## Studi Proteomik pada Protein Otot Rangka Rattus norvegicus
Menggunakan Spektrometri Massa Resolusi Tinggi

## Alvina Nur Aini
Program Studi Penjaminan Mutu Industri Pangan, Politeknik AKA Bogor, Bogor 16154, Indonesia
*E-mail: alvinaakabogor@gmail.com (Received : 30 Mei 2022; Accepted: 24 Agustus 2022; Published: 26 Agustus 2022)

## Abstrak
Analisis  proteomik  bertujuan  untuk  memperoleh  informasi  mengenai  ekspresi  protein  seluler.  Oleh  karena fungsi  penting  protein  dalam  organisme  hidup,  proteomik  memainkan  peran  penting  dalam  memahami  sistem dan proses biologi. Metode paling umum untuk identifikasi protein dalam proteomik adalah menggunakan Mass Spectrometry (MS).  Secara  lebih  spesifik,  instrumen  MS  yang  digunakan  dalam  analisis  proteomik  adalah Spektrometri  Massa  Resolusi  Tinggi,  yang  mampu  menganalisis  massa  eksak  suatu  ion  molekuler.  Dalam penelitian  ini  dilakukan  hidrolisis  sampel  protein  otot  rangka Rattus  norvegicus dengan  menggunakan  enzim tripsin untuk mendapatkan gambaran mengenai  proses analisis proteomik. Hidrolisis protein dilakukan dengan variasi  enzim:substrat  1:25  (b/b).  Hasil  hidrolisis  kemudian  diidentifikasi  dengan  menggunakan  Spektrometri Massa Resolusi Tinggi. Berdasarkan hasil analisis, terdapat 219 protein yang terindentifikasi. Hasil fragmentasi setiap  peptida  protein  menunjukkan  kesesuaian  dengan  fragmen  teoritis  secara in  silico .  Hal  ini mengindikasikan  bahwa  identifikasi  peptida  menggunakan  Spektrometri  Massa  Resolusi  Tinggi  mampu memberikan hasil yang akurat, sehingga dapat menghindari keraguan dalam identifikasi protein yang kompleks. Hasil  ini  juga  menunjukkan  bahwa  Spektrometri  Massa  Resolusi  Tinggi  memungkinkan screening target peptida dan identifikasi peptida dari matriks protein seluler.
Kata kunci : peptida; protein; proteomik; tripsin; spektrometri massa

## Abstract
Proteomic analysis aims to obtain the information about cellular proteins expression. Because of the important function of proteins in living organisms, proteomics plays an important role in understanding biological systems and processes. The most common method for identification and characterization of proteins in proteomics is the use  of  Mass  Spectrometer  (MS).  More  specifically,  the  MS  instrument  used  in  proteomic  analysis  is  the  High- Resolution Mass Spectrometry, which is capable to analyze the exact mass of molecular ions. In this study, the protein  sample  of  Rattus  norvegicus  was  hydrolyzed  by  using  the  trypsin  enzyme  to  get  an  awareness  of  the proteomic  analysis  process.  Protein  hydrolysis  was  carried  out  with  a  variation  of  enzyme:substrate  of  1:25 (w/w). The hydrolysis  results  were then identified using the High-Resolution Mass Spectrometry. Based on the results, there were 219 proteins could be identified. The results of fragmentation of each protein peptide showed conformity with the theoretical in silico fragment. This indicates that the identification of peptides using High- Resolution  Mass  Spectrometry  is  able  to  provide  accurate  results,  avoiding  doubts  in  the  identification  of complex  peptides.  These  results  also  show  that  High-Resolution  Mass  Spectrometry  allows  the  screening  of target peptides and identification of peptides from highly complex protein matrices.
Keywords: mass spectrometry; peptide; protein; proteomic; trypsin

## PENDAHULUAN
Studi  skala  besar  protein  disebut  dengan proteomik.  Proteomik  mengacu  pada  kajian  ilmiah mengenai karakteristik seluruh protein yang diekspresikan  dalam  sel  atau  suatu  jaringan  pada kondisi  tertentu.  Tujuan  dari  pendekatan  proteomik adalah  memperoleh  informasi  tentang  ekspresi protein seluler (Wilkins dkk., 1996).
Fungsi  penting  protein  dalam  organisme hidup  menjadikan  proteomik  memegang  peranan besar  dalam  memahami  sistem  dan  proses  biologi
(Kenyon  dkk.,  2002).  Berbeda  dengan  genom  yang bersifat  statis,  proteom  bersifat  sangat  dinamis  yang dipengaruhi oleh genom itu sendiri dan banyak faktor eksternal,  seperti  jenis  jaringan,  proses  metabolisme, dan berbagai interaksi seluler.
