## ANALISIS CHLORAMPHENICOL PADA UDANG WINDU (PENAEUS MONODON) SECARA SPEKTROFOTOMETRI BERBASIS REAKSI DIAZOTASI

## SPECTROPHOTOMETRIC ANALYSIS OF CHLORAMPHENICOL IN TIGER PRAWNS (PENAEUS MONODON) BASED ON THE DIAZOTATION REACTION
Moh. Syaiful Arif *, Indra Kurniawan 2 , Bohari Yusuf
Program Studi S1 Kimia, FMIPA, Universitas Mulawarman Jalan Barong tongkok No. 4 Kampus Gunung Kelua, Samarinda-Indonesia *Corresponding Author : syaifularif88@gmail.com
Submitted : 02 Agustus 2021 Accepted : 07 Maret 2023 Publish : 15 Mei 2023

## ABSTRACT
Spectrophotometric analysis of chloramphenicol in tiger prawns ( Penaeus Monodon ) based on the diazotation reaction has been carried out. Sulfanilamide is used as a source of diazo salt to be coupled with chloramphenicol. In this study, several optimizations were carried out such as optimization of temperature, volume of HCl, volume of NaNO 2 , volume of sulfanilamide and contact time. Diazonium salt coupled with sulfanilamide produces a clear  yellow compound with a maximum wavelength of 400.941 nm. The results of the analysis chloramphenicol on tiger shrimp, obtained the coefficient of variation  were 4.026 %; 1.951 %; and 4.277 %.. Accuracy ranges from 99.7143% to 100.8730%. The Limit of Detection value is 6.24 mg/mL and the Limit of Quantization value was 20.803 mg/mL. The sensitivity value is 0.0021 mL /  g.
Keywords : Tiger prawns, chloramphenicol and reaction diazotation.

## ABSTRAK
Analisis chloramphenicol pada  udang  windu  ( Penaeus  Monodon )  secara  spektrofotometri  berbasis  reaksi  diazotasi  telah dilakukan. Sulfanilamid digunakan sebagai sumber garam diazo yang akan dikopling dengan chloramphenicol . Pada penelitian ini dilakukan beberapa optimasi seperti optimasi suhu, volume HCl, volume NaNO 2 , volume sulfanilamid dan waktu kontak. Garam diazonium yang  dikopling dengan sulfanilamid menghasilkan menghasilkan senyawa l berwarna kuning jernih dengan panjang  gelombang  maksimum  400,941  nm.  Hasil  pengujian chloramphenicol pada  udang  windu,  diperoleh  nilai  koefisien variasi sebesar 4,026 %; 1,950 %; dan 4,277 %. Nilai akurasi pada rentang 99,7143% sampai 100,8730%. Nilai limit deteksi sebesar 6,24  g/mL dan nilai limit kuantisasi sebesar 20,803  g/mL. Nilai sensitivitas sebesar 0,0021 mL/  g.
Kata kunci : udang windu, chloramphenicol dan reaksi diazotasi.
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License .

