Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.2 Desember 2021 Hal 55 - 61 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048 DOI: http://dx.doi.org/10.20473/bikfar.v8i2.31761
Cite  this  as:  Hana  Sofiana  Maghfira,  Isnaeni1,  Asri  Darmawati  (2021).  Pengaruh  Suhu  dan  Waktu  Pemanasan  Larutan  Serbuk  Ekstrak  Rosela  (Hibiscus Sabdariffa L.) terhadap Hambatan Pertumbuhan Staphylococcus aureus ATCC 25923. Berkala Ilmiah Kimia Farmasi , 8(2), 55 -61.
This is an open access article under the CC BY-SA license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)

## Pengaruh Suhu dan Waktu Pemanasan Larutan Serbuk Ekstrak Rosela (Hibiscus Sabdariffa L.) terhadap Hambatan Pertumbuhan Staphylococcus aureus ATCC 25923
The Effect of Temperature and Heating Time of Roselle Extract (Hibiscus Sabdariffa L) Powder Solution on Growth Inhibition of Staphylococcus aureus ATCC 25923

## Hana Sofiana Maghfira, Isnaeni*, Asri Darmawati
Departemen Ilmu Kefarmasian, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Gedung Nanizar Zaman Joenoes, Kampus C Unair, Jl. Mulyorejo, Surabaya 60115, Indonesia
* Corresponding author,  e-mail: isnaeni@ff.unair.ac.id
Article History
Received: 1 September 2021; Received in Revision: 23 September 2021; Accepted: 30 September 2021

## ABSTRAK
Kandungan utama rosela (Hibiscus sabdariffa L.) yang memiliki khasiat antioksidan dan anti bakteri adalah flavonoid dan antosianin. Senyawa flavonoid tidak stabil pada suhu tinggi. Sedangkan pengolahan serbuk ekstrak rosela untuk menjadi  makanan  atau  minuman  siap  saji  umumnya  memerlukan  pemanasan.  Tujuan  penelitian  ini  adalah mengetahui  pengaruh  suhu  dan  waktu  pemanasan  larutan  serbuk  ekstrak  rosela  terhadap  hambatan  pertumbuhan mikroba  Staphylococcus  aureus  ATCC 25923.  Metode  penelitian ini  menggunakan  sampel  serbuk  ekstrak  bunga rosela siap-olah. Larutan serbuk ekstrak rosela dalam tabung bertutup ulir dipanaskan pada suhu 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C, 90°C di atas penangas air, dengan waktu pemanasan pada masing-masing suhu tersebut adalah 15 menit dan  30  menit.  Aktifitas  anti  bakteri  larutan  sampel  diukur  berdasarkan  kemampuan  menghambat  pertumbuhan Staphylococcus aureus ATCC 25923 dengan metode difusi agar sumuran. Zona hambat yang ditimbulkan sampel diukur dengan jangka sorong. Hasil penelitian ini menunjukkan zona ambat yang ditimbulkan oleh larutan sampel yang  sudah  mengalami  pemanasan  pada  suhu  tersebut  selama  15  menit  adalah  9,55±0,70  mm,  9,53±0,04  mm, 9,70±0,14 mm, 9,68±0,24 mm, 10,10±0,14 mm, 10,25±0,21  mm. Sedangkan diameter zona hambat sampel setelah pemanasan pada suhu tersebut selama 30 menit adalah 10,08±0,25 mm, 10,20±0,28 mm, 10,43±0,18 mm, 10,08±0,18 mm,  10,78±0,04  mm,  9,70±0,14  mm.  Uji statistik  two  way  ANOVA  Randomized  Control  Block  Design  dengan derajat  kepercayaan  95%  digunakan  untuk  membuktikan  adanya  perbedaan  yang  bermakna  diantara  rerata  zona hambat  masing-masing  sampel.  Kesimpulan  dai  penelitian  ini  adalah  suhu  dalam  rentang  40o-90o  C  tidak berpengaruh terhadap aktivitas anti bakteri sampel. Tetapi waktu pemanasan sampel berpengaruh terhadap aktivitas antibakteri larutan serbuk ekstrak rosela terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Kata  kunci:  Suhu  pengulahan,  waktu  pemanasan,  Larutan  Serbuk  Ekstrak  Rosela,  Aktivitas  Antibakteri, Staphylococcus aureus ATCC 25923

## ABSTRACT
The  main  ingredients  of  roselle  (Hibiscus  sabdariffa  L.)  which  have  antioxidant  and  antibacterial  effect  were anthocyanins, and flavonoids. Flavonoid compounds were unstable at high temperatures. Meanwhile, the processing of roselle extract powder into ready-to drink or food preparations generally requires the thermal processes. The aims of this study were to determine the effect of temperature and heating time of roselle extract powder solution on the inhibition of microbial growth of Staphylococcus aureus ATCC 25923. The method of this study uses a ready-to- process  roselle  powder  extract  sample.  The  roselle  extract  powder  solution  in  a  screw  cap  tube  was  heated  at  a temperature of 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C, and 90°C on a waterbath, with heating times at each temperature were 15 minutes and 30 minutes. Anti bacterial activity of the sample solution was measured based on the ability to inhibit the growth of Staphylococcus aureus ATCC 25923 by the agar-well diffusion method. The inhibition zone of the sample was measured by caliper. The result of this study showed that inhibition zones caused by the sample that had been heated at those temperature for 15 minutes were 9.55±0.70 mm, 9.53 ±0.04 mm, 9.70±0.14 mm, 9.68±0.24 mm, 10.10±0.14 mm, and 10.25±0.21 mm. Meanwhile, after heating for 30 minutes the inhibition zones were 10.08±0.25 mm, 10.20±0.28 mm, 10.43±0.18 mm, 10.08±0.18 mm, 10.78±0.04 mm, 9.70±0.14 mm. Two ways statistical test ANOVA Randomized Control Block Design with 95% confidence level was used to prove that there was a significant difference berween the mean inhibition zones of each sample. The conclution of this research was, the temperature in the range of 40 -90 oC has no effect on the anti-bacterial activity of the sample. However, the heating time of the sample affected the antibacterial activity of the roselle extract powder solution against Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Keywords: Heating, Roselle Powder Extract Solution, Antibacterial Activity, Staphylococcus aureus ATCC 25923

