Aktivitas Antioksidan Fraksi Daun Pegagan (Centella asiatica (L) Urb. ) dengan Metode FRAP
Antioxidant Activity of Centella asiatica (L) Urb. Leaves Fraction

## Using FRAP Method
Aristika Linda Puspita¹, Susilowati Susilowati²
1,2 Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Nasional puspitaaristikalinda@gmail.com , susilowati@stikesnas.ac.id
Abstract :  Centella  asiatica  or  known  as  Pegagan  is  an  Indonesian  plant and  it’s  contain  some secondary  metabolite  compounds  including  flavonoids,  polyphenols,  saponins,  triterpenoids  and steroids. These compounds are natural antioxidants that are useful for health. The purpose of this study was to determine the antioxidant power of the fraction from pegagan leaf extract. The study began with the  extraction  of  pegagan  leaves  using  70%  ethanol. Furthermore,  the  ethanol  extract was  extracted with n-hexane, ethyl acetate, and water sequentially to produce three fractions. Each fraction was tested for  their antioxidant power using FRAP method. The antioxidant power was seen from the FRAP value expressed in mg ascorbic acid equivalent/gram sample (mgAAE/g sample).  The antioxidant power of each fraction showed that the n-hexane fraction was 0.06210mgAAE/g, the ethyl acetate fraction was 0.09349mgAAE/g, and the water fraction was 0.08742mgAAE/g. The ethyl acetate fraction showed the highest antioxidant power although from the one way ANOVA test did not show a significant difference than n-hexane and water fractions.
Key words : Centella asiatica, ethyl acetat fraction, antioxidant, FRAP test
Abstrak :  Pegagan  (Centella  asiatica  (L)  Urb)  merupakan  tanaman  Indonesia  yang  mengandung flavonoid,  polifenol,  saponin,  triterpenoid  dan  steroid.  Senyawa-senyawa  tersebut  merupakan antioksidan alami yang berguna bagi kesehatan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi antioksidan  pada  fraksi  ekstrak  daun  pegagan.  Penelitian  diawali  dengan  ekstraksi  daun  pegagan menggunakan etanol 70%. Selanjutnya fraksinasi ekstrak dikerjakan secara bertingkat dengan pelarut n -heksan,  etil  asetat,  dan  air.  Ketiga  fraksi  yang  diperoleh  selanjutnya  diuji  aktivitas  antioksidanya dengan metode FRAP. Kekuatan antioksidan dilihat dari nilai FRAP yang dinyatakan dalam mg ascorbic acid  equivalent /  gram  sampel  (mg AAE /g  sampel).  Kekuatan  antioksidan  pada masing-masing fraksi menunjukkan fraksi n-heksana sebesar 0,06210mg AAE /g, fraksi etil asetat sebesar 0,09349mg AAE /g, dan  fraksi  air  sebesar  0,08742mg AAE /g.  Fraksi  etil  asetat  merupakan fraksi  yang memiliki  kekuatan antioksidan tertinggi meskipun pada uji one way ANOVA tidak menunjukkan perbedaan kekuatan yang bermakna dibandingkan fraksi n-heksana dan air.
Kata kunci: P egagan, fraksi etil asetat, antioksidan, uji FRAP

## I.  PENDAHULUAN
Senyawa antioksidan saat ini semakin banyak  digunakan  dan  dikembangkan seiring dengan semakin besarnya pemahaman  masyarakat  tentang  peranan senyawa  antioksidan  dalam  menghambat berbagai jenis penyakit mulai dari penyakit degenerative  sampai  dengan  COVID-19. Masalah-masalah  ini  berkaitan  dengan kemampuan  antioksidan  untuk  bekerja sebagai  inhibitor  (penghambat)  reaksi oksidasi  oleh  radikal  bebas  reaktif  yang menjadi  salah  satu  penyebab  penyakit- penyakit  tersebut.  Selain  itu  keberadaan antioksidan  di  dalam  tubuh  berkaitan dengan kerja fungsi sistem imunitas tubuh, terutama  untuk  menjaga  integritas  dan berfungsinya  membran  lipid,  protein  sel, asam  nukleat  serta  mengontrol  transaksi
signal  dan  ekskresi  gen  dalam  sel  imun (Winarsi,2007).
