e- Jurnal Rekayasa dan Teknologi Budidaya Perairan
Volume VIII No 2 Februari 2020 p-ISSN: 2302-3600, e-ISSN: 2597-5315

## DETERMINATION OF CELL TYPE AND HAEMOCYTE MORPHOMETRIC CHARACTERISTICS OF WESTERN AUSTRALIA
FRESHWATER CRAYFISH (Cherax cainii) AT DIFFERENT

## TEMPERATURES IN VITRO
Bambang Widyo Prastowo* 12 , Ricky Lareu, Rima Caccetta* 3 , Ravi Fotedar* 4

## ABSTRACT
The purpose of this study was to identify and morphologically characterize the  hemocyte  cell  types  of  freshwater  crayfish,  Cherax  cainii.  In  addition  to morphological  observations  using  a  light  microscope  (LM)  and  electron transmission microscope (TEM), a flow cytometer (FCM) is also used. Three main types  of  haemocyte  of  C.  cainii  were  identified  by  LM,  TEM,  and  FCM. Determination  of  haemocyte  by  LM  based  on  the  number,  size  of  cytoplasmic granules and the ratio of N:C. These cells are Hyaline (HC), Small Granule (SGC), and Large Granule (LGC) cells. Three types of haemocyte were also observed by TEM  based  on  cell  and  nucleus  size,  granule  diameter,  number  of  cytoplasmic granules per cell and N:C. Haemocyte population was successfully detected with FCM based on forward scatter (FSC) signals, versus side scattering signals/side scatter (SSC), with plot data via scatter parameter gating. Three cluster formations were observed, which were temporarily classified as SGC, LGC, and HC regions. Morphometric  analysis  was  performed  with  TEM  on  C.  cainii  haemocyte  to measure various cellular features. Some morphological features vary between types of haemocyte and are also affected by temperature. Total hemocyte count (THC) and differential hemocyte count (DHC) are calculated using FCM. THC increases with higher temperatures, from 1,9 x 10 6 /ml at 20 °C to 4.9 x 10 6 /ml at 30 °C.  The most abundant hemocyte at all temperatures is HC, followed by SGC and LGC.
Keywords: Freshwater crayfish, haemocyte, morphometrics, temperature, in vitro

## Pendahuluan
Pada hewan dekapoda krustasea,  hemosit  yang  bersirkulasi telah mendapat perhatian yang cukup besar  sebagai  mekanisme  utama
1 E-mail: Bambang_fds@yahoo.com
2 Loka Pemeriksaan Penyakit Ikan dan Lingkungan, Serang, Banten, Indonesia
3 School of Pharmacy, Faculty of Health Science, Curtin University, Perth 6845, Western Australia
4 School of Science, Curtin University, Perth 6845, Western Australia
imunitas  yang  diperantarai  oleh  sel. Hemosit  memainkan  peran  utama dalam  reaksi  imun  seluler,  seperti fagositosis penyerang patogen,
mobilisasi  melalui  agregat  nodular, enkapsulasi  benda  asing  yang  besar,
dan proses penyembuhan yang diikuti dengan  pembekuan    hemolimfa dengan  cepat  (Hose et  al .,  1990;
Soderhall & Thornqvist, 1997;
Iwanaga,  2002;  Eddy et  al .,  2007;
Vazquez,  2009).  Kerentanan  dan ketidakteraturan sel-sel imun krustasea,  di  samping  terbatasnya pengetahuan  tentang  perkembangan dan  diferensiasi  sel  imun,  membuat sulit untuk mengklasifikasikan hemosit  ke  dalam  kelas  ontogenik yang didefinisikan secara morfologis dengan  baik.  Secara  umum  mereka diperjelas  dengan  skema  morfologis dan  immuno-fungsional  yang  lebih seragam  dari  klasifikasi  sel  darah putih vertebrata (Zhang et al ., 2006). Kemampuan  untuk  memisahkan  dan mengisolasi populasi hemosit merupakan  faktor utama tidak hanya untuk mengkarakterisasi hemosit berdasarkan fungsi seluler dan humoral, tetapi juga untuk memahami interaksi sel-sel dan studi perkembangan. Kebanyakan penyeli- dikan  hemosit  dilakukan  dengan menggunakan  metode  sitologi  atau biokimia
tradisional, dengan mikroskop  cahaya  sebagai  teknik analitis  yang  paling  umum.  Namun, adanya  subjektivitas  yang  menonjol dalam teknik ini dan seringkali dapat menghasilkan  kontroversi.  Mikros- kop  fase  kontras  atau  mikroskop cahaya  medan  terang  (LM)  dan mikroskop transmisi  elektron (TEM) umumnya digunakan untuk
mengevaluasi  jumlah  dan  ukuran butiran  dan  juga  rasio  nukleus- terhadap-sitoplasma (N:C), yang penting  untuk  klasifikasi  morfologi
(Ding et al ., 2012). Namun demikian, keunggulan penggunaan flow cytometer (FCM) dibandingkan dengan  metode  konvensional  ini
menawarkan  beberapa  keuntungan.
Metode  ini  sangat  sensitif  dan memungkinkan analisis
multi-
parameter  secara  efisien.  Xue et  al . (2001) menambahkan informasi bahwa  FCM  menggunakan  auto- fluoresensi,  penanda fluorescent dan parameter  hamburan  cahaya  untuk mempelajari ukuran dan kompleksitas  sel,  termasuk  beberapa fungsi seluler. Krustasea semakin dikenal sebagai  hewan  budidaya  potensial dalam  industri  akuakultur,  sehingga pemantauan  fungsi  kekebalan  tubuh mereka  dan  meminimalkan  tekanan yang dapat menyembunyikan kekebalan  mereka  sangat  penting. Perubahan  fungsi  kekebalan  tubuh dapat disebabkan oleh variasi lingkungan.  Faktor  lingkungan  yang paling penting kemungkinannya adalah suhu air karena memiliki efek langsung  pada  asupan  oksigen, metabolisme, moulting, pertumbuhan dan kelangsungan hidup (Chen et al ., 1995;  Hennig  &  Andreatta,  1998). Variasi  suhu  sering  menyebabkan stres  bagi  krustasea,  menghasilkan penurunan  fungsi  kekebalan  yang dinilai berdasarkan jumlah hemositnya, aktivasi proPO, aktivitas fagosit, dan pelepasan radikal oksigen bebas  (Le  Moullac et  al .,  2000). Sebelumnya,  Vargas-Albores et  al . (1998)  dan  Le  Moullac  &  Haffner (2000)  melaporkan  bahwa  berbagai variasi  pada  pro-fenoloksidase  (pro- PO)  bergantung  pada  suhu.  Oleh karena  itu,  efek  dari  respons  variasi suhu pada krustasea akan
memberikan  informasi  yang  penting secara ekologis.
Tujuan  dari  penelitian  ini adalah  untuk  mengidentifikasi  dan mengkarakterisasi  secara  morfologis
tipe sel hemosit dari lobster air tawar atau dikenal dengan sebutan Marron, C. cainii , dan untuk membandingkan hasil  ini  dengan  spesies  invertebrata yang  telah  diselidiki  lebih  teliti. Persamaan  dan  perbedaan  di  antara spesies  dicatat  dan  diukur.  Selain pengamatan morfologis meng- gunakan  LM  dan  TEM,  kami  juga menggunakan teknik FCM yang lebih baru. Dalam penelitian ini kami juga menyelidiki  proses  fagositosis  pada hemosit C.  cainii .  Parameter  yang diuji  adalah  tantangan  suhu  dan imunologi  dengan Vibrio  mimicus yang  hidup  dan  yang  dibunuh-panas serta Escherichia coli yang dibunuh- panas secara in vitro.

