Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2015.26.1.124 Hasil Penelitian
PARAMETER  KINETIKA  INAKTIVASI  TERMAL  DAN  ISOLASI Staphylococcus aureus PADA  MINUMAN  DARI  GEL  CINCAU  HIJAU  DAN  ROSELA
[Thermal Inactivation Kinetics Parameter and Isolation of Staphylococcus aureus on Drink from Green Grass  Jelly and Roselle]
Eko Hari Purnomo 1,2) *, Puspo Edi Giriwono 1,2) , Dias Indrasti 1,2) , Antung Sima Firlieyanti 1,2) , dan Andini  Giwang Kinasih 1)
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Southeast Asian Food and Agriculture Science and Technology (SEAFAST), Bogor
Diterima 06 April 2015 / Disetujui 26 Juni 2015

## ABSTRACT
Information ab out heat resistance (D and z values) of target b acteria is needed for the thermal process design on drink from  Green Grass Jelly (Premna ob longifolia Merr.) and Roselle (Hib iscus sab dariffa L.) , so  it  can  guarantee  quality  and  safety  of  the  product.  The  ob jectives  of  this  research  were  to  isolate Staphylococcus  aureus  from  commercial  green  grass  jelly  and  to  determine  the  D  and  z  values  of Staphylococcus aureus (from commercial product and standard clinical isolate ATCC 25923) on heating menstruum  of green grass jelly and roselle. Isolation of S. aureus was done b y  inoculation in selective medium, D and z values of Staphylococcus aureus were assessed b y heating at constant tem peratures of 57,  53,  49,  and  45°C  during  the time interval 2.5, 5, 10, and 15 minutes.  The results showed that one isolate  (Isolate  A)  gave  positive  response  of  Staphylococcus  aureus in isolation tests and had similar percentage with the reference culture of 41.8% using the API Staph Kit. Heat resistance of Staphylococcus aureus (represented as D value) isolated from  green grass jelly at constant heating temperature of D 45 , D 49 ,  D 53 and  D 57 were  32.3,  17.9,  4.6,  and  1.5  minutes.  On  the  other  hand,  D value of isolates ATCC 25923 (standard clinical isolate) at constant heating temperature of D 45 , D 49 , D 53 and D 57 were 18.5, 6.8, 2.9, and 1.4 minutes. The z value of isolates A and ATCC 25923 were 8.8°C and 10.8°C. Smaller z value of  isolate  A  showed  that pasteurization process can b e accelerated and optimized with  increasing the temperature slightly b ut has the same lethality effect.
Keywords: D value, green grass jelly, roselle, Staphylococcus aureus, z value

