## Artikel Penelitian

## Studi In-Vitro Efektifitas Grain Kefir dengan Kombinasi Sorbitol Terhadap Pertumbuhan Streptococcus mutans
Viranda Sutanti, 1 Yuanita L. Rachmawati, 2 * Bintang V. N. Putra, 3 Herlambang Pangestu 3
1 Departemen Biologi Oral, 2 Departemen Ilmu Kesehatan Gigi Masyarakat-Pencegahan,
3 Program Studi Sarjana Kedokteran Gigi, Fakultas  Kedokteran Gigi Universitas Brawijaya, Malang
*Penulis korespondensi: yuanita.rachmawati.fk@ub.ac.id Diterima 23 November 2022; Disetujui 22 Agustus 2023 https://doi.org/10.23886/ejki.11.259.156

## Abstrak
Karies  gigi  adalah  penyakit  kronis  jaringan  keras  gigi  yang  disebabkan  oleh  Streptococcus  mutans (S.mutans).  Berbagai  metode  termasuk  aplikasi  pasta  gigi,  senyawa  antibakteri  dan  obat  kumur  yang mengandung fluoride bersama dengan penggunaan pemanis yang tidak dapat difermentasi seperti sorbitol telah  disarankan  untuk  mengurangi  aktivitas  bakteri  ini.  Pada  studi  ekologi  mulut  telah  mengkonfirmasi efektifitas  bakteri  probiotik  dalam  mengurangi jumlah  S.  mutans.  Grain  kefir  merupakan  salah  satu produk probiotik. Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat efektifitas grain kefir murni dan kombinasi dengan sorbitol terhadap pertumbuhan S. mutans secara in vitro. Penelitian dilakukan di laboratorium Biologi Oral Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Brawijaya pada  bulan Januari-Februari 2023. Dilakukan uji KHM (Konsentrasi Hambat  Minimum)  menggunakan  uji  tabung  dan  KBM  (Konsentrasi  Bakterisidal  Minimum)  menggunakan colony counter. Penentuan konstrasi perlakukan diawali dengan uji pendahuluan grain kefir murni konsentrasi 3,125%  dan  6,25%,  12,5%,  25%,  50%  dan  100%.  Nilai  KHM  grain  kefir  murni  uji  pendahuluan  terhadap S.mutans pada konsentrasi 12,5%. Pada konsentrasi perlakuan didapatkan nilai KHM grain kefir murni adalah 15%  dan  kombinasi  grain  kefir-sorbitol  terhadap  S.mutans  yaitu  pada  konsentrasi  12,5%.  Nilai  KBM  grain kefir  murni  didapatkan  pada  konsentrasi  15%  dan  kombinasi  grain  kefir-sorbitol  pada  konsentrasi  12,5%. Kombinasi grain kefir-sorbitol dapat menurunkan pertumbuhan S. mutans pada konsentrasi 12,5%. Kata kunci: sorbitol, grain kefir, probiotik, Streptococcus mutans.

## Effectiveness of the Combination of Sorbitol and Grain Kefir on the Growth of Streptococcus Mutans (In-Vitro Study)

## Abstract
Dental caries is a chronic disease of dental hard tissue caused by Streptococcus mutans (S. mutans). Various  methods  including  the  application  of  toothpastes,  antibacterial  compounds  and  fluoride-containing mouthwashes along with the use of non-fermentable sweeteners such as sorbitol have been suggested to reduce  the  activity  of  these  bacteria.  In  oral  ecology  studies  have  confirmed  the  effectiveness  of  probiotic bacteria in reducing the number of S. mutans. Kefir is a probiotic product. The purpose of this study was to see the effectiveness of pure kefir grains and their combination with sorbitol on the growth of S. mutans in vitro. The study was conducted in the Oral Biology laboratory of the Faculty of Dentistry, Universitas Brawijaya in January- February 2023. In this study, the MIC (Minimum Inhibitory Concentration) test was carried out using a tube test and the MBC (Minimum Bactericidal Concentration) test was carried out using a colony counter. Determination of the treatment concentration begins with a preliminary test of pure kefir grains with concentrations of 3.125% and 6.25%, 12.5%, 25%, 50% and 100%. The MIC value of pure kefir grains was pre-tested against S. mutans at a concentration of 12.5%. At the treatment concentration, the MIC value of pure kefir grain was 15% and the combined kefir-sorbitol grain for S. mutans was at a concentration of 12.5%. The MBC value of pure kefir grains was obtained at a concentration of 15% and the combination of kefir-sorbitol grains at a concentration of 12.5%. Grain kefir-sorbitol combination can reduce the growth of S. mutans on concentration 12.5%. Keywords: sorbitol, grain kefir, probiotik, Streptococcus mutans.

