Prelimenary Study of Genetic Linked Map Construction and Identification of Quantitative Trait Loci Linked to Early Growth of Rubber Plant

## STUDI PENDAHULUAN KONSTRUKSI PETA PAUTAN GENETIK DAN IDENTIFIKASI QUANTITATIVE TRAIT LOCI YANG TERPAUT DENGAN PERTUMBUHAN AWAL TANAMAN KARET
*Email : fetrina_oktavia@yahoo.com Fetrina Oktavia
Pusat Penelitian Karet, Jln Raya Palembang – Pangkalan Balai KM 29, Sembawa Banyuasin 30593 Sumatera Selatan
Diterima : 12 Juli 2020 / Disetujui : 12 Oktober 2020

## Abstract
Hevea brasiliensis is one of the main species producing of natural rubber. Efforts to develop  a  new  superior  rubber  clones  that have high latex yielding and good agronomic characters  need  to  be  carried  out  in  a continuously. One limiting factor for this effort is a long selection time around 25-35 years. An alternative approach that can be used to overcome this problem is selection assisted by molecular  markers.  The  research  aimed  to construct  a  genetic  linkage  map  and identification  of  QTLs  linked  to  early  rubber plant  growth.  QTLs  can  be  used  as  a molecular marker for early detection of growth of  girth  potential  of  rubber  clones.  The analysis was carried out on 201 F1 progeny obtained  from  crosses  of  PB  260  x  SP  217 clones. Phenotyping of girth data was carried out  on  F1  plants  aged  16-22  months  that planted in five ha area. The genetic link maps of population were compiled by using 263 of selected  SSR  markers.  The  observation showed that the growth of girth population on 22  months  old  ranged  from  5.5  to  25.04  cm with  an  average  of  14.66  cm.  The  average girth  increasing  of  F1  progenies  per  month ranges from 0.4-1 cm. The coefficient variance showed that there is a high diversity growth of girth  of  population.  Three  of  QTLs  linked  to early  growth  of  girth  rubber  plant  on  22 months  after  planting  were  succesfull identified on LG 14 with LOD 4.64, LG 13 LOD 3.5, and LG 1 LOD 3. QTL linked to increasing of  girth  from  16  to  22  months  old  was identified in LG 14 with LOD 4.1. The position of the loci of genes or DNA sequence that had effect to growth of girth was indicated by the TAs2185  marker  where  the  marker  give 11.7% of effect to growth of girth rubber plant.
To  know  the  stability  and  the  application  of marker assisted selection for girth as a tool for selection, the existence of the QTLs needs to be analyzed periodically.
Keywords  :  genetic  linkage  map;  Hevea brasiliensis; progeny; QTL; SSR
Hevea brasiliensis merupakan salah satu  spesies  utama  penghasil  karet  alam. Upaya  pengembangan  klon-klon  karet unggul baru yang memiliki produksi lateks tinggi  dan  karakter  agronomis  yang  baik perlu dilakukan secara berkelanjutan. Salah satu faktor pembatas upaya tersebut adalah lamanya  waktu  seleksi  yang  dibutuhkan yakni  berkisar  25-35  tahun.  Pendekatan alternatif  yang  dapat  digunakan  untuk mengatasi  permasalahan  tersebut  adalah seleksi  dengan  bantuan  marka  molekuler. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menyusun peta  pautan  genetik  dan  identifikasi  QTL yang  terpaut  dengan  pertumbuhan  awal tanaman  karet.  QTL  dapat  digunakan sebagai  penanda  molekuler  untuk  deteksi dini  potensi  pertumbuhan  lilit  batang  klon karet. Analisis dilakukan pada 201 progeni F1 hasil persilangan klon PB 260 x SP 217. Fenotipe  data  pertumbuhan  lilit  batang dilakukan  pada  tanaman  F1  umur  16-22 bulan yang ditanam pada areal seluas lima ha.  Penyusunan  peta  pautan  genetik populasi  dilakukan  menggunakan  263 marka  SSR  terseleksi.  Pengamatan menunjukkan  bahwa  pertumbuhan  lilit batang populasi umur 22 bulan berkisar 5,5 – 25,04 cm dengan rata-rata 14,66 cm. Rata- rata  penambahan  lilit  batang  progeni  F1
Abstrak
Jurnal Penelitian Karet, 2020, 38 (2) : 121 - 132 Indonesian  J.  Nat. Rubb. Res. 2020, 38 (2) : 121 - 132 Doi : https://doi.org/10.22302/ppk.jpk.v2i38.733
Tanaman  karet  ( Hevea  brasiliensis
Muell  Arg)  merupakan  spesies  utama penghasil  karet  alam.  Spesies  yang termasuk  ke  dalam  famili Euphorbiaceae tersebut  berasal  dari  lembah  Amazon  dan tumbuh  baik  di  daerah  tropis.  Hingga  saat ini  92%  produksi  karet  alam  dunia d i s u m b a n g k a n   o l e h   n e g a r a - n e g a r a penghasil  karet  alam  di  Asia  Tenggara termasuk Indonesia.
S e c a r a   u m u m   a n a l i s i s   Q T L dilakukan pada populasi F2 atau backcross . Pada  tanaman  tahunan  seperti  tanaman karet  hal  ini  sulit  untuk  dilakukan  karena siklus  hidup  tanaman  yang  panjang  dan kemampuan menghasilkan biji yang rendah akibat  adanya inbreeding  depression (Lespinasse  et  al.,  2000).  Keterbatasan tersebut  menyebabkan  hanya  turunan  F1 yang dihasilkan dari persilangan tetua yang heterozigot  yang  biasanya  mungkin disiapkan  sebagai  populasi  pemetaan  di mana  kondisi  ini  dapat  mengakibatkan terjadinya  segregasi  empat  alel  pada  satu lokus. Data yang dihasilkan dapat dianalisis sebagai double  pseudotestcross dan penyusunan  peta  genetik  untuk  masing- masing  tetua  dilakukan  secara  terpisah (Grattapaglia & Sederoff, 1994).
Analisis  QTL  pada  tanaman  karet dilaporkan telah dikembangkan secara luas untuk berbagai karakter agronomis, seperti
Pengembangan  MAS  berbasiskan Quantitative Trait Loci (QTL), yaitu lokus atau bagian dari genom yang menyandikan suatu karakter  dari  tanaman.  Identifikasi keberadaan  QTL  yang  terpaut  erat  dengan suatu  karakter  yang  diinginkan  dilakukan dengan melihat keterpautan antara karakter tersebut  (fenotipe)  dengan  faktor  marka genetik  (genotipe).  QTL  akan  teridentifikasi apabila  ditemukan  keterpautan  yang  erat antara  kedua  faktor  tersebut.  Nilai  pautan antara  kedua  faktor  tersebut  ditentukan berdasarkan nilai LOD ( logarithmic of odds ) di  mana  semakin  tinggi  nilai  LOD  akan semakin  kuat  pautan  antara  karakter dengan marka genetik. Secara umum suatu marka  genetik  dapat  dianggap  signifikan terpaut  dengan  suatu  karakter  pada  nilai LOD  3.  Pengaruh  QTL  terhadap  variasi karakter  fenotipik  dijelaskan  berdasarkan
2 nilai  R ,  di  mana  pengaruh  QTL  akan
2 tergolong mayor pada saat nilai R  diatas 0,1
2 dan minor pada saat nilai R  kurang dari 0,1. Secara umum QTL mayor relatif stabil pada semua  kondisi,  sedangkan  QTL  minor sensitif  terhadap  pengaruh  lingkungan sehingga  seringkali  keberadaannya  tidak terdeteksi  di  semua  tahap  dan  kondisi pertumbuhan tanaman (Collard et al., 2005; Semagn et al., 2006; Khan, 2015).

