Menara Perkebunan 2014 82(1), 32-38

## Ekspresi gen penyandi ACCase subunit biotin karboksilase dari mesokarp buah kelapa sawit pada
Escherichia coli
Expression of gene encoding ACCase subunit biotin carboxylase from oil palm fruit mesocarp in Escherichia coli
Asmini BUDIANI*)
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jl. Taman Kencana No. 1 Bogor 16128, Indonesia
Diterima tanggal 6 Maret 2014/disetujui tanggal 30 Juni 2014
Abstract Production of palm oil could be increased, one of which is  by  increasing  oil  content  in  the  mesocarp  of  oil  palm. This might be done by increasing the activity of key enzymes of  the  oil  biosynthesis  pathway  in  the  oil  palm  mesocarp. Acetyl-CoA  carboxylase  has  been  reported  as  the  enzyme that plays important role in oil accumulation in the oil palm mesocarp.  Gene  encoding  one  subunit  of  ACCase,  biotin carboxylase (BC) had been isolated from oil palm mesocarp and  cloned  in E.  coli .  This  reseach  was  aimed  to  examine the  expression  of  the  cloned  BC  gene  in  the  E.  coli.  The cloned  cDNA  encoding  BC  was  reisolated  from  recom- binant E.  coli by  PCR  using  spesific  primers.  The  PCR products  were  verified  in  the agarose  gel,  and  then  ligated to  pTrcHis-TOPO  expression  vector.  The  ligation  product, recombinant  vector  pTrcHis-TOPO/BC,  was  introduced into E.  coli XL1-Blue.  Recombinant  colonies  grew  in  the selection  media  were  analyzed  using  PCR  to  confirm  the existent of the target DNA . The colonies, which have been confirmed  to  contain  target  DNA  were  then  subcultured  in the  LB  media,  for  extraction  of  total  protein.  The  protein extract  was  then  analyzed  quantitatively  by  Lowry  method, and qualitatively by electrophoresis on SDS polyacrylamide gel.  The  result  showed  that  recombinant  plasmid  pTrcHis- TOPO/BC  has  been  successfully  inserted  into E.  coli XL-1 Blue.  SDS-PAGE  analysis  of  the  extracted  protein  showed that recombinant E. coli produced specific protein with MW of  about  43  kDa,  much  higher  compared  with  that  of untransformed E.  coli .  This  results  demonstrate that    the cloned BC was strongly expressed in E. coli .
[Keywords:  Palm  oil,  oil  biosynthesis,  over  expression, acetyl-CoA carboxylase]

## Abastrak
Produksi minyak sawit dapat ditingkatkan, salah satu- nya  dengan  meningkatkan  rendemen  minyak.  Hal  ini  dapat dilakukan dengan cara  meningkatkan aktivitas enzim kunci biosintesis  minyak  pada  mesokarp  buah  sawit.  Acetyl-CoA carboxylase  telah  dilaporkan  merupakan  enzim  yang berperan  penting  dalam  akumulasi  minyak  pada  mesokarp kelapa  sawit.  Pada  penelitian  sebelumnya,  gen  penyandi salah  satu  subunit  ACCase,  yaitu  biotin  carboxylase  (BC), telah  diisolasi  dari  jaringan  mesokarp  kelapa  sawit  dan diklon  pada E.coli. Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk menguji ekspresi gen tersebut pada E. coli. cDNA penyandi BC  diisolasi  kembali  dari E.  coli rekombinan  dengan  PCR menggunakan pasangan primer spesifik. Hasil isolasi diveri- fikasi pada gel agarose, kemudian diligasikan dengan vektor ekspresi    pTrcHis-TOPO.    Vektor    rekombinan  (pTrcHis-
TOPO/BC)  hasil  ligasi  diintroduksikan  ke  dalam E.  coli XL1-Blue. Koloni  rekombinan  yang  tumbuh  pada  media seleksi dianalisis menggunakan PCR untuk mengkonfirmasi ada  tidaknya  sisipan  DNA  target.  Koloni  yang    terbukti mengandung  sisipan  DNA  target  dikulturkan  pada  media LB  kemudian protein total diekstrak dari kultur E. coli dan dianalisis  dengan  elektroforesis  SDS-PAGE . Hasil  PCR koloni menunjukkan bahwa transformasi E. Coli XL-1 Blue menggunakan konstruk vektor rekombinan pTrcHis-TOPO / BC berhasil  baik.  Analisis  SDS-PAGE  dari  ekstrak  protein menunjukkan  bahwa E.  coli rekombinan  menghasilkan protein  dengan  berat  molekul  sekitar  43  kDa  yang  inten- sitasnya jauh lebih tinggi dibandingkan dengan protein yang sama  yang  dihasilkan  oleh E.  coli yang  tidak  ditrans- formasi.  Hal  ini  membuktikan  bahwa  gen  penyandi  BC dalam  vektor  pTrcHis-TOPO  dapat  diekspresikan  dengan kuat pada E. coli.
