## SKRINING FITOKIMIA DAN UJI TOKSISITAS EKSTRAK ETANOL
DAUN BROTOWALI ( Tinospora crispa (L.) Hook F. & T) DENGAN METODE Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Yoma Seivia F. Tarukbua 1) , Edwin De Queljoe 1) , Widdhi Bodhi 2)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Brotowali  provides  many  benefits,  one  of  which  is  to  kill  cancer  cells.  Research  on  natural substances suspected of potentially as medicinal as well as empirically has been used by society as a drug begins with pre-clinical test.This study aims to determine the active compound contained in the brotowali leaf and determine the LC 50 value of Artemia salina Leach larvae after giving ethanol extract of brotowali leaves.  Phytochemical  screening  included  alkaloid,  flavonoid,  tannin,  and  saponin  tests  based  on  the Harborne  method  and  toxicity  test  of  brotowali  leaf  extract  using  Brine  Shrimp  Lethality  Test  (BSLT). The  results  showed  that  brotowali  leaves  had  alkaloid,  flavonoid,  tannin,  and  saponin  compounds,  and had Lethality Concentration (LC 50 ) value of 62.75 μg / mL.
Keywords: Brotowali leaves, phytochemical scheme, toxicity, BLST, LC 50 .

## ABSTRAK
Brotowali  memberikan  banyak  manfaat,  salah  satunya  yaitu  dapat  mematikan  sel  kanker. Penelitian  bahan  alam  yang  diduga  berpotensi  sebagai  obat  maupun  secara  empiris  telah  digunakan masyarakat  sebagai  obat  diawali  dengan  uji  pre-klinis.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui golongan senyawa aktif yang terkandung dalam daun brotowali dan menentukan nilai LC 50 larva Artemia salina Leach setelah  pemberian  ekstrak  etanol  daun  brotowali.  Skrining  fitokimia  yang  dilakukan meliputi uji alkaloid, flavonoid, tanin, dan saponin yang berdasar pada metode Harborne dan uji toksisitas ekstrak  kental  daun  brotowali  menggunakan Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT).  Hasil  penelitian menunjukkan  daun  brotowali  mengandung  senyawa  alkaloid,  flavonoid,  tanin,  serta  saponin,  dan memiliki nilai toksisitas Lethality Concentration (LC 50 ) sebesar 62,75 µg/mL.
Kata kunci : Daun brotowali, skrinning fitokimia, toksisitas, BLST, LC 50 .

## PENDAHULUAN
Brotowali  ( Tinospora  crispa (L.) Hook F. & T) yang dikenal sebagai tanaman obat  yang  berasal  dari  Asia  Tenggara.  Di Indonesia  brotowali  banyak  ditemukan  di Pulau  Jawa,  Bali,  dan  Ambon.  Tanaman  ini dapat  ditemui  tumbuh  liar  di  hutan  atau ladang.  Penyebarannya  terutama  di  daerah berkawasan tropis. Brotowali justru menyukai tempat yang agak panas
(Muhlisah dan Ir. Fauziah, 2007). Tercatat
ada beberapa efek farmakologis  dari  brotowali  sehingga  dapat menyembuhkan  berbagai  jenis  penyakit. Brotowali dapat memberikan efek farmakologis, yaitu analgesik, anti- inflamasi, antikoagulan, tonikum, antiperiodikum,  dan  diuretikum  (Kresnady, 2003).
Penelitian  bahan  alam  yang  diduga berpotensi  sebagai  obat  maupun  secara empiris telah digunakan masyarakat sebagai obat,  diawali  dengan  uji  pre-klinis.  Metode uji toksisitas dapat dilakukan secara in vitro maupun  in  vivo.  Salah  satu  metode toksisitas  in  vitro  yang  sering  digunakan adalah  metode Brine  Shrimp  Letality  Test (BSLT) (Franky et al ., 2014).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui  golongan  senyawa  aktif  yang terkandung  di  dalam  daun  brotowali  dan mengetahui  berapa  besar  nilai  toksisitasnya terhadap  larva  udang Artemia  salina Leach melalui uji BSLT sehingga diharapkan dapat dikembangkan sebagai obat antikanker.

## METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan Januari  2018-  Juni  2018  di  Laboratorium
Farmakologi Program Studi Farmasi
Universitas Sam Ratulangi Manado.

## Jenis Penelitian
Penelitian  ini  adalah  penelitian eksperimental dengan pendekatan Post Test- Only  Control  Group  Design. Perlakuan dengan  pemberian  ekstrak  daun  brotowali terhadap larva udang Artemia salina Leach.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu ayakan mesh 200, mixer, batang  pengaduk,  gelas  ukur  ( Pyrex ), Erlenmeyer  ( Pyrex ),  tabung  reaksi  ( Pyrex ), pipet  tetes,  pot  gel,  corong,  ayakan mesh 200, pisau, timbangan analitik (aeADAM ® ), mixer  ( Philips ),  sudip,  beker  gelas  ( Pyrex ), hot  plate  (NESCO ® Lab),  cawan  petri ( Pyrex ), aluminium  foil ,kertas  saring whatman  42,  kertas  lebel,  spritus, Rotary evaporator, Labu  takar (Pyrex) ,  oven,  ,  rak tabung reaksi, Pot salep, Toples, Lampu.

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian  ialah  daun  brotowali  ( Tinospora crispa (L.)  Hook  F.  &  T),  aquades,  FeCl 3 , pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorf, pereaksi  wagner,  amonia,  asam  klorida, serbuk  magnesium,  asam  sulfat,  Etanol  96 %,  kloroform,  telur  larva  udang Artemia Salina Leach, garam non yodium.

## Pengambilan dan Persiapan sampel
Bahan  yang  digunakan  sebagai sampel ialah daun brotowali yang diambil di desa  Amurang,  Minahasa  Selatan,  Sulawesi
Utara.  Selanjutnya  sampel  dibersihkan  dan dikering  anginkan  hingga  sampel  kering. Setelah  kering  sampel  diblender  hingga sampel  menjadi  halus  lalu  diayak  dengan mesh 200.

## Ekstraksi Daun Brotowali
Ekstraksi  bahan  aktif  dilakukan dengan  metode  maserasi  dengan  pelarut etanol 96%. Serbuk daun brotowali
ditimbang sebanyak 100 gram dan dimasukkan ke dalam baker glass, kemudian ditambahkan  pelarut  hingga  volume  akhir mencapai  500  mL  dengan  perbandingan  1  : 5  (w/v)  selama  lima  hari.  Hasil  maserasi kemudian  disaring  dengan  kertas  saring Whatman  42  sehingga  dihasilkan  filtrat  dan residu.  Perendaman  dilakukan  1  kali remaserasi.  Filtrat  yang  diperoleh kemudian dipekatkan  dengan  rotary  evaporator  pada suhu  40 0 C  hingga  diperoleh  ekstrak  kental berupa pasta.

## Skrining Fitokimia
Skrining  fitokimia  yang  dilakukan meliputi  uji  alkaloid,  flavonoid,  tanin,  dan saponin yang berdasar pada metode Harborne.

## Alkaloid
Sebanyak 0,5 gram ekstrak dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 2  mL  kloroform  secukupnya  dan  10  mL amonia  lalu  ditambahkan  10  tetes  H 2 SO 4 . Campuran  dikocok  dan  dibiarkan  hingga membentuk  2  lapisan.  Lapisan  H 2 SO 4 dipindahkan  dalam  3  tabung  reaksi  dengan volume  masing-masing  2,5  mL.  Ketiga larutan  diuji  dengan  pereaksi  Meyer, Dragendorf dan Wagner.

## Flavonoid
Sebanyak 0,5 gram ekstrak dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan  5  mL  etanol  dan  dipanaskan selama  5  menit  dalam  tabung  reaksi. Selanjutnya  ditambahkan  10  tetes  HCl pekat.  Kemudian  ditambahkan  0,2  gram serbuk Mg.

## Tanin
Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan  dengan  10  mL  air  panas, kemudian  ditetesi  menggunakan  besi  (III) klorida.

