 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index

## Studi Filogenetik Gen Penyandi Glikoprotein Virus CyHV-3 Pada Ikan Koi Di Beberapa Daerah Jawa Timur

## Phylogenetic Study of CyHV-3 Virus Glycoprotein Encoding Genes in Koi Fish in Several Regions of East Java
Indra Sukma Putra* 2 , Mohammad Fathoni 2 , Suwarno 1 , Jola Rahmahani 1
1 Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya Kampus C Mulyorejo Surabaya, 60115 Telp. 031-5992785 2 Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Surabaya I Jl. Raya Bandara Juanda No. 23 Semambung, Gedangan, Sidoarjo Telp. 081335690974
E-mail: ahmadisukma14@gmail.com

## ABSTRAK
Virus Cyprinid Herpesvirus 3 (CyHV-3) merupakan salah satu penyebab infeksi akut penyebab kematian pada ikan koi. Genom CyHV-3 mengkode lima keluarga gen:ORF2, reseptor tumor necrosis factor (TNFR), ORF22,ORF25, dan RING. Dalam pemantauan Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Surabaya I tahun 2015 ditemukan penyakit Koi Herpesvirus di beberapa daerah di Jawa Timur yaitu Malang, Madiun, Kediri dan Blitar.  Sampel yang berupa ikan koi dilakukan deteksi terhadap CyHV-3 dengan metode PCR,setelah dipastikan positif terhadap virus CyHV-3, dilakukan PCR kembali pada isolat DNA dengan menggunakan primer spesifik terhadap gen penyandi glikoprotein (ORF25),selanjutnya disekuensing menggunakan metode direct sequencing sehingga diketahui sekuen nukleotida. Sekuen nukleotida selanjutnya diterjemahkan dalam bentuk asam amino. Hasil sekuen nukleotida dan asam amino di  alignment menggunakan program GENETYX ver 10, serta dilanjutkan analisa filogenetik. Hasil pohon filogenetik pada gen ORF25 menunjukkan isolat Jawa Timur (Malang, Madiun, Kediri dan Blitar,) dekat kekerabatannya dengan isolat China (KP004892),  Jepang (AP008984)  dan Korea (JQ308816) daripada dengan isolat Amerika (NC_009127.1) dan Israel (DQ177346). Pada penelitian ini dapat disimpulkan bahwa isolat CyHV-3Jawa Timur (Malang, Madiun, Kediri dan Blitar) memiliki homologi dan tingkat kekerabatan yang tinggi pada sekuen nukleotida dan asam amino dan diindikasikan berasal dari China,  sehingga gen ORF25pada isolat tersebut dapat diketahui untuk mengidentifikasi asal muasal penyakit dan menentukan kebijakan sehingga  dapat segera dicegah/dikendalikan penyakit KHV pada ikan koi.
Kata Kunci: CyHV-3; Gen Glikoprotein; Sekuensing; Ikan Koi; Jawa Timur
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index

## ABSTRACT
Virus cyprinid Herpesvirus 3 (CyHV-3) is one of the causes of acute infectious cause of death in koi fish. The CyHV-3genome encodes five  gene family ORF2, tumor necrosis factor receptor (TNFR), ORF22, ORF25, and RING. In monitoring Fish Quarantine, Quality Control and Safety of Fishery Class I  Surabaya I 2015, Koi Herpesvirus disease is found in some areas in East Java, Malang, Madiun, Kediri, and Blitar. Samples in the form of koi fish were detected for CyHV-3 with the PCR method. After it was confirmed positive for the virus CyHV-3, then re-isolate DNA PCR was  performed using specific primers to the gene coding for the glycoprotein (ORF25). Then, sequenced using direct sequencing method that is known as nucleotide sequences.The nucleotide sequences were then translated into amino acids. The results of the nucleotide and amino acid sequences were then aligned using the GENETYX ver 10 program and continued with phylogenetic analysis. The results of the phylogenetic tree of the gene ORF25 showed isolates East Java (Malang, Madiun, Kediri, and Blitar,) closely related to isolate China (KP004892), Japan (AP008984) and Korea (JQ308816) than the American isolates (NC_009127.1) and Israel ( DQ177346). In this study, it can be concluded that the isolated CyHV-3 East Java (Malang, Madiun, Kediri, and Blitar) has high homology in nucleotide and amino acid sequences, and can be indicated as originating from China, so that the isolate in the ORF25 gene can be identified to identify the origin of the disease and determine policies so that KHV disease can be immediately prevented/controlled in koi fish.
Keyword: CyHV-3; Glycoprotein gene; Sequencing; Koifish; East Java

## PENDAHULUAN
Produksiikan hias merupakan komponen pentingdari industriakuakulturdi beberapaNegara, termasuk di Indonesia. Secara khusus Ikan koi ( Cyprinus carpio) merupakan ikan hias yang bernilai ekonomis tinggi. Virus Cyprinid Herpesvirus 3 (CyHV-3) merupakan salah satu penyebab infeksi akut penyebab kematian pada ikan koi.
Virus ini mengakibatkan kematian massal, yaitu 80-90 % dari populasi sehingga berdampak pada kerugian ekonomi dan sosial.
Genom CyHV-3 adalah 295 kb, linear, double stranded Molekul DNA yang terdiri dari bagian tengah besar diapitoleh dua 22 kb daerah ulangan, disebut ulangan  kiri dan kanan. Genom CyHV-3 diperkirakan mengandung 155 protein-coding
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index
potensial open reading frame (ORFs), dimana delapan (ORF1-ORF8) adalah yang digandakan dalam ulangan terminal. Sembilan ORFs ditandai oleh adanyaintrons. Genom CyHV-3 mengkode lima keluarga gen:ORF2, reseptor tumor necrosis factor (TNFR), ORF22,ORF25, dan RING. Keluarga ORF25terdiri dari 6 urutan paralogous (ORF25, ORF26,ORF27, ORF65, ORF148 dan ORF149) yang berpotensi mengkode membran glikoprotein Tipe 1 (Aoki et al., 2007).
CyHV-3 yang telah menginfeksi ikan koi telah terdaftar pada Genbank yaitu NC_009127.1 (CyHV-3 complete genom asal Amerika), AP008984 (CyHV-3 complete genom asal Jepang),
KP004892 (CyHV-3 complete genom asal China), JQ308816 (CyHV-3 complete genom asal Korea), dan DQ177346 (CyHV-3 complete genom asal Israel).
Di Indonesia, penyakit Koi Herpesvirus (KHV) yang awal kalinya muncul di daerah Blitar Jawa Timur, saat ini telah menyerang budidaya ikan koi ataupun ikan cyprinid pada hampir semua wilayah di Indonesia. KHV muncul pertama kali di Indonesia pada tahun 2002, namun sampai saat ini belum ada langkah strategis untuk menanggulangi penyakit ini. Hal ini menyebabkan  Indonesia belum  aman dari ancaman wabah KHV. Berdasarkan hasil pemantauan hama dan penyakit ikan karantina (HPIK) yang dilakukan Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan
Hasil Perikanan Kelas I Surabaya I tahun 2015 di wilayah kerjanya telah ditemukan penyakit KHV. Gejala klinis yang utama oleh infeksi Penyakit KHV pada ikan Koi dan ikan mas pada umumnya menunjukkan tanda putih dan sel yang mati pada selaput insang. Ikan seringkali berenang di permukaan dan menunjukkan gangguan pernafasan.  Tanda lainnya seperti mata tenggelam atau masuk, luka pada sekujur tubuh, lendir  yang berlebihan dan kulit yang pucat. Hasil penyakit KHV yang ditemukan  telah dibuktikan dengan pengujian Polimerase Chain Reaction (PCR).  Oleh karena itu dari hasil penemuan penyakit KHV dalam pemantauan Balai KIPM Kelas I Surabaya I ini di beberapa wilayah di JawaTimur, khususnya di Blitar tahun 2015 ini perlu dilakukan studi genotipegen penyandi glikoprotein virus penyebab penyakit KHV (yaitu Cyprinid Herpesvirus-3 (CyHV-3)) pada ikan koi ( Cyprinid ) yang ada di sentra perikanan Jawa Timur.

