ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 19 (3) (2016) : 83 – 86
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa

## Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH fraksi Etil Asetat Daun
Bidens pilosa L.
Retno Sariningsih a , Meiny Suzery a* , Bambang Cahyono a
a Organic Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: meiny.suzery@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o

## A b s t r a c t
Keywords: Bidens pilosa , ethyl acetate fraction, DPPH, total phenolate and flavonoids
Research on antioxidant activity test with DPPH fraction of ethyl acetate of Bidens pilosa leaf. L. has conducted. The objective of this study was to obtain an ethyl acetate fraction from the methanol fraction of Bidens pilosa L., to obtain data on antioxidant activity, total phenolic and flavonoid content of the ethyl acetate fraction. This study was conducted in three  stages.  The  first  step  was  the  provision  of  ethyl  acetate  fraction  by  means  of stratified extraction of methanol extract. The second stage was antioxidant activity test with  DPPH,  total  phenolate  analysis  with  Folin-Ciocalteu  method  and  total  flavonoid analysis.  The  results  showed  that  ethyl  acetate  fraction  with  0.31%  yield  of  the  initial simplicia  weight  with  brown  color  having  IC 50 value  of  62,03  ppm,  total  content  of phenolate  equal  to  71.717 mg equivalent of galic  acid/g  extract,  total flavonoid  content 565.108 mg equivalent quercetin/g extract. The ethylacetate fraction of leaf Bidens pilosa L. is antioxidant but needs further research on secondary metabolite compounds that are anti oxidant.

## A b s t r a k
Kata Kunci: Bidens pilosa , fraksi etil asetat, DPPH, total fenolat dan flavonoid Telah dilakukan penelitian uji aktivitas antioksidan dengan DPPH fraksi etil asetat daun Bidens  pilosa L.  Tujuan  penelitian  ini  untuk  memperoleh  fraksi  etil  asetat  dari  fraksi metanol Bidens pilosa L, memperoleh data aktivitas antioksidan, kadar total fenolat dan flavonoid  dari  fraksi  etil  asetat.  Penelitian  ini  dilakukan  dalam  tiga  tahapan.  Tahapan pertama adalah penyediaan fraksi etil asetat dengan cara ekstraksi bertingkat dari ekstrak metanol. Tahapan yang kedua adalah uji aktivitas antioksidan dengan DPPH, analisis total fenolat  dengan  metode Folin-Ciocalteu dan  analisis  total  flavonoid.  Hasil  penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat dengan rendemen 0,31% dari berat simplisia awal dengan warna coklat yang mempunyai nilai IC 50 62,03 ppm, kadar total fenolat sebesar 71,717  mg  ekuivalen  asam  galat/g  ekstrak,  kadar  total  flavonoid  565,108  mg  ekuivalen kuersetin/g  ekstrak.  Fraksi  etilasetat  daun Bidens  pilosa L  bersifat  sebagai  antioksidan namun perlu dilalukan penelitian lebih lanjut terhadap senyawa metabolit sekunder yang bersifat sebagai anti oksidan.

