JURNAL ILMU TERNAK, DESEMBER 2006, VOL. 6 NO. 2, 145 – 149
Perlakuan Superovulasi Sebelum Pemotongan Ternak (Treatment Superovulation Before Animal Sloughter)
Nurcholidah  Solihati, Tita  Damayanti  Lestari, Kundrat  Hidajat,  Rangga Setiawan dan Lia January Nurhayat
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran Bandung

## ABSTRAK
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh perlakuan superovulasi selama 48 jam sebelum pemotongan ternak terhadap jumlah folikel, kualitas oosit, dan residu hormon gonadotropin eksogen. Penelitian ini menggunakan domba betina dewasa sebanyak delapan ekor  yang  dibagi  menjadi  dua  kelompok  masing-masing  terdiri  dari  empat  ekor  domba. Siklus estrus diamati dengan cara melakukan pengamatan/deteksi estrus baik secara visual maupun  dengan  menggunakan  pejantan  pengusik  (teaser).  Perlakuan  superovulasi dilakukan  dengan  memberikan  injeksi  intramuskular  500 i.u.  PMSG  (Folligon,  Intervet) pada  hari  ke-10  dari  siklus  estrus.    Pemotongan  dilakukan  48  jam  kemudian,  kemudian diambil  ovariumnya  dan  segera  dievaluasi. Pengujian  residu  hormon  dilakukan menggunakan metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography), sampel diambil dari  serum  darah. Parameter  yang  diamati  meliputi (1)  Jumlah  folikel  berdasarkan  ukuran dan,  (2)    Jumlah  oosit  berdasarkan  kualitas,  (3)  Residu hormon gonadotropin  eksogen (PMSG)  pada  ternak  yang  diberi  perlakuan.. Metode  penelitian  yang  digunakan  adalah metode  eksperimental.    Data  yang  diperoleh  dianalisa  menggunakan  uji  t  dengan  ulangan sama. Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa  tidak  terdapat  perbedaan  yang  nyata  antara domba kontrol  dengan  domba  yang  mendapat  perlakuan  injeksi  PMSG  dalam  hal  jumlah folikel, jumlah oosit maupun kualitas oosit, namun jumlah folikel ukuran sedang (2-6 mm) dan oosit grade A pada domba yang diberi PMSG lebih banyak dibandingkan pada domba kontrol. Hasil pengujian dengan HPLC ditemukan kadar hormon PMSG sebanyak 240,62 i.u/ml.
Kata Kunci :  superovulasi, pmsg, domba

## ABSTRACT
The  aim  of  this  research  was  to  know  the  effect  of  superovulation  treatment  during  48  h before  animal  slaughter  on number  of follicle,  oocyt  quality,  and    hormonal  residual  of gonadotropin  exogen. This  research  use  eight ewe and  split  in  two  group.    Estrous  cycle had  monitored  with  estrous  detection  both  visual  and  use  the  teaser.  Superovulation treatment do with give intramuscular injection of 500 i.u PMSG (Folligon, Intervet) at day 10 of estrous cycle.  Slaughter do 48 h after, then ovarium took and evaluated. Analisys for hormonal residual do with HPLC methode, sample take from blood serum. Parameters that inspected consist of (1) number of follicle base on  follicle  size, and (2) number of oocyte base  on  oocyte  quality,  and  (3)  hormonal  residual  of  gonadotropin  exogen (PMSG). Data was analized use t test with same replication.  Result of this research show that there was no significant different between control and PMSG treatment in number of follicle, number of oocyte and oocyte quality although more number follicle of 2-6 mm in size and oocyte with A  grade  resulted  from  ram  injected  PMSG  than  control. Result  of  HPLC  found 240,62 i.u/ml of PMSG.
