Journal Syifa Sciences and Clinical Research (JSSCR)
Volume 5 Nomor 2, 2023
Journal Homepage: http://ejurnal.ung.ac.id/index.php/jsscr , E-ISSN: 2656-9612 P-ISSN:2656-8187 DOI : https://doi.org/10.37311/jsscr.v5i2.21326
Potensi Ekstrak Enzim Daun Pepaya ( Carica papaya L.) Sebagai Agen Fibrinolitik Dengan Metode Clot Lysis in Vitro
Hervina Warninghiyun 1* , Ana Indrayati 2 , Pudiastuti RSP 3
1,2,3 Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi Surakarta, Jl. Letjen Sutoyo, Mojosongo, Kec. Jebres, Kota Surakarta 57127, Indonesia
* Penulis Korespondensi. Email: hervyna001@gmail.com

## ABSTRAK
Stroke  adalah  penyakit  yang  disebabkan  karena  sumbatan  pembuluh  darah.  Departemen Kesehatan 2013 menyatakan bahwa 15,4% orang meninggal karena stroke. Salah satu terapi pengobatan  yang  dapat  digunakan  yaitu  fibrinolitik.  Agen  fibrinolitik  mempunyai  peran dalam melisiskan bekuan darah, agen ini dapat diperoleh dari mikroba, tumbuhan dan hewan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kadar protein yang terkandung didalam ekstrak enzim daun pepaya ( Carica papaya L.), dan mengetahui potensi ekstrak enzim pada konsentrasi tertentu sebagai alternatif obat fibrinolitik secara alami. Penelitian diawali dengan determinasi tanaman, pengambilan sampel, ekstraksi enzim dengan diblender, pemurnian ekstrak dengan presipitasi  menggunakan  amonium  sulfat,  penentuan  kadar  protein dengan  metode Lowry , dan uji aktivitas fibrinolitik metode clot lysis in vitro . Konsentrasi uji dibuat tiga seri yaitu 20, 40 dan 80%. Hasil penelitian pada ekstrak daun pepaya menunjukkan kadar protein pada pelet pemurnian 1 sebesar 196,22 µg/ml dan pelet pemurnian 2 sebesar 306,33 µg/ml. Pada daun pepaya  terbukti  adanya  aktivitas  fibrinolitik  dengan  persentase  lisis  bekuan  darah  yang optimal pada pelet pemurnian 2 konsentrasi 80% yaitu sebesar 79%.
Kata Kunci:
Carica papaya ; Stroke; Fibrinolitik; Clot lysis
Diterima:
28-02-2023 Disetujui: 29-07-2023 Online: 01-08-2023

## ABSTRACT
Stroke is a disease caused due to blockage of blood vessels. Health department in 2013 stated that 15,4% of people died from strokes. One of the treatment therapies that can be used is fibrinolytic. Fibrinolytic agents have a role in lysing blood clots, these agents can be obtained from microbes, plants and animals. This study aims to determine the protein content contained in papaya leaf enzyme extract (Carica papaya L.), and to determine the potential of the enzyme extract at certain concentrations as an alternative to natural  fibrinolytic  drugs.  The  study  began  with  plant  determination,  sampling,  enzyme  extraction using a blender, purification of the extract by precipitation using ammonium sulphate, protein content determination using the Lowry method, and testing the fibrinolytic activity of the clot lysis method in vitro. Three series of test concentrations were made, namely 20, 40, and 80%. The results of the research on papaya leaf extract showed that the protein content in purification pellet 1 was 196,22 µg/ml and purification  pellet  2  was  306,33  µg/ml.  In  papaya  leaves,  fibrinolytic  activity  was  proven  with  the optimal percentage of blood clot lysis in purification pellet 2 with a concentration of 80% which was 79%.
Copyright © 2023 Jsscr. All rights reserved.
Keywords:
Carica papaya; Stroke; Fibrinolytic; Clot lysis
Received: 2023-02-28 Accepted: 2023-07-29 Online: 2023-08-01

