Peningkatan Efisiensi Regenerasi Melalui Optimasi Media Induksi Kalus dengan 2,4 -Dicholorophenoxyacetic acid pada Padi Indica (Oryza sativa L. var. Ciherang )
Enhancement of Regeneration Efficiency through Callus Induction Media Using 2,4- Dicholorophenoxyacetic acid in Indica Rice ( Oryza sativa L. var. Ciherang )
Kunti Anis Azizah * , Didik Pudji Restanto* * , Bambang Sugiharto *) * Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Univesitas Jember
* Fakultas Pertanian, Univesitas Jember
*) E-mail : sugiharto.fmipa@unej.ac.id

## ABSTRACT
Indica  rice  variety  Ciherang  is  the  most  planted  variety  in  Indonesia,  but  the  micropropagation technique  is  restricted  because  it    is  known  has  low  regeneration  frequency  and  included  as recalcitrant cultivar for tissue culture and tranformation activities. One of solution to resolve that problem is developing a technique of somatic embryogenesis in callus of ciherang rice cultivar. The  aims  of  study  were  to  determine  medium  composition  for  inducting  embryogenic  callus  in Ciherang rice and to know the effectivity of rice regeneration using callus as explant. The methods were  included  induction  of  embryogenic  callus  in callus  induction  media (CIM) containing MS basal, Proline 600 mg/l, Casein Hidrolisat 300 mg/l, phytagel 2,5 g/l,  BAP 0.25 mg/l, sukrosa 30 %, and 2,4-D in different concentration, from 2,4-D 0 mg/l as control (CIM 1), 2,4-D 2 mg/l (CIM 2), 2,4-D 3 mg/l (CIM 3), and 2,4-D 4 mg/l (CIM 4). It then be continued to regenerate the calli in RM 1 medium containing MS  basal, NAA 0,2 mg/l, Kinetin 2 mg/l,  Agarose 10 g/l, and sukrosa 30 %, pH 5,8 for six days in dark and RM2 medium containing MS  basal , NAA 0,2 mg/l, Kinetin 2 mg/l, Agarose 8 g/l, sukrosa 30 %, pH 5,8 in light room. Results showed CIM 4 medium using 2,4-D 4 mg/l gave optimum result in calli induction with procentage 57,63% and CIM 3 using 2,4- D  3  mg/l  gave  optimum  result  in  embryonic  calli  induction  with  procentage  53,63%.  Result  of embryonic calli gave regeneration frequency procentage is 9,6%. The total planlet obtained after five weeks old in regeneration medum were 11 planlets ready for aclimatization.
Keywords: somatic embryo, indica rice ( Oryza sativa L. var. ciherang), callus
PENDAHULUAN
Padi  ( Oryza  sativa L.)  varietas  Ciherang merupakan padi indica hasil persilangan antara varietas IR64 dengan varietas IR18349-53-1-3- 1-3/3 (Suprihatno et al .,  2009).  Padi  indica varietas  Ciherang  banyak  dibudidayakan  di Indonesia,  tetapi masih sulit digunakan untuk tujuan  mikropropagasi  karena sebagian  besar varietas padi  indica  dikenal mempunyai  daya regenerasi  rendah  dan  merupakan  varietas rekalsitran  untuk  kegiatan  kultur  jaringan  dan transformasi  genetik.  Varietas  rekalsitran dikenal karena rendahnya kemampuan tanaman dalam produksi dan regenerasi kalus (Khatun et al ., 2003). Kultur jaringan melalui embriogenesis  somatik  menggunakan  eksplan kalus merupakan salah satu teknik yang sering digunakan  dan  merupakan  langkah  kunci dalam  bioteknologi  padi  (Meneses et  al .,
2005).  Embriogenesis  somatik  adalah  proses perkembangan  sel  somatik  membentuk  sel embriogenik  melalui  tahap-tahap  perubahan morfologi  tanpa  proses  peleburan  sel  gamet (Quiroz-Figuera et  al .,  2006).  Petrasek et  al . (2002)  melaporkan  bahwa  pembelahan  dan pertumbuhan  sel  tanaman  secara in vitro membutuhkan  sumber  auksin  eksternal  yang sangat  penting  dalam  regulasi  fase  standar siklus  pertumbuhan.  Jenis  auksin  yang  sering digunakan  dalam  media  kultur  adalah  auksin sintetis 2,4- Dichlorophenoxy Acetic Acid (2,4- D).  Libin et  al .  (2012)  melaporkan  bahwa penggunaan  2,4-D  2  mg/l  dalam  media  MS sangat  efektif  dalam  menginduksi  kalus embriogenik  pada  padi  indica  varietas  Biris, Mondal et  al .  (2011)  melaporkan  penggunaan 2,4-D  4  mg/l  dalam  media  MS  menghasilkan induksi  kalus  embriogenik  maksimum  pada padi  indica  varietas  Swarna.  Sahoo et  al .
