## PENAPISAN  DAN PRODUKSI ANTIBAKTERI Lactobacillus plantarium NS(9) YANG DIISOLASI DARI BEKASAM IKAN NILA ATIN

## Screening and Production of Antibacterial from Lactobacillus plantarum NS(9)
Isolated from Nile Tilapia Bekasam

## Desniar*, Iriani Setyaningsih, Yoga Indra Purnama
Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga, Jalan Agatis, Telepon. (0251) 8622909-8622906, Faks.
(0251) 8622907, Bogor-Jawa Barat 16680. *Korespondensi: desniar2004@yahoo.com
Diterima: 15 Mei 2016/ Review: 15 Juli 2016/ Disetujui: 11 Agustus 2016
Cara sitasi: Desniar, Setyaningsih I, Purnama YI. 2016. Penapisan dan produksi antibakteri Lactobacillus plantarium NS(9) yang diisolasi dari bekasam ikan nila atin. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia 19(2): 132-139.

## Abstrak
Bakteri asam laktat telah digunakan sebagai biopreservatif  karena zat metabolit sekunder yang dihasilkannya aman dan memiliki aktivitas penghambatan terhadap bakteri enteropatogenik. Penelitian ini bertujuan menapis senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh Lactobacillus plantarum NS(9) dan memproduksi senyawa antibakterinya. Penelitian ini terdiri dari dua tahap. Tahap pertama adalah L. plantarum NS(9) dikultivasi pada suhu 37°C, selama 24 jam dalam kondisi semi anaerob. Supernatan bebas sel dari L. plantarum NS(9) diberi tiga perlakuan yaitu tidak dinetralkan (A), dinetralkan (N), dan pengendapan dengan ammonium sulfat 50% (P). Kemudian dilakukan uji aktivitas antibakteri terhadap E. coli , S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus , B. cereus , dan L. monocytogenes menggunakan metode difusi sumur agar. Tahap kedua, produksi antibakteri, L. plantarum NS(9) dikultivasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Setiap tiga jam dilakukan pengukuran optical dencity , pH, total asam tertitrasi, dan aktivitas antibakterinya. Hasil penapisan antibakteri menunjukkan bahwa supernatan  A menghasilkan aktivitas antibakteri terhadap kelima bakteri uji,  sedangkan supernatan N dan P tidak menghasilkan aktivitas antibakteri. Senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh L. plantarum NS(9) diduga bersifat asam. Produksi antibakteri dimulai pada 6 jam inkubasi dan terus meningkat seiring dengan pertumbuhan bakteri. Aktivitas antibakteri tertinggi terhadap E. coli , B. cereus dan L. monocytogenes pada akhir fase pertumbuhan eksponensial (12 -15 jam inkubasi) sedangkan S. aureus dan S. typhimurium ATCC 14028 masing-masing pada jam ke-21 dan ke-24 inkubasi. Aktivitas antibakteri seiring dengan peningkatan total asam tertitrasi (1,350-4,050%) dan penurunan pH (6-4) selama pertumbuhan.
Kata kunci: asam organik, bakteri asam laktat, bekasam, senyawa antibakteri

## Abstract
Lactic acid bacteria has been used as biopreservatif becouse produce a number of antibacterial substances are safety and has inhibitory activity against enteropatogenic bacteria. The aims of this study were to screen of antibacterial compounds produced by Lactobacillus plantarum NS (9) and to produce their antibacterial compounds. The research was devided into two stages. In the first stage was L. plantarum NS (9) inoculated at 37°C, for 24 hours in semi-anaerobic conditions. The cell-free supertnatant was given three treatment, ie not neutralized (A), neutralized (pH 7) (N), and precipitated with ammonium sulfate 50% (P). This three supernatant was assayed their antibacterial activity against E. coli , S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus , B. cereus and L. monocytogenes using the agar well diffusion method.  In the second stage, production of antibacterial compound was L. plantarum NS (9) inoculated at 37°C, for 24 hours in semi-anaerobic conditions. The Dencity Optical, value pH, acid total and antibacterial activity were measured every three hours during growth of bacteria. The results of the antibacterial screening showed that L. plantarum NS (9) produced inhibitory zone againts the five indicator bacteria from a supernatant, whereas N and P supernatant were not produced inhibitory zone.  This result indicated that inhibition
Available online: journal.ipb.ac.id/index.php/jphpi

## PENDAHULUAN
Bakteri asam laktat (BAL)  merupakan dasar biologi dari banyak makanan fermentasi, termasuk  fermentasi ikan seperti bekasam.
Bekasam merupakan salah satu produk olahan fermentasi ikan yang rasanya asam, banyak dikenal di daerah Sumatera Selatan dan Kalimantan Selatan. Bahan tambahan pada pembuatan bekasam adalah karbohidrat seperti nasi, kerak nasi, tepung tapioka, beras sangrai dan tape ketan. Penambahan karbohidrat bertujuan merangsang pertumbuhan bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat dapat menghasilkan senyawa antimikroba seperti asam organik (laktat, sitrat, dan lain-lain), diasetil, karbon dioksida, hidrogen peroksida dan bakteriosin (Diop et al. 2007; Galvez 2007). Asam laktat, asam asetat dan asam propionat telah digunakan secara luas dalam industri pangan sebagai aditif antibakteri (Threon & Lues 2011).
