# Korespondensi:  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam,  Universitas  Lampung.  Jl.  Soemantri  Brojonegoro  No.  1, Gedong  Meneng,  Bandar  Lampung  35145,  Indonesia. Tel.  +  62  721  704625 E-mail:  sumardi.bio@yahoo.co.id
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra

## AKTIVITAS DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE ISOLAT Bacillus sp. (UJ132) SECARA  KUALITATIF  DAN  KUANTITATIF
Sumardi # ,  Salman  Farisi,  Chiristina  Nugroho  Ekowati,  dan  Milsa  Solva  Diana
Jurusan  Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung Jl. Soemantri Brojonegoro No. 1, Gedong  Meneng, Bandar Lampung 35145
(Naskah diterima: 5 April 2019; Revisi final: 23 Agustus 2019; Disetujui publikasi: 23 Agustus 2019)

## ABSTRAK
Bakteri  penghasil enzim  protease  memiliki kemampuan  untuk  melakukan  bioremediasi limbah  protein. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas dan karakterisasi enzim protease dari isolat Bacillus sp. (UJ132) yang diisolasi dari udang pasir (Metapenaeus affinis) di kawasan hutan mangrove Desa Margasari, Lampung Timur. Uji aktivitas enzim dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Karakterisasi enzim meliputi penentuan suhu dan pH optimum, pengaruh ion logam, serta penentuan Km dan Vmaks. Dari hasil percobaan diketahui bahwa enzim protease dihasilkan pada waktu produksi optimum 18 jam dengan aktivitas protease sebesar 0,09 U/mL. Suhu optimum enzim ini yaitu pada suhu 50°C yang menghasilkan aktivitas sebesar 0,08 U/mL. Enzim protease ini mempunyai kondisi optimum pada pH 5 dengan nilai aktivitas 0,09 U/mL. Semua ion logam (Ca 2 +, Mn 2 +, Cu 2 +, Mg 2 +) berfungsi sebagai inhibitor kecuali ion Fe 3 + yang berfungsi sebagai aktivator pada konsentrasi 1 mM dan 5 mM. EDTA dengan konsentrasi 1 mM dan 5 mM berfungsi sebagai inhibitor pada enzim protease isolat UJ132. Nilai Vmaks enzim protease 0,33 U/mL sedangkan Km senilai 4,59 mg/mL substrat, enzim ini mempunyai afinitas yang tinggi terhadap substrat.
KATA KUNCI: Bacillus sp.; bakteri proteolitik; hutan mangrove; probiotik; protease
ABSTRACT: The activity and characterization of protease enzyme of Bacillus sp. UJ132, a probiotic candidate for  shrimp farming. By: Sumardi, Salman Farisi, Chiristina Nugroho Ekowati, and Milsa Solva Diana
Shrimp farming produces protein wastes which mainly come from the remnants of given feed and excreta (feces) of shrimp. Bacteria known to possess protease enzymes have the ability to solve this protein waste problem in the shrimp farming industry. This study was conducted to determine the production and characterization of protease enzyme from Bacillus sp. (UJ132) isolated from the mangrove forest area of Margasari Village of Lampung Timur. The enzyme activity test was done qualitatively and quantitatively. The objectives of this study were to determine the optimum production of the enzymes and observe their characteristics, including determining the temperature and optimum pH, the effect of several metal ions, as well as  Km and Vmax. The experimental results revealed that the protease enzyme had an optimum time of 18 hours of protease activity as much as 0.09 U/mL.  The optimum temperature of this enzyme was 50°C which produced an activity of 0.08 U/mL. This protease enzyme has an optimum working condition at pH 5 with an activity value of 0.09 U/mL. All metal ions (Ca2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+) acted as inhibitors except Fe3 + ions which acted as activators at concentrations of 1 mM and 5 mM. EDTA with a concentration of 1 mM and 5 mM served as an inhibitor of UJ132 isolate protease enzyme. The value of Vmax of the protease enzyme was 0.33 U/mL while Km was 4.59 mg/mL suggesting that this enzyme has a high affinity with the substrate.
KEYWORDS: Bacillus sp.; proteolytic bacteria; mangrove forest; probiotics; protease

