## DNA Barcoding Ikan Introduksi Khas Telaga Sari, Kabupaten Pasuruan
Dwi Anggorowati Rahayu 1)* , Endik Deni Nugroho 2) , Dwi Listyorini 3)
1*) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Surabaya, Jl. Ketintang
Gedung C3, Surabaya, Jawa Timur, Indonesia
2) Jurusan Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Borneo Tarakan, Jl. Amal Lama, Tarakan,
Kalimantan Utara, Indonesia
3) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Malang, Jl. Semarang No. 5
Malang, Jawa Timur, Indonesia
*) Alamat korespondensi: dwirahayu@unesa.ac.id

## ABSTRAK
Telaga  Sari  terletak  di  Purwodadi,  Kabupaten  Pasuruan  yang  memiliki  kelimpahan  jenis  ikan introduksi  dari  Famili  Poeciliidae.  Anggota  Poeciliidae  merupakan  ikan  yang  berukuran  kecil, live-bearers , memiliki  dimorfi  seksual  dari  segi  ukuran  tubuh  dan  pola  warna.  Ikan  jantan  memiliki  gonopodium  yang merupakan modifikasi sirip anal, dan ikan betina bunting dan melahirkan. Ikan ini terintroduksi di perairan Indonesia  sebagai  ikan  hias,  pengontrol  perkembangan  nyamuk  malaria  dan  dewasa  ini  diketahui  sebagai model  pembelajaran  dalam  studi  biologi.  Identifikasi cryptic  species menjadi  tantangan  dalam  pengelolaan ikan  introduksi  baik  untuk  tujuan  konservasi  dan  budidaya.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  identifikasi molekuler berdasarkan DNA Barcode COI. Amplifikasi gen target dilakukan dengan menggunakan primer barcode .  Analisis  identifikasi  molekuler  melalui  kekerabatan  pohon  filogenetik,  similaritas,  variasi  sekuen DNA,  jarak  genetik,  dan  BOLD System.  Hasil  identifikasi  molekuler  menunjukkan  terbentuk  dua  klaster besar  yang  terdiri  atas  dua  klad,  spesies  yang  teridentifikasi  sesuai  karakter  morfologi,  yaitu Poecilia reticulata dan Poecilia  mexicana dengan  indeks  kesamaan  90-100%,  sedangkan  satu  spesies  teridentifikasi sebagai Poecilia  reticulata (100%  identik  berdasarkan  BOLD System)  yang  seharusnya  secara  morfologi adalah Xiphoporus helleri. Hasil analisis karakter nukleotida diagnostik ditemukan empat nukleotida untuk Poecilia  reticulata ,  tujuh  nukleotida  untuk Xiphoporus  helleri dan  23  untuk Poecilia  mexicana .  Diversitas haplotype basa  nukleotida  sebesar  (0,00566)  yang  terbagi  menjadi  sembilan haplotype dengan  empat haplogroup .  Ketepatan  identifikasi  spesies  ikan  menjadi  kunci  utama  dalam  budidaya,  perdagangan, manajemen, konservasi, dan perkembangan ilmu pengetahuan.
Kata kunci : basa nukleotida diagnostik, DNA Barcode COI, filogenetik, jarak genetik, variasi genetik

## DNA Barcoding of Introduced Typical Fishes in Telaga Sari, Pasuruan Regency
Dwi Anggorowati Rahayu 1)* , Endik Deni Nugroho 2) , Dwi Listyorini 3)
1) Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Negeri Surabaya, Jl. Ketintang C3,
Surabaya, East Java, Indonesia
2) Department of Biology, Faculty of Education, Universitas Borneo Tarakan, Jl. Amal Lama, Tarakan, North
Kalimantan, Indonesia
3) Department of Biology, Faculty of Mathematics and Sciences, Universitas Negeri Malang, Jl. Semarang 5 Malang, East
Java, Indonesia
*) Email: dwirahayu@unesa.ac.id

## ABSTRACT
Telaga  Sari  is  located  in  Purwodadi,  Pasuruan  Regency  which  has  an  abundance  of  introduced  fish species from the Poeciliidae family. Poeciliidae members are small-sized fish, live-bearers, have dimorphism sexual  in  terms  of  body  size  and  color  patterns.  Male  fish  have  gonopodium  which  is  a  modification  of  the anal  fin,  and  pregnant and  birthing  females. These fish are  introduced in Indonesian waters as ornamental fish, controlling the development of malaria mosquitoes and today are known to also play a role as learning models in biological studies. Species identification becomes a new challenge in the management of introduced ornamental  fish  for  conservation  and  cultivation  purposes.  The  objective  of  this  study  was  to  identify  at molecular identification based on DNA Barcode COI. Amplification of target gene was done by using barcode primers. Molecular identification was decided through phylogenetic topology, similarity, sequence variation,
genetic distance, and BOLD System. Based on molecular identification showed two large clusters consisting of two clades, species identified according  to  morphological characters,  namely Poecilia reticulata and Poecilia mexicana with  similarity  index  90-100%.  One  species  identified  as Poecilia  reticulata (100%  identical  based on  the  Bold  System)  which  should  be  morphologically Xiphoporus  helleri .  Analysis  of  nucleotide  diagnostic characters  showed  that Poecilia  reticulata has  four  nucleotides, Xiphoporus  helleri seven  nucleotides  and Poecilia mexicana 23 nucleotides.  The haplotype diversity is (0.00566) which is divided into nine haplotypes belong  to  4  haplogroup.  The  corret  identification  of  fish  species  is  a  useful  tool  for  aquaculture,  trade, management, conservation and development of science.
Keywords: diagnostic sequence, DNA Barcode COI, phylogenetic, genetic distance, genetic variation

## PENDAHULUAN
Telaga Sari Purwodadi, Kabupaten
Pasuruan merupakan telaga kecil yang memiliki keanekaragaman ikan introduksi yang melimpah,  yaitu  ikan  anggota  Poeciliidae. Anggota  Famili  Poeciliidae  terdiri  dari  tiga  sub famili, yaitu Poeciliinae (220 spesies),
Procatopodinae (78
spesies), dan Aplocheilichthyinae  (satu  spesies)  [1].  Famili Poeciliidae  merupakan  ikan  yang  tersebar  luas hampir  di  seluruh  belahan  dunia  mulai  dari Afrika,  China,  Turki,  Prancis,  Mexico,  Inggris, Vietnam, Malaysia, Spanyol,  Portugis, Belanda, Denmark, Polandia, Rusia, Albania, dan Jepang, termasuk  di  Indonesia  [2].  Namun  ikan  ini merupakan  ikan  endemik  negara  Amerika, Australia Mexico, dan Kanada [3,4,5] yang kini keberadaannya melimpah di Indonesia.
