## Original Article
Received December 2023 / Revised January 2024 / Accepted January 2024

## Spizaetus: Jurnal Biologi dan Pendidikan Biologi
p-ISSN: 2716-151X
e-ISSN: 2722-869X
Inisiasi  Kalus  Embriogenik  Manggis ( Garcinia  mangostana L.) var. Macakal terhadap Pemberian 2,4- Dichlorophenoxyacetic Acid dan 6- Benzyl Amino Purine Secara In Vitro
Initiation of Embryogenic Callus of Manggis (Garcinia mangostana L. ) var. Macakal to 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid and 6-Benzyl Amino Purine In Vitro
Ratri Yulianingsari Negoro*, Susiyanti, Sulastri Isminingsih, dan Zahratul Millah
Universitas Sultan Ageng Tirtayasa, Serang, 42163, Indonesia *Corresponding author: ratriynegoro@gmail.com
Abstrak. Manggis Macakal merupakan varietas unggul yang  berasal dari Banten. Produksi manggis nasional  pada  2020-2022  mengalami  kondisi  yang  fluktuatif,  dikarenakan  masih  banyak  masyarakat yang  belum  banyak  membudidayakannya.  Selain  itu  penting  juga  dilakukannya  upaya  untuk melestarikan plasma nutfah tanaman lokal Banten. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian 2,4-D dan BAP terhadap inisiasi kalus embriogenik manggis. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium  Bioteknologi  Universitas  Sultan  Ageng  Tirtayasa,  Serang,  Provinsi  Banten  pada  bulan Juni-Oktober  2023.  Penelitian  menggunakan  RAK  faktorial  yang  terdiri  dari  dua  faktor  dan  empat ulangan. Faktor pertama pemberian 2,4-D (P) terdiri dari dua taraf yaitu: 1 ppm (P 1 ) dan 2 ppm (P 2 ). Faktor kedua pemberian BAP (R) terdiri dari tiga taraf yaitu: 0,5 ppm (R 1 ), 0,75 ppm (R 2 ), dan 1 ppm (R 3 ). Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan 2,4-D tidak berpengaruh nyata terhadap diameter kalus,  luasan  kalus  dan  kultur  tumbuh  kalus  embriogenik.  Perlakuan  BAP  memberikan  hasil  terbaik terhadap diameter kalus (12 MST) (0,79 cm) dan luasan kalus (12 MST) (0,97 cm 2 ). Informasi sampai saat ini bahwa belum ada yang melakukan perbanyakan tanaman manggis varietas Macakal secara in vitro . Hal inilah yang menjadi dasar pentingnya mengetahui seberapa besar pengaruh dari pemberian 2,4-D dan BAP terhadap inisiasi kalus embriogenik manggis Macakal.
Kata Kunci : 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid and 6-Benzyl Amino Purine , embryogenic callus; Garcinia mangostana
DOI: https://dx.doi.org/10.55241/spibio.v5i1.351

## 1.  Pendahuluan
Manggis  Macakal  merupakan salah  satu  varietas  unggulan  yang berasal  dari  Provinsi  Banten.  Varietas manggis  ini  berasal  dari  Kecamatan Cipanas,  Kabupaten  Lebak,  Banten. Manggis asal Cipanas ini memiliki ciri- ciri  yaitu  buah  yang  bewarna  ungu memiliki  keunggulan  dan  berkualitas.
Manggis  ini  memiliki  rasa  yang  khas yaitu perpaduan rasa manis dan asam, serta memiliki kulit bewarna ungu dan isi dalam buah berwarna putih dengan dagingnya bertekstur lunak [1].
Berdasarkan  data  dari  BPS produksi  manggis  di  Indonesia  pada tahun  2020  mencapai  322.414  ton.
Sedangkan  produksi  manggis  pada tahun 2021 menurun menjadi 303.934 ton.  Kemudian  pada  tahun  2022 produksi  manggis  meningkat  kembali yakni  mencapai  343.663  ton  [2]. Produksi  manggis  Nasional  tersebut mengalami kondisi yang fluktuatif.
Tanaman manggis sudah dikenal sejak lama, namun masih banyak yang belum  membudidayakannya.  Hal  ini disebabkan  karena  pertumbuhannya yang  lambat,  selain  itu  biji  manggis hanya  tersedia  pada  musim  tertentu ketika  musim  berbuah  (1 – 2  kali setahun). Setiap buah
hanya menghasilkan 1 – 2 biji yang berukuran besar  dan  yang  layak  untuk  dijadikan benih  [3].  Hal  tersebut  merupakan salah  satu  alasan  belum  banyak masyarakat yang membudidayakannya, sehingga tingkat  pelestariannya  masih  rendah. Upaya  yang  dapat  dilakukan  untuk mengatasi  permasalahan  tersebut yaitu  dengan  melakukan  pelestarian plasma nutfah.
Salah  satu  upaya  yang  dapat dilakukan  untuk  mengatasi  kedua permasalahan  tersebut  yaitu  dengan melakukan  perbanyakan  tanaman menggunakan  kultur  jaringan.  Kultur jaringan merupakan solusi yang dapat dilakukan  untuk  menghasilkan  bibit manggis  macakal  yang  sehat  dan seragam  dalam  jumlah  besar  serta tidak bergantung pada iklim, sehingga ketersediaan bibit dapat lebih terjamin [4].
Perbanyakan in  vitro dapat dilakukan  melalui  pembentukan  tunas lateral  dan  melalui  embriogenesis somatik, melalui embriogenesis somatik, embrio somatik dapat dihasilkan secara langsung dan secara
tidak  langsung  tanpa  melalui  fusi gamet. Embrio somatik yang terbentuk secara  tidak  langsung  terjadi  melalui fase antara, yaitu dengan membentuk kalus [5].
