Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2015.26.1.80 Hasil Penelitian

## SELEKSI  BAKTERI  ASAM  LAKTAT  PENGHASIL  AMILASE  DAN  PULULANASE DAN  APLIKASINYA  PADA  FERMENTASI  TALAS
[Selection of Amylase and Pullulanase Producing Lactic Acid Bacteria and Its  Application on Taro Fermentation]
R. Haryo Bimo Setiarto 1) *, Betty Sri Laksmi Jenie 2) , Didah Nur Faridah 2) , Iwan Saskiawan 1) , dan Sulistiani 1)
1) Pusat Penelitian Biologi LIPI Jalan Raya Jakarta-Bogor Km 46, Cibinong, Bogor
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 18 Februari 2015 / Disetujui 12 Juni 2015

## ABSTRACT
The ob jective of this study were to select amylase and pululanase producing lactic acid b acteria (LAB) for  taro  fermentation  and  to  find  out  the  length  of  fermentation  time  that  will  produce  short  chain polysaccharide.  Fourty  one  LAB  isolates  were selected b ased on the  amylase and pululanase activity (U/mL). Three isolates of LAB i.e. Lactob acillus plantarum D-240, SU-LS67 and SU-LS59 demonstrated the highest enzyme activities among other strains. The amylase activity for those three isolates was 2.57, 2.70, and 2.50 U/mL, respectively and the pullulanase activity was 2.72, 2.88 and 2.91 U/m L, respectively. Genotypic  identification  was  conducted  for  strains  SU-LS59  and  SU-LS67.  Strains  identification  b y sequencing  the  gene  encoding  16S  rDNA  and  phylogenetic analysis  using Neighb or Joining method showed that b oth isolates were identical to Leuconostoc mesenteroides NBRC 100496T (AB681194 ) with a b ootstrap value of 100%. Either single or mixed culture of L. plantarum D-240 and L. mesenteroides SU- LS 67 were then used as starter in taro fermentation  and DP values of the taro starch were examined at various fermentation times (0, 6, 12, 18, 24 h).  The results showed that applying 2% mixed culture (10 8 CFU/mL)  of  L.  plantarum  D-240  and  L.  mesenteroides  SU-LS  67)  at  the  ratio of 1:1 as starter in taro fermentation was found more effective than the single cultures due to its ab ility to hydrolize and generate starch  with  DP  value  around  27  after  18  h  fermentation.  Starch  with  DP  values  b etween  19-29  was considered  suitab le  for  the  formation  of  resistant  starch  (RS)  during  autoclaving -cooling  cycles.  This finding might b e advantageous as preliminary treatment for the production of RS-rich taro flour through autoclaving-cooling process.
Keywords: amylase, degree of polymerization, taro fermentation, lactic acid b acteria, pullulanase

## ABSTRAK
1
Tujuan dari penelitian ini adalah memilih bakteri asam laktat (BAL) yang mampu memproduksi amilase dan  pululanase  untuk  fermentasi  talas  dan  mengetahui  lama  waktu  fermentasi untuk menghasilkan polisakarida rantai pendek. Sebanyak empat puluh satu isolat BAL dipilih be rdasarkan parameter aktivitas amilase dan pululanasenya (U/m L). Tiga isolat BAL yaitu Lactob acillus plantarum D-240, SU-LS67 dan SU-LS59 menunjukkan aktivitas enzim amilase dan pululanase tertinggi dibandingkan dengan strain isolat yang lainnya. Aktivitas enzim amilase untuk tiga isolat tersebut masing-masing adalah 2,57; 2,70; dan 2,50 U/mL sedangkan aktivitas enzim pululanase berturut-turut adalah 2,72; 2,88; dan 2,91 U/mL. Identifikasi genotipe  dilakukan  untuk  strain  SU-LS59  dan  SU-LS67.  Identifikasi  strain  dengan  sekuensing  gen pengkode 16S rDNA dan analisis filogenetik dengan metode Neighbor Joining menunjukkan bahwa kedua isolat  identik dengan Leuconostoc mesenteroides NBRC 100496T (AB681194) dengan nilai b ootstrap sebesar  100%.  Baik  kultur  tunggal  maupun  kultur  campuran  dari L.  plantarum D-240 dan L. Mesen- teroides SU-LS 67 kemudian digunakan sebagai starter untuk fermentasi talas dengan variasi waktu (0, 6, 12, 18, 24 jam). Pada setiap interval waktu, nilai DP dari pati talas dianalisis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aplikasi 2% kultur campuran (10 8 CFU/mL) L. plantarum D-240 dan L. mesenteroides SU-LS 67 pada rasio 1:1 sebagai starter fermentasi talas  diketahui lebih efektif daripada kultur tunggal karena ke- mampuannya untuk menghidrolisis dan menghasilkan pati dengan nilai DP sekitar 27 setelah 18 jam fermentasi. Pati talas dengan nilai DP antara 19-29 sesuai untuk pembentukan pati resisten (RS) selama proses pemanasan bertekanan-pendinginan. Penemuan ini mungkin menguntungkan sebagai perlakuan awal untuk produksi tepung talas kaya RS melalui siklus proses  pemanasan bertekanan-pendinginan.
Kata kunci: amilase, bakteri asam laktat, derajat polimerisasi, fermentasi talas, pululanase
*Penulis Korespondensi: E-Mail:  haryobimo42@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Bakteri  asam  laktat  (BAL)  merupakan  kelom- pok  bakteri  gram  positif,  katalase  negatif  yang  dapat memproduksi  asam  laktat  dengan  cara  memfer- mentasi  karbohidrat.  BAL  yang  memiliki  kemampuan memanfaatkan  pati  sebagai  substrat  dikenal  sebagai BAL  penghasil  amilase  dan  pululanase  (Moradi et al., 2014).  Enzim  alfa  amilase  (EC  3.2.1.1)  adalah enzim  yang  menghidrolisis  ikatan  linier α-1,4  gliko- sidik  pada  amilosa  secara  acak  sehingga  meng- hasilkan  campuran  dekstrin,  maltosa,  dan  glukosa (Alariya et  al .,  2013;  Bhanwar  dan  Ganguli,  2014). Sementara  itu  enzim  pululanase  (amilopektin  6 – glucanohydrolase,  EC  3.2.1.41)  adalah  eksoenzim yang  menghidrolisis  ikatan  percabangan α-1.6  gliko- sidik  penghubung  amilopektin  untuk  menghasilkan oligosakarida  rantai  pendek  (Asha et al ., 2013).
BAL  yang  menghasilkan  dua  molekul  asam laktat  dari  fermentasi  glukosa  disebut  BAL  homo- fermentatif,  sedangkan  BAL  yang  menghasilkan satu  molekul  asam  laktat  dan  satu  molekul  etanol serta  satu  molekul  karbon  dioksida  disebut  BAL heterofermentatif  (Reddy et  al .,  2008).  Beberapa jenis  BAL  seperti Lactobacillus  plantarum , L.  fer- mentum,  L.  manihotivorans , L.  amylophillus,  L.  amy- lovorus,  L.  amilolyticus,  Leuconostoc  cellobiosus,  L. acidophillus,  Leuconostoc sp., Streptococcus  bovis dan Streptococcus  macedonicus telah  dilaporkan mampu  menghasilkan  enzim  amilase  dan  pulu- lanase  untuk  mendegradasi  pati  (Reddy et  al ., 2008; Alariya et  al .,  2013;  Pokhrel et  al. ,  2013;  Moradi et al ., 2014).
