Analisis genetik fragmen gen sitrokrom oksidase sub unit 1 dari Cirrhilabrus cf. ryukyuensis Ishikawa 1904 (Labridae) asal Teluk Cenderawasih dan Raja Ampat
[Genetic analisys of cytochrome oxidase sub unit 1 gene fragment from Cirrhilabrus cf.
ryukyuensis (Labridae) from Cenderawasih Bay and Raja Ampat]
Muhammad Dailami 1 , Darma Santi 1 , Murtihapsari 1 , Hermawaty Abubakar 2 , Abdul Hamid A. Toha 3*
1 Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Papua, Manokwari, 98314
2 Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Papua, Manokwari, 98314
3 Jurusan Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Papua, Manokwari, 98314
Diterima: 15 April 2017; Disetujui: 14 Agustus 2018

## Abstrak
Cirrhilabrus  cf. ryukyuensis asal  Teluk  Cenderawasih  dan  Raja  Ampat  secara  morfologi  memiliki  perbedaan  warna dengan Cirrhilabrus ryukyuensis . Penelitian ini  bertujuan menentukan  hubungan filogenetik, evolusi, dan keragaman genetik Cirrhilabrus cf. ryukyuensis berdasarkan gen Sitokrom Oksidase sub Unit I (COI). Genom DNA mitokondria diekstrak  menggunakan larutan chelex 10%. Primer FISH-BCH dan BCL digunakan untuk mengamplifikasi  fragmen Gen COI dan sekuensing. Analisis data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Sequencher 4.1 dan MEGA 5. Gen COI dari enam sampel C. cf. rykyuensis asal Teluk Cenderawasih dan Raja Ampat, memiliki panjang basa men- capai 613 bp. Komposisi rata-rata nukleotida T 32,8%, C 26,3%, A 23,2% dan G 17,7%. Terdapat  enam posisi poli- morfisme yang kesemuanya disebabkan oleh mutasi transition . Hasil penerjemahan nukleotida, diperoleh asam amino dengan  panjang  204  asam  amino  dengan  urutan  yang  sama.  Pohon  filogenetik  menunjukkan  keenam  sampel  berada dalam satu clade yang sama dan berbeda dari clade Cirrhilabrus cyanopleura data Gene Bank.
Kata penting: Cirrhilabrus cf ryukyuensis , DNA mitokondria, Gen COI, filogenetik

## Abstract
Cirrhilabrus  cf. ryukyuensis from Cenderawasih  Bay  and  Raja  Ampat  have  different  colormorphs  with Cirrhilabrus ryukyuensis . This study was conducted to determine the  phylogenetic relationship, evolution and  genetic diversity of Cirrhilabrus  cf. ryukyuensis based  on Cytochrome  oxidase  sub  unit  1  (COI)  gene.  Mitochondrial  DNA  extracted  by using  chelex  10%.  FISH-BCH and  BCL  primers  were  used  to  amplify  COI  gene  fragment  and  sequencing.  Data analysis conducted by using software Sequencher 4.1 and MEGA 5. COI genes from six samples of C. cf rykyuensis from  Cenderawasih  Bay  and  Raja  Ampat have  total  613  base  pairs. The  average  compositions of  nucleotides  are  T 32.8%, C 26.3%, A 23.2% and G 17.7%. There is six positions of polymorphism that caused by transition. Conversion of nucleotides to amino acid sequence resulted in 204 amino acid with the same sequence. The phylogenetic tree from six sample showed that all in one clade, but different clade from Cirrhilabrus cyanopleura from GenBank.
Key words: Cirrhilabrus cf. ryukyuensis , mitochondrial DNA, Gen COI, phylogenetic