## PENDAHULUAN
Penggunaan mikroba probiotik di sektor budidaya udang  yang  telah  menjadi  kebiasaan  saat  ini. Penggunaan  probiotik  untuk  pencegahan  penyakit
mempunyai  keuntungan  dibandingkan  cara-cara pengendalian  yang  lainnya,  karena:  (1)  menekan pertumbuhan  bakteri  pathogen  vibrio;  (2)  mampu memperbaiki  kualitas  air  (Moriarty,  1998);  (3) bioremediasi  kualitas  air  (Muliani  et  al.,  2004);  dan (4) efisiensi pada pakan (Murdianto, 2015).
Pakan  udang  dan  ikan  mengandung  protein sebanyak  55,51%-67,68%  (Hany,  2011).  Untuk
meningkatkan penggunaan pakan yang efisien tersebut maka  diperlukan  beberapa  mikroba  probiotik  yang dapat menghasilkan enzim protease. Beberapa mikroba diketahui sebagai penghasil protease untuk aplikasi komersial  yakni  Bacillus,  Lactobacillus,  Pyrococcus, Termonospora Rhizopus, Mucor, Endothia, dan Aspergil- lus (Ward, 2009; Sumardi et al., 2016).
Usaha  pemberian  proteolitik  Bacillus  sp.  yang terbaik berasal dari lingkungan alaminya seperti hutan mangrove. Dari studi literatur hingga saat ini belum banyak  isolat  Bacillus  sp.  dari  kawasan  mangrove digunakan  sebagai  probiotik.  Dalam  penelitian  ini digunakan  bakteri  isolat  Bacillus  sp.  UJ132  yang merupakan  isolat  penghasil  protease  tertinggi  dan belum  dikarakterisasi.  Isolat  tersebut  berasal  dari hutan mangrove di Desa Margasari, Lampung Timur. Dengan  demikian  maka  perlu  dilakukan  penelitian untuk mengetahui karakteristik enzim protease yang dihasilkan dari isolat Bacillus sp tersebut.

## BAHAN DAN METODE

## Isolat  Bakteri
Isolat  bakteri  tersebut  merupakan  koleksi  dari L aboratorium  Mikrobiologi  FMIPA  Universitas Lampung.  Isolat  yang  digunakan  adalah  Bacillus  sp. dengan kode isolat UJI32 yang diisolasi dari usus udang pasir di kawasan hutan mangrove. Isolat UJI32 terlebih dahulu diuji kemampuannya menghasilkan protease secara  kualitatif  .  Dalam  uji  tersebut  bakteri diinokulasi ke media skim milk + sea water complete (SWC)-agar yang terdiri atas, 5 g bacto pepton; 0,1 g yeast extract; 0,3 mL  gliserol; 75 mL air  laut; 25 mL aquadest; 1,5  g agar; dan 1  g skim milk. Zona  jernih yang terbentuk menunjukkan bahwa bakteri tersebut menghasilkan protease.

## Pembuatan Starter  Bacillus
Pembuatan  media  produksi  protease  dilakukan dengan cara membuat media starter terlebih dahulu. Media  starter  dibuat  sebagai  media  SWC  (sea  water complete)  ditambahkan  1-3  ose  isolat  Bacillus  sp. Selajutnya diinkubasi dalam shaker inkubator selama 24 jam dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang.

## Optimasi Waktu Produksi  Enzim  Protease
Sebanyak  5  mL  media  starter  (10 7 sel/mL) ditambahkan ke dalam 45 mL media produksi SWC. Kultur bakteri diinkubasi ke dalam shaker inkubator masing-masing selama 6, 12, 18, 24, 30, 36 jam dengan kecepatan  120  rpm  pada  suhu  ruang.  Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15  menit  pada  suhu  4°C  untuk  mendapatkan
supernatan. Supernatan tersebut digunakan untuk uji aktivitas,  serta karakterisasi  enzim  protease.

