## Pengayaan  Polifenol  Total  dari  Daun  Kadamba  Menggunakan  Metode Ekstraksi Berbantu Mikrowave Berbasis Pelarut Hijau
(Total Polyphenols Enrichment from Mitragyna speciosa Korth Havil Leaves Using Green Solvent Based Microwave-assisted Extraction Method)
Islamudin Ahmad 1* Andi Yusniah 1 , Yuspian Nur 2 , Wisnu Cahyo Prabowo 3 , Herman 1
1 Program Studi Sarjana (S1) Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Mulawarman, Samarinda, Kalimantan Timur, Indonesia.
2 Laboratorium Riset dan Pengembangan Kefarmasian “FARMAKA TROPIS”, Fakultas Farmasi, Universitas Mulawarman, Samarinda, Kalimantan Timur, Indonesia.
3 Program Studi Diploma Tiga (D3), Fakultas Farmasi, Universitas Mulawarman, Samarinda, Kalimantan Timur, Indonesia. *E-mail: islamudinahmad@farmasi.unmul.ac.id
Article Info: Received: 12 Maret 2020 in revised form: 21 September 2020 Accepted: 03 Oktober 2020 Available Online: 04 Oktober 2020

## ABSTRACT
The present study aims to optimize the natural deep eutectic solvent (NADES)  as  a  green  solvent-based  microwave-assisted  extraction (MAE) of total polyphenols content (TPC) from Mitragyna speciosa [Korth.]  Havil.  leaves  using  response  surface  methodology  (RSM). Preparation  of  natural  deep  eutectic  solvent  (NADES)  as  a  green solvent was performed by melting the two-component of malic acid and glucose using a magnetic stirrer. The leaves sample was extracted using  the  NADES-MAE  method  with  various  extraction  conditions with  four  factors  and  three  levels  (Box  Behnken  Design)  and optimized using RSM with licensed software of Design Expert V12. TPC was determined using a Folin-Ciocalteau reagent and absorbance was measured on a UV-VIS spectrophotometer at 770 nm and gallic acid  as  a  standard.  This  study  was  obtained  the  optimum  extraction conditions include: NADES ratio (malic acid: glucose) of 1:2 g/g, 50% microwave power, a solvent-sampel ratio of 12:1 mL/g, and extraction time for 7 minutes. The optimum conditions were obtained according to the equation formula: TPC = 165.17 – 33.97X 1 + 38.36X 2 – 6.08X 3 + 16.12X 4 – 62.77X 1 X 2 + 79.61X 1 2 X 2 , where a R 2 value = 0.7102 with a  TPC  prediction  of  402.087±43.81  mg  GAE/g  sample.  These conditions  can  be  used  to  extract  TPC  from  this  plant  efficiently, quickly, easily, and environmentally friendly.
Keywords : Box Behnken Design Mitragyna speciosa [Korth.] Havil. Natural Deep Eutectic Solvent Response Surface Methodology Total Polyphenols
Corresponding Author: Islamudin Ahmad Fakultas Farmasi Universitas Mulawarman Samarinda Indonesia email: islamudinahmad@farmasi.unmul.ac.id
Copyright © 2019 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.
How to cite (APA 6 th Style):
Ahmad,  I.,  Yusniah,  A.,  Nur,  Y.,  Prabowo,  W.C.,  Herman.  (2020).  Pengayaan  Polifenol  Total  dari  Daun  Kadamba Menggunakan Metode Ekstraksi Berbantu Mikrowave Berbasis Pelarut Hijau. Jurnal Farmasi Galenika :Galenika Journal of Pharmacy (e-Journal), 6 (2), 338-346. doi:10.22487/j24428744.2020.v6.i2.15035
Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmacy) (e-Journal) 2020; 6 (2): 338 – 346 ISSN : 2442-8744 (electronic); 2442-7284 (printed) Journal Homepage: https://bestjournal.untad.ac.id/index.php/Galenika DOI: 10.22487/j24428744.2020.v6.i2.15035

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh kondisi optimum dari metode ekstraksi berbantu microwave terhadap kadar polifenol  total dari  daun  Kadamba  ( Mitragyna speciosa [Korth.]  Havil.) menggunakan pelarut  hijau atau lebih dikenal Natural  Deep Eutectic Solvent (NADES) dengan komposisi  kombinasi  antara asam malat  dengan glukosa  yang  dianalisis  menggunakan Response  Surface  Methodology (RSM).  Preparasi  NADES  dengan  cara melebur kedua bahan (asam malat dan glukosa) menggunakan magnetic stirrer . Simplisia kering daun Kadamba diekstraksi menggunakan metode ekstraksi berbantu microwav e dengan NADES (asam sitrat dan glukosa) dengan berbagai  kondisi  ekstraksi  dengan  empat  faktor  dan  tiga  level  ( Box  Behnken  Design )  yang  dioptimasi menggunakan RSM dengan aplikasi perangkat lunak Design Expert versi 12 berlisensi. Penetapan kadar polifenol total dilakukan menggunakan reagen Folin-Ciocalteau dan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 770 nm dan asam galat sebagai standar. Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh kondisi  metode  ekstraksi  yang  optimum  meliputi:  konsentrasi  NADES  sebesar  1:2  g/g,  kekuatan microwave sebesar  50%,  rasio  sampel-pelarut  sebesar  12:1  mL/g,  dan  waktu  ekstraksi  selama  7  menit.  Kondisi  optimum tersebut  diperoleh  berdasarkan  persamaan:  Kadar  Polifenol  Total  =  165,17  –  33.97X 1 +  38,36X 2 –  6,08X 3 + 16,12X 4 – 62,77X 1 X 2 + 79,61X 1 2 X 2 (R 2 = 0,7102) dengan nilai kadar polifenol total prediksi sebesar 402,1 mg GAE/g  sampel.  Kondisi  ekstraksi  tersebut  digunakan  untuk  mengekstraksi  senyawa  polifenol  total  dari  daun Kadamba secara efisien, cepat, mudah, dan ramah lingkungan.
