## Peningkatan Kualitas Post Thawing Spermatozoa Epididimis Sapi Dengan Suplementasi Catechin Sebagai Antioksidan Pada Pengencer
Semen
(Improvement Of Post Thawing Cow Epididymal Spermatozoa Quality By Catechine Supplementation As Antioxidant On Cement Dilution)
Agung B. 1 ,  Handang W. 1 , dan M. Mirandy P.S. 2
1 Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada
2 Pascasarjana Sain Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada E-mail :

## Abstrak
Kualitas spermatozoa post thawing menjadi faktor penting keberhasilan proses fertilisasi pada Inseminasi Buatan pada sapi. Keberhasilan fertlisasi akan  berpengaruh  kepada pregnancy rate. Salah satu  kematian sel  yang  diakibatkan  oleh Reaction Oxygen Species (ROS)  diduga dapat  merangsang kejadian apoptosis eksogenik yang akan mengurangi kualitas spermatozoa sehingga diperlukan satu zat yang dapat menekan ROS  sebagai  antioksidan.  Catechin  dikenal  sebagai  antioksidan  pada  sel  yang  mampu  mengurangi kematian  akibat  ROS,  sehingga  diharapkan  dapat  bekerja  pada  proses  pembekuan  maupun  thawing spermatozoa  yang  kemungkinan  mengakibatkan  kematian  sel.  Tujuan  penelitian  ini  untuk  mengetahui efek  penambahan catechin dari  ekstrak  teh  hijau  dengan  konsentrasi  0,05%,  0,1%  dan  0,15%    pada pengencer  Tris-kuning  telur  untuk  meningkatkan  kualitas  spermatozoa  epididimis  sapi  yang  dikoleksi secara in  vitro .  Metode  koleksi  spermatozoa  dilakukan  dengan  mencacah  epididimis  sapi  pada  Nacl fisiologis  ditambah  antibiotik.  Pengencer  Tris-Kuning  telur  dengan  konsentrasi catechin yang  berbeda ditambahkan  ke  dalam  spermatozoa.  Evaluasi  motilitas  dan  prosentase  hidup  dilakukan  secara mikroskopik. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa motilitas dan prosentase hidup pada pengencer catechin  0,05%  ,  0,1%  dan  0,15%  secara  berturut-turut  (7,5%;  27,25%  ),  (12,5%;  31,75%  )  dan  (20%; 41%)  mempunyai  angka  yang  lebih  tinggi  disbanding  kontrol  (5%;  26,5%)  pada  semua  konsentrasi. Kesimpulan  penelitian  adalah  penambahan catechin dari  ekstrak  teh  hijau  dengan  konsentrasi  0,05%, 0,1% dan 0,15%  pada pengencer Tris-kuning telur, mampu meningkatkan motilitas dan prosentase hidup spermatozoa epididimis sapi post thawing.
Kata Kunci : spermatozoa, epididimis sapi, antioksidan, catechin, post thawing

## Abstract
The  quality  of  post-thawing  spermatozoa  become  an  important  factor  in  the  success  of  the  process  of fertilization  artificial  insemination  in  cattle.  The  succesfull  of  fertlisation  will  infulence  the  pregnancy rate. One of the cell death caused by Oxygen Reaction Species (ROS) is considered to stimulate apoptosis exogenic factors will reduce the quality of sperm. In this object the  substance that can suppress is ROS as an antioxidant. Catechine are known as antioxidants in cells capable of reducing deaths from ROS, which is expected to occure on freezing and thawing of spermatozoa that may result in cell death. The purpose of  this  study  was  to  determine  the  effect  of  the  addition  of  catechine  from  green  tea  extract  with  a concentration  of  0.05%,  0.1%  and  0.15%  in  Tris-egg  yolk  diluents  to  improve  the  quality  of  bovine epididymal  spermatozoa  which  collected  in  vitro.  Collection  of  epididymis  spermatozoa  have  done  by media  on  physiological  NaCl  plus  antibiotics.  Tris-yolk  diluents  with  different  concentrations  of catechine  were    added  to  the  spermatozoa. Evaluation  of  motility  and  percentage  of  live  had performed  microscopically  at  the  laboratory  of  reproduction  technology.  The  results  of  this study were indicated that the motility and the percentage living on  media with catechin 0.05%, 0.1% and 0.15% respectively were  (7.5%, 27.25%), (12.5%; 31 , 75%) and (20%, 41%) had a higher rate than the  controls (5%, 26.5%) at all concentrations. The  conclusion  of this study is the addition of catechine from green tea extract with a concentration of 0.05%, 0.1% and 0.15% in Tris-egg  yolk  diluent,  is increasing the  motility and percentage  of live and  death  cattle post thawing of epididymal spermatozoa.
Key words : Spermatozoa, epididymal, antioxidant, catechine, post thawing

