# Korespondensi:  Balai  Riset  Perikanan  Budidaya  Air  Payau  dan Penyuluhan  Perikanan.  Jl.  Makmur  Dg.  Sitakka  No.  129,
Maros  90511,  Sulawesi  Selatan,  Indonesia. Tel.  +  62  411  371544 E-mail:  andi_parenrengi@hotmail.com
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra

## PENGARUH APLIKASI dsRNA  VP-15 IN VITRO DAN  IN VIVO TERHADAP  SINTASAN DAN RESPONS IMUN UDANG WINDU Penaeus monodon
Andi  Parenrengi # ,  Andi  Tenriulo,  Sri  Redjeki  Hesti  Mulyaningrum,  Samuel  Lante, dan  Agus  Nawang
Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau dan Penyuluhan Perikanan Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90511, Sulawesi Selatan
(Naskah diterima: 16 September 2019; Revisi final: 11 Oktober 2019; Disetujui publikasi: 14 Oktober 2019)

## ABSTRAK
Teknologi RNA interference (RNAi) merupakan salah satu pendekatan yang digunakan untuk meningkatkan resistensi udang windu terhadap infeksi patogen termasuk WSSV. Pengembangan teknologi RNAi melalui aplikasi untai ganda RNA (dsRNA) yang berasal dari gen pengkode viral protein (VP) dari WSSV telah mulai dikembangkan  pada  udang.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengkaji  sintasan  dan  respons  imun  udang windu  yang  diberi  VP-15  pasca  uji  tantang  dengan  WSSV.  Udang  windu  (panjang  15,21  ±  1,19  cm  dan bobot 32,5 ± 1,83 g) diinjeksi dengan 0,2 µg/ekor dsRNA in vitro (A), dsRNA in vivo (B), dan larutan garam/ kontrol  (C).  Setelah  tiga  hari  vaksinasi,  udang  windu  ditantang  dengan  WSSV  dengan  dosis  50  µL/ekor. Pengamatan sintasan dilakukan setiap hari, sedangkan respons imun (THC dan aktivitas proPO) dilakukan pada  awal  dan  hari  ke-1,  ke-3,  dan  ke-5  pasca  uji  tantang,  serta  analisis  ekspresi  gen  antivirus  dan histopatologi hepatopankreas dilakukan pada akhir penelitian. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aplikasi dsRNA berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap sintasan, THC, dan proPO. Sintasan udang windu yang diberi dsRNA VP-15 in vitro dan in vivo memberikan sintasan yang lebih tinggi 75% dibandingkan dengan kontrol. Nilai proPO tertinggi didapatkan pada dsRNA in vivo (0,138); kemudian dsRNA in vitro (0,093); dan terendah kontrol (0,061); sedangkan THC tertinggi (5.704 x 10 4 sel/mL) pada dsRNA in vivo, kemudian dsRNA in vitro (3.516  x  10 4 sel/mL)  dan  terendah  pada  perlakuan  kontrol  (3.322  x  10 4 sel/mL).  Ekspresi  gen  antivirus semakin meningkat dengan semakin lamanya udang windu terpapar dengan WSSV. Jaringan hepatopankreas udang  windu  pada  perlakuan  kontrol  (tanpa  dsRNA)  menunjukkan  adanya  kerusakan  sel  akibat  infeksi virus.
KATA KUNCI: dsRNA VP-15; in vitro; in vivo; udang windu; uji tantang
ABSTRACT: The effects of in-vitro and in-vivo dsRNA application to survival rate and immune response of tiger shrimp, Penaeus monodon. By: Andi Parenrengi, Andi Tenriulo, Sri Redjeki Hesti Mulyaningrum, Samuel Lante, and Agus Nawang
RNA interference (RNAi) technology is one of the approaches used to improve tiger shrimp Penaeus monodon resistance against WSSV infection. The development of RNAi technology through double-stranded RNA (dsRNA) isolated from gene encoding viral protein (VP) of WSSV has been applied to shrimp. This study was aimed to assess the survival rate and immune response of injected-VP-15 WSSV tiger shrimp after a challenge with WSSV. The tiger shrimp (15.21 ± 1.19 cm in length and 32.5 ± 1.83 g in weight) were injected with 0.02 µ g/shrimp of in vitro dsRNA (A), in vivo dsRNA (b) and saline solution (C). After three days of vaccination, the tiger shrimp were challenged with WSSV using a dosage of 50 µ L/shrimp. The survival rate was observed daily. Analyses of immune responses (hemocyte total and PO activity) were performed in several stages: before the challenge test and day-1, day-3, and day-5 post-challenge test. The expression of the antivirus gene and hepatopancreas histophatology were was observed at the end of the experiment. The results showed that the application of dsRNA significantly influenced the shrimp survival rate, THC, and proPO. Tiger shrimp injected with dsRNA VP-15 of in vitro and in vivo exhibited a higher 75% survival rate than the control (P<0.05). The highest proPO activity (0.138) was obtained at dsRNA in vivo, followed by dsRNA in vitro (0.093) and
the lowest (0.061) in the control. The highest THC (5,704 x 10 4 cell/mL) was in vivo dsRNA, then in vitro dsRNA (3,516 x 10 4 cell/mL), and the lowest in the control (3,322 x 10 4 cell/mL). The longer the exposure with WSSV, the higher the antivirus gene expression. Histopathology analysis showed some damages to the hepatopancreas cells in the control shrimp (without dsRNA) caused by the virus infection.
KEYWORDS: dsRNA VP-15; in vitro; in vivo; tiger shrimp; challenged test
hasil produksi relatif sedikit.  Oleh karena itu, perlu dilakukan  upaya  produksi  secara  in  vivo  agar  dapat dilakukan  dengan  mudah dalam  jumlah  yang  relatif besar  karena  dapat  diproduksi  melalui  bakteri. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengkaji pengaruh aplikasi dsRNA VP-15 yang diproduksi secara in vitro dan in vivo terhadap sintasan dan respons imun udang windu pasca uji tantang dengan WSSV.

## BAHAN DAN METODE

## Hewan  Uji
Hewan uji yang digunakan adalah udang windu P. monodon dengan ukuran bobot dan panjang masing- masing adalah 32,5 ± 1,83 g dan 15,21 ± 0,19 cm. Hewan  uji  yang  berasal  dari  tambak  pembesaran, Instalasi  Pembenihan  Udang  Windu  (IPUW)  Barru, diaklimatisasi di bak Gedung Karantina, IPUW Barru, BRPBAP3  dan  selanjutnya  dilakukan  pengecekan kesehatan  udang  khususnya  infeksi  WSSV  dengan menggunakan teknik PCR. Hewan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah udang windu yang dinyatakan negatif atau bebas infeksi WSSV.

