Abstrak—Penerapan  LCC menggunakan kacang  tanah (Arachis  hypogaea)    pada  lahan  pertanian  kritis  akan  mampu meningkatkan  kesuburan  tanah.  Sistem  LCC  menghasilkan lingkungan  perakaran  yang  sesuai  bagi  pertumbuhan  bakteri. Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  kelimpahan  dan mengidentifikasi  genus  bakteri  penambat  nitrogen  non  simbiotik pada  lahan  restorasi  di  Pasirian,  Lumajang  dengan  penerapan metode LCC. Kelimpahan Bakteri dihitung dengan metode Total Plate  Count  (TPC).  Proses  isolasi  bakteri  diawali  dengan pengenceran  bertingkat  dan  didentifikasi  berdasarkan  Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Hasil penelitian didapatkan  populasi  bakteri  penambat  N  non  simbiotik  di  lahan pertanian  Pasirian  sebelum  LCC  adalah  sebesar  2,7x10 5 CFU/g dan setelah LCC adalah sebesar 1,8x10 6 CFU/g, serta didapatkan 30 isolat bakteri penambat nitrogen non simbiotik yang mengarah pada  genus  Azotobacter,  Beijerinckia,  dan  Derxia.  Azotobacter merupakan  bakteri  gram  negatif  cocoid,  Beijerinckia merupakan bakteri  gram  negatif    basil,  dengan  katalase  positif  dan  Derxia merupakan bakteri gram negatif basil dengan katalase negatif.
Kata Kunci—Bakteri penambat nitrogen, LCC, Lumajang, non simbiotik.

## I. PENDAHULUAN
ANAH  di  lahan  UMKM  Multi  Agro  Makmur,  Desa Condro,  Kecamatan  Pasirian,  Kabupaten  Lumajang  Jawa Timur. ini merupakan tanah yang ditanami secara monokultur. Akibat  sistem  monokultur  dan  aplikasi  pupuk  sintesis  yang tidak  terkendali,  yang  diterapkan  pada  lahan  tersebut menyebabkan kerusakan tanah secara biologis, kimia dan fisik. Perbaikan  lahan  pertanian  terus  diupayakan,  salah  satunya dengan    menggunakan  metode  Legume  Cover  Cropss  (LCC) [1].
Penerapan  LCC  menggunakan  kacang  tanag  (Arachis hypogaea)  akan  mampu  meningkatkan  kesuburan  tanah. Sistem LCC menghasilkan perakaran yang luas, dengan sistem perakaran  yang  mampu  mengeluarkan  eksudat  eksudat  akar. Sehingga  mampu  menciptakan  lingkungan  perakaran  yang memiliki  ketersediaan  senyawa  nitrogen  (NH 4 Cl,  NaNO 3 dan lainyya),  kelembaban,  aerasi  dan  kondisi  oprimum  dan  pH yang  sesuai  bagi  pertumbuhan  bakteri.  Hal  ini  memberikan
kesempatan  lebih  besar  terhadap  kolonisasi  mikoriza arbuskular  dan  kolonisasi  mikroba  lain,  salah  satunya  bakteri penambat N non simbiotik. Bakteri penambat N non simbiotik menggunakan  sumber  karbon  dari  tanaman  sebagai  sumber energi  dalam  mengubah  gas  N 2 menjadi  bentuk  tersedia  bagi tanaman [2].
Mikroba  penambat  N  non  simbiotik  (Azospirillum  sp, Azotobacter sp, Aerosomonas sp dan Aspergillus sp) memiliki kemampuan  ganda  dalam  penambatan  nitrogen  bebas  dari udara sekaligus sebagai pemantap agregat tanah [3].
Langkah  awal  dalam  pemanfaatan  kelompok  mikroba  ini adalah  dengan  mengisolasinya  dari  tanah  pertanian  tersebut untuk  kemudian  dilakukan  studi  terhadap  karakteristik mikroba.

