UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI KLOROFORM EKSTRAK ETANOL PEGAGAN ( Centella asiatica (L) Urb) SERTA IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIFNYA
1 Fahrina Rachmawati, 1 Maulita Cut Nuria, 2 Sumantri
1 Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang
2 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

## ABSTRAK
Penyakit  infeksi  merupakan  penyakit  yang  banyak  diderita  oleh  masyarakat  dan terus  berkembang  dari  waktu  ke  waktu  dalam  dunia  kesehatan.  Ekstrak  etanol  pegagan ( Centella  asiatica (L)  Urb)  memiliki  aktivitas  antimikroba  yang  lebih  baik  daripada ekstrak  petroleum  eter  dan  air  (Jagtap et  al .,  2009).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  ada  atau  tidaknya  aktivitas  antibakteri  fraksi  kloroform  dari  ekstrak  etanol pegagan  terhadap  bakteri  Gram  positif  ( S.  aureus dan B.  subtilis) dan  Gram  negatif  ( E. coli , P.  aeruginosa dan S.  typhi ),  mengetahui  besarnya  aktivitas  antibakteri  dari  fraksi kloroform tersebut dan mengidentifikasi golongan senyawa yang terkandung dalam fraksi tersebut.
Ekstrak  etanol  pegagan  diperoleh  dengan  menyari  simplisia menggunakan penyari  etanol  96%  secara  sokletasi,  lalu  diuapkan  dengan rotary  evaporator. Ekstrak tersebut kemudian difraksinasi bertingkat dengan pelarut n -heksan dan kloroform. Fraksi kloroform  yang  diperoleh  diuapkan  hingga  kekentalan  sekitar          300  cps  kemudian dilarutkan dalam DMSO, konsentrasi yang digunakan adalah 2063; 1031,5; 515,7; 257,8; 128,9  µg/ disk. Aktivitas  antibakteri  dilakukan  secara  difusi  agar,  identifikasi  senyawa aktif menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
Fraksi  kloroform  memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap B.  Subtilis dan P.aeruginosa , tetapi tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. aureus , E. coli dan S. typhi .  Fraksi  kloroform  tersebut  dapat  menghambat B.  subtilis pada  konsentrasi  257,8; 515,7;  1031,5;  2063  µg/ disk dengan  DDH  berturut-turut  sebesar  7,50;  7,86;  8,63;  9,76 mm, sedangkan P.aeruginosa pada konsentrasi 515,7; 1031,5; 2063 µg/ disk dengan DDH berturut-turut  sebesar        8,10;  9,10;  10,20  mm.  Fraksi  kloroform  tersebut  mengandung senyawa fenol dan terpenoid.
Kata kunci :   Fraksi  kloroform  ekstrak  etanol  pegagan,  aktivitas  antibakteri,  senyawa fenol dan terpenoid.

## PENDAHULUAN
Di  negara  berkembang  hampir  15  juta  orang  meninggal  setiap  tahunnya diakibatkan oleh penyakit infeksi. Beberapa penyakit infeksi yang masuk dalam daftar 10 penyakit terbanyak yang diderita masyarakat Indonesia diantaranya adalah diare, infeksi saluran  pernapasan  akut  dan  pneumonia  (Anonim,  2007  ;  Anonim,  2008).  Penyebab penyakit infeksi tersebut diantaranya adalah bakteri E. coli, P. aeruginosa atau B. subtilis . Pegagan  ( Centella  asiatica (L.)  Urb)  memiliki  berbagai  khasiat  diantaranya membersihkan darah, mengatasi demam, antibakteri, antiinflamasi, antialergi, insektisida, dan stimulant. Pegagan mempunyai kandungan kimia aktif seperti saponin, asiatikosida, madekasossida, asam brahmik, asam madasiatik, messoinositol, centellosida, karotenoida, hidrokotilin,  vellarine  (campuran  damar  dan  minyak  atsiri),  tannin,  serta  garam  mineral (Lasmadiwati, 2003).
Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Jagtap et  al .,  (2009)  mengenai  aktivitas antimikroba pada ekstrak petroleum eter, etanol dan air dari tanaman pegagan dilakukan dengan metode difusi agar. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol pegagan merupakan ekstrak yang paling aktif dibandingkan ekstrak petroleum eter dan ekstrak air.
Penelitian  ini  merupakan  lanjutan  dari  penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh Jagtap et  al .,  (2009)  dengan  cara  memfraksinasi  ekstrak  etanol  pegagan  secara  partisi cair-cair. Fraksinasi dilakukan bertingkat menggunakan pelarut    non polar yakni heksan dan  kloroform.  Fraksi  kloroform  hasil  fraksinasi  inilah  yang  digunakan  pada  penelitian ini. Uji kualitatif dengan menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis dilakukan untuk mengetahui  kandungan  senyawa  aktif  dalam  fraksi  uji  yang  berpotensi  sebagai antibakteri.

