## AKTIVITAS LIGNINOLITIK BEBERAPA JAMUR APHYLLOPHORALES DAN KEMAMPUANNYA MENDEGRADASI LIGNIN PADA LINDI HITAM

## Atria Martina, Tetty Marta Linda, Delita Zul, Nila Veronika, Ratna Jelita
Jurusan Biologi FMIPA Universitas Riau Pekanbaru
*Coressponding author: Tria_mt05@yahoo.com

## Abstract
Fourteen  local  isolate  Aphyllophorales  fungi  were  screened  their  ligninolytic  activity.  The  isolate with  highest  ligninolytic  activity  was  tested  it  capability  to  degrade  kraft  blackliquor  lignin.  The biodegradability of  black liquor  is  low because the presence of  lignin  and lignin  derivative in  the wastewater.  These  fungal  were  screened  for  ligninolytic  activity  by  decolorization  on  solid mediacontaining RBBR dye. The ability of the fungal strains to biodegrade kraft black liquor lignin was  performed  by  submerged  fermentation  condition  with  agitation  and  incubation  time  as treatment.  The  solid  culture  result  in  3  isolates  had  ligninolytic  activity  and  Ganoderma  sp.BTA1 gave  the  highest  ligninolytic.  Agitation  and  incubation  time  influenced  ligninbiodegradation  of blackliquor significantly. Optimum condition  for  lignin  biodegradation was at  200 rpm during 25 days with lignin reduction was 45,786%.
Keywords: Ganoderma sp. BTA1, lignin, black liquor, biodegradation

## PENDAHULUAN
Industri pulp dan  kertas  merupakan salah  satu  sektor  industri  yang  memberi kontribusi utama polusi di dunia.  Dua pabrik kertas  yang  terbesar  di  Indonesia  beroperasi di  Riau.  Menurut  Sumathi  dan  Hung  (2006); Font et  al .,  (2003),  proses  pembuatan pulp secara  kimia  menghasilkan  limbah  berupa lindi  hitam.  Lindi  hitam  terutama  mengan- dung  lignin  terlarut  dan  derivatnya  yang memberikan warna hitam kecoklatan.
Lignin merupakan polimer yang strukturnya  heterogen  dan  kompleks  yang terdiri  dari  koniferil  alkohol,  sinapil  alkohol dan  kumaril  alkohol  (Singh,  2006).  Dekom- posisi  lignin  berlangsung  sangat  lambat  di lingkungan  karena  struktur  kimia-nya  yang komplek, heterogen, tidak larut dalam air dan aromatic (Tuomela, 2002; Erden et al ., 2009).
Secara  alamiah  lignin  sukar  didegradasi  dan hanya  sedikit  mikroorganisme  yang  mampu mendegradasinya.
Beberapa kelompok jamur pelapuk putih Basidiomycota  diketahui  mampu  mendegra- dasi  lignin  dengan  efisien  (Dashtban et  al. , 2010).  Jamur  dapat  mendegradasi  lignin karena  mampu  mensintesis  enzim  ligninase.
Kelompok jamur pelapuk putih menghasilkan enzim  ligninolitik  ekstraseluler  yaitu:  lakase (Lac)  dandua  peroksidase: Mn  dependent peroxidase (MnP), versatile  peroxidase (VP) yang mampu mendegradasi lignin (Sivakumar et  al .,  2010).  Mikroba  ligninolitik  yang efisien mampu mendegradasi molekul organik rekalsitran  dan  komplek  seperti  senyawa senobiotik  (Tuomela,  2002;  Kausik  &  Malik, 2009; Song et al ., 2010).
Industri pulp dan  kertas  merupakan salah  satu  sektor  industri  yang  memberi kontribusi utama polusi di dunia.  Dua pabrik kertas  yang  terbesar  di  Indonesia  beroperasi di Riau.  Menurut Sumathi dan Hung (2006); Font et  al .,  (2003),  proses  pembuatan  pulp secara  kimia  menghasilkan  limbah  berupa lindi  hitam.  Lindi  hitam  terutama  mengan- dung  lignin  terlarut  dan  derivatnya  yang memberikan warna hitam kecoklatan.
Proses  biodegradasi  lignin  dipengaruhi oleh  beberapa  faktor    antara  lain  agitasi  dan waktu  inkubasi.  Menurut  Hossain  dan Antharaman  (2006),  peningkatan  kecepatan agitasi  dan  penambahan  waktu  inkubasi  akan meningkatkan aktivitas tiga enzim ligninolitik (LiP,  MnP  dan  lakase)  sampai  batas  tertentu
namun  kemudian  berangsur-angsur  menurun. Martina et  al .,  (2004)  telah  meneliti  kemam- puan Ganoderma sp.  mendegradasi  lignin pada beberapa konsentrasi lindi hitam, namun pengaruh faktor lainnya belum diketahui.
Penelitian  ini  bertujuan  menyeleksi jamur Aphyllophorales isolat lokal Riau yang mempunyai  aktivitas  ligninolitik  dan  menge- tahui  kemampuannya  dalam  mendegra-dasi lignin pada lindi hitam.

