## KADAR PROTEIN Klebsiella pneumoniae HASIL PEMANASAN 65  C

## Irawan Sugoro*, Devita Tetriana

## Badan Tenaga Nuklir Nasional
*Corresponding author : irawans@batan.go.id

## Abstract
Klebsiella  pneumoniae  is  one  of  a  coliform  bacteria  that  causing  mastitis.  This  disease  were founded  in  dairy  cows  and  can  be  prevented  by  vaccination.  The  research  has  been  conducted  to determine  the  inactive  times,  the  protein  concentration  and  profile  of  K.  pneumoniae  which inactivated by heating of 65 o C as material of mastitis vaccine. The cells culture inactivated by the different times, i.e. 0, 10, 20, 30, 40, 50 and 60 minutes. The inactive times was determined by the drop  test  method,  whereas  the  protein  concentration  of  cells  were  determined  by  Lowry  method. The results showed that the inactive times occured after 30 minute, and has a significant different on the protein concentration of bacteria cells that inactivated by the different times.
Keywords: Vaccine, protein, Klebsiella pneumoniae , heating 65 o C

## PENDAHULUAN
Salah  satu  faktor  yang  mempengaruhi produktivitas  sapi  perah  adalah  faktor kesehatan.  Penyakit  yang  sering  menyerang ternak  perah  dan  erat  kaitannya  dengan  air susu  ini  antara  lain  mastitis.  Mastitis  adalah suatu  peradangan  pada  tenunan  ambing  yang dapat  disebabkan  oleh  mikroorganisme,  zat kimia,  luka  termis  ataupun  luka  karena mekanis. Peradangan ini menyebabkan penurunan kualitas dan produksi susu (Fox & Mc Sweeney, 1998).
Penyakit  mastitis,  salah  satunya  dapat disebabkan  oleh  bakteri  dari  jenis  koliform. Bakteri koliform banyak menginfeksi ambing sapi  karena  banyak  terkandung  di  dalam feses.  Bakteri  yang  berasal  dari  feses  dapat masuk  ke  ambing  melalui  lubang  atau  kanal puting saat pemerahan atau ketika sapi duduk di lantai kandang (Hogan & Smith, 2002).
Cara  yang  biasa  dilakukan  untuk mengobati  penyakit  mastitis  adalah  dengan pemberian  antibiotik.  Pengobatan  ini  dapat menimbulkan  resistensi  pada  mikroba  dan adanya  residu  pada  susu,  sehingga  perlu mencari  alternatif  lain  untuk  mencegah penyakit ini (Kirk et. al. , 1994). Salah satunya adalah  pembuatan  vaksin.  Sampai  saat  ini, sebagian  besar  vaksin  yang  beredar  di Indonesia  berasal  dari  impor  dengan  kisaran
pasar  60-70%.  Oleh  karena  itu,  upaya pengembangan  bahan  vaksin  di  dalam  negeri memiliki  nilai  strategis  dan  peluang  bisnis (Soeripto, 2002). Ketergantungan akan vaksin impor  dapat  berakibat  pada  menurunnya cadangan  devisa  negara  dan  juga  dapat memungkinkan  masuknya  penyakit  hewan melalui  kontaminasi  agen  penyakit  pada vaksin  yang  diimpor.  Hal  yang  lebih berbahaya  lagi  adalah  timbulnya  efek  mutasi pada  vaksin  aktif  yang  dapat  mengakibatkan terjadinya penyakit baru (Mellenberger, 1997; Ruegg, 2001).
Penelitian  ini  menggunakan  bakteri Klebsiella  pneumoniae hasil  isolasi  dari  susu sapi  perah  berasal  dari  Garut  yang  terinfeksi mastitis  yang  telah  terseleksi  (Sugoro,  2004). Isolat  ini  mendominasi  setiap  sampel  susu yang terinfeksi mastitis dengan level berbeda. Isolat K.  pneumoniae yang  berhasil  diisolasi sebanyak 12 strain dan yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  strain K.  pneumoniae dari  level  mastitis  positif  3  (isolat  K3)  atau mastitis  akut.  Isolat  ini  memiliki  tingkat resistensi antibiotik tinggi (Sugoro & Tetriana, 2007).