## II. METODE PENELITIAN

## A. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  di  labolatorium  Mikrobiologi  dan tanah  diambil  dari    lahan  pertanian  di  UMKM  Multi  Agro, Desa Nguter Kecamatan Pasirian Kabupaten Lumajang. Tanah yang  digunakan  sebagai  sampel  untuk  analisis  biologi,  fisik dan  kimia  tanah  diambil  pada  kedalaman 0 cm sampai 20 cm yang merupakan lapisan top soil pada koordinat S 08 o 13’19.4” dan  E  113 o 07’47.3”.  Luas  area  sampling  yang  digunakan adalah 21x18 meter.

## B. Restorasi lahan dengan penerapan metode LCC
Tanah  seluas  18x20  m 2 ditanami  dengan  tanaman  Legume Cover  Cropss  (LCC)  yaitu  dengan  ditanami  kacang  tanah (Arachis  hypogaea).  Dibuat  12  bedeng,  setiap  bedeng ditanami kacang tanah (Arachis hypogaea) dengan jarak tanam 40  cm.  Tanah  digali  hingga  kedalam  15-20  cm  kemudian dimasukkan  3  biji  kacang  tanah  (Arachis  hypogaea)  pilihan. Ditumbuhkan hingga panen (±3 bulan).

## Isolasi dan Dentifiasi Bakteri Penambat

## Nitrogen Non Simbiotik pada Lahan Restorasi dengan Metode Legume Cover Crop (LCC) di Daerah Pasirian Lumajang Jawa Timur
Amik Agisti, Nur Hidayatul Alami, dan Tutik Nur Hidayati Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia e-mail: tutik@bio.its.ac.id
T

## C. Pengambilan sampel tanah
Sampel tanah diambil pada bedeng seluas 18x 20 m 2 secara aseptik  dengan  kedalaman  0-20  cm.  Pengambilan  dilakukan dengan  metode  komposit.  Sampel  tanah  diambil  sebelum  dan sesudah penerapan metode  Legume Cover Cropss (LCC).

## D. Isolasi bakteri penambat nitrogen non simbiotik dari tanah
Sebanyak  10  gram  dimasukkan  ke  dalam  enlenmeyer  yang berisi  aquades  steril  sebanyak  90  ml,  selanjutnya  dikocok hingga  homogen  menggunakan  vortex.  Dari  pengenceran  tadi diambil  1  ml  dimasukkan  dalam  elenmeyer  dan  ditambahkan aquades  9  ml  lalu  diencerkan  dengan  cara  yang  sama  sampai pengenceran  10 -7 . Dari masing-masing pengenceran diambil  1 ml  dan  dimasukkan  dalam  cawan  petri  steril,  selanjutnya cawan  petri  dituang  dengan  media  pertumbuhan  dengan metode  taburan  (pour  plate).  Selanjutnya  diinkubasi  selama  7 hari  pada  suhu  ruang.  Adanya  pertumbuhan  bakteri  penambat nitrogen  ditandai  dengan  zona  bewarna  biru  di  sekeliling koloni.  Koloni  yang  dikelilingi  zona  biru  menunjukan  adanya penambatan  nitrogen.  Dari  koloni  yang  terbentuk,  masing– masing diambil dengan jarum ose dan digores pada media NA.

## E. Penghitungan kelimpahan bakteri penambat nitrogen non simbiotik
Perhitungan kelimpahan bakteri pada medium menggunakan Colony counter kemudian  dihitung dengan rumus:
Total Bakteri = ∑ Koloni x Faktor pengencer

## F. Identifikasi menggunakan uji biokimia bakteri penambat nitrogen
Uji  biokimia  dilakukan  untuk  mengetahui  karakter  masing- masing  isolat. Isolat bakteri yang sudah diketahui karakternya kemudian dicocokkan dengan buku panduan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th Edition (Holt, et al., 2000). Uji  fermentasi  glukosa,  uji  katalase,  fermentasi  manitol, thioglikolat, oksidase.

