## VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR CYANOCOBALAMIN SECARA SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL DOUBLE BEAM
Ricson P. Hutagaol dan Niken F. MIPA Universitas Nusa Bangs a Jl. K. H. Soleh Iskandar Km. 4, Cimanggu, Tanah Sareal – Bogor 16166 email : tufakmipa@yahoo.co.id

## ABSTRACT

## Validation of Determination Method of Cyanocobalamin Content by Visible Double Beam Spectrophotometry
Validasion  of  new  modification  of  or  method,  must  be  done  before  the  validity  of  methods  and  tools used. A valid method will give accurate results so as to guarantee the quality of drugs. The increasing demand from  consumers  will  need  increasing  vitamin  B12,  so  need  more  validation  methods  of  cyanocobalamin  in  the tablet  dosage.  Analysis  of  the  studied  parameter  of  linearity,  accuracy,  precision,  robustness,  specificity,  and ranges. Analysis of cyanocobalamin is using a strong base anionic exchange resin for separation techniques in order  to  obtain  pure  cyanocobalamin,  pure  cyanocobalamin  obtained  after  measuring  through  visible  double beam spectrophotometry. The results of this validation of all parameters meet the requirements and acceptance criteria.  Linearity  parameter  obtained  resultes  of  the  correlation  coefficient  (r)  =  0,999  (minimum  0,98). Accuracy  parameter  of  the  results  abtained  between  98,12%  -  99,44%  (requirements  between  98%  -  102%). Precision parameter (repeatability method) obtained relative standard deviation (RSD) between 0,25%  - 0,38% (requirements is less than 2%). Intermediate precision parameters between SBR obtained 0,00% (requirements is less than 2%). Robustness parameters obtained 98,24% recovery and RSD was 0,00% (requirements is between 98% - 102%) recovery and RSD less than 2% (mets the requirements). Specificity parameters obtained that the sample  matrix  did  not  affect  the  results  of  the  analysis,  so  it  could  be  concluded  that  the  validation  of  method determination of cyanocobalamin measure was valid.
Key words : Method validation, cyanocobalamin, resin, spectrophotometry.

## ABSTRAK
Menurut  Harmita  (2004),  metode  yang  baru  atau  mengalami  modifikasi,  sebelum  digunakan  untuk penetapan rutin harus dilakukan validasi metode terlebih dahulu agar dapat diketahui keabsahan metode dan alat yang  digunakan.  Metode  yang  valid  akan  memberikan  hasil  yang  akurat  sehingga  dapat  menjamin  mutu  obat. Semakin  meningkatnya  permintaan  dari  konsumen  akan  kebutuhan  vitamin  B12  ( cyanocobalamin ),  maka  perlu dilakukan validasi metode terhadap kadar cyanocobalamin dalam sediaan tablet. Parameter analisis yang diteliti yaitu  linieritas,  akurasi,  presisi,  ketegaran,  spesifisitas,  dan  rentang.  Analisis cyanocobalamin ini  menggunakan resin  penukar  anionik  basa  kuat  untuk  teknik  pemisahan  agar  didapatkan cyanocobalamin murni,  setelah didapatkan cyanocobalamin murni  maka  kadarnya  dapat  diukur  secara  spektrofotometri  visible double  beam . Hasil  penelitian  dari  seluruh  parameter  validasi  ini  memenuhi  persyaratan  dan  sesuai  kriteria  penerimaan. Parameter  linieritas  didapatkan  hasil  koefisien  korelasi  (r)  =  0,999  sesuai  persyaratan  yaitu  minimum  0,98. Parameter akurasi didapatkan hasil % recovery diantara 98,12% - 99,44% sesuai persyaratan yaitu diantara 98% - 102%. Parameter presisi (kedapatulangan metode) didapatkan hasil simpangan baku relatif (SBR) diantara 0,25% -  0,38%  sesuai  persyaratan  yaitu  lebih  kecil  dari  2%.  Parameter  presisi  antara  didapatkan  SBR  0,00%  sesuai persyaratan yaitu lebih kecil dari 2%. Parameter ketegaran didapatkan hasil % recovery 98,24% dan SBR 0,00% sesuai  persyaratan  yaitu  % recovery diantara  98%  -  102%  serta  SBR  lebih  kecil  dari  2%  dengan  demikian parameter rentang juga memenuhi persyaratan. Parameter spesifisitas diperoleh hasil bahwa matriks sampel tidak mempengaruhi  hasil  analisis,  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  validasi  metode  penetapan  kadar cyanocobalamin adalah valid.