## MATERIAL DAN METODE Sampel dan medium
Sampel jamur Aphyllophorales di koleksi dari Taman Nasional Bukit Tigapuluh Kec.  Siberida  Indragiri  Hulu.Peremajaan  dan pemeliharaan  isolat  menggunakan  medium PDA. Seleksi aktivitas ligninolitik mengguna- kan  medium N-limited-RBB (Lestan et  al , 1996)  yang  telah  dimodifikasi  (Martina et  al ,
2004)  dengan  komposisi  (g/l):  indulin  AT (lignin)  0,5g,  RBB  0,2  g,  KH 2 PO 4 0,2g, CaCL 2 .2H 2 O 0,11g, NH 4 NO 3 0,095g, MnSO 4 7H 2 O  0,05g,  ZnSO 4 .7H 2 O  0,0425g, MnSO 4 .H 2 O  0,035  g,  CoCl 2 .6H 2 O  0,007  g, CuSO 4 .5H 2 O  0,007  g,  FeCl 3 .6H 2 O  0,0009  g, NaCl 0,00095 g, yeast ekstrak 0,2g, tween 80 0,05%  dan  H 2 O 2 0,26  ml.  dengan  pH  4,5. Medium disterilkan dengan autoklaf. Thiamin HCl  0,25g/l  yang  telah  disteril  dengan membran  filter  dimasukkan  ke  medium  N- Limited steril sebanyak 1%.

## Uji aktivitas ligninolitik secara kualitatif
Isolat  yang  tumbuh  pada  medium  PDA dipotong  berukuran  d  0,9  cm.  Potongan diinokulasi  ke  medium  N-Limited-RBB  yang mengandung  lignin  dan  diinkibasi  selama  6 hari.  Aktivitas  ligninolitik  dilihat  melalui perubahan    warna  medium  menjadi  kuning. Rasio  perbandingan  diameter  zona  terang dengan  diameter  koloni  (Rasio=Z/K)  diguna- kan  untuk  melihat  kemampuan  aktivitas ligninolitik  tiap  isolat  secara  kualitatif.  Isolat yang  mempunyai  aktivitas  ligninolitik  ter- tinggi  dari  uji  kualitatif  digunakan    untuk  uji kemampuan  isolat  mendegradasi  lignin  pada lindi hitam.

## Pembuatan inokulum
Isolat  yang  mempunyai  aktivitas  ligni- nolitik  tertinggi  diinokulasi  pada  medium
PDA  dan  diinkubasi  selama  20  hari.  Inoku- lum  diperoleh  dari  mencampur  akuades  steril dengan  miselium  berspora  untuk  mendapat- kan suspensi spora sehingga diperoleh jumlah 10 7 spora/ml.

## Biodegradasi lignin pada lindi hitam
Uji biodegradasi lignin pada lindi hitam menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap (RAL)    faktorial  yang  terdiri  dari  2  faktor yaitu  kecepatan  agitasi  dan  waktu  inkubasi. Medium  N-limited  sebanyak  50  ml  yang mengandung  lindi  hitam  30%  diinokulasi dengan spora isolat terpilih sebanyak 10 7 spora/ml.  Kultur  diagitasi  dengan  kece- patan  0,  100,  150  dan  200  rpm  pada  suhu ruang.  Setelah  masa  inkubasi  15,  20  dan  25 hari  dilakukan  pengukuran  kadar  lignin  pada medium  fermentasi.  Pengukuran  kadar  lignin pada medium fermentasi menggunakan metode  folin  fenol  pada  panjang  gelombang 700  nm  (APHA,1995).  Konsentrasi  lignin diperoleh  dengan  memetakan  nilai  absorban pada  kurva  standar.Penentuan  degradasi ligninpada medium fermentasi dihitung menggunakan persamaan :
%  degradasi=  [(X  awal  –  X  akhir)]  /  X awal x 100%
X = konsentrasi lignin

