Agro Bali : Agricultural Journal                                                                                     e-ISSN 2655-853X Vol. 7 No. 1: 167-178, March 2024 https://doi.org/10.37637/ab.v7i1.1535

## Induksi dan Kultur Suspensi Friable Embryogenic Callus Ubi Kayu Menggunakan Kultivar Lokal dan Jenis Auksin yang Berbeda

## Induction and Suspension Culture of Cassava Friable Embryogenic Callus Using Local Cultivar and Different Types of Auxins
Endah Cahyani Simamora ♥ , Slameto, Didik Pudji Restanto
Master of Agronomy Study Program, Faculty of Agriculture, University of Jember, Jember, Indonesia
♥ Corresponding author email: cahyanisimamora@gmail.com
Article history: submitted: September 18, 2023; accepted: March 22, 2024; available online: March 30, 2024 Abstract.  Cassava  (Manihot  esculenta)  has  become  a  prioritized  commodity  and  easy  to  cultivate.  Generative propagation is challenging thus induction of Friable Embryogenic Callus (FEC) needs to be conducted. However, there  are  several  challenges  in  generating  embryogenic  callus,  such  as  the  genotypes  and  the  exploration  of methods and protocols for FEC induction from various cassava cultivars. The study started from in vitro culture multiplication of cassava plants, callus induction from swollen structures formed by the development of axillary buds, followed by FEC induction from several cultivars, namely Kaspro (V1), Ketan (V2), and Kuning (V3) on GD medium followed by proliferation in suspension culture with the application of auxin was picloram at 12 mg.L -1 (P1), 20 mg.L- 1 (P2), and 2,4-D 12 mg.L- 1 (P3). The results showed the highest FEC frequency is Kaspro at 51,26 %, and FEC scores of 4 indicated a high ability to form FEC.  The highest increase in fresh weight was observed in P1 at 1.19 grams, and V2P1 at 0.64 grams. The highest suspension volume was found in treatment V1P2, while the highest cell viability was observed in V3P2.
Keywords: cassava; Friable Embryogenic Callus; picloram; suspension culture
Abstrak. Tanaman ubi kayu (Manihot Esculenta ) merupakan komoditas yang diprioritaskan serta mudah untuk dibudidayakan.  Perakitan  tanaman  ubi  kayu  memiliki  kesulitan  dikembangkan  secara  generatif  sehingga dibutuhkan  pendekatan  kultur  jaringan  melalui  induksi Friable  Embryogenic  Callus .  Beberapa  kendala  dalam menghasilkan kalus yang embriogenik yaitu genotip serta eksplorasi dari metode dan protokol induksi FEC dari beberapa varietas ubi kayu masih terbatas. Penelitian dilakukan dengan beberapa tahapan yaitu induksi FEC pada media GD dengan perlakuan kultivar yang berbeda yaitu Kaspro (V1), Ketan (V2), Kuning (V3) pada media GD, dilanjutkan dengan proliferasi pada kultur suspensi dengan perlakuan jenis auksin yaitu picloram 12 mg.L -1 (P1), 20 mg.L -1 (P1), dan 2,4-D 12 mg.L -1 (P3) dan perbedaan kultivar. Hasil penelitian yang diperoleh yaitu respon kalus  dari  kultivar  lokal  menunjukkan  rerata  frekuensi  dan  skor  FEC  tertinggi  terdapat  pada  Kultivar  Kaspro sebesar 51,26% dan skor 4 sebagai kategori kemampuan membentuk FEC tinggi. Pertambahan berat segar tertinggi terdapat  pada  perlakuan  P1  yaitu  1,19  gram  serta  perlakuan  V2P1  yaitu  0,64  gram.  Volume  suspensi  tertinggi terdapat pada perlakuan V1P2 serta viabilitas sel tertinggi terdapat pada perlakuan V3P2.
Kata kunci: Friable Embryogenic Callus ; kultur suspensi; picloram; ubi kayu

## PENDAHULUAN
Tanaman  ubi  kayu  merupakan  tanaman yang  relatif  mudah  dibudidayakan  sebab mampu  tumbuh  di  lahan  marginal,  toleran terhadap  cekaman  lingkungan  serta  dapat disimpan  lama  setelah  panen  sehingga dibutuhkan  usaha  peningkatan  tanaman  ubi kayu  dengan  produktivitas  yang  tinggi  dan kejelasan varietas melalui pemenuhan kebutuhan  benih  varietas  unggul.  Varietas unggul  tanaman  ubi  kayu  dapat  diperoleh melalui perakitan tanaman melalui penggabungan  dari  beberapa  sifat  unggul tanaman.  Salah  satu  pendekatan  yang  dapat dilakukan adalah teknik kultur jaringan sebab
terdapat  kesulitan  tanaman  ubi  kayu  untuk dikembangkan  secara  generatif  (Wen  et  al ., 2020).