## 1. Pendahuluan
Bidens  pilosa merupakan  tanaman  dari  family Asteraceae,  yang  banyak  ditemukan  di  negara  negara tropis dan subtropis. Di daerah Jawa Tengah tumbuhan ini  dikenal  dengan  nama  “ketul”  atau  “ajeran”. Kandungan  minyak  atsiri  tanaman Bidens  pilosa berpotensi sebagai antioksidan dan juga antibakteri [1].
Sedangkan  senyawa  flavonoid  seperti  Centaurein  dan Centaureidin dimanfaatkan untuk menstimulasi ekspresi interferon-gama  [2],  senyawa  kuersetin  berfungsi sebagai agen antioksidan dan efek hepatoprotektif atau melindungi organ hati [3]. Berdasarkan penelitian yang telah  dilakukan  sebelumnya,  tanaman Bidens  pilosa mempunyai  senyawa  metabolit  sekunder  seperti
poliasetilen,  flavonoid  [4],  seskuiterpen,  dan  diterpen. Senyawa-senyawa  tersebut  dapat  berupa  senyawa fenolik  maupun  non  fenolik.  Senyawa  yang  telah dilaporkan  tersebut  seperti  flavonoid  dan  terpenoid dapat  bergungsi  sebagai  agen  antioksidan.  Penentuan aktivitas  antioksidan  pada  tanaman Bidens  pilosa yang pernah  dilakukan  adalah  menggunakan  metode  FRAP, radikal hidroksil (OH) dengan metode deoksiribosa, dan metode  DPPH  [3].  Metode  DPPH  pada  umumya digunakan untuk peredaman radikal bebas dari senyawa- senyawa  yang  mengandung  gugus  hidroksil  sebagai akibat  dari  reaksi  radikal  bebas  dari  2,2  difenil-1- pikrilhidrazil  dengan  senyawa  fenolat.  Penelitian mengenai Bidens  pilosa hingga  kini  banyak  diarahkan pada  uji  aktivitas,  kebanyakan  menggunakan  ekstrak total atau senyawa murni dari golongan fenolat.
Usaha  untuk  memperoleh  ekstrak  yang  lebih  aktif dibanding  dengan  crude  total,  secara  teoritis  dapat dilakukan melalui proses pemisahan. Pada penelitian ini proses pemisahan dilakukan dengan cara ekstraksi cair- cair dan dengan kromatografi kolom. Ekstraksi cair-cair dilakukan  dengan  menggunakan  berbagai  pelarut dengan  kepolaran  yang  berbeda  yaitu  n-heksan, diklorometan, dan etil asetat, selanjutnya penelitian ini difokuskan  terhadap  fraksi  etil  asetat.  Terhadap  fraksi etil  asetat  dilakukan  uji  penapisan  fitokimia,  dan beberapa analisis seperti uji aktivitas antioksidan dengan DPPH, analisis total fenolat dan flavonoid.

## 2. Metode Penelitian

## Penetuan aktivitas antioksidan menggunakan DPPH
Sebanyak  0,05  g  ekstrak  metanol  dilarutkan kedalam 50 mL metanol 96%. Hal yang sama dilakukan pula  dalam  membuat  larutan  fraksi  etil  asetat,  air  dan dibuat  dengan  berbagai  variasi  konsentrasi  20,  40,  60, 80, 100 mg/L. Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan terhadap berbagai konsentrasi dengan memasukkan 0,2 ml larutan sampel ke dalam vial dan direaksikan dengan 3,8  ml  larutan  DPPH  induk.  Campuran  dihomogenkan dan  didiamkan  selama  30  menit  di  tempat  gelap  serta ditentukan serapannya menggunakan Spektrofotometer UV-Vis  pada  panjang  gelombang  516,5  nm.  Senyawa kuersetin  digunakan  sebagai  pembanding.  Kemampuan untuk meredam radikal DPPH (inhibisi) ditentukan dari nilai serapan yang dihasilkan dengan persamaan:
Analisis  total  Flavonoid.  Kurva  standar  kuersetin dilakukan  dengan  cara  membuat  larutan  (dalam metanol) dengan  konsentrasi 700,  800,  900,  1000,  dan 1100  mg/L.  Sebanyak  0,5  ml  larutan  dari  berbagai konsentrasi direaksikan dengan 2 ml akuades dan 0,15 ml NaNO 2 5%  kemudian  didiamkan  selama  6  menit. Sebanyak  0,15  ml  AlCl 3 10%  ditambahkan  ke  dalam larutan, kemudian didiamkan kembali 6 menit. Larutan direaksikan  dengan  2  ml  NaOH  4%,  kemudian diencerkan  hingga  volume  total  mencapai  5  ml  dan didiamkan  selama  15  menit.  Pada  akhirnya,  absorbansi dari larutan standar diukur pada panjang gelombang 510 nm  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis.  Kurva
standar  diperoleh  dari  hubungan  antara  konsentrasi quersetin (mg/L) dengan absorbansi.
Analisis Total Flavonoid Sampel. Sebanyak 0,3 gram fraksi  etil  asetat  dilarutkan  dengan  metanol  hingga volume  10  ml.  Sebanyak  0,5  ml  larutan  ekstrak dicampurkan  dengan  2  ml  akuades  dan  0,15  ml  NaNO 2 5%.  Setelah  didiamkan  selama  6  menit,  larutan ditambahkan  dengan  0,15  ml  AlCl 3 10%  dan  didiamkan kembali  6  menit.  Larutan  ditambahkan  2  ml  NaOH  4% dan diencerkan hingga volume 5 ml. Larutan digojok dan didiamkan  selama  15  menit.  Larutan  kemudian  diukur serapannya  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis pada  panjang  gelombang  510  nm  (dilakukan pengenceran  seperlunya  agar  masuk  dalam  kurva standar). Kadar flavonoid yang diperoleh merupakan mg ekuivalen quersetin/gram sampel.
Analisis  fenolat  total.  Analisis  kuantitatif  fenolat total  dilakukan  sesuai  menggunakan  metode  yang dilakukan  oleh  Lim  dan  Quah  [5]  terhadap  fraksi  yang menunjukkan tes positif adanya senyawa fenolat. Kurva kalibrasi  asam  galat  dibuat  dengan  variasi  konsentrasi antara  300,  400,  500,  600,  700  mg/L.  Masing-masing larutan  dipindahkan  ke  botol  vial,  kemudian ditambahkan  1  ml  reagent  Folin-Ciocalteu.  Campuran didiamkan selama 5 menit kemudian ditambahkan 3 ml Na 2 CO 3 20% dan dikocok lalu dibiarkan selama 1 jam pada suhu  ruang.  Absorbansi  seluruh  sampel  diukur  pada panjang  gelombang  763,5  nm  dengan  menggunakan spektrofotometer  dan  dibuat  kurva  kalibrasi  hubungan antara  konsentrasi  asam  galat  (mg/L)  dengan absorbansi.
Analisis fenolat total sampel. Sebanyak 0,2 mL dari fraksi etil asetat diencerkan dengan aquades 15,8 mL dan direaksikan  dengan  1  mL  reagen  Folin-Ciocalteau selanjutnya  dihomogenkan  serta  didiamkan  selama  8 menit.  Setelah  pengocokan  dan  pendiaman,  sebanyak  3 mL Na 2 CO 3 20% ditambahkan ke dalam larutan, dikocok sampai  homogen  dan didiamkan  selama 30 menit  pada suhu  ruang.  Larutan  kemudian  ditentukan  absorbansi pada λ = 763,5 nm menggunakan Spektrofotometer UV- Vis. Kandungan total fenolat dinyatakan sebagai jumlah mg ekuivalen asam galat/g ekstrak.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Hasil Fraksinasi dan Uji Penapisan Fitokimia.
Hasil  fraksinasi  menggunakan  pelarut  etil  asetat diperoleh  fraksi  seberat  8,61  gram  berwarna  coklat dengan rendemen fraksi 0,31 % dari berat simplisia awal. Hasil fraksinasi ini diperoleh melalui fraksi cair cair dari fraksi metanol dari daun Bidens pilosa L (2,7 kg) simplisia kering.
Tabel 1: Hasil uji penapisan fitokimia fraksi etil asetat beserta crude metanol
Dari  hasil  uji  skreening  fitokimia  menunjukkan bahwa fraksi  etilasetat  mengandung  senyawa golongan flavonoid.  Namun  bila  dibandingkan  dengan  fraksi metanol  menunjukkan  hasil  relatif  lebih  rendah dibandingkan dengan etilasetat.

