## ARTIKEL PENELITIAN
Verifikasi Metode ELISA ( Enzym Linked Immunosorbent Assay )
Untuk Penentuan Kadar AMH ( Anti Mullerian Hormone )
Verification of The ELISA Method (Enzym Linked Immunosorbent Assay) for Determination of AMH Levels ( Anti Mullerian Hormone )
3) e-mail: sudjarwo@ff.unair.ac.id

## ABSTRAK
Validasi adalah proses mengkonfirmasi bahwa metode yang digunakan memiliki kemampuan yang konsisten dengan apa yang diperlukan ketika sedang digunakan secara terus menerus. ELISA kit AMH sudah melakukan proses validasi metode sebelum dipasarkan dan digunakan dilabolatorium untuk  menetukan  kadar  AMH.  AMH  adalah  biomarker  spesifik  yang  digunakan  untuk mendiagnosis pasien PCOS. Labolatorium dapat mengadopsi prosedur yang telah divalidasi tetapi laboratorium  masih  perlu  mengkonfirmasi  kemampuannya  untuk  menerapkan  metode  ini. Verifikasi adalah penyediaan bukti objektif bahwa parameter  terukur memenuhi persyaratan yang ditentukan.  Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa baik verifikasi ELISA kit AMH  dan  membandingkan  perhitungan  4  PL  dengan  regresi  linear.  Berdasarkan  uji  statistic diperoleh  p=0.871  (p>0.05).  Dapat  dikatakan  bahwa  tidakada  perbedaan  yang  bermakna  antara Optical  Density harike  1  danke  7  pada  (p=0.05).  Persamaan  regresi  linear  (r)  0.9543  (p=0.000; p<0.05)  sedangkan  pada  persamaan  4  PL  (r)  1.000.Metode  ELISA  kit  AMH  telah  memenuhi persyaratan verifikasi. Kurva kalibrasi model 4PL lebih sesuai digunakan pada ELISA kit AMH dari pada model regresi linear
KataKunci: Verifikasi ELISA AMH 4 Parameter Logistik
Irvan Ipandi 1 , Ashon Sa’adi 2 , Sudjarwo 3*
1) Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya, JawaTimur, Indonesia 2) Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Surabaya, JawaTimur, Indonesia Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya, JawaTimur, Indonesia

## ABSTRACT
Validation  is  the  process  of  confirming  that  the  method  used  has  capabilities  that  are  consistent with what is needed while being used continuously. The AMH  ELISA kit has carried out a method validation process before marketed and used in a laboratory to determine AMH levels. AMH is a specific  biomarker  used  to  diagnose  PCOS  patients.  The  laboratory  can  adopt  a  validated procedure but the laboratory still needs to confirm its ability to apply this method. Verification is the provision  of  objective  evidence  that  the  measured  parameters  meet  the  specified  requirements. The purpose of this study was to find out how well verification of the ELISA AMH kit and comparing the calculation of 4 PL with linear regression. Based on the statistical test obtained p = 0.871 (p> 0.05). It can be said that there was no significant difference between Optical Density days 1 and 7(p = 0.05). Linear regression equation (r) 0.9543 (p = 0.000; p <0.05) while in equation 4 PL (r) 1,000. The ELISA kit AMH method meets the verification requirements. The 4PL model calibration curve is more suitable to be used in the AMH ELISA kit than the linear regression model.

