Hasil Penelitian                                                 Jurnal. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XVII No. 2 Th. 2006

## AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN SUJI ( Pleomele angustifolia N.E. Brown)
[Antioxidant Activity of Suji (Pleomele angustifolia N.E. Brown) Leaf Extrac]

## Endang Prangdimurti, Deddy Muchtadi, Made Astawan dan Fransiska R. Zakaria
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan FATETA IPB
Diterima  20  September 2006  / Disetujui 10 Oktober  2006

## ABSTRACT
Numerous studies showed that chlorophyll and its derivatives had antioxidant activity.  This research was conducted to obtain the chlorophyll-rich suji leaf liquid extract (SLE) and then to investigate the oral administration this extract on the antioxidant status by means of animal study. The use of Tween 80 0.75%  in sodium citrate 12 mM solution as an extraction solution combined with 30 minutes incubation time at 70-75 o C increased significantly the total chlorophylls content, the water-soluble chlorophylls content and the antioxidant activity  of  the  yielded  extract,  compared  to  the  suji  leaf  water-only  extract.    Two-months  oral  administration  of  SLE    to  male  Sprague Dawley rats showed that the liver malondialdehide (MDA) level significantly decreased, and the liver catalase and superoxide dismutase antioxidant enzyme activities significantly increased compared to the control group. This study suggested that the chlorophyll content in SLE might increase the antioxidant status of animal tested.
Key words : suji (Pleomele angustifolia N.E. Brown), chlorophyll, antioxidant

## PENDAHULUAN
Peningkatan  konsumsi  fitokimia  yang  memiliki aktivitas antioksidan dapat menekan timbulnya penyakit- penyakit  degeneratif  seperti  aterosklerosis,  kanker,  dan diabetes  mellitus.  Berbeda  dengan  senyawa  fitokimia lain,  seperti  komponen  fenolik,  klorofil  terdapat  dalam jumlah  banyak  dalam  tanaman  yaitu  rata-rata  1%  berat kering,  sehingga  sangat  berpotensi  dikembangkan sebagai  suplemen  pangan  atau  pangan  fungsional. Klorofil  alami  (seperti  klorofil-a  dan  klorofil-b)  bersifat lipofilik  karena  keberadaan  gugus  fitolnya  (C 20 H 39 OH). Hidrolisis  terhadap  gugus  tersebut  akan  mengubah klorofil  menjadi  turunannya  yang  larut  air,  seperti klorofilid dan klorofilin. Klorofil dan beberapa turunannya menunjukkan    kemampuan  antioksidatif  secara in  vitro dan ex vivo. Endo et al., (1985) menyebutkan bahwa jika klorofil  dioksidasi  dalam  sistem  metil  linoleat  akan dihasilkan  radikal  -kation  dari  klorofil  yang  dapat membentuk kompleks dengan radikal peroksi, kemudian dihasilkan  produk  yang  stabil.    Klorofilin  memiliki kemampuan  sebagai radical  scavenger terhadap  *OH, ROO*, 1 O 2 dan  H 2 O 2 dengan  konstanta  masing-masing sebesar 6.1±0.4 x 10 9 ,  5.0±1.3 x 10 7 ,  1.3 x 10 8 ,  2.7 x 10 6 M -1 .s -1 ( Kumar et al., 2001;  Kamat et al., 2000). Sebelum  adanya  laporan  Egner  et  al.,(2000), klorofil dianggap tidak diserap oleh tubuh. Mereka adalah yang  pertama  kali  menemukan  adanya  turunan  klorofil dalam  serum  manusia  yang  berwarna  hijau  setelah pemberian klorofilin dengan dosis 3x100 mg/hari selama
4  bulan.    Pengujian  secara in  vitro menggunakan  sel Caco-2 ( human intestinal cell line ), menunjukkan bahwa penyerapan klorofil  yang lipofil sebesar 5-10% (Ferruzzi et  al.,  2001),  sedangkan  klorofilin  sebesar  45-60% (Ferruzzi  et  al.,  2002a).  Klorofilid  maupun  klorofilin memiliki  aktivitas  menangkap  radikal  bebas  yang  lebih tinggi  dibandingkan  klorofil  yang  masih  mengandung gugus fitol (Ferruzzi et al., 2002b). Oleh karena itu upaya menghidrolisis  gugus  fitol  klorofil  agar  diperoleh  klorofil yang larut air diduga dapat meningkatkan manfaat klorofil bagi  kesehatan  tubuh.    Hidrolisis  dapat  dilakukan menggunakan asam, alkali atau enzim klorofilase. Saat ini semakin banyak beredar produk impor suplemen pangan kaya klorofil,  padahal dilihat dari segi geografis Indonesia memiliki potensi sumber klorofil yang besar.    Salah  satunya  adalah  daun  suji  ( Pleomele angustifolia N.E.  Brown)  yang  sejak  dahulu  digunakan sebagai  sumber  pewarna  hijau  alami  untuk  pangan. Oleh  karena  itu  perlu  dilakukan  kajian  untuk meningkatkan  manfaat  daun  suji,  khususnya  dalam meningkatkan status antioksidatif tubuh.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  mendapatkan ekstrak cair daun suji kaya klorofil dan menguji aktivitas antioksidannya secara in vivo.