Pembuatan  vaksin  dapat  dilakukan dengan  menggunakan  metode  konvensional, yaitu  dengan  pemanasan,  radiasi  atau  kimia. Pada  penelitian  ini  akan  digunakan  metode
pemanasan  untuk  inaktivasi  sel  bakteri dengan  suhu  65  C.  Pemilihan  suhu  tersebut didasarkan  pada  penelitian  vaksin Brucella abortus oleh  Sanakkalaya et  al .  (2005). Dipilihnya metode pemanasan karena memiliki  keuntungan  dalam  hal  mudah  dan murah  dalam  proses  pembuatannya  diban- dingkan  metode  lainnya.  Kualitas  bahan vaksin salah satunya ditentukan oleh keberadaan  antigen,  yaitu  protein  pada  sel bakteri.  Terdapat  kemungkinan  inaktivasi  sel bakteri K.  pneumonia dengan  pemanasan akan  menyebabkan  perubahan  pada  jumlah dan struktur protein.
Berdasarkan  uraian  di  atas  maka  tujuan dari  penelitian  ini  adalah  untuk  menentukan waktu pemanasan untuk  inaktivasi sel bakteri K.  pneumoniae dan  mengetahui  pengaruh waktu  inaktivasi  pemanasan  terhadap  kan- dungan  protein  ekstraseluler  dan  intraseluler dari isolat bakteri K.  pneumoniae .

## MATERIAL DAN METODE
Bakteri yang digunakan adalah
Klebsiella  pneumoniae (isolat  K3)  dari Laboratorium Pernakan-BATAN . Bahan yang digunakan  adalah Triptic  Soy  Broth (TSB) Pronadisa ® , Triptic  Soy  Agar (TSA)  Prona- disa ® ,  aseton,  NaCl  0,85%,  larutan  Lowry  I (Na 2 CO 3 4,9 ml dalam NaOH 0,1 N), larutan Lowry  II  (Folin  dan  akuadest  (1:1)  dan standar  BSA.  Alat  utama  yang  digunakan adalah inkubator shaker (SM  25 ® ), Sonikator (Branson ® 2210) dan Spektrofotometer (WPA &  Ultrospec  100  pro  Amersham  Bio- sciences ® ).
Pembuatan Kurva Tumbuh Bakteri
Klebsiella  pneumoniae untuk  Penentuan Fase Mid Log
Kultur  bakteri  berumur  24  jam  dalam  TSA miring,  diinokulasikan  sebanyak  3  ose  ke dalam medium TSB dan diinkubasi pada suhu kamar dan agitasi pada 120 rpm selama 1 hari untuk  memperoleh  kultur  inokulum.  Kan- dungan  sebanyak  10  %  v/v  (10 6 sel/ml)  dari kultur  inokulum  diinokulasikan  ke  dalam  30 ml  medium  TSB  dan  diinkubasi  pada  suhu kamar dan agitasi pada 120 rpm. Pencuplikan dilakukan  pada  menit  ke-0,  30,  60,  120,  180, 240  dan  300  untuk  pengukuran  absorbansi
dengan  menggunakan  spektrofotometer  pada  660nm . Kultur pada fase eksponensial dihitung jumlah  selnya  dengan  teknik droptest dalam medium  TSA  di  cawan  petri.  Caranya, dilakukan  pengenceran  pada  kultur  fase eksponensial, lalu diinokulasikan sebanyak 10 μl  ke  dalam  medium  TSA.  Selanjutnya diinkubasi  pada  suhu  kamar  selama  1  hari, dan diukur nilai absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer pada  660nm . Inaktivasi  Bakteri K.  penumoniae dengan Pemanasan
Kultur  pada  fase  mid  log  disentrifugasi  pada kecepatan  10.000  rpm  dan  suhu  1°C  selama 10  menit.  Kemudian  kultur  dibilas  dengan NaCl  0,85%  sebanyak  2  kali.  Supernatan yang  diperoleh  diencerkan  hingga  diperoleh jumlah  sel  10 12 sel/ml  dan  ditempatkan  di tabung  inkubasi  (yellow)  sebanyak  5  ml. Selanjutnya  dipanaskan  dalam  inkubator selama  0,  5,  10,  15,  30,  45  dan  60  menit. Kultur  hasil  pemanasan  kemudian  dihitung jumlah  selnya  dengan  teknik droptest untuk uji inaktivasi.
