Tersedia online di http://journal.ipb.ac.id/index.php/jhi

## Pengembangan Uji Tetrazolium sebagai Metode Analisis Vigor Benih Botani Bawang Merah
(Development of Tetrazolium Test as Vigor Analysis Method of True Seed of Shallot)
Nurul Afifah 1 , Eny Widajati 2* , dan Endah Retno Palupi 2
Diterima 5 Juni 2020/Disetujui 8 Agustus 2020

## ABSTRACT
The tetrazolium (TZ) test is one of methods to estimate viability and vigor of seed. This study aimed  to  improve  the  methodology  of  vigor  analysis  of  true  seed  of  shallot.  In  this  research,  two varieties of shallot seeds were used, those were Trisula and Tuk-tuk. Pre-treatment in the tetrazolium test of shallot seeds was applicated, directly soaking in water for 18 hours. Seed preparation before staining used method: the thoroughly linear side of the seed was cut longitudinally as the only thin slice, and convex side of seed was punctured with a scalpel. Seeds were stained for 18 hours in a 1% tetrazolium solution at 30 o C. Seed patterns classified in four categories were determined. The results were four patterns of high-seedling as criteria for seed vigor, five patterns of low seedling vigor, seven patterns  of  abnormal  seedling,  and  four  patterns  of  dead  seed.  Viability  and  vigor  physiological parameters are closely correlated with the results of high seedling vigor patterns. The high seedling vigor  patterns  had  high  the  correlation  coefficients  (r)  with  physiological  test  parameters  in  the laboratory including vigor index (r= 0.882), normal seedling dry weight (r= 0.899), and seed growth rate (r= 0.875). It indicated the vigor staining patterns can predict the vigor of seeds.
Keywords: Allium cepa, imbibition, seed quality, viability, true shallot seed

## ABSTRAK
Uji tetrazolium (TZ) merupakan salah satu metode untuk mengestimasi viabilitas dan vigor benih. Penelitian ini bertujuan  untuk memperbaiki metode analisis vigor pada benih botani bawang merah. Pada penelitian ini digunakan dua varietas benih bawang merah, yaitu Trisula dan Tuk-tuk. Pre-treatment dalam uji tetrazolium benih bawang merah dilakukan dengan perendaman benih dalam air  selama  18  jam.  Sebelum  pewarnaan  benih  disiapkan  dengan  menggores  sisi  lurus  secara longitudinal sebagai satu-satunya irisan tipis, dan sisi cembung benih ditusuk dengan scalpel . Benih diwarnai selama 18 jam dalam larutan tetrazolium pada suhu 1% suhu 30 o C dalam kondisi gelap. Pola pewarnaan benih diklasifikasikan dalam empat kategori yaitu empat pola normal kuat sebagai kriteria benih  vigor,  lima  pola  normal  lemah,  tujuh  pola  abnormal,  dan  empat  pola  benih  mati.  Parameter fisiologis viabilitas dan vigor berkorelasi erat dengan hasil pola vigor/ normal kuat. Pola normal kuat memiliki koefisien korelasi (r) yang tinggi dengan parameter uji fisiologis di laboratorium termasuk indeks vigor (r= 0.882), bobot kering kecambah normal (r= 0.899), dan kecepatan tumbuh (r= 0.875). Hal ini mengindikasikan pola pewarnaan vigor dapat memprediksi vigor benih.
Kata kunci: Allium cepa, benih botani, imbibisi, mutu benih, viabilitas
1 Balai Besar Pengembangan Pengujian Mutu Benih Tanaman Pangan dan Hortikultura Jl. Raya Tapos, Kotak Pos 20, Tapos, Depok, Jawa Barat 16957, Indonesia
2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor Jl. Meranti Kampus IPB Darmaga, Bogor, Jawa Barat 16680, Indonesia E-mail : eny_widajati@apps.ipb.ac.id (*penulis korespondensi)