## METODOLOGI
Bahan Daun  suji  ( Pleomele  angustifolia N.E.  Brown) yang  digunakan  berasal  dari  satu  lokal  di  daerah
perumahan  dosen  IPB  Darmaga  Bogor.    Daun  yang digunakan  adalah  daun  tua,  yaitu  7-10  helai  di  bawah pucuk daun. Untuk pembuatan ekstrak digunakan Tween 80  (Sigma  Co.),  trinatrium  sitrat  dihidrat,  NaHCO 3 . Sebagai  pembanding  ekstrak  daun  suji  digunakan klorofilin  ( Sodium  Copper  Chlorophyllin /SCC,  Sigma Co.).  Untuk studi in vivo , digunakan tikus jenis Sprague Dawley jantan  umur  2  bulan  dari  Badan  Pengawasan Obat  dan  Makanan  (BPOM)  Jakarta.  Untuk  simulasi pencernaan in  vitro digunakan  pepsin  (P-7000), pankreatin (P-1750) dan ekstrak bile (B-8631) dari Sigma Co.,  lipase  (NOVO),    dan  kantung  dialisis  6000-8000 MWCO  (Spectrapor).    Untuk  analisis  digunakan  antara lain 1,1-diphenyl-2-pycryl  hydrazyl (DPPH),  xantin oksidase  ( Grade  IV ,  dari  susu  sapi),  xantin, nitroblue tetrazolium (NBT), phosphat  buffer  saline (PBS), tetraetoksipropana  (TEP),  asam  tiobarbiturat  (TBA), asam trikloroasetat (TCA), H 2 O 2, aseton, petroleum eter.

## Metode penelitian

## Penentuan prosedur ekstraksi daun suji
Penentuan  prosedur  ekstraksi  daun  suji  yang digunakan  difokuskan  pada  jenis  larutan  pengekstrak yang  digunakan  dan  lama  inkubasi  yang  diterapkan untuk menghasilkan ekstrak dengan aktivitas antioksidan dan  kadar  klorofil  yang  terbaik.  Ada  6  jenis  larutan pengekstrak  yang  digunakan  yaitu  NaHCO 3 0.5%,  Na- sitrat  12  mM  dan  akuades,  masing-masing  dengan maupun  tanpa  penambahan  Tween  80  1%  (b/v). Pembuatan ekstrak daun suji mengikuti prosedur umum berikut  ini.  Daun  suji  yang  telah  dicuci  dan  dipotong- potong,  dihancurkan  dengan  larutan  pengekstrak  (1:10, b/v).  Setelah diinkubasi pada 70-75 o C selama 60 menit, dilakukan  penyaringan  dengan  kain  batis  2  lapis  dan disentrifugasi  600xg  selama  10  menit  untuk  membuang padatan. Supernatan  (ekstrak) yang diperoleh kemudian diblansir  dalam  air  mendidih  selama  1  menit.  Untuk meminimalkan  kerusakan  klorofil,  ekstraksi  dilakukan dalam cahaya redup.
Tahap selanjutnya adalah penentuan konsentrasi  Tween  80  yang  ditambahkan  ke  dalam larutan  pengekstrak  terpilih  (0.25,  0.5,  0.75,  dan  1.0%; b/v)  serta    proses  inkubasi  yang  diberikan  (tanpa diinkubasi,  diinkubasi  selama  0,  30,  dan  60  menit  pada 70-75 o C).    Inkubasi  0  menit  adalah  saat  pertama  kali ekstrak  mencapai  suhu  70 o C.  Inkubasi  ditujukan  untuk memberi kesempatan klorofilase suji bekerja.

## Pengukuran  aktivitas antioksidan ekstrak
Analisis  dilakukan  berdasarkan  metode  Kubo et  al.,  (2002)  dengan  sedikit  modifikasi.  Sebanyak  1  ml buffer asetat 100 mM (pH 5.5), 1.87 ml metanol, dan 0.1 ml  DPPH  3  mM  dalam  metanol  dimasukkan  dalam tabung reaksi.  Larutan DPPH dibuat segar setiap akan digunakan.  Selanjutnya,  sebanyak  0.03  ml  larutan sampel  ditambahkan  ke  dalam  tabung  tersebut  dan diinkubasi  25 o C  selama  20  menit.  Absorbansi  yang
dihasilkan dibaca pada 517 nm.  Sebagai larutan blanko, digunakan  0.03  ml  akuades    sebagai  pengganti  larutan sampel.  Semakin banyak radikal DPPH yang dinetralisir ditunjukkan  oleh  semakin  pudarnya  warna  campuran reaksi  atau  semakin  besarnya  selisih  absorbansi terhadap larutan blanko.   Aktivitas antioksidan (%) = (1- Absorbansi sampel/Absorbansi blanko) x 100%.

