## 1. Pendahuluan
Tempe adalah makanan sumber protein nabati  yang  sudah  lama  dibuat  oleh masyarakat  Indonesia.  Bahan  utama pembuatan  tempe  adalah  kedelai.  Kedelai telah  terbukti  mempunyai  banyak  manfaat pada kesehatan. Isoflavon ditemukan dalam jumlah yang signifikan pada kedelai (Zhang et  al.,  2007).  Tempe  kaya  akan  isoflavon; antara  lain  genistein  (5,7,4'-  trihidroksi flavon)  and  daidzein  (7,4'-  dihidroksi f l a v o n ) .   P r o s e s   f e r m e n t a s i   d a p a t meningkatkan  kandungan  isoflavon  dalam tempe (Hong et al ., 2012).
Beberapa  penelitian  membuktikan bahwa  isoflavon  kedelai  mempunyai aktivitas  antikanker.  Isoflavon  kedelai terbukti  berpotensi  sebagai  antikanker
, payudara (Barnes, 1997; Verma and Goldin, 1998; Rahal and Simmen, 2010). Selain itu, isoflavon  tempe  mempunyai  kemampuan menangkap  radikal  bebas  (Zielonka  et  al., 2003)  dan  menstimulasi  produksi  asam hialuronat   (Miyazaki  et  al.,  2002). Kemampuan  isoflavon  pada  penyakit jantung  diantaranya  berguna  bagi  penderita hipertensi,  arterosklerosis,  infark  kardiak,
dan  hiperlipidemia.  Isoflavon  juga  berguna untuk  mencegah  osteoporosis  melalui mekanisme  berikatan  secara  kuat  dengan ER- β dan ER- α (Watanabe et al., 2002).
Dengan  demikian,  tempe  dijadikan salah satu sumber isoflavon yang potensial. Oleh  karena  itu,  perlu  ada  metode  untuk penetapan  isoflavon  dalam  tempe  untuk mengetahui  kandungan  isoflavon  di  dalam tempe.  Penetapan  kadar  isoflavon  biasanya dilakukan  dengan  menggunakan  HPLC (Yuan  et  al.,  2006),  HPTLC  (Khan  et  al., 2010),  dan  KLT  (Yuan  et  al.,  2006).  Pada penelitian  ini  akan  dilakukan  penetapan kadar isoflavon tempe dengan metode yang mudah  dan  cepat  menggunakan  KLT- densitometri.
JURNAL FARMASI SAINS DAN KOMUNITAS, Mei 2014, hlm. 13-17
ISSN : 1693-5683

## ANALISIS KUANTITATIF ISOFLAVON TEMPE SECARA CEPAT DAN SEDERHANA MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS- DENSITOMETRI
1
2*
2
AGUSTINA SETIAWATI , SRI HARTATI YULIANI , MICHAEL RAHARJA GANI , EVY FENNY
2 2 1
VERONICA , DINA CHRISTIN AYUNING PUTRI , REZA EKA PUTRA , DAVID CHANDRA 2 3
3,4

## PUTRA , AGNES MUTIARA KURNIAWAN , ENADE PERDANA ISTYASTONO
1 Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
2 Laboratorium Teknologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma,Yogyakarta
3 Laboratorium Kimia Analisis, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
4 Pusat Studi Lingkungan Hidup, Universitas Sanata Dharma, Soropadan, Condongcatur, Yogyakarta Email korespondensi: srihartati.yuliani@gmail.com
Abstract: Rapid and simple quantitative analysis isoflavones tempe using densitometric TLC has been done. The mobile phase of the system was chloroform: methanol: ethylacetate (45: 5: 0.75).  Thin layer chromatography was performed on aluminium TLC plate s. Ascending distance of  1 μ L  sample  was  performanced  10  cm.  Then  the plate was  scanned  at  261  nm. A  linear relationship obtained at 0.08 - 2 μ g/spot with r= 0.9986. The LOD and LOQ of isoflavone were 0.014 μ g/spot and 0.048 μ g/spot. Genistein contained in tempe was 0.151± 0.005 % b/b.
Keywords: tempe, isoflavon, TLC
Gambar 1. Tempe

## 2. Bahan dan Metode Penelitian
Bahan  yang  digunakan:  tempe  yang dipasarkan di DIY, plate KLT Silica 60 F254, E-Merck,  Germany,  200  x  200  mm, kloroform  ( Merck ),  metanol  ( Merck ),  asam asetat ( Merck ).

