## SEKOLAH TINGGI KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN LABUHAN BATU
10

## PENENTUAN ANTOSIANIN DARI DAUN BAYAM MERAH ( Alternanthera amoena Voss.) SERTA ALIKASINYA SEBAGAI PEWARNA MINUMAN
Dini Hariyati Adam Pendidikan Biologi, STKIP Labuhan Batu, Jalan SM Raja No 126 A, Aek Tapa, Rantauprapat  email: Dini_adam89@yahoo.com

## Info Artikel
________________ Riwayat Artikel:
Diterima November 2016 Disetujui Januari 2017 Dipublikasikan Februari 2017 ________________

## Abstrak
___________________________________________________________________
Penelitian  tentang  penentuan  antosianin  dari  daun  bayam  merah  dan  aplikasinya sebagai pewarna dalam minuman telah dilakukan. Daun segar bayam merah ekstrak etanol  ditambahkan  0,1  M  HCl  dan  CH3COOH  25%  dan  etanol  tanpa  penambahan asam.  Ekstraksi  di  tempatkan  pada  tempat  gelap  selama  24  jam.  Ekstrak  diuji stabilitas  terhadap  pengaruh  konsentrasi,  pH,  suhu,  dan  kondisi  penyimpanan. Kemudian diidentifikasi oleh spektrofotometer UV-Vis dan lapisan tipis chromatografi (TLC). Hasil dari pengaruh konsentrasi menunjukkan bahwa jenis antosianin bayam merah  cyanidin,  yang  didasarkan  pada  nilai  absorbansi  maksimum  pada  290  nm (UV)  dan  536  nm  (terlihat).  Hasil  dari  efek  asam  tipe  menunjukkan  bahwa konsentrasi tertinggi antosianin. Monomer dan total antosianin berada di 0,1 M HCl, yang  memiliki  nilai  43,08  mg  /  L  dan  132,76  mg  /  L.  Hasil  dari  efek  pH menunjukkan ekstrak antosianin stabil pada pH 1-3, karena pada pH antosianin ini dalam bentuk kation flavilium. Suhu Efek menunjukkan bahwa antosianin berada di stabil  pada  suhu  60 o C,  karena  pada  suhu  ini,  degradasi  pewarna  adalah  25,14%. Kondisi  pengaruh  penyimpanan,  antosianin  stabil  dalam  penyimpanan  pada  suhu lemari es (± 4 o C), yang memiliki persentase degradasi adalah 4,91%. Dari TLC nilai Rf adalah 0,38. Ekstrak ini dapat diterapkan minuman dengan pH yang rendah.
Kata Kunci: Antosianin, Alternanthera amoena Voss, pewarna minuman.

## PENDAHULUAN
yang  bukan  digunakan  untuk  pangan  dan  bersifat karsinogen  semakin  marak  digunakan  produsen pangan  olahan  terutama  skala  industri  rumah tangga  mendapatkan  sorotan  pemerintah  (Natalia et  al .).  Oleh    karena  itu,  perlu  dicari  sumber pewarna  alamiyang  dapat  digunakan  dalam pengolahan  pangan  sehingga  dihasilkan  pewarna yang  aman.  Pewarna  sintetik  dapat  digantikan penggunaannya  dengan  pewarna  alami,  salah satunya  berasal  dari  daun  bayam  merah ( Alternanthera amoena Voss . ) karena menghasilkan  warna  merah  yang  dihasilkan  oleh pigmen  yang  bernama  antosianin    Antosianin merupakan  senyawa  kimia  yang  tesebar  luas  di alam sebagai zat warna dalam tumbuhan.
Pigmen  antosianin  larut  dalam  air  dan memiliki  warna  merah  muda,  merah,  ungu,  biru, dan  kuning  (Harborne  1987).      Secara  kimiawi antosianin  dapat  dikelompokkan  ke  dalam flavonoid.  Antosianin  dapat  ditemukan  diberbagai tanaman  di  alam  (Nazulis, et  al .  ,  2002). Antosianin  telah  banyak  digunakan  sebagai pewarna  khususnya  minuman.  Menurut  JEFCA ( Joint FAO/WHO Expert Committee  on  Food
Additives )  menyatakan    bahwa  ekstrak  yang mengandung antosianin mempunyai efek toksisitas yang  rendah,  dapat  mengurangi  resiko  penyakit jantung koroner, resiko stroke, aktivitas antikarsinogen, efek anti-inflammatorry, memperbaiki  ketajaman  mata  dan  memperbaiki perilaku  kognitif  (Ariviani,  2010)  dan  dapat diabsorbsi  dalam  bentuk  molekul  utuh  dalam lambung (santoni, et al ., 2013).
Sifat  antioksidan  dari  antosianin  yang terkandung dalam ekstrak mulberry, dimana aktivitas antioksidan pada spesies mulberry secara  umum  diperankan  oleh  senyawa fenolik khususnya antosianin. Mayoritas antosianin yang terdapat dalam mulberry adalah sianidin3-O- glukosida dan  sianidin-3-O-rutinosida, yang dilaporkan mempunyai efek menghambat terhadap migrasi  dan  invasi  pada sel  kanker  paruparu, sianidin-3-O-sophorosida (Turkan, 2009).

