## Penambatan molekular senyawa tangeretin dan kampferol pada protein antiapoptosis Bcl-xL: studi in silico
Molecular docking tangeretin and kaempferol compound against antiapoptotic Bcl-xL: in silico study

## Siska Febdian Nitami, Rifki Febriansah*
Department of Pharmacy, Faculty of Medicine and Health Sciences, Universitas Muhammadiyah Yogyakarta. Jalan Brawijaya, Tamantirto, Kasihan, Bantul, Yogyakarta, Indonesia 55183
E-mail : rifki.febriansah@umy.ac.id 2018

## Abstrak
Tanaman yang dapat dikembangkan sebagai agen kemoprevensi kanker yaitu kulit jeruk (Citrus  reticulata)  dan  daun  teh  (Camellia  sinensis).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  potensi  senyawa  tangeretin  dan  kaempferol  yang  terdapat  dalam  masing- masing  kulit  jeruk  daun  teh  sebagai  agen  kemoprevensi  kanker  secara  in  silico.  Uji  in silico  menggunakan  perangkat  lunak  Autodock  Vina  dengan  menambatkan  senyawa tangeretin dan kaempferol terhadap protein target Bcl-xL. Pada penambatan molekuler, senyawa tangeretin mempunyai  afinitas -5,8 kkal/mol, sedangkan senyawa kaempferol mempunyai afinitas -6,4 kkal/mol. Tangeretin memiliki potensi yang kuat dalam aktivitas penghambatan  terhadap  protein  Bcl-xL  dan  senyawa  kaempferol  kurang  poten  dalam inhibisi protein Bcl-xL.
Kata kunci: tangeretin, kaempferol, penambatan molekuler, apoptosis

## Abstract
The plants that can be developed as a chemopreventive agent are orange peel (Citrus reticulata)  and  tea  leaves  (Camellia  sinensis).  This  study  aims  to  determine  the chemopreventive  agent  of  tangeretin  and  kaempferol  in  silico.    In  silico  test  was performed molecular docking by using Vina Autodock Software by deprecating tangeretin and  kaempferol  compounds  against  target  protein  Bcl-xL.  Tangeretin  and  kaempferol have  an  affinity  to  the  protein  with  score  -5,8  kkal/mol  and  -6,4  kkal/mol,  respectively. Tangeretin  has  a  high  potency  in  inhibiting  activity  against  Bcl-xL  protein,  while kaempferol has less potency in inhibition of Bcl-xL protein.
Keywords: tangeretin, kaempferol, molecular docking, apoptosis

## PENDAHULUAN
Penyakit kanker merupakan salah satu penyebab kematian di seluruh dunia. Pada tahun 2015, sekitar  8,8  juta  kematian  disebabkan oleh  kanker. Berdasarkan    data    Globocan, International  Agency  for  Research  on  Cancer (IARC)  tahun  2008, kanker  payudara menempati  urutan  pertama  dari  seluruh  kanker  pada  perempuan  di dunia. Sampai

## Artikel Penelitian
saat  ini  terapi  kanker  payudara  masih  pada  kemoterapi, radiasi  dan  operasi. Pada penderita  kanker  payudara,  muncul  berbagai  protein  yang  abnormal  sehingga  terjadi perubahan perilaku sel yaitu meningkatnya proliferasi dan diferensiasi sel serta penurunan kemampuan apoptosis sel. Salah satu protein yang berperan dalam antiapoptosis adalah Bcl-xL.
Bcl-xL  merupakan  suatu  protein  transmembran  tersusun  dari  233  asam  amino  dengan berat  molekul  26  kD.  Selain  terekspresi  pada  membran  luar  mitokondria,  Bcl-xL  juga terdapat  pada  membran  retikulum  endoplasma  dan  pada  membran  nukleus.  Bcl-xL berperan  dalam  penghambatan  jalur  intrinsik  apoptosis.  Pada  saat  terdapat  stimulus apoptosis, Bcl-xL yang terdapat pada membran luar mitokondria diikat oleh Bad, suatu protein  Bcl-2  proapoptosis,  sehingga  Bcl-xL  tidak  dapat  melakukan  fungsinya  dalam menghambat apoptosis (Touzeau et al., 2018).
