Pengaruh Ekstrak Etanol Daun Murbei  ( Morus Alba L.)  dengan Glibenklamid Terhadap Ekspresi Gen CYP3A4 pada Kultur Sel Hepg2
Effect of Ethanol Extract Of Murbei Leaves ( Morus Alba L.) with Glibenclamide on CYP3A4 Gene Expression in Hepg2 Cell Culture
Nuralih 1,2 , Churiyah 2 , Sabar Pambudi 2 , Swasono R. Tamat 1 , Okpri Meila 3
1 Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila, Jl. Raya Lenteng Agung No.56-80, RT.1/RW.3, Srengseng Sawah, Kec. Jagakarsa, Jakarta
2 Teknologi Farmasi dan Medika, BPPT Puspiptek Serpong
3 Fakultas Farmasi Institut Sains dan Teknologi Nasional Jl.Moh Kahfi II Srengseng Sawah Jagakarsa Jakarta Selatan
Email: nuralih79@gmail.com ; okprimeila@gmail.com

## Abstrak
Daun murbei merupakan ramuan tradisional dan diprediksi memiliki ecdysteronecompound yang berperan sebagai  antihyperglicemid.  Glybenclamide  adalah  obat  sintetis  yang  digunakan  untuk  menyembuhkan penyakit  diabetes  mellitus  2.  Daun  dilaporkan  sebagai  penghambat  kompetitif  enzim  CYP3A4,  yang metabolizingglibenclamide.  Namun,  dalam  banyak  kasus,  kombinasi  ramuan  dengan  obat  sintesis menyebabkan  interaksi  jika  digunakan  pada  saat  bersamaan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui interaksi ekstrak daun  murbei etanol dengan glibenclamide  melalui ekspresi  gen  CYP3A4 pada kultur sel HepG2.  Sampel  ekstrak  murbei,  glibenklamid,  dan  kombinasi  kedua  sampel  diuji  ke  dalam  kultur  sel HepG2. Kemudian RNA diisolasi dan dimurnikan menggunakan PCR real time untuk melihat gen ekspresi CYP3A4.  Akibatnya,  ekstrak  murbei  bertindak  sebagai  enzim  penghambat  CYP3A4,  sedangkan glibenklamid  adalah  enzim  substrat.  Kombinasi  murbei  dan  glibenklamida  menunjukkan  peningkatan ekspresi gen CYP3A4, berarti enzim yang lebih besar diproduksi, dan obat yang lebih rendah pada plasma darah.
Kata kunci: Diabetes mellitus, ekspresi gen CYP3A4, HepG2, murbei.

## Abstract
Mulberry  leaf  is  a  traditional  herb  and  predicted  has  ecdysteronecompound  which  act  as antihyperglicemid.  Glybenclamide  is  a  synthetic  medicine  used  to  cure  diabetes  mellitus  type  2.  The  leaf reported as competitive inhibitor of CYP3A4 enzyme, which metabolizingglibenclamide. However, in many cases, combination of herbs with synthesis drugs causes interaction if used at the same time. This research aimed  to  see  interaction  of  ethanol  mulberry  leaf  extract  with  glibenclamide  through  CYP3A4  gene expression in HepG2 cell culture.Sample of mulberry extract, glibenclamide, and combination both sample were tested into cell HepG2 culture. Then RNA were isolated and purification using real time PCR to see the  gene  CYP3A4  expression.  As  a  result,  mulberry  extract  acts  as  inhibitor  enzyme  CYP3A4,  while glibenclamide  is  enzyme  substrate.The  combination  of  mulberry  and  glibenclamide  showed  increased  of expression of CYP3A4 gene, means greater enzyme produced, and lower medicine on blood plasma. Keywords: Diabetes mellitus, gene expression CYP3A4, glibenclamide, HepG2, mulberry.

