Abstrak— Biogrouting  adalah  teknologi  yang  mensimulasikan proses  diagenesis  yaitu  transformasi  butiran  pasir  menjadi batuan  pasir  (calcarinite/sandstone). Permasalahan  dalam penelitian  ini  adalah  bagaimana  mengoptimasi  produk  urease dengan melakukan uji aktifitas, mengisolasi, mempurifikasi dan mengkarakterisasi  urease  serta  mengaplikasikannya  sebagai material  grout.  Uji  aktifitas  dan  optimasi  dilakukan  dengan menumbuhkan isolat Oceanobacillus sp. pada 2 variasi medium (B4  urea  dan  B4  urin),  5  variasi  pH  (4-8)  dan  2  variasi  suhu (25°C  dan  29°C).  Hasil  uji  aktifitas  dan  optimasi  selanjutnya dipurifikasi  menggunakan  ammonium  sulfat  (Uji  Bradford) dan  dicari  titik  isoelektriknya.  Kemudian  hasil  protein presipitat dikarakterisasi menggunakan SDS-PAGE. Berdasarkan  hasil  penelitian  diketahui  bahwa  aktifitas  urease paling  tinggi  adalah  70.21  unit/ml.  Urease  optimal  dihasilkan pada  isolat  yang  ditumbuhkan  pada  B4  urea  pada  pH  7 temperatur  25°C.  Berat  molekul  urease  yang  dikarakterisasi menggunakan  SDS-PAGE  adalah  440  kDa,  sedangkan  titik isoelektriknya  pada  pH  6.  Urease  dapat  dijadikan  material grout karena memiliki kemampuan untuk melakukan sementasi pada aplikasi sederhana biogrouting.
Kata  Kunci — Biogrouting,  diagenesis,  Oceanobacillus  sp., urease.

## I. PENDAHULUAN
ROUT adalah  material  konstruksi  yang  terdiri  dari suspensi  (semen,  tanah,  lempung,  pozzolan,  bentonite dan  lain-lain)  bahan  kimia  seperti  silikat,  uretan,  urea, akrilamid  yang  digunakan  sebagai  pengeras  [1].  Proses pengisian  material  konstruksi  pada  pori  dan  celah  diantara partikel  tanah  dengan  kedalaman  tertentu  dikenal  sebagai grouting.  Grouting  dapat  digunakan  untuk  memperbaiki struktur  tanah  karena  pengendapan  grout  dapat  mengubah karakter  fisik  tanah  [2],[3].  Sampai  saat  ini  grouting  untuk tujuan rancang bangun dilakukan secara kimia menggunakan presipitasi  silika  (waterglass)  [1].  Silika  secara  spontan dapat mengendap ketika dicampur dengan asam bikarboksilat.  Reaksi  ini  merupakan  kelemahan  grouting secara  kimia,  karena  hanya  dapat  diaplikasikan  pada  titik injeksi  terdekat  dengan  tanah  yang  diperbaiki  strukturnya [4].
Di Indonesia metode grouting secara biologi (biogrouting)  mulai  dikembangkan  lima  tahun  terakhir. Biogrouting  merupakan  teknologi  yang  mensimulasikan proses  diagenesis,  yaitu  transformasi  butiran  pasir  menjadi batuan pasir [5]. Secara alami, proses ini memerlukan waktu hingga  jutaan  tahun.  Menurut  Van  Paasen  (2008)  proses diagenesis  tersebut  dapat  dipercepat  menggunakan  bakteri penghasil urease [1].
Aplikasi  bakteri  laut  sebagai  material  grout  telah  banyak dilakukan  [5].  Keterbatasan  faktor  abiotik,  seperti  pH  dan suhu  menyebabkan  kurang  optimalnya  proses  biogrouting [6].  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Keikha  et  al  (2012) menggunakan isolat bakteri laut (Bacillus sp.) menunjukkan bahwa  aplikasi  secara  langsung  pada  pasir  kurang  efisien dalam  proses  diagenesis.  Hal  ini  disebabkan  isolat  Bacillus sp.  sulit  masuk  ke  dalam  pori-pori  tanah.  Berdasarkan penelitian,  material  grout  dari  urease  dapat  diaplikasikan pada  pasir  dengan  kondisi  salin  selama  24  jam.  Proses grouting  ditandai  dengan  memadatnya  pasir  dan  perubahan pH tanah menjadi basa.
Kaltwasser  (1972)  dan  Ramakhrisnan  et  al  (2001) menyebutkan  bahwa  salah  satu  cara  untuk  meningkatkan efisiensi  dan  meminimalisir  dampak  terhadap  lingkungan adalah  memafaatkan  urease  sebagai  material  grouting. Urease  merupakan  enzim  yang  dihasilkan  oleh  bakteri  laut pengendap  karbonat.  Urease  berperan  sebagai  katalisator dan tidak bersifat toksik [7],[8].  Penelitian ini bertujuan untuk  mengoptimasi,  mengisolasi  serta  mengkarakterisasi produksi urease dengan memvariasikan kondisi pertumbuhan bakteri  dan  komposisi  mediumnya.  Urease  yang  diperoleh selanjutnya  diaplikasikan  secara  sederhana  dalam  proses biogrouting.
Pentingnya  urease  dalam  proses  biogrouting  dan  sampai sekarang  belum  ada  penelitian  mengenai  produksi  urease sebagai  material  grout  [9],  maka  dalam  penelitian  ini dilakukan  produksi  melalui  pengukuran  titik  isoelektrik, purifikasi  menggunakan  ammonium  sulfat  dan  karakterisasi menggunakan  SDS-PAGE,  serta  aplikasinya  dalam  proses biogrouting.  Berdasarkan  hasil  penelitian  diketahui  bahwa bakteri  biogrout  tumbuh  optimum  pada  medium  B4  urea dengan pH 7 dan temperatur 25 ° C, sedangkan pada medium B4  urin  bakteri  biogrout  tumbuh  optimum  pada  temperatur 25 ° C  dan  pH  8.  Pengukuran  aktifitas  urease  mencapai 144.12 unit/ml. Berdasarkan karakterisasi protein menggunakan  ammonium  sulfat,  protein  mengendap maksimal  pada  konsentrasi  90%  (70.21  unit/ml).  Titik isoelektrik  urease  adalah  pada  pH  6  dan  memiliki  berat molekul 440-500 kDa. Urease dapat dijadikan material grout karena  memiliki  kemampuan  untuk  melakukan  sementasi (diagenesis) pada aplikasi sederhana biogrouting menggunakan pasir laut dengan kondisi salin.