Salah  satu  teknologi  perakitan  tanaman secara  vegetatif  menggunakan  sel  somatik adalah  hibridisasi  somatik  atau  transformasi genetik.  Teknologi  tersebut  membutuhkan protoplas  sehingga  protoplas  dapat  diisolasi melalui  FEC  ( Friable  Embryogenic  Callus ) yang  memiliki  karakteristik  kuning  pucat, bertekstur  remah,  terdiri  atas  sejumlah  unit sel  embriogenik. Salah satu  tahapan penting dari  menghasilkan  protoplas  melalui  kalus adalah meningkatkan aktivitas proliferasi sel secara  cepat  untuk  memperbanyak  jumlah
Agro Bali : Agricultural Journal                                                                                     e-ISSN 2655-853X Vol. 7 No. 1: 167-178, March 2024 https://doi.org/10.37637/ab.v7i1.1535
sel, maka FEC akan dikulturkan pada media suspensi.  Metode  suspensi  telah  banyak dimanfaatkan  untuk  propagasi  tanaman, produksi  metabolit  sekunder,  menyediakan propagul  untuk  transformasi  genetik  dan isolasi protoplas (Liu et al., 2022 ; Wen et al . , 2020).  Media  suspensi  untuk  kultur  kalus merupakan metode yang dapat mempercepat proliferasi  sel  dengan  meningkatkan  jumlah kalus dalam waktu singkat serta meningkatkan  ukuran  kalus  agar  lebih seragam.  Sistem  kultur  suspensi  dilakukan dengan perendaman yang berlangsung secara terus-menerus  dan  digojok  di  atas orbital shaker sehingga mampu memisahkan agregat sel, mengatasi distribusi bentuk sel agar lebih seragam  serta  menyediakan  oksigen  dan nutrisi  dalam  media  dapat  merata  dan homogeni  untuk  menjaga  respirasi  sel  tetap optimal (Kong et al., 2020) . Berdasarkan metode
yang
dikembangkan  oleh  Taylor  et  al.  (1996) bahwa jenis  auksin yang dapat  menginduksi FEC  adalah picloram sehingga  untuk meningkatkan  proliferasi  sel  di  media suspensi  ditambahkan picloram 12  mg.L -1 . Kemudian  menurut  Lentz  et  al.  (2018)  FEC yang  dikulturkan  pada  media  dengan penambahan picloram 20  mg.L -1 dapat meningkatkan  proliferasi  pada  kultivar  ubi kayu  asal  Brazil.  Beberapa  kultivar  juga mampu menginduksi kalus sampai terbentuk somatik  embrio  dengan  pemberian  2,4-D hingga  40%  (Slameto  et  al.,  2023).  Selain faktor  zat  pengatur  tumbuh  yang  mampu menginduksi FEC, terdapat beberapa kendala dalam menghasilkan kalus yang embriogenik yaitu genotip dari tanaman.
Varietas  lokal  ubi  kayu  di  Indonesia memiliki karakter yang beragam berdasarkan genotip  tanaman  ubi  kayu  tersebut  sehingga pendekatan  kultur  in  vitro  dalam perakitan tanaman  ubi  kayu  membutuhkan  pemahaman mengenai  kemampuan  menghasilkan  kalus embriogenik  sehingga  metode  yang  dilakukan diharapkan  dapat  menghasilkan  ubi  kayu  yang memiliki  karakter  cita  rasa  yang  baik  sehingga bisa ditanam oleh petani. Menurut Diniyah et al. (2018)  ubi  kayu  dibedakan  berdasarkan  kadar HCN ( Hydrogen cyanide ) umbi yaitu umbi manis
dengan  kadar  HCN  rendah  yaitu  <100  mg.kg -1 serta umbi pahit yaitu kadar HCN >100 mg.kg -1 . Sifat-sifat  unggul  yang  diharapkan  dapat diperoleh  dari  penggabungan  karakter  dari varietas  ubi  kayu  kayu  seperti  Varietas  Ketan yang termasuk umbi manis dan ubi kayu varietas lokal  Kuning  yang  memiliki  kadar  beta  karoten yang  tinggi  dan  rasa  manis  sehingga  sangat berpotensi  untuk  dikembangkan,  tetapi  hasil produksi yang diperoleh belum efektif  (Supatmi et al., 2018) sedangkan terdapat varietas lokal ubi kayu  Kaspro  yang  termasuk  umbi  pahit  dan memiliki  produktivitas  tinggi  yaitu  35  ton  per hektar dibanding varietas jenis umbi manis yang produktivitasnya  sekitar  25  ton  per  hektar (Pranowo,  2021). Hal  tersebut  sesuai  dengan pendapat Rossin  &  Rey  (2011)  bahwa terdapat perbedaan signifikan dari kemampuan  setiap  kultivar  ubi  kayu  untuk menghasilkan  kalus  yang  embriogenik  serta terdapat  keterbatasan  dalam  menghasilkan FEC  dalam  jumlah  besar  sebab  eksplorasi dari metode beberapa kultivar ubi kayu masih terbatas.
Berdasarkan  uraian  di  atas,  dapat diketahui bahwa media kultur suspensi pada FEC  serta jenis kultivar dapat  memengaruhi tingkat  proliferasi  sel  sehingga  dibutuhkan peningkatan  proliferasi  sel  agar  didapatkan sel  yang viable .  Induksi  dan  kultur  suspensi FEC  pada  penelitian  ini  dilakukan  dengan menggunakan eksplan dari beberapa kultivar lokal tanaman ubi kayu sehingga tujuan dari penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui respon  induksi  kalus  dari  beberapa  kultivar lokal  pada  media  induksi  FEC  dan  tingkat proliferasi kalus beberapa kultivar lokal pada perbedaan jenis auksin pada media suspensi.

## METODE
Pelaksanaan  penelitian  dilakukan  pada bulan  November  2022  sampai  Juni  2023  di Laboratorium Ekofisiologi dan Kultur Jaringan Program  Studi Agronomi, Fakultas Pertanian,  Universitas  Jember.  Alat  dan bahan digunakan dalam pelaksanaan penelitian adalah botol, pinset, gunting, pisau scalpel,  pH-Meter, autoclave , Laminar  Air Flow  Cabinet (LAFC),  bunsen,  petridish, erlenmeyer, rotary  shaker ,    mikroskop
Agro Bali : Agricultural Journal                                                                                     e-ISSN 2655-853X Vol. 7 No. 1: 167-178, March 2024 https://doi.org/10.37637/ab.v7i1.1535
cahaya  merk  Leica  EZ4HD  dan  OptiLab, eksplan  tanaman  in  vitro  ubi  kayu  kultivar lokal  sesuai  perlakuan  berupa axillary  bud (AB),  media  Murashige  and  Skoog  (MS), media Gresshoff and Doy (GD),
Benzylaminopurine (BAP),
Picloram , Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), Napthtalene Acetic Acid (NAA).
