Yelli et al. : Optimasi Volume Buffer Ekstraksi dalam Mengisolasi DNA 381
Jurnal Agrotek  Tropika, Agustus  2022,  Vol  10,  No.  3,  pp.  381  -  387 DOI  :  http://dx.doi.org/10.23960/jat.v10i3.4955 ISSN:  2337-4993  (Print),  2620-3138  (Online)
OPTIMASI VOLUME BUFFER EKSTRAKSI DALAM MENGISOLASI DNA SPESIES MIKORIZA ARBUSKULAR UNTUK IDENTIFIKASI SECARA MOLEKULER
OPTIMIZATION OF  EXTRACTION  BUFFER  VOLUME  IN  ISOLATING ARBUSCULAR  MYCORRHIZAL  DNA  FOR MOLECULAR  IDENTIFICATION
Fitri Yelli*, Maria Viva Rini dan Inggar Damayanti Fakultas Pertanian, Universitas Lampung, Lampung; Indonesia *Email: fitri.yelli@fp.unila.ac.id
* Corresponding Author, Diterima:  2  Mar. 2022, Direvisi: 26 Mei 2022, Disetujui: 3 Jun. 2022

## ABSTRACT
Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) has the ability to increase plant growth by helping the absorption of water and nutrients from the soil. In addition, AMF also plays a role in increasing plant resistance to pathogenic  attacks. Laboratory  of  Plantation  Production, Faculty  of  Agri  culture, Lampung  University has 35 collections of mycorrhizal isolates. These isolates have not been well identified in the species level. This study aims at testing four volumes of InstaGene MatrixTM extraction buffer which are effective and economical  for  AMF  DNA  isolation  to  be  used  for  molecular  identification.  DNA  isolation  of  4  AMF isolates, namely Glomus sp., Gigaspora sp., Acaulospora sp., and Entrophospora sp. is conducted by using InstageneTM  Matrix (BIO-RAD)  extraction  buffer with  the volume  of  10, 15,  20,  and 25 μl .  To  see  the success of DNA Isolation is      by use the isolated DNA directly as a template in PCR process. The research results show that all of   the volumes (10, 15, 20, and 25 μl ) of extraction buffer were able to extract DNA from  all  of  the  four  isolates  tested  except  the  concentration  of  20 μl for  the  isolate  of  Gigaspora  sp.. Therefore, a volume of 10 μl of extraction buffer is able and more efficient to be used to extract AMF DNA spores.
Keywords: DNA, identification, isolation, mycorrhizae, nested PCR.

## ABSTRAK
Fungi  Mikoriza Arbuskular  (FMA)  mampu  meningkatkan  pertumbuhan  tanaman  dengan  cara  membantu penyerapan air dan unsur hara dari dalam tanah. Selain itu, FMA juga berperan dalam meningkatkan ketahanan tanaman terhadap serangan patogen. Laboratorium Produksi Tanaman Perkebunan Fakultas Pertanian Uni- versitas Lampung memiliki 35 koleksi isolat mikoriza. Isolat-isolat koleksi tersebut belum teridentifikasi dengan baik sampai ke level spesies. Penelitian ini bertujuan untuk menguji empat volume buffer ekstraksi InstaGene TM Matrix yang efektif dan ekonomis untuk isolasi DNA FMA yang akan digunakan untuk identifikasi secara molekuler. Isolasi DNA 4 isolat FMA yaitu Glomus sp., Gigaspora sp., Acaulospora sp., dan Entrophospora sp. dilakukan dengan menggunakan buffer ekstraksi Instagene Matrix (BIO-RAD) dengan volume 10, 15, 20, dan 25 μl.  Untuk melihat  keberhasilan isolasi DNA  yang dilakukan yaitu dengan menggunakan DNA tersebut sebagai template atau cetakan dalam proses PCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua volume (10, 15, 20, dan 25 μl) buffer ekstraksi yang diujikan mampu mengekstrak DNA dari ke 4 isolat yang diuji kecuali volume 20 μl pada isolat Gigaspora sp. Oleh karena itu, volume 10 μl buffer ekstraksi sudah dapat digunakan dan lebih efisien untuk mengekstrak DNA dari spora FMA.
