panjang gelombang 264 nm

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampel  berupa  mangrove Rhizopora apiculata diambil dari daerah estuari Tanjung Api- Api. Mangrove jenis ini dipilih dengan alasan jenis ini paling banyak ditemui dan mudah didapatkan didaerah estauri Tanjung Api-Api. Sampel  mangrove  Rhizopora  Apiculata  yang dikumpulkan  dimasukkan  ke  dalam  kantong plastik  untuk  kemudian  di  preparasi  di laboratorium.
Sebanyak 5 kilogram sampel daun Rhizopara Apiculata  di  kering  udarakan.  Lalu  di  haluskan dengan menggunakan blender dengan kecepatan sedang hingga menjadi serbuk halus. Serbuk halus kemudian di rendam dengan etanol 70 % selama 1  x  24  jam  (proses  maserasi).  Selanjutnya dilakukan  penyaringan  dengan  menggunakan kertas saring.  Ampas sisa penyaringan direndam kembali dengan etanol 70 % selama 1 x 24 jam lalu disaring  kembali.  Proses  maserasi  ini  dilakukan
secara  berulang  hingga  cairan  hasil  saringan jernih.
Hasil saringan kemudian di evaporasi dengan menggunakan  rotary  evaporator  pada  suhu dibawah  60  oC  hingga  diperoleh  ekstrak  kental. Dari 2,5 liter hasil penyaringan didapatkan ekstrak kental ± 1,5 gram. Selanjutnya ekstrak disimpan dalam  lemari pendingin sampai  digunakan pada tahap selanjutnya.

## Analisis Asam Askorbat Dengan HPLC
Asam askorbat dianalisis dengan fase gerak asam  asetat  0.1  %  dan  metanol  dengan perbandingan 60:40 [10].
Gambar 2. menunjukkan  kromatogram  dari  larutan  standar asam  askorbat  100  ppm  (volume  injeksi  20  µL) pada  kondisi  operasi  seperti  yang  tertera  pada Tabel  1.  Gambar  3.  menunjukkan  grafik hubungan luas area dan konsentrasi dari larutan standar asam askorbat. Gambar 4. menunjukkan kromatogram  asam  askorbat  pada  sampel mangrove Rhizopora  apiculata .  Ekstrak  sampel dilarutkan  dalam  larutan  pengencer  metanol aquabidest 70:30 dan disaring dengan menggunakan  kertas  saring  0.45  µm.  Sampel dinjeksikan untuk analisis sebanyak 20 µL.
Tabel 1. Kondisi analisis Column :  Shim-pack  VP  ODS  (150 mmL. x 4.6 mmi.d) Mobile Phase  :  Asam  asetat  0.1  %  dan metanol (60:40) Flow Rate :  1.0 mL/min Detection :  264 nm
Gambar 2. Kromatogram standar askorbat 50 ppm pada 264 nm. Fase diam : C18 panjang 150 mm, diameter 4,6 mm dan fase gerak Asam asetat 0.1 % dan metanol (60:40)
Gambar 3. Kromatogram standar askorbat 100 ppm pada 264 nm. Fase diam : C18 panjang 150 mm, diameter 4,6 mm dan fase gerak Asam asetat 0.1 % dan metanol (60:40)
Gambar 4. Kromatogram standar askorbat 200 ppm pada 264 nm. Fase diam : C18 panjang 150 mm, diameter 4,6 mm dan fase gerak Asam asetat 0.1 % dan metanol (60:40)
Gambar 5. Kromatogram standar askorbat 300 ppm pada 264 nm. Fase diam : C18 panjang 150 mm, diameter 4,6 mm dan fase gerak Asam asetat 0.1 % dan metanol (60:40)
Gambar 6. Kromatogram standar askorbat 500 ppm pada 264 nm. Fase diam : C18 panjang 150 mm, diameter 4,6 mm dan fase gerak Asam asetat 0.1 % dan metanol (60:40)
Pada gambar 2, 3, 4, 5, dan 6 terlihat bahwa titik  puncak  (peak)  standar  asam  askorbat berbagai konsentrasi muncul pada retention time 2.150  menit.  Retention  time  inilah  yang  akan dijadikan  acuan  penentuan  peak  asam  askorbat pada sampel.
Gambar 7. Grafik hubungan luas area dan konsentrasi larutan standar asam askorbat
Gambar 8. Kromatogram sampel mangrove Rhizopora apiculata . Fase diam : C18 panjang 150 mm, diameter 4,6 mm dan fase gerak asam asetat 0.1 % dan metanol (60:40). Diukur pada panjang gelombang 264 nm.
Dari  gambar  8.  diketahui  bahwa  asam askobat pada sampel muncul pada retention time 2.101  menit  dimana  retention  time  ini  sama dengan  retention  time  asam  askorbat  standar. Sehingga  dapat  dinyatakan  bahwa  peak  yang muncul  merupakan  asam  askorbat.  Luas  area
yang  tampak  pada  kromatogram  menunjukkan konsentrasi  asam  askorbat  yang  terdapat  dalam sampel  yang  dianalisis.  Kadar  asam  askorbat dalam  sampel  dapat  dihitung  dengan  cara menginterpolasikan  luas  area  yang  didapat  ke dalam  persamaan  yang  didapat  dari  kurva
standar.  Hasil  pengukuran  asam  askorbat  pada sampel dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil pengukuran sampel Sampel Retention Time (menit) Kadar asam askorbat (ppm) Rhizopora Apiculata 2.101 9.021
Dari  Tabel  2.  dapat  dilihat  bahwa  kadar asam askorbat pada sampel mangrove Rhizopora
apiculata adalah 9.021 ppm dengan retention time 2.101 menit.
Sebaiknya ditambahakan pembahasan  dengan  membandingkan  hasil  ini dengan beberapa referensi yang ada.

