ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 101-106
Extraction , Toxicity Assay and Identification of Active Compounds of Red Algae (Eucheuma cottonii) from Sumenep Madura
Sholeh Afif, A. Ghanaim Fasya, Rachmawati Ningsih
Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang
Email: shol89fif@gmail.com

## Abstract
Extraction,  Toxicity  Assay  and  Identification  ofActive  Compounds  of  Red  Algae  Extract (Eucheuma cottonii) from  Tanjung  Sumenep  Madura  was  analysed . Extraction  of  active  compound  was  conducted  by maceration method  using methanol as a solvent. The methanol extract was hydrolyzed with HCl 2 N. The result was  partitioned  using  five  solvents  (1-butanol,  ethyl  acetate,  chloroform,  petroleum    ether  and  n-hexane). Toxicity  level  was  determined  by  Brine  Shrimp  Lethality  Test  (BSLT).  The  identification  of  the  active compound  was  analyzed  by  phytochemical test,  qualitatively. The  result  showed  that  the  1-butanol  is the  best solvent  to  extract active  compounds  of  red  algae E.  Cottonii in  partition process.  1-Butanol  fraction  gives  the highest activity of toxicity with LC 50 70,32 ppm. LC 50 value for ethyl acetate, chloroform, petroleum ether and n- hexane was 143,43; 194,40; 195,28; 303,66; and 634,97 ppm, respectively. Identification of  active compounds indicated that 1-butanol fraction contains steroids and alkaloids.
Keywords : Eucheuma cottonii, extraction, Brine Shrimp Lethality Test, phythochemical

## Abstrak
Ekstraksi, uji toksisitas dan identifikasi golongan senyawa aktif ekstrak alga merah Eucheuma cottonii dari  Pantai  Tanjung  Sumenep  Madura  telah  dianalisis.  Ekstraksi  senyawa  aktif  dilakukan  dengan  metode maserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak pekat metanol dihidrolisis dengan HCl 2 N. Hidrolisat dipartisi menggunakan  lima  jenis  pelarut  yaitu  1-butanol,  etil  asetat,  kloroform,  petroleum  eter  dan n- heksana.  Uji toksisitas  menggunakan Brine  Shrimp  Lethality  Test .  Identifikasi  golongan  senyawa  aktif  dilakukan  secara kualitatif dengan uji fitokimia. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 1-butanol merupakan pelarut yang terbaik untuk  mengekstrak  senyawa  aktif  alga  merah E.  cottonii dengan  metode  partisi.  Pelarut  ini  memberikan toksisitas tertinggi dengan nilai LC 50 sebesar 70,32 ppm. Nilai LC 50 pada pelarut etil asetat; metanol; petroleum eter; kloroform dan n-heksana masing-masing sebesar 143,43; 194,40; 195,28; 303,66; dan 634,97 ppm. Hasil identifikasi golongan senyawa aktif E. cottonii menunjukkan bahwa fraksi 1-butanol mengandung steroid  dan alkaloid.
Kata Kunci: Eucheuma cottonii, ekstraksi, Brine Shrimp Lethality Test , fitokimia

## 1. Pendahuluan
Dua  pertiga  luas  wilayah  Indonesia merupakan lautan yang mempunyai potensi  sumber  daya  alam  yang  sangat penting  bagi kehidupan bangsa.  Salah satu sumber  daya  alam  yang  cukup  potensial dari perairan  laut Indonesia adalah rumput laut  dengan  berbagai  macam  jenisnya. Rumput  laut  dapat  dijumpai  di  hampir seluruh  perairan  Indonesia.  Budidaya rumput  laut  telah  dilakukan  di  beberapa daerah, antara lain di Pulau Lombok, Nusa Tenggara  Barat  (NTB)  dan  di  Pulau-pulau Jawa serta Madura. Rumput laut
merupakan  bagian  dari  tanaman  perairan, yang  termasuk  pada  kelas  makroalga (Costa, 2003).
Para  ahli  menggolongkan  rumput laut menjadi 5 kelompok yaitu Cyanophyta (alga  biru), Chlorophyta (alga  hijau), Chrysophyta (alga keemasan), Phaeophyta (alga  coklat),  dan Rhodophyta (alga merah).  Tetapi,  potensi  yang  banyak dimanfaatkan  adalah  jenis Rhodophyta (alga  merah)  dengan  berbagai  jenis diantaranya Eucheuma cottonii, Eucheuma spinosum,  Eucheuma  edule (Junaedi, 2004).  Alga  merah E.  cottonii banyak
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 101-106
ditemukan  di  daerah  pantai  Jumiang Pamekasan,  pantai  Tanjung  Sumenep  dan daerah-daerah  lain  di  perairan  Madura. Hasil  produksi  rumput  laut  di  daerah tersebut  mencapai  puluhan  ton  per  tahun. Sebagian rumput laut tersebut diekspor dan sebagian besar dijadikan bahan makanan.
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah untuk  mengetahui  pelarut  yang  terbaik dalam  mengekstrak  senyawa  aktif  alga merah E.  cottonii dari  Pantai  Tanjung Sumenep  Madura.  Selain    itu,  ditentukan pula    nilai    toksisitas    dan    kandungan metabolit  sekunder  pada  ekstrak  alga merah.

