Indonesian Journal of Chemical Science and Technology

## State University of Medan
e-ISSN : 2622-4968, p-ISSN : 2622-1349
IJCST-UNIMED, Vol. 05, No. 2, Page ; 80 – 87
Received : June 20 th , 2022 Accepted :  July 23 th , 2022             Web Publised ; July 30 th , 2022
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Cytotoxicity Test of Cocoa Leaf Ethanol Extract (Theobroma Cacao L.) With Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Method
Zulmai Rani a* , Ridwanto a , Dikki Miswanda a , Rafita Yuniarti a , Ani Sutiani b , Ricky Andi Syahputra b , Reza Irma a
a Department of Pharmacy, Universitas Muslim Nusantara Al Washliyah., Jalan Garu II Medan Amplas 20147,
North Sumatera, Indonesia
b Department of Chemistry, Universitas Negeri Medan, Jalan Willem Iskandar, Pasar V, Medan Estate, Medan 20221, North Sumatera, Indonesia
*Email : zulmairani@umnaw.ac.id

## ABSTRACT
Cancer  is  a  disease  characterized  by  uncontrolled  cell  division  and  the  ability  of  these  cells  to  invade  other biological  tissues,  either  by  direct  growth  in  adjacent  tissues  or  by  migration  of  cells  to  distant  sites.  The purpose  of  this  study  was  to  determine  the  class  of  secondary  metabolites  contained  in  the  ethanol  extract  of cocoa leaves and their cytotoxicity by looking at the LC 50 value using the Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method. This research includes phytochemical screening of ethanol extract and the BSLT method by looking at the number of deaths of Artemia salina leach larvae (LC 50 ). The results of phytochemical screening tests showed that  the  cocoa  leaves  contained  flavonoids,  alkaloids,  tannins,  saponins,  steroids,  and  glycosides.  The cytotoxicity  test  with  probit  analysis  showed  an  LC 50 value  of  269,15  µg/mL,  so  it  was  concluded  that  the ethanol extract of cocoa leaves was toxic and had potential as an anticancer.
Keywords : cocoa leaf, cytotoxicity, BSLT, LC50

## I. Pendahuluan
Kanker  adalah  segolongan  penyakit  yang ditandai  dengan  pembelahan  sel  yang  tidak terkendali  dan  kemampuan  sel-sel  tersebut  untuk menyerang  jaringan  biologis  lainnya,  baik  dengan pertumbuhan langsung di jaringan yang bersebelahan  atau  dengan  migrasi  sel  ke  tempat yang  jauh 1 .  Dalam  perkembangan  dibidang kesehatan  telah  ditemukan  obat-obat  antikanker dan  dilakukan  kemoterapi,  namun  obat  antikanker yang  telah  ada  umumnya  selain  memiliki  khasiat antikanker, obat tersebut juga bersifat merusak sel- sel yang normal serta faktor biaya yang mahal juga menjadi  kendala.  Hal  ini  mendorong  masyarakat
untuk  melakukan  pengobatan  menggunakan  bahan alam atau obat tradisional 2 .
Salah  satu  tanaman  yang  berpotensi  adalah tanaman  kakao 1 .  Tanaman  kakao  di  Indonesia (Theobroma  cacao L .) merupakan  tanaman perkebunan  yang  terus  dibudidayakan  hingga  saat ini,  karena  tanaman  kakao  mempunyai  nilai ekonomi  yang  tinggi  yang  dapat  dijadikan  sebagai sumber  pendapatan  perkebunan  ataupun  kelompok masyarakat 3 . Daun kakao berpotensi dikembangkan untuk  pengobatan  sebagai  anti  kanker  karena kandungan  senyawa  fitokimianya.  Ekstrak  daun kakao  mengandung  golongan  senyawa  kimia alkaloid,  flavonoid,  fenolik  dan  saponin.  ekstrak
daun  cokelat  juga  memiliki  potensi  sebagai antioksidan yang tinggi, dengan intensitas potensinya sebagai antioksidan (IC 50 ) sebesar 42,11 μg/ml 4 .  Peranan  antioksidan  sangat  penting  dalam meredam  efek  radikal  bebas  yang  berkaitan  erat dengan  terjadinya  penyakit  degeneratif  yang didasari  oleh  proses  biokimia  dalam  tubuh. Flavonoid  berperan  sebagai  antioksidan  dengan cara mendonasikan atom  hidrogennya atau melalui kemampuannya  mengikat  logam,  berada  dalam bentuk  glukosida  (mengandung  rantai  samping glukosa)  atau  dalam  bentuk  bebas  yang  disebut aglikon 5 .
