Penapisan Inhibitor β -laktamase Dari Bakteri Simbion Sponge Axinella sp.
Screening inhibitors of β -lactamase Axinella Sponge Simbion Bacteria sp.
Asadatun Abdullah * , Linawati Hardjito, Ernawati, Fatimah Abdillah
Departemen Teknologi Hasil PerairanFakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor, Jl. Lingkar Akademik, Kampus IPB, Darmaga, Bogor 16680
Diterima April 2007/ Disetujui Maret 2008

## Abstrak
Salah  satu  jenis  antibiotik  yang  umum  digunakan  dalam  pengobatan  adalah  antibiotik β -laktam.  Saat  ini  banyak  terdapat  bakteri  patogen  pada  manusia  yang  resisten  terhadap  antibiotik β -laktam.  Bakteri  patogen  yang  resisten  terhadap  antibiotik β -laktam  adalah  bakteri  yang  mampu memproduksi  enzim β -laktamase.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  menapis  produk  natural  inhibitor β -laktamase  dari  mikroorganisme  simbion Axinella sp.  Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan sebelumnya, telah diisolasi dan diidentifikasi secara biokimia 7 isolat bakteri simbion sponge Axinella sp. Penapisan inhibitor β -laktamase dilakukan dengan metode agar difusi menggunakan bakteri target E.coli R dan S.aureus R resisten ampisilin koleksi Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan. Pengukuran resistensi terhadap E.coli R dan S.aureus R dilakukan  pad a  konsentrasi  ampisilin  >32  µg/ml.  Dari  7  isolat  bakteri simbion  yang  ditapis  secara  intraseluler  dan  ekstraseluler,  4  isolat  pada  ekstraselulernya  positif menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen E.coli R dan S.aureus R .  4  bakteri  simbion  tersebut  adalah Bacillus sp., Halomonas sp., Alteromonas sp1  dan Alteromonas sp2.  Identifikasi  molekuler  bakteri simbion dan karakterisasi golongan senyawa inbitor β -laktamase sedang dalam proses penelitian.
Keywords : bakteri simbion Axinella sp., inhibitor β -laktamase, E.coli R dan S.aureus R

## PENDAHULUAN
Salah  satu  invertebrata  laut  yang  merupakan  sumber  potensial  penghasil komponen  bioaktif  adalah sponge .  Aktivitas  biologis  dari  komponen  bioaktif  yang terdapat dalam sponge antara  lain  adalah cytotoxic, antifungal, cell division inhibitors, antitumor,  antiviral,  anti-inflammatory,  antimicrobial dan  aktivitas  penghambatan enzim  ( enzyme  inhibitor ). Sponge juga  merupakan  tempat  hidup  untuk  berbagai mikroorganisme  yang  bersimbiosis  dengannya.  Mikroorganisme  yang  bersimbiosis dengan sponge dapat  menjadi sumber untuk berbagai produk alam dari  laut. Metabolit yang  terkandung  dalam sponge sangat  terkait  dengan  metabolit  yang  disintesis  oleh mikroorganisme simbionnya (Lee et al ., 2001).
Isu  semakin  meningkatnya  resistensi  berbagai  spesies  bakteri  patogen terhadap antibiotik telah menjadi keperdulian banyak peneliti di seluruh dunia dewasa ini. Secara umum  resiko  yang  ditimbulkan  dari  bakteri  patogen  yang  resisten  pada  pasien  adalah meningkatnya  jumlah  dosis  pemakaian  antibiotik.  Salah  satu  jenis  antibiotik  yang
* Korespondensi: telp/fax (022) 91574358, E-mail: sasa@yahoo.com
umum  digunakan  dalam  pengobatan  adalah  antibiotik β -laktam.  Bakteri  patogen  yang resisten  terhadap β -laktam  adalah  bakteri  yang  mampu  memproduksi  enzim β -laktamase. β -laktamase  adalah  enzim serine-dependent yang  diproduksi  oleh  bakteri sebagai pertahanan dalam melawan seluruh kelas antibiotik β -laktam, seperti penicillin , cephalosporins , carbapenem ,  dan monobactam (Venkatesan et  al .,  2004). Teridentifikasinya  lebih  dari  340  enzim β -laktamase  yang  spesifik  terhadap β -laktam telah menciptakan tantangan baru yang signifikan bagi pengobatan akibat infeksi bakteri patogen yang resisten.
