12
KARTIKA-JURNAL ILMIAH FARMASI, Des 2015, 3(2), 12-17 p- ISSN 2354-6565 / e- ISSN 2502-3438
UJI PENGHAMBATAN AKTIVITAS ENZIM XANTIN OKSIDASE TERHADAP EKSTRAK KULIT KAYU SECANG ( Caesalpinia sappan L.)
Pertamawati & Mutia Hardhiyuna Pusat Teknologi Farmasi dan Medika-LAPTIAB-BPPT Kawasan PUSPIPTEK Serpong – Banten Selatan Corresponding author email ; pertamawatikartakusumah@gmail.com

## ABSTRAK
Enzim  xantin  oksidase  adalah  enzim  yang  berperan  sebagai  katalisator  dalam  proses  oksidasi hipoxantin  menjadi  xantin  dan  kemudian  menjadi  asam  urat . Asam  urat  adalah  produk  dari metabolisme  purin  yang  mengendap  di  persendian  dan  membentuk  kristal  sehingga menimbulkan rasa nyeri yang hebat dan kaku, menyebabkan pembesaran dan penonjolan sendi. Obat sintetik yang biasa digunakan untuk  mengatasi asam urat adalah allopurinol. Allopurinol bekerja  menghambat pembentukan asam urat dari prekursornya (xantin dan hipoxantin).  Akan tetapi  allopurinol  memiliki  beberapa  efek  samping,  kadang–kadang  terjadi  toksisitas  pada gastrointestinal dan meningkatkan serangan akut gout pada awal terapi. Oleh karena itu, banyak masyarakat memanfaatkan tanaman  obat sebagai anti asam urat karena memiliki efek samping yang  relatif  kecil,  mudah  didapatkan,  dan  harganya  relatif  murah  dibandingkan  dengan  obat sintesis. Kulit kayu secang ( Caesalpinia sappan L.), ternyata memiliki kemampuan sebagai anti asam  urat.  Hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan  memperlihatkan  bahwa  ekstrak  kulit  kayu secang  mampu  menghambat  aktivitas  enzim  xantin  oksidase  sampai  56,47%,  sementara allopurinol  mampu  menghambat  aktivitas  enzim  xantin  oksidase  sampai  87,47%.  Hasil penelitian  ini  membuktikan  bahwa  kulit  kayu  secang  memiliki  aktivitas  penghambatan  enzim xantin oksidase, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai obat tradisional anti asam urat.
Kata kunci : xantin oksidase, kulit kayu secang, asam urat

## ABSTRACT
Xanthine oxidase is an enzyme that act as catalyst in the process of oxidizing hypoxanthine to become xanthine and then into uric acid. Uric acid is the product of metabolism of purine that settles in the joints and form crystal that sparks great pain and stiffness, also an enlargement and  protrusion  of  swollen  joints.  As  synthetic  drug  commonly  used  to  overcome  uric  acid  is allopurinol. Allopurinol work by inhibiting the formation of uric acid precursor (xanthine and hypoxanthine), however allopurinol have few side effects, sometimes occurs in gastrointestinal toxicity  and  increase  gout  attack  acute  at  the  beginning  of  therapy.  Hence,  many  people  use medicinal plants as anti uric acid because it has less side effects, easy to get and are relatively inexpensive as opposed to synhesis medicine. Bark of secang (Caesalpinia sappan L.).have the capability  to  inhibit  of  the  activity  of  the  xanthine  oxidase  until  56,473%,  while  allopurinol capable  of  inhibiting  the  activity  of  the  xanthine  oxidase  until  87,474%.  The  result  of  this research proves that bark of secang having activity to inhibit of xanthine oxidase, so that it can be used as traditional medicines for anti uric acid.
Keywords : xanthine oxidase, bark of secang, inhibitory activity.