## Pendahuluan
Karies gigi adalah penyakit kronis jaringan keras gigi yang paling umum di seluruh dunia. Karies gigi disebabkan oleh dekalsifikasi bagian anorganik dan penghancuran bagian organik matriks gigi dengan adanya tiga faktor utama, yaitu inang, karbohidrat yang  dapat  difermentasi,  dan  bakteri  penghasil asam. Oleh karena itu, upaya pencegahan karies gigi sering difokuskan terhadap pengendalian aktivitas bakteri rongga mulut. Streptococcus mutans adalah salah satu spesies bakteri terpenting yang terlibat dalam demineralisasi email gigi dan inisiasi karies gigi. Berbagai metode termasuk aplikasi pasta gigi, senyawa  antibakteri  (misalnya  klorheksidin),  dan obat  kumur  yang  mengandung  fluorid  bersama dengan  penggunaan  pemanis  yang  tidak  dapat difermentasi  seperti  xylitol  telah  disarankan  untuk mengurangi aktivitas bakteri ini. 1
Xylitol  merupakan  gula  alkohol  lima  karbon yang  telah  banyak  digunakan  sebagai  pemanis tambahan  dalam  produk  bebas  gula,  seperti permen  karet,  obat  kumur  dan  pasta  gigi.  Xylitol menunjukkan  efek  pencegahan  terjadinya  karies gigi  melalui  pengurangan  plak  gigi  dan  jumlah S.  mutans .  Xylitol  tidak  hanya  mengurangi perkembangan biofilm dengan mengganggu adhesi bakteri,  tetapi  juga  bertindak  sebagai  transporter kalsium dan remineralisasi pada enamel gigi. 2 Efek permen  karet  yang  mengandung  xylitol  terhadap penurunan jumlah S. mutans di plak gigi dan saliva telah  dipublikasikan  oleh  Nayak  dkk. 3 Namun demikian,  xylitol  tidak  efektif  terhadap  bakteri  di rongga  mulut  pada  individu  dengan  jumlah  karies yang rendah. 3
Sorbitol  dan  xylitol  adalah  poliol  atau  gula alkohol  seperti  yang  merupakan  karbohidrat terhidrogenasi  alami  dan  didistribusikan  secara luas  ditumbuhan  dan  hewan.  Chan  dkk 4 sugar alcohols  (xylitol  and  sorbitol  telah  melaporkan efek  penghambatan  xylitol  dan  sorbitol  terhadap pemecahan  karbohidrat  yang  diukur  dengan pertumbuhan  mikroba  atau  produksi  asam  in vitro.  Sorbitol  adalah  hexitol  yang  memiliki  dua atom  hidrogen  lebih  banyak  daripada  glukosa atau  fruktosa.  Oleh  karena  itu,  metabolismenya memerlukan  induksi  sistem  transpor  spesifik yang  bergantung  energi  dan  jalur  metabolisme spesifik. S.  mutans tidak  menggunakan  sorbitol sebagai sumber sintesis glukan atau fruktan. Oleh karena itu, sorbitol memiliki efek terbatas terhadap produksi  asam  oleh S.  mutans berbeda  dengan sukrosa, fruktosa dan glukosa. 4
Produk dental dan makanan yang mengandung bakteri  probiotik,  mendapat  perhatian  yang meningkat  untuk  pencegahan  karies.  Menurut Organisasi  Kesehatan  Dunia  ( World  Health Organization )  dan  badan  pengawas  obat  dan makanan  Amerika  Serikat,  konsumsi  probiotik dalam  kadar  yang  memadai  menyebabkan  efek kesehatan  yang  menguntungkan  untuk  inang mikroorganisme ini. Pada studi ekologi mulut yang dilakukan  Srivastava  dkk 5 ,  telah  mengkonfirmasi efektifitas  bakteri  probiotik  dalam  mengurangi jumlah S.  mutans . 5 Namun  demikian,  penelitian lain  mendeteksi  jumlah S.  mutans yang  tidak berubah  setelah  konsumsi  produk  probiotik. Sehingga  saat  ini,  peran  bakteri  probiotik  dalam mempengaruhi  mikroflora  rongga  mulut  masih menjadi isu kontroversial. 1
Produk  makanana    berbahan    susu    yang mengandung  bakteri  probiotik  antara  lain  yogurt, keju, es krim dan kefir. Kefir adalah produk fermentasi susu dengan biji-bijian dan kultur induk yang dibuat dari biji-bijian. Biji-bijian ini mengandung asam laktat, bakteri asam asetat, dan campuran ragi digabungkan bersama dengan kasein. Kasein sendiri sudah banyak dikaitkan dengan pencegahan terjadinya karies dan hubungannya dengan proses demineralisasi enamel gigi. 6 Konsumsi kefir telah dilaporkan memiliki efek positif untuk kesehatan. Efek menguntungkan dari susu fermentasi ini sebagian dapat dikaitkan dengan penghambatan mikroorganisme patogen oleh produk metabolisme seperti asam organik yang dihasilkan oleh  mikroflora  kefir.  Namun,  publikasi  tentang efektifitas kefir terhadap karies gigi 7 dan penyakit periodontal masih terbatas.
