Isolasi dan Identifasi Mikroba Rumen Penghasil Antihistamin

## “ Histamine Methyl Transferase “
Ning Iriyanti, Budi Rustomo, Efka Aris Rimbawanto
Fakultas Peternakan UNSOED Jl. dr. Soeparno Kotak Pos 110 Purwokerto 53123

## Abstract
The aim of this research was to find antihistamine ”Histamine Methyl Transferase” of microbe producers   through   isolation   and   testing   of   their   activities   on   various   substrates.   The   isolation process found four putative isolates i.e. N2k, N2b, N3 and N5. Their general characteristics were round, big and formed regular colonies; regular edge and wavy colonies. Colonies were whitish, shiny and had low convex elevation. N2k, N2b,  and  N5 isolates were Gram negative bacteria whereas N3 was Gram positive.  Those isolates were non-motile. Further tests were conducted to examine the isolate capability to produce catalase and utilize citric acid as the carbon source to which they showed positive result. Nitrate reduction test showed positive results for N2b and N5 but not for N2k and N3. The ability to ferment sugars into acid and gas indicated that all isolates except N3 were capable of fermenting glucose and lactose. However, only N2k was capable to produce gas.
Key words : Antihistamine, histamine methyl transferase , bacteria

## Pendahuluan
Bahan   pakan   ternak   terutama   bungkil   kedele,   jagung,   dan   tepung   ikan   sampai sekarang masih merupakan bahan pakan impor, sehingga ketersediaannya bergantung pada pasokan dari luar negeri, sedangkan tepung ikan yang berasal dari dalam negeri kurang dapat dimanfaatkan karena kualitasnya rendah dengan kadar garam dan air yang cukup   tinggi.     Prosesing   dan   penyimpanan   tepung   ikan   yang   kurang   tepat   akan menyebabkan histamin yang terkandung cukup tinggi.   Menurut   Kose dan Hall (2003), kadar histamin pada tepung ikan mencapai 127,93-415,24 mg/100g, sedangkan Brinker et   al . (2002),   kadar   histamin   pada   tepung   ikan   kering   dapat   mencapai   273   mg/kg. Histamin merupakan senyawa amin aktif dalam produk ikan dan daging, dibentuk dari perombakan histidin menjadi histamin oleh enzim histidin dekarboksilase.
Histamin   pada   kadar   tertentu   dapat   menyebabkan   toksik,   seperti   alergi,   sakit kepala,   sesak   napas,   diare,   dan   gangguan   pencernaan   yang   lain.   Tiga   faktor   yang mempengaruhi   pembentukan   histamin   di   dalam   makanan   yaitu:   (a)   tersedianya   asam amino bebas; (b) kehadiran dan perkembangan bakteri penghasil enzim dekarboksilase; dan   (c)   adanya   kondisi   yang   mendukung   pertumbuhan   mikroba   serta   proses dekarboksilasi asam amino tersebut (Halasz et al .,1994).
Histamin adalah bioaktif   amin dengan kadar tertentu dapat menyebabkan toksik. Histamin   dibentuk   dari   histidin   dengan   bantuan   enzim   histidin   dekarboksilase,   dan diproduksi pada sel mast ( mast cells ) di jaringan peritoneal dan jaringan konektif Histamin banyak terdapat pada sebagian besar jaringan sebagai granula pada Mast Cells atau basophil (Marieb, 2001).   Histamin dibentuk karena adanya enzim histidin dekarboksilase mikroba yang tumbuh optimum pada suhu 25  C (Kim et al ., 1999) atau pada   suhu   15-30  C   dan   aktivitas   enzim   histidin   dekarboksilase   masih   berlangsung, meskipun  disimpan pada    suhu 0-5  C (Ahmed, 1991).  Histamin melalui  metabolisme nutrien akan menghasilkan asam lambung, tetapi apabila mencapai dosis tertentu, maka dapat bersifat toksik (Taylor, 1986). Kadar histamin yang terdapat pada ikan dapat dipakai sebagai indikator tingkat kerusakan produk perikanan. Apabila kadar histamin lebih dari 15 mg/100g sudah mulai terbentuk kerusakan, pada kadar 50 mg/100g atau lebih sudah
berbahaya untuk kesehatan, dan kadar 100 mg/100g atau lebih sudah bersifat racun pada manusia (SNI 01-2360, 1991). Menurut Scoging (1998), produk perikanan dengan kadar histamin kurang dari 10 mg/100g masih aman untuk dikonsumsi.