## Metode
Bagan  pengujian  efek  suhu  yang berbeda pada hemosit C. cainii
Pengujian  untuk  mengetahui efek  dari  suhu  dilakukan  seperti diuraikan  pada  bagan  di  bawah  ini (Gambar  1).  Tiga  perangkat  tangki plastik silinder untuk  pengujian yang masing-masing  diisi  dengan  3  ekor marron  dipertahankan  pada  suhu  20, 25  dan  30°C  selama  dua  minggu sebelum  digunakan.  Hemolimfa  dari tiga ekor marron dari masing-masing perangkat  pengujian  dikumpulkan dan  dihitung  dan  digunakan  untuk pengujian  ini.  Pengujian  dilakukan pada  suhu  20,  25  dan  30  °  C  dan hemosit dimasukkan ke dalam sumuran micro  plate sebanyak  tiga kali  ulangan  yang  mengandung sekitar  satu  juta  hemosit.  Analisis mikroskop  elektron  transmisi  (TEM) dan flow cytometric (FCM) dilakukan pada  ketiga  tipe  sel  hemosit  (HC, SGC dan LGC).

## Prosedur Pengujian Sistem Aklimatisasi
Sistem  aklimatisasi  diatur  di laboratorium  yang  dirancang  khusus untuk  penelitian  akuakultur  dengan fasilitas  akuarium  dalam  ruangan milik Curtin Aquatic Research Laboratory (CARL), Universitas
Curtin,    Perth  Australia  Barat.  Unit pengujian  adalah  tangki  plastik silinder (diameter 80 cm dan tinggi 50 cm dan kapasitas 250 l). Tangki diisi dengan  air  tawar  dan  dilengkapi dengan  aerasi  konstan  serta  sistem filtrasi  biologis  resirkulasi  (Fluval 205, Askoll, Italia). Air dalam tangki mengalir  terus  menerus,  pada  laju sekitar 3 l/menit. Untuk menjaga suhu konstan  20,  25,  dan  30  ±  2  °C  di tangki  aklimatisasi,  setiap  tangki dilengkapi dengan termostat submersible . Tangki itu juga dilengkapi dengan tempat perlindungan bagi marron yang cukup jumlahnya  dalam  bentuk  pipa  PVC dengan  diameter  yang  sesuai  ukuran tubuhnya.
Gambar 1. Bagan pengujian efek suhu yang berbeda pada hemosit Cherax cainii

## Hewan Uji
Marron  jantan  (±  150  g)  dibeli dari  Aquatic  Resource  Management Pty  Ltd.,  Manjimup,  Australia  Barat 6258.  Hewan  uji  tersebut  diberi makan dengan pakan pelet komersial yang mengandung 26 % protein, 47 – 50 % karbohidrat, 9 % lemak, dan 8,9 %  abu  (Enviroplus  Pty  Ltd.,  Perth, Australia) hingga percobaan dimulai. Marron  diberi  makan  pada  sore  hari sebanyak  3  %  berat  badan/2  hari. Makanan  yang  belum dimakan dibuang  dengan  jalan  disiphon. Sebelum
penggunaan
untuk pengujian,  hewan  uji  diaklimatisasi- kan pada kondisi laboratorium selama satu  minggu.  Hanya  hewan  uji  yang tampak sehat yang dipergunakan.

## Persiapan Hemosit
Marron dibius  dengan air yang diisi dengan es selama 15 menit, dan sekitar  2  ml  hemolimfa  diekstraksi
per hewan uji dengan jarum suntik 5- ml dengan jarum 25 1 / 2 G yang berisi volume  yang  sama  dari  buffer sitrat/EDTA yang
didinginkan sebelumnya (0,45 M NaCI; 0,1 M M glukosa;  30  mM  trisodium  sitrat;  26 mM  asam  sitrat  dan  10  mM  EDTA) pH  4,6,  sebagai  larutan  antikoagulan (AB). Hemolimfa yang telah dilarutkan  ulang  didistribusikan  ke dalam tabung mikrosentrifus steril 10 ml  yang  terpisah  yang  disimpan  di dalam  pecahan  es  dan  disentrifugasi pada  500x  G  selama  5  menit  pada suhu  4  °C.  Supernatan  dibuang  dan masing-masing  pelet  sel  dilarutkan ulang dalam 2 ml AB dingin. Sampel tersebut  kemudian  dipindahkan  ke tabung  mikrosentrifus  terpisah  yang diletakkan didalam es. Setetes sampel yang telah dilarutkan ulang dipindahkan ke hemositometer untuk dihitung  selnya  dengan  mikroskop cahaya  (Olympus)  dan  diwarnai 3 ekor marron 3 ekor marron
Pool Hemolimfa Hemosit dihitung → 1x10 6 mL 3 sumuran/perlakuan, 20, 25 and 30°C Dipertahankan pada 20°C Analisa TEM dan FCM untuk masing-masing tipe hemosit 3 ekor marron 25°C 30°C Pool Hemolimfa
Pool Hemolimfa
dengan trypan  blue .  Hanya  sel  yang dipersiapkan  dengan  viabilitas  lebih tinggi  dari  90%  yang  digunakan. Sampel  yang  telah  dilarutkan  ulang yang  tersisa  diencerkan  dengan  AB untuk mendapatkan konsentrasi akhir sekitar 1 × 10 6 sel/ml.

## Mikroskop Transmisi Elektron
Dalam persiapan untuk mikroskop transmisi elektron  (TEM), 1  ml  hemolimfa  yang  diencerkan dengan AB dikumpulkan dari masing-masing 3 ekor marron. Hemolimfa ini kemudian disentrifugasi  pada  500x  G  selama  5 menit  pada suhu  4  °C. Pelet hemosit pertama  kali  dipasca  fiksasi  dengan glutaraldehid  5  %  yang  disiapkan dalam buffer fosfat (pH 7,3) selama 2 jam hingga semalam pada suhu 4 o C dan kemudian difiksasi dengan asam osmat krom Dalton 1 % dalam buffer yang sama pada suhu 4 o C selama 1 –
1½  jam.  Sel-sel  yang  difiksasi  tadi didehidrasi dalam serangkaian pencucian etanol diikuti oleh pencucian  dengan  propilena  oksida untuk  menghilangkan  sisa  etanol yang  sebelumnya  digunakan  untuk dehidrasi  sebelum  diproses  secara rutin  untuk  proses  embedding  secara konvensional dalam propilena oksida/resin Epoxy 812 (TAAB, UK). Bagian Ultrathin (tebal sekitar 90 nm) dipotong dengan menggunakan Ultramicrotome E.  Reichert  (Wina,
Austria)  dan  pisau  berlian  dipasang pada wadah kisi-kisi tembaga.
Potongan-potongan  itu  kemudian diwarnai  ganda  dengan  uranyl  asetat dan  timbal  sitrat.  Potongan  tersebut diamati  dan  difoto  dengan  Philips CM100 Biotwin Transmission
Electron  Microscope (Eindhoven, Belanda).

