Ekspresi dan kloning gen penyandi ADP-Glucose Phyrophosphorylase dari tanaman sagu ( Metroxylon sagu Rottb.)
Expression and cloning of gene encoding ADP-Glucose Phyrophosphorylase from sago palm (Metroxylon sagu Rottb. )
Asmini BUDIANI 1)*) , Riza Arief PUTRANTO 1) , Hayati MINARSIH 1) , Imron RIYADI 1) , SUMARYONO 1) & Barahima ABBAS 2 )
1) Pusat Penelitian Bioteknologi dan Bioindustri Indonesia, Jl. Taman Kencana No.1 Bogor, Indonesia
2) Pusat Penelitian Ubi-ubian dan Sagu, Universitas Negeri Papua, Jl. Gunung Salju, Amban, Manokwari 98314, Papua Barat, Indonesia
Diterima tanggal 15 Juni 2015/disetujui tanggal 1 September 2015

## Abstract
Sago  palm (Metroxylon  sagu Rottb.)  is  a potential food and energy resources becouse it is the highest  starch  producing  plant.    Breeding  of  sago palm  should  be  directed  to  produce  elite  genotype with superior characters such as high starch content, wider  pith  diameter,  without  spine  and  high  starch quality.  However,  research  on  sago  palm  in Indonesia  so  far  is  limited  espescially  in the  field  of cultivation  and  breeding,  and  attempt  to  produce such  elite  would  take  long  time.  Availability  of molecular  marker  for  starch  content  would  be beneficial  to  shorten  the  length  period  of  breeding. ADP-Glucose  Phyrophosphorylase  is  one  of  the important  enzymes  in  starch  biosynthesis.  Therefore its gene is an interesting subject in order to develope molecular  marker  of  high  starch  content.    This research  was  aimed  to  study  the  expression  of  gene encoding  AGP  in  the  sago  palm  with  high  starch content  versus  low  starch  content,  and  to  clone  the full cds of the gene. RNA was isolated from leaf and pith of both palms. Exspression analysis and amplify- cation  of  full  cds  were  conducted  by  Reverse Transcryptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) using  specific  primers.  The  results  showed  that  sago palm  with  higher  starch  content  expressed  AGP higher  than  that  of  sago  palm  with  lower    starch content. Expression of AGP in the full developing leaf was higher than in the young leaf, and there was no expression  detected  in  the  pith.  The  full  cds  of  AGP was  successfully  amplified  and  cloned.  Even  though the DNA sequence showed high  homology with DNA sequence of the same gene that has been deposited in GenBank,  there  were  differences  in  severall nucleotide  including that in the active domain of the enzyme.
[ Keywords: Metroxylon  sagu ,  starch  content, expression analysis, active domain ]
*) Penulis korespondensi: asminib@yahoo.com

## Abstrak
Tanaman  sagu  merupakan  sumber  pangan  dan energi  yang  sangat  potensial  untuk  dikembangkan karena  merupakan  tanaman  penghasil  karbihidrat tertinggi.  Pemuliaan  tanaman  sagu  mestinya  diarah- kan  untuk  menghasilkan  bibit  sagu  yang  selain memiliki  rendemen  pati  tinggi,  juga  memiliki diameter  empulur  besar,  tidak  berduri  dan  memiliki cita rasa pati yang enak. Namun, sampai saat ini riset mengenai  sagu  di  Indonesia  masih  sangat  terbatas, sehingga  pemuliaan  sagu  untuk  menghasilkan  bibit unggul  demikian  akan  memerlukan  waktu  lama. Ketersediaan  penanda  rendemen  pati  akan  sangat membantu mempercepat pemuliaan tanaman tersebut. ADP-Glucose  Pyrophosphorylase  adalah  salah  satu enzim  yang  berperan  penting  dalam  biosintesis  pati, sehingga  gene  penyandinya  merupakan  subjek  yang menarik dalam pengembangan marka kandungan pati tinggi.    Sebagai  bagian  dari  upaya  untuk  mendapat- kan penanda rendemen pati tinggi pada tanaman sagu, penelitian  ini  bertujuan  untuk  mempelajari  ekspresi gen penyandi AGP. RNA diisolasi dari daun tanaman sagu  rendemen  pati  rendah  dan  tanaman  sagu rendemen pati tinggi. Perbedaan tingkat ekspresi gen penyandi  AGP  dari  tanaman  sagu  rendemen  pati tinggi  vs  rendemen  pati  rendah,  dianalisis  dengan teknik  Reverse-Transcryptase  PCR  menggunakan primer spesifik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tanaman  sagu rendemen  pati tinggi  mengekspresikan AGP lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman sagu rendemen  pati  rendah.  Ekspresi  gen  tersebut  pada daun  tua  ( full  developing  leaf )  lebih  tinggi  di- bandingkan  dengan  pada  daun  muda,  dan  pada empulur tidak dideteksi ekspresi gen tersebut. Daerah penyandi  lengkap  AGP  subunit  kecil  telah  diklon. Meskipun  memiliki  homologi  yang  tinggi  dengan sekuen  DNA  gen  yang  sama  yang  telah  dideposit pada  GenBank,  namun terdapat perbedaan beberapa
76
Ekspresi dan kloning gen penyandi ADP-Glucose Phyrophosphorylase dari ….. (Budiani et al .)
nukleotida  termasuk  pada  daerah  domain  aktif  dari enzim tersebut.