## ABSTRAK
1
Informasi mengenai ketahanan panas  (nilai D dan z) bakteri target diperlukan dalam  desain proses termal  terhadap  minuman  yang  terbuat  dari  gel  cincau  hijau  (P remna  ob longifolia Merr.)  dan  rosela ( Hib iscus sab dariffa L.) sehingga dapat menjamin mutu dan keamanan produk. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi Staphylococcus aureus dari gel cincau hijau komersial dan menentukan nilai D dan z Staphylococcus aureus (isolat asal cincau hijau dan isolat klinis ATCC 25923) pada heating menstruum minuman dari gel cincau hijau dan rosela. Isolasi S. aureus dilakukan dengan penanaman pada medium selektif. Nilai D dan z Staphylococcus aureus diuji dengan panas  pada suhu konstan 57, 53, 49, dan 45°C selama interval waktu 2,5; 5; 10; dan 15 menit. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat A menunjukkan hasil positif Staphylococcus aureus pada pengujian isolasi dan memiliki persentase kesamaan dengan kultur referensi 41,8% menggunakan kit API Staph. Ketahanan panas Staphylococcus aureus (direpre- sentasikan sebagai nilai D) yang diisolasi dari gel cincau hijau pada suhu pemanasan konstan D 45 , D 49 , D 53 dan D 57 yaitu sebesar 32,3; 17,9; 4,6; dan 1,5 menit secara berurutan. Disisi lain, nilai D dari isolat ATCC 25923 pada suhu pemanasan konstan D 45 , D 49 , D 53 dan D 57 adalah 18,5; 6,8; 2,9; dan 1,4 menit secara  berurutan.  Nilai z dari Isolat Staphylococcus aureus A dan isolat Staphylococcus aureus ATCC 25923 adalah 8,8°C dan 10,8°C. Nilai z yang lebih kecil pada isolate S. aureus A menunjukkan bahwa proses pasteurisasi dapat dipercepat dan dioptimumkan dengan peningkatan suhu yang tidak terlalu besar namun efek letalitas yang sama.
Kata kunci: gel cincau hijau, nilai D, nilai z, rosela, Staphylococcus aureus
*Penulis Korespondensi : Email:  ekohari_p@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Saat ini,  terjadi  peningkatan  permintaan masyarakat  terhadap  produk  pangan  fungsional. Salah  satu  produk  pangan  fungsional  yang  sudah banyak  diteliti  dan  mulai  dikonsumsi  oleh  ma- syarakat  adalah  gel  cincau  hijau  dan  ekstrak  bunga rosella  (Sugito,  2011).  Secara  tradisional,  daun cincau  hijau  ( Premna  oblongifolia Merr.) digunakan sebagai  minuman  penyegar  dalam  bentuk  gel (Nurdin et  al., 2008).  Kandungan  komponen  aktif yang  terkandung  dalam  daun  cincau  hijau  yaitu karotenoid, flavonoid, dan klorofil. Manfaat kesehatan  dari  konsumsi  cincau  hijau  antara  lain dapat  menurunkan  panas  badan,  mual-mual,  dan gangguan  pencernaan.  Manfaat  dari  kandungan komponen  aktif  daun  cincau  hijau  menyebabkan upaya pengembangan produk cincau sebagai sumber  serat  pangan  mulai  dikembangkan  (Nurdin, 2007).  Meskipun  kaya  akan  manfaat,  gel  cincau hijau  merupakan  jenis  pangan  yang  memiliki  potensi dari  aspek  bahaya  mikrobiologis.  Potensi  bahaya tersebut  disebabkan  tidak  adanya  proses  pe- manasan  dalam  pembuatan  gel  cincau  hijau  secara konvensional.  Umumnya,  pembuatan  gel  cincau hijau  dilakukan  dengan  mengekstrak  daun  cincau menggunakan  air  dingin  (Prangdimurti et al., 2014). Tanaman  rosela  merupakan  jenis  tanaman dengan bunga berwarna merah dan banyak dijumpai  di  Indonesia.  Bagian  dari  bunga  rosela yang  dapat  diolah  menjadi  produk  pangan  yaitu bagian  kelopak  bunga  yang  mengandung  senyawa kimia  antara  lain  antosianin, gossypeptin ,  glukosida, hibiscin,  vitamin  A,  vitamin  C,  asam  amino,  asam organik,  polisakarida,  dan  unsur-unsur  lain  yang  di- perlukan  tubuh.  Sementara  komponen  aktif  yang terkandung  dalam  bunga  rosela  adalah  saponin, flavonoid,  kuinon,  dan  steroid  (Darusman et  al., 2012).  Manfaat  kesehatan  yang  diperoleh  melalui konsumsi  rosela  yaitu  menurunkan  kolesterol  tinggi, hipertensi,  mencegah  gangguan  jantung,  mencegah kanker,  sariawan,  dan  sembelit  (Wijakusuma  2008 dan  Atiqoh et  al., 2011).  Berdasarkan  manfaat kesehatan  serta  kandungan  komponen  aktif  dalam rosela  dan  daun  cincau  hijau,  maka  dapat  dikem- bangkan  minuman  dari  gel  cincau  hijau  dan  rosela merupakan  makanan  pencuci  mulut  yang  ber- manfaat  bagi  kesehatan.
Selain  manfaat  bagi  kesehatan  yang  ada pada  pangan  fungsional,  keamanan  pangan  me- rupakan  faktor  utama  yang  tidak  dapat  diabaikan. Pengolahan  pangan  yang  tepat  perlu  dilakukan untuk  menjamin  keamanan  pangan  konsumen. Kejadian  keracunan  makanan  umumnya  dapat terjadi  salah  satunya  karena  cemaran  mikroba. Staphylocoocus aureus merupakan  salah  satu
mikroba  jenis Staphylococcus sp . yang  paling berbahaya  karena  dapat  menyebabkan  keracunan pangan  apabila  jumlah  selnya  mencapai  10 5 -10 6 /g makanan  (Tille,  2012).  Bakteri  ini  secara  alami  ter- dapat  pada  tubuh  manusia,  di  udara,  di  lingkungan sekitar  dan  dapat  mengkontaminasi  makanan  yang diolah  dengan  kondisi  sanitasi  tidak  cukup  baik. Proses  pembuatan  cincau  hijau  yang  tidak  meng- gunakan  pemanasan  dan  budaya  praktek  higiene yang  rendah  dapat  menyebabkan  kemungkinan cemaran  mikrobiologis  yang  tinggi.  Berdasarkan penelitian  Pramitasari  (2012),  hasil  analisis  mikro- biologi  terhadap  14  sampel  cincau  hijau  memper- lihatkan  bahwa  sampel  cincau  hijau  mengandung total  mikroba, E.  coli ,  dan Staphylococcus sp.  Ber- turut-turut  sebesar:  1,6x10 4 –2,4x10 6 ;  3,0x10 2 -  4,4  x
10 3 ,  dan  2,5x10 1 -2,0x10 3 CFU/g.  Oleh  karena  itu, gel  cincau  hijau  berpotensi  mengandung  jumlah mikroba  yang  tinggi  disebabkan  tidak  adanya  pe- manasan  dalam  proses  pembuatannya.  Penelitian yang  dilakukan  oleh  Handayani  dan  Werdiningsih (2010)  menunjukkan  bahwa  produk  cincau  hijau dapat  mengandung  total  mikroba  hingga  7,2  x  10 7 CFU/mL dan positif mengandung Salmonella- Shigella .
Proses  termal  pasteurisasi  cincau  hijau  dalam medium  teh  rosela  kemasan  dapat  diaplikasikan untuk  meningkatkan  mutu  dan  keamanan  produk minuman  dari  gel  cincau  hijau  dan  rosela.  Hal  ini karena  proses  termal  merupakan  metode  pengawet- an  pangan  yang  mampu  memproduksi  produk pangan  dengan  umur  simpan  yang  lebih  panjang (Huang,  2013).  Kecukupan  proses  pemanasan dalam  produk  pangan  didasarkan  pada  ketahanan panas  mikroba  target  yang  dinyatakan  dalam  nilai  D dan  z  (Sukasih et  al., 2009).  Oleh  karena  itu,  pene- litian  ini  dilakukan  dengan  tujuan  untuk  mengisolasi mikroba  target  yaitu Staphylococcus  aureus dari  gel cincau  hijau  dan  mengetahui  parameter  dalam kinetika  inaktivasi  termal  (D  dan  z) Staphylococcus aureus selama proses pemanasan. Penelitian mengenai  kinetika  inaktivasi  termal Staphylococcus aureus yang  diisolasi  langsung  dari  cincau  hijau  ini bermanfaat  untuk  menentukan  parameter  inaktivasi termal  (D  dan  z)  yang  selanjutnya  dapat  digunakan sebagai  bahan  acuan  dalam  penetapan  kecukupan proses  termal  selama  pemanasan  bahan  pangan (Bahçeci  and  Acar,  2007).  Parameter  inaktivasi termal  isolat S.aureus dari  gel  cincau  hijau  tersebut akan  dibandingkan  dengan  referens  yaitu S.  aureus yang  diisolasi  dari  tubuh  manusia.  Hal  ini  karena setiap  mikroba  memiliki  ketahanan  panas  yang berbeda  tergantung  pada  medium  pertumbuhannya (Krapf et al., 2010).

## BAHAN  DAN METODE

## Bahan
Bahan  baku  utama  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  daun  cincau  hijau  segar  yang diperoleh dari Dramaga,  Bogor  (Jawa  Barat), kelopak  bunga  Rosela  kering  yang  diperoleh  dari supermarket  Giant  Dramaga,  Bogor  (Jawa  Barat), serta  gula  pasir  lokal  yang  diperoleh  dari  toko sekitar Kampus  IPB, Dramaga.

## Pembuatan gel cincau hijau
Daun  cincau  hijau  ( Premna  oblongifolia Merr.) diperkecil  ukurannya  menjadi  3  x  1,5  cm 2 ,  dihomo- genisasi  menggunakan  blender  (Philips,  Indonesia) dengan  air  panas  (100°C)  dengan  perbandingan  1  : 10  (w/v).  Cincau  hijau  disaring  dengan  kain  dan  di- tambahkan dengan 2% karagenan (Merck, Germany).  Filtrat  dicetak  dan  didinginkan  dalam suhu  4°C  selama 24  jam (Susantikarn,  2014)

## Pembuatan teh rosela
Kelopak  bunga  rosela  ( Hibiscus  sabdariffa L.) diekstrak  dengan  air  panas  100°C  (rasio  rosela:  air adalah  1:62,  W/V)  selama  30  menit.  Kemudian ekstrak  disaring  dengan  kain  setelah  mencapai  suhu ruang  (30°±2°C).  Ekstrak  rosela  ditambah  dengan gula  pasir  sebanyak  15  %  (w/v)  dan  disimpan  pada suhu  4°C  (Susantikarn,  2014).
Pembuatan  produk  minuman  dari  gel  cincau hijau dan rosela
Gel  cincau  hijau  dicampurkan  dengan  ekstrak rosela  dengan  perbandingan  4:5 (b/b).
Penanaman  pada media Baird Parker Agar (BPA) dan Egg Yolk Tellurite (EYT) Isolasi S.  aureus dilakukan  menggunakan media  BPA  dan  YET.  Persiapan  isolasi  dilakukan dengan  menimbang  sebanyak  25  gram  padatan cincau  hijau,  ditempatkan  dalam  plastik  steril  lalu  di- tambahkan  larutan  fisiologis  NaCl  0,8%  (Merck, Germany)  sebanyak  225  mL.  Homogenisasi  dilaku- kan  dengan  alat stomacher (Seward  stomacher®, United Kingdom). Larutan tersebut  diencerkan kemudian  diambil  1  mL  untuk  diinokulasikan  pada tiga  cawan  yang  berisi  media  BPA  (Oxoid,  England) dan  EYT  (Oxoid,  England)  masing-masing  0,4;  0,3; dan  0,3  mL.  Suspensi  kemudian  diratakan  dengan menggunakan hock ey  stick steril  hingga  suspensi mikroba  di  permukaan  media  tidak  terlihat.  Cawan diinkubasi  dengan  posisi  terbalik  pada  suhu  35°C selama  45-48  jam  menggunakan  inkubator  (Fischer sciencetific,  United  States).  Setelah  inkubasi,  di- lakukan  pengamatan  koloni S.  aureus sebagai  isolat yang  mempunyai  ciri  khas  berbentuk  bundar,  licin
dan  halus,  cembung,  diameter  2-3  mm,  berwarna abu-abu  sampai  hitam  pekat,  dan  dikelilingi  zona opaque dengan  zona  luar  yang  bening  ( clear  zone ) (Karlina et  al., 2013).  Koloni S.aureus memiliki konsistensi  seperti  mentega  bila  disentuh  dengan ose (Bennett  dan  Lancette,  2001).