## PENDAHULUAN
Upaya  peningkatan  produktivitas perkebunan karet melalui penggunaan klon- klon  unggul  baru  perlu  terus  dilakukan. Program  pemuliaan  pengembangan  klon- klon  baru  secara  umum  masih  dilakukan melalui  pendekatan  konvensional  melalui hibridisasi  dan  berbagai  tahapan  seleksi yang  membutuhkan  waktu  cukup  lama berkisar  20  –  25  tahun.  Hal  ini  menjadi tantangan  dalam  program  pemuliaan tanaman  karet,  sehingga  perkembangan kemajuan  di  bidang  molekuler  menjadi harapan untuk memperpendek masa seleksi dengan bantuan penanda molekuler ( Marka Asissted Selection atau MAS). Seleksi dengan bantuan marka molekuler dapat dilakukan secara  cepat  dan  akurat,  di  mana  seleksi
dapat dilakukan secara dini pada tahap awal pertumbuhan tanaman.
setiap bulan berkisar 0,4 – 1 cm. Koefisien keragaman  menunjukkan  bahwa  terdapat keragaman  pertumbuhan  lilit  batang  yang cukup tinggi pada populasi. Tiga QTL yang terpaut  pertumbuhan  awal  lilit  batang tanaman karet umur 22 bulan setelah tanam berhasil  teridentifikasi  pada  LG  14  dengan LOD 4,64, LG 13 dengan LOD 3,5, dan LG 1 dengan LOD 3. Pada LG 14 dengan LOD 4,1 berhasil  teridentifikasi  QTL  terpaut peningkatan  lilit  batang  dari  umur  16 sampai  22  bulan.  Posisi  lokus  gen  atau sekuen  DNA  yang  memberikan  pengaruh terhadap pertumbuhan lilit batang tersebut ditunjukkan  oleh  marka  TAs2185  di  mana gen tersebut memberikan pengaruh sebesar 11,7%  terhadap  pertumbuhan  lilit  batang tanaman  karet.  Keberadaan  QTL  tersebut perlu  dianalisis  secara  berkala  untuk mengetahui  kestabilan  sehingga  dapat digunakan sebagai alat bantu seleksi untuk lilit batang.
Kata kunci: Hevea brasiliensis ; peta pautan genetik; progeni; QTL; SSR
Oktavia
ketahanan  terhadap  penyakit  gugur  daun South American Leaf Blight (SALB) (Le Guen et al., 2003; Le-Guen et al., 2007; Le Guen et al., 2011a; Le Guen et al., 2013) dan penyakit gugur daun Corynespora (Tranh et al., 2016; Oktavia et al., 2021), pertumbuhan tanaman (; Novalina, 2013; Souza et al., 2011; Souza et al., 2013; Conson et al., 2018), serta QTL yang  terpaut  dengan  produksi  lateks (Chanroj et al., 2017; Rosa et al., 2018; An et al., 2019). Pada analisis tersebut dilakukan penyusunan  peta  pautan  genetik  pada berbagai populasi F1 hasil persilangan klon tetua yang berbeda. Penelitian ini bertujuan untuk  mengidentifikasi  QTL  yang  terpaut dengan  pertumbuhan  tanaman  karet menggunakan populasi F1 hasil persilangan PB 260 x SP 217.