(2011)  memaparkan  bahwa  penggunaan  2,4-D sebanyak  3  mg/l  memberikan  hasil  maksimal dalam  induksi  kalus  embriogenik  pada  empat varietas  indica,  salah  satunya  adalah  varietas
IR64. Hasil  tersebut  mengindikasikan  bahwa proliferasi kalus embriogenik dan  kemampuan regenerasi  ditentukan  oleh  metode  optimasi serta  formulasi  media  induksi  kalus  dan regenerasi yang tepat.
Kombinasi  antara  2,4-D  dan  BAP  pada media  induksi  kalus  berperan  dalam  induksi sifat-sifat  embriogenesis  somatik,  misal struktur  bipolar  melalui  regulasi  arah morfogenesis  dan  menginduksi  pertumbuhan kalus  melalui  proliferasi  (Haensch,  2007; George et al ., 2008). Penggunaan  kasein  hidrolisat  dan  prolin sebagai  penyedia  asam  amino  sangat  berperan dalam  mendukung  kerja  2,4-D  dalam menunjang proses inisiasi dan proliferasi kalus embriogenik,  sekaligus  mempertahankan  sifat embriogenik kalus (Zhang et al ., 1996; Kishor et al ., 1999). Kasein hidrolisat merupakan jenis asam  amino  yang  digunakan  sebagai  sumber nitrogen  organik.  yang  lebih  cepat  diasimilasi oleh  tanaman  daripada  nitrogen  (Saad  dan Ahmed,  2012).  Prolin  dikenal  sebagai  osmolit inert yang dapat melindungi struktur subseluler dan  makromolekul  pada  kondisi  tekanan osmotik  (Shubashini  dan  Reddy,  1991; Szabados dan Arnould, 2009).
Tujuan  yang  ingin  dicapai  dari  penelitian ini  adalah  untuk  menetukan  komposisi  media induksi  kalus  embriogenik  somatik  pada  padi ( Oryza  sativa L.  var.  Ciherang)  dan  untuk mengetahui  efektivitas  regenerasi  padi  dengan eksplan kalus pada padi Indica.
Penelitian  tentang  induksi  embriogenesis somatik  ini  merupakan  langkah  awal  untuk pengembangan teknik bioteknologi padi indica di  Indonesia.  Hasil  yang  didapat  diharapkan dapat  menjadi  acuan  teknis  dalam  melakukan transformasi  genetik padi  indica  di  Indonesia yang  dapat  memberikan  kontribusi  penting dalam peningkatan produktivitas padi nasional.

## METODE
Penelitian ini  menggunakan  biji padi  indica  ( Oryza sativa L. var. Ciherang). Jenis penelitian eksperimen dengan dua tahapan yaitu induksi kalus embriogenik menggunakan media dengan penggunaan 2,4-D pada konsentrasi  berbeda,  dimulai  dari  0  mg/l  sebagai perlakuan pertama sekaligus kontrol (CIM 1), 2,4-D 2 mg/l (CIM 2), 2,4-D 3 mg/l  (CIM 3), dan  2,4-D 4 mg/l  (CIM  4);  dan  regenerasi  kalus  embriogenik pada media regenerasi (RM) yang mengandung MS
basal, NAA 0,2 mg/l, Kinetin 2 mg/l,  Agarose 10-8 g/l,  dan  sukrosa  30  %, pH  5,8.  Metode  tersebut mengacu  pada  penelitian  yang  telah  dilakukan Sahoo et  a l,  (2011)  dengan  beberapa  modifikasi diantaranya  peggunaan  waktu  inkubasi  saat  induksi kalus  embriogenik  selama  21  hari  tanpa  subkultur dan  pemindahan  kalus  RM1  ke  RM2  tanpa  proses subkultur.
