p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
Enkapsulasi Probiotik Lactobacillus sp . Menggunakan Dua Tahap Proses
Rintan Fransiska Trimudita 1* , Djaenudin 2
1 Loka Penelitian Teknologi Bersih – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LPTB-LIPI) Bandung
2 Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Garut Gedung 50 – Kampus LIPI Jl. Cisitu Sangkuriang Bandung 40135 * Koresponden email: rintanfransiskatrimudita@gmail.com, aburizki@gmail.com
Diterima: 4 Maret 2021 Disetujui: 18 Maret 2021

## Abstract
The Lactobacillus sp. a probiotic microorganism that can’t  survive gastric acidity and  concentration of bile salts in the gastrointestinal tract. Probiotic encapsulation is one of the methods to protect probiotics during the processing, storage, and from acidic solutions in the gastrointestinal tract. The research was to know that viability was encrypted with an alginate matrix and we were against tests  in simulated stomach acid.  In  this  research,  the  encapsulation  process  was  performed  by  mixing Lactobacillus sp.  with  Na- Alginate to form a suspension as an encapsulation material. The microcapsules formed were coated with chitosan  with  concentrations i.e .,  1.2%;  1.6%;  and  2%. Lactobacillus sp.  encapsulated  chitosan  matrix viability was tested in gastric fluid simulation (0,2% NaCl pH 1,2 and 3)  for 1 minute, 60 minutes, and 120  minutes  using  the  TPC  method  (Total  Plate  Count).  After  the  viability  test, Lactobacillus sp. encapsulated with 2% chitosan could maintain the viability Lactobacillus sp. with the number of colonies was  of  7,41  log  Cfu/gram  in  the  simulation  of  gastric  acid  fluid  pH  3  for  120  minutes,  and  4,78  log Cfu/gram in the gastric acid fluid simulation  pH 1,2 with a duration 120 minutes . Keywords : probiotics, encapsulation , lactobacillus sp., na-alginate, chitosan

## Abstrak
Lactobacillus sp.  merupakan  mikroorganisme  probiotik  yang  tidak  dapat  bertahan  hidup  pada  tingkat keasaman lambung dan konsentrasi garam empedu pada saluran cerna. Enkapsulasi probiotik merupakan salah  satu  metode  untuk  melindungi  probiotik  pada  proses  pengolahan,  penyimpanan  dan  pada  saluran pencernaan yang bersifat asam. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui viabilitas probiotik yang telah ter-enkapsulasi  dengan  matriks  alginat  dan  kitosan  terhadap  pengujian  dalam  simulasi  cairan  asam lambung. Proses enkapsulasi dilakukan dengan cara mencampurkan Lactobacillus sp. dengan Na-Alginat sehingga  membentuk  suspensi  sebagai  bahan  enkapsulasi.  Mikrokapsul  yang  terbentuk  dilapisi  kitosan dengan konsentrasi 1,2%; 1,6% dan 2%. Lactobacillus sp. yang telah terenkapsulasi oleh matriks kitosan diuji viabilitasnya dalam simulasi cairan asam lambung (NaCl 0,2% pH 1,2 dan pH 3) selama 1 menit, 60 menit dan 120 menit dengan metode TPC ( Total Plate Count). Setelah dilakukan uji viabilitas didapatkan Lactobacillus sp. hasil enkapsulasi dengan penyalut kitosan 2% dapat mempertahankan viabilitas bakteri Lactobacillus sp.  dengan  jumlah  koloni  log  7,41  Cfu/gram  pada  simulasi  cairan  asam  lambung  pH  3 selama 120 menit dan log 4,78 Cfu/gram pada simulasi cairan asam lambung pH 1,2 selama 120 menit. Kata kunci: probiotik, enkapsulasi, lactobacillus sp., na-alginat, kitosan

## 1. Pendahuluan
Bakteri  Asam  Laktat  (BAL)  termasuk  ke  dalam  bakteri  gram  positif  yang  tidak  menghasilkan spora,  memililiki  dua  bentuk,  yaitu  bentuk  bulat  dan  batang  yang  memproduksi  asam  laktat  selama fermentasi karbohidrat sebagai hasil akhir metabolit utama [1]. Streptococcus , Pediococcus , Leuconostoc , dan Lactobacillus merupakan bakteri yang termasuk ke dalam BAL. Bakteri Lactobacillus sp. merupakan strain bakteri asam laktat [2] Lactobacilus sp. tidak dapat bertahan hidup pada tingkat keasaman lambung (pH  1,5-2,5)  dan  selama  proses  pengolahan  pada  suhu  tinggi  [3].  Penambahan  zat  pembawa  agar probiotik  berfungsi  agar Lactobacillus sp.  bisa  bertahan  hidup  saat  melewati  lambung  dan  berkoloni  di usus [4].
Standar minimum bakteri sediaan probiotik dalam makanan yaitu sebanyak 106-107 CFU ( colony forming  unit )/gram.  Probiotik  adalah  mikroorganisme  hidup  yang  dapat  memberikan  manfaat  kesehatan apabila dikonsumsi dalam jumlah cukup [5]. Upaya untuk meningkatkan ketahanan hidup Lactobacillus
sp.  dapat  melalui  metode  enkapsulasi  dengan  cara  memberikan  perlindungan  kepada  bakteri.  Proses enkapsulasi dilakukan dengan menggunakan bahan polimer alam seperti Na-Alginat dan Kitosan.
Alginat  merupakan  salah  satu  biopolimer  yang  paling  umum  digunakan  dalam  enkapsulasi. Keuntungannya adalah tidak toksik, murah, dan membentuk matriks gel untuk menjerap mikroba dengan larutan  CaCl2  [6].  Mikrokapsul  Alginat  berbentuk  pori  (porous),  maka  zat  aktif  didalamnya  dapat mengalami  kebocoran  (leakage)  [7].  Untuk  mencegah  kebocoran  maka  ditambahkan  kitosan  yang berfungsi sebagai penyalut. Kitosan merupakan hasil dari deasetilasi kitin, yang bersumber dari cangkang hewan vertebrata (dalam hal ini rajungan) [8].
Penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan  oleh  [9],  tentang  preparasi  mikrokapsul  kompleks alginat/kitosan/karboksimetil kitosan dan aplikasi dalam Lactobacillus casei ATCC 393, pada penelitian tersebut menggunakan kitosan 1% sebagai bahan pengapsul, variasi pH simulasi asam lambung yaitu 2,0; 3,0;  dan  6,5.  Diketahui  bahwa  kelangsungan  hidup  sel  yang  dienkapsulasi  secara  signifikan  lebih  baik daripada sel bebas setelah dilakuakn uji simulasi cairan asam lambung (pH 2,0) dan mikrokapsul alginat- kitosan-CMCS  dapat  melindungi Lactobacillus casei  terhadap  lingkungan  asam  secara  efektif. Sedangkan penelitian yang dilakukan oleh [10] tentang Mikroenkapsulasi Probiotik dan Prebiotik Dalam Kapsul  Alginat-Kitosan  untuk  Meningkatkan  Ketahanan  Hidup  dalam  Simulasi  Usus.  Dimana  pada penelitian  tersebut  menggunakan  kitosan  sebagai  bahan  penyalut  dari  mikrokapsul  alginat.  Upaya penyalutan  dari  mikrokapssul  alginat  ini  dilakuakan  karena Lactobacillus  gasseri yang  terjerap  oleh alginat  yang  telah  disalut  kitosan  mempunyai  viabilitas  yang  lebih  baik  dibandingkan  alginat  tanpa penyalutan  kitosan.  Hal  ini  terjadi  karena  kitosan  mempunyai  gugus  amin  bebas  bermuatan  positif sehingga  dapat  membentuk  membran  semipermeabel  pada  sekitar  polimer  bermuatan  negatif  seperti alginat.  Membran  yang  terbentuk  tidak  larut  dalam  pelarut  silang  alginat,  CaCl2  sehingga  dapat meningkatkan stabilitas gel dan membentuk penghalang pada pelepasan.
Ditinjau dari alasan tersebut, maka perlu dilakukan pembuatan enkapsulasi probiotik Lactobacillus sp.  menggunakan  dua  tahap  proses  serta  viabilitas  terhadap  viabilitas Lactobacillus sp.  dalam  simulasi cairan  asam  lambung.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  viabilitas  probiotik  yang  telah terenkapsulasi  dengan  matriks  alginat  dan  kitosan  terhadap  pengujian  dalam  simulasi  cairan  asam lambung.  Penelitian  ini  diharapkan  dapat  memberikan  informasi  ilmiah  mengenai  viabilitas  probiotik Lactobacillus sp. yang telah terenkapsulasi dengan matriks alginat dan kitosan terhadap pengujian dalam simulasi cairan asam lambung.

## 2. Metode Penelitian
Penelitian  ini  telah  dilaksanakan  di  Laboratorium  Loka  Penelitian  Teknologi  Bersih  -  Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bandung  dari Bulan Februari sampai Bulan Agustus 2020.  Metode yang digunakan pada penelitian ini yaitu eksperimental laboratorium dengan metode Total Plate Count (TPC). Prosedur Kerja 1. Inokulasi bakteri Lactobacillus sp .
Pada penelitian enkapsulasi probiotik Lactobacillus sp . menggunakan dua tahap proses dimulai dari inokulasi  bakteri Lactobacillus sp . Bakteri  dibuat  suspensi  dengan  beberapa  tahapan  sehingga  bakteri dapat  langsung  dilakukan  perhitungan  koloni  bakteri  sel  bebas  menggunakan  metode  dilusi  bertingkat sampai  pengenceran  10 10 dan  diinkubasi  dalam  suasana  asam  lambung  pada  suhu  37ºC  serta  dibuat enkapsulasi shell natrium  alginat  dan core berisi  bakteri  dan  kemudian beads probiotik  dengan shell natrium  alginat  yang  telah  terbentuk  dalam  larutan  CaCl 2 dimasukkan  ke  dalam  larutan  kitosan  yang berfungsi sebagai penyalut tambahan [9].
2. Enkapsulasi
Enkapsulasi  dilakukan  dengan  metode  ekstrusi  menggunakan  bahan  pengapsul  Na-alginat  dan Kitosan.  Kemudian  dilakukkan  perhitungan  koloni Lactobacillus sp.  yang  sudah  dienkapsulasi  dan diinkubasi dalam cairan simulasi asam lambung pH 1,2 dan pH 3 dengan variasi waktu 1 menit, 60 menit, dan 120 menit.
3. Total Plate Count (TPC)
Perhitungan koloni bakteri pada suspensi Lactobacillus sp. dilakukan dengan menggunakan metode TPC  ( Total  Plate  Count )  dimana  1  mL  suspensi Lactobacillus sp.  dimasukkan  ke  dalam  9  mL  larutan Peptone  0,1%  steril,  kemudian  dihomogenkan  dengan vortex ,  larutan  yang  telah  homogen  dipipet sebanyak 1 mL ke dalam cawan petri steril dan 1 mL ke dalam 9 mL larutan Peptone 0,1% steril sebagai pengenceran selanjutnya. Kemudian 1 mL larutan homogen yang berada dalam cawan petri ditambahkan dengan media MRS Agar lalu homogenkan sehingga bakteri dapat menyebar dalam cawan petri. Setelah itu cawan petri berisi MRS Agar dan larutan homogen diinkubasi pada suhu 37ºC selama 48 jam. Pada
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
perhitungan koloni bakteri ini dilakukan pengenceran dari 10 1 -10 9 dan didapatkan jumlah koloni bakteri sebanyak 5 x 10 10 cfu/mL.
Perhitungan bakteri menggunakan teknik pengujian total bakteri ( Total Plate Count) menggunakan media MRS (de Man-Rogasa-Sharpe), diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37ºC. Morfologi enkapsulasi probiotik  menggunakan  pengujian  SEM  ( Scanning  Electron  Microscophy ) serta  pengujian  total  bakteri dapat  diketahui  perbandingan  jumlah  koloni  bakteri  bebas  dan  bakteri  yang  dienkapsulasi  dan perbandingan asam lambung [9].
4. Uji Organoleptik
Untuk uji organoleptik dilakukan dengan cara melihat bentuk, warna dan bau.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Bakteri  asam  laktat  (BAL)  merupakan  sekelompok  bakteri  yang  dapat  memberikan  manfaat  bagi kesehatan. Lactobacillus sp. merupakan  genus  terbesar  dalam  bakteri  asam  laktat. Lactobacillus sp. merupakan bakteri gram positif, anaerob fakultatif, katalase-negatif, heterofermentatif, batang pembentuk non-spora,  dan  diisolasi  dari  banyak  habitat. Kultur  bakteri Lactobacillus sp.  diperoleh  dari  Loka Penelitian Teknologi Bersih LIPI Bandung.
