Efek Pericarpium Manggis ( Garcinia mangostana L.) Terhadap Protein Spermatozoa Epididimal Mencit Setelah Dipapar 2- Methoxyethanol

## Putri Ayu Ika Setiyowati
Program Studi S1 Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Muhammadiyah Lamongan
putriayuikasetiyowati@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak fraksi pericarpium manggis ( Garcinia mangostana L.) dengan variasi kepolaran dan dosis terhadap profil protein epididimal spermatozoa mencit ( Mus musculus ) yang terpapar 2- Methoxyethanol . Penelitian ini menggunakan 50 ekor mencit jantan strain BALB/C dengan berat badan 25-30 gram yang dibagi menjadi 8 kelompok; kelompok kontrol positif diberi 0,05  ml  larutan  CMC  0,05  %  selama  40  hari  ,  kelompok  kontrol  negatif  diberi  200  mg/kg  BB  2- Methoxyethanol selama 35 hari, kelompok perlakuan (P1, P2, P3, P4, P5, dan P6) diberi 200 mg/kg BB 2- Methoxyethanol selama 5 hari, dilanjutkan dengan pemberian ekstrak fraksi dan dosis, kelompok P 1 dan P 2 diberi ekstrak fraksi non polar pericarpium manggis dengan dosis 0,6 mg/kg BB dan 3 mg/kg BB selama 35 hari , P 3 dan P 4 diberi ekstrak fraksi semi polar dengan dosis 4 mg/kg BB dan 20 mg/kg BB selama 35 hari, P 5 dan  P 6 diberi  ekstrak  fraksi  polar  pericarpium  manggis  dengan  dosis  0,4  mg/kg  BB  dan  2  mg/kg  BB selama  35  hari.  Protein  diisolasi  dari  spermatozoa  yang  dikoleksi  dari  epididimis,  kemudian  diukur konsentrasinya dan dianalisis menggunakan elektroforesis SDS-PAGE. Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif dengan membandingkan profil protein kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. Hasil penelitian menunjukkan  bahwa  ekstrak  fraksi  polar  pericarpium  manggis  dengan  dosis  0,4  mg/kg  BB  dapat berpengaruh dalam memulihkan profil protein (20 kDa) dari spermatozoa epididimal mencit setelah terpapar 2- Methoxyethanol .
Kata Kunci : Garcinia mangostana L., protein spermatozoa, spermatozoa epididimal, 2- Methoxyethanol.

## ABSTRACT
The aim of this study to know the effect of mangosteen pericarp extract fraction with polarity and dose variation on the protein profile epididymal spermatozoa of mice (Mus musculus) after exposed 2-Methoxyethanol. This study  using  animal  model  of  50  male  mice  strain  BALB/C,  weight  25-30  gram,  divided  into  8  groups;  the positive control group was given 0,05 mL of 0,05% CMC within 40 days, negative control group was given 2- Methoxyethanol 200 mg/kg body weight within 5 days, treatment groups (P 1 , P 2 , P 3 , P 4 , P 5 , and P 6 ) were given 2-Methoxyethanol 200 mg/kg body weight within 5 days, continued by giving fraction extract and doses, P 1 and P 2 groups were given non polar fraction of mangosteen pericarp extract with doses 0,6 mg/kg body weight and  3  mg/kg  body  weight  within  35  days,  P 3 and  P 4 groups  was  given  semi  polar  fraction  of  mangosteen pericarp extract with doses 4 mg/kg body weight and 20 mg/kg body weight within 35 days, P 5 and P 6 groups was given polar fraction of mangosteen pericarp extract with doses 0,4 mg/kg body weight and 2 mg/kg body weight  within  35  days.  Proteins  were  isolated  from  epididymal  spermatozoa  then  the  concentration  was measured and analyzed using SDS-PAGE electrophoresis. Data were analyzed descriptively by comparing the protein profile of control and the treatment group. The result showed that magosteen pericarp polar fraction extract  with  doses  0,4  mg/kg  body  weight  influencial  to  recover  protein  profile  (20  kDa)  from  epididymal spermatozoa Mus musculus that exposoed by 2-Methoxyethanol.
Keywords : Garcinia mangostana L., spermatozoa protein, epididymal spermatozoa,  2- Methoxyethanol
Setiyowati Putri Ayu I : Efek Pericarpium Manggis ( Garcinia mangostana L.) Terhadap Protein Spermatozoa Epididimal Mencit Setelah Dipapar 2- Methoxyethanol

