Jayantie et al.;AKtivitas Antioksidan dan…..Pharmacoscript Volume 5 No. 1, Februari 2022

## AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN INHIBISI ENZIM TIROSINASE EKSTRAK
ETANOL BUAH GANDARIA ( Bouea macrophylla Griff.) SECARA IN VITRO
Dhyneu Dwi Jayantie 1,2* , Yunahara Farida 1 , Shelly Taurhesia 1
1 Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jakarta, Indonesia
2 Program Studi Farmasi Fakultas Sains, Farmasi dan Kesehatan, Universitas Mathla’ul Anwar, Banten, Indonesia
*Email: dhyneudj@gmail.com
Received: 11/01/2022 , Revised: 09/02/2022 , Accepted: 15/02/2022, Published: 28/02/2022

## ABSTRAK
Radikal  bebas  merupakan  penyebab  masalah  kulit,  salah  satunya  adalah  hiperpigmentasi  yaitu disebabkan oleh adanya peningkatan aktivitas enzim tirosinase. Ekstrak etanol 70% buah gandaria ( Bouea macrophylla Griff.) memiliki senyawa fenolik, tanin, vitamin C, flavonoid, flavonol, serta antosianin yg bisa menangkal radikal bebas serta mengurangi risiko permasalahan kulit. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antioksidan serta inhibisi enzim tirosinase ekstrak etanol buah B. macrophylla secara in vitro . Pada pembuatan ekstrak buah B. macrophylla , pelarut yang digunakan  nya  adalah  etanol  70%  dengan  metode  maserasi,  skrining  fitokimia,  uji  aktivitas antioksidan  menggunakan  metode  DPPH,  serta  inhibisi  enzim  tirosinase  memakai  substrat  L- DOPA. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah B. macrophylla memiliki kategori sangat kuat dengan nilai  IC 50 47,064  µg/mL, serta inhibisi enzim tirosinase paling tinggi  diperoleh dengan nilai 47,529%.
Kata kunci : Antioksidan, Gandaria ( Bouea macrophylla ), in vitro , Tirosinase .

## ABSTRACT
Free radicals are the cause of skin problems, one of which is hyperpigmentation, which is caused by an increase in the activity of the tyrosinase enzyme. The 70% ethanol extract of gandaria fruit (Bouea macrophylla Griff.) has phenolic compounds, tannins, vitamin C, flavonoids, flavonols, and  anthocyanins  which  can  ward  off  free  radicals  and  reduce  the  risk  of  skin  problems.  The purpose of this study was to determine the antioxidant activity and tyrosinase enzyme inhibition of the ethanolic extract of B. macrophylla fruit in vitro. In the manufacture of B. macrophylla fruit extract,  the  solvent  used  was  70%  ethanol  by  maceration  method,  phytochemical  screening, antioxidant activity test using the DPPH method, and tyrosinase enzyme inhibition using L-DOPA as a substrate. The antioxidant activity of the ethanolic extract of B. macrophylla fruit has a very strong category with an IC50 value of 47.064 g/mL, and the highest tyrosinase enzyme inhibition was obtained with a value of 47.529%.
Keywords: Antioxidant, Gandaria (Bouea macrophylla), in vitro, Tirosinase.
Jayantie et al./Pharmacoscript, Volume 5, No,1, Februari 2022,63-70
Safitri.,et al./Pharmacoscript, Volume 1, No. 2, Februari 2019, 1-12