Secara  alami,  tanaman  mengandung senyawa-senyawa metabolit sekunder yang memiliki  potensi  sebagai  antioksidan. Centella  asiatica (L) Urban atau  yang dikenal  dengan  pegagan  merupakan  salah satu  jenis  herba  yang  memiliki  manfaat yang  sangat  luas  dan  beragam  antar  lain peluruh  air  seni,  obat  sariawan,  penurun panas,  penambah  nafsu  makan  dan termasuk  sebagai  antioksidan.  Selain  itu, pegagan memiliki potensi sebagai imunodulator  kuat  dengan  adanya  respon yang  tinggi  terhadap  antibodi  primer  dan sekunder (Punturee, et al., 2005). Senyawa yang  bertanggungjawab  terhadap  potensi imunodulator dan digunakan sebagai senyawa penanda pegagan adalah
senyawa  glikosida  triterpen  (asiatikosida) (Cheng dan Qin, 2007).  Selain asiatikosida, pegagan diketahui  juga  mengandung senyawa flavonoid, polifenol, steroid, triterpenoid  dan  alkaloid  termasuk  dalam golongan senyawa metabolit dengan aktivitas  antioksidan  yang  bermanfaat  bagi kesehatan  (Sutardi,  2016).    Berdasarkan hal  tersebut,  menunjukkan  pegagan  dapat dieksporasi lebih lanjut untuk dikembangkan  sebagai  agen  antioksidan alami. Berdasarkan  Salamah  dan  Farahana (2014), ekstrak etanol pegagan menunjukkan kapasitas antioksidan sebesar  43,198  ±  2,048  mg  QE/g  ekstrak. Selain  itu,  pegagan  menunjukkan  potensi antioksidan  yang  sangat  kuat  dengan  nilai IC 50 ekstrak  etanolnya  sebesar  35.6±1.3 μg/ml  (Rahman  et  al.,2013).  Berdasarkan hasil penelitian yang menunjukkan kuatnya potensi  aktivitas  antioksidan  pada  ekstrak etanol  pegagan,  maka  perlu  dilakukan fraksinasi  dengan  beberapa  pelarut  pada tingkat  polartias  yang  berbeda  dengan tujuan agar memisahkan senyawa berdasarkan  tingkat  kepolarannya.  Hal  ini dilakukan sebagai strategi dalam menelusuri senyawa yang bertanggungjawab terhadap potensi aktivitas antioksidan pegagan.

## II.  METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian meliputi  seperangkat  spektrofotometri  UV Vis,  Rotary  evaporator,  labu  alas  bundar 500ml,  labu  ukur  100ml,  labu  ukur  10ml, pipet tetes, pipet volume 1ml, pipet volume 10ml,  kertas  saring,  corong,  kaca  arloji, cawan porselin, timbangan, batang pengaduk,  Blender,  Timbangan  analitik, tabung  sentrifuges,  tabung  reaksi.  Bahan yang digunakan meliputi etanol 70%, etanol p.a,  etil  asetat,  N-  heksana,  Aquadest, Asam  askorbat,  Asam  trikloroasetat  10%, FeCl3  0,1%,  Dapar  fosfat  (0,2  M,  pH  6,6), Ekstrak  daun  pegagan,  Kalium  ferrisianida 1 %.

## Persiapan Sampel Uji
Pegagan  segar  dipetik  dan  disortasi basah  untuk  memisahkan  kotoran  atau bahan-bahan  asing  pada  daun.  Bahan dicuci  dengan  air  mengalir  lalu  dikering anginkan  dan  dilakukan  sortasi  kering. Simplisia  yang  sudah  kering  dilakukan penyerbukan  dengan  blender  dan  diayak dengan anayakan no. 40 mesh.