## I. PENDAHULUAN

## 1. Latar Belakang
Indonesia  merupakan  Negara  biodiversitas,  yakni  salah  satunya  adalah  keanekaragaman tumbuhan (flora) yang berpotensi sebagai obat. Upaya pemanfaatan tanaman sebagai sumber suatu obat menjadi pilihan utama bagi para peneliti obat di Indonesia. Salah satu tanaman di Indonesia  yang  bisa  dimanfaatkan  untuk  tujuan  tersebut  adalah  buah  manggis  (Garcinia mangostana L.), terutama pemanfaatan pericarpiumnya (Fitri et al., 2017). Telah diketahui bahwa pericarpium manggis mengandung senyawa xanthone. Xanthone berfungsi sebagai antioksidan yaitu dengan cara menurunkan aktivitas radikal bebas (Kurniawati et al., 2014). Penelitian yang dilakukan oleh (Moongkarndi et al., 2004) telah menunjukkan dua senyawa mangostin (α dan γ) serta garsinon-E pada ekstrak kulit buah manggis dalam dosis (5 μg/ml) dan (10–20 μg/ml) berfungsi sebagai antioksidan, namun pada dosis yang tinggi (40 μg/ml) menyebabkan  apoptosis  pada  sel  dikarenakan  ketiga  senyawa  tersebut  mampu meningkatkan  kadar  Reactive  Oxygen  Species  (ROS)  atau  radikal  bebas  di  dalam  sel. Radikal bebas ini akan sangat berbahaya bagi beberapa organ salah satunya organ reproduksi yaitu  dapat  berpengaruh  pada  sintesis  proteinnya.  Salah  satu  protein  yang  sangat  penting untuk berlangsungnya proses fertilisasi adalah protein spermatozoa khususnya pada organ epididimis,  protein  tersebut  sangat  peka  terhadap  radikal  bebas  (Gaudreault  et  al.,  2001). Kehadiran  radikal  bebas  karena  peningkatan  ROS  dapat  disebabkan  oleh  paparan  bahan kimia  yang  bersifat  toksik  dan  merupakan  oksidan  yang  kuat,  salah  satunya  2- Methoxyethanol (2- ME). Senyawa teratogenik ini terbentuk dari hasil hidrolisis metabolit dimethoxyethyl  phthalate  (DMEP),  DMEP  merupakan  salah  satu  kelompok  dari  phthalic acid ester (PAEs) yang banyak digunakan sebagai pelentur dalam pembuatan plastik. Selain bersifat teratogenik DMEP dan turunannya, juga merupakan toksikan pada organ reproduksi terutama pada hewan jantan, dengan testis sebagai sasaran utamanya (Starek-͆wiechowicz et al., 2015). Sejauh ini telah banyak dilakukan penelitian tentang manfaat senyawa xanthone dan turunannya yang ada di crude (total keseluruhan) ekstrak pericarpium manggis, namun sepanjang  pengetahuan  penulis  belum  pernah  ada  penelitian  yang  menggunakan  ekstrak fraksi  pericarpium  manggis  terkait  pengaruhnya  terhadap  protein  spermatozoa,  sehingga perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui pengaruh ekstrak fraksi pericarpium manggis dengan berbagai tingkat kepolaran dan variasi dosis dalam upaya mendapatkan antioksidan yang efektif untuk memulihkan profil protein spermatozoa epididimal akibat paparan 2-ME.

## 2. Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas dapat dibuat rumusan masalah yaitu : Apakah pemberian ekstrak  fraksi  pericarpium  manggis  dengan  variasi  kepolaran  dan  dosis  berpengaruh terhadap profil protein epididimal spermatozoa mencit?

## 3. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian variasi kepolaran dan dosis ekstrak fraksi pericarpium manggis terhadap profil protein epididimal spermatozoa mencit (Mus musculus) yang telah terpapar senyawa 2-ME.