## PENDAHULUAN
Kulit merupakan organ terbesar yang menutupi  tubuh  dan  mencegah  penetrasi penetrasi  asing  masuk  ke  dalam  tubuh (Neupane et al ., 2020). Warna kulit berkaitan dengan  keberadaan  beberapa  biokrom  yang berkontribusi  pada  pertahanan  terhadap radiasi. Pigmen terpenting yang menentukan warna kulit adalah melanin (Solano., 2020). Melanin  adalah  molekul  pigmen  yang menghasilkan  warna,  berperan  penting dalam melindungi kulit dari radiasi sinar UV, dan  menghilangkan  bahan  kimia  beracun. Akumulasi melanin berlebihan dapat menyebabkan  hiperpigmentasi  kulit  seperti melasma,  bintik-bintik  gelap  dan  penuaan (Kong et al., 2020). Pencegahan pembentukan melanin dengan cara menghambat  aktivitas  enzim  tirosinase merupakan salah satu pencegahan hiperpigmentasi  (Goenka  &  Toussaint., 2020).
Enzim tirosinase mengkatalisis langkah  pembatas  laju  dalam  sintesis melanin  dengan  mengkatalisis  hidroksilasi
L-tirosin menjadi L-DOPA dan mengubahnya menjadi Dopaquinone (Goenka  &  Toussaint.,  2020).  Aktivitas tirosinase  menurun  baik  dengan  mengikat logam  tembaga  (Cu),  disisi  aktif  enzim menggunakan  inhibitor  tirosinase  langsung
atau dengan mengurangi produk Dopakuinon menggunakan  antioksidan  (Kong et  al ., 2020).
Antioksidan memblokir proses oksidasi  dengan  menetralkan  radikal  bebas, dengan demikian antioksidan menjadi teroksidasi. Antioksidan bekerja dengan cara pemutusan  rantai  rantai  molekul  radikal. Antioksidan  mencegah  reaksi  oksidasi dengan  mengurangi  proses  inisiasi  dengan membersihkan radikal-radikal awal, antioksidan  dapat  menggagalkan  reaksi oksidasi  agar  tidak  berlangsung  terus menerus  ,  dan  dapat  mencegah  oksidasi dengan  menstabilkan  radikal  logam  transisi seperti tembaga dan besi (Atta et al ., 2017).
Sumber  antioksidan  dari  bahan  alam  salah satunya adalah tumbuhan tumbuhan gandaria (Rajan & Bhat., 2017).
Gandaria ( Bouea macrophylla Griff.) termasuk Famili Anacardiaceae yang tersebar  luas  di  Asia  Tenggara  termasuk Malaysia,  Indonesia,  Laos,  Thailand,  dan Myanmar (Rajan & Bhat., 2017). Kandungan metabolit sekunder dari buah B. macrophylla adalah  senyawa  fenolik,  tanin,  vitamin  C, flavonoid, flavonol, dan antosianin (Rajan & Bhat.,  2017).  Buah B.  macrophylla juga mengandung  minyak  atsiri  jenis  senyawa hidrokarbon terpen (delta-kadinen, α- terpineol,  β-terpineol,  neral,  santolinatrien,
eugenol, α-copaen, isogermacren D, valencen,  gamma-cadinen,  seline-3,7(11)- diene , globulol, cubeban-11-ol, copaborneol, gamma-eudesmol,  α-muurolol,  aristolon) alkohol (linalool oxide, artemisia alkohol, 1 - hexadecanol )  ester  ( Z-Butanoic  acid,  3- hexenyl ester ) asam ( caprylic acid, nonanoic, dodecanoic  acid,  myristic  acid (Rajan  &
Bhat  2017).  Senyawa  asam  amino  esensial dari  buah B.  macrophylla yaitu,  isoleusin, leusin, penis alanin, metionin, treonin, valin, histidin, lisin, triptofan, sedangkan senyawa asam  amino  non  esensial  dari  buah B. macrophylla yaitu,  alanin,  prolin,  cistein, tirosin, asam  aspartat,  serin,  asam  glutamat, glisin, dan arginin (Rajan et al., 2014).
Beberapa  penelitian  membuktikan bahwa  tumbuhan B.  macrophylla memiliki kemungkinan  sebagai  sumber  antioksidan. Pada  jus  buah B.  macrophylla aktivitas antioksidan  dengan  nilai  IC 50 36,4  mg/mL (Lolaen et  al., 2013).  Ekstrak metanol  buah B.  macrophylla IC 50 sebesar  16,29  ppm (Rajan & Bhat., 2016). Ekstrak kulit buah B. macrophylla memiliki nilai IC 50 44,394 ppm (Indriani et  al., 2018).  Ekstrak  biji B. macrophylla memiliki  IC 50 1,757  g/mL (Indriani et al., 2018). Fraksi aktif ekstrak etil asetat  batang B.  macrophylla dilaporkan memiliki IC 50 sebesar 2,13 ppm (Rudiana et al., 2019).  Ektrak  etanol  kulit  batang B.
macrophylla IC 50 20,03  g/mL,  nilai  IC 50 ekstrak  etanol  daun  gandaria  sebesar  55,83 g/mL  (Andina  &  Musfirah.,  2017).  Dilihat dari  data  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan  peneliti  sebelumnya  tentang tumbuhan B.  macrophylla sebagai  sumber antioksidan yang sangat baik. Oleh karna itu penulis tertarik untuk menganalisis aktivitas antioksidan  dan  inhibisi  enzim  tirosinase ekstrak etanol buah B. macrophylla secara in vitro .

## METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
Dalam penelitian, menggunakan alat-alat  gelas  laboratorium  (Pyrex),  ayakan mesh 40 (ABM), rotary evaporator (Buchi), timbangan  analitik  (Scout  Pro),  oven (Memmert),  tanur  listrik  (Muffle  Furnace) GC  FID  Headspace  (Experis),  ICP-OES (AVIO), multiwell  plate  reader (ELISA) (Bio-Rad),  dan  spektrofotometer  UV-  VIS (Shimadzu).
Dalam penalitian bahan yang digunakan  adalah  sampel  buah  mentah B. macrophylla ,  asetat  anhidrida  (CH 3 CO) 2 O, asam sulfat (H 2 SO 4 2N), asam klorida (HCl 2N), amil alkohol (C 5 H 12 O), besi (III) klorida (FeCl 3 1  %),  akuadest  (H 2 O),  asam  kojat (C 6 H 6 O 4 ), Vitamin C (C 6 H 8 O 6 ), etanol 70% (C 2 H 5 OH),  metanol  (CH 3 OH),  dimetil
sulfoksida (C 2 H 6 OS), pita magnesium (Mg), hidrogen peroksida (H 2 O 2 30% ), timah (II) klorida (SnCl 2%), asam klorida pekat (HCl 4%),  pereaksi  Mayer,  pereaksi  Wagner, dapar posfat, air suling panas bebas klorida, serbuk  DPPH  (2,2 -difenil-1-pikrilhidrazil )  , enzim tirosinase, dan substrat L-DOPA.

