## EVALUASI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL SPONS Aplysina sp. DARI PERAIRAN SELAT LEMBEH KOTA BITUNG
Aprilia H. Manumpil 1) , Defny S. Wewengkang 1) , Adithya Yudistira 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Aplysina  sp.  Sponge  is  one  of  the  marine  biota  making  up  coral  reefs  that  contain  active  compounds whose percentage of activity is greater than the compounds produced by land plants. This study aims to determine  the  activity  of  antioxidant  compounds  from  the  ethanol  extract  of  Aplysina  sp.  from  Lembeh Strait Waters, Bitung City. Sponge Aplysina sp., was extracted by maceration with ethanol as a solvent. As  a  parameter,  testing  of  antioxidant  activity  was  carried  out  using  the  DPPH  (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl)  method,  which  was  measured  using  UV-Vis  Spectrophotometry  at  a  wavelength  of  517 nm. The result showed the ethanol extract of Aplysina sp., sponge proven to have antioxidant activity in each concentration test. The highest concentration has an antidote to free radical activity by reaching a percentage of 46,13%.

## Keywords: Aplysina sp. Sponge, Antioxidant, Extraction, DPPH

## ABSTRAK
Spons Aplysina sp. merupakan salah satu biota laut penyusun terumbu karang yang mengandung senyawa aktif  yang  presentase  keaktifannya  lebih  besar  dibandingkan  dengan  senyawa-senyawa  yang  dihasilkan oleh  tumbuhan  darat.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  aktivitas  senyawa  antioksidan  dari ekstrak  etanol  Spons Aplysina sp.  dari  Perairan  Selat  Lembeh,  Kota  Bitung.  Spons Aplysina sp. diekstraksi  menggunakan  metode  maserasi  dengan  etanol  sebagai  pelarut.  Sebagai  parameter, pengujian aktivitas  antioksidan  dilakukan  dengan  metode  DPPH  (1,1- difenil -2- pikrilhidrazil )  yang  diukur menggunakan Spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak  etanol  spons Aplysina sp.  terbukti  memiliki  aktivitas  antioksidan  disetiap  konsentrasi pengujian.Konsentrasi  tertinggi  memiliki  aktivitas penangkal  radikal  bebas  dengan  mencapai presentase 46,13%.
Kata Kunci : Spons Aplysina sp, Antioksidan, Ekstraksi, DPPH

## PENDAHULUAN
Radikal  bebas  merupakan  salah  satu bentuk  senyawa  reaktif,  yang  secara  umum diketahui  sebagai  senyawa  yang  memiliki elektron  yang  tidak  berpasangan  di  kulit terluarnya.  Radikal  bebas  sebagai  molekul atom  dengan  elektron  bebas  dalam  jumlah normal  dapat  berfungsi  dalam  membunuh virus dan bakteri, namun dalam jumlah yang sangat  besar  zat  ini  dapat  merusak  jaringan normal, menganggu produksi DNA, merusak dinding sel khususnya lapisan lipid, serta mempengaruhi pembuluh darah.
Radikal  bebas  dapat  ditangkal  atau  diredam dengan  pemberian  antioksidan  (Halliwel, 2007).
Antioksidan  berupa  senyawa  kimia yang  dapat  menyumbangkan  satu  atau  lebih elektron  kepada  radikal  bebas,  sehingga reaksi radikal bebas tersebut dapat terhambat. Penggunaan senyawa antioksidan berkembang  dengan  pesat,  baik  untuk makanan maupun pengobatan.
Penggunaannya sebagai obat semakin meningkat dengan bertambahnya pengetahuan  tentang  aktivitas  radikal  bebas terhadap  beberapa  penyakit  degeneratif seperti  penyakit  jantung,  diabetes,  kanker, inflamasi  jaringan,  kelainan  imunitas  dan penuaan dini (Jacob dan Burri, 1996).
Spons  adalah  organisme  laut  yang memiliki  potensi  cukup  besar  dalam menghasilkan senyawa aktif. Untuk menjaga kelangsungan hidup dan pertahanan dirinya, spons  menghasilkan  metabolit  primer  dan metabolit  sekunder.  Spons  mengandung senyawa  aktif  yang  presentase  keaktifannya lebih  besar  dibandingkan  dengan  senyawa- senyawa  yang  dihasilkan  oleh  tumbuhan darat  (Muniarsih  dan  Rachmaniar,  1999).
Spons  diketahui  menghasilkan  senyawa bioaktif  yang bermanfaat  sebagai  antibiotik, anti  jamur,  anti  kanker,  anti  inflamasi  dan antioksidan  yang  selama  ini  masih  terus dieksplorasi.  Salah  satu  metode  yang  sering dipakai dalam menguji aktivitas antioksidan yaitu metode DPPH ( 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil ).  Dari  penelitian-penelitian tentang spons yang telah dilakukan sebelumnya  mendorong  peneliti  untuk melakukan  penelitian  untuk  membuktikan bahwa spons Aplysina sp. memiliki kandungan  metabolit  sekunder  yang  dapat berpotensi sebagai antioksidan.