## Pendahuluan
Bentang  laut  kepala  burung  Papua (Pa- puan Seascape, BHS ) merupakan salah  satu  kawasan laut penting  di  Asia dan Pa- sifik  yang  kaya  dengan  keanekaragaman  hayati laut  (Allen  & Erdmann 2009,  Mangubhai et  al .
2012).  Perairan  laut  Papua  disebut  juga  sebagai jantung  segitiga  karang  dunia  (Veron et  al.
2010). Donelly & Mous (2002) melaporkan bah-
wa  wilayah  Raja  Ampat  memiliki  keragaman jenis  karang  yang  tinggi,  di  mana  75%  jenis karang  dunia  bisa  ditemukan  di  wilayah  ini. Selain  itu,  terdapat  899  (84%)  spesies  ikan  laut dari  total  1.074  spesies  ikan  karang  di  dunia.
Sementara perairan BHS lain  di Teluk Cendera- wasih  memiliki  spesies  endemik yang  tinggi (Wallace et  al .  2011,  Allen  & Erdman  2012). Labridae  adalah  famili ikan  karang  terbanyak
_____________________________ Penulis korespondensi
Alamat surel: hamid.toha@gmail.com
ketiga  yang  dijumpai  di  wilayah  ini  yang  keka- yaan jenisnya mencapai 109 spesies.
Cirrhilabrus ryukyuensis merupakan ikan karang dari famili Labridae yang pertama kali di- deskripsikan  dari  Pulau  Ryukyu  Jepang (Ishikawa 1904). Menurut Ruggiero et al . (2011),
C. ryukyuensis merupakan  nama sinonim Cirrhi- labrus  cyanopleura ,  akan  tetapi  menurut  Kuiter
& Tonozuka (2004) kedua spesies tersebut bukan spesies  sama.  Allen  dan  Erdmann menemukan spesies  yang  mirip  dengan Cirrhilabrus  ryukyu- ensis di perairan Papua dan mereka menyebutnya sebagai Cirrhilabrus  cf  ryukyuensis. C.  cf  ryu- kyuensis yang  berasal  dari  Teluk  Cenderawasih dan  Raja  Ampat  (Gambar  1),  secara  morfologis memiliki perbedaan warna jika dibandingkan de- ngan C. ryukyuensis (komunikasi pribadi dengan Gerald Allen & Mark Erdmann).
Identifikasi  spesies  dengan  teknik  DNA barcoding telah  banyak  digunakan  (Ward et  al. 2005;  Steinke et  al. 2009;  Hubert et  al. 2011,
Pentinsaari et al . 2016). Gen Sitokrom Oksidase Sub  Unit  I  (COI)  merupakan  DNA barcode (Hebert et  al. 2003)  yang  biasa  digunakan  se-
bagai acuan dalam identifikasi genetik. Gen COI dilaporkan  memiliki  potensi  laju  mutasi  yang rendah  dibandingkan  gen  sitokrom  b  (Da Fonseska et al. 2008). Gen COI juga merupakan gen  yang  banyak  digunakan  dalam  analisis  po- hon  filogenetik,  keragaman  genetik,  sejarah evolusi,  maupun  genetika  populasi  (De  Boer et al . 2014a, 2014b, Saleky et al. 2016).
Genus Cirrhilabrus Temminck  &  Schle- gel,  1845  telah  mengalami  peningkatan  sangat pesat  dalam  jumlah  spesies  yang  diakui  hingga saat ini. Penerapan teknik molekuler yang relatif baru  juga  telah  membuka  sumber  daya  yang sebelumnya  belum  dimanfaatkan  untuk  ahli taksonomi,  memungkinkan  pemeriksaan  lebih dekat  hubungan  antara  populasi  dan  terkadang mengungkapkan  spesies  samar  dalam  spesies nominal  (Victor  2015).  Hal  ini  termasuk  iden- tifikasi  spesies  menggunakan  COI  dalam  genus Cirrhilabrus (Allen et al . 2015, Tea et al . 2016).
Pada  tahun  2015  genus  ini  telah  mencakup  51 spesies  (Allen et  al. 2015)  dan  selanjutnya  ber- tambah menjadi 52 spesies (Tea et al . 2016).
Gambar 1. C. cf ryukyuensis Teluk Cenderawasih (kiri) dan Raja Ampat (kanan) (Foto: Erdmann dan Allen)
C. cf. ryukyuensis masih jarang diketahui secara ilmiah. Informasi awal tentang spesies ini hanya  diperoleh  melalui  komunikasi  pribadi  de- ngan  pakar  seperti  yang  disampaikan  sebelum- nya.  Penelitian  ini  adalah  penelitian  awal  yang menggunakan  penanda  genetik  COI.  Dalam penelitian ini digambarkan karakter genetik COI spesies C.  cf.  ryukuensis berdasarkan  enam  spe- simen  yang  dikumpulkan  dari  Raja  Ampat  dan Teluk  Cenderawasih.  Hasil  ini  penting  sebagai informasi awal dalam identifikasi dan penelitian genetik lanjut.

## Bahan dan metode

## Pengambilan sampel
Sampel  berupa  sirip  ikan  dikumpulkan dari  perairan  Raja  Ampat  (Flabacet,  Misool Tenggara)  dan  Teluk  Cenderawasih  (Pulau Roon).  Sebanyak enam sampel dianalisis dalam penelitian  ini.  Setiap  lokasi  diambil  masing- masing  tiga  sampel  (Tabel  1)  dan  disimpan  da- lam etanol 96% (Templado et al. 2010).
Gambar  1.  Lokasi  penelitian.  Pengambilan  sampel  dilakukan  di  Perairan  Papua,  masing-masing  Perairan Pulau Misool di Raja Ampat, dan Perairan Pulau Roon di Teluk Cenderawasih. Lokasi  peneli- tian ditunjukkan dengan lingkaran warna merah (Sumber: google maps di https://www.google.com/maps/place/).
Tabel 1 Informasi sampel No Kode identitas Nama Spesies Lokasi 1 MB020201 Cirrhilabrus cf ryukyuensis Teluk Cenderawasih 2 MB020204 Cirrhilabrus cf ryukyuensis Teluk Cenderawasih 3 MB020205 Cirrhilabrus cf ryukyuensis Teluk Cenderawasih 4 MB022014 Cirrhilabrus cf ryukyuensis Raja Ampat 5 MB022006 Cirrhilabrus cf ryukyuensis Raja Ampat 6 MB022002 Cirrhilabrus cf ryukyuensis Raja Ampat

