Abstrak— Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengidentifikasi spesies  isolat  bakteri  galur  D  dengan  menggunakan  pengujian secara genotip. Isolat bakteri galur D merupakan bakteri termofilik yang  diisolasi dari  sumber  mata  air  panas  Songgoriti,  Malang. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi  spesies  isolat bakteri galur D dengan metode analisa sekuen fragmen 16S rDNA. Kromosom  isolat  bakteri  galur  D  diisolasi  dan  diamplifikasi menggunakan PCR, selanjutnya dilakukan analisa sekuen fragmen gen  16S  rDNA.  Hasil  analisa  dibandingkan  dengan  sekuen  16S rDNA yang terdaftar di Bank Gen untuk mengetahui homologinya dengan  bakteri  lain.  Hasil  analisa  ini  menunjukkan  fragmen  gen 16S  rDNA  memiliki  kecocokan  dengan  Caldicellulosiruptor kristjanssonii dengan homologi sebesar 99%.
Kata Kunci— Fragmen gen 16S rDNA; PCR; Caldicellulosiruptor kristjanssonii.

## I. PENDAHULUAN
ndonesia  merupakan  negara  kepulauan  beriklim  tropis yang  banyak  memiliki  sumber  daya  alam  seperti  kawah gunung  berapi  maupun  sumber  air  panas.  Sumber  air panas  ini  memiliki  potensi  mengandung  organisme termofilik.  Termofilik  secara  umum  diartikan  sebagai organisme yang hidup pada suhu di atas 45 °C. Organisme ini menarik minat ilmuwan terutama setelah ditemukan bakteri-bakteri  yang  hidup  pada  suhu  didih  air  atau bahkan  lebih  tinggi.  Bakteri  termofilik  merupakan bakteri  dengan  kemampuan  bertahan  hidup  pada kondisi  panas  sampai  dengan  ekstrim  panas,  bahkan bakteri  termofilik  ada  yang  mampu  bertahan  hidup pada suhu 250 °C [1].
Bakteri  termofilik  berhasil  diisolasi  sebanyak  86  jenis bakteri  termofilik  penghasil  amilase  dengan  suhu pertumbuhan  optimum  40-70 °C dari  sumber  air  panas Rimbo Panti [2].  Bakteri termofilik  juga  berhasil diisolasi dari  sumber  air  panas  Danau  Ranau  Sumatera  selatan  dan didapat  dua  isolat  yang  merupakan  genus Bacillus  sp [3]. Bakteri  jenis Geobacillus  thermoleovourans diisolasi  dari sumber air Gedong Songo dan diidentifikasi dengan metode analisis  gen  16S  rDNA  yang  dapat  tumbuh  pada  kisaran suhu 65-70 °C [4].
Berdasarkan penelitian tentang isolasi bakteri termofilik dari  sumber  mata  air  panas  Songgoriti  dengan  sampel  air panas  yang  diambil  pada  suhu  50 °C dengan  pH  5,5 diperoleh  isolat  bakteri  galur  D  yang  kemudian  dilakukan pengujian  fenotip  menggunakan  uji  pewarnaan  gram,  uji fermentasi  glukosa  dan  uji  Na + .  Pengujian  pada  isolat bakteri  galur  D  tersebut  menunjukkan  isolat  bakteri
termasuk  bakteri  gram  negatif,  memiliki  sel  berbentuk batang,  positif  terhadap  uji  fermentasi  glukosa  dan  positif terhadap  uji  Na + .  Berdasarkan  pengujian  secara  fenotip ini, disimpulkan bahwa isolat bakteri galur D merupakan Vibrio sp [5].
Meski  demikian,  identifikasi  menggunakan  pengujian berdasarkan  sifat  fenotip  memiliki  kelemahan  karena  sifat fenotip  bakteri  dapat  berubah  sesuai  dengan  keadaan lingkungannya  yang  dapat menyebabkan  bakteri  berevolusi [6],  sehingga  diperlukan  pengujian  identifikasi  bakteri menggunakan  pengujian secara  genotip dengan mengetahui sekuen basa nitrogen pada nukleotida penyusun fragmen gen 16S  rDNA.  Metode  ini  memiliki  keunggulan  dibandingkan menggunakan pengujian fenotip karena urutan basa nitrogen dari  seluruh  spesies  bakteri  yang  telah  ditemukan  dapat dijadikan pedoman apabila ditemukan spesies baru.
Pada penelitian ini, karakterisasi bakteri termofilik dari isolat  bakteri  galur  D  ditentukan  sampai  tingkat  spesies dengan  dilakukan  amplifikasi  menggunakan Polymerase Chain  Reaction (PCR).  Hasil  amplifikasi  ini  kemudian  di sekuensing untuk mengetahui fragmen gen 16S rDNA yang kemudian dicocokkan dengan database dari bank gen.