Pengukuran Protein Sel Bakteri K.
pneumoniae dengan Metode Lowry Kultur hasil pemanasan diukur kandungan  protein  ekstraselular  dan  intra- selular. Sampel untuk mengetahui kandungan protein  ekstraselular  langsung  menggunakan kultur  hasil  pemanasan,  sedangkan  untuk protein intraselular diketahui  dengan didapat- kannya  jumlah  protein  total.  Jumlah  protein total  didapatkan dengan  cara dipecah terlebih dahulu  dengan  melarutkan  kultur  hasil pemanasan  ke  dalam  aseton  (1:9)  dan disonikasi selama 10 menit. Sampel sebanyak 1  ml  ditambahkan  5  ml  larutan  Lowry  I  dan dibiarkan  selama  10  menit.  Kemudian ditambahkan  0,5  ml  larutan  Lowry  II  dan dibiarkan  selama  30  menit.  Dibaca  dengan spektrofotometer  pada  750nm .  Absorbansi yang diperoleh dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar BSA untuk diketahui kadar protein.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kurva Tumbuh Sel Bakteri K. pneumoniae Hasil kurva tumbuh menunjukkan hanya terdapat  dua  fase  pertumbuhan  yaitu  fase logaritma dan fase stasioner (Gambar 1). Fase logaritma  terjadi  hingga  menit  ke-200,  dan setelah itu langsung memasuki fase stasioner. Pertumbuhan  bakteri  ini  dapat  dilihat  dari perubahan  nilai  absorbansi  yang  didapat setelah  dilakukan  pengukuran  pada  menit yang  berbeda.  Kurva  pertumbuhan  bakteri terdiri  dari  suatu  periode  awal  yang tampaknya  tanpa  pertumbuhan  (fase  kelam- batan  atau  fase  adaptasi)  diikuti  oleh  suatu periode  pertumbuhan  yang  cepat  ( fase  log ), kemudian  mendatar  ( fase  stasioner )  dan akhirnya  diikuti  oleh  suatu  penurunan populasi  sel  hidup  (fase  kematian).  Pada kurva  ini,  tidak  terdapat  fase  adaptasi  ( lag phase ).  Hal  ini  terjadi  karena  sebelumnya bakteri  yang  digunakan  telah  ditumbuhkan pada  medium  yang  sama,  sehingga  bakteri tersebut  tidak  memerlukan  adaptasi  terlebih dahulu  pada  medium  pertumbuhannya.  Oleh karena  itu,    pada  kurva  tumbuh  tersebut  fase adaptasinya  tidak  teramati  (Tri  dkk.,  2008). Adanya interaksi positif antar sel mikroba dan berlimpahnya nutrisi menyebabkan kecepatan pertumbuhan sel mikroba menjadi lebih tinggi (Suriawiria, 2005).
Kurva  tumbuh  ini  digunakan  untuk menentukan  fase  mid  log.  Fase  mid  log merupakan  suatu  fase  pertumbuhan  dimana terjadi  kecepatan  pembelahan  tertinggi.  Fase ini  diperlukan  karena  pada  fase  inilah nantinya  akan  dilakukan  pmanasan  terhadap sel bakteri. Fase ini terjadi pada menit ke-150, dengan  kecepatan  pertumbuhan  berdasarkan nilai  absorbansi  adalah  0,0037/menit.  Fase mid  log  digunakan  karena  sel-sel  bakteri dalam kondisi aktif melakukan metabolisme. Penentuan  Waktu  Inaktivasi Sel K. pneumoniae dengan Pemanasan Pemanasan  pada  suhu  65°C  dengan waktu  yang  berbeda  pada  kultur  bakteri menunjukkan  adanya  penurunan  jumlah  sel yang  hidup  sebanding  dengan  bertambahnya waktu  (Gambar  2).  Waktu  yang  diperlukan untuk menginaktivasi sel bakteri K. pneumoniae yaitu  setelah  30  menit.  Kondisi
inaktif  dapat  terjadi  karena  terganggunya metabolisme  sel  yang  menyebabkan  sel bakteri tidak mampu bereplikasi atau hilangnya kemampuan membelah diri. Metabolisme  sel  diatur  oleh  enzim  yang komponen utamanya adalah protein.
Kebanyakan  protein  merupakan  suatu enzim  yang  berfungsi  sebagai  katalisator, yang bersifat sangat peka terhadap perubahan lingkungannya.  Aktivitas  protein  banyak tergantung  pada  struktur  dan  konformasi molekul protein yang tepat. Apabila konformasi  protein  berubah,  salah  satunya oleh perubahan suhu, maka aktivitas biokimiawinya  berkurang.  Perubahan  konfor- masi alamiah menjadi  suatu konformasi  yang tidak  menentu  merupakan  suatu  proses  yang disebut  denaturasi.  Proses  denaturasi  ini biasanya  dapat  berlangsung  secara  reversibel ataupun  tidak  reversibel.  Protein  akan mengalami koagulasi apabila dipanaskan pada suhu  50  C  atau  lebih  (Walsh  dan  Headon, 1997).