## Jalannya Penelitian
Tahapan  –  tahapan  yang  dilakukan dalam  penelitian  dilakukan  dalam  yaitu menentukan tanaman, ekstraksi menggunakan  metode  maserasi.  Dilakukan uji  fitokimia,  uji  aktivitas  antioksidan menggunakan metode DPPH, dan penghambatan  enzim  tirosinase  ekstrak etanol buah B. macrophylla secara in vitro .
1. Persiapan Sampel
Pembuatan Simplisia Buah B. macrophylla Sebanyak  10  kg  buah B. macrophylla dipisahkan dari kotoran kemudian  dibakar  hingga  bersih,  sampel ditiriskan  dan  diiris  kecil-kecil,  bijinya dibuang,  kemudian  dikeringkan  di  bawah sinar  matahari.  Setelah  kering,  sampel dihaluskan,  kemudian  diayak  menggunakan ayakan mesh 40 (Ripaldo., 2020).
1.1. Ekstraksi Buah B. macrophylla
Ekstraksi  buah B.  macrophylla menggunakan  proses  maserasi,  mengikuti metode  Ripaldo  &  Sagala.,  2020  yang dimodifikasi.

## 1.2. Skrining Fitokimia
Skrining  fitokimia  meliputi  uji kualitatif  alkaloid  (Pereaks  Mayer  dan Wagner), flavonoid, tanin, saponin, terpenoid  dan  steroid.  Skrining  fitokimia mengikuti  prosedur  penelitian  skrining fitokimia pada (Konda et al., 2020).
2.  Uji  Aktivitas  Antioksidan  Metode DPPH
2.1. Pembuatan Larutan DPPH 0.5 mM
Serum DPPH (BM: 349.32) 0,009858 g  diencerkan  dengan  metanol  sebagai campuran 50 mL.

## 2.2. Pembuatan Blanko
Disiapkan tabung, kemudian masukan  0,6  mL  larutan  DPPH  0,5  mM dimasukan  ke  dalam  tabung,  ditambahkan 2,4  mL  metanol,  kemudian  dihomogenkan, diinkubasi  pada  suhu  selama  30  menit selanjutnya serapannya diukur pada 515 nm.

## 2.3. Uji Aktivitas Antioksidan
Metode radikal bebas DPPH digunakan  dalam  pengujian  Uji  aktivitas antioksidan  dengan mengikuti metode Charissa  dkk,  2016  yang  dimodifikasi. Metode  DPPH  digunakan  karena  metode DPPH  cocok  untuk  senyawa  –  senyawa fenolik karena Hidrogen dari gugus OH yang terikat pada benzene sehingga metode DPPH cocok  untuk  menguji  aktivitas  antioksidan
untuk  senyawa  –  senyawa  fenolik  atau aromatik.

## 3.  Uji  Aktivitas  Penghambatan  Enzim

## Tirosinase
Sebanyak  1  g  ekstrak  diencerkan dengan  100  mL  dimetil  sulfoksida.  Larutan stok ekstrak 10.000 ppm, ditambahkan dapar fospat  50 mM  pH 6,5.  Konsentrasi  ekstraks adalah 31,25; 62.5; 125; 250; 500; 1000; dan 2000ppm.  Kontrol  positif  yang  digunakan pada  konsentrasi  7.875;  15,75;  31.25;  62.5; 125;  250;  dan  500ppm. Terdapat  perbedaan konsentasi  antara  ekstrak  dengan  kontrol positif  karena  kontrol  positif  asam  kojat merupakan  senyawa  tunggal.  .  70  µL  dari setiap  pengenceran  ekstrak  ditambahkan  30 μL  enzim  tirosinase.  Kemudian  inkubasi pada  suhu  37 o C  selama  5  menit,  kemudian substrat  12 mM  L-DOPA  110  µL dicampur kedalam micro  plate .  Larutan  diinkubasi selama  30  menit  pada  suhu  kamar  sebelum absorbansi  diukur  pada  Panjang  gelombang 510  nm  dengan  menggunakan micro  plate reader (ELISA) (Batubara et al., 2010).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Preparasi Sampel dan Ekstraksi
Sampel  tumbuhan B.  macrophylla dideterminasi di Lembaga Ilmu Pengetahuan (LIPI) Pusat Penelitian Konservasi Tumbuhan  dan  Kebun  Raya  –  LIPI  Bogor
dan  menyatakan  bahwa  tumbuhan  gandaria ( Bouea  macrophylaa Griff)  yang  termasuk famili anacardiaceae dengan nomor surat B- 1615/IPH.3./KS/XII/2020.
Hasil  ekstraksi  sampel  buah B. macrophylla dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil Ekstraksi Sampel
Massa Sampel (g) Ekstrak Kental (g) % Rendemen 1000 200,7 20,07
Sebanyak  10  kg  sampel  mentah B. macrophylla disortasi basah bertujuan untuk memisahkan  kotoran  dari  benda  asing  lalu dikeringkan  Kemudian  dihaluskan  hingga didapat  serbuk  simplisia  (Wathan et  al., 2020). Hasil serbuk tanaman simplisia buah B.  macrophylla didapatkan  sebanyak  1  kg berwarna kuning kecoklatan. Metode maserasi  dipilih  untuk  mencegah  terjadinya penguraian zat aktif yang terkandung dalam sampel karena pemanasan, sehingga metode maserasi  dapat  digunakan  untuk  menyari bahan  yang  tidak  tahan  panas  atau  rusak karena  pemanasan  (Mutmainnah et  al., 2018). Etanol 70% digunakan sebagai pelarut untuk  pembuatan  ekstrak.  Sifat  etanol  yang memiliki  polaritas  yang  lebar  dari  mulai senyawa non polar sampai polar merupakan alas  an  utama.  Dan  jika  dibanding  dengan pelarut  lain  terkait  toksisitas,  maka  etanol 70% tidak toksik (Mutmainnah et al ., 2018). Agar  senyawa  aktif  yang  terkandung  dalam
Jayantie et al.;AKtivitas Antioksidan dan…..Pharmacoscript Volume 5 No. 1, Februari 2022
ekstrak  tidak  rusak,  maka  penguapan dilakukan  dengan rotary  evaporator untuk memperoleh ekstrak kental yang baik karena suhunya yang dapat diatur (Mutmainnah et al ., 2018). Ekstrak kental buah B. macrophylla yang  didapatkan  sebanyak  200,7  g  dan memiliki persen rendemen 20,07% (Tabel 1). Tingginya hasil dari ekstraksi berupa ekstrak kental dapat dilihat dari hasil rendemen suatu sampel.  Banyaknya  kandungan  senyawa aktif yang terkandung didalam sampel dapat
dilihat  dari  semakin  banyaknya  jumlah rendemen  yang  dihasilkan  (Hasnaeni  dkk., 2019).

