*) Peneliti  pada Balai  Besar  Riset Pengolahan  Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan dan  Perikanan

## TEKNIK ZYMOGRAM DAN APLIKASINYA DALAM RISET ENZIM
Ekowati Chasanah *)

## ABSTRAK
Teknik zymogram merupakan  pengembangan  dari  teknik  elektroforesis  yang  di  dalam  gel elektroforesis  disisipkan  substrat  sehingga  protein/enzim  yang  telah  dipisahkan  sekaligus  dapat dipelajari  kemampuannya  dalam  mendegradasi  substrat  tersebut.  Teknik  elektroforesis  sendiri merupakan  teknik  yang  biasa  digunakan  dalam  bidang  biokimia  untuk  memisahkan  campuran yang berisi  biomolekul  seperti enzim sehingga enzim yang  ada akan terpisah berdasarkan  muatan dan  berat  molekulnya.  Teknik zymogram telah  luas  digunakan,  diantaranya    untuk  deteksi  jenis- jenis  enzim  yang  disekresikan  oleh  mikroba  dan  mempelajari  karakteristiknya.  Dengan  semakin berkembangannya  peran  protein/enzim  dalam  berbagai  bidang  kesehatan,  teknik zymogram semakin  populer  dan  diperluas  aplikasinya.

## ABSTRACT: The zymogram technique and its application in enzyme research. By: Ekowati Chasanah
A  zymogram technique is a  development technique of electrophoresis  in which a  substrate  is incorporated  into  the  electrophoresis  gel  to  separate  protein/enzyme  and  to  analyze  the  capa- bility  of  the  enzyme  to  degrade  the  substrate.  An  electrophoresis  technique  is  a  common  tech- nique in  biochemistry  to  separate a mixture containing  biomolecules based on their charges and molecular weights. A zymogram technique has been  widely  used to detect the class and charac- teristic  of the  enzymes secreted  by microbes.  Increasing  role  of protein/enzyme  in various  appli- cation  including  health  service  and  drug  discovery,  the  zymogram  technique  nowadays  is  even more  popular  and  extensively  used.
KEYWORDS: zymogram, enzyme  detection, electrophoresis

## PENDAHULUAN
Enzim  merupakan  biokatalis  penting  yang aplikasinya  sangat  luas  dalam  industri  pangan, pertanian,  dan  kesehatan.  Pemenuhan  keperluan enzim untuk industri semakin meningkat, sehingga eksplorasi  enzim  terus  dilakukan  secara  intensif. Untuk itu, teknik deteksi enzim yang sederhana tetapi dapat digunakan secara luas sangat diperlukan. Di antara teknik yang dikembangkan, teknik zymogram merupakan  teknik  yang  dapat  digunakan  untuk mendeteksi  satu  atau  lebih  jenis  enzim  secara bersamaan dengan menggunakan gel elektroforesis. Dalam drug  discovery ,  teknik zymogram juga diaplikasikan  untuk  menapis  enzim  target  dari isomernya yang biasanya berada dalam konsentrasi rendah  di  dalam  campuran  komplek.  Karena  itu, metode zymogram untuk deteksi enzim dan piranti teknik untuk mempelajari karakter dan aplikasinya semakin berkembang pesat.
Zymogram adalah deteksi aktifitas enzim dengan menggunakan teknik elektroforesis  yang di  dalam gelnya terkandung substrat enzim target. Teknik ini telah lama digunakan untuk mendeteksi keberadaan enzim dan aktifitasnya, terutama enzim yang termasuk dalam    golongan    hidrolase,    secara  kualitatif.
Beberapa laporan menyebutkan bahwa teknik zymo- gram telah digunakan  secara  luas untuk  mendeteksi enzim protease di gel elektroforesis (Seung-Ho et al ., 1998a; Seung-Ho et  al .,  1998b; Nack-Shick et  al ., 2001;  Choi et  al .,  2006),  gelatinase  (Kleiner  & Stetlerstevenson, 1994) dan keratinase (Korkmaz et al ., 2003). Deteksi enzim xilanase (Rawashdeh et al ., 2005; Hong-Ge et  al .,  2006), pektin  esterase,  dan poligalakturonase (Szecsi, 1990) telah dikembangkan baik untuk deteksi secara kualitatif maupun secara kuantitatif.  Aplikasi zymogram untuk  mendeteksi enzim  pendegradasi  kitin  termasuk  kitinase  dan kitosanase telah dilaporkan oleh Grenier & Asselin (1990), Grenier (1997), Yuli (2004), dan Chasanah & Suhartono  (2005)  dengan  menggunakan  berbagai substrat turunan kitin. Teknik tersebut secara cepat dapat mengidentifikasi jenis enzim yang dikeluarkan oleh suatu mikroorganisme baik menggunakan 1 gel elektroforesis  ataupun  2  gel  elektroforesis,  yang dikenal  dengan  teknik overlay (Chasanah  & Suhartono,  2005)  untuk  m engatasi  m asalah penggunaan  substrat  yang  bersifat  tidak  larut  air ataupun mendeteksi jenis enzim dalam satu campuran enzim secara bersamaan (Choi et al ., 2004).
