## ANALISIS VARIABILITAS GENETIK

## Rigidoporus microporus (JAMUR AKAR PUTIH) PADA KARET DENGAN TEKNIK PCR-RFLP FRAGMENT ITS 1)
GENETIC VARIABILITY ANALYSIS OF Rigidoporus microporus ( WHITE ROOT ROT FUNGUS ) OF RUBBER BY PCR-RFLP FRAGMENT ITS TECHNIQUE
Ria Novianti 2) , Haryono Semangun 3) , Ferry F. Karwur * 3) , dan Martanto Martosupono 3)
2 ) Mahasiswa Program Studi  Magister Biologi, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga
3) Program Studi Magister Biologi, Universitas Kristen Satya Wacana, Jln. Diponegoro 52 – 60, Salatiga 50711 *Penulis untuk korespondensi. E-mail: fkwur@yahoo.com

## ABSTRACT
The  eleven  isolates  studied  fell  into  two  groups,  which  showed  that  the  fungus  did  not  have  high  genetic variability. Isolates from diseased rubber trees in shorter vicinities, which were due to pathogen’s vegetative spread through root contact, have close genetic relationship. Meanwhile isolates from far apart trees, either in one estate or from different islands, does not necessarily have distant genetic relationship. It might be due to the fact that long distance dispersal of the disease could also due to rhizomorph contaminating rubber stumps. PCR-RFLP Fragment ITS Techniques can be applied to study genetic relationship of Rigidoporus microporus isolates. It is expected that the technique will be applied with more isolates from different provinces by using additional different restriction enzymes. Keywords: genetic variability, PCR-RFLP Fragment ITS Technique, Rigidoporus microporus , white root rot of rubber

## INTISARI
Kesebelas isolat yang diteliti terbagi ke dalam dua kelompok, yang menunjukkan bahwa jamur ini tidak mempu- nyai variabilitas genetik yang tinggi. Isolat-isolat dari pohon karet sakit yang letaknya berdekatan, yang terjadi karena penularan vegetatif melalui kontak akar, mempunyai hubungan kekerabatan genetik yang erat. Isolat-isolat dari pohon karet sakit yang berjauhan, baik dalam satu kebun maupun dari pulau lain , tidak selalu mempunyai hubungan  keke- rabatan genetik yang jauh. Ini dapat disebabkan karena adanya penyebaran penyakit jarak jauh secara vegetatif dengan terbawanya rizomorf pada akar stump . Teknik PCR-RFLP Fragment ITS dapat dimanfaatkan untuk penelitian kekerabatan Rigidoporus microporus . Pemakaiannya perlu diperluas dengan pengumpulan isolat yang lebih tersebar, dengan memakai enzim restriksi yang lebih banyak.
Kata kunci: jamur akar putih karet, Rigidoporus microporus , variabilitas genetik, PCR-RFLP fragmen ITS.

## PENGANTAR
Penyakit akar putih yang disebabkan oleh jamur akar putih (JAP) (Rigidoporus microporus) adalah penyakit karet yang terpenting di Indonesia dan di beberapa negara penanam karet di Asia. Sampai sekarang para penanam karet beranggapan bahwa jamur menular dengan dua cara. Pada jarak dekat dari pohon ke pohon jamur menular melalui kontak antara akar yang sakit dengan akar yang sehat. Pada jarak jauh jamur dapat menular dengan basidiospora yang terbawa oleh angin. Spora yang jatuh pada tonggak  yang  masih  baru  akan  berkembang menginfeksi tonggak dan dari sini jamur mengin- feksi ke pohon sehat di dekatnya melalui kontak akar (Semangun, 2008).
Jika diperhatikan inti hifa jamur akar putih mau- pun  Polyporaceae  pada  umumnya,  basidiospora adalah haploid (n), berkembang membentuk hifa
primer haploid yang tidak dapat tahan lama. Basi- diospora yang lain akan berkembang menjadi hifa primer haploid (n) yang akan bersatu dengan hifa haploid yang pertama  untuk membentuk hifa se- kunder yang diploid (2n) yang dapat tahan lama, yang pada waktunya akan membentuk tubuh buah (basidioma) diploid (2n). Tubuh buah akan mem- bentuk  basidium  diploid  (2n),  yang  setelah mengalami  pembelahan  reduksi  (meiosis)  akan membentuk basidiospora haploid (n) (Campbell et al ., 2003). Penularan jarak dekat terjadi secara vegetatif oleh hifa sekunder, yang juga disebut secara klonal, dan diperkirakan menghasilkan sifat genetis yang sama. Sedangkan hasil penularan jarak jauh dengan spora akan menghasilkan hifa sekunder yang mem- punyai perbedaan dengan hifa yang pertama karena adanya  pencampuran  inti  dari  dua  basidiospora.