Akibat  penting  dari  denaturasi  protein adalah  protein  yang  bersangkutan  hampir selalu kehilangan aktivitas biologi khususnya. Denaturasi  protein  dapat  diakibatkan  bukan hanya oleh panas, tetapi juga oleh pH ekstrim oleh  beberapa  pelarut  organik  seperti  aseton (Stryer,  2000).  Uji  langsung  memperlihatkan bahwa  jika  protein  mengalami  denaturasi, tidak ada ikatan kovalen pada kerangka rantai polipeptida yang rusak. Hal ini berakibat deret asam  amino  khas  protein  tersebut  tetap  utuh setelah denaturasi. Namun demikian, aktivitas biologi  hampir  semua  protein  menjadi  rusak (Ophardt, 2003).
Pengukuran Kadar Protein Sel K. pneumoniae dengan Metode Lowry Protein  merupakan  komponen  utama dalam  semua  sel  hidup,  dan  merupakan komponen  terbesar  setelah  air.  Protein mempunyai  peranan  yang  sangat  penting. Fungsi utamanya sebagai zat pembangun atau pembentuk  struktur  sel  dan  mempunyai fungsi  khusus,  yaitu  enzim  (Seidman  dan Mowery,  2006).  Gambar  3  menunjukkan adanya  perbedaan  konsentrasi  protein K. pneumoniae akibat pemanasan. Hasil statistik
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Intraselular Ekstraselular Total Intraselular
0.572 0.52 0.497 0.986 0.916 1.002 0.661 Ekstraselular 0.514 0.073 0.109 0.124 0.391 0.452 0.437 Total 1.086 0.593 0.606 1.11 1.307 1.455 1.098
0 5 10 15 30 45 60
Gambar 1 .  Kurva pertumbuhan bakteri K. pneumoniae dalam medium TSB yang diinkubasi pada suhu  ruang  dan  diagitasi  pada  120  rpm  (A)  serta  kurva  jumlah  sel  bakteri K. pneumoniae terhadap waktu inaktivasi dengan pemanasan (B)
Gambar 2 . Histogram kadar protein K. pneumoniae terhadap waktu pemanasan pada suhu 65°C
menunjukkan  bahwa  adanya  perbedaan  nyata kadar  protein  intraseluler  hasil  pemanasan selama 15, 30, dan 45 menit terhadap kontrol (0 menit). Terjadi pula perbedaan nyata kadar protein  ektsraseluler  hasil  pemanasan  selama 5,  10  dan  15  menit  terhadap  kontrol. Kemudian  pada  kadar  protein  total,  terjadi perbedaan  nyata  hasil  pemanasan  selama  15, 30,  45  dan  60  menit  terhadap  kontrol.  Kadar protein  ekstraselular  cenderung  lebih  rendah daripada protein intraselular. Hal ini disebab- kan pembentukan protein ekstraseluler tergan- tung  dari  protein  intraseluler  yang  berupa enzim-enzim pembentuk protein ekstraseluler.
Kadar  protein  intraseluler  mengalami penurunan hingga pemanasan selama 10menit,  lalu  kembali  meningkat  pada pemanasan  selama  15  hingga  45menit, sedangkan  pada  pemanasan  selama  60  menit kembali  menurun.  Pada  protein  ekstraseluler, kadar  menurun  pada  pemanasan  selama  5 menit,  lalu  meningkat  pada  pemanasan selama  10  hingga  45  menit.  Meningkatnya kadar  protein  disebabkan  inaktivasi  dengan pemanasan hanya merusak kemampuan membelah  diri  bakteri,  sedangkan  sintesis protein  tetap  dapat  berlangsung  karena lisosom  sebagai  tempat  sintesis  protein  tidak
1x 10 12 1x 10 11
1x 10 10 1x 10 9 1x 10 8 1x 10 7 1x 10 6 1x 10 5 1x 10 4 1x 10
3 1x 10 2 1x 10 1 1 A B
dirusak. Sintesis protein yang terjadi memungkinkan  dihasilkannya Heat  Shock Protein (HSP)  dengan  adanya  pemanasan, sehingga  menyebabkan  meningkatnya  kadar protein pada sel bakteri.
