AKTIVITAS ANTIOKSIDAN HIDROLISAT PROTEIN MIOFIBRIL BELUT ( Synbranchus bengalensis ) YANG DIHIDROLISIS DENGAN ENZIM PAPAIN

## ANTIOXIDANT ACTIVITY OF EEL MYOFIBRILLAR PROTEIN HYDROLYSATESHYDROLYZED WITH PAPAIN ENZYME
Arlina Hidayati * , Joko Santoso, dan Desniar
Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor Kampus IPB Darmaga, Bogor, Jawa Barat, Indonesia
Email: arlinahidayati23@gmail.com
Makalah: Diterima 22 Maret 2019; Diperbaiki 19 November 2019; Disetujui 13 Desember 2019

## ABSTRACT
Protein hydrolysates contain bioactive peptides which have several function in order to maintain health and reduce the risk of disease. One of the functions of bioactive peptides is as an antioxidant. This study aims to characterize eel myofibril (Synbranchus bengalensis), determine the effect of papain enzyme ratio and hydrolysis time  on  eel  myofibril  protein  hydrolysates,  determine  the  antioxidant  activity  of  eel  myofibril  hydrolysates  by using DPPH and reducing power assay, and characterize the hydrolysate of myofibril proteins which have the best antioxidant activity. The results showed that eel myofibril protein contained moisture, fat, protein and ash of 85.91, 0.15, 0.14 and 12.78% respectively and contained the highest glutamic acid and lysine.  Hydrolysates of eel  myofibril  proteins  treated  using  various  enzyme  ratio  and  hydrolysis  time  had  hydrolysates  yields  ranging from 3.53-9.68%, the value of hydrolysis degrees 5.20 - 16.193%, IC 50 14.24 - 30.26 mg/mL for DPPH assay and absorbance  0.125  -  0.190  at  a  concentration  of  5  mg/mL  for  reducing  power  assay.  Hydrolysis  eel  myofibril protein using ratio papain 0.20:100 for 2 hours produced the highest antioxidant activities measuring by DPPH scavenging and reducing power iron. The hydrolysate had molecular weight approximately 19.51 kDa. Glutamic acid and lysine became the dominant amino acids of the hydrolysate.
Keywords: antioxidant, hydrolysates, myofibril, Synbranchus bengalensis, papain

## ABSTRAK
Hidrolisat  protein  mengandung  peptida  bioaktif  yang  berfungsi  untuk  menjaga  kesehatan  dan mengurangi  resiko  terhadap  penyakit.  Salah  satu  fungsi  peptida  bioaktif  adalah  sebagai  antioksidan.  Penelitian ini  bertujuan  untuk  mengkarakterisasi  miofibril  belut  ( Synbranchus  bengalensis ),  menentukan  pengaruh  rasio enzim  papain  dan  lama  waktu  hidrolisis  terhadap  hidrolisat  protein  miofibril  belut,  menentukan  aktivitas antioksidan  hidrolisat  miofibril  belut  (uji  DPPH dan reducing  power ),  dan  mengkarakterisasi  hidrolisat  protein miofibril  yang  memiliki  aktivitas  antioksidan  terbaik.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  miofibril  belut memiliki kadar protein, kadar lemak,  kadar air dan kadar abu berturut turut yaitu  85,91; 0,15; 0,14 and 12,78% serta mengandung  asam amino tertinggi yaitu asam glutamat dan lisin. Hidrolisat protein miofibril belut dengan perlakuan  perbedaan  rasio  enzim  dan  lama  hidrolisis  memiliki  rendemen  berkisar  antara  3,53  –  9,68%,  nilai derajat  hidrolisis  5,20  –  16,193%,  IC 50 14,24  –  30,26  mg/mL  (uji  DPPH)  dan  absorbansi  0,125  –  0,190  pada konsentrasi  5  mg/mL  (uji reducing power ).    Hidrolisat  dengan  aktivitas  antioksidan  tertinggi  diperoleh  dengan rasio enzim 0,20:100 dan lama hidrolisis 2 jam. Hidrolisat memiliki berat molekul kurang dari  19,51 kDa serta memiliki komposisi asam amino tertinggi yaitu asam glutamat dan lisina.
Kata kunci: antioksidan, hidrolisat, miofibril, Synbranchus bengalensis , papain

## PENDAHULUAN
Belut ( Synbranchus
bengalensis ) merupakan  jenis  ikan  yang  hidup  dengan  iklim subtropis hingga tropis dan tersebar luas di berbagai negara  Asia  termasuk  Indonesia  (Khanh  dan  Ngan, 2010).  Belut  memiliki  kandungan  gizi  yang diperlukan  tubuh  yaitu  protein,  lemak,  fosfor, kalsium,  zat  besi,  dan  vitamin  (Palupi et  al .,  2014). Protein  merupakan  salah  satu  kandungan  nutrisi belut  yang  tergolong  tinggi  yaitu  mencapai  81,25% (Herawati et  al., 2018),  sehingga  belut  dapat berpotensi sebagai bahan baku hidrolisat protein.
Hidrolisat  protein  merupakan  produk  yang dihasilkan  dari  proses  pemotongan  polipeptida protein  menjadi  peptida  dengan  berat  molekul rendah  (Srikanya et  al., 2017).  Hidrolisat  protein telah  dimanfaatkan  sebagai  sumber  nutrisi  (Kiewiet et  al .,  2018),  meningkatkan  karakteristik  produk (Normah dan Noorasma, 2015), dan flavor enhancer (Vijaykrishnaraj et  al .,  2016).  Selain  itu,  hidrolisat protein  mengandung bioaktif  peptida yang  memiliki aktivitas  biologis  bagi  tubuh  sehingga  berpotensi sebagai  pangan  fungsional  dan  nutrasetikal  (Balti et al ., 2011).
Jurnal Teknologi Industri Pertanian 29 (3):247-259 (2019) Nomor DOI: 10.24961/j.tek.ind.pert.2019.29.3.247 ISSN: 0216-3160    EISSN: 2252-390
Terakreditasi Peringkat 2 Dirjen Penguatan Riset dan Pengembangan No 30/E/KPT/2018 Tersedia online http://journal.ipb.ac.id/index.php/jurnaltin
Peptida bioaktif  merupakan peptida dengan urutan  asam  amino  spesifik  (Ovando et  al., 2018), terdiri dari 2 – 20 sekuen asam amino dan memiliki fungsi  fisiologi  bagi  tubuh  (Chandrasekara  dan Shahidi,  2011).  Beberapa  penelitian  menunjukkan peptida  bioaktif  memiliki  fungsi  sebagai  inhibitor tirosinase  (Ochiai et  al., 2016),  anti-inflamasi  (Leo et  al., 2016),  antioksidan  (Mirzaei et  al., 2018), antiobesitas  (Mudgil et  al., 2018),  antikanker (Vilcacundo et al., 2018), antihipertensi (Guan et al.,
2018),  antidiabetes  (Harnedy et  al., 2018), antimikroba (Farzaneh et al., 2018), dan antitrombotik (Qiao et al., 2018).
Salah  satu  fungsi  penting  peptida  bioaktif yaitu  sebagai  antioksidan.  Antioksidan  merupakan senyawa  yang  dapat  melindungi  sel  tubuh  dari kerusakan  akibat  radikal  bebas  (Boligon et  al., 2014).  Sel  tubuh  yang  mati  dapat  menyebabkan kerusakan  jaringan  dan  berbagai  penyakit  kronis seperti arteroklorosis, diabetes, kanker, dan neurodegenaratif (Cheung et al., 2015). Hidrolisat protein yang mengandung peptida bioaktif antioksidan dapat diproduksi dengan hidrolisis  secara  kimia  maupun  enzimatik.  Proses hidrolisis  secara  kimia  merupakan  hidrolisis  dengan asam  atau  basa,  dan  memiliki  beberapa  kelemahan. Suhu  tinggi  yang  digunakan  selama  hidrolisis  dapat merusak  beberapa  asam  amino  seperti  treonin, sistein,  lisin,  tirosin  dan  arginin  serta  proses netralisasi  pH  dapat  menghasilkan  garam  berlebih (Aspevik,  2016).  Proses  hidrolisis  enzimatik menggunakan  enzim  proteolitik  untuk  memotong secara  spesifik  rantai  peptida  (Ovissipour et  al., 2009)  sehingga  menghasilkan  hidrolisat  tanpa kehilangan  banyak  asam  amino  esensial  (Wijayanti et  al., 2015)  dan  memiliki  bioaktivitas  yang  baik terutama  aktivitas  antioksidan  (Klomklao et  al., 2013).  Aktivitas  antioksidan  hidrolisat  dengan hidrolisis  enzimatik  dipengaruhi  oleh  jenis  enzim, kondisi  hidrolisis  dan  bahan  baku  protein  yang digunakan. Pemilihan jenis enzim  merupakan faktor penting, karena jenis enzim yang berbeda mempunyai  perbedaan  spesifitas  dan  menghasilkan karakteristik  hidrolisat  yang  berbeda  (Slizyte et  al., 2005).  Papain  merupakan  salah  satu  enzim  yang berasal  dari  tanaman  yang  telah  banyak  digunakan untuk memproduksi hidrolisat protein yang memiliki aktivitas antioksidan (Najafian dan Babji, 2015).
Berdasarkan  kelarutannya,  protein  ikan dapat  diklasifikasikan  menjadi  protein  miofibril, sarkoplasma, dan stroma. Protein miofibril merupakan komponen utama protein yang mencapai 66  –  77%  dari  total  protein  dan  memiliki karakteristik  fungsional  yang  menguntungkan  untuk pangan.  Karakteristik  fungsional  protein  miofibril meliputi pembentukan gel (Tahergorabi et al., 2011), solubility,  foam  capacity, dan emulsion  capacity (Cercel et  al., 2015).  Selain  mempunyai  sifat fungsional,  protein  miofibril  mempunyai  sifat biologis  sebagai  antioksidan.  Beberapa  penelitian
menunjukkan  bahwa  hidrolisat  miofibril  memiliki aktivitas  antioksidan  yang  baik.  Ren et  al .  (2010), telah melakukan penelitian aktivitas antioksidan dari hidrolisat  miofibril  ikan  Karper.  Ghassem et  al. (2014),  telah  membuktikan  hidrolisat  protein miofibril  ikan  Patin  memiliki  aktivitas  antioksidan yang  baik.  Najafian  dan  Babji  (2015),  telah mengisolasi peptida yang memiliki aktivitas antioksidan  dari  miofibril  ikan  Patin.  Bahan  baku yang  berbeda  memiliki  kandungan  kimia  yang berbeda  (Petrova et  al .,  2018)  sehingga  optimasi proses hidrolisis sangat penting untuk menghasilkan hidrolisat yang mengandung peptida bioaktif dengan aktivitas  antioksidan  yang  tinggi  (Centenaro et  al ., 2011).  Optimasi  diperlukan  untuk  mengendalikan kondisi  hidrolisis  meliputi  lama  hidrolisis,  suhu, rasio  enzim  dan  pH  (Roslan et  al., 2014).  Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian tentang potensi hidrolisat protein  miofibril belut rawa ( Synbranchus bengalensis )  sebagai  antioksidan  yang  dihidrolisis menggunakan  enzim  papain  dengan  rasio  enzim papain dan lama hidrolisis sebagai faktor kajian.Penelitian  ini  bertujuan  untukmendapatkan data  karakterisasi  protein  miofibril  belutrawa ( Synbranchus  bengalensis ),  pengaruh  rasio  enzim papain  dan  lama  hidrolisis  terhadap  hidrolisat protein  miofibril  belut  ( Synbranchus  bengalensis ), memperoleh  data  aktivitas  antioksidan  hidrolisat miofibril belut rawa ( Synbranchus bengalensis ), dan karakterisasi  hidrolisat  protein  myofibril  yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi.