## BIOGROUTING: Produksi Urease Dari Bakteri Laut (Oceanobacillus sp.) Pengendap Karbonat
Sidratu Ainiyah 1 , Endry Nugroho Prasetyo 1 , Puspita Lisdiyanti 2 dan Maharani Pertiwi Koentjoro 1 1 Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia
2 Pusat Penelitian Bioteknologi – LIPI, Cibinong e-mail: endry@bio.its.ac.id
G

## II. METODOLOGI

## A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  selama  6  bulan  mulai  Januari 2014 sampai bulan Juni 2014 di Laboratorium Mikrobiologi dan  Bioteknologi,  Jurusan  Biologi,  Intitut  Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong-Bogor dan
Laboratorium Penyakit Tropis(TDC/Tropical Desease Center) Universitas
Airlangga.
B. Metode yang Digunakan

## Optimasi dan Uji Aktifitas Urease
Isolat  Oceanobacillus  sp.  ditumbuhkan  dalam  medium produksi (marine agar) dan medium yang mengandung urin. Urin yang digunakan adalah urin wanita tidak hamil, usia 22 tahun,  dan  memiliki  pH  5.  Diinkubasi  pada  inkubator bergoyang (rotary shaker) 150 rpm pada suhu ruang (30°C) selama  72  jam.  Aktivitas  urease  diukur  menggunakan metode Weatherburn (1967) yang dimodifikasi (Gambar 1), yaitu  Na 2 HPO 4 digunakan  dalam  larutan  alkalin  hipoklorit dibandingkan dengan NaOH dan waktu pembentukan warna ditambah dari 20 menit menjadi 30 menit.
Reaksi  dilakukan  dalam  tabung  reaksi  yang  berisi  100  µl sampel, 500 µl urea 50 mM dan 500 µl buffer KH 2 PO 4 100 mM  (pH  8,0)  sehingga  total  volume  adalah  1,1  ml. Campuran  reaksi  diinkubasi  dalam  water  bath  dengan  suhu 37°C  selama  30  menit.  Reaksi  dihentikan  dengan menambahkan100 µl campuran reaksi ke dalam tabung yang berisi 1000 µl larutan phenol-sodium nitroprusside. Larutan alkalin  hipoklorit  sebanyak  1000  µl  ditambahkan  ke  dalam tabung  dan  diinkubasi  pada  suhu  ruang  selama  30  menit. Selanjutnya diukur optical density (OD) dengan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  630  nm  dan dibandingkan  dengan  kurva  standar  (NH 4 ) 2 SO 4 .  Satu  unit enzim  berarti  jumlah  enzim  yang  dibutuhkan  untuk membebaskan  1  µmol  NH 3 dari  urea  per  menit  dalam kondisi standar [10].
Gambar  1.  Optimasi  dan  Uji  Aktivitas  Urease  Menggunakan  Kurva Standart