## METODOLOGI PENELITIAN
Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian  ini  yaitu scuba  diving ,  kamera, gunting, pisau, wadah botol air kemasan 600 mL,  cawan  porselin,  ziplok,  sarung  tangan, telenan,  gelas  ukur,  erlenmeyer,  kaca  arloji, labu  ukur  (100  mL  dan  50mL),  tabung reaksi, rak tabung reaksi, baker glass , vortex (Benchmark),  corong,  pipet  tetes,  mikro pipet,  timbangan  digital  (AE  ADAM), spatula,  oven  dan  spektrofotometer  UV-Vis (UV-1800).

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  pada penelitian  ini  yaitu  Spons Aplysina sp., etanol 96%, kertas saring, tissue , alumunium foil,  kertas  label,  serbuk  vitamin  c  p.a  dan serbuk DPPH ( 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil ).

## Prosedur Kerja
1. Pengambilan Sampel
Sampel spons Aplysina sp. diperoleh dari  perairan  selat  Lembeh,  Kota  Bitung. Sampel  diambil  dengan  menggunakan  alat bantu (masker, shorkel, fins, tabung oksigen, ziplok  dan  pisau),  kemudian  di  masukkan dalam  ziplok  dan  diberikan  lebel.  Kantong sampel  dimasukkan  kedalam  kotak  dingin ( cool  box )  yang  berisi  es  batu  dan  tidak terkena matahari secara lansung. Di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, sampel  yang  didapat  lansung  dibersihkan dari  pengotor,  lalu  dipotong  kecil-kecil. Sampel  yang  telah  dipotong  dimasukkan  ke dalam  botol  dengan  menggunakan  pelarut etanol  96%  dan  sampel  tersebut  lansung diekstraksi menggunakan metode maserasi.

## 2. Ekstraksi Metode Maserasi
Sampel yang diperoleh sebanyak 430 g  direndam  dengan  menggunakan  larutan etanol  96%.  Metode  ekstraksi  dilakukan dengan  cara  merendam  sampel  dengan larutan  penyari  selama  3  kali  24  jam  pada temperatur  kamar  yang  dilindungi  dari cahaya dan sesekali dikocok. Hasil ekstraksi kemudian  disaring  menggunakan  kertas saring  16  x  16  cm,  kemudian  diambil filtratnya dan residu di buang.Setelah proses ekstraksi  menghasilkan  3  filtrat  yang kemudian  dicampur  menjadi  satu.  Filtrat tersebut  dipekatkan  dengan  menggunakan oven  pada  suhu  40 o C  sampai  etanol menguap.