## BAHAN DAN METODE
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah belut rawa ( Synbranchus bengalensis ), NaCl, dan enzim papain.
Preparasi  Protein  Miofibril  Belut  (Wang et  al., 2013b) Preparasi miofibril belut berdasarkan penelitian  Wang et  al .  (2013)  dengan  modifikasi. Protein  miofibril  belut  dipreparasi    melalui  tiga  kali proses  pencucian.  Pencucian  pertama  dan  kedua dilakukan  dengan  penambahan  daging  belut  lumat dengan akuades perbandingan 1:3 dan dihomogenisasi  selama  5 menit.  Homogenat disentrifugasi  dengan  kecepatan  5000xg  suhu  4 o C selama  20  menit.  Supernatan  dipisahkan  dan  pelet didehidrasi  dengan  menggunakan  kain  blacu. Pencucian  ketiga,  pelet  disuspensikan  dengan akuades 1:3 dan ditambahkan NaCl 0,3%, kemudian dihomogenisasi  dan  difiltrasi  dengan  menggunakan saringan  dengan  mesh  1  mm  untuk  memisahkan jaringan  ikat.  Kemudian  filtrat  disentrifugasi.  Pelet didehidrasi dengan pengepresan dengan menggunakan kain  blacu.  Pelet  yang  telah didehidrasi merupakan konsentrat protein miofibril.

## Analisis Kandungan Kimia Bahan (AOAC 2005)
Analisis  kimia  bahan  baku  belut  rawa ( Ophisternon  bengalense )  berdasarkan  analisis proksimat  AOAC  (2005)  meliputi  kadar  air,  kadar abu, kadar protein, dan kadar lemak.
Hidrolisis  Protein  Miofibril  Belut  (Wang et  al. 2013b)
Hidrolisis  protein  miofibril  belut  rawa ( Synbranchus  bengalensis )  berdasarkan  metode Wang et  al. (2013).  Hidrolisis  dilakukandengan penambahan  enzim  papain  pada  rasio  enzim  dan protein  miofibril  0,1:100;  0,15:100;  0,20:100    ke dalam  protein  miofibril  belut  dengan  pelarut  bufer fosfat  (1:3  0,02  M)  pada  suhu  50 o C  dan  pH  7,0 dengan  lama  hidrolisis  2,  4  jam  dan  6  jam.  Setelah waktu  hidrolisis  tercapai,  dilakukan  inaktivasi protease  pada  suhu  85 o C  selama  15  menit  dan disentrifugasi  pada  kecepatan  4800x  g,  suhu  4 o C selama  30  menit.  Supernatan  kemudian  dikeringkan dengan freeze drier .

## Penentuan derajat hidrolisis (Adler-Nissen1986)
Derajat  hidrolisis  ditentukan  berdasarkan metode  Adler-Nissen  1986  dengan  pengendapan Trichloroacetic acid (TCA) 20% untuk menghasilkan10%  fraksi  protein  terlarut  dan  10% fraksi  tidak  larut.Sebanyak  20  mL  sampel  ditambah dengan 20 mL TCA 20% kemudian diinkubasi pada selama  30  menit    dan  suhu  37 o C.  Selanjutnya campuran  disentrifugasi  dengan  kecepatan  7800xg selama  15menit.  Supernatan  sampel  dianalisis dengan metode Kjeldahl .
DPPH Radical  Scavenging  Activity (Wu et  al., 2003)
Analisis aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH berdasarkan Wu et al. (2003). Larutan sampel 1,5 mL ditambahkan 1,5 mL 0,15 mM DPPH dalam etanol 95%. Kemudian diinkubasi pada ruang gelap  suhu  37 o C  selama  30  menit  dan  absorbansi diukur  pada  λ  517  nm.  Absorbansi  kontrol  diukur dengan  cara  yang  sama  dengan  sampel  namun sampel diganti dengan aquades.
Sampel  yang  digunakan  dilarutkan  dengan berbagai konsentrasi yang berbeda untuk mendapatkan  nilai  IC 50 yang  menyatakan  besarnya konsentrasi  larutan  sampel  yang  dibutuhkan  untuk mereduksi  radikal  bebas  DPPH  sebesar  50%. Persamaan regresi linear (y = a + bx) yang diperoleh dari nilai inhibisi pada setiap  konsentrasi digunakan untuk mencari nilai IC 50.
Reducing Power (Oyaizu 1988) Analisis aktivitas antioksidan menggunakan metode reducing  power berdasarkan  Oyaizu et  al. (1998).  Sampel 1  mL (5mg/mL) ditambahkan 2  mL buffer  phospat  0.2  M  (pH  6.6)  dan  K 3 [Fe(CN) 6 ] kemudian  diinkubasi  selama  20  menit  suhu  50 o C. Setelah  inkubasi,  sampel  ditambahkan  1  mL  TCA 10%  dan  disentrifugasi  dengan  kecepatan  3500xg
selama  10  menit.  Supernatan  1  mL  ditambahkan  1 mL  aquades  dan  200  uL  FeCl 3. Absorbansi  diukur pada  λ  700  nm  setelah  inkubasi  pada  suhu  37 o C selama 30 menit.

## Analisis  berat  molekul  dengan  SDS  PAGE
(Laemmli, 1970)
Analisis  berat  molekul  berdasarkan  metode Laemmli  (1970).  Sampel  dilarutkan  dalam  5%  SDS dan  diinkubasi  pada  suhu  85 o C  selama  1  jam. Campuran  disentrifugasi  pada  8500xg  selama  5 menit  pada  suhu  kamar.  Supernatan  yang  diperoleh dicampur  dengan  bufer  (Tris  HCl  60  mM,  pH  6,8, mengandung  2%  SDS  dan  25%  gliserol)  dengan rasio  1:10  (v/v)  dan  mengandung  10%  β- merkaptoetanol    (β-ME).  Campuran  dipanaskan dalam air mendidih selama 2 menit. Sebanyak 15 μL sampel  dimasukkan  ke  dalam gel  polyacrylamide yang terdiri dari 8% running gel dan 4% stacking gel dan  dielektroforesis  pada  arus  konstan  50  mA/gel selama  2  jam.  Setelah  elektroforesis  selesai,  gel diwarnai  dengan  0,05%  (b/v) coomassie biru  R-250 dalam  15%  (v/v)  metanol  dan  5%  (v/v)  asam  asetat selama  1  jam,  kemudian destained sampel  dengan campuran  30%  (v/v)  metanol  dan  10%  (v/v)  asam asetat  selama  1  jam. Destained dilakukan  kembali selama  30  menit.  Berat  molekul  protein  sampel diperkirakan  berdasarkan  berat  molekul  marker (Bio-Rad).

