Research Article

## UNPAD

## Volume Variation of Sweet Orange ( Citrus sinensis ) Juice and Peel Extract Toward the Characteristic and Antibacterial Activity of Nanosilver

## David Sarono Putro*, Dian Eka Ermawati, Adi Yugatama
Department of Pharmacy, Mathematics and Natural Science Faculty, Universitas Sebelas Maret, Jalan Ir. Sutami 36 A Kentingan, Jebres, Surakarta 57126
Submitted 15 October 2020; Revised 8 December 2021; Accepted 8 December 2022; Published 25 February 2022 *Corresponding author: davidsaronoputro@gmail.com
Abstract Biosynthesis of nanosilver by using sweet orange ( C. sinensis ) as a bioreductor has shown nano- sized results. In this research, the effect of volume variation of sweet orange juice and peel extract combination toward the characteristics and antibacterial activity of synthesized nanosilver will be studied. Solution of AgNO3 1 mM was mixed with a combination of sweet orange juice – peel extract with ratios (v/v), 3:0; 1.5:1.5; 1:2; 0.5:2.5 and 0:3 at 60˚C for 45 minutes. The color change of the mixed solution indicated the formation of nanosilver and confirmed by using UV/Vis spectrophotometer and TEM analysis. The results show that the addition of sweet orange juice in combination accelerated the color change of the mixed solution. The characterization of nanosilver with UV/Vis spectrophotometer confirmed SPR peak at 438-459 nm. The stability test showed that nanosilver reduced with sweet orange juice-peel extract 0,5:2,5 (v/v) was stable and had inhibition diameter tested by the diffusion method against S.aureus (19.50 mm) and S.epidermidis (18.09 mm), indicates a moderate inhibition. Its TEM analysis confirmed the particle's size of about 30-56 nm with spherical form. Keywords: nanosilver, biosynthesis, Citrus sinensis, characteristic, antibacterial activity.
Variasi Volume Sari Buah dan Infusa Kulit Buah Jeruk ( Citrus sinensis ) Terhadap Karakteristik dan Aktivitas Antibakteri Nanosilver

## Abstrak
Biosintesis nanosilver dengan buah jeruk ( C. sinensis ) sebagai bioreduktor diketahui dapat menghasilkan perak berukuran nano. Penelitian ini bertujuan melihat pengaruh variasi volume kombinasi sari buah dengan  infusa  kulit  buah  jeruk  terhadap  karakteristik  dan  aktivitas  antibakteri  nanosilver.  Sintesis nanosilver dilakukan dengan mencampur larutan AgNO3 1 mM dengan kombinasi sari buah – infusa kulit buah jeruk dengan perbandingan (v/v), 3:0; 1,5:1,5; 1:2; 0,5:2,5 dan 0:3 pada penangas air bersuhu 60˚C  selama  45  menit.  Perubahan  warna  larutan  mengindikasikan  telah  terbentuknya  nanosilver dan  konfirmasi  dilakukan  dengan  spektrofotometer  UV/Vis  serta  analisis  TEM.  Hasil  penelitian menunjukkan  penambahan  sari  buah  pada  bioreduktor  kombinasi  dapat  mempercepat  terjadinya perubahan  warna  dan  karakterisasi  nanosilver  dengan  spektrofotometer  UV/Vis  mengkonfirmasi puncak  SPR  direntang  438-459  nm.  Pengujian  stabilitas  memperlihatkan  nanosilver  hasil  reduksi dengan kombinasi sari buah – infusa kulit buah jeruk 0,5:2,5 (v/v) memiliki stabilitas paling memenuhi syarat dan pengujian zona hambat dengan metode difusi terhadap bakteri S.aureus (19,50 mm) dan S.epidermidis (18,09 mm) yang dihasilkan lebih besar daripada nanosilver hasil reduksi kombinasi formula lainnya, yang mengindikasikan respon hambat sedang. Analisis TEM menunjukkan nanosilver berukuran 30-56 nm berbentuk bulat.
Kata Kunci: nanosilver, biosintesis, Citrus sinensis, karakteristik, aktivitas antibakteri.

## 1.  Pendahuluan
Nanosilver merupakan salah satu nanomaterial yang saat ini paling banyak digunakan baik dalam produk perawatan kesehatan, kosmetik, industri makanan, peralatan medis, hingga peralatan elektronik. 1
Selain itu, telah ditemukan bahwa silver merupakan logam dengan aktivitas antibakteri yang paling efektif dan yang paling sedikit toksik pada sel hewan bila dibandingkan dengan  logam  lain  yang  juga  memiliki aktivitas antibakteri. Silver umumnya digunakan dalam bentuk nitrat untuk menginduksi efek antibakteri. Namun, ketika silver  dibuat  menjadi  nanopartikel  maka terjadi  peningkatan  pada  luas  area  kontak dengan bakteri yang menyebabkan aktivitas antibakteri menjadi lebih efektif. 2
Berbagai metode telah dikembangkan untuk menghasilkan nanopartikel logam, yaitu dengan teknik fisika, seperti ablasi laser, litografi,  dan  iradiasi  energi  tinggi  ataupun dengan teknik kimia, seperti penggunaan bahan pereduksi kimia, elektrokimia, dan reduksi fotokimia. Akan tetapi, kedua teknik yang digunakan untuk sintesis nanopartikel logam ini sering kali sangat mahal dan tidak ramah lingkungan, karena penggunaan bahan kimia berbahaya, bersifat toksik, dan mudah terbakar serta dibutuhkannya energi yang tinggi. 3 Metode lain sebagai alternatif untuk sintesis nanopartikel logam adalah teknik biologi dengan salah satunya menggunakan ekstrak tumbuhan. Tumbuhan dipilih karena merupakan bahan yang ramah lingkungan dan hemat biaya serta bagian-bagian tumbuhan dapat dimanfaatkan seperti daun, akar, batang, biji,  dan  buah  untuk  sintesis  nanopartikel. Selain  itu,  ekstrak  tumbuhan  dapat  bekerja dengan baik pada biosintesis nanopartikel logam karena komponen-komponen yang terkandung secara alami dalam ekstrak tumbuhan, seperti gula pereduksi, keton/ aldehid, gugus amin, senyawa heterosiklik larut air, dan protein baik berperan sebagai reducing agents atau agen pereduksi yang mereduksi ion logam maupun sebagai capping agents  atau  agen  penstabil  yang  menjaga stabilitas nanopartikel logam. 4,5 Hasil  penelitian  Kaviya  et  al  (2011)
menyatakan  bahwa,  kulit  buah  jeruk  manis ( C. sinensis ) dapat dimanfaatkan sebagai bioreduktor dalam biosintesis nanosilver dengan dihasilkan nanosilver berukuran 10 ± 1 nm untuk reaksi pada suhu 60˚C selama 45  menit.  Pengembangan  penelitian  ini selanjutnya  dilakukan  oleh  Kahrilas  et  al (2014), dengan kulit buah jeruk manis sebagai bioreduktor dan pemanasan dengan bantuan microwave saat proses biosintesis, di mana didapatkan nanosilver berukuran 7,36 ± 8,06 nm dengan durasi sintesis selama 15 menit. Selain  kulit  buah  jeruk  manis,  sari  buah jeruk manis juga telah dimanfaatkan sebagai bioreduktor dalam biosintesis nanosilver. Sari  buah  jeruk  manis  digunakan  sebagai bioreduktor, karena di dalam sari buah jeruk manis terkandung asam sitrat dan asam askorbat yang memiliki kemungkinan untuk berperan sebagai pereduksi ion logam serta sebagai penstabil yang efektif dalam sintesis nanopartikel logam. 6,7
Meskipun demikian, stabilitas ukuran partikel nanosilver yang dihasilkan dari penelitian yang dilakukan baik oleh Kaviya et  al  (2011)  maupun  Kahrilas  et  al  (2014) belum diamati. Di sisi lain, pemanfaatan seluruh bagian buah jeruk manis seperti sari buah  dengan  kulit  buah  jeruk  manis  dalam bentuk kombinasi sebagai bioreduktor dalam  biosintesis  nanosilver  juga  belum pernah dilakukan sebelumnya. Kombinasi kedua  bagian  buah  jeruk  manis  ini  sebagai bioreduktor  dapat  menjadi  pilihan  alternatif dan sangat berpotensi dalam sintesis nanosilver karena terdapat bukti bahwa pada buah jeruk manis, komposisi fitokimia yang terkandung bervariasi antar bagian buah. Minyak atsiri, gula, asam organik, asam fenolik, dan flavonoid merupakan senyawa-senyawa yang dapat  ditemukan  di  dalam  sari  buah  jeruk manis.  Sedangkan  dalam  kulit  buah  jeruk manis dapat ditemukan senyawa-senyawa seperti asam fenolik, asam organik, flavonoid, peptida, dan minyak atsiri. 8,9,10 Oleh karena itu, dalam penelitian ini sari buah dan infusa kulit buah jeruk manis akan dikombinasikan untuk memanfaatkan senyawa-senyawa yang  terkandung  dalam  buah  jeruk  manis secara maksimal sebagai agen pereduksi serta
agen penstabil dalam biosintesis nanosilver dengan harapan mendapatkan nanosilver yang stabil dan waktu perubahan warna reaksi relatif singkat dengan ukuran partikel serta aktivitas antibakteri nanosilver terhadap bakteri S. aureus dan bakteri S. epidermidis yang dihasilkan lebih baik bila dibandingkan dengan nanosilver hasil biosintesis yang hanya menggunakan bioreduktor sari buah atau ekstrak kulit buah jeruk manis saja.