Kata kunci : Validasi metode, cyanocobalamin , resin, spektrofotometri.

## PENDAHULUAN
Validasi  metode  adalah  suatu tindakan  penilaian  terhadap  parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium  untuk  membuktikan  bahwa parameter  tersebut  memiliki  persyaratan untuk  penggunaannya.  Validasi  bertujuan untuk  menjamin  prosedur  yang  aman  dan menekan sekecil mungkin risiko penyimpangan yang mungkin timbul. Hasil validasi  metode  dapat  digunakan  sebagai bahan  acuan  untuk  menentukan  suatu metode dapat digunakan untuk pemeriksaan  rutin  atau  tidak  (Harmita, 2004). Cyanocobalamin disebut juga vitamin B12 merupakan senyawa berbentuk  kristal,  berwarna  merah,  dan secara  kimia  merupakan  vitamin  yang paling  kompleks  (Departemen  Kesehatan Republik  Indonesia,  1995).  Vitamin  B12 merupakan salah satu vitamin yang penting bagi  tubuh  serta  semakin  meningkatnya permintaan konsumen akan vitamin B12 di pasaran saat ini, maka dilakukan penelitian mengenai  validasi  metode  terhadap  kadar cyanocobalamin dalam  sediaan  tablet secara  spektrofotometri  visible double beam ,  karena  metode  yang  valid  akan memberikan  hasil  analisis  yang  akurat sehingga  dapat  menjamin  mutu  obat tersebut.
Resin  penukar  anionik  basa  kuat yang  mempunyai  gugus  –CH 2 N(CH 3 ) 3 Cl - mampu  memisahkan  zat  warna  serta matriks tablet yang ada pada sediaan tablet yang mengandung cyanocobalamin sehingga akan didapatkan cyanocobalamin murni  yang  berwarna,  oleh  karena  itu kadar cyanocobalamin bisa  ditentukan menggunakan  spektrofotometer  visibel double  beam (Nalco  Chemical  Company, 2006).  Berdasarkan  sifat cyanocobalamin
yang tidak stabil dengan udara dan cahaya maka penentuan kadar
baku cyanocobalamin dilakukan  menggunakan harga  ekstingsi  spesifik  (E 1% 1cm )  yang ditentukan pada panjang gelombang maksimum  361  nm.  Menurut european pharmacopoeia harga  E 1% 1cm untuk cyanocobalamin =  207,  dari  harga  E 1% 1cm ini  akan  didapatkan  nilai  absorbansi
spesifik untuk cyanocobalamin yang besarnya sesuai dengan konsentrasi larutan yang  dianalisis  sehingga  bisa  didapatkan kadar standar baku cyanocobalamin . Selain itu cyanocobalamin mempunyai dua panjang  gelombang  maksimum  yaitu  pada 361  nm  dan  550  nm.  Panjang  gelombang 361  nm  merupakan  panjang  gelombang mutlak  untuk  menentukan  kadar  standar baku cyanocobalamin sedangkan  panjang gelombang  maksimum  untuk  sampel  bisa menggunakan  panjang  gelombang  361  nm atau  550  nm  tergantung  dari  sifat  obat yang  dianalisis. Cyanocobalamin yang digunakan  untuk  standar  baku  dan  sampel sama  yaitu  berasal  dari  satu  bahan  baku (The Committee On JP, 2006).

