Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(1), Maret 2022, 165-173 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
PENETAPAN KADAR FLAVONOID DAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN PADA EKSTRAK BATANG BROTOWALI (Tinospora crispa L.) DENGAN METODE  CUPRAC
Asep Roni * , Dewi Kurnia, Nurani Hafsyah Fakultas Farmasi Universitas Bhakti Kencana
*Email: asep.roni@bku.ac.id
Artikel diterima: 31 Desember 2021; Disetujui: 15 Maret 2022 DOI: https://doi.org/10.36387/jiis.v7i1.856

## ABSTRAK
Stres  oksidatif  adalah  kerusakan    yang  diakibatkan    oleh  spesi  oksigen reaktif.      Senyawa    yang  dapat    mencegah    terjadinya  stres  oksidatif  yaitu antioksidan.  Tanaman    brotowali    (Tinospora  crispa)    telah      digunakan      untuk pengobatan      diabetes      dan    hipertensi.    Tanaman      brotowali  mengandung senyawa  metabolit  sekunder  diantaranya  yaitu  flavonoid.  Flavonoid  diketahui merupakan    golongan    senyawa  yang  merniliki  aktivitas  antioksidan.  Penelitian bertujuan  untuk  mengetahui      aktivitas    antioksidan      pada    batang    brotowali yang  diekstraksi   dengan  pelarut berbeda  kepolaran,  sehingga  dapat diketahui jenis    pelarut      manakah    yang  paling  baik    dalam  mengekstrak      tanaman      uji batang  brotowali.   Ekstraksi    dilakukan   dengan   metode   refluks bertingkat mengguanakan    pelarut    n-heksana,  etil  asetat  dan  etanol    96%.  Penetapan aktivitas  antioksidan      menggunakan      metode      CUPRAC.    Penetapan    kadar flavonoid    total  menggunakan    metode    aluminium    klorida  kolorimetri    dengan kuersetin  sebagai standar. Hasil menunjukan  sampel ekstrak etil asetat merniliki aktivitas antioksidan  yang kuat dibandingkan sampel ekstrak dengan etanol 96% dan  n-heksana.  Nilai  ECso  ekstrak  etil  asetat  sebesar  53,637  µg/mL.  Ekstrak dengan  pelarut  n-heksana  merniliki  kadar  flavonoid paling tinggi yaitu 9,937 ± 0,009 gQE/100 g Ekstrak.
Kata kunci : antioksidan,  brotowali,  CUPRAC,  Tinospora crispa

## ABSTRACT
Oxidative    stress  is  damage    caused    by  reactive    oxygen    species Compounds    that  can  prevent  oxidative  stress  are  antioxidants.  The  brotowali plant  (Tinospora  crispa)  has  been  used  for  the  treatment  of  diabetes  and hypertension.  The  brotowali  plant  contains  secondary  metabolites  such  as flavonoids.  Flavonoids  are  known  to  be  a  class  of  compounds  that  have antioxidant activity. so it can be kind of solvent which is the most excellent in the test  plant  extract  brotowali.  Extraction  was  conducted  by  reflux-rise  that  use  n- hexane,  ethyl  acetate  and  ethanol  96%.  Determination  of  antioxidant  activity using  them  CUPRAC  method.  Determination    of  total  flavonoid  content  using colorimetric  aluminum  chloride method  with quercetin  as standard. The results showed  that  the  ethyl  acetate  extract    sample  had  strong  antioxidant    activity
p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
compared  to the extract sample with 96% ethanol and n-hexane. The EC50 value of the ethyl acetate extract was 53.637 g/mL.  Extract with n-hexane solvent had the highest flavonoid content, namely 9,937 ± 0.009 gQE/100 g extract.
Keywords: antioxidant, brotowali, CUPRAC, Tinospora  crispa.

