## PENYISIHAN PEWARNA TEKSTIL REAKTIF OLEH JAMUR PELAPUK PUTIH DAN EKSTRAK KASAR ENZIM LAKASE YANG DIPRODUKSI PADA SUBMERGED FERMENTATION FORM

## DECOLORIZATION OF REACTIVE SYNTHETIC DYE BY WHITE ROT FUNGI AND LACCASE CRUDE ENZYME PRODUCED IN SUBMERGED FERMENTATION FORM
Edwan Kardena 1 dan Intan Lestari Dewi 2
Program Studi Teknik Lingkungan, FTSL, Institut Teknologi Bandung Jalan Ganesha No. 10 Bandung 40132
Email: 1 edwankardena@gmail.com dan 2 intanldewi.ild@gmail.com
Abstrak: Pengolahan air limbah tekstil yang mengandung antrakuinon dan pewarna azo merupakan tantangan besar karena struktur aromatik dan toksisitasnya yang kompleks. Penelitian ini mempelajari penyisihan pewarna antrakuinon reactive blue 4 (RB4), single azo reactive orange 16 (RO16), dan diazo reactive red 120 (RR120) juga reactive  black  5 (RB5)  dengan  konsentrasi  awal  150  mg/L  dalam  medium  padat  (PDA)  dan submerged fermentation form (SFF) menggunakan berbagai jamur pelapuk putih (JPP). T. versicolor memiliki aktivitas enzim dominan  terbaik  (lakase)  di  antara JPP lain  (186  U.l -1 ).  Studi penyisihan  warna  diamati  pada  kondisi  SFF  dan hanya  menggunakan  ekstrak  kasar  enzim  lakase.  Untuk  kultur  cairan  jamur  menggunakan  medium  kirk, T. versicolor secara positif dapat menyisihkan pewarna tekstil reaktif. Diantara empat pewarna yang digunakan, RB4 memiliki persentase penyisihan warna tertinggi (99,99%), dibandingkan dengan RB5 (98,03%), RR120 (90,56%) dan RO16 (63,52%). Uji stabilitas pH dan suhu menunjukkan bahwa ekstrak kasar enzim lakase memiliki aktivitas terbaik dalam kisaran pH 2,4 dan suhu 20 0 C. Persentase penyisihan warna terbaik menggunakan ekstrak kasar enzim lakase adalah RB4 yaitu 99,84% dengan waktu inkubasi selama 60 menit. Metabolit yang terbentuk setelah biotransformasi oleh ekstrak kasar enzim lakase diamati menggunakan FTIR. Hasil spektra FTIR menunjukkan bahwa struktur antrakuinon, ikatan nitrogen, dan gugus amina RB4 dapat dipecah oleh ekstrak kasar enzim lakase. Studi  toksisitas  menggunakan Bacillus  sp. menegaskan  bahwa  produk  biotransformasi  RB4  berkurang toksisitasnya dibandingkan dengan pewarna induk sebelum dilakukan pengolahan.
Kata kunci: Azo, Antrakuinon, Jamur pelapuk putih, Lakase
Abstract: Treatment of textile wastewater containing anthraquinone and azo dye is quite a huge challenge due to its  complex  aromatic  structure  and  toxicity.  This  study  investigated  the  decolorization  of  anthraquinone  dye reactive blue 4 (RB4), Single azo reactive orange 16 (RO16), and diazo reactive red 120 (RR120) also reactive black 5 (RB5) with initial concentration of 150 mg/l in solid medium (PDA) and Submerged fermentation form (SFF) by various white rot fungi (WRF). T. versicolor has the best dominant enzyme activity (laccase) among others WRF (186 U.l -1 ). Decolorization study was observed in both SFF condition and using only crude enzyme. For SFF using kirk medium T. versicolor positively degrading reactive textile dyes. Among four different dyes, RB4  has the  highest  decolorization  percentage (99.99%), compared to RB5  (98.03  %),  RR120  (90.56  %)  and
RO16 (63.52 %). pH and thermo stability test show that laccase crude enzyme has the best activity in pH range 2.4 and temperature of 20 0 C. The best decolouration percentage using crude enzyme is RB4 as obtained 99.84% in  60  min.  The  metabolites  formed  after  biotransformation  was  characterized  by  FT-IR.  The  results  of  FTIR spectra showed that the anthraquinone structures, nitrogen linkages and amino groups of RB4 were destroyed by laccase crude enzyme. Toxicity study using Bacillus sp. confirmed that biotransformation product of RB4 is less toxic compared to parent dye.
Keywords: Azo, Anthraquinone, Laccase, White rot fungi

