ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 16 (2) (2013) : 38 – 41
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Studi Filogeni dan Uji Potensi Antibakteri serta Enzim Ekstraseluler Isolat Geobacillus sp. dari Sumber Air Panas Gedongsongo
Ifsantin Nihaya a , Purbowatiningrum Ria Sarjono a* , Agustina L. N. Aminin a ,
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: purbowatining@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t
Keywords: thermophilic bacteria, phylogeny, antibacterial, extracellular enzyme, Geobacillus sp.
Research  on  the study  of  phylogeny  and  test  of  antibacterial  potency  and  extracellular enzyme isolate Geobacillus sp. from Gedongsongo hot spring has been done. This study aims  to  explore  the  potential  of Geobacillus sp.  through  the  construction  of  phylogeny trees and to know its molecular potentials include antibacterial and extracellular enzymes xylanase and cellulase. The construction of phylogeny tree was done using Phylip 3.68 ed program,  Distance  Matrix  method  (Neighboring  joining)  with  parameter  F48.  It  also tested the antibacterial potential of secondary metabolites of Geobacillus sp. dYTae-14 and dGae-3  by  perforation  diffusion  method  against Escherichia  coli and Bacillus  subtilis . Extracellular enzyme test of xylanase and cellulase was done qualitatively. The results of phylogeny  tree  construction  show  that  these  eight  strains are Geobacillus sp.  typical  of Gedongsongo whose kinship is very close to each other and has a kinship relationship with the  bacteria Bacillus  caldotenax strain  BCRC  11956, Geobacillus  kaustophilus subsp. Vulgivagus strain CDZ 1 and Geobacillus thermoleovorans sp. Isolate Geobacillus sp. dYTae- 14  and  dGae-3  tested  for  their  antibacterial  potency  showed  no  antibacterial  potential against Escherichia coli and Bacillus subtilis . Eight isolates Geobacillus sp. does not show the potential for extracellular enzyme xylanase and cellulase.

## A b s t r a k
Kata Kunci: bakteri termofilik, filogeni,
antibakteri, enzim ekstraseluler,
Geobacillus sp.
Penelitian  tentang  studi  filogeni  dan  uji  potensi  antibakteri  serta  enzim  ekstraseluler isolat Geobacillus sp. dari sumber air panas gedongsongo telah dilakukan. Penelitian ini bertujuan  untuk  menelusuri  potensi Geobacillus sp.  melalui  konstruksi  pohon  filogeni serta mengetahui potensi-potensi molekulernya meliputi potensi antibakteri dan enzim ekstraselular xilanase dan selulase. Konstruksi pohon filogeni dilakukan menggunakan program Phylip 3.68 ed, metode Distance matriks (Neighbour joining) dengan parameter F48.  Selain  itu  juga  diuji  potensi  antibakteri  dari  metabolit  sekunder Geobacillus sp. dYTae-14 dan dGae-3 dengan metode difusi perforasi terhadap Escherichia coli dan Bacillus subtilis .  Uji  enzim  ekstraseluler  xilanase  dan  selulase  dilakukan  secara  kualitatif.  Hasil konstruksi  pohon  filogeni  menunjukkan  bahwa  kedelapan  strain  ini  merupakan Geobacillus sp. khas Gedongsongo yang hubungan kekerabatannya sangat dekat satu sama lain  dan  mempunyai  hubungan  kekerabatan  dengan  bakteri Bacillus  caldotenax strain BCRC  11956, Geobacillus  kaustophilus subsp.  Vulgivagus  strain  CDZ  1  dan Geobacillus thermoleovorans sp.  Isolat Geobacillus sp.  dYTae-14  dan  dGae-3  yang  diuji  potensi antibakterinya  tidak  menunjukkan  adanya  potensi  antibakteri  terhadap Escherichia  coli dan Bacillus subtilis . Kedelapan isolat Geobacillus sp. tidak menunjukkan potensi adanya enzim ekstraselluler xilanase dan selulase.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 16 (2) (2013) : 38 – 41