Talas  Bogor  sebagai  komoditas  lokal  tersedia dalam  jumlah  besar  yaitu  mencapai  68.000  ton  pada tahun  2012  sehingga  berpotensi  dikembangkan sebagai  pangan  fungsional  melalui  produksi  tepung talas  kaya  pati  resisten  (RS)  (Rahmawati et  al ., 2012).  Talas  Bogor  varietas  pandan  dipilih  sebagai bahan  baku  pada  penelitian  ini  karena  memiliki kandungan  amilosa  tertinggi  yaitu  25,78%  jika dibandingkan  dengan  varietas  lampung  (23,12%) dan  varietas  sutera  (24,56%)  (Rahmawati et  al ., 2012).  Amilase  dan  pululunase  bersama-sama menghidrolisis  pati  talas  sehingga  dihasilkan  poli- sakarida  rantai  pendek  dengan  nilai  Derajat  Poli- merisasi  (DP)  yang  rendah  (Reddy et  al .,  2008).  Pe- manfaatan  kedua  enzim  tersebut  dengan  melakukan optimasi  waktu  fermentasi  dapat  menghasilkan polisakarida  rantai  pendek  dengan  nilai  DP  sebesar 19-29  yang  memenuhi  syarat  untuk  pembentukan RS  (Zaragoza et  al., 2010).  Pemilihan  polisakarida rantai  pendek  dengan  nilai  DP  19-29  sebagai  bahan baku  pembentukan  RS  karena  sifatnya  yang  mudah mengalami  retrogradasi  setelah  diberi  perlakuan beberapa siklus pemanasan bertekanan-pen- dinginan  (Faridah et  al .,  2013).  Sementara  itu
Sajilata et  al. (2006)  melaporkan  bahwa  RS  dapat dibentuk  dari  polisakarida  rantai  pendek  dengan  nilai DP  kurang  dari  35.  Sebaliknya  oligosakarida  dengan nilai  DP  kurang  dari  10  menurunkan  kadar  RS karena  pembentukan  gula  pereduksi  yang  meng- hambat  terjadinya  retrogradasi  pati  (Sajilata et  al ., 2006;  Faridah et al ., 2013).
Sebanyak  41  strain  isolat  BAL  berhasil diisolasi  dari  sumber  nira  siwalan  ( Borassus  flabe- llifer L.)  dan  dari  sayur  asin.  Sulistiani et  al. (2014) melaporkan  bahwa  isolat  BAL  yang  diisolasi  dari sayur  asin  berhasil  diidentifikasi  melalui  sekuensing gen  pengkode  16S  rDNA  bakteri  dengan  metode Polymerase Chain Reactions (PCR)  dan  ter- identifikasi  sebagai L.  plantarum D-240.  Seluruh strain  isolat  BAL  tersebut  belum  diidentifikasi  dan kemampuannya  belum  diketahui  dalam  menghasil- kan  enzim  amilase  dan  pululanase,  kecuali  strain isolat Lactobacillus  plantarum D-240.  Identifikasi BAL  dapat  dilakukan  berdasarkan  sifat  fenotipik  dan genotipik.  Identifikasi  fenotipik  didasarkan  pada  hasil pengamatan  morfologi  koloni,  pengamatan  mikro- skopis  (pewarnaan  Gram),  uji  fisiologis,  metabolik (biokimia)  atau  kemotaksonomi  (Ammor et  al. , 2005).  Identifikasi  genotipik  dilakukan  dengan  meng- gunakan  metode  molekuler  melalui  sekuensing  gen pengkode  16S  rRNA  bakteri  dengan  metode  PCR (Nikolova et  al .,  2009).  Pada  penelitian  ini  dilakukan identifikasi  genotipik  isolat  BAL  unggul  penghasil amilase  dan  pululanase  dengan  metode  molekuler dan  analisis  filogenetik  metode neighbor  joining menggunakan program Molecular Evolutionary
Genetic  Analysis (MEGA)  versi  5.2  dengan Multiple Sequence Comparison by
Log-Expectation (MUSCLE)  (Tamura et  al .,  2011).  Penelitian  ini bertujuan  melakukan  seleksi  isolat  BAL  yang  me- miliki  kemampuan  menghasilkan  aktivitas  amilase dan  pululanase  tinggi,  menentukan  jenis  kultur  BAL terbaik  (kultur  tunggal  atau  campuran)  sebagai starter  dan  waktu  fermentasi  terbaik  yang  mampu menghasilkan  polisakarida  rantai  pendek  (DP  19-29) selama  fermentasi  talas.

## BAHAN  DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  41  strain  BAL  (koleksi  Pusat  Penelitian Biologi  LIPI)  yang  terdiri  dari  40  strain  isolat  BAL asal  nira  siwalan  ( Borassus  flabellifer L.)  dari  kota Kupang,  Nusa  Tenggara  Timur,  dan  satu  strain Lactobacillus  plantarum D-240  asal  sayur  asin (Sulistiani et  al. , 2014)  dari  Bogor,  Jawa  Barat. Sebagai  sumber  pati  digunakan  talas  Bogor  varietas pandan  dengan  umur  panen  8  bulan  yang  diperoleh dari  petani  di Kecamatan  Cijeruk,  Bogor.
Persiapan Kultur BAL  (Sujaya et al. , 2008) Sampel  isolat  murni  BAL ditumbuhkan  dalam erlenmeyer  100  mL  dengan  menginokulasikan  kultur murni  BAL  tersebut  masing-masing  ke  dalam  50  mL Mann  Rogose  and  Sharp  Broth  (MRSB)  (Sigma- Aldrich,  USA).  Selanjutnya  kultur  diinkubasi  dalam inkubator  (Isuzu,  Japan)  pada  suhu  37°C  selama  24 jam.

## Produksi  ekstrak  kasar  enzim  amilase  dan pululanase
Produksi  ekstrak  kasar  enzim  amilase  dilaku- kan  dengan  menumbuhkan  isolat  BAL  (10 8 CFU/mL, 2%)  ke  dalam  25  ml  media  MRSB  dengan  0,5% (b/v)  amilosa  (Sigma-Aldrich,  USA)  sebagai  sumber karbon  utama  selama  24  jam  pada  suhu  37°C. Untuk  produksi  ekstrak  kasar  enzim  pululanase, sebanyak  2%  kultur  BAL  (10 8 CFU/mL)  ditumbuhkan dalam  25  mL  media  MRSB  dengan  0,5%  (b/v) amilopektin  (Sigma-Aldrich,  USA)  sebagai  sumber karbon  utama  selama  24  jam  pada  suhu  37°C. Untuk  menganalisis  kemampuan  pertumbuhan  isolat BAL  selama  24  jam  dilakukan  analisis plate  count dalam  media  MRSA  sehingga  dapat  diketahui  jum- lah  total  populasi  BAL.  Ekstrak  kasar  amilase  dan pululanase  ekstraseluler  dari  isolat  BAL  dalam media  MRSB  diperoleh  dengan  melakukan  sentry- fugasi  (9,000  rpm,  10  menit,  4°C)  dengan High Speed  Refrigerated  Centrifuge Type  6500  (Kubota, Japan).  Ekstrak  kasar  enzim  amilase  dan  pulu- lanase  berada  dalam  supernatan,  sementara  bio- massa  sel  BAL  terendap  menjadi pellet .  Supernatan ekstrak  kasar  enzim  amilase  dan  pululanase selanjutnya digunakan  dalam  analisis  aktivitas enzim  amilase  (Moradi et  al. ,  2014)  dan  pululanase (Asha et al ., 2013).
Identifikasi BAL  terpilih (Nikolova et al. , 2009) BAL  dengan  aktivitas  amilase  dan  pulunase serta  jumlah  total  koloni  BAL  (Log  CFU/mL)  tertinggi diidentifikasi  secara  molekuler  dengan  mengamplifi- kasi  daerah  16S  rDNA.  Amplifikasi  PCR  dilakukan dengan  volume  sampel  per  reaksi  sebesar  30  L menggunakan  primer  27F  (5'-AGAGTTTGATCCT- GGCTCAG- 3’)  dan  1492R  (5'-GGTTACCTTGTT- ACGACTT- 3’)  (Macrogene  Inc,  South  Korea). Primer  27F  mempunyai  posisi  8-27  dan  primer 1492R  mempunyai  posisi  1510-1492  pada  kromo- som E.  coli .  Komposisi  reaksi  PCR  terdiri  atas:  15  L  GoTag  Green  master  mix  2x  (Macrogene  Inc, South  Korea),  2,4  L  primer  27F  10  M  dan  2,4  L primer  1492R  10  M,  9,2  L  NFW  (Macrogene  Inc, South  Korea)  dan  1  L  (10-100  ng)  DNA template (Macrogene Inc, South Korea). Reaksi PCR menggunakan  Thermal  Cyclers  PCR  (Bio-Rad,  UK) dengan  pradenaturasi  pertama  suhu  94°C  selama 90  detik,  dilanjutkan  dengan  30  siklus  yang  terdiri
dari  denaturasi  suhu  95°C  selama  30  detik,  penem- pelan  primer  suhu  50°C  selama  30  detik  dan  eks- tensi  suhu  72°C  selama  90  detik.  Setelah  30  siklus selesai,  diikuti  fase  ekstensi  pada  suhu  72°C selama 5  menit  dan  pendinginan  pada  suhu  4°C  selama  20 menit.