Gambar 1. Hasil pengamatan Lactobacillus sp pada SEM dengan perbesaran 10.000x Sumber: Loka Penelitian Teknologi Bersih – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bandung
Berdasarkan Gambar  1 .  terlihat  bahwa Lactobacillus sp . berbentuk  batang  dengan  lebar  0,7-1,1 µm  dan  panjang  2.0-4.0  µm.  Suhu  optimum  untuk  pertumbuhan Lactobacillus adalah  pada  30-37°C. Lactobacillus sp. terdapat dalam flora normal di saluran cerna manusia, saluran kemih, mulut, dan vagina wanita. Lactobacillus merupakan pelindung dalam tubuh namun pada beberapa pasien dengan gangguan imunitas,  bakteri  ini  dapat  berubah  menjadi  patogen.  Beberapa  jurnal  telah  mempublikasikan  mengenai pasien  AIDS  ( Acquired  Immune  Deficiency  Syndrome ),  neutropenia,  dan  pasien  yang  telah  melakukan transplantasi  organ  mengalami  infeksi  yang  disebabkan  oleh Lactobacillus sp.  [11]. Lactobacillus sp. diperlukan  untuk  mempertahankan  kesehatan  saluran  cerna  dan tidak  dianggap  patogen  pada tubuh host [4]. Beberapa keuntungannya seperti mengurangi gejala diare, menstabilkan barier mukosa usus, sebagai anti  kanker  dan  mengurangi  gejala irritable  bowel  syndrome .  Bakteri  ini  terdapat  dalam  yoghurt,  keju, atau  produk  olahan  susu  lainnya  [12].  Diketahui  bahwa  bakteri  probiotik  tidak  tahan  terhadap  asam lambung dan untuk meningkatkan ketahanan hidup probiotik saat melewati asam lambung adalah dengan melakukan  teknik  enkapsulasi.  Metode  yang  dilakukan  ini  bertujuan  untuk  memenuhi  syarat  probiotik yang  ditetapkan  oleh  WHO/FAO  (2001)  yaitu  makanan  yang  dikonsumsi  mengandung  probiotik  harus mencapai usus dan dapat berkoloni di dalam usus serta mengandung kurang lebih 10 6 –10 7 cfu /g [13]. Metode ekstrusi merupakan metode yang digunakkan dalam pembuatan enkapsulasi Lactobacillus sp. menggunakan matriks kitosan. Enkapsulasi atau sering disebut penyalutan adalah proses pembentukan salut  dari  suatu  partikel  untuk  mencapai  target  yang  diinginkan,  seperti  imobilitas  atau  isolasi perlindungan  atau  stabilisasi,  pelepasan  terkontrol,  dan  perubahan  sifat  fisik  [14].  Enkapsulasi  probiotik telah diteliti sebelumnya yang bertujuan untuk meningkatkan kelangsungan hidup probiotik dalam produk makanan  dan  saluran  pencernaan  [15].  Enkapsulasi  bertujuan  untuk  menstabilkan  sel  yang  berpotensi untuk  meningkatkan  kelangsungan  dan  stabilitas  probiotik  selama  produksi,  penyimpanan,  dan penanganan  [11].  Bakteri  probiotik  yang  dienkapsulasi  dapat  meningkatkan  viabilitasnya  dibandingkan dengan sel bebas tanpa enkapsulasi [16].
Pada proses enkapsulasi metode yang digunakan adalah metode ekstrusi dan metode gelasi ionik. Pemilihan metode ekstrusi bertujuan untuk menghindari suhu ekstrim saat proses enkapsulasi yang dapat
mengakibatkan  kurangnya  jumlah  ataupun  viabilitas  bakteri.  Alasan  pemilihan  metode  ekstrusi  yaitu karena  selain  alat  yang  digunakkan  sederhana  (jarum  suntik),  metode  ekstrusi  juga  dapat  menghindari kerusakan  yang  diakibatkan  oleh  suhu  tinggi  dan  tekanan  yang  ekstrim  pada  metode spray  drying [17]. Sementara  itu,  metode  gelasi  ionik  dipilih  karena  prosesnya  yang  sederhana,  tidak  menggunkan  pelarut organik, dan dapat dikontrol dengan mudah [18].
Proses  yang  dilakukan  pada  metode  ekstrusi  yaitu  larutan  Natrium  Alginat  yang  telah  disiapkan kemudian ditambahkan suspensi bakteri selanjutnya campuran tersebut di masukkan ke dalam syringe lalu dengan  menggunakan  jarum  dan  bantuan pump sehingga  campuran  jatuh  ke  dalam  larutan  CaCl 2 yang berfungsi  sebagai  larutan  pengeras/pembentuk  gel  [19].  Setelah  mikrokapsul  jatuh  ke  dalam  larutan pengeras,  mikrokapsul  direndam  di  dalamnya  dan  diaduk  selama  30  menit,  setelah  itu  mikrokapsul disaring  dengan  menggunakan  kertas  saring Whatman No.40  didalam Lmainar  Air  Flow (LAF)  secara aseptik, setelah mikrokapsul tersaring kemudian dibilas mikrokapsul menggunakan aquadest steril. Hal ini bertujuan  agar  mikrokapsul  tidak  melekat  satu  sama  lain  kemudian  mikrokapsul  ditimbang  untuk mengetahui  dari  penyalutan  matrik  kitosan  pada  tahap  berikutnya.  Mikrokapsul  yang  telah  ditimbang kemudian  dimasukkan  ke  dalam  wadah  berisi  kitosan  kemudian  mulut  wadah  tersebut  ditutup  dengan Aluminium  foil dan  diaduk  selama  15  menit.  Apabila  proses  penyalutan  dengan  kitosan  telah  selesai kemudian  mikrokapsul  disaring  dan  dibilas  kembali  menggunakan  aquadest  steril  lalu  ditimbang  untuk memperoleh berat akhir dari proses penyalutan tersebut.
Pengaruh  penyalutan  dua  jenis  penyalutan  (enkapsulasi)  pada  bakteri  probiotik  lebih  mampu mempertahankan  bakteri  probiotik  dibandingkan  bakteri  yang  tidak  disalut  oleh  penyalut  kitosan  [20]. Terdapat  beberapa  faktor  yang  dapat  mempengaruhi  keberhasilan  proses  enkapsulasi  seperti  sifat  fisiko kimia  bahan inti  dan  bahan  penyalut,  serta tahapan  dalam  enkapsulasi  [21].  Syarat  bahan  penyalut  yang digunakan untuk enkapsulasi harus dapat memberikan suatu lapisan tipis yang melekat dengan bahan inti, dapat bercampur secara kimia dan tidak bereaksi dengan bahan inti. Proses enkapsulasi dilakukan terhadap bakteri  kandidat  probiotik  berlapis  kitosan  menggunakan  alginat.  Alasan  menggunakan  kedua  bahan tersebut  karena  alginat  termasuk  hidrokoloid  alami,  telah  dilaporkan  pada  beberapa  penelitian  bahwa enkapsulasi  menggunakan  alginat  dapat  mempertahankan  viabilitas  probiotik  dalam  produk  makanan asam  selama  proses  penyimpanan  dengan  suhu  dingin  [22].  Sedangkan  pemilihan  kitosan  dikarenakan biopolimer alami yang  ketersediaan di alam sangat melimpah, selain itu kitosan merupakan polisakarida yang  dihasilkan  dari  deasetilasi  kitin  [23].    Beberapa  keuntungan  dari  penggunaan  kitosan  seperti antimikroba,  sukar  larut  dalam  air,  murah,  dan  sering  digunakan  sebagai  penyalut beads untuk meningkatkan  stabilitasnya  [24].  Enkapsulasi Lactobacillus sp.  yang  telah  dihasilkan  kemudian dimasukkan ke dalam plastik zipper dan di dalam lemari pendingin dengan suhu 4ºC dengan tujuan suhu yang rendah dapat menurunkan reaksi kimia yang merugikan [25].
