## UJI SITOTOKSIK EKSTRAK N- HEKSAN DAUN BOTTO’-BOTTO’  (Chromolaena odorata L.)

## TERHADAP CELL LINE KANKER KOLON WiDr
Dwi Wahyuni Leboe, Surya Ningsi, Anitsah Fiqardina
Jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Alauddin Makassar, JL. Sultan Alauddin No. 36, Samata, Gowa
Email: dwiwahyunileboe@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  efek  sitotoksik  ekstrak  n- heksan  daun  botto’-botto’ pada  cell  line  kanker  kolon  WiDr  secara in  vitro dan  mengetahui  berapa  besar  nilai  IC 50 dari  ekstrak tanaman  tersebut.  Uji  aktivitas  sitotoksik  ekstrak  n- heksan  daun  botto’-botto’  dilakukan  dengan memberikan  5  seri  konsentrasi  bahan  uji  yaitu  1000  µg/ml;  500  µg/ml;  250  µg/ml;  125  µg/ml  dan  62,5 µg/ml;  pada  sel  kanker  kolon  WiDr  yang  kemudian  diinkubasikan  selama  24  jam.  Penghitungan  sel dilakukan  setelah  pemberian  MTT  dan  SDS stopper . Persentase  inhibisi yang  dihasilkan  dari  masing- masing  konsentrasi  sampel  uji  secara  berturut-turut  adalah  97,9  %;  98,3%;  69,6%;  21,3%;  dan  14,5%. Ekstrak n- heksan daun botto’-botto’ mempunyai nilai IC 50 sebesar 162,18 µg/ml. Hasil ini tidak memenuhi kriteria yang ditetapkan NCI National Cancer Institute sebagai antikanker yaitu dengan range <30 µg/ml. Analisis korelasi-regresi pada grafik menunjukkan hasil yang tidak linear untuk 5 seri konsentrasi sampel uji  yang  digunakan.  Sehingga  dapat  disimpulkan  ekstrak  n- heksan  daun  botto’-botto’  ( Chromolaena odorata L.) tidak bersifat sitotoksik terhadap cell line kanker kolon WiDr.
Kata kunci :  Sitotoksik, Kanker Kolon, Sel WiDr, Chromolaena odorata L.

## Pendahuluan
Penyakit  kanker  merupakan  salah  satu penyebab  kematian  utama  di  seluruh  dunia. Pada  tahun  2012,  kanker  menjadi  penyebab kematian  sekitar  8,2  juta  orang.  Berdasarkan data  GLOBOCAN, International  Agency  for Research  on  Cancer (IARC)  diketahui  bahwa pada  tahun  2012  terdapat  14.067.894  kasus baru  kanker  dan  8.201.575  kematian  akibat kannker  di  seluruh  dunia.  Penyebab  terbesar kematian  akibat  kanker  setiap  tahunnya  salah satunya  disebabkan  oleh  kanker  kolorektal (Kemenkes, 2015).
Kanker kolorektal merupakan salah satu jenis  kanker  yang  terjadi  pada  mukosa  kolon dimana penyakit ini mempunyai angka morbiditas dan mortalitas yang tinggi. Berdasarkan  studi  epidemiologi  yang  dilakukan oleh  Haggar,  et al  tahun  2009  dikatakan bahwa jumlah  insiden  kanker  kolorektal  di  dunia mencapai  9%  dari  semua  jenis  kanker. Berdasarkan  data  dari World  Cancer  Research Fund  International (WCRF)    tahun  2008  kanker kolorektal  menempati  peringkat  ketiga  setelah kanker  paru  dan  kanker  payudara  sebagai kanker  dengan  frekuensi  terbanyak  dengan  1,2 juta kasus baru. Data World Health Organization (WHO)  tahun  2008  menempatkan  kanker kolorektal  pada  urutan  keempat  setelah  kanker paru,  kanker  lambung  dan  kanker  hati  sebagai penyebab  kematian  akibat  kanker  dengan 608.000  kematian.  Berdasarkan  jenis  kelamin penderitanya di seluruh dunia, kanker kolorektal menempati posisi kedua umum terjadi pada pria (746.000  kasus  atau  sebesar  10  %)  dan  posisi ketiga  pada  wanita  (614.000  kasus  atau  9,2%) (Globocan, 2012).