## 1. Pendahuluan
Stroke adalah penyakit serebrovaskular (pembuluh darah di otak) yang ditandai dengan  kematian  jaringan  otak  yang  disebabkan  oleh  penurunan  aliran  darah  dan suplai oksigen ke otak. Penurunan aliran darah dan oksigen ini dapat disebabkan oleh penyumbatan  karena  adanya  pembekuan  darah,  penyempitan,  atau  pecahnya pembuluh darah [1]. Berdasarkan data hasil riset kesehatan oleh departemen kesehatan RI tahun 2013 stroke merupakan penyebab kematian nomor tiga di Indonesia (15,4%) stroke  meningkat  dari  8,3  per  1.000  penduduk  tahun  2007  menjadi  12,1  per  1.000 penduduk di tahun 2013.
Terapi fibrinolitik adalah salah satu terapi yang dapat digunakan untuk penyakit stroke.  Agen  fibrinolitik  mampu  berperan  dalam  melisiskan  bekuan  darah.  Agen  ini dapat  diperoleh  dari  mikroba,  tanaman,  dan  hewan.  Agen  fibrinolitik  ini  memiliki keunggulan yaitu efek samping rendah, dan harga yang relatif murah, dibanding obat streptokinase karena obat tersebut dapat menyebabkan pendarahan dan kekambuhan [2]. Enzim protease serine tergolong dari salah satu enzim fibrinolitik.
Penelitian  Rohmah  dan  Fickri,  (2020)  berdasarkan  analisis  statistik  diketahui bahwa terdapat perbedaan yang signifikan antara persentase inhibisi agregasi alkaloid total dibanding kontrol negatif, namun hasil uji trombolitik pada alkaloid daun pepaya menunjukkan bahwa persentase trombolitik tidak berbeda jauh dengan kontrol positif (clopidogrel) yang berarti dapat digunakan sebagai agen trombolitik [3].

## 2.  Metode

## Alat dan Bahan
Blender, tabung reaksi ( Pyrex ), pipet volume ( Brand ), mikropipet ( DragonMed ), timbangan  analitik  ( Nankai ),  batang  pengaduk  ( Pyrex ),  inkubator  ( Memmert ), sentrifugasi ( DLAB ), spektrofotometer ( Shimadzu ), pH meter ( Hanna ), termometer ( Gea ), kertas saring ( Whatmann ).
Daun pepaya 100 gram, plasma darah kelinci, buffer fosfat 0,05M pH 7, aquadest, serbuk  SDS  ( Sodium  Dedocyl  Sulfate ),  BSA  ( Bovine  Serum  Albumin )  sebagai  larutan standar,  Tris-HCl  (pH  8),  aseton,  fenol,  metanol,  amonium  sulfat,  amonium  asetat, reagen  Lowry  berupa  Follin-Ciocalteu,  dapar  borat  pH  7,8,  NaOH, Na 2 CO 3 ,  Cu SO 4 , Sodium  Pottasium  Tartrat,  nattokinase  sebagai  kontrol  positif,  buffer  fosfat  sebagai kontrol negatif.

## Identifikasi Gen Protease Serin Tanaman Pepaya Menggunakan NCBI
Langkah awal mengunjungi situs resmi NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ selanjutnya memasukkan kata kunci pada kolom pencarian, dan memilih database.

## Determinasi Tanaman dan Pengambilan Sampel
Determinasi dilakukan di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat  dan  Obat  Tradisional  (B2P2TOOT)  Tawangmangu,  Jawa  Tengah.  Daun  pepaya diambil dengan keadaan segar, masih muda, tidak rusak, dan bebas penyakit.

## Ekstraksi Ekstrak Enzim Daun Pepaya
Menimbang daun pepaya sebanyak 100 gram selanjutnya ditambah buffer fosfat 0,05M  pH  7  (1:2)  dan  diblender  sampai  homogen.  Hasil  campuran  disaring  dengan kertas saring, yang disaring disebut dengan filtrat, filtrat selanjutnya didinginkan pada suhu ˂ 4°C selama 3 jam. Filtrat selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 30 menit. Hasil sentrifugasi berupa supernatan dan endapan.

## Pemurnian Parsial Ekstrak Enzim Daun Pepaya
Supernatan  diendapkan  dengan  ditambah  garam  amonium  sulfat  konsentrasi 60% dengan cara dimasukkan sedikit demi sedikit kedalam ekstrak kasar enzim sampai larut  dengan  menggunakan magnetic  stirrer pada  suhu ˂ 4°C.  Selanjutnya  campuran disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 30 menit dengan suhu ˂ 4°C, hasil sentrifugasi yang didapat berupa pelet pemurnian ke-1 dan ditimbang. Kemudian pelet dilarutkan dengan buffer fosfat pH 8.
Pelet pemurnian ke-1 yang sudah larut, kemudian dimasukkan dalam larutan buffer  yang  berisi  Tris-HCl  0,5M  (pH  8)  dan  1%  serbuk  SDS.  Larutan  selanjutnya dilarutkan  dengan 10%  fenol  sebanyak  1  ml  dan dicampur  sampai  homogen,  setelah sudah tercampur lalu disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4°C sebanyak 2 kali pengulangan. Didapat 2 fase terpisah yaitu fase fenol dan fase pengotor. Fase fenol ditambah campuran ammonium asetat 0,1M dengan metanol aduk sampai  homogen,  dan disimpan  pada  lemari  es  selama 24  jam.  Kemudian  campuran disentrifugasi  dengan  kecepatan  5.000  rpm  selama  20  menit.  Pelet  yang  diperoleh kemudian  dicuci  dengan  aseton  dan  metanol  didiamkan  dan  dikeringkan  dengan membalik  tabung  reaksi  diatas  tissue  kering.  Hasil  tersebut  didapat  sebagai  pelet pemurnian ke-2 [4].

