# Korespondensi:  Departemen  Budidaya  Perairan,  Fakultas Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan,  Institut  Pertanian  Bogor Jl.  Agatis  Kampus  IPB  Dramaga,  Bogor  16680,  Indonesia. Tel.  +  62  251    8622915 E-mail:  widanarni@yahoo.com
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra
PEMANFAATAN  MADU  UNTUK  MENINGKATKAN  RESPONS  IMUN  DAN  RESISTANSI UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei) TERHADAP INFEKSI White Spot Syndrome Virus
Widanarni *)# ,  Muhamad  Gustilatov *) ,  Sukenda *) ,  dan  Diah  Ayu  Satyari  Utami **)
*) Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor Jl. Agatis  Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680
**) Program Studi Budi Daya Ikan, Politeknik Kelautan dan Perikanan Jembrana Desa Pengambengan,  Kecamatan Negara, Kabupaten Jembrana,  Bali 82218
(Naskah diterima: 8 Mei 2019; Revisi final: 11 Juni 2019; Disetujui publikasi: 14 Juni 2019)

## ABSTRAK
Wabah  penyakit  white  spot  diseases  (WSD)  akibat  infeksi  white  spot  syndrome  virus  (WSSV)  menyebabkan penurunan produksi udang global. Alternatif pencegahan infeksi WSSV dapat dilakukan melalui peningkatan respons  imun  udang  dengan  aplikasi  madu  sebagai  prebiotik.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menguji efektivitas pemberian madu dalam meningkatkan respons imun dan resistansi udang vaname (Litopenaeus vannamei) terhadap infeksi WSSV. Penelitian ini terdiri atas lima perlakuan dan tiga ulangan yang meliputi perlakuan kontrol positif (tanpa pemberian madu dan diuji tantang dengan WSSV), kontrol negatif (tanpa pemberian madu dan tanpa uji tantang dengan WSSV), pemberian madu pada dosis 0,2%; 0,4%; dan 0,6%; serta diuji tantang dengan WSSV. Udang vaname berukuran 0,4 ± 0,11 g diberi pakan komersial dengan penambahan madu selama 10 minggu sebelum diuji tantang dengan WSSV, kemudian udang diuji tantang dengan WSSV dan diamati sintasan, serta parameter respons imunnya selama tujuh hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa parameter respons imun udang yang diberi perlakuan madu meliputi total haemocyte count (THC),  aktivitas fagositik  (AF), respiratory burst  (RB), dan  phenoloxidase (PO),  baik sebelum  maupun setelah uji tantang dengan WSSV lebih baik (P<0,05) dibanding kontrol. Pada akhir uji tantang, sintasan udang yang diberi perlakuan madu pada dosis 0,4% dan 0,6% masing-masing mencapai 66,67%; sedangkan pada perlakuan kontrol positif hanya mencapai 36,67%. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian madu pada dosis 0,4% efektif meningkatkan respons imun dan resistansi udang vaname terhadap infeksi WSSV.
KATA KUNCI: aktivitas fagositik; phenoloxidase; prebiotik; respiratory burst; sintasan; total haemocyte count
ABSTRACT: Utilization  of  honey  to  improve  immune  responses  and  resistance  of  Pacific  white  shrimp (Litopenaeus vannamei) against White Spot Syndrome Virus infection. By: Widanarni, Muhamad Gustilatov, Sukenda, and Diah Ayu Satyari Utami
White spot disease (WSD) outbreaks due to white spot syndrome virus (WSSV) infection cause the decline of the global shrimp production. The alternative prevention method against WSSV infection can be done by the improvement of immune responses through the application of honey as a prebiotic. This study aimed to evaluate the effectiveness of the administration of honey in improving immune responses and resistance of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) against WSSV infection. This study consisted of five treatments and triplicates including positive control (without the administration of honey and challenged by WSSV); negative control (without the administration of honey and without the challenge test with WSSV); the administration of honey at doses of 0.2%, 0.4%, and 0,6% and challenged by WSSV. Pacific white shrimp sized 0.4 ± 0.11 g were fed commercial feed with the addition of honey for 10 weeks before challenged by WSSV, then the shrimp were challenged by WSSV and were observed their survival and immune responses parameters for seven days. The results of the study showed that immune responses parameters of the shrimp treated by honey  treatments  including  total  haemocyte  count  (THC),  phagocytic  activity  (PA),  respiratory  burst  (RB),  and phenoloxidase (PO), both before and after the challenge test with WSSV were better (P<0.05) compared to control. At
the end of the challenge test, the survival of the shrimp treated with honey treatments at doses of 0.4% and 0.6% reached 66.67%, while that of positive control treatment only reached 36.67%. These results indicated that the administration of honey at a dose of 0.4% was effective to improve immune responses and resistance of Pacific white shrimp against WSSV infection.
KEYWORDS: phagocytic activity; phenoloxidase; prebiotic; respiratory burst; survival; total haemocyte count
penelitian  menunjukkan  bahwa  prebiotik  seperti fruktooligosakarida (FOS), galaktoligosakarida (GOS), mananoligosakarida  (MOS),  dan  inulin  dapat meningkatkan  pertumbuhan,  kelangsungan  hidup, kecernaan  pakan,  efisiensi  pakan,  komposisi mikroflora  dalam  usus,  serta  menghambat pertumbuhan  patogen,  dan  meningkatkan  imunitas udang (Li et al., 2009; Zhang et al., 2012; Aktas et al., 2014).  Pengaruh  pemberian  prebiotik  terhadap peningkatan  imunitas  merupakan  pengaruh  tidak langsung  dan  berhubungan  dengan  perubahan komposisi  mikrobiota  usus  yang  memegang  peran penting dalam peningkatan imunitas (Hoseinifar et al., 2015). Pemberian prebiotik menyebabkan peningkatan jumlah bakteri menguntungkan dan menekan jumlah bakteri merugikan. Bakteri menguntungkan tersebut menekan jumlah bakteri patogen melalui kompetisi lokasi  pelekatan,  produksi  asam  organik,  hidrogen peroksida,  dan  senyawa  lainnya  seperti  senyawa antibiotik,  bakteriosin,  siderophore,  lisozim,  serta memodulasi respons imun (Nayak, 2010). Pemberian prebiotik  juga  menyebabkan  tingginya  produksi metabolit  mikroba  seperti  propionat,  butirat  atau short-chain fatty acid (SCFA) yang dapat menginduksi sel-sel imun yang terdapat pada gut-associated lymphoid tissue (GALT) (Hoseinifar et al., 2015).
Salah  satu  bahan  alami  yang  dapat  digunakan sebagai sumber prebiotik, serta memiliki kandungan oligosakarida  seperti  fruktooligosakarida  (FOS), galaktooligosakarida (GOS), serta inulin adalah madu (Sanz et al., 2005). Karimah et al. (2011) melaporkan bahwa isolat oligosakarida madu memenuhi kriteria sebagai  prebiotik,  karena  resistan  terhadap  asam lambung  dan  enzim  pencernaan,  memiliki  efek stimulasi  pertumbuhan  yang  selektif,  serta memengaruhi aktivitas fermentasi. Indonesia memiliki potensi tinggi untuk menghasilkan madu dengan to- tal produksi mencapai 1.000-1.500 ton per tahun (Mus- lim,  2014).  Sejauh  ini  penelitian  mengenai  aplikasi madu  sebagai  prebiotik  banyak  dilakukan  pada manusia dan tikus (Sanz et al., 2005; Rosendale et al., 2016),  sedangkan  pada  organisme  akuatik  masih sangat terbatas. Penelitian ini bertujuan untuk menguji efektivitas pemberian madu terhadap respons imun dan resistansi udang vaname yang diinfeksi WSSV.