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, Vol. 17, No.1, 2011: 1–6
1) Pernah dikemukakan dalam Kongres Nasional XX Perhimpunan Fitopatologi Indonesia (PFI) dan Seminar Ilmiah, Makassar, 4–7 Agustus 2009
Penularan jarak jauh dapat dikatakan terjadi secara generatif  melalui  persatuan  inti.  Dengan  asumsi seperti ini diharapkan bahwa dengan teknik mole- kuler  tertentu akan  dapat  dilihat  persamaan  dan perbedaan antara miselium hasil penularan jarak dekat dengan hasil penularan jarak jauh.
Penelitian hubungan kekerabatan dapat dilaku- kan dengan beberapa cara. Hamidson dan Naito (2003) dan Suwandi (2007) meneliti kekerabatan isolat-isolat R.  microporus dengan  mengamati kompatibilitas  somatiknya.  Dalam  penelitian  ini para peneliti mempertimbangkan teknik yang di- kembangkan oleh Jasalavich et al. (2000) untuk mendeteksi dan mengidentifikasi jamur Basidio- mycota  yang  menyerang  kayu  dengan  Analisis Restriction  Fragment  Length  Polymorphism (RFLP). Farid et al. (2006) telah memanfaatkan teknik PCR untuk mendeteksi secara spesifik jamur akar putih, R. microporus. Penelitian  ini  didasarkan  atas  dua  hipotesis: (l)  Isolat R.  microporus dari  pohon  sakit  yang letaknya berdekatan mempunyai hubungan kekera- batan yang erat, dan (2) Isolat dari pohon sakit yang letaknya berjauhan mempunyai hubungan kekera- batan yang kurang erat. Penularan jarak dekat ter- jadi  melalui  kontak  antara  miselium  dengan hifa-hifa diploid secara vegetatif. Penularan jarak jauh terutama terjadi melalui basidiospora haploid yang membentuk hifa haploid, yang untuk perkem- bangannya perlu berhubungan dengan hifa haploid lain. Di sini terjadi perkembang biakan secara ge- neratif (seksual). Terdapat kemungkinan pemenca- ran  ( dispersal )  jarak  jauh  yang  terjadi  karena pengangkutan stump karet  yang  terinfeksi  atau membawa rizomorf R . microporus .

## BAHAN DAN METODE
Penelitian ini memakai 11 isolat R. microporus . Tujuh isolat diisolasi dari Kebun Merbuh (Sema- rang) dan Kebun Blimbing (Pekalongan). Empat isolat dari Balai Penelitian Karet Getas, Salatiga, yang  berasal  dari  Kebun  Widodaren  (Jember), Kebun Cikumpay (Purwakarta,), Kebun Warnasari (Cilacap), dan Kebun Balai Penelitian Sungei Putih (Deli Serdang, Sumatera Utara) (Tabel 1).
Isolasi R.  microporus dilakukan  dengan  cara yang dipakai di Balai Penelitian Karet Getas. Rizo- morf  dicuci  dengan  air  bersih,  didesinfestasi dengan sublimat 0,1%, dibilas dengan akuades ste- ril, dipotong-potong dan diletakkan di atas media PDA dalam cawan petri yang diberi 1 tetes asam laktat 25%. Untuk  menguji  bahwa  isolat  yang diperoleh adalah R. microporus , dilakukan Postulat Koch dengan penginokulasian isolat pada potongan- potongan  akar  karet  sehat  dalam  tabung-tabung gelas steril.
