## PERFORMA GENOTIP IKAN TAMBAKAN Helostoma temminckii (CUVIER, 1829) POPULASI SUMATERA, JAWA DAN KALIMANTAN DENGAN METODE RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD)
MH. Fariduddin Ath-thar 1)* , Intan Putriana 2) , Dinar Tri Soelistyowati 2) dan Rudhy Gustiano 1)
1) Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar Bogor
2) Departemen Budidaya Periaran, Institut Pertanian Bogor
* e-mail: faridkkp@yahoo.com

## ABSTRACT
Genotype performance of Tambakan, Helostoma temminckii (Cuvier, 1829) from Sumatera, Java and Kalimantan Polulation using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Tambakan, kissing gourami (Helostoma temminckii) is well known as a freshwater tropical species from  Southeast  Asia.  In  Indonesia, tambakan  is  an  important  commodity. However, total  production  of tambakan  tends to  decrease. Therefore, domestication has urgently  to  be  done  to  solve  the  problem  of Tambakan  population. Three different  tambakan populations  from  Sumatera,  Java  and  Kalimantan  were observed  to  find  good  genetic  resources  for  culture  activity. This  study  aimed  to  investigate  the  genetic variation of tambakan especially from West Java, Jambi, and South Kalimantan province using RAPD. The result  showed  that  the  highest  polymorphism  and  heterozygosity  was  from South Kalimantan  population among others. The three population observed had the fragment size ranged from 100- 2000 bp. The highest genetic distance was between Sumatera and Kalimantan (0,2877), while the lowest was between Kalimantan and Java (0,1961).
Key words: Helostoma temminckii, genetic, heterozigosity, genetic relationship

## ABSTRAK
Ikan  tambakan (Helostoma  temminckii) adalah  salah  satu  jenis  ikan  air  tawar  yang  berasal  dari wilayah  tropis,  tepatnya  Asia  Tenggara.  Di  Indonesia  ikan  tambakan  merupakan  salah  satu  ikan komoditas penting. Saat  ini,  jumlah  produksi  ikan  tambakan  cenderung  menurun. Sehingga  domestikasi  sangat diperlukan  untuk  mengatasi  masalah  peneurunan  populasi  tambakan  Tiga  populasi  ikan  tambakan  dari Sumatera,  Jawa  dan  Kalimantan  diobeservasi  untuk  mendapatkan  sumber  genetic  terbaik  yang  dapat digunakan  untuk  kegiatan  budidaya.. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi  keragaman  genetika populasi  ikan  tambakan Jambi, Jawa Barat  dan  Kalimantan  Selatan menggunakan  metode  RAPD.  Hasil menunjukkan  bahwa  polimorfisme  dan  heterosigositas  tertinggi  terdapat  pada  populasi  ikan  tambakan Kalimantan Selatan  jika dibandingkan  dengan populasi  ikan tambakan lainnya. Ukuran  fragmen  DNA teramplifikasi  berkisar  antara  100-2000  bp.  Jarak  genetik  paling  jauh  adalah  antara populasi  tambakan Sumatera  dengan  Kalimantan  (0,2877),  sedangkan  jarak  genetik  terendah  adalah  tambakan  Kalimantan dengan Jawa (0,1961).
Kata kunci: Helostoma temminckii, genetik, heterosigositas, kekerabatan

