Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Etanol Limbah Ketapang ( Terminalia catappa ) dengan Metode DPPH
Hafifah Jasman a) *, Ayu Rahmawati a) , M. Azhari Herli a)
a) Program Studi Farmasi, Fakultas MIPA dan Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Riau, Pekanbaru, Indonesia
Ketapang  ( Terminalia  catappa )  diketahui  mengandung  flavonoid  yang  dapat  menangkal  radikal  bebas  karena adanya gugus kromofor (ikatan rangkap terkonjugasi). Flavonoid dapat mendonorkan atom hidrogen kepada radikal bebas sehingga mengubah radikal ke bentuk yang lebih stabil . Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi etanol limbah ketapang ( Terminalia catappa ) yang diperoleh dengan metode maserasi  menggunakan  pelarut  etanol  96%.  Aktivitas  antioksidan  fraksi  etil  asetat  dan  fraksi  etanol  limbah ketapang ( Terminalia catappa ) ditentukan dengan mengukur % inhibisi dan nilai IC 50 ( inhibitory concentration 50%) menggunakan spektrofotometer UV Vis. Hasil penelitian menunjukkan fraksi etil asetat limbah ketapang ( Terminalia catappa )  tidak  memiliki  aktivitas  antioksidan  dengan  nilai  IC 50 -28,521  ppm,  sedangkan  fraksi  etanol  limbah ketapang  ( Terminalia  catappa )  memiliki  aktivitas  antioksidan  kuat  dengan  nilai  IC 50 32,53  ppm.  Pembanding kuersetin memiliki aktivitas antioksidan kuat dengan nilai IC 50 17,68 ppm.
Kata Kunci: limbah ketapang, fraksi etil asetat, fraksi etanol, aktivitas antioksidan
Antioxidant Activity of Ethyl Acetate Fraction and Ethanol Fraction of Ketapang Waste ( Terminalia catappa ) using the DPPH Method
Ketapang ( Terminalia catappa ) is known to contain flavonoids which can ward off free radicals due to the presence of chromophore groups (conjugated double bonds). Flavonoids can donate hydrogen atoms to free radicals so that they change the radicals to a more stable form. This study aims to determine the antioxidant activity of ethyl acetate fraction and ethanol fraction of ketapang waste ( Terminalia catappa ) obtained by maceration method using ethanol 96%  solvent.  The  antioxidant  activity  of  the  ethyl  acetate  fraction  and  the  ethanol  fraction  of  ketapang  waste ( Terminalia catappa ) was determined  by measuring the  %  inhibition and  the IC 50 (inhibitory concentration 50%) value  using  a  UV  Vis  spectrophotometer.  The  results  showed  that  the  ethyl  acetate  fraction  of  ketapang  waste ( Terminalia catappa ) did not have antioxidant activity with a value of IC 50 -28.521 ppm. While the ethanol fraction of ketapang waste ( Terminalia catappa ) had strong antioxidant activity with a value of IC 50 32.53 ppm. Quercetin comparators had strong antioxidant activity with a value of IC 50 17.68 ppm.
Keywords: Ketapang waste, ethyl acetate fraction, ethanol fraction, antioxidant activity
*Corresponding author : Program Studi Farmasi Fakultas MIPA dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Riau, Jl. Tuanku Tambusai Kota Pekanbaru, e-mail : hafifahjasman@umri.ac.id

