## RESPON PERTUMBUHAN TUNAS SANINTEN
( Castanopsis argentea (Blume) A.DC.) TERHADAP

## PEMBERIAN ZAT PENGATUR TUMBUH BAP DAN IAA SECARA IN VITRO
The growth response of Saninten (Castanopsis argentea (Blume) A.DC.) In Vitro by Adding Plant Growth Regulator BAP and IAA
Arum Sekar Wulandari 1 , Erina Sulistiani 2 dan Esthi Liani Agustiani 1
1 Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan IPB
2 Peneliti SEAMEO BIOTROP, Bogor

## ABSTRACT
Saninten ( Castanopsis argentea (Blume) A.DC.) is one of the member Fagaceae family which can produce wood and non-wood product. Micropropagation of saninten by in vitro has never been reported. This research aims to identify the growth response of saninten shoot by adding Plant Growth Regulator (PGR), they are  6-benzylaminopurine (BAP) and indole-3-acetic-acid  (IAA)  with  different  concentrations  in  propagation  in  vitro  on  woody  plant  medium  (WPM).  The research conducted a completely randomized design (CRD) factorial. They are PGR type and PGR concentration. The PGR type consist of two levels namely BAP and IAA. PGR concentration consist of three levels namely 0 mg/L BAP and IAA, 0.5 mg/L BAP or 0.1 mg/L IAA, and 1.0 mg/L BAP or 0.1 mg/L IAA. Parameters observed is the amount of shoot, shoot height, and callus growth. The combination of BAP (0, 0.5, 1 mg/L) and IAA (0, 0.1, 0.1 mg/L) haven’t produce optimal  growth  of  shoot.  WPM  medium  with  0.5  mg/L  BAP  was  able  to  produce  the  best  of  percentage  of  shoot,  the number of shoots, and shoot height growth. WPM medium with IAA concentration of 0.1  and 0.2 mg/L produce explant with callus.
Key words: 6-benzylaminopurine (BAP), Castanopsis argentea , indole-3-acetic-acid (IAA), woody plant medium (WPM)

## PENDAHULUAN
Saninten ( Castanopsis  argentea (Blume)  A.DC.) adalah  salah  satu  anggota  famili Fagaceae yang merupakan penghasil kayu dan non kayu. Kayu saninten biasanya digunakan untuk kayu pertukangan (Martawijaya et  al. 1987),  sedangkan  hasil  hutan  non kayu dari saninten berupa buah dan bahan pewarna dari kulit buahnya. Secara ekologi, pohon ini menjadi tempat bagi  satwa  liar  (terutama  burung  dan  mamalia)  untuk mencari pakan, beristirahat dan bersarang (Heriyanto et al . 2007).  Jenis  ini  juga  dapat  digunakan  untuk mereboisasi  lahan  dengan  kandungan  batu  yang  tinggi (Wibowo 2006), serta menjadi salah satu jenis tanaman yang  berpotensi  untuk  kegiatan  revegetasi  lahan  bekas tambang (Mansur 2013).
Manfaat  dari  tanaman  saninten  menjadi  salah  satu alasan pentingnya upaya perbanyakan tanaman saninten untuk  menunjang  keberadaan dan kebutuhan akan jenis ini.  Perbanyakan  secara  generatif  melalui  permudaan alam  untuk  jenis  ini  sulit  dilakukan  karena  buahnya yang disenangi satwa (Heriyanto et al . 2007). Selain itu, lamanya  pertumbuhan  dan  perkembangan  tanaman kehutanan  menjadi  alasan  untuk  ditemukannya  teknik perbanyakan secara vegetatif yang cepat dan menghasilkan individu tanaman yang unggul.
Perbanyakan saninten secara vegetatif telah dilakukan oleh Fitria (2015) melalui stek pucuk dengan
persentase  stek  hidup  sebesar  92.78%  dan  stek  berakar sebesar 40.56% pada umur 45 hari. Namun perbanyakan dengan  metode  ini  terkendala  serangan  fungi  yang muncul  di  bagian  pangkal  stek  pucuk  pada  beberapa stek  yang  hidup.  Teknik  perbanyakan  vegetatif  lainnya yang  dapat  dipilih  ialah  perbanyakan  tanaman  melalui kultur  jaringan,  dengan  keunggulan:  (1)  sifat  genetik yang  sama  dengan  pohon  induknya,  (2)  dapat diperbanyak  dalam  skala  besar,  dan  (3)  waktu  relatif singkat  (Sulistiani  dan  Yani  2012).  Perbanyakan saninten  secara in  vitro belum  pernah  dilaporkan. Lestari  (2008)  menyatakan  keberhasilan  tanaman melalui  teknik  kultur  jaringan  dipengaruhi  oleh keberadaan zat pengatur tumbuh (ZPT). Oleh karena itu, penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi  respon pertumbuhan  tunas  saninten  terhadap  pemberian 6- benzylaminopurine (BAP)  dan indole-3-acetic-acid (IAA) dengan konsentrasi yang berbeda secara in vitro .

## METODE

## Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan  September 2015 sampai dengan April 2016. Penelitian dilakukan di Laboratory Service Southeast Asian Regional Center for Tropical Biology (SEAMEO BIOTROP).

## Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol  kultur,  gelas  ukur,  labu  ukur,  cawan  petri,  pipet, pipet bulb, sendok pengaduk, pemanas, gunting, pinset, pisau ( scapel ), bunsen, sprayer, pH meter,  karet gelang, timbangan  analitik  (ketelitian  10 -4 ), magnetic  stirrer , magnetic stirring bars, oven, autoklaf, laminar air flow cabinet (LAFC),  ruang  transfer/subkultur,  dan  ruang kultur.
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah tunas pucuk saninten dari bibit berumur 2 tahun, kertas milimeter,  tissue,  dan  plastik.  Bahan  kimia  yang digunakan  yaitu  komponen  media  dasar woody  plant medium (WPM),  zat  pengatur  tumbuh  (ZPT)  berupa 6- benzylaminopurine (BAP)  dan indole-3-acetic-acid (IAA).  Bahan  sterilan  yaitu  fungisida  (bahan  aktif: benomil  50.4%),  bakterisida  (bahan  aktif:  streptomisin sulfat 20%), desinfektan (bahan aktif: natrium hipoklorit 5.25%), tween 20, alkohol 70% dan aquades steril.

## Prosedur Penelitian

## Penyiapan bahan tanaman
Bibit  saninten  dipangkas  untuk  mendapatkan tunas  baru,  serta  dilakukan  penyemprotan  bibit  setiap dua  hari  sekali  menggunakan  larutan  fungisida  dan bakterisida dengan konsentrasi masing-masing 2 g/L.

## Sterilisasi alat dan bahan
Peralatan  dan  bahan  penunjang  kegiatan  kultur disterilisasi  menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121 0 C selama  15  menit,  kemudian  disimpan  dalam  oven dengan suhu 80 0 C sampai alat tersebut digunakan. Alat logam  disterilisasi  sesaat  sebelum  digunakan  dengan mencelupkannya ke dalam alkohol 70% lalu dipanaskan di atas bunsen yang menyala .

## Sterilisasi lingkungan kerja
LAFC  disemprot  alkohol  70%  pada  bagian  dinding sebelum dilakukan penanaman eksplan. Tangan pekerja disterilkan  dengan  menyemprotkan  alkohol  70%,  serta menggunakan  jas  laboratorium  dan  masker  selama  di ruang kultur.

## Penyediaan aquades steril
Air  hasil  penyulingan  (destilasi)  dimasukkan  ke dalam  botol  kaca  bertutup,  kemudian  disterilkan  dalam autoklaf  pada  suhu  121 0 C  selama  30  menit.  Aquades steril kemudian disimpan dalam ruang transfer/subkultur.

## Pembuatan media
Media  yang  digunakan  adalah  media  WPM.  Media inisiasi  ditambahkan  BAP  0.5  mg/L,  sedangkan  media induksi  (perlakuan)  ditambahkan  kombinasi  ZPT  BAP (0, 0.5, 1 mg/L) dan IAA (0, 0.1, 0.2 mg/L). Pembuatan media  dilakukan  dengan  mencampurkan  larutan  bahan baku (unsur hara makro, mikro, vitamin, ZPT, sukrosa) menggunakan  pipet  sesuai  konsentrasi  yang  ditetapkan ke  dalam  labu  ukur  berisi  1000  mL  aquades.  Larutan media  diaduk  di  atas magnetic  stirrer .  Setelah  itu  pH
diatur  hingga  5.7,  kemudian  dimasukkan  agar-agar ( phytagel )  sebanyak  2  g/L  sebagai  bahan  pemadat media.  Media  dipanaskan  hingga  mendidih,  kemudian dituang  ke  dalam  botol  kultur  sebanyak  ±20  mL/botol. Botol  ditutup  plastik  dan  direkatkan  dengan  karet, kemudian  disterilisasi  di  dalam  autoklaf  pada  suhu  121 0 C selama 15 menit.

## Sterilisasi eksplan
Sterilisasi  tunas  saninten  disterilisasi  melalui  2 tahap. Tahap pertama dilakukan di luar LAFC dengan 3 macam  perendaman  yang  dilakukan  secara  berurutan, yaitu  perendaman  dalam  100  mL  aquades  +  3  tetes tween  20  (30  menit),  perendaman  dalam  larutan fungisida  2  g/L  +  3  tetes  tween  20  (60  menit),  dan perendaman  dalam  larutan  bakterisida  2  g/L  +  3  tetes tween  20  (60  menit).  Setiap  tahap  perendaman  diikuti pembilasan  dengan  aquades  sebanyak  3  kali.  Tahap kedua  dilakukan  perendaman  dengan  desinfektan berupa  larutan  natrium  hipoklorit  (NaOCl  5.25%)  di dalam  LAFC.  Perendaman  eksplan  dengan  NaOCl 5.25% dilakukan dengan 4  macam  metode perendaman (Tabel 1)
Tabel 1  Perbandingan prosedur metode  sterilisasi pada kultur saninten Metode Konsentrasi NaOCl 5.25% * (%) Lama perendaman (menit) 1 15 15 2 15 10 3 10 15 4 10 10 * Larutan NaOCl 5.25% dicampur dengan 3 tetes tween 20.
Eksplan yang sudah melalui tahap sterilisasi ditanam (diinisiasi)  dalam  media  WPM  dengan  ZPT  BAP  0.5 mg/L. Peubah yang diamati meliputi eksplan terkontaminasi  (fungi,  bakteri,  fungi  dan  bakteri),  mati dan steril. Setiap peubah dihitung dengan cara:
( ) mati % + i kontaminas % - 100% = steril % % 100 × nam eksplan ta mati eksplan = mati eksplan % % 100 × nam eksplan ta % i kontaminas eksplan = i kontaminas eksplan % ∑ ∑ ∑ ∑