## 2. Metode Penelitian

## 2.1 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  alga  merah  jenis E.
cottonii yang diperoleh dari pantai Tanjung, Sumenep, Madura.

## 2.2 Uji Taksonomi
Uji taksonomi dilakukan untuk mengidentifikasi  klasifikasi  alga  merah E. cottonii dilakukan di Laboratorium
Bioteknologi  Jurusan  Biologi  Universitas Islam  Negeri  Maulana  Malik  Ibrahim Malang.

## 2.3 Preparasi Sampel
Alga  merah E.  cottonii segar  dicuci dan kemudian dikeringkan pada suhu 38˚C selama 24 jam. Alga kering dihaluskan dan diayak dengan ukuran 80-100 mesh.

## 2.4 Analisis Kadar Air
Analisis  kadar  air  dilakukan  pada E. cottonii. Cawan  dipanaskan  dalam  oven pada  suhu  100-105˚C  selama  15  menit kemudian disimpan dalam desikator vakum  selama  10  menit.  Cawan  tersebut ditimbang  dan  dilakukan  perlakuan  yang sama sampai berat cawan konstan.
Sampel  basah  sebanyak  5  gram dimasukkan dalam cawan  dan dikeringkan dalam  oven  pada  suhu  100-105˚C  selama
15  menit.  Setelah  itu,  sampel  disimpan dalam  desikator  vakum  selama  10  menit dan  ditimbang.  Perlakuan  ini  diulangi hingga diperoleh berat konstan.

## 2.5 Analisis Kadar Garam
Lima  gram  sampel  dimasukkan dalam  gelas  kimia,  ditambahkan  10  mL akuades,  dan  diaduk  selama  15  menit. Proses  tersebut  diulangi  sebanyak  10  kali agar  garam  pada  sampel  larut  dalam akuades.  Setelah  itu,  sampel  disaring menggunakan  penyaring vacum  buchner . Garam  yang  sudah  terekstrak  ke  dalam pelarut akuades diukur kadarnya menggunakan salinometer .  Garam  dalam larutan tersebut diukur sebagai konsentrasi kepekatan.

