http://ejournal.radenintan.ac.id/index.php/biosfer/index

## IDENTIFIKASI FRAGMEN HV1 DNA MITOKONDRIA INDIVIDU DATARAN RENDAH DAN DATARAN TINGGI
1 Rina Budi Satiyarti, 2 Siti Aminah, 3 Tina Dewi Rosahdi
1 UIN Raden Intan Lampung. Jalan Letkol H. Endro Suratmin Bandar Lampung
2 UIN Sunan Gunung Jati Bandung. Jalan A.H. Nasution No. 105 Kota Bandung email: rinabudi07@gmail.com

## ABSTRACT
An  individual  adaptation  towards  the  geographical  altitude  associated  with genetic  factors,  one  of  the  genetic  materials  of  the  most  widely  used  to  study  the characteristic of individuals in the population is the mitochondrial DNA.Based on that condition, this research will deciding human Fragmen HVI mtDNA from Indramayu as lowland individual and Sukabumi as highland individual. The purpose of this research is  to  identify  hair  root    and  the  epithelial  cell  of  the  mouth  as  a  source  DNA mitochondrial that can used for a  amplification of human  fragment DNA mitokondria template  and  to  identify  fragment  territory  HV1  mtDNA  by  using  Polimerase  Chain Reaction  (PCR)  technic  and  detecting  the  yield  of  PCR    from  lowland  and  highland individual . The  steps  include  the  lysis  to  do  the  sample  of  the  hair  root    and  the epithelial  cell  of  the  mouth,    amplified  HV1  fragment  mtDNA  to  utilize  Polimerase Chain Reaction (PCR) technique and the result of PCR with elektroforesis gel agarosa. This  research  has  been  successfully,  hair  root    and  the  epithelial  cell  can  do  analyze DNA  mitochondrial  marked  by  the  fragment  measuring  0,4  kb  in  the  area  D-Loop mtDNA  and  it  can  easier  amplification  is  hair  root  characterized  by  the  presence  of DNA bands in agarose gel electrophoresis.
Keywords: mtDNA, HV1,  PCR, lowland, highland, D-loop .

## PENDAHULUAN
Di  dalam  tubuh  manusia  terdapat  suatu  sistem  kesetimbangan  yang  berperan dalam  menjaga  fungsi  fisiologis  tubuh  untuk  beradaptasi  terhadap  lingkungannya. Proses  adaptasi  yang  dilakukan  oleh  tubuh  manusia  salah  satunya  adalah  beradaptasi terhadap  ketinggian  geografis.  Faktor  ketinggian  geografis  biasanya  dihubungkan dengan  kadar  oksigen.  Udara  kering  mengandung  20,93  %  oksigen  pada  semua ketinggian  dengan  tekanan  rata-rata  barometrik  760  mmHg,  ketika  ketinggian bertambah  kadar  oksigen  tetap  sama  namun  jumlah  partikel  oksigen  mengalami pengurangan  yang  signifikan  akibat  turunnya  tekanan  barometrik.  Daerah  dataran rendah diketahui memiliki jumlah oksigen  yang relatif lebih banyak jika dibandingkan dengan dataran tinggi.Hasil dari adaptasi tersebut memungkinkan terjadinya perubahan
fisiologis dalam hal respirasi, sirkulasi, dan jumlah sel darah merah dalam tubuh.Orang yang tinggal di daerah dataran tinggi memiliki asupan jumlah O 2 lebih sedikit sehingga mengakibatkan oksigen ke seluruh jaringan menjadi berkurang [1] .
Oksigen  sangat  diperlukan  untuk  memproduksi  energi,  jika  seseorang kekurangan energi di dalam tubuhnya maka seluruh proses yang berlangsung di dalam tubuh  akan  terganggu,  sehingga  tubuh  akan  beradaptasi  dengan  cara  meningkatkan produksi sel darah merah dan konsentrasi hemoglobin. Sel darah merah berfungsi untuk mengikat oksigen. Semakin tinggi jumlah sel darah merah dan konsentrasi hemoglobin maka kapasitas oksigen respirasi akan meningkat [1] . Perbedaan kadar O 2 antara dataran tinggi dan dataran rendah akan mengakibatkan perbedaan laju metabolisme tubuh.