## Flowcytometry
Suspensi  hemosit  dianalisis
dengan Attune  Acoustic  Focussing Flow Cytometer (Applied Biosystems)  yang  dilengkapi  dengan 2 sistem laser: Laser Biru dan Merah dengan  emisi  yang  difilter  pada  488 dan 638 nm. Filter bandpass
Photomultiplier untuk  fluoresensi hijau  adalah  488/10  (BL1),  530/30 (BL2),  574/26  (BL3),  690/50  (BL4) dan  untuk  fluoresensi  merah  adalah 660/20 (RL1) dan 780/60 (RL2). Data sinyal  hamburan  ke  depan  (yang mengukur ukuran sel relatif) dikumpulkan  pada  skala  linier  dan data sinyal hamburan  samping  (yang mengukur granularitas sel)
dikumpulkan  pada  skala  logaritmik. Pengaturan  tegangan  adalah  FSC 1350,  SSC  1450,  BL1  1600,  BL2
2000,  BL3  2000,  BL4  2550,  RL1 2350  dan  RL2  1950.  Data  adalah gating FSC/SSC, dan 10.000
peristiwa  secara  total  diperoleh  per sampel. Perangkat Lunak Attune v1.2 digunakan  untuk  membuat  wilayah logis  untuk  analisis  data,  dan perangkat  lunak  FlowJo  digunakan untuk  membuat  wilayah  logis  untuk menganalisis  persentase  sel  di  setiap wilayah.

## Hasil dan Pembahasan
Penentuan Hemosit C. cainii Tiga  jenis  hemosit  utama diidentifikasi  dengan  LM,  TEM  dan FCM  pada C.  cainii berdasarkan jumlah dan ukuran butiran sitoplasma dan rasio N: C. Hemosit ini adalah sel hialin (HC), sel granula kecil (SGC), dan sel granula besar (LGC).
Penentuan Tipe Sel C. cainii dengan LM
Tiga jenis hemosit diamati oleh LM  dalam  hemolimfa C.  cainii
(Gambar  2).  Mereka  diidentifikasi sebagai HC, SGC dan LGC. Sel hialin adalah sel paling banyak ditemukan di
C.  cainii diikuti  oleh  SGC.  Jenis  sel yang  paling  tidak  melimpah  adalah LGC.  Persentase  relatif  dari  tipe hemosit yang bersirkulasi di C. cainii adalah HC (50 %), SGC (29,2 %) dan LGC (20,8 %).
Gambar 2. Hasil pengamatan mikroskop cahaya pada haemosit Cherax cainii : sel hialin  (HC),  menunjukkan  nukleus  besar  dan  sitoplasma  tipis,  sel  granula  kecil (SGC) menunjukkan bentuk yang berbeda dan sitoplasma yang divakuolisasikan; sel granula besar (LGCs) menghadirkan sejumlah butiran bundar yang tersebar luas di sitoplasma
Penentuan Tipe Sel C. cainii dengan TEM
Data  morfologis  didapatkan berdasarkan  pengamatan  setidaknya dari 15 haemosit dari masing-masing tipe  (dikumpulkan  dari  3  hemolimfa marron).
Sel Hialin (HC) Sel-sel  hialin  bentuknya  tidak beraturan dan memiliki nukleus besar yang dikelilingi oleh lapisan sitoplasma  yang  tipis,  dan  dengan demikian mempunyai rasio N: C yang tinggi  (Gambar  3).  Hemosit  terkecil yang  bersirkulasi  ini  memiliki  rasio
N:C  yang  lebih  tinggi  daripada  SGC dan  LGC.  Rasio  N:C  yang  tinggi berguna  untuk  identifikasi  mereka. Sel  hialin  memiliki  relatif  sedikit granula, berbentuk butiran bulat kecil di sitoplasma mereka. Butiran ini bisa dilihat  dengan  TEM  tetapi  tidak dengan  LM.  Inti  HC  bervariasi bentuknya, baik bentuk seperti ginjal atau  ovoid,  dengan  atau  tanpa nukleolus. Sitoplasma memiliki poliribosom  yang  bebas,  retikulum endoplasma kasar dan sedikit (hingga 20  per  bagian  sel),  vesikel  padat elektron kecil berdiameter sekitar 0,3 μm.
Gambar 3. Mikrograf transmisi  elektron dari hemosit Cherax cainii menunjukkan sel-sel hialin (HC). EDG, butiran padat elektron;  N, nukleus; V, vakuola dan M, mitokondria. Butiran hadir dalam hemosit hialin meskipun tidak banyak. Bar, 2 μm (a, b)
Sel Granulosa Kecil (SGC) Sel granula kecil juga mempunyai bentuk yang tidak beraturan. Mereka secara khas menampilkan banyak butiran elektron padat,  butiran  bulat  kecil  atau  bulat telur  dalam  jumlah  sitoplasma  yang relatif besar. Jumlah butiran elektron padat    lebih  sedikit  dibandingkan dengan LGC tetapi mengandung lebih banyak butiran daripada HC. Butiran masih  hanya  mengisi  kurang  dari  30 %  dari  ruang  sitoplasma.  Ukuran butiran  lebih  kecil  dari  butiran  LGC (lihat  di  bawah).  Nukleus  berbentuk bulat  atau  ginjal,  dengan  distribusi euchromatin yang lebih banyak. Ada banyak vakuola sitoplasma besar dan kecil, dan pseudopodia terus-menerus memanjang. Nukleus besar terletak di posisi sentral dengan profil polimorfik yang tidak teratur, kadang- kadang melengkung. Sitoplasma mempunyai  retikulum  endoplasma kasar yang berkembang dengan baik,
aparatus  Golgi,  dan  mitokondria kecil  (berdiameter  0,5  μm)  bulat
hingga  memanjang  dengan  krista tabular. SGC memiliki rasio N:C dua kali dari LGC (Gambar 4).
Gambar  4.  Mikrograf  transmisi    elektron  hemosit  dari Cherax  cainii yang menunjukkan tipe granula kecil (SGC). EDG, butiran padat elektron; N, nukleus; V,  vakuola;  RER,  retikulum  endoplasma  kasar;  G,  golgi  dan  M,  mitokondria;  P, pseudopodia. Bar, 2 μm (a, b)

## Sel Granula Besar (LGC)
Sel  granula  besar  berbentuk bulat  atau  bulat  telur  (Gambar  5). Mereka  dicirikan  dengan  butiran padat, besar, kurang struktur, tertutup membran elektron yang menunjukkan profil  butiran  seperti  bulat-oval dengan  diameter  maksimum  hingga 2,1 μm yang mengisi sebagian besar sitoplasma.  Butirannya  lebih  besar dari  pada  HC  dan  SGC,  dan jumlahnya  lebih  besar,  menempati lebih dari 50 % ruang sitoplasma. Sel bulat  atau  bulat  telur  ini  memiliki nukleus  yang  relatif  kecil,  dengan rasio  N:C  yang  relatif  rendah. Sitoplasma  dipenuhi  dengan  banyak butiran  besar  yang  kadang-kadang mengaburkan nukleus.  Ketika dilihat oleh  TEM,  nukleus  LGC  berbentuk ginjal  yang  menunjukkan  massa kromatin  terkondensasi  dan  nukleat bilobate.  Ada  lebih  sedikit  organel, tetapi  tampak  beberapa  vakuola sitoplasma  besar.  Pseudopodia  juga meluas ke pinggiran sel.