Dalam  beberapa  tahun  terakhir,  bidang proteomik  telah  berkembang  pesat.  Proteomik  telah diterapkan dalam berbagai sektor, seperti kedokteran, farmasi/obat-obatan,  pertanian,  dan  pangan.  Dalam bidang  pangan,  protein  dapat  berperan  sebagai indikator  ideal  untuk  mengetahui  sifat  makanan
terkait dengan kualitas makanan, komposisi, keamanan, maupun protein marker baru (Ortrea dkk., 2016).
Metode  paling  umum  untuk  identifikasi  dan karakterisasi  protein  dalam  proteomik  adalah  dengan menggunakan Mass Spectrometer (MS). Dari spektra MS  yang  dihasilkan,  dapat  diperoleh  informasi tentang  urutan  peptida  dan  kelimpahannya.  Langkah analisis  proteomik  dengan  MS  dapat  dilakukan dengan  dua  pendekatan,  yakni  pendekatan top-down dan bottom-up .  Pendekatan top-down dilakukan dengan  mengkarakterisasi  fragmen  yang  terbentuk dari disosiasi protein utuh secara langsung pada MS. Pendekatan ini tidak memerlukan hidrolisis enzimatik, tetapi memerlukan akurasi yang tinggi dari alat MS, sehingga penggunaannya terbatas (McLafferty dkk., 2007).
Pada pendekatan bottom-up , protein dihidrolisis terlebih dahulu secara enzimatik, umumnya  menggunakan  enzim  tripsin.  Peptida  yang dihasilkan selanjutnya dianalisis dengan menggunakan  MS  (Pandey  dan  Mann,  2000). Identifikasi  protein  melalui  pendekatan bottom-up dilakukan  dengan  melihat  pola  fragmentasi  massa dari  MS.  Pola fingerprint massa  dapat  dibandingkan dengan  perkiraan  massa  hasil  hidrolisis in  silico berdasarkan  urutan  yang  ada  di database protein, sehingga  didapatkan  identitas  protein  (Domon  dan Aebersold, 2006).
Dalam  analisis  proteomik,  pada  umumnya digunakan spektrometri massa dengan resolusi tinggi ( High-Resolution MS ) . Peralatan Spektrometri Massa Resolusi Tinggi mampu menentukan massa molekuler  suatu  senyawa  secara  tepat.  Tergantung dari  atom  yang  terkandung  dalam  suatu  molekul, dimungkinkan  bahwa  suatu  molekul  dengan  massa nominal  sama  memiliki  sedikit  perbedaan  massa terukur  ketika  pengukuran  presisi  dilakukan.  Jika pengukuran  massa  eksak  terhadap  rumus  molekul yang  massa  nominalnya  sama  menggunakan  massa isotop  yang  paling  umum  untuk  tiap  unsur,  maka perbedaan  massa  diantara  rumus  molekul  akan muncul pada angka  kedua dan  ketiga desimal.  Suatu instrumen Low-Resolution MS tidak  akan  mampu membedakan  rumus  molekul  tersebut.  Spektrometri Massa  Resolusi  Tinggi  tidak  hanya  menentukan massa  eksak  suatu  ion  molekuler,  tetapi  juga memungkinkan  untuk  mengetahui  rumus  molekul eksak.  Umumnya,  instrumen  ini  dapat  menentukan suatu  nilai m/z ion  sampai  empat  atau  lima  angka desimal.  Ketika  massa  diukur  dalam  tingkat ketepatan  ini,  hanya  ada  satu  rumus  molekul  yang akan  cocok  dengan  data  (Pavia  dkk.,  2009).  Hal  ini menjadikan  Spektrometri  Massa  Resolusi  Tinggi sangat  berguna  dalam  analisis  proteomik  karena sampel protein bersifat sangat kompleks.
Di  sisi  lain,  langkah  kunci  dalam  preparasi sampel  untuk  proteomik  adalah  konversi  protein menjadi  peptida  dengan  mengoptimalkan  preparasi serta  metode  LC-MS  yang  sesuai  dengan  protein
spesifik.  Hidrolisis  protein  dengan  protease  adalah salah  satu  langkah  utama  di  dalam  proteomik  (Steen dan Mann, 2004). Tripsin adalah enzim yang popular digunakan untuk reaksi ini. Enzim tripsin menghidrolisis  ikatan  peptida  pada  ujung  peptida karbonil arginin (Arg/R) atau lisin (Lys/K), sehingga menghasilkan  fragmen  peptida  dengan  ujung  C  (C- terminal) arginin atau lisin.  Hidrolisis dengan tripsin berlangsung  pada  pH  optimal  7,5-8,5  dan  umumnya dilakukan pada suhu 37 ℃ (Kapteyn dkk., 2006).