Terkait  sifat  yang  menguntungkan,  kombinasi sorbitol dan kefir diharapkan dapat digunakan untuk menurunkan  risiko  karies.  Penelitian  ini  bertujuan untuk melihat efektifitas probiotik yang terbuat dari grain  kefir  yang  dikombinasikan  dengan  sorbitol terhadap pertumbuhan S. mutans secara in vitro.

## Metode
Rancangan penelitian yang digunakan adalah true  experimental  post-test  only  control  group design .  Pada  penelitian  ini  dilakukan  uji  KBM (Konsentrasi  Bakterisidal  Minimum)  dan  KHM (Konsentrasi  Hambat  Minimum)  di  Laboratorium Biologi  Oral  Fakultas  Kedokteran  Gigi  Universitas Brawijaya.  Penelitian  dilakukan  pada  bulan Januari-Februari  2023.  Bahan  uji  yang  digunakan adalah sorbitol, kefir dan kombinasi sorbitol dengan kefir . Protokol  penelitian  ini  telah  mendapatkan persetujuan dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan
Politeknik  Kesehatan  Kemenkes  Malang  Reg. No.739/KEPK-POLKESMA/ 2023.

## Pembuatan Grain Kefir Susu Sapi
Butir kefir diinokulasi ke dalam susu steril dan difermentasi  pada  suhu  25  C  hingga  tercapai  pH 4,4  selama  24  jam.  Gumpalan  dan  cairan  susu kemudian  dipisahkan  menggunakan  filter  plastik di  akhir  proses  fermentasi. 8 Proses  pembuatan dilakukan di Laboratorium Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran Universitas Brawajaya.
Pembuatan Suspensi S. mutans 9 Pembuatan  suspensi  uji  bakteri S.  Mutans diawali  dengan  membuat  inokulum  bakteri  dalam larutan Brain Hearth Infusion (BHI) broth (Merck) . 10 Media  BHI-B  ditimbang  sebanyak  37  gram  dan dilarutkan  dalam  1  liter  akuades  dalam  tabung erlenmeyer, kemudian dihomogenkan menggunakan stirre r (Thermo Fischer Scientific) dengan kecepatan 500 rpm selama 10 menit. Setelah homogen, media di sterilisasi dalam autoclave di suhu 121°C selama 15  menit.  Setelah  media  BHIB  siap,  dilanjutkan dengan inokulasi bakteri S. mutans dari cawan stok ke dalam media BHIB kemudian di sentifugasi dan disimpan  dalam  inkubator  selama  24  jam  pada suhu  37 o C.  Media  BHIB  yang  telah  berisi  bakteri dimasukkan ke dalam spektrofotometer (Shimadzu Spectrophotometer  uv-1900i),  kemudian  diukur Optical  Density (OD)  atau  kepadatan  optisnya dengan  spektrofotometer  pada λ  maks  =  625  nm setara dengan standar 0,5Mc Farland. 11 Dari hasil yang diperoleh (OD = 0,1) didapat suspensi bakteri yang  mengandung  1x10 8 colony-forming  units (CFU)/ml. Diilakukan dilusi sebanyak dua kali untuk mendapatkan koloni sebanyak 1x10 6 CFU/ml (1:100) dengan media BHI-B.