## 3. Tata Cara Penelitian

## 3.1. Ekstraksi isoflavon tempe
Sebanyak  100  g  tempe  yang  telah ditumbuk  kasar  ditambah  dengan  200  mL petroleum  eter  dan  didiamkan  selama  30 menit.  Tempe  disaring,  tempe  yang  telah didefatisasi ditambah dengan 200 mL air  dan diblender, tempe yang telah halus ditambah 300  mL  etanol  teknis  dan  kemudian dimaserasi  semalaman.  Maserat  yang didapat dipekatkan dengan rotari evaporator pada suhu 60 C sampai volume konstan.

## 3.2. Analisis Kadar Isoflavon Tempe
Metode  Kromatografi  Lapis  Tipis (KLT)  digunakan  untuk  menetapkan  kadar isoflavon  yang  terkandung  dalam  tempe. Fase  diam  yang  digunakan  adalah plate aluminium KLT. Fase gerak dalam sistem ini adalah  kloroform:  metanol:  asam  asetat (45:5:0,75).  Sampel  sebanyak  1 μ L ditotolkan  menggunakan  Camag's  linomat pada  15  mm  dari  dasar plate ,  spot dikeringkan dengan gas N . Plate kemudian 2 dimasukkan  ke  dalam chamber Wheaton yang telah dijenuhi dengan fase gerak. Elusi fase  gerak  dilakukan  sepanjang  100  mm. Plate kemudian  dikeringkan  sampai  semua fase  gerak  menguap  pada  suhu  kamar  dan dilakukan scanning menggunakan  Camag's TLC Scanner yang telah dilengkapi dengan software winCAT. Deteksi dilakukan dengan
modifikasi  metode  (Huang  and  Liu,  2012) pada panjang gelombang 261 nm.
Linearitas. Linearitas  diuji  dengan menggunakan  5  seri  konsentrasi  standar genistein. Lima seri kadar tersebut ditotolkan sehingga jumlah genistein tiap totolan adalah 0,08 – 2 μ g/totolan. Korelasi antara luas area puncak  dan  konsentrasi  standar  genistein selanjutnya ditentukan.
Presisi. Variabilitas  metode  analisis dipelajari  menggunakan  metode  presisi intraday dan interday .  Parameter  yang digunakan untuk menghitung kriteria presisi adalah  %  KV  (%  koefisien  variasi). Persentase  koefisien  variasi  yang  dapat diterima  dalam  penelitian  ini  menurut Horwitz adalah 8% (Gonzalez and Herrador, 2007).
Akurasi. Standar  adisi  digunakan  untuk menguji  akurasi  dari  metode  analisis. Sebanyak  tiga  konsentrasi  larutan  standar genistein  ditambahkan  ke  dalam  ekstrak tempe  dan  dihitung  persentase recovery . Kriteria  penerimaan  persen  recovery  pada penelitian  ini  adalah  90  –  107%  (Gonzalez and Herrador, 2007).