## METODE PENELITIAN

## Bahan dan Alat
Bahan  –  bahan  yang  digunakan dalam  uji  validasi  metode  analisis  ini adalah cyanocobalamin buatan  Sanovi Aventis,  asam  klorida  p.a  buatan  Merck, Dowex  1-x4  type  100-200 mesh buatan Muromachi Technos, asam asetat ( glacial ) 100%  p.a  buatan  Merck,  akuades,  dan placebo  sediaan  tablet cyanocobalamin . Peralatan  yang  digunakan  dalam  uji validasi  metode  analisis  ini  adalah  pipet volumetrik (ukuran 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6  ml,  10  ml,  dan  30  ml),  neraca  analitik merek Sartorius, labu ukur cokelat (ukuran 50 ml dan 100 ml), stirrer , piala gelas 300 ml, pipet tetes, bulp , kuvet 10  mm, lemari pendingin,  labu  semprot,  tisu, shaker , centrifuge merek  Hettich  Mikro  22  R, tabung centrifuge ,  kolom  kromatografi berbentuk  buret  merek  Iwata,  corong, tabung  reaksi  100  ml, alu  voil ,  spatula, statip buret, dan spektrofotometer UV-VIS model U2001 merek Hitachi.

## Metode Penelitian
1. Penyiapan Matriks Sampel
2. Penyiapan Kolom Kromatografi
a. Kolom kromatografi : resin  penukar anionik    basa  kuat  (Dowex  1-x4,  Cl type, 100 – 200 mesh.
...........................................………………………
b. Penyiapan    kolom  :  setelah    resin Dowex      dicuci      denga      cara dekantasi,    dengan  menggunakan akuades,  Dowex    dimasukkan    ke dalam    kolom    kaca    hingga    tinggi kira – kira 7 cm, dilewatkan  6 x 25 ml    asam    asetat    6  N    melalui kolom    lalu  dibilas  dengan  air hingga  netral.  Kolom  diatur  hingga 5 cm sebelum digunakan.
3. Penyiapan Larutan Standar Cyanocobalamin yang telah dikeringkan selama ± 2 jam pada suhu 105
ºC  ditimbang  ±  50  mg,  dimasukkan  ke dalam  labu  ukur  cokelat  50  ml,  dilarutkan dan  diencerkan  dengan  akuades  hingga tanda  batas,  kemudiaan  dikocok  hingga homogen.  Larutan  standar  ini  adalah larutan  standar  induk  yang  digunakan untuk  larutan  standar  baku  dan  larutan standar sampel cyanocobalamin . Penyiapan larutan standar baku
cyanocobalamin yaitu  dengan  cara  larutan standar  induk  dipipet  4  ml  dimasukkan  ke dalam labu ukur cokelat 100 ml, dilarutkan dan  diencerkan  dengan  akuades  hingga tanda  batas,  kemudian  dikocok  hingga homogen  dan  diukur  pada  λ  maksimum 361  nm  dengan  spektrofotometer  UV  – VIS,  dan  digunakan  air  sebagai  blanko.
Penyiapan larutan standar sampel cyanocobalamin yaitu  dengan  cara  larutan standar  induk  dipipet  10  ml,  dimasukkan ke  dalam  labu  ukur  cokelat  100  ml, dilarutkan dan diencerkan dengan HCl 0,1 N  hingga  tanda  batas,  kemudian  dikocok hingga  homogen.  Larutan  tersebut  dipipet tepat  60  ml,  dilewatkan  melalui  kolom yang  dikemas  dengan  resin  penukar  ion bersifat basa kuat, dibawah kolom ditempatkan  labu  ukur  100  ml  berwarna cokelat  sebagai  penampung.  Setelah  itu kolom  dibilas  tiga  kali  setiap  kali  dengan 10 ml HCl 0,1 N digabungkan bilasan dan ditambahkan  HCl  0,1  N  hingga  100  ml kemudian  dikocok  hingga  homogen  dan diukur  pada  λ  maksimum  550  nm  dengan spektrofotometer UV – VIS dan digunakan HCl 0,1 N sebagai blanko.
