https://journal.ipb.ac.id/index.php/jurnalikt
e-ISSN                  : 2620-309X

## OPTIMASI SELULASE PADA ENZYME ASSISTED EXTRACTION LEMAK DARI
Caulerpa lentillifera SEGAR MENGGUNAKAN RESPONSE SURFACE METHODOLOGY
OPTIMIZATION OF CELLULASE ENZYME ASSISTED EXTRACTION OF LIPID FROM FRESH Caulerpa lentillifera USING RESPONSE SURFACE METHODOLOGY
Ishmah Hanifah 1* , Fauzia Izzati 2 , Siti Irma Rahmawati 2 , Joko Hermanianto 1 , Puspo Edi Giriwono 1 , Yatri Hapsari 2 , Bustanussalam 2 , Fauzy Rahman 2 , Eris Septiana 2 , & Partomuan Simanjuntak 2
1 Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB University, Bogor, 16002, Indonesia
2 Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor, 16911, Indonesia *E-mail: ishmahhanifah8@gmail.com

## ABSTRACT
Caulerpa lentillifera is one of the most potential green seaweed to explored. It is abundantly available and cultivated in several region in Indonesia. Seaweed is well-known as a low lipid content but it is arranged by polyunsaturated fatty acid. Generally, organic solvent is used for lipid extraction. In an extraction method needs pre-treatment such as enzyme assisted extraction for degrading its cell wall and increasing solvent access to entry the cell. This research was designed to study the optimum condition of lipid enzyme assisted extraction process using cellulase from fresh green macroalga C. lentillifera. The optimization was carried out by Response Surface Methodology (RSM) using Central Composite Design (CCD) model with 15 runs. The aim of this study was to analyze the effect of some independent variables namely enzyme concentrations, hydrolysis temperatures, and hydrolysis times respectively to the dependent variables of lipid content and antioxidant activity. The optimum condition obtained from this experiment was 2% enzyme concentration, 30 °C hydrolysis temperature, and 1 h. The optimum condition could then be verified by making 2 or more replications of the chosen treatment approached the predicted result based on software Design Expert vers. 10 prediction. After methylation, extracted fatty acids were identified as palmitic acid and lauric acid using GC-MS. Extraction optimization enables to explore C. lentillifera’s lipid based on influence factors.
Keywords: Caulerpa lentillifera, cellulase, enzyme assisted extraction, lipid, RSM

## ABSTRAK
Caulerpa  lentillifera merupakan  rumput  laut  hijau  yang  memiliki  potensi  besar  namun  kelimpahannya belum  banyak  dieksplorasi.  Rumput  laut  tersebut  tersebar  pada  beberapa  wilayah  perairan  di  Indonesia. Rumput laut diketahui memiliki kadar lemak yang rendah namun tersusun oleh poli asam lemak tidak jenuh. Ekstraksi  lemak  pada  umumnya  hanya  menggunakan  pelarut  organik.  Pada  proses  ekstraksi  diperlukan perlakuan awal seperti enzyme assisted extraction untuk mendegradasi dinding sel dan meningkatkan akses pelarut masuk ke dalam sel. Penelitian dirancang untuk mengetahui kondisi optimum proses enzyme assisted extraction lemak  rumput  laut  hijau  segar C.  lentillifera dengan menggunakan  enzim  selulase . Proses optimasi dilakukan menggunakan Response Surface Methodology (RSM) model Central Composite Design dengan  15  perlakuan.  Perlakuan  didapatkan  untuk  mengetahui  pengaruh  variabel  bebas,  diantaranya konsentrasi enzim, suhu hidrolisis, dan waktu hidrolisis terhadap variabel terikat yaitu jumlah ekstrak lemak dan aktivitas antioksidan.  Hasil penelitian  didapatkan  model 2FI dan  Linier berturut-turut  untuk  variabel terikat  jumlah lemak  dan aktivitas antioksidan. Kondisi  optimum yang diperoleh  yaitu konsentrasi enzim sebesar 2%, suhu hidrolisis sebesar  30 °C, dan waktu  hidrolisis selama 1 jam. Kondisi optimum tersebut kemudian dapat diverifikasi dengan diberikan perlakuan terpilih sebanyak 2 kali ulangan atau lebih hingga mendekati hasil prediksi. Asam lemak yang diperoleh setelah metilasi dan identifikasi dengan GC-MS yaitu asam palmitat dan asam laurat. Optimasi proses ekstraksi lemak memungkinkan potensi pemanfaatan lemak dari rumput laut segar C. lentillifera berdasarkan faktor yang memengaruhi.
Kata kunci : Caulerpa lentillifera, enzyme assisted extraction, lemak, selulase, RSM

## I. PENDAHULUAN
Rumput  laut  di  Indonesia  merupakan salah  satu  komoditas  unggulan  perikanan budi daya yang dapat diperbaharui. Potensinya  tersebar  di  23  provinsi  di Indonesia  (Perpres,  2019).  Ragam  sumber daya rumput laut terdiri dari 555 jenis, namun produksi  dan  perdagangan  rumput  laut didominasi  oleh  rumput  laut  merah  dan cokelat. Potensi jenis rumput laut hijau yang dapat  dikembangkan  salah  satunya  adalah genus Caulerpa sp. dengan spesies Caulerpa lentillifera (KKP,  2019).  Rumput  laut C. lentillifera tersebar  di  beberapa  wilayah Indonesia  yaitu  di  Kecamatan  Kei-Kecil Barat, Kabupaten Maluku Tenggara (Dangeubun  &  Kadmaer,  2018),  perairan Pulau  Beralas  Bakau,  Kabupaten  Bintan (Prakoso et  al., 2019),  dan  Pulau  Bunguran, Natuna (Razai et al ., 2019). Rumput laut juga dibudidayakan  di  Balai  Besar  Perikanan Budidaya  Air  Payau  (BBPBAB)  Jepara  dan Balai  Perikanan  Budidaya Air  Payau (BPBAP)  Takalar,  Sulawesi  (Dahlia et  al., 2015), dikenal dengan nama lokal “lawi-lawi” di Sulawesi dan  “latoh” di Jawa (Supriadi et  al., 2016). C.  lentillifera mengandung  protein,  asam  lemak  tak  jenuh, karbohidrat,  serta  kaya  akan  komponen bioaktif  (Sanjeewa et  al., 2018).  Iklim  dan kondisi  laut  dapat  menyebabkan  perbedaan komposisi  nutrisi  pada  rumput  laut. C. lentillifera pada kondisi segar memiliki kadar air  sebesar  98,28%,  kadar  protein  0,53%, kadar  lemak  0,09%,  serat  kasar  0,17%  dan kadar  karbohidrat  3,67%  (Nguyen et  al., 2011).  Beberapa  rumput  laut  memiliki kandungan polyunsaturated fatty acid (PUFA)  pada  kadar  lemaknya.  Namun kelimpahan  rumput  laut  di  Indonesia  belum banyak  di  eksplorasi.  Kandungan  dan  jenis asam lemak pada C. lentillifera dapat berbeda bergantung pada habitatnya (Ginneken et al., 2011).
Ekstraksi lemak umumnya menggunakan  pelarut  organik  misalnya heksana dan kloroform. Protokol dan pelarut
yang  berbeda  akan  menentukan  kuantitas lemak yang terekstrak. Selain itu, tipe sampel dan  keberadaan  dinding  sel  juga  dapat memengaruhi  jumlah  lemak  yang terekstrak. Ekstraksi  dengan  pelarut  organik  yang menghasilkan  lemak  paling  banyak  yaitu pada  metode bligh  and  dyer diikuti  dengan metode folch (Fiset et al., 2017). Rumput laut mensintesis  berbagai  jenis  polisakarida sebagai komponen struktural dinding sel atau cadangan  energi.  Dinding  sel  rumput  laut terdiri  dari  jaringan  biopolimer  yang  sangat terintegrasi  (Synytsya et  al., 2015).  Dinding sel  rumput  laut  secara  umum  tersusun  oleh kerangka  dengan  bahan  selulosa  (Deslandes et al., 2016). Sejumlah lemak terperangkap di dalam  dinding  sel,  sehingga  ekstraksi  hanya dengan  pelarut  akan  menghasilkan  jumlah lemak  yang  sedikit.  Pada  proses  ekstraksi diperlukan perlakuan awal untuk mendisrupsi atau  mendegradasi  sel  terlebih  dahulu. Perlakuan tersebut dapat meningkatkan akses pelarut untuk mengekstrak lemak di dalamnya.  Beberapa  contoh  perlakuan  awal sebelum ekstraksi adalah pengeringan, cairan superkritis, microwave , dan enzimatis. Proses enzimatis  merupakan  proses  biokimia  yang membutuhkan  energi  yang  sedikit  dibanding proses mekanis. Dinding sel dapat dilemahkan dan dihilangkan dengan degradasi selulosa (Lin et al., 2018).
Proses  ekstraksi  merupakan  tahapan yang  penting  untuk  mengisolasi  berbagai komponen  atau  senyawa  bioaktif  dari  bahan tanaman.  Keberadaan  berbagai  polisakarida dalam  jumlah  besar  di  dinding  sel  dapat mengurangi  efisiensi  ekstraksi.  Degradasi dari dinding sel dengan struktur polisakarida merupakan  langkah  dasar  dalam  pelepasan komponen  aktif  atau  komponen  lainnya. Teknik  ekstraksi  telah  dikembangkan  untuk meningkatkan efisiensi ekstraksi yaitu dengan menggunakan bantuan enzim sebagai pendegradasi dinding sel (Wijesinghe & Jeon, 2012).  Teknik  ekstraksi  dengan  bantuan enzim  tersebut  dinamakan  dengan enzyme assisted  extraction .  Pada  teknik  ini,  enzim yang  biasa  digunakan  adalah  karbohidrase
seperti selulase (Reddy & Majumder, 2014). Optimasi  ekstraksi  pada  lemak  dilakukan untuk  mengurangi  biaya  dan  efisiensi  waktu penelitian. Optimasi ekstraksi dengan pemodelan  statistik  dan  matematis  melalui analisis proses dapat mengefisiensi waktu dan tenaga  untuk  melakukan  total  percobaan. Salah  satunya  yaitu  dengan  menggunakan response surface methodology (RSM) (Mubarak et  al., 2016).  Metode  RSM didasarkan  pada  kecocokan  model  statistik untuk  mengukur  data  yang  diperoleh sehubungan  dengan  desain  eksperimen. Metode  ini terbukti untuk meningkatkan dan mengoptimalkan  proses  biokimia  untuk mengekstraksi  jumlah  maksimum  senyawa tertentu.  Model  percobaan  pada  RSM  yang umum  digunakan  adalah  model central composite  design (CCD).  Optimasi  dengan CCD  dapat  memungkinkan  penyaringan berbagai  parameter  serta  peran  setiap  faktor (Anne-sophie et  al., 2016).  Penelitian  ini bertujuan untuk mengoptimasi proses ekstraksi  lemak  dari C.  lentillifera yang berasal dari BBPBAP Jepara dengan bantuan enzim  selulase.  Pada  perlakuan  optimal tersebut, asam lemak diidentifikasi menggunakan  GC-MS  dan  diharapkan  dapat meningkatkan  nilai  tambah  dari  rumput  laut hijau C. lentillifera .