[Kata kunci:  Minyak  sawit,  biosintesis  minyak,  over- ekspresi, acetyl-CoA carboxylase]

## Pendahuluan
Rendemen  minyak  merupakan  salah  satu komponen penting dari produktivitas kelapa sawit. Di samping peningkatan berat tandan, usaha peningkatan produksi  minyak  sawit  juga  dapat  dilakukan  dengan peningkatan  rendemen  minyak.  Meskipun  penelitian konvensional  telah  memberikan  kontribusi  yang signifikan  dalam  peningkatan  produktivitas  tanaman kelapa  sawit,  namun  pemuliaan  untuk  menghasilkan bibit  kelapa  sawit  dengan  rendemen  minyak  tinggi belum  banyak  dilaporkan,  dan  upaya  demikian  akan terkendala oleh lamanya masa seleksi serta sempitnya keragaman  genetik  yang  tersedia.  Oleh  karena  itu diperlukan  teknologi  alternatif  sehingga  pemuliaan untuk menghasilkan bahan tanam kelapa sawit unggul dengan  rendemen  minyak  tinggi  dapat  dilakukan dengan  lebih  cepat.  Salah  satu  pendekatan  yang dinilai  sangat  potensial  adalah  melalui  bioteknologi molekuler,  dengan  cara  mengoverekspresikan  gen kunci dalam biosintesis minyak sawit.
Biosintesis minyak merupakan serangkaian reaksi yang  melibatkan  banyak  enzim,  salah  satunya  adalah Acetyl-CoA  carboxylase  (ACCase).  ACCase  telah diketahui   merupakan  penentu   dalam    biosintesis minyak pada berbagai tanaman termasuk kelapa sawit (Francki et  al. ,  2002;  Budiani,  2005).  Enzim    ini berperan  dalam  reaksi  pembentukan   malonyl-CoA
*) Penulis korespondensi: asminib@yahoo.com
Ekspresi gen penyandi ACCase subunit biotin karboksilase dari  mesokarp buah kelapa sawit …..(Budiani)
dari  acetyl-CoA,  tahapan  kunci  dalam  sintesis  asam lemak  (Tong,  2005).  Di  samping  sebagai  komponen penyusun  minyak/triasilgliserol,  asam  lemak  juga merupakan penyusun membran dan kutikula (Kunst & Samuels,  2003),  serta  diperlukan  dalam  sintesis  ber- bagai  senyawa  yang  berperan  dalam  sistem  per- tahanan  tanaman  (Kachroo  &  Kachroo,  2009).    Gen penyandi  ACCase  juga  dinilai  merupakan  target  gen yang  penting  dalam  pengembangan  tanaman  trans- genik penghasil minyak dan biodiesel (Jigiong et al. , 2011).  Pada  mamalia  deposisi  lemak  pada  hati diketahui  menjadi  penyebab  berbagai  penyakit. Chajes et  al .  (2006)  mengemukakan  bahwa  ACCase berperan  penting  untuk  mempertahankan  daya  hidup sel-sel kanker payudara.
Di  sisi  lain,  studi  genetik  ACCase  pada  bakteri menunjukkan bahwa ACCase sangat diperlukan untuk pertumbuhan in  vitro berbagai  bakteri  (Salama et  al. , 2004;  Payne et  al. ,  2007).  Oleh  karena  itu,  dalam bidang  kedokteran  ACCase  menjadi  objek  penelitian yang  sangat  intensif  untuk  pengembangan  obat terhadap  obesitas,  diabetes,  kanker  dan  beberapa penyakit akibat infeksi mikroba (Tong & Harwood Jr, 2006;  Wright  &  Reynolds,  2007;  Parsons  &  Rock, 2011).  Struktur,  fungsi,  kontrol  aktivitas  dan  meka- nisme inhibitor enzim ini telah banyak diteliti (Zhang et al. , 2004; Tong, 2005, Polyak et al ., 2012 ).
Dua jenis ACCase, yaitu multi subunit atau hete- romerik  dan  multi  fungsional  atau  homomerik  telah diidentifikasi  pada  sebagian  besar  tanaman.  ACCase heteromerik,  terdapat  dalam  plastid  dan  terdiri  dari empat  subunit  yang  dapat  dipisahkan,  yaitu    biotin carboxy-lase (BC), yang berfungsi mentransfer gugus carboxyl  ke  biotin,  biotin-carboxyl  carrier  protein (BCCP)  yaitu  situs  untuk  pengikatan  biotin,  dan carboxyl  transferase  (CT)  dan  ,  yang  mentransfer gugus  carboxyl  dari  biotin  ke  senyawa  lainnya. ACCase  homomerik  terdapat  dalam  sitosol  dan merupakan  protein  tunggal  yang  memiliki  domain BC,  BCCP  dan  CT  (Ke et  al .,  2000; Nikolau et  al., 2003).
Keberadaan  ACCase  homomerik  atau  hm- ACCase  dan  ACCase  heteromerik  atau  ht-ACCase telah  dikonfirmasi  pada  mesokarp  kelapa  sawit, namun  peran  ht-ACCase  dalam  akumulasi  minyak sawit  lebih  besar  dibandingkan  peran  hm-ACCase. (Budiani,  2005).  Peningkatan  aktivitas  ACCase  pada mesokarp  kelapa  sawit  mulai  dideteksi  dari  buah berumur  14  minggu  hingga  umur  20  minggu  setelah antesis.  Hasil  elektroforesis  protein  pada  gel  SDS- poliakrilamid  menunjukkan  adanya  dua  protein  yang konsentrasinya meningkat sejalan dengan peningkatan kandungan  minyak.  Analisis  sekuen asam amino dari protein  tersebut  menghasilkan  beberapa  polipeptida yang  mempunyai  homologi  dengan  gen  penyandi ACCase  subunit  BC,  gen  penyandi  enoyl-ACP reductase  dan  glyceraldehyde-3P  dehydrogenase (Budiani et  al. , 2008).  Hasil  tersebut  membuktikan bahwa ACCase merupakan salah satu enzim yang ber- peran  penting  dalam  akumulasi  minyak  pada  meso- karp  buah  sawit.  cDNA  lengkap  penyandi  ACCase
subunit biotin carboxylase (BC) telah diklon (Budiani et  al., 2013).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menguji ekspresi  cDNA  penyandi  ACCase  subunit  BC  yang telah diklon pada Escherichia coli.