## Pewarnaan Gram
Metode  pewarnaan  Gram  dilakukan  dengan mengambil  sedikit  koloni  terpisah  pada  media  BPA dan  EYT  dengan  ose  lalu  dioleskan  pada  gelas preparat.  Preparat  olesan  bakteri  difiksasi  pada pembakar  spirtus,  ditetesi  dengan  larutan Huck er's crystal violet  (Difto  Bacto®,  United  States)  selama  1 menit  kemudian  dicuci  sebentar  dengan  air  kering- kan  dengan  tisu.  Selanjutnya  preparat  ditetesi dengan  larutan  iodin  (Merck,  Germany)  selama  1 menit,  dicuci  dengan  air  mengalir,  dan  dikeringkan dengan tisu. Kemudian dekolorisasi  dilakukan dengan  meneteskan  ethanol  95%  (Setiaguna  Bogor, Indonesia)  hingga  seluruh  warna  biru  hilang  (kira- kira  30  detik).  Preparat  dicuci  kembali  dengan  air mengalir  dan  dikeringkan.  Selanjutnya,  preparat ditetesi dengan larutan Huck er's counterstain (safranin)  (Merck,  Germany)  selama  1  menit,  dicuci dengan  air  mengalir,  dan  dikeringkan.  Preparat diamati dibawah mikroskop (Olympus model CX21FS1,  Jepang)  dengan  perbesaran  100x  (BSN, 2011).

## Uji katalase
Uji  katalase  dilakukan  dengan  mengambil satu  ose  inokulum  yang  telah  disegarkan  dan  di- letakkan  di  atas  gelas  preparat,  kemudian  tetesi dengan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) (Merck, Germany)  untuk  melihat  pembentukan  gelembung- gelembung  gas  (Hardiningsih et  al., 2006).  Reaksi positif  ditandai  dengan  timbul  banyak  gelembung udara.

## Uji koagulase
Koloni  terduga Staphylococcus  aureus diin- okulasi  ke  dalam  0,2-0,3  mL Brain  Heart  Infussion Broth (BHIB)  (Bacto TM ,  United  States)  lalu  diin- okulasikan  ke  agar  miring Tryptose  Soya  Agar (TSA) (Oxoid,  England),  dan  diinkubasi  selama  18-24  jam pada  suhu  35°C.  Selanjutnya  sebayak  0,5  mL  koa- gulase  plasma  ditambahkan,  diaduk  dan  inkubasi pada  suhu  35°C.  Tabung  tersebut  diamati  setiap  6 jam  sekali  hingga  48  jam  untuk  melihat  terbentuk - nya  koagulan.  Reaksi  positif  teramati  bila  tabung dibalik  koagulan  tidak  jatuh  karena  terbentuk  secara padat  (+4)  yang  dapat  dilihat  pada  Gambar  1.  Tipe +2  dan  +3  memerlukan  uji  konfirmasi  lebih  lanjut (Bennett  dan  Lancette,  2001).
Gambar  1. Tipe  gumpalan  pada  uji koagulase
Penanaman  pada  media Mannitol  Salt  Agar (MSA)
Penanaman  dengan  MSA  (Oxoid,  England) dilakukan dengan cara mengambil satu ose inokulum  dan  digoreskankan  pada  media  MSA,  lalu diinkubasi  pada  37°C  selama  24  jam  menggunakan inkubator  (Heraeus  electronic,  Germany)  (Dewi, 2013).

## Pengujian dengan kit API staph
Pengujian  dengan  kit  API  Staph (Biome- rieux,  United  States)  dilakukan  melalui  tahapan: preparasi  strip,  preparasi  inokulum,  dan  inokulasi (Koop et  al., 2012).  Tahap  preparasi  strip  dilakukan dengan  pemberian  sedikit  air  destilata  steril  pada tray  kit  API  Staph  untuk  memberikan  kelembaban selama  inkubasi.  Tahap  preparasi  inokulum  di- lakukan  dengan  menyegarkan  isolat  pada  agar  TSA yang  diinkubasi  selama  18-24  jam  pada  suhu  36°C (Yulvizar et  al., 2014).  Tahap  inokulasi  dilakukan dengan  inokulasi  kultur  yang  berumur  18-24  jam  ke API  Staph  medium.  Selanjutnya  inokulasikan  2 sampai  3  tetes  suspensi  bakteri  pada  masing- masing microcupule .  Kit  API  Staph  yang  telah  diin- okulasikan  bakteri  kemudian  ditutup  dan  diinkubasi selama  18-24  jam  pada  suhu  35 –37°C  dan  diamati perubahan  yang  terjadi  dengan  memberikan  tanda positif  jika terjadi perubahan.

## Persiapan inokulum
Staphylococcus aureus diperoleh dengan cara  memindahkan  kultur  dari  agar  miring  TSA dengan  ose  ke  dalam  9  mL Trypticase  Soya  Broth (TSB)  (Difco TM ,  France)  kemudian  diinkubasi  selama 24  jam  pada  suhu  35°C.  Pada  fase  Log  akhir  ini jumlah  bakteri Staphylococcus  aureus diperkirakan 1,0x10 8 –1,0x10 9 CFU/mL.
Persiapan heating  menstruum Pembuatan heating  menstruum dilakukan dengan  memindahkan  9  mL  media  uji  yang  telah dihancurkan  (minuman  dari  gel  cincau  hijau  dan rosela)  ke  dalam  erlenmeyer  50  mL.  Media  uji  yang telah  dibuat  kemudian  disterilisasi  pada  suhu  121°C selama  15  menit  menggunakan  autoclave  (ALP, Jepang)  (Meliawaty,  2012).