## 2.  Metode
2.1.  Alat Spektrofotometer UV/Vis (Genesys, Thermo  Fisher  Scientific:  Walthman, MA),  timbangan  analitik  (Mettler  Toledo AL204,  d=0,0001  g,  Colombus,  Ohio), timbangan  digital  (Precisa  XB620C,  d=0,01 g, Moosmattstrasse, Swiss), sentrifugator (Heraeus  Fresco  17,  Thermo  Fisher Scientific,  Jerman),  TEM  (JEM-1400  Flash Electron Microscope, Jeol, Jepang), hot plate (Maspion, Indonesia), cawan porselen, batang pengaduk, penangas air, termometer , flakon, dan alat-alat gelas.
2.2.  Bahan
Buah  jeruk  manis  Pacitan  ( Citrus sinensis (L. ) Osbeck diambil dari Kab pacitan,  Jawa Tengah  bulan April  2020  dan diidentifikasi  di  Laboratorium  taksonomi tumbuhan, Fakultas Biologi UGM Yogyakarta dengan  no  voucher  sepsimen  No  014953/S. Tb/II/2020.
Aqua bidestilata, silver nitrate 99,8% (Merck  yang  dikemas  ulang  oleh  CV Nitra  Kimia,  Yogyakarta),  NaOH,  bakteri Staphylococcus aureus ATCC  25923  dan Staphylococcus epidermidis ATCC  12228, nutrien agar, standar cakram klindamisin (Oxoid, DA-2), dan aqua destilata.
2.3.  Prosedur Penelitian

## 2.3.1. Preparasi Sari Buah dan Infusa Kulit
Buah Jeruk Manis
Sari  buah  jeruk  manis  diperoleh dengan  memeras  buah  jeruk  manis  untuk mendapatkan sari buah yang kemudian disaring dengan kertas saring. Sari buah yang diperoleh, disentrifugasi dengan kecepatan
10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dikumpulkan dan kemudian digunakan sebagai sari buah jeruk manis. 6 Sementara  itu,  infusa  kulit  buah  jeruk manis diperoleh dengan merebus kulit buah  jeruk  manis  dalam  aqua  bidestilata mendidih.  Sebanyak  4  g  kulit  buah  jeruk yang telah dibersihkan dan dipotong, dimasukkan ke dalam 40 mL aqua bidestilata mendidih selama 2 menit. Larutan infusa yang  diperoleh  selanjutnya  disaring  dengan menggunakan kertas saring Whatman No. 1 dan dikumpulkan untuk kemudian digunakan sebagai infusa kulit buah jeruk manis. 11
2.3.2. Biosintesis Nanosilver Biosintesis nanosilver dilakukan dengan mencampurkan sebanyak 3 mL bioreduktor kombinasi  ke  dalam  40  mL  larutan AgNO3 1 mM. Proses biosintesis dilakukan di atas penangas air yang telah diatur suhunya sebesar  60  ˚C,  dengan  waktu  pemanasan selama 45 menit. 11 Perbandingan volume sari buah  dengan  infusa  kulit  buah  jeruk  manis dalam bioreduktor kombinasi divariasikan sebagai variabel bebas. Formula bioreduktor kombinasi yang digunakan antara lain dengan perbandingan sebagai berikut (v/v), 3:0; 1,5:1,5; 1:2; 0,5:2,5 dan 0:3.
