## Aktivitas Imunomodulator Ekstrak
n - Heksana, Etil Asetat, dan Metanol Biji Jinten Hitam ( Nigella sativa L.)

## Immunomodulator Activity of n-Hexane, Ethyl Acetate and Methanol Extract of Black Cumin Seeds (Nigella sativa L.)
Black cumin (Nigella sativa L.) is a plant that has imunomodulator activity. Black caraway seed contains volatile oil, alkaloid, saponin, tannin, polyphenol and fat. The aim of this study was to find out the imunomodulator effect  of  black  caraway  seed  extract  with  macrophage  phagocytosis  and  increasing  immunoglobulin  G  as parameters. The experiment used 30 balb/c mice divided in 6 groups. Group I was given 1.6843 mg/20 gBW n-hexane extract, group II was given 0.2682 mg/20 gBW ethyl acetate extract, Group III was given 0.4272 mg/20  gBW  methanol  extract,  group  IV  as  positive  control  that  was  given  0.065  mg/20  gBW  Imboost ® , group V was given  CMC 0.5%  and group VI as negative control was given 2 mg/20 gBW cyclophosphamide. The extract was given 21 days, at day-7 and day-14 each mice was injected with SRBC (Sheep Red Blood Cells). At  day-21  the  serum  of  mice  blood  was  taken  and  the  IgG  level  was  examined  with  ELISA  reader.  Macro- phages  phagocytosis  was  observed  according  to  macropages  activity  and  capacity  from  peritoneal  liquid smear preparation by counting percentage of 100 machropages that acting pahgocytosis. Capacity of phago- cytosis was determined according to latex amount that being phagocytosed by 50 active macropages. The result indicated that black cumin seed extract had imunomodulator effect, and n-hexane extract had high potential as imunostimulator compared with the other extract, with average result percentage of macropages phago- cytosis activity 89.5% and capacity of macrophages phagocytosis 1204 latex, the same as the result of IgG test.
Keywords:  nigella sativa, imunomodulator, IgG, macrophages.
Rini Prastiwi (a) *, Kisrini (b) , Anwar Iqbal (b) , Aprina Kristi (b)
(a) Universitas Muhammadiyah Prof. DR. Hamka
(b) Universitas Setia Budi , Solo, Indonesia
Jinten hitam ( Nigella sativa L.) adalah tanaman yang memiliki aktivitas imunomodulator. Kandungan biji jinten hitam adalah minyak atsiri, alkaloid, saponin, tanin, polifenol dan minyak lemak. Penelitian bertujuan untuk mengetahui  efek  imunomodulator  ekstrak  biji  jinten  hitam  dengan  parameter  fagositosis  makrofag  dan peningkatan imunoglobulin G. Penelitian menggunakan 30 ekor mencit balb/c yang dibagi ke dalam 6 kelompok. Kelompok I diberi ekstrak n -heksana dengan dosis 1,6843 mg/20 gBB, kelompok II diberi eksrak etil astat dosis 0,2682 mg/20 gBB, kelompok III diberi eksrak metanol dosis 0,4272 mg/20 gBB, kelompok IV kontrol positif menggunakan Imboost ® dosis 0,065 mg/20 gBB, kelompok V diberi CMC 0,5% , dan kelompok VI kontrol negatif siklofosfamid dosis 2 mg/20gBB. Ekstrak diberikan selama 21 hari, hari ke-7 dan hari ke-14 masing- masing mencit diinjeksikan SRBC (Sheep Red Blood Cells) intraperitoneal. Pada hari ke-21 darah mencit diambil untuk  diambil serumnya, kemudian  kadar IgG diperiksa dengan ELISA reader. Fagositosis makrofag dilihat berdasarkan aktivitas dan kapasitas makrofag dari sediaan apus cairan intraperitoneal, dengan menghitung persentase 100 makrofag yang melakukan fagositosis. Kapasitas fagositosis ditetapkan berdasarkan jumlah lateks yang difagositosis oleh 50 makrofag aktif. Hasil yang didapatkan ekstrak biji jinten hitam memiliki potensi sebagai imunomodulator dan ekstrak n -heksana memiliki potensi yang tinggi sebagai imunostimulator diban- dingkan  ekstrak lain dengan  hasil  rata-rata  presentasi  aktivitas fagositosis makrofag 89,5%  dan  kapasitas fagositosis makrofag 1204 lateks, begitu juga hasil dengan uji IgG.
Kata kunci: jinten hitam, imunomodulator, IgG, makrofag.

