## METODE DETEKSI CEPAT WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) DAN INFECTIUOS MYONECROSIS VIRUS (IMNV) MENGGUNAKAN PORTABEL / MOBILE POLYMERASE CHAIN REACTION
Isti Koesharyani *) dan Lila Gardenia **)
*) Pusat Penelitian Pengembangan Perikanan Budidaya Jl. Ragunan 20, Pasar Minggu, Jakarta Selatan 12540 E-mail: istisugama@yahoo.com
**) Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar Jl. Raya Sempur No. 1, Bogor 16154

## ABSTRAK
Budidaya udang Penaeus monodon dan Litopenaeus vannamei di Indonesia merupakan komoditas primadona untuk ekspor  dan  merupakan  salah  satu  spesies  unggulan  dalam  program  budidaya  pada  Kementerian  Kelautan  dan Perikanan. Kendala pada budidaya udang tersebut adalah penyakit yang disebabkan oleh infeksi virus, terutama white spot syndrome virus (WSSV) dan infectiuos myonecrosis virus (IMNV). Deteksi secara molekuler yang berbasis DNA merupakan metode deteksi sangat akurat dan tepat. Saat ini sudah ada metode deteksi PCR sederhana yang dapat diaplikasi langsung di lapangan, yaitu dengan menggunakan alat Portable-Polymerase Chain Reaction Pockit (iiPCR). Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan deteksi cepat WSSV dan IMNV pada udang P. monodon dan L. vannamei dengan menggunakan portabel-PCR. Aplikasi deteksi ini diujicobakan pada sampel udang yang diawetkan dan sudah diketahui kondisinya. Hasil analisis memperlihatkan hasil yang sesuai dengan hasil analisis sebelumnya dengan  menggunakan  PCR  konvensional.  Metode  ini  relatif  lebih  sederhana,  cepat  (hanya  memerlukan  waktu kurang dari 90 menit) dan dapat diketahui hasilnya tanpa adanya proses elektroforesis. Metode deteksi ini sangat membantu pembudidaya dalam monitoring penyakit di lapangan secara on the spot , serta cepat dan tepat.
KATA KUNCI: deteksi cepat, PCR, WSSV, IMNV, Penaeus monodon , dan Litopenaeus vannamei
ABSTRACT: Rapid detection white spot syndrome virus (WSSV) and infectiuos myonecrosis virus (IMNV) by using portable or mobile polymerase chain reaction. By: Isti Koesharyani and Lila Gardenia
Penaeus monodon and Litopenaeus vannamei culture in Indonesia are potential commodities for export, and high ranged species at the Ministry of Maritime Affairs and Fisheries program. Diseases is one constrain or obstacle on the shrimp culture, particularly infected by white spot syndrome virus (WSSV) and infectiuos myonecrosis virus (IMNV). Detection of diseases by DNA molecular-based is very accurate and precise for virus infection. Now, there is simple PCR detection method that can be applied directly in the field, using Portable Pockit-Polymerase Chain Reaction (iiPCR). The purpose of this study was to carry out rapid detection for shrimp viruses WSSV and IMNV infection by using portable PCR. This method was applied on preserved samples of shrimp that is already known of the health status. The test showed consistent results with the previous analysis using conventional PCR. This method was relatively simple, fast only took less than 90 minutes for shrimp health status and without the electrophoresis process as in conventional PCR. This method was very simply, fast and precise and can help for although un- educated farmers in terms for disease monitoring in the field directly.
KEYWORDS: rapid Test, PCR, WSSV, IMNV, Penaeus monodon , and Litopenaeus vannamei

## PENDAHULUAN
Budidaya  udang Penaeus  monodon dan Litopenaeus vannamei di  Indonesia  merupakan  komoditas  ekspor utama yang menjadi spesies unggulan dalam program industrialisasi  pada  Kementerian  Kelautan  dan Perikanan. Pada budidaya kedua jenis udang tersebut, infeksi white spot syndrome virus (WSSV) merupakan
ancaman  yang  telah  mengakibatkan  kerugian  yang sangat  besar  di  Asia  bahkan  di  dunia  (Huang et  al ., 1994; Nakano et al ., 1994; Koesharyani et al ., 2001) dan infectious  myonecrosis  virus  (IMNV)  yang  merupakan virus  baru,  yang  hanya  ada  di  Indonesia  dan  Brazil (Senapin et al ., 2007). WSSV dan IMNV sampai saat ini masih  sering  ditemukan  dan  menginfeksi  kedua  jenis
Metode deteksi cepat white spot syndrome virus (WSSV) dan infectiuos myonecrosis virus (IMNV) ..... (Isti Koesharyani)
udang tersebut sehingga sering terjadi kegagalan panen yang  pada  akhirnya  menimbulkan  kerugian  ekonomi yang tidak sedikit bagi para pembudidaya udang.
