Hasil Penelitian                                                Jurnal. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XVII  No. 2 Th. 2006

## SENYAWA BIOAKTIF RIMPANG JAHE
(Zingiber officinale Roscue ) MENINGKATKAN RESPON SITOLITIK SEL NK TERHADAP SEL KANKER DARAH K-562 IN VITRO
[Ginger Root Bioactive Compounds Increased Cytolitic Response of Natural Killer (NK) Cells Against Leucemic Cell Line K-562 In Vitro ]
Tejasari 1) , dan Fransiska Rungkat Zakaria 2)
1) Staf Pengajar Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Universitas Jember 2) Staf   Pengajar  Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB
Diterima  22 Februari 2006  / Disetujui 13 November  2006

## ABSTRACT
Natural killer (NK) cell, a kind of lymphocyte cells, plays an important role in attacking infectious, immature, and cancer cell. Its function  could  be  modulated  by  food  bioactive  compounds.  This  experiment  was  conducted  to  investigate  the  effects  of  ginger  root bioactive compounds such as oleoresin, gingerol, and shogaol on cytolitic response of NK cell in vitro. Lymphocyte cells were isolated by centrifugation on ficoll-hypaque density (1,77  0,001 g/ml) method. Leukemic cells line K-562 as target cells(TC) labelled by [ 3 H]-timidin, together with lymphocyte as effector cell (EC) were cultured in two ratio levels of EC : TC equal to 1:50  and  1:100), and two culture conditions,  for  4  hours,  respectively.  Paraquate  dichloride  (1,1-dimethyl-4,4-bipyridilium  dichloride)  3  mM  was  used  to  induce    stress oxidative circumstance. Cytolytic capacity of NK cells was determined by percentage of TC lysed by NK cells, in normal and oxidative stress conditions.
Statistical analysis showed that the effects of ginger bioactive compounds on cytolytic response of NK cell depended on the culture conditions, as shown by cultures in the presence of oleoresin, and gingerol, but not  shogaol. In the  lymphocyte culture without stress oxidative, oleoresin, gingerol and shogaol compounds increased significantly cytolytic response of NK cells cultured at a ratio of TC : EC  equal to 1:50, with the highest increament of 65 % at oleoresin concentration of 50  g/ml. However, in culture at a ratio of  TC  : EC equals  to  1:100,  only  oleoresin  at  a  concentration  of  50  g/ml  increased  significantly  cytolytic  response  of  NK  cells  with  the  highest increament of 8 %.   Shogaol did not affect significantly NK cells cytolytic response.
Under stress oxidative conditions, shogaol increased significantly cytolytic response of NK cells cultured at a ratio of TC:EC equal to 1:50, but  the highest increament of 56 % , was by  oleoresin  at concentration of 50  g/ml. Meanwhile, oleoresin and gingerol  did not increased significantly cytolytic response of NK cells.  At a culture-  ratio of TC: EC equal to 1:100, gingerol increased significantly cytolytic response of NK cells of 21 % at a concentration of 50  g/ml. However, oleoresin did not increased significantly cytolytic response of NK cells.   In contrast, shogaol decreased significantly cytolytic response of NK cell with the highest decreament of 16 % at 200  g/ml. These findings verified that ginger root bioactive compounds increased cytolityc response of NK cells in destroying cancer cells, at certain conditions and concentrations, especially at low concentrations.
Key  words :  ginger  bioactive  compound,  oleoresin,  gingerol,  shogaol,  stress  oxidative,      effector  cell,    target  cell,  natural  killer  cell, cytolytic response

## PENDAHULUAN
Paradigma  baru  menilai  fungsi  pangan  tidak hanya  sebagai  penyedia  zat  gizi  bagi  tubuh,  dan pemenuhan  selera  karena  rasa  dan  aromanya. Sekarang, makin berkembang pemikiran bahwa pangan mengandung zat aktif yang berkemampuan memodulasi proses  fisiologis  dan  biokimiawi  tubuh,  termasuk  sistem pertahanan  tubuh.    Zat  tersebut,  jika  masuk  ke  dalam tubuh atau sistem hayati lainnya dapat mengubah proses fisiologis  dan  biokimiawi,  sehingga  berpengaruh terhadap  kesehatan.  Prinsip  kerangka  pikir  tersebut adalah menilai makanan dan minuman tidak hanya dari rasa,  aroma  dan  nilai  gizi,  namun  lebih  pada  senyawa aktif  pangan  yang  berfungsi  dalam  pencegahan, peningkatan, bahkan pengobatan dan rehabilitasi.
Pangan  kelompok  rempah  yang  biasanya digunakan  sebagai  bumbu  dan  jamu  telah  banyak dirasakan  khasiat-sehatnya  secara  empiris  oleh masyarakat. Antara lain, rimpang jahe ( Zingiber officinale Roscoe), secara tradisional dikenal sebagai obat masuk angin,  obat  gosok,  penghangat  tubuh,  dan  untuk meningkatkan nafsu makan.  Khasiat jahe  secara ilmiah telah  dibuktikan,  antara  lain  sebagai  antimikroba, antiseptik,  mengurangi  keluhan  akibat  influenza, memperkuat lambung, memperbaiki pencernaan (Lucas, 1979; Keys, 1981; Lienni, 1991; Paimin dan Murhananto, 1991;  Tang  dan  Einsenbrand,  1992),    mengurangi flatulensi  dan  kolik  (Farrel,  1985),  merangsang pernafasan  dan  jantung  (Rismunandar,  1988),  dan meningkatkan kesuburan wanita (Sastroamidjojo, 1988). Selain  itu,    rimpang  jahe  telah  dibuktikan  berfungsi
sebagai analgesik dan dalam proses antiinflamasi karena berkaitan  dengan    efek  penghambatan  biosintesis prostaglandin (Subarnas dan Sidik, 1997).
Khasiat  jahe  tersebut  ditimbulkan  oleh kandungan  senyawa  bioaktif  jahe  (Tang  dan Einsenbrand,  1992).    Senyawa  fenolik  gingerol  dan zingeron  memiliki  sifat  sporostatik  terhadap Bacillus subtilis pada  konsentrasi  0,6  %  (Al-Khayat  dan  Blank,
1985).  Gingerol  dan  shogaol  berfungsi  sebagai antihepatotoksik  terhadap  tetraklorida  (CCl 4 )  dan galaktosamin penyebab sitotoksik pada hati tikus (Hikino et  al.,  1985).    Senyawa  (6)-gingerol,  (8)-gingerol  dan (10)-gingerol  dapat  mengurangi  aktivitas  kardiotonik (Shoji  et  al.,  1982).    Sementara  senyawa  (6)-shogaol lebih  efektif  daripada  (6)-gingerol  dalam  menekan kontraksi  usus,  dan  bersifat  antitusif  (Suekawa  et  al., 1984). Pada sistem in vitro ,  senyawa oleoresin, gingerol, dan  shogaol  meningkatkan  proliferasi  sel  limfosit  B  dan sel T (Tejasari, et al., 2002).
Pada  akhir  abad  ke-19,  secara in  vitro dan in vivo , dibuktikan bahwa ekstrak jahe memberi efek positif terhadap respons proliferatif dan sitolitik limfosit.  Selain itu,  ekstrak  etanol  jahe  segar  secara in  vitro meningkatkan  proliferasi  splenosit  dan  menurunkan tingkat kematian sel (Zakaria et al., 1996).  Kemampuan sel Natural Killer (NK) dalam  melisis  alur  sel  kanker ( cell  line )  sel  target  YAC-1  meningkat    pada    mencit yang  diberi  ekstrak  air  jahe  (Prangdimurti,  1999). Aktivitas sitolitik sel NK meningkat (Zakaria  et al.,  1999) pada  subjek  manusia  yang  mengkonsumsi  jahe  selama satu  bulan.  Studi  pada  subjek  manusia  menjelaskan bahwa  konsumsi sari jahe selama 30 hari meningkatkan aktivitas sitolitik sel NK (Nurrahman, 1998; Zakaria et al., 2003).
Tujuan  umum  studi  ini  ialah  untuk  mengetahui pengaruh  zat  aktif  dalam  senyawa  oleoresin  jahe terhadap  fungsi  sel  NK.  Tujuan  khusus  telaah  ini  untuk menentukan  jenis  zat  bioaktif  dalam  senyawa  oleoresin jahe  yang  meningkatkan  respons  sitolitik  sel  NK  dalam melisis  sel  kanker  darah  K-562  secara in  vitro .    Lebih lanjut,  percobaan  ini  bertujuan  untuk  menentukan hubungan  antara  zat  bioaktif  dalam  senyawa  oleoresin jahe dan respons sitolitik sel NK dalam melisis sel kanker darah pada sistem in vitro .