Di  Indonesia  sudah  mulai  banyak  data mengenai  angka  kejadian  kanker  kolorektal. Menurut Profil Kesehatan Indonesia tahun 2008, kanker  kolorektal  di  Indonesia  berada  pada peringkat  9  dari  10  peringkat  utama  penyakit kanker pasien rawat inap di seluruh rumah sakit di  Indonesia  dengan  jumlah  kasus  sebanyak 1.810 dengan proporsi sebesar 4,92%.
Berdasarkan data Rumah Sakit Kanker Dharmais  tahun  2010,  kanker  kolorektal  masuk dalam 10 besar kanker tersering dimana kanker rektum  menempati  urutan  keenam  dan  kanker kolon  menempati  urutan  kedelapan.  (Tatuhey dkk, 2012).
Masalah kanker umumnya dapat
ditangani berdasarkan
pada upaya
pengangkatan  jaringan  kanker  atau  dengan mematikan sel kanker tersebut serta meminimalkan  efek  yang  tidak  diinginkan
terhadap sel-sel normal.  Hal ini harus diimbangi dengan pemberian obat-obatan berupa kemoterapi  atau  penyinaran  dengan  sinar  X untuk  mengatasi  kemungkinan  sel    telah mengalami  metastasi  dan  untuk  menghambat proliferasi  sel  kanker  yang  mungkin  masih tertinggal  dan  perlu  terus  dikembangkan  usaha pengembangan  obat  yang  aman  dan  efektif, salah satunya melalui eksplorasi alam.
Indonesia  merupakan  negara  kedua setelah  Brazil  yang  memiliki  keanekaragaman genetik cukup banyak. Para ilmuan telah banyak menggali  dan  mengeksplorasi  kekayaan  alam untuk  mencari  peluang  dalam  mengembangkan obat-obatan  baru  (Hermani,  2006).  Namun demikian,  sampai  sejauh  ini  baik  mengenai kandungan kimia, khasiat maupun efek sampingnya (tanaman/obat herbal) belum banyak  dilaporkan  atau  diteliti  secara  ilmiah. Salah  satu  tumbuhan  yang  biasa  digunakan masyarakat  sebagai  bahan  obat  adalah  daun Botto’-botto’  atau  biasa  disebut  dengan  nama Kirinyu  (Sunda),  tumbuhan  ini  oleh  masyarakat hanya  digunakan  sebagai  obat luka  dan  secara luas juga dikenal sebagai gulma padang rumput dan perkebunan.
Botto’-Botto’, Chromolaena  odorata (L) (Asteraceae:  Asterales)  dalam  bahasa  Inggris disebut siam  weed merupakan  gulma  padang rumput  yang  sangat  luas  penyebarannya  di Indonesia.  Gulma ini  diperkirakan sudah tersebar  di  Indonesia  sejak  tahun  1910-an (Sipayung  et  al.,  1991),  dan  tidak  hanya terdapat di lahan kering atau pegunungan tetapi juga  banyak  terdapat  di  lahan  rawa  dan  lahan basah lainnya (Thamrin dan Asikin, 2013).
Studi  pendahuluan  telah  dilakukan dengan  tujuan  untuk  menskrining  senyawa toksik  dari  sampel  ekstrak  daun botto’-botto’ dengan  metode Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT)    dengan  LC 50 ekstrak  n-Heksan  10,91 µg/ml (Habritasari, 2014). Hasil dalam penelitian lain  dilaporkan  bahwa  ekstrak  n-heksan  daun botto’-botto’  berefek  antimitosis  pada  sel  telur bulubabi  ( Tripneustus  gratilla Linn)  dengan  nilai IC 50 yaitu 11,85 µg/ml (Pratiwi, 2014). Selain itu penelitian  yang  dilakukan  Suriyavathana  M  et al., tahun 2012 membuktikan adanya kandungan  dari  ekstrak  daun  botto’-botto’  yang memberikan  efek  antioksidan  seperti  kita ketahui  bahwa  antioksidan  dapat  menangkal radikal bebas. Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab kerusakan  DNA  di  samping  penyebab  lain seperti  virus.  Bila  kerusakan  tidak  terlalu  parah, masih  dapat  diperbaiki  oleh  sistem  perbaikan
DNA.  Namun,  bila  sudah  menyebabkan  rantai DNA  terputus  di berbagai  tempat,  kerusakan  ini tidak dapat diperbaiki lagi sehingga pembelahan sel  akan  terganggu.  Bahkan  terjadi  perubahan abnormal  yang  mengenai  gen  tertentu  dalam tubuh yang dapat menimbulkan penyakit kanker (Suryo, 2008).