## Analisis Profil Asam Amino (AOAC 1995)
Analisis  profil  asam  amino  berdasarkan AOAC  (1995).  Karakterisasi  jenis  asam  amino dilakukan untuk  mengetahui jenis asam amino  yang terdapat pada sampel. Instrumentasi yang digunakan yaitu UPLC ( Ultra Performance Liquid Chromatography )  Waters  1525  dengan  kolom Waters Bondapak NH2 3,9  mm  x 300  mm dan  fasa gerak  yaitu  asetonitril  :  air  (60:40).  Standar  asam amino  yang  digunakan  pada  analisis  ini  terdiri  dari 18  jenis  asam  amino  (histidina,  isoleusina,  leusina, lisina,  metionina,  fenilalanina,  threonina,  triptofana, valina, glisina, alanina, arginina, asam aspartat, asam glutamat,  prolina,  serina,  tirosina,  dan  sisteina). Sejumlah 100 mg sampel ditimbang dan dimasukkan ke  dalam  tabung  ulir  dan  ditambahkan  5  mL  HCl  6 N.  Hidrolisis  selama  22  jam  pada  suhu  110°C.  lalu diangkat,  disaring  dengan  filter  45  μm,  dan diencerkan dengan akuades dalam labu takar 50 ml. Filtrat  500  μL  ditambahkan  40  μm  AABA  dan  460 μl.  Sampel  sebanyak  10  μL  ditambahkan  70  μL AccQ-Fluor  Borate  Buffer  dan  20  μL  AccQ  Fluor, vortex,  biarkan  1  menit  pada  suhu  kamar,  lalu diinkubasi  pada  suhu  55°C  selama  10  menit. Kemudian  1  μL  dimasukkan  dalam  instrumen UPLC.

## Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian  ini  yaitu  Rancangan  Acak  Lengkap Faktorial.  Perlakuan  yang  digunakan  yaitu  rasio
enzim  dan  protein  miofibril  belut  rawa  (0,1:100; 0,15:100;  0,20:100)  dan  lama  hidrolisis  (2  jam,  4 jam dan 6 jam). Data hasil penelitian yang diperoleh akan dianalisis dengan analisis ragam (ANOVA) dan jika terdapat beda nyata antara taraf perlakuan maka dilanjutkan  dengan  uji  Beda  Nyata  Jujur  ( Tukey ) pada taraf kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Komposisi Miofibril Belut
Komposisi kimia daging dan miofibril belut ( Synbranchus  bengalensis )  yang  diperoleh  dengan perlakuan  pencucian  sebanyak  3  kali  dengan penambahan NaCl 0,3% pada pencucian ketigatersaji pada Tabel 1.
Tabel 1. Komposisi kimia daging dan miofibril belut
Parameter Daging (%) Miofibril (%) Kadar air 80,26 ± 0,03 85,91 ± 0,01 Kadar abu 0,91 ± 0,01 0,14 ± 0,01 Kadar lemak 2,21 ± 0,03 0,15 ± 0,01 Kadar protein 16,08 ± 0,00 12,78 ± 0,02
Tabel  1  menunjukkan  komposisi  kimia daging belut dan miofibril belut rawa. Hasil analisis komposisi  kimia  menunjukkan  bahwa  daging  belut yang  digunakan  pada  penelitian  ini  memiliki komposisi  kimia  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan belut  sawah  ( Monopterus  albus )  pada  penelitian Astiana et  al. (2015),  yaitu  kadar  air 78,90%,  kadar abu  0,33%,  kadar  lemak  0,12%,  dan  kadar  protein 15.90%. Perbedaan komposisi kimia dapat dipengaruhi  oleh  spesies,  habitat,  ukuran  tubuh kondisi  lingkungan,  masa  pemijahan  (Pacheco- Aguilar et  al., 2000),  umur  dan  jenis  pakan (Yathavamoorthi et al ., 2010).
Miofibril  belut  diperoleh  dengan  perlakuan pencucian  sebanyak  3  kali  dengan  penambahan NaCl  0,3%  pada  pencucian  ketiga.Selama  proses pencucian,  lemak  pada  daging  lumat  akan  terpisah dari  daging  dan  terapung  pada  permukaan  air sehingga miofibril belut memiliki kadar lemak lebih rendah  dibandingkan  dengan  daging.  Hal  tersebut serupa  dengan  penelitian  Das et  al. (2015), konsentrat  miofibril  mackerel  setelah  perlakuan pencucian  memiliki  lebih  rendah  dibandingkan dengan  bahan  bakunya.  Kadar  lemak  yang  rendah pada  miofibril  memiliki  nilai  positif  terhadap hidrolisat protein yang dihasilkan. Menurut Yarnpakdee et al . (2012), fishy smell pada hidrolisat protein  ikan  dapat  disebabkan  oleh  proses  oksidasi lemak  yang  menyebabkan  hidrolisat  tidak  stabil apabila  digunakan  sebagai  suplemen  dan  bahan fortifikasi.  You et  al. (2009)  menambahkan  bahwa oksidasi  lemak  dapat  menyebabkan  warna  gelap pada hidrolisat protein.
Kadar  air  miofibril  belut  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  kadar  air  daging  belut.  Hal
tersebut dapat disebabkan oleh proses hidrasi protein miofibril  selama  proses  preparasi  miofibril.  Hal tersebut serupa dengan hasil penelitian Lertwittayanon et  al .  (2013)  dan  Das et  al. (2015), proses  pencucian  daging  lumat  dapat  meningkatkan kadar air miofibril ikan barakuda dan ikan mackerel. Menurut  Bentis et  al .  (2005),  proses  pencucian daging  lumat  dapat  meningkatkan  hidrasi  daging lumat  sehingga  menyebabkan  proses  dehidrasi menjadi lebih sulit.
Kadar abu miofibril lebih rendah dibandingkan  dengan  daging.    Kadar  abu  pada daging merupakan unsur mineral yang terdapat pada daging.  Unsur  mineral  dalam  bentuk  garam anorganik  yang  terdapat  dalam  sarkoplasma,  darah dan  plasma  akan  terlarut  dalam  air  selama  proses pencucian  daging  lumat.  Menurut  Hassan et  al. (2017)  proses  pencucian  dapat  menurunkan  kadar abu pada konsentrat miofibril yang dihasilkan karena komponen  garam  anorganik  akan  terbuang  selama proses pencucian.
Kadar  protein  miofibril  belut  lebih  rendah dibandingkan  dengan  kadar  protein  pada  daging. Selama proses preparasi miofibril, terjadi pemisahan antara  protein  miofibril  dengan  protein  stroma  dan protein  sarkoplasma  Hal  tersebut  tidak  berbeda dengan  penelitian  Shekarabi et  al. (2014),  kadar protein  mengalami  penurunan  akibat  perlakuan pencucian  pada  proses  preparasi  miofibril.  Menurut Das et  al. (2015),  persentase  kadar  protein  yang menurun  dapat  disebabkan  menghilangnya  protein sarkoplasma  dan  stroma  selama  proses  pencucian. Ismail et  al. (2010)  menambahkan  bahwa  kadar  air yang  meningkat  akan  menurunkan  kadar  protein dalam konsentrat miofibril yang dihasilkan.

## Derajat Hidrolisis
Derajat hidrolisis (DH) merupakan presentase  jumlah  peptida  yang  terpotong  selama proses  hidrolisis  (Boutagef et  al .,  2010).  Derajat hidrolisis  berpengaruh  terhadap  berat  molekul  dan komposisi  asam  amino  yang  akan  mempengaruhi aktivitas  antioksidan  peptida  yang  dihasilkan. Derajat  hidrolisis  dari  hidrolisat  miofibril  belut tersaji pada Gambar 1.
Gambar  1.  Pengaruh  perbedaan  rasio  papain  dan lama hidrolisis terhadap derajat hidrolisis  hidrolisat  protein  miofibril belut rawa
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 4 6 De raj at Hi d ro li sis ( % ) Lama Hidrolisis (Jam) Papain 0,10:100 Papain 0,15:100 Papain 0,20:100
Perbedaan  rasio  enzim,  lama  hidrolisis  dan interaksinya  memberikan  pengaruh  yang  berbeda pada  persentase jumlah pemotongan peptida ( p< 0,05).  Selama  proses  hidrolisis,  enzim  papain akan  memecah  senyawa  protein  miofibril  belut menjadi senyawa peptida dengan berat molekul yang lebih  rendah.  Menurut  Najafian  dan  Babji  (2015), papain mampu memotong lebih banyak peptida pada miofibril ikan patin sehingga menghasilkan konsentrasi  peptida  yang  lebih  tinggi  dibandingkan dengan enzim alkalase dan flavourenzyme.
Derajat  hidrolisis  perlakuan  rasio  papain dan  protein  miofibril  belut  rawa  0,2:100  dengan lama  hidrolisis  4  jam  merupakan  kondisi  terbaik untuk  menghasilkan  persentase  jumlah  peptida terpotong  yang  tinggi  yaitu  16,93%.  Nilai  derajat hidrolisis  padalama  hidrolisis  6  jam  lebih  rendah dibandingkan  lama  hidrolisis  4  jam.  Hal  tersebut menunjukkan  tahap  hidrolisis  dari  proses  hidrolisis protein miofibril belut. Pada tahap pertama nilai DH terus meningkat yaitu pada perlakuan lama hidrolisis 2  dan  4  jam  sedangkan  setelah  4  jam  hidrolisis terjadi  fase  stabil.  Perlakuan  lama  hidrolisis  6  jam tidak  menghasilkan  DH  yang  stabil  dan  terjadi penurunan  nilai  DH  dapat  disebabkan  peptida hidrolisat  sensitif  terhadap  suhu  dibandingkan peptida  yang  dihasilkan  pada  perlakuan  lama hidrolisis  2  dan  4  jam.  Suhu  tinggi  yang  digunakan pada  tahap  inaktivasi  enzim  dapat  menyebakan koagulasi dan presipitasi peptida sehingga menurunkan  jumlah  peptida  dalam  hidrolisat. Miofibril mengandung myosin heavy chain . Menurut Thorarinsdottir et  al. (2002), myosin  heavy  chain mudah  terdanaturasi  dan  tidak  stabil.  Hal  tersebut dapat  menjadi  faktor  yang  menyebabkan  peptida yang  dihasilkan  dari  protein  miofibril  belut  rentan terhadap  suhu  tinggi  sehingga  diperlukan  metode alternatif inaktivasi enzim yang tidak mempengaruhi stabilitas peptida hidrolisat.

