## AKTIVITAS HEPATOPROTEKTOR KOMBINASI EKSTRAK AIR PEGAGAN
(Centella asiatica L. Urban) DAN EKSTRAK ETANOL KUNYIT (Curcuma longa Linn) TERHADAP TIKUS PUTIH JANTAN SPRAGUE DAWLEY

## Gelline Tama Anindia Firman, Min Rahminiwati, Ike Yulia Wiendarlina
Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pakuan

## ABSTRAK
Hepatoproktektor adalah senyawa yang dapat mencegah dan memperbaiki sel-sel hepar yang rusak. Parameter yang diamati adalah perubahan kadar SGPT pada hari ke 0, 2,  5,  9  dan  13.  Hasil  penelitian  dari  9  kombinasi  dosis  selama  13  hari  menunjukkan semua  kombinasi  menurunkan  kadar  SGPT  dengan  aktivitas  hepatoprotektor  terbaik adalah  terdapat  pada  tumbuhan  ektrak  air  pegagan:  ekstrak  etanol  kunyit  dengan perbandingan 2:3.
Kata  kunci: Pegagan  ( Centella  asiatica L.Urban),  Kunyit  ( Curcuma  longa Linn)  dan hepatoprotektor

## ABSTRACT
Hepatoprotector  is  a  compound  that  can  prevent  and  repair  liver  cell  damage. This research aimed to study the activity and effectivity of combination Centella asiatica water  extract  and  Curcuma  longa  ethanol  extract  as  hepatoprotector  by  SGPT ( Serum Glutamat  Piruvat  Transaminase ) in  Sprague  Dawley  male  white  rats  induced paracetamol. Parameters measured were changes in ALT levels at day 0, 2, 5, 9 and 13. Combinations  of  doses  for  13  days  showed  all  combinations  of  those  extract  potencial hepatoprotector.  The  best  activity  was  found  in  ratio  2:3  (Centella  asiatica extract:ethanol extract of turmeric).
Keywords: Centella asiatica L. Urban, Curcuma longa Linn and Hepatoprotector

## PENDAHULUAN
Hati  merupakan  organ  tubuh  yang besar,  kompleks  dan  terdapat  di  dalam rongga  perut  kanan  atas,  tepat  di  bawah diafragma  kanan  dan  dilindungi  tulang iga  kanan  bawah  serta  diselubungi  oleh peritoneum.  Fungsi  hepar  antara  lain adalah  detoksifikasi  zat-zat  beracun,  baik yang  masuk  dari  luar  maupun  yang dihasilkan  oleh  tubuh  sendiri,  sehingga hati sangat mudah menjadi sasaran utama ketoksikan (Dalimartha, 2005).
Penyebab terjadinya gangguan hepar  selain  virus  dan  bakteri,  juga  dapat berupa  obat-obatan,  seperti  parasetamol. Parasetamol  adalah  obat  analgesik  yang secara    umum    digunakan    dalam pengobatan  sebagai  antipiretik,  namun sifat dari parasetamol ini adalah hepatotoksik  jika  diberikan  pada  dosis tinggi.
Pengobatan  dan  harga  obat-obatan hepatitis  relatif  mahal  sedangkan  efeknya hanya  dapat  mencegah  dan  meredakan gejala-gejala  penyakitnya,          sehingga pemanfaatan obat tradisional pada saat ini terus  meningkat  sehingga  kecenderungan masyarakat  kembali  ke  alam  atau  lebih dikenal  dengan  istilah “back  to  nature” (Meistani, 2001).
Sejak  tahun  1976  telah  dilakukan usaha  untuk  menemukan  senyawa  kimia yang    berasal    dari    tumbuhan    yang memiliki  aktivitas  hepatoprotektor,  yaitu senyawa yang mempunyai aktivitas melindungi  selsel  hati  dan  bahkan memperbaiki   jaringan    hati.   Tanaman yang  digunakan  secara  tradisional  dalam pengobatan  penyakit  hati,  yaitu  pegagan ( Centella  asiatica L.Urban)  dan  Kunyit ( Curcuma longa Linn).
Rebusan   air   pegagan   memiliki efek hepatoprotektor pada dosis 6,25 mg/ 200  g  BB  (Setiani,  2012)  dan  ekstrak etanol   80% Curcuma   longa memiliki
efek perlindungan terhadap hepatotoksisitas    pada    tikus    yang diinduksi  parasetamol  dosis  800  mg/  Kg BB  (Kalantari et  al .  2007).  Hasil penelitian  terdahulu  menunjukkan  bahwa pegagan  mengandung  beberapa  senyawa aktif diantaranya adalah terpenoid, flavonoid dan glikosida. Senyawa flavonoid dalam tanaman diketahui merupakan  senyawa  antioksidan  dan berpotensi  mencegah  kerusakan  sel-sel tubuh,  diantaranya  sel  hepar  (Crawford, 1995),  sedangkan  kunyit  mengandung beberapa  senyawa  diantaranya  minyak atsiri,  kurkumin,  pati,  tanin  dan  resin (Hembing,  2005).  Baik  ekstrak  pegagan maupun kunyit berpotensi sebagai hepatoprotektor  dengan  mekanisme  yang sama yaitu melibatkan enzim GSH. Akan tetapi,  kurkumin  dari  kunyit  mempunyai efek  yang  tidak  terdapat  dalam  pegagan yaitu  kolagogum.  Interaksi  yang  muncul bila  kedua  ekstrak  tersebut  dikombinasi bisa  bersifat  sinergis  atau  antagonist. Interaksi dapat diketahui dengan mengukur perubahan SGPT tikus penderita hepatitis  yang diinduksi dengan parasetamol.

## METODE PENELITIAN Bahan dan Alat
Bahan   yang   digunakan   dalam penelitian  ini  adalah  tikus  putih  jantan galur Sprague  Dawley yang  berumur  3 hingga  4  bulan  dengan  bobot  180  g hingga 220 g sebanyak 48 ekor, pegagan ( Centella  asiatica ),  parasetamol,  kunyit ( Curcuma  longa Linn),  etanol  96%, aquadest ,  asam  ursodeoxycholic,  CMC Na  0,5  %,  larutan  EDTA,  reagen  SGPT (ALT).  Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah spektrofotometer UV-VIS , sonde, tabung sentrifuga, sentrifuga , timbangan analitik,
timbangan  digital  tikus,  kandang  tikus, termometer, vaccum   dry ,   evaporator,
kawat    penutup,    bak    plastik,    botol minum,  blender,  papan  fiksasi,  alat bedah,  alat-alat  gelas  dan alatalat  umum lainnya  yang  lazim  digunakan  di  dalam laboratorium kimia.