Metode zymogram didasarkan pada pemisahan protein  pada  Gel  Elektroforesis  baik  dengan

## E.  Chasanah
Poliakrilamid  Gel  Elektroforesis  ( native PAGE) maupun  Sodium  Dodesil Sulfat  Gel  Elektroforesis (SDS-PAGE).  Apabila  dalam  teknik zymogram pemisahan protein/enzim menggunakan SDS-PAGE yang di dalam preparasi sampelnya ada perlakuan yang  menyebabkan  protein  terdenaturasi  seperti penambahan  SDS  (sodium  dodesil  sulfat),  ß- merkaptoetanol, dan perlakuan pemanasan, maka perlakuan ini harus diminimalkan agar  struktur enzim masih  dapat  dipertahankan  dalam  struktur  tiga dimensinya.  Ketika  kondisi  yang  menyebabkan denaturasi  protein/enzim   terjadi,  m aka  tahap penghilangan denaturan harus dilakukan. Aktivitas enzim  selanjutnya akan dideteksi sebagai zona bening pada gel melalui pewarnaan tertentu, tergantung dari jenis enzim dan sifat substrat dalam gel elektroforesis. Dalam tulisan ini akan diulas teknik zymogram dengan studi kasus pada enzim pendegradasi kitin (kitinolitik).

## TEKNIK ELEKTROFORESIS
Elektroforesis  merupakan  salah  satu  metode penting yang digunakan  untuk pemisahan molekul biologi,  karena  dengan  teknik  tersebut  struktur biomolekul/biopolimer  tetap  dapat  dipertahankan struktur native -nya. Selain  itu, teknik ini sangat sensitif terhadap perubahan kecil masa dan muatan ( charge ) sehingga  sangat  efektif  untuk  proses  pemisahan biomolekul/biopolimer.  Cara    kerja  elektroforesis adalah  berdasarkan pergerakan molekul yang berbeda muatan dalam medan listrik. Pergerakan/mobilitas molekul  selanjutnya  merupakan fungsi dari ukuran, bentuk, dan muatan (Robyt & White, 1987). Untuk mengestimasi berat molekul protein/enzim dilakukan teknik elektroforesis SDS-PAGE. Dalam teknik SDS- PAGE, protein atau enzim  dipisahkan dalam kondisi terdenaturasi dengan penambahan detergen SDS yang memiliki sifat  polar dan nonpolar.  Bagian  hidrofobik SDS  akan mengikat bagian hidrofobik protein/enzim yang ada di daerah dalam  dan  bagian  polar yang bermuatan  negatif  akan    terpapar  di  bagian  luar. Aki batny a,  pr otein/enz im   ak an  di pisahkan berdasarkan  unitnya dan diluruskan akibat stuktur sekundernya  yang  terganggu.  Penambahan  ß- merkaptoetanol atau 1,4–ditiotreitol  yang  biasanya juga  dilakukan,  bertujuan  untuk  memecah  protein menjadi sub unit terkecilnya. Karena itu, dalam SDS- PAGE, unit-unit protein/enzim akan bermuatan sama, yaitu  negatif,  sehingga  molekul  bergerak  hanya didasarkan pada perbedaan berat molekul. Unit  pro- tein  dengan  berat molekul  rendah  akan  bergerak lebih    cepat    dibanding  unit  protein/enzim  yang memiliki berat molekul lebih tinggi.  Selain SDS-PAGE, elektroforesis secara native juga  dikembangkan  untuk mengetahui protein/enzim dalam bentuk native- nya.
Jika SDS-PAGE mengidentifikasi enzim dalam  bentuk unitnya, maka native PAGE mengidentifikasi protein/ enzim secara utuh.