Kata kunci: Kadamba ( Mitragyna speciosa [Korth.] Havil), Kadar Polifenol Total, Natural Deep Eutectic Solvent , Response Surface Methodology .

## PENDAHULUAN
Eksplorasi  bahan  alam  telah  memberikan  inspirasi  bagi  sebagian  besar  dari  bahan  aktif  dalam  dunia pengobatan, penarikan atau pemisahan senyawa metabolit sekunder target sangat ditentukan oleh proses ekstraksi. Proses ekstraksi merupakan tahap awal dalam penelitian obat terutama yang berasal dari bahan alam. Ekstraksi metabolit sekunder dari bahan alam (terutama tanaman) dapat dilakukan menggunakan berbagai metode ekstraksi baik ekstraksi secara konvensional maupun non-konvensional (Azmir et al., 2013).
Salah satu faktor yang sangat berpengaruh terhadap proses ekstraksi metabolit sekunder dari bahan alam adalah pemilihan pelarut. Pada umumnya, pelarut organik yang digunakan pada proses ekstraksi seperti heksana, etil asetat, etanol, metanol, aseton, kloroform, dan petroleum eter. Penggunaan pelarut tersebut memiliki dampak buruk baik kepada operator/peneliti hingga lingkungan karena bersifat toksik, mudah menguap,  dan  mudah  terbakar  (Chemat et  al., 2012;  Chemat  dan  Vian,  2014).  Namun,  disisi  lain, pengembangan  pelarut  dengan pendekatan prinsip  kimia  hijau  atau green  chemistry terus  mengalami peningkatan beberapa tahun belakangan. Natural deep eutectic solvents (NADES) merupakan pelarut alternatif  potensial  untuk  menggantikan  pelarut  organik  konvensional  yang  memiliki  sifat  mudah menguap, mudah terbakar, dan toksik. Penggunaan NADES diharapkan dapat meminimalkan masalah lingkungan, meningkatkan keselamatan dan kesehatan, serta meminimalkan biaya. NADES merupakan campuran  dari  molekul  yang  bersifat hydrogen  bonding  acceptor (HBA)  yang  membentuk  ikatan hidrogen  antar  molekul  dengan  satu  atau  lebih  molekul hydrogen  bonding  donor (HBD),  sehingga mengurangi titik leleh campuran untuk suhu yang jauh lebih rendah daripada komponen masing-masing (Mulia et  al., 2019).  Beberapa  penelitian  telah  melaporkan  penggunaan  pelarut  hijau  untuk mengekstraksi senyawa metabolit sekunder target seperti  ekstraksi kafein dan total polifenol dari biji kopi (Ahmad, et.al, 2018), ekstraksi xanton dari manggis  (Mulia et al., 2019), ekstraksi alkaloid dan polifenol  dari Peumus  boldus (Torres-Vega et  al., 2020)  yang  menunjukkan  bahwa  hasil  ekstraksi menggunakan pelarut NADES lebih optimal dibandingkan menggunakan pelarut organik konvensional.
