Regenerasi In Vitro Tanaman Bawang Merah (Allium ascalonicum L.)
1) Alfian Dwi Kurniawan dan 2) Wahyu Widoretno
1),2) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang Email : 1) alfianbio.ub10@gmail.com, 2) wahyu_widoretno@yahoo.com

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh zat  pengatur  tumbuh yang  ditambahkan pada  media  terhadap  induksi  kalus  dan  regenerasi  tanaman bawang  merah  (Allium  ascalonicum L.) secara in  vitro. Kalus  diinduksi  dari  eksplan cakram  /basal stem menggunakan  media Murashige  dan Skoog  (MS)  dengan  penambahan  2,4-D konsentrasi  1,  2,  3  dan  4 mg/L. Kalus  dikultur pada  media  MS dengan penambahan NAA 0,1 mg/L dan beberapa konsentrasi kinetin (2, 3 dan 5 mg/L) untuk induksi tunas. Tunas disubkultur pada media MS + IBA 2 mg/L untuk membentuk plantlet. Penambahan 2,4-D pada media kultur mampu menginduksi pembentukan kalus pada eksplan, tetapi konsentrasi 2,4-D yang tinggi pada  media menghambat  pembentukan  dan  pertumbuhan  kalus serta menyebabkan  terjadi pencoklatan pada  eksplan.  Penambahan  kinetin  yang  dikombinasikan  dengan  NAA pada  medium mampu  menginduksi  tunas  bawang  merah  dari  eksplan  kalus. Peningkatan  konsentrasi  kinetin berpengaruh  terhadap  jumlah  tunas  yang  terbentuk  pada  kalus.  Konsentrasi  kinetin  2 mg/L mampu menghasilkan tunas lebih banyak dibandingkan dengan kinetin pada konsentrasi yang lebih tinggi (3 dan 5 mg/L). Plantlet bawang merah diperoleh setelah tunas disubkultur pada media yang mengandung IBA 2mg/L, akar mulai muncul setelah 6-8 minggu kultur.
Kata kunci : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, Allium ascalonicum, kinetin, NAA, kalus, plantlet

## ABSTRACT
This  research  objectives were  to determine the  effects  of  growth  regulator  in  culture  media to callus  induction  and  plantlet  regeneration  of Allium  ascalonicum. Induction  of  callus  was conducted  by culturing  basal stem explants  on Murashige  and  Skoog  medium  supplemented  with different concentration of 2,4-D (1, 2, 3 and 4 mg/L). Callus explant were cultured in MS medium supplemented with 0,1 mg/L NAA and different concentration of kinetin (2, 3 and 5 mg/L) to induce shoots. Shoots were subcultured in MS medium supplemented with 2mg/L IBA. Addition 2,4-D in culture media was able to induce callus formation, but 2,4-D concentration in culture medium inhibit the growth and formation of callus and caused browning on explants. Kinetin combined with 0.1 mg / L NAA was able to induce onion shoots on callus explants. Increasing  concentrations  of  kinetin  affected the  number  of shoots. Media containing 2 mg/L kinetin produced more shoots than the higher concentrations (3 and 5 mg / L). Shallots plantlet were achieved after shoots were subcultured in IBA 2 mg/L medium, roots begin to appears after 6-8 weeks of culture .
Keyword : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, Allium ascalonicum, kinetin, NAA, callus, plantlet

## PENDAHULUAN
Bawang  merah (Allium ascalonicum L). merupakan komoditas sayuran yang digunakan sebagai  penyedap  rasa  masakan  dan obat tradisional. Kebutuhan  bawang  merah  saat  ini semakin  meningkat,  namun  produksi  bawang merah  di  Indonesia  masih  kurang,  sebanyak 20%  dari  kebutuhan  bawang  merah  masih dipenuhi dengan impor bawang [1].
Perbanyakan bawang merah umumnya dilakukan secara konvensional dengan metode
perbanyakan  vegetatif  menggunakan  umbi. Bibit dari umbi seringkali memiliki kelemahan yaitu adanya  patogen virus yang  dibawa  dari induk,  akumulasi  patogen  dari  induk  akan diturunkan pada setiap generasi sehingga dapat mengakibatkan menurunnya produktivitas bawang merah [2].
Teknik kultur jaringan  merupakan  teknik yang  efisien untuk perbanyakan klonal tanaman. Teknik kultur jaringan juga memberi peluang  untuk terbentuknya  individu  dengan
karakter  unggul melalui induksi  variasi somaklonal atau teknik rekayasa genetika. Perbanyakan tanaman bawang merah
secara in  vitro telah  dilakukan  pada Allium cepa dan Allium  ascalonicum [2,3,4,5,6].
