## PENGARUH VARIASI pH DAN NaCl TERHADAP PRODUKSI INHIBITOR PROTEASE YANG DIHASILKAN OLEH   Acinetobacter baumanii (BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Plakortis nigra)
Tati Nurhayati 1) , Maggy T. Suhartono 2) , Desniar 1) , Rini Suwardinni 3)

## Abstrak
Mengingat  semakin  jelasnya  keterlibatan  protease  dalam  penyebab  penyakit,  maka diperlukan  suatu  senyawa  untuk  menghambat  aktivitas  enzim  tersebut,  yaitu  inhibitor  protease. Senyawa  tersebut  dapat  dihasilkan  oleh  makro  dan  mikroorganisme  laut.    Untuk  memproduksi inhibitor  protease  diperlukan  suatu  kondisi  produksi  yang  tepat,  termasuk  NaCl  dan  pH  media. Oleh  karena  itu  tujuan  penelitian  ini  adalah  menentukan  konsentrasi  NaCl  dan  pH  yang  tepat dalam  media  untuk  menghasilkan  inhibitor  protease  dengan  aktivitas  tertinggi.    Metode  yang digunakan untuk mencapai tujuan tersebut adalah dengan menumbuhkan Acinetobacter baumanii dalam media marine broth +glukosa 0,05 %(w/v) dengan melakukan variasi NaCl (0 %,2 %, dan 4 %(w/v))  dan  juga  pH  (6,7,  dan  8).    Berdasarkan  hasil  penelitian  didapatkan  bahwa  konsentrasi NaCl  yang  tepat  untuk  produksi  maksimum  adalah  2  %(w/v)  dan  pH  media  8  dengan  waktu inkubasi 20-28 jam.  Aktivitas tertinggi yang dihasilkan adalah 1,64-1,93 U/ml.
Kata kunci: Acinetobacter baumanii, inhibitor protease

## PENDAHULUAN
Bakteri patogen dalam menjalankan aksinya menggunakan beberapa cara, yang  dikenal  dengan  istilah  faktor  virulensi,  diantaranya  dengan  mensekresikan protease  ke  dalam  inangnya.    Mengingat  pentingnya  protease  dalam  mekanisme terjadinya  penyakit,  maka  dalam  dasarwarsa  terakhir  ini  perhatian  terhadap protease  sebagai  target  senyawa  obat  bagi  penyakit  asal  bakteri,  virus,  bahkan penyakit  degeneratif  meningkat  pesat  (Suhartono,  2000).    Saat  ini  obat-obatan yang  beberapa  diantaranya  mempunyai  mekanisme  inhibitor  protease  telah tersedia  di  pasaran,  seperti  elafin,  antileukoprotease,  inhibitor  serum  ayam,  serta inhibitor protease alkalin dari Streptomyces sp.
Beraneka ragam makhluk hidup dapat menjadi  sumber inhibitor protease, termasuk  dari  makro  dan  mikroorganisme  yang  hidup  di  laut.  Spons  merupakan salah  satu  makroorganisme  laut  yang  potensial  sebagai  penghasil  komponen bioaktif, termasuk inhibitor enzim seperti Irchinia sp. sebagai penghasil inhibitor HIV  reverse  transkriptase  (Loya et  al., 1997), Xetospongia  exigua sebagai penghasil inhibitor  tirosin kinase, juga Theonella sp. sebagai  penghasil   inhibitor _________________________
1) Staf Pengajar pada Departemen Teknologi Hasil Perairan, FPIK, IPB
2) Guru Besar pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fateta, IPB
3) Alumni Departemen Teknologi Hasil Perikanan, FPIK, IPB
protease  serin  (Nakao et  al., 1998  diacu  dalam  Mayer  dan  Lehmann  2000).
Begitu  pula  dengan  mikroorganisme  yang  berasosiasi  dengan  spons.    Hal  ini disebabkan karena terdapat hubungan simbiotik antara spons dan mikroorganisme, mengingat  spons  merupakan  hewan  yang  memakan  makanan  dengan  cara menyaring  makanan  ( filter  feeder )  (Lee et  al., 2001).    Flowers et  al. (1998) melaporkan  bahwa  simbion  spons Oscillatoria  spongeliae mengandung  senyawa diketopiperazin  yang  juga  dihasilkan  oleh  inangnya,  yaitu Dysidea  herbacea. Hasil  penelitian  yang  diperoleh  Nurhayati  dan  Suhartono (2004)  menunjukkan bahwa bakteri yang berasosiasi dengan spons Plakortis nigra yaitu Acinetobacter baumanii menghasilkan  inhibitor  protease Escherichia  coli. Spons  tersebut  juga menghasilkan  inhibitor  protease  yang  sama  (Nurhayati et  al., 2004). Selanjutnya Nurhayati et  al. (2006)  melaporkan  bahwa    spons Jaspis  stellifera dan  juga simbionnya menghasilkan inhibitor protease Staphylococcus aureus.