## 2. Skrining Fitokimia
Hasil skrining fitokimia ekstrak etanol 70% buah B. macrophylla dapat dilihat pada Tabel  2.  Kandungan  metabolit  sekunder dalam  ekstrak  etanol  buah B.  macrophylla yaitu  fenolik,  tannin,  alkaloid,  saponin, flavonoid dan steroid.

## Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia
Pengujian Pereaksi Pengamatan Hasil Alkaloid Mayer Wagner Menghasilkan endapan putih Menghasilkan endapan coklat Positif Alkaloid Flavonoid Pita Mg + HCl + amil alkohol Warna  jingga  dilapisan  amil alcohol Positif Flavonoid Tanin FeCl 3 Warna hijau kehitaman Positif Tanin Steroid dan Triterpenoid Asetat anhidrat + H 2 SO 4 Warna hijau Positif Steroid Saponin H 2 O + HCl Buih tidak hilang Positif Saponin Fenolik FeCl 3 Warna biru kehitam Positif Fenolik

## 3. Uji Aktivitas Antioksidan
Adanya  perubahan  intensitas  warna menjadi  kuning  dari  semula  warna  ungu merpakan  prinsip  aktivitas  antioksidan menggunakan  metode  DPPH  yang  diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis sehingga  akan  diketahui  nilai  IC 50 .  Radikal bebas  yang  dapat  diredam  sebanyak  50% oleh senyawa uji dapat didefinisikan sebagai nilai  IC 50 .  Nilai  IC 50 yang  semakin  kecil
maka  dapat  dinyatakan  bahwa  aktivitas peredaman radikal bebas yang makin tinggi. Alat  yang  digunakan  pada  pengukuran aktivitas  antioksidan  yaitu  spektrofotometri UV-Vis dengan panjang gelombang 515 nm (Wahid et al., 2017).
Aktivitas  antioksidan  ekstrak  etanol buah B. macrophylla dilakukan secara triplo, pengukuran  serapan dilakukan  setelah inkubasi selama 30 menit. Tujuan dilakukan
inkubasi selama 30 menit agar reaksi antara larutan  sampel  dengan  larutan  DPPH berlangsung  sempurna  (Handayani  dkk., 2020). Sebagai pembandingnya menggunakan  Vitamin  C  sebagai  kontrol positif  karena  bekerja  sebagai  antioksidan sekunder  yaitu  mencegah  terjadinya  reaksi berantai,  antioksidannya  sangat  tinggi, Vitamin  C  mudah  didapat  dan  lebih  polar dari vitamin yg lain (Damaris dkk., 2020).
Aktivitas  antioksidan  ekstrak  etanol buah B.  macrophylla memiliki  nilai  IC 50 47,064  ppm  sedangkan  Kontrol  positif vitamin C didapatkan  IC 50 5,845 ppm Hasil tersebut  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol buah B. macrophylla dan vitamin C memiliki sifat antioksidan kategori sangat kuat karena IC < 50. Daya aktivitas antioksidannya dapat dilihat  dari  nilai  IC 50 ,  semakin  kuat  daya aktivitas  antioksidan  maka  semakin  kecil nilai  IC 50 nya  Vitamin  C  memiliki  aktivitas antioksidan yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan ekstrak etanol buah B. macrophylla memiliki  aktivitas  antioksidan lebih  rendah  Hal  ini  dikarenakan  ekstrak terdiri  dari  beberapa  campuran  senyawa sedangkan  vitamin  C  merupakan  senyawa murni  (Mokoginta  dkk.,  2020).  Dengan demikian, ekstrak etanol buah B. macrophylla merupakan  jenis  tumbuhan yang memiliki kemampuan antioksidan yang
sangat  kuat  karena  pengaruh  dari  senyawa metabolit  sekunder  yang  terkandung  dalam ekstrak etanol buah B. macrophylla (Bahriul dkk., 2014).
4. Uji Aktivitas
Inhibisi Enzim

