## STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF  STRUKTUR-AKTIVITAS SENYAWA TURUNAN MEISOINDIGO SEBAGAI INHIBITOR CDK4
Muhammad Arba * , Riki Ardiansyah, Messi Leonita
Fakultas Farmasi, Universitas Halu Oleo, Kendari, Sulawesi Tenggara,Indonesia, 93231 email :arba_muh@yahoo.com
Received 12 July 2016 Accepted 30 November 2016

## Abstrak
Cyclin-dependent  kinase-4 (CDK4)  adalah  target  penting  dalam  penanganan  kanker  dan pencarian  senyawa  yang  dapat  menghambat  aktivitas  CDK4  sedang  giat  dilakukan  di seluruh  dunia.  Pada  penelitian  ini  dilakukan  analisis  Hubungan  Kuantitatif  Struktur- Aktivitas  (HKSA)  senyawa  turunan  meisoindigo  sebagai  inhibitor  CDK4  untuk memperoleh persamaan HKSA yang dapat digunakan untuk desain inhibitor baru berbasis meisoindigo yang lebih poten dan selektif terhadap CDK4. Data senyawa dibagi menjadi training  set untuk  membangun  model  HKSA  dan test  set untuk  validasi  model. Perhitungan  deskriptor  dilakukan  menggunakan  MOE2009.10  dan  analisis  regresi multilinear  dilakukan  menggunakan  SPSS19.0.  Hasil  penelitian  menyatakan  bahwa aktivitas  penghambatan  CDK4  dari  senyawa  turunan  mesoindigo  bergantung  pada beberapa momen dipol, energi total, energi elektronik, panas pembentukan, dan kelarutan. Akurasi model HKSA yang diusulkan divalidasi dengan teknik validasi silang dan dengan validasi  eksternal.  Hasil  penelitian  ini  dapat  digunakan  untuk  desain  senyawa  inhibitor CDK4 yang lebih baik dari turunan meisoindigo.
Kata kunci : HKSA, meisoindigo, kanker, CDK4