## PENDAHULUAN
Secara  normal  setiap  sel  (jaringan)  tubuh manusia  menjalankan  metabolisme  yang  akan menghasilkan  oksigen  reaktif  (oksidan).  Oksidan disebut  juga  radikal  bebas  (Yuslianti,  2018). Tubuh  manusia  secara  alami  memiliki  sistem pertahanan  terhadap  radikal  bebas,  yakni antioksidan  dari  dalam  tubuh  atau  yang  disebut radikal bebas endogenus. Antioksidan endogenus terdiri dari enzim yang dapat disintesis oleh tubuh seperti  katalase,  glutation  peroksidase,  dan superoksida dismutase (SOD)(Astuti, 2012).
Di  Indonesia  banyak  tanaman  yang  sering dimanfaatkan  oleh  masyarakat,  baik  sebagai pangan  maupun  sebagai  obat.  Akan  tetapi  untuk limbah  tanaman  masih  jarang  (Rahayu et  al. , 2015).  Salah  satu  contohnya  adalah  limbah ketapang yang dapat dijumpai di tepi jalan sebagai pohon peneduh. Daun ketapang yang berguguran sering  dimanfaatkan  oleh  pecinta  ikan  cupang untuk  meningkatkan  mutu  ikan  cupang  dan mengobati  ikan  cupang  dari  berbagai  penyakit. Masyarakat  terkadang  tidak  menyadari  bahwa limbah  daun  ketapang  juga  dapat  dimanfaatkan sebagai obat untuk menyembuhkan penyakit dan pemelihara kesehatan yang bernilai ekonomis.
Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa  daun  ketapang  mengandung  alkaloid, flavonoid, saponin, fenol, dan terpenoid (Katiki et al. ,  2017).  Daun  ketapang  memiliki  aktivitas sebagai antioksidan (Anand et al. , 2015), antivirus (Amalraj & Gopi, 2017), antinflamasi (Coulibaly et al. , 2014),
antimikroba, hepatoprotektor (Kinoshita et al. , 2007), antibakteri dan antifungi (Machado-Gonçalves et al. , 2018).
Berdasarkan  uraian  di  atas,  maka  peneliti melakukan  uji  aktivitas  antioksidan  dari  fraksi etanol  dan  fraksi  etil  asetat  limbah  ketapang ( Terminalia  catappa )  berdasarkan  aktivitas pengikatan terhadap DPPH. Antioksidan merupakan  zat  yang  dapat  mencegah  atau menunda  terjadinya  reaksi  radikal  bebas  dalam oksidasi lemak (Ahmad et al. , 2012). Radikal bebas adalah  atom  atau  gugus  atom  yang  memiliki elektron tak berpasangan sehingga bersifat reaktif. Radikal bebas dapat terus- menerus terbentuk di dalam  tubuh  manusia,  jika  jumlahnya  sangat banyak dapat berpotensi mengoksidasikan lemak, menonaktifkan  berbagai  enzim  dan  mengganggu DNA  sehingga  menyebabkan  mutasi  sel  yang dapat  menimbulkan  kanker  (Sari et  al. ,  2015). Hasil  dari  penelitian  ini  diharapkan  dapat menambah  informasi  ilmiah  di  bidang  farmasi dalam  upaya  pemanfaatan  senyawa  antioksidan dari limbah ketapang.

## METODE PENELITIAN
A. Pengambilan dan pengolahan sampel Limbah  ketapang  ( Terminalia  catappa ) diperoleh  dari  jalan  di  Kota  Pekanbaru. Determinasi tumbuhan uji dilakukan di Laboratorium  Biologi  Universitas  Muhammadi- yah  Riau.  Pengolahan  tumbuhan  meliputi  sortasi
basah, pencucian, pengeringan, sortasi kering dan penggilingan menjadi serbuk simplisia.

## A.1. Pembuatan ekstrak limbah ketapang
Serbuk  simplisia  ditimbang  sebanyak  600 mg, diekstraksi dengan metode maserasi sebanyak 1000 ml menggunakan etanol 96%. Selama 6 jam pertama  sampel  sekali-kali  diaduk,  kemudian didiamkan  selama  3  hari.  Maserat  dipisahkan dengan kertas saring. Proses penyarian dilakukan sebanyak  tiga  kali  dengan  menggunakan  etanol 96%.  Maserat  yang  diperoleh  dipekatkan  pada tekanan rendah dengan suhu 45-50 ℃ menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental.

## A.2.Fraksinasi limbah ketapang
Fraksinasi  terhadap  ekstrak  kental etanol dilakukan  berdasarkan  perbedaan  kepolaran pelarut organik. Ekstrak etanol (20  g) dilarutkan dalam    pelarut    etanol  70%  sebanyak  50  ml, difraksinasi  dengan    pelarut  etil  asetat  (50  ml) dengan  menggunakan  corong  pisah  sehingga diperoleh 2 fase, yaitu  fraksi  etil asetat  dan fraksi etanol.  Hasil  fraksinasi  diuapkan  dengan rotary evaporator dengan suhu 45-50 ℃ dan didapatkan fraksi  etil  asetat  kental  dan  fraksi  etanol  kental limbah ketapang  (Iwansyah et al. , 2017).