## PENDAHULUAN
Ikan  Tambakan  adalah  salah  satu potensi  sumberdaya  genetik  (SDG)  air tawar Indonesia yang mempunyai potensi  untuk  dikembangkan  (Gustiano et  al.,  2015). Secara  umum,  keaneka- ragaman  sumberdaya  genetik  terbagi menjadi  sumberdaya  genetik  ikan  alam
liar yang belum dapat diadaptasikan dan sumberdaya  genetik  ikan  yang  sudah dapat dibudidayakan. Salah satu sumber daya  genetik  ikan liar  yang  sudah  dapat diadaptasikan  adalah  ikan  tambakan (Helostoma temminckii) (Gustiano et al., 2015). Ikan  tambakan  adalah  salah  satu jenis  ikan  air  tawar  yang  berasal  dari wilayah  tropis,  tepatnya  Asia  Tenggara.
Ikan tambakan dibudidaya untuk
diambil  dagingnya  di  wilayah  Asia Tenggara.  Di  Indonesia, ikan  tambakan merupakan  salah  satu  ikan  bernilai ekonomi  tinggi.  Sebagai  dampak  dari popularitasnya  sebagai  ikan  hias,  ikan tambakan  yang  berukuran  kecil  sekitar 12-15  cm  diekspor  ke  Negara  seperti Jepang,  Eropa,  Amerika  Utara,  dan Australia  (FAO,  2010).  Diluar  negeri, ikan  tambakan  berukuran  12-15  cm dijual  dengan  harga 3,00 - 6,00  USD/ ekor. Berdasarkan  data DJPT  KKP (2012)  jumlah  produksi ikan  tambakan untuk  konsumsi mulai  mengalami  pe- nurunan.  Pada  tahun  2010 jumlah  pro- duksi  ikan  tambakan  adalah 12914  ton dan  menurun  pada  tahun  2011 menjadi sebesar 12063 ton, atau mengalami penurunan produksi sekitar 6,59%.
Ikan  tambakan  merupakan  ikan dengan  pertumbuhan  yang  lambat  dan FCR  yang  cukup  tinggi,  sehingga  men- jadi  kendala  bagi  pembudidaya.  Oleh karena  itu,  masyarakat  kerap  mengan- dalkan  tangkapan  dari  alam.  Penurunan populasi  yang  diakibatkan  oleh  eksploi- tasi  yang  berlebihan  perlu  dicegah,  di- antaranya  dengan  pengembangan  budi- daya  ikan  tambakan  dan  pencegahan kerusakan  lingkungan.  Untuk  mening- katkan produksi ikan yang berkelanjutan perlu didukung oleh program pemuliaan atau  perbaikan  sediaan  genetik  yang unggul  (Gjedrem,  2005).  Habitat  yang kurang  memadai  dapat  menyebabkan perkembangan  populasi  ikan  tertekan dan  kemampuan  reproduksi  menurun. Ikan  tambakan  merupakan  ikan  omni- vora  yang  bersifat  bentopelagik  (hidup di antara per-mukaan dan wilayah dalam perairan). Ikan ini tidak membuat sarang maupun merawat anaknya seperti Anabantidae lainnya (Rainboth, 1996).
Dunham (2011) menyatakan bahwa variasi  genetik  penting  untuk  menjamin fitness suatu  spesies  atau  populasi terhadap perubahan lingkungan. Dewasa ini,  secara  genotip karakterisasi  banyak dilakukan  dengan  menganalisis  in- formasi  polimorfisme materi  DNA  inti atau DNA mitokondria (Dunham, 2011). Informasi  keragaman  sumber  daya genetic  merupakan  titik  tolak  dala  me-
lakukan  program  budidaya  yang  lestari melalui  program  pemuliaan. RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)  melalui  teknik  PCR  (Polymeras Chain  Reaction)  adalah  salah  satu  cara untuk mengetahui ragam genotip
(Dunham,  2011).  Metode  RAPD sangat baik  digunakan  untuk  mendeteksi  poli- morfisme  gen  dalam  jumlah  besar karena  primer  oligonukleotida  bisa  ter- amplifikasi  pada  semua  genom  yang memiliki  situs  ikatan  dalam  reaksi  PCR (Ali et  al,  2004). Selain  itu,  RAPD mampu  mendeteksi  sekuen  nukleotida hanya dengan menggunakan satu primer dan  dapat  digunakan  tanpa  mengetahui latar belakang genom sebelumnya.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk me- lakukan  karakterisasi  corak  kera-gaman genotip  ikan  tambakan  populasi  Jambi, Jawa  Barat  dan  Kalimantan  Selatan dengan menggunakan metode RAPD.

## BAHAN DAN METODA
Penelitian ini dilakukan pada bulan September – Oktober 2011  di  Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air  Tawar  Bogor. Ikan  tambakan  yang dianalisis dikoleksi dari Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar Bogor  berasal  dari  tiga  lokasi  yang berbeda yaitu Jawa (Jawa Barat) berasal dari  kolam  budidaya,  Sumatera  (Jambi) berasal dari  kolam  budidaya,  dan Kalimantan  (Kalimantan  Selatan)  ber- asal  dari  alam . Masing-masing  populasi diambil 10 ekor.

