ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 15 (2) (2012) : 53 - 57
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Aktivitas Trichoderma viride Fncc6013 dalam Menghidrolisis Kulit Pisang Raja (Musa Paradisiaca L. Var. Sapientum) dengan Variasi Waktu Fermentasi
Sandi Sutopo Aribowo a , Purbowatiningrum Ria Sarjono a* , Nies Suci Mulyani a
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: purbowatining@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o

## A b s t r a c t
Keywords: Trichoderma viride ,
plantain peel, cellulose, cellulase enzyme
Trichoderma viride is a cellulolytic fungus that produces a cellulase complex enzyme that can  hydrolyze  chemical  bonds  from  cellulose  to  glucose. Trichoderma  viride activity  is affected by fermentation time. This study aims were to obtain Trichoderma viride which has been adapted to the banana peel fermentation media and to obtain data of reducing sugar content from Trichoderma viride activity in hydrolyzing banana peel at variation of fermentation time. The research stages consisted of delignification of banana peel, tool and  material  sterilization,  preparation  of  fermentation  media, Trichoderma  viride mushroom rejuvenation, and Trichoderma viride activity test in hydrolyzing banana peel with  variation of fermentation  time. Trichoderma  viride could  grow  on  the banana  skin fermentation  medium. Trichoderma  viride activity  in  hydrolyzing  banana  peel  reached optimum at 7 day fermentation time with reducing sugar content 41.40 mg/L

## A b s t r a k
Kata kunci: Trichoderma viride , kulit pisang raja,
selulosa, enzim selulase
Trichoderma  viride merupakan  jamur  selulolitik  yang  menghasilkan  enzim  kompleks selulase yang dapat menghidrolisis ikatan kimia dari selulosa menjadi glukosa. Aktivitas Trichoderma  viride dipengaruhi  oleh  waktu  fermentasi.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mendapatkan Trichoderma  viride yang  telah  diadaptasikan  pada media fermentasi  kulit pisang raja dan memperoleh data kadar gula pereduksi dari aktivitas Trichoderma viride dalam menghidrolisis kulit pisang raja pada variasi waktu fermentasi. Tahapan penelitian terdiri  dari  delignifikasi  kulit  pisang raja,  sterilisasi alat dan  bahan,  pembuatan  media fermentasi,  peremajaan  jamur Trichoderma  viride ,  dan  uji  aktivitas Trichoderma  viride dalam  menghidrolisis  kulit  pisang  raja  dengan  variasi  waktu  fermentasi. Trichoderma viride dapat tumbuh pada media fermentasi kulit pisang raja. Aktivitas Trichoderma viride dalam menghidrolisis kulit pisang raja optimum pada waktu fermentasi hari ke-7 dengan kadar gula pereduksi sebesar 41,40 mg/L

