## Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Aktivitas Antibakteri dari Isolat Ekstrak Etil Asetat Bakteri (Te.325) terhadap

## Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
(Determination of Growth Curve and Antibacterial Activity of  Ethyl Acetate  Extract  Bacterial  Isolate  (Te.325)  on Staphylococcus aureus and Escherichia coli )
ALFIAN SYARIFUDDIN 1* , RATNA WIJAYATRI 1 , ICHSAN FERI KURNIAWAN 1 , HERMA FANANI AGUSTA 1
1 Departemen Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Magelang, Jalan Mayjend. Bambang Soegeng, Mertoyudan, Magelang, Jawa Tengah, 56172, Indonesia
Diterima 29 April 2021, Disetujui 15 Juli 2022
JURNAL ILMU KEFARMASIAN  INDONESIA, Oktober 2022,  hlm. ISSN 1693-1831
Abstract: The development of infection cases and inappropriate use of antibiotics has led to cases of antibiotic  resistance. An  alternative to  overcoming  the  many  antibiotics  that are  already  resistant  to bacteria has led to the discovery of new antibiotics. One of the processes of discovering antibiotics is from microorganisms, namely bacteria. The exploration process for the discovery of antibiotics uses a bacterial growth phase approach, namely the stationary phase which produces secondary metabolites, one of, which are bacteria that contain antibiotic compounds. Te.325 isolate is a producer of bacterial antibiotics but The growth phase is not yet known and can be used to approach the process of obtaining antibiotics. The study was to obtain the growth phase time of the Te.325 isolate and to extract antibiotic compounds  from  the  isolate.  The  determination  of  the  growth  curve  is  based  on  the  weight  of  cell biomass and the absorbance value on UV/ Vis spectrophotometry of the culture sampled every day for 14 days of culture incubation. The results showed a log/exponential phase on 5th day and a stationary phase on 9th day. The activity test of the ethyl acetate extract was carried out using the well method with an extract concentration of 40%, which resulted in an average diameter of 8.04mm in Staphylococcus aureus and 9.035mm in Escherichia coli. The ethyl acetate extract of Te.325 has medium potency.
Abstrak: Perkembangan kasus infeksi dan penggunaan antibiotik yang kurang tepat menimbulkan kasus resistensi antibiotik. Alternatif dalam mengatasi banyaknya antibiotik yang sudah resisten bakteri, yaitu dengan penemuan antibiotik baru. Proses penemuan antibiotik salah satunya dari mikroorganisme, yaitu dari bakteri. Proses eksplorasi penemuan antibiotik tersebut menggunakan pendekatan fase pertumbuhan bakteri,  yaitu  fase  stasioner  dimana  bakteri  memproduksi  metabolit  sekunder,  salah  satunya  adalah senyawa antibiotik. Isolat Te.325 merupakan bakteri penghasil antibiotik tetapi belum diketahui fase pertumbuhannya  yang  dapat  digunakan  untuk  melakukan  pendekatan  proses  perolehan  antibiotik. Tujuan penelitian ini untuk mendapatkan waktu fase pertumbuhan isolat Te.325 dan melakukan ekstraksi senyawa antibiotik dari isolat tersebut. Penentuan kurva pertumbuhan yaitu berdasarkan berat biomassa sel dan nilai absorbansi pada spektrofotometri UV/ Vis dari kultur yang disampling setiap hari selama 14 hari waktu inkubasi kultur. Hasil penelitian menunjukkan fase log/eksponensial pada hari ke-5 dan fase stasioner pada hari ke-9. Aktivitas antibakteri ekstrak etil asetat dilakukan pengujian menggunakan metode sumuran dengan konsentrasi ekstrak 40% yang menghasilkan rata-rata diameter zona hambat sebesar  8,04  mm  terhadap  bakteri  uji Staphylococcus  aureus dan  9,035  mm  pada Escherichia  coli . Ekstrak etilasetat Te.325 tergolong dalam potensi sedang.
25 2 -25 8
Keywords: Actinomycetes, Escherichia coli, rizofer, secondary metabolite, UV-Vis spectrophotometry
Kata kunci: Actinomycetes , Escherichia coli, metabolit sekunder, rizosfer, spektrofotometri UV-Vis, Staphylococcus aureus
SYARIFUDDIN ET AL.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
2

## BAHAN DAN METODE
BAHAN. Starter isolat Te.325 yang telah dilakukan isolasi  dari  rizosfer  tanaman  tebu  ( Saccharum officinarum  L )  di  Madugondo,  Desa  Sitimulyo, Kecamatan      Piyungan,  Kabupaten      Bantul, Provinsi          Daerah          Istimewa         Yogyakarta (7°49'57.9"S110°26'01.1"E), Starch Nitrate Broth (SNB) (10) , media Brain heart infusion ( BHI), media Mueller Hinton, dan bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli (E. coli).
