## UPAYA PERBAIKAN GENETIK DAN PENYEDIAAN BIBIT TANAMAN KARET
( Hevea brasiliensis Muell. Arg.) MELALUI PENDEKATAN BIOTEKNOLOGI
Effort on Genetic Improvement and Provision of  Planting Material of  Rubber Tree (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) by Biotechnology Approach
Muhamad Rizqi Darojat dan Radite Tistama Balai Penelitian Sungei Putih PO. BOX 1415 Medan 20001 Email: moriz_dj@yahoo.com
Diterima tgl 5 Februari 2014/Direvisi tgl 18 Juni 2014/Disetujui tgl 17 Juli 2014

## Abstrak
Beberapa  tantangan  dalam  kegiatan perakitan  klon  unggul  baru  tanaman  karet ( Hevea brasiliensis Muell. Arg.) melalui metode p e r s i l a n g a n   b u a t a n   ( k o nv e n s i o n a l ) diantaranya adalah membutuhkan waktu yang lama,  sifat  heterozigositas  yang  tinggi  dan tingkat  keberhasilan  yang  belum  optimal. Bioteknologi  diharapkan  dapat  menjadi metode  pendukung  dalam  menjawab t a n t a n g a n   y a n g   t e r j a d i   t e r s e b u t . Perkembangan  teknik in  vitro dan  rekayasa genetika  telah  memberikan  terobosan  baru dalam  perbanyakan  dan  perbaikan  genetik tanaman  karet.  Pemanfaatan  bioteknologi telah  berdampak  pada  proses  perbaikan g e n e t i k   t a n a m a n   k a r e t   d a l a m   h a l produktivitas,  kesehatan  tanaman,  dan peningkatan  toleransi  terhadap  cekaman. Selain itu penggunaan marka molekuler sangat bermanfaat  untuk  percepatan  seleksi  dalam kegiatan  pemuliaan  tanaman  karet.  Teknik tersebut juga berguna dalam identifikasi klon dan  tetua,  analisis  keanekaragaman  genetik, pengawasan hasil persilangan buatan, penciri klon dan  biologi  reproduksi.  Tulisan  ini menjabarkan tentang pendekatan bioteknologi untuk meningkatkan potensi genetik tanaman karet.
Kata kunci : Hevea brasiliensis , bioteknologi, kultur jaringan, rekayasa genetika

## Abstract
There  are  some  challenges  in  the  use  of traditional breeding method for improving genetic of rubber tree (Hevea brasiliensis).  They are very slow and time consuming, heterozygous nature, and low capacity  in  generating  fruit  set.  Biotechnology  is expected  to  be  an  supporting  method  for  genetic improvement. The development of  in vitro technique and  genetic  engineering  have  provided  a  powerful tool giving positive effect for propagation and genetic improvement  of   Hevea  in  order  to  achieve  the objective  of   breeding  program.  These  techniques, together  with  molecular  mechanism  knowledge, have an impact on genetic improvement of  Hevea in case  of   productivity,  plant  health,  and  enhanced stress tolerance. Molecular marker in Hevea breeding program  can  effectively  avoid  time  consuming bioasssays in early generation screening. In addition, molecular marker can be used for clone and parent identification,  genetic  diversity  analysis,  breeding control,  clone  characterization  and  biology  of reproduction.  This  article  describes  various technique for genetic improvement and propagation of  Hevea by biotechnology approach.
Keywords: Hevea brasiliensis , biotechnology, tissue culture, genetic engineering

## Pendahuluan
Karet alam memiliki peranan yang sangat penting  bagi  perekonomian  Indonesia. Sebagai negara penghasil karet alam terbesar
kedua,  komoditas  ini  telah  menghasilkan devisa  ekspor  sebesar  US$  6,9  milyar  pada tahun 2013 (Badan Pusat Statistik, 2014). Nilai ini  akan  terus  meningkat  seiring  dengan permintaan karet alam dunia yang cenderung naik  dari  tahun  ke  tahun.  Berdasarkan  data Direktorat  Jenderal  Perkebunan  Departemen Pertanian  (2012),  Indonesia  merupakan negara  yang  memiliki  area  perkebunan  karet terbesar di dunia dengan luas 3,4 juta hektar, namun produksi karet alam  Indonesia hanya sebesar 3 juta ton. Nilai tersebut masih kalah saing dengan negara tetangga yaitu Thailand yang  dapat  memproduksi  karet  alam  sebesar 3,5  juta  ton  dengan  luas  area  perkebunan berkisar  2,6  juta  hektar  ( International  Rubber Study Group , 2013).
Beberapa  hal  yang  menyebabkan  tidak optimalnya produksi karet di Indonesia adalah pengelolaan  lahan  yang  kurang  baik, penggunaan  bibit  tidak  unggul  dan  tidak seragam,  dan  pengaruh  kondisi  lingkungan (Siregar  dan  Suhendry,  2013;  Priyadarshan dan  Demange,  2004).  Salah  satu  upaya  yang dilakukan untuk meningkatkan produksi karet alam  adalah  dengan  cara  memperbaiki  mutu genetik  dan  propagasinya.  Upaya  tersebut dapat dilakukan secara konvensional maupun secara  inkonvensional.  Secara  konvensional dilakukan  dengan  persilangan  buatan  antara d u a   t e t u a   ya n g   k e mu d i a n   d i s e l e k s i berdasarkan karakter produksi dan ketahanan p e n ya k i t .   S e c a r a   i n k o nve n s i a l   ya i t u menggunakan suatu teknologi tertentu dalam merekayasa  suatu  sifat  tertentu  sehingga dihasilkan suatu cara atau produk yang lebih baik dari sebelumnya.
Beberapa  klon  telah  dihasilkan  melalui persilangan  buatan  dengan  potensi  produksi karet  kering  di  atas  2  ton/ha/tahun diantaranya adalah klon IRR 112 dan IRR 118 (Woelan et  al .,  2005).  Tantangan  perbaikan genetik  melalui  teknik  konvensional  adalah waktu yang cukup lama dari awal persilangan hingga  didapatkan  klon  unggul.  Selain  itu, persilangan buatan memiliki beberapa kendala yaitu ketidakcocokan bunga jantan dan betina, hasil  buah  sedikit,  masa  pematangan  buah yang  lama,  sifat  heterozigositas  tanaman,
lahan percobaan yang semakin berkurang dan belum tersedianya  karakter seleksi awal  yang handal (Venkatachalam et al ., 2007).
Beberapa permasalahan di lapangan belum dapat  teratasi  secara  optimal  melalui persilangan  buatan  seperti  sensitivitas terhadap  cekaman  abiotik  dan  gangguan fisiologis yang dapat menganggu produktivitas tanaman  karet  (Priyadarshan  dan  Demange, 2004). Aplikasi bioteknologi diharapkan dapat memberikan gagasan baru dalam mendukung perakitan  klon  unggul  sehingga  dapat menjawab  permasalahan  yang  ter jadi. Wardojo  dan  Tahardi  (1990)  menyatakan b a h wa   p e m a n f a a t a n   d a n   p e n e r a p a n bioteknologi  yang  tepat  akan  sangat menunjang  pembangunan  perkebunan. Pendekatan  bioteknologi  sebagai  metode pendukung  diantaranya  bertujuan  untuk proses perbanyakan tanaman karet, perbaikan genetik,  seleksi  klon,  peningkatan  produksi, dan  pengaturan  proses  per tumbuhan (Venkatachalam et al ., 2007).
Tulisan  ini  bertujuan  untuk  menjabarkan pendekatan bioteknologi dan perannya dalam m e n i n g k a t k a n   p o t e n s i   g e n e t i k   d a n perbanyakan tanaman karet. Secara skematik peran bioteknologi dalam menghasilkan klon unggul baru dijelaskan pada Gambar 1.

## Teknologi Kultur Secara In Vitro
Sampai saat ini perbanyakan tanaman karet unggul  hasil  persilangan  masih  dilakukan secara  vegetatif   yaitu  melalui  teknik  okulasi. Cara  ini  memiliki  beberapa  kelemahan  yaitu memerlukan lahan yang luas, keterbatasan biji untuk  batang  bawah,  waktu  yang  lama  dan tingkat juvenilitas yang rendah. Salah satu cara yang  saat  ini  sedang  dikembangkan  adalah perbanyakan klon unggul dengan teknologi in vitro melalui  kultur  jaringan.  Tabel  1 m e n ya j i k a n   p e r b a n d i n g a n   b e b e r a p a karakteristik  teknik  okulasi  dengan  teknik kultur  jaringan  dalam  proses  perbanyakan bibit tanaman karet.
