Aktivitas Ekstrak Etanol Daun Kenitu ( Chrysophyllum cainito L.) terhadap Jumlah Eritrosit Tikus Wistar yang Diinduksi Cyclophosphamide
Activity of Cainito Leaves Ethanol Extract (Chrysophyllum cainito L.) on Wistar’s Total Erythrocites Induced Cyclophosphamide
Heri Puguh Widodo 1 , Ika Rahmawati Sutejo 2 , Rini Riyanti 3
1 Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran Universitas Jember
2 Laboratorium Biokimia, Fakultas Kedokteran Universitas Jember
3 Laboratorium Patologi Klinik, Fakultas Kedokteran Universitas Jember Alamat email: ikarahmawati.fk@unej.ac.id

## ABSTRAK
Salah  satu  obat  kemoterapi  yang  sering  digunakan  yaitu cyclophosphamide .  Namun,  penggunaan cyclophosphamide dapat memberikan berbagai efek toksik. Efek toksik yang paling umum dari cyclophosphamide adalah supresi sumsum tulang dengan anemia sebagai salah satu tandanya. Kandungan antioksidan yang dimiliki daun  kenitu  berpotensi  meningkatkan  produksi  sel  darah  terutama  eritrosit.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  aktivitas  pemberian  ekstrak  etanol  daun  kenitu  terhadap  hitung  eritrosit  tikus  yang  diinduksi cyclophosphamide secara in  vivo .  Sampel  berjumlah  20  ekor  tikus  wistar  jantan  dibagi  dalam  lima  kelompok; kelompok  normal,  kelompok  kontrol  negatif,  dan  tiga  kelompok  perlakuan  ekstrak  etanol  daun  kenitu  dengan dosis  100  mg/kgBB,  200  mg/kgBB,  dan  400  mg/kgBB  yang  diberikan  selama  satu  minggu  diikuti  pemberian cyclophosphamide secara intraperitoneal dengan dosis 50 mg/kgBB sebanyak satu kali. Hasil Uji One Way Anova menunjukkan signifikansi 0,015 (p<0,05). Namun, hasil uji LSD menunjukkan tidak terdapat hasil berbeda signifikan antara  kelompok  kontrol  negatif  dengan  kelompok  perlakuan.  Kesimpulannya  adalah  tidak  terdapat  perbedaan jumlah eritrosit pada tikus yang hanya diberi cyclophosphamide dengan tikus sebelumnya diberikan ekstrak daun kenitu.
Kata kunci : Ekstrak etanol daun kenitu, proses pembentukan sel darah, eritrosit, cyclophosphamide

## ABSTRACT
One of the commonly used chemotherapy drugs is cyclophosphamide. However, the use of cyclophosphamide can provide various toxic effects. The most common toxic effect of cyclophosphamide is bone marrow suppression with anemia as one of its markers. The antioxidant content of cainito leaf potentially increase the production of blood cells,  especially  erythrocytes.  The  aims  of  this  study  is  determining  the  effectiveness  of  the  cainito  leaf  ethanol extract against cyclophosphamide induced mouse erythrocyte count in vivo. A sample of 20 male wistar rats was divided into five groups; normal group, negative control group, and three groups of ethanol extract of cainito leaf with  dose  100  mg/kgBW,  200  mg/kgBW,  and  400  mg/kgBW  were  administered  for  one  week  followed  by intraperitoneal  cyclophosphamide  with  dose  50  mg/kgBW  as  much  as  one  time.  One  Way  Anova  Test  result showed  a  significance  of  0.015  (p<0.05).  However,  the  LSD  test  results  showed  no  significant  different  results between the negative control group and the treatment group. The conclusion was that there was no difference in the amount of erythrocytes in mice given only cyclophosphamide with previous rats given cainito extract.