Introduksi  dan  distribusi  ikan  introduksi  ke dalam  perairan  dianggap  menjadi  salah  satu penyebab  utama  ancaman  keragaman  ikan  di alam  [6,7,8],  terutama  bagi  jenis  ikan  yang mendiami  perairan  tawar  [3].  Kelimpahan  ikan air  tawar  diduga  keberadaanya  menjadi  faktor utama  dalam  penyebaran  ikan  introduksi  dari satu  lokasi  ke  lokasi  lainnya  bahkan  sebagian dari ikan tersebut telah tercatat sebagai invasive alien species [9].
Anggota  Famili  Poeciliidae  merupakan ikan yang berukuran kecil (panjang total antara 4-20  cm),  ciri  diagnostiknya  yaitu  (1)  jari-  jari ke-  3,  4,  dan  5  dari  sirip  anal  mengalami modifikasi  menjadi  gonopodium  [10];  (2) fertilisasinya  secara  internal  (ikan  jantan memasukkan  sperma  ke  dalam  organ  genital betina);  (3)  bunting  dan  melahirkan  ( live bearers )  [3,11].  Selain  itu,  karakter  lain  yang dimiliki  oleh  ikan  yang  tergolong  Poeciliidae adalah  hanya  mempunyai  satu  sirip  punggung yang  merupakan  jari-jari  lunak,  jari-jari  sirip anal  pada  ikan  betina  berjumlah  A9,  jari-jari ketiga  sirip  anal  tersebut  tidak  bercabang, bentuk  sirip  ekor rounded atau emarginated, jari-jari  sirip  perut  berjumlah  V6,  sirip  dada memiliki  jari-jari  lunak  P9-16,  menunjukkan
dimorfi seksual dari segi ukuran tubuh dan pola warna, serta memiliki sisik sikloid [9]. Anggota ikan  ini  berperan  sebagai  objek  atau  model pembelajaran  dalam  studi  biologi  seperti: ekologi, anatomi, embriologi, morfologi, fisiologi,  dan  tingkah  laku  [3].  Beberapa  ikan anggota  Famili  Poeciliidae  ini  memiliki keunggulan  sebagai  pengontrol  perkembangan nyamuk malaria [11]. Namun, kajian sistematik,  keanekaragaman,  dan  hubungan kekerabatan  ( Phylogenetic  relationship )  di antara genus masih kurang [3].
Kemelimpahan ikan  introduksi  di Telaga Sari Purwodadi, Kabupaten Pasuruan menjadikan ikan ini  menarik untuk diteliti. Hal ini  dikarenakan  dalam  satu  danau  hanya ditemukan  ikan  Famili  Poeciliidae  tersebut dalam  jumlah  melimpah  dan  tidak  ditemukan jenis ikan lokal lainnya. Kemelimpahan ikan ini tidak  didukung  dengan  pengenalan  masyarakat sekitar  terkait  potensi  ikan  tersebut  di  alam. Rahayu  et  al.  [12]  menyatakan  secara  genetik berdasarkan  gen  16S  rRNA  ikan  introduksi yang  berada  di  Telaga  Sari  merupakan  Famili Poeciliidae, namun belum sampai teridentifikasi di  tingkat  spesies.  Dari  penelitian  tersebut terdapat  hal  yang  sangat  mengejutkan  bahwa ikan  gatul  dari  Telaga  Sari  memiliki  hubungan kekerabatan  yang  sangat  jauh  ( outgroup ) dengan Poecilia  reticulata yang  merupakan satu famili yaitu Poeciliidae. Belum diketahuinya secara pasti status taksonomi ikan introduksi tersebut membuat pentingnya dilaksanakannya  penelitian  lanjutan  terkait status  taksonomi  ikan  ini  dalam  upaya pengelolaan, budidaya dan konservasi keberlanjutannya. Dugaan awal susahnya identifikasi ikan introduksi tersebut dikarenakan adanya  fenomena cryptic  spesies ,  sehingga identifikasi ikan tersebut sulit dilakukan.
Kesesuaian  dan  ketepatan  identifikasi spesies  merupakan  masalah  utama  dalam pengelolaan  sumber  daya  ikan,  baik  ikan introduksi  maupun  endemik.  Frankham  et  al. [13] menyebutkan bahwa status taksonomi ikan merupakan  tahap  awal  konservasi  biologi.  Saat
ini,  semakin  berkembangnya  teknologi  di bidang biologi molekuler menjadikan terobosan baru  identifikasi  spesies  menggunakan  marka genetik.  Taylor  &  Harrist  [14]  menyebutkan bahwa  identifikasi  taksonomi,  penentuan  jenis spesies dan pengelompokannya dapat dilakukan melalui DNA Barcoding . Lebih lanjut Hebert et al.  [15]  menjelaskan  bahwa  gen cytochrome oxydase  oxidase  sub  unit  I (COI)  merupakan barcode genetik  untuk  semua  makhluk  hidup yang  belum  diketahui  jenisnya.  Peran  DNA Barcode dalam  studi  taksonomi  ikan  dapat diaplikasikan  pada  semua  tingkatan  stadia  dari telur hingga dewasa [16].
Gen COI memiliki dua keunggulan utama yaitu,  (1)  primer-primer  universal  untuk  gen  ini memiliki kemampuan sangat kuat, yaitu mampu mencakup  ujung  5’  dari  sebagian  besar  atau keseluruhan  filum  hewan  [16,  17];  (2)  gen  COI memiliki rentangan sinyal filogenetik yang lebih besar  dibandingkan  dengan  gen  mitokondrial lainnya. Evolusi pada gen ini cukup cepat untuk menunjukkan  perbedaan  tidak  hanya  untuk spesies yang berkerabat dekat, tetapi juga antara kelompok geography dalam  suatu  spesies tunggal  [18].  Gen  COI  ini  sudah  digunakan untuk identifikasi ikan air tawar di Kanada [19]; ikan laut di Australia termasuk di dalamnya ikan teleost, hiu dan pari [20]; dan ikan air tawar dari Mexico  dan  Guatemala  [21].  Selain  itu,  gen tersebut  juga  digunakan  untuk  identifikasi  larva ikan  yang  hidup  di  perairan  Australia,  dan identifikasi  ikan  sebelum  tahap  dewasa  yang mencakup  perkembangan  mulai  dari  telur sampai  tahap  dewasa  [22,  23].  Penggunaan DNA barcode dalam  identifikasi  spesies  ikan introduksi  salah  satunya  telah  dilakukan  oleh Collins et  al. [24]  dengan mengidentifikasi ikan hias  introduksi  yang  terdiri  atas  172  spesies Cyprinid. Ikan introduksi tersebut digemari oleh masyarakat dan beredar sangat luas di pasar ikan hias  internasional,  seperti  jenis  danio,  rasbora, barb, puntius, dan lain-lain.