## METODOLOGI

## Bahan Penelitian
1.Bahan penelitian : herba pegagan ( Centella asiatica (L) Urb)  berumur  ± 6 bulan  yang diperoleh dari desa Sumur Jurang, kecamatan Gunung Pati kabupaten Semarang dan dipanen pada bulan Juni 2010.
2.Bahan penyari : etanol 96% (berderajat p.a)
3.Bahan  untuk  fraksinasi  dengan  metode  partisi  cair-cair  : n -heksan,  kloroform,  dan campuran aquadest-etanol. 4.Bahan untuk uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar : a) Bakteri
: Pseudomonas  aeruginosa,  Bacillus  subtilis , Escherichia  coli, Salmonella typhi, dan Staphylococcus aureus b) Media : Nutrient broth (NB) (Merck), nutrient agar (NA) (Merck)
c) Kontrol positif  :  Antibiotik Ciprofloksasin 10 µg/ disk (Oxoid)
d) Kontrol negatif :  Dimetil sulfoksida (DMSO) (Merck)
5.Bahan untuk uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) :
a)Fase diam untuk  identifikasi  senyawa  fenol  dan  terpenoid  adalah  silika  gel  F 254 (Merck), sedangkan untuk flavonoid adalah   selulosa (Merck).
b) Fase  gerak  untuk  identifikasi  senyawa  fenol  adalah  metanol  :  asam  formiat (95:5),  identifikasi  senyawa  terpenoid  adalah  toluen  :  etil  asetat  (93:7), sedangkan  untuk  identifikasi  senyawa    flavonoid    adalah    etil  asetat-asam formiat-asam asetat-air (100:11:11:27).  Reagen yang digunakan berderajat pro analisis.
c) Penampak  bercak  untuk  senyawa  fenol  adalah  ferri  klorida,  untuk  senyawa terpenoid  adalah  vanilin  –  asam  sulfat,  sedangkan  senyawa  flavonoid  adalah uap amoniak (Wagner, 1984).

## Alat Penelitian
Alat yang digunakan adalah moisture balance, blender (Maspion), perangkat alat sokletasi,  alat-alat  gelas  (Iwaki  Pyrex),  oven  (Memmert),  timbangan  analitik  (Ohauss AR2140),  inkubator  (Binder),  micropipette  (Socorex),  waterbath  (Memmert),  autoklaf (All  American), Laminar  Air  Flow (LAF)  (Model  :  LAF  105/1  18),  rotary  evaporator (Eyela  Rotary  Vacuum  Evaporator  n-n  series  sb-651),  bejana  kromatografi,  lampu  UV 254, 366 nm.

## Jalannya Penelitian
1.Pembuatan Ekstrak Etanol Pegagan
Pembuatan ekstrak pada penelitian ini dilakukan dengan menyari serbuk pegagan menggunakan  metode  sokletasi.  Proses  sokletasi    dilakukan    sebagai  berikut  :  serbuk pegagan    sebanyak    400  gram  dibagi  menjadi    4  bagian  yang  sama  banyak,  sehingga proses  sokletasi  dilakukan  sebanyak  4  kali.  Serbuk  pegagan  diekstraksi  dengan  penyari etanol 96% menggunakan alat soxhlet pada suhu 60-80 o C kemudian ditunggu hingga zat aktif dalam simplisia tersari seluruhnya yang ditandai dengan jernihnya cairan yang lewat pada  tabung  sifron.  Sari  atau  menstrum  pegagan  yang  diperoleh  dari  4  kali  sokletasi selanjutnya diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 60 o C sampai diperoleh ekstrak kental (Harborne, 1996). Ekstrak etanol pegagan yang diperoleh kemudian dikumpulkan dan diukur bobotnya untuk menghitung rendemen yang dihasilkan.