## Saponin
Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan  dengan  10  mL  akuades kemudian dikocok kuat selama kurang lebih 1  menit.  Selanjutnya  didiamkan  selama  10 menit  dan  diamati  buih  atau  busa  yang terbentuk.
Penyiapan Larva Artemia salina Leach Penyiapan  telur Artemia  salina dilakukan  dengan  cara  merendam  sebanyak 30  mg  telur Artemia  salina dalam  wadah berisi air laut buatan dibawah cahaya lampu 25 watt. Telur Artemia  salina akan menetas dan menjadi larva setelah 24 jam.
Larva Artemia  salina yang  baik digunakan  untuk  uji  BSLT  yaitu  yang berumur 48 jam sebab jika lebih dari 48 jam dikhawatirkan  kematian Artemia  salina bukan  disebabkan  toksisitas  melainkan terbatasnya persediaan makanan.

## Pembuatan Konsentrasi Sampel Uji
Konsentrasi  Larutan  uji  BSLT adalah 1000 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, l00 μg/mL, 10 μg/ml, dan 0 μg/mL (sebagai kontrol  negatif).  Untuk  pembuatan  larutan stok  ekstrak  kental  etanol  96%  ditimbang sebanyak  50  mg,  kemudian  dilarutkan kedalam  air  laut  sebanyak  50  mL,  hingga diperoleh  konsentrasi  larutan  stok  1000 μg/ml.
1. Larutan  konsentrasi  1000  μg/mL  adalah larutan stok 50 mL.
2. Larutan  konsentrasi  500  µg/mL  dibuat dengan  cara diambil 25  mL  larutan stok dan  ditambahkan  air  laut  sampai  batas 50 mL.
3. Larutan  konsentrasi  250  µg/mL  dibuat dengan  cara  diambil  25  mL  larutan  500 µg/mL  dan  ditambahkan  air  laut  sampai batas 50 mL.
4. Larutan  konsentrasi  100  µg/mL  dibuat dengan  cara  diambil  20  mL  larutan  250 µg/mL  dan  ditambahkan  air  laut  sampai batas 50 mL.
5. Larutan  konsentrasi  10  µg/mL  dibuat dengan  cara  diambil  5  mL  larutan  100 µg/mL  dan  ditambahkan  air  laut  sampai batas 50 mL.
6. Larutan  (kontrol  negatif)  dibuat  dengan cara diambil 50 mL air laut.

## Pelaksanaan Uji Toksisitas
Pada  uji  toksisitas  masing-masing konsentrasi dilakukan 3 pengulangan dengan tiap  kelompok  memiliki  10  ekor  larva Artemia  salina. Disiapkan  wadah  untuk pengujian  pada  masing-masing  konsentrasi ekstrak sampel membutuhkan 3 wadah dan 1 wadah  sebagai  kontrol.  Selanjutnya,  pada tiap konsentrasi larutan dimasukkan 10 ekor
larva Artemia salina . Pengamatan dilakukan selama  24  jam  terhadap  kematian  larva Artemia  salina, dimana  setiap  konsentrasi dilakukan  3  pengulangan  dan  dibandingkan dengan  kontrol.  Kriteria  standar  untuk menilai kematian larva Artemia salina yaitu bila  larva  tidak  menunjukkan  pergerakan selama beberapa detik observasi.

## Analisis Data
Data hasil penelitian akan diolah dan disajikan  dalam  bentuk  table  dan  grafik. Data  dari  uji  toksisitas  akan  dianalisis dengan  analisis  regresi  linier  menggunakan Statistical  Product  and  Service  Solution (SPSS) 23 untuk menentukan nila LC 50 .

## HASIL DAN PEMBAHASAN Penyiapan Simplisia
Daun  Brotowali  yang  digunakan, diperoleh  dari  pekarangan  penduduk  desa Amurang,  kabupaten  Minahasa.  Dalam penelitian  ini  daun  yang  digunakan  adalah daun pucuk, muda hingga daun tua.
Sebelum  dijadikan  simplisia,  daun brotowali  melewati  tahap  sortasi,  pencucian dan  pengeringan.  Tujuan  dilakukan  sortasi adalah  untuk  memisahkan  antara  daun  dan tangkai.  Pencucian  dilakukan  menggunakan air  yang  mengalir  untuk  memisahkan kotoran dan partikel-partikel yang menempel pada daun. Pengeringan dilakukan  dengan  cara  dikering-anginkan pada suhu kamar agar kadar air dalam daun berkurang  sehingga  daun  tidak  mengalami pembusukan.
Setelah daun kering, daun dihaluskan menggunakan  blender  dan  di  ayak  dengan menggunakan  ayakan  mesh  200  agar
diperoleh  serbuk  yang  homogen.  Serbuk yang dihasilkan sebesar 100 gr.