Kalus embriogenik dapat berkembang secara bertahap merupakan  komponen  yang  penting pada  tahap  embriogenesis  somatik tidak  langsung  [6].  Oleh  karena  itu, upaya dalam inisiasi kalus embriogenik yang efisien merupakan tahap penting dalam  rangka  mendapatkan  bibit manggis Macakal dalam jumlah banyak [7].
Pertumbuhan dalam inisiasi kalus yang lebih baik akan diperoleh apabila ke dalam media tersebut ditambahkan Zat  Pengatur  Tumbuh  (ZPT).  2,4-D merupakan  ZPT  jenis  auksin  yang berfungsi  dalam  pertumbuhan  dan pemanjangan sel tanaman [8].
Sedangkan  BAP  merupakan  ZPT golongan  sitokinin  yang  berperan dalam  proses  pembelahan  sel  [9]. Kombinasi  auksin  dan  sitokinin  dapat menginduksi  kalus  embriogenik  [10]. Kedua  ZPT  tersebut  sering  kali digunakan dalam perbanyakan tanaman secara in vitro , karena tahan terhadap oksidasi [11]. Penelitian oleh Maadon et al . (2016)  media MS yang ditambahkan 2,4-D 1 ppm + BAP 0,75 ppm dapat menginduksi kalus embriogenik  dan  kalus  remah  pada daun  manggis  yang  diinkubasi  dalam kondisi gelap [12].
Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  pengaruh  pemberian konsentrasi  2,4-D  dan  BAP  terhadap inisiasi  kalus embriogenik  manggis ( Garcinia mangostana L.) var. Macakal secara in vitro .

## 2.  Metode
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen yang dilaksanakan  di  Laboratorium  Fisiologi dan Bioteknologi,
Jurusan Agroekoteknologi,  Fakultas  Pertanian, Universitas  Sultan  Ageng  Tirtayasa, Serang  Provinsi  Banten  pada  bulan Juni – Oktober 2023. Alat yang digunakan  dalam  peneltian  ini  adalah autoklaf, Laminar  Air  Flow (LAF), scalpel,  pinset,  cawan  petri,  bunsen, botol kultur, dan kain hitam. Bahan yang digunakan dalam peneltian ini diantaranya  eksplan  daun  muda manggis  Macakal  asal  Kab.  Lebak, media  MS,  2,4-D,  BAP,  aquades, ascorbic acid , PPM ( Plant Preservative Mixture ),  alkohol  70%,  fungsida, bakterisida,  tween-20,  detergen  cair, dan natrium hipoklorit (NaOCl 5,25%).
Penelitian ini dirancang menggunakan RAK faktorial yang terdiri dari 2 faktor. Faktor pertama 2,4-D (P) yang terdiri dari 2 taraf, yaitu: (P 1 ) 2,4-D 1  ppm  dan  (P 2 )  2,4-D  2  ppm.  Faktor kedua BAP (R) yang terdiri dari 3 taraf, yaitu: (R 1 ) BAP 0,5 ppm (R 2 ) BAP 0,75 ppm, dan (R 3 ) BAP 1 ppm.
Sterilisasi eksplan dilakukan dengan cara eksplan dikocok menggunakan  detergen  cair  sebanyak 3  tetes/100  ml  selama  3  menit, selanjutnya  eksplan  dikocok  dengan fungisida  2  g/L  dan  bakterisida  2  g/L selama 2 jam. Eksplan dikocok dengan alkohol  70%  selama  1  menit,  dilanjut dengan  pengocokan  menggunakan NaOCl  20%  dan  NaOCl  10%.  Tahap terakhir  eksplan  dibilas  menggunakan aquades  steril.  Eksplan  siap  ditanam, pada  satu  botol  kultur  terdiri  dari  1 potong eksplan dengan ukuran 1 cm x 1  cm.  Selanjutnya  botol  kultur diinkubasi pada kondisi gelap selama 1- 12 MST pada suhu ruang 20-26 ℃.
Parameter  pengamatan  yang diamati dalam penelitian ini meliputi 1) Waktu  muncul  kalus,  diamati  setiap minggu  dari  1-12  MST;  2)  Diameter kalus  (cm),  diukur  menggunakan ImageJ ;  3)  Luasan  kalus  (cm 2 ),  diukur menggunakan ImageJ ;  4)  Kultur tumbuh  kalus  embriogenik  (cm 2 ), diukur  menggunakan ImageJ ;  5) Persentase  eksplan  berkalus;  6) Tekstur dan warna kalus diamati secara visual  pada  12  MST;  7)  Persentase eksplan browning ;  8)  Persentase eksplan  terkontaminasi;  9)  Persentase eksplan hidup; 10) Fase embrio somatik (persentase  fase  globular,  persentase fase hati, persentase fase torpedo dan persentase fase kotiledonari).
% Eksplan Berkalus = Jumlah eksplan yang berkalus
Total eksplan × 100%
% Eksplan Browning = Jumlah eksplan yang 𝑏𝑟𝑜𝑤𝑛𝑖𝑛𝑔 Total eksplan × 100%
%  Eksplan Kontaminasi = Jumlah eksplan yang kontaminasi
Total eksplan ×
100%
% Eksplan Hidup = Jumlah eksplan yang hidup Total eksplan × 100%
% Persentase Fase Globular = Jumlah eksplan fase globular Total eksplan × 100%
% Persentase Fase Hati = Jumlah eksplan yang hati
Total eksplan × 100%
% Persentase Fase Torpedo = Jumlah eksplan fase hati Total eksplan × 100% %  Persentase  Fase  Kotiledonari  = Jumlah eksplan fase kotiledonari
Total eksplan ×
100%
Pengolahan  data  pada  penelitian ini  menggunakan  ANOVA  dengan software DSAASTAT  ver.  1.514. Analisis  data  dilakukan  dengan  uji  F taraf  5%.  Apabila  hasil  sidik  ragam menunjukan  berpengaruh  nyata  maka dilakukan  uji  lanjut  menggunakan DMRT pada taraf 5%.