Ekstraksi  diawali  dengan  memasukan
300g serbuk simplisisa kedalam toples kaca
kemudian  ditambahkan  3L  etanol  70% sampai simplisia pegagan terendam. Proses  perendaman  dilakukan  selama  3 hari  dalam  kondisi  tertutup  dan  terlindung dari  cahaya  dengan  pengadukan  secara berulang  (3x  tiap  24  jam).  Setelah  3  hari dilakukan  penyaringan  dan  ampasnya direndam  kembali  dengan  cairan  penyari yang baru (dilakukan sebanyak 3 kali). Hasil penyarian yang di dapat kemudian dikumpulkan dan di uapkan hingga diperoleh  ekstrak  etanol  yang  kental.  Hasil ekstrak dihitung nilai randemennya.
Ekstrak  kental  selanjutnya  difraksinasi menggunakan  metode  ekstraksi  cair-cair. Sebanyak  10  g  ekstrak  etanol  larutkan dengan  air  hangat  lalu  larutan  ekstrak dimasukkan  dalam  corong  pisah.  Pada pemisahan yang pertama dilakukan dengan menggunakan pelarut n -heksana sebanyak 50  mL,  kemudian  digojok  dan  fase  n- heksana ditampung. Penambahan n- heksana  lakukan  hingga  4  kali  sampai warna  fase  n-heksana  bening.  Fase  air selanjutnya ditambahkan dengan etil asetat. Dilakukan  ekstraksi  dengan  penambahan @50  mL  etil  asetat,  dan  diulangi  hingga  4 kali.  Fase  etil  asetat  dan  fase  air dikumpulkan  dan  dilakukan  penguapan masing-masing fraksi dengan rotary evaporator pada  suhu  60°C  sampai diperoleh fraksi kental.
Uji aktivitas antioksidan dengan metode FRAP  ( Ferric  Reducing  Antioxidant Power)
Metode  uji  FRAP  yang  digunakan mengacu pada Vijayalakshmi and Ruckmani (2016).
a.  Larutan Dapar fosfat 0,2 M pH 6,6 Larutan disiapkan dengan menimbang
2gr NaOH dan dilarutkan dengan Aquadest bebas CO2 hingga tepat 250ml dalam labu takar,  Kemudian  Sebanyak  6,8  gram KH2PO4(Monopotasium  fosfat  )  yang dilarutkan  dengan  Aquadest  bebas  CO2 250ml  dalam  labu  takar.  Kemudian  dipipet sebanyak  16,4ml  NaOH  dimasukan  dalam labu takar dan dicampurkan 50ml KH2PO4 selanjutkan di ukur dengan Aquadest bebas CO2 hingga 200ml. b.  Larutan K 3 Fe(CN) 6 ( Kalium Ferrisianida) Larutan  disiapkan  dengan  melarutkan 1gr kalium ferrisianida dalam air bebas CO2 dan diencerkan dalam labu takar 100ml.
c.  Larutan FeCl 3 0,1%
Larutan  disiapkan  dengan  melarutkan 0,1gr  FeCl 3 dalam  Aquadest  dan  di encerkan dalam labu takar 100ml.
d.  Larutan Asam trikloroasetat 10%
Siapkan larutan dengan cara
melarutkan 10gr TCA dalam Aquadest dan diencerkan dalam labu takar 100ml. e.  Penentuan Panjang Gelombang Maksimal Larutan Asam askorbat pada konsesntrasi 80ppm dipipet sebanyak 1 ml , lalu  ditambahkan  1  ml  larutan  dapar  fosfat 0,2 M (pH 6,6) dan 1 ml kalium ferrisianida lalu  masukan  dalam  tabung  reaksi  dan  di Inkubasi  selama  20  menit  dengan  suhu 50°C. Setelah diinkubasi larutan ditambahkan 1 ml TCA, larutan disentrifuge pada  kecepatan  3000  rpm  setelah  itu bagian  atas  di  pipet  1  ml  lalu  dimasukkan dalam labu ukur 10ml setelah itu ditambahkan  1  ml  Aquadest  dan  0,5  ml FeCl 3 0,1%  lalu  tambahkan  Etanol  Pa hingga  tanda  batas.  Serapan  tersebut  di ukur dengan Spektrofotometri UV Vis pada saat panjang gelombang 500-800nm sehingga akan diperoleh panjang gelombang maksimum. f.  Penetapan Operating Time Asam askorbat Penentuan  operating  time  dilakukan dengan  cara,  larutan  Asam  askorbat  pada konsentrasi  80ppm  dipipet  sebanyak  1ml lalu  ditambahkan  1  ml  larutan  dapar  fosfat 0,2  M  (pH  6,6)  dan  1  ml  larutan  kalium ferrisianida  kedalam  labu  ukur  10ml tambahkan  Etanol Pa  sampai  tanda  batas, kemudian serapan di ukur pada menit ke 0 sampai  ke  60  menit  pada  panjang gelombang 676,6nm.