## B. Uji aktivitas antioksidan

## B.1. Pembuatan larutan DPPH
Pembuatan  larutan  DPPH  (1,1-diphenyl-2- picryl  hydrazyl)  50  ppm  dilakukan  dengan  cara menimbang  DPPH  sebanyak  5  mg  kemudian dilarutkan  dengan  100  ml  etanol  96  %  (Brand- Williams et al. , 1995).

## B.2. Pembuatan larutan stok sampel
Larutan  stok  sampel  500  ppm  dibuat dengan  cara  menimbang  fraksi  etil  asetat  dan fraksi  etanol  limbah  ketapang  ( Terminalia catappa )  sebanyak  5  mg  dan  dilarutkan  dengan etanol 96 % lalu dicukupkan volumenya hingga 10 ml.  Variasi  konsentrasi  dibuat  10  ppm,  50  ppm, 100 ppm, 150 ppm dan 200 ppm (Brand-Williams et al. , 1995).

## B.3.  Pembuatan  larutan  pembanding
Larutan pembanding dibuat 100 ppm dengan cara menimbang  sebanyak  1  mg  kuersetin,  kemudian dilarutkan  dengan  etanol  96%  dicukupkan volumenya  hingga  10  ml.  Dibuat  variasi konsentrasi 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm dan 10 ppm (Brand-Williams et al. , 1995).

## B.4. Pengukuran daya antioksidan blanko
Pengujian dilakukan dengan memipet 4 ml DPPH, divorteks dan diinkubasi suhu 37 ° C dalam ruangan  gelap.  Absorbansi  larutan  diukur  pada panjang gelombang 517 nm (Brand-Williams et al. , 1995).
B.5.  Pengukuran  daya  antioksidan  fraksi etil  asetat  dan  fraksi  etanol  limbah ketapang
Pengujian dilakukan dengan mengambil 0,5 ml larutan fraksi etil asetat dan fraksi etanol dari berbagai  konsentrasi  (10  ppm,  50  ppm,  100  ppm dan  150  ppm  dan  200  ppm).  Kemudian  masing- masing ditambahkan 3,5 ml DPPH, divorteks dan diinkubasi  suhu  37 ⁰ C  dalam  ruangan  gelap. Absorbansi  diukur  pada  panjang  gelombang  517 nm (Brand-Williams et al. , 1995).
B.6.
Pengukuran daya antioksidan pembanding kuersetin
Uji  dilakukan  dengan  mengambil  0,5  ml kuersetin dari berbagai konsentrasi yaitu 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, dan 10 ppm. Masing-masing ditambahkan  3,5  ml  DPPH,  divorteks  dan diinkubasi  suhu  37 ⁰ C  dalam  ruangan  gelap. Absorbansi  diukur  pada  panjang  gelombang  517 nm (Brand-Williams et al. , 1995).

## C. Analisis data
Aktivitas  antioksidan  dari  fraksi  etil  asetat dan  fraksi  etanol  limbah  ketapang  ( Terminalia catappa )    dan  antioksidan  pembanding  kuesetin dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan rumus:
Nilai konsentrasi fraksi etil asetat dan fraksi etanol ataupun antioksidan pembanding (kuersetin) dan persen inhibisinya diplot masing- masing  pada  sumbu  x  dan  y  pada  persamaan regresi  linear.  Persamaan  regresi  linear  yang diperoleh  dalam  bentuk  persamaan  y  =  a  +  bx, digunakan  untuk  mencari  nilai  IC 50 ( inhibitory concentration 50%)  dari  masing-masing  sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang  akan  diperoleh  dari  IC 50 .  Nilai  IC 50 menyatakan  besarnya  kosentrasi  larutan  sampel (fraksi maupun antioksidan pembanding kuersetin)  yang  dibutuhkan  untuk  mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50 %.