## PENDAHULUAN
Xantin  oksidase  adalah  enzim  yang berperan  sebagai  katalisator  dalam  proses oksidasi  hipoxantin  menjadi  xantin  dan kemudian  menjadi  asam  urat  xantin  oxidase
merupakan enzim yang mereduksi O 2 menjadi H 2 O 2 dalam  sitosol  dan  diperkirakan  faktor utama dalam cedera iskemia terutama pada sel mukosa  usus.  Xantin  oksidase  merupakan homodimer  katalitik  subunit  independent, adalah  enzim  yang  mengkatalisis  hipoxantin
menjadi xantin dan xantin menjadi asam urat, yang merupakan jalur degradasi purin.
Asam urat adalah produk dari metabolisme purin  yang  mengendap  di  persendian  dan membentuk kristal kecil
sehingga menimbulkan rasa nyeri yang hebat dan kaku, juga  pembesaran  dan  penonjolan  sendi  yang bengkak.  Pada  kondisi  tertentu  dapat  terjadi peningkatan  kadar  asam  urat  dalam  darah melebihi batas normal yang disebut hiperurisemia  (Walker  dan  Edward,  2003). Hiperurisemia  dapat  disebabkan  oleh  tingkat produksi  asam  urat  yang  berlebih,  ekskresi asam urat melalui  ginjal yang berkurang atau kombinasi keduanya  (Wibowo,  2006). Hiperurisemia  yang  lanjut  dapat  berkembang menjadi gout. Gout merupakan jenis penyakit metabolik yang keberadaannya cukup populer dikalangan  masyarakat  dengan  sebutan  pirai (Price dan Wilson, 2005).
Obat  sintetik  yang  biasa  digunakan  untuk mengatasi  asam  urat  adalah  allopurinol. Allopurinol  merupakan  suatu  analog  asam urat, bekerja menghambat pembentukan asam urat dari prekursornya (xantin dan hipoxantin) dengan  menghambat  aktivitas  enzim  xantin oksidase  (Price  dan  Wilson,  2005).  Akan tetapi  allopurinol  memiliki  beberapa  efek samping  yaitu  kemerahan  pada  kulit, leukopenia,  kadang–kadang  terjadi  toksisitas pada  gastrointestinal  dan  meningkatkan serangan  akut  gout  pada  awal  terapi  (Dipiro dkk.,  2005).  Oleh  karena  itu,  sekarang masyarakat  banyak  yang  menggunakan tanaman  obat  sebagai  obat  tradisional  karena memiliki  efek  samping  yang  relatif  kecil, mudah didapatkan, dan harganya relatif murah dibandingkan dengan obat sintesis.
Kulit kayu secang ( Caesalpinia sappan L.) secara  empiris  dimanfaatkan  sebagai  bahan untuk  pengobatan  penyakit  asam  urat. Berbagai  macam  zat  yang  terkandung  dalam kulit  kayu  secang  antara  lain  brazilin, alkaloid,  falvonoid,  saponin,  tanin,  fenil propana  dan  terpenoid.  Selain  itu  juga mengandung  asam  galat,  brasilein,  delta-a phellandrene, oscimene, resin dan resorin. (Xu dkk, 1994. ) Penelitian  mengenai efek secang sebagai  agen  anti  hiper  urisemia  masih dirasakan  kurang,  padahal  potensi  biologis secang  cukup besar, sehingga dirasakan perlu dilakukan  penelitian  secang  sebagai  gen  anti hiper urisemia.
Tujuan  percobaan  ini  ialah  untuk mengetahui kemampuan penghambatan aktivitas  enzim  Xantin  oksidase  terhadap sampel ekstrak kulit kayu secang ( Caesalpinia sappan L.).  Pengolahan  data  yang  diperoleh dilakukan  secara  metoda  statistik  analisis varian  dan  untuk  menguji  perbedaan  nilai rata-rata  antar  dua  perlakuan  digunakan metode  Uji Wilayah  Berganda Duncan. Hasil percobaan  diharapkan  dapat  memberikan informasi  dalam  meningkatkan  kesehatan dengan mengembangkan Obat Herbal Terstandar (OHT). Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat Teknologi Farmasi dan Medika – LAPTIAB – TAB – BPPT.