[Kata  kunci: Metroxylon  sagu ,  kandungan  pati, analisis ekspresi, domain aktif]

## Pendahuluan
Tanaman  sagu  ( Metroxylon  sagu Rottb.) merupakan  sumber  pangan  dan  energi  yang  sangat potensial,  karena  merupakan  penghasil  karbohidrat tertinggi,  yaitu  15-25  ton  pati  kering/Ha/Th  (Flach, 1997, Tenda et al. , 2009). Luas areal tanaman sagu di dunia  lebih  kurang  dua  juta  hektar,  dan  sekitar  60% areal  sagu  dunia  berada  di  Indonesia,  90%  di antaranya  tersebar  di  Papua  dan  Papua  Barat (Novarianto, 2013). Meskipun memiliki potensi besar sebagai  sumber  pangan  dan  energi,  dan  telah  lama menjadi  bahan  makanan  pokok  bagi  sebagian  besar penduduk  Indonesia  bagian  Timur,  namun  riset terkait  dengan  budidaya  dan  pemuliaan  tanaman  ini jauh tertinggal dibandingkan dengan tanaman pangan maupun  perkebunan  lain.  Sejauh  ini  riset  terkait tanaman  ini  lebih  banyak  dilakukan  pada  aspek hilir seperti  pengolahan  dan  pemanfaatan  pati  sagu (Ngampongsai  &  Chanjula,  2009)  dan  limbahnya (Awg-Adeni et al. , 2010), hingga keamanan pati sagu sebagai  bahan  pangan  (Greenhill,  2006).  Untuk mengatasi keterbatasan bibit yang diperlukan, Riyadi et al. (2005) dan Sumaryono et al. (2009) melaporkan hasil  perbanyakan  klonal  tanaman  ini  melalui embryogenesis  somatik.  Abbas et  al (2009)  mem- pelajari  hirarki  dan  diferensiasi  genetik  serta hubungan  kekerabatan  genetik  tanaman  sagu  di Indonesia  menggunakan  teknik  RAPD.  Sedangkan hubungan  antara  distribusi  geografis  dengan  jarak genetik  tanaman  sagu  dilaporkan  oleh  Ehara  (2003). Dalam  bidang  molekuler,  Wee  &  Roslan  (2012) mengkonstruksi pustaka cDNA dan analisis EST dari daun muda tanaman sagu. Hasil analisis sekuen DNA menunjukkan  bahwa  mayoritas  transkript  yang dihasilkan  terlibat  dalam  metabolisme  primer  dan toleran stress.
Keragaman  tanaman  sagu  yang  tersebar  di Indonesia dapat dikelompokkan berdasarkan beberapa  karakter,  yaitu  tinggi  rendahnya  rendemen pati,  kualitas  (rasa)  pati,  ketebalan  empulur,  dan berduri  atau  tidak  berduri.  Sebagaimana  pada tanaman  tahunan  lainnya,  pemuliaan  pada  tanaman sagu  untuk  menghasilkan  bibit  unggul  dengan beberapa  karakter  terpilih  seperti  tidak  berduri, memiliki  diameter  batang  besar  dengan  rendemen pati  tinggi  akan  menghadapi  berbagai  kendala,  salah satunya  adalah  lamanya  masa  seleksi.  Aplikasi Marker  Assisted  Selection (MAS)  dalam  pemuliaan sagu  dapat  membantu  mempercepat  masa  seleksi, sehingga  usaha  perakitan  bibit  unggul  dapat dilakukan dengan lebih cepat. Pemilihan marka untuk
suatu  karakter  spesifik  merupakan  tahapan  yang penting,  dan  dilakukan  dengan  berbagai  pertimbang- an  seperti  seberapa  jauh  pengetahuan  biokimia  dan biologi molekuler yang mendasarinya telah diketahui.
Pati  ( starch )  disintesis  dalam  plastid  (Martin  & Smith,  1995)  melalui  serangkaian  reaksi    yang  me- libatkan  tiga  enzim  utama  yaitu:  (1) ADP-glucose pyrophosphorylase  (AGP);  (2)  starch  synthase  (SS); dan  (3)  starch  branching  enzyme  (SBE).  AGP berperan  mengkatalisis  reaksi  pembentukan  ADP- glucose  dari  Glucose-1P.SS  mengkatalisis  pem- bentukan  pati  dari  ADP-Glucose  melalui  pem- bentukan ikatan  (1-4)  antara  ujung  nonreduksi ( nonreducing  end )  dari  satu  rantai  glucan  dengan gugus glucosyl dari ADP-glucose dengan melepaskan satu  molekul ADP.  Sedangkan  SBE  menghasilkan ikatan  ά-(1,6)-dengan  memutus  ikatan  ά-(1,4)- internal  dan  mentransfer  ujung  tereduksi  yang dilepaskan  ke  C6  hidroksil  untuk  menghasilkan struktur  bercabang  molekul  amylopectin  (Tetlow et  al . , 2004).AGP  dari  tanaman  merupakan  enzim heterotetramer  yang  terdiri  dari  dua  subunit  besar (AGP-L)  dan  dua  subunit  kecil  (AGP-S)  (Martin  & Smith, 1995).