## 3.  Hasil dan Pembahasan
Waktu Muncul Kalus (MST)
Parameter waktu muncul kalus ini dilakukan  secara  visual  dan  dilakukan setiap minggu terhitung dari 1 – 12 MST.
Kalus yang muncul dalam penelitian ini rata-rata  pada  bagian  yang  terdapat luka.
Gambar 1. Histogram pengaruh kombinasi pemberian 2,4-D dan BAP terhadap waktu muncul kalus (MST)
Berdasarkan  Gambar  1,  rata-rata waktu  muncul  kalus  dimulai  pada  5 MST  pada  perlakuan  pemberian  P 2 R 1 dan P 2 R 3 . Waktu muncul kalus berakhir pada 12 MST pada perlakuan P 1 R 1 .
Pada  penelitian  ini  kondisi  media kultur yang digunakan memiliki
perbedaan  pada  konsentrasi  zat pengatur  tumbuh.  Eksplan  yang ditanam
dapat menunjukkan pertumbuhan  kalus  akan  tetapi  waktu muncul kalus setiap perlakuan berbeda-beda.
Munculnya  kalus  pada  suatu eksplan  dikarenakan  adanya  aktivitas auksin  endogen  yang  terdapat  secara alami  pada  eksplan  yang  apabila berinteraksi dengan sitokinin BAP [14]. Faktor  lain  yang  dapat  mempengaruhi waktu  muncul  kalus  yaitu,  genotipe tanaman,  sumber  eksplan,  periode kultur,  kondisi  media  kultur  dan
lingkungan. Induksi kalus dan regenerasi  dari  satu  sel  dipengaruhi oleh  beberapa  faktor  seperti  spesies atau  jenis  tanaman,  sumber  eksplan dan  kondisi  kultur  seperti  jenis  dan konsentrasi ZPT yang digunakan [6].

## Diameter Kalus (cm)
Berdasarkan  hasil  sidik  ragam perlakuan pemberian konsentrasi 2,4-D menunjukkan  hasil  yang  berpengaruh tidak  nyata  terhadap  parameter diameter kalus (8 MST) dan (12 MST). Sedangkan perlakuan pemberian konsentrasi  BAP  menunjukkan  hasil yang berpengaruh tidak nyata terhadap diameter kalus (8 MST) dan berpengaruh  sangat  nyata  (12  MST). Tidak terdapat interaksi antara perlakuan  konsentrasi  2,4-D  dan  BAP terhadap  parameter  diameter  kalus manggis Macakal.
Tabel 1. Pengaruh perlakuan pemberian konsentrasi 2,4-D dan BAP terhadap diameter kalus (cm)
Konsentrasi 2,4-D (P) (ppm) Konsentrasi BAP (R) (ppm) Rata-rata 0,5 (R 1 ) 0,75 (R 2 ) 1 (R 3 ) 8 MST
1 (P 1 ) 0,00 0,19 0,04 0,08 2 (P 2 ) 0,14 0,33 0,30 0,26 Rata-rata 0,07 0,26 0,17 0,17 12 MST 1 (P 1 ) 0,08 0,74 0,96 0,59 2 (P 2 ) 0,21 0,84 0,45 0,50
12 10.5 10 5 8.75 5 4 6 8 10 12 P1R1 P1R2 P1R3 P2R1 P2R2 P2R3 Wak tu M u n cu l K alu s (MST) Kombinasi Pemberian 2,4-D dan BAP
Rata-rata 0,14b 0,79a 0,71a 0,55
Keterangan:    Angka-angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama  pada  baris  yang  sama  menunjukkan berbeda tidak nyata pada uji lanjut DMRT 5%.
Berdasarkan  Tabel  1,  setelah dilakukan  uji  lanjut  DMRT  pada  taraf 5%,  perlakuan  pemberian  konsentrasi BAP  0,5  ppm  berbeda  nyata  dengan perlakuan  konsentrasi  BAP  0,75  ppm dan  BAP  1  ppm.  Pada  media  yang ditambahkan  dengan  BAP  0,75  ppm memiliki  nilai  rata-rata  terbesar  yaitu 0,79 cm. Lalu diikuti dengan konsentrasi  BAP  1  ppm  dengan  nilai rata-rata  0,71 cm  dan  pada  perlakuan konsentrasi BAP 0,5 ppm dengan hasil rata-rata terkecil yaitu 0,14 cm.
Pada penelitian ini diameter kalus terkecil  dihasilkan  pada  media  yang ditambahkan  dengan  BAP  0,5  ppm. Selaras dengan Anggraeni et al . (2022) pada media yang ditambahkan dengan BAP  0,5  ppm  memberikan  diameter kalus  terkecil  pada  induksi  kalus  daun Talinum triangulare (Jacq.) Willd [15].
Pengaruh  sitokinin  BAP  pada media  kultur  mempengaruhi  ukuran kalus, selain pengaruh dari BAP, ukuran kalus diduga dipengaruhi oleh kemampuan dari jaringan eksplan [16].
Luasan Kalus (cm 2 ) Berdasarkan  hasil  sidik  ragam perlakuan pemberian konsentrasi 2,4-D menunjukkan  hasil  berpengaruh  tidak nyata terhadap luasan kalus pada umur 8  dan  12  MST.  Pada  perlakuan pemberian konsentrasi BAP menunjukkan  hasil  berpengaruh  tidak nyata  terhadap  luasan  kalus  (8  MST) dan  berpengaruh  sangat  nyata  (12 MST).  Tidak  terdapat  interaksi  antara perlakuan pemberian konsentrasi 2,4-D dan  BAP  terhadap  parameter  luasan kalus.