## Abstract
Cyclin-dependent  kinase  4  (CDK4)  is  an  important  target  in  the  treatment  of  cancer. Exploring  of  compounds  that  can  inhibit  the  activity  of  CDK4  is  actively  performed worldwide.  This  research  was  conducted  to  do  Quantitative  Structure-Activity Relationship  (QSAR)  analysis  of  meisoindigo  derivative  compounds  as  inhibitor  for CDK4  in  order  to  get  QSAR  equation,  then  it  was  further  used  to  design  new  inhibitor based  meisoindigo  which  has  more  potent  and  selective  for  CDK4.  Data  compound  is divided  into  training  set  to  build  QSAR  models  and  the  test  set  to  validate  the  model. Calculation  was  done  by  MOE2009.10  descriptor  and  multilinear  regression  analysis, SPSS19.0.  The  results  showed  that  the  inhibitory  activity  of  mesoindigo  derived compounds  toward  CDK4  was  depended  on  several  dipole  moment,  total  energy, electronic  energy,  heat  of  formation,  and  solubility.  The  accuracy  of  QSAR  models proposed validated by cross validation techniques and with external validation. The results of  this  study  can  be  used  to  design  a  new  CDK4  inhibitor  compound  better  than meisoindigo derivative
Keywords : QSAR, meisoindigo, cancer, CDK4
Pendahuluan
Kanker  telah  menjadi  salah  satu penyebab  kematian  terbesar  di  seluruh dunia.  Sel  kanker  dicirikan  oleh pertumbuhan  yang  tidak  terkendali  dan pembelahan  terus-menerus  yang  lebih cepat  dibandingkan  dengan  sel  normal. Sel  kanker  terus  tumbuh  dan  bersifat invasif  sehingga  sel  normal  tubuh  dapat terdesak  atau  bahkan  mati.  Organisasi Kesahatan Dunia, World Health Organization (WHO)  (2012)  menyatakan bahwa di seluruh dunia terdapat 14,1 juta kasus  kanker  baru,  8,2  juta  kematian akibat  kanker  dan  32,6  juta  orang  hidup dengan  mengidap  penyakit  kanker.  Salah satu  penyakit  kanker  yang  banyak  terjadi yaitu  kanker  payudara.  Kanker  payudara menempati  urutan  ke  lima  penyebab kematian akibat kanker secara keseluruhan. Di Indonesia kanker payudara  merupakan  kanker  nomor  1 yang  sering  terjadi  pada  wanita  dengan angka  kejadian  30,5%  dan  angka kematian  21,5%  dibandingkan  dengan penyakit kanker lainnya (Depkes, 2009)
Terdapat  tiga  metode  penanganan kanker  yaitu  pembedahan,  radioterapi, dan  kemoterapi.  Pengobatan  dengan menggunakan obat-obat antikanker (kemoterapi)  dapat  dijadikan  suatu alternatif  dalam  penyembuhan  penyakit kanker.  Kekurangan  kemoterapi  yaitu selektivitas yang rendah, yaitu
berhubungan  dengan  ketidakmampuan agen kemoterapi membedakan sel normal dan  sel  kanker,  sehingga  penggunaannya dalam  jangka  panjang  dibatasi  karena memiliki  efek  samping  yang  berbahaya. Hal  ini  menuntut  perlunya  dilakukan usaha  terus-menerus  untuk  mendapatkan agen  anti  kanker  dengan  aktivitas  yang lebih  tinggi  dan  toksisitas  yang  lebih rendah.
Pada  tahun  2015,  Chiou  dkk. menunjukkan  bahwa  salah  satu  senyawa yang berpotensi sebagai antikanker adalah senyawa turunan meisoindigo. Meisoindigo adalah turunan dari senyawa indirubin yang sebelumnya telah diketahui  aktivitasnya  sebagai  antikanker dengan  mekanisme  kerja  menghambat cyclin  dependent  kinase (CDK)  pada pembelahan  sel.  Meisoindigo  memiliki
sifat  yang  kurang  toksik  dan  aktivitas lebih baik pada sel kanker.
Chiou  dkk.  (2015)  telah  meneliti beberapa  senyawa  turunan  meisoindigo dan  menguji  secara in  vitro terhadap  sel kanker  payudara  dan  diperoleh  fakta bahwa  turunan  meisoindigo  memiliki aktifitas  yang  baik  terhadap  sel  kanker payudara.  Diketahui  senyawa  turunan meisoindigo  berikatan  dengan  cyclin dependent  kinase  4  (CDK4)    yang merupakan  enzim  yang  berperan  dalam siklus sel sehingga mencegah pembelahan sel.
Pada  penelitian  ini  dilakukan  analisis Hubungan  Kuantitatif  Struktur-Aktivitas (HKSA)  senyawa  turunan  meisoindigo untuk  memperoleh  persamaan  HKSA. Suatu persamaan HKSA menggambarkan hubungan  matematis  antara  karakteristik fisiko-kimia  dengan  aktivitas  biologis pada suatu seri turunan senyawa tertentu. Hasil  penelitian  ini  diharapkan  dapat dijadikan  acuan  untuk  desain  senyawa turunan  meisoindigo  baru  yang  memiliki aktivitas penghambatan CDK4 yang lebih baik.