## Produksi  Vaksin dsRNA  Secara  In  Vitro
Isolasi gen target VP-15 dilakukan dari genom DNA udang windu positif terinfeksi penyakit WSSV. Setelah itu, dilakukan konstruksi gen VP-WSSV dengan pro- moter  T7  dengan  cara  menambahkan  sekuens  pro- moter pada setiap primer. Amplifikasi DNA dilakukan pada  mesin  PCR,  dengan  menggunakan  kit  sebagai reaksi  PCR  dan  1  µL  (50  mol/mL)  masing-masing primer dan dH 2 O untuk mencapai volume akhir 25 µL. Proses PCR dilakukan dengan program pre-denaturasi pada  94°C  selama  tiga  menit;  35  siklus  (denaturasi pada  94°C  selama  satu  menit,  annealing  pada  57°C selama 45 detik, dan ekstensi pada 72°C selama satu menit);  dan  ekstensi  akhir  pada  72°C  selama  lima menit. Hasil PCR selanjutnya dielektroforesis pada gel agarosa 2% untuk keperluan dokumentasi. Amplikon PCR  dielekroforesis  pada  gel  agarosa  untuk mengetahui  keberhasilan  pembentukan  konstruksi gen.
Produksi  vaksin  dsRNA  VP-15  secara  in  vitro, dilakukan menggunakan kit MEGAscript RNAi (Loy et al.,  2012).  Konstruksi  gen  VP-15  dengan  promoter T7 dari plasmid bakteri rekombinan dijadikan sebagai bahan dasar (template DNA) untuk perbanyakan vaksin

## PENDAHULUAN
Pendekatan  rekombinan  DNA  khususnya  vaksin DNA  telah  mulai  diaplikasikan  pada  akuakultur. Penerapan  bioteknologi  pada  akuakultur  dalam peningkatan  resistensi  ikan  atau  udang  melawan serangan penyakit atau patogen merupakan salah satu alternatif  pemecahan  masalah  penyakit.  Selain  itu, mekanisme  yang  potensial  dalam  peningkatan resistensi  penyakit  adalah  produksi  hewan  akuatik melalui penerapan interferensi RNA (RNA interference- RNAi) atau juga dikenal sebagai teknologi untai ganda RNA  (double-stranded  RNA-dsRNA).  RNAi  merupakan suatu teknologi yang dapat menghambat ekspresi gen virulensi dari virus.
Aplikasi  bioteknologi  dalam  upaya  pemecahan masalah penyakit khususnya pada krustase dilakukan dengan  pendekatan  yang  berbeda.  Penemuan  gen pengkode antimikroba penaeidin membuka peluang dalam  peningkatan  immunitas  udang  melawan serangan  patogen  pada  udang  Litopenaeus  vannamei (Destoumieux et al., 1997). Induksi imun pada udang melalui vaksinasi telah dilaporkan dengan penggunaan rekombinan protein WSSV pada udang Penaeus chinensis (Kim et al., 2004) dan antivirus menggunakan dsRNA pada  udang  L.  vannamei  (Robalino  et  al.,  2004). Penerapan RNAi telah menghasilkan suatu terobosan dalam produksi ternak khususnya pada ayam (CSIRO, 2014). Wulandari (2010) melaporkan bahwa aplikasi dsRNA Gonadal Inhibiting Hormone (GIH) secara in vitro dan in vivo dapat menstimulasi pematangan gonad pada udang windu.
Mekanisme RNAi pada hewan akuatik khususnya krustase terjadi pada beberapa tahap, di mana pada saat  dsRNA  diinduksi  ke  dalam  sel  target  terlebih dahulu  terjadi  pembentukan  siRNA  yang  kemudian mendegradasi  mRNA  sehingga  ekspresi  gen  secara spesifik  menjadi  inaktif  pada  tahap  post-transkripsi (Reshi  et  al.,  2014;  He  et  al.,  2015).  Aplikasi  vaksin dsRNA khususnya gen virulensi penkode viral protein (VP)  dari  WSSV  pada  udang  windu  masih  sangat terbatas.  Sebagai  langkah  awal,  telah  dilakukan karakterisasi gen penyandi VP-15 dan VP-24 dari WSSV dan  aplikasi  dsRNA  yang  diproduksi  secara  in  vitro (Tenriulo  et  al.,  2016;  Parenrengi  et  al.,  2017; Parenrengi et al.,  2018; Mulyaningrum  et al.,  2018). Produksi dsRNA secara in vitro menggunakan kit masih terkendala dalam hal biaya produksi yang tinggi dan
rekombinan dsRNA. Proses produksi dsRNA melalui tahapan: (a) perbanyakan dsRNA;  (b) digesti dsRNA; dan (c) pemurnian dsRNA. Verifikasi produksi dsRNA dilakukan  dengan  metode  elektroforesis.  Untuk menentukan konsentrasi vaksin dsRNA, hasil produksi diukur dengan menggunakan GeneQuan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (Linacero et al., 1998).

## Produksi  Vaksin dsRNA  Secara  In  Vivo
Produksi vaksin dsRNA VP-WSSV dilakukan melalui kloning  gen  target  ke  dalam  vektor  RNAi  dan selanjutnya  ditransformasikan ke  bakteri  kompeten sel  sehingga  konstruksi  gen  dapat  dilakukan  pada bakteri  rekombinan  (Parenrengi  et  al.,  2018). Pengklonan gene penyandi VP-WSSV dilakukan dengan cara  fragmen  DNA  dari  amplikon  PCR  yang  telah dielektroforesis  dalam  agarosa  gel  dipotong, kemudian DNA diisolasi dan dimurnikan dengan kit GF-1 Gel Recovery. Selanjutnya fragmen DNA direstriksi berdasarkan  enzim  restriksi  yang  sesuai,  kemudian diligasikan ke vektor L4440  yang mengandung pro- moter  T7  dan  selanjutnya  ditranformasi  ke  bakteri kompeten  Escheria  coli  DH5  .  Transformasi  bakteri dilakukan  melalui  teknik  kejut  panas  (heat  shock) dengan mencampurkan 5 µL hasil ligasi dengan 100 µL  sel  kompeten  bakteri  dalam  tabung  mikro  pada kondisi dingin. Hasil pencampuran tersebut diinkubasi pada  suhu  42°C  selama  30  detik  sebagai  perlakuan kejut panas dan dipindahkan ke dalam es selama 10 menit. Campuran gen VP yang sudah ditransformasi ke  dalam  sel  kompeten  dipindahkan  ke  tabung polipropilena volume 15 mL dan ditambahkan media LB 1 mL. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C dengan rotaryshaker  120  rpm  (satu  jam)  dan  disentrifugasi dengan  kecepatan  6.000  rpm  selama  lima  menit. Skrining koloni E. coli DH5  yang mengandung plas- mid  rekombinan  (T7-VP)  dilakukan  dengan  metode seleksi koloni berwarna putih dan biru. Koloni putih yang diduga mengandung insert gen VP-15 digunakan sebagai  template.  Koloni  putih  ditumbuhkan  pada media  LB  cair  dalam  test  tube  15  mL,  kemudian diinkubasi selama satu malam menggunakan shaker suhu 37°C dengan kecepatan 120 rpm. Panen bakteri dilakukan dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama lima menit dan pelet yang terbentuk digunakan sebagai template untuk  PCR. Isolasi  plas- mid  dari  bakteri  rekombinan  dilakukan  dengan menggunakan kit  isolasi plasmid  dengan mengikuti metode  yang  disarankan  oleh  vendor  (GENEAID). Konsentrasi plasmid DNA konstruksi gen VP-15 vaksin dsRNA dihitung dengan menggunakan GeneQuan pada panjang  gelombang  260  nm  dan  280  nm  (Linacero et al., 1998).

