## ALCHEMY : JOURNAL OF CHEMISTRY

## Artikel Penelitian

## Pengaruh Ekstrak Etanol 90% Daun Sirih Merah terhadap Kadar Malondialdehid (MDA) dan Superoksida Dismutase (SOD) Mencit Tikus yang Dipapar Asap Rokok
S.A. Prayitno 1* , Joni Kusnadi 2 , E.S. Murtini 2
1 Jurusan Teknologi Pangan, Universitas of Dr. Soetomo, Surabaya, Jawa Timur, Indonesia, 60118 2 Jurusan Ilmu dan Teknologi Pangan, Universitas Brawijaya, Malang, Jawa Timur, Indonesia, 65145
INFO ARTIKEL ABSTRAK Riwayat Artikel Direvisi 24 Mei 2018 Diterima 11 Juni 2018
Tersedia online 21 November 2018
* Email penulis korespondensi: sutrisnoadi2007@gmail.com
Cigarette smoke is a source of free radicals which cause human body organs damage when it is exposed. Cigarette smoke as a medium that causes oxidative stress  that  has  the  potential  to  cause  oxidative  damage.  In  addition,  cigarette smoke  also  has  potency  to  reduce  SOD  (Superoxide  dismutase)  levels  and increase MDA (Malondialdehyde) levels especially in lung tissue. To control or prevent  the  presence  of  free  radicals  in  the  body,  antioxidant  compounds  are needed by the body.  The purpose of this research is to know the effect of the extract  of  red  betle  on  SOD  and  MDA  content  of  mice  exposed  to  cigarette smoke. Red betle was extracted by maceration using ethanol. The exposed mice were  treated  with  red  betle  extract  for  14  days.  Lung  tissue  of  the  mice  was analyzed SOD and MDA conentrations. The results showed that SOD levels tend to increase and decrease MDA levels in mice test animals exposed to cigarette smoke. The optimal dose to decrease MDA levels and increase SOD is 230.4 mg/g  weight/day.  Histopatology  result  showed  there  is  different  figure  of  lung tissue (alveoli) before and after red betle extract treatment.
Keywords: Red  betel,  ethanolic  extract,  malondialdehyde  (MDA),  superoxide dismutase (SOD)
Asap rokok adalah sumber radikal bebas yang dapat mengakibatkan rusaknya organ  dalam  tubuh  manusia  apabila  terpapar.  Asap  rokok  sebagai  media penyebab  terjadinya  stress  oksidatif  yang  berpotensi  menyebabkan  kerusakan oksidatif.  Selain  itu,  asap  rokok  juga  berpotensi  dalam  menurukan  kadar  SOD (Superoksida  Dismutase)  dan  meningkatkan  kadar  MDA  (Malondialdehida) terutama  pada  jaringan  paru.  Untuk  mengendalikan  atau  mencegah  adanya radikal bebas ke dalam tubuh maka senyawa antioksidan dibutuhkan oleh tubuh. Tujuan penelitian adalah adalah mengetahui pengaruh ekstrak etanol daun sirih merah  terhadap  kadar  SOD  dan  MDA  mencit  yang  dipapar  asap  rokok.  Daun sirih merah diekstrak menggunakan metode maserasi. Mencit yang telah dipapar asap  rokok  diberi  perlakuan  ekstrak  selama  14  hari.  Jaringan  paru-paru dianalisis  kadar  MDA  dan  SOD.  Hasil  penelitian  menunjukan  kadar  SOD cenderung mengalami peningkatan dan kadar MDA mengalami penurunan pada hewan  uji  mencit  yang  dipapar  asap  rokok.  Dosis  yang  paling  optimal  untuk menurunkan kadar MDA dan menaikan SOD adalah dosis 230,4 mg/g bb/hari. Hasil  histopatologi  menunjukkan  terdapat  perbedaan  gambaran  jaringan  paru- paru (alveoli) sebelum dan setelah perlakuan ekstrak.
Kata  Kunci:  Sirih  merah,  ekstrak  etanol,  malondialdehid  (MDA),  superoksida dismutase (SOD)