## PENDAHULUAN
Proses
penuaan ialah perubahan    bertahap  yang  terjadi dalam  tubuh  manusia.  Penuaan yang  terjadi  lebih   cepat    dari   pada waktu    umurnnya    disebut    penuaan dini.    Salah    satu    penyebab terjadinya  penuaan    dini    adalah karena    adanya    spesi    oksigen reaktif.    Spesi    oksigen    reaktif adalah molekul yang tidak berpasangan,    sehingga  sangat  tidak stabil  dan  sangat  reaktif..  Spesi oksigen  reaktif  yang  paling    banyak dipelajari    karena    merniliki    efek berbahaya    dan    merusak    ialah superoksida      (0),  hidroksil    (-OH), dan  perhidroksil    (-OH).  Kerusakan akibat  spesi  oksigen    reaktif  disebut dengan  stress  oksidatif.  Sumber utama  pembentukan    spesi  oksigen
reaktif adalah pencemaran
lingkungan,  sinar  ultraviolet  yang berbahaya, ataupun diproduksi secara  terus-menerus    sebagai  hasil dari  metabolisme      normal   didalam tubuh,    dll.    spesi    oksigen    reaktif
akan    menyebabkan      misfolding protein,    kerusakan    kolagen, kerusakan    lipid,  kerusakan    DNA dan    fragmentasi    (Manisha,  hasan whidul,  2017).
Hasil    penelitian    Taniyama, 2003    menunjukan    bahwa    fungsi dari    endothelium    dipengaruhi    oleh spesi    oksigen    reaktif  yang    dapat menginaktivasi      nitrik    oksida (degradasi    NO*).    Nitrik    oksida bukan  radikal  yang  sangat  reaktif, namun produksi berlebihan menyebabkan    ischemia  reperfusion dan  degenerasi  syaraf  serta penyakit peradangan    kronis    seperti    artritis rematik    dan  peradangan  lambung. Nitrik    oksida    yang    berada    pada plasma darah menyebabkan penurunan      konsentrasi  vitamin    C dan asam urat serta memulai peroksidasi    lipid.  Peroksidasi    lipid merupakan    degradasi  oksidatif    lipid dimana    target    utama    terjadi      pada membran   sel  karena   merniliki  dua lapisan  fosfolipid    dan  protein    yang menyebabkan    kerusakan    pada    sel.
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(1), Maret 2022, 165-173 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
Produk    hasil    oksidasi    lipid    salah satunya  adalah  malonaldehid    yang dapat  bereaksi  dengan  grup  amino protein,  fosfolipid,  dan  asam  nukleat yang menyebabkan terjadinya modifikasi  struktural  yang  dapat menyebabkan tidak berfungsinya sistem    imun    semuanya    ini merupakan    mekanisme    yang mengawali
perkembangan
atherosclerosis, hipertensi dan penyak.it jantung  coroner (Muchtadi, 2009).
Berdasarkan    uraian    tersebut, perlu    upaya    untuk    mencegah terjadinya  stres  oksidatif  yang  dapat menyebabkan    sejumlah    penyakit berbahaya    sehingga    diperlukan suatu  antioksidan.  Antioksidan  yaitu senyawa  yang  mampu  menghambat oksidasi    molekul    yang    dapat menghasilkan      radikal  bebas. Terdapat      dua    jenis        antioksidan yaitu      antioksidan        sintetik      dan antioksidan    alami.
Salah  satu altematif  antioksidan alarni yang potensial  adalah tanaman brotowali    ( Tinospora  crisp L.). tanaman   ini  termasuk   dalam  genus Tinospora dari keluarga Menispermaceae.    Biasanya  terdapat
di  hutan  hujan  primer    atau  hutan gugur    campuran    di  Asia  Tenggara dan  Afrika    termasuk  Thailand, Malaysia,  dan   Indonesia.   T.  crispa telah      banyak      digunakan    sebagai antipiretik,  pengobatan  peradangan internal,    meningkatkan  rasa  lapar, mengobati keracunan yang disebabkan  oleh    obat-obat    atau alkohol.    Di  Indonesia    tepatnya    di daerah    Kalimantan  telah  digunakan untuk  pengobatan  diabetes    dan hipertensi. T. crispa memiliki keragaman metabolit sekunder. Sejurnlah studi  telah  dilakukan  pada konstituen    T.    crispa,    dan    lebih dari    65    senyawa      telah    diisolasi. Kandungan    senyawa    metabolit sekunder   yang  telah  teridentifikasi diantaranya  furanoditerpen,  lakton, steroid, flavonoid, lignan, dan alkaloid  (Ahmad  et al., 2016).