4. Penyiapan Larutan Sampel a. Parameter Akurasi, Presisi (Kedapatulangan Metode), Presisi Antara, dan Rentang
Lima belas buah tabung centrifuge ukuran  50  ml  disiapkan  dan  diberi identitas.  Matriks  tablet  masing-masing ditimbang  ±  7,59  gram  (setara  dengan  20 tablet)  lalu  dimasukkan  ke  dalam  setiap tabung centrifuge beserta  larutan stock untuk  masing-masing  konsentrasi  secara kuantitatif ke dalam setiap tabung centrifuge sesuai  dengan  ketentuan  pada Tabel  1  dan  penyiapan  larutan stock ini dapat  dilihat  pada  bagian  penyiapan larutan stock  cyanocobalamin .  Setiap tabung centrifuge ditambahkan  30  ml  HCl 0,1  N  dikocok  selama  10  menit  dengan shaker ,  dipisahkan  dengan centrifuge ,  dan diambil  cairan  supernatan  dimasukkan  ke dalam  labu  ukur  cokelat  100  ml.  Endapan yang  berada  di  dalam centrifuge diekstrak lagi  dengan  3  x  20  ml  HCl  0,1  N  dan cairan  supernatan  kembali  dimasukkan  ke dalam  labu  ukur  cokelat  100  ml  lalu ditambahkan HCl 0,1 N sampai tanda batas 100 ml kemudian dikocok hingga homogen.  Cairan  supernatan  ini  disaring lalu  dipipet  60  ml  dan  dimasukkan  ke dalam kolom kromatografi. Hasik kromatografi  ditampung  ke  dalam  labu ukur  cokelat  100  ml,  kemudian  kolom dicuci dengan 10 ml HCl 0,1 N sebanyak 3 kali  dan  ditampung  dalam  labu  ukur  yang sama. Volume labu ukur diimpitkan hingga 100 ml dengan HCl 0,1 N, dikocok hingga homogen,  diukur  pada  λ  maksimum  550 nm  dengan  spektrofotometer  UV  –  VIS, dan  digunakan  HCl  0,1  N  sebagai  blanko. Khusus  untuk  pengujian  presisi  antara hanya  dilakukan  pada  konsentrasi  100  % yang  diulang  sebanyak  3  kali  dan dikerjakan oleh orang yang berbeda.
b. Parameter Linieritas
Lima  buah  labu  ukur  cokelat ukuran 100 ml disiapkan, diberi tanda pada labu  untuk  setiap  variasi  konsentrasi,  dan ditambahkan larutan stock D sesuai dengan konsentrasi  yang  ada  pada  Tabel  2. Penyiapan  larutan stock D  dapat  dilihat pada  bagian  penyiapan  larutan stock
cyanocobalamin . Setiap labu ukur diencerkan dengan HCl 0,1 N hingga tanda batas,  kemudian  dikocok  hingga  homogen
dan  diukur  pada  λ  maksimum  550  nm dengan  spektrofotometer  UV  –  VIS  dan digunakan  HCl  0,1  N  sebagai  blanko.