## Analisis Mikrobiologi S. mutans
Penelitian pendahuluan dilakukan untuk menentukan  rentang  konsentrasi  perlakuan  yang akan diteliti, yaitu dengan menggunakan konsentrasi kefir 3,125% dan 6,25%, 12,5%, 25%, 50% dan 100%, dengan dilakukan sebanyak dua kali pengulangan. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah dilusi tabung. Suspensi S.mutans yang telah diinkubasi sesuai  dengan  standar  kekeruhan  McFarland  0,5 kemudian diencerkan kembali hingga mencapai 10 6 CFU/ml.  Hasil  penelitian  pendahuluan  didapatkan konsentrasi 12,5% mulai terlihat  bening. Sehingga konsentrasi  perlakukan  yang  diambil  adalah  10%, 12,5%, 15%, 17,5%, 20%, 22,5% dan 25%.
Selanjutnya disiapkan 34 tabung steril dengan rincian:  tujuh  tabung  diisi  dengan  grain  kefir  yaitu konsentrasi  10%,  12,5%,  15%,  17,5%,  20%, 22,5%,  25%;  Tujuh  tabung  diisi  kombinasi  grain kefir  dengan  konsentrasi  yang  sama  di  tambah sorbitol  0,08  gram;  Tiga  tabung  sebagai  kontrol berisi  sorbitol  0,08  gr,  aquades  dan  klorheksidin sebanyak  1  ml.  semua  34  tabung  ditambahkan  1 ml  suspensi  bakteri  dan  diinkubasi  dalam  kondisi anaerobik  dalam anaerobic  jar selama  24  jam disuhu  37°C.  Nilai  konsentrasi  hambat  minimum ditentukan  dengan  mengukur  kekeruhan  masing- masing tabung menggunakan kertas putih bergaris hitam  dengan  tabung  kontrol  digunakan  sebagai pembanding.  Setelah  itu,  masing-masing  tabung diberi label berdasarkan kejernihannya.
Setelah  nilai  KHM  ditentukan,  tabung  yang mulai terlihat bening diambil dengan ose kemudian digores  pada  BHI-A  ( Brain  Heart  Infusion  Agar), dan  diinkubasi  kembali  dalam anaerobic  jar selama  24  jam  di  suhu  37°C.  Setelah  24  jam, koloni bakteri yang tumbuh dihitung menggunakan colony  counter .  Konsentrasi  bakterisidal  minimum ditentukan dengan menghitung  0,1% dari Original inoculum (OI) , yang  merupakan  bakteri  dengan konsentrasi  10 6 CFU/ml  yang  ditanamkan  dalam kultur media agar sebelum inkubasi. 12

## Hasil
Uji  pendahuluan  didapatkan  konsentrasi 3,125%  sangat  keruh,  6,25%  keruh,  12,5%  jernih sedikit  keruh,  25%  jernih,  50%  keruh  dengan endapan  dan  100%  sangat  keruh  (Gambar  1). Pada  uji  pendahuluan  ini  ditetapkan  konsentrasi 12,5% sebagai nilai KHM.
Gambar 1.  Visualisasi  tabung  uji  tabung  pendahuluan konsentrasi A.  100%,  B.  50%,  C.  25%,
D.12,5%, E. 6,25% dan F. 3,125%.
Tabel 1 merupakan uji tabung KHM grain kefir murni  dan  kombinasi  sorbitol  dengan  rentang konsentrasi  dari  uji  pendahuluan  yaitu  12,5%,
15%,  17,5%,  20%,  22,5%,  25%,  sorbitol  0,08  gr, aquades  dan  klorheksidin.  Nilai  KHM  ditentukan dengan  melihat  kekeruhan  tabung  uji.  Hasilnya didapatkan  untuk  grain  kefir  murni  konsentrasi 15%    mulai    menunjukkan    hasil    yang    jernih,
sehingga  konsentrasi  ini  disimpulkan  menjadi nilai  KHM.  Sedangkan  konsentrasi  KHM  untuk kombinasi  grain  kefir  dan  sorbitol  didapatkan  di konsentrasi  12,5%  yang  ditandai  dengan  mulai terlihat jernih.