Pengembangan obat dari bahan alam sangat menjanjikan untuk pengobatan kanker. Bahan alam yang potensial sebagai agen ko-kemoterapi adalah kulit jeruk (Cirus reticulata) dan daun teh (Camellia sinensis L.) (Meiyanto et al., 2007; Deptan, 2012). Senyawa flavonoid tangeretin dan kaempferol, yang masing-masing terdapat dalam kulit jeruk dan daun teh diperkirakan berperan pada aktivitas antikanker sehingga dapat dikombinasikan dengan obat  kanker  dan  diharapkan  bekerja  secara  sinergis  sebagai  ko-kemoterapi.  Untuk mencapai  hal  tersebut,  kami  melakukan  uji  pendahuluan  dengan  studi  in  silico penambatan molekular senyawa tangeretin dan kaempferol pada protein Bcl-xL.

## BAHAN DAN METODE
Metode  penambatan  molekular  (molecular  docking)  menggunakan  aplikasi  Autodock Vina.  Pengambilan  struktur  protein  melalui  Protein  Data  Bank  (PDB)  (www.rscb.org) dengan PDB ID untuk Bcl-xL yaitu 1YSG dan 4TUH. Ligand asli (native ligand) dapat diambil langsung dari file protein target. Setelah itu, konversikan file protein dan ligan ke format  file  PDBQT  dengan  Autodock  Tools  dan  Open  Babel.  Sebelum  menjalankan fungsi  docking,  pastikan  file  1ysg.pdbqt  dan  ligand.pdbqt  telah  berada  di  folder  Vina. Kemudian buat text file baru dan beri nama conf.txt. Untuk menentukan nilai RMSD pilih konformasi dengan nilai RMSD kurang dari 2 Å. Visualisasi hasil docking untuk melihat ikatan antara Bcl-xL dengan ligand uji (tangeretin  dan  kaempferol,  native ligand) dapat dilakukan dengan aplikasi DS Visualizer.
Analisis data
Pada  analisis    molecular    docking,  dilakukan    analisis    data  score  docking  pada    sisi binding pocket  terhadap  senyawa  tangeretin dan kaempferol  dengan  afinitas  yang  baik dinyatakan  dengan  nilai  score  terendah  pada  suatu  molekul.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Molecular  docking  merupakan  metode  komputerisasi  yang  mampu  memperkirakan interaksi suatu senyawa dengan protein melalui jalur energi terendah. Kode protein yang digunakan yaitu 1YSG dan 4TUH yang digunakan sebagai protein target dalam bentuk aktif yang berikatan dengan native ligand. Proses preparasi senyawa uji dengan optimasi struktur  senyawa uji  dilakukan  dengan menggunakan bantuan program  Marvin Sketch. Struktur 3D senyawa uji digambar lengkap dengan atom hidrogen setelah itu dilakukan optimasi konformasi. Pada uji ini  dilakukan pada protein Bcl-xL yang berperan dalam proses apoptosis, struktur dari Bcl-xL dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Struktur Protein Bcl-xL (Oltersdorf dkk., 2005)
Docking dilakukan dengan cara melakukan docking native ligand pada reseptor. Metode docking  dilakukan  validasi  dengan  redocking  native  ligand  pada  binding  site  untuk mendapatkan  nilai  RMSD  dan  nilai  dari  RMSD  serta  score  docking  dari  setiap  ligan terhadap protein Bcl-xL pada kode protein 1YSG dan 4TUH dapat dilihat pada tabel 1 dan 2.