## METODOLOGI
Bahan dan alat Bahan  baku  yang  digunakan  pada  studi  ini adalah  rimpang  jahe  gajah  ( Zingiber  officinale Roscoe) umur  11  bulan,  yang  berasal  dari  Bogor.    Bahan  kimia dari  Sigma-USA,  yaitu  paraquat  atau  1,1’-dimethyl-4,4’- bipyridylium dichloride (M-2254), larutan ficoll hypaque ( 1077-1),  media  RPMI  1640  (R-7755),  gentamisin  (G- 1522),  L-glutamin  (G-  2150),  [ 3 H]-timidin  (32,222-9), mitogen  lipopolisakarida  atau  LPS  (L-6143)  dan fitohemaglutinin  atau  PHA  (L-9132), larutan  sintilasi,
triton  X-100  (T-8787),  dan phosphate  buffered  saline atau PBS  (P-3813).    Pelarut  murni  dari  E-Merck  yaitu etanol,  heksan,  dietileter,  aseton  dan  butanol,  asam sulfosalisilat,  pereaksi folin  denis ,  asam  tanat, folin ciaocalcateu , dan gas nitrogen. Bahan biologis, yaitu sel limfosit  dari  subyek  manusia  dan  serum  AB  dari sukarelawan,  sedangkan  sel  target  K-562  ( erythro leukemic  cell  line )  dari  Laboratorium    Imunologi  U.S. NAMRU-2, Jakarta. Peralatan yang digunakan untuk analisis kimia dan fraksinasi komponen oleoresin rimpang jahe meliputi freeze  dryer ,  peralatan soxhlet , shaker ,  alat  sentrifus (IEC  Centra-CLD),  lempeng  kromatografi  lapis  tipis  GF 254  dengan  tebal  0,2  mm  (E-Merck),  wadah pengembang, rotary  evaporator (Buchi  461)  dan  alat- alat gelas. Alat untuk analisis kultur sel meliputi repeater pipet , laminar flow (lab.gard Class II, Type A/B2, model NU-407-600),  inkubator  (  CO 2 water-jacketed  incubator , model  NU-2700E),  alat  sentrifusi  (Beckman  GS-6,  GH- 3.8  Horizontal  Rotor),  hemasitometer  (Neubauer), mikroskop  fluoresens  (Nicon,  Optihot-2),  mikroskop inverted (Diaphot-200),  alat  panen  sel  (model  200A Cambridge  Technology  Inc.), ß -counter (Beckman). Peralatan  habis  pakai  yaitu  :  lempeng  mikrotiter  96 sumur (Thomas Co. Labware), pipet, pipet mikro, tabung reaksi  15  ml  dan  50  ml,    tabung falcon  5  ml ,  tabung venoject ,  alat  suntik  dengan  jarum  butterfly  No.  23, membran  filter  1 µ m  (Gelman  sciences), acrodish 0,22 µ m (Millipore) dan lempeng piko (Packard TOP picoplate Scintillation ).

## Metode penelitian

## Rancangan penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  laboratorium ( Pure  Experiment )  dan  terdiri  atas  3  tahap  percobaan utama,  yaitu  1)  analisis  kimia  komponen  rimpang  jahe segar  dan  fraksinasi  komponen  oleoresin  rimpang  jahe, 2)  uji  efek  dosis  toksik  parakuat  untuk  induksi  kondisi stres  oksidatif,  dan  3)  uji  efek  komponen  oleoresin rimpang jahe terhadap respons sitolitik sel Natural Killer (NK), yang dibiakkan dalam kondisi normal, dan kondisi stres  oksidatif  secara  terpisah.    Percobaan  tahap  1 dilakukan  di  Laboratorium  Kimia  Pangan  PAU  Pangan dan Gizi IPB, sedangkan tahap 2, dan 3,  yang meliputi kultur sel dilakukan di laboratorium Virologi, Pusat Studi Satwa  Primata  IPB  (PSSP-IPB)  Bogor.    Panen  sel  NK dilakukan  di  Laboratorium  Biokimia  Departemen  TPG- IPB,  sementara  pembacaan  sel  NK  dilakukan  di Laboratorium  Imunologi  U.S.  NAMRU-2  ( United  States, Naval Medical Research Unit–2 ) di Jakarta.

## Rancangan percobaan
Percobaan in  vitro (tahap  2-3)  untuk mempelajari  pengaruh  penambahan  senyawa  oleoresin (OL),  gingerol  (GR)  dan  shogaol  (SH)  terhadap  limfosit manusia  dilakukan  secara  terpisah.    Setiap  senyawa
oleoresin  atau  komponennya  dicobakan  pada  empat taraf konsentrasi, yaitu 50, 100, 150 dan 200  g/ml, dan ditambah satu kontrol (KTR).   Berbagai taraf konsentrasi ini  dicobakan  dalam  dua  keadaan  kultur,    yaitu    tanpa stres  oksidatif  (tanpa  penambahan  paraquat  atau  PQ) dan  dengan  stres  oksidatif  (dengan  penambahan  PQ), sehingga  terdapat  delapan  kombinasi  perlakuan,  dan kontrol.    Setiap  kombinasi  perlakuan  ini  selanjutnya diulang sebanyak tiga kali.
Penambahan  senyawa  oleoresin,  zat  aktif gingerol  dan  shogaol  secara  terpisah  dilakukan  secara acak  sesuai  kombinasi  perlakuan  dan  kontrol.    Oleh karena  itu,  percobaan  dirancang  sebagai  rancangan acak  lengkap  dengan  perlakuan  faktorial.  Pengacakan perlakuan  pada  percobaan  biologis  pada  kondisi homogen dan terkontrol dimaksudkan untuk menghindari bias  sistematis  (Haaland,  1989).    Secara  skematis, rancangan percobaan ditunjukkan  pada Tabel  1.