Metode  regenerasi  tunas pada  media dengan penambahan BAP atau  BAP  yang dikombinasikan dengan NAA
hanya menghasilkan 3-4  tunas  per  kalus [3]. Zat pengatur  tumbuh  sitokinin  dalam  hal  ini  BAP menunjukkan  hasil  yang  kurang  optimal. Penelitian oleh Khar [7] pada regenerasi tunas Allium  cepa menggunakan  zat  pengatur tumbuh kinetin 2 mg/L menunjukkan  hasil yang  lebih  baik  dengan  terinduksinya  5-8 tunas pada kalus,  sementara penggunaan BAP menghasilkan  pertumbuhan  tunas yang albino dengan  defisiensi  klorofil. Beberapa hasil penelitian menunjukkan  zat  pengatur  tumbuh NAA  dan  kinetin  dapat  memacu  regenerasi tunas  pada  beberapa  tanaman  kultur  bawang [4,5,7,8]. Oleh karena itu penggunaan kombinasi  NAA+kinetin  untuk  regenerasi tunas  bawang  merah  berpeluang untuk menghasilkan  regenerasi  secara in  vitro bawang merah. Diperolehnya metode regenerasi  bawang  merah  secara in  vitro akan mendukung  pengembangan  tanaman  bawang merah.
Penelitian ini  bertujuan untuk  mengetahui konsentrasi zat  pengatur  tumbuh 2,4-D yang tepat pada pembentukan  kalus  dan kombinasi NAA + kinetin untuk regenerasi tunas bawang merah secara in vitro.

## METODE PENELITIAN
Induksi  kalus. Umbi  bawang merah disterilisasi dengan dicelupkan  pada  alkohol 70%  dan  dibakar  pada  api  bunsen selama  15 detik. Umbi  yang  telah  steril  dikupas  dan diambil bagian cakram/ basal stem sebagai eksplan.
Eksplan
cakram/basal stem dikulturkan pada media Murashige dan Skoog (MS)  dengan  penambahan  hormon  2,4-D konsentrasi  1,  2,  3  dan  4 mg/L. Setiap perlakuan diulang  3  kali  (3  botol) dan  setiap botol dikultur 2  eksplan. Kultur diinkubasi selama  2  bulan dalam  suhu 24-25 o C dengan pencahayaan  600  lux selama  2  bulan.
Parameter  pengamatan  adalah  pembentukan dan  pertumbuhan  kalus  yaitu berat  basah  dan berat kering kalus.

## Induksi  tunas  dan  regenerasi plantlet
Eksplan  kalus dikultur  pada  media  MS  +  0,1 NAA dan beberapa konsentrasi  kinetin  (2,  3 dan  5 mg/L) untuk  menginduksi  tunas. Setiap perlakuan  diulang sebanyak  3  kali (3  botol) setiap  botol  dikultur  sebanyak  0,1  g  kalus. Kultur diinkubasi  dengan  intensitas  cahaya 600  lux pada  suhu  25-26 0 C  selama  tiga  bulan sehingga dihasilkan  mata-mata  tunas. Mata tunas  yang  terbentuk disubkultur 2  kali untuk pemanjangan  tunas. Pengamatan  dilakukan meliputi  jumlah  tunas  yang  terbentuk  pada kalus setelah kultur selama 3 bulan.
Tunas yang  telah  terbentuk  dikultur pada media MS dengan penambahan hormon IBA 2 mg/L untuk  induksi  akar.  Kultur  diinkubasi pada  suhu  25-26 o C dengan  pencahayaan  600 lux selama  2  bulan hingga  terbentuk  plantlet bawang merah.
Analisis data. Data  dianalisis  dengan ANOVA  (Analysis  of  Variance), bila  terdapat perbedaan  yang  signifikan dilanjutkan  dengan uji Duncan pada selang kepercayaan 95% (α = 0.05).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Induksi kalus. Eksplan cakram/ basal stem yang dikultur pada media dengan penambahan zat pengatur tumbuh 2,4-D mampu membentuk kalus mulai  minggu  ke  4
inkubasi. Kalus yang terbentuk berwarna putih kekuningan dan  bertekstur  kompak. Induksi dan  pertumbuhan  kalus  dipengaruhi  oleh konsentrasi 2,4-D. Zat pengatur tumbuh 2,4-D 2 mg/L pada  media  mampu  menginduksi eksplan basal  stem untuk  membentuk  kalus lebih  baik  dibandingkan  konsentrasi  2,4-D lainnya, zat  pengatur  tumbuh 2,4-D  dengan konsentrasi  tinggi  (3  dan 4 mg/L)  pada  media menghambat pertumbuhan kalus dan menyebabkan  pencoklatan  (browning)  pada eksplan (Gambar 1 C dan D).