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
Limbah  ketapang  yang  digunakan  pada penelitian  ini  adalah  daun  ketapang  yang  sudah gugur  sebanyak  4000  gram.  Setelah  limbah ketapang  dikeringkan  menghasilkan  simplisia sebanyak  1000  gram  dengan  rendemen  simplisia sebesar  25%.  Serbuk  limbah  ketapang  kemudian diayak  dan  hasil  ayakan  yang  digunakan  untuk ekstraksi sebanyak  600 gram, diekstraksi dengan metode  maserasi  menggunakan  etanol  96% sebanyak 1000 mL. Selama 6 jam pertama sampel sekali-kali diaduk, kemudian didiamkan selama 3 hari.  Maserat  dipisahkan  dengan  kertas  saring. Proses  penyarian  dilakukan  sebanyak  tiga  kali dengan  menggunakan  etanol  96%.  Maserat  yang diperoleh dipekatkan pada tekanan rendah dengan
suhu  45-50 ℃ menggunakan rotary  evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental.
Hasil  rendemen  ekstrak  limbah  ketapang dengan  metode  maserasi  menggunakan  pelarut etanol  96  adalah  36  gram  (6  %).  Hasil  ini  lebih rendah  daripada  penelitian  sebelumnya  dimana rendemen  yang  diperoleh  menggunakan  metode maserasi dengan pelarut metanol pada penelitian sebelumnya sebesar 15,64 % (Nuria et al. , 2014). Uji DPPH fraksi etil asetat dan fraksi etanol limbah  ketapang  bertujuan  untuk  mengetahui kemampuan aktivitas antioksidan fraksi eti asetat dan  fraksi  etanol  limbah  ketapang  ( Terminalia catappa ). Pengukuran absorbansi fraksi etil asetat dan  fraksi  etanol  limbah  ketapang  dilakukan dengan  menggunakan  spektrofotometer  UV  Vis dengan  panjang  gelombang  517  nm  dan  volume yang  diambil  sebanyak  0,5  mL  dan  DPPH sebanyak  3,5  mL.  Konsentrasi  sampel  yang digunakan  adalah  10,  50,  100,  150  dan  200  ppm sedangkan konsentrasi pembanding adalah 2, 4, 6, 8 dan 10 ppm. Pembanding yang digunakan pada penelitian  ini  adalah  kuersetin.  Suatu  senyawa dinyatakan  sebagai  antiradikal  bebas  sangat  kuat apabila nilai IC 50 < 10 ppm, kuat apabila nilai IC 50 antara  10-50  ppm,  sedang  apabila  nilai  IC 50 berkisar  antara  50-100  ppm,  lemah  apabila  nilai IC 50 berkisar antara 100-250 ppm dan tidak aktif apabila IC 50 di atas 250 ppm (Phongpaichit et al. , 2007).
Fraksi etil asetat limbah ketapang ( Terminalia  catappa )  tidak  memiliki  aktivitas antioksidan dengan nilai IC 50 -28,521 ppm. Fraksi etanol  limbah  ketapang  ( Terminalia  catappa ) memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  kuat  dengan nilai  IC 50 32,53  ppm  (IC 50 10-50  ppm). Pembanding kuersetin memiliki aktivitas antioksidan kuat dengan nilai IC 50 17,68 ppm (IC 50 10-50  ppm). Senyawa  antioksidan  dapat  bereaksi dengan  radikal  DPPH  dengan  mekanisme antioksidan  mendonasikan  atom  hidrogen  dan sehingga  menyebabkan  terjadinya  peluruhan warna dari ungu ke kuning (Molyneux, 2004).
Uji fitokimia menunjukkan bahwa fraksi etil asetat limbah ketapang mengandung flavonoid dan fenolik,  sedangkan  fraksi  etanol  limbah  ketapang mengandung saponin dan alkaloid. Senyawa pada ketapang  yang  dapat  memiliki  aktivitas  sebagai antioksidan adalah flavonoid. Flavonoid merupakan  senyawa  polifenol  yang  dapat menyumbangkan  atom  hidrogen  kepada  radikal bebas,  sehingga  aktivitas  antioksidan  dapat dihasilkan dengan reaksi netralisasi radikal bebas atau menghentikan reaksi berantai (Handayani et al. ,  2014). Senyawa  alkaloid  yang  memiliki aktivitas antioksidan adalah quinolon, kafein dapat berfungsi  dengan  meredam  radikal,  hidroksi  dan melatonin  dapat  berperan  menjaga  sel  dari pengaruh  toksisitas  obat-obatan  dan  radiasi. Saponin  mampu  meredam  superoksida  melalui pembentukan intermediet hidroperoksida sehingga  mencegah  kerusakan  biomolekular (Yuhernita & Juniarti, 2011).
Tabel 1. Hasil pengukuran persen inhibisi dan nilai IC 50 fraksi etil asetat, fraksi etanol limbah ketapang dan pembanding kuersetin Sampel Konsentrasi (ppm) % inhibisi IC 50 (ppm) Fraksi etil asetat limbah ketapang 10 50 100 150 200 42,13 81,17 94,29 94,60 94,91 -28,521 Fraksi etanol limbah ketapang 10 50 100 150 200 31,52 58,86 86,38 94,55 94,81 32,53 Kuersetin 2 4 6 8 10 18,79 23,68
26,25 31,01 34,87 17,68 (a) (b) (c)
Gambar 1. Grafik konsentrasi terhadap % inhibisi (a) fraksi etil asetat limbah ketapang (b) fraksi etanol limbah ketapang (c) pembanding kuersetin

## KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan maka  dapat  disimpulkan  bahwa    fraksi  etil  asetat limbah  ketapang  tidak  memiliki  aktivitas antioksidan dengan nilai IC 50 -28,521 ppm. Fraksi etanol  limbah  ketapang  dan  kuersetin  memiliki antioksidan kuat dengan masing-masing nilai IC 50
32,53 ppm dan 17,68 ppm.

## ACKNOWLEDGEMENT
Ucapan terimakasih ditujukan kepada Kemenriskek  BRIN  atas  Dana  Hibah  Penelitian Dosen Pemula Tahun Anggaran 2020.
y = 0,2407x + 56,865 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 % IN H IBISI KONSENTRASI (ppm) y = 0,3335x + 39,21 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 % IN H IBISI KONSENTRASI (ppm) y = 1,9755x + 15,071 0 10 20 30 40 0 2 4 6 8 10 12 % IN H IBISI KONSENTRASI (ppm) r = 0,9967 r = 0,8048 r = 0,9189

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad,  A.,  Mun’im,  A.,  &  Elya,  B.  2012.  Study  of  antioxidant activity  with  reduction  of  DPPH  radical  and  xanthine  oxidase inhibitor  of  the  extract  of Ruellia  tuberosa LINN  Leaf, International Research Journal of Pharmacy . 3 : 66–70.
Amalraj, A., & Gopi, S. 2017. Medicinal properties of Terminalia arjuna (Roxb.) Wight & Arn.: a review, Journal of Traditional and Complementary Medicine . 7 (1):65-78.
Anand, A.V., Divya, N., & Kotti, P.P. 2015. An updated review of Terminalia catappa , Pharmacognosy Reviews . 9 (18): 93–98.
Astuti,  S.  2012.  Isoflavon  kedelai  dan  potensinya  sebagai penangkap  radikal  bebas, Jurnal  Teknologi  &  Industri  Hasil Pertanian . 13 (2): 126–136.
Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E., & Berset, C. 1995. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity, In LWT - Food Science and Technology . 28 (1): 25 - 30.
Coulibaly, K., Zirihi, G. N., Guessennd-Kouadio, N., Oussou, K. R., & Dosso, M. 2014. Antibacterial properties studies of trunk barks of Terminalia ivorensis , a commercial and medicinal species on some  methicillin-resistant  Staphylococci  species  strains, African Health Sciences . 14 (3): 753-756.
Handayani,  V.,  Ahmad,  A.R.,  Sudir,  M.  2014.  Uji  aktivitas antioksidan ekstrak metanol bunga dan daun patikala ( Etlingera elatior (Jack)  R.M.  Sm)  menggunakan  metode  DPPH, Pharmaceutical Sciences and Research . 1 (2): 86-93.
Iwansyah,  A.C.,  Damanik,  M.R.M.,  Kustiyah,  L.,  &  Hanafi,  M. 2017. Potensi fraksi etil asetat daun torbangun ( Coleus amboinicus
