Menara Perkebunan, 2009 77(2), 86-95.

## Pengaruh bahan pra-sterilan, tutup tabung kultur,
dan musim terhadap tingkat kontaminasi eksplan pada kultur microcutting karet
Effect of pre-sterilization agent, culture tube closure, and season on the contamination level of rubber microcutting culture
NURHAIMI-HARIS 1) , SUMARYONO 1) & M.P. CARRON 2)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan, Jl. Taman Kencana No.1 Bogor 16151, Indonesia
2) CIRAD, Montpellier-Cedex 5, France
Diterima tgl 28 Juni 2009/Disetujui tgl  12 September 2009

## Abstract
Microbial contamination is a major obstacle in  clonal  propagation  of  hevea  ( Hevea brasiliensis )  through  microcutting  technology; therefore the ability to reduce contamination will determine  the  success  of  the  application  of  this technology.    The  aim  of  experiments  was  to increase healthy and survived plantlets by testing pre-sterilization  agents  for  cleaning  explants during  pre-sterilization  step,  culture  tube closures  suitable  for  explants  growth  and  an appropriate  time  for  introducing  explants  at  the primary  culture  phase.  The  pre-sterilization agents  tested  were  aganol,  alcohol  and desogerme,  the  culture  tube  closures  used  were parafilm  and  cotton,  and  the  time  for  culturing explants  were  determined  by  using  rubber genotypes introduced during the year of 2006 and 2007.    The  results  show  that  desogerme decreased  significantly  the  level  of  explant contamination  compared  to  aganol  and  alcohol, meanwhile  the  type  of  culture  tube  closure  did not affect the level of explant contamination.  The type  of  culture  tube  closure  influenced significantly  the  survival  of  explants  where  the number  of  survived  explants  in  culture  tubes covered with cotton was higher than that of with parafilm.  Season also affected the contamination frequency  of  the  explants.    Higher  number  of healthy plantlets were obtained when introduction of the explants were conducted from June  to  October  considered  as  dry  season  in Bogor  compared  to  introduction  of  the  explants during  rainy  season  from  January  to  May. Different  genotypes  of  rubber  introduced  at  the primary  culture  phase  did  not  affect  the percentage of explant contamination .
[ Key words : Hevea brasiliensis , microcutting, microbial contamination, culture in-vitro ]

## Abstrak
Kontaminasi  oleh  mikroba  merupakan masalah utama pada perbanyakan klonal tanaman karet  ( Hevea  brasiliensis )  melalui  teknologi microcutting sehingga  kemampuan  mengurangi kontaminasi  menentukan  keberhasilan  aplikasi teknologi  tersebut.  Penelitian  ini  bertujuan mempelajari  pengaruh  jenis  bahan  pra-sterilan yang  efektif  untuk  pencucian  eksplan  tahap  pra- sterilisasi,  mempelajari  pengaruh  tutup  tabung terhadap  perkembangan  eksplan  serta  meng- identifikasi waktu yang tepat untuk melaksanakan introduksi  eksplan  pada  tahap  kultur  primer (kultur  awal)  sehingga  jumlah  eksplan  sehat  dan tumbuh  dapat  ditingkatkan.  Bahan  pra-  sterilan yang diuji adalah aganol, alkohol dan desogerme, tutup tabung yang digunakan adalah parafilm dan kapas,  sedangkan  identifikasi    waktu    kultur dilakukan   melalui introduksi eksplan sepanjang
Nurhaimi-Haris et al.
tahun 2006 dan 2007 terhadap berbagai genotipe tanaman  karet  yang  tersedia.    Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  desogerme  menurunkan secara  nyata  tingkat  kontaminasi  eksplan dibandingkan  dengan  aganol  dan  alkohol, sedangkan  jenis  tutup  tabung  tidak  berpengaruh terhadap  persentase  kontaminasi.    Jenis  tutup tabung  berpengaruh  sangat  nyata    terhadap persentase  eksplan  yang  hidup  dan  membentuk tunas,  di  mana  persentase  eksplan  membentuk tunas pada tabung dengan tutup kapas lebih tinggi dibandingkan dengan tutup parafilm. Musim juga sangat  mempengaruhi  tingkat  kontaminasi eksplan.  Eksplan  sehat  jauh  lebih  banyak diperoleh  apabila  penanaman  eksplan  dilakukan pada bulan Juni sampai Oktober, yang merupakan musim  kemarau  di  Bogor  dibandingkan  dengan introduksi  eksplan  pada  bulan  Januari  sampai Mei,  yang  merupakan  musim  hujan.  Jenis genotipe  yang  ditanam  pada  tahap  kultur  primer tidak berpengaruh terhadap persentase kontaminasi.