Sterilisasi Benih Biji  padi  ( Oryza  sativa var.  Ciherang)    yang  telah dikupas  disterilisasi  dalam  etanol  70% selama  5 menit,  kemudian  digojok  dalam  larutan  NaClo  1% selama 10 menit. Biji padi kemudian dibilas dengan akuades  steril  sebanyak  empat  kali,  kemudian dikeringkan  dengan  kertas  filter  steril  selama  dua jam.  Biji  diletakkan  ke  dalam    media  pengkalusan CIM 1,  CIM  2,  CIM  3,  dan  CIM  4.  Digunakan empat  cawan  petri  tiap  perlakuan  sebagai  ulangan dan  biji  yang  ditanam  tiap  cawan  petri  adalah sebanyak 18 biji.

## Induksi Kalus Embriogenik
Biji ditumbuhkan di tempat gelap selama 21 hari dan suhu  ruang  kultur  harus  tetap  terjaga  pada  kisaran 28° C. Media CIM yang digunakan memiliki pH 5,8 dan mengandung MS  basal, Prolin 600 mg/l, Casein Hidrolisat  300  mg/l,  phytagel  2,5  g/l,    BAP  0.25 mg/l,  sukrosa  30  %, dan  2,4  D  dengan  konsentrasi berbeda  dimulai  dari  0  mg/l  sebagai  perlakuan pertama  sekaligus  kontrol  (CIM  1),  2,4-D  2  mg/l digunakan pada media CIM 2, 2,4-D 3 mg/l sebagai media  perlakuan  3  (CIM  3),  dan    2,4-D  4  mg/l sebagai  media  perlakuan  4  (CIM  4).  Dihitung prosentase  frekuensi  induksi  kalus  total  tiap perlakuan  dan  kalus  embriogenik  dicirikan  dengan morfologi  berwarna  putih  kekuningan,  remah,  dan memiliki tekstur kering.

## Regenerasi Kalus Embriogenik
Kalus non-embriogenik (bertekstur basah, padat, dan berwarna  kuning)  dibuang,  sementara  kalus embriogenik  dipotong  dari  biji  dan  dipindahkan pada media regenerasi 1 (RM 1) kemudian disimpan dalam  ruang  gelap  dengan  suhu  27  ±  1°  C selama tujuh  hari.  Kalus  yang  telah  mengalami  proliferasi, dipindahkan  ke  tempat  terang  selama  seminggu, kemudian dipindahkan pada media regenerasi 2 (RM 2)  dan  disimpan  dalam    tempat  terang  (16  jam terang,  8  jam  gelap)  dengan  suhu  27  ± 1°  C  untuk disubkultur  tiap  tiga  minggu  sekali.  Media  RM1 yang  digunakan  mengandung  MS    basal, NAA  0,2 mg/l,  Kinetin  2  mg/l,    Agarose  10  g/l,  dan  sukrosa 30  %, pH 5,8;  sementara  media  RM2  mengandung MS  basal , NAA 0,2 mg/l, Kinetin 2 mg/l, Agarose 8 g/l, sukrosa 30 %, pH 5,8.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Induksi Kalus Embriogenik
Keberadaan  2,4-D  berpengaruh  terhadap kemunculan  kalus  pada  biji. Hasil  penelitian menunjukkan bahwa CIM 1 tanpa penambahan
2,4-D,  menunjukkan  hasil  konsisten  berupa tidak  terbentuknya  kalus,  melainkan  terjadi organogenesis langsung  membentuk tunas dan akar (Gambar. 1). Hal ini menunjukkan bahwa keberadaan 2,4-D dapat menghambat morfogenesis pada biji tanaman. Gambar  1.  Kondisi  kalus  umur  21  HST  pada perlakuan:  A)  CIM  1,  B)  CIM  2, C) CIM 3,dan D) CIM 4 Media CIM 2 mulai menampakkan adanya pertumbuhan kalus dan peristiwa morfogenesis tunas  dan  akar  direduksi,  akan  tetapi, kemunculan  kalus  embriogenik  masih  belum menampakkan hasil yang optimal. Media CIM 3 dengan menggunakan  2,4-D
3 mg/l menghasilkan kalus embriogenik paling optimal  dibandingkan  media  CIM  yang lainnya. Pertumbuhan kalus yang dicapai pada media CIM 3 menunjukkan kalus embriogenik dalam  jumlah  lebih  dari  50%    dari  total  kalus yang tumbuh. Media CIM 4 menggunakan 2,4- D  4  mg/l  memberikan  hasil  optimum  untuk menginduksi kalus terbanyak dengan prosentase    57,63%  (gambar  1).  Akan  tetapi, media  CIM  4  justru  memberikan  prosentase induksi  kalus  embriogenik  terendah  sebesar 14,8%. Penurunan prosentase kalus embriogenik ditunjukkan dengan meningkatnya  jumlah  kalus  yang  mengalami nekrotik (Gambar 1D). Sebagian  besar  kalus  dari  biji yang diinkubasi di  tempat  gelap  selama 21  hari menunjukkan ciri-ciri embriogenik. Gambar  2.  Kondisi  kalus:  A dan  C)  kalus embriogenik, B dan D) kalus non- embriogenik.
