## PERKEMBANGAN PENELITIAN INDUKSI KALUS EMBRIOGENIK PADA JARINGAN VEGETATIF TANAMAN KARET KLONAL
( Hevea brasiliensis Muell. Arg)
Research Development of  Embyogenic Callus on Rubber Clone Vegetative Tissue ( Hevea brasiliensis Muell. Arg) 1 2 1
Lestari Admojo , Ari Indrianto  dan Hananto Hadi
1 Balai Penelitian Getas, Pusat Penelitian Karet
2 Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada Email: tariadmojo@balitgetas.co.id
Diterima tgl 28 November 2013/Direvisi tgl 17 Maret 2014/Disetujui tgl 24 Maret 2014

## Abstrak
Perbanyakan  tanaman  karet  ( Hevea brasiliensis Muell  Arg)  saat  ini  masih menggunakan  cara  konvensional  yaitu okulasi.  Kelemahan  teknik  ini  antara  lain membutuhkan  waktu  yang  lama,  kebutuhan lahan  yang  luas,  musim  biji  yang  terbatas  di samping  juga  diperlukan  tenaga  kerja  yang cukup  banyak.  Permasalahan  tersebut mengharuskan  penelitian  diarahkan  pada perbanyakan  bibit  dengan  tehnik  yang  lebih efisien  dalam  skala  massal.  Teknik  kultur jaringan melalui embriogenesis somatik (EGS) membuka  peluang  tersebut.  Induksi  kalus embriogenik  merupakan  langkah  awal  untuk keberhasilan  teknik  EGS  secara  tidak langsung.  Tulisan  ini  merangkum  hasil penelitian  induksi  kalus  embriogenik  pada jaringan  vegetatif   tanaman  karet  klonal  yang dimulai  pada  tahun  2008  hingga  2012.  Hasil pengujian terhadap 6 klon karet (PB 260, PB 330,  IRR  111,  IRR  39,  GT  1  dan  IRR  112) menunjukkan bahwa klon IRR 112 dan PB 330 merespon  pembentukan  kalus  embriogenik, dan  membentuk  fase  embrio  dari  globular (IRR  112)  hingga  jantung  dan  torpedo  (PB 330). Hasil pengujian jaringan vegetatif  yang digunakan  sebagai  eksplan  (helai  daun, tangkai,  ketiak  tangkai,  mata  tunas) menunjukkan  bahwa  jaringan  tangkai  dan ketiak  tangkai  merespon  terbentuknya  kalus
embriogenik. Kombinasi media dasar MS+2,4 D  5  ppm  memberikan  respon  induksi  kalus friabel terbaik dan MS+NAA 0,1 ppm+BAP 2 ppm  memberikan  respon  kalus  embriogenik terbaik,  namun  frekuensinya  masih  rendah. Tingkat browning masih  tinggi  yang  menjadi faktor  pembatas  perkembangan  kalus.  Kalus yang  bersifat  embriogenik  diharapkan berpotensi  untuk  diinduksi  menjadi  planlet melalui teknik embriogenesis somatik.
Kata  kunci:  embriogenesis  somatik, Hevea brasiliensis , kalus embriogenik, klon karet.

## Abstract
Preparation  of   planting  material  of   rubber (Hevea brasiliensis Muell Arg) until now still uses conventional  propagation  by  budding.  The weaknesses  of   conventional  propagation  technique are  the  need  of   longer  time,  greater  land  use  and workers  and  limited  seed  seasons.  This  problems needed to be alleviated by using alternative technique of   propagation,  i.e  micropropagation  technique known as tissue culture. The technique can prepare rubber planting material rapidly and potentially can produce great number of  planting materials. One of promising  tissue  culture  technique  is  somatic embryogenesis.  Induction  of   embryogenic  callus  is the first step to pass indirect somatic embryogenesis technique.  This  review  discusses  induction  of embryo  somatic  on  rubber  clone  vegetative  tissue,
encompassing the work in the period of  2008 until 2012. From this research it showed that from among rubber clones (PB 260, PB 330, IRR 111, IRR 39, GT 1 and IRR 112) tested, IRR 112 and PB 330 gave a good response from globular phase (IRR 112) to heart shape and torpedo phase (PB 330). Among the vegetative tissue (leaf, stem, sub stem, bud stem) used as explants it was shown that stem and sub stem responded  to  embryogenic  callus.  The  media combination of  MS+2,4-D 5 ppm produced better response on friable callus induction and MS+NAA 0,1  ppm+BAP  2  ppm  has  better  responded  to embryogenic callus, but the frequency is still low. The browning intencity still high and it is the limitting factor for explants growth. The embryogenic callus can  potentially  be  developed  further  to  planlet  by induction in appropriate media.
