PEMODELAN HOMOLOGI KOMPARATIF FABP BELALANG KEMBARA ( Locusta migratoria ) DENGAN PHYRE2 DAN SKRINING VIRTUAL INHIBITOR POTENSIAL
Comparative Homology Modeling of Fatty-Acid Binding Protein (FABP) from Locusta migratoria Using Phyre2 and Virtual Screening for Potent Inhibitors
Fredy Z. Saudale * , Irenes R.S. Suatu
Program Studi Kimia, Fakultas Sains dan Teknik , Universitas Nusa Cendana, Jl. Adisucipto, Penfui, Kupang, NTT
*Corresponding author, e-mail: fredy_saudale@staf.undana.ac.id
Received: Nov. 2019 Published: Jan. 2020

## ABSTRACT
The outbreak of locusta migratoria has caused a local crisis in production and cultivation of agricultural crops in East Nusa Tenggara Province. FABP (Fatty Acid-Binding Protein) plays an important role in transporting fatty acids from cytoplasm into mitochondria to generate ATP energy for locusta to fly and migrate. FABP inhibition is an attractive strategy to be exploited for novel insecticide development. Comparative homology modeling using Phyre2 had been used to generate two FABP models built from desert locusta (Schistocerca gregaria, 98% percent identity) and mice (Mus musculus, 40% percent identity) FABP protein as templates. Both FABP models showed an acceptable quality  of stereochemistry and structural  energy with lower atomic clash scores after refinement. Virtual screening identified potent inhibitor candidates with highest affinity energies which are (i) a heterocyclic compound  C00628966  (-10.2  kcal/mol)  and  (iii) an  imidazole  derivative  C15721579  (-8.5  kcal/mol)  that  were stabilized  through  a  hydrogen  bond  with  Ser53  also  (iii)  a  pyrimidine  derivative  C73698912  (-8.1  kcal/mol) stabilized through hydrogen bonds with Thr57, Thr62 and Ser55. Their interactions resemble inhibitors that have been  known  to  inhibit  homologous  FABP  in  humans.  Therefore,  these  compounds  warrant  further  in  vitro validation and assay for development of selective insecticides to control locusta population.
Keywords: Locusta migratoria, FABP, modelling, PHYRE2.

## PENDAHULUAN
Dalam  rangka  pemanfaatan  lahan  kering kepulauan  untuk  mendukung  produksi  dan ketahanan  pangan  di  Nusa  Tenggara  Timur (NTT),  tantangan  dan  hambatan  berupa  ledakan hama  belalang  kembara  ( locusta  migratoria ) masih terus dijumpai dan belum dapat dituntaskan hingga  saat  ini  (Lassa,  2017). Belalang  kembara secara berkala menimbulkan kerugian diberbagai komoditas  budidaya  pertanian  seperti  padi  dan jagung (Lassa, 2017). Insektisida yang umum dan paling  banyak  digunakan  dipasaran  terhadap serangan  hama  belalang  kembara  saat  ini mengandung  senyawa-senyawa  kimia  aktif  yang termasuk dalam golongan karbamat, organofosfat dan  piretroid  (Nawaz  dkk.,  2016).  Namun demikian  kekurangan  dari  insektisida  golongan karbamat, organofosfat, piretroid dan organoklorin yang bersifat neuroaktif adalah efek
toksisitasnya  terhadap  kesehatan  manusia  dan lingkungan (Cortés-Eslava dkk., 2018). Selain itu, resistansi serangga terhadap golongan insektisida tersebut  juga  telah  dilaporkan  terus  meningkat (Yang dkk., 2009). Oleh karenanya adalah suatu urgensi untuk  mengembangkan insektisida dengan target molekul yang baru.
Fatty  Acid  Binding  Protein (FABP) berpotensi  untuk  dikembangkan  sebagai  target protein  baru  dalam  desain  dan  pengembangan insektisida  yang  selektif.  FABP  berperanan penting  dalam  mengangkut  asam  lemak  untuk disimpan sebagai trigliserida (TG) di lipid droplet sitoplasma  maupun  untuk  diproses  sebagai substrat  beta  oksidasi  menghasilkan  energi  ATP di mitokondria (Hotamisligil dan Bernlohr, 2015). Substrat  dari  FABP  belalang  kembara  adalah asam lemak oleat yang berinteraksi pada kantong pengikatan melalui ikatan hidrogen dengan residu Arg109, Arg129 dan Tyr131 dan beberapa residu
1
non polar melalui ikatan hidrofobik (Lücke dkk., 2006).  Inhibisi  aktivitas  FABP  oleh  senyawa kimia  disitus  tempat  pengikatan  substrat  asam oleat  dapat  diprediksikan  menurunkan  suplai energi dan menghambat kemampuan terbang dan migrasi dari belalang kembara tersebut. Gambaran  mekanisme  inhibisi  FABP  belalang kembara bisa didapatkan dari informasi penghambatan  pada  FABP  manusia  yang merupakan  protein  homolog  dan  memiliki kekerabatan  secara  evolusi.  Secara  evolusi, protein  homolog  adalah  protein  dari  organisme lain  yang  mempunyai  kemiripan  sekuen  asam amino  dengan  protein  target  dan  berasal  dari leluhur  yang  sama  ( common  ancestor) .  Jika struktur  protein  yang  mempunyai  kemiripan dengan  protein  target  sudah  dielusidasi  secara eksperimental  maka  struktur  3D  protein  target bisa diprediksi berdasarkan urutan asam aminonya. Hal ini didasarkan atas prinsip bhawa kemiripan  sekuen  asam  amino  yang  tinggi  ini mengimplikasikan kemiripan struktur 3D protein dan  juga  fungsinya  (R  Shenoy  dan  Jayaram, 2010).  