## Hasil Uji Aktivitas Antioksidan.
Untuk  memntukan  aktivitas  antioksidan  pertama dibuat  terlebih  dahulu  kurva  kalibrasi  menggunakan kuersetin.  Hasil  pengukuran  kurva  kalibrasi  kuersetin ditunjukkan pada gambar 1 dan pengukuran hubungan % inhibisi  dan  konsentrasi  fraksi  etil  asetat  ditunjukkan pada gambar 2.
Gambar 1. Grafik hubungan antara % inhibisi dan konsentrasi larutan standar kuersetin
Berdasarkan uji aktivitas antioksidan dengan DPPH menggunakan standar kuersetin menghasilkan nilai IC 50 larutan  standar  kuersetin  sebesar  21,64  ppm  yang diperoleh  dari  perhitungan  hasil  kurva  kalibrasi.  Nilai IC 50 pada  fraksi  etil  asetat adalah  62,03  ppm  yang diperoleh dari perhitungan hasil kurva kalibrasi. Masing- masing  sampel  uji  baik  fraksi  etil  asetat  maupun kuersetin mempunyai nilai IC 50 yang lebih kecil dari 200 mg/L,  sehingga  dapat  diklasifikasikan  sebagai  senyawa antioksidan yang memiliki aktivitas tinggi [6].
Gambar 2. Grafik hubungan antara % inhibisi dan konsentrasi fraksi etil asetat
Hasil Analisis Total Flavonoid .
Analisis kuantitatif total flavonoid dilakukan tuntuk mengetahui  keberadaan  senyawa  flavonoid  secara kuantitatif pada fraksi etil asetat tanaman Bidens pilosa L. Digunakan  kuersetin  sebagai  senyawa  standar,  karena
senyawa flavonoid dalam tanaman Bidens pilosa L salah satunya  adalah  kuersetin.  Pada  analisis  ini  digunakan persamaan  regresi  linier  dari  kurva  standar  kuersetin yang  bernilai  y=0,0003x+0,007  dan  r  bernilai  0,994. Berdasarkan  perhitungan  fraksi  etil  asetat  mempunyai kadar  flavonoid  sebesar  565,108  mg  ekuivalen kuersetin/gram  ekstrak.  Kurva  standar  kuersetin  dapat dilihat pada gambar 3.