g.  Pembuatan larutan blanko Sebanyak 1 ml dapar fosfat Ph 6,6 dan 1ml kalium ferrisianida dipipet kedalam labu ukur 5ml. Inkubasi selama 20 menit dengan suhu  50°C.  Setelah  di  Inkubasi  larutan ditambahkan 1ml TCA, Kemudian disentrifuge  selama  10  menit  setelah  itu bagian  atas  larutan  dipipet  1  ml  kemudian masukan  kedalam  labu  ukur  5ml  lalu tambahkan 1 ml aquadest dan 0,5 ml FeCl 0,1%  tambahkan  etanol  Pa  sampai  tanda batas kemudian diamkan selama 30 menit . Serapan diukur dengan panjang gelombang maksimal.
h.  Pengukuran  larutan  asam  askorbat berbagai  konsentrasi  dengan  metode FRAP Menimbang  seksama  10mg  Asam askorbat  dilarutkan  dengan  etanol  p.a. Dalam labu ukur 10ml kemudian tambahkan etanol pa hingga tanda batas. Larutan induk asam  askorbat  dipipet  masing-masing 0,6ml; 0,7ml; 0,8ml; 0,9ml; 1,0ml pada labu ukur  10ml  hingga  diperoleh  konsentrasi 60ppm,  70ppm,  80ppm,  90ppm,  100ppm kemudian dari masing- masing konsentrasi
dipipet  1ml  dan  ditambahkan  1ml  larutan dapar fosfat pH (6,6) dan 1ml larutan kalium ferrisianida  1%  dipipet  kedalam  tabung reaksi kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu 50°C. Setelah diinkubasi larutan ditambahkan TCA sebanyak menit, setelah proses  sentrifuge  selesai  lapisan  atas dipipet  sebanyak  1ml masukan  dalam labu ukur 5ml, lalu diamkan lagi selama 30 menit ditambahkan  1ml  aquadest  dan  0,5ml FeCl3  setelah  itu  ditambahkan  dengan etanolp.a  sampai  tanda  batas,  kemudian diukur serapanya pada panjang gelombang maksimal.
i.  Pengukuran  serapan  sampel  dengan metode FRAP Sebanyak  10  mg  Masing –  masing Fraksi  (  N  heksana  ,  Etil  asetat  ,  Air  ) dilarutkan  dalam  10  ml  etanol  kemudian dipipet  1ml  lalu  ditambahkan  1  ml  dapar fosfat 0,2M (pH 6,6) dan 1ml larutan kalium ferrisianida,  kemudian  di  Inkubasi  selama 20  menit  dengan  suhu  50°C.  Setelah  di Inkubasi  tambahkan  1  ml  larutan  TCA  lalu disentrifuge  dengan  kecepatan  3000rpm selama 10menit.  Setelah disentrifuge Kemudian bagian atas larutan di pipet 1 ml kemudian masukkan kedalam labu ukur 5ml lalu  tambahkan  1  ml  Aquadest  dan  0,5  ml FeCl  0,1%  larutan  didiamkan  selama  10 menit  dan  diukur  absorbansinya  pada panjang  gelombang  676,6nm.  Sebagai blanko  digunakan  campuran  larutan  dapat fosfat  dan  larutan  kalium  ferrisianida  yang ditambahkan  larutan  TCA.  Kurva  kalibrasi digunakan  dengan  menggunakan  larutan asam askorbat dengan berbagai konsentrasi. Nilai FRAP dinyatakan dengan mg equivalen asam askorbat/gr fraksi.

