## Research Articles

## Perhitungan  jumlah  bakteri  di  Laboratorium  Mikrobiologi menggunakan pengembangan metode Spektrofotometri
Rosmania 1* , Fitri Yanti 2
1 Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Sriwijaya, Sumatera Selatan, Indonesia
2 Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Sriwijaya, Sumatera Selatan, Indonesia

## Received 24 April 2020; Accepted 24 Mei 2020; Published 31 Mei 2020
Keyword:
Spectrophotometer ; Turbidity ; Escherichia coli ; Staphilococcus aureus ABSTRACT: The  used  of  spectrophotometry  in  this  study  was a  fast  way  to count the number of bacteria in a solution. This study aims to determine  the number of test bacteria whose absorbance values are equal to the McFarland 0.5 standard solution using the cup count method. This research was conducted in April-October 2019, at the Microbiology Laboratory, Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University, Indralaya. The research method used consisted of several stages, namely the making of media,  sterilization,  purification  of  test  bacteria,  rejuvenation  of  test  bacteria, manufacture  of  McFarland  0.5  standard  solutions,  maked  standard  bacteria curves,  making  bacterial  growth  curves,  maked  test  bacterial  suspensions, measuring bacterial counts turbidity method, and measurement of the number of bacteria by the cup count method. The results of this study indicate that the value of the McFarland standard solution 0.5 made according to the value of the standard McFarland solution kit (Himedia) is around 0.08-0.1. So it is more economical and easy to obtain. The results of the calculation of the number of Escherichia coli cells is 1.3 x 107 CFU/ml, the number of Staphilococcus aureus cells is 1.1 x 107 CFU/ml. @2020 Published by UP2M, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University
Kata Kunci:
Spektrofotometer;
Turbidity;
Escherichia coli ; Staphilococcus aureus
ABSTRAK: Penggunaan spektofotometri dalam penelitian ini merupakan cara yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri dalam suatu larutan. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan jumlah bakteri uji yang nilai absorban nya sama dengan larutan standar McFarland 0,5 dengan menggunakan metode hitungan cawan.  Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan  April-Oktober  2019,  di Laboratorium  Mikrobiologi,  Jurusan  Biologi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan  Alam,  Universitas  sriwijaya,  Indralaya.  Metode  penelitian  yang digunakan  terdiri  dari  beberapa  tahapan,  yaitu  pembuatan  media,  sterilisasi, pemurnian  bakteri  uji,  peremajaan  bakteri  uji,  pembuatan  larutan  standar McFarland  0,5,  pembuatan  kurva  standar  bakteri,  pembuatan  kurva pertumbuhan  bakteri,  pembuatan  suspensi  bakteri  uji,  pengukuran  jumlah bakteri secara metode turbidity, dan pengukuran jumlah bakteri secara metode hitungan cawan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa nilai larutan standar McFarland 0,5 yang dibuat sesuai dengan nilai larutan standar McFarland kit (Himedia) yaitu sekitar 0,08-0,1. Sehingga lebih ekonomis dan mudah didapat Hasil perhitungan jumlah sel Escherichia coli yaitu 1,3 x 107 CFU/ml, jumlah sel Staphilococcus  aureus  yaitu  1,1  x  107  CFU/ml.  @2020  Published  by  UP2M, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University

## Jurnal Penelitian Sains
Journal Home Page: http://ejurnal.mipa.unsri.ac.id/index.php/jps/index
∗ Corresponding author. E-mail address: rosmaniania83@gmail.com
2597-7059 Online, 1410-7058 print/ @2020 Published by UP2M, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University

## PENDAHULUAN
Perhitungan  jumlah  bakteri  merupakan salah  satu  cara  yang  dilakukan  untuk  bisa mengetahui  berapa  banyak  koloni  bakteri  yang terdapat pada suatu media, baik itu koloni sel yang hidup  maupun  koloni  sel  bakteri  yang  mati. Metode  yang  digunakan  adalah  perhitungan secara  langsung  dan  perhitungan  secara  tidak langsung.  Perhitungan  jumlah  bakteri  secara langsung  digunakan  untuk  menentukan  jumlah bakteri keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup.  Sedangkan  perhitungan  bakteri  secara tidak  langsung  digunakan  untuk  menentukan jumlah bakteri yang hidup saja.
Setiap  perhitungan  jumlah  bakteri  baik secara langsung maupun tidak langsung memiliki kelemahan masing-masing. Jumlah bakteri masih belum  mendekati  hasil  maksimal  dikarenakan perhitungan  yang  melibatkan  sel  hidup  maupun sel mati bakteri, keterbatasan alat dan bahan saat perhitungan, keperluan persiapan alat dan bahan yang  cukup  panjang,  ketelitian  penelitian  oleh peneliti dan lain-lain [1].
Perhitungan  bakteri  secara  Turbidimetri (kekeruhan) dengan memakai alat spektrofotometer  adalah  contoh  perhitungan jumlah bakteri secara tidak langsung. Fungsi alat Spektrofotometer  dalam  laboratorium  adalah mengukur  transmitan  atau  absorbans  suatu contoh  yang  dinyatakan  dalam  fungsi  panjang gelombang [2,3]. Oleh karena itu perlu dilakukan pengembangan  metode  spektrofotometer  yang digunakan  untuk  perhitungan  jumlah  bakteri  di laboratorium mikrobiologi.