## II. METODE PENELITIAN
Penelitian  dilakukan  pada  bulan Agustus-November  2019  di  Laboratorium Kimia Bahan Alam Pusat Penelitian Bioteknologi,  Lembaga  Ilmu  Pengetahuan Indonesia,  Bogor,  Indonesia.  Bahan  yang digunakan pada penelitian  ini adalah rumput laut C.  lentillifera dari  BBPBAP  Jepara, enzim selulase novozymes viscozyme cassava CL,  asam  asetat,  diklorometan, 2,2-Azinobis (3-Etilbenzotiazolin)-6-Asam  Sulfonat  (ABTS) , kalium  persulfat,  etanol,  heksana,  KOH, metanol, akuades, NaOH, DNS (3,5-Dinitrosalicylic  Acid),  fenol,  Na2S2O5, Na-K-Tartarat, buffer sitrat pH 5 dan standar glukosa.

## 2.1. Kinetika Enzim terhadap Substrat
Aktivitas  hidrolisis  pada  substrat rumput laut dapat diamati dengan menganalisis kinetika enzim yang digunakan. Metode yang digunakan adalah metode DNS. Pembuatan  pereaksi  DNS  dilakukan  dengan melarutkan  1  g  NaOH  di  dalam  25  mL akuades, kemudian tambahkan DNS sebanyak  1  g.  Fenol  sebanyak  0,02  g dilelehkan  pada suhu  50  °C.  Fenol dicampurkan  ke  dalam  larutan  NaOH-DNS (Larutan A). Sebanyak 0,05 g Na 2 S 2 O 5 dan 20 g  Na-K-Tartarat  dilarutkan  dalam  25  mL akuades (Larutan B). Larutan A dan Larutan B kemudian dicampur dan ditepatkan hingga 100  mL  dengan  akuades.  Larutan  standar yang  digunakan  adalah  larutan  glukosa dengan  serial  konsentrasi  0,05  g/L,  0,1  g/L, 0,15 g/L, 0,2 g/L, 0,25 g/L, dan 0,3 g/L.
Larutan standar diambil sebanyak 0,2 mL dan ditambah pereaksi DNS sebanyak 0,6 mL  kemudian  divorteks.  Larutan  dididihkan selama  10  menit  hingga  berubah  warna menjadi kecokelatan, setelah itu absorbansinya
diukur dengan
spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang 540 nm. Larutan sampel di dalam buffer sitrat disiapkan dengan serial konsentrasi 0 g/L, 2 g/L, 4 g/L, 6 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L dan 50 g/L, kemudian enzim  ditambahkan  sebanyak  3,4  g/L.  Total volume  larutan  adalah  sebanyak  5  mL selanjutnya  divorteks.  Setelah  divorteks, larutan sampel diinkubasi pada pH 5 dan suhu 50  °C  selama  40  menit.  Enzim  diinaktivasi pada  suhu  85  °C  selama  10  menit.  Larutan sampel diambil sebanyak 1 mL dan ditambah pereaksi  DNS  sebanyak  3  mL,  setelah  itu ukur  absorbansi  larutan  pada  panjang gelombang  540  nm.  (Saropah et  al., 2012; Guerra, 2017).

## 2.2. Enzyme Assisted Extraction
Sampel  rumput  laut C.  lentillifera dihancurkan  dan  ditimbang  sebanyak  100  g berat  basah  kemudian  ditempatkan  di  dalam tabung  erlenmeyer  250  mL.  Asam  asetat ditambahkan  hingga  mencapai  pH  optimum
enzim  yaitu  pH  5.  Setelah  mencapai  pH optimum, enzim ditambahkan sesuai konsentrasi  yang  telah  ditentukan.  Aktivasi enzim  dilakukan  dengan  pemanasan  dalam waterbath pada  suhu  yang  telah  ditentukan selama 30 menit. Kemudian sampel digoyangkan  menggunakan shaker dengan kecepatan  30  rpm  selama  waktu  yang  telah ditentukan. Inaktivasi enzim dilakukan untuk menghentikan  reaksi  dengan  menambahkan asam  asetat  hingga  mencapai  pH  3. Selanjutnya,  pelarut  ditambahkan  ke  dalam corong  pisah  dengan  perbandingan  1:1 (pelarut:  sampel  v/w).  Setelah  pengocokan dan pendiaman selama 2-5 menit, terbentuk 3 fase lapisan ( aqueous, cell debris , dan pelarut organik). Fase organik diambil dan dimasukkan ke dalam vial, kemudian pelarut diuapkan.  Hasil  ekstraksi  ditimbang  untuk menghitung  jumlah  lemak  yang  terekstrak (Liang et al., 2012; Yingyao et al., 2008).

## 2.3. Aktivitas Antioksidan ABTS
Sebanyak  19,2  mg  ABTS  dilarutkan dalam  5  mL  akuades  dan  dimasukkan  ke dalam  erlenmeyer  50  mL  yang  terbungkus alumunium  foil.  Sebanyak  88  µL  kalium persulfat  (189  mg  Kalium  persulfat  dalam  5 mL akuades) ditambahkan. Campuran kemudian  disimpan  selama  16  jam  dalam ruangan  gelap  pada  suhu  ruang.  Sebanyak  5 mL campuran dimasukkan ke dalam erlenmeyer  200  mL  yang  terbungkus alumunium  foil  untuk  dilarutkan  dengan etanol  sebanyak  155  mL.  Larutan  blanko adalah campuran etanol dan ekstrak (1:1 v/v), larutan zeroing adalah etanol dan ABTS (1:1 v/v), sedangkan larutan sampel berisi sampel dengan  konsentrasi  sebesar  100  ppm. Inkubasi dilakukan selama 6 menit pada suhu 37  °C  di waterbath .  Pengukuran  serapan dilakukan  pada  panjang  gelombang  734  nm dengan  spektrofotometer  UV-Vis  itachi U-3900H  (Fitriana et  al., 2015).  Aktivitas penghambatan radikal dapat
dihitung menggunakan persamaan (1):
............... (1)
Informasi: Abs adalah
absorbansi. Absorbansi yang digunakan adalah absorbansi  sampel  dan  absorbansi  blanko (tanpa sampel).

## 2.4. Pembuatan Fatty Acid Methyl Ester
(FAME)
Asam  lemak  dikonversi  menjadi FAME dengan menambahkan 2 mL KOH-CH3OH  (0,4  mol/L)  dan  dipanaskan pada  suhu  40  °C  selama  10  menit  di waterbath . FAME diekstrak dengan menambahkan  heksana  sebanyak  2  mL. Campuran kemudian ditambah dengan 5 mL akuades  dan  divortex  selama  15  detik. Bagian  atas  yang  mengandung  FAME kemudian  diambil  sebanyak  2  mL  dan dimasukkan  ke  dalam  vial.  Selanjutnya, sampel  dikeringkan  sebelum  dilakukan analisis  dengan  menggunakan  GC-MS  (Gao et al ., 2013).