## Bahan dan Metode
Bahan yang digunakan dalam kegiatan penelitian ini  adalah  sel E.  coli rekombinan  yang  mengandung cDNA  lengkap  penyandi  ACCase  subunit  biotin karboksilase  (BC)  dari  mesokarp  kelapa  sawit  yang disimpan dalam gliserol pada freezer bersuhu -40 ºC.
Isolasi  cDNA  lengkap  penyandi  BC  terklon  dari E. coli rekombinan
E.  coli rekombinan  yang  mengandung  vector pGEM-T  pembawa  cDNA  penyandi  ACCase  subunit BC (pGEM-T/BC) diremajakan dalam LB cair selama 16  jam. E.  coli rekombinan  yang  tumbuh  kemudian dipanen  dengan  sentrifugasi  pada  10.000  rpm  selama lima  menit. Isolasi plasmid rekombinan  pGEM-T/BC dari  sel E.  coli dilakukan  menggunakan  kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Plasmid rekombinan  hasil isolasi  dicek  ukurannya  pada  gel  agarose.  Sementara itu,  keberadaan  cDNA  penyandi  ACCase  subunit  BC pada  plasmid  rekombinan  diketahui  berdasarkan ukuran  plasmid  hasil  isolasi  pada  gel  agarosa,  dan hasil amplifikasi cDNA penyandi BC dengan templat DNA  plasmid  rekombinan  menggunakan  sepasang primer  yang  spesifik  untuk  gen  tersebut,  yaitu FLBCF/R.  Primer  tersebut  dirancang  menggunakan program  Primer3  berdasarkan  sekuen  DNA  penyandi BC  yang  telah  diperoleh  sebelumnya  (Budiani et  al. , 2013).  Di  samping  itu,  PCR  juga  dilakukan  meng- gunakan primer SP6 dan T7 untuk memastikan bahwa fragmen DNA yang diamplifikasi adalah sisipan DNA target  dalam  plasmid,  karena  kedua  primer  tersebut mengapit DNA target  yang dibawa. Selanjutnya hasil PCR diverifikasi pada gel agarosa.
Konstruksi  vektor  rekombinan pTrcHis-TOPO/BC dan introduksinya ke dalam E.coli XL1-Blue
cDNA  penyandi  BC  yang  telah  diisolasi  dari plasmid  rekombinan  pGEM-T/BC,  diligasikan  pada vektor  ekspresi  pTrcHis-TOPO ® (Invitrogen  life technologies)  untuk  diekspresikan  di E.  coli . Campuran ligasi yang terdiri dari produk PCR (cDNA penyandi  BC)  (4  μL)  dan  vektor  pTrcHis-TOPO ® (1 μL), diinkubasi lima menit. Selanjutnya digunakan dua  prosedur  untuk  mengintroduksikan  plasmid rekombinan  hasil  ligasi,  yaitu:  (i)  sebanyak  2  μL campuran  ligasi  diinkubasi  selama  lima  menit  pada suhu  kamar,  dilanjutkan  introduksi  hasil  ligasi  ke E. coli, dan (ii) sisa campuran ligasi (3 μL) disimpan terlebih  dahulu  pada  -20 o C  selama  24  jam,  sebelum diintroduksikan ke E.coli . Introduksi vektor rekombinan hasil ligasi ke dalam sel  kompeten E.  coli XL-1  Blue  dilakukan  dengan teknik kejutan panas. Setelah  diinkubasi di es  selama 30  menit,  campuran  diinkubasi  pada  suhu  42 o C selama  30  detik,   kemudian   didinginkan   kembali
39
dalam  es.  Setelah  ditambah  media  SOC  250  µL  dan dikocok  150  rpm  pada  suhu  37 o C  selama  satu  jam, sel E.  coli dikulturkan  pada  media  LB  yang  me- ngandung  ampicilin  50  µg/mL  dan  glukosa  0,5%, selama semalam pada suhu 37 o C. Keberadaan cDNA penyandi  BC  dalam  koloni  berwarna  putih  yang dihasilkan  dikonfirmasi  dengan  PCR  menggunakan primer  spesifik  BC.  Plasmid  rekombinan  diisolasi kembali  dari  koloni  yang  positif  mengandung  cDNA penyandi  BC  tersebut  menggunakan  kit High  Pure Plasmid Isolation (Roche)
Uji ekspresi BC dalam E. coli rekombinan
Pengujian  ekspresi  cDNA  penyandi BC terklon dilakukan  dengan  mengekstrak  protein  dari  kultur E. coli XL-1  Blue  hasil  transformasi  dengan  plasmid rekombinan pTrcHis-TOPO/BC maupun kultur E. coli XL-1  Blue native yang  tidak  ditransformasi.  Untuk mengekstrak  protein,  sel E.  coli dikulturkan  pada media  LB  +  ampicilin  50  µg/mL  +  glukosa  0,5% semalam  pada  suhu  37 o C.  Setelah  disentrifus,  pellet dilarutkan  dalam  1  mL  bufer  lisis  (Tris  HCl  50  mM pH  8,0;  EDTA  5  mM,  dan  NaCl  100  mM). Supernatan  yang  diperoleh  dipisahkan,  kemudian konsentrasi protein dalam supernatan dan dalam pellet ditentukan dengan  metode  Lowry (Waterborg, 2002). Ekstrak  protein  dianalisis  pola  proteinnya  dengan elektroforesis  pada  gel  SDS-poliakrilamid  (SDS- PAGE).

