## ISOLASI GEN smtAB BAKTERI RESISTEN LOGAM BERAT Pb DARI LIMBAH CAIR AGAR
Generation Insulation smtAB Resistent Bacteria Pb Heavy Metal In Liquid Waste
Senja Ike Rismawati 1
1 Prodi Teknologi Hasil Perikanan Universitas Yudharta Pasuruan Email: senjaiker@gmail.com

## ABSTRAK
Bakteri  Indigen  adalah  bakteri  asli  yang  memiliki  kemampuan  untuk  mereduksi senyawa berbahaya termasuk logam berat Pb. Bakteri indigen yang diisolasi dari limbah cair  tepung  agar  diketehui  memiliki  kemampuan  mereduksi  logam  berat  Pb  adalah Bacillus alvei, Bacillus pumilus dan Bacillus lichenformis. Kemampuan bakteri dalam mereduksi logam berat Pb disebabkan karena adanya gen resisten, yaitu gen smtAB . Gen smtAB merupakan  gen  yang bekerja untuk  menghasilkan protein pengikat  logam berat yang  disebut  metallothionein.  Setiap  bakteri  memiliki  gen  resisten  logam  berat  yang berbeda, oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengetahui spesies bakteri yang memiliki gen smtAB pada bakteri  yang diisolasi  dari limbah cair  agar. Jenis  penelitian yang  dilakukan  adalah  deskriptif  kualitatif.  Penelitian  ini  terdiri  dari  beberapa  tahap, yaitu peremajaan isolat bakteri, kultur isolat bakteri, isolasi DNA dengan Presto™ Mini gDNA  Bacteria  Kit ,  Elektoforesis,  amplifikasi  gen smtAB dan  konfirmasi  sekuens dengan  hasil  sekuensing  amplikon.    Berdasarkan  hasil  amplifikasi,  bakteri  indigen limbah  cair  agar  yang memiliki  gen smtAB adalah bacillus  alvei. Isolasi  gen smtAB yang diakukan menghasilkan sekuen yang tidak spesifik dengan gen target.
Kata Kunci: Isolasi Gen smtAB, Bakteri Resisten Logam Berat Pb, Limbah Cair Agar

## ABSTRACT
Indigenic  bacteria  are  native  bacteria  that  have  the  ability  to  reduce  harmful compounds  including  Pb  heavy  metals.  Indigenic  bacteria  isolated  from  flour  liquid waste  to  be  known  to  have  the  ability  to  reduce  Pb  heavy  metals  are  Bacillus  alvei, Bacillus pumilus and Bacillus lichenformis. The ability of bacteria to reduce Pb heavy metal is caused by the presence of resistant genes, namely the smtAB gene. The smtAB gene  is  a  gene  that  works  to  produce  heavy  metal  binding  proteins  called metallothionein.  Each  bacterium  has  a  different  heavy  metal  resistant  gene,  therefore this study aims to determine the bacterial species that have a common gene in bacteria isolated  from  agar  liquid  waste.  The  type  of  research  conducted  is  qualitative descriptive.  This  study  consisted  of  several  stages,  namely  rejuvenation  of  bacterial isolates,  bacterial  isolate  culture,  DNA  isolation  with  Presto  ™  Mini  gDNA  Bacteria Kit,  Electrophoresis,  SMAB  gene  amplification  and  sequence  confirmation  with amplicon  sequencing  results.  Based  on  the  results  of  amplification,  the  liquid  waste indigen bacteria so that the smtAB gene is bacillus alvei. The isolation of the SMT gene that was carried out produced a sequence that was not specific to the target gene. Keywords: smtAB Gen Insulation, Pb Heavy Metal Resistant Bacteria, Agar Waste