## BAHAN DAN METODE

## Pelaksanaan Penelitian
Pelaksanaan kegiatan penelitian ini dilakukan di Laboratorium Balai Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Surabaya I di Surabaya dan Institute of Tropical Disease (ITD) Universitas Airlangga, Surabaya, selama 3 (tiga) bulan mulai
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index
bulan  Desember  2015  sampai  dengan bulan Februari 2015.
Populasi dalam penelitian ini adalah ikan koi. Koleksi sampel ikan yang diduga terinfeksi penyakit KHV diperoleh dari sentra budidaya ikan wilayah pemantauan Balai KIPM Surabaya I di beberapa daerah di Jawa Timur yaitu Pasuruan, Tulungagung, Malang, Madiun, Kediri dan Blitar. Jumlah sampel yang diambil sebanyak enam sampai sepuluh ekor, dari total populasi tiap  kolam 100–250 ekor (Modifikasi Amoz (1985) dalamPusat Karantina Ikan, 2010) dan semua sampel diambil secara acak kemudian dijadikan satu dalam pengujiannya. Ikan yang diduga terinfeksi CyHV-3 atau menunjukkan gejala klinis spesifik terhadap  penyakit KHV yang ditandai dengan tubuh berwarna kemerahan, insang busuk serta diperkuat dengan hasil PCR konvensional spesifik terhadap Koi Herpesvirus (KHV) dan dinyatakan positif, selanjutnya dilakukan PCR kembali dengan primer gen ORF25 CyHV-3 kemudian dilakukan sekuensing DNA.
Pemeriksaan dengan uji Polymerase Chain Reaction (PCR) Ekstraksi  DNA TRI Reagent : Insang sebanyak 50-100 mg dipotong kecil-kecil dan digerus halus dengan pisau bedah atau gunting steril. Untuk menghindari kontaminasi, setiap sampel harus diproses dengan menggunakan tempat dan alat yang berbeda. Selanjutnya sampel tersebut
dilakukan ekstraksi DNA. Pertama dengan menambahkan 1 ml Tri Reagent® ke dalam Eppendorf yang berisi 50 mg sampel, dicampur sampai homogen dan diinkubasi pada suhu ruang  selama 5 menit, kemudian disentrifugasi  pada kecepatan 14.000 rpm pada suhu ruang selama 5-10 menit. Tahapan selanjutnya, dengan memindahkan supernatan ke dalam tabung baru, dan ditambahkan 0,5 ml ethanol 100% dicampur homogen. Kemudian supernatan disentrifugasi pada 10.000 rpm, suhu ruang, selama 5 menit. Supernatan kemudian dibuang, pellet dicuci dengan cara ditambahkan 1 ml alkohol 90%. Pencucian dengan 1 ml alkohol 90% ini dilakukan sebanyak 3 kali atau sampai warna pigmen kekuningan hilang. Selama proses pencucian, supernatan disentrifugasi pada 10.000 rpm, suhu ruang, selama 5 menit. Tahap terakhir, supernatan dibuang, pellet DNA dikeringkan dan dilarutkan dengan ddH 2 O atau Nuclease Free Water dan dilakukan amplifikasi (Pusat Karantina Ikan, 2008).

## Amplifikasi
Amplifikasi pertama dilakukan untuk memastikan adanya virus KHV berdasarkan OIE tahun 2012 . Primer mix dan template control diletakkan di atas es, untuk menghilangkan sifat aerosol serta mencampur dilakukan spin cepat atau sentrifugasi. Reaksi menggunakan kontrol negatif dari template atau water blank dan satu kontrol positif  ( template kontrol positif
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index
adalah positif untuk KHV). Selanjutnya ditambahkan 7 μ l ddH 2 O, 1 μ l primer mix (0,75 μ l  primer Bercovier TK primers= Forward : 5’-GGG-TTA-CCT- GTA-CGA-G-3’ Reverse : 5’-CAC-CCA- GTA-GAT-TAT-GC-3’ Product size = 409 bp), 12,5 μ l master mix, dan 4 μ l DNA template DNA. Kemudian dicampur dengan vortek spindown. Selanjutnya dilakukan amplifikasi : denaturasi pada 94 o C  selama 5 menit (1 siklus), a nnealing pada 95 o C  selama 1 menit, 55
o C selama 1 menit, 72 o C selama 1 menit (40 siklus), dan e xtension 72 o C selama 10 menit (1 siklus) (OIE, 2012).
Selanjutnya hasil ektrsaksi DNA dilakukan amplifikasi lagi dengan menggunakan  primer spesifik  CyHV-3
ORF25,  untuk melihat sekuen produk PCR-nya agar bisa dianalisa homologi molekulernya. Primer mix dan template
diletakkan di atas es, untuk menghilangkan sifat aerosol serta mencampur dilakukan spin cepat atau sentrifugasi.  Reaksi  menggunakan isolate/ template hasil isolasi DNA sampel yang dinyatakan positif PCR CyHV-3. Selanjutnya ditambahkan 7 μ l ddH 2 O,  12,5 μ l master mix, 4 μ l DNA template  yang telah dinyatakan positif CyHV-3 dan 1,5 μ l primer mix (@ 0,75 μ l primerForward/Reverse). Adapun untuk masing-masing primer dilakukan proses amplifikasi dengan pengaturan suhu yaitu  denaturasi  pada 95 o C selama 30 detik (1 siklus), a nnealing pada 95 o C selama 30 detik,  61 o C  (I), 59 o C  (II),  62 o C  (III)  selama  60 detik, 72 o C selama 90 detik (30  siklus), dan e xtension pada 72 o C selama 7 menit (1 siklus) (Modifikasi Han et. al ., 2013).
Tabel 1. Posisi dan Sekuens Nukleotida dari Primer CyHV-3
PRIMER SEKUEN NUKLEOTIDA LOKUS AMPLICON CyHV-3 Bercovier TK primers (OIE, 2012) F1 5’ GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G 3’ 96087-96103 409 bp R1 5’ CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC 3’ 96479-96496 CyHV-3 ORF 25  (Han, 2013) 25F1 5’ ATG-ACG-GGT-TGT-GGG-GTT-TGG 3’ 45570-45590 1,806 bp 25R1 5’ TTA-GGG-CCT-CCG-GGA-AAC-CTG 3’ 47355-47375
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index