Tabel 1. Hasil uji organoleptik enkapsulasi lactobacillus sp. menggunakan matriks kitosan
Konsentrasi Organoleptis Kitosan Bentuk Warna Bau 1,2% Bulat sempurna Putih Tidak berbau 1,6% Bulat sempurna Putih Tidak berbau 2% Bulat sempurna Putih Tidak berbau Sumber: Loka Penelitian Teknologi Bersih – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bandung
(i) (ii)
(iii)
Gambar 2. Enkapsulasi Lactobacillus sp. menggunakan matriks kitosan: (a) 1,2%; (b) 1,6%; dan (c) 2%. Sumber: Loka Penelitian Teknologi Bersih – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bandung
a b c
Berdasarkan Tabel  1 dan Gambar  2 dapat  diketahui  bahwa  uji  organoleptik  dari  enkapsulasi Lactobacillus sp. yang dihasilkan dari ketiga konsentrasi kitosan (1,2%; 1,6%; dan 2%) memiliki bentuk bulat  dengan  permukaan  yang  lembut  dan  halus  ketika  diraba  oleh  tangan,  berwarna  putih,  dan  tidak berbau.  Karakteristik  dari  mikrokapsul  yang  dihasilkan  ditentukan  oleh  jenis  dan  komposisi  biopolimer yang  digunakan  dalam  proses  enkapsulasi  akan  mempengaruhi  diameter  dan  bentuk  mikrokapsul  yang dihasilkan.  Selain  itu,  komposisi  biopolimer  juga  akan  mempengaruhi  viabilitas  probiotik  yang dienkapsulasi [26] (Sandoval-Castilla O). Pada studi Swelling menunjukkan bahwa mikrokapsul alginat dan  kitosan  dengan  daya swelling yang  rendah  tidak  terjadi  pengikisan  pada  media  lambung  yang disimulasikan. Hal tersebut terjadi karena terkait adanya ionisasi polielektrolit antara alginat dan kitosan. Pada  tingkat  keasaman  mendekati  pH  1,  kitosan  terprotonasi,  gugus  aminonya  tetap  sebagai  NH 3+ ,  dan alginat  memiliki  gugus  karboksilat  yang  tidak  terionisasi,  sebagai  COO-  dan  menunjukkan kecenderungan  mengendap.  Sifat  ini  yang  dapat  menyebabkan  struktur  menjadi  tertutup,  menghasilkan kontrol yang lebih kuat pada pelepasan obat dalam media asam [27].
Uji  viabilitas Lactobacillus sp.  hasil  enkapsulasi  bertujuan  untuk  mengetahui  keberhasilan  dari pembuatan  enkapsulasi Lactobacillus sp.  menggunakan  matriks  kitosan  dengan  menggunakna  metode TPC  ( Total  Plate  Count ).  Metode  TPC  ( Totral  Plate  Count) merupakan  metode  yang  digunakan  untuk menghitung  jumlah  bakteri  pada  sampel  yang  akan  dilakukan  pengujian.  Jumlah  mikroorganisme  pada sampel yang diperoleh dengan metode ini adalah gambaran populasi, karena tidak semua mikroorganisme dapat  tumbuh  dalam  media  MRS  Agar  dan  kondisi  inkubasi  yang  diterapkan  [28].  Hasil  perhitungan Lactobacillus sp dapat dilihat pada Tabel 2 .
Tabel 2. Perhitungan Lactobacillus sp. Hasil Enkapsulasi Matriks Kitosan
Konsentrasi Free call Lactobacillus sp. Lactobacillus sp. Kitosan (cfu/mL) Hasil Enkapsulasi (cfu/g) 1,2% 5 x 10 10 0,6 x 10 8 1,6% 5 x 10 10 1,6 x 10 8 2% 5 x 10 10 3,3 x 10 8
Sumber: Loka Penelitian Teknologi Bersih – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bandung
Berdasarkan Tabel 2 terlihat bahwa hasil perhitungan jumlah koloni bakteri setelah dienkapsulasi, yaitu berturut-turut dari konsentrasi 1,2%; 1,6%; dan 2% adalah 0,6 x 10 8 cfu/g; 1,6 x 10 9 cfu/g; dan 3,3 x 10 8 cfu/g.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  tidak  terjadi  penurunan  jumlah  koloni  yang  signifikan  antara suspensi  bakteri  bebas  dengan  mikrokapsul  hasil  enkapsulasi  menggunakan  matriks  kitosan,  sehingga mikrokapsul  daapat  diuji  viabilitas  dan  survivabilitas  pada  kondisi  lingkungan  yang  ekstrim  yaitu simulasi  cairan  asam  lambung  (NaCl  0,2%  pH  1,2  dan  3)  dengan  waktu  inkubasi  selama  1  menit,  60 menit, dan 120 menit. Jumlah koloni bakteri awal sebelum dilakukan enkapsulasi adalah 5 x 10 10 cfu/mL untuk seluruh perlakuan konsentrasi kitosan (1,2%; 1,6%; dan 2%).
Enkapsulasi adalah salah satu metode yang dapat digunakan untuk meningkatkan viabilitas bakteri probiotik.  Merujuk  pada    D’Orazio,  (2015)  [29]  jumlah  bakteri  dihitung  menggunakan  metode  TPC ( Total  Plate  Count ).  Jumlah  koloni  yang  diperoleh  dinyatakan  dengan  CFU  ( Coloning  Forming  Unit) [27]. Buffered  Peptone  Water (BPW)  0,1%  merupakan  larutan  pengencer  yang  berfungsi  untuk mengencerkan  media.  Natrium  sitrat  1%  merupakan  larutan  simulasi  usus  yang  berfungsi  membuka penyalutan  bakteri,  sehingga  dapat  dibuktikan  apakah  dengan  adanya  penyalutan  dapat  memperlambat dan  atau  mempertahankan  jumlah  koloni  bakteri  yang  seharusnya  tetap  saat  berada  dalam  kondisi ekstrim.
Tabel  2 juga  menunjukkan  penggunaan  suspensi  bakteri  untuk  enkapsulasi Lactobacillus sp. dengan  matriks  kitosan  berbeda.  Hal  ini  dikarenakan kendala teknis  dalam  pembuatan  mikrokapsul  dan juga  umur  simpan suspensi  bakteri bebas tidak  dapat bertahan  lama  meskipun  disimpan  didalam  lemari pendingin dengan suhu 4ºC. Jumlah bakteri dari free cell yang digunakan dalam proses enkapsulasi akan sangat  mempengaruhi  jumlah  bakteri  awal  yang  digunakan,  maka  akan  terserap  ke  dalam  polimer. Sehingga  viabilitas  bakteri  setelah  proses  enkapsulasi  akan  tetap  terjaga  dan  bakteri  tersebut  dapat memberikan manfaat bagi kesehatan, yaitu antara 10 6 -10 8 cfu/mL [13].