## Isolasi dan Purifikasi Urease Metode Presipitasi Protein Menggunakan Amonium Sulfat
Protein  ekstrak  kasar  yang  dihasilkan  dari  proses sentrifugasi  dipresipitasi  dengan  ammonium  sulfat  hingga mencapai  konsentrasi  ammonium  sulfat  100%.  Setelah proses  presipitasi  didapatkan  endapan  protein  yang kemudian  diresuspensikan  menggunakan  buffer  salin  fosfat hingga  didapat  protein  presipitat  sebanyak  10  ml.  Protein presipitat yang dihasilkan kemudian ditentukan konsentrasinya menggunakan metode Bradford [11].

## Metode Isoelektrik Point
Titik  Isoelektrik  merupakan  daerah  tertentu  dimana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif  dan  negatif  sama,  sehingga  tidak  bergerak  bila diletakkan  dalam  medan  listrik.  Pada  pH  isoelektrik  (pI), daya  kelarutan  protein  minimal,  sehingga  menyebabkan protein mengendap [12].
Pertama disiapkan 9 tabung reaksi bersih dan kering, lalu dimasukkan  1  ml  urease  pada  tiap-tiap  tabung.  Pada  setiap tabung  ditambahkan  1  ml  larutan  buffer  asetat  masing- masing  dari  pH  4;  5  dan  6.  Kemudian  dikocok,  lalu  dicatat derajat  kekeruhannya  setelah  0,  10,  dan  30  menit.  Diamati berapa tabung yang terbentuk endapan maksimal. Selanjutnya  semua  tabung  dipanaskan  diatas  penangas  air. Diamati  hasilnya.  Pembentukan  endapan  kekeruhan  paling cepat atau paling banyak merupakan titik isoelektrik [13].

## Karakterisasi Urease Elektroforesis SDS-PAGE
Karakterisasi  protein  menggunakan  SDS-Page  bertujuan untuk  mengetahui  berat  molekulnya  (BM).  Protein  yang telah  diberi  perlakuan  dengan  detergen  yang  mengandung ion  kuat  seperti  sodium  dodesyl  sulphate  (SDS)  dan  agen pereduksi  akan  mengalami  eliminasi  struktur  [14]. Metode yang  digunakan  dalam  pembuatan  gel  adalah  metode Edelstein  and  Bollag  (1991)  [15].  Bahan  untuk  separating gel  dicampur  satu  persatu  dengan  memasukkan  TEMED (Tetramethylethylenediamine) pada akhir campuran. Larutan tersebut  diaduk  dan  dipipet  perlahan  ke  dalam  plate  kaca sampai  1.5  cm  dari  permukaan  kaca  lalu  didiamkan  sekitar 15-20  menit.  Dalam  proses  ini  diusahakan  agar  tidak terbentuk gelembung udara. Setelah gel memadat, campuran stacking  gel  dipipet  perlahan  ke  dalam  plate  kaca  lalu dengan  segera  dimasukkan  sisir  (10  sumur)  sebagai  tempat memasukkan sampel.
Sampel yang telah dipanaskan pada 100 0 C selama 3 menit dicampurkan  dengan  buffer  sampel  lalu  dilakukan  loading sampel  ke  dalam  sumur  sebanyak  12  µl.  Berbeda  halnya dengan  sampel,  Marker  yang  di-loading  ke  dalam  sumur sebanyak  10  µl.  Sebelum  running  dilakukan,  buffer elektroforesis  dimasukkan  ke  dalam  chamber.  Running elektroforesis dilakukan pada 120 Volt, 28 A dalam kondisi dingin. Waktu yang diperlukan untuk running elektroforesis sekitar 1.5 jam.
Setelah  pemisahan,  gel  dilepas  dari  plate  kaca  lalu direndam  dalam  larutan  fiksasi  (25%  metanol  +  12%  asam asetat)  selama  1  jam.  Selanjutnya,  gel  tersebut  direndam dalam larutan etanol 50% selama 20 menit dan larutan etanol 30% selama 2 x 20 menit. Setelah itu, gel tersebut direndam dalam  larutan  enhancer  (larutan  Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O)  selama  1 menit. Gel kemudian dicuci dengan akuabides selama 3 x 20 menit. Setelah dicuci dengan akuabides, gel direndam dalam
larutan staining silver nitrat (larutan AgNO 3 + formaldehida 37%)  selama  30  menit  lalu  dibilas  cepat  dengan  akuabides selama  2  x  20  detik.  Kelebihan  warna  dihilangkan  dengan larutan  destaining  (larutan  Na 2 CO 3 +  formaldehida  37%) sampai  diperoleh  pita-pita  protein  yang  jelas  teramati dengan  latar  belakang  relatif  jernih.  Reaksi  dihentikan dengan menggunakan larutan fiksasi [15].