2.3.3. Karakterisasi Nanosilver Reseptor yang digunakan dalam penelKarakterisasi nanosilver hasil biosintesis dilakukan dengan pengamatan menggunakan instrumen Spektrofotometer UV/Vis dan TEM. Spektrofotometer UV/Vis digunakan untuk mengkonfirmasi  terbentuknya  nanosilver dari hasil biosintesis, yaitu dengan melihat posisi panjang gelombang maksimal (λmaks) pada spektra absorbansi. Larutan kombinasi sari buah dan infusa kulit buah jeruk manis digunakan sebagai blanko. Sampel diukur dengan panjang gelombang antara 200 sampai 800 nm. Sementara itu, TEM digunakan untuk melihat morfologi nanosilver, yaitu bentuk dan ukuran partikelnya. 12,13
2.3.4. Uji Stabilitas Nanosilver Pengujian  stabilitas  ukuran  partikel nanosilver dilakukan dengan melihat ada
atau tidaknya pergeseran λmaks pada spektra absorbansi spektrofotometer UV/Vis setelah nanosilver disimpan pada periode waktu tertentu. Nanosilver hasil biosintesis disimpan ke  dalam  lemari  pendingin  pada  suhu  4  ˚C selama satu bulan. Pada hari ke-1, 7, 14, 21, dan  29  penyimpanan  dilakukan  scanning spektra absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer UV/Vis. 5,13
Sementara itu, untuk melihat pengaruh pH media terhadap stabilitas nanosilver yang dihasilkan, maka dilakukan penyesuaian nilai pH media (6, 8, dan 10) dengan penambahan 0,1  mol/L  NaOH  ke  dalam  nanosilver  hasil biosintesis kombinasi sari buah dan infusa kulit buah jeruk manis. 14
2.3.5. Uji Aktivitas Antibakteri Nanosilver Pengujian  aktivitas  antibakteri  nanosilver dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumuran terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis . Media nutrien agar yang telah disiapkan, ke dalamnya masing-masing strain bakteri dikulturkan dengan meratakannya menggunakan batang ose steril. Selanjutnya,  sumuran  dengan  diameter  10  mm dibuat pada media dan sebanyak 100 µL larutan nanosilver dan aqua destilata sebagai kontrol negatif dimasukkan ke dalamnya. Standar cakram klindamisin, kemudian dipilih untuk digunakan sebagai kontrol positif. Setelah dilakukan inkubasi pada  suhu  37  ˚C  selama  24  jam,  zona  hambat bakteri yang terbentuk diukur. 11
2.3.6. Analisis Data Data dari hasil penelitian, antara lain data λmaks dari karakterisasi spektrofotometer UV/Vis diuji secara statistik dengan Kruskal- Wallis Test. Sementara itu, λmaks uji stabilitas nanosilver kelima formula selama satu bulan penyimpanan dan pengaruh penyesuaian
pH  terhadap  stabilitas  λmaks  nanosilver diuji  secara  statistik  dengan Wilcoxon Test . Pengujian statistik yang dilakukan seluruhnya menggunakan software SPSS v. 25.0. Nilai rata-rata dan standar deviasi didapatkan dari 3 replikasi pengujian sampel. 15
3.  Hasil Biosintesis nanosilver dalam penelitian eksperimental ini, dilakukan dengan mencampurkan bioreduktor kombinasi sari buah  –  infusa  kulit  buah  jeruk  manis  F1 (3:0 mL), F2 (1,5:1,5 mL), F3 (1:2 mL), F4  (0,5:2,5  mL)  dan  F5  (0:3  mL)  pada larutan AgNO 3 1 mM dan direaksikan di atas penangas air yang telah diatur suhunya sebesar 60 ˚C, dengan waktu reaksi selama 45 menit. Berdasarkan pengamatan, tiap formula menunjukkan  peristiwa  perubahan  warna larutan yang cukup berbeda antar formula. Data waktu perubahan warna dan warna yang teramati kelima formula nanosilver dapat  dilihat  di  Tabel  1.  Hasil  pengamatan menunjukkan  bahwa  semakin  banyak  sari buah  jeruk  manis  (F1)  yang  digunakan semakin cepat perubahan warna larutan yang terjadi (setelah 5 menit reaksi dimulai), serta semakin pekat warna larutan yang dihasilkan. Sebaliknya, semakin banyak infusa kulit buah jeruk manis (F5) yang digunakan perubahan warna  larutan  semakin  mendekati  (9  menit) dengan hasil dari penelitian yang dilakukan oleh Kaviya et al (2011), serta warna larutan yang  dihasilkan  tidak  terlalu  pekat.  Hal  ini terjadi kemungkinan disebabkan oleh karena adanya  perbedaan  profil  fitokimia  antara yang terkandung dalam sari buah dengan yang  terkandung  dalam  kulit  buah  jeruk manis. Sebagai perbandingan, asam sitrat dan asam askorbat ditemukan lebih banyak
Formula Waktu Perubahan Warna Warna yang Teramati F1 5 menit Cokelat pekat F2 5 menit Cokelat muda F3 9 menit Oranye pekat F4 9 menit Oranye bening F5 9 menit Kuning bening
Tabel 1. Waktu Perubahan Warna Nanosilver 5 Formula
di dalam sari buah daripada di dalam kulit buah  jeruk  manis. 8,10 Sebaliknya, senyawa- senyawa  flavonoid  seperti  hesperidin,  lebih banyak ditemukan di dalam kulit buah jeruk manis.16 Selain itu, dalam buah jeruk manis dapat  juga  ditemukan  golongan  senyawa lain yang terkandung pada satu bagian tapi tidak terkandung di bagian lain pada buah jeruk manis, misalnya karbohidrat/gula yang banyak ditemukan hanya di sari buah atau peptida yang banyak ditemukan hanya di kulit buah. 9 Karakterisasi nanosilver dengan spektrofotometer UV/Vis selanjutnya dilakukan dengan tujuan untuk mengkonfirmasi  terbentuknya  nanosilver dari hasil biosintesis dengan menggunakan bioreduktor kombinasi sari buah dan infusa kulit  buah  jeruk  manis  ( C. sinensis ), yaitu dengan menganalisis posisi λmaks nanosilver pada spektra absorbansi tiap formula yang hasil scanning dapat dilihat di Gambar 1. Berdasarkan hasil scanning, didapatkan posisi λmaks  nanosilver  F1,  F2,  F3,  F4,  dan  F5 secara berurutan yaitu 447, 443, 439, 438, dan 459  nm.  Pengujian  statistik  yang  dilakukan terhadap data λmaks karakterisasi nanosilver lima formula dengan spektrofotometer UV/ Vis menunjukkan bahwa dari uji normalitas, mayoritas data tidak terdistribusi secara normal yang dilihat dari nilai Sig. Shapiro- Wilk sebesar 0,000 < 0,05. Dengan demikian, untuk melihat perbedaan rata-rata posisi λmaks nanosilver antar kelima formula maka dilakukan pengujian statistik non parametrik dengan menggunakan Kruskal-Wallis Test. Berdasarkan dari uji statistik yang dilakukan
dengan Kruskal-Wallis Test, didapatkan nilai Asymp. Sig. sebesar 0,011 < 0,05 yang dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan hasil yang  signifikan  secara  statistik  antar  kelima formula. Dengan demikian, hasil karakterisasi nanosilver dengan s pektrofotometer UV/ Vis ini  menunjukkan  bahwa  kelima  formula bioreduktor kombinasi dapat digunakan sebagai bioreduktor untuk biosintesis nanosilver dengan karakteristik posisi λmaks nanosilver yang cukup berbeda antar formula. Oleh  karena  itu,  untuk  melihat  lebih  jelas pengaruh variasi volume kombinasi sari buah dan  infusa  kulit  buah  jeruk  manis  sebagai bioreduktor terhadap karakteristik nanosilver yang  dihasilkan  maka  pengujian  stabilitas nanosilver kelima formula bioreduktor kombinasi dilakukan.