## Penyediaan Simplisia
Pegagan  yang  digunakan  adalah pegagan  segar  dengan  ciri-ciri  daun  lebar bentuk  bulat,  berwarna hijau  dengan akar tunggang,  bulat  dan  putih.  Pegagan  segar diperoleh  dengan  cara  dikumpulkan  dari persawahan kemudian dicuci bersih untuk menghilangkan    dari    kotoran    seperti tanah, kemudian ditiriskan untuk membebaskan dari sisa-sisa air cucian.
Rimpang  kunyit  yang  digunakan adalah  rimpang  yang  segar  dengan  ciri- ciri  kulit  luar  rimpang  berwarna  jingga kecoklatan dan daging buah merah jingga kekuningan, tumbuh bercabang.  Rimpang kunyit  dikumpulkan  dari  perkebunan warga dan dicuci bersih untuk menghilangkan    dari    kotoran    seperti tanah, kemudian ditiriskan untuk membebaskan  dari  sisa-sisa  air  cucian kemudian  rimpang  kunyit  dipotong  tipis arah  melintang  dan  dirajang  dengan  cara dikeringkan  sampai  kering  pada  suhu kamar.

## Uji Pestisida
Uji  pestisida  dilakukan  terhadap kunyit  dan  pegagan.  Sampel  dicincang lalu dikondisikan pH 5-6 dengan penambahan etil asetat, kemudian diekstraksi dengan 100  ml petroleum eter selama 30 menit dengan cara pengocokan (alat shaker ).  Filtrat  dipisahkan  dari endapannya  dan  diekstraksi  kembali endapannya  dengan    50  ml    petroleum eter  dengan  cara  yang  sama  seperti ekstraksi  yang  pertama.  Disatukan  filtrat hasil kedua  ekstraksi tersebut  dan dilakukan penotolan pada plat KLT silika
gel  dengan  volume  sampel      10  µL  dan volume    standar    0,5    µL    dengan konsentrasi  1000  ppm,  kemudian  plat dikembangkan  dalam  larutan  campuran heksan  :  aseton  (70  :  30),  lalu  plat dikeringkan dengan cara disemprot berturut-turut  dengan  larutan fast  blue 1
%  dalam  etanol  dan  larutan  NaOH  20  % dan    dikeringkan    dengan    menggunakan alat evaporator (Yuningsih, 2008).

## Pembuatan     Ekstrak     Pegagan     dan
Kunyit Ekstrak pegagan dibuat menggunakan aquadest sebagai pengekstrak  dengan  cara  direbus  pada pemanasan konstan    tidak sampai mendidih  (90ºC)  selama      3  jam.  2,5  kg pegagan  yang  sudah  dicuci  bersih  dan ditiriskan,  lalu  direbus  menggunakan aquadest sebanyak  17,5  Liter      sampai diperoleh filtrat   setengahnya dari jumlah aquadest yang digunakan atau 8,75  Liter. Serkai  selagi  panas  melalui  kain  flanel. Filtrat  yang  diperoleh  dilakukan vaccum dry untuk menghasilkan ekstrak kering.
Ekstrak  kunyit  dibuat  dengan  cara maserasi.  Rimpang  kunyit  yang  sudah dikumpulkan  dari  perkebunan  warga sebanyak  4,5  kg,  dicuci  bersih  untuk menghilangkan    dari    kotoran    seperti tanah, kemudian ditiriskan untuk membebaskan  dari  sisa-sisa  air  cucian kemudian  rimpang  kunyit  dipotong  tipis arah  melintang  dan  dirajang  (dikeringkan sampai    kering    pada    suhu    kamar) kemudian  digrinder  sampai  didapatkan serbuk  halus  dan  diayak  menggunakan mesh  30.  Serbuk  yang  sudah  diayak, ditimbang  kembali.  Sebanyak  2,5  kg serbuk kunyit halus dimasukkan ke dalam tabung  coklat  ditambah  10  bagian  etanol 96%  atau  25  Liter  (perbandingan  ekstrak dengan  pelarut  yaitu  1:10),  direndam selama  3  hari  (sesekali  dikocok).  Semua
maserat  yang diperoleh dikumpulkan dan di vaccum  dry hingga  diperoleh  ekstrak kental   (DepKes   RI,   1979).   Rendemen dari      masing-  masing  ekstrak  dihitung dengan     membandingkan     berat     awal simplisia  segar  dan  berat  akhir  perasan yang dihasilkan. Rendemen Ekstrak = Bobotekstrak
x100%
Bobot awal simplisia segar

## Penetapan Kadar Air Ekstrak
Kadar  air  adalah  salah  satu parameter  standarisasi.  Adanya  air  dalam ekstrak akan memungkinkan pertumbuhan  mikroba.  Batas  kandungan air  masingmasing  ekstrak  menunjukan batas  diperbolehkan  jumlah  air  yang dikandung  oleh  ekstrak  yang  akan digunakan  untuk  keperluan  farmasi.  Uji kadar air dilakukan dengan menggunakan Moisture  Balance. Sebanyak  1  g  ekstrak ke  dalam  alat  yang  telah  disiapkan,  pada suhu  105 0 C  selama  10  menit.  Kemudian dicatat  kadar  yang  tertera  pada Moisture Balance .

## Penetapan Kadar Abu Ekstrak
Sebanyak 2 gram serbuk
dimasukkan  ke  dalam  krus  yang  sudah ditara,  kemudian  pijarkan  dalam  tanur pada  suhu  600 0 C  sampai  terjadi  abu didinginkan  dan  ditimbang.    Kadar  abu total =
Bobot Abu yang didapat
x100% Bobot Awal ekstrak Uji     Fitokimia     Senyawa     Golongan Alkaloid Sebanyak 0,5 gram ekstrak
ditambahkan    5    mL    amonia    30% kemudian  digerus  dalam  mortar,  lalu ditambahkan  20  mL  kloroform  digerus
dan  disaring.  Fase  organik  diambil  dan diekstraksi  dengan  10  mL  asam  klorida 10%  dan  lapisan  asamnya  dipisahkan  ke dalam  tabung  reaksi  yang  lain.  Lapisan asam  ini  diteteskan  pada  lempeng  tetes dan    ditambahkan    pereaksi    Meyer, Wagner  dan  Dragendorf.  Terbentuknya endapan  merah  bata  dengan  pereaksi Dragendorf,  Wagner  terbentuk  endapan coklat dan endapan putih dengan pereaksi Mayer  menunjukan adanya alkaloid (Rajendra, 2011).