Dengan  cakupannya  yang  luas,  analisis proteomik  merupakan  potensi  besar  yang  harus dikembangkan  untuk  mempelajari  protein  seluler. Oleh karena itu, dalam penelitian ini dilakukan studi hidrolisis  protein  dengan  sampel  otot  rangka Rattus norvegicus menggunakan  enzim  tripsin  untuk mendapatkan  gambaran  mengenai  proses  analisis proteomik.
Rattus norvegicus merupakan hewan mamalia  yang  paling  umum  digunakan  sebagai hewan  percobaan  laboratorium. Rattus  norvegicus banyak digunakan sebagai hewan uji karena beberapa alasan,  diantaranya  mempunyai  respon  yang  cepat, dapat  memberikan  gambaran  secara  ilmiah  yang mungkin  terjadi  pada  manusia  maupun  hewan  lain, siklus  hidup  yang  relatif  pendek,  jumlah  anak  per kelahiran  banyak,  variasi  sifat-sifatnya  tinggi,  dan mudah  dalam  penanganan  (Moriwaki  dan  Shiroishi, 1994).

## BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan
Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah Ultimate  3000  Rapid  Separation  Ultra High  Performance  Liquid  Chromatography yang terhubung dengan Q-Exactive Orbitrap Mass Spectrometer (Thermo  Scientific),  peralatan  gelas laboratorium,  tabung  mikro  1,5  mL,  tabung  konikal 15  mL  steril,  mikropipet  10-1000  μL  (Socorex), centrifuge High  Speed  Sigma  Sartorius  3-30K (Sigma), centrifuge Sorvall  Biofuge  Primo  R (Thermo  Scientific), deep  freezer -80 ℃ (Thermo Scientific),  timbangan  elektrik  (Denver  AA-250), vortex (MX-S  IKA),  dan shaker  mixer (RATEK Instrument). Software yang digunakan dalam penelitian  ini  meliputi  Xcalibur  dan  Proteome Discoverer 2.2 (Thermo Scientific).
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  jaringan  otot  rangka Rattus  norvegicus galur Wistar, sequencing  grade  modified  trypsin dan ditiotreitol dari Promega, Tris base dan Tris HCl dari Merck Millipore, iodoasetamida, amonium bikarbonat, aseton, dan asetonitril  LC-MS grade dari Merck, serta ultrapure distilled water dari INVITROGEN.

## Hidrolisis enzimatis protein
Proses  hidrolisis  protein  didahului  dengan purifikasi  protein  menggunakan  aseton  dingin. Sebanyak  200  μL  supernatan  protein  dipindahkan
pada  tabung  mikro  dan  diendapkan  dengan  1000  μL aseton  dingin  (-20 ℃ ).  Pelet  protein  diendapkan melalui  sentrifugasi.  Pelet  protein  dilarutkan  dalam 500  μL  amonium  bikarbonat  50  mM  (pH  8,5)  dan dihomogenkan  dengan vortex hingga  larut.  Sebanyak 100  μg  protein  direduksi  dengan  2  mM  ditiotreitol selama  60  menit  pada  suhu  ruang.  Selanjutnya, protein dialkilasi dengan 5 mM iodoasetamida selama 30 menit pada keadaan gelap.
Sebanyak  2  μg sequencing  grade  modified trypsin (perbandingan E:S 1:25 (b/b)) ditambahkan ke dalam  sampel  dan  reaksi  enzimatis  dibiarkan berlangsung selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Sampel diencerkan dengan ultrapure distilled water :asetonitril  95:5  (v/v), kemudian  disaring dengan syringe  filter nilon  0,22  μm.  Replikasi hidrolisis dilakukan sebanyak 3 kali.
Analisis  protein  dengan  Spektrometri  Massa Resolusi Tinggi
Sebelum  dianalisis  dengan  MS,  peptida dipisahkan  dengan Ultimate  3000  Rapid  Separation Ultra  High-Performance  Liquid  Chromatography . Sebanyak 5 μL  sampel diinjeksikan  ke  dalam  kolom Acclaim®  PepMap  RSLC  C18  (75  μm×150  mm). Peptida pada kolom dielusi secara gradien menggunakan  dua  fase  gerak,  yakni  fase  gerak  A yang berisi air dan 0,1% asam format dan fase gerak B yang berisi air:asetonitril 2:8 (v/v) dan 0,08% asam format, dengan laju alir 0,3 μL menit -1 .