## Tingkat Kemurnian Protein Ekstrak Daun Pepaya
Pelet  pemurnian  ke-1  dan  pelet  pemurnian  ke-2  diambil  sebanyak  50  µL, kemudian  dilarutkan  dalam  10  ml  larutan  buffer  fosfat.  Sampel  dianalisis  kemudian diukur volume dengan menggunakan spektrofotometri UV pada panjang gelombang 260  nm  dan  280  nm  dengan  menggunakan  buffer  fosfat  pH  7  sebagai  blanko,  dan didapat nilai absorbansi yang akan dibandingkan, absorbansi dilakukan dengan 3 kali replikasi yang kemudian dihitung rasio rata-ratanya [5].
Pengukuran Kadar Protein Ekstrak Enzim Daun Pepaya Dengan Metode Lowry Pertama,  menimbang  serbuk  BSA  sebanyak  50  mg,  untuk  pembuatan  kurva kalibrasi  yaitu  larutan  BSA  dengan  konsentrasi  1.000  ppm.  Serbuk  BSA  dilarutkan dengan  aquadest  50  ml  dan  dibuat  berbagai  seri  konsentrasi  0,  40,  80,  120,  160,  200. Sebanyak  1.000  µL  larutan  protein  standar  BSA.  Larutan  standar  kemudian ditambahkan kedalam tabung.
Reagen Lowry A dibuat dengan campuran yang berisi reagen Folin ciocalteau dan  aquadest  dengan  perbandingan  1:1,  Reagen  Lowry  B  yaitu  50  ml  larutan  yang mengandung 2% Na 2 CO 3 ditambah 0,1N NaOH dicampur dengan 1 ml larutan berisi 1% Cu SO 4 dan  1%  sodium  potassium  tartrat  dan  dicampur  dalam  air.  Selanjutnya campuran Lowry B dimasukkan sebanyak 5 ml kedalam larutan standar, dan didiamkan selama 10 menit. Kemudian ditambahkan sebanyak 0,5 ml larutan Lowry A, kocok dan diamkan selama 30 menit, diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm [6].
Pengukuran kadar protein, ekstrak enzim daun pepaya sebanyak 50 µL dengan pengenceran 100 kali. Kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml larutan Lowry B dan didiamkan selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml larutan Lowry A campuran dikocok, dan campuran didiamkan selama 30 menit. Baca absorbansi pada panjang gelombang 600 nm [6].

## Uji Aktivitas Fibrinolitik dengan Metode Clot Lysis
Penelitian ini menggunakan metode clot lysis , dengan menguji lisis bekuan darah secara in vitro . Darah kelinci dimasukkan kedalam 8 tabung eppendorf yang steril dan sudah  ditimbang  masing-masing  sebanyak  500  µl,  selanjutnya  diinkubasi  selama  50 menit  pada  suhu  37°C  sampai  menggumpal.  Setelah  inkubasi  akan  terbentuk  cairan pada bagian atas permukaan yang harus dipisah. Berat dari 8 tabung eppendorf masing- masing  yang  berisi  gumpalan  darah  harus  ditimbang,  tujuan  ditimbang  yaitu  untuk mengetahui  berat  dari  gumpalannya  (berat  tabung  eppendorf  yang  berisi  gumpalan darah – berat tabung eppendorf yang kosong). Pelet pemurnian ke-1 dengan konsentrasi 20,  40  dan  80%  dimasukan  kedalam  3  tabung  eppendorf  sebanyak  100  µL.  Pelet pemurnian ke-2 dengan konsentrasi 20, 40 dan 80% dimasukkan ke 3 tabung eppendorf sebanyak 100 µL. Dan 2 tabung eppendorf tersisa, diisikan dengan nattokinase (kontrol positif)  dan  buffer  fosfat  (kontrol  negatif)  yang  masing-masing  sebanyak  100  µL. Selanjutnya  8  tabung  eppendorf  diinkubasi  selama  90  menit  pada  suhu  37°C,  dan diamati peleburan gumpalan darahnya. eppendorf yang berisi leburan gumpalan darah tersebut kembali ditimbang, yang bertujuan untuk mengetahui berapa perbedaan berat sesudah gumpalan darah melebur [7]. Persentase lisis bekuan darah dihitung dengan menggunakan rumus [7].
Berat bekuan darah terlarut Berat bekuan darah sebelum larut × 100