## PENDAHULUAN
Pembangunan  di  bidang  industri tidak jarang menimbulkan dampak negatif berupa  limbah  yang  dihasilkan  baik dalam  bentuk  padat,  cair  dan  gas (Khasanah, 2009). Meningkatnya industrialisasi  akan  menyebabkan  pula meningkatnya  keluaran  bahan  kimia berbahaya  ke  lingkungan    yang  berasal dari limbah industri, terutama limbah yang mengandung logam berat (Gerdhart et al., 2008).  Kontaminasi  oleh  logam  berat menjadi  perhatian  serius  karena  dapat mencemari  tanah  maupun  air  tanah  serta dapat  menyebar  ke  daerah  sekitarnya melalui  air,  angin  dan  dapat  terakumulasi oleh  tumbuhan  (Knox  et  al.,  2000). Logam  berat  juga  tidak  dapat  didegradasi oleh tubuh dan bersifat racun pada mahluk hidup  serta  dapat  terakumulasi  dalam jangka waktu tertentu (Buhani, 2007).
Logam  berat  timbal  (Pb)  dapat menyebabkan gangguan pada sistem saraf, hemotologic,
hemetotoxic dan mempengaruhi kerja
ginjal (Suhendrayatna, 2001). Pemaparan jangka panjang  logam  berat  timbal  (Pb)  pada manusia  dapat  menyebabkan  anemia, kanker, mengganggu metabolisme vitamin D  dan  dapat  kematian  jika  dalam  darah manusia  mengandung  70µg/dl  (Fonte  et al, 2007; Lam et al, 2007 dan Steenland et
al, 2000).  Untuk mengurangi efek negatif yang  timbulkan  oleh  logam  berat  maka digunakan pendekatan bioteknologi remediasi atau bioremediasi.
Bioremediasi    merupakan  teknik  untuk mengurangi  atau  memecah  senyawa berbahaya di lingkungan dengan
memanfaatkan mikroorganisme (Soleimani  dan  Jaberi,  2014)  seperti jamur,  ragi,  dan  bakteri  (Chatterjee  et  al., 2012). Terdapat banyak jenis bakteri yang berpotensi  untuk  bioremediasi,  salah satunya  adalah  bakteri  indigen  yang diisolasi  dari  limbah  cair  agar  PT  X. Isolat  Bakteri  indigen  yang  telah  berhasil diisolasi  dari  limbah  cair  agar  adalah Bacillus  alvei,  Bacillus  pumilus dan

## Bacillus lichenformis
Bakteri  mampu  bertahan  hidup  di lingkungan  yang  terkontaminasi  logam berat    karena  mempunyai  gen  resisten. Salah satu gen resisten adalah  gen smtAB yang  terlibat  dalam  produksi  protein (metallothionein)  yang  dapat  mengikat logam  berat  (Shimoda  et  al.,  2003). Penelitian ini bertujuan untuk  mengetahui spesies  bakteri  indigen  dari  limbah  cair agar PT X yang memiliki gen smtAB

## METODE
Penelitian  ini  dilakukan  di  laboratorium mikrobiologi  Universitas  Negeri  Malang dan  laboratorium  Genetika  dan  Biologi
Molekuler  Departemen  Biologi  Fakultas Sains  dan  Teknologi  Universitas  Islam Negeri  Maulana  Malik  Ibrahim  Malang. Peralatan  yang  digunakan  antara  lain waterbath shaker, autoclave, tabung eppendorf,  Laminar  Air  Flow,    tabung sentrifugasi, mikropipet, mikrotip, frezeer , vortex,  mesin  sentrifugasi, GD  column, collection tube , inkubator, kertas parafilm , UV  box,  seperangkat  alat  elektroforesis merek  BioRad,  transiluminator  mesin  UV (gel  Doc  )  seri  molekul  BioRad  gel  Doc TM  Image  Xr  sistem  pencitraan  dan perangkat lunak Quantity One. Bahan yang  diperlukan  antara  lain  isolat bakteri  indigen  limbah  cair  agar  yaitu Bacillus  alvei,  Bacillus  pumilus dan Bacillus  lichenformis ,  ddH 2 O,  proteinase K,  buffer  TE,  bahan dari  Presto™  Mini gDNA  Bacteria  Kit ,  dan  gel  agarose  1%. agarosa  gel,  TBE  (Tris  Boric  EDTA), EtBr  (Ethidium  bromide),  pemuatan pewarna,  air  deionisasi,  Master  Mix  PCR merek  Promega  (Taq  polimerase,  dNTPs, buffer  PCR),  primer  smt1  (5’  GAT  CGA CGT  TGC  AGA  GAC  AG  3’)  dan  smt2 (5’ GAT CGA GGG CGT TTT GAT AA 3’),  marker,    DNA  terisolasi  (template), aquabidest, air suling, dan es batu.