Keywords: Cainito leaf ethanolic extract, process of blood cell formation, erythocyte, cyclophosphamide

## Pendahuluan
Kanker  adalah  salah  satu  penyakit  paling  penting  di dunia dan rumit karena menjadi multifaktorial dalam pandangan epidemiologi. Ada sekitar 14,9 juta kasus baru  di  dunia  pada  tahun  2012.  Salah  satu  kanker paling umum yakni kanker payudara dengan tingkat insiden  yang  tinggi  di  semua  negara.  Terdapat  1,7 juta  kasus  baru  kanker  payudara  per  tahun  dan merupakan  kanker  umum  kedua  dari  semua  jenis kanker  karena  dari  semua  jenis  kanker,  kanker payudara menyumbang sebesar 25%.
Kebanyakan kasus kanker payudara, kemo (terutama sebagai  pengobatan  adjuvan  atau  neoadjuvan) sangat  efektif  ketika  berbagai  kombinasi  obat digunakan.  Salah  satu  obat  kemo  yang  sering digunakan
yaitu cyclophosphamide . Cyclophosphamide adalah salah satu agen antikanker  paling  sukses  yang  pernah  disintesis. Cyclophosphamide merupakan  molekul  yang  paling efektif  diantara  1.000  senyawa  yang  dipilih  dan antibiotik  yang  diuji  terhadap  33  tumor.  Namun, penggunaan cyclophosphamide dapat  memberikan berbagai  efek  toksik.  Efek  toksik  yang  paling  umum dari cyclophosphamide adalah  supresi  sumsum tulang dengan anemia sebagai salah satu tandanya.
Antioksidan  mampu  meningkatkan  jumlah  sel  induk hemopoietik  dan  sel  progenitor  dengan  mekanisme yang  berbeda-beda.  Salah  satu  tanaman  yang  kaya dengan kandungan antioksidan yakni daun Chrysophyllum  cainito L . atau  yang  biasa  disebut kenitu  oleh  masyarakat  Indonesia.  Daunnya diketahui  sebagai  sumber  terpenoid  (seperti  asam ursolik,  lupeol,  beta-sisterol)  dan  fenolat  (asam galat)  dengan  komposisi  sebesar  4,004  ±  0,122%. Kandungan terpenoid daun Chrysophyllum cainito L . lebih besar dibanding daun Psidium guava L . dengan nilai 4,004±0,122% dan 1,000%.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan  jumlah  eritrosit  antara  kelompok  tikus yang  hanya  diberi cyclophosphamide dengan  tikus yang sebelumnya diberikan ekstrak daun kenitu.

## Metode Penelitian
Jenis  penelitian  ini  adalah quasi  experimental laboratories dengan  rancangan post  test  only control  group  design. Penentuan  sampel  penelitian menggunakan  metode Stratified  Random  Sampling dengan jumlah 20 ekor tikus Rattus novergicus galur wistar  jantan  dengan  berat  150-200  gram  dan
umur 2-3 bulan.  Sampel  dibagi  menjadi  lima kelompok,  masing-masing  terdiri  dari  4  ekor; kelompok  normal  (KN),  kelompok  kontrol  negatif (K(-)),  dan  tiga  kelompok  perlakuan  ekstrak  daun kenitu  Kp1  dosis  100  mg/kgBB,  Kp2  200  mg/kgBB, dan  Kp3  400  mg/kgBB.  Kelompok  normal  diberi normal  salin  dan  DMSO  10%  per  sonde  begitu  pun kelompok  negatif  namun  diikuti  pemberian cyclophosphamide 50 mg/kgBB intraperitoneal.
Pemeriksaan  jumlah  eritrosit  dilakukan  secara manual menggunakan metode pengenceran.  Proses ini  dilakukan  secara double  blinding .  Pemeriksaan dilakukan  dalam  24  jam  setelah  sampel  darah diambil.
Data  hasil  penelitian  dianalisis  menggunakan  uji normalitas Shapiro-Wilk dan  uji  homogenitas Levene’s  test .  Apabila  data  yang  didapatkan terdistribusi normal dan homogen, maka dilanjutkan dengan  uji  komparatif One-way  Anova dan dilanjutkan  dengan post  hoc  test LSD.  Apabila  data yang  diperoleh  tidak  terdistribusi  normal  dan homogen, dilanjutkan dengan uji Kruskal-Wallis .