## Uji  Aktivitas  Enzim  Protease
Aktivitas  protease  diukur  dengan  metode (Bergmeyer  &  Grassl,  1983)  menggunakan  kasein hammersten sebagai substrat (2% casein dalam 0,01 M  larutan  buffer  fosfat  pH  7,0).  Sebanyak  0,5  mL supernatan yang mengandung larutan enzim protease ditambahkan pada 0,1 mL larutan 0,01 M buffer fosfat pH 7.  Campuran reaksi diinkubasikan  kembali pada suhu 37°C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 0,5 mL 0,1 M trichloroacetic acid (TCA). Selanjutnya supernatan dipisahkan dari endapan dengan sentrifuse pada suhu 4°C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 0,38 mL filtrat ditambah dengan 1,25  mL 0,4 M natrium  karbonat kemudian ditambahkan  0,25  mL  reagen  folin  ciocalteau  dan diinkubasikan kembali selama 20 menit. Pembacaan optical density (OD) dilakukan pada panjang gelombang 578 nm. Penentuan nilai blanko dilakukan dengan cara yang sama, di mana 0,5 mL sampel protease diganti dengan 0,5 mL aquadest. Penentuan nilai standar juga dilakukan dengan cara sama di mana 0,5 mL sampel protease diganti dengan 0,5 mL  tirosin 5 mM. Satu unit  (U)  aktivitas  enzim  protease  adalah  banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol tirosin per menit pada kondisi pengujian. Perhitungan aktivitas  dilakukan  dengan  rumus  adalah  sebagai berikut:
di mana: PU : unit aktivitas protease (unit/mL) A sp : nilai absorbansi sampel A st : nilai absorbansi strandar A b l : nilai absorbansi blanko T : waktu

## Karakterisasi  Protease
Karakterisasi protease meliputi uji aktivitas suhu optimum 20°C-70°C. Pengaruh pH diuji dengan kisaran pH  4-12.  Satu  seri  buffer  pH  0,05  M  yang  berbeda, yakni: pH 4,5 (buffer sitrat); pH 6,7 (buffer fosfat); pH 8,9 (buffer tris-HCl); pH 10, 11, 12 (buffer glisin-NaOH). Uji  pengaruh  ion  logam  logam  Ca 2 +,  Mn 2 +,  Cu 2 +, Mg 2 +,  Fe 3 +,  dan  senyawa  inhibitor  asam  etilen diamintetraasetat (EDTA) dengan konsentrasi 1 mM dan 5 mM. Pegukuran Km dan Vmaks dilakukan dengan menguji  konsetrasi  substrat  0%;  1%;  1,5%;  2%;  2,5%; dan  3%.  Pada  setiap  karakterisasi,  dilakukan  uji aktivitas protease diukur dengan metode Bergmeyer & Grassl (1983).
T 1 x A A A A PU bl st bl sp   

## HASIL DAN BAHASAN

## Uji  Kualitatif
Pada uji kualitatif ini terlihat bahwa isolat UJ132 menghasilkan zona bening di sekitar koloni bakteri. Hal ini menunjukkan bahwa isolat UJI32 merupakan bakteri proteolitik atau mampu menghasilkan enzim protease (Gambar 1).
Bacillus sp. UJI 132 juga menghasilkan lainnya yakni selulase dan xilanase (Sumardi et al., 2019). Mikroba tersebut  dapat hidup  pada  media  pakan udang  dan pakan ikan. Pada media tersebut dapat menghasilkan enzim protase, selulase, dan xilanase.

## Optimasi  Waktu  Produksi
Penentuan produksi enzim dapat dilakukan dengan cara mengukur aktivitas enzimnya. Konsentrasi enzim tersebut  bekerjanya  akan  berbanding  lurus  dengan aktivitas enzim. Hasil percobaan membuktikan bahwa pada jam ke-6 masih rendah (0,02 U/mL); kemudian pada jam ke-12 naik menjadi 0,04 U/mL. Produksi pro- tease  dari  isolat  Bacillus  sp.  UJI32  optimum  adalah pada jam ke-18 sebesar 0,09 U/mL (Gambar 2).
Pada waktu jam ke-24 sampai dengan jam ke-36 produksi enzim menurun karena berkurangnya jumlah substrat yang dipecah. Produk enzim yang terbentuk dan produk lainnya berupa asam dapat menghambat pembentukan  kompleks  enzim  substrat.  Akibat gangguan  tersebut  bisa  terjadi  perubahan  struktur, sehingga sisi aktif enzim mengalami perubahan dan tidak dapat digunakan dalam mengikat substrat secara
baik (Yunita, 2012). Dugaan lain yakni kebutuhan nutrisi asam amino oleh bakteri sudah terpenuhi, atau bakteri mulai mengalami lisis atau mati (Yuniati et al., 2015). Aktivitas protease dari isolat Bacillus sp. UJ132 sebesar 0,09  U/mL.  Hasil  ini  lebih  besar  jika  dibandingkan dengan penelitian Inten et al. (2015) yang melaporkan ekstrak tanah mangrove memiliki aktivitas protease mencapai  1,9  x  10 -4 U/mL.  Berdasarkan  penelitian Yuniati  et  al.  (2015),  aktivitas  proteolitik  dari  isolat Bacillus sp. B1 yang diisolasi dari rizosfer tanaman sawi menunjukkan  aktivitas  optimumnya  pada  waktu produksi  30  jam.  Aktivitas  enzim  Bacillus  sp.  UJI32 dari penelitian ini masih lebih kecil dibandingkan nilai aktivitas enzim protease Bacillus sp. Ve1 yang memiliki aktivitas  protease  tertinggi  sebesar  397  U/mL  pada media  gelatin  cair  (Patel  et  al.,  2004).  Selain  hal tersebut,  Nilegaonkar  et  al.  (2006)  memberikan laporan yakni enzim protease Bacillus cereus MCM B- 326  yang  diisolasi  dari  kulit  kerbau  mempunyai aktivitas maksimum sebesar 126,87 U/mL di medium pati kedelai.