Ketika probiotik berhasil terenkapsulasi, penting untuk mengamatinya pada dua kondisi yaitu pada cairan lambung dan usus halus simulasi. Sebagian besar penelitian in vitro mengenai viabilitas probiotik terenkapsulasi  menyarankan  menggunakan Buffered  Peptone  Water (BPW)  sebagai  sumber  makanan yang dapat mempertahankan integritas dan viabilitas sel [11]. Sementara untuk pH menggunakan larutan Natrium Klorida (NaCl) diatur pada kondisi 1-3, nilai ini merupakan kisaran pH yang umumnya diamati pada lambung manusia [30].
Pengujian  viabilitas  mikrokapsul  untuk  hasil  enkapsulasi  dengan  matriks  kitosan  dalam  simulasi cairan  asam  lambung  dan  usus  halus  dilakukan  variasi  terhadap  waktu  dan  konsentrasi  cairan  asam lambung.  Waktu  inkubasi  mikrokapsul  di  dalam  simulasi  cairan  asam  lambung  berlangsung  selama  1 menit,  60  menit,  dan  120  menit,  sedangkan  konsentrasi  simulasi  cairan  asam  lambung  yang  digunakan yaitu pada derajat keasaman pH 1,2 dan 3. Setelah mikrokapsul melalui proses inkubasi selama 1 menit, 60  menit  dan  120  menit  pada  larutan  simulasi  yang  telah  ditentukan,  kemudian  mikrokapsul  direndam kembali  dalam  simulasi  larutan  garam  empedu  sambil  diaduk  sampai  mikrokapsul  hancur,  selanjutnya disuspensikan  ke  dalam  larutan  peptone  0,1%  dan  dilakukan  pengenceran  bertingkat  untuk  dihitung jumlah  koloni  bakteri  dengan  metode  TPC  ( Total  Plate  Count )  [29].  Setelah  dilakukan  pengujian didapatkan hasil bahwa mikrokapsul hanya bisa tumbuh stabil dalam simulasi cairan asam lambung pH 3, sedangkan pada pH 1,2 terjadi penurunan pertumbuhan seperti yang terlihat pada Tabel 3 dan Tabel 4 .
Tabel 3. Jumlah koloni bakteri pada free cell dan koloni bakteri setelah proses enkapsulasi dengan variasi waktu inkubasi dalam simulasi cairan asam lambung pH 3 pH 3 Konsentrasi Free cell Mikrokapsul Kitosan 1’ 60’ 120’ 1’ 60’ 120’ Cfu/mL Cfu/mL Cfu/mL Cfu/gr Cfu/gr Cfu/gr 1,2% 7 x 10 8 2 x 10 5 2 x 10 4 1 x 10 8 5 x 10 7 4,3 x 10 3 1,6% 7 x 10 8 2 x 10 5 2 x 10 4 2 x 10 8 24 x 10 7 5,3 x 10 5 2% 7 x 10 8 2 x 10 5 2 x 10 4 3 x 10 8 24 x 10 7 26 x 10 6
Sumber: Loka Penelitian Teknologi Bersih – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bandung
Tabel 4. Jumlah koloni bakteri pada free cell dan koloni bakteri setelah proses enkapsulasi dengan variasi waktu inkubasi dalam simulasi cairan asam lambung pH 1,2 pH 1,2 Konsentrasi Free cell Mikrokapsul Kitosan 1’ 60’ 120’ 1’ 60’ 120’ Cfu/mL Cfu/mL Cfu/mL Cfu/gr Cfu/gr Cfu/gr 1,2% 0 0 0 6 x 10 7 0 0 1,6% 0 0 0 4 x 10 7 3,6 x 10 3 0 2% 0 0 0 1 x 10 7 2,6 x 10 5 0,6 x 10 5
Sumber: Loka Penelitian Teknologi Bersih – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bandung
Berdasarkan Tabel 3 bakteri Lactobacillus sp. terenkapsulasi cenderung memiliki ketahanan yang lebih baik dibandungkan dengan free cell setelah dilakuakan uji pada simulasi cairan asam lambung pH 3 dengan  nilai  awal  koloni  berturut-turut  dengan  lama  inkubasi  1  menit,  60  menit,  120  menit  7  x  10 8 cfu/mL, 2 x 10 5 cfu/mL dan 2 x 10 4 cfu/mL, sedangkan untuk simulasi cairan asam lambung pH 1,2 pada Tabel  4 dengan  lama  inkubasi  1  menit,  60  menit  dan  120  menit tidak  terjadi  pertumbuhan  koloni  pada free  cell .  Hal  ini  disebabkan  bakteri Lactobacillus sp . tidak  tahan  terhadap  kondisi  ekstrim.  Lamanya waktu inkubasi yang dilakukan dalam simulasi cairan asam lambung pH 3 dan pada simulasi cairan asam lambung  pH  1,2  terjadi  penurunan  yang  sangat  signifikan  untuk  mikrokapsul  yang  tersalut  oleh  kitosan dengan konsentrasi 1,2% dan 1,6%, sedangkan untuk penyalutan kitosan konsentrasi 2% dapat bertahan hidup dengan inkubasi selama 120 menit dengan jumlah 0,6 x 10 5 cfu/gram. Sehingga dapat diasumsikan bahwa probiotik yang terenkapsulasi berada dalam range standar yang telah ditentukan oleh FAO/WHO, 2001  nilai  minimum  yang  harus  dipenuhi  sekitar  10 6 -10 7 Cfu/gram  bakteri  dalam  sediaan  probiotik  [5]. Hal  tersebut  sesuai  dengan  bahwa  enkapsulasi  bertujuan  untuk  melindungi  bakteri  dari  faktor-faktor berbahaya bagi bakteri [10].
Semakin  besar  persentase  dan  berat  molekul  kitosan  yang  digunakan  untuk  mengenkapsulasi probiotik semakin lambat proses pelepasan sel bakteri seperti yang terlihat pada Tabel  3 bahwa jumlah bakteri Lactobacillus sp.  hasil  enkapsulasi  yang  memliki  ketahanan  optimum  adalah  penyalutan menggunakan  matriks  kitosan  dengan  konsentrasi  2%  mengalami  penurunan  yang  sangat  kecil  dalam waktu inkubasi 1 menit, 60 menit dan 120 menit berturut-turut dengan nilai 3 x 10 8 cfu/g; 24 x 10 7 cfu/g; dan 26 x 10 6 dalam simulasi cairan asam lambung pH 3. Hal ini sesuai dengan teori tersebut [31] Probiotik yang masuk ke dalam saluran cerna akan mengalami penurunan jumlah yang disebabkan oleh  paparan  pada  tingkat  keasaman  yang  tinggi,  garam  empedu,  enzim  dan  pergerakan  saluran  cerna. Hasil  dari  proses  enkapsulasi  dapat  dikatakan  berhasil  apabila  bahan  yang  dienkapsulasi  memiliki viabilitas sel yang relatif tinggi dan memiliki sifat-sifat fisiologis yang relatif sama sebelum dienkapsulasi
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
[32].  Bakteri Lactobacillus sp.  yang  telah  terenkapsulasi  kemudian  dilakukan  uji  simulasi  cairan  asam lambung pada pH 3 dapat meningkatkan survivabilitas bakteri Lactobacillus sp., grafik % survivabilitas dan  viabilitas  (log  cfu).  Semakin  lama  waktu  inkubasi  berpengaruh  pada  penurunan  survivabilitas Lactobacillus sp. menurut [33]. Mikroenkapsulasi probiotik yang dienkapsulasi menggunakan alginat dan penyalutan  kitosan  dapat  meningkatkan  viabilitas Lactobacillus sp.  dan  B .bifidium pada  kondisi  cairan gastrointestinal, hasil penelitian menunjukkan hal yang sama dengan teori tersebut.
