EISSN: 2407-7690 https://ejournal3.undip.ac.id/index.php/jmr

## Identifikasi Molekuler dan Uji Potensi Khamir Laut sebagai Penghasil Enzim Esktraseluler
Wa Ode Rima Alam Sari Bolu 1 , Wilis Ari Setyati 2 *, Sri Sedjati 3
Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. Jacub Rais, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia *Corresponding author, e-mail: wilisarisetyati@yahoo.co.id
ABSTRAK: Khamir merupakan jamur bersel tunggal yang memiliki fase reproduksi aseksual berupa pembelahan sel serta reproduksi seksual yang tidak membentuk badan buah. Penelitian mengenai keanekaragaman  khamir  pada  lingkungan  terestrial  telah  dieksplorasi  dengan  baik,  namun penelitian  mengenai  khamir  laut  tergolong  relatif  sedikit.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah mengidentifikasi  khamir  laut  secara  molekuler  dan  menentukan  potensi  khamir  laut  sebagai penghasil  enzim  ekstraseluler.  Metode  dalam  penelitian  ini  yaitu  peremajaan  isolat,  uji  aktivitas enzim, karakterisasi morfologi khamir secara makroskopis meliputi bentuk koloni, margin, elevasi, appearance,  tekstur,  dan  warnanya,  serta  karakterisasi  mikroskopis  meliputi  bentuk  koloni  dan kenampakan  pertunasan  sel.  Identifikasi  molekuler  dilakukan  menggunakan Polymerase  Chain Reaction (PCR)  dengan  tahapan  ekstraksi  DNA,  amplifikasi  DNA,  pengecekan  kualitas  DNA, analisis  sekuens  DNA  dan  pembuatan  pohon  filogenetik.  Berdasarkan  identifikasi  molekuler menggunakan  primer  universal  (ITS1  dan  ITS4)  dengan  nilai  percent  similarity  sebesar  99.05%, isolat PB3.2 teridentifikasi sebagai spesies Candida tropicalis. Isolat ini tidak menunjukkan adanya kemampuan dalam memproduksi enzim amilase dan enzim protease.
Kata kunci: Enzim Ekstraseluler; Khamir Laut; Polymerase Chain Reaction

## Molecular Identification and Assessment of Marine Yeasts as Producers of Extracellular
Enzymes
ABSTRACT: Yeast is a unicellular fungus with a phase of asexual reproduction through cell division and lacks the formation of fruiting bodies during sexual reproduction. Research on yeast diversity in terrestrial  environments  has  been  well-explored;  however,  research  on  marine  yeast  is  relatively limited.  This  study  aims  to  molecularly  identify  marine  yeast  and  determine  their  potential  as producers  of  extracellular  enzymes.  The methods  employed in this  study  include strain isolation, enzyme activity assays, macroscopic morphological characterization of yeast, encompassing colony shape, margin, elevation, appearance, texture, and color, as well as microscopic characterization, involving colony shape and budding patterns. Molecular identification was performed through  the stages of DNA extraction, DNA amplification, DNA quality assessment, DNA sequence analysis, and the construction of a phylogenetic tree. Based on molecular identification using universal primers (ITS1 and ITS4) with a percent similarity value of 99.05%, isolate PB3.2 was identified as Candida tropicalis species. This isolate did not exhibit the ability to produce amylase and protease enzymes.