## PENDAHULUAN
Industri  tekstil  dan  produk  tekstil  (TPT)  di  Indonesia  diyakini  mampu  memberikan kontribusi  signifikan  terhadap  perekonomian  (Dwipayani  dan  Notodarmodjo,  2013) penerimaan devisa dari kegiatan ekspor. Tercatat sepanjang Januari-Juni 2018 nilai pengapalan produk  TPT  Indonesia  sudah  mencapai  USD  3,73  miliar,  dengan  peningkatan  3,86%  per tahunnya  (Kementerian  Perindustrian,  2018).  Namun,  terlepas  dari  peranannya  sebagai komoditi  ekspor  yang  diandalkan,  nyatanya  industri  tekstil  ini  menimbulkan  masalah  yang serius bagi  lingkungan terutama masalah yang diakibatkan oleh limbah cair yang dihasilkan (Ayu dan Roosmini, 2014).
Sekitar  2-50%  residu  dari  pewarna  sintetik  yang  digunakan  akan  tersuspensi  pada limbah cair tersebut (Sheth & Dave, 2009). Dalam kasus pewarna reaktif, karena tingkat fiksasi yang  rendah  terhadap  serat,  sebanyak  50%  dari  konsentrasi  pewarna  awal  yang  digunakan masih tertinggal pada air pencucian dalam bentuk terhidrolisis dan tidak lagi memiliki afinitas terhadap serat, sehingga tidak dapat digunakan kembali (Watanapokasin dkk., 2008).
Pada jenis pewarna reaktif, azo dan antrakuinon adalah kromofor utama yang sering digunakan (Erkurt dkk., 2009). Saat ini, parameter warna belum dimasukan dalam baku mutu limbah  cair  industri  tekstil.  Namun,  keberadaan  pewarna  reaktif  di  perairan  menjadi permasalahan serius pada waste water treatment plan (WWTP) dikarenakan intensitas warna, sifatnya  yang  bio-rekalsitran  serta  potensi  toksisitasnya  terhadap  lingkungan  (Jadhav  dkk., 2010).
Pada studi toksisitas lingkungan menggunakan organisme uji bakteri, ditemukan fakta bahwa pewarna azo Orange 2 (250-500 mg/L) dapat menghambat pertumbuhan P. syringae , E.  coli , B.  subtilis , M.  luteus ,  dan M.  aeruginosa .  Bakteri-bakteri  tersebut  dipilih  sebagai organisme  yang  umum  ditemui  di  lingkungan  (Legerská  dkk.,  2016).  Sedangkan,  studi toksisitas  lain  dari  pewarna  Reactive  black  5  yang  diujikan  terhadap S.  meliloti (bakteri
nitrifikasi),  menunjukan  adanya  penurunan  viabilitas  sel  pada  konsentrasi  pewarna  yang semakin tinggi, EC 50 yang terukur yaitu pada konsentrasi 164 mg/L (Enayatizamir dkk., 2011). Penyisihan  pewarna  dengan  metode  biologis  secara  umum  banyak  dipertimbangkan karena  ramah  lingkungan  dan  mengarah  pada  proses  mineralisasi  polutan  organik  secara menyeluruh  dengan  biaya  yang  relatif  ekonomis.  Saat  ini,  banyak  peneliti  memanfaatkan kemampuan jamur terutama jamur pelapuk putih, untuk  penyisihan berbagai  polutan karena sistem  ekstraseluler  enzimnya  yang  non-spesifik.  Enzim  oksidatif  ekstraseluler  yang  di ekskresikan Jamur Pelapuk Putih terdiri dari Mangan Peroksidase (MnP), Lakase, dan Lignin Peroxidase  (LiP).  Ditinjau  dari  beberapa  hasil  penelitian  sebelumnya,  menyatakan  bahwa diantara  berbagai  jenis  enzim,  lakase  menunjukan  potensi  yang  besar  untuk  diaplikasikan dalam bidang bioteknologi dan lingkungan (Rivera-Hoyos dkk., 2013; Senthivelan dkk., 2016). Beberapa  penelitian  telah  dilakukan  terhadap  kelompok  jamur  yang  mampu  menyisihkan pewarna  antara  lain Phanerochaete  chrysosporium (Senthilkumar  dkk.,  2014), Pleurotus ostreatus (Erkurt  dkk.,  2007), Trametes  sp. (Wang  dkk.,  2018), Marasmiellus  palmivorus (Centele dkk., 2017), dan Ganoderma sp. BTA1 (Martina, 2005). Namun, penelitian mengenai kemampuan penyisihan warna oleh jamur pelapuk putih tersebut masih terbatas pada satu jenis pewarna oleh masing-masing isolat jamur.
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi  potensi  berbagai  jenis Jamur Pelapuk Putih untuk menyisihkan pewarna tekstil jenis antrakuinon dan azo, baik yang memiliki ikatan monoazo  maupun  diazo,  dengan  menggunakan  berbagai  isolat  jamur  pelapuk  putih  yaitu: Pleurotus ostreatus dan Trametes versicolor sebagai salah satu jenis jamur yang dikenal baik dalam  memproduksi  enzim  lakase  (Kocyigit  dkk.,  2012); Marasmiellus  palmivorus sebagai jamur  yang  banyak  tumbuh  di  indonesia;  serta Ganoderma  sp., dan Phanerochaete chrysosporium yang  telah  banyak  disebutkan  dalam  berbagai  hasil  penelitian (Senthilkumar dkk.,  2014;  Dias  dkk.,  2003 ). Kelima  jenis  jamur  pelapuk  putih  tersebut  kemudian diidentifikasi efisiensi penyisihannya terhadap pewarna Reactive Blue 4 (RB4), Reactive black 5 (RB5), Reactive red 120 (RR120), dan Reactive orange 16 (RO16).

## METODOLOGI

## Isolat jamur dan Reagen
Isolat fungi yang digunakan adalah Pleurotus ostreatus, Phanerochaete chrysosporium, Marasmiellus palmivorus, dan Ganoderma sp. yang didapatkan dari Laboratorium Mikologi, Pusat  Ilmu  Hayati,  SITH  ITB.  Sementara Trametes  versicolor didapatkan  dari Indonesian
Culture Collection , Cibinong  – Jawa Barat.  Isolat  fungi tersebut ditumbuhkan pada medium PDA, kemudian diinkubasi pada suhu ruangan selama 7 hari.
Secara  terpisah,  media  cair  Kirk  termodifikasi  dibuat.  Media  Kirk  dibuat  dengan mencampurkan 9 jenis reagen, yaitu glukosa 10 g/L, KH 2 PO 4 1,7 g/L, MgSO 4 0,02 g/L, yeast extract 0,3 g/L, CuSO 4 .7H 2 O 0,01 g/L, Na 2 MoO 4 0,1 g/L, MnSO 4 .H 2 O 0,1 g/L, ZnSO 4 .7H 2 O 0,006  g/L,  Fe 2 (SO 4 ) 3 0,007  g/L  (Hanung  dkk.,  2013).  Seluruh  reagen  yang  digunakan merupakan Analytical grade .

## Screening Penyisihan Pewarna pada Medium PDA
Media  PDA  ditambahkan  dengan  masing-masing  pewarna  (RB4,  RB5,  RR120  dan RO16).  Medium  tersebut  digunakan  untuk  pengamatan  penyisihan  warna  oleh  isolat  jamur pelapuk  putih  yang  digunakan.  Dengan  menggunakan inoculating  punch, isolat  fungi diinokulasikan  dengan  diameter  5mm  pada  medium  PDA  yang  telah  diberi  warna  dengan konsentrasi 150 mg/L. kultur tersebut kemudian di inkubasi selama 24 hari pada suhu ruang (26 0 C) untuk diamati zona bening yang terbentuk di sisi bawah petri dish kultur dan diamati setiap 24 jam, serta diekspresikan dalam cm/hari (Rathnan dkk., 2013).

## Analisis Kurva Aktivitas enzimatik T. versicolor dan P. ostreatus
Aktivitas enzimatis 2 isolat terbaik yang didapat dari percobaan skala in vitro dilakukan analisis  untuk  mengetahui  enzim  yang  dominan  diproduksi  oleh  jamur  pelapuk  putih  yang digunakan. Enzim yang dianalisis berupa lakase, Mnp dan Lip selama 12 hari untuk melihat waktu optimal diproduksinya enzim dan enzim yang mendominasi. Erlenmeyer dengan volume 1 liter disiapkan dengan 750 ml medium kirk dan sebanyak 5 mL di inokulasikan isolat jamur yang sudah ditumbuhkan dalam medium PDB selama 7 hari (Centele dkk., 2017). Setiap 24 jam  diamati  aktivitas  enzim  (lakase,  Mnp  dan  Lip),  kemudian  didapatkan  1  isolat  dengan aktivitas  terbaik,  serta  1  enzim  yang  paling  dominan  diproduksi  jamur  dalam  medium  Kirk (Patrick dkk., 2011; Hafilah, 2017).

## Penyisihan pewarna sintetis dalam Submerged fermentation form (SFF)
Isolat terbaik kemudian ditumbuhkan dengan cara yang sama pada percobaan analisis kurva  aktivitas  enzimatis  (Patrick  dkk.,  2011;  Hafilah,  2017).  Namun,  kultur  stok  yang digunakan sebesar 5% (v/v) dari volume total dan waktu inkubasinya selama 5 hari. Setiap 24 jam  diamati  aktivitas  enzim,  penyisihan  warna,  Biomassa  serta  pH.  Seluruh  perlakuan dilakukan  dengan  3  kali  pengulangan  (triplo).  Masing-masing  sampel  sebelum  dan  sesudah
diolah, kemudian diukur perubahan panjang gelombang maksimum dengan rentang 200-800 nm untuk mengetahui mekanisme yang dominan yaitu biosorpsi atau biotransformasi (Zheng dkk, 2011; Patrick dkk., 2011; Erkurt dkk., 2007).