## 4. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terkait tentang pengaruh pemberian variasi  kepolaran  dan  dosis  ekstrak  fraksi  pericarpium  manggis  terhadap  profil  protein epididimal spermatozoa mencit (Mus musculus) yang telah terpapar oksidan kuat senyawa 2-ME.
Setiyowati Putri Ayu I : Efek Pericarpium Manggis ( Garcinia mangostana L.) Terhadap Protein Spermatozoa Epididimal Mencit Setelah Dipapar 2- Methoxyethanol

## II. METODE PENELITIAN
Metode  penelitian  ini  menggunakan  metode  eksperimental  laboratorik  dengan  tahapan penelitian  yaitu,  mengekstraksi  pericarpium  manggis,  perlakuan  terhadap  hewan  coba, mengisolasi spermatozoa epididimal mencit, elektroforesis protein spermatozoa epididimal, hingga analisis data. Analisis data  yaitu dengan  membandingkan profil protein  hasil SDS PAGE pada masing-masing kelompok kontrol, dan perlakuan. Profil protein yang diamati berupa  berat  molekul  (BM).  Perhitungan  BM  dari  masing-masing  protein  dilakukan berdasarkan  pada  marker  yang  tersedia.  Perhitungan  dilakukan  dengan  mengukur  jarak migrasi  pita  protein  atau  Retardation  factor  (Rf).  Nilai  Rf  dihitung  dengan  menggunakan rumus (Mahasri et al., 2010).
Rf = x1/x2 x1 = Jarak pergerakan protein dari tempat awal x2 = Jarak pergerakan warna dari tempat awal Kemudian dari nilai Rf tersebut, dihitung log BM dari masing-masing BM pita marker. BM pita polipeptida pada sampel dihitung dengan persamaan linier:
Y = a ± bx Nilai log BM sebagai sumbu x dan Rf sebagai sumbu Y.

## Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan  berupa bak plastik dengan penutup dan botol minuman, alat-alat untuk perlakuan berupa berupa botol-botol kecil tempat larutan yang akan dicobakan, spuit 1 cc, jarum  suntik,  alat  bedah,  botol  untuk  membius,  mikropipet,  timbangan  analitik,  shaker, papan paraffin, jarum, cawan petri kecil, microtube, mikroskop inverted, blue tip, yellow tip, vortex, sentrifuge, plate, power supply, penangas, chamber elektroforesis, spektrofotometer, autoclave,  rotary  evaporator,  dan  alat  destilasi.  Bahan  penelitian  yang  digunakan  adalah hewan uji yaitu menggunakan mencit (Mus musculus) jantan 50 ekor, strain BALB/C, umur 8 -9 minggu, berat badan 25 - 30g, n - heksan, etil asetat, etanol, 2- ME, alkohol 70%, untuk isolasi epididimial menggunakan larutan phosphate buffer saline (PBS), buffer lisis, es batu, dan  akuades  steril,  separating  gel.  Stacking  gel,  Reducing  Sampel  Buffer  (RSB),  larutan staining dan destaining, buffer elektroforesis.

## Pelaksanaan Penelitian
Fraksinasi variasi  kepolaran fraksi dari kulit manggis Proses  fraksinasi  ini  dilakukan  dengan  menggunakan  corong  pisah  untuk  memisahkan senyawa-senyawa  yang  terkandung,  dimulai  dari  senyawa  non  polar  terlebih  dahulu, dimasukkan n-heksan ke dalam toples kaca yang berisi berat kering pericarpium manggis, dilakukan pengocokan (dilakukan dengan cara diaduk setiap dua jam sekali selama tiga hari), kemudian fraksi n-heksan (bagian atas) ditampung. Hal ini dilakukan terus hingga fraksi n- heksan tidak berwarna/ jernih. Setelah jernih, dilakukan pergantian pelarut dari n-heksan ke etil  asetat, lalu dilakukan hal  yang sama seperti  n-heksan.  Ketika fraksi  etil  asetat selesai maka dilakukan pergantian pelarut terakhir yaitu dari etil asetat (pelarut semi polar) ke etanol (pelarut polar).