## 2.Pembuatan Fraksi Kloroform dari Ekstrak Etanol Pegagan
Ekstrak  kental  sebanyak  50  gram  dilarutkan  ke  dalam  50  ml  air  hingga  seluruh ekstrak  larut  sempurna,  karena  ada  bagian  yang  tidak  larut  maka  ditambahkan  10  ml campuran  air  dan  etanol  (9:1).  Selanjutnya  difraksinasi  menggunakan  corong  pisah dengan  pelarut n -heksan  terlebih  dahulu  kemudian  kloroform  yang  bersifat  semi  polar. Proses  ini  dilakukan  hingga  pelarut  kloroform  jernih.  Jumlah  pelarut  yang  digunakan untuk fraksinasi sebanding dengan jumlah air yang ditambahkan ke dalam ekstrak etanol (perbandingan  1:1).  Fase  kloroform  yang  diperoleh  kemudian  ditampung  dan  diuapkan menggunakan rotary  evaporator .  Fraksi  kloroform  yang  diperoleh  diukur  beratnya  dan diuji aktivitas antibakterinya.

## 3.Pembuatan Larutan Uji
Larutan  uji  dibuat  dari  fraksi  kloroform  ekstrak  etanol  pegagan.  Fraksi  tersebut dibuat  lima  seri  konsentrasi  yaitu  206,3  ;  103,15  ;  51,57  ;  25,78  dan  12,89  mg/ml, kemudian  dilarutkan  dengan  pelarut  dimetilsulfoksida  (DMSO).  Larutan  uji  tersebut kemudian dikonversi dosisnya dalam satuan µg/ disk (2063; 1031,5; 515,7 ; 257,8 ; 128,8 µg/ disk ).

## 4.Uji Aktivitas Antibakteri
Aktivitas antibakteri diuji dengan metode difusi agar. Larutan uji sebanyak 10 µl diteteskan  diatas paperdisk (diameter  =  6  mm)  kemudian  dibiarkan  hingga  mengering. Suspensi  bakteri  sebanyak  200  µl  dicampur  dengan  20  ml  media  nutrient  agar  (dalam keadaan  hangat), digojog  supaya  homogen  kemudian  dituang  ke  dalam  cawan  petri. Ditunggu beberapa saat hingga media membeku. Paperdisk yang mengandung larutan uji kemudian  diletakkan  di  atas  permukaan  media  agar,  dan  diinkubasi  pada  suhu  37 o C selama 18-24 jam. Kontrol positif menggunakan antibiotik ciprofloxacin 10 µg/ disk dan kontrol negatif digunakan paperdisk yang telah ditetesi pelarut DMSO.
5.Identifikasi  Golongan  Senyawa  Aktif  dengan  Metode  Kromatografi  Lapis  Tipis (KLT)
Bejana pengembang sebelumnya telah dijenuhi dulu dengan fase gerak yang akan digunakan. Larutan uji ditotolkan pada lempeng silika gel F 254 kemudian ditunggu hingga totolan kering. Setelah itu dielusi dalam bejana pengembang. Lempeng silika dikeringkan kemudian diamati bercaknya pada sinar UV 254 nm dan UV 365 nm. Deteksi dilakukan dengan penampak  bercak  ferri  klorida  untuk  senyawa  fenolik,  diuapi  amoniak  untuk  deteksi flavonoid, serta penampak bercak vanilin asam sulfat untuk senyawa terpenoid.

## 6.Analisis Data
Pembacaan  hasil  dari  uji  aktivitas  antibakteri  dengan  metode  difusi  agar  adalah dengan mengamati terbentuknya zona jernih di sekitar paperdisk yang menunjukkan ada atau tidaknya pertumbuhan bakteri. Hasil identifikasi golongan senyawa aktif dari fraksi ekloroform  ekstrak  etanol  pegagan  dilakukan  dengan  melihat  kromatogram  berdasarkan warna  yang  terbentuk  pada  bercak  dan  kesesuaian  bercak  senyawa  uji  dengan  bercak senyawa  standar.  Setelah  itu  dilakukan  penghitungan  nilai  faktor  retardasi  ( Rf )  pada masing-masing bercak.

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

## Ekstraksi dan Fraksinasi Pegagan
Ekstrak  kental  yang  dihasilkan  dari  proses  evaporasi  adalah  115  gram,  dengan warna hijau tua dan bau khas, sehingga rendemen hasil yang diperoleh adalah 12,706 % b / b . Fraksi kloroform yang diperoleh setelah proses penguapan adalah 825,2 mg.