Sekuen  asam  amino  FABP  belalang kembara  menunjukkan  kemiripan  sebesar  65% dan  64%  dengan  FABP  jantung  dan  adiposa manusia. Identifikasi inhibitor FABP jantung dan adiposa manusia telah banyak dieksplorasi dalam riset  pengembangan  obat  diabetes  (Beniyama dkk.,  2013,  Cai  dkk., 2015, Floresta  dkk.,  2017, Wang  dkk.,  2016).  Hal  ini  dilakukan  dengan memanfaatkan ketersediaan informasi struktur 3D protein  FABP  baik  yang  didapatkan  melalui eksperimen  kristalografi  sinar  X,  NMR  maupun pemodelan  komputasional  ( in  silico )  atau  yang dikenal dengan pendekatan structure-based drug design (SBDD)  (Kalyaanamoorthy  dan  Chen, 2011, Lounnas dkk., 2013, T. Wang dkk., 2016). Turunan  pirazol,  oxazol,  imidazol,  indol,  tiazol, karbamoil  dan  pirimidin  telah  dilaporkan menunjukkan aktivitas penghambatan yang tinggi terhadap  FABP  adiposa  manusia  (Floresta  dkk., 2017, Wang dkk., 2016). Sebagai contoh senyawa asam  2-({[(3,5-diklorofenil)  karbamoil]  metil} sulfanill) asetat menunjukkan karakteristik inhibisi  yang  kuat  dan  spesifik  terhadap  FABP adiposa manusia (Cai dkk., 2010). Residu Arg126 dan  Tyr128  pada  kantong  pengikatan  FABP adiposa  manusia  diketahui  memainkan  peran penting dalam interaksi ikatan hidrogen. Misalnya,  Arg126  bertindak  sebagai  hidrogen donor  ikatan  untuk  berinteraksi  dengan  gugus karboksil  dan  sulfon  senyawa  inhibitor.  Asam amino  Phe16  dan  Ser53  juga  memainkan  peran
penting  dalam  afinitas  dan  selektivitas.  Asam amino  Phe16  membentuk  interaksi  π-π  dengan cincin  aromatik  melalui  bantuan  residu  Ser53. Sehingga  dengan  demikian  informasi  tentang asam-asam  amino  penting  dikantong  pengikatan FABP homolog dari manusia ini yang menunjukkan interaksi dengan kandidat senyawa inihibitor dapat menjadi petunjuk dalam mengidentifikasi senyawa inhibitor baru terhadap FABP  dari  belalang  kembara  menggunakan pendekatan SBDD seperti pemodelan komputasional  ( in  silico ),  penapisan  virtual ( virtual screening ) maupun penambatan molecular  ( molecular docking )  (Firdaus  dkk., 2017; Floresta dkk., 2019, Gaspersz dan Sohilait, 2019;  Khan  dkk.,  2016,  La  Kilo  dkk.,  2019, Macalino dkk., 2015). Namun demikian walaupun  pendekatan  SBDD  telah  diterapkan secara  luas  dalam  riset  bidang  farmasi, aplikasinya dalam penelitian di bidang agrokimia masih  belum  banyak  ditemui  (Lamberth  dkk., 2013). Selain itu sampai saat ini belum pernah ada penelitian yang menerapkan prinsip SBDD dalam mengidentifikasi  inhibitor  potensial  terhadap FABP  belalang  kembara  untuk  pengembangan insektisida baru yang selektif.
Oleh  sebab  itu  dalam  penelitian  ini pemodelan  homologi  komparatif  dengan  Phyre2 akan  digunakan  dengan  tujuan  untuk  (i) membangun model protein target FABP belalang kembara in  silico menggunakan  templat  FABP belalang  gurun  dan  mencit  yang  kemudian  akan digunakan  dan  (ii)  untuk  mengidentifikasi kandidat-kandidat inhibitor melalui virtual screening serta docking . Penelitian ini merupakan  tahap  awal  ( preliminary )  yang bertujuan  untuk  mendapatkan  senyawa- senyawa kandidat insektisida yang direkomendasikan  untuk  divalidasi  dan diujikan  lebih  lanjut  secara in  vitro di laboratorium  maupun on  field di  lapangan . Implikasi  keterbaruan  dari  penelitian  ini  tertuju pada penerapan pendekatan pemodelan komputasional  ( in  silico )  SBDD  dalam  tahap- tahap  awal  riset  desain  dan  pengembangan insektisida untuk aplikasi di bidang pertanian dan ketahanan pangan terhadap hama penyakit secara khusus belalang kembara. Kelebihan SBDD yang dibantu  teknologi  komputasional  adalah  dalam menawarkan pendekatan baru yang lebih rasional, prediktif,  iteratif,  cepat,  ramah  lingkungan  yang mendukung  kampanye green  chemistry dengan
1
resiko  kecil  serta  biaya  murah  dalam  riset agrokimia (Shanmugam dan Jeon, 2017).

## METODOLOGI

## Perangkat keras (Hardware)
Seperangkat  laptop  HP  Pavilion  x360 Convertible Signature Edition sistem operasi 64- bit dengan spesifikasi prosesor Interl(R) Core(TM)  i5-6200U  CPU  @2.30GHz  2.40GHz, RAM 8 GB, harddisk 930 GB.

## Perangkat lunak (Software)
PyRx-Python  Prescription  0.8  (The  Scripps Research  Institute),  Poseview  versi  1.1.2 (BioSolveIT  GmBH,  Germany)  dan  PyMOL Molecular  Graphics  System  versi  2.2.3.  (The Schrodinger LLC, New York).

## Prosedur Kerja
Mendapatkan  Sekuen  Protein  Target  dan Analisis Penjajaran Sekuen Jamak
Sebanyak  134  asam  amino  protein  FABP belalang kembara ( Locusta migratoria ) didapatkan
dari database UniProtKB (https://www.uniprot.org/)  dan  disimpan  dalam format file FASTA (Consortium, 2014). Analisis penjajaran  sekuen  jamak  antara  FABP  otot terbang  belalang  kembara  ( Locusta  migratoria , kode  UniProtKB:  P41509),  FABP  otot  terbang belalang  gurun  ( Schistocerca  gregaria ,  kode UniProtKB:  P41496),  FABP  Jantung  Sapi  ( Bos taurus , kode UniProtKB: P10790), FABP adiposa Mencit  ( Mus  musculus ,  kode  UniProtKB: P04117)  dan  FABP  jantung  manusia  ( Homo sapiens ,  kode  UniProKB:  P05413,  PDB:  5HZ9) dilakukan menggunakan Clustal Omega (Sievers dan Higgins, 2018).