## PENDAHULUAN
Interaksi obat terjadi jika efek suatu obat berubah  akibat  adanya  obat  lain,  makanan, atau minuman. Interaksi obat dapat menghasilkan efek yang memang dikehendaki, atau efek yang tidak dikehendaki  seperti  menyebabkan  efek samping obat atau toksisitas karena meningkatnya  kadar  obat  di  dalam  plasma, atau  sebaliknya  menurunnya  kadar  obat
dalam plasma yang menyebabkan hasil terapi menjadi tidak optimal (Ament et. al , 2000).
Mekanisme  interaksi  obat  dapat  melalui beberapa  cara,  yakni  interaksi  secara farmasetik (inkompatibilitas), farmakokinetik, dan farmakodinamik. Interaksi  farmakokinetik  meliputi  absorpsi, distribusi,  metabolisme  dan  ekskresi  dapat meningkatkan  ataupun  menurunkan  kadar obat  di  dalam  plasma  obat.  Mekanisme interaksi yang terjadi pada proses metabolisme obat dapat berupa penghambatan metabolisme, induksi metabolisme,  dan  perubahan  aliran  darah hepatik.  Hambatan  ataupun  induksi  enzim pada  proses  metabolisme  obat  terutama berlaku terhadap obat-obat  atau zat-zat  yang merupakan  substrat  enzim  mikrosom  hati sitokrom  P450  (CYP),  diantaranya  CYP3A yang  memetabolisme  lebih  dari  50%  obat- obatan (Gitawati, 2008).
Dalam  skala in  vitro ,  enzim  CYP3A4 dapat  diproduksi  melalui  Sel  HepG2.  Sel HepG2  merupakan  sel  line  hepatokarsinom yang  telah  sukses  dikultivasi.  Sel  ini memiliki  tingkat  diferensiasi  morfologi  dan fungsional  yang tinggi, serta lebih stabil dan seragam  dibandingkan  sel  hati  primer, sehingga  cocok  sebagai  model  untuk mempelajari  dinamika  protein  pada  manusia secara in vitro (Adam, et al ., 2012).
Daun  Murbei  ( Morus  alba L.)  telah digunakan sebagai obat tradisional antidiabetes  karena  berkhasiat  menekan hiperglikemia.  Penggunaan  daun  murbei sebagai obat tradisional dimanfaatkan dengan cara meminum air hasil seduhan atau rebusan  dari  daun  tersebut.  Daun  murbei mengandung 1-deoxynorijimycin (DNJ), flavonol  glikosida,  tanin,  steroid,  saponin, dan  senyawa  kimia  lainnya.  DNJ  pada murbei  akan menghambat  aktivitas  enzim a- glucosidase usus  halus  (Amma,  2009, Wang et al ., 2013).
Glibenklamid  merupakan  obat  diabetes melitus  tipe  2,  yang  termasuk  dalam golongan  sulfonilurea  yang  merupakan
sekretagok  insulin,  dan  telah  secara  luas digunakan baik sebagai mono terapi ataupun kombinasi  karena  kemampuannya  dalam mengontrol  glukosa  darah  secara  efisien (Katzung,  2002).  Selain  itu  sulfonilurea sering  diberikan  sebagai  terapi  kombinasi karena memiliki kemampuan untuk meningkatkan  atau  mempertahankan  sekresi insulin dengan merangsang sel beta pankreas untuk melepaskan insulin (American Diabetes Association, 2012).
Ekstrak  daun    murbei  telah  dilaporkan dapat  menurunkan  kadar  glukosa  darah  pada pengujian antidiabetes secara in vivo (Amit et al.),  tetapi  belum  diketahui  pengaruhnya terhadap  ekspresi  CYP3A4.    Sedangkan glibenklamid  sebagai  obat  antidiabetes  oral telah  diketahui  sebagai  substrat  enzim CYP3A4.  Oleh  Karena  itu  penelitian  ini bertujuan  mengamati  ekspresi  gen  CYP3A4 pada  kutur  HepG2  dengan  perlakuan  ekstrak daun murbei dan glibenklamid secara tunggal atau kombinasi dari keduanya.

## METODE PENELITIAN Bahan
Bahan  utama  yang  digunakan  dalam penenlitian  adalah  ekstrak  etanol  daun murbei  ( Morus  alba L.)  yang  berasal  dari Taman  Nasional  Gunung  Rinjani  Lombok  – NTB, dan sel HepG2 dari laboratorium Pusat Teknologi  Farmasi  dan  Medika  (PTFM)  – BPPT.  Bahan  lain  adalah  glibenklamid serbuk produk Tokyo Chemical Industry Co., Ltd, Dulbecco  minimal  essential  medium (DMEM) dan foetal bovine serum (FBS) dari Gibco  Ltd  (Singapura),  dimetil  sulfoksida (DMSO) dari Sigma-Aldrich Ltd (Singapura), Trizole isolation reagent (Invitrogen,  Karlsuhe,  Germany),  isopropil alkohol  (MP  Biomedical),  air  bebas  RNAse (Promega Corporation, Singapura), primer β- actin dan CYP3A4 (1 st Base Ltd, Singapura), kit  one-step  qRT-PCR  KAPA  SYBR  Fast Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories Inc, Singapura).