## Hasil Penelitian
Rata-rata  jumlah  eritrosit  semua  kelompok  dapat dilihat  pada  tabel  1.  Hasil  rata-rata  dan  standar deviasi  jumlah  eritrosit  masing-masing  kelompok yakni  untuk  kelompok  normal  (KN)  sebesar 7,068±1,792  x  10 6 /mm 3 dan  kontrol  negatif  (K(-)) sebesar 4,955±1,047 x 10 6 /mm 3 . Hasil rata-rata yang diperoleh  dari  kelompok  perlakuan  dengan  dosis 100 mg/kgBB (Kp1) sebesar 4,423±1,271 x 10 6 /mm 3 , dosis  200  mg/kgBB  (Kp2)  sebesar  2,899±1,618  x 10 6 /mm 3 ,  dan  dosis  400  mg/kgBB  (Kp3)  sebesar 6,069±1,743 x 10 6 /mm 3 .
Tabel 1. Hasil rata-rata jumlah eritrosit No. Perlakuan Rata-rata ± Standar Deviasi (…x 10 6 /mm 3 ) 1. Kontrol Normal 7,068±1,792 2. Kontrol Negatif 4,955±1,047 3. Kelompok Kp1 4,423±1,271 4. Kelompok Kp2 2,899±1,618 5. Kelompok Kp3 6,069±1,743
Hasil  rata-rata  jumlah  eritrosit  dianalis  persebaran data  dengan  menggunakan  uji Saphiro-Wilk dan homogenitasnya  menggunakan  uji Levene’s  test . Hasil  kedua  analisis  tersebut  menunjukkan  p>0,05. Hal ini menunjukkan bahwa data terdistribusi normal dan  memiliki  varian  yang  sama.  Hasil  rata-rata
jumlah  eritrosit  kemudian  dianalisis  menggunakan One  Way  Anova untuk  mengetahui  perbedaan  yang signifikan antar kelompok.
Hasil uji One Way Anova didapatkan nilai signifikansi sebesar  p  =  0,015  (p<0,05)  menunjukkan  bahwa terdapat  minimal  dua  kelompok  yang memiliki rata- rata  jumlah  eritrosit  yang  berbeda  signifikan.  Uji lanjutan Post  Hoc LSD  digunakan  untuk  mengetahui perbedaan  antar  kelompok.  Hasil  uji  analisis Post Hoc LSD  berdasarkan  Tabel  2  didapatkan  data  antar kelompok sebagai berikut.
Tabel 2. Hasil Uji Post Hoc LSD Normal K(-) Kp1 Kp2 Kp3 Normal NS (*) (*) NS K(-) NS NS NS NS Kp1 (*) NS NS NS Kp2 (*) NS NS (*) Kp3 NS NS NS (*)

## Pembahasan
Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  aktivitas pemberian ekstrak etanol daun kenitu ( Chrysophyllum  cainito L.)  terhadap  hitung  eritrosit tikus  wistar  yang  diinduksi cyclophosphamide . Penelitian  ini  menggunakan  kelompok  kontrol negatif sebagai pembanding. Menurut Godall (1910) jumlah  eritrosit  tikus  normal  berada  pada  kisaran 6.000.000/mm 3 hingga 10.000.000/mm 3 dan Simonds  (1925)  menyebutkan  bahwa  rentang jumlah  eritrosit  pada  tikus  normal  berada  pada kisaran  6.000.000/mm 3 hingga  8.000.000/mm 3 . Namun,  pada  penelitian  ini  terdapat  beberapa hewan coba yang jumlah eritrositnya dibawah batas tersebut.  Hal  ini  menjadi  kekurangan  dalam penelitian  ini  yang  tidak  menggunakan  pretest sehingga  peneliti  tidak  mengetahui  kondisi  hewan coba  dari  awal  penelitian  atau  memang  pemberian ekstrak yang tidak memberikan pengaruh. Selain itu, penggunaan  metode  perhitungan  secara  manual juga rentan terhadap berbagai kesalahan yang dapat diakibatkan  mulai  dari  pengambilan  sampel, kesalahan pengenceran, kesalahan dalam memasukkan  ke  kamar  hitung,  dan  kelelahan  fokus mata  akibat  pemeriksaan  sampel  yang  banyak.