Imada et  al. (1985)  melaporkan  bahwa  produksi  inhibitor  protease  dari Alteromonas sp.  ditentukan  oleh  kondisi  medianya,  termasuk  konsentrasi  NaCl dan  pH  medium.    Inhibitor  protease  tersebut  dihasilkan  paling  baik  pada konsentrasi  NaCl  3,5  %(w/v)  dengan  pH  medium  6.    Konsentrasi  polipepton terbaik  untuk  produksi  inhibitor  protease  tersebut  adalah  0,6  %(w/v). Desniar et  al. (2006)  melaporkan  bahwa  konsentrasi  pepton  dan  yeast  ekstrak berpengaruh  terhadap  produksi  inhibitor  protease E.  coli yang  dihasilkan  oleh A.  baumanii. Kombinasi  pepton  dan  yeast  ekstrak  masing-masing  sebesar 0,5 %(w/v) menghasilkan inhibitor protease dengan aktivitas tertinggi.
Setelah  diketahui  kombinasi  pepton  dan  yeast  ekstrak  terbaik  untuk produksi  inhibitor  protease,  maka  kondisi  media  produksi,  seperti  pH  dan konsentrasi NaCl  merupakan parameter penting untuk diteliti.  Dengan demikian diharapkan  akan  didapatkan  media  dan  kondisi  produksi  yang  tepat  untuk produksi  inhibitor  protease E.  coli. Oleh  karena  itu  tujuan  penelitian  ini  adalah mendapatkan  kondisi  pH  dan  konsentrasi  NaCl  terbaik  guna  meningkatkan produksi inhibitor protease dari A. baumanii.

## METODOLOGI

## Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini meliputi E. coli sebagai sumber  protease  yang  diperoleh  dari  Rumah  Sakit  Pusat  Pertamina  Jakarta  dan A.  baumanii yang  diperoleh  dari  koleksi  pribadi.  Bahan-bahan  untuk  media produksi  meliputi  media  untuk  produksi  protease,  yaitu  Luria  Bertani  (tripton (oxoid),  yeast  ekstrak  (oxoid),  NaCl  (merck))  dan  media  produksi  inhibitor protease,  yaitu marine  broth (pepton  spesial  (oxoid),  yeast  ekstrak,  NaCl, trace element, glukosa  (merck)).  Alat-alat  yang  digunakan  meliputi waterbath  shaker , spektrofotometer  (Pharmacia  LKB,  Novasvec  2),  otoklaf  (Tommy),  mikropipet, inkubator, oven, sentrifugasi (Tommy).
Metode Penelitian

## Penentuan waktu propagasi A.baumanii
Isolat  bakteri  laut  ditumbuhkan  pada  media marine  broth (MB)  steril 150  ml  dengan  konsentrasi  NaCl  yang  berbeda  yaitu  0  %,  2  %  dan  4  %(w/v), kemudian diinkubasi dalam waterbath shaker pada suhu 30 o C, kecepatan agitasi 150 rpm.  Setiap 4 jam sekali dilakukan pengukuran optical density (OD) sampai fase  kematian  menggunakan  spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  660  nm. Selanjutnya dilakukan penentuan waktu propagasi bakteri laut dengan  pH media 6,  7,  dan  8  dengan  komposisi  NaCl  yang  terbaik.    Nilai  OD  pada  panjang gelombang  660  nm  tersebut  diplotkan  terhadap  waktu  untuk  mengetahui  waktu propagasi,  yaitu  perkembangbiakan  bakteri  yang  tepat  untuk  dipindahkan  pada media produksi.

## Produksi inhibitor protease dari A. baumanii
Produksi  inhibitor  protease  diawali  dengan  menumbuhkan  bakteri  pada media  MB  hingga  mencapai  waktu  propagasi.  Sebanyak  2  %(v/v)  inokulum dipindahkan  ke  dalam  media  produksi  MB  yang  ditambah  glukosa  0,05  %(w/v) dan diinkubasi pada suhu 30 o C dengan kecepatan agitasi 120 rpm selama 52 jam dengan  waktu  pengamatan  setiap  4  jam.    Parameter  yang  diamati  meliputi  pH (Apriyantono et  al., 1992),  OD,  aktivitas  inhibitor  protease  (Anson  1938  yang diacu  dalam  Imada et  al .,  1985  yang  dimodifikasi  Nurhayati  dan  Suhartono, 2004), konsentrasi protein (metode Bradford) (Hammond dan  Kruger, 1988) dan aktivitas protease ( Bergmeyer et al., 1984).  Sebagai substrat  untuk menentukan
aktivitas  inhibitor  protease  digunakan  protease  dari E.  coli yang  diproduksi menurut Baehaki (2004).