Kalus  embriogenik  ditetapkan  berdasarkan kondisi  morfologi  secara  mikroskopis  dengan ciri berwarna putih kekuningan ( creamy white ), remah  ( friable ),  dan  bertekstur  kering.  kalus embriogenik dapat dilihat pada gambar 2A dan 2C. Pertumbuhan  kalus  umur  21  HST ditentukan berdasarkan perhitungan perbandingan  antara  total  kalus  yang  tumbuh dengan  total  benih.  Prosentase  kemunculan kalus embriogenik  yang dapat diregenerasikan dapat  diperoleh  berdasarkan  perhitungan perbandingan  antara  total  kalus  embriogenik dengan  total  kalus  yang  tumbuh.  Grafik (gambar  3)  menunjukkan  pola  spesifik  pada pertumbuhan  kalus. Media  CIM  1  tanpa penambahan  2,4-D  menunjukkan  bahwa  tidak ada  pertumbuhan  kalus  tetapi  terjadi  proses morfogenesis  pada biji menjadi tunas dan akar. Ketiadaan  2,4-D menampakkan stimulus pada biji  untuk  melakukan  perkecambahan  secara normal.  Penambahan 2,4-D  sebanyak  1  mg/l memberikan  hasil  pertumbuhan  kalus  sebesar 45,68%.
A
B C D
Gambar  3.  Grafik  perbandingan  frekuensi induksi  kalus  dan kalus embriogenik.  Tanda  ND  ( Not Detected )  menunjukkan  bahwa pada  media  CIM  1  tidak  ada kalus  dan  kalus  embriogenik yang terinduksi. Pertumbuhan  kalus  akan  terus  meningkat seiring  dengan  peningkatan  konsentrasi  2,4-D dalam  media.  Hal  ini  dapat  ditunjukkan prosentase  pertumbuhan  kalus  tertinggi  pada media  CIM4  yang  mengandung  2,4-D  4  mg/l.
Hal  ini  mengindikasikan  bahwa  keberadaan
2,4D  dapat  menghambat  morfogenesis  pada perkecambahan    biji. Gaj  (2004)  memaparkan bahwa  keberadaan  2,4-D  dalam  kultur merupakan  agen  pemicu  stres  bagi  tanaman.
Ketika  tanaman  terpapar  stres,  maka  tanaman akan  memberikan  respon  stres  dan  sistem dalam jaringan  tanaman  akan  melakukan reprogramming
diferensiasi  sel  melalui aktivitas  metilasi  DNA  menuju  program dediferensiasi.  Program  dediferensiasi  tersebut yang akan mengawal pertumbuhan biji dengan mempertahankan fase mitotik.