Keywords: embryogenic  callus,  embryogenesis somatic, Hevea brasiliensis, rubber clone

## Pendahuluan
Perbanyakan  tanaman  karet  ( Hevea brasiliensis Muell  Arg) saat  ini  masih menerapkan  teknik  konvensional  yaitu okulasi.  Kelemahan  teknik  ini  antara  lain membutuhkan  waktu  yang  lama,  sekitar  18 bulan sejak pengecambahan hingga bibit siap dipindah  tanam  ( transplanting )  ke  lapangan. Kelemahan  lain  adalah  musim  biji  yang terbatas,  dibutuhkan  lahan  yang  luas  dan tenaga yang cukup banyak. Hal tersebut sering menjadi  kendala  untuk  memproduksi  bibit secara  konvensional  dalam  skala  massal. Teknik kultur jaringan melalui embriogenesis somatik  (EGS)  memberi  peluang  untuk perbanyakan  bibit  karet  secara  massal  dalam waktu cepat dan efisien.
E m b r i o g e n e s i s   s o m a t i k   a d a l a h pembentukan embrio dari sel-sel aseksual (sel- sel  somatik)  membentuk  struktur  yang menyerupai embrio zigotik. Pada proses EGS terjadi  pembentukan  struktur  bipolar  yang mengandung meristem tunas dan akar, tanpa melalui  penggabungan  gamet  seperti  halnya embrio zigotik (Jimenez, 2001). Pembentukan embrio  somatik  dapat  secara  langsung maupun  tidak  langsung.  Embriogenesis
somatik langsung adalah pembentukan embrio somatik  atau  jaringan  embriogenik  secara langsung  dari  eksplan  tanpa  melalui  fase pembentukan  kalus.  Sebaliknya,  pada embriogenesis  somatik  tidak  langsung  proses pembentukan  embrio  somatik  didahului melalui fase kalus. Induksi kalus embriogenik merupakan langkah awal untuk perbanyakan tanaman  melalui  teknik  ES  secara  tidak langsung.
Penelitian  EGS  pada  tanaman  karet  telah dimulai  sejak  tahun  1980-an  oleh  beberapa peneliti, antara lain oleh Wang et al .   (1980), Wan et  al .  (1982),  serta  Carron  dan  Enjalric (1985) yang hampir seluruhnya menggunakan eksplan jaringan generatif  seperti biji ataupun anter. Pada saat itu belum diperoleh hasil yang memuaskan  (Carron et  al., 1995).  Penelitian kultur jaringan tanaman karet hingga saat ini juga telah banyak dilakukan baik di Malaysia, Cina,  Perancis  maupun  Ceylon.  Beberapa penelitian  EGS  menggunakan  jaringan vegetatif   tanaman  berkayu  dewasa  telah banyak  dilakukan.  Disimpulkan  bahwa j a r i n g a n   ve g e t a t i f   t a n a m a n   d e wa s a memungkinkan  sebagai  sumber  eksplan (Ruaud and Paques, 1995).
Tulisan  ini  merangkum  hasil  penelitian induksi kalus embriogenik yang dilakukan di Balai Penelitian Getas sejak tahun 2008 hingga 2012.  Hasil  tersebut  termasuk  klon  yang prospektif   untuk  dijadikan  sebagai  sumber ekspan dari beberapa yang diuji (PB 260, PB 330,  IRR  111,  IRR  39,  GT  1  dan  IRR  112), jaringan  vegetatif   tanaman  karet  klonal  yang responsif   untuk  induksi  kalus  (tangkai  daun, anak tangkai daun, mata tunas, lamina, tunas pucuk) dan pengaruh kombinasi media dasar yang digunakan (MS, DKW dan WPM) serta respon kalus yang diperoleh (friabel, kompak dan embriogenik pada fase tertentu).