Teknologi  kultur  jaringan  telah  banyak digunakan  dalam  proses  perbanyakan  secara massal  pada  berbagai  tanaman  unggul
(Bhojwani  dan  Razdan,  1996).  Peningkatan permintaan  terhadap  bibit  unggul  tanaman karet membuat teknik kultur jaringan menjadi alternatif   cara  perbanyakan  tanaman  karet. Cara ini diharapkan dapat menyediakan bibit tanaman karet unggul dalam waktu cepat dan jumlah  yang  besar.  Selama  ini  penyediaan bahan tanam unggul belum dapat mencukupi kebutuhan  peremajaan  perkebunan  karet (Boerhendly et al ., 2009). Selain itu, teknologi in  vitro dapat  juga  digunakan  dalam
mendukung proses peningkatan mutu genetik tanaman  karet  melalui  teknik  kultur  serbuk sari,  kultur  protoplas,  dan  transformasi genetik.
Kultur  jaringan  pada  tanaman  karet pertama  kali  dilakukan  di  Perancis  yang menggunakan kalus untuk mempelajari sistem pembuluh  lateks.  Chua  (1966)  melakukan penelitian  mengenai  peran  konsentrasi osmotik,  karbohidrat,  dan  nilai  pH  dalam induksi  pertumbuhan  kalus.  Selanjutnya
Gambar 1. Diagram hubungan antara perbaikan genetik secara konvensional dan inkonvensional. . Perbaikan Genetik Hevea brasiliensis Konvensional (Bioteknologi) InKonvensional (Bioteknologi) Persilangan buatan Marka Molekuler Rekayasa Genetika Kultur Jaringan Propagasi Kultur anther, ER, SE Transformasi Genetik Tanaman Transgenik Klon Unggul Uji Tanaman F1 Uji Plot Promosi Uji Pendahuluan Uji Lanjutan 25 th 10 th 10 th Seleksi Tabel  1.  Perbandingan  karakteristik  perbanyakan  bibit  karet  melalui  teknik  okulasi  dan  kultur jaringan.
No Karakteristik Okulasi Kultur Jaringan 1 Waktu yang diperlukan 3 bulan – 1,5 tahun 1 – 1,5 tahun 2 Tenaga kerja yang dibutuhkan Banyak Sedikit 3 Lahan yang digunakan Luas Kecil 4 Rata-rata tingkat keberhasilan 80% 60% 5 Jumlah tanaman yang dihasilkan Massal Massal 6 Pengaruh batang bawah Ada Tidak ada 7 Kualitas bibit Tidak Juvenil Relatif Juvenil Sumber: Oktavia (2011), Carron et al . (1995a), dan Carron et al . (1995b).
Upaya perbaikan genetik dan penyediaan bibit tanaman karet ( hevea brasiliensis muell. arg.) melalui pendekatan bioteknologi
penelitian pertumbuhan, anatomi, dan potensi morfogenetik dari eksplan kalus dan suspensi sel  telah  berhasil  diamati  oleh  Wilson  dan Street  (1975).  Paranjothy  dan  Gandhimathi (1976) telah melakukan perbanyakan tanaman karet  dengan  menumbuhkan  kalus  dari berbagai eksplan.
Hingga  saat  ini  teknik  kultur  jaringan tanaman  karet  masih  terus  dikembangkan lebih  lanjut  dengan  berbagai  cara  yaitu embriogenesis  somatik,  kultur  tunas (mikropropagasi),  organogenesis  langsung, kultur  anther  (serbuk  sari),  dan  kultur p r o t o p l a s .   B e r b a g a i   c a r a   t e r s e b u t dimanfaatkan sebagai alternatif  perbanyakan bahan tanaman (Somatic Embrio genesis/SE, microcutting ,  dan  organogenesis)  ataupun pendukung  peningkatan  mutu  genetik tanaman  karet  (kultur  anther  dan  kultur protoplas).
1.  Embriogenesis Somatik Embriogenesis somatik atau SE merupakan teknologi  perbanyakan  tanaman  melalui proses  pembentukan  embrio  bersumber  dari sel  somatik  (sel  tubuh)  tanpa  melalui  fusi gamet  (Arnold et  al .,  2002).  Oktavia  (2011) menyatakan  bahwa  teknologi  SE  memiliki prospek yang baik dalam perbanyakan klonal bahan tanam karet unggul secara massal dan seragam  serta  menjamin  tanaman  memiliki tingkat  juvenilitas  yang  tinggi.  Selain  itu teknologi SE memiliki potensi meningkatkan pertumbuhan dan produksi berkisar 20 % - 30 %  dan  ber-peluang  dapat  mengeliminasi beberapa penyakit penting pada tanaman karet (Oktavia, 2011).
Somatic  embryogenesis pada  tanaman  karet pertama kali dilakukan di China dan Malaysia dengan menggunakan anther sebagai sumber eksplan.  Paranjothy  (1974)  telah  berhasil membentuk  embrio  somatik  bersumber  dari kalus yang berasal dari anther dan selanjutnya embrio  berhasil  diinduksi  menjadi  tunas (Paranjothy dan Ghandimathi, 1975). Eksplan yang digunakan pada teknik SE selain anther dapat berasal dari jaringan integumen, stamen , anther  muda,  kelopak  muda,  daun,  dan  akar (Venkatachalam et  al .,  2007).  Lebih  lanjut, Huang et al . (2005) telah berhasil mendapatkan
embrio  somatik  dan  tunas  menggunakan eksplan  kotiledon.  Terdapat  perbedaan karakter antara kalus yang berasal dari eksplan kotiledon  biji  muda  dan  kotiledon  biji  tua (Pasaribu  dan  Woelan,  2011).  Kotiledon  biji muda membentuk kalus dengan struktur lebih remah sedangkan kalus dari biji tua berstruktur kompak.  Hal  ini  diduga  karena  perbedaan umur jaringan eksplan yang digunakan.
Walaupun  teknologi  SE  telah  berhasil digunakan,  namun  masih  memiliki  kendala dalam  induksi  embrio  maupun  sistem regenerasinya.  Oktavia  (2011)  menyatakan bahwa salah satu faktor yang menjadi kendala adalah kandungan senyawa fenolik yang tinggi dan kandungan lateks pada jaringan tanaman sehingga dapat menghambat terjadinya proses embriogenesis.  Kendala  ini  dapat  diatasi dengan cara penambahan arang aktif  ke dalam media  sehingga  senyawa  fenolik  yang dikeluarkan  jaringan  eksplan  dapat  diserap media.
2.  Kultur Tunas ( Microcutting )
Perbanyakan tanaman karet melalui teknik okulasi  memiliki  beberapa  kendala.  Salah satunya  adalah  terjadi  kasus  inkompabilitas antara  jaringan rootstock-scion .  Tistama  dan Hamim  (2007)  menyatakan  bahwa  dampak dari  kasus  ketidakserasian  jaringan  ini  dapat mempengaruhi  pertumbuhan,  produk-tivitas tanaman dan bahkan menimbulkan kematian. Tu j u a n   u t a m a   k u l t u r   t u n a s   a d a l a h menyediakan  bahan  tanam  klon  utuh  dalam waktu  yang  cepat  dan  jumlah  yang  banyak. Perbanyakan  tanaman  karet  secara in  vitro telah  berhasil  dilakukan  menggunakan berbagai  macam  eksplan  dari  tanaman  asal seedling (Seneviratne,  1991;  Carron et  al ., 2007).
Kultur  tunas  pertama  kali  dilakukan  oleh Paranjothy  dan  Gandhimathi  (1976) menggunakan tunas yang berasal dari biji yang ditumbuhkan  secara in  vitro .  Planlet  berakar berhasil  ditumbuhkan  menggunakan  media MS  cair,  namun  belum  berhasil  pada  media semi  padat.  Seneviratne et  al .  (1998) menyatakan bahwa eksplan tunas yang berasal dari seedling memiliki  nilai  keberhasilan tumbuh lebih baik secara in vitro dibandingkan
eksplan yang berasal dari klon tanaman karet dewasa. Selain itu, letak dan jarak tunas dari perakaran  tanaman  juga  mempe-ngaruhi pertumbuhan secara in vitro .