Enkapsulasi probiotik terbukti dapat mempertahankan viabilitas probiotik, dengan cara melindungi sel  probiotik  dari  kondisi  yang  merugikan  kemudian  mengurangi  penurunan  jumlah  probiotik  [34]. Bakteri  probiotik  yang  jumlahnya  diatas  10 7 cfu/mL  memiliki  efek  menguntungkan  bagi  kesehatan manusia  diantaranya  dapat  meningkatkan  ketahanan  tubuh  terhadap  penyakit  terutama  infeksi  usus  dan diare,  meningkatkan  imunitas  tubuh  dalam  proses  pencernaan,  dan  juga  dapat  mencegah  kanker  usus besar [35]. Mikroba seperti probiotik sangat diperlukan dalam saluran cerna, hal ini dikarenakan proses fermentasi yang disebabkan adanya mikroba ini melibatkan vitamin K dan biotin [36].
Uji foto SEM ( Scanning Electron Microscophy) dilakukan untuk mengetahui bentuk morfologi dari bakteri Lactobacillus  sp hasil  enkapsulasi  sebagai  kontrol  yang  kemudian  dibandingkan  dengan  bakteri Lactobacillus sp hasil enkapsulasi yang telah direndam dalam simulasi cairan asam lambung pada pH 1,2 dan 3 dengan waktu inkubasi 1 menit, 60 menit dan 120 menit. Uji foto SEM dilakukan pada konsentrasi kitosan 2% yang merupakan konsentrasi yang dapat mempertahankan bakteri karena penurunan viabilitas yang terjadi sangat sedikit.
Gambar 3. Uji foto SEM mikrokapsul hasil enkapsulasi pada perbesaran 50x dan 80x: (a) Mikrokapsul Tanpa Diinkubasi dalam Simulasi Cairan Asam Lambung; (b)Mikrokapsul Diinkubasi selama 120 menit dalam Simulasi Cairan Asam Lambung pH 3; (c)Mikrokapsul Diinkubasi selama 120 menit dalam Simulasi Cairan Asam Lambung pH 1,2.
Sumber: Loka Penelitian Teknologi Bersih – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bandung
Berdasarkan Gambar 3 dari hasil analisa SEM dapat diketahui bahwa ukuran partikel mikrokapsul Lactobacillus sp.  dengan  konsentrasi  kitosan  2%  memiliki  ukuran  yang  berbeda-beda,  dimana  diameter untuk  setiap  manik  yang  diambil  secara  acak  berukuran  839,4  μm  sampai  1,395  μm  jika  diamati  pada perbesaran  50x  dan  80x.  Besar  kecilnya  ukuran  diameter  enkapsulasi  berpengaruh  pada  kemampuan matrik  melindungi  bakteri  yang  berada  didalamnya.  Ukuran  enkapsulasi  yang  lebih  besar  (2-4  mm) dengan  teknik  ekstrusi  dapat  melindungi  bakteri Lactobacillus  reuteri dibandingkan  dengan  ukuran enkapsulasi 20-1000 μm [29].
Gambar 4. Uji foto SEM mikrokapsul hasil enkapsulasi pada perbesaran 1000x: (a) Mikrokapsul Tanpa Diinkubasi dalam Simulasi Cairan Asam Lambung; (b) Mikrokapsul Diinkubasi selama 120 menit dalam Simulasi Cairan Asam Lambung pH 3, (c) Mikrokapsul Diinkubasi selama 120 menit dalam Simulasi Cairan Asam Lambung pH 1,2 Sumber: Loka Penelitian Teknologi Bersih – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bandung
a b
c a b c
Pada perbesaran 1000x dari hasil analisa SEM terlihat bahwa bahan pengapsul (alginat dan kitosan) mengalami  pengerutan  yang  disebabkan  oleh  simulasi  cairan  asam  lambung,  sehingga  muncul  ikatan hidrogen yang lebih kuat dan struktur dari bahan pengapsul menjadi rapat. Pada Gambar 4 (a) terdapat rongga  dan  serat-serat  kasar  diantara  lapisan-lapisannya,  sedangkan Gambar  4  (b) ,  dan Gambar  4  (c) terlihat lapisan-lapisan tersebut menjadi lebih rapat.
Gambar 5. Uji foto SEM mikrokapsul hasil enkapsulasi pada perbesaran 9000x : (a) Mikrokapsul Tanpa Diinkubasi dalam Simulasi Cairan Asam Lambung; (b)Mikrokapsul Diinkubasi selama 120 menit dalam Simulasi Cairan Asam Lambung pH 3; (c) Mikrokapsul Diinkubasi selama 120 menit dalam Simulasi Cairan Asam Lambung pH 1,2.
Sumber: Loka Penelitian Teknologi Bersih – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bandung
Pada  perbesaran  9000x  hasil  analisa  SEM  seperti  terlihat  pada Gambar  5 terlihat  bentuk  dari bakteri Lactobacillus sp. yang terlindungi oleh bahan penyalut yaitu kitosan. Pada Gambar 5 (a) terlihat bentuk dari Lactobacillus sp. dengan bentuk batang, Gambar 5 (b) terlihat koloni bakteri Lactobacillus sp . yang  terlapisi  kitosan  dan  pada Gambar  5  (c) terlihat  bahwa  bakteri Lactobacillus sp . sudah  tidak terlindungi  lagi  oleh  bahan  penyalut.  Hal  ini  sesuai  dengan  uji  viabilitas  bakteri  hasil  enkapsulasi  pada simulasi  cairan  asam  lambung  dengan  pH  1,2  bahwa  tidak  didapati  pertumbuhan  koloni  bakteri  pada media MRS Agar karena bakteri sudah dalam keadaan bebas tidak ada lapisan yang melindunginya dari paparan kondisi ekstrim.
Sampel  diuji  menggunakan  SEM  ( Scanning  Electron  Microscopy) diharuskan  dalam  keadaan konduktif agar berkas sinar elektron yang ditembakkan dapat diserap oleh sampel dimana sinar elektron akan  terhubung  dengan  amplifier  yang  menghasilkan  gambar  pada  monitor.  Sedangkan  manik  hasil enkapsulasi  bersifat  non  konduktif  sehingga  harus  dilakukan coating menggunakan  emas  murni  99,9% untuk  mencapai  keadaan  konduktif.  Pada  saat  uji  SEM  kondisi  ruang  didalamnya  harus  dalam  keadaan vakum sehingga elektron dapat bergerak bebas dan menghasilkan gambar yang jelas pada monitor.