## Peremajaan Bakteri
Peremajaan  bakteri  dilakukan  dengan mengambil  isolat  bakteri  sebanyak  1  ose
secara aseptik dan digoreskan pada media miring,  kemudian  isolat  diinkubasi  pada suhu 37°C.

## Persiapan Kultur Bakteri
Isolat  bakteri Bacillus  alvei,  Bacillus pumilus dan Bacillus lichenformis dibiakkan    dalam  medium  cair  LB  dan ditumbuhkan  selama  24  jam  pada  37 o C diaduk  pada  kecepatan  150-175  rpm dalam  water  bath  shaker.  Setelah  24  jam pertumbuhan  sel  Setelah  itu  isolat  bakteri siap untuk diisolasi DNAnya
Isolasi Genom DNA
Isolasi genom DNA bakteri Bacillus alvei, Bacillus pumilus
dan Bacillus lichenformis dilakukan  menggunakan  kit isolasi  DNA  yaitu Presto  mini  gDNA Bacteria Kit. Tahapan isolasi DNA bakteri adalah sebagai berikut:
1. Persiapan sampel: Pindahkan sel bakteri  (minimal  1x10 9 )  pada  tube microcentrifuge  1.5  ml.  Sentrifugasi selama  1  menit  pada  14  -  16.000  rpm kemudian  buang  supernatan.  Tuang buffer  Gram  +  (200  µl/sampel)  pada tube  sentrifugasi  15  ml.  Tambah Lysozyme (4 mg/ml) pada buffer gram +  (dalam  tube  sentrifugasi  15  ml) kemudian  vortex  untuk  melarutkan Lysozyme  secara  keseluruhan.  Tuang 200  µl  buffer  Gram  +  (yang  telah ditambah  Lysozyme)  pada  sampel  di
tube mikrosentrifugasi
1.5 ml kemudian  resuspensi  pelet  dengan vortex  atau  pipet.  Inkubasi  pada  37 0 C selama  30  menit.  Selama  inkubasi, balik-balik tube secara berkala. Tambahkan  20  µl  Pro  K  (yang  telah ditambah  ddH 2 O).  Inkubasi  pada  60 0 C minimal  10  menit.  Selama  inkubasi, balik-balik tube setiap 3 menit.
2. Lisis:  Tambahkan  200  µl  buffer  GB pada sampel dan campur dengan vortex selama  10  detik.  Inkubasi  pada  70 0 C minimal  10  menit  untuk  memastikan lysate  sampel  telah  hilang.  Selama inkubasi,  balik-balik  tube  setiap  3 menit.  Saat  ini,  panaskan  terlebih  dulu buffer  elusi  yang  diperlukan  (200  µl per  sampel)  pada  70 0 C  (untuk  tahap  5 DNA Elusi).
3. Pengikatan  DNA : Tambahkan  200  µl etanol absolut pada sampel dan campur segera  dengan  mengocok  kuat-kuat. Jika  presipitat  muncul,  hancurkan dengan  pipet.  Tempatkan  kolom  GD dalam  tube  koleksi  2  ml.  Tuang campuran  (termasuk  presipitat  tidak terlarut)  pada  kolom  GD  kemudian sentrifugasi pada 14 – 16.000 selama 2 menit.  Lepas  tube  koleksi  yang mengandung cairan kemudian tempatkan kolom GD pada tube koleksi 2 ml baru.
4. Pencucian:  Tambahkan  400  µl  buffer W1 pada kolom GD. Sentrifugasi pada 14 – 16.000 selama 30 detik kemudian buat cairan. Tempatkan kembali kolom GD  pada  tube  koleksi  2  ml.  Tambah 600  µl  wash  buffer  (telah  ditambah etanol)  pada  kolom  GD.  Sentrifugasi pada  14  –  16.000  selama  30  detik  lalu buang  cairan.  Tempatkan  kembali kolom  GD  pada  tube  koleksi  2  ml. Sentrifugasi  lagi  selama  3  menit  pada 14  –  16.000  untuk  mengeringkan matriks kolom.
5. Elusi  Volume  elusi  standar  adalah  100 µl. Jika sampel yang digunakan kurang, kurangi  volume  elusi  (30-50  µl)  untuk meningkatkan  konsentrasi  DNA.  Jika menginginkan  hasil  DNA  lebih  tinggi, ulangi  tahap  elusi  untuk  meningkatkan perolehan  DNA  dan  volume  total  elusi sekitar  200  µl.  Pindahkan  kolom  GD kering  pada  tube  microcentrifuge  1.5 ml. Tambah 100 µl buffer TE ke tengah matriks kolom. Biarkan selama 3 menit supaya  buffer  TE  diserap  sempurna. Sentrifugasi  pada 14-16.000 selama 30 detik untuk mengelusi DNA murni.