## Ekstraksi
Serbuk  kering  diekstraksi  dengan metode  maserasi  dengan  menggunakan pelarut  etanol  selama  5  hari  dan  dilakukan remaserasi  selama  2  hari.  Maserasi  sampel dilakukan  dengan  mengunakan  pelarut etanol  96%  karena  sifatnya  yang  mampu melarutkan  hampir  semua  zat,  baik  yang bersifat  polar,  semi  polar,  dan  non  polar serta  dapat  bertindak  sebagai  pelarut  dan pengawet sehingga zat yang dinginkan dapat terekstraksi  serta  tahan  lama  dan  tidak mudah ditumbuhi jamur.
Alasan  pemilihan  metode  maserasi karena  mempunyai  banyak  keuntungan dibandingkan  metode  lainnya.  Keuntungan utamanya yaitu, prosedur dan peralatan yang
sederhana,  metode  ekrtaksi  maserasi  tidak dipanaskan  sehingga  bahan  alami  tidak terurai.  Ekstraksi  dingin  memungkinkan banyak  senyawa  terektraksi.  Saat  proses maserasi  akan  terjadi  pemecahan  dinding dan  membran  sel  akibat  perbedaan  tekanan antara  didalam  dan  diluar  sel,  sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma  akan  terlarut  dalam  pelarut organik dan  ekstraksi senyawa  akan sempurna  (Heinrich,  2004  ;  Harborne, 1987).