Kultur  tunas  menggunakan  eksplan  yang berasal dari tanaman dewasa (klon) memiliki beberapa  hambatan.  Kendala  utamanya adalah  eksplan  tidak  berhasil  membentuk sistem  perakaran  yang  baik  yang  dibutuhkan tanaman agar dapat berdiri kokoh. Seneviratne (1991)  melaporkan  bahwa  penggunaan eksplan  asal  tanaman  dewasa  menghasilkan pertumbuhan  dan  perkembangan  eksplan yang  tidak  memuaskan.  Hal  ini  disebabkan oleh  tingkat  juvenilitas  yang  rendah  pada eksplan  asal  tanaman  dewasa    (Nurhaimi- Haris et  al .,  2009a).  Selain  itu,  tingkat kontaminasi  yang  tinggi  menjadi  hambatan lain  dalam  teknik in  vitro menggunakan eksplan tunas asal tanaman dewasa. Beberapa metode  sterilisasi  yang  efektif   telah dikembangkan  untuk  menghasilkan  eksplan steril (Seneviratne, 1991; Nurhaimi-Haris et al ., 2009b).
3.  Organogenesis Organogenesis  mer upakan  metode p e r b a n ya k a n   t a n a m a n   d e n g a n   c a r a menginduksi  eksplan  secara  langsung  untuk menghasilkan  tunas  atau  organ  tanaman lainnya  (Aitken-Christie et  al .,  1995).  Secara umum  metode  organogenesis  digunakan untuk perbanyakan komersial pada komoditas hortikultura,  pertanian,  florikultura,  dan perkebunan  (Debergh  dan  Zimmerman, 1991). Pada tanaman karet   metode ini telah digunakan  sejak  awal  tahun  1970-an,  namun sampai  saat  ini  perkembangan  metode  ini belum optimal dan memiliki nilai keberhasilan yang  rendah  dalam  perbanyakan  tanaman karet.  Mendanha et  al .  (1998)  telah melaporkan  mikropropagasi Hevea  brasiliensis menggunakan sumber eksplan daun dan tunas aksilar  melalui  metode  organogenesis.  Hasil penelitian  tersebut  menunjukkan  bahwa eksplan  daun  hanya  mampu  menghasilkan kalus  dan  belum  berhasil  meregenerasikan tunas ataupun organ sedangkan eksplan tunas aksilar dapat membentuk tunas.
4.  Kultur Anther dan Serbuk Sari Sifat  heterozigositas  tanaman  karet  yang tinggi  menjadi  salah  satu  tantangan  dalam p r o s e s   p e r s i l a n g a n   b u a t a n   k a r e n a m e n g h a s i l k a n   k e t u r u n a n   y a n g beranekaragam.  Secara  genetika  agar dihasilkan  keturunan  dengan  sifat  yang seragam  dibutuhkan  tetua  dengan  genotipe homozigot  (galur  murni).  Pada  tanaman tahunan,  termasuk  tanaman  karet,  untuk menghasilkan  galur  murni  membutuhkan banyak generasi dan waktu yang lama. Kultur anther atau serbuk sari dapat digunakan untuk menghasilkan  tanaman  karet  haploid  atau haploid ganda sehingga didapatkan tetua galur murni. Selain itu kultur anther atau serbuk sari dapat  juga  berfungsi  untuk  pemetaan  gen, transformasi genetik, dan pembentukan variasi klon  baru.  Ulasan  mengenai  pembentukan tanaman  haploid  melalui  kultur  anther  dan serbuk  sari  telah  dilaporkan  pada  tanaman berkayu (termasuk tanaman karet) (Andersen, 2005;  Srivastava  dan  Chaturvedi,  2008)  dan tanaman karet (Chen, 1990).
P e n e l i t i a n   k u l t u r   a n t h e r   u n t u k mendapatkan  tanaman  haploid  pertama  kali dilakukan tahun 1972 di Srilanka. Selanjutnya planlet tanaman karet telah berhasil diperoleh berasal  dari  eksplan  anther,  namun  belum mendapatkan  kondisi  kultur  yang  optimal (Chen et  al .,  1978).  Chen et  al .  (1982)  telah berhasil  mendapatkan  planlet  anther  dengan meningkatkan  jumlah  embrio  somatik  yang t e r b e n t u k   d e n g a n   m e n g o p t i m a l k a n perbandingan  kandungan  ammonium  nitrat dan kalium nitrat dalam media dediferensiasi. Selain  itu,  media  tanam  dengan  kandungan 2 , 4 - D   d a n   NA A   d i p e r l u k a n   u n t u k mengoptimalkan  proses  diferensiasi  embrio serbuk sari (Chen et al ., 1982).
Proses pembentukan tanaman haploid atau haploid  ganda  secara  umum  menggunakan anther  sebagai  sumber  eksplan,  dan  belum banyak  laporan  menggunakan  eksplan serbuksari  secara  langsung.  Jayashree et  al . (2005)  telah  mempelajari  berbagai  macam perlakuan  untuk  menginduksi  serbuk  sari menjadi kalus, dan mendapatkan hasil bahwa pra  perlakukan  anther  menggunakan  larutan
Upaya perbaikan genetik dan penyediaan bibit tanaman karet ( hevea brasiliensis muell. arg.) melalui pendekatan bioteknologi
mannitol  0,3  M  pada  suhu  33  ºC  dapat meningkatkan  pembelahan  sel  serbuk  sari. Selain  itu  media  induksi  kalus  bentuk  cair tanpa  aerasi  dapat  juga  meningkatkan pembentukan  serbuk  sari  multiseluler,  dan media dasar N6 yang mengandung 2,4-D (2,0 mg/l) dan KIN (1,0 mg/l) dapat menginduksi pembentukan  kalus.  Hasil  penelitian  tersebut diharapkan  dapat  menjadi  solusi  dalam meregenerasikan tanaman karet haploid ganda di masa depan.
5.  Kultur protoplas
Kultur  protoplas  merupakan  biakan  sel atau jaringan tanaman yang telah dihilangkan dinding  selnya.  Kultur  ini  selanjutnya  dapat digunakan  untuk  meningkatkan  kualitas genetik  tanaman  melalui  metode  hibridisasi somatik  dan  rekayasa  genetika.  Teknik protoplas  diharapkan  dapat  memperluas keragaman genetik dan meningkatkan kualitas tanaman  karet.  Kultur  protoplas  pada tanaman  karet  telah  diterapkan  sejak  tahun 1979 dengan melakukan isolasi, kultur dan fusi protoplas  yang  berasal  dari  daun Hevea brasiliensis dan H.  pauciflora .  Keberhasilan teknik  tersebut  masih  sangat  terbatas  dan memiliki beberapa kendala. Nurhaimi-Haris et al . (1993) telah berhasil mengisolasi protoplas yang  berasal  dari  kalus  anter  yang disuspensikan  menggunakan  campuran  1  % hemiselulase, 2 % selulase, 1 % maserase, dan 8 % manitol. Selanjutnya Sushamakumari et al . (2000) telah melapor-kan keberhasilan dalam meregenerasikan  tanaman  yang  berasal  dari protoplas melalui embriogenesis somatik.

## Rekayasa Genetika
Sampai saat ini beberapa sasaran kegiatan pemuliaan  belum  tercapai  secara  optimal melalui  persilangan  buatan  sehingga dibutuhkan  teknik  baru  untuk  mencapainya. Selain  membutuhkan  waktu  yang  lama, kendala persilangan buatan adalah sifat yang dibentuk tidak spesifik dan terjadi secara acak. Rekayasa genetika dapat menjadi sebuah alat untuk mempercepat proses pembentukan klon unggul  baru  pada  tanaman  karet  secara spesifik.  Rekayasa  genetika  adalah  suatu
t e k n o l o g i   y a n g   d i g u n a k a n   d a l a m memanipulasi  sifat  (DNA/gen)  untuk  tujuan tertentu pada makhluk hidup (Nichol, 2008). Tersedianya  teknik in  vitro (kultur  jaringan) memungkinkan  teknik  rekayasa  genetika dapat  digunakan  untuk  menghasilkan tanaman  karet  transgenik  dengan  memiliki sifat yang diinginkan.