## Analisis kadar total fenol  ekstrak jahe
Pereaksi folin denis dibuat dari  campuran 100 g Na 2 WO 4 .2H 2 O, 20 g asam fosfomolibdat, 50 ml H 3 PO 4 dan 750 ml akuades.  Campuran direfluks selama 1 jam dan  setelah  dingin  ditepatkan  volumenya  menjadi  satu liter dengan akuades. Larutan standar asam tanat dibuat dengan seri konsentrasi sebagai berikut : 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6,  7,  8  dan  9  mg/ml  dengan  penambahan  akuades. Campuran 75 ml akuades,  5 ml pereaksi folin denis dan 10 ml larutan Na 2 CO 3 14%  ditambahkan ke dalam labu takar  yang  berisi  0,1  ml  ekstrak  jahe,  lalu    ditepatkan menjadi  100  ml  dengan  akuades.    Setelah  dikocok selama satu menit, dan didiamkan selama 30 menit pada suhu  ruang,  lalu  dibaca  absorbansinya  pada  panjang gelombang (  )  760 nm.
Tabel 1.  Rancangan percobaan pengaruh zat bioaktif jahe terhadap fungsi sel NK
Tanpa stres oksidatif
Dengan stres oksidatif
1. Perlakuan senyawa oleoresin (OL) OL 50-1 OL 50-2 OL 50-3 OL 50-1 PQ OL 50-2 PQ OL 50-3 PQ OL 100-1 OL 100-2 OL 100-3 OL 100-1 PQ OL 100-2 PQ OL 100-3 PQ OL 150-1 OL 150-2 OL 150-3
OL 150-1 PQ OL 150-2 PQ OL 150-3 PQ OL 200-1
OL 200-2 OL 200-3
OL 200-1 PQ OL 200-2 PQ OL 200-3 PQ

## 2. Perlakuan komponen gingerol (GR)
GR 50-1 GR 50-2
GR 50-3 GR 50-1 PQ GR 50-2 PQ GR 50-3 PQ GR 100-1
GR 100-2 GR 100-3 GR 100-1 PQ GR 100-2 PQ GR 100-3 PQ GR 150-1
GR 150-2 GR 150-3 GR 150-1 PQ GR
150-2 PQ GR 150-3 PQ GR 200-1
GR 200-2 GR 200-3 GR 200-1 PQ GR
200-2 PQ GR 200-3 PQ
3.   Perlakuan komponen shogaol (SH)
SH 50-1 SH 50-2
SH 50-3 SH 50-1 PQ SH 50-2 PQ SH 50-3 PQ SH 100-1 SH 100-2 SH 100-3 SH 100-1 PQ SH 100-2 PQ SH 100-3 PQ SH 150-1 SH 150-2 SH 150-3 SH 150-1 PQ SH 150-2 PQ SH 150-3 PQ SH 200-1 SH 200-2 SH 200-3 SH 200-1 PQ SH 200-2 PQ SH 200-3 PQ

