J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 27(1): 17-30 Th. 2016 ISSN: 1979-7788 Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2016.27.1.17 Hasil Penelitian

## SENYAWA  INHIBITOR α-GLUKOSIDASE DAN ANTIOKSIDAN  DARI KUMIS KUCING DENGAN PENDEKATAN  METABOLOMIK  BERBASIS  FTIR
[ α-Glucosidase  Inhibitor  and Antioxidant  Compounds  from Orthosiphon  stamineus  Benth  Using  FTIR Based  Metabolomics]
Juliani 1) , Nancy D. Yuliana 2,3) *, Slamet Budijanto 2) , C. Hanny Wijaya 2,3) , dan Alfi Khatib 4)
1) Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
3) Pusat Studi Biofarmaka LPPM, Institut Pertanian Bogor, Bogor
4) Department of Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmacy, International Islamic University Malaysia, Malaysia
Diterima 22 April 2016 / Disetujui 24 Juni 2016

## ABSTRACT
Plant is well known as an excellent source for b ioactive compounds. Metab olomics was reported as a potential tool to accelerate plant acitive compounds identification. In this research, FTIR-b ased metab olomics method was used to identify active compounds with α-glucosidase inhibitory and antioxidant activity in aerial parts of Orthosiphon stamineus (OS) extract and its fractions. Chemical profile of OS methanolic extracts and hexane, chloroform, b utanol, and water fractions were analyzed using infrared spectroscopy. OS extracts and fractions  showed  inhibitory  activity  against  α-glucosidase  enzymes  with  IC 50 value  154.07±30.60- 465.83±85.34 µg/mL and antioxidant activity with IC 50 value 7.41±0.02-19.35±0.09 µg/mL. Butanol fraction was the fraction with the highest α-glucosidase inhibitory activity and moderate antioxidant activity with IC 50 value  b etween  154.07±30.60  µg/mL  and  10.84±0.54 µg/mL,  respectively.  The  correlation  b etween  the b iological  activity  and  chemical  composition  data  were  analyzed  using  Orthogonal  Projections  to  La tent Structures (OPLS). Based on the VIP (variab le influence on projection), the coefficient value of the respective OPLS  models,  and IR datab ase of compounds previously identified in OS, it was suggested that methoxy flavonoid  (sinensitin  and  5,6,7,3’-tetramethoxy-4’-hydroxy-8-C-preny-lflavone),  diterpenes  (orthosiphols, orthoarisins, neoorthosiphols, staminols, and stam inolactones) and triterpenes (ursolic acid, oleanolic acid, betulinic acid, hydroxybetulinic acid, maslinic acid, α-amyrin and β-amyrin) were identified as responsible compounds for the α-glucosidase inhibitory activity. Meanwhile phenolic (rosmarinic acid ), methoxy flavonoid (eupatorin, sinensetin, 5-hydroxy- 6,7,3’,4’-tetramethoxyflavone, salvigenin, 6-hydroxy-5,7,3’-trimethoxyflavone and  5,6,7,3’-tetramethoxy-4’-hydroxy-8-C-prenylflavone),  diterpenes  (orthosiphols,  orthoarisins,  neoortho- siphols,  staminols,  and  staminolactones)  and  triterpenes  (ursolic  acid,  oleanolic  acid,  b etulinic  acid, hydroxybetulinic acid, maslinic acid, α-amyrin and β-amyrin) were identified  as responsible compounds for the antioxidant activity.
Keywords: α-glucosidase inhibitors, antioxidants , metab olomics, Orthosiphon stamineus

## ABSTRAK
1
Tumbuhan  merupakan  salah  satu  sumber  senyawa  aktif  yang potensial. Pendekatan metabolomik dilaporkan sebagai salah satu metode alternatif yang dapat mempercepat proses identifikasi komponen aktif dari tumbuhan. Pada penelitian ini, metode metabolomik berbasis FTIR digunakan untuk meng-identifikasi senyawa aktif dengan aktivitas penghambatan terhadap enzim α-glukosidase dan antioksidan pada ekstrak dan fraksi tanaman kumis kucing (OS). Profil kimia ekstrak metanolik dan fraksi heksana, kloroform, butanol, dan air OS diukur dengan FTIR. Ekstrak dan fraksi OS menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap enzim α-glukosidase dengan nilai IC 50 berkisar 154,07±30,60-465,83±85,34 µg/mL dan aktivitas antioksidan dengan nilai IC 50 berkisar 7,41±0,02-19,35±0,09 µg/mL. Fraksi butanol adalah fraksi dengan aktivitas penghambatan α-glukosidase tertinggi dan aktivitas antioksidan menengah dengan nilai IC 50 berturut-turut turut 154,07±30,60 µg/mL dan 10,84±0,54 µg/mL. Korelasi antara data aktivitas biologis dan komposisi kimia dianalisis dengan orthogonal projections to latent structures (OPLS). Berdasarkan nilai VIP ( variab le influence on projection ), nilai koefisien dari model OPLS, dan pangkalan data IR senyawa yang telah teridentifikasi pada OS. Metoksi flavonoid  (sinensitin  dan  5,6,7,3’-tetrametoksi-4’-hidroksi-8-C-prenilflavon),  diterpena (ortosifol, ortoarisin, neoortosifol, staminol, dan staminolakton), triterpena (asam ursolat, asam oleanolat, asam betulinat, asam hidroksibetulinat , asam maslinat, α-amirin dan β-amirin) diidentifikasi sebagai senyawa penghambat aktivitas enzim  α-glukosidase  sedangkan  fenolik  (asam  rosmarinat),  flavonoid  (eupatorin,  sinensetin,  5-hidroksi- 6,7,3’,4’-tetrametoksiflavon, salvigenin, 6-hidroksi-5,7,3’-trimetoksiflavon dan 5,6,7,3’-tetrametoksi-4’-hidroksi- 8-C-prenilflavon), diterpena (ortosifol, ortoarisin, neoortosifol, staminol, dan staminolakton), triterpena (asam ursolat,  asam  oleanolat,  asam  betulinat,  asam  hidroksibetulinat,  asam maslinat, α -amirin dan β-amirin) diidentifikasi sebagai senyawa antioksidan.
Kata kunci: α-glukosidase inhibitor, antioksidan, metabolomik, Orthosiphon stamineus
*Penulis Korespondensi: E-mail: nancy_dew i@ipb.ac.id

## PENDAHULUAN
Diabetes  merupakan  penyakit  akibat  kesalahan metabolisme  glukosa  yang  disebabkan  oleh  ke- kurangan  sekresi  insulin,  resistensi  terhadap  insulin maupun  keduanya.  Indonesia  menempati  posisi ketujuh  negara  dengan  penderita  diabetes  ter- banyak  di  dunia  (IDF,  2013).  Kumis  kucing merupakan  tanaman  obat  tradisional  Indonesia  yang digunakan  untuk  mengobati  diabetes  dengan  cara menghambat  aktivitas  enzim  pencernaan  salah satunya  enz im  α-glukosidase  (Mohamed et  al., 2011;  Mohamed et  al., 2012).  Selain  anti  hiper- glikemik,  tanaman  kumis  kucing  kaya  akan  senyawa antioksidan  (Akowuah et  al., 2005)  sehingga  kumis kucing  berpotensi  pula  untuk  menurunkan  risiko komplikasi  diabetes  akibat  stres  oksidatif  (Baynes dan  Thorpe,  1999).  Dari  sejumlah  penelitian  ter- identifikasi  116  senyawa  aktif  dari  tanaman  kumis kucing  yang  berasal  dari  kelompok  monoterpena, diterpena,  triterpena,  saponin,  flavonoid,  minyak atsiri, dan  asam organik  (Adnyana et al., 2013).
Salah  satu  metode  yang  dapat  digunakan  untuk mempercepat  proses  identifikasi  komponen  aktif  dari ekstrak tanaman adalah metode metabolomik (Yuliana et  al., 2011).  Metabolomik  merupakan analisis  metabolit  baik  primer  maupun  sekunder secara  menyeluruh  di  dalam  suatu  tanaman  baik secara  kuantitatif  maupun  kualitatif  (Verpoorte et  al., 2007).  Pada  proses  identifikasi  senyawa  aktif dengan  metode  metabolomik  ini,  sampel  kering tanaman  diekstraksi  menggunakan  berbagai  pelarut (difraksinasi),  masing-masing  fraksi  kemudian  dibagi dua;  untuk  uji  bioaktifitas  dan  untuk  uji  profil  kimia. Kedua  data  ini  dianalisis  dengan  teknik  analisis multivariat data (MVDA), misalnya orthogonal projections  to  latent  structures (OPLS).  OPLS  dipilih pada  penelitian  ini  karena  teknik  ini  secara  efektif mampu memisahkan variasi yang berkorelasi dengan  aktivitas  dengan  variasi  yang  tidak  ber- korelasi  dengan  aktifitas  sehingga  memudahkan intepretasi  data  (Worley  dan  Powers, 2013).
Data  profil  kimia  sampel  dapat  diperoleh dengan  menggunakan  berbagai  teknik  kromatografi maupun  spektroskopi,  misalkan fourier  transform infrared (FTIR).  Persiapan  sampel  yang  cepat  dan mudah, robust, dan  non-destruktif  menyebabkan teknik  FTIR  berpotensi  untuk  memperoleh  data  profil kimia  pada  penelitian  ini  (Pop et  al., 2014). Metabolomik  berbasis  FTIR  cukup  sensitif  diguna- kan  untuk  mengevaluasi  perubahan  metabolit  buah pada  berbagai  musim  (Hussain et  al., 2009;  Yusof et al., 2015)  dan  waktu  panen  (Yusof et  al., 2015). Selain  itu,  metabolomik  berbasis  FTIR  juga  diguna- kan  untuk  mengevaluasi  komposisi  kimia  secara kuantitatif  untuk  membedakan  enam  kultivar  beri (Pop et  al., 2014).  Penelitian  ini  bertujuan  meng- identifikasi  senyawa  aktif  inhibitor α-glukosidase dan
senyawa antioksidan  melalui  identifikasi  gugus fungsi  yang  merupakan  penanda  dari  senyawa  aktif dengan menggunakan pendekatan metabolomik berbasis  FTIR.

## BAHAN  DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah  tanaman  (daun,  ranting,  bunga)  kumis  kucing ( Orthosiphon  stamineus Benth)  (Nagrak,  Sukabumi).

## Persiapan  sampel,  ekstraksi  dan  fraksinasi kumis  kucing
Sebanyak  3  kg  tanaman  kumis  kucing  segar disortir  dan  dikeringkan  dengan  pengering  kabinet pada  suhu  45°C  selama  8  jam.  Tanaman  kumis kucing  kering  dihaluskan  menggunakan  blender. Sebanyak  531  g  serbuk  tanaman  kumis  kucing dikemas  dalam  3  plastik  tertutup  untuk  3  kali ekstraksi.  Sampel  disimpan  di  dalam freezer pada suhu  -20°C  sampai dilakukan  proses  ekstraksi.