## III. HASIL DAN DISKUSI

## A. Gambar dan Tabel
Tabel 1. Hasil Kelimpahan Bakteri Penambat Nitrogen Non   Simbiotik Sampel Tanah Kelimpahan Bakteri (CFU/g) Sebelum LCC 2,7x10 5 Setelah LCC 1,8x10 6 Berdasarkan hasil analisis yang telah dilakukan menunjukan  perbedaan  jumlah  kelimpahan  bakteri  penambat nitrogen  non  simbiotik  sebelum  dan  sesudah  penerapan  LCC. Berdasarkan Tabel 1. tampak bahwa jumlah bakteri penambat nitrogen  non  simbiotik  yang  diisolasi  setelah  dilakukan  LCC lebih  banyak  daripada  sebelum  dilakukan  LCC.  Hal  ini menunjukan  adanya  kecenderungan  kenaikan  kelimpahan bakteri  penambat  nitrogen  non  simbiotik  setelah  dilakukan penerapan LCC.
Akar  tanaman  mempengaruhi  kehidupan  mikroorganisme
dan  secara  fisiologis  mikroorganisme  yang  berada  dekat dengan daerah perakaran akan lebih aktif daripada yang hidup jauh  dari  daerah  perakaran [4].  Salah  satunya  adalah  bakteri penambat nitrogen non simbiotik yang mengalami peningkatan setelah  penerapan  LCC. Sistem  LCC  memperbaiki  media tumbuh  mikroba  dalam  tanah.  Populasi  Azotobacter  pada lahan  alang  alang  sekitar  5x10 3 ,  sedangkan  populasi Azotobacter  pada  lahan  dengan  system  LCC  meningkat menjadi 2 kali [5].
Tabel 2. Hasil Pengujian Parameter Fisik dan Kimia Sampel Tanah Sebelum dan Setelah LCC ( Per g Tanah) Parameter Sebelum LCC (*) Kategori (**) Sesudah LCC (*) Kategori (**) N total (%) 0,13 Rendah 0,07 sangat rendah P (mg/Kg) 25,15 Tinggi 46,64 sangat tinggi K  (mg/100g) 0,36 sedang 0,52 Sedang pH 6,2 agak masam 6,4 agak masam
*Hasil uji labolatorium sampel tanah (2014) **Departemen Pertanian (1983)
Berdasarkan  hasil  analisis,  seperti  pada  Tabel  2, ditunjukkan  bahwa  pH  sebelum  dan  setelah  penerapan  LCC tidak  jauh  berbeda,  namun  terjadi  perubahan  yang  signifikan pada parameter kimia tanah yaitu peningkatan jumlah P dan K serta  penurunan  N.  Perubahan  tersebut  dimungkinkan  adanya pengaruh dengan penerapan sistem LCC menggunakan kacang tanah.