METODE.  Pembuatan  Kultur  Stater. Isolat Te.325 sebanyak 5 mL diinokulasi ke dalam media SNB sebanyak 50 ml pada erlenmeyer 100 ml (1:10) yang  diinkubasi  selama  5  hari  pada  suhu  kamar dengan pengadukan menggunakan magnetic stirrer/ shaker (11) .
Preparasi  Kultur  Uji. Starter  sebanyak  50 ml  dimasukkan  ke  dalam  erlenmeyer  yang  berisi 500  ml  media  SNB  streril.  Fermentasi  dilakukan dengan  diinkubasi  selama  14  hari  dengan  agitasi menggunakan magnetic stirrer . Preparasi kultur uji ini dilakukan dengan cara aseptis di ruang Laminar Air Flow (LAF) (12) .
Pembuatan  Suspensi  Bakteri. Stok  suspensi bakteri S. aureus dan E. coli disuspensikan kembali ke dalam 1 mL media cair BHI baru, diinkubasi selama 18 sampai 24 jam pada suhu 37°C. Sebanyak 100 μL, dimasukkan kedalam 1 mL BHI dan diinkubasi salama 4 sampai 8 jam pada suhu 37°C. Suspensi diencerkan menggunakan  NaCl  0,9%  hingga  kekeruhan  sesuai dengan standar Mc Farland (10⁸ CFU/mL) (13) .
Pemanenan  dan  Ekstraksi  . Kultur  uji  yang telah diinkubasi selama 14 hari disaring menggunakan corong buchner kemudian ﬁ ltrat dipekatkan pada suhu 50 0 C.  Filtrat  diekstraksi  dengan  pelarut  etil  asetat dengan perbandingan 1:1.
Uji Aktivitas  Ekstrak  Etil Asetat. Penapisan antibakteri ekstrak etil asetat isolat Te.325 dilakukan

## PENDAHULUAN
Penanganan infeksi bakteri yaitu dengan ter- api antibiotik. Seiring perkembangan kasus infeksi, terdapat  banyak  bakteri  yang  mengalami  resistensi terhadap antibiotik. Resisten antiobiotik dapat menye- babkan beberapa wabah infeksi yang serius, bahkan menyebabkan  kematian. Alternatif  cara  mengatasi banyaknya  antibiotik  yang  sudah  resisten  bakteri, salah satunya dengan melakukan penemuan antibiotik baru. Penemuan antibiotik baru perlu dilakukan yang bertujuan untuk mendapatkan antibiotik yang mampu menjadi  alternatif  penghambatan  atau  mematikan bakteri yang telah resisten terhadap beberapa antibi- otik (2) . Penemuan senyawa tersebut merupakan hasil metabolit dari suatu mikroorganisme, salah satunya bakteri Actinomycetes (3) . Actinomycetes merupakan bakteri gram positif yang terbukti mampu menghasil- kan metabolit sekunder, salah satunya senyawa anti- biotik. Actinomycetes terutama S treptomyces mampu menghasilkan sebanyak 95% dari 2000 antibiotik (4) . Actinomycetes banyak ditemukan seperti pada rizosfer ataupun tempat ekstrim seperti daerah kawah gunung berapi dan membutuhkan temperatur untuk tumbuh sekitar 25-37 ℃ yang  ukuran  besar  dengan  kecend- erungan untuk membentuk rantai atau ﬁ lament (5) .
Senyawa metabolit yang berpotensi sebagai antibiotik diproduksi setelah bakteri memasuki fase awal  stasioner  dan  terakumulasi  pada  fase  akhir stasioner (6) . Fase pertumbuhan suatu bakteri mempu- nyai waktu pertumbuhan yang variatif (7) . Waktu fase pertumbuhan antar bakteri yang bervariasi mempen- garuhi waktu inkubasi yang diperlukan suatu bakteri dalam mencapai fase stasioner dimana bakteri mulai melakukan metabolisme sekunder yang menghasilkan metaboli  sekunder,  salah  satunya  senyawa  antibio- tik (8) . Optimasi waktu pertumbuhan  dapat dilakukan berdasarkan serapan spektrofotometer UV/Vis pada panjang gelombang 600 nm pada Actinomycetes yang diisolasi di lautan (9) .
Berdasarkan  uraian-uraian  tersebut,  peneli- tian mengenai penentuan kurva pertumbuhan isolate bakteri Te.325  dan  uji  aktivitas  antibakteri  ekstrak etil  asetat  metabolit  sekundernya  terhadap  bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli .
5 3
INFEKSI menjadi salah satu penyebab kasus kematian sebesar 50-70% pada beberapa rumah sakit. Mayoritas kasus  infeksi  yang  banyak  terjadi  di  masyarakat, antara  lain:  infeksi  golongan Enterobacteria dari golongan Escherichia,  Salmonella , Shigella , Klebsiela , Staphylococcus aureus, dan Pseudomonas aeruginosa (1) .