## II. METODELOGI PENELITIAN

## A. Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  antara  lain seperangkat  peralatan  gelas,  mikropipet  1-10  µL,  tabung eppendorf, tabung PCR, microwave, parafilm, tip putih, satu peralatan  elektroforesis  (Biorad  Power  PAC  300),  satu  set peralatan  purifikasi,  satu  set  peralatan  pembuatan  gel agarosa, sentrifuge, inkubator dan PCR.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu kultur cair  isolat  bakteri  galur  D,  SDS  ( sodium  dodecyl  sulphate ) 10%,  proteinase  K  konsentrasi  10  mg/ml,  larutan  PCI (Fenol: kloroform: isoamil alkohol perbandingan 25: 24: 1), etanol  absolut  dingin,  etanol  70%,  ddH 2 O,  buffer  Te  (Tris EDTA),  buffer  STE  (Saline  Tris  EDTA),  enzim  DNA polymerase ,  primer forward dan  reverse,  stok  dNTP mengandung  dTTP;  dATP;  dGTP;  dan  dCTP,  buffer  PCR, MgCl,  larutan  EtBr,  agarosa,  buffer  TAE  (Tris  Asetat EDTA), marker DNA 1 kb (Intron Biotechnology).

## B. Isolasi DNA Kromosom Bakteri Galur D
Kultur cair isolat bakteri D sebanyak 10 ml dipisahkan dengan sentrifus dalam tabung eppendorf 1000 µL selama 2 menit  dengan  kecepatan  10000  rpm.  Supernatan  yang terbentuk  dibuang,  endapannya  disuspensi  dengan menambahkan  buffer  STE  sebanyak  500  µL.  Larutan dihomogenkan menggunakan vortex dan dipisahkan dengan

## Identifikasi Spesies Isolat Bakteri Galur D dengan Metode Analisa Sekuen Fragmen Gen 16S rDNA
Laras Nurwati dan Refdinal Nawfa Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS)
Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia e-mail : refnawfa@chem.its.ac.id
I
sentrifus  selama  2  menit.  Supernatan  dibuang  dan  pellet  di resuspensi dengan 500 µL buffer TE dan 100 µL SDS 10%. Larutan  dihomogenkan,  kemudian  ditambah  10  µL proteinase K dan di inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 °C. Setelah  inkubasi,  ditambahkan  500 µL  larutan  PCI. Larutan  dipisahkan  dengan  sentrifus  dengan  kecepatan 10000  rpm  selama  10  menit,  diambil  larutan  bagian  atas sebanyak  400  µL  dan  dipindahkan  ke  tabung  eppendorf steril  lain.  Etanol  absolut  dingin  sebanyak  800  µL ditambahkan kedalam larutan, selanjutnya didinginkan pada suhu  4 °C selama  30  menit.  Setelah  didinginkan, tabung  eppendorf  dipisahkan  dengan  sentrifus  selama 10  menit  dengan  kecepatan  10000  rpm.  Supernatan yang  diperoleh  dibuang  dan  endapan  diresuspensi dengan  etanol  70  %.  Larutan  dipisahkan  dengan sentrifus  kembali  selama  10  menit  dengan  kecepatan 10000  rpm.  Endapan  yang  diperoleh  dikeringkan menggunakan  evaporator.  Endapan  kering  di resuspensi dengan menambahkan 50 µL ddH 2 O.

## C. Pembuatan Gel Agarosa
Bubuk agarosa sebanyak 0,4 gram dilarutkan dalam 40 ml  buffer  TAE.  Campuran  dipanaskan  dengan  microwave selama  2  menit.  Larutan  selanjutanya  dituangkan  ke  dalam chamber elektroforesis,  setelah  mengeras  ditambahkan buffer TAE hingga gel terendam.