## PENDAHULUAN
Produksi  perikanan  budidaya  terus  mengalami peningkatan, dengan nilai produksi pada tahun 2017 mencapai 17,2 juta ton dan berkontribusi sebanyak 74%  dari  produksi  perikanan  Indonesia  (KKP,  2018). Salah satu komoditas perikanan budidaya Indonesia yang  menjadi  komoditas  ekspor  unggulan  adalah udang  vaname  (Litopenaeus  vannamei).  Indonesia menempati urutan ketiga sebagai produsen terbesar udang vaname setelah Cina  dan India, dengan total produksi mencapai 505.549 ton pada tahun 2015 (FAO, 2017).
Budidaya udang vaname masih menemui kendala berupa serangan berbagai penyakit mematikan. Virus dilaporkan menjadi patogen utama yang menyerang udang.  Beberapa  virus  yang  diketahui  menyerang udang  di  Asia  antara  lain  white  spot  syndrome  virus (WSSV), infectious myonecrosis virus (IMNV), yellow head virus  (YHV)  tipe-1,  dan  infectious  hypodermal  and haematopoietic necrosis (IHHNV) (Flegel, 2012). White spot  disease  (WSD)  merupakan  penyakit  viral  yang disebabkan oleh WSSV, yang berasal dari genus Whispo virus dan famili Nimaviridae. Penyakit ini bersifat letal bagi  organisme  budidaya  dengan  tingkat  kematian yang  tinggi  dan  berlangsung  relatif  cepat  (Flegel, 2006). Kematian akibat WSD dapat mencapai 70%-90% dalam waktu 3-7 hari pascainfeksi (Mai & Wang, 2010).
Berbagai  upaya  yang  telah  dilakukan  untuk mengendalikan penyakit tersebut antara lain dengan penggunaan  antibiotik,  vaksin,  imunostimulan,  dan probiotik.  Pengendalian  penyakit  dengan menggunakan antibiotik telah dibatasi karena dapat menyebabkan  resistansi  patogen  di  perairan  dan residu antibiotik dapat terakumulasi di dalam tubuh udang (Kathleen et al., 2016). Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk mencegah infeksi penyakit vi- ral  pada  udang  yakni  dengan  cara  meningkatkan respons  imun  non-spesifik  melalui  pemberian prebiotik.
Prebiotik adalah bahan pangan yang tidak dapat dicerna  inang,  namun  memberikan  efek menguntungkan  bagi  inangnya  dengan  cara merangsang  pertumbuhan  dan  aktivitas  sejumlah bakteri  tertentu  di  usus  sehingga  meningkatkan kesehatan inang (Cerezuela et al., 2011). Beberapa hasil

## BAHAN DAN METODE

## Persiapan  Wadah  dan  Media  Pemeliharaan
Wadah  yang  digunakan  adalah  akuarium  kaca berukuran 60 cm x 30 cm x 30 cm sebanyak 15 unit. Sebelum  digunakan,  akuarium  dicuci  bersih  dan didesinfeksi menggunakan klorin dengan dosis 30 µl/ L selama 24 jam. Akuarium kemudian dibilas dengan air  tawar  dan  dikeringkan.  Selanjutnya  bagian  luar akuarium dilapisi plastik hitam lalu akuarium diisi air laut dengan ketinggian 20 cm, serta dipasang aerasi.

## Persiapan  Hewan  Uji
Hewan uji yang digunakan adalah udang vaname bersertifikat spesific pathogen  free (SPF)  yang berasal dari hatchery PT Suri Tani Pemuka, Anyer, Banten. Udang pada  stadia  pascalarva  10  (PL-10)  terlebih  dahulu diaklimatisasi dan  dipelihara selama tiga  puluh hari hingga mencapai ukuran 0,4 ± 0,11 g. Selama proses adaptasi dan pemeliharaan, udang vaname diberi pakan nauplii  Artemia,  serta  pakan  komersial  (Feng-li  0) dengan frekuensi pemberian pakan sebanyak empat kali sehari secara ad satiation.

## Persiapan  Pakan  Uji
Pakan  yang  digunakan  adalah  pakan  komersial dengan  kandungan  protein  40%.  Pakan  uji  dibuat dengan  mencampurkan  pakan  komersial  dengan prebiotik  berupa  madu  sesuai  dosis  perlakuan  dan pengencer  berupa  phosphate  buffered  saline  (PBS) dengan perbandingan madu dan PBS yaitu 1:1, serta putih telur sebagai perekat (binder) dengan dosis 2% dengan metode coating. Madu yang digunakan yaitu madu yang berasal dari pembudidaya madu di Depok, Jawa barat.