## Analisis Data
Analisis  hasil  data  dilakukan  dengan  menggunakan  aplikasi  SPSS  ( Statistical Package for the Social Sciences ). Hasil data yang didapat dianalisis dengan Saphiro-wilk , apabila data yang didapat menunjukkan distribusi normal, maka selanjutnya dilakukan analisis dengan One Way Anova .

## 3.  Hasil dan Pembahasan

## Identifikasi Gen Protease Serin dari Tanaman Pepaya dengan NCBI
Pencarian diawali dengan mengunjungi situs resmi NCBI
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ,  (gambar  1)    selanjutnya  peneliti  memasukkan  kata kunci “protease serine, gene” pada kolom pencarian dan pilih nukleotida. Dikhususkan pada  tanaman  dan  akan  muncul  hasil  berupa  database  tanaman  apa  saja  yang mempunyai  gen  penyandi  protease  serine  salah  satunya  yaitu  tanaman  pepaya. Identifikasi gen pengkode yang spesifik, peneliti memilih urutan gen pengkode dengan skor identitas tertinggi yaitu 100%.

## Gambar 1. Hasil pencarian tanaman yang memiliki gen protease serin

## Determinasi Tanaman dan Pengambilan Sampel
Hasil determinasi menyatakan bahwa sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah benar tanaman pepaya dengan spesies Carica papaya L. yang termasuk dalam familia Caricaceae. Daun diambil dengan kondisi segar, masih muda, tidak rusak dan bebas dari penyakit. Daun muda memiliki tekstur yang lunak sehingga memudahkan dalam proses penggilingan.

## Ekstraksi Ekstrak Enzim Daun Pepaya
Daun pepaya 100 gram dengan cara diblender dan diberi penambahan buffer fosfat pH 7, tujuan penambahan buffer fosfat dapat menghindari terjadinya inaktivasi enzim  akibat  pH  yang  berubah  dan  dapat  menjaga  pH  supaya  tetap  netral [8]. Campuran  tersebut  kemudian  disaring  dengan  kain  flannel,  yang  bertujuan  untuk memisahkan  komponen  sel  dengan  zat  pengotor.  Setelah  disaring  kemudian dimasukkan kedalam lemari es dan didiamkan selama 3 jam pada suhu 4°C. Dilakukan pendinginan  pada  ekstrak  yaitu  untuk  menjaga  enzim  yang  terkandung  didalam ekstrak tersebut supaya tidak mengalami kerusakan. Proses pendiaman bertujuan untuk mengendapkan sisa-sisa serat daun pepaya yang berada pada ekstrak dan selanjutnya dipisah dengan sentrifugasi. Tujuan sentrifugasi untuk memisahkan supernatan dengan endapan  zat  pengotor  yang  tertinggal  didalamnya  [9].  Dilakukan  dengan  kecepatan 5.000  rpm  selama  30  menit.  Hasil  ekstraksi  ekstrak  enzim  daun  pepaya  diperoleh supernatan 200 mL.