Isolasi DNA dilakukan dari miselium berumur 2 minggu. DNA yang diperoleh digandakan dengan PCR ( Polymerase Chain Reaction ) . Primer yang digunakan adalah sepasang primer oligonukleotida, yaitu  primer  maju (forward  primer) dan  primer mundur (reverse  primer) .  Hasil  PCR  dipotong dengan enzim Hae III , Msp I, dan Hinf 1, dilanjutkan dengan elektroforesis dan deteksi fragmen-fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Selanjutnya dilaku- kan analisis polimerase pita DNA, diikuti dengan analisis  filogenetik  dengan  program  UPGMA ( Unweight Pairs Group Marker Analysis ) sehingga diperoleh dendrogram. Dalam teknik PCR-RFLP, DNA diisolasi dari 0,5  g  miselium  dari  masing-masing  isolat  (11
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia Vol. 17 No. 1
Tabel 1. Nama dan asal isolat Rigidoporus microporus yang diteliti
No. Sampel Nama Letak tanaman sakit dari Kebun …. Keterangan 1. 1AM Merbuh, Semarang, Jawa Tengah 2. 2AM Merbuh, Semarang, Jawa Tengah Berjarak 8 m dari 1AM 3. AK Merbuh, Bagian Kaliwringin, Semarang, Jawa Tengah Berjarak l.k. 1500 m dari 1AM dan 2AM 4. 1ABW Blimbing, Bag. Buwaran. Pekalongan, Jawa Tengah 5. 2ABW Blimbing, Bag. Buwaran, Pekalongan, Jawa Tengah Berjarak 3 m dari 1ABW 6. 3ABW Blimbing, Bag. Buwaran, Pekalongan, Jawa Tengah Berjarak 5 m dari 1ABW 7. ABL Blimbing, Bag. Blimbing, Pekalongan, Jawa Tengah Berjarak l.k. 1500 m dari 1ABW, 2ABW, dan 3ABW 8. KSW Warnasari, Cilacap, Jawa Tengah 9. KWD Widodaren, Jember, Jawa Timur 10. KC Cikumpay, Purwakarta, Jawa Barat
11. KPSP Puslit Karet Sungei Putih, Deli, Serdang, Sumatera Utara
isolat),  umur  dua  minggu  pada  suhu  25 o C), penggerusan dengan nitrogen cair, dengan buffer alkali (Tris-EDTA, pH 8.0; NaCl 1,4 M, 2% PVC 40.000; 0,2% merkaptoehanol; dengan 10% SDS). Potongan  DNA  target,  yakni  DNA Internal Transcribed  Spacers (ITS) yang terletak di antara gen pengkode 18S RNA dan 25S RNA diampli- fikasi menggunakan primer ITS1-F (5’-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3’) dan ITS4-B (5’- CAG  GAG ACT TGT ACA  CGG TCC AG-3’). PCR dilakukan sebanyak 35 siklus, dengan suhu daur PCR: (a) denaturasi 95 o C 35 detik, (b) penem- pelan primer 60 o C 55 detik, dan (c) sintesis-peman- jangan DNA 72 o C 1 menit. Hasil PCR dengan pita tunggal  ±900  pb  (pasangan  basa  dari  11  isolat), kecuali  isolat  2ABW,  masing-masing  dipotong secara terpisah dengan berturut-turut enzim restriksi Hae III, Msp I, dan Hinf I, pada suhu 37 o C selama 3 jam. Hasil pemotongan enzimatik dielektroforesis menggunakan 2% agarosa, diamati di bawah UV Transilluminator  2000,  dan  difoto  menggunakan kamera Canon Powershot A430. Kehadiran fragmen hasil  pemotongan  enzimatik dilakukan  menggu- nakan  teknik  matriks,  dengan  mengidentifikasi setiap potongan yang ada, dan dengan menaksir ukurannya berdasarkan penanda ukuran yang ada. Data dimasukkan ke dalam matriks pada program NTSYSpc2.0., dan analisis dendrogram menggu- nakan Program UPGMA ( Unweight Pairs Group Marker ).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ke-11 isolat R. microporus mempunyai morfo- logi dan kecepatan tumbuh yang agak bervariasi. Isolat 1AM, 2AM, 1ABW, 2ABW, 3ABW, ABL, KWS, KWD, dan KC miseliumnya sangat mirip satu dengan yang lain, terdiri atas hifa yang halus,
berstruktur radier. Isolat AK dan KPSP mempunyai banyak  persamaan,  mempunyai  hifa  yang  lebih halus, membentuk struktur radier, miselium terlihat mempunyai lingkaran-lingkaran konsentris (Gam- bar 1). Urutan kecepatan pertumbuhan miselium berturut-turut  adalah  KPSP,  KWS,  AK,  ABL, 1ABW,  KC,  1AM,  2AM,  2ABW,  3ABW,  dan KWD.  Miselium  KPSP  sudah  memenuhi  cawan petri pada hari ke-10, sedang KWD baru pada hari ke-14 (Gambar 2).