## Analisis    kimia  komponen  rimpang  jahe  gajah segar

## Persiapan ekstrak air jahe  dan tepung jahe
Sejumlah  50  gram  irisan  jahe  segar dihancurkan  dengan  500  ml  akuades  dalam  blender. Hancuran  jahe  dipanaskan  pada  suhu  50 o C  di  dalam penangas  air  selama  30  menit.    Filtrat  yang  diperoleh dari  penyaringan  kasar  melalui  kertas  saring  Whatman no.  42  didiamkan  selama  satu  jam.    Bagian  bening diambil  dan  disentrifus  dengan  kecepatan    3000  rpm selama  20  menit.    Ekstrak  air  jahe  diperoleh  melalui penyaringan supernatan dengan kertas Whatman no. 42. Tepung  jahe  diperoleh  dari  penghancuran  irisan  jahe kering  beku  dengan  kadar  air  lebih  kecil  dari  5  persen dan penyaringan ukuran 60 mesh.
Analisis  kadar    senyawa  oleoresin    dan  fraksinasi komponen oleoresin jahe
Sejumlah  20  gram  tepung  jahe  dibungkus dengan  kertas  saring  biasa  dan  direndam  dengan    300 ml etanol pada alat  soxhlet lalu dipanaskan pada suhu 70 o C,  selama  4-8  jam.    Ekstrak  etanol  jahe  yang diperoleh  berisi  senyawa  oleoresin.  Senyawa  oleoresin diperoleh setelah pelarut etanol diuapkan dengan rotary evaporator . Analisis kualitatif : lempeng GF-254 yang telah diaktifkan dengan pemanasan pada suhu 110 o C selama 4 jam  diberi spot ekstrak  yang berisi senyawa oleoresin dimulai  pada  garis  batas  lalu  dimasukkan  ke  dalam wadah  pengembang  yang  telah  jenuh  dengan  eluen heksan  dan  dietileter  dengan  rasio  3  :  7,  dan  dibiarkan perambatan  eluen  sampai  batas  akhir.    Plat  tersebut dikeluarkan  dari  wadah  pengembang,  dan  terlihat  fraksi yang terpisah satu sama lainnya karena memiliki nilai rf
Hasil Penelitian                                                Jurnal. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XVII  No. 2 Th. 2006
( Retardation    Factor )  yang  berbeda.  Nilai  rf  merupakan rasio jarak yang ditempuh oleh zat yang larut (spot awal sampai  posisi  fraksi  yang  bersangkutan)  terhadap  jarak yang  ditempuh  oleh  eluen  (spot  awal  sampai  batas akhir).    Penyemprotan  dengan  larutan folin  ciaocalteu dilakukan untuk pembenaran  fraksi 1 sebagai gingerol, dan fraksi 2 sebagai shogaol.
Analisis  kuantitatif :  prosedur  untuk  analisis kuantitatif  sama  dengan  analisis  kualitatif,  hanya konsentrasi  ekstrak  etanol  lebih  tinggi,  yaitu    10%. Beberapa  fraksi  muncul  pada  posisi  yang  sama,  dan tidak  berbentuk  spot  melainkan  berupa  luasan  tertentu sesuai  kadar  setiap  fraksi.      Fraksi  1  (gingerol)    dan  2 (shogaol) diekstrak dari silika dengan pelarut aseton (10- 30 ml) lalu dilakukan sentrifus 2800 x g selama 15 menit, dan  supernatan  diambil.  Sentrifus  dilakukan  beberapa kali  hingga  endapan  silika  tidak  berwarna  kecoklatan.
Supernatan disaring dengan kertas saring whatman no. 42,  sehingga  didapat  ekstrak  aseton  yang  berisi komponen  fraksi  1  (gingerol)  atau  fraksi  2  (shogaol). Aseton  diuapkan  dengan evaporator dan  dilanjutkan dengan gas nitrogen untuk menghilangkan residunya.
Persiapan  senyawa  dan  zat  bioaktif  jahe,  larutan paraquat (PQ), dan medium biakan
Persiapan  Senyawa  dan  Bioaktif  Jahe :
Senyawa  oleoresin,  gingerol  dan  shogaol  dilarutkan secara terpisah dalam media RPMI 1640.  Pengenceran bertingkat  dilakukan  untuk  mendapatkan  larutan  stok dengan  tingkat  konsentrasi  masing-masing  500,  1000, 1500  dan  2000  g/ml.    Larutan  stok  disterilkan  dengan penyaringan membran berpori 0,22  m.
Persiapan  Larutan  Paraquat : Paraquat diklorida  atau 1,1’-dimethyl-4,4’–bipyridylium  dichloride (BM  =  257,2)    ditimbang  sejumlah  0,02572  gr  dan dilarutkan  dalam  10  ml  RPMI  1640  untuk  mendapatkan larutan  stok  10  mM.    Pengenceran  bertingkat  dilakukan untuk mendapatkan larutan dengan 4 tingkat konsentrasi yaitu  1,2,3  dan  4  mM.      Larutan  disterilkan  dengan penyaringan membran berpori 0,22  m.
Persiapan  Medium  Biakan :    Medium  yang digunakan ada tiga jenis yaitu media basal, media semi lengkap  dan  media  lengkap.    Media  basal  digunakan untuk  pencucian  dan  dibuat  dari  bubuk  RPMI-1640 sebanyak  10,42  gram  dilarutkan  dengan  akuades  steril hingga  satu  liter,  lalu  ditambah  2  gram  NaHCO 3. Medium  semi  lengkap  merupakan  media  basal  yang ditambah  1  %  L-glutamin  2  mM  dan  1  %  antibiotik gentamisin.  Media  lengkap  digunakan  untuk  media pertumbuhan  limfosit,  dan  dibuat  dengan  penambahan 20  %  serum  dari  darah  manusia  golongan  AB.    Untuk analisis sel NK ditambahkan fetal bovine serum .  Semua larutan  media  disterilkan  dengan  penyaringan  membran berpori 0,22  m.
Isolasi limfosit, suspensi limfosit  dan kultur limfosit (modifikasi Freshney, 1994)
Analisis profil darah dilakukan dengan metode Quick  Blood  Count (QBC)  di  klinik  Caritas  Bogor. Pengambilan  darah  perifer  dilakukan  oleh    asisten tranfusi  darah  (Atd)  pada  pagi  hari  di  rumah  sakit  PMI Bogor.    Setelah  diberi informed  concern ,  darah  diambil dari  subyek  seorang    lelaki  dewasa  sehat  berusia  24 tahun    secara  aseptis  dengan  alat  suntik  dan  jarum butterfly No. 23 sekali pakai. Sampel darah ditempatkan dalam tabung venoject steril yang berisi antikoagulan 10 % sodium sitrat. Limfosit  diisolasi  dari  sampel  darah  perifer dengan  metode  sentrifus  berdasarkan    perbedaan densitas  larutan ficoll-hypaque (1,77  0,001  g/ml). Sentrifusi  pertama    dilakukan  pada    kecepatan  514  x  g selama 10 menit untuk pemisahan komponen seluler. Sel darah  merah  berada  di  bagian  bawah,  sedangkan plasma darah terpisah di bagian atas.  Lapisan buffy coat yang sebagian besar berisi sel limfosit berada di antara kedua  lapisan.  Lapisan buffy  coat diambil  lalu ditambahkan  ke  dalam  3  ml  media  basal.    Selanjutnya, lapisan buffy coat dalam media basal dilewatkan di atas larutan ficoll-hypaque secara  perlahan  sehingga terbentuk dua lapisan yang tidak bercampur.  Kemudian disentrifusi  pada    1430  x  g    selama  30  menit.    Sel limfosit,  monosit  dan  platelet  berada  di    lapisan  atas permukaan ficoll dan    tidak  menembus  ke  bawah, sedangkan  granulosit  dan  sel  darah  merah  terpisah  di dasar tabung sentrifus.   Lapisan yang berisi sel limfosit, monosit  dan  platelet  dicuci  2  kali  dengan  media  basal dan disentrifusi pada  228 x g selama 10 menit. Akhirnya, limfosit (dalam presipitat) terpisah dari  platelet, monosit, plasma  dan ficoll (dalam  supernatan). Sel  limfosit tersebut  dihitung  dengan  pewarnaan  biru  trifan  pada hemasitometer.    Suspensi  limfosit  dengan  jumlah  sel yang  hidup  di  atas  95  %  tersebut  disiapkan  dengan media  basal  untuk  berbagai  konsentrasi  yaitu  :    2x  10 6 sel/ml, 1x 10 5 sel/ml, 1x 10 7 sel/ml dan  5x 10 5 sel/ml. Sejumlah  100  l  suspensi  limfosit  homogen dibagikan  ke  30  sumur  pada  lempeng  mikro  berukuran 200  l  sehingga  limfosit  ada  dalam  jumlah  tertentu sesuai  metode  untuk  pengukuran  parameter  yang  diuji. Larutan  paraquat  ditambahkan  untuk  induksi  kondisi kultur stres oksidatif.  Selanjutnya ditambahkan masing- masing  senyawa  oleoresin,  komponen  gingerol  atau shogaol  ke  sumur  lempeng  mikro  secara  acak,  dan dilakukan  3  kali  ulangan.    Pada  kontrol  hanya ditambahkan  media  saja.    Kemudian,  lempeng  mikro dimasukkan  ke  dalam  inkubator  tekanan  O 2 95%  dan CO 2 5% serta  suhu  inkubasi  37 o C  untuk  waktu  4  jam. Setelah  selesai  inkubasi  lempeng  mikro  dikeluarkan untuk  dipanen  dengan cell  harvester ,    dan  di  simpan pada  suhu  –20 o C  untuk  kemudian  dihitung  jumlah  sel limfosit per menit yang disebut sebagai count per minute ( CPM ) dengan  -counter .

## Analisis respons sitolitik sel NK
Sel target yang digunakan adalah  sel  kanker darah merah K-562 (Roitt, 1991).  Sel target disuspensi dan  ditepatkan  konsentrasinya  menjadi    1x10 5 sel/ml dengan  media  lengkap  berisi  10  %  serum  janin  sapi (SJS).    Pelabelan  dilakukan  dengan  penambahan  [ 3 H]- timidin    2  Ci/ml  dan  inkubasi  selama  semalam  dalam inkubator  CO 2 5  %  dan  suhu  37 o C.    Setelah  sel  target diinkubasi  lalu  dicuci  dengan  media  basal  melalui sentrifusi pada  228 x g selama 10 menit.  Pelet diambil dan dibuat suspensi sel target  dengan konsentrasi 1x10 5 sel/ml dalam medium lengkap. Sejumlah  50  l  sel  target  (ST)  1x10 5 sel/ml terlabel  dibiakkan  dengan  50  l  sel  efektor  (SE)  1x10 7 sel/ml  dan  20  l  SJS    dalam  sumur  pada  lempeng mikrotiter  yang  telah  diberi  80  l  senyawa  oleoresin, gingerol  dan  shogaol  secara  terpisah  (Gambar  2). Selanjutnya  lempeng  mikrotiter  tersebut  diinkubasi selama empat jam dalam inkubator CO 2 5 %, pada suhu 37 o C. Kultur dilakukan juga dengan rasio ST:SE = 1: 50. Pada  kontrol,    sel  target  dibiakkan  dengan  medium pertumbuhan saja.
Sel  dipanen  dengan  alat cell  harvester . Membran  filter  pada  alat  tersebut  menahan  inti  sel  dan sel  utuh  yang  terlabel  dengan  [ 3 H]-timidin.    Setelah dikeringanginkan,  filter  tersebut  dimasukkan  ke  dalam sumur  pada  lempeng  piko  24  sumur  dan  diberi  larutan sintilasi  untuk  dibaca  menggunakan  -counter .    Nilai CPM yang  dibaca  oleh  -counter adalah  jumlah  sel target  berlabel  [ 3 H]-timidin  yang  tidak  lisis  atau  masih utuh.      Persen  lisis  (%)  terhadap  sel  target  merupakan rasio CPM sel  K562  pada  medium  dengan  perlakuan yang  lisis  terhadap CPM K562  kontrol  pada  medium standar  (Rose  et  al.,  1994).      Persen  lisis  tersebut menggambarkan respons sitolitik sel NK (Roitt, 1991).