Penelitian ini menguji aktivitas antikanker  ekstrak  daun  botto’-botto’  terhadap sel  kanker  kolon WiDr.  Sel WiDr    dipilih  karena memiliki  kelebihan  yaitu  mudah  dikulturkan  dan memiliki doubling  time yang  singkat  bila dibandingkan  dengan  kultur  sel  kanker  lainnya. Sel  ini  juga  memiliki platting  efficiency yang tinggi. (Noguchi et al., 1979).
Untuk menambah data ilmiah mengenai manfaat  daun  botto’-botto’,  utamanya  dalam menemukan  obat  kanker  alternatif,  maka  perlu dilakukan  penelitian  mengenai  uji  aktivitas ekstrak  n- heksan  daun  botto’-botto’  terhadap penghambatan sel WiDr.
Metode Penelitian
Jenis
Penelitian:
Penelitian
ini menggunakan  analisis  eksperimental  untuk  uji toksisitas  senyawa  aktif  dari  bahan  alam  untuk mencari obat baru secara in vitro.
1. Pengolahan Sampel
Sampel  yang  digunakan  adalah  daun botto’-botto’ yang segar, dicuci bersih dengan air mengalir  kemudian  dipotong-potong  kecil  dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan, tidak terkena  paparan  sinar  matahari  langsung. Kemudian dilakukan esktraksi berupa maserasi.
Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian  ini  yaitu  secara  maserasi.  Dimana maserasi  merupkan  metode  yang  paling  mudah dilakukan  dan  menggunakan  peralatan  yang sederhana,  yaitu  dengan  cara  merendam sampel  dalam  cairan  penyari.  Cairan  penyari yang digunakan adalah n-heksan.
Sampel daun botto’-botto’ yang sebelumnya telah dikeringkan, ditimbang sebanyak  300  gram  dimasukkan  dalam  wadah maserasi, kemudian ditambahkan dengan cairan  penyari  pertama  yaitu  n-heksan  hingga semua  sampel  terendam  keseluruhan  dan ditutup  rapat.  Dibiarkan  selama  2  kali  24  jam sambil diaduk sekali-kali. Disaring dan dipisahkan  filtratnya..  Ekstrak  n-heksan  yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator , didapatkan ekstrak kental n-heksan.
2. Pembuatan Media Kultur
Dilarutkan bubuk RPMI ke dalam 800 ml akuades,  kemudian  ditambahkan        2  gram 4- (2-hydroxyethyl)-1 piperazineethanesulfonic acid (HEPES)  dan  2  gram  NaHCO 3. Ditambahkan
akuades  sampai  volume  1  L.  Campuran dihomogenkan  dengan  cara  diaduk  kemudian pH diukur pada 7,2-7,4 dengan cara penambahan 1M NaOH atau 1M HCl. Sterilisasi dilakukan dengan cara
menyaring menggunakan  saringan  membran  0,2  µm, selanjutnya  ditambahkan  fungsion  0,5%, Fetal Bovine  Serum (FBS)  10%,  dan   streptomisin 1%. Ditampung ke dalam botol duran.
3. Penanaman Sel
Mula-mula dilakukan panen sel. Diambil sel dari  tangki  nitrogen  cair,  amati  kondisi  sel. Panen  sel  dilakukan  setelah  sel  80%  konfluen. Dibuang media dengan menggunakan mikropipet.  Dicuci  sel  sebanyak  2  kali  dengan PBS  (volume  PBS  adalah  ±½  volume  media awal). Ditambahkan tripsin-EDTA (tripsin 0,25%) secara merata dan diinkubasi di dalam inkubator selama    3  menit.  Ditambahkan  media  ±  5  ml untuk  menginaktifkan  tripsin.  Diamati  keadaan sel di mikroskop. Ditransfer sel yang telah lepas satu-satu ke dalam conical steril baru. Resuspensi sel di conical tube dari hasil panen. Diambil  10  µl  panenan  sel  dan  dipipetkan  ke haemocytometer . Dihitung sel di bawah mikroskop inverted dengan  bantuan  counter. Dilakukan transfer sejumlah sel yang diperlukan ke  dalam conical lain  dan  ditambahkan  media komplit  sesuai  konsentrasi  yang  dibutuhkan. Jika  sudah  siap,  ditransfer  sel  ke  dalam sumuran,  masing-masing  100  µl.  Sisakan  4 sumuran  kosong  untuk  kontrol  media.  Diamati keadaan sel di mikroskop inverted untuk melihat distribusi  sel  dan  didokumentasikan.  Diinkubasi 24 jam.
