## Peneguhan Diagnosis Penyakit Inclusion Bodies Hepatitis pada Ayam Broiler Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction
Diagnosis Confirmation of Inclusion Bodies Hepatitis on Broiler Chicken using

## Polymerase Chain Reaction Method
Jola Rahmahani 1* , Maha Kirana 1 , Fedik Abdul Rantam 1 , Suwarno 1
1 Laboratorium Vaksinologi dan Imunologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Surabaya , Indonesia.
* Corresponding author : jola_rahmahani@yahoo.co.id

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan mendiagnosis kasus Inclusion Bodies Hepatitis (IBH) pada ayam Broiler dari peternakan di Banten dan Jember. Sampel diambil dari organ hepar yang mengalami perubahan seperti rapuh, bewarna kekuningan, membesar. Sampel digerus dan dilakukan ekstraksi, kemudian dilakukan uji Polymerase chain reaction (PCR) menggunakan Primer Hexon A (5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’) dan Hexon B(5’- TAGTGATGMCGSGACATCAT-3’)  dengan  panjang  897  bp.  Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa  sampel kasus Ayam Broiler yang berasal dari Banten Positif 100 % terinfeksi oleh Virus IBH.
Kata kunci: Inclusion Bodies Hepatitis, Polymerase Chain Reaction, broiler

## Abstract
This study aimed to diagnose cases of Inclusion Bodies Hepatitis (IBH) in broiler chickens. A total of 6 chickens were collected from farms in Banten and Jember. Samples were taken from the liver which underwent changes such as brittle, yellowish in color  and enlarged. The samples were ground and extracted, then the Polymerase Chain Reaction (PCR) test was performed using Primers Hexon A (5'- CAARTTCAGRCAGACGGT-3') and Hexon B ( 5'-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3' ) with 897 bp length. The results  showed  that  the  broiler  chicken  case  sample  from  Banten  was  positively  100%  infected  by  the  IBH Virus.
Keywords: Inclusion Bodies Hepatitis, Polymerase Chain Reaction, broiler
Received: 12 August 2022 Revised: 5 September 2022 Accepted: 8 October 2022

## PENDAHULUAN
Inclusion  Bodies  Hepatitis  merupakan penyakit  menular  yang  sangat  merugikan peternak  Indonesia.Beberapa  Tahun  terakhir telah  terjadi  kasus  kematian  yang  tinggi  pada unggas  broiler  yang  disebabkan  oleh  IBH. Penyakit IBH disebabkan oleh Fowl adenovirus (FAdV),  virus  ini  termasuk  dalam  kelompok Avian  Adenovirs  I  (AAV-I)  yang  memiliki  12 serotype (1-11)  dan  5  spesies  group  (A-E). Sebagian  besar  kasus  IBH  disebabkan  oleh FAdV serotype 2,9,11 (Group D) dan Serotype 8a  dan  8e  (Group  E).  Unggas  yang  rentan terhadap  penyakit  IBH  adalah  unggas  ayam
muda  (4-8  minggu),  kalkun,  itik,  angsa  dan puyuh.  Pada Broiler ,  kasus  dapat  terjadi  pada umur 2-4 minggu (Monleon, 2014).
Patologi  anatomi  pada  hati  menunjukan perdarahan ptechiae ,  hati  membesar,  pucat kekuningan  dan  rapuh.  Secara  makroskopik pada sel hati terdapat benda inklusi intranuklear yang dapat bersifat eosinofilik atau basofilik dan solid (Kementan, 2014).
Penyakit  IBH  di  Indonesia,  penyakit  ini pertama  kali  muncul pada tahun  1985  di  Pulau Jawa  yaitu  Kabupaten  Semarang  dan  DKI Jakarta.  Penyakit  ini  sempat  meredup,  namun pada akhir 2017 sampai tahun 2018, ditemukan adanya  infeksi  IBH  pada  sampel  yang  diambil
dari kasus di lapangan dalam bentuk organ yang diformalin  dan  organ  segar.  BBVet  Wates menerima  sampel  organ  dari  peternakan  yang mempunyai  populasi  23.000  ekor  yang  telah terjadi kasus kematian hingga 6.000 ekor ayam pada  usia  23  hari  dengan  kata  lain  angka kematian sudah mencapai 26%. Kejadian serupa juga  dialami  oleh  peternakan  dengan  populasi 350.000  ekor  ayam  dengan  angka  kematian mencapai 40% di usia 25 hari. Setelah nekropsi, ditemukan beberapa kelainan antara lain adanya multifocal nekrosis pada hepar, hidropericardium,  hemoragi  otot  paha  dan setelah  dilakukan  pemeriksaan  PCR  dan histopathologi, ditemukan bahwa kasus tersebut disebabkan oleh FAdVs dan ditemukan adanya inclusion bodies pada pemeriksaan histopathologi  organ  hepar  (Pratamasari et  al ., 2018).
Penelitian ini bertujuan meneguhkan diagnosis penyakit IBH dari kasus lapangan pada ayam Broiler menggunakan uji Polymerase chain reaction (PCR).  Hasil  penelitian  ini  diharapkan dapat memberikan informasi kepada peternak dan mengambil  kebijakan  dalam  mengatasi  kerugian akibat penyakit IBH pada peternakan.