## 3. Pembuatan Larutan Stok 100 mL
Sebanyak  100  mg  ekstrak  etanol spons Aplysina sp.  dilarutkandidalam  etanol 96%  ad.100  mL  (konsentrasi  1000  ppm).
Dengan  masing-masing  konsentrasi  100 mg/L,  75  mg/L,  50  mg/L,  dan  25  mg/L dihitung dengan menggunakan rumus pengenceran, yaitu :
Pada  keempat  konsentrasi,  masing- masing  hasil  yang  didapatkan  dari  hasil  V 1 dipipet dan ditambahkan etanol 96% hingga mencapai  tanda  batas  (10  mL),  kemudian dipindahkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan ditutup dengan menggunakan aluminium foil untuk digunakan pada perlakuan selanjutnya.
4. Pembuatan Larutan DPPH
Penentuan aktivitas penangkal radikal  bebas  DPPH  menurut  Burda  dan Olezek  (2001).  Sebanyak  4  mg  serbuk DPPH ditimbangdan dilarutkan dalam etanol 96%  sebanyak  100  mL.  Selanjutnya  larutan stok  DPPH  dilakukan  pengujian  kontrol,  di uji  pada  spektrofotometer  UV-Vis  dengan panjang gelombang antara 400-800 nm.

## 5. Pengujian Kontrol Vitamin C
Setelah pengujian sampel dan pengujian kontrol, dilanjutkan pada pengujian  vitamin  C  p.a  sebagai  kontrol pembanding. Kaca arloji ditimbang, vitamin C  ditimbang  sebanyak  10  mg.  Kemudian, vitamin  C  p.a  dilarutkan  dalam  etanol  96% sebanyak  10  mL,  buat  larutan  stok  dengan konsentrasi  yang  sama  sebelumnya  yaitu konsentrasi  100  mg/L,  75  mg/L,  50  mg/L dan  25  mg/L  dengan  ditambahkan  masing- masing larutan dengan etanol 96% mencapai
tanda  batas  (10  mL),  dengan  pengulangan sebanyak  3  kali  pada  masing-masing konsentrasi. Pada masing-masing konsentrasi  di  pipet  2  mL  dan  ditambahkan larutan  DPPH  2  mL,  di  vorteks  selama  2 menit  dan  diinkubasi  selama  30  menit  pada suhu 37 0 C.  Sampel vitamin C p.a diuji pada spektrofotometer  UV-Vis  dengan  panjang gelombang 517 nm.
6. Pengujian Aktivitas Antioksidan

## Metode DPPH
Penentuan aktivitas
penangkal radikal  bebas  DPPH  menurut  Burda  dan Olezek  (2001).  Diambil  sebanyak  2  mL ekstrak  etanol  spons  Aplysina  sp.  dengan konsentrasi  100  mg/L,  75  mg/L,  50  mg/L dan 25 mg/L ditambahkan masing-masing 2 mL  larutan  DPPH  dalam  etanol  dan divorteks  selama  10  detik.  Berubahnya warna ungu menjadi warna kuning
menunjukkan  efisiensi  penangkal  radikal bebas.
Diukur absorbansi
pada spektrofotometer  UV-Vis  dengan  panjang gelombang  517  nm  setelah  diinkubasi selama  30  menit.  Kemudian  diamati perbandingannya  dengan  vitamin  C  p.a sebagai  standar.  Setelah  absorbansi  didapat, aktivitas penangkapan radikal bebas  (persen inhibisi) dihitung sebagai persentase berkurangnya warna DPPH dengan menggunakan rumus berikut:

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari hasil pengukuran pada penelitian  ini  diperoleh  absorbansi  yang kemudian digunakan untuk perhitungan nilai persen  inhibisi  atau  persen  perendaman senyawa  antioksidan  terhadap  DPPH.  Data persen inhibisi ekstrak etanol spons Aplysina sp.  dan  Vitamin  C  p.a  sebagai  pembanding disajikan pada tabel 1 berikut ini :
Tabel  1. Hasil  pengujian  perbandingan antara  Ekstrak  Etanol  Spons Aplysina sp. dan Vitamin C p.a
Uji aktivitas antioksidan suatu tanaman  maupun  biota  laut  sangat  penting dilakukan  untuk  mengetahui  apakah  dari tanaman  atau  biota  laut  tersebut  terbukti memiliki  aktivitas  pengikatan  terhadap radikal  bebas.  Pada  penelitian  ini,  biota  laut yang  digunakan  yaitu  spons Aplysina sp. Pada  penelitian  Marzuki,  (2016)  diketahui spons Aplysina sp.  mengandung  simbion yaitu  bakteri Arthrobacter sp., Bacillus sp., Micrococcus sp., Pseudomonas sp., Vibrio
Pengulangan Konsentrasi 25 mg/L 50 mg/L 75 mg/L 100 mg/L I Ekstrak 43,80% 44,20% 44,80% 46,50% Vit.C 93,90% 92,90% 93,80% 93,90% II Ekstrak 43,70% 44,70% 45,10% 46,10% Vit. C 94,00% 93,60% 93,30% 93,90% III Ekstrak 43,50% 43,80% 46,20% 45,80% Vit. C 93,90% 93,60% 93,80% 93,60% Rata- rata Ekstrak 43,66% 44,23% 45,36% 46,13% Vit. C 93,93% 93,36% 93,63% 93,80%
sp.  dan Aeromonas sp.  memiliki  aktivitas sebagai  antimikroba  sehingga  kemungkinan untuk  spons Aplysina sp.  juga  dapat mengandung  senyawa  metabolit  sekunder sebagai aktivitas antioksidan yang diproduksi  ketika  mempertahankan  diri  dari lingkungan maupun dari serangan organisme lain.
Sebagai parameter pengujian antioksidan  dilakukan  dengan  menggunakan metode  DPPH  ( 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil ).
Pemilihan  metode  ini  karena  merupakan metode  yang  sederhana,  mudah,  cepat  dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel untuk  evaluasi  aktivitas  antioksidan.  DPPH ( 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil ) merupakan radikal  bebas  sintetik  berwarna  ungu  yang banyak  digunakan  dalam  uji  aktivitas antioksidan.  Larutan  radikal  bebas  DPPH memiliki atom nitrogen yang tidak berpasangan.  Reaksi  DPPH  dengan  atom hidrogen  yang  terdapat  dalam  antioksidan dapat  membuat  larutan  DPPH  menjadi berkurang  reaktivitasnya,  yang  ditunjukkan dengan  memudarnya  warna  ungu  menjadi kuning. Perubahan warna ini mengakibatkan perubahan absorbansi pada panjang gelombang  maksimum  DPPH  menggunakan spektrofotometri  UV-Vis  yang  menjadi patokan (Molyneux, 2004). Penetuan panjang  gelombang  serapan  maksimum  (λ maks)  larutan  DPPH  dilakukan  dengan mengukur  absorbansi  larutan  pada  panjang gelombang  antara  400-800  nm.  Hasil  yang didapatkan  pada  penelitian  ini  adalah  517 nm dan memiliki absorbansi kontrol 0,715.
Pengujian aktivitas antioksidan dalam penelitian ini menggunakan perbandingan 1 : 1 yang artinya 2 mL larutan DPPH  dicampurkan  dengan  2  mL  larutan