## Pemodelan Homologi Komparatif
Sekuen asam amino FABP belalang kembara dijadikan  sebagai  input  ( query )  untuk  memulai pemodelan  homologi  komparatif  menggunakan webserver Phyre2 dengan mode default normal di http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2  (Kelley  dkk., 2015).

## Evaluasi, Validasi dan Penyempurnaan
Model  3D  FABP  belalang  kembara  yang dibangun tidak lepas dari kesalahan ( error ) secara stereokimia  maupun  energi.  Server  ProSA (Wiederstein dan Sippl, 2007), MolProbity (Chen dkk., 2010) dan SAVES ( Structure Analysis  and Verification  Server )  v5.0  yang  berisi  lima
program  verifikasi  struktural  yaitu  Verify  3D (Eisenberg  dkk.,  1997),    ERRAT  (Colovos  dan Yeates,  1993),  PROVE  (Pontius,  Richelle,  dan Wodak, 1996), PROCHECK (Laskowski, MacArthur,  Moss,  dan  Thornton,  1993)  dan WHATCHECK  (Hooft,  1996)  digunakan  untuk mengevaluasi  dan  memvalidasi  model  protein. Model protein FABP belalang kembara yang telah dievaluasi dan divalidasi kemudian disempurnakan  menggunakan  Galaxy  REFINE (Heo dkk., 2013).

## Skrining virtual dan docking Tahap I (Penapisan fragmen)
DOCK  Blaster  yang  menerapkan  algoritma docking  DOCK  3.6  digunakan  untuk  skrining pendahuluan sebanyak 1.611.889 senyawa fragmen  kimia  yang  terdapat  di  dalam  kategori subset  #12 clean  fragments dari  database  ZINC terhadap  model  protein  FABP belalang  kembara yang  telah  dibangun  menggunakan  templat belalang gurun dan mencit.

## Tahap II (Validasi)
Sebanyak  500  senyawa  fragmen  yang  telah didapat dari hasil virtual screening dengan DOCK Blaster selanjutnya diverifikasi dan dikonfirmasi dengan  melakukan re-docking menggunakan server  MTi  Open  Screen  (Labbé  dkk.,  2015). Input  data  menggunakan  model  protein  FABP belalang  kembara  dalam  file  PDB  dan  500 senyawa  fragmen  dalam  format  file  SDF ( Structure  Data  File ).  Situs  aktif  dan  kantong pengikatan  FABP  ditentukan  berdasarkan  atas residu-residu  asam  amino  yang  terdapat  disitus aktif    antara  lain  yaitu  Phe17,  Tyr20,  Met21, Gly34,  Ile41,  Leu77,  Arg108,  Ile117,  Ile119, Arg128,  Tyr130.  Sebanyak  10  top  senyawa fragmen  kemudian  dipilih  berdasarkan  skor re- docking dalam  bentuk  besaran  energi  afinitas (kkal/mol) , kesesuaian  konformasi  dan  orientasi ( pose )  fragmen  di  situs  aktif  dan  kantong pengikatan,  juga  banyaknya  interaksi  hidrogen dan hidrofobik yang terbentuk.
Tahap III: Farmakofor, penapisan dan docking senyawa kandidat
Top  fragmen  yang  didapatkan  dari  hasil virtual  screening dengan  model  protein  FABP belalang kembara menggunakan templat belalang gurun  dan  mencit  kemudian  dianalisis  fitur-fitur farmakofornya menggunakan PharmaGist
1
(Schneidman-Duhovny  dkk.,  2008).  Model farmakofor  yang  telah  dibangun  kemudian digunakan  untuk  melakukan virtual  screening senyawa-senyawa  kandidat (Berat  Molekul  300- 500  gram/mol)  menggunakan  Pharmit  (Sunseri dan  Koes,  2016)  dengan  database  dari  ZINC Purchasable.  Maksimun 10 senyawa top kandidat yang didapatkan kemudian di docking menggunakan PyRx (Dallakyan dan Olson, 2015) untuk  mengetahui  besarnya  energi  afinitas (kkal/mol) dan interaksi hidrogen juga hidrofobik yang terbentuk secara 2D menggunakan
Poseview  (Stierand  dan  Rarey,  2010)  dan  3D dengan PyMOL (Seeliger dan de Groot, 2010).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Untuk  mendapatkan  templat  protein  yang akan  digunakan  dalam  membangun  struktur  3D FABP belalang kembara menggunakan pemodelan homologi komparatif Phyre2 berdasarkan  tingkat  kemiripan  susunan  asam aminonya  maka  dilakukan  penjajaran  sekuen jamak menggunakan Clustal Omega. Didapatkan bahwa  residu  asam  amino  FABP  otot  belalang
Tabel 1. Karakteristik cetakan ( template ) protein yang digunakan dalam pemodelan struktur 3D FABP belalang kembara menggunakan PHYRE2
No Organisme Nama Protein Kode PDB % Confidence % Identity Apo/Holo Eksperimen Jumlah residu Referensi 1. BelalangGurun ( Schistocerca gregaria ) FABP otot terbang 1ftp 100% 98% Apo X-Ray, 2,2 Å 133 (Haunerland dkk., 1994) 2. Mencit ( Mus musculus ) FABP jaringan lemak 1g7n 100% 40% Apo X-Ray, 1,5 Å 131 (Reese dan Banaszak,
2004)
Gambar 1. Analisis penjajaran sekuen jamak antara asam amino FABP otot terbang belalang kembara ( Locusta migratoria ,), FABP otot terbang belalang gurun ( Schistocerca gregaria ) , FABP Jantung Sapi ( Bostaurus ), FABP jaringan adiposa Mencit ( Mus musculus ) dan FABP jantung manusia ( Homo sapiens ).
kembara  memiliki  persen  kesamaan  yang  tinggi dengan  FABP  otot  belalang  gurun  yaitu  sebesar 97,74%,  dengan  FABP  jantung  sapi  39,69%, dengan FABP jaringan lemak mencit 38,93% dan dengan FABP jantung manusia 39,39% (Gambar 1).