Kata kunci:  DNA, identifikasi, isolasi, mikoriza, nested PCR.

## 1.  PENDAHULUAN
Fungi  mikoriza  merupakan  jamur  yang  ber simbiosis mutualisme dengan hampir 80% tanaman yang ada di alam dan 67% diantaranya adalah fungi mikoriza arbuskular (FMA) (Begum et al. , 2019). Hubungan simbiotik yang dibangun an tara tanaman khususnya  akar  dengan  jamur  mikoriza  adalah berupa peningkatan penyerapan air dan unsur hara (khususnya  fosfor),  peningkatan  ketahanan terhadap  stress  dan  perlindungan  terha  dap serangan  patogen  (Song et  al. ,  2015). Apli  kasi mikoriza pada bibit kelapa sawit ( Elaeis guineensis Jacq.)  yang  berada  dalam  kondisi  cekaman  air menunjukkan indikator-indikator pertum buhan yang lebih  baik  dibanding  dengan  bibit  yang  tidak diberikan  perlakuan  mikoriza  (Rini  &  Efriyani, 2016). Beragam manfaat dari jamur mikoriza telah diketahui, namun pemanfaatannya masih terbatas.
Identifikasi fungi mikoriza meliputi jenis serta peranannya terhadap tanaman penting dila kukan agar potensinya dapat dimaksimalkan. Sejauh ini identifikasi mikoriza dilakukan secara tradisional / konvensional melalui pengamatan mikroskopik pada spora  mikoriza  yang  diisolasi  dari  tanah (Deswiniyanti et al. , 2017). Kelemahan identifikasi mikoriza konven sional yaitu tidak bisa konsisten dilakukan untuk semua jenis mikoriza dan di semua daerah  peng  hasil  mikoriza.  Identifikasi  atau karakterisasi morfologi sangat tergantung kepada produksi  spora  dari  masing-masing  mikoriza, sedangkan  tidak  semua  jenis  mikoriza  mampu menghasilkan  spora  dalam  jumlah  banyak  dan bahkan produksi spora juga dipengaruhi oleh musim tertentu (Schultz, 2019). Identifikasi morfologi meng gunakan spora yang dikoleksi dari lapangan cen derung lebih riskan terhadap rusaknya spora sela ma  proses  pengisolasiannya  (Redecker  & Wiemken,  2003),  disamping  itu  prosesnya  juga relatif sulit karena terjadinya perubahan penampilan morfologi  selama  masa  perkembangan  spora tersebut (Nobuhito et al. , 2011).
Kemajuan  terbaru  dalam  bidang  biologi molekuler dapat membantu mengatasi keter batasan identifikasi  dengan  karakter  morfologi  serta berpotensi  untuk  membantu  mempercepat identifikasi  jenis.  Identifikasi  secara  molekuler merupakan  salah  satu  pendekatan  yang  telah digunakan oleh beberapa peneliti untuk mengidenti fikasi mikoriza arbuskular (Crossay et al. , 2017; Na et al. , 2019 )
Parameter  untuk  menetapkan  identitas  dari fungi mikoriza arbuskular menggunakan metode
molekuler ini adalah dengan cara melihat kesamaan (polimorfisme) yang terdapat pada sekuen tiap gen- nya dengan melakukan sekuensing terhadap produk Polymerase Chain Reaction (PCR) (Sha et al. , 2016). Keberhasilan terbentuknya produk PCR tersebut dapat  dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor  seperti pemilihan metode ekstraksi DNA yang tepat.