## Rendemen Hidrolisat
Rendemen hidrolisat menunjukkan persentase  hidrolisat  protein  yang  dihasilkan terhadap  berat  miofibril  belut  sebelum  hidrolisis. Rendemen  hidrolisat  miofibril  belut  dapat  dilihat pada Gambar 2.
Gambar  2.  Pengaruh  perbedaan  rasio  papain  dan  lama hidrolisis terhadap rendemen hidrolisat miofibril belut
Perbedaan  rasio  papain  dan  lama  hidrolisis yang  berbeda  serta  interaksi  keduanya  memberikan pengaruh  yang  nyata  ( p< 0,05)  terhadap  rendemen hidrolisat  yang dihasilkan. Hidrolisat  miofibril belut merupakan  jumlah  protein  terlarut  yang  dihasilkan selama  proses  hidrolisis.  Perlakuan  rasio  papain 0,15:100 dengan lama hidrolisis 2 jam menghasilkan rendemen  hidrolisat  tertinggi  namun  menurn  pada lama  hidrolisis  4  dan  6  jam.  Penurunan  rendemen hidrolisat  dapat  disebabkan  oleh  sensivitas  peptida pada  suhu  tinggi.  Proses  inaktivasi  enzim  yang dilakukan  pada  suhu  85 o C  dapat  menyebabkan agergasi peptida. Inaktivasi enzim dengan pemanasan  dapat  merubah  struktur  peptida  yang menurunkan  petida  bebas  dan  meningkatkan pembentukan  agregat  sehingga  menurunkan  jumlah peptida  pada  supernatan  hidrolisat.  Berdasarkan penelitian  Foegeding et  al. (2002),  peptida  dari protein  whey  memiliki  sensitifitas  tinggi  terhadap suhu  tinggi  dan  terjadi  agregasi  pada  suhu  >  65 o C. Menurut  Wijayanti et  al. (2014),  agregasi  pada peptida  disebabkan  agregasi  disulfida  dan  interaksi non  kovalen.  Creusot et  al. (2006)  menambahkan bahwa  agregasi  peptide-peptida  dapat  terbentuk karena  interaksi  non  kovalen  pada  perlakuan pemanasan suhu 75 o C dan 85 o C.
Perlakuan  rasio  papain    0,15:100  dengan lama  hidrolisis  2  jam  menghasilkan  rendemen hidrolisat  tertinggi  dibandingkan  dengan  perlakuan lainnya  yaitu  9,68%.  Rendemen  hidrolisat  miofibril belut  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  hidrolisat dari daging merah tuna yaitu 1,21 g (Parvathy et al., 2018)  namun  lebih  rendah  dibandingkan  dengan hidrolisat  sarden  mencapai  7,01  g  (Jeevitha et  al ., 2014).  Menurut  Awuor et  al .  (2017),  perbedaan rendemen  hidrolisat  dapat  dipengaruhi  oleh  tipe enzim  dan  substrat,  kondisi  hidrolisis  (pH,  suhu, lama  hidrolisis,  rasio  substrat/enzim),  dan  rasio pelarut.

## Aktivitas Antioksidan
Radikal DPPH
( 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl )  merupakan  radikal  bebas  stabil dengan  delokalisasi  elektron  pada  molekulnya (Pisoschi et al ., 2009). Apabila DPPH bereaksi pada senyawa  donor  hidrogen,  molekul  DPPH  akan berubah  yang  dapat  diketahui  dari  perubahan  warna ungu  yang  memudar  hingga  berwarna  kuning (Thaipong et  al .,  2006).  Aktivitas  antioksidan hidrolisat  miofibril  belut  yang  dianalisis  dengan metode DPPH tersaji pada Gambar 3
Perlakuan  perbedaan  rasio  papain,  lama hidrolisis  dan  interaksinya  memberikan  pengaruh yang  nyata  ( p< 0,05)  pada  kemampuan  hidrolisat miofibril  belut  menangkap  radikal  DPPH  yang direpresentasikan  dengan  nilai  IC 50. Nilai  IC 50 menunjukkan  kemampuan  senyawa  menghambat proses oksidasi sebesar 50%. Nilai IC 50 yang rendah menunjukkan  aktivitas  antioksidan  yang  tinggi. Proses  hidrolisis  protein  oleh  enzim  papain  akan
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 2 4 6 R en d eme n ( %) Lama Hidrolisis (Jam) Papain 0,10:100
Papain 0,15:100 Papain 0,20:100
memotong  polipetida  menjadi  senyawa  yang  lebih sederhana.  Semakin  banyak  peptida  yang  terbentuk akan  meningkatkan  interaksi  radikal  DPPH  dengan asam amino peptida sehingga menghasilkan senyawa DPPH yang stabil.
Gambar 3. Pengaruh perbedaan rasio papain dan lama hidrolisis  terhadap  aktivitas  antioksidan hidrolisat miofibril belut dengan pengujian  menggunakan  DPPH  yang ditunjukkan dengan nilai IC 50
Nilai  IC 50 padarasio  papain  0,20:100 dengan  lama  hidrolisis  2  jam  memiliki  nilai  IC 50 terendah  yaitu  14,24  mg/mL  yang  menunjukkan aktivitas  antioksidan  tertinggi.  Perlakuan  rasio papain  0,20:100  dan  lama  hidrolisis  2  jam menghasilkan  peptida  yang  memiliki  kemampuan mendonorkan  hidrogen  pada  radikal  DPPH  lebih efektif  dibandingkan  dengan  perlakuan  lainnya. Aktivitas  antioksidan  dari  hidrolisat  miofibril  belut lebih  rendah  dibandingkan  dengan  hidrolisat miofibril  patin  yang  dihidrolisis  dengan  papain, alkalase dan flavouzyme (Najafian dan Babji, 2015) berturut-turut  menghasilkan  IC 50 1,12  mg/mL,  2,95 mg/mL  dan  1,94  mg/mL.  Perbedaan  aktivitas antioksidan  dapat  dipengaruhi  oleh  berat  molekul, jenis  asam  amino  pada  rantai  samping  peptida,  dan komposisi  asam  amino  peptida  (Najafian  dan  Babji, 2015).
Perlakuan  dengan  nilai  IC 50 terbaik  tidak memiliki  nilai  DH  yang  tinggi.    Menurut  Raghavan et  al .  (2008),  hidrolisat  dengan  derajat  hidrolisis yang  tinggi  memiliki  aktivitas  antioksidan  yang tinggi.  Menurut  Thianisakul et  al .  (2007),  nilai  DH hidrolisat  ikan round  scad ( Decapterus  maruadsi ) yang  semakin  tinggi  memiliki  aktivitas  antioksidan semakin  tinggi.  Berbeda  dengan  hidrolisat  miofibril belut,  derajat  hidrolisis  tertinggi  yaitu  perlakuan konsentrasi  enzim  0,2%  dengan  lama  hidrolisis  4 jam tidak memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi. Menurut  Moreno et  al .  (2014),  nilai  inhibisi  DPPH lebih  tinggi  pada  lama  hidrolisis  yang  lebih  singkat dapat  disebabkan  peptida  yang  memiliki  aktivitas antioksidan  sudah  terbentuk  pada  awal  hidrolisis namun  peptida  dapat  menjadi  tidak  aktif  pada  lama hidrolisis  yang  lebih  panjang.  Selain  itu,  menurut Najafian  dan  Babji  (2015)  aktivitas  inhibisi  DPPH dapat  dipengaruhi  oleh  berat  molekul  jenis  asam
amino pada rantai samping peptida, komposisi asam amino.
Keberadaan antioksidan pada sampel menyebabkan  reduksi ferricyanide komplek  Fe 3+ menjadi bentuk Fe 2+ dengan terbentuknya warna biru Perl’s  Prussian pada  panjang  gelombang  700  nm. Absorbansi  yang  tinggi  menunjukkan  aktivitas reducing power yang tinggi (Centenaro et al ., 2011). Nilai reducing  power hidrolisat  protein  miofibril belut tersaji pada Gambar 4.
Gambar  4.  Pengaruh  perbedaan  rasio  papain  dan lama  hidrolisis  terhadap  aktivitas antioksidan  hidrolisat  miofibril  belut dengan pengujian menggunakan reducing  power yang  ditunjukkan dengan nilai absorbansi pada λ700 nm
Perbedaan  rasio  papain  dan  lama  hidrolisis yang  berbeda  serta  interaksi  keduanya  memberikan pengaruh  yang  nyata  ( p< 0,05)  pada  kemampuan hidrolisat  miofibril  belut  mereduksi  Fe 3+ pada konsentrasi hidrolisat 5 mg/mL. Sampel dengan nilai reducing power yang tinggi menunjukkan kemampuan  hidrolisat  mendonorkan  elektron  pada elemen  non  radikal  bebas  seperti  logam  transisi sehingga  mencegah  terbentuknya  radikal  bebas. Menurut  (Shahidi  dan  Zhong,  2015),  kemampuan antioksidan  sebagai  donator  elektron  tidak  hanya bereaksi  terhadap  radikal  bebas  tetapi  mereduksi elemen  dengan  elektron  valensi  tinggi.  Potensial redoks  atau reducing  power dari  antioksidan merupakan  indikator  penting  aktivitas  antioksidan. Jomova  dan  Valko  (2011)  menambahkan  bahwa logam  transisi  aktif  seperti  Fe,  Cu,  Cr,  dan  Co mengalami  reaksi  siklus  redoks  dan  menghasilkan radikal reaktif pada sistem tubuh.
Absorbansi  pada  perlakuan  rasio  papain 0,20:100 dengan lama hidrolisis 2 jam berbeda nyata dengan  perlakuan  lainnya  dan  memiliki  nilai absorbansi tertinggi. Perlakuan rasio papain 0,20:100dan  lama  hidrolisis  2  jam  menghasilkan peptida  yang  memiliki  kemampuan  mendonorkan elektron  lebih  baik  dibandingkan  dengan  perlakuan lainnya.  Apabila  dibandingkan  dengan  hidrolisat miofibril  patin  yang  dihidrolisis  menggunakan papain  (Najafian  dan  Babji,  2015),  absorbansi  dari hidrolisat  miofibril  belut  lebih  rendah  yaitu  0,190 pada  konsentrasi  5  mg/mL  dibandingkan  dengan hidrolisat  miofibril  patin  yang  mencapai  0,305  pada konsentrasi  3  mg/mL.  Perbedaan  nilai reducing
0 5 10 15 20 25 30 35 2 4 6 IC 5 0 ( m g /m L ) Lama Hidrolisis (Jam) Papain 0,10:100 Papain 0,15:100 Papain 0,20:100 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 2 4 6 R ed u ci n g Po w er Lama Hidrolisis (Jam) Papain 0,10:100 Papain 0,15:100 Papain 0,20:100
power dapat  disebabkan  oleh  panjang  peptida, sekuen  peptida  (Thiansilakul et  al .,  2007)  dan  jenis asam  amino  yang  terdapat  pada  hidrolisat  seperti asam  amino  hidrofobik,  asam  amino  yang  bersifat asam  dan  asam  amino  yang  mengandung  gugus sulfur  yang  memiliki  kemampuan  sebagai  agen pereduksi (Udenigwe dan Aluko, 2011).