## Prospek Kalus Embriogenik Untuk
Perbanyakan Bibit Secara In Vitro
Salah  satu  jalur  yang  ditempuh  untuk meregenerasikan  tanaman  dengan  teknik kultur  jaringan  adalah  dengan  embriogenesis somatik.  Langkah  awal  proses  induksi
embriogenesis  somatik  adalah  pemilihan eksplan  yang  akan  digunakan.  Berdasarkan penelitian  sebelumnya,  eksplan  yang digunakan  pada  tanaman  karet  kebanyakan berasal dari jaringan generatif  seperti anter dan iner integumen atau kotiledon biji (Blanc et al , 1999;  Cailloux et  al ,  1996),  atau  bagian  akar kecambah  hasil  kultur in  vitro (Quan et  al , 2010). Pada percobaan yang dilakukan di Balai Penelitian  Getas,  eksplan  yang  digunakan berasal dari bagian jaringan vegetatif  (lamina, tangkai daun, anak tangkai daun, mata tunas, tunas pucuk) tanaman hasil okulasi (tanaman klonal),  sehingga  keunggulan  genetik  bibit yang dihasilkan lebih terjamin.
Fase  induksi  kalus  dianggap  berhasil apabila  kalus  yang  diperoleh  bersifat embriogenik dicirikan oleh sel yang berukuran kecil,  sitoplasma  padat,  inti  besar,  vakuola kecil-kecil dan mengandung butir pati. Embrio somatik dapat dihasilkan dalam jumlah besar dari  kultur  kalus,  namun  untuk  tujuan perbanyakan  skala  besar,  jumlahnya  kadang- kadang dapat ditingkatkan melalui inisisasi sel embriogenik dari kultur suspensi yang berasal dari kalus primer (Wiendi et al , 1991). Potensi terbesar  multiplikasi  klon  adalah  melalui embriogenesis  somatik  dimana  1  sel  dapat menghasilkan  1  embrio  untuk  menjadi tanaman lengkap.
Selain  media,  jenis  eksplan  juga  sangat berpengaruh  dalam  keberhasilan  proses embriogenesis.  Bagian  tanaman  yang  masih memiliki  sifat  meristematis  sangat  baik digunakan  sebagai  eksplan  dalam  proses embriogenesis somatik. Menurut Zhang et al . (2000),  keberhasilan  embriogenesis  melalui kultur in  vitro dipengaruhi  beberapa  faktor, yaitu  :  a)  genotip  tanaman  donor,  b)  kondisi fisiologis  tanaman  donor,  c)  jenis  media  dan kondisi fisik media, d) lingkungan kultur, dan e) zat pengatur tumbuh (ZPT).
Penggunaan  eksplan  yang  bersifat m e r i s t e m a t i k   u mu m n ya   m e m b e r i k a n keberhasilan  pembentukan  embrio  somatik yang  lebih  tinggi  (Vesco  and  Guerra,  2001). Eksplan  dari  biji  (embrio  zigotik)  yang dikecambahkan  secara in  vitro ideal  karena hampir  semua  bagian  dari  kecambah in  vitro
sel-selnya masih bersifat meristematis. Eksplan ini  mengandung  sel-sel  embriogenik ( proembryogenic determined cells ) yang potensial untuk  berkembang  menjadi  embrio  dan tanaman lebih banyak. Kelemahannya adalah kualitas  tanaman  yang  dihasilkan  sulit diprediksi karena keragaman genetik.
Penggunaan  eksplan  jaringan  vegetatif yang berasal dari tanaman induk hasil okulasi (klonal)  menjamin  kualitas  tanaman  lebih baik,  karena  tanaman  regenerasi  yang dihasilkan  identik  dengan  induknya. Penggunaan  eksplan  ini  mengharuskan adanya  proses  pra  sterilisasi  secara  optimal melalui  ' preconditioning-culture '.  Proses  ini diharapkan  mengurangi  kemungkinan timbulnya  kontaminasi  yang  sewaktu-waktu muncul  pada  kultur in  vitro .  Pada  proses dediferensiasi  akan  terbentuk  kalus.  Kalus yang  terbentuk  akan  dilanjutkan  ke  tahap berikutnya,  yaitu  proses  diferensiasi,  diawali dengan  terinduksinya  sel-sel  kalus  menjadi bersifat  embriogenik.  Kalus  yang  bersifat embriogenik  tersebut  akan  mudah  terinduksi menjadi embrio, dan akhirnya menjadi planlet yang  sempurna,  bila  digunakan  pada  media yang tepat.