## Skrining Fitokimia
Pengujian  fitokimia  menggunakan metode Harborne (1987) dengan pengujian 4 senyawa  kimia  yaitu  alkaloid,  flavonoid, tannin,  saponin.  Hasil  skrinning  fitokimia ekstrak  kental  daun  brotowali  dapat  dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil Skrining Fitokimia Daun Brotowali ( Tinospora crispa (L.) Hook F. & T)
Skrining  fitokimia  dilakukan  untuk memberikan  gambaran  golongan  senyawa yang  terkandung  dalam  tanaman.  Uji  yang dilakukan  menunjukkan  hasil  positif  pada semua  pengujian  yaitu  alkaloid,  flavonoid, tannin, dan saponin.
Pada uji alkaloid, tanaman brotowali menunjukkan  hasil  positif  pada  pereaksi Dragendroff  dan  Wagner,  namun  negatif pada  pereaksi  Meyer.  Pereaksi  meyer  yang positif  menunjukkan  adanya  endapan  putih pada tabung reaksi, namun dalam penelitian, ekstrak  kental  daun  brotowali  menunjukkan
Uji senyawa Perubahan positif Perubahan terjadi Hasil Pengujian Alkaloid Meyer Dragendroff Wagner Endapan putih Merah jingga cokelat Hijau keruh Merah jingga cokelat - + + Flavonoid Merah coklat Merah coklat + Tanin Hijau kehitaman Hijau kehitaman + Saponin Terbentuk buih atau busa selama 10 menit Terbentuk buih atau busa selama 10 menit +
warna  hujau  keruh.  Tanaman  dikatakan mengandung  alkaloid  jika  reaksi  positif yang  terbentuk  jika  sekurang-kurangnya terdapat  endapan  dengan  menggunakan  dua golongan  laruan  percobaan  yang  digunakan sehingga dalam penelitian ini daun brotowali  positif  mengandung  alkaloid. Kandungan  senyawa  metabolit  sekunder yang  terdapat  pada  daun  brotowali  dapat memberikan efek farmakologi pada manusia sehingga  dapat  dilakukan  untuk  penelitian lebih lanjut (Depkes RI, 1995).
Robinson  dalam  Sangi et  al. (2012), menyatakan  bahwa  penambahan  serbuk magnesium dan asam klorida pada flavonoid akan  menyebabkan  tereduksinya  senyawa flavonoid  yang  ada  sehingga  menimbulkan reaksi  warna  merah  yang  merupakan  ciri adanya flavonoid pada sampel.
Pengujian  tanin  dilakukan  dengan penambahan besi (III) klorida yang bereaksi dengan  salah  satu  gugus  hidroksil  yang  ada pada tannin. Fungsi besi (III) klorida adalah menghidrolisis  golongan  tannin  sehingga akan  menghasilkan  perubahan  warna  biru kehitaman dan hijau kehitaman (Sangi et al. , 2012).
Menurut  Robinson  (1995)  senyawa yang  memiliki  gugus  polar  dan  non  polar bersifat  aktif  permukaan  sehingga  saat dikocok dengan air dapat membentuk misel. Pada struktur misel, gugus polar menghadap
ke  luar  sedangkan  gugus  non  polarnya menghadap  ke  dalam,  keadaan  inilah  yang tampak seperti busa.
Uji toksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethaly Test (BSLT)
Uji  toksisitas  dilakukan  dengan metode Brine  Shrimp  Lethaly  Test (BSLT) menggunakan  larva  udang Artemia  salina Leach  dengan  menentukan  nilai  LC 50 pada aktifitas  senyawa  yang  terkandung  dalam tanaman.
Pengujian dilakukan terhadap ekstrak etanol 96% dengan menggunakan air laut  buatan  dengan  cara  melarutkan  20  gr garam non yodium ke dalam 1 liter akuades. Setelah  48  jam  perendaman,  telur  menetas dan  menghasilkan  larva Artemia salina Leach yang siap digunakan dalam pengujian.  Pengujian  dilakukan  dengan menggunakan  air  laut  buatan  dikarenakan, saat  penelitian  berlansung  telur  tidak  dapat menetas  pada  air  laut  asli  setelah  3  hari perendaman telur lalu dilakukan penggantian dengan air laut buatan kemudian larva menetas (Sangi et al ., 2006). Setelah  larva  berumur  48  jam,  larva dipindahkan  pada  wadah  dan  diberikan perlakuan  dengan  konsentrasi  1000,  500, 250,  100,  10 g/mL  dan  konsentrasi  0 g/mL sebagai kontrol dan diulang sebanyak tiga kali.
Tabel 2. Persentase Kematian Larva Udang Artemia Salina Leach
Berdasarkan Tabel 2 dapat diketahui bahwa  presentase  larva  mati  tertinggi  ada pada konsentrasi 1000, 500, 250 g/mL dan presentase  terendah  pada  konsentrasi  10 g/mL  dan  diperoleh  hasil  LC 50 sebesar 62.75 g/mL  dengan  menggunakan  analisis probit  pada  perhitungan  SPSS  23.  Hasil  ini menyatakan  bahwa  ekstrak  etanol  daun brotowali  bersifat  toksik  sesuai  dengan tingkat  toksisitas  menurut  Meyer et  al. (1982), yaitu :
Tabel 3. Tingkat toksisitas menurut Meyer .
Menurut  Meyer et  al .  (1982)  suatu senyawa  uji  dikatakan  bersifat  toksik  dan berpotensi sebagai kandidat antikanker pada pengujian  Brine  Shrimp  Lethality  Test (BST)  jika  memiliki  nilai  LC 50 lebih  kecil dari 1000 µg/mL.
Kematian  hewan  uji  Artemia  salina disebabkan  adanya  senyawa  yang  masuk  ke
dalam  tubuh  hewan  uji  melalui  difusi  dan transport  aktif.  Kemudian  senyawa  tersebut akan  menyebabkan  terjadinya  kerusakan pada permeabilitas membran sehingga dapat mengacaukan transport ion dan menyebabkan  penurunan  produksi  ATP  dan menghambat  reseptor  perasa  pada  daerah mulut Artemia  salina .  Dalam  hal  ini, senyawa  -  senyawa  tersebut  menghambat daya  makan  dengan  cara  bertindak  sebagai racun  perut  atau  stomach  poisoning,  yaitu sebuah  interaksi  penyerangan  yang  dapat membunuh suatu hewan uji dengan menyerang  sistem  pencernaan.  Senyawa- senyawa  tersebut  masuk  melalui  saluran pencernaan dan menyebabkan alat pencernaan menjadi terganggu (Connell dan Miller, 1995 ; Nguyen et al , 1999).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  yang  telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa metabolit  sekunder  yang  terkandung  dalam Ekstrak etanol daun brotowali ( Tinospora crispa (L.)  Hook  F.  &  T)  yaitu  Alkaloid,  Flavonoid, Tanin  dan  Saponin,  dan  ekstrak  etanol  daun brotowali  ( Tinospora  crispa (L.)  Hook  F.  &  T) memiliki nilai LC 50 sebesar 62, 75 µg/mL.
Pengujian Kontrol Negatif Jumlah Kematian Setiap Konsentrasi 10 g/mL 100 g/mL 250 g/mL 500 g/mL 1000 g/mL 1 2 3 Total mati Rata- rata Presentase Kematian 0 0 0 0 0 0 3 5 6 14 4,6 46% 10 9 7 26 8,6 86% 10 10 10 30 10 100% 10 10 10 30 10 100% 10 10 10 30 10 100% Kategori LC 50 (ppm) Sangat toksik Toksik Tidak toksik <30 30 - 1000 >1000