## Research Article
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.2, Juni 2021 Hal 55 - 61 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048

## Pendahuluan
Tanaman Rosela (Hibiscus sabdariffa L.) merupakan salah satu  tumbuhan  yang  banyak  digunakan  sebagai  alternatif pengobatan (Oktaviani dan Megantara, 2018). Kandungan utama  Hibiscus  sabdariffa  L.  yang  berkaitan  dengan khasiatnya sebagai antioksidan dan antibakteri adalah asam organik, antosianin, polisakarida dan flavonoid (Da-Costa- Rocha et al., 2014).
Menurut  penelitian  yang  dilakukan  Jung  et  al.,  (2013) ekstrak  air  bunga  rosela  terbukti  dapat  menghambat pertumbuhan  bakteri  Bacillus  subtilis  (ATCC  6633), Staphylococcus  aureus  (ATCC  6538)  dan  Eschericia  coli (ATCC  8739).  Mekanisme  antibakteri  senyawa  flavonoid antara  lain  dengan  menghambat  sintesis  asam  nukleat, penghambatan fungsi membran dan menghambat metabolisme energi (Xie et al., 2015).
Senyawa  flavonoid  tidak  stabil  pada  suhu  tinggi. Peningkatan suhu menyebabkan degradasi flavonoid karena terjadi reaksi oksidasi gugus hidroksil. (Zainol et al., 2009; Kemit  et  al.,  2019).  Suhu  tinggi  pada  saat  pengolahan maupun penyimpanan juga dapat menyebabkan penurunan stabilitas antosianin dan pigmen tumbuhan lainnya (Riaz et al., 2016). Daun dan bunga rosela (Hibiscus sabdariffa L.) kaya  akan  kandungan  antosianin  (Wu  et  al.,  2018). Antosianin  termasuk  dalam  golongan  flavonoid  yang memiliki karakteristik C-6 (cincin A) -C-3 (cincin C) -C-6 (cincin B), dicantumkan pada Gambar 1.
(A)
(B)
Gambar 1. Struktur flavonoid (A) dan antosianin (B)
Antosianin  banyak  ditemukan  di  alam  sebagai  glikosida yang  terdiri  dari  aglikon  dan  glikon.  Bagian  aglikon (antosianidin) cukup reaktif karena adanya kation flavilium yang  kekurangan  elektron.  Bagian  glikon  yang  paling umum  adalah  D-glukosa,  L-rhamnosa,  D-galaktosa,  D- xilosa  dan  arabinosa  (Riaz  et  al.,  2016).  Antosianin  yang paling  banyak  ditemukan  pada  tanaman  rosela  yaitu delphinidin-3-O sambubioside dan cyanidin-3-O- sambubioside (Hapsari et al., 2021).
Antosianin  sangat  tidak  stabil,  baik  dalam  jaringan tumbuhan  maupun  produk  pangan.  Secara  enzimatis, keberadaan  enzim  polifenol  oksidase  dan  peroksidase mempengaruhi stabilitas antosianin. Sedangkan secara non enzimatis  dipengaruhi  oleh  faktor  pH,  cahaya,  suhu  dan oksigen.  (Diaconeasa,  2018;  Amperawati  et  al.,  2019). Degradasi  antosianin  dapat  terjadi  karena reaksi  hidrolisis yang  diawali  dengan  pemutusan  ikatan  glikosidik. Hidrolisis  ini  dikenal  sebagai  langkah  awal  degradasi
antosianin. Suhu yang tinggi dapat menyebabkan hidrolisis antosianin  menjadi  khalkon,    cincin  C  terbuka  dan  tidak berwarna  (Diaconeasa,  2018;  Aryati  et  al.,  2020).  Reaksi degradasi  antosianin  juga  dapat  terjadi  akibat  reaksi  adisi nukleofilik  pada  atom  C2,  sehingga  membentuk  senyawa hemiketal  yang  selanjutnya  membentuk  senyawa  khalkon (Dangles  dan  Fenger,  2018).  Suzery  et  al.,  (2020) melaporkan  bahwa  pemanasan  ekstrak  kelopak  bunga rosela  pada  suhu  40  ⁰C,  60  ⁰C,  80  ⁰C  selama  60  menit menyebabkan  total  antosianin  menurun  karena  terjadi degradasi  struktur  antosianin.  Amperawati  et  al.,  (2019) juga melaporkan bahwa ekstrak kelopak bunga rosela yang dipanaskan  pada  suhu  70  ⁰C,  80  ⁰C,  90  ⁰C  dan  99,5  ⁰C selama  20,  40,  60,  80,  dan  100  menit  menunjukkan penurunan  kadar  antosianin  seiring  dengan  meningkatnya suhu dan lamanya waktu pemanasan.
Sementara itu proses termal lazim diaplikasikan pada proses pengolahan  pangan  untuk  tujuan  inaktivasi  enzim, perbaikan  warna  dan  tekstur,  perbaikan  mutu  nutrisi,  dan sterilisasi. Blanching, pemanggangan (roasting), perebusan (boiling),  oven  gelombang  mikro  (microwaving),  dan sterilisasi  adalah  beberapa  contoh  aplikasi  proses  termal (Rohadi and Wahjuningsih, 2019). Pada proses manufaktur produk  farmasi  pemilihan  suhu  yang  tepat  sangat  penting untuk menjamin kualitas produk (Valentine, 2014). Metode  difusi  agar  sumuran  banyak  digunakan  untuk menguji  aktifitas  antimikroba  ekstrak  tanaman,  yaitu dengan  mengukur  diameter  zona  hambat  disekeliling sumuran.  Menurunnya  kadar  senyawa  antimikroba  dalam ekstrak
karena terdegradasi diduga akan
mempengaruhi/mengurangi ukuran diameter zona hambat. Serbuk ekstrak rosela dalam penelitian ini merupakan bahan baku  yang  selanjutnya  akan  dikemas  atau  diolah  lagi menjadi sediaan (minuman/makanan atau kosmetik) Berdasarkan hal  tersebut  maka dilakukan penelitian untuk mengetahui  pengaruh  suhu  dan  waktu  pemanasan  larutan serbuk  ekstrak  rosela  Hibiscus  sabdariffa  L.  terhadap hambatan  pertumbuhan  Staphylococcus  aureus  ATCC 25923.