Analisis  MS  dilakukan  dengan Q-Exactive Orbitrap  Mass  Spectrometer .  Untuk  MS 1 dan  MS 2 dilakukan  dengan  metode  pengionan Nanospray Ionization (NSI). Deteksi MS menggunakan mode ion positif  yang  dioperasikan  dengan  mode high resolution  and  accurate  mass (HRAM).  Untuk analisis  MS 2 digunakan  rentang m/z 200-2000. Analisis  dilakukan  selama  90  menit.  Kromatogram diperoleh dari software Xcalibur yang terhubung pada instrumen.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Hidrolisis protein
Hewan  uji  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah Rattus  norvegicus galur  Wistar,  dengan jenis  kelamin  jantan,  usia  3  bulan,  dan  berbobot  200 gram.  Hewan  uji  diperoleh  dari  Laboratorium Penelitian  dan  Pengujian  Terpadu  (LPPT)  Unit  IV Universitas  Gadjah  Mada  dan  seluruh  prosedur perlakuan  hewan  telah  mendapatkan  sertifikat Kelaikan  Etik  dengan  nomor  00058/04/LPPT/2018. Jaringan  otot  rangka Rattus  norvegicus diambil  dan dilakukan ekstraksi protein.
Analisis  proteomik  dengan  MS  dilakukan dengan  analisis  peptida  (Steen  dan  Mann,  2004). Untuk  mendapatkan  peptida,  maka  protein  terlebih dahulu  dihidrolisis  menggunakan  suatu  enzim  yang dapat  memotong  protein  menjadi  peptida.  Tripsin adalah  enzim  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini. Sebelum  dilakukan  hidrolisis  dengan  tripsin,  protein
dipurifikasi  dengan  menggunakan  aseton  dingin. Sampel protein pada umumnya mengandung senyawa-senyawa  yang  dapat  mengganggu  analisis, seperti  garam-garam,  asam  nukleat,  lipida,  dan  lain- lain  (Antonioli,  2009).  Purifikasi  protein  bertujuan untuk  membuang  kontaminan  dan  memekatkan protein  dalam  bentuk  pelet/endapan,  sehingga  dapat dilarutkan dalam pelarut lain yang kompatibel dengan hidrolisis protein (Simpson dan Beynon, 2010).
Pelet protein selanjutnya dilarutkan ke dalam larutan  0,05  M  amonium  bikarbonat.  Amonium bikarbonat adalah  garam volatil  yang terurai  menjadi amonia,  karbon  dioksida,  dan  air.  Karena  volatil, garam  ini  kompatibel  dengan  MS.  Larutan  amonium bikarbonat  0,05  M  memiliki  rentang  pH  7-9,  yang merupakan pH optimum untuk aktivitas tripsin.
Setelah  dilakukan  purifikasi,  sampel  protein dihidrolisis  untuk  menghasilkan  peptida.  Sebelum dilakukan  reaksi  enzimatis,  reaksi  didahului  dengan reduksi  gugus  disulfida  sistein  dan  dilanjutkan alkilasi.  Protein  merupakan  kumpulan  polipeptida yang  memiliki  struktur  tiga  dimensi,  yang  saling melipat  membentuk  globular  besar.  Pelipatan  protein terjadi  karena  adanya  ikatan  disulfida  antar  residu sistein.    Dalam  banyak  kasus,  jika  protein  tidak terbuka ( unfolded ) dengan benar sebelum penambahan enzim protease, enzim tidak akan secara efisien memecah protein. Oleh karena itu, interpretasi data  MS  akan  sulit  karena  beberapa  peptida  hasil kesalahan  pemotongan  ( miscleavage )  akan  muncul dan  menghasilkan  beberapa  nilai m/z .  Peptida  yang sulit terionisasi tidak akan terdeteksi, yang menyebabkan  cakupan  urutan  protein  yang  lebih rendah. Kehadiran ikatan disulfida di banyak struktur pelipatan  protein  membuat  peneliti  berfokus  pada upaya  untuk  mereduksi  dan  mengalkilasi  protein. Reduksi  dan  alkilasi  dapat  dilakukan  dengan  reagen ditiotreitol (DTT) dan iodoasetamida (IAA) (Rebecchi dkk., 2011)
Ditiotreitol  adalah  agen  pereduksi  yang mengubah  ikatan  disulfida  sistein  menjadi  gugus sulfihidril bebas, sehingga reagen ini berfungsi untuk memutus ikatan disulfida protein, sedangkan iodoasetamida  adalah  agen  alkilasi  yang  bereaksi dengan gugus sulfihidril bebas dari sistein membentuk  S-karboksiamidometil  sistein,  yang  tidak dapat dioksidasi kembali membentuk ikatan disulfida. Reaksi  dapat  dilihat  pada  Gambar  1.  Menurut Rebecchi  dkk.  (2011),  langkah-langkah  tersebut sangat  penting  untuk  memberikan  akses  maksimum tripsin terhadap protein, sehingga pemotongan terjadi secara  maksimal.  Dengan  hilangnya  ikatan  disulfida protein,  maka  struktur  protein  menjadi  terbuka  dan dapat bereaksi dengan enzim tripsin secara maksimum.