Stabilitas ukuran partikel nanosilver dari hasil biosintesis dengan bioreduktor kombinasi sari buah – infusa kulit buah jeruk manis (F1, F2, F3, F4, dan F5) diamati selama satu bulan penyimpanan. Pengamatan stabilitas nanosilver dilakukan dalam beberapa waktu, yaitu hari ke-1, 7, 14, 21 dan 29 penyimpanan setelah  proses  biosintesis.  Posisi  λmaks digunakan sebagai salah satu parameter yang dianalisis untuk menentukan stabilitas kelima formula nanosilver. Selain itu, pengamatan fisik  pada  larutan  juga  dilakukan  untuk melihat ada atau tidaknya aglomerat yang terbentuk selama penyimpanan. Data posisi λmaks nanosilver kelima formula selama satu bulan penyimpanan dapat dilihat di Tabel 2. Berdasarkan dari hasil yang didapat terlihat bahwa selama satu bulan penyimpanan, posisi λmaks nanosilver kelima formula mengalami
Gambar 1. Spektra Absorbansi Nanosilver 5 Formula
pergeseran cukup beragam. Fluktuasi posisi λmaks lebih dari 1-4 nm terlihat terjadi pada nanosilver F1, F2, dan fluktuasi paling besar terjadi pada nanosilver F5. Pengujian statistik yang dilakukan terhadap data stabilitas posisi  λmaks  nanosilver  kelima  formula menunjukkan bahwa dari uji normalitas, data F5 tidak terdistribusi secara normal yang dilihat dari nilai Sig. Shapiro-Wilk sebesar 0,04 < 0,05. Dengan demikian, pengujian statistik non parametrik menggunakan Wilcoxon Test dipilih untuk membandingkan antara rata- rata posisi λmaks nanosilver hasil biosintesis menggunakan bioreduktor kombinasi sari buah dan infusa kulit buah jeruk manis (F2, F3,  dan  F4)  dengan  rata-rata  posisi  λmaks nanosilver hasil biosintesis menggunakan bioreduktor  sari  buah  jeruk  manis  saja  (F1) atau infusa kulit buah jeruk manis saja (F5) selama  satu  bulan  penyimpanan.  Hasil Wilcoxon Test antara nanosilver F2, F3 dan F4 terhadap nanosilver F5 menunjukkan nilai Asymp. Sig. sebesar 0,01 < 0,05 yang berarti bahwa  terdapat  perbedaan  yang  signifikan secara statistik antara rata-rata posisi λmaks nanosilver  F2,  F3  dan  F4  dengan  rata-rata posisi  λmaks  nanosilver  F5.  Sementara itu, hasil Wilcoxon Test yang  serupa  juga ditunjukkan  antara  nanosilver  F3  dan  F4 terhadap nanosilver F1 yaitu nilai Asymp. Sig. sebesar 0,01 < 0,05. Sedangkan, untuk hasil Wilcoxon Test antara nanosilver F2 terhadap nanosilver F1 menunjukkan nilai Asymp. Sig. sebesar 0,355 > 0,05 yang menandakan bahwa penambahan sari buah jeruk manis sebanyak 1,5 mL untuk dikombinasikan dengan infusa  kulit  buah  jeruk  manis  sebanyak  1,5 mL sebagai bioreduktor tidak memberikan perbedaan  signifikan  secara  statistik  bila dibanding dengan penggunaan sari buah jeruk  manis  saja  (F1)  sebagai  bioreduktor.
Sementara  itu,  dari  hasil  pengamatan  fisik larutan kelima formula nanosilver didapatkan bahwa pada hari ke-7 setelah biosintesis, terlihat aglomerat terbentuk pada dasar flakon larutan nanosilver F2 dan paling banyak pada larutan nanosilver F1.
Pengujian  pengaruh  pH  terhadap stabilitas ukuran partikel nanosilver selama satu bulan penyimpanan juga dilakukan dalam penelitian eksperimental ini untuk melihat adakah perbedaan yang dihasilkan dengan adanya penyesuaian pH. Pengujian diterapkan kepada dua formula variasi volume kombinasi sari buah dan infusa kulit buah jeruk, yaitu F3 dan  F4  yang  telah  terbukti  nanosilver  yang dihasilkan memiliki stabilitas yang baik. Kedua formula bioreduktor yang dipilih, setelah melalui proses biosintesis nanosilver kemudian  disesuaikan  pH  larutan  menjadi pH 6, 8, dan 10. Berdasarkan hasil pengujian, dapat dilihat bahwa dari kedua formula dengan  semakin  meningkatnya  pH  semakin terjadi pergeseran λmaks ke pergeseran biru/ blueshift. Dengan demikian, peningkatan pH yang diberikan untuk kedua formula tidak dapat  menjaga  stabilitas  nanosilver  selama satu bulan penyimpanan yang dilihat dari terjadinya fluktuasi posisi λmaks yang tidak teratur  pada  pH  10.  Sementara  itu  pada  pH 8,  posisi  λmaks  nanosilver  F4  mengalami fluktuasi yang sedikit lebih besar bila dibanding dengan  λmaks  nanosilver  F3.  Sebaliknya pada  pH  6,  fluktuasi  perubahan  nilai  λmaks untuk  kedua  formula  tidak  lebih  dari  1-4 nm  yang  mengkonfirmasi  bahwa  nanosilver dari hasil biosintesis dengan bioreduktor F3 dan  F4  pada  pH  6  stabil  selama  satu  bulan penyimpanan. Sementara itu, Wilcoxon Test juga  dipilih  pada  analisis  data  pengujian pengaruh  pH  ini  untuk  mengetahui  adakah perbedaan  yang  signifikan  secara  statistik
Tabel 2. Panjang Gelombang Maksimal Nanosilver 5 Formula Selama Satu Bulan Penyimpanan
Formula Panjang Gelombang (nm) Hari-1 Hari-7 Hari-14 Hari-21 Hari-29 F1 447 ± 3 442 ± 2 448 ± 1 448 ± 2 446 ± 1 F2 443 ± 1 444 ±1 448 ± 2 451 ± 3 451 ± 3 F3 439 ± 1 441 ± 2 439 ± 1 441 ± 1 440 ± 1 F4 438 ± 1 442 ± 1 438 ± 1 442 ± 1 440 ± 1 F5 459 ± 0 463 ± 2 453 ± 0 453 ± 1 452 ± 1
antara formula kontrol (pH 6) dengan formula yang disesuaikan pH-nya (pH 8 dan pH 10). Wilcoxon  Test  dipilih  karena  data  posisi λmaks pengaruh pH menunjukkan nilai Sig. Shapiro-Wilk < 0,05 untuk F4 pH 6 dan pH 8 yang berarti bahwa data tidak terdistribusi normal. Berdasarkan hasil Wilcoxon Test rata-rata  posisi  λmaks  nanosilver  F3  pH  8 terhadap F3 pH 6 serta rata-rata posisi λmaks nanosilver F4 pH 8 dan pH 10 terhadap F4 pH 6 menunjukkan nilai Asymp. Sig. sebesar 0,01 < 0,05 yang berarti bahwa terdapat perbedaan yang signifikan secara statistik saat dilakukan penyesuaian pH terhadap rata-rata posisi  λmaks  nanosilver  selama  satu  bulan penyimpanan.
Pengujian  aktivitas  antibakteri  pada penelitian eksperimental ini, dilakukan untuk mengetahui aktivitas antibakteri nanosilver dari hasil biosintesis dengan bioreduktor F3 dan F4 yang telah terbukti stabil selama satu bulan penyimpanan terhadap bakteri S.aureus dan S.epidermidis. Metode difusi sumuran digunakan untuk menguji aktivitas antibakteri nanosilver dengan diameter zona hambat sebagai parameter yang diukur. Data diameter zona hambat aktivitas antibakteri untuk
nanosilver F3 dan F4 dapat dilihat di Tabel 3. Data hasil pengujian memperlihatkan bahwa nanosilver hasil biosintesis baik dengan bioreduktor  F3  maupun  F4  menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap bakteri S.aureus dan S.epidermidis dengan dilihat dari terbentuknya zona hambat untuk masing- masing  bakteri  uji.  Berdasarkan  pengujian yang dilakukan, nanosilver F3 menghasilkan diameter  zona  hambat  sebesar  19,20  mm terhadap bakteri S.aureus dan  18,19  mm terhadap bakteri S.epidermidis, sedangkan nanosilver  F4  menghasilkan  diameter  zona hambat  sebesar  19,50  mm  terhadap  bakteri S.aureus dan  18,09  mm  terhadap  bakteri S.epidermidis . Analisis  dengan  menggunakan  TEM atau Transmission Electron Microscope digunakan sebagai tahapan karakterisasi akhir dalam penelitian eksperimental ini untuk melihat morfologi nanosilver dari hasil biosintesis, yang meliputi bentuk dan ukuran partikel. Gambar 2 memperlihatkan citra  hasil  pengamatan  dengan  TEM  yang mengkonfirmasi  terbentuknya  nanosilver dari hasil biosintesis dengan menggunakan bioreduktor F4 (0,5:2,5 mL). Nanosilver yang
Sampel Uji Diameter Zona Hambat (mm) Staphylococcus aureus (A) Staphylococcus epidermidis (B) F3 19,20 18,19 F4 19,50 18,09 K+ 31,38 33,26 K- 0 0

## Tabel 3. Diameter Zona Hambat Aktivitas Nanosilver F3 dan F4
Gambar 2. Citra TEM Nanosilver F4
dihasilkan berbentuk bulat dengan ukuran partikel terkecil 30 nm sampai ukuran partikel terbesar 56 nm.