## Pemeliharaan  Hewan  Uji
Udang uji dipindahkan ke dalam 15 unit akuarium perlakuan  dengan kepadatan  awal 100  ekor per  m 3 (15 ekor per akuarium). Pakan diberikan sebanyak lima kali sehari (pukul 06.00, 10.00, 14.00, 18.00, dan 22.00 WIB)  secara  ad  satiation.  Pengelolaan  kualitas  air dilakukan  dengan  penyiponan  setiap  hari  dan pergantian  air.  Udang  diberi  perlakuan  selama  10 minggu dan diamati respons imunnya, kemudian diuji tantang  menggunakan  WSSV.  Perlakuan  pemberian madu  pada  udang  uji  selama  10  minggu  bertujuan untuk mencapai ukuran udang uji yang layak diambil hemolimnya  untuk  sampel  pengukuran  parameter respons imun (8,50 ± 1,50 g/ekor), sehingga udang uji tidak mengalami stress atau kematian akibat diambil hemolimnya yang dikhawatirkan akan memengaruhi validitas data parameter respons imun.

## Uji  Tantang
Preparasi  filtrat  WSSV  dilakukan  berdasarkan metode  yang  dijelaskan  oleh  Ramos-Carreño  et  al. (2014). Organ udang vaname  yang positif terinfeksi WSSV  (insang  dan  daging)  digerus  dan  dilarutkan dalam TN buffer (200 mM Tris-HCl; 400 mM NaCl; pH 7,4) (perbandingan antara sampel dan TN buffer yaitu 1:4).  Sampel  yang  telah  larut,  disentrifugasi menggunakan sentrifus dengan kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Supernatan diambil dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh disaring menggunakan milipore dengan di- ameter 0,45  m.  Filtrat virus  yang dihasilkan  dapat langsung digunakan atau disimpan pada freezer dengan suhu  -80°C  sebelum  digunakan.  Virus  WSSV ditingkatkan virulensinya dengan teknik pasase pada udang sehat. Pasase dilakukan dengan menginjeksikan filtrat virus sebanyak 0,1 mL ke abdomen udang sehat dengan menggunakan syringe volume 1 mL. Selanjutnya udang  yang  dipasase,  diamati  gejala  klinisnya  dan dipelihara hingga mengalami kematian. Udang yang telah mengalami kematian karena WSSV hasil pasase selanjutnya dibuat filtrat virusnya untuk digunakan pada uji letal dosis 50% (LD 50 ). Pengujian LD 50 dilakukan pada pengenceran filtrat virus 10 -2 hingga 10 -6 . Dosis LD 50 yang diperoleh pada penelitian ini yaitu pengenceran 10 -4 WSSV.  Dosis  tersebut  kemudian  digunakan sebagai dosis filtrat virus yang diinjeksikan pada udang sehat  pada  saat  uji  tantang.  Uji  tantang  dilakukan dengan menginjeksikan filtrat virus pada pengenceran 10 -4 WSSV pada abdomen udang sehat menggunakan syringe volume 1 mL sebanyak 0,1 mL larutan virus. Udang kontrol negatif diinjeksi dengan PBS. Setelah dilakukan uji tantang, pengamatan respons imun dan mortalitas  udang  dilakukan  pada  hari  ketiga  (UT3), kelima (UT5), serta ketujuh (UT7).

## Pengukuran  Parameter  Kualitas  Air
Pengukuran parameter kualitas air dilakukan pada awal dan akhir pemeliharaan udang vaname. Param- eter kualitas air yang diukur yaitu dissolved oxygen (DO) menggunakan  DO  meter,  suhu  menggunakan termometer,  pH  menggunakan  pH  meter,  salinitas menggunakan salinometer, serta total ammonia nitro- gen  (TAN),  nitrit,  dan  nitrat  menggunakan spektrofotometer.  Nilai  kualitas  air  pada  semua perlakuan selama penelitian berkisar antara: DO 5,0- 6,2 mg/L; suhu 27,9°C-29,3°C; pH 7,0-7,3; salinitas 26- 33 g/L; TAN 0,0-0,1 mg/L; nitrit 0,0-0,3 mg/L; dan nitrat 0,24-1,04 mg/L.

## Konfirmasi  WSSV
Udang  yang  mengalami  kematian  setelah  uji tantang dikonfirmasi menggunakan analisis polymerase chain  reaction  (PCR)  setelah  tujuh  hari  uji  tantang. Konfirmasi  WSSV  mengacu  pada  metode  Nunan  & Ligthner (2011).

## Rancangan  Percobaan
Percobaan dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri atas lima perlakuan dan tiga ulangan yang meliputi perlakuan kontrol positif (K+) (tanpa penambahan madu dan  diuji tantang WSSV), kontrol  negatif  (K-)  (tanpa  penambahan  madu  dan diinjeksi PBS), penambahan madu 0,2% (A); 0,4% (B); 0,6% (C); dan diuji tantang WSSV. Data yang diperoleh ditabulasi menggunakan Microsoft Excel 2007 dan diuji lanjut menggunakan SPSS 20.0.

## Parameter  Uji
Parameter  yang  diamati  setelah  perlakuan pemberian madu dan pascauji tantang yaitu sintasan, serta respons imun yang meliputi total haemocyte count (THC),  aktivitas  fagositik  (AF),  respiratory  burst  (RB), dan  aktivitas  phenoloxidase  (PO).  Sintasan  atau kelangsungan hidup yaitu perbandingan jumlah udang yang hidup pada akhir pemeliharaan dengan jumlah udang  pada  awal  pemeliharaan  yang  dihitung berdasarkan  acuan  Effendie  (1997).  Total  haemocyte count  diuji  untuk  mengetahui  jumlah  hemosit  pada udang berdasarkan metode Wang & Chen (2006). Pa- rameter selanjutnya yaitu AF yang diukur berdasarkan Anderson  &  Siwicki  (1995).  Respiratory  burst  diuji berdasarkan reduksi nitroblue tertrazolium per 10 µL hemolim, sesuai dengan metode Cheng et al. (2004). Parameter terakhir yaitu aktivitas phenoloxidase yang diuji berdasarkan formasi dopachrome dalam 50 µL hemolim sesuai metode Liu & Chen (2004).