## Pengukuran Efisensi Penyisihan Warna dan Aktivitas Lakase
Sampel media cair yang dipisahkan dengan miselia  melalui proses  sentrifugasi 3500 rpm  selama  10  menit.  Pengamatan  penyisihan  warna  dilakukan  dengan  menggunakan Spektrofotometer  Optizen  2120UV  pada  panjang  gelombang  maksimum  masing-masing pewarna reaktif (Jayapal dkk., 2018).
Aktivitas  lakase  diuji  dengan  ABTS  atau  2,2’-azinio-bis-(3-ethylbenzhiazoline-6- sulphonic acid) sebagai substrat uji (Johannes dkk., 2006; Risdianto, 2007; Hanung dkk., 2013; Margot  dkk.,  2013;  Trejo  dkk.,  2015).  Aktivitas  Manganese  peroksidase  (MnP)  diuji berdasarkan  estimasi  penghilangan  substrat  fenol  red  (Kuwahara  dkk.,1984;  Hafilah,  2017). Sedangkan,  Aktivitas  Lignin  Peroksidase  (LiP)  ditentukan  berdasarkan  reaksi  demetilasi metilen biru (Magalhães dkk.,1996; Hafilah, 2017).

## Uji stabilisasi pH dan suhu ekstrak kasar enzim lakase
Pengaruh  pH  pada  aktivitas  laccase  ditentukan  menggunakan  buffer  asam  sitrat- Na 2 HPO 4 .  ABTS  digunakan  sebagai  substrat  (Wang  dkk.,  2018).  Dalam  uji  stabilitas  pH, ekstrak  kasar  enzim  lakase  dipreinkubasi  pada  suhu  4 0 C  dan  selanjutnya,  aktivitas  diukur menggunakan uji standar (substrat ABTS) dalam asam sitrat-buffer Na 2 HPO 4 (50 mM) pada pH 2,2 hingga 8,0 dengan rentang pH 0,2 (Ling dkk., 2015). Thermo stabilitas diujikan setelah mendapatkan kondisi pH optimum, enzim di pre inkubasi pada suhu 4 0 C kemudian, diinkubasi pada berbagai suhu berkisar 20 0 C–80 0 C dengan rentang 5 0 C selama 60 menit dan dilakukan pengujian aktivitas lakase.

## Penyisihan  warna  dengan  Ekstrak  kasar  enzim  lakase  dan  uji  toksisitas  hasil metabolitnya
Penyisihan  warna  dengan  menggunakan  crude  enzim  lakase  dilakukan  pada  pH  dan suhu optimum enzim, sebanyak 1,5 ml larutan stok warna 2000 ppm dicampurkan dengan 18,5 ml  ekstrak  kasar  enzim  sehingga  konsentrasi  warna  menjadi  150  ppm.  Kemudian  sampel diinkubasi  selama  60  menit  dan  diukur  persen  penyisihan  warnanya.  Sampel  dengan  persen penyisihan warna terbaik kemudian dilakukan analisis lanjutan menggunakan instrument FTIR
untuk mengetahui biotransformasi gugus fungsi pewarna sebelum dan sesudah diolah (Zheng dkk., 2011).
Koloni Bacillus  sp. ditumbuhkan  pada  medium  nutrient  broth  (NB)  selama  24  jam. Toksisitas RB4 dan produk hasil biotransformasinya dianalisis dengan menginokulasikan 1% (v/v) dari kultur yang sudah berumur 24 jam kedalam tabung tes yang mengandung NB dan RB4  sebelum  diolah  (150  ppm)  atau  RB4  yang  sudah  terolah  dalam  volume  total  20  mL. Tabung  tes  kemudian  di  inkubasi  pada  suhu  26 0 C  dan  diagitasi  140  rpm  selama  24  jam. Pengencerah  bertingkat  kemudian  disiapkan  (aquades  steril)  dan  1  mL  masing-masing percobaan  ditambahkan  kedalam  petri  yang  sudah  diberikan  NA  untuk  selanjutnya  diamati jumlah koloni dengan metode Total  plate counter (Legerská dkk., 2016; Enayatizamir dkk., 2011).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Zona penyisihan warna isolat fungi pada medium PDA yang diberi pewarna reaktif
Pada Gambar 1 Dari keempat warna yang digunakan, hanya isolate P. ostreatus dan T.  versicolor yang  dapat  menyisihkan  seluruh  warna  yaitu  RO16 , RR120 , RB4 dan  RB5 . Sehingga  keduanya  sangat  potensial  untuk  menyisihkan  pewarna  tekstil  reaktif  dan  dapat dilakukan analisis lanjutan untuk mengetahui mekanisme penyisihan yang terjadi.
Gambar 1. Grafik Zona penyisihan warna oleh JPP pada SFF
Analisis Kurva Aktivitas enzimatik T. versicolor dan P. ostreatus
Lignin Modified Enzyme (LME) dihasilkan oleh jamur pelapuk putih sebagai metabolit sekunder (Erkurt dkk., 2009), sehingga apabila ingin mendapatkan hasil enzim pendegradasi
0 2 4 6 8 10 Phanerochaete chrysosporium Marasmiellus palmivorus Trametes versicolor Ganoderma sp. Pleurotus ostreatus D ia m et er Z o n a P en y is ih a n W a rn a (c m ) RO16 RR120 RB4 RB5
warna  maka  pertumbuhan  miselia  jamur  harus  dioptimalkan  terlebih  dahulu.  Setelah  kultur stok di inkubasi selama 12 hari, dilakukan pengukuran kadar protein serta aktivitas enzimatis untuk mendapatkan gambaran apakah Isolat yang digunakan mampu menghasilkan enzim yang diharapkan.  Medium  cair  yang  digunakan  mengandung  glukosa  sebagai  sumber  karbon sederhana yang dapat  dimanfaatkan oleh jamur secara langsung. Namun, kehadiran glukosa yang terlalu tinggi pada medium dapat menurunkan produktivitas jamur untuk menghasilkan enzim ekstraseluler.
Hasil pada Gambar 2 menunjukan aktivitas lakase yang tinggi. Telah diketahui bahwa lakase dari  banyak spesies jamur menjadi kelompok isoenzim yang dikodekan oleh gen dari family  jamur tersebut, misalnya, Agaricus bisporus , Cerrena unicolor , Trametes sanguinea , dan Trametes  versicolor (Wang  dkk.,  2018). Penggunaan  medium  kirk  dalam  penelitian  ini tanpa penambahan sumber lignin, sehingga enzim Lip dan Mnp yang terukur tidak menunjukan hasil yang baik.
Gambar 2. Grafik aktivitas enzimatis (A) Trametes versicolor ; (B) Pleurotus ostreatus
Pada  penelitian  terdahulu,  menunjukkan  bahwa  senyawa  fenolik  dan  nonfenolat teroksidasi  oleh  senyawa  yang  berasal  dari  reaksi  Fenton  yang  dimediasi  oleh  kompleks molekul rendah Fe 3+ , seperti MnP, dan laccase dapat mengoksidasi senyawa lignin non-fenolik dengan kehadiran Fe 3+ atau Mn 2+ /Mn 3+ tersebut (Munoz dkk., 1997). Oleh karena itu, medium Kirk yang digunakan sebagai substrat utama untuk pertumbuhan jamur pelapuk putih memiliki komposisi ion-ion logam yang dibutuhkan untuk menjadi mediator. Sehingga, radikal hidroksil yang  dihasilkan  melalui  reaksi  berbasis  Fenton  non-enzimatik  tersebut  memulai  oksidasi substruktur non-fenolik, dan sebagian senyawa non-fenolik yang teroksidasi kemudian dapat
0 40 80 120 160 200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Aktivitas enzim (U. L -1 ) Wak tu p e n gam atan (h ar i) Lip Mnp Lac A 0 40 80 120 160 200 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Aktivitas enzim (U. L -1 ) Wa k tu p e n gam atan (h ar i) Lip Mnp Lac B
dioksidasi  lebih  lanjut  oleh  enzim  peroksidase  dan/atau  lakase  (Arantes  &  Milagres,  2006). Dari hasil penelitian ini, dapat diamati bahwa pada kedua isolat, aktivitas enzim lakase lebih tinggi dibandingkan Mnp dan Lip. Sehingga, untuk percobaan penyisihan warna dengan SFF hanya aktivitas lakase yang akan diamati sebagai ekstraseluler enzim yang dominan diproduksi dan  isolate T.  versicolor menghasilkan  enzim  lakase  dengan  aktivitas  yang  lebih  tinggi dibandingkan isolat P. ostreatus.