## Analisis kadar klorofil ekstrak
Pengukuran kadar total klorofil dan klorofil larut air  dalam  ekstrak  dilakukan  dengan  mengikuti  prinsip Gross  (1991).  Sejumlah  ekstrak  (1,5  ml)  dicampur dengan  8,5  ml  aseton    99.5%,  kemudian  dibiarkan selama  1  malam  dalam  refrigerator.    Selanjutnya campuran  disentrifus  600xg  selama  10  menit.  Untuk menganalisis  kadar  total  klorofil,  supernatan  yang diperoleh  diukur  absorbansinya  pada  645  dan  663  nm atau pada 652 nm.  Untuk mengukur kadar klorofil larut air,  sebagian  supernatan  (3  ml)  dicampur  dengan  6  ml petroleum  eter  dan  0.2  ml  air  deionisasi,  kemudian divorteks  dan  disentrifus.  Klorofil  larut  air  atau  yang bersifat  hidrofilik  akan  berada  pada  lapisan  aseton (bawah),  untuk  selanjutnya  diukur  absorbansinya. Perhitungan kadar klorofil dilakukan dengan menggunakan rumus berikut :
Kadar klorofil (mg/L) = 20.2 A 645.0  nm + 8.02 A 663.0  nm , atau Kadar klorofil (mg/L) = 1000 A 652 nm
34.5
Estimasi  tingkat  penyerapan  klorofil  menggunakan sistem pencernaan in vitro
Larutan  yang  diujikan  yaitu  ekstrak  daun  suji terpilih dan larutan klorofilin (SCC) sebagai pembanding. Sebelum pengujian dilakukan penyetaraan kadar klorofil larutan uji.
Sistem  pencernaan in  vitro mengadopsi prosedur Ferruzzi  et al., (2001). Fase lambung ( gastric ) dilakukan  dengan  menginkubasi  larutan  uji  dengan pepsin  (1.6  mg/ml)  selama  1  jam  dalam  penangas  air bergoyang  37 o C.  Larutan  uji  sebelumnya  telah  diatur menjadi  pH  2  menggunakan  HCl  4  N.  Selanjutnya,  ke dalam  larutan  uji  dimasukkan  kantung  dialisis  berisi NaHCO 3 0,5M. Setelah tercapai pH 7, inkubasi fase usus halus  dimulai  dengan    menambahkan  campuran pankreatin  (0.2  mg/ml),  ekstrak  empedu  (1.25  mg/ml) dan lipase (0.1 mg/ml). Setelah 2 jam inkubasi, kantung dialisis  diangkat  dan  dibilas,  kemudian  isi  kantung (dialisat)  diukur  volumenya.  Pengukuran  kadar  klorofil terlarut  dilakukan  pada  fraksi    awal,  fraksi  lambung ( gastric ), fraksi digesta (luar kantung) dan fraksi dialisat (isi kantung).  Tingkat penyerapan klorofil (%) diestimasi dari  kadar  klorofil  fraksi  dialisat  per-kadar  klorofil  fraksi awal,  lalu  dikalikan  100.  Data  ini  selanjutnya  digunakan dalam perhitungan dosis pengujian secara in vivo.
Pengujian  aktivitas  antioksidan  menggunakan  tikus percobaan
Tikus  yang  digunakan  terlebih  dahulu diadaptasikan selama 1 minggu. Setelah itu, tikus (berat rata-rata 220 g) dibagi dalam 3 kelompok yaitu kelompok yang  diberi:  (1)  ekstrak  daun  suji,  (2)  larutan  klorofilin, dan  (3)  akuades  (sebagai  kontrol).  Dosis  per–hari  yang diberikan  setara  dengan  20  mg  klorofil/kg  BB  untuk kelompok  suji,  dan  6.6  mg  SCC/kg  BB  untuk  kelompok SCC.  Ransum  yang  diberikan  adalah  ransum  basal dengan  sumber  protein  kasein  10%  mengikuti  AOAC (1984)  diberikan ad  libitum .  Setelah  2  bulan  masa perlakuan,  tikus  masing–masing  kelompok  (N=7) dietanasi  untuk dianalisis kadar MDA (malondialdehida) hati,    aktivitas  katalase  hati,  dan  aktivitas  superoksida dismutase (SOD) hati.

## Preparasi sampel hati
Preparasi  sampel  dari  organ  hati  dilakukan mengikuti metode Singh et al., (2002). Sebanyak 1.25 g hati  dicacah  dalam  kondisi  dingin  dalam  5  ml  larutan PBS ( phosphat buffer saline ) yang mengandung 11,5 g/L KCl.  Homogenat  yang  dihasilkan  kemudian  disentrifus 1074xg  hingga  diperoleh  supernatan  jernih.  Supernatan selanjutnya  digunakan  untuk  pengukuran  kadar  MDA, aktivitas SOD dan katalase.

## Pengukuran kadar MDA
Pengukuran  kadar  MDA  dilakukan  mengikuti prosedur  Singh et  al .  (2002).  Sebanyak  0.5  ml supernatan  hati  ditambah  2.0  ml  HCl  dingin  (0.25  N) yang  mengandung  15%  TCA,  0.38%  TBA  dan  0.5% BHT.    Campuran  dipanaskan  80 o C  selama  1  jam. Setelah  dingin,  campuran  disentrifus  822xg  selama  10 menit.    Absorbansi  supernatan  diukur  pada  532  nm. Sebagai larutan standar digunakan TEP.

## Pengukuran aktivitas SOD
Pengukuran  dilakukan  dengan  mengikuti prosedur Kubo et al . (2002) dan Wijeratne et al . (2005) dengan  sedikit  modifikasi.    Metode  ini  digunakan  untuk mengukur aktivitas menangkap radikal anion superoksida.  Anion  superoksida  dihasilkan  secara enzimatis oleh sistem xantin-xantin oksidase.  Sebanyak 0.06  ml  supernatan  hati  direaksikan  dengan  campuran yang  terdiri  dari  2.70  ml  bufer  Natrium-karbonat  yang
mengandung  0.1  mM  EDTA  (pH  10),  0.06  ml  xantin  10 mM, 0.03 ml bovine serum albumin (BSA) 0.5%, 0.03 ml NBT 2.5 mM.  Selanjutnya dilakukan penambahan xantin oksidase  (0.04  units).  Absorbansi  yang  dihasilkan setelah  30  menit  diukur  pada  panjang  gelombang  560 nm.    Sebagai  kontrol  digunakan  larutan  yang  dipakai dalam  preparasi  sampel  hati  (yaitu  PBS  yang mengandung 11.5 g/L KCl).  Aktivitas SOD (%) dihitung dengan  menggunakan  persamaan  berikut:  1-  (A/B)   x 100,  dimana  A=  absorbansi  larutan  sampel,  B= absorbansi larutan kontrol.