Berdasarkan  penelitian  pendahuluan  yang  telah  dilakukan  di  Laboratorium Bioteknologi  Hasil  Perairan, sponge  Axinella sp.  positif  mengandung cytotoxic antiovarian  cancer  cell  lines A  2780  (Hardjito,  2004),  diisolasi  12  isolat mikroorganisme simbion sponge Axinella sp.  yang terdiri dari 7  isolat bakteri, 3  isolat mikrofungal,  dan  2  isolat yeast .  (Abdullah,  2005)  dan  dari  hasil  penapisan  2  isolat bakteri simbion Axinella sp. salah satu  isolat berpotensi positif  menghasilkan  senyawa antibakteri  (Abdullah  dan  Hardjito,  2006).  Untuk  itu  penelitian  mengenai  penapisan inhibitor β -laktamase  dari  bakteri  simbion sponge  Axinella sp.  menjadi  penting  untuk dilakukan sebagai tindak  lanjut pencarian  bahan aktif  lain terkait yang dikandung oleh bakteri simbion Axinella sp.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  menapis  produk  natural  inhibitor β -laktamase dari  bakteri simbion Axinella sp. Manfaat dari dilakukannya penelitian  ini adalah  dihasilkannya  inh ibitor  β -laktamase  yang  memiliki  spektrum  daya  hambat β -laktamase luas.

## METODOLOGI
Marine  sponge yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah Axinella sp.  atau nama  daerahnya  adalah sponge Jengger .  Marine  sponge di  ambil  dari  perairan Kepulauan  Seribu.  Selanjutnya marine  sponge Axinella sp.  dibersihkan  dari  kotoran yang  menempel  dan  disimpan  dalam  air  laut  steril  sebelum  diisolasi  mikrobanya. Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan  sebelumnya  oleh  Abdullah  (2005),  maka  telah berhasil  didapatkan  7  isolat  bakteri  simbion Axinella sp.  Pada  penelitian  ini  dilakukan penapisan  inhibitor β -laktamase  yang  akan  diperoleh  dari  7  isolat  bakteri  simbion sponge Axinella sp.

## Alat dan Bahan.
Alat-alat yang digunakan meliputi: autoklaf, lemari es, oven, timbangan analitik, magnetik  stirer, waterbath  shaker ,  mikroskop  cahaya  elektrik,  inkubator,  mikropipet, vorteks, mini  mikrocentrifuge ,  kertas  pH, pH-meter ,  bulb,  pipet  volumetrik,  tabung reaksi, beaker  glass ,  sarung  tangan  steril, paper  disk steril,  serta  beberapa  alat  gelas lainnya.
Bahan  yang  digunakan  adalah  media-media  yang  diperlukan  untuk menumbuhkan  dan  pengayaan  mikroba,  yaitu  media marine  broth (MB), marine  agar (MA),  media  selektif eosin  methylen  blue (EMB),  agar  Mueller  Hinton,  berbagai antibiotik  golongan  β -lactam,  agar  bakto  ( bacto  agar ), tips untuk micropipet, rak tips , paper disk , larutan buffer, sodium chloride , glucose , etil asetat PA dan metanol PA.

## Metode Penelitian
Penapisan  dilakukan  dengan  menggunakan  metode  agar  difusi  dengan  bakteri target E.coli R dan S.aureus R yang  telah  diuji  sifat  resistensinya  pada  konsentrasi ampisilin  >  32  µg/ml .  Penapisan  dilakukan  pada  3  variasi  umur  kultivasi  yaitu  4  hari, 7  hari  dan  10  hari.  Kultivasi  dilakukan  dengan  menggunakan waterbath  shaker yang diatur suhunya pada  25ºC.
Pengujian Resistensi  Bakteri  Target  Terhadap  Antibiotik  β -laktam.  Pengujian resistensi  bakteri  target  pada  penelitian  ini  adalah  melihat  pertumbuhan  bakteri E.coli dan S.aureus koleksi  pribadi  Laboratorium  Bioteknologi  Hasil  Perairan dengan penambahan konsentrasi ampisilin 32 µg/ml ke dalam media pertumbuhannya.