## Uji ketahanan panas
Prinsip  uji  ketahanan  panas  yaitu  memanas - kan  sampel  berisi  isolat  pada  kombinasi  suhu  dan waktu  tertentu  (Sukasih et  al., 2009).  Uji  ketahanan panas  dilakukan  menggunakan  lima  buah  Erlen- meyer.  Satu  erlenmeyer  digunakan  sebagai  kontrol (ditempatkan  termometer  100°C).  Perlakuan  suhu 57,  53,  49,  dan  45°C  akan  diujikan  pada  dua  isolat Staphylococcus  aureus (hasil  isolasi  dan  ATCC 25923).  Masing-masing  erlenmeyer  berisi  9  mL minuman  dari  gel  cincau  hijau  dan  rosela  yang  telah steril  dipanaskan  dalam waterbath  shak er (Polys- cience  Dual  action  shaker,  United  States)  sesuai dengan  suhu  perlakuan.  Setelah  suhu  tercapai, sebanyak  1  mL  suspensi  kultur  yang  telah  mencapai fase  Log  akhir  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  9 mL heating  menstruum .  Keempat  erlenmeyer  dipanas- kan  kembali  dalam waterbath  shak er kemudian dilakukan holding pada  suhu  57,  53,  49,  dan  45°C dengan  interval  waktu  pencawanan  masing-masing 2,5;  5;  10,  dan  15  menit.  Setelah  pemanasan  men- capai  waktu  tersebut,  dilakukan  pendinginan  pada air  mengalir  untuk  mencegah  terjadinya  pemanasan lanjutan  dan  dilakukan  pengenceran  dari  10 -2 -10 -8 pada  larutan  pengencer.  Pemupukan  dilakukan pada  media  agar  BPA  dan  EYT  secara  duplo  dan selanjutnya  inkubasi  pada  suhu  35°C  (48  jam) (Shimamura et al., 2006).

## Pengamatan dan hitungan cawan
Cawan  yang  mengandung  20-200  koloni  di- pilih  untuk  penghitungan  jumlah  koloni  (Bennett  dan Lancette,  2001).  Koloni S.  aureus yang  tumbuh pada  BPA  dan  EYT dihitung  dan  dikalkulasi  dengan rumus Standard  Plate Count sebagai  berikut:
N = E C / [(1*n 1 ) + (0,1*  n 2 ) + .....] * (d)
Keterangan:
N = Jumlah  koloni  per  mL atau  per  gr produk EC = Jumlah  semua  koloni  yang dihitung
n 1
=Jumlah  cawan  pada  pengenceran  pertama n 2
= Jumlah  cawan  pada  pengenceran  kedua d = Pengenceran  pertama  yang  dihitung