## Perlakuan terhadap hewan coba
Mencit (Mus musculus) yang telah diaklimatisasi pada kondisi kandang selama satu minggu, lalu dibagi menjadi delapan kelompok dengan masing-masing kelompok  terdapat tujuh ekor mencit. Kelompok kontrol negatif diberi Carboxyl Methil Cellulosa (CMC) 0,05% sebanyak 0,05  ml  selama  40  hari  secara  sub  cutan.  Kelompok  kontrol  positif,  perlakuan  pertama, perlaukan  kedua,  perlakuan  ketiga,  perlakuan  keempat,  perlakuan  kelima  dan  perlakuan keenam diberi 2-ME dengan dosis 200 mg/kg BB setiap satu kali sehari selama lima hari. Kemudian kelompok kontrol positif dilakukan  perlakuan Carboxyl Methil Cellulosa (CMC) 0,05% sebanyak 0,05 ml selama 35 hari secara sub cutan. Pemberian larutan sebanyak 0,05 ml ini. Kelompok P1 dan P2 diberi fraksi non polar (n-heksan) pericarpium manggis dengan
Setiyowati Putri Ayu I : Efek Pericarpium Manggis ( Garcinia mangostana L.) Terhadap Protein Spermatozoa Epididimal Mencit Setelah Dipapar 2- Methoxyethanol
dosis  rendah  dan  tinggi  yaitu  0,6  mg/kg  berat  badan,  dan  3  mg/kg  berat  badan  yang dilarutkan dalam CMC 0,05% sebanyak 0,05 ml, selama 35 hari secara sub-cutan. P3 dan P4 diberi fraksi semi polar (etil asetat) pericarpium manggis dengan dosis rendah dan tinggi yaitu 4 mg/kg berat badan, dan 20 mg/kg berat badan yang dilarutkan dalam CMC 0,05% sebanyak 0,05 ml, selama 35 hari secara sub-cutan. P5 dan P6 diberi fraksi polar (methanol) pericarpium  manggis  dengan  dosis  rendah  dan  tinggi  yaitu  0,4  mg/kg  berat  badan,  dan  2 mg/kg berat badan  yang dilarutkan dalam CMC 0,05% sebanyak 0,05 ml, selama 35 hari secara sub-cutan.

## Tahap isolasi spermatozoa epididimal mencit (Mus musculus)
Metode  isolasi  protein  spermatozoa  epididimal  mencit  pada  penelitian  ini,  yaitu  yang pertama, koleksi spermatozoa yang telah diencerkan dengan larutan PBS pH 7,2, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit, diambil peletnya dan ditambahkan 70µl buffer ekstrak protein, lalu di vortex selama 10 menit untuk homogenisasi. Homogenate ini disentrifuse pada 6000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang didapatkan dipindahkan pada  microtube  yang  baru,  dan  disimpan  pada  suhu  -20°C  sampai  akan  dilakukan elektroforesis,  hasil  akhir  ini  disebut  isolat  crude  protein.  Untuk  mengetahui  konsentrasi protein total setiap isolat dilakukan uji kuantitatif menggunakan spektrofotometri.

## Analisis profil protein spermatozoa
Profil  protein  spermatozoa  dianalisis  berdasarkan  berat  molekul  menggunakan  Sodium Dodecyl Sulphate Poliacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE). (Laemmli, 1970) yang dilakukan dengan menggunakan metode standar. Sampel isolat protein dengan konsentrasi 70 µg/µl ditambahkan dengan 5µl buffer sampel, lalu dipanaskan pada suhu 50º C selama 2 menit.  Kemudian  didinginkan  pada  suhu  ruang.  Sampel  dimasukkan  ke  dalam  sumur  gel dengan volume 25 µL, sedangkan volume marker protein yang digunakan sebanyak 5 µL. Running dilakukan pada tegangan 100 V, 48 mA selama 1-2 jam dalam buffer elektoforesis. Setelah  running  elektroforesis,  gel  diwarnai  dengan  menggunakan  larutan  pewarna (Coomassie  Brilliant  Blue)  selama  dua  jam.  Pelunturan  warna  (destaining)  pada  gel dilakukan  dengan  larutan  peluntur  secara  berulang  kali  sampai  diperoleh  pita  protein berwarna biru dengan latar gel bening