Gambar  5.  Mikrograf  transmisi  elektron  hemosit  dari Cherax  cainii yang menunjukkan tipe granula besar (LGC). EDG, butiran padat elektron; N, nukleus; V, vakuola dan M, mitokondria
Penentuan  hemosit  C.  cainii  dengan FCM Populasi hemosit berhasil dideteksi dengan sinyal hamburan ke depan (FSC), yang mengukur ukuran sel  relatif,  dibandingkan  hamburan samping  (SSC),  yang  mengukur granularitas  sel  dengan  plot  data melalui scatter  parameter  gating .
Tiga  bentukan  kluster  diamati  dalam hemogram  khas  FSC versus SSC (Gambar  6a). Gating digambar  di sekitar setiap bentukan kluster (Gambar 6b), yang sementara diklasifikasikan sebagai wilayah SGC (R1), LGC (R2) dan HC (R3) dalam satu  parameter  dot-plot  dalam  skala log.
Gambar  6.  Flow  sitogram  dari  hemosit Cherax  cainii .  (a)  Dot  plot  hamburan  ke depan  (FSC)  dalam  skala  linier  versus  hamburan  samping  (SSC)  dalam  skala logaritmik.  (B)  Dot  plot  FSC  dan  SSC  pada  hemosit  dari Cherax  cainii
menunjukkan  tiga  populasi  sel  diduga:  R1  (sel  granula  kecil),  R2  (sel  granula besar), dan R3 (sel hialin)
Karakteristik Morfometrik
Morfometrik Hemosit C. cainii
Berdasarkan pengamatan
dengan  TEM,  tiga  populasi  hemosit yang  jelas  sesuai  dengan  analisis berdasarkan LM dan FCM:HC, SGC dan  LGC.  Analisis  morfometrik
dilakukan pada hemosit untuk mengukur berbagai fitur seluler. Fitur tersebut  adalah  ukuran  sel,  ukuran inti, diameter butiran, jumlah butiran sitoplasma  per  sel  dan  rasio  N:C (Tabel 1).
Tabel 1. Analisis morfometrik fitur hemosit Cherax cainii . Tipe Hemosit Hialin Granula kecil Granula besar Temperatur 20 o C 30 o C 20 o C 30 o C 20 o C 30 o C Ukuran sel Panjang 11,5 (1,0) ab 9,1 (0,2) ab 13,4 (1,5) b 12,1 (0,6) b 13,7 (0,6) b 9,5 (0,3) a Lebar 8,9 (0,3) a 8,2 (0,1) a 8,5 (0,2) a 9,7 (0,8) a 11,1 (0,7) ab 8,1 (0,2) a Ukuran inti Panjang 7,7 (0,6) ac 6,5 (0,7) ac 6,6 (0,4) ac 6,3 (0,5) ac 3,9 (0,6) c 3,8 (0,2) c Lebar 5,5 (0,8) c 5,1 (0,5) c 4,6 (0,4) c 4,6 (0,5) c 3,1 (0,9) c 3,5 (0,04) c Diameter granula 0.3 (0.1) d - 1.0 (0.3) e 0,5 (0,3) d - 2,1 (0,3) f 0,3 (0,2) d - 1,8 (0,9) f 0,3 (0,1) d - 1,4 (0,4) e 0,3 (0,2) d - 2,0 (0,3) f 0,4 (0,3) d - 2,1 (1,3) f Jumlah granula 19 (2.5) g 17 (2,7) g 29 (1,0) h 33 (2,3) h 36 (2,8) h 33 (2,2) h Rasio N:C 45.2 (2.7) i 40,5 (2,4) i 28,3 (0,8) j 25,2 (0,9) j 12,2 (2,6) k 17,3 (1,0) k
Keterangan:  Pengukuran  mewakili  rata-rata  (±  kesalahan  standar).  Ukuran  sel  dan  inti  disajikan dalam panjang x lebar (μm). Diameter butiran adalah dalam μm. Jumlah butiran adalah jumlah  per  bagian  sel.  Rasio  N:  C  dalam  persen.  Semua  data  morfometrik  di  atas didasarkan  pada  pengamatan  TEM  dari  setidaknya  15  hemosit  setiap  tipenya (dikumpulkan dari 3 ekor marron) pada suhu yang berbeda. Data dalam kolom yang sama  yang  memiliki  huruf  superskrip  yang  sama  menunjukkan  rata-rata  yang  sama yang tidak berbeda secara signifikan (α=0,05) Beberapa fitur morfologis
bervariasi  antara  jenis  hemosit  dan juga dipengaruhi oleh suhu. Sel hialin adalah  sel  terkecil  dibandingkan dengan SGC dan LGC. Tidak terdapat perbedaan  yang  nyata  dalam  ukuran sel  antara  SGC  dan  LGC,  baik  pada 20  atau  30 o C.  Terdapat  tren penurunan ukuran sel pada suhu yang lebih tinggi tetapi ini hanya signifikan untuk  populasi  LGC.  Sel-sel  hialin memiliki rasio N:C tertinggi sementara  LGC  memiliki  rasio  N:C terendah dan juga memiliki inti yang jauh lebih kecil dibandingkan HC dan SGC. Tidak terdapat perbedaan yang nyata  dalam  ukuran  granula  antara ketiga  jenis  hemosit  tetapi  LGC  dan SGC  memiliki  granula  bulat  kecil
yang  melimpah,  jumlah  yang  jauh lebih besar daripada HC.
Jumlah Total dan Diferensiasi
Hemosit Tiga ekor marron diadaptasikan selama  2  minggu  pada  suhu  yang berbeda  (20,  25  dan  30  °C)  dan hemolimfanya diambil untuk dihitung jumlah  total  hemosit  (THC)  dan jumlah  diferensial  haemosit    (DHC) menggunakan  FCM.  Jumlah  total hemosit  dalam C.  cainii meningkat pada suhu yang lebih tinggi, naik dari 1,9 juta per ml pada 20 °C menjadi 4,9 juta per ml pada 30 °C (Tabel 2). Sel- sel  granula  besar  meningkat  secara tidak proporsional ketika THC meningkat  dengan  suhu,  dan  kedua
tipe  lainnya  mengalami  penurunan sebagai  akibatnya.  Namun,  hemosit yang  paling  melimpah  pada  ketiga
suhu  adalah  HC,  diikuti  oleh  SGC, dengan  LGC  yang  paling  sedikit terwakili dalam jumlah.
Tabel 2. Jumlah total hemosit (THC) dari Cherax cainii pada suhu yang berbeda.
Temperatur ( o C) THC (x 10 6 sel/ml) HC (%) SGC (%) LGC (%) 20 1.978 (0,4) a 43,6 (0,6) a 37,5 (0,5) ab 18,9 (0,9) c 25 2.869 (0,5) ab 43,2 (1,1) a 34,3 (0,4) bc 22,5 (1,3) c 30 4.924 (0,7) b 40,8 (0,9) a 33,0 (1,6) bc 26,2 (2,7) bc
Keterangan:  Pengukuran mewakili rata-rata (dikumpulkan dari 3 ekor marron) ± kesalahan standar. Data ini diperoleh dengan FCM. Data dalam kolom yang sama yang memiliki huruf superskrip  yang  sama  menunjukkan  rata-rata  yang  sama  yang  tidak  berbeda  secara signifikan (α=0,05)
Diskusi Penelitian ini menyelidiki mengenai morfologi, jumlah total dan diferensial  sel  hemosit  pada  marron.