Pengukuran aktivitas inhibitor protease dari  A. baumannii.
Prosedur  pengukuran  aktivitas  inhibitor  protease  adalah  sebagai  berikut (Anson  1938  diacu  dalam  Imada et  al., 1985 yang  dimodifikasi  Nurhayati  dan Suhartono,  2004):    campuran  yang  terdiri  atas  0,5  ml  protease  dari E.  coli dan 0,5  ml  larutan  inhibitor  dari A.  baumanii dipre-inkubasi  pada  30 o C  selama  12 menit.  Sebanyak 1 ml kasein hammerstein 2 %(w/v) dalam bufer TrisCl 50 mM, pH 8 ditambahkan kedalamnya dan diinkubasi 12 menit pada suhu 30 o C.  Setelah diinkubasi,  2  ml  asam  trikloroasetat  (TCA)  5  %  (w/v)  ditambahkan  untuk menghentikan reaksi enzim.  Campuran diinkubasi kembali selama 20 menit pada suhu 30 o C.  Setelah selesai inkubasi, larutan disaring dengan kertas saring.  Filtrat yang  dihasilkan  ditambahkan  larutan  Bradford.  Kemudian  diukur  absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm.
Persentase nilai penghambatan protease dihitung menggunakan rumus:
% penghambatan = 1 –   (I s – I b ) x 100 %
(E s – E b )
Keterangan:    I s = absorbansi inhibitor sampel I b = absorbansi inhibitor blanko E s = absorbansi enzim sampel         E b = absorbansi enzim blanko
Satu  unit  aktivitas  inhibitor  protease  adalah  banyaknya  inhibitor  protease yang diperlukan untuk menghambat aktivitas enzim protease sebesar 50 %.

## Perlakuan
Produksi  inhibitor  protease  dari A.  baumanii menggunakan  media  MB dengan  perlakuan konsentrasi NaCl 0 %, 2 % dan 4 %(w/v) sehingga didapatkan konsentrasi  NaCl  terbaik  berdasarkan  nilai  penghambatan  tertinggi  dari  hasil pengukuran aktivitas inhibitor protease.  Selanjutnya dilakukan produksi inhibitor protease dengan perlakuan pH 6, 7 dan 8  pada konsentrasi NaCl terbaik.

## Analisis Data
Data  yang  diperoleh  dianalisis  secara  deskriptif  menggunakan  grafik hubungan antara waktu pengamatan dengan semua parameter yang diamati.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Penentuan Waktu Propagasi A. baumanii
Waktu propagasi  merupakan waktu perkembangbiakan  bakteri  yang tepat untuk  dipindahkan  ke  media  produksi.    Waktu  propagasi  biasa  terjadi  pada  fase logaritmik  yang  ditandai  oleh  pertumbuhan  bakteri  yang  seimbang,  yaitu  sel membelah dengan laju konstan. Waktu propagasi dilakukan untuk mempersingkat fase  adaptasi  pada  waktu  fermentasi  (Mangunwidjaja,  1994).    Penentuan  waktu propagasi dengan perlakuan NaCl dan pH dapat dilihat pada Gambar 1.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 w aktu inkubasi (jam) n ila i a b s o rb a n s i NaCl 0% NaCl 2% NaCl 4%
(A)                                                                           (B)
Gambar 1.  Penentuan waktu propagasi A. baumanii dengan perlakuan (A) NaCl 0 %, 2 % dan 4 %(w/v) dan (B) pH 6,7,8
Gambar  1(A)  memperlihatkan  pengaruh  konsentrasi  NaCl  pada  medium terhadap  waktu  propagasi A.  baumanii .    Berdasarkan  Gambar  1(A)  dapat ditentukan waktu propagasi pada medium yang mengandung NaCl 0 %, 2 %, dan 4  %(w/v)  berturut-turut  adalah  36  jam  (OD=2,053),  24  jam  (OD=2,169),  dan  40 jam (OD=2,009).
Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  konsentrasi  NaCl  menentukan  kecepatan pembelahan  sel  bakteri.    Konsentrasi  NaCl  2  %(w/v)  menunjukkan  jumlah  yang tepat  untuk  mempercepat  pembelahan  sel  bakteri  yang  ditandai  oleh  waktu propagasi yang lebih singkat dan nilai OD yang lebih tinggi dibandingkan dengan konsentrasi NaCl 0 % dan 4 %(w/v).  Waktu  propagasi  yang  cepat   dipengaruhi oleh  lingkungan dan keadaan  inokulum (Fardiaz 1992). Acinetobacter baumanii merupakan  bakteri  laut  yang  berasosiasi  dengan  spons P.  nigra ,  dengan konsentrasi  NaCl  air  laut  (habitat  asli)  bakteri  tersebut  sebesar  2  %(w/v)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Waktu inkubasi (jam) p H pH 6 pH 7 pH 8
(Nurhayati  dan  Suhartono,  2004).    Imada et  al. (1985)  melaporkan  bahwa Alteromonas sp. yang diisolasi dari sedimen laut mempunyai pertumbuhan paling cepat pada konsentrasi NaCl 3,5 %(w/v) sesuai dengan habitat aslinya.
Gambar  1(B)  menunjukkan  pengaruh  pH  medium  terhadap  waktu propagasi A.  baumanii .    Berdasarkan  Gambar  1(B)  dapat  ditentukan  waktu propagasi  untuk A.  baumanii dengan  pH  medium  6  adalah  40  jam  dengan  nilai OD  2,290.  Waktu  propagasi  yang  sama  dicapai  ketika  bakteri  tersebut ditumbuhkan pada medium dengan pH 7, namun mempunyai nilai OD yang lebih rendah,  yaitu  1,250.  Ketika  pH  medium  dinaikkan  menjadi  8,  waktu  propagasi yang dicapai lebih singkat, yaitu 32 jam dengan nilai OD 2,094.
Hasil ini menunjukkan bahwa pH juga merupakan faktor lingkungan yang mempengaruhi  pertumbuhan  sel  bakteri.    Sebagaimana  yang  dinyatakan  oleh Fardiaz  (1992)  bahwa  faktor  lingkungan  sangat  mempengaruhi  pertumbuhan  sel bakteri.  Jika dibandingkan dengan pH air laut asal bakteri A. baumnaii , yaitu 7,6, maka dapat disimpulkan bahwa bakteri tersebut tumbuh baik pada pH yang sama dengan  pH  air  laut  habitat  asli  bakteri  tersebut. Acinetobacter  baumanii dapat tumbuh baik pada pH 7-8 (Bouvet dan Grimont, 1986).
Merujuk  kepada  dua  parameter  di  atas,  disimpulkan  bahwa  pH  dan  NaCl mempengaruhi  waktu  propagasi.    Waktu  propagasi  terpendek  dicapai  ketika A.  baumanii ditumbuhkan  pada  konsentrasi  NaCl  2  %(w/v)  dan  pH  8,  yang merupakan kondisi yang sama dengan habitat asli bakteri tersebut.

## Produksi Inhibitor Protease dari A. baumanii
Inhibitor protease merupakan senyawa  yang diproduksi dengan  baik pada media fermentasi dalam kondisi yang ekstrim, yaitu pada saat semua nutrisi yang terkandung  dalam  media  fermentasi  tersebut  sudah  berkurang.  Nilai  pH,  OD, kadar protein, aktivitas inhibitor protease, dan aktivitas protease dari A. baumanii yang ditumbuhkan pada  media  MB+glukosa 0,05 %(w/v) dengan  variasi NaCl 0 %, 2 %, dan 4 %(w/v) selama inkubasi disajikan pada Gambar 2.
Gambar  2(A)  memperlihatkan  bahwa A.  baumanii yang  ditumbuhkan dalam  media  MB+glukosa  0,05  %(w/v)  dengan  konsentrasi  NaCl  0  %(w/v), memproduksi  inhibitor  protease  setelah  inkubasi  selama  16  jam  sampai  36  jam. Nilai  penghambatan  tertinggi  terjadi  setelah  bakteri  tersebut  diinkubasi  selama
NaCl 0% Jam 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 O D 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 pH 0 2 4 6 8 10 [pr ot ei n] 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 OD pH [protein] unit/ml protease Unit/ml pr ot eas e NaCl 2% Jam 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 O D 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 pH 0 2 4 6 8 10 [pr ot ei n] 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 OD pH [protein] unit/ml protease Unit/ml pr ot eas e N a C l 4 % J a m 0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 3 2 3 6 4 0 4 4 4 8 5 2 O D 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 2 .5 p H 0 2 4 6 8 1 0 [p ro te in ] 0 .0 0 0 .0 4 0 .0 8 0 .1 2 0 .1 6 0 .2 0 0 . 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 . 0 1 . 2 1 . 4 1 . 6 1 . 8 2 . 0 0 .0 0 0 .0 4 0 .0 8 0 .1 2 0 .1 6 0 .2 0 O D p H [p ro te in ] u n it/m l p ro te a s e U n it /m l p ro te a s e
20  jam  dengan  nilai  aktivitas  sebesar  1,81  unit/ml  dan  konsentrasi  protein 0,118  mg/ml.    Pada  kondisi  tersebut  inhibitor  protease  diproduksi  pada  fase logaritmik.