## 2.5. Identifikasi Asam Lemak dengan GC-MS
Lemak  yang  sudah  ditransmetilasi menjadi FAME kemudian dianalisis menggunakan  GC/MS-QP2010  Ultra  Kolom RTX-5MS  (30  m  x  0,15  mmID  x  0,25µm). Adapun  keterangan  alat  meliputi  mode injeksi  yaitu splitless dengan  suhu  250  °C, gas  pembawa  berupa  helium  dengan  aliran konstan, mode kontrol aliran yaitu kecepatan linier,  aliran  kolom  sebesar  2,40  mL/menit, kecepatan  linier  51,7  cm/detik,  dan  suhu oven yaitu dari 40 °C menuju 250 °C dengan kenaikan  5  °C/menit  (ditahan  selama  20,55 menit).

## 2.6. Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Model  yang  digunakan  adalah  CCD
dengan bantuan perangkat lunak Design

## Tabel 1. Kode perlakuan.
Table 1. Treatment code.
Independent variable Treatment code -1.682 -1 0 1 1.682 Enzyme concentration (%) 0.977 2.0 3.5 5.0 6.023 Temperature (°C) 19.773 30 45 60 70.227 Time ( h ) 0.318 1 2 3 3.682
Expert (DX) versi 10. Variabel bebas terdiri dari  konsentrasi  enzim,  suhu  hidrolisis,  dan waktu  hidrolisis  dengan  kode  perlakuan pada  Tabel  1.  Pada  variabel  terikat  terdiri dari rendemen lemak dan aktivitas antioksidan. Perlakuan optimal yang diperoleh  diidentifikasi  asam  lemaknya dengan GC-MS. Variabel  bebas dinotasikan sebagai  X 1 untuk  konsentrasi  enzim,  X 2 untuk  suhu  hidrolisis,  dan  X 3 untuk  waktu hidrolisis.  Variabel  terikat  dinotasikan sebagai  Y 1 untuk  jumlah  lemak  dan  Y 2 sebagai  aktivitas  antioksidan.  Rentang variabel bebas didapatkan dari studi pustaka dan  penelitian  pendahuluan.  Jumlah  titik percobaan ditentukan dengan rumus 2 k + 2k + centre  point .  Notasi k melambangkan faktor  percobaaan,  sedangkan  pada  2 k menunjukkan  uji  faktorial,  2 k menunjukkan uji  aksial,  dan  n c menunjukkan  uji  titik pusat.  Banyaknya  perlakuan  pada  model CCD  yaitu  2 3 +  (2x3)  +  1  =  15  titik percobaan (Tabel 2).
Variabel terikat (Y) yang didapatkan kemudian dianalisis menggunakan ANOVA. Dari pengolahan data menggunakan Design  Expert versi  10, didapatkan model linier yang diuji signifikansinya  ( p-value )  dan  kesesuaian model regresi ( lack of fit ). Hubungan antara variabel  terikat  (Y)  dari  hasil  pengamatan dan faktor-faktor (X) pada desain eksperimen  ini dapat dirumuskan  menjadi 2 yaitu model 2FI ( two factor interaction ) dan Linear  berdasarkan  saran  dari  perangkat lunak.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1. Kinetika Enzim terhadap Substrat Rumput Laut
Aktivitas  enzim  memiliki  unit  yang menunjukkan banyaknya enzim yang menghasilkan  1  µmol  glukosa  per  menit (U/mL).  Aktivitas  enzim  (U/mL)  dihitung dengan  kadar  glukosa,  faktor  pengenceran dibagi  dengan  bobot  molekul  glukosa  dan waktu  inkubasi  (Yogyaswari et  al., 2016). Aktivitas  enzim  (U/mL)  yang  dihasilkan dari  reaksi  katalitik  enzim  yaitu  1,98  U/mL sampai  4,14  U/mL.  Konsentrasi  glukosa yang  dihasilkan  dari  reaksi  hidrolisis tersebut  yaitu  0,049  g/L-0,101  g/L.  Reaksi katalitik  enzim  ditunjukkan  dalam  bentuk kinetika Michaelis-Menten yang  dicirikan oleh  hubungan  kecepatan  reaksi  ( velocity ) dan  konsentrasi  substrat  ([S])  (Lone et  al., 2014).  Konsentrasi  substrat  (g/L)  kemudian diplotkan dengan kecepatan reaksi (μmol/menit)  untuk  membentuk  kurva. Perhitungan kecepatan reaksi menjadi bentuk  glukosa  dengan  melibatkan  massa molekul  relatif  (Mr)  glukosa  yaitu  sebesar 180  (Haryanto et  al., 2018).  Kecepatan reaksi  yang  dihasilkan  yaitu  0 µ mol/menit –14,1 µ mol/menit (Gambar 1).
Persamaan Michaelis-Menten
kemudian  ditransformasi  menjadi  pemetaan kebalikan ganda yang menghasilkan persamaan Lineweaver-Burk (Puspitasari et al., 2019). Kurva
Lineweaver-burk digunakan  untuk  menemukan  kinetika enzim  seperti  K m dan  V maks .  Kurva  tersebut diperoleh  dengan  menghubungkan  1/[S] pada  sumbu  x  dengan  1/v  pada  sumbu  y ( double reciprocal plot ) (Lone et al., 2014). Penentuan  reaksi  laju  maksimum  (V maks ) dan konstanta Michaelis-Menten (K m )
Gambar 1.  Kurva Michaelis-Menten. Figure 1.    Michaelis-Menten Curve.
y = 0.1418x + 0.0914 R² = 0.6413 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 -1.000 -0.500 0.000 0.500 1.000 1/ v 1/s
Gambar 2.  Kurva Lineweaver-Burk.
Figure 2.    Lineweaver-Burk Curve.
penting  untuk  mengetahui  karakteristik enzim  (Maftukhah  &  Abdullah,  2018). Persamaan  linear  yang  dihasilkan  yaitu  y  = 0,1418x + 0,0914 dengan koefisien determinasi 0,6413 (Gambar 2). Nilai a pada persamaan  tersebut  menujukkan  K m /V maks , sedangkan  nilai  b  menunjukkan  1/V maks , sehingga  nilai  K m dan  V maks yang  diperoleh berturut-turut  adalah  1,55  g/L  dan  10,94 µmol/menit.
Nilai  V maks mengindikasikan  tingkat kejenuhan enzim terhadap substrat, sedangkan  K m mengindikasikan  efisiensi katalis  enzim  yang  didefinisikan  sebagai konsentrasi  substrat  pada  saat  kecepatan katalitik  enzim  mencapai  setengah  dari kecepatan  maksimumnya  (Maftukhah  &
Abdullah,  2018).  Semakin  kecil  nilai  K m maka  pengikatan  enzim  terhadap  substrat semakin  besar  (Lone et  al .,  2014).  Nilai V maks (μmol/menit)  menunjukkan  bahwa sebanyak  3,4  g/L  enzim  yang  ditambahkan ke  dalam  substrat  dapat  mengubah  produk sebesar  10,94  μmol  per  menit.  Nilai  K m yang  dihasilkan  kecil  sehingga  dapat dinyatakan  pengikatan  enzim  terhadap substrat cukup besar. Menurut Maftukhah & Abdullah  (2018),  nilai  K m sangat  bervariasi tergantung  pada  jenis  substrat,  keadaan lingkungan  dan  kekuatan  ion.  Enzim  yang diekstrak  dari  sumber  yang  berbeda  juga akan  memiliki  sifat  yang  berbeda,  terutama respons enzim  terhadap kondisi  lingkungan, seperti suhu dan pH.