## PENDAHULUAN
Negara indonesia yang merupakan negara maritim membuat sebagaian masyarakatnya bermata pencaharian sebagai nelayan ataupun budidaya, salah satu budidaya yang banyak dikembangkan ialah udang windu. Budidaya udang windu mulai berkembang sebagai suatu usaha industri sejak tahun 1980-an, namun pemanfaatannya masih sering  mengalami  berbagai  kendala  terutama  yang  disebabkan  oleh  serangan  organisme  patogen  sehingga mengakibatkan menurunnya produksi, baik pada usaha pembenihan maupun pada usaha pembesaran di tambak [1]. Dalam  rangka  mengendalikan  penyakit  udang  terutama  yang  disebabkan  oleh  bakteri,  maka  petambak  seringkali menggunakan antibiotik seperti chloramphenicol yangterkadang dicampurkan ke dalam pakan.
Chloramphenicol merupakan  antibiotika  golongan amphenicol yang  bersifat  bakteriostatik,  selain  itu chloramphenicol juga memiliki aktifitas spektrum luas aktif terhadap bakteri yang patogen. Selain digunakan untuk pengobatan, chloramphenicol juga digunakan pada pembilasan kolam dalam proses produksi dan sebagai desinfektan sebelum produk tersebut diproses lebih lanjut [2]. Penggunaan antibiotik yang tidak tepat berpotensi menyebabkan residu  dalam  jaringan  organ  ternak  hewan.  Hal  ini  tentu  cukup  berbahaya  bagi  kesehatan  manusia  yang mengkonsumsinya,  karena  dapat  menimbulkan  reaksi  alergi,  keracunan  bahkan  resistensi  jika  dikonsumsi  dalam jumlah besar dan jangka waktu yang lama, sehingga antibiotik tidak boleh ditambahkan pada pakan buatan untuk hewan ternak [3].
Batasan konsentrasi yang dianjurkan oleh Pemerintah United Kingdom tentang residu chloramphenicol dalam bahan makanan adalah dibawah 10 ppb. Sedangkan ambang batas konsentrasi chloramphenicol di dalam tubuh hewan yang masih diperbolehkan yaitu sebesar 0,3 ppb [4]. Lebih daripada itu maka hewan tidak boleh dikonsumsi karena akan memberikan dampak berbahaya bagi kesehatan manusia. Dampak negatif yang ditimbulkan chloramphenicol dalam jangka waktu yang lama dan berlebihan kadarnya dapat mengakibatkan depresi sumsum tulang belakang, yang menimbulkan kelainan darah yang serius, seperti anemia aplastik, granulositopenia, dan trombositopenia. Selain itu, obat ini juga dapat menyebabkan gangguan saluran cerna dan reaksi hipersensitivitas [5].
Berdasarkan pemaparan diatas, maka perlu dilakukan analisa chloramphenicol pada udang windu yang akan dijual ke konsumen dengan metode yang cepat, mudah dan murah sehinga diketahui kadar chloramphenicol pada udang windu yang akan dipasarkan.

## METODOLOGI PENELITIAN Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah, neraca analitik,spektrofotometer UV-Vis evolution 201, Hotplate stirer , sentrifuse, pipet ukur, pipet volume, labu ukur, gelas kimia, labu erlenmeyer, gelas arloji, corong gelas, spatula, pipet tetes, batang pengaduk, dan botol semprot.

## Bahan
Semua reagen yang digunakan dalam penelitian ini berderajat pro analisis. Adapun bahan yang digunakan antara dalam penelitian ini adalah, chloramphenicol (Merck), sulfanilamid (Merck), natrium nitrit (Merck), asam klorida pekat (Merck), garam dan es batu.

## Prosedur Penelitian Larutan induk chloramphenicol 1000 ppm
Ditimbang  0,01  gram chloramphenicol kemudian  dimasukkan  ke  dalam  gelas  kimia  50  mL,  ditambahkan etanol dan diaduk hingga larut. kemudian larutan dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL, diencerkan dengan etanol sampai tanda tera dan dikocok hingga homogen.

## Larutan asam sulfanilamid 0,3%
Ditimbang 0,3gram sulfanilamid kemudian dimasukkan ke dalam gelas kimia 100 mL dan dilarutkan dengan aquades. Selanjutnya larutan dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL kemudian diencerkan dengan aquades sampai tanda tera dan dikocok hingga homogen.

## Larutan natrium nitrit 1%
Ditimbang 1,0 gram natrium nitrit kemudian dimasukkan ke dalam gelas kimia 50 mL, dilarutkan dengan 40

## Kimia FMIPA UNMUL
mL aquades dan  diaduk sampai natrium nitrit larut. Selanjutnya larutan dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu ukur 100 mL kemudian diencerkan dengan aquades sampai tanda tera dan dikocok hingga homogen.

## Larutan asam trikloroasetat (TCA) 10%
Ditimbang 1,0 gram asam trikloroasetat kemudian dilarutkan dengan aquades, kemudian dipindahkan ke labu takar 10 mL, di encerkan hingga tanda tera dan dikocok dan dihomogenkan.