Mengacu  pada  fenomena cyptic  species dan  belum  adanya  kejelasan  status  taksonomi ikan  Famili  Poeciliidae  yang  mendiami  Telaga Sari,  Pasuruan,  maka  perlu  dilakukan  upaya assessment secara  cepat  melalui  identifikasi molekuler  dengan  menggunakan  marka  DNA Barcoding .  Penelitian  ini  dilakukan  untuk mengidentifikasi  jenis  ikan  introduksi  Famili Poeciliidae melalui identifikasi molekuler meliputi kekerabatan pohon filogenetik, similaritas,  variasi  sekuen  DNA,  jarak  genetik, dan BOLD System.
METODE PENELITIAN
Koleksi sampel. Koleksi sampel dilakukan di Telaga Sari, Purwodadi, Kabupaten Pasuruan.  Sampel  ikan  ditangkap  dengan menggunakan jaring lempar. Ikan yang tertangkap didokumentasikan selanjutnya disimpan dalam formalin untuk proses identifikasi  karakter  morfometrik,  meristrik  dan karakter  diagnostik  [25;  26]  dan  sebagian  lagi disimpan  dalam  alkohol pure  grade untuk identifikasi molekuler.
Ekstraksi  dan  amplifikasi  DNA. Isolasi DNA  total  dari  sampel  sirip  dada  dilakukan dengan  menggunakan  DNA  Isolation  Kit (NucleoSpin®
Tissue,
Macherey-Nagel,
Germany) dan mengikuti prosedur dari NucleoSpin® Tissue dengan beberapa modifikasi.  Hasil  DNA  murni  yang  didapatkan diukur  menggunakan  UV  spektrofotometer NANO  DROP  2000.  Kalibrasi  dilakukan menggunakan buffer elution (BE) yang merupakan pelarut stok DNA. Setelah didapatkan DNA murni, maka tahap selanjutnya yaitu kloning gen cytochrome-c oxidase I (COI) dengan  teknik  PCR  menggunakan  primer barcording khusus gen COI [17; 15; 27] yaitu:
COI
Barcoding Forward
5’ - GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’, COI Barcoding Reverse 5’ - TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’.
Berdasarkan  jumlah  DNA  total  yang didapatkan, reaksi PCR dilakukan dalam volume 50 μl (mengikuti prosedur iNtRON BIOTECHNOLOGY)  dengan  siklus  sebagai berikut  amplifikasi  PCR  dilakukan  dalam  40 siklus, denaturasi awal pada suhu 94 o C selama 2 menit,  denaturasi  pada  suhu  94 o C  selama  45 detik, annealing dengan  suhu  45 o C  selama  45 detik,  pemanjangan  pada  suhu  72 o C  selama  1,5 menit,  pemanjangan  akhir  pada  suhu  72 o C selama  10  menit.  Siklus  ini  diulang  sebanyak 40x.  Setelah  PCR,  pengecekan  keberhasilan amplifikasi PCR dilakukan melalui elektroforesis.  Setelah  muncul suspect  band pada hasil elektroforesis, hasil PCR disekuensing  melalui  Big  Dye  Terminator  ABI 3130  xl.  Proses  sekuensing  dilakukan  di Eijkman Institute for Molecular Biology Jakarta.
Tabel 1 . Kode sampel dengan Kerabatnya dari GenBank dan BOLD System
No Nama Sampel Lokasi Sampel Acc Number Gene Bank Acc Number Bold System 1 Xiphophorus helleri 1 Telaga Sari, Purwodadi, Pasuruan Sampel penelitian Sampel penelitian 2 Xiphophorus helleri 1 Telaga Sari, Purwodadi, Pasuruan Sampel penelitian Sampel penelitian 3 Xiphophorus helleri 2 Telaga Sari, Purwodadi, Pasuruan Sampel penelitian Sampel penelitian 4 Xiphophorus helleri 2 Telaga Sari, Purwodadi, Pasuruan Sampel penelitian Sampel penelitian 5 Poecilia mexicana Telaga Sari, Purwodadi, Pasuruan Sampel penelitian Sampel penelitian 6 Poecilia mexicana Telaga Sari, Purwodadi, Pasuruan Sampel penelitian Sampel penelitian 7 Poecilia reticulata Telaga Sari, Purwodadi, Pasuruan Sampel penelitian Sampel penelitian 8 Poecilia reticulata Telaga Sari, Purwodadi, Pasuruan Sampel penelitian Sampel penelitian 9 Xiphophorus hellerii voucher MXIV0344 Kanada HQ573209.1 MFIV062-10.COI-5P 10 Xiphophorus hellerii voucher MXIII381 Kanada GU807092.1 MXIII338-09.COI-5P 11 Xiphophorus hellerii voucher KW11T085 Kanada KU569081.1 FWAQ072-11.COI-5P 12 Xiphophorus hellerii voucher BIF2926 Kanada KU692952.1 BIFD2486-14.COI-5P 13 Poecilia mexicana voucher stri2074 Amerika JX968678.1 BOLD:ACR5435 14 Poecilia mexicana voucher SA9 Amerika JX968663.1 BOLD:AAA4518 15 Poecilia reticulata voucher KW11T027 Afrika Selatan KU568971.1 FWAQ014-11.COI-5P 16 Poecilia reticulata voucher Ex51H4 German KM287034.1 FFMBH2593-14.COI- 5P 17 Cyprinodontiformes sp. BOLD:AAA6554 voucher MXIII408 Kanada GU672713.1 MXIII365-09.COI-5P Analisis  data. Analisis  data  genetik dilakukan berdasarkan hasil pembacaan kromatogram (Finch  TV)  dari  sekuen Barcode COI (±500  bp).  Setelah  dicek  dengan software Finch  TV , selanjutnya  dianalisis  dengan menggunakan DNASTAR untuk melihat kromatogram  sekuen  dan  membuat consensus (menggabungkan  primer foward dan reverse ).