## Aplikasi  Vaksin  dsRNA  VP-15  WSSV
Aplikasi dsRNA pada penelitian ini difokuskan pada validasi metode produksi dsRNA pada udang windu, yang terdiri dari tiga perlakuan, yakni: (A) perlakuan injeksi  vaksin  dsRNA  dosis  0,2  µg  yang  diproduksi secara in vivo; (B) perlakuan injeksi vaksin dsRNA dosis 0,2 µg yang diproduksi secara in vitro; dan (C) perlakuan injeksi  larutan  fisiologis  (kontrol).  Setiap  perlakuan masing-masing memiliki tiga ulangan.
Aplikasi  vaksin  dsRNA  dilakukan  melalui  injeksi inter-muscular ke udang windu. Hewan uji yang telah divaksin  dipelihara  pada  bak  fiber  250  L  dengan kepadatan 10 ekor/bak menggunakan media air laut 32 ppt yang dilengkapi dengan aerasi dan pemberian pakan  pelet  4%  per bobot  tubuh  sebanyak  tiga  kali sehari. Setelah tiga hari vaksinasi, udang diuji tantang dengan WSSV dengan volume 50 µL/ekor (konsentrasi berdasarkan data LC-50 pada penelitian sebelumnya) melalui  injeksi,  dan  selanjutnya  dipelihara  dengan kepadatan dan wadah yang sama dengan saat vaksinasi. Sintasan udang windu pasca uji tantang diamati setiap hari  selama  12  hari.  Untuk  mengetahui  pengaruh dsRNA  terhadap  respons  imun  udang  uji,  maka dilakukan pengambilan hemolim sebelum uji tantang, kemudian hari ke-1, 3, dan 5 setelah uji tantang pada tiga ekor udang windu. Pada akhir penelitian dilakukan analisis ekspresi gen antivirus dan histopatologi pada organ hepatopankreas. Parameter respons imun yang diamati adalah:

## Total Hemocyte Count (THC)
Pengamatan  THC  dilakukan  dengan  mengambil hemolim 0,1 mL pada abdomen segmen kedua dengan menggunakan syringe 1 mL dan jarum berukuran 26 gauge yang sudah berisi 0,3 mL antikoagulan Na-sitrat 3,8%.  Jumlah  sel  hemosit  dihitung  dengan menggunakan haemositometer di bawah mikroskop pembesaran  100  kali  dengan  rumus  yang dikembangkan oleh Blakxhall & Daishley (1973).

## Aktivitas  Prophenoloxydase  (proPO)
Aktivitas  proPO  diukur  berdasarkan  formasi dopachrome yang dihasilkan oleh L-dihydroxyphenil ala- nine (L-Dopa) dengan menggunakan spektrofotometer. Pengukuran aktivitas PO mengacu pada prosedur Liu & Chen (2004). Sebanyak 0,1 mL hemolim ditambah dengan 0,9 mL antikoagulan lalu dihomogenkan dalam Effendorf. Campuran ini kemudian disentrifuge dengan kecepatan 700 x g pada 4°C selama 20 menit. Cairan supernatan  dibuang  dan  pelet  dibilas  dengan  1  mL cocodilate-citrate buffer (0,01 M sodium cacodylate; 0,45 M sodium chloride; 0,10 M trisodium citrate; pH 7) dan
disentrifuge kembali dengan kecepatan dan kondisi yang sama. Supernatan dibuang dan pelet dilarutkan dangan cacodylate buffer (0,01 M sodium cacodylate; 0,45 M  sodium  klorida;  0,01  M  kalsium  klorida;  0,26  M magnesium klorida; pH 7). Larutan kemudian dibagi dua masing-masing sebanyak 100 µL. Larutan pertama diinkubasi dengan 50 µL trypsin (1 mg/mL cacodylate buffer)  sebagai  aktivator  sedangkan  larutan  kedua ditambahkan  50  µL cacodylate  buffer  (pengganti tripsin). Kedua-duanya diinkubasi selama 10 menit pada suhu 25°C-26°C. Selanjutnya masing-masing ditambah 50  µL  L-DOPA  (3  mg/mL cacodylate  buffer)  dan  lima menit kemudian ditambahkan 800 µL cacodilate buffer. Aktivitas PO diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang absorban 490 nm. Densitas optikal (OD) dari aktivitas PO pada semua kondisi uji dinyatakan sebagai formasi dopachrome dalam 50 µL hemolim.

## Ekspresi  Gen  dan  Histopatologi
Ekspresi gen pada udang windu dilakukan dengan isolasi RNA dengan menggunakan kit isolasi RNA dan selanjutnya dilakukan sintesis cDNA untuk dijadikan sebagai template DNA untuk proses. Amplifikasi DNA dilakukan melalui teknik PCR dengan dengan mengacu pada  metode  yang  telah  dikembangkan  oleh Parenrengi et al. (2009a; 2009b). Keberadaan fragmen DNA pada posisi sekitar 520 bp pada genom DNA dan pada  cDNA  merupakan  indikator  keberadaan  dan terekspresinya  gen  antivirus  tersebut.  Ekspresi  gen â-aktin  udang  windu  digunakan  sebagai  kontrol ekspresi  gen.
Untuk  mengetahui  pengaruh  vaksin  dsRNA terhadap  infeksi  WSSV  maka  dilakukan  analisis histopatologi organ hepatopankreas. Hepatopangreas diawetkan  dengan  etanol  100%  sebelum  dilakukan analisis  histologi di  Balai  Besar Penelitian  Veteriner, Kementerian Pertanian di Maros.

## Analisis  Data
Untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap sintasan dan respons imun udang (THC dan aktivitas proPO)  udang  windu  pasca  uji  tantang,  maka  data dianalis  menggunakan  analisis ragam  (ANOVA),  dan uji lanjut menggunakan LSD pada taraf kepercayaan 0,05. Hasil pengamatan produksi dsRNA, ekspresi gen, serta histopatologi dianalisis secara deskriptif.