## Tirosinase
Pengujian  aktivitas  penghambatan enzim tirosinase dilakukan untuk mengetahui kemampuan  senyawa  bioaktif  pada  ekstrak etanol  buah B.  macrophylla terhadap aktivitas  penghambatan  enzim  tirosinase Aktivitas  inhibitor  tirosinase  dilakukan secara in vitro berdasarkan penurunan jumlah dopakrom yang merupakan hasil oksidasi L- DOPA  oleh  enzim  tirosinase.  Warna  jingga tua  hingga  merah  menunjukkan  adanya dopakrom  yang  terbentuk.  Jika  aktivitas tirosinase  terhambat  maka  intensitas  warna dopakrom akan menurun sehingga absorbansi  dapat  diukur  menggunakan microplate  reader (ELISA)  pada  panjang maksimum 510 nm (Tristiyanti et al., 2020). Metode
ELISA ( Enzyme linked Immunosorbent  Assay )  merupakan  analisis kuantitatif dan kualitatif yang sangat sensitif dan selektif terhadap antigen reaksi antibodi yang  menggunakan  substrat  reaksi  dengan enzim.  Reaksi  dinyatakan  positif  apabila menghasilkan produk  yang berwarna. untuk menghasilkan produk berwarna (Sakamoto et al., 2018).  Tirosinase  adalah  dua  reaksi
utama  dalam  biosintesis  melanin,  yaitu hidroksilasi  L-tirosin  menjadi  L-dopa  dan oksidasi L-dopa menjadi dopakuinon, kemudian  dopakuinon  akan  berpolimerisasi mebentuk dopakrom yang kemudian menjadi melanin.  .Penghambatan  tirosinase  sangat penting  sebagai  agen  depigmentasi  pada gangguan  hiperpigmentasi,  penghambatan tirosinase  akan  menghambat  pembentukan melanin  atau  reaksi  pencoklatan  (Petrillo et al ., 2016).
Gambar  1. Mekanisme  Pengujian  Inhibisi Tirosinase (Rohmat dkk.,
2019). Penghambatan enzim tirosinase ekstrak etanol buah B. macrophylla dilakukan  secara  triplo,  subsrat  yang digunakan  L-DOPA  karena  berdasarkan reaksi  yaitu  pengujian  yang  dihasilkan produk dopakrom dimana nilai serapan dapat diukur dengan metode spektrofotometri UV- VIS optimum (Umrah Noor and Magdalena 2018).  Pelarut  yang  digunakan  dalam pengenceran untuk deret konsentrasi pada uji enzim  tirosinase  ekstrak  etanol  buah B. macrophylla yaitu
DMSO
( Dimethylsulfoxide ). DMSO yang digunakan adalah 0,01%, apabila lebih dari konsentrasi
tersebut  maka  diduga  akan  mengganggu reaksi  pengujian  kegiatan  enzim  tirosinase tersebut. Larutan dapar dengan pH 6,5 yang digunakan karena pH ini adalah pH optimum pada  reaksi  katalisis  enzim  tirosinase. Sampel  uji  diinkubasi  pada  ruangan  37 o C selama  30  menit  dan  ketika  inkubasi  enzim selama  30  menit  telah  diklaim  relatif  untuk dapat  bekerja.  Pengujian  aktivitas  inhibitor enzim  tirosinase  menggunakan microplate reader (ELISA)  karena  mempunyai  sifat sensitifitas  yang  tinggi,  kecepatan  deteksi yang tinggi, serta sangat akurat. Asam kojat digunakan sebagai pembanding atau kontrol positif.  Kontrol  positif  yang  digunakan merupakan inhibitor enzim tirosinase dengan daya hambat dan kestabilan yang  tinggi pada suatu  kosmetik  pencerah  kulit,  dan  juga memiliki  kemampuan  untuk  mengkelat logam  tembaga  pada active  site enzim tirosinase  (Purnamasari  &  Sagala.,  2020). Akan  tetapi  penggunaan  asam  kojat  secara berlebihan  dapat  menyebabkan  alergi  pada kulit manusia (Kurniasari 2018).
Nilai  penghambatan  aktivitas  enzim tirosinase ekstrak etanol buah B. macrophylla konsentrasi 2000 ppm merupakan konsentrasi tertinggi yang memiliki  penghambatan  terhadap  persen penghambatan  L-DOPA  47,529%  Asam kojat  yang  digunakan  sebagai  kontrol
konsentrasi  positif  500  ppm  merupakan konsentrasi tertinggi yang memiliki penghambatan terhadap persen penghambatan L-DOPA 95,569%.
Peningkatan  kemampuan  inhibisi  yang dihasilkan,  emakin  tinggi  konsentrasi  yang digunakan, yang ditandai dengan penurunan pembentukan  dopakrom  serta  penurunan intensitas  rona  yang  terbentuk  (Sagala  & Telaumbanua.,  2020).  Tujuan  diperolehnya data dalam bentuk presentase untuk mengetahui  skala  perbandingan  aktivitas enzim  pada  setiap  konsentasi  sampel (Syamsuri et al., 2020).
Gambar  2. Dugaan  Reaksi  Inhibisi  Enzim Tirosinase  Dengan  Asam  Kojat  (Ashooriha et al., 2019).
Asam  kojat  memiliki  struktur  aktif dengan tirosin (ligan) adanya gugus hidroksi yang merupakan tempat untuk mengikat ion tembaga  dari  tirosinase  dan  membentuk komplek  dengan  logam  (Ashooriha et  al ., 2019).
Ekstrak  etanol  buah B.  macrophylla memiliki  senyawa  metabolit  sekunder  yang dapat menjadi penghambat enzim tyrosinase. Flavonoid adalah salah satu turunan polifenol
yang  tersebar  di  berbagai  buah,  daun,  biji pada  suatu  tanaman.  Flavonoid  memiliki aktivitas  sebagai  antivirus,  antiinflamasi, antioksidan  dan  antikanker  (Owalobi et  al., 2020).  Mentransfer  electron  pada  radikal bebas,  menghambat  oksidasi,  mengaktifkan antioksidan  enzimatik  dan  mengikat  katalik logam merupakan efek perlindungan flavonoid  dalam  sistem  biologi.  Fungsi  dari flavonoid  juga  sebagai  antioksidan  untuk menangkap  radikal  bebas,  dansalah  satunya adalah  melagenesis  yang  diakibatkan  oleh ROS  dapat  dihambat  dan  dinetralisasi. (Sholikha et  al., 2020).  Senyawa  fenolik seperti  flavonoid  dapat  bertindak  sebagai inhibitor  tirosinase  pada  reaksi  enzimatik. Untuk  masuk  ke  dalam  sisi  aktif  enzim, terjadi  kompetensi  antara  inhibitor  dengan substrat  karena  struktur  pada  flavonoid memiliki  penghambatan  dengan  substrat. (Cichorek et al., 2013).  Senyawa  fenolik seperti flavonoid memiliki aktivitas menghambat proses produksi melanin berlebih  dan  juga  dapat  bertindak  sebagai substrat  alternatif  untuk  enzim  tirosinase Senyawa  flavonoid  menunjukkan  suatu enzim  yang  baik  dengan  pembentukan dopakrom dapat mencegah Semakin banyak dopakrom yang dihasilkan maka penghambatan enzim tirosinase tidak terjadi, sebaliknya  apabila  penghambatan  enzim

