## ARTIKEL ASLI
Daya  Antiinflamasi  Salep  Basis  Larut  Air  Minyak  Atsiri  Bunga  Cengkeh (Syzygium  aromaticum)  dengan  Variasi  Komposisi  Enhancer  Asam  Oleat dan Propilen glikol
(Anti-inflammatory Activity of Ointment in Water Soluble Base of Volatile Oil of  Syzygium  aromaticum  with  Variation  Composition  of  Oleic  acid  and Propylene glycol as Enhancer)

## Dewi Rahmawati, Nining Sugihartini, Tedjo Yuwono

## Pascasarjana Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta

## ABSTRAK
Latar  Belakang :  Sediaan  antiinflamasi  salep  minyak  atsiri  bunga  cengkeh  basis  larut  air  telah  terbukti  berkhasiat  sebagai antiinflamasi  dengan  kandungan  zat  aktif eugenol .  Penelitian  lebih  lanjut  untuk  meningkatkan  penetrasi eugenol dalam menembus lapisan kulit perlu dilakukan dengan penambahan enhancer . Tujuan: Mengetahui daya antiinflamasi salep basis larut air minyak atsiri bunga cengkeh dengan variasi komposisi campuran asam oleat dan propilen glikol sebagai enhancer . Metode: Salep  dibuat  dengan  menggunakan  metode  peleburan.  Penambahan  komposisi enhancer mengacu  pada  sistem Simplex  Lattice Design untuk  formula  1,  formula  2,  dan  formula  3  berturut-turut  digunakan:  100%  asam  oleat;  50%  asam oleat : 50% propilen glikol;  dan 100% propilen glikol. Salep kemudian dievaluasi aktivitas antiiflamasi  dengan parameter tebal  epidermis,  jumlah  sel  radang,  dan  jumlah  sel  yang  terekspresi cyclooxygenase-2 (COX-2).  Uji  daya  antiinflamasi menggunakan  mencit  jantan  galur  BALB/C  yang  diinduksi  dengan croton  oil . Hasil: Uji  menunjukkan  bahwa  komposisi enhancer asam oleat dan propilen glikol memengaruhi daya antiinflamasi salep basis larut air minyak atsiri bunga cengkeh. Simpulan: Peningkatan komposisi propilen glikol meningkatkan daya antiinflamasi salep.
Kata kunci: minyak atsiri bunga cengkeh, salep basis larut air, antiinflamasi, enhancer.

## ABSTRACT
Background: The  dosage  form  of  ointment  clove  essential  oil  in  water-soluble  base  has  proven  efficacious  as  anti- inflammatory  with  eugenol  as  active  substance.  Further  research  to  increase  the  penetration  of  eugenol  in  penetrating  the skin layer needs to be done with the addition of enhancer. Purpose: To determine the anti-inflammatory activity of ointment base  water  soluble  of  clove  essential  oil  with  composition  variation  of  oleic  acid  and  propylene  glycol  as  enhancers. Methods: The  ointment  was  made  using  fusion  method.  Addition  of  enhancer  composition  refers  to  the  system  Simplex Lattice Design for Formula 1, Formula 2 and Formula 3 successively used: 100% oleic acid; 50% oleic acid: 50% propylene glycol;  and  100%  propylene  glycol.  The  evaluation  of  anti-inflammatory  activity  was  based  on  the  parameters  epidermal thickness, the number of inflammatory cells, and the number of  cells that expressed cyclooxygenase-2 (COX-2). The anti- inflammatory tests used male mice strain BALB/C which was induced by croton oil. Results: The enhancer composition of oleic  acid  and  propylene  glycol  affect  the  activity  of  ointment  clove  essential  oil  in  water-soluble  base. Conclusion: The increasing composition of propylene glycol improved anti-inflammatory activity of ointment.
Key words: essential oil of clove, water-soluble ointment base, anti-inflammatory, enhancer.