## HASIL DAN BAHASAN

## Sintasan
Setelah  diuji  tantang,  sintasan  udang  diamati selama  tujuh  hari  dan  tersaji  pada  Gambar  1.  Nilai sintasan tertinggi diperoleh pada perlakuan B dan C dengan nilai masing-masing 66,67 ± 11,54% dan 66,67 ± 5,774%, serta berbeda nyata (P<0,05) dengan K+ (36,67 ± 5,77%), sedangkan sintasan pada perlakuan A yaitu 50±10%.
Dosis  pemberian  madu  pada  perlakuan  B  dan  C mengindikasikan  efek  resistansi  terbaik  dalam melawan infeksi patogen. Sintasan yang berbeda nyata dengan perlakuan kontrol (P<0,05), juga dilaporkan oleh Partida-Arangure et al. (2013), pada udang vaname
yang diberi 0,8% inulin dan diuji tantang dengan WSSV. Febrianti  et  al.  (2016)  juga  melaporkan  bahwa pemberian mikrokapsul sinbiotik (probiotik dan MOS) dapat  meningkatkan  sintasan  udang  vaname  yang diinfeksi  WSSV.

## Total Haemocyte Count (THC)
Total  haemocyte  count  (THC)  diamati  setelah perlakuan  pemberian  madu  dan  pada  hari  ketiga, kelima, serta ketujuh setelah uji tantang (Gambar 2). Setelah  perlakuan  prebiotik  (madu),  nilai  THC tertinggi diperoleh pada perlakuan B (10,16 ± 0,55 x 10 6 sel/mL)  dan  berbeda  nyata  (P<0,05)  dengan perlakuan K+ dengan nilai THC yaitu 5,70 ± 0,26 x 10 6 sel/mL. Pengamatan THC pada hari ketiga setelah uji  tantang  menunjukkan  nilai  THC  tertinggi  pada perlakuan  C  (4,46  ±  0,65  x  10 6 sel/mL).  Nilai  THC setelah  hari  kelima  uji  tantang  menunjukkan  hasil tertinggi pada perlakuan C dengan THC yaitu 3,93 ± 0,15 x 10 6 sel/mL yang tidak berbeda nyata (P>0,05) dengan  pelakuan  A,  tetapi  berbeda  nyata  (P<0,05) terhadap perlakuan K+ (2,76 ± 0,41 x 10 6 sel/mL) dan C. Hari ketujuh setelah uji tantang, K+ menunjukkan THC  terendah  yaitu  4,30  ±  0,55  x  10 6 sel/mL  yang tidak  berbeda  nyata  (P>0,05)  dengan  perlakuan  A, tetapi berbeda nyata (P<0,05) dengan perlakuan B dan C  yang  masing-masing  memiliki  THC  yaitu  7,10  ± 0,45 x 10 6 sel/mL dan 6,4 ± 0,34 x 10 6 sel/mL.
Sebagai  organisme  akuatik  yang  tidak  memiliki respons  imun  spesifik,  hemosit  merupakan  bagian penting  dari  sistem  pertahanan  udang  melawan patogen.  Menurut  Sahoo  et  al.  (2008),  hemosit berfungsi dalam beberapa respons imun udang seperti aktivitas fagositik, enkapsulasi, agregasi nodula untuk partikel  asing,  serta  menjalankan  sistem  proPO. Meningkatnya nilai hemosit berbanding lurus dengan meningkatnya ketahanan udang dalam melawan infeksi patogen. Setelah perlakuan pemberian madu sebanyak 0,2%;  0,4%;  dan  0,6%;  pemberian  madu  terbukti memberikan pengaruh yang nyata (P<0,05) terhadap total  hemosit  pada  udang.  Hal  tersebut mengindikasikan  bahwa  pemberian  madu  mampu merangsang  pembentukan  hemosit  udang  vaname. Peningkatan nilai THC juga dilaporkan oleh Partida- Arangure et al. (2013) pada udang vaname yang diberi inulin.  Selanjutnya  hemosit  mengalami  penurunan pada  hari  ketiga  dan  kelima  setelah  diuji  tantang dengan WSSV, serta mengalami peningkatan kembali pada hari ketujuh setelah uji tantang dengan WSSV. Menurunnya total hemosit setelah uji tantang diduga karena hemosit bermigrasi dan terpusat pada jaringan yang  terinfeksi  oleh  WSSV  sehingga  hemosit  pada hemolim berkurang. Selain itu, sel hemosit juga rusak akibat  invasi  virus,  serta  terjadinya  apoptosis  pada
Gambar 1. Sintasan udang vaname (Litopenaeus vannamei) yang diberi madu pada dosis berbeda pascauji tantang dengan white spot syndrome virus.
Figure 1. Survival of Pacific white shrimp (Litopeneaus vannamei) administered with honey at different doses on post-challenge test period to white spot syndrome virus.
Keterangan: Huruf yang berbeda pada masing-masing batang menunjukkan hasil yang berbeda nyata (Duncan P<0,05) Note: Different  letters  on  each  bar  indicate  significantly  different  results  (Duncan P<0.05)
Keterangan: Huruf yang berbeda pada masing-masing batang dalam periode pengamatan yang sama menunjukkan hasil berbeda nyata (Duncan P<0,05); SP: setelah perlakuan prebiotik; UT3: tiga hari setelah uji tantang; UT5: lima hari setelah uji tantang; UT7: tujuh hari setelah uji tantang dengan white spot syndrome virus Note: Different  letters  on  each  bar  in  the  same  observation  period  indicate  significantly different  results  (Duncan  P<0.05);  SP:  post-prebiotic  treatment;  UT3:  three  days after  the  challenge  test;  UT5:  five  days after  the  challenge  test;  UT7:  seven  days after  the  challenge  test  with  white  spot  syndrome  virus Gambar 2. Total haemocyte count udang vaname (Litopenaeus vannamei) yang diberi madu pada dosis yang berbeda. Figure 2. Total haemocyte count of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) ad-
ministered with honey at different doses.
a d c b a ab a a c a a a c b b c b c b b 0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 SP UT3 UT5 UT7 T ot al H ae m oc yt e C ou nt (1 0 6 se l m L -1 ) k- k+ a b c c a ab b b 0 20 40 60 80 100 K- K+ A B C Si n tas an s et el ah u ji t an tan g
Su rv iv al a ft er c ha lle ng e te st (% )
Perlakuan (Treatments)
jaringan  hematopoietik  (Yeh  et  al.,  2009).  Kembali meningkatnya  jumlah  hemosit  pada  hari  ketujuh setelah  uji  tantang  mengindikasikan  udang  telah mengalami  recovery  dan  sistem  imun  berhasil meredakan serangan WSSV.