## Tabel 2. Posisi dan Sekuens Nukleotida dari Primer CyHV-3
PRIMER SEKUEN NUKLEOTIDA LOKUS AMPLICON ORF 25 (I)25F1 5’ ATGACGGGTTGTGGGGTTTGG 3’ 45570-45590 696 bp (I)R1 5’ TCACGTCAAAGGGACAGTCG 3’ 46246-46266 (II)F2 5’ GCGTCTCGGGAGATACTTTG 3’ 46140-46160 645 bp (II)R2 5’ GGGCACTCCATCTCAAAGAC 3’ 46765-46785 (III)F3 5’ AGGGCACCGTCTTTGAGATG 3’ 46757-46777 618 bp (III)25R1 5’ TTAGGGCCTCCGGGAAACCTG 3’ 47355-47375

## Visualisasi Hasil Amplifikasi
Produk hasil PCR divisualisasikan dengan metode elektroforesis yang menggunakan gel agarose 2% yang mengandung ethidium bromide dengan menggunakan buffer TAE. Marker yang digunakan 100 bp DNA ladder . Tahap elektroforesis dilakukan pada 100 volt selama kurang lebih 20-30 menit.
Selanjutnya untuk visualisasi dengan UV-transluminator pada panjang gelombang 302 nm (Nawan et al ., 2012).

## Purifikasi produk PCR
Purifikasi produk PCR dilakukan dengan menggunakan QLAquick Gel Extration Kit, fragmen DNA dari gel agarose dipotong dengan menggunakan scalpel yang bersih dan tajam. Potongan gen kemudian dimasukkan ke dalam mikrotube 1,5 ml dan ditimbang dan selanjutnya ditambah 3x volume gel dengan Buffer QG. Tube berisi potongan gel dan
buffer selanjutnya diinkubasi pada suhu 50°C selama 10 menit pada waterbath. Setelah gel larut sempurna ditambah dengan isopropanol sebanyak 1x volume gel, kemudian larutan tersebut dimasukkan ke dalam QLAquick spin column dan disentrifus dengan kecepatan 17.900 g selama 1 menit. Cairan pada bagian bawah kemudian dibuang dan selanjtnya ditambah 500 µl buffer QG kedalam QLAquick spin column dan disentrifus dengan kecepatan 17.900 g selama 1 menit. Cairan pada bagian bawah kemudian dibuang selanjutnya ditambah 750 Buffer PE kedalam QLAquick spin column dan setrifus dengan kecepatan 17.900 g selama 1 menit. QLAquick spin column dimasukkan  kedalam tube 1,5 ml dan ditambah  Buffer EB sebanyak 30 µl dibiarkan dahulu selama 3 menit pada suhu ruang. Selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 17.900 g selama 1
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index
menit. Hasil purifikasi produk PCR ini kemudian dilanjutkan dengan sekuensing (Hendriyanto, 2013).

## Sekuensing DNA
Sekuensing nukleotida ini dilakukan melalui tiga tahap, tahap pertama adalah melakukan tahap labelling yaituDNA yang sudah murni dilabel dengan Big Dye Terminator kit versi  3.1. Penambahan reagen ini bertujuan untuk memberikan fluoresensi yang digunakan untuk membedakan urutan nukleotida. Pada tahap ini mesin thermocycler diprogram dalam keadaan suhu initial denaturation 96 ⁰ C selama 1 menit, kemudian sebanyak 5 siklus pada 96 ⁰ C selama 10 detik, 50 ⁰ C selama 5 detik dan 60 ⁰ C selama 4 menit. Tahap kedua yaitu melakukan hasil purifikasi cycle sequencing menggunakan Big Dye X Terminator yang bertujuan untuk memurnikan nukleotida dan menghilangkan Big Dye Label yang tersisa. Setelah itu, tahap terakhir yaitu melakukan sekuensing genome CyHV- 3 dengan menggunakan mesin sequencer ABI 3500 xL GENETIC ANALYSER (Applied Biosystems, Inc.). Kegiatan Sekuensing dilakukan oleh PT. Genetika Science.

## Analisis Data Molekuler
Data yang terkumpul dari hasil sekuensing yaitu data urutan
nukleotida CyHV-3 potongan gen penyandi ORF25 tersebut, kemudian dianalisis  dan disambungkan serta dibandingkan dengan referensi menggunakan software GENETYX-Win versi 10. Sekuen nukleotida gen penyandi ORF25 CyHV-3 yang didapatkan dihomologikan dengan urutan nukleotida  dari berbagai genotipe dari GeneBank , menggunakan program software GENETYX-Win versi 10.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil Pemeriksaan Virus CyHV-3
Untuk memastikan adanya infeksi penyakit KHV pada ikan koi, perlu dilakukan pemeriksaan dengan teknik PCR. Pengujian dengan menggunakan teknik PCR merupakan Gold Standar untuk deteksi penyakit KHV. Prosedur dan kondisi PCR merujuk pada pengujian Office International des Epizooties (OIE) tahun 2012 dengan menggunakan primer spesifik CyHV-3 (Bercovier, 2005) yang menghasilkan produk  pada 409 bp. Hasil dari elektroforesis menunjukkan bahwa untuk ikan yang menunjukkan gejala klinis  penyakit  KHV diperoleh pita pada 409 bp atau sejajar dengan kontrol positif,  yaitu sampel ikan koi yang berasal dari daerah Malang, Madiun, Kediri dan Blitar.  Gambar hasil elektroforesis disajikan pada Gambar 1.
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index

## Hasil Pemeriksaan ORF25 CyHV-3
Hasil dari deteksi PCR terhadap virus penyebab penyakit Koi Herpesvirus Disease (CyHV-3) dilanjutkan untuk pemeriksaan terhadap gen penyandi glikoprotein virus tersebut. Hasil Ekstraksi dari sampel yang positif dilakukan amplifikasi lagi dengan menggunakan primer spesifik ORF25 CyHV-3.
Adapun  Hasil dari elektroforesis menunjukkan bahwa semua ikan yang menunjukkan gejala klinis terdapat pita ( band ) yang spesifik dengan ORF25 CyHV-3 dengan bp yang sesuai dengan primer masing-masing. Hasil elektroforesis  dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 1. Hasil elektroforesis Virus CyHV-3 sampel C (Malang), sampel D dari ikan koi (Madiun), sampel E (Kediri) dan sampel F (Blitar), K- adalah kontrol negatif, K+ adalah kontrol positif dan M adalah marker.
M      K+     K-       A        B       C        D        E         F 400 409 bp 500 300 bp
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index