Mishmar et,al., (2003) menemukan indikasi kuat bahwa seleksi alam khususnya faktor  geografi,  iklim  dan  nutrisi  memiliki  peran  penting  dalam  membentuk  variasi profil DNA mitokondria. Mitokondria adalah organel yang terletak di dalam sitoplasma sel  eukariota.Struktur  sel  eukariota  ini  berupa  kantung  yang  diselaputi  oleh  dua membran  yaitu  membran  luar  dan  membran  dalam.  Membran  dalam  membentuk struktur  yang  melipat  ke  dalam  disebut  krista  dan  memiliki  dua  kompartemen  yaitu matriks  dan  ruang  antar  membran.  Membran  luar  mengandung  sejumlah  protein transport  dan  enzim-enzim  yang  terlibat  dalam  biosintesis  lipid  dan  metabolisme mitokondria. Membran dalam memiliki struktur melekuk dan melipat ke bagian matriks mitokondria, yang dikenal sebagai krista. Struktur melekuk ini sangat membantu dalam meningkatkan luas permukaan membran dalam sehingga meningkatkan kemampuannya dalam menghasilkan ATP. Membran dalam dan matriks mitokondria terkait erat dengan aktivitas  utama  mitokondria  yaitu  terlibat  dalam  pembentukan  energi,  oksidasi  asam lemak dan siklus krebs. Matriks mitokondria mengandung protein, enzim, ribosom dan DNA mitokondria.
DNA mitokondria manusia memiliki sejumlah sifat genetik khas yang dibedakan dari genom inti, diantaranya adalah memiliki laju mutasi yang lebih tinggi yaitu sekitar 10-17  kali  DNA  inti.DNA  mitokondria  terdapat  lebih  dari  1000  kopi  dalam  tiap  sel, sedangkan  DNA  inti  hanya  berjumlah  2  kopi.DNA  inti  merupakan  hasil  rekombinasi DNA  kedua  orang  tua  sedangkan  DNA  mitokondria  hanya  diwariskan  dari  ibu.DNA mitokondria  memiliki  daerah  pengkode  dan  daerah  non  pengkode.DNA  mitokondria mengandung  37  gen  pengkode  untuk  rRNA,  22  tRNA,  dan  13  polipeptida  yang
merupakan  subunit  kompleks  enzim  yang  terlibat  dalam  fosforilasi  oksidatif.Daerah yang tidak mengkode yaitu D-Loop. D-Loop memiliki dua daerah yaitu Hipervariabel 1 (HV1) dan hipervariabel 2 (HV2).
Daerah  Hipervariabel  1  (HV1)  bersifat  sangat  variatif  (mempunyai  urutan  basa nukleotida  yang  bervariasi)  dan  mempunyai  laju  evolusi  lima  kali  lebih  cepat dibandingkan  dengan  daerah  lain  dalam  genom  mitokondria.  Keunikan  daerah  HV1 adalah  memiliki  tingkat  polimorfisme  (substitusi  basa)  yang  tinggi  dalam  DNA Mitokondria  (mtDNA).  Daerah  ini  sangat  beragam  antara  individu  tetapi  sama  untuk kerabat yang satu garis keturunan ibu.
Penelitian  tentang  adaptasi  genetik  manusia  belum  banyak  dilakukan,  terutama penelitian  yang  menghubungkan  ketinggian  geografis  dengan  DNA  manusia  pada dataran  rendah  dan  dataran  tinggi  di  Indonesia.  Gelvi,  dkk.,  (2004)  meneliti  tentang adaptasi ketinggian pada dataran tinggi  Tibet,  yaitu  bagaimana protein  menjaga enzim yang  berperan  dalam  perlindungan  otot  terhadap  adanya  bahaya  oksidatif.  Penelitian tersebut  menganalisis  adaptasi  genetik  manusia  pada  ketinggian  yang  sangat  ekstrim yaitu kurang dari 5500 m. Daerah kajian penelitian tersebut terletak pada tingkat DNA inti dan protein.