Flavonoid telah diketahui merupakan  golongan    senyawa  yang memiliki aktivitas antioksidan. Mekanisme  kerja  flavonoid  dalam menangkal radikal bebas yaitu dengan mengikat    ion  -ion  logam  seperti    Fe dan    Cu.  Flavonoid  juga  merupakan antioksidan  yang    efektif    untuk inaktivasi    radikal  hidroksil      dan
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(1), Maret 2022, 165-173 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
peroksil.      Flavonoid    dapat membentuk    ikatan    kompleks dengan  ion  logam  dan menghambat inisiasi    logam    untuk    melakukan oksidasi    lipid    (Muchtadi,    2009).
Flavonoid yang teridentifikasi
terdapat      dalam      batang      brotowali diantaranya  apigenin,   luteolin   4'  - metileter7-  glukosida,  dan  diosmetin (Ahmad  et al., 2016).
Pengujian    antioksidan    yang akan dilakukan menggunakan metode    uji    antioksidan    CUPRAC. metode    uji    antioksidan    dengan pereaksi    CUPRAC    mempunyai keunggulan    diantaranya    lebih selektif  karena  potensi  redoksnya lebih  rendah,  kemudian  reaksi  redoks yang menimbulkan kelat berwarna Cu (I)  -Ne  relatif  tidak  sensitif  terhadap sejumlah parameter yang mempengaruhi reagen radikal tertentu seperti  DPPH  yaitu  udara,  sinar matahari, jenis pelarut, dan pH (Apak et  al.,  2007).  Maka  dari  itu,  perlu dilakukan  pengujian  dengan  pelarut yang berbeda yang dapat mengekstraksi jenis golongan senyawa yang berbeda yang
terkandung  dalam  batang  brotowali,
sehingga
diharapkan dapat
mengetahui  jenis  pelarut  paling  baik untuk ekstraksi yang dapat menghasilkan  aktivitas  antioksidan paling  tinggi  dengan  menggunakan metode CUPRAC

## METODE PENELITIAN
Metodologi penelitian yang digunakan dalam penelitian ini mepiputi penyiapan bahan, karakterisasi simplisia, penapisan
fitokimia, ekstraksi, pengujian
aktivitas aktivitas antioksidan ekstrak    batang    brotowali    dengan metode    CUPRAC    menggunakan instrumen    spektrofotometer      UV- Vis,    Pengolahan    data    dan  analisis statistik .
Penyiapan bahan meliputi pengumpulan bahan yang akan digunakan,determinasi, pengolahan bahan sampai jadi simplisia.
Karakterisasi  simplisia  meliputi pemeriksaan spesifik dan non spesifik antara  lain  kadar  abu  total,  abu  tidak larut  asam,  kadar  sari  larut  air,  sari larut  etanol,  kadar  air  dan  susut pengeringan. Penapisan fitokimia meliputi pemeriksaan terhadap
beberapa  senyawa  seperti  alkaloid,
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(1), Maret 2022, 165-173 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
flavonoid,  tanin,  saponin,kuinon  dan steroid.
Ekstraksi dilakukan dengan cara refluks bertingkat menggunakan pelarut  n-Heksan,  etil  asetat  dan metanol. Ekstraksi dilakukan pengulangan  sebanyak  3  kali  yang masing-masing  dilakukan  selama  3 jam.  Kemudian  ekstrak  dipekatkan menggunakan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kental.