## Pendahuluan
Proses peningkatan populasi pada sapi perlu adanya  usaha  untuk  meningkatkan  kualitas  dan kuantitas  keturunan.  Pada  era  modern  ini  banyak
teknologi reproduksi yang diterapkan di masyarakat, salah  satunya  yaitu    Inseminasi  Buatan  (IB). Inseminasi  Buatan  merupakan  metode  untuk deposisi semen pada saluran reproduksi betina selain
dengan  kawin  alami  menggunakan  semen  beku ataupun semen cair  (Manafi, 2010).
Di  Indonesia,  sapi  merupakan  salah  satu komoditi  ternak  utama,  oleh  karena  itu  Inseminasi Buatan  (IB)  pada  sapi  banyak  diterapkan  untuk meningkatkan  produksi  ternak.  IB  pada  sapi memerlukan  semen  yang  berkualitas  baik  untuk mendapatkan  hasil  yang  maksimal,  oleh  karena  itu perlunya  inovasi  baru  untuk  meningkatkan  kualitas semen  dengan  penambahan  antioksidan.  Seperti semua  sel  yang  hidup  pada  kondisi  aerob,  sel spermatozoa  akan  menghasilkan Reactive  Oxygen Species (ROS), yang merupakan produk normal dari aktivitas metabolisme (Lamirande et al ., 1997).
Menurut  Moreira  da  Silva et  al (2010) Reactive Oxygen Species (ROS)
dapat mengakibatkan  kerusakan  sel  dan  kematian  sel spermatozoa.  Kejadian  kematian  sel  dapat  terjadi karena  nekrosis  maupun  karena  apoptosis.  Dua mekanisme  yang  menyebabkan  sel  mati.  ROS dispekulasikan dapat menyebabkan kejadian apoptosis.  Berbagai  proses  apoptosis  dapat  terjadi karena  faktor  eksogenik  dan  endogenik.pada  proses pembekuan dan thawing kemungkinan ada peristiwa apoptosis  atau  nekrosis  yang  terjadi  sebagai  suatu proses  alami  akibat  perubahan  suhu,  media    dan fisiologis. Catechine sebagai antioksidan diharapkan mampu  mengurangi  akibat  buruk  dari  ROS  tersebut sehingga  dapat  mengurangi  kematian  sel  yang diharapakan  dapat  meningkatkan  kualitas  hidup sperma  pos  thawing  (Sato et  al .,  2010  dan  Awoniyi et al ., 2012).
Viabilitas  dan  fertilitas  spermatozoa post thawing secara  umum  rendah  dibandingkan  dengan semen  cair  yang segar. Hal ini terjadi  karena  terjadi kerusakan  spermatozoa  selama  proses  pembekuan. Kerusakan  yang  terjadi  diakibatkan  oleh  adanya stress  osmosis,  kerusakan  secara  oksidatif, cold shock ,  dan  pembentukan  Kristal  es  (Rahman et  al ., 2012).
Teh  Hijau,  hasil  pemrosesan  dari  daun  teh ( Camelia sinensis ), mempunyai aktivitas antioksidan yang  kuat. Pholyphenol  utama pada teh  hijau antara lain  epicatechin  (EG),  epigallocatechin  (EGC), epicatechin  gallate  (ECG),  dan  epigallocatechin gallate  (EGCG)  (Raza  dan  John,  2008).  Senyawa Catechin  dapat  mengatasi adanya superoxide, radical hidroksil, radikal peroksil, dan radikal bebas. Selain itu catechin meningkatkan efek antioksidan dibandingkan dengan antioksidan lain, antara lain ɑ - tocopherol dan  vitamin  C  dan  E.  Kemampuan melawan  radikal  bebas  oleh  catechin  berhubungan dengan  struktur  kimia  dari  tiap  komponen  catechin, gallate  teresterifikasi  pada  posisi  3  cincin  C,  gugus catechol  (gugus  3,4-dihydroxyl)  pada  cincin  B,  dan