Protein  kemudian  dihidrolisis  dengan  enzim tripsin.  Hidrolisis  protein  dengan  protease  adalah salah  satu  langkah  kunci  di  dalam  proteomik. Parameter  hidrolisis  dapat  divariasi  secara  sistematis untuk  memantau  efeknya  terhadap  kecepatan  dan
kesempurnaan  hidrolisis.  Informasi  tentang  rasio enzim:substrat (E:S) sangat diperlukan untuk memastikan  jumlah  enzim  cukup  untuk  melakukan hidrolisis, tetapi tidak terlalu tinggi yang mengakibatkan produk autolisis dari tripsin itu sendiri (Hustoft  dkk.,  2012).  Rasio  E:S  antara  1:100  sampai 1:10 (b/b) adalah rasio yang direkomendasikan untuk hidrolisis protein (Smith, 2002; Wierenga dkk., 2002; Suder  dkk.,  2004;  Kapteyn  dkk.,  2006;  dan  Silva dkk., 2006). Optimasi dapat dilakukan dengan variasi rasio  tersebut,  dimana  setiap  jenis  protein  dapat memiliki rasio optimumnya masing-masing.
Orduna  dkk.  (2017)  melakukan  hidrolisis protein  daging  menggunakan  rasio  E:S  1:50  (b/b), sedangkan  Alfiraza  (2018)  melakukan  hidrolisis protein  gelatin  menggunakan  rasio  E:S  1:25  (b/b). Pada  penelitian  ini,  optimasi  dilakukan  pada  variasi E:S  1:25  (b/b).  Pemilihan  rasio  tersebut  karena merupakan  rasio  yang  tidak  terlalu  kecil  sehingga diharapkan  jumlah  peptida  yang  dihasilkan  banyak dan  juga  tidak  terlalu  besar  sehingga  menyebabkan autolisis dari tripsin itu sendiri.
Enzim tripsin bekerja secara spesifik dengan menghidrolisis  ikatan  peptida  pada  ujung  peptida karbonil  arginin  (Arg/R)  atau  lisin  (Lys/K),  sehingga menghasilkan  fragmen  peptida  dengan  ujung  C  (C- terminal)  arginin  atau  lisin.  Tahap  reaksi  dan  proses hidrolisis  protein  dapat  dilihat  pada  Gambar  2  dan Gambar 3.
Gambar  1.  Reaksi  pada  ikatan  disulfida  sistein  (Cys) dengan DTT dan IAA.
Gambar 2. Reaksi hidrolisis protein dengan enzim tripsin.
Gambar 3. Proses hidrolisis protein secara enzimatis.

## Analisis MS
Setelah dilakukan pemisahan peptida menggunakan Liquid  Chromatography ,  selanjutnya peptida  diionisasi  dan  difragmentasi  menggunakan MS. Mass  Spectrometry mengukur  rasio  massa terhadap  muatan  ion  untuk  mengidentifikasi  molekul dalam  campuran  sederhana  ataupun  kompleks.  MS telah  menjadi  alat  yang  digunakan  di  berbagai aplikasi termasuk proteomik. Dalam analisis proteomik,  pada  umumnya  digunakan  spektrometri massa  dengan  resolusi  tinggi  ( High-Resolution MS ) . Peralatan  Spektrometri  Massa  Resolusi  Tinggi mampu  menentukan  massa  molekuler  suatu  senyawa secara tepat.
Metode  MS  dengan  dua  kali  analisis  massa disebut tandem MS,  MS/MS,  atau  MS 2 .  Kombinasi MS 1 (tahap 1) dan MS 2 (tahap 2) yang terdapat pada Spektrometri  Massa  Resolusi  Tinggi  memungkinkan screening target  dan  identifikasi  peptida.  Sampel diinjeksikan  ke  MS,  diionisasi,  dipercepat,  dan dianalisis  dengan  MS.  Ion-ion  dari  spektra  MS 1 kemudian difragmentasi secara selektif dan dipisahkan  berdasarkan  masing-masing  rasio m/z dalam tahap kedua (MS 2 ) untuk menghasilkan spektra fragmen  ion  (Weisser  dan  Choudhary,  2017). Berdasarkan  hasil  analisis  MS,  terdapat  219  protein yang  berhasil  terindentifikasi  dari  sampel  jaringan otot rangka Rattus norvegicus (data ditampilkan pada File Tambahan ) .