## METODE PENELITIAN
Data set
Sebanyak
20 senyawa turunan
meisoindigo  yang  disintesis  oleh  Chiou dkk  (2015)  yang  memiliki  aktivitas penghambatan  pada  CDK4  digunakan dalam penelitian ini. Gambar 1 dan  Tabel 1  menunjukkan  struktur  senyawa  yang digunakan.
N O NHR 3 O R 2 R 1 Gambar 1. Senyawa meisoindigo
Tabel 1. Turunan meisoindigo yang digunakan dalam penelitian (Chiou dkk (2015) Senyawa R1 R2 R3 IC 50 MCF-7 ( µ M) 1 H p- Cl-Ph p -pyridinil 14 2 H p- Cl-Ph 6-quinolinyl 3,5 3 H 3-methylisoxazolyl p -MeO-Ph 4 4 H 3-methylisoxazolyl p -pyridinil 3,6 5 H 3-methylisoxazolyl 6-quinolinyl 3,2 6 MeO 3-methylisoxazolyl 6-quinolinyl 2,3 7 H 2-naphthalenyl 6-quinolinyl 4,7 8 H p- CF 3 -Ph 6-quinolinyl 1,5 9 H p- Br-Ph 6-quinolinyl 2,5 10 H p- NO 2 -Ph 6-quinolinyl 2,4 11 Me p- Cl-Ph 6-quinolinyl 6,2 12 H 2,6- Cl 2 -Ph 6-quinolinyl 4,1 13 H 3-methylisoxazolyl 3-methylisoxazolyl 3,9 14 H 3-methylisoxazolyl m -pyridinil 13,4 15 MeO p- NH 2 -Ph 6-quinolinyl 27,9 16 MeO p- Br-Ph 6-quinolinyl 3,1 17 OH p- Br-Ph 6-quinolinyl 3,5 18 H H Phenyl 84,9 19 H H 6-quinolinyl 44,7 20 H Me 6-quinolinyl 64,3 Pengembangan model HKSA Untuk pengembangan model HKSA,  20  senyawa  tersebut  dibagi menjadi training set sebanyak 16 senyawa dan test set sebanyak 4 senyawa. Training set  digunakan  untuk  membangun  model HKSA,  sedangkan test  set digunakan untuk validasi model yang telah dibangun.
Senyawa dibangun menggunakan GaussView  dan  dioptimasi  menggunakan metode  semi  empirik  Austin  Model  1 (AM1).  Perhitungan  deskriptor  dilakukan menggunakan  perangkat  lunak  MOE (Molecular  Operating  Environment  - MOE  2009).  Model  HKSA  dibangun menggunakan  teknik  regresi  multi  linear untuk  mendapatkan  variabel  yang  paling penting  dan  paling  berpengaruh  pada aktivitas senyawa. Validasi model HKSA dilakukan  menggunakan  teknik  validasi silang leave  one  out (LOO)  yang diindikasikan  dengan  diperolehnya  nilai koefisien  validasi  silang  ( q 2 ).  Menurut Tropsha  (2010),  suatu  model  HKSA dianggap baik jika memiliki nilai q 2 > 0,5. Nilai q 2 diperoleh  dengan  menggunakan rumus berikut:
( ) ( ) 2 2 2 1 pred y y q y y − = − − ∑ ∑ (1)
dimana y pred adalah aktivitas prediksi, y adalah aktivitas eksperimen, dan dalah aktivitas rata-rata (Hawkins dkk. 2003).

## Hasil dan Pembahasan

## Pemilihan Data Set
Data set yang digunakan dalam penelitian ini  merupakan  20  senyawa  turunan meisoindigo  yang  telah  diuji  secara in vitro .  Data  set  ini  kemudian  dibagi menjadi  dua  kelompok  data  yakni  data training  set dan  data test  set .  Data training  set berfungsi  untuk  membuat persamaan  HKSA  dan  data test  set digunakan  untuk  memvalidasi  persamaan HKSA  yang  telah  terpilih.  Data training set terdiri  dari  16  senyawa  dan  data test set terdiri  dari  4  senyawa.  Data training set dan test set dapat dililihat pada Tabel 2.
Tabel  2 .  Data  senyawa training  set dan test set .
Kode Senyawa Log IC 50 Eksperimen ( µ M) S8 0,18
S6 0,36 S10 0,38 S9 0,4 S16 0,49 S5* 0,51 S2 0,54 S17 0,54 S4 0,56 S13 0,59 S3 0,6 S12 0,61 S7 0,67 S11* 0,79 S14 1,13 S1* 1,15 S15 1,45 S19* 1,65 S20 1,81 S18 1,93 Senyawa dengan tanda * adalah senyawa yang digunakan sebagai test set

## Perhitungan Nilai Deskriptor
Pada  setiap  senyawa  data  set  yang telah  dioptimasi  kemudian  dilakukan perhitungan  nilai  deskriptor  dengan menggunakan  aplikasi  MOE.  Deskriptor yang  digunakan  dalam  penelitian  ini meliputi  13  deskriptor  yang  mewakili  3 parameter utama yaitu parameter hidrofobik, elektronik dan sterik. Deskriptor  yang  digunakan  meliputi lipofilisitas (LogP), kelarutan (LogS), luas permukaan hidrofobik (ASA_H), polaritas atom  total  (Apol),  orbital  molekul tertinggi  yang  terisi  elektron, highest
occupied molecular orbital (AM1_HOMO),  orbital  molekul  terendah yang  tidak  terisi  elektron, lowest unoccupied molecular orbital
(AM1_LUMO),  energi  total  (AM1_E), energi  elektronik  (AM1_Eele),  momen dipol  (AM1_dipole),  panas  pembentukan (AM1_HF),  globularitas  (glob),  volume van  der  Waals  (Vol),  dan  refraktivitas molar (Mr). Setelah dilakukan perhitungan nilai deskriptor, dihitung nilai XZSCORE  dari  tiap  senyawa.    Nilai XZCORE  digunakan dalam menentukkan senyawa yang berpeluang besar dikeluarkan  jika  penyebaran  data  yang didapat tidak merata.

