## Jurnal Pendidikan Matematika dan IPA Vol 10, No 1 (2019) h.139-148

## PENGARUH H 2 O pH 5,2 DAN TE BUFFER pH 7,8, UNTUK PERBAIKAN EFISIENSI REAKSI qPCR SKORING HER-2 KANKER PAYUDARA
Farida Mirnawati 1 , Abinawanto 1 , Anom Bowolaksono 1 , Dwi Wulandari 2 , Bugi Ratno Budiarto 2 , M. Ali Warisman 2 , Henny Widyowati 2 , Azamris 3 , Primariadewi Rustamadji 4 ,  Desriani 2 1 Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Science, University of Indonesia, 2 Research Center for Biotechnology, Indonesian Institute of Science (LIPI),
3 Division of Surgical Oncology Medical School of Andalas University , 4 Division of Anatomy Pathology Medical School of IndonesiaUniversity Email: gerodes@yahoo.com
DOI: 10.26418/jpmipa.v10i1.27628
Abstract
qPCR  reactions  validity  for  diagnostic  or  detection  technology  applications  is  very important. High validity of qPCR reactions would increase high level of confidence of qPCR result. The value of the correlation coefficient (R 2 ), efficiency (E), and coeffi- cient of variability (CV) were some of parameter to test the qPCR validity. Her-2 is a proto-oncogene  protein  as  a  prognostic  and  trastuzumab  predictive  factors  bi- omarker. Determination scoring HER-2 status can be performed using Immunohisto- chemistry  (IHC),  fluorescence in  situ  Hybridization  (FISH)  and  qPCR.  Of  the  three above techniques, qPCR is a quantified approach. With this approach, HER-2 gene amplification  and  calibrator  gene  were  needed  to  determine  HER-2  scoring  status. whn gene is one of the genes that can be used as a calibrator of HER-2scoring status. qPCR  efficiency  reportedly  influenced  by  many  factors,  including  the  pH.  pH  is known effected to the polymerase activity and DNA integrity. In this study, the influ- ence of two different solvents, H 2 O pH 5.2 and TE buffer pH 7.8, to the efficiency of qPCR reactions scoring HER-2 were compared. Preparation pGEM-T easy whn were also  be  reported  in  this  study  using  a  standard  technique,  which  can  be  used  as  a DNA template. Based on this research, Ct value of pGEM-T whn diluted with H2O pH 5.2 had a lower Ct value than TE buffer pH 7.8, which significantly affected to qPCR efficiency. The R 2 and E value of qPCR reactions both for H 2 O pH 5.2 and TE buffer pH  7.8 are:  0.98  and  115%;  0.99  and 99%  for  each  respectively.  Furthermore,  the CV value for both were below 10% as theory requirement. Confirming of qPCR result with gel electrophoresis and melt peak analysis for both solvents showed as one sin- gle band with a targeted size 93 bp and as a single peak with Tm ± 81 o C. As conclu- sions, TE buffer pH 7.8 is an ideal solvent than H 2 O for qPCR efficiency which fur- ther  could  be  applied  for  scoring  in  determining  of  HER-2  status  in  breast  cancer patients based qPCR method.