## PENDAHULUAN
Bawang  merah    ( Allium  cepa var.
ascolanicum B.) merupakan komoditas hortikultura  yang  banyak  dibudidayakan  di Indonesia.  Pada  tahun  2017  produktivitas bawang merah sebesar 9.29 ton ha -1 , kemudian tahun  2018  mengalami  penurunan  menjadi 9.06  ton  ha -1 (BPS  2019).  Penurunan produktivitas  tersebut  salah  satunya  diduga karena  rendahnya  penggunaan  benih  umbi bermutu.  Pemerintah  terus  melakukan  upaya peningkatan  produksi  bawang  merah  salah satunya dengan strategi percepatan ketersediaan  benih  bermutu  yaitu  dengan memperkenalkan  benih  botani  atau  disebut juga true seed of shallot (TSS). Beberapa  kelebihan  penggunaan  TSS sebagai  benih  yaitu:  sifat  benih  yang  jarang terkontaminasi  virus,  cendawan,  bakteri  dan nematoda,  benih  dapat  disimpan  lebih  lama, kebutuhan  benih  sedikit  3-7.5  kg  ha -1 ,  dan potensi  produktivitas  lebih  dari  20  ton  ha -1 (Prayudi et  al., 2015).  Berdasarkan  deskripsi varietas bawang merah beberapa di antaranya varietas Trisula dan Tuk-tuk memiliki potensi produksi mencapai 23 ton ha -1 dan 32 ton ha -1 . Nilai  potensi  produksi  tersebut  sangat  tinggi dibandingkan  dengan  nilai  produktivitas bawang merah di Indonesia saat ini yang hanya berkisar 9 ton ha -1 , oleh karena itu, mutu TSS perlu  diperhatikan  pada  saat  panen  maupun masa penyimpanan sebagai quality control . Informasi mutu suatu lot benih diperoleh melalui serangkaian pengujian benih. Uji daya berkecambah merupakan salah satu uji standar yang rutin digunakan. Nilai daya berkecambah dicantumkan  dalam  label  benih  bersertifikat yang  menggambarkan  viabilitas  benih,  tetapi kurang sensitif dalam membedakan lot benih. Sementara  uji  vigor  menghasilkan  informasi indeks  mutu  benih  yang  lebih  sensitif  dan menggambarkan  potensi  performa  tingkat  lot benih  yang  lebih  konsisten  (ISTA,  2016). Vigor  benih  adalah  sifat-sifat  benih  yang menggambarkan  performa  lot  benih  pada kisaran  kondisi  lingkungan  yang  luas  (ISTA, 2016),  oleh  karena  itu  diperlukan  metode pengujian  vigor  untuk  memperoleh informasi vigor/mutu  suatu  benih  dari  berbagai  aspek yaitu:  fisiologis,  fisik,  resisten/cekaman,  dan biokimia.
Beberapa  metode  uji  vigor  pada Allium cepa yang  sudah  dikembangkan  yaitu:
pengusangan cepat, deteriorasi terkendali, dan uji  konduktivitas  (Rodo  dan  Marcos-Filho 2003;  Dias et  al. 2006).  Pada  metode pengusangan cepat maupun deteriorasi terkendali  menggunakan  perlakuan  inkubasi, dilanjutkan  tahapan  evaluasi  perkecambahan yang  memakan  waktu  yang  cukup  lama.  Uji konduktivitas  hanya  efektif  pada  beberapa spesies, hal ini salah satunya dipengaruhi oleh semipermeable  nucellar  membrane (Elias  e t al ., 2012).
Uji tetrazolium (TZ) dapat mengestimasi mutu  benih  dari  aspek  biokimia  yaitu berdasarkan  aktivitas  enzim dehydrogenase .
Uji  TZ  menggunakan  larutan  2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride yang  diimbibisikan pada benih  kemudian  bereaksi  dengan  enzim dehydrogenase dalam jaringan benih sehingga terbentuk  endapan  formazan  berwarna  merah sebagai  indikator  bahwa  jaringan  tersebut masih  hidup.  Pola  pewarnaan  dan  intensitas warna  struktur  internal  benih  menentukan dalam  evaluasi  kriteria  sebagai  benih  yang vigor  yang  memiliki  potensi  berkembang menjadi kecambah yang normal (ISTA, 2016) . Kelebihan  uji  TZ  di  antaranya:  tidak terpengaruh  oleh  faktor  lingkungan,  dapat mendeteksi  kemunduran  benih,  alat  yang dibutuhkan sederhana, waktu yang dibutuhkan cepat, tidak dipengaruhi faktor dormansi, dan fokus evaluasi pada struktur benih. Kekurangan  dari pengujian ini  membutuhkan keterampilan  dan  pengetahuan  yang  khusus, dan  tingkat  subjektivitas  pada  evaluasi pewarnaan  (Franca-Neto  dan  Krzyzanowsky, 2019).
Beberapa kajian memberikan hasil bahwa uji  TZ  mampu  menilai  vigor  benih  dan berpotensi  untuk  dijadikan  metode  pengujian vigor secara cepat pada beberapa spesies yaitu: kapas,  kacang  tanah,  jagung,  kedelai,  dan tomat  (Marcos-Filho,  2015;  Dina,  2007; Santos et  al., 2007). International  Seed Technology  Association (ISTA)  (2003)  telah menetapkan  uji  tetrazolium  pada Allium spp. sebagai uji viabilitas dengan dua kriteria pola pewarnaan  yaitu viable dan non-viable .  Pola viable yang dimaksud belum menggambarkan atau mengestimasi vigor pada Allium spp. Oleh karena  itu  perlu  dicari  pola viable -vigor dengan  kriteria  yang  lebih  ketat.  Pada penelitian  yang  dilakukan  oleh  Abdullah (2017)  uji  TZ  pada  benih  bawang  merah menghasilkan  pola-pola  topografi  kriteria
normal  kuat  memiliki  nilai  koefisien  korelasi yang  tinggi  dengan  parameter  indeks  vigor, dan daya berkecambah. Akan tetapi masih ada yang  perlu  diperbaiki  yaitu  metode pre- treatment dan  bagian-bagian  internal  benih yang diamati dalam penentuan pola topografi.
Berdasarkan hal-hal tersebut perlu dilakukan  pengembangan  metode  analisis vigor  benih  botani  bawang  merah  dengan menggunakan uji tetrazolium. Tujuan penelitian  ini  adalah  mendapatkan  pola topografi  pewarnaan  tetrazolium  sebagai kriteria  benih vigor dan mendapatkan informasi  hubungan  antara  hasil  pengujian vigor di laboratorium.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian    terdiri  atas  dua  percobaan yaitu : (1) penetapan lama perendaman benih untuk pre-treatment uji  tetrazolium,  dan  (2) penentuan  kriteria  benih  vigor  berdasarkan pola topografi pewarnaan tetrazolium.

## Waktu dan Tempat
Penelitian  dilaksanakan  pada  bulan Desember  2018  s.d.  Agustus  2019  di laboratorium  Balai  Besar  Pengembangan Pengujian  Mutu  Benih  Tanaman  Pangan  dan Hortikultura, Depok.

## Bahan
Lot benih yang digunakan terdiri atas dua varietas  yaitu  varietas  Trisula  dan  Tuk-tuk. Benih  varietas  Trisula  TR1  (DB=  82%) diproduksi  oleh  Balai  Penelitian  Tanaman Sayuran.  Benih  varietas  Tuk-tuk  berasal  dari produsen swasta yaitu: Lot TA (DB=84%), T1 (DB= 85%), T2 (DB= 83%), T3 (DB= 65%), dan T4 (DB= 60%). Lot benih T2, T3, dan T4 diperoleh  dengan  proses artificial  aging dengan  penderaan  suhu  40-41 o C  dan  RH tinggi selama 2-6 hari.
Percobaan 1: Penetapan lama Perendaman Benih untuk Pre-treatment Uji Tetrazolium
Uji  tetrazolium  terdiri  atas  beberapa tahapan  yaitu: pre-treatment , persiapan benih sebelum  pewarnaan  berupa  pelukaan  atau
pemotongan,  pewarnaan,  dan  evaluasi  pola topografi. Penggunaan lama waktu perendaman  yang  tepat  untuk pre-treatment pada  uji  tetrazolium  akan  menghasilkan  pola topografi  pewarnaan  yang  lebih  informatif terkait  viabilitas  maupun  vigor  benih  yang diuji. Penetapan lama perendaman benih untuk tahapan pre-treatment didasarkan pada aktivasi  metabolisme  benih,  struktur  internal benih, dan waktu radicle emergence .