## Senyawa Golongan Flavonoid
Sebanyak 0,5 gram ekstrak dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian ditambahkan 100 mL air  panas dan    dididihkan    selama    5    menit. Campuran  tersebut  disaring  sehingga diperoleh  filtrat  yang  digunakan  untuk pengujian.  Sebanyak  10  mL  filtrat dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan ditambahkan    0,5    gram    serbuk magnesium,  2  mL  alkohol  klorhidrat (campuran  HCl  37%  dan  etanol  95  % 95%  dengan  perbandingan  1:1)  dan  20 mL  amil  alkohol  kemudian  dikocok dengan  kuat.  Terbentuknya  warna  merah, kuning,  jingga  pada  lapisan  amil  alkohol menunjukkan adanya flavonoid (Rajendra, 2011).

## Senyawa Golongan Saponin
Sebanyak  10  mL  larutan    yang diperoleh dari identifikasi golongan flavonoid  dimasukan  ke  dalam  tabung reaksi dan dikocok secara vertikal selama 10  detik  dan  dibiarkan  selama  10  menit. Adanya  saponin  ditunjukkan  dengan terbentuknya  buih  yang  stabil.  Bila ditambahkan  1  tetes  HCl  1%  busa  tetap stabil (Rajendra, 2011).

## Senyawa Golongan Tanin
Sebanyak 0,5 gram sampel ditambahkan
10  mL    FeCl 3 1    %.    Adanya    tanin ditunjukkan  dengan  terbentuknya  warna hijau,  biru  atau  keunguan,  ditambah gelatin   1%  adanya   endapan   (Rajendra, 2011).

## Senyawa GolonganSteroid/Triterpenoid
Sebanyak  10  mL  filtrat  dari  uji saponin  ditambahkan  3  tetes  anhidrat asetat dan 1 tetes H 2 SO 4 pekat. Terbentuknya  warna  hijau  atau  biru menunjukkan  adanya  senyawa  golongan steroid  dan  terbentuknya  warna  merah atau  ungu  menunjukkan  adanya  senyawa golongan triterpenoid (Rajendra, 2011).

## Persiapan Hewan Coba
Hewan  percobaan  yang  digunakan adalah  48  ekor  tikus  putih  jantan  galur Sprague    Dawley dengan    kondisi kesehatan  yang  baik,  berat  rata-rata  180 sampai  220  gram.  Dari  jumlah  tersebut, tikus dikelompokan secara random menjadi  12  kelompok perlakuan,  masing- masing   4   ekor   dalam   tiap   kandang. Empat  puluh  delapan  ekor  tikus  tersebut dikandangkan  secara  terpisah  di  dalam kandang  berbentuk  kotak  plastik,  dengan tutup  kawat  yang  mudah  dibuka.  Alas kandang  dialasi  dengan  gabah  padi  yang harus  diganti  setiap  3  hari  sekali  agar kondisi  kandang  tetap  kering  dan  sehat. Tikus  diadaptasikan  di  Laboratorium Farmasi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan  Alam  Universitas  Pakuan Bogor    selama    7    hari.    Kemudian dilakukan  penimbangan  dan  penandaan untuk  menentukan  kelompok  dosis  yang akan  dilakukan.  Selama  penelitian  semua kelompok  tikus  diberi  pakan  standar  dan air secara ad  libitum .