## 2. Metode

## Bahan dan cara kerja
Serbuk  ekstrak  rosela  produk  suatu  pabrik  farmasi  yang dibuat  dengan  cara  mengekstraksi  kuncup  bunga  rosela menggunakan  pelarut  etanol-air  kemudian  ditambahkan pengisi maltodextrin dengan perbandingan 1 : 1 Nutrient  Agar  (Oxoid),  Kanamisin  Sulfat  serbuk  untuk injeksi  (Meiji),  air  suling  (PD.  Surabaya  Aqua),  NaCl, Butanol,  Asam  Asetat,  Kloroform,  Etil  Asetat,  Asam Formiat,  Ammonia  dan  FeCl3.  Kecuali  dinyatakan  lain, bahan  tersebut  berderajat  kemurnian  pro  analisis  dari EMerck
Pemeriksaan karakteristik serbuk ekstrak rosela Pemeriksaan organoleptis.
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.2, Juni 2021 Hal 55 - 61 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
Dilakukan  pengamatan  serbuk  ekstrak  rosela  dan  larutan serbuk ekstrak rosela secara visual yakni bentuk, warna dan bau.
Pemeriksaan  fitokimia  menggunakan  Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Analisis  profil  kromatografi  lapis  tipis  senyawa  polifenol dilakukan  dengan  menimbang  1  gram  sampel  kemudian mencampurkan ekstrak dengan 10 ml air suling panas pada suhu  kamar.  Ekstrak  sebanyak  6  µl  kemudian  ditotolkan dengan  linomat  pada  plat  silika  gel.  Kemudian  plat  silika dieluasi  menggunakan  fase  gerak  kloroform  :  etil  asetat  : asam  formiat (0,5:9:0,5). Setelah proses eluasi  selesai  plat silica  dikeringkan  di  udara  kemudian  dilakukan  uji kualitatif menggunakan penampak noda FeCl3.
Analisis  senyawa  flavonoid  dilakukan  dengan  cara mengocok  1gram  sampel  menggunakan  n-heksana beberapa  kali  hingga  ekstrak  tidak  berwarna  kemudian residu dilarutkan dalam 5 ml etanol. Ekstrak sebanyak 6 µl kemudian  ditotolkan  dengan  linomat  pada  plat  silika  gel. Kemudian  plat  silika  dieluasi  menggunakan  fase  gerak butanol  :  asam  asetat  :  air  (4:1:5).  Setelah  proses  eluasi selesai plat silika dikeringkan di udara kemudian dilakukan uji kualitatif dengan penampak noda uap amonia (Isnaeni et al., 2020).

## Pembuatan larutan serbuk ekstrak rosela
Serbuk  ekstrak  rosela  ditimbang  sebanyak  5  g  nggunakan timbangan  analitik.  Kemudian  serbuk  ekstrak  dilarutkan dengan  air  suling  dalam  beaker  glass.  Setelah  larut masukkan kuantitatif ke dalam labu ukur 50 ml. Selanjutnya ditambahkan air suling sampai 50 ml.

## Pembuatan media nutrient agar
Medium NA sebanyak 28 g dengan komposisi meet extract 1 g, yeast  exract  2 g, 5 g pepton, NaCl  5 g dan agar 15 g dilarutkan  dalam  1000  ml  air  suling  dalam  erlenmayer. Kemudian  diaduk  sampai  larut,  jika  perlu  lakukan pemanasan menggunakan hotplate. Setelah itu, erlenmeyer ditutup dengan kapas lalu diikat dengan benang kemudian disterilisasi  dengan  autoklaf  pada  suhu  121ºC  selama  15 menit.