## Ekstraksi DNA
Bagian  dari  tubuh  ikan  yang  di- ektraksi  adalah  potongan  sirip  dengan berat5-10  mg.  Selanjutnya,  sirip  dibilas dengan  akuades  sebanyak  dua  kali kemudian dikeringkan dengan tisu. Sirip dimasukkan  ke  dalam  tabung  eppendorf kemudian ditambahkan  500 μL larutan TNES  Urea  dan  kemudian  ditambahkan 10 μL protein kinase  lalu  divortex hingga  homogen  dan  diinkubasi  selama 24  jam  pada  suhu 37ºC.  Selanjutnya,
campuran tersebut divortex dan
ditambahkan  dengan  larutan Phenol- chloroform sebanyak  1000 μL lalu divortex  sampai  homogen  dan disen- trifuse  dengan  kecepatan  10.000  rpm selama  10  menit.  Supernatan  yang terbentuk  diambil  dan  dipindahkan  ke tabung  yang  baru  lalu  ditambahkan  10 μL natrium  asetat  dan  1000 μL Etanol. Setelah  itu  tabung  dikocok  hingga terlihat benang  halus  berwarna  putih. Selanjutnya  tabung  disentrifuse  dengan kecepatan 10.000  rpm  selama  10  menit. Setelah  di-sentrifuse  maka  akan  ter- bentuk  endapan DNA.  Endapan  DNA dipisahkan  dari  larutan  dan dikering anginkan.  Setelah  itu, DNA  ditambah- kan  100 μL Rehydration  Solution DNA (Nugroho et al., 1997).

## Amplifikasi DNA dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)
Amplifikasi PCR dilakukan dengan cara  1  unit  dry  taq  produk  Promega ditambahkan dengan 1,5 μL DNA dan 2 μL primer.  Primer  yang  digunakan adalah OPA  2,  OPC  2,  dan  OPC  5. Selanjutnya  ditambahkan  akuades  hing- ga  total volume  menjadi  25 μL .  Setelah itu  dimasukkan ke  mesin  PCR  dengan 35 siklus, yaitu pre denaturasi pada 94ºC selama 2 menit, denaturasi pada suhu 94 ºC selama 1 menit, annealing pada suhu 36  ºC  selama  1 menit,  elongasi  pada suhu  72  ºC selama  2,5  menit,  elongasi akhir  pada  suhu  72  ºC  selama  7  menit, dan  proses penstabilan  pada  suhu  4  ºC selama 3 menit (Nugroho et al., 1997).

## Elektroforesis
Gel  agarose  dibuat  terlebih  dahulu dengan  konsentrasi  2%  dengan men- campurkan bubuk Agarose dengan larut- an  TBE  yang  diaduk  dengan magnetic stirrer dan dipanaskan pada suhu 150°C sampai homogen. Selanjutnya ditambah- kan  Etidium  bromida  sebanyak  10 μL .
Agarose  dituang  dalam  cetakan yang berlubang. Gel Agarose diletakkan pada alat  elektroforesis  sampai  gel terendam. Sekuen  DNA  sebanyak  3 μL ditam- bahkan dengan Loading  Dye (50  mM EDTA,  30%  gliserol,  0,25%  bromo- phenol  biru,  dan  0,25% xylene  cyanol) sebanyak 3 μL kemudian dimasukkan ke dalam lubang cetakan gel dengan mikro- tipe.elektroforesis  berlangsung  selama 30  menit  pada  tegangan  100  volt  dan suhu  ruang.  Selanjutnya,  gel  Agarose diamati  di  atas  lampu  ultraviolet  dan didokumentasikan  dengan  kamera  pola- roid khusus (Nugroho et al., 1997).