## Larutan HCl 1,0 M
Sebanyak 8,3  mL asam klorida pekat dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL, kemudian diencerkan dengan aquades hingga tanda tera dan dikocok hingga homogen. Larutan HCl 0,1 M dibuat dengan mengencerkan dari larutan HCl 1,0 M.

## Panjang gelombang maksimum chloramphenicol
Pengukuran  panjang  gelombang  maksimum chloramphenicol dilakukan  dengan  menyiapkan  larutan chloramphenicol 100 ppm. Kemudian larutan diukur menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada daerah panjang gelombang UV 200-400 nm menggunakan blanko etanol.

## Panjang gelombang maksimum senyawa azo sulfanilamid-CAP
Diambil 3,0 mL larutan sulfanilamid 0,3 % dimasukkan ke dalam gelas kimia 50 mL. Selanjutnya ditambahkan berturut-turut larutan 3,0 mL HCl 0,1 M dan 6,0 mL NaNO 2 1%. Larutan dicampur dengan baik dan dibiarkan pada suhu kamar selama 3 menit agar terjadi reaksi diazotasi. Selanjutnya larutan ditambahkan 2,0 mL chloramphenicol 500  g/mL  dan  diaduk  selama  6  menit  dalam  suhu  dingin.  Senyawa  azo  yang  dihasilkan  dipindahkan  secara kuantitatif ke dalam labu ukur 25 mL dan diencerkan dengan akuades sampai tanda tera kemudian diukur panjang gelombang maksimumnya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada daerah tampak 380 – 700 nm. Blanko yang digunakan adalah reagen yang terdiri dari sulfanilamid, HCl, NaNO 2 , tanpa chloramphenicol . Panjang gelombang yang  menghasilkan  nilai  serapan  maksimum  merupakan  panjang  gelombang  maksimum  dari  senyawa  azo sulfanilamid- chloramphenicol .

## Pembuatan Kurva Kalibrasi
Disiapkan 7 buah gelas kimia 50 mL masing masing dimasukkan 3 mL larutan sulfanilamid 0,3%. Kemudian ditambahkan 3 mL larutan HCl 0,1 M dan 6 mL larutan NaNO 2 1%. Kemudian larutan diaduk hingga homogen dan didiamkan selama 3 menit pada suhu dingin. Selanjutnya masing-masing ditambahkan 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 dan 4,0 mL chloramphenicol 500  g/mL kemudian diaduk selama 8 menit. selanjutnya diencerkan dalam labu takar 25 mL dan dihomogenkan sehingga diperoleh konsentrasi chloramphenicol 20  g/mL; 30  g/mL; 40  g/mL; 50  g/mL; 60  g/mL; 70  g/mL dan 80  g/mL. Lalu diukur absorbansi panjang masing-masing larutan dengan variasi volume tersebut menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum senyawa azo Sulfanilamid- Chloramphenicol .

## Analisis chloramphenicol dalam udang dengan metode adisi standar
Analisis chloramphenicol dalam sampel udang dengan metode adisi dilakukan dengan menghaluskan udang yang  tidak  mengandung chloramphenicol dengan  alu  dan  lumpang,  kemudian  diambil  5  gram  udang,  kemudian ditambahkan etanol kemudian disaring. Kemudian dipindahkan ke dalam tiga tabung sentrifugasi lalu ditambahkan larutan  TCA  10% dengan perbandingan  1:1  dan  disentrifugasi  pada  4000  rpm  selama  8  menit.  Terbentuk 2  fase, diambil dan dipindahkan fase atas ke dalam gelas kimia. kemudian ditambahkan larutan chloramphenicol dengan konsentrasi 20 𝜇 g/mL, 50 𝜇 g/mL, dan 80 𝜇 g/mL. Kemudian digunakan untuk reaksi kopling dengan sumber garam diazonium  yang  telah  dibuat  sebelumnya  sesuai  prosedur  pada  kondisi  optimum  percobaan.  Senyawa  azo  yang dihasilkan dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu ukur 25 mL ditambahkan aquades sampai tanda batas dan dikocok sampai homogen. Masing-masing larutan diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang  maksimum  menggunakan  larutan  blanko  reagen  dengan  udang  tanpa chloramphenicol .  Kemudian dilakukan perhitungan recovery untuk masing-masing chloramphenicol yang ditambahkan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan panjang gelombang maksimum chloramphenicol
Pada  spektra  hasil  pengukuran    didapatkan    panjang  gelombang maksimum chloamphenicol pada  rentang panjang  gelombang  sinar  UV  yaitu  276,183  nm.  Aisha  [6]  melakukan  penentuan  panjang  gelombang maksimum
chloramphenicol dimana diperoleh panjang gelombang yaitu 278 nm dimana hasil yang diperoleh tidak jauh berbeda dengan hasil penentuan panjang gelombang maksimum chloramphenicol yang telah dilakukan.