## 1. Pendahuluan
Selulosa  adalah  karbohidrat  paling  melimpah  dan sering ditemukan di alam [1]. Selulosa sebagai komponen utama  dinding  sel  tumbuhan,  yang  merupakan polisakarida  yang  dapat  dipakai  sebagai  sumber bioenergi  yang  hampir  tidak  pernah  habis  dan  mudah diperbarui  [2].  Komposisi  selulosa  dalam  tumbuhan dapat  mencapai  40-50%  dari  masa  tumbuhan  [3].
Selulosa terdiri atas monomer glukosa yang dihubungkan  dengan  ikatan β -1,4-glikosida;  [1,  2,  4]. Dengan menghidrolisis ikatan glikosida dapat diperoleh glukosa  yang  kemudian  diharapkan  dapat  digunakan untuk berbagai tujuan, seperti produksi sirup gula, asam organik [5].
Salah  satu  tanaman  yang  mengandung  selulosa adalah  kulit  pisang.  Berdasarkan  data  produksi  pisang
dari  BPS  menunjukkan  peningkatan  produksi  pisang yang  meningkat  secara  signifikan  dari  tahun  2003 sampai  2011  dengan  jumlah  4.177.155  ton  menjadi 6.132.695 ton per tahun (BPS, 2012) dan kira-kira 1/3 dari bobot  tersebut  merupakan  limbah  kulit  pisang.  Pisang raja  mempunyai  kulit  yang  tebal  dibandingkan  kulit pisang  yang  lain,  sehingga  memiliki  potensi  pati  yang cukup  besar.  Pemanfaatan  buah  pisang  raja  di masyarakat  hanya  sebatas  pada  daging  buahnya  saja, padahal kulit pisang juga mempunyai potensi yang cukup besar. Pada umumnya kulit pisang belum dimanfaatkan secara nyata, hanya dibuang sebagai sampah. Kandungan kulit  pisang  raja  adalah  sebagai  berikut:  air  11,46%, selulosa 13,53%, lignin 32,24% [6].
Proses  hidrolisis  selulosa  dapat  dilakukan  dengan hidrolisis asam encer (dilute-acid hydrolysis), hidrolisis asam pekat (concentrated acid hydrolysis), dan hidrolisis enzimatik (enzymatic hydrolysis) [7]. Hidrolisis dengan asam memiliki kelemahan karena bersifat sangat korosif. Hidrolisis  enzimatik  lebih  menguntungkan  karena kondisi  proses  lebih  lunak  (temperatur  rendah,  pH netral)  selain  itu  berpotensi  memberikan  hasil  yang tinggi, dan biaya pemeliharaan peralatan relatif rendah karena  tidak  ada  bahan  yang  korosif  [8].  Hidrolisis selulosa  secara  enzimatis  dapat  dilakukan  dengan bantuan  mikroorganisme  selulolitik  salah  satunya adalah Trichoderma viride .
Trichoderma viride merupakan jamur selulotik yang menghasilkan  enzim  kompleks  selulase  yang  dapat menghidrolisis  ikatan  kimia  dari  selulosa  menjadi glukosa. Enzim ini berfungsi sebagai agen pengurai yang spesifik untuk menghidrolisis ikatan kimia dari selulosa dan turunannya. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh  Kamara dkk. [9], Trichoderma  viride mampu menghidrolisis  selulosa  pada  batang  pisang  dan menghasilkan glukosa dalam jumlah yang tinggi sebesar 0,5676 mg/mL. Trichoderma viride mampu menghidrolisis  selulosa  pada  media  modifikasi  eceng gondok menghasilkan glukosa dalam jumlah yang tinggi pada jam ke-96 sebesar 1,3864 mg/mL pada temperatur fermentasi 35°C [10].
Dalam  melakukan  aktivitasnya, Trichoderma  viride sebagai penghasil enzim selulase dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti temperatur, pH, kandungan nutrien, agitasi  dan  waktu  fermentasi.  Waktu  fermentasi merupakan  waktu  yang  diperlukan  oleh Trichoderma viride untuk  menghasilkan  enzim  selulase  dan membentuk  produk  hidrolisis.  Berdasarkan  penjelasan tersebut  maka  diperlukan  waktu  fermentasi  optimum bagi Trichoderma  viride yang  aktivitasnya  ditandai  dari produk gula pereduksi yang dihasilkan. Penelitian yang dilakukan Kamara dkk. [9], kondisi optimum Trichoderma viride menghidrolisis  selulosa  pada  batang  pisang ditunjukkan  pada  konsentrasi  substrat  6%  dengan temperatur ruang, ukuran partikel 100 mesh dan waktu fermentasi  selama  9  hari  akan  menghasilkan  glukosa paling tinggi. Iyayi dan Aderolu [11] telah mendapatkan peningkatan  kadar  glukosa  pada  substrat  dedak  beras setelah  dikulturkan  pada Trichoderma  viride selama  14 hari.
Substrat yang berbeda dapat mempengaruhi kondisi optimum  dari  aktivitas Trichoderma  viride .  Untuk mengetahui konsentrasi  substrat dan waktu fermentasi optimum  aktivitas Trichoderma  viride pada  kulit  pisang maka  dilakukan  uji  aktivitas  dengan  range  waktu fermentasi 1 sampai 11 hari dengan ukuran partikel 100 mesh, temperatur dan pH yaitu 35°C, pH 5.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan Trichoderma viride yang telah diadaptasikan pada media fermentasi kulit pisang raja. Memperoleh data kadar gula pereduksi  dari  aktivitas Trichoderma  viride dalam menghidrolisis  kulit  pisang  raja  pada  variasi  waktu fermentasi.