Bakteriosin didefinisikan sebagai antimikroba peptida yang disintesis oleh ribosom dan dapat membunuh bakteri yang berhubungan erat dengan penghasil bakteriosin. Umumnya terdiri atas 12-45 residu asam amino (Galvez et al. 2007). Sebagian bakteriosin dari BAL adalah kationik, hidrofobik atau molekul amphifilik yang terdiri atas   20-60 residu asam amino (Chen & Hoover 2003).
Desniar et al. (2013) telah melakukan isolasi BAL dari beberapa produk fermentasi bekasam. Salah satunya adalah bekasam ikan nila yang diperoleh dari pengolah lokal di Desa Sungai Pasir Kecamatan Ogan Komiring
Ilir (Sumatera Selatan). Bakteri L. plantarum
NS(9) adalah salah satu isolat asal bekasam ikan nila yang telah dilaporkan berpotensi
sebagai antibakteri terhadap bakteri patogen makanan.
Penelitian terhadap L. plantarum NS(9) ini perlu dilakukan untuk mengetahui senyawa antibakteri yang dihasilkannya dan memproduksinya. Penelitian ini bertujuan menapis senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh L. plantarum NS(9) dan produksi senyawa antibakterinya.

## BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan diantaranya adalah bakteri L. plantarum NS(9) (koleksi
Desniar et al. 2013), media MRS ( mann rogosa sharpe ) agar dan broth, NA (nutrient agar), NB (nutrient broth), MHA (mueller hinton agar), dan bakteri uji S. typhimurium ,
L. monocytogenes , E. coli , B. cereus , dan
S. aureus . Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain autoklaf (Yamato SM 52 Autoclave), shaker bath , timbangan digital, clean bench (Thermo Scientific Ltd.), incubator (Thermolyne type 42000 incubator), spektrofotometer (UV Vis RS 2500), sentrifuse (Centrutium Scientific Ltd.), dan digital colony counter .

## Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri dari dua tahap, yaitu  1) penapisan senyawa antibakteri dari L. plantarum NS(9) dan 2) produksi  senyawa antibakteri L. plantarum NS(9).

## Penapisan Senyawa Antibakteri
Isolat dikultivasi dalam media MRSB kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C, semi anaerob selama 24 jam. Supernatan bebas
activity of L. plantarum (NS 9) was caused by the lower pH of supernatant. The antibacterial compouds were produced at 6 hours of incubation and were increased to simultaneously with increasing of bacteria growth. The highest antibacterial activity against E. coli , B. cereus and L.monocytogenes  were produced at the end of the exponential growth phase (12 -15 hours incubation) while against S. aureus and S. typhimurium ATCC 14028 at 21 and 24 hour of incubation, respectively. The antibacterial activity also was increased to simultaniously with increasing of   acid total (1.350 to 4.050%) and decreasing of pH value (6-4) during growth of bacteria.
Keywords: antibacterial compound, lactic acid bacteria, organic acid
sel diperoleh dengan melakukan sentrifugasi kultur cair dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 o C. Supernatan bebas sel diberi tiga perlakuan yaitu pertama tidak dinetralkan (A) dan kedua dinetralkan (N) (pH 7±0,24) dengan menambahkan NaOH 1N. Kemudian disaring menggunakan mikrofilter dengan diameter saringan 0,22 μm (Diop et al. 2007). Perlakuan ketiga ialah pengendapan dengan ammonium sulfat 50% (P). Supernatan dari ketiga perlakuan diuji aktivitas penghambatannya pada bakteri uji E. coli , S. typhimurium ATCC 14028, L. monocytogenes , B. cereus , dan S. aureus dengan menggunakan metode difusi sumur agar.

## Produksi Senyawa Antibakteri
Kultivasi L. plantarum NS(9) dilakukan pada suhu 37 o C  selama 24 jam. Pengamatan dilakukan setiap tiga jam dengan parameter yang diamati ialah pertumbuhan bakteri dengan mengukur optical dencity pada panjang gelombang 660 nm (OD660) menggunakan spektrofotometer, perubahan pH diukur menggunakan pH meter (eutech instruments), total asam tertitrasi (Modifikasi
Moore et al. 2011), aktivitas antibakteri dengan metode difusi sumur agar (agar well difusion).
Pengukuran total asam tertitrasi sebagai berikut: supernatan bebas sel dilarutkan dengan indikator  fenoftalein, kemudian dititrasi oleh NaOH hingga warna larutan supernatan berubah kemerahan. Volume
NaOH yang terpakai digunakan untuk melakukan perhitungan % total asam
tertitrasilaktat yang dihitung menggunakan rumus:

## HASIL DAN PEMBAHASAN Penapisan Senyawa Antibakteri
Penapisan senyawa antibakteri L. plantarum NS(9) bertujuan untuk mengetahui potensi dan jenis antibakteri yang dihasilkannya. Hasil uji aktivitas antibakteri dapat dilihat pada Tabel 1. Substansi antibakteri dengan perlakuan tidak dinetralkan (A) menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap kelima bakteri uji. Akan tetapi pada Perlakuan dinetralkan (N) dan yang diendapkan (P) tidak menunjukkan adanya aktivitas antibakteri. Hasil ini dapat diduga bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh L. plantarum NS(9) adalah asam organik dan tidak memproduksi antibakteri yang termasuk ke dalam jenis protein seperti bakteriosin pada pengendapan amonium sulfat 50%.