## Biomasa kering Trametes versicolor dan pH pada SFF
Hasil inkubasi selama 5 hari kultur T. versicolor yang diujikan dengan pewarna reaktif berdasarkan biomasa kering sel pada medium SFF dapat diamati pada Gambar 3A Pada akhir pengamatan  penyisihan  warna  RB5  menunjukan  hasil  biomassa  kering  tertinggi,  yaitu  4,66 g/L, kemudian RB4 dan RO16 (4,3 g/L), serta RR120 (4,28 g/L). Biomasa kering pada masing- masing  penambahan  warna  meningkat  dari  hari  ke-1  sampai  hari  ke-5.  Peningkatan pertumbuhan  biomasa  jamur  dalam  reaktor  SFF  menunjukan  kemampuan  toleransi  jamur terhadap pewarna tekstil yang digunakan.
Gambar 3. Grafik biomasa kering dan pH pda SFF
Pada pengamatan pH yang terukur ( Gambar 3B) , penurunan pH menunjukan adanya aktivitas  biologis  yang  menghasilkan  asam  organik  seperti  malat,  oksalat,  fumarat,  dan glioksalat  diproduksi  selama  fermentasi  jamur  pelapuk  putih.  Asam-asam  ini  bertanggung jawab atas penurunan pH. Secara alamiah jamur memiliki sistem buffer untuk tetap menjaga kualitas  enzim  yang  digunakan.  Hal  tersebut  tentunya  menguntungkan  karena  enzim  dapat bekerja pada rentang pH yang luas.
0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 B io m as a k e r in g (g. L -1 ) Waktu pengamatan (hari) RR120 RO16 RB4 RB5 A 3 4 6 0 2 4 pH Waktu pengamatan (hari) RR120 RO16 RB4 RB5

## Percobaan Penyisihan warna oleh Trametes versicolor pada SFF
Laju  penyisihan pewarna azo pada awal  sampai akhir pengamatan dapat  dilihat pada Gambar 4A selama 5 hari masa inkubasi. Pada penambahan pewarna jenis antrakuinon RB4 persen  penyisihan  warna  yaitu  sebesar  99,99%  disisihkan  lebih  baik  dibandingkan  jenis pewarna azo lainnya, RB5 (98,03 %), RR120 (90,56 %) serta RO16 (63,52 %). Pada percobaan ini enzim lakase aktivitasnya terus naik selama waktu inkubasi, aktivitas enzim yang terukur secara berturut-turut pada akhir perlakuan untuk RB4, RB5, RR120 dan RO16 adalah 547 U.l - 1 , 382 U.l -1 , 325 U.l -1 dan 294 U.l -1 ( Gambar 4B) .
Besarnya  aktivitas  enzim  lakase  yang  terukur  sebanding  dengan  persen  penyisihan warna  pada  percobaan  ini.  Hal  tersebut  dapat  membuktikan  bahwa  mekanisme  penyisihan warna  tersebut  dipengaruhi  oleh  aktivitas  lakase.  Dari  penelitian  ini,  percobaan  dengan penambahan  pewarna  RB4  yang  merupakan  jenis  antrakuinon  memiliki  persen  penyisihan yang lebih baik dibandingkan tiga jenis pewarna azo lainnya, pada konsentrasi pewarna 150 mg/L.
Gambar 4. Grafik (A) Penyisihan pewarna sintetik konsentasi 150 mg/L; (B) Aktivitas lakase pada masing-masing pewarna
Kemampuan T.  versicolor atau  lakasenya  untuk  penyisihan  pewarna  yang  berbeda ditunjukkan  dalam  beberapa  penelitian. T.  versicolor sebelumnya  telah  menunjukan kemampuan untuk penyisihan sejumlah pewarna baik seluruhnya atau sebagian dalam kondisi di  agitasi  (Ramsay  &  Nguyen,  2002).  Osma  dkk.,  (2010)  menunjukkan  bahwa  penyisihan warna  RBBR  oleh  lakase  yang  diimobilisasikan  memiliki  penyisihan  maksimum  (44%)
0% 20% 40% 60% 80% 100% 0 2 4 6 % P e n yi si h an w ar n a Waktu pengamatan (hari) RR120 RO16 RB4 RB5 0 100 200 300 400 500 0 2 4 6 A k ti v itas l ak as e (U . L -1 ) Waktu pengamatan (hari) RR120 RO16 RB4 RB5
diperoleh  dalam  42  jam  terutama  karena  peran  aktivitas  enzim,  produk  transformasi  RBBR yang terbentuk oleh pengolahan dengan enzim lakase menunjukkan lebih sedikit fitotoksisitas daripada pewarna induknya.  Menurut  hasil percobaan penyisihan warna dalam  SFF, penulis menyimpulkan  bahwa  enzim  ekstraseluler  dari  organisme  ini  dapat  secara  efisien menghilangkan berbagai jenis pewarna tekstil.
Hasil  tersebut  menekankan  peran  lakase  dalam  mendegradasi  pewarna  antrakuinon. Seperti hasil studi mengenai jalur transformasi RBBR oleh imobilisai lakase yang diusulkan oleh Osma dkk., (2010). Hubungan antara efisiensi penyisihan warna dan aktivitas enzim dari jamur  pelapuk  putih  telah  dilaporkan  sebelumnya  (Banat  dkk.,  1996).  Dalam  literatur, ditekankan  bahwa  untuk  penyisihan  yang  lebih  efisien,  berbagai  faktor  seperti  optimalisasi bahan-bahan  medium  utama,  pengamatan  pertumbuhan  jamur,  peningkatan  aktivitas  enzim, investigasi laju penyisihan warna harus dipertimbangkan.