gugus  hidroksil  pada  posisi  5  dan  7  cincin  A. Catechin  juga  dapat  melindungi  sel  dari  proses peroksidasi  lemak  dan  deaminasi  DNA  yang diinduksi  oleh Oxidative  Stress (OS)  (Sutherland et al , 2006).
Penelitian  ini  dilakukan  bertujuan  untuk mengkaji efek penambahan catechin pada pengencer pada  metabolisme  spermatozoa  sebelum  dilakukan proses pembekuan. Harapan  dari penelitian ini  yaitu dengan adanya catechin  yang ada pada  ekstrak daun teh  hijau,  dapat  menghambat  dan  mencegah kerusakan  sel  spermatozoa  yang  diakibatkan  oleh ROS. Dengan berkurangnya kematian sel maka akan dapat  meningkatkan  kualitas  spermatozoa  dan tingkat  hidup  spermatozoa post  thawing .    Selain  itu diharapkan dapat meningkatkan kualitas spermatozoa,  baik  itu  dari  segi  motilitas  maupun tingkat hidup spermatozoa.
Pada  saat  ini,  pemanfaatan  spermatozoa epididimis baik segar  maupun  yang telah dibekukan untuk  teknologi  reproduksi  seperti  Inseminasi Buatan dan In Vitro Fertilization (IVF) sangat jarang dilakukan  dibandingkan  dengan  spermatozoa  hasil ejakulasi.  Menurut  Hafez  dan  Hafez  (2000), spermatozoa  yang  berasal  dari  kauda  epididimis telah  memiliki  kemampuan  membuahi  oosit  sama baiknya  dengan  spermatozoa  hasil  ejakulasi..  Saat ini  epididimis  sapi  jantan  yang  dipotong  kurang mendapat  perhatian  yang  lebih  dan  hanya  terbuang sia-sia.
Penelitian  ini  menggunakan  spermatozoa yang  berasal  dari  epididimis  sapi  yang  dipotong. Upaya  pengolahan  spermatozoa  yang  dikoleksi  dari epididimis dapat sebagai alternative untuk menyelamatkan  genetik  unggul  sapi  yang  sudah tidak  memungkinkan  lagi  dikoleksi  semennya dengan  metode-metode  seperti  vagina  buatan,  tidak memberikan  respon  terhadap  elektroejakulator,  dan massage .    Metode  ini  juga  akan  membantu  dalam upaya  menyelamatkan  plasma  nutfah  hewan  jantan genetik  unggul  yang  mati  mendadak  atau  karena dipotong karena faktor usia.
Penambahan  pengencer  sitrat  kuning  telur dan  tris  kuning  telur  dapat  menjadi  media pembekuan,  sehingga  semen  dapat  bertahan  cukup lama  (Bearden  dan  Fuquay.2004).  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  efek  penambahan catechin  dari  ekstrak  teh  hijau  dengan  konsentrasi 0,05%,  0,1%  dan  0,15%    pada  pengencer  Tris- kuning  telur  sebagai  antioksidan  untuk  mengurangi Reactive Oxygen Species (ROS).