## 4. Kesimpulan
Kitosan  dengan  konsentrasi  1,2%;  1,6%;  dan  2%  efektif  dapat  digunakan  sebagai  matriks  dalam proses enkapsulasi bakteri Lactobacillus sp dengan nilai viabilitas masing-masing 0,6 x10 8 cfu/g; 1,6 x10 8 cfu/g;  dan  3,3x10 8 cfu/g.  Setelah  dilakukan  uji  viabilitas  probiotik  terenkapsulasi  dalam  simulasi  cairan asam lambung pH 1,2 dan 3 dengan waktu inkubasi 1 menit, 60 menit dan 120 menit, didapati konsentrasi penyalut  yang  dapat  mempertahankan  viabilitas  dalam  enkapsulasi  adalah  kitosan  2%  dengan  nilai viabilitas berturut-turut 1 x 10 6 cfu/g; 2 x 10 5 cfu/g; 0,6 x 10 5 cfu/g; dan 3 x 10 8 cfu/g; 24 x 10 7 cfu/g; 26 x 10 6 cfu/g.  Semakin  lama  waktu  inkubasi  akan  mengurangi  viabilitas  bakteri Lactobacillus sp . Pada  uji viabilitas bakteri terenkapsulasi dalam simulasi cairan asam lambung pH 1,2 probiotik Lactobacillus sp masih bertahan hidup dengan waktu inkubasi 120 menit.
Hasil yang diperoleh dari uji foto SEM mikrokapsul pada konsentrasi kitosan 2%  tanpa diinkubasi dalam  simulasi  cairan  asam  lambung  dan  diinkubasi  selama  120  menit  dalam  Simulasi  Cairan  Asam Lambung pH 1,2 dan pH 3 diameter untuk setiap manik yang diambil secara acak berukuran 839,4 μm sampai  1,395  μm  jika  diamati  pada  perbesaran  50x  dan  80x.  Semakin  asam  kondisi  lingkungan  maka semakin rapat pula lapisan-lapisan bahan pengapsul yang digunakan, sehingga dapat mendorong bakteri keluar dari manik seperti yang terjadi pada simulasi cairan asam lambung pH 1,2 dengan waktu inkubasi 120 menit.

## 5. Saran
Dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  mengenai  alat  yang  dapat  digunakan  dalam  teknik  ekstrusi sehingga  didapatkan  bentuk  manik  yang  lebih  seragam.  Perlu  adanya  penelitian  lebih  lanjut  mengenai
a b c
ketahanan  bakteri  dalam  cairan simulasi  asam  lambung  dan  usus  halus  untuk  melihat  ketahanan  bakteri tersebut dalam kondisi yang lebih mirip dengan kondisi saluran pencernaan.

## 6. Referensi
[1] Pato U. Potensi Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Dadih untuk Menurunkan Resiko Penyakit Kanker.  Potensi  Bakteri  Asam  Laktat  yang  Diisolasi  dari  Dadih  untuk  Menurunkan  Resiko Penyakit Kanker. 2017; 24(1):1–8.
[2] Kechagia,  M.,  Basoulis,  D.,  Konstantopoulou,  S.,  Dimitriadi,  D.,  Gyftopoulou,  K.,  Skarmoutsou, N.,  &  Fakiri,  E.  M.  (2013). Health  Benefits  of  Probiotics:  A  Review.  ISRN  Nutrition,  2013,  1– 7. doi:10.5402/2013/481651
[3] Osman  Gul  and  Muhammet  Dervisoglu.  (2020).  European  Food  Science  and  Engineering. Optimization  of  spray  drying  conditions  for  microencapsulation  of  Lactobacillus  casei  Shirota using response surface methodology. 1 (1), 1-8 https://dergipark.org.tr/tr/pub/efse
[4] Del  Piano  M,  Carmagnola  S,  Ballarè  M,  Sartori  M,  Orsello  M,  Balzarini  M,  et  al.  Is microencapsulation the future of probiotic preparations? the increased efficacy of gastro-protected probiotics. Gut Microbes. 2011;2(2):120–3.
[5] Setijawati D, Firdaus M, Kartikaningsih K. The Effect of Lactobacillus Acidophilus Microcapsule Which  Encapsulated  by  Kappa  Caragenan  Toward  in  Vivo  Functional  Test.  Res  J  Life  Sci. 2014;1(1):27–36.
[6] Cook  MT,  Tzortzis  G,  Khutoryanskiy  V  V.,  Charalampopoulos  D.  Layer-by-layer  coating  of alginate  matrices  with  chitosan-alginate  for  the  improved  survival  and  targeted  delivery  of probiotic bacteria after oral administration. J Mater Chem B. 2013;1(1):52–60.
[7] Westman, J. O., Ylitervo, P., Franzén, C. J., & Taherzadeh, M. J. (2012). Effects of encapsulation of  microorganisms  on  product  formation  during  microbial  fermentations.  Applied  Microbiology and Biotechnology, 96(6), 1441–1454. doi:10.1007/s00253-012-4517-y
[8] Praveen,  R.,  Prasad  Verma,  P.  R.,  Venkatesan,  J.,  Yoon,  D.-H.,  Kim,  S.-K.,  &  Singh,  S.  K. (2017). In  vitro  and  in  vivo  evaluation  of  gastro-retentive  carvedilol  loaded  chitosan  beads  using Gastroplus™. International Journal of Biological Macromolecules, 102, 642–
650. doi:10.1016/j.ijbiomac.2017.04.067
[9] Li  XY,  Chen  XG,  Sun  ZW,  Park  HJ,  Cha  DS.  Preparation  of  alginate/chitosan/carboxymethyl chitosan  complex  microcapsules  and  application  in  Lactobacillus  casei  ATCC  393.  Carbohydr Polym [Internet]. 2011;83(4):1479–85.
Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2010.09.053
[10]  Chávarri M, Marañón I, Ares R, Ibáñez FC, Marzo F, Villarán M del C. Microencapsulation of a probiotic  and  prebiotic  in  alginate-chitosan  capsules  improves  survival  in  simulated  gastro- intestinal  conditions.  Int  J  Food  Microbiol  [Internet].  2010;142(1–2):185–9.  Available  from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2010.06.022
[11]  Gbassi GK, Vandamme T. Probiotic encapsulation technology: From microencapsulation to release into the gut. Pharmaceutics. 2012;4(1):149–63.
[12]  Amila  Sholihat,  Amila  Gadri,  Gita  Cahya  Eka  Darma.  Optimasi  Kadar  Konsentrat  Likopen Terenkapsulasi Penyalut Alginat dan Kitosan. 2016;
[13]  Bielecka M. Probiotics in food. Chem Funct Prop Food Components, Third Ed. 2006;413-26.