Salah  satu  tumbuhan  Kalimantan  Timur  yang  menarik  kami  jadikan  objek  penelitian  adalah  daun Kadamba  ( Mitragyna  speciosa [Korth.]  Havil).  Tumbuhan  ini  merupakan  tumbuhan  endemik  Asia Tenggara  yang  banyak  ditemukan  di  Malaysia,  Myanmar,  Thailand,  Papua  Nugini,  dan  Indonesia
(terutama  di  Kalimantan)  (Brown et  al., 2017).  Secara  tradisional,  bagian  daun  dari  tumbuhan  ini dipercaya  masyarakat  memiliki  khasiat  seperti  mengatasi  nyeri  otot,  mengatasi  depresi,  obat kuat/perangsang,  batuk,  diare,  dan  diabetes  (Singh et  al., 2016;  Raini,  2017).  Telah  dilaporkan  pula bahwa daun Kadamba mengandung senyawa metabolit sekunder berupa flavonoid, terpenoid, polifenol, glikosida,  dan  alkaloid  sebagai  senyawa  mayor  (mengandung  40  jenis  alkaloid  terutama  mitraginin) (Ikhwan et al. , 2018). Sejauh ini, penggunaan metode ekstraksi non-konvensional untuk proses ekstraksi metabolit sekunder target dari daun Kadamba pernah dilaporkan oleh (Orio et al., 2012). Akan tetapi, optimasi metode ekstraksi berbantu microwave dengan pelarut hijau terhadap kadar polifenol total dari daun Kadamba belum pernah dilaporkan.
Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  dan  memperoleh  kondisi  optimum  dari metode  ekstraksi  berbantu microwave berbasis  NADES  dengan  komposisi  asam  malat  dan  glukosa terhadap kadar polifenol total dari daun Kadamba menggunakan response surface methodology (RSM).

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  yaitu  spektrofotometer  UV-VIS  (Shimadzu,  Jepang), mikropipet, microwave rumahan 900 Watt (Modena, USA), Design Expert v12 berlisensi, dan peralatan gelas  lainnya.  Bahan-bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  antara  lain;  asam  malat  (CV. Chlorogreen),  glukosa  (CV.  Chlorogreen),  reagen  Folin-Ciocalteau  (Sigma-Aldrich),  asam  galat (Sigma-Aldrich),  aquadest  (Brataco),  dan  natrium  karbonat  (Sigma-Aldrich).  Simplisia  kering  daun Kadamba  yang  diperoleh  dari  Melak  Kabupaten  Kutai  Barat  (sampel  tersebut  di  determinasi  di Laboratorium Dendrologi, Fakultas Kehutanan, Universitas Mulawarman). Pengambilan sampel segar dilakukan  pada  bulan  Mei  2019.  Setelah  disertasi  dan  di  cuci,  sampel  kemudian  dikeringkan menggunakan lemari pengering selama 3 kalo 24 jam. Sampel kering yang diperoleh kemudian disortasi kembali dan selanjutnya dibuat dalam bentuk haksel (atau potongan kecil-kecil).

## Metode

## Preparasi NADES
Komponen NADES sebagai pelarut hijau ditimbang dengan perbandingan asam malat dan glukosa yang sesuai dengan rancangan desain eksperimental (Wang, et al., 2018) yaitu dengan rasio 1:2, 1:3, dan 1:4 g/g. Kedua bahan  dilebur pada  suhu  70-80 o C  kemudian ditambahkan  aquades,  selanjutnya  dilakukan pengadukan dengan menggunakan hotplate stirrer pada suhu 50 o C pada kecepatan 500 rpm selama ±60 menit,  kemudian  di  saring  hingga  diperoleh  larutan  yang  homogen.  Larutan  tersebut  disimpan  pada wadah botol yang tertutup hingga digunakan.

## Proses Ekstraksi
Proses  ekstraksi  dilakukan  menggunakan  metode  ekstraksi  berbantu microwave dengan  komposisi NADES  asam  malat  dan  glukosa  yang  telah  dilebur  dalam  bentuk  larutan  sebagai  pelarut  hijau menggunakan  berbagai  kondisi  ekstraksi  berdasarkan  literatur  (Ahmad, et  al., 2017a;  Gómez et  al., 2019; González et al., 2018). Serbuk kering sampel ditimbang sebanyak 2 g kemudian dicampur dengan pelarut NADES kemudian diekstraksi dengan menggunakan metode ekstraksi berbantu microwave yang beroperasi  dalam  berbagai  kondisi  seperti  pada  Tabel  1.  Residu  dan  ekstrak  kemudian  dipisahkan dengan menggunakan penyaring dan dinginkan pada suhu kamar.