L.)  dalam  meningkatkan  produksi  susu,  bobot  badan  tikus,  dan anak tikus, Jurnal Gizi Dan Pangan . 12 (1): 61-68.
Katiki,  L.M.,  Gomes,  A.C.P.,  Barbieri,  A.M.E.,  Pacheco,  P.A., Rodrigues,  L.,  Veríssimo,  C.J.,  Gutmanis,  G.,  Piza,  A.M., Louvandini,  H.,  &  Ferreira,  J.F.S.  2017. Terminalia  catappa : chemical composition, in vitro and in vivo effects on Haemonchus contortus , Veterinary Parasitology . 246 : 118–123.
Kinoshita, S., Inoue, Y., Nakama, S., Ichiba, T., & Aniya, Y. 2007. Antioxidant  and  hepatoprotective  actions  of  medicinal  herb,
Terminalia  catappa L.  from  Okinawa  Island  and  its  tannin corilagin, Phytomedicine . 14 (11): 755-762.
Machado-Gonçalves,  L.,  Tavares-Santos,  A.,  Santos-Costa,  F., Soares-Diniz,  R.,  Câmara-de  Carvalho-Galvão,  L.,  Martins-de Sousa, E., & Beninni-Paschoal, M.A. 2018. Effects of Terminalia catappa Linn. extract on Candida albicans biofilms developed on denture acrylic resin discs, Journal of Clinical and Experimental Dentistry . 10 (7): 642-647.
Molyneux,  P.  2004.  The  use  of  the  stable  free  radical diphenylpicryl-hydrazyl  (DPPH)  for  estimating  antioxidant activity, Songklanakarin  Journal  of  Science  and  Technology . 26 (2): 211-219.
Sari,  N.P.K.,  Ritmaleni,  &  Sardjiman.  2015.  Uji  Aktivitas Antioksidan  Senyawa  Tetrahidroheksagamavunon-5  (Thhgv-5) ISBN-e:  978-602-73159-0-7. Seminar  Nasional  Kimia  Dan Pendidikan Kimia VII . Surakarta, 18 April 2015.
Nuria,  M.C.,  Chabibah,  Z.,  Banu,  S.,  &  Fithria,  R.F.  2014. Penelusuran  potensi  fraksi n -heksan  dan  etil  asetat  dari  ekstrak metanol  daun  gugur  ketapang  ( Terminalia  catappa L.)  sebagai antidiare, e-Publikasi  Ilmiah  Fakultas  Farmasi  Unwahas Semarang , DOI: 10.31942/jiffk.v0i0.1219.
Phongpaichit,  S.,  Nikom,  J.,  Rungjindamai,  N.,  Sakayaroj,  J., Hutadilok-Towatana, N., Rukachaisirikul, V., & Kirtikara, K. 2007. Biological  activities  of  extracts  from  endophytic  fungi  isolated from  Garcinia  plants, FEMS  Immunology  and  Medical Microbiology . 51 (3): 517-525.
Rahayu,  S.,  Kurniasih,  N.,  &  Amalia,  V.  2015.  Ekstraksi  dan identifikasi  senyawa  flavonoid  dari  limbah  kulit  bawang  merah sebagai antioksidan alami, Al-Kimiya , 2 (1): 1-8.
Yuhernita, & Juniarti. 2011. Analisis senyawa metabolit sekunder dari  ekstrak  metanol  daun  surian  yang  berpotensi  sebagai antioksidan, MAKARA of Science Series . 15 (1): 48–52.
Yuslianti, E. R. 2018. Pengantar Radikal Bebas dan Antioksidan . Deepublish, Yogyakarta.