4.  Pembahasan Selama proses biosintesis nanosilver, pengamatan dilakukan untuk melihat ada atau tidaknya peristiwa perubahan warna pada larutan. Pengamatan ini dilakukan, karena perubahan warna pada larutan saat proses biosintesis merupakan salah satu indikator dari terbentuknya nanosilver dalam larutan. 17 Peristiwa perubahan warna saat proses biosintesis juga disebutkan pada penelitian yang dilakukan oleh Kaviya et al (2011), di mana reaksi bioreduksi Ag + dengan penggunaan 3 mL ekstrak kulit buah jeruk  manis  (C.  sinensis)  pada  suhu  60  ˚C menunjukkan  perubahan  warna  dari  larutan tidak  berwarna  menjadi  larutan  berwarna kuning kecokelatan setelah 10 menit yang menandakan hadirnya nanosilver dalam larutan. Terbentuknya nanosilver dari reduksi ion logam Ag + pada penelitian eksperimental ini, tidak lepas dari peran senyawa-senyawa metabolit yang terkandung dalam buah jeruk manis seperti terpenoid, flavonoid, gula, asam fenolik, polifenol, dan protein. Berdasarkan dari studi-studi sebelumnya, terdapat dugaan bahwa  adanya  disosiasi  proton  gugus  –OH pada senyawa golongan terpenoid memicu terjadinya  resonansi  struktur  kimia  yang selanjutnya  dapat  menghasilkan  proses oksidasi senyawa tersebut sehingga ion logam tereduksi dan diikuti dengan pembentukan nanosilver. Di sisi lain, peristiwa transformasi tautomer  senyawa  golongan  flavonoid  dari bentuk  enol  menjadi  bentuk  keto  yang kemungkinan melepaskan hidrogen reaktif, dapat  menjadi  mekanisme  lain  dalam pembentukan nanosilver dari ion Ag + . Selain  itu,  flavonoid  merupakan  salah  satu golongan senyawa yang mampu mengkelat ion logam seperti ion Ag + sehingga kuat dugaan  flavonoid  juga  terlibat  pada  proses nukleasi dan agregasi atau fase pertumbuhan nanopartikel. Gugus aldehid yang ditemukan pada  monosakarida  seperti  glukosa,  juga diketahui dapat bertindak sebagai agen pereduksi. Adanya proses oksidasi gugus
aldehid yang terdapat pada struktur gula melalui penambahan nukleofil –OH, memicu terjadinya reduksi ion logam. Sementara itu, kehadiran senyawa-senyawa seperti protein, polisakarida, ligan organik dan komponen biologi lainnya pada permukaan nanopartikel telah diketahui dapat meningkatkan stabilitas partikel. 18 Dengan demikian, dilakukannya kombinasi antara sari buah dan infusa kulit buah jeruk manis merupakan salah satu upaya untuk memanfaatkan senyawa-senyawa metabolit yang terkandung dalam buah jeruk manis baik sebagai agen pereduksi maupun sebagai agen penstabil. Gambar 3 berikut merupakan salah satu kemungkinan yang dapat menjelaskan mekanisme reaksi reduksi ion silver dan kelasi nanosilver oleh senyawa flavonoid  Rutin  ( quercetin-3-O-rutinoside ) yang ditemukan pada ekstrak kulit buah jeruk manis untuk membentuk nanosilver yang stabil. 9,10,19,20 Hasil  karakterisasi  nanosilver  dengan spektrofotometer  UV/Vis  menunjukkan posisi  λmaks  yang  bervariasi  antar  formula. Posisi λmaks yang bervariasi ini dapat terjadi karena adanya beberapa pengaruh seperti dari ukuran partikel, bentuk nanosilver yang terbentuk, komposisi, dan senyawa penudung yang terdapat dalam larutan nanosilver. Penelitian Paramelle et al (2014) membuktikan bahwa nanosilver berukuran antara 20-100 nm menunjukkan korelasi baik dengan meningkatnya ukuran partikel maka posisi  λmaks  akan  bergeser  ke  pergeseran merah/redshift atau panjang gelombang yang lebih besar.
Pengamatan stabilitas nanosilver selanjutnya dilakukan dalam beberapa waktu, yaitu hari ke-1, 7, 14, 21 dan 29 penyimpanan setelah proses biosintesis. Parameter seperti suhu dan cahaya dikondisikan dalam penyimpanan, di mana suhu penyimpanan diatur  sebesar  4  ˚C  dan  flakon  tempat larutan nanosilver disimpan ditutup dengan alumunium foil untuk menghindari paparan cahaya. Pengaturan suhu penyimpanan dan pencegahan nanosilver terpapar cahaya ini dilakukan sebagai salah satu upaya untuk  menjaga  stabilitas  karena  nanosilver memperlihatkan  stabilitas  jangka  panjang
terbaik pada kondisi penyimpanan gelap dengan  suhu  5  ˚C. 5 Berdasarkan dari pengamatan yang dilakukan terlihat bahwa selama satu bulan penyimpanan, posisi λmaks nanosilver kelima formula mengalami
pergeseran cukup beragam yang menunjukkan kemungkinan  terjadinya  perubahan  ukuran partikel. 21 Pergeseran posisi λmaks nanosilver dapat dikatakan relatif konstan atau stabil, apabila selama penyimpanan perubahan
Gambar 3. Mekanisme Reaksi Reduksi Ion Silver oleh Senyawa Flavonoid
posisi λmaks berkisar antara 1-4. 22 Fluktuasi posisi λmaks lebih dari 1-4 nm terlihat terjadi pada nanosilver F1, F2, dan fluktuasi paling besar  terjadi  pada  nanosilver  F5.  Hal  ini menandakan bahwa dengan bioreduktor F1, F2, dan F5 nanosilver yang terbentuk tidak stabil selama masa satu bulan penyimpanan atau  dapat  juga  diduga  nanosilver  masih dalam fase pertumbuhan, karena morfologi nanosilver belum terbentuk sempurna dengan  ditandai  masih  terjadinya  fluktuasi posisi  λmaks. 23 Selain itu, adanya interaksi elektrostatik seperti misalnya peristiwa donor elektron dari oksigen elektronegatif dalam pelarut aqua bidestilata yang digunakan dapat berkontribusi pada terjadinya fluktuasi posisi λmaks. 24 Sementara itu, dari hasil pengamatan fisik  larutan  kelima  formula  nanosilver didapatkan bahwa pada hari ke-7 setelah biosintesis, terlihat aglomerat terbentuk pada dasar flakon larutan nanosilver F2 dan paling banyak pada larutan nanosilver F1. Terbentuknya  aglomerat  pada  bagian  dasar tempat nanosilver disimpan ini merupakan indikasi awal stabilitas nanosilver yang memburuk. 21 Dengan demikian, semakin banyak  sari  buah  jeruk  manis  (F1)  yang ditambahkan sebagai bioreduktor maka akan memungkinkan banyak aglomerat terbentuk selama waktu penyimpanan yang singkat sehingga akan mempengaruhi stabilitas nanosilver yang dihasilkan. Jadi, dari hasil pengukuran  posisi  λmaks  nanosilver  dan pengamatan  fisik  larutan  nanosilver  kelima formula selama satu bulan penyimpanan yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa nanosilver dari biosintesis dengan menggunakan  bioreduktor  F3  dan  F4  stabil selama satu bulan penyimpanan dilihat dari  pergeseran  posisi  λmaks  yang  teramati berkisar tidak lebih dari 1-4 nm serta selama penyimpanan  pada  dasar  flakon  tidak terbentuk aglomerat.