Paludan-Muller et al. (2002) menyatakan bahwa peran utama BAL ialah untuk memecah karbohidrat sehingga menyebabkan terjadinya penurunan pH. Hal ini penting untuk menghambat bakteri pembusuk dan patogen dan menjamin keamanan produk.
Asam organik (terutama asam laktat) merupakan faktor pengawet utama pada produk fermentasi ikan. Menurut Pelaez dan Orue (2010), asam laktat mampu melemahkan permeabilitas Tabel 1 Aktivitas antibakteri terhadap lima bakteri uji Bakteri uji Rataan Diameter Zona Bening (mm) A N P S. aureus 2,5 - - B. cereus 6,5 - - E. coli 8,7 - - S. typhimurium 6,7 - - L. monocytogenes 8,5 - - % Asam Laktat = V NaOH x N NaOH x 90 x FP Bobot Sampel x 100%
bakteri Gram negatif dengan merusak membran luar bakteri Gram negatif. Asam laktat merupakan molekul yang larut dalam air sehingga mampu menembus ke dalam periplasma bakteri Gram negatif melalui protein porin pada membran luarnya.
Pelindung dari permeabilitas membran luar berupa lapisan lipopolisakarida yang terletak pada permukaan membran dirusak oleh asam laktat sehingga substrat antibakteri yang lain yaitu diasetil, bakteriosin, hidrogen peroksida dan lactoperidase system dapat berpenetrasi ke dalam membran sitoplasma.
Produksi Senyawa Antibakteri L. plantarum NS(9) Pertumbuhan, Perubahan pH dan Kadar Total Asam Tertitrasi Pertumbuhan, perubahan pH dan produksi asam laktat oleh L. plantarum NS(9) selama inkubasi 24 jam dapat dilihat pada Gambar 1. Pertumbuhan mulai terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-12 yang disebut dengan fase eksponensial (fase log). Cohen (2011) menyatakan bahwa fase eksponensial terjadi karena konsumsi nutrisi dalam media oleh kultur bakteri. Kultur berkembang pada growth rate yang konstan, dimana growth rate proporsional terhadap nilai OD. Pada fase ini semua sel dalam kultur mengalami pembelahan biner. Setiap generasi yang dilalui, jumlah sel bertambah dua kali lipat
dan grafik meningkat dalam bentuk garis lurus atau grafik logaritmik. Kurva pertumbuhan mengalami fase stasioner pada jam ke-12 hingga jam ke-24. Kim et al. (2011) menyatakan bahwa kondisi nutrien yang hilang akibat konsumsi, medium yang semakin asam, akumulasi toksik atau karena zat yang dapat menghambat pertumbuhan menyebabkan pertumbuhan semakin menurun sehingga level pertumbuhan akan mendekati nol dan penambahan jumlah sel tidak ada.
Pertumbuhan bakteri terjadi, maka terjadi perubahan pH, dimana pH kultur cenderung menurun dari jam ke-0 sampai jam ke-12 inkubasi, setelah itu pH cenderung stabil sampai akhir inkubasi (24 jam), hal ini menunjukkan bahwa ketika Sel mengalami pertumbuhan eksponensial, terjadi peningkatan sel yang pesat sehingga pertumbuhan bakteri menjadi cepat dan aktivitas metabolismenya menjadi tinggi. Hasil dari aktivitas metabolisme ini merupakan asam-asam organik yang menyebabkan pH medium menjadi asam. Produksi total asam tertitrasi selama pertumbuhan meningkat tajam dari jam ke-0 sampai ke-12 inkubasi. Setelah jam ke-12 inkubasi peningkatan total asam tertitrasi cenderung kecil dengan nilai pH yang cenderung stabil. Alvarado et al. (2006) menyatakan bahwa penurunan pH diakibatkan oleh aktivitas pengasaman yang dipengaruhi oleh jumlah dan jenis asam organik yang dihasilkan.
lipopolisakarida yang terletak pada permukaan membran dirusak oleh asam laktat sehingga substrat antibakteri yang lain yaitu diasetil, bakteriosin, hidrogen peroksida dan lactoperidase system dapat berpenetrasi ke dalam membran sitoplasma.
Produksi Senyawa Antibakteri L. plantarum NS(9)
Pertumbuhan, Perubahan pH dan Kadar Total Asam Tertitrasi
Pertumbuhan, perubahan pH dan  produksi asam laktat oleh L.  plantarum
NS(9) selama inkubasi 24 jam dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar  1.  Kurva  pertumbuhan  isolat  NS(9)  (■),  perubahan  pH  (▲)  dan total asam tertitrasi (♦) selama inkubasi 24 jam.