## pH akhir medium fermentasi
Pengukuran pH dilakukan sesuai dengan masa  inkubasi  pada  fermentasi.  Pengukuran ini bertujuan untuk mengetahui perubahan pH selama proses fermentasi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari  14  isolat  yang  diuji,  terdapat  3  isolat yang mempunyai aktivitas ligninolitik dengan potensi  seperti  terlihat  pada  Tabel  1.  Isolat Ganoderma sp.  BTA1  mempunyai  aktivitas ligninolitik  tertinggi  pada  uji  kua-litatif.    Hal ini  terjadi  karena  isolat  tersebut  mampu menghidrolisis lignin  menjadi senya-wa  yang lebih  sederhana  yang  dapat  dilihat  dari pembentukan  zona  perubahan  warna  pada medium.  Enzim  tersebut  menguraikan  lignin pada  medium  menjadi  senyawa  yang  lebih sederhana  (Pointing,  1999;  Singh,  2006). Rasio aktivitas ligninolitik pada penelitian ini
lebih rendah daripada yang diperoleh Martina et  al., (2013)  yaitu 2,75  yang dihasilkan oleh isolat RPL-33 dari ordo Aphyllophorales hasil isolasi dari tanah gambut.
Biodegradasi lignin pada lindi hitam
Kemampuan  isolat Ganoderma sp. BTA1  dalam  mendegradasi  lignin  dari  lindi hitam yang diinkubasi pada berbagai
kecepatan  agitasi  dapat  dilihat  pada  Tabel  1. Penurunan  lignin  dalam  lindi  hitam  sangat nyata  dipengaruhi  oleh  kecepatan  agitasi  dan waktu  inkubasi.Perlakuan  interaksi  antara kecepatan agitasi dan waktu inkubasi menghasilkan  pengurangan  lignin  yang  lebih besar dibanding tanpa interaksi. Tabel 1 . Rasio aktivitas ligninolitik isolat pada medium N-Limited-RBB  inkubasi 6 hari No. Jenis isolat Rasio aktivitas 1. Ganoderma sp. BTA1 2,46 2. AMS 27 2,22 3 Stereum sp. 1,91
Tabel  2 . Penurunan  konsentrasi  lignin   dalam lindi  hitam  (%) oleh Ganoderma sp. BTA1  pada medium N-limited pada suhu ruang Kecepatan agitasi (rpm) Waktu inkubasi (hari) Rata-rata kecepatan agitasi 15 20 25 Kontrol 3,258 h 4,739 h 7,602 g 5,200 d 100 12,936 f 14,036 ef 16,026 c 14,333 c 150 22,860 d 26,970 c 33,488 b 27,773 b 200 22,510 d 25,477 c 45,786 a 31,258 a Rerata waktu inkubasi 15,391 c 17,806 b 25,651 a -
Keterangan  :  Angka-angka  yang  diikuti  oleh  huruf  pada  kolom  yang  sama  berarti  tidak  berbeda nyata menurut uji Duncan (DMRT) pada p=0,05
Tabel 3 . pH medium mengandung lindi hitam yang diinokulasi Ganoderma sp. BTA1 pada suhu ruang
Kecepatan agitasi (rpm) Waktu inkubasi (hari) 0 15 20 25 0 4,51 5,03 5,14 5,46 100 4,50 4,90 5,05 5,31 150 4,53 4,76 4,91 5,13 200 4,50 4,74 4,90 5,01