## Analisis Data
Keragaman  genetik  dianalisis  de- ngan  menggunakan  program  TFPGA (Tools  for  Population  Genetic  Analysis) (Nei  dan  Tajima,  1981).  Hubungan kekerabatan interpopulasi dianalisis ber- dasarkan  jarak  genetik  dengan  program UPGMA  (Unweight  Pair  Methods Arithmetic) menurut Wright (1978) yang dimodifikasi oleh Rogers (1972).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian  observasi  karakterisasi genetic  pada  ikan  tambakan  dengan menggunakan  metode  RAPD  ini  meng- gunakan  lima  primer  yaitu OPA-2, OPA-4,  OPA-7,  OPC- 2  dan  OPC-5. Hasil  amplifikasi  paling  optimal  ditun- jukkan  pada  tiga  primer  yaitu  OPA-2, OPC- 2, dan OPC-5.

## Profil RAPD
Keanekaragaman profil RAPD meliputi  jumlah  fragmen  dan  ukuran fragmen DNA. Hasil amplifikasi dengan menggunakan  tiga  primer  (OPA-2, OPC- 2, dan OPC-5) menunjukkan hasil yang  bervariasi  (Tabel  1).  Amplifikasi DNA pada  tiga  populasi  ikan  tambakan dapat dilihat pada Gambar 1-3.
Keterangan:  A1- A3:  Ikan  Tambakan  Populasi Jambi,  B1- B3: Ikan Tambakan Populasi Jawa Barat, C1-C3: Ikan Tambakan Populasi Kalimantan Selatan, M:
Marker Gambar  1.  Amplifikasi  OPA-2  pada ikan  Tambakan  populasi Jambi,  Jawa  Barat  dan Kalimantan Selatan
Keterangan:  A1- A3:  Ikan  Tambakan  Populasi  Jambi, B1-B3: Ikan Tambakan Populasi Jawa Barat, C1-C3: Ikan Tambakan Populasi Kalimantan Selatan, M: Marker
Gambar  2. Amplifikasi  OPC-2  pada ikan  Tambakan  populasi ikan  Tambakan populasi Jambi, Jawa Barat dan Kalimantan Selatan
Jumlah  fragmen  ikan  tambakan  Jawa dan  Kalimantan  memiliki jumlah  yang sama  yaitu  13-22,  sedangkan  jumlah fragmen  pada  ikan  tambakan  Sumatera berkisar  antara  19-24.  Ukuran  fragmen
pada setiap populasi berkisar antara 100- 2000  bp.  Namun,  ukuran  fragmen  pada setiap populasi memiliki nilai yang sama berkisar antara 100-2000 bp.
3000 bp
1000 bp
500 bp 100 bp M A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 3000 bp 1000 bp 500 bp 100 bp M A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Keterangan: A1- A3: Ikan Tambakan Populasi Jambi, B1-B3: Ikan
Tambakan  Populasi  Jawa Barat,  C1-C3:  Ikan Tambakan Populasi Kalimantan Selatan, M: Marker
Gambar  3  Amplifikasi  OPC-5  pada ikan  Tambakan  populasi ikan  Tambakan  populasi Jambi, Jawa Barat dan Kalimantan Selatan
Tabel 1. Profil DNA ikan Tambakan populasi ikan Tambakan populasi Jambi, Jawa Barat dan Kalimantan Selatan Populasi Ikan Tambakan Jumlah Fragmen Kisaran ukuran Sumatera 19-24 100 – 2000 bp Jawa 13-22 100 – 2000 bp Kalimantan 13-22 100 – 2000 bp
Hasil amplifikasi setiap primer me- miliki  karakter  yang  berbeda  sehingga jumlah  dan  ukuran  fragmen  yang  mun- cul pun berbeda. Pemilihan primer pada RAPD  berpengaruh  terhadap  polimor- fisme  fragmen  yang  dihasilkan  karena setiap primer memiliki situs penempelan sendiri  sehingga  fragmen  dari  DNA yang  diamplifikasi  oleh  primer  berbeda menghasilkan polimorfik dengan jumlah fragmen  dan  berat  molekul  berbeda (Dieffenbach & Dveksler, 2003).