Tabel 1. Penambahan Larutan Stock pada Sampel Akurasi dan Pesisi Identitas Sampel Variasi Konsentrasi (% terhadap konsentrasi sampel b/v) Ulangan Larutan Stock A (ml) Larutan Stock B (ml) Larutan Stock C (ml) SK 1-1 80 1 - 4 - SK 1-2 80 2 - 4 - SK 1-3 80 3 - 4 - SK 2-1 90 1 - - 10 SK 2-2 90 2 - - 10 SK 2-3 90 3 - - 10 SK 3-1 100 1 - 5 - SK 3-2 100 2 - 5 - SK 3-3 100 3 - 5 - SK 4-1 110 1 10 - - SK 4-2 110 2 10 - - SK 4-3 110 3 10 - - SK 5-1 120 1 - 6 - SK 5-2 120 2 - 6 - SK 5-3 120 3 - 6 - Tabel 2. Penambahan Larutan Stock pada Sampel Linieritas Identitas Sampel Variasi Konsentrasi (% terhadap konsentrasi sampel b/v) Larutan Stock D (ml) SL-1 50 2 SL-2 75 3 SL-3 100 4 SL-4 125 5 SL-5 150 6
...........................................………………………
a. Parameter Spesifisitas Pengujian spesifisitas sama dengan
pengujian  akurasi,  presisi  (kedapatulangan metode) dan rentang tetapi tanpa
penambahan  larutan stock dan  hanya menggunakan matriks tablet.
b. Parameter Ketegaran
Sampel SK 3-1, SK 3-2, dan SK 3- 3  yang  digunakan  untuk  pengujian parameter  akurasi,  presisi (kedapatulangan metode),  dan  rentang  disimpan  pada  suhu 15  ºC  selama  24  jam.  Kemudian  diukur absorbansi  sampel  pada  λ  maksimum  550 nm  dengan  spektrofotometer  UV-VIS menggunakan  larutan  standar  yang  baru yang  disiapkan  seperti  pada  penyiapan larutan standar untuk sampel, dan digunakan HCl 0,1 N sebagai blanko. 5. Penyiapan Larutan Stock Cyanocobalamin a. Larutan Stock A Cyanocobalamin yang telah
dikeringkan  selama  ±  2  jam  pada  suhu 105ºC ditimbang ± 110 mg, dimasukkan ke dalam labu ukur cokelat 100 ml, dilarutkan dan  diencerkan  dengan  HCl  0,1  N  hingga tanda  batas,  kemudian  dikocok  hingga homogen.
b. Larutan Stock B
Cyanocobalamin yang telah
dikeringkan  selama  ±  2  jam  pada  suhu 105ºC ditimbang ± 200 mg, dimasukkan ke dalam labu ukur cokelat 100 ml, dilarutkan dan  diencerkan  dengan  HCl  0,1  N  hingga tanda  batas,  kemudian  dikocok  hingga homogen.
c. Larutan Stock C Cyanocobalamin yang telah dikeringkan  selama  ±  2  jam  pada  suhu
105ºC ditimbang ± 90 mg, dimasukkan ke dalam labu ukur cokelat 100 ml, dilarutkan dan  diencerkan  dengan  HCl  0,1  N  hingga
tanda  batas,  kemudian  dikocok  hingga homogen.
d. Larutan Stock D Cyanocobalamin yang telah dikeringkan  selama  ±  2  jam  pada  suhu 105ºC ditimbang ± 150 mg, dimasukkan ke dalam labu ukur cokelat 100 ml, dilarutkan dan  diencerkan  dengan  HCl  0,1  N  hingga tanda  batas,  kemudian  dikocok  hingga homogen.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Linieritas
Menurut  International  Conference Harmonization Guidelines (1994), linieritas  merupakan  kemampuan  metode analisis  yang  memberikan  respon  secara langsung terhadap konsentrasi analit dalam contoh.  Linieritas  atau  kecenderungan korelasi  antara  dua  variable  biasanya dinyatakan  dalam  koefisien  korelasi  (r). Hasil  analisis  didapatkan  harga  r  =  0,999 dimana sesuai dengan persyaratan
penerimaan  r  dalam  sediaan  obat  yaitu  > 0,98.  Hal  ini  menandakan  sampel  yang dianalisis  stabil  dan  homogen.  Hasil linieritas cyanocobalamin dapat  dilihat pada  Tabel  3  dan  kurva  hasil  uji  linieritas cyanocobalamin dapat dilihat pada Gambar 1.