Terlihat  asam-asam  amino  yang  berperanan penting dalam berinteraksi dengan substrat asam lemak  seperti  Thr63,  Arg  109,  Arg129,  Tyr130 yang  membentuk  ikatan  hidrogen  tampak  lestari ( conserved )  pada  FABP  dari  semua  organisme (Lücke  dkk.,  2006).  Sementara  itu  Ser56  yang juga berperan dalam membentuk ikatan hidrogen tampak  lestari  pada  FABP  belalang  kembara, belalang  gurun  dan  mencit,  namun  bermutasi secara  sinonim  menjadi  Thr56  pada  FABP  sapi dan  manusia.  Asam-asam  amino  non  polar  yang menstabilkan  rantai  alifatik  dari  asam  lemak seperti  Phe18,  Met22,  Pro40,  Ile106  melalui interaksi  hidrofobik  juga  terlihat  lestari  pada FABP dari semua organisme. Informasi ini tidak hanya  menunjukkan  bagaimana  asam-asam amino tersebut berperanan sangat esensial dalam menstabilkan  interaksi  dengan  substrat  asam lemak,  tapi  juga  menjadi  petunjuk  dalam mengidentifikasi  senyawa-senyawa  kimia  baru yang  dapat  menunjukkan  interaksi  yang  sama dengan  residu  asam  amino  tersebut.  Senyawa- senyawa kimia yang dapat menunjukkan interaksi yang  sama  dengan  residu  asam  amino  yang berinteraksi  dengan  substrat  asam  lemak berpotensi menjadi kompetitor bagi substrat asam
lemak tersebut dengan demikian dapat dikembangkan menjadi  inhibitor FABP belalang kembara.  Ini  yang  nanti  menjadi  dasar  dalam pemilihan  senyawa  kandidat  inhibitor  melalui virtual screening dan docking .
Berdasarkan  analisis  penjajaran  sekuen jamak  maka  dipilih  FABP  belalang  gurun  dan mencit  sebagai  templat  atau  cetakan  yang  akan digunakan  untuk  membangun  model  FABP belalang kembara (Tabel 1). FABP otot belalang gurun dengan persentase asam amino yang identik sebesar  97,74%  diperoleh  dari  hasil  eksperimen kristalografi sinar X dengan resolusi 2,2 Å tanpa adanya  ligan  ( Apo )  pada  struktur  kristalnya (Haunerland  dkk.,  1994).  Sementara  itu  FABP adiposa  mencit  sebesar  38,93%  didapatkan  hasil eksperimen kristalografi  sinar X dengan resolusi 1,5 Å juga dengan tanpa adanya ligan ( Aolo ) pada struktur kristalnya (Reese dan Banaszak, 2004).
Kedua tempat ini dipilih untuk mempelajari pengaruh  (i)  persentase  kesamaan  asam  amino dan  (ii)  kualitas  resolusi  kristal  yang  didapatkan melalui eksperimen kristalografi sinar X terhadap kualitas  model  FABP  belalang  kembara  yang Model  3D  FABP  belalang  kembara  yang didapatkan  menggunakan  dua  templat  tersebut diatas dievaluasi dan divalidasi kualitas strukturnya  yang  kemudian  disempurnakan. Tabel  2  menunjukkan  bahwa  sebelum  dilakukan penyempurnaan  dengan  Galaxy  REFINE,  model FABP belalang kembara yang dibangun menggunakan templat mencit menunjukkan nilai
Gambar 2. Fitur farmakofor dari 10 top fragmen yang didapatkan dari skrining virtual model FABP belalang kembara yang dibanun dengan template ( A ) belalang gurun, ( B ) mencit. Fitur bulatan yang berwarna merah menunjukkan atom bermuatan negatif, biru menunjukkan atom bermuatan positif, kuning menunjukkan atom penerima ikatan hidrogen.
1
MolProbity  yang  lebih  rendah  yakni  1,38,  clash score 6,82, poor  rotamers (konformasi  rantai samping  yang  tidak  disenangi  secara  energi struktural)  0,00,  serta Rama  favoured (jumlah asam  amino  yang  menempati  wilayah  yang disenangi  pada  diagram  Ramachandran)  sebesar 91,4%  dibandingkan  yang  dengan  templat belalang gurun. Hal ini kemungkinan menunjukkan bagaimana kualitas resolusi kristal protein  menentukan  kualitas  model  yang didapatkan. Templat mencit mempunyai resolusi
kristal yang lebih baik yakni 1,5 Å dibandingkan templat  belalang  gurun  sebesar  2,2 Å. Akurasi dan ketepatan analisis struktur kristal bergantung pada limit resolusi dari kristal dalam rentang 1,5- 3,0 Å (Shi, 2014). Struktur kristal yang teratur dan baik  mempunyai  limit  resolusi  yang  kecil,  dan sebaliknya  untuk  yang  tidak  teratur  dan  kurang baik  mempunyai  limit  resolusi  yang  besar. Semakin  bagus  resolusi  tidak  hanya  atom-atom rantai  utama  (C,  N,  O)  saja  yang  bisa  terlihat secara detail tapi juga atom H dari rantai samping,
Tabel 1. Karakteristik cetakan ( template ) protein yang digunakan dalam pemodelan struktur 3D FABP belalang kembara menggunakan PHYRE2
No Organisme Nama Protein Kode PDB % Confidence % Identity Apo/Holo Eksperimen Jumlah residu Referensi 1. BelalangGurun ( Schistocerca gregaria ) FABP otot terbang 1ftp 100% 98% Apo X-Ray, 2,2 Å 133 (Haunerland et al., 1994) 2. Mencit ( Mus musculus ) FABP jaringan lemak 1g7n 100% 40% Apo X-Ray, 1,5 Å 131 (Reese & Banaszak, 2004)
