## PHARMACON– PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,

## ANTIOXIDANT ACTIVITY TEST SOLVENT ETHANOL, METHANOL, N-HEXANE AND CLOROFORM OF SPONGE Liosina paradoxa OBTAINED FROM THE ISLAND OF MANADO TUA
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN PELARUT ETANOL, METANOL, N-HEKSAN, DAN KLOROFORM SPONS Liosina paradoxa DIPEROLEH DARI PULAU MANADO TUA
Evans H.S Tatuhe 1)* , Adithya Yudistira 1) , Olvie S. Datu 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115 *evanshandayani@gmail.com

## ABSTRACT
Antioxidants are substances that can provide endogenous protection and exogenous oxidative stress by  scavenging  free  radicals  and  being  able  to  inhibit  other  molecular  oxidation.  Sponges  contain various bioactive compounds that act as antioxidants such as alkaloids, steroids/triterpenoids and flavonoids which have strong bioactivity. The purpose of this study was to determine the antioxidant activity  of  the  marine  sponge  Liosina  paradoxa.  This  research  is  extract  by  maceration  and fractionation  using  DPPH  method  [1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl]  to  analyze  antioxidant  activity on  UV-Vis  spectrophotometer  at  a  wavelength  of  517nm.  The  results  obtained  from  the  sponge Liosina paradoxa on the island of Manado Tua have antioxidant activity with % inhibition obtained in  the  ethanol  extract  of  48.5%  and  the  methanol  fraction  of  67.2%,  n-hexane  51.2%,  and chloroform 36.4%. which was tested at a concentration of 100 ppm.
Keywords: Lyosine paradoxa, Antioxidant, DPPH [1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl]

## ABSTRAK
Antioksidan adalah zat bisa memberi perlindungan endogen dan tekanan oksidatif eksogen dengan menangkap  radikal  bebas  dan  merupakan  molekul  mampu  menghambat  oksidasi  molekul  lain. Spons  mengandung  berbagai  senyawa  bioaktif  berperan  sebagai  antioksidan  seperti  alkaloid, steroid/triterpenoid dan flavonoid yang memiliki bioaktivitas kuat. Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengetahui  aktivitas  antioksidan  dari  biota  laut  spons Liosina  paradoxa .  Penelitian  ini  yakni ekstrak  dengan  cara  maserasi  dan  fraksinasi  menggunakan  metode  DPPH [1,1-difenil-2- pikrilhidrazil] untuk menganalisis aktivitas antioksidan pada alat uji spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 517nm. Hasil penelitian yang didapatkan dari spons Liosina paradoxa di pulau Manado Tua memiliki aktivitas antioksidan dengan % inhibisi diperoleh pada ekstrak etanol 48,5 % dan  fraksi  metanol  sebesar  67,2%,  n-heksan  51,2  %,  dan  kloroform  36,4  %  yang  di  uji  pada konsentrasi 100 ppm.
Kata kunci: Liosina paradoxa , Antioksidan, DPPH [1,1-difenil-2-pikrilhidrazil]