## B. Presisi
Menurut  Harmita  (2004),  pengujian presisi  kedapatulangan  metode  dilakukan sebanyak  15  kali  pengukuran  kadar. Memenuhi  persyaratan  penerimaan  jika simpangan  baku  relatif  (SBR)  ≤  2%.
Berdasarkan uji presisi untuk kedapatulangan  metode  diperoleh  hasil SBR  yang  memenuhi  persyaratan  yaitu 80%  =  0,30%,  90%  =  0,38%,  100%  =
0,33%, 110%= 0,26% dan 120% = 0,25%. Hasil presisi untuk kedapatulangan metode cyanocobalamin dapat dilihat pada Tabel 4 dan  diagram  presisi  untuk  kedapatulangan metode cyanocobalamin dapat dilihat pada Gambar 2.
C. Presisi Antara Menurut  International  Conference Harmonization Guidelines (1994), pengujian presisi antara dilakukan tiga kali ulangan oleh orang yang berbeda dan pada waktu  yang  berbeda  pula.  Memenuhi persyaratan  penerimaan  jika  SBR  ≤  2%. Berdasarkan  uji  presisi  antara  yang dilakukan terhadap cyanocobalamin
diperoleh  SBR  yang  kurang  dari  2  yaitu 0,00%  hasil  ini  memenuhi  persyaratan. Hasil  presisi  antara cyanocobalamin dapat dilihat  pada  Tabel  5  dan  diagram  presisi antara cyanocobalamin dapat  dilihat  pada Gambar 3.
Tabel 3. Hasil Linieritas Cyanocobalamin No. Konsentrasi Teoritis (% terhadap konsentrasi sampel b/v) Bobot Sampel Aktual (mg) Absorban Sampel Rata – Rata Konsentrasi Terkoreksi (% terhadap konsentrasi sampel b/v) R 1. 50 0,07508
0,1855 50,05
0,999 2. 75 0,272 75,08 3. 100 0,362 100,11 4. 125 0,449 125,13 5. 150 0,544 150,16
Gambar 1. Kurva Linieritas Cyanocobalamin
y = 0,0036x + 0,0049 R² = 0,9997 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 20 40 60
80
100 120 140 160 Absor ba n Konsentrasi Cyanocobalamin
(% terhadap konsentrasi sampel b/v)

## Tabel 4. Hasil Presisi untuk Kedapatulangan Metode
Cyanocobalamin Kode Sampel Konsentrasi Teoritis (% terhadap konsentrasi sampel b/v) Bobot Sampel Aktual (mg) Absorban Sampel Rata – Rata Bobot Standar Aktual (mg) Absorban Standar Rata – Rata Konsentrasi Aktual (% terhadap konsentrasi sampel b/v) SBR (%) 1-1 80 200,16 0,2855 50,00 0,361 79,17 0,30 1-2 80 0,284 78,76 1-3 80 0,2855 79,17 2-1 90 90,24 0,305 50,22 0,34375 89,36 0,38 2-2 90 0,305 89,36 2-3 90 0,307 89,95 3-1 100 200,01 0,349 50,03 0,35225 98,85 0,33 3-2 100 0,347 98,28 3-3 100 0,349 98,85 4-1 110 110,09 0,385 50,02 0,35375 108,56 0,26 4-2 110 0,387 109,12 4-3 110 0,386 108,84 5-1 120 200,24 0,4225 50,06 0,356 118,17 0,25 5-2 120 0,424 118,59 5-3 120 0,422 118,03