## METODE

## Bahan
- Bahan  utama  simplisia  kering  kulit  kayu secang,  dihaluskan  menjadi  potongan- potongan kecil berukuran sekitar 1 mm.
- Bahan  kimia  terdiri  dari  DMSO  (Sigma), K 2 HPO 4 (Sigma  P  0662),  NaOH  (Sigma 221465),  HCl  (Merck),  xantin  (X0626), xantin  oksidase  (Sigma  X4375)  pelarut perkolasi etanol 96% allopurinol,
aquadest bebas CO 2 Alat . Peralatan ekstraksi perkolasi (perkolator)  dari  Buchi  Pump  Controller  C- 610  dan  Buchi  Pump  Module  C-610. Peralatan Spektrofotometer
Shimadzu
Pharmaspec UV 1700.
Identifikasi  Tanaman. Tanaman  secang (kulit kayu), dideterminasi di Research Center for  Biology,  Indonesian  Institute  for  Science (LIPI).
Pembuatan Ekstrak. - Bahan  tanaman  dibersihkan,  dikeringkan dalam  oven  pada  suhu  55 o C  dan dihaluskan.  Pengeringan  dihentikan  bila kadar air telah mencapai sekitar 3%.
- Simplisia  ditimbang  sebanyak  20  gram, dibungkus  kertas  saring  sepanjang  tabung perkolator  bercorong  (panjang  28  cm diameter  4  cm).  Masukkan  bungkusan simplisia  tersebut  dengan  cara  disumbat (kertas  saring  pembungkus  diikat  atau digulung)  di  bagian  bawah  supaya simplisia tidak  keluar ketika alat perkolasi
dijalankan,  selanjutnya  alat  perkolasi tersebut ditutup.
- Pelarut  dimasukkan  ke  dalam  wadah (bejana),  pipa  palstik  kecil  dipasangkan dari bejana ke mesin motor perkolator
- Mesin motor perkolator dinyalakan sampai simplisia  terendam  larutan,  selanjutnya mesin  motor  dimatikan  dan  biarkan perendaman berlangsung selama ½ jam.
- Mesin  motor  dinyalakan  kembali  da biarkan perkolator bekerja selama 11/2 jam sampai diperoleh ekstrak yang diharapkan.
Persiapan Larutan
a. Pembuatan  larutan  dapar  kalium  fosfat pH 7,5 (50 mM)
- Timbang K 2 HPO 4 (40,6 mL) = 40,6 mL x 174,18 g/1000 mL = 7,071 g
- Timbang K 2 HPO 4 (9,4 mL) = 9,4 mL x 136,09 g/1000 mL = 1,279 g
- Kedalam  beaker  gelas  1  L,  masukkan kedua  bahan  kimia  tersebut,  tambah dengan  900  mL  aqua  bidestilata  (yang sudah  dipanaskan  bebas  O 2 dan  CO 2 ).
Aduk hingga larut.
- Tetapkan  pH  hingga  7,5  dengan penambahan NaOH 0,1 M/HCl 0,1 M.
- Baru  di  tambahkan  dengan  aqua bidestilata hingga 1 L.
Catatan: untuk membuat 500 mL berat K 2 HPO 4 = 3,536 g (=7,071:2) berat KH 2 PO 4 = 0,639 g (=1,279 : 2). K 2 HPO 4 (BM=174,18) KH 2 PO 4 (BM=136,09)
b. Pembuatan  larutan  substrat  0,75  mM (xantin,  BM  152,11)  (dibuat  fresh). Ditimbang  sejumlah  22,8  mg  +  300  µL NaOH  encer.  Kocok  hingga  larut  dalam tabung  eppendrof.  Tambahkan  dengan aquadest  hingga  18  mL,  tentukan  pH hingga  7,5  dengan  menggunakan  larutan HCl/NaOH  encer.  Tambahkan  dengan aquadest  hingga  20  mL.  Larutan  kerja dibuat dengan mengencerkan stok menjadi 1/10x-nya.