## Pemindahan eksplan ke media perlakuan
Eksplan  steril  yang  telah  diinisiasi  dalam  media WPM  dengan  BAP  0.5  mg/L  kemudian  diinduksi  ke dalam  media  perlakuan.  Percobaan  dilakukan  dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL)  faktorial, dengan 2 faktor yaitu macam ZPT dan konsentrasi ZPT. Macam  ZPT  terdiri  atas  2  taraf  yaitu  BAP  dan  IAA. Konsentrasi ZPT terdiri atas 3 taraf yaitu BAP dan IAA 0  mg/L,  BAP  0.5  mg/L  atau  IAA  0.1  mg/L,  dan  BAP 1.0 mg/L atau IAA 0.2 mg/L. Masing-masing perlakuan memiliki  4  ulangan  dengan  2  unit  amatan  pada  setiap ulangan.  Pengambilan  keputusan  berdasarkan  sidik ragam yakni: (1) tolak H0 jika nilai F hitung > F tabel, (2) terima H0 jika F hitung < F tabel.

## Pemeliharaan
Botol  kultur  disimpan  dalam  rak  pada  ruang  kultur dengan  suhu  udara  22−25 0 C  dan  diletakkan  di  bawah lampu fluorescent 36−40  watt  sebanyak  1  buah. Lamanya penyinaran lampu diatur 16 jam  menyala dan 8 jam padam.

## Pertumbuhan tunas saninten
Pertumbuhan  dan  perkembangan  eksplan  kemudian diamati selama 8 minggu setelah tanam (MST). Peubah yang diukur di antaranya:
Waktu  munculnya  tunas. Pengamatan  dilakukan setiap  hari  dengan  melihat  perkembangan  kemunculan tunas  pada eksplan.
Jumlah  tunas. Jumlah  tunas  dihitung  pada  saat akhir  pengamatan  yaitu  pada  8  MST  dengan  cara menghitung jumlah tunas yang terbentuk.
Tinggi tunas. Tinggi tunas diukur dari selisih tinggi tunas  pada  akhir  pengamatan  dengan  tinggi  tunas  saat masuk media perlakuan. Pengukuran dilakukan menggunakan kertas milimeter yang diletakan di bawah cawan petri.
Waktu  munculnya  kalus. Pengamatan  dilakukan setiap  hari  dengan  melihat  perkembangan  kemunculan kalus pada eksplan.
Ukuran  kalus. Penetapan  skor  pada  eksplan berkalus  dilakukan  berdasarkan  kriteria  penilaian  pada Tabel 2.
Tabel 2  Kriteria penetapan skor pada eksplan berkalus
Skor Kriteria
0 Eksplan hidup namun tidak membentuk kalus
1 Eksplan  membentuk  sangat  sedikit  kalus  (bagian eksplan yang tertanam media menggembung hingga belah)
2 Eksplan  membentuk  kalus  yang  sedikit  (terdapat bulatan kalus dengan diameter < 0.5 cm)
3 Eksplan  membentuk  kalus  sedang  (kalus  muncul berbentuk  remah  dengan  diameter  kalus  >  0.5−1.0 cm)
4 Eksplan  membentuk  kalus  banyak  (kalus  muncul dengan diameter > 1.0 cm)
5 Eksplan  membentuk  kalus  sangat  banyak  (kalus membentuk organ atau plantlet)

## Analisis Data
Pengaruh  perlakuan  yang  dicobakan  terhadap  data yang menggunakan skor dianalisis dengan menggunakan  statistik  non  parametrik  Kruskal-Wallis. Data jumlah tunas dan tinggi tunas diuji dengan analisis ragam (uji F).  Perbedaan yang berpengaruh nyata pada uji F diuji lanjut dengan menggunakan Duncan Multiple Range  Test (DMRT)  pada  taraf  kesalahan  5%. Pengolahan  data  dilakukan  dengan  menggunakan software SPSS ( Statistical Package for Social Sciences )