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  adalah  seperangkat  alat distilasi, rotary evaporator Heidolph WB 2000, plat
KLT,  spektrofotometer  UV-Vis  (UV-1700  Series)
Shimadzu,  kertas  saring  Whatman  No  1, alumunium  foil,  pH  meter,  termometer,  neraca analitik,  serangkaian  alat  vakum,  water  bath, aluminium  voil,  lampu  UV,  serta  peralatan  gelas yang umum digunakan dalam laboratorium.
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  daun  bayam  merah  segar,  dan  bahan- bahan  kimia  berupa  pelarut  organikseperti CH 3 CH 2 OH  teknis  yang  didistilasi,  akuades, CH 3 COOH  pekat,  HCl  pekat,  CH 3 COONH 4 ,  KCl,  I 2 , NH 4 Cl, dan NH 4 OH.

## Ekstraksi
Ekstraksi dimulai dengan menimbang daun bayam merah  sebanyak  100  gram  lalu  sampel  dipotong kecil-kecil.  Sampel  yang  telah  halus  dipindahkan ke  dalam  botol  gelap,  lalu  ditambahkan  pelarut etanol yang dibuat dalam suasana asam hingga pH 3 menggunakan jenis asam yaitu HCl 0,1 M, asam asetat 25% (v/v) serta tanpa menggunakan asam. Kemudian  dilakukan  proses  ekstraksi  secara maserasi pada temperatur kamar (± 30 o C) selama 24  jam  dalam  keadaan  gelap.  Kemudian  disaring sehingga didapatkan filtrat. Filtrat yang  diperoleh dipekatkan  dengan rotary  evaporator sehingga diperoleh  ekstrak  pekat  lalu  dianalisa  dengan spektroskopi  UV-Vis  dan  KLT.        Untuk  keperluan analisis  ekstrak  pekat  tersebut  disimpan  dalam botol tertutup yang  dilapisi dengan aluminium foil pada lemari esdengan suhu -4 o C.
Penentuan Kadar Total Antosianin Menurut Wrolstada, et al ., 2005 dan Giusti, et al ., 2001  kadar  total  monomer  antosianin  dan  kadar total  antosianin  dalamsampel  dapat  dihitung dengan menggunakan rumus:
A = (A 536 – A 700 ) pH 1,0 – (A 536 – A 700 ) pH 5,0
Konsentrasi monomer antosianin (mg/L) =
Dimana :  A’  =  ( A536 – A700) pH 1,0
Keterangan : E =  absorbsivitas  molar  sianidin-3-glukosida = 26900 L/mol.cm L =   lebar cuvet (1 cm) MW =   BM sianidin-3-glukosida = 449,2g/mol DF
=   faktor pengenceran