## Scanning Perubahan Panjang gelombang pada pewarna reaktif setelah perlakuan
Selain  dengan  pengukuran  konsentrasi,  dilakukan  juga scanning panjang  gelombang pewarna  teroksidasi.  Laju  penyisihan  pewarna  teroksidasi  menunjukkan  bahwa  terjadi penurunan  nlai  absorbansi  pada  Panjang  gelombang  sinar  tampak  untuk  keempat  pewarna. Hasil scanning panjang gelombang pewarna ditunjukkan oleh Gambar 5.
Pada  pewarna  tekstil  RR120  puncak  spektrum  menurun  pada  rentang  sinar  tampak namun  tidak  bertambah  pada  rentang  spektrum  serapan  elektronik  dari  protein  terutama ditandai  pada  daerah  ultraviolet  (185-320  nm).  Hal  tersebut  dapat  mengindikasikan  tidak terbentuknya  hasil  samping  produk  hasil  penyisihan  warna.  Berbeda  halnya  pada  pewarna tekstil  RB4,  RB5  dan  RO16,  pada  spektrum  ultraviolet  (185-320  nm),  adanya  penambahan absorbansi puncak spektrum yang dapat mengindikasikan terjadinya biotransformasi pewarna menjadi hasil samping produk lainnya.
Konsentrasi  pewarna  yang  digunakan  juga  mempengaruhi  kerja  enzim  dalam menyisihkan  pewarna  tekstil.  Beberapa  penelitian  menunjukkan  bahwa  kemampuan  enzim dalam menyisihkan warna memiliki kemampuan berbeda tergantung konsentrasi pewarna yang digunakan (Ratanapongleka & Phetsom, 2014). Penelitian tersebut menggunakan konsentrasi pewarna dari konsentrasi 20 mg/l hingga 140mg/l.
Gambar 5. Scanning Perubahan Panjang gelombang pada pewarna reaktif sebelum dan sesudah perlakuan (A) RR120; (B) RO16; (C) RB4; dan (D) RB5
Hilangnya  (total)  puncak  tunggal  pada  panjang  gelombang  maksimum  (λmax)  dari maing-masing pewarna menunjukkan bahwa proses tingkat penyisihan warna terlihat sampai pada titik dimana secara visual warna menjadi hilang. Pewarna terutama azo dikenal dengan penggunaan  pada  kuantitas  kecil  karena  warna  dan  kecemerlangannya  yang  khas.  Bentuk murni  pewarna  biasanya  direpresentasikan  oleh  warna  asli  dan  panjang  gelombang  pada absorbansi  tertinggi  (λmax) ditentukan dengan pemindaian UV. Hasilnya (UV-Vis spectra), disintegrasi  puncak  yang  diamati  pada  λmax  setelah  penyisihan  pewarna  terbukti  karena penurunan absorbansi di wilayah UV.

## Uji stabilitas pH pada ekstrak kasar enzim lakase dari T. versicolor
PH  media  kultur  merupakan  faktor  penting  dalam  produksi  lakase  dan  dapat mengganggu aktivitas enzim dan stabilitasnya (Sharma dkk., 2013). pH optimal ekstrak kasar
0 0.5 1 1.5 2 200 400 600 A b so r b an si Panjang gelombang (nm) sebelum sesudah A 0 0.5 1 1.5 2 200 400 600 A b so r b an si Panjang gelombang (nm) sebelum sesudah B 0 0.5 1 1.5 2 200 400 600 A b so r b an si Panjang gelombang (nm) sebelum sesudah C 0 0.5 1 1.5 2 200 400 600 A b so r b an si Panjang gelombang (nm) sebelum sesudah D
enzim lakase terhadap substrat ABTS yaitu pada pH 2,4. Sedangkan aktivitas relative enzim yang diamati pada pH 2,2 buffer asam sitrat-Na2HPO4 atau buffer McIlvaine (93,8%). Lebih dari 50% aktivitas enzim berkurang pada pH 3,8 dan lebih dari 95% aktivitas berkurang pada pH 5,8. Kemampuan oksidasi enzim hampir berkurang sepenuhnya pada kisaran pH lebih dari 6,2.  PH  optimal  untuk  aktivitas  lakase  umumnya rendah,  berkisar  antara  3,0  dan  5,0  (More dkk., 2011). Pada hasil penelitian ini pH optimal yang terbaik berkisar antara 2,2 sampai 4,4 dan kemudian aktivitas enzim terus menurun dan tidak terdeteksi adanya aktivitas dari rentang pH  6,8  sampai  8,0.  PH  optimal  untuk  aktivitas  lakase  tergantung  pada  substrat  yang  dipilih (Patel dkk., 2014), pH optimum dapat berubah menjadi kurang dari 5,0 untuk ABTS sedangkan untuk  guaiacol  agak  lebih  tinggi  (pH  5,0-7,0)  untuk  MPD  (2,6-Dimethoxyphenol)  dan syringaldazine  (Sharma  dkk.,  2013).  Hal  tersebut  dapat  dikaitkan  dengan  mekanisme  reaksi lakase,  yang  melibatkan  abstraksi  elektron  atau  hidrogen  yang  akan  dipengaruhi  oleh perubahan  pH.  Selain  itu,  reaksi  oksidasi  tergantung  pada  redoks  potensial  substrat.  pH mempengaruhi  keadaan  ionisasi  substrat  dan  karenanya  memengaruhi  kapasitasnya  untuk bertindak sebagai substrat pereduksi (Majcherczyk dkk., 1999).
Suhu optimal untuk ekstrak kasar enzim lakase T. versicolor adalah 20 0 C. Sekitar 67% dari  total  aktivitas relatif tetap terukur ketika diuji  hingga suhu 50 0 C. Lebih  dari  91% total aktivitas berkurang setelah 60 menit inkubasi pada suhu 55 0 C. ekstrak kasar enzim lakase juga memanifestasikan  stabilitas  yang  sangat  tinggi  dalam  kisaran  suhu  uji  20-50 0 C  selama inkubasi 60 menit. Setelah diinkubasi pada 20-50 0 C selama 60 menit, sebagian besar aktivitas pengoksidasi  enzim  tetap  ada.  Ketika  diinkubasi  pada  suhu  diatas  55 0 C,  enzim  mengalami penurunan aktivitas pengoksidasi dan hampir tidak terukur pada suhu 70-80 0 C.

## Percobaan penyisihan warna menggunakan ekstrak kasar enzim lakase
Dalam Tabel 1 , hasil penyisihan RR120, RO16, RB4 dan RB5 oleh ekstrak enzim kasar dengan aktivitas spesifik enzim sebesar 1842,91 U.L -1 disajikan. Pada penyisihan RB4 dengan waktu  kontak  60  menit  menunjukkan  persentase  penyisihan  di  atas  90%.  Pewarna  seperti pewarna antrakuinon adalah substrat yang baik untuk lakase dan penyisihan warna yang terjadi sebanding dengan aktivitas enzim (Wong & Yu, 1999).