Penetapan  kadar  flavonoid  total dari bahan uji dihitung terhadap kurva kalibrasi  quercetin  sebagai  standar. Uji  Aktivitas  antioksidan  dilakukan dengan      pengujian      uji      kualitatif senyawa   yang   terkandung   dalam bahan uji menggunakan Kromatografi Lapis Tipis dan
pengujian  kuantitatif  dengan  metode CUPRAC  yang  dilihat    berdasarkan tingkat absorbansi Cu (I)- neocuproine yang diukur mengguakan  spektrofotometer  UV- Vis.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembuatan dan Karakterisasi

## simplisia
Penyiapan    simplisia    batang brotowali    diawali    dengan  proses
sortasi basah.  Sortasi basah bertujuan untuk  mernisahkan  tanaman  dari kotoran  dan  polutan  lain  yang terbawa  selama  pengumpulan    atau pemanenan.    Tahap    selanjutnya yaitu  pencucian    tanaman    di  bawah air  mengalir  untuk  menurunkan jurnlah  mikroba  awal.  Kemudian dilakukan  proses  perajangan  yang bertujuan  untuk  memudahkan  proses ekstraksi yaitu dengan cara memperkecil ukuran tanaman sehingga dapat memperluas permukaannya kontak dengan pelarut. Setelah  dilakukan  proses  perajangan simplisia  dikeringkan  di  bawah  sinar matahari  tidak  langsung  hal  tersebut dilakukan untuk mengurangi kerusakan  bahan  aktif  yang  merniliki aktivitas antioksidan yang terkandung dalam simplisia. Karakterisasi simplisia  dilakukan  dengan  tujuan untuk  mengetahui  kualitas  dan  mutu simplisia yang digunakan.
Parameter  yang  bisa  digunakan antara  lain  kadar  air,  kadar  abu  total, kadar  abu  larut  air,  kadar  abu  tidak larut  asam,  kadar  sari  larut  air,  kadar sari larut etanol, dan susut
pengeringan. Hasil Karakterisasi
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(1), Maret 2022, 165-173 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
simplisia  dapat  dilihat  pada  tabel  1 berikut ini.
Tabel 1. Hasil Karakterisasi Simplisia Uji Karakterisasi Hasil Pengamatan %(B/B) Su s ut  Pe g eringan 10,68% Kadar  Abu  Total 4,70% Kadar  Abu  Tidak  Larut A s am 0,35% Kadar  Sari  Larut  Air 4,98% Kad ar Sari  Larut  Etanol 5,48 % Kadar  Air 7,28%

## Skrining Fitokimia
Skrining  fitokimia/  penapisan fitokimia bertujuan untuk mengetahui golongan-golongan  senyawa  yang terdapat didalam
simplisia.
Pemeriksaan ini meliputi pemeriksaan
alkaloid, flavonoid, steroid/triterpenoid,  kuinon,  tanin,dan sponin. Hasil Skrining fitokimia dapat dilihat pada tabel 2 berikuti ini :
Tabel 2. Hasil Penapisan Fitokimia

## Simplisia
Golongan Senyawa Hasil Pengamatan Alkaloid + Flavonoid - Saponin + Kuinon - Terpenoid/steroid + Tanin -

## Ekstraksi
Ekstraksi  yang  dilakukan  pada simplisia  batang  brotowali  sebanyak 301,34  gram  menggunakan  metode
refluks dengan cara ekstraksi bertingkat    menggunakan  pelarut  n- heksana,  etil  asetat  dan  etanol berdasarkan kepolarannya.