## Hasil Sekuensing Nukleotida  Gen ORF25 Virus CyHV-3
Hasil PCR masing- masing fragmen DNA  selanjutnya disekuensing dengan menggunakan ABI 35000 xL Genetic Analyzer sehingga dapat diketahui susunan nukleotida dari potongan gen ORF 25CyHV-3  sampel ikan koi tersebut di atas. Urutan nukleotida
yang diperoleh dari hasil sekuensing DNA CyHV-3 isolat  lokal selanjutnya dilakukan multiple alignment susunan nukleotida dengan isolat lain yang didapatkan dari GenBank . Hasil dari multiple alignment susunan nukleotida ORF25CyHV-3 terdapat beberapa perbedaan, yaitu dapat dilihat pada Gambar 3.
NC_009127.1-USA CyHV3 1 A T G A C GGG TT G T GGGG TTT GG T GG A C G A CC GG CC T GG C G TT G C T GG T C A T C G CC G T C T CC 60 Sampel C 1 . . . . . ... .. . . .... ... .. . .. . . . . .. .. .. . .. . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . . .. 60 Sampel D 1 . . . . . ...G . . . .... ... .. . .. . . . . .. .. .. . .. . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . . .. 60 Sampel E 1 . . . . . ...G . . . .... ... .. . .. . . . . .. .. .. . .. . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . . .. 60 Sampel F 1 . . . . . ...G . . . .... ... .. . .. . . . . .. .. .. . .. . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . . .. 60
AP008984-Japan CyHV3(TUMST1)   1 . . . . . ... .. . . .... ... .. . .. . . . . .. .. .. . .. . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . . .. 60
JQ308816-Korea CyHV3(SNUKHV)   1 . . . . . ... .. . . .... ... .. . .. . . . . .. .. .. . .. . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . . .. 60
KP004892-China CyHV3(HZ419)   1 . . . . . ... .. . . .... ... .. . .. . . . . .. .. .. . .. . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . . .. 60 GU815502-USA CyHV3(FL) 1 . . . . . ... .. . . .... ... .. . .. . . . . .. .. .. . .. . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . . .. 60 DQ657948-USA CyHV3(KHV-U) 1 . . . . . ... .. . . .... ... .. . .. . . . . .. .. .. . .. . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . . .. 60
DQ177346-Israel CyHV3(KHV-I)   1 . . . . . ... .. . . .... ... .. . .. . . . . .. .. .. . .. . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . . .. 60 KJ627438-China CyHV3(GZ11) 1 . . . . . ... .. . . .... ... .. . .. . . . . .. .. .. . .. . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . . .. 60 NC_009127.1-USA CyHV3 61 CC A T C T --- C A G C A G A CC A C GG CCC T C AA C A T AAA C T C TTT GG T C T A C T C T G T G A G C T A C 117 Sampel C 61 .. . . . . C T G . . . . . . . .. . . .. ... . . .. . . . ... . . . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 Sampel D 61 .. . . . . C T G . . . . . . . .. . . .. ... . . .. . . . ... . . . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 Sampel E 61 .. . . . . C T G . . . . . . . .. . . .. ... . . .. . . . ... . . . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 Sampel F 61 .. . . . . C T G . . . . . . . .. . . .. ... . . .. . . . ... . . . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 AP008984-Japan CyHV3(TUMST1)   61 .. . . . . C T G . . . . . . . .. . . .. ... . . .. . . . ... . . . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 JQ308816-Korea CyHV3(SNUKHV)   61 .. . . . . --- . . . . . . . .. . . .. ... . . .. . . . ... . . . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 KP004892-China CyHV3(HZ419)   61 .. . . . . C T G . . . . . . . .. . . .. ... . . .. . . . ... . . . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 GU815502-USA CyHV3(FL) 61 .. . . . . --- . . . . . . . .. . . .. ... . . .. . . . ... . . . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 DQ657948-USA CyHV3(KHV-U) 61 .. . . . . --- . . . . . . . .. . . .. ... . . .. . . . ... . . . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
Gambar  2. Hasil elektroforesis ORF25 CyHV-3 a). primer 1 (C1, D1, E1, F1), b). primer 2 (C2, D2, E2, F2) dan c). primer 3 (C3, D3, E3, F3).
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index
DQ177346-Israel CyHV3(KHV-I)   61 .. . . . . --- . . . . . . . .. . . .. ... . . .. . . . ... . . . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 KJ627438-China CyHV3(GZ11) 61 .. . . . . --- . . . . . . . .. . . .. ... . . .. . . . ... . . . ... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 NC_009127.1-USA CyHV3 1438 A CC A CC A CC A CCCC G A CCC T G CC A G T C A CC A C A CC AAA G A C G A C G A C G C T C A GG A C T A C A 1497 Sampel C 1441 . .. . .. . .. . .... . . ... . . .. . . . . . .. . . . .. ... . . G. . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1500 Sampel D 1441 . .. . .. . .. . .... . . ... . . .. . . . . . .. . . . .. ... . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1500 Sampel E 1441 . .. . .. . .. . .... . . ... . . .. . . . . . .. . . . .. ... . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1500 Sampel F 1441 . .. . .. . .. . .... . . ... . . .. . . . . . .. . . . .. ... . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1500
AP008984-Japan CyHV3(TUMST1)   1441 . .. . .. . .. . .... . . ... . . .. . . . . . .. . . . .. ... . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1500
JQ308816-Korea CyHV3(SNUKHV)   1438 . .. . .. . .. . .... . . ... . . .. . . . . . .. . . . .. ... . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1497 KP004892-China CyHV3(HZ419)   1441 . .. . .. . .. . .... . . ... . . .. . . . . . .. . . . .. ... . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1500 GU815502-USA CyHV3(FL) 1438 . .. . .. . .. . .... . . ... . . .. . . . . . .. . . . .. ... . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1497 DQ657948-USA CyHV3(KHV-U) 1438 . .. . .. . .. . .... . . ... . . .. . . . . . .. . . . .. ... . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1497 DQ177346-Israel CyHV3(KHV-I)   1438 . .. . .. . .. . .... . . ... . . .. . . . . . .. . . . .. ... . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1497 KJ627438-China CyHV3(GZ11) 1438 . .. . .. . .. . .... . . ... . . .. . . . . . .. . . . .. ... . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 1497 NC_009127.1-USA CyHV3 1558 A CC T C G C TT CC G A C G A C G TT C A C AA CCCC G A C G C T G A CC G T C G C -- CCCC G A C G ------ 1609 Sampel C 1561 . .. . . A . - A GG. . . -- . . . C. . .C G . G . TT C. . A C . . . G T. . A . AA .... . . . . C T G A CC 1617 Sampel D 1561 . .. . . A . - A GG. . . -- . . . C. . .C G . G . TT C. . A C . . . G T. . A . AA .... . . . . C T G A CC 1617 Sampel E 1561 . .. . . A . - A GG. . . -- . . . C. . .C G . G . TT C. . A C . . . G T. . A . AA .... . . . . C T G A CC 1617 Sampel F 1561 . .. . . A . - A GG. . . -- . . . C. . .C G . G . TT C. . A C . . . G T. . A . AA .... . . . . C T G A CC 1617
AP008984-Japan CyHV3(TUMST1)   1561 . .. . . A . - A GG. . . -- . . . C. . .C G . G . TT C. . A C . . . G T. . A . AA .... . . . . C T G A CC 1617 JQ308816-Korea CyHV3(SNUKHV)   1558 . .. . . A . - A GG. . . -- . . . C. . .C G . G . TT C. . A C . . . G T. . A . AA .... . . . . C T G A CC 1614
KP004892-China CyHV3(HZ419)   1561 . .. . . A . - A GG. . . -- . . . C. . .C G . G . TT C. . A C . . . G T. . A . AA .... . . . . C T G A CC 1617 GU815502-USA CyHV3(FL) 1558 . .. . . . . .. .. . . . . . . . .. . . . .. .... . . . . . . . . .. . . . . . -- .... . . . . ------ 1609 DQ657948-USA CyHV3(KHV-U) 1558 . .. . . . . .. .. . . . . . . . .. . . . .. .... . . . . . . . . .. . . . . . -- .... . . . . ------ 1609