c. Pembuatan larutan enzim
- Pembuatan larutan stok enzim
Ditimbang sejumlah 10  mg (~0,12 unit per  mg  padatan)  enzim  kemudian dilarutkan dalam 1 mL dapar fosfat pH 7,5,  suhu  kamar.  Kocok  hingga homogen  dan  dibagi  dalam  10 microtube (1,2  unit/ml),  simpan  dalam frezzer .  Yang  sudah  dicairkan  tidak boleh  dimasukkan  ke  dalam freezer kembali.
- Pembuatan  larutan  kerja  enzim  0,3 unit/ml
Larutan  kerja  adalah  mengencerkan larutan  stok  dengan  perbandingan  1:4 dengan dapar fosfat pH 7,5.
d. Pembuatan larutan sampel
- Larutan Stok (LS): Ditimbang sejumlah 10  mg  ekstrak,  tambahkan  200  µl DMSO  (20xberat  ekstrak)  vortek hingga larut. Kemudian tambahkan 300 µl  dapar  fosfat  (30x  berat  extract)  vortex  hingga  larut,  diperoleh  larutan uji  dengan  konsentrasi  20.000  ppm (LS=larutan stok1).
- Larutan  kerja  (LK).  LS  diencerkan 1/20x  dengan  dapar  fosfat  pH  7,5 hingga  diperoleh  larutan  kerja  (LK) dengan  konsentrasi  1000  ppm.0,05  mL LS1  +  0,95 mL dapar fosfatpH 7,5  konsentrasi 1.000 ppm
e. Pembuatan larutan pembanding (Allopurinol)
-  Satu tablet allopurinol (100 mg) digerus hingga  halus,  kemudian  dimasukan  ke dalam  labu  ukur  5  mL  dan  ditambah dengan dapar fosfat hingga batas.
- Disonikasi  selama  5  menit  pada  suhu kamar  dipindahkan  dalam  ependrof 1 mL  disentrifuse hingga didapatkan supernatant,  konsentrasi  larutan  ialah 2x10 4 ppm.
- Diencerkan  1/20  x  0,05  mL  stok  +
0,95 mL dapar fosfat  1.000 ppm.
f. Pelaksanaan pengujian
Proses  pengujian  inhibisi  xantin  oksidase dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  dengan  kuvet
kuarsa  3  mL  pada  panjang  gelombang 290 nm dengan prosedur sebagai berikut :
- Ke  dalam  kuvet  kuarsa  3  mL dimasukkan secara berturut-turut sampel  uji,  dapar  fosfat  dan  substrat xantin.  Kemudian  diinkubasi  pada
37 o C selama 5 menit.
- Selanjutnya  reaksi  dimulai  dengan penambahan  larutan  enzim  xantin oksidase dan dikocok hingga homogen. Inkubasi  tetap  dilakukan  pada  suhu 37 o C.
- Tambahan  larutan  untuk  menghentikan reaksi, yakni larutan HCL 0,5 M
- Dilakukan pengukuran kadar asam urat yang terbentuk selama 4 menit.
- Dibuat  kontrol  enzim  dimana  sampel diganti dengan dapar fosfat.
- Blanko  dibuat  sebagai  berikut:  blanko sampel  dibuat  dengan  menambahkan sampel+xantin+  dapar  fosfat  tanpa enzim. Blanko kontrol enzim digunakan xantin+dapar fosfat.