## 1. Pendahuluan
Asap  rokok  adalah  sumber  radikal  yang  dapat  mempengaruhi  aktivitas  enzim  dalam  tubuh  sehingga  dapat menyebabkan berbagai penyakit seperti kardiovaskular dan mempengaruhi sistem pernapasan, syaraf, dan imun [1, 2, 3, 4]. Asap rokok mengandung senyawa campuran (nikotin, tar dan 3,4-benzopiren, CO, CO 2 , NO, amonia, dan sulfur) yang bersifat karsinogenik dan menyebabkan kematian [5, 6]. Paparan asap rokok menurunkan kadar gluthatione (GSH) paru, penurunan aktivitas gluthatione peroksidase dan glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) [7].
Asap  rokok  dapat  penyebab  timbulnya  stres  oksidatif  yaitu  ketidakseimbangan  antara  prooksidan  dengan antioksidan.  Jumlah  prooksidan  di  dalam  tubuh  melebihi  kapasitas  untuk  dinetralisir  sehingga  prooksidan  berpotensi menyebabkan kerusakan oksidatif [8]. Stres oksidatif disebabkan asap rokok yang merusak membran sel lipid sehingga terbentuk  radikal  lipid  baru  dan  bereaksi  dengan  oksigen  yang  membentuk  senyawa  radikal  peroksil,  peroksida  dan malondialdehid (MDA) [9]. Peroksidasi lipid adalah reaksi oksidasi berantai yang menghasilkan radikal bebas sehingga menginisiasi  peroksidasi  lebih  lanjut  dan  menyebabkan  rantai  asam  lemak  membran  sel  terputus  menjadi  senyawa malondialdehid [10].
Asap  rokok  dapat  juga  merusak  jaringan  dengan  meningkatnya  kadar  MDA  dan  menurunnya  kadar  enzim superoksida  dismutase  (SOD).  Kerusakan sel  paru-paru  terjadi  pada  asam  lemak  tidak  jenuh fosfolipid  membran  sel, sehingga  terbentuk  peroksida  lipid.  Pada  akhir  rangkaian  degradasi  peroksida  lipid  menghasilkan  senyawa  etana, pentana  dan  MDA.  Senyawa  MDA  dapat  dijadikan biomarker peningkatan peroksida  lipid  akibat  radikal  bebas.  Enzim SOD adalah enzim endogen untuk meredam radikal bebas [11].
Efek radikal bebas dapat dicegah dengan mengkonsumsi makanan atau minuman yang mengandung antioksidan. Penggunaan  daun  sirih  merah  sebagai  sumber  antioksidan  untuk  menghambat  radikal  bebas  masih  jarang  dilakukan. Penelitian  ini  mengkaji  potensi  sirih  merah  ( Piper  crocatum) sebagai  antioksidan  alami.  Antioksidan  alami  merupakan sumber  antioksidan  sebagai  bentuk  perlindungan  kesehatan  terhadap  radikal  bebas  [12].  Ekstrak  daun  sirih  merah dengan  kandungan  senyawa  yang  berpotensi  sebagai  antioksidan  alami  selanjutnya  bisa  diaplikasikan  untuk meningkatkan kadar SOD dan MDA akibat adanya paparan asap rokok.

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1. Bahan
Bahan utama yang digunakan adalah daun sirih merah segar berasal dari Desa Menadi, Kabupaten Pacitan, Jawa Timur. Etanol 90% (teknis) digunakan sebagai pelarut pada proses ektraksi. Hewan uji yang digunakan adalah mencit putih  jantan  galur  balb/c  yang  berumur  2,5-3  bulan  (berat  badan  19-25  gram)  dengan  pakan  (BR-1)  dan  air  minum mencit. Rokok yang digunakan adalah rokok kretek tanpa filter (Gudang Garam). Bahan yang digunakan analisis MDA dan SOD adalah PBS ( Phosphate-Buffer Saline ), Xantine (MP), Xantine Oxidase (Sigma), NTB ( Nitroblue Tetrazolium ) (KPL),  TCA  ( Trichloroacetic  Acid )  100%  (Merck),  Na  Thiosulfat  1%  (Sigma)  dan  HCl  1  N  (Merck).  Uji in  vivo dan histopatologi memerlukan organ paru-paru mencit, BNF ( Buffer Normal Formalin ) 10%, alkohol (70, 80, 90, dan 95%), alkohol absolut (I, II, dan III) (Merck), xylol (I, II, III) (Merck), parafin, hemaktosilin (Merck), dan eosin (Merck).

## 2.2. Preparasi Sirih Merah
Daun  sirih  merah  disortasi  dan  dicuci  dengan  air  mengalir  agar  debu  dan  kotoran  hilang  sebelum  dilakukan pengeringan.  Pengeringan  menggunakan  oven  suhu  40°C  selama  24±2  jam.  Setelah  kering,  daun  sirih  merah dihaluskan menggunakan alat penggiling dengan disaring dengan saringan berukuran 90 mesh.