Kesalahan  perhitungan  dengan  teknik  manual sebesar 15-30% (Math et al. , 2016).
Pengambilan  sampel,  pengenceran,  dan  pemipetan yang  kurang  tepat  dapat  menyebabkan  darah  tidak tercampur  homogen  dengan  pelarut  sehingga  hasil perhitungan  menjadi  tidak  akurat.  Kesalahan  lain yang  sering  terjadi  berkaitan  dengan  kamar  hitung dan  teknik  perhitungan.  Perhitungan  harus  sesuai dengan  aturan  sehingga  eritrosit  tidak  terhitung berulang  kali  (Kiswari,  2014).  Selain  itu,  ketelitian dan  pengalaman  teknisi  juga  menentukan  hasil perhitungan (Pandit et al. , 2015; Ranjan et al., 2016).
Berdasarkan  Tabel  4.2  tidak  terdapat  perbedaan jumlah  eritrosit  yang  signifikan  antara  kelompok kontrol  negatif  dengan  ketiga  kelompok  perlakuan yang  diberikan  ekstrak  daun  kenitu.  Hal  ini dikarenakan  jumlah  sampel  yang  digunakan  tidak ideal,  dimana  penggunaan  sampel  yang  seharusnya berjumlah  lima  ekor  menjadi  empat  ekor.  Jumlah sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian  memiliki peran  besar  dalam  menentukan  hasil.  Penggunaan sampel  yang  lebih  kecil  dari  jumlah  ideal  dapat meningkatkan  kesalahan  asumsi  yang  seharusnya benar  menjadi  salah  sehingga  merusak  validitas penelitian.  Begitu  pula  penggunaan  sampel  yang lebih  besar  dapat  mengubah  perbedaan  kecil menjadi  perbedaan  yang  signifikan  secara  statistik, meskipun  hasil  sebenarnya  tidak  ada  signifikansi (Faber dan Fonseca, 2014).
Apabila kelompok perlakuan satu (dosis ekstrak 100 mg/kgBB)  dan  kelompok  perlakuan  dua  (dosis ekstrak  200  mg/kgBB)  dibandingkan  dengan kelompok  normal,  ketiganya  memiliki  penurunan jumlah  eritrosit  yang  bermakna  (p<0,05).  Hal  ini dipicu  oleh  aktivitas  metabolit cyclophosphamide . Cyclophosphamide merupakan  obat  kanker  yang tidak  aktif  dalam  bentuk  induknya.  Obat  ini  baru aktif  ketika  dimetabolisme  oleh  CYP-450  di  hepar menjadi 4-Hydroxycyclophosphamide dan  diedarkan ke seluruh tubuh melalui sirkulasi. Setelah memasuki sel (terutama sel pluripoten pembentuk eritrosit/CFU-E), 4-Hydroxycyclophosphamide diuraikan  menjadi  akrolein  dan  mustard  fosforamid yang  keduanya  merupakan  zat  sitotoksik  (de  Jonge et  al .,  2005;  Katzung et  al .,  2012).  Akrolein merupakan  aldehid  yang  sangat  reaktif  dan sitotoksik  yang  bekerja  dengan  cara  menurunkan kadar  glutation  seluler  melalui  konjugasi  (de  Jonge et  al .,  2005).  Berkurangnya  kadar  glutation  seluler dapat  memicu  timbulnya  stres  oksidatif  yang memainkan  peran  utama  dalam  proses  penuaan,
dan  patogenesis  berbagai  penyakit  salah  satunya anemia  (Wu et  al .,  2004).  Sedangkan  mustard fosforamid  bertanggung  jawab  memberikan  efek alkilasi  DNA  dengan  membentuk  kation  aziridium siklik ( ethyleneiminium ) melalui siklisasi intramolekuler  yakni  eliminasi  klorida.  Kation  ini sangat  tidak  stabil  dan  mudah  diserang  oleh beberapa nukleofil, seperti residu guanin DNA untuk membentuk  ikatan  kovalen  kedua  dengan  nukleofil lain  sehingga  mengganggu  replikasi  DNA  dengan membentuk intrastrand dan interstrand  DNA crosslinks (Emadi et  al. ,  2009).  Terbentuknya DNA crosslinks dapat  mencegah  proses  replikasi, transkripsi,  dan  penggunaan  informasi  oleh  untai komplementer guna perbaikan sehingga menghambat  metabolisme  sel  tubuh  khususnya  sel darah  dan  menimbulkan  salah  satunya  anemia (Grillari et al ., 2007).
