## DETEKSI KERAGAMAN SPESIES BAKTERI METANOGEN RUMEN SAPI MENGGUNAKAN KLONING GEN 16S rRNA DAN SEKUENSING

## S HOFFIANA N OOR , H ENDRO P RAMONO , S AEFUDDIN A ZIZ
Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, Jalan dr. Suparno 63 Purwokerto 53122

## A B S T R A C T
Ruminants produce methane gas which contributes to enhanced greenhouse effect in the atmosphere. Cattle issued the highest methane during the fermentation of feed in the rumen. Methane gas produced by methanogen bacteria in carbohydrates anaerobic fermentation. Methanogen bacteria are difficult to obtain diversity information because difficult cultured. One technique can be used is molecular rRNA 16S gene cloning and sequencing. This study was aims to determine the species diversity of methanogen bacteria in cattle's rumen using rRNA 16S gene cloning and sequencing technique by survey method. The results obtained 51 clones with 800 bp insert size length. The sequencing resulted 2 different sequences, ie 8-3L21 clone bacterium uncultured and BBS-12 clone methanogens rumen uncultured rRNA 16S  gene  partial  sequence  with  99%  and  100%  similarity.  The  Genus  sequences  for  gene  1  and  3  were Prevotella (24%), Clostridium (1.5%),  and  other  uncultured  bacteria,  whereas  the  2  gene  sequences  of  species  was Methanobrevibacter  ruminantium (21.83%), M. millerae (29.17%), M.  gottschalkii (6.47%), Methanosphaera  stadtmanae ,  and Methanobacterium  alcaliphilum .  This  research  provides scientific information about cattle rumen methanogen bacteria species diversity which can be used as a basis for control of cattle rumen methanogen bacteria.
K EY W ORDS : cattle rumen methanogens, rRNA 16S, gene cloning
Penulis korespondensi: S HOFFIANA N OOR | email: shoffianan@ymail.com

## P E N D A H U L U A N
Ternak  ruminansia  menghasilkan  gas  metan  (CH 4 ) yang  berkontribusi  terhadap  akumulasi  gas  rumah kaca  (GRK)  di  atmosfer.  Produksi  gas  metan  dari ternak ruminansia berkontribusi 95% dari total emisi metan  dunia  dan  sekitar  18%  dari  total  gas  rumah kaca  di  atmosfer  (Martin et  al. ,  2008).  Ternak  sapi mengeluarkan  hampir  73%  gas  CH 4 selama  proses fermentasi  pakan  dalam  rumen.  Sedangkan  kerbau dan  domba  masing-masing  mengeluarkan  gas  metan 10%  dan  kambing  4%  (US  Environment  Protection Agency, 1994). Kontributor emisi gas metan tertinggi di  sektor  peternakan  berasal  dari  sapi  potong,  yaitu sekitar  65%  dari  emisi  ternak  ruminansia  atau  59% dari  total  emisi  hewan  ternak  (DITJENNAK,  2007; IPCC, 2006).
Emisi gas metan oleh ternak ruminansia dihasilkan melalui  proses  metanogenesis  di  dalam  sistem pencernaan  khususnya  bagian  rumen.  Gas  metan dihasilkan  dari  rumen  sebesar  80-95%  dan  5-20  % dihasilkan dari usus besar (Shiddieqy, 2009). Menurut Johnson  dan  Johnson  (1995)  dan  Pelchen  dan  Peters (1998),  gas  metan  yang  dikeluarkan  dari  rumen mengindikasikan energi yang hilang dari tubuh ternak ruminansia  dengan  variasi  7-12%  dari  energi  yang dikonsumsi.  Gas  metan  dihasilkan  dari  fermentasi anaerob  karbohidrat  oleh  bakteri  penghasil  metan (metanogen).
Bakteri  metanogen  berperan  dalam  mengubah asam-asam  lemak  dan  alkohol  menjadi  metan  dan karbondioksida  (Speece,  1983).  Bakteri  metanogen dibagi  menjadi  dua,  yaitu  bakteri  metanogen hidrogenotropik  dan  asetotropik.  Bakteri  metanogen hidrogenotropik mengubah hidrogen dan karbondioksida  menjadi  metan.  Bakteri  metanogen asetotropik  mengubah  asam  asetat  menjadi  metan
dan  CO 2 (Mackie  dan  Bryant,  1984).  Bakteri metanogen  dikelompokkan  menjadi  tiga  ordo,  yaitu Methanobacteriales
(contoh: Methanobacterium, Methanobrevibacter,  Methanospaera,  Methanothermobacter,
dan Methylosphaera ),  Methanomicrobiales  (contoh: Methanomicrobium,  Methanogenium,  Methanospirilium,
Methanosarcina, dan Methanococcoid ), dan Methanococcales  (contoh: Methanococcus )  (Vogels et al ., 1988). Bakteri metanogen dapat berupa kelompok bakteri gram positif dan gram negatif (Moss, 1993).
Bakteri  metanogen  bersifat  anaerob  obligat  dan sulit  sekali  dikultur  secara  selektif.  Hal  ini  karena pengetahuan  mengenai  kondisi  alami  bakteri metanogen  masih  kurang  sehingga  sulit  untuk membuat  media  kultivasi  yang  sesuai.  Selain  itu, bakteri  yang  dapat  tumbuh  di  media  selektif jumlahnya  sangat  sedikit  sehingga  tidak  dapat mencerminkan  keragaman  spesies  (Amann et  al ., 1995).
Salah  satu  teknik  yang  cukup  akurat  untuk mengetahui  keragaman  bakteri  yang  sulit  sekali dikultur,  yaitu  menggunakan  teknik  kloning  gen. Teknik  molekuler  lain  yang  dapat  digunakan  untuk menganalisis mikroba pada suatu sampel di antaranya adalah Denaturing  Gradient  Gel  Electrophoresis (DGGE), Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA), dan
Restriction Fragment Length
Polimorfisme (RFLP), dan Fluorescence  In  Situ Hybridization Analysis (FISH). Kloning gen merupakan proses  perbanyakan  fragmen  gen  target  dengan mengintroduksi DNA rekombinan ke  dalam suatu  sel inang  (Brooker,  2005).  Teknik  kloning  gen memungkinkan  ekstraksi  DNA  secara  langsung  dari lingkungan  untuk  dianalisis  keragaman  spesies maupun  fungsinya  (Streit  dan  Schmitz,  2004). Keunggulan  dari  teknik  kloning  gen  adalah  materi DNA  bakteri  yang  terdapat  di  lingkungan  dapat
langsung diekstraksi tanpa melalui proses penumbuhan  pada  media  buatan  terlebih  dahulu (Lorenz dan Schleper, 2002).
Berdasarkan  hasil  penelitian  Nercessian et  al. (2005),  bakteri  metanogen  ukuran  800 bp telah berhasil  diklon  dari  sumber  dasar  hydrothermal. Riesenfeld et  al. (2004)  menyatakan  bahwa  gen resisten  antibiotik  aminoglycoside  bakteri  tanah ukuran 1,5 kb yang tidak dapat dikultur telah berhasil diklon  dari  sampel  waduk.  Fanani  (2011)  juga  telah berhasil mengklon gen glikosida hidrolase dari sampel tanah  menggunakan  teknik  kloning  gen  untuk degradasi biomassa.
Gen 16S rRNA digunakan dalam teknik kloning gen sebagai dasar melihat keragaman bakteri dalam suatu habitat (Schmeisser et al ., 2007). Gen 16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler karena bersifat universal  dengan  fungsi  yang  identik  pada  seluruh organisme  prokariot.  Gen  16S  rRNA  adalah  target utama  yang  digunakan  untuk  mengkarakterisasi bakteri  metanogen  dari  sampel  lingkungan.  Gen  16S rRNA  kekal  antara  spesies  mikroba  prokariotik seperti  bakteri  dan  archaea,  dengan  sekuen  berbeda banyak digunakan untuk identifikasi spesies. Gen 16S rRNA memiliki beberapa daerah yang memiliki urutan basa  yang  relatif  konservatif  dan  beberapa  daerah urutan  basanya  variatif  (Stackebrandt  dan  Goebel, 1995).
Bakteri metanogen dideteksi awal dengan metode PCR  gen  16S  rRNA.  Amplifikasi  PCR  adalah  langkah penting  pertama  untuk  memperbanyak  DNA  yang terdapat dalam jumlah rendah (Ahmed, 2006). Primer Met_86f  dan  Met_915r  dirancang  oleh  Wright et al . (2004)  dari  sekuen  gen  16S  rRNA  untuk  amplifikasi bakteri  metanogen. Susunan  primer  yang  digunakan dalam penelitian ini adalah 5’-GCT CAG TAA CAC GTG G-3’ (Met_86f) dan 5’-GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT- 3’  (Met_915r)  untuk  mendapatkan  sekuen  gen  16S rRNA  dengan  ukuran  yang  diinginkan  yaitu  800 bp . Analisis  gen  16S  rRNA  lebih  mudah  dibandingkan untuk  definisi  spesies  dan  keragamannya,  sehingga dapat dirancang suatu primer universal untuk seluruh kelompok bakteri (Yun dan Ryu, 2005).
Pemilihan primer dapat mempengaruhi komposisi dari  populasi  metanogen  (Skillman et  al. ,  2006). Penggunaan primer Met_86f/Met_1340r dan kombinasi Met_21f/Met_1340r oleh Wright dan Pimm (2006)  dengan  urutan  1200  dan  1300 bp tidak menghasilkan produk PCR. Primer Met_86f/Met_915r dapat  mengamplifikasi  gen  16S  rRNA  secara  parsial dengan  menghasilkan fragmen sebesar 800 bp untuk mendeteksi bakteri metanogen dari rumen sapi (Zhou et  al .,  2009).  Primer  Met_86f/Met_915r  dapat mengidentifikasi spesies
Methanobrevibacter, Methanobacterium,  Methanosphaera,  Methanoculleus, Methanomicrobium, Methanosarcina,
dan Methanococcus (Zhou et al ., 2011). Jenis bakteri metanogen dari ordo Methanobacteriales  adalah  yang  paling  umum ditemukan  dalam  rumen  sapi  (Skillman et  al .,  2004).
Berdasarkan penelitian Stadtman dan Barker (1951), hanya  7  spesies  bakteri  metanogen  rumen  sapi  yang berhasil  diidentifikasi  dengan  metode  kultur independen,  yaitu Methanobacterium  formicicum , Methanobacterium bryantii , Methanobrevibacter ruminantium , Methanobrevibacter olleyae , Methanobrevibacter millerae , Methanomicrobium mobile ,  dan Methanosarcina  barkeri .  Whitford et  al . (2001)  menyatakan  bahwa  terdeteksi  41  sekuen  gen 16S  rRNA  dari  rumen  sapi. Methanobrevibacter ruminantium dan Methanosphaera stadtmanae adalah spesies paling dominan, sedangkan genus Methanobrevibacter  yang  paling  sering  terdeteksi pada rumen sapi.
Perumusan masalah yang dapat diambil dari latar belakang di atas, yaitu :
1. Bakteri  metanogen  rumen  sapi  dari  spesies  apa yang  diperoleh  menggunakan  teknik  kloning  gen 16S rRNA dan sekuensing?
2. Kelompok  bakteri  metanogen  rumen  sapi  mana yang paling banyak ditemukan?
Berdasarkan  perumusan  masalah  tersebut,  perlu dilakukan penelitian dengan tujuan :
1. Mengetahui keragaman spesies bakteri metanogen rumen  sapi  menggunakan  teknik  kloning  gen  16S rRNA dan sekuensing.
2. Mengetahui  kelompok  bakteri  metanogen  rumen sapi yang paling banyak ditemukan.
Hasil  penelitian  ini  dapat  memberikan  informasi tentang keragaman spesies bakteri metanogen rumen sapi. Informasi tersebut dapat dijadikan sebagai dasar pengendalian bakteri metanogen rumen sapi.

## M E T O D E
Penelitian ini dilakukan dengan metode survey pada sampel rumen  dari  3  sapi  potong  yang  diperoleh  dari  rumah pemotongan  hewan  (RPH)  di  Mersi.  Data  yang  diamati mencakup  karakter  molekuler  berupa  marka  PCR.  Marka tersebut  diamplifikasi  dengan  satu  pasang  primer  spesifik Met_86f  dan  Met_915r  kemudian  dielusi  menggunakan GeneJet™  Extraction  Kit .  Amplifikasi  marka  PCR  dilakukan menggunakan  teknik  kloning  gen  16S  rRNA  kemudian disekuensing.
Variabel  yang  diamati  dalam  penelitian  ini  adalah ukuran pita insert hasil kloning gen 16S rRNA, yaitu 800 bp dari  amplifikasi  dengan  primer  spesifik  Met_86f  dan Met_915r.  Parameter  yang  diamati  yaitu  persentase similaritas  sekuen  gen  16S  rRNA  kedua  sekuen  berbeda bakteri metanogen rumen sapi.
Pengambilan  Sampel  menurut  Tilley  dan  Terry  (1963) dilakukan  dengan  cara  memotong  umen  sapi  yang  diambil dari rumah pemotongan hewan (RPH) di Mersi. Termos yang dipakai  untuk  tempat  cairan  rumen  sapi  diisi  dengan  air panas  sehingga  suhunya  mencapai  39 o C  kemudian  ditutup. Ambil rumen sapi kemudian diperas dengan kain blacu dan dimasukkan ke dalam termos hangat. Air panas yang ada di dalam  termos  dibuang  terlebih  dahulu  sebelum  digunakan untuk tempat cairan rumen sapi.
DNA  genom  diisolasi  dengan  metode  kit  ( Xprep  Plant DNA Mini Kit ) sesuai prosedur (Philekorea Technology, INC.) Amplifikasi  gen  16S  rRNA  dengan  PCR  dilakukan  pada mesin termocycler TC-5000.  Reaksi  PCR  dibuat  3 ependorf tube dengan  komposisi  mix  untuk  total  volume  setiap tube
20  µl  adalah  1  µl  DNA  produk  ekstraksi,  1  µM  primer Met_86f,  1  µM  primer  Met_915r,  2  mM  dNTP,  2  mM  bufer DNA Taq Polimerase, 0,3 U DNA Taq Polimerase, dan 12,7 µl akuabides steril.
Running PCR  dilakukan  selama  30  siklus  pada  kondisi pra-denaturasi  dengan  suhu  94 o C  selama  5  menit, denaturasi  95 o C  45  detik, annealing 56 o C  30  detik, polimerisasi  72 o C  1  menit,  dan  final  polimerisasi  72 o C  5 menit  yang  diprogram  berdasarkan  modifikasi  Sambrook dan  Russell  (2001).  Elektroforesis  sebelumnya  dilakukan dengan cara timbang 1% serbuk agarosa dalam 20 ml bufer TAE 1x dan setelah dipanaskan dicampur 2 µl EtBr. Running elektroforesis  dilakukan  pada  voltase  100  volt  selama  30 menit dengan komposisi 5 µl DNA produk PCR, 1 µl loading dye , dan 1 µl DNA ladder 100 bp . Pita  DNA  dielusi  dengan GeneJet™  Gel  Extraction  Kit sesuai  prosedur  kemudian  dilakukan  PCR  dengan  total volume  setiap tube 20  µl  dibuat  dengan  komposisi  mix adalah  3  µl  DNA  produk  elusi,  1  µM  primer  Met_86f,  1  µM primer  Met_915r,  2  mM  dNTP,  2  mM  bufer  DNA  Taq Polimerase,  0,3  U  DNA  Taq  Poiymerase,  dan  10,7  µl akuabides steril (Vogelstein dan Gillespie, 1979).
PCR  dilakukan  selama  30  siklus  pada  kondisi  pra- denaturasi  dengan  suhu  94 o C  selama  5  menit,  denaturasi 95 o C 1 menit, annealing 50 o C 30 detik, polimerisasi 72 o C 1 menit,  dan  final  polimerisasi  72 o C  5  menit.  Elektroforesis sebelumnya  dilakukan  dengan  cara  timbang  1,5%  serbuk agarosa dalam 20 ml bufer TAE 1x yang dicampur 2 µl EtBr setelah  dipanaskan. Running elektroforesis  dilakukan  pada voltase 100 volt selama 30 menit dengan 5 µl DNA produk PCR elusi, 1 µl loading dye , dan 1 µl DNA ladder 100 bp . Media  LB  (Luria-Bertani)  terdiri  dari bacto ® -tryptone , bacto ® -yeast  extract ,  dan  NaCl.  Timbang  12,5  serbuk  LB dalam  500  ml  akuades  steril.  Media  LA  dengan  ampisilin dibuat  dengan  cara  timbang  3,75  gr  agar  ke  dalam  250 media  LB  cair  dan  disterilisasi.  Dinginkan  media  sampai 50 o C  sebelum  menambah  ampisilin  sampai  konsentrasi akhir  200  ppm  (µg/ml).  Tuang  15-20  ml  media  ke  dalam cawan  petri  85  mm.  Biarkan  agar  memadat.  Simpan  pada suhu  4 o C.  Pembuatan  dan  komposisi  larutan/ buffer yang digunakan dalam penelitian dapat dilihat pada tabel 2.
Pembuatan sel kompeten E. coli DH5α dilakukan dengan metode  CaCl 2 (Sambrook  dan  Russell,  2001).  Ligasi  vektor pGEM ® -T Easy dengan sisipan gen digunakan enzim T4 DNA ligase (Promega, 2008). Reaksi ligasi sejumlah 10 µl terdiri atas 2x rapid ligation buffer T4 DNA ligase, 1 µl DNA vektor pGEM ® -T  Easy,  3  µl  DNA  produk  yang  telah  dielusi,  dan  3 unit T4 DNA ligase (3 unit/µl). Reaksi ligasi diinkubasi pada suhu 4 o C selama 16 jam. Transformasi  DNA  plasmid  ke  dalam  sel  kompeten E. coli DH5α  dilakukan  berdasarkan  Sambrook  dan  Russell (2001). Isolasi plasmid hasil seleksi klon dilakukan dengan metode kit ( GeneJet™ Plasmid Kit ) , kemudian dilakukan PCR dibuat  3 ependorf  tube dengan  komposisi  mix  untuk  total volume  setiap tube 20  µl  adalah  1  µl  DNA  produk  isolasi plasmid, 1 µM primer promoter T7, 1 µM primer SP6, 2 mM dNTP,  2  mM  bufer  DNA  Taq  Polimerase,  0,3  U  DNA  Taq Polimerase, dan 12,7 µl akuabides steril.
PCR  dilakukan  selama  30  siklus  pada  kondisi  pra- denaturasi  dengan  suhu  94 o C  selama  5  menit,  denaturasi 95 o C 1 menit, annealing 45 o C 30 detik, polimerisasi 72 o C 1 menit,  dan  final  polimerisasi  72 o C  5  menit.  Timbang  1% agarosa 20 ml bufer TAE 1x yang dicampur 2 µl EtBr setelah dipanaskan. Running elektroforesis  dilakukan  pada  voltase 100  volt  selama  30  menit  dengan  5  µl  DNA  produk  isolasi plasmid. Loading  dye dan DNA  ladder 100 bp yang
digunakan  sebanyak 1  µl.  Hasil  elektroforesis  divisualisasi menggunakan Dark Reader UVCL-Transilluminator . Sekuensing  adalah  pembacaan  sekuen  basa  nukleotida DNA. Metode sekuensing yang digunakan adalah automated DNA  sequencing dengan  mesin sequencer dan  ddNTP  yang dilabeli  pewarna  fluoresens  (Fairbanks  and  Andersen, 1999). Automated  DNA  sequencing meliputi  tahapan cycle sequencing ,  purifikasi  produk cycle  sequencing ,  dan pembacaan sekuens (Applied Biosystem 2000).
Cycle  sequencing adalah  tahapan  yang  menggunakan siklus  denaturasi, annealing ,  dan  polimerisasi  sehingga masing-masing  fragmen  DNA  memiliki  label  pewarna fluoresensi  pada  ddNTP  di  ujung  3’.  Purifikasi  bertujuan untuk  menghilangkan  pewarna  fluoresensi  berlebih  pada produk cycle sequencing agar tidak mengganggu pembacaan sekuen.  Alat sequencer mendeteksi  fluoresensi  dari  empat pewarna berbeda yang digunakan untuk mendeteksi reaksi ekstensi A, C, G, dan T dengan metode elektroforesis kapiler. Hasil  pembacaan  diinterpretasikan  oleh  perangkat  keras dan  lunak  komputer  dalam  bentuk  grafik  elektroferogram (Applied  Biosystem  2000).  Sekuensing  dilakukan  di  First BASE Laboratories Sdn Bhd, Malaysia.
Sekuen forward dan reverse hasil  sekuensing  disatukan untuk  mendapatkan  sekuen  lengkap  gen  16S  rRNA. Penyatuan  sekuen  dilakukan  dengan  bantuan  CrustalW pada  program  Bioedit  untuk  mencari  daerah overlapping dari  kedua  sekuen forward dan reverse ,  sehingga  dapat menghasilkan  satu  set  sekuen  promoter  lengkap.  Analisis sekuen nukleotida menggunakan Chromas Lite (versi 2.1.1., Technelysium  Pty  Ltd,  Australia)  yang  ditunjukkan  pada grafik elektroferogram.
Sekuen  gen  hasil  sekuensing  ( query )  disejajarkan dengan  basis  data  DNA  pada  GenBank  ( subject ) menggunakan
program BLASTN pada situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.  Hasil  analisis  BLASTN yang  menunjukkan subject dengan  persentase similarity terbesar  ditentukan  sebagai  sekuen  yang  memiliki kekerabatan terdekat dengan sekuen query . Tingkat similarity suatu  sekuen  DNA  dapat  dilihat melalui  beberapa  parameter  hasil  BLASTN,  yaitu bit  score, expect  value (E), identities, dan gaps . Bit  score merupakan nilai  perhitungan  statistik  hasil  perbandingan  antara  data sekuen query dan  sekuen subject .  Semakin  tinggi  nilai bit score ,  maka  semakin  tinggi  nilai similarity .  Nilai  E merupakan  jumlah  sekuen  pada subject yang  tidak  terkait dengan  sekuen query .  Semakin  kecil  nilai  E,  maka  semakin tinggi  tingkat  kepercayaan  terhadap  kesamaan  sekuen tersebut. Identities adalah  persentase similarity antara sekuen query dan sekuen subject . Gaps menunjukkan jumlah kekosongan  basa  yang  muncul  dari  keseluruhan  sekuen yang dibandingkan (Hall, 2001).

## H A S I L D A N P E M B A H A S A N
Kualitas  DNA  dapat  diketahui  melalui  kemurnian berdasarkan  perbandingan  nilai  absorbansi  panjang gelombang  260  nm  dan  280  nm  (A260/A280)  pada pembacaan  spektrofotometri.  Berdasarkan  hasil tersebut, kemurnian DNA produk ekstraksi 1, 2, dan 3 adalah 1.677, 1.692, dan 1.603. Menurut Sambrook et al. (1989), standar kemurnian DNA berkisar 1,8. Hasil pengukuran dalam penelitian ini menunjukkan semua DNA  produk  ekstraksi  memiliki  tingkat  kemurnian yang baik dan tingkat kemurnian terbaik adalah pada DNA produk ekstraksi 2 (Tabel 1).
Tabel 1 . Hasil pengukuran konsentrasi DNA produk ekstraksi secara kuantitatif menggunakan nanophotometer . Kode DNA produk ekstraksi A230 A260 A280 A320 A260/A280  A260/A230 Konsentrasi (µg/ml) 1 0,041 0,022 0,016 0,006 1,677 0,457 8.000 2 0,061 0,024 0,015 0,002 1,692 0,373 6.500 3 0,014 0,005 0,003 -0,001 1,603 0,4 3.000
Proses amplifikasi gen 16S rRNA merupakan tahap awal  dalam  penelitian.  Gen  16S  rRNA  diamplifikasi secara in  vitro dengan  teknik  PCR  untuk memperbanyak salinan spesifik gen target (Handoyo, D. dan Ari R., 2001). Reaksi PCR produk ekstraksi dan produk  elusi  yang  divisualisasikan  pada  gel  agarosa (1% dan 1,5%) berhasil mengamplifikasi fragmen gen 16S rRNA berukuran 800 bp secara spesifik (Gambar 1).  Hasil  visualisasi  gel  agarosa  menunjukkan  pita tunggal yang jelas, tebal, dan tidak smear . Hal tersebut menandakan  bahwa  DNA  produk  ekstraksi  dan produk elusi memiliki kualitas yang baik karena tidak terlihat  pola  pita  DNA  yang  terdegradasi.  Hasil  yang diperoleh  pada  penelitian  sesuai  dengan  pernyataan Herison et  al. (2003),  bahwa  kualitas  DNA  yang  baik dan tidak terdegradasi pada hasil elektroforesis tidak menampakkan pola pita yang smear .
A B
Gambar 1 . Pola pita hasil amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan primer Met_86f dan Met_915r.
A. DNA Produk ekstraksi, B. DNA Produk elusi
Keterangan: M= DNA ladder 100 bp ; 1, 2, 3 = DNA produk 1, 2, 3 Pola  pita  menunjukkan  bahwa  target  yang teramplifikasi  merupakan  gen  spesifik  metanogen dengan  ukuran  800 bp yang  terdapat  pada  gen  16S rRNA.  Bakteri  metanogen  memiliki  sekuen  gen  16S rRNA unik yang telah  digunakan untuk membedakan bakteri  metanogen  dari  mikroba  lain.  Profil metanogen  dalam  rumen  telah  diidentifikasi  dengan kombinasi  berbeda  dari  primer  spesifik  metanogen yang  digunakan  untuk  mengamplifikasi  fragmen  gen 16S  rRNA  secara  parsial.  Penggunaan  primer Met_86f/Met_1340r  dan  Met_21f/Met_1340r  oleh Wright  dan  Pimm  (2006)  dengan  urutan  1.200  dan 1.300 bp tidak  menghasilkan  produk  PCR.  Primer Met_86f/Met_915r  dapat  mengamplifikasi  gen  16S rRNA  secara  parsial  dengan  menghasilkan  fragmen sebesar 800 bp untuk mendeteksi bakteri metanogen dari  rumen  sapi  (Zhou et  al .,  2009).  Primer
Met_86f/Met_915r  dapat  mengidentifikasi  spesies ,
Methanosphaera,  Methanoculleus,  Methanococcus, Methanobrevibacter, Methanomicrobium, dan
Methanosarcina (Zhou et al ., 2011).
Keragaman  bakteri  metanogen  rumen  sapi  dapat dideteksi  dengan  metode  kloning  gen.  Kloning  gen merupakan  proses  perbanyakan  fragmen  gen  target dengan  mengintroduksi  DNA  rekombinan  ke  dalam suatu  sel  inang  (Brooker,  2005).  Molekul  DNA rekombinan  dibuat  dengan  menyisipkan  fragmen DNA  yang  mengandung  gen  target  ke  dalam  vektor (Brown,  2006).  Penyisipan  fragmen  DNA  ke  dalam vektor  untuk  membentuk  molekul  DNA  rekombinan melalui  ligasi  vektor  dan  gen  target  sisipan.  Enzim ligase  mengkatalisis  proses  perlekatan  basa-basa nukleotida  yang  saling  berkomplemen  (Brooker, 2005).  Ligasi  vektor  pGEM ® -T  Easy  dengan  sisipan gen  target  menggunakan  enzim  T4  DNA  ligase (Promega,  2008).  Reaksi  ligasi  yang  mengunakan enzim  T4  DNA  ligase  ditransformasi  ke  dalam  sel kompeten E.  coli DH5α  yang  dipreparasi  dengan metode CaCl 2 (Brooker, 2005). Pembuatan sel kompeten diawali dengan inokulasi kultur awal yang telah ditumbuhkan selama 12 jam ke dalam  kultur  sel  kompeten.  Menurut  Ausubel et  al . (1995), kultur sel kompeten ditumbuhkan pada suhu 37 o C  sampai  sel  bakteri  memasuki  awal  fase logaritmik  pertumbuhan.  Kultur  yang  dipanen  pada awal fase logaritmik memiliki kompetensi yang paling baik  (Sambrook  dan  Russell,  2001).  Sel  bakteri  pada fase  tersebut  mengalami  pertumbuhan  yang  optimal dan aktif membelah sehingga memudahkan introduksi DNA  asing  (Ausubel et  al .  1995).  Kultur  yang  telah dipanen  dengan  sentrifugasi  kemudian  diberi perlakuan  larutan  CaCl 2 .  Menurut  Old  dan  Primrose (2003), garam CaCl 2 kemungkinan dapat menyebabkan  perubahan  struktur  dinding  sel  yang meningkatkan pengikatan DNA pada bagian luar sel.
Proses  transformasi  vektor  dari  bagian  luar  ke dalam sel diinduksi oleh kejut panas ( heat-shock ) dari suhu  0 o C  ke  suhu  42 o C  selama  1  menit  45  detik. Kemungkinan  molekul  DNA  yang  telah  menempel pada  dinding  sel  kompeten  terintroduksi  ke  dalam sitoplasma  dengan  pemberian heat-shock (Brown, 2006).  Sel  transforman  yang  telah  diberikan heat- shock dikultur pada media LB sehingga sel kembali ke kondisi  awal  dan  vektor  dapat  mengekspresikan  gen resistensi antibiotiknya (Ausubel et al . 1995).
A B C D E
Gambar 2 . Koloni biru dan putih hasil transformasi.
a . E. coli DH5α, b. Vektor pGEM ® -T Easy (kontrol), c. Transforman 1, d. Transforman 2, e. Transforman 3. Keterangan : garis bawah = koloni biru; garis atas = koloni putih
Kultur E.  coli DH5α  hasil  transformasi  disebar  di atas media LB agar yang mengandung ampisilin yang sebelumnya kultur telah diberi X-gal dan IPTG. Koloni yang  dapat  tumbuh  pada  media  ampisilin  hanya  sel bakteri  yang  berhasil  mentransformasi  vektor pGEM ® -T  Easy  karena  plasmid  membawa  sifat resistensi  ampisilin  bagi  sel  (Sambrook  dan  Russell, 2001). Kualitas sel kompeten dapat diketahui dengan nilai  efisiensi  transformasi.  Menurut  Davis et  al . (1994),  metode  CaCl 2 memiliki  nilai  efisiensi transformasi  optimal  sekitar  10 6 cfu/µg  DNA. Menurut  Hanahan dalam Sambrook  dan  Russell (2001), nilai efisiensi transformasi dapat dipengaruhi oleh  sejumlah  faktor  teknis,  yaitu  kemurnian  reagen yang  digunakan,  kondisi  pertumbuhan  sel,  dan kebersihan peralatan gelas.
Bakteri E.  coli DH5α  yang  telah  ditransformasi dengan  DNA  plasmid  hasil  ligasi,  kemudian  diseleksi dengan media seleksi LB agar ampisilin, IPTG, dan X- gal.  Media  yang  mengandung  antibiotik  ampisilin berfungsi  untuk  memilih  DNA  rekombinan  yang terbentuk. Senyawa IPTG/X-gal pada media berfungsi untuk  seleksi  biru  putih  (Sambrook  dan  Russell, 2001).
Hasil  penelitian  memperlihatkan  koloni  yang tumbuh  pada  cawan  petri  1,  2,  dan  3  masing-masing hasil  ligasi  dengan  rasio  molar  vektor  :  sisipan  (1:3) berjumlah  2,  25,  dan  24  koloni  (Gambar  2).  Hasil menunjukkan  terbentuknya  koloni  putih  >  60%. Menurut  Promega  (2008),  terbentuknya  koloni  putih >  60%  menunjukkan  efisiensi  transformasi  yang tinggi. Hal tersebut menunjukkan bahwa proses ligasi
berhasil  dilakukan.  Satu  koloni  putih  dari  masing- masing  cawan  dipilih  secara  acak  kemudian  diisolasi dengan GeneJet™ Plasmid Kit .
Gambar 3. Hasil isolasi plasmid
Ket. : M=DNA ladder 100 bp ; 1, 2, 3 = produk isolasi plasmid 1, 2, 3 Hasil visualisasi produk isolasi plasmid menghasilkan pita yang jelas (Gambar 3). Hal tersebut menunjukkan  hasil  positif  bahwa  koloni  hasil transformasi  yang  diisolasi  merupakan  DNA rekombinan.  Menurut  Sambrook  dan  Russell  (2001), hasil  positif  DNA  rekombinan  membawa  sisipan fragmen gen target.
Ketiga  produk  isolasi  plasmid  kemudian  di amplifikasi  (PCR)  dan  disekuensing  menggunakan primer promoter T7 dan SP6. Hasil sekuensing berupa elektroferogram, yaitu hasil analisis yang menampilkan  grafik peak yang  mewakili  basa nukleotida  hasil  pembacaan  mesin sequencer . Peak tersebut  diterjemahkan  menjadi  basa-basa  nitrogen untuk  memudahkan  analisis  sekuen  dengan  program BLASTN.  Elektroferogram  menunjukkan  sekuen parsial  dari  masing-masing  sekuen  gen,  yaitu  berupa
sekuen forward dan reverse .  Hal  tersebut  terjadi karena  proses  reaksi  sekuensing  dilakukan  sebanyak dua  kali.  Analisis  sekuen  nukleotida  menggunakan Chromas  Lite (versi  2.1.1.,  Technelysium  Pty  Ltd, Australia) yang ditunjukkan pada grafik elektroferogram. Pembacaan basa sekuen gen 1 dan 3 mencapai ± 810 bp dan sekuen hasil sekuensing yang memiliki peak yang  jelas  dan  dapat  diterjemahkan menjadi  basa-basa  nitrogen  pada  kedua  sekuen forward dan reverse sekitar  ±  710 bp sedangkan sekuen  gen  2  sekitar  ±  760 bp dengan  panjang fragmen gen target sebesar ± 800 bp . Hasil  penyejajaran  ( alignment )  terhadap  sekuen forward dan reverse tersebut  tidak  menunjukkan adanya daerah gap (0%) pada gen 2, tetapi terdapat 1 gap pada  gen  1  dan  3  sepanjang  1  basa  pada  basa acuan/ subject 677 bp. Daerah gap merupakan daerah kosong  pada  hasil  penyejajaran  karena  sekuen forward dan reverse tidak overlap .  Proses penyejajaran  tersebut  salah  satunya  di reverse komplemen  kemudian  ditentukan  sekuen  dari gabungan forward dan reverse ditambah  beberapa bagian forward dan reverse yang  tidak  tercover. Penyatuan  sekuen  dilakukan  dengan  bantuan program CrustalW pada Bioedit untuk mencari daerah overlapping dari  kedua  sekuen forward dan reverse , sehingga dapat menghasilkan sekuen lengkap.
Hasil penyejajaran menunjukkan terdapat beberapa  perbedaan  basa  pada  gen  1  dan  3  dengan sekuen  acuan.  Perbedaan  tersebut  juga  terlihat  pada peak elektroferogram.  Gen  1  dan  3  memiliki  7 perbedaan  basa  sekuen query pada  posisi  4,  13,  397, 574, 631, 646, dan 783, yaitu basa G, C, T, A, C, G, dan C digantikan  oleh  basa  A,  T,  N,  N,  T,  A,  dan  T  pada sekuen  acuan/ subject. Perubahan  basa  yang  terlihat pada  hasil  penyejajaran  kemungkinan  dapat  terjadi karena basa menumpuk sehingga tidak dapat terbaca oleh  mesin sequencer .  Kesalahan  pembacaan  alat sekuensing dapat diklarifikasi
dengan
membandingkan peak yang terbentuk pada elektroferogram dengan sekuen acuan.
Hasil  sekuensing  dianalisis  dengan  program BLASTN  pada  situs  NCBI  (www.ncbi.nlm.nih.gov) untuk  melihat  similaritas  dengan  sekuen  acuan  dari GenBank.  Hasil  BLASTN  menunjukkan  kesamaan  gen 2  dengan  sekuen  klon  gen  16S  rRNA  (Acc.  No. JF951829.1). Sekuen forward dan reverse gen 1, 2, dan 3  menunjukkan  nilai identities sebesar  99%,  100%, dan 99%. Hasil BLASTN menunjukkan bahwa sekuen gen  2  hasil  sekuensing  dan  sekuen  acuan  gen  16S rRNA uncultured rumen  metanogen BBS-12 (Acc. No. JF951829.1)  memiliki  similaritas  yang  tinggi  dengan hasil  pada  tingkat  spesies.  Sekuen  gen  1  dan  3 memiliki  similaritas  yang  cukup  baik  dengan  sekuen acuan  gen  16S  rRNA uncultured  bacterium  clone 8- 3L21  walaupun  hanya  pada  tingkat  genus  (Acc.  No. FJ682537.1).
Menurut  Hall  (2001),  tingkat  similaritas  dapat ditentukan  oleh  nilai identities .  Semakin  tinggi  nilai identities semakin  menunjukkan  kemiripan  dengan
sekuen  acuan  pada  GenBank.  Hasil  tersebut menunjukkan  bahwa  fragmen  gen  800 bp tersebut adalah bakteri metanogen. Hal tersebut membuktikan keberhasilan  proses  ekstraksi  dan  amplifikasi fragmen gen 16S rRNA.
Hasil  analisis  BLASTN  diperoleh  2  sekuen  yang berbeda.  Sekuen  dicocokkan  dengan  sekuen  yang terdapat dalam NCBI. Berdasarkan NCBI, hasil sekuen gen 1 dan 3 diperoleh 1 sekuen klon yang sama pada tingkat genus, yaitu Prevotella 24%, Clostridium 1,5%, dan  sisa  bakteri uncultured lain  ( Arthrobacter, Asteroleplasma,  Bifidobacterium,  Collinsella,  Delftia, Eggerthella,  Lactobacillus,  Mitsuokella,  Olsenella, dan Propionibacterium ). Hasil analisis sekuen gen 2 secara keseluruhan  diperoleh  1  sekuen  klon  pada  tingkat spesies,  yaitu Methanobrevibacter  ruminantium,  M. millerae ,  dan M.  gottschalkii ditemukan  masing- masing  dengan  persentase  21,83%,  29,17%, 6,47%, dan  sisa  pada Methanosphaera  stadtmanae dan Methanobacterium  alcaliphilum . Methanobrevibacter millerae adalah spesies yang paling melimpah. Semua spesies  tersebut  termasuk  ke  dalam  ordo Methanobacteriales.  Hal  tersebut  sesuai  pernyataan Skillman et al . (2004) bahwa jenis bakteri metanogen dari  ordo  Methanobacteriales  adalah  yang  paling umum  ditemukan  dalam  rumen  sapi. Spesies  dari genus Methanobrevibacter adalah  yang  paling  sering terdeteksi pada rumen sapi (Whitford et al ., 2001). Bakteri  metanogen  dalam  rumen  semakin  sering diidentifikasi  dari  sekuen  gen  16S  rRNA.  Gen  16S rRNA  digunakan  sebagai  penanda  molekuler  karena molekul  ini  bersifat ubikuitus dengan  fungsi  yang identik  pada  seluruh  organisme.  Gen  16S  rRNA memiliki  beberapa  daerah  urutan  basanya  variatif. Urutan  basa  yang  bersifat  variatif  dapat  digunakan untuk  melacak  keragaman  dan  menempatkan  galur- galur  dalam  satu  spesies.  Jika  urutan  basa  16S  rRNA menunjukkan  derajat  kesamaan  yang  rendah  antara dua  takson,  deskripsi  suatu  takson  baru  dapat dilakukan tanpa hibridisasi DNA. Biasanya jika derajat kesamaan urutan basa gen 16S rRNA kurang dari 97% dapat  dianggap  sebagai  spesies  baru  (Stackebrandt dan Goebel, 1995).
Identifikasi  bakteri  berdasarkan  gen  16S  rRNA dengan  metode  molekuler  sangat  penting  dalam mempelajari  komunitas  bakteri  pada  sampel lingkungan.  Umumnya,  bakteri  metanogen  dipelajari melalui isolasi dan karakterisasi melalui kultur, tetapi tidak  semua  jenis  mikroba  dapat  dikultur  (Reeve, 1994).  Persentase  jumlah  mikroba  yang  dapat dikultur  hanya  sebesar  1%  dari  total  populasi mikroba yang ada di alam (Suwanto, 1994). Kegagalan teknik kultivasi terutama disebabkan oleh kebutuhan nutrisi  dan  kondisi  pertumbuhan  bakteri  sangat beragam  (Felske et  al .,  1998),  padahal  jenis  mikroba yang  belum  dapat  dikulturkan  juga  merupakan komponen  utama  dari  komunitas  mikroba  secara keseluruhan  sehingga  teknik  kultivasi  tidak  dapat dijadikan  sebagai  standar  untuk  mempelajari keragaman bakteri (Borneman et al ., 1996).

## K E S I M P U L A N
D A N S A R A N
Berdasarkan  hasil  dan  pembahasan  penelitian,  maka diperoleh kesimpulan sebagai berikut:
1. Diperoleh  total  51  klon  dengan  panjang  ukuran insert  sebesar  800  bp.  Genus  yang  diperoleh  dari sekuen gen 1 dan 3 adalah Prevotella, Clostridium , dan  bakteri uncultured lain  ( Arthrobacter, Asteroleplasma, Bifidobacterium, Collinsella, Delftia, Eggerthella,  Lactobacillus,  Mitsuokella,  Olsenella, dan Propionibacterium )  dengan  masing-masing persentase  sebesar  24%,  1,5%,  dan  sisa  bakteri uncultured lain,  sedangkan  dari  sekuen  gen  2
diperoleh
spesies
Methanobrevibacter ruminantium,  M.  millerae ,  dan M.  gottschalkii ditemukan  masing-masing  dengan  persentase 21,83%,  29,17%,
6,47%,  dan  sisa  pada Methanosphaera stadtmanae dan
Methanobacterium alcaliphilum .
2. Kelompok  bakteri  metanogen  rumen  sapi  yang paling  banyak  ditemukan  adalah  spesies Methanobrevibacter  millerae dan  genus Prevotella dengan masing-masing persentase sebesar 29,17% dan 24%.
Perlu  dilakukan  upaya  untuk  mengurangi pembentukan  gas  CH 4 dari  proses  pencernaan  pakan ruminansia  atau  upaya  untuk  meningkatkan  bakteri metanogen  untuk  menghasilkan  gas  CH 4 yang  lebih banyak  untuk  dimanfaatkan  sebagai  sumber  energi alternatif  dalam  bentuk  biogas.  Pemanfaatan  biogas diharapkan  dapat  menekan  efek  negatif  gas  CH 4 bagi lingkungan.  Selain  itu,  data  sekuen  dapat  digunakan untuk  analisis  filogenetik  sehingga  dapat  diketahui hubungan kekerabatan antar spesies.

## D A F T A R R E F E R E N S I
Amann  RI,  Ludwig  W,  Schleifer  KH.  1995.  Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiological Reviews 59: 143-169.
Applied  Biosystem.  2000.  Automated  DNA  sequencing:  chemistry guide. Applera Copporation, Foster City, hlm. 246.
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Sturhl  K,  Albright  LM,  Coen  DM,  Varki  A,  Jamsen  K.  1995. Qurrent protocols in molecular biology. 2 nd ed. John Wiley and Sons. Inc., Massachusetts 24(3): 1-9.
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA,
Struhl  K.  2002.  Current  protocol  in  molecular  biology  1.  John Wiley and Sons Inc., Canada 26(8): 1-2.
Borneman TD, Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 1996. Biology of microorganism. 7 th ed. Prentice-Hall, New Jersey 7: 909. Brooker  RJ.  2005.  Genetics:  analysis  and  principles.  McGraw  Hill Companies, Inc., Boston 26: 842.
Brown TA. 2006. Gene cloning and DNA analysis: An Introduction.
5 th ed. Blackwell Publishing, Oxford 20: 386.
Chromas Lite. 2013. Version 2.1.1., Technelysium Pty Ltd, Australia. Crustal W. 2012. Foster City. Ltd.
Davis  LG,  Kuehl  WM,  Battey  JF.  1994.  Basic  methods  in  molecular biology. 2 nd ed. Appleton and Lange. Connecticut 12: 777. DITJENNAK.  2007.  Statistik  peternakan.  Direktorat  Jenderal Peternakan, Departemen Pertanian, Jakarta.
Fairbanks  DF,  Andersen  WR.  1999.  Genetics:  Continuity  of  Life.
Brooks/Cole Publishing Company, New York 19: 820.
Fanani  MZ.  2011.  Eksplorasi  novel  gen  glikosida  hidrolase  untuk degradasi  biomassa:  pendekatan  secara  metagenomik. Surabaya: Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga. Felske T, Akratanakul P, Nettanomsak S, Huntamai S. 1998. Larval habitats  and  distribution  patterns  of Aedes  aegypti (Linnaeus)
and Aedes  albopictus (Skuse),  in  Thailand. Southeast  Asian J.
Tropical Medical Public Health 34(3): 529-535.
GeneJet™ Plasmid Kit. USA. 2013.
Hall BG. 2001. Phylogenetic trees made easy: a how to manual for molecular  biologist.  Sinaeur  Associates,  Inc.,  Sunderland  12: 179.
Hanahan D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. In : Sambrook, J. S. and D. W. Russell. 2001. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. J. Mol. Biol 166: 557-580. Handoyo  D,  Ari  R.  2001.  Manipulation  and  expression  of recombinant  DNA:  A  Laboratory  Manual.  2 nd ed.  London:
Elsevier Academic Press 16: 151.
Herison  C,  Rustikawati,  Eliyanti.  2003.  Penentuan  protokol  yang tepat  untuk  menyiapkan  DNA  genom  cabai  ( Capsicum  sp.). Jurnal Akta Agrosia 6(2): 38-43.
IPCC.  2006.  Emission  from  Livestock  and  Manure  Management. Guidelines for National Greenhouse Gas Inventories. Ch. 10. Johnson  KA,  Johnson  DE.  1995.  Methane  emissions  from  cattle.  J. Anim. Sci 73: 2483-2492.
Lorenz  K,  Schleper  A.  2002.  Bioimformatics  tools  and  guideline  to PCR primer design. Afr. J. Biotechnol. 2(5): 91-95.
Mackie  AT,  Bryant  DA.  1984.  Identification  of  a  novel  group  of bacteria  in  sludge  from  a  deteriorated  biological  phosphorus removal reactor. AEM J. 65(3): 1251-1258.
Martin  C,  Doreau  M,  Morgavi  DP.  2008.  Methane  mitigation  in ruminants: from rumen microbes to the animal. Inra, Ur 1213, Herbivores  Research  Unit,  Research  Centre  of  Clermont- Ferrand-Theix. France: F-63122 St Genes Champanelle.
Moss  AR.  1993.  Methane  Global  Warming  and  Production  by Animals. Chalcombe Publications, Canterbury.
NCBI. 2013. The BLAST sequence analysis tool, 1 November 2013. Nercessian  O,  Bienvenu  N,  Moreira  D,  Prieur  D,  Jeanthon  C.  2005.
Diversity  of  functional  genes  of  methanogens,  methanotrophs, and  sulfate  reducers  in  deep-sea  hydrothermal  environments. Environ. Microbiol. 7(1): 118-132.
Old  RW.  Primrose  SB.  2003.  Prinsip-Prinsip  Manipulasi  Gen: Pengantar  rekayasa  genetika.  Edisi  ke-4.  Terjemahan  dari Principles  of  gene  manipulation:  an  introduction  to  genetic engineering.  4 th ed,  oleh  Susilo  H,  Oorebima  AD.  Jakarta:  UI Press 8: 446.
Philekorea  Technology  INC.  Xprep  Plant  DNA  Mini  Kit  (RNase  A Included). Gasan-dong, Geumcheon-gu, Seoul, Korea Selatan pp: 153-803.
Promega.  2008.  pGEM ® -T  Easy  vector  systems:  technical  manual 42: 30.
Queen  BJ.  2000.  The  transformation  lab:  experiment  using E.  coli and pFluoroGreen. MdBioLab hlm. 19.
Reeve G. 1994. Molecular biology of dengue viruses. New York: CAB International 175-198.
Riesenfeld  CS,  Goodman  RM,  Handelsman  J.  2004.  Uncultured  soil bacteria  are  a  reservoir  of  new  antibiotic  resistance  genes. Environ. Microbiol. 6(9): 981-989.
Sambrook  J,  Fritsch  EF,  Manniatis  T.  1989.  Molecular  cloning:  a laboratory  manual.  2 nd ed.  New  York:  Cold  Spring  Harbour Laboratory Press 38(31): 9.
Sambrook  JS,  Russell  DW.  2001.  Molecular  cloning:  a  laboratory manual.  Volume  1-3.  3 rd ed.  New  York:  Cold  Spring  Harbor Laboratory Press: xxvii + 18.136 + A. 14. 1 + R. 22 + 1. 44 hlm.
Shiddieqy  CH.  2009.  16S  rDNA  fingerprinting  of  rhizosphere bacterial  communities  associated  with  healthy  and phytophthora infected avocado roots. FEMS Microbiol. Ecol. 35: 129-136.
Schmeisser  S,  Talamin  A,  Debruyne  M,  Falconar  A,  Deubel  V, Flamand  M.  2007.  Enzyme-linked  immunosorbent  assay spesific  to  dengue  virus  type-1  nonstructural  protein  ns1 reveals circulation of the antigen in the blood during the acute phase of disease in patients experiencing primary or secondary infections. J. of Clinical Microbiol. 40(2): 376-381.
Skillman LC, Evans PN, Naylor GE, Morvan B, Jarvis GN, Joblin KN.
2004.  16S  Ribosomal  DNA-directed  PCR  primers  for  ruminal methanogens  and  identiﬁcation  of  methanogens  colonising young lambs. Anaerobe 10: 277-285.
Skillman  LC,  Evans  PN,  Strompl  C,  Joblin  KN.  2006.  16S  rDNA directed  PCR  primers  and  detection  of  methanogens  in  the bovine rumen. Lett. J. of Appl. Microbiol. 42: 222-228.
Smith  KD,  Valenzuela  A,  Vigna  JL,  Aalbers  K,  Lutz  CT.  1993. Umwanted  mutation  in  PCR  mutagenesis:  Avoiding  the Predictable. Genome Research 2: 253-257.
Speece D. 1983. Quantitative aspects of microbial metabolism in the rumen  and  hindgut.  pp:  217-237. In :  J.P.  Jouany  (Ed.).  The Rumen  Microbial  Metabolism  and  Ruminant  Digestion.  Paris: INRA.
Stackebrandt  E,  Goebel  BM.  1995.  A  place  for  DNA-DNA reassociation  and  16S  rRNA  sequence  analysis  in  the  present species definition in bacteriology. Int. J. of Systematic Bacteriol.
44: 846-849.
Stadtman  TC,  Barker  HA.  1951.  Studies  on  the  methane fermentation.  Tracer  experiments  of  fatty  acid  oxidation  by methane bacteria. J. Bacteriol. 61: 67-80.
Streit  RD,  Schmitz  G.  2004.  PCR  core  system:  complete  reagent systems for DNA amplification. Promega Notes Magazine 62: 5- 8.
Suwanto  B.  1994.  Computer  programs  for  PCR  primer  design  and analysis.  PCR  cloning  protocol.  2 nd ed.  New  Jersey:  Humana Press, Inc. 19-30.
Tan ND, Wanapat M, Uriyapongson S, Cherdthong A, Pilajun R. 2012. Enhancing  mulberry  leaf  meal  with  urea  by  pelleting  to improve  rumen  fermentation  in  cattle. J.  of  Animal  Sci.  25(4): 452-461.
Tilley  JAM,  Terry  RA.  1963.  Two-stag  tecnique  for  the  in  vitro digestion of forage crops. J. British Grussland Soe. 18: 104.
US  EPA.  1994.  International  anthropogenic  methane  emission: estimates for 1990. EPA 230-R93-010. Washington DC: Office of Policy, Planning and Evaluation.
Vogelstein  B,  Gillespie  D.  1979.  Preparative  and  analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 615-619.
Vogels GD, Hoffe WF, Stumm CK. 1982. Association of metanogenic bacteria with rumen ciliates. Appl. Environ. Microbiol. 40: 608- 612.
Whitford MF, Teather RM, Forster RJ. 2001. phylogenetic analysis of methanogens from the bovine rumen. BMC Microbiol. 1: 5.
Wright AD, Williams AJ, Winder B, Christophersen CT, Rodgers SL,
Smith  KD.  2004.  Molecular  diversity  of  rumen  methanogens from sheep  in  western  Australia. Appl.  Environ. Microbiol.  70: 1263-1270.
Wright AD, Toovey AF, Pimm CL. 2006. Molecular  identiﬁcation of methanogenic  archaea  from  sheep  in  Queensland,  Australia reveal more uncultured novel archaea. Anaerobe 12: 134-139.
Yun  MC,  Ryu  SM.  2005.  Construction  and  characterization  of recombinant flaviviruses bearing insertions between E and NS1 genes. Virology Journal 4(115): 1-16.
Zhou M, Hernandez SE, Guan LL. 2009. Assessment of the microbial ecology  of  ruminal  methanogens  in  cattle  with  different  feed efﬁciencies. J. of Appl. Environ. Microbiol. 75: 6524-6533.
Zhou M, McAllisterb TA, Guan LL. 2011. Assessment of the microbial ecology  of  ruminal  methanogens  in  cattle  with  different  feed efﬁciencies. animal feed sci. and Technol. 166-167: 76-86.