## Keywords : verification ELISA AMH 4 Logistic Parameter

## PENDAHULUAN
Validasi  metode  pada  dasarnya adalah proses  mendefinisikan  persyaratan  analitis, dan  mengkonfirmasikan    bahwa  metode digunakan memiliki kemampuan yang konsisten  dengan  apa  yang  diperlukan  ketika sedang  digunakan  secara  terus  menerus. Tujuan  dari  validasi  metode  adalah  untuk menunjukan  bahwa  metode  sesuai  untuk tujuan  [1].    Parameter  validasi  menurut    FDA, USP  dan  ICH  meliputi  spesifisitas,  linearitas, presisi  ( repetability dan ruggedness )  akurasi, solution stability, limit of detection (LOD), Limit of  Quantification (LOQ)  dan  Robutness  [2].
Validasi  metode  perlu  dilakukan  karena hanya metode  analisa  yang  telah  dibuktikan  validitas nya  yang  dapat  dipertanggung  jawabkan  dan dipergunakan  sebagai  landasan,  sehingga kesimpulan  hasil  yang  diperoleh  benar-benar dapat dipercaya.
Labolatorium dapat mengadopsi prosedur  yang  telah  divalidasi  oleh  pabrikan, tetapi laboratorium
masih perlu mengkonfirmasi kemampuannya untuk menerapkan metodeini. Verifikasi adalah penyediaan  bukti  objektif  bahwa  parameter terukur memenuhi persyaratan yang ditentukan, di mana persyaratan yang ditentukan  memadai  untuk  penggunaan  yang dimaksudkan [1].
Metode ELISA ( Enzyme linked Immunosorbent  Assay )  merupakan  analisis kuantitatif  yang  menunjukkan  reaksi  antigen- antibodi  melalui  perubahan  warna  yang diperoleh  dengan  menggunakan  konjugat terkait  enzim  dan  substrat  enzim.  Metode ELISA digunakan dalam mengidentifikasi keberadaan  dan  konsentrasi  molekul  dalam cairan biologis [3]. Dalam mengidetifikasi suatu molekul  tertentu,  ELISA  kit  yang  digunakan harus  spesifik  terhadap  antigen    tersebut.
Dalam  hal  ini  antigen  spesifik  yang  ingind iindetifikasi  adalah  AMH  ( Anti  Mullerian Hormone ).  AMH  adalah  biomarker  spesifik yang  digunakan  untuk  mendiagnosis  pasien PCOS ( Polycystic Ovary Syndrome ) [4].
Pabrik  yang  memproduksi  ELISA  kit AMH sudah melakukan proses validasi metode sebelum dipasarkan dan digunakan dilabolatorium  untuk  menetukan  kadar  AMH. Ruang  lingkup  verifikasi  tergantung  pada  sifat perubahan dan hasil penilaian risiko [5]. Dalam hal  ini  paremeter  validasi  yang  digunakan untuk  memverifikasi  ELISA  kit  AMH  adalah linearitas.
Lineritas  merupakan  parameter  yang digunakan  untuk  menentukan  kemampuan metode  untuk  memperoleh  hasiltes  yang proporsional dengan konsentrasi [6]. Dalam hal ini parameter lineritas digunakan untuk memverifikasi  mentode  ELISA  karena  untuk melihat statabilitas larutan stok dan pengeceran  yang  tepat  [7].  Kurva  kalibrasi menggambarkan  hubungan  antara  terdeteksi variable  respon  dan  konsentrasi  standar referensi yang dianggap mewakili analit dalams ampel uji [8]. Model perhitungan kurva kalibrasi pada  metode  ELISA  untuk  menentukan  kadar AMH dapat menggunakan 4 parameter logistik (4  PL)  dan  regresi  linear.  Sehingga  pada penelitian  ini  ingin  mengetahui  seberapa  baik verifikasi  ELISA  kit  AMH  dan  membandingkan perhitungan  4  PL  dengan  regresi  linear  dalam menetukan kadar AMH.