## Alat
Alat-alat  yang  digunakan  meliputi  alat- alat  gelas, evaporator , karl-fischerlaminair flow  cabinet , mikropipet merek  eppendorp, tip , mikrotube , autoclave , inkubator CO 2 merek  memmert, spektrofotometer merek biodrop, centrifuge ,  PCR  konvensional  alat Real Time RT-PCR merek biorad.

## Pembuatan ekstrak etanol daun murbei
Serbuk  simplisia  kering  sebanyak  1  kg diekstraksi  dengan  cara  dingin,  yaitu maserasi  dengan  pengadukan  selama  empat jam  menggunakan  pelarut  etanol  70% setinggi  3–5  cm  diatas  serbuk  simplisia. Kemudian,  maserat  pertama  disaring  dan dilakukan  remaserasi  sebanyak  tiga  kali, sehingga  dihasilkan  ekstrak  cair  yang  sudah tidak berwarna pekat.

## Kultur sel HepG2
Sel  HepG2  yang  dikulturkan  dalam medium  DMEM  HG  dengan  10%  FBS  dan 1%  antibiotik  pen-strep  pada  suhu  37°C dengan  kelembaban  CO 2 5%.  Kemudian  sel ditempatkan  ke  dalam  12 well  plate dengan kerapatan  sel  2,0x10 5 sel/ml  media.  Kultur sel  diinkubasi  satu  hari  sebelum  diberikan obat  yang  diujikan  (Sambrook  and  Russel, 2001).

## Uji sitoksisitas
Selanjutnya,  uji  sitotoksik  dilakukan terhadap  bahan  uji  untuk  mengetahui konsentrasi  50%  efek  tosksik  terhadap partumbuhan  sel  HepG2,  nilai  IC 50 bahan serta  sebagai  rujukan  konsentrasi  pada  uji sampel.  Metode  yang  digunakan  adalah metode  MTT  yang  menghitung  jumlah  sel hidup setelah diberikan ekstrak (Gerets et al., 2012).

## Pengujian sampel
Sampel  uji  berupa  ekstrak  etanol  daun murbei, glibenklamid, dan kombinasi ekstrak etanol daun murbei dan glibenklamid. Setiap sample  dilarutkan  ke  dalam  DMSO  ≤0,1%, kemudian diujikan ke kultur sel HepG2 yang telah  diinkubasi  selama  satu  hari  dengan konsentrasi.  Pengujian  sampel  dilakukan pada kondisi 37°C dengan CO 2 5% selama 2
hari  (48  jam).  Pemanenan  kultur  sel menggunakan Trizole  isolation  reagent dan perhitungan  konsentrasi  total  RNA  dengan spektrofotometer  pada  absorbansi  260  nm  – 280  nm.  Pengujian  sampel  dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.

## Isolasi RNA
Isolasi  RNA  dilakukan  pada  kultur  sel HepG2  yang  telah  diuji  menggunakan tripsin-EDTA  dan  total  RNA  diekstraksi menggunakan  reagen Tripure  isolation sesuai dengan petunjuk dari manufaktur.

## Pengukuran kemurnian RNA
RNA  yang  telah  diisolasi  kemudian dimurnikan  dengan  spektrofotometer  pada panjang  gelombang  260  nm.  Kemurnian RNA dipastikan dengan perhitungan absorbansi pada 260nm – 280nm.

## Real Time RT-PCR
Pada tahap selanjutnya, preparasi sampel dilakukan dengan mencampurkan 30mM tiap primer,  12,5µL  SYBR  green  RT  PCR reaction mix, 0,5µL iScript reverse transcriptase,  100µg  template  RNA,  dan 9,5µL  air  bebas  RNAse.  Sampel  diinkubasi dalam  sistem real-time  thermal  detection dengan  kondisi:  10  menit  suhu  50°C  untuk sintesis  cDNA,  5  menit  pada  suhu  95°C untuk inaktivasi iScript reverse transcriptase ,  dan  siklus  PCR  dan  deteksi (40 siklus) dengan pengaturan 10 detik pada suhu 95°C untuk  proses  denaturasi,  30 detik pada  suhu  58°C  untuk  proses annealing dan ekstensi.  Nilai  ambang  batas  (Ct)  dihitung secara  otomatis  oleh software .  Data  nilai ambang  batas  (Ct)  diolah  sesuai  dengan metode yang dijelaskan oleh Pfaffl.