## Penentuan Kadar Polifenol Total
Penentuan kada polifenol total dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-VIS dengan reagen Folin- Ciocalteau yang  diukur  pada  panjang  gelombang  770  nm  dengan  mengacu  pada  beberapa  literatur
(Bobo-García et al., 2014; Ainsworth dan Gillespie, 2007; Sanchez-Rangel et al., 2013). Secara ringkas, sebanyak  1  mL  sampel  uji  dan  atau  larutan  standar  dimasukkan  kedalam  tabung  reaksi  kemudian ditambahkan  0,5  mL  larutan  encer Folin-Ciocalteau ,  dihomogenkan,  dan  didiamkan  selama  5  menit kemudian ditambahkan 2 mL natrium karbonat, selanjutnya diinkubasi selama ± 30 menit. Absorbansi campuran di ukur serapannya pada spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 770 nm. Kadar polifenol total dalam satuan mg GAE/g sampel dihitung menggunakan persamaan regresi linier yang diperoleh dari larutan standar asam galat pada berbagai konsentrasi, yaitu Y = -0,00095 + 0,0022X (R 2 = 0,9977), Y adalah absorbansi, dan X adalah kadar polifenol total.

## Prosedur Optimasi Metode Ekstraksi menggunakan RSM
Analisis  optimasi  kondisi  metode  ekstraksi  berbantu microwave berbasis  NADES  dengan  komposisi asam malat dan glukosa dilakukan menggunakan perangkat lunak Design Expert Versi 12 berlisensi. Sebanyak 29 kali eksperimen dirancang menggunakan pendekatan Box Behnken Design (BBD) dengan empat  faktor  dan  tiga  level.  Pada  penelitian  ini,  beberapa  faktor  kondisi  ekstraksi  digunakan  sebagai variabel bebas meliputi: rasio asam malat-glukosa (1:2, 1:3, dan 1:4 g/g), kekuatan microwave (10, 30, dan 50 % watt), rasio pelarut-sampel (12, 14, dan 16  mL/g), dan waktu ekstraksi (3, 5, dan 7 menit), serta variabel terikat adalah kadar polifenol total (mg GAE/g sampel) atau disebut juga respon. Model persamaan multilinier terbaik diperoleh dari hasil analisis berdasarkan data hasil eksperimen dari proses ekstraksi dengan variasi kondisi ekstraksi terhadap kadar polifenol total (Ahmad, et.al., 2017b).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
NADES merupakan jenis pelarut alami dalam bentuk deep eutectic solvent yang tersusun dari komponen beberapa  campuran  metabolit  primer  (misalnya  gula,  asam  amino,  asam  organik,  dan  lain-lain). Pemilihan  pelarut  dan  metode  ekstraksi  merupakan  faktor  utama  yang  harus  diperhatikan  untuk memperoleh efisiensi ekstraksi senyawa target dari bahan alam. Senyawa penyusun NADES yang tepat akan membentuk cairan jernih dan stabil, sedangkan komponen penyusun yang tidak tepat menyebabkan cairan  tersebut  tidak  stabil,  terbentuk  endapan,  serta  dapat  kembali  menjadi  bentuk  padat.  Pemilihan komposisi  NADES  yang  berupa  asam  malat  dan  glukosa  merupakan  kombinasi  yang  tepat  karena glukosa  memiliki  sifat hydrogen  bonding  acceptor (HBA)  dan  asam  malat  memiliki  sifat hydrogen bonding  donor (HBD)  sehingga  jika  kedua  bahan  dilebur  pada  suhu  tertentu  maka  akan  membentuk larutan stabil dan siap digunakan sebagai pelarut hijau (Mulia et al., 2019). Disisi lain, kedua bahan ini merupakan  bahan  eksipien  farmasetik  dan  aman  untuk  dikonsumsi  karena food  grade ,  sehingga diharapkan  ekstrak  yang  diperoleh  dapat  dikonsumsi  karena  tidak  mengandung  pelarut  organik  yang berbahaya. Sementara itu, pemilihan metode ekstraksi secara non konvensional yaitu metode ekstraksi berbantu microwave diharapkan  proses  ekstraksi  yang  dilakukan  dapat  berjalan  dengan  waktu  yang singkat, meminimalkan penggunaan pelarut, dan efisiensi penggunaan energi melalui energi microwave dalam proses pemanasan (Ahmad et al., 2018).
Oleh  karena  itu,  optimasi  metode  ekstraksi  sangat  diperlukan  untuk  mengetahui  parameter  kondisi ekstraksi yang berpengaruh signifikan terhadap kadar polifenol total sebagai senyawa metabolit target dari daun Kadamba dalam penelitian ini. Analisis optimasi dilakukan menggunakan RSM dengan BBD yang terdiri dari empat faktor dan tiga level sebagai mana yang ditunjukkan pada Tabel 1 dan Tabel 2 .