Keywords: Extracellular Enzymes; Marine Yeasts; Polymerase Chain Reaction

## PENDAHULUAN
Enzim merupakan molekul spesifik yang memiliki peran sebagai biokatalisator dalam reaksi kimia di dalam sel hidup yang umumnya berkaitan dengan proses metabolisme sel  (Prihatini dan Dewi, 2021). Berdasarkan fungsinya, enzim terdiri dari dua jenis, yaitu enzim intraseluler dan enzim ekstraseluler  (Remijawa et  al. ,  2020).  Enzim  intraseluler  merupakan  enzim  yang  disintesis  dan digunakan di dalam sel, sedangkan enzim ekstraseluler merupakan enzim yang disintesis di dalam
Journal of Marine Research Vol 13, No. 2 Mei 2024, pp. 257-264
sel  kemudian  disekresikan  ke  lingkungan  untuk  menghidrolisis  komponen  kompleks  menjadi komponen yang lebih sederhana (Dewi, 2020). Dalam bidang industri, enzim umumnya digunakan untuk  menyederhanakan  senyawa  kompleks  menjadi  senyawa  yang  lebih  sederhana  pada pembuatan suatu produk. Namun, pengaplikasian enzim pada bidang industri membutuhkan biaya yang  cukup  tinggi  (DiCosimo et  al. ,  2013).  Perkembangan  ilmu  pengetahuan  menawarkan penggunaan mikroorganisme sebagai sumber alternatif penghasil enzim.
Jamur merupakan organisme eukariotik yang memiliki spora sebagai sistem reproduksinya. Berdasarkan  klasifikasinya,  jamur  terbagi  menjadi  tiga  kelompok,  yaitu  mushroom,  kapang,  dan khamir.  Khamir  merupakan  jamur  bersel  tunggal  yang  memiliki  fase  reproduksi  aseksual  berupa pembelahan  sel  serta  reproduksi  seksual  yang  tidak  membentuk  badan  buah  (Boekhout et  al. , 2022). Persebaran khamir tergolong luas karena khamir mampu hidup pada berbagai lingkungan, termasuk pada wilayah bersalinitas. Khamir laut merupakan khamir yang diisolasi dari lingkungan laut  dan  mampu  tumbuh  lebih  baik  pada  media  bersalinitas  (Chi et  al. ,  2010).  Bernhard  Fischer merupakan ilmuwan pertama yang mengisolasi khamir laut pada tahun 1894 dari perairan Samudera Atlantik (Kutty dan Philip, 2008). Mikroorganisme laut termasuk khamir laut hidup pada lingkungan yang ekstrem. Hal tersebut memberikan potensi yang unik bagi khamir untuk mensintesis senyawa fungsional  maupun  enzim  yang  digunakan  sel  khamir  sebagai  pertahanan  sel  maupun  agen katalisator pada proses metabolisme (Connell et al. , 2008). Khamir laut dilaporkan memiliki potensi untuk memproduksi enzim ekstraseluler seperti enzim protease, selulase, amilase, dan lipase (Chi et al. , 2009). Khamir asosiasi rumput laut spesies Hortaea weneckii diketahui memiliki kemampuan memproduksi  enzim  ekstraseluler  seperti  alginat-lyase,  agarase,  dan  karagenase  (Sibero et  al. , 2022). Khamir dapat hidup berasosiasi dengan organime lain selama kebutuhan hidupnya terpenuhi. Penemuan  mengenai  keanekaragaman  hayati  khamir  pada  lingkungan  terestrial  telah dieksplorasi dengan baik, namun penelitian mengenai khamir laut tergolong relatif sedikit (Kutty dan Philip, 2008). Berdasarkan hal tersebut, melihat potensi khamir laut yang telah dikonfirmasi pada penelitian terdahulu menjadikan perlu dilakukannya eksplorasi lebih lanjut mengenai potensi khamir laut.  Penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan  mengidentifikasi  secara  molekuler  khamir  laut  asal Perairan Pasir Baru, Balikpapan, yang menjadi koleksi Sibero Project, Laboratory of Natural Product , Universitas  Diponegoro,  dan  menentukan  potensi  khamir  laut  sebagai  penghasil  enzim ekstraseluler.

## MATERI DAN METODE
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Natural Product, Laboratorium Terpadu Universitas Diponegoro,  Semarang,  pada  bulan  Desember  2022-Januari  2023.  Pengolahan  data  dari  hasil penelitian dilaksanakan pada Februari-Maret 2023.