## 1. Pendahuluan
Bakteri  ekstremofil  merupakan  mikroorganisme yang  tumbuh  dengan  subur  dalam  lingkungan  yang ekstrem  [1].  Salah  satu  jenis  bakteri  ekstremofil  adalah bakteri  termofilik  yang  mampu  bertahan  hidup  pada temperatur tinggi yaitu pada 45 0 C sampai lebih dari 70 0 C [2].  Bakteri  ini  umumnya  dapat  diisolasi  dari  berbagai sumber seperti kompos, limbah, tanah dan air  [3]. Dari kompos  panas,  ditemukan Bacillus  stearothermophilus yang  hidup  pada  temperatur  65-69 0 C  [4].  Selain  itu, beberapa  jenis  bakteri  aerobik  termofilik  juga  telah diisolasi  dari  sumber  air  panas  di  Fiji  yang  hidup  pada suhu 45-85 0 C dan bahkan mampu bertahan sampai suhu 90 0 C [5].
Isolasi delapan bakteri termofilik Geobacillus sp. dari sumber air panas Gedongsongo. Identifikasi isolat-isolat tersebut telah dilakukan berdasarkan urutan nukleotida gen  16S  rRNAnya,  tapi  hingga  saat  ini  belum  ditelusuri potensi molekulernya berdasarkan hubungan kekerabatannya.  Identifikasi  hubungan  kekerabatan antarbakteri  dapat  dilakukan  berdasarkan  urutan nukleotida gen 16S-rRNA. Bakteri termofilik mempunyai beberapa  potensi  yaitu  dapat  menghasilkan  enzim, antibiotik, komponen anti-alga dan zat anti kanker [6].
Salah  satu  potensinya  adalah  sebagai  agen antibakteri,  sejauh  ini  telah  ditemukan  senyawa antibakteri  dari Yersinia  sp.1 dan Aeromonas  hydrophila yang diisolasi dari sumber air panas di Jordan. Senyawa antibakteri  dari  bakteri  termofilik  ini  mampu menghambat  pertumbuhan Escherichia  coli dan Staphylococcus aureus . Selain itu, termofilik Bacillus specie SAT-4  menghasilkan  antibiotik  yang  stabil  pada  suhu tinggi  dan  mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri gram  positif S.aureus dan Micrococcus  luteus. Pencarian antibakteri  alternatif  perlu  dilakukan  mengingat semakin banyak bakteri patogenik yang menjadi resisten terhadap antibakteri yang sudah ada [7].
Selain  berpotensi  sebagai  antibakteri,  bakteri termofilik juga dapat menghasilkan enzim ekstraseluler termostabil.  Enzim  termostabil  mempunyai  banyak manfaat  yaitu  tahan  pada  suhu  tinggi,  peningkatan kecepatan reaksi, meningkatkan kelarutan substrat dan mengurangi  resiko  kontaminan  dari  mikroorganisme patogen [8].

## 2. Metode Penelitian

## Alat & Bahan
Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  inkubator  ( Memmert  model  300 ),  mikropipet, shaker ,  inkubator  shaker  (Memmert),  spektronic  20, autoklaf klinis (Clinical autoclave prestige medical series 2100),  cawan  petri,  sentrifuge  (Beckman  model  J2-21), jarum ose, alumunium foil, kulkas ( Sharp dan Panasonic ) , kapas,  botol  semprot  serta  alat-alat  gelas.  Bahan  yang digunakan  adalah  delapan  isolat Geobacillus  sp. ,  bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis, media BSM ( Basal salt medium ) , Media  NA  (Nutrien  agar),  Media  NB  (Nutrien broth),  Nutrisi  YT  ( Yeast  tripton ),  Nutrisi  NB  ( Nutrient
Broth ),  Congo  red,  Xilan,  Carboxy  Methyl  Cellulose, Glukosa, Alkohol 70%, dan akuades.

## Studi Filogeni
Studi  filogeni  dengan  cara  dikonstruksi  pohon filogeninya menggunakan program Phylip 3,68 ed Metode Distance  Matriks  (Neighbour  joining) dengan  parameter F48.