Pada  saat  pengambilan  sampel  tanah  di  daerah  Pasirian merupakan  musim  penghujan.  Dari  hasil  uji  sifat  fisik  dan kimia  tanah  menunjukan  bahwa  tanah  di  pasirian,  Lumajang tergolong tang lempung berpasir. Sifat fisik lahan kering yang memiliki struktur berpasir, mudah mengalami pencucian. Pada kondisi curah hujan tinggi, unsur  alkali tanah (Na, K, Ca, dan Mg)  banyak  yang  tercuci.  Pada  lahan  kering  yang  mudah tererosi,  rentan  terjadi  kehilangan  unsur  hara  oleh  adanya proses erosi dan pencucian (leching) yang dapat menyebabkan unsur  hara  terbawa  ke  bagian  dalam  tanah.  Nitrogen  (N) adalah  unsur  yang  sangat  mudah  mengalami  pencucian, sehingga  pada  tanah  kering  jumlah  nitrogen  menjadi  semakin terbatas [6].
Kacang  tanah  yang  termasuk  tanaman  Leguminosa mempunyai  kemampuan  untuk  membentuk  bintil  akar  yang mampu  menambat  nitrogen  bebas  dari  udara.  Kemampuan membentuk bintil akar ini mensuplai N dalam tanah. Disisi lain tanaman  kacang  tanah  termasuk  tanaman  yang  membutuhkan N dalam jumlah yang besar untuk pertumbuhanya. acang tanah nitrogen  sebanyak  15-20  kg  N/ha.  Kondisi  ini  yang memungkinkan  terjadinya  penurunan  N  setelah  penerapan LCC.  Dari  hasil  pengamatan  kandungan  nitrogen  total  dalam tanah  sebelum  LCC  lebih  besar  daripada  setelah  LCC. Diketahui  kandungan  nitrogen  total  sebelum  LCC  yaitu  0,13 (%)  sementara  kandungan  N  total  setelah  LCC  turun  menjadi sebesar 0,07 (%) [7].
Selain itu penurunan jumlah N total setelah penerapan LCC dimungkinkan  karena  di  dalam  tanah  terdapat  pula  mikroba yang  mampu  melakukan  proses  nitrifikasi  dan  denitrifikasi sehingga N tersedia lepas dalam bentuk NO 2 ke atmosfer [8].
Ketersediaan  fosfor  didalam  tanah  ditentukan  oleh  banyak faktor, tetapi yang paling penting adalah pH tanah. Pada tanah dengan  pH  rendah,  fosfor  akan  bereaksi  dengan  ion  besi  dan aluminium. Pada tanah dengan pH tinggi, fosfor akan bereaksi dengan  ion  kalsium.  Dengan  demikian,  tanpa  memperhatikan pH  tanah,  pemupukan  fosfor  tidak  akan  berpengaruh  bagi pertumbuhan tanaman [9], pH tanah netral terletak antara 6.5 – 7.5  [10].  pH  tanah  pertanian  cabai  sebelum  dan  setelah  LCC adalah  6.4.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pH  tanah  pertanian cabai  Lumajang  mendekati  netral.  Banyak  penelitian  yang mengemukakan  pendapat  tentang  kisaran  pH  tanah  yang mendukung  ketersediaan  dan  kelarutan  P  paling  tinggi,  yaitu 6.5-7.0 [11].