## Tabel 1. Penyisihan warna oleh ekstrak kasar enzim lakase T. versicolor
Strain Pewarna Tipe penyisihan warna/ Medium pH/Suhu/ Agitasi/ waktu kontak Penyisihan warna (%) Ref. Trametes trogii SYBC- LZ RBBR (50 mg/l) Medium terfiltrat/ solid soybean cake dan wood shavings substrate 30 0 C pH 4,0 kondisi statis 30 menit 85,2% Zheng dkk, 2011 RB 4 (35 mg/l) 69,6% AB 129 (83,3 mg/l) 45,6% AR 1 (10 mg/l) 90,2% RB5 (18,3 mg/l) 65,4% Trametes versicolor RR120 (150 mg/l) Medium terfiltrat/ medium Kirk 20 0 C pH 2,4 Agitasi 140 rpm 60 menit 6,61% Studi ini RO16 (150 mg/l) 4,95% RB4 (150 mg/l) 99,84% RB5 (150 mg/l) 0,56%
Penggunaan kultur jamur utuh untuk penyisihan warna tidak mudah diterapkan dalam skala  besar.  Selain  itu,  penggunaan  enzim  yang  dimurnikan  atau  diimobilisasi  akan meningkatkan  biaya  proses  penyisihan  warna  (Levin  dkk,  2010).  Filtrat  kultur  kasar  enzim memiliki  beberapa  keunggulan. Proses  produksinya  tidak  mahal,  mereka  mungkin  termasuk mediator lakase alami yang disekresikan oleh jamur (Johannes & Majcherczyk, 2005), dan di samping  itu,  faktor  lain  dalam  medium  seperti  protein,  sisa  makronutrien,  dan  metabolit ekstraseluler yang larut  dapat  menstabilkan enzim kasar.  Dalam hal  ini penghilangan warna oleh filtrat kultur kasar enzim dapat diselesaikan secara efisien dalam 60 menit pada RB4, yang jauh  lebih  pendek  daripada  proses  penyisihan  warna  oleh  kultur  jamur  pada  SFF  (sekitar  5 hari).  Selain  itu,  penyisihan  pewarna  menggunakan  enzim  kasar  dapat  menghindari penghambatan  pewarna  pada  pertumbuhan  jamur.  Dengan  demikian  penyisihan  warna menggunakan enzim kasar lebih menguntungkan. Berikut adalah stuktur kimia dari pewarna RB4 yang aktif didegradasi oleh ekstrak kasar enzim lakase ( Gambar 6 ).
Gambar 6. Struktur kimia pewarna tekstil RB4
Gambar 7. Hasil analisis FTIR pewarna RB4 sebelum dan sesudah diolah
Puncak pada 3425 cm -1 menunjukkan adanya ikatan -N-H- dalam pewarna asli, Amina primer =N─H dan amina sekunder  -NH2 sering  ada dalam struktur pewarna. Rentang nilai absorpsi  dari  peregangan  N-H  terkadang  sulit  dibedakan  dengan  ikatan  hidrogen  O-H. Penyerapan  (%  transmisi)  N-H  biasanya  lebih  tajam  karena  kecenderungan  yang  jauh  lebih lemah dari kelompok N-H untuk membentuk ikatan hidrogen (Manfred dkk., 1997). Namun, dalam kasus pewarna reaktif, baik kelompok O-H dan N-H kemungkinan ada dalam struktur pewarna.
Sementara  peregangan  gugus  -C-H  pewarna  teramati  pada  2933-3070  cm -1 , yang menghilang  dalam  spektrum  metabolit  (hasil  pengolahan).  Selain  itu,  pemutusan  cincin antrakuinon  juga  dibuktikan  oleh  puncak  yang  semakin  lemah  di  dekat  1571  cm -1 ,  yang bertanggung jawab untuk kombinasi getaran peregangan C=O terkonjugasi dengan C=C (Miao dan Tao, 2008). Secara khusus, ikatan penghubung antara cincin antraquinone dan cincin mono benzene  dengan  cepat  terputus  karena  menurunnya  intensitas  puncak  pada  1269  cm -1 untuk kelompok amina aromatik.
Gugus  karbonil  dalam  kromofor  pada  umumnya  cenderung  dikonjugasikan  dengan ikatan  rangkap  atau  cincin  aromatik  (sering  pada  kedua  substituen  pada  karbonil)  (Miller, 1977).  Kelompok  C=O  dapat  tumpang  tindih  dengan bending N-H  dan  C=C  terkonjugasi dengan  cincin  aromatik  dalam  spektrum  IR.  Oleh  karena  itu,  tidak  dapat  digunakan  untuk mengidentifikasi apakah pewarna tersebut termasuk pewarna reaktif jenis antrakuinon. Keton, =C=O, dapat ditampilkan dalam struktur reaktif biru. Kelompok C=N dapat ditemukan dalam beberapa pewarna reaktif.  Hal tersebut mungkin tumpang tindih dengan senyawa karbonil dan N-H bending dalam spektrum IR. Dengan mengacu pada pewarna reaktif, C=N sering terdapat dalam sistem siklik terkonjugasi.
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 20 40 60 80 100 55 1. 64 63 4. 58 67 8. 94 72 5. 23 10 43 .4 9 11 38 .0 0 12 28 .6 6 14 08 .0 4 14 89 .0 5 15 71 .9 9 53 0. 42 61 5. 29 87 3. 75 94 3. 19 10 74 .3 5 12 26 .7 3 12 98 .0 9 % T ra n sm is i Wavenumber (Cm -1) Sebelum diolah Sesudah diolah 34 25 .5 8 33 90 .8 6 30 70 .6 8 29 33 .7 3 29 35 .6 6 17 78 .3 7 16 35 .6 4 14 11 .8 9
Kehadiran puncak pada 1269 cm -1 merupakan amina aromatik yang ditemukan dapat diabaikan  setelah  penyisihan  pewarna  karena  puncaknya  yang  menghilang.  Pada  struktur cincin aromatic RB4 dengan puncak bilangan gelombang antara 619 dan 725 cm -1 menghilang setelah  proses  pengolahan,  yang  menunjukan  aktivitas  biotransformasi  oleh  ekstrak  kasar enzim lakase.
Cincin aromatik dapat diidentifikasi oleh beberapa daerah band di spektrum IR. Garam sulfonat,  gugus  R-SO3-  adalah  komponen  penting  dari  pewarna  reaktif  serta  senyawa kloroaromatika (C-Cl) sering pula terdapat dalam struktur pewarna reaktif. Senyawa aromtaik ada  dalam  struktur  warna  cyan,  magenta,  dan  hitam  dalam  penyerapan  yang  lemah,  tetapi intens dan luas dalam pada pewarna kuning.
Setelah  pengolahan  menggunakan  ekstrak  kasar  enzim,  spektrum  RB4  menunjukkan hilangnya berbagai puncak. Pada saat yang sama, muncul puncak baru di 1298 cm -1 dan 1778 cm -1 masing-masing menggambarkan adanya getaran CO asam dan deformasi C = O asam serta aldehida  yang  dapat  disebabkan  oleh  produk  sampingan  yang  terbentuk  selama  proses penyisihan RB4. Hasilnya menentukan bahwa ekstrak kasar enzim lakase T. versicolor secara efektif  menghilangkan  senyawa  terhalogenasi  serta  gugus  amina  dari  RB4  seperti  yang dijelaskan  sebelumnya  yaitu  penyisihan  warna  oleh Proteus  mirabilis dan Proteus  vulgaris serta cyanobacteria (Parmar & Shukla, 2015; Afreen dkk, 2017).