Berdasarkan   latar belakang di  atas, maka dalam  penelitian    ini akan dilakukan penentuan  fragmen  HV1  DNA  mitokondria  manusia  pada  individu  dataran  rendah provinsi Jawa Barat. Hasil penelitian diharapkan dapat memberikan informasi mengenai fragmen  HV1  DNA  mitokondria  manusia.  Selain  itu,  data  yang  didapatkan  akan digunakan  dalam    penyusunan database DNA  mitokondria  pada  populasi  manusia Indonesia.

## METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang digunakan adalah metode penelitian eksperimental yang terdiri  dari  empat  tahapan,  yaitu  pengumpulan  sampel,  lisis  terhadap  sampel  DNA mitokondria yang telah diperoleh dengan  menggunakan buffer lisis, amplifikasi daerah HV1 DNA mitokondria sampel dengan menggunakan metode PCR, pendeteksian hasil PCR dengan elektroforesis gel agarosa .

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik Sampel
Tahapan awal dalam penelitian ini adalah pengambilan sampel akar rambut dan sel  epitel  mulut  dari  individu  dataran  rendah  Indramayu  dan  dataran  tinggi  Sukabumi. Sampel yang diambil dari kedua individu berupa akar rambut dan sel epitel mulut. Akar rambut  dikelilingi  oleh  folikel.Folikel  merupakan  pusat  tumbuh  rambut  yang mengandung keratin yang berasal dari epitel epidermis, sehingga terdapat lebih banyak DNA mitokondria dibandingkan dengan bagian pangkalnya.
Hasil Lisis Sampel dengan Menggunakan Buffer lisis
Pengambilan sampel dari sel akar rambut dilakukan dengan cara mencabut 5-10 helai  rambut  sampai  bagian  akarnya  dan  pengambilan  sampel  sel  epitel  mulut  dengan cara  berkumur.  Perlakuan  sampel  sel  akar  rambut  dan  sel  epitel  mulut  selanjutnya dilakukan dengan buffer lisis untuk mendapatkan DNA mitokondria. Prinsip buffer lisis adalah  perusakan  dinding  sel  tanpa  harus  merusak  DNA  yang  diinginkan,  sedangkan tujuan dari lisis sel  yaitu untuk memecah dinding sel dan mengeluarkan seluruh isi sel termasuk  DNA.  Pada  proses  lisis  sampel  diperoleh  fragmen  DNA  mitokondria  yang digunakan sebagai templat.
Dalam tahap lisis dilakukan inkubasi pada suhu 55 ⁰ C selama 1 jam. Inkubasi ini berperan  dalam  mengoptimalkan  kerja  enzim  proteinase-K  yaitu  untuk  mendegradasi enzim-enzim  DNAse  dan  protein  lainnya  untuk  menghindari  degradasi  DNA  terutama DNA  mitokondria  pada  larutan  sampel.  Protein  dalam  DNA  mitokondria  dideaktifasi dengan pemanasan pada suhu 95 ⁰ C agar tidak merusak molekul-molekul proteinnya dan waktu pemanasan selama 10 menit sehingga didapatkan ekstrak DNA mitokondria yang berada  dalam  supernatan  dan  dapat  langsung  digunakan  sebagai  templat  untuk amplifikasi.  Templat  DNA  mitokondria  yang  diperoleh  dipisahkan  ke  dalam  tabung mikro  yang  baru  untuk  menghindari  bercampurnya  kembali  DNA  dengan  molekul lainnya.  Untuk  menjaga  kondisi  fisiologis  mtDNA,  templat  disimpan  dalam freezer pada  suhu  -20 ⁰ C.  Sampel  yang  terdapat  pita  DNA  dari  hasil  penelitian  dapat  dilihat pada Tabel 1.
