## UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN TERHADAP DPPH DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA AKTIF EKSTRAK KASAR MIKROALGA Chlorella sp .

## HASIL KULTIVASI DALAM MEDIUM EKSTRAK TAUGE
Siti Khairul Bariyyah, A. Ghanaim Fasya, Munirul Abidin, A. Hanapi
UIN Maulana Malik Ibrahim Malang Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi,

## ABSTRACT
Chlorella  sp .  is  one  of  the  low-level  plants  that  have  the  potential  to  be  utilized,  as  stated  in  al  Quran surah  asy  Syu’ara:  7. Chlorella  sp. is  one  species  of  microalgae  containing  antioxidant  compound,  such  as flavonoid,  tanin,  phenolic  compound,  terpenoid,  chlorophyll  and  karotenoid.  Purpose  this  research  was  to determine potential antioxidant activity and active compound of Chlorella sp . Chlorella sp . was cultivated in Tauge Extract Medium (TEM) 4 % and harvesting at 10 th day. Extraction of Chlorella  sp .  was  estimated  by  maceration  method  using  two  variationsolvent,  methanol  and  ethyl  acetate. Antioxidant activity of crude extract Chlorella sp. wasestimated by DPPH assay with spectrofotometryUV-Vis. Identification of active compound was estimated by phytochemical reagent assay, as alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, tanin, and ascorbic acid.
The result showed that the highest number of cells (4,6 x 10 5 cell/mL) when Chlorella sp . cultivation in TEM occured at 10 th day. The rendemen of methanol and ethyl acetate extract of Chlorellasp . as follows7,001 % and 3,673 %. EC 50 value of methanol and ethyl acetate extract Chlorellasp . were 18,610 ppm and 27,320 ppm. The identification result of active compound of crude extract Chlorellasp . showed that methanol extract contains steroid, tannin, and ascorbic acid, while ethyl acetate extract contains tannin and ascorbic acid.
Keywords : Chlorella sp ., Tauge Extract Medium, Antioxidant, DPPH

## ABSTRAK
Chlorella  sp.  merupakan  salah  satu  tumbuhan  tingkat  rendah  yang  mempunyai  potensi  untuk dimanfaatkan, sebagaimana Firman Allah Swt. dalam al-Quran surat asy Syu’ara ayat 7. Chlorella sp. termasuk dalam  spesies  mikroalga  dari  kelompok  Chlorophyta  yang  mengandung  senyawa  yang  berpotensi  sebagai antioksidan seperti flavonoid, tanin, senyawa fenolik, terpenoid, klorofil dan karotenoid. Tujuan dari penelitian ini  adalah  untuk  mengetahui  potensi  aktivitas  antioksidan  dan  golongan  senyawa  aktif  dari  Chlorella  sp.  yang ditumbuhkan dalam Medium Ekstrak Tauge (MET).
Chlorella sp. dikultivasi dalam MET 4 % dan pemanenan dilakukan pada hari ke-10. Ekstraksi Chlorella sp. dilakukan dengan metode maserasi menggunakan dua variasi pelarut yaitu metanol dan etil asetat. Aktivitas antioksidan  ekstrak  kasar  Chlorella  sp.  dilakukan  dengan  uji  DPPH  secara  spektrofotometri  sinar  tampak. Identifikasi  golongan  senyawa  aktif  dilakukan  dengan  menggunakan  uji  reagen  secara  kualitatif  yang  meliputi alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, tanin, dan asam askorbat.
Hasil penelitian  menunjukkan bahwa kerapatan sel tertinggi (4,6 x 105 sel/mL) saat  kultivasi  Chlorella sp.  dalam  MET  terjadi  pada  hari  ke-10.  Rendemen  dari  ekstrak  metanol  dan  ekstrak  etil  asetat  Chlorellasp. berturut-turut adalah 7,001 % dan 3,673 %. Ekstrak metanol Chlorella sp. mempunyai aktivitas antioksidan yang kuat dengan nilai EC50 sebesar 18,610 ppm, begitu juga dengan ekstrak etil asetat yang mempuyai nilai EC50 sebesar 27,320 ppm. Hasil identifikasi  golongan senyawa  aktif  yang  terkandung dalam  ekstrak  kasar  Chlorella sp.  menunjukkan bahwa ekstrak  metanol  mengandung  steroid, tanin dan asam askorbat, sedangkan ekstrak etil asetat mengandung tanin dan asam askorbat.
Kata kunci : Chlorella sp ., MET, Antioksidan, DPPH