## B. Identifikasi Genus Bakteri Penambat Nitrogen Non Simbiotik
Hasil  isolasi  bakteri  tanah  pada  lahan  perkebunan  cabai  di wilayah  Pasirian  Jawa  Timur,  sebelum  penerapan  LCC didapatkan  12  isolat  dan  18  isolat  pada  sesudah  penerapan LCC.  Semua  isolat  dilakukan  purifikasi,  pengamatan makroskopik,  pengamatan mikroskopik  dan  uji biokimia yang merupakan  tahapan  dalam  identifikasi  bakteri.  Isolat  sebelum LCC diberi kode A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9. A10, A11 dan A12. Sedangkan isolat sebelum LCC diberi kode P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12, P13, P14, P15, P16, P17, dan P18.
Dari  hasil  analisa  yang  telah  dilakukan  ditemukan  3 kecenderungan genus bakteri penambat nitrogen non simbiotik yang  ditemukan  di  daerah  Pasirian  Lumajang,  yaitu Azotobacter, Beijerinckia, dan Derxia.
Sebanyak  13  isolat  cenderung  masuk  ke  dalam  genus Azotobacter.  Karakter  kunci  utama  genus  Azotobacter  adalah sel  berbentuk  cocoid,  oksidase  negatif,  katalase  positif  dan membentuk  kista  (Gambar  1.)  yang  berfungsi  untuk melindungi  dari  keadaan  lingkungan  yang  ekstrim,  misalnya kekeringan,  sinar  ultraviolet  dan  radiasi ion [12]. Azotobacter merupakan  bakteri  berbentuk  kokus  yang  berukuran  1,5-2,0 µ m.  tidak  membentuk  endospora  tapi  kista.  Bergerak  dengan flagella,  bersifat  aerob  dan  kemoorganotrof,  menggunakan gula,  alkohol,  garam  dari  bahan  organik  untuk  tumbuh, katalase  positif.  pH  optimum  pada  7-7,5  dan biasa ditemukan di tanah dan air. Spesies tertentu dapat berasosiasi dengan akar tumbuhan [13].
Gambar 1. Diagram Dikotomi Karakterisasi Bakteri Gram Negatif Cocoid
Isolat  A  (A1,  A4,  P7,  P10,  P13)  yangmempunyai  bentuk
koloni  bulat,  tepian  koloni  utuh,  permukaan  koloni  cembung dan  warna  putih  bening.Isolat  D  (A5,  A8,  P2,  P5,  P15) mempunyai  bentuk  koloni  bulat,  tepian  koloni  berombak, permukaan koloni timbul dan warna putih putih.Isolat F (A10, P4,  P17)  mempunyai  bentuk  koloni  bulat,  tepian  koloni  utuh, permukaan  koloni  cembung  dan  warna  putih  kemerahan cenderung tergolong genus Beijerinckia.Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan bakteri  golongan Beiejrinckia menunjukan  kenampakan  pigmentasi  pada  koloni  seperti  B. indica  subsp.  indica  LMG  2817T  yang  berwarna  putih;    B. fluminensis  LMG  2819  berwarna  cream;    B.  fluminensis  CIP 106281T berwarna kecoklatan (Monike et al., 2009).
Karakter kunci dari genus Beijerinckia adalah sel berbentuk basil, gram negatif,  oksidasi positif,  katalase positif (Gambar 2.).
Gambar 2. Diagram Dikotomi Karakterisasi Bakteri Gram Negatif Basil
Isolat  A7,  P1,  P12  dan  P18  cenderung  masuk  ke  dalam genus  Derxia.  Karakter  kunci  utama  genus  Derxia  adalah  sel berbentuk basil, oksidase positif dan katalase negatif (Gambar 3.).