Hasil  amplifikasi  selanjutnya  dielektroforesis dalam  agarosa  (Sigma-Aldrich,  USA)  1%  selama  25 menit  pada  100  V.  Gel  hasil  elektroforesis  direndam dalam  larutan  ethidium  bromide  (Sigma-Aldrich, USA)  selama  15  menit.  Hasil  amplifikasi  DNA  di- dokumentasi menggunakan gel documentation system (Bio-Rad,  UK).  Ukuran  pita  DNA  hasil amplifikasi  PCR  diukur  menggunakan  DNA ladder 1 kb  plus  (Qiagen,  USA).  Purifikasi, cycle  sequencing, purifikasi  produk cycle  sequencing ,  dan sequencing produk  PCR  16S  rDNA  dilakukan  di  laboratorium Macrogene  Inc.,  Korea  selatan.  Semua  sekuensing produk  PCR  16S  rDNA  menggunakan  27F  (Macro- gene  Inc,  South  Korea).  Sekuen  DNA  dibandingkan dengan database pada GenBank menggunakan Basic  Local  Alignment  Search  Tool (BLAST) algorithm.

## Penentuan  jenis  starter  BAL  dan  waktu  fermen- tasi
Talas  Bogor  diiris  tipis  dengan  ketebalan  5 mm,  selanjutnya  irisan  talas  direndam  dalam  larutan 1%  NaCl  (Merck,  Germany)  menggunakan  rasio talas:larutan  sebesar  3:4  selama  1  jam  untuk  meng- hilangkan  kandungan  kristal  oksalat.  Setelah  proses perendaman,  irisan  talas  dipisahkan,  ditiriskan  lalu dicuci  beberapa  kali  dengan  akuades  steril.  Pro- sedur  penentuan  jenis  kultur  tunggal  atau  campuran BAL  dan  waktu  fermentasi  talas  terbaik  dilakukan sebagai  berikut:  sebanyak  20  g  irisan  talas  di- fermentasi  dalam  200  mL  akuades  steril  yang  telah diinokulasi  dengan  kultur  tunggal L.  Mesenteroides SU-LS  67,  kultur  tunggal L.  plantarum D-240,  dan kultur  campuran L.  mesenteroides SU-LS  67: L. plantarum D-240  (1:1)  masing-masing  sebanyak  2% dengan konsentrasi 10 8 CFU/mL. Selanjutnya semua  perlakuan  sampel  talas  diinkubasi  pada  suhu ruang  selama  0,  6,  12,  18,  dan  24  jam.  Sampel irisan  talas  diambil  sebanyak  1  g  pada  setiap interval  waktu  fermentasi  dan  dihancurkan  dengan blender  (Philips,  Netherlands)  sampai  terbentuk suspensi  untuk  dianalisis  jumlah  total  koloni  BAL, nilai  pH,  dan  DP.  Setiap  perlakuan  tersebut  di- lakukan  triplo.  Proses  fermentasi  talas  dihentikan jika  nilai  DP  telah  mencapai  kisaran  antara  19-29. Rancangan percobaan  untuk  penentuan  waktu fermentasi  terbaik  irisan  talas  oleh  kultur  tunggal maupun  kultur  campuran  adalah  rancangan  acak lengkap  (RAL)  dengan  lama  fermentasi  sebagai variable  dan  nilai  rata-rata  DP  sebagai  respon. Pengolahan  data  dilakukan  dengan  Analisis  ragam
(ANOVA)  menggunakan  perangkat  lunak  SPSS 17.0.  Jika  data  berbeda  signifikan,  maka  dilanjutkan dengan  Uji  Beda  Nyata  Terkecil  (BNT)  pada  level 95% (α=0,05).
Analisis  aktivitas  ekstrak  kasar  enzim  amilase (Moradi et al ., 2014) Sebanyak  250  L  sampel  ekstrak  kasar  ami- lase  dan  250  L  larutan  substrat  1%  (b/v)  amilosa dicampurkan,  lalu  dihomogenkan  dengan  meng- gunakan  vortex  dan  diinkubasi  selama  15  menit. Setelah  masa  inkubasi  ditambahkan  sebanyak  500  L  3,5-Di  Nitro  Salisilic  Acid  (DNS)  (Sigma-Aldrich, USA),  lalu  dipanaskan  selama  5  menit  dalam  pe- nangas  air  bersuhu  100°C  untuk  menghentikan reaksi  enzimatis  dan  agar  DNS  bercampur  dengan produk  glukosa  yang  terbentuk.  Pengenceran  di- lakukan  dengan  menambahkan  4  mL  akuades, kemudian  dihomogenkan  dengan  vortex.  Selanjut- nya  absorbansi  setiap  larutan  sampel  diukur  dengan spektrofotometer  UV-Vis  1700  (Shimadzu,  Japan) pada  λ=540  nm.  Blangko  sampel  dan  blangko substrat  dibuat  sebagai  faktor  koreksi  kadar  glukosa sampel  terhadap  nilai  aktivitas  enzim  amilase. Blangko  sampel  adalah  ekstrak  kasar  enzim  amilase ekstraseluler dari masing-masing isolat tanpa substrat  amilosa.  Blanko  substrat  adalah  larutan substrat  1%  (b/v)  amilosa  tanpa  ekstrak  kasar amilase  ekstraseluler.  Nilai  absorbansi  yang  di- peroleh  diplotkan  pada  kurva  standar  glukosa  untuk mengetahui konsentrasi produk glukosa pada sampel.  Satu  Unit  aktivitas  enzim  amilase  dinyata- kan  sebagai  jumlah  produk  glukosa (μ/mol)  hasil hidrolisis  enzim  amilase  per  satu  menit  pada  kondisi pengujian.
Analisis  aktivitas  ekstrak  kasar  enzim  pulula - nase (Asha et al ., 2013)
Sebanyak  250  L  sampel  ekstrak  kasar enzim pululanase  dan  250  L  larutan  substrat  1%  (b/v) amilopektin dicampurkan, lalu dihomogenkan dengan  menggunakan  vortex  dan  diinkubasi  selama 15  menit.  Setelah  masa  inkubasi  ditambahkan  se- banyak  500  L  DNS,  lalu  dipanaskan  selama  5 menit  dalam  penangas  air  pada  suhu  100°C.  Pe- ngenceran  dilakukan  dengan  menambahkan  4  mL akuades,  kemudian  dihomogenkan  dengan  meng- gunakan  vortex.  Selanjutnya  absorbansi  setiap larutan  sampel  diukur  dengan  spektrofotometer  UV- Vis  1700  pada  λ=540  nm.  Blangko  sampel  dan blangko  substrat  dibuat  sebagai  faktor  koreksi  kadar glukosa  sampel  terhadap  nilai  aktivitas  enzim  pulu- lanase.  Blangko  sampel  adalah  ekstrak  kasar  enzim pululanase  ekstraseluler  dari  masing-masing  isolat tanpa  substrat  amilopektin.  Sementara  blangko substrat  adalah  larutan  substrat  amilopektin  1%  (b/v)
tanpa  ekstrak  kasar  enzim  pululanase  ekstraseluler. Nilai  absorbansi  yang  diperoleh  diplotkan  pada kurva  standar  glukosa  untuk  mengetahui  konsen- trasi  produk  glukosa  pada  sampel.  Satu  Unit aktivitas  enzim  pululanase  dinyatakan  sebagai jumlah  produk  glukosa (μmol)  hasil  hidrolisis  enzim pululanase  per  satu menit pada  kondisi pengujian.