## I. PENDAHULUAN
Chlorella  sp.  merupakan  tumbuhan ganggang  hijau  bersel  tunggal,  hidup menyendiri atau berkelompok, tidak mempunyai batang, akar, dan daun sebenarnya.  Chlorella  sp.  tumbuh  di  air tawar,  air  payau,  dan  air  asin.  Beberapa keunggulan mikroalga Chlorella sp.,
diantaranya berkembang biak dengan cepat,
mudah dalam
membudidayakannya (Sidabutar,  1999)    karena  hidupnya  tidak tergantung musim, tidak memerlukan tempat  yang  luas  dan  tidak  memerlukan waktu  yang  lama  untuk  memanennya (Borowitzka,  1988),  keseluruhan  organnya dapat  dimanfaatkan,  mengandung  senyawa pemacu  pertumbuhan.  Selain  itu,  Chlorella sp.  mengandung  berbagai  nutrien  seperti protein, karbohidrat, asam lemak tak jenuh, vitamin, enzim (Kawaroe, 2008), klorofil a, klorofil  b,  serta  karotenoid.  Klorofil  dan karotenoid  ini  dapat  berfungsi  sebagai antioksidan.
Antioksidan merupakan senyawa yang  dapat  menghambat  reaksi  oksidasi, dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang  sangat  reaktif  (Winarsi,  2007). Keberadaan  antioksidan  dapat  melindungi tubuh  dari  berbagai  penyakit  degeneratif dan  kanker,  serta  membantu  menekan proses  penuaan/ antiaging (Tapan,  2005).
Saat ini antioksidan  yang umum digunakan merupakan  antioksidan  sintetik  diantaranya Butylated hydroxyanisole (BHA), Butylated hydroxytoluene (BHT), Propylgallate (PG)
dan Tert-Butylhydroquinone (TBHQ) (Sherwin,  1990).  Akan  tetapi,  senyawa tersebut  dicurigai  dapat  menyebabkan keracunan  dan  efek  karsinogenik  (Grillo dan  Gulout,  1995;  Safer  an  Nughamish, 1999;  Shanab,  2007).  Oleh  karena  itu, pengembangan serta pemanfaatan antioksidan  yang  lebih  efektif    dan  berasal dari  alam  penting  untuk  dilakukan  (Oktay, et al., 2003).
Pengujian aktivitas antioksidan mikroalga Chlorella  sp. yaitu  pada  ekstrak biomassa.  Oleh  karena  itu, Chlorella sp . dikultivasi  terlebih  dahulu  dalam  media kultur.  Media  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  Medium  Ekstrak Tauge  (MET).  MET  ini  merupakan  salah satu  media  alami  untuk  pertumbuhan mikroalga.  Tauge  kacang  hijau  merupakan jenis  sayuran  yang  umum  dikonsumsi, mudah  diperoleh,  ekonomis,  dan  tidak menghasilkan senyawa yang berefek toksik. Media perlakuan MET mengandung
nutrient organik seperti karbohidrat, protein, vitamin dan lemak yang dibutuhkan  sebagai  sumber  energi  bagi pertumbuhan  mikroalga.  Selain  itu,  media perlakuan  MET  ini  juga  mengandung makronutrient  anorganik  seperti  K,  P,  Ca, Mg,  dan  Na  yang  dibutuhkan  oleh  sel mikroba  sebagai  komponen  penyusun  sel, sedangkan mikronutrien seperti Fe, Zn, Mn, dan  Cu  dibutuhkan  oleh  sel  sebagai kofaktor  enzim  dan  sebagai  komponen pembentuk  klorofil  (Richmond,  2006). Dilaporkan bahwa senyawa-senyawa dalam media  kultur  juga  akan  mengefektifkan fotosintesis  pada  mikroalga.  Fotosintesis yang berlangsung efektif akan mempengaruhi  produk  yang  dihasilkan (Wulandari,  dkk.,  2010).  Selain  itu,  setiap jenis  media  kultur  memberikan  pengaruh berbeda terhadap kualitas kandungan mikroalga (Carolina, 1995).
II. METODE PENELITIAN
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksakan di Laboratorium Kimia Organik,
Laboratorium  Bioteknologi  Jurusan  Kimia dan  Laboratorium  Ekologi  Jurusan  Biologi Universitas  Islam  Negeri  (UIN)  Maulana Malik Ibrahim Malang pada bulan  Maret – Mei 2013.
Alat
Seperangkat alat gelas, cawan porselen,  shaker,  oven,  desikator,  rotary evaporator  vacuum,  kuvet,  inkubator,  pipet tetes,  aluminium  foil,  neraca  analitik, sentrifuse, spektronik
20+, dan spektofotometer UV-Vis Varian Carry.

## Bahan
Isolat  mikroalga Chlorella  sp. dari Laboratorium Ekologi Universitas Maulana Malik  Ibrahim  Malang.  Bahan-bahan  lain yang  digunakan  adalah  metanol p.a. ,  etil asetat p.a. ,  tauge    (kacang  hijau),  akuades, larutan  DPPH,  kloroform,  anhidrida  asetat, asam  sulfat  pekat,  serbuk  Mg,  HCl  37  %, HCl  2  %,  reagen  Dragendorff,  reagen Mayer,  FeCl 3 1  %,  larutan  gelatin,  kalium permanganat, vitamin C, dan BHT.
Metode Penelitian
A. Kultivasi Mikroalga Chlorella sp.
1. Sterilisasi Alat
Ditutup alat-alat yang akan disterilkan dengan alumunium foil. Dimasukkan  ke  dalam  autoklaf  dan  diatur pada  suhu  121  oC  dengan  tekanan  15  psi (per  square  inchi).  Sterilisasi  dilakukan untuk alat selama 30 menit (Hidayat, 2009). 2. Pembuatan Medium Ekstrak Tauge
Pembuatan  medium  ekstrak  tauge diawali  dengan  pembuatan  larutan  stok MET  yaitu  100  gram  tauge  direbus  dalam 500  mL  akuades  yang  mendidih  selama  1 jam  hingga  volume  ekstrak  200  mL. Medium  ekstrak  tauge  dibuat  dengan  cara melarutkan ekstrak tauge ke dalam akuades dengan  masing-masing  konsentrasi  4  % (Prihantini, dkk., 2005).
3. Kultivasi Chlorella sp. dalam Media