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil

## Sterilisasi eksplan
Hasil perbandingan metode sterilisasi eksplan pucuk saninten disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1 Pengaruh  metode  sterilisasi  terhadap  eksplan saninten steril yang dihasilkan pada 4 MST
Metode  perendaman  eksplan  dengan  larutan  NaOCl 5.25% konsentrasi 15% selama 10 dan 15 menit mampu menghasilkan eksplan steril yang tinggi, namun terdapat eksplan steril  yang  mengalami pencoklatan ( browning ). Metode  perendaman  eksplan  dengan  larutan  NaOCl 5.25%  konsentrasi  10%  selama  10  menit  mampu menghasilkan  100%  eksplan  steril  (Gambar  1),  namun setelah 4 MST terjadi perubahan kondisi eksplan berupa munculnya  kontaminan  pada  beberapa  eksplan.  Oleh karena  itu,  efektivitas  metode  sterilisasi  terbaik  yang dipilih ialah perendaman eksplan dengan larutan NaOCl 5.25% konsentrasi 10% selama 15 menit.
Tabel 3  Hasil  sterilisasi  eksplan  saninten  dengan perendaman desinfektan (NaOCl 5.25%)
konsentrasi 10% selama 15 menit pada 4 MST
Sterilisasi * Jumlah eksplan Kondisi eksplan (%) Steril Kontaminasi Mati 1 19 84.21 15.79 0.00 2 49 44.90 55.10 0.00 3 24 54.17 41.67 4.17 4 12 33.33 66.67 0.00
* Sterilisasi dilakukan pada waktu yang berbeda. Eksplan steril kemudian digunakan pada perlakuan berikutnya.
Persentase  eksplan  steril  yang  didapatkan  berkisar antara  33.33%  hingga  84.21%  (Tabel  3).  Adanya kontaminasi  pada  eksplan  saninten  disebabkan  oleh mikroorganisme  berupa  fungi  dan  bakteri.  Waktu munculnya  kontaminan  pada  eksplan  berbeda-beda, namun umumnya terjadi ketika 3 hari setelah tanam.
15’ 10’             15’             10’ NaOCl (%) – lama perendaman (menit) Steril Kontaminasi Mati 100
80
60 40 20 0 Ko n d isi e k sp la n (% )
Gambar  2    Jenis  kontaminan  pada  fase  inisiasi  tunas saninten selama 4 MST Kontaminasi tertinggi dalam penelitian ini disebabkan  oleh  fungi  sebesar  30.77%  (Gambar  2). Kontaminasi  oleh  bakteri  terjadi  sebesar  14.42%, sedangkan  kontaminasi  oleh  fungi  dan  bakteri  sebesar 0.96%.

## Pertumbuhan tunas
1. Jumlah tunas
Hasil  analisis  ragam  jumlah  tunas  saninten  pada umur  8  MST  menunjukkan  bahwa  faktor  jenis  ZPT, konsentrasi  ZPT  dan  interaksi  keduanya  tidak berpengaruh  nyata  terhadap  jumlah  tunas  yang terbentuk. Eksplan saninten yang diinduksikan ke dalam media perlakuan menunjukkan respon berupa kemunculan tunas (Tabel 4).
Tabel  4    Pengaruh  BAP  dan  IAA  pada  media  induksi
(WPM)  terhadap  kemunculan  tunas  saninten pada umur 8 MST BAP (mg/L) IAA (mg/L) Rentang waktu pertunasan (HST) Eksplan bertunas (%) Rentang jumlah tunas 0.0 0.0 0 0.0 0 0.5 0.0 14−42 37.5 0−8 1.0 0.0 14−28 25.0 0−3 0.0 0.1 7−10 25.0 0−2 0.5 0.1 7−14 25.0 0−2 1.0 0.1 7−14 25.0 0−2 0.0 0.2 0 0.0 0 0.5 0.2 10−14 25.0 0−3 1.0 0.2 10 12.5 0−3
Berdasarkan  pengamatan,  hampir  semua  perlakuan mampu  menghasilkan  eksplan  bertunas  kecuali  pada media  kontrol dan  media WPM dengan IAA 0.2  mg/L. Kemunculan tunas tercepat dimulai pada waktu 7 HST, dan  waktu  kemunculan  tunas  paling  lama  terjadi  pada 42  HST.  Tabel  4  menunjukkan  bahwa  persentase eksplan  bertunas  tertinggi  sebesar  37.5%  hanya  terjadi dalam media WPM dengan BAP 0.5 mg/L. Sama halnya dengan  jumlah  tunas  yang  dihasilkan,  jumlah  tunas tertinggi  sebesar  8  tunas  terjadi  pada  media  WPM dengan BAP 0.5 mg/L.
2. Tinggi tunas
Hasil  analisis  ragam  jumlah  tunas  saninten  pada umur  8  MST  menunjukkan  bahwa  faktor  jenis  ZPT, konsentrasi  ZPT  dan  interaksi  keduanya  tidak berpengaruh nyata terhadap pertambahan tinggi eksplan tunas saninten.
Gambar 3 Pertambahan  tinggi  tunas  saninten  dalam media WPM dengan kombinasi ZPT BAP (0, 0.5, 1 mg/L) dan IAA (0, 0.1, 0.2 mg/L) pada umur 8 MST
Gambar  3  menunjukkan  bahwa  perlakuan  media WPM  BAP  0  mg/L  dengan  IAA  pada  berbagai konsentrasi (0, 0.1, 0.2 mg/L) menghasilkan pertambahan  tinggi  tunas  yang  sama,  yaitu  sebesar  1.1 mm.  Perlakuan  media  WPM  BAP  0.5  mg/L  yang dikombinasikan  dengan  IAA  pada  berbagai  konsentrasi (0,  0.1,  0.2  mg/L)    menghasilkan  pertambahan  tinggi tunas yang semakin menurun seiring dengan penambahan  konsentrasi  IAA.  Respon  sebaliknya terjadi pada perlakuan media WPM dengan ZPT BAP 1 mg/L  yang  dikombinasikan  dengan  IAA  pada  berbagai konsentrasi  (0,  0.1,  0.2  mg/L),  terjadi  peningkatan pertambahan  tinggi  tunas  seiring  dengan  penambahan konsentrasi IAA. Perlakuan terbaik dalam menghasilkan pertambahan  tinggi  tunas  terjadi  pada  perlakuan  media WPM dengan  ZPT BAP 0.5 mg/L dengan nilai sebesar 1.7 mm.