## Ekstraksi DNA, PCR, elektroforesis
Ekstraksi  DNA  menggunakan  metode pertukaran  ion  dengan  larutan Chelex 10% (Walsh et al. 1991). Mula-mula dilakukan peng- ambilan sekitar 1 mg sirip C. cf ryukyuensis dan dimasukkan ke dalam larutan chelex 10%. Selan- jutnya  dicampur  dengan  alat vortex selama  15 detik lalu disentrifugasi 10 detik dan dipanaskan dalam alat pemanas ( heat block ) pada suhu 95 o C selama  2  jam.  Setelah  pemanasan  ini,  sampel dicampur dengan vortex lagi selama 15 detik dan disentrifugasi  selama  10  detik.  Hasil  ekstraksi berupa ekstrak DNA disimpan dalam lemari es.
Proses amplifikasi DNA dilakukan secara in vitro menggunakan  metode  Polimerase Chain Reaction (PCR). PCR dilakukan pada mesin PCR (thermo cycler) type MJ Mini Biorad model TN 1148 dengan metode Hotstart dan profil suhu se- bagai berikut: denaturasi awal 94 o C selama 5 me- nit,  denaturasi  94 o C  selama  30  detik, annealing (penempelan  primer)  50 o C  se-lama  30  detik, extention (pemanjangan primer) 72 o C selama 30 detik,  dan extention akhir  72 o C  selama  7  menit. Proses  PCR  berlangsung  sebanyak  37  siklus. Primer yang digunakan yaitu Fish BCH:  -GGG AGT AAA GTT AAT ACC TTT GCT C- -TTC CCG AAG GCA CAT TCT- et al. 2007).
Proses  PCR  dengan  enzim amplitaq  red menggunakan  dua mastermix modifikasi  Barber
& Erdman (2000). Mastermix satu terdiri atas 5,5
µL ddH 2 O, 1,5 µL PCR buffer, 2,5 µL dNTP (8 mM), 2 µL MgCl 2 (25 mM), 1,25 µL primer Fish BCH  dan  1,25  µL  primer  Fish  BCL  (10  mM). Mastermix dua  terdiri  atas  9  µL  ddH 2 O,  1  µL PCR buffer, 0,125 µL enzim amplitaq Red. Cam- pur  14  µL mastermix satu  dan    1  µL  ekstrak DNA dicampur ke dalam tabung PCR dan kemu- dian campuran ini diletakkan dalam  mesin ther- mo  cycler .  Mesin  dihidupkan  dengan  program awal  panas  ( hot  start )  sampai  suhu  80 o C.  Pro- gram  dihentikan  sementara  ( pause )  sebelum  si- klus pertama, lalu tambahkan 10,125 µL Master- mix dua. Setelah itu program dilanjutkan kembali hingga selesai.
Elektroforesis  dilakukan  dengan  meng- gunakan  gel  agarosa  1%  (b.v -1 )  dan  dengan  pe- warna  etidium  bromida  (EtBr).  Sebanyak  4  µL produk  PCR  dicampurkan  dengan  1  µL loading dye dan  dimasukan  ke  dalam  sumur  gel.  DNA low  mass  ladder digunakan  sebagai  penanda ( marker ).  Elektroforesis  dijalankan  dengan voltase 200 volt, arus 400 mA, selama 15 menit. Pita  DNA  dilihat  dengan  menggunakan  lampu UV- transluminator dan difoto dengan kamera.
Pemurnian  exo-sap,  siklus  pengurutan  nukle- otida, dan sekuensing
Pemurnian  hasil  PCR  dilakukan  dengan menggunakan  enzim Exonuklease - Shrimp  Ala- klin Phospatase (Exo-Sap). Proses Exo-Sap ber- tujuan  untuk  menghilangkan  sisa-sisa  primer yang  tidak  ikut  bereaksi  dan  juga  dNTPs  sisa selama  proses  PCR  berlangsung.  Sampel  yang berhasil  diamplifikasi  dengan  PCR,  selanjutnya dimurnikan dengan metode Exo-Sap. Komposisi dan  jumlah  komponen  dalam  Exo-Sap  yaitu enzim Exonuklease dan Shrimp  alkalin  phos- phatase ,  masing-masing  sebanyak  0,5  µL  dan produk PCR sebanyak 5 µL. Proses berlangsung dalam thermo  cycler dengan  suhu  37 o C  selama 30 menit, untuk menghentikan kerja enzim yaitu pada  suhu  80 o C  selama  15  menit,  kemudian  di- dinginkan  pada  suhu  kamar  25 o C  selama  satu menit.
Sequencing DNA adalah  metode  untuk menentukan  urutan  nukleotida  yang  terdapat dalam  DNA. Mastermix yang  digunakan  dalam cycle  sequencing terdiri  atas mastermix satu (MM1)  dan mastermix dua  (MM2).  Komposisi mastermix satu yaitu: 7 µL ddH 2 O, 2,5 µL buffer sekuensing, 0,5 µL DMSO, 0,5 µL big dye, dan
0,5 µL primer Fish-BCH. Untuk mas-termix dua
bahan  yang  digunakan  sama,  tetapi  primernya diganti dengan Fish BCL. Sebanyak 11 µL MM1 dalam  tabung  mikrosentrifugasi  48  lubang ditambahkan  dengan  1  µL  DNA  hasil  exo-sap. Pada lubang yang lain ditambahkan 11 µL MM2 dan 1 µL DNA hasil exo-sap. Selanjutnya, proses cycle sequencing dilakukan dalam thermo cycler dengan suhu 96 o C selama 10 detik, 50 o C selama
5  detik,  60 o C  selama  4  menit,  dan  dilakukan pengulangan sebanyak 25 siklus.
Dalam proses presipitasi, pada hasil cycle sequencing ditambahkan  sebanyak  48  µL  iso- propanol  30%  kemudian  disentrifugasi  dengan
kecepatan  2204  rcf  ( relative  centrifugal  force , gaya  sentrifugal  relatif)  selama  30  menit.  Sete- lah  30  menit,  larutan  dibuang  dengan  membalik tabung  di  atas  tisu,  sehingga  semua  larutan  ha- bis.  Untuk  memastikan  tidak  ada  larutan  yang tersisa,  mensentrifugasi dengan  keadaan  terbalik (dialasi  tisu)  pada  kecepatan  500  rcf  selama  1 menit.  Pellet  DNA  yang  tersisa  didalam  tabung ditambah  dengan  40  µL  etanol  70%,  dan  disen- trifugasi  dengan  kecepatan  2204  rcf  selama  30 menit. Selanjutnya etanol  dibuang dengan mem- balik tabung di atas tisu, dan disentrifugasi pada kecepatan  yang  sama  selama  satu  menit  dengan posisi  terbalik.  Pellet  DNA  yang  tersisa  dalam tabung  ditutup  dan  dikemas  dengan alumunium foil .
Pengurutan  nukleotida  dengan  teknik cycle  sequencing menggunakan big  dye  termi- nator berlabel  fluorosence.  Pembacaan  urutan nukleotida  dilakukan  di  Cornell  University,  Ca- lifornia  dengan  menggunakan  mesin  sekuenser otomatis.  Hasil  pembacaan  urutan  nukleotida dalam bentuk AB1 file yang dapat diedit dengan menggunakan  perangkat  lunak  Sequencher  4.1 ataupun MEGA 5.