Penapisan  Inhibitor β -laktamase.  Tahapan  pertama  untuk  menapis  inhibitor β -laktamase  adalah  bakteri  simbion  dikultivasi  dalam  media Marine  Broth (MB). Kultivasi  dihentikan  pada  fase  stasioner  dari  pertumbuhan  bakteri  simbion.    Setelah kultur  bakteri  siap  untuk  ditapis,  tahapan  selanjutnya  adalah  masing-masing  isolat disentrifugasi  untuk  memisahkan  bagian  intraseluler  dan  ekstraseluler.  Pelet  yang didapatkan kemudian dilisiskan selnya untuk digunakan dalam proses penapisan secara intraseluler. Filtrat kultur (bagian ekstraseluler) yang didapatkan dari pemisahan dengan peletnya  (intraseluler)  diekstrak  dengan  menggunakan  pelarut  etil  asetat  dan  metanol. Ekstrak  kasar  yang  didapatkan  ditapis  inhibitor β -laktamasenya  dengan  menggunakan metode  agar  difusi.  Setelah  inkubasi  selama  24  jam  dapat  diamati  zona  bening  yang
terbentuk,  untuk  selanjutnya  dilakukan  pengukuran  zona  hambat β -laktamase.  Daya hambat  terhadap  enzim β -laktamase  akan  diukur  dari  diameter  zona  bening  yang terbentuk.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari penelitian terdahulu telah diperoleh pendugaan  nama genus untuk 7  isolat bakteri  simbion  yang  diisolasi  dari Axinella sp.  yaitu Alteromonas , Bacillus ,  dan Halomonas .  7  bakteri  simbion  tersebut  merupakan  bakteri  yang  akan  ditapis  inhibitor β -laktamasenya pada kajian penelitian  ini. Hal tersebut penting dilakukan karena pada penelitian  yang  telah  dilakukan  sebelumnya  2  isolat  bakteri  yaitu  K41B ( Bacillus sp.) dan K43 ( Alteromonas sp.) berpotensi menghasilkan senyawa antibakteri.
Resistensi Bakteri Target Terhadap Antibiotik β -laktam .
Pengujian  resistensi  mengacu  pada  standar  NCCLS  ( National  Commitee  for Clinical  Laboratory  Standard ).  Konsentrasi  ampisilin  yang  umum  digunakan  sebagai obat  menurut  NCCLS  untuk  bakteri E.coli adalah  8  µg/ml  dan  untuk  bakteri S.aureus adalah  0,25  µg/ml.  Hasil  pengujian  menunjukkan  bakteri E.coli dan S.aureus koleksi Lab Bioteknologi HP dapat dihambat pertumbuhannya oleh ampisilin pada konsentrasi diatas standar NCCLS yaitu > 32 µg/ml (Gambar 1).
Gambar 1. Pengujian resistensi bakteri target
Penapisan Inhibitor β -laktamase .
Dari 7  isolat bakteri simbion  yang ditapis  inhibitor  β -lactamasenya secara  intraseluler dan  ekstraseluler  terhadap E . coli R dan S . aureus R didapatkan  hasil  4  isolat  positif  pada ekstraseluler-nya  yaitu,  isolat  bakteri  simbion  K2,  K3,  K43  dan  K41B  (Gambar  2). Pendugaan  nama  genus  untuk  4  bakteri  simbion  yang  positif  menghambat  bakteri patogen  resisten  β -laktam  tersebut  berdasarkan  hasil  penelitian  terdahulu  adalah Bacillus sp., Halomonas sp., Alteromonas sp1 dan Alteromonas sp2.
Gambar 2. Penapisan inhibitor β -laktamase
Salah satu upaya untuk mengatasi infeksi yang disebabkan bakteri patogen yang resisten  β -lactam adalah  dengan  menambahkan  inhibitor  β -laktamase.  Inhibitor β -laktamase  dalam  pemanfaatannya  dapat  disinergiskan  dengan  antibiotik  jenis β -laktam  untuk  membunuh  bakteri  patogen  yang  resisten.  Kombinasi  inhibitor β -laktamase  dan β -laktam  saat  ini  telah  umum  digunakan  secara  klinis.  Daya  hambat terhadap enzim β -laktamase pada penelitian ini diukur dari zona bening yang terbentuk disekeliling  ekstrak  ekstraseluler  maupun  ekstrak  intraseluler.  Zona  bening  yang terbentuk tersebut merupakan suatu indikasi adanya senyawa inhibitor β -laktamase yang dihasilkan oleh bakteri simbion.