## 2.6 Ekstraksi Sampel
Alga merah E.  cottonii halus sebanyak  100  gram  direndam  dalam  300 mL metanol (Hukmah, 2007). Selanjutnya, diaduk menggunakan shaker dengan kecepatan 120 rpm selama 24 jam. Larutan ekstrak  alga  merah  disaring  dan  ampas yang diperoleh dimaserasi kembali sebanyak  dua  kali  dengan  pelarut  dan perlakuan  yang  sama.  Ekstrak  alga  merah dipekatkan  dengan rotary  evaporator vacum dan diperoleh ekstrak pekat. Ekstrak pekat hasil maserasi dihidrolisis  dengan  5  mL  HCl  2  N  selama
1  jam  pada  suhu  40  °C  dan  didinginkan (Tensiska,  dkk.,  2007).  Hidrolisat  yang diperoleh  ditambah  natrium  bikarbonat hingga pH netral, dan dipartisi menggunakan pelarut 1-butanol, etil asetat, kloroform,  petroleum  eter  dan  n-heksana dengan perbandingan 1:1. Pada pelarut non polar ditambahkan DMSO untuk membantu proses pelarutan.
2.7  Uji  Toksisitas  Ekstrak  Alga  Merah Mengunakan BSLT
2.7.1 Penetasan Larva Udang Penetasan  larva  didasarkan  pada metode  dari  Swantara  (2000).    Telur
Artemia  salina Leach  sebanyak  2,5  mg dimasukkan  dalam  botol  penetasan  yang berisi  250  mL  air  laut.  Selama  proses penetasan  dilakukan  aerasi.  Telur  akan menetas  setelah  ±  48  jam  dan  siap digunakan sebagai target uji toksisitas.
2.7.2 Uji Toksisitas (Rita, dkk., 2008)
Kelima  fraksi  sebanyak  100  mg dilarutkan  dalam  10  mL  pelarutnya masing-masing.  Larutan  tersebut  dipipet masing-masing  200  µL,  150  µL,  100  µL, 50  µL  dan  25  µL  dan  dimasukkan  ke dalam  botol  vial.    Setelah  itu,  pelarutnya diuapkan  hingga  kering.  Seratus  mililiter DMSO,  satu  tetes  larutan  ragi  roti  dan  2 mL  air  laut  ditambahkan  pada  botol  vial kemudian  campuran  tersebut  dikocok hingga homogen. Larutan campuran dipindahkan  dalam  labu  ukur  10  mL, dimasukkan  10  ekor  larva  udang Artemia salina dan  ditambahkan  air  laut  sampai volumenya  menjadi  10  mL.  Konsentrasi masing-masing  larutan  adalah  200,  150, 100, 50 dan 25 ppm.
Larutan  kontrol dibuat sama dengan prosedur diatas namun tidak menambahkan sampel.  Pengamatan  dilakukan  selama  24 jam  terhadap  kematian  larva  udang. Analisis data dilakukan untuk mencari nilai LC 50 dengan  analisis  probit  menggunakan program  MINITAB  16  dengan  tingkat kepercayaan 95 % dan margin error 5 %.
2.8 Uji Fitokimia Ekstrak Alga Merah Uji kandungan senyawa aktif dilakukan  pada  ekstrak  dengan  nilai toksisitas  tertinggi.  Uji  fitokimia  yang dilakukan meliputi alkaloid, flavonoid, dan triterpenoid/steroid (Indrayani, dkk., 2006). 2.8.1 Uji Alkaloid
Ekstrak  alga  merah E.  cottonii dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambah 0,5 mL HCl 2 % dan larutan dibagi dalam dua tabung. Tabung I ditambahkan 0.5 mL reagen Dragendorff, tabung II ditambahkan 2-3  tetes  reagen  Mayer.  Jika  tabung  I terbentuk  endapan  jingga  dan  pada  tabung
II  terbentuk  endapan  kekuning-kuningan, menunjukkan adanya alkaloid.

## 2.8.2 Uji Flavonoid
Ekstrak  alga  merah E.  cottonii dilarutkan dalam 1-2 mL metanol panas 50 %. Setelah itu, ditambah logam Mg dan 0,5 mL  HCl  pekat.  Warna  merah  atau  jingga yang  terbentuk  pada  sampel  menunjukkan adanya flavonoid.
2.8.3 Uji Triterpenoi/ Steroid
Ekstrak  alga  merah E.  cottonii dilarutkan  dalam  0,5  mL  kloroform  dan direaksikan  dengan  0,5  mL  asam  asetat anhidrat.  Campuran  tersebut  ditambah  1-2 mL  H 2 SO 4 pekat  melalui  dinding  tabung. Hasil positif terpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya  cincin  kecoklatan  atau  violet pada  perbatasan  dua  pelarut,  sedangkan hasil  positif  steroid  ditunjukkan  dengan terbentuknya warna hijau kebiruan.