Pertumbuhan mulai terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-12  yang disebut dengan fase eksponensial (fase log). Cohen (2011) menyatakan bahwa fase eksponensial terjadi karena konsumsi nutrisi dalam media oleh kultur  bakteri. Kultur berkembang pada growth rate yang konstan, dimana growth rate proporsional terhadap nilai OD. Pada fase ini semua sel dalam kultur mengalami pembelahan biner. Setiap generasi yang dilalui, jumlah sel bertambah dua kali lipat dan grafik meningkat dalam bentuk garis lurus atau grafik logaritmik.
Kurva pertumbuhan mengalami fase stasioner pada jam ke-12 hingga jam
ke-24.  Kim et al . (2011) menyatakan bahwa kondisi nutrien yang hilang akibat konsumsi, medium yang semakin asam, akumulasi toksik atau karena zat yang dapat menghambat pertumbuhan menyebabkan pertumbuhan semakin menurun sehingga level pertumbuhan akan mendekati nol dan penambahan jumlah sel tidak ada.
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 0 3 6 9
12 15 18 21 24 Kad ar asam ter titra si (%)
OD 660 da n pH

## Lama inkubasi (jam)
Gambar 1 Kurva pertumbuhan isolat NS(9) ( ■ ), perubahan pH ( ▲ ) dan total asam tertitrasi ( ♦ ) selama inkubasi 24 jam
Asam laktat merupakan salah satu jenis asam organik yang diproduksi oleh bakteri asam laktat. Theron dan Lues (2011) menyatakan bahwa asam laktat merupakan salah satu metabolit utama dari bakteri asam laktat, namun pada bakteri heterofermentatif, bakteri asam laktat juga memproduksi asam asetat dan sebagian asam propionat dalam jumlah besar. Asidifikasi (pengasaman) yang diakibatkan asam organik meningkatkan aktivitas antibakterial baik asam organik maupun substansi inhibitor lain seperti bakteriosin.

## Produksi dan Aktivitas Antibakteri
Antibakteri adalah salah satu metabolit yang dihasilkan oleh BAL. Aktivitas antibakteri yang dihasilkan oleh L. plantarum NS(9) selama pertumbuhan bakteri terhadap kelima  bakteri  uji  dapat  dilihat  pada Gambar 2.
Supernatan bebas sel menunjukkan adanya aktivitas antibakteri terhadap kelima bakteri uji pada jam ke-6 inkubasi dengan pH supernatan 4,5 kecuali terhadap S.
aureus aktivitas antibakteri mulai dihasilkan pada supernatan bebas sel pada jam ke-12 inkubasi. Pola zona hambat yang terbentuk dari supernatan bebas sel terhadap kelima bakteri uji berbeda. Senyawa antibakteri yang dihasilkan juga berbeda sehingga menunjukkan aktivitas yang berbeda pada setiap bakteri uji.
Substansi antibakteri yang dihasilkan L.
plantarum NS(9) memiliki daya hambat yang paling rendah untuk S. aureus dibandingkan daya hambat terhadap bakteri uji lainnya. Diameter penghambatan terbesar (6 mm) pada bakteri L. monocytogenes , B. cereus , E. coli dan S. typhimurium dihasilkan masing- masing pada jam ke-12, ke-12, ke-15 dan ke- 24. Daya hambat zat antibakteri asam organik terhadap kelima bakteri patogen tersebut juga dipengaruhi oleh pH. Bakteri patogen seperti L. monocytogenes dan B. cereus terhambat maksimum pada jam ke-12 saat pH supernatan mencapai 4. Kedua bakteri uji tersebut sudah tidak mampu mentolerir pH yang terjadi pada jam tersebut sehingga mengakibatkan zona hambat yang terbentuk telah mencapai titik maksimal pada jam ke-12. Bakteri uji seperti E. coli dan S.
typhimurium adalah bakteri Gram negatif. Keduanya termasuk ke dalam golongan bakteri enteropatogenik. Bakteri jenis ini biasanya tahan terhadap pH yang cukup rendah. Korelasi dengan zona bening yang terbentuk adalah, butuh konsentrasi asam organik yang
Gambar 2. Produksi antibakteri L. plantarum NS(9)  selama inkubasi 24 jam dan aktivitasnya  terhadap bakteri uji E. coli (EC), S. typhimurium ATCC 14028  (ST), L. monocytogenes (LM), B. cereus (BC) dan S. aureus
(SA)
Supernatan bebas sel menunjukkan  adanya  aktivitas  antibakteri  terhadap kelima  bakteri uji pada jam ke-6 inkubasi dengan pH supernatan 4,5  kecuali terhadap S. aureus aktivitas antibakteri mulai dihasilkan pada supernatan bebas sel pada jam ke-12 inkubasi.  Pola zona hambat yang terbentuk dari supernatan bebas sel terhadap kelima bakteri uji berbeda.  Senyawa  antibakteri yang dihasilkan    diduga  berbeda sehingga menunjukkan aktivitas yang berbeda pada setiap bakteri uji.
Substansi antibakteri yang dihasilkan L. plantarum NS(9)  memiliki daya hambat yang paling rendah untuk S. aureus dibandingkan daya hambat terhadap bakteri uji lainnya. Diameter penghambatan terbesar  (6 mm)  pada bakteri L. monocytogenes, B. cereus, E. coli dan S. typhimurium dihasilkan masing-masing pada jam ke-12, ke-12, ke-15 dan ke-24.  Daya hambat zat antibakteri asam organik terhadap kelima bakteri patogen tersebut juga dipengaruhi oleh pH.