Penelitian  ini  dilakukan  sebagai  indikator awal dalam pengujian sitotoksik. Mayer mengemukakan juga bahwa salah satu metode awal untuk  uji  sitotoksik  adalah Brine  Lethality  Test (BSLT). BSLT merupakan salah satu metode yang banyak  digunakan  untuk  uji  sitotoksisitas/skrining senyawa antikanker baru yang berasal dari tanaman menggunakan  larva Artemia  salina  leach sebagai hewan  uji.  Metode  BSLT  telah  terbukti  memiliki korelasi  dengan  aktivitas  antikanker.  Metode  ini mudah  dikerjakan,  murah,  cepat,  dan  cukup akurat 6 .  Larva Artemia  salina dianggap  mewakili organisme  zoologis  untuk  uji  kematian  secara  in vivo.  Uji  BSLT  dilakukan  dengan  mengamati tingkat  kematian  yang  ditimbulkan  setelah  diberi ekstrak  terhadap  larva  udang  jenis Artemia  salina setelah  diinkubasi  selama  1x24  jam.  Hasil  yang diperoleh  kemudian  dihitung  sebagai  nilai  LC 50
( lethal  concentration )  ekstrak,  dimana  konsentrasi ekstrak yang dapat menyebabkan kematian Artemia salina sebanyak  50% 7 .  Berdasarkan  uraian  diatas dan  berbagai  aktivitas  biologis  senyawa  yang dikandung  oleh  daun  kakao  mendorong  penulis untuk  melakukan  penelitian  lebih  lanjut  terhadap daun  kakao  sebagai  bahan  alam  potensial  untuk dikembangkan  sebagai  agen  antikanker  dengan menguji  sitotoksisitas  dari  ekstrak  daun  kakao menggunakan  metode  BSLT  terhadap  larva  udang Artemia salina leach .

## II. Metodologi Penelitian
2.1. Bahan kimia, peralatan dan instrumentasi Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi  timbangan  analitik,  lemari  pengering, alumunium  foil,  mikroskop,  blender,  rotary evavorator,  tanur,  hot  plate,  cawang  penguap, desikator,  wadah  maserasi,  vial,  bejana  penetasan
telur Artemia  salina  leach ,  alat-alat  gelas laboratorium.
Bahan-bahan yang digunakan produksi Merck  meliputi:  asam  asetat  anhidrat,bismut nitrat,  asam  sulfat  pekat,  kloroform,  toluen,  raksa (II)  klorida,  timbal  (II)  asetat,  besi  (III)  klorida, serbuk magnesium, kloral hidrat, natrium hidroksida, asam klorida pekat, iodium, alfa naftol, kalium iodida, asam nitrat dan tanaman daun kakao ( Theobroma cacao L.), telur Artemia salina leach , garam laut, aquadest serta etanol 96%.
2.2. Prosedur penelitian Pembuatan Ekstrak
Prosedur  ekstraksi  dilakukan  menggunakan metode  maserasi  dengan  cara  menimbang  500 gram  serbuk  simplisia  daun  kakao  ( Theobroma cacao L.)  dimasukkan  ke  dalam  bejana,  kemudian dituangkan  dengan  75  bagian  (3750  ml)  cairan penyari  etanol  96%  lalu  dia  diaduk-aduk  sesekali. Setelah  5  hari  campuran  di  serkai  dan  ampasnya diperas.  Dicuci  ampasnya  dengan  cairan  penyari etanol  96%  secukupnya  hingga  diperoleh  100 bagian  (5000  ml)  maserat.  Lalu  dipindahkan  ke dalam  bejana  tertutup,  dibiarkan  di  tempat  sejuk terlindung  dari  cahaya  selama  2  hari  dan  disaring. Maserat  dipekatkan  dengan  alat rotary  evavorator pada temperatur tidak lebih dari 40 o C dan diperoleh ekstrak kental 8 . Karakterisasi Simplisia Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi : pemeriksaan  makroskopik  simplisia,  pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia, penetapan kadar air, penetapan  kadar  sari  larut  dalam  air,  penetapan kadar  sari  larut  dalam  etanol,  penetapan  kadar  abu total, penetapan kadar abu tidak larut asam 9 . Skrining Fitokimia
Skrining  fitokimia  meliputi  pemeriksaan golongan  senyawa  alkaloid,  flavonoid,  saponin, tanin, triterpenoid/steroid dan glikosida.