sampel  (ekstrak  etanol  spons Aplysina sp. atau  vitamin  C)  pada  tiap  konsentrasi  yang berbeda-beda. Sempurnanya campuran DPPH dan ekstrak dibantu dengan perlakuan di vortex selama  10  detik.  Berkurangnya intensitas warna larutan DPPH tersebut dapat menunjukkan  bahwa  terjadi  reaksi  antara atom  hidrogen  yang  dilepas  oleh  bahan  uji dengan  molekul  radikal  DPPH  sehingga terbentuk senyawa 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil yang berwarna kuning (Rumagit, 2015).
Konsentrasi  ekstrak  etanol  spons Aplysina sp.  yang  digunakan  adalah  100 mg/L,  75  mg/L,  50  mg/L,  dan  25  mg/L. Masing-masing  konsentrasi  dicampurkan dengan  larutan  DPPH  dengan  perbandingan yang  ada.  Campuran  dihomogenkan  dan diinkubasi  selama  30  menit  pada  tempat gelap  dengan  suhu  37 0 C.  Hal  ini  dilakukan untuk menghindari kontaminasi dan mengoptimalkan aktivitas DPPH agar terjadi reaksi  antara  DPPH  dengan  sampel  yang diuji  (Hatano et  al .,  1998).  Setelah diinkubasi, kemudian masing-masing ekstrak dilakukan  pengukuran  absorbansi  dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang  gelombang  serapan  maksimum  (λ maks)  DPPH  517  nm.  Pada  tiap  konsentrasi dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.
Pembanding  yang digunakan sebagai kontrol  positif  adalah  vitamin  C  p.a  dimana sebagai pembanding karena berfungsi sebagai antioksidan sekunder yaitu menangkap radikal bebas, mencegah terjadinya reaksi berantai, aktivitas antioksidannya  sangat  tinggi  dan  vitamin  C lebih polar dari vitamin yang lain. Vitamin C mempunyai  gugus  hidroksi  bebas  yang bertindak  sebagai  penangkap  radikal  bebas
(Isnindar et al ., 2011).
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh pada Tabel 1 menunjukkan bahwa pengukuran  persen  inhibisi  pada  ekstrak etanol  spons Aplysina sp.  memiliki  aktivitas antioksidan  dan    mengalami  peningkatan dari konsentrasi 25 mg/L sampai dengan 100 mg/L. Pada ekstrak etanol spons Aplysina sp. dengan  konsentrasi  100  mg/L    memiliki persen  inhibisi  rata-rata  paling  tinggi  yaitu sebesar  46,13  %.  Penigkatan  persen  inhibisi pada  ekstrak  etanol  spons Aplysina sp. menandakan bahwa konsentrasi ekstrak yang ditambahkan  mempengaruhi  kemampuan ekstrak  dalam  merendam  radikal  bebas.  Hal ini  didukung  oleh  penelitian  yang  dilakukan oleh  Hanani et  al .,  (2005)  yang  menyatakan bahwa  presentasi  penghambat  atau  persen inhibisi terhadap aktivitas radikal bebas akan ikut meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi.  Hasil  pengujian  perbandingan aktivitas  antioksidan  ekstrak  etanol  spons Aplysina sp.  dan  vitamin  C  (Tabel  1)  juga menukjukkan  bahwa  aktivitas  antioksidan ekstrak  etanol  spons Aplysina sp.  lebih rendah dibandingkan dengan vitamin C.
Dalam  penelitian  ini,  uji  DPPH dilakukan  dengan  mengamati  penurunan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV- Vis.  Penurunan  nilai  absorbansi  sebagai akibat  dari  penurunan  intensitas  warna  dari larutan yaitu dari warna ungu menjadi warna kuning.  Penurunan  intensitas  warna  itu terjadi  karena  penambahan  radikal  hidrogen dari senyawa antioksidan pada elektron yang tak berpasangan pada radikal nitrogen dalam struktur senyawa DPPH (Rorong, 2008).