Beberapa  sifat  unggul  yang  dapat dikembangkan  dalam  perakitan  klon  unggul diantaranya adalah resisten terhadap penyakit, toleran  terhadap  kering  alur  sadap  (KAS), produksi  lateks  tinggi,  produksi  protein rekombinan  dan  peningkatan  kualitas  kayu (Venkatachalam et al ., 2007). Teknik rekayasa genetika  pada  tanaman  karet  semakin  lebih mudah  dilakukan  dengan  telah  berhasil disusunnya  konsep  genom  (Rahman et  al ., 2013)  dan  pustaka  cDNA  dari  lateks  (Han et al .,  2000;  Chotigeat et  al .,  2010).  Hasil penelitian  tersebut  menunjukkan  jumlah  gen diperkirakan  sebesar  68.955  gen,  dan  12,7  % dari jumlah gen tersebut merupakan gen unik pada Hevea .  Gen-gen  tersebut  berhubungan d e n g a n   b i o s i n t e s i s   p a r t i k e l   k a r e t , pembentukan  kayu,  resistensi  penyakit  dan proses  alergenisitas  (Rahman et  al .,  2013). Perkembangan  penelitian  menggunakan teknik rekayasa genetika pada tanaman karet masih  terbilang  baru  dibandingkan  dengan tanaman  lain  karena  memiliki  banyak  faktor pembatas.
Perkembangan  penelitian  ekplorasi  gen telah  berdampak  pada  proses  perbaikan g e n e t i k   t a n a m a n   k a r e t   d a l a m   h a l produktivitas,  ketahanan  tanaman,  dan peningkatan  toleransi  terhadap  cekaman. Selama  ini  kegiatan  pemuliaan  masih menghadapi tingkat keberhasilan yang belum memuaskan  karena  kurangnya  pengetahuan tentang  interaksi  genetik  dan  jalur  biokimia yang terlibat dalam respon tanaman terhadap berbagai  cekaman  lingkungan  (Saha  dan Priyadarshan,  2012).  Penelitian  mengenai kandungan  genetik  tanaman  karet  telah dilakukan sejak tahun 1990 dengan melakukan kloning  dan  karakterisasi  dari  gen-gen  yang berperan  dalam  biosintesis  lateks,  cekaman biotik dan abiotik, penyakit kering alur sadap
(KAS),  dan  pengaruh  etilen  pada  produksi lateks.  Ulasan  tentang  kandungan  genetik tanaman karet telah dijelaskan secara lengkap oleh Venkatachalam et al . (2007) dan Saha dan Priyadarshan (2012).
Terdapat  dua  metode  yang  digunakan secara luas pada proses transfer gen ke dalam tumbuhan  yaitu  transfer  gen  secara  langsung melalui  suatu  alat  khusus  ( biolistic  gun )  dan melalui  bantuan  bakteri Agrobacterium tumefaciens .  Metode  kedua  lebih  banyak digunakan karena memiliki keuntungan dapat menghasilkan tanaman karet transgenik yang stabil  dalam  jumlah  besar  (Arokiaraj,  2007). Transformasi  genetik  pada  tanaman  karet pertama  kali  dipelopori  oleh  Arokiaraj  dan Wan (1991) menggunakan A . tumefaciens untuk mempelajari  transfer  gen  ke  dalam  tanaman karet.  Selanjutnya  Arokiaraj et  al .  (1994) berhasil  mendapatkan  tanaman  transgenik menggunakan  metode  biolistik.  Proses tahapan  rekayasa  genetika  disajikan  pada Gambar 3.
Tantangan  utama  dalam  transformasi genetik  pada  tanaman  karet  adalah menyediakan sistem transformasi yang efisien pada  setiap  klon.  Blanc et  al .  (2006)  telah melaporkan  prosedur  transformasi  yang efisien menggunakan Agrobacterium tumefaciens yang  menghasilkan  372  planlet  transgenik. Beberapa  cara  yang  digunakan  dalam meningkatkan  efisiensi  transformasi  yaitu menggunakan  CaCl pada  media maintenance 2 medium (MM)  (Montoro et  al .,  2000), menggunakan  kalsium  nitrat  pada  media prakultur dan asetosiringon pada media infeksi (Sobha et al ., 2012), dan menggunakan silver nitrat  pada  media  infeksi,  ko-kultivasi  dan seleksi (Kala et al ., 2013). Beberapa gen telah berhasil dipindahkan ke dalam tanaman karet m e l a l u i   t r a n s f o r m a s i   m e n g g u n a k a n Agrobacterium  tumefaciens diantaranya  adalah gen penanda dan seleksi (Venkatachalam et al ., 2006; Leclercq et al ., 2010; Sobha et al ., 2012), ketahanan terhadap cekaman (Venkatachalam et al ., 2006; Jayashree et al ., 2011; Sobha et al ., 2012)  dan  gen  protein  manusia  dan  hewan (Arokiaraj et al ., 2002; Yeang et al ., 2002).
Gambar 3. Diagram tahapan proses rekayasa genetika pada H. brasiliensis (Leclercq et al ., 2010).
Upaya perbaikan genetik dan penyediaan bibit tanaman karet ( hevea brasiliensis muell. arg.) melalui pendekatan bioteknologi

## Marka Molekuler
Salah  satu  kendala  program  perakitan genotipe  unggul  baru  pada  tanaman  karet adalah membutuhkan waktu yang cukup lama yaitu  antara  25-30  tahun.  Oleh  karena  itu diperlukan  suatu  cara  yang  tepat  dan  akurat untuk  menentukan  kualitas  klon  karet  baru secara  dini.  Penggunaan  parameter  seleksi marka molekuler diharapkan dapat menjawab tantangan  tersebut.  Marka  molekuler  telah dikenal  sejak  tahun  1950-an  menggunakan marka  iso-enzim,  namun  marka  molekular berbasis  DNA  baru  dikenal  pada  awal  tahun 1980-an.  Pada  tanaman  karet  penggunaan marka molekuler iso-enzim telah dimulai pada tahun  1980-an  dengan  tujuan  identifikasi kultivar,  analisis  keanekaragaman  genetik, pengawasan  hasil  persilangan  buatan,  dan biologi reproduksi (Chevallier, 1988).
Teknik  marka  molekuler  yang  tersedia selama tiga dekade terakhir dikelompokkan ke dalam  tiga  kategori  berdasarkan  waktu kemunculannya  yaitu  generasi  pertama, generasi kedua dan generasi ketiga. Generasi pertama meliputi Random Amlified Polymorphic DNA (RAPD) dan Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), generasi kedua meliputi Simple Sequence Repeats (SSR) atau mikrosatelit dan Amplified  Fragment  Length  Polymorphism (AFLP), dan generasi ketiga meliputi Expressed Sequence  Tags (EST)  dan Single  Nucleotide Polymorphism (SNP)  (Gupta et  al .,  2001). Seluruh teknik marka molekular tersebut telah diaplikasikan  pada  tanaman  karet  untuk mendukung  program  pemuliaan  dalam pembentukkan klon karet unggul.
1.  Marka RAPD
Te k n i k   R A P D   m e r u p a k a n   m a r k a molekuler yang didasarkan pada aplikasi PCR dengan menggunakan primer tunggal (10 pb) untuk  mengamplifikasi  sekuen  DNA.  Salah satu  masalah  serius  yang  terjadi  pada perkebunan karet adalah kerusakan tanaman oleh  angin.  Hal  ini  dapat  diatasi  dengan menggabungkan karakter kerdil dan produksi lateks tinggi sehingga menghasilkan tanaman kerdil dengan produksi tinggi. Venkatachalam
et  al .,  (2004)  telah  mengidentifikasi  karakter kerdil  pada  tanaman  karet  menggunakan marka  RAPD.  Marka  RAPD  juga  telah d i g u n a k a n   u n t u k   m e n g e t a h u i keanekaragaman genetik dan struktur plasma nutfah koleksi IRRDB 1981 (Lam et al ., 2009). Penelitian  tersebut  menyimpulkan  bahwa koleksi  plasma  nutfah  IRRDB  1981  di Vietnam  memiliki  karagaman  genetik  yang tinggi dan perbedaan interdistrict yang rendah. Oktavia et al ., (2011a) telah menganalisis jarak genetik  beberapa  klon  tanaman  karet menggunakan  marka  RAPD.  Amplifikasi DNA genom dari 45 klon menghasilkan 2.408 fragmen  DNA  yang  berukuran  250-3.000  bp dengan  kisaran  matriks  kesamaan  genetik cukup luas (59,18%-94,23%).