Hasil  pertumbuhan  kalus  embriogenik menampakkan  pola  parabola.  Peningkatan prosentase  kalus  embriogenik  diawali  dari konsentrasi 2,4-D 2 mg/l dan 3mg/l. Frekuensi kemunculan kalus sebesar 56,17% pada media CIM 3 yang paling optimal dalam menginduksi kalus  embriogenik.  Hal  tersebut menunjukkan hasil  yang  serupa  jika  dibandingkan  dengan penelitian  yang  dilakukan  Purnamaningsih (2006)  yaitu  sebesar    55,0%.  Dari  56,17% kalus,  sebanyak  53,63%    yang  dinyatakan sebagai  kalus  embriogenik  yang  dapat dipindahkan ke media regenerasi selanjutnya. Peningkatan  konsentrasi  2,4-D  menjadi  4 mg/l menurunkan prosentase kalus embriogenik secara drastis sampai pada kisaran
14,8%.  Hal  tersebut  mengindikasikan  bahwa meskipun  pertumbuhan  kalus  akan  terus
meningkat seiring peningkatan konsentrasi 2,4- D, akan tetapi pertumbuhan kalus embriogenik yang  optimal  hanya  akan  dicapai  pada konsentrasi 2,4-D tertentu yang tepat dan dapat direspon  dengan  baik  oleh  faktor  internal tanaman. Berdasarkan  hasil  penelitian  ini,  padi varietas  Ciherang  hanya  akan  menghasilkan kalus  embriogenik  dengan  jumlah  maksimal pada  konsentrasi  2,4-D  3  mg/l  dalam  media. Peningkatan  konsentrasi  2,4-D  secara  terus menerus  akan  menurunkan  prosentase  kalus embriogenik  disebabkan  karena  sel  tanaman menjadi stres dan tidak dapat mentoleransi efek fitotoksik 2,4-D.

## Frekuensi Regenerasi Kalus Embriogenik
Pada  umur  1  HST  pada  media  RM2,  kalus- kalus embriogenik tersebut  masih berada pada fase  globular dan  skutelar.  Fase globular pada embrio somatik (Gambar. 4A dan 4B) dicirikan oleh  bentuk  sel  nodular  yang  kecil  dengan sitoplasma padat, sementara pada fase skutelar, kalus  globular  mengalami  perkembangan menjadi  bentuk  terpedo  sebagai  cikal  bakal munculnya tunas (Gambar. 4C).
Gambar  4.  Tahap  Perkembangan  Kalus Embriogenik menuju Regenerasi. A-B) Fase globular,  C)  Fase  skutelar,  D) Fase koleoptil
Prosentase  frekuensi  regenerasi  eksplan kalus  embriogenik  dapat  dihitung  dengan perhitungan  perbandingan  antara total  kalus yang  beregenerasi  dengan  total  kalus embriogenik. Hasil  (gambar  5)  menunjukkan bahwa  rata-rata  frekuensi  kemunculan  bintik hijau  mencapai  90,2%.  Sebagian  bintik  hijau tersebut  mengalami browning dan  tidak mampu  melanjutkan  ke  fase  perkembangan kalus  selanjutnya  dan  sebanyak  23,4%  kalus
dengan  bintik  hijau  mampu  berlanjut  menuju fase  koleoptil.  Frekuensi  regenerasi  yang dicapai adalah sebesar 9,6%.
Gambar  5.  Grafik  frekuensi  proses  regenerasi kalus embriogenik
Frekuensi  kemunculan  bintik  hijau  sebesar 90,2%    menunjukkan  hasil  yang  tinggi.  Hasil ini  mengindikasikan  bahwa  padi  Ciherang memiliki  probabilitas  efisiensi  yang  tinggi apabila dilanjutkan pada kegiatan transformasi genetik  kendati  demikian,  peristiwa  browning yang  terjadi  pada  kalus  yang  memiliki  bintik hijau  memberikan  dampak  pada  penurunan kemunculan tunas setelah bintik  hijau. Hal ini dapat  dilihat  pada  tunas  yang  muncul  sebesar 23,4% dari total bintik hijau.
Timbulnya  browning  diduga  dikarenakan karena  ketidakseimbangan  komposisi  nutrisi pada  media  yang  menyebabkan  terbentuknya quinon  pada  kalus  dan  terjadinya  proses oksidasi  polifenol  (Husain et  al .,  2011).
Senyawa fenolik  tersebut  terakumulasi  di dalam  vakuola,  sehingga  akan  tercampur dengan  isi  plastida  dan  organel  lain  dan memunculkan  pigmentasi  gelap.  Hal  tersebut merupakan senyawa reaktif dan bersifat toksik karena  berpolimer  secara  cepat  membentuk ikatan  dengan  protein  dan  juga  menghambat aktivitas  enzim  sehingga  menghasilkan browning yang  bersifat  letal  (Grewal et  al ., 2005). Tunas  yang  muncul  sebesar  23,4%  dari total  bintik  hijau  mengalami  kegagalan  dalam melanjutkan  pertumbuhannya  menjadi  planlet utuh.  Hal  ini  disebabkan  karena  tunas  yang beregenerasi  mengalami  peristiwa  albino  dan browning sehingga  total  tunas  yang  dapat melanjutkan  pertumbuhan planlet  utuh hanya sebesar  9,6%.  Hasil  tersebut  menunjukkan adanya tingkat  efisiensi  regenerasi  yang berbeda  jika    dibandingkan  pada  penelitian Sulistyowati et  al .,  (2011)  yang  mendapatkan efisiensi regenerasi pada padi Ciherang sebesar 10,22%  dan  Purnamaningsih  (2006)  dengan
daya regenerasi padi Ciherang mencapai 69%.