## Analisis data
Studi  ini  menggunakan  rancangan  percobaan acak  lengkap  dengan  rancangan  perlakuan  faktorial sehingga model  percobaannya sebagai berikut : Y ijk =  + A i +Bj+AB ij +  ijk    , i = 1,…,5  ,   j = 1,2  , dan  k = 1,2,3 Y ijk =    nilai  pengamatan  ke  k  yang  memperoleh perlakuan ke i pada kondisi j.
 =  nilai tengah pengamatan
Ai =  pengaruh perlakuan ke-i
Bj      =  pengaruh kondisi kultur ke-j AB ij =  pengaruh  interaksi  perlakuan  ke-i  dan  kondisi kultur ke-j
 ijk =  pengaruh galat pada pengamatan ke-k, perlakuan ke –i dan kondisi ke-j
Analisis ragam (ANOVA) pada model percobaan digunakan  untuk  menilai  pengaruh  konsentrasi  dan kondisi  kultur  limfosit  serta  pengaruh  interaksinya,
masing-masing  untuk  senyawa  oleoresin,  gingerol,  dan shogaol.  Model  regresi  digunakan  untuk  menyimpulkan model  hubungan  antara  respons  dengan  konsentrasi senyawa aktif jahe dan kondisi biakan limfosit. Model ini mencakup model linier maupun tak linier sesuai perilaku data.      Berdasarkan  sebaran  data,  model  respons hubungan  yang  terjadi  adalah    bersifat  linier,  kuadratik, kubik,    dan  eksponensial,  yang  digambarkan  dalam persamaan  matematis  sebagai  berikut  :    Yij  =  o  +  1 X 2 +  2 X+  ij;   Yij =  o +  1 X + 
2 X 2 +  3 X 3 +  ij;  Yij =  o e -  1 k , dimana  Y =   respons limfosit,   X    =   konsentrasi jahe,  o   =   kemiringan (slope) garis yang melalui nilai tengah populasi  Y,    dan  1 ,  2 ,  3 =    intersep  populasi,  k= konstanta  (Steel  and Torrie, 1980; Mead et al ., 1993). Analisis  ragam  dan  regresi  dilakukan  menggunakan program  statistik Statistical  Analysis  System (SAS) for Windows.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Senyawa  bioaktif  jahe  ( zingiber  officinale roscoe)
Oleoresin    adalah  senyawa  fenolik  yang memiliki  banyak  gugus  hidroksil.    Oleoresin  jahe,  yang diperoleh dengan metode ekstraksi etanol, mengandung 5 komponen yang kemudian dikenal dengan zat aktif non volatil  jahe.    Fraksinasi  senyawa  oleoresin  dengan metode  kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  menunjukkan  ada lima  fraksi,  yaitu  fraksi  1  hingga  5  (Tabel  2). Berdasarkan telaah Kikuzaki and Nakatani (1993),  Chen et al., (1986), dan Wikandari (1994)  fraksi ke-1 dan ke-2 berturut-turut  adalah  senyawa    gingerol  dan  shogaol. Struktur kimia kedua senyawa fenol sederhana tersebut disajikan pada Gambar 1.
Tabel 2.  Perbandingan antara nilai rf hasil analisis KLT studi ini dan referensi
No. Fraksi Nilai rf Yang diperoleh studi ini Referensi 1) Referensi 2) 1 0,24 0,20  - 0,24 0,15 – 0,22 2 0,42 ------- 0,42 3 0,54 0,41 – 0,48 0,48 – 0,55 4 0,60 0,51 – 0,57 0,58 – 0,62 5 0,68 0,65 – 0,67 0,68 – 0,72 1) Wikandari (1994) 2) Chen  et al.,(1986)

## O     OH H3CO
(CH 2 )nCH 3 Gingerol
HO
O H 3 CO
(CH 2 )nCH 3 Shogaol

## HO
Gambar 1.  Struktur  kimia senyawa gingerol dan shogaol
Senyawa  gingerol  dan  shogaol    bersifat  lebih polar  daripada  ketiga  senyawa  fraksi  lain.    Adapun gingerol bersifat lebih polar daripada shogaol  (Nakatani, 1993).    Oleh  karena  itu,  gingerol  muncul  pada  fraksi dengan  nilai  rf  yang  terkecil.    Hal  ini  disebabkan adsorben  gel  silika  (SiO 2 )  pada  permukaan  plat  KLT bersifat  polar  sehingga  lebih  kuat  menyerap  molekul gingerol terlebih dahulu.  Selain  itu, pelarut heksan dan dietileter sebagai fase gerak bersifat non polar sehingga lebih menarik komponen yang non polar ke bagian atas lempeng  dan  meninggalkan  komponen  polar  di  bagian bawah  lempeng  KLT.  Kedua  senyawa  bioaktif  jahe tersebut  diduga  memberi  efek  positif  terhadap kemampuan  sel  NK  dalam  melisis  sel  kanker  darah. Kadar senyawa gingerol ( 0,52  persen b.k ) lebih besar dari shogaol (0,24 persen b.k.).
Senyawa  gingerol  dan  shogaol  memiliki banyak  gugus  hidroksil  sehingga  bersifat  polar  dan memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi (Hudson, 1990). Kikuzaki dan Nakatani (1993) telah membuktikan bahwa (6)-(gingerol),  (6)-shogaol  dan  (6)-gingerdiol  memiliki aktivitas  antioksidan  lebih  tinggi  dari  -tokoferol.
Senyawa  (6)-,  (8)-  dan  (10)-  gingerol  yang  ada  dalam ekstrak  etanol  jahe  segar  diduga  menstimulasi  aktivitas splenosit  dan  menurunkan  tingkat  kematiannya  selama inkubasi  (Zakaria  dkk.,  1996).    Berdasarkan  temuan tersebut,    diduga  mekanisme  efek  proteksi  komponen oleoresin rimpang jahe tersebut adalah melalui stimulasi respons  imun  (imunomodulasi)  dan  sifat  antioksidatif sehingga mampu melindungi sel dari kerusakan oksidatif.

