## KONSENTRASI HAMBATAN MINIMUM EKSTRAK Chlorella sp. TERHADAP BAKTERI DAN KAPANG*
Iriani Setyaningsih 1 , Desniar 2 dan Tresna Sriwardani 3

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk  mengekstrak  antimikroba intraseluler dari  mikroalga jenis Chlorella sp.  dan  menentukan  konsentrasi hambatan  minimumnya  pada  bakteri Salmonella typhi dan Escherichia  coli serta  kapang Aspergillus  niger dan Penicillium sp.  Tahapan  penelitian meliputi    kultivasi,  ekstraksi  antimikroba  dan  uji  aktivitasnya  terhadap  bakteri  dan  kapang  serta penentuan  konsentrasi  hambatan  minimum. Chlorella sp.  dikultur  dalam  medium  PHM,  yang dilengkapi  dengan  aerator  dan  lampu  neon  sebagai  sumber  cahaya.    Ekstraksi  antimikroba dilakukan terhadap sel biomassa yang dipanen pada hari ke-40.  Biomassa yang diperoleh sebesar 53,85  gram.      Konsentrasi  hambatan  minimum  dari  esktrak  intraseluler Chlorella sp.  dalam menhambat Salmonella typhi adalah 500 ppm dan potensi hambatan terhadap streptomycin sebesar 40  %,  konsentrasi  hambatan  minimum  ekstrak  terhapad E.  coli adalah  250  ppm  dan  potensi hambatan  terhadap  streptomycin  adalah  46,2  %.  Akan  tetapi  ekstrak  yang  dihasilkan  tidak  dapat menghambat  pertumbuhan  kapang Aspergillus  niger dan Penicillium sp.sampai  pada  konsentrasi 3000 ppm.
Key words : Bakteri, chlorella,  hambatan minimum.

## PENDAHULUAN
Mikroalga  merupakan  produsen  alami  dari  ekosistem perairan  yang  dapat menghasilkan  energi.    Selain  itu  mikroalga  juga  dapat  menghasilkan  metabolit yang  sangat  bermanfaat,  sehingga  keberadaannya  sebagai  organisme  hidup  yang berukuran mikroskopis sudah mulai banyak dikaji.  Pemanfaatan mikroalga pada saat ini sudah cukup berkembang, selain sebagai pakan alami dan makanan sehat, mikroalga  juga  memiliki  potensi  yang  dapat  menghasilkan  komponen  bioaktif untuk bahan farmasi, kedokteran, industri pangan dan sebagainya. Salah satu jenis mikroalga  yang  potensial  untuk  dikembangkan  adalah Chlorella sp.,  yang  mana telah diproduksi untuk pangan sehat sebagai sumber protein, vitamin, dan mineral. Selain  itu  juga      dapat  menghasilkan  komponen  bioaktif  untuk  bahan  farmasi, kedokteran, industri pangan dan sebagainya (Metting dan Pyne, 1986).
Salah  satu  jenis  komponen  aktif  dari Chlorella sp.  berupa  senyawa antibakteri  yang  merupakan  hasil  metabolit  sekunder.      Metabolit  sekunder merupakan  bahan  hasil  metabolisme  suatu organisme  yang  tidak  diperlukan  oleh
*Makalah telah disampaikan pada Seminar Persada pada tahun 2001
1 Staff Pengajar Departemen Teknologi Hasil Perairan FPIK IPB
2 Staff Pengajar Departemen Teknologi Hasil Perairan FPIK IPB 3 Alumni Departemen Teknologi Hasil Perairan FPIK IPB
organisme  tersebut  untuk  kelangsungan  hidupnya  (Bains,  1995).    Bahan antibakteri  tersebut  merupakan  campuran  asam  lemak  yang  disebut  chlorellin yang  memperlihatkan  aktivitas  antibakteri  dan  autotoksin.    Autotoksin  adalah bahan  yang dihasilkan oleh suatu organisme  yang bersifat toksik dan mempunyai efek menghambat pertumbuhannya sendiri (Metting dan Pyne, 1986).