## Analisa Data Penelitian
Aktivitas antioksidan dihitung menggunakan  persamaan  regresi  linier berdasarkan kurva kalibrasi larutan pembanding asam askorbat dari pembacaan  alat  spektrofotometri  UV-Vis. Persamaan  regresi  linear  hubungan  antar konsentrasi (ppm) vs absorbansi pengujian asam askorbat menghasilkan nilai A, B, dan r  dan  agar  kurva  linear  maka  nilai  r  harus mendekati  1,  sehingga  dapat  dihitung persamaan regresi linearnya yaitu :
Keterangan : x = konsentrasi sampel (ppm) Y = absorbansi A = intercept B = slope
Y = Bx + A
Rumus  regresi  linier  yang  diperoleh selanjutnya  digunakan  untuk  menghitung kekuatan  antioksidan    masing-masing  fraksi pegagan.  Nilai  absorbansi  dimasukan  dalam persamaan regresi linier sebagai y, sedangkan  x  adalah  konsentrasi  masing- masing fraksi pegagan. Selanjutnya kekuatan antioksidan  dinyatakan  dalam  ekuivalen  mg asam askorbat/gr fraksi.
Data yang terkumpul selanjutnya dilakukan  analisis  menggunakan  program SPSS  dengan  uji One  Way ANOVA  yang berfungsi untuk melihat signifikansi perbedaan  kekuatan  antioksidan  dari  ketiga sampel  Fraksi  (n-heksana,    etil    asetat  dan Air).

## III.  HASIL PENELITIAN
Daun  pegagan  yang  digunakan  berasal dari daerah Kebun teh Kemuning,
Ngargoyoso,  Tawangmangu,  Karanganyar.
Hasil ekstraksi simplisia menunjukkan ekstrak kental etanol daun pegagan dengan rendemen sebesar 8,56% b/b dengan bentuk kental,  warna  hijau  kehitaman  dan  berbau khas  aromatik.  Selanjutnya  ekstrak  kental yang diperoleh difraksinasi dengan n-heksan dilanjutkan dengan etil asetat yang selanjutnya disebut fraksi etil asetat dan sisa ampas difraksinasi dengan air yang selanjutnya disebut fraksi air. Hasil rendemen masing-masing fraksi dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Rendemen fraksi daun pegagan Fraksi % b/b Rendemen fraksi Organoleptis Fraksi  n- heksana 8,74 Kental, hijau kehitaman, aromatik Fraksi etil asetat 10,82 Kental,  coklat, aromatik Fraksi air 8,56 Kental,  coklat kehitaman, aromatik

## Uji aktivitas antioksidan
Pengukuran  aktivitas  antioksidan  diawali dengan penentuan panjang gelombang maksimum  asam  askorbat.  Hasil  penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat pada gambar 1 menunjukkan panjang gelombang maksimal 676,6nm.
Gambar 1. Spektrum kompleks biru berlin setelah penambahan asam askorbat pada rentang panjang gelombang 600nm-800nm
Selain  panjang  gelombang  maksimum juga dilakukan penentuan operating time yang menunjukkan  waktu  pengukuran  yang  stabil saat asam askorbat mampu mereduksi  secara sempurna  sehingga  terbentuk  kompleks  biru berlin yang stabil. Hasil penelitian menunjukkan operating time dipilih pada menit ke 27.
Gambar 2 kurva regresi linier antara konsentrasi versus absorbansi asam askorbat
Kurva  pada  gambar  2  menunjukkan persamaan  regresi  linear  antara  konsentrasi asam  askorbat  dengan  absorbansi  berlin  blue yang dihasilkan. Nilai r yang dihasilkan sebesar 0,9999  menunjukkan  hubungan  linearitas antara    konsentrasi  dan  abosrbansi  baik. Syarat  nilai  r  yang  baik  adalah  nilai  r  yang mendekati 1 dan minimal syarat nilai r = 0,997.