## TEKNIK ZYMOGRAM
Teknik zymogram menggunakan prinsip pemisahan biomolekul  berdasarkan  elektroforesis  baik  SDS- PAGE ataupun native PAGE, dengan menambahkan substrat  ke  dalam  gel  pemisah.  Kondisi  yang menyebabkan  protein/enzim  terdenaturasi  harus diminimalkan,  sedemikian  sehingga  struktur  tiga dimensi  atau  struktur native -nya  dapat  dipulihkan sehingga  enzim  dapat  aktif  kembali  (renaturasi). Penambahan ß-merkaptoetanol atau 1,4–ditiotreitol dan  perlakuan  pemanasan  biasanya  dihindarkan. Detergen  SDS,  yang merupakan komponen pada bufer  sampel  gel  elektroforesis,  akan  dihilangkan dengan proses renaturasi setelah proses pemisahan/ elektroforesis selesai. Renaturasi ini dilakukan  dengan cara merendam dan mengganti bufer  yang  ada  pada gel elektroforesis sehingga SDS yang ada dalam gel elektroforesis dapat dihilangkan. Bufer renaturasi yang digunakan akan berbeda untuk setiap jenis enzim, demikian  juga  kondisi  optimal  proses  renaturasi tersebut.  Untuk  enzim  golongan  protease,  bufer renaturasi    yang    digunakan    adalah  Triton  X-100 (Kleiner & Stetlerstevenson, 1994; Seung-Ho et al ., 1998a; Seung-Ho et  al .,  1998b;  Nack-Shick et  al .,
2001;  Korkmaz et  al .,  2003;  Choi et  al .,  2006). Selanjutnya,    enzim    yang    telah    dipulihkan strukturnya  dan  menjadi  aktif,  diinkubasi  pada lingkungan optimalnya (dalam bufer dengan pH dan suhu  inkubasi yang sesuai untuk enzim) sehingga enzim    mampu  mendegradasi  substrat  dalam  gel tersebut.  Aktiv itas    enzim     dalam    gel    akan divisualisasi  sebagai  zona  bening  sebagai  hasil degradasi  enzim  pada substrat  dalam  gel  dengan pewarnaan tertentu, misalnya dengan commasie blue untuk enzim  protease dan congo red untuk  enzim pendegradasi  kitin  (Kleiner & Stetlerstevenson, 1994; Seung-Ho et al ., 1998a; Seung-Ho et al ., 1998b; Nack- Shick et al ., 2001;  Korkmaz et al ., 2003; Yuli, 2004; Chasanah & Suhartono, 2005;  Choi et al ., 2006)
PENGGUNAAN

## ZYM OGRAM
DALAM MEMPELAJARI  ENZIM  PENDEGRADASI  KITIN: STUDI KASUS ENZIM KITOSANASE
Kitin  merupakan  polimer  terbesar  kedua  yang tersedia  di  alam  setelah  selulosa.  Di  alam,  enzim pendegradasi kitin sangat berperan untuk proses daur ulang.  Di  antara  enzim-enzim  pendegradasi  kitin, enzim kitinase dan kitosanase merupakan jenis enzim pendegradasi kitin yang banyak dipelajari. Keduanya memiliki kemampuan untuk memotong ikatan ß-1,4-
glikosida  pada  rantai  kitin untuk  kitinase dan kitosan untuk  kitosanase.  Kitinase  (EC  3.2.1.14)  akan menghasilkan  monomer N - acetylglucosamine (GlcNAc), sedangkan kitosanase (EC 3.2.1.132) akan menghasilkan  monomer N-glucosamine (Gooday, 1990). Perbedaan antara kitin dan kitosan adalah pada posisi  atom C  kedua monomernya  yang diisi  oleh gugus acetylamino untuk kitin (Gambar 1.) yang akan digantikan oleh gugus amina pada polimer kitosan setelah  proses  penghilangan  asetil  pada  gugus tersebut.  Namun  demikian,  di  alam  tidak  pernah dijumpai  ketersediaan  kitosan  dengan  kondisi atom C  ke-2  berupa  100%  gugus  amina,  tetapi  berupa campuran gugus amina dan asetilamina. Dikatakan bahwa apabila  komposisi gugus  amina pada atom C ke-2 berjumlah 70% atau lebih maka polimer tersebut sudah dikatakan kitosan (Hirano, 1997).