## Perkembangan Hasil Penelitian

## 1.  Respon Beberapa Klon Karet
Identifikasi  sumber  eksplan  jaringan vegetatif   yang  potensial  untuk  induksi  kalus embriogenik  diawali  dengan  pengujian terhadap 6 klon karet, yaitu PB 260, PB 330, IRR 111, IRR 39, GT 1 dan IRR 112. Eksplan tersebut  diambil  dari  kebun  entres  bagian pucuk  fase  sekitar  1  minggu  setelah flush . Respon  dari  keenam  klon  tersebut  disajikan dalam Tabel 1.
Pengujian  terhadap  6  klon  karet  yang d i g u n a k a n   s e b a g a i   s u m b e r   e k s p l a n memberikan  respon  yang  berbeda.  Klon  PB 260, PB 330 dan IRR 39 menunjukkan respon pembentukan  kalus  yang  lebih  banyak,  baik dari  sisi  massa  kalus  maupun  frekuensi terbentuknya  kalus.  Berdasarkan  karakter kalus yang diperoleh, hanya klon IRR 112 dan PB  330  yang  menunjukkan  karakter  kalus
Perkembangan penelitian induksi kalus embriogenik pada jaringan vegetatif  tanaman karet ( Hevea brasiliensis Muell. Arg)
Klon Bagian eksplan yang merespon Kalus Karakteristik kalus Sifat kalus Waktu mulai respon (MST) PB 260 Tangkai dan anak tangkai + + + + Hijau kilap (glossy/bening) NE 1 IRR 111 - - - - - IRR 39 Anak tangkai + + + + Hijau kilap dan agak kecoklatan NE 1 GT 1 Tangkai + Hijau kilap NE 1 IRR 112 Tangkai dan anak tangkai + + Hijau kekuningan, bergerombol dan remah (sebagian fase globular) E 5 PB 330 Tangkai dan anak tangkai + + + + Hijau kekuningan, bergerombol dan remah (sebagian fase globular, jantung dan torpedo) E 4
Keterangan : + + + + : sangat banyak, + + : sedang, + : sedikit, - : tidak terbentuk, NE : Non Embriogenik,
E : Embriogenik, MST : Minggu setelah tanam.
Tabel 1. Perbedaan respon pembentukan kalus pada beberapa klon karet.
embriogenik.  Munculnya  kalus  embriogenik ditandai  dengan  warna  kalus  yang  bening kehijauan/kuning  hijau,  mengkilap,  sangat friabel  (remah)  dan  bila  diamati  dibawah mikroskop  terlihat  sitoplasma  sangat  padat. Fase  embrio  yang  terbentuk  meliputi  fase
globular,  fase  jantung  dan  fase  torpedo ( G a m b a r   1 - 3 ) .   K a l u s   ya n g   b e r s i f a t embriogenik  diharapkan  berpotensi  untuk diinduksi  menjadi  planlet  pada  media  yang sesuai melalui teknik embriogenesis somatik.
Gambar 1. Kalus globular (panah merah) dari tangkai daun klon PB 330.
Gambar 2. Kalus bening kekuningan dan  tekstur remah dari klon IRR 112.
A A B
Gambar 3. Fase embrio pada kalus embriogenik yang terinduksi pada klon PB 330 (A : embrio fase jantung, B : embrio fase torpedo)
2.  Respon Jaringan Eksplan yang Digunakan D i a n t a r a   j a r i n g a n   ve ge t a t i f   ya n g digunakan,  hanya  jaringan  daun  yang  tidak merespon  pembentukan  kalus.  Massa  kalus yang  cukup  banyak  terinduksi  pada  jaringan tangkai daun dan antara tangkai-anak tangkai daun, dengan karakteristik kalus yang bersifat potensial  embriogenik  (Tabel  2).  Kalus  yang disubkultur  belum  memberikan  respon  pada beberapa media.
Berdasarkan  hasil  pengamatan,  tidak seluruh  eksplan  memberikan  respon  sama
walaupun ditanam pada media yang sama. Hal ini diduga karena faktor pengambilan eksplan, seperti perbedaan posisi pengambilan eksplan (pangkal  ataupun  ujung  tangkai),  posisi payung  daun,  ataupun  faktor  fisiologi  entres sebagai  sumber  eksplan.  Menurut  Jimenez (2005),  jaringan  atau  bagian  organ  tertentu tanaman dalam genotipe yang sama juga dapat berbeda  kemampuan  embriogenesisnya. Penampakan  respon  eksplan  pada  beberapa jaringan tanaman yang digunakan bisa dilihat pada Gambar 4 dan 5.