## Ekstrak Tauge
Sebanyak 100 ml isolat  Chlorella sp. diinokulasikan  ke  dalam  masing-masing 600  mL  MET  dalam  erlenmeyer  1000  mL yang  ditempatkan  pada  rak  kultur  yang telah dilengkapi dengan pencahayaan menggunakan lampu TL 36 watt (intensitas cahaya 1000 – 4000 lux) dan fotoperiodisitas  14  jam  terang  dan  10  jam gelap  selama  10  hari  (Prihantini,  dkk., 2005).
4. Pemanenan Biomassa Chlorella sp .
Media kultur Chlorella sp. disentrifuse  selama  15  menit  dengan kecepatan  3000 rpm .  Biomassa Chlorella sp . dipisahkan dari supernatannya.

## B. Penentuan Kadar Air
Cawan yang akan digunakan dipanaskan  dahulu  dalam  oven  pada  suhu 100–105  °C  selama  15  menit,  kemudian cawan  disimpan  dalam  desikator  10  menit, selanjutnya ditimbang dan dilakukan perlakuan yang sama hingga diperoleh berat cawan  yang  konstan.  Biomassa Chlorella sp. ditimbang  1  mg  kemudian  dimasukkan ke  dalam  cawan  dan  dikeringkan  di  dalam oven  pada  suhu  100  –  105  ºC  selama  30
menit, kemudian dimasukkan dalam desikator  dan  ditimbang.  Selanjutnya, dipanaskan  kembali  dalam  oven  30  menit, didinginkan dalam desikator dan ditimbang kembali  hingga  berat  konstan.  Kadar  air dihitung menggunakan rumus berikut :
Kadar air  = (b - c) b - a × 100%
Dimana : a = bobot cawan kosong b  =  bobot  sampel  +  cawan  sebelum dipanaskan c  =  bobot  cawan  +  sampel  setelah dipanaskan

## C. Preparasi Sampel
Sampel biomassa Chlorella sp . basah diambil
seluruhnya kemudian
dikeringanginkan  pada  suhu  ruang  selama 12  jam.  Selanjutnya  dilakukan  ekstraksi pada sampel biomassa kering yang diperoleh.

## D. Ekstraksi Senyawa Aktif Mikroalga
Chlorella sp.
Biomassa Chlorella sp. kering diambil  50  gram  kemudian  dimaserasi masing-masing dengan pelarut metanol dan etil asetat sebanyak 250 mL selama 24 jam dengan  di shaker selama  5  jam.  Maserasi dilakukan  tiga  kali.  Setelah  itu  dipisahkan antara  filtrat  dengan  residu  menggunakan corong  buchner.  Filtrat  yang  diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator vacuum hingga  diperoleh  ekstrak  pekat metanol dan etil asetat.

## E. Uji Aktivitas Antioksidan dengan
DPPH ( 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl )
1. Penentuan Panjang Gelombang

## Maksimum
Larutan  DPPH  0,5  mM  sebanyak  5 mL dimasukkan dalam kuvet hingga penuh. Dicari  λ maks larutan  dan  dicatat  hasil pengukuran  λ maks untuk  digunakan  pada tahap selanjutnya (Hanani, dkk., 2005).
2. Penentuan Waktu Kestabilan Pengukuran Antioksidan
Larutan  ekstrak  30  ppm  dipipet sebanyak  6,75  mL.  Ditambahkan  larutan DPPH  0,5  mM  sebanyak  2,25  mL, kemudian  dicari  waktu  kestabilan  tanpa inkubasi dan setelah inkubasi pada suhu 37 ºC  dan  rentangan  waktu  5  –  100  menit dengan  interval  5  menit.  Sampel  diukur pada  λ maks yang  telah  diketahui  pada  tahap sebelumnya.

## 3. Pengukuran Potensi Antioksidan Pada Sampel
Sampel  ekstrak  dilarutkan  dalam pelarutnya dengan konsentrasi 5, 10, 15, 20, 25,  dan  30  ppm.  Ekstrak  masing-masing konsentrasi dipipet 6,75 mL dan ditambahkan  2,25  mL  DPPH  0,5  mM kemudian  diinkubasi  dengan  suhu  37 o C pada waktu  kestabilan  yang diperoleh pada tahap sebelumnya, kemudian diukur absorbansinya
menggunakan
spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang  518,0  nm.  Data  absorbansinya yang  diperoleh  dari  tiap  konsentrasi masing-masing ekstrak dihitung nilai persen (%) aktivitas antioksidannya (Arindah, 2010):
= ( A kontrol–A sampel Akontrol ) × 100%
Selanjutnya,  dihitung  nilai  EC 50 nya dengan  memperoleh  persamaan  regresi menggunakan  program  “ GraphPad  prism5 software,  Regression  for  analyzing  dose- response data”.
Kontrol  yang  digunakan  yaitu  larutan DPPH 0,5 mM dalam metanol p.a.
Pembanding  BHT  dan  asam  askorbat (Vitamin C) diperlakukan seperti sampel.