## Aktivitas  Fagositik
Aktivitas  fagositik  (AF)  udang  vaname  selama penelitian disajikan pada Gambar 3. Aktivitas fagositik setelah perlakuan pemberian madu menunjukkan hasil tertinggi pada perlakuan B (66,33 ± 3,21%) dan berbeda nyata (P<0,05) terhadap kontrol yang menunjukkan nilai AF terendah yaitu 35,3 ± 1,15%. Nilai AF pada K+ pada hari ketiga setelah uji tantang yaitu 30,67 ± 1,53% dan berbeda nyata (P<0,05) dengan perlakuan A, B, dan C dengan nilai AF berturut-turut yaitu 34,67 ± 1,53%; 42,33 ± 2,31%;  dan 49,00 ± 1,73%. Pada hari  kelima  setelah  uji  tantang,  perlakuan  C menunjukkan nilai AF tertinggi yaitu 41,33 ± 0,58% yang tidak berbeda nyata dengan perlakuan B (39,67 ± 2,08%) dan AF terendah diperoleh pada perlakuan K+  (31,33  ±  2,08%).  Nilai  AF  tertinggi  pada  hari ketujuh setelah uji tantang diperoleh pada perlakuan B yaitu 46,00 ± 2,00% yang tidak berbeda nyata dengan
perlakuan C (43,67 ± 0,58%), sedangkan AF terendah diperoleh pada perlakuan K+ yaitu 34,67 ± 1,53%.
Aktivitas fagositik merupakan sistem pertahanan utama dalam melawan patogen yang masuk ke dalam tubuh  udang.  Kegiatan  tersebut  dilakukan  oleh  sel hialin  dan  sedikit  peran  dari  sel  semigranular (Johansson et al., 2000). Setelah perlakuan pemberian madu,  aktivitas  fagositik  tertinggi  diperoleh  pada perlakuan  B.  Pemberian  madu  diduga  mampu meningkatkan  jumlah  produksi  sel  hialin  dan meningkatkan  aktivitas  fagositik  udang.  Setelah  uji tantang, nilai aktivitas fagositik lebih rendah dibanding setelah  perlakuan  pemberian  madu.  Hal  tersebut berbanding lurus dengan menurunnya parameter to- tal hemosit setelah uji tantang. Aktivitas fagosit yang menurun  setelah  uji  tantang  diakibatkan  oleh banyaknya  sel  fagosit  yang  rusak  dan  lisis  dalam melawan  virus  yang  masuk.  Nilai  aktivitas  fagositik yang diperoleh dalam penelitian ini sesuai dengan hasil penelitian Widanarni et al. (2016), aktivitas fagositik pada udang vaname yang diberi sinbiotik (probiotik dan  prebiotik  dari  ekstrak  ubi  jalar)  mengalami peningkatan setelah perlakuan dan terjadi penurunan aktivitas fagositik setelah uji tantang dengan IMNV.
Keterangan: Huruf yang berbeda pada masing-masing batang dalam periode pengamatan yang sama menunjukkan hasil berbeda nyata (Duncan P<0,05); SP: setelah perlakuan prebiotik; UT3: tiga hari setelah uji tantang; UT5: lima hari setelah uji tantang; UT7: tujuh hari setelah uji tantang dengan white spot syndrome virus Note: Different  letters  on  each  bar  in  the  same  observation  period  indicate  significantly different  results  (Duncan  P<0.05);  SP:  post-prebiotic  treatment;  UT3:  three  days after  the  challenge  test;  UT5:  five  days after  the  challenge  test;  UT7:  seven  days after  the  challenge  test  with  white  spot  syndrome  virus
a b bc a a a a a b b b a d c c b c d c b 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 SP UT3 UT5 UT7 A kt iv it as f ag o si ti k
Ph ag oc yt ic a ct iv it y (% ) k- k+ a b c
Gambar 3. Aktivitas  fagositik  udang  vaname  (Litopenaeus  vannamei)  yang diberi madu dengan dosis yang berbeda.
Figure 3. Phagocytic  activity  of  Pacific  white  shrimp  (Litopenaeus  vannamei) administered with honey at different doses.