## 3.2. Variabel Terikat pada Desain Percobaan
Sampel  yang  digunakan  adalah rumput laut segar C. lentillifera (Gambar 3). Bentuk  rumput  laut  tersebut  menyerupai anggur  dan  berwarna  hijau.  Sampel  perlu dihancurkan  terlebih  dahulu  menggunakan blender  untuk  selanjutnya  diberi  perlakuan sesuai desain percobaan CCD.
Gambar 3. Rumput laut segar C. lentillifera.
Figure 3.    Fresh seaweed of C. lentillifera.
Pada desain percobaan CCD,
terdapat  titik  pusat  (titik  merah  dengan koordinat  0,  0,  0)  yang  terletak  ditengah kubus digunakan untuk mendeteksi kelengkungan  dalam  variabel  terikat.  Titik aksial (enam titik  biru terletak pada jarak α dari titik pusat) digunakan untuk memperkirakan  koefisien  suku  kuadrat, sedangkan  titik  faktorial  (delapan  titik abu-abu  terletak  di  sudut  kubus)  digunakan untuk memperkirakan koefisien dari suku-suku  linier  dan  interaksi  dua  arah. Pada  pengujian  empat  atau  lebih  faktor dalam  percobaan  Gambar  2  harus  diperluas menjadi dimensi keempat atau lebih (Dutka et al. , 2015).
Aspek  penting  pada  CCD  adalah lima  tingkat  faktor  yang  dipertimbangkan saat  membangun  desain  yaitu  -α,  -1,  0,  +1, dan  +α.  Nilai  α  tergantung  pada  jumlah variabel.  Pada  jumlah  variabel  2,  3,  dan  4 memiliki  nilai 1,41, 1,68, dan 2,00 (Ranade &  Thiagarajan,  2017).  Jumlah  percobaan yang dilakukan dalam CCD ditentukan oleh rumus berikut ketika desain faktorial adalah
full : N = 2 k + 2k +N 0 . Apabila jumlah faktor bertambah,  disarankan  untuk  membatasi jumlah  percobaan  (Ait-Amir et  al .,  2015). Berdasarkan  Tabel  2,  dengan  jumlah  faktor sebanyak  3,  maka  jumlah  perlakuan  yang digunakan adalah 15 dengan 1 titik pusat.
Gambar  4.  Visualisasi  CCD  tipe  asli  yang dapat  diputar  untuk  tiga  faktor (Dutka et al., 2015).
Figure 4.  Visualization  of  original  type rotatable  CCD  for  three  factors (Dutka et al., 2015).
Tabel 2. Jumlah uji coba di CCD (Air-Amir et al., 2015).
Table 2. Number of trials in CCD (Air-Amir et al ., 2015).
Number of factors Number of coefficient to estimate Number of trials 2 6 9 3 10 15 4 15 25 5 21 43 6 28 77
Setelah  data  dikumpulkan, model fitting dapat menyatakan bahwa tidak semua parameter model signifikan (Iwundu, 2018). Pada  penelitian  ini,  sebanyak  15  perlakuan ( run )  telah  dianalisis  dan  menghasilkan variabel  tetap  (Y)  yang  terdiri  dari  jumlah lemak  dan  aktivitas  antioksidan.  Hasil  pada tiap-tiap perlakuan dengan melibatkan
Tabel 3. Data hasil percobaan. Table 3. Experiment result.
Treatment X 1 (°C) X 2 (%) X 3 (h) Y 1 (mg/100 g) Y 2 (%) 1 30 2 1 9 28.60 2 19.773 3.5 2 4.8 48.41 3 70.227 3.5 2 7.2 41.40 4 45 3.5 3.682 5.0 46.51 5 60 5 3 9.2 57.44 6 45 0.977 2 11 30.23 7 45 6.023 2 3.6 21.63 8 30 2 3 3.2 67.43 9 60 2 3 5.4 29.30 10 45 3.5 2 3.6 49.07 11 30 5 1 23 30.23 12 45 3.5 0.318 4.6 17.67 13 60 2 1 5.6 22.09 14 30 5 3 4.0 46.51 15 60 5 1 10.6 28.17
faktor  yang  terdiri  dari  konsentrasi  enzim, suhu hidrolisis, dan waktu hidrolisis diperlihatkan  pada  Tabel  3.  Data  tersebut kemudian diolah dengan perangkat lunak DX versi 10 untuk menentukan kondisi optimum percobaan.

## 3.3. Jumlah Lemak
Jumlah lemak yang diperoleh memiliki  variasi  sebesar  3,2–23  mg/100  g berat basah rumput laut C. lentillifera dengan bantuan  enzim  dan  ekstraksi  pelarut  organik yaitu  diklorometan  modifikasi  Bligh and Dyer. Pada beberapa studi, kloroform diganti dengan diklorometan sebagai alternatif untuk mengurangi  tingkat  toksik  dari  kloroform (Maciel et al., 2016). Jumlah tersebut sangat kecil  jika  dibandingkan  dengan  total  lemak pada  berat  kering C.  lentillifera ( freeze dried ) yang dapat mencapai rentang 0,86%–2,87  yang  diperoleh  dari  beberapa negara (Zhang et al., 2020).
Pada  beberapa model,  DX  10 menyarankan  model  berdasarkan  variabel terikat  yang  diperoleh  yaitu  model  2FI  yang memiliki  nilai  p  terkecil  yaitu  sebesar 0,3412, namun nilai tersebut lebih besar dari 0,05  (α),  hal  tersebut  menunjukkan  bahwa keterandalan model rendah. (Tabel 4).
Analisis  ragam  digunakan  untuk mengevaluasi kecukupan model dan signifikansi  statistik  dari  faktor-faktor  yang digunakan  pada  model  (Pishgar-komleh et al., 2012).  Model  yang  disarankan  oleh perangkat  kemudian  dilakukan  analisis ragam. Berdasarkan analisis ragam (Tabel 5), nilai  p  yang  diperoleh  yaitu  0,4666  lebih besar dibanding alpha (0,05) sehingga dapat dinyatakan  tidak  berbeda  nyata.  Pada  nilai R- square ,  dihasilkan  nilai  sebesar  0,4376, nilai  tersebut  lebih  besar  dari  0,4  dan  lebih kecil  dari  0,599  yang  menunjukkan  tingkat hubungan  yang  sedang  (Sugiyono,  2015). Pada  nilai  tersebut  juga  menjelaskan  bahwa sekitar  43,76%  jumlah  lemak  dipengaruhi oleh  parameter  perlakuan  dan  lebih  dari separuh  data  rendemen  lemak  dipengaruhi oleh  faktor  lain.  Hasil  tersebut  dapat dinyatakan  bahwa  tidak  ada  satupun  faktor independen  yang  memengaruhi  variabel terikat.
Adapun  persamaan  yang  diperoleh berdasarkan  pada  model  2FI  variabel  terikat Y1  yaitu  jumlah  lemak  yang  dihasilkan dipengaruhi  oleh  faktor-faktor  diantaranya konsentrasi enzim (X1), suhu hidrolisis (X2), dan  waktu  hidrolisis  (X3)  tertuang  pada Persamaan (2).
Tabel 4. Model yang direkomendasikan untuk jumlah lemak.
Table 4. Recommended model for lipid amount.
Source Sequential p-value Adjusted R-Squared Information Linear 0.5589 -0.0631 2FI 0.3412 0.0159 Suggested Quadratic 0.8639 -0.3751 Cubic 0.4964 0.1836 Aliased
Tabel 5. Analisis sidik ragam jumlah lemak. Table 5. Analysis of variance of lipid amount.
Source Sum of Square Df Mean square F-value p-value Model 156.67 6 26.11 1.04 0.4666 X1 1.39 1 139 0.055 0.8198 X2 9.11 1 9.11 0.36 0.564 X3 48.47 1 48.47 1.93 0.2026 X1X2 4.5 1 4.5 0.18 0.6835 X1X3 67.28 1 67.28 67.28 0.1407 X2X3 25.92 1 25.92 25.92 0.3399 Residual 8 Cor-total 14 R-square 0.4376 St. Dev 5.02 ....................................................................... (2)
Kombinasi  faktor-faktor  tersebut  dievaluasi untuk  melihat  perolehan  rendemen  lemak. Grafik  kontur  dan  permukaan  3  dimensi dijelaskan pada Gambar 5a yang menjelaskan  tentang  faktor  suhu  dan  waktu hidrolisis  terhadap  jumlah  lemak  yang dihasilkan.  Berdasarkan  gambar  tersebut, peningkatan  faktor  suhu  maupun  waktu hidrolisis pada konsentrasi enzim 3,5% tidak meningkatkan  jumlah  lemak,  cenderung menurun  namun  tidak  signifikan.  Pada Gambar 5b mendeskripsikan tentang pengaruh  waktu  hidrolisis  dan  konsentrasi enzim  pada  suhu  30  °C  terhadap  jumlah lemak yang dihasilkan. Adapun penambahan konsentrasi  enzim  memberikan  peluang terjadi  peningkatan  jumlah  lemak,  namun berbanding  terbalik  dengan  penambahan waktu  hidrolisis.  Berdasarkan Gambar  5c, dalam waktu 1 jam  faktor  konsentrasi enzim
yang meningkat dapat memungkinkan terjadi peningkatan jumlah lemak, namun berbanding  terbalik  dengan  peningkatan suhu.
Pemilihan  faktor  independen  yaitu suhu, waktu, dan konsentrasi enzim merupakan  beberapa  faktor  yang  diduga dapat  memengaruhi  aktivitas  optimal  dari suatu  enzim  untuk  meningkatkan  jumlah rendemen  target  dalam  suatu  sel  tanaman. Pada  hampir  semua  penelitian  terkait  proses ekstraksi komponen dari rumput laut, bentuk sampel yang digunakan adalah dalam bentuk bubuk/kering setelah melalui proses liofilisasi. Berdasarkan hasil penelitian dapat dinyatakan bahwa, penggunaan sampel segar rumput laut dengan kandungan air  mencapai 98,28%  (Nguyen et  al., 2011)  cukup  sulit untuk mendeterminasi pengaruh faktor independen  terhadap  variabel  terikat  seperti persen  rendemen  lemak.  Penelitian  tentang disrupsi  sel  pada  sampel  kering  beku ( freeze-dried )  untuk  membantu  ekstraksi lemak  telah  dilakukan  pada  beberapa penelitian seperti Chlorella vulgaris (Orr et
(a) (b) ( c)
Gambar 5.  Grafik  respons  permukaan  (a)  suhu  dan  waktu  (b)  konsentrasi  enzim  dan  waktu (c) konsentrasi dan suhu enzim.
Figure 5.  Surface  response  graph  (a)  temperature  and  time  (b)  enzyme  concentration  and time (c) enzyme concentration and temperature.
al., 2015), Spirulina  platensis (Duongbia et al., 2018), Scenedesmus (Lai et  al., 2016), Undaria pinnatifida (Billakanti et al., 2013), Enteromorpha  prolifera (Michalak et  al., 2017), Soliera  chordalis  dan  Sargassum muticum (Terme et  al., 2018).  Penggunaan bahan  tanaman  segar  yang  diekstraksi lemaknya dilakukan pada penelitian Vanhercke et al. (2013) dengan sampel daun Nicotiana  tabacum dan  penelitian  Loneman et  al. (2017)  dengan  sampel  rambut  jagung. Asam  lemak  yang  diperoleh  dari  bentuk kering  pada  jaringan  jagung  lebih  tinggi
dibanding  dalam  bentuk  segar  dan  utuh. Perolehan  lemak  dari  daun N.  tabacum juga didapatkan  dari  lemak  permukaan  ( surface lipid ).
Secara  umum,  suhu  yang  optimum digunakan  sebagai  penentu  karakteristik enzim.  Penelitian  Almeida  &  Maranan (2019)  melaporkan  suhu  optimum  tidak konstan  pada  suatu  enzim.  Suhu  optimum pada  enzim  beta-glukosidase  berubah  5℃ dengan  modifikasi  lamanya  pengujian.  Hal tersebut berkolerasi terbalik dengan konsentrasi  enzim.  Denaturasi  pada  enzim
secara  terus  menerus  akan  menurunkan aktivitas enzim saat pengujian. Suhu optimum  hampir  tidak  mencerminkan  sifat enzim,  sehingga  mengadopsi  optimum  suhu pada lamanya waktu pengujian dan konsentrasi enzim dapat menghasilkan rendemen  yang  lebih  rendah.  Namun  pada beberapa  penelitian  terkait  enzim  selulase, parameter  suhu  optimum  tetap  digunakan untuk  menentukan  aktivitas  enzim.  Pada penelitian  Iqbal et  al. (2011)  suhu  optimum yang  dihasilkan  yaitu  55  °C,  jika  melebihi maka aktivitas enzim akan menurun diakibatkan  oleh  denaturasi  protein.  Adapun suhu  optimum  pada  penelitian  Islam  &  Roy (2018)  yaitu  sebesar  40  °C.  Grafik  pada Gambar  3  menunjukkan  bahwa  pada  suhu maksimal  yaitu  60  °C,  jumlah  lemak  yang dihasilkan  semakin  sedikit  dapat  disebabkan karena aktivitas enzim yang menurun. Faktor konsentrasi  pada  Gambar 3  terlihat  bahwa semakin  tinggi  konsentrasi  maka  jumlah lemak  yang  dihasilkan  semakin  meningkat. Penelitian  terkait  konsentrasi  enzim  selulase (Ghazal et  al., 2016),  konsentrasi  yang digunakan  adalah  1%,  3%,  dan  5%.  Adapun pada  konsentrasi  3%  menghasilkan  ekstrak lemak  terbanyak.  Pada  waktu  hidrolisis merupakan  waktu  kontak  antara  enzim selulase  dan  substrat  selulosa  pada  dinding sel  rumput  laut.  Grafik  menunjukkan  bahwa interaksi waktu hidrolisis cenderung menghasilkan jumlah lemak menurun namun tidak signifikan seiring bertambahnya waktu. Pada penelitian terkait waktu hidrolisis (You et  al., 2011),  menggunakan  waktu  hidrolisis 2  jam,  5  jam,  dan  8  jam  pada  enzim karbohidrase.  Jumlah  lemak  yang  dihasilkan fluktuatif. Pada waktu 2 jam dan 8 jam dapat
menghasilkan jumlah lemak yang sama.