[14]  Chan ES, Wong SL, Lee PP, Lee JS, Ti TB, Zhang Z, et al. Effects of starch filler on the physical properties of lyophilized calcium-alginate beads and the viability of encapsulated cells. Carbohydr Polym [Internet]. 2011;83(1):225–32.
Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2010.07.044
[15]  Gina  Kholisoh.  Uji  Viabilitas  Enkapsulasi Lactobacillus  casei Menggunakan  Matriks  Kappa Karagenan Terhadap Simulasi Cairan Asam Lambung. Skripsi. 2016;
[16]  Afzaal, M., Saeed, F., Arshad, M. U., Nadeem, M. T., Saeed, M., & Tufail, T. (2018). The Effect of Encapsulation on The Stability of Probiotic Bacteria in Ice Cream and Simulated Gastrointestinal Conditions. Probiotics and Antimicrobial Proteins. doi:10.1007/s12602-018-9485-9.
[17]  Carlos Pasqualin Cavalheiro, Mariana de Araújo Etchepare, Maria Fernanda da Silveira Cáceres de Menezes, Cristiano Ragagnin de Menezes, e Leadir Lucy Martins Fries. (2015). Encapsulation: an alternative  for  application  of  probiotic  microorganisms  in  thermally  processed  foods.  Doi: 10.5902/2179-460X19717
[18]  Mardliyati  E,  Muttaqien  S  El,  Setyawati  DR.  Sintesis  Nanopartikel  Kitosan-  Trypoly  Phosphate Dengan  Metode  Gelasi  Ionik :  Pengaruh  Konsentrasi  Dan  Rasio  Volume  Terhadap  Karakteristik Partikel. Pros Pertem Ilm Ilmu Pengetah dan Teknol Bahan. 2012;90–3.
[19]  Rokka  S,  Rantamäki  P.  Protecting  probiotic  bacteria  by  microencapsulation:  Challenges  for industrial applications. Eur Food Res Technol. 2010;231(1):1–12.
[20]  Priyanka  Singh,  Pinki  Saini,Shreyasi  Dubey,  Urvashi  Srivastava.  (2020).  Microencapsulation  of Probiotic by Exopolysaccharides-sodium Alginate dan Evaluation of their Survival in Simulated GI Conditions. Doi: 10.2174/1573401316666200123095452
[21]  Solanki  HK,  Pawar  DD,  Shah  DA,  Prajapati  VD,  Jani  GK,  Mulla  AM,  et  al.  Development  of microencapsulation  delivery  system  for  long-term  preservation  of  probiotics  as  biotherapeutics agent. Biomed Res Int. 2013;2013.
[22]  Rosburg, V., Boylston, T., & White, P. (2010). Viability of Bifidobacteria Strains in Yogurt with Added  Oat  Beta-Glucan  and  Corn  Starch  during  Cold  Storage.  Journal  of  Food  Science,  no– no. doi:10.1111/j.1750-3841.2010.01620.x
[23]  Ayumi,  D.  2018.  Pembuatan  Dan  Karakterisasi  Nanopartikel  Ekstrak  Etanol  Daun  Ekor  Naga (Rhaphidophora  pinnata (L.f.)  Schott)  Menggunakan  Metode  Gelasi  Ionik  [skripsi].  Fakultas Farmasi USU, Medan.
[24]  Mannuela,  Novella.  2016.  Preparasi  dan  Evaluasi  Nanodroplet  Azitromisin  Kitosan  dan  Uji Aktivitas  Antibakteri  Terhadap  Propionibacterium  acnes.  [skripsi].  Fakultas  Kedokteran Universitas Tanjungpura.
[25]  Heidebach T,  Först  P,  Kulozik  U.  Influence  of casein-based  microencapsulation  on  freeze-drying and  storage  of  probiotic  cells.  J  Food  Eng  [Internet].  2010;98(3):309–16.  Available  from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2010.01.003
[26]  Sandoval-Castilla  O,  Lobato-Calleros  C,  García-Galindo  HS,  Alvarez-Ramírez  J,  Vernon-Carter EJ.  Textural  properties  of  alginate-pectin  beads  and  survivability  of  entrapped  Lb.  casei  in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt.
2010;43(1):111-117
DOI: 10.1016/j.foodres.2009.09.010
[27]  Lucinda-Silva RM, Salgado HRN, Evangelista RC. Alginate-chitosan systems: In vitro controlled release of triamcinolone and in vivo gastrointestinal transit. Carbohydr Polym. 2010;81(2):260–8.
[28]  Tim Sandle. 2016. Pharmaceutical Microbiology. ISBN 9781907568381
[29]  D’Orazio, G., Di Gennaro, P., Boccarusso, M., Presti, I., Bizzaro, G., Giardina, S., … La Ferla, B. (2015). Microencapsulation  of  new  probiotic  formulations  for  gastrointestinal  delivery:  in  vitro study  to  assess  viability  and  biological  properties.  Applied  Microbiology  and  Biotechnology, 99(22), 9779–9789. doi:10.1007/s00253-015-6853-1
[30]  Shah,  N.,  Shah,  T.,  &  Amin,  A.  (2011).  Polysaccharides:  a  targeting  strategy  for  colonic  drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery, 8(6), 779–796. doi:10.1517/17425247.2011.574121
[31]  Calinescu,  C.,  Mondovi,  B.,  Federico,  R.,  Ispas-Szabo,  P.,  &  Mateescu,  M.  A. (2012). Carboxymethyl  starch:  Chitosan  monolithic  matrices  containing  diamine  oxidase  and catalase  for  intestinal  delivery.  International  Journal  of  Pharmaceutics,  428(1-2),  48– 56. doi:10.1016/j.ijpharm.2012.02.032
[32]  Sumeisey,  NG,  2019.  Penyalutan  bakteri  asam  laktat  menggunakan  nanopartikel  kitosan. Pharmacon Volume 8 Nomor 4 November 2019
[33]  Khosravavi  Zanjani,  Babak  GT,  Anausheh  S,  and  Nima  M.  Microencaptulation  of  probiotics  by calcium alginat-gelatized starch with citosan coating and evaluation of survival in simulated human gastrointestinal condition. 2014. Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 13 (3): 843-852.
[34]  Raphael D. Ayivi, Rabin Gyawali, Albert Krastanov, Sulaiman O. Aljaloud. Lactic Acid Bacteria: Food Safety and Human Health Applications. 2020;
[35]  Masood, M. L., Qadir. M.I., Shirazi. J.H., and Khan, I.U. 2011. Beneficial effects of Lactic Acid Bacteria on human beings. Critical Rev.Microb. 37 (1): 91-98
[36]  Chaudry  R,  Bamola  VD,  Panigrahi  P.  2011.  Host-microbe  interactions  in  the  gut  :  A Microbiologist’s  perspective.  Dalam  Nair  dan  Takeda.  Probiotic  foods  in  Health  and  Disease.  5. New Delhi (IN): CRC Press .