Tanaman  kumis  kucing  (177  g) diekstraksi dengan  menambahkan  metanol  80%  (Merck,  USA) sebanyak  dua  kali  volume  serbuk  kumis  kucing, kemudian disonikasi dengan ultrasonic bath (Bransonic  Ultrasonic  Cleaner  model  8510E  MTH, Branson  Ultrasonic  Corporation,  USA)  selama  30 menit  pada  suhu  ruang,  disaring  dan  diambil filtratnya.  Proses  ekstraksi  ini  diulang  dua  kali.  Hasil ekstraksi disatukan dan dikeringkan dengan evaporator  putar  (Butchi  Rotavapor  R-210,  BÜCHII Labortechnik,  Switzerland),  dengan  pompa  vakum (Buchi  B-169 vacum  system ,  BÜCHII  Labortechnik, Switzerland)  pada  suhu  40°C  sampai  1/3  volume awal  (500  mL),  sebanyak  100  mL  dipisahkan (ekstrak  ini  selanjutnya  disebut  ekstrak  metanolik ). Sisa  larutan  ekstrak  sebanyak  400  mL  dikeringkan untuk  kemudian  difraksinasi  sebagai  berikut;  ekstrak kering  dilarutkan  dalam  250  mL  air,  dimasukkan  ke dalam  labu  pemisah  dan  ditambahkan  250  mL pelarut  organik  (1:1  v/v).  Pelarut  organik  yang ditambahkan  berturut-turut  adalah  heksana  (Merck, USA),  kloroform  (Merck,  USA),  dan  n-butanol (Merck,  USA).  Tahapan  proses  ekstraksi  dan fraksinasi  ini  diulang  sebanyak  3  kali.  Ekstrak  dan fraksi  dipekatkan  dengan  evaporator  putar  dan dikeringkan  dengan  pengering  beku  (Gamma  2-16 LSC,  Martin  Christ  Gefriertrocknungsanlagen  GmbH Germany).
Uji penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase Uji  ini  mengacu  pada  Sancheti et  al. (2009). Sebanyak  50  µL  bufer  fosfat  0,1  M  pH  6,9  (Sigma Aldrich  P0662  dan  P3786),  25  µL  larutan  p- nitrofenill- α-D-glukopiranosida  (Sigma  Aldrich  N137 7)  (dilarutkan  dalam  0,1  M  larutan  bufer  fosfat  pH
,
465,83 ± 85,34 TA* 250,69 ± 51,89 154,07 ±
30,60 TA* 0,02 ± 0,00 0 100 200 300 400 500 600 N il a i I C 5 0 (µ g /m L )
6,9),  ekstrak  kumis  kucing  sebanyak  10  µL dilarutkan  dalam  DMSO  (Merck,  USA)  dan  akarbosa (Glucobay®,  PT.  Bayer  Indonesia)  sebagai  kontrol positif  dilarutkan  dalam  akuabides,  25  µL α- glukosidase  0,04  U/mL  (Sigma  Aldrich  G3651) dalam  larutan  bufer  0,1  M  pH  6,9  dicampurkan. Campuran  ini  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  30 menit.  Reaksi  dihentikan  dengan  menambahkan  100 µL  larutan  natrium  karbonat  0,2  M  (Sigma  Aldrich 223530).  Reaksi  hidrolisis  enzimatis  diukur  pada panjang  gelombang  410  nm  menggunakan micro- plate  reader (Epoch  Microplate  Spectrophotometer, BioTek ® Instruments  Inc.,  USA).  Pengujian  dilaku- kan  sebanyak  3 kali.  Aktivitas inhibisi α-glukosidase dinyatakan  sebagai  %  inhibisi  dan  dihitung  sebagai berikut:
inhibisi [( A  AK ) (A  AK )] (A  AK x
AB  =  absorbans  blanko,  AKB  =  absorbans kontrol  blanko,  AS  =  absorbans  sampel,  AKS  = absorbans  kontrol  sampel.

## Uji aktivitas  antioksidan  dengan DPPH
Uji  ini  mengacu  pada  Salazar-Aranda et  al. (2011).  Sebanyak  500  µL  larutan  ekstrak  ditam- bahkan  ke  dalam  500  µL  larutan  DPPH  125  µM (Sigma  Aldrich  D9132)  dalam  EtOH  (Merck,  USA), diaduk  dan  didiamkan  pada  suhu  ruang  selama  30 menit.  Penurunan  absorbansi  diukur  menggunakan microplate  reader (Epoch  Microplate  Spectrophoto- meter,  BioTek ® Instruments  Inc.,  USA)  pada  gelom- bang  517  nm.  Kuersetin  (Sigma  Aldrich  337951) digunakan  sebagai  kontrol positif.
aktivitas antioksidan [( A  AK ) (A  AK )]
(A  AK x
AB  =  absorbansi  blanko,  AKB  =  absorbansi kontrol  blanko,  AS  =  absorbansi  sampel,  AKS  = absorbansi  kontrol  sampel.
Uji  profil  kimia  tanaman  kumis  kucing  dengan FTIR
Uji  profil  kimia  sampel  diukur  dengan  FTIR (Tensor 37, Bruker Optik GmbH, Germany) dilengkapi  detektor  DTGS  ( deuterated  triglycine sulphate) menggunakan  teknik  pelet  KBr  pada  mode absorbans.  Spektrum  diperoleh  kemudian  diproses dengan  peranti  lunak  OPUS  versi  4.2.  Perlakuan pendahuluan  berupa  pemrosesan  sinyal  dilakukan pada  area  puncak  spektra  FTIR  ekstrak  dan  fraksi yang  diperoleh  dari  hasil  pengukuran  yang  diskala- kan  terhadap  puncak  total  dan  dikurangi  menjadi daerah  terintegrasi  dengan  lebar  sama  (bilangan gelombang  2  cm -1 )  menggunakan  peranti  lunak XLSTAT  versi  2012.

## Analisis  data
Pada  penelitian  ini  spektrum  FTIR  merepre- sentasikan  profil  kimia  ekstrak  dan  fraksi  kumis kucing  yang  kemudian  digunakan  sebagai  matriks data  X,  sedangkan  aktivitas  (penghambatan  enzim α-glukosidase  atau  antioksidan  merupakan  matriks data  Y).  Spektrum  dibuat  turunannya  menggunakan metode multi-plicative  signal correction (MSC).  Data dianalisis  dengan orthogonal  projection  to  latent structures (OPLS)  menggunakan  perangkat  lunak SIMCA-P  versi  13.0  dengan  penskalaan  pareto. Model  di-deskripsikan  dengan  kriteria  ketepatan model  (R 2 Y)  dan  ketepatan  prediksi  (Q 2 Y).  Model kemudian  divalidasi  dengan  CV  ANOVA  dan  uji permutasi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivitas penghambatan  α-glukosidase ekstrak dan fraksi  kumis  kucing
Hasil  uji  aktivitas  penghambatan  enzim  α- glukosidase  oleh  ekstrak  dan  fraksi  kumis  kucing dapat  dilihat  pada  Gambar  1.  Ekstrak  metanol,  fraksi kloroform  dan  butanol  menunjukkan  aktivitas  peng- hamba tan  terhadap  enzim  α-glukosidase  akan tetapi aktivitas  penghambatan  terkuat  diperoleh  dari  fraksi butanol.  Namun  demikian  aktivitas  penghambatan oleh  fraksi  butanol  masih  lebih  rendah  dibandingkan dengan  kontrol  positif  akarbosa.
Keterangan:  *Tidak  aktif  pada  konsentrasi  tertinggi diujikan yaitu 476 µg/mL
Gambar  1. Aktivitas penghambatan  enzim  α- glukosidase  oleh  ekstrak  dan  fraksi kumis kucing
Ekstrak  etanol  daun  kumis  kucing  dilaporkan memiliki  aktivitas  penghambatan  terhadap  enzim  α- glukosidase  dengan  IC 50 sebesar  4,63  mg/mL (Mohamed et  al., 2012)  lebih  besar  dibandingkan dengan  nilai  IC 50 yang  diperoleh  dari  hasil  penelitian yaitu  sebesar  sebesar  465,83  µg/mL.  Perbedaan asal  geografis  tempat  tumbuh,  jenis  pelarut  dan bagian tanaman  yang  yang  digunakan  mem-
pengaruhi kandungan bioaktif sehingga dapat menyebabkan perbedaan  aktifitas  biologis  dari tanaman  kumis  kucing  (Rafi et  al., 2015; Akowuah et al., 2005).  Penggunaan  metanol  dan  air  ( aquaeos methanol )  sebagai  pelarut  untuk  ekstraksi  tanaman kumis  kucing  diketahui  mampu  mengekstrak  lebih banyak  senyawa  aktif  dan  memiliki  kandungan  total fenolik  lebih  tinggi  dibandingkan  pelarut  lainnya (Abdelwahab et  al., 2011).  Tanaman  kumis  kucing kaya  akan  kandungan  senyawa  fenolik  termasuk flavonoid  (Sriplang et  al., 2007).  Beberapa  literatur menyatakan  senyawa  penghambat  aktivitas α- glukosidase  termasuk  dalam  kelompok  ini  (Kwon et al., 2008;  Shobana et al., 2009). Fraksi kloroform kumis kucing diketahui mengandung terpenoid  dan  flavonoid  termasuk sinensitin  (Mohamed et  al., 2011).  Sinensitin  me- rupakan  senyawa  metoksi  flavonoid  larut  kloroform dengan  aktivitas anti  α-glukosidase  kuat  (IC 50 0,66 mg/mL)  (Mohamed et  al., 2012).  Aktivitas  peng- hambatan  α-glukosidase  oleh  fraksi  butanol  kumis kucing belum pernah dilaporkan akan tetapi senyawa  glikosida  dan  flavonoid  dengan  aktivitas anti  α-glukosidase  kuat  diisolasi  dari  fraksi  butanol herbal Gynostemma  pentaphyllum (Yang et  al., 2013). Kumis kucing dilaporkan mengandung senyawa  glikosida  termasuk  saponin  (Siddiqui et  al., 2009).
Aktivitas  antioksidan  ekstrak  dan  fraksi  kumis kucing
Pada  Tabel  1  dapat  diamati  aktivitas  anti- oksidan  ekstrak  dan  fraksi  kumis  kucing.  Aktivitas antioksidan  pada  penelitian  ini  lebih  tinggi  pada fraksi  dan  ekstrak  yang  semipolar  dan  polar  (air, butanol,  dan  metanolik)  dibandingkan  fraksi  non- polar  (kloroform  dan  heksana)  akan  tetapi  aktivitas yang  diperoleh  lebih  rendah  dibandingkan  kuersetin sebagai  kontrol  positif.  Perbedaan  polaritas  pelarut ekstraksi  digunakan  yaitu  MeOH  80%  dengan MeOH  60%  dapat  menjadi  salah  satu  penyebab perbedaan  nilai  IC 50 yang  diperoleh  dari  penelitian  ini dengan  Abdelwahab et  al. (2011).  Kemampuan solven  yang  digunakan  dalam  melarutkan  senyawa fenolik  menentukan  aktivitas  antioksidan.  Senyawa marker  terpolar  yaitu  asam  rosmarinat  dilaporkan tertinggi  kandungannya  pada  solven  MeOH  50% secara  signifikan  dibandingkan  MeOH  100%.  Asam rosmarinat  merupakan  antioksidan  terkuat  diban- dingkan  marker  lainnya  (Akowuah et  al., 2005). Khamsiah et  al. (2006)  melaporkan  perbedaan tempat  tumbuh  tanaman  kumis  kucing  yang  juga dapat  menjadi  penyebab  perbedaan  kandungan senyawa  fenolik  dan  aktivitas  antioksidan.  Fenolik merupakan  salah  satu  kelompok  penting  senyawa aktif  kumis  kucing  yang  berkontribusi  terhadap aktivitas  antioksidan  (Akowuah et al., 2004).