Bakteri patogen seperti L.monocytogenes dan B. cereus terhambat maksimum pada jam ke-12 saat pH supernatan mencapai 4. Kedua bakteri uji tersebut sudah tidak mampu mentolerir pH yang terjadi pada jam tersebut sehingga mengakibatkan zona hambat yang terbentuk telah mencapai titik maksimal pada jam ke-12.
Bakteri uji seperti E. coli dan S. typhimurium adalah bakteri Gram negatif.
Keduanya termasuk ke dalam golongan bakteri enteropatogenik. Bakteri jenis ini
Gambar 2 Produksi antibakteri L. plantarum NS(9)  selama inkubasi 24 jam dan aktivitasnya terhadap bakteri uji E. coli (EC), S. typhimurium ATCC  14028  (ST),
L. monocytogenes (LM), B. cereus (BC) dan S. aureus (SA)
8
Gambar 2. Produksi antibakteri L. plantarum NS(9)  selama inkubasi 24 jam dan aktivitasnya  terhadap bakteri uji E. coli (EC), S. typhimurium ATCC 14028  (ST), L. monocytogenes (LM), B. cereus (BC) dan S. aureus (SA)
Supernatan bebas sel menunjukkan  adanya  aktivitas  antibakteri  terhadap kelima  bakteri uji pada jam ke-6 inkubasi dengan pH supernatan 4,5  kecuali terhadap S. aureus aktivitas antibakteri mulai dihasilkan pada supernatan bebas sel pada jam ke-12 inkubasi.  Pola zona hambat yang terbentuk dari supernatan bebas sel terhadap kelima bakteri uji berbeda.  Senyawa  antibakteri yang dihasilkan    diduga  berbeda sehingga menunjukkan aktivitas yang berbeda pada setiap bakteri uji.
Substansi antibakteri yang dihasilkan L. plantarum NS(9)  memiliki daya hambat yang paling rendah untuk S. aureus dibandingkan daya hambat terhadap bakteri uji lainnya. Diameter penghambatan terbesar  (6 mm)  pada bakteri L. monocytogenes, B. cereus, E. coli dan S. typhimurium dihasilkan masing-masing pada jam ke-12, ke-12, ke-15 dan ke-24.  Daya hambat zat antibakteri asam organik terhadap kelima bakteri patogen tersebut juga dipengaruhi oleh pH.
Bakteri patogen seperti L.monocytogenes dan B. cereus terhambat maksimum pada jam ke-12 saat pH supernatan mencapai 4. Kedua bakteri uji tersebut sudah tidak mampu mentolerir pH yang terjadi pada jam tersebut sehingga mengakibatkan zona hambat yang terbentuk telah mencapai titik maksimal pada jam ke-12.
Bakteri uji seperti E. coli dan S. typhimurium adalah bakteri Gram negatif.
Keduanya termasuk ke dalam golongan bakteri enteropatogenik. Bakteri jenis ini
Gambar 2. Produksi antibakteri L. plantarum NS(9)  selama inkubasi 24 jam dan aktivitasnya  terhadap bakteri uji E. coli (EC), S. typhimurium ATCC 14028  (ST), L. monocytogenes (LM), B. cereus (BC) dan S. aureus (SA)
Supernatan bebas sel menunjukkan  adanya  aktivitas  antibakteri  terhadap kelima  bakteri uji pada jam ke-6 inkubasi dengan pH supernatan 4,5  kecuali terhadap S. aureus aktivitas antibakteri mulai dihasilkan pada supernatan bebas sel pada jam ke-12 inkubasi.  Pola zona hambat yang terbentuk dari supernatan bebas sel terhadap kelima bakteri uji berbeda.  Senyawa  antibakteri yang dihasilkan    diduga  berbeda sehingga menunjukkan aktivitas yang berbeda pada setiap bakteri uji.
Substansi antibakteri yang dihasilkan L. plantarum NS(9)  memiliki daya hambat yang paling rendah untuk S. aureus dibandingkan daya hambat terhadap bakteri uji lainnya. Diameter penghambatan terbesar  (6 mm)  pada bakteri L. monocytogenes, B. cereus, E. coli dan S. typhimurium dihasilkan masing-masing pada jam ke-12, ke-12, ke-15 dan ke-24.  Daya hambat zat antibakteri asam organik terhadap kelima bakteri patogen tersebut juga dipengaruhi oleh pH.
Bakteri patogen seperti L.monocytogenes dan B. cereus terhambat maksimum pada jam ke-12 saat pH supernatan mencapai 4. Kedua bakteri uji tersebut sudah tidak mampu mentolerir pH yang terjadi pada jam tersebut sehingga mengakibatkan zona hambat yang terbentuk telah mencapai titik maksimal pada jam ke-12.
Bakteri uji seperti E. coli dan S. typhimurium adalah bakteri Gram negatif.