Alamat korespondensi: Nining Sugihartini, Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan, kampus III: Jl. Prof. Dr. Soepomo, Janturan,  Umbulharjo,  Yogyakarta  55164.  Telepon:  (0274)  563515,  Fax  (0274)564604;  081291136034,  email: nining.sugihartini@pharm.uad.ac.id.

## PENDAHULUAN
Inflamasi  merupakan  respons  perlindungan normal  saat  terjadi  kerusakan  jaringan  atau  infeksi pada  tubuh.  Inflamasi  juga  berfungsi  untuk  melawan
zat-zat  asing yang masuk ke  dalam  tubuh (mikroorganisme atau zat asing lain). Proses inflamasi juga berperan untuk mengeliminasi sel-sel inang yang telah  rusak  atau  mati.¹  Respons  ini  merupakan  upaya
tubuh  dalam  meminimalkan  kerusakan  jaringan  serta memulai  proses  penyembuhan  pada  jaringan.²  Proses ini melalui serangkaian mekanisme seperti vasodilatasi,  peningkatan  permeabilitas  vaskuler, peningkatan  aliran  darah,  dan  juga  pergerakan leukosit  ke  tempat  inflamasi  untuk  menetralisir kerusakan.³
Salah  satu  bahan  aktif  yang  telah  terbukti berkhasiat  sebagai  antiinflamasi  adalah  minyak  atsiri bunga  cengkeh.  Kandungan eugenol ( 4-allyl-2- methoxyphenol )  dalam  minyak  atsiri  bunga  cengkeh telah  banyak  diteliti  terbukti  memiliki  aktivitas sebagai  antioksidan  dan  antiinflamasi. ⁴ Mekanisme kerja eugenol sebagai  anti  inflamasi  melalui penghambatan  terhadap  sintesis  prostaglandin  dan neutrofil  chemotaxis ,  selain  itu  juga  mampu menghambat faktor nuclear factor -kB (NF-kB) dalam mengaktivasi  faktor tumor necrosis  factor-α (TNF-α) dan menghambat ekspresi cyclooxygenase-2 (COX-2) dalam lipopolisakarida (LPS)  yang  dirangsang makrofag. 2,5,6
Minyak atsiri bunga cengkeh dengan bahan aktif eugenol berperan sebagai antiinflamasi, telah dikembangkan  bentuk  sediaan  yang  dapat  diterima dengan  baik  oleh  masyarakat  luas.  Bentuk  sediaan salep  basis  larut  air  yang  diaplikasikan  pada permukaan kulit yang mengalami inflamasi merupakan  salah  satu  sediaan  yang  dapat  diterima baik karena telah banyak digunakan oleh masyarakat. Disertasi  tahun  2016  oleh  Diah  menunjukkan  bahwa formulasi  minyak atsiri bunga cengkeh basis larut air konsentrasi 5% dapat digunakan sebagai antiinflamasi.  Pengembangan  berikutnya  dilakukan untuk  meningkatkan  kemampuan  penetrasi  agar  sifat antiinflamasi meningkat.
Enhancer atau peningkat penetrasi adalah bahan yang dapat  meningkatkan permeabilitas  kulit ataupun mengurangi  impermeabilitas  kulit. 7 Bahan  peningkat penetrasi  tidak  memiliki  efek  terapi,  tetapi  dapat meningkatkan  daya  transport  obat  ke  dalam  kulit. Alasan  dibutuhkan  penggunaan  bahan  peningkat penetrasi adalah adanya sawar penetrasi, yaitu stratum korneum .
Peneliti ingin melihat aktivitas antiinflamasi dari sediaan  salep  basis  larut  air  minyak  atsiri  dari  bunga cengkeh ( Syzygium aromaticum ) yang telah terstandarisasi dengan penambahan enhancer . Diharapkan penambahan enhancer akan meningkatkan  efek eugenol sebagai  antiinflamasi. Aktivitas antiinflamasi tersebut diuji dengan menghitung daya antiinflamasi berdasarkan parameter ketebalan epidermis, jumlah sel radang, dan COX-2.