## Pengukuran aktivitas katalase
Pengukuran  dilakukan  dengan  mengikuti prosedur  Iwai et  al .  (2002).    Aktivitas  katalase  diukur berdasarkan  besarnya  reduksi  hidrogen  peroksida. Dalam  kuvet  kuarsa,  sebanyak  0.5  ml  supernatan  hati ditambahkan ke dalam 2.0 ml bufer kalium fosfat (pH 7.0) yang  mengandung  10  mM  hidrogen  peroksida. Perubahan  absorbansi  pada  240  nm  dicatat  setiap  15 detik selama 1 menit.  Aktivitas katalase dihitung dengan menggunakan data kemiringan ( slope ) kurva  absorbansi larutan  sampel  (SL)  maupun  larutan  blanko  (SLb) mengikuti rumus berikut ini :
Aktivitas katalase (U/ml) =  (SL- SLb) x  2.5 0.0436         0.5

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Penentuan prosedur ekstraksi daun suji
Ekstrak  daun  suji  yang  diinginkan  adalah ekstrak  cair  yang  memiliki  aktivitas  antioksidan,  kadar total  klorofil  dan  kadar  klorofil  larut  air  yang  tinggi. Skrining  terdahulu    terhadap  beberapa  larutan pengekstrak,  yaitu  Na 2 CO 3 (0.1-0.5%),  NaHCO 3 (0.1- 0.5%),  Na-sitrat  12  mM  menunjukkan  bahwa penggunaan larutan pengekstrak NaHCO 3 0.5% dan Na- sitrat  12  mM  menghasilkan  ekstrak  dengan  aktivitas antioksidan, kadar total klorofil, dan kadar klorofil larut air yang  baik  (Prangdimurti et  al .,  2005).    Oleh  karena  itu untuk  selanjutnya  dicobakan  6  jenis  larutan  yaitu NaHCO 3 0.5%,  Na-sitrat  12  mM  dan  akuades,  masing- masing dengan  maupun tanpa penambahan Tween 80 1% (b/v).  Hasil yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1.  Pengaruh jenis larutan pengekstrak terhadap nilai rata-rata aktivitas antioksidan, kadar total klorofil, dan kadar klorofil larut air dari ekstrak daun suji yang dihasilkan Larutan pengekstrak Akktivitas antioksidan (%) Kadar total klorofil (mg/10 ml) Kadar klorofil larut air (mg/10 ml) Akuades 1.74 a 1.487 a 0.091 a Akuades + Tween 80 1% 8.74 b 2.540 b 0.509 bc Na-sitrat 12 mM 8.07 b 2.478 b 0.129 ab Na-sitrat 12 mM + Tween 80 1% 14.13 c 2.586 b 0.670 c NaHCO 3 0.5% 12.11 bc 2.575 b 0.258 ab NaHCO 3 0.5% + Tween 80 1% 11.94 bc 2.606 b 0.770 c
Ket. : Nilai rata-rata yang diikuti oleh huruf yang berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata (p<0.05).
Tabel  1  menunjukkan  bahwa  penambahan Tween  80  1%  ke  dalam  larutan  pengekstrak meningkatkan aktivitas antioksidan (aktivitas menangkap radikal  DPPH)  dari  ekstrak  akuades  dan  ekstrak  Na- sitrat,  meningkatkan  kadar  klorofil  larut  air  dari  ketiga ekstrak,  serta  meningkatkan  kadar  total  klorofil  dari ekstrak  akuades.      Penggunaan  larutan  pengekstrak Tween  80  1%  dalam  Na-sitrat  12  mM  menghasilkan aktivitas antioksidan ekstrak yang paling tinggi, serta  pH ekstrak  yang  mendekati  netral  (sekitar  6.6),  sehingga terpilih untuk digunakan pada tahap berikutnya.
Tween  80  (polioksietilen  sorbitan  monooleat) merupakan  surfaktan  atau  deterjen  non  ionik  dan termasuk  dalam  bahan  tambahan  pangan  kelas polisorbat.  Penggunaan  Tween  80  dalam  ekstraksi klorofil dapat menekan pembentukan feofitin dibandingkan deterjen anionik (Vargas dan Lopez, 2003). Tween  80  dapat  membantu  klorofil  lipofil  teremulsi  di dalam  air  dan  mempermudah  kontak  dengan  enzim klorofilase. Klorofilase bekerja menghidrolisis gugus fitol klorofil  sehingga  mengubahnya  menjadi  klorofilid  yang larut air.
Na-sitrat 12 mM dilaporkan dapat meningkatkan  aktivitas  klorofilase  (Lopez  et  al.,  1992). Larutan  pengekstrak    Tween  80  1%  dalam  Na-sitrat  12 mM  memiliki  pH  7.65,  yaitu  mendekati    pH  optimum klorofilase  daun  suji  (pH  7.4)  (Sibarani,  1994).  Kondisi tersebut menyebabkan lebih banyak klorofil larut air yang terbentuk.  Penggunaan  suhu  inkubasi  sebesar  70 o C adalah berdasarkan pertimbangan bahwa suhu optimum klorofilase  dalam  pelarut  air  berkisar  antara  65-75 o C (Clydesdale  dan  Francis,  1976).  Perlakuan  blansir terhadap  ekstrak  dilakukan  selama  1  menit,  karena waktu  yang  lebih  lama  dapat  merangsang  terjadinya reaksi oksidasi non enzimatis (Eskin, 1979).