Penelitian  disusun  dengan  Rancangan Acak  Lengkap.  Sebelum  dilakukan  kultur suspensi  terlebih  dahulu  dilakukan  evaluasi kemampuan  tiap  kultivar  lokal  untuk membentuk  FEC  melalui  perlakuan  jenis kultivar  yaitu  Kaspro  (V1),  Ketan  (V2)  dan Kuning  (V3)  diulang  sebanyak  6  kali. Kemudian  rancangan  percobaan  kultur suspensi  dilakukan  dengan  rancangan  acak lengkap  faktorial  dengan  dua  faktor  diulang sebanyak tiga kali. Dua faktor tersebut yaitu kultivar  tanaman  ubi  kayu  terdiri  atas  tiga taraf  yaitu  Kultivar  Kaspro,  Kuning,  Ketan dan jenis auksin pada kultur suspensi terdiri atas tiga taraf yaitu Picloram 12 mg.L -1 (P1), Picloram 20  mg.L -1 (P2)  dan  2,4-D  mg.L -1 (P3)  sehingga  diperoleh  9  kombinasi perlakuan  yaitu  V1P1,  V2P1,  V3P1,  V1P2, V2P2, V3P2, V1P3, V2P3, V3P3.
Tahap awal dari penelitian yaitu induksi swollen dari  kultur  in  vitro  pada  media Cassava  Auxiliary  Medium (CAM)  yaitu pada MS dengan penambahan BAP 10 mg.L - 1 , setelah swollen tumbuh kemudian dipindahkan  ke  media  CIM  ( cassava induction  medium )  yaitu  pada  media  MS dengan  penambahan picloram 12  mg.L -1 . Kalus  yang  terbentuk  kemudian  diinduksi pada  media  GD  dengan  penambahan picloram 12 mg.L -1 untuk induksi FEC, FEC yang  telah  terbentuk  diuji  kemampuan regenerasinya pada media regenerasi dengan tiga  tahapan  yaitu  pematangan  embrio  di media MS dengan penambahan NAA 1 mg.L - 1 selama  3  minggu  kemudian  dipindahkan pada  media  induksi  tunas  yaitu  MS  dengan penambahan BAP 0,1 mg.L -1 kemudian pada media  pemanjangan  tunas  yaitu  MS  dengan penambahan  BAP  0,4  mg.L -1 .  Setelah diketahui kemampuan regenerasi tiap varietas,  kemudian  FEC  dipindahkan  pada
media  suspensi  untuk  proliferasi  sel  yaitu pada  media  GD  dengan  penambahan  auksin sesuai perlakuan.
Variabel pengamatan yang diamati pada induksi FEC adalah frekuensi FEC (%), skor pembentukan FEC mulai dari  tidak terbentuk FEC  =  0,    persentase  kalus  ≤10%  =  1, persentase kalus 11 – 25% = 2, persentase 26 – 50% = 3, 51  – 75  %= 4, persentase lebih dari 75% = 5. Kemudian pada kultur suspensi yaitu  volume  sel  (ml)  dengan  metode  CVS ( cell  after  sedimentation ),  berat  segar  kalus (gram) dikalkulasi sebagai nilai growth index (GI), viabilitas sel dengan metode haemocytometer dan histologi kalus. Analisis data  dilakukan  dengan  analisis  sidik  ragam atau analysis of variance (ANOVA) dan data yang  signifikan  dilanjutkan  dengan  uji Duncan  Multiple  Range  Test (DMRT)  taraf 0,05.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pengaruh Jenis Kultivar terhadap FEC
Kultivar  Kaspro  memiliki  persentase pembentukan  kalus  atau  frekuensi  FEC tertinggi  yaitu  51,26%  yang  diikuti  oleh perlakuan  lainnya  yaitu  Kuning  dengan persentase  pembentukan  kalus sebesar 43,58%  serta  rerata  frekuensi  FEC  Ketan yang  membentuk  kalus  sebesar  7,87%. Kemudian  variabel  pengamatan  nilai  skor FEC  menunjukkan  Kultivar  Kuning  dan Kaspro memiliki nilai skor berurutan yaitu 4 dan  2  sedangkan  skor  FEC  ketan  memiliki nilai  skor  rata-rata  terendah  yaitu  0,17  yang berbeda dari dua varietas lainnya (Tabel 1).
Berdasarkan hasil tersebut dapat diketahui bahwa kemampuan kalus membentuk  FEC  akan  meningkatkan  nilai skor  varietas  dalam  membentuk  FEC.  Hal tersebut  menunjukkan  bahwa  ZPT picloram mampu menginduksi kalus sebab telah terjadi sinergi antara genotip dan kerja picloram . Hal tersebut  telah  dijelaskan  sebelumnya  bahwa frekuensi  pembentukan  kalus  dari  eksplan mengindikasikan terjadi efek antara interaksi genotip  dan  auksin  yang  diaplikasikan (Ahmad et al., 2021).