Kadar   histamin   dapat   ditekan   melalui   pemberian   obat-obatan   antihistamin   atau dengan   mengendalikan   aktivitas   enzim   histidine   dekarboksilase.     Dengan   keberadaan Histamine Methyl Transferase (HMT) dan Diamine oxsilase (DAO), histamin penyebab toksik dapat dicegah seminimal mungkin dan histamin dapat masuk ke dalam aliran darah (Taylor, 1986). Kerja antihistamin adalah mengurangi gejala alergi dengan cara memblokir kerja enzim histamin (Greene, 1998).  Enzim  HMT atau enzim DAO/ Histaminase mikroba banyak terdapat pada saluran pencernaan (Kerr et al ., 2002).
Pencegahan   histidin   menjadi   histamin   antara   lain   menggunakan   enzim   yang dihasilkan   oleh   mikroba   yaitu   enzim   HMT   atau   DAO   yang   mampu   mencegah pembentukan   histamin   dari   histidin,   sehingga   tidak   bersifat   toksik   baik   pada   pakan maupun pangan.  Mikroba tersebut dapat diisolasi dari rumen sapi, yang sampai saat ini para peneliti belum ada yang meneliti sampai seberapa jauh peranan dan jenis mikroba antihistamin yang sesuai.

## Materi dan Metode
Cairan rumen sapi, histamin (difco), anthihistamin, media Tryptone Soya Agar (TSA) yang terdiri dari 0,5% tryptone, 0,5 yeast extract, 2,7% L-histidin-2HCl, 0,5% NaCl, 0,1% CaCO 3 , 2% agar, dan 0,006% bromocresol purple (pH 5,3) disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121  C selama 15 menit.
Isolasi tahap I dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 1 g cairan rumen sapi dimasukkan dalam 9 ml garam fisiologis (0,85% larutan NaCl). Seri pengenceran dengan   garam   fisiologis   sampai   10 -6 dilakukan.   Suspensi   dari   3   pengenceran   terakhir diambil 0,1 ml dan ditabur secara tabur ulas ( spreadplating ) pada media TSA. Inkubasi dilakukan   pada   pada   suhu  37  C   selama  2-3x24   jam,   mikroba   yang   tumbuh   dihitung, hasilnya ditampilkan sebagai colony forming unit /g  (CFU/g) . Isolasi tahap II dilakukan untuk mikroba penghasil Antihistamin (Niven et al ., 1981; Yoshinaga and Frank, 1982; Pousti et al ., 2002). Hasil Isolasi Tahap I ditumbuhan pada media TSA agar yang diperkaya dengan Histamin. Pembuatan media TSA agar dengan bahan yaitu 0,5% tryptone (Difco), 0,5 yeast extract (Difco), 2,7% L-histidin-2HCl, 0,5% NaCl, 0,1% CaCO 3 , 2% agar, dan 0,006% bromocresol purple (pH 5,3), dan histamin. Bahan   disterilisasi   dengan   autoclave   pada   suhu   121  C   selama   15   menit.  Jika pertumbuhan pada pada TSA yang diperkaya histamin menunjukkan hasil yang lebih baik berarti bakteri tersebut mampu menggunakan histamin
Isolasi selanjutnya adalah isolat ditumbuhkan pada media Glukosa 10% diperkaya dengan Histamin, setelah tumbuh. Untuk menentukan bahwa isolat hanya mampu tumbuh pada media yang mengandung histamin, isolat selanjutnya ditumbuhkan pada media TSA maupun   Glukosa   10%   yang   diperkaya   dengan   antihistamin   10%.     Apabila   isolat pertumbuhannya   sangat   minimal   pada   media   yang   mengandung   anthihistamin   berarti isolat   tersebut   hanya   mampu   tumbuh   apabila   substrat   mengandung   histamin.   Setelah isolat-isolat tersebut diyakini kemurniannya (jika diperlukan dilakukan goresan berulang untuk mendapatkan kultur murni), isolat-isolat tersebut ditumbuhkan pada medium TSA yang mengandung histamin. Selanjutnya, isolat ditumbuhkan lagi pada media TSA atau Glukosa agar 10% dengan  cara cap ( stamped method ). Inkubasi dilakukan pada suhu 37  C selama 24 jam