## Prosedur Percobaan
a. Aktivasi metabolisme benih Aktivasi  metabolisme  benih  dilakukan dengan  perlakuan  perendaman  yang  akan diamati  proses  imbibisinya.  Pengamatan proses  imbibisi  terdiri  atas  dua  metode  yaitu pertambahan bobot dan peningkatan kadar air benih.
Pengukuran imbibisi berdasarkan penambahan  bobot  menggunakan  lot  benih Trisula  (TR1)  dan  Tuk-tuk  (TA).  Benih disiapkan sebanyak 1.5  g  direndam  dalam 20 ml  aquades  pada  gelas  piala  untuk  periode waktu perendaman yaitu 0, 12, 18, 24, 30, dan 36 jam sebanyak 3 ulangan pada kondisi suhu 20±2 o C.  Benih  ditimbang  dengan  neraca analitik,  kemudian  benih  direndam  kembali sampai waktu periode berikutnya.
Pengukuran  imbibisi  berdasarkan pertambahan  kadar  air  benih  menggunakan benih sebanyak 2 g direndam dalam 20 ml air pada  gelas  piala  untuk  perendaman  dengan periode waktu perendaman yaitu 0, 12, 18, 24, 30,  36  jam  sebanyak  3  ulangan  pada  kondisi suhu 20±2 o C. Benih yang sudah dikeringanginkan ditimbang dan diukur kadar airnya.  Penetapan KA benih dilakukan dengan mengoven  1.5  g  benih  pada  suhu  103±2 o C selama  17±1  jam  menggunakan  cawan porselen (ISTA, 2016).
b. Struktur internal benih Benih  TA  direndam  dalam  20  ml  air sebanyak 50 butir pada gelas piala pada empat periode perendaman yaitu 12, 18, 24, 30, dan 36 jam dan diinkubasi pada kondisi suhu 20±2 o C. Benih  diamati sebanyak 50 butir  masing- masing  periode  perendaman.  Pengamatan dilakukan  dengan  mengiris  benih  secara longitudinal  untuk  membuka  bagian  poros embrio,  kemudian  diamati  menggunakan mikroskop stereo perbesaran 7-30 kali.  Bagian yang  diamati  struktur  internal  benih  yaitu:
radikula, kotiledon, haustorium , dan endosperma.
c. Penetapan waktu radicle emergence (RE) Penetapan  RE  menggunakan  empat  lot benih  varietas  Tuk-tuk  dengan  beberapa tingkat  viabilitas  yang  berbeda  yaitu:  lot  T1,
T2, T3,  dan  T4. Benih dikecambahkan  dalam boks plastik tertutup, menggunakan metode uji di atas kertas/ top of paper (TP). Benih ditabur di atas media yang telah dilembabkan  dengan air.  Selanjutnya  diinkubasi  pada germinator room pada  suhu  20±2 o C  selama  120  jam. Pengecambahan  dilakukan  dengan  empat ulangan masing-masing 100 butir. Pengamatan dilakukan  per  enam  jam  selama  120  jam setelah  penanaman  pada  media. Radicle emergence dihitung  berdasarkan  persentase jumlah  benih  yang  berkecambah  dengan kriteria panjang radikula minimal 2 mm.
Percobaan  2:  Penentuan  Kriteria  Benih Vigor Berdasarkan Pola Topografi Pewarnaan Tetrazolium

## Prosedur Percobaan
a. Pengujian tetrazolium Lot  benih  yang  digunakan  sebanyak empat lot benih varietas Tuk-tuk yaitu: Lot T1, T2,  T3,  dan  T4.  Pada  pengujian  TZ,  benih sebanyak  100  butir  sebanyak  empat  ulangan direndam dengan aquades pada suhu 20±2 o C dengan  waktu  perendaman  selama  18  jam (hasil  percobaan  1).  Kemudian  benih  digores tipis  pada  bagian  sisi/penampang  yang  datar, dan  tusuk  bagian  sisi  cembung  secara longitudinal  dekat  pada  bagian  tengah  benih diantara  radikula  dan  kotiledon.  Selanjutnya benih  direndam  dalam  larutan  tetrazolium klorida 1% dalam buffer fosfat selama 18  jam, pada  suhu  30 o C  dan  kondisi  gelap  (ISTA 2016).
Pengamatan dilakukan dengan mengelompokkan  benih  berdasarkan  pola topografi  dan  pewarnaan  yang  terbentuk. Fokus  pengamatan  dilakukan  pada  bagian struktur  internal  benih  bawang merah berdasarkan  intensitas  dan  lokasi  pewarnaan dengan bantuan  mikroskop stereo. Kelompok pola benih terdiri atas empat kriteria yaitu: (1) benih viable -vigor  yang  ditunjukkan  dengan pola normal kuat, (2) benih viable -tidak vigor yang  ditunjukkan  pola  normal  lemah,  benih
non-viable yang  ditunjukkan  dengan  (3)  pola abnormal  dan  (4)  mati.  Topografi  pewarnaan dilihat  dengan  menggunakan  mikroskop. Kemudian  masing-masing  pola  dihitung  dan dipersentasekan.
b. Pengujian  viabilitas  dan  vigor  dengan pendekatan fisiologis
Pengujian  fisiologis  dilaksanakan dengan  menggunakan  metode  uji  di  atas kertas/ top of paper menggunakan boks plastik berukuran 14 cm x 9 cm x 5 cm (Madyasari et al .,  2017).  Benih  yang  digunakan  sebanyak 100 butir setiap ulangan, setiap lot benih terdiri atas  empat  ulangan  dan  diinkubasi  pada germinator room pada suhu 20±2 o C selama 12 hari  (ISTA,  2016).  Pengujian  fisiologis meliputi beberapa tolok ukur yaitu: (a) indeks vigor  (IV)  merupakan  persentase  kecambah normal pada hitungan pertama yaitu hari ke-6 (Copeland dan McDonald, 1995), (b) kecepatan tumbuh (KCT) dihitung
berdasarkan jumlah dari persentase kecambah normal  per  satuan  etmal (24 jam) (Sadjad et al. 1999),  (c)  daya  berkecambah  (DB)  yang dihitung  berdasarkan persentase jumlah kecambah normal (KN)  pada  pengamatan ke- 1  (hari  ke-6)  dan  ke-2  (hari  ke-12)  (ISTA 2016), (d) potensi tumbuh  maksimum (PTM) dihitung  berdasarkan  persentase  keseluruhan kecambah  yang tumbuh baik  normal  maupun abnormal  sampai  akhir  pengamatan,  dan  (e) berat  kering  kecambah  normal  (BKKN) diperoleh dengan menimbang bobot kecambah normal  yang  tumbuh  pada  hari  ke-6  pada  uji perkecambahan di atas kertas pada suhu 80 o C selama 24 jam.