## PHARMACON– PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,

## PENDAHULUAN
Indonesia  merupakan  negara  kepulauan memiliki  garis  panjang  pantai  sekitar  81.000  km dengan  perbandingan  luas  lautan  dan  daratan  7:3, hal  ini  menjadikan  Indonesia  mempunyai  potensi keanekaragaman  hayati  laut  sehingga  memberi peluang  dapat  dimanfaatkan  dalam  berbagai bidang  industri  termasuk  makanan,  zat  warna, kosmetik  dan  kesehatan  (Handayani  dan  Dian, 2010).
Organisme laut khususnya pada invertebrate memiliki kandungan senyawa kimia terbanyak di bandingkan dengan tumbuhan laut. Contohnya in vertebrate adalah spons laut atau filum porifera , h ewan lumut atau filum bryozoa , softcoral atau filu m  cnydaria dan  hewan  bermantel filum  tunicata (Handayani dan Dian, 2010).
Spons  merupakan  hewan  multiseluler filum polifera tidak memiliki organ dan jaringan, namun pada  tubuhnya  memiliki  pori  atau  disebut  dengan ostia  dan  saluran  sirkulasi  air  pada  rongga  pusat atau oskulum (Thomas et al , 2016).
Spons dapat mengambil 95% karbon organik terlarut  dalam  air  melalui  pori-porinya  serta mengubahnya  menjadi  partikel  tersuspensi  dan bahan  terlarut  dapat  dijadikan  sebagai  bahan makanan untuk hewan lain (FAO, 2017).
Antioksidan dapat didefinisikan sebagai suat u senyawa mampu menunda, memperlambat,  atau menghambat  reaksi  oksidasi.  Senyawa  oksidan dapat  melawan  radikal  bebas  atau Reactive
Oxygen Species (ROS) terbentuk dari metabolisme dalam tubuh (Miryanti et al , 2011).
Radikal bebas adalah suatu atom atau mole kul mempunyai electron tidak berpasangan. Radik al bebas merupakan factor penyebab dari sejumlah penyakit seperti kadiovaskular, neurogeneratif, da n kanker. Reaksi radikal bebas tersebut dapat terh ambat dengan adanya senyawa antioksidan (Lioch ev, 2013).
Belakangan ini penelitian tentang antioksidan marak  dilakukan  untuk  menemukan  antioksidan alami  untuk  pengobatan  preventif.  Hal  ini bisa disebabkan karena jumlah antioksidan dimiliki ole h tubuh berfungsi untuk mencegah kerusakan oksidatif itu tidak cukup serta banyak antioksidan sintetik bersifat karsinogenik (Alyaqoubi et al, 2015).
Berdasarkan  kajian  literatur  ada,  spons mengandung  berbagai  senyawa  bioaktif  berperan sebagai antioksidan seperti alkaloid, steroid/triterpenoid dan flavonoid memiliki bioaktivitas kuat.
Sebelumnya  sudah  dilakukan  penelitian dengan tahapan uji  ekstrak etanol pada spons laut dengan  sampel  di  ambil  berasal  dari  tempat berbeda  dan  hasil  pengujian  aktivitas  antioksidan ekstrak  etanol  terhadap  spons  laut  dengan menggunakan  metode DPPH mempunyai aktifitas antioksidan  kuat.  Oleh  sebab  itu  akan  dilakukan penelitian  lebih  lanjut  tentang  uji  antioksidan ekstrak dan fraksi khususnya pada biota laut spons Liosina paradoxa.

## METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan Oktober 2021 sampai dengan bulan Maret 2022 di Laboratorium  Farmasi  Lanjut  Program  Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan  Alam  Universitas  Sam  Ratulangi, Manado. Sampel diambil dari pulau Manado Tua.

## Alat dan Bahan Alat
Alat-alat    digunakan  dalam  penelitian  ini adalah scuba diving , sarung tangan, masker, pisau, talenan,  kertas  label,  spidol  permanen,  tissue kering, cool  box ,  kamera underwater , zipper  lock bag , labu ukur 10 mL ( pyrex ), erlenmeyer 200 ml, wadah botol, timbangan analit ik, spektrofotometer  UV-Vis,  aluminium  foil, corong,  mikro  pipet,  tabung  reaksi, rotary evaporator .

## Bahan
Bahan  digunakan  dalam  penelitian  ini yaitu  kertas  saring,  etanol  95%,  DPPH [1,1- difenil2 pikrilhidrazil], ekstrak dan fraksi  dari spons Liosina paradoxa dan pelarut kloroform, n-heksan dan methanol.

## Prosedur Penelitian
1. Pengambilan Sampel
Sampel ini diambil dari pulau Manado Tua, Provinsi  Sulawesi  Utara  menggunakan  alat  bantu (masker  dan  snorkel).  Sebelum  diambil  sampel dipotret menggunakan kamera bawah laut, setelah diambil  dimasukan  dalam  kantong  plastik  jepit sudah  disiapkan  dan  disimpan  dalam  kotak pendingin  lalu  dibawah  ke  Laboratorium  Farmasi Lanjut Program Studi Farmasi Fakultas

## PHARMACON– PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sam Ratulangi.

## 2. Preparasi Sampel
Spons Liosina  paradoxa sudah  diambil dicuci  kembali  dan  dipotong-potong  kecil, ditimbang dengan berat botol dan keseluruhan lalu sebanyak  1328  gr  sampel  dimasukan  ke  dalam wadah  botol,  sampel  di  dalam  botol  diisi  dengan etanol 95% sebanyak 200 mL.