(A)                                                                       (B)
(C)
Gambar 2.  Produksi  inhibitor  protease,  OD,  pH,  protein  dan  protease  dalam media  yang  mengandung  NaCl  0  %  (A),  NaCl  2  %  (B)  dan  NaCl 4 %(w/v) (C) dari bakteri A. baumannii
Gambar  2(B)  memperlihatkan  bahwa A.  baumanii yang  ditumbuhkan dalam  media  MB+glukosa  0,05  %(w/v)  dengan  konsentrasi  NaCl  2  %(w/v), memproduksi  inhibitor  protease  setelah  inkubasi  selama  16  jam  sampai  36  jam. Nilai penghambatan tertinggi terjadi setelah bakteri tersebut diinkubasi selama 28 jam  dengan  nilai  aktivitas  sebesar  1,93  unit/ml  dan  konsentrasi  protein  0,101 mg/ml.  Pada kondisi tersebut inhibitor protease diproduksi pada fase logaritmik.
Gambar  2(C)  memperlihatkan  bahwa A.  baumanii yang  ditumbuhkan dalam  media  MB+glukosa  0,05  %(w/v)  dengan  konsentrasi  NaCl  4  %(w/v), memproduksi  inhibitor  protease  setelah  inkubasi  selama  12  jam  sampai  52  jam. Nilai penghambatan tertinggi terjadi setelah bakteri tersebut diinkubasi selama 24 jam  dengan  nilai  aktivitas  sebesar  1,90  unit/ml  dan  konsentrasi  protein  0,104 mg/ml.    Pada  kondisi  tersebut  inhibitor  protease diproduksi  pada  fase  logaritmik sampai fase stasioner.
Berdasarkan Gambar 2 dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan konsentrasi protein pada media tumbuh A. baumanii yang mengandung  NaCl (0 %, 2 % dan 4 % w/v) seiring dengan peningkatan OD.  Dalam hal ini, diduga bahwa inhibitor protease merupakan protein.
Bila  ditinjau  dari  parameter  peningkatan  nilai  OD,  maka  berdasarkan Gambar 2 dapat dilihat bahwa OD tertinggi pada A. baumanii yang ditumbuhkan dalam  media  baik  yang  mengandung  NaCl  0  %,  2  %,  maupun  4  %(w/v)  terjadi setelah bakteri tersebut diinkubasi 48 jam .  Namun terdapat perbedaan nilai OD, dengan  nilai  tertinggi  dicapai  ketika  bakteri  tersebut  ditumbuhkan  dalam  media yang  mengandung  NaCl  2  %(w/v)  yaitu  sebesar  2,52  (Gambar  2(B)).  Ini  berarti bahwa  kondisi  NaCl  terbaik  untuk  pertumbuhannya  adalah  yang  sesuai  dengan kondisi NaCl habitat asli bakteri tersebut.
Konsentrasi  NaCl  yang  berbeda  (0  %,  2  %  dan  4  %w/v)  pada  médium produksi  ternyata  berpengaruh  terhadap  titik  awal  diproduksinya  inhibitor protease  seperti  dapat  dilihat  pada  Gambar  2.  Titik  awal  diproduksi  inhibitor protease  pada  médium  yang  mengandung  NaCl  0  %  dan  2  %(w/v)  sama,  yaitu setelah A.  baumanii diinkubasi  selama  16  jam  (Gambar  2(A)  dan  2(B)).    Ketika NaCl dalam médium ditingkatkan menjadi 4 %(w/v) inhibitor protease dihasilkan dengan  titik  awal  produksi  yang  lebih  singkat  yaitu  setelah  inkubasi  8  jam (Gambar 2(C)).  Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa bakteri A. baumannii membutuhkan  NaCl  yang  tepat   dalam  produksi  inhibitor  protease.   Imada et  al.
(1985)  menyatakan  bahwa  inhibitor  protease  dari  bakteri  laut Alteromonas sp.
dihasilkan dengan aktivitas yang tinggi pada konsentrasi NaCl 3,5 %(w/v).
Secara umum, peningkatan konsentrasi NaCl 0 % sampai 4 %(w/v) dalam medium  produksi A.  baumanii tidak  menyebabkan  perubahan  pH  yang  berarti
Penghambatan tertinggi 1.81 1.927 1.90 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 NaCl 0% NaCl 2% NaCl 4% Perlakuan U n it /m l
selama inkubasi, yaitu sekitar 7-8,5.  Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa inhibitor  protease  yang  diproduksi  pada A.  baumannii terjadi  pada  pH  netral. Imada et  al .  (1985)  menyatakan  bahwa  inhibitor  protease  yang  berasal  dari Alteromonas sp. yang disebut marinosatin diproduksi pada pH 6-7.