## Produksi Urease
Bakteri yang digunakan untuk aplikasi biogrouting adalah bakteri  yang  memiliki  aktivitas  enzim  tertinggi  diantara isolat  yang  lain.  Isolat  ditumbuhkan  dalam  media  B4  cair 100  mL  dan  media  urin  100  mL.  Kemudian  diinkubasi menggunakan Erlenmeyer 250 mL selama 5 hari diatur suhu, pH dan medium optimal (sesuai data optimasi urease). Produk  yang  dihasilkan  masih  mengandung  biomassa  sel yang  tidak  dibutuhkan  pada  proses  biogrouting.  Urease dapat  diaplikasikan  setelah  hasil  fermentasi  disentrifugasi dengan kecepatan 10000-12000 rpm selama 15 menit [5].

## Aplikasi Urease pada Biogrouting
Aplikasi  biogrouting  dilakukan  dengan  menyiapkan urease pada syringe ukuran 5mL. Kemudian disiapkan pasir laut  yang  masih  dalam  kondisi  salin(fresh)  ke  cetakan, kemudian  ditimbang  massa  pasirnya.  Pasir  diberikan perlakuan  menggunakan  metode  injeksi  langsung  (De  Jong et  al,  2006),  dengan  volume  urease  masing-masing  10  mL. Selanjutnya campuran pasir dan urease diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam, setiap 4 jam diukur perubaan pH pasir, pembentukan  mineral  kalsit  secara  visual  dan  proses pemadatannya. Secara kuantitatif diukur massa pasir setelah memadat [16].

