## ANALISIS PERBANDINGAN EFEKTIVITAS PROLOTERAPI DAN STEROID TERHADAP KEPADATAN FIBROBLAST PADA TERAPI RUPTUR PARSIAL TENDON ACHILLES TIKUS (RATTUS NORVEGICUS): STUDI HISTOPATOLOGI
Yose Waluyo
Departemen Kedokteran Fisik dan Rehabilitasi Medik, Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin

## Abstrak
Latar  Belakang :  Peningkatan  prevalensi  ruptur  tendon  achilles  terjadi  tiap  tahunnya.  Hingga  saat  ini  belum adanya metode penanganan yang diunggulkan dalam menangani ruptur tendon achilles, sehingga pengembangan terapi alternatif banyak dikembangkan, salah satunya adalah proloterapi.
Tujuan :  Mengetahui  adanya  perbedaan  efektivitas  proloterapi  dan  steroid  terhadap  kepadatan  fibroblast  pada ruptur parsial tendon achilles tikus.
Metodologi : Penelitian ini menggunakan desain randomized post test only control group design , terdapat 20 tikus yang dilakukan tenotomi parsial kemudian dibagi menjadi 4 kelompok sesuai perlakuan yaitu kelompok kontrol: tidak diberikan intervensi, kelompok saline: diberi injeksi normal saline, kelompok steroid: diberi injeksi steroid, kelompok  proloterapi:  diberi  injeksi  dextrose.  Intervensi  ini  dilakukan  pada  tikus  dengan  memberikan  injeksi sebanyak  lima  kali  dengan  interval  pemberian  tiap  lima  hari.  Pemeriksaan  histopatologi  dilakukan  setelah intervensi selesai.
Hasil penelitian : Nilai rerata kepadatan fibroblast paling rendah didapatkan pada kelompok steroid dengan nilai 1.00,  sedangkan  nilai  rerata  paling  tinggi  didapatkan  pada  kelompok  dextrose  dengan  nilai  2.00.  Didapatkan adanya perbedaan yang bermakna antara injeksi prolotherapy dibandingkan dengan steroid (p = 0.003), namun tidak didapatkan perbedaan bermakna antara kelompok proloterapi dengan kontrol dan normal saline.
Kesimpulan :  Injeksi  dextrose  intra-tendinous  lebih  efektif  dalam  meningkatkan  kepadatan  fibroblast dibandingkan dengan injeksi steroid pada model ruptur tendon Achilles. Meskipun belum dapat dibuktikan bahwa proloterapi lebih unggul dibandingkan kelompok kontrol dan injeksi normal saline.
Kata kunci: proloterapi, ruptur tendon, dextrose, kortikosteroid, kepadatan fibroblast

## Pendahuluan
Kerusakan  tendon  adalah  kelainan muskuloskeletal  yang  sering  terjadi  dan menjadi  salah  satu  penyebab  kecacatan, nyeri,  menghabiskan  biaya  yang  banyak, serta  menurunkan  produktivitas  secara signifikan.  Salah  satu  kerusakan  tendon yang  sering  terjadi,  khususnya  akibat olahraga, adalah ruptur tendon achilles [1]. Kejadian ruptur tendon achilles di Amerika Serikat dikabarkan meningkat tiap tahunnya.  Tercatat  dari  2012-2016,  terjadi
peningkatan signifikan dari 1.8 per 100.000 orang  menjadi  2.5  per  100.000  orang. Ruptur  tendon  achilles  paling  banyak terjadi  pada  laki-laki  dengan  rentang  usia 20-39 tahun [2].
Berdasarkan suatu rangkuman panduan praktis klinis, belum ada penanganan utama dan  yang  direkomendasikan  untuk  terapi ruptur  tendon  achilles,  baik  non  operatif maupun  operatif  [3].  Bahkan  beberapa penelitian mengemukakan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara
penanganan operatif dan non operatif [4–6]. Oleh  karena  belum  adanya  metode penanganan  yang  diunggulkan  dalam menangani ruptur tendon achilles, sehingga pengembangan  terapi  alternatif  banyak dikembangkan, salah satunya adalah proloterapi.