Tabel 1. Pengaruh jenis varietas terhadap frekuensi FEC dan skor FEC
Perlakuan Frekuensi FEC (%) Skor FEC Ketan Kuning Kaspro 7,87±9,34 a
43,58±27 a
51,26±7,68 a 0,17±0,4 a 2±2,45 b 4±0,63 b
Keterangan: Angka yang diikuti huruf (notasi) yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji DMRT ( Duncan Multiple Range Test ) taraf 0,05

## Tahapan Regenerasi FEC
Kalus  yang  diinduksi  pada  media  CIM kemudian dipindahkan pada media GD untuk induksi kalus sekunder (Gambar 1-d). Media GD memungkinkan untuk meningkatkan jumlah sel  embriogenik  dengan  penambahan  auksin dengan konsentrasi tinggi. Media GD sebelumnya  telah  menunjukkan  keberhasilan pembentukan  FEC  pada  genotip  asal  Indonesia yaitu  Adira  4    (Raemakers  et  al.,  2006). Berdasarkan  Gambar  1-e  FEC  dapat diinduksi  pada  media  GD  selanjutnya  dapat
berkembang ke fase torpedo (Gambar 1 f-g). Kemudian  kalus  embriogenik  (Gambar  1-h) pada  media  GD  dipindahkan  pada  media NAA  1  mg.L -1 selanjutnya  kalus  kultivar kaspro menunjukkan potensi regenerasi kalus ditandai dengan pertumbuhan akar pada kalus embriogenik  (Gambar  1.i) . Pembentukan akar dimulai dengan terjadinya metabolisme cadangan  nutrisi  yaitu  karbohidrat  sehingga menghasilkan energi dan memicu terjadinya pembentukan  jaringan  baru  (Pratiwi  et  al., 2023).
Gambar 1. Tahapan regenerasi pada Kultivar Kaspro. Induksi swollen dari auxillary bud pada media CAM (a), swollen 4 HST pada media CIM (b), pembentukan kalus pada media CIM (c), sub kultur kalus pada media CIM (d), induksi FEC pada media GD (e), sub-kultur FEC pada media GD (f), kalus fase torpedo pada media GD (g), kalus embriogenik pada media GD (h), regenerasi kalus pada media NAA (i).
Berdasarkan hasil uji regenerasi Kultivar Ketan dapat diketahui kemampuan regenerasi kultivar  tersebut  rendah  sebab  kalus  yang
diinduksi pada media GD tidak menunjukkan adanya  pertumbuhan  dan  perkembangan kalus  sekunder  kemudian  sub-kultur  pada
a b c d e f g h i
Agro Bali : Agricultural Journal                                                                                     e-ISSN 2655-853X Vol. 7 No. 1: 167-178, March 2024 https://doi.org/10.37637/ab.v7i1.1535
media NAA tidak menunjukkan respon akar atau tunas (Gambar 2). Kemampuan Kultivar Ketan  untuk  membentuk  FEC  rendah sehingga skor pembentukan FEC dikategorikan  skor  rendah  atau  varietas rekalsitran.
Berdasarkan
penelitian (Mongomake  et  al.,  2015)  diketahui  bahwa beberapa kultivar kalus rekalsitran mengalami kegagalan menyinkronkan interaksi  antara  genotip  dan  fitohormon meskipun kultivar rekalsitran mampu membentuk  struktur  kalus  proembriogenik atau globular, fase kalus tersebut sulit untuk berkembang  menjadi  fase  torpedo  atau embrio. Kultivar Kuning diketahui memiliki potensi untuk regenerasi melalui pembentukan  calon  tunas  pada  media  NAA pada 20 HST . Swollen dapat tumbuh menjadi kalus (Gambar 2 c-d). Kemudian dipindahkan  pada  media  GD  sehingga muncul  kalus  primer  dan  terbentuk  fase globular  (Gambar  2  e).  Kemudian  kalus disubkultur pada media GD dan membentuk fase heart dan torpedo (Gambar 2f). Kultivar Kuning  diketahui  memiliki  potensi  untuk regenerasi melalui pembentukan calon tunas di  media  NAA  pada  20  HST  (hari  setelah tanam) . Swollen dapat tumbuh menjadi kalus (Gambar 2 c-d). Kemudian dipindahkan pada media GD sehingga muncul kalus primer dan terbentuk  fase  globular  (Gambar  2e). Kemudian kalus disubkultur pada media GD sehingga membentuk fase heart dan torpedo (Gambar  2f).  Ketan  diketahui  memiliki kemampuan  regenerasi  rendah  sebab  kalus yang  diinduksi  pada  media  GD  tidak menunjukkan  adanya  pertumbuhan  dan perkembangan  kalus  sekunder.  Kemudian ketika  disub-kultur  pada  media  NAA  tetap tidak  menunjukkan  respon  akar  atau  tunas (Gambar 3).

## Volume Media Suspensi
Volume suspensi diamati setiap interval 7 hari sekali sampai dengan 28 HST. Volume yang  diamati  adalah  volume  endapan  dari kalus. Berdasarkan Gambar 4 dapat diketahui bahwa  volume  akhir  tertinggi  terdapat  pada perlakuan V1P2 dengan rerata volume secara
berurutan  mulai  dari  1,33  ml  pada  7  HST sampai  21  HST  dan  mengalami  kenaikan volume  menjadi  1,5  ml  pada  28  HST. Kemudian  volume  terendah  pada  hari terakhir pengamatan perlakuan V2P3 menunjukkan nilai rata-rata volume terendah yaitu  0,6  ml.  V1P2  menunjukkan  kenaikan volume  pada  hari  ke  28  HST  sedangkan perlakuan  V3P1,  V1P1,  V2P1,  V3P2,  V2P2 dan  V2P3  menunjukkan  kenaikan  volume pada  14  HST.  Kemudian  tidak  terjadi kenaikan  volume  pada  V1P3.  Perlakuan  P1 dapat  meningkatkan  volume  kalus  pada  14 HST  dan  21  HST  pada  Kultivar  Kuning sedangkan  pada  kenaikan  volume  hanya terjadi pada 14 HST dan 21 HST pada Ketan dan Kaspro (Gambar 4).