http://ejournal.radenintan.ac.id/index.php/biosfer/index
Tabel 1. Sampel yang digunakan untuk lisis sel dengan menggunakan buffer lisis
Lisis sel Sampel Hasil Buffer lisis Akar rambut Menunjukkan pita DNA Buffer lisis Epitel mulut Tidak menunjukkan pita DNA
Pada  Tabel  1. Sampel  akar  rambut  dengan  menggunakan buffer lisis menunjukkan  pita  DNA,  sedangkan  pada  sampel  epitel  mulut  tidak  menunjukkan  pita DNA. Karena sel yang ada pada akar rambut tidak terlalu banyak dan memiliki aktifitas metabolik yang sangat tinggi sehingga pada bagian akar rambut terdapat sejumlah besar mitokondria,  sedangkan  pada  sel  epitel  mulut  yang  diperoleh  dengan  cara  berkumur merupakan  campuran  yang  sangat  kompleks  dan  terdapat  pula  sisa  makanan. Keberadaan  zat-zat  tersebut  dalam  sampel  epitel  mulut  mengganggu  reaksi  PCR, terbukti dengan tidak terdapatnya pita DNA pada penelitian ini.

## Hasil Amplifikasi Fragmen HV1 mtDNA dengan metode PCR
PCR  merupakan  suatu  metode  sintesis  DNA  secara in  vitro untuk memperbanyak  fragmen  DNA  yang  spesifik.  Metode  ini  melibatkan  dua oligonukleotida sebagai  primer  yang membatasi fragmen DNA mitokondria  yang akan diperbanyak  (amplifikasi)  dan  menginisiasi  proses  perbanyakan.  Produk  PCR  berupa amplikon  fragmen  D-loop  DNA  mitokondria,  yang  kemudian  dikonfirmasi keberadaannya  melalui  elektroforesis  gel  agarosa.  Keberhasilan  amplifikasi diidentifikasi dengan cara membandingkan posisi fragmen sampel dengan marker DNA yang sudah diketahui ukurannya dan untuk meyakinkan bahwa DNA mitokondria yang diamplifikasi merupakan DNA mitokondria target bukan DNA asing.
Siklus PCR pada penelitian ini meliputi tiga tahap yaitu tahap denaturasi, tahap penempelan (Annealing) dan  tahap  pemanjangan (Extension) .  Tahap  denaturasi bertujuan  untuk  melepaskan  semua  ikatan  hidrogen  yang  menghubungkan  dua  untai DNA  sehingga  menghasilkan  DNA  tunggal.  Suhu  denaturasi  DNA  templat  berkisar antara  93 ⁰ C  –  95 ⁰ C,  tergantung  pada  panjang  fragmen  pada  DNA  target.  Pada  tahap penempelan (annealing) suhu  dan  waktu  yang  digunakan  yaitu  50 ⁰ C  selama  1  menit,
http://ejournal.radenintan.ac.id/index.php/biosfer/index
pemilihan suhu dan waktu annealing berkaitan dengan panjang primer yang digunakan pada proses PCR, sedangkan pada tahap pemanjangan (extension) suhu dan waktu yang digunakan  yaitu  72 ⁰ C  selama  4  menit.  Proses  ekstensi  primer  pada  proses  PCR dilakukan  pada  suhu  72 ⁰ C  karena  pada  suhu  tersebut  merupakan  suhu  optimum  DNA polimerase yang biasa digunakan untuk proses PCR.
Setiap  melakukan  reaksi  PCR  dibutuhkan  reagen-reagen  PCR  dan  keberhasilan PCR  ditentukan  dari  komposisi  reagen-reagen  tersebut.  Campuran  dari  semua  reagen PCR yang dibutuhkan dalam setiap kali reaksi PCR disebut master mix . Reagen PCR yang digunakan diantaranya buffer PCR, MgCl 2 , dNTP, primer M1, primer M2, DNA polimerase dan ddH 2 O.
dNTP  bertindak  sebagai building  block DNA  yang  diperlukan  dalam  proses ekstensi  DNA.  dNTP  akan  menempel  pada  gugus  hidroksi  (-OH)  pada  ujung  3’  dari primer  membentuk  untai  baru  yang  komplementer  dengan  untai  DNA  templat.  Bufer PCR untuk menjamin pH medium, selain bufer PCR diperlukan juga adanya ion Mg 2+ yang  berasal  dari  MgCl 2 .  MgCl 2 bertindak  sebagai  kofaktor  yang  berfungsi menstimulasi  aktivitas  DNA  polimerase.  MgCl 2 akan  meningkatkan  interaksi  primer dengan templat yang membentuk kompleks larut dengan dNTP (senyawa antara). DNA taq  polimerase  dalam  proses  PCR  berfungsi  sebagai  katalis  untuk  reaksi  polimerisasi DNA. Enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA [21] .