## 2. Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Erlenmeyer  (Pyrex),  tabung  reaksi  (Pyrex),  gelas ukur  (Pyrex),  gelas  beker  (Pyrex),  micropipette (Ependorf), lampu spiritus; autoklaf (Clinical Autoclave Prestige  Medical  Series  2100),  autoklaf  (Napco  model 8000-DSE  autoclave),  penangas  air,  pengaduk, aluminium  foil,  neraca  analitis  (Mettler  Toledo  JL602- G/L),  shaker;  pH  stick,  kertas  saring,  lemari  pendingin (Sanyo SR-LV 239  N), spektrometer  UV-VIS (Spectrophotometeruv-1601  shimadzu),  waterbath, inkas, ballmilled, pipet tetes, dan kawat ose.
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini meliputi  jamur Trichoderma  viride FNCC6013,  Kulit pisang  raja,  kentang,  dekstrosa,  akuades,  CMC (Carboxymethylcellulose)  teknis,  alkohol  70%,  Reagen Asam 3,5-Dinitrosalisilat  (Merck,  p.a), Kalium Natrium Tartarat, NaOH teknis, buffer asetat 0,05 M pH 5, FeCl 3 (Merck,  p.a),  MgSO4,  yeast,  pepton  (Conda,  p.a), (NH 4 ) 2 SO 4 , CaCl 2 , FeSO 4 .S

## Delignifikasi
Delignifikasi  dilakukan  sebagai pretreatment awal terhadap kulit pisang raja untuk mengurangi kandungan lignin  di  dalamnya.  Kulit  pisang  raja  yang  telah dikeringkan  dilarutkan  dalam  NaOH  2  %  (w/v), kemudian dilakukan pemanasan pada suhu 90°C selama 3  jam  [12].  Tahap  selanjutnya,  larutan  yang  didapat disaring  dengan  kertas  saring  kemudian  dilakukan pencucian  dengan  akuades  sampai  pH  residu  menjadi netral.  Kulit  pisang  raja  yang  telah  netral  kemudian dikeringkan  dan  dihaluskan  menggunakan ballmiled hingga berbentuk serbuk. Serbuk kulit pisang raja yang bebas  lignin  ini  digunakan  untuk  tahap  selanjutnya. Larutan  dari  hasil  delignifikasi,  kemudian  di  uji menggunakan  larutan  FeCl 3 .  Senyawa  fenolat  yang terdapat  pada  larutan  hasil  delignifikasi  bila  diuji menggunakan  larutan  FeCl 3 memberikan  perubahan warna Merah hingga keunguan [13].
Adaptasi Jamur Trichoderma viride pada Media CMC
Sebanyak  satu  jarum  ose  jamur Trichoderma  viride yang berasal dari  inokulum  media PDA ( Potato Dextrose Agar ) ditempatkan secara aseptik pada 100 mL media cair CMC dengan penambahan mineral yang telah disterilkan dan  dikocok  menggunakan shaker pada  suhu  ruang
selama  9  hari  sampai  jamur  tumbuh.  Komposisi  media CMC  dengan  penambahan  mineral  yang  digunakan terdapat pada tabel 1. Setelah Trichoderma viride mampu tumbuh pada media CMC kemudian diadaptasikan pada media kulit pisang raja.
Tabel 1: Komposisi media modifikasi CMC Bahan Media Jumlah (dalam 100 mL Media) Yeast Extract 3 gram Pepton 2 gram CMC 1 gram (NH 4 ) 2 SO 4 0,2 gram CaCl 2 0,2 gram MgSO 4 0,05 gram FeSO 4 0,01 gram Buffer Asetat Sampai 100 mL Akuades 60 mL Adaptasi Jamur Trichoderma viride pada Media Kulit

## Pisang Raja
Sebanyak 1 mL jamur Trichoderma viride yang berasal dari  inokulum  media  CMC  ditempatkan  secara  aseptik pada  100  mL  media  cair  kulit  pisang  raja  dengan penambahan mineral yang telah disterilkan dan dikocok menggunakan shaker pada  suhu  ruang  selama  9  hari sampai jamur tumbuh. Komposisi media kulit pisang raja dengan  penambahan  mineral  yang  digunakan  terdapat pada tabel 2.