Identifikasi isolat bakteri dilakukan melalui pengamatan secara mikromorfologi dan uji   biokimiawi   berpedoman   pada Cowan   and   Steel's   Manual   for   the   Identification   of Medical Bacteria (Barrow  dan  Feltham, 1993) serta  Bergey's Manual of Determinative Bacteriology  (Holt, 1994). Pengamatan mikromorfologi  meliputi bentuk sel, sifat Gram, motilitas.   Uji-uji   biokimiawi   meliputi   kemampuan   memproduksi   katalase,   reduksi   nitrat, fermentasi   gula-gula   glukosa,   laktosa   dan   pembentukan   gas,   serta   kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber C.

## Hasil dan Pembahasan
Dari hasil isolasi pada media TSA diperoleh 19 isolat bakteri. Selanjutnya,  isolat ditumbuhkan pada media TSA-agar yang diperkaya dengan Histamin dan diperoleh 10 isolat. Tahap berikutnya ditumbuhkan pada media TSA dan media Glukosa 10% yang diperkaya dengan Antihistamin dan diperoleh 4 isolat yang menunjukkan pertumbuhan koloni paling tipis (miskin pertumbuhannya) pada media tersebut. Hal ini berarti bahwa isolat tersebut hanya mampu tumbuh apabila substrat mengandung histamin dan akan mengubah histamin menjadi histidin.  Dari hasil isolasi bakteri penghasil antihistamin yaitu “ Histamine   Methyl   Transferase ”   diperoleh   empat   isolat   unggulan.   Hasil   identifikasi selengkapnya disajikan pada Tabel 1 dan 2; serta Gambar 1-4.
Pengamatan terhadap makromorfologi dilakukan dengan melihat ciri-ciri koloni yang meliputi bentuk,  tepi, warna,  permukaan dan elevasi  koloni  bakteri. Hasil  pengamatan morfologi koloni ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1.   Hasil identifikasi secara makroskopis isolat penghasil antihistamin Table 1. Results of microscopic identification of the isolates producing antihistamine
Kode Isolat Bentuk Koloni Tepi Koloni Warna koloni Permukaan koloni Elevasi koloni N2k Besar teratur Berlekuk Putih keruh Mengkilap Cembung rendah N2b Besar teratur Berlekuk Jernih Mengkilap Cembung rendah N3 Bulat Bergelombang Putih keruh tidak tembus cahaya Mengkilap Cembung rendah N5 Besar Teratur Putih keruh tembus cahaya Mengkilap Cembung rendah
Untuk   keperluan   identifikasi,   pengamatan   mikromorfologi   dan   uji-uji   biokimiawi berpedoman   pada  Barrow  dan  Feltham  (1993)   dan  Holt  (1994)   dilakukan   pula. Pengamatan mikromorfologi meliputi bentuk sel, sifat Gram, motilitas. Uji-uji biokimiawi yang   dilakukan   meliputi   kemampuan   memproduksi   katalase,   reduksi   nitrat,   fermentasi glukosa, laktosa dan produksi gas, serta kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber C. Hasil pengamatan tersebut ditunjukkan dalam Tabel 2.