## Penentuan Aktivitas Hepatoprotektor
Tikus    dipuasakan    makan    16 hingga 18 jam sebelum diinduksi parasetamol 180 mg/ kg BB, minum tetap diberikan  secara ad  libitum .  Seminggu sebelum diinduksi parasetamol, dilakukan analisis  darah  untuk  mengetahui  kadar SGPT    awal    pada    masingmasing kelompok.  Parasetamol  diberikan  kepada semua  kelompok tikus,  kecuali  kelompok normal.  Induksi  dilakukan  sampai  kadar SGPT      meningkat      sedangkan     analisis darah  dilakukan  pada  hari  ke-2  setelah dilakukan induksi parasetamol hari ke-1    sampai    diketahui    kadar    SGPT meningkat  yaitu  nilai  SGPT  lebih  dari kontrol   normal.   Kadar   SGPT   normal dalam  tikus  putih  adalah  17,5-30,2  UI/L (Smith    dan    Mangkoewidjoyo,    1988). Setelah diketahui kadar SGPT meningkat dari  kontrol  normal  kemudian  dilakukan perlakuan  selama  13  hari  berturut-turut dan   dilakukan   pengecekan   darah   pada hari  ke-5,  ke-9  dan  ke-13.  Setelah  tikus dilakukan   perlakuan   selama   13   hari, maka  tikus    di eutanasia dan    dibedah untuk   diambil   hatinya.   Kelompok   uji perlakuan selama 13 hari sebagai berikut: a. Kelompok   I:   kontrol   positif   diberi parasetamol  180  mg/200  g  BB  dan asam     ursodeoxycholic     per     oral dengan   dosis   12,6   mg/200   g   BB dalam CMC Na 0,5%.
b. Kelompok  II:  kontrol  negatif  diberi per  oral  parasetamol  180  mg/200  g BB  dan  CMC  Na  0,5%  sebanyak  1 mL/200 g BB.
c. Kelompok  III:  kontrol  normal  diberi aquadest.
d. Kelompok    IV:    diberi    per    oral parasetamol  180  mg/200  g  BB kemudian diberikan ekstrak air pegagan dosis 6,25 mg/200 g BB.
e. Kelompok      V:      diberi      per    oral parasetamol    180    mg/200    g    BB
kemudian   diberikan   ekstrak   etanol kunyit dosis 112 mg/200 g BB.
f. Kelompok     VI:     diberi     per     oral parasetamol  180  mg/200  g  BB kemudian    diberikan    kombinasi ekstrak    air    pegagan    dan    kunyit dengan  perbandingan  dosis  1:1  yang diberikan  pada  2  dosis,  dosis  masing- masing  6,25  mg/200  g  BB  dan  112 mg/200  g  BB  sehingga  dosis  ekstrak kombinasi  1:1  adalah  118,25  mg/200 g BB.
g. Kelompok    VII:    diberi    per    oral parasetamol  180  mg/200  g  BB kemudian    diberikan    kombinasi ekstrak    air    pegagan    dan    kunyit dengan  perbandingan  dosis  1:2  yang diberikan  pada  2  dosis,  dosis  masing- masing  6,25  mg/200  g  BB  dan  224 mg/200  g  BB  sehingga  dosis  ekstrak kombinasi  1:2  adalah  230,25  mg/200 g BB.
h. Kelompok    VIII:    diberi    per    oral parasetamol  180  mg/200  g  BB kemudian    diberikan    kombinasi ekstrak    air    pegagan    dan    kunyit dengan  perbandingan  dosis  1:3  yang diberikan  pada  2  dosis,  dosis  masing- masing  6,25  mg/200  g  BB  dan  336 mg/200  g  BB  sehingga  dosis  ekstrak kombinasi  1:3  adalah  342,25  mg/200 g BB.
i. Kelompok     IX:     diberi     per     oral parasetamol  180  mg/200  g  BB kemudian    diberikan    kombinasi ekstrak    air    pegagan    dan    kunyit dengan  perbandingan  dosis  2:1  yang diberikan  pada  2  dosis,  dosis  masing- masing  12,5  mg/200  g  BB  dan  112 mg/200  g  BB  sehingga  dosis  ekstrak kombinasi 2:1 adalah  124,5 mg/200  g BB.
j. Kelompok     X:     diberi     per     oral parasetamol  180  mg/200  g  BB kemudian       diberikan       kombinasi
ekstrak    air    pegagan    dan    kunyit dengan  perbandingan  dosis  2:3  yang diberikan  pada  2  dosis,  dosis  masing- masing  12,5  mg/200  g  BB  dan  336 mg/200  g  BB  sehingga  dosis  ekstrak kombinasi 2:3 adalah  348,5 mg/200  g BB.
k. Kelompok    XI:    diberi    per    oral parasetamol  180  mg/200  g  BB kemudian    diberikan    kombinasi ekstrak    air    pegagan    dan    kunyit dengan  perbandingan  dosis  3:1  yang diberikan  pada  2  dosis,  dosis  masing- masing  18,75  mg/200  g  BB  dan  112 mg/200  g  BB  sehingga  dosis  ekstrak kombinasi  3:1  adalah  130,75  mg/200 g BB.
l. Kelompok     XII:     diberi     per    oral parasetamol  180  mg/200  g  BB kemudian    diberikan    kombinasi ekstrak    air    pegagan    dan    kunyit dengan  perbandingan  dosis  3:2  yang diberikan  pada  2  dosis,  dosis  masing- masing  18,75  mg/200  g  BB  dan  224 mg/200 g
BB  sehingga  dosis  ekstrak  kombinasi  3:2 adalah 242,75 mg/200 g BB.

## Pengukuran Kadar SGPT
Pengujian  kadar  SGPT  dilakukan pada hari ke-2 sampai diketahui peningkatan    kadar    SGPT    setelah diinduksi  parasetamol  dan  3  hari  sekali selama  13  hari  perlakuan  kombinasi ekstrak  pegagan  dan kunyit  untuk keperluan pengujian kadar SGPT dilakukan   pengambilan   darah   dengan cara memotong ekor tikus yang sebelumnya  telah  direndam  dengan  air hangat.  Darah  yang  keluar  dimasukkan kedalam  tabung  mikrosentrifuga  yang telah  dibasahi  larutan  EDTA.  Darah dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga   dan   disentrifuga   pada 3.000   rpm   selama   10   menit.    Untuk pengukuran   SGPT,    sebanyak   100   µl
plasma  ditambahkan  1000  µl  substrat  L- alanin  dan  asam  X  –  oksoglutarat, kemudian  inkubasi  selama  1  menit  pada suhu  37 0 C.  Serapan  sampel        dibaca dengan   spektrofotometer   pada   panjang gelombang    340    nm     dengan    faktor konversi 1745 (Arafah dkk , 2005).

## Pengamatan    Patologi    dan    Anatomi Hati Secara Makroskopik
Pengamatan    makroskopik    hati pada  tikus  meliputi  warna,  permukaan dan  konsistensi.  Hati  yang  normal berwarna merah kecoklatan,
permukaannya  licin  dan  konsistensinya kenyal (Anggraini, 2008).
Kriteria normal bila tidakditemukan: a.   Perubahan warna b.   Perubahan struktur permukaan c.   Perubahan    konsistensi    Derajat kerusakan hati:
0 = tidak terjadi perubahan
1 = bila ditemukan 1 kriteria 2 = bila ditemukan 2 kriteria 3
= bila ditemukan 3 kriteria

## Pemprosesan  Jaringan     Hati     Secara Mikroskopik
Sampel    jaringan    hati    dibuat sediaan  histologi.  Hati  yang  telah  dicuci dengan  larutan  NaCl  fisiologis  0,9  %, difiksasi  dengan  larutan  bouin  selama  12 sampai  24  jam.  Kemudian  diblok  dengan paraffin, setelah didehidrasi  dengan serial alkohol  (70,  80,  90,  100  %)  dan  clearing dengan  xylol  (I,  II,  III).  Blok  paraffin dipotong  dengan  mikrotom  setebal  5 mikron. Sayatan yang balk diletakan pada gelas  objek,  dipanaskan  hingga  paraffin meleleh,  kemudian  dilakukan  pewarnaan Hematoksilin  Eosin  (HE).  Pengamatan histologi  terhadap  hati  meliputi  hepatosit
(sel-sel  hati),  vena  sentralis  dan  sinusoid (Arafah dkk , 2005).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pembuatan Ekstrak
Hasil dari rebusan 2,5 kg pegagan segar  yang  telah  di vaccum  dry diperoleh ekstrak  kering sebanyak  74,967  g dengan nilai  rendemen  2,9  %  (b/b).  Pemerian ekstrak  air  pegagan  yang  dilakukan menunjukkan bahwa ekstrak yang dihasilkan  mempunyai  warna  coklat, aroma    tidak    spesifik,    lemah    dan    rasa pahit.
Ekstrak kental yang diperoleh dari 2,5  kg  serbuk  kunyit  yang  digunakan adalah  sebanyak  172,87  g  dengan  nilai rendemen  4,8%  (b/b).  Pemerian  ekstrak kental kunyit yang
dilakukan menunjukkan bahwa ekstrak yang dihasilkan  mempunyai  warna  kuning kecoklatan,  aroma  menyengat  dan  khas serta rasa kelat.