## D. Pemisahan  DNA  Kromosom  Galur  D  dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Loading  buffer  sebanyak  3  µL  disiapkan  pada  lembar parafilm.  Sampel  hasil  isolasi  DNA  ditambahkan  sebanyak 7 µL ke dalam loading buffer. Marker DNA dimasukkan ke dalam  lubang  sumur  paling  ujung  di  gel  agarosa. Elektroforesis dilakukan selama 30 menit dengan tegangan 5 V/cm,  setelah  itu  gel  direndam  dalam  larutan  EtBr  selama 10  menit  untuk  proses  pewarnaan.  Seusai  pewarnaan,  gel agarosa  direndam  dalam  air  selama  1  menit.  Pengamatan migrasi  DNA  dilakukan  menggunakan  lampu  UV transiluminator.

## E. Amplifikasi Fragmen 16S rDNA
Larutan DNA cetakan sebanyak 5 µL, reagen multimix PCR sebanyak 25 µL, primer forward 5’CACGGTCTTCTTCGCCCTC(A/T)CGCCGGTT-3’ sebanyak 5 µL,
primer reverse 3’GTGAAGCTTACGGYTACCTTGTTACGACTT-5’ sebanyak  5  µL  (Promega  Corporation,  USA)  dan  ddH 2 O sebanyak  10 µL dimasukkan ke dalam tabung PCR dengan pengaturan  suhu  prapemisahan  95 °C selama  5  menit, suhu  pemisahan  95°C semala  30  detik,  suhu penempelan  primer  60  °C selama  30  menit  dan  suhu perpanjangan rantai 72 °C selama 1 menit.
F. Pemurnian Produk Amplifikasi dengan Gel Agarosa
Hasil amplifikasi diambil sebanyak 30 µL dimasukkan ke  eppendorf,  kemudian  ditambahkan  ddH 2 O  sebanyak  70 µL  dan binding  buffer sebanyak  500  µL.  Campuran dipisahkan  dengan  sentrifus  selama  1  menit  dengan kecepatan  10000  rpm.  Larutan  yang  terpisah  dibuang, ditambahkan  buffer  pencuci  sebanyak  500  µL  dan dipisahkan  dengan  sentrifus  kembali.  Pencucian  dengan buffer  dilakukan  dua  kali.  Tabung  pemisah  dimasukkan  ke dalam  tabung eppendorf,  ditambahkan  ddH 2 O  sebanyak  25 µL  dipisahkan  dengan  sentrifus  kembali.  Larutan  yang diperoleh pada dasar dipisahkan dengan gel elektroforesis.

## G. Analisa Sekuen Fragmen Gen 16S rDNA
Larutan hasil pemurnian produk amplifikasi di analisa dengan  sekuen  fragmen  gen  16S  rDNA  menggunakan primer forward.
H. Analisa  Filogenetik  Gen  16S  rDNA  dari  Isolat  Bakteri Galur D yang Diidentifikasi
Urutan sekuen fragmen gen 16S rDNA yang diperoleh selanjutnya  diupload ke bank gen melalui  program  BLAST pada  website www.ncbi.nlm.nih.gov untuk  mengetahui kemiripannya  dengan  gen  16S  rDNA  yang  sudah dilaporkan.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Isolasi DNA Kromosom Bakteri galur D
DNA kromosom bakteri galur D yang berhasil di isolasi dilarutkan  dalam  ddH 2 O  dan  disimpan  dalam  suhu  -20 °C sebelum di analisa menggunakan elektroforesis.

## Gambar 1. Hasil isolasi DNA kromosom bakteri galur D

## B.  Pemisahan  DNA  Kromosom  Galur  D  dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Uji elektroforesis dilakukan untuk mengetahui kualitas DNA  hasil  isolasi  serta  ukuran  DNA  tersebut.  Uji elektroforesis  ini  menggunakan  alat  elektroforesi  dan marker  DNA  berukuran  250-10000  bp.  Hasil  elektroforesis tersaji pada Gambar 2.
Pada  gambar  terdapat  dua  jalur  migrasi  DNA  isolat bakteri galur D. Pita pertama terdapat  diatas 10000 bp. Hal ini  menunjukkan adanya  molekul  dengan  ukuran lebih  dari 10000  bp.  Pita  yang  tipis  mengindikasikan  konsentrasi molekul yang terseparasi pada daerah ini rendah, sedangkan adanya  pita  di  1500  dan  250  bp  menunjukkan  adanya molekul lain yang diduga merupakan DNA plasmid.