IMNV  merupakan  virus  yang  banyak  ditemukan menyerang  udang  putih L.  vannamei dan  penyakit  ini pertama  kali  ditemukan  di  Brazil  pada  tahun  1983 (Briggs et al ., 2004 dalam Senapin et al ., 2007). Infeksi IMNV  merupakan  penyakit  introduksi  yang  muncul hampir  bersamaan  waktunya  dengan  masuknya udang  putih  ke  Indonesia.  Kasus  infeksi  akibat  IMNV pertama  kali  ditemukan  dan  menginfeksi  udang L. vannamei di  Situbondo,  Jawa  Timur  pada  awal  tahun 2006,  kemudian  menyebar  ke  sentra-sentra  budidaya udang  vaname  di  Indonesia  (Senapin et  al .,  2007; Koesharyani et al ., 2012). Serangan IMNV diperkirakan mengakibatkan kerugian ekonomi sebesar $200 juta di Brazil  dan  $200  juta-$1  miliar  di  Indonesia  (Sunarto, 2011). IMNV merupakan RNA virus utas ganda (double- stranded), termasuk dalam family Totaviridae yang tidak beramplop  (non-enveloped),  berbentuk  icosahedral dengan  diameter  virion  40  nm  (Senapin et  al .,  2007). Sampai saat sekarang virus ini masih sering ditemukan pada sentra budidaya udang.
Sedangkan  infeksi  WSSV  yang  menjadi  kendala utama  dalam  budidaya  udang P.  monodon ini  sudah terjadi sejak tahun 1900-an dan hingga saat ini masih menjadi ancaman serius. Udang yang terinfeksi WSSV dapat  mengalami  kematian  massal  beberapa  hari setelah terjadinya infeksi (Kasornchandra et al ., 1998). Virus ini pertama kali ditemukan di Taiwan pada tahun 1992  (Chou et  al .,  1995)  dan  dalam  waktu  singkat menyebar  ke  Cina  hingga  Asia  termasuk  Indonesia. WSSV dapat cepat tersebar karena penularannya dapat terjadi  secara  horizontal  yaitu  dengan  mengonsumsi jaringan yang terinfeksi (kanibalisme dan predator) dan melalui air atau water borne infeksi (OIE, 2006).
Diagnosa  penyakit  atau  deteksi  kedua  jenis  virus ini  bisa  dilakukan  dengan  beberapa  teknik.  Metode yang sederhana dapat dilakukan menggunakan teknik histologi dengan pewarnaan H&E. Metode lain adalah dengan  metode  molekuler  yaitu Polymerase  Chain Reaction (PCR)  dan  Reverse  Transcriptase- Polymerase Chain  Reaction (RT-PCR)  dengan  teknik  yang  lebih cepat  dan  tepat  menggunakan  spesifik  primer.  Selain itu,  saat  ini  telah  tersedia  beberapa  kit  komersial yang  memudahkan  dalam  proses  pengerjaannya. Teknik terkini lainnya adalah Quantitative PCR (qPCR) ataupun  Quantitative  RT-PCR  (qRT-PCR)  yang  dapat mendeteksi  secara  kuantitatif  dan  sangat  akurat  di dalam mendeteksi adanya infeksi.