Tabel  1.  Perbandingan  aktivitas  antioksidan  oleh ekstrak  dan  fraksi  kumis  kucing  yang diperoleh pada penelitian  ini  dengan literatur Ekstrak atau Fraksi IC 50 (µg/mL) Hasil Penelitian Abdelwahab et al., 2011 Metanolik 7,41±0,02 16,66 Heksana TA* 126,2 Kloroform TA* 31,25 Butanol 10,84±0,54 13,56 Air 19,35±0,09 23,0 Kuersetin** 5,46±0,00 -
Keterangan:  *Tidak aktif pada konsentrasi  yang tertinggi diujikan yaitu 25 µg/mL, ** kontrol positif
Dari  empat  marker  yaitu  sinensetin  (SEN), eupatorin  (EUP   and  3’-hidroksi-5,6,7,4’-tetrametok- siflavon  (TMF)  dan  asam  rosmarinik  (RA)  fraksi kloroform  tinggi  akan  kandungan  SEN  dan  EUP (Akouwah et  al., 2005).  Oleh  karena  gugus  O-metil pada  SEN,  EUP  dan  TMF  senyawa-senyawa  ini bersifat  lipofilik  sehingga  memungkinkan  terkandung dalam  jumlah  besar  dalam  ekstrak  non  polar.  Fraksi kloroform  dan  heksan  tinggi  akan  kandungan  total flavonoid (Abdelwahab et  al., 2011).  Diantara solven-solven  yang  digunakan  kloroform  dan  heksan merupakan  solven  paling  tidak  polar  sehingga memungkinkan  melarutkan  sebagian  besar  senyawa flavonoid  lipofilik.  Aktivitas  antioksidan  tinggi  pada fraksi  dan  ekstrak  semipolar  dan  polar  dapat  di- sebabkan  salah  satunya  oleh  senyawa  RA  yang diketahui  merupakan  senyawa  polar.  Tidak  hanya  itu senyawa  gula  diduga  juga  dapat  berperan  sebagai antioksidan  mengingat  penstabilan  aktivitas  radikal bebas  oleh  antioksidan  disebabkan  oleh  kemam- puannya  mendonorkan  hidrogen  (Akowuah et  al., 2005).
Korelasi  profil  komposisi  kimia  dan  bioaktivitas ekstrak  dan fraksi  kumis  kucing  dengan OPLS
Pada  prinsipnya  OPLS  mencoba  mengorelasi- kan  dua  jenis  data  matriks,  yaitu  data  berupa komposisi  kimia  sampel  ( X )  dan  data  aktivitas sampel  ( Y ).  Terdapat  beberapa  keluaran  OPLS yang  dapat  digunakan  untuk  menafsir  data  di antaranya score  plot, plot Y-related  coefficient dan plot variable  influence  on  projection (VIP).  Untuk mengidentifikasi  gugus  fungsi  senyawa  aktif,  plot VIP  digunakan  sebagai  parameter  sinyal  x  penting terhadap  data  Y  sedangkan  plot Y-related  coefficient digunakan  guna  mempelajari  sinyal  yang  berkorelasi positif  dengan  mariks  data  Y  (bioaktivitas).  VIP hanya  memberikan  nilai  korelasi  positif  untuk  semua sinyal  sedangkan  plot Y-related  coefficient dapat memberikan  nilai  korelasi  baik  positif  dan  negatif (Eriksson et  al., 2006).  Sinyal  yang  dipilih  adalah sinyal yang berkorelasi  positif  dan  bernilai  VIP>0,5.
Profil  kimia  senyawa  penghambat  aktivitas  en- zim α-glukosidase
Score  plot pada  OPLS  digunakan  untuk mengelompokkan  sampel  berdasarkan  karakteristik data  matriks  Y  (aktivitas  penghambatan  enzim  α- glukosidase).  Pemisahan  yang  baik  antara  sampel dengan aktivitas rendah dan sampel  dengan aktivitas  tinggi  menunjukkan  bahwa  OPLS  dapat digunakan  lebih  lanjut  untuk  mengidentifikasi  gugus fungsi  senyawa  aktif.  Pada  Gambar  2  terlihat  fraksi aktif  dan  fraksi  tidak  aktif  terpisah  dengan  baik sehingga  proses  identifikasi  gugus  fungsi  senyawa aktif  dengan  OPLS  dapat  dilakukan  lebih  lanjut. Ketepatan  model  OPLS  dapat  dilihat  dari  nilai  R 2 Y dan  Q 2 Y.  Nilai  R 2 Y  merupakan  jumlah  variabel  Y yang  dapat  dijelaskan  oleh  model  dan  peninjauan kecocokan  model.  Q 2 Y  adalah  hasil  validasi  silang dan  pengukuran  kuantitatif  antara  hasil  prediksi dengan  data  yang  sebenarnya.  Nilai  R 2 Y  diperoleh pada  model  ini  sebesar  0,76  sedangkan  nilai  Q 2 Y sebesar  0,59.  Pada  model  OPLS  ini  kedua  nilai tersebut  >0,5  sehingga  tergolong  model  yang  baik (Eriksson et al., 2006). OPLS cenderung memaksakan kecocokan model  dengan  data  ( over-fit) sehingga  dibutuhkan tahapan validasi untuk  memastikan  keandalan ( reliability )  dari  model  (Worley  dan  Powers,  2013). Nilai p yang  menjadi  patokan  pada  metode  validasi CV  ANOVA  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini sebesar  0,03,  lebih  kecil  dari  nilai  maksimum  yang diterima,  yaitu P <0,05  sehingga  model  dianggap memiliki  reabilitas  yang  baik  (Eriksson et  al., 2008). Selain  itu,  test  permutasi  juga  dilakukan  untuk mengetahui  seberapa  besar  terjadinya  korelasi  yang tidak  disengaja  akibat  jumlah  sampel  yang  kecil
dengan  variabel  yang  berjumlah  besar  (Lindgren et al., 1996).  Model  yang  valid  seharusnya  memiliki nilai  intersep  R 2 dan  Q 2 pada  sumbu  Y  berturut-turut tidak  lebih  dari  0,3-0,4  (Eriksson et  al., 2006).  Nilai intersep  R 2 dan  Q 2 yang  diperoleh  pada  model  ini berturut-turut  adalah  0,26 dan  -0,94.
Pada  Gambar  3  diketahui  ada  lima  area  puncak bilangan  gelombang  yang  berkorelasi  positif  ter- hadap  aktivitas  penghambatan  enzim  α-glukosidase yaitu  Area  A  (2844-2978  cm -1 ),  Area  B  (1675-1758 cm -1 ),  Area  C  (1161-1302  cm -1 ),  Area  D  (934-980 cm -1 ),  dan  Area  E  (480 –399  cm -1 ).  Area  Puncak  A, B,  C  dan  D  dipilih  untuk  diidentifikasi  lebih  lanjut karena  pada  puncak  tersebut  terdapat  sinyal penanda  senyawa  aktif  penting  terhadap  aktivitas penghambatan  terhadap  α-glukosidase.  Pita  se- rapan  Area  A  (2845-2977  cm -1 )  mengindikasikan vibrasi  ulur  asimetri  dan  simetri  gugus  fungsi  dari grup  metilena  (CH 2 dan  CH 3 ),  turunan  metoksi  dan C-H  (aldehid)  termasuk  cis  ikatan  rangkap  dan hidroksil  (Saidan et  al., 2015).  Area  B  (1676-1755 cm -1 )  mengindikasikan  gugus  karbonil  sedangkan Area  C  (1162-1301  cm -1 )  mengindikasikan  gugus ulur  C-O  dan  OH.  Area  D  (935-979  cm -1 )  meng- indikasikan  keberadaan  vinil  atau  pita  tekuk  C-H  dari senyawa  aromatik  (Silva et  al., 2014;  Pop et  al., 2014).

## Penanda  senyawa  penghambat  aktivitas  enzim α-glukosidase
Pita  serapan  serapan  sempit  dan  tajam  pada bilangan  gelombang  2924  cm -1 dan  2854  cm -1 yang mencirikan  senyawa  metoksi  flavonoid  (Rafi et  al., 2015).
Gambar  2.  OPLS score  plot ak tivitas  penghambatan  α-glukosidase  oleh  ekstrak  dan  fraksi  kumis  kucing. Tiap  sampel  diwakili  oleh  lingkaran  dengan  variasi  warna  abu-abu  ke  hitam  mewakili  sampel dengan  aktivitas  rendah  ke  aktivitas  tinggi.  Sumbu  dan  ordinat  plot  menunjukkan  skor  OPLS untuk setiap  sampel
22,5131-40,4579 40,4579-58,4027 58,4027-76,3474 76,3474-94,2922 1,00065 * t[1] R2X [X Side Comp. 1] = 0,793 Ellips: Hotelling’s T2 (95%) A1b A1a B1a B1b B2a B2b M1a A2a A2b M1b a H3b M3b H3a H2a H2b A3a H1b A3b K2b K1a B3a B3b K1b K2a K3a K3b M2b M2a M3a H1a 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80 1 ,1 8 4 2 9 * t o [1 ] Tidak Aktif Aktif 10 5 0 -5 -10 -15
15
Gambar  3.  Plot Y-related  coefficient ekstrak  dan  fraksi  kumis  kucing.  Area  A  (2845-2977  cm -1 ),  Area  B (1676-1755  cm -1 ),  Area  C  (1162-1301  cm -1 ),  Area  D  (935-979  cm -1 ),  dan  Area  E  (480 –399 cm -1 ) adalah  puncak-puncak  yang  m enunjukkan  korelasi  positif  dengan  aktivitas  penghambatan  α - glukosidase
Hasil  analisis  OPLS  mengindikasikan  senyawa sinensitin  dan  5,6,7,3’-tetrametoksi-4’-hidroksi-8-C- prenilflavon  (Hossain  dan  Rahman,  2015)  memiliki aktivitas  penghambatan  terhadap  enzim α-gluko- sidase.  Flavonoid  kumis  kucing  umumnya  terdapat dalam  bentuk  termetoksilasi  dan  larut  kloroform, bilangan  gelombang  penanda  gugus  fungsi  aktif flavonoid  seperti  OCH 3 (2928  cm -1 dan  2857  cm -1 ), C-O  (1234-1284  cm -1 ),  C-O  dan  C-OH  (1173-1176 cm -1 )  dan  dan  pita  tekuk  C-H  dari  senyawa  aromatik (913-997  cm -1 )  pada  penelitian  ini  dapat  diamati pada  spektrum  fraksi  aktif  kloroform.  Perbedaan antara  bilangan  gelombang  yang  diperoleh  pada literatur  dengan  pada  spektra  kemungkinan  disebab- kan  oleh  senyawa  yang  diukur  pada  literatur merupakan  senyawa  murni.  Pengukuran  contoh dalam  bentuk  campuran  memungkinkan  terjadi tumpang  tindih  puncak  gugus  fungsi  penanda senyawa  aktif  dalam  spektra  ekstrak  maupun  fraksi (Stehfest et  al., 2004).  Rangkuman  hasil  analisis karakteristik  IR  seluruh  senyawa  yang  diidentifikasi memiliki  aktivitas penghambatan  terhadap  α-gluko- sidase  berupa  nilai  VIP  berkisar  0,00-1,63  dan memiliki  nilai Y-related coefficient positif  dapat dilihat pada  Tabel  2. Nilai  VIP≥ ,5  dianggap  relevan sedangkan  nilai  VIP>1  sangat  relevan  (Galindo- Prieto et  al., 2014).  Sinensitin  dengan  gugus  fungsi dari  grup  metoksi,  asam  karboksilat,  cincin  aromatik dan  heteroaromatik,  metil,  hidroksi  fenolik,  C-O,  dan ujung  metilena  merupakan  salah  satu  senyawa  yang diketahui  memiliki  aktivitas  penghambatan  terhadap α-glukosidase (Hossain dan Rahman, 2015; Mohamed et  al., 2012).  Hasil  berbeda  dikemukakan oleh  Damsud et  al. (2014)  yang  mengisolasi  4 flavonoid  yaitu  sinensetin,  salvigenin,  tetrametil- skutellarein  dan  3,7,4'-tri-O-metilkaempferol.  Dari
empat  flavonoid  tersebut  tetrametilskutellarein  dan 3,7,4'-tri-O-metilkaempferol  menghambat  a-glukosi- dase  khamir  dengan  IC 50 berturut-turut  sebesar  6,34 mM  dan  0,75  mM.  Diketahui  bahwa  subtitusi  gugus metoksil  pada  flavonoid  menurunkan  aktivitas  peng- hambatan α-glukosidase  (Gao et  al., 2004;  Asghari et  al., 2015).  Sinensetin  dengan  struktur  kimia terdapat  lima  gugus  metoksi  merupakan  senyawa flavonoid  dengan  subtitusi  gugus  metoksi  terbanyak dari  tanaman  kumis  kucing.  Selain  itu  keberadaan gugus  OH  dan  C=O  diduga  memiliki  kecenderungan meningkatkan aktivitas penghambatan α-gluko- sidase  oleh  flavonoid.  Kemampuan  gugus  fungsi C=O  diduga  lebih  baik  dibandingkan  gugus  fungsi OH  dalam  membentuk  ikatan  hidrogen  pada  sisi aktif  enzim  yang  merupakan  salah  satu  mekanisme penghambatan  enzim α-glukosidase  oleh  senyawa bioaktif  (Asghari et al., 2015;  Uddin et al., 2012).