Hasil consensus dicocokkan  dengan  BLAST secara online , tujuannya adalah untuk mengetahui kecocokan gen target dengan Query yang  diperoleh  dari Gene  Bank dan  BOLD System. Sebelum tahap alignment , setiap sampel ditranslasi  menjadi  protein  (tanpa  adanya  stop kodon di bagian tengah/numt) dengan menggunakan DNASTAR .  Tahap  selanjutnya
yaitu alignment dengan menggunakan Clustal W di  Mega  6 [28]  selanjutnya  diperiksa  secara manual  menggunakan  Bioedit  ver  7.0.9.  Hasil alignment kemudian  dicek  satu  per  satu  untuk identifikasi  secara online pada  BOLD  System (www.barcodinglife.org)  dan  cek  similaritas melalui  GenBank  serta  dibandingkan  dengan kerabatnya pada genbank (Tabel 1). Selanjutnya, membuat  konstruksi  topologi  filogenetik  untuk mengetahui hubungan kekerabatan antara spesies  satu  dan  spesies  lainnya  dengan menggunakan  program  komputer  Mega  6 dengan  metode Maximum  Parsimony (MP), Maximum  Likelihood (ML)  dan Neighbour Joining (NJ) dengan model perhitungan algoritmik  Kimura-2  parameter  (lebih  efektif untuk barcoding , karena opsi tersebut mempertimbangkan  titik  substitusi  transisi  dan transversi)  serta  menghitung  jarak  genetik  intra dan inter spesies [29]. Evaluasi pohon dilakukan dengan menggunakan analisis bootstrap sebanyak  1000  ulangan.  Perhitungan  nilai similaritas  yaitu    Persentase  Similaritas  =  (1  - Jarak  Genetik)  x  100%.  Analisis  variasi  sekuen basa  nukleotida  dan haplotype antara  Famili Poeciliidae  dilakukan  dengan  menggunakan program  komputer  DnaSP  v.5.0,  serta  membuat haplogroup  berdasarkan  analisis median  joining network Famili  Poeciliidae  dengan  kerabatnya berdasarkan haplotype menggunakan  program komputer Network 4.1.0.8 [30].

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Identifikasi  melalui  BOLD  System.
Sejumlah  556  basa  nukleotida  telah  berhasil ditranslasi  menjadi  protein  tanpa  ditemukan adanya stop kodon di tengah sekuen (pseudogen)  di  antara  delapan  sampel  yang telah  dilakukan  sekuensing.  Basa  nukleotida tersebut kemudian dianalisis lebih lanjut dengan identifikasi online melalui  BOLD  System (Tabel  2).  Kesamaan  dari  kelompok Poecilia mexicana dengan  data  Bold  System  sangat tinggi antara 99,20-99,33%, begitu juga dengan Poecilia  reticulata sebesar  99,20-99,50%. Kesamaan  tinggi  antara Xiphoporus  helerii sampel  dengan Poecilia  reticulata disebabkan karena  kesalahan  pemberian  nama  pada data base BOLD  System.  Setelah  dilakukan  cek sampel  berdasarkan  kode  spesimen  ( voucher ) pada  BOLD  System,  spesimen  tersebut merupakan  karakter  dari  kelompok  genus Xiphoporus yaitu  adanya  ekor  pedang  pada spesies  jantan  dan  terlihat  adanya  gonopodium
(modifikasi  sirip  anal)  [10].  Sehingga  dapat disimpulkan  bahwa  sampel Xiphoporus  helleri yang  ditemukan  di  Telaga  Sari,  Pasuruan merupakan Xiphoporus  helerri menggunakan DNA Barcode COI  dengan  indeks  similaritas sebesar  98,82-100%  dengan  BOLD  System. Hal ini juga didukung dari asal usul data BOLD yaitu  Amerika  dan  Afrika  Selatan  yang merupakan  habitat  asli  dari  kelompok  Famili Poeciliidae.  Aringthon  [33]  menyatakan  bahwa ikan  anggota  Famili  Poeciliidae  bersifat eurytermic .  Famili  Poeciliidae  merupakan  ikan yang  mampu  hidup  pada  rentang  suhu  yang besar,  dan  kemampuan  beradaptasi  dengan lingkungan  baru  menjadikan  kesuksesan  ikan introduksi  tersebut  untuk  bertahan.  Hal  ini sejalan  dengan  data  yang  dirilis  oleh Global
Invasive Species Database
(http://www.iucngisd.org/gisd/)  terdata  bahwa spesies  yang  ditemukan  memiliki  potensi sebagai invasive  alien  species (menginvasi lingkungan).
Penelitian  ini  menambahkan  data  ikan- ikan  yang  mendiami  perairan  Indonesia, khususnya Telaga Sari Pasuruan pada perpustakaan  DNA barcoding (BOLD  System). Dengan  mengikuti  persyaratan  yang  telah dikeluarkan  oleh  GenBank,  yaitu  (1)  memiliki sekuen nukleotida sepanjang 500 bp berasal dari situs  barcoding  gen  COI,  (2)  amplifikasi mengacu pada primer yang telah ditentukan oleh konsorsium,  (3)  rekam  jejak  file  dapat  diakses secara  terbuka,  dan  (4)  penamaan  spesies  telah mengacu  pada  dokumen  yang  telah  disepakati. Melalui  BOLD  System,  permasalahan  status taksonomi  ikan  yang  mendiami  perairan Indonesia  (baik  lokal,  endemik,  maupun introduksi)  dapat  terselesaikan  secara  cepat, tepat dan akurat [15].
Variasi  basa  nukleotida. Kekhawatiran saat  menggunakan marker DNA  mitokondria untuk  amplifikasi  adalah  adanya  " COI  like sequence "  atau  pseudogen  yang  berasal  dari mitokondria (numt)  [31].  Untuk  mengonfirmasi urutan  ini  benar-benar berasal  dari  gen  COI DNA  mitokondria  atau  bukan,  kami melakukan beberapa  analisis  lanjut.  Salah  satunya  yaitu identifikasi  adanya karakter  numt,  adanya penyisipan dan penghapusan dalam urutan DNA (NUMTs)  [32].  Namun,  hasil  dari  penyelarasan gen COI Famili Poeciliidae dalam penelitian ini tidak  ditemukan  adanya  insersi  dan  delesi ( indel ).  Selain  itu,  untuk  memastikan  adanya numt, telah diperiksa secara cermat heterozigositas peak puncak  kromatogram  [31],
dan urutan yang diperoleh tidak tumpang tindih.
Jadi  bisa  dipastikan  sekuen  DNA  yang  telah
teramplifikasi  dalam  penelitian  ini  adalah  gen COI pada DNA mitokondria.