Proloterapi  merupakan  suatu  modalitas injeksi yang mengguanakan substansi tertentu seperti  dextrose, phenol-glycerine-glucose (P2G), atau sodium morhhuate pada struktur yang  mengalami  lesi  atau  inflamasi  [7]. Modalitas  ini  diduga  dapat  menstimulasi penyembuhan  dari  kerusakan  kronik  pada ekstraartikular dan  intraartikular.  Proloterapi berpotensi  untuk  menstimulasi  pengeluaran growth factor yang dapat membantu penyembuhan  jaringan  lunak  [8].  Beberapa penelitian  membuktikan  bahwa  proloterapi dinilai  efektif  dalam  menangani  kasus kerusakan  tendon  achilles  untuk  outcome fungsional  dan  pemeriksaan  ultrasound  [9– 11].
Proloterapi telah terbukti memiliki efek yang  baik  terhadap  rasa  nyeri  dan fungsional  outcome  pasien,  namun  studi mengenai  efek  proloterapi  sebagai  terapi regeneratif yang dinilai berdasarkan histopatologi  dan  morfologi  sel  masih jarang  dilakukan.  Oleh  karena  itu,  peneliti tertarik melakukan penelitian untuk mengetahui  efek  proloterapi  terhadap regenerasi sel yang dievaluasi berdasarkan
studi  histopatologis,  sehingga  perbaikan pada tingkat anatomi dan fungsional dapat dibuktikan.

## Bahan dan Metode
Penelitian ini merupakan desain eksperimen  murni  ( true  experimental design ) menggunakan rancangan randomized post-test only controlled group design dengan  hewan  coba  sebagai  subjek penelitian. Penelitian ini telah mendapatkan perizinan dan persetujuan etik dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan Fakultas
Kedokteran Universitas
Hasanuddin dengan  nomor  protokol  UH18110927.
Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium
Fakultas
Kedokteran Universitas Hasanuddin  dan  Klinik  Hewan  selama  1 bulan.  Jumlah  sampel  pada  penelitian  ini sebanyak 20 sampel. Terdapat 4 kelompok yang  terdiri  dari  5  ekor  tikus.  Sebelum diberi perlakuan, dilakukan adaptasi selama 7 hari kemudian dilakukan tenotomi parsial. Tikus  dibius  dengan  pemberian  ketamin (150mg/kgBB)  secara  intramuskular  lalu dilakukan tenotomi parsial dengan memotong 1 mm di sepertiga tengah tendon dari  medial  ke  lateral.  Setelah  dilakukan tenotomi, tikus dibagi menjadi 4 kelompok dan  diberi  perlakuan  berbeda  seperti sebagai berikut: kelompok kontrol: kelompok  tanpa  intervensi;  kelompok saline: kelompok yang diberi injeksi normal
saline  sebanyak  0.15  mL;  kelompok steroid:  kelompok  yang  diberi  injeksi dexamethasone  sebanyak  0.75  mg  (0.15 mL);  kelompok  dextrose:  kelompok  yang diberi injeksi dextrose 10% sebanyak 0.15 ml.  Masing-masing  perlakuan  diulangi sebanyak  5  kali  dengan  interval  5  hari. Setelah rangkaian intervensi selesai dilakukan,  selanjutnya  jaringan  tendon dievaluasi  dan  dilakukan  pengamatan histopatologi  dengan  memberikan  skoring pada  masing-masing  sampel.  Kepadatan fibroblast akan diklasifikasikan berdasarkan skor dengan penjelasan sebagai  berikut:  kepadatan  fibroblast  0- 10%  mendapatkan  skor  1,  10-40% mendapatkan skor 2, dan >40% mendapatkan skor 3. Selanjutnya, data hasil penelitian  dilakukan  analisis  statistik menggunakan software SPSS 20.