## Strain bakteri
Geobacillus strain  dGae-3,  dNbae-1,  dNBae-3X, dYTae-1,  dYTae-3,  dYTae-5,  dYTae-13  dan  dYtae-14 merupakan bakteri yang diisolasi dari sumber air panas Gedong  Songo,  Semarang  [9].  Bakteri  ini  dikulturkan dalam  media Basal  salt  medium (pH  6)  [10]  dengan penambahan  nutrisi  0,05%  glukosa, yeast  ekstrak dan nutrient broth dan diinkubasi pada suhu 55 0 C.

## Produksi senyawa antibakteri
Sebanyak  25  L  isolat Geobacillus dari  media  stater diinokulasikan  kedalam  250mL  media  BSM  cair  dan diinkubasi pada suhu 55 0 C. Inkubasi dihentikan pada fase kematian.  Setelah  mencapai  fase  kematian,  campuran kultur  disentrifugasi  pada  5000  rpm  sehingga didapatkan supernatan.

## Pengujian aktivitas antibakteri
Pengujian  aktivitas  antibakteri  dilakukan  dengan metoda difusi agar secara perforasi. Bakteri penguji yang digunakan  adalah Escherichia  coli dan Bacillus  subtilis . Kedalam cawan petri dimasukkan biakan bakteri penguji dalam  media  nutrien  agar  cair  steril.  Setelah  dingin, media  kemudian  dilubangi  dengan  alat  pelubang. Kemudian pada lubang tersebut dimasukkan supernatan hasil fermentasi. Selanjutnya, diinkubasi pada suhu 30 0 C dan  dilakukan  pengamatan  diameter  hambatan  yang terjadi disekitar lubang.

## Uji enzim ekstraseluler
Aktivitas  xilanase  diukur  dengan  uji  kemampuan enzim kasar menghidrolisis xilan menjadi gula reduksi. Analisis  gula  reduksi  dilakukan  dengan  menggunakan pereaksi  DNS.  Sedangkan  aktivitas  sellulase  dilakukan dengan  menginokulasikan  isolat  bakteri Geobacillus  sp. pada  media  padat  BSM  yang  mengandung  0,5%  CMC, kemudian  diinkubasi  pada  suhu  55 0 C.  Setelah  inkubasi, ditambahkan  larutan  penguji  congo  red  dan  dicuci dengan menggunakan larutan NaCl. Terbentuknya zona bening menunjukkan adanya aktivitas enzim selulase.

## 3. Hasil Dan Pembahasan

## Studi Filogeni
Data  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  isolat Geobacillus  sp. dGae-3,  dNBae-1,  dNBae-3X,  dYTae-1, dYTae-3,  dYTae-5,  dYTae-13  dan  dYTae-14  telah didaftarkan  pada Genebank National  Centre  of Biotechnologi  Information  (NCBI).  Urutan-urutan tersebut  kemudian  bandingkan  dengan  data  dalam Genebank menggunakan program BLAST N pada website National Centre of Biotechnologi Information (NCBI).
Konstruksi  pohon  filogeni  dilakukan  dengan menggunakan  program Phylip 3.68  ed,  metode distance matriks dengan  parameter  F48.  Hasil  konstruksi  pohon filogeni  masing-masing  isolat Geobacillus  sp. pada gambar  1  menunjukkan  bahwa  kedelapan  isolat Geobacillus  sp. ini  berada  dalam  satu  kelompok kekerabatan yang sangat dekat satu sama lain.
Gambar 1. Hasil konstruksi pohon filogeni dengan program Phylip 3.68 ed metode D istance matrics parameter Neighbour joining
Kedelapan  isolat Geobacillus  sp. ini  mempunyai tingkat  kekerabatan  yang  berdekatan  dengan  bakteri- bakteri  termofilik yang  lain  terutama  dengan Bacillus caldotenax strain BCRC 11956 dan Geobacillus kaustophilus subsp.  Vulgivagus strain  CDZ  1.  Bakteri  termofilik Geobacillus  thermoleovorans , Geobacillus  thermoleovorans isolat  T7 dan  Geobacillus  thermoleovorans isolat  T70 merupakan bakteri yang memiliki hubungan kekerabatan terdekat dengan kedelapan isolat Geobacillus sp. setelah Bacillus  caldotenax strain  BCRC  11956  dan Geobacillus kaustophilus subsp. Vulgivagus strain CDZ 1.