## Analisis Statistik Persamaan HKSA
Hasil  perhitungan  nilai  deskriptor  tiap senyawa  yang  telah  didapatkan  dari  hasil perhitungan  menggunakan  aplikasi  MOE digunakan  untuk  membangun  persamaan HKSA. dengan melakukan analisis regresi multilinear.  Analisis  regresi  multilinear ini  menggunakan  variabel  bebas  berupa nilai  13  deskriptor  dan  variabel  terikat berupa nilai IC 50 eksperimen dari masing- masing  senyawa training  set .    Hasil perhitungan    analisis    statistik    regresi multilinear  ditampilkan  pada Tabel  3 . Bedasarkan  analisis  tersebut,  didapatkan 10  model  persamaan  HKSA,  setelah  itu dipilih persamaan yang paling baik.
Tabel  3 .  Deskriptor  dan  nilai  koefisien  korelasi  serta standard  error  of  estimate (SEE) untuk setiap model HKSA
No. Deskriptor R R 2 Standard error of estimate (SEE) 1 (Konstan), vol, AM1_LUMO, AM1_HF,
AM1_dipole, glob, logS, AM1_HOMO, logP(o/w), AM1_E, ASA_H, apol, AM1_Eele 0,978 0,957 0,243 2 (Konstan),  vol,  AM1_HF,  AM1_dipole,  glob, logS, AM1_HOMO, logP(o/w), AM1_E, ASA_H, apol, AM1_Eele 0,978 0,956 0,214 3 (Konstan),  vol,  AM1_HF,  AM1_dipole,  glob, logS, AM1_HOMO, logP(o/w), AM1_E, ASA_H, AM1_Eele 0,976 0,952 0,198 4 (Konstan), vol, AM1_HF, AM1_dipole, glob, logS, AM1_HOMO, AM1_E, ASA_H, AM1_Eele 0,973 0,947 0,192 5 (Konstan),  vol,  AM1_HF,  AM1_dipole,  glob, 0,967 0,935 0,195
logS, AM1_E, ASA_H, AM1_Eele 6 (Konstan),  AM1_HF,  AM1_dipole,  glob,  logS, AM1_E, ASA_H, AM1_Eele 0,955 0,912 0,214 7 (Konstan),  AM1_HF,  AM1_dipole,  glob,  logS, AM1_E, AM1_Eele 0,949 0,901 0,213 8 (Konstan),  AM1_HF,  AM1_dipole,  logS, AM1_E, AM1_Eele 0,930 0,865 0,236 9 (Konstan),  AM1_HF,  AM1_dipole,  AM1_E, AM1_Eele 0,913 0,833 0,250 10 (Konstan), AM1_HF, AM1_E, AM1_Eele 0,887 0,786 0,272
Model  HKSA  yang  akan  terpilih  harus dapat  memenuhi  semua  kriteria  ststistik yang  digunakan  dan  memiliki  deskriptor yang  spesifik  yang  mewakili  parameter hidrofobik, elektronik, dan sterik. Beberapa  kriteria  statistik  yang  harus dipenuhi  adalah  nilai  R  >  0,8;  nilai  R 2 ≥ 0.8; F hitung / F tabel > 1 dan q 2 ≥ 0.5. Dari 10 model  persamaan  pada  Tabel  2,    model persamaan  8  yang  memiliki  nilai  R  = 0,930, nilai R 2 = 0,865, F hitung /F tabel = 3,84 dengan  jumlah  deskriptor  5  yang mewakili parameter hidrofobik,
elektronik, dan sterik. Selanjutnya, model 8  yang  telah  terpilih  divalidasi  untuk membuktikan    apakah  model  terpilih tersebut    benar-benar  merupakan  model persamaan  HKSA  yang  valid  dan prediktif.