Tabel 2. Evaluasi danValidasi 3 model FABP belalang kembara menggunakan template FABP belalang gurun, sapi dan mencit sebelum dan sesudah penyempurnaan dengan GALAXY Refine
Template GALAXY Refine Verify 3D ERRAT PROVE ProSA MolProbity Clash score Poor rotamer Rama favored Belalang gurun Sebelum 100% 98,4 % 3,3 % -5,35 2,55 13,55 13,04 90,7% Sesudah 81,95% 98,2% 4,5 % -5,79 1,12 3,27 0,87 95,8% Adiposa mencit Sebelum 100% 95,87% 3,5% -8,3 1,38 6,82 0,00 91,4% Sesudah 100% 100 3,6% -8,33 1,18 3,89 0,00 96,6%
Tabel 3. Top hit senyawa kandidat inhibitor hasil virtual screening ZINC Pharmer dengan fitur farmakofor fragmen kimia yang berinteraksi dengan model FABP belalang kembara menggunakan template belalang gurun. No ZINC ID & Nama Struktur Energi afinitas (kkal/mol) Atom Non Hidrogen Efisiensi ligan Residu FABP yang berinteraksi 1. C73698912 2-{[2- (diphenylamino)- 6-(4- methoxyphenyl) pyrimidin-4-yl] oxy} acetic acid -8,1 32 0,26 Thr57, Thr62, Ser55, Met21, Pro39, Gly34, Leu77
1
bahkan molekul air. Semakin buruk resolusi maka sangat  sulit  untuk  mendapatkan  gambaran  yang benar  dari  struktur  kristal  protein  yang  akan menjadi  masalah  besar  jika  digunakan  sebagai templat  dalam  pemodelan  homologi  komparatif. Namun demikian, setelah penyempurnaan dengan Galaxy REFINE model
FABP belalang kembara yang dibangun dari templat  belalang  gurun  mengalami  perbaikan nilai  PROVE  menjadi  4,5%,  ProSA  -5,79, MolProbity 1,12, clash score 3,27, poor rotamers 0,87,  dan Rama  favoured sebesar  95,8%. Demikian  juga  model  FABP  belalang  kembara yang  dibangun  dengan  templat  mencit  juga mengalami perbaikan pada nilai ERRAT menjadi 100%,  PROVE  3,6%,  MolProbity  1,18,  clash score  3,89,  dan  asam  amino  yang  menempat wilayah  yang  disukai  pada  plot  Ramachandran sebesar  96,6%.  Dari  data  ini  dapat  dikatakan bahwa penyempurnaan dapat memperbaiki error stereokimia maupun energi struktural dari model yang  dibangun  dari  kualitas  templat  yang berbeda.  Galaxy  REFINE  menyempurnakan model  dengan melakukan pengepak  ulang  rantai samping  dengan  melakukan  minimisasi  struktur melalui  simulasi  dinamika  molekuler  singkat selama  0,2  ps  secara  berulang  (iteratif  yang mampu  merelaksasi,  mengurangi  ketegangan struktur dan meminimalkan energinya (Heo et al., 2013).  Ketegangan  struktur  dapat  meningkatkan benturan  atom  yang  akan  mempengaruhi kemampuan  senyawa  kandidat  inhibitor  untuk
menambat  di  kantong  pengikatan  sehingga  bisa mempengaruhi interpretasi hasil virtual screening dan docking .
Hasil skrining virtual dengan DOCK Blaster, dan  validasi  menggunakan  MTI  Open    Screen didapatkan  10  top  fragmen  yang  berinteraksi dengan  model  FABP  belalang  kembara  distus
aktif  pengikatan.  Untuk  model  FABP  yang dibangun  dengan  templat  belalang  gurun diperoleh  10  fragmen  kimia  terbaik  berdasarkan rentang  energi  afinitas  dari  -7,8  hingga  -8.0 kkal/mol  serta  ketepatan  pose  atau  konformasi pengikatan dengan protein.
Dari  ke  10  top  fragmen  ini  kemudian dilakukan  analisis  farmakofor  yang  merupakan sekumpulan  fitur  sterik  dan  elektronik  yang diperlukan  untuk  memastikan  interaksi  yang optimal  antara  ligan  dengan  protein  target  yang bertujuan  untuk  menginduksi  atau  menginhibisi respons  biologisnya  (Koes,  2016).  Analisis farmakofor  dari  ke-10  top  fragmen  tersebut menunjukkan  kesamaan  fitur  farmakofor  yang dimiliki  yaitu  2  cincin  aromatik,  1  atom bermuatan positif, 1 atom bermuatan negatif, dan 2  akseptor  hidrogen.  (Gambar  2A).  Fitur-fitur farmakofor  yang  dihasilkan  ini  kemudian digunakan  sebagai  input  untuk  melakukan skrining  virtual  dengan  Pharmit  terhadap senyawa-senyawa  kandidat  (300-500  Dalton) yang  ada  di  dalam  database  ZINC  Purchasable
Tabel 4. Interaksi 2D dan 3D antara senyawa kandidat terbaik dengan model FABP belalang kembara yang dibangun menggunakan template belalang gurun
1
(Sunseri  dan  Koes,  2016).  Skrining  virtual farmakofor ini dengan database ZINC Purchasable mendapatkan satu senyawa kandidat baru  C73698912  dengan  berat  molekul  427,48 gram/mol yang merupakan turunan dari pirimidin (Tabel 3).
Docking  C73698912  dengan  model  FABP belalang kembara yang dibangun dengan templat belalang  gurun  memberikan  energi  afinitas sebesar -8,1 kkal/mol.