Enzim  kitosanase  menjadi  perhatian  selama dekade terakhir ini dengan dilaporkannya aktivitas biologis  dari  potongan kitosan (kitosan oligomer) yang  penting  untuk  bidang  kesehatan  dan  pangan (Guo-Jane et al. , 2000; Sagoo et al ., 2002; Chung et al ., 2004; Chasanah & Suhartono,  2005). Pemotongan secara  enzimatik  akan  menghasilkan  produk potongan (oligomer) kitosan yang  bersifat spesifik, aman  dari  bahan  kimia  sehingga  aman  untuk dikonsumsi,  dan  tidak  menghasilkan  limbah  yang berbahaya.  Oligomer  kitosan  memperlihatkan aktivitas mereduksi kolesterol  plasma  dan  mencegah penyakit  hati  pada  penderita  kecanduan  alkohol, sedangkan oligomer kitosan dengan rantai pendek yaitu tetramer (rantai 4 unit monomer)  memperlihatkan sifat sebagai antibakteri (Guo-Jane et al. , 2000; Sagoo et  al .,  2002;  Chung et  al .,  2004).  Oligomer  yang memiliki rantai 2–8 unit monomer memperlihatkan aktivitas  anti  kapang  beberapa patogen tanaman (Hirano  &  Nagao,  1989).  Semakin  tinggi  derajat deasetilasinya (semakin sedikit gugus asetilamino) maka semakin bagus aktivitas biologisnya. Untuk itu, diperlukan enzim kitosanase sebagai bio katalis yang dapat  memotong  kitosan dengan  derajat  deasetilasi tinggi dan memotong secara spesifik.
Kemampuan    kitosanase    dalam    memecah kitosan  dengan  derajat  deasetilase  100%  dan ketidakmampuan  kitinase  dalam  memecah  substrat tersebut membuat  teknik zymogram dapat digunakan untuk  menapis  enzim  kitosanase melalui perbedaan kemampuan  ini.  Substrat  untuk  enzim  kitosanase yaitu kitosan memiliki kemampuan kelarutan terbatas pada kondisi elektroforesis, yaitu hanya larut pada pH rendah. Kitosan hanya larut dalam asam lemah seperti asam  asetat, sehingga  akan menimbulkan masalah (menjadi tidak larut) ketika diaplikasikan ke dalam gel elektroforesis yang memiliki pH 8,8. Karena itu,  teknik overlay telah  dikembangkan  untuk mengatasi masalah ini dengan memodifikasi teknik yang telah ada (Chasanah & Suhartono,  2005).

## DETEKSI  ENZIM  KITOSANASE  MENGGUNAKAN 2 GEL ATAU OVERLAY
Protokol zymogram untuk  mendeteksi  enzim kitosanase secara overlay telah dikembangkan oleh Chasanah & Suhartono (2005), sebagai berikut:
• Pada  teknik  ini,  enzim  kitosanase dipisahkan berdasarkan sub unitnya di dalam SDS-PAGE tanpa pendenaturan ß-merkaptoetanol atau 1,4–ditiotreitol dan tanpa dipanaskan.
• Selesai  proses  pemisahan  pada  SDS-PAGE, protein/enzim  pada  gel  di renaturasi dengan  cara merendam gel elektroforesis dalam bufer penghilang SDS yang berisi 0,4 M Tris-HCl, 0,02% sodium azida, 2 mM EDTA, 1% kasein (pH 9) selama 2 jam (4 x 30 menit). Setelah itu perendaman dilakukan dalam bufer sodium asetat 0,1 M  (pH 4,8) selama 2 x 20 menit, dan dilanjutkan dalam 25%  2-propanol selama 15 menit.
•  Setelah  proses  renaturasi,  gel  dicuci  dengan akuabides yang dilanjutkan dengan pencucian dalam bufer fosfat 0,05 M (pH 6,0). Selanjutnya  enzim dalam gel siap bekerja untuk memecah substrat.
• Pemisahan  protein/enzim  juga dapat secara native PAGE, dan ketika digunakan teknik ini maka proses renaturasi dapat dihilangkan.
Gambar 1. Struktur kimia kitin (Gooday, 1990). NHCOCH 3 OH CH 2 OH NHCOCH 3 OH CH 2 OH

## E.  Chasanah
• Gel yang berisi substrat dibuat dengan komposisi hasil modifikasi dari Grenier et al . (1997) yaitu  0,1% substrat kitosan larut dalam asam asetat (1%), 0,1 M (pH 6,0) bufer fosfat 5,0 mL, akuabides 2,3 mL, akrilamid 30% (w/v) sebanyak 2,5 mL dan 0,8% (w/v) BIS, 0,02 mL TEMED, dan 0,1 mL 10% (w/v) amonium persulfat yang dicampur sampai homogen. Campuran tersebut dicetak dalam plate elektroforesis sampai padat/beku.