## Validasi persamaan HKSA
Model  8  yang  telah  diperoleh  dari analisis  regresi  multilinear  kemudian divalidasi  menggunakan  teknik  validasi
silang  ( cross  validation ).  Cara  pengujian teknik  validasi  silang    yaitu  dengan menerapkan Leave  One  Out (LOO) menggunakan  kriteria q 2 .  Dengan  teknik LOO,  setiap  senyawa  yang  digunakan dihilangkan  data  aktivitas  eksperimennya dalam  analisis  regresi  multilinear.  Hasil dari  analisis  regresi  tersebut  kemudian dihitung  nilai q 2 nya.  Nilai q 2 semakin baik  jika  mendekati  satu.    Persamaan dikatakan  dapat  diterima  jika  nilai q 2 ≥ 0.5  (Tropsha,  2010).  Setelah  dilakukan analisis,    diperoleh  nilai  q 2 dari  model persamaan  8  yaitu  0,54.  Hasil  tersebut menunjukan    bahwa  model  8  dapat  telah valid  dan  dapat  digunakan  untuk menghitung  nilai  IC 50 prediksi  dari senyawa test set . Gambar 2 menunjukkan grafik  hubungan  antara  nilai  IC 50pred versus  log  IC 50eks untuk  senyawa  pada training set dan senyawa test set dan nilai koefisien  korelasi  sebesar  0,8789  yang mengindikasikan  bahwa  model  8  yang dipilih  valid  baik  secara  internal  maupun secara eksternal.
2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 log IC50 pred 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Log IC50ekp Y=1,0175x+0,0101 R 2 =0,8789
Gambar 2 . Grafik log IC 50pred versus log IC 50eks untuk senyawa pada training set (tanda plus) dan senyawa test set (tanda kotak).
Bentuk matematis persamaan HKSA terpilih adalah : LogIC 50 =  6,4301130  +    0,1074397(AM1_dipole)  +  0.0001182(AM1_E)  + − 0,0000096 (AM1_Eele) + − 0,0073190 (AM1_HF) + 0,0936594 (logS).

## Kesimpulan
Pada  penelitian  ini  telah  diperoleh  suatu model  HKSA  untuk  senyawa  turunan meisoindigo  yang  dapat  digunakan  untuk desain  turunan  baru  dari  senyawa meisoindigo dengan aktivitas penghambatan  CDK4  yang  lebih  baik. Persamaan HKSA terpilih adalah: LogIC 50 = 6,4301130 + 0,1074397(AM1_dipole) + 0.0001182(AM1_E) + − 0,0000096
(AM1_Eele)  + − 0,0073190  (AM1_HF)  + 0,0936594  (logS).  Persamaan  HKSA
tersebut  telah  divalidasi  secara  internal dan  secara  eksternal  menggunakan test set ,  sehingga  dapat  digunakan  untuk desain  senyawa  inhibitor  baru  CDK4 yang lebih poten dan selektif.

## Daftar Pustaka
Chiou, C., Wei C.L., Jiahn H.L., Jing J.C.,
Lie  C.L.,  Chih  Y.C,,  dkk.,  2015. Synthesis  and  Evaluation  Of  3- Ylideneoxindole  Acetamides  as Potent Anticancer Agents. European  Journal  Of  Medicinal Chemistry . 98(1) .
Depkes RI., 2009. Buku Saku Pencegahan Kanker  Leher  Rahim  dan  Kanker Payudara . Depkes RI. Jakarta. Hawkins,  D.M.,  Basak,  S.C.,  Mills,  D.,
2003. Assessing model fit by cross- validation.  J.  Chem.  Inf.  Comput. Sci. 43, 579–586.
Molecular Operating Environment (MOE), 2009.10; Chemical Computing  Group  Inc.,  Canada, 2009 .
SPSS  Inc  (2001)  SPSS  for  Windows, Version 11.0.1. SPSS Inc, Chicago. Tropsha  A.  Best  practices  for  QSAR model development, validation, and exploitation. Molecular Informatics. 2010; 29: 476-488.
WHO.,  2012.  GLOBOCAN  2012: Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. http://globocan.iarc.fr.  19  April 2016.