Tabel 1. Uji Tabung Konsentrasi Hambat Minimum Grain Kefir Murni
Perlakuan Konsentrasi Keterangan Kefir 10% Sangat keruh 12,5% Keruh 15%* Jernih 17,5% Jernih 20% Jernih 22,5% Jernih 25% Jernih Kombinasi Kefir dan Sorbitol 10% Keruh 12,5%* Jernih 15% Jernih 17,5% Jernih 20% Jernih 22,5% Jernih 25% Jernih Kontrol Positif Chlorhexidine Jernih Kontrol Negatif Aquades Sangat keruh Sorbitol 0,08 gram Jernih Keterangan: (*) Nilai KHM Tabel 2. Uji Konsentrasi Bakterisidal Minimum Grain Kefir Murni dan Kombinasi Perlakuan Pengulangan dan Jumlah Koloni Rata-Rata I II III OI 272 299 292 287,6 Grain kefir 10% 268 254 261 261 12,5% 132 134 123 129,6 15% * 0 0 0 0 17,5% 0 0 0 0 20% 0 0 0 0 22,5% 0 0 0 0 25% 0 0 0 0 Kombinasi Grain kefir + Sorbitol 10% 62 52 38 50,6 12,5% * 0 0 0 0 15% 0 0 0 0 17,5% 0 0 0 0 20% 0 0 0 0 22,5% 0 0 0 0 25% 0 0 0 0 Kontrol positif Khlorhexidine 0 0 0 0 Kontrol negatif Aquades 316 288 276 293,0 Sorbitol 0,08 gram 100 57 72 76,3 Keterangan: (*) Nilai KBM
Tabel 2 adalah rata-rata hasil perhitungan koloni S.mutans menggunakan colony counte r dan Gambar 2 adalah visualisasi colony counter untuk menemukan nilai KBM. Nilai KBM grain kefir serta kombinasi grain kefir dan sorbitol terhadap pertumbuhan S.mutans ditentukan jika pertumbuhan koloni bakteri adalah 0
atau kurang dari 0,1% dari OI. Nilai OI adalah 154 CFU/ml, jadi 0,1% darinya adalah 0,154. Berdasarkan persyaratan  tersebut,  KBM  dari  grain  kefir  adalah konsentrasi  15%  serta  kombinasi  grain  kefir  dan sorbitol terhadap S.mutans mempunyai KBM pada konsentrasi grain kefir 12,5%.
Gambar  2.  Visualisasi  Koloni  S.Mutans  Menggunakan  Colony  Counter  untuk  Menentukan  Nilai KBM. A Kelompok grain kefir murni. B Kelompok kombinasi grain kefir dan sorbitol. C Kelompok (+) Klorhexidine, (-) Aquades

## Diskusi
Penelitian  Dhar  dkk 13 menunjukkan  konsumsi tinggi  sukrosa  dan  gula  dapat  menyebabkan terjadinya  karies,  sehingga  mulai  digalakkan konsumsi gula rendah atau non-fermentasi seperti xylitol  dan  sorbitol.  Sorbitol  mengurangi  produksi asam di plak gigi yang berperan dalam pembentukan karies  awal. 13 Penelitian  ini  merupakan  penelitian pendahuluan  untuk  pembuatan  produk  dengan komposisi  bahan  mengandung  sorbitol  dan  kefir. Pemilihan  dosis  sorbitol  0,08  gram  adalah  berat rata-rata sorbitol yang ada dalam kandungan bahan makanan  yang  memiliki  berat  3  gram. 14 Wicklow, Ireland  Sorbitol  adalah  poliol  yang  paling  umum digunakan  sebagai  alternatif  untuk  gula  dengan kalori rendah. 15
Penelitian  oleh  Chan  dkk 4 mengungkapkan efek  penghambatan  yang  signifikan  terhadap pembentukan biofilm S. mutans, ketika xylitol atau sorbitol digunakan secara tunggal. Penelitian Chan dkk 4 juga menemukan hal sebaliknya, suplementasi sukrosa  secara  signifikan  mengurangi  efek penghambatan  poliol  terlepas  dari  adanya  xylitol, sorbitol atau kombinasi pada konsentrasi 10%, yang terbukti dari kuantifikasi biofilm dan teknik pencitraan. 4
Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa produk kesehatan yang mengandung gula poliol, tidak akan mampu mencegah plak gigi yang mengandung S. mutans , jika tersedia banyak sukrosa di rongga mulut. 4 Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  hal  yang  hampir serupa, yaitu pada uji tabung larutan sorbitol 0,08 gr menunjukkan hasil cairan yang jernih dan pada colony counter menunjukkan jumlah rata-rata koloni bakteri adalah  76,3.  Penelitian  Chan  dkk 4 menggunakan dosis  yang  lebih  tinggi  yaitu  10%  sehingga jumlah  koloni  bakteri  yang  didapatkan  berbeda. Penelitian Rafeek dkk 15 menunjukkan sorbitol juga mempengaruhi beberapa spesies Streptokokus lain dalam air liur, termasuk meningkatkan kelimpahan S.  cristatus yang  merupakan  bakteri  komensal oral  sehinggamenghambat  bakteri  terkait  dengan penyakit periodontitis kronis. 15