## Uji Hasil Isolasi DNA
Kemurnian  hasil  isolasi  genom  DNA bakteri  diuji  dengan  menggunakan  alat nanodrop, langkah-langkahnya adalah sebai berikut:
1. Blank  Nanodrop  menggunakan  5 mikrolit buffer TE.
2. Meneteskan  5  mikrolit  sampel DNA pada Nanodrop.
3. Membaca  grafik  kemurnian  dan konsentrasi DNA
Amplifikasi gen smtAB
Amplifikasi  gen smtAB dilakukan dengan  metode  PCR  dengan  primer smt1 (5’ GAT CGA CGT TGC AGA GAC AG 3’)  dan smt2 (5’  GAT  CGA  GGG  CGT TTT GAT AA 3’) , denaturasi  awal  pada suhu  94°C  selama  3  menit,  denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit, annealing pada suhu 56°C selama 1 menit, Elongasi pada  suhu  72°C  selama  1  menit,  pasca elongasi  pada  suhu  72°C  selama  5  menit dilakukan  sebanyak  35  siklus.  Untuk mendeteksi  apakah  gen  target  telah diseparasi dilakukan elektroforesis. Proses elektroforesis menggunakan elektroforesis horizontal  pada  gel  1,5%.Produk  hasil berupa  amplikon  gen smt AB  yang teramplifikasi  melalui  PCR  dikirim  ke perusahaan  (First  BASE,  Laboratories Selangor,  Malaysia)  untuk  disekuensing. Alat  yang  digunakan  adalah  ABI  PRISM 3730 Genomic Analyzer, Biosystem USA

## Analisis Hasil Sekuensing
Sekuens gen smtAB hasil sekuensing dianalisis menggunakan menggunakan  program  BLAST  pada website www.ncbi.nlm.gov

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi genom DNA bakteri
Bacillus  alvei,  Bacillus  pumilus dan Bacillus  lichenformis yang  dilakukan menggunakan
Presto mini gDNA Bacteria  Kit memberikan  hasil  yang optimal. Berdasarkan Pengukuran konsentrasi DNA menggunakan
spektrofotometer Nano  Drop 2000  pada panjang  gelombang  260/280  nm  (Tabel 4.9)  isolat  H  memiliki  rasio  260/280  nm sebesar  1,857,  isolat  E  memiliki  rasio 260/280  nm    sebesar  1,883  dan  isolat  F memilik  rasio  260/280  nm  sebesar  1,877. Nilai rasio 260/280 nm  tiap isolat tersebut menunjukkan  bahwa  ketiga  isolat  telah murni  tanpa  kontaminan  apapun.  Hal  ini didukung  oleh  penyataan  Clark  (2005) bahwa  DNA  dinyatakan  murni  jika memiliki nilai rasio Optical Density (OD)
260/280 sebesar 1,8-1,9. Rasio (Å260/Å280) kurang dari 1,8 menunjukkan  kontaminasi  fenol  atau protein,  sedangkan  rasio  lebih  dari  1,9 menunjukkan kontaminasi RNA (Khosravinia et al., 2007)