Hanya  sedikit  perhatian  yang  telah diberikan pada hemosit C. cainii jika dibandingkan dengan krustasea lainnya. Setelah menggunakan teknik
LM,  TEM  dan  FCM  untuk  melihat dan menganalisis hemosit dari spesies ini,  kami  mengelompokkan  mereka menjadi  tiga  jenis  sel.  Sel  hialin mengandung beberapa butiran sitoplasma  dan  SGC  mengandung sejumlah  granula  kecil.  LGC  diisi dengan  granula  besar.  Bauchau (1981)  mengenali  jenis  sel  berikut dari berbagai krustasea dan meninjaunya  sebagai  berikut:  1)  HC dengan  tidak  ada  atau  hanya  satu tubuh Golgi dan tidak ada atau sedikit granula  kecil;  2)  SGC  dengan  satu atau  lebih  tubuh  Golgi  dan  sejumlah sedang  granula  kecil;  dan  3)  sel granula  dengan  tidak  ada  atau  hanya satu tubuh Golgi dan banyak granula besar.  Kami  telah  menggunakan klasifikasi  yang sama, dan meskipun hanya  didasarkan  pada  tidak  adanya atau  keberadaan  granula  dan  ukuran relatifnya,    hal  itu  memungkinkan untuk mengidentifikasi hemosit secara konsisten dengan
menggunakan  LM,  TEM  dan  FCM (juga  menggunakan  ukuran  sel). Sistem  ini  telah  digunakan  dalam banyak  studi  haemosit  krustasea  dan tidak  tunduk  pada  variasi  prosedural dan/atau interpretasi subjektif (Giulianini, et  al .,  2007;  Sung et  al .,
2002).
Banyak skema klasifikasi  telah menetapkan  signifikansi  yang  sama atau  lebih  banyak  pada  beberapa karakteristik, misalnya ukuran, struktur,  atau  fitur  pewarnaan  sel. Pada  udang  karang,  dan  udang- udangan  lainnya,  perbedaan  ukuran sel tidak signifikan untuk penggunaan praktis.  Struktur  sel  juga  merupakan dasar  yang  tidak  mencukupi  untuk melakukan klasifikasi hemosit, karena  sebagian  besar  sel  adalah ovoid secara in vivo, dan strukturnya cepat  berubah secara in  vitro dengan menggunakan  pemanjangan  filipodia dan  lamellipodia  (Johnson,  1987). Dalam  penelitian  lain,  Dall  (1964) menggunakan perbedaan dalam bentuk sel hemosit udang ( Metapenaeus mastersii ) untuk
membedakan  jenis  sel:  limfosit, thigmocytes,  dan  amoebosit  granula besar    yang  mirip  dengan  HC,  SGC, dan  LGC.  Variasi  dalam  struktur hemosit  mungkin  disebabkan  karena
sel  yang  diperiksa  tanpa  fiksasi sebelumnya.  Kejadian  pseudopodia dalam dua jenis sel terakhir menunjukkan  bahwa  mereka  telah mulai  memanjang,  karena  hemosit krustasea  lain  juga  telah  diketahui untuk  melakukan  fillipodia  dan pseudopodia, sementara mereka berada  di  dalam  substrat.  Karena kekurangan dari penentuan
karakteristik secara tradisional  (yaitu ukuran  sel,  bentuk,  dan  karakteristik pewarnaan)  untuk  mengklasifikasi- kan  hemosit,  kami  menganggap bahwa  klasifikasi  hemosit  menjadi tiga  jenis  hanya  berdasarkan  pada tidak  adanya  atau  keberadaan  dan ukuran granula relatif menjadi
klasifikasi  yang  paling  mudah  dan konsisten yang saat ini ada.
Hemosit C.  cainii dan  fitur-
fiturnya  yang  berbeda  dapat  diamati dengan jelas menggunakan
mikroskop  cahaya  standar.  Sel-sel hialin  tidak  memiliki  granula  yang jelas,  sementara  SGC  memiliki sedikit granula kecil yang tidak dapat dibiaskan, dan LGC memiliki banyak butiran  besar  yang  sangat  mudah dibiaskan  yang  sering  menutupi nukleus.  Namun,  Ashton-Alcox  & Ford  (1998)  menjelaskan  bahwa cukup sulit untuk menghitung jumlah granula  dengan  mikroskop  cahaya. Selain  itu,  Martin  &  Graves  (1985) menjelaskan bahwa identifikasi beberapa  fitur  menggunakan  metode pewarnaan standar, seperti pewarnaan dengan  Wright,  haematoxylin  dan eosin,  yang  umumnya  digunakan untuk mewarnai sel plasma vertebrata dengan sukses, adalah tidak
informatif  karena  mereka  seringkali tersembunyi atau tidak tepat, seringkali  tidak  dapat  diproduksi ulang oleh peneliti lain dan akhirnya,
tidak  menggunakan  perangkat  yang memungkinkan  untuk  melakukan diferensiasi  beberapa  granula  pada fase  pematangan  yang  berbeda  dan fungsi fisiologis yang berbeda. Selain itu, ketika pewarnaan tersebut diimplementasikan  pada  teknik  ulas hemolimfa,  struktur  sel  menjadi sangat  rusak.  Pada  kenyataannya, kami  juga  berusaha  menggunakan pewarnaan  Wright  Giemsa  dengan sedikit  keberhasilan  (data  tidak ditampilkan).
Tiga  kategori  hemosit  juga dapat diidentifikasi dengan menggunakan  TEM.  Keberhasilan metode  ini  tergantung  pada  proses fiksasi sel yang akan diperiksa setelah dikeluarkan dari tubuh udang karang.
Hal ini penting karena dapat membuatnya  lebih  mudah  untuk membedakan sel-sel  hemolimfa yang bersirkulasi dari perubahan
morfologis sel yang bereaksi terhadap inisiasi pembekuan darah atau karena kehadiran partikel asing, misal jarum suntik atau kaca penutup. Data dalam penelitian ini merupakan catatan dari penggunaan TEM untuk pertama kali terhadap  populasi  hemosit C.  cainii .
Meskipun  memerlukan  pengorbanan waktu  dan  tenaga  yang  besar,  TEM adalah teknik penting untuk investigasi  respon  seluler  terhadap parameter  lingkungan  dan  untuk memantau fitur yang berbeda dari sel invertebrata.  Dalam  studi  mengenai korelasi garis keturunan dari tiga jenis hemosit  pada  udang  Penaeid  dan Palaemonid,  data  TEM  memberikan klasifikasi  yang  lebih  detil  dari pematangan hemosit, meskipun hasilnya masih tetap menjadi pertanyaan terbuka (Martin & Graves, 1985; Tsing et al ., 1989). Menggunakan TEM, hemosit
granular  yang  jarang  diamati  dan telah  berhasil  diamati  dalam  kasus yang  tidak  biasa  (hanya  terlihat  di beberapa  bagian  lintas  sel  yang sama).  Johnson  (1987)  mengakui bahwa  morfologi  hemosit  krustasea berubah dengan cepat, dan membuatnya tampak sebagai tambahan  kategori  sel.  Tiga  jenis hemosit dari kepiting C. sapidus telah diidentifikasi  dengan  menggunakan TEM sebagai HC, semi granular dan sel  granular  (Bodammer,  1978). Penulis  tersebut  menemukan  bahwa ada  beberapa  granula  kecil  dan peralatan  Golgi  yang  berkembang dengan  baik  di  HC,  dan  menduga bahwa mereka tidak dapat menemukan sel tanpa granula kemungkinan  karena  jumlah  mereka yang  relatif  rendah  dan  sifat  labil mereka. Hearing and Vernick (1967) juga  tidak  dapat  menemukan  sel-sel agranular  dalam  hemosit  lobster dengan menggunakan TEM, meskipun  mereka  mengidentifikasi tiga  kategori  hemosit  yang  masing- masing memiliki granula.