Tabel 2. Pengaruh perlakuan pemberian konsentrasi 2,4-D dan BAP terhadap luasan kalus (cm 2 ) Konsentrasi 2,4-D (P) (ppm) Konsentrasi BAP (R) (ppm) Rata-rata 0,5 (R 1 ) 0,75 (R 2 ) 1 (R 3 ) 8 MST
1 (P 1 ) 0,00 0,23 0,07 0,10 2 (P 2 ) 0,18 0,40 0,46 0,35 Rata-rata 0,09 0,31 0,27 0,22 12 MST 1 (P 1 ) 0,14 0,94 1,13 0,74 2 (P 2 ) 0,28 1,00 0,61 0,63 Rata-rata 0,21b 0,97a 0,87a 0,68
Keterangan:  Angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada baris yang sama menunjukkan berbeda tidak nyata pada uji lanjut DMRT 5%.
Berdasarkan Tabel 2,
menunjukkan  nilai  rata-rata  tertinggi luasan  kalus  terdapat  pada  perlakuan BAP  0,75  ppm  sebesar  0,97  cm 2 ,  lalu diikuti  dengan  pemberian  BAP  1  ppm 0,87  cm 2 dan  BAP  0,5  ppm  0,21  cm 2 . Hal  tersebut  diduga  karena  tanaman manggis  Macakal  kurang  responsif dengan  auksin  jenis  2,4-D,  sehingga
luasan kalus pada penelitian ini diduga lebih  besar  dipengaruhi  oleh  auksin endogen.  Pembentukan  kalus  pada suatu  eksplan  dikarenakan  adanya aktivitas auksin endogen yang terdapat secara alami pada eksplan yang apabila berinteraksi dengan sitokinin BAP [14].
Pemberian  sitokinin  BAP  dapat mempengaruhi  ukuran  kalus  pada
tanaman Binahong ( Anredera cordifolia L.). Sitokinin BAP merupakan ZPT yang dapat  merangsang  pertumbuhan  pada kalus [16].
Kultur  Tumbuh  Kalus  Embriogenik (cm 2 ) Berdasarkan  hasil  sidik  ragam perlakuan  pemberian  2,4-D  dan  BAP
berpengaruh  tidak  nyata  terhadap parameter kultur tumbuh tumbuh kalus embriogenik.  Tidak  terdapat  interaksi antara perlakuan pemberian konsentrasi  2,4-D  dan  BAP  terhadap parameter kultur tumbuh kalus embriogenik.
Tabel  3. Pengaruh  perlakuan  pemberian  konsentrasi  2,4-D  dan  BAP  terhadap  kultur  tumbuh  kalus embriogenik (cm 2 ) Konsentrasi 2,4-D (P) (ppm) Konsentrasi BAP (R) (ppm) Rata-rata 0,5 (R 1 ) 0,75 (R 2 ) 1 (R 3 )
.... ………….………….(cm 2 )………….…………….. 1 (P 1 ) 0,06 0,04 0,17 0,09 2 (P 2 ) 0,02 0,13 0,05 0,07 Rata-rata 0,04 0,08 0,11 0,08 Berdasarkan  Tabel  3  diatas menunjukkan bahwa perlakuan konsentrasi 2,4-D dan BAP
berpengaruh  tidak  nyata  pada  kultur tumbuh  kalus  embriogenik  dengan rata-rata 0,08 cm 2 . Pada  penelitian  ini  menghasilkan kalus bewarna kekuningan atau bening mengkilap dengan tekstur kalus remah, ciri ini diduga menandakan bahwa kalus tersebut  termasuk  kalus  embriogenik. Kalus  embriogenik  dicirikan  dengan
struktur  kalus  kering,  berwarna  putih bening, susu atau krem dan berstruktur remah [17].

## Persentase Eksplan Berkalus (%)
Perkembangan kalus dapat terjadi akibat  adanya  pelukaan  pada  pada bagian  eksplan  yang  kemudian  akan menyerap  nutrisi  pada  media  yang ditambahkan  ZPT,  sehingga  kalus dapat tumbuh dan berkembang.
Gambar 3. Histogram Persentase Eksplan Berkalus (%)
Berdasarkan Gambar 3, perlakuan P 1 R 2 ,  P 1 R 3 ,  dan  P 2 R 2 menghasilkan persentase  eksplan  berkalus  sebesar 100%.  Kemudian  pada  perlakuan  P 2 R 3 menghasilkan persentase eksplan berkalus  sebesar  75%,  lalu  diikuti
dengan  P 2 R 1 sebesar  50%  dan  P 1 R 1 sebesar 25%.
Perbandingan  konsentrasi  auksin dan  sitokinin  menjadi  faktor  kritis, sehingga  diperlukan  kombinasi  yang
25% 100% 100% 50% 100% 75% 20% 40% 60% 80% 100% P1R1 P1R2 P1R3 P2R1 P2R2 P2R3
tepat agar dapat menginduksi pembentukan kalus yang optimal.

## Tekstur dan Warna Kalus
Pada  penelitian  ini  kalus  yang dihasilkan didominasi oleh kalus remah. Secara  visual,  kalus  remah  yang tampak pada eksplan daun muda ikatan antar  selnya  tampak  renggang  dan mudah  dipisahkan.  Sedangkan  kalus kompak secara visual tampak lebih sulit dipisahkan.
Tekstur kalus remah dan kompak masing-masing  memiliki  keunggulan. Kalus remah baik untuk kultur suspensi dalam  upaya  perbanyakan  massa  sel. selain  itu  juga  dapat  meningkatkan aerasi  oksigen  antar-sel  [18].  Tekstur kalus  yang  kompak  baik  digunakan untuk memproduksi metabolit sekunder [19].