## Gambar 2. Pola pita elektroforesis DNA kromosom isolat bakteri galur D

## C. Amplifikasi Fragmen 16S rDNA
Amplifikasi  fragmen  gen  26S  rDNA  dilakukan menggunakan PCR sebanyak 25 siklus. Tiap siklus memiliki
250 bp 1500 bp 10000 bp Pita DNA Isolat Bakteri galur D Marker
tahap  pengaturan  suhu  tertentu.  Pada  proses  awal,  diawali dengan  tahap  inisiasi  dimana  suhu  ditahan  ( hold ). Hold pertama  berlangsung  pada  suhu  96  °C  selama  5  menit. Fungsi  inisiasi hold ini  untuk  mendenaturasi  rantai  DNA awal yang panjang agar terdenaturasi sempurna. Pada proses akhir dilakukan hold kedua yang berfungsi menyempurnakan perpanjangan rantai. Setelah tahap inisiasi masuk  ke  dalam  tahap  denaturasi  untuk memisahkan rantai ganda  menjadi  rantai  tunggal  dengan  cara  memutuskan ikatan  hidrogen  menggunakan  suhu  tinggi.  Suhu  pada  saat denaturasi    95  C  selama  30  detik.  Kemudian  dilanjutkan dengan  tahap  penempelan primer  pada DNA  rantai  tunggal dengan  suhu 60  C selama  30  menit.  Tahap  ini dilanjutkan dengan  proses  perpanjangan rantai (elongasi)  yang  berjalan dengan suhu 72  C selama 1 menit.

## .
Gambar 3 Pita elektroforesis fragmen gen 16S rDNA bakteri galur D
Fragmen  gen  16S  rDNA  yang  telah  di  amplifikasi kemudian  diuji  dengan  elektroforesis  untuk  mengetahui hasil amplifikasi. Dari hasil elektroforesis terdapat pita pada marker  di  daerah  1500  bp. Pada  Gambar  3,  hasil elektroforesis fragmen  gen 16S rDNA bakteri galur D pada jalur migrasi ke-1 pita elektroforesis yang dihasilkan berupa pita tebal tanpa adanya pengotor dibandingkan dengan jalur migrasi  ke-2  terlihat pita  tebal  dengan  bagian  yang terseparasi  diatas  daerah  1500  bp.  Bagian  yang  melebar diatas  1500  bp  diduga  merupakan  RNA  Keberadaan  RNA dalam  larutan  DNA  disebabkan  karena  tidak  ditambahkan enzim  RNAse  pada  prosedur  ini [7].  Berdasarkan  hasil  ini, pita  elektroforesis  pada  jalur  migrasi  1  digunakan  untuk proses  pemurnian  selanjutnya  sebelum  dilakukan  analisa sekuensing.

## D. Pemurnian Produk Amplifikasi dengan Gel Agarosa
Purifikasi  hasil  amplifikasi  fragmen  gen  16S  rDNA dilakukan untuk menghilangkan sisa enzim i taq-polymerase, dNTP  dan  sisa  reagen  amplifikasi  lainnya.  Purifikasi  ini penting  dilakukan  karena  sisa  reagen  amplifikasi  akan mengganggu proses analisa urutan sekuen fragmen gen 16S rDNA
Berdasarkan  pita  elektroforesis  yang  terlihat  pada Gambar 4, terlihat  ada satu  pita  berada  di  marker  1500  bp. Hal  ini  menunjukkan  hanya  terdapat  satu  jenis  molekul fragmen gen 16 rDNA  bakteri isolat  D tanpa ada pengotor. Dari  hasil  ini,  sampel  hasil  purifikasi  ini  dapat  dilanjutkan ke uji sekuen fragmen gen 16S rDNA.

## Gambar 4 Pita elektroforesis produk amplifikasi setelah purifikasi

## E. Analisa Sekuen Fragmen Gen 16S rDNA
Analisa  sekuen  fragmen  gen  16S  rDNA  dilakukan menggunakan  software  Sequence  Scanner  dari Applied Biosystems. Hasil purifikasi kemudian disekuensing. Primer yang digunakan primer forward seperti pada PCR. Dari hasil sekuen fragmen gen 16S rDNA didapat pada primer forward sebanyak 449 sekuen. Urutan basa nukleotidanya yaitu :
TNCGCTGGCGGCGTGCCTAACGCATGCAAGTCGAG CGGAGATGGTAGCTGAAGGTGATGAGCTGGAAGCT ATCATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGA GCAACCTACCCTCAGCACGGGGATAACAGCTCGAA AGGGCTGCTAATACCCGATGGGACCACGGCATCGC ATGGTGCTGTGGTGAAAGGGTAGCCGGAGAGGCTA TGCCGGCTGGGGATGGGCTCGCGGCCCATCAGCTA GTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGG GTAGCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACAGTGGGA CTGAGACACGGCCCACACTCCTACGGGAGGCAGCA GCGGGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACG CAGCGACGCCGCGTGAGGGAAGAAGCCCTTCGGG GTGTAAACCTCTTTGGACGGAGTAAGCTAG
Sekuen fragmen 16S rDNA yang didapat ini kemudian diunggah  melalui  program Basic  Local  Alignment  Search Tool (BLAST)  pada  website ncbi.nlm.nih.gov untuk mengetahui homologinya dengan sekuen 16S rDNA bakteri lain  yang  telah  terdaftar  pada  database  bank  gen  untuk mengetahui spesies bakteri tersebut.