## 4. Hasil dan Pembahasan
Tempe  adalah  makanan  tradisional Indonesia yang terbuat dari kedelai. Kedelai sebagai  bahan  utama  pembuatan  kaya  akan isoflavon.  Isoflavon  ditemukan  dalam jumlah yang signifikan pada kedelai (Zhang et  al.,  2007).  Genistein,  daidzein,  dan glycitein  adalah  isoflavon  aglikon  yang terdapat dalam tempe (Rostagno et al., 2007). Proses  fermentasi  kedelai  menjadi  tempe tidak  merusak  kandungan  isoflavon  di dalamnya.
Fase  gerak  yang  menghasilkan pemisahan  isoflavon  tempe  yang  terbaik diantaranya  metanol:  kloroform  (7:  3); kloroform: etil asetat: metanol (8: 1: 0,5) dan kloroform: metanol: asam asetat (9: 1: 0,15). Campuran fase gerak terakhir dan jarak elusi 10  cm  memberikan  pemisahan  terbaik dengan  resolusi  1,57.  Pemisahan  dikatakan baik  jika  resolusi  >  1,25.  Berdasarkan scanning panjang gelombang yang dilakukan terhadap  standar  genistein  maupun  sampel
SETIAWATI, dkk.
Gambar 2. Struktur genistein, isoflavon utama dalam tempe
e k s t r a k   t e m p e   d i d a p a t k a n   p a n j a n g gelombang maksimum pada 261 nm.
Evaluasi terhadap linearitas dilakukan dengan  menggunakan  5  seri  kadar  dimana dalam tiap totolan mengandung 0,08 – 2 μ g genistein.  Penetapan  kadar  genistein mempunyai persamaan linear y = 44,848 x– 353,46 dengan koefisien korelasi R = 0,9986
2 dan  R   =  0,9973.  Rasio  signal  noise  yang digunakan dalam perhitungan LOD dan LOQ adalah  3  dan  10.  LOD  dan  LOQ  isoflavon yang di dapat dengan sistem ini adalah 0,014 μ g/totolan dan 0,048 μ g/totolan.
Variabilitas metode yang terjadi diukur dengan  menggunakan  presisi  intraday  dan interday.  Parameter  yang  digunakan  pada metode ini adalah %KV. Presisi intraday dan interday  yang  ditemukan  dalam  sistem  ini adalah  0,43%  dan  2,38%.  Kriteria penerimaan  %  KV  yang  diterima  dalam penelitian  ini  adalah  berdasarkan  Horwitz yaitu  kurang  dari  8%  (Gonzalez  and Herrador,  2007).  Dapat  disimpulkan  bahwa metode ini mempunyai presisi yang baik.
Akurasi  metode  ditentukan  dengan metode  standar  adisi.  Larutan  standar genistein  ditambahkan  ke  dalam  ekstrak isoflavon  tempe.  Persentase recovery ditentukan  pada  3  level  konsentrasi.  Hasil
menunjukkan recovery metode  95,99  – 106,27%  pada  400  ppm,  94,24  –  106,27% pada 450 ppm dan 98,33 – 103,86% pada 500 ppm. Menurut kriteria penerimaan recovery metode  adalah  90  –  107%  (Gonzalez  and Herrador,  2007);  dengan  demikian disimpulkan  bahwa recovery metode  yang digunakan adalah memenuhi kriteria.
Ekstraksi  isoflavon  dari  tempe dilakukan  dengan  menggunakan  metode maserasi. Sebelum proses maserasi tempe di defatisasi  menggunakan  petroleum  eter. Proses  ini  dilakukan  untuk  menghilangkan fase lemak yang terdapat dalam tempe.
Penanganan  selama  proses  ekstraksi menggunakan  suhu  tidak  lebih  dari  60  C untuk  menjaga  supaya  kandungan  aktif ekstrak  tempe  tidak  rusak.  Ekstrak  yang dihasilkan  kemudian  diuji  menggunakan T L C - s c a n n e r.   G a m b a r   3   d i   a t a s memperlihatkan  bahwa  di  dalam  sampel terdapat  genistein.  Hal  tersebut  dapat dipastikan  dengan  adanya  peak  1  pada ekstrak  yang  mempunyai  Rf  sama  dengan peak pada standar genistein. Sehingga dapat dikatakan  bahwa  ekstrak  tempe  yang dihasilkan  mengandung  genistein  yang merupakan  isoflavon.  Hasil  uji  ekstrak menggunakan  TLC  scanner  menghasilkan
SETIAWATI, dkk. Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas 15
Parameter
Results Linearity Rentang 0,08 – 2 µg/totolan Persamaan linear Y = 44,848x – 353,46 Koefisien korelasi 0,9986 R kuadrat 0,9973 Presisi (% KV) Intraday (n=3) 0,43 Interday (n=3) 2,38 Limit of detection 0,014 µg/totolan Limit of quantification 0,048 µg/totolan Recovery Konsentrasi 400 ppm 95,99 – 106,27% Konsentrasi 450 ppm 94,24 – 106,78% Konsentrasi 500 ppm 98,33 – 103,86% Tabel 1. Ringkasan Parameter Validasi Isoflavon Tempe
peak  dengan  Rf  sama  dangan  standar genistein  (Gambar  3).  Ekstrak  tempe mengandung  salah  satu  senyawa  golongan isoflavon,  yaitu  genistein.  Setelah memastikan  adanya  isoflavon  yang terdeteksi sebagai genistein, maka penetapan kadar dapat dilanjutkan dengan melakukan 5 kali  replikasi  dengan  hasil  seperti  yang terlihat pada Tabel 2.
Dalam  penelitian  ini  kadar  isoflavon dalam  tempe  yang  terhitung  sebagai genistein adalah 0,151± 0,005 % b/b.

## 5. Kesimpulan
M e t o d e   T L C -   d e n s i t o m e t r i k merupakan metode yang cepat dan sederhana untuk  menentukan  kadar    isoflavon  dalam tempe. Kadar genistein dalam tempe dalam penelitian ini adalah 0,151 % b/b.