Penambahan 2,4-D pada media kultur dapat berpengaruh pada berat basah dan berat kering kalus. Berat  basah  dan  berat  kering  kalus tertinggi terdapat pada media dengan penambahan  2,4-D 2 mg/L. Penambahan
2,4-D lebih tinggi  dapat  menyebabkan berat basah  dan berat  kering  kalus  semakin menurun,  bahkan  penurunan  mencapai  86% pada  pemberian  2,4-D  konsentrasi  4 mg/L (Gambar  2). Demikian  juga  jika  konsentrasi 2,4-D  dalam  medium  rendah  kurang  dari  2
mg/L, pertumbuhan kalus juga belum optimum.
Gambar  1. Pertumbuhan  kalus  dari  eksplan  yang dikultur  pada  medium  dengan  konsentrasi  2,4-D yang  berbeda. (A)  1 mg/L (B) 2 mg/L (C)  3 mg/L (D) 4 mg/L.
Gambar 2. Pengaruh  konsentrasi  2,4-D  terhadap berat  basah  dan  berat  kering  kalus  bawang  merah. Keterangan:  huruf  yang  sama  pada  setiap  variabel menunjukkan  tidak  beda  nyata  pada  uji  Duncan (α=0.05)
Kalus  merupakan  proliferasi  massa  sel meristematik yang  belum  terdiferensiasi. Kalus  dapat  diinduksi  secara in  vitro dengan penambahan zat  pengatur  tumbuh  auksin  atau kombinasi  auksin  dan  sitokinin. Induksi  kalus dipengaruhi  oleh  rasio  auksin  dan sitokinin yang seimbang, sehingga diperlukan kombinasi  yang  tepat  agar dapat  menginduksi pembentukan kalus yang optimal. Zat pengatur tumbuh 2,4-D berperan  dalam meningkatkan aktivitas  pembelahan  sel pada  jaringan. Penambahan  2,4-D pada  media  kultur  dapat menginduksi  terbentuknya  kalus  namun pada konsentrasi  yang  tinggi dapat  menghambat pembentukan  kalus dan dapat menyebabkan terjadi pencoklatan pada eksplan [9].
Penggunaan  2,4-D  untuk  menginduksi  kalus telah  dilakukan  pada  eksplan cakram/basal stem dan  embrio Allium  cepa [4,5,7],  eksplan meristem A.sativum [3,9]  dan  eksplan  daun dan biji A.ampeloprasum [8]. Kisaran konsentrasi  2,4-D  yang  mampu  menginduksi
kalus pada eksplan cakram/basal stem bawang merah  antara 0,5-5 mg/L,  namun penambahan 2,4-D  konsentrasi  5 mg/L menurunkan persentase  pembentukan  kalus hingga 17% [4,7]. Induksi Tunas dan Regenerasi Plantlet. Eksplan  kalus yang  dikultur pada  media dengan  penambahan  NAA  0,1 mg/L dan kinetin mampu  membentuk mata tunas (Gambar 3 A). Mata tunas mulai muncul pada eksplan  kalus setelah 5-6  minggu kultur.
Peningkatan  konsentrasi  kinetin  berpengaruh terhadap waktu  muncul  dan  jumlah  tunas. Kinetin  dengan  konsentrasi  tinggi  3  dan  5 mg/L menghambat  terbentuknya mata tunas pada eksplan kalus.
Jumlah mata tunas  terbanyak terbentuk dari kalus yang  dikultur  pada  media dengan penambahan  kinetin  2 mg/L. Peningkatan konsentrasi kinetin pada media kultur menurunkan secara  signifikan jumlah  tunas yang  terbentuk pada  eksplan (Gambar 4). Mata-mata  tunas  yang  muncul  dikultur  pada media NAA 0,1 mg/L + kinetin 2 mg/L untuk pemanjangan tunas (Gambar 3 B). Tunas  dipindahkan  pada  media  yang mengandung zat pengatur tumbuh IBA 2mg/L untuk  regenerasi  plantlet. Tunas mampu membentuk akar pada media yang mengandung  IBA 2 mg/L setelah  6-8  minggu kultur (Gambar  3 C). Penambahan  IBA dengan  konsentrasi  2 mg/L menunjukkan respon terbaik dalam menginduksi akar Allium ascalonicum L.  Zat  pengatur  tumbuh IBA merupakan  salah  satu jenis auksin  dan  umum digunakan untuk  induksi  akar  secara in  vitro pada beberapa tanaman.
Gambar 3.  Pembentukan  tunas  dan  regenerasi
plantlet bawang merah (A) Muncul mata tunas (B) Pemanjangan Tunas (C) Regenerasi plantlet
Gambar 4. Pembentukan tunas pada eksplan kalus bawang  merah  yang  dikultur  pada  media  dengan variasi  kinetin. Keterangan:  huruf yang  sama menunjukkan  tidak  beda  nyata  pada  uji  Duncan (α=0.05)
Zat  pengatur  tumbuh  auksin  dan  sitokinin berperan  penting  dalam  regenerasi  tanaman secara  umum,  auksin  mampu  menginduksi proliferasi  dan  pertumbuhan  kalus,  sedangkan sitokinin  lebih  berperan memacu  regenerasi pemanjangan  dan  pertumbuhan  tunas [3].