Metode turbidimetri merupakan cara yang cepat  untuk  menghitung  jumlah  bakteri  dalam suatu  larutan  dengan  menggunakan  alat spektrofotometer. Digunakan untuk uji antibakteri,  dimana  jumlah  bakteri  nya  dihitung dengan  membandingkan  kekeruhan  suspensi bakteri  dengan  menggunakan  larutan  standar McFarland. Larutan McFarland standar digunakan sebagai referensi untuk menyesuaikan kekeruhan  bakteri  suspensi  sehingga  jumlah bakteri  dalam  kisaran  yang  diberikan  untuk membakukan  mikroba  pengujian [ 4].  Contoh pengujian  tersebut  adalah  antibiotik  kerentanan pengujian oleh pengukuran konsentrasi penghambatan  minimum  yang  secara  rutin digunakan  dalam  medis  mikrobiologi  dan penelitian.  Jika  suspensi  yang  digunakan  terlalu pekat atau terlalu encer, hasil yang salah (tahan palsu  atau  palsu  rentan)  untuk  setiap  agen antimikroba yang diberikan bisa terjadi.
Keakuratan jumlah bakteri standar McFarland  dapat  dilakukan  dengan  metode hitungan  cawan.  Metode  ini  termasuk  metode
perhitungan bakteri secara tidak langsung. Prinsip metode hitungan cawan adalah  jika sel mikroba yang  masih  hidup  ditumbuhkan  pada  medium agar,  maka  sel  mikroba  tersebut  akan berkembang  biak  dan  membentuk  koloni  yang dapat  dilihat  langsung  dengan  mata  tanpa menggunakan  mikroskop  [5].  Metode  hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung  jumlah  mikroba  karena  hanya  sel yang  masih  hidup  yang  dihitung  dan  beberapa jenis  mikroba  dapat  dihitung  sekaligus.  Metode hitungan  cawan  memiliki  kelemahan  yaitu membutuhkan  persiapan  dan  waktu  inkubasi beberapa  hari  untuk  menghitung  pertumbuhan koloni  bakteri  [6].  Oleh  karena  itu,  mahasiswa penelitian  kebanyakan  menggunakan  metode turbidity  saja  untuk  menentukan  jumlah  bakteri dalam suspensi bakteri uji yang akan digunakan. Untuk membuktikan bahwa metode spektrofotometri  (turbidity)  memberikan  hasil yang valid maka perlu pengujian akurasi metode yang  dibandingkan  dengan  metode  hitungan cawan. Pada penelitian ini menggunakan bakteri Escherichia coli dan bakteri Staphylococcus aureus sebagai bakteri uji yang sering digunakan dalam uji  aktivitas  antibakteri  dan  konsentrasi  hambat minimum.
Pada  penelitian  ini  dilakukan  pembuatan McFarland standard untuk mendapatkan keakuratannya sama dengan McFarland standard kit  sebagai  pengganti  di  laboratorium,  sehingga mudah  di  dapat  dan  nilai  nya  lebih  ekonomis. Untuk  itu  dilakukan  pembacaan  nilai  absorban kultur bakteri yang kekeruhan nya sama dengan McFarland standard menunjukan jumlah bakteri yang  sama  dengan  McFarland  standard. Penentuan jumlah bakteri yang nilai absorban nya sama  dengan  larutan  standar  McFarland  0,5 dengan menggunakan metode hitungan cawan.

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan April-Oktober
2019, di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Universitas sriwijaya, Indralaya.

## Prosedur Penelitian

## Cara Kerja
1. Pembuatan Media Pemurnian,
Peremajaan¸Su-spensi  dan  Pengujian  Bakteri [7];[8];[9].
a. Media Eosin  Methylen  Blue  Agar (EMBA). Ditimbang  36  gram  dilarutkan  dengan aquadest sebanyak 1 liter dalam Erlenmeyer  1000  ml  kemudian  dimasak sampai larut diatas hot plate magnetic stirrer yang  ditandai  dengan  muncul  nya gelembung  air  didasar  erlenmeyer,  alat dimatikan.  Erlenmeyer  diangkat  dan mulutnya  ditutup  dengan  kapas  yang dibaluti  dengan  kain  kasa  dan  ditutupi dengan aluminium foil.
b. Media Brain  Heart  Infusion (BHI)  Agar. Ditimbang  sebanyak  52  gram  dilarutkan dengan aquadest sebanyak  1  liter  dalam Erlenmeyer  1000  ml  kemudian  dimasak sampai larut diatas hot plate magnetic stirrer .
Setelah larut yang ditandai dengan larutan jadi  jernih  ada  gelembung  didasar erlenmeyer,  alat  dimatikan.  Erlenmeyer diangkat  dan  mulut  nya  ditutup  dengan kapas yang dibaluti dengan kain kasa dan ditutupi dengan aluminium foil.
c. Media Nutrient  Agar (NA).  Ditimbang sebanyak  20  gram  dilarutkan  dengan aquadest sebanyak 1 liter dalam Erlenmeyer
1000  ml  kemudian  dimasak  sampai  larut diatas hot  plate  magnetic  stirrer .  Setelah larut  yang  ditandai  dengan  larutan  jadi jernih ada gelem-bung didasar erlenmeyer, alat  dimatikan.  Erlenmeyer  diangkat  dan mulut  nya  ditutup  dengan  kapas  yang dibaluti  dengan  kain  kasa  dan  ditutupi dengan aluminium foil.
d. Media Nutrient  Broth (NB).  Ditimbang sebanyak  8  gram  dilarutkan  dengan aquadest sebanyak 1 liter dalam Erlenmeyer 1000  ml  kemudian  dimasak  sampai  larut diatas hot  plate  magnetic  stirrer .  Setelah larut  yang  ditandai  dengan  larutan  jadi jernih ada gelembung didasar erlenmeyer, alat  dimatikan.  Erlenmeyer  diangkat  dan mulut  nya  ditutup  dengan  kapas  yang dibaluti  dengan  kain  kasa  dan  ditutupi dengan aluminium foil.