Pengujian  Sitotoksisitas  dengan  Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Pembuatan Larutan Ekstrak Larutan ekstrak etanol daun kakao ( Theobroma  cacao L.)  dibuat  menjadi  10 konsetrasi untuk terlebih dahulu digunakan sebagai orientasi, yaitu konsentrasi 100, 200, 300, 400, 500, 600,  700,  800,  900  ,  1000  µg/ml,  dan  1  tabung digunakan  untuk  kontrol  negatif,  masing-masing dengan tiga kali pengulangan.
Pembuatan Air Laut Buatan
Air laut buatan dibuat dengan cara melarutkan  38  gram  garam  tanpa  iodium  dalam  1 liter  air,  lalu  diaduk  sampai  homogen.  Kemudian disaring dengan kertas Whatman 10 .
Penetasan Telur Artemia Salina Leach
Penetasan  telur  dilakukan  dalam  wadah bening  dengan  menggunakan  media  air  laut. Wadah yang  digunakan dibagi menjadi dua bagian oleh sekat berlubang, yaitu bagian gelap dan bagian terang.  Sekat  berlubang  menjadi  jalan  untuk  larva yang  telah  menetas  untuk  bergerak  secara  alamiah ke  arah  terang.  Wadah  diisi  dengan  satu  liter  air laut  buatan.  Kemudian  pada  bagian  gelap dimasukkan  satu  sendok  telur.  Pada  wadah  bagian gelap  ditutup  dengan  alumunium  foil  atau  lakban hitam. Pada wadah bagian terang diberi penerangan dengan cahaya lampu agar suhu penetasan 25-30 o C tetap  terjaga.  Telur  udang  dibiarkan  terendam selama  48  jam  sampai  telur  menetas.  Telur  akan menetas dalam waktu 24-36 jam dan akan bergerak secara  alamiah  menuju  daerah  terang  sehingga larva udang terpisahkan dari bagian telur atau kulit telur.  Larva  yang  telah  aktif  bergerak  siap digunakan sebagai hewan uji dalam penelitian 11 .
Uji Sitotoksisitas Ekstrak Daun Kakao
Disiapkan  vial  untuk  tiap  kelompok  sesuai tingkat  konsentrasi,  masing-masing  disediakan  5 vial    dan  replikasi  sebanyak  3  kali.  Vial  diisi dengan  sampel  yang  telah  dilarutkan  dengan  air laut  buatan  sebanyak  10  ml.  Sebanyak  10  ekor larva Artemia dimasukkan  ke  dalam  masing- masing  vial  yang  telah  berisi senyawa  uji.  Kontrol negatif (blanko) diberi perlakuan yang sama seperti larutan uji tetapi tidak ditambahkan dengan ekstrak. Jumlah  larva  udang  yang  mati  dalam  tiap  vial dihitung  selama  24  jam.  Tingkat  toksisitas ditentukan  dengan  menghitung  jumlah  larva  yang mati. Kriteria standar untuk menilai kematian larva udang  adalah  bila  larva  udang  tidak  menunjukkan pergerakan selama beberapa detik observasi 12 .
2.3 Analisis Data Data  hasil  penelitian  dihitung  dengan menggunakan  analisis  probit  menggunakan  SPSS 20 for windows untuk mengetahui harga LC 50 , yaitu dengan menghitung tingkat kematian atau mortalitas    secara  regresi  linier,  yaitu  dengan membandingkan antara jumlah larva yang mati dan jumlah total larva. Nilai LC 50 diperoleh dengan cara menarik garis pada nilai 50% dari sumbu mortalitas sampai memotong sumbu grafik. Perpotongan garis
ditarik  ke  garis  konsentrasi dimana  konsentrasi  zat yang  menyebabkan  kematian  50%  larva  yang disebut  LC 50. Untuk  menghitung  LC 50 digunakan kurva  yang  menyatakan  log  konsetrasi  sebagai sumbu X dan % mortalitas sebagai sumbu Y. Hasil LC 50 diperoleh  dari  perpotongan  garis  terhadap kedua sumbu tersebut 13 .

## III. Hasil dan Diskusi
3.1. Analisis hasil karakterisasi
Penetapan  karakterisasi  suatu  simplisia  perlu dilakukan dengan tujuan untuk menjamin mutu dari suatu simplisia tersebut. Penetapan karakterisasi ini dilakukan  sesuai  dengan  prosedur  yang  telah ditetapkan  dalam  Materia  Medika  Indonesia. Hasil karakterisasi  simplisia  daun  kakao  dapat  dilihat pada tabel 1.