## Peremajaan Isolat
Stok khamir  dengan  kode isolat  PB3.2  yang tersimpan pada  gliserol  dilakukan  peremajaan dengan menginokulasi khamir pada cawan petri berisi media Potato Dextrose Agar (PDA) kemudian dilakukan inkubasi selama 7x24jam (Putri et al. , 2019).

## Uji Aktivitas Enzim
Uji aktivitas enzim dilakukan untuk melihat potensi khamir dalam memproduksi enzim protease dan amilase. Media uji aktivitas enzim amilase mengandung 2% agar, 0.1% yeast extract, dan 0.5% peptone, dan 0.2% pati atau starch (Ayuningtyas et al. , 2021). Media uji aktivitas enzim protease dilakukan menggunakan media skim-milk agar dengan penambahan 2% agar dan 10% skim milk powder (Fadhli et al. , 2019). Isolat khamir ditumbuhkan pada setiap media uji dan dilakukan inkubasi selama  7x24jam.  Media  uji  aktivitas  enzim  amilase  dibuat  dengan  menambahkan  0,2%  amilum dalam  media  PDA.  Penentuan  aktivitas  enzim  amilase  dilakukan  dengan  menggunakan  larutan
Journal of Marine Research Vol 13, No. 2 Mei 2024, pp. 257-264
lugol.  Kenampakan  zona  bening  di  sekitar  koloni  mengindikasikan  adanya  aktivitas  enzim. Penentuan aktivitas enzim protease diindikasikan dengan adanya zona bening di sekitar koloni.

## Identifikasi Makroskopik dan Mikroskopik
Identifikasi makroskopik khamir dilakukan dengan mengamati bentuk, margin, elevasi, ukuran, dan  warna  koloni  khamir  yang  tumbuh  pada  media  PDA  (Van  der  Walt  dan  Yarrow,  1984). Identifikasi  mikroskopis  dilakukan  dengan  mengamati  bentuk  sel  dan  tipe  pertunasan  khamir  di bawah mikroskop dengan bantuan pewarna lactophenol cotton blue (Kurtzman et al. , 2011).

## Ekstraksi DNA
Metode yang digunakan dalam ekstraksi DNA adalah metode Chelex. Isolat khamir diinokulasi ke dalam microtube steril yang berisi 1 mL saponin dan 100 µL dd H 2 O, kemudian diinkubasi pada suhu 4°C selama 24jam. Sampel yang telah diinkubasi kemudian dicuci dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan kemudian 1 mL PBS  steril  ditambahkan  ke dalam microtube  steril  dan sampel  disentrifugasi  pada  kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan kemudian 100 µL dd H 2 O dan 50 µL  larutan  Chelex  20%  ditambahkan  ke  dalam  microtube  dan  dihomogenkan  menggunakan mikropipet.  Sampel  dipanaskan  menggunakan  heating  blok  pada  suhu  80°C  selama  10  menit. Campuran  tersebut  kemudian  disentrifugasi  pada  kecepatan  12000  rpm  selama  10  menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan pada microtube steril (Sibero et al. , 2017).

## Amplifikasi DNA
Amplifikasi  DNA  dilakukan  secara  in  vitro  menggunakan polymerase  chain  reaction (PCR) dengan ITS1 (5ʹ -TCC GTA GGT GAA CCT GCG G- 3ʹ) sebagai primer forward dan ITS4 (5ʹ -TCC TCC  GCT  TAT  TGA  TAT  GC- 3ʹ) sebagai  primer reverse .  Campuran  PCR  mengandung  12.5  µL GoTaq Green Master Mix Promega, 1 µL primer ITS1, 1 µL primer ITS4, 9.5 µL ddH2O, dan 1 µL DNA template dengan total volume adalah 25 µL. Pengaturan kondisi PCR mengacu pada Sibero et  al. (2016)  dengan  denaturasi  awal  95 ℃ selama  3  menit,  kemudian  diikuti  dengan  30  siklus denaturasi pada suhu 95 ℃ selama 1 menit, annealing pada suhu 55 ℃ selama 1 menit, dan ekstensi pada  suhu  72 ℃ selama  1  menit,  kemudian  diikuti  oleh  ekstensi  akhir  pada  suhu  72 ℃ selama  7 menit.