• Selanjutnya, gel substrat ditumpuk ( overlay ) pada gel PAGE (Gambar 2).
• Inkubasi dlakukan pada kondisi optimal kerja enzim, dalam hal ini suhu 55 0 C pada kondisi lembab (gel dibungkus tisu yang dibasahi dengan bufer pro- tein/enzim). Untuk kitosanase dari B. licheniformis MB-2, waktu inkubasi optimum adalah 2 jam.
• Pewarnaan dilakukan dengan memindahkan gel substrat pada larutan  1% congo red selama 20 menit, diikuti dengan merendam dalam larutan 1 M NaCl selama 5–10 menit.
• Tahap akhir adalah fiksasi gel tersebut dalam larutan asam  asetat selama 1 menit. Zona bening dengan  latar  belakang  merah  bata  menandakan adanya aktivitas enzim kitosanase pada gel tersebut.
Gambar 3 memperlihatkan hasil zymogram enzim kitosanase B. licheniformis MB-2. Pada percobaan tersebut, ekstrak kasar enzim (20 μ L) diaplikasikan dalam SDS-PAGE, menggunakan 10% gel akrilamid. Setelah  proses renaturasi, gel substrat ditumpuk pada gel protein/enzim dan diinkubasikan pada suhu 55 o C selama 2 jam. Gel protein diwarnai dengan Coomassie blue B,  dan  gel substrat diwarnai dengan larutan 0,1% congo red A. Gambar 3B memperlihatkan pita protein/enzim yang menghasilkan aktivitas  pada  gel substrat (Gambar 3A). Kode 1 adalah  sampel  yang dikeringbekukan ( freeze dried ), kode 2 adalah hasil dialisis setelah pemekatan dengan amonium sulfat, kode 3 adalah pemekatan amonium sulfate (80% satu- ration ) dan 4 adalah enzim kasar ( broth ). Kadar pro- tein sampel adalah 1,425 mg/mL (sampel yang dikering bekukan); 4,374 mg/mL (hasil pemekatan amonium
Gambar 3. Deteksi enzim ekstrak kasar kitosanase Bacillus licheniformis MB-2.
1        2       3          4             1            2         3           4 1        2       3          4             1            2         3           4
A                                                       B
Gambar 2. Teknik overlay pada deteksi enzim kitosanase.
sulfat);  0,642  mg/mL  (dialisis);  dan  0,211  mg/mL (ekstrak kasar). Deteksi enzim menggunakan sistem overlay ini  memerlukan  jumlah/konsentrasi  enzim yang lebih besar yaitu 0,003 U per sumur (Chasanah & Suhartono, 2005) dibanding penggunaan 1 gel yang berisi  substrat  sekaligus.  Hal  ini  dapat  dimengerti karena  enzim  harus  memecah  substrat  pada  gel terpisah. Percobaan pada zymogram enzim kitinase yang menggunakan 1 gel (enzim dan substrat dalam 1 gel elektroforesis) menghasilkan konsentrasi mini- mal sebesar 0,0009 U atau 0,059 U/mg/mL per sumur (Situmorang, 2003).
Pada Gambar 4, enzim kitosanase yang digunakan adalah  enzim  murni  dengan  aktivitas  enzim  yang dimasukkan  dalam  sumur  elektroforesis  sebesar berturut-turut 0,33 U (baris 1); 0,033 U (baris 2); 0,011 U (baris 3); 0,0033 U (baris 4); dan 0,00033 U (baris 5). Dari gambar ini dapat dilihat bahwa zona bening (pada gambar terlihat putih) dapat dideteksi pada baris 1–4.  Konsentrasi  terkecil  enzim  yang  mampu membentuk zona adalah sebesar 0,0033 U (baris 4).

## APLIKASI TEKNIK ZYMOGRAM UNTUK DETEKSI ENZIM LAIN
a)  Deteksi  Enzim  Proteolitik  Pendegradasi Kasein,    Gelatin,    Kolagen,    Fibrin,    dan Keratin
Zymogram enzim proteolitik pendegradasi kasein, gelatin, kolagen, fibrin, dan keratin disiapkan dengan menggunakan substrat 1% kasein, 1% gelatin, fibrino- gen (0,12%, w/v) dan 100 µl  trombin (10 NIH unit/ml). Setelah elektroforesis pada 10 miliAmper (mA) secara konstan, gel diinkubasi selama 30 menit dalam larutan buffer 50 mM Tris (pH 7,4), yang berisi  2,5% Triton X- 100. Setelah dicuci dengan akuades selama 30 menit yang ditujukan untuk menghilangkan Triton X-100, gel diinkubasi dalam bufer zymogram yang berisi 30 mM
Tris ( pH 7,4) dan NaN 3 pada  37 o C selama  12 jam. Gel  kemudian  diwarnai  dengan Coomassie  blue selama 1 jam dan di destaining . Zona bening aktivitas enzim akan terlihat dengan latar belakang warna biru (Choi et al ., 2001; Korkmaz et al ., 2003).