## Analisis data
Pengeditan  dan  analisis  data  urutan  DNA hasil  sekuensing  menggunakan  perangkat  lunak Sequencher 4.1 ( Gene Code ) dan MEGA 5 (Ta- mura et  al. 2011).  Penjajaran  ( alignment )  seku- ens  berdasarkan Clustal  W dengan  perangkat lunak  MEGA5.    Analisis  keragaman  genetik individu  berdasarkan  komposisi  nukleotida,  sisi variabel,  transisi  dan  transversi  sekuens  berda- sarkan  Kimura-2-Parameter.  Rasio  tingkat  sub- stitusi  sisi  non-sinonim  dan  sinonim  (dN/dS) berdasarkan  metode  Nei-Gojobori  dengan MEGA  5  (Tamura et  al. 2011).  Analisis  trans-
lasi  nukleotida  fragmen  Gen  Sitokrom  Oksidase sub  unit  I  menjadi asam  amino  menggunakan perangkat lunak MEGA 5.
Identifikasi  spesies  dilakukan  dengan BLAST  ( basic  local  alignment  search  tools ) untuk  menentukan  homologi  sekuens  penelitian dengan sekuens GeneBank. Identifikasi dilanjut- kan dengan analisis pohon filogenetik dan anali- sis  jarak  genetik  berdasarkan  Kimura-2-parame- ter  antara  pasangan  sekuens  menggunakan  pe- rangkat lunak MEGA5. Pohon filogenetik dibuat dengan beberapa parameter berikut: model statis- tik Maksimum Likelyhood , model subtitusi HKY, dan boostrap dengan  1000  kali  replikasi.  Untuk sekuen pembanding, diunduh dari data gene bank ( www.ncbi.nlm.  nih.gov ).  Pemilihan  model  evo- lusi  memberikan  nilai  BIC  ( Bayesian  Informa- tion  Criterion )  terkecil  yaitu  model  subtitusi Hasegewa-Khisino-Yano  (HKY).  Model  subti-
tusi HKY menganggap subtitusi dari satu nukle- otida  ke  nukleotida  lainnya  memiliki  nilai  yang berbeda  (Nei  &  Kumar  2000,  Tamura et  al. 2007).  Perbedaan  nilai  tersebut  yang  dijadikan dasar dalam pembuatan pohon filogenetik.

## Hasil

## Amplikon gen COI
Hasil  amplifikasi  dengan  menggunakan teknik  PCR  berupa  amplikon  fragmen  gen  COI dari C.  cf  ryukyuensis divisualisasikan  dengan menggunakan  metode  elektroforesis  pada  gel agarosa  1%  (b.v -1 ).  Pewarnaan  molekul  DNA dilakukan  dengan  menggunakan  etidium  bromi- da  (EtBr)  yang  memberikan  warna  jingga  jika dilihat  dengan UV transluminator .  Hasil  elek- troforesis disajikan pada Gambar 2.
Gambar  2.  Hasil Elektroforesis produk  PCR  yang  dilihat  dengan UV  transluminator .  Sumur  gel  pertama adalah DNA ladder yang telah terpotong dengan panjang basa tertentu. Pita DNA pada sumur pertama, terdapat 6 baris pita yang mana baris pertama memiliki ukuran sekitar 1800 pb, baris kedua  1200  pb,  ketiga  800  pb,  keempat  400  pb,  kelima  200  pb,  keenam  100  pb  (Invitrogen 2005).
Hasil  elektroforesis  menunjukkan  bahwa keenam  sampel  positif  memperoleh  amplikon fragmen  gen  COI  yang  ditandai  dengan  adanya pita DNA pada sumur gel nomor 2 sampai 7 de- ngan  panjang  sekitar  700  pasangan  basa  (pb). Hasil  ini  memastikan  bahwa  gen  hasil  amplifi- kasi  yang  diperoleh  benar-benar  merupakan  gen target dari primer yang digunakan.

## Urutan nukleotida fragmen gen COI
Hasil  sekuensing  dalam  bentuk  elektro- foregram  dan  sebagian  urutan  nukleotida  frag- men gen COI disajikan pada Gambar 3.
Hasil  sekuens  keenam  sampel  memper- oleh  nukleotida  dengan  panjang  basa  613  pb. Sekuens  terbanyak  merupakan  nukleotida  Timin (T). Rata-rata kandungan nukleotida Guanin dan Cytosin  (G+C)  adalah  44%,  sedangkan  rata-rata kandungan  nukleotida  Adenin  dan  Timin  (A+T) mencapai  56%.  Komposisi  nukleotida  untuk  se- tiap sampel dapat dilihat pada Tabel 2.
Keenam  sampel  tidak  memiliki  urutan nukleotida yang sama. Terdapat beberapa perbe- daan  nukleotida  (polimorfisme)  yang  diakibat- kan  adanya  mutasi  titik.  Polimorfisme  pada  ke- enam sampel ini disajikan pada Tabel 3.
Gambar  3.  Elektroforegram  dari  sampel  MB.020201.  Setiap  nukleotida  memiliki  puncak  ( peak ) dengan warna  yang  berbeda,  nukleotida  A  ditunjukkan  dengan  munculnya peak berwarna  hijau,  G berawarna hitam, C berwarna biru dan T berwarna merah.
Tabel 2 Komposisi nukleotida keenam sampel ID Sampel T (%) C (%) A (%) G (%) MB020201 TC 32,6 26,4 23,4 17,6 MB020204 TC 33,0 26,0 23,2 17,8 MB020205 TC 32,8 26,3 23,2 17,7 MB022014 R4 32,7 26,4 23,3 17,6 MB022006 R4 32,6 26,4 23,2 17,8 MB022002 R4 33,0 26,1 23,3 17,6 Rata-Rata 32,8 26,3 23,2 17,7