## PENDAHULUAN
Penyebab gangguan sistem kekebalan tubuh misalnya infeksi, kanker, leukimia, obat-obat kortiko- steroid, obat untuk kanker. Melemahnya imunitas tubuh akibat pajanan ringan sekalipun akan me- nimbulkan manifestasi klinis yang sangat meng- gangu, terlebih jika terjadi serangan agen infek- sius yang ganas (Hanafi, 2009). Imunitas atau daya tahan tubuh merupakan respon tubuh terhadap bahan asing. Respon imun merupakan reaksi yang dikoordinasi oleh sel-sel dan/atau molekul-molekul terhadap mikroba ataupun agen-agen lain, sehingga ketika kondisi imun menurun, maka pertahanan tubuh akan menurun dan tubuh bisa mudah ter- serang penyakit (Mathilda, 1997).
Makrofag  sangat  penting  dalam  memper- antarai  respon  imun  dan  sering  dikenal  sebagai Antigen-Presenting Cell (APC) sebab mereka meng- ambil, mencerna, dan menyajikan material asing ini  kepada  sistem  kekebalan  lain  seperti  sel  T dan sel B (Yosaphat et al., 2008). Imunoglobulin G  adalah  imunoglobulin  yang  paling  banyak. Molekul  ini  mencapai  konsentrasi  yang  berarti baik intravaskuler maupun ekstravaskuler, mem- punyai  waktu  paruh  relatif  lama  (23  hari),  dan dapat melewati plasenta. IgG diduga membantu imunitas  melawan  beberapa  agen  infeksi  yang disebarkan  melalui  darah  seperti  bakteri,  virus, parasit, dan beberapa jamur. Selain itu juga dapat memberi aktivitas antibodi di dalam jaringan.
Salah satu tanaman yang memiliki aktivitas imunomodulator  adalah  jinten  hitam  ( Nigella sativa L.).  Telah  banyak  dilakukan  penelitian untuk mengetahui aktivitas biologisnya yang mem- perlihatkan  efek  antidiabetes  dan  antimalaria (Abdulelah et al., 2007), anti tumor  (Mbarek et al., 2007), anti fungal (Khan et al., 2003), anti- bakteri (Alhaj et al., 2008), antiinflamasi, spas- molitik, hepatoprotektor (Mahmoud et al., 2005), antidiabetik (Khanam dan Matira, 2008), dan anti- kanker (Iddamaldeniya et al., 2003).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek  imunomodulator  ekstrak  biji  jinten  hitam ( Nigella  sativa L.)  dengan  parameter  imuno- globullin G dan fagositosis makrofag.

## METODE PENELITIAN

## Alat
Soxhlet,  kondensor,  lampu  spiritus,  mikroskop, alat  gelas  lainnya,  kandang  mencit,  jarum  oral, jarum suntik, mikropipet, inkubator, ELISA reader.
Bahan
Biji jinten hitam, n -heksana, etil asetat, metanol. kit ELISA, siklofosfamid, mencit balb/c, silika gel GF 254 , kloroform, toluen, butanol, air, Imboost ®.

## Tahapan Penelitian
Identifikasi Makroskopik dan Mikroskopik Ser- buk Biji Jinten Hitam
Diamati bentuk, warna, bau dan rasanya serta dilihat fragmen  spesifiknya  dengan  menggunakan  mi- kroskop dan preparat ditetesi dengan kloralhidrat.

## Penetapan Kadar Air Serbuk  Biji Jinten Hitam
Penetapan kadar air mengunakan destilasi dengan toluen.

## Pembuatan Ekstrak Biji Jinten Hitam
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan soxhlet dengan ekstraksi bertingkat, dari pelarut non polar ke polar. Urutan pelarut yang digunakan adalah n -heksana, etil asetat, metanol. Ekstraksi dengan menggunakan serbuk sebanyak 50 gram. Masing- masing  sari  yang  diperoleh  dari n -heksana,  etil asetat, dan metanol kemudian diuapkan dengan vacuum evaporator . Ekstrak yang diperoleh dibuat konsentrasi kadar sesuai dengan yang akan digu- nakan untuk percobaan.
Identifikasi Kualitatif Ekstrak Biji Jinten Hitam Pengujian dilakukan terhadap alkaloid, saponin, tanin, polifenol, minyak atsiri, dan minyak lemak. Prosedur  pengujian  sesuai  literatur  Harbone (1987) dan Anonim (1979).