2. Sterilisasi [9]
Media  yang  sudah  dibuat  di  sterilisasi bersama dengan alat-alat lain yang akan dipakai seperti cawan petri, tabung reaksi, tip mikropipet.
Di sterilisasi pakai alat Autoklaf pada suhu 121 0 C tekanan 15 lbs selama 15 menit.
3. Pemurnian Bakteri Uji [9]
Media yang sudah disterilisasi, biarkan suhu nya  turun  sampai  ±  40 0 C  pada  suhu  ruang. Setelah itu, dimasukan kedalam cawan petri steril. Biarkan  media  padat  dalam  cawan  petri  ±  20 menit.  Bakteri  uji  yang  digunakan  adalan Escherichia coli dan Staphilococcus aureus . Masing -masing  bakteri  diinokulasikan  kedalam  cawan petri  secara  kuadrant  4.  setelah  dinokulasikan bakteri,  cawan  petri  dibungkus  dengan  kertas, dimasukan ke dalam incubator secara tebalik pada suhu 37 0 C selama 1x24 jam.
4. Peremajaan Bakteri Uji [9]
Koloni  tunggal  yang  tumbuh  pada  media cawan diambil dengan jarum ose, diinokulasikan ke  dalam  media  miring  dalam  tabung  reaksi secara  zig  zag.  Pekerjaan  ini  dilakukan  dengan aseptik dekat dengan api bunsen. Tabung reaksi dibungkus  dengan  kertas,  diinkubasi  dalam inkubator selama 1x24 jam.
5. Pembuatan  Larutan  Standar  McFarland  0,5 [10,11].
a. Pembuatan Larutan BaCl2 1 %. Ditimbang dengan  teliti  BaCl2  sebanyak  1  gram. Dilarutkan  kedalam  labu  ukur  100  ml dengan aquadest sampai  tanda  batas  lalu homogenkan. Pindahkan larutan ke dalam botol reagent yang  bertutup  rapat  dan gelap.  Penyimpanan  larutan  BaCl2  1  %  di dalam kulkas.
b. Pembuatan Larutan H2SO4 1 %. Disiapkan labu ukur 100 ml yang sudah diisi aquadest sebanyak ± 50 ml. Dipipet dengan hati-hati asam  sulfat  pekat  sebanyak  1,02  ml, dimasukan  ke  dalam  labu  ukur  100  ml melalui dinding secara mengalir. Keluarkan cairan sampai habis. Paskan larutan dengan aquadest  sampai  tanda  batas.  Pindahkan larutan  ke  dalam  botol reagent yang bertutup  rapat.  Penyimpanan  larutan H2SO4 1 % pada suhu ruang.
c. Pembuatan Larutan McFarland 0,5. Dipipet larutan  BaCl2  1  %  sebanyak  0,05  ml dimasukan  ke  dalam  tabung  reaksi  tutup ulir. Kemudian dipipet juga larutan H2SO4
1  %  sebanyak  9,95  ml.  Dicampurkan kedalam  tabung  reaksi  tutup  ulir  yang sudah berisi larutan BaCl2 1 %. larutan ini di  vortex  sampai  tercampur  sempurna. Penyimpanan larutan di dalam kulkas.
6. Pembuatan Kurva Standar Bakteri [12,13]
Bakteri Escherichia  coli dan Staphilococcus aureus yang digunakan diambil masing-masing 2 ose, dimasukan dalam 25 ml media Nutrient Broth (NB) yang sudah disterilkan. Kemudian di inkubasi pada shaker incubator suhu 37 o C, 120 rpm selama semalaman,  sehingga  didapatkan  kultur  bakteri. Setelah itu, diukur nilai Absorban nya dengan alat Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 625 nm. Lalu dilakukan pengenceran kultur bakteri dengan pengenceran 1;1, 1:2, 1:4, 1:8,  1:16,  1:32  dengan  larutan  pengencer  NaCl fisiologis  (NaCl  0,85  %).  Masing-masing pengenceran  diukur  nilai  Absorban  nya  dan jumlah  sel  bakteri  dengan  metode  hitungan cawan.  Setelah  diketahui  nilai  Absorban  dan jumlah  sel  bakteri,  maka  dibuat  kurva  standar yaitu  grafik  hubungan  antara  Absorban  pada sumbu y dengan jumlah sel bakteri pada sumbu x. Pada  grafik  akan  didapatkan  persamaan  regresi linier  yang  akan  digunakan  untuk  menghitung jumlah  sel  bakteri  pada  kurva  pertumbuhan bakteri.
Rumus persamaan regresi linier : y = ax + b keterangan : y = Absorban (OD) a dan b = konstanta yang didapat dari garis linier x = jumlah sel bakteri
7. Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri [14] Bakteri Escherichia  coli dan Staphilococcus aureus yang digunakan diambil masing-masing 2 ose, dimasukan dalam 25 ml media Nutrient Broth (NB) yang sudah disterilkan. Kemudian di inkubasi pada shaker incubator suhu 37 o C, 120 rpm selama semalaman,  sehingga  didapatkan  kultur  bakteri. Setelah itu, diukur nilai Absorban nya dengan alat Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 625 nm. Lalu dilakukan pengenceran kultur  bakteri  dengan  larutan  pengencer  NaCl fisiologis  dengan  nilai  Absorban  0,08 – 1.  Setelah didapatkan  kultur  bakteri  yang  Absorban  nya
0,08 – 0,1,  kemudian  kultur  ini  dibagi  ke  dalam tabung reaksi steril sebanyak 8 tabung, masing – masing diisi 10 ml secara aseptis. Lalu di inkubasi pada shaker incubator pada suhu 37 o C, 120 rpm. Setiap 3 jam diukur nilai Absorban nya selama 24 jam.