## 2.9 Analisis Data
Data  yang  diperoleh  dibuat  dalam bentuk  tabel  dan  grafik  Analisis  probit pada uji toksisitas dilakukan menggunakan program  MINITAB  16  dengan  tingkat kepercayaan 95%  an margin error 5 %.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1 Uji Taksonomi
Uji  taksonomi  menunjukkan  bahwa alga merah tersebut memiliki ciri-ciri; talus silindris,  permukaan  licin, cartilogeneus, warna  merah,  bentuk  talus  kompleks,  duri pada talus runcing memanjang banyak dan tidak bersusun melingkari talus, percabangan  ke  berbagai  arah  dengan batang  utama  keluar  saling  berdekatan  ke daerah  basal  (pangkal).  Berdasarkan  ciri- ciri  tersebut  dapat  disimpulkan  bahwa sampel  mirip  dengan  jenis Eucheuma cottoniii Weber-van  Bosse  atau  sinonim:
Kappaphycus alvarezzi (doty) Doty ex P.C. Silva.
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 101-106

## 3.2 Preparasi Sampel
Preparasi  sampel  diawali  dengan pengeringan dan penghalusan yang bertujuan  untuk  menghasilkan  ekstraksi yang  maksimal.  Menurut  Suryaningrum (2006).  ekstrak  kasar  maupun  hasil fraksinasi  sampel  kering  pada E.  cottoniii memiliki  toksisitas  yang  lebih  baik dibandingkan dengan sampel segar.  Proses penghalusan  sampel  dilakukan  agar  luas permukaan semakin besar sehingga interaksi  metabolit  sekunder  dan  pelarut semakin  optimal.  Selain  itu,  penghalusan juga  mempermudah  sel-sel    alga  merah terpecah  sehingga  senyawa  aktif  mudah terekstrak.  Serbuk  alga  merah  disimpan dalam wadah kedap udara untuk mengurangi degradasi mikroorganisme.

## 3.3 Analisis Kadar Air
Hasil  pengukuran  ini  menunjukkan bahwa  sampel  yang  dianalisis  mempunyai kadar  air  cukup  baik  untuk  dilakukan proses ekstraksi (Tabel 1). Semakin rendah kadar  air  suatu  sampel  maka  semakin mudah pelarut untuk mengekstrak komponen  senyawa  aktif.  Sulistijowati (2001)  menyatakan  bahwa  kadar  air maksimum  yang  disyaratkan  agar  proses ekstraksi  dapat  berjalan  lancar  yaitu sebesar 11 %.
Tabel 1. Kadar air ekstrak E. cottonni Ekstrak Kadar Air (% b/b) Sampel basah 79,6 Sampel kering 4,74 3.4 Analisis Kadar Garam Hasil analisis kadar garam menunjukkan bahwa sampel basah mempunyai jumlah kadar garam lebih kecil dibandingkan  sampel  kering  (Tabel  2). Kadar  garam  yang  tinggi  pada  sampel kering  tidak  menunjukkan  efek  yang signifikan terhadap sifat toksisitas sampel.
Hasil  ini  didukung  oleh  Matthew (1982)  yang  menyatakan  bahwa  paparan salinitas  antara  22,7  dan  33,0  ppt  tidak
memberikan  pengaruh  yang  signifikan terhadap  perkembangan  embrio  normal mikrolga.

## 3.5 Ekstraksi Sampel
Ekstraksi  yang  digunakan  pada penelitian  ini  adalah  maserasi  dan    partisi (cair-cair). Ekstrak hasil maserasi dilakukan  proses  hidrolisis  menggunakan asam kuat, HCl. Proses ini bertujuan untuk memisahkan  antara  senyawa  glikon  dan aglikon pada senyawa glikosida. Hidrolisat dilakukan ekstraksi kembali dengan partisi dengan  lima  variasi  pelarut  yaitu  n- heksana,  klororform,  petroleum  eter,  1- butanol,  dan  etil  asetat.  Pelarut-pelarut tersebut  memiliki  kepolaran  yang  berbeda sehingga  diharapkan  mampu  mengekstrak senyawa yang memiliki kepolaran berbeda pula.  Rendemen  hasil  ekstraksi  maserasi sebesar 16,97 %, sedangkan hasil rendemen  partisi  pada  1-butanol,  etil asetat,  kloroform,  petroleum  eter  dan  n- heksana  masing-masing  sebesar  4,94%; 8,54%; 16,98%; 10,7% dan 5,14 %.
Tabel 2. Kadar garam ekstrak E. cottonnii Ekstrak Kadar Garam (% b/b) Sampel basah 4,50 Sampel kering 25,5