## 3.4. Aktivitas Antioksidan
Analisis aktivitas antioksidan dilakukan  dengan  menggunakan  metode ABTS.  Pengujian  aktivitas  antioksidan dengan  radikal  ABTS  didasarkan  pada transfer  elektron  (Sivaramakrishnan et  al., 2017).  Konsentrasi  penghambatan  yang digunakan  adalah  100  ppm  untuk  setiap perlakuan.  Pada  varibel  terikat  aktivitas antioksidan,  model  yang  disarankan  adalah model  linear  yang  memiliki  nilai  p  kurang dari  0,05  (α),  hal  tersebut  menunjukkan bahwa keterandalan cukup tinggi (Tabel 6).
Model  linear  yang  disarankan  untuk variabel terikat aktivitas antioksidan kemudian  dianalisis  menggunakan  analisis ragam.  Tabel  7  menjelaskan  terkait  analisis ragam  pada  aktivitas  antioksidan.  Adapun nilai-p  pada  tabel  tersebut  yaitu  sebesar 0,0294,  nilai  tersebut  menunjukkan  hasil yang signifikan karena p>0,05 sebagai alpha , terutama  pada  faktor  waktu  yang  meiliki nila-p  sebesar  0,005.  Sehingga  dapat dinyatakan  bahwa,  aktivitas  antioksidan berbeda nyata karena dipengaruhi oleh faktor waktu.  Nilai  R- square atau  koefisien determinasi  yang  dihasilkan  yaitu  0,5442. Nilai  tersebut  lebih  besar  dari  0,5  namun kurang dari 0,599 sehingga tingkat hubungannya dapat dinyatakan sedang (Sugiyono,  2015).  Pada  nilai  tersebut  juga menjelaskan 54,42% dipengaruhi oleh faktor independen  terkait,  sedangkan  persentase lainnya  dipengaruhi  oleh  faktor  luar.  Hal tersebut  menunjukkan  <50%  variabel  terikat dipengaruhi oleh faktor lain.
Tabel 6. Model yang direkomendasikan untuk aktivitas antioksidan. Table 6. Recommended model for antioxidant activity.
Source Sequential p-value Adjusted R-Squared Information Linear 0.0294 0.4198 Suggested 2FI 0.3909 0.4407 Quadratic 0.2592 0.5732 Cubic 0.6241 0.5764 Aliased
Tabel 7. Analisis sidik ragam aktivitas antioksidan. Table 7. ANOVA of antioxidant activity.
Source Sum of Square Df Mean square F-value p-value Model 156.67 3 534.24 4.38 0.029 X1 1.39 1 165.62 1.36 0.269 X2 9.11 1 0.016 1.306 0.99 X3 48.47 1 1437.1 11.77 0.005 Residual 1342.6 11 122.1 Cor total 2945.3 14 R-square 0.5442 St. Dev 11.05
Persamaan yang diperoleh dari model linear  dengan  keterangan  X1  konsentrasi enzim,  X2  suhu  hidrolisis  dan  X3  waktu sebagai  faktor  dan  Y  adalah  aktivitas antioksidan dijabarkan pada Persamaan (3):
.......... (3)
Tidak  dilihat  interaksi  antar  faktor independen pada model linear, t. Berdasarkan  Tabel  8,  setiap  faktor  dilihat pengaruhnya masing-masing terhadap variabel  terikat.  Faktor  tersebut  diantaranya suhu hidrolisis, konsentrasi enzim dan waktu hidrolisis.  Pada  Gambar  6a  menjelaskan konsentrasi enzim terhadap aktivitas antioksidan dalam bentuk persentase penghambatan  radikal  ABTS.  Peningkatan konsentrasi enzim tidak meningkatkan aktivitas  antioksidan  namun  cenderung konstan,  sedangkan  pada  Gambar  6b menjelaskan  grafik  tentang  pengaruh  faktor suhu terhadap aktivitas antioksidan. Peningkatan suhu terlihat menurunkan penghambatan  ekstrak  terhadap  radikal. Pengaruh  faktor  waktu  terhadap  aktivitas antioksidan dijelaskan pada Gambar 6c. Pada grafik tersebut menunjukkan bahwa, kenaikan waktu dapat meningkatkan aktivitas  antioksidan  pada  konsentrasi  100 ppm.
Berdasarkan  pada  pengaruh  faktor pada  Gambar  6,  suhu  hidrolisis  dan  waktu
hidrolisis  memperlihatkan  penurunan  dan kenaikan pada aktivitas antioksidan. Menurut Sivaramakrishnan et al. (2017) pada konsentrasi ekstrak yang rendah cukup untuk membatalkan  mediasi  reaksi  berantai  dari radikal bebas, sehingga pengaruhnya cenderung  konstan.  Komponen  antioksidan pada  semua  studi  dapat  menurun  seiring dengan  peningkatan  suhu,  namun  laju penurunannya berbeda-beda (Réblová, 2012).  Aktivitas  antioksidan  pada  rumput laut telah ditemukan dari berbagai komponen seperti polisakarida, serat makanan,  mineral, protein,  asam  amino,  vitamin,  polifenol  dan karotenoid.  Rumput laut menghasilkan berbagai  jenis  antioksidan  untuk  mengatasi tekanan lingkungan (Boonchum et al., 2011). Karakteristik  dan  aktivitas  antioksidan  pada ekstrak  dari  rumput  laut  segar  dipengaruhi oleh  pelarut  yang  digunakan.  Aktivitas radikal  ABTS  digunakan  untuk  menentukan kapasitas  antioksidan  hidrofilik  maupun hidrofobik (Yarnpakdee et al., 2018). Pelarut yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah diklorometan  yang  tergolong  ke  dalam pelarut  non  polar,  maka  komponen  yang terekstrak  dapat  memiliki  sifat  hidrofobik. Ekstrak  diklorometan  dari  rumput  laut cokelat Padina  tetrastomatica (Chandini et al., 2008)  memiliki  aktivitas  antioksidan mencapai  14,23%  dengan  metode  DPPH, sedangkan  rumput  laut  merah Euchema kappaphycus hanya mencapai 6,41%
(Ganesan et al., 2008).
(a) (b)