2.  Marka RFLP
Marka  RFLP  merupakan  salah  satu  jenis analisis  molekuler  yang  didasarkan  pada pemotongan situs DNA dengan menggunakan enzim  restriksi  sehingga  menghasilkan fragmen-fragmen  DNA  dengan  berbagai ukuran.  Perbedaan  ukuran  fragmen  tersebut disebabkan  adanya  perbedaan  jumlah  dan distribusi  situs  restriksi  yang  terdapat  pada DNA sehingga mempengaruhi aktivitas enzim t e r s e b u t .   B e s s e e t   a l .   ( 1 9 9 4 )   t e l a h mengidentifikasi  keragaman  genetik  dari  92 tipe liar (Amazonian) dan 73 klon Wickham. Hasil  penelitian  tersebut  mendapatkan  124 variasi  fragmen  restriksi  menggunakan kombinasi  31  probe  dan  hanya  10  fragmen yang spesifik untuk individu tunggal.
3.  Marka AFLP
Teknik AFLP didasarkan pada amplifikasi selektif   menggunakan  metode Polymerase Chain  Reaction (PCR)  terhadap  sekumpulan DNA  genomik  yang  sebelumnya  dipotong dengan enzim restriksi dan diligasikan dengan adapter  berupa  oligonukleotida  utas  ganda. Lespinasse et  al .  (2000)  telah  berhasil memperoleh  peta  genetik Hevea berdasarkan keturunan F1 dari persilangan antara PB 260 dan  RO  38  menggunakan  beberapa  teknik marka  molekuler  termasuk  marka  AFLP. To r u a n - M a t h i u s e t   a l .   ( 2 0 0 2 )   t e l a h mengidentifikasi  kesamaan  genetik  antar
beberapa klon karet yang tergolong tahan dan rentan  terhadap  penyakit  gugur  daun Corynespora (PGDC)  menggunakan  marka AFLP  serta  mempelajari  efektivitas  marka t e r s e b u t .   H a s i l   p e n e l i t i a n   t e r s e b u t menunjukkan  bahwa  marka  AFLP  lebih efektif   dan  diskriminatif   berdasarkan  nilai marka  indeks  dan  kesamaan  genetik dibandingkan dengan marka RAPD.
4.  Marka SSR (Mikrosatelit)
Marka  SSR  merupakan  suatu  marka molekular  yang  akan  mendeteksi  rangkaian pola  nukleotida  (DNA),  biasanya  antara  dua sampai  enam  pasang  basa  N,  yang  berulang secara berurutan. Marka ini sering digunakan untuk  mempelajari  pautan  ( linkage ),  menguji kemurnian galur, pemetaan, analisis populasi, sistem  perkawinan  dan  struktur  populasi. Beberapa keunggulan teknik SSR diantaranya adalah  keberadaannya  berlimpah,  bersifat kodominan,  polimorfik  tinggi,  jumlah  lokus yang  banyak,  dan  tidak  memerlukan  waktu lama. Souza et al . (2009) telah mendapatkan 27 lokus  mikrosatelit  polimorfik  yang  diisolasi dan  dikarakterisasi  dari  pustaka  genom dengan  sekuen  GA-CA  berlimpah.  Lokus yang teridentifikasi tersebut dapat menjadi alat untuk  mempelajari  genetik  populasi, keragaman  genetik  dan  aliran  gen  diantara spesies Hevea .
5.  Marka Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Single  Nucleotide  Polymorphism merupakan variasi  DNA  atau  gen  yang  berasal  dari perubahan  satu  atau  dua  basa  pada  sekuen DNA  atau  gen.  Perubahan  satu  nukleotida pada  DNA  atau  gen  dapat  terjadi  melalui mutasi titik/gen yang meliputi mutasi transisi, tranversi,  insersi  dan  delesi.  Penelitian menggunakan  marka  SNP  untuk  identifikasi keragaman pada tanaman karet masih sangat sedikit  dilakukan.  Pootakham et  al .  (2011) telah  menggunakan  marka  SNP  untuk mengidentifikasi  keragaman  pada H. brasiliensis .  Penelitian  tersebut  telah mengidentifikasi  5883  SNP  bialel  dalam  9,2 Mb sekuen. Variasi nukleotida terjadi karena mutasi transisi (56,3 %), mutasi transversi (33,7 %), dan mutasi insersi/delesi (10 %).

## Perkembangan Penelitian Bioteknologi
H. Brasiliensis di Indonesia
Walaupun  Indonesia  memiliki  areal perkebunan  karet  terluas  di  dunia  namun produksi karet alam Indonesia masih berada di peringkat  kedua  setelah  Thailand.  Sutrisno (2006)  menyatakan  bahwa  bioteknologi d i h a r a p k a n   d a p a t   b e r p e r a n   d a l a m mewujudkan tujuan peningkatan dan stabilitas produksi, peningkatan mutu dan nilai tambah produk pertanian (termasuk juga perkebunan). Sampai  saat  ini  perkembangan  penelitian bioteknologi pada tanaman karet di Indonesia berkaitan dengan propagasi melalui teknik SE dan microcutting serta  studi  identifikasi keragaman  (Tabel  2).  Sementara  itu  negara penghasil karet alam lainnya seperti Malaysia dan  Thailand  telah  melakukan  penelitian bidang  rekayasa  genetika  untuk  medapatkan klon unggul tanaman karet. Bahkan Srilanka telah  memulai  penelitian  mengenai  kultur anther  (serbuk  sari)  sejak  tahun  1973  untuk menghasilkan  tanaman  haploid  atau  haploid ganda (Satchuthananthabale, 1973).
Bioteknologi  pada  tanaman  karet  di Indonesia  telah  dilakukan  sejak  pertengahan tahun  1980-an  oleh  Balai  Penelitian Bioteknologi  Perkebunan  Indonesia  (BPBPI) dan  Balai  Penelitian  Sungei  Putih  (BPSP). Penelitian  diawali  dengan  studi  keragaman populasi H.  brasiliensis menggunakan  sidik protein  dan  perbanyakan  tanaman  karet menggunakan teknik stek mikro. Selanjutnya Pusat  Penelitian  Perkebunan  Sungei  Putih (1990)  melaporkan  keberhasilan  beberapa program  bioteknologi  yaitu  kultur  embrio in vitro ,  induksi  tunas  ganda  dan  sidik  protein pada  tanaman  karet.  Tahardi  (1998a)  telah mendapatkan  tanaman  karet  berasal  dari perbanyakan  menggunakan  teknik somatic embryogenesis , namun tingkat keberhasilannya masih  rendah  yaitu  di  bawah  10%.  Jika dibandingkan  dengan  komoditas  perkebunan lainnya  bioteknologi  pada  tanaman  karet masih  berjalan  belum  optimal  (Tabel  3). Teknik bioteknologi pada tanaman karet baru sebatas  diaplikasikan  untuk  perbanyakan tanaman  (somatik  embrio  dan microcutting )
Upaya perbaikan genetik dan penyediaan bibit tanaman karet ( hevea brasiliensis muell. arg.) melalui pendekatan bioteknologi
dan  identifikasi  sifat  (marka  molekuler). Sedangkan,  tanaman  transgenik  melalui teknik rekayasa genetika telah dihasilkan pada komoditas perkebunan lainnya seperti kelapa sawit  (Purwoko,  2012),  tebu  (Susiyanti et  al , 2007),  kopi  (Siswanto et  al .,  2003),  dan  teh (Siswanto et al ., 1999).
Pe n e l i t i a n   m e n g e n a i   i d e n t i f i k a s i keragaman  genetik  menggunakan  marka RAPD  pada  tanaman  karet  telah  berhasil dilakukan  untuk  menganalisis  kekerabatan hasil  persilangan  (Aidi-Daslin et  al .,  2007; Woelan, 2007), pengelompokan tetua (Oktavia et  al .,  2007;  Tistama et  al .,  2008),  dan
Tabel 2. Perkembangan penelitian bioteknologi Hevea brasiliensis di beberapa Negara.
Negara Perkembangan penelitian SE Microcutting Identifikasi Kultur anther Eksplorasi gen Rekayasa genetika
Sumber: Pasaribu dan Woelan (2011). Woelan et al . (2007), Tahaedi JS (1998), Arokiaraj (2007), Nurhaimi-Haris et al . (2009b), Protakham et al . (2011), Satchuthananthable (1973), Seneviratne (1991).
Indonesia Malaysia Thailand Srilanka
Tabel 3. Perkembangan penelitian bioteknologi pada tanaman karet.