Tabel  2. Tiga  nilai  kecocokan  tertinggi  dari  identifikasi  melalui  BOLD  System  dengan  representasi nilai similaritas
Nama spesimen Identifikasi BOLD (3 tertinggi) Similaritas (%) Xiphophorus helleri 1 Poecilia reticulata Poecilia reticulata Poecilia reticulata 100 99,98 99,94 Xiphophorus helleri 1 Poecilia reticulata Poecilia reticulata Poecilia reticulata 99,84 99,84 99,84 Xiphophorus helleri 2 Poecilia reticulata Poecilia reticulata Poecilia reticulata 98,82 98,82 98,82 Xiphophorus helleri 2 Poecilia reticulata Poecilia reticulata Poecilia reticulata 98,82 98,82 98,82 Poecilia mexicana Poecilia mexicana Poecilia mexicana Poecilia mexicana 99,33 99,33 99,33 Poecilia mexicana Poecilia mexicana Poecilia mexicana Poecilia mexicana 99,20 99,20 99,20 Poecilia reticulata Poecilia reticulata Poecilia reticulata Poecilia reticulata 99,50 99,50 99,50 Poecilia reticulata Poecilia reticulata Poecilia reticulata Poecilia reticulata 99,20 99,20 99,20
Tabel 3. Variasi basa nukleotida, tipe mutasi dan komposisi basa nukleotida gen COI
Spesies Conserved sites Variasi Variable sites si sv Komposisi basa nukleotida Pi s AT GC Gen COI Xiphoporus helleri 1 556 4 6 10 7 3 57,37% 42,63% Xiphoporus helleri 2 556 4 6 10 7 3 57,37% 42,63% Poecilia mexicana 556 16 7 23 18 5 55,94% 44,06% Poecilia reticulata 556 2 2 4 3 1 57,55% 42,45% Semua sampel 556 21 10 31 22 9 57,55% 42,45%
Keterangan: Pi: Parsimony-informative site , s: singleton site , si: transition pair , sv: transversi pair
Tabel  4. Variasi  basa  nukleotida  Famili  Poecilidae  berdasarakan  gen  COI  serta  Nukleotida penciri (automophi) Famili Poeciliidae
6 1 5 2 1 2 2 2 4 2 5 3 3 3 6 6 0 6 3 1 0 8 1 1 7 1 5 0 1 5 3 1 7 4 1 8 9 2 0 2 2 0 7 2 2 9 2 4 3 2 5 5 2 7 3 3 2 2 Poecilia reticulata C C C C T T G A T T C A C C C A T A T G C T T Poecilia reticulata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Xiphoporus helerii 2 T . G A G G . . . C . . . T . . . G . . T . . Xiphoporus helerii 2
T . G A G G . . . C . . . T . . . G . . T . . Xiphoporus helerii 1 T . G A G G . . . C . . . T . . . G . . T . . Xiphoporus helerii 1
T . G A G G . . . C . . . T . . . G .
. T . . Poecilia mexicana . T A T A . A T C . T C T . A G C T G A . C C Poecilia mexicana . T A T
A . A T C . T C T . A G C T G A . C C
Variasi Basa Nukleotida Spesimen
4 3 5 4 3 6 4 4 4 4 5 5 4 6 8 4 7 4 4 9 2 5 0 1 5 1 9 5 2 8 Poecilia reticulata T T A A C G T A T G Poecilia reticulata . . . . . . . . . . Xiphoporus helerii 2 . . . . A . . . . . Xiphoporus helerii 2 . . . . A . . . . . Xiphoporus helerii 1 . . . . A . . . . . Xiphoporus helerii 1 . . . . A . . . . . Poecilia mexicana C C C G T A A T G A Poecilia mexicana C C C G T A A T G A Spesimen Variasi Basa Nukleotida
Tabel  5 . Jarak  genetik  antar  grup  (OTU) ikan  Famili  Poeciliidae  berdasarkan  sekuen  Barcode  gen  COI menggunakan model perhitungan p-distance (Persentase)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1 Poecilia mexicana 2 Poecilia mexicana 0 3 JX968663.1 Poecilia mexicana 0 0 4 JX968678.1 Poecilia mexicana 1.3 1.3 1.3 5 Poecilia reticulata 13.2 13.2 13.2 14 6 Poecilia reticulata 13.2 13.2 13.2 14 0 7 Xiphoporus hellerii 2 12.9 12.9 13.2 13.6 1.1 1.1 8 Xiphoporus hellerii 2 12.9 12.9 12.9 13.6 1.1 1.1 0 9 Xiphoporus hellerii 1 12.9 12.9 12.9 13.6 1.1 1.1 0 0
10 Xiphoporus hellerii 1
12.9 12.9 12.9 13.6 1.1 1.1 0 0 0 11 KM287034.1 Poecilia reticulata voucher Ex51H4 13.1 13.1 13.1 13.8 5.4 5.4 4.5 4.5 4.5 4.5
12 KU568971.1 Poecilia reticulata voucher KW11T027 13.4 13.4 13.4 14.2 6 6 5.1 5.1 5.1 5.1 0.5 13 KU692952.1 Xiphoporus hellerii voucher BIF2926 16.2 16.2 16.2 16.3 17.6 17.6 17.1 17.1 17.1 17.1 15.1 14.9 14 KU569081.1 Xiphoporus hellerii voucher KWIII408 16.2 16.2 16.2 16.3 17.6 17.6 17.1 17.1 17.1 17.1 15.1 14.9 0
15 GU807092.1 Xiphoporus hellerii voucher MXIII408 16.3 16.3 16.3 16.5 17.6 17.8 17.2 17.2 17.2 17.2 15.2 15.1 0.2 0.2 16 HQ573209.1 Xiphoporus hellerii voucher MXIV0344 16.2 16.2 16.2 16.3 17.8 17.6 17.2 17.1 17.1 17.1 14.9 14.9 0 0 0.2 17 GU672713.1 Cyprinodontiformes sp. BOLD AAA654 19.2 19.2 19.2 18.9 23 23 22.7 22.7 22.7 22.7 23.6 23.6 20 0.2 20 20
Tabel 6. Persentase Jarak genetik intra dan interspesies berdasarka model K2P
Jarak Genetik Poecilia reticulata Poecilia mexicana Xiphoporus hellerii Gen COI Jarak minimum intraspesies 0 0 0 Jarak maksimum intraspesies 0.1 1.3 0.2 Rata-rata jarak intraspesies 0.5 1.3 1.1 Rata-rata jarak interspesies 18.7
Gambar  1 . Topologi  filogenetik  Famili  Poeciliidae  dari  Telaga  Sari,  Pasuruan dengan  referensi  gen COI dari gene bank (NJ, MP dan ML dengan bootstrap 1000 kali ulangan)
Gambar  2 . Haplotype  network dan  distribusi  geografis haplotype ikan  Famili  Poeciliidae  A.
Haplotype  network dari  sembilan haplotype berdasarkan  sekuen  gen  COI. Haplotype ditunjukkan  dengan  bentuk  lingkaran  dan  pola  yang  berbeda.  Percabangan  antar haplotype ditunjukkan dengan subtitusi berdasarkan posisi alignment sekuen gen COI.