[Kata kunci: Hevea brasiliensis , microcutting , kontaminasi mikroba, kultur in-vitro ]

## Pendahuluan
Microcutting merupakan  salah  satu teknik  mikropropagasi  tanaman  berbasis kultur in  vitro dan  telah  berhasil diaplikasikan  untuk  perbanyakan  tanaman karet  asal  biji  ( seedling )  dengan  meng- gunakan  tunas  aksiler  sebagai  eksplan (Carron  &  Enjalric,  1983).    Keuntungan teknik  tersebut  adalah  terbukanya  peluang untuk  menghasilkan  batang  bawah  klonal yang  selama  ini  belum  pernah  ada  pada tanaman  karet.  Penggunaan  batang  bawah klonal  akan  meningkatkan  keseragaman pertanaman  karet  di  lapang,  karena  klon batang  atas  didukung  oleh  batang  bawah yang  sama  dan  lebih  seragam,  dibanding- kan  dengan  batang  bawah  asal  biji  yang digunakan  saat  ini.    Di  samping  itu,
teknologi perbanyakan tersebut juga membuka  peluang  untuk  melakukan  seleksi terhadap  batang  bawah  sesuai  dengan karakter  yang  diinginkan,  misalnya  batang bawah  dengan  karakter  tahan  terhadap penyakit  akar  atau  toleran  terhadap  kondisi lahan kering.  Material bahan tanam tersebut kemudian  dapat  diperbanyak  secara  klonal . Penggunaan  batang  bawah  unggul  dan klonal berpeluang besar untuk meningkatkan produksi  lateks  dari  batang  atas  karena diduga  potensi  produksi  dapat  ditampilkan secara optimal.
Proses  perbanyakan  tanaman  karet melalui  teknologi microcutting terdiri  atas beberapa tahap, yaitu kultur primer ( primary culture ), multiplikasi, conditioning
(hardening) ,  induksi  dan  inisiasi  perakaran serta  aklimatisasi  (Carron et  al .,  2005).
Kultur  primer  merupakan  tahap  penanaman eksplan  pada  medium  pertumbuhan  steril untuk  menginisiasi  kultur  aseptik,  yang merupakan  tahap  awal  dalam  teknologi kultur  jaringan  (Ahloowalia et  al .,  2002). Eksplan pada tahap kultur primer merupakan potongan  batang  tanaman  karet  muda  yang dipelihara dalam polibeg di rumah kaca dan eksplan tersebut memiliki minimal satu mata tunas aksiler ( axillary bud ).  Dalam kondisi in vitro , eksplan yang bebas dari kontaminan dan tumbuh baik dapat diperbanyak melalui subkultur  berulang-ulang  sehingga  kultur primer  merupakan  tahap  yang  menentukan untuk keberhasilan dan keberlanjutan perba- nyakan  tanaman  menggunakan  teknologi tersebut.
Keberhasilan  implementasi  teknologi microcutting pada  tanaman  sangat  dipenga- ruhi  oleh  kemampuan  untuk  mengatasi masalah  kontaminasi,  yang  merupakan masalah  serius  dan  selalu  ditemui,  terutama di  daerah  beriklim  tropis  seperti  Indonesia. Seringkali  kegagalan  eksplan  untuk  tumbuh dan  berkembang  bukan  disebabkan  oleh
Pengaruh bahan pra-sterilan, tutup tabung kultur, dan musim terhadap.....
medium  pertumbuhan  yang  kurang  sesuai namun  oleh  tingginya  tingkat  kontaminasi. Pada microcutting karet,  metode  sterilisasi yang  efektif  telah  dilaporkan  di  daerah dengan  empat  musim  (Perancis)  sehingga eksplan  sehat  dapat  mencapai  90%,  dan ternyata  metode  yang  sama  tidak  efektif apabila diaplikasikan di daerah tropis seperti Guadeloupe  (Afrika).    Penerapan  metode sterilisasi  yang  sama  di  Guadeloupe  hanya menghasilkan  tanaman  aseptik  tidak  lebih dari  20%  (Enjalric et.  al .,  1988).
Kontaminan  utama  adalah  bakteri,  yakni mencapai  73%  dari  keseluruhan  konta- minasi, didominasi oleh genus Enterobacter dan Pseudomonas , sedangkan dari kelompok fungi  adalah Neurospora .    Di  alam,  jenis mikroba  tersebut  banyak  ditemukan  di tanah,  air  ataupun  ber-asosiasi  dengan tanaman.