Perlakuan  P2  yang  dikombinasikan dengan kultivar menunjukkan bahwa kenaikan volume terjadi pada 14 HST dan 21 HST pada Kuning dan Ketan sedangkan pada Kaspro dikombinasikan dengan P2
menunjukkan kenaikan volume pada 28 HST. Kemudian perlakuan P3
yang dikombinasikan dengan kultivar pada Gambar  4,  menunjukkan  hasil  bahwa kenaikan  volume  terjadi  pada  Kultivar Kuning  dan  Ketan  pada  14  HST  sedangkan Kaspro  tidak  mengalami  kenaikan  volume selama  kultur  suspensi.  Pertumbuhan  kultur suspensi dapat dilihat dari volume kalus pada kultur suspensi yang meningkat.
Metode cell  volume  after  sedimentation dapat digunakan sebagai indikator pertumbuhan pada media suspensi. Terdapat tiga  fase  berbeda  pada  kultur  suspensi  yaitu fase lag ,  eksponensial  dan stationary (Ramulifho et al., 2019). Fase lag pada kultur suspensi  yaitu  pada  7  hari  setelah  tanam merupakan fase awal dari pertumbuhan kalus sehingga  belum  terdapat  kenaikan  volume (Gambar 4). Kemudian pada pengamatan hari ke-14  dan  21  kultur  suspensi  mengalami kenaikan  volume  sehingga  fase  tersebut merupakan  fase  eksponensial.  Pengamatan hari ke 28 menunjukkan bahwa volume kalus tidak  mengalami  kenaikan  kecuali  pada perlakuan  V3P1  dan  V3P2.  Kultur  suspensi FEC ubi kayu berada pada fase stationary di
Agro Bali : Agricultural Journal                                                                                     e-ISSN 2655-853X Vol. 7 No. 1: 167-178, March 2024 https://doi.org/10.37637/ab.v7i1.1535
28 HST. Setiap tanaman memiliki fase yang berbeda  dalam  kemampuan  proliferasi  dan daya  hidup  di  media  suspensi  sehingga idealnya sebelum memasuki fase stationary , bisa  langsung  dipindahkan  ke  media regenerasi.  Hal  tersebut  sesuai  dengan protokol transformasi tanaman ubi kayu yang menggunakan eksplan FEC bahwa FEC harus
dipindahkan  ke  media  pematangan  kalus pada 21 HST (P. Zhang & Gruissem, 2004). Umumnya  beberapa  kultur  suspensi  dapat bertahan pada 28 HST seperti pada tanaman Angelica  sinensis yang  diketahui  bahwa kultur  suspensi  kalus  tanaman  tersebut memasuki masa stationary di 28 HST (Y. H. Zhang et al., 2019).
Gambar 2. Tahapan regenerasi FEC pada Kultivar Kuning. Induksi swollen dari axillary bud pada media CAM (a), swollen 4 HST pada media CIM (b), pembentukan kalus pada media  CIM  (c),  sub  kultur  kalus  pada  media  CIM  (d),  induksi  FEC  pada  media  GD kemudian  membentuk  fase  globular  pada  28  HST  (e),  sub-kultur  FEC  pada  media  GD memasuki  fase  torpedo  dan heart (f),  kalus  embriogenik  pada  media  NAA  20  HST  (g), perkembangan kalus embriogenik menjadi tunas pada media BAP 0,1 mg.L -1 (h) regenerasi kalus embrio somatik pada media BAP 0,4 mg. L -1 (i)
Gambar 3. Tahapan regenerasi pada varietas ketan. Induksi swollen dari axillary bud pada media CAM (a), swollen 4 HSTpada media CIM (b), kalus fase globular pada medi GD (c)
a b c d e f g h i h t
a b c
Gambar 4. Kenaikan volume kalus pada kultur suspensi

## Berat Segar Kalus
Peningkatan berat segar kalus dikalkulasikan  menjadi  nilai growth  index yaitu  peningkatan  berat  segar  kalus  pada media  kultur  suspensi.  Kalus  yang  remah ditimbang  sebanyak  0,25  gram  sebagai  W0 (berat  awal  kalus)  kemudian  dikulturkan  di media perlakuan suspensi. Setelah 28 HST di media suspensi,  berat  segar kalus  ditimbang hingga  didapatkan  W1  (berat  segar  kalus  di akhir  pengamatan).  Kemudian  dihitung selisih antara berat akhir dan berat awal serta dibagi  berat  awal  sehingga  didapatkan  nilai growth index .
Nilai  rerata  tertinggi  dari growth  index adalah  perlakuan  V2P1  dengan  nilai  0,64 gram  tetapi  tidak  berbeda  dari  perlakuan lainnya  kemudian  nilai  rerata  terendah terdapat pada perlakuan V3P3, V2P3, V3P1. Nilai  terendah  tersebut  menunjukkan  tidak terjadinya  peningkatan growth  index (Tabel 2).  Peningkatan  biomassa  pada  suspensi dapat  dipengaruhi  oleh  pembelahan  dan perkembangan  sel  ditinjau  dari  proliferasi. Hal  tersebut  disebabkan  oleh  jenis  dan konsentrasi  auksin  sehingga  auksin  menjadi
penentu  dalam  meningkatkan  proliferasi  sel pada media suspensi  (Tripathi et al., 2021).