## Pertumbuhan kalus
Hasil  analisis  Kruskal  Wallis  terhadap  skor  berupa kemunculan  kalus  pada  eksplan  tunas  saninten  pada  8 MST menunjukkan hasil yang tidak berpengaruh nyata. Setelah  8  MST,  terdapat  beberapa  kondisi  eksplan seperti yang disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5  Pengaruh  BAP  dan  IAA  pada  media  induksi (WPM)  terhadap  kemunculan  kalus,  kematian eksplan dan kontaminasi eksplan
BAP (mg/L) IAA (mg/L) Rentang waktu kemunculan kalus (HST) Eksplan berkalus (%) Eksplan mati (%) Eksplan terkontaminasi (%) 0.0 0.0 0 0.0 0.0 25.0 0.5 0.0 10−48 37.5 12.5 0.0 1.0 0.0 10−48 37.5 12.5 25.0 0.0 0.1 10−32 50.0 0.0 25.0 0.5 0.1 14−48 50.0 25.0 12.5 1.0 0.1 14−48 62.5 12.5 0.0 0.0 0.2 10−48 75.0 0.0 12.5 0.5 0.2 14 25.0 12.5 12.5 1.0 0.2 10−49 50.0 12.5 12.5
Respon  kalus  muncul  di  seluruh  perlakuan  media induksi  kecuali  pada  media  tanpa  ZPT  (kontrol).  Kalus umumnya  muncul  pada  10  dan  14  HST.  Persentase
Jenis kontaminan
Fungi Bakteri Fungi dan Bakteri 30,77
14,42 0,96
Ko n tam in asi ( %) 40 30 20 10 0 0 0,1 0,2
Konsentrasi IAA (mg/L) BAP 0 mg/L BAP 0,5 mg/L BAP 1 mg/L 2 1,5 1
0,5 0 P ertam b ah an ti n g g i (m m )
eksplan  berkalus  tertinggi  pada  WPM  dengan  IAA  0.2 mg/L (Tabel 5). Media WPM + BAP 1 mg/L + IAA 0.1 mg/L  memiliki  persentase  eksplan  berkalus  kedua, namun  kualitas  kalus  yang  baik  pada  media  tersebut hanya  terjadi  pada  satu  eksplan.  Media  induksi  yang menghasilkan  persentase  kalus  tinggi  dengan  kualitas kalus  yang  baik  setelah  media  WPM  dengan  IAA  0.2 mg/L  adalah  media  WPM  dengan  IAA  0.1  mg/L.  Pada media  tersebut  terdapat  eksplan  dengan  kalus  yang berorganogenesis menjadi akar.

## Pembahasan

## Sterilisasi eksplan
Kegiatan  dalam  kultur  jaringan  dimulai  dengan tahap sterilisasi bahan tanam (eksplan), inisiasi eksplan, induksi  dan  multiplikasi,  kemudian  dilakukan  tahap aklimatisasi atau pengakaran (Hendaryono dan Wijayani  2012).  Proses  sterilisasi  eksplan  dilakukan untuk  menghilangkan  sumber  kontaminan  yang  tidak diinginkan  dengan  gangguan  seminimal  mungkin  pada eksplan. Berdasarkan konsentrasi dan waktu perendaman  eksplan  dalam  larutan  NaOCl  5.25%, metode  perendaman  eksplan  dalam  larutan  NaOCl 5.25%  konsentrasi  10%  selama  15  menit  lebih  baik karena  mampu  menghasilkan  eksplan  steril  yang  stabil kondisinya  pada  4  MST  serta  kematian  eksplan  akibat browning yang  rendah  (0.96%).  Persentase  eksplan steril  tertinggi  dan  terendah  dari  hasil  sterilisasi menggunakan  metode  ini  sebesar  84.21%  dan  33.33%. Pada  sterilisasi  eksplan  tembesu  ( Fagraea  fragrans Roxb)  oleh  Ardiansyah  (2014),  penggunaan  larutan NaOCl  0.5%  selama  15  dan  20  menit  menghasilkan eksplan  tembesu  steril  sebesar  26.67%  dan  33.33%. Kondisi  tersebut  menunjukkan  bahwa  konsentrasi  yang tepat  dari  bahan  sterilan  dan  pemilihan  waktu  lamanya eksplan  terpapar  bahan  sterilan  mampu  meminimalkan kerusakan eksplan dan menjaga peluang hidup eksplan.
Adanya  kontaminan  pada  eksplan  hasil  sterilisasi diduga  disebabkan  oleh  proses  sterilisasi  yang  kurang optimal.  Zulkarnain  (2009)  menyatakan  bahwa  sumber kontaminasi  mikroorganisme  pada  sistem  kultur jaringan  dapat  berasal  dari  beberapa  faktor,  seperti faktor  medium  dan  alat  yang  tidak  sempurna sterilisasinya,  lingkungan  kerja  yang  kurang  steril, eksplan,  dan  pekerjaan  yang  kurang  teliti.  Pada  kultur eksplan  saninten,  kontaminasi  tetap  terjadi  dengan persentase  kontaminasi  tertinggi  disebabkan  oleh  fungi sebesar 30.77%. Hal serupa juga terjadi pada penelitian yang  dilakukan  oleh  Khairunisa  (2009),  kontaminasi terbesar  dalam  inisiasi  tunas  binahong  ( Anredera cordifolia [Ten.] Steenis) disebabkan oleh fungi. Sumber kontaminasi pada eksplan dapat disebabkan oleh  kontaminan  yang  berasal  dari  dalam  jaringan tanaman sehingga tidak dapat dihilangkan hanya dengan sterilisasi  permukaan,  seperti  adanya  bakteri  endofit pada  jaringan  tanaman  (Zulkarnain  2009).  Adanya penyerapan  unsur  hara  dari  media  oleh  eksplan,  akan mendorong  bakteri  endofit  dalam  jaringan  tanaman terbawa  keluar  dan  berkembang  pada  media.  Kondisi lingkungan in  vitro dengan  unsur  hara  dan  sukrosa dalam  jumlah  besar,  kelembaban  yang  tinggi,  dan  suhu yang hangat dapat mendorong pertumbuhan
mikroorganisme  dengan  cepat  (Zulkarnain  2009), sehingga akan mengganggu pertumbuhan dan perkembangan eksplan hingga menyebabkan kematian.