Tabel 1. Rancangan eksperimen dengan beberapa variabel faktor menggunakan RSM
Faktor Unit Simbol Range dan Level -1 0 1 Rasio asam malat dan glukosa g/g X 1 1:2 1:3 1:4 Kekuatan microwave % watt X 2 10 30 50 Rasio pelarut-sampel mL/g X 3 12:1 14:1 16:1 Waktu ekstraksi Menit X 4 3 5 7
Berdasarkan hasil penelitian  yang telah dilakukan dari 29 kali percobaan (Tabel 2) diperoleh kondisi dengan kadar tertinggi sebesar 420,1 mg GAE/g (pada kondisi rasio MAG 1:2 g/g, kekuatan microwave 50% watt, waktu 5 menit dan rasio solid-liquid 1:14 g/mL). Sedangkan kondisi dengan kadar terendah sebesar 57,5 mg GAE/g (pada kondisi rasio MAG 1:4 g/g, kekuatan microwave 10% watt, waktu 5 menit dan rasio solid-liquid 1:14 g/mL). Selanjutnya ke 29 data tersebut dilakukan analisis untuk mengetahui kondisi  optimum  dari  metode  ekstraksi  menggunakan  program  RSM  pada  perangkat  lunak Design Expert v12 berlisensi dengan regresi multilinier kuadratik model.
Tabel 2. Desain eksperimen pada parameter kondisi ekstraksi terhadap kadar polifenol total
Percobaan Rasio NADES (asam malat dan glukosa) (g/g) Kekuatan Microwave (%watt) Rasio pelarut- sampel (mL/g) Waktu Ekstraksi (Menit) Kadar Polifenol Total (mg GAE/g) 1 1:4 30 14:1 7 92,8 2 1:3 50 14:1 7 195,8 3 1:3 10 14:1 7 118,2 4 1:4 30 12:1 5 111,4 5 1:3 30 12:1 7 230,6 6 1:2 30 14:1 7 128,1 7 1:4 50 14:1 5 167,9 8 1:3 10 16:1 5 88,5 9 1:2 50 14:1 5 420,8 10 1:4 30 14:1 3 83,5 11 1:3 50 12:1 5 207,2 12 1:4 10 14:1 5 57,5 13 1:2 30 16:1 5 59,5 14 1:3 50 16:1 5 188,8 15 1:2 30 16:1 5 119,3 16 1:3 10 12:1 5 130,6 17 1:3 50 14:1 3 156,8 18 1:3 30 16:1 3 207,5 19 1:2 30 14:1 3 143,1 20 1:2 30 12:1 5 191,9 21 1:3 30 16:1 7 233,0 22 1:3 10 14:1 3 104,4 23 1:3 30 14:1 5 237,8 24 1:3 30 14:1 5 190,4 25 1:4 30 16:1 5 148,2 26 1:4 30 12:1 3 186,6 27 1:3 30 14:1 5 194,0 28 1:3 30 14:1 5 230,5 29 1:3 30 14:1 5 167,1
Berdasarkan hasil perhitungan ANOVA ( Analysis of Variance ) menggunakan perangkat lunak Design Expert v12 berlisensi sebagaimana yang terlihat pada Tabel 3 menunjukkan bahwa model dengan nilai F hitung sebesar 8,99 mengimplikasikan bahwa model signifikan (model yang dimaksud adalah model persamaan  yang  melibatkan  variabel  X 1 ,  X 2 ,  X 1 X 2 ,  dan  X 1 2 X 2 ),  dan  hanya  ada  kemungkinan  0,01% bahwa nilai F hitung sebesar ini dapat terjadi karena kebetulan atau ketidaksengajaan. Nilai p < 0,05 menunjukkan  bahwa  model  yang  diperoleh  adalah  signifikan,  dalam  hal  ini,  X 1 (rasio  asam  malat- glukosa),  X 2 (kekuatan microwave ),  X 1 X 2 ,  dan  X 1 2 X 2 ,  merupakan  variabel  model  yang  signifikan.
Sedangkan jika nilai p > 0,05 menunjukkan model tidak signifikan. Sementara itu, nilai F hitung Lack of Fit (ketidaksesuaian) sebesar 4,26 dengan nilai probabilitas 0,0848 yang mengimplikasikan bahwa model tersebut tidak signifikan atau menyiratkan ada peluang 8,49% terjadi karena ketidaksesuaian.