## Pengecekan Kualitas Produk PCR
Pemeriksaan  produk  hasil  PCR  dilakukan  menggunakan  elektroforesis  dengan  cara memasukkan  2.5  µL  produk  PCR  ke  dalam  sumur  gel  agarose  1%  yang  dibuat  dengan mencampurkan 1 gram agarose ke dalam 100 mL TBE 1X kemudian ditambahkan larutan Ethidium Bromida (EtBr) sebanyak 5 µL. DNA ladder dimasukkan pada sumur pertama gel agarose sebagai penanda. Gel dielektroforesis dengan tegangan sebesar 100 V dan 400 mA selama 30 menit. Pita hasil PCR dapat dilihat dengan menggunakan alat gel documentation (Hidayati et al. , 2016). Sampel dengan band DNA kemudian dikirim ke PT. Genetika Science, Jakarta, Indonesia.

## Analisis Sekuens dan Pembuatan Pohon Filogenetik
Analisis hasil sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan software MEGA X kemudian hasilnya  dicocokkan  dengan  database  pada  GeneBank  yang  dapat  diakses  melalui  tautan (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) melalui opsi pelacakan database Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) untuk mengetahui spesies khamir yang diperoleh ((Sibero et al. , 2018).
Journal of Marine Research Vol 13, No. 2 Mei 2024, pp. 257-264
Analisis pohon filogenetik dilakukan menggunakan software MEGA X dengan mensejajarkan sekuens  isolat  dengan  sekuens  pembanding.  Konstruksi  pohon  filogenetik  dibentuk  berdasarkan jarak  kekerabatan  genetik  dengan  menggunakan  metode Neighbor  Joining  Tree dengan  nilai boostrap 1000 kali.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji  aktivitas  enzim  dilakukan  dengan  menginokulasi  isolat  pada  dua  jenis  media  berbeda. Pengujian aktivitas enzim pada penelitian ini bersifat kualitatif. Isolat PB3.2 diinokulasi pada media skim-milk  agar  dan  media  pengujian  enzim  amilase  kemudian  diinkubasi  selama  7x24jam  untuk dilakukan  uji  antivitas  enzim  protease  dan  enzim  amilase. Indikator  keberhasilan  pada  pengujian aktivitas enzim protease ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni isolat. Indikator yang digunakan  pada  pengujian  aktivitas  enzim  amilase  adalah  larutan lugol.  Keberhasilan  pada pengujian ini ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni isolat. Zona bening yang dihasilkan pada pengujian aktivitas enzim menandakan bahwa isolat khamir mampu mendegradasi substrat media (Hengkengbala et al. , 2021). Berdasarkan hasil pengujian, isolat PB3.2 tidak mampu memproduksi  enzim  protease  dan  enzim  amilase  (Tabel  1).  Ketidakmampuan  isolat  dalam memproduksi enzim protease dapat terjadi karena beberapa hal seperti isolat yang tidak memiliki kemampuan  untuk  memproduksi  enzim,  isolat  memproduksi  enzim  namun  tidak  disekresikan  ke lingkungan, dan isolat memproduksi enzim dan disekresikan ke lingkungan, namun proses deteksi aktivitas enzim terhambat oleh media.