Keywords : superovulation, pmsg, follicle number, oocyt quality
Pendahuluan Superovulasi adalah suatu prosedur pemberian ormone pada  ternak  betina  sehingga menghasilkan beberapa oosit atau sel telur, dimana secara  normal  hanya dihasilkan  satu  oosit pada setiap estrus.  Pada domba, kambing atau sapi rata- rata diperoleh 12  ovulasi setelah induksi superovulasi. Tujuan  utama  superovulasi  adalah
untuk  meningkatkan  jumlah  oosit yang  dilepaskan dan jumlah  embrio  yang  potensial.    Hormon  yang biasa  digunakan  untuk  merangsang  pertumbuhan folikel  dan  ovulasi  adalah pregnant  mare  serum gonadotrophin (PMSG)  dan follicle  stimulating hormone (FSH).
Target  organ  superovulasi  adalah ovarium dimana terdapat folikel yang didalamnya
mengandung oosit.  Di  rumah  pemotongan  hewan (RPH)  ovarium  tergolong  kepada  limbah  dan bersama  dengan  organ  reproduksi  yang  lain  dijual dengan  harga  yang  sangat  murah. Induksi superovulasi pada ternak yang akan dipotong dapat meningkatkan  jumlah  folikel  dan  oosit  yang dihasilkan,  sehingga  akan  meningkatkan manfaat ovarium dari ternak-ternak yang dipotong di RPH, dan selanjutnya dapat digunakan untuk memproduksi embrio secara in vitro.
Permasalahan  yang  dihadapi  adalah lama waktu  ketika  ternak  berada  di  RPH  sebelum dipotong  sangat singkat,  yaitu  sekitar  dua  hari, sehingga  lama  waktu  induksi  superovulasi  hanya mungkin  dilakukan  dalam  selang  waktu    tersebut. Sebelumnya  telah  ada  laporan  bahwa  interval waktu  antara  pemberian  FSH  dan  pemotongan ternak  dapat  memberikan  pengaruh  terhadap kemampuan  oosit  untuk  memperoleh  kemampuan perkembangan,  dimana  interval  waktu  48  jam menghasilkan  paling  banyak  embrio  (Blondin and Sirard,  1997). Untuk  mengetahui  kelayakan aplikasi  superovulasi di  RPH  terhadap ternak sebelum dipotong, perlu dilakukan penelitian yaitu yang menyangkut kualitas ovarium. Yang dihasilkan.  Selama selang waktu tersebut, induksi superovulasi  diharapkan  dapat  meningkatkan jumlah  folikel  matang  yang  berukuran  besar dimana  terdapat oosit dengan  kualitas  yang  lebih baik.

## Metode

## Ternak Percobaan
Ternak  percobaan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah domba betina  dewasa sebanyak delapan  ekor  yang  dibagi  menjadi  dua kelompok  masing-masing  terdiri  dari  empat  ekor domba. Kelompok pertama mendapatkan perlakuan injeksi  intramuskular 500  I.U.  PMSG, kelompok  kedua  adalah  control  yang  tidak mendapatkan injeksi PMSG. .

## Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan terdiri dari spuit, jarum suntik, pisau, beaker glass, cawan petri, dan mikroskop.    Bahan  yang  digunakan  terdiri  dari PMSG (Folligon, Intervet), larutan NaCL fisiologis. Metodologi Penelitian Sebelum dilakukan perlakuan
superovulasi,  seluruh  domba  yang  digunakan dalam  penelitian ini terlebih  dahulu diamati  siklus estrusnya dengan
cara melakukan pengamatan/deteksi estrus  baik  secara  visual maupun  dengan  menggunakan  pejantan  pengusik (teaser). Perlakuan superovulasi dilakukan dengan
memberikan injeksi intramuskular 500 I.U. PMSG (Folligon,  Intervet) pada hari  ke-10  dari  siklus estrus.    Pemotongan  dilakukan 48  jam kemudian. Setelah ternak  dipotong,  lalu diambil ovariumnya dan dicuci  dengan  NaCl  Fisiologis.    Setelah dibersihkan,  ovarium diperiksa  kualitasnya. Oosit diperoleh dengan  cara  aspirasi  folikel  pada ovarium  menggunakan  spuit  dan  jarum  suntik, kemudian  disimpan  dalam  cawan  Petri  dan diperiksa dibawah mikroskop.