HSP adalah satu kelompok protein yang jumlahnya  meningkat  bila  sel-sel  diberi perubahan suhu atau tekanan lain.
Peningkatan  ini  diatur  secara  transkripsional. Pengaturan dramatis dari HSP ini kebanyakan diinduksi  oleh Heat  Shock  Faktor (HSF), yang  merupakan  salah  satu  kunci  terhadap tanggapan  kejutan  panas ( Heat Shock Response ) (Ang dkk, 1991).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  di  atas  maka  dapat disimpulkan  bahwa  waktu  pemanasan  yang diperlukan  untuk  menginaktivasi  sel  bakteri K.  pneumoniae adalah  lebih  dari  30  menit. Waktu  pemanasan  mempengaruhi  kandungan protein  intraselular  dan  ekstraselular  sel bakteri K.  pneumoniae .  Kadar  protein intraselular sel   lebih besar dibanding protein ekstraselular.

## DAFTAR PUSTAKA
Ang,  D.,  Liberek.,  K.,  Skowyra.,  D.,  Zylicz, M.  &  Georgeopoulos,  C.  (1991). Biological  Role  and  Regulation  of  The Universally  Conserved  Heat  Shock Proteins. J  Biol  Chem.  266.  24233- 24236 (akses  02  April  2008,  pukul 15.30 WIB)
Fox, P. F. & McSweeney, P. L. (1998). Dairy Chemistry  and  Biochemistry .  London: Blackie Academic and Professional.
Goldman,  B.  (2002).  Heat  Shock  Proteins
Vaccine  Potential:  from  Basic  Science
Breakthroughs  to  Feashible  Personal- ized Medicine.
Journal . http://www.antigenics.com/whitepapers/
HSP_potential.html (akses  02  April 2008, pukul 14.20)
Hogan,  J.,  and  K.  L.  Smith.  2002. Coliform Mastitis .  Ohio,  U.S.A.:  The  Ohio  State University, Wooster.
Kirk, J. H., De Graves. F., & Tyler, J. (1994). Recent  Progress  in:  Treatment  and Control  of  Mastitis  in  Cattle. JAVMA 204.  1152-1158 (akses  13  Desember 2007, pukul 17.10).
Mellenberger,  R.  (1997).  Vaccination  against Mastitis. J  Dairy  Sci.  60(6).  1016-1021
( akses  3  Desember  2007  pukul  11.20
WIB)
Ruegg, P. L. (2001). Evaluating the
Effectiveness of Mastitis Vaccines . University of Wisconsin–Madison.
Sanakkalaya,  N.,  Sokolovska,  A.,  Gulain,  J., Hogenesch,  H.,  Sriranganthan,  N.,  Boyle, S., Schurig, G., & Vemulapalli, R. (2005). Induction  of  antigen  specific  Th1-type Immune  Responses  by  Gamma  Irradiated recombinant  Brucella  abortus  RB51. Clinical and diagnostic laboratory immunology, American Society for
Microbiol. 12(12). Seidman,  L.,  &  J.  Mowery.  (2006).  Chapter  2: Protein Structure. Article . http://matcmadison.edu. (akses 07 Agustus 2008, pukul 14.10 WIB) Soeripto.  (2002).  Pendekatan  konsep  kesehatan hewan  melalui  vaksinasi. J  Litbang Pertanian, 21(2) (akses 6 Februari 2008, pukul 14.00 WIB)
Stryer,  L.  (2000). Biochemistry ,  Four  Edition.
Alih Bahasa Indriati P. H. Jakarta: EGC. Sugoro,  I.  (2004).  Pengontrolan  Penyakit Mastitis  dan  Manajemen  Pemerahan Susu. Artikel . PATIR - BATAN. Jakarta. Suriawiria,  U.  (2005).  Mikrobiologi  Dasar.
Jakarta: Penerbit Papas Sinar Sinanti. Susilorini,  T.  (2006). Produk  Olahan  Susu . Jakarta: Penebar Swadaya.
Tetriana,  D.,  &  Sugoro.  I.  (2007).  Vaksin Radiasi  Coliform  Mastitis. Laporan Penelitian . PATIR-BATAN.
Tri,  T.  S.,  Nastiti,  S.  J.,  &  Sutaningsih,  A.  E. (2008). Mikrobiologi
Umum . Yogyakarta: Universitas Atma Jaya.
Walsh,  G.,  &  Headon,  D.  R.  (1997). Protein Biotechnology .  New  York:  John  Wiley and Sons.