## 3.6 Uji  Toksisitas  Menggunakan  BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)
Data  nilai  LC 50 pada  Tabel  3 menunjukkan  bahwa  ekstrak  alga  merah mampu membunuh 50% hewan uji. Semua ekstrak  tersebut  memiliki  sifat  toksik. Penentuan  ini  didasarkan  pada  Wahyuni (2003)  yang  menyatakan  bahwa  suatu ekstrak  bersifat  toksik  apabila  memiliki nilai  LC 50 kurang  dari  1000  ppm.  Nilai LC 50 didefinisikan  sebagai  konsentrasi  zat yang  menyebabkan  terjadinya  kematian pada  50%  larva Artemia  salina Leach sebagai hewan uji.
Lisdawati (2002) menyebutkan
bahwa  semakin  kecil  nilai  LC 50 maka semakin besar aktivitas biologi/efek
farmakologi ekstrak tersebut, salah satunya sebagai antitumor. Winarno (2002) menyatakan  bahwa  nilai  LC 50 antara  30- 200  ppm  berpotensi  sebagai  antimikroba. Berdasarkan  Tabel  3,  ekstrak  yang  paling
berpotensi sebagai antitumor dan antimikroba adalah fraksi 1-butanol dengan nilai LC 50 sebesar 70,32 ppm.
Tabel 3. Nilai LC 50 pada Berbagai Pelarut
Fraksi Nilai LC 50 (ppm) Metanol 194,4 1-Butanol 70,32 Etil asetat 143,4 Kloroform 303,7 Petroleum eter 195,3 n-heksana 635,0

## 3.7 Uji Fitokimia Ekstrak Alga Merah
Ekstrak methanol alga merah mengandung  metabolit  sekunder  yang meliputi  flavonoid,  steroid  dan  alkaloid. Metabolit  sekunder  ekstrak  etil  asetat adalah  alkaloid,  triterpenoid  dan  steroid, sedangkan ekstrak kloroform adalah flavonoid, triterpenoid dan alkaloid. . Menurut Widyawati (2011), metanol secara  efektif  dapat  mengekstrak  senyawa polar,  seperti  flavonoid,  fenolik  dan saponin.  Sedangkan  etil  asetat  dilaporkan dapat  mengekstrak  senyawa  saponin, alkaloid, triterpenoid, steroid dan flavonoid. Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa fraksi 1-butanol mengandung senyawa aktif berupa steroid dan alkaloid. Steroid  dan  alkaloid  merupakan senyawa yang berpotensi sebagai antimikroba karena dapat merusak dinding sel.  Farouk,  dkk.  (2007)  menyatakan bahwa metabolit sekunder yang berpotensi sebagai senyawa antimikroba adalah golongan  atau  turunan  dari  senyawa terpenoid,  diantaranya  steroid,  triterpenoid dan  alkaloid.  Golongan  senyawa  tersebut memiliki  polisakarida  sehingga  dapat menembus  membran  sel  bakteri,  sehingga sel  tersebut  rusak.  Lamothe  (2009) menyatakan  mekanisme  kerja  alkaloid
sebagai  antimikroba  diprediksi  melalui penghambatan  sintesis  dinding  sel  yang akan  menyebabkan  lisis  pada  sel  sehingga akan rusak dan mati.

## 4. Kesimpulan
Pelarut terbaik untuk mengekstrak E. cottonii  adalah  1-butanol  dengan  metode partisi.    Fraksi  1-butanol  memiliki  nilai toksisitas tertinggi dengan nilai LC 50 70,32 ppm.  Fraksi  ini  mengandung  metabolit sekunder  yang  terdiri  atas  steroid  dan alkaloid.