Senyawa  diterpen  ditandai  dengan  adanya  pita serapan  gugus  hidroksil  pada  bilangan  gelombang 3500-3480  cm -1 ,  ester  karbonil  pada  bilangan gelombang  1270-1150  cm -1 ,  dan  fenil  pada  bilangan gelombang  1600  cm -1 dan  1420  cm -1 (Sim et  al., 2004).  Senyawa  diterpen  dapat  diisolasi  dari  fraksi kloroform  (Awale et  al., 2002;  Awale et  al., 2003). Pada  spektrum  aktif  fraksi  kloroform  dapat  diamati gugus  fungsi  aktif  penanda  diterpen  yaitu  hidroksil pada  bilangan  gelombang  3396-3420  cm -1 dan  ester karbonil  pada  bilangan  gelombang  1113-1284  cm -1 . Berdasarkan  hasil  identifikasi  gugus  fungsi  penanda senyawa  penghambat  aktivitas  enzim α-glukosidase mengindikasikan  senyawa  dari  kelompok  diterpen tipe  isopimaran  yaitu  ortosifol  F-J  (Tezuka et  al., 2000),  ortoarisin  A,  ortoarisin  B,  ortoarisin  C, ortoarisin  D,  ortoarisin  E,  ortoarisin  F,  ortoarisin  G (Di et  al., 2013)  sebagai  senyawa  penghambat
Y R e la te d Pro fi le (Va r_ 1 8 6 7 ) 0,04 0,02 0 -0,02 -0,04 -0,06 -0,08 -0,1 A
B
A C D E Var ID (Sampel) 3 9 9 6 ,2 2 3 8 7 2 ,7 8 3 7 4 9 ,3 5 3 6 2 5 ,9 1 3 5 0 2 ,4 8 3 3 7 9 ,0 4 3 2 5 5 ,6 1 3 1 3 2 ,1 7 3 0 0 8 ,7 4 2 8 8 5 ,3 2 7 6 1 ,8 7 2 6 3 8 ,4 3 2 5 1 4 ,9 9 2 3 9 1 ,5 6 2 2 6 8 ,1 2 2 1 4 4 ,6 9 2 0 2 1 ,2 5 1 8 9 7 ,8 2 1 7 7 4 ,3 8 1 6 5 0 ,9 5 1 5 2 7 ,5 1 1 4 0 4 ,0 8 1 2 8 0 ,6 4 1 1 5 7 ,2 1 1 0 3 3 ,7 7 9 1 0 ,3 3 5 7 6 8 ,9 6 6 3 ,4 6 5 5 4 0 ,0 2 9 4 1 6 ,5 9 4
aktivitas  enzim α-glukosidase.  Walaupun  belum  ada laporan  aktivitas  senyawa  isopimaran  diterpen  dari kumis  kucing  tetapi  isopimaran  diterpen  baru  5 R , 6 S ,  10 S ,  11 R ,  13 R and  14 S dan  isopimaran  diterpen teridentifikasi  11-deoksidiaportein  A  dari  kapang  laut Epicoccum sp.  HS-1  dilaporkan  memiliki  aktivitas penghambatan terhadap enzim α-glucosidase dengan  nilai  IC 50 berturut-turut  4, 6  μM  dan  11,9  μM (Xia et al., 2015). enyawa  penghambat  aktivitas  enzim  α-gluko- sidase  juga  diidentifikasi  dari  kelompok  diterpen  tipe isopimaran  teroksigenasi  yaitu  ortosifol  O,  ortosifol P,  ortosifol  Q,  dan  noortosifonolida  A  (Awale et  al., 2002),  kelompok  diterpen  tipe  isopimaran  ter- oksigenasi  tinggi  ortosifol  A,  ortosifol  B,  ortosifol  U, ortosifol  V,  ortosifol  W,  ortosifol  X,  ortosifol  Y  dan ortosifol  Z  (Masuda et  al., 1992;  Awale et  al., 2003), kelompok  diterpen  tipe  isopimaran  termigrasi  yaitu neoortosifol  A  dan  neoortosifol  B  (Ohashi et  al., 2000),  dan  senyawa  ortoarisin  H  dari  kelompok diterpen  tipe  sekoisopimaran  (Di et  al., 2013). Diterpen tipe isopimaran teroksigenasi tinggi ortosifol  A  yang  dikarakterisasi  berdasarkan  data spektroskopi  secara  selektif  menghambat  enzim maltase  dengan  nilai  IC 50 sebesar  6,54  mM.  Studi lebih  lanjut  ortosifol  A  menunjukkan  bahwa  aktivitas penghambatan  fungsi  maltase  terjadi  secara  tidak kompetitif  (Damsud et  al., 2014).  Diterpen  tipe  seko- isopimaran dari Salvia cinnabarina diketahui memiliki  aktivitas  antipasmodik  (Capasso et  al., 2004)  dan  mutagenik  (Di  Sotto et  al., 2009)  akan tetapi  akt ivitas  penghambatan  terhadap  enzim  α- glukosidase  belum  pernah  dilaporkan.  Senyawa penghambat  aktivitas  enzim α-glukosidase  diidenti- fikasi  dari  kelompok  diterpen  tipe  staminan  adalah staminol  A,  staminol  B,  staminolakton  A,  stamino- lakton  B,  norstaminol  A  (Tezuka et  al., 2000)  dan ortoarisin  I (Di et al., 2013).
Asam  ursolat,  asam  oleanolat,  asam  betulinat, asam  hidroksibetulinat, α-amirin,  β-amirin,  asam maslinat  (Hossain  dan  Ismail,  2013)  merupakan senyawa  triterpen  yang  diidentifikasi  dari  gugus fungsi  penanda  senyawa  penghambat  aktivitas enzim α-glukosidase  yang  diduga  berkontribusi  ter- hadap  aktivitas  penghambatan  enzim α-glukosidase. Asam  maslinat  dan  asam  oleanolat  dari  ekstrak  etil asetat  daun Lagerstroemia  speciosa dilaporkan memiliki  aktivitas  penghambatan  terhadap  enzim α- glukosidase  dengan  IC 50 berturut-turut 5,52  g/mL dan  6,29  g/mL  (Hou et  al., 2009).  Lebih  lanjut senyawa  triterpen  penghambat  aktivitas  enzim α- glukosidase  asam  ursolat  (IC 50 47,6 μM)  dan  asam betulinat  (IC 50 14,0 μM)  diisolasi  dari  apel  emas merah  ( Malus  domestica )  (He et  al., 2014).  Asam ursolat  dan  asam  oleanolat  sebagai  senyawa  yang menghambat  aktivitas  enzim α-glukosidase  secara tidak  kompetitif  dengan  nilai  IC 50 berturut-turut  39,0 dan  35,0  mM  juga  dilaporkan  dari  bunga Punica
granatum L.  (Salah et  al., 2014).  Asam  hidroksi- betulinat  belum  pernah  dilaporkan  memiliki  aktivitas penghambatan  terhadap  enzim α-glukosidase  akan tetapi  pentasiklik  triterpen  asetat 3β-asetoksi- 6β- asam  hidroksibetulinat  dari  tanaman Fagara  tess- mannii Engl.  menunjukkan  aktivitas  penghambatan yang  signifikan  terhadap  enzim α-glukosidase  (IC 50 7,6 μ M)  (Mbaze et  al., 2007).  Secara in  vivo α-amirin dan β-amirin  menunjukkan  aktivitas  antihiper- glikemik  pada  konsentrasi  10,  30  dan  100  mg/kg terhadap  mencit  (Santos et  al., 2012).  Aktivitas antihiperglikemik  ini  dapat  diakibatkan  salah  satunya oleh  aktivitas  penghambatan  terhadap  enzim α- glukosidase. β-amirin  dari Memecylon  umbellatum Burm.  F  dilaporkan  memiliki  aktivitas  pengham- batan  terhadap  enzim  α-glukosidase  secara  signifi- kan pada  konsentrasi  10,0 mM (Sridevi et al., 2015).

## Profil kimia senyawa antioksidan
Score  plot pada  OPLS  digunakan  untuk mengelompokkan  sampel  berdasarkan  karakteristik data  matriks  Y  (aktivitas  antioksidan).  Pada  Gambar 4  terlihat  fraksi  aktif  dan  fraksi  tidak  aktif  terpisah dengan  baik  sehingga  memungkinkan  penggunaan OPLS  dalam  mengidentifikasi  gugus  fungsi  senyawa aktif  lebih  lanjut.  Nilai  R 2 Y  dan  Q 2 Y  diperoleh berturut-turut  sebesar  0,82  dan  0,59.  Hasil  validasi silang  CV  ANOVA  diperoleh  0,03  sehingga  secara statistik  metode  ini  tergolong  valid  (Eriksson et  al., 2008).  Dari  hasil  permutasi  diperoleh  nilai  intersep R 2 dan  Q 2 berturut-turut  adalah  0,29  dan  -0,95 sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  model  OPLS  ini cukup  valid.  Pada  Gambar  5  terdapat  lima  area puncak  dengan  bilangan  gelombang  yang  ber- korelasi  positif  terhadap  aktivitas  antioksidan  yaitu Area  A  (3020-3649  cm -1 ),  Area  B  (1600-1635  cm -1 ), Area  C  (1519 –1598  cm -1 ),  Area  D  (1380-1409  cm -1 ), dan  Area  E  (408 –430 cm -1 ).  Selain  Area  E  (408 –430 cm -1 ),  puncak-puncak  yang  korelasi  positif  dengan aktivitas  antioksidan  digunakan  untuk  identifikasi senyawa  aktif  lebih  lanjut  karena  terdapat  sinyal penanda  senyawa  aktif  penting  (VIP>0,5).  Gugus fungsi  OH  direpresentasikan  oleh  bilangan  gelom- bang  pada  Area  A  (3020 –3649  cm -1 )  sedangkan Area  B  (1600-1635  cm -1 ),  Area  C  (1519 –1598  cm -1 ) mengindikasikan  keberadaan  cincin  aromatik.  Area D  (1380-1409  mengindikasikan  pita  tekuk  CH 3 (Pop et al., 2014; Saidan et al., 2015).