Tabel  1. Hasil  karakterisasi  simplisia  daun  kakao ( Theobroma cacao L.) No Parameter Rata-rata Persyaratan MMI (%) 1 Kadar air 7,33  % < 10 2 Kadar  sari  larut air 7,86 % ≥ 7 3 Kadar  sari  larut etanol 4,97 % ≥ 3,5 4 Kadar abu total 3,92 % ≤ 8 5 Kadar  abu  tidak larut asam 0,49 % ≤ 1 Penetapan kadar air dilakukan untuk memberikan  batasan  maksimal  atau  rentang besarnya  kandungan  air.  Pengaturan  kadar  air sesuai dengan standar bertujuan untuk menghindari pertumbuhan jamur yang cepat pada ekstrak. Hasil dari  penetapan  kadar  air  simplisia  daun  kakao  ini diperoleh    7,33%,  sehingga  hal  ini  sesuai  dengan yang  di  persyaratkan  pada  MMI  yaitu  <10%  yang merupakan  nilai  maksimal  yang  diperbolehkan terkait  dengan  kemurnian  dan  kontaminasi  yang mungkin  terjadi.  Pada  pengujian  kadar  sari  larut dalam  air  serbuk  simplisia  daun  kakao  didapatkan persentase  kadar  sebesar  7,86  %,  sedangkan  untuk pengujian  kadar  sari  larut  dalam  etanol  serbuk simplisia  daun  kakao  di  peroleh  persentase kadarnya sebesar 4,97 %. Kadar sari larut dalam air dan  etanol  merupakan  pengujian  untuk  penetapan jumlah  kandungan  senyawa  yang  dapat  terlarut dalam  air  dan  kandungan  senyawa  yang  dapat terlarut  dalam  etanol.  Prinsip  dari  ekstraksi didasarkan  pada  distribusi  zat  terlarut  dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling bercampur 14 .
Pada  pengujian  kadar  abu  total  serbuk simplisia  daun  kakao  didapatkan  persentase  kadar sebesar  3,92  %  dan  untuk  pengujian  kadar  abu tidak  larut  asam  didapatkan  persentase  kadarnya sebesar  0,49  %.  Penetapan  kadar  abu  total bertujuan untuk  memberikan  gambaran  kandungan mineral  internal  dan  eksternal  dari  proses  awal hingga  terbentuknya  ekstrak,  sedangkan  penetapan kadar  abu  tidak  larut  asam  bertujuan  untuk mengetahui  besarnya  tingkat  pengotor  yang tercampur  pada  serbuk  saat  preparasi  simplisia. Prinsip  kerjanya  yaitu  bahan  di  panaskan  pada temperatur hingga senyawa organik dan turunannya terdekstruksi  dan  menguap  hingga  tersisa  unsur mineral dan anorganik saja 14 .
Skrining  fitokimia  dilakukan  untuk  menguji ada tidaknya senyawa metabolit sekunder diantaranya  seperti  alkaloid,  flavonoid,  saponin, steroid/triterpenoid,tannin  dan  glikosida.  Hasil skirining fitokimia ekstrak etanol daun kakao dapat dilihat pada tabel 2.
Hasil  skrining  menunjukkan  bahwa  serbuk simplisia dan ekstrak etanol daun kakao mengandung  senyawa  metabolit  sekunder  yang sama  yaitu  golongan  alkaloid  positif  ditandai  pada pereaksi  mayer  menunjukkan  hasil  positif  karena terbentuk  endapan  menggumpal  berwarna  putih kemudian  pada  pereaksi  dragendorf  menunjukkan hasil  yang  positif  karena  terbentuk  warna  jingga dan  pada  pereaksi  bouchardat  juga  menunjukkan hasil  yang  positif  karena  membentuk  endapan cokelat,  flavonoid  ditandai  terjadi  warna  jingga pada lapisan amil alkohol, saponin ditandai dengan terbentuk busa, tanin ditandai dengan terjadi warna biru  kehitaman,  steroid  ditandai  dengan    terjadi warna  biru  hijau  dan  glikosida  ditandai  dengan terbentuknya cincin berwarna ungu.