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  dilaksanakan  di  Kebun Percobaan dan Laboratorium Fisiologi Pusat Penelitian  Karet,  Sembawa,  Banyuasin, Sumatera Selatan serta Laboratorium Bios, Cirad, Perancis dari tahun 2016-2018.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  terdiri  dari  tiga  tahapan, yaitu phenotyping yang terdiri dari beberapa tahapan  yaitu  pengamatan  pertumbuhan lilit  batang  setiap  bulan  selama  dua  tahun s e r t a   a n a l i s i s   d a t a   p e r t u m b u h a n ( phenotyping ),  penyusunan  peta  pautan genetik  atau genetic  linkage  group (LG) m e n g g u n a k a n s o f t w a r e   j o i n t   m a p ( genotyping ),  serta  identifikasi  keberadaan QTL  yang  merupakan  penggabungan  data phenotyping dan genotyping menggunakan software Map QTL .
Evaluasi  Pertumbuhan Tanaman  F1  di Lapangan ( Phenotyping )
Evaluasi  pertumbuhan  dilakukan melalui  pengukuran  lilit  batang  semua genotipe F1 setiap bulan pada saat tanaman berumur 16 sampai 22 bulan. Pengukuran lilit  batang  dilakukan  pada  tahun  kedua pertumbuhan  di  ketinggian  150  cm  dari pertautan  okulasi  (dpo)  menggunakan meteran.

## Metode Penelitian

## Materi tanaman
Analisis QTL dilakukan pada progeni F1 hasil persilangan klon PB 260 x SP 217 yang ditanam di lapangan pada areal seluas 5  ha.  Penelitian  menggunakan  Rancangan Acak Kelompok yang terdiri dari 201 progeni F1  dan  setiap  progeni  ditanam  sebanyak  2 pohon dengan lima ulangan.
Sampel  daun  karet  muda  dikoleksi dari  masing-masing  progeni  F1  dan  kedua klon tetua di kebun percobaan dan langsung digunakan  untuk  isolasi  DNA  total.  DNA total  sebagai template untuk  analisis  SSR diisolasi  berdasarkan  metode  Orozco- Castillo  et  al.  (1994)  dengan  beberapa modifikasi.  Satu  gram  daun  muda  dari masing-masing  aksesi  digerus  dengan penambahan 0,1 g PVP (polivenil pirolidon) dan nitrogen cair sampai dihasilkan serbuk daun  yang  halus.  Selanjutnya  serbuk dimasukkan ke dalam 5 ml buffer ekstraksi yang  telah  dipanaskan  dan  diberi mercaptoethanol  1%,  di  vortex  serta dipanaskan selama 30 menit pada suhu 65 o C.
Analisis  Molekuler  dengan  Penanda  SSR ( Genotyping )
Sampel kemudian didinginkan pada suhu  kamar,  ditambahkan  dengan  5  ml (24:1)  chloroform:isoamilalkohol  (CI)  dan divortex.  Sampel  disentrifus  selama  10 menit  dengan  kecepatan  11.000  rpm  pada suhu  ruang.  Cairan  bagian  atas  dipipet  ke tabung  baru  dan  ditambahkan  dengan isopropanol  dingin  sebanyak  satu  volume. Sampel  dikocok  secara  perlahan  sampai homogen  dan  selanjutnya  disimpan  pada o suhu 4  C selama 30 menit, dan disentrifus 10  menit  dengan  kecepatan  11.000  rpm. Selanjutnya  pellet  DNA  diambil  dan dikeringkan. DNA yang diperoleh dilarutkan dalam 1 ml buffer TE (10 M Tris-HCl pH 8,0, 1 M EDTA), lalu ditambahkan CH COONa 3 3 M  pH  5,2  sebanyak  1/1  V  dan  ethanol absolut  sebanyak  2,5  ml,  selanjutnya dikocok  sampai  homogen  dan  disimpan
o pada  suhu  -20  C  selama  20  menit.
Isolasi DNA

## Studi Pendahuluan Konstruksi Peta Pautan Genetik dan Identifikasi Quantitative Trait Loci yang Terpaut dengan Pertumbuhan Awal Tanaman Karet
Genotyping dilakukan  dengan menggunakan  263  primer  SSR  terseleksi koleksi Laboratorium Bios, Cirad (Le Guen et al.,  2011b).  Reaksi  PCR  dilakukan  dalam volume 25 µl yang terdiri dari 1x PCR buffer, 0,2 mM dNTP mix, 2 mM MgCl , 0,5 U Taq 2 polymerase (Kapa Biosystem Inc. USA), 0,2 µM  masing-masing  primer,  dan  5  ng template DNA. Volume akhir diatur menjadi 25  µl  dengan  menambahkan nuclease  free water . Amplifikasi dilakukan menggunakan DNA thermal cycler (Thermal Cycler Applied Biosystem)  dengan  menggunakan  program o denaturasi awal pada 95  C selama 3 menit,
o diikuti  denaturasi  pada  95 C  selama  15
o detik,  annealing  53-56 C  selama  30  detik,
o extention 72 C selama 10 detik sebanyak 35 o siklus, dan final extention pada 72  C selama 10 menit.
Hasil PCR selanjutnya dikuantifikasi dan  dilakukan  pelabelan  menggunakan fluoresent.  Elektroforesis  hasil  amplifikasi PCR  dengan  primer  SSR  dilakukan  secara sistem  kapiler  menggunakan  alat Genetic Analyzer (Applied  Biosystem).  Hasil
elektroforesis  selanjutnya  dianalisis menggunakan software GeneMapper version 4.0.
Selanjutnya campuran disentrifus 10 menit dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4 o C,  dan  pellet  DNA  yang  diperoleh  dicuci dengan  ethanol  70%  dan  dikeringkan. Kemudian  pellet  dilarutkan  dalam  100  l o buffer TE dan disimpan pada suhu –20  C. K u a l i t a s   d a n   k u a n t i t a s   D N A   d i u j i menggunakan elektroforesis agarose 1%.
Amplifikasi PCR