## Tabel 1 Kemurnian Genom DNA Bakteri Indigen Paling Potensial
Sampel Rasio λ260/λ280 Konsentrasi µg/g sampel Bacillus alvei 1,857 135 Bacillus pumilus 1,883 187 Bacillus lichenformis 1,877 101 Gambar 1 Pola Elektroforesis DNA Genom
Bakteri Indigen
Keterangan:  Marker = 1kb, H= Bacillus alvei, E= Bacillus pumilus dan  F= Bacillus lichenformis
Berdasarkan visualisasi (Gambar1) hasil  elektroforesis  genom  DNA  ketiga bakteri  terdeteksi  adanya  molekul  dengan diatas  wilayah  10.000  bp.  Ukuran  pita yang  jelas  dan  tebal  mengindikasikan bahwa konsentrasi molekul yang terseparasi  pada  wilayah  ini  tinggi. Tertahannya  laju  migrasi  molekul  pada daerah  10000  bp  mengindikasikan  bahwa molekul  tersebut  adalah  molekul  DNA kromosom  bakteri,  karena  berdasarkan penelitian  Demerdash  (2012)  kromosom bakteri  memiliki  ukuran  lebih  dari  10000 bp,  yakni  21000  bp  –  23000  bp.  Wang dalam Nuroniyah (2012) juga melaporkan
bahwa  pola  pita  elektroforesis  DNA kromosom  bakteri  dengan  menggunakan marka  DNA  250bp–10000bp  terpisah pada daerah diatas 10000bp.
Amplifikasi  gen  target  pada  isolat bakteri indigen H, E dan F telah dilakukan dengan  menggunakan  sepasang  primer smt1 (5’  GAT  CGA  CGT  TGC  AGA GAC  AG  3’)  dan smt2 (5’  GAT  CGA GGG  CGT  TTT  GAT  AA  3’)  dengan suhu denaturasi awal sebesar 94°C selama 3  menit,  1  menit  denaturasi  dengan  suhu 94°C,  anealling  selama  1  menit  dengan suhu 56°C, 1 menit elongasi  dengan suhu 72°C  dan  5  menit  pasca  elongasi  dengan suhu  72°C  sebanyak  35  siklus.  Hanya isolat  bakteri  indigen  H  yang  berhasil teramplifikasi dengan panjang sekuen gen berkisar  500bp.  Amplifikasi  gen  target dengan  panjang  500bp  adalah  sesuai dengan  amplikon  yang  diharapkan  dari sepasang  primer  yang  telah  digunakan sehingga  hanya  isolat  bakteri  indigen  H yang akan disekuensing. Hasil amplifikasi fragmen  gen  smtAB  disajikan  dalam Gambar 2