4. Preparasi Sampel dan Treatment
Larutan Uji dibuat dengan melarutkan 10 mg  ekstrak  n- heksan  botto’  botto’ dalam  100  µl DMSO  sehingga diperoleh stok 1000 ppm. Dari larutan  stok  dibuat  seri  konsentrasi  1000  µg/ml; 500 µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; dan 62,5 µg/ml dalam  media  kultur  RPMI  untuk  uji  sitotoksik. Pekerjaan  ini  dilakukan  di  LAF.  Diambil  plate dari  inkubator  CO 2 untuk  dibawa  ke  LAF. Dibuang  media  sel (balikkan plate 180°)  di  atas tempat buangan dengan jarak 10 cm, kemudian tekan plate secara  perlahan  di  atas  tisu  untuk meniriskan sisa cairan. Dimasukkan  seri konsentrasi  sampel  ke  dalam  sumuran  (triplo). Inkubasi di dalam inkubator CO 2 selama 24 jam.
5. Uji Sitotoksik MTT
Menjelang waktu akhir inkubasi, dokumentasikan  kondisi  sel  untuk  setiap perlakuan  (foto  dahulu).  Buang  media  sel, tambahkan  reagen  MTT  100  µl  ke  setiap sumuran,  termasuk  kontrol  media  (tanpa  sel).
Inkubasi sel selama 2-4 jam di dalam inkubator (sampai  terbentuk  formazan).  Periksa  kondisi sel  dengan  mikroskop  inverted.  Jika  formazan telah  jelas  terbentuk,  tambahkan stopper SDS 10%  dalam  0,1  N  HCl.  Pekerjaan  tidak  perlu dilakukan  di  dalam  LAF  hood.  Bungkus plate dengan  kertas  atau  aluminium  foil  dan inkubasikan  di  tempat  gelap  (suhu  ruangan) semalam.  Selanjutnya  pembacaan  absorbansi, hidupkan ELISA reader , tunggu proses progressing  hingga  selesai.  Buka  pembungkus plate dan  tutup plate .  Masukkan  ke  dalam ELISA reader. Baca absorbansi masing-masing sumuran  dengan  ELISA reader pada  panjang gelombang  595  nm  tekan  tombol START . Matikan  ELISA reader .  Simpan  dan  tempel kertas hasil ELISA pada LOG BOOK.

## Hasil dan Pembahasan
Tabel 1. Hasil Ekstraksi Daun Botto’-Botto’
Berat Sampel Berat Ekstrak % Rendemen 300 g 500 mg 0.16 % Tabel 2. Uji Sitotoksik WiDr Konsentrasi Log Konsentrasi % Inhibisi Nilai Probit 1000 3 97,9 7,0335 500 2,6989 98,3 7,1204 250 2,3979 69,6 5,5129 125 2,0969 21,3 4,2039 62,5 1,7958 14,5 3,9419
Sejumlah  300  gram  simplisia  daun  botto’- botto’    diekstraksi  menggunakan  metode maserasi menggunakan pelarut n-heksan sebanyak 4 liter (dilakukan dua kali), menghasilkan  ekstrak  kental  daun  botto’-botto’ sebanyak 500 mg. Jumlah persentase rendemen yang diperoleh dari ekstrak n-heksan daun botto’-botto’ adalah 0,16 %.
Hasil  yang  didapatkan  pada  pengujian menggunakan  kultur  sel  WiDr  untuk  ekstrak  n- heksan  daun  botto’-botto’  dengan  konsentrasi 1000  µg/ml;  500  µg/ml;  250  µg/ml;  125  µg/ml dan  62,5  µg/ml  dengan  nilai  persentase  inhibisi berturut-turut  sebagai  berikut  97,9%;    98,3  %; 69,6  %;  21,3  %  dan  14,5  %.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi dari  sampel  uji  yang  diberikan  maka  semakin kecil  persentase  kehidupan  sel  kanker  dan semakin besar sifat toksisitasnya.