Keyword: standard curve, qPCR, RNase- free water, TE buffer, R 2 , Efficiency
Received : 14/09/2018 Revised : 12/10/2018
Accepted : 30/01/2019

## JURNAL PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN IPA
Vol 10, No 1 (2019) h.139-148
http://jurnal.untan.ac.id/index.php/PMP
HER-2 merupakan proto onkogen  dengan  berat  molekul 185kDa, terdiri dari protein reseptor, transmembran  dan  tyrosin  kinase,
digolongkan kepada epidermal growth  factor  receptor (EFGR)  atau dikenal  juga  sebagai  HER  family disandikan  oleh  gen  her-2  pada  kro- mosom  17q21  (Clifford  dan  Hudis, 2007;  Ross  dkk., 2004). Dalam kon- disi  normal,  protein  ini  bersama dengan  protein  HER  lainnya  mem- bentuk  homodimer    ataupun  hetero- dimer  meregulasi berbagai fungsi sel termasuk  proliferasi  sel,  apoptosis, diferensiasi, respon immune dan lain sebagainya.  Protein  HER-2,  merupa- kan  salah  satu  biomarker  yang  pent- ing  pada  penyakit  kanker  payudara. Pada  kondisi  overekspresi  HER-2, akan  menjadi  penyebab  timbulnya kanker  payudara  sub  type  HER-2. Overekspresi  proto-onkogen  HER-2 terjadi  20-30%  dari  total  kasus kanker payudara. Pemeriksaan status HER-2  akan  menentukan  terhadap prognosis,  keganasan  kanker,  dan terapi  yang  diberikan  kepada  pasien. Pasien kanker payudara HER-2 iden- tik dengan prognosis yang jelek, dan angka  harapan  hidup  yang  juga  ren- dah.  Untuk  terapi  pengobatannya, pasien  kanker  payudara  HER-2 dilaporkan  resisten  terhadap  pen- gobatan  terapi  endokrin  dan  akan lebih  responsif  serta  dapat  memper- baiki daya survival  pasien pada pen- gobatan menggunakan antibodi mon- oclonal  trastuzumab (Herceptin; Genetech, South San Fransisco, CA), baik pada penggunaan secara tunggal ataupun  dikombinasi  dengan  agen kemoterapi  lain.  Metoda Immuno- histochemistry (IHK), Fluorescence in situ hybridization (FISH), merupa- kan  metoda  yang  direkomendasikan
untuk  penetapan  status  HER-2  (Ellis dkk,  2003).  Kedua  metoda  tersebut sudah  diakui  oleh  FDA,  untuk penggunaan  secara  rutin  IHK  meru- pakan  metoda  yang  paling  banyak digunakan. Metoda qPCR juga dapat digunakan  untuk  menentukan  status skoring  HER-2.  Dengan  meng- gunakan qPCR, skoring HER-2 dapat dikuantifikasi.  Disamping  itu,  keun- tungan qPCR lainnya adalah sensitiv- itas,  akurasi,  dan  fleksibilitas  yang tinggi (Ginzinger, 2002).
Nilai  E,  R 2 ,  CV  merupakan parameter  yang  penting  untuk  men- gukur  validitas  suatu  reaksi  qPCR. Untuk menentukan nilai  tersebut, di- perlukan  serial  pengenceran  untuk pembuatan  kurva  standar.  Standar DNA  yang  digunakan  untuk  mem- bangun kurva standar dapat
menggunakan DNA plasmid, produk PCR,  oligonukleotida  sintetik,  DNA genom,  atau  cDNA  (Dorak,  2006; Hou  dkk.  2010).  Diantara  standar tersebut,  DNA  plasmid  adalah  yang paling  umum  digunakan  sebagai standar,  karena  produksi  dan  pe- nanganannya  yang  relatif  mudah. Meskipun  dilaporkan  unggul,  akibat kesalahan dalam penanganan, penyimpanan,  preparasi,  dan  peru- bahan  konformasi  DNA  plasmid standar menjadi tidak tepat, akan ber- pengaruh  terhadap  akurasi  analisis qPCR  (Lin  dkk.,  2011).  Disamping itu,  pH  juga  berpengaruh  terhadap efisiensi dan performa dari PCR. pH normal  cendrung  basa  akan  menjaga konsistensi  reaksi  PCR,  sedangkan pH  asam  akan  menyebabkan  depuri- nasi  DNA  templat.  Depurinasi  DNA adalah  proses  tersingkirnya  basa  pu- rin  (adenin  ataupun  guanin)  dari DNA.  Hal  lainnya  yang  juga  dapat
dilakukan  untuk  mengukur  efisiensi dan  performa  qPCR  adalah  dengan membandingkan  DNA  polymerase, sistem  buffer  yang  digunakan,  dan system  labeling  ataupun  pewarna yang  digunakan  (Lin  dkk.,  2011; Dhanasekaran  dkk.,  2010;  Wolfs dkk.,  2003).  Pada  penelitian  ini  ber- tujuan  untuk  mempelajari  pengaruh pelarut  yang  berbeda  dengan  pH yang  juga  berbeda  (H 2 O  pH  5,2  dan Buffer TE pH 7,8) terhadap performa dan  efisiensi  qPCR.  Parameter  yang dilihat  untuk  mengukur  validitas qPCR  adalah  nilai  R 2 ,  E,  CV  dan kemudian hasil analisis produk qPCR pada agarose 1% dan pola melt peak yang  terbentuk.  DNA  template  yang digunakan  untuk  pembuatan  kurva standar adalah plasmid pGEM-T easy yang disisipkan gen whn , yang nant- inya akan digunakan sebagai gen ac- uan  untuk  kuantifikasi  HER-2.  Gen ini  digunakan  karena  terletak  pada kromosom  yang  sama  dengan  gen target  HER-2,  yaitu  kromosom  17, dan  merujuk  pada  penelitian  sebe- lumnya  (Mendoza  dkk,  2013).  Pada penelitian sebelumnya juga dilaporkan  bahwa  nilai  ekspresi  un- tuk  gen  ini  selama  perhitungan menunjukkan  konsistensi  di  semua sampel  uji,  dan  hal  ini  merupakan syarat  yang  tepat  untuk  dijadikan kalibrator  dalam  perhitungan  relatif copy  number HER-2  dengan  metode qPCR.