Pemisahan B iomassa S el   dengan M etabolit. Kultur  dilakukan  inkubasi  14  hari  dan disampling setiap  hari  sebanyak  2  ml.  Sampling cairan   kultur disentrifuse   selama   10   menit   pada kecepatan   8000  rpm.  Supernatan  dipisahkan  dari endapan biomassa sel dan dimasukkan dalam tabung eppendorf baru dan disimpan dalam freezer (12) .
O p t i m a s i P e r t u m b u h a n d e n g a n Spektrofotometri  UV-VIS. Penentuan  kurva pertumbuhan  isolat  bakteri  Te.325  berdasarkan serapan  absorbasi  spektromoter  Ultraviolet-visible (Uv-Vis) yang dilakukan pada sampling kultur setiap hari selama 14 hari dan replikasi 3 kali.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia ` pada  bakteri Staphylococcus aureus dan  bakteri Escherichia coli dengan  kertas  cakram  yang  diberi 20  µl  ekstrak  etil  asetat  40%  isolat  Te.325  dan ditempel  pada  permukaan  media.  Hasil  perlakuan diinkubasi selama 18 sampai 24 jam pada suhu 37℃ kemudian diamati dan diukur rata-rata diameter zona hambatnya (13) .
Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT). Ekstrak ditotolkan pada plat dengan bantuan pipa kapiler 5 μL.  Ekstrak etil  asetat  sebanyak      8  mg  dilarutkan dengan  40  μL  metanol.  Fase  diam  yang  digunakan adalah  silica  gel F254.  Fase  gerak  yang  digunakan adalah  kloroform:  metanol  (7:3).  Plat  KLT  dielusi, dikeringkan, kemudian diamati proﬁ l pemisahannya di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm kemudian hitung nilai Rf nya (12) .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembuatan Kultur Starter. Kultur starter pada penelitian  ini  menggunakan  media  SNB  ( Starch Nitrat Borth ) steril. Media SNB ( Starch Nitrat Borth ) digunakan  karena  terdapat  nutrisi  yang  diperlukan untuk  petumbuhan  bakteri Actinomycetes. Media SNB ( Starch Nitrat Borth ) digunakan karena terdapat sumber karbon dan mineral yang berasal dari pati dan gliserol pada soluble starch . Media pertumbuhan yang baik adalah media yang dapat menyediakan sumber karbon  dan  mineral-mineral  lain  yang  dibutuhkan isolate bakteri untuk pertumbuhan bakteri. Mineral- mineral  lain  tersebut  adalah  sumber  nitrogen  yang berasal  dari  NO 3 ,  banyak  isi  sel,  terutama  protein, mengandung nitrogen dan aktivator enzim, mineral yang diperlukan sebagai aktivator enzim, seperti Mg, Fe, K, dan Ca (14) . Pembuatan kultur starter dilakukan dengan perbandingan (1:10) isolate Te.325 dan media SNB  dan  diinkubasi  selama  5  hari  dengan  agitasi menggunakan magnetic stirrer (11) . Inkubasi selama 5 hari dilakukan untuk membuat kultur starter agar ada proses  penyesuaian  dengan  media  yang  digunakan dan  telah  mencapai  fase  log,  yaitu  fase  dimana pertumbuhan sel secara optimal (13) .
Pembuatan  Kultur  Uji. Pembuatan  kultur  uji ini dilakukan dengan cara memasukkan 5 mL cairan kultur starter yang sudah diinkubasi selama 5 hari ke dalam erlenmeyer berisi 50 mL media SNB yang telah disterilkan (13) .  Pemindahan  kultur  uji  ini  dilakukan secara  aseptis  di  dalam  LAF  agar  tidak  terjadi kontaminasi. Pembuatan kultur uji ini dilakukan dengan perbandingan antara kultur starter dengan media SNB dengan  perbandingan  1:10.  Selanjutnya  dilakukan inkubasi selama  14  hari  dengan  pengadukan  di atas      hotplate  stirrer (11) . Selama  masa  inkubasi  14 hari terjadi perubahan warna dari warna putih keruh
menjadi  kekuningan.  Terjadinya  perubahan  warna cairan kultur ini karena Actinomycetes mengeluarkan pigmen warna yang mampu berdifusi maupun tidak pada media selama masa inkubasi yaitu 14 hari dengan suhu ruangan. Suhu ruangan dibutuhkan karena suhu optimum untuk pertumbuhan ini berkisar antara 25- 35°C (15) .  Pernyataan  tersebut  dapat  menunjukkan bahwa  perubahan  warna  yang  terjadi  pada  cairan kultur isolat Te.325 disebabkan karena isolat Te.325 mengeluarkan pigmen warna dan bakteri mengalami pertumbuhan.  Hasil  pengamatan  pada  kultur  yang diinkubasi mengalami perubahan warna pada kultur uji ditunjukkan pada Tabel 1 dan Gambar 1.