- %  inhibisi  xantin  oksidase  dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
% inhibisi= (1 – slope sampel) Slope kontrol enzim ×100%
Komposisi  pereaksi  pada  pengukuran inhibisi  xantin  oksidase  dituliskan  dalam Tabel 1 sebagai berikut :
Tabel 1. Komposis Pereaksi Pada Pengukuran Inhibisi Xantin Oksidase Kontrol Enzim  Blanko Enzim  Sampel/Allopurinol  Blanko Sampel Sampel/allopurinol -- 100 100 bp 800 840 700 740 Xantin 160 160 160 160 ----- inkubasi pada 37 0 C selama 5 menit XO 40 -- 40 --
-----inkubasi pada 37 0 C dan ukur absorbansinya setiap menit selama 4 menitpada λ mak  290 nM
Analisis data. Data yang diperoleh berupa hasil pengukuran serapan secara
spektrofotometri  UV  Data  yang  diperoleh (unit/ml  enzim)  digunakan  untuk  menghitung aktivitas dalam unit/mg solid. Data digunakan untuk  menghitung  persentase  penghambatan xantin  oksidase  dengan  rumus:  Nilai  IC50 (konsentrasi  inhibitor  yang  menghasilkan penghambatan  aktivitas  xantin  oksidase sebesar  (50%)  dapat  ditentukan  dengan analisis  regresi  linier  antara  konsentrasi senyawa uji terhadap
persentase penghambatan  aktivitas  xantin  oxsidase, kemudian  dilanjutkan  denganuji  statistik dengan uji t dengan taraf kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebelum  analisis  dilakukan,  terlebih dahulu dicari berapa panjang gelombang yang sesuai untuk analisis dengan alat spektrofotometer. Pencarian panjang
gelombang  yang  sesuai  dilakukan  dengan mengukur  panjang  gelombang  salah  satu ekstrak  dan  dihitung  berapa  besar  nilai spektrofotometri-nya  berdasarkan  panjang
gelombang  yang  diberikan (300  nm, 295  nm, 290  nm,  285  nm  dan  280  nm).  Hasil  yang diperoleh tertulis dalam Tabel 2.
Tabel 2. Nilai Spektrofotometri Panjang gelombang (nm) Absorbansi 300 0,280 295 0,280 290 0,392 285 0,312 280 0,158
Selanjutnya  semua  larutan  ekstrak  diukur nilai  spektrofotometrinya  pada  panjang gelombang 290 nm.
Penelitian  untuk  mengetahui  persentase penghambatan aktivitas enzim xantin oksidase oleh  allopurinol  (sebagai  kontrol  positif) dilakukan untuk mengetahui nilai kepercayaan yang  dihitung  secara  statistik.  Hasil  yang diperoleh terlihat dalam Grafik 1.
Grafik1. Presentasi  Penghambatan  Aktivitas Enzim  Xantin  oksidase    oleh  Kontrol Positif  (Allopurinol)  pada  Variasi
Konsentrasi
Dari  Grafik  1  terlihat  bahwa  semakin tinggi konsentrasi  allopurinol  semakin meningkat pula grafik yang terjadi. Presentasi penghambatan  (%  inhibisi)  aktivitas  enzim Xantin  oksidase  oleh  kontrol  positif allopurinol  (1000  ppm)  adalah  yang  tertinggi (78,48%).  Semakin  tinggi  konsentrasi  (dalam ppm)  semakin  tinggi  pula  presentasi penghambatan aktivitas enzim Xantin
oksidase,  namun  peningkatannya  tidak setajam pada konsentrasi 100 ppm sampai 500 ppm.
Uji  penghambatan  aktivitas  enzim  xantin oksidase  terhadap  ekstrak  kulit  kayu  secang, (hasil  validasi  =  pengujian  ulang  3  kali) dilakukan  dengan  menggunakan  peralatan spektrofotometri  UV  –  Vis  seperti  yang terlihat  dalam  bab  Bahan  dan  Metode (pelaksanaan penelitian). Hasil yang diperoleh tertulis dalam Tabel 3 sebagai berikut:
Tabel 3. Hasil uji penghambatan aktivitas enzim xantin oksidase  terhadap ekstrak secang (hasil validasi) Jenis ekstrak % Inhibisi Secang (1) 56,47 Secang (2) 55,81 Secang (3) 58,92 Allopurinol (Kontrol positif) 1000 ppm 87,47
Dari Tabel 3 terlihat bahwa penghambatan aktivitas  enzim  xantin  oksidase  terhadap ekstrak  secang  adalah  58,92%,  sedangkan terhadap  allopurinol  adalah  87,47%.  Dari hasil  pengujian  tersebut  dapat  diketahui bahwa  ekstrak  secang  mempunyai  daya
inhibisi  terhadap  enzim  xantin  oksidase  yang cukup tinggi. Daya inhibisi ekstrak allopurinol yang  lebih  tinggi  karena  allopurinol merupakan obat sintetis untuk menanggulangi asam urat.