## METODE
Preparasi  pGEM-T  easy whn untuk pengembangan kurva standar qPCR
Produk  PCR  dari  gen  acuan whn (93 bp) diamplifikasi  dari DNA genom kanker payudara
menggunakan  primer  10  pmol  whn-
F:  5’-GGT  GGA  ATG  ACC  GAA GCT  AT-3’  dan  whn-R:  5’-GTC
CTT  CTG  TGG  CTC  AAT  CT-3’ yang didesain sesuai dengan penelitian  sebelumnya  (Mendoza dkk.,  2013).  Produk  PCR  kemudian diklon  ke  dalam  plasmid  vektor pGEM-T  easy  (Promega  ®)  dan ditransformasikan  ke  sel  kompeten Escherichia  coli galur  DH5α.  Klon positif ditumbuhkan dalam media LB cair  dengan  5  µl  ampisilin.  DNA plasmid selanjutnya diekstraksi mengikuti protokol High-Speed Mini
Kit  (Geneaid).  Keberhasilan  proses kloning  dilihat  hasil  seleksi  biru putih, PCR koloni dan hasil sekuens- ing.
Pengukuran  konsentrasi  dan  pen- genceran  sampel  DNA  genom  dan DNA plasmid
Sampel DNA genom dan DNA plasmid (pGEM-T HER-2 dan pGEM -T whn )  diukur  terlebih  dahulu  kon- sentrasinya  dengan  spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm un- tuk  dapat  dilakukan  pengenceran. Pengenceran  sampel  DNA  plasmid dilakukan  secara  serial  dengan  2x faktor  pengenceran,  dengan  konsen- trasi  awal  0,915  ng/µl  hingga menghasilkan  9  titik  pengenceran. Pengenceran  dilakukan  dengan  H 2 O pH  5,2    ataupun  buffer  TE  pH  7,8 (10mM Tris HCl+1mM EDTA)
Uji Quantitative Real-time PCR
Uji  qPCR  dilakukan  di  dalam mesin CFX96 TM Real-time PCR (Bio -Rad)  dengan  menggunakan  KAPA SYBR  Fast  Kit.  Primer  yang digunakan  untuk  mengamplifikasi gen whn adalah  sama  dengan  sebe-
lumnya.  Reaksi  dilakukan  dengan total campuran reaksi 10 µl, masing- masing terdiri dari 3 µl pelarut (H2O pH  5,2  /TE  buffer  pH  7,8),  5  µl  2x KAPA  SYBR  Green  I,  masing- masing  0,5  µl  primer  forward  dan reverse whn 10 pmol, dan 1 µl DNA template.  Kondisi  reaksi  dijalankan dengan  preheating  pada  suhu  95 o C selama  3  menit,  diikuti  35x  siklus denaturation,  annealing  dan  elonga- tion  masing-masing  95 o C  selama  10 detik,  60 o C  selama  30  detik,  dan 72 o C selama 30 detik, diikuti penam- bahan melt curve pada suhu 65 o C ke 95 o C selama 5 detik dengan kenaikan 0,2 o C  sebelum  akhir  reaksi.  Setiap sampel dijalankan dalam tiga ulangan (triplo) untuk menghindari hasil posi- tif  palsu,  dan  nilai  rata-rata digunakan  untuk  perhitungan  lebih lanjut. Non template control juga dii- kutsertakan dalam setiap reaksi untuk memastikan  tidak  ada  kontaminasi pada  campuran  reaksi.  Masing- masing  hasil  reaksi  amplifikasi  di- periksa  ada  tidaknya  produk  PCR spesifik  dengan  elektroforesis  gel agarose 1% dan analisis melt peak.