## Peremajaan Staphylococcus aureus ATCC 25923
Dimasukkan 10 ml media agar yang telah masak ke dalam tabung  reaksi  kemudian  ditutup  dengan  kapas.  Media tersebut disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC. Kemudian tabung media agar diletakkan pada kemiringan  45ºC  biarkan  pada  suhu  ruangan  selama  ±  30 menit  sampai  media  memadat.  Perlu  diperhatikan  bahwa media agar tidak boleh menyentuh tutup tabung. Media agar dibiarkan menjadi dingin dan keras. Kemudian satu koloni biakan murni bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 diambil  dengan  menggunakan  ose  steril,  selanjutnya ditanam  dalam  medium  Nutrien  Agar  (NA)  miring, kemudian  diinkubasikan  dalam  inkubator  pada  suhu  37°C selama 24 jam (Putri at el., 2019).
Penyiapan inokulum bakteri
Bakteri  Staphylococcus  aureus  ATCC  25923  yang  telah melalui proses peremajaan diberi NaCl 0,9% steril. Tabung digoyangkan  sampai  koloni  pada  permukaan  medium terlepas dan tersuspensi dalamNaCl 0,9%. Suspensi bakteri diukur transmitannya menggunakan spektrofotometer pada panjang  gelombang  580  nm  hingga  diperoleh  transmitan sebesar 25%. Blanko yang digunakan adalah NaCl 0,9%.
Penentuan  konsentrasi  hambat  minimum  larutan  serbuk ekstrak rosela
Larutan  serbuk  ekstrak  rosela  5%  diencerkan  menjadi beberapa  seri  konsentrasi  yaitu  konsentrasi  2,5%,  1,25%, 0,625%,  dan  0,312%.  Kemudian  dilakukan  uji  aktivitas antibakteri  larutan  serbuk  ekstrak  rosela  konsentrasi tersebut  dalam  satu  cawan  petri  dengan  menggunakan medium nutrient agar.
Disiapkan  2  tabung  reaksi  yang  berisi  Nutrien  Agar  (NA) steril. Satu tabung berisi media untuk base layer dan tabung lainnya  berisi  media  untuk  seed  layer.  Sebanyak  12  ml media  nutrient  agar  dimasukkan  kedalam  cawan  petri, kemudian diratakan dan ditunggu hingga memadat sebagai base layer. Inokulum bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923  sebanyak  3  µL  dimasukkan  dalam  8  ml  media Nutrient  Agar.  Kemudian  dihomogenkan  dengan  vortex mixer.  Media  yang  telah  mengandung  bakteri  kemudian dituangkan  diatas  base  layer  yang  telah  memadat  sebagai seed layer.
Dibuat 9 lubang atau sumuran yang terdiri dari 2 sumuran untuk  masing-masing  konsentrasi  dan  1  sumuran  untuk kontrol positif yaitu Kanamisin Sulfat 100 ppm. Sebanyak 50  µl  ekstrak  dan  kontrol  positif  dimasukkan  ke  dalam sumuran  agar.  Selanjutnya  cawan  petri  diinkubasi  selama 24  jam  pada  inkubator.  Setelah  diinkubasi  selama  24  jam dilakukan pengukuran diameter zona hambat bakteri. KHM ditentukan  untuk  mengetahui  kadar  minimal  ekstrak  yang akan  digunakan  untuk  pengujian  pengaruh  suhu dan  lama pemanasan terhadap aktifitas antibakteri.

## Pemanasan larutan serbuk ekstrak rosela
Larutan serbuk ekstrak rosela konsentrasi 2,5% dimasukkan ke  dalam  12  tabung  reaksi  bertutup  ulir.  Masing-masing tabung  reaksi  yang  berisi  larutan  serbuk  ekstrak  rosela ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik untuk mengetahui berat awal larutan ekstrak pada tiap-tiap tabung. Kemudian  dilakukan  pemanasan  dalam  waterbath.  Suhu waterbath diatur 40 ⁰C, 50 ⁰C, 60 ⁰C, 70 ⁰C, 80 ⁰C, dan 90 ⁰C dengan waktu pemanasan 15 dan 30 menit. Dua tabung reaksi  digunakan  untuk  masing-masing  suhu  dan  waktu pemanasan  (duplo).  Sampel  yang  telah  diberi  perlakuan kemudian didiamkan hingga dingin. Selanjutnya tabung ulir ditimbang kembali dan berat yang diperoleh dicatat sebagai berat  akhir.  Tahapan  ini  dilakukan  untuk  memastikan bahwa volume larutan serbuk ekstrak rosela tidak berkurang akibat perlakuan pemanasan. Apabila terdapat selisih berat awal  masing-masing  tabung  dengan  berat  akhir  setelah pemanasan  maka  ditambahkan  aquades  hingga  diperoleh berat  awal  (mengembalikan  berat  awal  larutan  ekstrak).
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.2, Juni 2021 Hal 55 - 61 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
Selanjutnya  dilakukan  uji  aktivitas  antibakteri  larutan serbuk ekstrak rosela.
Uji aktivitas antibakteri larutan serbuk ekstrak rosela Penyaringan larutan serbuk ekstrak rosela Masing-masing  sampel  dalam  12  tabung  yang  telah dipanaskan  pada  berbagai  suhu  dan  waktu,  disaring menggunakan  membran  filter  milipore.  Filtrat  yang diperoleh  dimasukkan  ke  dalam  tabung  eppendorf  dan diberi label sesuai perlakuan suhu dan waktu pemanasan.