Kefir adalah produk susu yang dihasilkan dari fermentasi  berbagai  susu  hewani  (yaitu  kambing atau  sapi)  dengan  menambahkan  biji  kefir.  Butir kefir  berwarna  kuning  dengan  ukuran  diameter bervariasi  dari  1 –6  mm.  Kualitas  kefir  sangat dipengaruhi oleh jenis susu yang digunakan, dosis butir  kefir,  jenis  bakteri  asam  laktat,  khamir,  dan waktu inkubasi. 16 Kefir juga dikenal dengan berbagai
nama  yaitu  kefyr,  kephir,  kefer,  kiaphur  knapon, kepi  atau  kippi.  Gao  and  Li 17 melaporkan  spesies mikroflora  pada  kefir  dan  biji  kefir  adalah  bakteri asam laktat ( Lactobacilli, Lactococci, Streptococci ), bakteri asetat dan ragi ( Candida sp., Kazachstania sp., Kluyveromyces sp., Saccaromyces sp., Torulosis Sp. , Zygosaccharomyces sp .). 17
Hasil  penelitian  menunjukkan  grain  kefir murni  dapat  menghambat pertumbuhan S. mutans pada  konsentrasi  KHM  12,5%  dan  15% untuk  KBM.  Hal  ini  sejalan  dengan  penelitian  Lin dkk 18 tentang  pengaruh Lactobacillus probiotik terhadap S.  mutans .  Studi  in  vitro yang  dilakukan oleh  Lin  dkk 18 membuktikan  bahwa  spesies Lactobacillus probiotik  telah  menunjukkan  efek penghambatan  terhadap  pertumbuhan S.  mutans dengan  mengubah  komposisi  biofilm  saliva  yang berperan  penting  terhadap  terjadinya  karies  gigi. Kim  dan  Lee  melakukan  penelitian  tentang  efek penghambatan dari Lactococcus lactis HY 449 dan menemukan  bahwa  strain  probiotik Lactococcus lactis HY 449 membantu pencegahan pembentukan biofilm  kariogenik.  Hal  ini  disebabkan  oleh  efek penghambatan  ekspresi  gen  glikosiltransferase oleh Lactococcus  lactis yang  berperan  penting dalam  metabolisme  sukrosa  oleh S.  mutans . 19 Penelitian  Reddy  dkk 20 melaporkan  konsumsi probiotik susu kefir telah mampu menurunkan CFU S.  mutans pada  penelitian  in  vivo  dengan  subjek penelitian anak usia 8-12 tahun. Penelitian in vivo pada  subjek  usia  22-32  tahun  yang  dilakukan Ghasempour  dkk 21 menunjukkan  kelompok  subjek yang  menggunakan  obat  kumur  sodium  fluoride dan  subjek  yang  meminum  kefir  keduanya  dapat menghambat pertumbuhan S. mutans. 21
Pada  penelitian  uji  tabung  grain  kefir  murni diperoleh  hasil  konsentrasi  12,5%  tampak  jernih sedikit  keruh,  25%  berwarna  jernih,  50%  keruh dengan endapan dan 100% sangat keruh. Pada uji KBM grain kefir murni didapatkan konsentrasi 15% sampai dengan 25% tidak ditemukan pertumbuhan bakteri  pada colony  counter .  Fenomena  ini dimungkinkan  adanya  penggunaan  aquades sebagai pelarut untuk kefir. Komposisis kefir terdiri atas  asam  laktat,  protein,  karbohidrat  dan  lemak. Lemak  merupakan  senyawa  non  polar. 22 Lemak berpengaruh  pada  kelarutan  kefir  dalam  aquades yang  bersifat  polar.  Disamping  itu  kefir  memiliki viskositas tinggi karena dipengaruhi oleh curd kefir akibat bakteri asam laktat (BAL) selama fermentasi dan  pertumbuhan  starter  bakteri  menghasilkan eksopolisakarida yang akan memproduksi molekul
yang  besar. 23 Karakter  kimia  aquades  dan  kefir inilah  yang  menyebabkan  munculnya  kekeruhan dan  endapan  pada  larutan  dengan  konsentrasi kefir yang tinggi, dikarenakan aquades tidak dapat melarutkan kefir secara sempurna.