Hasil  pengujian  resistensi  bakteri  target  menunjukkan  bahwa  kedua  isolat bakteri E.coli dan S.aureus bersifat  resisten  terhadap  ampisilin  pada  ambang  batas konsentrasi  32  µg/ml. Berdasarkan  Gambar  1,  yaitu  pengujian  pada  konsentrasi ampisilin  32  µg/ml menunjukkan  bahwa  bakteri S.  aureus lebih  resisten  daripada bakteri  E.coli.  Kedua  isolat  bakteri  target E.coli dan S.aureus yang  merupakan  isolat koleksi  pribadi  Laboratorium  Bioteknologi  HP  dapat  digunakan  sebagai  bakteri  target pada tahapan penelitian selanjutnya yaitu penapisan inhibitor β -laktamase.
Berdasarkan hasil penapisan inhibitor β -laktamase dari 7 genus bakteri simbion Axinella sp.  secara  intraseluler  dan  ekstraseluler,  hanya  penapisan  dari  bagian ekstraseluler bakteri simbion yang mampu membentuk zona bening. Penapisan inhibitor β -laktamase pada umur kultur 4 hari, 7 hari dan 10 hari menunjukkan  hasil  yang tidak berbeda  nyata  Bakteri  simbion Axinella sp.  yang  mampu  menghasilkan  senyawa inhibitor β -laktamase ekstraseluler adalah Bacillus sp., Halomonas sp., Alteromonas sp1 dan Alteromonas sp2.
Aktivitas  inhibitor  β -laktamase  yang  ditunjukkan  dengan  zona  bening  paling stabil  dan  paling  besar  dihasilkan  oleh  isolat  bakteri  K41B  yang  diduga  termasuk
golongan  genus Bacillus .  Sedangkan,  ketiga  bakteri  lainnya  menunjukkan  diameter zona  bening  yang  tidak  terlalu  berbeda  nyata.  Hal  tersebut  mungkin  disebabkan  oleh respon  masing-masing  sel  bakteri  simbion  terhadap  kondisi  lingkungan  berbeda, sehingga senyawa aktif yang dihasilkanpun berbeda.
4  isolat  bakteri  simbion Axinella sp.  terutama  isolat  genus Bacillus (K41B) merupakan isolat penghasil inhibitor β -laktamase yang perlu dikembangkan lebih lanjut untuk  dapat  mengatasi  permasalahan  resistensi  terhadap  antibiotik  β -laktam.  Terutama pada kasus bakteri yang mampu menghasilkan enzim β -laktamase.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian  ini  dibiayai  oleh  Kementerian  Negara  Riset  dan  Teknologi,  pada program Insentif Riset Dasar Tahun Anggaran 2007 a.n. Asadatun Abdullah.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdullah  A.  2005.    Isolasi  dan  Identifikasi  Mikroba  Simbion  Sponge Axinella sp. Kumpulan  Seminar  Hasil-hasil  penelitian  Dosen  Muda  IPB  tahun  anggaran 2004-2005. LPPM-IPB.
Abdullah A, Hardjito L. 2006. Isolation of Symbiotic Bacteria From Indonesian Marine Sponge Axinella sp.  And  Screening  For  Their  Antimicrobial  Activities. Pre- proceeding International Seminar and Workshop Marine Biodiversity and Their Potential  for  Developing  Bio-Pharmaceutical  Industry  in  Indonesia .  May  17 th - 18 th 2006. Jakarta.
Hardjito,  L.  2004.  Bioactive  Compounds  from  Indonesian  Marine  Invertebrates  and Their  Sustainable  Production  through  Mariculture.    Di  dalam:  Laporan  RUTI Year 2004.
Lee KY, Lee HJ, Lee HK.  2001.  Microbial Symbiosis in Marine Sponges. The Journal of Microbiology . Vol. 29: No 4. p(254-264).
Venkantesan  MA  et  al.  2004.  Novel  imidazole  sustitude  6-methylidine-penems  as broad- spectrum  β -lactamase  inhibitors. Journal  of  Bioorganic  &  Medical Chemistry . Vol 12. p(5807-5817).