## Gambar 2 Amplifikasi Daerah Gen Target
Keterangan: Marker = 1kb, H= Bacillus alvei, E= Bacillus pumilus dan F= Bacillus lichenformis
Pengecekan hasil PCR yang dilakukan dengan elektroforesis menunjukkan band (pita DNA) pada isolat
H  sepanjang  ±500  bp    (Gambar  2) sedangkan  untuk  isolat  E  dan  F  tidak menunjukkan  amplifikasi.  Hal  ini  berarti pada  isolat  H  terdapat  gen smtAB sedangkan  pada  isolat  E  dan  F  tidak terdapat gen smtAB . Salah satu kemungkinan tidak teramplifikasinya sekuen  gen smtAB .  pada  isolat  bakteri  E
dan  F  adalah  perbedaan  sekuen  gen  pada isolat bakteri E dan F dengan primer yang digunakan.  Yuwono  (2006)  menyebutkan bahwa pada saat proses annealing, primer akan  menempel  pada  untaian  DNA  yang telah  terpisah  menjadi  rantai  tunggal.
Primer tersebut selanjutnya akan
membentuk ikatan hidrogen dengan untaian  DNA  pada  daerah  sekuen  yang komplementer  dengan  sekuen  primer. Berdasarkan hasil tersebut dapat dikatakan,  isolat  bakteri  E  dan  F  tidak memiliki  sekuen  yang  komplementer dengan  perekatan  primer  gen  pengkode metallotionein.
Hasil  analisis  sekuen  fragmen  gen smtAB yang  dilakukan  menunjukkan panjang  sekuens  basa  nukleotida  adalah sebesar  479  bp.  Sekuens  nukleotida  hasil sekuensing ditunjukkan pada Gambar 3
Gambar 3 Hasil sekuensing
Hasil  amplifikasi  yang  diduga  telah mengamplifikasi gen target di baca urutan basanya menggunakan alat sekuenser ABI PRISM 3730 Genomic Analyzer,
Biosystem  USA .  Analisis  data  hasil sekuensing  menggunakan  fasilitas Peak trace (online) dan BLAST Hasil
sekuensing  fragmen  DNA  menunjukkan
panjang  sekuens  basa  nukleotida  adalah sebesar  479  bp  yang  diperoleh  tidak spesifik,  terlihat  dari  adanya  urutan  basa yang  tidak  terbaca  yang  ditunjukkan dengan munculnya notasi N. Sekuen DNA dikoreksi  menggunakan  aplikasi Peak
Trace untuk  memaksimalkan  pembacaan peak (puncak-puncak kromatrogram). Notasi  N  menunjukkan  sekuens  ganda pada  bagian  awal  dan  akhir  fragmen (Gambar 4)
Gambar 4 Bagian dari Sekuen yang Terbaca ‘N’ Memiliki Peak Ganda (anak panah)
Fragmen  yang  teramplifikasi  tidak menunjukkan sekuen yang spesifik ditunjukkan  dengan  banyaknya  notasi  N. Urutan  basa  nukleotida  dibaca  oleh  alat sekuensing  berdasarkan peak (puncak grafik)  kromatogram  yang  mencirikan suatu basa nukleotida, umumnya menggunakan  pembeda  warna.  Sekuen tidak spesifik ditunjukkan oleh kromatogram  dan  karakterisasi  hasil sekuensing  dapat  dilakukan  berdasarkan kromatogram tersebut (McGill, 2012).
Query merupakan  frekuensi  basa nukleotida  yang  sama  dengan  sekuen  gen referensi yang ditunjukkan dengan persentase kesamaan. Hasil analisis BLAST  dari  sekuen  menunjukkan Query sebesar  80%  dengan  genom  bakteri Bacillus  amyloliquenfaciens L33 . Hal
tersebut menunjukkan bahwa sekuen yang didapat  merupakan  bagian  dari  genom bakteri  tetapi  bukan  gen  target  yang diinginkan.    Hal  ini  diduga  disebabkan oleh  kesalahan  desain  primer.Desain primer  memegang  peran  penting  untuk memastikan gen atau DNA yang teramplifikasi adalah spesifik atau tunggal (Thompson,  2006).  Primer  yang  didesain tidak spesifik  atau terlalu umum dijumpai urutannya disepanjang gen target menyebabkan  munculnya  lebih  dari  satu tapak  perlekatan  primer  ( binding  side ) (McGill,  2012).  Hasil  visualisasi  fragmen hasil PCR (Gambar 2.) menunjukkan satu pita,  sehingga  kemungkinannya  fragmen yang teramplifikasi bukan daerah conserve gen target melainkan bagain dari genom.  Daerah conserve merupakan
bagian urutan  gen  yang  memiliki susunan basa  yang  konstan  pada  sekelompok makluk  hidup  sehingga  dapat  dijadikan pengenal  gen  target  (Tang et  al. ,  2012).
Hasil  penelitian  ini  diketahui  bahwa pendesainan  primer  pada  daerah conserve dari  spesies  yang  berbeda  memberikan kemungkinan  untuk  terjadi  amplifikasi ganda yang menyebabkan kesulitan dalam identifikasi  gen  target.  Primer  yang didesain sebaiknya dapat mengamplifikasi secara spesifik lokus gen target. Referensi sekuen gen yang berasal dari kerabat yang tidak dekat perlu dikaji dari sudut pandang lain yaitu diantaranya posisi translasi yang benar  ( Open  Reading  Frame atau ORF ), ekson-intron  (Thomas et  al. ,  2006),  serta homologi  evolusioner  (Thompson  dan Denis,  2006).  Hal  lain  yang  harus diperhatikan  dalam  merancang  primer adalah  bahwa  gen  yang  mengkode  sifat tertentu  pada  beberapa  jenis  makhluk hidup  umumnya  memiliki  kesamaan namun  bersifat  spesifik  baik  dalam  hal urutan  basa  nukleotida  maupun  urutan asam amino (Thomas et al. , 2006).