## Gambar 3. Kurva kalibrasi kuersetin

## Hasil Analisis Total Fenolat.
Analisis  kuantitatif  total  fenolat  dilakukan  untuk mengetahui  keberadaan  senyawa  fenolat  secara kuantitatif pada fraksi etil asetat tanaman Bidens pilosa L. Digunakan  standar  asam  galat  karena  banyaknya publikasi  yang  menggunakan  senyawa  ini  sebagai standart sehingga mempermudah memberikan gambaran mengenai kualitas bahan yang dianalisis. Pada analisis  ini  digunakan  persamaan  regresi  linier  dari kurva standar asam galat yang bernilai y = 0,001x + 0,027 dengan  r  =  0,994.  Berdasarkan  perhitungan  fraksi  etil asetat  mempunyai  kadar  fenolat  sebesar  71,71  mg ekuivalen  asam  galat/g  ekstrak.  Kurva  kalibrasi  asam galan ditunjukkan pada gambar 3.
Gambar 3. Kurva kalibrasi asam galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu
Dari data yang sudah dihasilkan diatas meunnjukkan bahwa fraksi etilasetat menunjukkan kadar total fenolat dan  flavonoid  yang  lebih  tinggi  dari  penelitian  yang pernah  dilakukan  oleh  Kviecinski dkk. [3]  yang  berasal dari  Amerika  Utara  dan  Lee dkk. [7]  yang  berasal  dari Brazil.

## 4. Kesimpulan
Fraksi  etil  asetat  daun Bidens  pilosa dari  daerah Semarang, Jawa Tengah mengandung flavonoid, fenolat, dan  triterpenoid.  Fraksi  etil  asetat  berpotensi dikembangkan sebagai senyawa antioksidan.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Fajar  Budi  Laksono,  Enny  Fachriyah,  Dewi  Kusrini, Isolasi  dan  Uji  Antibakteri  Senyawa  Terpenoid Ekstrak  N-Heksana  Rimpang  Lengkuas  Merah (Alpinia purpurata), Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi , 17, 2, (2014) 37-42
[2]  Raymond Chang, Chemistry, Jhon Wiley & Sons, Ltd, England, 2005.
[3]  Maicon  Roberto  Kviecinski,  Karina  Bettega  Felipe, João  Francisco  Gomes  Correia,  Eduardo  Antonio Ferreira,  Maria  Helena  Rossi,  Fernando  de  Moura Gatti, Danilo Wilhelm Filho, Rozangela Curi Pedrosa, Brazilian Bidens  pilosa Linné  yields  fraction containing  quercetin-derived  flavonoid  with  free radical  scavenger  activity  and  hepatoprotective effects, Libyan  Journal  of Medicine ,  6, 1,  (2011)  5651 http://dx.doi.org/10.3402/ljm.v6i0.5651
[4]  Michael R. Hoffmann, Scot T. Martin, Wonyong Choi, Detlef  W.  Bahnemann,  Environmental  Applications of Semiconductor Photocatalysis, Chemical Reviews , 95, 1, (1995) 69-96 10.1021/cr00033a004
[5]  Y.  Y.  Lim,  E.  P.  L.  Quah,  Antioxidant  properties  of different  cultivars  of  Portulaca  oleracea, Food
Chemistry , 103, 3, (2007) 734-740 http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2006.09.025
[6]  Marsden S. Blois, Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical, Nature , 181, (1958) 1199 http://dx.doi.org/10.1038/1811199a0
[7]  Wen-Chin Lee, Chiung-Chi Peng, Chi-Huang Chang, Shiau-Huei Huang, Charng-Cherng
Chyau, Extraction  of  antioxidant  components  from Bidens
pilosa flowers and their uptake by human intestinal Caco-2  cells, Molecules ,  18,  2,  (2013)  1582-1601 http://dx.doi.org/10.3390/molecules18021582