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Protein  penanda  (marker)  pada  penelitian  ini  menggunakan Chromatein  Prestained Protein Ladder . Perhitungan jarak migrasi, nilai Rf, dan log BM protein marker dapat di lihat pada tabel berikut:
Tabel 1 . Perhitungan Jarak Migrasi, Nilai Rf,dan Log BM Protein Marker
Berat Molekul (BM) (kDa) Jarak Migrasi Nilai Rf Log BM 175 0,14 0.0349 2.2430 130 0,24 0.0603 2.1139 95 0,4 0.0984 1.9777 70 0,6 0.1524 1.8451 62 0,9 0.2223 1.7924 51 1,1 0.2826 1.7076 42 1,4 0.3524 1.6232
Setiyowati Putri Ayu I : Efek Pericarpium Manggis ( Garcinia mangostana L.) Terhadap Protein Spermatozoa Epididimal Mencit Setelah Dipapar 2- Methoxyethanol
29 2,1 0.5169 1.4624 22 2,8 0.7074 1.3422 14 3,7 0.9265 1.1461 10,5 3,9 0.9773 1.0212
Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa profil protein pada semua kelompok baik control maupun perlakukan mengekpresikan  8 pita protein dengan berat molekul: 90, 70, 62, 51, 42, 35, 27, dan 22 kDa. Namun, pada kelompok perlakuan positif (K2) dan perlakuan polar dosis  2  mg/kgBB  terdapat  perbedaan,  yaitu  muncul  protein  dengan  BM  27  kDa  (pada kelompok  K2)  dan  20  kDa  (pada  kelompok  P6)  Hasil  isolasi  protein  spermatozoa epididimal dengan menggunakan SDS-PAGE dapat di lihat pada Gambar 1 dan Gambar 2
Gambar 1. Hasil isolasi protein spermatozoa epididimal diberi perlakuan ekstrak fraksi pericarpium  manggis  dengan  variasi  perlakuan  kepolaran  dan  dosis  ekstrak  fraksi.  M adalah marker dengan berat molekul 175 – 10,5 kDa, kontrol negatif (CMC 0,05%) (K 1 ), kontrol  positif  (2-ME)  (K 2 ),  variasi  perlakuan  kepolaran  dan  dosis  ekstrak  fraksi  yaitu: ekstrak fraksi n-heksan dengan dosis 0,6 mg/kg berat badan (P 1 ), ekstrak fraksi n- heksan dengan dosis 3 mg/kg berat badan (P 2 ), ekstrak fraksi etil asetat dengan dosis 4 mg/kg berat badan (P 3 ), ekstrak fraksi etil asetat dengan dosis 20 mg/kg berat badan (P 4 ), ekstrak fraksi methanol dengan dosis 0,4 mg/kg berat badan (P 5 ), ekstrak fraksi methanol dengan dosis 2 mg/kg berat badan (P 6 ).
Gambar 2. Visualisasi representasi pita protein spermatozoa epididmal.
Hasil  pengukuran  pola  pita  protein  pada  elektroforesis  diproses  menggunakan software Paint  Shop  Pro  5 dan Adobe  Photoshop  CS  3 untuk  memperoleh  gambaran band-band protein secara lebih jelas dan data jarak migrasi pita protein yang nantinya akan digunakan untuk  menghitung  besarnya  berat  molekul  protein  yang  berada  di  luar  marker  sehingga diperoleh data sebaran pola pita protein. Data sebaran pola pita protein disajikan pada tabel 2.
Tabel 2 . Data sebaran pola pita protein B er at m ol ek u l p rote in m ar k er (kDa ) B er at m oleku l p rote in (kDa) Kon tr ol n egatif (C M C 0,05%) K1 Kon tr ol Positif (2 - M E 200 m g/k g B B ) K2 *NP ( 0,6 m g/k g B B ) P 1 *NP (3 m g/k g B B ) P 2 *S P (4 m g/k g B B ) P 3 *S P (20 m g/k g B B ) P 4 *P ( 0,4 m g/k g B B ) P 5 *P ( 2 m g/k g B B ) P6 175 - -