## Penentuan panjang gelombang maksimum senyawa azo sulfanilamid-chloramphenicol
Pada Penentuan panjang gelombang maksimum senyawa azo sulfanilamid- chloramphenicol diperoleh panjang gelombang yaitu 400,941 nm.
Gambar 1. Panjang gelombang maksimum chloramphenicol, dan senyawa Azo sulfanilamid- chloramphenicol
Pada pembentukan senyawa azo sulfanilamid- chloramphenicol terjadi dua tahapan reaksi. Pada tahap pertama yaitu reaksi  diazotasi  sulfanilamid  pada  saat  direaksikan  dengan  HCl  dan  NaNO 2 ,  reaksi  ini  terjadi  disebabkan  pada sulfanilamid    memiliki  gugus  amina  primer  pada  cincin  aromatisnya,  dimana  akan  bereaksi  dengan  asam  nitrat melalui ion nitrosonium.
Tahap 1
Gambar 2. Reaksi pembentukan garam diazonium
Pada tahap kedua terjadi reaksisi kopling, garam diazonium bertindak sebagai elektrofil lemah yang akan menyerang chloramphenicol yang  bersifat  nukleofilik.  Dimana  garam  diazonium  akan  terikat  pada  posisi  meta  karena disebabkan adanya efek sterik dimana gugus 2,2 –dichloro-N-(1,3-dihydroxybutan-2-yl)acetamide memiliki bobot yang lebih besar daripada gugus NO 2 sehingga senyawa azo Sulfanilamid- chloramphenicol dapat terbentuk.

## Kimia FMIPA UNMUL

## Tahap 2
Gambar 3. Reaksi kopling garam diazonium dengan chlorampenicol

## Pembuatan kurva kalibrasi
Pada  penentuan  kurva  kalibrasi  dilakukan  pengukuran  konsentrasi chloramphenicol dengan  variasi  yang berbeda yaitu 20-80 g/mL. Dari hasil pengukuran yang dilakukan, didapatkan persamaan regresi linear y = 0,0021x +  0,1403,  dimana y sebagai  absorbansi  dan x sebagai  konsentrasi  CAP.  Adapun  nilai  koefisien  korelasi  dari persamaan regresi linear yaitu R 2 = 0,9935 dan terlihat bahwa kurva kalibrasi yang dihasilkan menunjukkan linearitas. Dimana jika koefisien determinasi (R) semakin mendekati 1 maka kurva tersebut memiliki linearitas yang baik [7].
Gambar 4. Kurva Kalibrasi chloramphenicol
Tabel 1. Karakteristik metode penentuan chloramphenicol Parameter Nilai Jenis metode Kopling azo Reagen sumber garam diazonium Sulfanilamid Panjang gelombang maksimum, λ max (nm) 400,941  nm Warna senyawa azo Kuning jernih Rentang Hukum Beer  (μg/ mL) 20 – 80 Absorptivitas molar (L mol –1 cm –1 ) 1779,8807

## Kimia FMIPA UNMUL
Sensitivitas Sandell’s (μg cm –2 / 0,001 unit absorbansi) 0,1966 Persamaan regresi  (y = bx + a) Slop (b) 0,0021 Intersep (a) 0,1403 Koefisien korelasi (r) 0,9967