Studi  pada  berbagai  tanaman  menunjukkan bahwa  AGP  merupakan  enzim  pengontrol  aliran (‘flux’)  ke  dalam  biosintesis  pati  (Loong,  2001)  dan reaksi  yang  dikatalisisnya  merupakan  tahapan penentu  pertama  pada  biosintesis  pati (Tetlow et  al . , 2004). Satu cDNA lengkap dan  3 cDNA parsial AGP telah  diisolasi  dari  tanaman  sagu  (Loong,  2001).  Di samping mempengaruhi jumlah pati yang dihasilkan, AGP  juga  mempengaruhi  komposisi  pati.  Mutasi pada  kacang  polong  yang  mempengaruhi  subunit besar dilaporkan menurunkan produksi total pati dan mengubah  kualitas  pati  dengan  meningkat-nya proporsi  amylopectin  (Martin  &  Smith,  1995). Meskipun  demikian,  berdasarkan  hasil-hasil  peneli- tian  lain,  Martin  &  Smith  (1995)  mengemukakan bahwa komposisi pati tidak semata-mata dipengaruhi oleh aktivitas AGP, tetapi merupakan hasil akhir dari keseluruhan  tahapan  biosintesis  pati.  Over  ekspresi AGP  pada  gandum,  padi  dan  jagung  dilaporkan meningkatkan  produksi  dan  jumlah  biji,  yang  mem- buktikan  bahwa  AGP  menentukan  akumulasi  pati secara keseluruhan (Geigenberger, 2011).
Berdasarkan  publikasi  hasil  penelitian  pada berbagai  tanaman  diduga  AGP  merupakan  enzim kunci  yang  menentukan  kandungan  pati  pada tanaman  sagu.  Aktivitas  AGP  ditentukan  oleh ekspresi  gen  penyandinya,  sedangkan  ekspresi  suatu gen  dikontrol  melalui  beberapa  mekanisme,  yang pada  umumnya  melibatkan  sekuen  DNA  daerah  5’ upstream  (promoter)  dari  gen  tersebut.  Oleh  karena itu  sebagai  langkah  awal  dari  penelitian  untuk mendapatkan  marka  rendemen  pati  pada  tanaman sagu,  penelitian  ini  bertujuan untuk mengamplifikasi
fragmen  gen  penyandi  AGP  dan  mempelajari ekspresinya pada tanaman sagu rendemen pati tinggi dan rendemen pati rendah.

## Bahan dan Metode
Pemilihan  tanaman  sagu  sebagai  bahan  penelitian dan analisis kandungan pati
Tahap awal dari penelitian ini adalah menentukan tanaman  yang  akan  digunakan,  yaitu  dua  jenis tanaman sagu dengan rendemen yang berbeda, tinggi dan  rendah.  Sampel  tanaman  sagu  diambil  dari koleksi  BPPT  di  Bogor.  Tanaman  sagu  yang  dipilih untuk analisis  pati  adalah tanaman  yang  sedang  aktif mensintesis pati. Bahan tanaman yang telah diperoleh dikonfirmasi  kembali  kandungan  patinya.  Analisis kandungan  pati  pada  batang  tanaman  dilakukan dengan  metode  Anthron  yang  dimodifikasi  sebagai- mana dilaporkan oleh Tjasadihardja (1987).

## Isolasi RNA total
Daun sagu yang digunakan sebagai sumber RNA adalah  daun  yang  telah  berkembang  penuh  dan diambil  dari  tanaman  yang  sedang  aktif  mensintesis pati.  RNA  total  diisolasi  dari  jaringan  daun  dan empulur  sagu  menggunakan  prosedur  hasil  modi- fikasi  dari  metode  Chang et  al .  (1993),  sebagaimana dilaporkan oleh Budiani et al. (2006). Integritas RNA hasil isolasi dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarosa  1%.  Elektroforesis  dilakukan  pada  tegangan 50  volt  selama  satu  jam.  Setelah  selesai  elektro- foresis,  visualisasi  RNA  dilakukan  di  bawah penerangan  sinar  UV.  Kandungan  dan  kemurnian RNA dianalisis secara spektrofotometri pada panjang gelombang  260  nm,  280  nm  dan  230  nm.  Kuantitas RNA  ditunjukkan  berdasarkan  serapannya  pada 260 nm.  Kemurnian  RNA dari  protein ditunjukkan oleh nilai ratio A 260 / A 280 , sedangkan kemurnian RNA dari senyawa lainnya seperti polisakarida ditunjukkan oleh nilai A 260 / A 230.