## Rancangan Percobaan
Pengujian  viabilitas  dan  vigor  di laboratorium  menggunakan  rancangan  acak lengkap  dengan  satu  faktor  yaitu  tingkat viabilitas  lot    benih  yang  terdiri  atas  empat tingkat  viabilitas  dan  empat  ulangan.  Setelah dianalisis  sidik  ragam  dilakukan  uji  lanjut dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada α 5%.

## Analisis Data
Penelitian  ini  menggunakan  metode analisis  korelasi  regresi  antara  nilai  vigor berdasarkan  uji  fisiologi  dengan  nilai  vigor yang  diukur  dengan  tetrazolium.  Sebagai
sumbu  X  adalah  nilai  vigor  yang  diukur  dari pengujian  tetrazolium  sedangkan  sumbu  Y adalah  nilai  vigor  dan  viabilitas  pendekatan fisiologis dengan tolok ukur IV, K CT , BKKN, DB  dan  PTM.  Nilai  koefisien  korelasi  (r) digunakan  untuk  melihat  keeratan  hubungan antara  nilai  vigor  dan  viabilitas  pendekatan fisiologis dengan nilai vigor berdasarkan pola pewarnaan tetrazolium.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Percobaan 1: Penetapan Lama Perendaman  Benih  untuk  Pre-Treatment Pengujian Tetrazolium
a. Aktivasi metabolisme benih Pengamatan imbibisi dilakukan selama  0-36  jam.  Pengamatan  pertama dilakukan  pada  12  jam  setelah  perendaman dengan  hasil  terjadi  peningkatan  bobot  yang sangat  signifikan  pada  benih  bawang  merah varietas  Trisula  dan  Tuk-tuk  (Gambar  1a). Begitu  juga  pada  pengamatan  imbibisi berdasarkan  kadar  air,  jam  ke-12  setelah perendaman  terjadi  peningkatan  kadar  air Trisula  dan  Tuk-tuk  secara  signifikan.  Kadar air awal Trisula sebesar 7.2% meningkat tajam menjadi  40.7%.  Tuk-tuk  juga  mengalami peningkatan  kadar  air  yang  sangat  signifikan yaitu 4.8% menjadi 36.2% (Gambar 1b). Pada pengamatan  imbibisi  berdasarkan  bobot maupun  kadar  air  benih  menghasilkan  lama
perendaman  12  s.d  36  jam  merupakan  waktu benih  mencapai  bobot  dan  kadar  air  yang maksimum  dengan  kenaikan  yang  mendekati stagnan.
b. Pengamatan struktul internal benih Struktur  benih  bawang  merah  yang diamati  yaitu: radikula, kotiledon, haustorium dan  endosperma.  Radikula,  dan  kotiledon, yang diamati merupakan struktur yang esensial pada  kecambah  untuk  berkembang  menjadi tanaman normal. Endosperma dan haustorium merupakan  bagian  struktur  internal  benih berperan penting dalam proses perkecambahan benih.
Pengamatan  struktur  internal  benih dilakukan pada 12, 18, 24, dan 30 jam setelah perendaman untuk imbibisi. Pada perendaman 12 jam laju imbibisi berlangsung  maksimum, ukuran  benih  membesar  secara  signifikan. Radikula  belum  ada  yang  menembus  testa. Pada  jam  ke-18  benih  relatif  tidak  berbeda, embrio  mulai  membesar  radikula  mulai memanjang. Pada jam ke-24 radikula memanjang mendekati testa, dan embrio terus membesar. Pada jam ke-30 endosperma mulai sedikit menyusut seiring tumbuh dan berkembangnya  embrio,  radikula  semakin mendekati  testa.  Pada  imbibisi  jam  ke-36 kondisi embrio dan endosperma tidak berbeda dengan  jam  ke-30  akan  tetapi  ukuran  embrio semakin membesar (Gambar 1).
(a) (b) Gambar 1.  Kurva pertambahan bobot benih (a), dan kadar air benih (b) pada imbibisi dengan lama 0 s.d 36 jam 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 1 2 1 8 2 4 3 0 3 6 B o b o t b en ih (g ) Waktu (Jam) Trisula Tuk-tuk 0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 1 8 2 4 3 0 3 6 ka d ar a ir b en ih (% ) Waktu (Jam) Trisula Tuk-tuk
(a) (b)                (c) (d) (e)
Gambar 2. Perkembangan struktur internal benih bawang merah pada beberapa periode imbibisi yaitu 12 jam (a), 18 jam (b), 24 jam (c), 30 jam (d), dan 36 jam (e), (perbesaran 20 kali).
Gambar 3. Radicle emergence pada periode waktu selama 120 jam dari empat lot benih bawang merah di atas media kertas suhu 20±2 o C
c. Pemunculan radikula/ radicle emergence (RE) Gambar  3  menunjukkan  pertambahan
RE  pada  setiap  interval  6  jam  pengamatan mulai dari 0 s.d 120 jam setelah pengecambahan. Pada grafik tersebut memberikan  informasi lag  period masing- masing lot benih. Lot T1 dan T2 yang memiliki vigor  dan  viabilitas  tinggi  menghasilkan lag period yang singkat yaitu 42 jam,  sebaliknya lot T3 dan T4 dengan vigor dan viabilitas yang rendah  menghasilkan lag  period yang  lebih panjang  yaitu  48  dan  60  jam.  Benih  yang memiliki  vigor  rendah  membutuhkan  waktu yang  lebih  lama  untuk  proses  pemunculan radikula. Lag  period yang  lebih  panjang dibutuhkan dalam proses perbaikan metabolisme,  DNA  dan  proses  enzimatik (Matthews dan Powell, 2011).