## C. Analisis Data
Analisis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah General  Linear  Model  (GLM).  Tiap  perlakuan  diulang  10 kali, tiap ulangan dibuat 3 kali pengukuran. Kombinasi yang digunakan adalah variasi jenis medium (sumber B4 urea dan B4 urin), pH (4; 5; 6; 7; 8, dan 9), dan temperatur (25 0 C dan 29°C)  saat  pengukuran  aktivitas  urease.  Grafik  yang menunjukkan  nilai  tertinggi  dipilih  sebagai  kondisi  paling optimum.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Uji Aktifitas dan Optimasi Urease
Uji  aktifitas  dan  optimasi  dilakukan  untuk  mengetahui aktifitas  optimum  bakteri  biogrouting  dalam  menghasilkan urease.  Enzim  inilah  yang  nantinya  akan  diproduksi  untuk diaplikasikan pada skala laboratorium.
Isolat bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat  dengan  kode  P3BG43.  Berdasarkan  penelitian sebelumnya  isolat  ini  merupakan  koleksi  dari  Pusat Penelitian  Bioteknologi  LIPI  Cibinong.  Menurut  [5],  isolat P3BG43  ini  diambil  dari daerah dengan ketinggian (±4.000 m  di  atas  permukaan  laut)  yang  memiliki  tekanan  udara rendah  sehingga  suhu  lingkungan  juga  rendah.  Oleh  karena itu bakteri ini sulit ditumbuhkan di daerah tropis. Bakteri ini cukup  sensitif  terhadap  perubahan  lingkungan,  suhu  dan medium. Hal ini ditunjukkan dengan banyaknya pengulangan  yang  dilakukan  untuk  mengadaptasikan  agar
isolat  dapat  tumbuh.  Perlu  4-5  kali  kultivasi  menggunakan medium NB, B4 (marine agar), dan NA.
Berdasarkan  penelitian  sebelumnya  isolat  P3BG43 diidentifikasi sebagai Oceanobacillus sp, dengan karakteristik  fenotipik  antara  lain  berbentuk  batang-lurus (berukuran  0.3-2.2x1.2-7.0µm),  bersifat  motil  dengan flagella  tipe  lateral,  membentuk  endospora  resisten  panas (dengan  jumlah  tidak  lebih  dari  satu  dalam  satu  sel sporangia) serta memberikan reaksi positif pada urease test. Oceanobacillus sp. tidak memiliki aktifitas enzim ektraseluler  ketika  uji  hidrolisis  pati,  trybutirin  dan  kasein. Isolat  P3BG43  dipilih  karena  diketahui  memiliki  aktifitas urease  paling  tinggi  berdasarkan  metode  Weatherburn (1967) yang dimodifikasi (Gambar 1) [5].
Optimasi pertumbuhan bakteri biogrout dilakukan dengan menumbuhkan  isolat  dalam  medium  B4  dan  B4  yang termodifikasi menggunakan urin (B4 urin). Kemudian diukur kepadatan  selnya  menggunakan  spektrofotometer.  Medium B4  merupakan  medium  yang  kandungan  nutrisinya  berisi mineral dan urea. Urea (NH ₄ ) ₂ CO ₃ mengandung ammonium yang  menyebabkan  presipitasi  kalsit  [17].  Sedangkan medium  B4  yang  sumber  ureanya  diganti  dengan  urin  (B4 urin) mengandung ammonia (NH ₃ ) [18]. Kandungan amonia pada  urin  menyebabkan  reaksi  tidak  sempurna  untuk mempresipitasi  karbonat.  Keberadaan  amonia  dalam medium  yang  mengandung  air  (aquades)  menyebabkan terjadinya reaksi spontan. Reaksi spontan yang terjadi akibat adanya  air  (H ₂ O)  mengkonversi  amonia  (NH ₃ )  menjadi ammonium  (NH ₄⁺ )  dan  karbondioksida  (CO ₂ )  akan menyeimbangkan  reaksi  kimia  menjadi  asam  karbonat,  ion bikarbonat  dan  ion  karbonat.  Kenaikan  pH  disebabkan karena ion hidroksil yang terbentuk dari produksi NH ₄⁺ yang melebihi  ketersediaan  Ca ²⁺ .  Kondisi  ini  menyebabkan lingkungan  alkalin  sehingga  karbonat  dibutuhkan  untuk presipitasi kalsit.
Optimasi pertumbuhan bakteri dilakukan dengan mengondisikan pada 2 jenis medium, variasi pH kisaran 3-9 serta  pada  temperatur  25 ° C  dan  29 ° C.  Pengaturan  kondisi medium,  pH  dan  temperatur  ini  dilakukan  dengan  asumsi masih  sesuai  pada  saat  produk  biogrout  diaplikasikan  di lingkungan.
Berdasarkan  analisis  data  menggunakan  General  Linear Model  diketahui  bahwa  pada  temperatur  25 ° C  dan  pH  7 merupakan kondisi optimum pertumbuhan bakteri biogrouting (Gambar 2). Diketahui P value kurang dari 0.05 (p<0.05)  (tolak  H0  terima  H1)  yang  berarti  pH  dan temperatur  berpengaruh  terhadap  pertumbuhan  bakteri biogrout.
Sedangkan  uji  optimasi  pertumbuhan  bakteri  biogrout pada  medium  urin  menunjukkan  hasil  yang  kurang signifikan.  Perlakuan  dilakukan  hingga  10x  pengulangan. Hal  tersebut  dimungkinkan  karena  beberapa  faktor diantaranya  kisaran  pH  urin  dan  kadar  amonia  yang  tidak terukur.  Menurut  Shafiee  et  al  (2003)  urin  lebih  banyak mengandung  garam  sisa  metabolisme  tubuh  dan  sedikit ammonia  [19].  Berdasarkan  uji,  diketahui  bakteri  biogrout dapat  tumbuh  optimal  pada  medium  B4  urin  pH  8  dan temperatur 25 ° C
Berdasarkan  analisis  data  menggunakan  General  Linear Model,  pertumbuhan  bakteri  pada  B4  urin  (Gambar  3) menunjukkan  p  value  lebih  kecil  dari  0.05  (p<0.05 ,ᾱ (alfa) 5%.).  Angka  tersebut  menunjukkan  bahwa  urin  yang terdapat dalam medium B4 signifikan berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri (terima H0 tolak H1).

## Gambar 3. Kurva Pertumbuhan Bakteri pada Medium B4 Urin
Aktifitas  urease  diukur  berdasarkan  kondisi  optimum pertumbuhan  bakteri.  Berdasarkan  hasil  analisis  data, diketahui  waktu  optimal  pertumbuhan  bakteri  adalah  pada jam  ke- 12 sampai jam ke- 13. Waktu tersebut diasumsikan sebagai  waktu  potensial  untuk  menghasilkan  urease  paling banyak. Berdasarkan pengukuran aktifitas enzim menggunakan  metode  Bradford  diketahui  144  unit/ml (Gambar  4).  Sedangkan  pengukuran  aktifitas  enzim menggunakan  metode  Weatherburn  (1967)  didapatkan aktifitas urease 203.32 unit/ml.