Tabel 1. Hasil molecular docking senyawa uji pada protein Bcl-xL (kode protein 1YSG)
No Senyawa Uji Konformasi Nilai RMSD Score Docking (kkal/mol) 1 Native Ligand 2 0,992 -6,4 2 Kaempferol 8 1,738 -6,7 3 Tangeretin 5 1,333 -4,5 4 5-Flurourasil 2 1,437 -4,9 5 Doxorubicin 2 1,207 -3,6 Tabel 2. Hasil molecular docking senyawa uji pada protein Bcl-xL (kode protein 4TUH) NO Senyawa Uji Konformasi Nilai RMSD Score Docking (kkal/mol) 1 Native Ligand 3 1,422 -7,8 2 Kaempferol 3 1,930 -6,4 3 Tangeretin 2 1,132 -5,8 4 5-Flurourasil 5 1,513 -7,0 5 Doxorubicin 5 1,901 -4,5
Hasil docking yang berupa skor yang menggambarkan kekuatan suatu ikatan yang stabil antara ligan dan reseptor. Semakin kecil skor yang diperoleh maka ikatan antara ligan dan reseptor  semakin  stabil,  yang  mana  setiap  senyawa  uji  akan  menghasilkan  sembilan konformasi  dengan  nilai  RMSD  yang  berbeda-beda  sehingga  dapat  dipilih  konformasi dengan nilai RMSD < 2Å. Senyawa kaempferol dan tangeretin dipilih konformasi ke-8 dan  5  pada  kode  protein  1YSG  dengan  nilai  RMSD  1,738  Å  dan  1,333  Å.  Skor  yang diperoleh  yaitu  -6,7  kkal/mol  untuk  senyawa  kaempferol,  dan  -4,5  kkal/mol  untuk senyawa tangeretin.
Ligan  asli  memiliki  nilai  RMSD  0,992  Å  dan  memiliki  skor  -6,4  kkal/mol  pada konformasi ke-2.  Berdasar hasil tersebut senyawa tangeretin memiliki skor lebih rendah dari  ligan  asli,  sedangkan  pada  senyawa  kaempferol  lebih  tinggi  dari  ligan  asli.  5- flurourasil dan doksorubisin memiliki nilai RMSD masing-masing 1,437 Å dan 1,207 Å dengan  skor  -4,9  kkal/mol  (konformasi  kedua)  dan  -3,6  kkal/mol  (konformasi  kedua). Skor docking kaempferol tidak lebih baik dari 5-flurourasil dan doksorubisin, sedangkan skor  docking  tangeretin  lebih  baik  dari  5-flurourasil  tetapi  tidak  lebih  baik  dari doksorubisin.
Senyawa  kaempferol  dan  tangeretin  dipilih  konformasi  ke-3  dan  2  pada  kode  protein 4TUH dengan nilai RMSD 1,422 Å dan 1,132 Å. Skor yang didapat yaitu -6,4 kkal/mol untuk  senyawa  kaempferol,  dan  -5,8  kkal/mol  untuk  senyawa  tangeretin.  Ligan  asli memiliki  nilai  RMSD  1,422  Å  dan  memiliki  nilai  skor  docking  -7,8  kkal/mol  pada konformasi ke-3. Berdasar hasil  tersebut, senyawa kaempferol  dan tangeretin memiliki nilai yang lebih baik dari ligan asli. 5-flurourasil dan doksorubisin memiliki nilai RMSD 1,513  Å  dan  1,901  Å  dengan  skor  docking  -7,0  kkal/mol  dan  -4,5  kkal/mol  pada konformasi  ke  5  untuk  5-flurourasil  maupun  doksorubisin.  Senyawa  tangeretin  dan kaempferol tidak lebih baik dari doksorubisin tetapi lebih baik dari 5-flurourasil terhadap protein Bcl-xL.
Senyawa  yang  diuji  dan  telah  didocking  dengan  Autodock  Vina  dapat  kita  amati interaksinya  secara  visual  menggunakan  aplikasi  DS  Visualizer,  senyawa  yang ditambahkan pada  protein  Bcl-xL  akan  berinteraksi  dengan residu  asam  aminonya dan kemungkinan terjadinya ikatan antara senyawa yang di uji dan protein, hal ini dapat dilihat pada Tabel 3 dan 4.