## Respons sitolitik sel NK
Sel  NK  adalah  sel  efektor  sitolitik  (SE)  non spesifik  terhadap  sel  target  (ST),  seperti  :  sel  terinfeksi virus  dan  sel  kanker.    Pada  manusia  dewasa,  sel  NK berjumlah 10-15 persen dari jumlah sel limfosit darah tepi (Kuby, 1992; Kleinsmith dan Kish, 1995).  Analisis QBC subyek menunjukkan limfosit total berjumlah 1,5 x10 6 per
mL.  Jumlah sel NK  darah tepi yang diuji berjumlah 15 persen dari total limfosit, yaitu sekitar  22,5 x 10 4 sel per mL.
Pada kondisi normal (tanpa stres oksidatif) dan setelah diinkubasi selama  4 jam, jumlah sel kanker yang masih utuh  (1624  sel ) pada biakan sel dengan nisbah ST:SE=1:50,  dan  1060  sel  pada  biakan  sel  dengan nisbah  ST:SE=1:100.    Sebaliknya,  pada  kondisi  stres oksidatif  dan  inkubasi  4  jam,  jumlah  sel  kanker  (CPM) yang  masih  utuh    1722    sel  pada  biakan  sel  dengan nisbah  ST:SE=1:50,  dan  1140  sel  pada  biakan  sel dengan nisbah ST:SE=1:100.   Pada dua kondisi biakan, jumlah sel target pada biakan sel dengan nisbah  ST:SE = 1:50  lebih sedikit daripada kondisi biakan sel denngan nisbah ST:SE=1:100.  Hal tersebut terjadi karena jumlah sel NK pada biakan ST:SE=1:100 lebih banyak daripada biakan ST:SE = 1:50  sehingga lebih banyak sel kanker yang lisis.
Respons sitolitik sel NK adalah aktivitas sel NK dalam melisis sel target K562 dalam biakan ( in vitro ), dan dinyatakan sebagai persen lisis.  Persen lisis merupakan nisbah antara jumlah sel K562 yang lisis terhadap jumlah sel K562 yang masih utuh pada kelompok kontrol, dalam persen.   Semakin banyak sel K562 yang lisis, semakin kecil nilai CPM hasil pembacaan sinar  ( dari 3 H-timidin terlabel  pada  sel  K562  yang  utuh)  oleh  β -counter .  Hal tersebut  berarti  memperbesar  persen  lisis  atau meningkatkan respons  sitolitik sel NK.
Pada  kondisi  normal,  dan  biakan  sel  dengan nisbah  ST:SE=1:50 , senyawa  oleoresin,  gingerol,  dan shogaol  meningkatkan  respons  sitolitik  sel  NK.    Nilai persen lisis tertinggi  terjadi pada penambahan oleoresin 50  g/ml,    gingerol  50  g/ml,  dan  shogaol    200  g/ml, yaitu  sebesar    60  %,    52  %,  dan  53  %  berturut-turut, versus  36,4  %  pada  biakan  kontrol.    Sementara,  pada biakan  sel  dengan  nisbah  ST:SE=1:100,  hanya penambahan  oleoresin    50  dan  100  g/mL  yang meningkatkan  respons  sitolitik  sel  NK  dengan  nilai
persen lisis tertinggi sebesar 63 %, versus 58,5 % pada biakan  kontrol.    Kedua  senyawa  lainnya,  yaitu  gingerol dan shogaol tidak meningkatkan respons sitolitik sel NK (Gambar 2).
Pada    kondisi  stres  oksidatif,    dan  biakan  sel dengan  nisbah  ST:SE=1:50  dan  senyawa  aktif  jahe senyawa oleoresin, gingerol, dan shogaol mengakibatkan  peningkatan  respons  sitolitik  sel  NK. Persen  lisis  tertinggi  juga  terjadi  pada  penambahan senyawa oleoresin 50  g/mL, yaitu 69 %, versus 32,5 % pada  biakan  kontrol.    Pada  biakan  sel  dengan  nisbah ST:  SE  =  1:100,    senyawa  oleoresin  dan  gingerol  jahe tersebut  meningkatkan  respons  sitolitik  sel  NK,  tidak pada  shogaol.    Respons  sitolitik  sel  NK  tertinggi  terjadi pada penambahan oleoresin 50  g/mL dan  dan gingerol
50  g/mL,  yaitu  70  %  dan  67%,  versus  58,5  %  pada kontrol (Gambar 3)
Hasil  analisis  ragam  menunjukkan  bahwa  pada  biakan sel  dengan  nisbah  ST:SE=1:50  dan  ST:SE=1:100, kondisi  biakan  berpengaruh  terhadap  kemampuan oleoresin,  dan  gingerol  dalam  memodulasi  respons sitolitik sel NK.  Sebaliknya,  pengaruh shogaol terhadap respons  sitolitik  sel  NK  tidak  tergantung  pada  kondisi biakan.    Artinya,  pada  kedua  kondisi  biakan,  respons sitolitik  sel  NK  mengikuti  pola  respons  yang  sama  atau tidak  berbeda.  Sementara,  hasil  uji  pengaruh  senyawa aktif jahe terhadap respons sitolitik sel NK pada dua jenis nisbah  biakan  ST:SE  dan  dua  kondisi  biakan  disajikan pada Tabel 3.
a)  Biakan  sel ST : SE =  1 : 50 0 10 20 30 40 50 60 P ers en L isis (% ) 0 50 100 150 200 Konsentrasi (ug/ml) OL GR SH b)  Biakan sel ST : SE =  1 :  100 0 10 20 30 40 50 60 70 Persen Li si s (%) 0 50 100 150 200 Konsentrasi (ug/ml) OL GR SH
Gambar    2.    Persen  Lisis  (%)  sel  NK  sebagai  respons  penambahan  senyawa  oleoresin,  gingerol,  dan  shogaol    pada  biakan  sel  a) ST:SE=1:50, dan b) ST:SE=1:50    dan kondisi normal
a)  Biakan  ST : SE =  1 : 50
0 10 20 30 40 50 60 70 P er se n L is is ( % ) 0 50 100 150 200 Konsentrasi (ug/ml) OL GR SH b)  Biakan  ST : SE =  1 :  100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 P e rs e n L is is (% ) 0 50 100 150 200 Konsentrasi (ug/ml) OL GR SH
Gambar    3    Persen  Lisis  (%)  sel  NK  sebagai  respons  penambahan  senyawa      oleoresin,  gingerol,  dan  shogaol    pada  biakan  sel  a) ST:SE=1:50,  dan b) ST:SE=1:50  dan kondisi  stres oksidatif
Tabel  3.   Hasil Uji Pengaruh Senyawa Bioaktif Jahe terhadap Respons sitolitik sel NK pada biakan limfosit dengan nisbah
ST:SE = 1:50 dan 1:100  dan dua kondisi biakan sel
Respons Sitolitik Yang diuji Komponen Bioaktif Nilai-F Normal Stres Oksidatif 1. Aktivitas sitolitik sel NK  (%) (ST:SE=1:50) Oleoresin 0,0007 * 0,0 tn Gingerol 0,0077 * 0,0 tn Shogaol 0,0 tn 0,0008  * 2. Aktivitas sitolitik sel NK  (%) (ST:SE=1:100) Oleoresin 0,0001 * 0,0 tn Gingerol 0,0006 * 0,0004  * Shogaol 0,0 tn 0,001  *
Pada  kondisi  normal,  dan  biakan  sel  dengan nisbah  ST:SE  =  1:50  dan  ST:SE  =  1:100,  senyawa oleoresin  dan  gingerol  berpengaruh  nyata  terhadap respons  sitolitik  sel  NK,  sebaliknya  shogaol  tidak. Respons sitolitik sel NK tertinggi terhadap penambahan oleoresin  50  g/mL  sebesar  63  %  dan    60  %,  masing- masing  pada  biakan  sel  dengan  nisbah  ST:SE  =  1:50 dan ST:SE = 1:100.   Akibat penambahan tersebut terjadi peningkatan respons sitolitik sel NK sebesar  4 % dan 24 %.  Hubungan  respons  sitolitik  sel  NK  akibat penambahan  oleoresin  dan  gingerol  masing-masing adalah    kuadratik  dan  linier  negatif    (Gambar  4). Semakin tinggi konsentrasi gingerol, respons sitolitik sel NK  secara  kuadratik  dan  linier  semakin  menurun. Peningkatan  dan  penurunan  respons  sitolitik  sel  NK, yang dibiakkan pada dua tingkat nisbah,  sebagai akibat penambahan shogaol tidak nyata.
Analisis statistik tersebut di atas membuktikan bahwa  pada  biakan  limfosit  dalam  kondisi  tanpa  stres oksidatif,  senyawa  oleoresin  dan  gingerol  pada konsentrasi rendah mampu meningkatkan fungsi sitolitik sel  NK    untuk  melisis  sel  target  K562.  Peningkatan respons  sitolitik  sel  NK  kemungkinan  disebabkan  oleh aktivasi senyawa oleoresin dan gingerol  terhadap sel NK untuk  mengeluarkan  faktor  sitotoksiknya,  yaitu  perforin atau sitolisin. Menurut Kuby (1992), setelah kontak atau pelekatan sel NK ke sel target, granula sitoplasmik yang berisi  perforin  mengalami  degranulasi.  Perforin menyebabkan  terbentuknya  lubang  pada  membran  sel target, dan dalam waktu 15 menit sampai 3 jam berakibat
pada fragmentasi DNA, yang berakibat pada kerusakan sel target. Sebaliknya, penurunan aktivitas sitolitik sel NK dapat terjadi karena ketidaklengkapan biokimiawi dalam proses  pembunuhan  sel  target,  antara  lain ketidakmampuan  pengenalan  sel  target  (Sherman  dan Lockwood, 1987).
Sebagai  perbandingan,  studi  Prangdimurti (1998)  telah  membuktikan  bahwa  pada  sistem in  vitro pemberian  ekstrak  jahe  pada  mencit  yang  diberi  PQ meningkatkan  aktivitas  sitolitik  sel  NK  sebesar  41,80 persen.  Demikian  pula  studi  Zakaria  et  al.,    (1999)  dan Zakaria  et  al.,  2003  pada  sistem in  vivo membuktikan bahwa konsumsi sari jahe meningkatkan aktivitas sitolitik sel NK manusia dalam melisis sel target K562.
Pada  kondisi  stres  oksidatif dan  biakan  sel dengan  nisbah  ST:SE  =  1:50,  hanya  shogaol  yang berpengaruh  terhadap  respons  sitolitik  sel  NK. Sementara  pada  biakan  sel  dengan  nisbah  ST:SE  = 1:100,  senyawa  gingerol  dan  shogaol  berpengaruh terhadap respons sitolitik sel NK (Tabel 3). Penambahan shogaol berpengaruh nyata terhadap penurunan respons sitolitik  sel NK.   Kurva respons  sitolitik  sel NK terhadap penambahan shogaol bersifat  linier negatif (Gambar 5). Artinya  semakin  tinggi  konsentrasi  shogaol  yang diberikan,  aktivitas  sitolitik  sel  NK  semakin  kecil. Peningkatan  respon  sitolitik  sel  NK  akibat  penambahan oleoresin, dan gingerol tidak nyata.
Gambar 4. Kurva respons sitolitik sel NK pada biakan sel dengan nisbah   ST:SE=1:100  dalam kondisi tanpa stres  oksidatif
Ygr = -0,0489x + 57,439 R 2 = 0,6866 Yol = -0,0005x 2 + 0,0576x + 59,264 R 2 = 0,7816 40 45 50 55 60 65 70 0 50 100 150
200
250 Konsentrasi oleoresin dan gingerol (ug/ml) P erse n li si s (% ) Oleoresin Gingerol Linear (Gingerol)
Poly. (Oleoresin)
a) ST : SE  =  1 : 50
b)  ST : SE  =  1 : 100
y = -0,0007x 2 + 0,2121x + 37,733 R 2 = 0,6614 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 50 100 150 200 250 Konsentrasi shogaol (ug/ml)l P er se n l is is ( % )
Gambar 6.  Kurva respons sitolitik sel NK dalam biakan sel dengan nisbah a) ST:SE=1:50,  b) ST:SE = 1: 100 kondisi stres oksidatif terhadap penambahan shogaol