## Gambar 4 Aktifitas Urease pada Kondisi Optimum
B. Isolasi dan Purifikasi Urease

## Presipitasi Protein Menggunakan Amonium Sulfat
Presipitasi  protein  dilakukan  untuk  memisahkan  crude ekstract  yang  mengandung  urease  dari  senyawa-senyawa pengotor  lain.  Metode  presipitasi  protein  menggunakan ammonium sulfat dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme.  Protein  yang  dipresipitasi  adalah  enzim
ektrak  kasar.  Menurut  Fujimoto  et  al  (2002)  protein  yang akan  dipresipitasi  harus  melalui  tahap  sentrifugasi  karena densitas larutan jenuh bernilai rendah [20].
Berdasarkan  hasil  presipitasi  ammonium  sufat,  protein dapat  terfraksinasi  dalam  larutan  uji.  Urease  tidak menunjukkan  pengendapan  pada  konsentrasi  ammonium sulfat  40%.  Presipitasi  urease  yang  cukup  signifikan  terjadi pada  konsentrasi  ammonium  antara  40%  sampai  90% (Gambar 5). Pada konsentrasi ammonium sulfat 90% terjadi pengendapan  yang  paling  besar,  namun  untuk  pemisahan enzim ini lebih baik digunakan konsentrasi mulai 40%-80%. Kelarutan  protein  akan  terus  meningkat  sejalan  dengan peningkatan  konsentrasi  garam.  Semakin  tinggi  konsentrasi garam  maka  kelarutan  protein  akan  menurun  [21].  Setelah didapatkan protein presipitat selanjutnya diuji menggunakan uji  Bradford.  Pengukuran  konsentrasi  protein  menggunakan Bradford dilakukan berdasarkan nilai absorbansi maksimum. Reagen yang digunakan adalah Coomasiie Brilliant Blue G- 250  yang  terikat  pada  protein.  Kemudian  larutan  diukur menggunakan  spektrofotometer  dengan  panjang  gelombang 595nm.
Pengukuran  aktifitas  urease  dari  hasil  presipitasi menggunakan  ammonium  sulfat.  Aktifitas  urease  paling tinggi  mencapai  70.21  unit/ml  dan  terendah  5.36  unit/ml. Aktifitas  urease  dalam  satuan  unit/ml  berarti  1  unit  enzim dibutuhkan  untuk  membebaskan  1  µmol  NH 3 dari  urea  per menit dalam kondisi standar [11].

## Isoelektrik Point
Titik  Isoelektrik  merupakan  kondisi  tertentu  dimana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif  dan  negatif  sama,  sehingga  tidak  bergerak  bila diletakkan dalam medan listrik. Titik isoelektrik pada enzim ekstrak kasar medium B4 urea dan B4 urin adalah pada pH 6 (Gambar  5).  Hal  ini  ditunjukkan  dengan  terbentuk  endapan paling banyak setelah dipanaskan.
(a)
(b)
Gambar  5.  (a)  Isoelectric  point  medium  B4  urea  (b)  Isoelectric  point medium B4 urin.

## Karakterisasi Urease Elektroforesis SDS-PAGE
Karakterisasi  protein  menggunakan  SDS-Page bertujuan  untuk  mengetahui berat molekulnya(BM). Protein yang  telah  diberi  perlakuan  dengan  detergen  yang mengandung ion kuat seperti sodium dodesyl sulphate (SDS) dan agen pereduksi akan mengalami eliminasi struktur [13].
Setelah elektroforesis, protein dapat divisualisasikan dengan pewarna yang berikatan denga protein [22].
Berdasarkan  pita  protein  yang  terlihat  pada  gel poliakrilamid  dengan  separating  gel  7%,  stacking  gel  3%, tegangan  listrik  120  volt  28  A  dan  elektroforegram pewarnaan  gel  dengan  coomasie  blue  diperoleh  sembilan pita protein dengan berat molekul 440-500 kDa (Gambar 6). Pita  paling  identik  berada  pada  berat  molekul  440  kDa. Acrylamide  7%  pada  separating  gel  digunakan  untuk memisahkan  protein  dengan  berat  molekul  100-500  kDa protein. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Jones  and  Mobley  (1989)  bahwa  berat  molekul  urease adalah 440-480 kDa [23].

## Gambar 6. SDS-PAGE

## C. Produksi Urease
Enzim  yang  akan  digunakan  untuk  aplikasi  biogrouting adalah  enzim  yang  memiliki  aktivitas  tertinggi  pada  fase optimasi.  Berdasarkan  hasil  analisis,  aktifitas  urease  paling tinggi  dihasilkan  oleh  bakteri  yang  ditumbuhkan  pada medium  B4  urea  sebesar  70.21  unit/ml,  sedangkan  isolat yang  ditumbuhkan  pada  B4  urin  sebesar  51.74  unit/ml. Peneliti  melakukan  produksi  dengan  menumbuhkan  isolat pada  2  variasi  medium  B4  masing-masing  100ml  medium. Berdasarkan rancangan penelitian isolat ditumbuhkan dalam medium  B4  cair  1500  mL  dan  medium  urin  1500  mL. Kemudian  diinkubasi  menggunakan  fermentor(ukuran  5L) selama  5  hari  diatur  suhu,  pH  dan  medium  optimal  (sesuai data optimasi urease). Fermentor yang digunakan merupakan fermentor  modifikasi  dari  Renge  et  al  (2012)  [24].  Hal tersebut  tidak  dapat  dilakukan  karena  terjadi  kerusakan  alat pada  fermentor  dan  keterbatasan  jumlah  medium.  Produksi dengan skala 100ml dikondisikan sesuai dengan pertumbuhan  optimum  bakteri  (Gambar  7).  Medium  B4 urea,  bakteri  optimal  tumbuh  pada  pH  7  temperatur  25 ° C sedangkan medium B4 urin optimal tumbuh pada pH 8 suhu yang sama.