Parameter yang diukur :
1. Jumlah dan  ukuran folikel, yaitu dengan  cara menghitung banyaknya folikel yang dihasilkan dari ovarium setiap  ekor  ternak  yang dikelompokan berdasarkan  ukuran.  Diameter  folikel  diukur dengan  menggunakan  jangka  sorong  dan  dihitung jumlah  folikelnya  dengan  menggunakan counter. Ukuran folikel  dikelompokan  berdasarkan  kriteria menurut  Tan  dan  Lu,  (1990)  dan  Lonergan et  al., (1991), yaitu :
- Ukuran kecil : 1-2 mm - Ukuran sedang : 2-6 mm - Ukuran besar
: > 6 mm
2. Jumlah dan  kualitas oosit, yaitu dengan  cara menghitung banyaknya  oosit  yang  diperoleh  dari folikel di ovarium setiap ekor ternak yang diamati dibawah  mikroskop  dan digolongkan  menjadi tiga katagori berdasarkan penilaian visual dari kekompakan  sel-sel  kumulus.  Pengelompokan oosit digolongkan menjadi tiga katagori berdasarkan  kualitas  oosit  (A,  B,  dan  C)  menurut Madison, dkk (1992) yaitu:
A = sepenuhnya dikelilingi oleh sel-sel kumulus B = sebagian dikelilingi oleh sel-sel kumulus C = oosit yang gundul

## Rancangan Percobaan
Metode  penelitian  yang  digunakan  adalah metode  eksperimental  dengan  perlakuan  yang diberikan  yaitu  induksi  PMSG  dan  tanpa  PMSG. Data  yang  diperoleh  dianalisa  menggunakan  uji  t dengan  ulangan  sama.  Peubah  yang  diamati meliputi: ukuran folikel dan kualitas oosit.

## Hasil dan Pembahasan
Pengaruh Pregnant Mare Serum Gonadotrophin (PMSG) Terhadap Jumlah Folikel
Jumlah folikel yang dihasilkan dari domba kontrol dan yang diberi perlakuan PMSG disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Pengaruh Pregnant Mare Serum
Gonadotrophin (PMSG) Terhadap Jumlah Folikel. Perlakuan Rataan Jumlah Folikel Kontrol PMSG 22,25 23,25
Berdasarkan Tabel  1  dapat  dilihat  bahwa rataan jumlah folikel yang dihasilkan oleh ovarium domba yang diberi  suntikan  PMSG  menunjukan jumlah  yang  lebih  banyak  dibandingkan  kontrol (23,25 vs  22,25). Hasil analisis  statistik menunjukan bahwa hormon PMSG yang diinduksikan  tidak  berpengaruh  nyata  terhadap jumlah  folikel.    Hal  ini  dapat  disebabkan  oleh beberapa  faktor  diantaranya  adalah  umur  ternak yang  belum  dewasa,  sehingga  respons  ovarium terhadap hormon gonadotrofin  sangat  kurang. Kemungkinan lain adalah kurangnya kadar hormon yang diberikan serta jarak waktu antara penyuntikan  hormone  dengan  pemotongan  yang relatif singkat,  sehingga hormon tersebut  belum terserap dan digunakan sepenuhnya untuk pertumbuhan folikel. Menurut Shahib (2001) kerja hormon  selain  dipengaruhi  oleh  kadar  hormon darah,  juga  tergantung  kepada  keadaan  reseptor pada  sel  target  dan  protein  pengangkut  di  dalam darah.
Hasil  penelitian Yulnawati et  al.  (2005) menunjukkan  bahwa  jumlah  folikel  tertinggi didapatkan  dari  sepasang  ovarium  dengan  adanya CL  tanpa  folikel dominan. Pertumbuhan  folikel selama siklus dikontrol oleh hormon FSH dan LH, yang  keduanya  harus  ada  bila  diharapkan pertumbuhan  dan  fungsi  (sekresi  estrogen)  folikel yang normal (Nalbandov, 1990).