## Analisis  derajat polimerisasi (DP) irisan talas
Sampel  suspensi  talas  dipanaskan  pada  suhu 100°C  selama  15  menit  agar  kandungan  gula  dalam suspensi  terlarut  secara  homogen.  Nilai  rata-rata  DP dihitung  berdasarkan  persamaan  berikut:
Kadar total gula Kadar gula pereduksi
Analisis  kadar  gula  total  diukur  dengan metode  fenol-sulfat  (Dubois et  al .,  1956).  Sebanyak 0,5  mL  sampel  suspensi  talas  bebas  lemak  dan gula-gula  sederhana  ditambah  0,5  mL  fenol  5%  (b/v) (Merck,  Germany)  dan  2,5  mL  asam  sulfat  pekat (Merck,  Germany).  Selanjutnya  sampel  dihomogen- kan  dengan  menggunakan  vortex,  diinkubasi  pada suhu  ruang  selama  10  menit,  dan  dipanaskan  dalam penangas  air  pada  suhu  40°C  selama  20  menit. Sampel  lalu  diencerkan  dengan  penambahan  12  mL akuades  dan  diukur  absorbansinya  dengan  spektro- fotometer  UV- Vis  1700  pada λ=490 nm. Hasil absor- bansi  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  persamaan kurva  standar  glukosa 0-100  mM.
Gula  pereduksi  dianalisis  menggunakan  me- tode  (Miller,  1959)  sebagai  berikut.  Sebanyak  250 μL  sampel  suspensi  talas  bebas  lemak  dan  gula sederhana  ditambah  dengan  500 μL  larutan  reagen DNS  kemudian  dihomogenkan  dengan  mengguna- kan  vortex.  Setelah  itu,  sampel  dipanaskan  pada suhu  100°C  selama  15  menit  sampai  berubah  warna menjadi  merah  kecoklatan.  Selanjutnya  sampel  di- encerkan  dengan  akuades  sebanyak  4  mL  dan diukur  absorbansinya  dengan  spektrofotometer  UV- Vis 1700 pada λ=540 nm. Hasil absorbansi dimasuk- kan  ke  dalam  persamaan  kurva  standar  glukosa  0-5 mM.
Analisis  jumlah  total  koloni  BAL  (Kim et  al., 2008)
Jumlah  total  koloni  BAL  (CFU/mL)  diukur pada  setiap  interval  waktu  fermentasi  talas  dengan metode  tuang.  Sebanyak  1  mL  suspensi  talas  yang telah  dihancurkan  ditambah  dengan  9  mL  akuades steril,  dan  dilakukan  pengenceran  berseri  yaitu  10 5 , 10 6 ,  dan  10 7 .  Tiga  seri  hasil  pengenceran  dipipet sebanyak  1  mL  dan  diinokulasi  pada  media  MRSA, kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  2 hari.

## Analisis  statistik
Pengolahan  data  dilakukan  dengan  meng- gunakan  Analisis  ragam  (ANOVA).  Jika  berbeda signifikan  maka  dilanjutkan  dengan  Uji  Beda  Nyata Terkecil  (BNT)  pada  level  95%  (α=0,05).  Data diolah menggunakan  perangkat  lunak  SPSS 17.0.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Seleksi  bakteri  asam  laktat  penghasil  enzim amilase dan pululanase
Pada  penelitian  ini  seleksi  terhadap  41  isolat BAL  dilakukan  dengan  menggunakan  tiga  parameter yaitu  aktivitas  amilase  dan  pululanase  serta  jumlah total  koloni  BAL  yang  ditumbuhkan  selama  24  jam. Aktivitas  amilase  dan  pululanase  yang  tinggi  meng- indikasikan  potensi  isolat  BAL  dalam  menghidrolisis substrat  amilosa  maupun  amilopektin.  Hasil  hidro- lisis  dari  kedua  enzim  tersebut  pada  substrat  pati menghasilkan  beberapa  oligosakarida  rantai  pen- dek,  maltosa,  maltotriosa  dan monomer α-D-glukosa (Reddy et  al. ,  2008).  Jumlah  total  koloni  BAL  yang tinggi  dapat  mendukung  kemampuan  BAL  dalam menghasilkan  aktivitas  amilase  dan  pululanase  yang tinggi.  Semakin  tinggi  nilai  logaritmik  pertumbuhan menunjukkan  isolat  BAL  tersebut  semakin  cepat  dan mudah  tumbuh  pada  substrat pati.
Aktivitas  amilase  dari  41  isolat  BAL  tersebut berada  pada  kisaran  1,24 –2,70  Unit/mL,  sedangkan aktivitas  pululanase  pada  kisaran  0,69 –2,91 unit/mL. Jumlah  total  koloni  BAL  dari  41  isolat  BAL  relatif tinggi  yaitu  berada  pada  kisaran  6,18 –8,43  (Tabel 1).  Berdasarkan  aktivitas  amilase  dan  pululanase serta  jumlah  total  koloni  BAL  tertinggi,  maka  tiga isolat  BAL  terpilih  untuk  digunakan  pada  penelitian selanjutnya  yaitu  isolat  SU-LS  59  dan  SU-LS  67 serta L.  plantarum D-240  (Tabel  1).  Berdasarkan hasil  ANOVA  dan  uji  BNT  ( P <0,05)  diketahui  bahwa baik  aktivitas  amilase  (2,50-2,70  U/mL),  pululanase (2,72-2,91  U/mL)  maupun  jumlah  total  koloni  BAL (8,04-8,29  Log  CFU/mL)  dari  ketiga  isolat  BAL  ter- sebut  tidak  berbeda  nyata.  Sebanyak  tujuh  Isolat BAL  lain  (SU-LS  38,  SU-LS42,  SU-LS57,  SU-LS  61, SU-LS62, SU-LS63, SU-LS72) juga memiliki aktivitas  amilase  dan  pululanase  yang  tinggi  akan tetapi  tidak  dipilih  karena  rendahnya  jumlah  total koloni  BAL  dan  memerlukan  waktu  yang  lebih  lama untuk  tumbuh  (48  jam).  Vishnu et  al. (2006) melaporkan  bahwa  kultur Lactobacillus  amylophilus GV6  mampu  menghidrolisis  substrat  pati  dengan menghasilkan  ekstrak  kasar  enzim  amilase  dan pululanase  masing-masing  dengan  aktivitas  0,59 U/mL  dan  0,34  U/mL.  Sementara  itu  Bhanwar  dan Ganguli  (2014)  melaporkan  bahwa Lactobacillus lactis yang diisolasi dari pikel ubi mampu memproduksi  ekstrak  kasar  enzim  α-amilase dengan  aktivitas  2,54  U/mL.