## Identifikasi Kandungan Secara KLT
Dilakukan  terhadap  alkaloid,  saponin,  minyak atsiri, tanin, polifenol.
Pembuatan Larutan Uji Ekstrak pekat dari ekstrak n -heksana, etil asetat, dan metanol dibuat suspensi dengan konsentrasi ekstrak n -heksana 1,6830 mg/ml, ekstrak etil asetat 0,2681 mg/ml, metanol 0,4272 mg/ml, siklofos- famid 2 mg/ml dan Imboost ® 0,65 mg/ml. Pem- buatan sediaan dengan pengenceran menggunakan larutan  CMC  0,5%  sebagai  pensuspensi.  Dosis Imboost ® dikonversikan  dari  dosis  penggunaan pada  manusia  yaitu  250  mg  x  0,0026  (faktor konversi) = 0,65 mg/20 gBB mencit. Sedangkan untuk siklofosfamid sesuai dengan Ghaisas et al. ( 2009)  yang  digunakan  sebagai  standar  imuno- supresan 100 mg/kg = 100 mg/1000g= 2 mg/20 gBB mencit.

## Pembuatan SRBC
Darah diambil pada vena jugularis yang terdapat pada leher domba, diambil sebanyak  20  ml. Sel darah  merah  domba  dipisahkan  dari    plasma dengan pemusingan 1500 rpm selama 15 menit. Plasma dikeluarkan kemudian dilakukan pencucian dengan PBS pH 7,4. Pencucian dilakukan minimum 3 kali. Setelah pencucian selesai didapatkan sus- pensi  SRBC  100%.  Pembuatan  SRBC  20%  di- lakukan  dengan  cara  mengambil  sebanyak  2  ml kemudian ditambah NaCl fisiologis hingga 100 ml.

## Pengelompokan dan Perlakuan Hewan Coba
Sebanyak 30 ekor mencit balb/c dibagi ke dalam 6 kelompok. Kelompok I diberi ekstrak n -heksana dengan  dosis  1,6843  mg/20  gBB,  kelompok  II diberi  ekstrak  etil  asetat  dosis  0,2682  mg/20 gBB,  kelompok  III  diberi  ekstrak  metanol  dosis 0,4272 mg/20 gBB, kelompok IV kontrol positif menggunakan Imboost ® dosis 0,065 mg/20 gBB, kelompok V diberi CMC 0,5%, dan kelompok VI kontrol  negatif  siklofosfamid  dosis  2  mg/20 gBB. Ekstrak diberikan selama 21 hari, hari ke-7 dan hari ke-14 masing-masing mencit diinjeksikan SRBC ( Sheep Red Blood Cells) intraperitoneal.
TABEL 1. Hasil Randemen Ekstrak
TABEL 2 . Hasil Identifikasi Kualitatif Ekstrak TABEL 3 . Hasil Identifikasi KLT Ekstrak
Keterangan : H=ekstrak heksana, E=ekstrak etil asetat, M=ekstrak metanol.

## TABEL 4 . Hasil Pemeriksaan Titer Imunoglobulin G (IgG)
Pada  hari  ke-21  darah  mencit  diambil  untuk diambil  serumnya,  kemudian  kadar  IgG diperiksa  dengan  ELISA reader. Fagositosis makrofag  dilihat  berdasarkan  aktivitas  dan  ka- pasitas  makrofag  dari  sediaan  apus  cairan  intrap- eritoneal,  dengan  menghitung  persentase  100 makrofag yang melakukan fagositosis. Kapasitas
fagositosis ditetapkan berdasarkan jumlah lateks yang difagositosis oleh 50 makrofag aktif.