## Perancangan Primer
Dari  studi  bioinformatika  diperoleh  informasi sekuen DNA lengkap dari gen AGP subunit kecil dan sekuen  DNA  parsial  dari  gen  AGP  subunit  besar. Berdasarkan  sekuen  tersebut  dirancang  primer  untuk analisis ekspresi AGP subunit kecil dan AGP subunit besar.,  serta  untuk  amplifikasi  cds  lengkap  penyandi AGP  subunit  kecil.  Perancangan  primer  dilakukan dengan  program  Primer3  yang  dapat  diakses  secara online ( http://www.biotools.umassmed.edu/ ).
Reverse-Transcryptase PCR untuk analisis ekspresi
Ekspresi  gen  AGP  pada  sagu  rendemen  pati tinggi  dan  rendemen pati  rendah  dianalisis  secara
kualitatif    dengan Reverse  Transcryptase  PCR (RT- PCR)  menggunakan  primer  spesifik  yang  telah dirancang sebelumnya (Tabel 1, primer 5/6, 7/8, 9/10, 11/12,  dan  13/14).  Optimasi  kondisi  RT-PCR  akan dilakukan  untuk  mendapatkan  produk  amplifikasi yang  baik,  yang  meliputi  suhu annealing dan  jumlah siklus  amplifikasi.  Produk  RT-PCR  dianalisis  untuk mengkonfirmasi  bahwa  fragmen  tersebut  adalah bagian dari gen penyandi AGP.
Amplifikasi  dan  kloning cds lengkap  penyandi  AGP subunit kecil
Amplifikasi cds lengkap AGP  subunit kecil juga dilakukan  dengan  RT-PCR  menggunakan  primer spesifik.  Produk  RT-PCR  untuk cds lengkap  AGP subunit  kecil  dimurnikan  dari  gel,  diligasikan  pada plasmid  pGEM-T  easy,  kemudian  diinsersikan  ke dalam E.  coli kompeten . Sel E.  coli transforman kemudian  diseleksi  pada  media  seleksi  yang mengandung  IPTG  dan  X-Gal.  Koloni  putih  yang tumbuh  pada  media  seleksi  diklon  diisolasi, kemudian  dianalisis  adanya  sisipan  fragmen  DNA target.  Koloni  yang  telah  teruji  mengandung  sisipan DNA target, kemudian diisolasi plasmid rekombinan- nya  untuk  sekuensing  DNA.  Sekuen  DNA  yang dihasilkan  kemudian  dianalisis  untuk  mengetahui homologinya  dengan  gen  yang  sama  yang  telah terdeposit di GenBank .

## Hasil dan Pembahasan

## Sampel tanaman sagu
Berdasarkan analisis kandungan pati, baik sampel asal Bogor maupun asal Papua, telah  ditetapkan dua jenis  sampel  untuk  analisis  ekspresi,  yaitu  yang memiliki  rendemen  pati  tinggi  dan  tanaman  lainnya dengan  rendemen  pati  lebih  rendah.  Kedua  jenis tanaman tersebut untuk selanjutnya digunakan dalam preparasi  RNA  untuk  analisis  ekspresi,  sedangkan untuk  kloning  gen  AGP  hanya  dipilih  salah  satu sampel  yang  memiliki  rendemen  pati  tinggi.Data hasil analisis kandungan pati tidak ditampilkan.

## Primer spesifik dan analisis ekspresi AGP
Lima pasang primer untuk analisis ekspresi AGP dan dua pasang primer untuk amplifikasi cds lengkap penyandi  AGP  subunit  kecil,  beserta  susunan nukleotidanya  disajikan  pada  Tabel  1.  Pasangan primer  1/2  dan    3/4    untuk  amplifikasi  cds  lengkap penyandi  AGP    subunit  kecil,  pasangan  5/6  dan  7/8 untuk  analisis  ekspresi  AGP  subunit  kecil  kecil, sedangkan .tiga pasang primer lainnya untuk analisis ekspresi  AGP  subunit  besar.  Posisi  primer  terhadap sekuen gennya disajikan pada Gambar 1 dan Gambar 2.
Ekspresi dan kloning gen penyandi ADP-Glucose Phyrophosphorylase dari ….. (Budiani et al .)
Tabel 1.Primer yang digunakan untuk amplifikasi cds lengkap dan analisis ekspresi AGP.
Table1. Primers used for amplification of full cds and expression analysis of AGP.