Pengujian  pengaruh  pH  selanjutnya dilakukan terhadap dua formula variasi volume kombinasi sari buah dan infusa kulit buah jeruk, yaitu F3 dan F4 yang telah terbukti nanosilver yang dihasilkan memiliki stabilitas  yang  baik.  Pengaruh  pH  berperan penting dalam potensi reduksi yang dimiliki
oleh  senyawa-senyawa  dalam  ekstrak  jeruk terhadap proses reduksi ion silver (Ag + ). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Konwarh et al (2011), dapat dijelaskan bahwa komponen senyawa aktif yang terkandung dalam  ekstrak  kulit  buah  jeruk  tidak  efektif untuk mereduksi pada kondisi lingkungan asam. Hal ini dikarenakan adanya stabilisasi struktural senyawa-senyawa tersebut yang utamanya berhubungan dengan ikatan hidrogen, di mana sebagai contoh asam askorbat yang telah dikenal sebagai agen reduksi akan mengalami penurunan potensi reduksinya pada kondisi lingkungan asam. Sementara itu, gugus nitrat dari garam perak pada  pH  rendah  merupakan  oksidator  kuat dibanding Ag + dan dapat mengoksidasi asam askorbat, sehingga reduksi Ag+ oleh asam askorbat tidak terjadi. 14
Hasil pengujian menunjukkan bahwa dari kedua formula dengan semakin meningkatnya pH semakin terjadi pergeseran λmaks ke pergeseran biru/blueshift. Pergeseran λmaks ke panjang gelombang yang semakin pendek  dengan  meningkatnya  nilai  pH  ini, juga  terjadi  pada  penelitian  yang  dilakukan oleh Qin et al (2010). Pada penelitian tersebut, meningkatnya  pH  akan  meningkatkan aktivitas asam askorbat untuk mereduksi Ag + dan dihasilkanlah pergeseran biru yang menandakan pengurangan ukuran rata- rata nanosilver yang terbentuk. Umumnya, asam askorbat pada kondisi netral bertindak sebagai donor elektron stabil dan bersama dengan ion radikal semidehydroascorbic acid bertanggung jawab dalam reaksi reduksi Ag + menjadi Ag0 . 25 Akan tetapi pada kondisi basa, asam askorbat mengalami ionisasi yang sebagai hasilnya hanya semidehydroascorbic acid saja  yang  bertanggung  jawab  dalam reduksi Ag + dan dengan demikian saat proses nukleasi untuk membentuk nanosilver hanya sedikit Ag 0 yang terlibat sehingga ukuran partikel nanosilver yang terbentuk lebih kecil. Adanya penambahan sitrat sebagai penstabil dalam penelitian yang dilakukan oleh Qin et al (2010) tidak menghasilkan perbedaan
selama reduksi Ag + , sehingga menguatkan dugaan bahwa reaktivitas asam askorbat yang  berperan  saat  pH  diubah.  Meskipun demikian, stabilitas nanosilver hasil sintesis dengan reduktor asam askorbat selama penyimpanan  dengan  adanya  pengaruh  pH belum  dijelaskan.  Berdasarkan  dari  hasil penelitian eksperimental ini, peningkatan pH yang diberikan untuk kedua formula tidak dapat  menjaga  stabilitas  nanosilver  selama satu bulan penyimpanan yang dilihat dari terjadinya fluktuasi posisi λmaks yang tidak teratur  pada  pH  10.  Sedangkan  pada  pH 8,  posisi  λmaks  nanosilver  F4  mengalami fluktuasi  yang  sedikit  lebih  besar  bila dibanding  dengan  λmaks  nanosilver  F3. Sebaliknya  pada  pH  6,  fluktuasi  perubahan nilai λmaks untuk kedua formula tidak lebih dari  1-4  nm  yang  mengkonfirmasi  bahwa nanosilver dari hasil biosintesis dengan bioreduktor  F3  dan  F4  pada  pH  6  stabil selama satu bulan penyimpanan.
Nanosilver hasil biosintesis baik dengan bioreduktor ekstrak kulit buah jeruk maupun  sari  buah  jeruk  manis  ( C. sinensis ) telah  diketahui  menunjukkan  aktivitas antibakteri terhadap bakteri-bakteri, seperti E.coli, P.aeruginosa, S.aureus, B.subtilis, dan Shigella. 7,11,13 Bakteri S.aureus dan S.epidermidis dipilih sebagai bakteri uji  karena  keduanya  termasuk  bakteri Staphylococcus yang banyak ditemukan pada kulit manusia dan merupakan patogen yang dapat menyebabkan penyakit infeksi oportunistik. 26,27 Meskipun demikian, kedua bakteri tersebut memiliki karakteristik yang cukup berbeda. Bila bakteri S.epidermidis merupakan bakteri Staphylococcus golongan coagulase-negatif, maka berbeda halnya dengan bakteri S.aureus yang termasuk bakteri Staphylococcus golongan coagulase-positif  yang  bekerja  dengan mengurangi enzim coagulase sehingga dapat menyebabkan sakit parah hingga kematian. Di sisi lain, terdapat bukti bahwa strain bakteri S.epidermidis tertentu menghasilkan modulin larut fenol yang secara selektif menghambat pertumbuhan patogen kulit serta dapat memodulasi respons imun non spesifik host untuk melawan patogen, seperti
bakteri S.aureus . 27,28 Sementara itu, bakteri S.epidermidis juga diduga ikut terlibat dalam patofisiologi jerawat melalui interaksi dengan bakteri P.acnes atau yang saat ini berganti nama  menjadi  bakteri C.acnes , bakteri utama  penyebab  jerawat.  Pada  kulit  sehat bakteri C.acnes berperan dalam menghambat pertumbuhan bakteri S.aureus , sebaliknya saat kolonisasi berlebihan bakteri ini terjadi maka peradangan pada kulit yang menyebabkan terbentuknya  jerawat  dapat  berkembang. Bakteri S.epidermidis dan bakteri C.acnes keduanya menggunakan gliserol sebagai sumber karbon dalam produksi asam lemak rantai pendek yang berfungsi untuk menjadi agen antimikroba dalam kompetisi satu sama lain sehingga kesetimbangan kedua bakteri pada kulit dapat terjaga. Penggunaan antibakteri topikal seperti eritromisin dan klindamisin monoterapi untuk mengatasi kolonisasi berlebihan bakteri C.acnes pada penelitian-penelitian sebelumnya, menunjukkan  bahwa  tidak  hanya  jumlah bakteri C.acnes yang  berkurang,  tetapi  juga bakteri S.epidermidis yang sangat bermanfaat untuk  menjaga  kesetimbangan  flora  normal kulit serta menghambat pertumbuhan patogen kulit penyebab penyakit. Selain itu, penggunaan kedua antibakteri topikal tersebut secara berlebihan dapat memicu perkembangan resistensi baik terhadap bakteri C.acnes maupun bakteri S.epidermidis . 27,29 Dengan demikian, nanosilver hasil biosintesis menggunakan  bioreduktor  F3  atau  F4 diharapkan dapat dimanfaatkan sebagai agen antibakteri topikal alternatif terhadap bakteri S.aureus dan S.epidermidis untuk mengatasi jerawat. Hasil pengujian aktivitas antibakteri menunjukkan diameter zona hambat nanosilver F3  dan  F4  terhadap  bakteri  S.aureus  dan S.epidermidis yang terbentuk berada dalam rentang 16-20 mm, di mana respons hambat pertumbuhan agen antibakteri pada rentang ini  diklasifikasikan  sebagai  kategori  sedang untuk menghambat pertumbuhan bakteri.30 Sementara itu, dari hasil pengujian aktivitas antibakteri nanosilver dari biosintesis dengan ekstrak kulit buah jeruk manis saja terhadap bakteri S.aureus yang dilakukan oleh Kaviya et  al  (2011)  menunjukkan  diameter  zona
hambat sebesar 7,8 mm untuk sintesis pada suhu 25 ˚C dan 9,2 mm untuk sintesis pada suhu 60 ˚C di mana diameter-diameter zona hambat ini masuk dalam rentang <10 mm dan  diklasifikasikan  sebagai  kategori  tidak ada respon hambat pertumbuhan bakteri. 30
Menurut Kaviya et al (2011), diameter zona hambat nanosilver yang kurang dari 10 mm tersebut disebabkan karena bakteri S.aureus merupakan bakteri gram-positif yang memiliki struktur dinding sel tebal tersusun dari lapisan peptidoglikan yang mengandung polisakarida berikatan cross-linked dengan peptida sehingga membentuk struktur kaku yang menyulitkan nanosilver untuk berpenetrasi ke dalamnya.