## F. Identifikasi Golongan Senyawa Aktif Secara Kualitatif
1. Uji Triterpenoid dan Steroid
Ekstrak kasar diambil dan dilarutkan dengan  kloroform  sebanyak  0,5  mL,  lalu ditambah  dengan  0,5  mL  anhidrida  asetat. Selanjutnya  ditambah  dengan  1  –  2  mL H 2 SO 4 pekat  melalui  dinding  tabung tersebut. Warna hijau kebiruan menunjukkan  adanya  steroid,  jika  berupa
cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan adanya triterpenoid.
2. Uji Flavonoid
Ekstrak  dilarutkan  dalam  1  –  2  mL metanol  panas  50  %,  kemudian  ditambah logam Mg dan 0,5 mL HCl pekat. Senyawa flavonoid  akan  menimbulkan  warna  merah atau jingga.

## 3. Uji Alkaloid
Ekstrak  kasar  ditambah  0,5  mL  HCl 2  %,  selanjutnya  larutan  dibagi  dalam  dua tabung.  Tabung  I  ditambahkan  2  –  3  tetes reagen Dragendorff, tabung II ditambahkan 2  –  3  tetes  reagen  Mayer.  Jika  tabung  I terbentuk  endapan  jingga  dan  pada  tabung II  terbentuk  endapan  kekuning-kuningan menunjukkan adanya alkaloid.
4. Uji Tanin
 Uji dengan FeCl 3 Ekstrak  ditambahkan  dengan  2  –  3 tetes  larutan  FeCl 3 1  %.  Jika  larutan menghasilkan  warna  hijau  kehitaman  atau biru tua, maka mengandung tanin.
 Uji dengan Larutan Gelatin
Ekstrak  ditambah  dengan  larutan gelatin.  Jika  terbentuk  endapan  putih, menunjukkan adanya tanin.

## 5. Uji Asam Askorbat
Masing-masing  ekstrak  dilarutkan dalam  akuades  kemudian  ditambahkan larutan KMnO 4 0,1 %. Jika terbentuk warna cokelat  maka  menunjukkan  adanya  asam askorbat.

## G. Analisis Data
Analisis  data  dilakukan  dengan menghitung persen (%) aktivitas
antioksidan  yang  diperoleh  dari  data absorbansi kemudian dilakukan perhitungan nilai EC 50 dengan menggunakan persamaan regresi  yang  menyatakan  hubungan  antara konsentrasi  ekstrak  (x)  dengan  persen  (%) aktivitas  antioksidan  (y).  Sampel  yang mempunyai nilai
EC 50 terendah menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki  kemampuan  sebagai  antioksidan yang tinggi.
Aktivitas antioksidan