7. C72171575 2-(5-methyl-2-phenyl- 1H-imidazole-4-
carbonyl)-2,8- diazaspiro[4.5]decane- 3-carboxylic acid
-6,7
27 0,25 Ser53, Ile62, Gln93, Val75
Tabel 5. Top hit senyawa kandidat inhibitor hasil virtual screening ZINC Pharmer dengan fitur farmakofor fragmen yang berinteraksi dengan model FABP belalang kembara menggunakan
template mencit No ZINC ID & Nama Struktur Energi afinitas (kkal/mol) Atom Non Hidrogen Efisieni ligan Residu FABP yang berinteraksi 1. C00628966
(2-carboxyethyl)- triazahexacyclo, tricosa-undecaen-4- ylium -10,2 28 0,36 Ser53, Phe16, Val75, Val115, Gln93 2. C15721579 (2S)-2-acetamido-3- [1- (triphenylmethyl)- 1H-imidazol-4-yl] propanoic acid -8,5 33 0,26 Ser53, Tyr19, Arg126, Cys117, Ile104, Met20
3. C13640660 (3Z)-3-(1H-1,3-
benzodiazol-2-yl)-4- (4-bromophenyl) but-3-enoic acid -8,3 27 0,31 Ser53, Phe16, Ile104, Val75 4. C36208749 3-[1- (triphenylmethyl)-
1H-imidazol-4- yl]propanoic acid -8,3 29 0,29 Ser53, Met20, Gln95, Val75, Val23, Phe16 5. C77291184
4-[[2-Butyl-5-(2,2- dicarboxyvinyl)-1H-
imidazol- 1yl)methylbenzoic Acid -8,2 27 0,30 Thr60, Ser53, Phe16, Val15, Ile104 6. C72127248 2-[2-(1-methyl-1H- imidazol-2-yl) benzoyl]-2,8- diazaspiro [4.5]
decane-3- carboxylic acid
-7,0 27 0,26 Ser53, Phe16, Val75, Phe16, Met20, Ile26,
Thr60
1
Tabel 6. Interaksi 2D dan 3D antara senyawa kandidat terbaik dengan model FABP belalang kembara yang dibangun menggunakan template mencit
1
1
Ikatan  ini  distabilkan  melalui  ikatan hidrogen antara gugus karboksiltat dengan Thr57, Thr62, Ser55 dengan jarak masing-masing 3,2Å, 3,2Å dan 2,2Å serta melalui interaksi hidrofobik Met21,  Pro39,  Gly34  dan  Leu77  (Tabel  4). Interaksi  senyawa  C73698912  dengan  FABP belalang  kembara  menyerupai  perilaku  interaksi antara inhibitor turunan karbamoil dengan FABP adiposa  manusia  dimana  ikatan  hidrogen  yang terbentuk  oleh  Ser55  berperanan  penting  dalam afinitas dan selektifitas (Cai et al., 2010). Namun berbeda dengan senyawa turunan pirimidin yakni 4-hidroksipirimidin  yang  telah  didapati  sebgai inhibitor  FABP4  yang  cukup  kuat  dan  selektif oleh  (Ringom  et  al.,  2004),    analisis  struktur kristal menunjukkan bahwa gugus hidroksil pada pirimidin  membentuk  interaksi  hidrogen  dengan Tyr128  dan  Arg126  dengan  cara  yang  mirip dengan  gugus  karboksilat  dari  substrat  asam lemak  rantai  panjang.  Sementara  itu  cincin aromatik terletak pada kanting lipofilik yang diisi oleh residu Phe16, Met20, Val23, Ala33, Phe57, dan Ala75.
Sementara  itu  untuk  model  FABP  belalang kembara  yang  dibangun  dengan  templat  dari mencit  didapatkan  10  top  fragmen  terbaik berdasarkan  rentang  energi  afinitas  dari  -8,2 hingga  -9.0  kkal/mol  serta  ketepatan  pose  atau konformasi pengikatan dengan protein. Kesepuluh top fragmen memiliki fitur farmakofor sebanyak 2 cincin aromatik, 2 hidrogen askeptor, 1  atom bermuatan  positif  dan  1  atom  bermuatan negatif (Gambar 2B). Skrining virtual farmakofor 10  top  fragmen  yang  berinteraksi  dengan  FABP belalang kembara yang dibangun dengan template mencit  diperoleh  tujuh  (7)  senyawa  kandidat
inhibitor yaitu C00628966, C15721579, C13640660, C36208749, C77291184,
C72127248  dan  C72171575  dengan  energi afinitas secara berturut-turut ialah -10,2 kkal/mol, -8,5  kkl/mol,  -8,3  kkal/mol,  -8,3  kkal/mol,  -8,2 kkal/mol, -7,0 kkal/mol dan -6,7 kkal/mol (Tabel 5).  Beberapa  senyawa  kandidat  ini  merupakan turunan  imidazol  (C15721579,  C36208749, C77291184, C72127248, C72171575) dan benzodiazol  (C13640660).  Senyawa-senyawa kandidat  tersebut  distabilkan  oleh  Ser53  dan Thr60,  melalui  interaksi  hidrogen  dan  Phe16, Val75,  Val23,  Val115,  Ile26,  Ile62,  Gln95, Gln93,  Tyr19,  Arg126,  Cys117,  Ile104,  Met20 melalui  interaksi  hidorofobik  (Tabel  6).  Sejalan dengan  hasil  yang  didapatkan,  inhibitor  turunan imidazol  terhadap  protein  FABP  yang  pernah didapatkan adalah BMS309403  yang  juga menunjukkan  bagaimana  residu  asam  amino Ser53  berperanan  penting  dalam  menstabilkan afinitas  ikatan  intrinsik  dengan  cincin  azol (Sulsky et al., 2007).
Semua  kandidat  inhibitor  yang  telah didapatkan  menunjukkan  afinitas  yang  tinggi dengan model FABP belalang kembara dibandingkan  dengan  afinitas  FABP  dengan substrat  asli  asam  oleat  (-5,5  kkal/mol).  Hal  ini menunjukkan  bahwa  semua  kandidat  inhibitor dapat  menjadi  kompetitor  bagi  substrat  asam oleat. Ini dapat dihipotesiskan dengan masuknya senyawa kandidat inhibitor maka akan menghalangi transport asam lemak oleh FABP ke mitokondria  menghasilkan  energi.  Sehingga diprediksi  inhibisi  tersebut  dapat  mempengaruhi kemampuan terbang dan bermigrasi dari belalang kembara.  Namun  demikian  hipotesis  ini  serta
1
prediksi in  silico interaksi  senyawa  inhibitor disitus aktif FABP belalang kembara masih perlu ditindaklanjuti  melalui  validasi  dan  pengujian in vitro di laboratorium.