## Analisa Data
Analisa data dengan menggunakan ANOVA satu arah dengan uji Tukey HSD dan LSD.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil Identifikasi Mikroskopik dan Makroskopik Serbuk
Hasil  organolepstis  :  serbuk,  warna  coklat  kehi- taman,  bau  khas,  rasa  khas.  Hasil  mikroskopik: didapatkan  fragmen  pengenal  epidermis  dalam, fragmen kulit biji, fragmen endosperm, fragmen lapisan sel berisi hablur berbentuk prisma.

## Hasil Penetapan Kadar Air
Penetapan  kadar  air  serbuk  diperoleh  rata-rata kadar air serbuk adalah 5,77%.

## Randemen Ekstrak yang Diperoleh
Randemen ekstrak yang diperoleh adalah untuk ekstrak n -heksana  34,65%,  ekstrak  etil  asetat 5,34%, dan metanol 9,76% ( Tabel 1 ).

## Identifikasi Kualitatif Ekstrak (Tabel 2)

## Hasil Identifikasi KLT (Tabel 3)
Kandungan  minyak  atsiri  di  dalam  biji  jinten hitam adalah thymoquinon, dithymoquinon, thymo- hydroquinon , dan thymol . Senyawa-senyawa ini yang berpotensi sebagai imunomodulator dengan cara  meningkatkan  sel  T  dan  sel  NK  ( natural killer ),  sebagai  perantara  respon  imun  jika  ter- jadi infeksi atau ada benda asing yang masuk ke dalam tubuh (Salem, 2005).
Hasil Pemeriksaan Titer Imunoglobulin G (IgG) Penelitian ini menggunakan 5 hewan coba untuk tiap kelompok perlakuan. Untuk percobaan kadar titer  IgG  karena  ketika  dihitung  masing-masing hasil tiap kelompok ada yang tidak masuk dalam ring  standar  deviasinya,  maka  data  yang  bisa diterima digunakan adalah 3 ekor mencit untuk masing-masing  kelompok.  Analisis  data  secara statistik menggunakan ANOVA satu jalan. Hasil pengujian Kolmogorov-Smirnov diperoleh  data terdistribusi  secara  normal  (0,684>0,05).  Hasil homogenitas dengan Levene Test data diperoleh 0,157>0,05.  Melalui  hasil  uji  LSD  didapatkan hasil bahwa perlakuan dengan ekstrak n -heksana berbeda  nyata  secara  signifikan  dengan  ekstrak etil  asetat,  metanol,  siklofosfamid,  tetapi  tidak berbeda secara signifikan dengan perlakuan Im- boost ® .  Kelompok  perlakuan  CMC  0,5%  tidak dimasukkan ke dalam perhitungan statistik karena CMC  hanya  sebagai  zat  tambahan  yang  tidak bersifat toksikan.
Hasil Pemeriksaan Aktivitas Fagositosis Makrofag Aktivitas fagositosis ditetapkan berdasarkan jumlah makrofag yang aktif melakukan fagositosis dalam 100 sel makrofag (Kusmardi et al . 2007) .
Dari Tabel  5 diperoleh hasil bahwa persentase aktivi- tas fagositosis makrofag yang tertinggi dimiliki oleh
Bahan Berat Serbuk (g) Berat Ekstrak (g) Randemen (%) Rata-rata Randemen (%) Ekstrak n-heksana 50,026 16,863 33,65 34,65 49,990 17,747 35,50 49,953 17,832 34,80 Ekstrak Etil Asetat 50,026 2,514 5,03 5,34 49,990 2,847 5,70 49,953 2,644 5,30 Ekstrak Metanol 50,026 4,626 9,23 9,76 49,990 4,739 9,48 49,953 5,287 10,58