Tabel  1. Aktivitas  enzim  amilase,  pululanase,  dan total  koloni  BAL  pada  substrat  amilosa maupun  amilopektin  selama  24 jam
Jenis Isolat Total Koloni BAL (Log CFU/mL) Aktivitas Enzim Amilase (Unit/mL) Aktivitas Enzim Pululanase (Unit/mL) SU-LS50 6,40 a 1,24±0,018 a 0,99±0,015 a SU-LS45 8,33 b 1,75±0,028 b 1,06±0,012 a SU-LS42 6,54 a 2,18±0,017 c 2,50±0,024 b SU-LS36 8,38 b 1,85±0,020 b 0,72±0,016 c SU-LS37 SU-LS48 6,18 a 8,22 b 1,41±0,010 a 1,95±0,015 d 0,83±0,022 c 2,57±0,013 b SU-LS43 6,17 a 1,99±0,018 d 0,93±0,019 a SU-LS49 7,48 c 1,83±0,045 b 2,53±0,01 b SU-LS39 7,86 c 1,37±0,018 a 2,56±0,011 b SU-LS61 8,11 b 2,25±0,022 c 2,52±0,011 b SU-LS58 SU-LS64 7,90 c 8,15 b 1,66±0,008 b 1,43±0,008 a 0,82±0,015 c 2,47±0,011 b SU-LS70 8,31 b 2,33±0,008 c 0,88±0,013 c SU-LS52 SU-LS57 8,43 b 7,46 c 2,38±0,010 c 2,11±0,022 d 1,09±0,012 a 2,60±0,018 d SU-LS71 7,69 c 2,10±0,013 d 0,90±0,008 a SU-LS69 8,31 b 2,10±0,013 d 0,98±0,008 a SU-LS60 SU-LS68 SU-LS41 8,26 b 8,20 b 7,08 c 1,66±0,006 b 1,72±0,012 b 1,90±0,014 d 2,58±0,008 b 0,69±0,021 c 0,78±0,008 c SU-LS40 6,78 a 1,90±0,016 d 0,91±0,008 a SU-LS63 7,55 c 2,27±0,020 c 2,68±0,007 d SU-LS 65 SU-LS 67 SU-LS75 8,09 b 8,04 b 7,89 c 2,11±0,007 d 2,50±0,016 e 1,76±0,012 b 1,36±0,008 e 2,91±0,015 f 2,61±0,020 d SU-LS74 6,78 a 2,31±0,028 c 1,21±0,007 e SU-LS66 8,12 b 1,84±0,031 b 0,90±0,007 a SU-LS62 7,02 b 2,37±0,029 c 2,74±0,011 f SU-LS59 8,11 b 2,70±0,021 e 2,88±0,007 f SU-LS38 SU-LS44 6,40 a 8,41 b 2,10±0,040 d 1,89±0,020 d 2,24±0,007 g 0,92±0,011 a SU-LS47 6,18 a 2,15±0,021 c 1,90±0,010 g SU-LS46 8,36 b 1,71±0,015 b 0,89±0,007 a SU-LS54 7,06 c 2,41±0,022 c 0,94±0,013 a SU-LS72 SU-LS53 7,83 c 8,43 b 2,08±0,011 d 1,45±0,012 a 2,65±0,007 d 1,07±0,018 a SU-LS55 8,31 b 2,60±0,012 e 1,19±0,017 e SU-LS51 SU-LS73 8,19 b 7,68 c 1,00±0,018 f 1,39±0,033 a 1,04±0,011 a 0,89±0,011 a SU-LS56 8,23 b 2,11±0,015 d 1,13±0,011 a L. plantarum D240 8,29 b 2,57±0,021 e 2,72±0,016 f
Keterangan: Huruf yang sama pada kolom menunjukkan nilai  yang  tidak  berbeda  nyata (α=5%),  setelah  di- lakukan uji statistik dengan uji BNT pada SPSS 17.0
Ketiga  isolat  BAL  terpilih  dalam  penelitian  ini memiliki  aktivitas  amilase  dan  pululanase  yang  lebih tinggi jika dibandingkan dengan Lactobacillus isolat  BAL  unggulan  tersebut,  ada  satu  isolat  yang sudah  teridentifikasi  yaitu L.  plantarum D-240. amylophilus GV6  dan Lactobacillus  lactis. Dari  ketiga
Sementara  itu  dua  isolat  lainnya  yaitu  SU-LS  59  dan SU-LS  67  masih  belum  diidentifikasi,  sehingga kedua  isolat  ini  perlu  diidentifikasi  pada  tahapan selanjutnya.

## Identifikasi  BAL terpilih penghasil enzim amilase dan pululanase
Identifikasi  dilakukan  terhadap  isolat  SU-LS 59  dan  SU-LS  67  yang  belum  diketahui  strain  jenis spesiesnya.  Hasil  amplifikasi  PCR  berupa  sekuen 16S  rDNA  bakteri  dielektroforesis  dalam  media  1% agarose.  Produk  PCR  sampel  SU-LS  59  dan  SU-LS 67  divisualisasi  menggunakan gel  documentation system. Panjang  molekul  daerah  16S  rDNA  hasil amplifikasi  menggunakan  primer  27F  dan  1492R berukuran  1500  bp,  seperti  ditampilkan  dalam Gambar  1. Sekuen  16S  rDNA  strain  BAL  SU-LS59 dengan  panjang  976  bp  dibandingkan  dengan GenBank   database NCBI menggunakan  BLAST algorithm  menunjukkan  homologi  99%  terhadap L. mesenteroides qz-504.  Berdasarkan  hasil  tersebut BAL  strain  SU-LS59  teridentifikasi  sebagai L. mesenteroides .  Klasifikasi  BAL  strain  SU-LS59 sebagai berikut kingdom: Bacteria, Filum: Firmicutes ,  Kelas: Bacilli ,  Ordo: Lactobacillales , Famili: Leuconostocaceae ,  Genus: Leuconostoc , Spesies: L. mesenteroides SU-LS59 . Analisis  filogenetik  sekuen  16S  rDNA  strain SU-LS59  dan  SU-LS67  ditampilkan  pada  Gambar  2 dilakukan  menggunakan  program  MEGA  versi  5.2 dengan  MUSCLE  (Tamura et  al., 2011).  Konstruksi pohon  filogenetik  berdasarkan  jarak  kekerabatan genetik  dengan  metode neighbor  joining (Saitou  dan Nei,  1987).  Parameter-parameter  yang  digunakan yaitu:  model  substitusi  menggunakan  Kimura  2- parameter model, gap diperlakukan sebagai ‘ missing  data ’.  Pemilihan  model subtitusi didasarkan pada hasil analisis menggunakan Find best DNA/Protein  Models (ML)  pada  program  MEGA. Kekuatan  pohon  filogenetik  diuji  menggunakan metode bootstrap (Efron,  1979)  dengan  100  kali ulangan.
Hasil  analisis  filogenetik  berdasarkan  metode Neighbor  Joining menunjukkan  bahwa  sekuen  16S rDNA  strain  SU-LS59  dan  SU-LS67  berada  satu klaster  dengan  spesies  tipe L.  mesenteroides NBRC 100496 T (AB681194)  dengan  nilai bootstrap 100%. Nilai bootstrap menunjukkan  ke-dekatan  homologi. Dengan  mengacu  pada  data  hasil  BLAST  dan analisis  filogenetik  tersebut  maka  strain  SU-LS59 dan  SU-LS67  teridentifikasi  sebagai L.  mesen- teroides (Gambar  2).  Berdasarkan  metode Neighbor Joining tersebut  juga  dapat  diketahui  bahwa  strain SU-LS  59  dan  SU-LS  67  memiliki  nilai  kedekatan homologi dengan Leuconostoc pseudomesen- teroides NRIC  1777 T (AB023-237)  sebesar  98%, Leuconostoc  palmae TMW  2.694 T (AM940225)
sebesar  95%,  dan  dengan Leuconostoc  citreum ATCC  49370 T (AF111948)  sebesar  94%.  Identifikasi isolat  BAL Leuconostoc sp.  juga  pernah  dilakukan oleh  (Dziuba,  2011)  dengan  metode  kombinasi teknik  PCR  dan  analisis  spektroskopi  FTIR  pada bilangan gelombang 4.000 cm -1 –500 cm -1 . Kombinasi metode tersebut mampu meng- identifikasi  strain Leuconostoc sp.  sampai  level spesies  dengan  tingkat  kedekatan  homologi  men- capai  83-92%.
Gambar  1.  Hasil  amplifikasi  16S  rDNA  bakteri  asam laktat isolat SU-LS59  dan  SU-  LS67
Keterangan: Produk PCR 16S rDNA strain SU-LS59 dan SU-LS67 berukuran ±1500 bp; M adalah Ladder DNA 1  kb  plus   100,  200,  300,  400,  500,  650,  850,  1000, 1650, 2000, 3000 bp
Pemilihan  terhadap  salah  satu  strain  di  antara L.  mesenteroides SU-LS  59  dan L.  mesenteroides SU-LS  67  dilakukan  karena  kedua  strain  tersebut berasal  dari  spesies  yang  sama,  diisolasi  dari sumber  yang  sama,  serta  memiliki  aktivitas  amilase dan  pululanase  yang  tidak  berbeda  nyata.  Pada penelitian  ini  dipilih  strain  isolat L.  mesenteroides SU-LS  67  yang  lebih  mudah  dan  lebih  cepat ditumbuhkan  sebagai  variabel  uji.