## Tabel 2 Komposisi media modifikasi kulit pisang raja
Bahan Media Jumlah (dalam 100mL Media) Yeast Extract 3 gram Pepton 2 gram Kulit Pisang Raja 1 gram (NH 4 ) 2 SO 4 0,2 gram CaCl 2 0,2 gram MgSO 4 0,05 gram FeSO 4 0,01 gram Buffer Asetat Sampai 100 mL Akuades 60 mL

## Penentuan Jumlah Gula Pereduksi dengan Metode DNS
Penentuan jumlah gula pereduksi dilakukan dengan menggunakan metode DNS. Langkah awal, 3 mL larutan glukosa  standart  dengan  berbagai  variasi  konsentrasi (0,1 mg/L-50 mg/L) dilakukan penambahan 3 mL larutan DNS.  Setelah  dilakukan  penambahan  DNS,  kemudian dipanaskan  selama  15  menit.  Tahap  berikutnya  diukur absorbansinya  pada  panjang  gelombang  maksimum (498,5  nm),  kemudian  dilanjutkan  pembuatan  kurva standart absorbansi versus konsentrasi glukosa.
Penentuan Waktu Fermentasi Optimum Trichoderma viride dalam Menghidrolisis Kulit Pisang Raja
Penentuan  pengaruh  waktu  fermentasi  pada aktivitas  hidrolisis  selulosa  pada  kulit  pisang  raja  oleh jamur Trichoderma  viride ,  dengan  waktu  fermentasi  0 sampai 11 hari pada konsentrasi substrat kulit pisang raja
1  %.  Langkah  pertama,  2  erlenmeyer  yang  masing- masing berisi 100 mL media kulit pisang raja yang sudah disterilkan. Inokulum sebanyak 1 mL ditempatkan secara aseptik  ke  dalam  erlenmeyer  kemudian  dikocok menggunakan shaker pada  suhu  ruang.  Setiap  24  jam sekali hasil fermentasi diambil dan diuji gula pereduksi dengan metode DNS.

## 3. Hasil Dan Pembahasan
Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mendapatkan  data aktivitas mikroorganisme dalam menghidrolisis selulosa menjadi gula pereduksi dengan pengaruh variasi waktu fermentasi  dan  konsentrasi  substrat.  Mikroorganisme yang  digunakan  adalah Trichoderma  viride ,  yang  telah diketahui  memiliki  aktivitas  selulotik.  Pembahasan dalam bab ini meliputi penjelasan mengenai delignifikasi kulit pisang raja, pengadaptasian Trichoderma viride , dan uji  aktivitas Trichoderma  viride dalam  menghidrolisis kulit  pisang  raja  dengan  variasi  waktu  fermentasi  dan konsentrasi substrat.

## Delignifikasi
Selulosa di alam ini tidak pernah ditemukan dalam keadaan  murni  melainkan  berikatan  dengan  lignin  dan hemiselulosa  membentuk  suatu  lignoselulosa.  Lignin akan menghambat proses hidrolisis selulosa oleh enzim selulase  karena  lignin  merupakan  molekul  kompleks yang terdiri atas unit-unit fenilpropana yang umumnya sulit  didegradasi  oleh  enzim  selulase  [8].  Lignin membentuk ikatan yang kuat dengan selulosa sehingga memberikan  bentuk  yang  kokoh  pada  dinding  sel tanaman. Lignin yang melindungi selulosa bersifat tahan terhadap hidrolisis enzim selulase karena adanya ikatan aril eter.
Lignin  dapat  dihilangkan  atau  dikurangi  salah satunya dengan penambahan alkali menggunakan NaOH. Penambahan  NaOH  dapat  melarutkan  lignin  dari selulosa. Selulosa  dapat  mengendap  pada  kondisi alkali sehingga  dengan  penambahan  NaOH  selulosa  akan mengendap  [14].  Lignin  dalam  NaOH  akan  membentuk garam  fenolat  yang  larut  dalam  air.  Garam  fenolat terbentuk  maka  ikatan  selulosa  dan  lignin  akan  lepas sehingga  akan  diperoleh  selulosa  dalam  keadaan  bebas lignin.
Filtrat dari hasil delignifikasi di uji secara kualitatif. Uji tersebut dengan menambahkan FeCl 3 ke dalam filtrat hasil delignifikasi. Penambahan FeCl 3 untuk mendeteksi adanya  senyawa  dengan  gugus  fenol.  Senyawa  yang mengandung gugus fenol bila diuji menggunakan larutan FeCl 3 memberikan  perubahan  warna  merah  hingga keunguan  [13].  Hasil  uji  lignin  pada  delignifikasi  kulit pisang  raja  menggunakan  FeCl 3 pada  filtrat  hasil pencucian pH 14 dan pH 7 dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Hasil uji lignin menggunakan FeCl 3 pada saat (a) pH awal (pH 14) dan (b) pH netral (pH 7)
Sampel yang digunakan adalah air hasil penyaringan pertama dengan filtrat pH 14 dan filtrat yang telah dicuci dengan  aquadest  hingga  pH  7.  Hasil  uji  lignin menggunakan  FeCl 3 mengalami  perubahan  warna  dari hitam  menjadi  merah  bata  pada  pH  14  dan  pada  pH  7 tidak  memberikan  perubahan  warna  (tetap  kuning jernih).  Perubahan  warna  pada  filtrat  hasil  pencucian dengan  akuades  pH  14  menunjukkan  bahwa  senyawa lignin  telah  lepas  dari  selulosa,  sedangkan  filtrat  hasil pencucian  pada  pH  7  tidak  terjadi  perubahan  warna, menunjukkan  bahwa  substrat  kulit  pisang  raja  telah bebas lignin.