## Penyiapan Media Difusi Agar
Disiapkan  2  tabung  reaksi  yang  berisi  Nutrien  Agar  (NA) steril. Satu tabung berisi media untuk base layer dan tabung lainnya  berisi  media  untuk  seed  layer.  Sebanyak  30  ml media  nutrient  agar  dimasukkan  ke  dalam  cawan  petri, kemudian diratakan dan ditunggu hingga memadat sebagai base  layer.  Kemudian  inokulum  bakteri  staphylococcs aureus yang memiliki transmittan 25% diambil sebanyak 8 µl  lalu  dimasukkan  dalam  20  ml  media  Nutrient  Agar. Kemudian  dihomogenkan  dengan  vortex  mixer.  Media yang telah mengandung bakteri kemudian dituangkan diatas base layer yang telah memadat sebagai seed layer. Pengujian Sampel
Dibuat  lubang  atau  sumuran  pada  media  uji  yang  telah disiapkan  pada  cawan  petri  menggunakan  pipa  pencetak agar steril. Sumuran dibuat sebanyak 27 yang terdiri dari 24 sumuran  untuk  sampel  yang  telah  diberi  perlakuan,  2 sumuran untuk kontrol negatif dan 1 sumuran untuk kontrol positif. 24 sumuran untuk uji terdiri dari 2 lubang perlakuan berbagai  suhu  selama  15  menit  dan  30  menit.  Larutan serbuk  ekstrak  rosela  2,5%  yang  telah  diberi  perlakuan dimasukkan  sebanyak  50  µl  pada  sumuran  uji.  Ke  dalam sumuran  kontrol  negatif  dimasukkan  50  µl  ekstrak  yang tidak diberi perlakuan dan kedalam sumuran kontrol posisitf dimasukkan  50  µl  antibiotik  Kanamisin  Sulfat  100  ppm. Kemudian  dilakukan  inkubasi  pada  suhu  37°C  selama  24 jam.
Pengukuran Diameter Zona Hambatan Pengukuran  diameter  zona  hambat  dilakukan  dengan menggunakan  alat  jangka  sorong  dengan  cara  mengukur dimeter zona jernih yang terbentuk disekitar sumuran agar. Pengukuran masing-masing zona jernih dilakukan sebanyak dua  kali  yakni  secara  diagonal  transversal  dan  horizontal kemudian  hasil  yang  diperoleh  dirata-rata.  Pengukuran dilakukan pada tiap-tiap zona jernih yang terbentuk. Hasil pengukuran  zona  jernih  sekitar  sumuran  agar  dicatat sebagai diameter zona hambat pertumbuhan bakteri.

## Rancangan Analisis Data
Analisis data dilakukan dengan menetapkan diameter zona hambat  larutan  serbuk  ekstrak  rosela  yang  telah  diberi perlakukan berbagai suhu terhadap bakteri Staphylococcus aureus  ATCC  25923.  Selanjutnya  data  diameter  zona hambat pada berbagai perlakuan suhu dan waktu dianalisis menggunakan  analisis  statistik  untuk  mengetahui  adanya perbedaan bermakna antara kelompok perlakuan suhu dan waktu pemanasan. Metode analisis yang digunakan adalah
analisis  varian  two  way  ANOVA  Randomized  Control Block  Design  (RCBD)  atau  two  way  ANOVA  tanpa interaksi. Dari hasil analisis two ways ANOVA RCBD jika diketahui  hasilnya  berbeda  makna,  maka  dilakukan  uji lanjutan  untuk  mengetahui  perbedaan  bermakna  antar kelompok  perlakuan  menggunakan  metode  uji  tukey dengan derajat kepercayaan 0,95 ( 𝛼 = 0,05).

## Hasil dan Pembahasan

## Pemeriksaan organoleptis
Tabel  1 Hasil  pemeriksaan  organoleptis  serbuk  ekstrak rosela dan larutan serbuk ekstrak rosela
Pemeriksaan fitokimia
menggunakan metode kromatografi lapis tipis