## b) Deteksi Enzim Xilanase
Substrat  yang  digunakan  adalah  xylan  (0,1%). Setelah selesai SDS-PAGE, maka gel dicuci 4 kali selama 30 menit dalam 100 mM buffer fosfat (pH 7,0), yang  berisi  25%  (v/v)  isopropil  alkohol  (2x  yang pertama), yang ditujukan untuk menghilangkan SDS dan merenaturasi protein dalam gel. Gel kemudian diinkubasi  selama  20  menit  pada  kondisi  optimal enzim  yang  dilanjutkan  dengan merendam  gel  ke dalam larutan congo red selama 5 menit pada suhu kamar. Pencucian dilakukan dalam larutan 1 M NaCl sampai kelebihan pewarnaan diminimalkan dari zona bening  enzim  aktif.  Tahap  akhir,  fiksasi  dilakukan dengan  merendam  gel  dalam  larutan  0,5%  asam asetat. Background akan berubah menjadi biru gelap disekitar zona bening menandakan aktivitas xilanase (Rawasdeh et al ., 2005; Hong-Ge et al ., 2006).
c) Deteksi Autolisin
Pada zymogram , substrat yang digunakan adalah sel Microccocus  luteus dan  yang  diamati  adalah kemampuan me lisis . Pemisahan protein yang dapat memecah  sel M.  luteus dilakukan  pada  14%  gel akrilamid dengan voltase konstan 180 volt. Setelah elektroforesis, gel direndam dalam akuades selama 30  m enit,  suhu  kam ar,  dan  selanjutnya  gel dipindahkan pada buffer renaturasi yang terdiri dari campuran 50mM Tris-HCl pH 8 yang berisi 1% Triton X-100. Renaturasi dilakukan pada suhu 40 0 C dengan penggoyangan  supaya  homogen,  selama  2  jam. Aktifitas autolisin akan nampak sebagai garis yang bening dengan latar belakang keruh. Kontras akan
Gambar 4. Zymogram metode overlay dengan   sampel  enzim  kitosanase  murni   konsentrasi  0,33 U (baris 1); 0,033 U (baris 2); 0,011 U (baris 3); 0,0033 U (baris 4); dan 0,00033 U (baris 5).
1             2           3             4               5 1             2           3             4               5
diperoleh  apabila  gel  diwarnai  dengan  0,1%  (w/v) methylene  blue dalam  0,01%  (w/v )  potasium hidroksida (Velence & Lortal, 1995)
PERKEMBANGAN  MUTAKHIR  TEKNIK ZYMO- GRAM
Teknik zymogram yang  melibatkan  2  tahapan proses yaitu pemisahan protein/enzim dan deteksi aktivitas  enzim  telah  banyak  digunakan  untuk mengidentifikasi  enzim  dan  mempelajari  karakter enzim seperti ketahanan suhu, pH, penambahan ad- ditives seperti  detergen,  berbagai  garam,  serta pengaruhnya  terhadap  aktiv itas  enzim .  Pada perkembangannya, teknik ini juga dapat digunakan untuk  membuat  peta protein/enzim  dan  fungsinya apabila dipadukan dengan teknik lain seperti teknik elektroforesis  2  dimensi  (2-D)  sehingga  akan memberikan informasi yang sangat lengkap seperti titik isoelektrik dan berat molekul protein/enzim serta responnya terhadap berbagai substrat. Titik isoelektrik protein/enzim akan diperoleh setelah protein/enzim di- running ke dalam Isoelectric Focusing , di mana protein/enzim akan dipisahkan dalam gel elektroforesis yang memiliki gradien pH berbeda. Protein/enzim yang telah terpisah tersebut akan di- running dalam SDS- PAGE, yang akan menghasilkan pemisahan protein sesuai  dengan  berat  molekulnya.  Penambahan informasi seperti kemampuan protein/enzim dalam mendegradasi  substrat  akan  semakin  menambah informasi peta protein/enzim yang dihasilkan. Melalui pemotongan dengan enzim tripsin maka protein/enzim yang  m emiliki  aktifitas  tertentu  berdasarkan substratnya akan dapat dilihat pola peptidanya dengan MALDI-TOF mass spectrometric analysis . Data yang diperoleh berupa susunan/urutan asam amino ini akan dievaluasi menggunakan data dasar ExPasy pada http://prospector.ucsf.edu/, sehingga  data  protein/ enzim yang diteliti dapat dibandingkan dengan data base protein/enzim  yang  telah  diidentif ikasi sebelumya. Dari data ini dapat diperoleh peran dan aplikasi ke depan protein/enzim yang diteliti apabila protein/enzim tersebut telah ada di database . Apabila belum ada  di database , maka  protein/enzim yang diteliti adalah baru, yang dapat dilanjutkan dengan riset yang lebih mendalam.