## Gambar 7. Produksi urease

## D. Aplikasi Urease pada Biogrouting
Aplikasi  biogrouting  dilakukan  dengan  metode injeksi  langsung  (De  Jong  et  al,  2006)  (Gambar  8a)  [25]. Sebanyak  10ml  urease  diinjeksikan  pada  200gr  pasir  laut
dengan kondisi salin (Gambar 8b). Berdasarkan pengamatan parameter  aplikasi,  pH  pasir  meningkat  dari  pH  netral  (7) menjadi  pH  basa  (11).  Terjadi  pembentukan  mineral  kalsit secara  visual,  dan  proses  pemadatan  pasir.  Kontrol  negatif yang digunakan adalah pasir tanpa diinjeksi urease.
Berdasarkan  hasil  pengamatan,  terjadi  peningkatan  pH pasir serta permukaan pasir setelah perlakuan injeksi urease mulai rata dan mengeras. Mengerasnya pasir ini disebabkan oleh  adanya  senyawa  karbonat  hasil  aktifitas  bakteri  yang menjadi jembatan sementasi antara butiran pasir.
Terjadi  perbedaan  hasil  antara  control  (tidak  diinjeksi urease),  dengan  pasir  yang  diinjeksi  dengan  urease  dari medium  B4  urea  dan  B4  urin.  Diduga  kecepatan  sementasi tersebut disebabkan oleh besar kecilnya aktifitas urease yang dihasilkan.
(a) (b) Gambar 8. Aplikasi biogrouting