Pembuatan kurva standar
Kurva  standar  dibuat  dengan  mem- plot  nilai  log  copy  number  terhadap nilai  Ct  yang  dihasilkan  dari  pen- genceran serial.  Nilai log copy num- ber  didapatkan  dari  rumus  umum (Mendoza dkk., 2013):
Evaluasi kualitas qPCR
Evaluasi  kualitas  qPCR  ditentukan dengan  melihat  koefisien  korelasi (R 2 )  yang  terbentuk  dari  plot  kurva standar dan menghitung nilai
efisiensi, didapatkan dari perhitungan (Dorak, 2006).
E = [(10 -1/ slope ) – 1] x 100%
Kualitas  qPCR  yang  optimal  diten- tukan dengan nilai  koefisien korelasi (R 2 )  >0,980  dan  nilai  persentase efisiensi  (%E)  dalam  kisaran  90  – 105% (Bio-Rad Laboratories, 2006).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kloning gen whn pada pGEM- T  easy  telah  berhasil  diisolasi (Gambar  1)  dan  diinsersi  kedalam plasmid  pGEMT-easy whn dikonfir- masi  dengan  seleksi  biru  putih    dan sequencing (Gambar 2).  Selanjutnya, pGEMT-easy whn digunakan sebagai bahan  untuk  pembuatan  kurva standar.  Hasil  uji  qPCR  DNA  plas- mid  standar  pGEM-T whn dengan masing-masing  pelarut  (H 2 O  pH  5,2 dan  TE  buffer  pH  7,8),  diperoleh nilai Ct yang berbeda dari kurva am- plifikasi  yang  terbentuk.  Untuk pGEM-T whn yang  dilarutkan dengan  H 2 O  pH  5,2,  nilai  Ct  yang dihasilkan lebih rendah dibandingkan dengan  pGEM-T whn yang  dilarut- kan dengan TE  buffer pH 7,8 (Tabel 1).
Nilai  Ct  kemudian  digunakan untuk  membangun  kurva  standar dengan  memplot  log  copy  number terhadap  nilai  Ct  (Gambar.  3.).  Dari plot  regresi  linier  yang  terbentuk, didapatkan  nilai  koefisien  determi- nasi (R 2 ) dan nilai efisiensi dapat di- hitung untuk masing-masing plasmid standar.  Nilai  R 2 dan  efisiensi  untuk masing-masing  standar  yaitu  0,98 dan  115%  untuk  pGEM-T whn yang diencerkan dengan H 2 O pH 5,2; 0,99
Farida Mirnawati, Abinawanto, Anom Bowolaksono, Dwi Wulandari, Bugi Ratno Budiar- to, M. Ali Warisman, Henny Widyowati, Azamris, Primariadewi Rustamadji,  Desriani Pengaruh H 2 O pH 5,2 dan Te Buffer pH 7,8, untuk Perbaikan Efisiensi Reaksi qPCR  Skoring Her-2 Kanker Payudara
dan  99%  untuk  pGEM-T whn yang diencerkan dengan TE buffer pH 7,8.
Hasil  analisa melt  peak dan  el-
ektroforesis  agarose  1%  menunjuk- kan spesifisitas primer dalam mengenali targetnya, yang diindikasi- kan  dengan  satu  puncak  tunggal
dengan nilai Tm ±81 o C dan satu pita tunggal  dengan  ukuran  93  bp (Gambar 4).
Penilaian status skoring HER-2 pasien  kanker  payudara  penting  un- tuk dilakukan sebagai landasan untuk penentuan  pengobatan  dengan  terapi
Gen whn, 98bp. 50                                    60 o C    NTC
Gambar  1 Hasil gradient PCR isolasi gen whn, dari rentang suhu 50-60 o C (kiri ke kanan).
Seleksi biru putih pGEM-T easy whn        kontrol minus amp                         kontrol plus amp
Gambar 2 Konfirmasi pGEM-T easy whn menggunakan metoda seleksi biru putih (atas) dan sequencing (bawah).