Gambar  1. Perubahan wana kultur selama masa inkubasi selama 14 hari. (a) Hari ke-1, (a) Hari ke-5, (c) Hari ke-10,
(d) Hari ke-14.
Proﬁ l  Pertumbuhan  Bakteri Actinomycetes Isolate  Te.325. Profil  pertumbuhan  bakteri Actinomycetes (Isolat  Te.325)  dihasilkan  dari pemisahan antara supernatan dan endapan (biomassa sel)  selama  14  hari.  Supernatan  digunakan  untuk menguji aktivitas antibakteri dan endapan (biomassa sel) digunakan untuk mengetahui proﬁ l pertumbuhan bakteri.  Endapan  dikeringkan  dan  ditimbang  setiap harinya  sehingga  di  peroleh  grafik.  Grafik  yang diperoleh  fase  eksponensial  tercapai  pada  hari  ke- 9.  Penelitian  penentuan  fase  pertumbuhan  yang dilakukan  oleh  Dahlan  dkk  (2017)  adalah  dengan membuat  sebuah  grafik  pertumbuhan,  sehingga dapat  mengetahui  waktu  tumbuh  optimum  (fase eksponensial)  dari  mikroba  tersebut (16) .  Hasil  dari grafik  pertumbuhan  biomasa  sel,  yaitu  semakin kecil kekeruhan maka biomasa sel semakin sedikit, sedangkan semakin besar kekeruhan maka biomasa sel semakin banyak. Pengujian untuk memperoleh proﬁ l pertumbuhan tersebut dilakukan dengan cara kultur uji  yang  telah  diambil  selama  14  hari  disentriﬁ us
Tabel 1. Perubahan warna inkubasi kultur isolat bakteri (Te.325) selama 14 hari.
Hari Warna Hari Warna 1. Putih kekuningan 8. Kuning keruh 2. Putih kekuningan 9. Kuning 3. Putih kekuningan 10. Kuning 4. Putih kekuningan 11. Kuning 5. Putih kekuningan 12. Kuning 6. Putih kekuningan 13. Kuning 7. Kuning keruh 14. Kuning
SYARIFUDDIN ET AL.
2
dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit (17) . Hasil dari  biomassa  sel  dikeringkan  menggunakan  oven pada suhu 50 o C kemudian di timbang menggunakan timbangan  analitik  dan  didapatkan  hasil  berat sel.  Grafik  yang  diperoleh  sebagai  pertumbuhan bakteri Actinomycetes (isolat  Te.325) (18) .  Profil pertumbuhan isolat Te.325 ditunjukkan pada Gambar 2. Pertumbuhan bakteri terdapat empat fase, yaitu fase lag, fase log, fase stasioner, serta fase kematian. Fase lag bakteri Actinomycetes isolat Te.325 dimulai pada hari ke-1 dimana pada hari ke-1 ini bakteri beradaptasi dengan lingkungan sekitar, seperti pH, suhu, nutrisi, dan lain sebagainya. Pada fase ini peningkatan jumlah sel bakteri berlangsung lambat. Fase kedua adalah fase Log, pertumbuhan bakteri berlangsung sangat cepat, pada fase ini suatu jenis mikroba memperbanyak diri dengan cara membelah diri menjadi dua, kemudian masing- masing membelah lagi menjadi dua sehingga pada  setiap  generasi  jumlahnya  menjadi  dua  kali populasi sebelumnya. Waktu yang dibutuhkan untuk terjadinya proses ini disebut waktu generasi (19) . Fase log  isolat  Te.325  dimulai  pada  hari  ke-5  dimana bakteri  mulai  membelah  diri  dan  memasuki  masa pertumbuhan. Pada fase ini kecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh media tempat tumbuh seperti pH dan kandungan nutrien, juga kondisi lingkungan termasuk suhu dan kelembaban udara. Fase Stasioner dimulai  pada  hari  ke-9  dimana  pertumbuhan  dan kematian seimbang dan terdapat titik puncak, terjadi peningkatan  yang  signifikan  sehingga  dianggap telah  mencapai  fase  stasioner  jumlah  sel  tidak  lagi mengalami peningkatan.