Tanaman Aspek Penelitian Institusi* Perkembangan penelitian Karet Propagasi massal BPBPI Tanaman  berasal  dari  embrio  somatik (Tahardi, 1998a) BPBPI& PPK Tanaman  batang  bawah  berasal  dari stek  pucuk  (Nurhaimi-Haris et  al ., 2009b) Identifikasi sifat PPK Analisis kekerabatan (Aidi-Daslin et al ., 2007),  pengelompokkan  tetua  (Tistama et  al .,  2008),  dan  identifikasi  klon  karet anjuran (Oktavia et al ., 2009).
Keterangan: * BPBPI : Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. PPK : Pusat Penelitian Karet.
.
identifikasi klon karet anjuran (Oktavia et al ., 2009). Hasil penelitian tersebut sangat berguna dalam  proses  seleksi  klon  hasil  persilangan ataupun  seleksi  tetua  yang  akan  digunakan dalam  persilangan  sehingga  didapatkan  klon unggul baru dengan waktu relatif  lebih cepat. Sementara itu penelitian mengenai microcutting belum  banyak  dilaporkan.  Nurhaimi-Haris et al .  (2009b)  melaporkan  bahwa  teknik microcutting memiliki  keberhasilan  tahap primary culture sebesar 60 %, laju multiplikasi per  siklus  subkultur  1,2  –  1,5  kali,  dan keberhasilan tahap aklimatisasi berkisar 20 % – 60  %.  Sampai  saat  ini  masih  ter us dikembangkan  metode  yang  efisien  untuk m e l e n g k a p i   t e k n i k m i c ro c u t t i n g a g a r didapatkan tingkat keberhasilan yang tinggi.
Penelitian bioteknologi pada tanaman karet memerlukan  suatu  keseriusan  dalam  hal pembinaan dan pengembangan baik dari segi SDM maupun sarana/prasarana. Tidak dapat dipungkiri  penyediaan  sarana/prasarana penelitian  yang  memadai  sangat  dibutuhkan untuk  mendukung  kemajuan  bioteknologi. Selain  itu  sumber  dana  yang  besar  dan berkesinambungan  perlu  diperhatikan  agar keberlangsungan  penelitian  dapat  terlaksana. Hal  yang  tidak  kalah  penting  dari  itu  semua adalah kerjasama yang erat tidak hanya antar peneliti namun juga antara lembaga penelitian negara maupun swasta serta universitas baik di dalam maupun di luar negeri.

## Kesimpulan
Bioteknologi dapat menjadi sebuah sarana yang handal untuk perbaikan mutu genetik dan perbanyakan  bibit H.  brasiliensis dalam menunjang  kemajuan  program  pemuliaan tanaman  karet.  Beberapa  teknik  yang  dapat digunakan  adalah  teknologi  kutur  jaringan, rekayasa  genetika,  dan  marka  molekuler. Selain itu, bioteknologi dapat mempersingkat waktu dalam menghasilkan klon unggul baru tanaman karet melalui teknik marka molekuler dan rekayasa genetika. Kultur jaringan mampu memecahkan permasalahan berkaitan dengan perbanyakan  klon  unggul  tanaman  karet
melalui  teknik  embriogenesis  somatik,  kultur tunas,  dan  organogenesis.  Marka  molekuler dapat  berfungsi  untuk  analisis  kekerabatan, pengelompokkan  tetua  persilangan,  dan identifikasi  sifat  unggul  tanaman  karet  hasil persilangan.  Teknik  rekayasa  genetika  sangat potensial  sebagai  alat  dalam  pembentukkan klon  unggul  baru  yang  memiliki  sifat-sifat spesifik dengan waktu yang lebih singkat.

## Daftar Pustaka
Aidi-Daslin, Sayurandi, dan S. Woelan. 2007. Analisis  kekerabatan  genetik  populasi  F1 hasil  persilangan  tetua  tanaman  karet penghasil  lateks  dan  kayu  berdasarkan teknik RAPD. J. Penelitian Karet 25(2): 1-9.
Aitken-Christie J, T. Kozai, and S. Takayama.
1995.  Automation  in  plant  tissue  culture: general  introduction  and  overview.  In: Automation and environmental control in plant  tissue  culture.  Kluwer  Academic Publisher.
Andersen  S.  B.  2005.  Haploids  in  the improvement  of   woody  spesies. In :  C.E. Palmer, W. A. Keller, and K. J. Kasha (eds). Biotechnology in Agricultural and Forestry. Berlin  Heidelberg,  Springer-Verlag.  243- 257.
Arnold S. V., I. Sabala, P. Bozhkov, J. Dyachok, and  L.  Filonova.  2002.  Developmental pathways of  somatic embryogenesis. Plant Cell,  Tissue  and  Organ  Culture  69: 233–249.
Arokiaraj,  P.  and  A.  R.  Wan.  1991.
Agrobacterium -mediated  transformation  of Hevea cells derived from in vitro and in vivo seedling cultures. J. Nat. Rub. Res. 6: 55-61. Arokiaraj,  P.,  H.  Jones,  K.  F.  Cheong,  S. Coomber, and B. V. Charlwood. 1994. Gene insertion  into Hevea  brasiliensis .  Plant  Cell Reports 13: 425-430.
Arokiaraj,  P.,  F.  Ruker,  E.  Obermayr,  A.  R. Shamsul Bahri, J. Hafsah, D. C. Carter, and H.  Y.  Yeang.  2002.  Expression  of   human serum  albumin  in  transgenic Hevea brasiliensis . J. Nat. Rub. Res. 5: 157-166.5.
Upaya perbaikan genetik dan penyediaan bibit tanaman karet ( hevea brasiliensis muell. arg.) melalui pendekatan bioteknologi
Arokiaraj, P. 2007. Rubber. In : E. C. Pua and M.  R.  Davey  (eds).  Biotechnology  in Agriculture  and  Forestr y,  Vol.  60 Transgenic  Crops  V.  Berlin  Heidelberg, Springer-Verlag. 371-386.
Badan  Pusat  Statistik.  2014.  Statistika  Karet Indonesia  2013.  Badan  Pusat  Statistik,
Jakarta.
Besse,  P.,  M.  Seguin,  P.  Lebrun,  M.  H.
Chevallier,  D.  Nicolas,  and  C.  Lanaud. 1994.  Genetic  diversity  among  wild  and cultivated  populations  of Hevea  brasiliensis assessed  by  nuclear  RFLP  analysis. Theoretical and Applied Genetics 88: 199- 207.
Bhojwani, S. S. and M. K. Razdan. 1996. Plant tissue  culture:  theory  and  practice,  a Revised Edition. Elsevier Science.
Blanc, G., C. Baptiste, G. Oliver, F. Martin, and
P.  Montoro.  2006.  Efficient Agrobacterium tumefaciens -mediated  transformation  of embryogenic  calli  and  regeneration  of Hevea brasiliensis Mull Arg. Plants Plant Cell Rep. 24: 724–733.
Boerhendhy, I., C. Nancy, dan K. Amypalupy. 2009. Strategi pengembangan bahan tanam klon  karet  unggul.  Dalam  Prosiding Lokakarya  Nasional  Pemuliaan  Karet. Pusat Penelitian Karet.
Carron, M. P., Nurhaimi-Haris, L. Lardet, V. Caussanel, J. Keli, B. G. Dea, A. Leconte, Sumarmadji, and P. Montoro. 2007. Hevea rootstock clones development. Building up new varietal type: a multi-faceted challenge. Proc. of  IRCE Conference, Bali, June 2007. Chevallier, M. H. 1988. Genetic variability of Hevea  brasiliensis germplasm  using isozyme  markers.  J.  Nat.  Rub. Res.  3: 42–53.
Chen, F., C. Chen, C. S. Wang, H. Hsu, Y. Ho, and U. T. Li. 1978. Obtaining pollen plants of Hevea brasiliensis Muell Arg. Proc. Symp.
Plant Tissue Culture, Peking, China: 11-22. Chen, Z., C. Qian, M. Qin, X. Xu, and Y. Xiao.
1982. Recent advances in anther culture of
Hevea  brasiliensis (Muell.  Arg).  Theoretical and Applied Genetics 62: 103-138.
Chen,  Z.  1990.  Rubber (Hevea  brasiliensis Muell.  Arg.):  in  vitro  production  of h a p l o i d s .   I n   Y P S   B a j a j   ( e d s ) , Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol.  12  Haploids  in  Crop  Improvement  I. Berlin Heidelberg, Springer-Verlag. p. 215- 236.
Chotigeat,  W.,  S.  Duangchu,  and  A.
Phongdara.  2010.  cDNA  library  from  the latex of Hevea brasiliensis . Songklanakarin J.
Sci. Technol 32 (6): 555-559.