## Urutan asam amino fragmen gen COI
Urutan  sekuens  nukleotida  dapat  diterje- mahkan  menjadi  urutan  asam  amino.  Seluruh nukelotida  diterjemahkan  ke  dalam  asam  amino dan kodon awal ( start codon ) mulai dari nukleo- tida  pertama.  Panjang  613  pb  nukleotida  memi- liki  delapan  posisi  polimorfisme  atau  mutasi
subtitusi  yang  semuanya  merupakan  subtitusi synonymous .  Hal  ini  dilihat  dari  hasil  terjemah- an  asam  aminonya.  Keenam  sampel  memiliki urutan  asam  amino  yang  sama  tanpa  ada  sedi- kitpun  yang  berbeda.  Data  perubahan  setiap kodon  yang  mengalami  subtitusi  beserta  terje- mahan asam aminonya ditampilkan pada Tabel 4.
Tabel 3 Polimorfisme enam sampel ID sampel Posisi nukleotida Haplotipe 117 150 174 255 294 516 594 612 #MB020201_TC T A G C T C G C 1 #MB020204_TC T G G T T C G T 2 #MB020205_TC T G G T T C G C 3 #MB022014_R4 C G G T T C A C 4 #MB022006_R4 T G G T C C G C 5 #MB022002_R4 T G A T T T G C 6 Jenis mutasi Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr Tr
Keterangan:  T,  C,  A,  dan  G  masing-masing  merupakan  singkatan  nukleotida  timin,  cytosin,  adenin,  dan guanin; Tr = Transition (transisi) , Tv = Transvertion (transversi).
Tabel 4. Subtitusi dan pengaruhnya pada asam amino
No Posisi kodon Kodon awal Asam amino Kodon tersubtitusi Asam amino Posisi subtitusi 1 39 AUU I AUC I Ketiga 2 50 GGA G GGG G Ketiga 3 58 UUG L UUA L Ketiga 4 85 CUC L CUU L Ketiga 5 98 GGU G GGC G Ketiga 6 172 CUC L CUU L Ketiga 7 198 GGG G GGA G Ketiga 8 204 UAC Y UAU Y Ketiga
Keterangan: Singkatan asam amino : I (isoleusin), G (glisin), L (lisin), Y (tirosin)

## Pembahasan
Ukuran  amplicon  gen  COI  produk  PCR pada  penelitian  ini  sesuai  dengan  pernyataan Ivanova et  al .  (2007)  yang  mengatakan  bahwa primer  COI  dapat  digunakan  untuk  mengampli- fikasi  fragmen  gen  COI  dengan  panjang  sekitar 608  sampai  645  pb.  Enzim taq  polymerase me- rupakan  protein  kompleks  yang  berperan  dalam proses  polimerisasi  molekul  DNA. Taq  polyme- rase ini diisolasi bakteri Thermus aquaticus BM.
Rantai polipetida yang  menyusun  enzim ini  me- miliki  berat  molekul  kurang  dari  95 kilo  dalton. Enzim  ini  memiliki  suhu  optimum  antara  75- 80 o C dan masih dapat aktif meskipun mengalami pemanasan  hingga  mencapai  suhu  95 o C (Yuwono 2006).
Konsentrasi  nukleotida  produk  PCR  di- tentukan  berdasarkan  tingkat  kecerahan  pita DNA penelitian dibandingkan dengan pita DNA ladder .  Hasil  penelitian  pada  sumur  nomor  2 sampai nomor 7 menunjukkan tingkat kecerahan yang mendekati DNA ladder baris ke 3 (80 ng).
Hal ini berarti bahwa konsentrasi DNA gen COI hasil  amplifikasi  memiliki  konsentrasi  kurang dari 80 ng tetapi lebih dari 40 ng. Hal ini sesuai dengan kecerahan pada pita DNA ladder . Menu- rut Invitrogen (2005), pita DNA ladder baris per- tama  memiliki  konsentrasi  200  nano-gram  (ng), baris  kedua  sampai  keenam  masing-masing menunjukkan  konsentrasi  120  ng,  80  ng,  40  ng, 20 ng, dan 10 ng.

## Polimorfisme  fragmen  gen  COI  C.  cf  ryukyu- ensis
Sebuah  sekuens  dinyatakan  berbeda  ha- plotipe dengan sekuens lain, jika memiliki mini- mal satu nukleotida yang berbeda. Berdasarkan polimorfisme  pada  Tabel  3,  keenam  sampel  da- pat dikelompokkan menjadi enam haplotipe yang berbeda.  Keenam  sampel  menunjukkan  tingkat
keragaman  haplotipe  yang  tinggi  baik  di  daerah Teluk  Cenderawasih  maupun  di  daerah  Raja Ampat.  Polimorfisme  ini  terjadi  akibat  adanya mutasi pada DNA.
Pada dasarnya,  mutasi  dapat  terjadi  seca- ra alami dan terjadi akibat adanya  faktor ekster- nal. Mutasi alami terjadi karena adanya kesalah- an  penyalinan  molekul  DNA  pada  saat  terjadi replikasi  DNA,  sedangkan  mutasi  akibat  faktor eksternal  terjadi  karena  radiasi  ataupun  adanya paparan  bahan  kimia.  Meskipun  dalam  tubuh terdapat sistem perbaikan DNA, peristiwa muta- si  masih  terjadi  dan  terkadang  masih  terakumu- lasi  dan  terbawa  sampai  generasi  berikutnya. Mutasi-mutasi  tersebut  yang  akan  mengakibat- kan adanya evolusi (Toha 2011).
Mutasi  transisi  lebih  sering  dan  mudah terjadi dibandingkan mutasi transversi. Hasil pe- nelitian  ini  menunjukkan  bahwa  kedelapan  mu- tasi  merupakan  mutasi  transisi,  yakni  antara  nu- kleotida  adenilat  dan  guanilat,  serta  nukleotida sitidilat  dan  timidilat.  Hal  ini  disebabkan  oleh adanya  kemungkinan  kesalahan  pasangan  dalam molekul  DNA  (Graur  &  Li  2000).  Graur  &  Li (2000)  mengatakan  bahwa  kemungkinan  kesa- lahan  pasangan  yang  diizinkan  oleh  konsep Watson  dan  Crick  adalah  kesalahan  pasangan antara  basa  purin  dan  pirimidin.  Penelitian  se- lanjutnya  menambahkan  informasi  bahwa  kesa- lahan  pasangan  antara  purin  dan  purin  masih mungkin  terjadi,  sedangkan  kesalahan  pasangan antara basa pirimidin dan pirimidin tidak  mung- kin terjadi. Itulah  sebabnya  mutasi  transisi  lebih mudah dan sering terjadi daripada transversi.