Variasi  basa  nukleotida  tipe  transisi  gen COI  ditemukan  lebih  banyak  terjadi  daripada transversi.
Berdasarkan semua sampel Poeciliidae, jumlah variasi mutasi transisi adalah 22,  sedangkan  variasi  basa  nukleotida  tipe transversi adalah sembilan atau dengan rasio 2,4 (Tabel  5).  Jumlah  mutasi  transisi  ini  juga ditemukan  pada  DNA  mitokondria  seperti  yang dilaporkan  Lakra  et  al.  [33]  dalam  penelitian mereka  menunjukkan  bahwa  rasio  transisi dengan  transversi  adalah  2,0  pada  gen  COI. Fenomena  bias  transisi  terjadi  karena  adanya mutasi  spontan  yang  melibatkan  mutasi  transisi jauh  lebih  besar  daripada  mutasi  transversi. Kedua,  seleksi  alam  memengaruhi  bias  transisi karena  mutasi  transisi  cenderung  sinonim daripada mutasi transversi [34]. Sekuen barcode gen  COI  menunjukkan  bahwa  komposisi  basa nukleotida GC kurang dari AT. Komposisi basa nukleotida  GC  antara  42,45%-44,06%.  Hal  ini serupa  dengan  hasil  penelitian  Nugroho  et  al. [35]  jumlah  basa  nukleotida  AT  ikan  Nomei yang  ditemukan  di  perairan  Kalimantan  Utara lebih  banyak  daripada  jumlah  GC.  Variasi tersebut  bisa  dihubungkan  dengan  fisiologi metabolisme organisme tersebut.
Berdasarkan alignment semua  sampel (sampel penelitian dengan GenBank yang tertera pada Tabel 4 menunjukkan terdapat 556 bp yang terdiri atas 31 variasi basa nukleotida dan 556 bp basa nukleotida yang conserved . Dari keseluruhan  sampel  yang  telah  disejajarkan ( alignment )  ditemukan  basa  nukleotida  yang unik (karakter basa
nukleotida
diagnostik/penciri)  yang  ditemukan  pada  Famili Poeciliidae yang mendiami Telaga Sari, Pasuruan.  Sebagai  contoh  pada  basa  nukleotida nomer  468  terdapat  tiga  karakter  penciri  yaitu Poecilia  reticulata memiliki  basa  nukleotia Sitosin  (C), Xiphoporus  hellerii (A),  sedangkan Poecilia mexicana (T). Karakter basa nukleotida diagnostik  tersebut  dapat  digunakan  untuk membedakan  jenis  ikan  Poeciliidae.  Beberapa karakter  basa  nukleotida  dapat  digunakan sebagai simple  diagnostic  nucleotide (sND). Sarkar et al. [36] menggunakan karakter tersebut untuk  mendeskripsikan  beberapa  karakter  yaitu shared  nucleotide  site (ND)  atau attribute character (CA),  karakter  ini  telah  banyak digunakan [37;38].  Keberadaan basa nukleotida diagnostik  merupakan  syarat  utama  dalam identifikasi spesies menggunakan DNA Barcoding [21].  Pada  penelitian  ini,  karakter sND sangat penting digunakan untuk mengidentifikasi Famili Poeciliidae hingga level
spesies  meskipun  ada  salah  pemberian  nama pada BOLD System.
Jarak  genetik. Jarak  genetik  (Tabel  5) antara sampel dengan kerabat dekatnya dihitung menggunakan model p-distance . Rata-rata jarak genetik  di  antara Xiphoporus  hellerii adalah 1,1%, Poecilia  reticulata 1,3%  dan Poecilia mexicana 0,5%. (Tabel 6). Hal ini menunjukkan bahwa  keragaman  genetik  intragrup  sangat rendah atau kurang dari 2%. Nilai jarak genetik yang  lebih  dari  2%  menunjukkan  bahwa terdapat  spesies  yang  berbeda  dengan  anggota grup  lainnya,  sebaliknya  nilai  jarak  genetik kurang dari 3%, menunjukkan grup atau klaster tersebut  berasal  dari  spesies  yang  sama  atau satu jenis [39]. Hasil menarik ditunjukkan pada ketiga spesies yang ditemukan telah teridentifikasi  berdasarkan  nilai  jarak  genetik intragroup.  Jarak  genetik  antara  ketiga  spesies tersebut yaitu 18,7%. jarak genetik ini melewati batas ambang dari standardisasi yang disebutkan  oleh  Hebert  et  al.  [15],  yang  dapat diartikan  bahwa  ketiganya  memang  adalah spesies  yang  berbeda  dengan  variasi  basa nukleotida  yang  tinggi  di  antaranya  dan  dapat diartikan  di  antara  ketiga  spesies  tersebut memiliki keragaman genetik yang tinggi.
Hubungan kekerabatan genetik. Konstruksi  topologi  pohon  filogenetik  antara sampel  dengan  kerabat  dekatnya  (GenBank) dianalisis  menggunakan  metode  NJ,  MP  dan ML  dengan  model  perhitungan  K2P  ( boostrap 1000  kali  ulangan)  (Gambar  1).  Berdasarkan kladogram  yang  terbentuk  terbagi  atas  dua klaster  besar  yang  membagi  atas  klad Poecilia mexicana,  Poecilia  reticulata,  Xiphoporus hellerii dengan  kerabat  dekatnya  dari genbank . Klaster pertama membagi kelompok Xiphoporus  helleriii dengan Poecilia  reticulata dengan  nilai bootsrap 100/99/100.  Sedangkan kelompok Poecilia  mexicana satu  klad  dengan Poecilia mexicana dari genbank . Mengacu pada nilai  bootstrap  masing-masing  OTU  berkisar antara  83  hingga  100,  hal  ini  dapat  dikatakan bahwa pengelompokan tersebut memiliki tingkat  kesamaan  yang  tinggi.  Hal  berbeda tampak  pada  klaster  kedua,  dimana  kelompok Xiphoporus hellerii dari genbank yang memisah klad dengan Xiphoporus hellerii sampel dengan nilai bootstrap 84.  Hal  ini  disebabkan  karena terjadinya  fenomena cyrptic  species (spesies yang  samar)  dan  telah  terisolasi  lama  dalam geografis yang berbeda. Sebagian besar spesies ikan air tawar yang mendiami wilayah perairan
tropis  memiliki  kemampuan  adaptasi  yang cukup  tinggi,  sehingga  bisa  terjadi  perubahan karakter  morfologi  ( radiation  of  morphology ).
Ribeiro  et  al.  [40]  menyatakan  bahwa  Famili Poeciliidae  merupakan  famili  yang  kompleks dengan penyebaran luas dan keragaman tinggi.