## Pengadaptasian Trichoderma viride
Pengadaptasiaan Trichoderma viride diawali dengan menginokulasikan  inokulum  dari  media  PDA  (Potato Dextrose Agar) ke media
cair CMC ( Carboxymethylcellulose )  yang  telah  ditambah  mineral- mineral.  Tahap  ini  dilakukan  untuk  mengaktifkan Trichoderma  viride sehingga  perannya  maksimal  pada proses  selanjutnya.  Media  awal  dari  biakan  murni Trichoderma viride adalah PDA, kemudian diadaptasikan ke  media  CMC  dengan  penambahan  mineral.  CMC digunakan  sebagai  sumber  karbon  untuk  pertumbuhan Trichoderma  viride sebelum  digunakan  pada  media bersubstrat. Substrat yang digunakan adalah kulit pisang raja  hasil  delignifikasi,  yang  merupakan  selulosa kompleks.  Hasil  peremajaan  ini  akan  diperoleh Trichoderma  viride yang  hanya  menghasilkan  enzim selulase. Trichoderma  viride yang  telah  diremajakan tersebut  digunakan  untuk  menghidrolisis  selulosa menjadi gula pereduksi.
Uji Aktivitas Trichoderma viride dalam Hidrolisis Kulit Pisang Raja dengan Variasi Waktu Fermentasi
Aktivitas Trichoderma  viride dalam  menghidrolisis selulosa  dipengaruhi  oleh  waktu  fermentsasi  dan konsentrasi  substrat.  Waktu  fermentasi  merupakan waktu  yang  diperlukan  mikroorganisme  dalam melakukan  sintesis  enzim  sehingga  berpengaruh  pada proses  reaksi  untuk  menghasilkan  produk.  Hasil  kadar gula  pereduksi  dari  berbagai  waktu  fermentasi  kulit pisang raja yang diambil setiap 24 jam sekali ditunjukan pada Gambar 2.
Gambar 2. Grafik waktu fermentasi Trichoderma viride dalam menghasilkan gula pereduksi
Gambar  2  menunjukkan  mulai  awal  fermentasi kadar gula pereduksi terus meningkat sampai hari ke-7, dan  pada  hari  ke-8  sampai  hari  ke-11  kadar  gula pereduksi  yang  dihasilkan Trichoderma  viride hampir sama.  Grafik  tersebut  menunjukan,  mulai  awal fermentasi  sampai  hari  ke-5  terjadi  pembelahan  sel jamur Trichoderma  viride yang  cepat.  Pembelahan  sel jamur Trichoderma viride yang cepat memerlukan energi yang  banyak.  Peningkatan  jumlah  energi  untuk pembelahan  sel  jamur Trichoderma  viride menyebabkan konsumsi  gula  pereduksi  meningkat,  sehingga  kadar gula  pereduksi  sisa  yang  dihasilkan  sedikit.  Hari  ke-5 sampai hari ke-7 jamur Trichoderma viride telah bekerja menghasilkan gula pereduksi. Meningkatnya kadar gula pereduksi  sebanding  dengan  jumlah  sel  sehingga aktivitas Trichoderma  viride dalam  menghidrolisis selulosa  meningkat.  Hari  ke-8  sampai  hari  ke-11  kadar gula  pereduksi  tidak  terjadi  peningkatan  yang disebabkan  oleh  gula  pereduksi  yang  dihasilkan digunakan untuk metabolisme Trichoderma viride , selain itu  nutrient  didalam  media  mulai  berkurang.  Dari  data yang dihasilkan dapat diketahui bahwa waktu fermentasi optimum Trichoderma  viride untuk  menghasilkan  gula pereduksi terjadi pada hari ke-7.