Sedikit  yang  diketahui  tentang penggunaan FCM untuk menganalisa hemosit  dari C.  cainii ,  meskipun teknik ini lebih cepat dan menyediakan  data  yang  lebih  akurat dan  kuantitatif.  Dalam  banyak  hal, FCM  telah  menggantikan  evaluasi secara mikroskopis karena ia menawarkan kemampuan secara cepat dan simultan untuk membedakan populasi seluler berdasarkan berbagai variabel, seperti ukuran relatif, kompleksitas /
granularitas  dan  sifat  fluoresen (Shapiro, 2003; Bakke, 2000). Namun, Ford et al . (1994)
menjelaskan  bahwa  persentase  sel dalam  hemosit  dari  masing-masing
tiram  berubah  dua  hingga  lima  kali lipat  dengan  menggunakan  FCM. Terlepas dari ketidakkonsistenan dalam  beberapa  penelitian,  dalam penelitian  ini  kami  memverifikasi bahwa  FCM  dengan  dua  parameter sederhana,  FSC  dan  SSC,  dapat secara  efektif  menentukan  populasi hemosit C. cainii . Pengumpulan data hamburan samping pada skala logaritmik  yang  merupakan  indikasi bahwa dibutuhkan lebih banyak daya untuk  mengukur  kisaran  granularitas yang luas di antara populasi hemosit. Shapiro  (1995)  menemukan  tiga faktor,  selain  ukuran  sel,  yang  dapat mempengaruhi pengukuran data hamburan  ke  depan:  perbedaan indeks  bias  antara  sel  dan  media suspensi;  keberadaan  material,  di dalam  atau  di  atas  sel,  dengan penyerapan  yang  kuat  pada  panjang gelombang iluminasi yang
digunakan;  dan  struktur  internal  sel. Beberapa  struktur  internal,  misalnya granula  atau  vakuola,  memiliki kecenderungan  untuk  menurunkan penyebaran  cahaya  ke  depan;  untuk alasan itu sel-sel dengan ukuran lebih besar  ditempatkan  dekat  sumbu. Dalam  penelitian  ini,  menggunakan FCM,  kami  dapat  dengan  jelas mengidentifikasi  3  populasi  sel haemosit C.  caini :  LGC,  yang memiliki  ukuran  sel  dan  jumlah granula  terbesar  (dalam  R2);  SGC yang berukuran sedang dan memiliki jumlah  granula  yang  lebih  kecil (dalam  R1);  dan  HC,  yang  memiliki ukuran  sel  terkecil  dan  kompleksitas paling  kecil  (dalam  R3).  Sebagai perbandingan,
sulit untuk
membedakan  antara  SGC  dan  LGC dari C. cainii berdasarkan ukuran dan karakteristik  morfologisnya  dengan penyelidikan  mikroskopis  cahaya,
karena  mereka  sangat  mirip.  Namun sel-sel  ini  dapat  dengan  mudah dibedakan menggunakan FCM.  Xian et al . (2009) menggunakan FCM pada hemosit  udang  penaeid, Litopenaeus vannamei ,  dan  memiliki  hasil  yang serupa  dengan  hasil  penelitian  kami ini.  Begitu  juga  Comesana et  al . (2012), yang menunjukkan kesamaan sub-populasi  hemosit  untuk  tiram datar Ostrea  edulis dengan  populasi hemosit yang telah kami tunjukkan di sini untuk C. cainii . Di tangan kami, analisis  FCM  adalah  teknik  yang lebih  disukai  untuk  mengidentifikasi populasi  hemosit C.  cainii ,  dan  oleh karena  itu  memungkinkan  evaluasi terhadap  perubahan  dalam  proporsi relatif  dari  tipe-tipe  hemosit  ini, tentunya  lebih  unggul  daripada  LM dan TEM.
Jumlah  total  hemosit  (THC) adalah metode praktis untuk mengevaluasi status
fisiologis krustasea. Namun, ada berbagai nilai THC  yang  telah  disampaikan  tetapi karena skema klasifikasi  dan metode yang  digunakan  berbeda  yang  mana adalah tidak
memungkinkan melakukan  perbandingan  informatif antara  berbagai  krustasea.  Faktor lingkungan seperti suhu dan salinitas juga mempengaruhi THC pada tiram
Crassostrea virginica in vivo (Oliver & Fisher, 1995). Setelah
mengadaptasikan  marron  pada  suhu yang  berbeda  selama  dua  minggu, kami  telah  menunjukkan  bahwa terjadi  perubahan  yang  mencolok pada  THC,  dengan  suhu  30  ⁰C  yang menaikkan  jumlahnya  lebih  dari  dua kali lipat. Alvarez et al .  (1989); Chu &  La  Peyre,  (1993);  dan  Hégaret, (2003) mengemukakan bahwa suhu di atas tingkat tertentu dapat
mengakibatkan  kondisi  stres  pada
hemosit  tiram,  sebagai  akibat  dari mereka  yang  kurang  reaktif.  Selain itu, kapasitas penyaringan dan aktivitas  metabolisme  dari  kerang Mediterania Chamelea gallina berkurang secara dramatis pada suhu di bawah 10 °C atau lebih dari 30 °C (Ramon & Richardson, 1992). Perbedaan  THC  dalam  krustasea tidak hanya disebabkan karena perbedaan  suhu  atau  salinitas  tetapi juga  dapat  disebabkan  oleh  faktor- faktor lain seperti ketersediaan makanan,  jenis  kelamin,  diet,  lama pemeliharaan dan tahap siklus molting (Stewart et al ., 1967; Tsing et al ., 1989; Baldaia et al ., 1984; Cuzin- Roudy et  al .,  1989;  Sequeira et  al .,
1995). Melalui penggunaan FCM, jumlah  diferensial  hemosit    (DHC) untuk C.  cainii menunjukkan  bahwa HC adalah sel yang paling melimpah, diikuti  oleh  SGC  dan  LGC  yang paling sedikit jumlahnya.