## F.  Analisa  Filogenetik  Gen  16S  rDNA  dari  Isolat  Bakteri Galur D yang di Identifikasi
Berdasarkan  hasil  sekuen  fragmen  gen  16S  rDNA, didapat  pada  primer  forward  sebanyak  449  sekuen.  Hasil jumlah sekuen yang  didapatkan pada penelitian ini  berbeda bila  dibandingkan  dngan  uji  elektroforesis  yang  diketahui bahwa  fragmen  16S  rDNA  yang  teramplifikasi  memiliki ukuran sekitar 1500 bp. Hal ini dapat disebabkan antara lain konsentrasi dan stabilitas enzim polimerase yang digunakan ataupun lama reaksi pada proses sekuensing.
Menurut  hasil  sekuen  yang  telah  dicocokkan  dengan database  bank  gen,  sekuen  yang  melekat  pada  primer forward  homolog  dengan Caldicellusiruptor  kristjanssonii dengan  kemiripan  sebesar  99%,  Caldicellusiruptor lactoaceticus 6A sebesar 99% dan Caldicellusiruptor  bescii DSM  6725  (memiliki  nama  sinonim Anaerocellum thermophilum DSM  6725)  sebesar  97%.  Hasil  sekuen  ini menunjukkan tidak adanya kemiripan antara  bakteri Vibrio sp dengan isolat bakteri galur D karena tidak ada homologi yang ditemukan.
Bakteri galur D Marker 1 2
Hasil Amplifikasi 1500 bp
Hasil Purifikasi 1500 bp
Bakteri Caldicellusiruptor  kristjanssonii ditemukan  di sumber  mata  air  panas  di  Islandia [8],  termasuk  bakteri anaerob  berbentuk  batang  (2,8-9,4  x  0,7 μm ),  tidak  dapat bergerak  aktif    (non  motil),  tidak  memiliki  spora  dan termasuk  bakteri  gram  negatif  yang  hidup  pada  kondisi ekstrim  termofilik  pada  suhu  45-82  C dengan  suhu pertumbuhan  optimal  78  C . Bakteri Caldicellusiruptor kristjanssonii dapat  hidup  pada  pH  5,5-8,0  dengan  pH  7 sebagai  derajat  keasaman  optimal  pertumbuhan.  Uji fermentasi  glukosa  pada Caldicellusiruptor  kristjanssonii menghasilkan produk akhir berupa asam asetat, asam  laktat, etanol dan asam format. Uji sensitifitas NaCl juga dilakukan dengan  penambahan  NaCl  sebesar  1-2%,  dimana  pada penambahan  tersebut  tidak  menghambat  pertumbuhan Caldicellusiruptor kristjanssonii.
Bakteri Caldicellusiruptor  lactoaceticus 6A yang diisolasi dari sumber mata air panas [9], merupakan bakteri anaerob  yang  hidup  pada  suhu  50-78  C  dengan  suhu optimal pertumbuhan 68  C.  Bakteri ini merupakan bakteri anaerob    berbentuk  batang  (1,5-3,5  x  0,7  μm),    non  motil dan  tidak  memiliki  spora. Caldicellusiruptor  lactoaceticus 6A  dapat  tumbuh  pada  pH  5,8-8,2  dengan  pH  7  sebagai derajat  keasaman  optimal.  Hasil  fermentasi  mayor Caldicellusiruptor  lactoaceticus 6A  berupa  asam  laktat, asam  asetat  dan  gas  hidrogen,  sedangkan  hasil  fermentasi minor berupa gas karbon dioksida dan etanol. Uji NaCl yang dilakukan menggunakan NaCl 1% pada media pertumbuhan, dimana  penambahan  NaCl  ini  tidak  menghambat pertumbuhan bakteri.
Berdasarkan  analisa  hasil  sekuensing  yang  diperoleh, hal  ini    berbeda  dengan  dugaan  semula yang mengidentifikasi  isolat  bakteri  galur  D  sebagai Vibrio  sp dengan menggunakan beberapa pengujian seperti pewarnaan gram,  uji  fermentasi  glukosa  dan  uji  Na + [5].  Pengujian dengan  uji Na + menggunakan NaCl 6% pada isolat bakteri galur  D  menunjukkan  hasil  positif,  dimana  bakteri  dapat tumbuh  pada  media  tersebut.  Hal  ini  menunjukkan  isolat bakteri  galur  D  dapat  hidup  pada  keadaan  kadar  mineral yang  tinggi, sedangkan  pada  bakteri Caldicellusiruptor kristjanssonii pengujian yang dilakukan menggunakan NaCl 1-2%.  Bakteri Caldicellusiruptor  lactoaceticus 6A dalam pengujiannya  menggunakan  NaCl  1%.  Kedua  hasil  yang diperoleh menunjukkan kadar NaCl yang ditambahkan pada media pertumbuhan bakteri menunjukkan bakteri tetap dapat hidup  pada  media  tersebut  dengan  Caldicellusiruptor kristjanssonii memiliki toleransi  lebih tinggi terhadap  NaCl dibandingkan  dengan Caldicellusiruptor  lactoaceticus  6A. Kemampuan  hidup Caldicellusiruptor  kristjanssonii pada pH 5,5-8,0 sama dengan pH saat isolasi isolat bakteri galur D yaitu pH 5,5, sedangkan Caldicellusiruptor lactoaceticus 6A  mampu  hidup  pada  pH  5,8-8,2  sedikit  lebih  tinggi dibandingkan pH isolat bakteri galur D.
IV. KESIMPULAN DAN SARAN Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan,  maka dapat  disimpulkan  bahwa dengan  pengujian  secara  genotip menggunakan analisa sekuen fragmen gen 16S rDNA, isolat bakteri  galur  D  memiliki    homologi  sebesar  99%  dengan Caldicellusiruptor kristjanssonii .