## 4. Kesimpulan
Trichoderma  viride mampu  tumbuh  pada  media modifikasi kulit pisang raja. Aktivitas Trichoderma viride dalam  menghidrolisis  kulit  pisang  raja  optimum  pada waktu fermentasi hari ke-7 dengan kadar gula pereduksi sebesar 41,40 mg/L.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  G Ramanathan, S Banupriya, D Abirami, Production and  optimization  of  cellulase  from  Fusarium oxysporum by submerged fermentation, (2010)
[2]  Mohammed Inuwa Jarsquo, Obasola Ezekiel Fagade, Optimization studies on cellulase enzyme production by an isolated strain of Aspergillus niger YL128, African Journal of Microbiology Research , 4, 24,
(2010) 2635-2639
[3]  MA Milala, A Shugaba, A Gidado, AC Ene, JA Wafar, Studies on the use of agricultural wastes for cellulase enzyme production by Aspergillus niger, Res. J. Agric. Biol. Sci , 1, 4, (2005) 325-328
[4]  Hai-Yan Sun, Juanhua Li, Pingjuan Zhao, Ming Peng, Banana  peel:  A  novel  substrate  for  cellulase production  under  solid-state  fermentation, African Journal of Biotechnology , 10, 77, (2011) 17887-17890
[5]  Xue-Cai  Hao,  Xiao-Bin  Yu,  Zhong-Li  Yan, Optimization  of  the  medium  for  the  production  of cellulase by the mutant Trichoderma reesei WX-112 using  response  surface  methodology, Food
Technology and Biotechnology , 44, 1, (2006) 89-94
[6]  Hery Murphi, Pemanfaatan Kulit Buah Pisang untuk Produksi  Enzim  Selulase  oleh Trichoderma  viride , Aspergilus  niger  dan  Asperhilus  Oryzae,  Fakultas Teknologi  Pertanian,  Institute  Pertanian  Bogor, Bogor
[7]  Carlo N Hamelinck, Geertje Van Hooijdonk, Andre PC Faaij, Ethanol from lignocellulosic biomass: techno- economic performance in short-, middle-and long- term, Biomass and bioenergy , 28, 4, (2005) 384-410 http://dx.doi.org/10.1016/j.biombioe.2004.09.002
[8]  Mohammad  J  Taherzadeh,  Keikhosro  Karimi, Enzymatic-based  hydrolysis  processes  for  ethanol from lignocellulosic
materials: A review,
BioResources , 2, 4, (2007) 707-738
[9]  SD  Kamara,  SD  Rachman,  S  Gaffar,  Degradasi Enzimatik  Selulosa  dari  Batang  Pisang  untuk Produksi  Glukosa  dengan  Bantuan  Aktivitas Selulotik Trichoderma viride , in:  FMIPA, Universitas Padjadjaran, Bandung, 2006.
[10] W. S. Setyani, Uji Aktivitas Trichoderma viride dalam Hidrolisis  Selulosa  Eceng  Gondok  (Eichhornia crussipes)  dengan  Variasi  Temperatur  dan  Waktu Inkubasi,  Skripsi,  Departemen  Kimia,  Universitas Diponegoro, Semarang
[11]  Eustace A Iyayi, Zaid A Aderolu, Enhancement of the feeding  value  of  some  agro-industrial  by-products for  laying  hens  after  their  solid  state  fermentation with Trichoderma  viride , African  Journal  of Biotechnology , 3, 3, (2004) 182-185
[12] AF  Hamisan,  S  Abd-Aziz,  K  Kamaruddin,  UK  Md Shah,  N  Shahab,  MA  Hassan,  Delignification  of  oil palm  empty  fruit  bunch  using  chemical  and microbial pretreatment methods, Int. J. Agric. Res , 4,
(2009) 250-256
[13] R. Orchidea, Andi K.W., Dedy R.P., Lisa F.S., Khoir L., Pengaruh  Metode  Pretreatment  pada  Bahan Lignoselulosa  terhadap  Kualitas  Hidrosilat  yang Dihasilkan,  Seminar  Nasional  Teknik  Kimia Soebardjo Brothohardjono, (2010).
[14] Nur Richana, Tun Tedja Irawadi, M Anwar Nur, Illah Sailah, Khaswar Syamsu, Yandra Arkenan, Ekstraksi xilan dari tongkol jagung, J. Pascapanen , 4, 1, (2007) 38-43