Namun,  pada  kelompok  perlakuan  ketiga  dengan dosis ekstrak 400 mg/kgBB tidak memiliki perbedaan signifikan  dengan  kelompok  normal  karena  jumlah eritrosit  yang  hampir  sama.  Kondisi  ini  diakibatkan oleh  kandungan  terpenoid  dalam  ekstrak  daun kenitu.  Terpenoid  adalah  zat  antioksidan  yang terkandung  dalam  tanaman  dan  terbentuk  dari isoprena,  oleh  karena  itu  zat  ini  juga  disebut isoprenoid.  Terpenoid  telah  banyak  digunakan dalam berbagai pengobatan diantaranya untuk obat nyeri,  flu,  bronkitis,  dan  penyakit  gastrointestinal yang melibatkan ROS (Kohlert et al. , 2000).
Terpenoid  sebagai  antioksidan  mampu  mengikat ROS  secara  langsung  dengan  menyumbang  atom hidrogen. Karena reaktivitas gugus hidroksilnya yang tinggi,  ROS  dibuat  tidak  aktif  dengan  menetralkan muatannya  sehingga  kerusakan  oksidatif  pada konstituen  eritrosit  dapat  dicegah  (Korkina  dan Afanas’ev,  1997).  Mekanisme  lain  yang  mungkin dilakukan  oleh  terpenoid  yakni  melalui  interaksi antar  berbagai  enzim  antioksidan  (Nijveldt et  al. , 2001). Terpenoid menginduksi electrophile responsive  element (EpRE) seperti  NAD(P)H -quinone oxidoreductase dan glutathione  S-transferase (GST) yang merupakan enzim pertahanan utama terhadap stres oksidatif (Lee-Hilz et al. , 2006).
Selain  bekerja  sebagai  antioksidan,  terpenoid  dapat merangsang  produksi  eritropoietin  (EPO).  EPO merupakan  hormon  yang  bertanggung  jawab terhadap  produksi  eritrosit  di  sumsum  tulang. Hormon  ini  secara  umum  disekresikan  oleh  ginjal ketika kadar oksigen dalam darah turun, dan sekitar 10%-15% EPO juga diproduksi oleh hepar. Terpenoid
dapat mempengaruhi produksi EPO melalui dua jalur yang  berbeda  yakni  menstimulasi  HIF-1R,  dan mengurangi  degradasi  HIF-1R-OH.  Secara  umum, regulasi HIF sebagian besar bergantung pada tingkat mRNA  HIF-1R.  Kadar  mRNA  HIF-1R  dapat  diatur melalui  tekanan  retikulum  endoplasma  selama hipoksia atau iskemia (Zheng et al. , 2011). Kondisi ini menghambat  kerja Angiotensin  Converting  Enzyme (ACE)  dan  merangsang  sekresi  EPO  oleh  kapiler peritubuler nefron (Vander et al. , 1994).

## Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dan analisis data dapat disimpulkan  bahwa  pemberian  ekstrak  daun  kenitu tidak  berpengaruh  terhadap  jumlah  eritrosit  tikus wistar  yang  diinduksi cyclophosphamide .  Perlu dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  mengenai  efek ekstrak  etanol  daun  kenitu  terhadap  sel  darah dengan  jumlah  sampel  yang  lebih  ideal  dan menggunakan hematology analizer .

## Daftar Pustaka
De Jonge, M. E., A. D. R. Huitema, S. Rodenhuis, dan J. H. Beijnen. 2005. Clinical pharmacokinetics of cyclophosphamide. Clinical Pharmacokinetics . 44(11): 1135-1164.
Emadi,  A.,  R.  J.  Jones,  dan  R.  A.  Brodsky.  2009.
Cyclophosphamide and cancer: golden anniversary. Nature Review Clinical Oncology . 6: 638-647.