## IV. KESIMPULAN/RINGKASAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan  bahwa bakteri  biogrout  tumbuh  optimum  pada  medium  B4  urea dengan pH 7 dan temperatur 25 ° C, sedangkan pada medium B4  urin  bakteri  biogrout  tumbuh  optimum  pada  temperatur 25 ° C  dan  pH  8.  Pengukuran  aktifitas  urease  mencapai 144.12 unit/ml. Berdasarkan karakterisasi protein menggunakan ammonium sulfat protein mengendap maksimal  pada  konsentrasi  90%  (70.21  unit/ml).  Diketahui titik isoelektrik urease adalah pada pH 6 dan memiliki berat molekul 440-500 kDa. Urease dapat dijadikan material grout karena  memiliki  kemampuan  untuk  melakukan  sementasi (diagenesis) pada aplikasi sederhana biogrouting menggunakan pasir laut dengan kondisi salin.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Van  Paassen,  L.  “Microbes  Build  Underground  Constructions”. Natural  Resources,  Jaargang  11  -  Nummer  2  p.  10-14,  TU  Delft, Netherland (2008).
[2] Karol,  R.H.  Chemical  Grouting  and  Soil  Stabilization.  International Journal NewYork, NY (2003) pp. 558.
[3] Xanthakos,  P.P.,Abramson,L.W.,  Bruce,  D.A.  Ground  Control  and Improvement. Review. John Wiley and Sons, New York, NY. pp. 910 (1994).
[4] Hammes,  F.,  and  W.  Verstraete..  Key  roles  of  pH  and  calcium metabolism  in  microbial  carbonate  precipitation.  Re/Views  in Environmental Science & Bio/Technology (2002) 1: 3-7.
[5] Lisdiyanti P. “Bacterial carbonate precipitation for biogrouting”. Prosiding Simposium Nasional Ekohidrologi (2011) PP 219-232.
[6] Hammes,  F.,  N.  Boon,  J.  De  Villiers,  S.  D.  Siciliano,  and  W. Verstraete.  Strain-specific  ureolytic  microbial  calcium  carbonate precipitation.  Applied  and  Environmental  Microbiology  Journal (2003b) 69: 4901-4909
[7] Fujita  Y,  Ferris  FG,  Lawson  RD,  Colwell  FS,  Smith  RW.  Calcium carbonate precipitation by ureolytic subsurface bacteria. Geomicrobiol Journal (2000) 17:305– 318.
[8] Mobley,  H.  L.  T.,  and  R.  P.  Hausinger.  1989.  “Microbal  ureases: Significance, regulation, and molecular characterization”. Microbiological. Reviews. 53: 85-108 (1989).
[9] Chu  Jian,  V  and  Ivanov.  Applications  of  microorganisms  to geotechnical engineering for bioclogging and biocementation of soil in situ. Rev Environ Sci Biotechnol (2008) 7:139–153.
[10] Wijngaarden  V  K.W  M.  “Modelling  Biogrout:  a  new  ground improvement  method  based  on  microbial  induced  carbonate precipitation”.  ISSN  1389-6520  Reports  of  the  Delft  Institute  of Applied Mathematics Delft (2009).
[11] Keykha  A.H,  Bujang  B.K,  Afshin  Asadi  and  Satoru  Kawasaki. ”Electro-Biogrotuing  and  Its  Challenges.  Paper”.  Department  of Civil Engineering, University Putra Malaysiaand Hokaido University (2012).
[12] Burgess,  Thomson,  Anthony  C.  Grabski1  and  Richard  R. “Preparation  of  protein  samples  for  SDS-polyacrylamide  gel electrophoresis:  procedures  and  tips1”. Applied  Microbiology  and Biotechnology ( 2002) 62: 191-201
[13] Weaver  IC.  “Early  Environmental  Regulation  of  Hippocampal
Glucocorticoid Receptor Gene Expression”. International Publishing. Ann NY Acad Sci 1024:182-212 (2005).
[14] Bang,S.S.,  Johnna  K.  Galinat,  dan  V.  Ramakrishnan.  “Calcite Precipitation  induced  by  Polyurethane-Immobilized  Bacillus pasteurii”. Enzyme and Microbial Technology Journal 28 (2001) 404 – 409.
[15] Baskar,  S.,  R.  Baskar,  L.  Mauclaire,  and  J.  A.  McKenzie. “Microbially  induced  calcite  precipitation  in  culture  experiments: Possible  origin  for  stalactites  in  Sahastradhara  caves”.  Dehradun, India, Current Science, 90(1) (2006) 58-64.
[16] Harkes, M.P. Microbial Induced Carbonate Precipitation as Ground Improvement  Method  –  Bacterial  Fixation  and  Empirical Correlation  CaCO 3 vs  Strength.  Proceeding  of  The  1 st International Conference Bio Geo Civil Engineering. Netherlands (2008).
[17] Ramakrishnan,  V.,  Santosh,  K.R.,  Duke, E.F., and Bang, S.S. ”SEM Investigation  of  Microbial  Calcite  Precipitation  in  Cement”,
Proceedings  of  the  22nd  International  Conference  on  Cement Microscopy, April, Montreal, Quebec, Canada (2000).
[18] Lee,  T.S.  “Computations  in  the  early  visual  cortex”. J.  Physiology (Paris) (2003) 97(203), 121-139.
[19] Shafiee M,  Carbonneau MA,  Urban N,  Descomps B  &  Léger CL. “Grape and grape seed extract capacities at protecting LDL against oxidation  generated  by  Cu 2+ ,  AAPH  or  SIN-1  and  at  decreasing superoxide  THP-1  cell  production”.  A  comparison  to  other  extracts or compounds. Journal Science Free Radic. Res.37: 573−584 (2003).
[20] Fujimoto,  C.  Titanium  dioxide  coated  surfaces  for  capillary electrophoresis and capillary electrochromatography. Electrophoresis Journal (2002) 23(17), 2929-2937.
[21] S. Englard and S. Seifter. Methods Enz Journal. (1990) 182:285-300.
[22] Burden  D  W  and  D  B  Whitney.  Biotechnology:  Proteins  to  PCR Book. by. pp 336. Birkhfiuser, Basel. (1995).
[23] Mobley,  H.  L.  T.,  M.  D.  Island,  and  R.  P.  Hausinger.  “Molecular Biology  of  Microbial  Ureases”.  Microbiological  Reviews.  59:  451- 480 (1995).
[24] Renge  V.C,  Khedkar.V,  and  Nikita  R.  Nandukar.  “Enzym  Synthesis By  Fermentation  Method”.  A  Review.  Department  of  Chemical Engineering,  College  of  Engineering  and  Technology,  NH,  India. No.6 (2012).
[25] De  Jong,  Jason  T.,  Fritzges,  Michael  B.,  and  Nusslein,  Klaus. Microbially  Induced  Cementation  to  Control  Sand  Response  to Undrained  Shear.  Journal  of  Geotechnical  and  Geoenvironmental Engineering. American Society of Civil Engineers (2006).