Gambar 2. Diagram Hasil Uji Presisi untuk Kedapatulangan Metode Cyanocobalamin
0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Konse ntra si C yanoc obalamin (%) Replikasi tiap konsentrasi Konsentrasi Teoritis Konsentrasi Aktual
Tabel 5. Hasil Presisi Antara Cyanocobalamin
Kode Sampel Konsentrasi Teoritis (% terhadap konsentrasi sampel b/v) Bobot Sampel Aktual (mg) Absorban Sampel Rata – Rata Bobot Standar Aktual (mg) Absorban Standar Rata – Rata Konsentrasi Aktual (% terhadap konsentrasi sampel b/v) SBR (%) 3-4 100 200,95 0,348 50,50 0,3525 99,16 0,00 3-5 100 0,348 99,16 3-6 100 0,348 99,16
A. Akurasi Menurut  Firdaus  (2004),  akurasi merupakan  ukuran  ketepatan  hasil  analisis dengan  kadar  analit  yang  sebenarnya. Akurasi sering dinyatakan sebagai perolehan  kembali  atau recovery .  Uji akurasi menunjukkan ketepatan antara nilai yang dihasilkan pada saat penetapan kadar cyanocobalamin dengan  nilai  sebenarnya. Hasil  perolehan  kembali  ( recovery )  yang didapat dari hasil analisis adalah 98,12%  - 99,44%  dengan  demikian  akurasi  hasil analisis  yang  didapatkan  telah  memenuhi persyaratan  yaitu  98%  -  102%.  Hasil akurasi cyanocobalamin dapat dilihat pada Tabel 6 dan diagram akurasi cyanocobalamin dapat dilihat pada Gambar 4. B. Ketegaran Menurut Harmita (2004), ketegaran  merupakan  kapasitas  suatu
prosedur  analitik  untuk  tidak  terpengaruh oleh variasi kecil dalam parameter metode yang akan memberikan indikasi kehandalan prosedur analitik selama aplikasi yang normal. Parameter yang diuji pada  validasi  metode  ketegaran  bisa berupa  pengaruh  waktu  penyimpanan. Memenuhi  persyaratan  penerimaan  jika SBR  ≤  2%  dan  % recovery 98%  -  102%. Berdasarkan  uji  ketegaran  yang  dilakukan pada  konsentrasi  100%    sebanyak  3  kali diperoleh  SBR  yang  kurang  dari  2%  yaitu 0,00%  dan  hasil  perolehan  kembali ( recovery )  yaitu  98,24%  dengan  demikian hasil  analisis  yang  didapatkan  telah memenuhi  persyaratan  SBR  dan recovery . Hal  ini  menandakan  kestabilan  sampel yang  telah  didiamkan  selama  24  jam  di dalam  lemari  pendingin  bersuhu  sekitar
15ºC.  Hasil  ketegaran cyanocobalamin dapat  dilihat  pada  Tabel  7  dan  diagram ketegaran cyanocobalamin dapat  dilihat pada Gambar 5.