Pada lag  period benih  melakukan metabolisme  aktif  untuk  mempersiapkan pemunculan  radikula  yaitu:  sintesis  protein, pematangan  mitokondria,  aktivasi  enzim  dan perombakan  cadangan  makanan  (Copeland dan  Mcdonald  1998). Lag  period ditandai kenaikan  bobot  dan  kadar  air  yang  hampir stagnan atau stabil. Menurut Bradford (1990) proses  perkecambahan  benih  dimulai  dengan imbibisi benih yang  terdiri atas tiga fase yaitu: penyerapan air secara cepat, ditandai peningkatan kadar air yang signifikan (fase 1); laju  imbibisi  mulai  stagnan  dan  terjadi
peningkatan  kadar  air  walaupun  sedikit jumlahnya  (fase  2/ lag  period );  terjadi peningkatan kadar air  dan munculnya radikula (fase 3).
Percobaan 1 yang meliputi pengamatan aktivasi metabolisme, pengamatan  struktur  internal  benih  dan  RE menghasilkan  beberapa  informasi  yaitu: periode perendaman 12 s.d. 36 jam  merupakan bagian  dari lag  period yang  ditandai  mulai adanya  penyerapan  air  yang  mendekati stagnan,  pada  jam  ke-36  imbibisi  struktur internal  benih  sudah  semakin  membesar  dan radikula sudah mendekati ujung testa, dan lag period berakhir  sekitar  42  jam  setelah imbibisi,  yang  ditandai  pemunculan  radikula walaupun dalam jumlah yang  sedikit. Berdasarkan hasil tersebut, waktu uji tetrazolium  yang  dipilih  36  jam.  Waktu tersebut  berada  pada  akhir lag  period yang diharapkan kondisi jaringan benih sedang aktif melakukan  metabolisme  yang  maksimal  atau menyeluruh,  namun  pemunculan  radikula belum terjadi. Jaringan benih yang sudah aktif melakukan  metabolisme  akan  menghasilkan pewarnaan yang optimal.
Tahapan uji tetrazolium yaitu: (1) pre- treatment atau  persiapan  benih  (perendaman dan skarifikasi), (2) proses pewarnaan dengan perendaman  larutan  tetrazolium  1%,  dan  (3) evaluasi  pola  pewarnaan  (ISTA  2016). Berdasarkan  hasil  percobaan  1  waktu  uji
0 20 40 60 80 100 0 6 1 2 1 8 2 4 3 0 3 6 4 2 4 8 5 4 6 0 6 6 7 2 7 8 8 4 9 0 9 6 1 0 21 0 81 1 41 2 0 R E ( % ) Waktu (jam) T1 (DB=85%) T2 (DB=83%) T3 (DB=65%) T4 (DB=60%)
tetrazolium  ditetapkan  pada  jam  ke-36, sementara  pada  tahapan  ke-2  uji  tetrazolium masih  membutuhkan  waktu  selama  18  jam. Oleh  karena  itu,  tahapan pre-treatment (perendaman  benih  dengan  air)    akan dilakukan selama 18 jam.
Percobaan  2:  Penentuan  Kriteria  Benih Vigor Berdasarkan Pola Topografi Pewarnaan Tetrazolium Pada  percobaan  2  dilakukan  uji tetrazolium  (TZ)  pada  benih  botani  bawang
merah  dengan  mengamati  struktur  internal benih  yang  terwarnai  satu  persatu  dengan menggunakan  mikroskop  stereo.  Struktur internal  yang  diamati  adalah:  radikula, kotiledon,  haustorium,  dan  endosperma. Benih-benih yang diamati dikelompokan pada empat  kriteria: pola  vigor/ normal  kuat (NK), normal lemah (NL), abnormal, dan mati. Pola- pola yang masuk dalam empat kriteria tersebut dirangkum dalam Tabel 1 s.d. 4.
Tabel 1. Pola pewarnaan tetrazolium kriteria normal kuat/ vigor
No Gambar Pola Pewarnaan
Wilayah Struktur Internal Benih
No Gambar Pola Pewarnaan Wilayah Struktur Internal Benih Radikula  Kotiledon Haustorium  Endosperma Radikula  Kotiledon  Haustorium Endosperma 1 Merah merata Merah merata Merah merata Merah merata 3 Merah cerah Merah cerah Merah Merah 2 Merah merata Merah cerah Merah Merah muda merata 4 Merah cerah Merah cerah Merah cerah Merah Cerah

## Tabel 2. Pola pewarnaan tetrazolium kriteria normal lemah
No Gambar Pola Pewarnaan Wilayah Struktur Internal Benih No Gambar Pola Pewarnaan Wilayah Struktur Internal Benih Radikula  Kotiledon Haustorium  Endosperma Radikula  Kotiledon  Haustorium Endosperma 1 Merah muda Merah muda Merah muda Merah 4 Merah cerah Merah muda Merah muda Merah muda 2 Merah muda Merah muda Merah muda Merah muda 5 Merah muda Merah muda Merah cerah Merah 3 Merah Merah dengan bercak sedikit merah tua Merah Merah bercak putih Batasan yang digunakan dalam kriteria  pola  benih  pola  NK/  vigor  adalah seluruh  area  terwarnai  secara  merata  dengan warna  merah  sampai  merah  cerah,  struktur embrio  dan  endosperma  turgid/kokoh  tanpa lendir  dan  tidak  lunak  (Tabel  1).  Pola  NL  – seluruh  area  terwarnai  >  50%,  area  yang terwarnai bewarna merah, merah cerah, merah muda  secara  merata,  struktur  embrio  turgid, embrio berwarna merah dengan sedikit bercak merat tua, atau sedikit nekrosis, bercak hitam
cendawan  (Tabel  2).  Menurut  ISTA  (2003) seluruh struktur internal meliputi poros embrio dan endosperma terwarnai dengan tetrazolium pada  benih Allium  spp. dimasukkan  dalam kategori viable .  Batas  yang  diperbolehkan hanya  bagian  sedikit  dalam  bentuk  nekrosis pada  bagian  endosperma  tetapi  tidak  pada bagian penghubung tempat embrio menempel dengan endosperma.