## Karakteristik Hidrolisat Miofibril Belut
Hidrolisat  dengan  aktivitas  antioksidan terbaik yaitu hidrolisat yang diperoleh dari perlakuan rasio  enzim  0,20:100  dan  lama  hidrolisis  2  jam dilakukan  analisis  lebih  lanjut  meliputi  profil  berat molekul  dan  komposisi  asam  amino.  Berat  molekul merupakan  salah  satu  faktor  yang  mempengaruhi aktivitas  antioksidan.  Sampel  dengan  aktivitas antioksidan  terbaik  dianalisis  profil  berat  molekul dengan  menggunakan  elektroforesis  SDS  PAGE. Profil  berat  molekul  hidrolisat  miofibril  belut  dapat dilihat pada Gambar 5.
(a)                                             (b)
Gambar  5.    Profil  berat  molekul  miofibril  belut  (a)
dan  Hidrolisat  miofibril  belut  dengan perlakuan rasio papain 0,20:100 dengan  lama  hidrolisis  2  jam  (b). Miofibril  (Mio),  hidrolisat  miofibril belut (H), marker (M)
Gambar  5  menunjukkan  protein  miofibril belut  memiliki  berat  molekul  yang  tinggi.  Berat molekul  miofibril  belut  yang  teridentifikasi  yaitu 224,42 kDa, 67,22 kDa, 44,19 kDa 35,83 dan 20,44 kDa  yang  diduga  merupakan  komponen  protein miofibril  yaitu  miosin,  aktin  dan  tropomiosin. Kristinsson  dan  Rasco  (2000),  miosin  merupakan komponen  terbesar  pada  miofibril  mencapai  60%, dan  memiliki  berat  molekul  besar  yang  terdiri  dari myosin  heavy  chains (223  kDa)  dan myosin  light chains (22  dan  18  kDa).  Menurut  Karaulova  dan Yakush  (2017),  berat  molekul  ikan myosin  light chain memiliki  berat  molekul  16  –  27  kDa,
tropomyosin  33  –  36  kDa  dan  aktin  47  kDa. Hidrolisis  miofibril  dengan  rasio  papain  0,20:100 dengan  lama  hidrolisis  2  jam  menyebabkan  protein terhidrolisis  menjadi  peptida  yang  memiliki  berat molekul  rendah.  Berat  molekul  hidrolisat  miofibril belut  rawa  yang  diperoleh  dari  perlakuan  terbaik telah teridentifikasi dengan berat molekul 19,51 kDa dengan konsentrasi tinggi  yang ditandai dengan pita tebal  pada  hasil  elektoforesis  SDS  PAGE.  Menurut Bhaskar  dan  Mahendrakar  (2008),  berat  molekul rendah  menunjukkan  hidrolisat  ikan  memiliki  nilai nutrisi  yang  tinggi  dan  berpotensi  sebagai  produk pangan fungsional.
Peptida  dengan  berat  molekul  rendah berpotensi  memiliki  aktivitas  antioksidan  yang tinggi.  Hidrolisat  miofibril  belut  memiliki  peptida dengan  berat  molekul  yang  masih  tergolong    tinggi sehingga  belum  memiliki  kemampuan  berinteraksi dengan  radikal  bebas  yang  tinggi.  Berat  molekul rendah  pada  hidrolisat  kolagen  sisik  ikan  croceine croaker ( Psedosciaena crocea ) sangat berperan pada aktivitas  antioksidan  pada  radikal  DPPH  dan reducing  power (Wang et  al .,  2013b).  Semakin rendah  berat  molekul  peptida  semakin  efektif menghambat  reaksi  radikal  bebas.  Berat  molekul peptida  <3kDa  dari  hidrolisat  miofibril  patin memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  peptida  dengan  berat  molekul 10  kDa  (Najafian et  al., 2013).  Berat  molekul  <3 kDa  memiliki  peran  penting  pada  aktivitas antioksidan  miofibril  ikan grass  carp .  Peptida  yang memiliki  2  –  10  asam  amino  memiliki  aktivitas antioksidan  yang  sangat  baik  (Wang et  al .,  2013a). Hidrolisat  dengan  berat  molekul  yang  rendah  dapat dengan  mudah  melewati  membran  usus  sehingga mempercepat  efek  biologis  (Ranathunga et  al ., 2006),  dan  lebih  mudah  dan  efektif  berinteraksi dengan  radikal  bebas  sehingga  dapat  menghambat siklus  propagasi  pada  peroksidasi  lemak  (Wang et al ., 2013).
Komposisi  asam  amino  hidrolisat  protein sangat  berpengaruh  terhadap  aktivitas  antioksidan (Najafian et  al., 2013).  Komposisi  asam  amino hidrolisat miofibril belut dengan aktivitas antioksidan terbaik tersaji pada Tabel 2
Hidrolisat  miofibril  belut  dengan  aktivitas antioksidan terbaik memiliki komposisi asam amino tertinggi  pada  asam  amino  hidrofobik.  Komposisi asam  amino  yang  bersifat  hidrofobik  yang  tinggi pada hidrolisat  miofibril belut tidak berbeda dengan hidrolisat  miofibril patin (Najafian dan Babji 2015). Asam  amino  hidrofobik  pada  hidrolisat  dapat berpengaruh  terhadap  aktivitas  antioksidan.  Sekuen peptida  yang  mengandung  asam  amino  hidrofobik memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi (Wattanasiritham et  al .,  2016).  Asam  amino hidrofobik  memfasilitasi  interaksi  dengan  target hidrofobik,  seperti  membran  sel,  dan  dengan demikian  meningkatkan  bioavailabilitas  (Himaya et al ., 2012).