## HASIL DAN BAHASAN

## Produksi dsRNA VP-15 WSSV
Produksi vaksin  dsRNA VP-15  secara in vitro  dan konstruksi gen pT7-VP15 yang dijadikan sebagai bahan dasar  pembentukan  vaksin  dsRNA  telah  berhasil
dilakukan padan udang windu. Sedangkan dsRNA secara in vivo juga telah berhasil diproduksi melalui bakteri rekombinan. Verifikasi keberhasilan produksi dsRNA secara in vivo dan in vitro dilakukan dengan metode elektroforesis  (Gambar  1).
Keberadaaan fragmen DNA pada posisi sekitar 253 bp,  merupakan  indikator  keberhasilan  dalam mengisolasi  dan  memproduksi  vaksin  dsRNA  VP-15 (Parenrengi  et  al.,  2018).  Gambar  1  menunjukkan bahwa  produksi  dsRNA  berhasil  dilakukan  dengan tingkat kemurniaan yang sangat tinggi yakni 1,8-1,9; serta ditandai dengan pita DNA tunggal yang bersih. Linacero et al. (1998) telah merekomendasikan bahwa kemurnian DNA untuk kegiatan molekuler sebaiknya berada pada kisaran 1,8-2,0. Kuantitas produksi dsRNA secara  in  vitro  sangat  tergantung  dari  kit  yang digunakan.  Penggunaan  kit  MEGAScript  RNAi menghasilkan  volume  produksi  sebanyak  400  µL, sedangkan  produksi  dsRNA  secara  in  vivo  dapat dilakukan dengan volume yang lebih besar sepanjang produksi bakteri rekombinan dapat dilakukan dengan massal.

## Sintasan
Udang  windu sampai  dengan  hari  ke-4 pasca  uji tantang memperlihatkan sintasan yang masih cukup tinggi dan belum memperlihatkan perbedaan antara perlakuan  yang  dicobakan  (Gambar  2).  Perlakuan kontrol  mempelihatkan  penurunan  sintasan  sampai dengan  20%  pada  hari  ke-3  pasca  uji  tantang,  dan selanjutnya kematian yang relatif besar pada hari ke-5 (kumulatif sintasan 55%) dan berlangung terus sampai mencapai kematian total pada hari ke-12. Sedangkan perlakuan dsRNA VP-15 baik in vitro maupun in vivo pada  hari  ke-5  sampai  dengan  hari  ke-10 memperlihatkan  kematian  yang  relatif  sedikit  dan setelah hari ke-10 memperlihatkan sintasan yang stabil sampai  dengan  penelitian  berakhir.  Sintasan  udang windu yang divaksin dengan dsRNA in vitro dan in vivo memperlihatkan  sintasan  yang  lebih  tinggi  (75%) dibandingkan dengan kontrol (P<0,05).
Gambar 2 menunjukkan bahwa pola kematian udang windu yang diberi dsRNA VP-15 yang diproduksi secara in vitro relatif sama dengan perlakuan dsRNA in vivo di mana  setelah  hari  ke-10  tidak  lagi  mengalami kematian.  Hal  ini  diduga  karena  udang  windu  yang diberi dsRNA telah melakukan perlawanan terhadap infeksi dengan sistem peningkatan respons imum dan penghambatan  ekspresi  gen  virulensi  WSSV  yang menyebabkan tidak patogen. Mekanisme in-aktivasi gen  virulensi  pada  virus  telah  digambarkan  oleh Mocellin & Provenzano (2004) dan Reshi et al. (2014) melalui  beberapa  tahap,  yakni:  (1)  untaian  panjang dsRNA  (long  dsRNA)  dipotong  oleh  enzim  RNAse-III
melalui  mekanisme  dicer  menjadi  fragmen-fragmen kecil yang panjangnya sekitar 19-23 nukleotida dengan 2-4 nukleotida overhang pada ujung 3’. Hasil potongan ini  disebut  small  interfering  RNA  (siRNA)  yang selanjutnya memicu terjadinya RNAi pada sel target. Proses  pemotongan  dsRNA  oleh  RNAse-III  tidak memerlukan ATP tetapi oleh aktivitas enzim nuklease; (2)  beberapa  fragmen  siRNA  berikatan  dengan kompleks protein RISC (RNA-induced silencing complex) yang  akan  memandu  mengenal  mRNA  yang  berisi sekuen homolog, selanjutnya kedua sekuens ini akan berkomplemen,  dan  setelah  berkomplemen  maka enzim nuklease yang ada pada kompleks RISC akan mendegradasi  mRNA;  dan  (3)  setelah  mRNA terdegradasi  maka  ekspresi  gen  secara  spesifik menjadi inaktif pada tahap post-transkripsi.
Studi pendahuluan yang dilakukan sebelumnya oleh Parenrengi et al. (2018) menunjukkan bahwa dengan aplikasi  dsRNA  VP-15  dapat  meningkatkan  sintasan udang windu hingga 36,7% dibandingkan dengan tanpa penggunaan  vaksin  atau  kontrol  (3,3%)  atau  setara dengan nilai RPS (relative percentage survival) sebesar 37,9%.  Pengamatan  terhadap  sintasan  udang  windu selama  uji  tantang  pemberian  vaksin  dsRNA  VP-24 dengan  dosis  0,2  ìg  memperlihatkan  peningkatan sintasan  yang  signifikan pada  udang  windu  sebesar 65% dibandingkan kontrol hanya 10% (Mulyaningrum et al., 2018). Peningkatan sintasan pada udang yang divaksin  dengan  dsRNA  dari  serangan  WSSV  telah dilaporkan  sebelumnya  oleh  Krishnan  et  al.  (2009) sebesar  62%;  Sarathi  et  al.  (2010)  sebesar  37%;  dan Puneeth et al. (2017) sebesar 50% pada udang windu.
400 bp 
300 bp  200 bp  400 bp  300 bp 
200 bp  M         1            2          3          4 M       (-)          5        6          7        8        9 (A) (B) 400 bp 300 bp 200 bp 400 bp 300 bp
200 bp M          1           2           3           4 M        (-)         5         6          7          8         9
Gambar 1. Elektroforesis dsRNA VP-15 hasil produksi secara in vitro menggunakan kit MEGAscript (A)  dan  in  vivo  yang  diisolasi  dari  plasmid  rekombinan  DNA  (B).  M=  marker  DNA; 1-4= dsRNA VP-15 in-vitro; 5-9= dsRNA VP-15 secara in vivo; dan (-)= kontrol negatif.
Figure 1. Electhrophoresis of VP-15 dsRNA produced by in vitro using MEGAscript RNAi Kit (A) and by in vivo isolated from DNA plasmid of bacteria recombinant (B). M= DNA marker; 1-4= VP- 15 dsRNA in vitro; 5-9= VP-15 dsRNA in vivo; and (-)= negative control.
Gambar 2. Kumulatif  sintasan  udang  windu  yang  diberi  dsRNA  VP-15  in  vitro  dan  in vivopasca uji tantang dengan WSSV.
Figure 2.
Cumulative  survival  rate  of  tiger  shrimp  vaccinated  with  in  vitro  and  in  vivo dsRNA VP-15 after challenged with WSSV.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Awal Initial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 K u m u la ti f si n ta sa n
C um ul at iv e su rv iv al r at e (% ) Waktu pemeliharaan (hari) Rearing period (days) dsRNA in vivo dsRNA in vitro Kontrol tanpa dsRNA (Control without dsRNA) dsRNA in vivo dsRNA in vitro Kontrol tanpa dsRNA (Control without dsRNA)
Penggunaan vaksin dsRNA dengan dosis 2,0 µg pada udang L. vannamei dapat meningkatkan sintasan 100% melawan IHNV (Loy et al., 2012). Aplikasi vaksin VP- 26  dan  VP-28  pada  udang  P.  japonicus  dapat meningkatkan resistensinya dengan nilai RPS masing- masing  80%  dan  95%  (Namikoshi  et  al.,  2004), sedangkan aplikasi dsRNA VP-28 pada Macrobrachium rosenbergii menghasilkan RPS sebesar 44,5% terhadap WSSV (Jariyapong et al., 2015). Vaksinasi udang windu dengan  menggunakan  VP-19  melalui  pakan  dapat meningkatkan sintasan dengan nilai RPS sebesar 77% pada  hari  ke-7  dan  29%  pada  hari  ke-21  setelah  uji tantang dengan WSSV (Witteveldt et al., 2004). Pada hari  ke-9  setelah  ditantang  dengan  WSSV,  udang  L. vannamei  yang  diinjeksi  dengan  plasmid  yang mengandung  VP-28,  VP-39,  dan  wsv-477 memperlihatkan  sintasan  masing-masing  50%,  60%, dan 90% dibandingkan dengan kontrol (0%) (Akhila et al., 2015).