## Hasil dan Pembahasan
Isolasi  gen  penyandi BC terklon  dari E.  coli rekombinan
Susunan  nukleotida  dari  primer  yang  digunakan untuk  mengamplifikasi  cDNA  penyandi  BC  dari plasmid  rekombinan  pGEM-T/BC  dan  dari  plasmid rekombinan  pTrcHis-TOPO ® /BC  disajikan  pada Tabel  1.  Primer  SP6  dan  T7  digunakan  untuk menguatkan  atau  meyakinkan  bahwa  produk  PCR yang  diisolasi  adalah  benar  berdasarkan  ukurannya pada gel poliakrilamid.
Gambar  1A  menyajikan  hasil  isolasi  plasmid rekombinan  pGEM-T/BC  yang  diisolasi  dari  kultur E.  coli rekombinan,  sedangkan  Gambar  1B  memper- lihatkan  hasil  isolasi  kembali  cDNA  penyandi  BC dari plasmid rekombinan dengan PCR menggunakan
Tabel 1.  Susunan nukleotida primer yang digunakan untuk isolasi kembali  cDNA penyandi BC
Table 1.   Nucleotide  sequence  of  primers  used  for reisolation of the cDNA encoding BC Primer Susunan nukleotida ( Nucleotide sequence ) FLBC-F 5’- AGTACGCGGGGATCTCTTCT – 3’ FLBC-R 5’- CCCAAATTGTTTCCAAGCAG – 3’ SP6 5’- ATTTAGGTGACACTATAG -3’ T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ pTrcHis-F 5’-GAGGTATATATTAATGTATCG-3’
pTrcHis-R 5’-GATTTAATCTGTATCAGG-3’
primer  FLBC-F/R.  Gambar  1C  adalah  hasil  isolasi cDNA  yang  sama  menggunakan  primer  SP6/T7. Nampak  bahwa  produk  amplifikasi  dari  Gambar  1A memiliki  ukuran  yang  sesuai  dengan  plasmid  rekom- binan  yang  membawa  cDNA  penyandi  BC  terklon yaitu sekitar 5200 pb. Ukuran vektor pGEM-T adalah 3000 pb sehingga ukuran fragmen DNA yang dibawa diperkirakan  sekitar  2200  pb.  Hal  ini  sesuai  dengan hasil pada Gambar 1B yang memperlihatkan fragmen DNA  hasil  amplifikasi  dengan  primer  FLBC-F/R dengan  ukuran  sekitar  2200  pb,  ukuran  yang  sama dengan  cDNA  lengkap  penyandi  BC.  Amplifikasi menggunakan  primer  SP6/T7  menghasilkan  fragmen DNA  dengan  ukuran  sedikit  lebih  besar  dari  ukuran fragmen  yang  dihasilkan  dari  amplifikasi  dengan primer FLBC-F/R (Gambar 1C). Hal ini karena posisi primer  T7  pada  vektor  kloning  pGEM-T  adalah sekitar 50 basa di atas gen tersisip, sedangkan primer SP6 berada pada posisi sekitar 70 basa di bawah gen tersisip  (Gambar  2A).  Hasil  tersebut  menunjukkan kestabilan gen penyandi BC yang diklon dalam E. coli menggunakan vektor pGEM-T Easy .
Konstruksi  vektor  rekombinan  pTrcHis-TOPO ® /BC dan introduksinya ke dalam E.coli XL1-Blue
Ligasi cDNA penyandi BC (sekitar  2200 pb) ke vektor  pTrcHis-TOPO ® yang  berukuran  4390  pb (Gambar  2B)  akan  menghasilkan  vektor  rekombinan pTrcHis-TOPO ® /BC  dengan  ukuran  sekitar  6,5  kb. Introduksi vektor rekombinan pTrcHis-TOPO ® /BC ke dalam E. coli akan menghasilkan E. coli rekombinan yang  tumbuh  pada  media  seleksi.  Hasil  analisis  PCR koloni  produk  transformasi  yang  tumbuh  pada  media seleksi disajikan pada Gambar 3. Dua prosedur trans- formasi  yang  berbeda  menghasilkan  jumlah  koloni rekombinan  yang  berbeda.  Prosedur  pertama,  yaitu campuran  ligasi  diinkubasi  lima  menit  pada  suhu kamar,  volume  sel  transforman  yang  dikultur  pada media seleksi  sebanyak 10 μL dan 50 μL; sedangkan prosedur kedua, sisa campuran ligasi pertama disimpan 24  jam  pada  -20  ºC  sebelum  digunakan  untuk  trans- formasi,  dan  volume  sel  hasil  transformasi  yang dikulturkan  pada  media  seleksi  adalah  100  μL  dan 200    μL.  Kedua  prosedur  tersebut  menghasilkan jumlah  koloni  transforman  yang  berbeda  setelah dikulturkan  pada  media  seleksi.  Prosedur  pertama hanya  menghasilkan  satu  koloni  putih,  sedangkan prosedur   kedua menghasilkan masing-masing 16 dan 17 koloni putih.  Hasil analisis PCR dari koloni putih yang  diperoleh  disajikan  pada  Gambar  3.  Nampak koloni dari prosedur (1) dan dua koloni dari prosedur (2) yang  teruji  mengandung  sisipan  DNA  berukuran  lebih kurang sama dengan ukuran BC yang diintroduksikan.