## Uji Aktivitas Antibakteri
Pengujian  aktivitas  aktibakteri  dilakukan  dengan  berbagai  tingkat  konsentrasi yang  bertujuan  untuk  mengetahui  apakah  kenaikan  konsentrasi  akan  meningkatkan aktivitas antibakterinya. Kontrol  positif  yang digunakan adalah antibiotik Ciprofloxacin, kontrol  negatifnya  adalah  DMSO  (dimetilsulfoksida).  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  kontrol  negatif  tidak  memberikan  zona  hambatan.  Hal  tersebut  membuktikan bahwa pelarut tidak berpengaruh terhadap aktivitas antibakteri, sehingga aktivitas hanya berasal dari larutan uji, bukan dari pelarut yang dipakai.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  larutan  uji  memiliki  aktivitas  antibakteri terhadap Pseudomonas  aeruginosa dan Bacillus  subtilis yang  ditandai  dengan  adanya daerah  hambatan  di  sekitar paper  disk. Pada  kadar  257,8  µg/ disk larutan  uji  hanya  bisa menghambat bakteri B. subtilis. Bila konsentrasi dinaikkan menjadi 515,7 µg/ disk maka larutan  uji  bisa  menghambat B.  subtilis dan P.  aeruginosa .  Bila  konsentrasi  terus dinaikkan sampai 2063 µg/ disk , maka larutan uji hanya bisa menghambat  kedua bakteri tersebut dengan nilai DDH yang tidak terlalu jauh berbeda (Tabel I).
Tabel  I.    Hasil  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Fraksi  Kloroform  dari  Ekstrak  Etanol  Pegagan Terhadap  Bakteri  Uji  dengan  Diameter Paperdisk 6  mm.  Nilai  DDH  merupakan nilai rata-rata dari 3 kali pengukuran.
Konsentrasi Larutan Uji (µg/ disk ) Diameter Daerah Hambat (mm) P. aeruginosa B. subtilis 128,9 - - 257,8 - 7,50 515,7 8,10 7,86 1031,5 9,10 8,63 2063 10,20 9,76 Ciprofloksasin 10 µg/ disk 27,50 26,75 DMSO - -
Larutan uji pada kadar 257,8 µg/ disk menghasilkan DDH sebesar  7,50 mm pada B. subtilis , sedangkan antibiotik ciprofloksasin pada kadar 10 µg/ disk menghasilkan DDH sebesar  26,75  mm.  Hal  ini  berarti  b/ahwa  aktivitas  antibakteri  larutan  uji  lebih  lemah dibandingkan  kontrol  positifnya,  sehingga  harus  dilakukan  upaya  untuk  meningkatkan
aktivitasnya,  salah  satunya  dengan  jalan  isolasi  senyawa  aktif  dari  larutan  uji.  Isolasi senyawa aktif akan menghasilkan senyawa yang lebih spesifik sehingga aktivitasnya akan lebih spesifik karena   tidak ada lagi senyawa-senyawa pengotor yang bisa mengganggu aktivitas antibakteri larutan uji.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  larutan  uji  lebih  mudah  menghambat bakteri  Gram  positif  dibandingkan  bakteri  Gram  negatif,  artinya  bakteri  Gram  positif lebih  rentan  terhadap  senyawa-senyawa  kimia  dibandingkan  Gram  negatif.  Hal  ini kemungkinan disebabkan oleh perbedaan komposisi dan struktur dinding sel pada bakteri Gram positif dan Gram negatif. Struktur dinding sel bakteri Gram positif lebih sederhana, yaitu  berlapis  tunggal  dengan  kandungan  lipid  yang  rendah  (1-4%)  sehingga memudahkan  bahan  bioaktif  masuk  ke  dalam  sel.  Struktur  dinding  sel  bakteri  Gram negatif  lebih  kompleks,  yaitu  berlapis  tiga  terdiri  dari  lapisan  luar  lipoprotein,  lapisan tengah  lipopolisakarida  yang  berperan  sebagai  penghalang  masuknya  bahan  bioaktif antibakteri,  dan  lapisan  dalam  berupa  peptidoglikan  dengan  kandungan  lipid tinggi  (11- 12%)(Jawetz et al ., 2005).
Hasil  uji  aktivitas  antibakteri  terhadap  Gram  negatif  hanya P.  aeruginosa yang bisa  dihambat  sedangkan  bakteri E.  coli dan S.  typhi tidak  bisa  dihambat.    Hal  ini kemungkinan disebabkan karena E. coli dan S. typhi mempunya struktur antigenik yang kompleks  dibandingkan P.  aeruginosa .  Struktur  antigenik  kompleks  tersebut  meliputi antigen  O  yang  berperan  alam  resistensi  terhadap  aktivitas  bakterisidal,  antigen  K (kapsular)    dan  antigen  H  (flagellar)  berfungsi  untuk  meningkatkan  daya  invasif  dari bakteri patogen. Pada S. typhi , antigen kapsular disebut antigen Vi. Antigen O merupakan bagian  terluar  dinding  sel  lipopolisakarida  dan  terdiri  dari  unit  berulang    polisakarida. Bakteri P.  aeruginosa hanya  mempunyai  polisakarida,  tetapi  tidak  mempunyai lipopolisakarida yang tersusun dari unit pengulangan polisakarida. Hal ini menyebabkan P.  aeruginosa tidak  mempunyai  struktur  antigen  yang  kompleks.  Antigen  O  memiliki sifat  tahan  terhadap  panas  dan  alkohol,  sehingga  hal  ini  memungkinkan E.  coli dan S. typhi lebih  tahan terhadap senyawa-senyawa  yang  terkandung  dalam  larutan  uji (Jawetz et al ., 2005).