## Gambar 3 Diagram Dikotomi Karakterisasi Bakteri Gram Negatif Basil
Derxia  gummosa  yang  banyak  ditemukan  di  wilayahtropis Amerika  Utara,  mampu  tumbuh  dengan  baik  pada pH  4,5-6,5 [14].  Penelitian  lain  menyebutkan  bahwa  Derxia  gummosa mampu  menggunaka  metana  dan  methanol  sebagai  sumber karbon.  Tumbuh  pada  glukosa,  fruktosa,  manitol,  etanol, glycerol, dan sangat  baik pada sorbitol. Umum dijumpai pada tanah tropis.  Derxia  gummosa juga mampu melakukan fiksasi nitrogen  secara  efektif  dengan  range  yang  luas  pada  pH  dan pO 2 [15].

## IV. KESIMPULAN/RINGKASAN
Berdasarkan  perhitungan  populasi  bakteri,  pengamatan karakteristik  bakteri  dan  uji  potensi  penambat  nitrogen  (N) oleh  bakteri  penambat  N  non  simbiotik  sebelum  dan  setelah LCC di lahan pertanian Pasirian , dapat disimpulkan:
1) Kelimpahan populasi bakteri penambat N non simbiotik di lahan  pertanian  Pasirian  cenderung  mengalami  kenaikan dari sebesar 2,7x10 5 CFU/g sebelum LCC menjadi sebesar 1,8x10 6 CFU/g setelah LCC.
2) Genus  bakteri  penambat  nitrogen  non  simbiotik  yang ditemukan  pada  lahan  pertanian  Pasirian  dengan penerapan  metode  LCC  adalah  Azotobacter  sp., Beijerinckia sp. dan Derxia sp.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis A.A. (inisial nama mahasiswa) mengucapkan terima kasih  kepada  Direktorat  Pendidikan  Tinggi,  Departemen Pendidikan  dan  Kebudayaan  Republik  Indonesia  yang  telah memberikan dukungan finansial.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Saribay,  G¸l    Fid'an.  Growth    and    nitrogen    fixation    dynamics    of Azotobacterchroococcum  in  nitrogen-free  and  omw  containing medium. The middle east technicaluniversity. (2003) p:1-12.
[2] Killham, K. Soil ecology. Cambridge :  University Press. (1994).
[3] Nurhayati, Hesti. Isolasi Dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen  Non Simbiotik Dari Lahan Kering Masam. Thesis. Jurusan Biologi Fakultas Sains  Dan  Teknologi  Universitas  Islam  Negeri  (Uin)  Malang.  Malang. (2006).
[4] Schottendreier,  M.  and  U.  Falkengren-greup.  Plant  induced  alteration in the rhizosphere and the utilization of soil heterogenicity. Plant Soil.
(1999) 209: 297-309.
[5] Sudharto, T., Suwardjo, H., Erfandi, D., Budhyastoro, T. Permasalahan dan  Penanggulangan  Lahan  Alang  Alang.  Prosiding  Seminar  Lahan Alang  Alang:  Pemanfaatan  Lahan  Alang  Alang  untuk  Usaha  Tani Berkelanjutan. (1993). Bogor, 1 Desember 1992. Puslittanak. Bogor.
[6] Suciatmih.  Populasi  Jamur  Mikoriza  Vesikular-Arbuskular  Pada Lahan  Bekas  Galian  Emas  Yang  Direklamasi  Dengan Legum  Tumbuh Cepat  Dikombinasikan  Dengan  Penutup  Tanah  Dan  Mikroba.  Berk. Penel. Hayati. (2006) 12 (45–49). Bidang Mikrobiologi, Puslit Biologi – Lipi Jl. H. Juanda 18, Bogor 16122. Surabaya.
[7] Yulhasmir.  Respon  Pertumbuhan  dan  Produksi  Tanaman  Kacang Tanah  (Arachis  hypogea.  L)  Terhadap  Dosis  dan  Waktu  Pemberian
Pupuk KCL. AgronobiS. (2009). Vol. 1, No. 2.
[8] Mulyadi, Achmad. Pengaruh Pemberian Legin, Pupuk Npk (15:15:15) Dan  Urea  Pada  Tanah  Gambut  Terhadap  Kandungan  N,  P  Total Pucuk  Dan  Bintil  Akar  Kedelai  (Glycine  max  (L.)  Merr.).  Kaunia.
(2012) Vol. Viii, No. 1, April 2012: 21-29.
[9] Rukmi.  Pengaruh  Pemupukan  Kalium  dan  Fosfat  Terhadap Pertumbuhan  dan  Hasil  Kedelai.  Skripsi.  Fakultas  Pertanian Universitas Muria Kudus. (2009).
[10] Sulaeman,  Mulyadi,  Dwiningsih  S.  Penentuan  ketersediaan  P  tanah menggunakan  kurva  erapan  pada  tanah  sawah  bukaan  baru.  Jurnal Tanah dan Iklim. (2000). 18: 23-28.
[11] Agbenin,  J.O. Phosphorus  Sorption  by  three  Cultivated  Savanna Alfisols as influenced by pH. Fertilizer Research (1996). 44:107-11.
[12] Madigan,  M.T.,  Martinko,  J.M  and  J.  Parker.  1997.  “Biology  of Microorganisms”. USA: Prentice Hall. (1997).
[13] Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T dan Williams, S. T. “Bergeys Manual Determinative Bacteriology, Edisi Ke 9. Amerika :
Lippincott Williams dan Wilki N. S. (1999).
[14] Tate, R. L. “Soil Microbiology”, second edition. New York. Jhon Wiley & Sons,Inc. (2000).
[15] Laskar,  Folguni  .,  Sharma,  G.D.  dan  Deb,  B.  Biodiversity  of Diazotrophs  Derxia  and  Beijerinckia  in  the  Rhizospheric  and Nonrhizospheric  Soils  of  Rice  Plant-  A  Review  Assam  University. Journal  of  Science  &  Technology  :  Biological  and  Environmental Sciences. (2010). Vol. 5 Number I 154-162.