## 3. Ektraksi
Sampel  spons Liosina  paradoxa sebanyak 1328  g  dimaserasi  dengan  pelarut  etanol  95% sebanyak  200  mL  dengan  3  kali  pengulangan selama  24  jam.  Sampel  kemudian  disaring  untuk mendapatkan filtrat. Hasil diperoleh dipekatkan dengan rotary  evaporator pada  suhu  40 0 C sehingga  menghasilkan  ekstrak  kental/ekstrak kasar dari sampel spons Liosina paradoxa .

## 4. Fraksinasi
Ekstrak  kasar  spons Liosina  paradoxa dimasukkan  ke  dalam  erlenmeyer,  kemudian dilarutkan  dengan  methanol  80%  sebanyak  100 ml.  Dimasukkan  dalam  corong  pisah  dan ditambahkan  pelarut  n-heksan  sebanyak  100  ml setelah  itu  dikocok  sampai  homogen.  Dibiarkan sampai  terbentuk  lapisan  metanol  dan  lapisan  n- heksan, kemudian masing-masing lapisan ditampung  dalam  wadah  berbeda.  Lapisan  n- heksan  kemudian  di  evaporasi  menggunakan rotary  evaporator  hingga  kering,  lalu  ditimbang dan diperoleh fraksi n-heksan.
Selanjutnya  lapisan  metanol  ditambahkan aquades  sebanyak  100  ml  kemudian  dipartisi dengan  pelarut  kloroform  dengan  perbandingan 1:1  v/v  dalam  corong  pisah,  setelah  itu  dikocok kembali  sampai  homogen.  Dibiarkan  sampai terbentuk  dua  lapisan  yaitu  lapisan  metanol  dan kloroform,  kemudian  masing-masing  lapisan ditampung  dalam  wadah  berbeda.  Lapisan kloroform  selanjutnya  dievaporasi  menggunakan rotary  evaporator  hingga  kering  lalu  ditimbang berat  sampel  dan  diperoleh  fraksi  kloroform. Lapisan  metanol  kemudian  dievaporasi  hingga kering,  lalu  ditimbang  dan  diperoleh  fraksi metanol.
5. Pembuatan Larutan Ekstrak
Larutan  sampel  dibuat  dengan  konsentrasi 100 ppm dengan menimbang 10 mg ekstrak etanol spons Liosina  paradoxa kemudian  dilarutkan dalam  100  ml  etanol  95%  dan  dikocok  hingga homogen.  Selanjutnya  perlakuan  sama  dilakukan pada fraksi n-heksan, kloroform, dan dan metanol.

## 6. Pembuatan Larutan DPPH
Sebanyak  5  mg  DPPH  ditimbang  dan dilarutkan  dalam  etanol  95%  sebanyak  100  mL, selanjutnya  larutan  dibuat  untuk  uji  aktivitas antioksidan  yaitu  ekstrak  etanol  spons Liosina paradoxa dipipet  sebanyak  2  mL  dimasukan kedalam  tabung  reaksi  dengan  masing-masing konsentrasi  50  ppm  dan  di  tambahkan  2  mL larutan DPPH ke dalam masing-masing konsentrasi  dan  divortex  selama  5  detik  sebanyak 3 kali pengulangan.

## 7. Pembuatan Larutan Kontrol DPPH
Pembuatan  larutan  kontrol  DPPH  yakni dengan  melarutkan  2  ml  etanol  95%  dengan  2  ml larutan  DPPH  50  ppm  dan  kemudian  dikocok. Larutan control di uji menggunakan spektrofotom eter UV-Vis dengan panjang gelombang 517 nm.
8. Pengujian  Larutan  Kontrol  DPPH  dan Aktivitas Antioksidan dengan metode DPPH
Pembuatan  larutan  uji  sampel  dibuat dengan memasukkan 2 mL larutan DPPH kedalam masing-masing larutan sampel kemudian di vortex dan  di  inkubasi  selama  30  menit  pada  suhu ruangan  yaitu  37 0 C  sampai  terjadi  perubahan warna dari aktivitas DPPH.
Semua sampel dilakukan 3 kali pengulangan dan setelah itu diukur nilai absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis panjang gelombang  517  nm.  Kemudian  ekstrak  dan  fraksi dari  spons Liosina  paradoxa dengan  pelarut  n- heksan,  kloroform  dan  metanol  diamati  sebagai standar. Aktivitas penangkapan radikal bebas % in hibisi dengan rumus:

## PHARMACON– PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tabel 1 . Hasil Nilai % inhibisi Antioksida
Dari  hasil  didapat,  berdasarkan  tabel  1 bahwa pada metanol, pengulangan 1, 2 dan 3 nilai % inhibisi didapatkan  adalah  paling  tertinggi dengan  nilai  rata-rata  didapat  yaitu  67,2%. Metanol  merupakan  gugus  polar  lebih  kuat  dari pada  gugus  nonpolar  hal  ini  dapat  terlihat  dari struktur  kimia  metanol  mengandung  gugus hidroksil (polar) dan gugus karbon (nonpolar).
Sebelum di uji menggunakan spektrofotom eter  UV-Vis  dengan  panjang  gelombang  517  nm untuk  mengetahui  nilai  absorbansinya,  sampel metanol  setelah  di  inkubasi  selama  30  menit, untuk  pengulangan  1  dan  2  terjadi  perubahan warna  dari  ungu  ke  kuning.  Perubahan  intensitas warna terjadi berhubungan dengan berkurangnya ikatan  rangkap  terkonjugasi  pada  DPPH  sebab adanya  penangkapan  satu  elektron  oleh  zat antiradical menyebabkan tidak adanya kesempatan  bagi  elektron  tersebut  beresonansi dimana perubahan ini dicatat pada spektrofotomet er (Asih et al. , 2012).
Selanjutnya  hasil  pada  ekstrak  etanol diperoleh  sebesar  48,5%  sedikit  lebih  rendah dibandingkan  dengan  penelitian  sebelumnya yakni  ekstrak  etanol  spons Liosina  paradoxa di koleksi  dari  Pulau  Mantahage,  pada  beberapa kosentrasi  yakni  0,5  ppm  (53,3%),  0,6  ppm (52,67%) dan konsentrasi 0,7 ppm sebesar (54,70 %).  Hal  ini  sesuai  dengan  dikemukakan  oleh Dewi  (2014)  bahwa  konsentrasi  digunakan  juga mempengaruhi kemampuan pelarut dalam mengekstrak  suatu  senyawa  bioaktif  terdapat dalam sampel tersebut.
Pada  hasil  fraksi  untuk  pengulangan  1,2  dan  3  n- heksan diperoleh hasil sebesar 51,2% dapat dilihat bahwa  semakin  rendah  absorbansi  sampel  maka semakin  tinggi  nilai  %  inhibisi  di  dapatkan. Adanya peningkatan konsentrasi berbanding lurus dengan  besarnya  %  inhibisi,  artinya  aktivitas antioksidannya  sangat  lemah.  Hal  ini  karena  n- heksan  merupakan  pelarut  bersifat  non-polar sehingga  pada  proses  fraksinasi  n-heksan  tidak mampu  menarik  senyawa-senyawa  terkandung didalamnya (Miryanti, 2011).
Dilihat  pada  hasil  ada  pada  pelarut kloroform,  pengulangan  1,2  dan  3  hasil  diperoleh hanya  41,6%.  Ini  berarti  bahwa  hanya  sedikit  % saja pelarut kloroform mampu untuk menarik senyawa ada didalamnya.
Pelarut  juga  sangat  tergantung  kepada kelarutan  dari  suatu  senyawa  tersebut  ada  dalam pelarut,  sesuai  dengan  prinsip  like  dissolve  like yaitu  suatu  senyawa  akan  terlarut  pada  pelarut dengan  sifatnya  sama  (Prayoga,  2013).  Dari ketiga pelarut digunakan, pelarut metanol mempunyai  persen  penghambatan  paling  tinggi, ini  diduga  karena  kandungan  senyawa  metabolit sekunder terlarut dalam pelarut metanol mempengaruhi  besarnya  persen  penghambatan. Dapat dikatakan bahwa semakin tinggi % inhibisi antioksidan  dapat  menunjukan  bahwa  ada  banyak atom  hydrogen  diberikan  oleh  senyawa  aktif radikal  sehingga  DPPH  bisa  tereduksi  atau terjadinya penambahan elektron.
Jadi  Radikal  bebas  DPPH  akan  ditangkap oleh  senyawa  antioksidan  untuk  mendapatkan pasangan  elektron  dan  mengubahnya  menjadi difenil  pikrilhidrazil (Rahayu et  al .,  2010)
Ekstrak/Fraksi Absorbansi Kontrol Konsentrasi (ppm) Absorbansi Sampel (pengulangan) Nilai Rata-Rata % inhibisi Antioksidan 1 2 3 Ekstrak etanol 0,719 100 ppm 0,388 0,380 0,344 48,5 % Metanol 0,719 100 ppm 0,195 0,188 0,325 67,2 % n-heksan 0,719 100 ppm 0,357 0,364 0,334 51,2 % Kloroform 0,719 100 ppm 0,410 0,462 0,509 36,4 %