Faber, J., dan L. M. Fonseca. 2014. How sample size influences research outcomes. Dental Press J.
Orthod . 19(4): 27-29.
Goodall,  A.  1910.  The  numbers,  proportions,  and characters  of  the  red  and  white  blood corpuscles  in  certain  animals. The  Journal  Of Pathology . 14(2): 195-199.
Grillari,  J.,  H.  Katinger,  dan  R.  Voglauer.  2007. Contributions  of  DNA  interstrand  cross-links to  aging  of  cells  and  organisms. Nucleic  Acid Res . 35(22): 7566-7576.
Katzung, B. G., S. B. Masters, dan A. J. Trevor. 2012. Basic  &  Clinical  Pharmacology .  12 th Edition. California:  The  McGraw-Hill  Companies. Terjemahan  oleh  B.  U.  Pendit.  2013. Farmakologi Dasar & Klinik . Edisi 12. Jakarta: EGC.
Kiswari,  R.  2014. Hematologi  dan  Tranfusi .  Jakarta: Erlangga.
Kohlert, C., I. van Rensen, R. Marz, G. Schindler, E. U.
Graefe, dan M. Veit. 2000. Bioavailability and pharmacokinetics of natural volatile terpenes in animals and humans. Planta Med . 66: 495- 505.
Korkina, L. G., dan I. B. Afanas’ev. 1997. Antioxidant and  chelating  properties  of  flavonoids. Adv Pharmacol . 38: 151-163.
Lee-Hilz, Y. Y., A. M. J. F. Boerboom, A. H. Westphal, W. J. H. van Berkel, J. M. M. J. G. Aarts, dan I. M.  C.  M.  Rietjens.  2006.  Pro-oxidant  activity of  flavonoids  induces  EpRE-mediated  gene expression. Chem.  Res.  Toxicol .  19:  1499- 1505.
Math, M. V., Y. R. Kattimani,  R. M.  Khadkikar, S. M. Patel,  V.  Santi,  dan  R.  S.  Inandar.  2016.  Red blood  cell  count:  brief  history  and  new method. MGM J Med Sci . 3(3): 116-119.
Nijveldt, R. J., E. van Nood, D. E. C. van Hoorn, P. G. Boelens,  K.  van  Norren,  dan  P.  A.  M.  van Leeuwen.  2001.  Flavonoids:  a  review  of probable mechanisms of action and potential applications. Am. J. Clin. Nutr . 74: 418-425.
Pandit,  A.,  S.  Kolhar,  dan  P.  Patil.  2015.  Survey  on automatic  rbc  detection  and  counting. International Journal of Advanced Research in
Electrical,  Electronics  and  Instrumentation Engineering . 4(1): 128-131.
Ranjan,  R.,  R.  K.  Singh,  dan  Rigvardhan.  2016.  Cost effectiveness and accuracy analysis of manual versus  automated  methods  of  estimation  of basic  haematological  parameters  in  a resource poor setting. Indian Journal of Basic and Applied Medical Research . 5(4): 121-127.
Simonds,  J. P. 1925.  The blood of normal  mice. The Anatomical Record . 30(2): 99-106.
Vander, A. J., J. H. Sherman, dan S. D. Luciano. 1994. Human  Physiology-Mechanism  of  Body Function .  Sixth  Edition.  Shenton:  McGraw- Hillm.
Wu,  G.,  Y.  Z.  Fang,  S.  Yang,  J.  R.  Lupton,  dan  N.  D. Turner. 2004. Glutathione metabolism and its implications for health. J. Nutr . 134: 489-492.
Zheng, K. Y. Z., R. C. Y. Coy, A. W. H. Cheung, A. J. Y. Guo, C. W. C. Bi, K. Y. Zhu, Q. Fu, Y. Du, W. L. Zhang, J. Y. X. Zhan, R. Duan, D. T. W. Lau, T. T.  X.  Dong,  dan  K.  W.  K.  Tsim.  2011. Flavonoids  from Radix  astragali induce  the expression of erythropoietin in cultured cells: a  signaling mediated via the  accumulation of hypoxia-inducible  factor-1α. Journal  Of Agricultural  And  Food  Chemistry .  59:  1697- 1704.