Farida Mirnawati, Abinawanto, Anom Bowolaksono, Dwi Wulandari, Bugi Ratno Budiar- to, M. Ali Warisman, Henny Widyowati, Azamris, Primariadewi Rustamadji,  Desriani Pengaruh H 2 O pH 5,2 dan Te Buffer pH 7,8, untuk Perbaikan Efisiensi Reaksi qPCR  Skoring Her-2 Kanker Payudara
tertarget  trastuzumab  (Goddard  dkk., 2012). Penilaian  status  HER-2  yang akurat  tidak  luput  dari  metoda  skor- ing  yang  digunakan.  Metoda  skoring HER-2  dengan  qPCR  merupakan skoring  yang  dapat  terkuantifikasi.
Efisiensi qPCR dengan validitas yang tinggi akan dapat meningkatkan ting- kat  kepercayaan  terhadap  hasil  ana- lisis  skoring.  Penilaian  yang  akurat dan  terapi  yang  tepat  sasaran,  mem- buat  pasien  mendapatkan  manfaat
Tabel 1 Nilai rata-rata Ct plasmid standar pGEM-T whn.
Concentration of pGEM-T whn (ng/µl) CT value Coefficient of variation/CV (%) RNase- free water TE buff- er pH 7,8 RNase-free water TE buffer pH 7,8 0.915 13.46 14.71 0.84 0.08 0.098 13.5 15.59 0.91 1.06 0.049 14.08 17.09 0.77 0.44 0.024 15.18 17.73 1.27 0.43 0.012 16.16 18.76 1.70 1.36 0.0061 17.24 20.05 0.45 0.22 0.0030 18.18 20.96 0.15 1.03 0.0015 19.21 21.8 0.92 1.08 0.0008 20.14 22.55 0.28 0.69
Gambar 3 Kurva standar pGEM-T whn . Biru untuk RNase-free water; merah untuk TE buffer pH 7,8.
sekaligus  keuntungan  dari  terapi  ini (Baselga dkk., 2006).
Preparasi  kurva  standar  dapat digunakan sebagai sarana untuk men- gukur  efisiensi  dan  validitas  scoring HER-2 yang mengindikasikan seberapa baik reaksi PCR yang dijal- ankan , sekaligus  sebagai  kontrol pekerjaan skoring itu sendiri. Hal ini dapat dilihat dari integritas data yang didapatkan,  harus  memenuhi  teori yang  telah  ditetapkan.    Pada  pene- litian ini, kurva standar dibuat dengan menggunakan  DNA  plasmid.  Tem- plate  ini  dipilih  dikarenakan  proses perbanyakan  dan  penyimpanan  yang mudah. Untuk mengevaluasi efisiensi reaksi qPCR, kurva standar dievalua- si  dengan  memperhatikan  beberapa parameter  yaitu nilai ko e fisien deter- minasi (R 2 ) , CV dan efisiensi qPCR (Dorak  2006).  Pada  penelitian  ini nilai  R 2 untuk  kedua  standar  sesuai dengan  ketentuan  yaitu  >0,980,  na- mun  nilai  efisiensi  yang  diperoleh
dari  kurva    standar  yang  dipreparasi dengan  TE  buffer  pH  7,8  meng- hasilkan  efisiensi  terbaik,  mendekati 100% sedangkan dengan H 2 O pH 5,2 menunjukkan  efisiensi  115%.    Ber- dasarkan  konsistensi  nilai  Ct  yang terbentuk,  R 2 dan  efisiensi  amplifi- kasi  qPCR  pada  penggunaan  TE buffer  pH  7,8  memperbaiki  efisiensi dan  performa  qPCR  dibandingkan menggunakan  H 2 O  pH  5,2  sebagai pelarut.  Dhanasekaran  dkk.  (2010) melaporkan  bahwa  perbedaan  nilai efisiensi  merupakan  efek  langsung dari  pergeseran  nilai  Ct  yang dihasilkan.  Variasi  nilai  Ct  ini  akan berpengaruh langsung mengubah efi- siensi  standar  qPCR  secara  signif- ikan,  tetapi  tidak  pada  koefisien  ko- relasi. Tingginya nilai efisiensi qPCR secara teori dilaporkan mengindikasi- kan  bahwa  telah  terjadi  kesalahan pada  proses  pipetting.  Berbeda dengan  penelitian  ini,  nilai  CV  yang merupakan indikator reprodusibilitas , diperoleh berada dibawah 10% sesuai
Gambar  4 Kurva melt peak dan visualisasi hasil elektroforesis gel pGEM-T whn . (A) H 2 O pH 5,2; (B) TE buffer pH 7,8.