## Tabel  2. Hasil  pemeriksaan  fitokimia  serbuk  ekstrak rosela
Hasil  pengamatan  dengan  metode  kromatografi  lapis  tipis menunjukkan  bahwa  serbuk  ekstrak  rosela  mengandung senyawa  polifenol  dan  flavonoid.  Hasil  ini  sejalan  dan penelitian  (Obouayeba et  al. ,  2015)  bahwa  ekstrak  kelopak bunga  rosela  mengandung  senyawa  polifenol  dan  flavonoid serta beberapa senyawa lainnya.
Timbulnya noda berwarna hitam disebabkan karena senyawa polifenol  mengandung  gugus  OH  yang  kemudian  bereaksi dengan  FeCl3  membentuk  kompleks  flavonoid-Fe 3+ (Warsi dan  Sholichah,  2017).  Adanya  senyawa  flavonoid  ditandai dengan terbentuknya noda berwarna kuning intensif pada plat KLT  setelah  direaksikan  dengan  uap  amonia.  Flavonoid bereaksi  dengan  amonia  membentuk  quinoid  pada  cincin  B yang  mengandung  ikatan  rangkap  terkonjugasi  (Warsi  dan Sholichah, 2017)
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.2, Juni 2021 Hal 55 - 61 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
Penentuan  konsentrasi  hambat  minimum  larutan  serbuk ekstrak rosela terhadap Stphylococcus aureus ATCC 25923
Diameter zona hambat berbagai konsentrasi larutan serbuk ekstrak rosela terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 ditunjukkan pada  Tabel  III.  Larutan  ekstrak  dengan  konsentrasi  2,5%,  dan 1,25%  berturut-turut  memiliki  diameter  zona  hambat  sebesar 13,57  ±  0,10  mm  dan  11,35  ±  0,21  mm.  Sedangkan  pada konsentrasi  0,625%  dan  0,312%  tidak  terbentuk  zona  hambat bakteri.  Kontrol  posistif  Kanamisin  Sulfat  100  ppm  diperoleh diameter  zona  hambat  bakteri  sebesar  22,20  mm.  Sehingga disimpulkan konsentrasi hambat minimum (KHM) larutan serbuk ekstrak rosela adalah 1,25%.
Tabel  3.  Diameter  zona  hambat  larutan  serbuk  ekstrak rosela terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923
Tabel  4.  Rata-rata  diameter  zona  hambat  larutan  serbuk ekstrak rosela 2,5% terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 setelah pemanasan pada suhu 40 ⁰C, 50 ⁰C, 60 ⁰C, 70 ⁰C, 80 ⁰C, dan 90 ⁰C dengan waktu pemanasan 15 menit dan 30 menit
Diameter  zona  hambat  yang  diperoleh  setelah  larutan sampel dipanaskan suhu 40 ⁰C, 50 ⁰C, 60 ⁰C, 70 ⁰C, 80 ⁰C, dan  90  ⁰C  selama  15  menit  dan  30  menit  tercantum  pada Tabel IV. Hasil pengukuran diameter zona hambat bakteri pada  tiap  suhu  pemanasan  selama  30  menit  lebih  besar dibandingkan  dengan  pemanasan  selama  15  menit. Sehingga  dapat  dikatakan  bahwa  lamanya  waktu pamanasan  larutan  serbuk  ekstrak  rosela  mengakibatkan aktivitas antibakteri ekstrak semakin meningkat.
Kenaikan aktivitas antibakteri larutan serbuk ekstrak rosela akibat  lamanya  pemanasan  diduga  karena  terbentuknya degradan dari senyawa antosianin yaitu khalkon yang juga memiliki  gugus  fenolik  sehingga  memiliki  aktivitas antibakteri.  Aktivitas  antibakteri  khalkon  kemungkinan lebih tinggi sehingga menyebabkan kenaikan diameter zona hambat larutan serbuk ekstrak rosela terhadap Staphylococcus  aureus  ATCC  25923.  Senyawa  khalkon
diketahui  lebih efektif melawan MRSA daripada flavanon maupun  flavon,  dikarenakan  adanya  gugus  hidroksil  pada posisi  2  yang  penting  untuk  aktivitas  antistaphylococcal senyawa  khalkon  (Cushnie  dan  Lamb,  2005).  Selain  itu pemanasan  juga  menyebabkan  peningkatan  senyawa fenolik.  Musilova  et  al.,  (2020)  melaporkan  bahwa  Total Phenolic  Compound  (TPC)  dalam  ubi  jalar  yang  telah melalui  proses  microwave  mencapai  5,5  kali  lebih  tinggi daripada  ubi  jalar  mentah.  Al-Farsi  et  al.,  (2005)  juga melaporkan  bahwa  kandungan  total  fenolik  dalam  kurma menunjukkan  peningkatan  setelah  pengeringan  dibawah sinar  matahari  akibat  degradasi  tanin  oleh  suhu  selama proses pengeringan. Sehingga kenaikan aktivitas antibakteri larutan  serbuk  ekstrak  rosela  setelah  perlakuan  lamanya waktu  pemanasan  kemungkinan  juga  disebabkan  karena kenaikan total fenolik.
Sehingga dalam hal ini tidak hanya senyawa flavonoid saja yang  berperan  dalam  aktivitas  antibakteri  larutan  serbuk ekstrak rosela namun juga terdapat senyawa lain (degradan) yang juga memiliki aktivitas antibakteri.
Pada suhu pemanasan 90⁰C selama 30 menit diameter zona hambat  yang  dihasilkan  lebih  kecil  dibandingkan  dengan pemanasan selama 15 menit. . Hasil penelitian Chaaban et al., (2017) menunjukkan bahwa pada suhu pemanasan 90 ⁰C selama 2 jam menyebabkan degradasi senyawa rutin hingga 50% begitu juga dengan senyawa luteolin yang terdegradasi sebesar  45%.  Chen  et  al.,  (2014)  menyebutkan  bahwa polifenol  ekstrak  apel  memiliki  stabilitas  yang  baik terhadap  panas  namun  saat  kenaikan  suhu  dari  70  ⁰C menjadi  95 ⁰C konsentrasi  polifenol  apel  sedikit  menurun yakni  dari  750  ppm  menjadi  700  ppm.  Peningkatan  suhu pemanasan  menyebabkan  degradasi  flavonoid  karena terjadi reaksi oksidasi gugus hidroksil (Zainol et al., 2009). Substitusi gugus hidroksil merupakan aspek penting dalam aktivitas  antibakteri  flavonoid,  sebagai  contoh  pada flavonol  adanya  gugus  hidroksil  pada  posisi  4’  akan meningkatkan aktivitas antibakteri (Wu et al., 2013). Tanpa kehadiran dari gugus hidroksil akan menyebabkan aktivitas antibakteri senyawa flavonoid menjadi menurun. Diameter zona hambat terbesar larutan esktrak serbuk rosela trhadap Staphylococcus  aureus  ATCC  25923  terjadi  pada  suhu pemanasan 80 ⁰C selama 30 menit yaitu sebesar 10,78±0,04 mm.  Pemanasan  pada  suhu  80  ⁰C  selama  30  menit merupakan  suhu  dan  waktu  pemanasan  larutan  serbuk ekstrak rosela dengan hambatan pertumbahan staphylococcus aureus ATCC 25923 yang paling tinggi. Analisis statistik menggunakan metode analisis varian two way ANOVA Randomized Control Block Design (RCBD) atau  two  way  ANOVA  tanpa  interaksi  untuk  mengetahui pengaruh  suhu  dan  pengaruh  waktu  terhadap  aktivitas antibakteri larutan serbuk ekstrak rosela. Analisis didahului dengan  pemeriksaan  normalitas  dan  homogenitas  sampel sebagai  syarat  untuk  dapat  dilakukannya  analisis  dengan metode  two  way  ANOVA.  Hasil  tes  normalitas  sampel menggunakan  normality  test  Shapiro-Wilk  test  diperoleh nilai sig. ≥ 0,05 untuk masing-masing perlakuan suhu dan waktu  sehingga  sampel  dalam  pengujian  ini  dinyatakan berdistribusi  normal.  Hasil  tes  homogenitas  sampel
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.2, Juni 2021 Hal 55 - 61 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
diperoleh sig. 0,080 sehingga sampel dinyatakan homogen (sig. ≥ 0,05). Syarat analisis meggunakan metode two way ANOVA lainnya adalah data yang akan dianalisis berskala rasio  atau  interval  dan  masing-masing  populasi  saling independen. Berdasarkan hal tersebut maka dapat dikatakan data  pada  penelitian  ini  telah  memenuhi  syarat  untuk dilakukan  pengujian  dengan  metode  analisis  two  way ANOVA. Hasil analisis two way ANOVA RCBD dengan derajat  kepercayaan  95%  (α  =  0,05)  diperoleh  nilai  sig. 0,088  untuk  variabel  suhu  pemanasan  sehingga  dapat dikatakan  bahwa  suhu  pemanasan  tidak  berpengaruh terhadap aktivitas antibakteri larutan serbuk ekstrak rosela terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dikarenakan nilai  sig.  nya  ≥  0,05.  Sedangkan  hasil  sig.  untuk  variabel waktu  adalah  0,004  sehingga  dapat  dikatakan  bahwa lamanya waktu  pemanasan berpengaruh terhadap aktivitas antibakteri  larutan  serbuk  ekstrak  rosela  terhadap Staphylococcus  aureus  ATCC  25923  karenakan  nilai  sig. nya ≤ 0,05. Dikarenakan hasil analisis untuk variabel waktu didapatkan  sig.  ≤  0,05  maka  dilakukan  uji  lanjutan  untuk mengetahui  perbedaan  pada  kelompok  perlakuan  waktu. Pada penelitian ini hanya terdapat dua kelompok perlakuan waktu  yaitu  15  menit  dan  30 menit  maka  dapat  dikatakan bahwa kelompok waktu 15 menit berbeda dengan kelompok waktu 30 menit.