No. No. Primer Primers Sekuen DNA DNA sequence Ukuran produk Product size 1 AGP-MS-F1 5'- CGAATTCCGCTCTTGAAAAC -3' 1628 pb 2 AGP-MS-R1 5'- CGTGAGGATGAACAA AGCAAG -3' 3 AGP-MS-F2 5'- ATGGCTGCTACCGGGATCTC -3' 1753 pb 4 AGP-MS-R2 5'- CTCGCGAGGGAAACTTATTTAG -3' 5 AGPS1 (F1) 5'- CAAGGAGCGTAATGTTCAGGC - 3' 324 pb 6 AGPS1 (R1) 5’-TCATAGGAATCGGCACCCATC - 3' 7 AGPS2 (F2) 5'- AGATCCTTCCATCAGCTGTCA - 3' 336 pb 8 AGPS2 (R2) 5'- AATCGGCACCCATCATCATG - 3' 9 AGPL10_F_234 5’-ACCCTTCTTCACATCGCCTA-3’ 240 bp 10 AGPL10_R_474 5’-TATGGGCACCTTACCCTCTG-3’ 11 AGPL19_F_250 5’CCACGGTTTTTACCACCAAC-3’ 232 bp 12 AGPL19_R_482 5’-CCAACACCAACTGGAACCTT-3’ 13 AGPL12_F_240 5’-CTTCACATCGCCTCGTTTTT-3’ 232 bp
14 AGPL12_R_472   5’-TTGGCACCTTACCCTCTGAC-3’
Gambar 1. Sekuen DNA tiga cds parsial penyandi AGP subunit besar (AGPP10, AGPP19, dan AGPP12) dari tanaman sagu yang telah terdeposit pada GenBank dan posisi primer.
Figure 1.   DNA sequences of three parsial cds AGP large subunit (AGPP10, AGPP19 and AGPP12) from sago  palm that have been deposited in GenBank and position of the primers.
Gambar 2. Sekuen DNA cds lengkap penyandi AGP subunit kecil dari tanaman sagu yang telah terdeposit pada GenBank dan posisi primer untuk amplifikasi cds lengkap.
Figure 2.   DNA sequence of complete cds AGP small subunit of sago palm deposited in GenBank and  position or primer for amplification of the complete cds.
Hasil  elektroforesis  pada  gel  agarosa  menunjuk- kan  bahwa  RNA  yang  diperoleh  memiliki  integritas yang  tinggi.  Analisis  spektrofotometer  juga  me- nunjukkan  kemurnian  RNA  yang  tinggi,  baik  ter- hadap  kontaminan  protein  (A260/A280)  maupun terhadap kontaminan polisakarida (A260/A230) (data tidak  disajikan),  sehingga  cukup  memadai  untuk digunakan dalam penelitian selanjutnya, yaitu analisis ekspresi maupun untuk isolasi gen. Dari lima pasang primer  yang  dirancang    untuk  analisis  ekspresi
(Tabel  1),  hanya  dua    primer  yaitu  AGPS2  dan AGPL-19    yang  menghasilkan  produk  amplifikasi. Elektroforesis  hasil  RT-PCR  dengan  kedua  primer tersebut  disajikan  pada  Gambar  2.  Dari  gambar tersebut,  dapat  dilihat  bahwa  primer  AGPS2  yang mengamplifikasi  fragmen  DNA  AGP  subunit  kecil menghasilkan  frgmen  DNA  dengan  ukuran  yang lebih  kurang  sama  dengan  ukuran  fragmen  DNA target,  yaitu  336  pb.  Primer  AGPL-19  yang  meng- amplifikasi  fragmen AGP  subunit  besar  menghasil-
Ekspresi dan kloning gen penyandi ADP-Glucose Phyrophosphorylase dari ….. (Budiani et al .)
kan  produk  dengan  ukuran  antara    200  –  300  pb sejalan dengan ukuran fragmen DNA target. Nampak bahwa produk amplifikasi dari kedua primer tersebut lebih intensif pada tanaman sagu rendemen pati tinggi dibandingkan dengan sagu rendemen pati rendah. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman sagu yang memiliki kandungan  pati  tinggi  mengekspresikan  gen  tersebut pada lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman sagu dengan kandungan pati rendah. Dari  gambar tersebut juga terlihat bahwa ekspresi AGP subunit besar pada daun tua, lebih tinggi dibandingkan dengan pada daun muda.  Sedangkan  pada  empulur,  tidak  dideteksi ekspresi gen terbut. Dari Gambar 2 juga dapat dilihat bahwa  primer  AGP-MS-F1  terletak  pada  basa  ke-22 dari  ATG  (Open  Reading)  dan  pasangannya  primer AGP-MS-R1 pada basa ke-1670 pada daerah 3'-UTR, sedangkan primer AGP-MS-F2 terletak pada basa ke- 01  dari  ATG  dan  pasangannya  primer  AGP-MS-R2 pada basa ke-1756 pada daerah 3'-UTR. Sekuen DNA produk sekuensing dua arah dari fragmen DNA hasil amplifikasi  dengan  primer  AGPL19  kemudian dianalisis  dengan  BlastN.  Hasilnya  menunjukkan bahwa fragmen tersebut adalah benar bagian dari gen penyandi AGP (Gambar 4).  Dengan cara yang sama, fragmen  hasil  amplifikasi  dari  sagu  rendemen  pati rendah  juga  disekuen  dan  dianalisis  dengan  BastN. Hasilnya  mengkonfirmasi  bahwa  fragmen  produk RT-PCR  tersebut  juga  merupakan  bagian  dari  gen AGP.  Terdapat  sedikit  perbedaan  pada  sekuen  DNA
antara  sagu  rendemen  pati  tinggi  dengan  sagu rendemen pati (data sekuen tidak ditampilkan).