## Pemurnian Parsial Ekstrak Enzim Daun Pepaya
Pemurnian  enzim  fibrinolitik  adalah  langkah  berikutnya  setelah  didapatkan supernatan (ekstrak kasar) hasil ekstrak enzim daun pepaya. Proses pemurnian perlu dilakukan  dengan  tujuan  untuk  mendapatkan  enzim  spesifik  yang  diinginkan [10]. Penelitian  ini  menggunakan  metode  presipitasi  dengan  garam  ammonium  sulfat. Prinsip pengendapan protein dengan garam amonium sulfat adalah salting out, pada penambahan garam dengan konsentrasi tinggi dapat mengakibatkan kelarutan protein menurun [11].  Amonium  sulfat  yang  ditambahkan  pada  ekstrak  daun  pepaya  yaitu dengan  konsentrasi  kejenuhan  60%.  Pada  saat  penambahan  amonium  sulfat menggunakan magnetic stirrer, dilakukan dengan sedikit demi sedikit yang bertujuan untuk memudahkan dalam proses pelarutan dan menghomogenkan secara merata.
Pemurnian enzim dilakukan dengan kondisi ekstrak yang dingin, dengan cara menggunakan bongkahan es batu disampingnya  yang bertujuan supaya tidak terjadi inaktivasi  serta  dapat  menjaga  kestabilan  suhu  enzim,  karena  kenaikan  suhu  dapat menyebabkan  enzim  mengalami  denaturasi  atau  rusak [12].  Kemudian  dimasukkan kedalam  lemari  es  selama  semalam  pada  suhu  4°C  yang  bertujuan  untuk mengendapkan secara sempurna. Disentrifugasi dan diperoleh endapan atau pelet yang disebut sebagai pelet pemurnian ke-1.
Hasil pelet pemurnian enzim ke-1 dilarutkan dengan campuran yang terdiri dari Tris-HCl  pH  8  dan  serbuk  SDS.  Setelah pencampuran,  selanjutnya  ditambah  dengan 10%  fenol  sampai  tercampur  secara  homogen  dan  kemudian  dilakukan  sentrifugasi. Hasil sentrifugasi berupa 2 fase terpisah yaitu fase fenol dan fase pengotor. Fase fenol yang  diambil,  tujuan  penambahan  fenol  untuk  melarutkan  pengotor  yang  berada didalam  ekstrak  kasar  enzim,  maka  dari  itu  protein  akan  berada  pada  fase  fenol sedangkan zat lain ikut larut dalam fase air [13].
Tabel 1. Berat pelet pemurnian ekstrak enzim daun pepaya Sampel Berat Pelet (g) Pelet Pemurnian ke-1 31,87 Pelet Pemurnian ke-2 15,27
Fase  fenol  ditambah  dengan  metanol  yang  sudah dicampuri amonium  asetat. Amonium asetat dalam metanol bertindak sebagai larutan pencuci yang memisahkan protein  dari  pengotor  dalam  ekstrak  daun  pepaya.  Kemudian  disentrifugasi  setelah campuran dari larutan tersebut didiamkan, tahap berikutnya yaitu pencucian dengan metanol  dan  aseton.  Setelah  pencucian  dengan  methanol,  selanjutnya  dengan penggunaan aseton bertujuan untuk mencuci pelet yang didapat dari zat pengganggu lain.  Pelet  didiamkan  dan  dikeringkan  dengan  cara  membalik  tabung  reaksi  dengan dibawahnya menggunakan tissue, sehingga diperoleh pelet pemurnian 2. Adapun berat pelet pemurnian ekstrak enzim daun papaya terdapat pada tabel 1.

## Tingkat Kemurnian Ekstrak Enzim Daun Pepaya
Tingkat  kemurnian  dari  ekstrak  enzim  daun  pepaya  dianalisis  dengan spektrofotometri  UV  pada  panjang  gelombang  280  nm,  merupakan  penyerapan maksimum  protein.  Metode  spektrofotometri  UV  memiliki  kelebihan  yaitu kesensitivitas  yang  tinggi,  relatif  cepat,  dan  metode  yang  dapat  dikerjakan  tanpa penggunaan reagen. Sedangkan kekurangan metode ini terdapat asam nukleat beserta komponen  senyawa  yang  berisi  cincin  pirimidin  dan  purin,  sehingga  menyebabkan absorbansi  kuat  pada  panjang  gelombang  280  nm  dan  dapat mengganggu  pada saat pembacaan hasil. Maka dari itu sebagai faktor koreksi dilakukan juga pengukuran pada panjang  gelombang  260  nm.  Perbandingan  rasio  rata-rata  absorbansi  antara  panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dapat digunakan untuk mengetahui tingkat kemurnian protein enzim.
Tabel 2. Tingkat kemurnian ekstrak enzim daun pepaya Sampel Jumlah Sampel (µL) 𝐀 𝟐𝟔𝟎 ± SD 𝐀 𝟐𝟖𝟎 ± SD Rasio Rata-rata 𝐀 𝟐𝟔𝟎 / 𝐀 𝟐𝟖𝟎 Pelet pemurnian ke-1 50 0,661 ± 0,009 0,489 ± 0,009 1,352 ± 0,008 Pelet pemurnian ke-2 50 0,445 ± 0,018 0,369 ± 0,007 1,205 ± 0,041
Hasil dari sampel pelet pemurnian 1 dan pelet pemurnian 2 mendapatkan rasio rata-rata A260/280 yaitu < 1,8 dengan nilai yang didapat 1,352 dan 1,205 yang berarti ekstrak enzim daun pepaya masih terkontaminasi atau terdapat protein dan senyawa organik lain (tabel 2). Penelitian Koopaee & Koshkoiyeh  menyatakan bahwa nilai rasio rata-rata A260/ A280 untuk karakter DNA yang murni berkisar antara 1,8-2,0. Apabila nilai rasio diatas 2,0 menunjukkan adanya kontaminan sampel dengan RNA sedangkan nilai rasio absorbansi dibawah 1,8 menunjukkan sampel terkontaminasi dengan protein dan polisakarida [14].