## Respiratory  Burst
Respiratory  burst  (RB)  udang  vaname  selama penelitian disajikan pada Gambar 4. Nilai RB tertinggi setelah  perlakuan  pemberian  madu  diperoleh  pada perlakuan B yaitu 0,874 ± 0,090 dan berbeda nyata (P<0,05) dengan semua perlakuan lainnya. Pada hari ketiga setelah uji tantang, perlakuan B memiliki nilai RB tertinggi yaitu 0,624 ± 0,024 yang tidak berbeda nyata (P>0,05) dengan perlakuan C (0,556 ± 0,094); tetapi berbeda nyata (P<0,05) dengan perlakuan A dan K+.  Nilai  RB  terendah  pada  hari  kelima  setelah  uji tantang diperoleh pada perlakuan K+ yaitu 0,261 ± 0,013 dan tertinggi pada perlakuan B yaitu 0,490 ± 0,009. Pada hari ketujuh setelah uji tantang, perlakuan K+  menunjukkan  nilai  RB  terendah  yaitu  0,373  ± 0,003; sedangkan perlakuan C menunjukkan nilai RB tertinggi yaitu 0,523 ± 0,009 yang tidak berbeda nyata (P>0,05) dengan perlakuan A (0,509 ± 0,012); namun berbeda nyata (P<0,05) dengan perlakuan B (0,457 ± 0,010).
Patogen yang masuk ke dalam tubuh udang akan difagositosis  oleh  sel-sel  fagosit.  Patogen  yang menginfeksi akan dihancurkan dan partikelnya akan
dihilangkan oleh beberapa enzim degradatif ke dalam fagosom, serta menghasilkan reactive oxygen interme- diates (ROI). Rangkaian proses penghapusan partikel dan pelepasan enzim tersebut dikenal dengan istilah respiratory  burst  (RB)  (Rodriguez  &  Moullac,  2000). Setelah perlakuan pemberian madu, nilai RB tertinggi diperoleh pada perlakuan B. Hal tersebut menunjukkan adanya pengaruh pemberian madu terhadap aktivitas RB yang berbanding lurus dengan nilai THC. Setelah uji tantang, nilai RB menurun yang disebabkan oleh adanya  stress  biologis  berupa  infeksi  patogen  yang dapat  menyebabkan  penurunan  nilai  ROI,  serta penurunan jumlah hemosit yang mengakibatkan adanya penurunan  produk  yang  dihasilkan  dari  proses fagositosis (Febrianti et al., 2016).

## Aktivitas  Phenoloxidase
Aktivitas phenoloxidase (PO) udang vaname selama penelitian disajikan pada Gambar 5. Setelah perlakuan pemberian madu, nilai PO K+ (0,201 ± 0,008) berbeda nyata (P<0,05) dengan perlakuan B (0,343 ± 0,061) dan C  (0,290 ± 0,006).  Pada hari ketiga  setelah uji tantang, nilai PO tertinggi diperoleh pada perlakuan B
Keterangan: Huruf yang berbeda pada masing-masing batang dalam periode pengamatan yang sama menunjukkan hasil berbeda nyata (Duncan P<0,05); SP: setelah perlakuan prebiotik; UT3: tiga hari setelah uji tantang; UT5: lima hari setelah uji tantang; UT7: tujuh hari setelah uji tantang dengan white spot syndrome virus Note: Different  letters  on  each  bar  in  the  same  observation  period  indicate  significantly different  results  Duncan  (P<0.05);  SP:  post-prebiotic  treatment;  UT3:  three  days after  the  challenge  test;  UT5:  five  days after  the  challenge  test;  UT7:  seven  days after  the  challenge  test  with  white  spot  syndrome  virus Gambar 4. Respiratory burst udang vaname (Litopenaeus vannamei) yang diberi madu dengan dosis yang berbeda. Figure 4. Respiratory burst  of Pacific  white shrimp  (Litopenaeus  vannamei)  ad- ministered with honey at different doses.
a b c b a a a a a b b c c c d b b c c c 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 SP UT3 UT5 UT7 R esp ir at or y bu rst O .D 6 3 0 n m k- k+ a b c
yaitu  0,206 ±  0,010.  Pada  pengamatan hari  kelima setelah uji tantang, nilai PO pada perlakuan pemberian madu berbeda nyata (P<0,05) dengan K+ (0,091 ± 0,009). Pada hari ketujuh setelah uji tantang, nilai PO tertinggi diperoleh pada perlakuan A yaitu 0,258 ± 0,008  yang  tidak  berbeda  nyata  (P>0,05)  dengan perlakuan C (0,232 ± 0,001).
Salah satu respons imun humoral pada udang adalah dengan dibentuknya phenoloxidase (PO). Phenoloxidase (PO) dalam hemolim terdapat dalam bentuk inaktif yang disebut dengan prophenoloxidase (proPO). Phenoloxidase (PO) memiliki tugas untuk mengenali zat asing yang masuk ke dalam tubuh udang, serta melawan patogen yang masuk. Setelah perlakuan pemberian madu, nilai PO  tertinggi  diperoleh  pada  perlakuan  B.  Menurut Febrianti et al. (2016), nilai PO dan RB berhubungan dan berbanding lurus dengan nilai THC. Nilai PO setelah perlakuan  pemberian  madu  yang  lebih  tinggi  pada perlakuan  B  dan  C  dibanding  perlakuan  lainnya menunjukkan bahwa pemberian madu pada dosis 0,4% dan 0,6% dapat secara signifikan meningkatkan respons imun humoral udang. Nilai PO pada hari ketiga dan kelima  setelah  uji  tantang  mengalami  penurunan
seiring  menurunnya  jumlah  hemosit.  Hal  tersebut sejalan dengan nilai hemosit yang kembali meningkat di hari ketujuh setelah uji tantang, sehingga nilai PO pun  mengalami  kenaikan  pada  hari  ketujuh  setelah uji tantang yang mengindikasikan adanya proses re- covery udang setelah diinfeksi patogen.