Peningkatan proliferasi kalus embriogenik  pada  tanaman  ubi  kayu  dapat dipicu  oleh  jenis  auksin  yaitu  picloram  12 mg.L -1 ( Lentz et al. (2018) . Penggunaan media suspensi  dengan  penambahan  auksin  akan meningkatkan  kemungkinan  terbentuknya kalus embriogenik sebab penambahan auksin akan  mempengaruhi  perkembangan  kalus menuju  embriogenesis  dan  fase  maturase untuk  memungkinkan  terjadinya  regenerasi. Apabila growth index stagnan dapat dimungkinkan  akibat  terjadinya  penurunan laju  biomassa  kalus  akibat  dari  pembelahan sel  yang  kurang  optimal  sehingga  fase perkembangan kalus selanjutnya tidak optimal  (Silvina  et  al.,  2022).  Selanjutnya penggunaan  ZPT  2,4-D  menunjukkan  tidak terjadinya  peningkatan growth  index dapat disebabkan  oleh  penggunaan  2,4-D  dengan konsentrasi  terlalu  tinggi  dapat  menurunkan perkembangan sel sebab terjadinya plasmolysis sel  yang  merupakan  indikator berkurangnya  kadar  air  pada  sel (Tripathi  et al., 2021) .
1 1 1.33 1.43 1.43
1.33
1.33 1.33 1.33 1.5
0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 1 1 1.23 1.33 1.33 0.83 0.83 0.93 1.13 1.13 0.53 0.53 0.57 0.6 0.6 1 1 1.1 1.3 1.47 1 1 1.17 1.27
1.3
1
1
1.03 1.03 1.03 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 0   H S T 7   H S T 1 4   H S T 2 1   H S T 2 8   H S T V o lu m e S u sp en si (m l) KASPRO.P1 KASPRO.P2 KASPRO.P3 KETAN.P1
KETAN.P2 KETAN.P3 KUNING.P1 KUNING.P2 KUNING.P3
Tabel 2. Pengaruh kultivar dan jenis auksin terhadap berat segar
Perlakuan Berat Segar (gram) V3P3 0±0a V2P3 0±0a V3P1 0±0a V1P2 0,19±0,02ab V2P2 0,2±3,40abc V3P3 0,39±0,02bcd V3P2 0,39±0,08bcd V1P1 0,55±0,09cd V2P1 0,64±0,07d
Keterangan: Angka yang diikuti huruf (notasi) yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji DMRT ( Duncan Multiple Range Test ) taraf 0,05.
Tabel 3. Pengaruh jenis auksin terhadap berat segar kalus ( Growth Index )
Keterangan: Angka yang diikuti huruf (notasi) yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji DMRT ( Duncan Multiple Range Test ) taraf 0,05.
Diketahui  perlakuan  jenis  auksin  P1 menunjukkan  rata-rata  perlakuan  tertinggi dibanding P2 dan P3 dan terdapat perbedaan antar perlakuan (Tabel 3).  Beberapa hal yang memengaruhi kultur suspensi adalah eksplan berupa  FEC  yang  tergantung  pada  sifat genotip  dan  komposisi  media  beserta  ZPT. Hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan  sesuai dengan  penelitian  sebelumnya    bahwa peningkatan berat segar kalus kultur suspensi dapat  dipengaruhi  oleh  klon  yang  berbeda, hal  tersebut  kemungkinan  dipengaruhi  oleh kemampuan proliferasi kalus yang diinduksi dan  hormon  endogen  yang  terdapat  pada inisiasi awal kalus (Karyanti et al., 2021).

## Viabilitas Sel
Rerata  persentase  sel  viabel  tertinggi terdapat  pada  perlakuan  V3P2  sebesar 81,68%  kemudian  nilai  rerata  terendah terdapat  pada  perlakuan  V2P1  66,48%. Semakin  tinggi  nilai  sel  yang  viabel  maka
semakin tinggi kemungkinan sel embriogenik yang  terdapat  pada  sampel  kalus  tersebut (Gambar 5).  Menurut (Chan et al., 2020) sel yang hidup memiliki membran sel yang utuh sehingga  zat  pewarna  seperti tryphan  blue tidak  mampu  menembus  sel,  sel  suspensi yang  dicampur  dengan  zat  pewarna  tertentu kemudian divisualisasikan untuk menentukan sel  yang  menyerap  atau  tidak  menyerap  zat pewarna.
Sel viabel yang berhasil dideteksi berada di rentang 66,48% - 81,68%. Semakin tinggi jumlah  sel  viabel  maka  semakin  tinggi kemungkinan kalus yang bersifat embriogenik sehingga masih mampu melakukan proliferasi. Hal tersebut didukung oleh penelitian Sumaryono &  Riyadi (2016) bahwa kultur suspensi Kina yang menunjukkan persentase viabilitas sel mencapai 81% sehingga dapat dimungkinkan sebagian sel masih tetap utuh dan tidak terjadi kerusakan  sel  akibat  dari  penggojokan  di shaker .
Perlakuan Growth index (gram) P1 1,19±1,04ab P2 0,77±0,34a P3 0,39±0,67a
Gambar 5. Pengaruh perlakuan kultivar dan auksin terhadap viabilitas sel kultur suspensi

## Histologi
Hasil  histologi  jaringan  dapat  diketahui melalui  kalus  yang  diinduksi  pada  media CIM ( Casava Induction Medium ) atau media induksi kalus primer yang bersifat meristematik ditandai dengan ruang antar sel yang rapat sehingga bagian jaringan meristematik  terlihat  lebih  gelap  (Gambar 6a). Kalus yang berada pada media Gresshoff and  Doy (GD)  yaitu  media  induksi  kalus primer  menunjukkan  adanya  pola  sel meristematik dengan jaringan yang rapat dan berwarna  lebih  gelap  serta  membentuk globular (Gambar 6b). Varietas Kaspro pada media P1 (Gambar 6c)  menunjukkan bahwa kalus  pada  media  suspensi  membentuk  fase
heart dan globular sehingga kalus dari media suspensi diketahui sesuai dengan tujuan dari kultur  suspensi  yaitu  proliferasi  kalus.  Fase globular  dan heart merupakan  fase  yang terdapat  pada  sel  embriogenik  sehingga memungkinkan  untuk  dijadikan  eksplan untuk  perbaikan  genetik  tanaman  ubi  kayu dengan  pendekatan  kultur  jaringan.  Hal tersebut menandakan bahwa fase awal kalus yaitu globular merupakan tahapan awal yang penting  sebab  kalus  pada  fase  globular mengindikasikan terdapatnya sel meristematik yang ditandai dengan perkembangan sel terus membelah (Restanto et al., 2022).