## Pengaruh  waktu  fermentasi  dan  jenis  kultur starter  BAL
Waktu  fermentasi  talas  dan  jenis  starter  BAL terbaik  ditetapkan  berdasarkan  pada  nilai  rata-rata DP  pati  talas  yang  memenuhi  syarat  untuk  pem- bentukan  RS  yaitu  antara  19-29.  Jenis  kultur  starter BAL  yang  diragamkan  yaitu  kultur  tunggal L.  plan- tarum D-240,  kultur  tunggal L.  mesenteroides SU- LS67,  dan  kultur  campuran L.  plantarum D-240  dan L.  mesenteroides SU-LS  67  rasio  (1:1).  Waktu fermentasi  yang  diragamkan  dalam  fermentasi  talas
M        SU-LS59 SU-LS67 Bp
[
1650--
1000-- 500--
Leuconostoc citreum ATCC 49370 T (AF111948)
Leuconostoc holzapfelii LMG 23990 T (AM600682)
Leuconostoc lactis JCM 6123 T (AB596941)
Leuconostoc palmae TMW 2,694 T (AM940225)
Leuconostoc pseudomesenteroides NRIC 1777 T (AB023237)
Leuconostoc mesenteroides NBRC 100496 T (AB681194)
SU-LS67

## SU-LS59
Leuconostoc kimchii KCTC 2386 T (AF173986)
Leuconostoc gasicomitatum LMG 18811 T (AF231131)
Leuconostoc miyukkimchii M2 T (HQ263024)
Leuconostoc inhae IH003 T (AF439560)
Leuconostoc durionis LMG 22556 T (AJ780981)
Leuconostoc ficulneum FS-1 T (AF360736)
Leuconostoc pseudoficulneum LC 51 T (AY169967)
Leuconostoc fallax DSM 20189 T (AF360738)
Oenococcus oeni NBRC 100497 T (AB681195) 100 93 63 94 74 95 53 100 98 56 68 100 0,02
adalah  0 –24  jam.  Setelah  24  jam  fermentasi  talas, nilai  pH  talas  hasil  fermentasi  baik  pada  kultur tunggal L.  plantarum D-240  maupun L.  mesen- teroides SU-LS  67  serta  kultur  campuran  keduanya terus  menunjukkan  penurunan  dari  kisaran  pH  5,70 – 5,85  menjadi  3,68 –4,65  (Tabel  2).
Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  semakin lama  waktu  fermentasi  maka  semakin  tinggi  tingkat keasaman  pada  irisan  talas  yang  difermentasi. Penurunan  pH  secara  signifikan  dari  5,77  menjadi 3,68  pada  irisan  talas  yang  difermentasi  24  jam dengan  kultur  tunggal L.  mesenteroides SU-LS  67 mengindikasikan bahwa kultur tersebut mem- produksi  asam  laktat  dalam  jumlah  yang  lebih  besar jika  dibandingkan  dengan  kultur  tunggal L.  plan- tarum .  Penurunan  nilai  pH  yang  terjadi  pada  kultur campuran  BAL  (dari  5,85  menjadi  3,74)  lebih  di- dominasi  oleh  aktivitas  metabolisme L.  Mesen- teroides SU-LS  67  dalam  melakukan  fermentasi asam  laktat  terhadap  irisan  talas.  Widaningrum et al. (2013)  dan  Jenie et  al. (2012)  juga  melaporkan bahwa  fermentasi L.  plantarum kik pada  irisan pisang menyebabkan  terjadinya  penurunan  pH karena dihasilkannya  50-80%  asam  laktat.  Selama fermentasi  24  jam  pada  irisan  talas  telah  terjadi peningkatan  jumlah  total  koloni L.  plantarum D-240 dan L.  mesenteroides SU-LS  67  baik  pada  kultur tunggal  maupun  kultur  campuran  (Tabel  3).
Jumlah  total  koloni  BAL  kultur  campuran  lebih tinggi  jika  dibandingkan  dengan  kultur  tunggal  baik L.  plantarum D-240  maupun L.  mesenteroides SU- LS  67.  Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  Jenie et  al . (2012),  Widaningrum et  al .  (2013),  dan  Nurhayati et al .  (2014)  yang  melakukan  fermentasi  kultur  cam- puran  BAL  pada  irisan  pisang  tanduk  dan  pisang  uli. Penggunaan  kultur  campuran  menghasilkan  per- tumbuhan  eksponensial  tercapai  pada  jam  ke-12 yang  ditandai  dengan  jumlah  total  koloni  BAL sebesar  9,14  Log  CFU/mL  dan  pertumbuhan  mulai melambat  pada  jam  ke-24  (9,50  Log  CFU/mL) karena  telah  memasuki  fase  stasioner.
Tabel  2.  Pengaruh  waktu  fermentasi  dan  jenis starter  terhadap  pH  irisan talas
Waktu (Jam) pH L. plantarum D-240 L. mesenteroides SU-LS 67 Kultur Campuran* 0 5,70±0,01 a 5,77±0,02 a 5,85±0,02 a 6 5,17±0,04 b 4,96±0,05 c 4,99±0,03 c 12 4,92±0,01 d 4,36±0,03 e 4,43±0,04 e 18 4,76±0,02 f 3,71±0,02 g 3,79±0,03 g 24 4,65±0,03 h 3,68±0,02 i 3,74±0,01 i
Keterangan:  Huruf  yang  sama  pada  kolom  dan  baris menunjukkan  nilai  yang tidak berbeda nyata dengan taraf nyata 95%, (α= 5%), setelah dilakukan uji statistik dengan BNT pada SPSS 17.0; * L. plantarum D-240 + L. mesenteroides SU-LS 67
Gambar  2.  Pohon  filogenetik  sekuen  16S  rDNA  strain  SU-LS59  dan  SU-LS67  menggunakan  metode Neighbor  Joining dengan  100  kali  ulangan  dan Oeno-coccus  oeni NBRC  100497 T (AB681-195) sebagai outgroup
Kultur  tunggal L.  mesenteroides SU-LS  67 menunjukkan  tingkat  pertumbuhan  yang  lebih  tinggi daripada  kultur  tunggal L.  plantarum D-240.  Kultur tunggal L.  mesentroides SU-LS  67  mencapai  per- tumbuhan  eksponensial  pada  jam  ke-18  dengan jumlah total koloni  BAL  9,27  Log  CFU/mL. Sementara  itu  kultur  tunggal L.  plantarum D-240 mencapai  fase  eksponensial  pada  jam  ke-24 dengan  jumlah  total koloni  BAL 9,28 Log  CFU/mL.