Untuk mendapatkan fragmen hasil amplifikasi yang diinginkan, maka komponen PCR  harus  dipastikan  sudah  berada  dalam  campuran  atau master  mix .  Masing-masing komponen  memiliki  komposisi  tertentu  dalam  setiap  campuran  dan  komposisi  templat juga  harus  sesuai  agar  hasil  amplifikasi  yang  diperoleh  optimal,  dibutuhkan  optimasi terhadap masing-masing komponen PCR.
Komponen penting lain yang juga berbeda dalam reaksi PCR adalah penggunaan primer. Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer  yang digunakan. Di  dalam  proses  PCR,  primer  berfungsi  sebagai  pembatas  fragmen  DNA  target  yang akan  diamplifikasi  dan  sekaligus  menyediakan  gugus  hidroksi  (-OH)  pada  ujung  3’ yang  diperlukan  untuk  proses  eksitensi  DNA.  Perancangan  primer  dapat  dilakukan berdasarkan  urutan  DNA  yang  telah  diketahui  ataupun  dari  urutan  protein  yang dituju.Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database genebank . Apabila urutan  DNA  maupun  urutan  protein  yang  dituju  belum  diketahui  maka  perancangan
primer  dapat  didasarkan  pada  hasil  analisis  homologi  dari  urutan  DNA  atau  protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat [17] .

## Rancangan Primer
Rancangan primer dibuat dengan cara memasukan urutan D-Loop mtDNA yang diperoleh dari database NCBI  ke dalam program seqman DNA star, lalu urutan primer yang kita gunakan dimasukkan ke dalam program seqman tersebut. Tujuan dari proses ini adalah untuk mengetahui apakah primer yang digunakan merupakan primer spesifik dan  urutan  nukleotidanya  menempel  pada  urutan  D-Loop  mtDNA.  Gambar  1. merupakan rancangan primer M1 menggunakan program seqman DNA star.
Gambar 1. Rancangan primer M1 menggunakan program seqman DNA star Pada Gambar  1. primer  M1  menempel  pada  urutan  D-Loop  mtDNA  dengan urutan  nukleotida  -CACCATTAGCACCCAAAGCT-  pada  posisi  15.928-15.947  yaitu menunjukkan bahwa primer yang digunakan spesifik. Gambar 2 berikut ini merupakan rancangan primer M2 menggunakan program seqman DNA star .
Gambar 2. Rancangan primer M2 menggunakan program seqman DNA star Pada Gambar 2 primer M2,  primer M2 menempel pada urutan D-Loop mtDNA dengan  urutan  nukleotida    -CACCATCCTCCGTGAAATC-  sebagai  komplemen  dari primer  M2  yang  digunakan  yaitu  -GTGGTAGGAGGCACTTTAG-  menempel  pada posisi 16.351- 16.369.
Gambar 3. Ukuran fragmen hasil PCR
Gambar  3 menunjukkan  proses  amplifikasi  dengan  metode  PCR  pada  sampel akar  rambut  dengan  menggunakan  primer  M1  dan  M2  memberikan  hasil  amplifikasi fragmen yang berukuran sekitar 0,4 kb atau 403 pb. Cara menentukan ukuran fragmen yaitu  berdasarkan  informasi database genom  mitokondria  yang  didapatkan  dari  NCBI melalui internet,  kemudian dilakukan proses penempelan primer dengan  menggunakan program DNA star. Urutan genom mitokondria, primer M1 dan primer M2 dimasukkan dalam  program  DNA  star  tersebut,  setelah  itu  primer  M1  dan  primer  M2  akan menempel pada daerah yang diinginkan.