## METODE PENELITIAN Alat da nBahan
Alat-alat    yang    digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  iMark™  Microplate Absorbance Reader Bio-RAD, Inkubator 37  C± 0,5  C, kertas penyerap dan pipet presisi.
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam penelitian ini yaitu Human AMH ( Anti Mullerian Hormone )  ELISA  Kit  (Elabscience ® ),  yang terdiri  dari  Micro  ELISA  Plate, Reference Standard , Concentrated  Biotinylated  Detection Ab, Concentrated HRP Conjugate,  Reference Standard & Sample  Diluen t,  Biotinylated Detection  Ab  Diluent,  HRP  C onjugate  Diluent, Concentrated Wash Buffer , Substrate Reagent, Stop  Solution,  Plate  Sealer  dan Product Description

## PROSEDUR KERJA
Tambahkan  100  μL  standar  kesetiap sumur kemudian tutup dengan sealer. Inkubasi selama 90 menit pada suhu 37 ° C, kemudian keluarkan  cairan  dari  masing-masing  sumur, jangan  dicuci.  Segera tambahkan  100  μL larutan Biotinylated Detection Ab untuk masing-masing  sumur.  Tutup  dengan  sealer Plat.  Lembut  campur.  Inkubasi  selama  1  jam pada  suhu  37  °  C.  Aspirasi atau  tuang  larutan dari masing-masing sumur, tambahkan 350 uL wash  buffer kesetiap  sumur.  Rendam  selama 1-2  menit  dan  buang  larutan  dari  masing- masing  sumur  dan  tepuk  kering  di  atas  kertas penyerap    yang    bersih.  Ulangi  m  langkah cucim  ini  3  kali,  kemudian tambahkan  100  μL
solusi  kerja  HRP  Conjugate  kemasing-masing sumur.  Tutup  dengan  sealer  Plat.  Inkubasi selama 30 menit pada suhu 37 ° C, lakukankan kembali pencucian dengan pengulangan 5 kali, lalu tambahkan 90 μL substrat reagen kesetiap lubang.  Tutup  dengan  sealer  piring  baru. Inkubasi selama sekitar 15 menit pada suhu 37 °  C.  Lindungi  piring  dari  cahaya.  Tambahkan 50  μL  dari Stop  Solution kemasing-masing sumur lalu baca pada panjang gelombang 450
nm.  Hasil  OD  hari  1  dan  ke  7  dianalisis menggunakan SPSS version 2.1