## Penanda senyawa antioksidan
Pita  ulur  dari  grup  fenil  (C=C)  pada  bilangan gelombang  1609-1608  cm -1 dan  bilangan  gelom- bang  1516-1516  cm -1 merupakan  karakteristik  IR tipikal  senyawa  aromatik  yang  dapat  mengindikasi- kan  keberadaan  senyawa  fenolik  (Silva et  al., 2014). Pada  spektra  karakteristik  IR  senyawa  fenolik berupa  pita  ulur  dari  grup  fenil  (C=C)  berada  pada bilangan  gelombang  1602-1608  dan  1522-2527  cm - 1 .
Gambar  4.  OPLS score  plot antioksidan  ekstrak  dan  fraksi  kumis  kucing.  Tiap  sampel  diwakili  oleh lingkaran  dengan  variasi  warna  abu-abu  ke  hitam  mewakili  sampel  dengan  aktivitas  rendah  ke aktivitas  tinggi. Sumbu  dan  ordinat  plot menunjukkan  skor OPLS untuk setiap  sampel
Gambar  5.  Plot Y-related  coefficient ekstrak  dan  fraksi  kumis  kucing.  Area  A  (3020 –3649  cm -1 ),  Area  B (1600-1635  cm -1 ),  Area  C  (1519 –1598  cm -1 ),  Area  D  (1380-1409  cm -1 ),  dan  Area  E  (408 –430 cm -1 ) adalah  puncak-puncak  yang menunjukkan  korelasi  positif dengan  aktivitas  antioksidan
Asam  rosmarinat  yang  merupakan  senyawa fenolik  polar  turunan  asam  kafeat  dengan  gugus fungsi  cincin  aromatik,  C-H  aromatik,  grup  fenol  dan karboksilat diketahui memiliki kontribusi kuat terhadap  aktivitas  antioksidan  (Stehfest et  al., 2004; Hunaefi et  al., 2012).  Rangkuman  hasil  analisis karakteristik  IR  seluruh  senyawa  yang  diidentifikasi memiliki  aktivitas  antioksidan  berupa  nilai  VIP berkisar  0,01-0,67  dan  memiliki  nilai Y-related coefficient positif  dapat  dilihat  pada  Tabel  3.  VIP merupakan parameter yang digunakan untuk mengukur  secara  kumulatif  pengaruh  variabel  X pada  model  yang  mana  nilai  VIP≥ ,5  dianggap relevan  (Galindo-Prieto et  al., 2014).  Gugus  fungsi
OH  (>3000  cm -1 )  dan  cicin  aromatik  (>1500-1600 cm -1 )  bernilai  VIP  berturut-turut  0,15-0,67  dan  0,09- 0,33  memiliki  peranan  penting  terhadap  aktivitas antioksidan.  Kedua  gugus  fungsi  ini  sangat  umum ditemukan  terutama  jika  contoh  yang  diukur  dalam bentuk  campuran  sehingga  tumpang  tindih  gugus fungsi  OH  dan  cincin  aromatik  senyawa  aktif  dengan senyawa  tidak  aktif  sangat  mungkin  terjadi.  Kumis kucing  diketahui  tinggi  akan  kandungan  senyawa fenolik  salah  satunya  flavonoid.  Berdasarkan  hasil identifikasi  gugus  fungsi  penanda  senyawa  antioksi- dan  mengindikasikan  senyawa-senyawa  metoksi flavonoid  dan  flavonoid  terprenilasi  berikut  memiliki aktivitas  antioksidan  antara  lain  eupatorin,  sinensitin,
Y R e la te d Pro fi le (Va r_ 1 8 6 7 ) 0,01 0 -0,01 -0,02 -0,03 -0,04 -0,05 -0,06 -0,07 Var ID (Sampel) 3996, 22 3 8 7 2 ,7 8 3 7 4 9 ,3 5 3 6 2 5 ,9 1 3 5 0 2 ,4 8 3 3 7 9 ,0 4 3 2 5 5 ,6 1 3 1 3 2 ,1 7 3 0 0 8 ,7 4 2 8 8 5 ,3 2 7 6 1 ,8 7 2 6 3 8 ,4 3 2 5 1 4 ,9 9 2 3 9 1 ,5 6 2 2 6 8 ,1 2 2 1 4 4 ,6 9 2 0 2 1 ,2 5 1 8 9 7 ,8 2 1 7 7 4 ,3 8 1 6 5 0 ,9 5 1 5 2 7 ,5 1 1 4 0 4 ,0 8 1 2 8 0 ,6 4 1 1 5 7 ,2 1 1 0 3 3 ,7 7 9 1 0 ,3 3 5 7 6 8 ,9 6 6 3 ,4 6 5 5 4 0 ,0 2 9 416 ,5 9 4 A B A C D E A Tidak Aktif Aktif 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80 1 .0 5 9 5 3 * t o [1 ] 10 5 0 -5 -10
-15 15 1,00052 * t[1] R2X [X Side Comp. 1] = 0,804 Ellips: Hotelling’s T2 (95%)
17,9153-57,6217 57,6217-97,3282 H2b A1a A1b H1b M1a H1a H3b M1b K3b  K3a K1a K1b H3a K2a K2b B1b B1a B2b A2b B2a A2a A3a A3b M3a M2a M2b M3b B3b B3a
5-hidroksi- 6,7,3’,4’-tetrame-toksflavon,
salvegenin,
6-hidroksi- 5,7,3’-trimetok-siflavon,  dan  5,6,7,3’-tetra- metoksi- 4’-hidroksi-8-C-prenilflavon (Hossain dan Rahman  2015). Eupatorin  dan  3’-hidroksi-5,6,7,4’- tetrametoksiflavon  (TMF)  diketahui  memiliki  aktivitas antioksidan  yang  relatif  sama  dengan butylated hydroxylanisole (BHA)  sedangkan  aktivitas  anti- oksidan  sinensitin  lebih  rendah  dari  BHA  pada konsentrasi  yang  sama  (0,05  mg/mL)  (Akowuah et al., 2005).
Tabel  2.  Karakteristik  IR  senyawa  aktif  terhadap aktivitas  penghambatan  enzim  α-gluko- sidase  berdasarkan  nilai Y-related  coe- fficient dan VIP Seny awa Bilangan Gelombang (cm -1 ) Y-related Coe- fficients VIP Ref . Sinensitin 2850 + 0,72 Hossain dan Rahman, 2015 1215 + 0,67 1189 + 0,72 5,6,7,3’- tetrametoksi- 4’-hidroksi-8- C-prenilf lav on 2964 + 0,69 2936 + 1,13 1271 + 0,93 1200 + 0,77 Neoortosif ol A 1720 + 1,01 Ohashi et al., 2000 1267 + 0,88 Neoortosif ol B 1720 + 1,01 1250 + 0,75 Ortosif ol O 1725 + 0,94 Awale et al., 2002 1280 + 0,98 Ortosif ol P 1720 + 1,01 1275 + 0,96 Ortosif ol Q 1725 + 0,94 1265 + 0,86 Noortosif onoli da A 1720 + 1,01 1285 + 0,94 Ortosif ol A 2967 + 0,60 Masuda et al., 1992 1723 + 0,98 1287 + 0,89 1240 + 0.69 Ortosif ol B 2970 + 0,40 1717 + 1,12 1289 + 0,82 1240 + 0.69 Ortosif ol U 1720 + 1,01 Awale et al., 2003 1210 + 0,72 1180 + 0,80 Ortosif ol V 1720 + 1,01 1210 + 0,72 1180 + 0,80 Ortosif ol W 1725 + 0,94 1210 + 0,72 1180 + 0,80 Ortosif ol X 1720 + 1,01 1210 + 0,72 1175 + 0,81 Ortosif ol Y 1735 + 0,66 1210 + 0,72 Ortosif ol Z 1725 + 0,94 1265 + 0,86 Ortosif ol F 1725 + 0,94 Tezuka et al., 2000 1280 + 0,98 Ortosif ol G 1720 + 1,01 1280 + 0,98 Ortosif ol H 1725 + 0,94 1280 + 0,98 1240 + 0,69 Ortosif ol I 1725 + 0,94 1270 + 0,91 Ortosiphol J 1725 + 0,94 1270 + 0,91 1230 + 0,63 Staminol A 1725 + 0,94
Seny awa Bilangan Gelombang (cm-1) Y-related Coe- fficients VIP Ref . 1200 + 0,77 1270 + 0,91 Staminol B 1725 + 0,94 1200 + 0,77 1270 + 0,91 Staminolakton A 1730 + 0,83 1200 + 0,77 1240 + 0,67 Staminolakton B 1730 + 0,83 1270 + 0,91 1200 + 0,77 1240 + 0,67 Norstaminol A 1725 + 0,94 1280 + 0,98 1200 + 0,77 1240 + 0,67 Ortoarisin A 1716 + 1,12 Di et al., 2013 1275 + 0,96 Ortoarisin B 1716 + 1,12 1279 + 0,98 Ortoarisin C 1720 + 1,01 1276 + 0,93 Ortoarisin D 1712 + 1,19 1238 + 0,67 Ortoarisin E 2972 + 0,32 2944 + 0,77 2883 + 0,04 1729 + 0,86 1276 + 0,93 Ortoarisin F 2970 + 0,42 2938 + 1,02 2881 + 0,06 1725 + 0,94 1283 + 0,78 1235 + 0,65 1174 + 0,81 Ortoarisin G 2970 + 0,42 2938 + 1,02 2881 + 0,06 1725 + 0,94 1283 + 0,78 1235 + 0,65 1174 + 0,81 Ortoarisin H 1731 + 0,79 1277 + 0,97 1244 + 0,71 Ortoarisin I 1718 + 1,06 1271 + 0,93 Asam ursolat 1293 + 0,62 Hossain dan Ismail, 2013 1216 + 0,65 963 + 0,07 Asam oleanolat 2876 + 0,18 1265 + 0,86 1227 + 0,62 964 + 0,06 Asam betulinat 2953 + 0,78 2887 + 0,04 1682 + 0,57 1221 + 0,63 1194 + 0,73 980 + 0,00 Asam hidroksi- betulinat 2926 + 1,63 1742 + 0,46 1254 + 0,77 975 + 0,07 α-amirin 2969 + 0,51 2931 + 1,36 2849 + 0,61 1254 + 0,77 969 + 0,07 β-amirin 2964 + 0,69 2920 + 1,67 1753 + 0,08 1260 + 0,81 Asam maslinat 2926 + 1,63 1742 + 0,46 1254 + 0,77 975 + 0,07
Aktivitas antioksidan oleh flavonoid dan senyawa  fenol  lainnya  sebagian  besar  disebabkan oleh  gugus  hidroksil  aromatik  sehingga  radikal fenolik  menjadi  lebih  stabil  langsung  setelah  radikal terbentuk  ketika  satu  hidrogen  radikal  didonorkan  ke DPPH  (de  Souza et  al., 2013).  Semakin  banyak gugus  hidroksi  pada  struktur  kimia  semakin  tinggi aktivitas  antioksidan  oleh  senyawa  tersebut  (Liu et al., 2010).  Sebaliknya,  flavonoid  yang  disubtitusi dengan  sejumlah  metoksi  menunjukkan  penurunan aktivitas  antioksidan  (Jeong et  al., 2007).  Senyawa diterpen  ditandai  dengan  adanya  pita  serapan  gugus hidroksil  pada  bilangan  gelombang  3500-3480  cm -1 , ester  karbonil  pada  bilangan  gelombang  1270-1150 cm -1 ,  dan  fenil  pada  bilangan  gelombang  1600  cm -1 dan  1420  cm -1 (Sim et al., 2004).