Selama produksi inhibitor protease (Gambar 2A-2C), ternyata A. baumanii juga  menghasilkan  protease,  namun  aktivitasnya  sangat  rendah  dan  cenderung konstan, yaitu berkisar 0,01-0,04 U/ml.
Berdasarkan  pengukuran  aktivitas  inhibitor  protease  yang  dihasilkan A. baumanii terhadap protease E. coli dalam media dengan konsentrasi NaCl 0 %, 2  %  dan  4  %(w/v)  dipilih  nilai  penghambatan  tertinggi  untuk  masing-masing perlakuan  yaitu  sebesar  1,81  unit/ml,  1,93  unit/ml  dan  1,90  unit/ml  (Gambar  3). Setelah  diketahui  nilai  penghambatan  tertinggi  dari  ketiga  perlakuan  tersebut dipilih  nilai  penghambatan  terbaik  yaitu  NaCl  2  %  (w/v)  dengan  nilai penghambatannya sebesar  1,93 unit/ml.
Gambar 3. Aktivitas inhibitor protease tertinggi yang dihasilkan oleh A. baumanii yang ditumbuhkan pada media yang mengandung NaCl 0 %, 2 %, dan
4 %(w/v)
Nilai pH, OD,  protein, aktivitas  inhibitor protease, dan aktivitas protease dari A.  baumanii yang  ditumbuhkan  pada  media  MB+glukosa  0,05  %(w/v) dengan variasi pH 6,7, dan 8 selama inkubasi disajikan pada  Gambar 4.
Gambar 4(A) memperlihatkan bahwa A. baumanii yang ditumbuhkan pada media  dengan  pH  6  memproduksi  inhibitor  protease  setelah  diinkubasi  4  jam sampai 36 jam.  Inhibitor protease dengan aktivitas penghambatan tertinggi terjadi setelah bakteri tersebut diinkubasi selama jam ke-16 dengan nilai aktivitas sebesar
pH 6 Jam 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 O D 0 2 4 6 8 pH 0 2 4 6 8 10 [pr ot ei n] 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 pH 6 OD Protein unit/ml protease Unit/ml pr ot eas e pH 7 Jam 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 O D 0 2 4 6 8 10 pH 0 2 4 6 8 10 [pr ot ei n] 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 pH 6 OD Protein unit/ml protease Unit/ml pr ot eas e p H  8 J a m 0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 3 2 3 6 4 0 4 4 4 8 5 2 O D 0 2 4 6 8 1 0 pH 0 2 4 6 8 1 0 [pr ot ei n] 0 .0 0 0 .0 4 0 .0 8 0 .1 2 0 .1 6 0 .2 0 0 . 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 . 0 1 . 2 1 . 4 1 . 6 1 . 8 2 . 0 0 .0 0 0 .0 4 0 .0 8 0 .1 2 0 .1 6 0 .2 0 p H  6 O D P r o t e in u n it/ m l p r o te a s e Unit/ml pr ot eas e
1,54 unit/ml, konsentrasi protein 0,107 mg/ml.  Inhibitor protease dihasilkan pada fase logaritmik.
Acinetobacter  baumanii yang  ditumbuhkan  pada  media  produksi  dengan pH  7,  menghasilkan  inhibitor  protease  selama  inkubasi  16  sampai  40  jam (Gambar  4(B)).    Inhibitor  protease  dengan  nilai  penghambatan  tertinggi  terjadi setelah  diinkubasi  20  jam  dengan  aktivitas  sebesar  1,64  unit/ml,  konsentrasi protein  0,154  mg/ml    dan  jam  ke-40  dengan  aktivitas  sebesar  1,45  unit/ml, konsentrasi  protein  0,161  mg/ml.    Adanya  dua  puncak  aktivitas  ini  diperkirakan karena  adanya  kerja  metabolit  yang  berbeda.    Pada  aktivitas  metabolit  yang pertama  meningkatnya  penghambatan  seiring  dengan  peningkatan  kadar  protein, sedangkan metabolit yang kedua aktivitasnya berkorelasi dengan penurunan kadar protein (Sabana, 2004).  Inhibitor protease diproduksi pada fase logaritmik.
(A)                                                                     (B)

## (C)
Gambar 4.  Produksi  inhibitor  protease,  OD,  pH,  protein  dan  protease  dalam media  dengan  pH  6  (A),  pH  7  (B)  dan  pH  8  (C)  dari  bakteri A. baumannii .