Menurut  Mahadi et  al .  (2016) perbedaan  laju  pertumbuhan  tekstur kalus selain dipengaruhi oleh peningkatan kecepatan pembelahan sel karena pengaruh pemberian 2,4-D dan BAP  juga  dipengaruhi  oleh  kondisi genetis,  umur  jaringan,  dan  jenis tanaman  serta  faktor  lingkungan  yang meliputi  cahaya,  kandungan  O 2 ,  suhu, dan kelembapan udara serta
kemampuan  jaringan  untuk  menyerap zat-zat  hara  yang  tersedia,  hal  ini banyak  dipengaruhi  oleh  aerasi  pada media dan tekstur kalus yang dihasilkan [13].
Warna kalus yang terbentuk pada penelitian ini menghasilkan warna kalus kekuningan  ( pale  yellow )  dan  kuning ( yellow ). Warna kalus biasanya mengikuti warna jenis sumber eksplan. Kalus  yang  berwarna  kuning  diduga disebabkan  oleh  penyimpanan  pada ruang  inkubasi  dengan  kondisi  gelap atau  tanpa  penyinaran,  hal  tersebut dilakukan  dengan  tujuan  mengurangi oksidasi  fenolik  pada  eksplan  yang telah  dikultur.  Cahaya    dianggap sebagai salah satu yang paling penting karena pengaruhnya yang menentukan terhadap perkembangan tanaman pada kultur jaringan, hal tersebut dikarenakan  oksidasi  fenolik  terbentuk di bawah penerangan [20]. Kultur umbi gembili  kalus  tidak  berwarna  hijau karena diinkubasi dalam kondisi gelap. Pada  kondisi  ini,  etioplas  tidak mengalami diferensiasi menjadi proplastida sehingga warna kalus tetap kekuningan  [21].  Warna  kalus  dapat bermacam-macam  tergantung  dari jenis sumber eksplan yang diambil [22].
Gambar 2. Tekstur dan warna kalus dari daun manggis Macakal a. (P 1 R 1 U 1 ) remah- pale yellow , b. (P 1 R 3 U 2 ) remah- pale yellow , c. (P 1 R 3 U 4 ) remah- pale yellow , d. (P 2 R 1 U 3 ) remah- yellow , e. (P 2 R 2 U 4 ) remah- pale yellow , f. (P 2 R 3 U 1 ) remah- pale yellow
a b e f c d
Persentase Eksplan Browning (%) Salah  satu  upaya  yang  dapat dilakukan  untuk  menekan  tingkat browning pada  eksplan  yaitu  dengan menambahkan  asam  askorbat  atau vitamin  C  pada  media  kultur.  Pada penelitian ini dosis asam askorbat yang
digunakan  yaitu  100  mg/l.  Sejalan dengan  Sarkar et  al .  (2019)  hasil perlakuan pemberian antioksidan asam askorbat  dengan  konsentrasi  100 – 200 mg/l yang ditambahkan kedalam media MS  dapat  menekan  tingkat browning pada tanaman kusum [23].
Tabel 4. Persentase Eksplan Browning (%) Perlakuan Jumlah Eksplan Browning Persentase Eksplan Browning P 1 R 1 2 50% P 1 R 2 2 50%
P 1 R 3 2 50% P 2 R 1 3 75%
P 2 R 2 1 25%
P 2 R 3 0 0% Total 10 41,67%
Tabel  4.  Menunjukkan  bahwa persentase  eksplan browning sebesar 75%  terdapat  pada    P 2 R 1. Pencoklatan yang  terjadi  pada  eksplan  tidak semuanya mengalami kematian, adapun eksplan yang berhasil menumbuhkan kalus dari eksplan yang browning .  Dari  total  10  eksplan  yang browning terdapat  7  eksplan  yang berhasil  menumbuhkan  kalus  yaitu pada  perlakuan  P 2 R 1 ,  P 1 R 2 ,  P 2 R 2 ,  dan P 1 R 3 . Sejalan dengan Illahi et al . (2022) pada  induksi  kalus  daun  bisbul ( Diospyros  discolor Willd)  kalus terbentuk
pada eksplan yang mengalami browning [24].

## Eksplan Terkontaminasi
Pada  penelitian  ini  tidak  terjadi kontaminasi  pada  eksplan  maupun pada media.  Kontaminasi dalam  kultur jaringan  dapat  diminimalisir  dengan
menggunakan  PPM,  dalam  penelitian ini menggunakan PPM yang ditambahkan  sebanyak  0,5  ml/L  pada media  yang  bertujuan  menghindari terjadinnya kontaminasi oleh mikroorganisme seperti cendawan dan bakteri  pada  media.  Sejalan  dengan yang disampaikan oleh Syatria (2017), penggunaan  0,5  ml/L  PPM  yang ditambahkan pada medium kultur dapat mengendalikan  kontaminasi  tanpa menyebabkan  pengurangan  dalam efektivitas sistem kultur [25].

## Persentase Eksplan Hidup (%)
Eksplan yang dikategorikan sebagai  eksplan  hidup  ialah  kondisi eksplan yang tidak mengalami kontaminasi  dan  eksplan browning namun  masih  dapat  menumbuhkan kalus.
Tabel 5. Persentase Eksplan Hidup (%)
Perlakuan Jumlah Eksplan Hidup Persentase Eksplan Hidup P 1 R 1 2 50%
P 1 R 2 4 100% P 1 R 3 4 100% P 2 R 1 3 75% P 2 R 2 4 100% P 2 R 3 4 100% Total 21 87,5%
Berdasarkan Tabel  5, persentase eksplan  hidup  mencapai  nilai  rata-rata 100% kecuali pada perlakuan P 1 R 1 dan P 2 R 1 , hal ini disebabkan karena eksplan yang  mengalami  pencoklatan.  Seperti yang telah dijelaskan pada pembahasan  sebelumnya,  eksplan yang  mengalami  pencoklatan  ada sebagian  yang  berhasil  berkalus, namun sebagian lainnya tidak berkalus.