Peningkatan suhu dari 20 menjadi 30 o C  menghasilkan  perubahan  yang kecil namun signifikan, serta terbalik pada  angka  SGC  dan  LGC.  Variasi dalam DHC telah ditemukan di antara spesies  krustasea  yang  dipengaruhi oleh  faktor  intrinsiknya  (yaitu  jenis kelamin  dan  tahap  siklus moulting ) dan  faktor  ekstrinsik  (yaitu  faktor lingkungan, diet, dan panjang penangkaran) (Lorenzon et al ., 1999). Dari  pengamatan  mikroskopis  dan
FCM sebelumnya, HC adalah hemosit yang  paling  banyak  pada  beberapa spesies Penaeid (77 –  89%),
(LeMoullac et  al .,  1997;  Owens  & O'Neill,  1997)  dan  hemosit  tiram timur, Crassostrea virginica (Ford et al .,  1994;  Ashton-Alcox  &  Ford,
1998).  Cardenas et  al .  (2000)  juga menemukan bahwa hasil dari
pengamatan  dengan  mikroskop  dan FCM  menunjukkan  pola  distribusi yang  sama  di  antara  jenis  sel, meskipun nilai HC dari FCM sekitar 10 % lebih rendah. Smith & Soderhall
(1983),  menemukan  dari  hemosit monolayer  lobster  air  tawar Astacus astacus dengan pengamatan mikroskop  terdiri  dari  semi-granular
 50 % (setara dengan SGC), granular
 30 % (setara dengan LGC), dan HC
 20 %. Demikian pula, populasi tipe hemosit L.  vannamei yang  diamati menggunakan  TEM  terdiri  dari  SGC sebagai  jenis  yang  paling  melimpah, diikuti  oleh  HC  dan  LGC  (Heng  & Wang,  1998).  Sequeira et  al .  (1995) dan  Owens  &  O'Neill  (1997), menunjukkan hasil yang bertentangan dengan  beberapa  laporan  lainnya, menemukan bahwa granulosit (9 – 13 %)  lebih  banyak  daripada  semi- granulosit  (2  %),  yang  mirip  dengan laporan  lain  (Ford et  al .  ,  1994; Ashton-Alcox  &  Ford,  1998).  Amen et  al .  (1992)  tidak  menemukan indikasi adanya jenis sel yang berbeda pada  hemosit  siput Lymnaea stagnalis dengan menggunakan FCM.

## Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, kami telah menunjukkan, melalui beberapa teknik,  bahwa  hemosit  dari C.  cainii
dapat  diklasifikasikan menjadi  3 tipe populasi  yang  konsisten  dengan krustasea  lain.  Perbedaan  jumlah hemosit untuk C. cainii mengungkapkan  bahwa  HC  adalah sel  yang  paling  melimpah,  diikuti oleh SGC dengan LGC. Oleh karena itu,  DHC  dapat  digunakan  untuk mengevaluasi perubahan relatif dalam populasi  hemosit karena  faktor lingkungan yang dapat
mempengaruhi  sistem  imunologis mereka. Untuk dapat membandingkan antara spesies krustasea  yang  berbeda,  terdapat kebutuhan untuk menggunakan teknik yang standar. Skema
klasifikasi  yang  kami  sampaikan dalam  penelitian  ini  menawarkan metode yang mudah dan praktis untuk mengkarakterisasi  hemosit C.  cainii dan  juga  sesuai  dengan  penelitian terkini  tentang  hemosit  di  krustasea lain. Klasifikasi yang diusulkan akan bermanfaat  untuk  pengembangan lebih  lanjut,  kemungkinan  juga termasuk  untuk  parameter  lain  yang dapat  memberikan  informasi  lebih lanjut  tentang  tahap  perkembangan dan  pematangan  hemosit  serta  untuk mengevaluasi fungsi fisiologis mereka.

## Daftar Pustaka
Alvarez, M. R., Friedl, F.E., Johnson, J.S.  and  Hinsch,  G.W.  (1989). "Factors affecting in vitro phagocytosis by oyster hemocytes." Journal of Invertebrate Pathology , 54(2): 233
– 241.
Amen, R. I., Aten, J.A., Baggen, J.M.,
Meuleman,  E.A.,  de  Lange-de Klerk, E.S. and Sminia, T. (1992). " Trichobilharzia ocellata in Lymnaea stagnalis : a flow cytometric  approach  to  study  its effects  on  hemocytes."  Journal  of Invertebrate  Pathology 59 (1):  95- 98.
Ashton-Alcox,  K.  A.  and  Ford,  S.E. (1998).  "Variability  in  molluscan hemocytes:  a  flow  cytometric study."  Tissue &  Cell 30 (2):  195- 204.
Bakke,  A.  C.  (2000).  "Clinical applications  of  flow  cytometry." Laboratory  Medicine  31(2):  97- 102.
Baldaia,  L.,  Porcheron,  P.,  Coimbra,
J. and Cassier, P. (1984). "Ecdysteroids in the shrimp Palaemon  serratus :  relations  with molt cycle." General and Comparative Endocrinology 55 (3): 437-443. Bauchau, A.G. (1981). "Crustaceans". In Invertebrate
Blood Cells. Vol.2 (Eds. Ratcliffe, N.A. and A.F. Rowley). Academic Press. Sidney. pp. 385-420. Bodammer, J. E. (1978). "Cytological observations  on  the  blood  and hemopoietic  tissue  in  the  crab, Callinectes  sapidus .  I.  The  fine structure  of  hemocytes  from intermolt  animals."  Cell  and Tissue Research 187 (1): 79-96.
Cardenas,  W.,  Jenkins,  J.A.  and Dankert,  J.R.  (2000).  "A  flow cytometric  approach  to  the  study of  crustacean  cellular  immunity." Journal  of  Invertebrate  Pathology
76 (2): 112-119.
Chen,  J.  C.  (1995).  "Survival, hemolymph  osmolality  and  tissue water of Penaeus chinensis juveniles  acclimated  to  different salinity  and  temperature  levels." Comparative  Biochemistry  and Physiology a-Molecular & Integrative  Physiology  110(3): 253-258. Chu,  F.  L.  E.  and  Lapeyre,  J.F.
(1993).
"Perkinsus-Marinus susceptibility  and  defense-related activities in eastern oysters Crassostrea virginica - temperature  effects."  Diseases  of Aquatic  Organisms  16(3):  223- 234. Comesana, P., Casas, S.M.,  Cao, A., Abollo,  E.,  Arzul,  I.,  Morga,  B. and Villalba, A. (2012). "Comparison of haemocytic parameters  among  flat  oyster Ostrea edulis stocks with different susceptibility  to  bonamiosis  and the  Pacific  oyster Crassostrea gigas ."  Journal  of  Invertebrate
Pathology 109 (3): 274-286. Cuzin-Roudy, J., Strambi, C., Strambi,  A.  and  Delbecque,  J.P. (1989). "Hemolymph ecdysteroids and  molt  cycle  in  males  and females of Siriella armata m. edw.
(Crustacea:  Mysidacea):  possible control by the MI-ME X-organ of the eyestalk." General and Comparative Endocrinology 74 (1): 96-109. Dall,  W.  (1964).  "Studies  on  the physiology of a shrimp, Metapenaeus  mastersii (Haswell) (Crustacea: Decapoda: Penaeidae)". Australian Journal of Freshwater  Resources  15:  145- 161.
Ding, Z., Du, J.,  Ou, J-T., Li, W., Wu, T.,  Xiu, Y., Meng, Q.G., Ren, Q., Gu,  W.,    Xue,  H.,  Tang,  J-Q., Wang,  W.  (2012).  "Classification of circulating hemocytes from the red  swamp  crayfish Procambarus clarkii and  their  susceptibility  to the  novel  pathogen Spiroplasma eriocheiris  in  vitro ."  Aquaculture
356-357 : 371-380.
Eddy,  F.,  Powell,  A.,  Gregory,  S., Nunan,  L.M.,  Lightner,  D.V.,
Dyson,  P.J.,  Rowley,  A.J.  and, Shields,  R.J.  (2007).  "A  novel bacterial  disease  of  the  European shore  crab, Carcinus  maenas molecular pathology and epidemiology." Microbiology 153(Pt 9): 2839-2849.