## Produksi senyawa antibakteri
Dari  kedelapan  strain  isolat Geobacillus  sp. ,  hanya dua  strain Geobacillus  sp. dGae-3  dan  dYTae-14  yang berhasil  diproduksi  metabolit  sekundernya.  Sehingga hanya  dua  strain Geobacillus  sp. saja  yang  akan  diuji potensi  antibakterinya.  Hal  ini  karena  pada  keenam strain Geobacillus  sp. yang  lain  sulit  diikuti  pola pertumbuhannya  sehingga  sulit  menentukan  fase kematian  dimana  pada  fase  ini  terdapat  metabolit sekunder yang akan diujikan.

## Pengujian aktivitas antibakteri
Hasil uji potensi antibakteri dari strain Geobacillus sp. dGae-3  dan  dYTae-14  terlihat  pada  gambar  2.  Dari gambar 2 terlihat bahwa supernatan metabolit sekunder dari  strain Geobacillus  sp. dGae-3  dan  dYTae-14  tidak membentuk zona bening.
Gambar 2. (a). Metabolit sekunder dYTae-14 terhadap E.coli; (b). Metabolit sekunder dYTae-14 terhadap B.subtilis ; (c). Metabolite sekunder dGae-3 terhadap E. coli ; (d). Metabolit sekunder dGae-3 terhadap B.subtilis ;
Hal ini menunjukkan bahwa dua strain Geobacillus sp. dGae-3  dan  dYTae-14  memberikan  hasil  uji  potensi antibakteri yang negatif terhadap bakteri penguji E. coli dan B.  subtilis. Metabolit  sekunder  sebagai  agen antimikroba  memiliki  toksisitas  yang  berbeda-beda terhadap  beberapa  jenis  bakteri  tertentu  [11].  Hasil  uji antibakteri metabolit sekunder dari dGae-3 dan dYTae- 14  negatif  terhadap B.subtilis dan E.coli tetapi dimungkinkan  masih  banyak  jenis  bakteri  patogen  lain yang bisa dihambat pertumbuhannya.

## Uji enzim ekstraseluler
Hasil  yang  didapatkan  dari  masing-masing  strain Geobacillus  sp. menunjukkan  aktivitas  negatif  xilanase. Aktivitas  negatif  xilanase  juga  ditemukan  pada Geobacillus toebii  subsp  [12].  Demikian  pula  didapatkan hasil aktivitas selulase yang negatif dari masing-masing strain Geobacillus  sp. ,  yaitu  ditandai  dengan  tidak terbentuknya zona bening di sekitar koloni.