Tabel  3.  Karakteristik  IR  senyawa  aktif  terhadap aktivitas  antioksidan  berdasarkan  nilai Y- related  coefficient dan  VIP Seny awa Bilangan Gelombang (cm -1 ) Y-related Coe- fficients VIP Ref . Asam rosmarinat 3382 + 0,66 Abedini et al., 2013 1606 + 0,21 1522 + 0,11 Eupatorin 3470 + 0,44 Hossain dan Rahman, 2015 3250 + 0,55 1605 + 0,22 1599 + 0,31 Sinensitin 1600 + 0,27 1590 + 0,23 5-hidroksi- 6,7,3’,4’- tetrametoksf lavon 3415 + 0,52 1600 + 0,27 1590 + 0,23 Salv egenin 3450 + 0,52 1600 + 0,27 1590 + 0,23 6-hidroksi- 5,7,3’- trimetoksif lavon 3470 + 0,44 1595 + 0,33 1590 + 0,23 5,6,7,3’- tetrametoksi- 4’- hidroksi-8-C- prenilf lav on 3435 + 0,43 1610 + 0,19 1595 + 0,33 Neoortosif ol A 3420 + 0,61 Ohashi et al., 2000 3080 + 0,51 Neoortosif ol B 3410 + 0,55 3080 + 0,51 Ortosif ol O 3550 + 0,19 Awale et al., 2002 3400 + 0,50 Ortosif ol P 3550 + 0,19 3450 + 0,52 Ortosif ol Q 3550 + 0,19 3450 + 0,52 Noortosif onolida A 3550 + 0,19 3450 + 0,52 Ortosif ol A 3425 + 0,62 Masuda et al., 1992 Ortosif ol B 3420 + 0,61 Ortosif ol U 3450 + 0,52 Awale et al., 2003 1605 + 0,22 1590 + 0,23 Ortosif ol V 3450 + 0,52 1605 + 0,22 1590 + 0,23 Ortosif ol W 3400 + 0,50 1605 + 0,22 1590 + 0,23 Ortosif ol X 3450 + 0,52 1605 + 0,22 1585 + 0,09
Seny awa Bilangan Gelombang (cm-1) Y-related Coe- fficients VIP Ref . Ortosif ol Y 3450 + 0,52 Ortosif ol Z 3450 + 0,52 Ortosif ol F 3550 + 0,19 Tezuka et al., 2000 3450 + 0,52 Ortosif ol G 3550 + 0,19 3400 + 0,50 Ortosif ol H 3550 + 0,19 3400 + 0,50 Ortosif ol I 3550 + 0,19 3400 + 0,50 Ortosif ol J 3550 + 0,19 Staminol A 3550 + 0,19 3430 + 0,61 3300 + 0,53 1600 + 0,27 Staminol B 3550 + 0,19 3430 + 0,61 3300 + 0,53 1600 + 0,27 Staminolakton A 3570 + 0,44 1600 + 0,27 Staminolakton B 3570 + 0,44 1600 + 0,27 Norstaminol A 3550 + 0,19 1600 + 0,27 Ortoarisin A 3580 + 0,15 Di et al., 2013 1602 + 0,24 Ortoarisin B 3439 + 0,45 1602 + 0,24 Ortoarisin C 3430 + 0,61 1601 + 0,27 Ortoarisin D 3460 + 0,56 1601 + 0,27 Ortoarisin E 3519 + 0,32 1601 + 0,27 Ortoarisin F 3425 + 0,62 1601 + 0,27 Ortoarisin G 3425 + 0,62 1601 + 0,27 Ortoarisin H 3363 + 0,58 1601 + 0,27 Ortoarisin I 3438 + 0,45 1601 + 0,27 Asam ursolat 3435 + 0,43 Hossain dan Ismail, 2013 3243 + 0,67 1621 + 0,12 1600 + 0,27 1528 + 0,12 1380 + 0,01 Asam oleanolat 3331 + 0,54 3161 + 0,65 3095 + 0,54 1616 + 0,16 Asam betulinat 3473 + 0,38 3063 + 0,46 Asam hidroksibetulinat 3435 + 0,43 1380 + 0,01 α-amirin 3446 + 0,48 3035 + 0,34 β-amirin 3452 + 0,52 3035 + 0,34 Asam maslinat 3435 + 0,43 1380 + 0,01
Berdasarkan  hasil  identifikasi  gugus  fungsi penanda senyawa antioksidan mengindikasikan senyawa  dari  kelompok  diterpen  tipe  isopimaran yaitu  ortosifol  F,  ortosifol  G,  ortosifol  H,  ortosifol  I, ortosifol  J  (Tezuka et  al., 2000),  ortoarisin  A,  orto- arisin  B,  ortoarisin  C,  ortoarisin  D,  ortoarisin  E, ortoarisin  F  dan    ortoarisin  G  (Di et  al., 2013).  Diter- pen  tipe  isopimaran  teroksigenasi  antara  lain  orto- sifol  O,  ortosifol  P,  ortosifol  Q,  dan  noortosifonolida A  (Awale et  al., 2002),  diterpen  tipe  isopimaran
teroksigenasi  tinggi  antara  lain  ortosifol  A,  ortosifol B,  ortosifol  U,  ortosifol  V,  ortosifol  W,  ortosifol  X, ortosifol  Y,  dan  ortosifol  Z  (Masuda et  al., 1992; Awale et  al., 2003),  diterpen  tipe  isopimaran termigrasi  neoortosifol  A  dan  neoortosifol  B  (Ohashi et  al., 2000)  dan  diterpen  tipe  sekoisopimaran ortoarisin  H  (Di et  al., 2013).  18  senyawa  diterpen (ortosifol  U-Z,  ortosifol  A,  B,  D,  F,  G,  I,  J,  O,  R,  T, ortosifonon  A  dan  sekoortosifol  B)  diisolasi  dari ekstrak  metanol  kumis  kucing  menujukkan  aktivitas penghambatan  yang  signifikan  terhadap  produksi nitrit  oksida  (NO)  pada  sel  serupa  mikrofag  J774,1 teraktivasi  lipopolisakarida  (LPS).  Namun  demikian ortosifol  A,  B,  D,  dan  X  menunjukkan  aktivitas  peng- hambatan kuat melebihi kontrol positif NG- monometil-L-arginin  (L-NMMA).  Ortosifol  U  me- nunjukkan  aktivitas  terkuat  dengan  nilai  IC 50 sebesar 6,4 µM  (Awale et al., 2003).
Selain  itu  senyawa  antioksidan  juga  diduga  dari kelompok  diterpen  tipe  staminan.  Beberapa  se- nyawa  diterpen  tipe  staminan  diidentifikasi  yaitu staminol  A,  staminol  B,  staminolakton  A,  stamina- lakton  B,  norstaminol  A  (Tezuka et  al., 2000)  dan ortoarisin  I  (Di et  al., 2013).  Aktivitas  antioksidan diterpen  tipe  staminan  terhadap  produksi  nitrit oksida  (NO)  pada  sel  serupa  mikrofag  J774,1 teraktivasi  lipopolisakarida  (LPS)  dilaporkan  dari senyawa  staminol  C  dan  D  yang  diisolasi  dari ekstrak  metanol  kumis  kucing  dengan  nilai  IC 50 berturut-turut  sebesar  61,1  µM  dan  92,0 µM (Nguyen et al., 2004).
Berdasarkan  hasil  identifikasi  gugus  fungsi penanda senyawa antioksidan mengindikasikan senyawa  dari  kelompok  triterpen  yaitu  asam  ursolat, asam  oleanolat,  asam  betulinat,  asam  hidroksi- betulinat, α-amirin,  β-amirin,  dan  asam  maslinat (Hossain  dan  Ismail,  2013)  sebagai  senyawa antioksidan.  Asam  ursolat  yang  diisolasi  dari  ekstrak Sambucus  australis menunjukkan  aktivitas  anti- oksidan  terhadap  senyawa  DPPH  dengan  nilai  IC 50 sebesar  5,97  x  10 -2 mg/mL,  asam  maslinat  yang diisolasi  dari  kulit  buah Ziziphus  jujuba Mill.  menun- jukkan  aktivitas  antioksidan  terhadap  DPPH  setara standar  BHT  dengan  nilai  dengan  nilai  IC 50 berturut- turut  sebesar  39,6;  28,12  µg/mL  (do  Nascimento et al., 2014;  Rajopadhye  dan  Upadhye,  2016).  Aktivitas antioksidan  juga  dilaporkan  dari  triterpen β-amirin dari  daun Symplocos  cochinchinensis Moore.  yang menunjukkan  aktivitas  antioksidan  terhadap  radikal DPPH  (IC 50 89,63  g/mL),  hidroksil  (IC 50 76,41  g/mL), nitrit  oksida  (IC 50 87,03  g/mL)  dan  superoksida  (IC 50 81,28  g/mL)  sekaligus  aktivitas  mereduksi  radikal yang  tinggi  dan  kuat  dalam  menekan  pengaruh peroksidasi  lipid  (Sunil et  al., 2014).  Selain  itu, senyawa  triterpen α-amirin,  asam  ursolat,  dan asam oleanolat  yang  diisolasi  dari F.  pseudopalma merupakan  pendonor  proton  dengan  nilai  IC 50 >333,33  µM  dan  kemampuan  mereduksi  sebessar
RC 50 >909.09  µM.  Asam  ursolat  merupakan  peng- hambat NO•  tertinggi  (IC 50 >166,67  µM)  yang  disusul asam  oleanolat  dan  kemudian α-amirin.  Asam ursolat  juga  merupakan  penghambat  radikal •O2 tertinggi.  Tidak  hanya  itu, α-amirin,  asam  oleanolat dan  asam  ursolat  menujukkan  kemampuan  meng- hambat  peroksidasi  lipid  dengan  nilai  IC 50 <15  µM (Santiago et al., 2014).