METODE
Bahan  yang  digunakan  adalah  minyak  atsiri bunga cengkeh yang didapat dari Pusat Studi Minyak Atsiri/ Center  of  Essential  Oils  Studies (CEOS) Universitas  Islam  Indonesia  Sleman  Yogyakarta, Polietilen  glikol  (PEG)  400  (derajat  farmasetis)  dan PEG  4000  (derajat  farmasetis), crotton  oil (Sigma), mencit  jantan  galur  BALB/c  umur  2-3  bulan  dengan berat  badan  20-30  g,  perontok  rambut  ( Veet )  dan mikroskop (Olympus).
Pembuatan  salep  minyak  atsiri  bunga  cengkeh dalam  basis  larut  air  dilakukan  dengan  cara  sebagai berikut:  konsentrasi  minyak  atsiri  bunga  cengkeh yang digunakan dalam pembuatan salep basis larut air adalah konsentrasi optimum pada penelitian tesis yang dilakukan  oleh  Diah  sebelumnya,  yaitu  sebesar  5%. Selanjutnya  dalam  formula  tersebut  ditambahkan enhancer asam  oleat  dan  propilen  glikol  yang komposisi  optimumnya  telah  ditentukan  berdasarkan metode Simplex Lattice Design seperti yang disajikan pada Tabel 1.
Metode  pembuatan  formula  salep  basis  larut  air minyak  atsiri  bunga  cengkeh  menggunakan  metode peleburan.  Salep  dibuat  dengan  memanaskan  PEG 400 dan PEG 4000 kemudian diaduk sampai terbentuk massa  yang  kental  dan  homogen  lalu  dimasukkan enhancer (asam oleat dan propilen glikol) dan diaduk sampai  homogen.  Minyak  atsiri  ditambahkan  ketika sudah dingin kemudian dicampur hingga homogen.
Evaluasi daya antiinflamasi dilakukan terhadap 4 kelompok  mencit  jantan  galur  BALB/C  (berat  badan 20-30  g,  umur  2-3  bulan).  Pembagian  kelompok mencit  sebagai  berikut:  kelompok  kontrol  positif, pada kelompok ini  mencit  mendapatkan induksi agen inflamasi  (0,1  ml croton  oil konsentrasi 4%) kemudian  diberikan  produk  pembanding  sediaan topikal voltaren®  (produk pasaran)  sebanyak 100  mg yang telah diketahui berkhasiat sebagai antiinflamasi; kelompok  kontrol  negatif,  pada  kelompok  ini  mencit mendapatkan  induksi  agen  inflamasi  saja  tanpa diberikan  agen  antiinflamasi  apapun;  kelompok kontrol  sehat,  pada  kelompok  ini  mencit  tidak mendapatkan induksi agen inflamasi maupun perlakuan terhadap sampel F1, F2, dan F3, kelompok ini juga dikenal sebagai kelompok baseline ; kelompok salep  larut  air  tanpa enhancer ,  pada  kelompok  ini mencit mendapatkan induksi agen inflamasi kemudian diberikan salep larut air  minyak atsiri bunga cengkeh tanpa enhancer asam  oleat  dan  propilen  glikol; kelompok  variasi  e nhancer F1,  F2,  dan  F3,  pada kelompok  ini  mencit  mendapatkan  induksi  agen inflamasi  kemudian  diberikan  salep  minyak  atsiri bunga cengkeh dalam basis larut air.
Prosedur  induksi  inflamasi  adalah  pertama-tama punggung  mencit  dicukur  rambutnya  sampai  bersih.