Berdasarkan  pengolahan  data  yang  telah dilakukan dengan metode analisis probit diperoleh nilai IC 50 untuk sel WiDr dari pengujian menggunakan  ekstrak  n- heksan  daun  botto’- botto’  adalah  162,18  µg/ml  µg/ml.  Penetapan
batas toksik penelitian ini menggunakan  kriteria National  Cancer  Institute (NCI).  Kriteria  ini menyebutkan  suatu  ekstrak  dinyatakan  aktif memiliki  aktivitas  antikanker  apabila  memiliki nilai  IC 50 <  30  µg/ml,  moderate  aktif  apabila memiliki  nilai  IC 50 ≥  30  µg/ml  dan  IC 50 <  100 µg/ml dan dikatakan tidak  aktif apabila nilai IC 50 >  100  µg/ml.  Hasil  ini  menunjukkan  bahwa ekstrak  n- heksan  daun  botto’-botto’  tidak  aktif terhadap cell line kanker kolon WiDr karena nilai IC 50 yang  diperoleh  lebih  dari  100  µg/ml.  Oleh karena  itu  penelitian  ini  akan  lebih  baik  bila dilanjutkan  pengujiannya  dengan  mengisolasi senyawa  murni  yang  terkandung  dalam  ekstrak daun  botto’-botto  yang  mampu  memberikan reaksi  aktif  terhadap cell  line kanker  dengan hasil yang memenuhi kriteria.

## Kesimpulan
1.  Ekstrak  n- heksan  daun  botto’-botto  tidak memiliki aktivitas  sitotoksik  terhadap cell  line kanker kolon WiDr.
2.   Nilai IC 50 ekstrak n- heksan daun botto’-botto’ adalah      162,18    µg/ml.  Hasil  IC 50 yang diperoleh  >  100  µg/ml  sehingga  disimpulkan tidak aktif sebagai antikanker.

## Kepustakaan
Habritasari,  Annisa. Skrining  Uji  Toksisitas Ekstrak  Etanol  dan  Ekstrak  N-Heksan
Daun
Botto’-Botto’
(Chromolaena
Odorata)  Dengan  Metode  Brine  Shrimp Lethality  Test. Skripsi  Sarjana,  Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar. 2014 Haggar FA and Boushey RP. Colorectal Cancer Epidemiology: Incidence, Mortality,
Survival  and  Risk  Factors. Thieme Medical Publisher. 2009.
Hermani  dan  Raharjo,  M. Tanaman  Berkhasiat Antioksidan , Penebar Swadaya. Jakarta.
2006
Kementerian  Kesehatan  RI. Buletin  induk  data dan informasi kesehatan : situasi penyaki kanker . Jakarta. 2015
Noguchi,  P.,  Wallace,  J.J.,  Early,  M.E.,  O’Brien S.,  Ferrone,  S.,  Pellegrino,  A.M.,  at  al . Characterization  of  WiDr  :  A  Human
Colon  Carcinoma  Cell  Line,  In  Vitro . 1979
Pratiwi. Skrining  Uji  Efek  Antimitosis  Ekstrak
Daun Botto’-Botto’
(Chromolaena
odorata  L.)  Menggunakan  Sel  Telur
Bulubabi (Tripneustus gratilla L.). Skripsi Sarjana,  Fakultas  Kedokteran  dan  Ilmu Kesehatan  Universitas  Islam  Negeri Alauddin Makassar. 2014
Sipayung,  A.,  R.D.  De  Chenon  and  P.S. Sudharto. Observations
on Chromolaena  odorata  (L.)  R.M.  King and  H.  Rubinson  in  Indonesia.  Second international  Wokshop  on  the  Biological Control
and
Management
of
Chromolaena  odorata .  Biotrop,  Bogor. 1991.
Suriyavathana  M  et  Al. In-Vitro  Antioxidant Activity  of  Chromolaena  Odorata  (L.) King  and  Robinson. Department  of Biochemistry,  Periyar  University.  India. 2012
Suryo. Genetika  Manusia .  Yogyakarta:  Gadjah Mada University Press. 2008.
Tatuhey,  W.S.,  Nikijuluw,  H.,  Mainase,  J., Karakteristik Kanker Kolorektal Di RSUD Dr.  M  Haulussy  Ambon  Periode  Januari 2012-Juni  2013 .  Molucca    Medica: Jurnal Kedoteran dan Kesehatan
Volume 4. 2014
Thamrin, M., Asikin S., dan Willis M. Tumbuhan Kirinyu Chromolaena odorata (L) (Asteraceae: Asterales) Sebagai Insektisida Nabati Untuk Mengendalikan Ulat  Grayak  Spodoptera  litura .  Balai
Penelitian Pertanian Lahan Rawa. Kalimantan Selatan. 2013