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Verifikasi dilakukan dengan cara mengukur OD standard  ELISA  kit  AMH  dalam  waktu  yang berbeda  yaitu  hari  ke  1  dan  ke  7.  Hal  ini bertujuan  untuk  mengetahui  kestabilan  dari standard  ELISA  kit  AMH.  Hasil  pembacaan optical  density (OD)  dari  konsentrasi  standard AMH  hari  ke  1  dan  hari  ke  7  didapatkan  hasil sebagai berikut :
Tabel I. OD ( Optical Density ) Standard AMH  hari 1 danhari 7
Konsentrasi
(pg/mL) OD ( Optical Density ) harike 1 OD ( Optical Density ) harike 7 0 0.056 0.057 46.875 0.063 0.055 93.75 0.069 0.065 187.5 0.092 0.073 375 0.121 0.119 750 0.193 0.176 1500 0.320 0.270 3000 0.618 0.514 6000 0.861 0.867 Rata-rata 0.26589 0.2440 SD 0.287575 0.277021
Tabel II. Hasil uji Independent t test Levene's Test for Equality of Variances t-test for Equality of Means Sig. Sig. (2-tailed) Optical_ Density Equal variances assumed .821 .871 Equal variances not assumed .871
Berdasarkan hasil uji independent t test diperoleh  p=0.871  (p>0.05).  Hal  ini  dapat disimpulkan  bahwa  tidak  ada  perbedaan  yang bermakna  antara  OD  hari  ke  1  dan ke 7 pada
(p=0.05).  Sehingga  dapat  dikatakan  bahwa ELISA kit AMH dalam keadaan baik dan dapat digunakan  untuk  menentukan  kadar  AMH dalam serum.
TabelIII. OD ( Optical Density ) Standard AMH
Konsentrasi (pg/mL) Optical Density (OD) 0 -0.002 46.875 0.061 93.75 0.112 187.5 0.204 375 0.389 750 0.762 1500 1.483 3000 2.316 6000 2.943
Hubungan  antara  konsentrasi  standard AMH dengan (OD) Optical Density diuji dengan persamaan regresi linearitas yaitu Y=bx+a dan 4  parameter  logistik  (4PL).  Perhitungan  model 4  parameter  logistik  (4PL)  menggunakan rumus sebagaiberikut:
𝑦 = 𝑎 + 𝑑 − 𝑎 1 + ( 𝑥 𝑐 ) 𝑏
Dimana:
y = Respons optical density x = Konsentrasi a = Responterendahkonsetrasi,
d = Respontertinggikonsentrasi
c = Konsentrasipadatitikrefleksikurva
b = Faktorpertumbuhan.
(Stephanie, et al, 2018).
Gambar 1. Grafik Persamaan 4PL
Dari  persamaan  4PL didapatkan hasil  sebagai berikut:
𝑦 = 0.061 + 3.551 − 0.061 1 + ( 𝑥
1963.202 ) −1.400
Dari  model  persamaan  4PL  diperoleh koefisien korelasi (r) yaitu 1.000.
Gambar 2. GrafikPersamaanRegresi
Dari  model  persamaany  =  0.0005x  + 0.2781 diperoleh kofisien korelasi (r) yaitu0.9543 (p=0.000; p<0.05). Koefisien korelasi  adalah  ukuran  yang  dipakai  untuk mengetahui  derajat  hubungan  antara  dua variabel  [9].  Nilai  kofisien  korelasi  dengan persamaan  regresi  linear  mempuyai nilai  yang baik yaitu(r) 0.9543 (p=0.000; p<0.05). Sehingga  dapat  diartikan  bahwa  variabel konsentrasi standard AMH (X) memiliki pengaruh  signifikan  terhadap  variabel Optical Density (Y).Ketika  nilai  kofisien  korelasi  (r) mendekati  -1  atau  +1  maka  semakin  baik,  hal ini  dikarenakan  semua  titik  data  terletak  tepat di  garis  lurus,  sehingga  semakin  kuat hubungan  variabel  (X)  terhadap  variabel  (Y) [10].
Nilai  kofisien  korelasi  dari  persamaan 4PL  adalah  (r)  1.000.  Nilai  ini  menunjukkan bahwa  antara  konsentrasi  standard  AMH terhadap Optical  Density terdapat  korelasi sebesar  100%.  Menurut  Referensi  [11]  hal  ini
y = 0.0005x + 0.2781 r = 0.9543 (p=0.000; p<0.05) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Konsentrasi (pg/mL) O pt ica l D en si ty (O D )
disebabkan karena terjadi peningkatan konsentrasi  dua  kali  lipat  dari  standard  AMH yang  meyebabkan  nilai Optical  Density akan menjadi  dua  kali  lipatnya  sehingga  pada saatnya nilai Optical Density akan cendenrung melandai seperti yang terlihat pada gambar 1.
Pemilihan  model  kurva  kalibrasi  harus mempertimbangkan karakteristik dari ELISA kit hal  bertujuan  agar  kurva  kalibrasi  dapat mengoptimalkan  akurasi  dan  presisi  pada seluruh  rentang  kalibrasi  yang digunakan  [12]. Pada  ELISA  kit  AMH  kurva  kalibrasi  yang sesuai  untuk  digunakan  adalah  dalam  bentuk nonlinear.  Model  4PL  merupakan  model  yang sering digunakan untuk menggambarkan kurva sigmoid  [13].  Meskipun  nilai  kofisien  korelasi pada persamaan regresi linear telah membuktikan adanya pengaruh yang signifikan antara  konsentrasi  terhadap Optical  Density .
Model  persamaan  4  PL  dianggap  lebih  sesuai digunakan pada ELISA kit AMH.