## Pertumbuhan tunas
Teknik perbanyakan kultur jaringan yang diterapkan dalam  penelitian  ini  dilaksanakan  melalui  kultur  tunas. Inisiasi  eksplan  saninten  berupa  bagian  apeks  dengan satu  ruas  daun  pertama  dalam  media  pre-kondisi  WPM dengan  BAP  0.5  mg/L  ternyata  mampu  memunculkan tunas  aksilar.  Tunas  aksilar  tersebut  tumbuh  sebagai respon  pemanjangan  tunas  ketiak  pada  eksplan. Saninten  merupakan  jenis  tanaman  berkayu,  sehingga dalam penelitian ini media yang digunakan ialah media WPM. Selain  media dan jenis eksplan  yang digunakan, penambahan  ZPT  juga  berpengaruh  pada  keberhasilan kultur jaringan (Herawan et al. 2014).
Pemindahan  eksplan  steril  hasil  inisiasi  ke  media induksi  dengan  penambahan  ZPT  bertujuan  untuk memperbanyak  atau  menggandakan  tunas.  Eksplan saninten  dalam  media  WPM  tanpa  ZPT  (kontrol)  dan media WPM dengan IAA 0.2 mg/L tidak menghasilkan tunas. Pada media kontrol, tidak adanya kandungan ZPT eksogen  membuat  eksplan  tidak  mampu  memproduksi tunas.  Kondisi  tersebut  memperlihatkan  bahwa  secara fisiologis  kandungan  sitokinin  endogen  dalam  eksplan sangat rendah. Pada media WPM dengan IAA 0.2 mg/L, tidak  adanya  kemunculan  tunas  dapat  disebabkan  oleh dominasi  ZPT  auksin  eksogen  yang  mengalahkan  kerja sitokinin  endogen  pada  eksplan.  Hendaryono  dan Wijayani (2012) menyatakan bahwa pembentukan tunas akan terjadi ketika konsentrasi sitokinin lebih tinggi dari auksin.
Menurut Hendaryono dan Wijayani (2012), keseimbangan  antara  auksin  dan  sitokinin  sangat penting  dalam  menginduksi  tunas  karena  masing- masing  zat  tersebut  mempunyai  peranan  dalam menginduksi  tunas.  Media  dengan  kombinasi  BAP (0.5−1  mg/L)  dan  IAA  (0.1−0.2  mg/L)  menghasilkan persentase  bertunas  dan  jumlah  tunas  yang  hampir sama.  Kondisi  tersebut  dapat  terjadi  karena  belum tercapainya  keseimbangan  konsentrasi  BAP  dan  IAA yang ditambahkan ke dalam media untuk memunculkan tunas pada eksplan saninten.
Selain  kemunculan  tunas,  pertambahan  tinggi  tunas pada  eksplan  yang  dikulturkan  dapat  menunjukkan potensi morfogenesis dan kemampuan adaptasi tumbuhan  terhadap  lingkungannya,  serta  kapasitas pertumbuhan eksplan (Prihartini 2004). Auksin memiliki  peranan  dalam  pemanjangan  sel,  sedangkan sitokinin berperan dalam pembelahan sel (Sulistiani dan Yani  2012).  Dalam  penelitian  ini,  kombinasi  sitokinin (BAP  0.5−1  mg/L)  dan  auksin  (IAA  0.1−0.2  mg/L) yang digunakan menghasilkan pertumbuhan tinggi yang fluktuatif.  Hanya  pada  media  WPM  dengan  BAP  0.5 mg/L  yang  mampu  menghasilkan  pertambahan  tinggi tunas  yang  paling  baik.  Ketika  konsentrasi  BAP dinaikkan  menjadi  1  mg/L  justru  terjadi  penurunan tinggi  tunas.  Pada  perbanyakan  gaharu,  kondisi  serupa terjadi  akibat  periode  inkubasi  terlalu  lama  pada  media yang  mengandung  sitokinin  sehingga  menyebabkan perpanjangan tunas terhambat (Azwin et al. 2006). Pada induksi biji  manggis (Harahap et al. 2014) penggunaan
BAP  terlalu  tinggi  sebesar  10  mg/L  menghasilkan pertumbuhan  tunas  yang  kerdil.  Selain  itu,  pada beberapa  jenis  tanaman  dengan  pertumbuhan  lambat ( slow growing ), sifat pertumbuhan alami tanaman dapat mempengaruhi keberhasilan kutur in vitro (Yelnitis dan Joni 2015).
Media  WPM  dengan  BAP  0.5  mg/L  merupakan media  dengan  persentase  bertunas,  jumlah  tunas  dan pertambahan tinggi tunas paling baik. Konsentrasi BAP 0.5  mg/L  merupakan  konsentrasi  ZPT  yang  digunakan pada  media  pre-kondisi  awal.  Kemungkinan  eksplan tunas  saninten  sudah  adaptif  dengan  kandungan  ZPT BAP  0.5  mg/L  sehingga  mampu  menghasilkan  kondisi pertunasan  dan  pertambahan  tinggi  tunas  paling  baik. Menurut  Gunawan  (1992),  terkadang  eksplan  dapat memiliki kemampuan tumbuh dan multiplikasi sel tanpa pemberian  auksin  ketika  telah  lama  dipelihara  dan disubkultur  beberapa  kali.  Kemungkinan  besar  dalam sel-sel  tersebut  telah  terjadi  peningkatan  level  auksin, sehingga  tidak  memerlukan  auksin  dari  luar.  Sel-sel demikian disebut sel-sel yang habituated.