## Amplikon Fragmen Daerah HV1 mtDNA Hasil PCR
Produk  PCR  berupa  amplikon  fragmen  HV1  mtDNA  kemudian  dikonfirmasi keberadaannya melalui elektroforesis gel agarosa. Gel agarosa terbuat dari agarosa yang merupakan polisakarida rumput laut dan akan membentuk gel ketika dilarutkan dengan buffer  TAE  melalui  pemanasan.  EtBr (Ethidium  Bromide) yang  ditambahkan  pada  gel mempunyai  kemampuan  untuk  menyisip  di  antara  pasangan  basa  nukleotida  dalam untai  DNA  mitokondria  karena  memiliki  geometri  molekul  yang  hampir  sama  dengan DNA  mitokondria  yaitu  planar.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  jumlah  molekul  EtBr sebanding  dengan  jumlah  pasangan  basa  nukleotida  DNA  mitokondria  yang  diamati. EtBr berfungsi sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela basa nukleotida.
Pengamatan hasil elektroforesis dilakukan di bawah sinar ultraviolet  ( UV ) pada panjang  gelombang  260  nm.EtBr  dapat  berflouresensi  bila  disinari UV ,  dengan  warna merah orange.Pada pH mendekati netral, DNA mitokondria bermuatan negatif sehingga
molekul  ini  dapat  bermigrasi  dari  kutub  negatif  (anoda)  ke  kutub  positif  (katoda) dengan kecepatan yang dipengaruhi oleh berat molekul fragmen DNA mitokondria dan kekuatan arus listrik  yang digunakan. Fragmen DNA mitokondria yang memiliki berat molekul  yang rendah akan bergerak lebih cepat  daripada  yang memiliki berat  molekul yang besar.
Untuk  menentukan  ukuran  hasil  PCR  digunakan  penanda (marker) ,  yang berfungsi sebagai penanda bahwa fragmen yang diinginkan berhasil diamplifikasi. Pita untuk fragmen HV1 menggunakan primer M1 dan M2 berukuran sekitar 0,4 kb. Untuk mengetahui apakah pita DNA hasil elektroforesis sesuai dengan target penelitian maka harus dilakukan elektroforesis bersama-sama dengan DNA standar yang telah diketahui ukurannya [23] . Ukuran 0,4 kb dapat dilihat dengan membandingkan posisi pita dengan marker yang  digunakan  yaitu  KAPA  1  KB  DNA  ladder.  Hasil  elektroforesis  sampel akar  rambut  dengan  menggunakan  buffer  lisis  yang  telah  divisualisasi  dengan  lampu UV dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4.4 menujukkan M adalah penanda ( marker ) KAPA 1 KB DNA ladder dengan ukuran pitanya disamping kanan 0,5 kb sedangkan angka 1 menunjukkan kode sampel  dataran  rendah    dan  angka  2  menunjukkan  kode  sampel  dataran  tinggi.  Pita berukuran 0,4 kb menandakan adanya fragmen HV1 mtDNA.
Gambar 4. Elektroforesis gel agarosa hasil amplifikasi fragmen HV1 mtDNA.
Hasil  elektroforesis  gel  agarosa  pada  sampel    sel  epitel  mulut  dengan menggunakan buffer lisis dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Elektroforesis gel agarosa hasil amplifikasi fragmen HV1 dari sel epitel mulut menggunakan buffer lisis.
Hasil  elektroforesis  gel  agarosa  pada  sampel  sel  epitel  mulut  dengan menggunakan buffer lisis  tidak  menunjukkan  pita  DNA  karena  sampel  epitel  mulut yang diperoleh dengan cara berkumur di dalamnya terdapat sisa makanan. Keberadaan sisa makanan dalam sampel mengganggu pada reaksi PCR sedangkan pada akar rambut lebih mudah dilisis karena akar rambut dikelilingi oleh folikel  yang  yang mengandung keratin dari epitel epidermis, sehingga terdapat lebih banyak DNA mitokondria.
Pada  penelitian  ini  dilakukan  proses  sekuensing,  akan  tetapi  belum  bisa dilakukan  analisis  lebih  lanjut  karena  hasil  sekuensing  yang  didapatkan  kurang  baik sehingga  tidak  bisa  dipastikan  terjadi  mutasi  atau  tidak  terjadi  mutasi  pada  individu dataran  rendah  maupun  dataran  tinggi.  Tampilan    sekuensing  individu  dataran  rendah dengan menggunakan primer M1 disajikan pada Gambar 6.