DQ177346-Israel CyHV3(KHV-I)   1558 . .. . . . . .. .. . . . . . . . .. . . . .. .... . . . . . . . . .. . . . . . -- .... . . . . ------ 1609 KJ627438-China CyHV3(GZ11) 1558 . .. . . A . - A GG. . . -- . . . C. . .C G . G . TT C. . A C . . . G T. . A . AA .... . . . . C T G A CC 1614 NC_009127.1-USA CyHV3 1610 ------------- A GGG A T CC A G C GG C G C G C T GG T GG T G C T C A T C G T C A T AA CC G T G TTT 1656 Sampel C 1618 G T C G CCCCC G A C G . ... . . .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . ... 1677 Sampel D 1618 G T C G CCCCC G A C G . ... . . .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . ... 1677 Sampel E 1618 G T C G CCCCC G A C G . ... . . .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . ... 1677 Sampel F 1618 G T C G CCCCC G A C G . ... . . .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . ... 1677 AP008984-Japan CyHV3(TUMST1)   1618 G T C G CCCCC G A C G . ... . . .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . ... 1677
JQ308816-Korea CyHV3(SNUKHV)   1615 G T C G CCCCC G A C G . ... . . .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . ... 1674 KP004892-China CyHV3(HZ419)   1618 G T C G CCCCC G A C G . ... . . .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . ... 1677 GU815502-USA CyHV3(FL) 1610 ------------- . ... . . .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . ... 1656 DQ657948-USA CyHV3(KHV-U) 1610 ------------- . ... . . .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . ... 1656
DQ177346-Israel CyHV3(KHV-I)   1610 ------------- . ... . . .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . ... 1656 KJ627438-China CyHV3(GZ11) 1615 G T C G CCCCC G A C G . ... . . .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . ... 1674 NC_009127.1-USA CyHV3 1777 TT C GGGG CCC A GG TTT CCC GG A GG CCC T AA 1806 Sampel C 1798 .. . .... ... . .. ... ... .. . .. ... . .. 1827 Sampel D 1798 .. . .... ... . .. ... ... ..G.. ... . .. 1827 Sampel E 1798 .. . .... ... . .. ... ... . A. .. ... . .. 1827 Sampel F 1798 .. . .... ... . .. ... ... . A. .. ... . .. 1827 AP008984-Japan CyHV3(TUMST1)   1798 .. . .... ... . .. ... ... .. . .. ... . .. 1827
JQ308816-Korea CyHV3(SNUKHV)   1795 .. . .... ... . .. ... ... .. . .. ... . .. 1824 KP004892-China CyHV3(HZ419)   1798 .. . .... ... . .. ... ... .. . .. ... . .. 1827 GU815502-USA CyHV3(FL) 1777 .. . .... ... . .. ... ... .. . .. ... . .. 1806 DQ657948-USA CyHV3(KHV-U) 1777 .. . .... ... . .. ... ... .. . .. ... . .. 1806
DQ177346-Israel CyHV3(KHV-I)   1777 .. . .... ... . .. ... ... .. . .. ... . .. 1806 KJ627438-China CyHV3(GZ11) 1795 .. . .... ... . .. ... ... .. . .. ... . .. 1824
Keterangan : Sampel C: ikan koi Malang, Sampel D: ikan koi Madiun, Sampel E :ikan koi Kediri dan  Sampel F : ikan koi Blitar
Gambar 3. Multiple alignment susunan nukleotida dari isolat lokal CyHV-3 pada gen ORF25 dari Jawa Timur dibandingkan dengan isolat CyHV-3 lain dari GenBank .
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index
Urutan  nukleotida isolat Jawa Timur (Malang, Madiun, Kediri dan Blitar) selanjutnya diterjemahkan dalam bentuk asam amino menggunakan software GENETYX ver. 10 kemudian
dibandingkan dengan urutan asam amino isolat lain yang didapatkan dari GenBank danhasil dari multiple alignment susunan asam amino dapat dilihat pada Gambar 4.
NC_009127-USA 1 M TGCG V WWTTG LALLVIAV S P S - QQTT AL N I NS LVY S V S Y S VP R F CG V NG LPY E I S A T F T 59 Sampel C 1 . .... . ..... ........ . . . L .... .. . . .. ... . . . . . .. . . .. . .. ... . . . . . . . 60 Sampel D 1 . .... . ..... ........ . . . L .... .. . . .. ... . . . . . .. . . .. . .. ... . . . . . . . 60 Sampel E 1 . .... . ..... ........ . . . L .... .. . . .. ... . . . . . .. . . .. . .. ... . . . . . . . 60 Sampel F 1 . .... . ..... ........ . . . L .... .. . . .. ... . . . . . .. . . .. . .. ... . . . . . . . 60 AP008984-Japan CyHV3(TUMST1) 1 . .... . ..... ........ . . . L .... .. . . .. ... . . . . . .. . . .. . .. ... . . . . . . . 60 JQ308816-Korea CyHV3(SNUKHV) 1 . .... . ..... ........ . . . - .... .. . . .. ... . . . . . .. . . .. . .. ... . . . . . . . 59 KP004892-China CyHV3(HZ419) 1 . .... . ..... ........ . . . L .... .. . . .. ... . . . . . .. . . .. . .. ... . . . . . . . 60 GU815502-USA CyHV3(FL) 1 . .... . ..... ........ . . . - .... .. . . .. ... . . . . . .. . . .. . .. ... . . . . . . . 59 DQ657948-USA CyHV3(KHV-U) 1 . .... . ..... ........ . . . - .... .. . . .. ... . . . . . .. . . .. . .. ... . . . . . . . 59 DQ177346-Israel CyHV3(KHV-I) 1 . .... . ..... ........ . . . - .... .. . . .. ... . . . . . .. . . .. . .. ... . . . . . . . 59 KJ627438-China CyHV3(GZ11) 1 . .... . ..... ........ . . . - .... .. . . .. ... . . . . . .. . . .. . .. ... . . . . . . . 59 NC_009127-USA 480 TTTT P T LPV TT P K TTT L R TTT LPAPP T I TTTT P GSSTG A GTS ------ LP TT F TT P T L T V 533 Sampel C 481 .... . . ... .. . .R .. . . ... ..... . . .... . ..... . ...QG P ST A.. .. . .. . . . . . 540 Sampel D 481 .... . . ... .. . . ... . . ... ..... . . .... . ..... . ...QG P ST A.. .. . .. . . . . . 540 Sampel E 481 .... . . ... .. . . ... . . ... ..... . . .... . ..... . ...QG P ST A.. .. . .. . . . . . 540 Sampel F 481 .... . . ... .. . . ... . . ... ..... . . .... . ..... . ...QG P ST A.. .. . .. . . . . . 540
AP008984-Japan CyHV3(TUMST1)   481 .... . . ... .. . . ... . . ... ..... . . .... . ..... . ...QG P ST A.. .. . .. . . . . . 540 JQ308816-Korea CyHV3(SNUKHV)   480 .... . . ... .. . . ... . . ... ..... . . .... . ..... . ...QG P ST A.. .. . .. . . . . . 539
KP004892-China CyHV3(HZ419)   481 .... . . ... .. . . ... . . ... ..... . . .... . ..... . ...QG P ST A.. .. . .. . . . . . 540 GU815502-USA CyHV3(FL) 480 .... . . ... .. . . ... . . ... ..... . . .... . ..... . ... ------ .. .. . .. . . . . . 533 DQ657948-USA CyHV3(KHV-U) 480 .... . . ... .. . . ... . . ... ..... . . .... . ..... . ... ------ .. .. . .. . . . . . 533 DQ177346-Israel CyHV3(KHV-I)   480 .... . . ... .. . . ... . . ... ..... . . .... . ..... . ... ------ .. .. . .. . . . . . 533 KJ627438-China CyHV3(GZ11) 480 .... . . ... .. . . ... . . ... ..... . . .... . ..... . ...QG P ST A.. .. . .. . . . . . 539 NC_009127-USA 594 G A Q V S RR P 601 Sampel C 601 . . . . . .. . 608 Sampel D 601 . . . . . . G . 608 Sampel E 601 . . . . . .. . 608 Sampel F 601 . . . . . .. . 608 AP008984-Japan CyHV3(TUMST1)   601 . . . . . .. . 608 JQ308816-Korea CyHV3(SNUKHV)   600 . . . . . .. . 607 KP004892-China CyHV3(HZ419)   601 . . . . . .. . 608 GU815502-USA CyHV3(FL) 594 . . . . . .. . 601 DQ657948-USA CyHV3(KHV-U) 594 . . . . . .. . 601 DQ177346-Israel CyHV3(KHV-I)   594 . . . . . .. . 601 KJ627438-China CyHV3(GZ11) 600 . . . . . .. . 607
Keterangan  asam amino  :  A: Alanin;  C: Sistein;  D: Asam aspartat;  E: Asam glutamat;  F: Fenilalanin; G: Glisin; H: Histidin; I: Isoleusin; K: Lisin; L: Leusin; M: Metionin; N: Aspargin; P: Prolin; R: Arginin; V: Valin; S: Serin; T: Treonin.
Gambar  4. Multiple alignment urutan asam amino dari isolat Jawa Timur (sampel C (Malang), sampel D (Madiun), sampel E (Kediri), sampel F (Blitar)) dari gen ORF25 dibandingkan dengan isolat ORF25 CyHV3 lain dari GenBank .
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index