## Tabel 2. Komposisi asam amino hidrolisat miofibril belut (g/100g)
Asam amino Miofibril Belut Hidrolisat Miofibril Belut* Kebutuhan Asam amino (berat badan 70 kg)** Lisin d 11,39 8,53 2,10 Valin a 4,37 4,12 1,82 Isoleusin a 4,46 3,84 1,40 Leusin a 7,91 7,28 2,73 Triptofan c 0,68 0,59 0,28 Histidin d 1,83 2,44 0,70 Metionin a 3,08 2,62 1,05 Threonin e 4,89 4,77 1,05 Fenilalanin c 3,88 4,39 1,75 Glisin a 3,27 4,37 Alanin a 5,15 4,70 Arginin d 5,83 7,45 Asam aspartat b 8,37 7,11 Asam glutamat b 15,37 13,53 Prolin a 2,55 3,19 Serin e 3,85 3,94 Sistein e 0,37 0,31 Tirosin c 3,45 3,94 AA hidrofobik a 30,79 30,14 AA muatan negatif b 23,74 20,64 AA aromatik c 8,01 8,93 AA muatan positif d 19,05 18,42 AA hidrofilik e 9,11 9,02
Keterangan: * Hidrolisat miofibril dengan rasio papain 0.20:100 dengan lama hidrolisis 2 jam
** FAO (2013), kebutuhan asam amino untuk dewasa per hari dengan berat badan 70 kg. Kebutuhan asam amino akan lebih rendah pada berat badan kurang dari 70 kg dan lebih tinggi pada ibu hamil dan anak-anak.
Selain itu,  peptida  hidrofobik  dapat melindungi  oksidasi  pada  makromolekul  dengan menyumbangkan  proton/elektron  ke  radikal  reaktif (Chi et  al., 2015).    Hidrolisat  miofibril  belut memiliki  kandungan  asam  amino  dominan  yaitu asam glutamat (13,53%) dan lisin (8,53%). Menurut Yazdi et  al. (2012),  residu  asam  glutamat  (E)  pada peptida  memiliki  pengaruh  penting  pada  aktivitas antioksidan.  Menurut  Feng et  al. (2018),  asam glutamat  berpengaruh  terhadap  aktivitas  antioksidan dengan  cara  memproduksi  asam  glutamat  yang teroksidasi  pada  proses  penghilangan  atau  reduksi hidrogen  peroksida.  Hidrogen  peroksida  merupakan senyawa penting dalam proses pembentukan radikal bebas.Aktivitas antioksidan tidak hanya dipengaruhi oleh  jenis  asam  amino  dan  komposisi  asam  amino tetapi  dapat  dipengaruhi  oleh  posisi  asam  amino pada  sekuen  peptida,  struktur  sekunder  peptida, asam amino pada N-terminal dan C-terminal (Zou et al .  2016),  stabilitas  peptida  terhadap  panas  (Hou et al .  2014)  dan  pencernaan  (Borawska et  al .  2015) serta  efek  sinergisme  antar  peptida  (Song et  al . 2015).
Hidrolisat protein miofibril belut mengandung  asam  amino  esensial  yang  dapat mencukupi  kebutuhan  asam  amino  untuk  orang dewasa.  Asam  amino  lisin  merupakan  asam  amino esensial  dominan  pada  hidrolisat  miofibril  belut.
Kandungan  asam  glutamat  yang  tinggi  pada hidrolisat  dapat  memberikan  rasa  umami  sehingga dapat  digunakan  sebagai flavour  enhancer .  Oleh karena itu, hidrolisat miofibril belut selain berfungsi sebagai  sumber  antioksidan,  hidrolisat  miofibril belut  dapat  memenuhi  kebutuhan  asam  amino esensial dan sebagai alternatif flavour enhancer pada pangan.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Miofibril belut memiliki kandungan protein,  lemak  dan  abu  yang  lebih  rendah dibandingkan  dengan  daging  belut,  sedangkan kandungan  air  terjadi  sebaliknya.    Miofibril  belut memiliki  kandungan  asam  glutamat  dan  lisin tertinggi.  Perlakuan  perbedaan  rasio  enzim  papain dan  lama  hidrolisis  berpengaruh  nyata  terhadap derajat  hidrolisis,  rendemen  hidrolisat  dan  aktivitas antioksidan.  Perlakuan  rasiopapain  dan  miofibril belut  0.20:100  dengan  lama  hidrolisis  4  jam memiliki aktivitas antioksidan terbaik(metode DPPH dan reducing power ). Karakteristik hidrolisat dengan aktivitas antioksidan terbaik memiliki berat molekul kurang  dari  19,51  kDa  serta  memiliki  komposisi asam amino tertinggi yaitu asam glutamat dan lisin.

## Saran
Proses  purifikasi  hidrolisat  protein  perlu dilakukan  untuk  mendapatkan  aktivitas  antioksidan yang  lebih  tinggi  dan  mengetahui  sekuen  peptida yang  berperan  sebagai  antioksidan.  Perlu  dilakukan pengujian aktivitas antioksidan hidrolisat belut yang dihidrolisis  dengan  menggunakan  enzim  yang berbeda.