Hasil amplifikasi PCR dilakukan 2 kali untuk tiap  DNA  isolat.  Kesebelas  isolat  yang  telah diamplifikasi dengan primer ITS1-F dan ITS4-B semua menghasilkan pita DNA tunggal berukuran 900 pb. Ini membuktikan bahwa pasangan primer universal untuk Basidiomycota sesuai untuk identi- fikasi R. microporus (Gambar 3). Untuk melihat variasi atau keragamannya, pita DNA hasil PCR dipotong dengan enzim Hae III, Msp I, dan Hinf I . Terlihat  bahwa  DNA  hasil  PCR  dapat  terpotong dengan enzim Hae III. Isolat 1AM, 2AM, 1ABW, 2ABW, 3ABW, ABL, KWS, KWD, dan KC terpo- tong menjadi 2 pita dengan ukuran 350 pb dan 550 pb, sedangkan isolat AK dan KPSP terpotong men- jadi 3 pita dengan ukuran 250 pb, 300 pb, dan 350 pb (Gambar 4).
Hasil pemotongan dengan enzim Msp 1 menun- jukkan bahwa dari 11 isolat ada 2 isolat yang tidak terpotong  DNA-nya,  yaitu  isolat AK  dan  KPSP, sedangkan  isolat  1AM,  2AM,  1ABW,  2ABW, 3ABW,  ABL,  KWS,  KWD,  dan  KC  terpotong menjadi 3 pita pada ukuran 100 pb, 350 pb, dan 450 pb (Gambar 5). Dengan enzim Hinf I terlihat bahwa kesebelas  isolat  terpotong  menjadi  4  pita.  Isolat 1AM, 2AM, 1ABW, 2ABW, 3ABW, ABL, KWS, KWD, dan KC terpotong pada ukuran 125 pb, 200 pb, 225 pb, dan 350 pb. Sedangkan isolat AK dan
Novianti et al .: Analisis Variabilitas Genetik Rigidoporus microporus dengan Teknik PCR-RFLP
B
A
Gambar 3. Pita DNA tunggal 900 pb hasil amplifikasi DNA dari 11 isolat jamur akar putih (JAP) dengan primer ITS1-F dan ITS4-B
M =1 kb K 1A M 2A M AK 1A BW 2A BW 3A BW AB L KW S KW D KC KP SP M =1 00 bp 1000 900
800 700 600 500 400
300 200 100 10000 9000 8000 7000 6000 5000 Gambar 2. Grafik kecepatan pertumbuhan isolat-isolat jamur akar putih (JAP) 1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Pertumbuhan JAP (Hari) Di am ete r m ise liu m JA P (m m ) 1AM 2AM AK 1ABW 2ABW 3ABW ABL KWS KWD KC KPSP
Gambar 4. Pita-pita berukuran 350 pb dan 550 pb (1AM, 2AM, 1ABW, 2ABW, 3ABW, ABL, KWS. KWD, dan KC); 250 pb, 300 pb, dan 350 pb (AK dan KPSP) hasil restriksi produk PCR dengan enzim Hae III; K adalah kontrol produk PCR tanpa pemotongan 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 M K 1A M 2A M AK 1A BW 2A BW 3A BW AB L KW S KW D KC KP SP
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia Vol. 17 No. 1 4
KPSP pada ukuran 100 pb, 200 pb, 250 pb, dan 350 pb (Gambar 6).
Hasil analisis filogenetik mengenai hubungan kekerabatan R. microporus yang diolah dengan pro- gram UPGMA menghasilkan dendogram yang ter- tera pada Gambar 7. Terlihat adanya 2 kelompok kekerabatan pada isolat-isolat yang diteliti. Kelom- pok 1 terdiri atas isolat 1AM, 2AM, 1ABW, 2ABW, 3ABW, ABL, KWS, KWD, dan KC. Kelompok 2 terdiri atas isolat AK dan KPSP.
Dalam penelitian ini terlihat adanya hasil yang sesuai antara  penelitian  morfologi  dan  fisiologi dengan  penelitian  genetik  lewat  penanda  DNA. Kedua cara menunjukkan adanya dua kelompok di antara isolat-isolat yang diteliti. Semua isolat dari pohon-pohon  sakit  yang  berdekatan  mempunyai hubungan kekerabatan yang sangat erat, yang terli- hat dari morfologi dan kecepatan tumbuh miselium, dan dari analisis dengan pemotongan-pemotongan DNA.