Regenerasi  tanaman  melalui  eksplan  kalus dipengaruhi  oleh  auksin  dan  sitokinin  pada kalus  yang  menentukan  arah  diferensiasi.
Kombinasi NAA dan kinetin dapat menginduksi  munculnya  mata  tunas  pada eksplan kalus tanaman Ipomoea obscura [10]. Peningkatan  konsentrasi kinetin pada  media dapat  menghambat  waktu  muncul  tunas  pada eksplan kalus Allium cepa [4] dan tunas Allium sativum [11].

## KESIMPULAN
Pertumbuhan  kalus  dan  regenerasi  tunas dipengaruhi  oleh  konsentrasi  zat  pengatur tumbuh  dalam  media  kultur.  Pertumbuhan kalus  terbaik  terdapat  pada  media  MS  dengan penambahan  2,4-D  2 mg/L.  Peningkatan konsentrasi  2,4-D  yang  tinggi  menyebabkan pencoklatan/browning pada eksplan.
Regenerasi  tunas  terbaik dihasilkan pada media dengan kombinasi zat pengatur tumbuh NAA 0,1 mg/L + kinetin 2 mg/L. Peningkatan konsentrasi  kinetin  menurunkan  jumlah  tunas yang terbentuk pada kalus.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Suhendra.  2014.  Ini  Alasan  Indonesia
Harus  Tetap  Impor  Bawang  Merah. htttp://finance.detik.com/read/2014/05/06/ 134735/2574622/4/ini-alasan-indonesia- harus-tetap-impor-bawang-merah
[2] Budiyono, J.P. 2012. Multiplikasi In vitro Tunas Bawang Merah (Allium
ascalonicum l.)  pada  Berbagai  Taraf
Konsentrasi Air Kelapa. Jurnal Agronomi 8(2):75-80 [3] Dixit,  V.,  S.  P.  Rai  &  B.  R.  Chaudary.
2013. Allium    sativum:    Four-Step
Approach  to  Efficient  Micropropagation. Int.  J. Innov. Biol. Res. 2(1): 6-14. [4] Hailekidan,  B.,  M.  Andargie.  &  K. Assefa. 2013. In vitro Plantlet Regeneration  from  the  Bulbs  of  Shallot (Allium  cepa Var.  Group  Aggregatum). Research in Plant Sciences 1 (2): 45-52 [5] Marinangeli,P., D. Zappacosta,
C.Galmarini & N. Curvetto. 2005. Callus
Induction  and  Plant  Regeneration  in Onion  (Allium  cepa L.). Acta  Hortic 688 :301-308
[6] Hidayat,  I.M.  2005. In  vitro Plant Regeneration  and  Bulbet  Formation  of Shallots  (Allium  ascalonicum L.). Acta Hort. 688:251-258
[7] Khar,  A.,  B.  Ramdhan.,  Y.  Neelam. & V.K. Chowdhury. 2005. Effect of explant and  genotype  on  callus  culture  and Regeneration  in  onion  ( Allium  cepa l.). Akdeniz üniversitesi ziraat fakültesi dergisi 18(3): 397-404
[8] Monemi,    M.    B.,    S.    K.    Kazemitabar, G.  B.Khaniki, E. Yasari, F. Sohrevardi & R.Pourbagher.    2014.    Tissue    Culture Study    of    the    Medicinal    Plant    Leek (Allium    ampeloprasum L.). IJMCM. 3(2):1-8
[9] Salam,  M.  A.,  M.  R.  Ali,  Md.  E.  Ali,  K. A.Alam,  M.  S.  H.  Reza,  S.  Salam  & S.M.    M.    Rahman.    2008.    Callus Induction    and    Regeneration    of Indigenous  Garlic  (Allium  sativum  L.).
Am. J. Plant Physiol 3(1): 33-39
[10] Mungole,  A.,  R.  Awati.,  S.  Dey.,  A. Chaturvedi.  &  P.  Zanwar.  2009. In-vitro callus induction and shoot regeneration in Ipomoea  obscura (L.):  potent  Indian medicinal plan. Indian Journal of Science
and Technology 2(8): 24-26
[11] Gull,I.,  N.Asma., A.Shahbaz., A.Amin. 2014.    Comparative  effect  of  different pyhtohormones  on  the  micropropagation of Allium sativum . Pak. J. Biochem. Mol. Biol 47(1-2): 121-124.