No. Kandungan Kimia Pereaksi n - heksana Etil Asetat Metanol 1 Alkaloid Reagen Meyer dan Dragendorf - - + 2 Saponin Ekstrak+ air panas kocok 10 menit → timbul busa - + + 3 Tanin Ekstrak + 5 tetes FeCl 3 5% - - + 4 Polifenol Ekstrak + FeCl 3 → warna orange Ekstrak + 0,5 ml Fehling A dan B - - + 5 Minyak atsiri Ekstrak diteteskan pada permukaan air Ekstrak + sudan III + - - 6 Minyak lemak Uji Salkowski + - - Senya- wa Fase Diam Fase Gerak Deteksi Pereaksi Hasil Pustaka 254 nm 366 nm Alkaloid Silika Gel GF 254 CHCL 3 : MeOH (8,8:1,2) Kuning hijau  Hijau Dragen- dorf H : - E : - M : + Anonim, 1992 Saponin Silika Gel GF 254 CHCL 3 :
MeOH : air (65:35:2) Kuning  Hijau  Anisal- dehid H : - E : + M : + Anonim, 1992 Minyak Atsiri Silika Gel GF 254 Toluen : etil asetat (93:7) - - Anisal- dehid H : + E  : - M : - Depkes, 1987 Tanin Silika Gel GF 254 n-heksana : etil asetat (3:7) - - FeCl 3 1% H : - E : - M : + Depkes, 1987 Poli- fenol Silika Gel GF 254 Butanol : asam asetat : air ( 4:1:5) -  Kuning ungu FeCl 3 1% H : - E : + M : + Soegihadjo et al., 1996 Hewan Coba Ekstrak n - heksana Ekstrak Etil Asetat Ekstrak Metanol Imboost ® Siklofosfamid 1 2,517 0,818 0,959 1,279 0,685 2 1,191 0,610 0,956 1,383 0,794 3 1,085 0,786 0,660 1,831 0,608 Rata-rata titer IgG 1,598 0,738 0,858 1,498 0,696
TABEL 5 . Hasil Pemeriksaan Aktivitas Fagositosis Makrofag
TABEL 6 . Hasil Post Hoc Anova Fagositosis Makrofag
TABEL 7 . Hasil Kapasitas Fagositosis Makrofag
GAMBAR 1. Histogram kadar titer imunoglobulin G (IgG).
GAMBAR 2. Histogram persentase fagositosis makrofag.
ekstrak n -heksana, kemudian diikuti oleh ekstrak etil asetat, dan metanol. Hasil yang diperoleh di- dapatkan bahwa ekstrak biji jinten hitam dengan pelarut n -heksana ternyata lebih baik dibanding- kan dengan Imboost ® dalam memfagositosis ma- krofag. Data hasil analisa statistik menggunakan ANOVA satu jalan. Hasil pengujian Kolmogorov- Smirnov diperoleh data terdistribusi secara normal
GAMBAR 3 . Fagositosis makrofag tiap kelompok perlakukan, (a) siklofosfamid, (b) UV 366 nm, (c) ekstrak metanol, (d) ekstrak etil asetat, (e) ekstrak n -heksana.
(p>0,05). Hasil homogenitas dengan Levene Test data diperoleh data p>0,05. Hasil uji Post Hoc den- gan Tukey HSD  didapatkan  ekstrak n -heksana memiliki  beda  nyata  dengan  ekstrak  etil  asetat, ekstrak  methanol, siklofosfamid dan  Imboost ® . Sedangkan  ekstrak  etil  asetat,  ekstrak  metanol dan  Imboost ® tidak  berbeda  secara  signifikan. Penelitian yang telah dilakukan memberikan hasil bahwa dengan pelarut n -heksana memiliki potensi yang paling tinggi sebagai imunostimulan diban- dingkan  dengan  ekstrak  etil  asetat  dan  ekstrak metanol. Dari Gambar  3 terlihat pada estrak n - heksana  memfagositosis  lateks  lebih  banyak  di- bandingkan dengan kelompok ekstrak yang lain.