Dari hasil ekstraksi, pengamatan ekstrak secara
organoleptik antara ekstrak dan fraksi tidak  menunjukkan  perbedaan  yang signifikan  dimana  ekstrak  berwarna hijau  kehitaman,  sedangkan  fraksi masing kepolaran pun berwarna hijau kehitaman dan bertekstur pekat
Tabel 3. Hasil Rendemen Ekstrak
Pelarut Ekstrak Kental (Gram) Randemen Ekstrak (Gram) Organo- leptik N – Heksana 5,69 1,88 Pekat, Hijau kehitaman Etil Asetat 7,30 2,42 Pekat, Hijau kehitaman Etanol 96% 19,31 6,41 Pekat, Hijau kehitaman

## Penetapan Kadar Flavonoid
Penetapan      kadar      flavonoid total      terhadap      sampel      dilakukan dengan      metode      kolorimetri aluminium    klorida.  Prinsip    metode tersebut    adalah    aluminium    klorida membentuk  kompleks  asam    yang stabil  dengan  gugus  keto  C-4  dan gugus    hidroksil    C-3    atau  C-5    dari flavon    dan  flavonol.    Selain    itu,
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(1), Maret 2022, 165-173 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
membentuk  kompleks      asam    labil dengan  gugus  orto-dihidroksil  pada cincin  A atau B dari flavonoid. Salah satu  senyawa    flavonoid    golongan flavonol    yang  dapat  bereaksi dengan   aluminium   klorida   adalah kuersetin.    Maka    dari    itu    kuersetin digunakan  sebagai  standar  untuk penetapan  kadar flavonoid  total.
Perubahan    reaksi    yang  terjadi pada    senyawa    flavonoid    dalam sampel    dan  aluminium    klorida diidentifikasi    melalui    absorbansi pada    panjang  gelombang    415    nm menggunakan  spektrofotometr    Vis. Semakin      tinggi    kandungan senyawa      flavonoid      pada      sampel maka  semakin    tinggi    nilai absorbansinya.    Selain    itu,    secara visual    perubahan      warna    kuning yang terbentuk  akan  semakin  pekat.
Gambar 1. Kadar Flavonoid Total
Dari  hasil  percobaan,  sampel yang  kandungan    flavonoid    total
paling  tinggi  berturut  -turut  adalah sampel    yang  menggunakan    pelarut N-heksana  kemudian  sampel dengan pelarut    etil asetat    dan   yang    paling rendah    sampel    dengan    pelarut etanol    96%.    Urutan    sampel    pada kandungan  flavonoid  total  berbeda dengan  urutan  kandungan  fenol  total, hal  ini  dapat  dikarenakan    tingginya kandungan  fenol  pada  sampel  etil asetat  tidak  hanya  disebabkan    oleh golongan  flavonoid  saja.  Perbedaan tersebut  dapat  disebabkan  karena metode kolorimetri aluminium klorida    kurang    sensitif    dalam menguji    golongan    flavonoid. Aluminium klorida dapat mengkompleks   beberapa  kelompok flavonoid    seperti    flavon    (Krisin, apigenin    dan  luteolin)  dan  flavonol (kuersetin,  mirisetin,  morin,  dan rutin) tetapi tidak dapat mengkompleks  golongan  flavanon dan flavanonol (Widyastuti, 2010). Uji Aktivitas Antioksidan Uji aktivitas
antioksidan dilakukan  dengan  metode  CUPRAC, dimana  metode  ini  memiliki  prinsip yaitu  kompleks    bisneokuproin- tembaga  (II)  akan  mengoksidasi senyawa antioksidan yang
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(1), Maret 2022, 165-173 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
terkandung  dalam  ekstrak  tanaman dan  mengalarni  reduksi      sehingga membentuk kompleks
bis- neokuproin-tembaga(I). perubahan reaksi tersebut ditandai dengan warna kompleks  larutan  dari  biru  toska menjadi kuning (Widyastuti, 2010).