## Pertumbuhan kalus
Respon  yang  diperlihatkan  pada  kultur  saninten lainnya ialah kemunculan kalus pada eksplan. Beberapa kultur pada semua perlakuan dapat memunculkan kalus pada  umur  8  MST,  kecuali  pada  media  tanpa  ZPT (kontrol). Pembentukan kalus tidak terjadi dalam media kontrol,  disebabkan  oleh  tidak  adanya  ZPT  auksin eksogen  pada  media,  sehingga  sel  tidak  terpacu  untuk membentuk kalus. Waktu awal munculnya kalus terjadi pada 10−14 HST hampir terjadi pada seluruh perlakuan. Pada  waktu  tersebut  diduga  eksplan  telah  merespon kerja  auksin  yang  ditambahkan  ke  dalam  media perlakuan.
Respon  eksplan  pada  media  kombinasi  sitokinin (BAP  0.5−1  mg/L)  dan  auksin  (IAA  0.1−0.2  mg/L) menghasilkan  persentase eksplan  berkalus yang fluktuatif,  sedangkan  penambahan  konsentrasi  IAA  0.1 menjadi  0.2  mg/L  menunjukkan  hasil  pertambahan persentase  eksplan  berkalus.  Sama  halnya  dengan produksi  tunas  dan  tinggi  tunas,  kombinasi  konsentrasi BAP  dan  IAA  dalam  penelitian  ini  belum  mencapai keseimbangan yang optimal untuk merangsang pembentukkan kalus. Penggunaan auksin secara tunggal lebih  memacu  pertumbuhan  kalus.  Hal  tersebut dikarenakan auksin memiliki peranan dalam menginduksi pembentukan kalus (Lesari 2011). Hingga akhir pengamatan, umumnya kalus yang terbentuk pada seluruh  perlakuan  (kecuali  kontrol)  belum  mampu berdiferensiasi  menjadi  tunas.  Diferensiasi  kalus  yang terjadi hanya membentuk organ berupa akar, yaitu pada satu eksplan dalam media WPM dengan IAA 0.1 mg/L.
Selama  fase  induksi  tunas,  terdapat  perubahan eksplan  berupa  kematian  tunas  dan  kontaminasi. Kematian  tunas  awalnya  disebabkan  oleh  munculnya metabolit  sekunder  dari  eksplan  berupa  zat  fenolik. Eksplan  tersebut  akhirnya  mengalami  kematian  pada umur  8  MST.  Zat  fenolik  ini  juga  yang  menyebabkan perubahan  warna  kalus  pada  eksplan  yang  semakin menghitam  ketika  kultur  semakin  lama  dalam  media. Kontaminasi  pada  beberapa  kultur  yang  steril  dapat
disebabkan  oleh  agen  kontaminan  yang  telah  bertahan di dalam jaringan  sampai  kondisi  yang  menguntungkan untuk  pertumbuhannya  (kontaminan  laten)  (Zulkarnain 2009) maupun akibat proses subkultur eksplan ke media induksi yang kurang teliti.
Keseimbangan konsentrasi ZPT sitokinin dan auksin yang  digunakan  belum  memperlihatkan  pertumbuhan tunas  yang  maksimal.  Menurut  Mesa et  al. (2002), konsentrasi  BAP  rendah  namun  mampu  menghasilkan pertumbuhan  tunas  dapat  dipilih  sebagai  konsentrasi yang diterapkan dalam perbanyakan tunas agar tercapai efektivitas dan efisiensi biaya.

## SIMPULAN DAN SARAN

## Simpulan
Kombinasi  ZPT  BAP  (0,  0.5,  1  mg/L)  dengan  IAA (0,  0.1,  0.2  mg/L)  belum  menghasilkan  pertumbuhan tunas yang optimal. Media WPM dengan BAP 0.5 mg/L mampu  menghasilkan  persentase  eksplan  bertunas, jumlah  tunas,  dan  pertambahan  tinggi  tunas  terbaik. Media WPM dengan IAA konsentrasi 0.1 dan 0.2 mg/L menghasilkan pertumbuhan eksplan ke arah pembentukan kalus.