Diédhiou et al. , (2014) telah berhasil melakukan isolasi DNA fungi mikoriza dengan menggunakan beberapa reagen kimia seperti, DNeasy Plant Mini Kit, serta menggunakan 3 buffer ekstraksi yaitu PVP (polyvinylpyrrolidone), PVPP (polyvinylpoly- pyrrolidone)  dan AC  (activated  charcoal)  yang diaplikasikan secara sendiri atau dikombinasikan. Sedangkan  (Saito,  2015)  menggunakan  buffer ekstraksi dari Bio-Rad yaitu InstaGene Matrix.
InstaGene matrix (Bio-Rad) merupakan salah satu  larutan  yang  berfungsi  untuk  mempercepat proses isolasi DNA mikoriza, selain itu DNA yang dihasilkan mempunyai kualitas yang bagus yang cocok  untuk  digunakan  sebagai template untuk PCR.  Untuk  melakukan  isolasi  DNA  mikoriza volume InstaGene Matrix yang digunakan adalah 20 μl untuk semua jenis spora (Taylor et al. , 2014), Sedangkan ukuran spora mikoriza bervariasi dari yang ukuran kecil yaitu 20 μm untuk spesies Glomus sampai  480  μm  untuk  spesies  Gigaspora.  Oleh karena  itu,  diperlukan  optimasi  volume  larutan InstaGene  yang  sesuai  dengan  ukuran  spora mikoriza. Untuk ukuran spora yang kecil diharapkan volume  larutan  yang digunakan  bisa  diturunkan tetapi tidak menurunkan konsentrasi dan kualitas DNA  yang  dihasilkan  sehingga  akan  lebih menguntungkan dan lebih ekonomis. Oleh karena itu,  penelitian  ini  dilakukan  untuk  menetapkan volume buffer ekstraksi untuk proses isolasi DNA mikoriza sebagai langkah awal identifikasi spesies.

## 2.  BAHAN  DAN  METODE

## 2.1  Waktu dan Tempat
Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium Produksi  Perkebunan  dan  Laboratorium Bioteknologi  Fakultas  Pertanian  Universitas Lampung. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2020 sampai dengan September 2020.

## 2.2  Bahan dan  Alat
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 4 spesies Fungi Mikoriza Arbuskular (FMA) yang merupakan bagian dari koleksi isolat yang
sudah diidentifikasi secara morfologi yang ada di Laboratorium  Produksi  Perkebunan  Universitas Lampung. Spesies FMA tersebut memiliki diameter spora yang berbeda-beda, antara lain: (1) Glomus sp. isolat MV4 (226,7 µm); (2) Entrophospora sp. isolat MV2 (113,33 µm); (3) Gigaspora sp. isolat MV8 (371,67 µm) dan (4) Acaulospora sp. isolat MV33 (193,33 µm)
Bahan-bahan  yang  digunakan  untuk  isolasi DNA mikoriza adalah spora tunggal dari masing- masing isolat, kit komersial InstaGene TM Matrix (Bio-Rad) untuk isolasi DNA, mikropipet dan tips, gloves,  Ethidium  bromide  (EtBr),  agarose  gel, larutan  buffer  (TBE  1x,  TE  1x),  sonikator, waterbath ,  mesin  PCR.  Bahan  yang  digunakan untuk  PCR  adalah  PCR  kit  MyTaq™  Red  Mix (Bioline, USA), pasangan primer NS1 dan NS4 dan pasangan primer AML1 dan AML2, serta ddH2O.

## 2.3  Persiapan Spora Tunggal  Mikoriza
Spora mikoriza yang akan diidentifikasi diisolasi menggunakan  metode  penyaringan  basah menggunakan saringan mikro ukuran 35 μm, 150 μm, 350 μm, dan 500 μm dengan bantuan pinset spora.  Spora  hasil  isolasi  dimasukkan  ke  dalam gelas arloji. Selanjutnya dipilih 10-20 spora untuk dibersihkan menggunakan air steril. Spora tersebut dimasukkan  ke  dalam  microtube  1  ml  dan ditambahkan air sebanyak 0,25 ml. Kemudian spora dimasukkan  ke  dalam  sonikator  dan  disonikasi selama  10  detik  untuk  membersihkan  partikel- partikel yang melekat di dinding spora. Hal yang sama diulang sebanyak 3 kali untuk meyakinkan spora benar-benar bersih. Spora yang sudah bersih ini siap untuk digunakan dalam proses isolasi DNA.