Chua, S. E. 1966. Studies on tissue culture of
Hevea  brasiliensis :  role  of   osmotic concentration, carbohydrate and pH value in  induction  of   callus  growth  in  plumule tissue  from Hevea seedling.  Journal  of Rubber Research Institute of  Malaya 19 (5): 272-276.
Debergh,  P.  and  R.  H.  Zimmerman.  1991. Micropropagation:  technolog y  and application. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht : 484 .
Direktorat Jendral Perkebunan. 2012. Statistik perkebunan  Indonesia:  tanaman  karet. Jakarta, Sekretariat Ditjenbun, Jakarta.
Gupta, P. K., J. K. Roy, and M. Prasad. 2001. Single  nucleotide  polymorphism  for molecular  marker  technology  and  DNA polymorphism detection with emphasis on their use in plants. Curr. Sci. 80: 524–535.
Han, K., D. O. Shin, J. Yang, I. J. Kim, S. K.
Oh,  and  K.  S.  Chow.  2000.    Genes expressed  in  the  latex  of Hevea  brasiliensis. Tree Physiology 20 (8): 503-510.
Huang  Tiandai,  Li  Weiguo,  Huang  Huasun, and  Lizhe.  2005.  Somatic  embryogenesis and  plant  regeneration  from  cotyledone ex p l a n t s   o f H e v e a b ra s i l i e n s i s .   I n International  Natural  Rubber  Conference, Rubber Research Institute of  India : 79.
Internatioal  Rubber  Study  Group.  2013.
Rubber Statistical Bulletin January – March 2013. IRSG, Singapore.
Jayashree, R., K.   Rekha, S. Sushamakumari, a n d   A .   T h u l a s e e d h a r a n .   2 0 0 5 . Establishment  of   callus  cultures  from isolated  microspores  of Hevea  brasiliensis . National  Symposium  on  Biotechnological Inter ventions  for  Improvement  of Horticultural Crops, Trissu: 176-178. Jayashree, R., S. Sobha, K. Rekha, R. Supriya, M.  Vineetha,  S.  Sushamakumari,  R.  G. Kala, P. K. Jayasree, A. Thulaseedharan, K. Annamalainathan, D. B. Nair, S. Sreelatha, R. Krishnakumar, and J. Jacob. 2011. Over- expression of  MnSOD and related drought tolerant traits in MnSOD Transgenic Hevea brasiliensis . Natural Rubber Research 24 (1):
18-27.
Kala,  R.  G.,  V.  Abraham,  S.  Sobha,  P.  K.
J a y a s r e e ,   A .   M .   S u n i ,   a n d   A . Thulaseedharan.  2013. Agrobacterium- mediated  genetic  transformation  and somatic embryogenesis from leaf  callus of Hevea brasiliensis : effect of  silver nitrate. in : a sabu  and  a  augustine  (eds),  prospects  in bioscience: addressing the issues. Springer, India.
Lam, L. V., T. Thanh, V. T. Q. Chi, and L. M. Tuy.  2009.  Genetic  diversity  of Hevea IRRDB'81  collection  assessed  by  RAPD markers. Mol Biotechnol 42: 292–298. Leclercq, J., L. Lardet, F. Martin, T. Chapuset, G. Oliver, and P. Montoro. 2010. The green fluorescent protein as an efficient selection marker  for  Agrobacterium  tumefaciens- mediated  transfor mation  in Hevea brasiliensis (Mull. Arg). Plant Cell Rep 29: 513-522.
Lespinasse, D., M. Rodier-Goud, L. Grivet, A. Leconte, H. Legnat´e, and M. Seguin. 2000. A saturated genetic linkage map of  rubber tree  ( Hevea spp.)  based  on  RFLP,  AFLP, microatellite  and  isozyme  markers.  Theor Appl Genet 100: 127–138.
Mendanha, A. B. L., R. A. A. Torres,and A. B. Freire.  1998. Micropropagation  of   rubber trees ( Hevea brasiliensis Muell. Arg.). Genet. Mol. Biol 21 (3): 1415.
Montoro,  P.,  N.  Tcinscree,  W.  Rattana,  P. Kongsawadworakul,  and  N.  Michaux- Ferriere. 2000. Effect of  exogenous calcium on Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer  in Hevea  brasiliensis (rubber  tree) friable calli. Plant Cell Reports 19: 851-855.
Nichol,  D.  S.  T.  2008.  An  introduction  to genetic engineering. Cambridge University Press, New York.
Nurhaimi-Haris,  A.  Darussamin,  and  W.  A.
Dodd. 1993. Isolation of  rubber tree ( Hevea brasiliensis Muell.  Arg)  protoplasts  from callus  and  cell  suspensions.  Menara Perkebunan 61(2), 25-31.
Nurhaimi-Haris,  Sumaryono,  dan  M.  P.
Carron.  2009a.  Pengaruh  bahan  pra- sterilan,  tutup  tabung  kultur,  dan  musim terhadap tingkat kontaminasi eksplan pada k u l t u r m i c ro c u t t i n g k a r e t .   M e n a r a Perkebunan 77(2): 89-99.
Nurhaimi-Haris,  Sumaryono,  Siswanto, Sumarmadji, D. P. Kasi, dan M. P. Carron. 2009b.  Teknologi microcutting untuk p e r b a n ya k a n   b a h a n   t a n a m   k a r e t . Lokakarya  Nasional  Pemuliaan  Tanaman Karet. Pusat Penelitian Karet.
Oktavia, F., M. Lasminingsih, S. Ismawanto, dan  Kuswanhadi.  2007.  Analisis  genetik klon-klon tanaman karet ( Hevea brasiliensis ) m e n g g u n a k a n   p e n a n d a   R A P D.   J. Penelitian Karet 25(1): 1-12.
O k t av i a ,   F. ,   M .   L a s m i n i n g s i h ,   d a n Kuswanhadi.  2009.  Identifikasi  klon  karet anjuran dengan teknik RAPD. J. Penelitian Karet 27(1): 21-31.
Oktavia,  F.  2011.  Prospek  penggunaan teknologi somatic  embryogenesis dalam penyediaan bibit karet secara massal. Warta perkaretan 30 (1): 1-9.
O k t av i a ,   F. ,   M .   L a s m i n i n g s i h ,   d a n Kuswanhadi.  2011a.  Genetic  relationship of   Wickham  and  IRRDB  1981  rubber population  based  on  RAPD  markers Analysis. HAYATI Journal of  Biosciences 18 (1):  27-32.
Upaya perbaikan genetik dan penyediaan bibit tanaman karet ( hevea brasiliensis muell. arg.) melalui pendekatan bioteknologi
O k t av i a ,   F. ,   M .   L a s m i n i n g s i h ,   a n d Kuswanhadi.  2011b.  Selection  of   parent trees for Rubber ( Hevea brasiliensis ) breeding based  on  RAPD  analysis.  Nusantara Bioscience 3 (3): 124-129.
Paranjothy,  K.  1974.  Induced  root  and embryoid differentiation in Hevea brasiliensis in culture. Third International Congress of Plant  Tissue  and  Cell  Culture.  Univ. Leicester Abstract No. 67.
Paranjothy,  K.  and  H.  Ghandimathi.  1975. Morphogenesis in callus cultures of Hevea brasiliensis Muell. Arg. Proceedings of  Plant Tissue.  Culture  Symposium,  Kuala Lumpur.
Paranjothy,  K.  and  H.  Gandimathi.  1976. Tissue  and  organ  culture  of Hevea. Proceedings  of   International.  Rubber Conference, Kuala Lumpur.
Pasaribu, S. A. dan S. Woelan. 2011. Induksi kalus  dari  eksplan  kotiledon  pada pembentukan  embrio  somatic  tanaman karet. Warta perkaretan 30 (2): 80-87.
Pootakham,  W.,  J.  Chanprasert,  N.  Jomchai,
D.   S a n g s r a k r u ,   T.   Yo o c h a ,   K . T h e r a w a t t a n a s u k ,   a n d   S . Tangphatsornruang.  2011.  Single  nucleo- tide polymorphism marker development in the  r ubber  tree, Hevea  brasiliensis ( Euphorbiaceae ).  American  Journal  of Botany: 337–338.
Pusat  Penelitian  Perkebunan  Sungei  Putih.
1990.  Laporan  Tahunan  1990.  Pusat Penelitian Perkebunan Sungei Putih.
Purwoko,  D.  2012.  Rekayasa  genetika t a n a m a n   k e l a p a   s a w i t . www.biotek.bppt.go.id.,  diakses  pada  24 November 2013.