8. Pembuatan suspensi bakteri uji
Bakteri Escherichia  coli dan Staphilococcus aureus yang digunakan diambil masing-masing 1 ose, dimasukan dalam 25 ml media Nutrient Broth (NB) yang sudah disterilkan. Kemudian di inkubasi pada shaker incubator suhu 37 o C, 120 rpm selama waktu generasi terpendek nya. kemudian diukur nilai Absorban nya dengan alat Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 625 nm.
9. Pengukuran  jumlah  bakteri  secara  metode turbidity (spektrofotometri)
Disiapkan  larutan  standar  McFarland  0,5 dan  suspensi  bakteri  uji  yang  akan  diukur  nilai Absorban  nya.  Yang  pertama  diukur,  larutan McFarland  0,5  selanjutnya  suspensi  bakteri  uji. Kalau  nilai  Absorban  suspensi  bakteri  uji  lebih besar,  maka  dilakukan  pengenceran  sehingga didapatkan  nilai  Absorban  suspensi  uji  sama dengan  larutan  standar  McFarland  yaitu  pada panjang  gelombang  625  memberikan  hasil  nilai Absorban 0,08 – 0,1 [15].
10. Pengukuran  jumlah  bakteri  secara  metode hitungan cawan [20]
Suspensi bakteri uji yang sudah ditentukan nilai absorban nya harus  segera dihitung jumlah sel bakteri nya. Sebelum nya sudah disiapkan alat dan  bahan  steril  untuk  melakukan  proses perhitungan  bakteri.  Suspensi  bakteri  uji diencerkan  dari  10 -1 sampai  10 -7 ,  tujuan  dari pengenceran  bertingkat  ini  untuk  mengurangi jumlah  mikroba  dalam  cairan  memudahkan dalam melakukan perhitungan. Penentuan tingkat pengenceran  tergantung  kepada  perkiraan jumlah mikroba yang ada pada sampel. Suspensi bakteri  1  ml  diambil  dengan  mikropipet  lalu dimasukan pada tabung pertama (10 -1 ) yang berisi 9  ml  larutan  NaCl  fisiologi  lalu  di  vortex  sampai homogen.  Selanjutnya  diambil  1  ml  lalu dimasukan ke dalam tabung kedua (10 -2 ) di vortex sampai  homogen.  Ini  dilakukan  terus  sampai tabung ketujuh (10 -7 ). Setelah selesai
pengenceran  bertingkat,  lalu  diambil  seri pengenceran  2  terakhir  masing-masing  diambil 100  µl  dengan  mikropipet  dimasukan  kedalam cawan  petri  steril  kemudian  tuangkan  media Nutrient agar (NA) steril yang suhu nya ± 40 o C. homogenkan dengan cara memutar cawan diatas meja  secara  perlahan  dengan  gerakan  seperti angka  delapan.  Biarkan  ±  15  menit,  kemudian cawan dibungkus dengan kertas dan  di inkubasi dalam incubator secara terbalik suhu 37 o C selama 1x24 jam.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pemurnian Bakteri
Berdasarkan  Tabel  1  didapatkan  hasil pemurnian bakteri dengan metode cawan  gores adalah  biakan  murni,  dimana  biakan  murni adalah  biakan  yang  sel-sel  nya  berasal  dari pembelahan satu sel tunggal. Prinsip nya adalah mengencerkan mikroorganisme sedemikian sehingga  individu  spesies  dapat  dipisahkan  dari lainnya,  dengan  anggapan  bahwa  setiap  koloni terpisah  yang  tampak  pada  cawan  setelah inkubasi  berasal  dari  satu  sel  tunggal  [16]. emurnian  bakteri  dilakukan  untuk  mendapatkan isolat tunggal bakteri [17]. Tabel 1. Hasil Pemurnian Bakteri No. Jenis Bakteri Jenis Media Hasil Keterangan 1. Escherichia coli EMB agar Koloni tunggal yang terpisah  bewarna  hijau metalik, 2. Escherichia coli NA Koloni tunggal yang terpisah  bewarna  krem, bentuk bulat besar 3. Staphilococcus aureus BHI agar Koloni tunggal yang terpisah  bewarna  kuning muda, bentuk bulat kecil 4. Staphilococcus aureus NA Koloni tunggal yang terpisah  bewarna  kuning, bentuk bulat kecil

## Peremajaan Bakteri
Peremajaan  bakteri  dilakukan  setelah didapatkan  isolat  tunggal  bakteri Escherichia coli dan Staphilococcus  aureus. Koloni  tunggal  yang tumbuh pada media cawan pada saat pemurnian diambil  dengan  menggunakan  jarum  ose kemudan  diinokulasikan  ke  dalam  media  miring dalam tabung reaksi secara zig zag. Kultur bakteri ini diinkubasi dalam  inkubator selama 1x24 jam. Hasil  yang  didapatkan  pada  proses  peremajaan
bakteri Escherichia coli dan Staphilococcus aureus dapat dilihat pada Tabel 2.
