## EVALUATION OF ANTIOXIDANT PROPERTIES AND STANDARDIZATION OF Centella asiatica L. Urb HERBS FROM VARIOUS REGIONS IN WEST JAVA
Kania Fajarwati 1 *, Wempi Budiana 1 , R. Herni Kusriani 1 , Neng Dian Mardiana 1 , Taufik Muhammad Fakih 2
1 Fakultas Farmasi, Universitas Bhakti Kencana, Jl Soekarno-Hatta No 754, Cipadung Kidul, Kec. Panyileukan, Kota Bandung, Jawa Barat 40614,
Indonesia
2 Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Pengetahuan Alam, Universitas Islam Bandung, Jl Ranggagading No 8, Tamansari, Kec. Bandung Wetan, Kota Bandung, Jawa Barat 40116, Indonesia
Corresponding author: Kania Fajarwati ( kania.fajarwati@bku.ac.id )

## ARTICLE HISTORY
Received: 13 March 2023                                 Revised: 11 July 2024                                       Accepted: 27 July 2024

## Abstract
Centella  asiatica L.  Urb,  commonly  known  as  gotu  kola,  is  a  plant  renowned  for  its beneficial properties, particularly as an antioxidant that aids in neutralizing free radicals and  preventing  associated  cellular  damage.  Free  radicals  are  implicated  in  various diseases. The active compounds in gotu kola responsible for its antioxidant potential include  tannins,  flavonoids,  and  terpenoids.  This  study  aims  to  establish standardization  parameters  for  gotu  kola  and  assess  the  antioxidant  activities  of samples  sourced  from  five  different  regions.  The  standardization  process  yielded specific and non-specific parameters that adhere to the requirements outlined  in the Indonesian  Herbal  Pharmacopoeia.  Samples  were  extracted  using  the  maceration method with 96% ethanol, and the antioxidant activity was evaluated qualitatively via thin-layer  chromatography  and  quantitatively  using  a  UV-visible  spectrophotometer. The  DPPH  (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)  method  indicated  varying  IC 50 values ranging from 67.61 to 89.32 μg/mL, with the most potent extract originating from the Pangandaran region at 67.61 μg/mL, compared to ascorbic acid at 4.22 μg/mL. These findings underscore the antioxidant potential of all five gotu kola extracts studied.
Keywords: antioxidant activity, centella asiatica L. Urb, DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl), gotu kola, standardization process
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205

## PENILAIAN SIFAT ANTIOKSIDAN DAN STANDARISASI HERBA

## Centella asiatica L. Urb DARI BERBAGAI DAERAH DI JAWA BARAT
Abstrak Centella asiatica L. Urb, yang lebih dikenal sebagai herba pegagan, adalah tumbuhan yang  memiliki  manfaat  yang  berharga,  salah  satunya  sebagai  antioksidan  yang membantu mengimbangi radikal bebas dan mencegah kerusakan sel yang disebabkan oleh  mereka.  Radikal  bebas  diketahui  memainkan  peran  dalam  berbagai  penyakit. Senyawa-senyawa  seperti  tanin,  flavonoid,  dan  terpenoid  yang  terdapat  dalam  herba pegagan  memiliki  potensi  sebagai  antioksidan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk menetapkan parameter standar herba pegagan serta mengevaluasi aktivitas antioksidan dari  sampel  herba  pegagan  yang  berasal  dari  lima  wilayah  berbeda.  Parameter standarisasi  yang  spesifik  dan  non-spesifik  yang  diperoleh  dari  proses  ini  telah memenuhi  persyaratan  yang  ditetapkan  dalam  Farmakope  Herbal  Indonesia.  Sampel diekstraksi  menggunakan metode maserasi  dengan  pelarut  etanol  96%,  dan  aktivitas antioksidan  dievaluasi  secara  kualitatif  dengan  menggunakan  kromatografi  lapis  tipis dan  secara  kuantitatif  dengan  menggunakan  spektrofotometer  UV-visible.  Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) digunakan untuk menilai aktivitas antioksidan, dengan rentang nilai IC 50 antara 67,61 hingga 89,32 μg/mL. Ekstrak yang paling aktif ditemukan berasal dari wilayah Pangandaran dengan nilai IC 50 sebesar 67,61 μg/mL, dibandingkan dengan  asam  askorbat  yang  memiliki  nilai  IC 50 sebesar  4,22  μg/mL.  Kesimpulannya, semua lima ekstrak herba pegagan menunjukkan potensi sebagai sumber antioksidan yang berharga.
Kata kunci : aktivitas antioksidan, centella asiatica L. Urb, DPPH (1,1-difenil-2- pikrilhidrazil), herba pegagan, proses standarisasi

## Pendahuluan
Indonesia dikenal sebagai salah satu negara yang memiliki beragam tanaman obat yang  belum  sepenuhnya  dijelajahi  mengenai  manfaat  dan  komposisinya.  Untuk meningkatkan  peran  obat  tradisional  sebagai  bentuk  pengobatan,  perlu  dilakukan penelitian terhadap tanaman obat, dan pada akhirnya, penggunaan tanaman-tanaman ini sebagai obat yang aman dan efektif oleh masyarakat Indonesia dapat tercapai. 1 Salah  satu  kondisi  yang  dapat  dihindari  adalah  penyakit  yang  timbul  akibat penurunan  fungsi  organ  karena  paparan  radikal  bebas. 2 Untuk  melawan  reaktivitas senyawa  tersebut,  tubuh  kita  memiliki  sebuah  sistem  yang  di  dalamnya  memiliki antioksidan. 3 Antioksidan adalah senyawa yang memiliki kemampuan dalam melawan radikal  bebas  dalam  proses  oksidasi. 3 Berdasarkan  informasi  yang  ada,  antioksidan dapat  diklasifikasikan  menjadi  dua  jenis,  yaitu  antioksidan  buatan  dan  alami.  Sumber alami antioksidan juga dapat ditemukan dalam berbagai jenis sayuran hijau, termasuk pegagan ( Centella asiatica L. Urb). 4
Senyawa-senyawa sekunder yang terdapat dalam tanaman ini meliputi flavonoid, saponin, tanin, alkaloid, steroid, dan triterpenoid. 5 Adapun Senyawa lain yang terdapat dalam herba pegagan yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan yaitu tanin, flavonoid, dan  terpenoid. 6 Menurut  penelitian  sebelumnya,  Ekstrak  etanol  dari  herba  pegagan menunjukkan aktivitas antioksidan yang signifikan dengan nilai IC 50 sebesar 78,26 ppm. 7 Mengingat  pentingnya  peran  obat  tradisional  dan  berbagai  tumbuhan  dalam bidang  kesehatan  proses  standarisasi  dilakukan  dengan  tujuan  untuk  memperoleh simplisia dan ekstrak yang lebih baik sesuai aturan yang telah ditetapkan, berdasarkan
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205
parameter mutu spesifik dan non spesifik. 8 Sebelumnya penelitian tentang standarisasi yang pernah dilakukan seperti yang dilakukan oleh Rahmaniati M, Ulfah dan Mulangsari 9 terhadap  ekstrak  etanol  daun  pegagan  pada  dua  tempat  tumbuh  yang  berbeda  yaitu Kabupaten  Tawangmangu dan  Kabupaten  Kediri.  Hasil  yang  diperoleh  dari  penelitian tersebut belum memenuhi persyaratan yang ditetapkan  pada Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan. Sedangkan hasil penelusuran pustaka belum ditemukan penelitian mengenai standarisasi herba pegagan dengan parameter spesifik dan non-spesifik dari beberapa  tempat  tumbuh  yang  berbeda  dan  menurut  penelitian  Leliqia 10 terdapat perbedaan aktivitas antioksidan pada lengkuas dari tempat yang berbeda.
Oleh karena alasan tersebut, peneliti tertarik untuk melakukan proses standarisasi herba pegagan dan membandingkan uji  aktivitas antioksidan dari beberapa daerah di Jawa  Barat,  diantaranya  daerah  Lembang,  Sumedang,  Pangandaran,  Bogor,  dan Sukabumi.

## Metode

## Alat
Alat  gelas  standard,  oven,  grinder  (makindo),  mikroskop,  kertas  saring,  cawan penguap (RRC), hot plate, desikator, tanur, timbangan analitik (Mettler Toledo ME204E), moisture balance, rotary evaporator , lampu UV 254 nm dan 366 nm, mikropipet (Thermo Scientific), pipet tetes, spektrofotometri UV-Vis (Shimadzu Uv-1800).

## Bahan
Herba  pegagan  ( Centella  asiatica L.  Urb)  yang  berasal  dari  daerah  Lembang, Sumedang,  Bogor,  Sukabumi,  dan  Pangandaran  yang  dikumpulkan  pada  bulan Desember 2021 dan telah dideterminasi dibuktikan dengan surat hasil determinasi no 6543/IT1.C11.2/TA.00/2021  pada  instansi  Sekolah  Ilmu  Teknologi  Hayati  Institut Teknologi Bandung (SITH ITB). Kloralhidrat 70%, air jenuh kloroform, etanol p teknis, aquadest, toluene, asam klorida encer LP, etanol 96% p.a, sitroborat, FeCI 3 10%, H 2 SO 4 10% dalam metanol p.a, DPPH, ammonia 25%, kloroform p, reagen uji fitokimia vitamin C, silica gel F254.
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205

## Metode
Gambar 1. Diagram alir penelitian uji aktivitas antioksidan dan standarisasi herba
Centella asiatica L. Urb.

## Penyiapan Bahan
Pengumpulan  bahan  herba  pegagan  dari  lima  daerah  yang  berbeda  yaitu Sumedang,  Sukabumi,  Pangandaran,  Lembang  dan  Bogor.  Setelah  herba  pegagan didapatkan kemudian dibersihkan dari pengotor atau dari benda-benda asing yang tidak digunakan.  Kemudian,  lakukan  proses  pencucian  menggunakan  air  mengalir  secara menyeluruh  untuk  menghapus  segala  kotoran  yang  masih  menempel  pada  herba pegagan,  kemudian  biarkan  mengering.  Kemudian  dirajang  agar  dapat  mempercepat proses pengeringan dengan menggunakan lemari pengering pada suhu 50 ℃ selama 48
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205
jam. Kemudian lakukan sortasi kering untuk memisahkan bahan yang sudah kering dari bahan  asing  lainnya  dan  memilih  bahan  yang  layak  digunakan  yang  ditandai  dengan herba yang mudah hancur. Selanjutnya simplisia dihaluskan dengan menggunakan alat yaitu mesin grinder kemudian disimpan dalam wadah tertutup rapat. 11

## Standarisasi dan Skrining Fitokimia
Standarisasi simplisia melibatkan penilaian berdasarkan parameter yang bersifat khusus  dan  umum.  Parameter  khusus  mencakup  identitas,  pengamatan  mikroskopis, dan  pengamatan  makroskopis,  sedangkan  parameter  umum  mencakup  penentuan kadar air, analisis ayak kering, kandungan serat kasar, dan kandungan abu. 12
Skrining fitokimia dari simplisia dan juga ekstrak, terdiri dari pemeriksaan golongan senyawa menggunakan pereaksi yang sesuai, seperti alkaloid (dragendorff dan mayer), flavonoid (serbuk mg, HCl dan amyl alcohol), tannin (gelatin, FeCl 3 , dan steasny), kuinon (NaOH), saponin, dan steroid atau triterpenoid (Liebermann-burchard). 13,14

## Ekstraksi
Bahan yang digunakan adalah 200 gram serbuk kering herba pegagan yang telah diekstraksi  menggunakan  metode  maserasi  dengan  pelarut  etanol  96%.  Sampel direndam  selama  3x24  jam,  dan  diaduk  selama  6  jam  pertama  setiap  setelah penggantian pelarut, maserat yang didapatkan dipisahkan lalu di pindahkan ke tempat lain,  sedangkan  ampasnya  diperlakukan  sama  sebanyak  3  kali  maserasi.  Maserat tersebut  disatukan  kemudian  lakukan  pemekatan  dengan  menggunakan  alat rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. 15

## Aktivitas Antioksidan
Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan secara kualitatif dengan menggunakan teknik KLT GF254 menggunakan pengembang non polar seperti n-heksana:etil asetat (6:4),  semipolar  kloroform:methanol  (8:2),  dan  polar  menggunakan  etil  asetat:asam format:air  (8:1:1)  dan  secara  kuantitatif,  aktivitas  antioksidan  diukur  dengan membandingkan dengan vitamin C menggunakan metode 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) dan menggunakan spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1800).
𝑃𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖 (%)   = 𝐴𝑏𝑠 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝐴𝑏𝑠 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝐴𝑏𝑠 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
× 100%
Nilai IC 50 dihitung menggunakan persamaan regresi linear y = bx + a, di mana x adalah konsentrasi larutan uji dan y adalah persentase inhibisi.

## Hasil
Standarisasi herba pegagan dilakukan dengan beberapa pengujian. Tabel 1  dan Tabel  2  menunjukkan  hasil  pemeriksaan  standarisasi  spesifik  herba  pegagan  secara makroskopis dan mikroskopis.

## Tabel 1. Hasil Pemeriksaan Makroskopik Herba Pegagan

## No  Pemeriksaan  Lembang  Bogor  Pangandaran  Sumedang  Sukabumi
1. Bentuk
Kipas dengan tepi bergigi, permukaan dan punggungnya yang licin, tulang daun berpusat di akar. 2. Warna Hijau
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205

## Tabel 1. (Lanjutan)
Tabel 2. Hasil Pemeriksaan Mikroskopik Herba Pegagan
Hasil  pengujian  standarisasi  non  spesifik  herba  pegagan  terlihat  pada  Tabel  3 mengenai kadar sari herba pegagan, susut pengeringan dan kadar air herba pegagan pada Tabel 4,  dan pengujian kadar abu pada Tabel 5.
Tabel 3. Hasil Penetapan Kadar Sari Herba Pegagan
Parameter Standarisasi Hasil % b/b Lembang Bogor Pangandaran Sumedang Sukabumi Kadar sari larut air 23% 16% 18% 18% 23% Kadar sari larut etanol 33% 20% 20% 15% 25%
Tabel 4. Hasil Susut Pengeringan dan Kadar Air Herba Pegagan
Parameter Standarisasi Hasil % b/b Lembang Bogor Pangandaran Sumedang Sukabumi Susut pengeringan 5,831 7,076 6,916 5,868 6,477 Kadar air 2,5* 2,5* 5* 5* 5*
Ket   * : % v / b
No Pemeriksaan Lembang Bogor Pangandaran Sumedang Sukabumi 3. Bau Tidak berbau 4. Rasa Agak pahit 5. Ukuran Tinggi 19,6 cm Tinggi 14 cm Tinggi 19,2 cm Tinggi 9 cm Tinggi 20,2 cm Fragmen Pengenal Urat daun dengan kristal kalsium oksalat yang memiliki bentuk roset yang khas CA- Lembang CA-Bogor CA- Pangandaran CA- Sumedang CA-Sukabumi
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205
Tabel 5. Hasil Penetapan Kadar Abu Herba Pegagan Parameter Standarisasi Hasil % b/b Lembang Bogor Pangandaran Sumedang Sukabumi Kadar abu total 11,3 11 11 10,5 10,6 Kadar abu tidak larut asam 0,3 1,3 1,3 0,6 1,6
Setelah  dilakukan  standarisasi,  sampel  simplisia  dan  ekstrak  herba  pegagan  di lakukan pengujian skrining fitokimia untuk melihat ada tidaknya golongan senyawa pada sampel tersebut. Hasil pengujian tersebut terlihat pada Tabel 6.
Tabel 6. Hasil Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak Herba Pegagan
Senyawa Fitokimia Hasil Skrining Simplisia dan Ekstrak Herba Pegagan Lembang Bogor Pangandaran Sumedang Sukabumi S E S E S E S E S E Alkaloid − − − − − − − − − − Flavonoid + + + +
+
+
+ + + + Saponin + − + − + − + − + − Tannin + + + +
+
+ + + + + Kuinon − − − − − − − − − − Steroid/ Triterpenoid + + + +
+
+
+ + + +
Ket : Positif (+)  = mengandung senyawa yang diujikan                  S = Simplisia
Negatif (−)  = tidak mengandung senyawa yang diujikan        E = Ekstrak
Setelah dilakukan ekstraksi, dilakukan penghilangan pelarut menggunakan Rotary evaporator  sehingga  menghasilkan  ekstrak  kental.  Hal  ini  dilakukan  untuk memperkirakan  banyaknya  senyawa  yang  tersari  dalam  ekstrak.  Hasil  perhitungan rendemen ekstrak terdapat pada Tabel 7.

## Tabel 7. Hasil Rendemen Ekstrak Etanol Herba Pegagan
Pengujian  aktivitas  antioksidan  dilakukan  secara  kualitatif  dan  juga  kuantitatif. Pengujian  antioksidan  secara  kualitatif  menggunakan  Kromatografi  Lapis  Tipis  F254 dengan beberapa penampak bercak yang sesuai, sebagaimana terlihat pada Gambar 2- 4. Hasil yang ditandai menunjukkan adanya golongan senyawa yang dimaksud.
No Sampel Herba Pegagan Berat Ekstrak (g) Hasil Rendemen (% b/b) 1. Lembang 29,85 14,92 2. Sukabumi 31,55 15,77 3. Bogor 25,45 12,72 4. Pangandaran 27,89 13,94 5. Sumedang 21,15 10,57
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205
Gambar 2. Kromatogram lapis tipis ekstrak etanol herba pegagan, fase diam silika gel F 254 nm, fase gerak non polar yaitu n-heksana:etil asetat (6:4). (1) herba pegagan daerah Lembang, (2) ekstrak etanol daerah Bogor, (3) ekstrak etanol daerah Pangandaran, (4) ekstrak etanol daerah Sumedang, (5) ekstrak etanol daerah Sukabumi. (a) sinar tampak, (b) sinar UV 254 nm, (c) sinar UV 365 nm, (d) penampak bercak H 2 SO 4 10%, (e) penampak bercak AlCl 3 5%, (f) penampak bercak FeCl 3 10%, (g) penampak bercak DPPH 0,2%.
Gambar 3. Kromatogram lapis tipis ekstrak etanol herba pegagan, fase diam silika gel F 254 nm, fase gerak semi polar yaitu kloroform:methanol (8:2). (1) herba pegagan daerah Lembang, (2) ekstrak etanol daerah Bogor, (3) ekstrak etanol daerah Pangandaran, (4) ekstrak etanol daerah Sumedang, (5) ekstrak etanol daerah Sukabumi. (a) sinar tampak, (b) sinar UV 254 nm, (c) sinar UV 365 nm, (d) penampak bercak H 2 SO 4 10%, (e) penampak bercak AlCl3 5%,  (f) penampak bercak FeCl 3 10%, (g) penampak bercak DPPH 0,2%.
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205
Gambar 4. Kromatogram lapis tipis ekstrak etanol herba pegagan, fase diam silika gel F 254 nm, fase gerak polar yaitu Etil asetat:Asam format:Air (8:1:1). (1) herba pegagan daerah Lembang, (2) ekstrak etanol daerah Bogor, (3) ekstrak etanol daerah Pangandaran, (4) ekstrak etanol daerah sumedang, (5) ekstrak etanol daerah Sukabumi. (a) sinar tampak, (b) sinar UV 254 nm, (c) sinar UV 366 nm, (d) penampak bercak H 2 SO 4 10%, (e) penampak bercak AlCl3 5%, (f) penampak bercak FeCl 3 10%, (g) penampak bercak DPPH 0,2%.
Pengujian antioksidan secara kuantitatif, menggunakan spektrofotometer UV-VIS dengan  sebelumnya  membuat  terlebih  dahulu  beberapa  konsentrasi  DPPH  untuk memilih  konsentrasi  DPPH  yang  dapat  digunakan  untuk  pengujian,  dimana  syarat penggunaan DPPH adalah memiliki absorban pada rentang 0,8-1,0.
Gambar 5. Kurva kalibrasi DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil).
Hasil pengujian antivitas antioksidan dari herba pegagan pada beberapa daerah di Jawa Barat terlihat pada gambar 6, dimana aktivitas antioksidan paling kuat terdapat pada herba pegagan dari Pangandaran dengan nilai IC50 sebesar 67,61 μg/mL.
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205
Gambar 6. Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak herba pegagan

## Pembahasan
Sampel yang digunakan berupa herba pegagan dari daerah yang berbeda di Jawa Barat  yaitu  Sumedang,  Sukabumi,  Pangandaran,  Lembang  dan  Bogor.  Herba  yang sudah dirajang, dilakukan pengeringan dengan menggunakan lemari pengering dengan suhu  50ºC.  Tujuan  dari  dilakukan  pengeringan  adalah  untuk  menghilangkan  atau mengurangi  kandungan  air  dari  dalam  sampel.  Kemudian  sampel  dilakukan penyerbukkan menggunakan grinder untuk memperkecil ukuran partikel.
Sebagaimana  hasil  karakterisasi  simplisia  pada  Tabel  1,  terlihat  ciri  khas  dari masing-masing sampel herba pegagan, dimana terdapat perbedaan dari ukuran herba tersebut, dan pada Tabel 2 terdapat ciri khas secara mikroskopik dari herba pegagan, dimana herba tersebut memiliki ciri khas kristal kalsium oksalat yang berbentuk roset.
Dari hasil penetapan kadar sari Tabel 3, kadar air dan susut pengeringan Tabel 4 dan  kadar  abu  Tabel  5,  semua  hasil  yang  didapatkan  memenuhi  persyaratan  pada Farmakope  Herbal  Indonesia  (FHI),  syaratnya  adalah  bahwa  kadar  ekstrak  harus melebihi  15,4%  untuk  ekstrak  larut  air  dan  lebih  dari  4,4%  untuk  ekstrak  larut  etanol. Untuk  penetapan  kadar  air  semua  sampel  berada  di  bawah  batas  maksimal  yang ditetapkan yaitu 10% dan susut pengeringan berada diatas kadar air. Tujuan dari kadar air harus dibawah 10% adalah untuk mencegah terjadinya reaksi enzimatis yang dapat mempercepat  pertumbuhan  bakteri.  Untuk  hasil  penetapan  kadar  abu  total  semua sampel berada dibawah batas yaitu 11,6%, dimana pengujian ini bertujuan untuk melihat kandungan mineral dalam sampel tersebut.
Hasil penapisan fitokimia ditunjukkan oleh Tabel 6, dimana kelima sampel positif mengandung flavonoid, dimana flavonoid adalah senyawa yang diduga memiliki khasiat sebagai antioksidan. 16
Ekstraksi  dilakukan  menggunakan  metode  perendaman  dengan  pelarut  etanol 96% untuk mengurangi kemungkinan kerusakan senyawa yang terdapat dalam sampel herba  pegagan  akibat  panas.  Hasil  dari  ekstraksi  dipekatkan  menggunakan rotary evaporator dan ekstrak kental ditimbang kemudian dihitung nilai rendemen sesuai pada Tabel 7.
Aktivitas  antioksidan  dievaluasi  secara  kualitatif  dengan  menggunakan Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT)  untuk mengidentifikasi  kemampuan  antioksidan dalam ekstrak  menggunakan  penampak  bercak  spesifik  DPPH  0,2%  dan  AlCl 3 5%  untuk melihat  ada  tidaknya  kandungan  senyawa  antioksidan  dan  flavonoid  pada  ekstrak.
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205

## Bercak H
2 SO 4 adalah penampakan universal yang dapat digunakan untuk mendeteksi sebagian  besar  senyawa,  dan  FeCl 3 untuk  melihat  golongan  fenolat.  Pemantauan  ini menggunakan pengembang yang berbeda dari masing-masing kepolaran untuk melihat senyawa-senyawa  yang  aktif  sebagai  antioksidan  sesuai  kepolarannya.  Bercak  yang dilihat adalah bercak yang memiliki fluoresensi ketika dilihat dibawah lampu UV 366 nm seperti yang terlihat pada Gambar 2, Gambar 3, dan Gambar 4.
Pengujian  aktivitas  antioksidan  secara  kuantitatif  pada  ekstrak  herba  pegagan menggunakan  metode  DPPH  melibatkan  penggunaan  nilai  Inhibition  Concentration (IC ₅₀ )  sebagai  parameter  untuk  mengukur  kemampuan  senyawa  uji  dalam  meredam radikal  bebas  hingga  50%.  Senyawa  dengan  aktivitas  antioksidan  yang  tinggi  akan memiliki nilai IC ₅₀ yang rendah. Pengujian dimulai dengan optimasi panjang gelombang DPPH dalam rentang 200-800 nm. Panjang gelombang optimum yang diperoleh adalah 516  nm  dalam  pelarut  metanol,  sesuai  dengan  literatur  yang  menunjukkan  bahwa panjang gelombang maksimum untuk DPPH terletak antara 515-520 nm. 17 Pengukuran absorbansi selanjutnya akan dilakukan pada Panjang gelombang tersebut. Kemudian, dilakukan pembuatan kurva kalibrasi larutan DPPH dengan tujuan untuk menunjukkan hubungan  linear  antara  absorbansi  larutan  dan  konsentrasi  larutan  DPPH.  Selain  itu kurva  kalibrasi  bertujuan  untuk  menentukan  konsentrasi  larutan  stock  DPPH  yang digunakan. Seri konsentrasi  yang dibuat adalah 50, 60, 70, 80, dan 100 μg/mL yang dilarutkan  dalam  metanol.  Setiap  konsentrasi  diambil  sebanyak  1  mL  dan  dicampur dengan 1 mL metanol, kemudian diinkubasi selama 30 menit di tempat gelap dan pada suhu  kamar  guna  menghindari  terjadinya  penguraian  pada  larutan  DPPH,    kemudian absorbansi  diukur  menggunakan  spektrofotometer  sinar  tampak. 18 Kurva  kalibrasi larutan DPPH pada gambar 11 menghasilkan regresi linear y =0,0093 + 0,014 dengan kuadrat koefisien korelasi (R 2 ) 0,9919 dengan panjang gelombang puncak larutan DPPH adalah  516  nm  pada  konsentrasi  70  μg/mL.  Kurva  kalibrasi  yang  dihasilkan menunjukkan  bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  DPPH,  semakin  tinggi  nilai absorbansinya.  Maka  dipilih  konsentrasi  70  μg/mL  sebagai  larutan  stok  DPPH  untuk melanjutkan  pengujian  aktivitas  antioksidan  pada  ekstrak  herba  pegagan  dari  kelima daerah yang berbeda dan Asam askorbat (Vitamin C). Pada tahap berikutnya, aktivitas antioksidan sampel diukur dengan menginkubasi sampel bersama larutan DPPH (1:1) yang dilakukan di tempat gelap, dilapisi dengan alumunium foil dan tertutup rapat, untuk menghindari  terurainya  larutan  DPPH  karena  mudah  teroksidasi.  Setelah  sampel direaksikan dengan larutan DPPH, inkubasi dilakukan selama 30 menit, pada saat  ini terjadi  reaksi  pendonoran  proton  yang  berasal  dari  sampel  yang  memiliki  aktivitas antioksidan.  Setiap  pengukuran  dilakukan  sebanyak  3  kali  untuk  melihat  akurasi  dan presisinya.  Perubahan  warna  terjadi  karena  sampel  awalnya  berwarna  ungu  berubah menjadi  kuning,  kemudian  diukur  pada  panjang  gelombang  516  nm.  Aktivitas antioksidan  dihitung  dengan  menggunakan  nilai  IC ₅₀ (konsentrasi  inhibisi  50%) berdasarkan persamaan regresi linier (y  = bx + a), yang menghubungkan konsentrasi sampel  (μg/mL)  dengan  persentase  inhibisi.  “y”  merupakan  nilai  perendaman  50% (%inhibisi)  sedangkan  “x”  merupakan  hasil  IC ₅₀ yang  dimana  IC ₅₀ adalah  parameter untuk menunjukan aktivitas antioksidan. 19 Pada pengujian aktivitas antioksidan, kontrol positif menggunakan Asam askorbat (Vitamin C) diuji dengan langkah yang serupa.
Berdasarkan data pada Gambar 6 didapatkan hasil nilai IC 50 dari kelima sampel setelah dirata-ratakan dari tiga kali pengulangan. Hasil hitungan menunjukan nilai rata- rata IC 50 dari ketiga percobaan didapatkan nilai rata-rata untuk ekstrak herba pegagan Pangandaran  sebesar  67,61  μg/mL,  untuk  ekstrak  dari  Lembang  dengan  nilai  IC 50 sebesar 69,73 μg/mL, lalu untuk ekstrak pegagan dari sumedang sebesar 71,49 μg/mL, untuk ekstrak dari Bogor sebesar 78,14 dan untuk ekstrak dari daerah sukabumi yaitu 89,32  μg/mL.  Hasil  vitamin  C  sebagai  kontrol  positif  memiliki  nilai  IC 50 sebesar  4,22
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205
μg/mL. Semuanya dilakukan tiga kali pengulangan dengan nilai SD <2%. Antioksidan dianggap  sangat  kuat  jika  nilai  IC 50 - nya kurang dari 50 μg/mL, kuat jika nilai  IC 50 -nya antara 50- 100 μg/mL, lemah jika nilai IC 50 -nya antara 100- 150 μg/mL, dan sangat lemah jika nilai IC 50 -nya antara 150- 200 μg/mL. Berdasarkan hasil yang diperoleh ekstrak herba pegagan dari kelima daerah termasuk kedalam kategori kuat sebagai penangkal radikal bebas karena nilai IC 50 yang didapatkan ada dalam rentang 50- 100 μg/mL. Sementara itu,  vitamin  C  sebagai  kontrol  positif  diklasifikasikan  sebagai  antioksidan  yang  sangat kuat  karena  memiliki  nilai  IC 50 kurang dari 50 μg/mL. Semakin rendah nilai IC 50 yang diperoleh,  semakin  besar  kemampuan  dalam  meredam  radikal  bebas.  Dari  data tersebut, terlihat bahwa aktivitas antioksidan ekstrak herba pegagan dari Pangandaran lebih  kuat  dibandingkan  dengan  ekstrak  pegagan  dari  daerah  lainnya.  Hal  ini dikarenakan beberapa faktor yang dapat mempengaruhi kualitas dari tanaman pegagan di daerah tersebut, salah satunya yaitu faktor ketinggian tempat tumbuh herba pegagan. Hasil  yang  didapatkan  sama  dengan  penelitian  sebelumnya 7 menyatakan  bahwa aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol herba pegagan masuk dalam kategori yang kuat, dengan nilai IC 50 sebesar 78,26 ppm.

## Kesimpulan
Dari kelima ekstrak herba pegagan nilai  IC 50 dari  yang paling rendah yaitu dari daerah  Pangandaran  sebesar  67,611  μg/mL,  kemudian  Lembang  69,73  μg/mL, Sumedang  71,49  μg/mL,  Bogor  78,14  μg/mL  dan  Sukabumi  yaitu  89,324  μg/mL. Penetapan  standarisasi  dari  simplisia  herba  pegagan  ( Centella  asiatica L.Urb) Lembang,  Bogor,  Pangandaran,  Sumedang,  dan  Sukabumi  telah  memenuhi persyaratan berdasarkan Farmakope Herbal Indonesia.

## Ucapan Terima Kasih
Terima kasih kepada Kemendikbud RI yang telah mendanai penelitian ini melalui hibah  Penelitian  Dosen  Pemula  (PDP)  tahun  2022  dengan  nomor  SK 032/E5/PG.02.00/2022 dan terima kasih kepada Universitas Bhakti Kencana yang telah menyediakan  sarana  untuk  melakukan  penelitian  berupa  ruangan  laboratorium  dan peralatan.

## Daftar Pustaka
1. Jabbar A, Wahyuni W, Malaka MH, Apriliani A. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah, daun, batang dan rimpang pada tanaman Wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith). J Farm Galen (Galenika J Pharmacy). 2019;5(2):189 –97.
2. Badarinath A V, Rao KM, Madhu C, Chetty S, Ramkanth S, Rajan TVS, et al. A review  on  in-vitro  antioxidant  methods:  comparisions,  correlations  and considerations. Int J PharmTech Res. 2010;2(2):1276 –85.
3. Alim N, Jummah N, Pratama AS, Nurdiyanti N. Skirining fitokimia ekstrak etanol kulit  buah  sirsak  (Annona  muricata  Linn)  dan  uji  aktivitas  antioksidan  dengan metode DPPH. Sasambo J Pharm. 2021;2(2):60 –4.
4. Tristantini  D,  Ismawati  A,  Pradana  BT,  Jonathan  JG.  Pengujian  aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH pada daun tanjung ( Mimusops elengi L ). Semin Nas Tek Kim Kejuangan". 2016;1 –7.
5. Sutardi  S.  Kandungan  bahan  aktif  tanaman  pegagan  dan  khasiatnya  untuk meningkatkan  sistem  imun  tubuh.  J  Penelit  dan  Pengemb  Pertan. 2017;35(3):121 –30.
6. Widyani M, Ulfa M, Wirasisya DG. Efek penghambatan radikal bebas infusa dan ekstrak etanol herba pegagan (Centella asiatica (L.) Urb) dengan metode DPPH. J Pijar Mipa. 2019;14(1):100 –6.
Vol. 15; No. 2; Juli 2024 Halaman 193-205
7. Yahya  MA,  Nurrosyidah  IH.  Antioxidant  activity  ethanol  extract  of  gotu  kola (Centella asiatica (L.) Urban) with DPPH method (2,2-Diphenyl-1-Pikrilhidrazil). J Halal Prod Res. 2020;3(2):106 –12.
8. Utami YP, Umar AH, Syahruni R, Kadullah I. Standardisasi simplisia dan ekstrak etanol daun leilem (Clerodendrum). J Pharm Med Sci. 2017;2(1):32 –9.
9. Rahmaniati M A, Ulfah M, Mulangsari DAK. Standarisasi parameter non spesifik ekstrak etanol daun pegagan (Centella asiatica L.) di dua tempat tumbuh. J Inov Tek Kim. 2018;3(1):67 –71.
10. Leliqia NPE, Harta IKGGG, Saputra AABY, Sari PMNA, Laksmiani NPL. Aktivitas antioksidan kombinasi fraksi metanol virgin coconut oil dan madu kele bali dengan metode  DPPH  (2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl).  JPSCR  J  Pharm  Sci  Clin  Res. 2020;5(2):84 –96.
11. Rakhmawatie MD, Marfu’ati N. Pembuatan simplisia dan teknik penyiapan obat tradisional  jahe merah  dan  daun  pepaya  untuk  standardisasi  dosis.  Berdikari  J Inov dan Penerapan Ipteks. 2023;11(1):12 –24.
12. Depkes  RI.  Parameter  standar  umum  ekstrak  tumbuhan  obat.  Edisi  IV. Departement Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta; 2000.
13. Kemenkes RI. Farmakope herbal indonesia. Pills and the Public Purse. 2017;
14. Farnsworth NR. Biological and phytochemical screening of plants. Vol. 55, Journal of Pharmaceutical Sciences. 1966. p. 245 –69.
15. Djoko W, Taurhesia S, Djamil R, Simanjuntak P dkk. Standardisasi ekstrak etanol herba pegagan (Centella asiatica). Sainstech Farma. 2020;13(2):59 –64.
16. Syawal AN, Laeliocattleya RA. Potensi teh herbal rambut jagung (Zea mays L.) sebagai  sumber  antioksidan:  kajian  pustaka.  J  Ilmu  Pangan  dan  Has  Pertan. 2020;4(1):1 –6.
17. Molyneux P. The use of the stable free radical Diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol. 2004;26(December 2003):211 –9.
18. Kaligis  AY,  Yudistira  A,  Rotinsulu  H.  Uji  aktivitas  antioksidan  alga  Halimeda opuntia  dengan  metode  DPPH  [1,1-difenil-2-pikrilhidrazil].  PHARMACON. 2020;9(1):1 –7.
19. Parwati  NKF,  Napitupulu  M,  Diah  AWM.  Uji  aktivitas  antioksidan  ekstrak  daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) steenis) dengan 1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) menggunakan spektrofotometer Uv-vis. J Akad Kim. 2014;3(4):206 –13.