Gambar  6.  Regenerasi  tanaman  padi  var. Ciherang. A) umur 3 minggu B) umur  5  minggu  C-D)  perakaran umur 5 minggu.
Pertumbuhan  planlet  dari  fase  koleoptil menuju  planlet  lengkap  membutuhkan  waktu rata-rata tiga minggu. Subkultur dilakukan dua kali  dengan  interval  waktu  rata-rata  dua minggu  untuk  kemudian  planlet  siap diaklimatisasi.
Hasil  menunjukkan  bahwa  pada  umur  tiga minggu  di  media  regenerasi,  kalus rata-rata telah  membentuk 2 planlet (Gambar. 6A). Pada  umur  lima  minggu  (Gambar. 6B)  pada media regenerasi rata-rata jumlah planlet yang terbentuk adalah 11 planlet serta telah muncul sistem  perakaran dan  diaklimatisasi (gambar 6C dan 6D). Keberadaan  planlet  albino  disebabkan karena  kondisi  kultur  yang  tidak  cocok  baik dari segi suhu inkubasi dan komposisi medium yang  tidak  sesuai  bagi  tanaman  (International Rice  Research  Institute,  1983).  Sangat disarankan  untuk  menggunakan    suhu  yang stabil pada kisaran 27°C-28°C. Jika suhu yang digunakan  terlalu  tinggi  pada  kisaran  30°C menyebabkan  tanaman  rekalsitran  menjadi peka  dan  mengalami  perubahan  sistem fisiologis yang berperan dalam pertumbuhannya.

## KESIMPULAN
Disimpulkan bahwa media CIM 4
menggunakan  2,4-D  4  mg/l  memberikan  hasil optimum  untuk  menginduksi  kalus  terbanyak dengan prosentase  57,63%. Akan tetapi, media CIM  3  dengan  menggunakan  2,4-D  3  mg/l menghasilkan  kalus  embriogenik  paling
maksimal  dibandingkan  media  CIM  yang lainnya, yaitu dengan prosentase 53,63%. Hasil regenerasi  kalus  embriogenik  menunjukkan frekuensi  regenerasi  yang  dicapai  adalah sebesar  9,6%. Hasil  tersebut  mengindikasikan bahwa  penelitian  dapat  dilanjutkan  dengan melakukan  transformasi  genetik  pada  padi Ciherang.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Direktorat  Pendidikan  Tinggi,  Departemen Pendidikan  dan  Kebudayaan  Republik Indonesia  yang  telah  memberikan  dukungan finansial  melalui dana  hibah  MP3EI dan Prof. Bambang Sugiharto sebagai pemilik proyek.

## DAFTAR PUSAKA
Gaj  M.D.  2004.  Factors  influencing  somatic embryogenesis  induction  and  plant regeneration  with  particular  reference  to Arabidopsis  thaliana (L.)  Heynh. Plant Growth Regulation 43: 27-47
George, E. F., M. A. Hall, dan G. J. de Klerk. 2008. Plant Propagation by Tissue Culture . Dordrecht: The Netherland Grewal,  D.,  R.  Gill,  dan  S.S.  Gosal.  2005. Factors  Enhancing  Induction  of  High Frequency  Plant  Regeneration  from
Somatic  Embryos  of  Indica  Rice  ( Oryza sativa L.). Jour. Bio. Sci 5 (6): 697-702
Haensch,  K.T.  2007.  Influence  of  2,4-D  and BAP  on  callus  growth  and  the  subsequent regeneration  of  somatic  embryos  in  long- term cultures of Pelargonium x domesticum cv. Madame Layal. Elec. Jour. of Biotech . : 69-77 Husain, A., S. N. H. Nazir dan Z.K. Shinwari. 2011. Tissue culture of black pepper ( Piper nigrum L.) in Pakistan. Pak. J. Bot., 43(2): 1069-1078 International  Rice  Research  Institute.  1983.