Hasil isolasi plasmid rekombinan dari koloni yang telah  teruji  positif  mengandung  sisipan  DNA  target sebagaimana  ditunjukkan  pada  Gambar  3B  dan  3C, dapat dilihat pada Gambar 4. Berdasarkan ukurannya, diharapkan  plasmid  tersebut  adalah  plasmid  rekom- binan yang mengandung cDNA penyandi BC.
Ekspresi gen penyandi ACCase subunit biotin karboksilase dari  mesokarp buah kelapa sawit …..(Budiani)
Gambar 1. Profil elektroforesis dari : (A) plasmid rekombinan pGEM-T/FLBC hasil isolasi dari dua koloni E. coli rekombinan, (B)  cDNA  penyandi  BC  hasil  isolasi  dari  kedua  plasmid  rekombinan pGEM-T/FLBC dengan  PCR  menggunakan primer  FLBC-F/R,  dan  (C)  cDNA  penyandi  BC  hasil  isolasi  dari  kedua  plasmsid  rekombinan  dengan  PCR menggunakan primer SP6/T7. M= 1 kb DNA ladder.
Figure 1.  Electrophoretic profile of; (A) recombinant plasmid pGEM-T/FLBC isolated from the two colonies of recombinant E.  coli, (B)  cDNA  encoding  BC  isolated  from  the  two  trecombinant  plasmids  of pGEM-T/FLBC  by  PCR  using specific  primers FLBC-F/R,  and  (c)  cDNA  encoding  BC  isolated  from  the  two  recombinant  plasmids  of pGEM- T/FLBC by PCR using SP6/T7 primers.
Gambar 2.   (A) Peta vektor kloning pGEM-T dan (B) peta vektor ekspresi pTrcHis-TOPO.
Figure 2.     (A) Maps of pGEM-T cloning vector, and (B) pTrcHis-TOPO expression vector.
Gambar 3. Profil elektroforesis dari (A) hasil PCR koloni yang diperoleh dari prosedur transformasi pertama. (B) hasil PCR koloni dari prosedur transformasi kedua dengan primer FLBC-F/R. (C)  hasil PCR kembali dua koloni positif pada (B) dengan primer pTrcHis-F/R.
Figure 3.  Electrophoretic profile of  (A) PCR of colonies produced from the the first transformation procedure, (B) PCR of colonies  produced  from  the  second    transformation  procedure,  and  (C)  PCR  of  the  two  positive  colonies  from Figure 3B using primers of  pTrcHis-F/R.
A M 2.000 1.000 3.000 10.000 750 500 B M 10.000 3.000 2.000 1.000 500 750 Pb/bp Pb/bp C 2.000 3.000 10.000 750 500 Pb/bp 1.000 A B 12.000 2.000 1.650 1.000 650 500 300 100 A B C Pb/bp

## Menara Perkebunan 2014 82(1), 32-38
Ekspresi gen penyandi BC dalam E. coli rekombinan
Protein total diekstrak dari kultur E. coli rekom- binan dan E.coli non rekombinan (yang tidak ditrans- formasi) . Konsentrasi  protein  hasil  ekstraksi  dari kedua  kultur  tersebut  disajikan  pada  Tabel  2.  Untuk sel yang ditransformasi diukur konsentrasi proteinnya baik dari pelet maupun dari supernatan yang diperoleh setelah  sel  dilisis  dan  disentrifugasi.  Konsentrasi protein  dalam  supernatan  pada  sel  rekombinan  dan non  rekombinan  hampir  sama  yaitu  1025,10  µg/mL dan  1057,98  µg/mL.  Untuk  sel  yang  ditransformasi, konsentrasi  protein  pada  pelet  lebih  besar  dibanding- kan dengan konsentrasi protein dalam supernatan.
Profil  protein  hasil  elektroforesis  SDS-PAGE dari E.  coli rekombinan  hasil  transformasi  dengan pTrcHis/BC dan dari E. coli yang tidak ditransformasi ditampilkan  pada  Gambar  5.  Dari  Gambar  tersebut nampak  jelas E.  coli transforman  mengekspresikan protein  pada  berat  molekul  sekitar  43  kDa  jauh  lebih tinggi  dibandingkan  dengan E.  coli yang  tidak  di- transformasi.  Peningkatan  akumulasi  protein  tersebut sangat  jelas  dan  ditemukan  baik  pada  supernatan maupun  pelet  dari E.  coli rekombinan.  Hasil  tersebut memperlihatkan bahwa peningkatan akumulasi protein  43  kDa  disebabkan  karena  introduksi  dan ekspresi  cDNA  penyandi  ACCase  subunit  biotin carboxylase.