Efektivitas senyawa antimikroba dapat dilihat pada pengujian antimikroba dengan  menentukan  konsentrasi  terkecil  agar  pertumbuhan  organisme  uji  dapat terhambat.    Pengujian  antimikroba  dengan  menentukan  konsentrasi  terkecil dilakukan  dengan  metode Minimum  Inhibitory  Concentration (MIC).      Metode MIC ini terdiri dari dua teknik, yaitu teknik tabung pengenceran dan teknik difusi agar (Middelbeek dan Drijver de Haas, 1992).
Kriteria  zat  ideal  yang  digunakan  sebagai  zat  antimikroba  adalah aktivitasnya  yang  cukup  luas,  tidak  bersifat  racun,  ekonomis,  sebaiknya  bersifat membunuh  daripada  hanya  menghambat  pertumbuhan  mikroba  (Pelczar  dan Chan,  1988).    Keadaan-keadaan  yang  dapat  mempengaruhi  kerja  antimikroba antara  lain  konsentrasi  antimikroba  yang  digunakan,  jumlah  mikroorganisme, suhu  dan  waktu  kontak,  spesies  atau  jenis  mikroorganisme,  keberadaan  bahan organik  dan  pH  (Frazier  dan  Wessthof,  1988).    Cara  kerja  zat  antimikroba  pada organisme, yaitu dengan merusak dinding sel, merubah permeabilitas dinding sel, merubah  molekul  protein  dan  asam  nukleat  serta  menghambat  sintesis  asam nukleat dan protein (Pelczar dan Chan, 1988)
Antimikroba  yang  dihasilkan oleh Chlorella termasuk  antimikroba  alami, yang  mempunyai  kelebihan  antara  lain  lebih  aman  penggunaannya,  kultivasi Chlorella sp  relatif  mudah,  tidak  membutuhkan  tempat  yang  luas,  tidak tergantung musim sehingga kontinuitasnya dapat terjaga.
Beberapa  hasil  penelitian  menyatakan  bahwa  komponen algisidal allelopatik yang  dihasilkan  oleh  mikroalga  mempunyai  fungsi  sebagai autoinhibitor.    Salah  satu  jenis  mikroalga  yang  menghasilkan  senyawa  aktif bersifat  autoinhibitor  adalah Chlorella  vulgaris .      Senyawa  tersebut  merupakan produk  metabolisme  sel  yang  disekresikan  dan  diakumulasi  ke  medium    yang mempunyai  efek  menghambat  pertumbuhan  mikroalga  sendiri  dalam  kultur sehingga  pertumbuhan  sel  mikroalga  menurun.    Pembentukan autoinhibitor
terjadi  karena  adanya  perubahan  kondisi  lingkungan  (kultur),  seperti  pH  dan konsentrasi  nutrient,  yang  menyebabkan  pembentukan  senyawa allelopatik (Metting  dan  Pyne,  1986). Allelopatik merupakan  gejala  kemampuan  tumbuhan mengeluarkan zat untuk mematikan tumbuhan atau tanaman penting di sekitarnya dalam mengamankan kelangsungan hidupnya
Penggunaan antimikroba ini diharapkan dapat menanggulangi  keberadaan mikroba  patogen  yang  sering  mengkontaminasi  bahan  pangan.    Akan  tetapi konsentrasi  terkecil  dalam  menghambat  atau  membunuh  mikroba  patogen  belum diketahui,  sehingga  perlu  dilakukan  penelitian  dalam  menentukan  konsentrasi hambatan  minimum  dari  ekstrak Chlorella sp.  terhadap  beberapa  mikroba patogen.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  mikroalga  air  tawar Chlorella sp.  Kultivasi dilakukan di laboratorium Mikrobiologi Hasil Perikanan, Departemen  Teknologi  Hasil  Perikanan,  FPIK-IPB.    Bakteri  yang  digunakan untuk  uji  aktivitas  hambatan  adalah Salmonella  typhi dan Escherichia  coli ,  serta kapang Aspergillus  niger dan Penicillium sp.    Bahan-bahan  lain  yang  digunakan meliputi  medium  PHM,    kloroform, Nutrient  agar , Potato  dextrose  agar , Dimethylsulfoxida , paper disc , streptomycin , dan kertas saring.