Semakin tinggi konsentrasi sampel menunjukkan maka semakin tinggi pembentukan  kompleks berlin  blue akibat kemampuan  reduksi  yang  dihasilkan  oleh asam askorbat. Selanjutnya persamaan regresi linier y = 0,00998x – 0,2864 digunakan untuk menghitung kapasitas antioksidan dalam masing-masing  fraksi  dimana  (y)  menyatakan nilai absorbansi dan (x) menyatakan kekuatan antioksidan yang dihasilkan. Kekuatan antioksidan masing-masing fraksi dapat dilihat pada tabel 2. y = 0,00998x - 0,2864
R = 0,999 0 0.2 0.4 0.6 0.8 50 70 90 110 Ab so rb an si Konsentrasi asam askorbat(ppm)
Tabel 2. Kekuatan antioksidan fraksi daun pegagan Fraksi Rata-rata Kekuatan antioksidan (mgAAE/g) Fraksi n-heksana 0,06210 Fraksi etil asetat 0,09349 Fraksi air 0,08742 Analisa  data  perbandingan  kekuatan antioksidan masing-masing fraksi
menggunakan uji one way ANOVA dapat dilihat pada tabel 3. Hasil menunjukkan nilai normality sebesar  0,04  dan  homogenity  sebesar  0,48 yang  menyatakan  bahwa  data  memiliki sebaran yang normal dan homogen. Selanjutnya  dari  uji  one  way  ANOVA  pada tabel  3  diperoleh  nilai  signifikansi  sebesar 0,714  (>  0,05)  sehingga  menunjukkan  nilai kekuatan  antioksidan  maisng-masing  fraksi tidak ada perbedaan yang signifikan atau tidak ada perbedaan yang bermakna.

## Tabel 3. Data uji one way anova kekuatan antioksidan fraksi daun pegagan
Sum of Squares df Mean Square F   Sig. Between Groups Within Groups 1736038.222 2 868019.111  .356 0.714 14629491.333 6   2438248.556 Total 16365529.556 8

## IV.  PEMBAHASAN
Pada tahap persiapan daun pegagan yang telah dipanen dilakukan sortasi basah dengan tujuan  untuk  memisahkan  bagian  tanaman rusak  dan  tidak  dikehendaki.  Pencucian dilakukan  dengan  air mengalir  yang  bertujuan untuk  membersihkan  kotoran  yang  masih melekat  pada  daun.  Setelah  dilakukan  sortasi basah dilakukan pengirisan agar memudahkan proses  antara  bahan  dengan  panas  lebih maksimal.  Proses  pengeringan  dilakukan dengan  ditutupi kain  hitam bertujuan  untuk menghindari  adanya  paparan  langsung  sinar UV yang dapat merusak senyawa dalam bahan yang  dikeringkan.  Simplisia  kering  daun pegagan dibuat menjadi serbuk agar memperkecil  ukuran  bahan,  sehingga  pada saat  proses  ekstraksi  akan  didapatkan  hasil yang  lebih  maksimal.  Proses  ekstraksi  pada penelitian ini dilakukan dengan cara remaserasi  dengan  menggunakan  pelarut etanol  70%.  Pemilihan  pelarut  etanol  70% untuk  ekstraksi  dikarenakan  pelarut  tersebut merupakan  pelarut  yang  bersifat  semi  polar sehingga diharapkan mampu menarik senyawa
metabolit  aktif  dalam  daun  pegagan  termasuk diantaranya flavonoid, tannin dan asiatikosida. Pada penelitian Salamah dan Farahana (2014) menunjukkan penggunaan pelarut etanol 70% pada  ekstrak  npegagan  mampu menunjukkan potensi  antioksidan  yang  tinggi  dan  mampu menyari  senyawa  asiatikosida,  polifenol  dan flavonoid dalam daun pegagan. Ekstrak kental daun  pegagan  yang  diperoleh  difraksinasi dengan  tujuan  untuk  memisahkan  senyawa berdasarkan  polaritasnya  sehingga  diperoleh fraksi  n-heksana  sebagai  fraksi  non  polar, fraksi etil asetat sebagai fraksi semi polar dan fraksi air sebagai fraksi polar.