Pada  penelitian  ini  eksplan  yang digunakan  ialah  daun  muda.  Eksplan daun muda dipilih karena pada bagian tersebut  jaringan maristem masih aktif membelah sehingga akan menghasilkan  kalus.  Hal  tersebut dikarenakan  jaringan  tanaman  yang masih  muda  bersifat  meristematik. Bahan  eksplan  yang  masih  muda adalah  eksplan  yang  baik  untuk perbanyakan  tanaman  secara in  vitro . Semakin  tua  organ  tanaman  eksplan, maka proses pembelahan dan regenerasi  sel  cenderung  menurun, oleh  karena  itu  jaringan  yang  masih
muda lebih baik digunakan karena pada umumnya  jaringan  tersebut  masih berproliferasi [26] .
Kemampuan  hidup  eksplan  pada kultur in  vitro sangat  tergantung  dari eksplan itu sendiri, jenis dan komposisi media  serta  kandungan  zat  pengatur tumbuh  yang  diberikan.  Jenis  dan komposisi media sangat mempengaruhi  besarnya  ketersediaan zat  makanan  bagi  eksplan  sehingga secara langsung dapat mempengaruhi besarnya  daya  tahan  eksplan  untuk hidup pada media tersebut, sedangkan zat  pengatur  tumbuh  endogen  dan eksogen berpengaruh untuk menginduksi pola morfogenesis tertentu [27].

## Fase Embrio Somatik
Hasil  penelitian  inisiasi  kalus manggis Macakal ini, bentuk kalus yang didapatkan  membentuk  fase  globular, fase  hati,  fase  torpedo  dan  fase kotiledonari.
Tabel 6. Pengaruh Kombinasi Pemberian 2,4-D dan BAP terhadap Fase Embrio Somatik
Perlakuan Persentase Fase Globular (%) Persentase Fase Hati (%) Persentase Fase Torpedo (%) Persentase Fase Kotiledonari (%) P 1 R 1 25% 0% 0% 0% P 1 R 2 25% 0% 0% 0% P 1 R 3 25% 0% 25% 0% P 2 R 1 0% 25% 0% 0% P 2 R 2 25% 0% 0% 25% P 2 R 3 0% 0% 25% 0% Total 16,67% 4,17% 8,33% 4,17%
Berdasarkan  hasil  yang  disajikan pada  Tabel  6,  persentase  rata-rata kalus  membentuk  fase  globular terdapat  pada  perlakuan  P 1 R 1 U 1 , P 1 R 2 U 1 ,  P 1 R 3 U 4 dan  P 2 R 2 U 1 sebesar 25%. Pada penelitian ini, fase globular yang  dihasilkan  terlihat  secara  visual bewarna  putih  kekuningan  dengan bentuk membulat. Kalus yang berbentuk  globular  dan  berwarna bening
biasanya mempunyai kemampuan lebih tinggi untuk membentuk  tunas  dari  pada  kalus kompak dan berwarna coklat kehitaman [28].
Persentase rata-rata kalus membentuk  fase  hati  terdapat  pada perlakuan  P 2 R 1 U 4 sebesar  25%.  Kalus pada fase hati memiliki ciri-ciri terdapat penonjolan  pada  kedua  sisi  daerah terminal  yang  terlihat  seperti  jantung. Fase  hati  adalah  fase  dimana  terlihat adanya  pendataran  dan  penonjolan pada  kedua  sisi  daerah  terminal, sehingga  massa  sel  membentuk struktur  seperti  jantung.  Penonjolan pada  sisi  kanan  dan  kiri  terjadi  akibat pembelahan sel yang lebih cepat pada daerah  tersebut.  Daerah  penonjolan
disusun  oleh  sel  yang  memiliki  sifat meristematik,  ditandai  dengan  sel bersitoplasma pekat dan inti yang jelas dengan penyerapan warna yang cukup banyak [28].
Persentase rata-rata kalus membentuk fase torpedo terdapat pada media P 1 R 3 U 1 dan P 2 R 3 U 3 sebesar 25%. Ciri-ciri  pada  fase  ini  yaitu  bentuk pemanjangan  dari  fase  hati,  sehingga memiliki  bentuk  yang  menyerupai terminal pada salah satu ujungnya yang akan  membentuk  organ  baru.  Pada embrio  somatik  yang  telah  memasuki fase  dewasa,  yaitu  fase  torpedo memiliki struktur bipolar yang memiliki meristem pada ujung terminalnya [29].
Persentase rata-rata kalus membentuk  fase  kotiledonari  terdapat pada  perlakuan  P 2 R 2 U 4 sebesar  25%. Fase  akhir  perkembangan  pada  fase embrio  somatik,  dimana  kotiledonari akan  membesar  dan  sumbu  embrio akan membesar. Perkembangan selanjutnya  dari  struktur  torpedo  ini akan  membentuk  struktur  seperti kotiledon  yang  pada  akhirnya  akan membentuk tunas [30].

## 4.  Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian dapat  disimpulkan  bahwa  perlakuan pemberian konsentrasi 2,4-D berpengaruh  tidak  nyata  terhadap parameter diameter kalus, luasan kalus dan  kultur  tumbuh  kalus  embriogenik. Kemudian perlakuan pemberian konsentrasi BAP 0,75 ppm memberikan hasil  terbaik  terhadap  parameter diameter kalus (12 MST) sebesar 0,79 cm.  Kemudian  pada  parameter  luasan
kalus (12 MST) sebesar 0,97 cm 2 . Serta tidak terdapat interaksi antara perlakuan pemberian konsentrasi 2,4-D dan BAP terhadap parameter diameter kalus, luasan kalus, dan kultur tumbuh kalus  embriogenik.  Saran  yang  dapat diberikan  yaitu,  untuk  mendapatkan hasil  terbaik  pada  parameter  diameter kalus  dan  luasan  kalus  disarankan menggunakan BAP 0,75 ppm.