## KESIMPULAN
Metode  metabolomik  berbasis  FTIR  memung- kinkan  identifikasi  secara  cepat  gugus  fungsional penanda  senyawa  yang  berkorelasi  positif  dengan aktivitas  penghambatan  enzim  α-glukosidase  dan antioksidan  dari  ekstrak  kasar  dan  fraksi  kumis kucing.  Hasil  analisis  menunjukkan  bahwa  gugus fungsi  karbonil,  metoksi,  hidroksil  dan  C-O  yang mengindikasikan  keberadaan  senyawa  dari  kelom- pok  m etoksi  flavonoid  (sinensitin  dan  5,6,7,3’- tetrametoksi- 4’-hidroksi-8-C-prenilflavon), diterpena (ortosifol,  ortoarisin,  neoortosifol,  staminol,  dan staminolakton),  triterpena  (asam  ursolat,  asam oleanolat,  asam  betulinat,  asam  hidroksibetulinat , asam  maslinat,  α-amirin  dan  β-amirin)  diidentifikasi sebagai  senyawa  penghambat  aktivitas  enzim  α- glukosidase  sedangkan  fenolik  (asam  rosmarinat), flavonoid  (eupatorin,  sinensetin,  5-hidroksi- 6,7,3’,4’- tetrametoksiflavon, salvigenin, 6-hidroksi- 5,7,3’- tr imetoksiflavon  dan  5,6,7,3’-tetrametoksi-4’-hidrok- si-8-C-prenilflavon),  diterpena  (ortosifol,  ortoarisin, neoortosifol,  staminol,  dan  staminalakton),  triter- pena  (asam  ursolat,  asam  oleanolat,  asam  betulinat, asam  hidroksibetulinat,  asam  maslinat,  α-amirin dan β-amirin)  diidentifikasi  sebagai  senyawa  antioksidan. Untuk  konfirmasi,  senyawa-senyawa  tersebut  dapat diisolasi  dan  diuji  aktivitas  penghambatan  enzim α- glukosidase  dan  antioksidannya.  Dengan  adanya informasi  dari  analisis  OPLS  ini,  maka  proses  isolasi dan  identifikasi  akan  jauh  lebih mudah  dan  terarah.

## UCAPAN  TERIMA KASIH
Penelitian  ini  dapat  terlaksana  atas  bantuan dari  Riset  Inovatif  Produktif  (RISPRO)  Lembaga Pengelola  Dana  Pendidikan  (LPDP)  bekerja  sama dengan  PT  Soho  Industri  Farmasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdelwahab  SI,  Mohan  S,  Elhassan  MM,  Al- Mekhlafi  N,  Mariod  AA,  Abdul  AB,  Abdulla  MA. Alkharfy  KH.  2011.  Antiapoptotic  and  antioxi- dant  properties  of Orthosiphon  stamineus benth (cat’s  whiskers):  intervention  in  the  Bcl-2- mediated apoptotic pathway. Evid-Based
Compl  Alt  Med  2011:  1-11.  DOI:  10.1155/  2011/ 156765.
Abedini  A,  Roumy  V,  Mahieux  S,  Biabiany  M, Standaert-Vitse  A,  Rivière  C,  Sahpaz  S,  Bailleul F,  Neut  C,  Hennebelle  T.  2013.  Rosmarinic  acid and its methyl ester as antimicrobial components  of  the  hydromethanolic  extract  of Hyptis  atrorubens poit.  ( lamiaceae ).  Evid-Based Compl  Alt  Med  2013:  1-11.  DOI:  10.1155/ 2013/604536.
Adnyana  IK,  Setiawan  F,  Insanu  M.  2013.  From ethnopharmacology  to  clinical  study  of Orthosi- phon  stamineus Benth.  Int  J  Pharm  Sci  5:  63- 66.
Akowuah  GA,  Ismail  Z,  Norhayati  I,  Sadikun  A. 2005. The effects of different extraction solvents  of  varying  polarities  on  polyphenols  of Orthosiphon  stamineus and  evaluation  of  the free  radical-scavenging  activity.  Food  Chem  93: 311 –317.  DOI:  10.1016/j.foodchem.2004.09.02
8.
Asghari  B,  Salehi  P,  Sonboli  A,  Nejad  ES.  2015. Flavonoids  from Salvia  chloroleuca with  α- amylsae  and  α-glucosidase  inhibitory  effect. Iran  J Pharm  Res 14:  609-615.
Awale  S,  Tezuka  Y,  Banskota  AH,  Kouda  K,  Tun KM,  Kadota  S.  2002.  Four  highly  oxygenated isopimarane-type  diterpenes  of Orthosiphon stamineus .  Planta  Med  68:  286-288.  DOI: 10.1055/s-2002-23137.
Awale  S,  Tezuka  Y,  Banskota  AH,  I  Ketut  Adnyana,
Kadota S. 2003. Nitric oxide inhibitory isopimarane-type  diterpenes  from Orthosiphon stamineus of  Indonesia.  J  Nat  Prod  66:  255-8. DOI:  10.1021/np020455x.
Baynes  JW,  Thorpe  SR.  1999.  Perspectives  in diabetes: Role  of  oxidative  stress  in  diabetic complications  a  new  perspective  on  an  old paradigm.  Diabetes  48:  1-09.
Capasso  R,  Izzo  AA,  Romussi  G,  Capasso  F,  De Tommasi  N,  Bisio  A,  Mascolo  N.  2004.  A secoisopimarane diterpenoid from Salvia cinnabarina
inhibits rat urinary bladder contractility  in  vitro.  Planta  Med  70:  185-8.  DOI: 10.1055/s-2004-815501.
Damsud T, Grace MH, Adisakwattana S,
Phuwapraisirisan  P.  2014.  Orthosiphol  A  from the  aerial  parts  of Orthosiphon  aristatus is putatively  responsible  for  hypoglycemic  effect via alpha-glucosidase inhibition. Nat  Prod Commun  9: 639-41.
de  Souza  RF,  Marinho  VHS,  da  Silva  GA,  Costa-Jr. LM,  da  Silva  JKR,  Bastos  GNT,  Arruda  AC,  da Silva  MN,  Arruda  MSP.  2013.  New  isoflvones from  the  leaves  of Vatairea  guianensis aublé.  J
Brazil  Chem  Soc  24:  1857-1863.  DOI:  10.5 935/0103-5053.20130231.
Di  XX,  Wang  SQ,  Zhang  XL,  Wang  B,  Lou  XL,Wang XN.  2013.  Diterpenoids  from  the  aerial  parts  of Orthosiphon  aristatus var.  aristatus.  Phytochem Lett  6:  412 –417.  DOI:  10.1016/j.phytol.2013. 05.015.
Di  Sotto  A,  Mastrangelo  S,  Romussi  G,  Bisio  A, Mazzanti  G.  2009.  Antimutagenic  activity  of  a secoisopimarane diterpenoid from Salvia cinnabarina M.  Martens  et  Galeotti  in  the bacterial  reverse  mutation  assay.  Food  Chem Toxicol  47:  2092-2096.  DOI:  10.1016/j.fct. 2009.05.030.2.
do  Nascimento  PG,  Lemos  TL,  Bizerra  AM,  Arriaga ÂM,  Ferreira  DA,  Santiago  GM,  Braz-Filho  R, Costa  JG.  2014.  Antibacterial  and  antioxidant activities of ursolic acid  and  derivatives.
Molecules  19:  1317-1327.  DOI:  10.3390/mole cules19011317.
Eriksson  L,  Johansson  E,  Wold  N,  Trygg  J, Wikstrom  C,  Wold  S.  2006.  Multi-  and  Mega- variate  Data  Analysis:  Advanced  Appli-cations and  Method  Extensions.  1st  ed.  103-119. Umetrics AB, Umea  Sweden.
Eriksson  L,  Trygg  J,  Wold  S.  2008.  CV-ANOVA  for significance  testing  of  PLS  and  OPLS  models. J Chemometr  22:  594 –600.  DOI:  10.1002/cem. 1187.
Galindo-Prieto  B,  Eriksson  L,  Trygg  J.  2014.
Variable  influence  on  projection  (VIP)  for  ortho- gonal  projections  to  latent  structures  (OPLS).  J Chemometr  28:  623-632.  DOI:  10.1002/cem.26 27.
He  QQ,  Yang  L,  Zhang  JY,  Ma  JN,  Ma  CM.  2014. Chemical  constituents  of  gold-red  apple  and their  α-glucosidase  inhibitory  activities.  J  Food Sci  79:  C1970-83.  DOI:  10.1111/1750-3841.125 99.
Hossain  MA,  Rahman  SMM.  2015.  Isolation  and characterisation  of  flavonoids  from  the  leaves  of me  dicinal  plant Orthosiphon  stamineus .  Arab  J Chem 8: 218-221. DOI: 10.1016/j.arabjc.
2011.06.016. Hossain MA, Ismail Z. 2013. Isolation  and characterizati  on  of  triterpenes  from  the  leaves of Orthosiphon  stamineus .  Arab  J  Chem  6: 295 –298.  DOI: 10.1016/j.arabjc.2010.10.009.
Hou  W,  Li  Y,  Zhang  Q,  Wei  X,  Peng  A,  Chen  L, Wei Y.  2009.  Triterpene  acids  isolated  from Lager- stroemia  speciosa leaves  as  alpha-glucosidase inhibitors.  Phytother  Res  23:  614-618.  DOI: 10.1002/ptr.2661.
Hunaefi  D,  Akumo  DN, Riedel  H, Smetanska I.  2012. The  effect  of Lactobacillus  plantarum ATCC
8014  and Lactobacillus  acidophilus NCFM
fermentation on antioxidant properties of selected in  vitro sprout  culture  of Orthosiphon aristatus (Java  Tea)  as  a  Model  Study.  Anti- oxidants  (Basel)  1:  4 –32.  DOI:  10.3390/anti ox1010004.
Hussain  K,  Ismail  Z,  Sadikun  A,  Ibrahim  P.  2009. Evaluation  of  metabolic  changes  in  fruit  of Piper sarmentosum in  various  seasons  by  meta- bolomics  using  fourier  transform  infrared  (FTIR) spectroscopy. Int  J Clin  Pharm Res 1: 68-71.
Jeong  JM,  Choi  CH,  Kang  SK,  Lee  IH,  Lee  JY,  Jung H.  2007.  Antioxidant  and  chemosensitizing effects  of  flavonoids  with  hydroxy  and/or methoxy  groups  and  structure-activity  relation- ship. J Pharm  Pharm  Sci 10: 537-46.
Khamsiah  SM,  Akowah  G,  Zhari  I.  2006.  Antioxidant activity  and  phenolic  content  of Orthosiphon stamineus benth  from  different  geographical origin.  J Sustain  Sci Manage  1: 14-20.
Kwon  YI,  Apostolidis  E,  Shetty  K.  2008.  In  vitro studies of  eggplant  ( Solanum  melongena ) phenolics  as  inhibitors  of  key  enzymes  relevant for  type  2  diabetes  and  hypertension.  Bioresour Technol  99:  2981-8.  10.1016/j.biortech.2007. 06.035.
[IDF] International Diabetes Federation. 2013. Diabetes  atlas.  Sixth  edition.  http://www.idf.org/ diabetesatlas.  [28 Februari  2014].
Lindgren  F,  Hansen  B,  Karcher  W .  1996.  Model validation  by  permutation  tests:  applications  to variable  selection.  J  Chemometr  10:  521-532. DOI: 10.1002/(SICI)1099-128X(199609)10:5/6< 521::AID-CEM448>3.0.CO;2-J.