Kontaminasi  oleh  bakteri Pseudo- monas dan  bakteri  Gram  negatif  lainnya dapat  disebabkan  oleh  beberapa  faktor, seperti  prosedur  sterilisasi  eksplan  dan medium  yang  tidak  efisien,  atau  keteram- pilan  dan  pemahaman  pekerja  yang  belum memadai untuk teknik kultur aseptik (Leifert & Cassells, 2001). Percobaan  pendahuluan microcutting tanaman  karet  di  Balai  Penelitian  Biotek- nologi  Perkebunan  Indonesia  (BPBPI) menunjukkan  bahwa  tingkat  kontaminasi tahap  kultur  primer  sangat  tinggi,  yakni  di atas  30%,  bahkan  pada  beberapa  kultur dapat  mencapai  100  %  (Nurhaimi-Haris  & Carron,  2007),  sehingga  menjadi  pembatas utama  aplikasi  teknologi  tersebut  untuk perbanyakan  skala  massal  secara  efisien. Apabila  dilakukan  sterilisasi  eksplan  yang terlalu  keras  maka  jaringan  di  sekitar  mata tunas rusak sehingga mempengaruhi pertum- buhan  eksplan,  bahkan  menyebabkan kematian  eksplan.  Oleh  karena  itu,  keber- hasilan  mengatasi  masalah  kontaminasi tanpa merusak eksplan merupakan tantangan
awal yang harus diatasi dalam implementasi teknologi microcutting tersebut.    Penelitian ini  bertujuan  untuk  mempelajari  pengaruh bahan  pra-sterilan  untuk  mencuci  eksplan, jenis  tutup  tabung  kultur  dan  waktu  yang tepat  untuk  introduksi  eksplan  pada  tahap kultur  primer  sehingga  tingkat  kontaminasi dapat ditekan serendah mungkin.

## Bahan dan Metode
Bahan  tanam  dan  inisiasi  kultur    (primary culture)
Genotipe  tanaman  karet  dengan  dua lingkaran  pertumbuhan  daun  (dua  payung) yang  ditumbuhkan  dalam  polibeg  di  rumah kaca  BPBPI,  Bogor,  digunakan  sebagai sumber  eksplan  dalam  penelitian  ini. Tanaman tersebut merupakan semai dari biji klon  GT  1,  RRIM  600  dan  PB  260  yang diseleksi pertumbuhannya di Kebun Percobaan  Balai  Penelitian  Sungei  Putih (Puslit  Karet)  tahun  2005.  Perlakuan sterilisasi yang digunakan adalah kombinasi antara  bahan  pra-sterilan  dalam  proses  pra- sterilisasi  eksplan  dengan  bahan  penutup tabung  kultur,  yaitu  aganol-parafilm  (bahan prasterilan  adalah  aganol,  bahan  penutup tabung  kultur  adalah  parafilm),  aganol- kapas,  alkohol-parafilm,  alkohol-kapas, desogerme-parafilm  dan  desogerme-kapas. Batang  tanaman  karet  muda  yang  me- ngandung  mata  tunas  aksiler  dikumpul-kan dan  dikelompokkan  berdasarkan  genotipe- nya.  Pra-sterilisasi  eksplan  dilakukan melalui  pencucian  eksplan  selama  lima menit  dengan  larutan  tertentu  (aganol 5  mL/L,  alkohol  70%,  desogerme  5  mL/L) sesuai  perlakuan,  kemudian  disterilisasi melalui  pencucian  sesaat  dengan  alkohol 70%,  direndam  dalam  larutan  H 2 O 2 17,6% selama  20  menit  dan  dicuci  dengan
Nurhaimi-Haris et al.
akuades  steril  sebanyak  tiga  kali.  Eksplan selanjutnya dipotong dengan ukuran    1,0– 1,5cm,  masing-masing  potongan  minimal mempunyai  satu  mata  tunas  aksiler. Kemudian  setiap  eksplan  direndam  selama 2,5 - 4 jam dalam tabung kultur yang berisi 10  mL  medium  MID  cair  (Carron et  al.,
2005). Setelah perendaman, eksplan dikulturkan dalam tabung kultur yang berisi 13  mL  medium  MM1  0H  padat  (Carron et al., 2005)  dengan  posisi  mata  tunas  aksiler menghadap  ke  atas.    pH  kedua  medium tersebut diatur pada 5,8 sebelum di Autoklaf pada  suhu  121 0 C  dengan  tekanan  1  atm selama  20  menit.  Berdasarkan  ketersediaan bahan  tanam  sumber  eksplan  (tanaman induk),  penanaman  eksplan  pada  media kultur pada tahun 2006 dilakukan dari bulan Februari  sampai  Desember  (kecuali  bulan September  dan  Oktober),  sedangkan  pada tahun  2007  dilakukan  dari  bulan  Januari sampai Oktober.