## (c)
Gambar 6.  Grafik satu faktor (a) konsentrasi enzim (b) suhu hidrolisis (c) waktu hidrolisis. Figure 6.  One  factor  graph  (a)  enzyme  concentration  (b)  hydrolysis  temperature  (c) hydrolysis time.

## 3.5. Hasil Optimasi
Data  yang  didapatkan  untuk  kedua respons  tidak  tersedia lack  of  fit .  Menurut Rheem et  al. (2017),  ketika  model  terhadap data  memiliki lack  of  fit yang  buruk  atau tidak  memiliki lack  of  fit ,  hasil  pemodelan dan  optimasi  mungkin  tidak  akurat.  Nilai lack  of  fit memiliki  derajat  bebas  sebesar  0 (nol).  Hal  tersebut  dapat  disebabkan  karena bentuk  sampel  yang  digunakan  berbentuk segar. Pada beberapa penelitian, sampel yang
digunakan berbentuk kering beku ( freeze-dried ). Secara umum, prosedur ekstraksi  lemak  dari  jaringan  tumbuhan memiliki  beberapa  langkah  yaitu  perlakuan awal sampel seperti pengeringan, pengecilan ukuran dan hidrolisis, homogenisasi jaringan dengan  pelarut,  pemisahan  cairan  dan  fase padat,  penghilangan  kontaminan  nonlemak, penguapan  pelarut  dan  pengeringan  ekstrak (Shahidi  &  Wanasundara,  2008).  Pada  data tersebut dilanjutkan ke tahap optimasi

## Tabel 8. Prediksi variabel independen.
Table 8. Independen variable prediction.
Optimum prediction condition Prediction value Temp. Enzyme conc. Time Lipid amounts Antioxidant activity 30 °C 2% 1 h 9.05657 mg 30.836 2% Tabel 9. Hasil identifikasi asam lemak. Table 9. Fatty acid identification result. Optimum condition RT (min) % Area Fatty acid Temp . Enzyme conc. Time 30 °C 2% 1 h 30.98 0.01 Palmitic acid 61.36 0.01 Lauric acid melalui perangkat lunak. Kondisi optimum pada suatu rancangan percobaan ditentukan berdasarkan kriteria  setiap  faktor  yang  diinginkan.  Pada setiap faktor yaitu suhu hidrolisis, konsentrasi enzim, dan waktu hidrolisis yang diinginkan  adalah  minimal.  Solusi  yang diberikan  oleh  perangkat  lunak  DX  10  yaitu pada  suhu  hidrolisis  sebesar  30  °C,  pada konsentrasi  enzim  sebesar  2%  dan  pada waktu hidrolisis adalah 1 jam (Tabel 8). Pada kondisi  tersebut  diprediksi  jumlah  lemak yang  dihasilkan  adalah  9,057  mg  dan aktivitas  penghambatan  yaitu  30,836%. Kondisi  optimum  tersebut  kemudian  dapat diverifikasi  dengan  melakukan  perlakuan terpilih  sebanyak  2  kali  ulangan  atau  lebih, hingga  mendekati  hasil  prediksi.  Kriteria suhu,  konsentrasi,  dan  waktu minimize , sedangkan  jumlah  lemak  dan  aktivitas antioksidan in range .

## 3.6. Profil Asam Lemak
Identifikasi asam lemak
yang terkandung  di  dalam  ekstrak  lemak  rumput laut  sebelumnya  dikonversi  terlebih  dahulu menjadi  FAME,  kemudian  disaring  dengan filter  Millipore  0,45  µm  dan  dimasukkan  ke dalam  vial  kecil.  Sampel  diinjeksikan  ke dalam  GC/MS-QP2010  Ultra.  Berdasarkan Tabel 9, asam lemak pada C. lentillifera dari Jepara  yang  terdeteksi  yaitu  asam  palmitat atau C16:0 dan asam laurat atau C12:0. Pada
penelitian  dengan  sampel C.  lentillifera kering dari Kalimantan Timur dengan pelarut dietil  eter,  asam  palmitat  atau  C16:0 merupakan asam lemak jenuh yang melimpah  yaitu  mencapai  33,78%  setelah asam lemak oleat atau omega 9 (Matanjun & Muhammad, 2010).