## Karakteristik      Ekstrak      Penetapan Kadar Air
Rata-rata  kadar  air  ekstrak  air pegagan yang diperoleh kurang dari 10 % yaitu    3,215    %    dan    kadar    air    ekstrak etanol  kunyit  5,875  %.  Kadar  air  ekstrak kering  pegagan  dan  ekstrak  kental  kunyit memenuhi  persyaratan  Materia  Medika Indonesia  Edisi  I  (Depkes  RI,  1977)  dan Monograph   of   Indonesian   Medicinal Plant  Extracts  volume  1 (BPOM,  2004) adalah  7,6  %  dan      tidak  lebih  dari  5% sedangkan kadar air ekstrak kental kunyit adalah  tidak  lebih  dari   10%  (DepKes, 1977).

## Penetapan  Kadar  Abu  Pegagan  Segar dan Ekstrak Air Pegagan
Penetapan  kadar  abu  bertujuan untuk  mengetahui  atau  mengidentifikasi
Uji Fitokimia
Pegagan Segar Ekstrak Air Pegagan Alkaloid + + Flavonoid + + Saponin + + Tanin + + Steroid/ Triterpenoid + -
kadar  zat  anorganik  dan  mineral.  Hasil perhitungan  rata-rata  kadar  abu  pegagan segar adalah 1,75  % lebih kecil dari rata- rata  ekstrak  air  pegagan  yaitu  11,55%. Hal    ini    mungkin    terkait    dengan kandungan   air   dalam   pegagan   segar masih   tinggi,   sehingga   dengan   bobot yang  sama  kadar  abunya  akan  berbeda. Kadar  abu  pegagan  tidak  lebih  dari  19% (DepKes RI,1977)..
Penetapan  kadar  Abu  Serbuk  Kunyit dan Ekstrak Etanol Kunyit Hasil  perhitungan  rata-rata  kadar  abu serbuk  kunyit  adalah  5,53  %  lebih  kecil dari  rata-rata  ekstrak  etanol  kunyit  yaitu 1,89  %.  Hal  ini  mungkin  terkait  dengan kandungan  air  pada  serbuk  kunyit  masih tinggi, sehingga dengan  bobot  yang sama kadar  abunya  akan  berbeda.  Kadar  abu kunyit  tidak  lebih  dari  9%  (DepKes RI,1977).

## Hasil Uji Fitokimia Pegagan Segar dan
Ekstrak Air Pegagan Tabel 1. Hasil Uji Fitokimia Pegagan Segar dan Ekstrak Air Pegagan
terhadap  flavonoid,  polifenol,  alkaloid, saponin dan triterpenoid. Sedangkan hasil uji fitokimia ekstrak air  pegagan  bereaksi positif  terhadap  flavonoid,  polifenol, alkaloid,  saponin  dan  bereaksi  negatif terhadap  triterpenoid.  Tidak terdeteksinya triterpenoid  pada  ekstrak  terkait  dengan sifat  kelarutan  triterpenoid.  Triterpenoid lebih  bersifat  nonpolar  sehingga  tidak tertarik    oleh   pelarut aquadest yang bersifat polar.