## KESIMPULAN
Senyawa  oleoresin  jahe,  termasuk  gingerol dan  shogaol  memiliki  kemampuan  imunomodulasi karena  mampu  meningkatkan  respons  sitolitik  sel  NK. Senyawa  aktif    jahe  tertentu  pada  kondisi  tertentu meningkatkan  kemampuan  lisis  sel  NK  terhadap  sel target K-562 yang dibiakkan secara in vitro . Pada  kondisi  tanpa  stres,  senyawa  oleoresin, gingerol,  dan  shogaol  jahe  meningkatkan  kemampuan lisis sel NK terhadap sel target K-562 baik pada biakan sel  dengan  nisbah  ST:SE=1:50,  dan  ST:SE=1:100. Peningkatan tertinggi terjadi pada penambahan oleoresin dan  gingerol  pada  konsentrasi  rendah  (50  g/mL).
Sebaliknya,  shogaol  mampu  meningkatkan  respons sitolitik  sel  NK  pada  konsentrasi  tinggi  (150  dan  200
 g/mL), namun pengaruhnya tidak nyata. Pada  kondisi  stres  oksidatif,  dan  biakan  sel dengan  nisbah  ST:SE=1:50  ketiga  senyawa  aktif  jahe meningkatkan respons sitolitik sel NK.  Tetapi pengaruh peningkatan respons sitolitik sel NK akibat penambahan oleoresin  dan  gingerol  tidak  nyata.  Senyawa  shogaol secara  nyata  meningkatkan  respons  sitolitik  sel  NK. Pada  biakan  sel  dengan  nisbah  ST:SE=1:100,  gingerol secara  nyata  meningkatkan  respons  sitolitik  sel  NK, sebaliknya    shogaol    secara  nyata  menurunkannya. Semakin  tinggi  konsentrasi  senyawa  shogaol,  semakin
y = -0,0471x + 54,823 R 2 = 0,6594 40 45 50 55 60 65 0 50 100 150 200 250 Konsentrasi shogaol (ug/ml) P e rs e n l is is (% )
rendah respons sitolitik sel NK, bahkan lebih rendah dari biakan sel kontrol.