Jaringan Eksplan Respon Daun Rata-rata dalam 1 minggu setelah tanam mengalami browning dan mati Mata tunas Hanya muncul sedikit  kalus, non embriogenik Anak tangkai Rata-rata membentuk kalus pada bagian tengah atau ketiaknya dalam 1-3 minggu setelah tanam, sebagian bersifat embriogenik Tangkai daun Rata-rata membentuk kalus yang sebagian bersifat embriogenik baik pada bagian tengah maupun ujung pada 4-5 minggu setelah tanam Tunas apikal Hanya sedikit membentuk kalus, non embriogenik dan rata-rata mengalami browning pada 2-3 minggu setelah tanam
Tabel 2. Perbedaan respon pembentukan kalus pada beberapa jaringan eksplan.
Gambar 4. Kalus pada jaringan antara tangkai-anak tangkai (A). Kalus rata-rata muncul  dari ketiak tangkai, bukan bekas potongan (B).
(A) (B)
Perkembangan penelitian induksi kalus embriogenik pada jaringan vegetatif  tanaman karet ( Hevea brasiliensis Muell. Arg)
3.  Pengaruh Kombinasi Media Dasar + Zat Pengatur Tumbuh
Penelitian kombinasi media menggunakan media  dasar  MS  (Murashige  dan  Skoog), DKW  (Driver-Kuniyuki  Walnut)  dan  WPM ( Woody  Plant  Medium )  dengan  Zat  Pengatur Tumbuh  (ZPT)  auksin  dan  sitokinin.  Auksin yang  digunakan  untuk  induksi  kalus  adalah 2,4-D  dan  NAA  pada  rentang  konsentrasi antara  5-10  µM  (1-7  ppm),  sedangkan kombinasi auksin dan sitokinin menggunakan NAA  dan  BAP  pada  rentang  konsentrasi sama.  Formula  terbaik  didasarkan  atas terjadinya  inisiasi  kalus,  karakteristik  kalus dan sifat kalus.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa kombinasi media dasar MS+ZPT memberikan respon  eksplan  yang  lebih  banyak  dan  lebih baik  dibandingkan  kombinasi  media  dasar DKW+ZPT  dan  WPM+ZPT  (Tabel  3). Penampilan  respon  kalus  terlihat  pada Gambar 6.
Penambahan ZPT tertentu sering berperan dalam  induksi  EGS.  Zat  pengatur  tumbuh yang  sering  digunakan  adalah    auksin  dan sitokinin. Auksin merupakan salah satu ZPT yang  paling  sering  digunakan  dalam  induksi ES (Cooke et al, 1993 cit Jimenez, 2005). Hal ini  diduga  karena  pengaruh  gradien  auksin selama  fase  induksi,  yang  merupakan  fase
penting  untuk  inisiasi  bilateral  selama embriogenesis  jaringan  somatik  dan  zigotik, baik pada tanaman monokotil maupun dikotil (Schiavone  and  Cooke,  1987 cit Jimenez, 2005).  Pada  sebagian  besar  spesies  yang menggunakan ZPT untuk induksi EGS, auksin dan  sitokinin  merupakan  faktor  kunci  yang berperan  dalam  respon  embriogenik.  Hal tersebut disebabkan karena kombinasi auksin dan  sitokinin  sangat  berperan  pada  regulasi siklus sel dan pembelahan sel (Gaj, 2004). Juga dinyatakan  bahwa  lebih  80%  dari  protokol yang  dipelajari,  ES  diinduksi  dengan  adanya a u k s i n   t u n g g a l   a t a u   a u k s i n   y a n g dikombinasikan dengan sitokinin (Gaj, 2004).
Gaj (2004) selanjutnya menyatakan bahwa l e b i h   6 5 %   p e n e l i t i a n   E G S   t e r b a r u menggunakan kombinasi auksin dan sitokinin atau  kombinasi  auksin  dan  zat  pengatur tumbuh lainnya. Naphtalene Acetic Acid (NAA), adalah  jenis  auksin  terbanyak  kedua  yang sering digunakan untuk menginduksi somatik embriogenesis setelah 2,4-D (Raemakers et al, 1995 cit Jimenez,  2005).  Hal  senada dilaporkan antara lain oleh Cuenca et al , Pinto et al , Hernandez et al , Toribio et al, cit . Jimenez
(2005),  dimana  auksin  seringkali  digunakan secara  tunggal  atau  dikombinasikan  dengan sitokinin,  terutama  pada  beberapa  tanaman berkayu.  Pada  induksi  EGS  yang  tidak
Gambar 5. Kalus dari jaringan tangkai daun (A). Kalus dari tunas apikal (B).