Tabel  3.  Hasil  Perhitungan  ANOVA  (Analysis  of  Variance)  menggunakan  perangkat  lunak Design Expert v12 berlisensi
Sumber Jumlah Kuadrat df Kuadrat Rata-rata F-Hitung Prob Model 0,0000104 6 17326,69 8,99 < 0,0001 X 1 14544,58 1 14544,58 7,54 0,0118 X 2 11773,45 1 11773,45 6,11 0,0217 X 3 444,08 1 444,08 0.2303 0,6360 X 4 2995,29 1 2995,29 1,55 0,2257 X 1 X 2 15762,80 1 15762,80 8,18 0,0091 X 1 2 X 2 16901,73 1 16901,73 8,77 0,0072 Residual 42414,97 22 1927,55 Lack of Fit 40311,91 18 2239.55 4,26 0,0849 Pure Error 2103,07 4 525.77 Cor Total 0.00001464
Pada Tabel  4  menunjukkan  nilai  estimasi  koefisien,  derajat  bebas,  standar  eror, confidence  interval (interval kepercayaan), dan VIF ( variance inflation factor ). Nilai estimasi koefisien mewakili perubahan yang diharapkan dalam respons per unit perubahan dalan nilai faktor ketika semua faktor yang tersisa dipertahankan  konstan.  Koefisien  sendiri  merupakan  penyesuaian  disekitar  rata-rata  berdasarkan pengaturan faktor parameter yang digunakan. Intersep dalam desain ortogonal adalah respons rata-rata keseluruhan dari semua proses. Dalam kondisi sebagai faktor dalam bentuk ortogonal, nilai VIF adalah 1, VIF >1 menunjukkan multi-kolinearitas, semakin tinggi nilai VIF maka semakin besar korelasi faktor yang didapatkan. Namun, batas toleransi adalah nilai VIF harus lebih kecil dari 10. VIF bertujuan untuk mengukur  seberapa  banyak  variasi  disekitar  estimasi  koefisien  meningkat  dengan  kurangnya ortogonalitas  dalam  desain  (Meeker et  al., 2017).  Oleh  karena  itu,  model  persamaan  yang  diperoleh memiliki  korelasi  yang  baik.  Adapun  persamaan  regresi  multilinier  yang  diperoleh  adalah  Kadar Polifenol Total = 165,17  – 33.97X 1 + 38,36X 2 – 6,08X 3 + 16,12X 4 – 62,77X 1 X 2 + 79,61X 1 2 X 2 (R 2 = 0,7102). X 1 adalah rasio asam malat-glukosa (g/g), X 2 adalah kekuatan microwave (%watt), X 3 adalah rasio  pelarut-sampel  (mL/g),  dan  X 4 adalah  waktu  ekstraksi  (menit).  Koefisien  regresi  mewakili perubahan yang diharapkan dalam respon kadar polifenol total per perubahan unit di X ketika semua faktor yang tersisa tetap konstan.
Tabel 4. Koefisien estimasi, standard error (SE), confidence interval dan VIF Faktor Koefisien Estimasi df SE 95% CI Low 95% CI High VIF Intersep 165,17 1 8,22 148,12 182,22 X 1 -33,97 1 12,37 -59,62 -8,32 1,03 X 2 38,36 1 15,52 6,17 70,56 1,50 X 3 -6,08 1 12,68 -32,37 20,20 1,00 X 4 16,12 1 12,93 -10,70 42,93 1,03 X 1 X 2 -62,77 1 21,95 -108,31 -17,24 1,00 X 1 2 X 2 79,61 1 26,89 23,85 135,38 1,50

## A                                                                          B
Gambar 1. Kontur Plot dua dimensi ( A ) dan tiga dimensi ( B ) tentang hubungan antara konsentrasi NADES dengan Kekuatan microwave .
Berdasarkan  hasil  analisis  dari  RSM,  model  persamaan  yang  diperoleh  dengan  hasil  analisis  yang ditunjukkan pada Tabel 3 dan Tabel 4 menunjukkan bahwa variasi untuk masing-masing faktor yang berpengaruh signifikan terhadap respon hanyalah faktor X 1 dengan nilai F hitung sebesar 7,54 dan nilai p < 0,05 dan X 2 dengan nilai F hitung 6,11 dan nilai p < 0,05. Namun, secara keseluruhan dua faktor lainnya  memberikan  pengaruh  signifikan  pada  model,  sehingga  model  dapat  digunakan  untuk memprediksi  kondisi  optimum  yang  diinginkan  dalam  rangka  ekstraksi  polifenol  total  dari  daun Kadamba. Selanjutnya, jika dilihat dari kontur plot tiga dimensi seperti yang ditampilkan pada Gambar 1,  menunjukkan  pada  kondisi  rasio  asam  malat-glukosa  pada  konsentrasi  1:2  g/g  dengan  kekuatan microwave yang  tertinggi  maka  masih  menghasilkan  kadar  polifenol  total  yang  maksimum.  Hal  ini sesuai  dengan  hasil  analisis  pada  poin  prediksi  RSM  yang  menyarankan  kondisi  optimum  diperoleh pada rasio asam malat-glukosa sebesar 1:2 g/g, 50% watt (setara dengan 450 watt) kekuatan microwave , rasio pelarut-sampel sebesar 12:1 mL/g, dan waktu ekstraksi selama 7 menit, maka akan diperoleh kadar polifenol prediksi sebesar 402,1 mg GAE/g sampel. Perhitungan hasil prediksi tersebut diperoleh dari persamaan hasil analisis dengan RSM.