## Ekspresi gen CYP3A4
Ekspresi gen CYP3A4  diketahui dengan melihat  nilai  ambang  (Ct)  dari  setiap perlakuan  menggunakan    metode  Pfaffl (Matsuda et al ., 2002).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil uji sitotoksisitas dari ekstrak etanol daun  murbei  dan  glibenklamid  terhadap  sel HepG2 ditunjukkan pada gambar 1.
Berdasarkan  analisa  menggunakan  software GraphPad  Versi5  diperoleh  nilai  IC 50 untuk ekstrak etanol sebesar 441.6 ppm  sedangkan glibenklamid  memiliki  IC 50 sebesar  201.4 ppm.
Gambar 1. Hasil uji sitoksisitas
Hasil  IC 50 dari  ekstrak  murbei  dan glibenklamid pada uji sitotoksisitas bertujuan mengetahui  pengaruh  ekstrak  murbei  dan glibenklamid  maupun  kombinasi  ekstrak daun  murbei  dan  glibenklamid  dengan perbandingan 1:1 terhadap ekspresi CYP3A4 digunakan konsentrasi masing-masing sampel uji  6.25, 12.5, 25, 50 dan 100 ppm. Pengujian    dilakukan  sebanyak  3  kali ulangan,  meggunakan  24  well  plate  dengan jumlah sel/well  2 x 105 sel.
Pada pengujian Real-Time PCR dilakukan  perancangan  primer  yang  tepat, karena  primer  menjadi  faktor  penting  dalam amplifikasi  yang  menentukan  berhasil  atau tidaknya  proses  Real-Time  PCR.  Selain  itu, perancangan  primer  yang  tepat  diperlukan untuk  meminimalisasi  amplifikasi  sekuens yang  tidak  diinginkan.  Perancangan  primer yang tepat akan menghasilkan primer dengan spesifitas tinggi.
Primer  yang  digunakan  dalam  penelitian isolasi  RNA  menggunakan Trizole  isolation reagent yang  mengandung  fenol  dan guanidin  isotiosianat,  dimana  keduanya berfungsi    menjaga  RNA  agar  tetap  utuh ketika  terjadi  pelisisan  sel.  Selain  itu, guanidin  isotiosianat  juga  berfungsi  untuk mendenaturasi  protein  seperti  enzim  RNAse
dan  protein  kontaminan  lainnya.  Kemudian, inkubasi  diperlukan  untuk  memaksimalkan kerja  dari  fenol  dan  guanidin  isotiosianat. Setelah  diinkubasi,  penambahan  kloroform dilakukan untuk memisahkan antara kontaminan  seperti  lipid  dan  protein  dengan RNA.  Penambahan  kloroform    diikuti dengan  sentrifugasi  sehingga  terbentuk  dua fase, yaitu (a) fase air (berisi RNA) dan fase organik berisi protein yang larut dalam fenol dan  lipid  yang  larut  dalam  kloroform. Sentrifugasi  dilakukan  pada  suhu  4˚C  untuk meminimalisasi degradasi RNA akibat panas yang terjadi saat sentrifugasi.
Selanjutnya,  fase  air  dipindahkan  ke dalam microtube baru  dan  ditambahkan isopropanol. Penambahan isopropanol dimaksudkan untuk  pemulihan RNA dengan cara  pengendapan  dan  terbentuk  pelet  RNA. Setelah  itu  sentrifugasi  dilakukan  untuk mengendapkan  RNA  sehingga  pelet  RNA terlihat  di  dasar  atau  dinding microtube . Kemudian supernatan dibuang dan ditambahkan  etanol.  Fungsi  etanol  sama dengan isopropanol, yaitu untuk mengendapkan
RNA. Penggunaan isopropanol  lebih  baik  dari  etanol  dalam mengendapkan  RNA.  Namun  isopropanol kurang volatil, sehingga dilakukan kombinasi  penambahan  isopropanol  dan etanol  untuk  mendapatkan  pellet  RNA dengan  kemurnian  tinggi.  Selanjutnya,  pelet RNA  dialiri  dengan  udara  kering  untuk menghilangkan  sisa  etanol.  Setelah  selesai proses  pengeringan,  pelet  RNA  diresuspensi dengan RNAse  Free  Water .  Kemudian dilakukan pengukuran konsentrasi dan kemurnian  RNA  dengan  spektrofotometer pada  panjang  gelombang  260  nm  dan  280 nm.  Pada  panjang  gelombang  260  nm menunjukkan konsentrasi total asam nukleat, sementara  pada  panjang  gelombang  280  nm menunjukkan  kemurnian  RNA.  Data  hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian RNA CYP3A4 dapat dilihat pada tabel 1.
Konsentrasi  RNA  hasil  isolasi  yang diperoleh antara 163,4 ng hingga 3176,8 ng.
Selanjutnya,  RNA  hasil  isolasi  disimpan pada  -80˚C  untuk  menghindari  kontaminasi dengan  RNAse  serta  degradasi  RNA  akibat suhu.
Tabel 1. Data konsentrasi dan kemurnian RNA ekstrak etanol murbei (M), glibenklamid (G) dan kombinasi ekstrak murbei dan glibenklamid (K) dengan kontrol (C).
No  KodeSampel Konsentrasi RNA (ng/µl) 1 2 3 1 C 163,4 489,5 593,7 2 G 1 212,7 714,2 270,1 3 G 2 238,9 198,4 705,3 4 G 3 406,2 414,8 433,5 5 G 4 993,2 185,9 1534,3 6 G 5 826,9 1065,4  1089,5 7 M 1 300,3 277,8 217,7 8 M 2 363,2 447,8 415,1 9 M 3 869,5 781,4 1295,1 10 M 4 3176,8  1420,6 432,7 11 M 5 474,5 629,8 890,3 12 K 1 105,2 257,7 444,9 13 K 2 753 307,4 643,9 14 K 3 639,1 74,57 492,1 15 K 4 159,5 373,2 967,1 16 K 5 657,4 519,3 386,2
Ini  adalah  primer  gen  CYP3A4  dengan primer gen β-actin. Primer CYP3A4 forward memiliki
urutan basa 5- CTCAAGGAGATGGTCCCTATCATTGC- 3
dan CYP3A4
reverse
5- TAGGCCCCAAAGACGTCTTTCAAGG-3.
Sedangkan  primer  β-actin  memiliki  urutan basa  5-CTGGCACCCAGCACAATG-3  dan primer
β-actin
reverse 5- GCCGATCCACACGGAGTACT-3.  Urutan basa  primer  CYP3A4  dan  β-actin  diuji spesifitasnya  dengan  menggunakan  software Snapgene .  Hasil  uji  spesifitas  menunjukkan urutan  basa  primer  CYP3A4  dan  β-actin memiliki  kemiripan  100%  dengan  CYP3A4 dan β-actin manusia.
Untuk  menguji  efisiensi  amplifikasi  gen CYP3A4  menggunakan  primer  yang  sudah didisain  sebelumnya  dilakukan  optimasi suhu annealing primer dengan menggunakan PCR  konvensional.  Suhu  annealing  yang digunakan  dalam  optimasi  adalah  55˚C    dan
60˚C.  Ukuran  fragmen  hasil  amplifiksi dengan  menggunakan  primer  yang  telah didesain  adalah  sekitar  76  bp.  Berdasarkan hasil  optimasi  suhu  annealing  yang  paling optimal  untuk  mengamplifikasi  gen  target adalah suhu 60˚C.