(A) (B)
langsung,  efek  dari  sitokinin  terutama  pada proliferasi  sel  secara  massal  sebelum dediferensiasi  embrio  (Lakshmanan  and  Taji 2000). Reamakers et al . (1995) telah mereview bahwa  diantara  sitokinin  yang  digunakan
untuk  induksi  EGS  yang  sering  digunakan adalah  BAP  (57%),  diikuti  Kinetin  (37%), Zeatin (3%) dan Thidiazuron (3%) (Jimenez, 2005).
Respon WPM + ZPT DKW + ZPT MS + ZPT Klon yang membentuk kalus PB 260, IRR 39, GT 1 PB 260, IRR 39, IRR 112 PB 260, PB 330, IRR 39, GT 1, IRR 112 Jumlah eksplan yang membentuk kalus (dari 60 eksplan) 10 32 48 Sifat kalus NE NE dan sebagian E NE dan sebagian E Karakteristik kalus Hijau kilap (glossy/bening) Hijau kilap, hijau kekuningan, hijau kecoklatan, Hijau kilap, hijau kekuningan, hijau kecoklatan, bergerombol, remah Waktu terbentuknya kalus 1 – 3 MST 1 – 4 MST 1 – 5 MST
Tabel 3. Perbedaan respon kalus yang terbentuk pada beberapa kombinasi media dasar + ZPT.
Keterangan : NE : Non Embriogenik, E : Embriogenik, MST : Minggu Setelah Tanam, ZPT : kombinasi 2,4-D/NAA dan BAP
Gambar 6. Kalus yang terinduksi pada jaringan antara tangkai-anak tangkai daun klon IRR 112 pada 3 Bulan Setelah Tanam (BST) dalam media MS + ZPT (A). Kalus yang terinduksi pada jaringan tangkai daun klon IRR 112 pada 3 Bulan Setelah Tanam (BST) dalam media DKW + ZPT (B).
Perkembangan penelitian induksi kalus embriogenik pada jaringan vegetatif  tanaman karet ( Hevea brasiliensis Muell. Arg)
4.  Kendala yang Dihadapi
Tingkat browning atau pencoklatan eksplan yang  tinggi  menjadi  faktor  pembatas  pada penelitian induksi kalus embriogenik di Balai Penelitian  Getas  (Gambar  7).  Tamin  (1987) menyatakan  masalah  yang  sering  dihadapi pada kultur tanaman berkayu meliputi bahan tanaman  sumber  eksplan,  proses  sterilisasi, browning ,  mengeluarkan  zat  atau  eksudat tertentu,  kebutuhan  nutrisi,  kehilangan potensial    morfogenetik,  dan  jaringan mengalami  vitrifikasi. Browning tersebut diduga  menjadi  salah  satu  faktor  rendahnya frekuensi  pembentukan  kalus  embriogenik. Tang  dan  Newton  (2004)  juga  melaporkan b a h wa   p e n c o k l a t a n   j a r i n g a n   s a n g a t menurunkan  regenerasi  secara in  vitro dari kultur kalus pada beberapa tanaman berkayu. Tabiyeh et  al .  (2006)  menyatakan  bahwa p e n c o k l a t a n   e k s p l a n   d i s e b a b k a n meningkatnya produksi senyawa fenolat yang
diikuti oksidasi oleh aktivitas enzim oksidase (PPO) dan polimerasinya. Fenilalanin amonia liase  (PAL)  adalah  salah  satu  enzim  dalam fenilpropanoid  yang  sangat  berpengaruh terhadap  terjadinya  pencoklatan.  Salah  satu penyebab utama pencoklatan dalam kultur in vitro  adalah  luka  karena  pemotongan  pada jaringan.  Luka  tersebut  memacu  stres  dan menyebabkan peningkatan aktivitas PAL yang diikuti  oleh  produksi  fenilpropanoid  dan menyebabkan pencoklatan. Pencoklatan pada kultur  jaringan  dapat  dihindari  dengan beberapa  cara,  antara  lain  menghilangkan produksi  senyawa  fenol,  modifikasi  potensial redoks,  penghambatan  aktivasi  enzim  fenol oksidase,  penurunan  aktivitas  fenolase,  dan ketersediaan  substrat.  Penanggulangan perubahan  ini  dalam  praktek  seringkali dilakukan  melalui  pra-perlakuan  terhadap eksplan,  antara  lain  dengan  cara  merendam dan  pra-kondisi  pada  media  dasar  (Hutami, 2008).