Escherichia  coli merupakan  bakteri  gram negatif,  berbentuk  basil,  panjang  sekitar  2 mikrometer dan diamater 0,5 mikrometer. Bakteri ini  bersifat  anaerob  fakultatif,  biasanya  dapat bergerak dan tidak membentuk spora. Bakteri mi umumnya hidup pada rentang 20-40 °C, optimum pada  37  °C. Staphylococcus  aureus merupakan flora  normal  yang  terdapat  pada  kulit  manusia [18].
Tabel 2. Peremajaan Bakteri No Jenis Bakteri Jenis Media Hasil Keterangan 1. Escherichia coli NA Terbentuk  goresan  zig-zag murni. 2. Staphilococcus aureus NA Terbentuk  goresan  zig-zag murni.

## Larutan Standar McFarland 0,5
Larutan McFarland 0,5 buatan merupakan kombinasi  campuran  larutan  BaCl 2 1  %  0,05  ml dan larutan H2SO4 1 % sebanyak 9,95 ml. Larutan standar McFarland 0,5 buatan diasumsikan setara dengan larutan Standar McFarland 0,5 Himedia, hal  ini  dapat  dilihat  pada  Table  3.  Larutan
McFarland  0,5  buatan  digunakan  sebagai referensi  untuk  menyesuaikan  atau  diasumsikan setara  dengan  kekeruhan  bakteri  suspensi sehingga  jumlah  bakteri  dalam  kisaran  yang diberikan untuk membakukan mikroba pengujian [14,19].
Tabel 3. Larutan Standar McFarland 0,5 No. Jenis Larutan Hasil Keterangan 1. Larutan Standar McFarland 0,5 Himedia Suspensi  keruh,  pembacaan  Absorban  pada panjang gelombang 625 adalan 0,08 2. Larutan Standar McFarland 0,5 Skala Labortorium Suspensi  keruh,  pembacaan  Absorban  pada panjang gelombang 625 adalan 0,085

## Kurva Standar Bakteri
Kurva  standar  bakteri  merupakan  suatu kurva untuk menghitung jumlah sel bakteri secara tidak  langsung,  dengan  cara  meregresikan  nilai absorbansi dan jumlah koloni kedalam persamaan garis kurva standar y = ax + b, dimana y = jumlah koloni, dan x = besarnya nilai absorbansi. Setiap mikroorganisme  bakteri  memiliki  kurva  standar pertumbuhan  bakteri  [2].  Pada  metode perhitungan jumlah sel bakteri Escherichia coli dan
Staphilococcus  aureus yang  digunakan  dalam pembuatan  kurva  standar  pada  penelitian  ini, adalah  dengan  menggunakan  metode  hitungan cawan  [20]  dan  yang  kedua  dengan menggunakan  spektrofotometer  untuk  melihat tingkat kekeruhan ( Optical Density ) yang terbaca melalui  nilai  absorbansi  yang  dihasilkan  [21]. Sehingga dari data (Table 4 dan 5) menghasilkan kurva standar dengan persamaan pada Gambar 1.
Tabel 4. Data kurva standar jumlah sel Escherichia coli
No Pengenceran (v/v) Absorban (OD) Jumlah sel (CFU/ml) Log jumlah sel (CFU/ml) 1 1:1 2,021 3,1 x 10 9 9,4 2 1:2 1,493 1,3 x 10 9 9,1 3 1:4 1,087 3,1 x 10 8 8,4 4 1:8 0,463 1,1 x 10 8 8 5 1:16 0,237 5,6 x 10 7 7,7
6 1:32 0,118 2,8 x 10 7 7,4
Tabel 5. Data kurva standar jumlah sel Staphilococcus aureus No Pengenceran (v/v) Absorban (OD) Jumlah sel (CFU/ml) Log jumlah sel (CFU/ml) 1 1:1 2,173 2,6 x 10 9 9,4 2 1:2 1,559 8,1 x 10 8 8,9 3 1:4 0,906 3,3 x 10 8 8,5 4 1:8 0,487 1,6 x 10 8 8,2 5 1:16 0,246 9,5 x 10 7 7,9 6 1:32 0,124 4,5 x 10 7 7,6
Kurva  standar  bakteri  uji dihitung  dengan menggunakan  metode  turbidimetri  dengan memakai  alat  Spektrofotometer  UV-vis  dan hitungan  cawan.  Dari  data  tabel  4  dan  5  diatas akan dibuat kurva standar yaitu grafik hubungan antara  Absorban  pada  sumbu  y  dengan  log jumlah sel bakteri pada sumbu x. Pada grafik akan
didapatkan  persamaan  regresi  linier  yang  akan digunakan  untuk  menghitung  jumlah  sel  bakteri pada kurva pertumbuhan bakteri. Pada gambar 1 didapatkan  garis  persamaan  linear: Escherichia coli, y = 0,9502x - 7,0151; Staphilococcus aureus, y= 1,2027x - 9,2069
Gambar 1. Kurva standar bakteri Escherichia coli dan Staphilococcus aureus
Kurva pertumbuhan bakteri Bakteri Escherichia  coli dan Staphilococcus aureus yang digunakan diambil masing-masing 2 ose, dimasukan dalam 25 ml media Nutrient Broth (NB) yang sudah disterilkan. Kemudian di inkubasi pada  shaker  incubator  suhu  37 o C,  120  rpm selama  semalaman,  sehingga  didapatkan  kultur bakteri.  Setelah  itu,  diukur  nilai  Absorban  nya dengan  alat  Spektrofotometer  UV-Vis  pada panjang  gelombang  625  nm.  Lalu  dilakukan pengenceran  kultur  bakteri  dengan  larutan pengencer NaCl fisiologis dengan nilai Absorban 0,08 – 1.  Setelah  didapatkan  kultur  bakteri  yang Absorban nya 0,08 – 0,1, kemudian kultur ini dibagi
ke dalam tabung reaksi steril sebanyak 8 tabung, masing – masing diisi 10 ml secara aseptis. Lalu di inkubasi pada shaker incubator pada suhu 37 o C, 120 rpm. Setiap 3 jam diukur nilai Absorban nya selama 24 jam.