## KESIMPULAN
Pemodelan
homologi komparatif
menggunakan  Phyre2  menghasilkan  dua  model FABP belalang kembara yang dibangun menggunakan templat belalang gurun dan mencit. Model  FABP  yang  dibangun  menunjukkan kualitas stereokimia dan energi struktural dengan batasan nilai yang bisa diterima setelah dilakukan penyempurnaan. Virtual  screening dan docking model  FABP  belalang  kembara  mendapatkan senyawa  turunan  pirimidin,  imidazol  dan benzodiazol  sebagai  kandidat  senyawa  inhibitor yang  menunjukkan  afinitas  yang  tinggi  serta konformasi  yang  menyerupai  inhibitor  yang serupa yang telah diketahui aktivitasnya terhadap protein FABP homolog pada manusia.
Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  pendekatan SBDD melalui pemodelan komputasional, virtual screening dan docking dapat  diterapkan  pada tahap  awal  riset  desain  dan  pengembangan insektisida  yang  selektif  untuk  mendapatkan senyawa-senyawa  kandidat  yang  menunjukkan interaksi  yang  mirip  dengan  inhibitor  komersial untuk  dapat  direkomendasikan  menuju  tahap pengujian dan validas lebih lanjut secara in vitro maupun in vivo .

## DAFTAR PUSTAKA
Beniyama,  Y.,  Matsuno,  K.,  Miyachi,  H.,  2013, Structure-guided  design,  synthesis  and  in vitro evaluation of a series of pyrazole-based fatty acid binding protein (FABP) 3 ligands, Bioorg.Med. Chem. Lett. , 23(6), 1662–1666. Cai,  H.,  Liu,  Q.,  Gao,  D.,  Wang,  T.,  Chen,  T., Yan, G., Chen, K., Xu, Y., Wang, H., Li, Y., 2015,  Novel  fatty  acid  binding  protein  4 (FABP4)  inhibitors:  Virtual  screening, synthesis and crystal structure determination, Eur. J. Med. Chem. , 90, 241–250.
Cai, H., Yan, G., Zhang, X., Gorbenko, O., Wang, H.,  Zhu,  W.,  2010,  Discovery  of  highly selective  inhibitors  of  human  fatty  acid binding  protein  4  (FABP4)  by  virtual screening, Bioorg.Med.  Chem.  Lett ,  20(12), 3675–3679.
Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D.  A.,  Immormino,  R.  M.,  Kapral,  G.  J.,
Murray, L. W., Richardson, J.  S.,
Richardson,  D.  C.,  2010,  MolProbity:  All- atom structure validation for macromolecular crystallography, Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. , 66(1), 12– 21.
Consortium, U., 2014, UniProt: A hub for protein information, Nucleic.  Acids.  Res. ,  43(D1), D204–D212.
Cortés-Eslava, J., Gómez-Arroyo, S., Risueño, M.
C.,  Testillano,  P.  S.,  2018,  The  effects  of organophosphorus  insecticides  and  heavy metals  on  DNA  damage  and  programmed cell death in two plant models.
Environmental Pollution , 240, 77–86.
Dallakyan, S., Olson, A. J., 2015, Small-molecule library  screening  by  docking  with  PyRx.  In Chemical biology (pp. 243–250). Springer.
Firdaus,  F.,  Dali,  S.,  Rusman,  H.  J.,  2017,
Imobilisasi Enzim Lipase Dedak Padi (Oryza Sativa L.) Pada Karbon Aktif: Karakterisasi, dan Uji Stabilitas Kerja Enzim Imobil, Indo. J. Chem. Res. , 5(1), 32–36.
Floresta, G., Gentile, D., Perrini, G., Patamia, V.,
Rescifina, A., 2019, Computational Tools in the  Discovery  of  FABP4  Ligands:  A
Statistical and Molecular Modeling Approach, Mar. Drugs. , 17(11), 624.
Floresta, G., Pistara, V., Amata, E., Dichiara, M., Marrazzo, A., Prezzavento, O., Rescifina, A., 2017, Adipocyte fatty acid binding protein 4 (FABP4)  inhibitors.  A  comprehensive systematic review, Eur. J. Med. Chem. , 138, 854–873.
Gaspersz, N., Sohilait, M. R., 2019, Penambatan Molekuler  α,  β,  dan  γ-mangostin  Sebagai Inhibitor α-amilase Pankreas Manusia. Indo. J. Chem. Res. , 6(2), 59–66.
Haunerland, N. H.,  Jacobson,  B. L.,  Wesenberg, G., Rayment, I., Holden, H. M., 1994, Three- dimensional  structure  of  the  muscle  fatty- acid-binding protein isolated from the desert locust  Schistocerca  gregaria, Biochemistry ,
33(41), 12378–12385.
Heo, L., Park, H., Seok, C., 2013, GalaxyRefine: Protein structure refinement driven by side- chain  repacking, Nucleic.  Acids.  Res. , 41(W1), W384–W388.
Hotamisligil,  G.  S.,  Bernlohr,  D.  A.,  2015,
Metabolic functions of FABPs—
Mechanisms  and  therapeutic  implications, Nat. Rev. Endocrinol. , 11(10), 592.
Kalyaanamoorthy,  S.,  Chen,  Y.-P.  P.,  2011,
Structure-based  drug  design  to  augment  hit
discovery, Drug. Discov. Today. , 16(17–18),
831–839.
Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N.,  Sternberg,  M.  J.  E.,  2015,  The  Phyre2 web  portal  for  protein  modeling,  prediction and analysis, Nat. Protoc. , 10(6), 845–858. Khan, F. I., Wei, D.-Q., Gu, K.-R., Hassan, M. I., Tabrez,  S.,  2016,  Current  updates  on computer  aided  protein  modeling  and designing, Int.  J.  Biol.  Macromol. ,  85,  48– 62.