sehingga dapat mengetahui waktu tumbuh optimum (fase  eksponensial)  dari  mikroba  tersebut (16) .  Hasil dari graﬁ k pertumbuhan biomasa sel, yaitu semakin kecil kekeruhan maka biomasa sel semakin sedikit, sedangkan semakin besar kekeruhan maka biomasa sel semakin banyak. Pengujian untuk memperoleh proﬁ l pertumbuhan tersebut dilakukan dengan cara kultur uji  yang  telah  diambil  selama  14  hari  disentriﬁ us dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit (17) . Hasil dari  biomassa  sel  dikeringkan  menggunakan  oven pada suhu 50 o C kemudian di timbang menggunakan timbangan  analitik  dan  didapatkan  hasil  berat sel.  Grafik  yang  diperoleh  sebagai  pertumbuhan bakteri Actinomycetes (isolat  Te.325) (18) .  Profil pertumbuhan isolat Te.325 ditunjukkan pada Gambar 2. Pertumbuhan bakteri terdapat empat fase, yaitu fase lag, fase log, fase stasioner, serta fase kematian. Fase lag bakteri Actinomycetes isolat Te.325 dimulai pada hari ke-1 dimana pada hari ke-1 ini bakteri beradaptasi dengan lingkungan sekitar, seperti pH, suhu, nutrisi, dan lain sebagainya. Pada fase ini peningkatan jumlah sel bakteri berlangsung lambat. Fase kedua adalah fase Log, pertumbuhan bakteri berlangsung sangat cepat, pada fase ini suatu jenis mikroba memperbanyak diri dengan cara membelah diri menjadi dua, kemudian masing- masing membelah lagi menjadi dua sehingga pada  setiap  generasi  jumlahnya  menjadi  dua  kali populasi sebelumnya. Waktu yang dibutuhkan untuk terjadinya proses ini disebut waktu generasi (19) . Fase log  isolat  Te.325  dimulai  pada  hari  ke-5  dimana bakteri  mulai  membelah  diri  dan  memasuki  masa pertumbuhan. Pada fase ini kecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh media tempat tumbuh seperti pH dan kandungan nutrien, juga kondisi lingkungan termasuk suhu dan kelembaban udara. Fase Stasioner dimulai  pada  hari  ke-9  dimana  pertumbuhan  dan kematian seimbang dan terdapat titik puncak, terjadi peningkatan  yang  signifikan  sehingga  dianggap telah  mencapai  fase  stasioner  jumlah  sel  tidak  lagi mengalami peningkatan.
A n a l i s i s A c t i n o m y c e t e s d e n g a n Spektrofotometri UV-VIS. Analisis Spektrofotometri UV-VIS  merupakan  salah  satu  metode  pengukuran biomassa  sel.  Hasil  pembacaan  ditunjukkan  pada Gambar 3. Fase pertumbuhan bakteri Actinomycetes isolat Te.325 berdasarkan serapan pada spektrofotometri UV-VIS  dilakukan  menggunakan  cairan  yang disampling per hari selama 14 hari, dimana semakin keruh maka nilai absorbansinya semakin tinggi. Hal tersebut ada peningkatan jumlah sel bakteri sehingga meningkatkan kekeruhan. Kurva pertumbuhan terdiri dari  fase lag ,  fase log ,  fase  stasioner. Tujuan  dari pengukuran  biomassa  sel  adalah  untuk  mengetahui kurva pertumbuhan dari isolat bakteri yang diperoleh
Gambar 2. Graﬁ k pertumbuhan bakteri berdasarkan bobot sel.
5 5
Proﬁ l pertumbuhan bakteri Actinomycetes (Isolat Te.325) dihasilkan dari pemisahan antara supernatan dan endapan (biomassa sel) selama 14 hari. Supernatan digunakan  untuk  menguji  aktivitas  antibakteri  dan endapan (biomassa sel) digunakan untuk mengetahui proﬁ l  pertumbuhan  bakteri.  Endapan  dikeringkan dan  ditimbang  setiap  harinya  sehingga  di  peroleh grafik.  Grafik  yang  diperoleh  fase  eksponensial tercapai  pada  hari  ke-9.  Penelitian  penentuan  fase pertumbuhan yang dilakukan oleh Dahlan dkk (2017) adalah dengan membuat sebuah graﬁ k pertumbuhan,
Vol 20, 2022
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia `
Uji Aktivitas Antibakteri. Uji  antibakteri dilakukan  untuk  mengetahui  aktivitas  antibakteri dari  ekstrak  etil  asetat  isolat  Te.325  terhadap bakteri Staphylococcus  aureus dan E.coli .  Metode yang  digunakan  dalam  pengujian  ini,  yaitu  metode difusi  sumuran  yang  direplikasi  sebanyak  3  kali. Hasil  pengamatan  berupa  diameter  zona  bening disekeliling  sumuran.  Pengukuran  diameter  zona hambat  dapat  menggunakan  penggaris  atau  jangka sorong. Proses pembuatan suspensi bakteri terdapat dua tahap inkubasi. Inkubasi yang pertama dilakukan selama  18-24  jam  tujuannya  untuk  mendapatkan banyak  bakteri  yang  tumbuh,  sedangkan  inkubasi yang  kedua  dilakukan  selama  3-5  jam  tujuannya untuk  mempertahankan  bakteri  pada  fase  log dimana  pada  fase  log  ini  merupakan  metabolisme yang  paling  aktif (21) .  Hasil  uji  aktivitas  Ekstrak  etil asetat  isolat Actinomycetes TE325  terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus disajikan  pada  Gambar 4  –  5      serta  Tabel  2  –  3.  Berdasarkan  pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etil astetat isolat TE325 menunjukkan adanya daya hambat yang berbeda-beda terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus dan E.coli adanya  zona  hambat  dikedua  bakteri  menunjukkan bahwa isolat Actinomycetes (isolat Te.3325) memiliki aktivitas antibakteri spektrum luas. Potensi antibakteri diperoleh dengan pengukuran diameter zona hambat dan dibagi ke dalam 4 kategori kekuatan daya hambat, yaitu sangat kuat (zona hambat > 20 mm), kuat (zona hambat 10-20 mm), sedang (zona hambat 5-10 mm) dan  lemah  (zona  hambat  <  5  mm).  Berdasarkan kategori  tersebut  dapat  dilihat  bahwa  ekstrak  etil asetat isolat TE325 memiliki aktivitas penghambatan sedang  karena  memiliki  kemampuan  menghambat pada S. ureus dan E. coli dengan rata rata 8,04 mm dan 9,035 mm.