## PENUTUP
Teknik zymogram yang  awalnya  digunakan sebagai salah satu alat untuk mendeteksi keberadaan enzim  secara  kualitatif,  saat  ini  telah  banyak dikembangkan  untuk  studi  protein/enzim  secara kuantitatif. Teknik ini merupakan teknik yang relatif sederhana  yang  dapat  digunakan  dan dikembangkan untuk  m elengkapi  studi  protein/enzim  secara
menyeluruh. Kombinasi teknik ini dengan berbagai teknik elektroforesis seperti penggunaan elektroforesis yang  memiliki  gradien  pH pada gelnya atau yang dik enal  sebagai Isoelect ric  F ocusing dan elektroforesis  2-dimensi akan menghasilkan  peta protein/enzim yang lebih lengkap sehingga informasi fungsi,  aplikasi  dan  kebaruan  protein/enzim  yang diteliti segera dapat diketahui. Zymogram juga dapat diaplikasikan untuk mengetahui kemampuan lisis dari autolisin dengan menggunakan  substrat mikroba.
Dalam teknik zymogram ini yang perlu diperhatikan adalah jenis substrat yang tepat, bufer renaturasi dan prosesnya termasuk optimasinya, serta pewarnaan untuk visualisasi hasil zymogram.

## DAFTAR PUSTAKA
Chasanah, E. and Suhartono , M.T.  2005. A  Direct Screen- ing  of  Heat  Stable  Chitosanase  by  Zymographic Method. National  Seminar  on  Ligno-cellulose  Biom- ass Proceeding .  UNAIR,  Surabaya.
Choi,  Nack-Shick,  Dong-Min  Chung,  Chung  Hun  Ryu1, Kab-Seog  Yoon  Pil  Jae  Maeng,  and  Seung-Ho  Kim. 2006.  Identification  of  Three  Extracellular  Proteases from Bacillus  subtilis KCTC  3014. J.  Microbiol. Biotechnol 16  (3),  p.457–464.
Choi, Nack-Shick, Yoo  Ki-Hyun, Yoon  Kab-Seog,  Maeng PJ .,  And  Kim  Seung-Ho.  2004.  Nano-scale proteomics  approach  using  two-dimensional  fibrin zymography  combined  with  fluorescent SYPRO  ruby dye. J. Biochem and Mol Biol 37 (3): p. 298–303. Choi, Nack-Shick. and  Seung-Ho, Kim. 2001. The effect of  sodium  chloride  on  the  serine-type  fibrinolytic  en- zymes  and  the  thermostability  of  extracellular  pro- tease  from  Bacillus  amyloliquefac iens  DJ -4. J . Biochem and Mol  Biol 34 (2): 134–138.
Chung  Y.C.,  Su Y.P.,  Chen  C.C.,  Jia,  G.,  Wang  HI.,  Wu JCG.,  and  Lin  J.G.  2004.  Relationship  between  anti- bacterial  activity  of  chitosan  and  surface  characteris- tics  of  cell  wall. Acta  Pharmacol  Sin 25:  932–936. Gooday, G.W. 1990. Physiology of microbial degradation of  chitin  and  chitosan  from  Ratledge  C,  (ed.). Bio- chemistry  of  Microbial  Degradation .  Netherlands: Kluwer Academic  Publ.  p.  279–12.
Grenier  J.  and  Asselin  A.  1990.  Some  pathogenesis- related  proteins  are  chitosanases  with  lytic  activity against    fungal    spores. Molecular  Plant  Microbe Interactions . 3 (6): p.  401–407.