## Penyusunan  Peta  Pautan  Genetik  dan Identifikasi QTL
Hasil genotyping 263  marka  SSR digunakan  untuk  menyusun  peta  pautan genetik  201  progeni  F1  menggunakan software Joint Map 4.1. Peta pautan genetik ( linkage  group )  201  progeni  F1  hasil persilangan  klon  PB  260  dengan  SP  217 disusun pada marker SSR yang bersegregasi dengan pola 1:1:1:1, 1:2:1, 3:1, dan 1:1. Pola segregasi  masing-masing  progeni  pada setiap  lokus  dilakukan  dengan  lima  tipe sistem  pengkodean  seperti  yang  tercantum pada Tabel 1.
A n a l i s i s   Q T L   d i l a k u k a n menggunakan  prosedur  interval  mapping (IM)  seperti  yang  dijelaskan  oleh  Lander  & Botstein (1989) serta prosedur multiple QTL mapping  (MQM)  menggunakan cofactor marker dengan skor nilai LOD tertinggi pada analisis  IM  yang  dilakukan  sebelumnya (Jansen,  1993).  Selanjutnya  untuk  melihat segregasi  masing-masing  lokus  dilakukan test  nonparametric  Kruskal-Wallis  (KW) (Ooijen,  2004).  Keberadaan  QTL  dilakukan berdasarkan LOD di atas 3. QTL yang berada pada  LOD  di  bawah  3  merupakan  putative QTL  yang  tingkat  signifikansinya  masih rendah.  Identifikasi  keberadaan  QTL  yang terpaut pertumbuhan lilit batang dilakukan menggunakan software Map QTL.
No No Kode Code Posisi Lokus Heterozigot Position of Heterizogous Locus Rasio Ratio Jumlah Alel Number of Allele 1 ab x cd Kedua tetua 1:1:1:1 4 2 eg x eg Kedua tetua 1:2:1 3 3 hk x hk Kedua tetua 1:2:1 atau 3:1 3 4 lm x ll Satu tetua 1:1 2 5 nn x np Satu tetua lain 1:1 2

## Table 1. Coding system of segregation pattern of mapping population obtained crossing of PB
260 x SP 217 by using SSR marker
Tabel 1. Sistem pengkodean pola segregasi populasi pemetaan hasil persilangan PB 260 x SP 217 dengan marka SSR