Kekurangan  dari  kefir  adalah  memiliki  rasa asam yang cenderung kurang disukai. Chen dkk 24 melaporkan  bahwa  rasa  asam  kefir  disebabkan oleh asam laktat, dan muncul buih karena karbon dioksida, dan konsentrasi alkohol dari aksi sel ragi dalam  biji-bijian.  Kefir  mengandung  campuran kompleks  bakteri  asam  laktat,  bakteri  asetat, dan  ragi. Untuk  mengurangi  rasa  asam  dapat dilakukan  dengan  mencampurkan  beberapa  jenis gula. Karena latar belakang inilah pada penelitian ini  dilakukan  kombinasi  dengan  sorbitol  dengan mempertimbangkaan  efek  anti  kariogenik  yang dimiliki oleh sorbitol.
Keterbatasan  dari  penelitian  ini  adalah  tidak dilakukan  identifikasi  bakteri  probiotik  yang terdapat dalam grain kefir yang digunakan. Namun proses  pembuatan  grain  kefir  telah  mendasarkan pada penelitian sebelumnya. 8 Kekuataan dari studi ini  adalah  masih  terbatasnya  penelitian  terkait efektifitas kombinasi grain kefir dan sorbitol dalam penghambatan S. mutans , sehingga hasil penelitian ini  dapat  menjadi  referensi  untuk  pengembangan penelitian selanjutnya.

## Kesimpulan
Kombinasi kefir dan sorbitol dengan konsentrasi 12,5% dapat menurunkan pertumbuhan S. mutans secara in-vitro. Penelitian ini membuktikan adanya kombinasi yang baik antara sorbitol dan kefir dalam menghambat pertumbuhan S. mutans .

## Daftar Pustaka
1.  Ghasemi  E,  Mazaheri  R,  Tahmourespour  A.  Effect  of probiotic yogurt and xylitol-containing chewing gums on  salivary S.  mutans count.  J  Clin  Pediatr  Dent. 2017;41:257-63. doi: 10.17796/1053-4628-41.4.257
2.  Janakiram  C,  Deepan  Kumar  C  .,  Joseph  J.  Xylitol in preventing dental caries: A systematic review and meta-analyses.  J  Nat  Sci  Biol  Med.  2017;8:16-21. doi: 10.4103/0976-9668.198344
3.  Nayak PA, Nayak UA, Khandelwal V. The effect of xylitol on dental caries and oral flora. Clin Cosmet Investig Dent. 2014;6:89-94. doi: 10.13181/mji.v6i3.826
4.  Chan  A,  Ellepola  K,  Truong  T,  Balan  P,  Koo  H, Seneviratne  CJ.  Inhibitory  effects  of  xylitol  and sorbitol  on Streptococcus  mutans and Candida albicans biofilms  are  repressed  by  the  presence of  sucrose.  Arch  Oral  Biol.  2020;119:104886.  doi: 10.1016/j.archoralbio.2020.104886
5.  Srivastava  S,  Saha  S,  Kumari  M,  Mohd  S.  Effect of  probiotic  curd  on  salivary  ph  and  s treptococcus mutans : A double blind parallel randomized controlled trial.  J  Clin  Diagnostic  Res.  2016;10:ZC13-6.  doi: 10.7860/JCDR/2016/15530.7178
6.  Sutanti V, Hartami E, Milla L El, Saharani F. Etawa goat milk ’ s casein as an antibacterial agent against
Streptococcus  mutans on  primary  tooth  Etawa
Goat Milk’s casein as an antibacterial agent against Streptococcus  mutans on  primary  tooth.  AIP  Conf Proc. 2022;2513:020011. doi: 10.1063/5.0099363
7.  Cogulu D, Topaloglu-Ak A, Caglar E. Potential effects of a multistrain probiotic-kefir on salivary Streptococcus mutans and Lactobacillus spp . J Dent Sci. 2010;5:144- 9. doi: 10.1016/S1991-7902(10)60021-9
8.  Farag  MA,  Jomaa  SA,  Aida  AE-WE-S,  Hesham  R. The  many  faces  of  kefir  fermented  dairy  products. Nutrients. 2020;12:346. doi: 10.3390/nu12020346