Kurva  pertumbuhan  bakteri  uji dihitung dengan  menggunakan  metode  turbidimetri dengan  memakai  alat  Spektrofotometer  UV-vis. Metode  turbidimetri  memiliki  kelebihan,  yaitu cepat, tidak destruktif, dan tidak mahal [22]. Pada tabel  6  dan  7  dapat  dilihat  interval  waktu  yang digunakan  untuk  mengukur  kurva  pertumbuhan adalah setiap 3 jam selama 24 jam.
Tabel 6. jumlah sel Escherichia coli saat kurva pertumbuhan No Waktu (jam) Absorban (OD) Log Jumlah sel (CFU/ml) 1 0 0,094 7,4 2 3 0,510 7,9 3 6 0,703 8,1 4 9 0,964 8,4 5 12 1,073 8,5 6 15 1,391 8,8 7 18 1,881 9,4 8 21 0,968 8,4 9 24 0,862 8,3
Tabel 7. Jumlah sel Staphilococcus aureus saat kurva pertumbuhan No Waktu (jam) Absorban (OD) Log Jumlah sel (CFU/ml) 1 0 0,090 7,7 2 3 0,344 7,9 3 6 0,596 8,2 4 9 0,988 8,5 5 12 1,038 8,5 6 15 1,1861 8,6 7 18 1,641 9 8 21 1,151 8,6 9 24 1,137 8,6
Pada  Gambar  2,  kurva  pertumbuhan Escherichia  coli dan Staphilococcus  aureus dilakukan  untuk  mengetahui  fase  pertumbuhan biakan  bakteri  tersebut.  Fase  pada  kurva pertumbuhan terdiri dari beberapa fase yaitu fase lag  (adaptasi),  fase  eksponensial  (fase  log),  fase stasioner (fase stagnan) dan fase kematian [21,23- 26].
Fase  lag  pada Escherichia  coli dan Staphilococcus  aureus tidak  tampak,  mungkin
terjadi  pada  jam  ke  0  hingga  jam  ke  3.  hal  ini terjadi dikarenakan bakteri tersebut tumbuh pada media  yang  sama  dengan  media  pada  saat pembuatan  inokulum  sehingga  penyesuaian  diri dengan lingkungan yang baru berlangsung cepat. Menurut [27-29] menyatakan bahwa Jika medium dan  lingkungan  pertumbuhan  sama  seperti medium  dan  lingkungan  sebelumnya,  mungkin tidak diperlukan waktu adaptasi.
Gambar 2. Kurva pertumbuhan Escherichia coli dan Staphilococcus aureus
Fase log atau fase ekponensial Escherichia coli terjadi pada jam ke 0 hingga jam ke 18. Pada Staphilococcus  aureus, fase  log  nya  sama  yaitu pada  jam  ke  0  hingga  jam  ke  18.  fase  stasioner Escherichia  coli dan Staphilococcus  aureus pada kurva  pertumbuhan  tidak  tampak.  Pada  fase kematian Escherichia  coli dan Staphilococcus aureus sama yaitu setelah jam ke 18.
Berdasarkan penelitian ini dapat disimpulkan  bahwa  waktu  yang  efektif  untuk melakukan uji aktivitas antibakteri kurang dari jam ke  18,  karena  bakteri  masih  mengalami pertumbuhan yang baik [30].

## Perhitungan Jumlah Bakteri Uji
Metode  yang  dipakai  adalah  metode hitungan  cawan  (SPC)  dengan  membandingkan kekeruhan  suspensi  bakteri  dengan  larutan standar McFarland 0,5. Pada tabel 8. didapatkan
hasil yaitu jumlah sel Escherichia coli adalah 1,3 x 10 7 CFU/ml dan jumlah sel Staphilococcus aureus adalah 1,1 x 10 7 CFU/ml, sedangkan hasil larutan standar McFarland 0,5 pada pembacaan panjang gelombang  625  nm  memberikan  nilai  Absorban 0,08 - 0,1 yang ekuivalen dengan jumlah bakteri 1,5 x 10 8 CFU/ml.
Jumlah sel bakteri uji yang digunakan tidak sama  jumlahnya  dengan  larutan  standar McFarland 0,5 ini mungkin disebabkan oleh faktor lingkungan  yang  mempengaruhi  pertumbuhan bakteri  yaitu  nutrisi,  suhu,  pH  dan  kelembaban [31]. E.  coli memiliki  suhu  optimum  37 o C,  pH optimum untuk pertumbuhannya adalah pada 7- 7,5.  Nilai  A w (kadar  air)  minimum  untuk pertumbuhan E.  coli adalah  0,96  [32]  Suhu optimum untuk pertumbuhan S. aureus yaitu 35 o C - 40 o C [33].