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pertumbuhan  Lilit  Batang  Tanaman  F1 Hasil  Persilangan  PB  260  x  SP  217 ( Phenotyping )
Evaluasi pertumbuhan 201 genotipe F1  dan  klon  tetua  dilakukan  setiap  bulan dari umur 16 sampai 22 bulan dengan cara pengukuran lilit batang pada ketinggian 150 cm  dpo.  Hasil  pengukuran  menunjukkan
bahwa  lilit  batang  tanaman  F1  pada  TBM umur  22  bulan  berkisar  5,5  –  25,04  cm dengan  rata-rata  14,66  cm.  Rata-rata penambahan  lilit  batang  progeni  F1  setiap bulan  berkisar  0,4  –  1  cm  setiap  bulan. Berdasarkan  koefisien  keragaman  (18,83) terlihat  bahwa  terdapat  keragaman pertumbuhan lilit batang yang cukup tinggi pada progeni F1 yang menunjukkan adanya segregasi karakter pertumbuhan lilit batang (Gambar 1).
Figure 1.   Distribution of girth (A) and growth comparison of girth of F1 progenies obtained from crossing of PB 260 x SP 217 with parent clone on 16-22 month after planting (B)
Gambar 1. Sebaran rata-rata lilit batang (A) dan perbandingan pertumbuhan lilit progeni F1 hasil persilangan PB 260 x SP 217 dengan kedua klon tetua pada umur 16 -22 bulan setelah tanam (B)
Studi Pendahuluan Konstruksi Peta Pautan Genetik dan Identifikasi Quantitative Trait Loci yang Terpaut dengan Pertumbuhan Awal Tanaman Karet
A n a l i s i s p h e n o t y p i n g d a t a pertumbuhan lilit batang dilakukan dengan menganalisis  rata-rata  lilit  batang  semua progeni F1 pada umur 16 – 22 bulan (G16 – G22)  dan  pertambahan  lilit  batang  dari umur 16 sampai 22 bulan (Gi 16-22). Hasil analisis  korelasi  Pearson  yang  dilakukan dengan  membandingkan  perhitungan menggunakan aritmatika dan analisis BLUB ( b e s t   l i n e a r   u n b i a s e d   p r e d i c t i o n ) m e n u n j u k k a n   t i n g g i n y a   k o r e l a s i pertumbuhan  lilit  batang  antar  bulan, namun  untuk  peningkatan  pertumbuhan lilit  batang  masih  tergolong  moderat  (Tabel 2). Informasi tersebut menunjukkan bahwa pengaruh  faktor-faktor  genetik  dan l i n g k u n g a n   y a n g   m e m e n g a r u h i pertumbuhan  lilit  batang  tanaman  karet bersifat  stabil  setiap  bulan  selama  masa p e n g a m a t a n .   D e n g a n   d e m i k i a n diperkirakan keberadaan QTL yang terpaut dengan  pertumbuhan  lilit  batang  tanaman karet  adalah  QTL  mayor  yang  akan terdeteksi  selama  masa  pengamatan tersebut (umur 16 – 22 bulan).
Penyusunan  Peta  Pautan  Genetik ( genotyping )  Populasi  Hasil  Persilangan PB 260 x SP 217
Penyusunan  peta  pautan  genetik atau linkage group (LG) 201 progeni F1 hasil persilangan  klon  PB  260  dengan  SP  217 dilakukan  menggunakan  263  marker  SSR terseleksi. Hasil analisis keterpautan marka yang  bersegregasi  dengan  pola  1:1:1:1, 1:2:1, dan 1:1 menggunakan program Joint Map menghasilkan 22 kelompok pautan (22
LG) dengan jarak kelompok pautan berkisar 1  –  119,2  cm.  Berdasarkan  jumlah kromosom  tanaman  karet  yaitu  18 kromosom,  jumlah  kelompok  pautan  yang diperoleh pada peta genetik ini sudah cukup baik. Hal ini karena kelompok pautan pada peta  genetik  merupakan  representatif  dari jumlah kromosom tanaman yang dianalisis (Collard  et  al.,  2005).  Pada  tanaman  karet, kelompok  pautan  ideal  yang  diharapkan adalah  sebanyak  18  LG  sesuai  dengan jumlah kromosom.
Penyusunan  peta  pautan  genetik pada  penelitian  dilakukan  berdasarkan informasi penyusunan  peta  pautan  genetik pada  populasi  hasil  persilangan  PB  260  x RRIM  600  yang  menggunakan  marka  SSR yang  sama  (Rattanawong  et  al.,  2009). Berdasarkan  informasi  tersebut  diketahui bahwa  beberapa  marker  SSR  yang  berada pada  LG  berbeda  pada  analisis  ini seharusnya berada dalam satu LG, sehingga
Adanya perbedaan LG yang diperoleh pada  penelitian  dengan  jumlah  kromosom merupakan  suatu  hal  yang  dapat  terjadi karena marka yang digunakan masih belum mampu  mendeteksi  beberapa  bagian  dari genom  tanaman  yang  dianalisis.  Hal tersebut dapat diatasi dengan penambahan marka-marka  yang  dapat  menjembatani beberapa LG yang seharusnya berada dalam satu  kesatuan.  Penggunaan  marka  yang lebih  banyak  akan  mampu  menghasilkan peta pautan genetik dengan kerapatan yang tinggi ( high density LG ) (Collard et al., 2005; Collard & Mackill, 2008).
Variabel Variable G16 G17 G18 G19 G20 G21 G22 G17 0.94 G18 0.92 0.95 G19 0.87 0.93 0.96 G20 0.81 0.88 0.93 0.97 G21 0.79 0.85 0.90 0.95 0.97 G22 0.76 0.82 0.88 0.93 0.96 0.98 Gi16-22 0.07 0.14 0.21 0.30 0.38 0.43 0.49
Tabel 2. Tabel korelasi lilit batang progeni F1 hasil persilangan PB 260 x SP 217 antar umur tanaman pada 16-22 bulan setelah tanam
Table 2. Correlation of girth of F1 progeny obtained from crossing of PB 260 x SP 217 16-22 month after planting
Identifikasi  keberadaan  QTL  yang terpaut  dengan  pertumbuhan  lilit  batang t a n a m a n   k a r e t   d i l a k u k a n   d e n g a n menggabungkan  data  peta  pautan  genetik yang  diperoleh  pada  kegiatan genotyping dengan data pertumbuhan lilit batang hasil analisis phenotyping menggunakan software Map  QTL.  Hasil  analisis  menunjukkan bahwa  terdapat  tiga  QTL  yang  terpaut dengan  pertumbuhan  lilit  batang  pada tanaman  berumur  22  bulan  setelah  tanam yang  berhasil  diidentifikasi.  QTL  tersebut ditemukan  pada  LOD  yang  cukup  tinggi yaitu 4,64 di LG no 14 dengan jarak 42,83 cM dari  marka  TAs2185,  dan  memberikan p e n g a r u h   s e b e s a r   1 1 , 7 %   t e r h a d a p keragaman  pertumbuhan  lilit  batang tanaman  karet  umur  22  bulan  (Tabel  3). Menurut  Collard  et  al.  (2005)  QTL  yang memberikan  pengaruh  diatas  10%  adalah tergolong  QTL  mayor,  yang  diperkirakan bersifat  stabil  dan  tidak  sensitif  terhadap perubahan  lingkungan.  Berdasarkan informasi  tersebut,  diharapkan  QTL  yang berhasil  diidentifikasi  pada  penelitian  ini cukup  kuat,  stabil  serta  konsisten  selalu ditemukan  pada  analisis  pertumbuhan  lilit batang selanjutnya.
Jumlah  kelompok  pautan  dan k e r a p a t a n   m a r k a   y a n g   d i h a s i l k a n merupakan  faktor  penentu  keberhasilan dalam  proses  identifikasi  QTL.  Semakin mendekati jumlah kromosom tanaman yang dianalisis  dan  semakin  tinggi  kerapatan marka dengan jarak yang dekat, maka akan semakin  informatif  peta  pautan  yang diperoleh.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa semakin  besar  bagian  genom  yang  dapat dianalisis.  Beberapa  peneliti  melaporkan b a h w a   Q T L   y a n g   t e r p a u t   d e n g a n pertumbuhan  lilit  batang  tanaman  karet berhasil  diidentifikasi  pada  23  LG  dengan kerapatan marka setiap 10 cm (Souza et al., 2013),  21  LG  kerapatan  5  cm  (Rosa  et  al., 2018),  18  LG kerapatan  3,5 cm (Conson et al.,  2018),  dan  15  LG  dengan  kerapatan marka 3 cm (An et al., 2019).