Gambar 7. Eksplan tangkai (A) dan tunas pucuk (B) yang mengalami browning, selanjutnya diikuti kematian eksplan.
A B

## Kesimpulan
Kalus embriogenik berhasil diperoleh pada eksplan tangkai daun dan anak tangkai daun dari klon IRR 112 dan PB 330. Embrio yang terbentuk  menunjukkan  fase  globular  (IRR 112)  dan  globular,  jantung  dan  torpedo  (PB 330).  Kalus  embriogenik  tersebut  berpotensi untuk  diinduksi  membentuk  planlet  pada media yang sesuai.
Induksi kalus friabel terbaik diperoleh pada perlakuan  media  MS+2,4-D  5  ppm  dan induksi  kalus  embriogenik  terbaik  berhasil diperoleh  pada  media  MS+NAA  0,1  ppm +BAP  2  ppm.  Tingkat browning masih  tinggi yang menjadi faktor pembatas perkembangan kalus.
Pada  penelitian  selanjutnya  perlu dilakukan pada sumber eksplan terejuvenasi untuk melihat pengaruh juvenilitas tanaman klonal  terhadap  respon  eksplan  secara in vitro .  Eliminasi  tingkat browning dapat dilakukan  dengan  subkultur  berulang, perendaman  dalam  arang  aktif  +  sukrosa, penambahan polyamine dan  penempatan kultur dalam ruang gelap.

## Daftar Pustaka
Blanc, G., N. Michaux-Ferriere, C. Teisson, L. Lardet, and M. P. Carron. 1999. Effects of carbohydrate addition on the induction of somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis . Plant  Cell,  Tissue  and  Organ  Culture  59. pp. 103-112.
Cailloux, F., J. J. Guerrier, L. Linossier and A. Coudret.  1996.  Long-term  somatic embryogenesis and maturation of  somatic embryos in Hevea brasiliensis . Plant Science 120. pp. 185-196.
Carron, M. P., and F. Enjalric. 1985. Somatic embryogenesis  from  inner  integument  of the seed of Hevea brasiliensis Mull. Arg. CR Acad. Sci. Paris. 300: 653-658
Carron,  M.  P.,  H.  Etienne,  N.  Michaux- Ferriere,  and  P.  Montoro.  1995.  Somatic embyogenesis  in  rubber  tree  ( Hevea brasiliensis Mull. Arg.) p. 353-369 In Y. P. S.
Bajaj  (ed).  Biotechnology  in  Agriculture and  Forestry  30  Somatic  Embryogenesis and  Synthetic  Seed  I.  Springer  Verlag. Germany. 472 p.
Cooke, T. J., R. H. Racusen, and J. D. Cohen. 1993.  The  role  of   auxin  in  plant embryogenesis. Plant Cell 5: 1494-1495.
Cuenca, B., M. C. San-José, M. T. Martínez, A.  Ballester,  and  A.  M.  Vieitez.  1999. Somatic embryogenesis from stem and leaf explants of Quercus robur L. Plant. Cell. Rep.
18: 538-543.
Gaj, M. D. 2004. Factors influencing somatic embryogenesis  induction  and  plant regeneration  with  particular  reference  to Arabidopsis  thaliana (L.)  Heynh.  Plant
Growth Regulation. 43 : 27-47.
Hernández,  I.,  C.  Celestino,  and  M.  Toribio.
2003.  Vegetative  propagation  of Quercus suber L.  by  somatic  embryogenesis.  I. Factors  affecting  the  induction  in  leaves from  mature  cork  oak  trees.  Plant.  Cell. Rep. 21: 759-764.
H u t a m i ,   S.   2 0 0 8 .   U l a s a n :   m a s a l a h pencoklatan  pada  kultur  jaringan.  Jurnal AgroBiogen 4(2):83-88
Jimenez, V. M., E. Guevara, J. Herrera and F. Bangerth.  2001.  Endogenous  hormone levels  in  habituated  nucellar Citrus callus during  the  initial  stages  of   regeneration. Plant Cell Report. 20: 92-100.