bakteri  yang  bermultiplikasi  pada  media  cair  SNB akan  menyebabkan  media  menjadi  keruh.  Semakin keruh media maka pertumbuhan bakteri Actinomycetes akan  semakin  tinggi. Aquadest  digunakan  sebagai larutan  standar  kemudian  dilakukan  pengujian dengan  supernatan  yang  telah  dipisahkan  dengan endapan (biomassa sel) dengan pengambilan sampel selama  14  hari  dari  panjang  gelombang  maksimal 275,5  nm  kemudian  dari  data  yang  diperoleh  ini menjadi standar untuk pembuatan kurva pertumbuhan bakteri Actinomycetes isolat Te.325. Penelitian yang dilakukan  oleh  Khoiriyah  dan Ardiningsih  (2014) dinyatakan bahwa hasil pengukuran isolat 16IM7 pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm berada dalam fase log dimulai pada hari ke-2 waktu inkubasi hingga hari ke-11 dan fase stasioner dimulai hari ke-14 (19) . Isolat Te.325 memiliki perbedaan fase pertumbuhan karena Actinomycetes mempunyai waktu pertumbuhan yang sangat variatif.
Gambar 3. Proﬁ l Pertumbuhan Bakteri Actinomycetes Iso- lat Te.235 Berdasarkan Serapan Pada Spektrofotometri UV-
VIS.
Gambar  4.  Diameter  zona  hambat  bakteri Staphylococcus aureus .
Bakteri  melakukan  proses  adaptasi  terhadap kondisi  lingkungannya  Pada  fase  lag  seperti:  pH, suhu, nutrisi, Peningkatan jumlah sel bakteri pada fase ini  berlangsung  lambat.  Fase  lag  ini dimulai  dihari ke-3.  Fase  log,  dimana  pada  fase  ini  pertumbuhan bakteri  sangat  cepat  dimulai  pada  hari  ke-6.  Pada fase  ini  bakteri  memperbanyak  diri,  fase  stasioner berada  pada  hari  ke-9.  Dimana  pada  fase  ini  tidak terjadi  penambahan  jumlah  bakteri  yang  tumbuh karena bakteri yang tumbuh dan yang mati jumlahnya seimbang (19) .
Proﬁ l pertumbuhan bakteri Actinomycetes isolat TE325  yang  di  uji  menggunakan  spektrofotometri UV-VIS sebanding dengan proﬁ l pertumbuhan bakteri Actinomycetes isolat Te.325 yang di uji berdasarkan bobot  sel.  Banyaknya  biomasa  sel Actinomycetes didalam  larutan  uji  sebanding  dengan  besarnya absorbansi yang di peroleh. Semakin besar absorbansi larutan yang di peroleh, maka biomasa sel di dalam larutan  semakin  banyak,  pada  awal  pengukuran, terbentuk daerah kurva yang konstan antara absorbansi dengan  panjang  gelombang.  Daerah  ini  digunakan untuk menentukan nilai puncak panjang gelombang dari hari 1-14.
Kromatograﬁ   Lapis  Tipis  (KLT). Hasil  dari analisis KLT ekstrak etil asetat isolat Actinomycetes (isolat Te.325) setelah dielusi dan dilihat pada sinar UV 254 dan 366 dapat dilihat pada Gambar 6.
Penapisan senyawa antibiotik dapat dilihat pada bercak yang ada pada lempeng. Hasil pada sinar UV
SYARIFUDDIN ET AL.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
2
Tujuan  dari  penggunaan  metode  KLT  adalah untuk penapisan senyawa antibiotik dengan meninjau bercak pada nilai Rf yang dihasilkan (23,24) . Berdasarkan hasil analisis menggunakan KLT hanya terdapat satu bercak yang diduga sebagai antibiotik. bercak yang aktif sebagai antibiotik dapat terbaca pada sinar UV 254  nm  dan  sinar  UV  366  nm  pada  Rf  0,95  dari masing-masing panjang gelombang. Penelitian yang dilakukan  oleh  Syarifuddin  et  al.,  (2019)  uji  KLT biautograﬁ  ekstrak etil asetat isolat AL6 didapatkan senyawa pada nilai Rf 0,94 dengan konsentrasi 40% memiliki aktivitas antibiotik (21) .  Isolat dan AL6 dan Te.325  merupakan  isolat Actinomycetes dari  hasil isolasi rizosfer tanah tebu. Identiﬁ kasi nilai Rf isolat AL6 memiliki nilai yang hampir sama dengan isolat Te.325  maka,  senyawa  tersebut  dapat  dikatakan memiliki  kemungkinan  karakteristik  senyawa  yang sama jika ditinjau dari nilai Rf nya.