## Hasil Uji Fitokimia Serbuk Kunyit dan Ekstrak Etanol Kunyit
Hasil  uji  fitokimia  serbuk  kunyit dan  ekstrak  etanol  kunyit  menunjukan reaksi positif terhadap alkaloid dan reaksi negatif terhadap flavonoid, tanin, saponin dan   triterpenoid,   hal   ini   disebabkan karena  senyawa  flavonoid,  tanin,  saponin datriterpenoid  tidak  tertarik  oleh  pelarut etanol  yang  bersifat  semipolar  sedangkan alkaloid  larut  dalam  pelarut  lipofil sehingga  alkaloid  tertarik  pada  ekstraksi menggunakan etanol.
Tabel   2. Hasil   Uji   Fitokimia   Serbuk Kunyit dan Ekstrak Etanol Kunyit
Uji Fitokimia Serbuk Kunyit Ekstrak Etanol Kunyit Alkaloid + + Flavonoid - - Saponin - - Tanin - - Steroid/Triterpenoid - - Keterangan :
-= Tidak terdapat senyawa + = Terdapat senyawa
Uji  fitokimia  bertujuan  untuk mengetahui  kandungan  senyawa  yang terdapat dalam pegagan segar dan ekstrak kering  pegagan.  Hasil  uji  fitokimia pegagan  segar  menunjukan  reaksi  positif
Gambar 1. Grafik Pengaruh Pemberian Parasetamol  180  mg/200  g  BB  terhadap Kadar SGPT Tikus Putih Jantan Keterangan:   K1   (kontrol   positif),   K2 (kontrol   negatif),   K3  (kontrol   normal), K4  (pegagan  dosis  6,25  mg/  200  g  BB), K5 (kunyit dosis 112 mg/ 200 g BB), K6 (kombinasi   dosis   1:1),   K7   (kombinasi
dosis  1:2),  K8  (kombinasi  dosis  1:3),  K9 (kombinasi  dosis  2:1),  K10  (kombinasi dosis 2:3), K11 (kombinasi dosis 3:1) dan K12 (kombinasi dosis 3:2).
Dari grafik tersebut, terlihat bahwa masing-masing  kelompok  yang  diberikan parasetamol,  menunjukkan  profil  kadar SGPT yang berbeda. Pengaruh pemberian parasetamol  berpengaruh  terhadap  kadar SGPT,  hal  ini  ditunjukkan  meningkatnya kadar SGPT secara signifikan. Pemberian parasetamol  terhadap  tiap  perlakuan (kecuali  K  3  atau  kontrol  normal) menunjukkan  kadar  SGPT  tinggi.  Hasil kadar  SGPT  tertinggi  terdapat  pada  K  6 (1:1, 1 bagian dari pegagan dan 1 bagian
dari  kunyit)  pada  hari  ke-2  setelah diinduksi  parasetamol.  kombinasi  ekstrak selama 13 hari.
Keterangan:  K1  (kontrol  positif),  K2 negatif),  K  3  (kontrol  normal),  K  4 (pegagan dosis 6,25 mg/  200 g  BB),  K 5
(kunyit  dosis  112  mg/  200  g  BB),  K  6 (kombinasi  dosis  1:1),  K  7  (kombinasi dosis 1:2), K 8 (kombinasi dosis 1:3), K 9 (kombinasi  dosis  2:1),  K  10  (kombinasi dosis  2:3),  K  11  (kombinasi  dosis  3:1) dan K 12 (kombinasi dosis 3:2).
Dari grafik tersebut, terlihat bahwa masing-masing  kelompok  yang  diberikan parasetamol    dan    kombinasi    ekstrak selama  13  hari  menunjukkan  penurunan grafik  yang  bervariasi.  Penurunan  yang bervariasi  ini  kemungkinan  disebabkan karena  pengaruh  beberapa  faktor  yaitu bobot  badan  hewan  coba  dan  sudah rusaknya   sebagian   organ   hewan   coba
tersebut, salah  satunya  hati  akibat pemberian parasetamol.
Tabel 3. Data Pengukuran Kadar SGPT (U/L) Selama 13 Hari
Perlakuan Rata-rata Kadar SGPT (U/L) Hari ke % Penurunan Awal 2 5 9 13 Kelompok I (Kontrol Positif) 48,76± sd 9.27 56,87± sd 2.72 43,87± sd 4.48 33,98± sd 0,60 23,65± sd 1.75 58,41% bc ± sd 1.47 Kelompok II (Kontrol Negatif) 34,53± sd 3.43 36,75± sd 4.19 92,35± sd 15.92 58,74± sd 8.48 29,72± sd 3.55 19,12% bcd ± sd 16.79 Kelompok III (Kontrol Normal) 29,66± sd 8.49 38,39± sd 2.53 19,73± sd 1.67 15,43± sd 1.47 10,71± sd 2.10 72,10% a ± sd 6.57 Kelompok IV (Pegagan 6,25 mg/ 200 g BB) 32,71± sd 4,80 62,81± sd 23.33 69,79± sd 23.85 13,81± sd 1.80 11,19± sd 3.50 82,18 % b ± sd 5.91 Kelompok V (Kunyit 112 mg/ 200 g BB) 30,09± sd 6.34 59,47± sd 23.90 65,42± sd 22.17 31,56± sd 18.76 19,33± sd 10.25 67,49 % bc ± sd 20.43 Kelompok VI (Kombinasi Dosis 1:1) 38,09± sd 3.44 89,86± sd 19.29 104,68± sd 8.48 33,78± sd 26.92 29,43± sd 25.01 67,24 % d ± sd 35.12 Kelompok VII (Kombinasi Dosis 1:2) 37,19± sd 0.84 74,15± sd 15.26 78,66± sd 16.04 61,64± sd 34.14 45,65± sd 19.54 38,43 % d ± sd 17.47 Kelompok VIII (Kombinasi 33,71± sd 1.81 80,26± sd 23.39 86,08± sd 24.84 19,04± sd 10.37 15, 1 4± sd 80,26 % bcd ± sd 14.79
Dosis 1:3) 8.95 Kelompok IX (Kombinasi Dosis 2:1) 31,25± sd 7.13 54,52± sd 15.58 60,78± sd 15.33 23,99± sd 6.70 17,00± sd 4.60 68,81 % b ± sd 9.65 Kelompok X (Kombinasi Dosis 2:3) 29,08± sd 8.04 61,94± sd 23.0 66,99± sd 24.24 19,38± sd 5.92 14,74± sd 5.90 76,20 % b ± sd 9.54 Kelompok XI (Kombinasi Dosis 3:1) 32,28± sd 5.16 56,56± sd 17.15 64,70± sd 14.33 27,67± sd 8.57 24,63± sd 7.80 56,45 % bc ± sd 18.74 Kelompok XII (Kombinasi Dosis 3:2) 31,83± sd 4.93 83,9± sd 51.57 91,46± sd 48.61 34,8± sd 20.59 27,88± sd 17.83 66,76 % cd ± sd 14.85
Keterangan:  Angka  yang  diikuti  superskrip  yang  tidak  sama  pada  lajur  yang  sama  menunjukan  pengaruh  yang  sangat  berbeda nyata (P<0.01) antar perlakuan.
Perlakuan Ulangan Total Rata-Rata 1  2  3  4 Kontrol Normal 0 1 0 0 1 0,25 a ± 0.5 Kontrol negatif 1 1 1 2 5 a 10 ± 0.5 Kontrol Positif 0 0 1 1 2 a 0,5 ± 0.5 G 1 Pegagan 6,25mg/ Kg BB 0 0 1 0 1 a 0,25 ± 0.00 G 2 Kunyit 112mg/ Kg BB 1 1 1 2 5 1,25 c ± 0.5 G 3 Kombinasi 1:1 2 1 2 1 6 1,50 d ± 0.57 G 4 Kombinasi dosis 1:2 2 1 2 2 7 1,75 c ± 1.75 G 5 Kombinasi dosis 1:3 2 1 1 2 6 1,50 c ± 0.57
G 6 Kombinasi dosis 2:1 0 1 1 2 4 1,00 bc ± 0.81 G 7 Kombinasi dosis 2:3 0 0 0 1 1 0,25 a ± 0.5
Kombinasi  ekstrak air  pegagan  dan  ekstrak etanol   kunyit   yang   diberikan   pada   tikus penderita     hepatitis     selama     13     hari menunjukkan          potensinya          sebagai hepatoprotektor,  hal  ini  dapat  dilihat  dari menurunnya kadar SGPT pada tikus  secara significant yang   diperoleh   dari   ekstrak pegagan  dosis  6,25  mg/200  g  BB,  ekstrak kunyit   dosis   112   mg/   200   g   BB   dan kombinasinya pada hari ke 13. Kemampuan kedua        kombinasi        ekstrak        dalam menghambat    kerusakan    hati    ditunjukan dengan variasi kombinasi dosis dan respon. Dosis       ekstrak       dalam       menghambat kerusakan  hati  adalah  dosis  pegagan  6,25 mg/200 g BB dengan persen penurunan 82,18  %.  Hasil  penelitian  ini  sesuai  dengan hasil    penelitian   Setiani   (2012)   bahwa ekstrak  air  pegagan  dosis  6,25  mg/200  g BB  yang  diberikan  selama  7  hari  adalah 72,13       %,       menyebabkan       terjadinya penurunan kadar SGPT yang sama (P>0.05) menunjukkan potensinya sebagai
hepatoprotektor.  Persen  penurunan  pada kombinasi  dosis  menunjukkan  angka  yang significant pada  kombinasi  dosis  1:3 sebanyak  80,26  %  dan  kombinasi  dosis  2:3 sebanyak  76,20  %  menyebabkan  pengaruh penurunan    kadar    SGPT    yang    sangat berbeda  nyata  (P<0.01)  terhadap  kontrol positif asam ursodeoxycolic sebanyak 51,49 %.  Semakin  tinggi  persen  penurunan  kadar SGPT,  maka  semakin  besar  aktivitas hepatoprotektor.