Kultur  dipelihara  di  rak  kultur  dengan pencahayaan  selama  12  jam/hari  meng- gunakan  lampu  TL  40  W  dengan  intensitas cahaya  sekitar  30  µmol  foton/m2/detik  dan dengan  kelembaban  relatif  berkisar  antara 65–80%.  Suhu ruang diatur pada kisaran 26 –  28 0 C.    Inisiasi  kultur  dilakukan  selama enam  minggu  sebelum  dipindah  ke  tahap berikutnya.    Pengamatan  dilakukan  setiap minggu  dan  parameter  yang  diamati  pada tahap  kultur  primer  adalah  jumlah  eksplan terkontaminasi  dan  mati,  mata  tunas  pecah serta  jumlah  tunas  yang  diperoleh  dari masing-masing genotipe.

## Multiplikasi eksplan
Setelah selesai tahap kultur primer (± 6 minggu),  eksplan  yang  menghasilkan  tunas selanjutnya diperbanyak.  Proses perbanyak- an  dilakukan  dengan  memotong  tunas  baru
menjadi  bagian  yang  lebih  kecil,  dan selanjutnya  dikulturkan  pada  medium  baru. Pada tahap ini terdapat tiga bentuk eksplan, yaitu stock eksplan  (S)  yang  merupakan eksplan  awal  yang  diperoleh  dengan memisahkan  tunas  baru  yang  terbentuk, nodal  eksplan  (NE)  yang  diperoleh  dari bagian  batang  tunas  baru,  serta shoot eksplan (ST) yang merupakan bagian apikal tunas  baru,  biasanya  mengandung  beberapa daun muda.
Masing-masing eksplan
tersebut dikulturkan  di  medium  baru  yang  berbeda, yaitu stock eksplan  dalam  medium  padat MM1,  nodal  eksplan  dalam  medium  padat MM2  dan  shoot  eksplan  dalam  medium padat  MA1  (Carron et  al., 2005).    Kondisi pemeliharaan  dan  lingkungan  kultur  sama seperti pada tahap kultur primer. Satu siklus tahap multiplikasi adalah empat minggu, dan tahap ini dapat diulang antara 3 – 12 siklus tergantung  jumlah  planlet  yang  diinginkan. Pengamatan  dilakukan  setiap  minggu  dan parameter  yang  diamati  adalah  jumlah eksplan  terkontaminasi  serta  jumlah stock eksplan,  nodal  eksplan  dan shoot eksplan pada setiap siklus multiplikasi.

## Hasil dan Pembahasan
Pengaruh  bahan  pra-sterilan  dan  tutup tabung
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa bahan  pra-sterilan  berpengaruh  nyata terhadap  persentase  kontaminasi  (Tabel  1). Tingkat kontaminasi eksplan pada perlakuan desogerme  secara  nyata  lebih  rendah dibandingkan  dengan  perlakuan  aganol  dan alkohol.  Desogerme  dan  aganol  merupakan larutan  disinfektan,  desogerme  dengan bahan  aktif quaternary  alkyl  chloride dan garam polyimino  biguanidide, sedangkan
Pengaruh bahan pra-sterilan, tutup tabung kultur, dan musim terhadap.....
aganol  dengan  bahan  aktif alkyl  dimethyl benzyl  ammonium  chloride .  Persentase kontaminasi  tidak  dipengaruhi  oleh  jenis tutup  serta  tidak  ada  interaksi  antara  bahan pra-sterilan  dan  jenis  tutup  terhadap persentase kontaminasi.