Gambar 5. Pita-pita berukuran 100 pb, 350 pb, dan 450 pb (1AM, 2AM, 1ABW, 2ABW, 3ABW, ABL, KWS, KWD, dan KC); 900 pb (AK dan KPSP) hasil restriksi produk PCR dengan enzim Msp I; K adalah kontrol produk PCR tanpa pemotongan
M K 1A M 2A M AK 1A BW 2A BW 3A BW AB L KW S KW D KC KP SP 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
Gambar 6. Pita-pita berukuran 125 pb, 200 pb, 225 pb, dan 350 pb (1AM, 2AM,1ABW, 2ABW, 3ABW, ABL, KWS. KWD, dan KC); 100 pb, 200 pb, 250 pb, dan 350 pb (AK dan KPSP) hasil restriksi produk PCR dengan enzim Hinf I; K adalah kontrol produk PCR tanpa pemotongan
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 M K 1A M 2A M AK 1A BW 2A BW 3A BW AB L KW S KW D KC KP SP
Novianti et al .: Analisis Variabilitas Genetik Rigidoporus microporus dengan Teknik PCR-RFLP 5
Isolat yang asalnya berjauhan, dalam satu kebun ataupun dari pulau lain, tidak semuanya mempunyai hubungan kekerabatan yang jauh. Isolat KPSP dan isolat AK yang asalnya sangat berjauhan, bahkan berbeda pulau, mempunyai hubungan kekerabatan yang sangat erat. Demikian juga isolat-isolat 1AM, ABL, KWS, KWD, dan KC yang berbeda provinsi. Memang,  di  sini  terdapat  kemungkinan  bahwa isolat yang berjauhan itu bukan hasil pemencaran lewat spora secara generatif, tetapi secara vegetatif misalnya lewat rizomorf yang melekat pada stump karet  yang  diangkut  jarak  jauh.  Ini  menekankan pentingnya pemencaran jamur akar putih sebagai rizomorf yang terbawa oleh stump karet. Dari penelitian ini diketahui juga bahwa secara molekuler kedua kelompok R. microporus tersebut mempunyai perbedaan yang cukup tegas. Untuk mengetahui  apakah  kedua  kelompok  itu  masih tergolong dalam satu spesies perlu dilakukan pene- litian kompatibilitas somatik seperti yang dilakukan oleh  Hamidson  &  Naito  (2004)  dan  Suwandi (2007). Masih diperlukan penelitian untuk mende- teksi  adanya  varian  di  dalam  kedua  kelompok tersebut.

## KESIMPULAN
1. Isolat jamur akar putih ( Rigidoporus microporus ) dari pohon sakit yang berdekatan mempunyai hubungan kekerabatan yang erat.
2. Isolat  dari  pohon  sakit  yang  berjauhan,  yang bukan terjadi karena penularan lewat kontak akar, tidak selalu mempunyai hubungan kekerabatan yang jauh, karena adanya kemungkinan pemen- caran karena rizomorf yang terbawa stump .

## DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell. 2003. Biologi edisi kelima. Jilid II. (diterjemahkan dari: Biology , 5 th ed ., penerjemah:W. Manalu). Erlangga, Jakarta. 404 p. Farid, A.M., S.S. Lee, H. Mohd. Rosli, & M. Patahayah. 2006. Specific Detection of the White Root Disease Fungus, Rigidoporus lignosus , through a PCR-based Technique . Univ. Sains Malaysia, Penang.
Hamidson,  S.H.  &  S.  Naito.  2004. Distribution  of Rigidoporus lignosus Genotypes in a Rubber Planta- tion, as Revealed by Somatic Compatibility. Myco- science 45: 72–75.
Jasalavich, C.A., A. Ostrofsky, & J. Jellison. 2000. Detection  and  Identification  of  Decay  Fungi  in Spruce Wood by Restriction Fragment Length Poly- morphism Analysis of Amplified Genes Encoding rRNA. Applied and Environmental Microbiology 66: 4725–4734.
Semangun, H. 2007. White Root Disease of Rubber: Some  of  its  Biological Aspects,  p.  60–67. In S. Prawirosoemardjo, B. Setyawan, H. Suryaningtyas, M.  Supriadi  (eds.), Proceeding  of  International Workshop on White Root Disease of Hevea Rubber, Salatiga, 28–29 November 2006.
Semangun, H. 2008. Penyakit-Penyakit Tanaman Perkebunan di Indonesia . ed. kedua, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. 835 p.
Suwandi. 2007. Mode of Dispersal and Variation in Population  of  White  Root  Fungus Rigidoporus microporus as Revealed by Mycelial Incompatibility, p. 68–75. In S. Prawirosoemardjo, B. Setyawan, H. Suryaningtyas, M. Supriadi (eds.), Proceeding of International Workshop on White Root Disease of Hevea Rubber, Salatiga, 28–29 November 2006.
Gambar 7. Pohon filogenetik isolat jamur akar putih (JAP) yang menunjukkan tingkat kekerabatan dengan pemotongan enzim Hae III , Msp I , dan Hinf I 1AM 2AM 1ABW KC
KWD KWS ABL
3ABW 2ABW AK KPSP
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia Vol. 17 No. 1 6