## Pengaruh  Suhu
Setiap  enzim  dapat  memiliki  aktivitas  optimum yang tertentu. Enzim protease dari isolat Bacillus sp. UJ132 memiliki optimum pada suhu 50°C (Gambar 3).
Suatu enzim akan memiliki aktivitas yang semakin tinggi jika suhu semakin dinaikkan hingga mencapai aktivitas  maksimum.  Namun,  Jika  kenaikan  suhu semakin  dilakukan  ketika  enzim  mencapai  fase maksimum hal ini akan menyebabkan protein dalam
Gambar 1. Bakteri Bacillus sp. UJI132 ditumbuhkan pada media skim milk + SWC-agar umur 24 jam pada suhu ruang.
Figure 1. Bacteria of Bacillus sp. UJI132 was grown on media of skim milk +
SWC-agar at room temperature for 24 hours.
enzim  akan  terdenaturasi  yang  menyebabkan penurunan  aktivitas  enzim  hingga  kembali  ke  fase minimum. Pada suhu 20°C dan 30°C aktivitas protease sebesar  0,01  U/mL  (aktivitas  relatif  100%).  Nilai tersebut  paling rendah  dibandingkan aktivitas  pada suhu  yang  lain.  Aktivitas  tertinggi  terjadi  pada perlakuan suhu 50°C dengan nilai sebesar 0,08 U/mL. Oleh karena itu, suhu 50°C merupakan suhu maksimum produksi protease dari isolat Bacillus sp. hutan man- grove. Meskipun aktivitas protease  pada suhu 60°C tetap ada namun sangat rendah. Hal ini diakibatkan enzim protease telah mencapai fase optimum. Soeka et  al.  (2011)  melaporkan  Bacillus  licheniformis mempunyai aktivitas optimum pada suhu 60°C. Yandri et al. (2007) juga melaporkan aktivitas protease hasil pemurnian B. subtilis ITBCCB148 optimum pada suhu
60°C enzim protease hasil pemurnian dengan aktivitas 0,91 U/mL.

## Pengaruh  pH
pH mempunyai peranan penting terhadap aktivitas suatu enzim. Kondisi lingkungan enzim harus sesuai dengan karakter enzim sehingga enzim dapat bekerja secara optimum dan mencapai hasil yang maksimum. Isolat Bacillus sp. UJ132 hasil isolasi dari sampel udang pasir di hutan mangrove Lampung Timur yang telah diukur aktivitasnya dalam rentang pH 4-12 mempunyai aktivitas tertinggi pada pH 5 (Gambar 4).
Selain suhu, pH juga memengaruhi aktivitas enzim. Aktivitas protease pada pH 5 terlihat dari Gambar 4 yang memiliki nilai aktivitas enzim protease sebesar
Gambar 2. Pengaruh waktu produksi terhadap aktivitas protease. Figure 2. The effect of production period on protease activity.
Gambar 3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas relatif protease dari Bacillus sp. UJ132.
Figure 3. The effect of temperature on relative protease activity of Bacillus sp. UJ132. 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 20 30 40 50 60 70 A kt iv it as p ro te as e re lat if R el at iv e p rot ea se a ct iv it y Suhu (Temperature) (°C) -0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 6 12 18 24 30 36 A kt iv it as p ro te as e Pr ot ea se a ct iv it y (U /m L)
Waktu produksi (jam) / Production time (hours)
0,09 U/mL. Selanjutnya pada pH 6-12 aktivtas protease menurun  di  rentang  nilai  0,01  dan  0,02  U/mL. Penurunan aktivitas protease dapat disebabkan karena pH  yang  sudah  tidak  optimum  di  rentang  pH  6-12. Sehingga dapat dikatakan bahwa kondisi pH maksimum protease isolat Bacillus dari hutan mangrove ada pada pH 5. Pada penelitian Novita et al. (2006) melaporkan bahwa isolat Bacillus amyloliquefaciens NRRL B-14396 memiliki aktivitas optimum pada pH 7,5. Begitu pula Bacillus  subtillis  yang  diisolasi  dari  terasi  Samarinda mempunyai pH optimum 8,5 (Yati & Sulistiyani, 2014). Perubahan pH yang ekstrem, enzim dapat mengalami denaturasi  akibat  gangguan  terhadap  berbagai interaksi nonkovalen yang menjaga kestabilan struktur tiga dimensi enzim (Hames & Hooper, 2000).