## Identifikasi QTL
Berdasarkan  analisis  korelasi  yang menunjukkan bahwa terdapat korelasi yang tinggi  pertumbuhan  lilit  batang  tanaman karet dari umur 16 sampai 22 bulan, maka analisis QTL dilakukan pada tanaman umur 22  bulan  dengan  perkiraan  bahwa  QTL tersebut  dapat  teridentifikasi  pada  semua u m u r   t a n a m a n .   S e l a i n   i t u ,   u n t u k
memastikannya juga dilakukan analisis QTL pada pertambahan lilit batang dari umur 16 bulan ke 22 bulan.
Selain  itu  juga  ditemukan  putative QTL yang terpaut pertumbuhan lilit batang pada LOD 3,5 di LG 13 dan LOD 3 di LG 1 pada umur 22 bulan setelah tanam (Gambar 2).  Hal  ini  berarti  bahwa  terdapat  gen-gen atau sekuen DNA pada kromosom no 14, 13, dan 1 yang memengaruhi pertumbuhan lilit batang  tanaman  karet  umur  22  bulan. Apabila  dibandingkan  dengan  penelitian yang  dilaporkan  oleh  Souza  et  al.  (2013) t e r l i h a t   b a h w a   L O D   Q T L   t e r p a u t p e r t u m b u h a n   l i l i t   b a t a n g   y a n g teridentifikasi  pada  penelitian  ini  masih lebih  rendah  dimana  pada  penelitian tersebut  diperoleh  QTL  pada  LG  5  dengan LOD mencapai 5,41, namun pengaruh QTL terhadap  keragaman  pertumbuhan  lilit batang  hanya  5,25%.  Rosa  et  al.  (2018) m e l a p o r k a n   b a h w a   1 5   Q T L   y a n g memberikan  pengaruh  sebesar  11,6% t e r h a d a p   p e r t u m b u h a n   b e r h a s i l d i i d e n t i f i k a s i   p a d a   p o p u l a s i   h a s i l
dibutuhkan  marka  tambahan  baik  marka SSR,  AFLP,  STS,  maupun  SNP  untuk menggabungkan  marka-marka  tersebut menjadi satu LG. Upaya penggabungan LG pada genome karet telah banyak dilaporkan. Lespinasse  et  al.  (2000)  memperoleh  18 kelompok pautan dengan kerapatan marka setiap  3  cm  pada  analisis  106  progeni  F1 hasil  persilangan  PB  260  x  RO38 menggunakan  717  lokus  yang  terdiri  dari 301 RFLP, 388 AFLP, 18 SSR, dan 10 isozim. Pada  populasi  yang  sama,  Le-Guen  et  al. (2007)  menggunakan  234  marka  SSR  di mana  marka  tersebar  setiap  10-15  cm. Demikian juga dengan analisis 351 progeni F1  hasil  persilangan  PB  260  x  MDF  180 menggunakan 203 marka SSR polimorfik, 96 AFLP,  dan  1  STS  yang  menghasilkan  18 kelompok  pautan  ( Le  Guen  et  al.,  2011a). Sedangkan Triwitayakorn  et  al.  (2011) memperoleh 23 peta pautan dengan interval antar lokus sebesar 11,9 cm pada analisis 81 tanaman F1 dengan 97 lokus SSR.
Studi Pendahuluan Konstruksi Peta Pautan Genetik dan Identifikasi Quantitative Trait Loci yang Terpaut dengan Pertumbuhan Awal Tanaman Karet
Gambar  2.  Posisi  QTL  yang  terpaut  dengan  pertumbuhan  lilit  batang  populasi  F1  hasil persilangan PB 260 x SP 217 umur 22 bulan setelah tanam pada linkage group 14 LOD 4,64 (A), linkage group 1 LOD 3 (B), dan linkage group 13 LOD 3,5 (C).
Figure 2.   Position of QTLs linked to growth of girth of F1 population obtained from crossing of PB 260 x SP 217 on 22 month old after planting on linkage group 14 LOD 4.64 (A), Linkage group 1 LOD 3 (B) and linkage group 13 LOD 3.5 (C).
Gambar  3.  Posisi  QTL  yang  terpaut  dengan  penambahan  lilit  batang  tanaman  karet  dari umur 16 sampai 22 bulan setelah tanam pada linkage group 14 LOD 4,1
Figure 3.   Position of QTL linked to increasing of girth of rubber plant from 16-22 month old after planting on linkage group 14 LOD 4.1
persilangan  PR  255  dan  PB  217  dengan kerapatan  marka  mencapai  5  cM.  Hasil terbaik  dilaporkan  oleh  An et  al .  (2019), dimana  dengan  kerapatan  marka  yang mencapai 3,5 cM berhasil diidentifikasi total 38  QTL  yang  memberikan  pengaruh mencapai  14,07%  terhadap  pertumbuhan diameter batang tanaman karet.
Identifikasi  keberadaan  QTL  juga dilakukan  pada  pertambahan  lilit  batang
dari tanaman umur 16 bulan sampai umur 22 bulan. Analisis menunjukkan bahwa QTL pada  kromosom  14  juga  ditemukan  pada nilai LOD 4,1. Hal ini menunjukkan bahwa keberadaan QTL tersebut diduga kuat akan ditemukan pada pertumbuhan lilit batang di umur  tanaman  berikutnya  (Gambar  3). Kestabilan  keberadaan  QTL  tersebut  akan d i a m a t i   p a d a   t a h a p   p e r t u m b u h a n selanjutnya.
Table 3. Effect of QTLs on LG 14 to variation of girth growth of rubber plant 22 month old Tabel 3. Pengaruh QTL pada LG 14 terhadap variasi pertumbuhan lilit batang tanaman karet umur 22 bulan