## Saran
Perlu  dilakukan  pengkajian  lebih  lanjut  dalam penggunaan  BAP  0.5  mg/L  dengan  selang  konsentrasi IAA  yang  lebih  rendah  agar  didapatkan  keseimbangan penggunaan  ZPT  dalam  menghasilkan  pertumbuhan tunas yang maksimal.

## DAFTAR PUSTAKA
Ardiansyah R. 2015. Mikropropagasi tembesu ( Fagraea fragrans ROXB)  [tesis].  Bogor  (ID): Institut Pertanian Bogor.
Azwin, Siregar IZ, Supriyanto. 2006. Penggunaan BAP dan  TDZ  untuk  perbanyakan  tanman gaharu  ( Aquilaria  malaccensis Lamk.). Media Konservasi 11(3):98-104. Fitria  NF.  2015.  Stek  pucuk  saninten  ( Castanopsis argentea BLUME)  menggunakan  ZPT komersial  dan  jenis  media  tanam  yang berbeda  [skripsi].  Bogor  (ID):  Institut Pertanian Bogor.
Gunawan LW. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Bogor(ID): PAU IPB Pr. Harahap F, Poerwanto R, Suharsono, Suriani C, Rahayu S.  2014. In  vitro and  rooting  of mangosteen ( Garcinia mangostana L.) on medium  with  different  concentrations  of plant growth regulator. Hayati J Bioscience 21(4):151-158. Hendaryono  DPS,  Wijayani  A.  2012. Teknik  Kultur Jaringan:  Pengenalan  dan  Petunjuk Perbanyakan  Tanaman  Secara  Vegetatif- Modern . Yogyakarta (ID): Kanisius.
Herawan  T,  Putri  AI,  Ardhany  F,  Widowati  TB.  2014. Pertumbuhan  dan  perkembangan  kalus embriogenik Eucalyptus pellita menggunakan teknik embriogenesis somatik. Dalam Prosiding Seminar
Nasional  Benih  Unggul  untuk  Hutan Tanaman,  Restorasi  Ekosistem,  dan Antisipasi  Perubahan  Iklim, 2014  Nov 19-20,  Yogyakarta,  Indonesia.  Bogor (ID): SEAMEO BIOTROP. hlm 287-294.
Heriyanto NM, Sawitri R, Subandinata D. 2007. Kajian ekologi permudaan Saninten ( Castanopsis argentea (Bl)  A.DC.)  di  Taman  Nasional Gunung  Gede  Pangrango,  Jawa  Barat.
Buletin Plasma Nutfah 13 (1):34-42. Khairunisa  R.  2009.  Penggunaan  beberapa  jenis
sitokinin  terhadap  multiplikasi  tunas  dan pertumbuhan binahong ( Anredera cordifolia [Ten.] Steenis) [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Lestari  EG.  2008. Kultur  Jaringan:  Menjawab Persoalan  Pemenuhan  Kebutuhan  akan Peningkatan  Kualitas  Bibit  Unggul  dan Perbanyakan secara besar-besaran.
Bogor (ID): Penerbit Akademia.
Mansur  I.  2013. Teknik  Silvikultur  untuk  Reklamasi Lahan  Bekas  Tambang .  Bogor  (ID): SEAMEO BIOTROP.
Martawijaya A, Kartasujana I, Mandang Y, Prawira SA,
Kadir  K.  1989 .  Atlas  Kayu  Indonesia, Jilid II. Bogor (ID): Badan Penelitian dan Pengembangan  Kehutanan.  Departemen Kehutanan Bogor.
Mesa D, Romero A, Cruz AM. 2002. Study of differnet benzylaminopurine (BAP)  concentrations in  the in  vitro micropropagation  of Leucaena leucocephala cv Peru. Cuban J Agriscience 36(3):261-264.
Prihartini R. 2004. Pengaruh  posisi penanaman eksplan terhadap pertumbuhan tunas aksilar bambu  apus  ( Gigantochloa  apus (J.A  & J.H Schultes) Kurz) [skripsi]. Depok (ID):
Universitas Indonesia.
Sulistiani  E,  Yani  SA.  2012. Produksi  bibit  tanaman dengan menggunakan teknik kultur jaringan . Bogor (ID): SEAMEO
BIOTROP.
Wibowo C. 2006. Hubungan antara keberadaan saninten ( Castanopsis  argentea BLUME)  dengan beberapa  sifat  tanah:  kasus  di  Taman Nasional  Gunung  Gede  Pangrango,  Jawa Barat  [disertasi].  Bogor  (ID):  Institut Pertanian Bogor.
Yelnitis,  Joni  M.  Penggunaan  BA,  kinetin,  dan thidiazuron  dalam  pembentukan  tunas kulim  ( Scorodocarpus  borneensis Becc). Dalam Prosiding Seminar Nasional Biosains  2:  Penguatan  Biologi  sebagai Ilmu  Dasar  untuk  Menunjang  Kemajuan Sains  dan  Teknologi. 2015  Nov  19-20, Denpasar,  Indonesia.  Denpasar  (ID): Universitas Udayana. hlm 52-59. Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan: Solusi Perbanyakan Tanaman  Budidaya. Jakarta  (ID):  Bumi Aksara.