## VI. KESIMPULAN
Kondisi  optimum  yang  diperoleh yaitu  suhu  hidrolisis  sebesar  30  °C,  pada konsentrasi  enzim  sebesar  2%  dan  pada waktu  hidrolisis  adalah  1  jam.  Asam  lemak yang  diperoleh  mengandung  asam  palmitat dan  asam  laurat.  Optimasi  proses  ekstraksi lemak  memungkinkan  potensi  pemanfaatan lemak  dari  rumput  laut  segar C.  lentillifera dengan  metode  yang  efektif  berdasarkan suhu hidrolisis, konsentrasi enzim dan waktu hidrolisis  yang  dibutuhkan.  Hal  ini  akan berdampak  pada  efisiensi  biaya  ekstraksi lemak pada rumput laut.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih kepada
Kementerian
Riset dan Teknologi
Pendidikan Tinggi melalui pendanaan Insentif  Riset  Sistem  Inovasi  Nasional (INSINAS)  gelombang  2  tahun  anggaran 2019. Pendanaan tersebut telah berkontribusi besar pada kelancaran penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Ait-Amir, B., P. Pougnet, & A.E. Hami. 2015. Meta-model development. Embedded Mechatronic  Systems  2.  Elsevier. Amsterdam. 158 pp. Almeida,  V.M.  &  S.R.  Marana.  2019. Optimum  temperature  may  be  a misleading  parameter  in  enzyme characterization and application. Plos ONE, 14(2): 1-8.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0 212977
Anne-sophie,  B.,  B.  Gilles,  &  B.  Nathalie. 2016. Response surface  methodology for  enzyme-assisted  extraction  of water-  soluble  antiviral  compounds from  the  proliferative  macroalga
Solieria chordalis . Enzyme Engineering, 5(2): 1-8.
https://doi.org/10.4172/2329-6674.10
00148
Billakanti,  J.M.,  O.J.  Catchpole,  T.A. Fenton,  K.A.  Mitchell,  &  A.D. MacKenzie.  2013.  Enzyme-assisted extraction  of  fucoxanthin  and  lipids containing polyunsaturated fatty acids from Undaria  pinnatifida using dimethyl  ether  and  ethanol. Process biochemistry, 48(12): 1999-2008. https://doi.org/10.1016/j.procbio.201
3.09.015
Boonchum,  W.,  Y.  Peerapornpisal,  D. Kanjanapothi,  J.  Pekkoh,  C.  Pumas, U.  Jamjai,  &  P.  Vacharapiyasophon. 2011.  Antioxidant  activity  of  some seaweed  from  the  Gulf  of  Thailand. International  J.  of  Agriculture  & Biology , 13(1): 95–99. https://www.fspublishers.org/publish ed_papers/67335_..pdf
Chandini,  S.K.,  P.  Ganesan,  &  N.  Bhaskar. 2008.  Food  chemistry  in  vitro antioxidant activities of three selected brown  seaweeds  of  India. Food Chemistry , 107: 707–713. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.20 07.08.081
Dahlia,  I.,  S.  Rejeki,  &  T.  Susilowati.  2015.
Pengaruh  dosis  pupuk  dan  substrat yang  berbeda  terhadap  pertumbuhan Caulerpa lentillifera . J. of Aquaculture Management and Technology , 4(4): 28–34.
https://ejournal3.undip.ac.id/index.ph
p/jamt/article/view/9802
Dangeubun,  J.L.  &  E.M.Y.  Kadmaer.  2018.
Penerapan iptek di Desa Wab Ngufar untuk manajemen budidaya
makroalga  hijau Caulerpa  racemosa dan Caulerpa  lentillifera “LAT”. Majalah  Aplikasi  Ipteks  Ngayah, 9(2): 246-258. https://e-journal.unmas.ac.id/index.ph p/ngayah/article/view/200
Deslandes,  E.,  V.  Stiger-Pouvreau,  &  N.
Bourgougnon.  2016.  Carbohydrates from  seaweeds.  In:  Fluerence,  J.  and I.  Levine  (eds.).  Seaweed  in  health and  disease  prevention.  Academic
Press. Cambridge. 255 pp.
Duongbia, N., S. Chaiwongsar, C.
Chaichana,  &  S.  Chaiklangmuag.
2018.  Acidic  hydrolysis  performance and
hydrolyzed lipid characterizations  of  wet Spirulina platensis . Biomas  Conversion  and Biorefinery, 9: 305-319. https://doi.org/10.1007/s13399-018-0 350-6 Dutka,  M.,  M.  Ditaranto,  &  T.  Lovas.  2015. Application  of  a  central  composite design for the study of NOx emission performance  of  a  low  NOx  burner.
Energies, 8(5): 3606-3627. https://doi.org/10.3390/en8053606 Fiset, C., J. Liefer, A.J. Irwin, & Z.V. Finkel.
2017. Methodological biases in estimates of macroalgal macromolecular
composition.
Limnology  and  Oceanography ,  15: 618–630.
https://doi.org/10.1002/lom3.10186
Fitriana,  W.D.,  S.  Fatmawati,  &  T.  Ersam.
2015. Uji aktivitas antioksidan terhadap  DPPH  dan  ABTS  dari
fraksi-fraksi  daun  kelor  ( Moringa oleifera ). Prosiding Simposium Nasional  dan  Pembelajaran  Sains, 8 dan 9 Juni 2015. 657–660 hlm.
Ganesan,  P.,  C.S.  Kumar,  &  N.  Bhaskar. 2008.  Antioxidant  properties  of methanol  extract  and  its  solvent fractions  obtained  from  selected indian  red  seaweeds. Bioresource Technology , 99: 2717–2723. https://doi.org/10.1016/j.biortech.200
7.07.005
Gao,  Y.,  M.  Yang,  &  C.  Wang.  2013.
Bioresource technology nutrient deprivation  enhances  lipid  content  in marine microalgae. Bioresource Technology , 147: 484–491.
https://doi.org/10.1016/j.biortech.201 3.08.066
Ghazal, M.A., H.A.H Ibrahim, N.A. Shaltout, & A.E. Ali. 2016. Biodiesel and  bioethanol  production  from Ulva fasciata delie  biomass  via  enzymatic pretreatment  using  marine-derived Aspergillus  niger . Int.  J.  Pure  App. Bioscience , 4(5): 1–16. https://doi.org/10.18782/2320-7051.2 374 Puspitasari,  G.,  W.  A.  Safrihatini,  &  K. Umam.  2019.  Studi  kinetika  reaksi dari  enzim  α-amilase  pada  proses penghilangan kanji kain kapas. Arena Tekstil, 34(1): 1-6. https://doi.org/10.31266/at.v34i1.509 1042 7 Ginneken,  V.J.T.  van,  J.P.F.G.  Helsper,  W. de  Visser,  H.  van  Keulen,  &  W.A. Brandenburg.  2011.  Polyunsaturated fatty  acids  in  various  macroalgal species  from  north  atlantic  and tropical  seas. Lipids  in  Health  and Disease , 10(1): 104-112. https://doi.org/10.1186/1476-511X-1
0-104
Guerra, N.P. 2017. Enzyme kinetics experiment  with  the  multienzyme complex  viscozyme  L  and  two substrates for the accurate
determination of michaelian
parameters .  J.  Chem.  Educ., 94(6): 795-799. https://doi.org/10.1021/acs.jchemed.6 b00351 Haryanto, M.G., S. Setyahadi, M. Sahlan, M.
Yohda, Y. Fukutani, E.A. Suryono, & Misri.  2018.  Characterization  of cellulase from E. coli BPPTCC-EGRK2. Consortium
Studies  of  Smallholder  Palm  Oil International  Conference,  Sarawak,
Malaysia,  9  Juli-11  Juli  2018. 1660-1666 pp.
https://doi.org/10.1051/e3sconf/2018 5200024
Iqbal,  H.M.N.,  I.  Ahmed,  M.A.  Zia,  &  M.
Irfan. 2011. Purification and characterization of the kinetic parameters  of  cellulase  produced from  wheat  straw  by Trichoderma viride under  SSF  and  its  detergent compatibility.
Advances
in
Bioscience  and  Biotechnology ,  2  (3):
149–156.
https://doi.org/10.4236/abb.2011.230
24
Islam,  F.  &  N.  Roy.  2018.  Screening, purification  and  characterization  of cellulase  from  cellulase  producing bacteria  in  molasses. BMC  Research Notes , 11(1): 1–6.
https://doi.org/10.1186/s13104-018-3 558-4
Iwundu, M.P. 2018. Construction of modified central composite design for non-standard  models. Int.  J.  of Statistics  and  Probability ,  7(5):
95-119.
https://doi.org/10.5539/ijsp.v7n5p95
Kementrian  Kelautan  dan  Perikanan  (KKP).
2019. Pedoman umum pembudidayaan  rumput  laut.  Nomor 1/KEPMEN-KP/2019.  KKP.  Jakarta.
4-5 hlm.
Lai, Y.J.S., F. De Francesco, A. Aguinaga, P. Parameswaran,  &  B.E.  Rittmann. 2016.  Improving  lipid  recovery  from
Scenedesmus wet biomass by surfactant-assisted  disruption. Green Chemistry, 18(5): 1319-1326. https://doi.org/10.1039/C5GC02159F
Liang,  K.,  Q.  Zhang,  &  W.  Cong.  2012. Enzyme-assisted  aqueous  extraction of  lipid  from  microalgae. J.  of Agricultural  and  Food  Chemistry ,
60(47): 11771–11776.
https://doi.org/10.1021/jf302836v
Lin,  Y.,  X.  Xie,  B.  Yuan,  J.  Fu,  L.  Liu,  H. Tian, & D. He. 2018. Optimization of enzymatic cell disruption for improving  lipid  extraction  from Schizochytrium sp.  through  response surface  methodology. J.  of  Oleo Science , 67(2): 215-224. https://doi.org/10.5650/jos.ess17166
Lone, M.A., S. Sahay, R. Rana, M.A. Rather,
F.A. Dar, F.A. Maila, & M.A. Reshi. 2014. Kinetic determining innovations
of carboxymethyl
cellulase enzyme isolated from Trichophyton terrestre in carboxymethyl  cellulose  solution. Discovery J ., 24(84):110-117. https://www.discoveryjournals.org/di scovery/current_issue/v24/n80-85/A1
6.pdf?