## Penghitungan nilai D dan z
Penghitungan jumlah bakteri dinyatakan dalam  satuan  CFU/mL.  Penghitungan  Nilai  D  dilaku- kan  dengan  memplotkan  grafik  pertumbuhan  bakteri dengan  sumbu  Y  menyatakan  jumlah  koloni  yang hidup  (Log  CFU)  dan  sumbu  X  menyatakan  selang waktu  setelah  pemanasan pada  empat  suhu  ber- beda.  Nilai  D  ditentukan  sebagai  waktu  yang  di- butuhkan untuk menurunkan jumlah mikroba sebesar  satu  siklus  Log  pada  suhu  konstan  tertentu. Berdasarkan  nilai  D  pada  suhu  percobaan  dibuat kurva thermal  death  time (TDT)  yang  menunjukkan
hubungan  antara  nilai  D  (dalam  menit)  pada  skala logaritmik  dengan  suhu  (°C).  Penentuan  nilai  z diperoleh  dari  kurva  semi-logaritmik  yang  berbentuk linear  dengan  slope -1/z (Fraiha et al., 2010).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Staphylococcus  aureus dari  cincau  hijau komersial
Tahapan  isolasi  bakteri Staphylococcus  au- reus dilakukan  menggunakan  media  BPA  dan  YET yang  berasal  dari  gel  cincau  hijau  yang  ada  di pasaran.  Hasil  isolasi  yang  didapatkan  mengguna- kan  media  BPA  dan  EYT  adalah  9  jenis  isolat  yang diduga  sabagai S.  aureus yaitu  kode  isolat  A,  B1, B2,  B3,  B4,  B5,  B6,  B7,dan  B8.  Kode  A  menunjuk- kan  bahwa  isolat  berasal  dari  gel  cincau  hijau  di daerah  Pasar  Dramaga,  sedangkan  kode  B  me- nunjukkan  gel  cincau  hijau  yang  diperoleh  dari daerah  Pasar  Laladon.  Hasil  uji  katalase  dan pewarnaan  Gram  terhadap  sembilan  jenis  isolate terduga S.  aureus dicantumkan  pada  Tabel  1.  Hasil uji  pewarnaan  Gram  yang  dilakukan  pada  isolat  A dan  B8  adalah  berbentuk  kokus,  seragam,  bewarna ungu  violet,  dan  bersifat  Gram  positif  (Tabel  1). Organisme  yang  bersifat  Gram  positif  ditandai dengan  warna  biru  gelap  atau  ungu  (PHE,  2014). Staphylococcus  aureus merupakan  bakteri  Gram positif  berbentuk  kokus,  tersusun  dalam  kelompok- kelompok  yang  tidak  teratur  seperti  buah  anggur, fakultatif  anaerob,  tidak  membentuk  spora  dan  tidak bergerak  (Tille,  2012  dan  Purwohadisantoso et  al., 2009).
Hasil  uji  katalase  terhadap  isolat  A  dan  B8 menunjukkan  reaksi  positif  yang  ditandai  dengan timbulnya  gelembung-gelembung  udara  (Tabel  1). Hal  ini  menunjukkan  bahwa  isolat  A  dan  B8 diidentifikasikan  sebagai S.  aureus karena S.aureus bersifat  positif  terhadap  uji  katalase  serta  bersifat Gram  positif.  Mikrroorganisme  ini mampu meng- hasilkan  enzim  katalase  yang  dapat  mengkatalisis penguraian  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 )  menjadi  H 2 O dan  O 2 (Tille,  2012).  Hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 ) terbentuk  sewaktu  metabolisme  aerob,  sehingga mikroorganisme  yang  tumbuh  dalam  lingkungan aerob  menguraikan  senyawa  tersebut  (Huda et  al., 2012).
Tabel  2  menunjukkan  hasil  uji  koagulase  dan uji  penanaman  pada  medium  MSA  empat  jenis isolat:  kontrol  negatif,  kontrol  positif, A, dan B8. Hasil uji  koagulase  terhadap  isolat  A  adalah  koagulase positif  (+2)  dan  isolate  B  koagulase  positif  (+1)  yang ditunjukkan  dengan  adanya  koagulan  pada  bagian atas  dalam  jumlah  sedikit  (Tabel  2).  Koagulase adalah  protein  enzim  yang  diproduksi  oleh  mikro- organisme  tertentu  salah  satunya Staphylococcus
aureus untuk  mengkonversi  fibrinogen  menjadi  fibrin (Tille,  2012).  Koagulase  mengikat  plasma  fibrinogen, menyebabkan  mikroorganisme  dapat  menggumpal- kan  plasma  (PHE,  2014).  Hasil  uji  penanaman  pada media  MSA  adalah  positif  terhadap  bakteri S. aureus pada  isolat  kontrol  positif,  isolat  A,  dan  B8 yang  ditandai  dengan  terjadinya  perubahan  warna pada  media  MSA  dari  merah  menjadi  kuning  (Tabel 2).  MSA  merupakan  media  selektif  dan  differensial yang digunakan  dalam  isolasi Staphylococcus (Rosida  dan  Susiloningsih,  2007). Staphylococcus memiliki  ketahanan  terhadap  tekanan  osmotik  oleh 7,5%  NaCl  dan  dapat  memfermentasi  mannitol sehingga  menghasilkan  warna  kuning  pada  media MSA  (Shields  dan  Tsang,  2006).  Apabila  bakteri staphylococci bersifat  koagulase  positif  dan  dapat memfermentasi  manitol  pada  MSA  maka  bakteri staphylococci tersebut adalah Staphylococcus aureus (Khusnan et al., 2008).
Tabel  1.  Hasil  uji  katalase  dan  pewarnaan  Gram isolat Staphylococcus  aureus hasil  isolasi pada  media  BPA dan  EYT
Kode Isolat Pengamat- an Uji Katalase Uji Pewarnaan Gram Morfologi Gram A 1 +++ Kokus + 2 +++ Kokus + B1 1 - Batang + 2 - Batang + B2 1 - Batang + 2 - Batang + B3 1 + Batang + 2 - Batang + B4 1 - Campuran Td 2 - Campuran Td B5 1 - Campuran Td 2 - Campuran Td B6 1 - Campuran Td 2 - Campuran Td B7 1 + Campuran Td 2 + Campuran Td B8 1 +++ Kokus + 2 +++ Kokus +
Keterangan: Uji katalase : (-) Tidak timbul gelembung, (+) Timbul  sedikit  gelembung,  (++)  Timbul  gelembung, (+++) Timbul banyak gelembung. Uji Pewarnaan Gram (Gram) : (+) Positif, (-) Negatif, (td) Tidak teridentifikasi
Isolat S.aureus yang  dipilih  untuk  diidentifikasi lebih  lanjut  menggunakan  kit  API  Staph  adalah  isolat S.  aureus yang  menunjukkan  hasil  positif  pada  uji pewarnaan  Gram,  uji  katalase,  penanaman  pada media  BPA  dan  EYT,  penanaman  pada  media  MSA, dan  uji  koagulase.  Isolat S.  aureus yang  terpilih adalah  isolat  A.  Gambar  2  memperlihatkan  hasil  dari identifikasi  lanjut  menggunakan  kit  API  Staph.  Hasil