## KESIMPULAN
Pada  penelitian  ini,  diperoleh  kondisi  optimum  dari  metode  ekstraksi  berbantu microwave dengan NADES dengan kombinasi asam malat dan glukosa diperoleh  pada kondisi rasio asam malat-glukosa sebesar 1:2 g/g, kekuatan microwave 50% watt (setara dengan 450 watt), rasio pelarut-sampel sebesar 12:1  mL/g,  dan  waktu  ekstraksi  selama  7  menit  secara  efektif,  cepat,  mudah, dan  ramah  lingkungan. Hasil penelitian ini merupakan data awal untuk mengembangkan dan memanfaatkan bahan alam dengan pendekatan  kimia  hijau.  Namun,  masih  perlu  dilakukan  optimasi  lagi  dengan  menggunakan  faktor- faktor  yang  lain  seperti  pengaruh  suhu, penggunaan  jenis  eksipien  yang  lain  sebagai  bahan  NADES, maupun  menggunakan  metode  ekstraksi  yang  lain  yang  tersedia  di  laboratorium.  Penerapan  prinsip kimia hijau dalam proses ekstraksi senyawa metabolit sekunder target dari bahan alam, diharapkan dapat meningkatkan  penggunaan  bahan  alam  dalam  memenuhi  kebutuhan  bahan  baku  obat  berbasis  bahan alam Indonesia. Hingga saat ini, bahan baku di Indonesia masih sebagian impor dan penggunaan pelarut organik  konvensional  memiliki  persyaratan  khusus  untuk  layak  digunakan  sebagai  bahan  baku  dari ekstrak yang diperoleh.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terima  kasih  kami  sampaikan  kepada  Kementerian  Riset,  Teknologi,  dan  Perguruan  Tinggi (KEMRISTEKDIKTI)  Republik  Indonesia  dan  Lembaga  Penelitian  dan  Pengabdian  kepada Masyarakat  (LP2M)  Universitas  Mulawarman.    Penelitian  ini  di  biayai  oleh  KEMRISTEKDIKTI melalui  Hibah  Penelitian  Dasar  Unggulan  Perguruan  Tinggi  (PDUPT)  Tahun  2019-2020  (Nomor Kontrak: 203/UN17.41/KL/2019)

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, I., Yanuar, A., Mulia, K., & Mun’im, A. (2017a). Application of ionic liquid based microwave- Assisted  extraction  of  the  secondary  metabolite  from Peperomia  pellucida (L)  Kunth. Pharmacognosy Journal , 9 (2). https://doi.org/10.5530/pj.2017.2.38
Ahmad, I, Pertiwi, A. S., Kembaren, Y. H., Rahman, A., & Mun’im, A. (2018). Application of natural deep eutectic solvent-based ultrasonic assisted extraction of total polyphenolic and caffeine content from coffe beans ( Coffea Beans L.) for instant food products. Journal of Applied Pharmaceutical Science , 8 (8), 138–143. https://doi.org/10.7324/JAPS.2018.8819
Ahmad, I, Yanuar, A., Mulia, K., & Mun’im, A. (2017b). Optimization of ionic liquid-based microwave- assisted extraction of polyphenolic content from Peperomia pellucida (L) Kunth using response surface  methodology. Asian  Pacific  Journal  of  Tropical  Biomedicine , 7 (7),  660–665. https://doi.org/10.1016/j.apjtb.2017.06.010
Ahmad,  I,  Yanuar,  A.,  Mulia,  K.,  &  Mun’im,  A.  (2018).  Ionic  liquid-based  microwave-assisted extraction:  Fast  and  green  extraction  method  of  secondary  metabolites  on  medicinal  plant. Pharmacognosy Reviews , 12 (23), 20–26. https://doi.org/10.4103/phrev.phrev
Ainsworth,  E.,  &  Gillespie,  K.  (2007).  Estimation  of  total  phenolic  content  and  other  oxidation substrates  in  plant  tissues  using  Folin–Ciocalteu  reagent. Nature  Protocols , 2 (4),  875–877. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.102
Azmir,  J.,  Zaidul,  I.  S.  M.,  Rahman,  M.  M.,  Sharif,  K.  M.,  Mohamed,  A.,  Sahena,  F., et.al .  (2013). Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: A review. Journal of Food Engineering , 117 (4), 426–436. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2013.01.014
Bobo-García,  G.,  Davidov-Pardo,  G.,  Arroqui,  C.,  Vírseda,  P.,  Marín-Arroyo,  M.,  &  Navarro,  M. (2014).  Intra-laboratory  validation  of  microplate  methods  for  total  phenolic  content  and antioxidant  activity  on  polyphenolic  extracts,  and  comparison  with  conventional spectrophotometric  methods. Journal  of  the  Science  of  Food  and  Agriculture , 95 (1),  204–209. https://doi.org/10.1002/jsfa.6706
Brown, P. N., Lund, J. A., & Murch, S. J. (2017). A botanical, phytochemical and ethnomedicinal review of  the  genus  Mitragyna  Korth:  Implications  for  products  sold  as  kratom. Journal  of Ethnopharmacology , 202 , 302–325. https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.03.020
Chemat, F., & Vian, M. A. (2014). Green Chemistry and Sustainable Technology: Alternative Solvents for Natural Products Extraction . Heildelberg, New York, Dordrecht, London: Springer US.