## KESIMPULAN DAN SARAN
Lilit  batang  progeni  F1  hasil persilangan PB 260 x SP 217 umur 22 bulan setelah  tanam  berkisar  5,5  –  25,04  cm dengan  rata-rata  14,66  cm.  Penambahan rata-rata lilit batang progeni F1 setiap bulan yaitu  berkisar  0,4  –  1  cm.  Berdasarkan koefisien keragaman terlihat bahwa terdapat keragaman  segregasi  pertumbuhan  lilit batang yang cukup tinggi pada progeni F1. Analisis QTL menunjukkan bahwa terdapat
tiga QTL yang terpaut dengan pertumbuhan lilit  batang  tanaman  umur  22  bulan  yang berhasil  diidentifikasi  yaitu  pada  LG  no  14 pada LOD 4,64, LG no 13 LOD 3,5 dan LG 1 LOD 3. Selain itu juga ditemukan QTL yang terpaut  dengan  penambahan  lilit  batang tanaman  umur  16  bulan  sampai  22  bulan yaitu  pada  LG  14  LOD  4,1.  Untuk  melihat kestabilan  keberadaan  QTL  tersebut  perlu dianalisis  secara  berkala  sesuai  dengan pertumbuhan tanaman.

## Studi Pendahuluan Konstruksi Peta Pautan Genetik dan Identifikasi Quantitative Trait Loci yang Terpaut dengan Pertumbuhan Awal Tanaman Karet