## Identifikasi Golongan Senyawa Aktif dengan metode KLT
Berdasarkan  penelusuran  literatur,  kemungkinan  senyawa  yang  bisa  tertarik dalam  fraksi  kloroform  ekstrak  etanol  pegagan  adalah  senyawa  fenol,  flavonoid  dan terpenoid. Oleh karena itu dilakukan identifikasi terhadap ketiga senyawa tersebut secara kualitatif  menggunakan  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT).  Kromatogram  identifikasi golongan  senyawa  fenol  menunjukkan  bercak  berwarna  abu-abu  pada  daerah  visibel. Berdasarkan  reaksi  warna  pada  kromatogram  dapat  diketahui  bahwa  fraksi  kloroform ekstrak  etanol  pegagan  mengandung  senyawa  fenol.  FeCl 3 bisa  digunakan  untuk mendeteksi  adanya  senyawa  fenol.  Bila  senyawa  fenol  direaksikan  dengan  FeCl 3 akan menjadi berwarna abu-abu atau hitam (Harborne, 1996).
Kromatogram  identifikasi  flavonoid  tidak  menunjukkan  warna  kuning  setelah diuapi amoniak pada daerah visibel namun pembanding rutin memberikan warna kuning. Hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa  fraksi  kloroform  ekstrak  etanol  pegagan  tidak mengandung  senyawa  flavonoid.  Kromatogram  identifikasi  terpenoid  menunjukkan bercak berwarna ungu pada daerah visibel. Berdasarkan reaksi warna pada kromatogram di  bawah  dapat  diketahui  bahwa  fraksi  kloroform  ekstrak  etanol  pegagan  mengandung senyawa  terpenoid.  Warna  violet  yang  terdeteksi  pada  kromatogram  setelah  direaksikan dengan  penampak  bercak  vanilin  asam  sulfat  diakibatkan  oleh  reaksi  Liebermann- Burchard, yaitu salah satu reaksi warna yang paling umum pada senyawa terpenoid tinggi dan steroid. Pereaksi ini merupakan campuran antara asam asetat anhidrat dan asam sulfat
pekat.  Menurut  Wagner  (1984)  senyawa  terpenoid  dapat  dideteksi  dengan  pereaksi vanilin  asam  sulfat  dengan  mekanisme  abstraksi  H + sehingga  terbentuk  senyawa  yang memiliki ikatan rangkap terkonjugasi. Ikatan rangkap dua pada struktur kimia terpenoid memiliki  spektrum  serapan  pada  sinar  ultraviolet  dan  sinar  visibel,  sehingga  deteksi  di daerah cahaya tampak terlihat berwarna violet (Wagner, 1984).
Hasil uji kualitatif dengan metode KLT menunjukkan bahwa golongan senyawa aktif  dalam  fraksi  kloroform  adalah  senyawa  fenol  dan  terpenoid,  sehingga  aktivitas antibakterinya  diduga  diakibatkan  oleh  kandungan  senyawa  tersebut.  Mekanisme senyawa  fenol  sebagai  antibakteri  pada  konsentrasi  rendah  adalah  dengan  merusak membran  sitoplasma  dan  dapat  menyebabkan  kebocoran  inti  sel,  sedangkan  pada konsentrasi  tinggi  senyawa  fenol  berkoagulasi  dengan  protein  seluler.  Aktivitas  tersebut sangat  efektif  ketika  bakteri  dalam  tahap  pembelahan  dimana  lapisan  fosfolipid  di sekeliling sel sedang dalam kondisi yang sangat tipis sehingga fenol dapat dengan mudah merusak isi sel (Volk and Wheller, 1984).
Mekanisme  terpenoid  sebagai  antibakteri  adalah  bereaksi  dengan  porin  (protein transmembran) pada membran luar dinding sel bakteri, membentuk ikatan polimer yang kuat  sehingga  mengakibatkan  rusaknya  porin.  Rusaknya  porin  yang  merupakan  pintu keluar masuknya senyawa akan mengurangi permeabilitas dinding sel bakteri yang akan mengakibatkan  sel  bakteri  akan  kekurangan  nutrisi,  sehingga  pertumbuhan  bakteri terhambat atau mati (Cowan, 1999).