Loneman, D.M.,  L. Peddicord,  A. Al-rashid, J.  Nikolau,  N.  Lauter,  &  M.D. Yandaeau-Nelson.  2017.  A  robust and efficient method for the extraction of plant extracellular surface  lipids  as  applied  to  the analysis  of  silks  and  seedling  leaves of  maize. Plos  ONE, 12(7):  1-21. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0 180850
Maciel,  E.,  M.C.  Leal,  A.I.  Lillebø,  P. Domingues,  M.R.  Domingues,  &  R. Calado.  2016.  Bioprospecting  of marine  macrophytes  using  ms-based lipidomics  as  a  new  approach.
Marine Drugs , 14(49): 1–28. https://doi.org/10.3390/md14030049 Maftukhah,  S.  &  Abdullah.  2018.  Cellulase enzyme  production  from  rice  straw
using  solid  state  fermentation  and fungi  Aspergillus  niger  ITBCC  L74. The  24th  Regional  Symposium  on Chemical  Engineering,  Semarang, Indonesia,  15-16  November  2017. 1-7 pp. https://doi.org/10.1051/matecconf/20
1815601010
Matanjun,  P.  &  K.  Muhammad.  2010.
Comparison of cardiovascular protective effect of tropical seaweeds,
Kappaphycus alvarezii, Caulerpa lentillifera, and Sargassum polycystum on High-Cholesterol/High-Fat  Diet  in Rats. J.  of  Medicinal  Food, 13(4): 1–10.
https://doi.org/10.1089/jmf.2008.121
2
Michalak,  I.,  A.  Dmytryk,  A.  Smieszek,  &
K. Marycz. 2017. Chemical characterizaton of Enteromorpha prolifera extract obtained by enzyme-assisted  extrction  an  its influence on the metabolic activity of Caco-2. International J. of Molecular Science 18(3): 1-20. https://doi.org/10.3390/ijms18030479 Mubarak,  M.,  A.  Shaija,  &  T.V.  Suchithra. 2016. Optimization of lipid extraction from Salvinia  molesta for  biodiesel production using RSM and its FAME Analysis. Environmental Science and Pollution Research , 23: 14047–14055. https://doi.org/10.1007/s11356-016-6 343-8
Nguyen, V.T.,  J.P.  Ueng, &  G.J. Tsai. 2011.
Proximate composition, total
phenolic  content,  and  antioxidant activity of seagrape ( Caulerpa lentillifera ). J.  of  Food  Science , 76(7): 950–958.
https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2 011.02289.x
Orr,  V.C.A.,  N.V.  Plechkova,  K.R.  Seddon, & L. Rehmann. 2015. Disruption and wet  extraction  of  the  microalgae
chlorella vulgaris using room-temperature  ionic  liquids. ACS Sustainable Chemistry and Engineering, 4(2): 591-600 . https://doi.org/10.1021/acssuschemen g.5b00967
Peraturan  Presiden  (Perpres).  2019.  Peta
Panduan  ( Road  Map )  Pengembangan
industri  rumput  laut  nasional  tahun 2018-2021. Peraturan Presiden Republik Indonesia Nomor 33 Tahun
2019, Indonesia.
Pishgar-komleh, S., A. Keyhani, M. Mostofi-Sarkari,  &  A.  Jafari.  2012. Application  of  response  surface methodology  for  optimization  of picker-  husker  harvesting  losses  in corn  seed. Iranica  J.  of  Energy  &
Environment , 3(2): 134–142. https://doi.org/10.5829/idosi.ijee.201
2.03.02.0027
Prakoso,  F.D.,  F.  Lestari,  &  T.  Apriadi.
2019. Jenis dan sebaran makroalga di perairan Pulau Beralas Bakau Kecematan Gunung Kijang Kabupaten  Bintan. J.  Perikanan  dan Kelautan, 9(2): 235-245.
https://doi.org/10.33512/jpk.v9i2.735 7
Ranade,  S.S.  &  P.  Thiagarajan.  2017.
Selection  of  a  design  for  response surface. Material Science and
Engineering , 263(2): 022043. https://doi.org/10.1088/1757-899X/2 63/2/022043
Razai, T.S., I.P. Putra., F. Idris, T. Febrianto, M. Firdaus. 2019. Identifikasi, keragaman, dan sebaran Caulerpa sp. sebagai komoditas potensial budidaya Pulau Bunguran, Natuna. Simbiosam , 8(2): 168-178.
https://doi.org/10.33373/sim-bio.v8i2 .2177
Réblová,  Z.  2012.  Effect  of  Temperature on the  antioxidant  activity  of  phenolic acids. Czech  J.  Food  Sci. ,  30(2):
171–177.
https://doi.org/10.17221/57/2011-CJF
S Reddy, A. & A.B. Majumder. 2014. Use of a
Combined technology of ultrasonication, three-phase
partitioning,  and  aqueous  enzymatic oil extraction for the extraction of oil from Spirogyra sp. J.  of Engineering
Hindawi , 2014(2): 1-6. https://doi.org/http://doi.org/10.1155/
2014/740631
Rheem,  S.,  I.  Rheem,  &  S.  Oh.  2017.
Response  surface  methodology  using a fullest balanced model: a re-analysis  of  a  dataset  in  the  korean journal  for  food  science  of  animal resources. Korean  J.  for  Food Science  of  Animal  Resources, 37(1): 139-146. https://doi.org/10.5851/kosfa.2017.37 .1.139 Sanjeewa, K.K.A., W. Lee, & Y. Jeon. 2018. Nutrients  and  bioactive  potentials  of edible  green  and  red  seaweed  in korea.
Fisheries and Aquatic
Sciences , 21(19): 1–11. https://doi.org/10.1186/s41240-018-0
095-y
Saropah,  D.A.,  A.  Jannah,  &  A.  Maunatin. 2012.  Kinetika  reaksi  enzimatis ekstrak  kasar  enzim  selulase  bakteri selulolitik  hasil  isolasi  dari  bekatul. Alchemy , 2(1): 35–45. https://doi.org/10.18860/al.v0i0.2297
Shahidi,  F.  &  P.  Wanasundara.  2008.  Food Lipids.  Third  Edition.  CRC  Press. 126-127 pp.
Sivaramakrishnan,  T.,  S.  Swain,  K.R.K.S.
Saravanan,  S.D.  Roy,  L.  Biswas,  & B.  Shalini.  2017.  In  vitro  antioxidant and  free  radical  scavenging  activity and  chemometric  approach  to  reveal their  variability  in  green  macroalgae from  south  andaman  coast  of  india. Turkish  J.  of  Fisheries  and  Aquatic Sciences, 17: 639–648.
https://doi.org/10.4194/1303-2712-v1 7_3_20 Sugiyono. 2015. Metode Penelitian
Manajemen (Edisi Keempat). Alfabeta. Bandung. 51 p.
Supriadi, S., R. Syamsuddin, A. Abustang, & I.  Yasir.  2016.  Pertumbuhan  dan kandungan karotenoid lawi-lawi Caulerpa racemosa yang ditumbuhkan pada tipe substrat berbeda. J.  Rumput  Laut Indonesia,
1(2): 117-122.
https://journal.indoseaweedconsortiu m.or.id/index.php/jrli/article/view/28/
25
Synytsya,  A.,  W.J.  Kim,  &  Y.I.  Park.  2015. Cell  wall  polysaccharides  of  marine algae. Marine  Alga  Biotechnology .
Springer. Berlin. 543 p. https://doi.org/10.1007/978-3-642-53 971-8
Terme,  N.,  R.  Boulho,  J.P.  Kucma,  N. Bourgougnoun,  &  G.  Bedoux.  2018. Radical  scavenging  activity  of  lipids from seaweeds isolated by solid-liquid extraction and supercritica  fluids. Oilseeds  and  fats crops and lipids, 25(5): 1-6. https://doi.org/10.1051/ocl/2018054
Vanhercke,  T.,  A.E. Tahchy,  Q.  Liu,  &  J.R.
Petrie.  2014.  Metabolic  engineering of  biomass  for  high  energy  density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant
Biotechnology J., 12(2): 231-239. https://doi.org/10.1111/pbi.12131
Wijesinghe,  W.A.J.P.  &  Y.  Jeon.  2012.
Enzyme-assistant extraction (EAE) of bioactive components: a useful approach  for  recovery  of  industrially important metabolites from seaweeds:
A review. Fitoterapia, 83(1): 6–12. https://doi.org/10.1016/j.fitote.2011.1 0.016
Yarnpakdee,  S.,  S.  Benjakul,  &  T.  Senphan.
2018.  Antioxidant  activity  of  the extracts  from  freshwater  macroalgae
( Cladophora  glomerata )  grown  in northern  thailand  and  its  preventive effect  against  lipid  oxidation  of refrigerated  eastern  little  tuna  slice. Turkish  J.  of  Fisheries  and  Aquatic Sciences , 19(3): 209–219. https://doi.org/10.4194/1303-2712-v1
9_3_04
Yingyao, W., W. Zhang, C. Shangwei, & H.
Fei. 2008. Aqueous enzymatic extraction of oil and protein hydrolysates  from  peanut. Food  Sci.
Technol. Res ., 14(6): 533–540. https://doi.org/10.3136/fstr.14.533
Yogyaswari,  S.A.,  M.G.I.  Rukmi,  &  B.
Raharjo.  2016.  Eksplorasi  bakteri selulolitik  dari  cairan  rumen  sapi peranakan  fries  holland  (PFH)  dan limousine  peranakan  ongole  (limpo). J. Biologi , 5(4): 70-80. https://ejournal3.undip.ac.id/index.ph p/biologi/article/view/19516/18508
You,  J.,  C.  Peng,  X.  Liu,  X.  Ji,  J.  Lu,  Q. Tong,  &  Z.  Li.  2011.  Bioresource technology  enzymatic  hydrolysis  and extraction  of  arachidonic  acid  rich lipids from Mortierella alpina . Bioresource  Technology, 102(10):
6088–6094.
https://doi.org/10.1016/j.biortech.201 1.01.074
Zhang,  M.,  Y.  Ma,  X.  Che,  Z.  Huang,  P. Chen,  G.  Xia,  &  M.  Zhao.  2020. Comparative  analysis  of  nutrient composition  of Caulerpa  lentillifera from  different  regions. J.  Ocean Univ. China, 19(2): 1-7. https://doi.org/10.1007/s11802-020-4 222-x
Received   :   11 November 2020 Reviewed :   07 December 2020 Accepted  :   15 February 2021