Kontaminasi  termasuk  pembatas  utama dalam  perbanyakan  tanaman  melalui  kultur in  vitro ,  terutama  apabila  sumber  eksplan berasal  dari  lingkungan  non-steril,  seperti rumah  kaca  atau  lapangan.  Penurunan tingkat kontaminasi eksplan dapat diupayakan  melalui  pre-kondisi  tanaman sumber  eksplan  dengan  bahan  antimikroba, seperti  fungisida,  yang  diikuti  dengan perlakuan  pencucian  eksplan  dengan disinfektan  tertentu  serta  penggunaan jaringan  tanaman  semuda  mungkin  sebagai eksplan  (Enjalric et  al .,  1988;  Lardet et  al .,
1994).    Desogerme  yang  digunakan  dalam proses  pra-sterilisasi  dengan  kombinasi bahan  aktif quaternary  alkyl  chloride dan
garam poly-imino  biguanidide memiliki kemampuan  merusak  membran  sel  dan protein  berbagai  jenis  mikroba,  termasuk fungi,  namun  cukup  aman  untuk  jaringan tanaman,  sehingga  secara  efektif  dapat digunakan sebagai disinfektan.
Jenis  tutup  tabung  berpengaruh  sangat nyata  terhadap  persentase  hidup  dan pembentukan tunas eksplan. Dengan larutan pra-sterilan  apapun  (aganol,  alkohol,  atau desogerme),  jumlah  eksplan  (mata  tunas aksiler) yang hidup dan meng-hasilkan tunas pada tabung kultur dengan tutup kapas jauh lebih  banyak  dibanding-kan  dengan  pada tabung  kultur  yang  ditutup  parafilm  (Tabel 2).  Tidak  ada  interaksi  antara  bahan  pra- sterilan  dan  jenis  tutup  terhadap  persentase tumbuh  eksplan.  Secara  visual  perbedaan pengaruh  jenis  tutup  tabung  terhadap pembentukan tunas dari setiap eksplan dapat dilihat  pada  Gambar  1.  Tutup  tabung  kapas mampu menginduksi dengan lebih baik mata
Tabel 1.  Persentase kontaminasi   eksplan microcutting karet pada dua jenis penutup tabung kultur dan tiga jenis bahan pra-sterilan.
Table 1.  Percentage of  contamination of   rubber  microcutting  explants  in  two kind  of culture tube closure and three kind of pre-sterilization agent.
Bahan pra-sterilan Pre-sterilization agent Penutup tabung kultur Culture tube closure Rerata Average Parafilm ( Parafilm )
Kapas ( Cotton )
Eksplan terkontaminasi (%) Contaminated explants (%) Aganol 50,8 44,9 47,9  a* Alkohol ( Alcohol ) 41,9 37,7 39,8  a Desogerme 27,1 21,4 24,2  b Rerata ( Average ) 39,9  a* 34,7  a
*) Masing-masing rerata  pada  kolom   dan  baris  yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata menurut uji jarak berganda Duncan pada P=0,05.
*) Each   average on  column  and  row  followed  by  the  same letters  are  not   significantly   different according to Duncan’s multiple range test at P=0.05 .
Nurhaimi-Haris et al.
tunas  aksiler  untuk  menghasilkan  tunas, dibandingkan dengan tutup tabung parafilm. Hal  ini  diduga  berhubungan  erat  dengan peluang  terjadinya  pertukaran  udara  ( gas exchange ) antara udara di dalam dan di luar tabung  kultur.  Penutup  tabung    kapas memberikan  peluang  aerasi  yang  lebih  baik dan  jenis  tutup  tabung  seperti  ini  banyak digunakan  di  awal  teknik  kultur in  vitro diperkenalkan.  Tabung,  botol  kultur,  atau bejana apapun yang digunakan dalam proses perbanyakan  kultur in  vitro ,  perlu  ditutup untuk  melindungi  eksplan  dan  media pertumbuhan,  baik  terhadap  konta-minasi mikroorganisme  maupun  penguapan  yang berlebihan.  Namun  penutup  yang  diguna- kan harus tetap memberi peluang terjadinya pertukaran  udara  di  dalam  tabung. Pertukaran  udara  berperan  penting  dalam ketersediaan  oksigen  dan  CO 2 ,  serta penguapan  air  dan  eliminasi  gas  etilen  di dalam  tabung  kultur  (Prakash et  al .,  2002).
Gas  etilen  merupakan  fitohormon  yang dihasilkan  planlet  dan  akan  terakumulasi  di
dalam tabung atau botol kultur apabila tutup tabung  atau  botol  terlalu  rapat  (Kozai  & Kubota, 2005).  Akumulasi gas etilen dalam jumlah tertentu dapat merusak pertumbuhan planlet (Prakash et al., 2002).