Keduanya termasuk ke dalam golongan bakteri enteropatogenik. Bakteri jenis ini
8
Gambar 2. Produksi antibakteri L. plantarum NS(9)  selama inkubasi 24 jam dan aktivitasnya  terhadap bakteri uji E. coli (EC), S. typhimurium ATCC 14028  (ST), L. monocytogenes (LM), B. cereus (BC) dan S. aureus (SA)
Supernatan bebas sel menunjukkan  adanya  aktivitas  antibakteri  terhadap kelima  bakteri uji pada jam ke-6 inkubasi dengan pH supernatan 4,5  kecuali terhadap S. aureus aktivitas antibakteri mulai dihasilkan pada supernatan bebas sel pada jam ke-12 inkubasi.  Pola zona hambat yang terbentuk dari supernatan bebas sel terhadap kelima bakteri uji berbeda.  Senyawa  antibakteri yang dihasilkan    diduga  berbeda sehingga menunjukkan aktivitas yang berbeda pada setiap bakteri uji.
Substansi antibakteri yang dihasilkan L. plantarum NS(9)  memiliki daya hambat yang paling rendah untuk S. aureus dibandingkan daya hambat terhadap bakteri uji lainnya. Diameter penghambatan terbesar  (6 mm)  pada bakteri L. monocytogenes, B. cereus, E. coli dan S. typhimurium dihasilkan masing-masing
pada jam ke-12, ke-12, ke-15 dan ke-24.  Daya hambat zat antibakteri asam organik terhadap kelima bakteri patogen tersebut juga dipengaruhi oleh pH.
Bakteri patogen seperti L.monocytogenes dan B. cereus terhambat maksimum pada jam ke-12 saat pH supernatan mencapai 4. Kedua bakteri uji tersebut sudah tidak mampu mentolerir pH yang terjadi pada jam tersebut sehingga mengakibatkan zona hambat yang terbentuk telah mencapai titik maksimal pada jam ke-12.
Bakteri uji seperti E. coli dan S. typhimurium adalah bakteri Gram negatif.
Keduanya termasuk ke dalam golongan bakteri enteropatogenik. Bakteri jenis ini
8
Gambar 2. Produksi antibakteri L. plantarum NS(9)  selama inkubasi 24 jam dan aktivitasnya  terhadap bakteri uji E. coli (EC), S. typhimurium ATCC 14028  (ST), L. monocytogenes (LM), B. cereus (BC) dan S. aureus
(SA)
Supernatan bebas sel menunjukkan  adanya  aktivitas  antibakteri  terhadap kelima  bakteri uji pada jam ke-6 inkubasi dengan pH supernatan 4,5  kecuali terhadap S. aureus aktivitas antibakteri mulai dihasilkan pada supernatan bebas sel pada jam ke-12 inkubasi.  Pola zona hambat yang terbentuk dari supernatan bebas sel terhadap kelima bakteri uji berbeda.  Senyawa  antibakteri yang dihasilkan    diduga  berbeda sehingga menunjukkan aktivitas yang berbeda pada setiap bakteri uji.
Substansi antibakteri yang dihasilkan L. plantarum NS(9)  memiliki daya hambat yang paling rendah untuk S. aureus dibandingkan daya hambat terhadap bakteri uji lainnya. Diameter penghambatan terbesar  (6 mm)  pada bakteri L. monocytogenes, B. cereus, E. coli dan S. typhimurium dihasilkan masing-masing pada jam ke-12, ke-12, ke-15 dan ke-24.  Daya hambat zat antibakteri asam organik terhadap kelima bakteri patogen tersebut juga dipengaruhi oleh pH.
Bakteri patogen seperti L.monocytogenes dan B. cereus terhambat maksimum pada jam ke-12 saat pH supernatan mencapai 4. Kedua bakteri uji tersebut sudah tidak mampu mentolerir pH yang terjadi pada jam tersebut sehingga mengakibatkan zona hambat yang terbentuk telah mencapai titik maksimal pada jam ke-12.
Bakteri uji seperti E. coli dan S. typhimurium adalah bakteri Gram negatif.
Keduanya termasuk ke dalam golongan bakteri enteropatogenik. Bakteri jenis ini
8
Gambar 2. Produksi antibakteri L. plantarum NS(9)  selama inkubasi 24 jam dan aktivitasnya  terhadap bakteri uji E. coli (EC), S. typhimurium ATCC
14028  (ST), L. monocytogenes (LM), B. cereus (BC) dan S. aureus (SA)
Supernatan bebas sel menunjukkan  adanya  aktivitas  antibakteri  terhadap kelima  bakteri uji pada jam ke-6 inkubasi dengan pH supernatan 4,5  kecuali terhadap S. aureus aktivitas antibakteri mulai dihasilkan pada supernatan bebas sel pada jam ke-12 inkubasi.  Pola zona hambat yang terbentuk dari supernatan bebas sel terhadap kelima bakteri uji berbeda.  Senyawa  antibakteri yang dihasilkan    diduga  berbeda sehingga menunjukkan aktivitas yang berbeda pada setiap bakteri uji.
Substansi antibakteri yang dihasilkan L. plantarum NS(9)  memiliki daya hambat yang paling rendah untuk S. aureus dibandingkan daya hambat terhadap bakteri uji lainnya. Diameter penghambatan terbesar  (6 mm)  pada bakteri L. monocytogenes, B. cereus, E. coli dan S. typhimurium dihasilkan masing-masing pada jam ke-12, ke-12, ke-15 dan ke-24.  Daya hambat zat antibakteri asam organik terhadap kelima bakteri patogen tersebut juga dipengaruhi oleh pH.