Deteksi  secara  molekuler  merupakan  metode deteksi  yang  sangat  sensitif  dan  spesifik,  namun prosedur  analisisnya  mulai  dari  ektraksi  DNA/RNA, amplifikasi dan elektroforesis harus dikerjakan secara aseptis  di  dalam  laboratorium  yang  terkontrol  dan memerlukan alat laboratorium yang khusus dan rumit. Tetapi dengan berkembangnya metode diagnosa, saat
ini telah ada teknik diagnosa berbasis molekuler yang dapat  dikerjakan  langsung  di  lapangan  “ on  the  spot ” menggunakan  Pockit  (iiPCR)  metode  ini  adalah  salah satu  teknik  deteksi  dengan  menggunakan  portable- PCR  ( Rapid  Test  on  the  spot ).  Teknik  ini  dapat  dengan mudah dikerjakan oleh petani di lapangan (tambak atau hatcheri)  dan  dapat  dikerjakan  di  luar  laboratorium dengan proses amplifikasi yang bersifat semi-kit tanpa proses  elektroforesis  dan  hasil  akhir  secara  kualitatif dapat dilihat langsung pada mesin amplifikasi. Tujuan penelitian  ini  untuk  mengaplikasikan  deteksi  cepat WSSV dan IMNV pada udang P. monodon dan L. vannamei dengan menggunakan portabel-PCR. Sehingga hasilnya dapat  langsung  dilihat  di  lapangan  untuk  selanjutnya dapat segera diambil tindakan.

## BAHAN DAN METODE

## Sampel Udang
Sampel udang P. monodon berasal dari Sidoarjo, Jawa Timur  yang  mengalami  kematian  massal  pada  tahun 2009 akibat terinfeksi virus yang ditandai dengan spot putih pada permukaan kulit udang. Sedangkan sampel L.  vannamei didapat  dari  tambak  udang  di  Lampung pada tahun 2011 yang juga mengalami kematian massal dengan tanda adanya otot badan yang memutih. Kedua jenis  udang  tersebut  masing-masing  disimpan  dalam larutan pengawet ethanol 90% untuk analisis WSSV dan larutan RNAlater® (Qiagen) untuk analisis IMNV yang akan digunakan sebagai bahan uji selanjutnya.

## Ekstraksi Asam Nukleat (DNA dan RNA)
Ekstraksi  asam  nukleat  menggunakan  Extraction Kit  (IQ  PlusTM  Extraction  Kit)  di  mana  alat  untuk ektraksi  secara  sederhana  seperti  sentrifugator, mikropiet,  dan  lain-lain,  serta  alat  amplifikasi  sudah tersedia dalam satu paket (Gambar 1). Ekstraksi asam nukleat berupa DNA dan RNA dilakukan dengan teknik spin  column  secara  bersamaan  (simultaneous),  asam nukleat  berupa  campuran  DNA  dan  RNA  selanjutnya digunakan dalam proses amplifikasi. Sampel organ bisa berupa pleopod (50 mg) atau 10 ekor untuk ukuran PL atau 20 mg hepatopancreas. Sampel dimasukan dalam mikrotube  1,5  mL  ditambahkan  500  µL  larutan-1 (larutan  lysis)  kemudian  dihancurkan  dengan  pestel. Setelah semua bahan uji lisis atau hancur ditambahkan 500  µL  larutan-2  (larutan  yang  mengadung  alkohol sebagai pengikat DNA/RNA) dan dicampurkan dengan baik dan diendapkan (spin) selama satu menit untuk memisahkan  protein  dan  asam  nukleat.  Sebanyak 500  µL  supernatan  yang  mengandung  asam  nukleat (DNA  dan  RNA)  dipindahkan  ke  dalam spin-column tube, kemudian diendapkan (spin) selama satu menit, lalu  cairan  yang  ada  di  dalam  tabung  penampung dibuang, sedangkan asam nukleat berada pada bagian dasar  spin  column.  Untuk  pembilasan  ditambahkan larutan-2  kembali  sebanyak  500  µL  pada spin- column , diendapkan selama 3 menit lalu larutan yang
tertampung  pada  tabung  dibuang.  Pindahkan spin- column (yang  mengandung  asam  nukleat  DNA  dan RNA) pada 1,5 mL tabung mikro baru dan tambahkan pelarut/elution  asam  nukleat  sebanyak  200  µL (untuk  sampel  jaringan)  dan  400  µL  (untuk  sampel hepatopankreas) kemudian diendapkan (spin) selama satu menit. Selanjutnya asam nukleat (DNA dan RNA) yang didapat, digunakan untuk amplifikasi WSSV dan IMNV.  Untuk  jumlah  sampel  tersebut  di  atas  akan menghasilkan konsentrasi DNA/RNA 10-100 ng/µL.