Tabel  2 Hasil  Skrining  Fitokimia  Simplisia  Dan

## Ekstrak Etanol Daun Kakao
No Parameter Hasil Simplisia Ekstrak 1 Alkaloid + + 2 Falvonoid + + 3 Tanin + + 4 Saponin + + 5 Steroid + + 6 Glikosida + + Keterangan : (+) memberikan reaksi (-) tidak memberikan reaksi
Aktivitas  senyawa  antikanker  pada  ekstrak daun kakao, salah satunya dipengaruhi oleh adanya
senyawa flavonoid. Senyawa flavonoid, merupakan golongan  polifenol  yang  diketahui  bersifat  sebagai antioksidan  dikarenakan  gugus  hidroksil  yang terikat  pada  struktur 4 .  Pengujian  pada  daun  kakao menunjukkan positif mengandung senyawa golongan  alkaloid,  flavonoid,  saponin,  tannin, steroid dan glikosida. Dari hasil skrining fitokimia, mengandung  senyawa  flavonoid  yang  dapat menangkap  radikal  bebas  untuk  menghambat kerusakan  sel.  Kandungan  flavonoid  yang  tinggi berkontribusi  pada  efek  antioksidan,  peningkatan imun, dan sifat antikanker 7 .
3.2 Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanol Daun Kakao ( Theobroma cacao L.) Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Uji  sitotoksisitas  ini  dilakukan  dengan metode  BSLT  menggunakan Artemia  salina  leach sebagai  hewan  uji  karena  lebih  mudah  dalam pengerjaannya, harganya murah, cepat mendapatkan  hasilnya  . Artemia  salina yang digunakan  pada  pengujian  sitotoksisitas  adalah Artemia salina yang berada pada tahap naupli atau tahap  larva.  Larva  yang  digunakan  adalah  larva yang  berumur  48  jam    karena  larva  berada  dalam keadaan  paling  peka  pada  umur  48  jam.  Hal  ini disebabkan  karena pada umur 48 jam organ-organ pada Artemia  salina sudah    terbentuk  lengkap. Dengan  terbentuknya mulut, Artemia salina dapat meminum ALB (air laut buatan) yang sudah diberi ekstrak  daun  kakao  dengan  berbagai  konsentrasi, sehingga  kematian Artemia  salina benar-benar disebabkan  karena  ekstrak  daun  kakao  dalam berbagai konsentrasi tersebut 15 .
Larutan  ekstrak  etanol  daun  kakao  dibuat menjadi  10  konsentrasi  untuk  terlebih  dahulu digunakan sebagai orientasi, yaitu konsentrasi 100, 200,  300,  400,  500,  600,  700,  800,  900  dan  1000 µg/mL  dengan  ditambah  kontrol  negatif  yang hanya  berisi  air  garam  dan  larva  udang. Penambahan  kontol  negatif  dilakukan  untuk mengetahui pengaruh air garam maupun faktor lain terhadap  kematian  larva,  sehingga  kematian  larva dapat  dipastikan  karena  efek  dari  ekstrak  yang ditambahkan.  Uji  BSLT  ini  dilakukan  masing- masing sebanyak 3 kali pengulangan (triplo) untuk memperoleh keakuratan data dan mengurangi kesalahan  dalam  proses  penelitian.  Pengamatan dilakukan  24  jam  setelah  perlakuan    konsentrasi ekstrak.  Perhitungan  kematian  larva  dilakukan dengan  cara  mengamati  pergerakan  larva  selama
beberapa  detik.  Kematian  larva  dihitung  jika  tidak ada pergerakan larva selama beberapa detik 12 . Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh  kematian  larva  berbeda-beda  pada
masing-masing  konsentrasi.  Untuk  hasil  uji pendahuluan  pada  uji  sitotoksisitas  daun  kakao dapat dilihat pada tabel 3.

## Tabel 3 Uji Sitotoksisitas Ekstrak Daun Kakao
No Konsentrasi (µg/mL) Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3 Rata-rata % Mortalitas Larva mati % Mortalitas Larva mati % Mortalitas Larva mati % Mortalitas 1 Blanko 0 0 0 0 0 0 0 2 100 3 30 2 20 2 20 23,33 % 3 200 3 30 4 40 4 40 36,66 % 4 300 4 40 4 40 5 50 43,33 % 5 400 6 60 5 50 6 60 56,66 % 6 500 8 80 8 80 5 50 70 % 7 600 8 80 7 70 7 70 73,33 % 8 700 9 90 8 80 8 80 83,33 % 9 800 9 90 9 90 9 90 90 % 10 900 10 10 10 10 9 90 96,66 % 11 1000 10 100 10 100 10 100 100,00%
Tabel 4. Hasil Pengujian Sitotoksisitas Ekstrak Daun Kakao ( Theobroma cacao L.)