## Uji Kestabilan Antosianin
1. Pengaruh Konsentrasi
Ekstrak  pekat  antosianin  divariasikan  0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7% dan 0,9% (b/v)
2. Pengaruh pH
Stabilitas  ekstrak  pekat  antosianin  dibuat dalam  5  tingkat  keasaman  (pH  :  1,  3,  5,  7, dan 9)
3. Pengaruh Suhu
4. Sampel  dipanaskan  pada  temperatur  40,  60, 80 dan 100°C di water bath selama 30 menit.
5. Pengaruh kondisi penyimpanan Ekstrak antosianin disimpan pada temperatur kamar (± 30 o C) dan di kulkas (± 4 o C) selama 7  hari,  masing-masing  sampel  diletakkan dalam botol gelap.
Kemudian  masing-masing  ekstrak  di  analisis dengan  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis dengan  panjang  gelombang  200  -  800  nm.  Data yang  diperoleh  dibandingkan  dengan  data  yang terdapat pada literatur.

## Aplikasi pada Minuman
Ekstrak pigmen dicobakan pada minuman bersoda yang tidak berwarna dan susu fermentasi. Dengan cara menambahkan 0,9 g ekstrak pekat pada 100 mL  minuman  bersoda  yang  tidak  berwarna (aquaeous  pH  asam)  dan  susu  fermentasi.  Lalu dilihat perubahan warnanya.

## HASIL PENELITIAN
Ekstraksi  pigmen  dapat  dilakukan  dengan  cara maserasi  selama  24  jam  dalam  keadaan    gelap. Ekstraksi  senyawa  golongan  flavonoid  termasuk antosianin  dianjurkan  dilakukan  pada  suasana asam  karena  asam  berfungsi  mendenaturasi membran  sel  tanaman,  kemudian  melarutkan pigmen antosianin sehingga dapat keluar dari sel.
Hasil  ekstraksi  zat  warna  dari  daun  bayam merah menggunakan HCl 0,1 M didapatkan ekstrak berwarna  merah  tua,  ekstraksi  menggunakan CH3COOH  berwarna  ungu-kemerahan,  sedangkan ekstraksi  tanpa  menggunakan  asam  ekstrak berwarna  merah  kecoklatan.  Lalu  ekstrak  yang didapatkan dipekatkan dengan pompa vakum yang bertujuan  untuk  menguapkan  pelarut.  Sehingga didapatkan  ekstrak  pekat.  Selanjutnnya  ekstrak pekat  di  analisisamenggunakan  spektroskopi  UV- Vis dan KLT.
Hasil  percobaan  pendahuluan  menunjukkan bahwa  penggunaan  asam  klorida  menghasilkan konsentrasi  monomer  antosianin  dan  total antosianin  tertinggi  dibandingkan  dengan  asam asetat  dan  tanpa  menggunakan  asam.  Hal  ini dapat  di  lihat  pada  gambar  2  diatas,  dimana  HCl memberikan serapan tertinggi dibandingkan CH3COOH dan tanpa asam, ini disebabkan karena pada  HCl  antosianin  lebih  banyak  terekstrak
dibandingkan  dengan  asam  asetat  dan  tanpa asam.
Dari hasil di atas dapat di lihat bahwa  konsentrasi monomer  antosianin  dan  total  antosianin  terbesar yaitu  menggunakan  jenis  HCl  0,1  M  dimana konsentrasi  monomer  antosianin  yang  didapatkan sebesar  43,08  mg/L  sedangkan  total  antosianin sebesar  132,76  mg/L.  Tetapi  karena  ekstrak antosianin ini akan di aplikasikan sebagai pewarna alami maka digunakan jenis asam asetat. Perbedaan konsentrasi monomer antosianin dan  total  antosianin  yang  dihasilkan  untuk  setiap jenis  asam  berkaitan  erat  dengan  perbedaan tetapan  disosiasi  dari  masing-masing  jenis  asam. HCl  memiliki  tetapan  disosiasi  yang  lebih  besar dibandingkan  CH 3 COOH.  Tetapan  disosiasi  untuk HCl  10 7 dan  CH 3 COOH  1,75  x  10 -5 .Semakin  besar tetapan disosiasi semakin kuat suatu asam karena semakin  besar  jumlah  ion  hidrogen  yang dilepaskan ke dalam larutan.
Keadaan yang semakin asam akan menyebabkan semakin banyaknya pigmen antosianin  berada  dalam  bentuk  kation  flavilium yang  berwarna  hal  ini  disebabkan  karena terjadinya  denaturasi  membran  sel  tanaman  yang kemudian melarutkan pigmen antosianin dan dapat keluar  dari  sel  sehingga  pengukuran  absorbansi akan meningkat.