Pengujian  ekspresi  merupakan  tahapan  penting yang perlu dilakukan dalam isolasi gen, untuk menge- tahui  apakah  gen  yang  diklon  dalam  suatu  plasmid dapat  menghasilkan  protein  yang  diinginkan.  Pada beberapa kasus, gen yang diklon dalam suatu plasmid tidak dapat diekspresikan menghasilkan protein target, salah  satunya  disebabkan  karena  sekuen  DNA  yang dimiliki  tidak in  frame atau  berada  di  kode  inisiasi translasi  yang  tepat.    Vektor  pTrcHis-TOPO ® yang digunakan  dalam  kegiatan  ini  adalah  vektor  ekspresi yang  dirancang  untuk  ekspresi  protein  rekombinan secara efisien pada E. coli serta purifikasinya. Sisipan
Gambar  4.  Profil  elektroforesis  dua  plasmid  rekombinan hasil  isolasi  dari  kedua  koloni  positif  sebagai- mana ditunjukkan pada Gambar 3B.
Figure  4.  Electrophoretic  profile  of  two  recombinant plasmids  isolated  from  the  two  positif  colonies as  shown  in  figure  3B.  M:  1  kb  plus  DNA ladder.
Tabel  2.  Konsentrasi  protein  hasil  ekstraksi  dari  kultur E. coli transforman dan non transforman.
Table 2.   Concentration of protein extracted from culture of transformed and untransformed E. coli.
Sumber protein Source of protein A 750 Protein (µg/mL) XL-1 Blue non rekombinan, supernatan  0.354 1057.98 XL-1 Blue rekombinan, pelet 0.331 989.24 XL-1 Blue rekombinan, supernatan 0.343 1025.10
Gambar  5.  Profil  SDS-PAGE  ekstrak  protein.  Lajur  1-3: E. coli native; lajur 4-6: E. coli rekombinan dari ekstraksi  pelet;  lajur  7-9: E.  coli rekombinan dari  ekstraksi  supernatan.  Lajur  1,4,  7:  volume loading  5  µL  ekstrak  protein,  lajur  2,  5,  8: volume loading 10 µL ekstrak protein; lajur 3, 6, 9:  volume  loading  15  µL  ektrak  protein.  M: marker protein
Figure 5.  SDS-PAGE  profile  of  the  extracted  protein. Lanes  1–3:  native E.  coli; lanes  4-6:  recom- binant E.  coli of  extracted pellets;  lanes  7-9: recombinant E.  coli of  extracted  supernatants).
Lanes  1,  4,  7:  loading  volume  5  µl  extracted protein;  lanes  2,  5,  8:  loading  volume  10  µL extracted  protein;  lanes  3,6,  9:  loading  volume 15 µL extracted protein. M: protein marker.
DNA  target  diposisikan  di  bawah  ( downstream )  dan in  frame dengan  sekuen  yang  menyandi  enam  residu histidin yang berfungsi sebagai metal binding domain dalam  translasi  protein  (Gambar  2B).  Adanya N- terminal  fusion  peptide pada  vektor  tersebut  akan menambahkan  3-4  kDa  dari  protein  yang  diekspresi- kan.  Dengan  demikian,  BM    protein    hasil  ekspresi cDNA BC terklon adalah sekitar 40 kDa.
cDNA penyandi ACCase subunit biotin carboxy- lase   yang diuji ekpresinya pada penelitian ini adalah hasil  kloning  yang  telah  dilaporkan  sebelumnya (Budiani et al., 2013).  Panjang nukleotida gen terklon adalah 2182 pb, dengan start codon terletak pada basa ke  224-226.  Untuk  mengetahui  fungsi  protein  yang dihasilkan dan perkiraan berat molekulnya, dilakukan analisis  menggunakan  program  Geneious  R5  (Bio- matters  Ltd.).  Hasil  analisis  menunjukkan  bahwa protein  hasil  translasi  tersusun  oleh  536  asam  amino, mempunyai  domain  biotin  karboksilase  dan  prediksi berat molekulnya adalah 58,24 kDa (Gambar 6). Hasil ini sama dengan berat molekul ACCase subunit biotin
M           1            2 2000 12000 5000 12.000 2.000 1.650 1.000 650 500 300 200 5.000 Pb/bp M     1      2       3       4      5      6       7      8      9 43 kDa 43 kDa 97,4 kDa 200 116 66
45
31 21,5 14,5
Ekspresi gen penyandi ACCase subunit biotin karboksilase dari  mesokarp buah kelapa sawit …..(Budiani)
carboxylase  dari  jarak  pagar  ( Jatropha  curcas )  yang diprediksi  berdasarkan  sekuen  cDNA  penyandi  BC yang  berhasil  diklon  (Gu et  al. ,  2011).  Namun, prediksi  BM  berdasarkan  sekuen  DNA  tersebut  ter- nyata berbeda dengan BM protein pada analisis meng- gunakan  SDS-PAGE  yang  disajikan  pada  Gambar  5, yaitu  lebih  kurang  40  kDa.  Perbedaan  berat  molekul protein  BC  juga  dilaporkan  oleh  Shen et  al. (2006) dalam  studinya  mengenai  kaitan  antara  struktur dengan  aktivitas  katalitik  BC.  BC wild  type yang berbentuk  dimer  dalam  larutan  mempunyai  BM  87 kDa,  sedangkan  BM  BC  yang  diperoleh  dari  filtrasi gel  adalah  50  kDa.  Beberapa  molekul  BC  lainnya mempunyai BM 43 – 48 kDa, yang dinyatakan sesuai dengan stase monomer protein tersebut dalam larutan.