Tabel 2.  Hasil Identifikasi dari isolasi mikroba rumen penghasil antihistamin Table 2. Identification results of isolated rumen microbes producing antihistamine
Kode Isolat Bentuk Sel Gram Katalase Motilitas Reduksi Nitrat Fermentasi Sitrat glu lak As gas N2k Cocco bacill (-) (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+) N2b Coccus (-) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) N3 Bacil (+) (+) (-) (-) (-) (-) (+) (+) N5 Coccus (-) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+)
Berdasarkan   pada   ciri-ciri   makro   dan   mikromorfologi   serta   uji-uji   biokimiawi,   ke empat   isolat   adalah     N2k.   (Gambar   1),   N2b   (Gambar   2),   N3   (Gambar   3),   dan   N5 (Gambar 4).
Gambar 1. Isolat N2k Gambar 2.  Isolat N2b Figure 1. N2k isolate Figure 2. N2b isolate Gambar 3.  Isolat N3 Gambar 4.  Isolat N5 Figure 3. N3 isolate Figure 4. N5 isolate
Pemanfaatan isolat-isolat  tersebut  sebagai  agensia   penghasil   antihistamin  dalam produksi   pakan   ternak   berkualitas   masih   memerlukan   uji   lanjut   yaitu   uji   patologis. Tahapan uji patologis ini penting untuk mengetahui potensi isolat-isolat bakteri tersebut dalam   menimbulkan   penyakit.   Hanya   bakteri-bakteri   yang   tidak   bersifat   patogen   yang aman digunakan dalam proses produksi pakan.
Tabel   2   menunjukkan   bahwa   isolat   N2k,   N2b,   dan   N5   merupakan   bakteri   Gram negatif, sedangkan N3 sebagai bakteri Gram positif.  Hal ini sesuai pendapat Takahashi et al . (2003)  bahwa bakteri rumen mempunyai sifat Gram negatif  dan positif. Semua isolat bersifat   non-motil.   Hasil   identifikasi   bakteri   pendegradasi   histamin   yang   diperoleh Takahashi et al . (2003) menunjukkan bakteri bersifat Gram   negatif. Dari 37 isolat yang diperoleh   dan   hasil   PCR   menunjukkan   bahwa   bakteri     menghasil histidine- decarboxylating merupakan   bakteri   Gram-negatif   yang   diduga Citrobacter   braakii. Sebagian   besar   bakteri   penghasil   histamin   adalah   bersifat   Gram   negatif   seperti Morganella morganii , Klebsiella spp., dan Enterobacter spp.
Uji lanjut adalah uji kemampuan isolat dalam menghasilkan enzim katalase yang menunjukkan bahwa semua isolat positif menghasilkan katalase. Semua isolat diketahui mampu   menggunakan   asam   sitrat   sebagai   satu-satunya   sumber   C.   Pengujian kemampuan reduksi nitrat menunjukkan bahwa isolat N2b dan N5 mampu, sedangkan N2k   dan   N3   tidak   mampu   mereduksi   nitrat.   Semua   isolat   kecuali   N3   mampu memfermentasi   glukosa   dan   laktosa   yang   ditunjukkan   dengan   pembentukan   asam. Pembentukan gas dalam substrat gula ditunjukkan oleh isolat N2k dan N3, tetapi tidak oleh N2b dan N5.

## Kesimpulan
Penelitian   menghasilkan   4   isolat   yang   menunjukkan   kemampuan   menggunakan histamin.   Hal   ini   diduga   karena   isolat-isolat   tersebut   menghasilkan Histamine   Methyl Transferase . Hasil identifikasi menunjukkan isolat terdiri dari 3 bakteri Gram negatif yaitu N2k ( Acinetobacter sp.), N2b (belum diketahui), N5 (belum diketahui) dan 1 isolat bakteri Gram positif yaitu N3 ( Corynebacterium sp.).