## Kesimpulan
Suhu pemanasan (40 ⁰C, 50 ⁰C, 60 ⁰C, 70 ⁰C, 80 ⁰C, dan 90 ⁰C)  larutan  serbuk  ekstrak  rosela  tidak  berpengaruh terhadap  hambatan  pertumbuhan  Staphylococcus  aureus ATCC 25923. Namun lamanya waktu pemanasan (15 menit dan 30 menit) berpengaruh terhadap hambatan pertumbuhan  Staphylococcus  aureus  ATCC  25923. Pemanasan  pada  suhu  40  ⁰C-90  ⁰C  hingga  30  menit merupakan  suhu  dan  waktu  pemanasan  yang  sesuai  untuk mempertahankan kemampuan larutan serbuk ekstrak rosela dalam menghambat Staphylococcus aureus ATCC 25923.

## Saran
Dalam mengonsumsi  atau mengolah serbuk ekstrak rosela yang  prosesnya  melibatkan  pemanasan  dapat  dilakukan pada rentang suhu 40 ⁰C-90 ⁰C hingga 30 menit karena suhu dan  waktu  pemanasan  tersebut  dapat  mempertahankan kemampuan  serbuk  ekstrak  rosela  dalam  menghambat Staphylococcus  aureus  ATCC  25923.  Apabila  akan dilakukan pemanasan pada suhu dan waktu diluar dari yang disarankan  pada  penelitian  ini,  maka  perlu  dilakukan penelitian  lebih  lanjut  untuk  menentukan  suhu  dan  waktu pemanasan  yang  sesuai  untuk  mempertahankann  aktivitas antibakteri  serbuk  ekstrak  rosela  terhadap  Staphylococcus aureus ATCC.