No Konsentrasi (µg/mL) Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3 Rata-rata % Mortalitas Larva mati % Mortalitas Larva mati % Mortalitas Larva mati % Mortalitas 1 Blanko 0 0 0 0 0 0 0 2 100 3 30 2 20 2 20 23,33 % 3 200 3 30 5 50 4 40 40 % 4 300 4 40 4 40 6 60 46,66 % 5 400 6 60 5 50 7 70 60 % 6 500 8 80 8 80 5 50 70 % 7 600 8 80 6 60 9 90 76,66 % 8 700 9 90 8 80 8 80 83,33 % Konsentrasi yang digunakan untuk
sitotoksisitas yaitu persentase kematian larva antara 20-80%  karena  dengan  persentase  kematian tersebut sudah dapat memberikan kurva yang lebih linier,  sehingga  LC 50 yang  didapatkan  pada  uji BSLT  ini  dapat  menggambarkan  hasil  yang sebenarnya.
Berdasarkan  tabel  4  didapatkan  persentase kematian  larva  pada  rentang  20-80%  yaitu  pada konsentrasi 100-700 µg/mL. Untuk hasil pengujian sitotoksisitas daun kakao dapat dilihat pada tabel 4.
Berdasarkan  data  tersebut  jumlah  larva  tiap perlakuan  adalah 10 ekor dengan 3 kali perlakuan, sehingga  totalnya  30  ekor.  Tabel  4.4  dapat diketahui  persentase  mortalitas  dari  konsentrasi
yang rendah 100 µg/mL ke konsentrasi yang paling tinggi  terdapat  pada  konsentrasi  700  µg/mL mempunyai  persentase  yaitu  sebesar  20-80%. Sedangkan pada blanko tidak memberikan mortalitas  terhadap  larva.  Hal  ini  sesuai  dengan teori,  bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  ekstrak semakin banyak jumlah larva yang mati. Selain itu dari  persentase  kematian  larva  tersebut  dapat disimpulkan  bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi ekstrak  akan  menghasilkan  jumlah  kematian  larva yang semakin tinggi pula 12 . Cara kerja senyawa toksik yang menyebabkan  kematian  larva artemia adalah dengan  bertindak  sebagai  stomach  poisoning  atau racun perut. Senyawa toksik ini dapat mengganggu
alat  pencernaan  dan  menghambat  reseptor  perasa pada  daerah  mulut  larva.  Hal  inilah  yang menyebabkan kegagalan larva mendapatkan stimulus  rasa  sehingga  tidak  mampu  mengenali makanannya dan menyebabkan kematian larva 16 .
Mekanisme  kematian  larva  diperkirakan berhubungan dengan fungsi senyawa flavonoid dan alkaloid. Flavonoid dan alkaloid memiliki mekanisme  sebagai  antikanker  karena  flavonoid yang  menghambat  daya  makan  larva.Selain  dari itu,  mekanisme  flavonoid  sebagai  anti  kanker  ada beberapa teori. Flavonoid sebagai antioksidan yaitu melalui  mekanisme  pengaktifan  jalur  apoptosis  sel kanker.  Mekanisme  apoptosis  sel  pada  teori  ini akibat  fragmentasi  DNA.  Fragmentasi  ini  diawali dengan  dilepasnya  rantai  proksimal  DNA  oleh senyawa  oksigen  reaktif  seperti  radikal  hidroksil. Efek lainnya adalah flavonoid sebagai penghambat proliferasi tumor/kanker yang salah satunya dengan menginhibisi  aktivitas  protein  kinase  sehingga menghambat  jalur  transduksi  sinyal  dari  membran ke  sel  inti.  Flavonoid  menghambat  aktivitas reseptor  tirosin  kinase,  karena  aktivitas  reseptor tirosin  kinase  yang  meningkat  berperan  dalam pertumbuhan keganasan sel kanker. Flavonoid juga berfungsi  untuk  mengurangi  resistensi  tumor terhadap agen kemoterapi 5 .