## Ucapan Terimakasih
Penelitian  ini  didanai  oleh  DP2M DIKTI  melalui  dana  Penelitian  Hibah Bersaing tahun anggaran 2013.

## Daftar Pustaka
Barnes, S. 1997. The chemopreventive properties of soy isoflavonoids in animal models of breast cancer. Breast  Cancer  Research  and Treatment , 46, 169–179.
Gonzalez, A.G. and Herrador, M.A. 2007. A practical guide  to  analytical  method  validation, including  measurement  uncertainty  and accuracy  profiles. Trends  in  Analytical Chemistry , 26, 227–238. Huang,  M. and Liu,  D.  2012.  Thin  Layer C h r o m a t o g r a p h y   D e n s i t o m e t r i c Determination  of  Soybean  Isoflavones  in Wild  Soybean  (Glycine  soja)  Seeds. Asian Journal of Chemistry . 24, 1322.
Khan,  H.N.,  Gupta,  R.,  Farooqi,  H.,  Habib, A. and Akhtar,  P.  2010.  Biochemical  analysis  of Glycine  max  seeds  under  different germinating  periods  and  densitometric analysis of genistein. Journal of Phytology, 2 , 83–86.
Miyazaki, K., Hanamizu, T., Iizuka, R. and Chiba, K. 2002.  Genistein  and  daidzein  stimulate hyaluronic  acid  production  in  transformed human  keratinocyte  culture  and  hairless mouse skin. S kin Pharmacology and Applied Skin Physiology , 15, 175–183. Rahal,  O.M. and Simmen,  R.C.M.  2010.  PTEN  and p53  cross-regulation  induced  by  soy
SETIAWATI, dkk. 16

## Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas
Gambar 3. Peak hasil scanning menggunakan Camag's TLC scanner dengan software WinCAT pada sampel ekstrak tempe (a) dan standar genistein (b).
Genistein ditunjukkan peak 1 dengan Rf 0,51
a b Kadar ekstrak (ppm) Ekstrak tempe
(mg) Kadar isoflavon tempe (% b/b) Rata-rata SD 405,58 202,79 0,142
0,151 0,005 435,06 217,53 0,153 430,38 215,19 0,151 427,95 213,97 0,150 446,52 223,26 0,157 Tabel 2. Kadar Genistein dalam Tempe
isoflavone  genistein  promotes  mammary epithelial cell cycle arrest and lobuloalveolar differentiation. Carcinogenesis ,  31, 1491–1500.
Rostagno,  M.  a,  Palma and M.  and  Barroso,  C.G. 2007.  Ultrasound-assisted  extraction  of isoflavones from soy beverages blended with fruit  juices. Analytica  chimica  acta ,  597,
265–272.
Verma,  S.P. and Goldin,  B.R.  1998.  Effect  of  soy- derived isoflavonoids on the induced growth of MCF-7 cells by estrogenic environmental c h e m i c a l s   E f f e c t   o f   S o y - D e r i v e d Isoflavonoids  on  the  Induced  Growth  of MCF-7  Cells  by  Estrogenic  Environmental Chemicals. Nutrition  and  Cancer ,  30,
232–239.
Watanabe,  S.,  Uesugi,  S. and Kikuchi,  Y.2002. Isoflavones  for  prevention  of  cancer, cardiovascular  diseases,  gynecological problems and possible immune potentiation. Biomedicine  &  pharmacotherapy ,  56, 302–312. Yuan, D., Chen, Y., Bai, X., Pan, Y. and Kano, Y. 2006. TLC and HPLC Analysis of Soy Isoflavones
in Semen Sojae Praeparatum. Asian Journal of Traditional Medicines, 1, 3–9. Zhang, E.J., Ng, K.M. and Luo, K.Q. 2007. Extraction and  Purification  of  Isoflavones  from Soybeans  and  Characterization  of  Their E s t r o g e n i c   A c t i v i t i e s . J o u r n a l   o f Agricultural  and  Food  Chemistry 55, 6940–6950. Zhang,  J.,  Xu,  S.,  Zhang,  S. and Du,  Z.  2008. Preparation  and  Characterization  of Tamarind Gum/Sodium Alginate Composite Gel  Beads. Iranian  Polymer  Journal 17, 899–906.
Zielonka,  J.,  Gbicki,  J. and Grynkiewicz,  G.2003. Radical  scavenging  properties  of  genistein. Free  Radical  Biology  and  Medicine 35, 958–965.
SETIAWATI, dkk. Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas 17