Setelah 24 jam, punggung  mencit ditetesi dengan 0,1 ml croton oil konsentrasi 4% pada luas area 2x2 cm. Pengolesan salep sebesar 100 mg dilakukan 30 menit setelah  penetesan croton  oil .  Hari  berikutnya  juga diberi  perlakuan  yang  sama.  Perlakuan  tersebut diberikan  selama  3  hari.  Setelah  itu  mencit dikorbankan dan diambil jaringan bagian punggungnya  untuk  dibuat  preparat  pengecatan Hematoxillin Eosin (HE) dan COX-2. Kulit diambil di sekitar  daerah  perlakuan  dengan  ukuran  1x1  cm. Jaringan  kulit  dimasukkan  dalam  wadah  yang  telah berisi  larutan  formalin  10%  hingga  potongan  kulit terendam sempurna yang kemudian dibawa ke bagian Laboratorium  Patologi  Anatomi  Fakultas  Kedokteran Universitas  Gadjah  Mada  untuk  pembuatan  preparat histologi  dan  pengecatan  HE.  Tesis  yang  dilakukan oleh  Utami  S.  menggunakan  pengecatan  dengan antibodi  anti-COX-2  dilakukan  di  Laboratorium Patologi  Anatomi  RS  Dr.  Sardjito  Yogyakarta. Preparat  yang  sudah  dicat  kemudian  diukur  tebal epidermis,  jumlah  sel  radang,    dan  jumlah  ekspresi COX-2.  Tebal  epidermis  dihitung  pada  bagian  sel
epidermis dengan menggunakan program ( ToupView ) yang  dihubungkan  dengan  mikroskop  cahaya  dengan satuan  piksel  yang  kemudian  diubah  menjadi  μm. 8 Jumlah  sel  radang  dilakukan  dengan  menghitung jumlah  sel  neutrofil  yang  bermigrasi,  demikian  juga sel  yang  mengekspresikan  COX-2  pada  daerah subkutan  jaringan  kulit  punggung  mencit  dilihat  di bawah  mikroskop  cahaya  dengan  pembesaran  400x. Tesis  yang  dilakukan  oleh  Utami  S  tentang  ekspresi COX-2  pada  mencit  betina  melakukan  penilaian persentase  ekspresi  COX-2  masing-masing  perlakuan dengan persamaan :
% ekspresi COX-2 = x 100%

## HASIL
Profil  jumlah  sel  dengan  ekspresi  COX-2,  tebal epidermis, dan jumlah sel radang disajikan pada Tabel 2.  Berdasarkan  konsep Simplex  Lattice  Design maka dapat  dihitung  jumlah  sel  dengan  ekspresi  COX-2 pada  komposisi enhancer lainnya  sehingga  terbentuk kurva seperti disajikan pada Gambar 1, 2, 3.
Tabel 1. Formula sediaan salep basis larut air minyak atsiri bunga cengkeh dengan penambahan enhancer asam oleat dan propilen glikol
Bahan Formula 1 Formula 2 Formula 3 Minyak atsiri bunga cengkeh 5 5 5 Asam oleat 10 5 0 Propilen glikol 0 5 10 PEG 4000 42,5 42,5 42,5 PEG 400 42,5 42,5 42,5 Jumlah 100 100 100 Keterangan = Formula 1 : Formula salep larut air dengan komposisi asam oleat 100% Formula 2
: Formula salep larut air dengan komposisi asam oleat 50% dan propilen glikol 50%
Formula 3
: Formula salep larut air dengan komposisi propilen glikol 100%
PEG : Polietilen glikol
Tabel  2. Jumlah  sel  dengan  ekspresi  COX-2,  tebal  epidermis,  jumlah  sel  radang  pada  kelompok  perlakuan kontrol  sehat,  kontrol  positif,  kontrol  negatif,  salep  tanpa  enhancer  dan  salep  dengan  penambahan enhancer asam oleat 100% (F1), asam oleat 50%:propilen glikol 50% (F2),  dan propilen glikol 100% (F3) (N=6 ) Perlakuan Jumlah ekspresi COX-2 (%) Tebal epidermis (µm) Jumlah sel radang Kontrol sehat 18,60  ±  4,95 81,90  ±  26,88 13,17  ±  2,31 Kontrol positif 31,23  ±  2,41 107,70  ±  8,42 59,67  ±  2,50 Kontrol negatif 43,63  ±  3,57 228,00  ±  12,95 70,83  ±  3,66 Salep tanpa enhancer 28,14  ±  3,69 180,80  ±  2,11 58,67  ±  0,52 F1 27,42  ±  4,46 176,3  ±  3,68 57,00  ±  4,89 F2 20,76  ±  2,47 168,40  ±  2,36 43,66  ±  5,88 F3 19,79  ±  4,26 157,10  ±  3,23 13,33  ±  1,86
Keterangan = COX-2  : C yclooxygenase-2
Berkala Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin – Periodical of Dermatology and Venereology
F1 : Formula salep larut air dengan komposisi asam oleat 100%
F2 : Formula salep larut air dengan komposisi asam oleat 50% dan propilen glikol 50%
F3 : Formula salep larut air dengan komposisi propilen glikol 100% PEG : Polietilen glikol
Gambar 1. Grafik profil jumlah sel radang dengan penambahan enhancer .