## Amplifikasi
WSSV  dan  IMNV  diamplifikasi  menggunakan  IQ PlusTM WSSV Kit dan IQ PlusTM IMNV Kit. Sebelumnya persiapkan  Premix  pack  (dalam  mikrotube)  yang mengandung  (dNTPs,  spesifik  primer  WSSV  dan  atau IMNV,  flourescent  probes  dan  enzim)  dalam  bentuk pelet  kering  kemudian  ditambahkan  50  µL  premix
buffer  sebagai  pelarut  premix  (larutan  yang  telah dilarutkan harus segera digunakan dalam waktu kurang dari satu jam) dan dilanjutkan pada proses berikutnya. Ambil  atau  tambahkan  1  loop  (loop  plastik  tersedia dalam kit) asam nukleat DNA/RNA uji ke dalam larutan premix  (Gambar.  2A).  Selanjutnya  semua  premix  dan DNA/RNA  uji  dipindahkan  ke  dalam  R-tube  (Gambar 2B  dan  2C),  kemudian  R-tube  diletakkan  pada  holder (Gambar  2D)  yang  telah  tersedia  dengan  posisi  baik dan benar dengan menggunakan sarung tangan, karena bagian bawah R-tube berupa tabung gelas optikal yang berpengaruh  dalam  proses  deteksi/membaca  dengan bantuan  flourescent.  Bagian  atas  R-tube  diberi  label kemudian  setelah  tertutup  dengan  baik,  rangkaian R-tube  dimasukkan  ke  dalam  mesin  Pockit.  Pada alat  dipilih  panjang  gelombang  520  nm  +  550  nm, selanjutnya mesin dijalankan dengan menekan tombol ” Run ” sesuai dengan petunjuk.
Gambar 1. Perlengkapan Pockit  Nucleic  Acid  Analyzer portabel-PCR  berupa  mesin  PCR,
mikro pipet dan alat spind down  (A & B), serta paket reagensia ekstraksi dan amplifikasi  (C  &  D)  yang  dikemas  dalam  satu  koper  kecil  yang  siap  dibawa untuk pengecekan virus udang di lapangan (E) Figure 1. Pockit Nucleic Acid Analyzer for portable-PCR, micro pipet and spind down (A & B), extract reagent and amplification (C & D) package in one case ready for checking virus (E)
A E C B D
Metode deteksi cepat white spot syndrome virus (WSSV) dan infectiuos myonecrosis virus (IMNV) ..... (Isti Koesharyani)

## HASIL DAN BAHASAN
Keberhasilan  budidaya  udang  ditentukan  oleh kualitas induk dan benih, deteksi dini adanya penyakit dan skrining induk dan benur sebelum tebar adalah hal yang sangat penting dan harus dilakukan. Hanya induk  sehat  bebas  virus  yang  dapat  menghasilkan benur  yang  berkualitas  dan  lebih  tahan  penyakit. Menurut Sritunyalucksana et al . (2006), metode yang paling  efektif  mencegah  kerugian  akibat  penyakit pada  udang  adalah  dengan  mencegah  masuknya patogen  ke  dalam  sistem  budidaya.  Pengawasan ketat  pada  prosedur-prosedur  tersebut  (deteksi dini, skrining induk,  dan  benur  sebelum  tebar), serta  ditambah  pencegahan  masuknya  hewan  yang menjadi “natural carrier” terbukti dapat mengurangi tingkat infeksi WSSV seperti yang berhasil dilakukan di Jepang.
Saat ini, metode deteksi dini dan skrining induk, serta benih yang banyak digunakan adalah Polymerase Chain Reaction /PCR (Lo et al ., 1998). Metode berbasis molekuler ini menjadi pilihan karena sangat sensitif dan  spesifik  untuk  mendeteksi  virus  penyebab penyakit pada udang. Kelebihan lain dari metode ini yaitu  dapat  menghasilkan  amplifikasi/perbanyakan produk target yang akurat, cepat, dan spesifik, serta
hanya  membutuhkan  jumlah  sampel  yang  sedikit. Namun metode ini juga memiliki kekurangan antara lain  mudah  terkontaminasi.  Selain  itu,  dikarenakan memerlukan  berbagai  macam  alat  dengan  ukuran yang cukup besar, maka sebagian besar tahap analisis sampel harus dilakukan di dalam laboratorium.