## Daftar Pustaka
[1] E. G. Dora, “Buah Manggis Lebak Tembus Ekspor Pasar Mancanegara.,” 2023. [Online]. Available: https://investor.id/national/341539/buah-manggis-lebak-tembus-ekspor- pasar-mancanegara
[2] BPS, “Produksi Tanaman Buah - Buahan.” [Online]. Available:
https://www.bps.go.id/id/statistics-table/2/NjIjMg==/produksi-tanaman-buah- buahan.html
[3] R. S. Handayani, M. Maisura, and A. Rizki, “Pengaruh Letak Posisi Eksplan dan Sitokinin Pada  Perkecambahan  Biji  Manggis  ( Garcinia  mangostana L.)  Lokal  Aceh  Secara  in- Vitro,” J. Agrium , vol. 14, no. 2, p. 1, 2018, doi: 10.29103/agrium.v14i2.874.
[4] Y.  Riono,  “Zat  Pengatur  Tumbuh  Kinetin  Untuk  Pertumbuhan  Sub  Kultur  Pisang Barangan ( Musa paradisiaca L.) dengan Metode Kultur Jaringan. Jurnal Agro Indragiri,” J. Agro Indragiri , vol. 1, no. 2, pp. 23 – 33, 2019.
[5] M. R. A. Dos Santos and El. S. Paz, “Effect of 2,4 -D on callus induction in leaf explants of peach palm ( Bactris gasipaes H.B.K),” Int. J. Curr. Res. , vol. 8, no. 09, pp. 38688 – 38691, 2016.
[6] Yelnititis,  “Induksi  Kalus  Embriogenik  dan  Embrio  Somatik  dari  Eksplan  Daun  Kulim ( Scorodocarpus borneensis Becc.).,” J. Pemuliaan Tanam. Hutan , vol. 14, no. 2, pp. 75 – 84, 2020, doi: 10.20886/jpth.2020.14.2.73-81.
[7] E.  Hendriyani,  T.  Warseno,  and  N.  K.  E.  Undaharta,  “Pengaruh  Jenis  Eksplan  dan Kombinasi  Zat  Pengatur  Tumbuh  (ZPT)  Terhadap  Induksi  Kalus Begonia  bimaensis Undaharta  dan  Ardaka  secara  in  Vitro.,” Bul.  Kebun  Raya ,  vol.  23,  no.  1,  pp.  82 – 90, 2020, doi: 10.14203/bkr.v23i1.8.
[8] D.  Rahmawati  and  E.  Sandra, Buku  Panduan  Praktik  Teknologi  Kultur  Jaringan  di Laboratorium Bioteknologi. 2021. [Online]. Available:
https://biotrop.org/publication/show/buku-panduan-praktik-teknologi-kultur-jaringan-di- laboratorium-bioteknologi
[9] B. D. Ratnasari., E. Suminar, A. Nuraini, and A. Ismail, “Pengujian efektivitas berbagai jenis  dan  konsentrasi  sitokinin  terhadap  multiplikasi  tunas  mikro  pisang  ( Musa paradisiaca L.)  secara In  Vitro ,” Kultivasi ,  vol.  15,  no.  2,  pp.  74 – 80,  2016,  doi: 10.24198/kultivasi.v15i2.11870.
[10]  Taryono, Pengantar Bioteknologi untuk Pemuliaan Tanaman. Yogyakarta: UGM Press, 2016.  [Online].  Available:  https://ugmpress.ugm.ac.id/id/product/pertanian/pengantar- bioteknologi-untuk-pemuliaan-tanaman
[11] F.  W.  Lestari,  E.  Suminar,  and  S.  Mubarok,  “Berbagai  Eksplan  Kentang  ( Solanum tuberosum L.) dengan Penggunaan Konsentrasi BAP dan NAA yang Berbeda.,” J. Agro , vol. 5, no. 1, pp. 66 – 75, 2018.
[12] S.  N.  Maadon,  E.  R.  Rohani,  I.  Ismail,  S.  N.  Baharum,  and  M.  N.  Normah,  “Somatic embryogenesis and metabolic differences between embryogenic and non-embryogenic structures in mangosteen,” Plant Cell. Tissue Organ Cult. , vol. 127, no. 2, pp. 443 – 459, 2016, doi: 10.1007/s11240-016-1068-4.
[13] I. Mahadi, S. Wulandari, and A. Omar, “Pembentukan Kalus Tanaman Rosella ( Hibiscus sabdariffa ) Pada Pemberian Naftalen Acetyl Acid (NAA) dan Benzyl Amino Purin (BAP) Sebagai  Sumber  Belajar  Bioteknologi,” Biogenesis ,  vol.  11,  no.  1,  pp.  1 – 6,  2014, [Online].
Available:
https://biogenesis.ejournal.unri.ac.id/index.php/JPSB/article/view/2467
[14] A. Saepudin, A. Amilin, U. Undang, and T. Sudartini, “Kultur in Vitro Pisang Cavendish ( Musa acuminata L.) Pada Media dengan Konsentrasi Berbeda Ekstrak Jambu Batu dan Benzyl  Amino  Purine ,” Paspalum  J.  Ilm.  Pertan. ,  vol.  11,  no.  1,  p.  87,  2023,  doi: 10.35138/paspalum.v11i1.481.