## DOI:
10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232
Adapun hasil dari multiple alignment susunan nukleotida ORF25secara utuh dari masing –  masing sampel CyHV-3
setelah diketahui beberapa
perbedaannya,  ditampilkan sebagai berikut pada Gambar 5.

## A. Sampel Malang

## B. Sampel Madiun
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index

## C. Sampel Kediri

## D. Sampel Blitar
Gambar 5. Urutan nukleotida hasil sekuensing DNA secara utuhORF25 CyHV-3 Ikan KoiJawa Timur (A. Malang, B. Madiun, C. Kediri dan D. Blitar).
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index

## Analisis Sekuen Nukleotida dan Asam
Amino Gen ORF25 CyHV-3 Isolat Lokal Setelah diketahui masing-masing hasil nukleotida dari PCR dengan primernya, dilakukan penggabungan dengan  program GENETYX ver. 10 menunjukan nukleotidanya sepanjang 1827 bp. Panjang nukleotida yang dihasilkan berbeda dengan referensi GenBank NC_009127.1-USA CyHV-3. Menurut referensi GenBank , nukleotida NC_009127.1-USA gen ORF25 CyHV-3 sepanjang  1806 bp, perbedaan ini ditunjukkan dengan adanya insersi dan delesi terhadap nukleotida sampel isolat lokal. Bila dibandingkan referensi NC_009127.1 CyHV3 dari USA, insersi untuk isolat sampel dari Malang, Madiun, Kediri dan Blitar ada pada beberapa sekuen yaitu : setelah sekuen ke- 67  CTG ; sekuen ke-1594  AA ; sekuen ke-1604  CTGACCGTCGCCCCCGACG, sedangkan untuk nukleotida yang mengalami delesi pada sekuen ke- 1565,1572,1573 (T,G,A). Adanya penambahan dan pengurangan basa nukleotida ini mengakibatkan bedanya strain isolat lokal dengan USA, Berbeda lagi jika dibandingkan dengan isolate dari referensi china KP004892 CyHV3- China (HZ149) yang memiliki kesamaan sekuennaya.  Selain itu, jika dibandingkan dengan referensi GenBank (nukleotida NC_009127.1-USA gen ORF25 CyHV-3), nukleotida sampel isolat malang ini juga mengalami mutasi titik yaitu pada sekuen ke-1478
(C  G), 1563 (G  A), 1566 (T  A), 1567
(C  G),1568 (C  G), 1577 (T  C), 1581 (A  C), 1582 (A  G), 1584 (C  G), 1586 (C  T), 1587 (G  T), 1588 (A  C), 1591 (C  A), 1592 (T  C), 1596 (C  G), 1597 (G  T), 1600 ((G  A). Selanjutnya untuk isolat sampel dari Madiun mengalami mutasi titik pada sekuen Ke-9 (T  G), 1563 (G  A), 1566 (T  A), 1567 (C  G),1568 (C  G), 1577 (T  C),
1581 (A  C), 1582 (A  G), 1584 (C  G), 1586 (C  T), 1587 (G  T), 1588 (A  C), 1591 (C  A), 1592 (T  C), 1596 (C  G), 1597 (G  T), 1600 (G  A), 1819 (A  G). Hal lain juga telah diketahui bahwa isolat sampel dari Kediri dan Blitar yang mempunyai persaman sekuen, namun berbeda dengan referensi yaitu selain delesi dan insersi juga terjadi mutasi titik yaitu pada sekuen ke-9 (T  G), 1563 (G  A), 1566 (T  A), 1567 (C  G),1568 (C  G), 1577 (T  C), 1581 (A  C), 1582 (A  G), 1584 (C  G), 1586 (C  T), 1587 (G  T), 1588 (A  C), 1591 (C  A), 1592 (T  C), 1596 (C  G), 1597 (G  T), 1600 (G  A) DAN 1818 (G  A). Selanjutnya untuk analisis sekuen asam aminonya dengan menggunakan program GENETYX ver. 10 menunjukkan asam amino keempat sampel Jawa Timur sepanjang 608. Panjang asam amino yang dihasilkan berbeda dengan referensi GenBank NC_009127.1-USA CyHV-3. Menurut referensi GenBank , asam amino NC_009127.1-USA gen ORF25 CyHV-3 sepanjang 601 asam amino, perbedaan ini ditunjukkan dengan adanya insersi dan mutasi titik terhadap asam amino
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index
sampel isolat dari ikan koi Jawa Timur. Bila dibandingkan referensi NC_009127.1 CyHV3 dari USA, insersi untuk isolat sampel dari Malang, Madiun, Kediri dan Blitar ada pada beberapa sekuen yaitu : setelah sekuen ke- 22  L ; sekuen ke-521  QGPSTA, sedangkan untuk nukleotida yang mengalami mutasi titik pada sekuen ke- 493 dari T  R pada isolat Malang dan pada sekuen 600 pada referensi USA berubah dari R  G pada isolat Madiun.
Berbeda lagi jika dibandingkan dengan isolate dari referensi china KP004892 CyHV3-China (HZ149) yang memiliki kesamaan sekuennya, hanya berbeda mutasi titik pada sampel Malang (titik 494, T  R) dan Madiun (titik 607, R  G).  Hal lain juga telah diketahui bahwa isolat sampel dari Kediri dan Blitar yang mempunyai persaman sekuen, dimana sekuen asam aminonya sama
identik dengan sampel referensi China KP004892 CyHV3-China (HZ149) dan dari Japan AP008984-Japan CyHV-3 (TUMST1) untuk regio gen ORF25nya. Hal ini membuktikan bahwasanya sampel yang khususnya ada di Blitar dan Kediri serta umumnya di wilayah sentra ikan koi Jawa Timur menunjukkan virus penyebab awalnya penyakit KHV berasal dari Negara Cina ataupun Jepang.