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Kultivasi Mikroalga Chlorella sp.
Kultivasi Chlorella  sp. dilakukan dalam  Medium  Ekstrak  Tauge  (MET) menggunakan  erlenmeyer  1000  mL.  MET merupakan  salah  satu  sumber  media  alami yang dapat digunakan untuk media pertumbuhan  mikroalga  (Prihantini,  dkk., 2005). MET mengandung unsur makro dan mikro,  vitamin,  mineral  serta  asam  amino yang dibutuhkan bagi pertumbuhan mikroalga.  Unsur  hara  yang  terkandung dalam  MET  seperti  K,  P,  Fe,  Na,  dan  K, sedangkan  vitamin  yang  terkandung  dalam media tersebut diantaranya karoten, thiamin,  riboflavin,  niasin,  dan  vitamin  C (Persagi, 2009).
Chlorella  sp. dikultur  dalam  MET selama  10  hari  dengan  fotoperiodisitas  14 jam  terang  dan  10  jam  gelap.  Cahaya mempunyai  peranan  yaitu  sebagai  sumber energi dalam proses fotosintesis. Penyinaran dengan lampu TL selama kultur digunakan sebagai pengganti cahaya matahari  agar  sel Chlorella  sp .  dapat melakukan proses fotosintesis.
Temperatur selama kultivasi Chlorella  sp .  menggunakan  temperatur ruang  (biasanya  berkisar  antara  temperatur 25  –  30  ºC).  Kondisi  temperatur  tersebut merupakan  kisaran  temperatur  yang  baik untuk  pertumbuhan  mikroalga  termasuk Chlorella  sp .  karena  untuk  pertumbuhan mikroalga yang optimal digunakan temperatur  15  –  30  ºC  (De  La  Nouve  dan De Pauw, 1988).
Derajat  keasaman  (pH)  pada  kultur Chlorella sp . selama kultivasi berkisar  7 – 7,2. Kisaran pH ini berada pada kisaran pH yang  sesuai  untuk  pertumbuhan  mikroalga yaitu 4,5 – 9,3 (Prihantini, dkk., 2005).
Selama  kultivasi  terjadi  perubahan warna  kultur  pada  media  perlakuan  yang semula berwarna hijau kekuningan menjadi hijau  tua  seperti  pada  Gambar  1.  Warna hijau  dari  kelima  media  relatif  sama. Perubahan  warna  kultur  ini  diasumsikan juga  diikuti  dengan  peningkatan  kepadatan sel Chlorella sp. yang menandakan
terjadinya pemanfaatan nutrien (unsur hara) yang  terkandung  dalam  MET  oleh  sel-sel Chlorella sp. Begitu juga kesesuaian faktor cahaya, temperatur, dan pH yang digunakan mendukung penyerapan nutrien oleh sel-sel Chlorella sp.
Kultur hari ke-0
Kultur hari ke-5 Kultur hari ke-10
Gambar 1. Warna kultur Chlorella sp. pada hari berbeda
Pertumbuhan  mikroalga  pada  kultur juga  ditandai  dengan  bertambah  besarnya ukuran  sel  atau  bertambah  banyaknya jumlah sel. Pertumbuhan Chlorella sp . yang dikultivasi  dalam  MET  pada  penelitian  ini memiliki  pola  pertumbuhan  yang  dimulai dari  fase  eksponensial,  fase  stasioner,  dan fase  kematian.  Fase  eksponensial  dimulai dari  hari  ke-0  sampai  hari  ke-8,  fase stasioner terjadi pada hari ke-8 sampai hari ke-11  dan  fase  kematian  setelah  hari  ke-11 sampai  hari  ke-15.  Pola  pertumbuhan Chlorella sp . tidak mengalami fase lag. Hal ini  terjadi  karena Chlorella  sp .  yang diinokulasikan  tersebut  diambil  dari  fase eksponensial  sehingga  tidak  mengalami fase lag. Salah satu faktor yang menentukan lamanya  fase  adaptasi  adalah  umur  kultur yang  digunakan  sebagai  inokulum.  Fase adaptasi  akan  menjadi  lebih  singkat  atau bahkan  tidak  terlihat  apabila  sel-sel  yang diinokulasikan  berasal  dari  kultur  yang berada  dalam  fase  eksponensial.  Fase adaptasi  tidak  terlihat  secara  jelas  pada media perlakuan kemungkinan juga disebabkan  sel-sel  yang  diinokulasikan cepat  beradaptasi  terhadap  media  kultur yang  baru,  mampu  tumbuh  dan  membelah dengan cepat (Prihantini, dkk., 2005).
B. Pemanenan Mikroalga Chlorella sp. Pemanenan Chlorella  sp. dilakukan pada fase stasioner. Fase stasioner
merupakan tahap pertumbuhan yang konstan  dimana  laju  reproduksi  sama dengan  laju  kematian.  Meskipun  pada  fase stasioner  nutrien  semakin  berkurang,  tetapi pembelahan  sel  masih  dapat  berlangsung. Hal  ini  disebabkan  sel  memiliki  cadangan energi  sehingga  masih  dapat  menggunakan komponen tersebut untuk melakukan pertumbuhan dan mempertahankannya meski sangat rendah (Schlegel, 1994). Pada fase  stasioner  juga  terjadi  metabolisme sekunder  yang  merupakan  keseluruhan proses  sintesis  dan  perombakan  produk metabolit  primer  (Herbert,  1995).  Selain itu,  terjadi  penumpukan  produk  beracun dan  kehabisan  nutrien,  serta  menghasilkan komponen-komponen  (metabolit  sekunder) yang  berfungsi  untuk  pertahanan  hidup. Contoh produk senyawa metabolit sekunder seperti senyawa fenol, alkaloid, triterpenoid (Yudha, 2008).
Pemanenan Chlorella  sp. dilakukan pada  fase  stasioner  yaitu  pada  hari  ke-10. Hal  ini  karena  pada  hari  tersebut, pertumbuhan Chlorella sp . mencapai kepadatan  sel  tertinggi  yang  ditandai dengan  kultur  yang  berwarna  hijau  tua dengan jumlah sel 4,6 x 10 6 sel/mL. Proses pemanenan Chlorella sp. dilakukan dengan cara  mengumpulkan  biomassa  dan  filtrat dalam  wadah  botol.  Filtrat  dan  biomassa dari hasil pemanenan dipisahkan menggunakan  sentrifuse  dengan  kecepatan 3000 rpm selama  15  menit.  Teknik pemisahan  biomassa  dan  filtrat  dengan menggunakan  sentrifuse  merupakan  salah satu cara yang efisien (Volshak, 1990).

## C. Analisis Kadar Air
Penentuan kadar air dilakukan dengan  menguapkan  sampel  dalam  oven pada  suhu  100  –  105  ºC.  Kadar  air  dari biomassa Chlorella  sp. ditunjukkan  pada Tabel 1.
Tabel 1. Kadar air biomassa Chlorella sp.
Biomassa Kadar Air (%) Basah Kering 93,046 12,036

## D. Preparasi Sampel
Preparasi  sampel  pada  mikroalga Chlorella  sp. dilakukan  dengan  cara pengeringan biomassa hasil kultur. Pengeringan  biomassa  mikroalga Chlorella sp . dilakukan dengan cara dikeringanginkan pada suhu ruang selama 12 jam menggunakan kipas angin. Hembusan kipas angin  yang  dihasilkan  kipas  angin  tidak menimbulkan  panas  dan  dapat  membawa uap  air yang  lebih  besar  daripada pengeringan  AC  dan blowerheat ,  sehingga proses pengeringan berlangsung lebih cepat sebelum terjadinya kerusakan bahan (Sopyan, 2001).
Hasil  yang  diperoleh  dari  proses pengeringan  ini  menunjukkan  bahwa  dari 400  gram  biomassa  basah  didapatkan biomassa  kering  sebesar  55  gram,  yang berwarna hijau pekat.