Bakteri patogen seperti L.monocytogenes dan B. cereus terhambat maksimum pada jam ke-12 saat pH supernatan mencapai 4. Kedua bakteri uji tersebut sudah tidak mampu mentolerir pH yang terjadi pada jam tersebut sehingga mengakibatkan zona hambat yang terbentuk telah mencapai titik maksimal pada jam ke-12.
Bakteri uji seperti E. coli dan S. typhimurium adalah bakteri Gram negatif.
Keduanya termasuk ke dalam golongan bakteri enteropatogenik. Bakteri jenis ini
lebih banyak untuk menghambat bakteri ini. Zona bening maksimum yang ditunjukkan pada bakteri uji E. coli terbentuk pada jam ke- 15 inkubasi, lebih lama daripada bakteri uji L. monocytogenes dan B. cereus , begitu juga dengan bakteri uji Salmonella typhimurium , dimana zona hambat maksimum ditunjukkan pada jam ke-24 inkubasi. Alvarez-Ordonez et al. (2009) menyatakan S. typhimurium diketahui dengan kemampuannya bertahan hidup pada pH ekstrem, yaitu 3. Kemampuan hidup pada pH ekstrem tersebut tidak menjadikan bakteri ini dapat hidup dengan normal ketika bereaksi dengan asam organik. Sifat adaptasi asam dari S. typhimurium juga didapat dari peningkatan osmotik, toleransi terhadap garam, dan proteksi silang menjadi sistem laktoperoksidase yang aktif. Aktivitas senyawa antibakteri terhadap L. monocitogenes , B. cereus dan E. coli memiliki pola yang sama yaitu meningkat dari jam ke-6 sampai jam ke-12, kecuali pada E. coli meningkat sampai jam ke-15 inkubasi dengan zona hambat 2-6 mm dan setelah itu sampai akhir inkubasi (24 jam) cenderung stabil (5 mm). Senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh L. plantarum NS(9) bersamaan dengan pertumbuhannya dimana aktivitasnya maksimum ketika pertumbuhannya juga maksimum.
Aktivitas antibakteri terhadap S. aureus mulai dihasilkan pada jam ke-12 inkubasi dan terus meningkat maksimum sampai jam ke-21 setelah itu aktivitas antibakterinya menurun. Diduga senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh L. plantarum NS(9)  yang aktif terhadap S. aureus diproduksi pada fase stasioner, dan ini berbeda dengan senyawa antibakteri yang aktif terhadap bakteri uji yang lain.
Hasil yang  berbeda juga ditunjukkan oleh pola aktivitas antibakteri terhadap S. typhimurium ATCC 14028, dimana aktivitas antibakteri meningkat dari jam ke-6 sampai jam ke-24 inkubasi. Hal ini menunjukkan bahwa Antibakteri masih memungkinkan diproduksi setelah jam ke-24 inkubasi apabila lama inkubasi diperpanjang.
Hasil penapisan diduga senyawa antibakteri yang dihasilkan L. plantarum
NS(9)  berupa asam organik diantaranya yang dominan adalah asam laktat dan asam asetat. Asam laktat dan asetat yang dihasilkan oleh BAL termasuk generally regarded as safe (GRAS) dan digunakan dalam beberapa makanan sebagai bahan tambahan untuk meningkatkan flavor dan daya awet serta sebagai tindakan pencegahan keamanan terhadap mikroorganisme yang tidak diinginkan. Asam ini dan garamnya digunakan dalam makanan pada level 1-2%. Bakteri uji memiliki ketahanan masing- masing terhadap jenis asam organik yang berbeda-beda. Garner et al. (2006) telah melaporkan bahwa L. monocytogenes memiliki kerentanan yang lebih besar terhadap asam laktat dibandingkan dengan asam asetat. Borsoi et al. (2011)  menyatakan bahwa E. coli dan S. typhimurium memiliki kerentanan yang tinggi terhadap asam laktat dan asam asetat.
B. cereus yang merupakan golongan bakteri Gram positif memiliki kerentanan yang tinggi terhadap asam laktat dan asam propionat. Bakteri uji S. aureus memiliki ketahanan asam yang paling tinggi dibandingkan dengan empat bakteri uji lainnya. Charlier et al. (2009) mengatakan bahwa S. aureus akan bertambah rentan terhadap asam apabila terjadi peningkatan kadar garam. Sebaliknya Wallin-Carlquist et al. (2010) menyatakan bahwa bakteri S. aureus juga sangat peka terhadap aktivitas asam asetat.
Asam asetat umumnya bersifat bakteriostatik pada 0,2% tetapi bersifat bakteriosidal diatas 0,3%, dan lebih efektif terhadap bakteri Gram-negatif. Akan tetapi pengaruh ini tergantung pH dan pengaruh bakterisidal lebih nyata pada pH rendah (<4,5). Asam laktat dan garamnya digunakan dalam makanan lebih untuk peningktan flavor daripada untuk pengaruh antibakterinya, khususnya ketika digunakan diatas pH 5,0. Studi terakhir menunjukkan bahwa asam laktat mempunyai pengaruh antibakteri yang nyata ketika digunakan dalam makanan
pada level 1-2%; pada pH 5 atau lebih pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif dikurangi, yang menunjukkan aksi bakteriostatik meningkat.  Asam laktat pada pH<5 mempunyai pengaruh bakterisidal khususnya terhadap bakteri Gram negatif. Asam laktat tidak mempunyai pengaruh fungistatik dalam lingkungan makanan (Ray 2004).