Salah  satu  protein  yang  teridentifikasi  oleh MS  adalah  aspartat  aminotransferase  mitokondrial dengan  nomor  asesi  P00507.  Protein  ini  merupakan protein yang terlibat dalam proses metabolisme asam amino.  Jumlah  peptida  yang  teridentifikasi  adalah  8. Salah satu peptida protein ini yaitu IAATILTSPDLR. Peptida  ini  merupakan  peptida  pada  posisi  ke-326 sampai  337  dari  urutan  asam-asam  amino  protein aspartat  aminotrasferase  mitokondrial  (Gasteiger dkk.,  2003).  Peptida  IAATILTSPDLR  teridentifikasi dari  fragmentasi  MS 2 dengan m/z 635,87232,  [M- H] + =1270,73737  Da  ([M-H] + teoritis =1270,73657  Da), dan z=+2. Spektra fragmentasi MS 2 ditunjukkan pada
Gambar 4, sedangkan pola fragmentasinya ditampilkan pada Gambar 5.
Gambar 4. Spektra fragmentasi MS 2 peptida IAATILTSPDLR protein aspartat aminotransferase mitokondrial.
Fragmen  ion  peptida  IAATILTSPDLR  yang terkonfirmasi  dalam  MS 2 adalah  y 1 + ;  y 1 + -NH 3 ;  y 1 2+ ; y 2 + ;  y 2 + -NH 3 ;  y 2 2+ -NH 3 ;  y 3 + ;  y 3 + -NH3;  y 4 + ;  y 4 + -NH 3 ; y 4 2+ -NH 3 ;  y 5 + ;  y 5 + -NH 3 ;  y 6 + ;  y 7 + ;  y 7 + -NH 3 ;  y 7 + -H 2 O; y 8 + ;  y 9 + ;  y 9 2+ -H 2 O;  y 10 + ;  y 10 + -H 2 O;  y 11 + ;  b 2 + ;  b 3 + ;  b 4 + ; b 4 + -H 2 O; b 5 + ; b 5 + -H 2 O; b 6 + -H 2 O dan b 10 2+ -H 2 O. Untuk  mengetahui  informasi  struktural  dari MS,  molekul  bermuatan  harus  melalui  proses
fragmentasi. Menurut nomenklatur Roepstroff- Fohlmann-Biemann,  pemutusan  ikatan  terjadi  pada ikatan  paling  lemah,  yakni  ikatan  amida.  Pemutusan ikatan ini  menghasilkan ion b + atau  y + . Ion b + terjadi apabila muatan berada pada fragmen yang mempunyai ujung amina (N-terminal), sedangkan ion y + terjadi  apabila  muatan  berada  pada  fragmen  yang mempunyai  ujung  karboksil  (C-terminal)  (Steen  dan Mann,  2004).  Pada  penelitian  ini,  pola  fragmentasi menghasilkan ion b + dan y + , dimana ion ini dapat pula merupakan  ion  yang  kehilangan  NH 3 atau  H 2 O. Sebagai  perbandingan,  fragmen  teoritis  peptida IAATILTSPDLR ditunjukkan pada Tabel 1.
Selain  protein  aspartat  aminotransferase mitokondrial, terdapat protein beta-enolase yang juga teridentifikasi  dengan  nomor  asesi  P15429.  Protein beta-enolase  merupakan  protein  yang  terlibat  dalam proses  metabolisme  glukosa  dan  respon  stimulus. Jumlah  peptida  yang  teridentifikasi  sebanyak  41. Peptida  TLGPALLEK  merupakan  salah  satu  peptida yang  teridentifikasi  dari  protein  tersebut.  Menurut database peptida  pada website expasy.org  (Gasteiger dkk.,  2003),  peptida  ini  berada  pada  posisi  ke-72 hingga  80  dari  urutan  asam-asam  amino  yang membangun protein beta-enolase.
Tabel 1. Fragmen teoritis ion b + dan y + peptida IAATILTSPDLR (http://db.systemsbiology.net/)
Nomor b + Sekuen y + Nomor 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 114,09139 185,12850 256,16561 357,21329 470,29735 583,38141 684,42910 771,46112 868,51389 983,54083 1096,62489 1252,72600 I A A T I L T S P D L R 1270,73657 1157,65251 1086,61539 1015,57828 914,53060 801,44654 688,36247 587,31479 500,28277 403,23000 288,20306 175,11900 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Peptida TLGPALLEK teridentifikasi dari fragmentasi  MS 2 dengan m/z 471,28700,  [M- H] + =941,56672  Da  ([M-H] + teoritis =941,56661  Da), dan  z=+2.  Spektra  fragmentasi  MS 2 ditunjukkan pada  Gambar  6,  sedangkan  pola  fragmentasinya ditampilkan pada Gambar 7. Fragmen ion peptida TLGPALLEK  yang  terkonfirmasi  dalam  MS 2 adalah  y 1 + ;  y 1 + -NH 3 ;  y 1 2+ ;  y 2 2+ ;  y 2 2+ -NH 3 ;  y 2 2+ - H 2 O; y 3 + ; y 7 + ; b 1 + -H 2 O; b 2 + dan b 8 2+ -H 2 O. Sebagai perbandingan,  fragmen  teoritis  peptida  tersebut ditunjukkan pada Tabel 2.