Identifikasi  molekuler  pada  isolat  PB3.2  dilakukan  melalui  beberapa  tahap,  yaitu  ekstraksi DNA, amplifikasi DNA, pengecekan kualitas DNA, sekuensing DNA, dan analisis pohon filogenetik. Proses ekstraksi DNA pada penelitian ini dilakukan menggunakan metode Chelex karena metode ini  memiliki  proses  yang  cepat  dengan  tahapan  yang  sederhana  sehingga  dapat  meminimalisir resiko terjadinya kontaminasi pada proses ekstraksi (Jayanti dan Mushlih, 2021). Amplifikasi DNA dilakukan  melalui  beberapa  tahap,  yaitu  tahap  denaturasi, annealing ,  dan  ekstensi. Annealing merupakan  tahapan  penting  pada  proses  PCR  dikarenakan  pada  tahapan  ini,    terjadi  proses penempelan primer pada DNA yang sudah terbuka. Suhu optimal pada proses annealing dibutuhkan agar proses penempelan primer pada sampel DNA dapat terjadi. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat menyebabkan primer menempel pada sisi lain DNA, sedangkan suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan  gagalnya  proses  amplifikasi  dikaernakan  tidak  terjadinya  proses  penempelan (Rahmadhan et al. , 2019).
Hasil identifikasi berdasarkan persamaan BLAST homology , diperoleh kesamaan isolat PB3.2 dengan Candida tropicalis (NR_111250_1) sebesar 99.05% dengan query cover 100% (Tabel 3). Hal tersebut menunjukkan bahwa isolat PB3.2 memiliki kesamaan basa yang sangat mirip dengan spesies Candida tropicalis sehingga dapat dikatakan bahwa isolat PB3.2 adalah spesies Candida tropicalis .  Adapun  ciri  makroskopik  dan  mikroskopik  isolat  PB3.2  adalah  bentuk  koloni circular , margin entire , elevasi raised , kenampakan dull dengan tekstur butyrous , warna koloni isolat krem dengan adanya sedikit pseudohifa. Bentuk sel ellipsoidal dan membentuk budding (Tabel 2). Hal tersebut  sesuai  dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh  Pratiwi  dan  Akhdiya  (2020)  yang mengkonfirmasi  bahwa  genus Candida memiliki  bentuk  sel  bervariasi  dari  bulat,  oval,  silindris, hingga memanjang dengan atau tanpa pseudohifa. Reproduksi aseksual dari genus Candida adalah dengan  membentuk  pertunasan  atau  budding.  Genus  ini  juga  tidak  memiliki  pigmen  karotenoid sehingga  berwarna putih hingga  krem.  Hal tersebut  sesuai  dengan  hasil  uji  aktivitas enzim  yang tidak menunjukkan adanya kemampuan dari isolat PB3.2 untuk memproduksi enzim amilase dan protease.  Hasil  tersebut  sesuai  dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh  Devi et  al. (2019)  yang menunjukkan  bahwa  spesies Candida  tropicalis tidak  mampu  memproduksi  enzim  amilase  dan protease,  sedangkan  spesies Candida  fermentati mampu  memproduksi  enzim  protease.  Hal tersebut  dapat  terjadi  karena  aktivitas  enzim  turut  dipengaruhi  oleh  jenis  spesies  dan  kondisi lingkungan seperti suhu, pH, dan salinitas (Shahat, 2017).