## PHARMACON– PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,

## KESIMPULAN
Berdasarkan  Hasil  penelitian  diperoleh, dapat  disimpulkan  bahwa  dari  spons Liosina paradoxa yang diperoleh dari pulau Manado Tua memiliki aktivitas antioksidan tertinggi terdapat pada fraksi
Metanol dengan presentase 67,2% pada konsentrasi 100 ppm.

## SARAN
Kiranya  dapat  dilakukan  penelitian  lebih lanjut  dengan  menggunakan  beberapa  konsentrasi dan  juga  metode  lain  seperti  metode  FRAP ( Ferric Reducing Antioxidant Power ), ABTS ( 2,2- Azinobiz  3-etyl  benzothiazoline  6-sulfonic  acid) dan  FIC  ( Ferrous  Ion  Chelating ) supaya  hasilnya bisa dibandingkan dengan hasil penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Alyaqoubi,  S.,  Abdullah,  A.,  Muhamad,  S., Norrakiah, A., Addai, Z.R & Musa,
K.H et  al .  2015.  Study  of antioxidant activity and physicoche mical  properties  of  coconut  milk (Pati  santan)  in  Malaysia. Journal of  Chemical  and  Pharmaceutical Research . 7(4) : 967-973.
Asih,  I.A.R.  Astiti  &  Setiawan  I.M.A ,  et  al . 2012. Senyawa Golongan Flavonoi d pada Ekstrak Kulit Batang Bungu r  ( Lagerstroemia  speciosa  Pers ).
FMIPA: Universitas Udayana
Dewi N.W.O. 2014. Uji Aktivitas Antioksida n  senyawa  flafonoid  ekstrak  etanol biji terong Belanda (Solanum betac eum, syn) dalam menghambat reaks i  peroksidasi  lemak  pada  plasma darah  tikus  wistar.  Indonesian  E- Journal of applied Chemistry 2(1) : 7-16.
Membri,  D.K.,  Yudistira,  A.,  Sumantri,  S. (2021). Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Spons  Liosina  paradoxa  Yang Dikoleksi Dari Pulau
Mantehage.  Pharmacon,  10(2), 775– 777. FAO,  2017.  Sponges  and  their  role  in  the marine environment. http://www.fao. org/3/a-i7775e.pdf.
Handayani,  dan  Dian.  2012.  Isolasi  Senyawa Sitotoksik dari Spons Laut Petrosia sp . Jurnal JPB Perikanan 7(1) : 69– 76.
Liochev,  S.I.  2013. Reaztive  OxygenSpecies and  the  Free  Radical  Theoryof Aging.  Free  Radical  Biology  and Medicine . 6 : 1-4.
Miryanti, Y. A., Sapei, L., Budiono, K., Indra, S et al . 2011. Ekstraksi antioksidan dari  kulit  buah  manggis (Garcinia mangostana L.) . Laporan Penelitian Lembaga Penelitian dan Pengabdian  Masyarakat.  Bandung, Universitas Katolik Parahan.
Prayoga,  G.  2013.  Uji  Aktivitas  Antioksidan dengan Metode DPPH dan Identifikasi Golongan Senyawa Kimia  dari    Ekstrak  Teraktif  Daun Sambang Darah ( Excoecaria cochinchinensis  Lour ).  Fakultas Farmasi : Universitas Indonesia
Rahayu  ,  D.S.,  K.,  Dan  Enny,  F et  al .  2010. Penentuan  Aktivitas  Antioksidan Dari Ekstrak Etanol Daun Ketapang  (Terminalia  catappa  L) dengan  Metode  DPPH. FMIPA Kimia, Universitas Diponegoro.
Thomas T, Moitinho-Silva L., Lurgi M, et a l. 2016.  Diversity,  structure,  and convergent  evolution  of  the  global sponge microbiom. Nature Communications 7 (11870) : 1-12.