## E. Ekstraksi Senyawa Aktif Mikroalga

## Chlorella sp.
Ekstraksi Chlorella  sp. dilakukan dengan metode maserasi menggunakan dua variasi  pelarut  yang  berbeda  kepolarannya, yaitu  metanol  (polar)  dan  etil  asetat (semipolar). Maserasi  ini digunakan karena prosesnya  mudah,  sederhana,  dan  tidak menggunakan suhu tinggi yang dimungkinkan dapat merusak senyawa aktif pada mikroalga Chlorella sp .
Hasil  rendemen  ekstrak  metanol  dan etil asetat ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Rendemen Ekstrak Chlorella sp. Pelarut Rendemen (%)(b/b) Warna Ekstrak Pekat Metanol Etil asetat 7,001 3,673 Hijau tua pekat Hijau tua kecoklatan
Rendemen  ekstrak  metanol  lebih besar  daripada  etil  asetat,  hal  ini  karena pelarut  metanol  yang  bersifat  polar  lebih banyak mengekstrak senyawa aktif daripada pelarut  etil  asetat  yang  bersifat  semipolar. Metanol  merupakan  pelarut  polar  yang sering digunakan karena penetrasi ke dalam dinding sel lebih efisien sehingga
menghasilkan  metabolit  sekunder  lebih banyak.  Hal  ini  menyebabkan  maserasi dengan pelarut metanol
akan mengahasilkan  ekstrak  dengan  kandungan metabolit  sekunder  lebih  banyak  dan beragam.

## F. Uji Aktivitas Antioksidan dengan
DPPH ( 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl )
1. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Hasil  penentuan  panjang  gelombang DPPH 0,5 mM diperoleh panjang gelombang maksimum sebesar 518,0 nm.
2. Penentuan Waktu Kestabilan

## Pengukuran Antioksidan
Pengukuran waktu
kestabilan dilakukan  untuk  mengetahui  waktu  sampel dan  DPPH  sudah  bereaksi  secara  stabil yang  ditunjukkan  dengan  tidak  adanya  lagi penurunan  absorbansi.  Setiap  senyawa memiliki  waktu  kestabilan  yang  berbeda untuk  dapat  bereaksi  secara  sempurna (Brand dan William, 1995).
Penentuan  waktu  kestabilan  pada ekstrak  metanol  dan  ekstrak  etil  asetat dilakukan  tanpa  inkubasi  dan  dengan inkubasi  pada  suhu  37  ºC  selama  5  –  100 menit  dengan  interval  5  menit.  Hasil penentuan  waktu  kestabilan  menunjukkan bahwa  sampel  yang  ditambahkan  dengan DPPH  dengan  inkubasi  memiliki  nilai absorbansi  yang  lebih  stabil  dibandingkan tanpa  inkubasi.  Grafik  penentuan  waktu kestabilan  ekstrak  metanol  dan  etil  asetat setelah ditambah larutan DPPH ditunjukkan pada Gambar 2 dan Gambar 3.
Gambar 2. Penentuan waktu kestabilan ekstrak metanol
Gambar 3. Penentuan waktu kestabilan ekstrak etil asetat
3. Pengukuran Potensi Antioksidan pada Mikroalga Chlorella sp.
Uji  kuantitatif  potensi  antioksidan pada ekstrak Chlorella sp . dalam penelitian ini  dilakukan  dengan  uji  DPPH  secara spekrofotometri  sinar  tampak.  Metode  ini didasarkan  pada  perubahan  warna  radikal DPPH. Perubahan warna tersebut disebabkan oleh reaksi antara radikal bebas DPPH  dengan  satu  atom  hidrogen  yang dilepaskan senyawa yang terkandung dalam bahan  uji  untuk  membentuk  senyawa 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazin yang  berwarna kuning.  Pada  metode  ini  absorbansi  yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH sisa yang  tidak  bereaksi  dengan  senyawa antioksidan (Josephy, 1997).
Pengujian  aktivitas  antioksidan  pada ekstrak metanol dan etil asetat Chlorella sp . yaitu  dengan  variasi  konsentrasi  5,  10,  15, 20,  25,  dan  30  ppm,  selanjutnya  diukur serapannya  pada  panjang  gelombang  518,0 nm  dengan  waktu  kestabilan  yang  telah didapatkan pada masing-masing ekstrak.
Parameter  yang  digunakan  untuk mengetahui  potensi  antioksidan  dalam ekstrak Chlorella  sp. yaitu  persen  (%) aktivitas  antioksidan  dan  nilai  EC 50 .  EC 50 dapat  didefinisikan  sebagai  konsentrasi larutan  sampel  yang  akan  menyebabkan reduksi terhadap aktivitas DPPH sebesar 50 %. Semakin kecil nilai EC 50 maka aktivitas antioksidannya  semakin  tinggi  (Molyneux, 2004).  Data  hasil  %  aktivitas  antioksidan dan nilai EC 50 ditunjukkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Persen aktivitas antioksidan dan nilai EC 50 ekstrak Chlorella sp . dan
pembanding N o Sampel % aktivitas antioksidan Nilai EC 50 (ppm) 5 ppm 10 ppm 15 ppm 20 ppm 25 ppm 30 ppm 1 Ekstrak Metanol 5,784 6,041 9,590 69,690 85,383 90,139 18,610 2 Ekstrak etil asetat 5,927 7,373 7,404 8,218 15,358 85,580 27,320 3 Asam askorbat 67,620 92,744 95,056 96,190 96,744 96,795 3,527 4 BHT 39,460 66,247 77,674 86,498 89,823 89,879 6,552
Ekstrak  mikroalga Chlorella  sp . fraksi  metanol  dan  etil  asetat  memiliki potensi  antioksidan  yang  kuat,  walaupun lebih  rendah  jika  dibandingkan  dengan antioksidan asam askorbat dan BHT.
G. Uji  Fitokimia  Ekstrak Chlorella  sp .
dengan Reagen
Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui  kandungan  senyawa  aktif  pada tanaman.  Uji  fitokimia  pada  penelitian  ini dilakukan  terhadap  ekstrak  metanol  dan ekstrak  etil  asetat Chlorella  sp .  Hasil  uji fitokimia mikroalga Chlorella sp . ditunjukkan dalam Tabel 4.
Tabel  4.  Hasil  pengamatan  uji  fitokimia  ekstrak mikroalga Chlorella sp .
N o Golongan Senyawa Hasil Pengujian Ekstrak Metanol Ekstrak Etil asetat 1 2 3 4 5 6 Alkaloid Flavonoid Steroid
Triterpenoid Tanin - FeCl 3 - gelatin Asam askorbat - - + -
- + + - - - -
- + + Keterangan  :  tanda (+) : terkandung
senyawa/warnamuda
tanda (–) : tidak terkandung senyawa/tidak terbentuk warna
1. Steroid
Uji
yang digunakan untuk
mengidentifikasi  adanya golongan senyawa steroid  pada  ekstrak  kasar Chlorella  sp . yaitu  menggunakan  reaksi  Liebermann- Burchard  (anhidrida  asetat-H 2 SO 4 pekat) yang  menghasilkan  warna  hijau  biru.
Steroid  akan  mengalami  dehidrasi  dengan penambahan  asam  kuat  dan  menghasilkan produk  oksidasi  yang  memberikan  reaksi warna  hijau  kebiruan.  Hasil  identifikasi menunjukkan bahwa ekstrak metanol Chlorella  sp .  mengandung  steroid  yang ditandai  dengan  terbentuknya  warna  hijau kebiruan.