Rendahnya  aktivitas  antioksidan  ini kemungkinan  disebabkan  oleh  berbagai
faktor,  diantaranya  karena  metode  ekstraksi yang  digunakan  kemungkinan  tidak  cukup menarik  komponen  kimia  yang  bersifat antioksidan dalam spons Aplysina sp. Selain itu  vitamin  C  merupakan  senyawa  murni sedangkan ekstrak etanol spons Aplysina sp. masih  merupakan  senyawa  campuran  dan belum  diketahui  kandungan  senyawanya yang  bersifat  antioksidan,  dimana  adanya senyawa  yang  tidak  bersifat  antioksidan kemungkinan  bisa  mempengaruhi  aktivitas antioksidan ekstrak etanol spons Aplysina sp. itu  sendiri.Menurut  penelitian  Palekahelu (2018), rendahnya nilai rendemen juga dapat mempengaruhi hasil.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  dari  hasil  penelitian yang telah dilakukan maka, dapat disimpulkan  bahwa  ekstrak  etanol  spons Aplysina sp.  dari  Perairan  Selat  Lembeh, Kota  Bitung  memiliki  aktivitas  antioksidan disetiap  konsentrasi.  Aktivitas  antioksidan tertinggi  terlihat  pada  konsentrasi  tertinggi yaitu  pada  konsentrasi  100  mg/L  dengan mencapai presentase 46,13%.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut untuk mengetahui senyawa aktif yang terkandung  dalam  ekstrak  etanol  spons Aplysina sp.  dan  pengujian  aktivitas antioksidan  dengan metode  lain  dan sebaiknya  membandingkan  hasilnya  dengan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Burda,  S.,  dan  Olezek.  2001.  Antioxidant and  Antiradical. J.Nat.  Prod .,  63: 1035-1042.
Halliwel,  B.  2007.  Dietary  Polyphenols:
good,  bad  or  indifferent  for  your healt. Journal Cardiovascular Research 73 :341-347.
Hanani  E,  Mun’im  B,  Sekarini  R.  2005.
Identifikasi  senyawa  antioksidan dalam  spons Callispongia sp.  dari Kepulauan  Seribu. Jurnal  Ilmu Kefarmasian 2  (3) :  127-133.
Jurnal (Endang Hanani) .
Isnindar  et  al.  2011. Isolasi  dan  Identifikasi Senyawa Antioksidan Daun Kesemek  (Diopyroskaki  Thunb) dengan  Metode  DPPH .  Majalah Obat Tradisional. 16 (3) : 157-164.
Jacob,  R.A.,  dan  Burri,C.J.  1996.  Oxidative Damage  and  Defense. J.Clin  and
Nutr . 63, 985S-990S.
Marzuki, I. 2018. Eksplorasi Spons Indonesia  :  Seputar  Kepulauan Spermonde .  Nas  Media  Pustaka,
Makassar.
Molyneux,  P.  2004. The  Use  of  The  Stable
Free Radikal DPPH. J.Sci. Technol. 26  (2 )  :  211-219.  Narins, D.M.C.  1996. Vitamin  Dalam Krause’s  FOOD,  Nutrition  and Diet  Therapy .  Mahlan,  L.K,  hal 110-114..
Muniarsih,  T  dan  Rachmaniar,  R.  1999.
Isolasi Substansi Bioaktif Antimikroba dari Spons Asal Pulau Pari  Kepulauan  Seribu. Osean  dan Limnologi  Indonesia .  xxx:  151- 158. Jurnal (Suparno).
Palekahelu,  N.  2018.  Aktivitas  Antioksidan dan Antibakteri dari Ekstrak Etanol dan Metanol  Daun Kapehu ( Guioa diplopetala ). Jurnal Ilmiah Farmasi 3 ( 2 ).
Rorong,  J.  2008.  Uji  Aktivitas  Antioksidan dari  Daun  Cengkeh  ( Eugenia
Carryophyllus )  dengan  Metode DPPH. Journal Chemistry Progress 1(2) .
Rumagit,  H.,  M.  Runtuwene.,  dan  S.
Sudewi.  2015.  Uji  Fitokimia  dan Uji  Aktivitas  Antioksidan  dari Ekstrak Etanol Spons Lamellodysidea  herbacea . Jurnal
Ilmiah Farmasi 4 (3) .