Acinetobacter  baumanii yang  ditumbuhkan  pada  media  produksi  dengan pH  8  menghasilkan  inhibitor  protease  selama  inkubasi  4  jam  sampai  44  jam (Gambar  4(C)).    Aktivitas  inhibitor  protease  dengan  penghambatan  tertinggi terjadi  setelah  diinkubasi  20  jam  dengan  aktivitas  sebesar  1,64  unit/ml, konsentrasi  protein  0,152  mg/ml.    Produksi  inhibitor  protease  terjadi  pada  fase logaritmik.
Berdasarkan Gambar 4 dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan konsentrasi protein  pada  media  tumbuh A.  baumanii dengan  pH  6-8  seiring  dengan peningkatan  OD.    Ini  berarti  dapat  diduga  bahwa  inhibitor  protease  merupakan protein.
Secara  umum,  produksi  inhibitor  protease  memperlihatkan  bahwa peningkatan  pH  (6,  7  dan  8)  medium  produksi  berpengaruh  terhadap  nilai  OD maksimum.    Pada  pH  medium  6  nilai  OD  maksimum  yang  dicapai  adalah  2,189 setelah A.  baumanii diinkubasi  selama  40  jam  (Gambar  4(A)).  Bila  pH  medium dinaikkan  menjadi 7,  maka  nilai OD  maksimum  yang dicapai  mengalami sedikit penurunan  menjadi  2,153  setelah  bakteri  tersebut  diinkubasi  44  jam  (Gambar 4(B)). Nilai OD maksimum yang dicapai apabila pH medium dinaikkan menjadi 8 adalah  2,542  setelah  diinkubasi  48  jam  (Gambar  4(C)).   Dengan  demikian  dapat disimpulkan bahwa A. baumanii akan tumbuh lebih baik pada pH 8.  Bouvet dan Grimont (1986) menyatakan bahwa A. baumanii tumbuh pada kisaran pH 7-8.
Peningkatan  pH  medium  dari  6  sampai  8  menyebabkan  perubahan  pada titik awal diproduksinya inhibitor protease. Titik awal produksi inhibitor protease oleh A.  baumanii pada  media  produksi  dengan  pH  7  adalah  setelah  diinkubasi selama 12 jam (Gambar 4(B)), sedangkan bila bakteri tersebut ditumbuhkan pada media  dengan  pH  6  dan  8,  inhibitor  protease  sama-sama  diproduksi  setelah diinkubasi 4 jam (Gambar 4(A) dan 4(C)).
Peningkatan pH 6 sampai 8 tidak menyebabkan perubahan pH yang berarti selama  inkubasi  (Gambar  4),  yaitu  berkisar  6-8.  Hal  ini  diduga  karena  inhibitor protease A.  baumannii diproduksi  pada  pH  6-8.  Selama  produksi  inhibitor protease  (Gambar  4),  ternyata A.  baumanii juga  menghasilkan  protease,  namun aktivitasnya sangat rendah dan cenderung konstan, yaitu berkisar 0,009-0,01 U/ml.
Penghambatan tertinggi 1.69 1.64 1.84 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 pH 6 pH 7 pH 8 Perlakuan U n it /m l
Berdasarkan  pengukuran  aktivitas  inhibitor  protease  yang  diproduksi A. baumanii diketahui bahwa inhibitor protease yang dihasilkan selama inkubasi pada  pH  6,  7  dan  8  masing-masing  mempunyai    penghambatan  tertinggi  yaitu sebesar 1,69 unit/ml, 1,64 unit/ml dan 1,84 unit/ml (Gambar 5). Dengan demikian dapat  disimpulkan  bahwa  pH  8  merupakan  pH  yang  tepat  untuk  menghasilkan inhibitor protease dengan aktivitas yang tinggi dibandingkan dengan pH 6 dan 7.
Gambar 5. Aktivitas inhibitor protease tertinggi yang dihasilkan oleh A. baumanii yang ditumbuhkan pada media dengan pH 6-8

## KESIMPULAN
Produksi  inhibitor  protease  ditentukan  oleh  konsentrasi  NaCl  dan  pH media produksi. Acinetobacter baumanii menghasilkan inhibitor protease dengan aktivitas  tertinggi  setelah  ditumbuhkan  selama  28  jam  pada  media  yang mengandung NaCl  2 %(w/v), dengan aktivitas sebesar 1,93 U/ml dan konsentrasi protein  0,101  mg/ml.  pH  8  merupakan  pH  yang  tepat  bagi A. baumanii untuk menghasilkan  inhibitor protease dengan aktivitas tertinggi sebesar 1,64 U/ml dan konsentrasi protein 0,152 mg/ml dengan waktu produksi selama 20  jam.Inhibitor protease dihasilkan pada fase logaritmik.