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Vieille,  C.,  Zeikus,  G.J.,  (2001).  Hyperthermophilic  Enzymes: Sources,  Uses  and  Molecular  Mechanism  for  Thermostability. Biochemistry  Department.  Michigan  State  University,  East  lansing. Michigan. Hal. 20.
[2]    Daniel.  (2001).  Skrining  Bakteri  Termofilik  Penghasil      Enzim Amylase  Pada  Sumber  Air  Panas  Rimbo  Panti,  Skripsi,  Universitas Andalas, Padang.
[3] Muharni. (2010 ) . Isolasi dan Identifikasi Bakteri Penghasil Kitinase dari  Sumber  Air  Panas  Danau  Ranau  Sumatera  Selatan.  Jurusan Biologi FMIPA. Universitas Sriwijaya. Sumatera Selatan.
[4] Helin,  Y.S.,  Mulyani,  N.S.,  Asy’ari,  M.,  (2010).    Identifikasi Fragmen  Gen  16S  rRNA  bakteri  termofilik  Hasil  Isolasi  Dari Sumber Air Panas Gedong Songo. Skripsi. Universitas Diponegoro, Semarang.
[5] Maria, Y.E.P., (2012). Isolasi Bakteri termofilik Dari Sumber Mata Air  Panas  dari  Songgoriti.  Tugas  Akhir.  KIMIA  FMIPA.  Institut Teknologi Sepuluh Nopember. Surabaya.
[6] Ochman, H., (2005). Genomes on The Shrink. Proc. Natl Acad Sci. USA. 102: 11959-11960.
[7] Anam,  Khoirul.  (2012).  DNA  Rekombinasi.  Sekolah  Pascasarjana Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
[8] Bredholt,  S.,  Hansen,  J.s.,  Nielsen,  P.,  Mathrani,  I.M.,  (1999). Caldicellulosiruptor kristjanssonii sp. Nov., a cellulolytic, extremely thermophilic anaerobic bacterium. IJSEM. Vol 49: 991-996.
[9] [9] Mladenovska, Z., Mathrani, I.M., Ahring, B.K. (1995). Isolation an Characterization  of  Caldicellulosiruptor  lactoaceticus  sp.  Nov.,  an extremely  thermophilic,  cellulolytic,  anaerobic  bacterium,  Arch Microbiol 163, 223-230.