## Materi dan Metode Materi
Pada  penelitian  ini  digunakan  kauda epididimis  yang  diambil  dari  testis  sapi.  Testis diperoleh  dari  sapi  yang  dipotong  di  Rumah Pemotongan  Hewan  (RPH)  Giwangan  Yogyakarta. Penelitian  untuk  evaluasi  secara  keseluruhan dilakukan  di  Rumah  Pemotongan  Hewan  (RPH) Giwangan Yogyakarta.
Bahan  yang  digunakan  adalah  kauda epididimis  sapi, PBS , Eosin-Negrosin , Aquabides , Cathecin ,  Pen-Strep,  Gliserol,  Asam  Sitrat,  Tris buffer-kuning telur, Fruktosa, dan NaCl Fisiologis.
Alat  yang  digunakan  adalah scalpel , blade , pinset  anatomis,  gunting,  cawan  petri, deck  glass , object  glass ,  Bunsen,  gelas  ukur,  labu  Erlenmeyer, pipet,  spuit, stirrer ,  nampan,  lampu,  etiket, gloves , tissue , mikroskop, dan kamera digital.

## Metode Koleksi dan penyimpanan testis
Pada penelitian ini digunakan 4 pasang testis sapi  yang  diperoleh setelah sapi tersebut  disembelih di  Rumah  Pemotongan  Hewan  Giwangan.  Setelah testis  dikoleksi  segera  dibawa  ke  ruang  evaluasi  di Rumah  Pemotongan  Hewan  Giwangan,  Yogyakarta sebelumnya  dicuci  menggunakan  larutan  NaCl fisiologis ditambah antibiotik.

## Koleksi dan evaluasi spermatozoa
Kauda  epididimis  dicacah  dengan scalple blade dan gunting di dalam sebuah cawan petri yang berisi Phosphate  Buffer  Saline (PBS).  Disiapkan pengencer  kontrol,  pengencer  0,05%  cathecin, pengencer  0,1%  cathecin,  dan  pengencer  0,15% cathecin.  Setelah  itu  melakukan  evaluasi  motilitas progresif  spermatozoa  dan  viabilitas  spermatozoa pada keempat kelompok spermatozoa.

## Pembuatan pengencer Tris-kuning telur
Pembuatan  pengencer  Tris-kuning  telur menggunakan  buffer  antibiotik  yang  berisi  Tris (hidroxymethyl)  aminomethan  3,87  gram,  Asam sitrat  2,17  gram,  fruktosa  1,56  gram,  Penisilin 500.000  IU,  Streptomisin  50  mg  dan  ditambah aquabides hingga volumenya mencapai 100 ml.
Bagian  putih  telur  dipisahkan,  kemudian dengan  menggunakan  spuit,  kuning  telur  diambil bagian  dalam  kuning  telur.  Bahan  pengencer  secara keseluruhan  yaitu  dengan  mencampur  secara homogen  antara  buffer  antibiotic  sebanyak  73,6 ml,kuning  telur  20  ml,  dan  gliserol  6,4  ml.  Pada bahan pengencer dengan kandungan cathecin 0,05%,
dibuat  dengan  mencampur  sebanyak  0,05  gram cathecin  dalam 100  ml bahan pengencer. Kemudian pada  pengencer  dengan  kandungan  cathecin  0,1% dibuat  dengan  mencampur  0,1  gram  cathecin  dalam 100  ml  bahan  pengencer,  sedangkan  untuk pengencer dengan kandungan cathecin 0,15% dibuat dengan  mencampur  0,15  gram  cathecin  dalam  100 ml bahan pengencer.

## Evaluasi spermatozoa
Pengamatan motilitas
spermatozoa dilakukan  dengan  meletakkan  semen  di  atas object glass dan  ditutup  dengan deck  glass kemudian diamati  di  bawah  mikroskop  dengan  perbesaran  40 kali.  Angka  yang  diberikan  berkisar  antara  0% sampai  100%  dengan  skala  5%  (Rizal et  al .2005). Pengecatan  spermatozoa  menggunakan  pewarna eosin  negrosin  dilakukan  dengan  meneteskan pewarna pada tepi object glass dan semen diteteskan di atas object glass tersebut dengan perbandingan 1 : 1  kemudian  diapus  dengan  ujung  object  glass  yang lain  dengan  sudut  kemiringan  45  dan  difiksasi  di atas  api  Bunsen.  Viabilitas  spermatozoa  diukur dengan  menghitung  jumlah  spermatozoa  hidup  dan spermatozoa  mati.  Spermatozoa  yang  berwarna merah  terhitung  mati  dan  spermatozoa  yang  tidak menyerap  warna  atau  sedikit  menyerap  warna terhitung  hidup.  Persentase  hidup  spermatozoa diambil  dari  100  spermatozoa  yang  terhitung  (Rizal et al .2005).

## Analisis Hasil
Data  yang  diperoleh  meliputi  motilitas,dan prosentase  hidup  mati  spermatozoa  pada  masing- masing  kelompok  pengencer.  Data  analisis  dengan metode  ANOVA.  Perbedaan  antar  perlakuan  diuji dengan uji signifikansi (P<0,05).