## Pengaruh Ion Logam  terhadap  Aktivitas Enzim Protease
Pengaruh ion logam Ca 2+ , Mn 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ , serta inhibitor spesifik EDTA terhadap aktivitas isolat Bacillus sp. hutan mangrove terlihat pada Gambar 5. Semua ion logam yang ditambahkan pada uji aktivitas protease berfungsi sebagai inhibitor kecuali ion logam Fe 2+ (5  mM)  yang  berfungsi  sebagai  aktivator (Gambar 5).
Selain suhu dan pH, ion logam juga memengaruhi aktivitas  enzim.  Ion  logam  merupakan  kofaktor. Kofaktor  digunakan  untuk  mendukung  aktivitas katalitik  enzim.  Ion  logam  dapat  menjadi  aktivator dan juga inhibitor. Ion dapat dikatakan aktivator jika dapat menaikkan aktivitas enzim. Sementara, dapat menjadi  inhibitor  apabila  ion  logam  tersebut menghambat aktivitas protease yang ditandai dengan
menurunnya  aktivtas  enzim.  Pada  isolat  Bacillus  sp. UJ132  semua  ion  logam  (Ca 2+ ,  Mn 2+ ,  Cu 2+ ,  Mg 2+ ) bekerja  sebagai  inhibitor  kecuali  ion  Fe 2+ yang bertindak sebagai aktivator baik pada konsentrasi 1 mM dan 5 mM. Hal ini dapat dilihat dari grafik (Gambar 5).  Pada  percobaan  Sumardi  et  al.  (2018)  juga membuktikan  bahwa  ion  logam  Fe 2+ yang  diberi paparan medan magnet 0,2 mT dalam medium dapat meningkatkan  produksi  protease  pada  Bacillus  sp. EDTA  mempuyai  pengaruh  yang  signifikan  dalam aktivitas  protease  isolat  Bacillus  sp.  UJI132  yakni sebagai  inhibitor  pada  semua  reaksi.  Perbandingan ion  logam  sebagai  inhibitor  atau  aktivator  dapat dilihat  dengan  membandingkan  setiap  aktivitas  ion logam  dengan  kontrol  (tanpa  ion  logam).  Hasil penelitian Utarti et al. (2009) menunjukkan bahwa ion logam yang berfungsi sebagai kofaktor protease dari Bacillus sp. 31 adalah ion Fe 2+ . Hal ini berbeda dengan hasil karakterisasi dari Adinarayana et al. (2003) bahwa serin alkalin protease dari B. subtilis PE-11 kofaktornya adalah ion Ca 2+ , Mg 2+ , dan Mn 2+ . Sementara pada pro- tease dari  Bacillus  sp.  APR-4 kofaktornya  adalah  ion Ca 2+ dan  ion  Cu 2+ (Kumar  &  Bhalla,  2004).  Adanya penghambatan ion logam terhadap aktivitas proteaase pada konsentrasi tertentu berkaitan dengan kekuatan ion,  dan  kekuatan  ion  itu  sendiri  memengaruhi konformasi  atau  struktur  tiga  dimensi  dari  protein enzim atau protein substrat (Suhartono, 1989).