## Pharmacoscript Volume 5 No. 1 Februari 2022
tirosinase  terjadi  maksimal  maka  artinya dopakrom  tidak  terbentuk  (Mustika et  al., 2020).
Reaksi penghambatan enzim tirosinase oleh flavonoid, fenolik, dan steroid dapat  disebabkan  oleh  interaksi  gugus  OH dari  senyawa-senyawa  tersebut  dengan radikal  bebas  yang  terdapat  pada  sisi  aktif enzim  atau  pada  ion  tembaga  (Cu)  yang merupakan active  site enzim  tirosinase.  jua jumlah  gugus  hidroksil  berperan  penting pada  proses  penghambatan  aktivitas  enzim tirosinase (Mustika et al., 2020).

## KESIMPULAN
Dari hasil penelitian dan pembahasan maka bisa dirancang konklusi bahwa ekstrak etanol  butir  B.  macrophylla  mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, saponin,  tannin,  flavonoid,  steroid,  serta fenolik. Nilai IC 50 untuk aktivitas antioksidan dari B. macrophylla yaitu 47,064 ppm  yang  membuktikan  bahwa  ekstrak tersebut  memiliki  aktivitas  antioksidan dengan kategori sangat kuat.
Aktivitas  inhibisi  enzim  tirosinase ekstrak etanol buah B. macrophylla berbanding  lurus  dengan  konsentrasi  rata- rata  persen  inhibisi  berturut  turut  pada konsentrasi 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000 dan  2000  ppm  adalah  13,442;  13,673;
16,667; 21,911; 22,122; 41,953 dan 47,529%.  Semakin  tinggi  konsentrasi  yang digunakan,  semakin  besar  inhibisi  yang dihasilkan.

## DAFTAR PUSTAKA
Andina,  Lisa,  and  Yaumi  Musfirah.  2017.
“Total Phenolic Content of Cortex And Leaves of Ramania ( Bouea Macrophylla Griffith) and Antioxidant Activity  Assay  by  DPPH  Method.”
Rjpbcs 8(1): 134–40.
Ashooriha,  Morteza  et  al.  2019.  “1,2,3- Triazole-Based Kojic Acid Analogs as Potent  Tyrosinase  Inhibitors:  Design, Synthesis  and  Biological  Evaluation.”
Bioorganic Chemistry 82(October 2018): 414–22.
https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2018.
10.069.
Atta,  Emad  M,  Nawal  H.  Mohamed,  and Ahmed  A.  M.  Abdelgawad.  2017. “Antioxidants:  An  Overview  on  the
Natural and Synthetic Types.”
European Chemical Bulletin 6(8): 365. Batubara, Irmanida et al. 2010. “Potency of Indonesian Plants as Tyrosinase Inhibitor  and  Antioksidan  Agent.” Journal  of  Biological  Sciences 10(2): 138–44.
Bahriul, P., Rahman, N., & dan Diah, A. W.
M.  2014.  Uji  Aktivitas  Antioksidan
Ekstrak Daun Salam ( Syzygium polyanthum )  Dengan  Menggunakan
1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil. Jurnal Akademika Kimia . 3 (3) : 143-149.
Charissa,  M.,  Djajadisastra,  J.,  &  Elya,  B.
2016.  Uji  Aktivitas  Antioksidan  dan Penghambatan  Tirosinase  serta  Uji Manfaat  Gel  Ekstrak  Kulit  Batang Taya ( Nauclea subdita ) terhadap Kulit.
Jurnal Kefarmasian Indonesia . 6 (2) :
98-107.
Cichorek, Mirosława, Małgorzata Wachulska,  Aneta  Stasiewicz,  and Agata Tymińska. 2013. “Skin Melanocytes: Biology and
Development.” Postepy Dermatologii i Alergologii 30(1): 30–41.
Damanis,  F. V. M.,  Wewengkang,  D. S.,  & Antasionasti,  I.  2020.  Uji  Aktivitas Antioksidan  Ekstrak  Etanol Ascidian
Herdmania  momus Dengan  Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil).
PHARMACON . 9 (3) : 464- 469.
Fadlilaturrahmah.,  Wathan,  N.,  Firdaus,  A. R., & Saufy Arishandi. 2020. Pengaruh Metode  Ekstraksi  Terhadap  Aktivitas Antioksidan  dan  Kadar  Flavonoid Daun  Kareho  ( Callicarpa  Longifolia
Lam). PHARMA XPLORE . 5 (1) : 23- 33.
Goenka, Shilpi, and Jimmy Toussaint. 2020.
“Citrate-Coated Platinum Nanoparticles  Exhibit  a  Primary Particle-Size  Dependent  Effect  on Stimulating  Melanogenesis  in  Human Melanocytes.” Cosmetics 7(4): 1–15.
Handayani,  S.,  Najib,  A.,  Wisdawati.,  & Khoiriyah, A. 2020. Aktivitas Antioksidan Caulerpa  lentillivera J.
Agardh  Dengan  Metode  Perendaman
Radikal
Bebas 1,1-dhypenyl-2-
picrylhydrazil. Jurnal  Kesehatan .  13
(1) : 61-70.
Hasnaeni.,  Wisdawati.,  &  Usman,  S.  2019.
Pengaruh  Metode  Ekstraksi  Terhadap Rendemen Dan Kadar Fenolik Ekstrak Tanaman  Kayu  Beta-Beta  ( Lunasia amara Blanco). Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmacy). 5 (2) : 175-182.
Indriani,  Vinny,  Novita  Eka  Kartab  Putri Tobing,  and  Laode  Rijai.  2018.
“Formulasi Self-Nanoemulsifying
Drug  Delivery  System  (SNEDDS)
Ekstrak Biji
Ramania ( Bouea Macrophylla Griff)  Dengan  Asam Oleat  (Oleic  Acid)  Sebagai  Minyak
Pembawa.” Proceeding of Mulawarman Pharmaceuticals