Tahap selanjutnya ditujukan untuk menentukan konsentrasi  Tween  80  dan  lama  inkubasi,  dengan menggunakan larutan pengekstrak Tween 80 1% dalam Na-sitrat  12  mM.  Hasil  dari  tahap  ini  dapat  dilihat  pada Gambar  1.  Pengujian  sidik  ragam  menunjukkan  bahwa adanya  tahapan  inkubasi  meningkatkan  aktivitas antioksidan  dan  kadar  klorofil  larut  air.    Peningkatan konsentrasi  Tween  meningkatkan  kadar  klorofil  larut  air dari ekstrak, namun peningkatan konsentrasi Tween dari 0.75% menjadi 1% tidak menghasilkan perbedaan kadar klorofil  larut  air  (p>0.05).    Dari  tahap  ini  disimpulkan bahwa  prosedur  ekstraksi  yang  terbaik  adalah  dengan menggunakan  larutan  pengekstrak  Tween  80  0.75% dalam Na-sitrat 12 mM  dan pemberian inkubasi selama 30  menit  pada  suhu  70-75 o C sebelum  tahapan pemisahan  padatan.  Menurut  Sibarani  (1994)  waktu inkubasi  optimum  untuk  klorofilase  daun  suji  adalah  30 menit.
Estimasi  tingkat  penyerapan  klorofil  ekstrak  daun suji
Suatu komponen pangan dapat dengan mudah diserap oleh usus apabila berada dalam kondisi terlarut atau  tidak  terikat  oleh  komponen  lain  yang  berukuran besar,  oleh  karena  itu  besarnya  klorofil  yang  dapat diserap berkorelasi positif dengan kadar klorofil terlarut. Berdasarkan kurva standar SCC, kadar klorofil ekstrak daun suji (0.1 g/ml) setara dengan larutan SCC 2,3  mM.  Selama  pencernaan  terjadi  penurunan  kadar klorofil  terlarut,  baik  klorofil  suji  maupun  SCC  (Gambar 2).  SCC,  suatu  klorofilin,  umum  digunakan  sebagai bahan  utama  suplemen  pangan  kaya  klorofil  atau minuman klorofil. Sebanyak 45% klorofil suji terdegradasi di  lambung  (Gambar  2a),  diperkirakan  berubah  menjadi feofitin.  Ferruzzi  et  al.,  (2001)  menyebutkan  bahwa sebanyak  75-77%  klorofil  pure  bayam  berubah  menjadi feofitin  di  lambung.    Adanya  senyawa  antioksidan  lain dalam  ekstrak  daun  suji  diduga  turut  berperan  dalam mencegah  degradasi  klorofil  suji.    Analisis  yang  telah dilakukan  terpisah  terhadap  ekstrak  daun  suji menunjukkan  bahwa  ekstrak  mengandung  total  karoten sebanyak 17.0 ppm dan total fenol sebanyak 230.3 ppm. Ferruzzi et al., (2002a) mengungkapkan hal yang  sama bahwa  keberadaan  antioksidan  dalam  saus  apel  yang ditambahkan  ke  dalam  larutan  SCC  menurunkan    laju degradasi klorofilin.  Gambar 2a memperlihatkan adanya penurunan jumlah klorofil terlarut dari SCC pada kondisi asam  (lambung),  yang  jika  dilihat  secara  visual  tampak adanya  endapan  butiran  SCC.  Namun  endapan  yang terbentuk  bersifat reversible yaitu  dengan  adanya peningkatan  pH  hingga  di  atas  7,  seperti  yang  terjadi pada  kondisi  usus  halus,  sebagian  SCC  dapat  melarut kembali. Ferruzzi et al.,(2002a) juga menyatakan adanya kehilangan  sejumlah  SCC  selama  pencernaan in  vitro dan berubah menjadi produk yang belum diketahui.  Hal ini    menegaskan  kembali  bahwa  SCC  juga  mengalami degradasi di dalam saluran pencernaan, meskipun tidak sebesar klorofil a maupun klorofil b.
Tingkat  penyerapan  klorofil  ekstrak  daun  suji jauh  lebih  rendah  dibandingkan  larutan  SCC  (Gambar 2b).    Hal  ini  sejalan  dengan  yang  dikemukakan  oleh Ferruzi  et  al.,  (2001;  2002a),  yang  menggunakan  sel absorptif  Caco-2,  dimana  tingkat  penyerapan  klorofil lipofil sebesar 5-10% sedangkan klorofilin sebesar 45%- 60%.  Klorofil  lipofil  membentuk  misel  berukuran  besar sehingga  menghambat  dialisisnya  ke  dalam  kantung dialisis 6000-8000 MWCO (Salin et al., 1999 ).