## Aktivitas  Prophenoloxydase  (proPO)
Nilai  proPO  untuk  semua  perlakuan memperlihatkan kecenderungan semakin meningkat dengan semakin lamanya udang windu terpapar dengan WSSV (Gambar  3a). Perlakuan  dsRNA in  vitro dan  in vivo memperlihatkan perlawanan yang relatif lebih kuat dengan terjadinya peningkatan nilai proPO yang lebih tinggi  dibandingkan  dengan  kontrol.  Hal  ini menununjukkan  bahwa  aplikasi dsRNA  VP-15  dapat memberikan  perlawanan  melalui  peningkatan proPOnya. Pengamatan pada aktivitas proPO sebelum dan sesudah uji tantang dengan WSSV memperlihatkan bahwa  ProPO  tertinggi  diperoleh  pada  pemberian
vaksin dsRNA in vivo (0,138); kemudian diikuti dengan perlakuan  dsRNA  in  vitro  yakin  0,093  dan  terendah perlakuan kontrol sebesar 0,061 (Gambar 3b).
Hasil  analisis  ragam  (ANOVA)  memperlihatkan bahwa perlakuan vaksin dsRNA memberikan pengaruh yang  nyata pada  aktivitas  proPO  (P<0,05); di  mana aktivitas proPO tertinggi didapatkan pada perlakuan dsRNA  VP-15  in  vivo  dan  selanjutnya  in  vitro  dan kontrol.  Hasil  penelitian  ini  juga  mengungkapkan bahwa  aktivitas  proPO  semakin  meningkat  dengan semakin lamanya  hewan uji  terpapar dengan  WSSV. Hal yang sama juga didapatkan pada aplikasi dsRNA VP-24,  di  mana  aktivitas  proPO  udang  windu meningkat pada 24 jam hingga 72 jam setelah ditantang dengan WSSV (Mulyaningrum et al., 2018). Sedangkan Paria et al. (2013) melaporkan bahwa uji tantang WSSV pada  pengujian  dsRNA  VP-28  tidak  memberikan perubahan yang signifikan pada ekspresi gen proPO udang  windu  hingga  24  jam,  namun  terjadi peningkatan ekspresi  hingga tiga  kali lipat  pada 48 jam  setelah  injeksi.  ProPO  merupakan  komponen mayor pada sistem imunitas innate pada udang atau yang  dikenal  dengan  istilah  sistem  kekebalan  non- spesifik seluler dan humoral yang keduanya aktif dan bekerja secara bersama-sama saat terjadi tantangan kekebalan.  Tassanakajon  et  al.  (2013)  menjelaskan bahwa  di  antara  berbagai  jenis  respons  kekebalan humoral,  salah  satu  teknik  imun  invertebrata  yang paling  efektif  melawan  partikel  asing  adalah enkapsulasi  melanotik  seluler,  atau  melanisasi  yang merupakan komponen pertahanan imun pada krustasea di  mana  sintesis  melanin  dilakukan  dengan mengaktivasi  sistem  proPO  yang  melibatkan  enzim
Gambar 3. Nilai  proPO udang  windu  sebelum  dan hari  ke-1,  ke-3, dan  ke-5  pasca  uji tantang  dengan WSSV (a) dan nilai rata-rata proPO udang windu pasca uji tantang (b).
Figure 3. The proPO value of  tiger shrimp before and day-1, day-3, and day-5  after challenged with WSSV (a) and average of proPO value of tiger shrimp after challenged with WSSV (b).
(a)                                                                        (b) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 p ro PO In vitro In vivo Kontrol (Control) 0.00 0.10 0.20 0.30 Awal Initial 1 2 3 p ro PO Pengamatan (hari) / Observation (days) In vitro In vivo Kontrol (Control)
In vitro         In vivo         Kontrol (Control) In vitro         In vivo         Kontrol (Control)
PO  sehingga aktivitas  proPO meningkat.  Sementara penurunan aktivitas sistem proPO dapat menyebabkan kegagalan  fagositosis  dan  menyebabkan  kerusakan jaringan (Amparyup et al., 2013).