Metode CUPRAC dipilih
sebagai metode uji kuantitatif aktivitas  antioksidan  karena  pereaksi CUPRAC  lebih  stabil  dibandingkan metode  antioksidan  yang  lain,  lebih selektif  karena  memiliki  potensi redoksnya lebih rendah, dan memiliki reaksi  yang  cukup  cepat  untuk mengoksidasi  tiol  jenis  antioksidan. Uji  aktivitas  antioksidan    dilakukan pada  sampel  dan  baku  pembanding. Pembanding    yang  digunakan    yaitu vitamin    C. Berdasarkan  penelitian yang  dilakukan      oleh  Irianti  uji aktivita s penangkapan radikal DPPH  pada  ektrak  etanol  batang brotowali  ( Tinospora c rispa L ) memiliki aktivit as terbaik pad a fr aks i e til ase t a t  d e n ga n  kon se ntr as i 2 00 µ g / mL  berh as i l m e nan g k a p se b es ar 53 , 57 % radikal  beb as  ( lri a nti  et a l. , 2011 )
Tabel 4. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode
CUPRA C Ekstrak Batang Brotowali EC50 (g/mL) N – Heksana 161,954 ± 0,169 Etil Asetet 53,637 ± 0,180 Etanol 96% 87,540 ± 0,556
Berdasarkan   nilai  ECso   tiap sampel    ekstrak    pada    Tabel    V.6 sampel    pada    ekstrak    batang brotowali    dengan  pelarut  Etil  asetat dan  Etanol  96%  memiliki    aktivitas antioksidan    yang  kuat  dimana  pada ekstrak  batang  brotowali    dengan pelarut  etil  asetat  memiliki    nilai EC50  sebesar  53,637    µg/mL    dan nilai  ECso ekstrak  batang  brotowali dengan  pelarut  etanol  96%  sebesar 87,540   µg/rnL.  sedangkan   ekstrak batang    brotowali      dengan    pelarut N-heksana      memiliki  aktivitas antioksidan  yang lemah dengan nilai ECso sebesar  161,954 µg/rnL.

## KESIMPULAN
Hasil penelitian aktivitas antioksidan  batang  brotowali  dengan metode  CUPRAC  dapat  disimpulkan bahwa      ekstrak  yang  memiliki aktivitas antioksidan yang kuat adalah ekstrak  dengan  pelarut  etil  asetat dengan  nilai  ECso  yang  lebih  besar
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(1), Maret 2022, 165-173 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
yaitu  53,637      µg/mL.    Ekstrak dengan  pelarut  n-heksana  memiliki kadar  flavonoid  paling  tinggi    yaitu 9,937 ± 0,009  gQE/100 g Ekstrak.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  Fakultas Farmasi  dan  Lembaga  Penelitian  dan Pengabdian  Masyarakat  Universitas Bhakti  Kencana,  atas  dukungannya dalam penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Choma., Irena, M.,Edyta, M.G. 2010.
Bioautography Detection in
Thin-Layer Chromatography. Journal  of  Chromatography  A
Chroma-351708.
Dirjen  POM.  Farmakope  Indonesia, Edisi  IV.  Jakarta:  Departemen
Kesehatan RI, 1995. Hal 7
Harborne,  J.B.  Metode  Fitokimia.
Penuntun Cara modern mengekstraksi Tumbuhan (Koasish Padmawinata dan Iwang  Soediro,  penerjemah). Bandung:  ITB,  1987.  Hal  103- 104 Heyne, K., 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, Jilid Ketiga, Departemen  kehutanan  Badan Penelitian  dan  Pengembangan Kehutanan,Yayasan Sarana Wahana  Jaya  (Penterjemah), Jakarta. Irianti,  T.,  Puspitasari,    A.,  & Suryani,  E.    (2011).  The Activity Of Radical Scavenging  Of  2,2-Diphenyl- 1-Pycrilhydrazil By Ethanolic Extracts Of (Tinospora  Crispa  (L.)  Miers) Stem And Its Fractions. Majalah Obat Tradisional , 16(3),  139-146.
Markham  KR. Cara  Mengidentifikasi
Flavonoid .  Bandung  :  Penerbit
ITB. 1988. Hal 58-60
Mursyidi, A., 1990, Analisis Metabolit  Sekunder,  Gadjah Mada University Press, Yogyakarta, 175-180