## Pengukuran Kadar Protein dengan Metode
Lowry
Membuat berbagai reagen lowry antara lain reagen lowry A yang terdiri dari Na 2 CO 3 dan NaOH. Reagen lowry B terdiri dari Cu SO 4 .5 H 2 O dan NaK tartrat. Reagen lowry C terdiri dari campuran kedua reagen yaitu reagen lowry A dan reagen lowry B. Reagen lowry D terdiri dari Follin Phenol Ciocalteu dan ditambah aquadest. Pembuatan larutan  baku  standar  yaitu  dengan  menimbang  serbuk  BSA  sebanyak  50  mg  dan dilarutkan dengan aquadest 50 mL.
Penentuan  panjang  gelombang  maksimum  dilakukan  dengan  memasukkan aqua  destilata  dikuvet  bagian  belakang  (sebagai  blanko).  Dibuat  dengan  konsentrasi larutan induk 1000 ppm dan dibuat berbagai seri pengenceran yaitu 0, 40, 80, 120, 160, dan  200  ppm.  Konsentrasi  200  ppm  dipilih  untuk  pengukuran  panjang  gelombang maksimum. Panjang gelombang maksimum BSA dipilih pada panjang gelombang yang menunjukkan  nilai  absorbansi  yang  tinggi.  Berdasarkan  hasil  pengukuran  yang dilakukan, panjang gelombang maksimum yang didapat yaitu 745 nm.
Penentuan OT dengan cara larutan baku standar dibaca nilai absorbansinya pada panjang gelombang 745 nm dari menit 0-45 menit, sampai diperoleh nilai absorbansi yang  stabil.  Berdasarkan  hasil  pengukuran  yang dilakukan diperoleh  OT  yang  stabil pada menit ke 41-43 dengan nilai serapan tetap yaitu 0,495.
Absorbansi  diukur  menggunakan  spektrofotometri  pada  panjang  gelombang 745 nm. BSA digunakan sebagai pembanding pada metode Lowry dengan berbagai seri konsentrasi 0, 40, 80, 120, 160, dan 200 ppm (tabel 3).
Tabel 3. Absorbansi dari berbagai seri konsentrasi Konsentrasi (ppm) Absorbansi 0 0,197 40 0,276 80 0,348 120 0,529 160 0,632 200 0,815
Nilai absorbansi yang didapat dari berbagai seri konsentrasi seperti tabel diatas, selanjutnya dipakai untuk mencari persamaan regresi linier yang akan digunakan untuk mencari nilai x yang berarti kadar protein dari ekstrak enzim daun pepaya, persamaan regresi linier yang diperoleh yaitu y = 0,0031 + 0,1562x.
Tabel 4. Hasil kadar protein ekstrak enzim daun pepaya
Sampel Rata-rata serapan (y) ± SD Kadar Protein (µg/mL) (x) Kadar Protein (µg/mL) (x faktor pengenceran) Pelet pemurnian ke-1 0,3096 ± 0,0215 1,962 196,22 Pelet pemurnian ke-2 0,4816 ± 0,0716 3,063 306,33
Pelet pemurnian ke-1 dan pelet pemurnian ke-2 dicari nilai absorbansi dengan diuji serapan pada panjang gelombang maksimum yang didapat yaitu 745 nm, dengan masing-masing  pelet  diuji  serapan  sebanyak  3  kali  replikasi.  Selanjutnya  ketiga absorbansi dicari rata-rata untuk mendapat nilai rata-rata serapan (y). Hasil penelitian membuktikan  bahwa  semakin  murni  ekstrak  enzim,  maka  akan menghasilkan kadar protein yang lebih tinggi (tabel 4).