## DAFTAR PUSTAKA
Al-Khayat,  M.A.  and  G.  Blank.    1985. Phenolic  spice components sporostitatics to B. substilis. J. Food Sci. 50:971-974.
Chen,  C.,  C.K.  May  and  C.T.  Ho.    1986 .    High performance liquid chromatographic determination    of  pungent  gingerol  compound  of ginger ( Zingiber offinale Roscoe ) J. of  Food  Sci. 51 (12): 1364-1365.
Cillard,  J.,  P. Cillard and M. Cormier.  1980. Effects of  experimentaal  factors  on  the  prooxidant behavior  of  tocopherol.  J.  Am.  Oil  Chem.  Soc., 57:255-261.
Farrel, K.T.  1985. Spices, condiments and seasoning. Avi. Publ. Co. Inc., Wesport, Connecticut, USA.
Gordon,    M.  H.    1990. The  mechanism  of  antioxidant action in  vitro.  In Hudson,  B.  J.  F.  (ed.)    Food antioxidants.  Elsevier Applied Science.  London.
Haaland,  P.D.    1989. Experimental  Design  in Biotechnology.  Marcel Dekker Inc.  New York.
Hikino, H., Y. Kiso, N. Kato, Y. Humada, T. Shioiri, R. Aiyama, H. Itokawa, F. Kiuchi and U. Sankawa. 1985. Antihepatotoxic  actions  of  gingerols  and diarylheptanoids.  J. Ethnophrmacol. 14 : 31-39.
Hudson,  B.J.F.  (ed.).    1990. Food  Antioxidants. Elseviere.  Applied Science, New York.
Kartikawati,    D.    1999. Studi  efek  protektif  vitamin  C dan  E  terhadap  respon  imun  dan  enzim antioksidan mencit yang dipapar paraquat.  Tesis- FPS,  IPB.
Keys,    J.D.    1981. Chinese  herbs  :  their  botany, chemistry  and  Pharmacodynamics.    Charles  E. Tuttle Company Tokyo, Japan. pp. 77-78
Kikuzaki, H. and N. Nakatani.   1993. Antioxidant effect of some ginger constituents.  J.  Food  Sci.  58 : 1407-1410.
Kleinsmith,  L.J.  and    V.M.  Kish.    1995. Principles  of cell and molecular biology. Harpercollins College Publishers.  New   York.
Kuby,    J.      1992. Immunology.    W.H.  Freeman  and Company, New York.
Lienni,  K.  1991. Pengaruh sari jahe ( Zingiber offcinale Roscue)  terhadap aktivitas pertumbuhan beberapa  bakteri  penyebab  infeksi  maknan.
Tesis Pascasarjana  IPB. Bogor.
Lucas,  R.    1979 .    Secrets  of  the  Chinese  Herbalists. Corner Stone Library.  New York. pp. 28-29.
Mead,  R.,  R.N.  Curnow  and  A.M.  Hasted.    1993.
Statistical Methods in Agriculture and Experimental  Biology.    Chapman  &  Hall,  New York.
Nakatani , N.  1993 .  Natural antioxidant from spices .  In Huang,  M.T.,  C.T.  Ho  and  C.  Y.  Lee.,    1993. Phenolic compounds in food and their effects on health II.  ACS Symposium Series 507.  American Chemical Society, Washington, D.C
Nurrahman.    1998. Pengaruh  konsumsi  sari  jahe terhadap  kadar  MDA  sel,  sel  CD3+  pada mahasiswa pesantren Ulil Albab, Kedung Badak, Bogor.  Tesis.  Pascasarjana IPB, Bogor.
Paimin,    F.B.  dan  Murhananto.    1991. Budidaya, pengolahan  dan  perdagangan  jahe.    Penebar swadaya,  Jakarta.
Prangdimurti,  E.  1999. Mempelajari efek perlindungan ekstrak jahe terhadap respon imun mencit yanng diberi  perlakuan  pestisida  parakuat.    Tesis. Pascasarjana  IPB.
Rismunandar.  1988. Rempah-rempah Komoditi Ekspor Indonesia.  C.V. Sinar Baru,  Bandung.
Roitt,    I.M.    1991. Essential  Immunology.    Blackwell Scientific Publication,   London.
Rose,  N.R., E.C. de Macario, J.L. Fahey, H. Friedman and  G.M.  Penn.    1994. Manual  of  Clinical Laboratory  Immunology.  American  Society  for Microbiology, Washington, D.C.
Sastroamidjoyo,  S.  1988. Obat asli Indonesia.  Dian Rakyat.  Jakarta.
Sherman,    A.R.  dan  J.F.  Lockwood.    1987. Impaired natural killer  cell activity in iron-deficiency rat. J. Nutr.  Immunol. 117 : 567-571.
Shoji,  N.,    A.  Iwasa,  T.  Takemoto,  Y.  Ishida  and  Y. Ohizumi.    1982. Cardiotonic  principle  of  ginger ( Zingiber officinale Roscue). J. Pharm. Sci.  71 : 1174-1175.
Subarnas,    A.  dan  Sidik.  1997. Peranan  dan  khasiat rempah-rempah dalam jamu. Di dalam Prosiding Seminar Pusat Kajian Makanan Tradisional, PAU Pangan dan Gizi, IPB, Bogor.
Suekawa,    M.A.,    K.  Ishige,    K.  Yuasa,  M.  Sudo,  M.
Aburada dan E. Hosoya. 1984.
Pharmacological studies on ginger I.
Pharmacological actions of pungent constituents, (6)-gingerol  and  (6)-shogaol.  J.  Pharmacobiodyn 7 : 836-848.
Steel, R.G.D. and  J. H. Torrie.  1980. Principles and Procedures of Statistics.  McGraw-Hill, Inc.  New York.
Tang, W. and G. Einsenbrand.  1992. Chinese Drugs of Plant Origin : chemistry, pharmacology and use in  traditional  and  modern  medicine.    Spring- Verlag, New York. pp. 1011-1015.
Tejasari,  F.R.  Zakaria,  dan  D.Sajuthi.  2002. Sifat immunomodulative  senyawa  oleoresin,  fraksi  1 dan  2  terhadap  fungsi  sel  limfosit  B  dan  T Manusia  secara in  vitro .    Jurnal  Teknologi  dan Industri   Pangan, XIII(1) : 47-53.
Wikandari, P.  1994. Pengembangan Metode Ekstraksi dalam  Analisis  Gingerol  dari  Jahe  Segar  dan Beberapa  Produk  Jahe  Olahan.    Pascasarjana IPB.  Bogor. Tesis
Zakaria, F.R., L. Darsana, H. Wijaya.  1996. Immunity enhancement and cell protection activity of ginger bud  and  fresh  ginger  on  mouse  spleen
lymphocyte.    Symposium  Non  Nutritive  Health Factors  for  Future  Food.    Korean  Society  of Foods  Science  and  Technology  (KoSFoST), September 28-30, 1996.
Zakaria,  F.R.,  J.  Wiguna    dan  A.  Hartoyo.    1999. Konsumsi  minuman  jahe  ( Zingiber  officinale Roscue) meningkatkan aktivitas sel Natural Killer mahasiswa  pesantren  Ulil  Albab  di  Bogor.  Bul. Teknol. dan Industri Pangan.  X(2): 40-45.
Zakaria-Rungkat,  F.,  Nurahman,  Prangdimurti,  E.,
Tejasari. 2003. Antioxidant and
Immunoenhancement  Activities  of  Ginger ( Zingiber  officinale Roscoe)  Extracts  and Compounds  in  In  Vitro  and  In  Vivo  Mouse  and Human System. Nutraceuticals and Foods.8;  96- 104 .