Pengukuran  kekuatan  antioksidan  pada penelitian  ini  menggunakan  metode  FRAP dikarenakan  memiliki  sensitivitas  yang  tinggi dibandingkan  dengan  metode  DPPH  dan  FIC ( Ferrous Ion Chelating ) (Maesaroh et al , 2018). Benzie  dan  Strain  (1996)  menyatakan  bahwa FRAP  merupakan  metode  untuk  mengukur kekuatan antioksidan berdasarkan pada kemampuan  dalam  mereduksi  ion  ferri  (Fe 3+ ) menjadi  ion  ferro  (Fe 2+ )  pada  pH  rendah dengan  membentuk  kompleks  warna  biru ( berlin  blue )  yang  menandakan  adanya aktivitas  antioksidan  pada  sampel.  Baku pembanding dalam pengujian ini adalah asam askorbat yang merupakan antioksidan sekunder dengan kemampuan mampu menangkal berbagai radikal bebas ekstraseluler.  Hal  itu  dikarenakan  asam askorbat  mempunyai  gugus  hidroksi  bebas yang  bertindak  sebagai  penangkap  radikal bebas dan adanya gugus polihidroksi meningkatkan  aktivitas  antioksidannya  (Kim, 2005). Selain hal tersebut, standar antioksidan asam  askorbat  terbukti  paling  efektif  sebagai antioksidan  dibandingkan  dengan  baku  asam galat  dan  kuersetin  (Maesaroh et  al ,  2018).
Selanjutnya penambahan TCA pada penelitian bertujuan  agar  kompleks  kalium  ferrosianida mengendap dan penambahan FeCl 3 bertujuan untuk  membentuk  kompleks  berwarna  hijau sampai  biru  ( berlin  blue )  yang  selanjutnya terukur dalam spektrofotometri.
Daya reduksi merupakan indikator potensi suatu  senyawa  antioksidan.  Senyawa  yang mempunyai  daya  reduksi  dapat  berperan sebagai antioksidan karena dapat menstabilkan  radikal  dengan  mendonorkan elektron atau atom hidrogen sehingga senyawa radikal  berubah  menjadi  lebih  stabil  (Kim, 2005).  Kekuatan  antioksidan  pada  masing- masing fraksi menunjukkan kekuatan antioksidan  tertinggi  pada  fraksi  etil  asetat (0,09349mg AAE /g  )  diiukti  dengan  fraksi  air (0,08742mg AAE /g)  dan  kekuatan  terendah pada  fraksi  n-heksana  (0,06210mg AAE /g). Fraksi  etil  asetat  menunjukkan  fraksi  yang
memiliki kekuatan antioksidan tertinggi meskipun  pada  uji one  way ANOVA  tidak menunjukkan perbedaan kekuatan yang bermakna.  Selain  menunjukkan  kekuatan antioksidan  yang  tertinggi,  fraksi  etil  asetat (10,82%b/b) juga menunjukkan jumlah rendemen  tertinggi  dibandingkan  fraksi  n- heksana (8,74%b/b) dan fraksi air (8,56%b/b). Hasil  tersebut  berkaitan  dengan  senyawa metabolit  daun  pegagan  yang  tersari  dalam masing-masing  pelarut  fraksi.  Artanti et  al (2014)  menyatakan  bahwa  polaritas  pelarut memberikan pengaruh yang signifikan terhadap  kandungan  kimia  dan  aktivitas antioksidan pegagan yang  menunjukkan semakin meningkatnya polaritas pelarut penyari  pegagan  menunjukkan  kandungan flavonoid  total  dan  fenolik  total  tertinggi,  akan tetapi  menurunya  polaritas  menunjukkan kandungan  triterpenoid  total  tertinggi.  Hal  ini mendasari  perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut untuk mengukur kadar senyawa antioksidan dalam fraksi n-heksana, etil asetat dan  air  ekstrak  etanol  daun  pegagan  serta perlu untuk mengetahui pengaruhnya terhadap kekuatan antioksidan masing-masing fraksi.