## Pengujian  aktivitas  antioksidatif  menggunakan  tikus percobaan
Tikus  selama  percobaan  dalam  keadaan  sehat yang  ditunjukkan  oleh  adanya  kenaikan  berat  badan sebesar  1,7-1,8  g/hari,  dan  konsumsi  ransum  rata-rata sebanyak  15  g/hari.  Hasil  pengukuran  terhadap  berat organ  dan  parameter  antioksidatif  dapat  dilihat  pada Tabel 2.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 tanpa ink 0' 30' 60' lam a inkubasi (m enit) k a d a r k lo ro fi l la ru t a ir ( m g /g ) Tw een 0,25% Tw een 0,5% Tw een 0,75% Tw een 1% 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 tanpa ink 0' 30' 60' lam a inkubasi (m enit) A k t a n ti o k s id a n ( % ) Tw een 0,25% Tw een 0,5% Tw een 0,75%
Tw een 1%
Gambar  1.  Pengaruh  tingkat  konsentrasi  Tween  80  yang  ditambahkan  ke  dalam  larutan  pengekstrak  Na-sitrat  12  mM  dan  lama inkubasi terhadap: (a) kadar klorofil larut air, dan (b) aktivitas antioksidan
26,36 27,02 14,45 0,49 13,86 15,09 1,78 5,97 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 Ekstrak suji 0,1 g/ml SCC 2,3 mM m g k lo r o f il Aw al Gastrik Digesta Dialisat 6,74 22,08 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 Ekstrak Suji Lar SCC % k lo ro fi l te rs e ra p
Gambar 2. (a) Kadar klorofil terlarut pada masing-masing fraksi selama pencernaan in  vitro , (b) estimasi jumlah klorofil yang terserap
Tabel  2. Pengaruh pemberian ekstrak daun suji dan SCC terhadap berat organ dan parameter antioksidatif tikus percobaan
Parameter Kelompok Kontrol Kelompok Suji Kelompok SCC Berat  organ (g per 100 g BB): hati 2.98 a 3.22 a 3.21 a limpa 0.20 a 0.18 a 0.18 a ginjal 0.54 a 0.56 a 0.53 a Kadar MDA hati (pmol/g) 217.97 b 65.17 a 116.49 a Aktivitas katalase hati (U/ml) 16.75 a 23.49 b 19.58 ab Aktivitas SOD hati (%) 19.02 a 23.77 b 31.52 c
Ket. : Nilai rata-rata yang diikuti oleh huruf yang berbeda dalam baris yang sama menunjukkan adanya perbedaan nyata (p<0.05)
(b)
(a) a
b
Pemberian  ekstrak  daun  suji  maupun  SCC tidak  mengakibatkan  perbedaan  berat  organ  hati,  limpa dan  ginjal  (p>0.05).    Berdasarkan  laporan  JECFA (Anonim,  1969),  tembaga  (Cu)  dalam  senyawa  Cu- klorofil/klorofilin  terikat  kuat  dan  tidak  ada  efek toksikologis yang berarti jika diberikan melalui jalur oral, bahkan  pada  pengujian  jangka  panjang  menggunakan tikus  percobaan.  Pemberian  Cu-klorofilin  dalam  ransum sebanyak  1500  mg/kg  berat  badan  per  hari  tidak mengakibatkan  efek  toksikologis.    Perkiraan  ADI ( Acceptable  Daily  Intake )  Cu-klorofil/klorofilin  untuk manusia  sebesar  0-15  mg/kg  berat  badan.  Sedangkan untuk  ekstrak  daun  suji  belum  dilakukan  analisis histopatologis maupun uji toksisitas.
Pengujian  aktivitas  antioksidan  dilakukan dengan  mengukur  kadar  MDA  (malondialdehida), aktivitas  SOD  dan  aktivitas  katalase  hati.  MDA    adalah produk  peroksidasi  lipid,  dan  kadarnya  dapat  ditekan oleh  keberadaan  senyawa-senyawa  antioksidan. Dengan kata lain kadar MDA yang rendah menunjukkan adanya penghambatan terhadap oksidasi lipid oleh suatu antioksidan.    Tabel  2  di  atas  menunjukkan  bahwa pemberian ekstrak  daun suji maupun SCC  menurunkan kadar MDA sebesar 70%  dan 47%, diduga karena  sifat antioksidatif  dari  klorofil.  Endo  et  al.,  (1985) mengemukakan  bahwa  klorofil  merupakan  antioksidan pemutus rantai yang bekerja dengan cara mendonorkan elektronnya  kepada  radikal  bebas.  Dalam  menghambat oksidasi  lipid,  klorofil  bekerja  pada  tahap  inisiasi. Dikatakannya  pula  bahwa  yang  berperan  dalam  sifat antioksidatif klorofil adalah struktur porfirinnya.
Kerentanan suatu jaringan terhadap kerusakan oksidatif  tergantung  terutama  pada  mekanisme pertahanan  oksidatifnya,  antara  lain  enzim-enzim antioksidannya.    Enzim  katalase  dan  SOD  termasuk enzim-enzim  utama  yang  berperan  dalam  melindungi oksidasi  jaringan.    Katalase  dan  SOD  adalah  enzim- enzim yang bekerjasama menetralisir radikal superoksida.    Radikal  superoksida  pertama-tama didismutasi oleh SOD menjadi H 2 O 2 yang masih bersifat toksik,  dan  selanjutnya  H 2 O 2 didegradasi  oleh  katalase menjadi  produk  yang  tidak  toksik.  Dalam  analisis  yang dilakukan,  katalase  ditambahkan  ke  dalam  campuran reaksi  dalam  jumlah  yang  sama,  kemudian  dihitung kecepatan  penguraian  dari  H 2 O 2 yang  ditambahkan. Hasil  pengujian  terhadap  ekstrak  hati  kelompok  suji menunjukkan  adanya  peningkatan  aktivitas  katalase sebesar 40% lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol (p<0.05).  Kecepatan  penguraian  H 2 O 2 ini  diduga disebabkan  oleh:  (1)  peningkatan  aktivitas  katalase  hati dan/atau (2) kemampuan klorofil menangkap ( scavenge ) H 2 O 2 .    Efek  klorofil  terhadap  katalase  telah  dibuktikan secara in  vitro antara  lain  oleh  Hsu  et  al.,  (2005)  yang menyatakan  bahwa  klorofil  larut  air,  dalam  hal  ini feoforbid  a  dan  feoforbid  b,  memperkuat  ketahanan limfosit  manusia  terhadap  kerusakan  oksidatif  yang diinduksi  oleh  H 2 O 2 .  Kemampuan  klorofil  menangkap H 2 O 2 telah  diteliti  oleh  Kumar  et  al.,  (2001)  yang
menyebutkan  bahwa konstanta  kecepatan reaksi antara klorofilin dengan H 2 O 2 adalah sebesar 2.7 x 10 6 M -1 .s -1 .
Katalase  maupun  klorofil  memiliki  kerangka  porfirin dalam strukturnya, sehingga diduga klorofil berkontribusi dalam  sintesis  katalase.    Selain  itu  keberadaan antioksidan  lain  dalam  ekstrak  daun  suji,    seperti karotenoid  dan  komponen  fenolik  berkonstribusi  dalam peningkatan status antioksidatif kelompok suji.
SOD  merupakan  enzim  antioksidan  yang berperan  dalam  dismutasi  radikal  superoksida.    Dalam analisis  yang  dilakukan,  radikal  superoksida  dihasilkan terlebih  dahulu  dari  reaksi  antara  xantin  dan  xantin oksidase.    Radikal  superoksida  akan  mengoksidasi garam  tetrazolium  (berwarna  kuning)  menjadi  formazan yang berwarna biru. Semakin tinggi aktivitas SOD berarti semakin  banyak  radikal  superoksida  yang  dinetralisir, dan  hal  ini  ditunjukkan  oleh  semakin  rendahnya  jumlah formazan  yang  terbentuk.  Kelompok  suji  dan  SCC memiliki  aktivitas  menangkap  radikal  superoksida  yang lebih  besar,    yaitu  masing-masing  25%  dan  66%  lebih besar  dibandingkan  kelompok  kontrol.  Boloor et  al .
(2000) menyatakan bahwa klorofilin pada konsentrasi 10 µM melindungi membran mitokondria hati tikus terhadap radiasi  dan  fotosensitasi,  yang  ditandai  dengan penurunan  peroksida,  protein  oksidasi,  serta  restorasi GSH (glutation) dan SOD.