Ford,  S.  E.,  Ashtonalcox,  K.A.  and Kanaley, S.A. (1994). "Comparative cytometric and microscopic  analyses  of  oyster hemocytes." Journal of Invertebrate Pathology 64 (2): 114- 122. Giulianini, P. G., Bierti, M., Lorenzon,  S.,  Battistella,  S.  and Ferrero, E.A. (2007). "Ultrastructural  and  functional characterization of circulating hemocytes  from  the  freshwater crayfish Astacus  leptodactylus : cell  types  and  their  role  after  in vivo artificial non-self challenge." Micron 38(1): 49-57.
Hearing, V. and Vernick, S.H. (1967). "Fine structure of the blood cells of the lobster, Homarus americanus ". Chesapeake  Science  8  (3):  170- 186.
Hégaret,  H.,  Wikfors,  G.H.  and Soudant, P. (2003). "Flow cytometric analysis of haemocytes from  eastern  oysters, Crassostrea virginica ,  subjected  to  a  sudden temperature elevation. II. Haemocyte functions: aggregation, viability, phagocytosis, and respiratory burst."  Journal  of  Experimental
Marine  Biology  and  Ecology 293 (2): 249-265.
Heng,  L.  and  Wang,  L.  (1998).  "On the ultrastructure and classification of  the  hemocytes  of  penaeid shrimp, Penaeus vannamei (Crustacea,  Decapoda)".  Chinese Journal of Oceanology and Limnology 16: 333-338.
Hennig,  O.  L.  and  Andreatta,  E.R. (1998).  "Effect  of  temperature  in an  intensive  nursery  system  for Penaeus paulensis (Perez Farfante,
1967)."  Aquaculture  164(1-4):
167-172.
Hose, J. E., Martin, G.G. and  Gerard,
A.S. (1990). "A decapod hemocyte classification  scheme  integrating morphology,  cytochemistry,  and function." Biological Bulletin 178 (1): 33-45. Johnson,  P.  T.  (1987).  "A  review  of fixed  phagocytic  and  pinocytotic cells of decapod crustaceans, with remarks on hemocytes." Developmental  &  Comparative Immunology 11 (4): 679-704.
Iwanaga,  S.  (2002).  "The  molecular basis  of  innate  immunity  in  the horseshoe  crab."  Current  Opinion in Immunology 14(1): 87-95.
Le  Moullac,  G.,  LeGroumellec,  M.,
Ansquer,  D.,  Froissard,  S.  and Levy,  P.  (1997).  "Haematological and phenoloxidase activity changes  in  the  shrimp Penaeus stylirostris in  relation  with  the moult  cycle:  protection  against vibriosis." Fish & Shellfish Immunology 7 (4): 227-234.
Le  Moullac,  G.  and  Haffner,  P.
(2000).  "Environmental  factors affecting  immune  responses  in Crustacea." Aquaculture 191 (1-3): 121-131.
Lorenzon, S., de Guarrini, S., Smith,
V.J.  and  Ferrero,  E.A.  (1999). "Effects  of  LPS  injection  on circulating haemocytes in crustaceans in  vivo ."  Fish  & Shellfish Immunology 9 (1): 31-50.
Martin,  G.  G.  and  Graves,  B.L. (1985). "Fine-structure and classification of shrimp hemocytes." Journal of Morphology 185 (3): 339-348.
Oliver, L. M. and Fisher, W.S. (1995). "Comparative  Form  and  Function of  Oyster  Crassostrea-Virginica
Hemocytes  from  Chesapeake  Bay (Virginia)  and  Apalachicola  Bay (Florida)."  Diseases  of  Aquatic Organisms 22 (3): 217-225.
Owens,  L.  and  O'Neill,  A.  (1997).
"Use  of  a  clinical  cell  flow cytometer for differential counts of prawn Penaeus monodon haemocytes." Diseases of Aquatic Organisms 31 (2): 147-153.
Ramon,  M.  and  Richardson,  C.A.
(1992).  "Age-determination  and shell  growth  of Chamelea  gallina (Bivalvia,  Veneridae)  in the Western  Mediterranean."  Marine Ecology Progress Series 89 (1): 15- 23. Sequeira, T., Vilanova, M., L.obodoCunha, A., Baldaia, L. and AralaChaves,  M.  (1995).  "Flow cytometric analysis of molt-related changes in hemocyte type in male and  female Penaeus  japonicus ." Biological  Bulletin 189 (3):  376- 380. Shapiro, H.M. (1995). "Practical flow cytometry". In: Shapiro, H.
(editor). Wiley-Liss: New York. p. 542.
Shapiro, H.M. (2003). "Practical flow cytometry". Wiley, Hoboken, New Jersey.
Smith, V. J. and Soderhall, K. (1983).
"Induction  of  degranulation  and lysis  of  haemocytes  in  the freshwater crayfish, Astacus astacus by  components  of  the prophenoloxidase activating system in  vitro ."  Cell  and  Tissue
Research 233 (2): 295-303.
Soderhall,  K.  and  Thornqvist,  P.O.
(1997).  "Crustacean  immunity--a short  review."  Developments  in Biological Standardization 90 : 45- 51.
Stewart,  J.E.,  Cornick,  J.W.  and Dingle, J.R. (1967). "An electronic  method  for  counting lobster ( Homarus americanus milne edwards) hemocytes and the influence  of  diet  on  hemocyte numbers and hemolymph proteins".  Canadian  Journal  of Zoology 45: 291-304. Sung, H. H. and Sun, R. (2002). "Use of  monoclonal antibodies  to classify  hemocyte  subpopulations of tiger shrimp ( Penaeus monodon )." Journal of Crustacean
Biology 22(2): 337-344. Tsing, A., Arcier, J.M. and Brehelin, M. (1989). "Hemocytes of penaeid and palaemonid shrimps - Morphology,  cyto-chemistry,  and hemograms." Journal of Invertebrate  Pathology 53 (1):  64- 77. Vargas-Albores, F. (1998). "Influence of temperature and salinity on the yellowleg shrimp, Penaeus californiensis Holmes, prophenoloxidase system." Aquaculture Research 29(8): 549- 553.
Vazquez, L., Alpuche, J., Maldonado, G., Agundis, C., Pereyra-Morales, A.  and  Zenteno,  E.  (2009).
"Review:  Immunity  mechanisms in  crustaceans."  Innate  Immunity 15(3): 179-188.
Xian,  J.-A.,  Wang,  A-L.,  Tian,  J-X., Huang, J-W., Ye, C-X., Wang, W-
N. and Sun, R-Y. (2009). "Morphologic,  physiological  and immunological changes of haemocytes from Litopenaeus vannamei treated by lipopolysaccharide."  Aquaculture 298 (1-2): 139-145.
Xue,  Q.  G.,  Renault,  T.  and Chilmonczyx,  S.  (2001).  "Flow
cytometric assessment of haemocyte  sub-populations  in  the European  flat  oyster, Ostrea
edulis ,  haemolymph."  Fish  &
Shellfish Immunology 11 (7): 557- 567. Zhang,  Z.  F.,  Shao,  M.  and  Kang,
K.H.  (2006).  "Classification  of haematopoietic cells and haemocytes  in  Chinese  prawn Fenneropenaeus  chinensis ."  Fish
&  Shellfish  Immunology 21 (2): 159-169.