## V.  SIMPULAN
Fraksi etil asetat daun pegagan menunjukkan  kekuatan  antioksidan  tertinggi dengan  nilai FRAP  sebesar  0,09349mg AAE /g diikuti dengan fraksi air (0,8621mg AAE /g) dan fraksi n -heksana  (0,06210mg AAE /g)  namun tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan.

## DAFTAR PUSTAKA
Artanti,  Nina.,  Dewi,  Rizna  Triana,  dan Maryani Faiza., Pengaruh lokasi dan
Pelarut pengekstraksi terhadap kandungan  fitokimia  dan  aktivitas antioksidan ekstrak Pegagan
( Centella asiatica L. Urb)., JKTI. , Vol 16, No 2: 88-92
Benzie, I.F.F., and Strain, J.J, 1996, The Ferric
Reducing Ability of Plasma as a Measure of Antioxidant Power. The FRAP assay, Analythical Biochemitical 239: 70-76 Cheng CJ, Qin LP. 2007, Chemical component of Centella asiatica and their bioactivities,  J  Chin  intert  Med,  5(3): 384-36.  Cheng  CJ,  Qin  LP.  2007,
Chemical  component  of  Centella asiatica  and  their  bioactivities, J  Chin intert Med , 5(3): 384-36.
Kim,O.S., 2005, Radical Scavenging Capacity and Antioxidant Activity of The Vitamin Fraction In rice bran . J Food Sci . (3): 208- 213 Maesaroh et al , 2018, Perbandingan Metode Uji Aktivitas  Antioksidan DPPH, FRAP dan FIC Terhadap Asam Askorbat, Asam Galat dan Kuersetin.,
Universitas Padjajaran, Bandung. Punturee  K.,  Wild  C.P.,  Kasinrerk  W., Vinitketkumnuen U. 2005, Immunomodulatory Activities of
Centella  asiatica  and  Rhinacanthus nasutus extracts, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention , 6, 396-400. Rahman, Mijanur; Hossain, Shahdat;
Rahaman,  Asiqur;  Fatima,  Nusrat; Nahar,  Taslima;  Uddin,  Borhan  and Basunia, Mafroz Ahmed; 2013, Antioxidant Activity of Centella asiatica (Linn.)  Urban:  Impact  of  Extraction Solvent Polarity, Journal of Pharmacognosy  and  Phytochemistry , Vol. 1 No. 6 2013
Salamah,  Nina  dan  Farahana  Liani,  2014,  Uji aktivitas  antioksidan  ekstrak  etanol herba  pegagan  ( Centella  asiatica (L.) Urb )  dengan  metode  fosfomolibdat, Pharmaciana , Vol. 4, No. 1, 2014 : 23- 30.
Salewa, W., Runtuwene, M.R.J., dan Citraningtuas, Google., 2013., Kandungan Flavonoid dan Kapasitas Antioksidan Total Ekstrak Etanol Daun Binatang (Anreedera cordifolia (ten)Steenis.)., Jurnal Ilmiah Farmasi.,
2 (1), 18-22
Sutardi,  2017,  Kandungan  Bahan  Aktif Tanaman  Pegagan  Dan  Khasiatnya Untuk  Meningkatkan  Sistem  Imun Tubuh, Jurnal  Litbang  Pertanian  Vol. 35 No. 3 : 121-130
Winarsi,  H.,  2007, Antioksidan  Alami  dan Radikal Bebas: Potensi dan Aplikasinya dalam Kesehatan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta
Vijayalakshmi,  M.,  and  Ruckmani,  K.  2016.
Ferric  Reducing  Anti-oxidant    Power assay  in  Plant  Extract. Bangladesh Journal of Pharmacology . (11). pp.570- 572.