## Kinetika  Enzim  (Km  dan  Vmaks)
Dari  persamaan  lineweaver-Burk  diperoleh  harga Vmaks  enzim  protease  0,330  U/mL;  sedangkan  Km senilai 4,598 mg/mL substrat (Gambar 6).
Gambar 4. Pengaruh pH buffer terhadap aktivitas relatif protease dari Bacillus sp. UJ132.
Figure 4. The enfluence of buffer pH on relative protease activity of Bacillus sp. UJ132. 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A kt iv it as p ro te as e re lat if R el at iv e p rot ea se a ct iv it y pH
Kinetika enzim merupakan saah satu karakteristik yang  dibutuhkan dalam  mengkarakter suatu  enzim. Kinetika  enzim  sendiri  diartikan  sebagai  setiap konsentrasi  substrat  yang  memengaruhi  aktivitas suatu  enzim.  Dari  persamaan  Lineweaver-Burk diperoleh harga Vmaks enzim protease 0,330 U/mL; sedangkan Km senilai 4,598 mg/mL substrat (Gambar 6).  Harga Km  lebih  besar  jika dibandingkan  dengan isolat Bacillus sp. 31 yang mempunyai nilai Km sebesar 1,5 x 10 -3 (Utarti et al., 2009). Bila dibandingkan dengan
serin  protease  dari  Bacillus  sp.  31  yang  mempunyai Vmaks  21,32  U/mg  (Utarti  et  al.,  2009)  kecepatan maksimum  protease  dari  Bacillus  sp.  31  tergolong rendah.

## KESIMPULAN
Enzim protease Bacillus sp. UJ132 diproduksi dalam waktu  yang  relatif  singkat  (18  jam)  dengan  nilai kecepatan aktivitas V maks enzim protease sebesar 0,33  U/mL;  walaupun  mempunyai  daya  ikat  rendah
Gambar 5. Pengaruh  ion  logam  dan  inhibitor  EDTA  terhadap  aktivitas  protease relatif dari Bacillus sp. UJ132.
Figure 5. The effect of metal ion and EDTA inhibitors on relative protease activity of
Bacillus  sp.  UJ132.
Gambar 6. Kurva lineweaver-Burk (1/V terhadap 1/[S]) untuk mengetahui kinetika protease dari Bacillus sp. UJ132.
Figure 6. Lineweaver-Burk plot (1/V versus 1/[S]) for determination of kinetic protease of Bacillus sp.  UJ132.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Kontrol Control Mg Mn Ca Fe Cu EDTA A kt iv it as p ro te as e re la ti f R el at iv e p rot ea se a ct iv it y (% ) Ion logam (Metals ion) 1 mM 5 mM
y = 15.94x + 2.4911 R² = 0.9493 0 5 10 15 20 25 30 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 1 /ak ti vi tas p ro te as e 1/ pr ot ea se a ct iv it y (U /m L) 1/konsentrasi substrat 1/substrate concentration (%)
terhadap substrat (Km 4,59 mg). Enzim protease dari Bacillus  sp.  UJ132  ini  mempunyai  kondisi  optimum pada pH 5 dan suhu 50°C.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didanai oleh Hibah Pascasarjana Uni- versitas Lampung dengan kontrak No: 1572/ UN26.21 / PP / 2018, tanggal 9 Juli 2018.