## Hasil dan Pembahasan Hasil
Pada Tabel 1. diketahui bahwa motilitas dan prosentase  hidup  pada  pengencer  yang  diberi catechin berbagai  konsentrasi    tidak  mempunyai perbedaan  yang  signifikan  (P>0,05),  dibandingkan dengan  motilitas  dan prosentase hidup pada  kontrol. Rerata  motilitas  pada  pengencer  kontrol  sebesar 5,00%;  pengencer catechin 0,05%  sebesar  7,50%; pengencer catechin 0,1%  sebesar  12,5%;  dan pengencer catechin 0,15%  sebesar  20,00%.  Rerata prosentase  hidup  ada  pengencer  kontrol  sebesar 26,50%; pengencer catechin 0,05% sebesar 27,25%; pengencer catechin 0,1%  sebesar  31,75%;  dan pengencer catechin 0,15% sebesar 41,00%.
Tabel  1.  Prosentase  kualitas  spermatozoa  epididimis  sapi  dengan  penambahan catechin berbagai konsentrasi pada pengencer.

## Pembahasan
Peningkatan  kualitas    ini  ditunjukkan dengan  motilitas  spermatozoa  pada  pengencer kontrol sebesar 5,00%; pengencer catechin 0,05% sebesar  7,50%;  pengencer catechin 0,1%  sebesar 12,5%;  dan  pengencer catechin 0,15%  sebesar 20,00%. Lebih jelas terlihat pada Gambar 1 dalam grafik  motilitas  dan  presentase  hidup  mati spermatozoa post thawing.
Penelitian  ini  sesuai  dengan  pendapat sebelumnya  yang  menyatakan  bahwa  motilitas spermatozoa  bergantung  pada  suplai  energy berupa  ATP  hasil  metabolism.  Metebolisme  akan berlangsung  baik  jika  membrane  sel  dalam keadaan  utuh.  Sel  yang  rusak  dapat  dikurangi dengan  adanya  antioksidant  tersebut.  Hasil sampingan metabolisme spermatoza dapat menghasilkan Reactive  Oxygen  Species (ROS). Reactive Oxygen Species (ROS) dapat
mengakibatkan  kerusakan  sel  dan  kematian  sel spermatozoa (Lamirande et 2007).
Menurut  Sutherland et  al (2006),  Proses pembentukan Reactive  Oxygen  Species (ROS) dapat  ditekan  dengan  zat  aktif  yang  bernama catechin .  Senyawa  Catechin  dapat  mengatasi adanya superoxide, radical hidroksil, radikal
peroksil,  dan  radikal  bebas.  Selain  itu  catechin meningkatkan  efek  antioksidan  dibandingkan dengan  antioksidan  lain.  Pada  penelitian  ini, dilihat  dari  rerata  motilitas  dan  prosentase  hidup mati spermatozoa, penambahan catechin cenderung  meningkatkan  motilitas dan prosentase hidup  spermatozoa.  Gambar  1  menunjukkan bahwa  motilitas  dan  persentase  hidup  pada spermatozoa dengan  pengencer catechin (0,15% ;
20%;  41%),  rerata  lebih  tinggi  dibandingkan dengan kontrol (5%; 26,5%). Hal ini dapat terjadi karena catechin mampu mencegah dan menghambat  serangan  oksidatif  pada  membrane sel  .  Sehingga  kematian  sel  dapat  dicegah,  dan membrane  sel  tidak  rusak  dan  dapat  berfungsi dalam  mengatur  lalu  lintas  masuk  dan  keluar seluruh  substrat  dan  elektrolit  yang  dibutuhkan dalam  proses  metabolism.  Gugus  hidroksi  dari senyawa catechin bertindak  sebagai  antioksidan yang  mampu  mengurangi  produksi Reactive Oxygen Species (ROS) (Armoskaite, 2011).
Dari  hasil  penelitian  ini  diketahui  bahwa penambahan Catechin dari  ektrak  teh  hijau dengan  konsentrasi  0,05%,  0,1%  dan  0,15% meningkatkan motilitas dan prosentase hidup mati spermatozoa epididimis sapi secara absolut.
Gambar 1. Motilitas dan persentase hidup spermatozoa dengan berbagai pengencer catechin
Pengencer Motilitas (%) Hidup (%) Kontrol 5,00 26,50 Catechin 0,05% 7,50 27,25 Catechin 0,1% 12,50 31,75 Catechin 0,15% 20,00 41,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Kontrol Pengencer Catechin 0,05% Pengencer Catechin 0,1%
Pengencer Catechin 0,15%
Ku al it as S pe rm at oz oa ( % ) Motilitas Hidup

## Kesimpulan
Pemberian Catechin dari  ektrak  teh  hijau dengan  konsentrasi  0,05%,  0,1%  dan  0,15% mampu  meningkatkan  motilitas  dan  prosentase hidup  mati  spermatozoa  epididimis  sapi  secara absolut. Catechine secara efektif kemungkinan dapat mengurangi  kematian  sel  karena  ROS  sehingga dapat  mengoptimalkan  proses  metabolism  post thawing dari spermatozoa.