## Keragaman asam amino fragmen gen COI C. cf rykyuensis
Dalam  setiap  DNA  terdapat  berbagai macam  gen,  baik  yang  menyandi  protein  mau- pun yang tidak menyandi protein. Salah satu gen
yang menyandi protein dalam DNA mitokondria adalah  gen  COI.  Gen  COI  merupakan  gen  yang menyandi  protein  Sitokrom  C  Oksidase  I (Pentinsaari et  al .  2016)  yang  berperan  dalam proses transfer elektron pada saat sintesis Adeno- sine  Triphosphate (ATP)  dalam  mitokondria.
Gen ini berada dalam genom mitokondria (DNA mitokondria).  Penyusun  utama  suatu  protein adalah  asam-asam  amino  yang  dihubungkan dengan  adanya  ikatan  peptida.  Urutan  setiap asam  amino  penyusun  protein  ditentukan  oleh urutan  nukleotida  gen  yang  menyandi  protein tersebut.  Perbedaan  urutan  asam  amino  akan menyebabkan  perbedaan  struktur  dan  fungsi protein  tersebut  dalam  tubuh.  Dengan  mengeta- hui  urutan  nukleotida  suatu  gen,  maka  urutan asam  aminonya  dapat  diterjemahkan  berdasar- kan kode genetiknya.
Berdasarkan Tabel 4, terlihat bahwa mes- kipun  terjadi  perubahan  nukleotida,  ternyata  ti- dak  merubah  urutan  asam  amino  yang  disandi- nya.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  subtitusi  yang terjadi  pada  posisi  ketiga  setiap  kodon  memiliki peluang  yang  kecil  untuk  merubah  asam  amino yang disandinya. Hal ini sesuai dengan pendapat Graur  &  Li  (2000) yang  menyatakan  bahwa kemungkinan 70%  mutasi  yang  terjadi  pada po- sisi  ketiga  setiap  kodon  adalah synonymous ,  se-
dangkan  mutasi  yang  terjadi  pada  posisi  kedua semuanya adalah non-synonymous . Untuk posisi pertama, 96%-nya adalah non-synonymous .

## Pohon filogenetik
Setiap sampel dibandingkan  dengan selu- ruh  data Gene  Bank dan  dipilih  satu  sekuens yang  memiliki  kemiripan  paling  tinggi.  Setiap sekuens yang memiliki kemiripan tinggi diguna- kan  dalam  pembuatan  pohon  filogenetik.  Hasil BLAST keenam sampel disajikan dalam Tabel 5.
Keenam  sampel  merujuk  pada  spesies Cirrhilabruss  cyanopleura .  Hal  ini  terbukti dengan  hasil  BLAST  ( Basic  local  alignment search  tools )  ke  data Gene  Bank yang  menun- jukkan  bahwa  sekuens  ini  memiliki  kemiripan yang tinggi dengan ikan C. cyanopleura. Dalam data  Gene  Bank,  tidak  ditemukan  adanya  seku- ens  gen  COI  dari C.  ryukyuensis .  Hal  ini  dise- babkan  kebanyakan  ahli  menganggap  bahwa C. ryukyuensis merupakan  sinonim  dengan C.  cya- nopleura ,  sehingga  data  sekuens  yang  mereka unggah  ke  Gene  Bank  menggunakan  nama C. cyanopleura .
Hasil  analisis  lebih  lanjut  dengan  pohon filogenetik  menunjukkan  bahwa  seluruh  sampel memang berbeda dengan C. cyanopleura. Pohon filogenetik ditampilkan pada Gambar 4.
Tabel 5. Hasil BLAST ke data GeneBank No Nomor ID Hasil BLAST Spesies Hasil BLAST Query Qoverage Identity 1 MB020201 FJ583213.1 C. cyanopleura 100% 99% 2 MB020204 FJ583219.1 C. cyanopleura 100% 99% 3 MB020205 FJ583219.1 C. cyanopleura 100% 99% 4 MB022006 FJ583219.1 C. cyanopleura 100% 99% 5 MB022014 FJ583216.1 C. cyanopleura 100% 99% 6 MB022002 FJ583219.1 C. cyanopleura 100% 99%
Gambar 4.   Pohon Filogenetik keenam sampel. Pohon filogenetik dibuat dengan menggunakan  perangkat lunak  MEGA5.  Tiga  sekuens C.  cyanopleura yang  memiliki  kemiripan  tertinggi  dari  Gene Bank,  digunakan  sebagai  pembanding,  yaitu  sekuens  dengan  kode  akses  FJ583213.1, FJ583219.1,  dan  FJ583216.1  (Steinki et  al. 2009)  Sebagai out  group digunakan  sekuens C. rubriventralis (kode akses : FJ58241.1) (Steinki et al. 2009) dari GeneBank . Out group berada dalam clade tersendiri dari keenam sampel dan data Gene Bank lainnya.
Pohon  filogenetik  menunjukkan  bahwa keenam  sampel  berada  dalam  satu clade (grup atau  kelompok) dan  didukung  oleh  90%  nilai boostrap ,  akan  tetapi  terpisah  dari  grup C.  cya- nopleura dengan  dukungan  60%  nilai boostrap .
Sekuens  dari Gene  Bank dengan  kode  akses
FJ583219  memiliki  hubungan  kekerabatan  yang paling  dekat  dengan  keenam  sampel.  Hal  ini berbeda  dengan  hasil  BLAST.  Hal  ini  karena nilai boostrap yang  rendah  dan  terpisah  grup antara  keenam  sampel.    Dengan  demikian  tidak ada  jaminan  bahwa  sampel  penelitian  ini  meru- pakan satu spesies dengan C. cyanopleura .
Hasil  analisis  jarak  genetik  keenam  sam- pel  dibandingkan  dengan  data  genebank  disaji- kan pada Tabel 6.
Jarak  genetik  di  antara  keenam  sampel berkisar  antara  0,002    0,007,  sedangkan  jarak genetik  antara  keenam  sampel  dan  sekuens C. cyanopleura berkisar antara 0,008   0,015. Jarak genetik paling jauh ditunjukkan antara out group , sampel  penelitian  dan  data Genebank lainnya dengan  kisaran  0,102    0,114.  Jarak  genetik  ini menunjukkan  tingkat  kekerabatan  setiap  sampel dan data Genebank .
Tabel 6. Jarak genetik keenam sampel dan data Genebank
No ID SAMPEL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 MB020201_TC
2 MB020205_TC 0,003 3 MB020204_TC 0,005 0,002 4 MB022002_R4 0,007 0,003 0,005 5 MB022014_R4 0,007 0,003 0,005  0,007 6 MB022006_R4 0,005 0,002 0,003  0,005  0,005 7 C. cyanopleura FJ583216.1 0,015 0,012 0,013  0,015  0,012  0,013 8 C. cyanopleura FJ583213.1 0,013 0,01 0,012  0,013 0,01 0,012  0,002 9 C. cyanopleura FJ583219.1 0,012 0,008 0,01 0,012  0,012 0,01 0,003  0,002 10 C. rubriventralis FJ58241.1 0,112 0,112 0,114  0,112  0,112  0,114  0,102  0,102  0,104

## Simpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat disimpulkan bahwa nukleotida fragmen Gen COI dari C. cf ryukyuensis pada penelitian ini memi- liki  panjang  mencapai  613  pb.  Komposisi  nu- kleotida terdiri atas T 32,8%, C 26,3%, A 23,2%, G 17,7%. Kandungan A+T lebih tinggi daripada kandungan  G+C.  Keragaman  nukleotida  terjadi akibat adanya delapan mutasi transisi yang terja- di  pada  nukleotida  ke  117,  150,  174,  255,  294, 516,  594  dan  612.  Hasil  penerjemahan  613  pb nukleotida didapatkan 204 asam amino. Kompo- sisi penyusun asam amino dengan jumlah terting- gi yaitu Leusin (Leu) 15,686 % dan terendah ya- itu asam amino Sistein (Cys) 0%. Keenam sam- pel C.  cf  ryukyuensis memiliki  keragaman  asam amino  yang  rendah  karena  memiliki  jumlah  dan urutan  asam  amino  yang  sama.  BLAST  dengan data  Gene-bank,  menunjukkan  bahwa  sekuens yang  diperoleh  benar-benar  sekuens  Gen  COI yang  dibuktikan  dengan  kemiripannya  dengan sekuens  Gen  COI  dari C.  cyanopleura. Pohon filogenetik  menunjukkan  bahwa  keenam  sampel berada  dalam  satu  kelompok atau  grup  dan berbeda dengan grup C. cyanopleura.