## 2. Tanin
Uji  fitokimia  adanya  senyawa  tanin dalam  ekstrak Chlorella  sp .  menggunakan uji  dengan  FeCl 3 dan  uji  dengan  larutan gelatin.  Uji fitokimia  pertama yaitu menambah  ekstrak  dengan  larutan  FeCl 3 sebagai  reagen,  hasil  positif  ditunjukkan dengan  perubahan  warna  menjadi  hijau kehitaman  atau  biru  tua.  Sedangkan  uji fitokimia kedua yaitu menambahkan gelatin ke  dalam  ekstrak  dan  ditunjukkan  dengan adanya endapan putih.
Uji  fitokimia  dengan  penambahan FeCl 3 menunjukkan  hasil  negatif  karena tidak  terbentuk  warna  hijau  kehitaman/biru tua.Uji  fitokimia  dengan  penambahan gelatin  menunjukkan  hasil  positif  yang ditunjukkan dengan adanya endapan putih.
Uji fitokimia tanin dengan penambahan  FeCl 3 menunjukkan  hasil negatif  sedangkan  dengan  penambahan gelatin  menunjukkan  hasil  positif.  Hal  ini diduga karena senyawa tanin yang terkandung  dalam  ekstrak  masih  dalam bentuk glikosidanya sehingga sulit berikatan dengan ion logam (mengkelat ion logam).  Akan  tetapi,  dengan  penambahan gelatin  semua  tanin  menimbulkan  endapan sedikit  atau  banyak  (Harborne,  1987).  Hal ini  dikarenakan,  meskipun  masih  dalam bentuk  glikosidanya,  tanin  masih  mampu
untuk  berinteraksi  dengan  gelatin  melalui ikatan hidrogen.

## 3. Asam Askorbat
Ekstrak  metanol  dan  ekstrak  etil asetat  positif  mengandung  asam  askorbat yang  ditunjukkan  dengan  terbentuknya warna coklat. Hal ini didukung bahwa asam askorbat  bersifat  polar  sehingga  akan  larut dalam senyawa polar maupun semipolar.

## IV. KESIMPULAN
Aktivitas antioksidan ekstrak
Chlorella sp . terhadap DPPH ( 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl )  ditunjukkan  dengan  nilai EC 50 .  Nilai  EC 50 dari  ekstrak  metanol  dan ekstrak  etil  asetat  berturut-turut  yaitu 18,610  ppm  dan  27,320  ppm.  Aktivitas antioksidan Chlorella  sp .  tergolong  kuat karena  mempunyai  nilai  EC 50 kurang  dari 50 ppm.
Hasil  identifikasi  golongan  senyawa dalam  ekstrak  kasar  mikroalga Chlorella sp .  dengan  pelarut  metanol  dan  etil  asetat menunjukkan bahwa ekstrak metanol mengandung  senyawa  steroid,  tanin,  dan asam askorbat, sedangkan ekstrak etil asetat mengandung tanin dan asam askorbat.