## Total Haemocyte Count (THC)
THC  merupakan  salah satu  parameter  gambaran darah yang dapat digunakan untuk mendeteksi tinggi- rendahnya resistensi udang windu. Pola perlawanan udang windu melalui pengamatan respons imun THC memperlihatkan kecenderungan semakin meningkat setelah dilakukan uji tantang dengan WSSV (Gambar 4a).  Udang  windu  baik  yang  diberi  vaksin  dsRNA maupun  kontrol  memberikan  perlawanan  terhadap infeksi  patogen  dengan  indikator  meningkatnya jumlah THC, kecuali pada hari ke-3 pasca uji tantang terjadi  penurunan  yang  walaupun  relatif  kecil.  Tren nilai THC tersebut relatif sama dengan respons imun udang  windu  lainnya  seperti  nilai  proPO  yang  juga cenderung  terjadi  penurunan  pada  hari  ke-3. Penurunan THC pasca uji tantang umumnya disebabkan oleh bermigrasinya sel hemosit dari sistem sirkulasi tubuh  menuju  jaringan  akibat  banyaknya  sel  yang terinfeksi (Yeh et al., 2009).
Pengamatan THC udang windu pasca uji tantang menunjukan  bahwa  perlakuan  dsRNA  in  vivo memperlihatkan rata-rata THC yang lebih tinggi yakni 5.704 x 10 4 sel/mL, kemudian aplikasi dsRNA in vitro sebesar 3.516 x 10 4 sel/mL dan terendah pada perlakuan kontrol yakni 3.322 x 10 4 sel/mL (Gambar 4b). Hasil analisis  ragam  menunjukkan  bahwa  perlakuan pemberian vaksin dsRNA berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap jumlah THC dalam hemolim udang windu. Hasil  penelitian  Mulyaningum  et  al.  (2018)
menunjukkan  bahwa  aplikasi  vaksin  dsRNA  VP-24 memberikan pengaruh yang nyata terhadap jumlah THC pada hemosit udang windu, di mana dosis yang opti- mal adalah 0,2 µg/ekor dengan jumlah THC sebesar 1.550 x 10 4 sel/mL.
Peningkatan  jumlah  THC  merupakan  salah  satu upaya  pertahanan  udang  dalam  meningkatkan resistensinya  terhadap  infeksi  patogen.  Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa penggunaan dsRNA yang  diproduksi  secara  in  vivo  memberikan  efek peningkatan THC tertinggi dengan semakin lamanya terpapar  WSSV.  Peningkatan  sel-sel  hemosit  dalam tubuh udang berperan penting dalam menghambat atau menghancurkan patogen yang masuk ke dalam tubuh udang. Pada krustase, termasuk udang windu, terdapat tiga jenis utama sel darah, yakni: sel hialin, sel semi- granular,  dan  sel  granular,  yang  berperan  dalam kekebalan  tubuh  dan  pertahanan  terhadap  infeksi penyakit (Cerenius et al., 2010; Rowley & Pope, 2012). Seperti  halnya  dengan  vaksin,  pemberian imunostimulan pada udang yang dilakukan secara terus- menerus dapat mengatur dan mempertahankan sistem imun pada kondisi optimal sampai dengan pemberian berhenti dilakukan (Jane et al., 2015).

## Ekspresi  Gen  Antivirus  dan  Histopatologi Hepatopankreas
Ekspresi gen merupakan salah satu parameter yang dapat digunakan dalam mengetahui pertahanan tubuh atau resistensi udang windu. Gen PmAV merupakan gen antivirus yang umumnya dapat diekspresikan pada udang  windu  pada  beberapa  jaringan  khususnya  di jaringan  hepatopankreas  dengan  menggunakan ekspresi  gen  -aktin  sebagai  kontrol  internal
Gambar 4. THC udang windu sebelum dan hari ke-1, ke-3, dan ke-5 pasca uji tantang dengan WSSV (a) dan nilai rata-rata THC udang windu pasca uji tantang (b).
Figure 4. The  THC  of  tiger  shrimp  before  and  day-1,  day-3,  and  day-5  after  challenged  with  WSSV  (a)  and average of THC value of tiger shrimp after challenged with WSSV (b).
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 1 2 3 T H C ( 1 0 4 se l/m L)
T H C ( 1 0 4 ce ll/ m L) Pengamatan (hari) / Observation (days) In vitro In vivo Kontrol (Control) 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 T H C ( 1 0 4 se l/m L) T H C ( 1 0 4 ce ll/ m L) In vitro     In vivo     Kontrol (Control)
(a)                                                                         (b)
(Parenrengi, 2010). Keberhasilan analisis ekspresi gen udang  windu  pada  riset  ini  ditandai  dengan tereksresinya  gen  -aktin  pada  sintesis  cDNA  yang diisolasi dari udang windu. Fragmen DNA tunggal pada posisi sekitar 400 bp dan kontrol negatif tanpa band pada  posisi  tersebut  (Gambar  5a).  Gambar  tersebut menunjukkan  intensitas  ekspresi  yang  relatif  sama sehingga menjadi indikator keberhasilan isolasi cDNA dan proses PCR sudah berlangsung dengan baik.
Analisis ekspresi gen antivirus pada penelitian ini menunjukkan adanya  kecenderungan meningkatnya ketebalan pita ekspresi gen antivirus dari awal sampai dengan  pengamatan  hari  ke-5  yang  menandakan terjadinya  perlawanan  infeksi  virus  yang  semakin meningkat. Analisis semi-kuantitaif ini memperlihatkan bahwa pada awal sebelum uji tantang belum  terlihat  adanya  ekspresi  gen  antivirus  tetapi setelah uji tantang ekspresi gen semakin meningkat pada hari ke-1 dan relatif bertahan pada hari ke-3 dan hari  ke-5  (Gambar  5b).  Ekspresi  gen  pada  aplikasi dsRNA  in  vivo  memperlihatkan  ekspresi  yang  relatif lebih tinggi (ekspresi terlihat jelas pada hari ke-1, ke- 3, dan ke-5) dibandingkan dengan kontrol. Meskipun demikian aplikasi dsRNA in vitro relatif sama dengan kontrol (tanpa aplikasi dsRNA VP-15). Teknologi RNAi dapat secara langsung merusak WSSV tetapi juga dapat menginduksi  gen-gen  respons  imun  (Mocellin  & Provenzano, 2004; Robalino et al., 2004; Reshi et al., 2014);  oleh  karena  itu,  ekspresi  gen  antivirus  yang relatif sama antara perlakuan dsRNA in vitro dengam kontrol  diduga  akibat  respons  dsRNA  yang  lebih banyak terjadi pada proses langsung merusak patogen dibandingkan dengan menginduksi gen antivirus udang windu.  Meskipun  demikian  mekanisme  tersebut secara  detail  masih  diperlukan  penelitian  secara kuantitatif yang lebih mendalam.
Analisis  histopatologi  juga  dapat  dijadikan indikator perlawanan organisme terhadap infeksi pada udang windu. Kematian udang windu pasca uji tantang pada  penelitian  menunjukkan  adanya  infeksi  WSSV yang  dibuktikan  dengan  teknik  PCR.  Selain  analisis tersebut,  kematian  udang  windu  atau  kerusakan jaringan dapat diketahui dengan analisis histopatologi. Histopatologi dilakukan pada jaringan hepatopankreas udang  windu  untuk  mengetahui  hubungan  antara kerusakan jaringan akibat infeksi virus dengan sintasan udang  windu  yang  divaksin  maupun  tidak  divaksin. Pengamatan  histopatologi  udang  uji  pada  aplikasi vaksin  VP-15  menunjukkan  bahwa  jaringan hepatopankreas  udang  tanpa  vaksin  mengalami abnormalitas bila dibandingkan dengan udang yang diberi vaksin baik in vitro maupun in vivo (Gambar 6). Setelah  adanya  uji  tantang  WSSV,  hepatopankreas udang  windu  tanpa  vaksin  mengalami  tingkat kerusakan inti sel lebih tinggi dibandingkan dengan udang  yang  divaksin  dsRNA,  yang  ditandai  dengan masih banyaknya sel-sel yang masih normal. Kerusakan jaringan hepatopankreas udang windu akibat adanya infeksi WSSV telah dilaporkan oleh Firmansyah (2002) dan  Rahmawati  (2002)  yang  ditandai  adanya  badan inklusi yang sentronuklear, eosinofilik, dan terpisah dari  membran  sel,  dan  akhirnya  kemudian  benang- benang kromatin menepi. Mulyaningrum et al. (2018) memperlihatkan adanya beberapa tingkat kerusakan sel jaringan akibat adanya infeksi WSSV pada udang windu, seperti inklusi badan, nekrotik sel, peningkatan degenerasi lemak, dan lisis sel pada hepatopankreas. Perbandingan antara jaringan hepatopankreas udang windu setelah ditantang dengan WSSV telah dilaporkan sebelumnya  oleh  Parenrengi  et  al.  (2018)  di  mana aplikasi vaksin dsRNA memperlihatkan kerusakan yang lebih  rendah  dibandingkan  dengan  udang  windu kontrol atau tanpa perlakuan penggunakan dsRNA.
Gambar 5. Ekspresi gen â-aktin (a) dan antivirus PmAV (b) udang windu pasca uji tantang dengan  WSSV. M=  marker  DNA,  A= dsRNA  in  vitro,  B=  dsRNA  in  vivo,  (-)= kontrol negatif, 0= awal, 1= hari ke-1, 3= hari ke-3, dan 5= hari ke-5. Figure 5. Expression  of  â-actin  gene  (a)  and  antiviral  PmAV  gene  (b)  of  tiger  shrimp  after challenged with WSSV. M= DNA marker, A= in vitro dsRNA, B= in vivo dsRNA, C= control without dsRNA, (-) = negative control, 0= initial, 1= day-1, 3= day-3, and 5= day-5. M        A0      A1      A3      A5      B0       B1      B3       B5      C0      C1      C3       C5       (-)
( a)
(b)