dengan  teori  yang  telah  ditetapkan. Sehingga  penyebab  tingginya  nilai efisiensi qPCR pada pelarut H 2 O pH 5,2 bukan dikarenakan kesalahan pa- da  proses  pipetting.  Teori  lainnya menyatakan  bahwa  tingginya  nilai efisiensi  qPCR  dapat  disebabkan oleh  amplifikasi  non  spesifik.  Ke- beradaan amplifikasi non target akan menyebabkan penundaan munculnya nilai  Ct  (Dorak,  2006).  Pada  pe- nelitian ini, berdasarkan hasil a nalisa melt  peak menunjukkan  pita tunggal menggunakan  kedua  pelarut.  Hal  ini diperkuat dengan hasil elektorforesis pada  1%  menunjukkan  pita  tunggal pada ukuran  yang ditargetkan, 93bp. Pita  non  spesifik  dan  primer  dimer tidak  ditemukan  pada  hasil  elektro- foresis  agarose  1%.    Hal  ini mengindikasikan bahwa primer bekerja  secara  spesifik  pada  tar- getnya. Ditinjau dari nilai NTC yang diperoleh,  nilai  NTC  menunjukkan nilai  pada  kisaran  8  siklus.  Dengan perbedaan  lebih  kurang  8  siklus, kecil  kemungkinan  tingginya  nilai efisiensi qPCR disebabkan oleh kon- taminasi.  Dorak  (2006)  menyatakan, nilai  Ct  yang  dapat  diterima  adalah nilai Ct ≥ 5 siklus dengan NTC.
Tingginya nilai efisiensi
qPCR  pada  pelarut  menggunakan
H 2 O  pH  5,2  kemungkinan  dikare- nakan rendahnya pH pada pelarut ini. pH  normal  cenderung  basa  akan menjaga  konsistensi  reaksi  PCR,  se- dangkan  pH  asam  akan  menyebab- kan  depurinasi  DNA  templat. Menurut  An  dkk.,  (2014),  semakin rendah  pH  maka  akan  semakin meningkatkan  proses  depurinasi DNA,  kecepatan  proses  depurinasi pada  suhu  37 o C  pH  5,1  adalah 2,4x10 -8 k,s -1 untuk  guanin  dan
1,9x10 -8 k,s -1 untuk adenin.  Selanjut- nya,  keberadaan    EDTA  sebagai  sa- lah  satu  penyusun  buffer  TE  pH  7,8 akan semakin meningkatkkan perfor- ma  pelarut  ini  dalam  menjaga  integ- ritas plasmid dari kerusakan disebab- kan oleh nuclease  yang bisa jadi be- rada  didalam  campuran  reaksi  PCR ataupun  pada  pengenceran  plasmid (Glover dkk., 1988).

## SIMPULAN DAN SARAN
pH  berpengaruh  terhadap efisiensi qPCR. Pelarut TE buffer pH 7,8  merupakan  pelarut  yang  lebih baik  dan  ideal  dibandingkan  pelarut H 2 O  pH  5,2.  Nilai  R2,  efisiensi qPCR  dan  CV  untuk  TE  buffer  pH 7,8  adalah  0,99;  99%  dan  CV dibawah  10%.  Hasil  konfirmasi dengan elektroforesis gel dan analisis melt  peak  menunjukkan  satu  pita tunggal dengan ukuran yang ditarget- kan (93 bp) dan peak tunggal dengan Tm ±81 o C.
Ucapan  terima  kasih  kepada RISTEK SINAS DIKTI, PI. Dr. Eng. Desriani, Laboratorium Biologi Molekular  Kesehatan  dan  Diagnos- tik,  PUSLIT  Bioteknologi,  LIPI  Ci- binong.

## DAFTAR  PUSTAKA
An, R., Jia, Y., Wan, B., Zhang, Y., Dong,  P.,  Li,  J.,  Liang,  X. (2014).
Non-enzymatic depurinations  of  nucleic  ac- ids:  factors  and  mecha- nisms. Plos One -: 1-17.
Baselga, J., Perez, E.A., Pienkowski, T.,  Bell,  R.  (2006).  Adju- vant  trastuzumab:  a  mile-
stone  in  treatment  if  HER2- positif  early  breast  cancer. The Oncologist , 11(suppl 1), 4-12.