- - - - - - 130 - - - - - - - - 90 90 90 90 90 90 90 90 90 70 70 70 70 70 70 70 70 70 62 62 62 62 62 62 62 62 62 51 51 51 51 51 51 51 51 51 42 42 42 42 42 42 42 42 42 34 34 34 34 34 34 34 34 29 - - - - - - - - - 27 - - - - - - 22 22 22 22 22 22 22 22 22 20 20 - - - - - 20 -
Setiyowati Putri Ayu I : Efek Pericarpium Manggis ( Garcinia mangostana L.) Terhadap Protein Spermatozoa Epididimal Mencit Setelah Dipapar 2- Methoxyethanol
* = Ekstrak Fraksi Pericarpium Manggis NP = Non Polar (N-heksan) SP = Semi Polar (Etil asetat) P = Polar (Methanol)
Profil protein dari sampel spermatozoa epididimal mencit, menunjukkan adanya beberapa pita protein dengan berat molekul (BM) berkisar antara 20-90 kDa. Secara umum, fungsi dari  protein  yang  tereskpresi  tersebut  sebagai  penentu  keberhasilan  terjadinya  fertilisasi diantaranya :
1. Protein 90 kDa, sebagai proakrosin untuk pengikatan kelompok glikoprotein dari zona pelucida (Nagdas et al., 2014).
2. Protein  70  kDa,  protein  ini  disintesis  pada  saat germ cell  dan  terekspresi  pada membrane luar akrosom dan principal piece (Kim et al., 2010). , dikenal sebagai Het Shock Protein (HSP 70) yang berfungsi  dalam motilitas spermatozoa  (Han et  al., 2011).
3. Protein  50-64  kDa,  berperan  saat  fosforilasi  tiroksin  pada  maturasi  spermatozoa tikus  (Fàbrega  et  al.,  2011)  serta  penyusun  tubulin  α  dan  β  yang  berperan  pada pembentukan struktur flagella dan motilitas (El-Shahat et al., 2016).
4. Protein  42  kDa,  sebagai  protein  protease  yang  berperan  dalam  penetrasi  zona pelucida pada tikus (Hidayat et al., 2016) ; (Awda et al., 2009)
5. Protein 18-34 kDa, sebagai sperm protein (SP-10), merupakan protein spesifik yang terdapat di akrosom dan berfungsi untuk interaksi spermatozoa dengan ovum.  Pada spermatozoa  epididimal  manusia,  protein  34  kDa  merupakan  protein  p34H (Arrotéia et al., 2011).
6. Protein  22-24  kDa,  merupakan  protein  SP-17  yang  berfungsi  pada  awal  reaksi akrosom (Lea et al., 2004).
Protein spesifik yang hanya dapat terekspresi pada kelompok kontrol 2-ME 200 mg/kg berat badan  yaitu  protein  dengan  berat  molekul  27  kDa,  protein  ini  terekspresi  spesifik  diduga karena  terjadi  denaturasi  protein  pada  kelompok  kontrol  ini,  2-ME  merupakan  kelompok senyawa oksidan kuat yang dapat menyebabkan stress oxidative , selian itu protein tersebut kemungkinan  merupakan kelompok protein pelindung yang hadir ketika terjadi jejas pada sel fungsinya melindungi sel agar tetap pada keadaan homeostasisnya serta sedapat mungkin menjaga  keberlangsungan  proses  sintesis  protein  pada  sel.  