## Hasil Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan kepadatan fibroblast pada  ruptur  parsial  tendon  achilles  tikus dengan sampel tikus berdasarkan perbedaan pemberian  pengobatan  injeksi.  Setelah intervensi, dilakukan pemeriksaan histopatologi  untuk  menilai  kepadatan fibroblast. Hasil pemeriksaan histopatologi dapat dilihat pada gambar berikut:
Dari  hasil  pengamatan  histopatologi kemudian  dilakukan  pengamatan  terhadap
kepadatan fibroblast yang tertera pada tabel 1.  Kepadatan  fibroblast  pada  luka  insisi tikus pada kelompok kontrol menunjukkan variasi  antara  derajat  kepadatan  fibroblast 10-40%  (skor=2)  dan  derajat  kepadatan fibroblast 0-10% (skor=1), kelompok saline menunjukkan variasi antara derajat kepadatan fibroblast  10-40% (skor =2) dan derajat kepadatan fibroblast 0-10% (skor=1),  sedangkan  kelompok  steroid menunjukkan  derajat  kepadatan  fibroblast 0-10%  (skor=1)  dan  kelompok  dextrose menunjukkan  derajat  kepadatan  fibroblast 10-40% (skor=2).
Tabel  2  menampilkan  nilai  rata-rata dari  kelompok  perlakuan.  Nilai  rerata kepadatan fibroblast paling rendah didapatkan  pada  kelompok  steroid  dengan nilai  1.00,  sedangkan  nilai  rerata  paling tinggi  didapatkan  pada  kelompok  dextrose dengan  nilai  2.00,  rerata  kepadatan fibroblast  kelompok  saline  adalah  1.60, sedangkan kelompok kontrol rerata kepadatan fibroblast adalah 1.80.
Selanjutnya  diilustrasikan  dalam grafik dot plot. Berdasarkan grafik  terlihat bahwa  rerata  kepadatan  fibroblast  yang paling  tinggi  didapatkan  pada  kelompok dextrose,  sedangkan  rerata  kepadatan fibroblast  yang  paling  rendah  didapatkan pada  kelompok  steroid.  Untuk  lebih jelasnya dapat dilihat pada gambar 2.
Sebelum  dilakukan  analisis  statistik dilakukan  eksplorasi  data  terlebih  dahulu, kemudian  dilakukan  tes  nonparametrik dengan  menggunakan  uji Kruskal-Wallis dengan hasil p=0,011.
Perbedaan  antar  kelompok  perlakuan dilanjutkan  dengan  uji Mann-Whitney  U.
Didapatkan adanya perbedaan yang bermakna antara injeksi steroid dibandingkan kontrol dan dextrose (nilai p masing-masing  0.014;  0.003).  Selain  itu, tidak  ada  perbedaan  bermakna  antara injeksi  dextrose  dibandingkan  dengan kontrol  dan  saline  (nilai  p  masing-masing 0.317;0.134).

## Pembahasan
Pada  penelitian  ini  didapatkan  hasil bahwa  kelompok  injeksi  steroid  memiliki nilai rerata kepadatan fibroblast yang paling rendah  dibandingkan  dengan  kontrol, saline,  dan  proloterapi.  Serta  bermakna secara signifikan jika dibandingkan dengan kelompok kontrol dan normal saline. Hal ini menunjukkan  bahwa  injeksi  steroid  intra- tendinous  tidak  memiliki  efek  yang  lebih terhadap aspek kepadatan fibroblast dibandingkan  kelompok  lainnya.  Hasil  ini sama dengan hasil penelitian Kennedy dkk, Tatari  dkk,  dan  Kapetanos  yang  juga menemukan  tidak  adanya  efek  signifikan injeksi  steroid  pada  ruptur  tendon  achilles [12–14]. Kennedy dkk bahkan
mendapatkan  tikus  yang  dilakukan  injeksi steroid berulang dapat melemahkan tendon [12].  Hasil  ini  diduga  terjadi  akibat  efek kortikosteroid  yang  dapat  menurunkan produksi  kolagen  dan  protein  matriks ekstrasel dengan fibroblast dan meningkatkan  resorpsi  tulang  [15].  Selain itu,  steroid  juga  menekan  produksi  enzim degradasi matriks ekstrasel seperti MMP-3 (stromelysin-1),  MMP-13  (collagenase-3) dan MMP-1 (collagenase-1) pada beberapa jaringan, seperti ligamen [16]. Namun, pada penelitian lain yang dilakukan oleh Arslan dkk  didapatkan  adanya  perbaikan  yang signifikan secara biomekanis dan histopatologis pada tikus yang dibuat ruptur tendon Achilles setelah injeksi kortikosteroid  intra-tendon  [17].  Oleh karena  itu,  Shrier  dkk  menyimpulkan bahwa data-data yang telah dipublikasikan belum cukup untuk menentukan resiko dan manfaat injeksi kortikosteroid pada tendon [18].  Wang  dkk  juga  mengatakan  bahwa efek  kortikosteroid  pada  tendon  masih belum jelas sampai saat ini [19].