## Hasil Analisis Homologi Gen ORF25 Virus CyHV3Ikan Koi Jawa Timur
Susunan nukleotida dan asam amino dari isolat CyHV3 dari Ikan Koi asal Jawa Timur (Malang, Madiun, Kediri dan Blitar) dihomologikan dengan beberapa isolat CyHV-3 lain yang diambil dari Gene  Bank. Homologi menggunakan program BLAST dan hasilnya dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Nilai homologi nukleotida isolat Jawa Timur padan gen ORF25 terhadap isolat CyHV3 lain dari Gene Bank . Isolat Pembanding Nilai Homologi (%) Isolat sampel C (Malang) Isolat sampel D (Madiun) Isolat sampel E (Kediri) Isolat Sampel F (Blitar) sampel C (Malang) - 99,9 99,7 99,7 sampel D (Madiun) 99,9 - 99,8 99,8 sampel E (Kediri) 99,7 99,8 - 100 sampel F (Blitar) 99,7 99,8 100 - NC_009127.1-USA CyHV3 98,8 98,7 98,5 98,5 AP008984-Japan CyHV3(TUMST1) 99,9 99,9 99,7 99,7 DQ177346-Israel CyHV3(KHV-I) 98,8 98,7 98,5 98,5 DQ657948-USA CyHV3(KHV-U) 98,8 98,7 98,5 98,5
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index
DOI: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232
GU815502-USA CyHV3(FL) 98,8 98,7 98,5 98,5 JQ308816-Korea CyHV3(SNUKHV) 99,8 99,7 99,6 99,6 KJ627438-China CyHv3(GZ11) 99,8 99,7 99,6 99,6 KP004892-China CyHV3(HZ419) 99,9 99,9 99,7 99,7

## KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa hasil identifikasi molekuler terlihat fragmen ORF 25 CyHV-3 masing- masing sepanjang 696bp, 645 bp dan 618 bp. Masing-masing hasil elektoforesis selanjutnya disekuensing serta digabungkan menjadi sepanjang 1827 bp. CyHV-3 dari ikan Koi daerah Kediri dan daerah Blitar mempunyai sekuen  yang identik 100% pada gen ORF25. Untuk isolat Malang, Madiun dan Blitar pada gen ORF25  memiliki homologi sekuen nukleotida hampir mirip sebesar ±99%,yaitu sekuenIsolat malang dengan Kediri dan Blitar homologi sebesar 99,7%, isolat Malang dengan Madiun sebesar  99,9%  dan isolat madiun dengan Blitar homologi 99,8%. Ketiga isolat Jawa Timur ini memiliki homologi sekuen lebih mirip dengan isolat referensi Asia yaitu dari Jepang, China dan Korea (±99%) daripada isolat referensi Israel ataupun Amerika (±98%,) untuk sekuen gen ORF25-nya.
.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terimakasih kepada  Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga atas kesempatan berharga yang diberikan kepada penulis untuk menempuh pendidikan di Program Studi Magister Vaksinologi dan Imunoterapetika Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.  Serta kepada Kepala Balai Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Surabaya I yang telah mengijinkan menggunakan Laboratoriumnya untuk kegiatan penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonimous. 2012. Fisiologi Ikan Koi. Online. https://zonaikan.wordpress.com/2 012/07/01/fisiologi-ikan-koi/. Aoki, T., Hirono, I., Kurokawa, K., Fukuda, Nahary, R., Eldar, A., Davison, A.J., Waltzek, T.B., Bercovier, H., and Hendrick, R.P. 2007.  Genome Sequences of Three Koi herpesvirus Isolates
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index
Representing the Expanding Distribution of an Emerging Disease Threatening Koi and Common Carp Worldwide. J.Virol . 81, 5058-5056. Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Surabaya I. 2015. Laporan Pemantauan Tahun 2015. Surabaya Balai Uji Standar, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan. 2011. Metode Standar Penggunaan Squencer ABI 3130. Jakarta.
Bercovier, Y. Fishman, R. Nahary, S. Sinai, A. Zlotkin, M. Eyngor, O. Gilad,  A. Eldar, R.P. Hedrick. 2005.Cloning of the koi herpesvirus (KHV) gene encoding thymidine kinase and its use for a highly sensitive PCR baseddiagnosis . BMC Microbiol .5, pp. 13–22.
Dishon A, M. Davidovich, M. Ilouze, M.
Kotler. 2007. Persistence of cyprinid herpesvirus 3 in infected cultured carp cells. J. Virol. , 9, pp. 4828–4836 Fusianto, Cahya Kurnia. 2013. Kloning Gen, Ekspresi dan Purifikasi Protein
ORF25 Koi herpesvirus Sebagai Kandidat Vaksin. Tesis UGM. Gotesman M, Soliman H, El-Matbouli M. 2013. Antibody screening identifies 78 putative host proteins involved in Cyprinid herpesvirus 3 infection or propagation in common carp, Cyprinus carpio L. J.Fish Diseases. , 36:721–733.
Gray, W.L., Mullis, L., Lapatra, S.E.,
Groff, J.M. & Goodwin, A. 2002. Detection of koi herpesvirus DNA
in tissues of infected fish. J. Fish Diseases. 25 ,171–178.
Han, J.E., Kim, J.H., Renault, T., Casiano Jr., C., Shin, S.P., Jun, J.W. and Park, S.C. 2013. Identifying the Viral Genes Encoding Envelope Glycoproteins for Differentiation  of Cyprinid herpesvirus 3 Isolates . Viruses. 5 , 568-576.
Hedrick, R.P., Marty, G.D., Nordhausen, R.W., Kebus, M., Bercovier, H., Eldar, A. 1999. A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, Cyprinus carpio .Fish Health Newsletter. Fish Health Section . American Fisheries Society 27:7. Hendrianto, Eryk. 2013. Stabilitas Gen Pengkode Protein Envelope (E) Virus Dengue Serotipe 1 Sebagai Kandidat Vaksin Isolat Indonesia. Surabaya. Tesis. Magister Biologi Fakultas Sains Dan Teknologi Universitas Airlangga.
Hutoran, M., Ronen, A., Perelberg, A., Ilouze, M., Dishon, A., Bejerano, I., Chen, N. & Kotler, M. 2005. Description of an as yet unclassified DNA virus from diseased Cyprinus carpio species .J. Virol. 79 , 1983–1991. Kepmen Kelautan dan Perikanan. 2013. Kep.26/Men/2013. Tentang
Penetapan Jenis-jenis Hama dan Penyakit Ikan Karantina, Golongan, Media Pembawa dan Sebarannya. Michel, B., Leroy, B., Stalin Raj, V., Lieffrig, F., Mast, J., Wattiez, R. , Vanderplasschen, A.F., and Costes, B. 2010. The Genome of Cyprinid 68
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index
Herpesvirus 3 Encodes 40 Proteins Incorporated in Mature Virions. J. Gen Virol. 91, 452-462.