## Pharmacoscript Volume 5 No. 1 Februari 2022
Conferences 8(November 2018): 276– 84.
Konda,  Josepin  P  et  al.  2020.  “Aktivitas Antioksidan  Ekstrak  Metanol  Biji Langsat  ( Lansium  Domesticum  Var.
Pubescens)  Dan  Duku  ( Lansium
Domesticum Var . Domesticum)
Dengan Metode DPPH.” Jurnal Ilmiah Sains 20(2): 113.
Kong,  Saerom  et  al.  2020.  “Milk  Protein- Derived  Antioxidant  Tetrapeptides  as Potential  Hypopigmenting  Agents.”
Antioxidants 9(11): 1–12.
Kurniasari,  Aprillia,  Effionora  Anwar,  and Joshita  Djajadisastra.  2018.  “Potensi Ekstrak Biji Coklat ( Theobroma Cacao Linn)  Sebagai  Inhibitor  Tirosinase Untuk Produk Pencerah Kulit.” Jurnal Kefarmasian Indonesia .
Lolaen,  Landy  A  Ch,  Fatimawali,  and Gayatri  Citraningtyas.  2013.  “Uji
Aktivitas Antioksidan Kandungan
Fitokimia  Jus  Buah  Gandaria  ( Bouea Macrophylla Griffith).” Jurnal  ilmiah
Farmasi 2(02): 1–8.
Mustika,  Rina,  Siti  Hindun,  and  Nurul
Auliasari.  2020.  “Potensi  Tanaman Sebagai  Pencerah  Wajah  Alami.”
Jurnal Sains dan Kesehatan 2(4): 558–
62. https://jsk.farmasi.unmul.ac.id.
Mutmainnah. 2018. “Mutmainnah.”
Lantanida Journal, Vol. 6 No. 1 (2018) 1-102 6(1): 1–11. Mutmainnah,  Nurul,  Sitti  Chadijah,  and Muhammad Qaddafi. 2018.
“penentuan  suhu  dan  waktu  optimum penyeduhan batang teh hijau ( Camelia Sinensis L.)  Terhadap  kandungan antioksidan kafein, tanin dan katekin.” Lantanida Journal 6(1): 1.
Neupane, Rabin et al. 2020. “Alternatives to Biological Skin in Permeation Studies: Current  Trends  and  Possibilities.”
Pharmaceutics 12(2).
Owolabi, J. O., Fabiyi, O. S., Adelakin, L. A.,
&  Ekwerike,  M.  C.  2020.  Effects  of Skin  Lightening  Cream  Agents  – Hydroquinone and Kojic Acid,  on the Skin  of  Adult  Female  Experimental Rats. Clinical, Cosmetic and Investigational  Dermatology .  2020
(13) : 283-289.
Petrillo,  Amalia  et  al.  2016.  “Tyrosinase
Inhibition  and  Antioxidant  Properties of Asphodelus Microcarpus Extracts.” BMC  Complementary  and  Alternative
Medicine 16(1): 1–9.
http://dx.doi.org/10.1186/s12906-016- 1442-0.
Purnamasari,  Dini  Rizky,  and  Zuraida Sagala.  2020.  “Uji  Aktivitas  Inhibitor Enzim Tirosinase Ekstrak Etanol Daun
Bidara  Arab  ( Ziziphus  Spina-Christi
L.) Secara in Vitro.” Іndоnеѕіа Nаturаl
Rеѕеаrсh  Рhаrmасеutісаl  Jоurnаl 5(1): 35–44.
Putri,  N.  E.  K.  2018.  Aktivitas  Antioksidan Ekstrak  Metanol  Kulit  Buah  Ramania ( Bouea  macrophylla Griff)  dengan
Metode DPPH. Proceeding of Mulawarman Pharmaceuticals
Conferences . 7 (1) : 28-31
Rajan, Nithiya Shanmuga, and Rajeev Bhat.
2017. “Volatile Constituents of Unripe and  Ripe  Kundang  Fruits  ( Bouea Macrophylla Griffith).” International Journal  of  Food  Properties 20(8): 1751–60. https://doi.org/10.1080/10942912.201 6.1218892.
Rajan, Nithiya Shanmuga, Rajeev Bhat, and A.  A.  Karim.  2014.  “Preliminary Studies on the Evaluation of
Nutritional Composition of Unripe and Ripe ‘Kundang’ Fruits ( Bouea Macrophylla Griffith).” International Food Research Journal 21(3): 949–54.