## Daftar pustaka
Allen  GR,  Erdmann  MV.  2009.  Reef  fishes  of
Indonesia. Check List: Journal of species lists and distribution , 5(3): 587-628.
Allen  GR,  Erdmann  MV.  2012.  Reef  Fishes  of the  East  Indies.  Volumes  I III.  Tropical Reef Research, Perth.
Allen  GR,  Erdmann  MV,  Dailami  M.  2015. Cirrhilabrus  marinda ,  a  new  species  of wrasse  (Pisces:  Labridae)  from  eastern Indonesia,  Papua  New  Guinea,  and Vanuatu. Journal  of  the  Ocean  Science Foundation , 15: 1 15.
Barber PH, Erdmann MV. 2000. Molecular sys- tematic  of  the  Gonodactylidae  (Stomato- poda)  using  mitochondrial  cytochrome oxidase  C  (sub  unit  1)  DNA  sequence data. Journal  of  Crustacean  Biology, 20(2): 20-36.
da  Fonseca  RR,  Johnson  WE, Brien  SJ,  Ra- mos  MJ,  Antunes  A.  2008.  The  adaptive evolution  of  the  mammalian  mitochon- drial genome. BMC Genomic. 9: 119.
DeBoer TS, Naguit MRA, Erdmann MV, Ablan - Lagman  MC,  Ambariyanto,  Carpenter KE, Toha AHA, Barber PH. 2014a. Con- cordance  between  phylogeographic  and biogeographic  boundaries  in  the  Coral Triangle: conservation implications based on comparative analyses of multiple giant clam species. Bulletin  of Marine Science, 90(1): 277 300.
DeBoer TS, Naguit MRA, Erdmann MV, Ablan - Lagman  MC,  Ambariyanto,  Carpenter KE, Toha AHA, Barber PH. 2014b. Con- cordant  phylogenetic  patterns  inferred from  mitochondrial  and  microsatellite DNA in the giant clam, Tridacna crocea . Bulletin  of  Marine  Science, 90(1):  301 329.
Donelly R, Mous PJ. 2002. Laporan Survey Kaji Ilmiah  Ekologi  cara  cepat  di  Kepulauan Raja Ampat, Papua, Indonesia, dilaksana- kan  pada  30  Oktober    22  November 2002. Penerjemah: UNIPA, TNC South- east Asia Center for MPA . Bali, 46-55.
Graur  D,  Li  WH.  2000. Fundamentals  of  Mole- cular  Evolution ,  2  ed.  Sinauer  Asociates. Sunderland, Massachusetts. 481 p.
Hebert  PDN,  Cywinska  A,  Ball  SL,  de  Waard JR.  2003.  Biological  identifications through  DNA  barcodes. Proceedings  of the Royal Society B: Biological  Sciences , 270: 313-321.
Hubert  N,  Paradis  E,  Bruggemann  H,  Planes  S. 2011.  Community  assembly  and  diversi- fication  in  Indo-Pacific  coral  reef  fishes . Ecology and Evolution , 1(3): 229-277.
Ishikawa  C. 1904.  Notes  on  some  new  or  little- known  fishes  of  Japan. Proceeding  of Natural History, Tokyo Museum, 1(1): 17 pp.
Invitrogen.  2005.  Catalog  2005: Life  sciences research  product  and  services.  Invitro- gen corporation , California: XV + 736 p.
Ivanova  NV,  Zemlak  TS,  Hanner  RH,  Hebert PDN. 2007. Universal primer cocktails for fish  DNA  barcoding . Molecular  Ecology Notes , 7(4): 544-548.
Kuiter  RH,  Tonozuka  T.  2004. Indonesian  Reef Fishes Denpasar, Bali.
Mangubhai  S,  Erdmann  MV,  Wilson  JR,  Huf- fard  CL,  Ballamu  F,  Hidayat  NI,  Hiti- peuw  C,  Lazuardi  ME,  Muhajir,  Pada  D, Purba  G,  Rotinsulu  C,  Rumetna  L,  Su-
Head  Seascape:  Emerging  threats  and challenges  in  the  global  center  of  marine biodiversity. Marine  Pollution  Bulletin , 64(11): 2279 2295.
Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics .  Oxford  University  Press, New York. 352p.
Pentinsaari M, Salmela H, Mutanen M, Roslin T. 2016.  Molecular  evolution  of  a  wi-dely- adopted  taxonomic  marker  (COI)  across the  animal  tree  of  life. Scientific Reports ,  6 (35275): 1-12.
Ruggiero  M,  Gordon  D,  Bailly  N,  Kirk  P, Nicolson  D.  2011.  The  catalogue  of  life taxonomic  classification,  Edition  2,  Part A. In: Bisby FA, Roskov YR, Orrell TM, Nicolson  D,  Paglinawan  LE,  Bailly  N, Kirk  PM,  Bourgoin  T,  Baillargeon  G, Ouvrard  D  (eds.)  Species  2000  &  ITIS Catalogue  of  Life:  2011  Annual  Check- list.  Digital  Resource  at  www.catalogue- oflife.org/col/;  Species  2000:  Reading, UK.
Saleky D, Setyobudiandi I, Toha HA, Takdir M, Madduppa  H.  2016.  Length-weight  rela- tionship  and  population  genetic  of  two marine  gastropods  species  (Turbinidae: Turbo  sparverius and Turbo  bruneus )  in ua, Indone- sia. Biodiversitas , 17(1): 208-217.
Steinke D,  Zemlak TS, Hebert PDN. 2009.  Bar- coding  Nemo:  DNA-Based  Identifica- tions for the Ornamental Fish Trade . Plos One, 4(7) e6300: 1-5.
Tamura  K,  Dudley  J,  Nei  M,  Kumar  S.  2007. MEGA4:  Molecular  Evolutionary  Gene- tics  Analysis  (MEGA)  software  version 4.0. Molecular  Biology  and  Evolution 24(8): 1596-1599
Tamura  K,  Peterson  D,  Peterson  N,  Stecher  G, Nei  M,  Kumar  S.  2011.  MEGA5:  Mole- cular  Evolutionary  Genetiks  Analysis using  maximum  likelihood,  evolutionary distance,  and  maximum  parsimony  me- thods. Molecular  Biology  and  Evolution , 28(10): 2731-2739.
Tea  YK,  Senou  H,  Greene  BD.  2016. Cirrhila- brus  isosceles ,  a  new  species  of  wrasse (Teleostei:  Labridae)  from  the  Ryukyu Archipelago  and  the  Philippines,  with notes on the C. lunatus complex. Journal of the Ocean Science Foundation , 21: 18 37.
Templado J, Paulay G, Gittenberger A, Meyer C. 2010.  Chapter  11    Sampling  the  marine realm . In : Eymann J, Degreef J, Häuser C, Monje  JC,  Samyn  Y,  Spiegel  DV  (eds). Manual  on  Field  Recording  Techniques and  Protocols  for  All  Taxa  Biodiversity Inventories  and  Monitoring. Abc  Taxa, 8(1): 273-311.
Toha  AHA.  2011. Ensiklopedia  Biokimia  dan Biologi  Molekuler .  Penerbit  EGC.  Jakar- ta. 884 hlm.
Veron JEN, DeVantier LM, Turak E, Green AL, Kininmonth  S,  Stafford  SM,  Peterson  N. 2010. The Coral Triangle. Manuscript The Nature Conservancy . Australia.
Victor BC. 2015. How many coral reef fish spe- cies  are  there?  Cryptic  diversity  and  the new  molecular  taxonomy. In :  Mora  C (editor). Ecology  of  Fishes  on  Coral Reefs .  Cambridge  University  Press, Cambridge. pp. 76-87.
Wallace CC, Turak E, De Vantier  L. 2011. No- vel  characteristics  in  a  conservative  coral genus:  three  new  species  of  Astreopora (Scleractinia:  Acroporidae)  from  West
Papua. Journal of Natural History , 45(31- 32): 1905 1924.
Walsh  PS,  Metzger  DA,  Higuchi  R.  1991.  Che- lex-100  as  medium  for  simple  extraction of  DNA  for  PCR  based  typing  from  fo- rensic  material. Biotechniques ,  10(4): 506-513.
Ward  RD,  Zemlak  TS,  Innes  BH,  Last  PR,  He- bert PDN. 2005. DNA Barcoding Austra-
Philosophical  Trans- actions  of  the  Royal  Society  of  London. Series  B, Biological  Sciences, 360(1462): 1847-1857.
Yuwono  T.  2006. Teori  dan  Aplikasi  Polymer- ase  Chain  Reaction .  Penerbit  Andi.  Yo- gyakarta. 240 hlm.