## Kadar Total Antosianin
Tabel 1 . Konsentrasi Monomer dan Total  Antosianin Daun Bayam Merah dengan Variasi Jenis Asam
Jenis Asam Konsentrasi monomer antosianin (mg/L) Tanpa asam 15,69 Etanol + CH 3 COOH 25% 30,73 Etanol + HCl 0,1 M 43,08

## Uji Kestabilan Pigmen Antosianin Pengaruh Konsentrasi
Gambar 7. Spektrum UV-Vis antosianin  dari daun bayam merah, dengan perbedaan konsentrasi. ( ) 0,1%,
( ) 0,3%, ( ) 0,5%, ( ) 0,7%, ( ) 0,9%
Hasil  pengamatan  dari  data  konsentrasi menunjukkan  bahwa  semakin  besar  konsentrasi maka absorban yang dihasilkan juga akan semakin tinggi.  Disini  berlaku  hukum  lamber-beer  dimana absorban berbanding lurus dengan konsentrasi.
Absorban tertinggi yaitu pada konsentrasi
0,9%  (b/v)  sebesar  0,529,  yang    dapat  dilihat pada  gambar  3.  Menurut  Qin,  2010;  Anis  ;
Markham,  1988,    antosianin  memiliki  nilai  λ  Maks yaitu  270-290 nm untuk daerah UV dan untuk di daerah  tampak  yaitu  465-560  nm.  Dari  spektrum di  atas  didapatkan  nilai  λ  maksimum  yaitu  pada daerah UV 290 nm dan pada daerah Vis yaitu 536 nm  yang  merupakan  senyawa  antosianin  berjenis sianidin  dimana  untuk  antosianin  berjenis  sianidin memiliki puncak serapan pada λ 290 nm untuk UV dan λ 536 nm untuk daerah tampak.

## Pengaruh pH
Gambar 8 . Spektrum UV-Vis antosianin  dari daun bayam  merah, dengan perbedaan pH. (   ) pH 1,  (   ) pH3, (   ) pH 5, (    ) pH 7, (    ) pH 9
Hasil  pengamatan  pada  pH  yang  berbeda memperlihatkan adanya kenaikan absorban dengan  menurunnya  pH  (semakin  asam)  seperti yang  ditunjukkan  pada  spektrum  gambar  8, Kestabilan  dari  pigmen  antosianin    sangat dipengaruhi  oleh  pH.  Antosianin  lebih  stabil  pada larutan  yang  bersifat  asam  dibandingkan  larutan yang bersifat netral mapun basa. Antosianin stabil pada  pH  1  –  3  dimana  semakin  rendah  nilai  pH maka  warna  yang  dihasilkan  semakin  pekat,
karena  pada  keadaan  ini  antosianin  berada  dalam bentuk kation flavilium (Samsudin et al ., 2008).
Pada  pH  5  warna  dari  antosianin  semakin berkurang  karena  antosianin  berubah  menjadi bentuk  karbinol.  Pada  pH  7  antosianin  berwarna merah  muda  berbentuk  kalkon  yang  tidak  stabil. Serta pada pH 9 antosianin berwarna kuning yang berbentuk  kuinoidal  yang  tidak  stabil.  Dimana perubahan  warna  dapat  dilihat  pada  pada  gambar di bawah ini :