## KESIMPULAN
Dari  hasil  penelitian  yang  dilakukan dapat disimpulkan bahwa: ELISA kit AMH telah memenuhi  persyaratan  verifikasi  dan  kurva kalibrasi  model  4PL  lebih  sesuai  digunakan pada  ELISA  kit  AMH  daripada  model  regresi linear.

## REFERENSI
1.  Eurachem  Guide.  2014  The  Fitness  for Purpose of Analytical Methods A Laboratory Guide to Method Validation and
Related  Topics  2 nd .  ISBN  978-91-87461- 59-0
2.  Chauhan  ashish,  Bharti  M  &  Priyanka. 2015.Analytical  Method  Development  and Validation:  A  Concise  Review.  Journal  of Analytical  &  Bioanalytical  Techniques.  (6)
1. pp 1-5. Doi: 10.4172/2155- 9872.1000233
3. Aydin  Suleyman.  2015.A  Short  History, Principles,  and  Types  of  ELISA,  and  our Laboratory
Experience with Peptide/Protein  Analyses  Using  ELISA. Peptides. (72). pp 4-15.
Doi: 10.1016/j.peptides.2015.04.012
4.  Dewailly  D,  Claus  Y.A,  Adam  B,  Frank  B,
Nafi  D,  Renato  F,  Georg  G,  Tom  W.K, Antonio  L.M,  Cornelius  L,  Helen  M,  Scott M.N,  Jenny  A.V,  Hamish  W  and  Richard A.A.  2014.  The  physiology  and  clinical utility ofanti-Mullerian hormone in women. Human  Reproduction. (20)  3.  pp 1-16. Doi: 10.1093/humupd/dmt062.
5.  WHO.  2016.  Guidelines  On  Validation Appendix  4  Analytical  Method  Validation Working
6.  FDA. 2016. Guidelines for the Validation of Analytical  Methods  for  the  Detection  of Microbial  Pathogens  in  Foods  and  Feeds. pp 1-54
7.  European Medicine Agency (EMEA). 2011.
Guideline on Bioanalytical Method Validation.Commitee for Medicinal Products for Human Use.
EMEA/CHMP/EWP/192217/2009  Rev.  1 Corr. 2 8.  Azadeh M., Gorovits B., Kamerud J.,MacMannis  S.,Safavi  A.,Sailstad  J.,and Sondag  P.  2017.  Calibration  Curves  in Quantitative Ligand Binding Assays:
Recommendationsand  Best  Practices  for Preparation,  Design,  and  Editing  of Calibration  Curves. The  AAPS  Journal .
20(1).  pp  1-16.  doi:  10.1208/s12248-017- 0159-4.
9.  Samuel  M  &  Lawrence  E.O.  2015.  The Relevance And Significance Of Correlation
In Social Science Research. International Journal of Sociology and Anthropology Research .  3(1).  pp  22-28.  ISSN  2059- 1209, ISSN 2059-1217
10. Schober  P,  Christa  B  &  Lothar  S.  2018.
Correlation  Coefficients:  Appropriate  Use
and
Interpretation.
Correlation
Coefcients in  Medical Research . 126(5). pp. 1763-1768.
doi:
10.1213/ANE.0000000000002864.
11. Masdor N.A,  Altintas Z &Tothill I.E. 2016. Sensitive    Detection    Of Campylobacter Jejuni using Nanoparticles Enhanced QCM Sensor. BiosensBioelectron : 78. pp 328 – 36. doi: 10.1016/j.bios.2015.11.033
12. John  W.A.  F  &  Robert  F.D.  2007. Appropriate  Calibration  Curve  Fitting  in Ligand  Binding  Assays. The  AAPS Journal . 9(2). pp 260-267. doi: 10.1208/11psj0902029
13. Hyun  W.S,  Weng  K.W  &Yarong  Y.  2018 . VNM:  An  R  Package  for  Finding  Multiple ObjectiveOptimal  Designs  for  the  4- Parameter  LogisticModel. Journal  of Statistical Software . 83(5). pp 1-  19.  doi: 10.18637/jss.v083.i05