Asam terdisosiasi menjadi ion hidrogen dan anion toksik yang mampu mengganggu fungsi fisiologis sel dan mendestabilasi protein sel (Theron dan Lues 2011). Asam terdisosiasi yang menembus membran akan menjadi penyebab kematian sel (Bjornsdottir et al. 2006).

## KESIMPULAN
Senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh L. plantarum NS(9) diduga bersifat asam yang berasal dari asam organik yang dihasilkan BAL. Produksi antibakteri dimulai pada 6 jam inkubasi dan terus meningkat seiring dengan pertumbuhan bakteri. Aktivitas antibakteri tertinggi terhadap E. coli , B. cereus dan L. monocytogenes pada akhir fase pertumbuhan eksponensial (12 - 15 jam inkubasi) sedangkan S. aureus dan S. typhimurium masing-masing pada jam ke-21 dan ke-24 inkubasi. Aktivitas antibakteri seiring dengan peningkatan total asam tertitrasi (1,350-4,050%) dan penurunan pH (6-4)  selama pertumbuhan. Setiap bakteri uji memiliki ketahanan masing-masing terhadap jenis asam organik yang berbeda- beda. Bakteri uji S. aureus memiliki ketahanan asam yang paling tinggi dibandingkan dengan empat bakteri uji lainnya.

## DAFTAR PUSTAKA
Alvarado S, Garcia Almandarez BE, Martin SE, Regalado C.  2006.  Food-associated lactic acid bacteria with antimicrobial potential from tradisional Mexican foods. Microbiologia 48:206-268.
Alvarez-Ordonez A, Fernandez A, Bernardo A, Lopez M. 2009. Comparison of acids on the induction of an acid tolerance response in
Salmonella typhimurium , consequences for food safety. Journal Meat Science 81(1): 65–70.
Bjornsdottir K, Breidt F, McFeeters RF. 2006.
Protective effects of organic acid on survival of Escherichia coli O157:H7 in acidic environtments. Applied and Environtmental Microbiology 72(1): 660-664. Borsoi A, Santos LR, Diniz GS, Salle CTP, Moraes HLP, Nascimento VP. 2011. Salmonella fecal excretion control in broiler chickens by organic acids and essential oils blend feed added. Brazilian Journal of Poultry Science 13(1): 65-69 Chen H, Hoover DG.  2003.  Bacteriosins and their food apllications. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 2. Charlier C, Cretenet M, Even S, Le Loir Y. 2009.
Interactions between S taphylococcus aureus and lactic acid bacteria: and old story with new perspective. International Journal of
Microbiology 131: 30-39
Cohen GN. 2011. Microbial Biochemistry: Second Edition. London: Springer Science. p. 7-10.
Diop MB, Dubois-Dauphin R, Tine E, Ngom
A, Destain J, Thonart P. 2007. Bacteriocin producers from traditional food products. Biotechnol Agron Soc Environ 11: 275–281.
Desniar, Rusmana I, Suwanto A, Mubarik NR. 2013. Characterization of lactic acid bacteria isolated from an Indonesian fermented fish (bekasam) and their antimicrobial activity against pathogenic bacteria. Emir. J. Food
Agric 25 (6): 489-494.
Garner MR, James KE, Callahan MC. 2006.
Exposure to salt and organic acid increases the ability of Listeria monocytogenes to invade caco-2 cells but decrease its ability to survive gastric stress. Applied and Environtmental Microbiology 72(8): 5384- 5395. Gálvez A, Abriouel H, López RL, Omar NB. 2007. Bacteriocin-based strategies for food biopreservation. Int J Food Microbiol 120:
51–70. Kim K, Kim JJ, Masui R, Kuramitsu S, Sung
MH. 2011. A commensal symbiotic interrelationship for the growth of
Symbiobacterium toebii with its partner bacterium, Geobacillus tobii . BMC Research
Notes 4(437): 1-9. Paludan-Muller C, Madsen M , Sophanodora P, Gram L, Møller PL. 2002. Fermentation and microflora of plaa-som, a Thai fermented fish product prepared with different salt concentrations. Int J Food Microbiol 73:
61–70.
Pelaez SM, Orue SM. 2010. Feeding strategies for the control of Salmonella in pigs. Food Science and Technology Bulletin 5(1): 39-47. Ray B. 2004. Fundamental Food Microbiology.
Ed. ke-3. New York: CRC Press. p. 225-231,
483-490.
Theron MM, Lues JFR. 2011. Organic Acids and Food Preservation. United States: CRC Press. p. 273. Wallin-Carlquist N, Cao R, Marta D, da Silva AS, Schelin J, Radstrom P. 2010. Acetic acid increases the phage-encoded enterotoxin A expression in Staphylococcus aureus . BMC Microbiology 10(147): 1-10.