## Tabel 3. Pola pewarnaan tetrazolium kriteria abnormal
No Gambar Pola Pewarnaan Wilayah Struktur Internal Benih No  Gambar Pola Pewarnaan Wilayah Struktur Internal Benih Radikula  Kotiledon  Haustorim  Endosperma Radikula Kotiledon Haustorium Endosperma 1 Merah muda Merah muda, bercak merah tua (warna tidak merata) Merah muda Merah muda  5 Merah Putih < 50% Merah Merah 2 Merah muda pucat Merah muda Merah muda Merah muda  6 Merah tua  Putih Putih Merah muda 3 Merah cerah Merah cerah Merah cerah <50% merah  7 Merah tua Merah Tua Merah Tua  Merah Tua 4 Merah Putih Putih
Merah

## Tabel 4. Pola pewarnaan tetrazolium kriteria mati
No Gambar Pola Pewarnaan Wilayah Struktur Internal Benih No Gambar Pola Pewarnaan Wilayah Struktur Internal Benih Radikula  Kotiledon Haustorium  Endosperma Radikula  Kotiledon  Haustorium Endosperma 1 Putih Putih dengan <50% merah muda Putih Merah 3 Putih dengan bercak merah Putih Putih 2 Putih <50% merah Merah Merah 4 Merah muda pucat Putih Putih
Batasan  kriteria  pola  abnormal  yaitu area yang terwarnai <50%, area yang terwarnai berwarna merah muda, merah tua, merah muda yang  pucat,  pada  bagian  kotiledon  tidak terwarnai atau terwarnai <50%, terdapat lendir atau jaringan lunak yang bersifat  minor tidak pada  bagian  area  radikula  dan  haustorium (Tabel  3).  Pola  mati  area  yang  terwarnai kurang dari 50%, warna merah muda pucat dan putih, struktur benih tidak turgid, lunak mudah hancur,  warna  tidak  merata  atau  seluruhnya tidak terwarnai, endosperma atau embrio yang seluruhnya  tidak  terwarnai  (Tabel  4).  Pada jaringan yang mati tidak terjadi proses reduksi garam  tetrazolium  sehingga  tidak  terbentuk endapan  formazan  yang  berwarna  merah. Jaringan  yang  tampak  akan  tetap  berwarna putih (Franca-Neto dan Krzyzanowski, 2019).
Kriteria-kriteria kelompok pola pewarnaan  yang  telah  ditetapkan  diharapkan menggambarkan  parameter  vigor  maupun viabilitas.  Kelompok  pola  normal  kuat
menggambarkan  vigor,  penjumlahan  pola normal  kuat  dan  lemah  menggambarkan viabilitas  potensial.  Parameter  vigor  dengan pendekatan fisiologis digambarkan pada tolok ukur  IV,  K CT ,  dan  BKKN,  sedangkan parameter  viabilitas  potensial  digambarkan oleh tolok ukur DB dan PTM.
Tabel  5  menunjukan  nilai  vigor  dan viabilitas  potensial  dari  pendekatan  fisiologis dan biokimiawi (pola pewarnaan  TZ). Empat lot  benih  botani  bawang  merah  memiliki tingkat  vigor  dan  viabilitas  yang  berbeda nyata.  Lot T1 dan T2 memiliki nilai vigor dan viabilitas tertinggi secara nyata dibandingkan lot T3 dan T4. Tolok ukur IV dan BKKN dapat membedakan  tiga  tingkat  vigor  benih, sementara  tolok  ukur  DB  dan  PTM  hanya dapat  membedakan  dua  tingkat  viabilitas. Pada pengujian pendekatan fisiologis ini tolok ukur  IV  dan  BKKN  merupakan  tolok  ukur yang  paling  sensitif  dibandingkan  tiga  tolok ukur lainnya. Hal ini sesuai dengan pernyataan
Marcos-Filho  (2015)  bahwa  uji  vigor  mampu menyediakan informasi mutu fisiologis lot-lot benih  yang  lebih  sensitif  dibandingkan  uji perkecambahan.
Pada  tolok  ukur  IV  yang  didasarkan pola NK hasil pewarnaan TZ lot benih, nilai IV dari  lot  T4  tidak  berbeda  nyata  dengan  T3. Akan  tetapi  nilai  IV  T4  tetap  lebih  rendah dibandingkan  T3,  sama  halnya  pada  IV  tolok ukur fisiologis. Pada nilai DB yang didasarkan pada pewarnaan TZ  menghasikan tiga tingkat lot. Nilai DB T3 sebesar 72.50% yang berbeda nyata  dengan  T4  sebesar  61.75%,  sementara pada  uji  fisiologis  nilai  DB  T3  sebesar  65%. Nilai  DB  yang  didasarkan  pola  NK  dan  NL cenderung  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan nilai uji fisiologis.
Pada  Tabel  6  menunjukkan  data persamaan  regresi  dan  korelasi  antara  uji
fisiologis  dan  uji  tetrazolium  berdasarkan persentase pola kriteria normal kuat (NK) dan persentase  N  yaitu  jumlah  dari  pola  kriteria NK  dan  NL.  Sementara  tolok  ukur  PTM dikorelasikan  dengan  pola  G  yaitu  persentase jumlah pola NK, NL, dan abnormal.
Hasil analisis pada Tabel 6 menunjukkan  adanya  hubungan  positif  antara uji  fisiologi  dengan  uji  tetrazolium.  Pola  NK memiliki nilai koefisien korelasi (r) yang lebih tinggi dibandingkan pola N. Nilai korelasi NK dengan  nilai  dari  tolok  ukur  IV  (r  =  0.882), KCT (r = 0.875), BKKN-h6 (r = 0.899), DB (r =  0.806)  dan  pada  uji  fisiologis.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  pola  pewarnaan  kriteria NK  pada  uji  tetrazolium  dapat  digunakan dapat  mengestimasi  vigor  dan  viabilitas potensial benih bawang merah.
Tabel  5.  Nilai  parameter  viabilitas  dan  vigor  pendekatan  fisiologis  dengan  hasil  pola  pewarnaan tetrazolium pada empat lot benih varietas Tuk-tuk No Lot Tolok Ukur Fisiologis Pola Pewarnaan TZ IV (%) K CT (%/etmal) BKKN-h6 (g) DB (%) PTM (%) IV (NK) DB (N) PTM (G) 1 T1 81.25 a 17.173 a 0.1068 a 85.00 a 90.25 a 74.75 a 87.25 a 95.75 a 2 T2 79.00 a 17.058 a 0.0807 b 83.25 a 89.50 a 72.25 a 83.00 a 94.75 a 3 T3 49.25 b 10.276 b 0.0399 c 65.00 b 79.00 b 50.00 b 72.50 b 84.50 b 4 T4 38.00 c 10.161 b 0.0244 d 60.00 b 76.25 b 41.50 b 61.75 c 80.00 b KK (%) 6.72 5.83 8.91 5.58 3.99 11.26 7.16 3.63
Keterangan:  angka-angka pada kolom yang diikuti dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji DMRT pada taraf 5%, IV=  indeks  vigor,  KCT=  kecepatan  tumbuh,  BKKN-h6=  berat  kering  kecambah  normal  hari  ke-6,  DB=  daya berkecambah,  PTM= potensi tumbuh maksimum, NK= normal kuat, N= jumlah NK dan NL, G= jumlah NK, NL dan abnormal, dan KK= koefisien keragaman. Angka-angka yang diikuti dengan huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan nilai tidak berbeda nyata pada uji DMRT taraf α = 5%