Pada  penelitian  ini  juga  didapatkan bahwa kelompok injeksi dextrose memiliki nilai  rerata  kepadatan  fibroblast  paling tinggi dibandingkan dengan kontrol, saline, dan  kortikosteroid  serta    didapatkan  hasil perbedaan yang bermakna secara signifikan pada  kelompok  dextrose  dibandingkan dengan  steroid  (p=0.003).  Hasil  ini  serupa
dengan penelitian yang dilakukan Ahn, dkk yang  menunjukkan  jumlah  fibroblast lebih banyak pada kelompok proloterapi dibandingkan dengan kontrol [20]. Martins, dkk  menyatakan  hal  yang  berbeda,  hasil penelitiannya menyatakan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara kelompok yang diberi proloterapi dengan kortikosteroid  [21].  Walaupun  secara histopatologis  belum  banyak  bukti  yang didapatkan, namun penelitian yang menilai efektivitas  proloterapi  terhadap  ruptur tendon  achilles  ditinjau  dari  klinis  telah banyak  dilakukan  [9,10,22].  Hingga  saat ini,  mekanisme  kerja  dari  senyawa proloterapi masih belum dapat diterangkan secara jelas. Namun, secara umum hipotesis yang  berkembang  dan  diduga  kuat  terkait mekanisme  tersebut  adalah  munculnya respon inflamasi. Ketika senyawa proloterapi  (dextrose ,  P2G,  morrhuate sodium )  diinjeksikan  ke  ruang  artikular, tendon,  atau  ligamen  maka  senyawa tersebut akan berperan sebagai benda asing dalam tubuh.  Pemberian senyawa  dextrose dengan  konsentrasi  melebihi  10% akan menginduksi  respon  inflamasi  jaringan seketika [23]. Hal ini disebabkan pemberian dextrose dengan konsentrasi lebih dari 10% akan  memicu  terciptanya  gradien  osmotik (pekat)  di  luar  sel  pada  titik  penyuntikan. Fenomena ini akan menginduksi perpindahan  cairan  intrasel  yang  akan
menyebabkan sel kekurangan air (dehidrasi)  dan  akhirnya  melisiskan  sel tersebut. Hasil dari proses lisis inilah yang merangsang respon inflamasi dan pembentukan  faktor-faktor  pertumbuhan [24]. Larutan  dextrose  hipertonis  akan merangsang  pembentukan growth  factor salah  satunya  adalah basic  fibroblast growth factor yang nantinya akan meningkatkan  kepadatan  fibroblast  tendon [23].
Perbedaan  mekanisme  kerja  inilah yang  diduga  menjadi  penyebab  adanya perbedaan nilai rerata kepadatan  fibroblast yang  signifikan  antara  kelompok  dextrose dan  steroid  pada  penelitian  ini.  Dimana mekanisme  kerja  dari  proloterapi  adalah menginduksi low-grade inflammation sehingga terbentuk growth factor , sedangkan steroid mencegah proses inflamasi dan menurunkan produksi protein matriks ekstrasel [15,23].

## Kesimpulan dan Saran
Injeksi  dextrose  intratendon  lebih  efektif dalam  meningkatkan  kepadatan  fibroblast dibandingkan  dengan  injeksi  steroid  pada model  ruptur  tendon  Achilles,  meskipun belum  dapat  dibuktikan  bahwa  proloterapi lebih  unggul  dibandingkan  kelompok kontrol dan injeksi normal saline. Penelitian lanjutan perlu dilakukan untuk menilai efek proloterapi  dan  steroid  ditinjau  dari
keseluruhan  aspek  histopatologis  dengan jumlah sampel yang lebih besar, serta lama pemberian dan dosis yang tepat.