## Pengaruh Pemberian  Kombinasi Ekstrak
Air  Pegagan  dan  Ekstrak  Etanol  Kunyit Terhadap  Patologi  Anatomi  Hati  Tikus Secara Makroskopis dan Mikroskopis Parameter  lain  dalam  penentuan aktivitas  hepatoprotektor  adalah  patologi anatomi  hati  tikus  yang  meliputi  perubahan warna,  struktur  permukaan  dan  konsistensi hati tikus.

## Skor 0            Skor 1            Skor 2
Gambar 3. Patologi dan Anatomi Hati Tikus Keterangan: W. Perubahan warna, B. Bintik- bintik.
Tabel 4. Data Anatomi Patologi Hati
00 00
berbeda nyata (P<0.01) antar perlakuan. Skor 0:Tidak terjadi perubahan Skor    1:    Bila    ditemukan    perubahan kriteria 1 Skor    2:    Bila    ditemukan    perubahan  2 kriteria G 8
Kombinasi
dosis 3:1
1 1 1 1 4 1,00 bc ± 0.
G 9 Kombinasi dosis 3:2
1 1 1 1 4 1,00 bc ± 0.
Keterangan: Angka  yang diikuti superskrip yang     sama     pada     lajur     yang     sama menunjukkan     pengaruh     yang     sangat
Berdasarkan  analisis  statistik  terhadap nilai skoring  yang meliputi perubahan warna, struktur permukaan dan konsistensi  hati,  hasil  pemeriksaan menunjukan dari masingmasing
perlakuan  pengaruh  yang  diberikan terhadap  anatomi  hati  pengaruh  yang diberikan sangat berbeda nyata (P<0.01),  untuk  lebih  memperkuat hasil  analisis  ini,  maka  dilakukan pemeriksaan histopatologi. Pemeriksaan histopatologi bertujuan untuk mengetahui pemberian  kombinasi  ekstrak  air pegagan  dan  ekstrak  etanol  kunyit terhadap  kerusakan  sel  hati  yang
disebabkan oleh parasetamol.
Gambar  4 .  Penampang  Melintang  Histologi Hati  Kontrol  Normal.  SK  ( sel  kuffer ),  H (hepatosit), S (sinusoid), a (amiloid)
Gambar 5 . Penampang Melintang Histologi Hati
Kombinasi  dosis  2:3.  D  (degenerasi  sel),  p (poliferasi  sel),  SK  ( sel  kuffer ),  s  (sinusoid melebar),  v  (vena  sentralis  tampak  utuh),  a (amiloid)
9 |
Kontrol  normal,  kombinasi  dosis  2:3 dan  pegagan  dosis  6,25  mg/  200  g  BB mempunyai  pengaruh  yang  sama  terhadap histopatologi  hati  tikus,  yaitu  mengalami pelebaran  sinusoid,  adanya  amiloid  atau pendarahan  di  sinusoid.  Vena  sentralis tampak    utuh    pada    kombinasi    dosis    2:3, tetapi    terjadi    poliferasi    sel    pada    daerah portal sekitar pembuluh darah.
Gambar  6 .  Penampang  Melintang  Histologi Hati  pemberian  pegagan  dosis  6,25  mg/200  g BB, n ( sel kuffer ), n1 (hepatosit menyimpang), s (sinusoid melebar), v (vena sentralis)
Kontrol  negatif  parasetamol  180 mg/200  g  BB  dan  CMC  Na  0,5% memberikan  pengaruh  yang  sama  dengan kontrol    normal,    tetapi    lebih    parah, ditambah  nekrosis  (hampir  semua  sel), adanya degenerasi sel, hepatosit menyimpang,  adanya degenerasi lipid  dan
vena sentralis tidak utuh.
Pemberian asam ursodeoxycholic  dosis  12,6  mg/200  g BB  dan  kombinasi  2:1,  kombinasi  3:1 dan kombinasi 1:3 memberikan pengaruh  yang  sama  jika  dilihat  dari hasil foto histopatologi hati, akan tetapi lebih  parah  karena  banyaknya  sel  yang mengalami
kerusakan ( severe multifocal  necrosis ),  selain  itu  terjadi necrosis , hepatosit menyimpang,
degenerasi  sel, karioreksi dan  vena sentralis  tidak  utuh. Karioreksi adalah pecahnya  inti  sel  menjadi  beberapa bagian kecil.Pemberian ekstrak    etanol
kunyit dosis 112 mg/200g BB
menyebabkan kerusakan sel yang ditandai  dengan  adanya  degenerasi  sel, karioreksi ,  degenerasi  lipid,  hepatosit menyimpang   dan sinusoid melebar.
Kombinasi dosis 1:2
menyebabkan      kerusakan      hati      yang lebih    parah,    ditandai    dengan pendarahan  di  sinusoid,  pelebaran sinusoid  dan  nekrosis  hamper  semua sel.  Nekrosis  pada  sel  hati  tikus disebabkan  oleh  parasetamol.  Nekrosis merupakan  kematian  sel  yang  bersifat irreversible ,  yaitu  pada  saat  sel  telah mencapai  titik  dimana  sel  tidak  tidak dapat lagi
melangsungkan
metabolisme.
Gambar        7. Penampang  Melintang Histologi Hati dengan Pemberian Parasetamol  180  mg/200  g  BB,  D (degenerasi  sel),  K  ( karioreksi ),  H1 (hepatosit  menyimpang).  N  (nekrosis), S (sinusoid), v (vena sentralis).
Gambar  8 .  Penampang  Melintang  Histologi Hati  kombinasi  dosis  2:1,  d  (degenerasi  sel), DL (degenerasi lipid), h1 (hepatosit menyimpang),  n  (nekrosis),  S  (sinusoid melebar),  n  (nekrosis),  v  (vena  sentralis  tidak utuh dan adanya amiloid).
Gambar  8 .  Penampang  Melintang  Histologi Hati  kombinasi  dosis  3:1,  d  (degenerasi  sel), h1  (hepatosit  menyimpang),  n  (nekrosis),  S (sinusoid  melebar),  n  (nekrosis),  v  (vena sentralis tidak utuh dan adanya amiloid).
Hal  ini        konsisten  dari  penelitian sebelumnya sedangkan kombinasi dosis 2:3 (2 bagian  pegagan  dan  3  bagian  kunyit)  persen penurunannya sebesar 76,20%.
Hasil  uji  histopatologi  ekstrak  air pegagan  dosis  6,25  mg/200  g  BB  dan kombinasi  dosis  2:3  (2  bagian  pegagan  dan  3 bagian kunyit) memberikan efek terbaik.