## KESIMPULAN
Ekstraksi  daun  suji  dilakukan  dengan menggunakan  larutan  pengekstrak  Tween  80  0.75% dalam Na-sitrat 12 mM diikuti dengan inkubasi selama 30 menit  pada  70-75 o C.    Metode  ini  mampu  menghasilkan ekstrak  daun  suji  yang  lebih  baik,  yaitu  memiliki  kadar total  klorofil,  kadar  klorofil  larut  air  dan  aktivitas antioksidan  yang  signifikan  lebih  tinggi,  dibandingkan dengan  ekstrak  yang  dihasilkan  dengan  hanya menggunakan air (akuades) seperti yang biasa dilakukan di  tingkat  rumah  tangga.  Pengujian  dengan menggunakan  kantung  dialisis  menunjukkan  bahwa klorofilin  (SCC)  diserap  lebih  banyak  dibandingkan klorofil ekstrak daun suji, yaitu berturut-turut sekitar 22% dan 7%.
Pemberian  ekstrak  daun  suji  maupun  SCC secara  oral  selama  2  bulan  tidak  mengakibatkan perbedaan  berat  organ  hati,  limpa  dan  ginjal  tikus Sprague  Dawley  jantan.    Pemberian  ekstrak  daun  suji dapat  meningkatkan  status  antioksidatif  tubuh,  yang antara  lain  ditunjukkan  oleh  adanya  penurunan  kadar MDA  hati  sebesar  70%  dan  peningkatan  aktivitas katalase  hati  sebesar  40%  dibandingkan  kelompok kontrol,  bahkan  kondisi  ini    lebih  baik  dibandingkan kelompok  SCC.  Pemberian  ekstrak  daun  suji  maupun SCC  meningkatkan  aktivitas  SOD  hati,  yaitu  masing- masing  25%  dan  66%  lebih  besar  dibandingkan kelompok  kontrol.  Peningkatan  status  antioksidatif  tikus
percobaan diduga disebabkan oleh  aktivitas antioksidan klorofil yang terkandung dalam ekstrak daun suji maupun SCC.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Direktorat  Pembinaan  Penelitian  dan  Pengabdian kepada  Masyarakat,  Ditjen  Pendidikan  Tinggi, Departemen  Pendidikan  Nasional  R.I  atas  dana penelitian  yang  diberikan  melalui  Program  Hibah Bersaing  XIII  dengan  No.kontrak:  026/SPPP/PP- PM/DP3M/IV/2005  dan  No.kontrak:  317/SP3/PP/ DP2M/II/2006