Pada kondisi NaCl dan pH yang tepat untuk produksi inhibitor protease, ternyata diimbangi oleh densitas sel dan konsentrasi protein yang tinggi.  Selama waktu  inkubasi  ternyata  tidak  terjadi  perubahan  pH  yang  nyata,  serta  aktivitas protease yang rendah.

## DAFTAR PUSTAKA
Apriyantono  A,  Fardiaz  D,  Puspita  NL,  Budiyanto  S.    1989. Petunjuk Laboratorium Analisis Pangan .  Bogor: PAU Pangan dan Gizi, IPB.
Baehaki  A.    2004.    Karakteristik  protease  beberapa  bakteri  patogen.    [Tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, IPB.
Bergmeyer  HV,  Grassl  M,  Walter  HE.    1984. Methods  of  Ezymatic  Analysis ,
Volume 5.  Amsterdam: Verlag chemie, Weinheim.  .
Bouvet PJM,  Grimont  PAD.   1986.  Taxonomy  of  genus Acinetobacter with  the recognition of Acinetobacter baumanii sp. noc., Acinetobacter johnsonii sp.  nov., Acinetobacter  haemolyticus sp.  nov.,  and Acinetobacter  junii sp.  nov.,  and  emended  description  of Acinetobacter  calcoaceticus and Acinetobacter lwoffii . Int J Syst  Bacteriol 36: 228-240 .
Desniar,  Nurhayati  T,  Suhartono  MT, Isa  EM.    2006.   Modifikasi  media marine broth pada  produksi  inhibitor  protease  dari  bakteri Acinetobacter baumanii yang  hidup  bersimbiosis  dengan  sponge Plakortis  nigra. Buletin THP IX(1):67-76.
Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pangan I .  Bogor: PAU  Pangan dan Gizi.  Institut Pertanian Bogor.  .
Flowers  AE,  Garson  MJ,  Webb  RI,  Dumdei  EJ,  Charan  RD.    1998.    Cellular origin  of  chlorinated  diketopiperazines  in  the  dictyoceratid  sponge Dysidea her bacea (Keller). Cell Tissue Res 292:597-607.
Hammond  JBW,  Kruger  J.  1988.  The  bradford  method  for  protein  quantitation. Di  dalam  Walker  JM,  editor. New  Protein  Technique .  Clifton,  New Jersey: Humana Press.
Imada C, Taga N, Maeda M.  1985.  Cultivation conditions for subtilisin inhibitor- producing  bacterium  and  general  properties  of  the  inhibitor “marinostatin”. Bull Jap Soc Sci Fish .  51 (5) : 805-810.
Lee  YK,  Lee  JH,  Lee  HK.   2001.   Microbial  symbiosis  in  marine  sponges. The J Microbiol 39:254-264.
Loya S, Rudi A, Kashman Y, Hizi A.  1997.  Mode of inhibition of HIV reverse transcriptase by 2-hexaprenyl-hydroquinone, a novel general inhibitor of RNA-and DNA-directed DNA polymerases. Biochem J 324:721-727.
Mangunwidjaja D.  1994. Teknologi Bioproses .  Jakarta:Penebar Swadaya.
Mayer  AMS  and  Lehmann  VKB.  2000.  Marine  pharmacology. The  Pharmacol 42:62-69.
Nurhayati  T,  Suhartono  MT.    2004.    Pemilahan  dan  Karakteristik  Inhibitor Protease  dari  Mikroba  laut  pada  Bunga  Karang    (Sponge)  Kepulauan Seribu.  Bogor : LPPM, IPB.
Nurhayati  T,  Suhartono  MT,  Suptijah  P,  Febrian  I.    2004. Screening inhibitor protease dari sponge, Kepulauan Seribu. Buletin THP VII(2): 72-83.
Nurhayati T, Suhartono MT, Nuraida L, Poerwanto SB.  2006. Karakterisasi awal inhibitor protease dari bakteri yang berasosiasi  dengan spons asal Pulau Panggang, Kepulauan Seribu. J Hayati 13(2):58-64.
Sabana  A.    2004.    Screening  dan  Karakteristik  Bakteri  Laut  Penghasil  Inhibitor Protease pada Sponge dari  Kepulauan Seribu, Jakarta. [Skripsi]. Bogor:
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB.
Suhartono  MT.    2000.    Pemahaman  karakteristik  biokimiawi  enzim  protease dalam  mendukung  industri  berbasis  bioteknologi.    [Orasi  Ilmiah]. Bogor: IPB.