## Pengaruh musim terhadap kontaminasi
Perlakuan  terbaik  pada  percobaan  di atas,  yaitu  desogerme  sebagai  larutan  pra- sterilan,  dikombinasi  dengan  tutup  tabung kapas  yang  dibungkus  dengan  kain  kasa, digunakan  dalam  penelitian  selanjutnya. Sepanjang  tahun  2006  dan  2007  telah ditanam  sekitar  7.556  eksplan  pada  tahap kultur  primer . Eksplan  yang  terkontaminasi oleh mikroba, terutama fungi biasanya dapat diamati  pada  10  hari  pertama  kultur  dan semakin berkurang setelah melewati 10 hari tersebut.    Namun  kontaminan  yang  bersifat laten, yakni yang tidak terlihat secara visual biasanya  akan  bertahan  lama  pada  kultur tanpa  menunjukkan  gejala  pada  pertum- buhan  tanaman  ataupun  medium  (Leifert  &
Tabel 2.  Persentase hidup eksplan microcutting karet pada dua jenis penutup tabung kultur dan tiga jenis bahan pra-sterilan.
Table 2.  Percentage of  survival  explants of  rubber microcutting  explants  in two  kind  of culture tube closure and three kind of pre-sterilization agent.
Bahan pra-sterilan Pre-sterilization agent Penutup tabung kultur Culture tube closure
Rerata
Average Parafilm ( Parafilm )
Kapas ( Cotton )
Eksplan hidup (%) Survival explants (%) Aganol 8,6 41,4 25,0  a* Alkohol ( Alcohol ) 7,4 49,8 28,6  a Desogerme 20,4 61,5 40,9  a Rerata ( Average ) 21,1  b* 50,9  a
*) Masing-masing  rerata  pada kolom  dan baris  yang  diikuti  oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata menurut uji jarak berganda Duncan pada P=0,05.
*) Each average on column and row followed by the same letter are not significantly  different according to Duncan’s multiple range test at P=0.05 .
Pengaruh bahan pra-sterilan, tutup tabung kultur, dan musim terhadap.....
Gambar 1. Penampilan  eksplan  tanaman  karet  pada  tabung  kultur  dengan  dua jenis bahan penutup tabung: (a) parafilm, (b) kapas.
Figure 1.  Performance of rubber explants in culture tubes with two kinds of tube closure: (a) parafilm, (b) cotton .
Cassells,  2001).  Tingkat  kontaminasi  kultur pada  tahap  akhir  kultur  primer  pada  setiap bulan penanaman menunjukkan variasi yang sangat  tinggi  dari  waktu  ke  waktu,  namun terdapat  pola  yang  mirip  sepanjang  tahun (Gambar 2).
Kultur  eksplan  yang  dilakukan  sekitar bulan  Januari  sampai  Mei,  yang  merupakan bulan-bulan basah setiap tahunnya di Bogor, menunjukkan  tingkat  kontaminasi    relatif tinggi, baik tahun 2006 maupun 2007. Rata- rata  kontaminasi  pada  bulan-bulan  tersebut melebihi  30%,  yaitu  batas  maksimal  konta- minasi yang diperbolehkan pada tahap kultur primer  (Carron,  komunikasi  pribadi). Sebaliknya,  apabila  penanaman  eksplan dilakukan  pada  bulan-bulan  kering  sekitar Juni  sampai  Oktober  tingkat  kontaminasi turun  sampai  di  bawah  batas  maksimum (30%).
Keberhasilan  teknologi microcutting untuk  perbanyakan  massal  bahan  tanam karet  secara  klonal  sangat  ditentukan  oleh dua hal, yaitu kemampuan mengatasi tingkat kontaminasi  serta  respon  dari  eksplan. Kontaminasi  seringkali  menjadi  masalah serius,  terutama  untuk  eksplan  yang  berasal dari  lingkungan  luar  seperti  lapangan  dan
rumah  kaca  (Niedz  &  Bausher,  2002). Dalam  penelitian  ini,  dari  7.556  eksplan tanaman  karet  yang  dikulturkan  pada  tahap kultur  primer  sepanjang  tahun  2006  dan 2007,  kehilangan  kultur  akibat  kontaminasi mencapai  26%  dan  eksplan  tidak  responsif (mati)  mencapai  10%.  Tingkat  kontaminasi tersebut  masih  lebih  rendah  dibandingkan dengan  perbanyakan  tanaman  bambu ( Guadua  angustifolia )  menggunakan  tunas aksiler, dimana sebagian besar eksplan yang berasal  dari  tanaman  di  lapangan  terkonta- minasi sedangkan yang berasal dari tanaman di rumah kaca terkontaminasi sebanyak 50% (Jimenez et al ., 2006).