## Linearitas
Penentuan  linearitas  ditentukan  dari  persamaan  regresi  linear  kurva  kalibrasi.  Berdasarkan  kuva  tersebut diperoleh  nilai  serapan  meningkat  secara  linear  seiring  dengan  meningkatnya  konsentrasi chloramphenicol yang diberikan.  Hubungan  linear  yang  terjadi  menunjukkan  bahwa  nilai  serapan  berbanding  lurus  dengan  kadar chloramphenicol pada batas Hukum Beer dalam rentang 20-80  g/mL. Linearitas didapat dari harga koefisien regresi (R 2 ) yang diperoleh dari persamaan regresi linear. Berdasarkan perhitungan diperoleh keofisien korelasi (r) = 0,9967 dan  berdasarkan  uji  t  diperoleh  t hit >  t tabel .  Keduanya  menggambarkan  terdapat  korelasi  linear  antara  konsentrasi chloramphenicol dengan nilai serapan. Koefisien korelasi diperoleh 0,9967, artinya 99,67% perubahan nilai serapan dipengaruhi oleh konsentrasi chloramphenicol .

## Sensitivitas
Sensitivitas suatu metode ditentukan berdasarkan harga kemiringan ( slope ) dari persamaan regresi linier kurva kalibrasi  [8].  Semakin  besar  nilai slope menunjukkan  perubahan  konsentrasi  analit  yang  sedikit  akan  memberi perubahan serapan yang besar, sehingga sensitivitas metode dikatakan baik [9]. Berdasarkan persamaan regresi dari kurva  kalibrasi  diperoleh  nilai  sensitivitas  0,0021  mL/  g.  Nilai  tersebut  menunjukkan  bahwa  dengan  perubahan konsentrasi chloramphenicol sebesar 10,0 µg/mL akan menghasilkan perubahan serapan sebesar 0,0021. Berdasarkan nilai  sensitivitas  tersebut  dapat  dikatakan  metode  yang  diusulkan  memiliki  sensitivitas  yang  cukup  baik.  Hal  ini didukung dengan perolehan absorptivitas molar yang tinggi sebesar 1779,8807 L/mol cm.

## Presisi
Presisi atau ketelitian adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil  dari  campuran  yang  homogen.  Perhitungan  nilai  presisi  ditentukan  melalui  koefisien  variasi  (KV)  yang diperoleh dari proses pengukuran yang dilakukan secara berulang. Pada penelitian ini untuk mengetahui presisi dari metode  yang  diusulkan  sesuai  hasil  optimasi  sebelumnya,  dilakukan  pengukuran  pada  tiga  konsentrasi  berbeda dengan tiga kali pengulangan. Penentuan presisi diambil dari data konsentrasi chloramphenicol 20 µg/mL, 40 µg/mL dan 70 µg/mL. Dari hasil perhitungan diperoleh nilai koefisien variasi pada konsentrasi chloramphenicol 20 µg/mL, 40 µg/mL, dan 70 µg/mL berturut-turut adalah 4,0269%, 1,9509 % dan 4,2771 %. Sedangkan koefisien variasi rata- rata perhitungan diperoleh 3,4183 %.

## Limit deteksi
Limit deteksi  atau limits of detection (LOD) menyatakan jumlah terkecil analit yang masih dapat memberikan sinyal yang dapat ditangkap oleh detektor. Sedangkan limit kuantitas atau limits of quantitation (LOQ) merupakan konsentrasi terkecil dari suatu sampel yang dianalisis dengan penentuan kuantitatif dapat menunjukkan hasil yang teliti. Semakin kecil nilai limit deteksi suatu metode, maka semakin baik pula metode tersebut dalam mendeteksi suatu  analit.  Berdasarkan  hasil  perhitungan  diperoleh  limit  deteksi  dan  limit  kuantifikasi  masing-masing  adalah 6,2411  g/mL dan 20,8036  g/mL. Nilai tersebut merupakan batas terkecil dari konsentrasi chloramphenicol yang masih dapat dianalisis secara spektrofotometri berbasis reaksi diazotasi.