## Tabel  6.  Nilai  persamaan  regresi  parameter  pengujian  fisiologis  di  laboratorium  dengan  pola pewarnaan vigor
Keterangan : r = koefisien korelasi,  R 2 = koefisien determinasi IV=  indeks  vigor,  KCT= kecepatan tumbuh, BKKN-h6= berat kering kecambah normal hari ke-6, DB= daya berkecambah,  PTM= potensi tumbuh maksimum, NK= normal kuat, N= jumlah NK dan NL, G= jumlah NK, NL dan abnormal.
Parameter vigor/ viabilitas
Y=ax+b R R 2 P value IV (%) IV       =  -3.316+1.093NK 0.882 0.779 <0.0001 IV (%) IV       =  -52.694+1.505N 0.866 0.750 <0.0001 K CT (% etmal -1 ) K CT = 1.723+0.2NK 0.875 0.766 <0.0001 K CT (% etmal -1 ) K CT = -6.259+ 0.262N 0.826 0.682 <0.0001 BKKN-6h (g) BKKN-h6 = -0.0521+0.00193NK 0.899 0.808 <0.0001 BKKN-6h (g) BKKN-h6 = -0.1319+0.00256N 0.850 0.723 <0.0001 DB (%) DB            = 14.491+0.7700N 0.734 0.539 0.0012 DB (%) DB            = 37.234+0.605NK 0.806 0.650 0.0002 PTM (%) PTM          = 12.897+0.798G 0.846 0.715 <0.0001
Pola  N  merupakan  persentase  dari jumlah kecambah NK dan NL. Pola kecambah NL diprediksi menghasilkan kecambah dengan  daya  kemampuan  yang  cukup  untuk tumbuh  menjadi  tanaman  normal  akan  tetapi tidak vigor. Hal ini diduga adanya variasi yang tinggi pada evaluasi pola NL dengan abnormal karena  keduanya  memiliki  sifat  intermedit yang  berdekatan.  Hal  ini  dapat  terjadi kekeliruan  evaluasi  dalam  menentukan  pola normal lemah atau abnormal. Oleh  karena itu mengakibatkan  korelasi  pola  N  dengan  nilai daya  berkecambah  nilai  korelasinya  lebih rendah  dibandingkan  dengan  korelasi  antara parameter  vigor  maupun  viabilitas.  Nilai koefisien  korelasi  antara  parameter  vigor dengan NK lebih tinggi dibandingkan dengan nilai korelasi antara viabilitas dengan NK. Penelitian sebelumnya menyebutkan uji tetrazolium  dapat  dijadikan  sebagai  uji viabilitas  maupun  uji  vigor.  Pada  penelitian Flores et  al. (2011)  terdapat  empat  pola pewarnaan  benih  yang  viable  dan  dua  non- viable  benih  walnut  hitam  dan  koefisien korelasi yang tinggi antara hasil uji TZ dengan pengujian  perkecambahan  (r  =  0.98).    Pada penelitian Santos et al. (2007)  uji tetrazolium dapat  mengestimasi  viabilitas  maupun  vigor benih  tomat.  Pada  penelitian  Dina  (2007) diperoleh tiga pola topografi dapat mengestimasi vigor benih kedelai di laboratorium  dan  pertumbuhan  di  lapangan. Tiga pola tersebut juga memiliki kolerasi yang tinggi terhadap pertumbuhan maupun produksi