## 2.4   Isolasi  DNA  Mikoriza
Isolasi  DNA  dilakukan  pada  spora  tunggal mikoriza.  Hal  ini  dilakukan  untuk  menghindari tercampurnya spora dari jenis mikoriza yang lainnya. Metode ekstraksi DNA yang akan dilakukan yaitu dengan mengisolasi 1 spora FMA ke dalam cawan atau microtube steril yang berisi Tween-20 dengan konsentrasi  0,05%  di  bawah  mikroskop  stereo. Selanjutnya spora yang berada di dalam microtube steril  dimasukkan  ke  dalam  Ultrasonic  Cleaner selama 1 menit yang bertujuan untuk membersihkan spora tersebut dari kontaminan-kontaminan. Spora dipindahkan  ke  dalam  microtube  0,2  ml  steril menggunakan pinset spora. Spora disimpan dalam suhu  -40 0 C  selama  semalam.  Setelah  itu
ditambahkan  InstaGene  Matrix  (BIO-RAD)  ke dalam microtube yang berisi spora tersebut dengan 4 volume berbeda yaitu: 10 µL, 15 µL, 20 µL, dan 25 µL, masing-masing volume diulang sebanyak dua kali.
Spora  digerus  menggunakan  pipet  tip  steril dengan ujung tumpul sampai hancur. Kemudian dipanaskan pada suhu 56 0 C selama 30 menit dan 95 0 C  selama  10  menit  menggunakan  Thermal Cycler. Dilakukan proses spin down dan diambil supernatannya sebanyak 5 - 25 µL lalu dipindahkan ke microtube 0,2 ml steril, selanjutnya digunakan sebagai DNA template , atau jika tidak langsung digunakan dapat disimpan pada suhu -40 0 C.

## 2.5 PCR DNA Spora Mikoriza
DNA hasil ekstraksi selanjutnya diamplifikasi dengan pasangan primer NS1 sebagai Forward dan NS4  sebagai  primer  Reverse  pada  mesin  PCR (Tabel  1).  Primer  ini  mengamplifikasi  bagian ribosom  subunit  besar  pada  eukariot.  Reagen- reagen yang diperlukan untuk PCR dibuat berupa master  mix  PCR  yang  bertujuan  untuk menghomogenkan semua reagen yang digunakan pada  setiap  sampel.    Komposisi  bahan  yang digunakan dalam PCR mix adalah sebagai berikut: MyTaq™ Mix (Bioline) sebanyak 12,5µL, 1,25 µL (10 µM) primer forward (NS1), 1,25 µL (10 µM) primer reverse (NS1), ddH 2 O steril sebanyak 9 µL dan DNA template sebanyak 1 µL sehingga total volume  reaksi  adalah  25  µL.  Semua  bahan dimasukkan  ke  dalam  microtube  steril  0,2  ml, kemudian di spin down dan dimasukkan ke dalam Thermal Cycler dengan kondisi PCR seperti pada Tabel 2. Selanjutnya dilakukan nested PCR yaitu produk  PCR  awal  digunakan  kembali  sebagai cetakan  DNA  untuk  PCR  kedua dengan  primer AML1 dan AML2 (Tabel 1).
PCR  mix  untuk  reaksi  dengan AML1  dan AML2 ini adalah sebagai berikut: MyTaq™ Mix (Bioline) sebanyak 12,5µL, 1,25 µL (10 µM) primer forward (AML1), 1,25 µL (10 µM) primer reverse (AML2), ddH 2 O steril sebanyak 9 µL dan DNA template sebanyak  1  µL  sehingga  total  volume reaksi adalah 25 µL dengan kondisi PCR seperti pada Tabel 3. Hasil amplifikasi dikonfirmasi pada elektroforesis gel agarose 0,2% (TBE 1x).