## Gambar 2. Elektroforesis optimasi PCR konvensional gen CYP3A4
Hasil amplifiksi pada suhu 55˚C menunjukan hasil smear yang diakibatkan oleh penempelan  primer  pada  posisi  yang  tidak spesifik  pada  template  cDNA  (gambar  2 lajur  2).  Oleh  sebab  itu  peningkatan  suhu annealing diharapkan dapat membuat primer menempel  pada  gen  target  seperti  yang ditunjukan pada  gambar 2 pada lajur 3. Dari hasil  optimasi  PCR  konvensional  diperoleh suhu  optimal  yang  akan  digunakan  dalam Real  Time  PCR    dengan  primer  CYP3A4 adalah suhu 60˚C (gambar 3).
Gambar 3. Hasil optimasi  PCR konvesional
Proses  Real-Time  PCR  dilakukan  dengan menggunakan  KAPA  SYBR  master  mix yang  memiliki  komposisi  enzim  Hot  start KAPA  SYBR  DNA  Polymerase,  SYBR Green  I  fluorescent  dye, MgCl 2 , dNTP s ,  dan
Keterangan :
1. Marker 1 kb ladder plus
2. Amplifikasi CYP3A4 suhu 55 ˚ C
3. Amplifikasi
CYP3A4 suhu 60 ˚ C
4.
stabilizer.  Penggunaan  Real-Time  PCR master  mix memiliki  keuntungan  berupa kemudahan  dalam  penggunaannya  serta ketepatan jumlah komponen yang diperlukan dalam  reaksi  Real-Time  PCR.  Prosedur Real-Time  dilakukan  dengan  jumlah  siklus 35.  Didasari  pada  hasil  optimasi  yang  telah dilakukan  sebelumnya  yang  menunjukan bahwa  siklus  yang  optimal  adalah  35 (Gambar 4).