Analisis  TEM  yang  dilakukan, mengkonfirmasi  terbentuknya  nanosilver dari hasil biosintesis dengan menggunakan bioreduktor F4 (0,5:2,5 mL). Nanosilver yang dihasilkan berbentuk bulat dengan ukuran partikel terkecil 30 nm sampai ukuran partikel terbesar 56 nm. Sebagai pembanding, hasil karakterisasi TEM nanosilver dari biosintesis menggunakan ekstrak kulit buah jeruk manis saja yang dilakukan oleh Kaviya et al (2011) didapatkan ukuran partikel sebesar 35 ± 2 nm  dengan  sintesis  pada  suhu  25  ˚C  dan ukuran partikel sebesar 10 ± 1 nm dengan sintesis  pada  suhu  60  ˚C.  Sementara  itu, dengan bantuan microwave pada penelitian Kahrilas  et  al  (2014)  nanosilver  yang didapatkan  menunjukkan  partikel-partikel dengan diameter yang beragam di mana 56 nm merupakan ukuran partikel terbesar nanosilver yang terukur dan rata-rata ukuran partikel yaitu 7,36 ± 8,06 nm. Sedangkan, karakterisasi TEM nanosilver hasil biosintesis menggunakan ekstrak kulit buah jeruk manis yang dilakukan oleh Annu et al (2018) didapatkan ukuran partikel berkisar antara 9-46  nm.  Selain  itu,  dari  hasil  penelitian- penelitian yang telah disebutkan, didapatkan kesamaan  terhadap  jenis  distribusi  ukuran partikel dan morfologi bentuk nanosilver yang dihasilkan.  Karakterisasi  TEM  nanosilver dari hasil biosintesis dengan menggunakan ekstrak kulit buah jeruk manis ( C. sinensis ) menunjukkan  nanosilver  terdistribusi  secara polidispers dan berbentuk bulat. Sementara
itu,  hasil  karakterisasi TEM  pada  penelitian eksperimental ini juga mengkonfirmasi hasil yang serupa, yaitu nanosilver terdistribusi kemungkinan secara polidispers dan berbentuk bulat. Partikel-partikel besar yang ditemukan dari  hasil  karakterisasi  TEM  baik  pada penelitian-penelitian yang telah disebutkan di atas maupun pada penelitian eksperimental ini, disebabkan karena kandungan senyawa- senyawa dalam bioreduktor yang kompleks dapat  memberikan  efek  signifikan  terhadap sifat aglomerasi dan dekomposisi nanosilver yang dihasilkan. Selain itu, suhu reaksi yang dipilih juga merupakan faktor penting untuk bisa mendapatkan ukuran partikel nanosilver yang diinginkan. 17 Dengan demikian, meskipun ukuran partikel nanosilver yang dihasilkan masih masuk dalam kisaran rata-rata dari hasil penelitian-penelitian yang telah disebutkan, hasil karakterisasi TEM  yang  telah  dilakukan  pada  penelitian eksperimental  ini  menunjukkan  bahwa variasi volume kombinasi sari buah dan infusa kulit buah jeruk manis yang digunakan sebagai bioreduktor dapat mempengaruhi karakteristik ukuran partikel nanosilver yang dihasilkan bila dibandingkan dengan penggunaan  ekstrak  kulit  buah  jeruk  manis saja sebagai bioreduktor tunggal

## 5.  Simpulan
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan penambahan sari buah pada bioreduktor kombinasi  dapat  mempercepat  terjadinya perubahan warna dan karakterisasi nanosilver dengan spektrofotometer UV/Vis mengkonfirmasi  puncak Surface Plasmon Resonance (SPR)  direntang  438-459 nm.  Pengujian  stabilitas  memperlihatkan nanosilver hasil reduksi dengan kombinasi sari  buah  –  infusa  kulit  buah  jeruk  0,5:2,5 (v/v) memiliki stabilitas paling memenuhi syarat  dan  pengujian  zona  hambat  dengan metode difusi terhadap bakteri S.aureus (19,50  mm)  dan S.epidermidis (18,09 mm) yang dihasilkan lebih besar daripada nanosilver hasil reduksi kombinasi formula lainnya, yang mengindikasikan respon hambat sedang. Analisis TEM menunjukkan nanosilver berukuran 30-56 nm bentuk bulat.

## Daftar Pustaka
1. Rezvani,  E.,  Rafferty,  A.,  McGuinness, C.,  Kennedy,  J.  2019.  Adverse  Effects of Nanosilver on Human Health and The Environment. Acta Biomaterial, 94:145– 159.
2.  Ahmed, S., Ahmad, M., Swami, BL., Ikram, S. 2016. A Review on Plants Extract  Mediated  Synthesis  of  Silver Nanoparticles for Antimicrobial Applications: A Green Expertise. Journal of Advanced Research, 7(1):17–28.
3.  Rai, M., Alves dos Santos, C. 2017.  Nanotechnology  Applied  To Pharmaceutical  Technology.  Springer International Publishing.
4.  Hebbalalu, D., Lalley, J., Nadagouda, M N., Varma, RS. 2013. Greener Techniques for The Synthesis of Silver Nanoparticles Using  Plant  Extracts,  Enzymes, Bacteria, Biodegradable Polymers, and Microwaves. ACS Sustainable Chemistry & Engineering, 1(7):703–712.
5. Velgosova, O., Čižmárová, E., Málek, J., Kavuličova,  J.  2017.  Effect  of  Storage Conditions  on  Long-Term  Stability  of Ag Nanoparticles Formed via Green Synthesis. International Journal of Minerals, Metallurgy, and Materials, 24(10):1177–1182.