Grenier  J.,  Trudel  J.,  and  Asselin, A.  1997.  Gel  electro- phoretic  analysis  of chitinase,  chitosanase  and  chitin deasetylase. Chitin  Handbook .  Edited  by  Muzzarelli RAA. and Peter MG. Atec, Grottammare, Italy.
Guo-Jane   T.,  Yuon W.Z.,  and  Huey  S.W.  2000.  Anti- bacterial    activity    of    chitooligosaccharide    mixture prepared  by  cellulose  digestion  of  shrimp  chitosan and    its    application  to  milk  preservation. J.  Food Protection. 63 (6):  747–752.
Hirano,  S.    and    Nagao,  N.  1989.  Effects  of  chitosan, pectic  acid, lysozyme  and  chitinase  on  the  growth  of several  phytopathogens. Agric  Biol  Chem 53:3065- 3066
Hirano,    S.  1997. Application  of  Chitin  and  Chitosan  In Ecological  and  Environmental  Fields. In Application of chitin and chitosan, (ed.) Goosen MFA. Technomic Pub.  Co.  Inc,  Lancester,  Basil.
Hong-Ge  Chen,  Xin  Yan,  Xin-Yu  Liu,  Ming-Dao  Wang,
Hui-Min  Huang,  Xin-Cheng,  Jia,  and  Jin-An  W ang. 2006.  Purification  and  Characterization  of  Novel  Bi- functional  Xylanase,  XyniII,  Isolated  from Aspergillus niger A-25. J.  Microbiol.  Biotechnol. 16(7): p.  1132– 1138.
Kleiner  DE,  Stetlerstevenson  W.G.  1994.  Quantitative Zymography:  Detection  of  Picogram  Quantities  of Gelatinases. Anal  Biochem 218  (2):  p.  325–329 Korkmaz1  H.,  Ünaldi MN.  Aslan B, . Coral G., Arikan B., Diÿnçer B., and Çolak O. 2003. Keratinolytic activity of Streptomyces strain BA7,  a new  isolate from Turkey. Annals Microbiol .  53: p.  85–93.
Nack-Shick C., Kab-Seog Y., Jin-Young L., Kyoung-Yoen H.,  and  seung-Ho  Kim.  2001.  Comparison  of  three substrates  (casein,  fibrin  and  gelatin)  in zymogram gel. J.  Biochem Mol. Biol . 34 (6): p. 531–536.
Rawashdeh R., Ismail, S.,  and Amjad, M. 2005. Effect of cultural  conditions  on  xylanase  production  by Strep- tomyces sp. (strain  Ib  24D) and its potential to utilize
tomato pomace. Afric  J  of Biotechnol . 4 (3),  p. 251– 255.
Robyt J.F. and W hite BJ. 1987. Biochemical Techniques: Theory And  Practice .  Waveland  Press. Inc.407 Seung-Ho K. and Nack-Shick C. 1998a. A direct analysis of  fibrinolytic  enzymes  on  gels  . Anal  Biochem 263, p.115–116.
Seung-Ho  K.  and  Nack-Shick  C.  1998b.  Electrophore- sis  analysis  of  protease  inhibitors  in  fibrin zymography. Anal  Biochem.  270, 179–181.
Situmorang,  S.H.  2003. Karakterisasi  Enzim  Kitinase Termostabil  Isolate  B.  Lic heniformis   Mb-2  Dari Tompaso,  Sulawesi    Utara    Menggunakan    Teknik Zymogram. Skripsi.  Fakultas Teknologi  Pangan,  IPB, Bogor.
Sagoo  S.,  Board  R.,  Roller  S.  2002.  Chitosan  inhibits growth  of  spoilage  microorganisms  in  chilled  pork products. Food  Microbiol 19:  175–182.
Szecsi ,  A. 1990.  Analysis of Pectic Enzyme Zymograms of Fusarium species  I. Fusarium  lateritium and  Re- lated  Species. J  of  Phytopatholog 128  (1):  p.75–83.
Valence, F., and Lortal,  S. 1995. Zymogram and prelimi- nary  characterization  of  Lactobacillus  helveticus autolysins. Appl.  Env.  Microb 61  (9):  3391–3399 Yuli, P.E.,  Suhartono MT.,  Rukayadi Y.,  Hwang  J.K., and Pyun  Y.R.,  2004.  Characteristics  of  thermostable chitinase  enzymes  from  the  Indonesian Bacillus sp.13.26, Enzyme  Microb  Technol ,  35:  147–153.