## KESIMPULAN
Metode pre-treatment dalam uji tetrazolium  telah  didapatkan  perendaman benih  dengan air  selama 18 jam, dilanjutkan pewarnaan  dengan  larutan  tetrazolium  1  % selama  18  jam.    Pola  pewarnaan  tetrazolium benih  botani  bawang  merah  yang  diperoleh yaitu: kecambah normal  kuat yang berjumlah 4  pola,  kecambah  normal  lemah  sejumlah  5 pola, kecambah abnormal sejumlah 7 pola, dan benih mati sejumlah 4 pola. Pola normal kuat memiliki  nilai  koefisien  korelasi  (r)  yang tinggi  dengan  parameter  uji  fisiologis  di laboratorium  yaitu:  indeks  vigor  (r  =  0.882), berat  kering  kecambah  normal  hari  ke-6  (r  = 0.899), dan kecepatan tumbuh (r = 0.875). Pola pewarnaan  kriteria  normal  kuat  pada  uji
tetrazolium dapat digunakan sebagai parameter vigor benih bawang merah.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada Badan Penyuluhan dan Pengembangan
Sumber Daya Manusia Pertanian, Kementerian  Pertanian  atas  dana  yang diberikan  untuk  penelitian  ini,  Balai  Besar Pengembangan Pengujian Mutu Benih Tanaman  Pangan  dan  Hortikultura  atas fasilitas  yang  disediakan,  dan  berbagai  pihak yang  terlibat  dalam  mendukung  kelancaran menjalankan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdullah,  M.  2017.  Pola  pewarnaan  pada  uji tetrazolium  untuk  deteksi  vigor  benih bawang merah ( Allium ascolanicum L.).
Skripsi.  Institut  Pertanian  Bogor. Bogor. 45 hal.
Bradford, K.J. 1990. A water relations analysis of seed germination rates. Plant Physiol. 94: 840-849. Doi: https://doi.org/10.1104/pp.94.2.840 Copeland,  L.O.,  M.B.  McDonald.  2001. Principles of Seed Science and Technology.  Fourth  Edition.  Kluwer
Academic Publishers, Massachuset.
Dias, D.C.F.D.S., M.C. Bhering, D. Tokuhisa, P.C. Hilst.  2006. Electrical conductivity test to evaluate onion seed vigor.  Revista Brasileira de Sementes. 28 (1): 154-162. Doi: http://dx.doi.org/10.1590/S0101- 31222006000100022
Dina, E. Widajati, B. Wirawan, S.  Ilyas. 2007. Pola  topografi  pewarnaan  tetrazolium sebagai  tolok  ukur  viabilitas  dan  vigor benih  kedelai  ( Glycine  max L.  Merr.) untuk  pendugaan  pertumbuhan  tanaman di lapangan. Bul. Agron. 35 (2): 88-95.
Elias,  S.G.,  L.O.  Copeland,  M.B.  McDonald,
R.Z.  Baalbaki.  2012.  Seed  Testing Principles and  Practices. Michigan  State University Press, East Lansing, Michigan. Flores,  P.C.,  D.  Poggi,  S.M.  Garcia,  N.F. Gariglio.  2011.  Topographic  tetrazolium testing of black walnut ( Juglans nigra L.) seeds. Seed Sci. & Technol. 39: 230-235. https://doi.org/10.15258/sst.2011.39.1.23
Franca-Neto,  J.B.,  F.C.  Krzyzanowski.  2019. Tetrazolium:  an  important  test  for physiological  seed  quality  evaluation. Journal of Seed Science. 41 (3): 359-366.
Doi: https://doi.org/10.1590/2317- 1545v41n3223104 [ISTA] International Seed Testing Association. 2003. ISTA Working Sheets on Tetrazolium  Testing Volume 1. Leist N, Kramer S, Jonitz A (eds.).
International  Seed  Testing  Association, Zurich. [ISTA] International Seed Testing Association. 2016. International Rules of Seed Testing. International Seed Testing Association, Zurich.
Madyasari,  I.,  C.  Budiman,  Syamsuddin,  D. Manohara,  S.  Ilyas.  2017.  Efektivitas seed  coating  dan  bioprimingdengan rizobakteri dalam mempertahankan viabilitas  benih  cabai  dan  rizobakteri selama  penyimpanan.  J.  Hort.  Indonesia 8(3): 192-202. Doi: https://doi.org/10.29244/jhi.8.3.192-202 Marcos-Filho, J. 2015. Seed  vigor testing: an overview  of  the  past,  present  and  future perspective.  Scientia  Agricola.  72  (4): 363-374.
Doi: https://doi.org/10.1590/0103-9016-2015- 0007
Matthews,  S.,  A.  Powell.  2011.  Towards automated  single  counts  of  radicle emergence to predict seed and seedling vigour. Seed Testing International. 142: 44-48.
Prayudi,  B.,  R.  Pangestuti,  A.C.  Kusumasari. 2015. Produksi umbi mini bawang merah asal true shallot seed. Dalam I. Djatnika, M.J.A.  Syah,  D.  Widiastoety,  M.P. Yufdy,  S.  Prabawati,  S.  Pratikno,  O. Lutfiyah  (eds.).  Inovasi  Hortikutura
Pengungkit Peningkatan Pendapatan Rakyat. IAARD Press, Jakarta. Rodo, A.B., J. Marcos-Filho. 2003. Accelerated aging and controlled deteroration  for  the  determination  of  the physiological  potential  of  onion  seeds. Scientia  Agricola  60  (3):  465-469.  Doi: http://dx.doi.org/10.1590/S0103- 90162003000300008
Sadjad,  S.,  E.  Muniarti,  S.  Ilyas.  1999. Parameter  Pengujian  Vigor  Benih  dari Komparatif  ke  Simulatif.  Grasindo,
Jakarta.
Santos,  M.A.O.,  A.D.L.C.  Novembre,  J. Marcos-Filho.  2007.  Tetrazolium  test  to assess  viability  and  vigour  of  tomato seeds. Seed Sci. & Technol. 35: 213-223.
Doi: https://doi.org/10.15258/sst.2007.35.1.19 Statistika  tanaman  sayuran  dan  buah-buahan semusim Indonesia. 2018. https://www.bps.go.id/publication/2019/
10/07/9c5dede09c805bc38302ea1c/statis tik-tanaman-sayuran-dan-buah---buahan- semusim-indonesia-2018.html.  [4  Mei 2019].