## Saran
1. Perlu    dilakukan    penelitian    untuk menentukan dosis efektif Kunyit ( Curcuma  longa Linn)  terhadap  tikus penderita hepatitis supaya saat dikombinasikan  menunjukkan  hasil yang lebih baik.
2. Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut terhadap  senyawa  kurkumin  yang diduga  bersifat  hepatoprotektor  pada kunyit ( Curcuma longa Linn).
3. Perlu   dilakukan   penelitian   lebih lanjut  terhadap     efek     toksisitas pegagan,  kunyit  dan  kombinasi keduanya   terhadap   hewan   coba.
Gambar 9. Penampang Melintang Histologi Hati dengan Pemberian Kombinasi  dosis  1:2,  a  (adanya  amiloid atau pendarahan di sinusoid), n (nekrosis hampir    semua    sel),    s    (pelebaran sinusoid).  Skala  50  µm,  pembesaran  40 x, Pewarnaan HE.

## SIMPULAN
1. Kombinasi    ekstrak    air    pegagan ( Centella  asiatica L.  Urban)  dan ekstrak  etanol  kunyit        ( Curcuma longa Linn)  bersifat  hepatoprotektor terhadap kerusakan
hati yang
diinduksi parasetamol.
2. Hasil     pengukuran     kadar     SGPT pegagan  dosis  6,25  mg/200  g  BB menunjukkan persen penurunan
sebesar 82,18%, hal

## DAFTAR PUSTAKA
Anggraini,     D.     R.     2008.     G ambaran Makroskopik   dan   Mikroskopik   Hati dan  Ginjal  Mencit  Akibat  Pemberian
Plumbun Asetat . Tesis Sekolah Pascasarjana      Universitas      Sumatra Utara. Medan.
Arafah, E., D. Muchtadi, F. R. Zakaria., T.
Terhadap Kerusakan Hati
Yang Diinduksi  CCl 4 . Jurnal  Teknologi  dan Industri Pangan Volume XV No. 3.
Badan   Pengawas   Obat   dan   Makanan   RI.
2004. Monograph of Indonesian Medicinal  Plant  Extracts  Volume  I . Jakarta. Hal 18-20.
Crawford,   S.   1995. Gotu   Kola. The   Gale Encyclopedia of Alternative
Medicine
Dalimartha,  S.  2005. Ramuan  Tradisional Untuk  Pengobatan     Hepatitis (Edisi Revisi) . Penebar Swadaya. Depok.
Departemen Kesehatan RI 1977. Materia Medika   Indonesia ,   Edisi   I . Direktorat Pengawasan Obat dan Makanan.
Jakarta
Wresdiyati dan Sidik. 2005. Pengaruh .   1979. Materia   Medika   Indonesia , Perlindungan      Ekstrak      Rimpang Bangle
(Zingiber         cassumunar         Roxb) Edisi II . Direktorat Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta
Hembing.     2005. Atasi     Kanker     dengan
Kalantari,   H.,    L.    S,  Khorsandi.,
M, Taherimobarakeh. 2007. The Tanaman Obat . Penerbit Puspa Swara: Jakarta: 47-48.
Protective  Effect  of  The  Curcuma Longa  Extract  on  Acetaminophen– Induced  Hepatotoxicity  in  Mice.
Journal  of  Natural  Pharmaceutical Products 2007; 2(1): 7-12.
Meistiani,      Y.      2001. Isolasi      Dan Identifikasi Senyawa Alkaloid Dari Akar  Kuning   (Arcangelisiaflava  (L) Merr) . Karya Ilmiah Jurusan Kimia
Fakultas      Matematika      dan      Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor.
Rajendra,  CE.,  Gopal.  S.  Magadum., M, Ali Nadaf., S. V. Yashoda., M, Manjula.  2011. Phytochemical
Screening  of  The  Rhizome  of
Kaempferia  Galanga. Journal  of Pharmacognosy and Phytochemical    Research    2011; 3(3): 61-63. Setiani, I. 2012. Uji Aktivitas Hepatoprotektor    Ekstrak    Air Herba  Pegagan ( Centella  asiatica L.  Urban) terhadap  Tikus  Putih Jantan  Sprague  Dawley  yang
Diinduksi Parasetamol . Skripsi. Jurusan Farmasi,  Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan  Alam  Universitas Pakuan Bogor.
Smith.  J.  B.  dan  S,  Mangkoewidjojo.
1988. Pemeliharaan,  Pembiakan dan Penggunaan Hewan Percobaan  di  Daerah  Tropis . Penerbit Universitas
Indonesia (UI-Press). Jakarta
Yuningsih.      2008. Deteksi       Cepat
Insektisida  Karbofuran  (Karbamat)
Dalam  Isi  Rumen  Sapidengan  Cara Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT) . Seminar Nasional Teknologi
Peternakan  dan    Veteriner.    Balai Besar Penelitian Veteriner. Bogor.