Ripaldo,  firganta.  2020.  “uji  aktivitas inhibitor  enzim  tirosinase  dan  uji antioksidan ekstrak etanol buah harendong
( Melastoma Malabathricum L.)  Secara  in  vitro.” Indonesia Natural
Research
Pharmaceutical Journal 5(1): 114–29. Rudiana, Tarso et al. 2019. “Characterization of Antioxidative Fraction of Plant Stem B ouea Macrophylla Griff.” Journal of Physics: Conference Series 1341(7).
Rohmat, A., Kardono, L., & Lotulung, D. P. 2019. Isolasi dan Bioinhibitor Aktivitas  Enzim  Tirosinase  Dari Ekstrak Etil Asetat Padi Hitam ( Oryza Sativa L  Indica). Borneo  Journal  of Phamascientech . 3 (2) : 153-159.
Sagala,  Zuraida,  and  Kurnia  Telaumbanua. 2020.  “Formulasi,  Uji  Stabilitas  Dan Aktivitas  Inhibitor  Enzim  Tirosinase Sediaan  Krim  Dari  Ekstrak  Buah
Harendong ( Melastoma Affine
D.Don).” Indonesia  Narutal  Research Pharmaceutical Journal 5(2): 149–73. Sakamoto,  Seiichi  et  al.  2018.  “Enzyme- Linked  Immunosorbent  Assay  for  the Quantitative/Qualitative  Analysis  of Plant Secondary Metabolites.” Journal of  Natural  Medicines 72(1):  32–42. https://doi.org/10.1007/s11418-017- 1144-z.
Shanmuga Rajan, Nithiya, and Rajeev Bhat.
2016.  “Antioxidant  Compounds  and Antioxidant  Activities  in  Unripe  and
Ripe Kundang Fruits ( Bouea Macrophylla Griffith).” Fruits 71(1): 41–47.
Sholikha, Munawarohthus, Amelia Febriani, and  Ajeng  Wahyuningrum.  2020. “Formulasi  Gel  Ekstrak  Lobak  ( Raphanus  Sativus L  .  )  Sebagai Antioksidan Dan Inhibitor Tirosinase.”
Jurnal Ilmu Kefarmasian 13(1): 15–20.
Solano,  Francisco.  2020.  “Photoprotection and  Skin  Pigmentation:  Melanin- Related  Molecules  and  Some  Other New  Agents  Obtained  from  Natural Sources.” Molecules 25(7): 1–18.
Syamsuri,  S.,  Khaerani,  and  Hasrawati.
2020.  “pengujian  aktivitas  inhibitor enzim tirosinase ekstrak n-heksan dari umbi  wortel  ( Daucus  Carrota L.).” Jurnal  Farmasi  Fakultas  Kedokteran dan  Ilmu  Kesehatan  UIN  Alaudin Makassar 8(2): 1–8.
Tristiyanti,  Deby,  Ledianasari,  and  Silva Oktaviani.  2020.  “Inhibitory  Activity of  Tyrosinase  Enzyme  on  Lotion
Contains Pear ( Pyrus Pyrifolia
(Burm.F)  Nakai)  Rind  Extract.”  26:
88–91.
Umrah  Noor,  Siti,  and  Pamela  Magdalena.
2018.  “Uji  Aktivitas  Inhibisi  Enzim
Tirosinase In-Vitro Krim Ekstrak Akar
Manis  ( Glycyrrhiza  Glabra L.)  (In
Vitro  Enzyme  Tyrosinase  Inhibitory Activity  Test  on  Liquorice  Root Extract  Cream  ( Glycyrrhiza  Glabra
L.).” Jurnal Ilmu Kefarmasian
Indonesia .
Wahid, Anang, M Diah, and Minarni Rama. 2017. “uji aktivitas antioksidan ekstrak air  dan  ekstrak  etanol  daun  kelor  ( Moringa  Oleifera LAM  )  Antioxidant Activity  Tests  of  Water  and  Ethanol Extracts  of  Moringa  ( Moringa Oleifera LAM  )  Leaves.”  6(May): 125–31.
Wathan,  Nashrul,  Akhmad  Rezeki  Firdaus,
and Saufy
Arishandi. 2020. “antioksidan dan kadar flavonoid daun kareho  ( Callicarpa  Longifolia Lam  ) The  effect  of  extraction  method  on antioxidant  activity  and  flavonoid levels  of  kareho  leaves  ( Callicarpa Longifolia Lam  ).” Pharma  Xplore 5(1): 23–33.