## Daftar Pustaka
1. Thomopoulos  S,  Parks  WC,  Rifkin
DB,  Derwin  KA.  Mechanisms  of tendon  injury  and  repair.  J  Orthop Res. Juni 2015;33(6):832–9.
2. Lemme  NJ,  Li  NY,  DeFroda  SF, Kleiner J, Owens BD. Epidemiology of  Achilles  Tendon  Ruptures  in  the United States: Athletic and Nonathletic  Injuries  From  2012  to
2016.  Orthop  J  Sport  Med.  26
November 2018;6(11):232596711880823.
3. Chiodo CP, Glazebrook M, Bluman
EM, Cohen BE, Femino JE, Giza E, et  al.  Diagnosis  and  Treatment  of
Acute Achilles Tendon Rupture. Am Acad Orthop Surg. Agustus 2010;18(8):503–10.
4. Metz  R,  Verleisdonk  E-JMM,  van der  Heijden  GJ-M-G,  Clevers  G-J, Hammacher ER, Verhofstad MHJ, et al.  Acute  Achilles  Tendon  Rupture: Minimally  Invasive  Surgery  versus Non-operative Treatment with
Immediate  Full  Weightbearing--  A
Randomized Controlled Trial. Am J Sports Med. September 2008;36(9):1688–94. 5. Möller  M,  Movin  T,  Granhed  H,
Lind K, Faxén E, Karlsson J. Acute Rupture  of  Tendon  Achilles:  A Prospective  Randomised  Study  of Comparison  Between  Surgical  and Non-Surgical  Treatment.  J  Bone  Jt Surg. Agustus 2001;83(6):843–8.
6. Cetti  R,  Christensen  S-E,  Ejsted  R, Jensen NM, Jorgensen U. Operative versus  nonoperative  treatment  of Achilles tendon rupture. A prospective  randomized  study  and review of the literature. Am J Sports Med. 23 November 1993;21(6):791– 9.
7. Rabago  D,  Slattengren  A,  Zgierska A.  Prolotherapy  in  Primary  Care Practice. Prim Care - Clin Off Pract. 2010;37(1):65–80.
8. Reeves  KD,  Sit  RWS,  Rabago  DP.
Dextrose  Prolotherapy:  A  Narrative Review  of  Basic  Science,  Clinical
Research,  and Best Treatment Recommendations. Phys Med Rehabil Clin N Am.
2016;27(4):783–823.
9. Lazzara  MA.  The  Non-Surgical Repair  of  A  Complete  Achilles Tendon  Rupture  by  Prolotherapy: Biological  Reconstruction.  A  Case Report.  J  Orthop  Med.  7  Januari 2005;27(3):128–32.
10. Chan  O,  Havard  B,  Morton  S,
Pritchard M, Maffulli N, Crisp T, et al.  Outcomes  of  Prolotherapy  for Intra-tendinous  Achilles  Tears:  A Case  Series.  Muscles  Ligaments Tendons J. 2017;7(1):78–87.
11. Ryan  M,  Wong  A,  Taunton  J. Favorable Outcomes After Sonographically Guided Intratendinous Injection of Hyperosmolar Dextrose for Chronic Insertional  and  Midportion  Achilles
Tendinosis.  Am  J  Roentgenol. 2010;194(4):1047–53.
12. Kennedy JC, Willis RB. The Effects of  Local  Steroid  Injections  on
Tendons:  A  Biomechanical  and Microscopic Correlative Study. Am J Sports Med. 1976;4(1):11–21.
13. Tatari H, Koşay C, Baran O, Özcan O,  Özer  E.  Deleterious  Effects  of
Local  Corticosteroid  Injections  on
The  Achilles  Tendon  of  Rats.  Arch Orthop Trauma Surg. 2001;121(6):333–7. 14. Kapetanos  G.  The  Effect  of  The Local Corticosteroids on The Healing and Biomechanical Properties  of  The  Partially  Injured
Tendon.  Clin  Orthop  Relat  Res. Maret 1982;(163):170–9.
15. Karin  M.  New  Twists  in  Gene Regulation by Glucocorticoid Receptor: Is DNA Binding
Dispensable? Cell. Mei
1998;93(4):487–90.