## 2.6 Visualisasi  PCR  produk  (Elektroforesis)
Proses  elektroforesis  diawali  dengan menyiapkan  larutan  agarose  gel  0,5%.  Setelah dipanaskan hingga mendidih dan semua agarose
384 Jurnal Agrotek Tropika 10(3): 381-387, 2022
Primer Sekuen basa Jumlah basa NS1 (5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’) 19 basa NS4 (5’-CTT CCG TCA ATT CCT TTA AG-3’) 20 basa AML-1 (5’-ATC AAC TTT CGA TGG TAG GAT AGA-3’) 24 basa AML-2 (5’-GAA CCC AAA CAC TTT GGT TTC C-3’) 22 basa
Tabel 1. Urutan Sekuen Basa Primer NS1, NS4, AML1 dan AML2
terlarut dengan baik maka ditambahkan Ethidium Bromida (Etbr). Selanjutnya dituangkan kedalam tangki mesin elekroforesis yang sudah dipasangkan sisir  untuk  membentuk  sumur  gel  dan  ditunggu hingga larutan beku. DNA produk PCR selanjutnya dimasukkan ke dalam masing-masing sumur gel yaitu sebanyak 3 µL secara berurutan sesuai dengan perlakuan dan ulangan, yaitu dimulai dari volume paling kecil hingga volume terbesar buffer ekstraksi DNA yang digunakan. Sumur pertama digunakan untuk DNA marker (GeneAid 100 bp).

## 3.  HASIL  DAN  PEMBAHASAN
Pada  penelitian  ini  dilakukan  percobaan menggunakan beberapa volume buffer  ekstraksi InstaGene matrix yaitu 10 µL, 15 µL, 20 µL, dan 25 µL untuk mengisolasi DNA empat spesies FMA yang  berbeda  yaitu Glomus sp.  isolat  MV4, Entrophospora sp.  isolat  MV2, Gigaspora sp. isolat  MV8,  dan Acaulospora sp.  isolat  MV33. Untuk spora berukuran kecil diharapkan InstaGene volume 10 µL sudah mampu mengisolasi DNA yang dapat  digunakan  selanjutnya  untuk  proses identifikasi spesies mikoriza.
Untuk menentukan keberhasilan proses isolasi DNA  menggunakan  beberapa  volume  buffer ekstraksi InstaGene  Matrix dalam penelitian ini adalah dengan melihat pita ampifikasi DNA pada produk PCR. Melalui hasil elektroforesis produk PCR  dapat  diketahui  bahwa  DNA  yang  telah diisolasi dari spora mikoriza berhasil atau tidak berhasil  dilakukan  serta  dapat  dilihat  tingkat kemurnian DNA yang dihasilkan. Menurut (Vesty et  al. ,  2017)  tingkat  kemurnian  DNA  dapat
ditentukan  dengan  menggunakan  ND-1000 (NanoDrop Technologies  Inc., Wilmington,  DE, USA) dimana DNA yang murni dikatakan murni atau bebas dari kontaminan-kontaminan jika  ratio A260/280 nm berkisar antara 1,8 – 2,0.
Pasangan  primer  yang  digunakan  untuk amplifikasi DNA hasil isolasi ini merupakan primer untuk identifikasi DNA mikoriza dengan metode nested PCR  yaitu  primer  NS1  dan  NS4  serta AML1 dan AML2, kedua primer ini adalah primer yang telah berhasil digunakan untuk identifikasi spora  mikoriza  (Na et  al. ,  2019).  Gambar  1A, merupakan visualisasi hasil PCR DNA Gigaspora sp pada gel elektroforesis.