## 5. Daftar Pustaka
Doty  MS.  1985. Eucheuma  alvarezii sp.nov  (Gigartinales,  Rhodophyta) from  Malaysia.  Di  dalam:  Abbot  IA, Norris  JN  (editors).  Taxonomy  of Economic  Seaweeds .  California  Sea Grant College Program.
Farouk, A.E., Faizal A.H.G., dan Ridzwan
B.H..  2007.  New  Bacterial  Species Isolated from Malaysian Sea Cucumbers  with  Optimized  Secreted Antibacterial Activity . American Journal of Biochemistry and Biotechnology : 64-69.
Hukmah,  S.  2007.  Aktivitas  Antioksidan Katekin  dari  Teh  Hijau  ( Camellia Sinensis O.K.  Var. Assamica (mast))
Hasil Ekstraksi dengan Variasi
Pelarut dan Suhu . Skripsi . Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang, Malang.
Indrayani, L., H. Soetjipto, dan L. Sihasale. 2006.  Skrinning  Fitokimia  dan  Uji Toksisitas  Ekstrak  Daun  Pecut  Kuda ( Stachytarpheta jamaicensis L. Vahl) Terhadap  Larva  Udang Artemia salina Leach.  Jurnal  Fakultas  Sains dan  Matematika,  Universitas  Kristen Satya Wacana  Salatiga.
Junaedi, W. 2004. Rumput Laut, Jenis dan Morfologi . Direktorat Jenderal
Pendidikan  Dasar  Dan  Menengah Kejuruan, Jakarta.
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 101-106
Lamothe,  R.G.  2009.  Plant  Antimicrobial Agents  and  Their  Effects  on  Plant and  Human  Pathogens. International Journal  of  Molecular  Science, 10:
3400-3419 .
Lisdawati, V. 2002. Berdasar Uji Penapisan  Farmakologi  pada  Buah Mahkota Dewa. Fakultas Kedokteran .  Yogyakarta:  Universitas
Gajamada. http://www.farmakologi.fk. ugm.ac.id/2008/05/30/berdasar- ujipenapsisanfarmakologi-pada- buah-mahkota-dewa/. Diakses tanggal 15 Januari 2009. Matthew P.C. 1982. The Effects of Salinity on  Copper  and  Silver  Toxicity  to Embryos  of  the  Pacific  Oyster. California  Department  of  Fish  and Game,  Marine  Bioassay  Laboratory, California.
Rita,  W.  S.,  Suirta,  I.W.  dan  Sabirin,  A.
2008. Isolasi dan Identifikas iSenyawa  yang  Berpotensi  Sebagai Antitumor  pada  Daging  Buah  Pare
(Momordica  carantia  L). Jurnal Kimia, Vol. 2(1): 1-6. Sulistijowati,  S.  dan  Gunawan,  D.  2001.
Efek  Ekstrak  Daun  Kembang  Bulan (Tithonia difersifolia A. Gray) Terhadap  Candica  albicans  Serta Profil Kromatografinya . Pusat Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Jakarta. Suryaningrum,  D.  dkk.,2006. Uji  Aktivitas Senyawa  Antioksidan  dari  Rumput Laut  Halymenia  harveyana dan
Eucheuma
cottonii. Universitas
Diponegoro, Semarang. Swantara, I.M. 2001. Identifikasi Senyawa
Aktif  Antibakteri  dalam  Tumbuhan
Kentut-kentut ( Paederia foetida Auct.).  Fakultas  Matematika  dan Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Universitas Udayana, Denpasar. Tensiska,  I.S,  Setiasih,  dan  Irawati,  D. 2007.  Deskripsi  Minuman  Emulsi
VCO pada Berbagai Jumlah
Penambahan  Air. Prosiding  Seminar Nasional Patpi, Bandung. 17-18. Wahyuni,  S.  I.  2003.  Uji  Fitokimia Tanaman  Anting-Anting  ( Acalypha indica L.) dengan Variasi Pelarut dan Uji  Toksisitas  Menggunakan Brine Shrimp ( Artemia  salina Leach). Skripsi  Tidak  Diterbitkan. Jurusan Kimia  Universitas  Islam  Negeri
Maulana  Malik  Ibrahim  Malang, Malang. Widyawati, P.S. 2011. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanolik Daun Beluntas  ( Pluchea  indica Less)  dan Fraksinya serta Kemampuan Mencegah Warmed Over Flavor pada Daging  Itik  yang  telah  Dipanaskan.
Tesis . Program Pasca Sarjana, Institut
Pertanian Bogor, Bogor.
Winarno,  F.  G.  2002. Kimia  Pangan  dan Gizi .  Jakarta:  PT  Gramedia  Pustaka Utama.