Pada  hewan  monotokus  maupun  politokus jumlah  folikel  yang  berkembang  pada  fase folikuler dalam siklus jauh lebih besar dibandingkan dengan jumlah yang bertahan sampai ovulasi.  Folikel  yang  tidak  mencapai  ukuran ovulasi mengalami degenerasi  selama fase folikuler,  sehingga  dibutuhkan  hormon  lebih sedikit  untuk  memulai  pertumbuhan  folikel dibandingkan  dengan  mempertahankan  folikel yang  lebih  besar  dan  membawanya  ke  ukuran ovulasi  (Nalbandov,  1990).  Data  hasil  penelitian menunjukan bahwa induksi hormon yang dilakukan pada hari ke-10 dalam siklus estrus tidak memberikan  pengaruh  pada  pertumbuhan  folikel sehingga  hasilnya  tidak  berbeda  nyata  dengan kontrol.  Meskipun  sekresi  hormon  pada  betina yang  belum  dewasa  menstimulasi  pertumbuhan folikel,  namun  dari  pertumbuhan  duktus  yang lambat  ternyata  hanya  sedikit  estrogen  yang disekresikan (Nalbandov, 1990).
Sebagaimana pada hewan dewasa, keragaman  respons  itu  timbul  terutama  akibat  (a) sifat  dan  potensi  biologi  sediaan  hormon  yang digunakan  dan  (b)  variasi  yang  bersifat  menurun dalam  sensitivitas  ovarium  antara  sesama  hewan (Hunter,  1995).  Faktor  utama  yang  menghambat
jumlah  folikel  yang  mengalami  pemasakan  pada hewan  dengan  siklus  normal  adalah  konsentrasi gonadotrofin  dalam  sirkulasi  darah,  dan  tentu  saja ini  dapat  diperbesar  oleh  materi  hormon  yang disuntikkan. Pada  penelitian  ini,  konsentrasi hormon  yang  diberikan  kepada  setiap  ekor  domba merupakan konsentrasi paling rendah yaitu sebesar 500  IU.  Hal  lain  yang  menentukan  respons ovarium  terhadap  jumlah  folikel  yaitu  teknik induksi. Teknik induksi secara subcutan akan lebih cepat mencapai target daripada secara intramuskular.
Apabila  diuraikan  lebih  lanjut,  jumlah folikel  tersebut  di  atas  dibagi  menjadi  jumlah folikel  ukuran  <  2  mm  dan  ukuran  2 – 6  mm. Jumlah folikel dengan kedua ukuran tersebut pada domba  kontrol  maupun  yang  diberi  perlakuan PMSG tersaji pada Tabel 2.
Tabel 2. Pengaruh Pregnant  Mare  Serum Gonadotrophin (PMSG) Terhadap Jumlah  Folikel  Berdasarkan  Ukuran Folikel. Perlakuan Jumlah Folikel berdasarkan Ukuran < 2 mm 2 – 6 mm Kontrol PMSG % 52,38 47,31 % 47,62 52,70
Berdasarkan  Tabel  2  terlihat  bahwa komposisi  jumlah  folikel  kecil  (<  2  mm)  pada domba  kontrol  lebih  banyak  dibandingkan  jumlah folikel  ukuran  sedang    (2-6  mm).    Hal  sebaliknya terjadi  pada  domba  yang  diberi  perlakuan  dimana jumlah  folikel  ukuran  sedang  diperoleh  lebih banyak  dibandingkan  jumlah  folikel  ukuran  kecil. Hal  ini  memberikan  gambaran  bahwa  pemberian PMSG  dapat  meningkatkan  jumlah  folikel  ukuran sedang  sebagai  akibat  terjadinya  peningkatan folikulogenesis pada ovarium.