## SARAN
Diharapkan untuk dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengisolasi senyawa sitotoksik tumbuhan sebagai usaha pengembangan obat alternatif antikanker mengingat bahwa daun brotowali ( Tinospora crispa (L.) Hook F. & T) bersifat toksik.

## DAFTAR PUSTAKA
Connel,  D.W., dan Gregory J. Miller. 1995.
Kimia Dan Ekotoksikologi Pencemaran . UI-Press. Jakarta
Depkes RI. 1995. Materia Medika Indonesia Jilid  VI .  Departemen  Kesehatan
Republik Indonesia.
Franky., Roslizawaty., Pertiwi, D. 2014. Uji
Toksisitas  Ekstrak  Etanol  Sarang
Semut  Lokal  Aceh  ( Mymercodia sp .)  Dengan  Metode  Bslt  Terhadap Larva Udang Artemia salina Leach . Jurnal  Medika  Veterinari. 8(1) : 60-62. Harborne,  J.  B.  1987. Metode  Fitokimia.
Terbitan  II .    Terjemahan  Kosasih Padmawinata  dan  Iwang  Sudiro.
ITB, Bandung
Heinrich,  M.,  Barnes,  J.,  Gibbons,  S.,
Williamson, E.M . 2004. Fundamental  of  Pharmacognosy and Phytotherapi. Hungary, Elsevier
Kresnady,  B.  2003. Khasiat  dan  Manfaat Brotowali .  PT  Argomedia  Pustaka,
Jakarta.
Meyer, B. N., Ferrigni, N. R., Putman, J. E., Jacbsen,  L.  B.,  Nicols,  D.  E.,  and McLaughlin,  J.  L.  1982. Brine Shrimp  :  A  Comvenient  general Bioassay For Active Plant Constituents . Plant Medica.
Muhlisah,  dan  Ir.  Fauziah.  2007. Tanaman
Obat  Keluarga  (TOGA). Jakarta, PT. Seri Agri Sehat.
Nguyen  H.H,  Widodo  S.  Momordica  L.
1999.  In:  Medicinal  and  Poisinous Plant  Research  of  South-East  Asia 12. De Padua L. S. N.
Bunyapraphatsana  and  R.  H.  M.  J.
Lemmens  (eds.). Pudoc  Scientific
Publisher . Wageningen, the
Netherland. p.353-359. Robinson,  T.  1995. Kandungan  Senyawa Organik Tumbuhan Tinggi . Diterjemahkan oleh Prof. Dr. Kosasih Padnawinata. ITB, bandung.
Sangi,  M.  S.,  L.  I.  Momuat  &  M.
Kumaunang.  2012.  Uji  Toksisitas dan  Skrining  Fitokimia  Tepung Gabah  Pelepah  Aren  ( Arenga pinnata ). J. Ilmiah S . 12 : 128-134.