Jimenez,  V.  M.  2005.  Involvement  of   plant hormones and plant growth regulators on in vitro  somatic  embryogenesis.  (review paper).  Plant  Growth  Regulation  47  :  91- 110.
Lakshmanan  P.  and  A.  Taji.  2000.  Somatic embryogenesis in leguminous plants. Plant Biology. 2: 136-148
Perkembangan penelitian induksi kalus embriogenik pada jaringan vegetatif  tanaman karet ( Hevea brasiliensis Muell. Arg)
Pinto, G., C. Santos, L. Neves , and C. Araújo.
2002.  Somatic  embryogenesis  and  plant regeneration  in Eucalyptus  globulus Labill. Plant. Cell. Rep. 21: 208-213.
Quan, N. Z., Z. H. Jiang, T. D. Huang, W. G. Li, A. H. Sun, X. M. Dai and Z. Li. 2010. P l a n t   r e g e n e r a t i o n   v i a   s o m a t i c embryogenesis from root eksplants of Hevea b r a s i l i e n s i s .   A f r i c a n   J o u r n a l   o f Biotechnology. 9 (49): 8168-8173.
Raemakers, C. J. J. M., E. Jacobsen, and R. G.
F.  Visser.  1995.  Secondary  somatic embryogenesis  and  applications  in  plant breeding. Euphytica 81: 93-107
Ruaud,  J.  N.  and  M.  Paques.  1995.  Somatic embryogenesis  and  rejuvenation  of   trees. p.99-118 In Jain, S. M., P. K. Gupta, and R. J. Newton (eds). Somatic embryogenesis in woody  plants  Vol.  1.  Kluwer  Academic Publishers, London. 460 p.
Schiavone,  F.  M.  and  T.  J.  Cooke.  1987.
U n u s u a l   p a t t e r n s   o f   s o m a t i c embryogenesis in the domesticated carrot: developmental effects of  exogenous auxins and auxin transport inhibitors. Cell Differ. 21: 53-62.
Tabiyeh,  D.  T.,  F.  Bernard,  and  H.  Shacker. 2006. Investigation of  glutathione, salicylic acid  and  GA   effects  on  browning  in 3
Pistacia vera shoot tips culture. ISHS Acta Hort. 726 p.
Tamin,  M.  B.  M.  1987.  Micropropagation  : The  problems  with  woody  species  In  Cell and  Tissue  Culture  in  Field  Crop Improvement  (Proceed.  of   Seminar).
th Tsukuba, Japan on October 4-9  1987.
Tang, W. and R. J. Newton. 2004. Increase of polyphenol  oxidase  and  decrease  of polyamines correlate with tissue browning in  Virginia  pine  ( Pinus  virginiana Mill.). Plant Sci. 167(3):621-628.
Toribio, M., C. Fernández, C. Celestino, M. T. Martínez,  M.  C.  San-José,  and  A.  M. Vieitez.  2004.  Somatic  embryogenesis  in mature Quercus robur trees. Plant. Cell.Tiss.
Org. Cult. 76: 283-287.
Vesco, L. L. D. and M. P. Gurerra. 2001. The effectiveness  of   nitrogen  sources  in  feijoa somatic  embryogenesis.  Plant  Cell  and Organ Culture 64:19-35.
Wan, A. R., W. Y. Ghandimathi,   H. Rohani, and  K.  Paranjothy.  1982.  Recent development in tissue culture of Hevea . In Rao,  A.  N  (ed).  Tissue  Culture  of Economically  Important  Plant.  COSTED and ANBS, Singapore. pp 152-158
Wang, Z., X. Zeng , C. Chen, H. Wu, Q Li, G.
Fan , and W. Lu. 1980. Induction of  rubber planlets  from  anther  of Hevea  brasiliensis Mull. Arg in vitro. Chin. J. Trop. Crops. 1: 25-26
Wiendi, N. M. A., G.A. Wattimena dan L.V. Gunawan. 1991. Bioteknologi Tanaman I. PAU IPB. 507 p.
Zhang,  B.,  F.  Liu,  and  C.  Yao.  2000.  Plant regeneration via somatic embryogenesis in cotton.  Plant  Cell  Tissue  and  Organ Culture. 60: 89-94
Zhe, L. 2006. Tissue culture in Hevea brasiliensis in  Training  on  Rubber  Breeding  in  China 2006 by Rubber Research Institute, Chinese Academy  of   Tropical  Agricultural Sciences.