Gambar 3. Diagram Hasil Uji Presisi Antara Cyanocobalamin 98,5 99 99,5 100 1 2 3 100 100 100 99,16
99,16 99,16
K o n se n tra si Cya n o co b a la min (% terh ad ap k o n se n tras i sa m p el b /v )
Replikasi konsentrasi
Konsentrasi Teoritis
Konsentrasi Aktual
...........................................…………………………

## Tabel 6. Hasil Akurasi Cyanocobalamin
Kode Sampel
Konsen trasi Teoritis (% terhadap konsen trasi sampel b/v) Bobot Sampel Aktual (mg) Absor ban Sampel Rata – Rata Bobot Stan dar Aktua l (mg) Absor ban Standar Rata – Rata Konsen trasi Aktual (% terhadap konsen trasi sampel b/v) Reco very (%) 1-1 80 200,16 0,2855 50,00 0,361 79,17 98,92 1-2 80 0,284 78,76 98,41 1-3 80 0,2855 79,17 98,92 2-1 90 90,24 0,305 50,22 0,34375 89,36 98,79 2-2 90 0,305 89,36 98,79 2-3 90 0,307 89,95 99,44 3-1 100 200,01 0,349 50,03 0,35225 98,85 98,85 3-2 100 0,347 98,28 98,28 3-3 100 0,349 98,85 98,85 4-1 110 110,09 0,385 50,02 0,35375 108,56 98,42 4-2 110 0,387 109,12 98,92 4-3 110 0,386 108,84 98,67 5-1 120 200,24 0,4225 50,06 0,356 118,17 98,24 5-2 120 0,424 118,59 98,59 5-3 120 0,422 118,03 98,12
Gambar 4. Diagram Hasil Uji Akurasi Cyanocobalamin
0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Ko n sen tr asi
C ya n o co b a la min (% ter h ad ap k o n sen tr asi sam p el b /v )
Replikasi tiap konsentrasi
Konsentrasi Teoritis Konsentrasi Aktual
Tabel 7. Hasil Ketegaran Cyanocobalamin Kode Sam pel Konsen trasi Teoritis (% terhadap konsen trasi sampel b/v) Bobot Sampel Aktual (mg) Absorb an Sampel Rata – Rata Bobot Standar Aktual (mg) Absorb an Standar Rata – Rata Konsen trasi Aktual (% terhadap konsentra si sampel b/v) SBR (%) Recove ry (%) 3-1 100 200,01 0,354 50,00 0,361 98,24 0,00 98,24 3-2 100 0,354 98,24 98,24 3-3 100 0,354 98,24 98,24
Gambar 5. Diagram Hasil Uji Ketegaran Cyanocobalamin
F. Ketegaran Dilakukan juga pengukuran puncak untuk larutan matriks tablet dengan spektrofotometer visibel double beam yang bertujuan  untuk  menunjukkan  bahwa  pada panjang  gelombang  maksimum  550  nm dari sampel sediaan tablet cyanocobalamin matriks  tablet  tidak  memberikan  serapan yang berarti.
G. Rentang
Berdasarkan  hasil  analisis  dari parameter presisi dan akurasi pada rentang konsentrasi  yang  dipersyaratkan,  dimana
% recovery dan  simpangan  baku  relatif memenuhi kriteria penerimaan, maka dapat disimpulkan untuk parameter rentang pada validasi metode penetapan kadar cyanocobalamin ini juga memenuhi kriteria penerimaan yang disyaratkan.

## KESIMPULAN
1. Metode penetapan kadar cyanocobalamin dinyatakan valid.
2. Hasil  parameter  ketegaran  didapatkan hasil  yang  stabil  untuk  penyimpanan larutan  sampel  selama  24  jam  pada lemari pendingin bersuhu 15ºC.
97 98 99 100 1 2 3 100 100 100 98,24
98,24 98,24
Ko n se n tras i Cy a n o co b a la min (% terh ad ap k o n se n tras i sa m p el b /v )
Replikasi konsentrasi
Konsentrasi Teoritis
Konsentrasi Aktual
DAFTAR PUSTAKA Departemen Kesehatan Republik Indonesia.    1995. Farmacope Indonesia .  Edisi IV. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta. Firdaus,  D.  R.  2004. Validasi    Metode
Analisis    C-14      Menggunakan Teknologi  Preparasi  Tangkapan Gas  CO 2 Dalam  Sistem  Loop . Skripsi . Universitas Nusa Bangsa. Bogor. Harmita.  2004.  Validasi  Metode  Analisis. Majalah Ilmu Kefarmasian . Volume I, Nomor 3. Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia. Jakarta. International  Conference  Harmonization Guidelines.  1994. Validation  of Analytical  Methods  :  Definitions and  Terminology .  International Conference Harmonization Guidelines. Nalco  Chemical  Company.  2006. Resin
Rinse,  Productivity  Management for Ion Exchange. USA.
The Committee on JP. 2006. The Japanese Pharmacopoeia .  Edisi  XV.  The Committee on JP. Jepang.