Tabel 1 . Hasil Uji Aktivitas Enzim Protease dan Amilase Khamir Laut
Kode Isolat Enzim protease Enzim Amilase PB3.2 ̶ ̶ Keterangan: + : terdapat aktivitas enzim; : tidak terdapat aktivitas enzim Tabel 2 . Hasil Pengamatan Makroskopik dan Mikroskopik
Kode Isolat Karakteristik Makroskopis Karakteristik Mikroskopis Bentuk Margin Elevasi Appear- ance Tekstur Warna Bentuk Sel Budding PB3.2 Circular Entire Raised Dull Butyrous Krem Ellipsoidal Ya Tabel 3 . Hasil Identifikasi Isolat melalui DNA Kode Isolat Closest Similarity* Percent identification Query Cover Accession PB3.2 Candida tropicalis 99.05% 100% NR_111250_1
(a) (b)
Gambar 1. Isolat Khamir PB3.2 (a) kenampakan makroskopik isolat, (b) kenampakan mikroskopik isolat
Gambar 2. Rekonstruksi Pohon Filogenetik Isolat Khamir Laut
Journal of Marine Research Vol 13, No. 2 Mei 2024, pp. 257-264
Rekonstruksi pohon filogenetik pada penelitian ini dilakukan menggunakan metode neighbor joining . Penggunaan metode neighbor joining dilakukan karena proses kalkulasinya yang cepat dan mudah. Analisis menggunakan metode neighbor joining dilakukan dengan analisis boostrap 1000 kali  ulangan  untuk  memprediksi  tingkat resampled dalam  membentuk  cabang  maupung  ranting pohon  filogenetik  yang  baik.  Konstruksi  pohon  filogenetik  merupakan  hal  yang  penting  untuk menentukan jarak evolusi pada spesies tertentu. Analisis filogenetik dapat dilihat melalui gap yang terbentuk  setelah  tahapan multiple  aligntment yang  menunjukkan  adanya  mutasi  genetik  dalam sekuens (Su’udi, 2018) . Jarak genetik pada pohon filogenetik menunjukkan nilai 0,050 yang artinya terdapat perbedaan 5 basa dalam setiap 100 basa pada setiap sekuensnya dan menghasilkan nilai sebesar 90% yang berarti sekuens isolat ini berbeda nyata dengan outgrup karena memiliki urutan pasangan basa yang berbeda jauh (Larasati et al. , 2021). Spesies outgroup yang digunakan pada konstruksi  pohon  filogenetik  penelitian  ini  adalah Cryptococcus  neoformans (NR  171785.1)  yang didasari  pada  perbedaan  taksonomi  yang  dimiliki C.  neoformans dengan  isolat  yang  diperoleh. Rekonstruksi pohon filogenetik pada penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 2.

## KESIMPULAN
Identifikasi molekuler menunjukkan bahwa isolat PB3.2 memiliki kesamaan BLAST homology dengan  spesies Candida  tropicalis (NR_111250_1)  sebesar  99.05%  dengan query  cover 100%. Khamir laut yang teridentifikasi sebagai spesies Candida tropicalis ini tidak memiliki potensi untuk memproduksi enzim protease dan enzim amilase.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  seluruh  pihak  UPT  Laboratorium  Terpadu, Universitas  Diponegoro atas  izin yang diberikan  sehingga  penelitian  ini  dapat  terlaksana  dengan baik. Kami juga mengucapkan terima kasih atas dukungan finansial yang diberikan oleh Dr. Mada Triandala Sibero, S.Pi., M.Si., dalam mendukung penelitian ini. Terima kasih juga kepada seluruh pihak yang telah membantu dalam pembuatan dan penulisan artikel ilmiah ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Ayuningtyas,  E.P.,  Sibero,  M.T.,  Hutapea,  N.E.B.,  Frederick,  E.H.,  Murwani,  R.,  Zilda,  D.S., Wijayanti, D.P., Sabdono, A., Pringgenies, D., & Radjasa, O.K. 2021. Screening of Extracellular Enzyme  from  Phaeophyceae-Associated  Fungi. IOP  Conference  Series:  Earth  and Environmental Science , 750(1): 1-14. DOI: 10.1088/1755-1315/750/1/012005
Boekhout, T., Amend, A.S., El Baidouri, F., Gabaldón, T., Geml, J., Mittelbach, M., Robert, V., Tan,
C.S., Turchetti, B., Vu, D., Wang, Q.M., & Yurkov, A. 2022. Trends in yeast diversity discovery, Fungal Diversity. Fungal Diversity , 114(1): 491-537. DOI: 10.1007/s13225-021-00494-6