## Polimorfisme dan Heterosigositas
Persentase  polimorfisme  dan  hete- rosigositas dianalisis dengan mengguna- kan  program  TFPGA.  Data  persentase
polimorfisme  dan  heterosigositas se- lengkapnya  disajikan  pada  Tabel  2. Persentase  polimorfisme  dari  tiga  po- pulasi  ikan  tambakan  berkisar  antara 57,1429%-60,7143%. Persentase  poli- morfisme  tertinggi  terdapat  pada  ikan tambakan  Kalimantan  yaitu  sebesar 60,7143%, sedangkan polimorfisme terendah  terdapat  pada  ikan  tambakan Sumatera  dan  Jawa  dengan  nilai  yang sama  yaitu  57,1429%.  Nilai  hetero- sigositas  berkisar  antara  0,2259  sampai 0,2478.  Nilai  heterosigositas  tertinggi terdapat  pada  populasi  ikan  tambakan kalimantan  sebesar  0,2478,  sedangkan nilai  heterosigositas  terendah  terdapat pada  populasi  ikan  tambakan  Sumatera sebesar 0,2259.
Tabel  2.  Persentase  polimorfisme dan  heterosigositas ikan Tambakan populasi ikan
Tambakan populasi Jambi, Jawa Barat dan Kalimantan Selatan Populasi Ikan Tambakan Polimorfisme (%) Heterosigositas Sumatera 57.1429 0.2259 Jawa 57.1429 0.2324 Kalimantan 60.7143 0.2478
3000 bp 1000 bp 500 bp
100 bp M A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tabel 3. Uji perbandingan berpasangan Fst dari rata-rata 3 lokus ikan Tambakan populasi Jambi, Jawa Barat dan Kalimantan Selatan Populasi Ikan Tambakan Polimorfisme (%) Heterosigositas Sumatera 57.1429 0.2259 Jawa 57.1429 0.2324 Kalimantan 60.7143 0.2478
Persentase  polimorfik  tertinggi  di- peroleh  pada  populasi  Kalimantan  yaitu 60,7143%,  sedangkan  polimorfik  ikan tambakan  Sumatera  dan  Jawa  memiliki nilai  yang  sama  yaitu  57,1429%.  Nilai heterosigositas tertinggi diperoleh popu- lasi Kalimantan sebesar 0.2478, sedang- kan  nilai  terendah  pada  populasi Sumatera  sebesar  0.2259. Heterozi- gositas  menunjukkan  potensi  kemam- puan  adaptasi  terhadap  lingkungannya karena  semakin  tinggi  heterozigositas maka  semakin  banyak  gen  yang  terlibat dalam menyumbangkan kebugaran suatu populasi.  (Kapsucinski  dan  Jacobson, 1987;  Kirpichnikov,  1981;  Tave,  1993). Kondisi  keragaman  genetik  dipengaruhi oleh  ukuran  populasi  dan  sistem  pe- ngembangbiakan  yang  dilakukan.  Ukur- an  populasi  yang  besar  dan  persilangan bebas  (acak)  dapat  mempertahankan ragam  genetic  (Falconer  dan  Mackay, 1996).  Tingginya  keragaman  genetik ikan  tambakan  diduga  karena  ikan  tam- bakan  memiliki  tingkat  migrasi  yang lebih tinggi dibandingkan ikan air tawar lainnya  sehingga  peluang  adanya  per- silangan  dengan  populasi  (stok)  yang lainnya semakin  besar  pula.  Ikan
tambakan  merupakan  jenis  ikan  yang tidak  merawat  anaknya  sehingga  me- mungkinkan  ikan  tambakan  untuk  me- lakukan  migrasi  dengan  jarak  yang  cu- kup  jauh.  Populasi  dengan  laju  migrasi yang  sempit  atau  jarak  yang  pendek mempunyai  heterosigositas  rendah  di- bandingkan dengan populasi yang mem- punyai migrasi luas dan bersifat terbuka.

## Uji Perbandingan Berpasangan Fst
Secara  statistik  dengan  mengguna- kan  uji  perbandingan  berpasangan  Fst (Tabel  5)  menunjukkan  tidak  terdapat perbedaan  yang nyata  antara  ketiga populasi ikan tambakan (P>0,05).