Analisis haplotype dengan  menggunakan metode Median  Joining  Network dari  delapan individu  Famili  Poeciliidae  dengan  kerabat dekatnya dianalisis dengan menggunakan program  komputer  Network  4.1.0.8  [30]. Median  joining  network membuat  deskripsi variasi  Famili  Poeciliidae  dengan  kerabatnya menjadi sembilan haplotype dan terbagi menjadi empat haplogroup .  Ikan  Poeciliidae  masuk dalam  dua haplogrup yang  berbeda  yaitu haplotype  3  ( Poecilia  reticulata )  dan haplotype 4  ( Xiphoporus  helleri )  termasuk  kelompok  C, sedangkan haplotype 1  ( Poecilia  mexicana ) termasuk  kelompok  2. Haplotype yang  berbeda dari  lokasi  yang  sama  diindikasi  bahwa individu-individu yang terambil memiliki MtDNA tipe  heteroplasmik. Xiphoporus  hellerii yang membentuk haplotype tersendiri, meskipun berada dalam satu lokasi (Telaga Sari) (Gambar 2).  Heteroplasmik  merupakan  sel  induk  yang memiliki  mitokondria  yang  materi  genetiknya mutan  dan wildtype ,  jika  terjadi  segregasi replikatif, sel anak bisa memiliki  materi genetik mutan  dan  normal  [41].  Pada  kasus  ikan Xiphoporus hellerii tersebut kemungkinan DNA mitokondria yang terambil adalah yang heteroplasmik  sehingga  dihasilkan haplotype yang berbeda.
Ada beberapa informasi genetik dan status taksonomi  molekuler  yang  telah  diidentifikasi dalam  penelitian  ini  yang  dapat  dijadikan sumber informasi dasar untuk studi lebih lanjut. Upaya  konservasi  ikan  introduksi  Famili Poeciliidae  di  Telaga  Sari,  Pasuruan  bertujuan untuk  meningkatkan  kuantitas  dan  kualitas populasi  atau  individu  sebagai  upaya  budidaya dengan  benar,  pengelompokan  sesuai  dengan spesies dan entitas genetik, serta pengembangan kriopreservasi plasma nutfah untuk keberlanjutannya.  Studi  genetik  yang  lebih  luas perlu  dilakukan,  terutama  dengan  memasukkan lebih  banyak  sampel  dan  penggunaan  marker molekuler yang lebih bervariasi.

## KESIMPULAN
Penggunaan marka genetik DNA
Barcode COI  telah  berhasil  mengidentifikasi tiga  spesies  introduksi  ( Poecilia  reticulata, Poecilia  mexicana dan Xiphoporus  hellerii )
yang mendiami Telaga Sari, Pasuruan berdasarkan  jarak  genetik,  variasi  genetik, karakter  sekuen  DNA  diagnostik,  topologi filogenetik dan BOLD System.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terimakasih kepada segala  pihak  yang  membantu  selama  penelitian berlangsung.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]. Lucinda  PHF  (2003)  Family  Poeciliidae, Check  list  of  the  freshwater  fishes  of South  and  Central  America.  Edipucrs, Porto Alegre, Brazil, pp: 555-581.
[2]. Tamaru  CS,  Cole  B,  Bailey  R  (2001)  A manual for commercial production of the Swordtail Xiphophorus  helleri .  CTSA Publication/128, Honolulu, pp. 36.
[3]. Canonico GC, Arthington A, McCray JK, Thieme  ML  (2005)  The  effects  of introduced tilapias on native biodiversity. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems 15 (5): 463-483.
[4]. Lintermans  M  (2004)  Human-assisted dispersal  of  alien  freshwater  fish  in Australia.  New  Zealand  Journal  of Marine  and  Freshwater  Research  38  (3): 481-501.
[5]. Koehn  JD,    MacKenzie  RF  (2004)
Priority  management  actions  for  alien freshwater fish species in Australia. New Zealand Journal of Marine and
Freshwater Research 38 (3): 457-472.
[6]. Lee  CE  (2002)  Evolutionary  genetics  of invasive  species.  Trends  in  Ecology  and Evolution 17 (8): 386- 391.
[7]. Semmens  BX,  Buhle  ER,  Salomon  AK, Pattengill-Semmens CV (2004) A hotspot  of  non-native  marine  fishes: evidence  for  the  aquarium  trade  as  an invasion pathway. Marine Ecology Progress Series 266: 239-244.
[8]. Dudgeon  D,  Arhtington  AH,  Gessner MO, Kawabata ZI, Knowler DJ, Leveque, C. Naiman RJ, Prieur-Richards AH, Soto D, Stiassny MLJ, Sullivan CA (2006) Freshwater biodiversity:
importance, threats, status and conservation  challenges.    Biological
Review 81 (2): 163-182. [9]. Parenti  LR  (1981)  A  phylogenetic  and biogeographic analysis of Cyprinodontiformes fishes (Teleostei,
Atherinomorpha).  Nature  168  (4):  335- 557.
[10]. Hensen  RR,  Ploeg  A,  Fossa  SA    (2010) Standard  names  for  freshwater  fishes  in the  ornamental  aquatic  industry.  OFI educational  publication  5.  Ornamental Fish International, Netherlands.
[11]. Kallman  KD,  Walter  RB,  Morizot  DC, Kazianis  S  (2004)  Two  new  species  of Xiphophorus (Poeciliidae) from the Isthmus of Tehuantepec, Oaxaca, Mexico, with a discussion of the distribution of the X.  clemenciae clade.  American  Museum Novitates 3441: 1-34.
[12]. Rahayu  DA,  Jannah  M,  Winaris  N, Listyorini  D  (2010)  The  phylogenetic  of Gatul  fish  ( Xiphoporus sp.)  in  Sari  Lake Pasuruan  Regency,  In  Proceedings  of  the Association  for  Tropical  Biology  &
Conservation 2010 Meeting, Bali. Indonesia.
[13]. Frankham  R,  Ballau  JD,  Briscoes  DA (2002) Introduction to conservation genetic.  Cambridge  University  Press, Cambridge, 607 pp.
[14]. Taylor  HR,  Harrist  WE  (2012)  An emergent science onthe brink of irrelevance: a review of the past 8 years of DNA  barcoding.  Molecular  Ecology Resources 12 (3): 377-388.
[15]. Hebert  PDN,  Cywinska  A,  Ball  SL, DeWaard JR (2003) Biological identifications  through  DNA  barcodes.
Proceedings  of  The  Royal  Society  B: Biological Sciences 270 (1512): 313-321.