## Konfirmasi White Spot Syndrome Virus
Udang  yang  mengalami  kematian  setelah  uji tantang dengan WSSV kemudian dikonfirmasi melalui analisis PCR untuk membuktikan penyebab kematian udang. Analisis PCR  menunjukkan bahwa perlakuan K+,  A,  B,  dan  C  positif  terinfeksi  WSSV  dengan terbentuknya  pita  deoxyribonucleic  acid  (DNA)  yang teramplifikasi pada panjang 942 bp, sedangkan pada perlakuan K- tidak menunjukkan pita DNA, sehingga K- terinfeksi WSSV (Gambar 6).
Udang vaname yang diinfeksi WSSV menunjukkan gejala klinis yaitu menurunnya nafsu makan, saluran pencernaan kosong, udang mengalami lethargic dan tidak  responsif,  perubahan  warna  hepatopankreas menjadi pucat, serta terdapat bintik-bintik putih pada udang terutama di bagian karapas. Menurut Lightner
Gambar  5. Aktivitas phenoloxidase udang vaname (Litopenaeus vannamei) yang diberi prebiotik madu dengan dosis yang berbeda.
Figure 5. Phenoloxidase activity of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) ad- ministered with honey at different doses.
Keterangan: Huruf yang berbeda pada masing-masing batang dalam periode pengamatan yang sama menunjukkan hasil berbeda nyata (Duncan P<0,05); SP: setelah perlakuan prebiotik; UT3: tiga hari setelah uji tantang; UT5: lima hari setelah uji tantang; UT7:
tujuh hari setelah uji tantang dengan white spot syndrome virus Note: Different  letters  on  each  bar  in  the  same  observation  period  indicate  significantly different  results  (Duncan  P<0.05);  SP:  post-prebiotic  treatment;  UT3:  three  days  after the  challenge  test;  UT5: five  days  after  the  challenge  test;  UT7: seven  days  after  the challenge  test  with  white  spot  syndrome  virus
a e a ab a a c a ab b b b c d b a b c b ab 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450 SP UT3 UT5 UT7 A kt iv it as p he nol ox id ase Ph en ol ox id ase a ct iv it y O .D 4 9 2 n m k- k+ a b c
(2011), WSSV menginfeksi sel-sel pada jaringan me- sodermal,  serta  eksodermal  seperti  jaringan  epitel subkutikula,  limfoid,  dan  hematopoeietik.  Bintik- bintik putih pada udang disebabkan oleh abnormalitas deposit  garam  kalsium  pada  epitel  kutikular.  Pada beberapa kasus infeksi WSSV, terjadi discolourization yang  disebabkan  oleh  rusaknya  jaringan  kutikular kromatofora.

## KESIMPULAN
Pemberian prebiotik berupa madu melalui pakan dapat  meningkatkan  respons  imun  dan  resistansi udang vaname terhadap infeksi WSSV dengan tingkat respons imun dan resistansi  terbaik diperoleh pada pemberian madu sebanyak 0,4%.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan pada Direktorat Riset  dan  Pengabdian  pada  Masyarakat,  Direktorat Jenderal  Penguatan  Riset  dan  Pengembangan, Kementerian Riset, Teknologi, dan Pendidikan Tinggi yang telah membiayai penelitian ini melalui Penelitian Terapan Unggulan Perguruan Tinggi tahun 2018.

## DAFTAR  ACUAN
Aktas, M., Ciger, O., Genc, E., Genc, M.A., & Çavdar,
N. (2014). Effects of mannan oligosaccharide and
serotonin on molting, growth, body composition and hepatopancreas histology of white leg shrimp Litopenaeus  vannamei  (Boone  1931).  Turkish  Jour- nal of Fisheries and Aquatic Sciences, 14, 205-211.
Anderson,  D.P.  &  Siwicki,  A.K.  (1995).  Basic haematology  and  serology  for  fish  health  pro- grams.  In  Second  Symposium  on  Diseases  in  Asian Aquaculture “Aquatic Animal Health and The Environ- ment” (p. 17). Phuket, Thailand.
Cerezuela, R.,  Meseguer, J., & Esteban,  M.A. (2011). Current knowledge in synbiotic use for fish aquac- ulture: a review. Journal of Aquaculture Research & Development, S1, 008.
Cheng,  W.,  Liu,  C.H.,  Yeh,  S.T.,  &  Chen,  J.C.  (2004). The  immune  stimulatory  effect  of  sodium  algi- nate  on  the  white  shrimp  Litopenaeus  vannamei and its resistance against Vibrio alginolyticus. Fish & Shellfish Immunology, 17(1), 41-51.
Effendie, M.I. (1997).  Biologi Perikanan. Yogyakarta: Yayasan Pustaka Nusatama, hlm. 128-132.
FAO. (2017). Moderate and positive production trends for  farmed  shrimp.  http://www.fao.org/in-action/ globefish/market-reports/resource-detail/en/c/ 1042377/. [akses 01 Desember 2017].
Febrianti,  D.,  Yuhana,  M.,  &  Widanarni.  (2016).  Di- etary synbiotic microcapsule influence the immune responses,  growth  performance  and  microbial
Keterangan: KP: kontrol positif white spot syndrome virus; KN: kontrol negatif white spot syndrome virus; K-: perlakuan kontrol negatif; K+: perlakuan kontrol positif; A: perlakuan A; B: perlakuan B; C:
perlakuan C Note: KP: positive control of white spot  syndrome virus; KN: negative control of white  spot  syndrome  virus;  K-:  negative  control  treatment;  K+:  positive control treatment;  A: treatment A; B: treatment B; C: treatment C Gambar 6. Hasil  konfirmasi  white  spot  syndrome  virus  melalui  analisis polymerase chain reaction. Figure 6. The result of the confirmation of white spot syndrome virus through polymerase chain reaction analysis.