## Gambar 4. Hasil optimasi  Real Time PCR

## Gambar 5. Ekspresi gen CYP3A4
Berdasarkan analisa ekspresi CYP3A4 secara  Real  Time  PCR  pada  Gambar  5 perlakuan  ekstrak  murbei  menunjukkan bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  yang diberikan ekspresi CYP3A4 semakin menurun,  dengan  demikian  diduga  bahwa murbei merupakan inhibitor enzim CYP3A4. Demikian pula dengan perlakuan glibenklamid  semakin  tinggi  konsentrasi Glibenklamid ekspresi CYP3A4 juga semakin  menurun.  Hal  yang  sama  pada kombinasi keduanya, yaitu ekspresi CYP3A4 juga  semakin  kecil  dengan  meningkatnya konsentrasi uji yang diberikan.
Nilai  rasio  ekpresi  CYP3A4  pada  perlakuan ekstrak  daun  murbei  dan  glibenklamid tercantum  pada  Tabel  2  dimana  pada perlakuan ekstrak daun murbei menunjukkan peningkatan  rasio  ekspresi  gen  CYP3A4 sebesar  1.43  dan  1.19  kali  dibandingkan glibenklamid  pada  dosis  100  ppm  dan  50 ppm. Sebaliknya pada konsentrasi yang lebih rendah 25, 12,5 dan 6,25 ppm rasio ekspresi CYP3A4  akibat  perlakuan  murbei  lebih rendah dibanding glibenklamid.
Tabel 2. Nilai rasio ekspresi CYP3A4 pada perlakuan ekstrak daun murbei dan glibenklamid Konsen trasi Mur bei Gliben klamid Nilai Rasio Ekspresi 100 0.8 0.56 1.43 50 1 0.84 1.19 25 0.91 1.14 0.80 12.5 0.71 1.97 0.36 6.25 1.54 1.64 0.94 Tabel 3. Nilai rasio ekpresi CYP3A4 pada perlakuan ekstrak murbei dan kombinasi ekstrak murbei dari glibenklamid (1:1) Konsent rasi Mur bei Kombi nasi Nilai Rasio Ekspresi 100 0.8 0.5 1.60 50 1 0.85 1.18 25 0.91 0.87 1.05 12.5 0.71 1.57 0.45 6.25 0.54 1.58 0.34
Sedangkan  rasio  ekspresi  CYP3A4 antara ekstrak daun murbei dengan kombinasi pada Tabel 3menunjukkan peningkatan  ekspresi  gen  CYP3A4  pada ekstrak  daun  murbei  sebesar  1.60,  1.18  dan 1.05  kali  dibandingkan  kombinasi  ekstrak daun  murbei  dan  glibenklamid  pada  dosis 100  ppm,  50  ppm  dan  25  ppm.  Sebaliknya pada  konsentrasi  dibawahnya  12,5  dan 6,25ppm    rasio  ekspresi  perlakuan  murbei menjadi  lebih  kecil  yaitu  0,45  dan  0,34%
dibanding  dengan  kombinasi  murbei  dan glibenklamid.
Semakin tinggi eskpresi CYP3A4 berarti semakin banyak enzim yang diproduksi  dan  aktivitas  metabolisme  oleh enzim  tersebut  semakin  meningkat  sehingga kadar  obat  didalam  plasma  semakin  sedikit. Sebaliknya semakin rendah ekspresi CYP3A4  semakin  sedikit  kadar  enzim  dan metabolisme  menurun  sehingga  kadar  obat didalam plasma menjadi lebih banyak. Interaksi antara ekstrak daun murbei sebagai inhibitor  CYP3A4  dengan  glibenklamid sebagai  substratnya  akan  menyebabkan peningkatan  kadar  plasma  atau  peningkatan bioavailabilitas glibenklamid sehingga memungkinkan  aktivitas  glibenklamid  yang meningkat  sampai  terjadinya  efek  samping yang  tidak  dikehendaki  yaitu  peningkatan efek hipoglikemik yang membahayakan.
Dengan  demikian  pemberian  ekstrak  daun murbei  pada  pasien  diabetes  melitus  yang menerima  glibenklamid,  dosis  pemberian glibenklamid dapat diturunkan sehingga efek sampingnya dapat diminimalkan.