## DAFTAR  ACUAN
Adinarayana, K., Ellaiah, P., & Prasad, D.S. (2003). Pu- rification and partial characterization of thermo- stable serine alkaline protease from a newly iso- lated  Bacillus  subtilis  PE  11.  AAPS  Pharm.Sci.Tech, 4(4), 1-9.
Bergmeyer, H.U. & Grassl, F. (1983). Method of enzy- matic analysis. Third Edition. VCH (Verlagsgesellschaft), Meinheim, Germany. Volume II (Samples, reagents, assesment of results), p. 1- 159.
Hames, B.D. & Hooper, N.M. (2000). Biochemistry: The Instant Notes. Ed.ke-2. Hongkong: Springer-Verlag Hany, H. (2011). Optimalisasi substitusi tepung Azolla terfermentasi pada pakan ikan untuk meningkatkan produktivitas ikan nila GIFT. Jurnal Teknik Industri, 12(2), 177-181.
Inten, H.N., Nengah, I.W., & Mayun, L.A.A.I.A. (2015). Analisis potensi protease ekstraseluler tanah hutan mangrove Pantai Suwung Kauh Bali. Cakra Kimia, 3(2), 84-90.
Kumar, D. & Bhalla, T.C. (2004). Purification and cha- racterization of a small size protease from Bacil- lus sp. APR-4. Exp. Biol., 42, 515-517.
Moriarty,  D.J.W.  (1998).  Control  of  luminous  Vibrio species in penaeid aquaculture ponds. Aquaculture, 184, 351-358.
Muliani,  Nurbaya,  Tompo,  A.,  &  Atmomarsono,  M. (2004).  Eksplorasi  bakteri  filosfer  dari  tanaman mangrove sebagai bakteri probiotik pada budidaya udang windu Penaeus monodon. J. Pen. Perik. Indo- nesia, 2, 47-57.
Murdianto. (2015). Study on the effects of probiotic, Pediococcus  acidilactici  in  the  diet  on  some  bio- logical  indices  of  Oscar  astronautsocellatus.  Inter- national  Research  Journal  of  Applied  and  Basic  Sci- ences, 4(11), 3458-3464.
Nilegaonkar,  S.S.,  Zambare,  V.P.,  Kanekar,  P.P., Dhakephalkar,  P.K.,  &  Saranik,  S.S.  (2006).  Pro- duction and partial characterization of dehairing protease from Bacillus cereus MCM B-326. Bioresource Technology, 98, 1238-1245.
Novita,  W.,  Arief,  K.,  Nisa,  F.C.,  &  Murdiyatmo,  U.
(2006). Karakterisasi parsial ekstrak kasar enzim
protease  dari  Bacillus  amyloliquefaciens  NRRL  B- 14396. Jurnal Teknologi Pertanian, 7(2), 96-105.
Patel, R., Dodia, M., & Singh, S.P. (2004). Extracellu- lar  alkaline  protease  from  a  newly  isolated haloalkaliphilic Bacillus sp.: Production and opti- mization. Process Biochemistry, 40, 3569-3575.
Soeka, Y.S., Rahayu, S.H., Setianingrum, N., & Naiola, E. (2011). Kemampuan Bacillus licheniformis dalam memproduksi enzim protease yang bersifat alkalin dan  termofilik.  Media  Litbang  Kesehatan,  21(2), 89-95.
Suhartono,  M.T.  (1989).  Enzim  dan  bioteknologi. Departemen  Pendidikan  dan  Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Antar Uni- versitas  Bioteknologi.  Institut  Pertanian  Bogor. Bogor.
Sumardi, Sutyarso, Susanto, G.N., Kurtini, T., Hartono,
M., & Widhi, R.R.E.P.N. (2016). Pengaruh probiotik terhadap kolesterol darah pada ayam petelur (layer). Jurnal Kedokteran Hewan, 10(2), 128-131.
Sumardi, Agustrina, R., Irawan, B., & Selfiana, I. (2018). Pengaruh paparan medan magnet 0,2 mT pada ion logam  Fe  dan  Zn  dalam  media  pertumbuhan terhadap  protease  Bacillus  sp.  Jurnal  Ilmu Lingkungan, 16(2), 173-177.
Sumardi,  Ekowati,  C.N.,  &  Rismayanti.  (2019).  The activity  assay  of  protease,  cellulase,  amylase, xylanase, and mannanase from Bacillus sp. as a can- didate of probiotics. World Journal of Pharmaceuti- cal and Life Sciences, 5(3), 88-93.
Ward, O.P, Rao, M.B., & Kulkarni, A. (2009). Proteases production.  Applied  Microbiol.  Industrial,  p.  495- 511.
Utarti,  E.,  Nurita,  L.,  &  Arimurti,  S.  (2009). Karakterisasi  protease  ekstrak  kasar  Bacillus  sp. 31 characterization of crude protease Bacillus sp. 31. Jurnal Imu Dasar, 10(1), 102-108.
Yandri, T.S., Dian, H., & Sutopo, H. (2007). The chemi- cal modification of protease enzyme isolated from local bacteria isolate, Bacillus subtilis  ITBCCB148 with  cyanuric  chloride  polyethylenglycol.  Europ. J. Scien. Resea., 23, 177-186.
Yati, S.S. & Sulistiyani. (2014). Karakterisasi protease Bacillus subtilis A1 Inacc B398 yang diisolasi dari terasi Samarinda. Berita Biologi, 13(2), 203 211.
Yuniati,  R.,  Nugroho,  T.T.,  &  Puspita,  F.  (2015).  Uji aktivitas  enzim  protease  dari  isolat  Bacillus  sp. galur lokal Riau. JOMP FMIPA, 1, 116-122.
Yunita, S.P. (2012). Skrining dan uji aktivitas enzim pro- tease bakteri dari limbah rumah pemotongan hewan. Skripsi. Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga, Surabaya.