## V. DAFTAR PUSTAKA
Sidabutar,  E.A..  1999.  Pengaruh  Medium Pertumbuhan  Mikroalga Chlorella  sp. terhadap  Aktivitas  Senyawa  Pemacu Pertumbuhan  yang  Dihasilkan. Skripsi
Tidak  Diterbitkan.  Institut  Pertanian Bogor.
Borowitzka,  M.  A.  dan  Lesley,  J.  B.  1988.
Microalgae Biotechnology . London: Cambridge University Press.
Kawaroe,  M.  2008.  Mikroalga  sebagai  Bahan Baku  Biofuel.  Surfactant  and  Bioenergy Research  Centre,  Lembaga  Pengabdian Pada  Masyarakat,  Institut  Pertanian Bogor.
Winarsi,  H.  2007. Antioksidan  Alami  dan Radikal  Bebas .  Yogyakarta:  Penerbit Kanisius.
Tapan  E..  2005. Kanker,  Antioksidan,  dan Terapi  Komplementer .  Jakarta:  PT Gramedia.
Sherwin,  F.R.,  1990. Antioxidant.  In:  Food Additive (ed.  Branen  R).  New  York:
Marcel Dekker.
Grillo, C.A. and F.N. Dulout. 1995. Cytogenetic  Evaluation  of  Butylated Hydroxytoluene. Mutat.  Res., (345)  : 73–85.
Safer,  A.M.  dan  A.L.  Nughamish.  1999.
Hepatotoxicity Induced by the Antioxidant  Food  Additive  Butylated Hydroxytoluene  (BHT)  in  Rats:  An Electron  Microscopical  Study. Histol. Histopathol., XIV: 391–406. Shanab,  S.M.M..  2007. Antioxidant  and Antibiotic  Activities  of  Some  Seaweeds (Egyptian  Isolates).  Agriculture  and Biology , IX (2): 220–225.
Oktay,  M.,  I.  Gulcin,  and  O.,  Kufrevioglu, 2003. Determination o f In Vitro Antioxidant Activity of Fennel (Foeniculum  Vulgare)  Seed  Extract . Lebensmittel-Wissenchaft
and
Technology, XXXVI: 263-271.
Richmond,  A.E..  1986. Microalga  Culture .
Tokyo: CRC Press.
Wulandari,  A.P.,  Frida  N.,  Annisa  E.P.,  dan
Dilaekha R.P.. 2010. Identifikasi Mikroalgae di Sekitar Pantai Pangandaran dan Potensi Pertumbuhannya pada Formulasi Medium Ekstrak Tauge (MET). Prosiding  Seminar  Nasional  Limnologi,
V.
Carolina,  S.  1995.  Kualitas  Algae  Bersel Tunggal Chlorella  sp. pada  Berbagai
Media. Seminar Ilmiah . Balai
Pengembangan  Teknologi  Tepat  Guna, Puslitbang Fisika Terapan-LIPI, Subang. Hidayati, Nurul. 2009. Uji Efektivitas Antibakteri  Ekstrak  Kasar  Daun  The (Camellia  sinensis  L,  v.  assamica)  Tua Hasil  Ekstraksi  Menggunakan  Pelarut Akuades  dan  Etanol. Skripsi  Tidak Diterbitkan. Malang:  Universitas  Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang.
Prihantini,  N.H,  Putri  B.,  dan  Yuliati  R..
2005. Pertumbuhan Chlorella  sp. dalam Medium  Ekstrak  Tauge  (MET)  dengan Variasi pH Awal . Makara, Sains , IX (1):
1-6.
Hanani,  E.,  M.  Abdul  dan  Ryany,  S.  2005.
Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam Spons Callyspongia  sp. dari  Kepulauan
Seribu. Majalah  Ilmu  Kefarmasian ,  II (3): 127-133.
Arindah,  D.  2010.  Fraksinasi  dan  Identifikasi Golongan  Senyawa  Antioksidan  pada Daging Buah Pepino (Solonum Muricatum  aiton) yang  Berpotensi sebagai  Antioksidan. Skripsi Tidak Diterbitkan.  Malang:  Jurusan  Kimia Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang.
Persagi  (Persatuan  Ahli  Gizi  Indonesia).  2009.
Tabel  Komposisi  Pangan  Indonesia . Jakarta: PT. Elex Media Komputindo. De La Noue dan De Pauw. 1988. The Potential of Microalgal Biotechnology : A Review of  Production  and  Uses  of  Microalgae. Journal of Biotechnology Advances , VI. Schlegel,  S.  1994. Mikrobiologi  Umum .  Tedja
Baskara, penerjemah. Yogyakarta:
Gajahmada University Press. Herbert  RB.  1995. Biosintesis  Metabolit Sekunder . Bambang Srigandono,
penerjemah.  Edisi  kedua.  Semarang: IKIP Semarang Press.
Yudha,  A.P..  2008.  Senyawa  Antibakteri  dari
Mikroalga Dunaliella  sp. pada  Umur Panen  yang  Berbeda. Skripsi Tidak Diterbitkan.  Bogor  :  Fakultas  Perikanan dan  Ilmu  Kelautan,  Institut  Pertanian
Bogor. Vonshak,  A.  1990. Recent  Advances  in Microalgal Biotechnology . Biotechnology adv , VIII. Sopyan,  I.  2001.  Rancangan  Awal  Alat Pengering Energi Matahari ( Solar Dryer ) untuk Pengeringan Rumput Laut. Skripsi Tidak Diterbitkan. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Brand-Williams, W. 1995. Use of Free Radical
Method to Evaluate Antioxidant activity .
Lebensmettel –  Wissenschaft  and Technologie.  Dalam  Ratmo.  2007. Potensi  Ekstrak  Daun  Sirih  Merah ( Piper  crocotum )  sebagai  Antioksidan. www.kimiabrawijaya.ac.id. Josephy,  P.D.  1997. Molecular  Toxicology . New York: Oxford University Press. Harborne,  JB..  1987. Metode  fitokimia  Edisi
Kedua .  Padmawinata  K,  Soediro  I,
penerjemah.  Bandung:  Institut Teknologi
Bandung.