## METODE PENELITIAN

## Koleksi sampel
Sampel  berupa  organ  ayam  yang  berasal dari  supect  IBH  peternakan  ayam  komersial (ayam broiler )  di  wilayah  Banten  dan  Jmber dengan gejala klinis ayam mengalami kelesuan, depresi, gemetar, bulu kusam berdiri, anoreksia dan  terjadi  kematian  tinggi.  Ayam  dinekropsi dilapangan kemudian diambil organ hatinya dan ditaruh  dalam  tube  yang  mengandung  media transport PBS dan antibiotik (OIE, 2012).

## Ekstraksi dan PCR
DNA  virus  dari  gerusan  organ  dilakukan ekstraksi  menggunakan  DNAzol TM Reagent Invitrogen  dan  dilakukan  ekstraksi  sesuai instruksi.Setelah proses ekstraksi DNA
selanjutnya dilakukan amplifikasi. Proses amplifikasi DNA sesuai dengan program berikut: proses  predenaturasi  diatur  pada  suhu  94 ⁰ C
selama  10  menit,  proses  denaturasi  pada  suhu 94 ⁰ C selama 1 detik, proses annealing pada suhu 52 ⁰ C selama 1 menit, proses elongasi pada suhu 72 ⁰ C  selama  2  menit,  dan  proses  post elongasi pada  suhu  72 ⁰ C  selama  10  menit.  Siklus amplifikasi  dimulai  dari  denaturasi  hingga elongasi  diulangi  sebanyak  40  kali.  Amplifikasi PCR FAdV menggunakan primer dari Macrogen (Tabel 1).
Tabel 1. Daftar primer gen hexon virus FAdV.
Primer Hexon Sekuens 5’- 3’ Product Position Hexon A CAA RTT CAG RCA GAC GGT 897 bp 144-161 Hexon B TAG TGA TGM CGS GAC ATC AT 1040-1120 Elektroforesis Pembuatan gel elektroforesis dibuat menggunakan  bubuk  agarose  sebanyak  5  gram yang  dicampur  dengan  TBE  1x  50ml  hingga konsentrasi  1%,  kemudian  dipanaskan  dan ditambahkan  ethydium  bromide  sebanyak  2µl, lalu  dituangkan  ke  cetakan,  diberi tray dan ditunggu  hingga  mengeras.  Gel  yang  sudah mengeras dimasukan ke dalam alat elektroforesis yang  sudah  disambungkan  ke power  supply dan diberi  TBE  1x  sebagai buffer hingga  agar tenggelam.  Sampel  dan  kontrol  yang  sudah selesai  di  PCR  diambil  sebanyak  5µL  dan dicampurkan dengan Fluorescense DNA stain 1µl dan  DNA Ladder sebanyak  2µl  juga  dimasukan ke  sumuran  paling  pertama  untuk  mengetahui ukuran DNA hasil. Tangki elektroforesis ditutup, kemudian power  supply dinyalakan  dengan kekuatan  100  volt  selama  60  menit.  Agarose diambil  setelah power  supply dimatikan  dan diletakan  dalam  alat  GelDoc  untuk  membaca hasil elektroforesis menggunakan sinar UV.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan  dari  hasil  elektroforesis  dalam Gambar  1,  sampel  B1,  B2,  B3,  B4,  B5,B6 amplifikasi  dari  protein  Hexon  virus  Fowl
adenovirus  penyebab  IBH  menunjukan  hasil positif dan menampilkan band DNA 897 bp dari hasil  PCR  pada  sumuran.  Hasil  penelitian  ini sesuai  dengan  yang  dilakukan  Silaen  (Silaen et al ., 2020).
Gambar 1. Hasil  amplifikasi  dari  penyakit IBH  gen  Hexon  dengan  1% Agarose. M adalah DNA ladder marker 100 bp, B1, B2, B3, B4, B5,  B6  adalah  positif  sampel dari ayam broiler yang menunjukan band 897 bp.
Uji  PCR  pada  sampel  dilakukan  untuk meneguhkan diagnosa dugaan infeksi FAdV yang menyebabkan perubahan anatomi organ hati dan adanya  temuan  dengan  ciri  IBH  secara histopatologi. Hati terlihat membengkak/ membesar, lebih pucat, rapuh, sehingga dilakukan pemeriksaan  PCR  untuk  pemeriksaan  lanjutan. Pada pengujian PCR, primer-primer spesifik yang digunakan  adalah  untuk  deteksi  gen  penyandi antigen permukaan (Hexon) dari FAdVs dengan menggunakan  reaksi  PCR.  Sebagaimana  telah dipublikasi  sebelumnya  sesuai  dengan  yang dilakukan Silaen bahwa efektivitas metode PCR yang digunakan mencapai 100 % dimana dari 25 sampel  terdapat  6  yang  positif  menderita  IBH (Silaen et al ., 2020).
Hasil  PCR  dari  Sampel  B1,  B2,  B3,B4, B5,B6  menunjukkan  produk  amplifikasi  dari primer-primer  Hexon  yaitu  pita/band  DNA spesifik  dengan  panjang  kurang  lebih  897-bp (Gambar  1)  sebagaimana  yang  telah  dibuktikan sebelumnya dalam literatur (Silaen et al ., 2020).
Dalam Gambar 1 juga ditunjukkan hasil PCR dari Sampel J1, J2 namun menunjukkan hasil negatif
dimana  pita  DNA  spesifik  897-bp  tidak terdeteksi.  Hasil  negatif  pada  sampel  Jember  1 dan  Jember  2  negatif,  tetapi  hepar  menunjukan gejala IBH hal ini memungkinkan adanya infeksi penyakit  lain  yang  mungkin  mengakibatkan perubahan pada hati adalah Aflatoxin, Aflatoxin menyebabkan  imunosupresi  dan  gejala  serupa dengan infeksi FAdV dimana secara makroskopis hepar  menunjukkan  adanya  perubahan  warna coklat kekuningan, tepi lobus tumpul, konsistensi kenyal,  dan  bidang  irisan  rata  pada  infeksi Aflatoxin  hal  ini  sesuai  yang  dilakukan  Filazi (Filazi et al ., 2017).