## Pengaruh Temperatur
Pada  pengamatan  terhadap  stabilitas  warna antosianin  dari  daun  bayam  merah,  adanya pengaruh  temperatur  menyebabkan  terjadinya degradasi  warna  antosianin  yang  ditunjukkan terjadinya penurunan absorban, dimana perubahan absorban dapat dilihat pada gambar 6.
Pada  gambar  7,  pemucatan  warna disebabkan  karena  terjadinya  perubahan  struktur antosianin  sehingga  bentuk  aglikon  berubah menjadi karbinol (tidak berwarna).
Warna  antosianin  pada  daun  bayam  merah relatif  stabil  pada  pemanasan  hingga  temperatur 60 o C.  Karena  pada  suhu  ini  warna  antosianin hanya berkurang sekitar 25,14% selama pemanasan 30 menit. Sedangkan pemanasan pada suhu  80 o C  –  100 o C,  warna  antosianin  berkurang sekitar  58,5%  dan  87,52%.  Sehingga  pigmen antosianin  relatif  stabil  pada  suhu  rendah, degradasi  warna  yang  terjadi  dapat  dilihat  pada tabel 2.
Gambar  10. Spektrum  UV-Vis  antosianin    dari  daun  bayam  merah,  dengan  perbedaan  temperatur.  (      )  awal,  (      )  40 o C, (   ) 60 o C, (    ) 80 o C, (   ) 100 o C.
Gambar 7 . Perubahan warna akibat pengaruh temperatur
Tabel 2. Degradasi warna akibat pemanasan pada berbagai suhu
Temperatur Absorban (A) Degradasi warna (%)
30 o C 40 o C 60 o C 80 o C 100 o C 0,529 0,451 0,396 0,246 0,066 0 14,74 25,14 53,49 87,52
Keterangan : Pada tabel 2, hilangnya pigmen antosianin (degradasi warna) secara bertahap meningkat dengan meningkatnya temperatur.

## Pengaruh Kondisi Penyimpanan
Berdasarkan  pengamatan  terhadap  stabilitas antosianin bahwa kondisi penyimpanan juga dapat menyebabkan  terjadinya degradasi warna.  Kondisi penyimpanan  pada  temperatur  kulkas  (±  4oC) lebih baik dibandingkan dengan penyimpanan pada temperatur kamar (± 30oC).
Dari  data  di  atas  dapat  dilihat  bahwa penyimpanan  pada  temperatur  ±  4oC,  degradasi warna  yang  terjadi  hanya  sebesar  4,91  % sehingga  masih  mampu  mempertahankan  warna antosianin sekitar 95,09 % selama penyimpanan 7 hari.  Sedangkan  penyimpanan  pada  temperatur  ± 30oC mempercepat terjadinya degradasi antosianin  yang  mengubah  warna  antosianin menjadi  merah-kecoklatan.  Hal  ini  disebabkan karena  adanya  faktor  cahaya  yang  dapat mempercepat terjadinya proses degradasi antosianin tersebut. Penyimpanan pada temperatur ±  30oC  degradasi  yang  terjadi  sebesar  19,28  %. Sehingga  antosianin  lebih  baik  disimpan  di  dalam kulkas dibandingkan pada temperatur ruang.