Gambar 6. Histologi kalus Kultivar Kaspro dari beberapa tahapan media. Kalus pada media CIM  (a),  kalus  pada  media  GD  (b),  kalus  pada  media  suspensi  P1  (c).  Kalus  pada  media suspensi (c) ge = globular sc = secondary callus h= kalus fase heart sm = sel meristematik

## SIMPULAN
Respon  induksi  kalus  dari  beberapa kultivar  lokal  pada  media  induksi  FEC menunjukkan rerata frekuensi dan skor FEC tertinggi  terdapat  pada  Kultivar  Kaspro sebesar  51,26%  dan  skor  4  sebagai  kategori
kemampuan membentuk FEC tinggi. Tingkat proliferasi  kalus  pada  jenis  auksin  yang berbeda  menunjukkan  adanya  perbedaan hasil  suspensi  FEC  pada  pertambahan  berat segar dengan pemberian 12 mg.L -1 picloram yang menghasilkan rata-rata berat segar yaitu 1,19 gram. Respon kalus menunjukkan berat
66.48 72.28 74.28 74.84 75.94 76.64 78.44 78.96 81.68 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 V1P1 V2P2 V3P3 V1P1
V2P3 V3P1 V1P3 V2P2 V3P2 V iab il it as S el (% ) Perlakuan
a sm g sc sm sm b c
segar  tertinggi  yaitu  pada  perlakuan  Ketan yang  diinteraksikan  dengan  penambahan Picloram 12 mg.L -1 yaitu 0,64 gram sehingga dapat  direkomendasikan  penggunaan  ZPT pada  media  suspensi  FEC  ubi  kayu  dari kultivar Kaspro, Ketan dan Kuning menggunakan picloram 12 mg.L -1 .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terimakasih kepada Laboratorium Ekofisiologi  dan  Kultur  Jaringan,  Program Studi  Agronomi,  Universitas  Jember  yang telah memfasilitasi analisis histologi jaringan pada penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad,  A.,  ul  Qamar,  M.  T.,  Shoukat,  A.,
Aslam, M. M., Tariq, M., Hakiman, M., &  Joyia,  F.  A.  (2021).  The  effects  of genotypes  and  media  composition  on callogenesis,  regeneration  and  cell suspension culture of chamomile (Matricaria  chamomilla  L.). PeerJ , 9 , e11464. https://doi.org/http://dx.doi.org/10.7717 /peerj.11464
Chan, L. L. Y., Rice, W. L., & Qiu, J. (2020). Observation  and  quantification  of  the morphological  effect  of  trypan  blue rupturing  dead  or  dying  cells. PLoS
ONE , 15 (1), 1–17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.02
27950
Diniyah,  N.,  Subagio,  A.,  Nur  Lutfian  Sari, R., Gita Vindy, P., & Ainur Rofiah, A. (2018). Effect of Fermentation Time and Cassava Varieties on Water Content and the  Yield  of  Starch  from  Modified Cassava  Flour  (MOCAF). Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology , 5 (2), 71. https://doi.org/10.24198/ijpst.v5i2.1509
4
Karyanti,  K.,  Tajuddin,  T.,  Khairiyah,  H., Sukarnih,  T.,  Rahmadara,  G.,  Hanifah, N. F., Rudiyana, Y., Kitagawa, S., Mira, F.  R.,  &  Saga,  H.  (2021).  Proliferation Of  Oil  Palm  (Elaeis  Guineensis  Jacq.)
Embryogenic  Callus  with  Repeated Subculturesi In Liquid Medium. Jurnal
Bioteknologi  &  Biosains  Indonesia (JBBI) , 8 (1), 1–11. https://doi.org/10.29122/jbbi.v8i1.4715
Kong,  E.  Y.  Y.,  Biddle,  J.,  Foale,  M.,  & Adkins,  S.  W.  (2020).  Cell  suspension culture:  A  potential  in  vitro  culture method  for  clonal  propagation  of coconut plantlets via somatic embryogenesis. Industrial  Crops  and Products , 147 (October  2019),  112125. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2020.1 12125
Lentz,  E.  M.,  Eisner,  S.,  McCallum,  E.  J., Schlegel,  K.,  Campos,  F.  de  A.  de  P., Gruissem,  W.,  &  Vanderschuren,  H. (2018).  Genetic  transformation  of recalcitrant cassava by embryo selection and increased hormone levels. Methods and Protocols , 1 (4), 1–10.
https://doi.org/10.3390/mps1040042
Liu, Y., Liang, Q., Tang, D., Chen, Y., Zang, J., Zhao, W., Chen, J., Zhang, Q., & Yin, Z.  (2022).  Development  of  suspension culture technology and hormone effects on  anthocyanin  biosynthesis  for  red Cyclocarya  paliurus  cells. Plant  Cell, Tissue  and  Organ  Culture  (PCTOC) , 149 (1),
175–195.
https://doi.org/10.1007/s11240-021- 02215-y
Mongomake, K., Doungous, O., Khatabi, B., &  Fondong,  V.  N.  (2015).  Somatic embryogenesis and plant regeneration of cassava  (Manihot  esculenta  Crantz) landraces from Cameroon. SpringerPlus , 4 (1), 1–12. https://doi.org/10.1186/s40064-015-
1272-4
Pranowo,  D.  (2021).  Deskripsi  Klon Tanaman Ubi Kayu (Manihot Esculenta Crantz)  yang  Ditanam  Petani  di  Enam Kabupaten di Provinsi Lampung.