dari  identifikasi  lanjut  menggunakan  kit  API  Staph terhadap  isolat  A  menunjukkan  persentase  ke- samaan  dengan  kultur  referensi  sebesar  41,8% untuk  identifikasi  sebagai Staphylococcus  aureus. Selanjutnya  isolat  A  digunakan  untuk  analisis penentuan  nilai  D  dan  z  pada  minuman  dari  gel cincau  hijau  dan  rosela.  Nilai  D  dan  z  ini  merupakan dua  parameter  penting  yang  perlu  diperhitungkan dalam  proses  pengolahan  pangan  mengingat  sifat patogen  dari  baketri S. aureus .
Tabel  2.  Hasil  uji  koagulase  dan  penanaman  pada media  MSA isolat Staphylococcus  aureus
Kode Isolat Pengamatan Uji Koagulase Uji Penanaman pada MSA Kontrol negatif - - Kontrol positif 1 +3 + 2 +4 + A 1 +2 + 2 +2 + B8 1 +1 + 2 +1 +
Keterangan:  Uji  Koagulase:  (-)  Jika  koagulan  tidak terbentuk,  (+1)  Jika  koagulan  tidak  terkumpul  dan sedikit,  (+2)  Jika  koagulan  terkumpul  dibagian  atas dan  sedikit,  (+3)  Jika  koagulan  terkumpul  dibagian bawah  dan  banyak,  (+4)  Jika koagulan pada tabung dibalik  tidak  jatuh.  Uji  Penanaman  pada  MSA:  (+) Kuning, (-) Merah
Gambar  2. Hasil uji dengan  kit API Staph isolat A
Nilai  D  isolat Staphylococcus  aureus A  dan ATCC  25923
Ketahanan  panas  mikroba  atau  sensitifitas panas  mikroba  oleh  suhu  pemanasan  yang  dinyata- kan  dengan  nilai  D  yang  berbeda-beda  untuk  setiap mikroba  (Yuswita,  2014).  Nilai  D  didefinisikan sebagai  waktu  dalam  menit  pada  suhu  tertentu  yang diperlukan  untuk  menurunkan  jumlah  spora  atau  sel vegetatif  tertentu  sebesar  90%  atau  satu  logaritmik. Pengujian  ketahanan  panas  dilakukan  terhadap isolat S.  aureus A  dan  isoat  ATCC  25923  sebagai pembanding.  Gambar  3  dan  4  menunjukkan  pe- nurunan  logaritmik  jumlah  mikroba  isolat S.  aureus ATCC  25923  dan  isolat S.aureus A  yang  dipanas- kan  pada  suhu  konstan  45,  49,  53,  dan  57°C  (pada selang  waktu  tertentu)  dengan heating  menstruum minuman  gel  cincau  hijau  dan  rosela  (pH  3,17).
Penurunan  jumlah  bakteri  berbanding  lurus  terhadap lama  waktu  pemanasan  yaitu  semakin  lama  per- lakuan  proses  pemanasan  maka  semakin  kecil jumlah  bakteri  yang  terhitung.  Hal  ini  sesuai  dengan teori  yang  menyatakan  bahwa  laju  penurunan jumlah  mikroba  akan  semakin  besar  jika  suhu  yang digunakan  ditingkatkan  (Maldonado et  al., 2008). Berdasarkan  hasil  penelitian  diketahui  bahwa  isolat A  memiliki  nilai  D  pada  suhu  45,  49,  53,  dan  57°C berturut-turut  sebesar  32,3;  17,9;  4,6;  dan  1,5  menit. Isolat  ATCC  25923  memiliki  nilai  D  pada  suhu  45, 49,  53,  dan  57°C  berturut-turut  sebesar  18,5;  6,8; 2,9  dan  1,4  menit.  Data  uji  ketahanan  panas  untuk kedua  isolat  menunjukkan  semakin  tinggi  suhu maka  nilai  D  semakin  kecil.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  semakin  tinggi  suhu  pemanasan,  maka waktu  yang  diperlukan  untuk  menginaktivasi  mik - roba  sebesar  1  siklus  Log  akan  semakin  singkat (Hawa et al., 2011).
Selain  itu,  berdasarkan  perhitungan  terhadap nilai  D  diketahui  bahwa  isolat S.  aureus A  memiliki nilai  D  pada  berbagai  suhu yang  lebih  tinggi  di- bandingkan  isolat S.  aureus ATCC  25923  pada heating  menstruum minuman  dari  gel  cincau  hijau dan  rosela.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  isolat  A bersifat  lebih  tahan  panas  dibandingkan  isolate ATCC.  Isolat S.  aureus ATCC  25923  merupakan isolat  klinis  yang  diisolasi  dari  tubuh  manusia (Widowati et  al., 2014),  sementara  isolat  A  berasal dari  gel  cincau  hijau  di  pasaran.  Pertumbuhan  isolat Staphylococcus  aureus ATCC  25923  di  dalam  tubuh manusia  berada  pada  suhu  optimum  (sekitar  37°C) sehingga  tidak  memiliki  efek  ketahanan  panas  yang tinggi.  Proses  pengolahan  gel  cincau  hijau  me- nyebabkan  adanya  seleksi  ( screening )  terhadap mikroba,  sehingga S.aureus yang  terisolasi  cen- derung  memiliki  ketahanan  panas  yang  lebih  tinggi. Mikroorganisme  yang  diberi  kondisi  stres  dapat menjadi  lebih  resisten  (Cebrián et  al., 2010).  Selain itu,  isolat S.aureus A  pada heating  menstruum minuman  berada  dalam  kondisi  yang  lebih  mend- ekati  keadaan  aslinya  yaitu  produk  gel  cincau  hijau (Yuliana,  2008).  Hal  ini  memungkinkan  bahwa  isolat dari  gel  cincau  hijau  tersebut  (isolat  A)  lebih  mudah beradaptasi.
Bakteri  dengan  jumlah  yang  sama  belum tentu  dapat  direduksi  dengan  jumlah  panas  yang sama.  Hal  ini  karena  banyak  faktor  yang  mem- pengaruhi  ketahanan  panas  mikroba  antara  lain  air, lemak,  garam,  karbohidrat,  pH,  protein  dan  kom- ponen  lain,  jumlah  mikroba,  umur  mikroba,  faktor tumbuh,  waktu  dan  suhu,  komponen  inhibitor,  efek ultrasonik  (Jay,  2000). S.  aureus memiliki  nilai  D 49 , D 54,5 ,  dan  D 60 berturut-turut  sebesar  9,4;  4,9;  dan  1 menit  pada  pH  4,5  (ICMSF,  2003).  Sedangkan  nilai D 49 , D 54,5 ,  dan  D 60 isolat S.  aureus pada heating
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 10 20 30 40 50 Log J u m la h M ikro b a (C F U /m L )