Perbedaan  tingkat  ekspresi  AGP  (satu  subunit kecil  dan  satu  subunit  besar)  antara  tanaman  sagu rendemen pati tinggi dan rendemen pati rendah yang ditunjukkan pada hasil penelitian ini, dapat dijadikan dasar  untuk  mengkaji  lebih  lanjut  sekuen  DNA  gen terkait  maupun  sekuen  daerah  regulatori,  seperti promoter,  apakah  perbedaan  ekspresi  tersebut  terkait dengan perbedaan sekuen DNA pada daerah promoter atau bahkan pada daerah penyendinya.
Amplifikasi  dan  kloning cds lengkap  AGP  subunit kecil
Gambar  5A  menyajikan  hasil  amplifikasi cds lengkap AGP subunit kecil  dengan primer AGP-MS- F2/R2.  RT-PCR  dengan  pasangan  primer  AGP-MS- F1/R1  tidak  menghasilkan  fragmen  DNA.  Dari gambar  tersebut  dapat  dilihat  bahwa  ukuran  produk amplifikasi  lebih  kurang  sama  dengan  prediksi ukuran  fragmen  DNA  target  (±  1700  pb).  Fragmen produk  RT-PCR  tersebut  diklon,  dan  koloni  yang tumbuh  pada  media  seleksi  dianalisis  untuk mengetahui  adanya  fragmen  DNA  terklon  dengan PCR  koloni menggunakan  primer  yang  sama  dengan primer  untuk  RT-PCR  yaitu  AGP-MS-F2/R2.  Hasil PCR  koloni  menunjukkan  bahwa  fragmen  DNA target produk RT-PCR telah terklon (Gambar 5B).
.
Gambar 3.  Profil  elektroforesis  hasil  RT-PCR.(A)  menggunakan  primer    AGPS2_F/R.    lajur  1:  daun tanaman  sagu  pati  tinggi;  2:  daun,  tanaman  sagu  pati  rendah);  (B)  menggunakan  primer AGPL19_F/R.  Lajur  1  :  daun  tua  tanaman  sagu  pati  tinggi;  2  :  daun  tua  tanaman  sagu  pati rendah;3:  daun  muda  tanaman  sagu  pati  tinggi;  4:  daun  muda  tanaman  sagu  pati  rendah;  5: empulur  tanaman  sagu  pati  tinggi,  6:  empulur tanaman  sagu  pati rendah.  M: marker 1  kb  plus DNA ladder.  Bagian bawah adalah profil RNA dari setiap sampel.
Figure 3. Electrophoretic profile of RT-PCR product. (A) using primer AGPS2_F/R. Lane 1: mature leaf, high  starch  content;  2:  mature  leaf, low  starch  content;  3: young  leaf,  high  starch  content;  4: young leaf, low starch content; 5: pith, high starch content; 6: pith, low starch content. M: 1 kb plus DNA ladder marker. Underneath: RNA profile of each sampel.
500 pb A M               1            2 200.pb 500.pb B M         1           2           3           4           5           6 B
Gambar  4.  Hasil  analisis  Blast  sekuen  DNA  dari  produk  RT-PCR  sampel  daun  tanaman  sagu  rendemen  pati tinggi.
Figure 4.    Result of Blast analysis of DNA sequence of the RT-PCR product from leaf, high starch sago plant.
Gambar 5.  (A)  Profil  elektroforesis  hasil  RT-PCR  menggunakan  pasangan  primer  AGP-MS-F2/R2,  pada berbagai suhu annealing (lajur 1: 50 o C; 2:55 o C; 3:60 o C; 4: 62 o C; 5: 65 o C), (B) hasil PCR koloni E. coli hasil transformasi dengan produk RT-PCR.
Figure 5.  (A)  Electrophoretic  profile  of  RT-PCR  product  using  primer  pair  AGP-MS-F2/R2,  at  different annealing temperature  (lane  1:50 o C; 2:  55 o C; 3:  60 o C;  4: 62 o C;  5:  65 o C).  (B)  Result  of colony PCR of transformed E. coli using RT-PCR product.
Sekuensing  dan  analisis  DNA  menggunakan plasmid  rekombinan  yang  diisolasi  dari  koloni  yang telah teruji positif menunjukkan bahwa fragmen DNA terklon berukuran dengan ukuran 1756 pb, sedangkan daerah  coding  sequence  (ORF)  berukuran  panjang 1590  pb.  Untuk  mengetahui  lebih  jauh  ada  tidaknya perbedaan  sekuen  DNA  dan  asam  amino  terutama
pada  domain  aktif  dari  AGP,  dilakukan  analisis conserved domain database (CDD) pada situs NCBI. Hasil  analisis menunjukkan  bahwa  Gen AGP  terklon pada  penelitian  ini  memiliki  dua  domain  aktif  yaitu domain ADP-G  (No  domain  di  NCBI  cd02508)  dan LbH-G1P  (No  domain  di  NCBI  cd04651).  Terdapat perbedaan  basa   tunggal  (SNP,  Single  Nucleotide
A M        1       2      3      4       5 1500 pb A M        1         2 1500 pb B
Ekspresi dan kloning gen penyandi ADP-Glucose Phyrophosphorylase dari ….. (Budiani et al .)