Berdasarkan  Tabel 2 menunjukan bahwa folikel ukuran < 2 mm diperoleh lebih banyak dari ternak kontrol (52,38%) dibandingkan ternak yang diberi  PMSG  (47,31),  namun  hasil  analisis statistika menunjukkan perbedaan yang tidak nyata (P>0,05).    Jumlah  folikel  ukuran  <  2  mm pada ovarium  domba  yang  diberi  PMSG  hasilnya  lebih kecil  daripada  domba  kontrol  menunjukan  bahwa pemberian  PMSG  memicu  pertumbuhan  folikel sehingga  folikel  yang  berukuran  <  2  mm  sudah berkembang  menjadi  folikel  yang  lebih  besar  dan jumlahnya  lebih  sedikit  diperoleh  dibandingkan pada domba kontrol.
Tanggapan  organisme  terhadap  hormon tergantung  kapasitas  jaringan  dan  organ  sasaran
untuk  menanggapinya. Pada  umumnya,  jaringan- jaringan  yang  tanggap,  secara  nyata  menunjukkan pengambilan hormon yang tersebar dan penahanan yang terlama (Turner dan Bagnara, 1988).
Secara  alami  folikel  tersier  yang  akan menjadi  masak  pada  domba  hanya  terdapat  1-2 folikel sehingga FSH berperan dalam perangsangan  folikel  tersier  menjadi  folikel de  Graaf.  Lapis  sel  teka  interna  dan  sel  granulosa pada  folikel  de  Graaf  menghasilkan  estrogen. Semakin masak atau semakin besar dimensi folikel de  Graaf  semakin  tinggi  pula  produksi  estrogen (Partodihardjo, 1987). Estrogen tertuju pada folikel besar  seiring  diproduksinya  LH  untuk  ovulasi. Tingginya estrogen akan menghambat pertumbuhan  folikel  primer  menjadi  folikel sekunder.
Berdasarkan  Tabel 2 menunjukan  bahwa rata-rata persentase  folikel  ukuran  2-6  mm  lebih besar (52,70%) diperoleh  dari  domba  yang  diberi PMSG dibandingkan kontrol  (47,62%),  namun secara statistik tidak menunjukkan perbedaan yang nyata  (P>0,05). Pengaruh PMSG terhadap pencapaian folikel  ukuran  2-6  mm  cukup  besar, sehingga  folikel  dengan  ukuran  tersebut diperoleh lebih banyak  dibandingkan  dengan  kontrol. Hasil ini  menunjukan  bahwa  PMSG  berperan  untuk perkembangan  folikel  sehingga  pada  domba  yang diberi  perlakuan  PMSG  diperoleh  folikel  yang berukuran  sedang  lebih  banyak  dibandingkan dengan domba kontrol.

## Pengaruh Pregnant Mare Serum Gonadotrophin (PMSG) Terhadap Kualitas Oosit
Pengamatan  tehadap  jumlah  oosit  tersaji pada Tabel 3.
Tabel 3. Pengaruh Pregnant Mare Serum Gonadotrophin (PMSG) Terhadap
Jumlah Oosit. Perlakuan Rataan Jumlah Oosit (sel) Kontrol PMSG 20,25 20,75
Berdasarkan  Tabel 3 menunjukan  bahwa jumlah  oosit  yang  dihasilkan  dari  domba  yang diberi suntikan PMSG 500 IU hampir sama dengan kelompok kontrol,  dan  secara  statistic  tidak berbeda nyata.  Hal ini karena jumlah folikel yang dihasilkan dari kedua kelompok perlakuan tersebut juga  tidak  berbeda  nyata,  mengingat  sel  telur terdapat  di  dalam  folikel. Dengan  kata  lain, jumlah oosit akan mengikuti jumlah folikelnya.
Oosit  akan  tumbuh  dalam  lingkungan folikel  dan  akan  mengikuti  siklus  ovarium. Hadirnya  folikel  dominan  dalam  ovarium  akan mengurangi  konsentrasi  FSH  dan  menyebabkan folikel  lainnya mengalami  stress  dan  regresi (Varishaga et  al.  1998). Hadirnya corpus  luteum dan  folikel  dominan  di  dalam  ovarium  akan memberikan  pengaruh  bagi  perkembangan  folikel dan  status  ovarium. Masalah  terbesar  pada superovulasi adalah variasi yang sangat besar pada respons  superovulasi  pada  spesies  yang  sama (Bowen dan Pineda, 1989).