## KESIMPULAN
Jamur  pelapuk  putih  jenis Pleurotus  ostreatus,  Trametes  versicolor,  Marasmiellus palmivorus, dan Ganoderma sp. memiliki potensi yang berbeda dalam mendegradasi pewarna tekstil reaktif. Secara in vitro pada medium PDA spesies P. ostreatus dan T. versicolor aktif menyisihkan keempat pewarna yang digunakan, yaitu antrakuinon ( reactive blue 4 ) , monoazo ( reactive orange 16 ) dan diazo ( reactive red 120 dan reactive black 5 ). Evaluasi aktivitas enzim kedua  spesies  menunjukan  bahwa  lakase  merupakan  enzim  yang  dominan  terukur  pada medium nutrient yang digunakan, lebih lanjut T. versicolor memiliki aktivitas lakase terbaik, serta mampu menyisihkan pewarna reaktif sebesar 60-90% pada SFF. Aktivitas lakase dapat bekerja pada rentang pH 2,2 hingga 4,4, serta pada suhu 20–50 0 C. 5. Percobaan penyisihan warna dengan ekstrak kasar enzim lakase terbaik yaitu pada RB4 sebesar 99,84%. Hasil studi toksisitas  menggunakan Bacillus  sp. terhadap  pewarna  RB4  sebelum  dan  sesudah  diolah, menunjukan hasil metabolitnya telah berkurang toksisitasnya dibandingkan senyawa induknya.