Blake,  R.  (1995).  Denaturation  of
DNA dalam Molecular Biol- ogy  and  Biotechnology. Willey.
Clifford,  A.,    Hudis,  M.D.  (2007).
Trastuzumab-mechanism  of action  and  use  in  clinical parctice. New England jour- nal of medicine 357: 39-51. Chen,  J.,  Kadlubar,  F.F.,  Chen,  J.Z. (2007).  DNA  supercoiling suppresses  real-time  PCR:  a new  approach  to  quantifica- tion  of  mitochondrial  DNA damage  and  repair. Nucleic
Acids Res ., 35, 1377-1388.
Ellis, I.O., Bartlett,  J., Dowsett, M., Humphreys,  S.,  Jasani,  B.,
Miller,  K.,  Pinder,  S.  E., Rhodes,  A.,  Walker,  R. (2004).  Updated  recommen- dation  for  HER2  testing  in the  UK. Journal  Clinical Pathology 57 (176):  233  – 237.
Dhanasekaran,  S.,  Doherty,  T.M., Kenneth,  J.,  (2010).  Com- parison  of  different  stand- ards  for  real-time  PCR- based  absolute  quantifica- tion. Journal of Immunologi- cal Methods , 354, 34-39.
Dorak, M.T. (2006). Real-time PCR.
Taylor  &  Francis  Group. New York. Ginzinger, D.G. (2002). Gene quanti- fication using real-time quantitative PCR: an emerg-
ing  technology  hits  the mainstream.  Exp. Hematol. , 30, 503-512.
Giulietti,  A.,  Overbergh,  L.,  Valckx, D.,  Decallonne,  B.,  Bouil- lon,  R.,  Mathieu,  C.  (2001). An  overview  of  real-time quantitative  PCR:  applica- tions  to  quantify  cytokine gene  expression. Methods ,
25, 386.
Glover, J.N.M., Haniford, D.B., Pul-
leyblank, D.E. (1988). Inter-
mediate  range  effects  in DNA  I:  low  pH/stress  in- duced conformational changes in the vicinity of an extruded d(AT)n.d(AT)n cruciform. Nucleic  Acid  Re- search , 16(12), 5473-5490.
Goddard,  K.A.B.,  Bowles,  E.J.A., Feigelson, H.S., Habel, L.A., Alford, S.H., McCarty, C.A., Nekhlyudov, L., Onitilo,  A.A.,  Rahm,  A.K., Webster,  J.A.  (2012).  Utili- zation of HER2 genetic test- ing  in  a  multi-institutional observational  study. Am.  J. Manag.  Care ,  18(11),  704- 712.
Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S.  (2010).  Serious  overesti- mation  in  quantitative  PCR by  circular  (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna  as  the  model  gene. PLoS ONE , 5: e9545.
Lin,  C-H.,  Chen,  Y-C.,  Pan,  T-M. (2011).  Quantification  bias caused  by  plasmid  DNA conformation  in  quantitative real-time  PCR  assay. PLoS
ONE , 6(12): e29101
Mendoza,  G.,  Portillo,  A.,  Olmos-
Soto,  J.  (2013).  Accurate breast cancer diagnosis through real-time PCR her-2 gene  quantification  using immunohistochemically- identified  biopsies. Oncolo- gy Letters , 5, 295-298.
Nogva,  H.K.  and  Rudi,  K.  (2004).
Potential  influence  of  the first PCR cycles in real-time comparative  gene  quantifi- cations. Biotechniques, 37, 246-253.
Ross J. S., Fletcher J. A., Bloom, K. J.,  Linette  G.  P.,  Stec,  J., Symmans,  W.  F.,  Pusztai, L.,  Hortobagyi,  N.  (2004). Targeted  Therapy  in  Breast Cancer.  molecular  and  Cel- lular Proteomics 379-398
Wollfs,  P.,  Grage,  H.,  Hagberg,  O., Radstrom, P. (2004). Impact of  DNA  Polymerases  and their  Buffer  Systems  on Quantitative  Realtime  PCR. Journal  of Clinical  Microbi- ology. 42(1): 408-411.
Wong,  M.L.  and  Medrano,  J.F. (2005).  Real-time  PCR  for mRNA  quantitation. Bio- techniques , 39, 75-85.