Alat-alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  meliputi  alat-alat  untuk kultivasi  mikroalga  (erlenmeyer,  aerator,  lampu  dan  sebagainya),  alat  untuk ekstraksi  antimikroba  ( sentrifus,  freezer,  refrigerator,  freeze  dryer dan sebagainya), alat-alat untuk uji aktivitas antimikroba, (cawan petri, tabung reaksi, pipet volumetrik, mikropipet, ruang laminar flow,  autoclaf dan sebagainya) serta alat-alat penunjang lainnya.

## Metode penelitian
Penelitian  ini  meliputi  beberapa  tahap  antara  lain  kultivasi,  ekstraksi  dan  uji aktivitas antimikroba.
1.  Kultivasi Chlorella sp
Chlorella sp. ditumbuhkan pada erlenmeyer 1000 ml  yang berisi medium PHM,  yang  dilengkapi  dengan  aerasi  dan  lampu  sebagai  sumber  cahaya. Kultivasi dilakukan pada suhu kamar.  Selanjutnya biakan dikultur pada skala lebih besar dengan menggunakan botol berkapasitas sekitar 20 liter.
2.  Ekstraksi senyawa antimikroba dari Chlorella sp.
Chlorella sp.  yang  akan  diekstrak  antimikrobanya  dipanen  pada  fase stasioner.  Hal ini sesuai dengan hasil  penelitian Trianti (1998), yaitu aktivitas bahan  antimikroba  dari  mikroalga Chlorella sp.  yang  paling  baik  terhadap bakteri  yang  diujikan  adalah  ekstrak Cholrella sp.  yang  dipanen  pada  fase tengah stasioner.  Metode ekstraksi bahan antimikroba dilakukan berdasarkan modifikasi  metode yang digunakan oleh Naviner et al . (1999).
Hasil  panen Chlorella sp  dipisahkan  dengan  menggunakan  sentrifus, kemudian disaring dengan kertas saring Whatman untuk memisahkan biomasa dan    supernatan.    Selanjutnya  biomasa  dikeringkan  dengan  menggunakan freeze  dryer ,  sehingga  diperoleh  biomasa Chlorella sp  kering.    Kemudian ditambah  dengan  kloroform  dengan  perbandingan  1:25  dan  dilanjutkan dengan sonikasi.  Supernatan yang diperoleh dihilangkan pelarutnya dan  hasil yang  diperoleh  merupakan  ekstrak  kasar  untuk  dilakukan  tahap  uji  aktivitas terhadap bakteri dan kapang.
3.  Uji aktivitas antimikroba
Pada  uji  aktivitas  ekstrak Chlorella sp.  terhadap  bakteri  digunakan medium Nutrient  agar ,    sedangkan  untuk  kapang  digunakan Potato  dextrose agar .    Sampel  yang  akan  diujikan  terlebih  dahulu  dilarutkan  dalam  DMSO.
Konsentrasi  ekstrak  antimikroba  yang  akan  diujikan  pada  bakteri  adalah  25, 50,  100,  250,  500  dan  700  ppm,  sedangkan  yang  akan  diujikan  pada  kapang adalah  2000,  2500  dan  3000  ppm.    Bakteri  yang  akan  dujikan  adalah Salmonella  typhi dan Escherichia  coli ,  sedangkan    jenis  kapang  yang  akan diujikan  adalah Aspergillus  niger dan Penicillium. Sebagai  kontrol  positif digunakan streptomycin .
Aktivitas  antimikroba berupa  antibakteri  dan  antifungi  ditentukan  dengan mengukur  diameter  hambatan  yang  terbentuk,  yaitu  daerah  bening  yang
terbentuk  di  sekitar  kertas  cakram  yang  telah  ditetesi  ekstrak.    Kemudian dicari  konsentrasi  terkecil  yang  masih  mempunyai  hambatan  sebagai konsentrasi  minimum  inhibisi  yang  mempunyai  kepekaan  terhadap  mikroba. Suatu  antimikroba  dikatakan  mempunyai  aktivitas  yang  tinggi  terhadap mikroba  apabila  nilai  konsentrasi  minimum  hambatannya  rendah  tetapi mempunyai daya hambat yang besar (Hayati, 1999).