Tabel 4.    Pengaruh Pregnant  Mare  Serum
Gonadotrophin (PMSG) Terhadap Jumlah Oosit Grade A, B, dan C. Perlakuan Rataan Kualitas Oosit A B C % control 33,27 33,71 33,03 PMSG 40,58 33,02 26,40
Berdasarkan  Tabel 4.  terlihat  bahwa  pada domba  kontrol  mempunyai  komposisi  oosit  grade A, B, dan C yang relatif sama (33,27% vs 33,71% vs  33,03%).    Pada  domba  yang  diberi  perlakuan injeksi  PMSG  terlihat  bahwa  jumlah  oosit terbanyak  diperoleh dari  oosit  grade  A (40,58%), disusul  oleh  grade  B (33,02%) dan  grade  C (26,40%).    Hal  ini  menunjukan  bahwa  pemberian PMSG  dapat  meningkatkan  jumlah  oosit  grade  A dan memperkecil oosit grade C. Pemberian PMSG akan  meningkatkan  folikulogenesis  yang  terjadi pada  ovarium  sehingga  terjadi  perkembangan folikel  dan  peningkatan  sintesis  estrogen  dari  sel- sel granulosa di dalam folikel.  Hal ini selanjutnya akan memberikan tambahan nutrisi terhadap oosit- oosit  yang  berada  di  dalam  folikel  sehingga kualitas oosit tersebut meningkat.
Hasil  penelitian  ini menunjukan bahwa oosit grade  A yang  diperoleh dari  domba  yang diberi  induksi  PMSG lebih  banyak  dibandingkan kontrol,  namun  hasil  uji  statistik  menunjukan perbedaan yang tidak nyata. Hasil ini menunjukan bahwa pemberian PMSG meningkatkan perkembangan folikel. Oosit grade A ini diperoleh dari folikel berukuran 2-6 mm, yang menunjukkan bahwa pada folikel  yang  mencapai  ukuran maksimum  banyak  terdapat  nutrisi  didalamnya yang  berguna  untuk meningkatkan kualitas  oosit, sehingga pada domba yang diberi PMSG diperoleh oosit grade A lebih banyak. Penelitian sebelumnya melaporkan  bahwa  jumlah  tertinggi  oosit  dengan grade A  diperoleh dari  sepasang  ovarium  dengan
adanya  CL  dan  folikel  dominan  (Yulnawati, et  al. 2005).
Waktu  penyuntikan  hormon  eksogen  juga berpengaruh  terhadap  besar  kecilnya  rangsangan yang  diterima  oleh  setiap  organ  dan  jaringan- jaringan. Kompetensi  sel  sasaran  tergantung kepada banyak  faktor,  seperti  spesies  hewan, jenis kelamin, kebuntingan, nutrisi, pencahayaan, kondisi  refraktori,  suhu,  umur,  dan  hormon- hormon lain di dalam sistem (Turner dan Bagnara, 1988).
Hasil  Pengujian  HPLC  Terhadap  Serum  Domba yang Diberi PMSG
Berdasarkan pengujian menggunakan metode  HPLC  diperoleh  hasil  bahwa  di  dalam serum  domba  ditemukan  hormon  PMSG  dengan kadar  240,62  i.u/ml. Sampai  saat  ini  belum  ada laporan  mengenai  efek  negatif  dari  residu  hormon protein  baik  terhadap  ternak  maupun  manusia. Demikian pula belum ada laporan yang menyatakan  hormon  protein  dapat  bertindak sebagai bahan karsinogen (Hardjopranjoto, 2001).