Tabel 3. Visualisasi interaksi senyawa uji dan protein Bcl-xL (IYSG)
No Senyawa uji Potensi ikatan asam amino 1 Kaempferol Arginin (ARG 208), Lisin (LYS 209), Asam Glutamat (GLN 96,100), Alanin (ALA 97), Tirosin (TYR 199) 2 Tangeretin Lisin (LYS 20 ), Alanin (ALA 153), Asam Glutamat (GLU 102,157), 3 Doksorubisin Treonin (THR 113), Lisin (LYS 24,20), Fenilalanin (PHE 109), Valin (VAL 156), Asam Aspartat (ASP 99), Asam Glutamat (GLU 102) 4. 5-Flurourasil Tirosin (TYR 177), Triptopan (TRP 173), Histidin (HIS 181), Asam Glutamat (GLU 128) 5 Ligan asli Glutamat (GLU 188), Alanin (ALA 97), Arginin (ARG 208), Tirosin (TYR 199)
Tabel 4. Visualisasi interaksi senyawa uji dan protein Bcl-xL (4TUH)
No Senyawa uji Potensi ikatan asam amino 1 Kaempferol Treonin (THR 190), Alanin (ALA 119), Asam Glutamat (GLU 193) 2 Tangeretin Asam Aspartat (ASP 189), Prolin (PRO 180), Asam Glutamat (GLU 193), Histidin (HIS 177), Alanin (ALA 119), Asam Glutamat (GLU 124) 3 Doksorubisin Histidin (HIS 177), Alanin (ALA 199), Glutamit (121), Serin (122), Glisisn (GLY 177), Treonin (THR 190), Asam Glutamat (GLU 193), Prolin; (PRO 180) 4 5-Flurourasil Arginin (ARG 165), Treonin (THR 190), Asam Aspartat (ASP 176), Alanin (ALA 119) 5 Ligan asli Lisin (LYS 157), Histidin (HIS 113), Alanin (ALA 119), Asam Aspartat (ASP 189), Asam Glutamat (GLU 179), Glutamin (GLU 183), Treonin (THR 115)
Senyawa-senyawa uji  yang  berikatan dengan  protein Bcl-xL  pada  binding  site  tertentu sehingga dapat berpotensi untuk berikatan dengan asam amino di sekitar binding site-nya. Jenis interaksi yang terbentuk antara senyawa uji dan residu asam amino ptotein  Bcl-xL yaitu ikatan hidrogen dan seperti yang ditunjuk oleh Gambar 2 dan 3.
Tangeretin                                      Kaempferol
Doxorubicin                                        5-Flurourasil
Native ligand
Gambar 2. Visualisasi 2D interaksi asam amino protein Bcl-xL (1YSG)
Kaempferol                                          Tangeretin
Doxorubicin                                                5-Flurourasil
Native Ligand
Gambar 3. Visualisasi 2D interaksi asam amino protein Bcl-xL (4TUH)
Hasil  uji  molecular  docking  menunjukkan  bahwa  ikatan  antara  senyawa  flavonoid tangeretin  terhadap  protein  Bcl-xL  memiliki  aktivitas  inhibisi  lebih  stabil,  sehingga aktivitasnya  lebih  tinggi  terhadap  Bcl-xL.  Sedangkan  senyawa  flavonoid  kaempferol memiliki  aktivitas  yang  hampir  sama  dengan  agen  kemoterapi  5-flurourasil  dan  native ligand. Hasil  tersebut juga  dapat  dilihat  pada visualisasi  3D menggunakan aplikasi DS Visualizer antara ligan dan senyawa target. Senyawa uji tangeretin sebanding dengan 5- flurourasil  yang mengikat  4  dan 6  ikatan  hidrogen,  berinteraksi  pada  asam  amino  lisin pada posisi 20 (LYS 20), Alanin pada posisi 153, 119 (ALA 153, 119), Asam Glutamat pada posisi 102, 157, 193, 124 (GLU 102, 157, 193, 124), Asam Aspartat pada posisi 189 (ASP 189), Prolin pada posisi 180 (PRO 180), Histidin pada posisi 177 (HIS 177) yang hampir  sama  dengan  senyawa  native  ligand  dan  5-flurourasil  tapi  tidak  dengan  agen kemoterapi  doksorubisin  yang memiliki  ikatan asam  amino  lebih banyak dibandingkan dengan tangeretin yang memiliki ikatan asam amino 7 dan 8.