9.  Sutton S. Determination of inoculum for microbiological testing. J GXP Compliance. 2011;15:49-53.
10.  Sulistiowati  CP,  Suhartono  M,  Rahmawati  DF.  In- Vitro Inhibitory Efficacy of 3 Types of probiotics on the growth  of Aggregatibacter  actinomycetemcomitans bacteria. Front Biosci. 2023;28:106. doi: 10.31083/j. fbl2805106
11.  Leber AL. Preparation of routine media and reagents used in antimicrobial susceptibility testing. in: clinical microbiology  procedures  handbook.  Washington, DC: ASM Press. 2016. doi: 10.1128/9781555818814. ch5.20.1
12.  Sutanti V, Destyawati AA. The use of yellow kepok bananapeelextract( MusaparadisiacaL.varbluggoe ). J  Smart  Bioprospecting  Technol.  2019;01:16-20. doi: 10.21776/ub.jsmartech.2019.001.01.4
13.  Dhar V, Tinanoff N. The role of sugar alcohols in caries prevention. Dimens Dent Hyg. 2016;14(5):58-61.
14.  Alshibani  N,  Shalabi  M,  AlMugbel  K,  AlSaqer  E, AlFarraj N, Allam E. Xylitol content and acid production of  chewing gums  available  in the  markets  of  Saudi Arabia. Saudi Dent J. 2022;34:121-8. doi: 10.1016/j. sdentj.2021.11.001
15.  Rafeek  R,  Carrington  CVF,  Gomez  A.  Xylitol  and sorbitol  effects  on  the  microbiome  of  saliva  and plaque.  J  Oral  Microbiol.  2019;11:1536181.  doi: 10.1080/20002297.2018.1536181
16.  Alraddadi FAJ, Ross T, Powell SM. Evaluation of the microbial communities in kefir grains and kefir over time.  Int  Dairy  J.  2023;136:105490.  doi:  10.1016/j. idairyj.2022.105490
17.  Gao  X,  Li  B.  Chemical  and  microbiological characteristics of kefir grains and their fermented dairy products: A review. Cogent Food Agric. 2016;2. doi: 10.1080/23311932.2016.1272152
18.  Lin  X,  Chen  X,  Tu  Y,  Wang  S,  Chen  H.  Effect  of probiotic lactobacilli on the growth of Streptococcus mutans and  multispecies  biofilms  isolated  from children  with  active  caries.  Med  Sci  Monit. 2017;23:4175-81. doi: 10.12659/MSM.902237
19.  Kim  Y-J,  Lee  S-H.  Inhibitory  Effect  of  Lactococcus lactis  HY  449  on  Cariogenic  Biofilm.  J  Microbiol Biotechnol. 2016;26:1829-35. doi: 10.4014/ jmb.1604.04008
20.  Reddy  S,  Madhu  V,  Punithavathy  R,  Satyam  M, Chowdary UK, Mythraiye R. Comparative evaluation of  efficacy  of  kefir  milk  probiotic  curd  and  probiotic drink  on Streptococcus  mutans in  8 –12-year-old children:  An  in  vivo  study.  Int  J  Clin  Pediatr  Dent. 2021;14:120-7. doi: 10.5005/jp-journals-10005-1883 21.  Ghasempour  M,  Sefdgar  SAA,  Moghadamnia  AA, Ghadimi R, Gharekhani S, Shirkhani L. Comparative study  of  kefir  yogurt-drink  and  sodium  fluoride mouth  rinse  on  salivary  mutans  streptococci.  J Contemp  Dent  Pract.  2014;15:214-7.  doi:  10.5005/ jp-journals-10024-1517
22.  Kurniati  T,  Windayani  N,  Listiawati  M.  Total  Lactic acid, protein, fat, and carbohydrates in curd kefir and cow  colostrum  kefir.  J  Biodjati.  2020;5:271-80.  doi: 10.15575/biodjati.v5i2.9668
23.  Amelia  F,  Taufik  E,  Arief  I.  Karakteristik  Kefir Susu  Sapi  Dengan  Penambahan  Ekstrak  Bunga Telang  (Clitoria  ternatea).  J  Ilmu  Pertan  Indones. 2022;28:34-45. doi: 10.18343/jipi.28.1.34
24.  Chen  MJ,  Liu  JR,  Lin  CW,  Yeh  YT.  Study  of  the microbial and chemical properties of goat milk kefir produced by inoculation with Taiwanese kefir grains. Asian-Australasian  J  Anim  Sci.  2005;18:711-5.  doi: 10.5713/ajas.2005.711