Hasil  pengujian  hambatan  aktivitas  enzim xantin  oksidase  terhadap  ekstrak  secang tersebut digambarkan dalam Grafik 2 sebagai berikut :
1 Secang (1)
2 Secang (2)
3 Secang (3)
4 Allopurinol (Kontrol positif) 1000 ppm
Grafik 2. Persentase (%)  inhibisi aktivitas enzim xantin  oksidase  terhadap  ekstrak  kulit kayu secang
Dari  Grafik  2  terlihat  bahwa  ekstrak  kulit kayu  secang  mampu  menghambat  aktivitas enzim  xantin  oksidase  yang  cukup  tinggi, sedangkan  allopurinol  sebagai  obat  sintetis untuk  anti  asam  urat  memiliki  daya  inhibisi yang  lebih  tinggi  (87,47%).  Hasil  yang diperoleh ini memungkinkan untuk menjadikan  secang  sebagai  obat  herbal  anti asam urat.
Dengan  penelitian  lebih  lanjutdiusahakan agar  daya  inhibisi  penghambatan  terhadap enzim xantin oksidase dapat lebih meningkat, sehingga  dapat  diterapkan  dalam  usaha memajukan industri obat herbal, produk  yang dihasilkan dapat diperoleh dengan harga yang relatif lebih murah dan terjangkau.

## KESIMPULAN
1. Ekstrak  kulit  kayu  secang  bermanfaat sebagai  anti  asam  urat  dengan  persentase (%)  inhibisi  sebesar  58,922%,  sementara persentase  inhibisi  allopurinol  sebesar 87,47%.
2. Penelitian ini merupakan uji penghambatan aktivitas  enzim  xantin  oksidase  terhadap ekstrak kulit kayu secang dalam taraf awal.
78,48%
62,48% 31,28%
15,93% y = 0,0632x + 20,377 R² = 0,9116 0 20 40 60 80 100 0 500 1000 1500 % In hi bi si Allopurinol (ppm)
Diharapkan  penelitian  selanjutnya  dapat mengidentifikasi  metabolisme  senyawa bioaktif  ekstrak  secang  yang  berperan dalam pengujian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
http://tyasistiqomah.blogspot.co.id/2011_02_0 1_archive.html  xantin  oksidase  diakses pada tanggal 10 September 2015.
Joseph  T.  DiPiro,  Robert  L. Talbert,  Gary  C. Yee, Gary R. Matzke, Barbara G. Wells, L. Michael Posey. 2005. Pharmacotherapy: A Pathophysiological  Approach  (Eds).  7th edition.  Chapter  100.  Acne  Vulgaris  :
Treatment : Acne Vulgaris
Accesspharmacy.
http://www.accesspharmacy.com/content.a spx?aID=3212123 Price,  S  &  Wilson,  L,  2005.  Patofisiologi:
Konsep  Klinis  Proses-Proses  Penyakit. Edisi 6. EGC, Jakarta Walker,  R.  dan  Edward,  C.  (2003). Clinical
Pharmacy  And  Therapeutics .  Edisi  3. USA: Churchill Livingstone Wibowo, S. 2006. Asam Urat, http://suryo_wibowo.blogspot.com. Diakses pada tanggal 9 September 2015 Xu,  H.,  Zhou,  Z.,  Yang,  J.,  1994.  Chemical
Constituents  of  Caesalpinia  sappan  L., Zhongguo  Zhongyao  Zazhi,  19,  (8)  485- 486