Inovasi Pembangunan : Jurnal Kelitbangan , 9 (03), 271. https://doi.org/10.35450/jip.v9i03.249
Pratiwi, B. I., Nugrahani, P., & Augustien K.,
N.  (2023).  Pengaruh  Nutrisi  AB  Mix dan  Benzyl  Amino  Purine  (BAP) terhadap  Pertumbuhan  Pisang  (Musa acuminata)  Var.  Cavendish  In  Vitro. Agro  Bali :  Agricultural  Journal , 6 (1), 231–240. https://doi.org/10.37637/ab.v6i1.1163
Raemakers, K., Pereira, I., van Putten, H. K.,
&  Visser,  R.  (2006).  Indirect  Somatic Embryogenesis  in  Cassava  for  Genetic Modification  Purposes.  In  V.  M. Loyola-Vargas  &  F.  Vázquez-Flota (Eds.), Plant Cell Culture Protocols (pp. 101–109).
Humana Press. https://doi.org/10.1385/1-59259-959-
1:101
Ramulifho, E., Goche, T., Van As, J., Tsilo,
T.  J.,  Chivasa,  S.,  &  Ngara,  R.  (2019). Establishment  and  Characterization  of Callus and Cell Suspension Cultures of Selected Sorghum  bicolor (L.) Moench Varieties:  A  Resource  for  Gene Discovery  in  Plant  Stress  Biology. Agronomy ,
9 (5). https://doi.org/10.3390/agronomy90502
18
Restanto,  D.  P.,  Farlisa,  V.  Y.,  Dewanti,  P., Hariyono,  K.,  &  Handoyo,  T.  (2022). Induksi  Somatic  Embriogenesis  dan Kultur  Suspensi  Sel  Pada  Tanaman Porang (Amorphophallus muelleri Blume). Agriprima : Journal of Applied Agricultural  Sciences , 6 (2),  111–123. https://doi.org/10.25047/agriprima.v6i2 .448
Rossin, C. B., & Rey, M. E. C. (2011). Effect of explant source and auxins on somatic embryogenesis  of  selected  cassava (Manihot  esculenta  Crantz)  cultivars. South African Journal of Botany , 77 (1), 59–65. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j. sajb.2010.05.007
Silvina, F., Isnaini, I., & Ningsih, W. (2022). Induksi  kalus  daun  binahong  merah (Basella rubra L.) dengan pemberian 2, 4-D dan kinetin. Jurnal Agro , 8 (2), 274– 286.
https://doi.org/https://doi.org/10.15575/ 14273
Slameto, Fariroh, I., Kriswanto, B., Restanto, D. P., &  Hariyono, K. (2023). Somatic embryogenesis induction in four cassava landraces  in  East  Java,  Indonesia. Journal of Plant Biotechnology , 50 , 11–
18.
https://doi.org/10.5010/JPB.2023.50.00
2.011
Sumaryono,  .,  &  Riyadi,  I.  (2016).
Pertumbuhan biak kalus dan suspensi sel tanaman  kina  (Cinchona  ledgeriana Moens)  Growth  of  callus  and  cell suspension cultures of cinchona (Cinchona ledgeriana Moens). E- Journal Menara Perkebunan , 73 (1), 1– 11. https://doi.org/10.22302/iribb.jur.mp.v7 3i1.158
Supatmi,  S.,  Rahman,  N.,  &  Hartati,  N.  S. (2018). Induksi, Multiplikasi dan Pertumbuhan Tunas Ubi Kayu (Manihot esculenta  Crantz)  Genotip  Ubi  Kuning Secara In Vitro. Jurnal Biologi Indonesia , 14 (2), 191–200. https://doi.org/https://doi.org/10.14203/
jbi.v14i2.3738
Taylor,  N.  J.,  Edwards,  M.,  Kiernan,  R.  J., Davey,  C.  D.  M.,  Blakesley,  D.,  & Henshaw, G. G. (1996). Development of friable embryogenic callus and embryogenic suspension culture
systems  in  cassava  (Manihot  esculenta Crantz). Nature  Biotechnology , 14 (6), 726–730.
https://doi.org/10.1038/nbt0696-726
Tripathi,  M.  K.,  Tripathi,  N.,  Tiwari,  S., Tiwari, G., Mishra, N.,  Bele, D., Patel, R.  P.,  Sapre,  S.,  &  Tiwari,  S.  (2021). Optimization  of  different  factors  for initiation  of  somatic  embryogenesis  in suspension  cultures  in  sandalwood (Santalum  album  l.). Horticulturae ,
7 (5),
1–15. https://doi.org/10.3390/horticulturae705 0118
Wen, F., SU, W. pan, Zheng, H., YU, B. chi,
MA, Z. feng, Zhang, P., & Guo, W. wu. (2020). Plant regeneration via protoplast electrofusion  in  cassava. Journal  of Integrative Agriculture , 19 (3), 632–642. https://doi.org/10.1016/S2095- 3119(19)62711-5
Zhang,  P.,  &  Gruissem,  W.  (2004). Production  of  Transgenic  Cassava (Manihot  Esculenta  Crantz).  In  I.  S. Curtis  (Ed.), Transgenic  Crops  of  the World:  Essential  Protocols (pp.  301–
319). Springer Netherlands. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-
2333-0_23
Zhang, Y. H., Lu, Y. Y., He, C. Y., & Gao, S. F. (2019). A method for cell suspension culture  and  plant  regeneration  of Angelica  sinensis  (Oliv.)  Diels. Plant Cell, Tissue and Organ Culture , 136 (2),
313–322.
https://doi.org/10.1007/s11240-018-
1517-3