## SIMPULAN
Fase pertumbuhan isolat Te.325 memasuki fase log pada hari ke-5 dan fase stasioner pada hari ke-9. Ak- tivitas antibiotik ekstrak etil asetat Te.325 pada bakteri S. aureus dan E. coli tergolong dalam potensi sedang.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Ramadhan H. Isolasi actinomycetes penghasil antibiotik terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dari tanah sawah. In Prosiding Seminar Nasional dan Presentasi Imiah Perkembangan Terapi Obat Herbal Pada Penyakit Degeneratif. 2011;1(1):50–64.
2.  Wulandari  W,  Rahayu  T.  Aktivitas  antibakteri isolat Actinomycetes  dari  sampel  pasir  Gunung Merapi  dengan  lama  fermentasi  yang  berbeda terhadap  bakteri Escherichia  coli multiresisten antibiotik. Bioeksperimen: Jurnal Penelitian Biologi. 2015;1(2):53–9.
3.  Jakubiec-Krzesniak K, Rajnisz-Mateusiak A, Guspiel A, Ziemska  J,  Solecka  J.  Secondary  metabolites of actinomycetes and their antibacterial, antifungal and antiviral properties. Polish Journal of Microbiology. 2018;67(3):259–72.
4.  Pujiati  P.  Isolasi  actinomycetes  dari  tanah  kebun sebagai  bahan  petunjuk  praktikum  mikrobiologi. Florea :  Jurnal  Biologi  dan  Pembelajarannya. 2018;1(2):42–6.
5.  Wulandari W. Aktivitas antibakteri isolat actinomycetes dari sampel pasir Gunung Merapi dan Bromo dengan lama  fermentasi  yang  berbeda  terhadap  bakteri Escherichia  coli multiresisten  antibiotik.  Doctoral dissertation, Universitas Muhammadiyah Surakarta. 2014.
6.   Harir M, Bendif H, Bellahcene M, Fortas Z, Pogni R.
Streptomyces secondary  metabolites.  Basic biology
Gambar 5. Diameter zona hambat bakteri E. coli .
Tabel  2.  Respon  hambat  ekstrak  etil  asetat  terhadap bakteri Staphylococcus aureus. Perlakuan Mean Kontrol positif (Kloramfenikol) 27,06 mm Kontrol negatif (DMSO10%) - Isolat Actinomycetes (isolat Te.325) 8,04 mm Perlakuan Mean Kontrol positif (Kloramfenikol) 27,06 mm Kontrol negative (DMSO 10%) - Ekstrak isolat Te.325 9,035 mm Tabel  3.  Respon  hambat  ekstrak  etil  asetat  terhadap bakteri E.coli .
Gambar 6. Hasil KLT ekstrak isolat Actinomycetes Te.325, A: Pengamatan Visual, B: Lampu UV 366, C: Lampu UV 254.
254  memperlihatkan  satu  bercak  yang  berﬂ uorensi menjadi  warna  hitam  yang  dilihat  secara  langsung dengan nilai Rf sebesar 0,95. Penyerapan sinar UV disebabkan  karena  adanya  molekul  kromofor  yang terdiri ikatan rangkap dua atau ikatan rangkap 3 dan ikatan rangkap tersebut terkonjugasi. Hasil pada sinar UV 366 memperlihatkan satu bercak yang berﬂ uorensi menjadi warna pink ungu yang dilihat secara langsung dengan  nilai  Rf  sebesar  0,95.  Flouresensi  atau berpendarnya bercak pada sinar lampu UV 366 nm karena  adanya  interaksi  lampu  UV  dengan  gugus kromofor yang terikat oleh ausokrom (22) .
5 7
Dahlan A, Wahyuni  S, Ansharullah.  Morfologi  dan karakterisasi  pertumbuhan  bakteri  asam  laktat  (um 1.3a)  dari  proses  fermentasi  wikau  maombo  untuk studi awal produksi enzim amilase. Jurnal Sains dan Teknologi Pangan. 2017;2(4):657–63.
17.   Setiawati S, Yusan RT. Actinomycetes as A source of potential antimicrobial and antibioﬁ lm agents. Medical and Health Journal. 2022;2(1):50-70.