## KESIMPULAN
Produksi dsRNA VP-15 WSSV baik secara in  vitro menggunakan kit MEGAscript RNAi maupun secara in vivo  melalui  kloning  gen  telah  berhasil  dilakukan. Aplikasi  vaksin  dsRNA  VP-15  WSSV  menunjukkan bahwa udang windu yang diberi dsRNA VP-15 baik in vivo maupun in vitro memperlihatkan resistensi lebih tinggi terhadap  infeksi WSSV, di  mana sintasan  dan respons  imun  (proPO  dan  THC)  lebih  baik dibandingkan  dengan  kontrol  (tanpa  dsRNA).  Hasil penelitian  ini  berimplikasi  bahwa  aplikasi  dsRNA (khususnya yang diproduksi secara in vivo) memiliki prospek yang baik untuk dikembangkan dalam upaya penanggulangan penyakit pada biota akuakultur.

## DAFTAR  ACUAN
Akhila, D.S., Mani, M.K., Rai, P., Condon, K., Owens, L.,  &  Karunasagar,  I.  (2015).  Antisense  RNA  me- diated protection from white spot  syndrome virus (WSSV)  infection  in  Pacific  white  shrimp Litopenaeus vannamei. Aquaculture, 435, 306-309.
Amparyup, P., Charoensapsri, W., & Tassanakajon, A. (2013). Prophenoloxidase system and its role in shrimp immune  responses against  major patho- gens. Fish & Shellfish Immunology, 34, 990-1001.
Blakxhall, P. & Daishley, K. (1973). Some blood para- meters of the rainbow trout I. The Kamloops va- riety. J. Fish. Biol., 5, 1-8.
Cerenius, L., Jiravanichpaisal, P., Liu, H., & Söderhäll, I.  (2010).  Crustacean  immunity.  In  Söderhäll,  K. (Ed.). Invertebrate immunity. New York, USA: Landes Bioscience and Springer Science Business Media, wLLC, p. 239-258.
CSIRO (2014). Biosecurity: Protecting Australia, CSIRO Biosecurity Flagship. Paper presented at Workshop CSIRO-BPPT. August 19 th 2014, in Jakarta.
Destoumieux, D., Bulet, P., Loew, D., Dorsselaer, A.V., Rodriguez, J., & Bachere, E. (1997). Penaeidins, a new family of antimicrobial peptide isolated from the shrimp Penaeus  vannmaei (Decapoda). J.  Biol. Chem., 272(45), 28398-28496.
Firmansyah, A. (2002). Uji patogenitas white spot syn- drome  virus  (WSSV)  pada  udang  windu  (Penaeus monodon  Fabr.).  Skripsi.  Fakultas  Perikanan  dan Ilmu  Kelautan,  Institut  Pertanian  Bogor.  Bogor, 88 hlm.
He,  Y.,  Jua,  C.,  &  Zhanga,  X.  (2015).  Roles  of  small RNAs in the immune defense mechanisms of crus- taceans. Molecular Immunology, 68, 399-403.
Jane,  M.S.,  Amar,  A.,  &  Amar,  E.C.  (2015).  Use  of immunostimulans in  shrimp culture:  An update. Biotechnological advances in shrimp health mana- gement  in  the  Philippines.  Research  Signpost, p. 45-71.
Jariyapong, P., Chotwiwatthanakun, C., Direkbusarakom, S., Hirono, I.,
Wuthisuthimethavee, S., & Weerachatyanukul, W. (2015).  Delivery  of  double  stranded  RNA  by Macrobrachium rosenbergii nodavirus-like particles to protect shrimp from white spot syndrome vi- rus. Aquaculture, 435, 86-91.
Kim, D.K., Jang, I.K., Seo, H.C., Shin, S.O., Yang, S.Y., & Kim, J.W. (2004). Shrimp protected from WSSV disease  by  treatment  with  egg  yolk  antibodies (IgY) against a truncated fusion protein derivated from WSSV. Aquaculture, 237, 21-30.
Gambar 6. Gambaran histopatologi hepatopankreas udang windu yang ditantang dengan WSSV (skala bar= 20 µm; A= vaksin dsRNA in vitro; B= vaksin dsRNA  in  vivo;  C=  kontrol  (tanpa  dsRNA);  dan  tanda  panah  hitam menunjukkan inti sel normal, dan tanda panah merah menunjukkan lisis  inti  sel). Figure 6. Histophatolgy profile of tiger shrimp hepatopacreas after challenged with WSSV  (bar  scale=  20  µm;  A=  in  vitro  dsRNA;  B=  in  vivo  dsRNA;  C= control (without dsRNA);  and black arrow= normal nucleus  cell; and red arrow= cell lysis).
Krishnan, P., GireshBabu, P., Saravanan, S., Rajendran,
K.V.,  &  Chaudhari,  A.  (2009).  DNA  constructs expresing  long-hairpin  RNA  (lhRNA)  protects Penaeus  monodon  against  white  spot  syndrome virus. Vaccine, 27, 3849-3855.
Linacero, R., Rueda, J., & Vazquez, A.M. (1998). Quan- tification of DNA. p. 18-21, In Isaac, G. & Ingram, D.S. (Ed.). Molecular Tools for Screening Biodiversity: Plants and Animals. London, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras: Chapman and Hall.
Liu, C.H. & Chen, J.C. (2004). Effect of ammonia on the immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei  and  its  susceptibility  to  Vibrio alginolyticus. Fish Shellfish Immunol., 16, 321-334.
Loy, J.D., Mogler, M.A., Loy, D.S., Janke, B., Kamrud, K., Scura, E.D., Harris, D.L.H., & Bartholomay, L.C. (2012). dsRNA provides sequence-dependent pro- tection  against  infectious  myonecrosis  virus  in Litopenaeus  vannamei.  Journal  of  General  Virology, 93, 880-888.