## M           KP           KN         K-         K+         A            B             C
bp 1000 900 500 942
populations to white spot syndrome virus in Pa- cific white shrimp (Litopenaeus vannamei). Journal of Fisheries and Aquatic Science, 11(1), 28-42.
Flegel,  T.W.  (2006).  Detection  of  major  penaeid shrimp  viruses  in  Asia,  a  historical  perspective with  emphasis  on  Thailand.  Aquaculture,  258(1), 1-33.
Flegel, T.W. (2012). Historic  emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia. Jour- nal of Invertebrate Pathology, 110(2), 166-173.
Hoseinifar,  S.H.,  Esteban,  M.Á.,  Cuesta,  A.,  &  Sun, Y.Z. (2015). Prebiotics and fish immune response: A  review  of  current  knowledge  and  future  per- spectives. Reviews in Fisheries Science & Aquaculture, 23(4), 315-328.
Johansson,  M.W.,  Keyser,  P.,  Sritunyalucksana,  K.,  & Söderhäll, K. (2000). Crustacean haemocytes and haematopoiesis. Aquaculture, 191(1), 45–52.
Karimah,  U.,  Anggowo,  Y.N.,  Falah,  S.,  &  Suryani. (2011).  Isolasi  oligosakarida  madu  lokal  dan analisis  aktivitas  prebiotiknya.  Jurnal  Gizi  dan Pangan, 6(3), 217-224.
Kathleen, M.M., Samuel, L., Felecia, C., Reagen, E.L., Kasing, A., Lealey, M., & Toh, S.C. (2016). Antibi- otic resistance of diverse bacteria from aquacul- ture  in Borneo.  International  Journal of  Microbiol- ogy, Article ID 2164761.
KKP. (2018). Produktivitas perikanan Indonesia. https:/ /kkp.go.id/wp-content/uploads/2018/01/KKP- Dirjen-PDSPKP-FMB-Kominfo-19-Januari-2018.pdf. [akses 02 Juli 2018].
Li, J., Tan, B., & Mai, K. (2009). Dietary probiotic Ba- cillus  OJ  and  isomaltooligosaccharides  influence the intestine microbial populations, immune re- sponses and resistance to white spot syndrome vi- rus in shrimp (Litopenaeus vannamei). Aquaculture, 291(1), 35-40.
Lightner, D.V. (2011). Virus diseases of farmed shrimp in the Western Hemisphere (the Americas): A re- view. Journal of Invertebrate Pathology, 106(1), 110- 130.
Liu, C.H. & Chen, J.C. (2004). Effect of ammonia on the immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei  and  its  susceptibility  to  Vibrio alginolyticus. Fish & Shellfish Immunology, 16(3), 321- 334.
Mai,  W.J.  &  Wang,  W.N.  (2010).  Protection  of  blue shrimp  (Litopenaeus  stylirostris)  against  the  white spot  syndrome  virus  (WSSV)  when  injected  with shrimp lysozyme. Fish & Shellfish Immunology, 28(4), 727-733.
Muslim, T. (2014). Potensi madu hutan sebagai obat dan pengelolaannya di Indonesia. Dalam Seminar Balai  Penelitian  Teknologi  Konservasi  Sumber  Daya
Alam  “Tumbuhan  Obat  dari  Hutan:  Konservasi, Budidaya  dan  Pemanfaatan”  (hlm.  67-82). Balikpapan, Indonesia: Balai Penelitian Teknologi Konservasi Sumber Daya Alam.
Nayak,  S.K.  (2010).  Probiotics  and  immunity:  A  fish perspective. Fish & Shellfish Immunology, 29(1), 2- 14.
Nunan, L.M. & Lightner, D.V. (2011). Optimized PCR assay  for  detection  of  white  spot  syndrome  virus (WSSV). Journal of Virological Methods, 171(1), 318- 321.
Partida-Arangure,  B.O.,  Luna-González,  A.,  Fierro- Coronado, J.A., Flores-Miranda, M.C., & González- Ocampo,  H.A.  (2013).  Effect  of  inulin  and probiotic  bacteria  on  growth  survival,  immune response, and prevalence of white spot syndrome virus (WSSV) in Litopenaeis vannamei cultured un- der  laboratory conditions.  African  Journal of  Bio- technology, 12(21), 3366-3375.
Ramos-Carreño,  S.,  Valencia-Yáñez,  R.,  Correa- Sandoval,  F.,  Ruíz-García,  N.,  Díaz-Herrera,  F.,  & Giffard-Mena, I. (2014). White spot syndrome virus (WSSV) infection in shrimp (Litopenaeus vannamei) exposed to low and high salinity. Archives of Virol- ogy, 159(9), 2213-2222.
Rodriguez, J. & Moullac, G.L. (2000). State of the art of  immunological  tools  and  health  control  of penaeid shrimp. Aquaculture, 191(1-3), 109-119.
Rosendale, D., Butts, C.A., de Guzman, C.E., Maddox, I.S.,  Martell,  S.,  McIntyre,  L.,  Skinner,  M.A., Dinnan,  H.,  &  Ansell,  J.  (2016).  Consumption  of antimicrobial manuka honey does not significantly perturb the  microbiota in the  hind gut  of mice. PeerJ, 4, e2787.
Sahoo, P.K., Das, A., Mohanty, S., Mohanty, B.R., Pillai, B.R.,  &  Mohanty,  J.  (2008).  Dietary  -1,3-glucan improves the immunity and disease resistance of freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii chal- lenged with Aeromonas hydrophila. Aquaculture Re- search, 39(14), 1574-1578.
Sanz,  M.L.,  Polemis,  N.,  Morales,  V.,  Corzo,  N., Drakoularakou,  A.,  Gibson,  G.R.,  &  Rastall,  R.A. (2005).  In  vitro  investigation  into  the  potential prebiotic activity of honey oligosaccharides. Jour- nal of Agricultural and Food Chemistry, 53(8), 2914- 2921.
Wang,  F.I.  &  Chen,  J.C.  (2006).  Effect  of  salinity  on the  immune  response  of  tiger  shrimp  Penaeus monodon and its susceptibility to Photobacterium damselae subsp. damselae. Fish & Shellfish Immunol- ogy, 20(5), 671-681.
Widanarni, Sukenda, & Septiani, G.R. (2016). Aplikasi sinbiotik  untuk  pencegahan  infeksi  infectious myonecrosis virus pada udang vaname (Litopenaeus
vannamei).  Jurnal  Kedokteran  Hewan,  10(2),  121- 127.
Yeh,  S.P.,  Chen,  Y.N.,  Hsieh,  S.L.,  Cheng,  W.,  &  Liu,
C.H.  (2009). Immune  response  of white  shrimp, Litopenaeus vannamei, after a concurrent infection with white spot syndrome virus and infectious hy- podermal and hematopoietic necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology, 26(4), 582-588.
Zhang, J., Liu,  Y., Tian, L., Yang, H., Liang,  G., & Xu, D. (2012). Effects of dietary mannan oligosaccha- ride on growth performance, gut morphology and stress tolerance of juvenile Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei. Fish & Shellfish Immunology, 33(4), 1027-1032.