Kondisi  optimal  degradasi  lignin  pada lindi hitam adalah pada kecepatan agitasi 200 rpm  waktu  inkubasi  hari  ke  25  dengan penurunan konsentrasi  lignin45,786%. Proses degradasi  berlangsung  secara  optimal  karena adanya pemberian  oksigen  yang tinggi  dalam waktu yang cukup lama sebab Ganoderma sp BTA1  bersifat  aerob.  Agitasi  memiliki  pe- ranan  menyuplai  kebutuhan  oksigen  pada organisme  serta  mensuspensi  dan  meratakan nutrisi  yang  dikandung  dalam  kultur  cair. Hasil  ini  serupa  ditemui  pada Phanerochaete chrysosporium bahwa  produksi  salah  satu
enzim  ligninolitik  yaitu  lignin  peroksidase optimum  pada  agitasi  200  rpm  (Alam et al. 2009),  sedangkan  enzim  lakase  pada Rhizoctonia  praticola juga  optimum  pada kecepatan  agitasi  200  rpm  (Janusz et  al ., 2006).
Degradasi  lignin  oleh Ganoderma sp. BTA1  pada  lindi  hitam  dengan  pemberian agitasi  berlangsung  lebih  baik  daripada  tanpa agitasi  (statik). Hal ini dapat disebabkan  oleh pertumbuhan  pelet  pada  kultur  tanpa  agitasi yang lebih rendah daripada pemberian agitasi sehingga aktivitas ligninolitik yang dihasilkan
lebih  sedikit.  D’Souza et  al., (1999) menyatakan bahwa produksi lignin-modifying enzymes pada Ganoderma lucidum umumnya sedikit dalam kultur  statik.   Erden et  al .,
(2009) mendapatkan pada Ganoderma carnosum ,  kecepatan  agitasi  mempengaruhi produksi enzim ligninolitik Lac dan MnP.
Ganoderma sp.  BTA1  mampu  menu- runkan  lignin  pada  lindi  hitam  pada  masing- masing  perlakuan.  Hal  ini  disebabkan  isolat mampu  melombak  lignin  menjadi  senyawa lebih  sederhana  dengan  mengekskre-sikan enzim  ligninolitik  ekstraseluler  yaitu  lakase (Lac),  Mn-peroksidase  (MnP)  dan  lignin peroksidase  (LiP)  yang  memodifikasi  dan menguraikan  lignin  (Baldrian  ,2011).  Namun tidak semua jamur menghasilkan ketiga enzim ini, Lentinus  polychrous dan Ganoderma lucidum pada  lindi  hitam  hanya  menghasilkan lakase  dan  MnP  (D’Souza,  1999;  Budda, 2012).
Metabolisme lignin oleh Ganoderma sp. BTA1 menyebabkan perubahan pH pada lindi hitam  (Tabel  2).  Peningkatan  pH  terjadi sampai  pada  akhir  masa  inkubasi  terutama pada  perlakuan  tanpa  agitasi.  Ada  kecen- derungan  bahwa  semakin  kecil  penurunan lignin  maka  kenaikan  pH  akan  semakin tinggi,  seperti  yang  terlihat  pada  perlakuan tanpa agitasi. Hal ini disebabkan bahwa lignin menghambat  produksi  asam  pada  jamur (Xiong et  al .,  2007).  Kenaikan      pH    dapat diakibatkan  dari  metabolism  nitrogen  jamur dari yeast ekstrak  sehingga  terjadi  penum- pukan produk alkali seperti NH 3 . Levin et al., ( 2002) menyatakan bahwa kandungan N yang tinggi  dapat  menaikkan  pH  dan  ini  akan mempengaruhi kemampuan ligninolitik.

## KESIMPULAN
Ganoderma sp.  BTA1  mempunyai aktivitas  ligninolitik  yang  tertinggi  daripada isolat  Aphylophorales  lainnya.  Pemberian agitasi  dan  waktu  inkubasi  mempengaruhi kemampuan Ganoderma  sp .BTA1  dalam menurunkan  konsentrasi  lignin  pada  lindi hitam.Kemampuan degradasi lignin pada lindi hitam  oleh Ganoderma sp.BTA1  optimal pada kecepatan agitasi 200 rpm dengan waktu inkubasi  25  hari  yaitu    sebesar  45,786%.
Biodegradasi  lignin  pada  lindi  hitam  oleh Ganoderma BTA1 meningkatkan pH medium fermentasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Alam,  M.  Z.,  Mansor,  M.  F.,  Jalal,  K.  C.  A. (2009). Optimization of lignin peroxidase  production  and  stability  by
Phanero-chaete  chrysosporium using sewage-treatment-plant sludge as substrate  in  a  stirred-tank  bioreactor . Journal  of  Industrial  Microbiol.  & Biotechnol . 36(5), 757-764 American Public Health Association (APHA).
(1995).  Standard  Methods  for  the Examination  of  Water  and  Wastewater. APHA. Washington
Baldrian,  P.  (2011).  Production  of  lingo- cellulolytic  enzymes  by  mushrooms.- p.339-343.    Proceedings  of  the  7th International  Conference  on  Mushroom
Biology and Mushroom Products (ICMBMP7) 2011.Arcachon. France Budda,  W.,  Saranthima,  R.,  Khammuang,  S., Milintawisamai,  N.,  Naknil,  S.  (2012). Ligni-nolytic  enzymes  of Lentinus polychrous grown on solid subtrates and its application in black liquor treatment. Journal  of  Biological  Sciences. 12(1), 25-33.
Dashtban,  M.,  Schraft,  H.,  Syed,  T.A.,  Qin, W.  (2010).  Fungal  biodegradation  and enzymatic  modificationof  lignin.  In.t J. Biochem. Mo. Biol . 1(1), 36-50.
Dominic  W.,  Wong,  S.  (2009).  Structure  and Action  Mechanism  of  Ligninolytic Enzymes.  Applied  Biochemistry  and Biotechno-logy . 157(2), 174-209 . D’Souza,  T.  M.,  Merrith,  C.S.,  Reddy,  A. (1999).  Lignin  Modifying  Enzymes  of the White Rot Basidiomycete Ganoderma lucidum . Appl. and Environ.  Micro-biol .  65(12),  5307- 5313.
Font X., Caminal, G., Gabarrell, X., Romero,
S.,  Vicent,  M.  T.  (2003).  Black  liquor detoxification  by  laccaseof Trametes versicolor pellets. J.  Chem.  Technol. Biotechnol . 78, 548-554.
Hossain,  S.  M.,  Anantharaman,  N.  M.  D (2007). Studies on lignin biodegradation of wheat straw using Trametes versicolor snd Lentinus critinus . Indians Electronic Journal . 87, 42-50.
Janusz  G.,  Rogalski,  J.,  Barwinska,  M., Szczodrak,  J.  (2006).  Effect  of  culture conditions  on  production  of  extra- cellular  laccase  by Rhizoctonia  prati- cola . Polish  Journal  of  Microbiology .
55(4), 309-319.
Kausik, P., Malik, A. (2009). Microbial deco- lourization  of  textile  dyes  through isolates  obtained  from  contaminated sites. Journal  of  Sci.  &  Industrial Research . 68, 325-331.
Lestan,  D.,  Strancar,  A.,  Perdih,  A.  (1990).
Influence of some oil and surfactans on ligninolitytic  activity,  growth  and  lipid fatty  acids  of Phanerochaete  chryso- sporium.  Appl.  Microbiol.  Biotech .  34, 426-428.
Levin I, Forchiassin, F., Ramos, A.M. (2002).
Copper  induction  of  lignin-modifying enzymes  in  the  white-rot  fungus Trametes  trogii . Mycologia 94,  377- 383.
Martina,  A.  (2003).  Aktivitas  ligninolitik jamur  Aphyllophorales  strain  lokal  dari
Taman Nasional Bukit Tigapuluh (TNBT)  dengan  menggunakan  Poly  R- 478.  Laporan  Penelitian  HEDS  Project. Universitas Riau.
Martina,  A.,  Devi,  S.  (2004).  Kemampuan Ganoderma  sp .  strain  lokal  mendeg- radasi  lignin  pada  beberapa  konsentrasi lindi  hitam.  hlm.  225-233,  di  dalam Prosiding  seminar  UNRI-UKM  ke  3.
Universitas Riau. Pekanbaru
Martina  A.,  Fibriarti,  B.L.,  Roza,  R.M.,  D. Zul,  D.  Sari,  E.P.  (2013).  Isolasi  dan seleksi  kapang  ligninolitik  dari  tanah gambut  di  desa  Rimbo  Panjang  Kab.
Kampar Propinsi Riau. Prosiding Semirata  MIPA  BKS  PTN  Barat.
Universitas Lampung.
Paszczynski  A.,  Crawford,  R.  L.  (1995) Potential  for  bioremediation  of  xeno- bioticcompounds  by the  white-rot fungus Phanerochaete  chrysosporium . Biotechnol.Prog .11, 368-379.
Singh,  H.  (2006).  Mycoremediation.  Jhon Wiley and Sons, Inc: America.
Sivakumar  R.,  Rajendran,  R.,  Balakumar,  C., Tamilvendan,  M.  (2010).  Isolation, screening  and  optimization  of  produc- tion  medium  for  thermostable  laccase production from Ganoderma sp. International  Journal  of  Engineering Science  and  Technology .  2(12),  7133- 7141.
Sumathi S., Hung, Y. T. (2006). Treatment of pulp  and  paper  mill  wastes.  hlm.  453- 498.  dalam Waste  Treatment  in  the Process  Industries .  CRC  Press.  New York.
Tuomela,  M.  (2002).  Degradation  of  lignin and  other  14C-labelled  compounds  in compost  and  soil  with  an  emphasis  on white-rot  fungi.  Dissertasion.  Dept.  of Applied Chem.and Microbiology. University of Helsinki.
Xiong Z., Zhang, X., Wang, H., Ma, F., Li, L. Li,  W.  (2007).  Application  of  Brown- Rot  Basidiomycetes Fomitopsis sp.
IMER2 for biological treatment of black liquor. Journal  of  Bioscience  and Bioengineering . 104(6), 446-450.