## Waktu Pemanasan (Menit)
Suhu 45 C Suhu 49 C Suhu 53 C Suhu 57 C 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 10 20 30
40 50 L o g Ju m la h M ikro b a (C F U /m L)
Waktu Pemanasan (Menit) Suhu 45 C Suhu 49 C Suhu 53 C Suhu 57 C
menstruum  buffer  phosphate (pH  6,5)  sebesar  42,1; 11,9; dan  2,5  (ICMSF,  2003).
Gambar  3.  Penurunan  logaritma  jumlah  mikroba isolat S.  aureus ATCC  25923  (Log CFU/mL)  yang  dipanaskan  pada  suhu konstan  45,  49,  53,  dan  57°C  dalam selang  waktu  tertentu  pada heating menstruum minuman  dari  gel  cincau hijau  dan  rosela  (pH  3,17)
Gambar  4.  Penurunan  logaritma  jumlah  mikroba isolat S.  aureus A  (Log  CFU/mL)  yang dipanaskan  pada  suhu  konstan  45,  49, 53,  dan  57°C  dalam  selang  waktu tertentu  pada heating  menstruum minu- man  dari  gel  cincau  hijau  dan  rosela (pH  3,17)
Hal  ini  menunjukkan  bahwa  nilai  D  isolat S. aureus uji  memiliki  nilai  yang  lebih  kecil  dibanding- kan  isolat S.  aureus pada  pH  yang  lebih  tinggi.  Nilai pH heating  menstruum minuman  dari  gel  cincau
hijau  dan  rosela  sekitar  3,17  atau  bersifat  lebih asam  dari  nilai  pH heating  menstruum  buffer  phos- phate sekitar  4,5  dan  6,5.  pH  optimum  pertumbuhan S.aureus optimum  pada  pH  6,0-7,0  dimana  pada  pH optimum  pertumbuhan,  mikroorganisme  biasanya paling  resisten  terhadap  panas  atau  nilai  D  relatif besar  (Jay,  2000).
Berdasarkan  hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  penggunaan  nilai  D 45 ,  D 49 ,  D 53 ,  dan  D 57 isolat S.  aureus A  dalam  penentuan  kecukupan  proses pasteurisasi  dinilai  mampu  memberikan  jaminan mutu  produk  yang  lebih  baik  dibandingkan  isolat pada heating  menstruum  buffer  phosphate (pH  6,5) karena  berakibat  proses  panas  menjadi  berlebih ( over  process ).  Perlakuan  panas  berlebih  berpe- ngaruh  terhadap  kualitas  atau  mutu  produk  yang dihasilkan  seperti  tekstur  gel  yang  terbentuk  serta nilai  fungsionalnya  yaitu  jumlah  antioksidan  maupun senyawa  bioaktif  lainnya  (Achyadi,  2009).
Nilai  z  isolat Staphylococcus  aureus A  dan ATCC  25923
Nilai  z  didefinisikan  sebagai  sensitivitas  nilai  D terhadap  perubahan  suhu  atau  besarnya  perubahan suhu  (°C)  yang  diperlukan  untuk  menurunkan  nilai  D sebesar  satu  siklus  Log  (Herdiana et  al., 2014).  Ber- dasarkan  nilai  D  pada  suhu  percobaan  dibuat  kurva thermal death  time (TDT)  yang  menunjukkan hubungan  antara  nilai  D  (dalam  menit)  pada  skala logaritmik  dengan  suhu  (°C).  Penentuan  nilai  z diperoleh  dari  kurva  semi-logaritmik  berbentuk  linear dengan  slope  -1/z  (Groenewald et  al., 2013).  Pada Gambar  5  disajikan  kurva  yang  menunjukkan hubungan  antara  nilai  D  dengan  suhu  49,  54,5,  dan 60°C  terhadap  tiga  jenis  isolat S.  aureus pada heating  menstruum .  Kurva  ini  menunjukkan  kecen- derungan  ketahanan  panas  mikroba  yang  dinyata- kan  dalam  nilai  z,  dimana  isolat S.aureus A  memiliki nilai  z  sebesar  8,8°C,  S. aureus ATCC  25923  se- besar  10,8°C,  dan S.  aureus (pH  4,5)  sebesar 11,3°C.  Terlihat  dalam  Gambar  5  bahwa  untuk  isolat S.aureus A  memiliki  kemiringan  kurva  yang  paling curam.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  nilai  z  isolat S. aureus A  paling  kecil  diantara  ketiga  isolat  tersebut. Kurva  yang  lebih  curam  menyebabkan  isolat S. aureus A  pada  suhu  tertentu  dapat  memiliki  nilai  D yang  lebih  kecil  dibandingkan  dua  isolat  lainnya. Penentuan  parameter  proses  termal  didasarkan  atas nilai  D  yang  dapat  menjamin  keamanan  proses namun  tidak berlebihan  ( over  process ).
Isolat  yang  diperoleh  dari  hasil  penelitian mempunyai  nilai  z  yang  lebih  kecil  dibandingkan nilai  z  pigmen  (merah  dan  hijau, browning, nutrisi seperti  Karoten,  Thiamin,  dan  Asam  Askorbat) (Toledo,  2007).  Proses  pasteurisasi  yang  umumnya dilakukan  pada  suhu  85-95°C  selama  2-3  detik dapat  menyebabkan over  process jika  diterapkan
dalam  minuman  dari  gel  cincau  hijau  dan  rosela (Sukasih et  al., 2005).  Oleh  karena  itu,  nilai  z  yang lebih  kecil  berdasarkan  hasil  penelitian  ini  meng- akibatkan  waktu  proses  pasteurisasi  menjadi  lebih singkat  dengan  peningkatan  suhu  yang  tidak  terlalu besar  namun  memiliki  efek  letalitas  yang  sama (Juneja et  al., 2006).  Hal  ini  sekaligus  dapat  me- minimalkan  kerusakan  zat  gizi  yang  terkandung dalam  produk  (Safaryani et al., 2007).
Gambar  5.  Kurva  ketergantungan  nilai  D  terhadap suhu  45,  49,  53,  dan  57°C  untuk  isolat S.aureus A  dan  ATCC  25923  pada heating  menstruum minuman  dari  gel cincau  hijau  dan  rosela  (pH  3,17) beserta  kurva  ketergantungan  nilai  D terhadap  suhu  49,  54.5,  dan  60°C untuk  isolat S.aureus pada heating menstruum buffer  phosphate (pH  4,5) (ICMSF,  2003)