Tabel 8. data jumlah sel bakteri uji No.  Jenis Larutan Absorban (OD) Jumlah Sel Bakteri (CFU/ml) 1. Standar McFarland 0,5 0,080 1,5 x 10 8 2. Suspensi Escherichia coli 0,098 1,3 x 10 7 3. Suspensi Staphilococcus aureus 0,095 1,1 x 10 7
Menurut [34], pertumbuhan pada dasarnya adalah  hasil  metabolisme,  suatu  reaksi  kimia terarah  yang  berlangsung  di  dalam  sel  yang dikatalisis oleh enzim, dengan meningkatnya suhu maka  reaksi  kimia  akan  meningkat.  Peningkatan suhu  menyebabkan  peningkatan  energi  kinetik reaktan, maka peningkatan suhu akan menyebabkan peningkatan pertumbuhan hingga suatu saat peningkatan suhu tidak diikuti dengan meningkatnya pertumbuhan. Penentuan pengaruh  pH  awal  penting  untuk  dilakukan karena pH awal kultur bakteri yang berpengaruh pada laju pertumbuhan spesifik.

## KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan,  dapat  diperoleh  kesimpulan  sebagai berikut:
1. Mendapatkan hasil pembacaan nilai absorban larutan standar McFarland yang dibuat sesuai dengan  nilai  larutan  standar  McFarland  kit (Himedia)  yaitu  0,083.  sehingga  lebih ekonomis dan mudah didapat.
2. Jumlah Escherichia  coli adalah  1,3  x  107
CFU/ml  dan  jumlah  sel Staphilococcus  aureus adalah 1,1 x 107 CFU/ml.
3. Metode  spektrofotometri  ini  lebih  mudah dikerjakan dan cepat dalam penentuan jumlah bakteri pada kurva pertumbuhan bakteri.
4. Kinerja  alat  spektrofotometer  bagus  kinerja nya,  dengan  memberikan  hasil  pembacaan nilai  Absorban  McFarland  standar  kit (Himedia) yaitu 0,08.

## REFERENSI
[1] Wibowo,  A.P.W.,  dan  Andrivani,  R.  2016. Perhitungan  Jumlah  Bakteri Escherichia  coli dengan  Pengolahan  Citra  Melalui  Metode Thresholding  dan  Counting  Morphology. Jurnal  Ilmiah  Teknologi  Informasi  Terapan , 2(3): 235-243.
[2] Khoiroh,  Z.  2014.  Bioremediasi  logam  berat timbal (Pb) dalam lumpur Lapindo menggunakan campuran bakteri
( Pseudomonas pseudomallei dan Pseudomonas
aeruginosa ). Tesis. Universitas  Islam  Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang, 41-55.
[3] Lester,  J.N.,  dan  J.W.Birket.  (1999). Microbiology and Chemistry For Environmental Scientists  and  Engineers. London:  Taylor  and Francis Group. Hal. 71-73.
[4] Fitri  K,  S.A.,  Agung,  M.U.K.,  dan  Meika,  J. 2015.  Larutan  McFarland  standar  digunakan sebagai referensi untuk menyesuaikan kekeruhan  bakteri  suspensi  sehingga  jumlah bakteri  dalam  kisaran  yang  diberikan  untuk membakukan  mikroba  pengujian. Jurnal Akuatika, 6(2): 128-139.
[5] Nurtjahyani,  S.D.,  dan  Shyntya,  D.  2014.
Efektivitas Pengenceran terhadap Pertumbuhan  Koloni  Mikroba  pada  Saus Tomat . Jurnal Saintek, 11(2): 65-68
[6] Nurhayati,  Samallo,  I.M.  2013.  Analisis Degradasi  Polutan  Limbah  Cair  Pengolahan Rajungan  ( Portunus  pelagicus )  Dengan Penggunaan Mikroba Komersial. Jurnal Ilmiah Fakultas Teknik , 9(1): 1-13.
[7] Harijani, N., Rahadi, U.S.E., Nazar, D.S. 2013. Isolasi  Escherichia  coli  pada  Daging  yang Diperoleh dari Beberapa Pasar Tradisional di Surabaya Selatan. Veterinaria Medika , 6(1): 39-
44.
[8] BHI agar. 2016. Technical Product Information . Notheast Laboratory Services, China. 1-3.
[9] Lizayana,  Mudatsir,  Iswadi.  2016.  Densitas Bakteri  Pada  Limbah  Cair  Pasar  Tradisional. Jurnal  Ilmiah  Mahasiswa  Pendidikan  Biologi , 1(1): 95-106.
[10] Sutton, S. 2011. Measurement of Microbial Cells by Optical Density . Journal of Validation Technology . 17: 46-49.
[11] Haris, A., Arniati, Werorilangi, S. 2013. Uji
Antibakteri Patogen Ekstrak Sponge
Menggunakan  Metode  High  Troughput Screening  (HTS)  dengan  indikator  MTT  (3- [4,5-dimethylthiazol2-yl]-2,5 diphenyltetra
zolium  bromide). Artikel  Penelitian  Unggulan . Universitas Hasanudin, 1-14.
[12] Hadisoetomo,  R.S.  1993. Mikrobiologi Dasar  dalam  Praktek:  Teknik  dan  Prosedur Dasar laboratorium. Jakarta: Gramedia.
[13] Rizqi,  H.D.  2016.  Pengaruh  Penambahan Bakteri  Terhadap  Biodegradasi  Ddt  Oleh Daedalea  dickinsii.  Tesis .  Institut  Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya: 1-100.