Gen penyandi ACCase telah diklon dari berbagai tanaman termasuk dari kelapa sawit, namun pengujian ekspresinya pada organisme rekombinan, baik E. coli maupun  tanaman  transgeniknya,  belum  banyak  di- laporkan. Hasil penelitian mengenai kloning, ekspresi dan  evolusi  gen  penyandi  ACCase  subunit  α-CT  dari Brasica napus dilaporkan  oleh  Li et  al. (2010). Sedangkan  kloning  gen-gen  penyandi  keempat  sub- unit  penyusun  ACCase  dari  jarak  pagar  ( Jatropha curcas )  dilaporkan  oleh  Gu et  al. (2011).  Hasil analisis  ekspresi  menunjukkan  bahwa  gen-gen  ter- sebut  terekspresi  secara  temporal  dan  spasial  pada
daun  dan  endosperm,  dan  diregulasi  oleh  perkem- bangan  dan  lingkungan.    Pada  tanaman  kelapa  sawit, kloning  gen  penyandi  ACCase  subunit  β-CT  dan subunit  BC  telah  dilaporkan  (Nugkaew,  2005; Nakkaew et  al. ,  2008;  Omar et  al. ,  2008).  Dari berbagai studi mengenai struktur, fungsi dan inhibitor ACcase, diketahui pula bahwa β -CT merupakan factor pembatas  ACCase  heteromerik,  sedangkan  BCCP adalah  regulator  negatif  dalam  sintesis  asam  lemak (Jieqiong, 2011). Di samping itu, ACCase dari rumput ( grasses ) adalah target dari herbisida yang telah lama dikomersialkan (Tong & Harwood Jr, 2006).
Peran  kunci  ACCase  dalam  biosintesis  asam lemak  dan  akumulasi  minyak,  memberikan  peluang ACCase  sebagai  target  gen  dalam  pengembangan tanaman  transgenik  penghasil  minyak  dan  biodiesel. Oleh karena itu isolasi dan kloning gen ACCase, serta pengujian  ekspresinya  merupakan  tahapan  penting yang  diperlukan  untuk  tujuan  tersebut.  Peningkatkan rendemen  minyak  dapat  dilakukan  melalui  meka- nisme up regulation untuk mengover-ekspresikan gen tersebut.    Sebaliknya, down  regulation dari  ACCase akan  mengarahkan  metabolit  acetyl-CoA  ke  produksi PHB  (Polyhydroxybutyrate ) dan  PHBV  (poly  (3- hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate ) , senyawa yang banyak  digunakan  untuk  bioplastik  (Omar et  al. , 2008) .
Gambar  6.  Hasil  analisis  sekuen  cDNA  penyandi  BC  yang  diekspresikan  pada E.  coli. (A)    Sekuen  asam  amino  hasil translasi  yang  menunjukkan adanya domain biotin  karboksilase; (B) Prediksi jumlah  asam amino  dan berat molekul protein hasil translasi.
Figure  6.    Results  of  sequence  analysis  of  cDNA  encoding  BC  expressed  in E.  coli .  (A)  Amino  acid  sequense  of  the translation    productshowing  the  biotin  carboxylase  ;  (B)  Predicted  number  of  amino  acid  and  molecular weight of the translation product.
A Statisics
Length    : 536
Molecular weight: 58.240 kDa
Isoelestric point: 6.97 Extinction Coefficient: 25,495
B

## Kesimpulan
cDNA lengkap penyandi  ACCase subunit biotin carboxylase    asal  kelapa  sawit  dapat  diekspresikan pada E.  coli XL-1  Blue  dengan  vektor  expresi pTrcHis-TOPO  menghasilkan  protein  dengan  berat molekul  sekitar  43  kDa.  Untuk  mengkonfirmasi fungsinya sebagai biotin karboksilase, protein tersebut perlu dimurnikan dan diuji aktivitasnya.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr. Riza Arief  Putranto  DEA,  atas  bantuannya  dalam penggunaan  program  Geneious  R5  untuk  analisis sekuen asam amino.

## Daftar Pustaka
Budiani  A  (2005).  Ekspresi  protein  spesifik  dalam biosintesis  minyak  dan  kloning  gen  penyandi  ht- ACCase  subunit  biotin  karboksilase  dan  enoil-ACP reduktase dari mesokarp kelapa sawit ( Elaeis guineensis Jacq.). Tesis S3.  Bogor,  Sekolah  Pascasarjana.  Institut Pertanian Bogor.
Budiani  A,  D  Santoso,  H  Aswidinnoor  &  A  Suwanto (2008).  Accase  activity  of  oil  palm  mesocarp  and cloning  of  gene  fragment  encoding  biotin  carboxylase subunit of  ACCase. Ind J of Agricul 1(1),  44-50.
Budiani  A, A  Suwanto,    H  Aswidinnoor,    D  Santoso & BJ  Nikolau  (2013).  Kloning  cDNA  lengkap  penyandi ACCase  subunit  biotin  carboxylase  dari  mesokarp kelapa  sawit  ( Elaeis  guineensis Jacq.). Menara Perkebunan 81(2), 55-66.
Chajes  V,  M  Cambot,  K  Moreau,  GM  Lenoir  &  V  Joulin (2006).  Acetyl-CoA  carboxylase  alpha  is  essential  to breast cancer cell survival. Cancer Res 66, 5287–5294.