## Kesimpulan dan Saran
Berdasarkan  hasil  penelitian  ini dapat  dikemukakan  kesimpulan  sebagai beikut  spesies  bakteri  indigen dari limbah cair  agar PT X  yang memiliki  gen smtAB
adalah bacillus  alvei. isolasi  gen smtAB menghasilkan  sekuen  yang  tidak  spesifik dengan gen target.
Saran  untuk  penelitian  selanjutnya adalah  perlu  adanya  penggunaan  primer yang  lebih  spesifik  dan  metode  isolasi yang berbeda dengan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Buhani.2007. Alga  Sebagai  Biondikator dan    Biosorben    Logam    Berat
Bagian :1” . tersedia di:
http//www.chemistry.org diakses pada 10 januari 2015
Clark, D. 2005. Molecular Biology . USA: Elsevier Academic Press.
Fonte,  R.,  Agosti,  A.,  Scafa,  F  and Chandura, S.M. Anemia and Abdiminal Pain Due to Occupational Lead Poisoning. Haematologica. 2007. 92: 13-14 Gerdhart,  K.E.,  Huang,  X..,  Bernard  R.,
Greenberg.,  and  Bruce,  M.  2008. Phytoremediation  of  organic  soil contaminants: potential and challenge s. Journal of Phytoremediation.  Department  of Biology  University  of  Waterloo.
Elsevier Science Limite d.Canada.
Khasanah,  Eliya.2009.  Adsorpsi  Logam
Berat. Oceana .  Vol  XXXIV  No 4:1-7
Khosravinia,  H.,  H.  N.  N.  Murthy,  D.  T. Prasad,  &  N.  Pirany.  2007. Optimizing  Factors  Influencing DNA  extraction. African  Journal of Biotechnology , 6(4). 481-486
Knox,  A.S.,  Seaman,  J.,  Andriano,  D.C.,
dan Pierzynski, G. 2000.
Chemostabilization  of  metals  in contaminated soils : Bioremediation  of  Cotaminated Soils.  New  York:  Marcek  Dekker
Inc. hlm 811-836.
Lam,  T.V.,  Agovino,  P.,  Niu,  X.  And Roche,  L.,  Linkage  Study  of Cancer Risk Among Lead Exposed Worker  in  New  Jersy. Sci  Total Environ. 2007. 372:455-462.
McGill.  2012. Trubleshooting  Sequencing
Product .  McGill  University  and
Genome Quebec innovation Centre Sequencing Servise
Nuroniyah  dan  Putra  2012.  Identifikasi Spesies  Isolat  Bakteri  S1  Dengan Metode  Analisa  Sekuen  Fragmen Gen  16S  rDNA. Jurnal  Teknik Pomits Vol. 1, No. 1, (2012) 1-6
Soleimani,  Mohsen  and  Jaberi,  Najmeh. 2014.  Comparison  of  Biological and Thermal Remediation Methods  in  Decontamination  of Oil  Plluted  Soils. J.  Bioremed
Biodeg. 5: 3.
Shimoda,  Ryuya.,  Achanzar,  William  E.,
Qu.,  Wei.,  Nagamine,  Takeaki.,  And
Takagi,  Hitoshi.  2003.  Metallothionein  is a Potential Negative Regulator of
Apoptosis. Toxicological  Science. Vol. 73: 294-300
Suhendrayatna,  2001,  Bioremoval  Logam
Berat Dengan Menggunakan Microorganime (Suatu Kajian Pustaka).  Makalah  Disampaikan pada  Seminar  on-air  Bioteknologi Untuk Indonesia, 1-4 Februari
Steenland,  K  and  Boffeta,  P.  Lead  and Cancer in Humans: Where We Are Now?. J.  Ind.Med.. 2000.  38:295- 299
Tang,  L.,  Gao,  H.,  Zhu,  X.,  Wang,  X., Zhou,  M.,  Jiang,  R.  2012.
Construction  Small  Intelligent Focused Mutagenic Libraries Using Well Designed Combination Degenerate Primers. BioTechniques 149-158 Thomas,  P.J.,  Anand,  T.,  Suresh,  P., Janarthnan.,  S.,  Vincent.  2006. Designing Specific Oligonukleotide Primers for Metallothionein  Genes. Indian Journal  of  Biotechnology vol.  5, pp.120-122
Thompson,  B.,  Denis.  2006. Finding Homologous Genes  With Primers Designed Using Evolutionary Models (Dissertation). North Caroline State University Yuwono,T.  2006. Teori  dan  Aplikasi Polymerase Chain
Reaction
(PCR). Andi. Yogyakarta. 231 hal.
Zulaika, E., 2012 . Bakteri Resisten Logam Berat  Yang  Berpotensi  Sebagai Biosorben Dan Bioakumulator. Disampaikan  pada Seminar Nasional Waste Managament For Suistainable Urban Developing Teknik Lingkungan ITS, 21 Februari 2012