## DAFTAR PUSTAKA
Adler-Nissen  J.  1986. Enzymic  hydrolysis  of  food proteins . London: Elsevier Applied Science Publisher.
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 1995. Official  Methods  of  Analysis . Washington  (USA):  The  Association  of Official Analytical Chemist Inc.
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2005. Official Methods ofAnalysis (18 Edn) . Mayland  (USA):  Association  of  Official Analytical Chemist Inc.
Aspevik T. 2016. Fish protein hydrolysate based on atlantic  salmon  by-products  [disertasi]. Bergen (NO): University of Bergen.
Astiana  I,Nurjanah,  Suwandi  R,  Suryani  AA,
Hidayat  T.  2015.  Pengaruh  penggorengan belut  sawah  ( Monopterus  albus )  terhadap komposisi  asam  amino,  asam  lemak, kolesterol  dan  mineral. Depik .  4(1):  49-57.
Doi: 10.13170/depik.1.1.2366 . Awuor OL, Kirwa ME, Jackim MF, Betty  M. 2017.
Optimization of alcalase hydrolysis conditions for production of dagaa
( Rastrineobola Argentea ) protein
hydrolysate  with  antioxidative  properties.
Ind  Chem .  3(1):  1-6.  Doi:  10.4172/2469-
9764.1000122. Balti R, Bougatef A, Hadj A.. 2011.
Comparativestudy on biochemical properties and antioxidative activity ofcuttlefish  ( Sepia  officinalis )  Protein hydrolysates  produced  byalcalase  and Bacillus  licheniformis NH1  proteases. JAmino Acids : 1-9. Doi:
10.4061/2011/107179.
Bentis CA, Zotos A, Petridis D. 2005. Production of fish-protein  products  (surimi)  from  small pelagic fish ( Sardinops pilchardusts ) underutilized  by  the  industry. J  Food  Eng . 68:303–308. Doi:
10.1016/j.jfoodeng.2004.06.003 .
Bhaskar  N,  Mahendrakar  NS.  2008.  Protein hydrolysate from visceral wastes proteins of catla ( Catla catla ): optimization of hydrolysis  conditions  for  comercial  neutral protease. Bioresour  Technol . 99(10):  4105- 4111. Doi: 10.1016/j.biortech.2007.09.006 .
Boligon  AA,  Machado  MM,  Athayde  ML.  2014.
Technical evaluation of antioxidant
activity. Med  chem .  4(7):  517-522.  Doi: 10.4172/2161-0444.1000188.
Borawska J, Darewicz M, Pliszkaa M, Vegarud GE. 2015.  Antioxidant  properties  of  salmon ( Salmo salar L.) protein fraction hydrolysates  revealedfollowing  their ex vivo digestion  and in  vitro hydrolysis. J  Sci
Food Agric. 96: 2764–2772. Doi: 10.1002/jsfa.7441. Boutagef  A,  Arroume  NN,  Manni  L,  Ravallec  R, Barkia  A,  Guillochon  D,  Nasri,  M.  2010.
Purification  and  Identification  of  novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates  hydrolysates  of  Sardinella (Sardinella  aurita) by-product  protein. Food  Chem .  118(3):  559–565.  Doi:
10.1016/j.foodchem.2009.05.021 . Centenaro  GS,  Salas-Mellado  M,  Pires  C,  Batista  I, Nunes  M  L,  Prentice  C.  2011.  Antioxidant activity  of  protein  hydrolysates  of  fish  and chicken  bones. Adv  J  Food  Sci  and Technol . 3(4): 280-288. Doi: DJ2012066739.
Cercel  F,  Stroiu  M,  Alexe  P,  Ianitchi  D.  2015.
Characterization  of  myofibrillar  chicken breast  proteins  for  obtain  protein  films  and biodegradable coatings
generation.
Agriculture  Agricultural  Sci  Proced .  6  (1): 197 – 205. Doi: 10.1016/j.aaspro.2015.08.059
Chandrasekara  A,  Shahidi  F.  2011.  Inhibitory activities  of  soluble  and  bound  millet  seed phenolics  on  free  radicals  and  reactive oxygen  species. J.  Agric.  Food  Chem .  59: 428–436. Doi: 10.1021/jf103896z.
Cheung  RC,  Ng  Tzi  B,  Wong  JH.  2015.  Marine peptides:  bioactivities  and  applications. Mar.  Drugs . 13 (7):  4006-4043.  Doi: 10.3390/md13074006.
Chi  CF,  Hu  FY,  Wang  B,  Li  ZR,  Luo  HY.  2015. Influence  of  aminoacid  compositions  and peptide profiles on antioxidant capacities of two protein hydrolysates from skipjack tuna ( Katsuwonus  pelamis )  dark  muscle. Mar.
Drugs. 13: 2580-2601. Doi:
10.3390/md13052580.
Creusot  N,  Gruppen  H,  Van  Konningsveld  GA,  de Kruif  CG,  Voragen  AGJ.  2006.  Peptide- peptide  and  protein-peptide  interactions  in mixtures  of  whey  protein  isolate  and  whey protein isolate hydrolysates. Int DairyJ. 16: 840-849. Doi: 10.1016/j.idairyj.2005.06.010.
Das  N,  Khuntia  BK,  Raychaudhuri  U,  Dora  KC, Ganguly  S.  2015.  Effect  of  water  washing on  the  functional  properties  of  fish  meat. IJMMTD . 1(1): 8-12. Doi: 10.18231.
[FAO]  Food  and  Agricultural  Organization.  2013.
Dietary  Protein  Quality  Evaluation  in Human Nutrition. Report Of An Fao Expert
Consultation .  Roma  (IT):  Food  and Agricultural  Organization  of  the  United Nations.
Farzaneh P, Khanahamadi M, Ehsani M. R, Sharifan
A.  2018.  Bioactive  properties  of Agaricus bisporus and Terfezia  claveryi proteins hydrolyzed  by  gastrointestinal  proteases.
LWT-Food  Sci  and  Technol .  91:  322-329.
Doi: 10.1016/j.lwt.2018.01.044.
Feng  YX,  Ruan  GR,  Jin  F,  Xu  J,  Wang  FJ.  2018. Purification, identification, and synthesis of five  novel  antioxidant  peptides  from Chinese  chestnut  ( Castanea  mollissima Blume )  protein  hydrolysates. LWT-  Food Sci  and  Technol .  92:  40–46.  Doi: 10.1016/j.lwt.2018.01.006.
Foegeding EA, Davis JP, Doucet D, KMcGuffey M .
2002. Advances in modifying and understanding  whey  protein  functionality. Trends  in  Food  Sci  &  Technol.  13(5):151- 159. Doi: 10.1016/S0924-2244(02)00111-5 . Ghassem M,  Arihara K, Babji AS, Said M, Ibrahim
S.  2015.  Purification  and  identification  of
ACE  inhibitory  peptides  from  Haruan ( Channa sriatus ) myofibrillar protein hydrolysate using HPLC-ESI-TOF MS/MS. Food Chem . 129: 1770-1777. Doi: 10.1016/j.foodchem.2011.06.051 . Guan H, Diao X, Jiang F, Han J, Kong B. 2018. The enzymatic  hydrolysis  of  soy  protein  isolate by  Corolase  PP  under  high  hydrostatic pressure  and  its  effect  on  bioactivity  and characteristics of hydrolysates. Food Chem . 245: 89-96. Doi: 10.1016/j.foodchem.2017.08.081.
Harnedy  PA,  Parthsarathy  V,  Mclaughlin  CM, O’Keeffe  MB,  Allsop  PJ,  Mcsorley  EM, O’Harte  FPM,  FitzGerald  R.  2018.  Blue whiting ( Micromesistius poutassou ) muscle hydrolysate  with  in  vitro  and  in  vivo antidiabetic  properties. J  Funct  Food .  40: 137-145. Doi: 10.1016/j.jff.2017.10.045. Hassan  MA,  Balange  AK,  Senapati  SR,  Martin XKA.  2017.  Effect  of  different  washing cycles  on  the  quality  of Pangasius hypophthalmus surimi. Fishery  Technol . 54: 51-59.
Herawati VE, Nugroho RA, Pinandoyo, Hutabarat J,
Prayitno  Budi,  Karnaradjasa  O.  2018.  The growth performance and nutrient quality of asian  swamp  eel Monopterus  albus in central  java  indonesia  in  a  freshwater aquaculture  system  with  different  feeds. J Aqua FoodProduct Tech . 1-9. Doi:
10.1080/10498850.2018.1483990 . Himaya  SW,  Ryu  B,  Ngo  DH,  Kim  SK.  2012. Peptide  isolated  from  Japanese  flounder skin  gelatin  protects  against  cellular oxidative  damage. J.  Agric.  Food  Chem. 60: 9112–9119. Doi: 10.1021/jf302161m.
Hou Y, Zhou J, Liu W, Yongxia C, Wu L, Yang G.
2014.  Preparation  and  characterization  of antioxidant  peptides  from  fermented  goat placenta. Korean J Food Sci Annual . 34(5):
769-776.
Ismail I, Huda N, Ariffin F, Ismail N. 2010.  Effects of  washing  on  the  functional  properties  of duck  meat. Intl  JPoultry  Sci .  9(6):  556-561. Doi: 10.3923/ijps.2010.556.561 .
Jeevitha  K,  Khora  S,  Priya  KM.  2014.  Antioxidant activity  of  fish  protein  hydrolysates  from Sardinella  longiceeps.  Int  J  Drug  Dev  &
Res . 6(4): 137-145. Doi: 10.5851/kosfa.2014.34.6.769.
Jomova  K,  Valko  M.  2011.  Advances  in  metal- induced oxidative stress and human disease. Toxicology . 283: 65-87. Doi:
10.1016/j.tox.2011.03.001.
Karaulova  EP  dan  Yakush  EV.  2017.  The comparative  study  of  myofibrillar  proteins of  skeletal  muscles  of  some  deep-sea  fish species. J  Fish  Sci. 11(2):  1-8.  Doi:
10.21767/1307-234X.1000112.
Khanh  NH  dan  Ngan  HTB.  2010.  Current  practices of  rice  field  eel Monopterus  albus (Zuiew, 1793)  culture  in  Vietnam. Res  Institute  for Agriculture. 3: 26- 29.
Kiewiet  MBG,  Dekkers  R,  Ulfman  LH,  Groeneveld
A, de Vos P, Faas MM. 2018. Immunomodulating  protein  aggregates  in soy  and  whey  hydrolysates  and  their resistance  to  digestion  in  vitro  infant gastrointestinal  model:  new  insights  in  the mechanism of immunomodulatory hydrolysates. Food Funct . 9: 604-613. Doi: 10.1039/c7fo01537b.
Klomklao  S,  Benjakul  S,  dan  Kishimura  H.  2013. Functional properties and antioxidant activity  of  protein  hydrolysates  from toothed  ponyfish  muscle  treated  viscera extract  from  hybrid  catfish. Food  Sci Technol . 48(7): 1483-1489. Doi:
10.1111/ijfs.12116 . Kristinsson  HG,  Rasco  BA.  2000.  Fish  protein hydrolysates:  production,  biochemical,  and functional  properties. Crit  Rev  Food  Sci
Nutr . 40(1): 43-81. Doi:
10.1080/10408690091189266.
Laemmli  UK.  1970.  Cleavage  of  structural  protein during  the  assembly  of  the  head  of bacterophage  T4. Nature .  227:  680-685. Doi: 10.1038/227680a0.
Leo  EEM,  Fernández  JJA  ,  Campos  MRS.  2016.
Biopeptides  with  antioxidant  and  anti- inflammatory  potential  in  the  prevention and  treatment  of  diabesity  disease. Biomed &  Pharmacotherapy .  83:  816–826.  Doi: 10.1016/j.biopha.2016.07.051.
Lertwittayanon  K,  Benjakul  S,  Maqsood  S, Encanacion  AB.  2013.  Effect  of  different
salts  on  dewatering  and  properties  of yellowtail barracuda surimi. Int Aquatic Res .
5: 1-10.  Doi: 10.1186/2008-6970-5-10. Mirzaei  M,  Mirdamadi  S,  Ehsani  MR,  Aminlari  M. 2018.  Production  of  antioxidant  and  ACE- inhibitory  peptides  from  Kluyveromyces marxianus  protein  hydrolysate:  purification and  molecular  docking. J  Food  and  Drug Analysis. 26: 696-705. Doi:
10.1016/j.jfda.2017.07.008.
Moreno PJG, Batista I, Pires C, Bandara NM, Carpio FJE,  Guadix  A,  Guadix  EM.  2014.