Chi,  Z.M.,  Liu,  G.,  Zhao,  S.,  Li,  J.,  &  Peng,  Y.  2010.  Marine  yeasts  as  biocontrol  agents  and producers  of  bio-products. Applied  microbiology  and  biotechnology, 86:  1227 – 1241.  DOI: 10.1007/s00253-010-2483-9
Chi, Z., Zhe, C., Zhang, T., Liu, G., Li, J. & Wang, X. 2009. Production, characterization and gene cloning  of  the  extracellular  enzymes  from  the  marine-derived  yeasts  and  their  potential applications. Biotechnology Advances , 27(3): 236 – 255. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2009.01.002 Connell, L., Redman, R., Craig, S., Scorzetti, G., Iszard, M. & Rodriguez, R. 2008. Diversity of soil yeasts  isolated  from  South  Victoria  Land,  Antarctica. Microbial  Ecology ,  56:  448 – 459.  DOI: 10.1007/s00248-008-9363-1
Devi,  S.A.,  Wulandary,  D.A.,  Saputra,  E.,  Muchlissin,  S.I.  &  Setyati,  W.A.  2019.  Potential  and Enzymatic  Characterizations  of  Marine  Yeast  for  Pufas  from  Balai  Taman  Nasional Karimunjawa. IOP  Conference  Series:  Earth  and  Environmental  Science ,  246(1):  1-5.  DOI: 10.1088/1755-1315/246/1/012074
Dewi,  E.R.S.  2020.  Bioremediasi:  Mikroorganisme  sebagai  Fungsi  Bioremediasi  pada  Perairan
Tercemar. Repository Upgris.
DiCosimo,  R.,  McAuliffe,  J.,  Poulose,  A.J.  &  Bohlmann,  G.  2013.  Industrial  use  of  immobilized enzymes. Chemical Society Reviews , 42(15): 6437 – 6474. DOI: 10.1039/c3cs35506c Fadhli, H., Kusdiyantini, E., & Nurhayati. 2019. Karakterisasi morfologi , biokimia , dan uji enzimatis isolat  khamir  buah  apel  ( Malus  domestica Borkh  .)  yang  berpotensi  menghasilkan  bioetanol morphological , biochemical and enzymatic characterization of yeast isolates from apple. Biologi Tropika , 2(2): 62 – 73.
Hengkengbala, S.I., Lintang, R.A., Sumilat, D.A., Mangindaan, R.E., Ginting, E.L. & Tumembouw, S.  2021.  Karakteristik  Morfologi  Dan  Aktivitas  Enzim  Protease  Bakteri  Simbion  Nudibranch. Jurnal Pesisir Dan Laut Tropis , 9(3): 83-94. DOI: 10.35800/jplt.9.3.2021.36672 Hidayati,  H.,  Saleh,  E.,  &  Aulawi,  T.  2016.  Identifikasi  Keragaman  Gen  Bmpr-1b  (Bone Morphogenetic Protein Receptor Ib) Pada Ayam Arab,Ayam Kampung Dan Ayam Ras Petelur Menggunakan Pcr-Rflp. Jurnal Peternakan , 13(1): 1-11. DOI: 10.24014/jupet.v13i1.2383 Jayanti, L.D., & Mushlih, M. 2021. Comparison of the Quality of DNA Template Isolation Results of the Resin Method with and Without Centrifugation. Indonesian Journal of Innovation Studies , 15: 1 – 9. DOI: 10.21070/ijins.v15i.551
Kurtzman, C., Fell, J.W., & Boekhout, T. 2011. The yeasts: a taxonomic study. Elsevier. Kutty, S.N., & Philip, R. 2008. Marine Yeasts A Review. Yeast , 25(7): 465 – 483. DOI:
10.1002/yea.1599
Larasati, S.J.H., Sabdono, A., & Sibero, M.T. 2021. Identifikasi Molekuler Kapang Asosiasi Spons menggunakan Metode DNA Barcoding. Journal of Marine Research , 10(1): 48 – 54. DOI:
10.14710/jmr.v10i1.28334
Pratiwi, E., & Akhdiya, A. 2020. Keragaman Karakter Morfologi dan Biokimia Isolat Khamir Rizosfer dan Endofit
Tanaman Padi. Buletin
Plasma Nutfah , 26(1): 39-50. DOI:
10.21082/blpn.v26n1.2020.p39-50
Prihatini, I., & R.K. Dewi. 2021. Kandungan Enzim Papain pada Pepaya (Carica papaya L) Terhadap Metabolisme Tubuh. Jurnal Tadris IPA Indonesia, 1(3): 449 – 458. DOI: 10.21154/jtii.v1i3.312 Putri,  D.R.,  Asri,  M.T.,  &  Ratnasari,  E.  2019.  Aktivitas  Antifungi  Ekstrak  Buah  Pare  (Momordica charantia L.) dalam Menghambat Pertumbuhan Jamur Fusarium oxysporum. LenteraBio , 8(2):
156 – 161. DOI: 10.30602/jlk.v2i1.325
Rahmadhan, D., Sari, R., & Apridamayanti, P. 2019. Pengaruh suhu annealing terhadap amplifikasi gen  tem  menggunakan  primer  dengan  %GC  rendah. Jurnal  Mahasiswa  Farmasi  Fakultas Kedokteran Untan , 4(1): 1 – 7.