Gambar 6. Penjajaran sekuen DNA cds AGP subunit kecil yang diperoleh pada penelitian ini dengan sekuen DNA dari Genebank serta posisi primer AGP-MS-F1/R1 dan AGP-MS-F2/R2.
Figure 6.    DNA sequence alignment of the cloned cds AGP small subunit with the same gene deposited on GenBank, and position of primers AGP-MS-F1/R1 dan AGP-MS-F2/R2.
Gambar 7.  Penjajaran  domain  aktif  sekuen  DNA  penyandi  AGP  subunit  kecil  dari  tanaman  sagu  yang diperoleh pada penelitian ini dan dari gen yang sama yang  di Genebank.
Figure 7.  Alignment of active domain of the DNA sequence encoding AGP small subunit produced from this research with that of the same gene deposited on the GenBank.
Polymorphysm)  pada  daerah  domain  aktif  MsAGP yang  menentukan  aktivitas  MsAGP  pada  tanaman sagu, yaitu pada basa ke-391 G/A yang menghasilkan asam  amino  berbeda,  G/R;  pada  basa  ke-600  C/T yang  tidak  merubah  asam  amino  (D);  pada  basa  ke- 984  A  dan  G  yang  juga  tidak  merubah  asam  amino (G);  dan pada  basa  ke  1043  G/A  yang  menghasilkan dua  asam  amino  berbeda  R/Q.  Secara  total  terdapat tujuh  perbedaan  basa tunggal  sepanjang  daerah CDS (termasuk di dalam domain aktif), yaitu pada basa ke- 174 (G/A) menghasilkan perubahan pada asam amino (R/K),  pada basa ke-1248 (A/T) yang tidak merubah asam  amino  (V),  pada  basa  ke-1384  (G/A)  meng- hasilkan perubahan asam amino (E/K).  Hasil analisis Blastn  dari  NCBI  terhadap  sekuen  Query  menunjuk- kan  99%  kesamaan  sekuen  nukleotida  dengan MsAGP  No  aksesi  AF395516.1.  Dari  alignment terdeteksi  beberapa  SNPs  yang  kemungkinan  me- nunjukkan  polymorphism  dari  query  dan  MsAGP NCBI.  Adanya  polymorphism  pada  daerah  aktif domain  AGP,  kemungkinan  akan  berpengaruh  ter- hadap  aktivitas  enzim  tersebut.  Perbedaan  isoform antara  sekuen  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini dengan  sekuen  yang  telah  terdeposit  pada GenBank kemungkinan  disebabkan  oleh  perbedaan  jenis/tipe tanaman sagu yang digunakan sebagai sumber gen.
Studi  mengenai  gen AGP  pada  berbagai  tanaman telah  dilaporkan.  Akihiro et  al. (2005)  melaporkan hasil  penelitiannya  mengenai  ekspresi  AGP  dan kandungan  pati  pada  kultur  sel  padi.  Pada  tanaman sagu,  studi  AGP  dilaporkan  oleh  Greenhill.  Hasil penelitian  ini  sejalan  dengan  yang  dilaporkan  oleh Greenhill  (2006),  namun  adanya  perbedaan  pada sekuen  DNA  menunjukkan  bahwa  gen  yang  diklon kemungkinan  menyandi  AGP  dengan  aktivitas  yang berbeda  dengan  yang  telah  dilaporkan  oleh  Greenhil (2006).

## Kesimpulan
Tanaman  sagu  rendemen  pati  tinggi  meng- ekspresikan  dua  gen  AGP,  yaitu  satu  gen  penyandi subunit  kecil  dan  satu  gen  penyandi  subunit  besar, lebih tinggi dibandingkan dengan pada tanaman sagu rendemen  pati  rendah.  Ekspresi  gen  tersebut  pada daun  tua  ( full  developing  leaf )  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  pada  daun  muda,  dan  pada empulur tidak dideteksi ekspresi gen tersebut. Daerah penyandi  lengkap  ( full  cds )  AGP  subunit  kecil  telah diklon  dan  sekuennya  telah  dikonfirmasi  memiliki 99%  kesamaan  dengan  gen  yang  sama  yang  telah dideposit  pada GenBank ,  tetapi  terdapat  perbedaan beberapa  basa  termasuk  pada  daerah  domain  aktif yang dapat mempengaruhi aktivitas AGP.
84
Ekspresi dan kloning gen penyandi ADP-Glucose Phyrophosphorylase dari ….. (Budiani et al .)

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada Kementerian  Riset  dan  Teknologi,  yang  telah mendanai penelitian ini melalui proyek penelitian kerjasama SINAS tahun 2014.