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian,  maka  dapat  disimpulkan  beberapa  hal  sebagai berikut:
1. Fraksi kloroform ekstrak  etanol pegagan  mempunyai aktivitas antibakteri terhadap B. subtilis dan P.  aeruginosa ,  tetapi  tidak  memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap S. aureus , E. coli dan S. typhi .
2. Fraksi kloroform tersebut dapat menghambat B. subtilis pada konsentrasi 257,8; 515,7;
1031,5; 2063 µg/ disk dengan DDH berturut-turut sebesar 7,50; 7,86; 8,63; 9,76 mm, sedangkan P.aeruginosa pada konsentrasi  515,7; 1031,5;   2063 µg/ disk dengan DDH berturut-turut sebesar 8,10; 9,10; 10,20 mm.
3.  Hasil  KLT  dari  fraksi  kloroform  tersebut  mengandung  senyawa  golongan  fenol  dan terpenoid.

## Saran
1. Perlu  dilakukan  penelitian  tentang  isolasi  senyawa  penuntun  ( lead  compound )  dari fraksi kloroform ekstrak etanol pegagan yang berkhasiat sebagai antibakteri.
2. Perlu  dilakukan  penelitian  lanjutan  dengan  menggunakan  bakteri  Gram  positif  dan Gram negatif lainnya.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim,  2007, Indonesia  Health  Profile  2005 ,  hal.  22,  Departemen  Kesehatan  Republik Indonesia, Jakarta.
Anonim,  2008, Infection , http://www.globalhealth.org/infectious_diseses/  mortality_morbidity/ , diakses tanggal 4 Agustus 2011.
Cowan, M., 1999, Plant Product as  Antimicrobial Agent, Clinical Microbiology Reviews , 12 ( 4) , hal. 564-582.
Harborne,  J.B.,  1996, Metode  Fitokimia ,  diterjemahkan  oleh  Kokasih  Padmawinata  dan  Iwang Soediro, Cetakan ke-2, hal. 47, 69-72, 155, Institut Teknologi Bandung Press, Bandung. Jagtap, N.S., Khadabadi, S.S., and Ghorpade, D.S., 2009, Antimicrobial and Antifungal Activity of Centella  asiatica (L)  Urb,  Umbeliferae ,  Research J.  Pharm  and  Tech, 2(2), hal. 328  – 330.
Jawetz,  E.,  Melnick,  J.L.,  and  Adelberg,  E.,  2005, Mikrobiologi  Kedokteran ,  Penerjemah  dan editor Bagian Mikrobiologi Kedokteran Universitas Airlangga, hal 20, 21, 29, 30, 33, 34, 36,  79,  82,  224,  233-235,  317,  318,  351,  352,  371,  372,  Penerbit  Salemba  Medika, Jakarta.
Lasmadiwati,  E.,  2003, Pegagan  Meningkatkan  Daya  Ingat,  Membuat  Awet  Muda,  Menurunkan Gejala Stres, Meningkatkan Stamina, hal. 18-20, Penebar Swadaya, Jakarta. Volk  and  Wheller,  1984, Mikrobiologi  Dasar ,  diterjemahkan  oleh  Soenartono  Adisoemarto,  hal. 137-138, Erlangga, Jakarta.
Wagner, H., 1984, Plant Drug Analysis a Thin Layer Chromatography Atlas , hal. 164, Springer- Verlag.