18.   Warsi W, Sulistyani N. The optimization of secondary metabolite production time and screening antibacterial activity of actinomycetes isolate from tin plant rizosfer ( Ficus  carica ).  Jurnal  Teknologi  Laboratorium. 2018;7(1):15.
19.   Khoiriyah H, Ardiningsih P. Penentuan waktu inkubasi optimum terhadap aktivitas bakteriosin Lactobacillus sp . RED4. Jurnal Kimia Khatulistiwa. 2014;3(4):52-6.
20.   Fitriana, Rusli. Penentuan waktu optimum produksi metabolit sekunder isolat bakteri actinomycetes dari tanah rhizosfer akar tanaman jarak pagar ( Jatropha curcas L.)  terhadap  bakteri  patogen. As-Syifaa. 2018;10(1):74–82.
21.   Syarifuddin A, Kamal S, Yuliastuti F, Pradani MPK, Septianingrum  NMAN.  Ekstraksi  dan  identiﬁ kasi metabolit  sekunder  dari  isolat  al6  serta  potensinya sebagai antibakteri terhadap Escherichia coli . Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia. 2019;6(2):210-8. 22.   Nuthan BR, Rakshith D, Marulasiddaswamy KM, Rao HY, Ramesha KP, Mohana NC, Siddappa S, Darshan D, Kumara KK, Satish S. Application of optimized and  validated  agar  overlay  TLC–bioautography assay for detecting the antimicrobial metabolites of pharmaceutical interest. Journal of chromatographic science. 2020;58(8):737-46.
23.  Setyaningsih D, Murti YB, Fudholi A, Hinrichs WL,
Mudjahid R, Martono S, Hertiani T. Validated TLC method for determination of curcumin concentrations in  dissolution  samples  containing Curcuma  longa extract.  Jurnal  Ilmu  Kefarmasian  Indonesia. 2017;14(2):147-57.
24.  Cita  YP;  Radjasa  OK;  Sudharmono  P. Aktivitas Antibakteri isolat bakteri X2 yang berasosiasi spons Xestospongia  testudinaria dari  Pantai  Pasir  Putih Situbondo terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa . Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 2017;14(2):206- 11.
and applications of actinobacteria. 2018;6:99-122. 7.   Rolfe  MD,  Rice  CJ,  Lucchini  S,  Pin  C, Thompson A, Cameron AD, Alston M, Stringer MF, Betts  RP, Baranyi J, Peck MW. Lag phase is a distinct growth phase that  prepares bacteria for exponential growth and  involves  transient  metal  accumulation.  Journal of bacteriology. 2012;194(3):686-701.
8.   Kumari  M,  Myagmarjav  BE,  Prasad  B,  Choudhary M. Identiﬁ cation  and  characterization  of  antibiotic- producing actinomycetes isolates. American journal of Microbiology. 2013;4(1):24.
9.   Pudi  N,  Varikuti  GD,  Badana AK,  Gavara  MM, Kumari S, Malla R. Studies on optimization of growth parameters  for  enhanced  production  of  antibiotic alkaloids by isolated marine actinomycetes. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 2016;6(10):181-8.
10.   Aini  NN,  Sulistyani  N.  Isolation  of  actinomycetes from sugarcane ( Saccharum oﬃ  cinarum ) rhizosphere and the ability to produce antibiotic. In2019 Ahmad Dahlan International Conference Series on Pharmacy and Health Science (ADICS-PHS 2019) 2019; 131-6.
11.   Ramadhani  MA,  Sulistyan  N.  Uji  aktivitas  isolat actinomycetes (Kode Gst, Kp, Kp11, Kp16, T24, dan T37) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Escherichia coli ATCC 25922. 2018;01:29–37.
12.   Syarifuddin A,  Sulistyani  N.  Karakterisasi  fraksi teraktif senyawa antibiotik isolat kp 13 dengan metode densitometri  dan  KLT-semprot.  Jurnal  Ilmiah  Ibnu Sina. 2019;4(1):156-66.
13.   Mulyadi  M,  Sulistyani  N. Aktivitas  cairan  kultur 12  isolat  actinomycetes  terhadap  bakteri  resisten. Kes  Mas:  Jurnal  Fakultas  Kesehatan  Masyarakat Universitas Ahmad Dahlan. 2013;7(2):89–96.
14.   Syarifuddin A,  Sulistyani  N,  Kintoko  K. Activity of antibiotic bacterial isolate kp13 and cell leakage analysis  of Escherichia  coli bacteria.  Jurnal  Ilmu Kefarmasian Indonesia. 2018;16(2):137-44.
15.   Syarifuddin A,  Sulistyani  N,  Kintoko.  Proﬁ l  KLT- bioautograﬁ  dan densitometri fraksi teraktif (isolate kp13)  dari  bakteri  rizosfer  kayu  putih  ( Melaleuca leucadendron L.). Jurnal Farmasi Sains dan Praktis. 2019;5(1):27–33.
25 8
16.