## KESIMPULAN
Isolat S.  aureus A  menunjukkan  hasil  positif pada  uji-uji  pewarnaan  Gram,  uji  katalase,  uji penanaman  pada  media  BPA  dan  EYT,  uji  pe- nanaman  pada  media  MSA,  uji  koagulase,  serta memiliki persentase kesamaan dengan kultur referensi  41,8%  menggunakan  kit  API  Staph.  Isolat A  memiliki  nilai  D 45 ,  D 49 ,  D 53 dan  D 57 pada heating menstruum berturut-turut  sebesar  32,3;  17,9;  4,6; dan  1,5  menit.  Sementara  isolat  ATCC  25923  yang merupakan  isolat  klinis  dari S.  auresus memiliki  nilai D 45 ,  D 49 ,  D 53 dan  D 57 berturut-turut sebesar 18,5; 6,8, 2,9;  dan  1,4  menit.  Nilai  z  isolat  A  yang  lebih  kecil dibandingkan  isolat  ATCC  25923  (referens)  menun- jukkan  bahwa  dengan  proses  pasteurisasi  dapat
dipercepat dengan sedikit meningkatkan  suhu proses  tanpa  mempengaruhi  keamanan  dan  mutu produk.

## UCAPAN  TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  ditujukan  kepada  Ke- menterian  Pendidikan  dan  Kebudayaan  yang  telah membiayai  penelitian  ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Achyadi  NS.  2009.  Kajian  pengaruh  jenis  dan konsentrasi bahan penggumpal terhadap karakteristik gel cincau titam ( Mesona palustris). J Teknol  Insentif  3: 1-47.
Atiqoh  H,  Wardani  RS,  Meikawati  W.  2011.  Uji antidiabetik infusa kelopa bunga  rosella ( Hibiscus  sabdariffa Linn.)  pada  tikus  putih jantan  galur  wistar  yang  diinduksi  glukosa.  J Kesehatan  Masyarakat  Indonesia  7: 43-50.
[BSN]  Badan  Standarisasi  Nasional.  2011.  Cara  uji Mikrobiologi-Bagian  9:  Penentuan Staphylo- coccus aureus pada  Produk  Perikanan. Jakarta  (ID):  BSN.
Bahçeci  KS,  Acar  J.  2007.  Modeling  the  combined effects  of  pH,  temperature  and  ascorbic  acid concentration  on  the  heat  resistance  of Alicyclobacillus  acidoterrestis. Int  J  Food Microbiol  120:  266-273.
Bennett  RW,  Lancette  GA.  2001. Staphylococcus aureus, Chapter  12. In FDA  Bacteriological Analytical  Manual,  8 th ed.,  Rev.  A.  AOAC International,  Gaithersburg,  MD.
Cebrián  G,  Sagarzazu  N,  Pagán  R,  Condón  S,
Mañas  P.  2010.  Development  of  stress  resis- tance in Staphylococcus aureus after exposure  to  sublethal  environmental  con- itions.  Int  J  Food  Microbiol 140:  26 –33.  DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2010. 02.017.
Darusman  F,  Saptarini  NM,  Priatna  B.  2012. Aktivitas  anti-inflamasi  ekstrak  kelopak  bunga Hisbiscus  sabdariffa .  J  Medika  Planta  1:  18- 23.
Dewi AK. 2013. Isolasi, identifikasi  dan  uji sensitivitas Staphylococcus  aureus terhadap amoxicillin dari sampel susu kambing peranakan ettawa (PE)  penderita  mastitis  di wilayah  Girimulyo,  Kulonprogo,  Yogyakarta.  J Sain Veteriner  31: 138-151.
Fraiha M, Ferraz ACO, Biagi JD. 2010.
Determination  of  thermobacteriological  para- meters  and  size  of Bacillus  stearother-
0 0.5 1 1.5 2 2.5 40 45 50 55 60 65 N il a i L o g D Suhu ( °C) S. aureus ATCC 25923 S. aureus A
S. aureus pH 4,5
mophilus ATCC  7953  spores.  Food  Sci Technol  30:  1041-1045.  DOI:  10.1590/S0101- 2061201000032.
Groenewald  WH,  Gouws  PA,  Witthuhn  RC.  2013. Thermal inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris  spores  isolated  from  a  fruit processing  plant  and  grape  juice  concentrate in  South  Africa.  Afr  J  Microbiol  Res  7:  2736- 2740.  DOI:  10.5897/AJMR12.1789.
Karlina  CY,  Ibrahum  M,  Trimulyono  G.  2013. Aktivitas  antibakteri  ekstrak  herba  krokot ( Portulaca  oleracea L.)  terhadap Staphylo- coccus  aureus dan Escherichia  coli .  Lentera Bio 2: 87-93.
Koop  G,Visscher  AD,  Collar  CA,  Bacon  DAC,  Maga EA,  Murray  JD,  Karlien  S,  Vleigher  SD, Haesebrouck  F,  Rowe  JD.  2012.  Identification of  coagulase-negative  staphylococcus  spe- cies  from  goat  milk  with  the  API  staph identification  test  and  with  transfer  RNA- intergenic spacer PCR combined with capillary-electrophoresis.  J  Diary  Sci  95: 7200-7205.  DOI:  10.3168/jds.2012-5747.
Handayani  BR,  Werdiningsih  W.  2010.  Kondisi sanitasi  dan  keracunan  makanan  tradisional. J Agroteksos  20: 131-139.
Hardiningsih  R,  Naputupulu  RNR,  Yulinery  T.  2006. Isolasi  dan  uji  resistensi  beberapa  isolat  pada pH  rendah.  J  Biodiversitas  7:  15-17.  DOI: 10.13057/biodiv/d070105.
Hawa  LC,  Susilo  B,  Jayasari  NE.  2011.  Studi komparasi  inaktivasi Escherichia  coli dan perubahan  sifat  fisik  pada  pasteurisasi  susu sapi  segar  menggunakan  metode  pemanasan dan  tanpa  pemanasan  dengan  kejut  medan listrik. J Teknol  Pertanian  12: 31-39.
Herdiana  DD,  Utami  R,  Anandito  BK.  2014.  Kinetika degradasi  termal  aktivitas  antioksidan  pada minuman tradisional wedang uwuh siap minum . J  Teknosains  Pangan  3: 46-53.
Huda  C,  Salni,  Melki  S.  2012.  Penapisan  aktivitas antibakteri  dari  bakteri  yang  berasosiasi dengan karang lunak Sarcophyton sp.
Maspari  J  4: 69-76.
Huang  L.  2013.  Determination  of  thermal  inactivation kinetics  of Listeria  monocytogenes in  chicken meats  by  isothermal  and  dynamic  methods . Food  Control  33:  484-488.  DOI:  10.1016/j. foodcont.2013.03.049.
[ICMSF] International Comission  Microbiological
Specification  for  Food.  2003.  Microorganisms in  Foods  5:  Characteristics  of  Microbial Pathogens.  London  (UK):  Kluwer  Academic/ Plenum  Publisher.
Jay  JM.  2000. Modern  Food  Microbiology  6th Edition.  Gaithersburg,  Maryland  (US):  Aspen Publishers,  Inc.
Juneja  VK,  Eblen  BS  Ransom  GM.  2006.  Thermal inactivation  of  Salmonella  spp.  In  chicken broth,  beef,  pork,  Turkey,  and  chicken: determination  of  D-  and  Z-values . J  Food  Sci 66:  146-152.  DOI: 10.1111/j.1365-2621.2001. tb15597.x.
Khusnan,  Salasia  SIO,  Soegiyono.  2008.  Isolasi, identifikasi,  karakterisasi  bakteri Staphylo- coccus  aureus dari  limbah  penyembelihan dan  karkas  ayam  potong.  J  Veteriner  9:  45 – 41.
Krapf  T,  Gantenbein-Demarchi  C.  2010.  Thermal inactivation of Salmonella spp. during conching,  LWT –Food  Sci  Technol:  43:  720- 723.  DOI:  10.1016/j.lwt.2009.10.009.
Maldonado  MC,  Belfiore  C,  Navarro  AR.  2008. Temperature,  soluble  solids  and  pH  effects  on Alicyclobacillus acidoterrestris viability in lemon  juice  concentrate.  J  Ind  Microbiol Biotechnol  35: 141 –144.
Meliawaty  F.  2012.  Efisiensi  sterilisasi  alat  bedah mulut  melalui  inovasi  oven  dengan  ozon  dan infrared.  J  Kedokteran  Maranatha  11:  147- 167.
Nurdin  SU.  2007.  Evaluasi  efek  laksatif  dan fermentabilitas komponen pembentuk gel daun  cincau  hijau  ( Premna  oblongifolia Merr.). J Teknol  Industri  Pangan  13:  10-16.
Nurdin  SU,  Suharyono,  Rizal  S.  2008.  Karakteristik fungsional  polisakarida  pembentuk  gel  daun cincau  hijau  ( Premna  oblongifolia Merr.).  J Teknol  Industri  Hasil  Pertanian  13:  4-9.
Pramitasari  N.  2012.  Cemaran  Mikrobiologis  pada Cincau  Hijau  ( Premna  oblongifolia Merr.) serta  Evaluasi  Sanitasi  dan  Higiene  pada Penjual  Cincau  Hijau  di  Wilayah  Bogor. [Skripsi].  Bogor  (ID):  Fakultas  Teknologi Pertanian,  Institut Pertanian  Bogor.
Prangdimurti  E,  Herawati  D,  Firlieyanti  AS,  Briantoto RD. 2014. Perubahan mutu fisik dan mikrobiologi  gel  cincau  hija  kemasan  selama penyimpanan.  J Mutu Pangan  1: 40-45.
[PHE]  Public  Health  England.  2014.  Catalase  test, coagulase  test,  staining  procedures:  UK standards  for  microbiology  investigations  TP  8 Issue3.https://www.gov.uk/uk-standards-for- microbiology-investigations-smi-quality-and- consis tency-
in-clinical-laboratories.[17
Januari  2015].
Purwohadisantoso  K,  Zubaidah  E,  Saparianti  E.
2009.  Isolasi  bakteri  asam  laktat  dari  sayur
kubis yang memiliki kemampuan peng- hambatan  bakteri  patogen  ( Staphylococcus aureus,  Listeria  monocytogenes,  Escherichia coli, dan Salmonella  thypimurium ).  J  Teknol Pertanian  10: 19-27.
Safaryani  N,  Haryanti  S,  Hastuti  ED.  2007. Pengaruh suhu dan lama penyimpanan terhadap  penurunan  kadar  vitamin  C  brokoli ( Brassica  oleracea L.).  Bul  Anatomi  Fisiologi 15: 1-7.
Shields  P,  Tsang  AY.  2006.  Mannitol salt agar plates protocols.  Protocols.  American  Society  for Microbiology,  Washington,  DC.  www.micro belibrary.org.  [14 Januari  2015].
Shimamura  Y,  Kidokoro  S,  Murata  M.  2006.  Survey and properties of Stapylococcus  aureus isolated from Japanessed-style dessert.
Bioscie Biotecnol Biochem  70: 1571-1577.
Sugito.  2011.  Pemanfaatan  cincau  hijau  sebagai pangan fungsional antitumor, antioksidan biologis  dan  peningkat  sistem  imun  tubuh.  J Pembangunan  Manusia  5: 1-12.
Sukasih  E,  Setyadjit,  Hariyadi  RD.  2005.  Analisis kecukupan  panas  pada  proses  pasteurisasi puree  manga  ( Mangifera  indica L.).  J  Pasca- panen  2: 8-17.
Sukasih  E,  Prabawati  S,  Hidayat  T.  2009.  Optimasi kecukupan  panas  pada  pasteurisasi  santan dan  pengaruhnya  terhadap  mutu  santan  yang dihasilkan . J Pascapanen  6: 34-42.
Susantikarn Ploypailin.  2014.  Characteristic  of Canned  Green  Grass  Jelly  in  Rosela  [Thesis]. Bogor (ID): Faculty  of  Agricultural  and Engineering,  Bogor  Agricultural  University.
Rosida, Susiloningsih EKB. 2007. Pengaruh konsentrasi  starter Lactobacillus  plantarum dan  lama  fermentasi  terhadap  kualitas  dan kerusakan  produk  terasi.  FTI  UPN  Veteran Jawa  Timur  15: 72-76.
Tille P. 2012. Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology, 13th  Edition.  Canada:  Elsevier Canada.
Toledo  RT.  2007.  Fundamentals  of  Food  Process Engineering  3rd.  Georgia  (US):  Springer.
Widowati  TW,  Hamzah  B,  Wijaya  A,  Pambayun  R.
2014.  Sifat  antagonistic Lactobacillus sp. B441  dan  II442  asal  tempoyak  terhadap Staphylococcus  aureus. Agr  J 34: 430-438.
Yuliana  N.  2008.  Kinetika  pertumbuhan  bakteri asam  laktat  isolate  T5  yang  berasal  dari tempoyak.  J  Teknol  Industri  dan  Hasil  Per- tanian  13: 108-116.
Yulvizar  C,  Dewiyanti  I,  Defira  CN.  2014.  Seleksi bakteri  berpotensi  probiotik  dari  ikan  mas ( Cyprinus carpio ) indigenous jantho berdasarkan  aktivitas  antibakteri  secara in vitro .  J  Teknol  Industri  Pertanian  Indonesia  6: 20-24.
Yuswita  E.  2014.  Optimasi  proses  termal  untuk membunuh Clostridium  botulinum .  J  Aplikasi Teknol  Pangan  3: 5-6.