## Murwantoko. 2009. Cloning ORF2
Membrane Protein of Koi herpesvirus Lake Toba, Indonesian Isolate. HAYATI Journal of Biosciences. 16, 49-53.
Nelson  , D.L and Cox, M.M. 2008, Lehninger Principles of. Biochemistry . Fourth Edition. New York: Macmillan co ltd, Pp 10-15.
Office International des Epizooties (OIE). 2012. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animal . Office International des Epizooties. Ouyang P, Rakus K, Boutier M, Reschner A, Leroy B, Ronsmans M, Fournier G, Scohy S, Costes B, Wattiez R, Vanderplasschen A. 2013. The IL-10 homologue encoded by cyprinid herpesvirus 3 is essential neither for viral replication in vitro nor for virulence in vivo. Vet Res . 44:53.
Perelberg, A., Smirnov, M., Hutoran, M., Diamant, A., Bejerano, Y., Kotler, M. 2003. Epidemiological Description of A new Viral Disease Afflicting Cultured Cyprinus carpio in Israel.
Pikarsky E., Ronen A., Abramowitz J., Jevavi-sivan B., Hutoran M., Shapira Y., Steinitz M., Perelberg A., Soffer D. and Kotler M. 2004. Pathogenesis of acute viral disease induced in fish by
carp interstitial nephritis and gill necrosis virus . J. Virol., 78, 9544–9551. Pusat Karantina Ikan. 2010. Pengambilan Contoh Media Pembawa Hidup Air
Tawar/Payau/.Laut. Penerbit Puskari. Jakarta Pusat Karantina Ikan. 2008. Metode Standar Pemeriksaan HPIK Golongan Virus Koi Herpesvirus (KHV). Penerbit Puskari. Jakarta. Rahmawati, Zulfa, Uun Y., Diana A. 2016. Analisis Histopatologi Otot Ikan Mas ( Cyprinus carpio ) yang terinfeksi Koi Herpesvirus (KHV) pada kolam pemeliharaan Ikan Mas. Prosiding Seminar Nasional Kelautan 2016. Universitas Trunojoyo. Madura Rakus K., I. Irnazarow, M. Adamek, L. Palmeira, Y. Kawana, I. Hirono, H. Kondo, M. Matras, D. Steinhagen, B. Flasz, G. Brogden, A. Vanderplasschen, T. Aoki. 2012. Gene expression analysis of common carp ( Cyprinus  carpio L.) lines during Cyprinid herpesvirus 3 infection yields insights into differential immune responses . Dev. Comp. Immunol. 37, pp. 65–76. Rakus K., P. Ouyang, M. Boutier, M. Ronsmans, A. Reschner, A. Vancsok, J. Jazowiecka-Rakus and A. Vanderplasschen. 2013. Cyprinid herpesvirus 3: an interesting virus for applied and fundamental research. Veterinary Research . 44:85. Ronen, A. Perelberg, J. Abramowitz, M. Hutoran, S. Tinman, Y. Bejerano, M.
 2022. Putra et al .Open access under CC BY–SA license,doi: 10.20473/mkh.v33i3.2022.214-232 Received:29-06-2022, Accepted:14-08-2022, Published online:08-09-2022
Available at https://e-journal.unair.ac.id/MKH/index
Steinitz, M. Kotler. 2003. Efficient vaccine against the virus causing a lethal disease in cultured Cyprinus carpio . Vaccine . 21, pp. 4677–4684.
Rosenkranz D, Klupp BG, Teifke JP,
Granzow H, Fichtner D, Mettenleiter TC, Fuchs W. 2008. Identification of envelope protein pORF81 of koi herpesvirus. J Gen Virol .89:896–900.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2 nd ed. N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sunarto, A., Mc Coll, K. A., Crane, M. St. J., Sumiati, T. , Hyatt, A. D., Barnes, A. C., and Walker, P. J., 2011. Isolation and Char acterization of Koi herpesvirus (KHV) from Indonesia: Identification of a New Genetic Lineage. Fish Dis J. 34, 87- 101.
Sunarto, A., Rukyani, A., Cameron, A., and Subasinghe, R. 2004. Outbreak of Disease Causing Mass Mortality in Koi and Common Carp in Indonesia. Workshop on Koi Herpesvirus. London. Wahidi, Budi Rianto. 2013. Analisis

## Filogenetik Gen Thymidin Kinase
Koi Herpesvirus (KHV) Beberapa Ikan Air Tawar  di Sentra Budidaya
Provinsi Jawa Timur. Tesis. Program Pascasarjana. Universitas Airlangga. Surabaya. Walker, J.P., 2000. Molecular epidemiology of viral infection. CSIRO Tropical Agriculture, Indrooroopilly, Queensland, Australia.
Waltzek T.B., Kelley G.O., Stone D.M., Way K., Hanson L., Fukuda H., Hirono I., Aoki T., Davison A.J. & Hedrick R.P. 2005. Koi herpesvirus represents a third cyprinid herpesvirus (CyHV-3) in the family Herpesviridae . J. Gen. Virol. 86 ,1659– 1667.
Yuasa K., Sano M., Kurita J., Ito T. & Iida T. 2005. Improvement of a PCR method with the Sph 1–5 primer set for the detection of koi herpesvirus (KHV). Fish Pathol. 40 , 37–39. Yusuf, K. Z. 2010. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) . Saintek Vol 5, No 6.   Universitas Negeri Gorontalo.
Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Andi Offset.