## KESIMPULAN
Pemberian  secara  tunggal  ekstrak  murbei akan menghambat enzim CYP3A4,
sedangkan glibenklamid merupakan substrat  enzim  CYP3A4.  Pengamatan ekspresi  CYP3A4  antara  ekstrak  daun murbei  dengan  kombinasi  menunjukkan peningkatan  ekspresi  gen  CYP3A4.  Hal tersebut  menandakan  semakin  banyak enzim  yang  diproduksi  dan  aktivitas metabolisme  oleh  enzim  tersebut  semakin meningkat  sehingga  kadar  obat  di  dalam plasma semakin sedikit.

## DAFTAR PUSTAKA
Adam  I,  Melva  L,  Arleni,  SriWAJ,  Franciscus  DS.  Influence  of  primaquine  and  ritonavir interaction  on  CYP3A4  mRNA  expression  in  HepG2  cell  culture.  Medical  Journal Indonesia. 2012; 2(1):3-7.
Ament  PW,  Bertolino  JG,  Liszewski  JL.  Clinical  pharmacology:  clinically  significant  drug interactions. Am Fam Physician. 2000; 61:1745-1754.
American  Diabetes  Association.  Standards  of  medical  care  in  diabetes.  Diabetes  care.
2012:11 – 13.
Amit  K,  Pulok  KM,  Sankarsan  S,  Shiv  B,  SK  Milan  A  and  Subrata  P.  Possible  herb-drug interaction  of  Morus  alba  L.  α  potential  anti-diabetic  plant  from  Indian  Traditional Medicine. Indian Journal of Traditional Knowledge. 2015; 14(4): 626-631.
Amma NR. 2009. Efek hipoglikemik ekstrak daun murbei (Morusmulticaulis) terhadap kadar glukosa darah tikus dm. Tesis. Sekolah Pasca sarjana Institut Pertanian Bogor.
Gerets  HHJ,  Tilmant    K,  Gerin  B,  Chanteux  H,  Depelchin  BO,  Dhalluin  S,  Atienzar  FA. 2012. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level  and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biol Toxicol 28:69-87, DOI 10.1007/s10565-011- 9208-4.
Gitawati  R.  2008.  Interaksi  obat  dan  beberapa  implikasinya.  Media  Litbang  Kesehatan 18(4):175-184.
Katzung  BG.  Farmakologi  dasar  dan  klinik.  Ed  VIII.  Diterjemahkan  oleh  Dripa  Sjabana. Surabaya: Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga; 2002.
Matsuda H, Kinoshita K, Sumida A, Koichi Takahashi K, Fukuena S, Fukuda T, et al. 2002. Taurine  modulates  induction  of  cytochrome  P450  3A4  mRNA  by  rifampicin  in  the HepG2 cell line. Biochimica et Biophysica Acta 1593: 93–98.
Sambrook J, Russel DW. Molecular cloning, a laboratory manual. Edisi III. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001: xxvi + 3.4 - 14.53 + 1.44.
Yihai  Wang,  Limin  Xiang,  Chunhua  Wang,  Chao  Tang,  Xiangjiu  He.Antidiabetic  and antioxidant  effects  and  phytochemicals  of  mulberry  fruit  ( Morus  alba L.)  polyphenol enhanced extract. Plos One. 2013; 8(7): 1-10.