Liu  W, Yu  Y,  Yang  R,  Wan  C,  Xu  B,  Cao  S.  2010. Optimization of total flavonoid compound extraction  from Gynura  medica leaf  using response  surface  methodology  and  chemical composition  analysis.  Int  J  Mol  Sci  11:  4750 – 4763.  DOI:  10.3390/ijms11114750.
Masuda  T,  Masuda  K,  Shiragami  S,  Jitoe  A, Nakatani  N.  1992.  Orthosiphol  A  and  B,  novel diterpenoid  inhibitors  of  TPA  (12-O-  Tetradeca- noylphorbol-13-acetate)-induced inflammation, from Orthosiphon  stamineus . Tetrahedron  48: 6787 –6792.  DOI:  10.1016/  S00404020(01)898 68-9.
Mbaze  LM,  Poumale  HM,  Wansi  JD,  Lado  JA,  Khan SN,  Iqbal  MC,  Ngadjui  BT,  Laatsch  H.  2007. alpha-Glucosidase inhibitory
pentacyclic triterpenes  from  the  stem  bark  of Fagara tessmannii ( Rutaceae ).  Phytochemistry  68: 591-5.  DOI:  10.1016/j.phytochem.2006.12.015. Mohamed  EAH,  Mohamed  AJ,  Asmawi  MZ,  Sadikun A,  Ebrika  OS,  Yam  MF.  2011.  Antihyper-
glycemic  effect  of Orthosiphon  stamineus  b enth leaves extract and its bioassay-guided fractions. Molecules  16:  3787-3801.  DOI:  10.33 90/molecules16053787.
Mohamed  EAH,  Siddiqui  MJA,  Ang  LF,  Sadikun  A, Chan  SH,  Tan  SC,  Asmawi  MZ,  Yam  MF. 2012. Potent  α-glucosidase  and  α-amylase  inhibitory activities of standardized 50% ethanolic extracts and sinensetin  from Orthosiphon stamineus Benth  as  anti-diabetic  mechanism. BMC  Complem  Altern  M  12:  01-07.  DOI: 10.1186/1472-6882-12-176.
Nguyen  MT,  Awale  S,  Tezuka  Y,  Chien-Hsiung  C, Kadota  S.  2004.  Staminane-  and  isopimarane- type  diterpenes  from  Orthosiphon  stamineus  of Taiwan  and  their  nitric  oxide  inhibitory  activity.  J Nat Prod  67:  654-8.  DOI:  10.1021/np030471+.
Ohashi  K,  Bohgaki  T,  Matsubara  T,  Shibuya  H. 2000. Indonesian medicinal plants. XXIII.
Chemical  structures  of  two  new  migrated pimarane-type  diterpenes,  neoorthosiphols  A and  B,  and  suppressive  effects  on  rat  thoracic aorta  of  chemical  constituents  isolated  from  the leaves  of Orthosiphon  aristatus ( Lamiaceae ). Chem  Pharm  Bull (Tokyo)  48: 433-435.
Pop  RM,   uzoianu  AD,  Raţi  IV,   ocaciu  C.  2  4.
Untargeted  metabolomics  for  sea  buckthorn ( Hippophae  rhamnoides ssp. carpatica )  berries and  leaves:  fourier  transform  infrared  spectros- copy  as  a  rapid  approach  for  evaluation  and discrimination.  Not  Bot  Horti  Agrobo  42:  545- 550.  DOI:  10.1583/nbha422  9654.
Rafi  M,  Purwakusumah  ED,  Ridwan  T,  Barus  B, Sutandi  A,  Darusman  LK.  2015.  Geographical classification of Java tea ( Orthosiphon stamineus )  from  Java  Island  by  FTIR  spectro- copy  combined  with  canonical  variate  analysis. J Sains Matematika 23: 25-31.
Rajopadhye  A,  Upadhye  AS.  2016.  Estimation  of bioactive  compound,  maslinic  acid  by  HPTLC, and  E  valuation  of  hepatoprotective  activity  on fruit  pulp  of Ziziphus  jujuba mill.  Cultivars  in India.  Evid-Based  Compl  Alt  2016:  1-8.  DOI: 10.1155/2016/4758734.
Saidan  NH,  Hamil  MSR,  Memon  AH,  Abdelbari  MM, Hamdan  MR,  Mohd  KS,  Majid  AMSA,  Ismail  Z. 2015.  Selected  metabolites  profiling  of Orthos- iphon  stamineus Benth.  leaves  extracts  combin- ed  with  chemometrics  analysis  and  correlation with  biological  activities.  BMC  Complem  Altern M  15:  12-30.  DOI:  10.1186/  s12906-015-0884- 0.
Salah  EDR,  Ma  Q,  Kandil  ZA,  El-Halawany  AM. 2014.  Triterpenes  as  uncompetitive  inhibitors  of α-glucosidase  from  flowers  of Punica  granatum
L.  Nat  Prod  Res  28:  2191-2194.  DOI:  10.1080/ 14786419.2014.928292.
Salazar-Aranda  R,  P´erez-L´opez  LA,  L´opez-Arroyo J,  Alan´ıs-Garza  BA,  de  Torres  NW.  2011. Antimicrobial  and  antioxidant  activities  of  plants from  Northeast  of  Mexico.  Evid-Based  Compl Alt  2011: 01-06.  DOI:  10.1093/ecam/nep127.
Sancheti  S,  Sancheti  S,  Seo  SY.  2009.  Chaeno- meles  Sinensis :  A  potent  α-and  β-glucosidase inhibitor.  Am  J  Pharm  Toxicol  4:  8-11.  DOI: 10.3844/ajptsp.2009.8.11.
Santiago  LA,  Dayrit  KC,  Correa  PCB,  Mayor  ABR. 2014.  Comparison  of  antioxidant  and  free radical  scavenging  activity  of  triterpenes  α- amyrin,  oleanolic  acid  and  ursolic  acid.  J  Nat Prod  7: 29-36.
Santos  FA,  Frota  JT,  Arruda  BR,  de  Melo  TS,  de Carvalho  Almeida  da  Silva  AA,  de  Castro  Brito GA,  Chaves  MH,  Rao  VS.  2012.  Antihyper- glycemic  and  hypolipidemic  effects  of α,  β  - amyrin,  a  triterpenoid  mixture  from Protium heptaphyllum in  mice.  Lipids  Health  Dis  11:  98. DOI:  10.1186/1476-511X-11-98.
Siddiqui  M,  Hafizoh  S,  Zhari  I,  Sahib  H,  Helal  M, Majid  AA.  2009.  Analysis  of  total  proteins, polysaccharides  and  glycosaponins  contents  of Orthosiphon  stamineus Benth.  in  spray  and freeze  dried  methanol:  water  (1:1)  extract  and its  contribution  to  cytotoxic  and  antiangiogenic activities.  Pharmacognosy  Res 1: 320-326.
Silva  SD,  Feliciano  RP,  Boas  LV,  Bronze  MR.  2014.
Application  of  FTIR-ATR  to  Moscatel  dessert wines  for  prediction  of  total  phenolic  and flavonoid  contents  and  antioxidant  capacity. Food  Chem  150:  489 –493.  DOI:  10.1016/j.food chem.2013.11.028.
Sim  CO,  Hamdan  MR,  Ismail  Z  ,  Ahmad  MN.  2004. Assessment  of  herbal  medicines  by  chemo- metrics-assisted  interpretation  of  FTIR  spectra. J Anal  Chimica  Acta 570: 116-123.
Shobana  S,  Sreerama  YN,  Malleshi  NG.  2009. Composition  and  enzyme  inhibitory  properties of  finger  millet (Eleusine  coracana L.)  seed  coat phenolics:  Mode  of  inhibition  of  α-glucosidase and  pancreatic  amylase.  Food  Chem  115: 1268 –1273.  DOI:  10.1016/j.foodchem.2009.01.
042.
Sridevi  H,  Jayaraman  P,  Pachaiyappan  P.  2015. Evaluation  of  α-glucosidase  inhibitory  action  of isolated compound beta amyrin from Memecylon  umbellatum burm.  Int  J  Pharma- cogn  Phytochem Res 7: 1033-1038.
Stehfest  K,  Boese  M,  Kerns  G,  Piry  A,  Wilhelm  C. 2004.  Fourier  transform  infrared  spectroscopy as  a  new  tool  to  determine  rosmarinic  acid  in situ.  J  Plant  Physiol  161:  151 –156.  DOI:
10.1078/0176-1617-01099.
Sunil  C,  Irudayaraj  SS,  Duraipandiyan  V,  Al-Dhabi NF,  Agastian  P,  Ignacimuthu  S.  2014.  Anti- oxidant  and  free  radical  scavenging effects of β- amyrin  isolated  from S.  cochinchinensis Moore.
Leaves.  Ind  Crop  Prod  61:  510 –516.  DOI:
10.1016/j.indcrop.2014.07.005.
Tezuka  Y,  Stampoulis  P,  Banskota  AH,  Awale  S, Tran  KQ,  Saiki  I,  Kadota  S.  2000.  Constituents of  the  Vietnamese  medicinal  plant Orthosiphon stamineus .  Chem  Pharm  Bull  (Tokyo)  48:  1711- 9. DOI:  10.1248/cpb.48.1711.
Uddin  G,  Rauf  A,  Al-Othman  AM,  Collina  S, Arfan M, Ali  G,  Khan  I.  2012.  Pistagremic  acid,  a glucosidase  inhibitor  from Pistacia  integerrima . Fitoterapia  83:  1648-52.  DOI:  10.1016/j.fitote. 2012.09.017.
Worley  B,  Powers  R.  2013.  Multivariate  analysis  in metabolomics.  Current  Metabolomics  1:  92- 107.  DOI:  10.2174/2213235X11301010092.
Verpoorte  R,  Choi  YH,  Kim  HK.  2007.  NMR-based metabolomics  at  work  in  phytochemistry. Phyto- chem  Rev  6:  3 –14.  DOI:  10.1007/s11101-006- 9031-3.
Xia  X,  Qi  J,  Liu  Y,  Jia  A,  Zhang Y, Liu C, Gao C, She Z.  2015.  Bioactive  isopimarane  diterpenes  from the  fungus, Epicoccum sp.  HS-1,  associated with Apostichopus  japonicus .  Mar  Drugs  13: 1124-32.  DOI:  10.3390/md13031124.
Yang  F,  Shi  H,  Zhang  X,  Yang  H,  Zhou  Q,  Yu  L.
2013. Two  new  saponins  from  tetraploid jiaogulan ( Gynostemma pentaphyllum ),  and their  anti-inflammatory  and  a-glucosidase  inhibi- tory  activities.  Food  Chem  141:  3606 –3613.
DOI:  10.1016/j.foodchem.2013.06.015.
Yuliana  ND,  Khatib  A,  Verpoorte  R,  Choi  YH.  2011.
Comprehensive  extraction  method  integrated with  NMR  metabolomics:  a  new  bioactivity screening  method  for  plants,  adenosine  A1 receptor  binding  compounds  in Orthosiphon stamineus benth.  Anal  Chem  83:  6902 –6906. DOI:  10.1021/ac201458n.
Yusof  NA,  Isha  A,  Ismail  IS,  Khatib  A,  Shaari  K, Abas  F,  Rukayadi  Y . 2015.  Infrared-metabo- lomics  approach  in  detecting  changes  in Andrographis  paniculata metabolites  due  to different  harvesting  ages  and  times.  J  Sci  Food Agr 95:  2533-43.  DOI:  10.1002/jsfa.6987.