Jumlah eksplan sehat pada tahap kultur primer  sangat  dipengaruhi  oleh  waktu penanaman  eksplan  (Gambar  3).    Kultur eksplan  yang  dilakukan  pada  bulan  basah (Februari – April 2008) hanya menghasilkan eksplan  sehat  di  bawah  50%,  namun  pada bulan  kering  (Juli  dan  Agustus  2008)  dapat meningkatkan eksplan sehat, bahkan mendekati  80%  pada  pelaksanan  bulan Agustus  (Gambar  3).    Dengan  demikian untuk  meningkatkan  efisiensi  perbanyakan tanaman  karet  dengan  teknologi micro- cutting perlu  diperhatikan  waktu  yang  tepat
a b
Nurhaimi-Haris et al.
Gambar 2.  Tingkat kontaminasi tahap akhir kultur primer pada tanaman karet yang diperbanyak dengan teknologi microcutting dari waktu ke waktu sepanjang Februari 2006 s/d Oktober 2007.
Figure 2.   Contamination level at the end of primary culture on rubber plant propagated through microcutting technology from time to time during February 2006 until October 2007.
Musim kemarau ( Dry season ) Musim hujan ( Rainy season ) Musim kemarau ( Dry season ) 0 10 20 30 40 50 60 Fe b-0 6 Ma r-0 6 Ap r-0 6 Ma y-0 6 Ju n-0 6 Ju l-0 6 Au g-0 6 Se p-0 6 Oc t-0 6 No v-0 6 De c-0 6 Ja n-0 7 Fe b-0 7 Ma r-0 7 Ap r-0 7 Ma y-0 7 Ju n-0 7 Ju l-0 7 Au g-0 7 Se p-0 7 Oc t-0 7 Waktu (date) Ti ngk at k ont am ina si ( % ) Le ve l of co n tam in at io n ( % ) % contam 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Feb-08 Mar-08 Apr-08
May-08 Jun-08 Jul-08
Aug-08
Bulan (Month) Ek s p la n h id u p , te rk o n ta m in a s i d a n m a ti ( % ) Al iv e , c o n ta m in a te d & d e a d e x p la n t (% ) % mati/tidak respon (dead & no response) % kontaminasi (contaminated) % hidup (alive)
Gambar 3.  Variasi eksplan tanaman karet yang hidup, terkontaminasi dan mati pada tahap akhir kultur  primer pada berbagai waktu kult ur.
Figure 3.   Variation of  live, contaminated and dead rubber explants at the end of primary culture at  various dates of culture .
Pengaruh bahan pra-sterilan, tutup tabung kultur, dan musim terhadap.....
Tabel 3.   Persentase kontaminasi eksplan microcutting karet dari 15 genotipe,  dikulturkan pada musim berbeda.
Table 3.  Percentage of contamination of rubber microcutting explants from 15 genotypes, cultured at different season.
Genotipe Genotype Kontaminasi  ( Contamination ) (%) Musim hujan +) Rainy season Musim kemarau ++) Dry season 2 45,90 18,72 4 30,69 13,24 5 36,94 17,81 7 51,80 17,84 9 34,08 18,78 11 64,75 16,99 26 41,31 9,92 38 56,21 11,68 43 45,83 10,32 55 43,33 11,08 58 62,73 10,14 60 46,97 10,90 63 43,59 14,59 78 30,14 26,05 91 49,71 16,03 Rerata Average 45,60 a* 14,94 b
+) January – May 2006 & 2007 ++) June – October 2006 & 2007
*) Rerata pada kolom yang diikuti oleh huruf yang berbeda menunjukkan beda nyata menurut uji-t pada  P=0,05.
*) Average on column followed by the different letters are significantly different according to t-test at P=0.05 .
untuk  menanam  eksplan  pada  tahap  kultur primer.    Berdasarkan  data  pada  Gambar  2 dan  3  diketahui  bahwa  waktu  penanaman eksplan yang sesuai adalah pada bulan-bulan kering, yaitu Juni sampai Oktober, sehingga kehilangan  kultur  akibat  kontaminasi  dapat ditekan  seminimal  mungkin  dan  persentase hidup eksplan jauh lebih tinggi.

## Pengaruh genotipe terhadap kontaminasi
Untuk mengetahui apakah jenis genotipe  karet  memberikan  pengaruh  ter-
hadap  tingkat  kontaminasi  dilakukan  peng- ujian  menggunakan  15  macam  genotipe, yaitu  genotipe-genotipe  yang  menunjukkan respons  pertumbuhan  yang  baik  dalam lingkungan kultur in vitro .  Hasil pengujian menunjukkan  bahwa  genotipe  karet  tidak berpengaruh  terhadap  persentase  kontami- nasi serta tidak ada interaksi antara genotipe dan musim terhadap persentase kontaminasi tersebut (Tabel 3). Dari data ini jelas terlihat bahwa  persentase kontaminasi sangat nyata dipengaruhi  oleh  musim,  apapun  jenis genotipe yang dikulturkan.