Gambar 2. Grafik profil tebal epidermis kelompok perlakuan.
Gambar 3 . Grafik profil tebal epidermis kelompok perlakuan.

## PEMBAHASAN
Pada  gambar  1,  2,  dan  3  dapat  diketahui  bahwa semakin  banyak  komposisi  propilen  glikol  maka jumlah  persentase  ekspresi  COX-2,  tebal  epidermis, dan  jumlah  sel  radang  menjadi  menurun.  Hal  ini menunjukkan potensi propilen glikol sebagai enhancer yang  dapat  meningkatkan  kelarutan  obat dalam  stratum  korneum  sehingga  meningkatkan jumlah eugenol yang  penetrasi  melewati  kulit sehingga  jumlah  ekspresi  COX-2,  tebal  epidermis, dan  jumlah  sel  radang  menjadi  berkurang. 9,10
Berdasarkan  penelitian  pascasarjana  yang  dilakukan oleh  Sugihartini  N  tahun  2015,  diketahui  bahwa jumlah  persentase  ekspresi  COX-2,  tebal  epidermis, dan  jumlah  sel  radang  secara  berturut-turut  untuk sediaan  salep tanpa enhancer yaitu  sebesar 28,14±3,69; 180,8±2,11; 58,67±0,52. Hal ini membuktikan  bahwa  penambahan enhancer dapat meningkatkan  penetrasi  eugenol  ke  dalam  kulit sehingga  aktivitas  sebagai  antiinflamasi  meningkat yang ditunjukkan dengan penurunan jumlah persentase  ekspresi  COX-2,  tebal  epidermis,  dan jumlah sel radang.
Hasil  uji  statistik  menunjukkan  bahwa  terdapat perbedaan  signifikan  antara  kontrol  negatif  dan kontrol sehat (p>0,05) pada semua parameter uji. Hal ini membuktikan bahwa pemberian croton oil mampu menginduksi  terjadinya  inflamasi  pada  kulit.  Pada kelompok  perlakuan  yang  diberikan  F1,  F2,  dan  F3 terjadi penurunan jumlah persentase ekspresi  COX-2, tebal  epidermis,  dan  jumlah  sel  radang  yang  berbeda signifikan  dengan  kontrol  negatif  (p<0,05),  oleh karena  itu  dapat  dikatakan  bahwa  F1,  F2,  dan  F3 memiliki  aktivitas  sebagai  antiinflamasi.  Aktivitas tersebut  juga  didukung  oleh  adanya  penambahan enhancer . Hal ini terlihat dari adanya perbedaan yang signifikan  (p<0,05)  antara  kelompok  kontrol  tanpa enhancer dengan kelompok perlakuan yang diberikan F1,  F2,  dan  F3,  namun  demikian  penurunan  jumlah persentase  ekspresi  COX-2,  tebal  epidermis,  dan jumlah  sel  radang  tersebut  belum  bisa  menyebabkan kulit  yang  mengalami  inflamasi  kembali  ke  kondisi sehat  karena  masih  ada  perbedaan  yang  signifikan (p<0,05)  dengan  kontrol  sehat.  Hal  tersebut kemungkinan  karena  pemberian  salep  basis  larut  air minyak atsiri bunga cengkeh yang masih singkat yaitu 3  hari  sehingga  belum  dapat  memberikan  efek  yang maksimal.  Demikian  juga  dengan  kontrol  positif masih  ada  perbedaan  yang  signifikan.  Hal  ini menunjukkan bahwa aktivitas formula yang ada masih belum  sama  dengan  aktivitas  antiinflamasi  sediaan obat yang  sudah ada di pasaran. Komposisi enhancer ternyata juga berpengaruh terhadap jumlah persentase
ekspresi  COX-2.  Hal  ini  ditunjukkan  oleh  adanya perbedaan yang signifikan antara F1, F2, dengan F3.