Pockit  Nucleic  Acid  Analyzer adalah  salah  satu teknik  deteksi  dengan  menggunakan  portable-PCR (Gambar  1)  yang  dapat  melakukan  analisis  secara langsung di lapangan ( Rapid Test on the spot ). Seluruh perlengkapan yang diperlukan sudah siap dalam satu koper kecil sehingga mudah dibawa kemana saja.
Setelah  proses  amplifikasi  (Gambar  2)  pada mesin Pockit  Nucleic  Acid  Analyzer ,  sampel  langsung dianalisis  dan  hasilnya  dapat  dilihat  pada  layar mesin.  Hasil  analisis  dapat  diperoleh  dalam  waktu yang  lebih  singkat  (sekitar  satu  jam  saja).  Proses analisis  sampel  dapat  menjadi  lebih  cepat  karena tidak  memerlukan  proses  elektroforesis.  Dengan demikian  kontaminasi akibat percikan aerosol  hasil buka/tutup  mikrotube  (yang  telah  mengandung banyak DNA hasil amplifikasi) dapat dihindari.
Hasil  analisis  WSSV  dan  IMNV  menggunakan portabel-PCR sesuai dengan hasil analisis kedua virus tersebut sebelumnya menggunakan PCR konvensional
Loop A C B D R-Tube
Gambar 2. Tahap  amplifikasi  pada  portabel-PCR  menggunakan  loop untuk  mengambil  template  DNA/RNA  sebesar  1  mikroliter (A), dipindahkan ke dalam R-tube/tabung R amplifikasi (B),
ditempatkan  pada  holder  dan  ditutup  dengan  baik  (C), selanjutnya posisi tabung pada holder dimasukan pada alat PCR
Figure 2.  Amplification  phase  at  portable-PCR  use  loop  for  DNA/RNA 1microliter template (A), R-tube amplification (B), place at closed holder (C), and position tube placing at PCR
(Tabel  1).  Walaupun  sampel  jaringan  yang  digunakan sudah cukup lama disimpan (> 1 tahun) namun terlihat kualitas DNA dan RNA hasil ekstraksi masih sangat baik. Hal ini disebabkan karena penyimpanan jaringan udang dalam  larutan  preservasi  ethanol  90%  untuk  sampel DNA  dan  RNA-later  untuk  sampel  RNA.  Penyimpanan sampel pada larutan yang tepat sangat memengaruhi kualitas DNA/RNA yang dihasilkan, di mana RNA later dapat menjaga kestabilan RNA dalam jaringan hingga satu  tahun  penyimpanan  (Novita et  al .,  2009).  Selain itu,  metode  Extraction  Kit  (IQ  PlusTM  Extraction Kit)  dengan  teknik  spin  column  menghasilkan  asam nukleat DNA dan RNA yang lebih bersih dan berkualitas tinggi.  Dengan  demikian  kemungkinan  terjadinya “false  negatif ”  akibat  kualitas  DNA/RNA  yang  buruk dapat  dihindari.  Teknik  ekstraksi  pada  kit  ini  dapat
mengekstraksi  DNA  dan  RNA  secara  bersamaan sehingga  menghemat  waktu  dan  hasil  analisis  dapat lebih cepat diperoleh.
Analisis  menggunakan  PCR  konvensional,  untuk pencegahan terjadinya false negatif dilakukan melalui pengecekan  kualitas  DNA/RNA  hasil  ekstraksi  sampel udang  menggunakan  primer  set  (143F  dan  145R). Pengecekan  tersebut  dilakukan  sebelum  DNA/RNA sampel tadi diamplifikasi menggunakan primer spesifik untuk virus yang diduga menginfeksi udang tersebut. Pasangan primer 143F dan 145R ini merupakan bagian urutan  18S  rRNA  dari  decapod  (Lo et  al .,  1996)  yang akan mengamplifikasi gen decapod sehingga menjadi indikator  baik/tidaknya  kualitas  DNA/RNA  hasil ekstraksi (internal kontrol).