Perhitungan  hasil  pengamatan  dilakukan  dengan  cara  mengukur  diameter hambatan  senyawa  yang  diperiksa  dibandingkan  dengan  diameter  hambatan senyawa standar pada konsentrasi yang sama (Sherley, 1998).
Diameter hambatan senyawa antimikroba Potensi   =  _________________________________________ x  100 % Diameter senyawa baku dengan konsentrasi sama

## HASIL DAN PEMBAHASAN
1.  Kultivasi mikroalga Chlorella sp.
Selama  kultivasi Chlorella sp.  menggunakan  suhu  ruangan  yang  berkisar antara (27–29) o C. Kondisi temperatur tersebut merupakan kisaran temperatur yang baik untuk pertumbuhan mikroalga termasuk Chlorella sp., karena untuk pertumbuhan  mikroalga  yang  optimal  digunakan  temperature  yang  berkisar antara (15-30) o C (De La Noue dan De Pauw, 1988).
Selama kultivasi 40 hari kepadatan sel Chlorella sp. meningkat dari 4,75  x  10 5 sel/ml  menjadi  1,52  x  10 7 sel/ml.    Hal  ini  menunjukkan  bahwa Chlorella sp.  mempunyai  kemampuan  dalam  melakukan  pembelahan  sel secara  aktif  pada  kondisi  yang  disediakan.    Warna  kultur  juga  berubah  dari hijau  muda  menjadi  hijau  tua,  yang  menunjukkan  bahwa  mikroalga melakukan aktivitasnya dalam mensintesa pigmen.
2.. Hasil ekstraksi antimikroba
Ekstraksi  merupakan  suatu  proses  penarikan  komponen  yang  diinginkan dari  suatu bahan.    Panen  mikroalga  dilakukan  pada  fase  stasioner,  yaitu pada umur kultur 40 hari.
Supernatan  dan  biomasa  dari  hasil  pemanenan  dipisahkan  dengan menggunakan  sentrifus.    Teknik  pemisahan  biomasa  dengan  menggunakan
sentrifus  merupakan  salah  satu  cara  pemisahan  yang  efisien,  karena  dapat memisahkan  biomasa  dengan  supernatannya  dengan  lebih  sempurna  dan waktu  yang relatif cepat.  Pada penelitian  ini ekstraksi antimikroba dilakukan pada  biomasa  sel Chlorella sp.    Hal  ini  sesuai  dengan  pernyataan  Stewart (1974) bahwa  mikroalga memiliki  suatu  substansi  organik  yang  berlimpah  di dalam  selnya  yang  disebut  metabolit  sekunder  yang  merupakan  jenis intraseluler.
Penggunaan  sonikasi dan  kloroform dalam penelitian  ini bertujuan untuk memecahkan sel sehingga bahan antimikroba yang diinginkan akan keluar dan komponen  tersebut  terikat  serta  larut  dalam  pelarut  organik  tersebut.    Berat basah  biomasa  yang  diperoleh  setelah  pemisahan  dengan  sentrifus  sebesar 53,65  gram,  setelah  dilakukan  pengeringan  menjadi  1,53  gram,  dan  ekstrak yang  dihasilkan  sebesar  0,59  gram.    Ekstrak  yang  diperoleh  merupakan ekstrak kasar yang belum mengalami tahap pemurnian.
3.   Hasil aktivitas ekstrak Chlorella sp. terhadap bakteri dan kapang
Aktivitas  antibakteri  ditentukan  dengan  mengukur  diameter  hambatan, yaitu  daerah  bening  di  sekitar  kertas  cakram.    Jika  diameter  hambatan  yang terbentuk  lebih  besar  atau  sama  dengan  6  mm,  maka  bahan  tersebut dikategorikan  memiliki  aktivitas  sebagai  antimikroba.    Tapi  bila  diameter hambatan  yang  terbentuk  lebih  kecil  dari  6  mm  atau  tidak  terbentuk  sama sekali maka bahan antimikroba tersebut dikategorikan tidak memiliki aktivitas sebagai antimikroba (Bell, 1984).