Nurhaimi-Haris et al.

## Kesimpulan
Pada  perbanyakan  tanaman  karet menggunakan teknologi microcutting , bahan pra-sterilan  desogerme  pada  tahap  pre- sterilisasi  eksplan  secara  nyata  menurunkan tingkat  kontaminasi  eksplan  dibandingkan bahan  pra-sterilan  aganol  dan  alkohol, sedangkan  jenis  tutup  tabung  tidak mempengaruhi  tingkat  kontaminasi.    Jenis genotipe  karet  tidak  berpengaruh  terhadap persentase  kontaminasi  serta  tidak  ada interaksi  antara  genotipe  dan  musim terhadap persentase kontaminasi.  Penurunan tingkat  kontaminasi  juga  dicapai  apabila penanaman  eksplan  tahap  kultur  primer dilakukan  pada  bulan-bulan  kering.    Mata tunas eksplan akan berkembang membentuk tunas  apabila  jenis  tutup  tabungnya  adalah kapas  yang  dibungkus  kain  kasa.  Dengan demikian,  tutup  tabung  kapas  menginduksi dengan  lebih  baik  pembentukan  tunas dibandingkan dengan tutup tabung parafilm.

## Daftar Pustaka
Ahloowalia BS, J Prakash, VA Savangikar & C Savangikar  (2002). Plant  tissue  culture. In: Low  Cost  Options  for  Tissue  Culture Technology  in  Developing  Countries. Proceedings  of  a  Technical  Meeting organized by the Joint FAO/IAEA Division of  Nuclear  Techniques  in  Food  and Agriculture. Vienna, 26–30 August 2002.
Carron MP & F Enjalric (1983).  Perspectives du microbouturage  de l’Hevea  brasiliensis .
Caoutchoucs et Plastiques 627-628, 65-68.
Carron  MP,  L  Lardet  &  P  Montoro  (2005). Hevea  microcutting. Technical  Notes  on The Process .  CIRAD
Enjalric  F,  MP  Carron  &  L  Lardet  (1988). Contamination  of  primary  cultures  in
tropical  areas:  The  case  of Hevea brasiliensis . Acta Horticult 225, 57 – 65.
Jimenez  VM,  J  Castillo,  E  Tavares,    E  Guevara & M Montiel (2006). In vitro propagation of the  neotropical  giant  bamboo, Guadua angustifolia Kunth,  through  axillary  shoot prolifaration. Plant Cell Tiss & Org Cult 86, 389-395. Kozai  T  &  C  Kubota  (2005). In  vitro aerial environments  and  their  effects  on  growth and development of plants. In : Kozai et al .  (Eds) Photoautotrophic  (Sugar  Free Mendium(  Micropropagation  as  a  New Micropropagation and Transplant Production  System .    The  Netherlands. Kluwer Academic Publisher. p, 31-52.
Lardet  L,  M  Bes,  F  Enjalric  &  MP  Carron (1994).  Mineral  imbalance  in Hevea brasiliensis microcuttings:  Relation  with in vitro multiplication and acclima-tization. J Plant Nutrition 17(12), 2135-2150.
Leifert  C  &  AC  Cassells  (2001).  Microbial hazards  in  plant  tissue  and  cell  cultures. In vitro Cell Dev Biol Plant 37, 133-138.
Niedz RP & MG Bausher (2002).  Control of in vitro contamination  of  explants  from greenhouse- and field-grown trees. In Vitro Cell Dev Biol 38(5), 468-471.
Nurhaimi-Haris  &  MPCarron  (2007). Progress Report .  Toward  the  development  of rootstock  clones  for  high  productivity  in rubber plants ( Hevea brasiliensis Muell.Arg.).  Bogor,    Indonesian  Biotech- nology  Research  Institute  for  Estate  Crops. PI. 01/Bud/2007.
Prakash J, MI Hoque & T Brinks (2002). Culture media and containers. In: Low Cost Options for Tissue Culture Technology In
Developing  Countries .  Proceedings  of  a Technical  Meeting  organized  by  the  Joint FAO/IAEA Division of Nuclear Techniques in  Food  and  Agriculture.  Vienna,  26–30 August 2002.