Gigaspora sp  merupakan  spesies  mikoriza yang termasuk berukuran paling besar dibandingkan dengan spesies lainnya. Pada Gambar 1A diketahui bahwa  amplifikasi  DNA Gigaspora sp.  dengan menggunakan primer AML1 dan AML2 berhasil dilakukan  pada  DNA  hasil  isolasi  dengan menggunakan volume 10 µl, 15 µl, dan 25 µl dengan ukuran pita DNA yaitu sebesar 800 bp. Dari hasil visualisasi produk PCR melalui elektroforesis dapat dilihat bahwa tidak terdapat pita DNA pada sampel ulangan 1 dengan volume 15 µl. Hal yang sama terjadi pada sampel ulangan 1 dan 2 dengan volume 20 µl. Pada sampel ulangan 2 dengan volume 25 µl pita DNA yang terlihat lebih tipis daripada pita DNA pada ulangan 1. Tebal tipis nya pita DNA hasil PCR saat divisualisasikan pada gel elektroforesis ini dapat dipengaruhi  oleh  konsentrasi  DNA  awal  yang digunakan sebagai DNA cetakan. Pita DNA yang tipis  pada  sampel  volume  25  µl  ulangan  2 menandakan  konsentrasi  DNA  lebih  rendah dibandingkan dengan ulangan 1. Berhasilnya proses
Reaksi Temperatur ( o C) Waktu (menit) Total siklus Pre-denaturation 95 4 1 Denaturation 95 1 Annealing 50 1 30 Extension 72 1 Final extension 72 5 1
Tabel 2. Kondisi reaksi PCR untuk pasangan primer NS1 dan NS4
Gambar 1. Hasil amplifikasi DNA Gigaspora sp. (A) dan Glomus sp. (B). M= Marker
100 200 300 400 500 800 1.500 3.000 M A B
amplifikasi DNA menandakan bahwa proses isolasi DNA sudah berhasil dilakukan.
Pada  Gambar  1B  menampilkan  pita amplifikasi DNA mikoriza jenis Glomus sp. Pada Gambar ini dapat dilihat bahwa hampir semua volume  InstaGene  Matrix  yang  digunakan berhasil mengekstraksi DNA Glomus sp. kecuali sampel  ulangan  2  dengan  volume  25  µl. Sedangkan pada volume reaksi 15 µl DNA pada sampel  ulangan  2  terlihat  lebih  tipis  daripada sampel yang lainnya. Berdasarkan pada Gambar 1B  tersebut  diketahui  bahwa  semua  volume InstaGene Matrix yang digunakan telah mampu mengisolasi DNA mikoriza mulai dari volume 10 µl, 15 µl, 20 µl, dan 25 µl meskipun terdapat pita pada beberapa volume buffer ekstraksi InstaGene yang terlihar lebih tipis namun volume 10 µl telah dapat  digunakan  untuk  isolasi  DNA  mikoriza spesies Glomus sp.
Gambar 2 menyajikan foto gel elektroforesis hasil PCR FMA pada jenis Acaulospora sp. dan Entrophospora sp.  Pada  jenis Acaulospora sp. dapat dilihat bahwa pita DNA terlihat pada semua volume buffer ekstraksi, kecuali pada volume 20 µl ulangan kedua. Pada volume 25 µl ulangan 1, pita DNA muncul tetapi sangat tipis. Hal yang sama juga terlihat pada produk amplifikasi PCR sampel DNA jenis Entrophospora sp. pita DNA terlihat
pada  semua  volume  buffer  yang  digunakan, meskipun pada perlakuan volume 15 µl ulangan 1 dan volume 20 µl ulangan 2 lebih tipis dan terlihat smear dibandingkan sampel lain.
Untuk keperluan identifikasi mikoriza secara molekuler  dibutuhkan  DNA  sampel  dengan kuantitas dan kualitas yang baik. Oleh karena itu prosedur serta bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA perlu dioptimalkan sehingga selain produk yang bagus dapat dihasilkan namun juga secara  ekonomis  lebih  menguntungkan.  Isolasi DNA yang dilakukan pada penelitian ini  adalah dengan menggunakan kit komersial InstaGene TM Matrix  (Bio-Rad).  InstaGene TM Matrix mengandung 6%  w/v Chelex  matrix  yang dapat mengabsorbsi zat-zat terlarut hasil lisis sel yang berpotensi mengganggu proses amplifikasi PCR. Kojima et al. (2011) melakukan isolasi DNA fungi mikoriza menggunakan volume 20 µL InstaGene untuk semua jenis dan ukuran spora mulai dari yang berukuran kecil 40 µm ( Glomus sp.) hingga yang berukuran besar 200 µm ( Gigaspora sp.) Hasil PCR juga dapat dipengaruhi oleh proses PCR  yang  berlangsung.  Jika  produk  PCR  yang dihasilkan mengandung banyak DNA yang tidak spesifik serta ukurannya bervariasi dan pita DNA tampak smear pada  agarose  gel,  kondisi  ini dikatakan bahwa terjadi gangguan pada PCR yang
Gambar 2. Hasil amplifikasi DNA Acaulospora sp. (A) dan Entrophospora sp. (B). M= Marker
telah  dilaksanakan,  bahkan  kadang  bisa  juga menyebabkan  tidak  terbentuk  pita  sama  sekali (Lorenz, 2012).  Meskipun pita DNA hasil PCR terlihat  tipis  namun  hal  ini  sudah  membuktikan bahwa volume buffer ekstraksi dan prosedur isolasi DNA  yang  digunakan  sudah  berhasil  untuk mengisolasi DNA mikoriza.
Tahapan  amplifikasi  DNA  fungi  mikoriza arbuskular yang telah diekstraksi dilakukan dengan teknik  PCR  menggunakan  mesin  thermocycler. Prinsip dasar dari alat ini adalah memperbanyak fragmen  DNA  target  menggunakan  bantuan oligonukleotida  primer  (Zein  &  Prawiradilaga, 2013). Pada penelitian ini digunakan dua pasang primer NS dan AML, dengan metode nested PCR. Metode  ini  adalah  suatu  teknik  perbanyakan (replikasi)  sampel  DNA  menggunakan  bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang  primer  untuk  mengamplifikasi  fragmen dengan  menggunakan nested PCR,  jika  ada fragmen  yang  salah  diamplifikasi  maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua  kalinya  oleh  primer  yang  kedua.  Dengan demikian, nested PCR  adalah  PCR  yang  sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi. Meskipun waktu yang diperlukan lebih lama dibandingkan dengan teknik PCR biasa.

## 4.  KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh  dapat disimpulkan  bahwa  volume  buffer  ekstraksi InstaGene  Matrix  10  µl  sudah  cukup  untuk mengekstraksi DNA dari spora FMA pada semua spesies yang diuji. Hal ini lebih ekonomis. Dari penelitian  ini  disarankan  untuk  melakukan pemurnian DNA terlebih dahulu sebelum digunakan untuk identifikasi spesies mikoriza secara molekuler.

## 5.  UCAPAN TERIMA  KASIH
Tulisan ini diterbitkan atas hibah penelitian yang berasal  dari  DIPA  BLU  Universitas  Lampung
Tabel 3. Kondisi reaksi PCR untuk pasangan primer AML1 dan AML2
Reaksi Temperatur ( o C) Waktu (menit) Total siklus Pre-denaturation 95 4 1 Denaturation 95 1 Annealing 58 1 30 Extension 72 1 Final extension 72 5 1
Tahun  anggaran  2020.  Ucapan  terimakasih diberikan kepada semua pihak yang berkontribusi dalam pelaksanaan penelitian ini.

## 6.  DAFTAR  PUSTAKA
Begum, N., C. Qin, M. A. Ahanger, S . Raza, M. I. Khan, M. Ashraf, N. Ahmed & L. Zhang. 2019. Role of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in Plant Growth Regulation/ : Implications in Abiotic Stress Tolerance. Front. Plant Sci. 10: 1–15. Bever J. D, J. B. Morton, J. Antonovics & P. A. Schultz. 2019. Host-Dependent Sporulation and  Species  Diversity  of  Arbuscular Mycorrhizal Fungi in a Mown Grassland. J. Ecol. 84 (1): 71–82.
Crossay, T., C. Antheau, D. Redecker, L. Bon, N. Chedri, L. Guentas, Y. Cavaloc & H. Amir. 2017. New Method for the Identification of Arbuscular Mycorrhizal Fungi by Proteomic- Based Biotyping of Spores Using MALDI- TOF-M S. Sci. Rep. 7: 1–16.
Deswiniyanti, N. W., N. Kadek & D. Lestari. 2017. Identification  of Arbuscular  Mycorrhizal Fungi in Rhizosphere Soil of Several Grass Species and Cacao ( Theobroma cacao L.) Based  on  its  Spore  Morphological Characteristics. J. Bio sci. Biotechnol. Res.
Asia. 107 (1): 102–107.
Diédhiou, A. G., W. L. Borges, O. Sadio & S. M. D.  Faria.  2014.  Acta  Scientiarum Assessment of DNA Extraction Methods for Detection of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in  Plant  Roots  by  Nested-PCR. Acta  Sci. 36: 433–441.
Lorenz, T. C. 2012. Polymerase Chain Reaction/ : Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimi- zation Strategies. J. Vis. Exp. 22 (63): 1-14. Na, A., S. Kabirun, K. Fujiyama & D. Widianto. 2019. Molecular Identification and In Vitro Propagation of Arbuscular Mycorrhiza from Tea Plant Rhizosphere. Curr. Res. Environ. Appl. Mycol. 9: 92–102.
Nobuhito, N., K. Yuki & M. Yukio. 2011. Molecular Identification of Arbuscular Mycorrhizal Fungi Colonizing Athyrium yokoscense of the Ikuno Mine Site, Japan. J. Jpn. Bot. 86:73–81.
Redecker, D., H. Isabelle & A. Wiemken. 2003. Molecular  Identification  of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in Roots: Perspectives and Problems. Folia geo bot. 38: 113–124. Rini, M. V. & U. Efriyani. 2016. Respons Bibit
Kelapa  Sawit  ( Elaeis guineensis Jacq  .) terhadap  Pemberian  Fungi  Mikoriza Arbuskular  dan  Cekaman Air. Menara Perkebunan. 84 (2): 107–116.
Sawaki,  H.,  S.  Koya  &  M.  Saito.  1998.
Phylogenetic  Position  of  an Arbuscular Mycorrhizal  Fungus,  A caulospora gerdemannii , and its Synanamorph Glomus leptotichum , Based Upon 18S rR NA Gene Sequence. Mycoscience. 39: 477–480. Sha, S. P., A. Anupama, P. Pradhan, G. S. Prasad
&  J.  P.  Tamang.  2016.  Identification  of
Yeasts  by  Polymerase-Chain-Reaction- Mediated  Denaturing  Gradient  Gel Electrophoresis  in  Marcha,  an  Ethnic Amylolytic  Starter  of  India. Journal  of Ethnic Foods . 3 (4): 292–296.
Song, Y., D. Chen, K. Lu, Z. Sun & R. Zeng. 2015. Enhanced  Tomato  Disease  Resistance Primed by Arbuscular Mycorrhizal Fungus. Front. Plant Sci. 6: 786.
Kojima, T., H. Sawaki & M. Saito. 2011. Detection of  Arbuscular  Mycorrhizal  Fungi  , Archaeospora  Leptoticha,  and  Related Species Coloning Plant Roots by Specific PCR  Primer  Detection  of  Arbuscular Mycorrhizal Fungi , Archae ospora. Soil Sci. Plant Nutr . 50 (1): 95–101.
Vesty, A., K. Biswas, M. W. Taylor, K. Gear & R. G. Douglas. 2017. Evaluating the Impact of DNA Extraction Method on the Representation of  Human  Oral  Bacterial  and  Fungal Communities. PloS one . 12 (1): 1–13.