Pengujian menggunakan Pockit Nucleic Acid Analyzer
Tabel 1.  Sampel udang dan hasil analisis WSSV dan IMNV menggunakan PCR konvensional dan portabel-PCR
Table 1.  Result of WSSV and IMNV analyzed with PCR conventional and portable-PCR
Gambar 3. Hasil  analisis  WSSV  pada  sampel  udang L.  vannamei (sampel  1-3  baris atas)  dan P.  monodon (sampel  4-6  baris  atas)  dengan  menggunakan portabel-PCR.  Sampel  7  baris  atas  merupakan  plasmid  positif  kontrol WSSV. Sedangkan baris bawah menunjukkan internal kontrol
Figure 3.  Result of WSSV analysis on shrimp samples L. vannamei (samples 1-3 top line) and P. monodon (samples 4-6 top line) by using PCR-portable. Sample 7 on top line indicates positive plasmid for WSSV control, while bottom line indicates control internal
pada mobile-PCR ini berdasarkan pada prinsip multiplex iiPCR untuk mendeteksi virus pada udang. Penambahan primer  spesifik  dan  probe  hidrolisis  berfluorescent digunakan  untuk  menghasilkan  sinyal  yang  akan berpendar pada saat berikatan dengan DNA virus yang terdapat  pada  sampel.  Primer  dan  probe  tersebut akan berikatan dengan virus target (pada urutan asam nukleat tertentu), namun tidak akan bereaksi dengan DNA genom udang dan asam nukleat dari patogen lain. Primer dan probe untuk internal kontrol akan berikatan dengan  gen  “house  keeping”  dari  udang  (IQ+  user manual, 2012).
Analisis dengan Pockit Nucleic Acid Analyzer portabel- PCR  tidak  memerlukan  tahapan  sebelum  amplifikasi untuk pengecekkan DNA/RNA hasil ekstraksi. Selain itu, kondisi  sampel  dan  kualitas  DNA/RNA  hasil  ekstraksi yang telah dilakukan dapat sekaligus langsung terllihat secara  kualitatif  pada  mesin.  Bagian  atas  merupakan hasil  pengukuran  pada  panjang  gelombang  520  nm yang menunjukan hasil analisis deteksi adanya infeksi virus,  sedangkan  pada  bagian  bawah  merupakan hasil  pengukuran  pada  panjang  gelombang  550  nm yang  menunjukkan  kualitas  DNA/RNA  yang  diekstrak sebagai  internal  kontrol  untuk  bahan  pengujian analisis deteksi (Gambar 3 dan 4). DNA/RNA yang baik harus menunjukkan tanda positif (+). Sebaliknya, bila kualitas  DNA/RNA  tidak  baik,  maka  akan  menunjukan tanda  negatif  (-)  yang  berarti  harus  melakukan tahapan  ekstraksi  ulang  DNA/RNA.  Indikator  tersebut dengan  mudah  terbaca  pada  layar  mesin  portabel- PCR  dan  menjadi  sangat  penting  untuk  mengurangi kemungkinan kesalahan analisis akibat “false negatif ” yang disebabkan kualitas DNA/RNA yang kurang baik.

## KESIMPULAN
Deteksi  cepat  menggunakan  portabel-PCR  ini sederhana,  cepat  dan  dapat  diketahui  hasilnya  tanpa adanya proses elektroforesis. Interpretasi hasil sangat mudah  dapat  dilihat  secara  langsung  pada  layar  di Mesin PCR dengan tanda positif dan negatif yang jelas, adanya  internal  kontrol  DNA/RNA  yang  menunjukkan kualitas  DNA/RNA  yang  diekstraksi  mengurangi kemungkinan  terjadinya  “false  negatif ”  pada  hasil analisis  sampel.  Penggunaan  portabel-PCR  sangat membantu pembudidaya dalam monitoring penyakit di lapangan secara cepat dan tepat tanpa menggunakan fasilitas laboratorium.

## DAFTAR ACUAN
Chou, H.Y., Huang, C.Y., Wang, C.H., Chiang, H.C., & Lo, C.F.  (1995).  Pathogenicity  of  baculovirus  infection causing  white-spot  syndrome  in  cultured  penaeid shrimp in Taiwan. Diseases of Aquatic Organisms , 23, 165-173.
Huang,  J.,  Song,  S.L.,  Yu,  J.,  &  Yang,  C.H.  (1994). Baculoviral  hypodermal  and  hematopoietic necrosis-patholgy of the shrimp explosive epidemic disease.  Yellow  Sea  Fishery  Research  Institute, Qingdao, PR, China (Abstract).
IQ  Plus TM WSSV  Kit  for  White  Spot  Syndrome  Virus Detection. (2012). User Manual.