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim.    1969. Chlorophyll  copper  complex  and chlorophyllin  copper  complex,  sodium  and potassium  salts.  Thirteenth  report  of  the JECFA-FAO Nutr. Meetings Rep. Series.
AOAC  (Association  of  Official  Analytical  Chemists). 1984. Official  Methods  of  Analysis. Washington D.C.
Boloor,  K.K.,  J.P.  Kamat  and  T.P.  Devasagayam. 2000. Chlorophyllin  as  a  protector  of mitochondrial  membranes  against  gamma- radiation  and  photosensitization.    J.  Toxicology 155 (1-3): 63-71.
Clydesdale, F.M. dan F.J. Francis. 1976. Pigments. Di dalam O.R.  Fennema.  Principles  of  Food Science. Marcel Dekker, Inc., New York.
Egner,  P.A.,  K.H.  Stansbury,  E.P.  Snyder,  M.E. Rogers,  P.A.  Hintz  dan  T.W.  Kensler.  2000 . Identification  and  characterization  of  chlorin  e4 ethyl ester in sera individuals participating in the chlorophyllin
chemoprevention trial.
Chem.Res.Toxicol. 13:900-906.
Endo,  Y.,  R.  Usuki,  dan  T.  Kaneda.  1985. Antioxidant effects  of  chlorophyll  and  pheophytin  on  the autoxidation of oils in the dark. II. The mechanism of antioxidative action of chlorophyll.  JAOCS 62 :1387-1390.
Eskin, N.A. 1979. Plant Pigments, Flavour and Texture : The  chemistry  and  biochemistry  of  selected compound. Academic Press, New York.
Ferruzzi, M. G., M. L. Failla, dan S. J. Schwartz. 2001. Assessment  of  degradation  and  intestinal  cell uptake  of  carotenoid  and  chlorophyll  derivatives from spinach puree using an in vitro digestion and
Caco-2  human  cell  model.  J.  Agric.  Food  Chem 49: 2082-2089.
Ferruzzi,  M.  G.,  M.  L.  Failla,  dan  S.  J.  Schwartz. 2002a. Sodium  copper  chlorophyllin: in  vitro digestive  stability  and  accumulation  by  Caco-2 human  intestinal  cells.  J.Agric.Food  Chem.  50: 2173-2179.
Ferruzzi, M. G., Bohm, V.,   Courtney, P.D., dan S. J. Schwartz. 2002b. Antioxidant and antimutagenic activity  of  dietary  chlorophyll  derivatives determined  by  radical  scavenging  and  bacterial reverse  mutagenesis  assays.  J.  Food  Sci. 67(6):2589-2594.
Gross,  J.  1991. Pigments  in  Vegetables:  chlorophylls and  carotenoids.  Van  Nostrand  Reinhold,  New York.
Hsu, C.Y., C.M. Yang, C.M. Chen, P.Y. Chao dan S.P. Hu.    2005. Effects  of  chlorophyll-related compounds  on  hydrogen  peroxide  induced  DNA damage withim human lymphocytes. J.Agric.Food Chem. 53:2746-2750.
Iwai,  K.,  N.  Nakaya,  Y.  Kawasaki,  dan  H.  Matsue. 2002. Antioxidative  functions  of  natto,  a  kind  of fermented soybeans: effect on LDL oxidation and lipid metabolism in cholesterol-fed rats.  J.,Agric. Food Chem. 50:3597-3601.
Kamat J.P., K.K. Bolor, danT.P. Devasagayam.  2000. Chlorophyllin  as  an  effective  antioxidant  against membrane damage in vitro and ex vivo .  Biochem Biophys Acta 1487(2-3):113-27.
Kubo,  I.,  N.  Masuoka,  P.  Xiao.,  dan  H.  Haraguchi. 2002. Antioxidant  activity  of  dodecyl  gallate.  J. Agric. Food Chem. 50:3533-3539.
Kumar,  S.S.,  T.P.  Devasagayam,  B.  Bhushan,  dan N.C.  Verma.    2001. Scavenging  of  reactive oxygen  species  by  chlorophyllin:  an  ESR  study. Free Radic Res. 35 (5) : 563-74
Lopez,  J.A.F.,  L.  Almela,  M.S.  Almansa  dan  J.M. Lopez-Roca.  1992. Partial  purification  and properties  of  chlorophyllase  from  chlorophyll citrus  limon leaves.  Phytochem.  31  (2)  :  447  – 449.
Prangdimurti,  E.  D.  Muchtadi,  M.  Astawan,  F.R. Zakaria.  2005. The effect of extraction solutions and  incubation  time  on  chlorophyll  solubility  and antioxidant capacity of suji ( Pleomele angustifolia N.E.  Brown) leaf extracts.   Pre-proceeding of 9 th ASEAN  Food  Conference  Jakarta,  8-10  August 2005.
Salin, M.L., L.M. Alvarez, B.C. Lynn, B. Habulihaz, dan A.W.  Fountain.  1999. Photooxidative  bleaching of chlorophyllin.  Free Radic Res. 31:S97-105.
Sibarani,  J.  1994. Pemurnian  Parsial  dan  Pengujian Aktivitas  Enzim  Klorofilase  dari  Daun  Suji ( Pleomele  angustifolia N.E.  Brown).  Skripsi. Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB, Bogor.
Singh,  R.P.,  K.N.C.  Murthy,  dan  G.K.  Jayaprakasha. 2002. Studies  on  the  antioxidant  activity  of pomegranate  ( Punica  granatum )  peel  and seed extracts using in vitro models. J. Agric.
Food Chem. 50: 81-86.
Vargas, F.D dan O.P. Lopez, 2003. Natural Colorants for Food and Nutraceutical Uses. CRC Press, London. p 221-232.
Wijeratne, S.S.K., S.L. Cuppett dan V. Schlegel. 2005. Hydrogen  peroxide  induced  oxidative  stress damage and antioxidant enzyme response in Caco-2  human  colon  cells.    J.Agric.Food Chem. 53:8768-8774.