Pada  penelitian  ini  dapat ditemukan  protein  dengan  berat  molekul  20  kDa,  namun  protein  tersebut  hanya  dapat terekspresi pada kelompok kontrol CMC 0,05% dan kelompok perlakuan fraksi polar dosis 0,4 mg/kg berat badan, diduga karena senyawa polar yang ada pada pericarpium manggis mengandung banyak senyawa yang mempunyai aktifitas farmakologi seperti flavonoida dan xanthone  yang  berfungsi  sebagai  antioksidan.  Tidak  terkespresinya  protein  dengan  berat molekul  rendah  pada  kontrol  2-ME  200  mg/kg  berat  badan  diduga  karena  terjadi peningkatan  ROS.  Kadar  ROS  yang  tinggi  dapat  menimbulkan  kerusakan  membran spermatozoa dan dapat berpengaruh pada kualitas spermatozoa. ROS yang meningkat akan menyerang polyunsaturated  fatty  acids (PUFA)  sehingga  menyebabkan  terjadinya peroksidasi  lipid  pada  membran  spermatozoa  (Agarwal  &  Prabakaran,  2005).  Penyebab tidak terekspresinya protein dengan berat molekul 20 kDa pada fraksi polar dosis 2 mg/kg berat badan diduga karena terjadi peningkatan konsentrasi berlebih dari senyawa xanthon yang  dapat  menjadi  oksidan.  Berdasarkan  penelitian  dari  (Moongkarndi  et  al.,  2004), menunjukkan  dua  senyawa  turunan  xanthon  yaitu  senyawa  mangostin  (α  dan  γ)  serta garsinon-E ektrak  kulit  buah  manggis  pada  dosis  tinggi  dapat  bersifat  menjadi  oksidan. Oksidasi  pada  protein  menyebabkan  kerusakan  protein  dan  modifikasi  protein  serta  asam amino. Tidak ada perbedaan jumlah ekspresi pita protein baik pada fraksi non polar dosis
0,6 mg/kg berat badan, fraksi non polar dosis 3 mg/kg berat badan, fraksi semi polar dosis 4 mg/kg berat badan, dan fraksi semi polar dosis 20 mg/kg berat badan. Pelarut non polar (n- heksan) merupakan jenis pelarut yang dapat melarutkan beberapa senyawa kimia meliputi waxes, lemak, dan minyak. Kadar tanin yang semakin meningkat dapat menghambat sintesis protein  spermatozoa  pada  bagian  ekor  (Rahmaningtyas  et  al.,  2013).  Selanjutnya  untuk pelarut semi polar (etil asetat), pelarut ini dapat melarutkan beberapa senyawa kimia salah satunya yaitu alkaloid. Senyawa alkaloid terlarut bisa mengganggu aktifitas enzim ATP-ase pada  membran  sel  spermatozoa  dibagian  tengah  ekor.  Jika  aktivitas  enzim  ATP-ase terganggu,  maka  homeostasis  ion  natrium  dan  kalium  akan  terganggu  sehingga  dapat memicu  terjadinya  degradasi  membran.  Jika  degradasi  membran  sel  terjadi,  diduga  akan menyebabkan terdegradasinya komponen dalam membran sel yang penting seperti protein, DNA, dan akhirnya terjadi kematian sel (Weecharangsan et al., 2006). Pada penelitian ini mampu  membuktikan  bahwa  ekstrak  fraksi  pericarpium  manggis  yang  diketahui mengandung  senyawa  xanthon  mampu  memulihkan  profil  protein  yang  hilang  akibat pemberian senyawa 2-ME.