[15] D. Anggraeni, L. Ismaini, M. I. Surya, H. Rahmi, and N. W. Saputro, “Inisiasi Kalus Daun Talinum triangulare (Jacq.) Willd pada Beberapa Kombinasi Konsentrasi Zat Pengatur
Tumbuh 2,4- Dichlorophenoxyatic Acid dan Benzyl Adenine ,” Agrikultura , vol. 33, no. 3, p. 276, 2022, doi: 10.24198/agrikultura.v33i3.40540.
[16] T.  Rahayu  and  U.  Mardini,  “Respon  Eksplan  No dus  dan  Daun  Tanaman  Binahong ( Anredera cordifolia L .) pada Media MS dengan Variasi Konsentrasi BAP,” Semin. Nas. XII Pendidik. Biol. FKIP UNS , vol. 14, no. 2, pp. 657 – 661, 2015.
[17] K. Ayuningrum, I. Budisantoso, and K. Kamsinah, “Respon Pemberian Hormon 2,4 -D dan  BAP  terhadap  Pertumbuhan  Subkultur  Kalus  Kedelai  ( Glycine  max (L.)  Merrill) secara In Vitro,” Biosfera , vol. 32, no. 1, p. 59, 2015, doi: 10.20884/1.mib.2015.32.1.296.
[18] Yelnititis, “Pembentukan Kalus Remah dari Eksplan Daun Ramin ( Gonystylus bancanus (Miq) Kurz.).,” J. Pemuliaan Tanam. Hutan , vol. 6, no. 3, pp. 73 – 83, 2013.
[19] P. Indah and D. Ermavitalini, “Induksi Kalus Daun Nyamplung ( Calophyllum inophylum Linn.)  pada  Beberapa  Kombinasi  Konsentrasi  6- Benzylaminopurine (BAP)  dan  2,4- Dichlorophenoxyacetic acid (2,4- D).,” J. Sains Dan Seni Pomits , vol. 2, no. 1, pp. 1 – 6, 2013.
[20] K.  Kariyana  and  Nisyawati,  “Effect  of  Ascorbic  Acid,  Activated  Carbon  and  Light Duration on Explant Browning of Banana Cultivar Barangan ( Musa acuminata L.) In Vitro Culture.,” IJRRAS , vol. 16, no. 1, pp. 118 – 123, 2013.
[21] A.  Lutfiah  and  N.  A.  Habibah,  “Pengaruh  Pemberian  Elisitor  Ekstrak  Khamir  pada Pertumbuhan  Kultur  Kalus  Gembili  dengan  Penambahan  ZPT  2,4- D  dan  Kinetin,” Indones.  J.  Math.  Nat.  Sci. ,  vol.  45,  no.  2,  pp.  77 – 83,  2022,  doi: 10.15294/ijmns.v45i2.39728.
[22] A. Shofiyani and A. M. Purnawanto, “Pengaruh kombinasi 2,4 -D dan Benzil Amino Purin (BAP) Terhadap Pembentukan Kalus pada Eksplan Daun Kencur ( Kaemferia galangi L.) secara In Vitro ,” 2010.
[23]  P.  K.  Sarkar et  al. ,  “Effect  of  pretreatment  of  explants  and in  vitro culture  media  in controlling  infection  and  browning  in  Kusum  [ Schleichera  oleosa (Lour.)  Oken],”  no. March  2020,  2019,  [Online].  Available:  http://files/911/Sarkar  et  al.  -  2019  -  Effect  of pretreatment of explants and in vitro cu.pdf
[24] A. K. Illahi, E. Ratnasari, and S. K. Dewi, “Pengaruh 2, 4 -D terhadap Pertumbuhan Kalus Daun Diospyros discolor Willd Pada Media MS Secara In Vitro ,” Lentera Bio Berk. Ilm. Biol. , vol. 11, no. 3, pp. 369 – 377, 2022.
[25] N. Syatria, “Penggunaan Plant Preservative Mixture (PPM) untuk Sterilisasi Eksplan dan Media pada Kulur In Vitro .,” vol. 2, no. January, pp. 978– 979, 2017.
[26] F. F. F. Rasullah, T. Nurhidayati, and Nurmalasari, “Respon Pertumbuhan Tunas Kultur Meristem Apikal Tanaman Tebu ( Saccharum officinarum ),” J. Sains Dan Seni Pomits , vol. 2, no. 2, pp. 99 – 104, 2013.
[27] L. Sundari, L. Siregar, and D. S. Hanafiah, “Kajian Awal : Respon Eksplan Nodus dalam Inisiasi  Tunas  Mikro  Tanaman  Karet  ( Hevea  brasiliensis Muell.  Arg.)  dalam  Medium WPM.,” J. Online Agroekoteknologi , vol. 3, no. 1, pp. 179 – 187, 2015.
[28] H. Hartati, N. S. Hartati, and E. Sudarmonowati, “Regeneration Rate of Eggplant Somatic Embryogenic In Various Maturation Media,” J. ILMU DASAR , vol. 19, no. 2, p. 125, 2018, doi: 10.19184/jid.v19i2.6260.
[29]  S. S. Bhojowani, Plant Tissue Culture: Applications and Limitations. New Delhi: Elsevier Science,  2012.  [Online].  Available:  https://shop.elsevier.com/books/plant-tissue- culture/bhojwani/978-0-444-88883-9#main-content
[30] I.  Nawangsih,  “Induksi  Kalus  dan  Embriogenesis  Somatik  dari  Jaringan  Endosperma Durian cv. Abu Secara In Vitro .,” Universitas Sultan Ageng Tirtayasa, 2015. [Online]. Available:
https://repository.untirta.ac.id/TA/KS/KS05/KS0502/2015/KS050200032/induksi-kalus- dan-embriogenesis-somatik-dari-jaringan-endosperma-durian-durio-zibethinus-murr- cv-abu-secara-in-vitro.html