Remijawa,  E.S.,  Rupidara,  A.D.,  Ngginak,  J.,  &  Radjasa,  O.K.  2020.  Isolasi  dan  seleksi  bakteri penghasil enzim ekstraseluler pada tanah mangrove di pantai noelbaki. Jurnal Enggano , 5(2):
164 – 180. DOI: 10.31186/jenggano.5.2.164-180
Shahat,  A.S.  2017.  Production  of  Extracellular  Hydrolytic  Enzymes  by  Yeast  Extracts  on  Some Commercial Media. Annals of Biological Research , 8(3): 12 – 20.
Sibero, M.T., Frederick, E.H., Sabdono, A., Wijayanti, D.P., Pringgenies, D., Radjasa, O.K., Zilda,
D.S., & Murwani, R. 2022. First report of seaweed-associated yeast from Indonesia: Species composition and screening of their polysaccharides-degrading enzymes. Biodiversitas , 23(3):
1408 – 1419. DOI: 10.13057/biodiv/d230327 Sibero,  M.T.,  Sabdaningsih,  A.,  Cristianawati,  O.,  Nuryadi,  H.,  Radjasa,  O.K.,  Sabdono,  A.,  & Trianto, A. 2017. Isolation, identification and screening antibacterial activity from marine sponge- associated  fungi  against  multidrug-resistant  (MDR) Escherichia coli . IOP  Conference  Series: Earth and Environmental Science , 55(1): p. 012028 DOI: 10.1088/1755-1315/55/1/012028 Sibero, M.T., Tarman, K., Radjasa, O.K., Sabdono, A., Trianto, A., & Bachtiarini, T.U. 2018. Produksi Pigmen  dan  Identifikasi  Kapang  Penghasilnya  Menggunakan  Pendekatan  DNA  Barcoding. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia , 21(1): 9 – 108. DOI: 10.17844/jphpi.v21i1.21454 Sibero,  M.T.,  Triningsih,  D.W.,  Radjasa,  O.K.,  Sabdono,  A.,  &  Trianto,  A.  2016.  Evaluation  of antimicrobial  activity  and  identification  of  yellow  pigmented  marine  sponge-associated  fungi from  Teluk  Awur,  Jepara,  Central  Java. Journal  of  Biotechnology, 21:  1 – 11.  DOI: 10.22146/ijbiotech.26058
Su’udi, M. 2018. Studi in silico potensi DNA barcode pada anggrek langka Paphiopedilum. Biosfer: Jurnal Biologi dan Pendidikan Biologi , 3(1): 20 – 26. van der Walt, J.P., dan D. Yarrow. 1984. Methods for the isolation, maintenance, classification and identification of yeasts, The Yeasts, . Elsevier Science Publishers B.V. DOI: 10.1016/B978-0- 444-80421-1.50009-7