Chemat,  F.,  Vian,  M.  A.,  &  Cravotto,  G.  (2012).  Green  extraction  of  natural  products:  Concept  and principles. International Journal of Molecular Sciences , 13 (7), 8615–8627. https://doi.org/10.3390/ijms13078615
Gómez, A. V., Tadini, C. C., Biswas, A., Buttrum, M., Kim, S., Boddu, V. M., et.al. (2019). Microwave- assisted  extraction  of  soluble  sugars  from  banana  puree  with  natural  deep  eutectic  solvents
(NADES). LWT - Food Science and Technology , 107 (October 2018), 79–88. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2019.02.052
González, C. G., Mustafa, N. R., Wilson, E. G., Verpoorte,  R., & Choi, Y. H. (2018). Application of natural deep eutectic solvents for the “green”extraction of vanillin from vanilla pods. Flavour and Fragrance Journal , 33 (1), 91–96. https://doi.org/10.1002/ffj.3425
Ikhwan, D., Harlia, & Widiyantoro, A. (2018). Karakterisasi senyawa sitotoksik dari fraksi etil asetat daun Kratom ( Mitragyna speciosa Korth.) dan aktivitasnya terhadap sel kanker payudara T47D. Jurnal Kimia Khatulistiwa , 7 (2), 18–24.
Meeker,  W.,  Hahn,  G.,  &  Escobar,  L.  (2017). Statistical  Intervals,  A  Guide  for  Practioners  and Researchers (2nd Editio). John Wiley and Sons, Inc.
Mulia, K., Fauzia, F., & Krisanti, E. A. (2019). Polyalcohols as hydrogen-bonding donors in choline chloride-based deep eutectic solvents  for extraction of xanthones from the pericarp of Garcinia mangostana L. Molecules , 24 (3). https://doi.org/10.3390/molecules24030636
Orio, L., Alexandru, L., Cravotto, G., Mantegna, S., & Barge, A. (2012). UAE, MAE, SFE-CO2 and classical  methods  for  the  extraction  of Mitragyna  speciosa leaves. Ultrasonics  Sonochemistry ,
19 (3), 591–595. https://doi.org/10.1016/j.ultsonch.2011.10.001
Raini,  M.  (2017).  Kratom  ( Mitragyna  speciosa Korth):  Manfaat,  efek  samping  dan  legalitas. Media Penelitian dan Pengembangan Kesehatan , 27 (3), 175–184.
https://doi.org/10.22435/mpk.v27i3.6806.175-184
Sanchez-Rangel, J., Benavides, J., Heredia, J., Cisneros-Zevallos, L., & Jacobo-Velazquez, D. (2013). The  Folin-Ciocalteu  assay  revisited:  improvement  of  its  specificity  for  total  phenolic  content determination. Anal. Methods , 5 (21), 5990–5999. https://doi.org/10.1039/b000000x
Singh,  D.,  Narayanan,  S.,  &  Vicknasingam,  B.  (2016).  Traditional  and  non-traditional  uses  of Mitragynine  (Kratom):  A  survey  of  the  literature. Brain  Research  Bulletin , 126 ,  41–46. https://doi.org/10.1016/j.brainresbull.2016.05.004
Torres-Vega, J., Gomez-Alonso, S., Perez-Navarro, J., & Pastene-navarrete, E. (2020). Green extraction of  alkaloids  and  polyphenols  from Peumus  boldus leaves  with  natural  deep  eutectic. Plants , 9 , 242–259.
Wang,  H.,  Ma,  X.,  Cheng, Q., Xi,  X., &  Zhang,  L.  (2018). Deep  eutectic  solvent-based  microwave- assisted extraction of baicalin from Scutellaria baicalensis Georgi. Journal of Chemistry , 2018 . https://doi.org/10.1155/2018/9579872