## KESIMPULAN
Kadar  asam  askorbat  pada  mangrove Rhizopora apiculata yang dianalisis dengan HPLC adalah  9.021  ppm.  Dengan  teridentifikasinya kadar  asam  askorbat  sebagai  salah  satu antioksidan yang terdapat dalam mangrove jenis Rhizopora Apiculata dengan menggunakan HPLC menunjukkan  bahwa  HPLC  yang  ada  di laboratorium  Jurusan  Ilmu  Kelautan  bisa dioptimalkan  penggunaannya  untuk  kegiatan praktikum  Bioteknologi  Kelautan  pada  materi analisis antioksidan dengan HPLC.

## REFERENSI
[1] Shimadzu  Document. Analysis  of  Water Vitamins  Using  The  Prominence  System .
Shimadzu HPLC Application Report No.24.
[2] Wadge.2003. Safe  Upper  Levels  for  Vitamins and Minerals . Food Standart Agency.
[3] Almatsier,  S.  2001. Prinsip  Dasar  Ilmu  Gizi .
Jakarta : Gramedia Pustaka Utama.
[4] Khairina,  D.  2008. Faktor-faktor  yang berhubungan dengan status gizi . Jakarta : FKM
UI.
[5] Techinamuti  N  dkk.  Review  : Metode  Analisis Kadar  Vitamin  C .  Jurnal  Farmaka  Suplemen Volume  16  Nomor  12.  Fakultas  Farmasi Universitas Padjadjaran.
[6] Sitorus,  L  dkk.  2015. Analisis  Beberapa  Asam Organik  dengan  Metode  High  Performance Liquid Chromatography (HPLC) Grace Smart Rp 18  5  µ .  Jurusan  Kimia,  FMIPA,  Unsrat, Manado.
[7] Deman,  John,  M.  1997. Kimia  Makanan . Bandung : Penerbit ITB.
[8] Gazdik,  Zbynek,  dkk.  2008. Determination  of Vitamin  C  (Ascorbic  Acid)  Using  High Performance  Liquid  Chromatography  Coupled with Electrochemical Detection . Journal Sensors 2008, 8, 7097-7112; DO; 10.3390/s8117097.
[9] Adriana, dkk. 2010. HPLC Analysis of Vitamin B3  and  Vitamin  C  from  A  Dairy  Product Containing  Brewer’s  Yeast .  Journal  of Agroalimentary  Processes  and  Technologies 2010, 16 (2), 136-140.
[10] Razc, dkk. 1990. HPLC Method For Determination Of Ascorbic Acid In Fruits And Vegetables.hemistry, Technical University, H- 1521, Budapest.