Cell  and  Tissue  Culture  Techniques  for Cereal  Crops  Improvement .  Beijing: Science Press Khatun,  M.  M.  Mahmuda, H.  Ali, & N.  V.
Desamero.  2003. Effect  of  Genotype  and Culture  Media  on  Callus  Formation  and Plant  Regeneration  from  Mature  Seed Scutella Culture in Rice. Plant Tissue Cult .
13(2) : 99-107
Kishor P.B.K, S. Sangam, & Naidu K.P. 1999. Sodium,  Potassium,  Sugar,  alcohol  and proline  mediated  somatic  embryogenesis
and  plant  regeneration  in  recalcitrant  rice callus.  Plant  Tissue  Cult.  Biotech.
Emerging Trends. Proc. Symp : 78-85
Libin,  A.,  P.  J.  H.  King,  K.  H.  Ong,  J.  K. Chubo & P.  Sipen.  2012.  Callus  induction and  plant  regeneration  of  Sarawak  rice ( Oryza  sativa L.)  variety  Biris. African
Journal  of  Agricultural  Research Vol. 7(30): 4260-4265 Meneses, A., D. Flores, M. Munoz, G. Arrieta, A.M.  Espinosa.  2005.  Effect  of  2.4-D, Hydric  stress  and  light  on  indica  rice ( Oryza sativa
) somatic embryogenesis. Rev Biol Trop (Int J) 53(3-4): 361-368 Mondal, S., R. P. Singh, C.  Sen dan B. Bose. 2011. Study  of  Physiological  Potentiality of  Callus  and  Plant  Regeneration  through Somatic  Embrygenesis  in  Rice  Variety Swarna. Am. J. Plant Physiol , 6(2): 91-98
Petrasek,  J.  Elckner,  Morris  D.A.,  dan
Zazimalova.  2002.  Auxin  Efflux  Carrier Activity & Auxin  Accumulation  Regulate Cell  Division  and  Polarity  in  Tobacco Cells. Planta 216: 302–308 Purnamaningsih,  R.  2006. Induksi  Kalus  dan Optimasi  Regenerasi  Empat  Varietas  Padi melalui Kultur In Vitro. Jurnal AgroBiogen 2(2): 74-80 Quiroz-Figueroa  F.,  Rojas-Herrera  R,  Galaz-
Avalos  R.M,  Loyola-Vargas  V.M.  2006. Embryo  Production  Through  Somatic Embryogenesis Can be Used to Study Cell
Differentiation  in  Plants: Review  Paper. Plant Cell Tiss Organ Cult . 86: 285-301
Saad,  A.  I.M. & Ahmed  M.  E.  2012. Recent Advances  in  Plant in  vitro Culture . Libya: Intech Sahoo, K. K., Amit K. T., Ashwani P., Sudhir K. S., & Sneh L. S-P. 2011. An Improved Protocol  for  Efficient  Transformation  and Regeneration  of  Diverse  Indica  Rice
Cultivars. Plant Methods 7:49-60 Shubashini,  K. & G.M.  Reddy,  1991.  Role  of Proline  in  Callus  Growth  and  Plant Regeneration  Under  Salt  Stress  in  Rice.
Proc. Indian Naim. Sci. Acad . B57 (1): 81- 84 Suprihatno,  B.,  Aan  A.  D.,  Satoto,  Baehaki S.E.,  I.  N.  Widiarta.  2009. Deskripsi Varietas  Padi. Subang :Balai  Besar Penelitian Tanaman Padi Sulistyowati,  Y.,  Agus  R.,  Fatimah  Z., Syamsidah  R., & Satya  N.  2011. Genetic transformation  of  rice  cv.  Ciherang  using double  T-DNA  vector  harboring cry1Ab
gene. Annales Bogorienses Vol. 15.1 : 27-
32 Szabados,  L. & Arnould  S.  2009.    Proline:  a Multifunctional  Amino  Acid. Trends  in Plant Science 15  (2): 89-97 Zhang  Y,  Chautler  S.E.,  Gupta  S.,  Zhao  Y., Hannah, L.C, Meyer C., Weston J., Wu M- X.,  Preiss  J.,  dan  Okita T.W.  1996. Molecular  Approaches  to  Enhance  Rice Production Through Manipulation of Starch Metabolism  During  Seed  Development. Proc. Third Int’l Rice Gen. Symp:809-813