## Pengujian Aktivitas Fibrinolitik Metode Clot Lysis
Darah dengan cara dimasukkan ke dalam alat inkubator selama 50 menit pada suhu 37°C. Bekuan darah ditimbang dengan mengurangkan berat dengan bobot tabung eppendorf kosong. Persentase lisis dicari dengan rumus bobot sesudah lisis dibagi bobot sebelum lisis dikali 100. Penelitian ini menggunakan nattokinase (kontrol positif) dan buffer  fosfat  (kontrol  negatif).  Nattokinase  merupakan  suatu  enzim  fibrinolitik  yang didapat dari fermentasi natto. Mekanisme kerja dari nattokinase yaitu seperti plasmin sehingga  mampu  melisiskan  fibrinogen,  serta  aktif  dalam  memecah  benang  fibrin (fibrinolitik) dan dapat menghancurkan trombi [15].
Keterangan : Tabung Eppendorf 1 = Pelet pemurnian ke-2 konsentrasi 20% Tabung Eppendorf 2 = Pelet pemurnian ke-2 konsentrasi 40% Tabung Eppendorf 3 = Pelet pemurnian ke-2 konsentrasi 80%

## Gambar 2. Hasil Uji Clot Lysis
Uji aktivitas fibrinolitik dilakukan pada pelet pemurnian 1 dan pelet pemurnian 2 dengan berbagai seri konsentrasi yaitu 20, 40, dan 80% (gambar 2). Hasil perhitungan persentase lisis bekuan darah terdapat pada tabel 5. Kontrol negatif buffer fosfat 100 µL menunjukkan lisis bekuan darah 7%. Sedangkan pada kontrol positif nattokinase 100 µL menunjukkan  lisis  bekuan  darah  87%.  Pelet  pemurnian  1  dengan  berbagai  seri konsentrasi, masing-masing menunjukkan lisis bekuan darah 41%, 47%, dan 55%. Untuk pelet pemurnian 2 dengan berbagai seri konsentrasi, masing-masing menunjukkan lisis
1 2 3
bekuan  darah  61%,  68%,  dan  79%.  Parameter  yang diamati yaitu  penurunan  bekuan darah dibandingkan dengan sebelum diberi perlakuan. Semakin rendah berat bekuan darah yang tersisa, maka semakin tinggi aktivitas fibrinolitik. Persentase lisis gumpalan darah tertinggi ditunjukkan oleh ekstrak enzim daun pepaya hasil pemurnian 2 pada konsentrasi 80% sebesar 79% dengan kadar protein 306,33 µg/ml.
Tabel 5. Hasil perhitungan persentase lisis bekuan darah Sampel (%) Replikasi 1 (%) Replikasi 2 (%) Replikasi 3 (%) Rata-rata Replikasi (%) Pelet 1 20 39 47 37 41 Pelet 1 40 37 50 54 47 Pelet 1 80 55 53 56 55 Pelet 2 20 54 62 67 61 Pelet 2 40 69 60 75 68 Pelet 2 80 77 83 77 79 K- 5 8 7 7 K+ 84 86 92 87
Hasil  uji  lisis  bekuan  darah  dianalisis  dengan  SPSS,  pertama  menguji  data dengan  normalitas.  Uji  normalitas  dilakukan  dengan Shapiro-wilk ,  karena  data  yang dianalisis ˂ 50  hasil  uji  menunjukkan  nilai  sig. ˃ 0,05  yang  berarti  data  terdistribusi secara normal. Data selanjutnya dianalisis homogenitas dengan Lev ene’s test homogeny didapat  hasil  sig. ˃ 0,05  yang  berarti  data  homogen.  Sehingga  uji  dapat  dilanjutkan dengan  metode One  Way  Anova menunjukkan  hasil  sig. ˂ 0,05  yang  artinya  masing- masing dari sampel memiliki perbedaan yang signifikan satu dengan yang lain. Dilanjut uji Post Hoc Tukey menunjukkan hasil 6 subset kelompok. Hasil analisis dengan SPSS rata-rata tertinggi yaitu pada kontrol positif nattokinase dan terendah kontrol negatif buffer fosfat. Hal ini sudah sesuai dengan teoritis dan validasi metode. Sampel tertinggi pada  pelet  pemurnian  2  dengan  konsentrasi  80%,  hal  ini  dapat  terjadi  karena  faktor konsentrasi sampel yang lebih besar daripada konsentrasi yang lain.

## 4.  Kesimpulan
Kadar  protein  ekstrak  enzim  daun  pepaya  ( Carica  papaya L.)  dengan  metode Lowry , pelet pemurnian 1 sebesar 196,22 µg/ml dan pelet pemurnian 2 sebesar 306,33 µg/ml. Ekstrak enzim daun pepaya memiliki aktivitas sebagai agen fibrinolitik secara in vitro , dan konsentrasi dari ekstrak enzim daun pepaya ( Carica papaya L.) yang memiliki aktivitas optimal sebagai agen fibrinolitik yaitu konsentrasi 80%.