Priyadarshan,  P.  M.  and  A.  Clément- Demange.  2004.  Breeding Hevea rubber: formal and molecular genetics. Advances in Genetics 52: 51-115.
Rahman, A. Y. A, A. O. Usharraj, B. B. Misra, G. P. Thottathil, K. Jayasekaran, Y. Feng, S. Hou, S. Y. Ong, F. L. Ng, L. S. Lee, H. S. Tan,  M.  K.  L.  M.  Sakaff,  B.  S.  The  B.  F. Khoo, S. S. Badai, N. A. Aziz, A. Yuryev, B. Knudsen,  A.  Dionne-Laporte,  N.  P. Mchunu,  Q.  Yu,  B.  J.  Langston,  T.  A.  K. Freitas, A. G. Young, R. Chen, L. Wang, N. Najimudin, J. A. Saito, and M. Alam. 2013. Draft genome sequence of  the rubber tree Hevea brasiliensis . BMC Genomics: 14, 75.
Saha,  T.  and  P.  M.  Priyadarshan.  2012.
Genomics of Hevea Rubber. In: RJ Schnell &  PM  Priyadarshan  (eds),  Genomics  of Tree  Crops.  Springer  Science+Business Media, India.
Satchuthananthabale.  1973. Hevea tissue culture. J Rubb Res Inst Sri Lanka (Ceylon) 50: 91-97.
Seneviratne,  P.  1991.  Micropropagation  of juvenile and mature Hevea brasiliensis . PhD. Thesis, University of  Bath, UK.
Seneviratne, P., S. S. Gammanaliyanage, and G. A. S. Wijesekara. 1998. The effect of  the origin of  the explant on in vitro growth of axillary buds of Hevea brasiliensis . Tropical Agricultural Research and Extension 1 (2): 98-102.
Siregar  dan  Suhendry.  2013.  Budidaya  dan teknologi karet. Penebar Swadaya.
Siswanto, F. Oktavia, A. Budiani, Sudarsono, P r i yo n o,   d a n   S.   M awa r d i .   2 0 0 3 . Transfor masi  kopi  robusta  ( Cof fea canephora )  dengan  gen  kitinase  melalui Agrobacterium  tumefaciens LBA4404.
Menara perkebunan 71 (2): 51-63.
Siswanto,  D.  Santoso,  and  T.  Chaidamsari. 1999. Transient GUS expression and callus development  of   cocoa,  coffee  and  tea f o l l o w i n g A g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d transformation. Menara perkebunan 67 (2): 8-16.
Sobha,  S.,  S.  Sushamakumari,  K.  Rekha,  R. Jayashree, R. G. Kala, R. Supriya, and A. Thulaseedharan.  2012.  Factor  promoting A g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d   g e n e t i c transformation  efficiency  in Hevea brasiliensis . Rubber Science 25 (2): 173-182. Souza, L. M., C. C. Mantello, M. O. Santos, P. S.  Goncalves,  and  A.  P.  Souza.  2009. Microsatellites  from  rubber  tree  ( Hevea brasiliensis ) for genetic diversity analysis and cross-amplification  in  six Hevea wild species. Conserv Genet Resour 1: 75-79. Srivastava, P. and R. Chaturvedi. 2008. In vitro androgenesis in tree species: an update and p r o s p e c t   f o r   f u r t h e r   r e s e a r c h .
Biotechnology Advances 26: 482–491.
Sushamakumari,  S.,  M.  P.  Asokan,  P. Anthony,  K.  C.  Lowe,  J.  P.  Power,  M.  R. Davey.  2000.  Plant  regeneration  from embryogenic  cell  suspension-derived protoplasts  of   rubber.  Plant  Cell, Tissue Organ Culture 61: 81-85.
Susiyanti, G. A. Wattimena, M. Surahman, A.
Purwito,  dan  D.  A.  Santosa.  2007.
Transformasi  tanaman  tebu  ( cv .  PSJT  94- 41)  dengan  gen  fitase  menggunakan Agrobacterium tumefaciens GV 2260 ( p BinPI- IIEC). Bul Agron 35 (3): 205-211. Sutrisno.  2006.  Peran  bioteknologi  dalam pembangunan  pertanian  di  Indonesia. Dalam  Seminar  Aplikasi  Isotop  dan Radiasi.
Tahardi,  J.  S.  1998a.  Plant  regeneration  in H e v e a   b r a s i l i e n s i s v i a   s o m a t i c embryogenesis. Menara Perkebunan 66 (1):
1-8.
Tistama, R. dan Hamim. 2007. Inkompabilitas jaringan Rootstock-Scion :  kasus  pada tanaman  karet  ( Hevea  brasiliensis ).  Warta Perkaretan 26 (2): 1-9.
Tistama,  R.,  Sayurandi,  Aidi-Daslin,  dan  S. Woelan.  2008.  Pengelompokan  tetua tanaman  karet  ( Hevea  brasiliensis Muell Arg.) berdasarkan penanda RAPD. J Penel Karet 26(1): 10-19.
Toruan-Mathius, N., Z. Lalu, Soedarsono, dan H. Aswidinnoor. 2002. Keragaman genetik klon-klon  karet  ( Hevea  brasiliensis Muell.
Arg)  yang  resisten  dan  rentan  terhadap Corynespora  casiicola berdasarkan  penanda RAPD dan AFLP. Menara Perkebunan 70 (2): 35-49.
Venkatachalam,  P.,  P.  Priya,  C.  K. Saraswathyamma,  A.  Thulaseedharan. 2004. Identification, cloning and sequence analysis of  a dwarf  genome specific RAPD marker  in  rubber  tree  ( Hevea  brasiliensis) . Plant Cell Rep 23: 237–332.
Venkatachalam, P., R. Jayashree, K. Rekha, S.
Sushmakumari, S. Sobha, P. Jayashree, R. G.  Kala,    and  A.  Thulaseedharan.  2006. Rubber tree ( Hevea brasiliensis Muell. Arg.).
In:  Wang  K  (ed)  Methods  in  molecular biology  (Vol  344) :  Agrobacterium protocols (Vol 2), Humana Press Inc., NJ, pp 153-164. Venkatachalam,  P.,  P.  K.  Jayasree,  S. Sushmakumari, R. Jayashree, K. Rekha, S. Sobha,  P.  Priya,  R.  G.  Kala,  and  A. T h u l a s e e d h a r a n .   2 0 0 7 .   C u r r e n t p e r s p e c t i v e s   o n   a p p l i c a t i o n   o f biotechnology  to  assist  the  genetic improvement  of   rubber  tree  ( Hevea brasiliensis Muell.  Arg.):  an  overview. f u n c t i o n a l   p l a n t   s c i e n c e   a n d Biotechnology . Global Science Books. Wardojo  dan  Tahardi.  1990.  Pemanfaatan b i o t e k n o l o g i   u n t u k   m e n u n j a n g pembangunan  perkebunan.  Dalam Seminar  Bioteknologi  Perkebunan  dan Lokakarya Biopolimer untuk Industri.
Wilson,  H.  M.  and  H.  E.  Stree.  1975.  The growth,  anatomy  and  morphogenetic potential  of   callus  and  cell  suspension cultures  of Hevea  brasiliensis .  Annals  of Botany 39: 671-682.
Woelan,  S.,  Aidi-Daslin,  I.  Suhendry,    M. Lasminingsih.  2005.  Evaluasi  keragaan klon  karet  IRR  Seri  100  dan  200  dalam Prosiding  Lokakarya  Nasional  Pemuliaan Tanaman Karet. Pusat Penelitian Karet.
Upaya perbaikan genetik dan penyediaan bibit tanaman karet ( hevea brasiliensis muell. arg.) melalui pendekatan bioteknologi
Woelan,  S.,  R.  Tistama,  dan  Aidi-Daslin. 2007. Determinasi keragaman genetik hasil persilangan  antar  populasi  berdasarkan karakteristik morfologi dan teknik RAPD.
J. Pen. Karet 25 (1): 13-26.
Yeang, H. Y., P. Arokiaraj, H. Jaafar, S. A. M
Arif, S. Rajamanikam, J. L. Chan, J. Sharib, R. Leelavathy, S. Hamzah, and C. P. E. Van Der Logt. 2002. Expression of  a fungcional recombinant antibody fragment in the latex of  transgenic Hevea brasiliensis . J. Rub. Res. 5
(4): 215-225.