## Ucapan Terimakasih
Pada kesempatan ini kami ucapkan terimakasih  kepada  Bidang  Peternakan  Propinsi Daerah  Istimewa  Yogyakarta  atas  bantuan  fasilitas, perlengkapan  dan  tenaga  selama  penelitian  ini. Kepada  seluruh  anggota  tim  penelitian  dari  FKH UGM  atas  kerja  keras  dan  kerjasama  yang  baik sehinga  dapat  diselesaikannya  penelitian  ini  dan semua  pihak  yang  tidak  dapat  saya  sebutkan  satu persatu  yang  telah  mendukung  lancarnya  penelitian ini.
Daftar Pustaka Armoskaite,V., Ramanauskiene,K., Maruska,A., Razukas,A., Dagilyte,A., Baranauskas,A.,dan Breidis,V.2011. The analysis  of  quality  and  antioxidant  activity of  green  teaextracts. Journal  of  medicinal Plants Research.Vol %(5) : pp 811-816.
Awoniyi  DO,  Aboua  YG,  Marnewick  J,  Brooks  N.
2012 The  effects  of  rooibos  (Aspalathus linearis),  green  tea  (Camellia  sinensis)  and commercial rooibos and green tea supplements  on  epididymal  sperm  in oxidative  and  Wellness  Sciences .  Cape Peninsula University of Technology,
Bellville  7535,  South  Africa.  stress-induced rats.  Department  of  Biomedical  Sciences, Faculty  of  Health Phytother  Res. 2012 Aug;26(8):1231-9. doi: 10.1002/ptr.3717. Bearden,  J.H.  dan  Fuquay,  J.W.  2004. Applied
Animal  Reproduction,  6 th edition .  Prentice Hall,New Jersey.
Hafez,  E.S.E.  dan  B.  Hafez.  2000. Reproduction  in Farm  Animal,  7 th edition .  Baltimore  : Lippicott Williams and Wilkins. Sato,  K., Sueoka,  K.,  Tanigaki,  R.,  Tajima,  H., Nakabayashi, A., Yoshimura, Y. dan Hosoi, Y.  2010. Green  tea  extracts  attenuate doxorubicin-induced spermatogenic disorders  in  conjunction  with  higher telomerase activity in mice. J Assist Reprod Genet.; 27(8): 501–508.
Lamirande,de,E.,  Hong,  J.,  Zini,  A.,  Kodama,  H., dan  Gagnon,  C.  1997. Reactive  Oxygen Species  and  Sperm  Physiology. Reviews  of Reproduction. Vol 2 :48-54. Manafi,M.2010. Artificial  Insemination  in  Farm Animals . Intech : India
Rahman, H.J., Ahmad, N., Rahman, N., Waheed, S., Ahmad,  M.,  Younis,  M.,  dan  Ahmad,  T. 2012. Effect  of  Different  Levels  of  Pigeon Egg  Yolk  in  Extenders  on  the  Post-Thaw Semen Quality of Sahiwal Bulls . Pak.Vet .J. 32 (2) : 315-318. Raza, H. dan John,  A. 2008. In Vitro Effects  of  Tea Polphenols  on  Redox  Metablism,  Oxidative Stress,  and  Apoptosis  in  PC12  Cells. Ann.N.Y.Acad.Sci . 1138 : 358-365
Rizal,  M.,  Toelihere,  M.R.,  Tuty,  L.,  Yusuf, Purwantara,  B.,  Situmorang,  P.Z.  2005. Pengaruh  Waktu  Penyimpanan  Epididymis pada Suhu 5°C terhadap Kualitas
Spermatozoa  Epididymis  Domba  Garut . Jvet. 5:3.
Sutherland,  B.A.,  Rahman,  R.M.A.,  Appleton,  I.
2006. Mechanisms  of  Action  of  Green  Tea Catechins,  with  a  Focus  on  Ischemia- induced  Neurodegeneration .  Journal  of Nutritional Biochemistry.17:291-306. Vilakazi, D.M. 2003. Factor affecting the quality of semen  of  A.I.  dairy  bulls  in  South  Africa . Faculty of Natural and Agricultural Sciences University of Pretoria.South Africa.