Berdasarkan perbandingan, hasil fragmentasi  peptida-peptida  dan  fragmen  teoritis in  silico bersesuaian  satu  sama  lain.  Kesesuaian ini dapat dilihat hingga 3 angka di belakang koma. Hal  ini  mengindikasikan  bahwa  identifikasi peptida menggunakan Spektrometri Massa Resolusi  Tinggi  mampu  memberikan  hasil  yang akurat,  sehingga  dapat  menghindari  keraguan dalam  identifikasi  peptida.  Hasil  ini  juga menunjukkan bahwa Spektrometri Massa Resolusi Tinggi  yang  mengkombinasikan  dua  tahap analisis  massa  (MS 1 dan  MS 2 )  memungkinkan screening target  dan  identifikasi  peptida  dari
matriks  protein  yang  sangat  kompleks,  sehingga sangat  membantu  dalam  studi  protein.  Dalam penelitian  ini,  penggunaan  enzim  tripsin  dapat secara spesifik menghidrolisis ikatan peptida pada ujung  peptida  karbonil  arginin  (Arg/R)  atau  lisin (Lys/K),  sehingga  menghasilkan  fragmen  peptida dengan ujung C (C-terminal) arginin atau lisin.
Gambar 6. Spektra fragmentasi MS 2 peptida TLGPALLEK protein beta-enolase
Tabel 2. Fragmen teoritis ion b + dan y + peptida TLGPALLEK (http://db.systemsbiology.net/)
No b + Sekuen y + No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 102,05500 215,13906 272,16053 369,21329 440,25040 553,33447 666,41853 795,46112 923,55609 T L G P A L L E K 941,56665 840,51897 727,43491 670,41391 573,36068 502,32357 389,23951 276,15544 147,11285 8 7 6 5 4 3 2 1
Gambar 7. Pola pemotongan peptida TLGPALLEK berdasarkan hasil spektra MS 2

## KESIMPULAN
Dalam  penelitian  ini,  analisis  proteomik dilakukan terhadap otot rangka Rattus norvegicus . Hidrolisis  protein  menggunakan  tripsin  bertujuan untuk  mengkonversi  protein  menjadi  peptida. Identifikasi  protein  dilakukan  dengan  melihat pola  fragmentasi  peptida  yang  dihasilkan  oleh Spektrometri Massa Resolusi
Tinggi. Berdasarkan  hasil  analisis  MS,  terdapat  219 protein  yang  berhasil  terindentifikasi  dari  sampel jaringan  otot  rangka Rattus  norvegicus .  Hasil fragmentasi  peptida  menunjukkan  kesesuaian dengan fragmen teoritis secara in silico , sehingga analisis  proteomik  dengan  Spektrometri  Massa Resolusi  Tinggi  memungkinkan screening target peptida  dan  identifikasi  peptida  dari  matriks protein  yang  sangat  kompleks,  serta  sangat membantu dalam studi protein seluler.

## DAFTAR PUSTAKA
Alfiraza,  E.N.  (2018).  Identifikasi  Peptida Spesifik pada Gelatin Babi Menggunakan Liquid Chromatography-High Resolution Mass  Spectrometry  (LC-HRMS) , Tesis , Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Domon,  B.,  &  Aebersold,  R.  (2006).  Mass Spectrometry  and  Protein  Analysis,
Sciences , 312 , 212-217.
Gasteiger,  E.,  Gattiker,  A.,  Hoogland,  C.,  Ivanyi, I.,  Appel,  R.D.,  &  Bairoch,  A.  (2003). ExPASy:  The  Proteomics  Server  for  In- Depth  Protein  Knowledge  and  Analysis, Nucleic Acids Research , 31 , 3784-3788. http://db.systemsbiology.net/, diakses pada 20
Mei 2022.
Hustoft,  H.K.,  Malerod,  H.,  Wilson,  S.R., Reubsaet, L., Lundanes, E. and Greibrokk,  T.  (2012). A  Critical  Review of  Trypsin  Digestion  for  LC-MS  Based Proteomics, Integrative Proteomics , Rijeka: InTech.