## Aplikasi sebagai Pewarna Minuman
Ekstrak  pigmen  dengan  hasil  yang  terbaik ditambahkan  ke  dalam  minuman  bersoda  yang tidak  berwarna  dan  susu  fermentasi.  Pada minuman  bersoda  ekstrak  pigmen  larut  dengan sempurna.  Sementara  ektrak  pigmen  antosianin pada susu fermentasi menyebabkan susu menggumpal. Hal ini mungkin disebabkan karena
ekstrak  pigmen  memiliki  pH  asam  sehingga  dapat menggumpalkan  protein  pada  susu.  Oleh  karena itu  ekstrak  pigmen  ini  cocok  diaplikasikan  pada minuman yang memiliki pH asam seperti minuman soda yang tidak berwarna.
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa,
1. Berdasarkan pengaruh jenis asam bahwa  yang menghasilkan  konsentrasi  monomer  antosianin dan  total  antosianin  terbesar  yaitu  HCl  0,1  M sebesar 43,08 mg/L dan 132,76 mg/L.
2. Berdasarkan  pengaruh  konsentrasi,  semakin tinggi  konsentrasi  maka  semakin  tinggi absorban.  Absorban  tertinggi  yaitu  pada konsentrasi  0,9%  (b/v),  dengan  nilai    λ maksimum  536  nm  pada  daerah  tampak  dan 290  nm  pada  daerah  UV,  dimana    nilai  λ maksimum  ini  merupakan  antosianin  dengan jenis sianidin.
3. Ekstrak pigmen daun bayam merah stabil pada pH  1-3  yang  berada  dalam  bentuk  kation flavilium.
4. Berdasarkan  pengaruh  temperatur,  tingkat degradasi  warna  terbesar  yaitu  pada  suhu 100oC sebesar 87,52 %.
5. Berdasarkan  kondisi  penyimpanan  bahwa antosianin lebih stabil disimpan pada temperatur  kulkas  karena  pada  kondisi  ini degradasi warna hanya sebesar 4,91 %.
6. Setelah diaplikasikan sebagai pewarna minuman,  maka  ekstrak  antosianin  cocok digunakan  untuk  minuman  yang  memiliki  pH asam. Tabel 3 . Degradasi warna terhadap pengaruh kondisi penyimpanan Kondisi penyimpanan Absorban (A) Degradasi warna (%) Awal Temperatur kulkas (±4 o C) Temperatur kamar (±30 o C) 0,529 0,503
0,427
0
4,91 %
19,28 %
Gambar 8 . Aplikasi sebagai pewarna

## DAFTAR PUSTAKA
Anis,  Elfi. Identifikasi  dan  Uji  Kualitas  Pigmen  Kulit  Buah Naga  Merah  (Hylocareus  costaricensis)  pada
Beberapa  Umur  Simpan  dengan  Perbedaan  Jenis Pelarut.
Ariviani,  Setyaningrum.  2010.  Kapasitas    Anti  Radikal Ekstrak  Antosianin  Buah  Salam  (Syzygium Polyanthum)  Segar  Dengan  Variasi  Proporsi Pelarut. Jurusan Ilmu dan Teknologi Pangan UNS.
Giusti, M. M. dan R. E. Worlstad.. 2001. Characterization and Measurement    of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy . Oregon State University.
Harborne.  J.B.,  1987. Metode    Fitokimia:  Penuntun  Cara Modern  Menganalisis  Tumbuhan. Penerbit  ITB Bandung.
Markham,  K.R.  1988. Cara    Mengidentifikasi  Flavonoid.
Penerjemah:  Kosasih  Padmawinata.  Penerbit  ITB. Bandung.
Natalia,  Dita. Ekstraksi  Pewarna  Alami  dari    Buah  Arben (Rubus ideaus Linn.) dan Aplikasinya pada Sistem Pangan .UNPAD.
Samsudin,  Asep,  M,  dkk.  2008. Ekstraksi,    Filtrasi Membran  dan  Uji  Stabilitas  Zat  Warna  dari  Kulit
Manggis (Garcinia mangostana). UNDIP.
Semarang.
Santoni,  A,  Djaswir  Darwis,  Sukmaning    Syahri.  2013.
Isolasi  Antosianin  dari  Buah  Pucuk  Merah (syzygium  campanulatum  korth.)  Serta  Pengujian
Antioksidan  dan  Aplikasi  sebagai  Pewarna  Alami .
Prosiding  Semirata FMIPA Universitas Lampung.
Turkan  Kutlu,  Gokhan  Durmaz,  Burhan  tes,  Ismet Yilmaz1,  and  M.  Sevket  Cetin.    2009.  Antioxidant Properties Of Different Extracts Of Black Mulberry
(Morus nigra L.). Turkei. Hal 104-105.
Wrolstada,  Ronald,    Robert  W.  Dursta    and  Jungmin Leeb.2005. Tracking color and pigment changes in anthocyanin  products. Department  of  Food Science  and  Technology,Wiegand  Hall,  Oregon State University.
Nazulis,  Z,  dkk.  2002. Kimia  Bahan  Alam .    Reviewer  : Nurhasnah Aliunir. Penerbit UNP. Padang.