Ekstrak  yang  akan  diuji  dilarutkan  dalam  DMSO  sesuai  dengan konsentrasi  yang  ditentukan.    Nilai  diameter  hambatan  dan  potensi  hambatan sebagai  hasil  uji  aktivitas  ekstrak  intraseluler  terhadap  bakteri Salmonella typhi disajikan pada Tabel 1, sedangkan terhadap E. coli disajikan pada Tabel
2.
Tabel 1.   Hasil pengujian aktivitas ekstrak Chlorella sp. terhadap S. typhi.
Salmonella typhi A B C Konsentrasi ekstrak Chlorella (ppm) Diameter daerah hambatan (mm) Potensi hambatan (%) Diameter hambatan (mm) Potensi hambatan (%) 700 16 7 43.7 7 43,7 500 15 6 40 6 40 250 14 5 35,7 5 35.7 100 12 4 33,3 4 33,3 50 7 1 14,3 1 14,3 25 5 0 0 0 0 Keterangan :    A = streptomycin B dan C = ekstrak Chlorella sp. Sumber : Sriwardani (2000)
Hasil  uji  aktivitas  dari  ekstrak Chlorella sp.  menunjukkan  bahwa  ekstrak tersebut  dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri Salmonella  typhi .    Pada konsentrasi  700  ppm  memiliki  diameter  hambatan  ekstrak  dan  streptomycin berturut-turut  7  mm  dan  16  mm  dengan  potensi  hambatan  43,7  %,  pada konsentrasi  ekstrak  500  ppm  daerah  hambatannya  6  mm  dan  15  mm  dengan potensi  hambatan  sebesar  40  %.    Akan  tetapi  pada  konsentrasi  ekstrak  lebih rendah, daerah hambatannya lebih kecil dari 6 mm.
Berdasarkan hasil pengujian aktivitas ekstrak Chlorella sp. yang diperoleh dapat  dikatakan  bahwa  konsentrasi  hamabatan  minimum  ekstrak  tersebut adalah  500  ppm,  dan  konsentrasi  ekstrak  700  ppm  mempunyai  daya  hambat yang  relatif  sama  dengan  konsentrasi  streptomycin  50  ppm, dengan  diameter hambatan 7 mm.
Tabel 2.  Hasil pengujian aktivitas ekstrak Chlorella sp terhadap E. coli Escherichia coli A B C Konsentrasi ekstrak Chlorella (ppm) Diameter daerah hambatan (mm) Potensi hambatan (%) Diameter hambatan (mm) Potensi hambatan (%) 700 18 11 61,1 11 61,1 500 16 9 56.3 9 56.3 250 13 6 46,2 6 46,2 100 12 4 33,3 4 33,3 50 9 2 22,2 2 22,2 25 6 1 16,7 1 16,7 Sumber : Sriwardani (2000) Hasil  uji  aktivitas  ekstrak Chlorella sp  terhadap E.  coli menunjukkan bahwa  adanya  penghambatan  pertumbuhan  bakteri.    Aktivitas  hambatan terhadap E.coli terjadi pada konsentrasi ekstrak sebesar 700, 500 dan 250 ppm dengan  diameter  hambatan  11,  9  dan  6  mm  serta  potensi  hambatan  terhadap streptomycin  sebesar  61,1  %,  56,3  %  dan  46,2  %.    Berdasarkan  hasil  yang diperoleh dapat dikatakan bahwa konsentrasi hambatan minimum dari ekstrak Chlorella sp. terhadap E. coli adalah 250 ppm. Selain itu juga dapat dikatakan bahwa konsentrasi ekstrak sebesar 500 ppm mempunyai daya hambat relative sama  dengan  konsentrasi  streptomycin  50  ppm  dengan  diameter  hambatan  9 mm,  sedangkan  konsentrasi  ekstrak  250  ppm  relative  sama  dengan streptomycin 25 ppm dengan diameter hambatan 25 ppm
Hasil uji aktivitas ekstrak Chlorella sp terhadap kapang Aspergillus niger menunjukkan  bahwa  pada  konsentrasi  3000,  2500  dan  2000  ppm  tidak menghasilkan daerah  hambatan. Demikian  juga  hasil uji terhadap Penicillium sp  yang  menunjukkan  bahwa  ekstrak Chlorella sp.  tidak  dapat  menghambat pertumbuhan kapang tersebut pada konsentrasi ekstrak yang diuji.  Kecil hasil uji  aktivitas  ekstrak  tersebut  diduga  karena  ekstrak  yang  diperoleh  masih merupakan ekstrak kasar, sehingga kurang optimal hasilnya.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Ekstrak intraseluler kasar Chlorella sp. mempunyai aktivitas penghambatan  terhadap  bakteri Salmonella  typhi dan Escherichia  coli dengan konsentrasi  hambatan  minimum  masing-masing  500  ppm  dan  250  ppm  serta mempunyai  potensi  hambatan  terhadap  streptomycin  40  %  dan  46,2  %.   Ekstrak Chlorella sp.  yang  diperoleh  tidak  mempunyai  aktivitas  hambatan  terhadap kapang Aspergillus niger dan Penicillium sp.