Tabel  3.  Pengaruh  waktu  fermentasi  dan  jenis starter  terhadap  jumlah  total  koloni  BAL pada  irisan  talas Waktu (Jam) Total Koloni BAL (Log CFU/mL) L. plantarum D-240 L. mesenteroides SU-LS 67 Kultur Campuran* 0 6,68±0,28 a 6,60±0,15 a 6,88±0,22 b 6 7,98±0,27 c 7,84±0,24 c 7,98±0,20 c 12 8,34±0,18 d 8,85±0,19 e 9,14±0,12 f 18 8,99±0,13 e 9,27±0,15 f 9,38±0,14 g 24 9,28±0,21 f 9,40±0,11 g 9,50±0,10 g
Keterangan:  Huruf  yang  sama  pada  kolom  dan  baris menunjukkan  nilai yang tidak berbeda nyata (α=5%), setelah dilakukan uji statistik dengan BNT pada SPSS 17.0; * L. plantarum D-240 + L. mesenteroides SU-LS 67
Fase  adaptasi  kultur  tunggal L.  plantarum D- 240  relatif  lebih  lambat  daripada  kultur  tunggal L. mesenteroides SU-LS  67.  Hal  ini  mengindikasikan bahwa  kultur  tunggal L.  mesenteroides SU-LS  67 bekerja  lebih  dominan  dalam  proses  fermentasi talas  sehingga  memiliki  jumlah  total  BAL  (Log  CFU/ mL)  tidak  berbeda  nyata  ( P <0,05)  dengan  kultur campuran.  Persiapan  kultur  dilakukan  pada  media MRSB,  sehingga  pada  saat  diinokulasi  pada  irisan talas  kultur  BAL  membutuhkan  waktu  adaptasi kurang  dari  6  jam.  Fase  adaptasi  bergantung  pada kecepatan  penyesuaian  dengan  lingkungan,  jika nutrien  yang  tersedia  dan  kondisi  lingkungan  yang baru  sangat  berbeda,  diperlukan  waktu  penyesuaian untuk  mensintesis  enzim-enzim  yang  dibutuhkan untuk  metabolisme.  Fase  eksponensial  pada  kultur campuran  sudah  tercapai  pada  jam  ke-12  yang dilanjutkan  fase  stasioner  pada  jam  ke-18  sampai jam  ke-24.  Sementara  itu  pada  kultur  tunggal L. plantarum atau L.  mesenteroides fase  eksponensial berlangsung  mulai  dari  jam  ke-6  sampai  jam  ke-18 dan  dilanjutkan  fase  stasioner  mulai  dari  jam  ke-18 sampai  jam ke-24.
Nilai  rata-rata  DP  pada  fermentasi  talas dengan  kultur  tunggal L.  plantarum D-240  maupun L.  mesenteroides SU-LS  67  menunjukkan  bahwa nilai  DP  optimum  untuk  pembentukan  RS  berhasil dicapai  pada  jam  ke-24.  Selama  24  jam,  kultur tunggal L.  plantarum D-240  atau L.  mesenteroides
SU-LS  67  mampu  menghidrolisis  amilosa  dan amilopektin  pada  talas  hingga  mencapai  nilai  rata- rata  DP  masing-masing  sebesar  24,67  dan  22,95 (Tabel  4).  Hasil  analisis  statistika  menunjukkan bahwa  tidak  ada  perbedaan  nyata  ( P <0,05)  antara nilai  rata-rata  DP  dari  fermentasi  talas  dengan  kultur tunggal L.  plantarum D-240  maupun L.  mesen- teroides SU-LS  67.  Hal  tersebut  membuktikan bahwa  kultur  tunggal  baik L.  plantarum D-240 maupun L.  mesenteroides SU-LS  67  dapat  diman- faatkan  untuk  fermentasi  talas  dengan  waktu optimum  24  jam  guna  menghasilkan  irisan  talas dengan  DP 19-29  sebagai  bahan  baku RS.
Tabel  4. Pengaruh waktu fermentasi  dan  jenis starter  terhadap  derajat  polimerisasi  irisan talas
Waktu (Jam) Rata-rata Nilai DP L. plantarum D-240 L. mesenteroides SU-LS 67 Kultur Campuran* 0 162,77± 0,22 a 13904± 0,12 b 112,02± 0,24 c 6 56,54± 0,07 d 48,69± 0,71 e 46,83± 0,72 e 12 45,62± 0,49 e 37,52± 0,36 f 33,37± 0,37 g 18 34,37± 0,44 g 31,27± 0,09 h 27,13± 0,17 i 24 24,67± 0,17 j 22,95± 0,29 j 20,81± 0,24 k
Keterangan:  Huruf  yang  sama  pada  kolom  dan  baris menunjukkan  nilai  yang  tidak  berbeda  nyata  dengan taraf nyata 95 %, (α= 5%), setelah dilakukan uji statistik dengan BNT pada SPSS 17.0; * L. plantarum D-240 + L. mesenteroides SU-LS 67
Penggunaan  kultur  campuran L.  plantarum D- 240  dan L.  mesenteroides SU-LS  67  merupakan perlakuan  terbaik  dalam  fermentasi  talas  karena mampu  menghasilkan  rata-rata  nilai  DP  pada  irisan talas  sebesar  27,13  dalam  waktu  yang  lebih  singkat daripada  kultur  tunggal  yaitu  pada  jam  ke-18  (Tabel 4).  Jenie et  al .  (2012)  melaporkan  bahwa  kultur campuran  BAL L.  plantarum kik  dan L.  fermentum selama  fermentasi  24  jam  dapat  menghidrolisis  pati menjadi  amilosa  rantai  pendek  sebagai  bahan  baku pati  resisten.  Dengan  demikian  kultur  campuran L. plantarum D-240  dan L.  mesenteroides SU-LS  67 dalam  penelitian  ini  memiliki  kemampuan  lebih  baik dalam  mempersingkat  waktu  fermentasi  jika  di- bandingkan  dengan  kultur  campuran  pada  penelitian Jenie et al . (2012).
Pada  penelitian  ini  tidak  dilakukan  analisis mikrostruktur,  akan  tetapi  penelitian  Wronkowska et al .  (2006)  dapat  menjelaskan  bahwa  fermentasi bahan  pangan  berpati  oleh  BAL  selama  24  jam  me- nunjukkan  perubahan  mikrostruktur  pati  yaitu  pem-
bentukan  struktur  globular  dan  lamellar.  Hidrolisis parsial  amilosa  rantai  panjang  oleh  enzim  amilase dapat  menurunkan  nilai  DP  amilosa  sehingga  di- hasilkan  polisakarida  rantai  pendek  (Vishnu et  al. , 2006).  Sementara  itu  pelepasan  cabang  ( debran- ching )  amilopektin  oleh  pululanase  menghasilkan polimer  glukosa  rantai  lurus  yang  merupakan  poli- sakarida  dengan  DP  lebih  kecil  (Vatanasuchart et al .,  2010).  Semakin  banyak  polisakarida  rantai pendek  (DP  19-29)  yang  terbentuk  meningkatkan kadar  RS  yang  dapat  dihasilkan  melalui  proses retrogradasi  (Soto et  al., 2007;  Sugiyono et  al., 2009;  Zaragoza et al., 2010;  Faridah et al ., 2013).

## KESIMPULAN
Dari  41  isolat  BAL  yang  diseleksi  telah diperoleh  tiga  isolat  dengan  aktivitas  ekstrak  kasar amilase,  pulunase  serta  jumlah  total  koloni  BAL tertinggi  yaitu  isolat L.  plantarum D-240,  SU-LS  59 dan  SU-LS  67.  Hasil  identifikasi  dengan  metode sekuensing  PCR  dan  analisis  filogenetik Neighbor Joining menunjukkan  bahwa  strain  SU-LS59  dan SU-LS67  teridentifikasi  sebagai L.  mesenteroides dengan  nilai bootstrap 100% .  Kultur  campuran L. plantarum D-240  dan L.  mesenteroides SU-LS  67 dengan  rasio  1:1  merupakan  perlakuan  terbaik dalam  fermentasi  talas  karena  menghasilkan  nilai DP  yang  memenuhi  syarat  (27,13)  dengan  waktu fermentasi  yang  lebih  singkat (18 jam).

## UCAPAN  TERIMA KASIH
Kegiatan  penelitian  ini  didanai  oleh  Program Beasiswa  Pascasarjana  Kementerian  Ristek  dan mendapatkan  bantuan  bahan  kimia  dari  DIPA  PN Pusat Penelitian  Biologi  LIPI  2014.

## DAFTAR PUSTAKA
Alariya  SS,  Sethi  S,  Gupta  S,  Lal  GB.  2013.
Amylase  activity  of  a  starch  degrading bacteria  isolated  from  soil.  Arch  Appl  Sci  Res 5: 15-24.