Francki  MG,  P  Whitaker,  PM  Smith  &  CA  Atkins  (2002). Differential expression   of  a  novel  gene  during  seed triacylglycerol  accumulation  in  lupin  species  ( Lupinus angustifolius L.  and L.  mutabilis L.). Funct  & Intregative Genom 26, 292-300.
Gu K, H Chiam, D Tian & Z Yin (2011). Molecular cloning and  expression  of  heteromeric    ACCase  subunit  genes from Jatropha curcas . Plant Sci 180(4), 642-649.
Jieqiong  LI,  Z  Shixue,  Y Ziniu &  Z  Jibing  (2011).  Acetyl- coenzyme  A  carboxylase:  A  key  metabolic  enzyme  of fatty  acid  and  progress  of  its  gene  clone. Chin  J  Appl Environ Biol 17(5), 753-758.
Kachroo  A  &  P  Kachroo  (2009).  Fatty  acid  –  derived signals in plant defense. Ann Rev Phytopathol 47, 153– 76.
Ke  J,  T-N  Wen,  BJ  Nikolau  &  ES  Wurtele  (2000).
Coordinate regulation of the nuclear and plastidic genes coding  for  the  subunit  of  heteromeric  acetyl-coenzyme A carboxylase. Plant Physiol 122, 1057-1071.
Kunst L &  AL Samuels (2003). Biosynthesis and secretion of plant cuticular wax. Prog Lipid Res 42, 51 – 80.
Li Z-G, W-B Yin, H Guo, L-Y Song, Y-H Chen, R-Z Guan, J-Q  Wang,  RR-C  Wang  &  Z-M  Hu  (2010)  Genes encoding  the  α-carboxyltransferase  subunit  of  acetyl- CoA  carboxylase  from Brassica  napus and  parental species:  cloning,  expression  patterns,  and  evolution. Genome 53, 360–370.
Nakkaew A, W Chotigeat, T Eksomtramage & A Phongdara (2008). Cloning  and  expression  of  a  plastid-encoded subunit,  beta-carboxyltransferase  gene  ( accD )  and  a nuclear-encoded  subunit,  biotin  carboxylase  of  acetyl- CoA  carboxylase  from  oil  palm  ( Elaeis  guineensis
Jacq.) Plant Sci 175(4), 497 – 504.
Nikolau  BJ,  JB  Ohlrogge  &  ES  Wurtele  (2003). Plant biotin-containing  carboxylases. Arch  Biochem  and Biophys 414, 211–222.
Nugkaew A  (2005). Cloning Acetyl-CoA Carboxylase beta subunuit  (AccD)  from  mesocarp  of  oil  palm ( E.  guineensis ). Taken  from http://agris.fao.org/records/ th2005002332. [July, 2006]
Omar  WSW,  LB  Willis,    RHA  Chokyun,  AJ  Sinskey,
US Ramli, AMM Yunus, GK Parveez & R  Sambanthamurthi  (2008).  Isolation  and  utilization  of Acetyl-CoA  Carboxylase  from  oil  palm  ( Elaeis guineensis )  mesocarp. J  Oil  palm  Res  Special  Issue  on Malaysia 2,  97. Parsons  JB  &  CO    Rock    (2011).  Is bacterial  fatty  acid  synthesis  a  valid  target  for antibacterial  drug  discovery?. Curr  Opin  Microbiol 14, 544–549.
Payne DJ, MN Gwynn, DJ Holmes, DL Pompliano  (2007) Drugs  for bad bugs: confronting the challenges of  anti- bacterial discovery. Nat Rev Drug Discov 6, 29–40.
Polyak  SW,  AD  Abell,    MCJ  Wilce,    L  Zhang  &
GW  Booker  (2012).  Structure,  function  and  selective inhibition  of    bacterial  acetyl-coa  carboxylase. Appl Microbiol Biotechnol 93, 983–992.
Salama  NR,  B  Shepherd  &  S  Falkow  (2004).  Global transposon  mutagenesis  and  essential  gene  analysis  of Helicobacter pylori . J Bacteriol 186,7926–7935.
Shen Y, C-Y  Chou, G-G  Chang  (2006).  Is  dimerization required  for  the  catalytic  activity  of  bacterial  biotin carboxylase?. Mol Cell 22, 807–818.
Tong  L  (2005).  Acetyl-Coenzyme  A  Carboxylase:  crucial metabolic  enzyme  and  attractive  target  for  drug discovery. Cell Mol Life Sci 62,1784-1802.
Tong  L  &  HJ  Harwood  Jr  (2006) . Acetyl-coenzyme  A carboxylases:  versatile   targets  for  drug  discovery.
J of Cell Biochem 99, 1476–1488.
Waterborg  JH  (2002).  The  lowry  method  for  protein quantitation. In: J.M.  Walker. The  Protein  Protocol Handbook. 2 nd. ed . New Jersey, Humana Press,  p. 7-9.
Wright HT & KA Reynolds (2007). Antibacterial targets in fatty  acid  biosynthesis. Curr  Opin  Microbiol 10,447– 453.
Zhang H, B Tweel, J Li & L Tong (2004). Crystal structure of  the  carboxyltransferase  domain  of  Acetyl-coenzyme A  carboxylase  in  complex  with  CP-640186. Structure 12, 1683–1691.