## Daftar Pustaka
Amperawati, S., Hastuti, P., Pranoto, Y., and Santoso, U. 2019. The Anthocyanins Content , Colour Changes and  Thermal  Stability  of  Roselle  (Hibiscus
sabdariffa L .) Petal Extract. International Journal of Science and Research (IJSR), Vol. 8, No. 4, pp. 428– 435.
Aryati,  D.  L.,  Rohadi  dan  Pratiwi,  E.  2020.  Aktivitas Antioksidan  Ekstrak  Kelopak  Bunga  Rosela  (H  . sabdariffa  L  .)  Merah  Pada  Berbagai  Suhu Pemanasan.  Jurnal  Teknologi  Pangan  dan  Hasil Pertanian, Vol. 15, No. 1, pp. 1–9.
Chaaban, H., Ioannou, I., Chebil, L., Slimane, M., Gerardin, C., Paris, C., Charbonnel C., Chekir L., and Ghoul, M.  2017.  Effect  of  heat  processing  on  thermal stability  and  antioxidant  activity  of  six  flavonoids. Journal of Food Processing and Preservation, pp. 1– 12.
Chen, J., Sun, H., Wang, Y., Wang, S., Tao, X., and Sun A. 2014. Stability of apple polyphenols as a function of temperature  and  pH.  International  Journal  of  Food Properties, Vol. 17, pp. 1742–1749.
Cushnie,  T.  P.  T.  and  Lamb,  A.  J.  2005  Antimicrobial activity  of  flavonoids.  International  Journal  of Antimicrobial Agents, Vol. 26, pp. 343–356.
Da-Costa-Rocha, I., Bonnlaender, B., Sievers, H., Pischel, I., dan Heinrich, M. 2014 Hibiscus sabdariffa L. - A phytochemical  and  pharmacological  review.  Food Chemistry, Vol. 5, pp. 424–443.
Dangles,  O.  and  Fenger,  J.-A.  2018.  The  Chemical Reactivity of Anthocyanins and Its Consequences in Food Science and Nutrition. Molecules, Vol. 23, pp. 1–23.
Diaconeasa,  Z.  2018.  Time-dependent  degradation  of polyphenols  from  thermally-processed  berries  and their  in  vitro  antiproliferative  effects  against melanoma. Molecules, Vol. 23, No. 10, pp. 1–18.
Hapsari,  B.  W.,  Manikharda  and  Setyaningsih,  W.  2021. Methodologies  in  the  analysis  of  phenolic compounds  in  roselle  (Hibiscus  sabdariffa  L.): Composition,  biological  activity,  and  beneficial effects on human health. Horticulturae, Vol. 7, No. 35, pp. 1–36.
Isnaeni, I., Hendradi, E. and Zettira, N. Z. 2020. Inhibitory effect of roselle aqueous extracts-HPMC 6000 gel on the growth of staphylococcus aureus ATCC 25923. Turkish  Journal  of  Pharmaceutical  Sciences,  Vol. 17, No. 2, pp. 190–196.
Jung,  E.,  Kim,  Y.  and  Joo,  N.  2013.  Physicochemical properties  and  antimicrobial  activity  of  Roselle (Hibiscus  sabdariffa  L.).  Journal  of  the  Science  of Food and Agriculture, Vol. 93, pp. 3769–3776.
Putri, R. M., Diana, V. E. and Fitri, K. 2019. Perbandingan Uji Aktivitas Antibakteri dari Ekstrak Etanol Bunga, Daun  dan  Akar  Tumbuhan  Rosella  (Hibiscus sabdariffa  L.)  Terhadap  Bakteri  Staphylococcus aureus. Jurnal Dunia Farmasi, Vol. 3, No. 3, pp. 131– 143.
Riaz,  M.,  Zia-Ul-Haq,  M.  and  Saad,  B.  (2016)
Anthocyanins and Human Health: Biomolecular and therapeutic aspects, Springer Briefs in Food, Health
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.2, Juni 2021 Hal 55 - 61 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
and Nutrition. Switzerland: Springer Briefs in Food, Health and Nutrition.
Rohadi  and  Wahjuningsih,  S.  B.  2019.  The  Effect  of Thermal  Treatment  on  Tea  (C.  sinensis  Linn.) Extract,  Type  of  White  Tea  on  the  Stability  of  Its Antioxidant Activity. Jurnal Industri Hasil Perkebunan, Vol. 14, No. 1, pp. 41–49.
Suzery, M., Nudin, B., Bima, D. N., and Cahyono, B. 2020.
Effects  of  Temperature  and  Heating  Time  on Degradation and Antioxidant Activity of Anthocyanin from Roselle  Petals (Hibiscus sabdariffa  L.).  International  Journal  of  Science, Technology & Management, Vol. 1, No. 4, pp. 288– 236.
Valentine,  P.  N.  E.  2014.  Semi  Solid  dosage  Forms Manufacturing:  Tools,  Critical  Process  Parameters, Strategies, Optimization and Validation. Sch. Acad. J. Pharm., Vol. 3, No. 2, pp. 153–161.
Wang, D., Liang, J., Zhang, J., Wan, Y., and Chai, X. 2020. Natural  Chalcones  in  Chinese  Materia  Medica: Licorice.    Evidence-based  Complementary  and Alternative Medicine, Vol, 2020, pp. 1–14.
Warsi and Sholichah, A. R. 2017. Phytochemical screening and  antioxidant  activity  of  ethanolic  extract  and ethyl  acetate  fraction  from  basil  leaf  (Ocimum basilicum L.) by DPPH radical scavenging method. IOP  Conference  Series:  Materials  Science  and Engineering, Vol. 259, pp. 1–11.
Wu, H. Y., Yang, K. M. and Chiang, P. Y. 2018. Roselle anthocyanins: Antioxidant properties and stability to heat  and pH. Molecules, Vol. 23, No. 1357, pp. 1– 13.
Xie,  Y.,  Yang,  W.,  Tang,  F.,  Chen,  X.,  Ren,  L.  2015. Antibacterial  Activities  of  Flavonoids:  Structure- Activity  Relationship  and  Mechanism.  Current Medicinal Chemistry, Vol. 22, No. 1, pp. 132–149.
Zainol, M. K. M., Hamid A., Bakar, A., dan Dek, P. 2009. Effect  of  different  drying  methods  on  the degradation  of  selected  flavonoids  in  Centella asiatica.  International  Food  Research  Journal,  Vol. 16, pp. 531–537.