Alkaloid yang berasal dari tumbuhan memiliki  mekanisme  sitotoksik  yaitu  berperan sebagai  tubulin  inhibitor.  Pada  proses  siklus  sel alkaloid  berikatan  dengan  tubulin  yaitu  suatu protein  yang  menyusun  mikrotubulus.  Terikatnya tubulin  pada  alkaloid  mengakibatkan  polimerisasi protein  menjadi  mikrotubulus  akan  terhambat sehingga  pembentukan  spindle  mitotik  akan terhambat  pula  dan  siklus  sel  akan  terhenti  pada metafase. Karena tidak dapat melakukan pembelahan  sel,  sel  tersebut  kemudian  akan mengalami apoptosis 17 . Data  yang  diperoleh  pada  tabel  4.4 tersebut, kemudian dianalisis dengan menggunakan tabel  analisis  probit  untuk  mendapat  nilai  LC 50 . Lethal  concentration 50  (LC 50 )  adalah  besarnya konsentrasi yang dapat membunuh hewan
percobaan  sebanyak  50%  dari  keseluruhannya. Nilai LC 50 dapat dihitung dengan persamaan regresi garis  lurus  tersebut  dengan  memasukkan  nilai (probit  50%  kematian  hewan  uji)  sebagai  y sehingga dihasilkan x sebagai nilai log konsentrasi. Antilog  nilai  x  tersebut  merupakan  nilai  LC 50. Parameter  yang  ditunjukkan  untuk  mengetahui adanya  aktivitas  biologis  pada  suatu  senyawa terhadap  hewan  uji  ialah  dengan  menghitung jumlah larva yang mati karena pengaruh pemberian senyawa  dengan  konsentrasi  yang  telah  ditentukan (Agustini,  2013).  Setelah  dilakukan  analisis  probit dapat  diketahui  grafik  persamaan  garis  lurus  Y  = 1,9629  X  +  0,2363.  Sedangkan  koefesien  korelasi yang  didapatkan  yakni  R 2 =  0,964  yang  berarti sebesar  96,4%  perubahan  nilai  probit  dipengaruhi oleh konsentrasi ekstrak.
Hal ini menunjukkan meningkatnya konsentrasi  ekstrak  diikuti  meningkatnya  nilai probit  (respon  kematian  larva)  (Dahlan,  2018). Berdasarkan  nilai  R 2 yang  didapatkan  tersebut dapat  dikatakan  bahwa  tingkat  hubungan  yang dihasilkan tergolong sangat kuat.
Grafik  menunjukkan  log  konsentrasi terhadap  nilai  probit  yang  didapat  dari  persentase kematian  larva.  Kemudian  dimasukkan  nilai    Y yaitu  nilai  probit  50%  hewan  ujidan  didapatkan nilai  X  =  2,43  maka  nilai  LC 50 antilog    2,43  yaitu 269,15 µg/mL.
Suatu  senyawa  bersifat  toksik  dan berpotensi  sebagai  antikanker  pada  uji  BSLT  jika memiliki nilai LC 50 <1000 µg/mL. Hasil LC 50 yang didapat  lebih  kecil  dari  1000  µg/mL  yaitu  269,15 µg/mL. Sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol  daun  kakao  bersifat  toksik  dan  berpotensi sebagai antikanker 6 .
86
© 2022 State University of Medan
Gambar 4.1 Grafik Regresi Linier Konsentrasi Ekstrak Daun Kakao ( Theobroma cacao L.) Terhadap Nilai Probit

## IV. Kesimpulan
Golongan  senyawa  yang  terkandung  didalam daun  kakao ( Theobroma  cacao L.)  dengan  metode skrining  fitokimia  yaitu  alkaloid,  flavonoid,  tanin, saponin,  steroid  dan  glikosida.  Berdasarkan  hasil uji  sitotoksisitas  menggunakan  metode Brine Shrimp  Lethality  Test menunjukkan  bahwa  ekstrak etanol daun kakao ( Theobroma cacao L.) memiliki daya  sitotoksisitas  dengan  nilai  LC5 50 269,15 µg/mL.

## Referensi
1. Nurani,  L,  H.  (2012,  May).  Uji  Sitotoksitas dan Anti Proliferatif Sel Kanker Payudara t47d dan Sel  Vero  Biji  Nigella  Sativa . Yogyakarta . Jurnal Ilmiah Kefarmasian , 2 (1). Hal.17-29.
2. Muaja, A.D., Koleangan, H.S.J., dan Runtuwene, M.R.J. (2013, Juli). Uji Toksisitas Dengan Metode BSLT dan Analisis Kandungan  Fitokimia  Ekstrak  Daun  Seyogik (Saurauia  Bracteosa  DC )  Dengan  Metode Soxhletasi.  Manado. Jurnal  Mipa  Unsrat Online, 2(2). Hal.115-118.
3. Masro’atun.,  Sari,  D,  N,  R.,  dan  Hasanah,  A, U.  (2017).  Efektivitas  Ekstrak  Daun  Kakao
Terhadap Phytopthora palmivora effectiveness  of  Kakao  Leaf  Extracts  to Phytopthora palmivora . Jember. Jurnal Biologi  dan  Pembelajaran  Biologi, 2(1).  Hal. 50-60
4. Hasanah,  M.  (2016,  Feb).Analisis  Golongan Senyawa  Kimia  dan  Uji  Potensi  Antioksidan dari Ekstrak Daun Cokelat (Theobroma cacao
L.) Hasil  Ekstraksi  Maserasi . Palembang.