Gambar 6. Tampilan sekuensing individu

## SIMPULAN DAN SARAN
Dari hasil penelitian ini dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1. Sel  epitel  mulut  dan  akar  rambut  dapat  dilakukan  analisis  DNA  mitokondria, ditandai  dengan terdapatnya pita DNA pada elektroforesis gel agarosa.
2. Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  dilakukan,  penggunaan  metode  PCR  dengan menggunakan  primer  M1  dan  M2  menghasilkan  fragmen  DNA  berukuran  0,4  kb pada elektroforesis gel agarosa.

## DAFTAR PUSTAKA
Gumilar, G.G, Supriyanti, F. M.T., Siti, H.H. (2008). Bioteknologi. Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI.
Devor,  E.J.(2005).  IDTutorial  : Mitochondrial  DNA) .USA  :  Integrated  DNA Technologies.
Poedjiadji,  Anna  dan  Supriyanti  F.M.T.  (2006). Dasar-dasar  Biokimia .  Jakarta  :
Universitas Indonesia Press.
Wikipedia. 2014.http://id.wikipedia. Org/wiki/. diakses tanggal 1 November 2014, 21.30 WIB.
Gaffar,  Shabrani,  M.Si.  2007. Buku  Ajar  Bioteknologi  Molekul. Bandung:  FMIPA Universitas Padjajaran.
Stanfield, William D., Jaime  S. Colome., Raul  J. Cano. 2003. Shaum’s Easy Outlines: Molecular and Cell Biology. USA : McGraw-Hill  Companies, Inc.
Purves,  William  K.,  David  Sadava.,  Gordan    H.Orians.,  and  Craig  Heller.  2004. Life  : The  Science  Of  Biology. Edisi  Ketujuh.  United  Staties    of  America:  Sinauer Associates and W. H. Freeman.
Yuwono, Tribowo. 2009. Biology Molekular. Jakarta: Erlangga.
Anderson,  S. et  al .  (1981).  “  Sequence  and  Organization  of  the  Cambridge  Reference Sequence for Human Mitochondrial DNA” . Nat Genet. 23, 147.
www.mitomap.org diakses pada tanggal 2 November 2014, 22.00 WIB.
Susmiarsih,  T.  (2010).  Peran  Genetik  DNA  Mitokondria  pada  Motilitas  Spermatozoa.
Majalah kesehatan Pharma Medika, 2010 Vol.2., No.2.
Nakada, K. (2006). Mitochondria- Related Male Infertility. PNAS: 103 (41): 151 48-53.
Giles, R.E., Blanc, H., Cann H.M., dan Wallace, D.C. 1980. “ Maternal Inheritance of Human  Mitochondrial  DNA  “  .  Proc. Natl.  Acad.  SCI  .  USA. 77,  (11),  6715- 6719.
Wallace,  D.C.,  1992:  Diseases  of  the  mitochondrial  DNA,  Annu  Rev  Biochem,  61,
1175-1212.
Bogrnhagen, Daniel F. 1999. DNA REPAIR’99 Repair of mtDNA in Vertebrates. Am. J. Hum. Genet. 64, 1276-1281.
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi Kedua. Bogor. IPB  Press.
Innis,  M.A.,  Gelfan,  D.H.  (1990),  Optimation  of  PCRs,  PCR  protocols  :a  guide  to Methods and Aplications, Academic Press, Inc, California, 3-12.
Zyskind, J. W. and S. I. Bemstain. 1992. Recombinant DNA Manual. Academic Press., Inc. California.
Sambrook, J., Fritsc, E.F., and Maniatis, T., (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Puspitasari,  Dea.(2007). Urutan  Nukleotida  Daerah  HVSI  DNA  Mitokondria  Manusia Poli-C . Skripsi Program Studi ITB Bandung: Tidak diterbitkan.
http://ejournal.radenintan.ac.id/index.php/biosfer/index
Qiagen.(2006). Genomic  DNA  Purification. [Online].  Tersedia  :  http:  //www. qiagen.com /literature brochurs /index. [5 Oktober 2015].
Ratnayani,  K., et  al (2007).  “Analisis  Variasi  Nukleotida  Daerah  D-Loop  DNA Mitokondria Pada Satu Individu Suku Bali Normal “ Jurnal Kimia 7-14