## Jarak Genetik
Jarak  genetik  interpopulasi  meng- gambarkan  status  kekerabatan  antar po- pulasi ikan tambakan. Jarak  genetik ter- tinggi  adalah  antara  populasi  Sumatera dengan  Kalimantan  sebesar  0,2877,  se- dangkan  jarak  genetik  terendah  adalah 0,1961 yaitu antara populasi Kalimantan dengan Jawa.
Gambar  4. Dendrogram  hubungan  kekerabatan ikan  Tambakan  populasi  Jambi,  Jawa Barat dan Kalimantan Selatan
Jawa Barat Kalimantan Selatan Jambi
Dendrogram pada Gambar 4 memperlihatkan hubungan terdekat adalah  antara  populasi  Jawa  dengan
Kalimantan,  sedangkan  hubungan  ter- jauh  adalah antara  kedua  populasi  ter- sebut dengan  populasi  Sumatera.  Jarak genetik  antara  populasi  ikan  tambakan Sumatera  dan  Kalimantan  lebih  tinggi yaitu  0,2877  dibandingkan  dengan tambakan dari Jawa menandakan bahwa kedua  populasi  tersebut  memiliki  hu- bungan  kekerabatan  yang  lebih  jauh dibanding populasi lainnya.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Polimorfisme  dan  heterosigositas tertinggi  terdapat  pada  populasi  ikan tambakan  Kalimantan.  Ukuran  fragmen pada setiap populasi berkisar antara 100- 2000  bp.  Jarak  genetik  tertinggi  adalah antara populasi Jawa dengan Kalimantan sebesar 0,2877, sedangkan jarak genetik terendah  adalah  0,1961  yaitu  antara populasi Kalimantan dengan Sumatera.

## Saran
Untuk penelitian selanjutnya disarankan  untuk  menambah  jumlah populasi  ikan  yang  diobservasi dari lokasi  lain sehingga  hasilnya  lebih representatif.

## DAFTAR PUSTAKA
Ali, B.A., Huang T.H, Qin D. N., Wang X.M.  2004.  A  review  of random amplified polymorphic
DNA  (RAPD)  markers  in  fish research. Reviews  in  Fish Biology and Fisheries 14: 443- 453 Dieffenbach ,C.W  dan Dveksler G.  S. 2003. PCR primer: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 520 pp Direktorat  Jendral  Perikanan  Tangkap. 2012. Statistik perikanan tangkap Indonesia 2012. Kementerian  Kelautan  Per- ikanan Dunham,  R.A.  20011.  Aquaculture  and fisheries biotechnology: Genetic Approach. CABI publishing,  Cambridge,  USA. P: 85-99.
FAO.  2010. Helostoma  temminckii
(Cuvier,  1829).  Species  fact sheet. FAO, Roma
Falconer, F.S. dan Mackay T.F.C. 1996.
Introduction  to  quantitative genetics.  Longman  England. 464pp Gjedrem, T.  2005. Selection  and breeding programs in aquaculture.  Springer.  New York. P: 251-277 Gustiano  R.,  Kusmini  I.I.,  Ath-thar M.H.F. Mengenal sumber daya  genetik  ikan  spesifik lokal  air  tawar  indonesia untuk pengembangan budidaya.  PT  Penerbit  IPB Press. Kapuscinski, A.R  dan  Jacobson  L.D. 2007.  Genetic  guideline  for fisheries management. University of Minnesota, Minnesota  Sea  Grant  Collge Program. Sea  Grant  Research Report 17, 1-66 Kirpichnikov, V.S.  Genetic  Bases  of Fish Selection. Springer Verlag Berlin. 410pp Nei,  M  and  Tajima F..  1981.  DNA Polymorphism  detectable  by resctriction endonuclease. Genetics 97: 146-163.
Nugroho,  E.,  M.  Takagi,  N.  Taniguchi. 1997.  Practical  manual  on detection of DNA polymorphism in fish population  study. Bulletin  of Marine Sciences and Fisheries
17:109-129.
Rainboth,  W.L. 1996. FAO  species
identification  field  guide  for fishery purposes. Fishes of the Cambodian Mekong.  Rome, FAO. 265 pp. Tave,  D.  1993. Genetics  for  fish hatchery  managers.  Kluwer Academic Publications. Netherland. 415pp