6. Sujitha,  MV.,  Kannan,  S.  2013.  Green Synthesis of Gold Nanoparticles Using Citrus Fruits (Citrus limon, Citrus reticulata and Citrus sinensis) Aqueous Extract  and  Its  Characterization. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 102:15– 23.
7. Arooj, N., Dar, N., Samra, ZQ. 2014. Letter to the Editor Stable Silver Nanoparticles Synthesis by Citrus sinensis (Orange) and Assessing Activity Against Food Poisoning Microbes. Biomedical and Environmental  Sciences,  27(10):815– 818.
8. Kelebek, H., Selli, S. 2011. Determination of  Volatile,  Phenolic,  Organic  Acid and  Sugar  Components  in  A  Turkish cv. Dortyol (Citrus sinensis L. Osbeck) Orange Juice. Journal of the Science of
Food and Agriculture, 91(10):1855–1862.
9.  Favela-Hernández,  JM.,  González- Santiago, O., Ramírez-Cabrera, MA.,
Esquivel-Ferriño,
PC., Camacho- Corona Mdel, R. 2016. Chemistry and Pharmacology of Citrus sinensis. Molecules, 21(2):247.
10. Liew,  SS.,  Ho,  WY.,  Yeap,  SK., Sharifudin, SAB. 2018. Phytochemical Composition  and  In  Vitro  Antioxidant Activities of Citrus sinensis Peel Extracts.
PeerJ, 6(8):e5331.
11. Kaviya, S., Santhanalakshmi, J., Viswanathan,  B.,  Muthumary,  J., Srinivasan, K. 2011. Biosynthesis of Silver Nanoparticles Using Citrus sinensis Peel Extract and Its Antibacterial Activity. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy,
79(3):594–598.
12. Konwarh, R., Gogoi, B., Philip, R., Laskar, MA., Karak, N. 2011. Biomimetic Preparation of Polymer-Supported Free Radical Scavenging, Cytocompatible and Antimicrobial ‘Green’ Silver Nanoparticles Using Aqueous Extract of Citrus sinensis Peel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 84(2):338–345.
13. Annu., Ahmed, S., Kaur, G., Sharma, P., Singh,  S.,  Ikram,  S.  2018.  Fruit  Waste (Peel) as Bio-Reductant to Synthesize Silver Nanoparticles with Antimicrobial. Antioxidant  and  Cytotoxic  Activities. Journal of Applied Biomedicine,
16(3):221–231.
14. Qin,  Y.,  Ji,  X.,  Jing,  J.,  Liu,  H.,  Wu, H.,  Yang,  W.  2010.  Size  Control  Over Spherical Silver Nanoparticles by Ascorbic Acid Reduction. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 372(1–3):172–176.
15. Puišo, J., Jonkuvienė, D., Mačionienė, I., Šalomskienė, J., Jasutienė, I., Kondrotas, R.  2014.  Biosynthesis  of  Silver Nanoparticles Using Lingonberry and Cranberry Juices and Their Antimicrobial Activity. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, 121: 214–221.
16. Celano, R., Campone, L., Pagano, I., Carabetta, S., DiSanzo, R., Rastrelli,
L.,  Piccinelli,  AL.,  Russo,  M.  2019. Characterisation of Nutraceutical Compounds  from  Different  Parts  of Particular Species of Citrus sinensis ‘Ovale Calabrese’  by  UHPLC-UV-ESI-HRMS. Natural Product Research, 33(2):244–251.
17. Kahrilas, GA., Wally, LM., Fredrick, SJ., Hiskey, M., Prieto, AL., Owens, JE. 2014. Microwave-Assisted Green Synthesis of Silver Nanoparticles Using Orange Peel Extract.  ACS  Sustainable  Chemistry  & Engineering, 2(3):367–376.
18. Makarov, VV., Love, AJ., Sinitsyna, OV., Makarova, SS., Yaminsky, IV., Taliansky, ME.,  Kalinina,  NO.  2014.  "Green" Nanotechnologies: Synthesis of Metal Nanoparticles Using Plants. Acta Naturae, 6(1):35-44.
19. Aziz,  SB.,  Hussein,  G.,  Brza,  MA., Mohammed, SJ., Abdulwahid, RT., Raza, SS., Hassanzadeh, A. 2019. Fabrication of Interconnected Plasmonic Spherical Silver Nanoparticles  with  Enhanced  Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) Peaks Using Quince Leaf Extract Solution. Nanomaterials, 9(11):1557.
20. Kapešová, J., Petrásková, L., Markošová, K.,  Rebroš,  M.,  Kotik,  M.,  Bojarová, P.,  Křen,  V.  2019.  Bioproduction  of Quercetin and Rutinose Catalyzed by Rutinosidase: Novel Concept of “Solid State Biocatalysis”. International Journal of Molecular Sciences, 20(5):1112.
21. Rai, M., Shegokar, R. 2017. Metal Nanoparticles in Pharma. Springer International Publishing.
22. Ridwan, RN., Gusrizal, G., Nurlina, N., Santosa,  SJ.  2019.  Sintesis  dan  Studi Stabilitas  Nanopartikel  Perak  Tertudung Asam Salisilat. Indonesian Journal of Pure and Applied Chemistry, 1(3):83.
23. Kanchi, S., Ahmed, S. 2018. Green Metal Nanoparticles: Synthesis,Characterization and  Their  Applications.  New  Jersey: Wiley-Scrivener Publishing LLC.
24. Mogensen,  KB.,  Kneipp,  K.  2014.  Size- Dependent Shifts of Plasmon Resonance in Silver Nanoparticle Films Using Controlled  Dissolution:  Monitoring  The Onset  of  Surface  Screening  Effects.
The  Journal  of  Physical  Chemistry  C, 118(48):28075–28083.
25. Zhang, N.,   Yu, X.,   Hu, J.,   Xuea, F., Ding, E. 2013. Synthesis of silver nanoparticle- coated poly-(styrene-co-sulfonic acid) hybrid materials and their application in surface-enhanced Raman scattering (SERS) tags. RSC Adv, (3):13740-13747.
26. Coates, R., Moran, J., Horsburgh, MJ. 2014. Staphylococci: Colonizers and Pathogens of  Human  Skin.  Future  Microbiology, 9(1):75–91.
27. Claudel,  JP.,  Auffret,  N.,  Leccia,  MT., Poli,  F.,  Corvec,  S.,  Dréno,  B.  2019. Staphylococcus epidermidis: A Potential New  Player  in  The  Physiopathology  of Acne. Dermatology, 235(4):287-294.
28. González-Martín,  M.,  Corbera,  JA., Suárez-Bonnet,  A.,  Tejedor-Junco,  MT. 2020.  Virulence  Factors  in  Coagulase- Positive  Staphylococci  of  Veterinary Interest other than Staphylococcus aureus The Veterinary Quarterly, 40(1):118–131.
29. Dreno, B., Martin, R., Moyal, D., Henley, JB., Khammari, A., Seité, S. 2017. Skin  Microbiome  and  Acne  Vulgaris: Staphylococcus. A New Actor in Acne, Exp Dermatol, 26(9):798-803.
30. Fauziah,  AS.,  Ri.,  Hendriani,  R.  2015. Tinjauan  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak Cassia  fistula  Terhadap  Staphylococcus aureus  dan  Escherichia  coli:  Artikel Review. Farmaka, 15(2):101–110.