## Referensi
[1] Wardhani  NR,  Martini  S.  Faktor  yang  Berhubungan  dengan  Pengetahuan Tentang  Stroke  pada  Pekerja  Institusi  IPendidikan  Tinggi  Related  factor  of Knowledge  by  Stroke  in  Institute  of  Higher  Education  Employees.  J  Berk Epidemiol 2014;2:13 – 23.
[2] Kotb  E.  Purification  and  partial  characterization  of  serine  fibrinolytic  enzyme from  Bacillus  megaterium  KSK-07  isolated  from  kishk,  a  traditional  Egyptian fermented food. Appl Biochem Microbiol 2015;51:34 – 43.
https://doi.org/10.1134/S000368381501007X.
[3] Rohmah  MK,  Fickri  DZ.  Uji  Aktivitas  Antiplatelet,  Antikoagulan,  dan Trombolitik  Alkaloid  Total  Daun  Pepaya  (Carica  papaya  L.)  secara  in  Vitro.  J Sains Farm Klin 2020;7:115. https://doi.org/10.25077/jsfk.7.2.115-125.2020.
[4] Wang W, Vignani R, Scali M, Cresti M. A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis. Electrophoresis 2006;27:2782 – 6. https://doi.org/10.1002/elps.200500722.
[5] Farmawati D, Wirajana I, Chandra Yowani S. Perbandingan Kualitas Dna Dengan Menggunakan  Metode  Boom  Original  Dan  Boom  Modifikasi  Pada  Isolat Mycobacterium Tuberculosis 151. J Kim 2015;9:41 – 6.
[6] Purwanto MGM. Purwanto_Perbandingan Analisa_2014.pdf. J Ilm Sainsn Teknol 2014;7:1 – 71.
[7] Prasad  S,  Kashyap  RS,  Deopujari  JY,  Purohit  HJ,  Taori  GM,  Daginawala  HF. Development  of  an  in  vitro  model  to  study  clot  lysis  activity  of  thrombolytic drugs. Thromb J 2006;4. https://doi.org/10.1186/1477-9560-4-14.
[8] Nahdhiyati A, Krisna A. DARI DAUN KELOR ( Moringa oliefera Lamk . ) from Moringa  Leaves  (  Moringa  oliefera  Lamk  .).  J  Teknol  Pertan  Vol  15  No  3
[Desember 2014] 191-200 2014;15:191 – 200.
[9] Sebayang R, Idawati Y, Sinaga H. Analisis Lactat Dehydrogenase dalam Serum Darah  Menggunakan  Sentrifugasi.  J  Keperawatan  Silampari  2020;4:274 – 80. https://doi.org/10.31539/jks.v4i1.1450.
[10]  Fitria  F,  Rahmani  N,  Pujiyanto  S,  Raharjo  B,  Yopi  Y.  Pemurnian  Parsial  dan Karakterisasi Enzim Xilanase dari Bakteri Laut Bacillus safencis strain LBF P20 Asal Pulau Pari Jakarta. Agritech 2017;37:31. https://doi.org/10.22146/agritech.17004.
[11]  Purwanto MGM. The Role and Efficiency of Ammonium Sulphate Precipitation in Purification Process of Papain Crude Extract. Procedia Chem 2016;18:127 – 31. https://doi.org/10.1016/j.proche.2016.01.020.
[12]  Wahyuni  S,  Suarya  P,  Saputra  IMA.  ISOLASI  ENZIM  AMILASE  DARI
KECAMBAH  BIJI  JAGUNG  LOKAL  SERAYA  (Zea  mays  L.)  UNTUK HIDROLISIS PATI. J Kim 2017:122. https://doi.org/10.24843/jchem.2017.v11.i02.p04.
[13]  Hutami R, Bisyri H, Sukarno S, Nuraini H, Ranasasmita R. Ekstraksi DNA dari Ikan Kerapu. J Agroindustri Halal 2020;4:209 – 16.
[14]  Koopaee  HK,  Koshkoiyeh  AE.  SNPs  genotyping  technologies  and  their applications  in  farm  animals  breeding  Programs:  Review.  Brazilian  Arch  Biol Technol 2014;57:87 – 95. https://doi.org/10.1590/S1516-89132014000100013.
[15]  Sumi  H,  Hamada  H,  Tsushima  H,  Mihara  H,  Muraki  H.  A  novel  fibrinolytic enzyme  (nattokinase)  in  the  vegetable  cheese  Natto;  a    typical  and  popular soybean  food  in  the  Japanese  diet.  Experientia  1987;43:1110 – 1. https://doi.org/10.1007/BF01956052.