## REFERENSI
Afreen, S., Anwer, R., Singh, R.K., dan Fatma, T. (2016): Extracellular laccase production and its optimization from Arthrospira maxima catalyzed decolorization of synthetic dyes, Saudi J. Biol. Sci .
Arantes,  V.,  dan  Milagres,  A.M.F.  (2006):  Degradation  of  cellulosic  and  hemicellulosic  substrates  using  a chelator-mediated Fenton reaction, Journal of Chemical Technology & Biotechnology , 81, 413–9
Banat, I.M., Nigam, P., Singh, D., dan Marchant, R. (1996): Microbial decolorization of textile-dye-containing effluents: a review, Biore-source Technol, 58 , 217-227.
Centele, C., Fontana, R.C., Mezzomo, A.G., da Rosa, L.O., Poleto, L., Camassola, M., dan Dillon, A.J.P. (2017):
Production,  characterization  and  dye  decolorization  ability  of  a  highlevel  laccase  from Marasmiellus palmivorus, Biocatalysis and Agricultural Biotechnology , 12, 15–22.
Dias, A.A., Bezerra, R.M., Lemos, P.M., dan Pereira A.N. (2003): In vivo and Laccasecatalysed Decolourization of Xenobiotic Azo Dyes by a Basidiomycetous Fungus: Characterization of Its Ligninolytic System, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 19, 969-975
Dwipayani, A. R., & Notodarmodjo, S. (2013). Penggunaan Lempung sebagai Adsorben dan Coagulant Aid dalam Penyisihan Cod Limbah Cair Tekstil. Jurnal Teknik Lingkungan, 19(2), 130-139.
Enayatizamir, N., Tabandeh, F., Rodriguez-Couto, S., Yakhchali, B., Alikhani, H.A., dan Mohammadi, L. (2011):
Biodegradation  pathway  and  detoxification  of  the  diazo  dye  Reactive  Black  5  by Phanerochaete chrysosporium , Bioresource Technology, 102, 10359–10362
Erkurt, E.A. Erkurt, H.A. dan Unyanyar, A. (2009). Decolorization of Azo Dyes by White Rot Fungi, Hdb Env Chem ., 9 , 157–167.
Erkurt, E.A., Unyayar, A., dan Kumbur, H. (2007): Decolorization of synthetic dyes by white rot fungi, involving laccase enzyme in the process, Process Biochemistry , 42, 1429–1435.
Hanung, C.D., Osmond, R., Risdianto, H., Suhardi, S.H., dan Setiadi, T. (2013): Optimisasi produksi enzim lakase pada fermentasi kultur pada menggunakan jamur pepelapuk putih Marasmius sp. : Pengaruh ukuran partikel, kelembaban, and konsentrasi Cu, Jurnal Selulosa, 3, 67 – 74.
Jadhav, J.P., Kalyani, D.C., Telke, A.A., Phugare, S.S., dan Govindwar, S.P. (2010): Evaluation of the efficacy of a bacterial consortium for the removal of color, reduction of heavy metals, and toxicity from textile dye effluent, Bioresour Technol , 101, 165–173.
Jayapal, M., Jagadeesan, H., Shanmugam, M., Danisha J., P., dan Murugesan, S. (2018): Sequential anaerobic- aerobic  treatment  using  plant  microbe  integrated  system  for  degradation  of  azo  dyes  and  their  aromatic amines by-products, Journal of Hazardous Materials , 354, 231–243
Johannes,  C.,  dan  Majcherczyk,  A.  (2000):  Natural  mediators  in  the  oxidation  of  polycyclic  aromatic hydrocarbons by laccase mediator systems, Appl. Environ. Microb., 66, 524–528.
Johannes,  T.W.,  Woodyer,  R.D.,  dan  Zhao,  H.  (2006):  High-Throughput  Screening  Methods  Developed  for Oxidoreductases, dalam Reymond,  J.L.  (Ed.), Enzyme  Assays:  High-Throughput  Screening,  Genetic Selection and Fingerprinting, ISBN: 3-527-31095-9, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 77 - 92.
Kementerian  Perindustrian.  2018.  Ringkasan  Eksekutif  Perkembangan  Ekspor  dan  Impor  Industri  Pengolahan Bulan Juni 2018, diakses tanggal 30 Januari 2019 pukul 20.00 WIB.
Kocyigit, A., Pazarbasi, M.B., Yasa, I., Ozdemir, G., dan Karaboz, I. (2012): Production of laccase from Trametes trogii TEM H2: a newly isolatd white-rot fungus by air sampling, J. Basic Microbiol., 52, 661-669.
Kuwahara,  M.,  Glenn,  J.K.,  Morgan,  M.A.,  dan  Gold,  M.H.  (1984):  Separation  and  Characterization  of  Two Extracelullar  H 2 O 2 -dependent  Oxidases  from  Ligninolytic  Cultures  of Phanaerochaete  chrysosporium, European Biochemical Societies, 169, 247-250.
Legerska, B., Chmelova, D., dan Ondrejovic, M. (2016): Degradation of Synthetic Dyes by Laccases – A Mini- Review. Nova Biotechnologica et Chimica. 15 , 90-106.
Levin, L., Melignani, E., dan Ramos, A. (2010): Effect of nitrogen sources and vitamins on ligninolytic enzyme production  by  some  white-rot  fungi  Dye  decolorization by selected  culture  filtrates, Bioresour.  Technol., 101, 4554–4563.
Ling,  Z.R., Wang,  S.S., Zhu,  M.J.,  Ning,  Y.J., Wang,  S.N.,  Li,  B.,  Yang,  A.Z.,  Zhang,  G.Q.,  dan  Zhao,  X.M.
(2015): An extracellular laccase with potential dye decolorizing ability from white rot fungus Trametes sp.
LAC-01 , Int. J. Biol. Macromol. 81, 785-793.
Magalhães,  D.B.,  de  Carvalho,  M.E.A.,  Bon, E.,  Neto, J.S.A., dan  Kling,  S.H.  (1996):  Colorimetric  assay  for lignin peroxidase activity determination using methylene blue as a substrate, Biotechnology Techniques, 10 , 273-276.
Majcherczyk, A., Johannes, C., dan Hutterman, A., (1999): Oxidation of aromatic alcohols by laccase from Trametes versicolor mediated by the 2,20-azinobis-(3 ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) cation radical and dication. Appl. Microbiol. Biot. 51 , 267–276.
Manfred, H., Meier, H. dan Zeeh, B. (1997): Spectroscopic Methods in Organic Chemistry , New York: George Thieme.
Margot, J., Granier, C.B., Maillard, J., Blanquez, P., Barry, D.A., dan Holliger, C. (2013): Bacterial Versus Fungal Laccase: Potential for Micropollutant Degradation, AMB Express , 3 , 1 - 14.
Martina,  A.,  (2005):  Kemampuan Ganoderma  sp. strain Lokal mendegradasi  lignin  pada  beberapa  konsentrasi lindi hitam, Prosiding seminar UNRI UKM ke-3 , Pekanbaru.
Miao, H., dan Tao, W. (2008): Ozonation of humic acid in water, J. Chem. Technol . Biot., 83 , 336–344.
Miller, R.K. (1977): Infrared spectroscopy in The Analytical Chemistry of Synthetic Dyes, Venkataraman, K., ed., John Wiley & Sons, Inc.
More, S.S., Renuka, P.S., Pruthvi, K., Swetha, M., Malini, S., Veena, S.M. (2011): Isolation, purification, and characterization of fungal laccase from Pleurotus sp., Enzym. Res. , 2011–2017.
Munoz,  C.,  Guillen,  F.,  Martinez,  A.T.,  dan  Martinez,  M.J.  (1997): Laccase  isoenzymes  of Pleurotus  eryngii : characterization,  catalytic  properties,  and  participation  in  activation  of  molecular  oxygen  and  Mn 2+ oxidation, Applied and Environmental Microbiology, 63 , 66–74.
Osma, J.F., Toca-Herrera, J.S., dan Rodríguez-Couto, S. (2010): Transformation pathway of Remazol Brilliant Blue R by immobilised laccase, Bioresource Technology , 101, 8509–8514.
Parmar, N., dan Shukla, S.R. (2015): Microbial decolorization of reactive dye solutions. Clean- Soil Air Water,
43, 1426-1432
Patrick, F., Mtui, G., Mshandete, A.M., dan Kivaisi, A. (2011): Optimization of laccase and manganese peroxidase production  in  submerged  culture  of Pleurotus  sajor-caju , African  Journal  of  Biotechnology, 10, 10166- 10177.
Ramsay, J.A., dan Nguyen, T. (2002): Decolorisation of textile dyes by Trametes versicolor and its effect on dye toxicity, Biotechnol Lett , 24, 57–61.
Ratanapongleka, K., dan Phetsom, J. (2014): Decolorization of Synthetic Dyes by Crude Laccase from Lentinus Polychrous Lev., International Journal of Chemical Engineering and Application, 5, 26-30.
Rathnan,  R.K.,  Anto,  S.  M.,  Rajan,  L.,  Sreedevi, E.  S.,  Ambili,  M.,  dan Balasaravan,  T.  (2013): Comparative studies  of  Decolorization  of  Toxic  Dyes  with  Laccase  Enzymes  producing  Mono  and  Mixed  cultures  of Fungi, Research Article , 1 , 21- 24.
Risdianto,  H.  (2007):  Produksi  Lakase  dari Marasmius  sp. Menggunakan  Bioreaktor  Imersi  Berkala Termodifikasi untuk Pemutihan Pulp Kimia, Tesis, Teknik Kimia, Institut Teknologi Bandung, Indonesia. Rivera-Hoyos,  C.M.,  Morales-Alvarez,  E.D.,  Poutou-Pinales,  R.A.,  Pedroza-Rodriguez,  A.M.,  Rodriguez- Vazquez, R., dan Delgado-Boada, J.M. (2013): Fungal laccases, Fungal Biol. Rev. 27, 67-82
Senthilkumar  S.,  Perumalsamy  M.,  dan  Prabhu,  J.  (2014):  Decolourization  potential  of  white-rot  fungus Phanerochaete chrysosporium on synthetic dye bath effluent containing Amido black 10B, Journal of Saudi Chemical Society, 18, 845–853.
Senthivelan  T.,  Kanagaraj,  J.,  dan  Panda,  R.C.  (2016):  Recent  trends  in  fungal  Laccase  for  various  industrial applications: an eco-friendly approach - a review, Biotechnol. Bioproc. Eng. , 21, 19-38
Sharma, K.K., Shrivastava, B., Sastry, V.R., Sehgal, N., dan Kuhad, R.C. (2013): Middle-redox potential laccase from Ganoderma sp. : its application in improvement of feed for monogastric animals. Sci. Rep. 3, 1299
Sheth, N.T., dan Dave, S.R. (2009): Optimisation for enhanced decolourization and degradation of Reactive Red BS C.I. 111 by Pseudomonas aeruginosa NGKCTS, Biodegradation , 20 , 827–836.
Tiara, A. (2014). Uji Toksisitas Akut Pada Ipal Terpadu Kawasan Industri Tekstil Terhadap Daphnia magna DI DAYEUHKOLOT. Jurnal Teknik Lingkungan , 20 (2), 109-119.
Trejo, E.B., Benavides, L.M., dan Yanez, J.M.S. (2015): Inconsistencies and Ambiguities in Calculating Enzyme Activity: The Case of Laccase, Journal of Microbiological Methods , 119 , 126 - 131.
Wang,  S.N.,  Chen,  Q.J.,  Zhu,  M.J.,  Xue,  F.Y.,  Li,  W.C.,  Zhao,  T.J.,  Li,  G.D.,  dan  Zhang,  G.Q.  (2018):  An extracellular  yellow laccase from  white  rot  fungus Trametes  sp. F1635 and its mediator  systems  for  dye decolorization, Biochimie , 148, 46-54.
Watanapokasin, R.Y., Boonyakamol. A., Sukseree, S., Krajarng, A., Sophonnithiprasert, T., Kanso, S., dan Imai,
T. (2008): Hydrogen production and anaerobic decolorization of wastewater containing Reactive Blue 4 by a bacterial consortium of Salmonella subterranea and Paenibacillus polymyxa , Biodegradation , 20 , 411– 418.
Wong, Y., dan Yu, J. (1999): Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes, Water Res. , 33 : 3512–3520.
Zheng, F., Cui, B.K., Wu, X.J., Meng, G., Liu, H.X., dan Si, J. (2016): Immobilization of laccase onto chitosan beads to enhance its capacity to degrade synthetic dyes, Int. Biodeterior. Biodegradation , 110, 69-78.