[16]. Rasmussen  RS,  Morrissey  MT,  Hebert PDN (2009) DNA barcoding of
commercially  important  salmon  and  trout species  ( Oncorhynchus and Salmo )  from North  America.  Journal  of  Agricultural and Food Chemistry 57 (18): 8379-8385.
[17]. Folmer O, Hoeh BW, Lutz R, Vrijenhoeicatk R (1994) DNA primers for amplification of mitochondrial Cytochrome-c  Oxidase Subunit  I from diverse Metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3 (5): 294-299. [18]. Zhang DX, Hewitt GM (1997)
Assesment  of  the  universality  and  utility of  a  set  of  conserved  mitochondrial primers  in  insect.  Insect  Molecular Biology 6 (2): 143-150.
[19]. Ward  RD,  Costa  OF,  Holmes  BH, Steinke  D  (2008)  DNA  Barcoding  of
Shared  fish  species  from  the  North
Atlantic and Australasia: Minimal divergence  for  most taxa, but Zeus  faber and Lepidopus  caudatus each  probably constitute  two  spesies.  Aquatic  Biology 3: 71-78.
[20]. Hubert N, Hanner R, Holm EM, Nicholas E (2008) Identifying Canadian freshwater fishes through DNA Barcodes. PLoS One 3 (6): e2490.
[21]. Ward  RD,  Zemlak  TS,  Innes  BH,  Last PR, Hebert PDN (2005) DNA Barcoding Australia’s  fish  species.  Philosophical Transactions  of  Royal  Society  B: Biological  Sciences  360  (1462):  1847- 1857.
[22]. Moreno MV, Ivanova NV, Guiterrez ME, Contreras S, Hebert PDN (2009) Probing diversity  in  freshwater  fishes  from Mexico  and  Guatemala  with  DNA barcodes. Journal of Fish Biology 74 (2):
377-402.
[23]. Rock  J,  Costa  FO,  Walker  JD,  North WA,  Hutchinson  FW,  Carvalho  RG (2008)  DNA  barcodes  of  fish  of  the Scotia  Sea,  Antartica  indicates  priorty groups  for  taxonomic  and  systematics focus. Antartic Science 20 (3): 253-262.
[24]. Collins RA, Armstrong KF, Meier R, Yi Y,  Brown  SDJ  (2012)  Barcoding  and border  biosecurity:  Identifying  Cyprinid fishes  in  the  aquarium  trade.  PLoS  ONE 7 (1): e28381.
[25]. Kotellat  M,  Whitten  AJ,  Kartikasari  SN, Wirjoatmodjo S (1993) Freshwater fishes of  Western  Indonesia  and  Sulawesi, Periplus, Hong Kong.
[26]. Robert  TR  (1989)  The  freshwater  fishes of  Western  Borneo.  California  Academy of Science, California.
[27]. Ribak MP (2010) Assessing the phylogenetic  utility  of  DNA  barcoding using  the  New  Zealand  Cicada  Genus Kikihia.  Thesis.  The  University  of Connecticut.
[28]. Tamura  K,  Stecher  G,  Peterson  D, Filipski  A,  Kumar  S  (2013)  Mega6: Molecular  evolutionary  genetics  analysis version 6.0. Mol Biol Evol 30 (12): 2725- 2729.
[29]. Kimura  (1980)  A  simple  method  for estimating  evolutionary  rates  of  base substitutions  through  comparative  studies of  nucleotide  sequences.  J  Mol  Evol 16 (2): 111-20.
[30]. Bandelts  HJ,  Forster  P,  Rohl  A  (1999) Median  Joining  Networks  for  inferring intraspesific phylogenies. Molecular Biological  Evolution  16  (1):  37-48.  doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a026036
[31]. Buhay  JE  (2009)  “COI-like”  sequences are  becoming  problematic  in  molecular systematic  and  DNA  barcoding  studies. Journal of Crustacean Biology 29 (1): 96- 110.
[32]. Bensasson  D,  Zhang  DX,  Hartl  DL, Hewitt GM (2001) Mitochondrial
pseudogenes: Evolution’s misplaced witnesses.  Trends  Ecology  and  Evolution
16 (6): 314-321.
[33]. Arthington  AH  (1991)  Ecological  and genetic  impacts  of  introduced  and translocated freshwater fishes in Australia.  Canadian  Journal  of  Fisheries and Aquatic Sciences 48 (S1): 33-43.
[34]. Lakra  WS,  Goswami  M,  Gopalakrishnan A  (2009)  Molecular  identification  and phylogenetic relationships of seven Indian
Sciaenids (Pisces: Perciformes, Sciaenidae)  based  on  16S  rRNA  and cytochrome c oxidase subunit I mitochondrial genes A. Molecular
Biology Reports 36 (5): 831-839.
[35]. Beckenbach AT, Thomas WK, Sohrabi H (1990)  Intraspecific  sequence  variation in the  mitochondrial  genome  of  rainbow trout  ( Oncorhynchus mykiss ). Genome 33 (1): 13-15.
[36]. Nugroho  ED,  Nawir  D,  Amin  M,  Lestari U  (2017)  DNA  barcoding  of  Nomei  fish (Synodontidae: Harpadon sp.) in Tarakan Island,  Indonesia.  AACL  Bioflux 10 (6):1466-1474.
[37]. Sarkar IN, Thornton JW, Planet PJ (2002) An  automated  phylogenetic  key  for classifying homeoboxes.
Molecular
Phylogenetics  and  Evolution  24  (3):  388- 399.
[38]. Wong EH, Shivji MS, Hanner RH (2009) Identifying  sharks  with  DNA  barcodes: Assessing  the  utility  of  a  nucleotide diagnostic  approach.  Molecular  Ecology Resources 9: 243-256.
[39]. Wong  EHK,  Hanner  RH  (2008)  DNA barcoding  detects  market  substitution  in North  American  seafood. Food  Research International 41 (8): 828-837.
[40]. Ribeiro  AO,  Caires  RA,  Mariguela  CT, Pereira  LHG.,  Hanner  R,  Oliveira  C, Garcia LH, Hanner R, Oliveira C (2012)
DNA  barcodes  identify  marine  fishes  of Sao  Paulo  State,  Brazil.  Molecular Ecology Resources 12 (6): 1012-1020.
[41]. Nelson,  JS  (2006)  Fishes  of  the  world (4th  ed).  John  Wiley  &  Sons,  New Jersey, pp. 624.
[42]. Esa BY, Siti, Shapor S, Siti, Khalijah, D, Khairul,  Adha  AR,  Jeffrine  RR,  Soon,
GT (2008) Mitochondrial DNA diversity of Tor Tambraides Valenciennes
(Cyprinidae) from five natural populations  in  Malaysia.  Zoological Studies 47 (3): 360-36.