Kapteyn, J.C., Saidi, M.D., Dijkstra, R., Kars, C., Tjon, J.C., Weverling, G.J., de Vocht, M. L.,  Kompier,  R.,  van  Montfort,  B.  A., Guichoux, J-Y., Goudsmit, J., & Lagerwerf, F. M. (2006). Haemagglutinin Quantiﬁcation  and  Identiﬁcation  of Inﬂuenza  A&B  Strains  Propagated  in PER.C6(R)  Cells:  A  Novel  RP–HPLC Method, Vaccine , 24 , 3137–3144. Kenyon, G.L., DeMarini, D.M., Fuchs, E., Galas, D.J.,  Kirsch,  J.F.,  Leyh,  T.S.,  Moos, W.H.,  Petsko,  G.A.,  Ringe,  D.,  Rubin, G.M.,  &  Sheahan,  L.C.  (2002).  Defining the  Mandate  of  Proteomics  in  the  Post- Genomics Era: Workshop Report, Molecular  &  Cellular  Proteomics , 1 , 763–780.
McLafferty,  F.W.,  Breuker,  K.,  Jin,  M.,  Han,  X., Jiang,  H.,  Kong,  X.,  &  Begley,  T.P. (2007).  Top-Down  MS:  a  Forward Complement  to  the  High  Capabilities  of Proteolysis  Proteomics, FEBS  Journal , 274 , 6256-6268.
Moriwaki,  K.T.,  &  Shiroishi,  H.Y.  (1994).
Genetic  In  Wild  Mice,  Its  Application  to Biomedical Research , Tokyo: Karger.
Orduna,  A.R.,  Husby,  E.,  Yang,  C.T.,  Ghosh,  D.
and Beaudy, F. (2017). Detection of Meat
Species Adulteration Using High-
Resolution  Mass  Spectromery  and  a Proteogenomics Strategy, Food Additives & Contaminats , 34 .
Ortrea,  I.,  O’Connor,  G.,  &  Maquet,  A.  (2016).
Review on Proteomics for Food
Authentication, Proteomics , 147 ,  212- 225.
Pan, S., Zhang, H., Rush, J., Eng, J., Zhang, N., &
Patterson,  D.  (2005).  High-Throughput Proteome-Screening for Biomarker Detection, Molecular & Cellular
Proteomics , 4 , 182-190.
Pandey,  A.,  &  Mann,  M.  (2000)  Proteomics  to Study  Genes and Genomes, Nature , 405 ,
837-846.
Pavia,  D.L.,  Lampman,  G.M.,  Kriz,  G.S.,  & Vyvyan,  J.A.  (2009). Introduction  to Spectroscopy ,  4 th Ed.,  Boston:  Cengage Learning.
Rebecchi,  K.R.,  Go,  E.P.,  Xu,  L.,  Woodin,  C.L.,
Mure,  M.,  &  Desaire,  H.  (2011).  A General Protease Digestion Procedure for Optimal  Protein  Sequence  Coverage  and PTM Analysis
of Recombinant Glycoproteins: Application to the Characterization of HLOXL2
Glycosylation, Analytical  Chemistry , 83 , 8484-8491.
Silva,  J.C.,  Gorenstein,  M.V.,  Li,  G-Z.,  Vissers, J.P.C.,  &  Geromanos,  S.J.  (2006). Absolute  Quantiﬁcation  of  Proteins  by LCMSE:  A  Virtue  of  Parallel  MS
Acquisition, Molecular & Cellular
Proteomics , 5 , 144–156. Smith, B.J. (2002). Protein Sequencing Protocols , Totowa: Humana.
Steen,  H.,  &  Mann,  M.  (2004).  The  ABC’s  (and
XYZ’s) of Peptide Sequencing,
Molecular  &  Cellular  Biology , 5 ,  699-
711.
Suder,  P.,  Bierczynska,  A.,  Konig,  S.,  & Silberring, J. (2004). Acid-Labile
Surfactant  Assists  In-Solution  Digestion of  Proteins  Resistant  to  Enzymatic
Attack, Rapid  Communication  Mass Spectrom , 18 , 822–824. Weisser, H. and Choudhary, J.S. (2017). Targeted Feature  Detection  for  Data-Dependent
Shotgun
Proteomics,
Journal of
Proteome Research , 16 , 2964-2974. Wierenga,  S.K.,  Zocher,  M.J.,  Mirus,  M.M., Conrads, T.P., Goshe, M.B., & Veenstra, T.D.  (2002).  A  Method  to  Evaluate Tryptic  Digestion  Efﬁciency  for  High- Throughput  Proteome  Analyses, Rapid Communication  Mass  Spectrom , 16 , 1404–1408. Wilkins, M.R., Pasquali, C., Appel, R.D., Ou, K., Golaz, O., & Sanchez, J.C. (1996). From
Proteins  to  Proteomes:  Large  Scale Protein
Identification
by Two- Dimentional  Electrophoresis  and  Amino Acid Analysis, Biotechnology , 14 , 61-65.