## IV. KESIMPULAN
Pemberian ekstrak fraksi polar dengan dosis optimal yaitu 0,4 mg/kg berpengaruh terhadap profil protein epididimal spermatozoa mencit ( Mus musculus ). Terbukti degan terekspresi kembalinya beberapa protein yaitu protein dengan berat molekul 20 kDa yang hilang akibat paparan senyawa 2-ME.

## DAFTAR PUSTAKA
Agarwal, A., & Prabakaran, S. A. (2005). Mechanism, measurement and prevention of O.S.
Indian Journal of Experimental Biology , 43 (November), 963–974. Arrotéia,  K.  F.,  Garcia,  P.  V.,  &  Barbieri,  M.  F.  (2011). The  Epididymis :  Embryology  , Structure , Function and Its Role in Fertilization and Infertility . Awda, B. J., Mackenzie-Bell, M., & Buhr, M. M. (2009). Reactive Oxygen Species and Boar Sperm Function1. Biology of Reproduction , 81 (3), 553–561. https://doi.org/10.1095/biolreprod.109.076471
El-Shahat,  K.  H.,  Taysser,  M.  I.,  Badr,  M.  R.,  &  Zaki,  K.  (2016).  Effect  of  L-arginine treatment on motility, hyperactivity, acrosome reaction of ejaculated ram spermatozoa. Animal Reproduction , 13 (2), 75–80. https://doi.org/10.21451/1984-3143-AR788 Fàbrega, A., Guyonnet, B., Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Puigmulé, M., Bonet, S., & Pinart, E. (2011). Expression, immunolocalization and processing of fertilins ADAM-1 and ADAM-2  in  the  boar  (sus  domesticus)  spermatozoa  during  epididymal  maturation. Reproductive  Biology  and  Endocrinology , 9 ,  1–13.  https://doi.org/10.1186/1477- 7827-9-96
Fitri,  R.  A.,  Sumarmin,  R.,  &  Yuniarti,  E.  (2017). BioScience|Volume  1  no . 1 (2). https://doi.org/10.24036/bsc.v1i2.7718
Gaudreault, C., El Alfy, M., Légaré, C., & Sullivan, R. (2001). Expression of the Hamster Sperm Protein P26h During Spermatogenesis1. Biology of Reproduction , 65 (1), 79– 86. https://doi.org/10.1095/biolreprod65.1.79
Han, C., Park, I., Lee, B., Jin, S., Choi, H., Kwon, J. T., Kwon, Y. il, Kim, D. H., Park, Z. Y.,  &  Cho,  C.  (2011).  Identification  of  heat  shock  protein  5,  calnexin  and  integral membrane  protein  2B  as  Adam7-interacting  membrane  proteins  in  mouse  sperm. Journal of Cellular Physiology , 226 (5), 1186–1195. https://doi.org/10.1002/jcp.22444 Hidayat, E., Susanti, R., & Marianti, A. (2016). Protein Profile and Mda Spermatozoa Levels of  Hyperglycemic  Mice  Fed  By  Bean  Sprouts  Extract. Indonesian  Journal  of Pharmacy , 26 (4), 192. https://doi.org/10.14499/indonesianjpharm26iss4pp192
Kim, E., Lee, J. W., Baek, D. C., Lee, S. R., Kim, M. S., Kim, S. H., Kim, C. S., Ryoo, Z. Y.,  Kang,  H.  S.,  &  Chang,  K.  T.  (2010).  Processing  and  subcellular  localization  of ADAM2 in the Macaca fascicularis testis and sperm. Animal Reproduction Science , 117 (1–2), 155–159. https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2009.04.002
Kurniawati, M., Mahdi, C., & Aulanni’am, A. (2014). The Effect Of Juice Mangosteen Rind (Garcinia Mangostana L.) To Blood Sugar Levels And Histological Of Pancreatic Rats With The Induction Of Streptozotocin. The Journal of Pure and Applied Chemistry Research , 3 (1), 1–6. https://doi.org/10.21776/ub.jpacr.2014.003.01.145
Lea, I. A., Widgren, E. E., & O’Rand, M. G. (2004). Association of sperm protein 17 with A-kinase anchoring protein 3 flagella. Reproductive Biology and Endocrinology , 2 , 1– 7. https://doi.org/10.1186/1477-7827-2-57
Mahasri, G., Fajriah, U., & SUBEKTI, S. (2010). Karakterisasi protein Lernaea cyprinacea dengan Metode Elektroforesis SDS-PAGE. Jurnal Ilmiah Perikanan Dan Kelautan , 2 (1), 61–67.
Moongkarndi, P., Kosem, N., Kaslungka, S., Luanratana, O., Pongpan, N., & Neungton, N. (2004).  Antiproliferation,  antioxidation  and  induction  of  apoptosis  by  Garcinia mangostana  (mangosteen)  on  SKBR3  human  breast  cancer  cell  line. Journal  of Ethnopharmacology , 90 (1), 161–166. https://doi.org/10.1016/j.jep.2003.09.048 Nagdas, S. K., McLean, E. L., Richardson, L. P., & Raychoudhury, S. (2014). Identification and  characterization  of  TEX101  in  bovine  epididymal  spermatozoa. Biochemistry Research International , 2014 . https://doi.org/10.1155/2014/573293
Rahmaningtyas, E., Yusa, N. M., & Puspawati2, N. N. (2013). Pengaruh penambahan cmc (. Teknologi Pertanian
Universitas
Udayana , 34 (1), 1–7. https://ojs.unud.ac.id/index.php/itepa/article/download/27494/17403/.
Starek-͆wiechowicz, B., Szymczak, W., Budziszewska, B., & Starek, A. (2015). Testicular effect of a mixture of 2-methoxyethanol and 2-ethoxyethanol in rats. Pharmacological Reports , 67 (2), 289–293. https://doi.org/10.1016/j.pharep.2014.09.011
Weecharangsan,  W.,  Opanasopit,  P.,  Sukma,  M.,  Ngawhirunpat,  T.,  Sotanaphun,  U.,  & Siripong, P. (2006). Antioxidative and neuroprotective activities of extracts from the fruit  hull  of  mangosteen  (Garcinia  mangostana  Linn.). Medical  Principles  and Practice , 15 (4), 281–287. https://doi.org/10.1159/000092991
Accepted Date Revised Date Decided Date Accepted to Publish 06 Agustus  2020 08 Agustus 2020 11 Agustus 2020 Ya