Menurut  Manalu  (2001),  apabila  terdapat peningkatan kadar hormon (somatotropin dan IGF) pada  daging  yang  dikonsumsi  manusia,  maka secara  biologis  tidak  ada  masalah,  karena  hormon tersebut  akan  dirusak  oleh  enzim  pepsin di lambung,  kemudian  oleh  enzim  tripsin  dan kimotripsin  di  usus  dan  oleh  enzim-enzim peptidase  sebelum  diserap  di  dinding  usus  halus. Dengan  demikian  pada  manusia  normal  dewasa tidak  akan  pernah  ada  molekul  protein  yang  akan utuh  masuk  ke  dalam  darah  dari  saluran pencernaan.    Kalaupun  ada  yang  tidak  terurai secara  sempurna  menjadi  asam  amino,  molekul tersebut  tidak  akan  mempunyai  aktivitas  biologis lagi sebagai hormon.

## Kesimpulan
Tidak  terdapat  perbedaan  yang  nyata antara  domba  kontrol  dengan  domba  yang mendapat  perlakuan  injeksi  PMSG  dalam  hal jumlah folikel, jumlah oosit maupun kualitas oosit, namun jumlah folikel ukuran sedang (2-6 mm) dan oosit grade A pada domba yang diberi PMSG lebih banyak dibandingkan pada domba kontrol.

## Daftar Pustaka
Blondin, P.  and  Sirard,  M.A.,  1997.    The  time  interval between FSH-P administration and slaughter can influence  the  developmental  competence  of  beef cattle oocytes.  Theriogenology (47) : 184.
Bowen, R.A. and M.H. Pineda.  1989.  Embryo Transfer in  Domestic  Animals.    In  :  L.E.  McDonald. Veterinary  Endocrinology  and  Reproduction. Lea&Febiger Philadelphia, London. 527-533. Hafez,  B.  and  E.S.E.  Hafez.  2000. Reproduction  in Farm  Animals.  7 th Ed.  Lea  and  Febiger, Philadelphia. 96-107 Hunter,  R.H.F.  1995. Fisiologi  dan Teknologi Reproduksi  Hewan  Betina  Domestik.  Penerbit ITB, Bandung. 82-95.
Lonergan, P., Monaghan, P., Rizos, D., Boland, M. and Gordon,  I.    1994.    Effect  of  follicle  size  on bovine  oocyte  quality  and  developmental competence  following  maturation,  fertilization and culture in vitro.  Molecular Reproduction and Development (37) : 48-53.
Madison, V., B. Every, and T. Grave. 1992. Selection of immature  bovine  oocytes  for  developmental potention in vitro. J. Animal. Reprod. Sci. 27 : 1- 9.
Nalbandov,  A.  V.  1990. Fisiologi  Reproduksi  Pada Mamalia  dan  Unggas.  Penerbit  Universitas Indonesia, Jakarta, 22, 74, 180, 183.
Partodihardjo,  Soebadi.  1990. Ilmu  Reproduksi  Hewan. Mutiara  Sumber  Widya,  Jakarta,  48-49,  84,120- 121.
Shahib,  M.N.    2001.    Hormon  :  Dari  klinik  ke bioteknologi. Proceeding, Seminar  Sehari  : Problematika Penggunaan Hormon Dalam Produksi Ternak. Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran.  Bandung. 6-13.
Tan,  S.J.  and  Lu,  K.H.    1990.    Effects  of  different oestrous  cycle  stage  of  ovaries and  sizes  of follicles  on  generation  of  IVF  early  bovine embryos.  Theriogenology (33) : 335.
Turner,  C.D.  dan  J.T.  Bagnara. 1988. Endokrinologi Umum.    Airlangga  Univ.  Press,    Surabaya.    61- 63.
Varishaga,  M.D.,  C.  Sumantri,  M.  Murakami,  M. Fachrudin,  T.  Suzuki.    1998. Morphology classification  of  the  ovaries  in  relation  to  the subsequent  oocyte  quality  for  IVF-produced bovine  embryos.    Theriogenology  50  :  1015- 1023.
Yulnawati,  M.A.  Setiadi,  and  A.  Boediono.    2005. Maturation and fertilization rate of ovine oocytes collected  from  different  status  of  ovaries. Proceedings,  Reproductive  Biotechnology  for Improved  Animal  Breeding  in  Southeast  Asia. Bali, Indonesia.  199-202 .