Antioxidant activity of protein hydrolysates obtain  from  discarded  mediterranea  fish species. Food  Res  Intl .  65:  469-476.  Doi: 10.1016/j.foodres.2014.03.061 .
Mudgil  P,  Kamal  H,  Yuen  GC,  Maqsood  S.  2018. Characterization and identification of novel antidiabetic  and  anti-obesity  peptides  from camel  milk  hydrolysates. Food  Chem. 259: 46-54. Doi: 10.1016/j.foodchem.2018.03.082.
Najafian  L,  Babji.  2015.  Isolation,  purification  and identification  of  three  novel  antioxidative peptides  from  patin  ( Pangasius  sutchi ) myofibrillar  protein  hydrolysates. LWT  - Food  Sci  Technol. 60:  452-46.  Doi: 10.1016/j.lwt.2014.07.046 .
Najafian  L,  Jafarzade  M,  Said  M,  Babji  AS.  2013. Biochemical  properties  and  antioxidant activity of myofibrillar protein hydrolysates obtained  from  patin  ( Pangasius  sutchi ). Int J  Food  Sci  Technol .  48:  2014-2022.  Doi: 10.1111/ijfs.12162.
Normah I dan Noorasma M. 2015. Physicochemical properties of mud clam ( Polymesoda erosa ) hydrolysates obtained using different microbial  enzymes. IFRJ .  22(3):  1103- 1111. Doi: 43b2142687e648cb88109098bb5931db.
Ochiai  A, Tanaka S, Tanaka  T, Taniguchi M. 2016.
Rice  bran  protein  as  a  potent  source  of antimelanogenetic  peptides  with  tyrosinase inhibitory  activity. J  Nat  Prod .  79:  2545- 2551. Doi: 10.1021/acs.jnatprod.6b00449. Ovando  CA,  de  Carvalho  JC,  de  Melo  Pereira  GV, Jacques  P,  Soccol  VT,  and  Soccol  CR. 2018.  Functional  properties  and  health benefits  of  bioactive  peptides  derived  from Spirulina:  A  review. Food  Reviews  Int . 34(1): 34-51. Doi: 10.1080/87559129.2016.1210632.
Ovissipour  M,  Abedian  A,  Motamedzadegan  A, Rasco  B,  Safari  R,  Shahiri  H.  2009.  The effect  of  enzymatic  hydrolysis  time  and temperature  in  the  properties  of  protein hydrolysates from persian sturgeon ( Acipenser  persicus )  viscera.  115(1):  238- 242. Doi: 10.1016/j.foodchem.2008.12.013.
Oyaizu  M.  1988.  Antioxidative  activities  of browning products of glucosamine fractionated  by  organic  solvent  and  thin- layer  chromatography. Nippon  Shokuhin Kogyo  Gakkaishi .  35:  771–775.  Doi:
10.3136/nskkk1962.35.11_771.
Pacheco-Aguilar  R,  Lugo-Sanchez  ME,  Robles-
Burgueno MR. 2000. Postmortem biochemical  and  functional  characteristics of  Monterey  sardine  muscle  at  0°C. JFood Sci .  65:  2586–90.  Doi: 10.1111/j.1365- 2621.2000.tb15953.x .
Palupi  S,  Hamidah  S,  Yuriani.  2014.  Upaya peningkatan  pendapatankelompok  usaha belut  melalui  variasi  hasilolahan  dan kemasan  di  Godean. Inotek .  18(1):  109- 119.
Parvathy  U,  anizam  AA,  Ninan  G,  Panda  SK, Ravishankar  CN.  2018.  Characterization  of fish  protein  hydrolysate  from  red  meat  of Euthynnus  affinis and  its  application  as  an antioxidant  in  iced  sardine. J  Sci  Ind  Res . 77: 111-119. Doi: 123456789/43540 . Pisoschi  AM,  Charegi  MC,  Danet  AF.  2009.  Total antioxidant  capacity  of  some  commercial fruit juices: electrochemical and spectrophotometrical approaches. Molecules . 14(1): 480-493. Doi: 10.3390/molecules14010480.
Qiao M, Tu M, Wang Z, Mao FJ, Chen H, Qin L, Du M.  2018.  Identification  and  antithrombotic activity  of  peptides  from  blue  mussel (Mytilus  edulis)  protein. Int  J  Mol  Sci .
19(1): 138-149. Doi: 10.3390/ijms19010138.
Ranathunga  S,  Rajapakse  N,  Kim  SK.  2006.
Purification
andcharacterization of antioxidantative  peptide  derived  from muscle  ofconger  eel  ( Conger  myriaster ). European Food ResTechnol . 222: 310–315. Doi: 10.1007/s00217-005-0079-x.
Ren  J,  Wang  H,  Zhao  M,  Cui  C,  Hu  X.  2010. Enzymatic hydrolysis of grass carp myofibrillar protein and antioxidant properties  of  hydrolysates. Czech  J  Food Sci . 28(6): 475-484. Doi: 10.17221/343/2009-CJFS.
Roslan  J,  Yunos  KFM,  Abdullah  N,  Mazlina  S,
Kamal  M.  2014.  Characterizations  of  fish protein hydrolysates from tilapia ( Oreochromis  niloticus )  by  products. Agric Sci Pocedia . 2:312-319. Doi: 10.1016/j.aaspro.2014.11.044 .
Shahidi  F  dan  Zhong  Y.  2015.  Measurement antioxidant activity. J Funct Food . 18: 757- 781. Doi: 10.1016/j.jff.2015.01.047.
Shekarabi  SPH,  Hosseini  SE,  Soltani  M,  Kamali  A, Valinassab  T.  2014.  A  comparative  study on physicochemical and sensorycharacteristics  of  minced  fish  and
surimi from black mouth croaker ( Atrobucca  nibe ). JAgrSciTech. 16:  1289- 1300.  Doi: jast.modares.ac.ir/  article-23- 3094.
Slizyte  R.  Rustad  T,  dan  Storro  I.  2005.  Enzymatic hydrolysis  of  cod  ( Gadus  morhua )  by- products:  Optimization  of  yield  and properties  of  lipid  and  protein  fractions. Process  Biochem .  40(12):  3680-3692.  Doi: 10.1016/j.procbio.2005.04.007 .
Song  R,  Wei  RB,  Ruan  GQ,  Luo  HY.  2015.
Isolation  and  identification  of  antioxidant peptides  from  peptic  hydrolysates  of  half- fin anchovy ( Setipinna taty ). LWT-Food Sci Technol . 60: 221–229. Doi:
10.1016/j.lwt.2014.06.043 .
Srikanya K,  K Dhanapal, K  Sravani, K Madhavi, K Praveen . 2017. A study on optimization of fish  protein  hydrolysate  preparation  by enzymatic  hydrolysis  from  tilapia  fish waste mince. Int. J Curr Microbiol App Sci . (6): 3220-3229. Doi:
10.20546/ijcmas.2017.612.375.
Tahergorabi  R,  Hosseini  SV,  Jaczynski  J.  2011.
Food Proteins: Seafood Proteins . Cambridge (GB): Woodhead Publishing.
Thaipong  K,  Boonprakob  U,  Crosby  K,  Cisneros-
Zevallos  L,  Byrne  DH.  2006.  Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC assays for  estimating  antioxidant  activity  from guava  fruit  extracts. J  Food  Composition
Analysis . 19: 669–675. Doi: 10.1016/j.jfca.2006.01.003.
Thiansilakul  Y , Benjakul  S , Richards  MP .  2011.
Effect of myoglobin from Eastern little tuna muscle  on  lipid  oxidation  of  washed  Asian seabass  mince at different pH conditions . J
Food Sci . 76(2): 242-249. Doi: 10.1111/j.1750-3841.2010.01992.x.
Thorarinsdottir  KH,  Arason  S,  Geirsdottir  M, Bagason  SG,  Kristbergsson  K.  2002. Changes  in  myofibrillar  proteins  during processingof  salted  cod  ( gadus  morhua )  as determined by electrophoresis and differential  scanning  calorimetry. Food Chem. 77(3): 377-385. Doi: 10.1016/S0308- 8146(01)00349-1 .
Udenigwe  CC  dan  Aluko  RE.  2011.  Chemometric analysis  of  the  amino  acid  requirements  of antioxidant  food protein hydrolysates. Int J Molecular  Sci. 12:  3148–3161.  Doi: 10.3390/ijms12053148 .
Vijaykrishnaraj  M,  Roopa  BS,  dan  Prabhasankar  P.
2016.  Preparation  of  gluten  free  bread enriched with green mussel ( Perna canaliculus )  protein  hydrolysates  and characterization  of  peptides  responsible  for mussel  flavour. Food  Chem .  211:  715-25. Doi: 10.1016/j.foodchem.2016.05.094.
Vilcacundo  R,  Miralles  B,  Carillo  W,  Hernandez- Ledesma  B.  2018.  In  vitro  chemo chemopreventive  properties  of  peptides released from quinoa ( Chenopodium quinoa Willd.) protein under simulated
gastrointestinal  digestion. Food  Res  Int . 105: 403-411. Doi: 10.1016/j.foodres.2017.11.036. Wang  B,  Wang  YM,  Chi  CF,  Luo  HY,  Deng  SG, Ma JY. 2013a. Isolation and Characterization of Collagen and
Antioxidant  Collagen  Peptides  from  Scales of Croceine Croaker ( Pseudosciaena crocea ). Mar  Drugs. 11:  4641-4661.  Doi: 10.3390/md11114641.
Wang  H,  Zhang    F,  Cao  J,  Zhang  Q,  and  Chen  Z. 2013b. Proteolysis characteristics of sarcoplasmic,  myofibrillar,  and  stromal proteins  separated  from  grass  carp  and antioxidant properties of their hydrolysates.
Food Sci.  Biotechnol .  22(2): 531-540.  Doi: 10.1007/s10068-013-0111-z.
Wattanasiritham L, Theerakulkait C,
Wickramasekara  S,  Maier  CS,  Stevens  JF. 2016.Isolation and identification of antioxidant  peptides  from  enzymatically hydrolyzed  rice  branprotein. Food  chem. 192:156-162. Doi:
10.1016/j.foodchem.2015.06.057.
Wijayanti  HB,  Bansal  N,  dan  Deeth  HC.  2014. Stability  of  whey  proteins  during  thermal processing:  a  review. Comprehensive  Rev in  Food  Sci  Food  Safety .  13:  1235-1251.
Doi: 10.1111/1541-4337.12105.
Wijayanti  I,  Romadhon,  dan  Rianingsih  L.  2015. Pengaruh Konsentrasi Enzim Papain terhadap  Kadar  Proksimat  dan  Nilai Rendemen Hidrolisat Protein Ikan Bandeng ( Chanos  chanos Forks).  PENA  Akuatika
Volume 12 (1): 13-23.Doi:
10.31941/penaakuatika.v12i1.323 . Wu CH, Chen HM, Sdan hiau CY. 2003. Free amino acids and peptides as related  to antioxidant properties  in  protein  hydrolysates  of mackerel  ( Scomber  austriasticus ). Food Res  Intl .  36:  949-957.  Doi: 10.1016/s0963- 9969(03)00104-2 .
Yarnpakdee S, Benjakul S, Nalinanon S, Kristinsson HG. 2012. Lipid oxidation and fishy odour development  in  protein  hydrolysate  from Nile tilapia ( Oreochromis niloticus ) muscle as  affected  by  freshness  and  antioxidants. Food Chem . 132:1781–1788. Doi: 10.1016/j.foodchem.2011.11.139 . Yathavamoorthi  R,  Sankar  TV,  Ravishankar  CN. 2010.  Effect of ice  storage and  washing on the protein constituents andtextural properties  of  surimi  from Labeo  calbasu (Hamilton, 1822). Indian J. Fish . 57(4): 85- 91. Doi: 267967851 .
Yazdi MM, Asoodeh A, Chamani JK. 2012. A novel antioxidant  and  antimicrobial  peptide  from hen  egg  white  lysozyme  hydrolysates. J Func Food . 4(1): 278-286. Doi: 10.1016/j.jff.2011.12.004. YouL, Zhao M, Cui C, Zhao H, Yang B.2009. Effect of  degree  of  hydrolysis  on  the  antioxidant activity of loach ( Misgurnus anguillicaudatus ) protein hydrolysates.
Innovative  Food  Sci  Emerging  Technol .
10(2): 235-240. Doi: 10.1016/j.ifset.2008.08.007 . Zou Tang-Bin, Zou, He Tai-Ping, Li Hua-Bin, Tang
Huan-Wen, Xia En-Qin. 2016.  The structure-activity relationship of theantioxidant peptides from natural proteins. Molecules .    21(1):  72-86.  Doi: 10.3390/molecules21010072 .