Kasornchandra, J., Boonyaratpalin, S., & Itami, T. (1998). Detection  of  white-spot  syndrome  in  cultured penaeid  shrimp  in  Asia:  Microscopic  observation and  polymerase  chain  reaction. Aquaculture ,  164, 243-251.
Gambar 4. Hasil analisis IMNV pada sampel udang L. vannamei (sampel 1-3 baris atas)  dan P.  monodon (sampel  4-6  baris  atas)  dengan  menggunakan portabel-PCR. Sampel 7 baris atas merupakan plasmid positif kontrol WSSV. Sedangkan baris bawah menunjukkan internal kontrol
Figure 4.  Result of IMNV analysis on shrimp samples L. vannamei (samples 1-3 top line) and P. monodon (samples 4-6 top line) by using PCR-portable. Sample 7 on top line indicates positive plasmid for WSSV control, while bottom line indicates control internal
Koesharyani,  I.,  Gardenia,  L.,  &  Supriyadi,  H.  (2012). Multi  infeksi  pada  udang Litopenaeus  vannamei : Diagnosis  dengan Polymerase  Chain  Reaction (PCR) dan Reverse  Transcriptase-Polymerase  Chain  Reaction (RT-PCR). J. Ris. Akuakultur , 7(1), 73-84.
Koesharyani,  I.,  Roza,  D.,  Mahardika,  K.,  Johnny,  F., Zafran, & Yuasa, K. (2001). Manual for fish disease diagnosis-II  (Marine  fish  and  Crustacean  diseases in  Indonesia).  Gondol  Research  Institute  for Mariculture  and  Japan  International  Cooperation Agency. 49 p.
Nakano,  H.,  Koube,  H.,  Umezawa,  S.,  Momoyama,  K., Hiraoka, M., Inouye, K., & Oseko, N. (1994). Mass mortalities  of  cultured  kuruma  shrimp, Penaeus japonicus , in Japan in 1993: epizootiological survey and infecion trails. Fish Pathol ., 29, 135-139.
Lo, C.F., Leu, J.H., Ho, C.H., Chen, C.H., Peng, S.E., Chen, Y.T., Chou, C.M., Yeh, P.Y., Huang, C.J., & Kou, G.H. (1996).  Detection  of  bacolovirus  associated  with white  spot  syndrome (WSBV)  in  penaeid  shrimps unsing polymerase chain reaction. Diseases of Aquatic Organisms , 25, 133-141.
Lo,  C.F.,  Chang,  Y.S.,  Cheng,  C.T.,  &  Kou,  G.H.  (1998). PCR monitoring of cultured shrimp for white spot syndrome virus (WSSV) infection in growout ponds. In Flegel, T.W. (Ed.). Advances in shrimp biotechnology .
National  Center  for  Genetic  Engineering  and Biotechnology, Bangkok.
Novita,  H.,  Mufidah,  T.,  &  Koesharyani,  I.  (2009). Perbandingan penggunaan berbagai preservasi RNA jaringan  dengan  RNAlater,  alkohol  dan  alkohol- gliserol  untuk  deteksi  IMNV  dengan  PCR. J.  Ris. Akuakultur , 4(3), 377-383
OIE.  (2006).  Manual  of  diagnostic  test  for  aquatic animals.  Fifth  ed.  OIE,  Paris.  (http://www.oie.int/ eng/normes/fmanual).
Senapin,  S.,  Phewsaiya,  K.,  Briggs,  M.,  &  Flegel,  T.W.
(2007).  Outbreaks  of  infectious  myonecrosis virus  (IMNV)  in  Indonesia  confirmed  by  genome sequencing  and  use  of  an  alternative  RT-PCR detection method. Aquaculture , 266, 32-38.
Sritunyalucksana, K., Srisala, J., McColl, K., Nielsen, L., & Flegel, T.W. (2006). Comparison testing methods for white  spot  syndrome  virus (WSSV)  infections  in penaeid shrimp. Aquaculture , 255, 95-104.
Sunarto,  A.  (2011).  Current  status  and  problems  of infectious  myonecrosis  virus  (IMNV)  in  Pacific white shrimp ( Litopenaeus vannamei ) in Indonesia.
Paper presented in “ One Day Workshop on Prevention and Control of IMNV in Indonesia ”,  Jakarta,  14  July 2011.  Ministry  of  Marine  Affairs  and  Fisheries. Jakarta, 6 pp.