## Akurasi Metode pada udang windu dengan Metode Adisi Standar
Data  akurasi  lebih  lanjut  dipastikan  dengan  melakukan  percobaan recovery pada  tiga  konsentrasi chloramphenicol yang berbeda menggunakan metode adisi standar. Konsentrasi chloramphenicol yang ditambahkan masing-masing  20  µg/mL,  50  µg/mL  dan  80  µg/mL.  Metode  adisi  standar  diaplikasikan  pada  penentuan chlorampenicol dalam diselidiki untuk membuktikan bahwa metode yang diusulkan tidak terpengaruh oleh matriks sampel.

## Kimia FMIPA UNMUL
Tabel 2. Tabel hasil perhitungan recovery
Chloramphenicol ditambahkan (  g/mL) Chloramphenicol yang diperoleh (  g/mL) Recovery(%) (n =3) 20 20,1746 100,8730 50 49,8571 99,7143 80 80,3333 100,4167 Rerata 100,3347

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian pada penentuan chlorampenicol dengan metode adisi standar pada konsentrasi chloramphenicol 20 µg/mL, 50 µg/mL dan 80 µg/mL. Pada recovery diperoleh masing-masing adalah 100,8730%, 99,7143%  dan  100,4167%.  Sedangkan recovery rata-ratanya  adalah    100,3347%.  Pada  nilai  koefisien  variasi diperoleh berturut-turut adalah 4,0269 %, 1,9509 % dan 4,2771 %. Sedangkan koefisien variasi rata-rata perhitungan diperoleh 3,4183 %. Dengan nilai LOD dan LOQ masing-masing sebesar 6,2411  g/mL dan 20,8036  g/mL. Serta nilai sensitivitas sebesar 0,0021 mL/  g dengan perolehan absorptivitas molar  sebesar 1779,8807 L/mol cm. Metode ini  dapat  digunakan  pada  sampel  yang  memiliki  konsentrasi  diatas  6,2411  ppm,  jika  diatas  konsentrasi  tersebut metode ini tidak dianjurkan ataupun direkomendasikan.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Atmomarsono, M., M. I. Madeali., A. Tompo., dan Muliani. 2000. Teknologi Budidaya Udang Berkelanjutan. Balai Penelitian Perikanan Pantai Maros. Makalah pada Konferensi Nasional II Pengelollaan Sumberdaya Pesisir dan lautan Indonesia , Makassar 15-17 Mei 2000.
[2] Wahab, Abdul dan Lestari, Lies Amin. 1999. Menulis Karya Ilmiah. Surabaya: Airlangga University Press.
[3] Yuningsih., Murdiati, T. B., & Juariah, S. 2005. Keberadaan Residu Antibiotik Tilosin (golongan makrolida) Dalam Daging Ayam Asal Daerah Sukabumi, Bogor Dan Tangerang. Jurnal Penelitian Valentir,2(3), 921- 925.
[4] Suparno.  2000.  Langkah-langkah  Penulisan  Artikel  Ilmiah  dalam  Saukah,  Ali  dan  Waseso,  M.G.  2000. Menulis Artikel untuk Jurnal Ilmiah. Malang: UM Press.
[5] Jannah,  Miftahul.  2014.  Waktu  Henti  Chloramphenicol  Pada  Lobster  (Chorax Quadricarinatus)  Air  Tawar. Skripsi. Fakultas Perikanan dan Kelautan. Universitas Airlangga.
[6] Aisha,  Sarah,  Bambang  Kuswandi  dan  Dwi  Koko  Pratoko.  2018.  Pengembangan  Sensor  Kloramfenikol Berbasis Bouvine Serum Albumin Menggunakan Spektrofotometri UV. E-Jurnal Pustaka Kesehatan. Vol 6. No.1.
[7] Riyanto, 2014. Validasi dan Verifikasi Metode Uji: Sesuai dengan ISO/IEC 17025 Laboratorium Pengujian dan Kalibrasi. Edisi 1. Cetakan 1. Yogyakarta: Deepublish.
[8] Skoog, D.A., 1985, Prinsiples of Instrumental Analysis, CBS College Publishing, USA.
[9] Miller, J.C. dan Miller. J.N. 1988. Statistict for Analytical Chemistry. Second Edition. New York: John Wiley & Son