Jurnal Ilmiah Bakti Farmasi , 1 (2).Hal.43-48.
5. Rahimah, S., Maryam, F,.dan Limbong, A, B. (2019,  May).  The  Toxicity  Test  of  Ethanol Extract  of  Leaves Averrhoa  bilimbi L . Using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) . Makassar. Journal  of  Pharmaceutical  and Medicinal Sciences. 4 (1). Hal.10-14.
6. Meyer,  B.N.,  Ferrigni,  N.R.,  Putnam,  J.E., Jacobsen, L.B., Nichols, D.E., dan
McLaughlin , J.L. (1982, May). Brine Shrimp : A  Convenient  General  Bioassay  for  Active Plant  Constituents .  Journal  of  medicinal Planta Medica, 45(5). Hal.31-34.
7. Chusniasih,  B,  dan  Tutik.  (2020,  Oct).  Uji Toksisitas  dengan  Metode  Brine  Shrimp Lethality Test (bslt) dan Identifikasi Komponen  Fitokimia  Ekstrak  Aseton  Kulit Buah Kakao (Theobroma cacao L .) . Lampung. Jurnal Analytical and Environmental Chemistry, 2 (2). Hal. 192-201
8. Departemen  Kesehatan  RI.  (1979,  Juli  1). Materia  Medika  Indonesia ,  jilid  III.  Jakarta: Depkes RI. Hal. 155-159.
9. Departemen Kesehatan RI. (2000). Parameter Standar  Umum  Ekstrak  Tumbuhan  Obat . Jakarta: Depkes RI. Hal. 3-12.
10. Djamil,  R.,  dan  Anelia,  T.  (2009,  Sep). Penapisan  Fitokimia,  Uji  BSLT  Dan  Uji Antioksidan Ekstrak Metanol Beberapa Spesies Papilionaceae . Jakarta Selatan. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 7(2).Hal.13-15.
11. Fadli.,  Suhaimi.,  dan  Muhammad,  I.  (2019, Apr).  Uji  Toksisitas  Akut  Ekstrak  Etanol Daun  Salam  ( Syzygium  Polyanthum)(Wight) Walp.) Dengan  Metode  BSLT  ( Brine  Shrimp Lethality  Test). Pontianak. Open  Jornal
87
Systems  STF  Muhammadiyah ,  4(1).  Hal.17- 21.
12. Supriningrum,  R.,  Sapri.,  Pranamala,  V.  A. (2016,  Nov).  Uji  Toksisitas  Akut  Ekstrak
Etanol  Akar  KB (Coptosapelta  tomentosa Valeton  ex  K.Heyne) dengan Metode  Brine Shrimp  Lethality  Test (BSLT).  Samarinda. Jurnal Ilmiah Manuntung , 2(2). Hal.161-165. 13. Agustini, N.W.S. (2013).
Aktivitas Antioksidan  Dan  Uji  Toksisitas  Hayati
Pigmen Fikobili Protein dari Ekstrak Spirulina
Platensis. Bogor. Journal Bioteknologi, 9(1).Hal. 107-110.
14. Handayani, S., Komar, R. W., dan Insanu, M. (2018,  Feb) . Penapisan  Fitokimia  Dan Karakterisasi  Simplisia  Daun  Jambu  Mawar ( Syzygium  jambos  Alston ). Journal  Farmasi , 5(3). Hal.174-180. 15. Panjaitan,  B.R.  (2011,  Juli).  Uji  Toksisitas Akut  Ekstrak  Kulit  Batang  Pulasari (Alyxiae Cortex)  Dengan  Metode  Brine  Shirmp Lethality  (BSLT). Yogyakarta. Skripsi. Hal.
42.
16. Sondakh,  M.R.  (2017).  Uji  Toksisitas  Akut Ekstrak  Spons  Laut  ( Callyspongia  aerizusa ) terhadap Larva  Artemia  salina  Leach  dengan
Metode Brine
Shrimp Lethality Test. Manado. Jurnal  e-Biomedik  (eBm), 6  (2). Hal.1-4.
17. Nuraini.,  Asriani,  I.,  dan  Iin,  N.  (2015,  Jul). Identifikasi dan Karakterisasi Senyawa
Bioaktif Antikanker Dari Ekstrak Etanol Kulit Batang Kayu Bitti ( Vitex cofassus ). Al Kimia. Makassar: UIN Alauddin. 3(2): 15-27.