Secara  umum  dapat  terlihat  bahwa  komposisi enhancer asam oleat dan propilen glikol memengaruhi daya  antiinflamasi  salep  basis  larut  air minyak  atsiri bunga cengkeh. Formula 3 dengan perbandingan asam oleat  0%:  propilen  glikol  100%  memiliki  jumlah ekspresi  COX-2,  jumlah  sel  radang,  dan  tebal epidermis yang paling kecil.

## KEPUSTAKAAN
1. Stevenson DE, Hurst RD, Polyphenolic phytochemicals-just antioxidants or much more? a review. Cell Mol Life Sci 2007; 64: 2900-16.
2. Rathee  P,  Chaudhary  H,  Rathee  S,  Rathee  D, Kumar  V,  Kohli  K.  Mechanism  of  action  of flavonoids  as  anti-inflammatory  agents:  a review.  Inflammation  &  Allergy  -  Drug  Targets 2009; 8: 229-35.
3. Lima  M.,  Montenegro  A,  Almeida  CLF,  F1lho A,  Batista  LM.  Database  survey  of  anti- inflammatory plants in south America: a review. Journal  of  Molecular  Sciences 2011;  12:  2692- 749.
4. Chainy  GBN,  Manna  SK.,  Chaturvedi  MM, Aggarwal  BB.  Anethole  blocks  both  early  and late  cellular  responses  transduced  by  tumor necrosis factor: effect on NFkappaB, AP-1, JNK, MAPKK  and  apoptosis.  Oncogene  2000;  19: 2943–950.
5. Ma  Q,  Kineer  K.  Chemoprotection  by  phenolic antioxidants,  inhibition  of  tumor  necrosis  factor alpha induction in macrophages. Journal Biology Chemical 2002; 277: 2477-484.
6. Murakami  Y,  Shoji  M,  Hanazawa  S,  Tanaka  S, Fujisawa  S.  Preventive  effect  of  bis-eugenol,  a eugenol  ortho  dimer,  on  lipopolysaccharide- stimulated  nuclear  factor  kappaB  activation  and inflammatory cytokine expression in macrophages.  Biochemical  Pharmacology  2003; 66:1061–66.
7. Kumar P, Priyanka. Cellular permeation pathways: current focus of permeation enhancers for effective drug delivery. BAOJ Pharmaceutical Sciences 2015; 1(1): 1-13.
8. Sari  MF,  Yuliani  SH.  Pembuatan  dan  Uji Aktivitas  Sediaan  Unguenta Scarless  Wound dengan Ekstrak Binahong dan Zat Aktif Aspirin, Jurnal  Farmasi  Sains  dan  Komunitas  2015; 12(2): 81-7.
9. Muhammed  D,  Hirata  K,  Hadgraft  J,  Lane  M. Influence  of  skin  penetration  enhancers  on  skin barier  function  and  skin  protease  activity.  Eur  J Pharm Sci 2014; 51: 118-22.
10. Duracher  L,  Blasco  L,  Hubaud  JC,  Vian  L,
Marti-Mestres  G.  The  Influence  of  alcohol, propylene  glycol  and  1,2-pentanediol  on  the permeability  of  hydrophilic  model  drug  through excised  pig  skin.  International  Journal  of Pharmaceutics
2009; 374: 39-45.