## UCAPAN TERIMA KASIH

## DAFTAR PUSTAKA
Chanroj, V., Rattanawong, R., Phumichai, T., Tangphatsornruang, S., & Ukoskit, K. (2017).  Genome-wide  association mapping  of  latex  yield  and  girth  in Amazonianaccessions  of Hevea brasiliensis grown  in  a  suboptimal climate zone. Genomics , 109, 475-484. doi:  http://dx.doi.org/  10.1016/ j.ygeno.2017.07.005
Collard,  B.  C.  Y.,  &  Mackill,  D.  J.  (2008).
M a r k e r - a s s i s t e d   s e l e c t i o n :   a n approach for precision plant breeding in  twenty-first  century. Philosophical Thansactions of the Royal Society , 363, 557-572.
Terima kasih diucapkan kepada Dr. Pascal  Montoro  dan  Dr.  Andre  Clement- Demange,  Cirad,  Perancis  atas  training, diskusi dan masukan yang diberikan selama penelitian pendahuluan dilakukan.
Collard, B. C. Y., Jahufer, M. Z. Z., Brouwer, J.  B.,  &  Pang,  E.  C.  K.  (2005).  An introduction  to  markers,  quantitative trait  loci  (QTL)  mapping  and  marker- a s s i s t e d   s e l e c t i o n   f o r   c r o p improvement:  The  basic  concepts. Euphytica, 142, 169-196.
An, Z., Zhao, Y., Zhang, X., Huang, X., Hua, Y.,  Cheng,  H.,  Li,  X.,  &  Huang,  H. (2019). A high-density genetic map and
QTL  mapping  on  growth  and  latex y i e l d - r e l a t e d   t r a i t s   i n   H e v e a brasiliensis Müll. Arg. Industrial Crops P r o d u c t i o n ,   3 2 ,   4 4 0 - 4 4 8 .   d o i : doi.org/10.1016/j.indcrop.2019.03.0 02.
Jansen,  R.  C.  (1993).  Interval  mapping  of multiple  quantitative  trait  loci. Genetics , 135, 205– 211.
Khan,  S.  (2015).  QTL  mapping:  A  tool  for improvement in crop plants. Research Journal of Recent Sciences , 4, 7-12.
Le Guen, V., Garcia, D., Doaré, F., Mattos, C., Condina, V., Couturier, C., & Seguin, M.  (2011a).  A  rubber  tree's  durable resistance  to Microcyclus  ulei is conferred  by  a  qualitative  gene  and  a major  quantitative  resistance  faktor. Tree Genetic Genome , 7, 877–889.
Le Guen, V., Garcia, D., Mattos, C., Doare, F., Lespinasse, D., & Seguin, M. (2007). By passing  of  a  phyllogenic Microcyclus ulei resistance in rubber tree analyzed by  QTL  detection. New  Phytologist , 173, 335-345.
Lander, E. S., & Botstein D. (1989). Mapping m e n d e l i a n   f a k t o r s   u n d e r l y i n g quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics , 121, 185– 199.
Conson, A. R. O., Taniguti, C. H., Amadeu, R. R., Andreotti, I. A. A., de Souza, L. M., dos Santos, L. H. B., Rosa, J. R. B. F., Mantello, C. C., da Silva, C. C., José, S. J.  E.,  Ribeiro,  R.  V.,  Le  Guen,  V., Garcia, A. A. F., de Souza, G. P., & de Souza,  A.  P.  (2018).  High-resolution genetic  map  and  QTL  analysis  of growth-related  traits  of Hevea b r a s i l i e n s i s c u l t i v a t e d   u n d e r suboptimal temperature and humidity conditions. Front  Plant  Science , 9,
1255. doi: 10.3389/fpls.2018.01255
Grattapaglia,  D.,  &  Sederoff,  R.  (1994). Genetic  linkage  maps  of Eucaliptus grandis and Eucaliptus urophylla using pseudo-test-cross-mapping  strategy and  RAPD  markers. Genetics ,  137,
1121-1137.
Oktavia
Semagn, K., Bjornstad, A., & Ndjiondjop, M. N.  (2006).  Principles,  requirements and  prospects  of  genetic  mapping  in p l a n t s . A f r i c a n   J o u r n a l   o f Biotechnology , 5(25), 2569-2587.
Souza, L., Gazaffi, R., Mantello, C., Silva, C., Garcia, D., & Le Guen, V. (2013). QTL mapping  of  growth-related  traits  in  a full-sib  family  of  rubber  tree  ( Hevea brasiliensis )  evaluated  in  a  sub- tropical climate. PLoS One , 8(4), 1-10
Oktavia,  F.,  Sudarsono,  Dinarti,  D.  (2021).
P r e l i m i n a r y   Q T L   d e t e c t i o n   f o r C o r y n e s p o r a   l e a f   f a l l   d i s e a s e resistance in rubber plant. Nusantara B i o s c i e n c e , 1 3 ,   5 3 - 6 1 .   d o i : https://doi.org/10.13057/nusbiosci/ n130108
Novalina,  &  Sagala,  A.  D.  (2013). Construction  of Hevea  brasiliensis genetic linkage map and Identification of  quantitative  trait  loci  using  RAPD markers. International  Journal  of Advance  and  Science  Engineering Information Technology, 3(1), 71-75.
Lespinasse, D., Rodier-Goud, M., Grivet, L., Leconte, A., Legnate, H., & Seguin, M. (2000).  A  saturated  genetic  linkage map of rubber tree ( Hevea spp.) based on  RFLP,  AFLP,  microsatellite  and isozyme  markers. Theoritical  and Applied Genetics , 100, 127-138.
Le Guen, V., Gay, C., Xiong, T. C., Souza, L. M.,  Rodier-Goud,  M.,  &  Seguin  M. ( 2 0 1 1 b ) .   D e v e l o p m e n t   a n d c h a r a c t e r i z a t i o n   o f   2 9 6   n e w polymorphic microsatellite markers for rubber tree ( Hevea brasiliensis ). Plant Breeding ,  130(2),  294-296.  doi: 10.1111/j.1439-0523.2010.01774.x
Le Guen, V., Garcia, D., Mattos, C., Fouet, O., Doaré,  F.,  Condina,  V.,  &  Seguin,  M. (2013).  A  newly  identified  locus controls  complete  resistance  to Microcyclus ulei in the Fx2784 rubber clone. Tree Genetic Genome , 9(3), 805-
812.  doi:  10.1007/s11295-013-0599- 7.
Le  Guen,  V.,  Lespinasse,  D.,  Oliver,  G., Rodier-Goud, M., Pinard, F., & Seguin, M. (2003). Molecular mapping of genes conferring  field  resistance  to  South
American Leaf Blight ( Microcyclus ulei ) in rubber tree. Theoritical and Applied Genetics ,  108(1),  160-167.  doi: 10.1007/s00122-003-1407-9
Orozco-Castillo, Chalmers, C., Waugh, R., & Powell, W. (1994). Detection of genetic d i v e r s i t y   a n d   s e l e c t i v e   g e n introgression  in  coffee  using  RAPD markers. Theoritical  and  Applied Genetics , 87, 934-940.
Rattanawong, R., Prapan, K., Lekawipat, N., Seguin,  M.,  Clement-Demange,  A. (2009).  Detection  of  QTLs  assotiation with  growth,  latex  production  and rubber  quality  for  the  development  of Marker  Asissted  Selection  ( Hevea brasiliensis ).  IRRDB  workshop  on genome and transcriptome.
Rosa, J. R. B. F., Mantello, C. C., & Garcia, D. (2018).  QTL  detection  for  growth  and latex  production  in  a  full-sib  rubber tree  population  cultivated  under suboptimal  climate  conditions. BMC Plant  Biology, 18(223),1-16.  doi: doi.org/10.1186/s12870-018-1450-y .
Ooijen, V. J. W. (2004). MapQTL® 5, Software for  the  mapping  of  quantitative  trait loci  in  experimental  populations. Wageningen, the Netherlands: Kyazma BV.
.
Souza, L., Mantello, C., Suzuki, F., Rodrigo, G., & Le Guen, V. (2011). Development of  a  genetic  linkage  map  of  rubber ( H e v e a   b r a s i l i e n s i s )   b a s e d   o n m i c r o s a t e l l i t e   m a r k e r s .   P a p e r p r e s e n t e d   a t   t h e   I U F R O   t r e e biotechnology conference.   26 Jun - 2 Jul  2011,  Arraial  D'Ajuda,  Bahia, Brazil.
Studi Pendahuluan Konstruksi Peta Pautan Genetik dan Identifikasi Quantitative Trait Loci yang Terpaut dengan Pertumbuhan Awal Tanaman Karet
Tran, D. M., Cle´ment-Demange, A., De´on, M., Garcia, D., Le Guen, V., Cle´ment- Vidal,  A.,  et  al.  (2016).  Genetic D e t e r m i n i s m   o f   s e n s i t i v i t y   t o Corynespora  cassiicola exudates  in rubber  tree  ( Hevea  brasiliensis ). PLoS
ONE ,  11(10).  doi:10.1371/journal. pone.0162807 Triwitayakorn,  K.,  Chatkulkawin,  P., Kanjanawattanawong, S., Sraphet, S.,
Y o o c h a ,   T . ,   S a n g s r a k r u ,   D . , Chanprasert,  J.,  Ngamphiw,  C., Jomchai,  N.,  Therawattanasuk,  K. , et al.  (2011).  Transcriptome  sequencing of Hevea  brasiliensis for  development o f   m i c r o s a t e l l i t e   m a r k e r s   a n d construction of a genetic linkage map. DNA Research, 18, 471-482.

## Oktavia