16. Kydd  A,  Hart  D.  Effect  of Glucocorticoid Treatment on mRNA Levels  in  Normal  Rabbit  MCL, ACL,  and  Synovium.  Society. 2001;31(3):6505–6505.
17. Arslan  İ,  Yücel  I,  Öztürk  TB,
Karahan N, Orak MM, Midi A. The Effects of Corticosteroid Injection in The  Healthy  and  Damaged  Achilles Tendon  Model:  Histopathological and  Biomechanical  Experimental Study  in  Rats.  Turk  Patoloji  Derg. 2020;36(1):39–47.
18. Shrier I, Matheson GO, Kohl HWIII.
Achilles Tendonitis:
Are Corticosteroid  Injections  Useful  or Harmful?  Clin  J  Sport  Med. 1996;6(4).
19. Wang  JH-C,  Iosifidis  MI,  Fu  FH. Biomechanical Basis for
Tendinopathy.  Clin  Orthop  Relat Res. Februari 2006;443(:):320–32.
20. Ahn  KH,  Kim  HS,  Lee  WK,  Kim HW, Yun DH, Kim DH. The Effect of  the  Prolotherapy  on  the  Injured Achilles  Tendon  in  a  Rat  Model.
2002.
21. Martins  CAQ,  Bertuzzi  RT,  Tisot RA,  Michelin  AF,  do  Prado  JM, Stroher A, et al. Dextrose Prolotherapy and Corticosteroid
Injection  into  Rat  Achilles  Tendon.
Knee  Surgery,  Sport  Traumatol Arthrosc. 2012;20(10):1895–900.
22. Fullerton BD. High-Resolution
Ultrasound and Magnetic Resonance
Imaging to Document Tissue Repair After  Prolotherapy:  A  Report  of  3 Cases.  Arch  Phys  Med  Rehabil. 2008;89(2):377–85.
23. Yoshii  Y,  Zhao  C,  Schmelzer  JD,
Low PA, An K, Amadio PC. Effects of  multiple  injections  of  hypertonic dextrose in the rabbit carpal tunnel : a  potential  model  of  carpal  tunnel syndrome development. 2014;52–7.
24. Jensen  KT,  Rabago  DP,  Best  TM,
Patterson  JJ,  Jr  RV.  Response  of Knee Ligaments to Prolotherapy in a Rat Injury Model. :1347–57.
(a)
(b) (c)
(d)
Gambar 1. Pengamatan histopatologi mengggunakan perwarnaan hematoksilin dan eosin (HE) terhadap kepadatan fibroblast disekitar luka insisi tikus pada kelompok  dextrose (a); kelompok steroid (b); kelompok kontrol (c); kelompok saline (d).
Gambar 2. Grafik Dot Plot kepadatan fibroblast
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 1 2 3 4 5 6 KONTROL SALINE STEROID DEXTROSE
Tabel  1.  Hasil  pemeriksaan  histopatologi  terhadap  kepadatan  fibroblast  disekitar  luka insisi pada tikus
Kelompok Kontrol Saline Steroid Dextrose Subyek N1 2 1 1 2 N2 2 2 1 2 N3 2 1 1 2 N4 2 2 1 2 N5 1 2 1 2
Keterangan: skor 1 = kepadatan fibroblast 0-10%; skor 2 = kepadatan fibroblast 10-40%.
Tabel 2. Hasil analisis deskriptif
Kelompok Perlakuan N Rerata Median Standar Deviasi Standar Error Interval Kepercayaan 95% Batas Bawah Batas Atas Kontrol 5 1,80 2,00 0,447 0,200 1,24 2,36 Saline 5 1,60 2,00 0,548 0,245 0,92 2,28 Steroid 5 1,00 1,00 0,000 0,000 1,00 1,00 Dextrose 5 2,00 2,00 0,000 0,000 2,00 2,00

## Tabel 3. Hasil uji statistik Mann Whitney-U terhadap kepadatan fibroblast
Kelompok Kontrol Saline Steroid Dextrose Kontrol 0,513 0,014 * 0,317 Saline 0,513 0,050 * 0,134 Steroid 0,014 * 0,050 0,003 * Dextrose 0,317 0,134 0,003 *
*: Beda signifikan