## Kapasitas Fagositosis Makrofag
Kapasitas fagositosis makrofag berdasarkan jumlah lateks yang difagositosis oleh 50 sel makrofag aktif (Kusmardi et al ., 2007). Hasil uji ANOVA dilaku- kan  dengan  menggunakan  LSD  diperoleh  data bahwa  ekstrak n -heksana  memiliki  beda  nyata dengan  etil  asetat,  metanol,  dan  siklofosfamid, sedangkan dengan kontrol positif Imboost ® tidak berbeda  secara  signifikan.  Kapasitas  fagositosis yang paling besar adalah ekstrak n -heksana dengan 1204. Penelitian yang telah dilakukan memberi- kan hasil bahwa ekstrak biji jinten hitam dengan pelarut n -heksana  memiliki  potensi  meningkat- kan sistem kekebalan tubuh mencit yang dibukti- kan dengan peningkatan fagositosis makrofag dan titer  imunoglobulin  G  (IgG).  Bila  dibandingkan dengan  kontrol  positif  Imboost ® ,  hasil  yang diperoleh lebih baik.

## KESIMPULAN
Ekstrak n -heksana biji  jinten hitam mempunyai aktivitas yang paling tinggi sebagai imunostimu- lan bila dibandingkan dengan ekstrak etanol dan ekstrak etil asetat. Hasil fagositosis makrofag un- tuk ekstrak n -heksana adalah 84,20%, kapasitas fagositosis makrofag 1204, sedangkan kadar IgG adalah 1,598.
Ekstrak
n -heksana Ekstrak Etil Asetat Ekstrak Metanol Imboost ® Siklo- fosfamid 96 73 86 78 52 Persentase Aktivitas Fagositosis Makrofag (%) 95 53 64 79 52 91 70 53 65 39 76 71 59 76 57 63 26 41 61 30 Rata-rata 84,2 58,6 60,6 71,8 46
Ekstrak n -heksana Ekstrak Etil Asetat Ekstrak Metanol Imboost ® Siklo- fosfamid Kapasitas Fagositosis Makrofag (%) 444 218 186 159 121 202 124 102 272 113 291 106 113 202 90 267 172 117 238 95 Total 1204 620 518 871 419

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas AK, Abdulelah et al., 2007, In Vitro Anti-malarial Test of Nigella sativa (Black Seed) Different Extract, Am  J  Phar- macol Toxicol , 2(2), 46-50.
Anonim, 1979, Materia  medika  Indonesia , Jilid III, De- partemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, 112-117, 187. Ghaisas et  al., 2009,  Evaluation  of  the  immunomodulatory activity  of  ethanolic  extract  of  the  stem  bark  of  Bauhinia variegata Linn, Int J Green Pharm , 3, 70-74.
Hanafi, M, 2009, Memburuknya  Penyakit  Infeksi  Aki- bat Lemahnya Sistem Imun , Jakarta.
Harbone  JB,  1987, Metode  Fitokimia ,  Padmawati  K  dan Sudiro I (penerjemah), Penerbit ITB, Bandung.
Khan et al., 2003, The In Vivo Antifungal Activity of The Aque- ous Extract from Nigella  sativa Seeds, Phytother  Res, 17
(2), 183-186.
Khanam  dan  Matira,  2008,  Effect  of  the  Crude  and  the N - hexane Extract of Nigella  sativa Linne (Kalajira) upon Dia- betic Rats, Bangladesh J Pharmacol , 4, 17-20.
Kusmardi et al. , 2007, Efek imunomodulator Daun Ketepeng Cina  ( Casia  alata L.)  Terhadap  Aktifitas  dan  Kapasitas Fagositosis Makrofag, Makara Kes , 11(2).
Mathilda, 1997, Imunomodulator , Jurusan Farmasi Insti- tut Teknologi Bandung.
Mbarek et  al., 2007,  Anti-tumor  Properties  of  Blackseed ( Nigella sativa L.) Extracts, Braz J Med Biol Res, 40(6), 839- 847.
Mahmoud et al., 2002, The Effect of Nigella sativa Oil Againts the Liver Damage Induced by Schitosoma mansoni Infection in Mice, J Ethnopharmacol , 79(1), 1-11.
Iddamaldeniya et al., 2003, Protection Againts Diethylnitro- soamine-induced  Hepatocarcinogenesis  by  an  Indigenous Medicine Comprised of Nigella sativa, Hemidesmus indicus and Smilax glabra : Preliminary Study, J Carcinog , 2(1), 6.
Salem, 2005, Imunomodulatory and Therapeutic Properties of  The Nigella  sativa L Seed, Int  Immunopharmacol ,  5
(13-14), 1749-70, Epub 2005 Jul I.
Soegihardjo et al. , 1996, Uji  Aktifitas  Sari  Daun  Randu Ceiba  pentandra Gaertn.) Sebagai Penumbuh Ram- but , Penelitian Fakultas Farmasi UGM.
Yosaphat et al., 2008, Pengujian  Efek  Imunomodulator Mikrokapsul Habatussauda ( Nigella sativa ) pada Tikus Putih  terinfeksi Vibrio  cholerae , Universitas Brawijaya, Malang.