[14] Sharah,  A.,  Karnila,  R.,  Desmelati.  2015. Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat Yang Diisolasi Dari Ikan Peda Kembung ( Rastrelliger sp.). JOM, https://media.neliti.com/media/publications/20 3144-none.pdf. 1-19
[15] Septiani,  V.,  Choirunnisa,  A.,  dan  Syam, A.K.  2017.  Uji  Aktivitas  Antimikroba  Ekstrak Etanol Daun Karuk ( Piper sarmentosum Roxb.) terhadap Streptococcus  mutans dan Candida albicans. Jurnal Ilmiah Farmasi, 5(1): 7-14.
[16] Munawar,  Hary,  W.,  Elisa,  N.,  dan Merieska,  V.  2016. Buku  Penuntun  Praktikum Mikrobiologi . Indralaya : Universitas Sriwijaya.
[17] Oktavia, N., dan Pujiyanto, S. 2018. Isolasi dan  Uji  Antagonisme  Bakteri  Endofit  Tapak Dara  ( Catharanthus  Roseus ,  L.)  terhadap Bakteri Escherichia  coli dan Staphylococcus aureus. Berkala Bioteknologi , 1(1): 1-7.
[18] Dwidjoseputro,  D.  (1990). Dasar – Dasar Mikrobiologi .  Jakarta:  Djambatan.  Hal.  187- 192.
[19] Hariyadi,  R.D.,  dan  Cynthia.  2014. Inaktivasi  Bakteri  Patogen  Planktonik  dan Biofilm oleh Sanitaiser Komersial. Jurnal Mutu Pangan, 1(2): 110-117.
[20] Yunita, M., Yusuf, H., Yulianingsih, R. 2015.
Analisis Kuantitatif Mikrobiologi Pada
Makanan  Penerbangan  ( Aerofood  ACS ) Garuda  Indonesia  Berdasarkan  TPC  ( Total Plate Count ) Dengan Metode Pour Plate. Jurnal Keteknikan Pertanian Tropis dan Biosistem , 3(3):
237-248.
[21] Septiani, Dewi, E.N., dan Wijayanti, I. 2017. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Lamun ( Cymodocea  rotundata )  terhadap  Bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli . Saintek Perikanan , 13(1): 1-6.
[22] Iswadi. 2016. Fage Litik Spesifik Escherichia coli Pada Limbah Cair Pasar Tradisional di Kota
Banda Aceh . Jurnal Biotik, 4(2): 95-99.
[23] Wahyuningsih,  N.,  dan  Zulaika,  E.  2018. Perbandingan Pertumbuhan Bakteri Selulolitik Pada Media Nutrient Broth dan Carboxy Methyl Cellulose . Jurnal  Sains  dan  Seni ITS.  7(2):E36- E38.
[24] Sutiknowati,  L.I.  2016.  Bioindikator Pencemar,  Bakteri Escherichia  coli . Jurnal Oseana . 41(4): 63-71.
[25] Ratnadewi,  A.A.I.,  Alidion,  M.Y.,  Santoso, A.B.,  dan  Oktavianawati,  I.  2017.  Eksplorasi Kaldu  Usus  Ayam  Potong  Sebagai  Media Pertumbuhan Escherichia coli BL21 pET-Endo Penghasil Enzim Endo- β 1,4-D-Xilanase. Jurnal Penelitian Kimia, 13(2): 191-204.
[26] Ristiati, N.P. 2015. Uji Bioaktivitas Forbazol E  terhadap  Hambatan  Pertumbuhan  Pada Staphylococcus  Aureus. Jurnal  Sains  dan Teknologi, 4(1): 566-577.
[27] Yuliana,  N.  2008.  Kinetika  Pertumbuhan
Bakteri Asam Laktat Isolat T5 yang Berasal dari Tempoyak. Jurnal Teknologi Industri dan Hasil Pertanian. 13(2):108-116.
[28] Widiastuti., dan Fitria, A. 2008. Penetapan Kadar  Besi  (Fe)  pada  Bayam  Hijau,  Bayam
Raja  dan  Bayam  Duri  di  Pasar  Mojosongo.
Jurnal Analisis Kimia . 1(1): 31-44.
[29] Fardiaz,  S.  (1993). Analisis  Mikrobiologi Pangan .  Bogor:  Institut  Pertanian  Bogor.  Hal. 35-39.
[30] Mahmudah,  F.L.,  dan  Atun,  S.  2017.  Uji Aktivitas  ntibakteriI  dari  Ekstrak  Etanol
Temukunci ( Boesenbergia pandurata )
Terhadap Bakteri Streptococcus mutans. Jurnal Penelitian Saintek. 22(1): 59-66.
[31] Maftuhah, A., Bintari, S.H., dan Mustikaningtyas,  D.  2015.  Pengaruh  Infusa
Daun  Beluntas  ( Pluchea  indica )  Terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphilococcus epidermidis. Unnes Journal of Life Science 4 (1)
: 60-65
[32] Faridz,  R.,  Hafiluddin,  dan  Anshari,  M.
2007. Faktor Lingkungan yang Mempengaruhi Pertumbuhan  Bakteri  yaitu  Nutrisi,  Suhu,  pH dan Kelembaban. Embryo , 4(2): 94-106.
[33] Pelczar,  M.J.,  dan  Chan,  E.C.S.  (2005). Dasar-dasar  Mikrobiologi .  Jakarta:  UI  Press. Viii+443 hlm.
[34] Subagiyo,  Margino,  S.,  Triyanto,  Setyati, W.A. 2015. Pengaruh pH, Suhu Dan Salinitas Terhadap  Pertumbuhan  dan  Produksi  Asam Organik  Bakteri  Asam  Laktat  Yang  Diisolasi Dari Intestinum Udang Penaeid. Ilmu Kelautan , 20(4): 187-194.