## Daftar Pustaka
Abbas B, BIintoro M. H, Sudarsono, Surahman M & Ehara H (2009). Genetic relationship of sago palm ( Metroxylon  sagu Rottb.)  in  Indonesia  based  on RAPD markers. Biodiversitas 10(4), 168 – 174.
Akihiro  T,  K  Mizuno  &  T  Fujimura  (2005).  Gene Expression  of  ADP-glucose  pyrophosphorylase and  starch  contents  in  rice  cultured  cells  are cooperatively  regulated  by  sucrose  and  ABA. Plant Cell Physiol 46(6), 937–946.
Awg-AdeniDS, S Abd-Aziz, K Bujang & MA Hassan (2010).  Bioconversion  of  sago  residue  into  value added  products. African  J  of  Biotechnol ,  9(14), 2016-2021.
Budiani  A,  D  Santoso,  H  Aswidinnoor,  A  Suwanto (2006). Aktivitas ACCase  mesokarp  kelapa  sawit dan  kloning  fragmen  gen  penyandi  ACCase subunit  biotin  karboksilase. Menara  Perkebunan. 74(1), 33-43.
Chang S, J Puryear & J Cairney (1993). A simple and efficient  method  for  isolating  RNA  from  pine trees. Plant Mol  Biol Rep 11, 98 – 100.
Ehara  H,  S  Kosaka,  N  Shimura,  D  Matoyama, O  Morita,  H  Naito,  C  Mizota,  S  Susanto, MH Bintoro & Y Yamamoto (2003).  Relationship between  geographical  distribution  and  genetic distance of sago palm in Malay Archipelago. Sago Palm 11, 8-13.
Flach  M  (1997). Sago  Palm Metroxylon  sagu Rottb.
Promoting the Conservationand Use of Underutilized  and  Neglected  Crops .  13 . Rome- Italy,  International  Plant  Genetic  Resources Institute. 76p.
Geigenberger  P  (2011).  Regulation  of  starch biosynthesis  in  response  to  a  fluctuating environment. Plant Physiol (155), 1566–1577.
Greenhill  (2006).  Food  safety  and  security  of  sago starch  in  rural  Papua  New  Guinea.  PhD. Thesis , James Coock University, Townville.
Loong  AS  (2001). Isolation  and  characterisation  of cdna  clones  encoding  ADP-Glucose  Pyrophos- phorylase  (AGP)  from  sago  palm  ( Metroxylon sagu ). Thesis. Master  Faculty  of  Food  Science and Biotechnology, Universiti Putra Malaysia.
Martin C & AM Smith (1995).  Starch Biosynthesis. The Plant Cell (7), 971-985.
Novarianto    H  (2013).  Sumber  daya  genetik  sagu mendukung  pengembangan  sagu  di  Indonesia dalam  penguatan  inovasi  teknologi  mendukung kemandirian usahatani perkebunan rakyat (Karmawati  E.,  Siswanto,  RS  Hartani,  IM Trisawa), hal 1 – 14.
Ngampongsai  W  &  P  Chanjula  (2009).  Effect  of different  levels  of  sago  palm  pith  on  nutrient utilization  in  Thai  native  cattle  fed  with plicatulum hay ( Paspalum plicatulum Michx.) and soybean  meal. Songklanakarin  J  Sci  Technol 31 (2), 117-124.
Riyadi  I,  JS  Tahardi    &  Sumaryono  (2005).  The development  of  somatic  embryos  of  sago  palm ( Metroxylon sagu Rottb.) on solid media. Menara Perkebunan 2005, 73(2), 35-43.
Sumaryono,  I  Riyadi    &  PD    Kasi    (2009).  Clonal propagation  of  sago  palm  ( Metroxylon  sagu Rottb.)  through  tissue  culture. J  Appl  Indust Biotech in Trop Region 2(1), 1-4.
Tenda  E,  H  Mangindaan  &  J  Kumaunang  (2003).
Eksplorasi  jenis-jenis  sagu  potensialdi  Sulawesi Tenggara. Dalam :  Prosiding  Seminar  Sagu untuk Ketahanan  Pangan,  Manado  6  Oktober  2003. Balai Penelitian Tanaman Kelapa dan Palma lain.
Tetlow  IJ,  MK  Morell  &  MJ  Emes      (2004).  Recent developments  in  understanding  the  regulation  of starch metabolism in higher plants. J Exp Bot 55,
(406),  2131–2145.
Tjasadihardja A (1987). Hubungan antara pertumbuh- an  pucuk,  perkecambahan  buah  serta  tingkat kandungan  asam  indol  asetat  di  dalam  biji  dan layu  pent il  kakao  ( Theobroma  cacao L.). Disertasi .  Bogor,  Fakultas  Pascasarjana  Institut Pertanian Bogor. Indonesia.  45p.
Wee  CC  &    HA  Roslan  (2012).  Expressed  sequence tags  (ESTs)  from  young  leaves  of Metroxylon sagu. Biotech 2, 211–218.