Senyawa kaempferol mengikat 6 dan 3 ikatan  hidrogen yang berinteraksi dengan asam amino Arginin pada posisi 208 (ARG 208), Lisin pada posisi 209), Asam Glutamat pada posisi 96,100,193 (GLU 96,100,193), Alanin pada posisi 97,119 (ALA 97,119), Tirosin pada posisi 199 (TYR 199), Treonin pada posisi 190 (THR 190). Kaempferol memiliki ikatan asam  amino  lebih banyak dibandingkan dengan native ligan yaitu  6  ikatan  pada kode protein 1YSG dan mengikat 3 ikatan pada kode protein 4TUH. Kaempferol memiliki ikatan  yang  hampir  sama  dengan  5-flurourasil,  tapi  tidak  dengan  doksorubisin  yang memiliki ikatan asam amino yang lebih banyak. Semakin banyak ikatan yang terbentuk antara ligan dan protein target, maka  potensi aktivitas suatu senyawa tersebut semakin kuat. Hal ini menunjukkan  bahwa  senyawa uji  tangeretin  dengan  uji in  silico memiliki potensi  yang kuat  dalam  aktifitas penghambatan  terhadap  protein  Bcl-xL  dan  senyawa kaempferol  kurang  poten  dalam  inhibisi  protein  Bcl-xL,  tetapi  kekuatannya  masih sebanding dengan ligan aslinya.

## KESIMPULAN
Senyawa uji tangeretin  dengan  uji in silico memiliki potensi yang  kuat dalam aktivitas penghambatan  terhadap  protein  Bcl-xL  dan  senyawa  kaempferol  kurang  poten  dalam inhibisi protein Bcl-xL, tetapi kekuatannya masih sebanding dengan ligan aslinya.

## REFERENSI
Deptan, 2012. Kajian Umum Mengenai Tanaman Jeruk Avaliable at http://ditlin.hortikultura.go.id/jeruk_cvpd/jeruk01.
IARC GLOBOCAN 2008 Breast Cancer Incidence and Mortality Worldwide in 2008 Summary [internet]. 2010 [cited 2015 January 22]. Available in: http://globocan.iarc.fr/factsheets/cancers/breast.asp.
International  Agency  for  Research  on  Cencer,  WHO,  2014.  World  cancer  report  2014. http://id.scribd.com/doc/249125578/World-Cancer-Report-2014.
Meiyanto, E., Fitriasari, A., Rokhman, M.R., Latifah, N., Yunus, S.R., 2007. Penggunaan Ekstrak Etanolik Kulit Buah Jeruk Mandarin (Citrus reticulata) untuk Meningkatkan Sensitivitas Sel Kanker Payudara MCF- 7 Terhadap Agen Kemoterapi Doxorubicin.
Oltersdorf, T.H., Elmore, S.W., Shoemarker, A.R., Armstrong, R.C., Augeri, D.J., Belli, B.A., et al, 2005, An Inhibitor of Bcl-2 Family Proteins Inducer Regression of Solide Tumors, Nature, 435,677-681.
Touzeau C, Maciag P, Amiot M, Moreau P. 2018. Targeting Bcl-2 for the treatment of multiple myeloma. Leukemia. 32(9):1899-1907.
© The Author(s) 2019