Koes,  D.  R.,  2016,  Pharmacophore  Modeling: Methods  and  Applications.  In  W.  Zhang (Ed.), Computer-Aided Drug Discovery (pp.
167–188). Springer New York.
La  Kilo,  A.,  Sabihi,  I.,  La  Kilo,  J.,  2019,  Studi
Potensi  Pirazolin  Tersubstitusi  1-N  dari Thiosemicarbazone sebagai Agen
Antiamuba  melalui  Uji  In  Silico. Indo.  J. Chem. Res. , 7(1), 9–24.
Labbé, C. M., Rey, J., Lagorce, D., Vavruša, M., Becot,  J.,  Sperandio,  O.,  Miteva,  M.  A., 2015,  MTiOpenScreen:  A  web  server  for structure-based  virtual  screening, Nucleic. Acids. Res. , 43(W1), W448–W454. Lamberth, C., Jeanmart, S., Luksch, T., Plant, A., 2013,  Current  challenges  and  trends  in  the discovery of agrochemicals, Science , 341(6147), 742–746.
Lassa, J. A., 2017, The Return of Locust Outbreak in  Sumba,  Indonesia:  A  Rapid  Situational Analysis .  Working  Paper#  17,  Institute  of
Resource  Governance  and  Social  Change (IRGSC).
Lounnas, V., Ritschel, T., Kelder, J., McGuire, R.,
Bywater,  R.  P.,  Foloppe,  N.,  2013,  Current progress  in  structure-based  rational  drug design  marks  a  new  mindset  in  drug discovery, Comput.  Struc.  Biotechnol.  J. , 5(6), e201302011.
Lücke,  C.,  Qiao,  Y.,  Van  Moerkerk,  H.  T.,
Veerkamp,  J.  H.,  Hamilton,  J.  A.,  2006, Fatty-acid-binding  protein  from  the  flight muscle  of  Locusta  migratoria:  Evolutionary variations in fatty acid binding,
Biochemistry , 45(20), 6296–6305.
Macalino, S. J. Y., Gosu, V., Hong, S., Choi, S., 2015, Role of computer-aided drug design in modern  drug discovery, Arch.  Pharm. Res. , 38(9), 1686–1701.
Nawaz, A., Gogi, M. D., Sufyan, M., 2016, Insect- Pests  in  Dryland  Agriculture  and  their Integrated  Management,  In Innovations  in
Dryland Agriculture (pp. 143–186). Springer.
R  Shenoy,  S.,  Jayaram,  B.,  2010,  Proteins: Sequence  to  structure  and  function-current status, Curr. Protein. Pept. Sci. , 11(7), 498– 514.
Reese,  A.  J.,  Banaszak,  L.  J.,  2004,  Specificity determinants  for  lipids  bound  to  β-barrel proteins, J. Lipid. Res. , 45(2), 232–243. Ringom, R., Axen, E., Uppenberg, J., Lundbäck, T.,  Rondahl,  L.,  Barf,  T.,  2004,  Substituted benzylamino-6-(trifluoromethyl)  pyrimidin- 4  (1H)-ones:  A  novel  class  of  selective human  A-FABP  inhibitors, Bioorg.Med. Chem. Lett. , 14(17), 4449–4452.
Seeliger,  D.,  de  Groot,  B.  L.,  2010,  Ligand docking  and  binding  site  analysis  with PyMOL  and  Autodock/Vina, J.  Comput. Aided. Mol. Des. , 24(5), 417–422.
Shanmugam, G., Jeon, J., 2017, Computer-aided drug  discovery  in  plant  pathology, Plant. Pathol. J. , 33 (6), 529.
Shi,  Y.,  2014,  A  glimpse  of  structural  biology through X-ray crystallography , Cell , 159(5), 995–1014.
Sievers, F., Higgins, D. G., 2018, Clustal Omega for  making  accurate  alignments  of  many protein sequences, Protein. Sci. , 27(1), 135– 145.
Stierand,  K.,  Rarey,  M.,  2010,  PoseView– molecular interaction patterns at a glance, J. Cheminform. , 2(S1), P50.
Sulsky, R., Magnin, D. R., Huang, Y., Simpkins,
L., Taunk, P., Patel, M., Zhu, Y., Stouch, T. R.,  Bassolino-Klimas,  D.,  Parker,  R.,  2007, Potent and selective biphenyl azole inhibitors  of  adipocyte  fatty  acid  binding protein  (aFABP), Bioorg.Med.  Chem.  Lett. , 17(12), 3511–3515.
Sunseri,  J.,  Koes,  D.  R.,  2016,  Pharmit: Interactive  exploration  of  chemical  space, Nucleic. Acids. Res. , 44(W1), W442–W448. Wang, T., Wu, M.-B., Zhang, R.-H., Chen, Z.-J., Hua,  C.,  Lin,  J.-P.,  Yang,  L.-R.,  2016, Advances  in  computational  structure-based drug  design  and  application  in  drug discovery, Curr.  Top.  Med.  Chem. ,  16(9), 901–916.
Wang, Y.-T., Liu, C.-H., Zhu, H.-L., 2016, Fatty acid  binding  protein  (FABP)  inhibitors:  A patent  review  (2012-2015), Expert.  Opin. Ther. Pat. , 26(7), 767–776.
Wiederstein, M., Sippl, M. J., 2007, ProSA-web:
Interactive web service for the recognition of
1
errors  in  three-dimensional  structures  of proteins, Nucleic.  Acids.  Res. ,  35(suppl_2),
W407–W410.
Yang, M. L., Zhang, J. Z., Zhu, K. Y., Xuan, T.,
Liu,  X.  J.,  Guo,  Y.  P.,  Ma,  E.  B.,  2009, Mechanisms  of  organophosphate  resistance in  a  field  population  of  oriental  migratory locust, Locusta migratoria manilensis (Meyen), Arch.  Insect.  Biochem.  Physiol. , 71(1), 3–15.