## KESIMPULAN
Dari  penelitian  yang  telah  dilakukan  dapat disimpulkan,  teknik  PCR  dapat  mendeteksi adanya  infeksi  fowl  adenovirus  (FAdV)  dari kasus  IBH  pada  peternakan  broiler  di  Banten. Hasil  ini  meneguhkan  pemeriksaan  sebelumnya yang  telah  mendiskripsikan  perubahan  berupa warna kekuningan pada organ Hepar.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  pada peternakan  ayam  di  Banten  dan  Jember  yang memberi izin dalam koleksi sampel.

## DAFTAR PUSTAKA
Filazi, A., Yurdakok-Dikmen, B., Kuzukiran, O.,
&  Sireli,  U.  T.  (2017).  Mycotoxins  in poultry. Poultry Science. pp: 73-92.
Kementrian Pertanian. (2014). Manual Penyakit Unggas. Cetakan kedua. Direktorat Jendral peternakan dan Kesehatan Hewan. Hal: 44- 48.
Monleon,  R.  (2014).  Serological  Monitoring  of Fowl Adenovirus. pp: 102.
Office International des Epizooties (OIE). (2012). “Newcastle  Disease.  Manual  of  Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals,” Chapter
2.3.14.
http://www.oie.int/international- standartsetting/terrestrial-manual/access online.
Pratamasari,  D.,  Kumorowati,  E.,  &  Nurani,  S.
(2018).  Temuan  Penyakit  Inclusion  Body Hepatitis  pada  Sampel  Surveilans  Pasif Kasus  Kematian  Tinggi  Unggas  Broiler  di
Wilayah Kerja Balai Besar Veteriner Wates Yogyakarta. Silaen,  O.  S.  M.,  Murtini,  S.,  Pamungkas,  J.,  & Nugroho,  C.  M.  H.  (2020).  Isolation  and molecular characterization of fowl
aviadenovirus  associated  with  inclusion body  hepatitis  from  poultry  in  Banten  and
West Java, Indonesia. Veterinary World , 13(9 ), 1940.
***