## Ucapan Terima kasih
Artikel   ini   merupakan   sebagian   hasil   penelitian   yang   didanai   oleh   Hibah Fundamental   tahun   I   (2007/2008).   Terima   kasih   kami   sampaikan   kepada   pemerintah Republik Indonesia melalui Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi yang telah membiayai penelitian ini.

## Daftar Pustaka
Ahmed, F., 1991. Scrombroid (histamine) fish poisoning. Committee on evaluation of the safety of fishery products, National Academy Press, Washington.
Barrow, G.H. and Feltham, R.K.A., 1993.  Cowan and steel's manual for identification of medical bacteria. Third edition. Cambridge University Press, Cambridge.
Brinker, C., Kerr, M., and Rayner, C., 2002. Investigation of biogenic amines in fish and fish   product.   Feed   Mix.2   1-17.   Public   health   division.   Victorian   Government Departemen of Human Services. Ed.1. www. Foodsafety.vic.gov.au
Greene,   1998.   Anti-histamine   organics.   Food,   herb,   vitamin   sources. http://www.dietitian.com/allergie.html.
Halasz, A., Barath, A., Simon-Sarkadi, L., and Holzapel, W., 1994.  Biogenic amines and their production by micro-organism in food-Review.   Trends in Food Science and Tecnology, 5:42-49.
Holt, J.G., 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore.
Kim, S.H., An, H., and Price, R.J., 1999.   Histamine formation and bacterial spoilage of albacore harvested off the U.S. Northwest coast.   Journal of Food Science, 64(2): 340-343.
Kerr, M., Lawicki, P., Aguirre, S. and Rayner, C., 2002.   Effect of storage conditions on histamine   formation   in   fresh   and   canned   tuna.   Public   health   division.   Victorian Government Departemen of Human Services. Ed.1. www. Foodsafety.vic.gov.au.
Kose, S.  and   Hall, P.Q.G.,  2003.   Change in the level of histamine during processing and storage of fish meal. Anim Feed Sci.  and Tech., 107: 161-172
Marieb,   E.,   2001.   Human   anatomy   and   physiology.  5th   Ed.   Benjamin   Cumming,  San Francisco.
Niven,   C.C.G.,   Da   Ponte,   D.J.B.,   and   Enes   Dapkevivius,   M.L.N.,   1981.   Storage temperature effect on histamine formation in big eye tuna and skipjack. Jornal of Food Science, 63(4): 644-647.
Pousti, A., Malihi, G., Bakhtiarian, A., and Abdollahi, Z.,  2002.  The comparative effect of four   anthistamines   on   isolated   rat   atria.     Irianian   Journal   of   Pharmacology   and Therapeutics,  1(2): 20-23.
Scoging,  A.C.,   1998.   Scombrotoxic   (histamine)   fish   poisoning   in   the   United   Kingdom. Communicable   Diseases   and   Public   Health,   1(3):   204-205.       BSN.,   2009.   SNI 2354.10:2009: Cara uji kimia - bagian 10 - penentuan kadar histamin pada produk perikanan   dengan   spektroflorometri   dan   kromatografi   cair   kinerja   tinggi   (KCKT) pada produk perikanan ICS.67.050. Badan Standarisasi Nasional, Jakarta.
Takahashi, H., Kimura, B., Yoshikawa, M., and  Fujii, T.,  2003.  Cloning and sequencing of the histidine decarboxylase genes of Gram-negative, Histamine-producing bacteria and their application in detection and identification of these organisms in fish.  Appl Environ Microbiol., 69(5): 2568–2579.
Taylor,  S.L.,   1986.     Histamine   food   poisoning:   toxicology   and   clinical   aspects.   Critical reviews in toxicology, 17(2): 91-128.
Yoshinaga,   D.H. and Frank, H.A., 1982. Histamine-producing  bacteria in decomposing skipjack   tuna   ( Katsuwonas   pelamis ).     Applied   Environmental   Microbiology,   4(2): 447-52.