## Saran
Hasil  uji  aktivitas  ekstrak Chlorella sp.  terhadap Salmonella  typhi dan E. coli masih belum optimal, karena masih merupakan ekstrak kasar, sehingga perlu dilakukan  pemurnian  agar  diperoleh  ekstrak  lebih  murni  dan  lebih  optimal aktivitasnya.    Selain  itu  juga  perlu  dilakukan  uji  aktivitas  pada  spektrum  bakteri yang lebih luas

## DAFTAR PUSTAKA
Bains W.  1995.  Biotechnology from A to Z.  Oxford University Press.  Oxford-
New York-Tokyo
Bell, SM.  1984.  Antibiotic sensitivity testing by CDS methods.  Dalam Clinical Microbiology  Up  date  Programme.    The  Prince  of  Wales  Hospital, Randwick, N.S.W.
De La Noue J dan De Pauw N.  1988.  The potential of microalgal biotechnology : A  review of  production  and  uses  of  microalgae.    Journal  of  Biotechnology Advances. Vol 6.  Pergemon Press. Britain
Hayati AP.  1999.   Sintesis dan uji aktivitas biologi antibiotic 3-hidroksipikolinil serin  oktil  ester  dan  turunannya.    [Tesis].    Magister  Sains  Ilmu  Kimia. Progran Pascasarjana.  Program studi Ilmu Kimia.  Universitas Indonesia.
Metting B dan Pyne JW  1986.  Biologically active compounds from microalgal.
Journal of Enzyme Microb. Tech.  Vol. 8.  Butterworth and Co Publish.
Middelbeek  EJ  dan  Drijver  JS  de  Haas.    1992.    In  vitro  cultivation  of microorganism.  Biotechnology by Opening Learning.  Open University and Thames Polytechnic.  Butterworth Heinemann.
Naviner M, Berge JP Durand P dan Lee  Bris  H.    1999.  Antibacterial activity of the  marine  diatom Skeletonema  costatum against  Aquacultural  pathogens. Aquaculture 174 (1999): 15-24
Pelczar  MJ  dan  Chan  ECS.    1986.    Dasar-dasar  Mikrobiologi  Jilid  1  dan  2. Penterjemah  Hadioetomo  RS,  Imas  T,  Tjitrosomo  SS  dan  Angka  SL.  UI Press.  Jakarta
Sherley. 1998.  Sintesis dan uji  aktivitas biologi  senyawa analog antibiotic  UK-3 (2-hidroksinikotinil-heksil-serin-ester  dan  turunannya).  [Tesis]  Magister Sains  Ilmu  Kimia.    Program  Pascasarjana.    Program  studi  Ilmu  Kimia.
Universitas Indonesia.
Stewart  DP.  1974.    Algal  Physiology  and  Biochemistry.    Blackwell  Scientific Published.  London
Trianti  R.    1998.    Ekstraksi  dan  uji  aktivitas  senyawa  antibakteri  dari  mikroalga Chlorella sp.  [Skripsi].  Program studi Teknologi Hasil Perikanan.  Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB.  Bogor.