Ammor  S,  C  Rachman  C,  Chaillou  S,  Prevost  H, Dousset  X,  Zagorec  M,  Dufour  E,  Chevallier  I. 2005.  Phenotypic  and  genotypic  identification of  lactic  acid  bacteria  isolated  from  a  small- scale facility producing traditional dry sausagees.  Food  Microbiol  22:  373 –382. DOI: 10.1016/j.fm.2004.11.005.
Asha  R,  Niyonzima  FN,  Sunil  SM.  2013.  Purification and  properties  of  pullulanase  from Bacillus halodurans .  Int  Res J  Biol Sci 2: 35-43.
Bhanwar  S,  Ganguli  A.  2014.  α-amylase  and  β- galactosidase  production  on  potato  starch waste  by Lactococcus  lactis subsp  lactis isolated  from  pickled  yam.  J  Sci  Ind  Res  73: 324-330.
Dziuba  B.  2011.  Identification  of  selected Leu- conostoc species  with  the  use  of  FTIR spectroscopy  and  artificial  neural  networks. Acta Sci Pol Technol  Aliment 10: 275-28.
Dubois  M,  Gilles  KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F.  1956.  Calorimetric  method  for  deter- mination  of  sugars  and  related  substances. Anal  Chem  28:  350 –356.  DOI:  10.1021/ac 60111a017.
Efron  B.  1979. Bootstrap  methods:  another  look  at the jackknife.  Ann Statist 7: 1-26.
Faridah  DN,  Rahayu  WP,  Apriyadi  MS.  2013. Modifikasi  pati  Garut  ( Marantha  Arundinacea ) dengan  perlakuan  hidrolisis  asam  dan  siklus pemanasan-pendinginan  untuk  menghasilkan pati  resisten  tipe  3.  J  Teknol  Industri  Per- tanian 23: 61-69.
Jenie BSL, Reski  PP,  Kusnandar  F.  2012. Fermentasi  kultur  campuran  bakteri  asam laktat  dan  pemanasan  otoklaf  dalam  me- ningkatkan  kadar  pati  resisten  dan  sifat fungsional tepung pisang tanduk ( Musa parasidiaca  formatypica ).  J  Penelitian  Pasca- panen  pertanian  9: 18-26.
Kim  JH,  Sunako  M,  Ono  H,  Murooka  Y,  Fukusaki  E,
Yamashita.  2008.  Characterization  of  gene encoding amylopullulanase from plant- originated  lactic  acid  bacterium, Lactobacillus
Miller  GL.  1959.  Use  of  dinitrosalicylic  acid  reagent for  determination  of  reducing  sugar.    Anal Chem  31:  426-428.  DOI:  10.1021/ac6014 7a030.
Moradi  M,  Shariati  P,  Tabandeh  F,  Yakhchali  B, Khaniki  GB.  2014.  Screening  and  isolation  of powerful  amylolytic  bacterial  strains. Int  J  Curr Microbiol  Appl Sci 3: 758-768.
Nikolova  D,  Evstatieva  Y,  Georgieva  R,  Danova  S, Savov  V,  llieva  S,  Dalev  P.  2009.  Molecular taxonomic  characterisation  of  probiotic  strain Lactobacillus sp.  50  P1.  Biotechnol  Biotec 23: 779-782.  DOI:  10.1080/13102818.2009.1081 8539.
Nurhayati,  Jenie  BSL,  Widowati  S,  Kusumaningrum HD.  2014.  Komposisi  kimia  dan  kristalinitas tepung  pisang  termodifikasi  secara  fermentasi
plantarum L137.  J Biosci  Bioeng  106:  449-
459. DOI: 10.1263/bb.106.449.
spontan  dan  siklus  pemanasan  bertekanan- pendinginan.  Agritech  34: 146-150.
Pokhrel  B,  Wanjare  P,  Singh  S,  Purushotham  B, Kumara  SW.  2013.  Isolation,  screening  and characterization  of  promising  alfa-amylase producing  bacteria  from  sewage  enriched  soil. Int  J Adv  Biotechnol  Res 4: 286-290.
Rahmawati  W,  Kusumastuti  YA,  Aryanti  N.  2012. Karakterisasi  pati  talas  ( Colocasia  esculenta
(L) Schoot )  sebagai  alternatif  sumber  pati  di Indonesia.  J  Teknol  Kimia Industri  1: 347-351.
Reddy  G,  Altaf  MD,  Naveena  BJ,  Venkateshwar  M,
Kumar  EV.  2008.  Amylolytic  bacterial  lactic acid  fermentation-A  review.  Biotechnol  Adv 26:  22 –34.  DOI:  10.1016/j.biotechadv.2007. 07.004.
Saitou  N,  Nei  M.  1987.  The  neighbor-joining  method: A  new  method  for  reconstructing  phylogenetic trees. Mol Biol Evol  4: 406-425.
Sajilata  MG,  Rekha  SS,  Puspha RK. 2006. Resistant starch  a  review.  Compr  Rev  Food  Sci  F  5:  1- 17.  DOI:  10.1111/j.1541-4337.2006.tb00076. x.
Soto  RAG,  Escobedo  RM,  Sanchez  HH,  Rivera  MS,
Bello-Perez  LA.  2007.  The  influence  of  time and  storage  temperature  on  resistant  starch formation from autoclaved debranched banana  starch.  Food  Res  Int  40:  304 –310.
DOI:  10.1016/j.foodres.2006.04.001.
Sugiyono,  Pratiwi  R,  Faridah  DN.  2009.  Modifikasi pati Garut dengan perlakuan siklus pemanasan  suhu  tinggi-pendinginan  untuk menghasilkan  pati  resisten  tipe  III.  J  Teknol Industri  Pangan  20: 17-24.
Sujaya  N,  Ramona  Y,  Widarini  NP,  Suariani  NP,
Dwipayanti  NMU,  Nociaanitri  KA,  Nursini  NW. 2008.  Isolasi  dan  karakterisasi  bakteri  asam laktat  dari  susu  kuda  Sumbawa.  J  Veteriner  9: 52-59.
Sulistiani,  Abinawanto,  Sukara  E,  Salamah  A, Dinoto A,  Mangunwardoyo  W.  2014.  Identification  of lactic  acid  bacteria  in  sayur  asin  from  Central Java (Indonesia) based on 16S rDNA sequence.  Int  Food  Res J  21: 527-532.
Tamura  K,  Peterson  D,  Peterson  N,  Stecher  G,  Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis
using maximum  likelihood,  evolutionary  distance, and  maximum  parsimony  methods. Mol  Biol Evol 28:  2731-2739.  DOI:  10.1093/molbev/ msr121.
Vatanasuchart  N,  Tungtrakul  P,  Wongkrajang  K, Naivikul  O.  2010.  Properties  of  pullulanase debranched  cassava  starch  and  type  III resistant  starch.  Kasetsart  J  (Nat Sci) 44: 131- 141.
Vishnu  C,  Naveena  BJ,  Altaf  MD,  Venkateshwar  M,
Reddy  G.  2006. Amylopullulanase —A  novel enzyme  of  L.  amylophilus  GV6  in  direct fermentation  of  starch  to  L(+)  lactic  acid.
10.1016/j.enzmictec.2005.07.010.
Widaningrum,  Jenie  BSL,  Nur  Richana,  Suliantari. 2013. Penambahan tepung pisang uli modifikasi  kaya  pati  resisten  pada  pembuatan yoghurt  sinbiotik.  J  Penelitian  Pascapanen Pertanian  10: 38-47.
Wronkowska  M,  Smietana  MS,  Krupa  U,  Biedrzycka E.  2006. In  vitro fermentation  of  new  modified starch preparations —changes of micro- structure and bacterial end-products. J Enzyme Microb  Tech  40:  93 –99.  DOI: 10.1016/j.enzmictec.2005.10.039.
Zaragoza  EF,  Riquelme-Navarrete  MJ,  Sanchez- Zapata  E,  Perez-Alvarez  JA.  2010.  Resistant starch  as  functional  ingredient:  A  review.  Food Res  Int  43:  931-942.  DOI:  10.1016/j.foodres. 2010.02.004.
Enzyme  Microb Tech  38:  545 –550.  DOI: