Menara Perkebunan , 2009, 77(2), 79-88.

## Kloning gen LEAFY kakao dari jaringan bantalan bunga aktif
Cloning of cacao LEAFY gene from the active flower cushions
Tetty CHAIDAMSARI 1+) Rita HAYATI 2+) Auzar SYARIEF 2) ,
Aswaldi ANWAR 2) , Djoko SANTOSO 1*)
1) Balai Peneltian Bioteknologi Perkebunan,  Bogor 16151, Indonesia
2) Fakultas Pertanian Universitas Andalas,  Padang 25163, Indonesia

## Summary
Attempts to improve productivity of cacao plantations lead us to study the molecular mechanism of flowering. In the model species Arabidopsis thaliana as well as some other species, LEAFY is a central regulatory gene for the transition of shoot apical meristems to flowering meristems. Different from that of Arabidopsis, cacao inflorescence is a cauliflorous type, by which flowers can develop repeatedly from the same flower cushion on the trunk. In this research, a LEAFY homolog was isolated from active flower cushion with RT-PCR using a pair of DNA primer specifically designed to isolate its complete cds. Gel electrophoresis examination indicated the presence of a 1.2 kb amplicon.  Purified from the gel, this DNA fragment was cloned into competent cells of E. coli XL1 Blue using pGEM-T Easy cloning vector at an orientation according to the T7 promoter of the plasmid. Sequence analysis using BLASTX, showed that the amplicon was LEAFY (LFY) homolog. Alignment analysis using Clustal W indicated that the cTcLFY highly homologous to those from other perennial crops such as citrus, grape, apple and poplar. The highest homology (conserved region) was found in the C terminal of the encoded proteins .
[ Key words : cTcLFY , Theobroma     cacao L., flowering gene].

## Ringkasan
Usaha untuk meningkatkan produktivitas perkebunan kakao telah mendorong penelitian molekuler tentang mekanisme pembungaan kakao. Pada tanaman model Arabidopsis thaliana dan lainnya, LEAFY merupakan gen kunci dalam transisi meristem tunas jadi meristem bunga. Berbeda dengan sistem pada Arabidopsis , pembungaan kakao termasuk tipe cauliflorous, bunga dapat muncul dari bantalan bunga yang sama sepanjang tahun. Dalam penelitian ini homolog LFY diisolasi dari bantalan bunga aktif menggunakan RT-PCR dengan sepasang primer spesifik yang dirancang berdasarkan sekuen DNA di kedua ujung gen tersebut. Pemeriksaan gel elektroforesis menunjukkan adanya amplikon tunggal berukuran 1,2 kb. Setelah dimurnikan dari gel, amplikon dapat diklon ke dalam sel kompeten E. coli galur XL1 Blue menggunakan vektor pGEM-T Easy dengan orientasi yang sesuai dengan promoter T7 dari vektor. Analisis BLASTX sekuen DNA  membuktikan bahwa amplikon tersebut  adalah homolog dari gen LEAFY . Analisis penjajaran dengan mengguna- kan ClustalW menunjukkan bahwa gen cTcLFY tersebut memiliki homologi yang tinggi dengan gen sejenis dari tanaman keras lainnya seperti tanaman jeruk, anggur, apel dan poplar. Homologi tertinggi ( daerah terkonservasi ) terdapat pada ujung (terminal) C dari protein yang disandinya.
*) Penulis korespondensi,
+) Penulis berkontribusi sepadan
Chaidamsari et al.

## Pendahuluan
Perkebunan kakao memiliki peranan ekonomi dan sosial yang cukup penting bagi Indonesia, dan merupakan salah satu komoditas perkebunan yang direvitalisasi. Pekebun kecil mendominasi kepemilikan dan pengelolaannya, mencapai 80% dari total areal 776.900 Ha. Namun demikian produk- tivitasnya relatif masih rendah. Produktivitas rata-rata per tahun dari kebun kakao Indonesia hanya sekitar 0,6 ton biji kering per hektar (Indonesia, Direktorat Jenderal Perke- bunan, 2002).  Angka ini setara dengan empat hingga lima kali lebih rendah daripada potensinya, yang mencapai lebih dari 3 ton biji kering per hetar per tahun (Duke, 1983).
Produktivitas tanaman kakao bervariasi dan dipengarungi oleh genotipe bibit dan faktor lingkungan termasuk teknik budi- dayanya. Produksi akhir berkorelasi positif dengan jumlah atau densitas buah matang yang dipanen per hektar per jumlah biji per buah serta ukuran bijinya (Abdullah et al. , 1986). Densitas buah kakao dapat dikendali- an melalui tiga tahapan perkembangan re- produktif, yaitu pembungaan, pembuahan dan pendewasaan buah. Tanaman kakao dapat menghasilkan bunga sepanjang tahun dengan puncaknya terjadi pada musim hujan. Di pulau Jawa, pembungaan mulai terjadi di bulan Nopember (awal musim hujan) dan mencapai puncaknya  antara bulan Desember hingga bulan Januari pada tahun berikutnya (Tjasadihardja, 1987).
Tanaman kakao memiliki tipe bunga cauliflorous. Bunga dapat terjadi secara konsisten dari bantalan bunga pada batang dan cabang pohon kakao. Bantalan ini berkembang dari ketiak daun ( leaf axils ). Bunga yang muncul dari kuntum yang kecil biasanya mengalami aborsi (Lent, 1966).
Bunga yang tidak terpolinasi saat pembukaannya juga akan teraborsi dalam waktu 24 jam (McKelvie, 1956). Sebatang pohon kakao dewasa yang sehat dapat menghasilkan lebih dari 10.000 bunga per tahun. Sekitar 10% dari bunga tersebut terpolinasi, dan 20% dapat menjadi buah dan berkembang (Wood, 1972). Pada kebanyakan perkebunan kakao di Indonesia, jumlah buah yang terpanen jauh lebih rendah. Menurut Iswanto et al. (1999), densitas buah bervariasi antara 33 hingga 40 per pohon kakao.
Perbaikan perkembangan reproduktif kakao diarahkan untuk tujuan  meningkatkan produktivitas kebun. Usaha ini diawali dengan mempelajari mekanisme molekuler dari pembungaan kakao. Gen LFY menjadi gen yang utama karena peranannya dalam proses pembungaan. Pada Arabidopsis , LFY dan AP1 menginduksi transisi dari pertum- buhan vegetatif menjadi bunga. Peranan LFY secara mutualistik diperkuat oleh ekspresi gen AP1 (Liljegren et al. , 1999). Determinasi dari fenotipe pembungaan oleh LFY telah dibuktikan secara in vitro . Ekspresi ectopik LFY dalam kultur sel in vitro dilaporkan dapat menginduksi pembungaan (Wagner et al. , 2004). Tulisan ini melaporkan hasil penelitian kloning dan karakterisasi dari cTcLFY dari jaringan bantalan bunga aktif kakao.

## Bahan dan Metode
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan tanaman dan bahan kimia. Bahan tanaman yang diguna- kan adalah jaringan bantalan bunga aktif dari tanaman kakao lindak. Bahan kimia terdiri dari Nitrogen cair N 2 cair), Kloroform

## Kloning gen LEAFY kakao dari jaringan bantalan bunga aktif
Isoamilalkohol, Etanol absolut, NaOH, NaCl, PVP, β -merkaptoetanol kualitas p.a. diperoleh dari Merck atau Sigma melalui rekanan lokal. Bahan kimia kualitas biologi molekuler seperti DEPC- treated water , Natrium asetat, Lithium Chloride, Phenol, CTAB, EDTA, dan Tris-HCl dibeli dari Sigma. Untuk Sintesis First-Strand DNA menggunakan kit SuperScript TM II Reverse Transcriptase (Invitrogen).

## Perancangan primer
Primer dirancang dengan program Primer tiga yang tersedia pada situs web http://frodo.mit.edu/. Sekuen gen LFY tanaman yang digunakan untuk merancang primer diantaranya yaitu Citrus sinensis, Vitis vinifera, dan Arabidopsis thaliana. Hasil perancangan tersebut berupa urutan oligonukelotida dengan beberapa data yang penting untuk diketahui dalam pelaksanaan proses PCR, seperti; Tm ( melting temperature ), jumlah basa, kandungan GC, dan yang lainnya.

## Isolasi RNA total
RNA total diisolasi dari bantalan bunga aktif kakao menggunakan prosedur yang diuraikan oleh Chaidamsari et al ., (2006) dengan sedikit modifikasi. Sebanyak 1 gram jaringan dihaluskan dengan nitrogen cair dan dihomogenkan dengan bufer ekstraksi (EDTA 20 mM pH 8,0; CTAB 2%, NaCl 2 M, Tris HCl 100 mM pH 8,0; PVP) dan 1% β -merkaptoetanol pada suhu 65°C selama satu jam dan pengocokan setiap 15 menit. Setelah satu jam tabung didinginkan pada suhu kamar, kemudian diekstraksi dengan kloroform:isoamilalkohol (24:1) dengan volume yang sama dan dikocok
hingga kedua lapisan membentuk emulsi. Campuran ekstraksi tersebut kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 20.000 xg selama 15 menit pada suhu ruang. Supernatan  diekstraksi  kembali  dengan 1 volume berturut-turut dengan campuran campuran fenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), kloroform:isoamilalkohol (24:1), dan disentrifugasi pada kondisi yang sama dengan sebelumnya. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 10 M LiCl hingga konsentrasi 3 M, dan kemudian diinkubasi pada suhu 4°C over night . Endapan RNA yang sudah dimalamkan selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 20.000 x g selama 30 menit pada 4°C. Pelet yang dihasilkan dilarutkan dengan 500 μ L DEPC- treated water . Selanjutnya diekstraksi kembali dengan fenol, campuran fenol:kloroform: isoamil- alkohol, dan kloroform: isoamil-alkohol masing-masing sebanyak 1 volume, disentri- fugasi dengan kecepatan 15.000 x g selama 15 menit pada suhu 4 °C. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikro baru, dan ditambahkan tiga kali volume etanol absolut dan 0,1 volume Na-asetat 3 M pH 5,8. Setelah diendapkan selama tiga jam pada suhu -70 °C, selanjutnya disentrifus dengan  kecepatan  15.000  x  g  selama 30 menit pada suhu 4°C. RNA dicuci dengan 70% etanol dingin, dikeringkan dengan speed vac dan dilarutkan dengan 30 μ L DEPC- treated water .

## RT-PCR
Sintesis cDNA utas pertama dilakukan menggunakan kit SuperScript TM II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Proses pemanasan dan inkubasi dilakukan dengan mesin PCR  (Biometra T-personal). Sintesis
Chaidamsari et al.
first strand menggunakan 2 μ g RNA total bantalan bunga aktif. Prosedur yang digunakan sesuai dengan yang di manual SuperScript TM II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Setelah diinkubasikan pada suhu 42 °C selama 50 menit, reaksi dinonaktifkan dengan pemanasan 70°C selama 15 menit, selanjutnya ditambahkan 1 μ L RNase H dan diinkubasi pada 37°C selama 20 menit. Setelah itu cDNA utas pertama yang terbentuk selanjutnya diguna- kan sebagai template untuk amplifikasi fragmen gen LFY , menggunakan primer spesifik LFY . Sebanyak 1 μ L template dari bantalan aktif bunga kakao diamplifikasi dengan primer spesifik yang dirancang untuk gen LFY. Sampel diamplifikasi menggunakan mesin PCR Biometra T-personal dengan program sebagai berikut: initial denaturasi pada suhu 94 °C, lima menit dilanjutkan denaturasi pada suhu  94 °C selama 45 detik, annealing 50 °C selama 45 detik, ekstensi 72 °C selama lima menit. Hasil amplifikasi diverifikasi pada gel agarose 1% mengguna- kan Axyprep DNA gel extraction kit (Axygen) . Pita DNA yang ukurannya sesuai dengan yang diharapkan selanjutnya diekstraksi dari gel. Hasil ekstraksi selanjutnya diligasi pada vektor kloning dalam hal ini pGEM-T Easy.
Kloning fragmen DNA amplikon dengan pGEM-T Easy
Hasil ligasi menggunakan enzim T4 DNA ligase tersebut, ditransformasikan ke dalam kompeten E. coli XL1 Blue . Sel yang telah ditransformasi kemudian disebarkan ( plated ) di atas medium padat LB agar yang mengandung ampisilin sebagai marker seleksi dan diinkubasi semalam.
Koloni yang terbentuk adalah sel E. coli yang berhasil ditransformasi. Sel yang tidak berhasil tertransformasi akan mati akibat perlakuan ampisilin. Dua jenis koloni akan terbentuk pada cawan Petri. Koloni yang berwarna putih menunjukkan sel yang mengandung plasmid yang berhasil disisipi. Koloni yang berwarna biru mengandung plasmid yang tidak berhasil disisipi. Koloni putih kemudian diamplifikasi dengan primer universal yaitu M13 Forward dan M13 Reverse dengan kondisi PCR sebagai berikut initial denaturasi pada suhu 94°C, tiga menit dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik, annealing 55°C selama satu menit, ekstensi 72 °C selama dua menit. Hasil reaksi PCR ini diperiksa pada gel agarosa.

## Sekuensing dan analisis DNA
Untuk keperluan sekuensing, koloni yang positif mengandung plasmid tersisipi, selanjutnya dikulturkan dalam medium LB yang mengandung ampisilin selama semalam pada suhu 37ºC dengan pengocokan 150 rpm. DNA plasmid yang diperoleh selanjutnya disekuen di lembaga Charoen-Pokphand Jakarta. DNA disekuen menggunakan primer M13-Forward dan M13-Reverse. Sekuen DNA yang diperoleh dianalisis identitasnya dengan program bioinformatika online Blast

## Hasil dan Pembahasan

## Isolasi dan kloning
Isolasi klon cDNA dari RNA total jaringan bantalan bunga aktif tanaman kakao dilakukan dengan pendekatan RT-PCR. Hasil amplifikasi cDNA utas tunggal
Kloning gen LEAFY kakao dari jaringan bantalan bunga aktif
menggunakan primer spesifik memberikan pita DNA tunggal yang kuat dengan ukuran sekitar 1,2 kb (Gambar 1 panel kiri). Pemeriksaan kembali dari amplikon yang telah dimurnikan dari gel agarosa memberi- kan amplikon murni dengan ukuran yang konsisten 1,2 kb (Gambar 1 panel kanan). Ukuran ini mirip dengan cds dari gen-gen yang berfungsi sejenis dari spesies tanaman lainnya. Sebagai contoh adalah 1,179 kb pada FLORICAULA/ LEAFY -like protein 3 dari Buddleja davidii (Adkins et al. , 2005); 1,250 kb pada LEAFY/FLORICAULA dari Solanum tuberosum (Guo et al. , 2006);
1,194 kb pada LEAFY (http://www.ncbi. nlm.nih.gov). dari Citrus sinensis (Pillitteri et al. , 2004).
Dibandingkan dengan ukuran klon genomiknya, ukuran klon cDNA ini (1,2 kb) lebih kecil sekitar setengah dari ukuran gTcLFYg yaitu 2,5 kb (Santoso et al. , 2004). Di dalam gTcLFY tersebut terdapat empat intron yang ukurannya bervariasi dan menyisipinya di beberapa tempat yang ber- beda diantara lima ekson. Di dalam sel-sel eukariot adanya intron di dalam genomnya merupakan karakteristik yang membedakan-
nya dari prokariot. Pada proses ekspresi gen, sebelum ditranslasikan menjadi protein, intron-intron tersebut dihilangkan ( splicing ) dari mRNAnya.
Koloni yang tumbuh pada media seleksi diduga kuat membawa konstruk gen target. Untuk menguji adanya gen ini dilakukan PCR koloni menggunakan universal primer M13. Hasil pengujian ini ditampilkan pada Gambar 2. Data elektroforesis tersebut membuktikan bahwa proses ligasi, trans- formasi dan seleksi telah berhasil. Hal ini ditunjukkan dengan adanya pita DNA yang ukurannya sekitar 1,4 kb (lihat lajur 3 dan 14). Namun demikian efisiensi proses tersebut tergolong rendah karena dari 14 sampel yang ditampilkan, hanya dua yang positif. Ada berbagai faktor yang dapat menyebabkan rendahnya efisiensi proses. Meskipun demikian hal ini untuk tujuan penelitian ini bukanlah masalah karena sudah ada yang diduga kuat positif.
Ukuran pita DNA dari PCR koloni ini sedikit lebih besar daripada amplikon sebenarnya. Hal ini karena primer yang digunakan dalam RT-PCR ini adalah primer universal M13 forward dan M13 reverse.
Gambar 2.  PCR koloni dengan primer universal  M13 (1-14). Lingkaran adalah DNA dari koloni Positif.
Figure 2.    Colony PCR using M13 universal primers (1-14). Circled  bands  are  from  positive
Colonies.
1   2   3  M  4   5   6  7  8   M  9 10 11 12 13 M 14 1,4 kb
Gambar 1.  RT-PCR dengan  primer spesifik LFY . A & B  elektroforesis  gel preparatif, dan DNA  yang  dimurnikan  dari gel preparatif.
Figure 1.  RT-PCR with LFY specific primer. A & B are preparative  gel  electrophoresis and DNA purified from the gel.
1 kb A B
Chaidamsari et al.
Posisi kedua primer tersebut pada pGEM-T terletak masing-masing kurang lebih 100 bp dari MCS ke arah yang berlawanan. Dengan demikian tambahan nukleotida yang teramplifikasi dengan primer universal tersebut sekitar 200 bp. Koloni yang diduga kuat positif dan terkonfirmasi membawa DNA sisipan teramplifikasi yang berukuran sesuai, kemudian DNA plasmid diisolasi dan dimurnikan dari klon yang positif untuk karakterisasi lebih lanjut.
Karakterisasi dan identifikasi gen cTcLFY
Salah satu karakteristik yang ingin diketahui adalah orientasi dari cTcLFY putatif pada peta plasmid rekombinan yang diperoleh. Karakterisasi dilakukan dengan menganalisis hasil sekuensing, yaitu posisi relatif antara sekuen DNA sisipan terhadap sekuen kontaminan dari vektor kloning. Hasil analisis untuk karakteritik tersebut ditampilkan pada  Gambar 3. Hasil ini menunjukkan bahwa kodon permulaan ATG ( start codon ) teletak dekat dengan ujung promoter T7 yang berarti jauh dari promoter SP6. Dengan demikian sebaliknya adalah kodon  akhir  TAA (stop  kodon)  jauh   dari ujung   promoter   T7   yang   berarti   dekat
dengan ujung promoter SP6. Orientasi ini diperlukan antara lain untuk mempermudah atau memastikan proses modifikasinya misalnya ketika ingin diuji fungsi dari gen interes tersebut melalui proses transformasi.
Untuk memastikan identitas sekuen DNA yang diperoleh, dilakukan analisis BlastX. Analisis penjajaran ini memban- dingkan antara sekuen asam amino tertranslasi dari klon cDNA tersebut dengan seluruh sekuen asam amino yang ada di GenBank. Hasil analisis penjajaran ini ditampilkan pada Gambar 4. Berdasarkan warna kunci nilai penjajaran menunjukkan bahwa sekuen asam amino dari sekuen entri memiliki tingkat homologi tinggi dengan sekuen asam amino yang ada di GenBank, yaitu ditunjukkan dengan adanya warna merah yang dominan (nilai tertinggi, > 200). Demikian juga kalau dilihat score bits dan E Value -nya. Dengan tanaman tahunan jeruk ( Citrus sinensis ) dan poplar ( Populus tomentosa ) masing-masing E - Value nya mencapai 2e-137 dan 6e-131. Nilai ini jelas menunjukan tingkat homologi yang tinggi. Secara teoritis analisis semacam ini apabila memberikan kisaran skor > 50 bits dengan E-value > e-04 menunjukkan tingkat kemiripan yang cukup tinggi (Claveri et al., 2003; Jaya et al ., 2001). Dengan demikian
P T7 M 13 P SP 6 M 13 cTcLFY TA AT MC MC pGEM::cTcLFY Gambar 3. Orientasi gen cTcLFY dalam plasmid rekombinan pGEM:: cTcLFY sesuai  dengan promoter T7.
Figure 3.   The orientation of cTcLFY in the recombinant plasmid of pGEM:: cTcLFY is under T7 promoter.
Kloning gen LEAFY kakao dari jaringan bantalan bunga aktif
dari analisis ini, dapat disimpulkan bahwa identitas amplikon yang diperoleh dari transkrip kakao tersebut adalah homolog gen LEAFY , atau cTcLFY .
Analisis tingkat homologi sekuen asam amino cTcLFY dengan spesies tanaman ber- kayu yang relatif terdekat hubungannya (berdasarkan nilai E dari hasil analisis penjajaran tersebut di atas), dilakukan dengan program penjajaran online Clustal W
(www.ebi.ac.uk). Spesies pembanding ter- sebut adalah tanaman anggur ( VvLFY ), apel ( MxdLFY ), poplar ( PtLFY ), dan jeruk ( CsLFY ). Hasil analisis ditampilkan pada Gambar 5. Dari penjajaran ini terlihat daerah yang memiliki homologi tinggi pada daerah terminal C, yaitu antara residu asam amino nomor 257 hingga 394. Pada daerah lainnya (terutama) pada daerah ujung N, memiliki tingkat homologi yang relatif rendah. Pola
Gambar 4.  Hasil analisis Blast X dari sekuen asam amino ( deduced sequence ) dari klon putatif cTcLFY dari bantalan bua aktif tanaman kakao.
Figure 4.    Blast X analysis of the deduced amino acid  sequence  of  the  putative cTcLFY of the cacao active Cushion.
Score    E Sequences producing significant alignments:               (Bits) Value gb|ABA43523.1| FLORICAULA/LEAFY-like protein 3 [Buddleja   511  7e-143 gb|AAR01229.1| LEAFY [Citrus sinensis]                     493  2e-137 gb|ABN11915.1| LEAFY-like protein [Vitis hybrid cultivar   491  6e-137 gb|AAS45975.1| floricaula [Mimulus ringens]                491  6e-137 gb|ACN97632.1| LEAFY-like protein [Mangifera indica]       489  2e-136 gb|AAC49782.1| UNIFOLIATA protein [Pisum sativum]          484  6e-135 gb|AAT57872.1| leafy/floricaula-like protein [Hevea bras.  484  7e-135 gb|ABK56828.1| LEAFY/FLORICAULA [Solanum tuberosum] >gb|.  477  9e-133 gb|ABE02270.1| LEAFY-like protein [Glycine max] >gb|ABE0.  476  2e-132 gb|AAO73539.1| leafy/floricaula [Salix discolor]           473  2e-131 gb|AAO53547.2| LEAFY-like protein [Populus tomentosa]      471  6e-131
Chaidamsari et al.
konservasi semacam ini juga dijumpai pada tingkat klon DNA genomik yang dilaporkan sebelumnya (Santoso et al. , 2004). Gen LEAFY atau LFY dikenal sebagai pengendali utama ( switch on ) kompetensi pembungaan tanaman (Putterill et al. , 2004; Wagner et al. , 2004). Pada beberapa tanaman keras (berkayu) dilaporkan
memiliki dua jenis gen LFY (Wada et al. , 2002; Santoso et al. , 2004). Pada tanaman apel AFL1 hanya diekspresikan pada kuncup bunga sedangkan AFL2 diekspresikan baik di kuncup bunga maupun pada jaringan vegetatif. Meskipun dilaporkan ada lebih dari satu gen LFY pada kakao, spesifikasi spatial ekspresi gen LFY kakao
Gambar 5.  Analisis kekerabatan genetik cTcLFY dengan ortolognya dari spesies tanaman jeruk ( CsLFY ), poplar  ( PtLFY ), apel ( MxdLFY ), dan anggur ( VvLFY ).
Figure 5. Genetic   analisis  of cTcLFY compared  to its ortologues of plant species of citrus (CsLFY), poplar (PtLFY), apple (MxdLFY), and gravevine (VvLFY).
VvLFY   MDPDAFTAS-LFKWDPRGAVAPP-NRLLEAVAPPPPGAAAPAPVAAAYA--IRPRE---LGGLEDLSQEYGVRYYTAAKI 73 MxdLFY  MDPDAFSAN-LFKWGLRGMVVPT-NRVQLEAAVPP--AAAAAAAAAGCT--LRPPGELGLGGLEDLFQAYGVRYYTAAKI 74
PtLfy   MDPEAFTAS-LFKWDTRAMLPHP-NRLLEMVPPPQ------QPPAAAFA--VRPRE---LGGLEDLFQAYGVRYYTAAKI 67 CsLFY   MDPEAFTAS-LFKWDPRVVVAPPPARVQLEQVSQPPAVPLGAAAAAAYSALVRPRE---LGGLEELFQAYGIRYHTAAKM 56 cTcLFY  MDPEAFTTGGFFKWDPRGVVAPTPARLMEAVAPPQP--QTAAAVAAAYMG-RAPRE---LGGIEELFQAYGIRYYTAAKI 54 ***:**::. :***. *  :  .  *:               . **.      *     * *:*:* * **:**:****: VvLFY   AELGFTVSTLLDMKDEELDDMMNSLCQIFRWDLLVGERYGIKAAVRAERRRLDEEESRRRHLLSADT-ANAIDALSQEGL 152 MxdLFY  AELGFTVKTLLDMTDDELDDMMSSLSQIFRWELLVGERYGIKAAVRAERRHLDEEDSRRRNHVSGDTTTNALDALSQEGL 154 PtLfy   AELGFTVNTLLDMKDEELDEMMNSLSQIFRWDLLVGERYGIKAAVRAERRRLDEEDPRRRQLLSGDNNTNTLDALSQEGF 147 CsLFY   AELGFTVNTLLDMKDEELDEMMNSLGHLFRWELLVGERYGIKAAVRAERRRLDEDDLRRRHFLSSDTTTNAVDALSQEGL 136 cTcLFY  AELGFTVSTLLGMKEEELDEMMNSVSQIFRWELLVGERYGIKAAVRAERRRLEEEDSRRRHLVSGDT-TNALDALSQEGL 133
*******.***.*.::***:**.*: ::***:******** **********:*:*:: ***: :*.*. :*:*******: VvLFY   SEEPVQQEKEAGGSGGVGTWEVVVAGERKKQQRR-KKGKTRMGSADDNMNEDDNEGGDEDDDK------GSGERGS---- 221 MxdLFY  SEEPVQQEKEMVGSGGGAAWEVATAGERRKKQRRMKKGQFRNCSAGGRHNNDNNEGVDDEDDNDMDDMTGHGNGGGGGML 234 PtLfy   SEEPVQQDKEAAGSGGRGTWEAVAAGERKKQPGR-KKGQRKVVDLDG----DDEHGG---------------------AI 201 CsLFY   SEEPVQQDKEAAGSGGGGPWEVAER--KKKQRGRKGPRPRKVVDVNLEDENDDDEYG--------------GGCGG---- 196 cTcLFY  SEEPVQQEKEAAGSGGGGTWEVVVAGGRKKQRRR--KGPKKVVEVDNEDELEGAEDDE------------NGDIGG---- 195
*******:**  **** ..**..    ::*:  *      :  . .     :. . VvLFY   -ERQREHPFIVTEPGEVARGKKNGLDYLFHLYEQCRDFLIQVQNIAKERGEKCPTKVTNQVFRYAKKAGASYINKPKMRH 300 MxdLFY  GERQREHPFIVTEPGEVARGKKNGLDYLLHLYEQCRDFLIQVQNIAKERGEKCPTKVTNQVFRYAKKAGASYINKPKMRH 314 PtLfy   CERQREHPFIVTEPGEVARGKKNGLDYLFHLYEQCRDFLIQVQSIAKERGEKCPTKVTNQVFRYAKKAGASYINKPKMRH 281 CsLFY   MERQREHPFIVTEPGEVARGKKNGLDYLFHLYEQCRDFLIQVQNIAKERGEKCPTKVTNQVFRYAKKAGASYINKPKMRH 276 cTcLFY  YXRQREXRSLSXSLVXXPR-QKNGLDYLFHLYEQCREFLIQVQNIAKERGEKCPTKVTNQVFRYAKKAGASYINKPKMRH 274 ****   :  .    .* :*******:*******:******.************************************
VvLFY   YVHCYALHCLDEEASNALRRAFKERGENVGAWRQACYKPLVALAARQGWDIDAIFNAHPRLAIWYVPTRLRQLCHSERSN 380 MxdLFY  YVHCYALHCLDEEASNALRRAFKERGENVGAWRQACYKPLVAIAAGQGWDIDAIFNSHPRLSIWYVPTKLRQLCHAERNN 394 PtLfy   YVHCYALHCLDEDASNALRRAFKERGENVGAWRQACYKPLVAIASRQGWDIDSIFNAHPRLAIWYVPTKLRQLCYAERNS 361 CsLFY   YVHCYALHCLDEEASNALRRAFKERGENVGAWRQACYKPLVAIAARQGWDIDAIFNAHPRLGIWYVPTRLRQLCHAERNG 356 cTcLFY  YVHCYALHCLDEEASNALRRAFKERGENVGAWRQACYKPLVAIAARQGWDIDAIFNAHRRLAIWYVPTKLRQLCRAERNN 354 ************:*****************************:*: ******:***:* **.******:*****.:**.. VvLFY   AAAAAAAAASSCIS-GGADH----LPF 402 MxdLFY  ------ATASSSAS-GGGDH----LPY 410 PtLfy   ------ATSSSSVS-GTGGH----LPF 377 CsLFY   AG----AAASSSVS-AGAEHSVILKPY 398 cTcLFY  ------AAASSSVS-GGPDH----MAF 390 *::**. *. *     .:

## Kloning gen LEAFY kakao dari jaringan bantalan bunga aktif
belum diketahui. Namun demikian, karena diisolasi dari jaringan bantalan bunga aktif, diduga kuat TcLFY yang didapat dari penelitian ini memiliki spesifisitas yang dominan pada jaringan reproduktif tersebut. Untuk memastikan hal ini perlu dilakukan pengujian lebih lanjut.
Analisis penjajaran sekuen asam amino dari cTcLFY ( deduced sequence ) ini juga dilakukan terhadap sekuen asam amino ( deduced sequence ) dari klon genomik yang diperoleh sebelumnya (Santoso et al. , 2004). Hasil penjajaran dengan program Align two sequences using BLAST(bl2seq) dari http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, menunjuk- kan bahwa kedua sekuen  tersebut memiliki tingkat homologi sekitar 91% (data tidak ditunjukkan). Hasil ini memberikan indikasi yang kuat bahwa kedua gen TcLFY tersebut berasal dari lokus yang berbeda, dan sangat mungkin memiliki fungsi atau paling tidak karakteristik yang berbeda pula. Fenomena yang serupa juga dilaporkan terdapat pada tanaman keras apel (Wada et al. , 2002). Implikasi lainnya dari karakeristik ini adalah bahwa gen cTcLFY tersebut diekspresikan spesifik pada jaringan meristematik pem- bungaan (bantalan bunga aktif) yang sangat mungkin berarti bahwa transkripnya tersebut merupakan switch on pada proses pem- bungaan kakao.

## Kesimpulan
Dengan teknik RT-PCR menggunakan sepasang primer spesifik telah berhasil diisolasi homolog gen LEAFY dari bantalan bunga aktif kakao. Kloning menggunakan vektor pGEM-T Easy menghasilkan plasmid rekombinan yang membawa cTcLFY dengan orientasi yang sesuai dengan promoter T7 pada vektor pGEM. Analisis sekuen DNA
membuktikan identitas amplikon sebagai cTcLFY yang memiliki homologi yang relatif sangat tinggi ( conserved region ) di daerah terminal C dari proteinnya.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini dibiayai DIKTI melalui program SINTA Badan Litbang Pertanian dengan Nomor dan Tanggal Naskah Perjanjian: 1891.2/LB.620/I.1/5/2009 & Tanggal 7 Mei 2009.

## Daftar Pustaka
Abdullah, I., S. Subali & A.B. Saad (1986). Performance of control pollinated Brazilian progenies under Hilir Perak conditions. In : E. Pushparajah & C.P. Soon (eds). Cocoa and Coconuts: Progress and Outlook . Kuala Lumpur, Incorporated Society of Planters.
Adkins,J.A., J.D. Williamson & D.J. Werner (2005). Cloning and expression analysis of FLORICAULA/LEAFY homologs in Buddleja davidii (Unpublished). Submitted (SEP-2005) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases http://www.uniprot.org/uniprot/ Q3HTH6
Chaidamsari,  T.,  Samanhudi,  H.  Sugiarti,
D. Santoso, G.C. Angenent &
R.A. de Maagd (2006). Isolation and characterization of an AGAMOUS homo- logue from cocoa. Plant Sci., 170 , 968-975.
Claveri, J. M. & C. Notredame (2003). Bioinformatics for Dummies . 2 nd ed. New York.  Wiley Publishing Inc., p. 215-238.
Duke, J.A. (1983). Theobroma cacao L.
Sterculiaceae: Chocolate, Cacao, Cocoa. Handbook Of Energy Crops . Unpublished, Last up date January 9, 1998 http://www.hort urdue.edu/newcrop/ nexus/  Theobroma _cacao _nex.html
Chaidamsari et al.
Guo, J., Y. Zhang & Q. Yang (2006). Direct Submission (Unpublished). http://www. ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=Retrieve &db=protein&dopt=GenPept&RID=9BM9 D7FG01N&log%24=prottop&blast_rank=2 9&list_uids=117671283
Indonesia, Direktorat Jenderal Perkebunan (2002). Statistical Estate Crops of Indonesia 2000 – 2002: Cacao . Jakarta, Ministry of Agriculture. p.34
Iswanto, A., H. Winarno & D. Suhendi (1999). Kajian stabilitas hasil dan komponen buah beberapa hibrida kakao. Pelita Perkebunan, 15 (2), 81-90.
Jaya, A.M.S., H. Aswidinnoor & D. Santoso (2004). Deteksi dan analisis sekuen gen inhibitor proteinase pada beberapa klon kakao harapan tahan PBK dari Sulawesi Selatan. Menara Perkebunan, 72 , (1), 1-10.
McKelvie, A. D. (1956). Cherelle wilt of cacao. I. Pod development and its relation to wilt. J. Exp. Bot.,. 7, 252-263.
Lent, R. (1966). The origin of the cauliflorous inflorescence of Theobroma cacao . Turrialba, 16 , 352-356.
Liljegren, S. J., C. Gustafson-Brown, A. Pinyopich, G. S. Ditta &  M. F. Yanofsky (1999). Interactions among APETALA1, LEAFY, and TERMINAL FLOWER1 specify meristem fate. The Plant Cell , 11 , 1007-1018.
Pillitteri, L. J., I. L. Walling &  C. J. Lovatt
(2004). Characterization of CsLFY and CsAP1, homologs of LEAFY and APETALA1, from 'Washington' navel
orange ( Citrus sinensis L. Osbeck) (Unpublished). Submitted (JUL-2003) to the EMBL/GenBank/ DDBJ databases http:// www. uniprot.org/ uniprot/Q6EEV9
Putterill, J., R. Laurie & R. Macknight (2004). It's time to flower: the genetic control of flowering time. BioEssays, 26, 1-11.
Santoso,  D.,  Samanhudi,  T.  Chaidamsary,
R. A. de Maagd & G. Angenent (2004).
Study on flowering induction in cacao: Identification of the LEAFY homolog in cacao. In : The 3 rd Indonesian Biotechnology
Conf. , Sanur-Bali, Dec 1-3 rd 2004.
Santoso, D., A.A. Handayani, S. Moeljopawiro. (2007). Identifikasi dan isolasi promoter gen pembungaan kakao TcLFY . Menara Perkebunan, 75 (1),13-21.
Tjasadihardja, A. (1987). Hubungan antara pertumbuhan pucuk, perkembangan buah serta tingkat kandungan asam indol asetat di dalam biji dan layu pentil kakao. Desertasi , IPB, 124p.
Wada, M., Qie-fen Cao, N. Kotoda, Jun-ichi Soejima & T. Masuda (2002). Apple has two orthologues of FLORICAULA/LEAFY involved in flowering. Plant Mol. Biol., 49 ,
567–577
Wagner, D., F. Wellmer, K. Dilks, D. William, M.R. Smith, P.P. Kumar, J.L. Riechmann, A.J. Greeland & E.M. Meyerowitz (2004). Floral induction in tissue culture: a system for the analysis of LEAFY-dependent gene regulation. The Plant J., 39 , 273-282.
Wood, G.A.R. (1972). Cacao Third Ed. Longman, Tropical Agricultural Series