## 4. Kesimpulan
Masing-masing  isolat Geobacillus  sp. memiliki hubungan  kekerabatan  yang  dekat  satu  sama  lain  dan memiliki hubungan kekerabatan dengan bakteri Bacillus caldotenax strain  BCRC  11956, Geobacillus  kaustophilus subsp.  Vulgivagus strain  CDZ  1  dan Geobacillus thermoleovorans  sp. Metabolit  sekunder  dari  isolat Geobacilllus sp. dYTae-14 dan dGae-3 tidak menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dan Bacillus substilis. Kedelapan  isolat Geobacillus  sp. tidak  memiliki enzim ekstraselluler xilanase dan selulase.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Z.  Elnasser,  A.  Maraqa,  W.  Owais,  A.  Khraisat, Isolation and Characterization of New Thermophilic Bacteria  in  Jordan, The  Internet  Journal  of Microbiology , 3, 2, (2006)
[2]  T N Nazina, T P Tourova, A B Poltaraus, E V Novikova, A  A  Grigoryan,  A  E  Ivanova,  A  M  Lysenko,  V  V Petrunyaka,  G  A  Osipov,  S  S  Belyaev,  M  V  Ivanov,
Taxonomic  study  of  aerobic  thermophilic  bacilli: descriptions  of Geobacillus subterraneus  gen.  nov., sp.  nov.  and Geobacillus uzenensis  sp.  nov.  from petroleum  reservoirs  and  transfer  of  Bacillus stearothermophilus,  Bacillus  thermocatenulatus, Bacillus  thermoleovorans,  Bacillus  kaustophilus, Bacillus  thermodenitrificans  to Geobacillus as  the new  combinations  G.  stearothermophilus,  G.  th, International  Journal  of  Systematic  and  Evolutionary
Microbiology , 51, 2, (2001) 433-446 http://dx.doi.org/10.1099/00207713-51-2-433
[3]  Tairo  Oshima,  Kazutomo  Imahori,  Description  of Thermus thermophilus (Yoshida and Oshima) comb. nov.,  a  Nonsporulating  Thermophilic  Bacterium from a Japanese Thermal Spa, International Journal of
Systematic  and  Evolutionary  Microbiology ,  24,  1,
(1974) 102-112 http://dx.doi.org/10.1099/00207713- 24-1-102
[4]  Michel Blanc, Laurent Marilley, Trello Beffa, Michel Aragno,
Notes: Rapid
Identification of Heterotrophic, Thermophilic, Spore-Forming
Bacteria  Isolated  from  Hot  Composts, International Journal  of  Systematic  and  Evolutionary  Microbiology , 47, 4, (1997) 1246-1248 http://dx.doi.org/10.1099/00207713-47-4-1246
[5]  Vinay  V.  Narayan,  Mohamed  A.  Hatha,  Hugh  W. Morgan, Dhana Rao, Isolation and Characterization of Aerobic Thermophilic Bacteria from the Savusavu Hot Springs in Fiji, Microbes and Environments , 23, 4,
(2008)
350-352 http://dx.doi.org/10.1264/jsme2.ME08105
[6]  Rudolf  Ladenstein,  Garabed  Antranikian,  Proteins from  hyperthermophiles:  Stability  and  enzymatic catalysis  close  to  the  boiling  point  of  water,  in:  G. Antranikian  (Ed.) Biotechnology  of  Extremophiles , Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg, 1998, pp. 37-85.
[7]  Julian Davies, Vera Webb, 8 Antibiotic resistance in bacteria,  in:  R.M.  Krause  (Ed.) Biomedical  Research Reports , Academic Press, 1998, pp. 239-273.
[8]  A.  Kademi,  N.  Aït-Abdelkader,  L.  Fakhreddine,  J. Baratti,  Purification  and  characterization  of  a thermostable esterase from the moderate thermophile Bacillus circulans, Applied Microbiology and  Biotechnology ,  54,  2,  (2000)  173-179 http://dx.doi.org/10.1007/s002530000353
[9]  Agustina  L.  N.  Aminin,  F.  Madayanti,  P.  Aditiawati, Akhmaloka,  Isolation  of  Thermophiles  From Gedongsongo Hot Spring Using A Simple Enrichment Medium,  in:    International  Seminar  Advance  in Biological Science, 2007.
[10] H  Zhang,  S  Hanada,  T  Shigematsu,  K  Shibuya,  Y Kamagata,  T  Kanagawa,  R  Kurane,  Burkholderia kururiensis  sp.  nov.,  a  trichloroethylene  (TCE)- degrading  bacterium  isolated  from  an  aquifer polluted with TCE, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology , 50, 2, (2000) 743-749 http://dx.doi.org/10.1099/00207713-50-2-743
[11]  Syed Aun Muhammad, Safia Ahmad, Abdul Hameed, Antibiotic  Production  By  Thermophilic  Bacillus Specie  SAT-4, Pakistan  journal  of  pharmaceutical sciences , 22, 3, (2009)
[12] Annarita  Poli,  Ida  Romano,  Gaetano  Caliendo, Giancarlo Nicolaus, Pierangelo Orlando, Antonio de Falco,  Licia  Lama,  Agata  Gambacorta,  Barbara
Nicolaus, Geobacillus toebii  subsp.  decanicus  subsp. nov.,  a  hydrocarbon-degrading,  heavy  metal resistant bacterium from hot compost, The Journal of General and Applied Microbiology , 52, 4, (2006) 223- 234 http://dx.doi.org/10.2323/jgam.52.223