Mocellin, S. & Provenzano, M. (2004). RNA interfer- ence: learning gene knock-down from cell physio- logy. Journal of Translational Medicine, 2(39), 6 pp.
Mulyaningrum,  S.R.H.,  Parenrengi,  A.,  Tampangallo, B.R.,  &  Trismawanti,  I.,  (2018).  Respons  imun udang  windu  Penaeus  monodon  terhadap  vaksin dsRNA  VP24  pada  dosis  berbeda.  Jurnal  Riset Akuakultur, 13(1), 77-84.
Namikoshi, A., Wu, J.L., Yamashita, T., Nishizawa, T., Nishioka,  T.,  Arimoto,  M.,  &  Muroga,  K.  (2004). Vaccination trials with Penaeus japonicas to induce resistence  to  white  spot  syndrome  virus.  Aquacul- ture, 229(1), 25-35.
Parenrengi, A., Alimuddin, Sukenda, Sumantadinata,
K., Yamin, M., & Tenriulo, A. (2009a). Cloning of ProAV promoter isolated from tiger prawn Penaeus monodon. Indonesian Aquaculture Journal, 4(1), 1-7.
Parenrengi, A., Alimuddin, Sukenda, Sumantadinata,
K., & Tenriulo, A. (2009b). Karakteristik sekuens cDNA pengkode gen antivirus dari udang windu, Penaeus  monodon.  Jurnal  Riset  Akuakultur,  4(1), 1-13.
Parenrengi,  A.  (2010).  Peningkatan  resistensi  udang windu  Penaeus  monodon  terhadap  penyakit  white spot  syndrome  virus  melalui  transfer  gen  Penaeus monodon antiviral. Disertasi. Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor, 108 hlm.
Parenrengi,  A.,  Alimuddin,  &  Tenriulo,  A.,  (2017). Characteristics of viral protein, VP-15, of whitespot syndrome virus isolated from infected tiger shrimp Penaeus  monodon  (Fabricius,  1798).  Indonesian Aquaculture Journal, 12(2), 67-75.
Parenrengi, A., Mulyaningrum, S.H.R., Tenriulo, A., & Nawang, A., (2018). Gen penyandi viral protein 15 (VP-15)  white  spot  syndrome  virus  (WSSV)  dan aplikasinya sebagai vaksin rekombinan pada udang windu. Jurnal Riset Akuakultur, 13(1), 57-65.
Paria, A., Greeshma, S.S., Chaudhari, A., Makesh, M., Purushothaman,  C.S.,  &  Rajendran,  K.V.  (2013). Nonspecific  effect  of  double-stranded  (ds)  RNA on  prophenoloxidase  (proPO)  expression  in Penaeus monodon. Appl. Biochem. Biotechnol., 169, 281-289.
Puneeth,  T.G.,  Akhila,  D.S.,  Dechamma,  M.M., Shreeharsha, J.M., Shivakumar, S.K., & Venugopal, M.N. (2017). Comparative efficacy of dsRNA VP24, VP26, RR1 and WSV477 gene against WSSV infec- tion in Penaeus monodon. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci., 6(2), 665-674.
Rahmawati, R. (2002). Uji patogenitas white spot syn- drome  virus  (WSSV)  pada  udang  windu  (Penaeus monodon Fabr.) melalui metode perendaman dengan konsentrasi 200 µg/mL selama 30, 60, dan 90 menit . Skripsi.  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Bogor, 80 hlm.
Reshi, M.L., Wu, J.L., Wang, H.V., & Hong, J.R. (2014). RNA interference technology used for the study of aquatic virus infections. Fish & Shellfish Immu- nology, 40, 14-23.
Robalino, J., Browdy, C.L., Prior, S., Metz, A., Parnell, P., Gross, P., & Warr, G. (2004). Induction of anti- viral immunity by double-stranded RNA in a ma- rine invertebrata. J. Virol., 78, 10442-10448.
Rowley, A.F. & Pope, E.C.  (2012). Vaccines and crus- tacean  aquaculture:  A  mechanistic  exploration. Aquaculture, 334-337, 1-11.
Sarathi,  M.,  Simon,  M.C.,  Venkatesan,  C.,  Thomas, J., Ravi, M., Madan, N., Thiyagarajan, S., & Hameed, A.S.S.  (2010).  Efficacy  of  bacterially  expressed dsRNA  specific  to  different  structural  genes  of white spot syndrome virus (WSSV) in protection of  shrimp  from  WSSV  infection.  Journal  of  Fish Diseases, 33, 603-607.
Tassanakajon, A., Somboonwiwat, K., Supungul, P., & Tang, S. (2013). Discovery of immune molecules and  their  crucial  functions  in  shrimp  immunity. Fish & Shellfish Immunology, 34, 954-967.
Tenriulo, A., Tampangallo, B.R., Parenrengi, A., & Dewi, R.A. (2016). Isolasi dan karakterisasi gen penyandi protein VP-24 WSSV pada udang windu (Penaeus monodon) untuk pengembangan teknologi RNAi. Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur, hlm. 593-598.
Witteveldt,  J.,  Cifeuntre,  C.C.,  Vlak,  J.M.,  &  Hulten, M.C.W.  (2004).  Protection  of  Penaeus  monodon against white spot syndrome virus by oral vacci- nation. J. Virol., 78, 2057-2061.
Wulandari, A.S. (2010). Konstruksi dan produksi dsRNA gonad-inhibiting  hormone  udang  windu  (Penaeus monodon)  secara  in  vitro  dan  in  vivo  pada  vektor
ekspresi  L4440.  Tesis.  Program  Studi  Magister Bioteknologi, Institut Teknologi Bandung.
Yeh,  S.P.,  Chen,  Y.N.,  Hsieh,  S.L.,  Cheng,  W.,  &  Liu, C.H.  (2009). Immune  response  of white  shrimp, Litopenaeus vannamei, after a concurrent infection with  white  spot  syndrome  virus  and  infectious hypodermal  and  hematopoietic  necrosis  virus. Fish She