## 2.3. Ekstraksi Sirih Merah
Metode  ekstraksi  menggunakan  prosedur  Prameswari  dan  Widjanarko  [13]  yang  dimodifikasi.  Metode  ekstraksi menggunakan maserasi dengan merendam serbuk dalam pelarut etanol 90% dengan perbandingan 1 : 8 (b/v). Ekstraksi dilakukan selama 3 hari dengan erlenmeyer tertutup dimana erlenmeyer ditempatkan pada rotary shaker selama 3-4 jam dan didiamkan selama 24 jam. Kemudian, dilakukan penyaringan dan pengganti pelarut baru dengan volume yang sama. Filtrat yang sudah diperoleh dipekatkan menggunakan rotary evaporator suhu 40°C pada kecepatan 40-45 rpm.

## 2.4. Perlakuan Hewan Uji
Mencit  diaklimatisasi  (penyesuaian  diri  dengan  lingkungan)  selama  satu  minggu,  diberi  pakan  dan  minum secukupnya  ( ad  libitum ).  Berat  badan  mencit  saat  awal  dan  saat  sesudah  adaptasi  ditimbang  agar  dapat  terpantau beratnya (19-25 gram). Jumlah yang digunakan adalah sebanyak 24 ekor yang dibagi dalam 6 kelompok (tiap kelompok ada 4 ekor). Penentuan jumlah mencit dalam kelompok dihitung berdasarkan rumus Federer, yaitu (n-1)(t-1) ≥ 15.

## 2.5. Perlakuan Pemaparan Asap Rokok
Prosedur ini dilakukan berdasarkan penelitian Adyttia, dkk. [14]. Pemaparan asap rokok dilakukan setiap pagi pukul 08.00  WIB  menggunakan  2  batang  rokok  dan  dilakukan setiap  15 menit  sampai  rokok  habis.  Pemaparan  asap  rokok pada mencit dilakukan selama 14 hari pada kotak pemaparan asap dengan ukuran 35,8x28,5x22,5 cm yang dilengkapi dengan lubang kecil sebagai tempat memasukan asap rokok. Cara memperoleh asap adalah dengan membakar rokok dan sambungkan dengan pipa kemudian dihisap (disedot) dengan spuit 50 mL dan dihisap 10 kali hisapan. Pemaparan asap  rokok  dilakukan  pada  semua kelompok  kecuali  pada  kelompok  negatif  (A1)  selama  total  waktu  2  jam.  Satu  jam setelah pemaparan asap rokok, mencit diberi ekstrak etanol 90% daun sirih merah sesuai variasi dosis (A3, A4, dan A5) dan kontrol vitamin E (A6). Pada penelitian ini digunakan kontrol posifif (A2) dimana mencit dipapar dengan asap rokok dan tanpa pemberian ekstrak.

## 2.6. Penetapan Dosis Uji Ekstrak Etanol dan Vitamin E
Dosis yang dihitung berupa dosis ekstrak etanol sirih merah dan dosis vitamin E . Dosis ekstrak etanol yang dipakai untuk perlakuan ada tiga dosis awal perhitungan. Dosis tersebut adalah dosis rendah 57,6 mg/25 g bb/hari, dosis sedang 115,2 mg/25 g bb/hari dan dosis tinggi 230,4 mg/25 g bb/hari. Adapun dosis vitamin E yang digunakan adalah 0,86 mg/g bb/hari mencit.

## 2.7. Analisis Kadar Malonaldehida (MDA)
Prosedur  penelitian  Sholichah,  dkk. [15]  digunakan  untuk  menganalisis  kadar  MDA.  Analisis  kadar  MDA  pada jaringan organ paru-paru dilakukan setelah masa perlakuan selama 14 hari. Hasil pengukuran MDA dinyatakan dalam ng/mL. Paru-paru sebanyak 100 mg dipotong kecil-kecil lalu digerus dalam mortar (homogenisasi) dan ditambahkan 1 mL akuades. Homogenat dipindahkan ke dalam tabung mikro dan sentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 20 menit dan diambil supernatannya. Campuran 100 µL supernatan, 100 µL Na tiosulfat 1%, 100 µL TCA 100%, dan 250 µL HCl 1  N  digunakan  untuk  deproteinasi  (setiap  penambahan  reagen  larutan  dihomogenkan  dengan  vortex).  Kemudian, campuran tersebut disentrifugasi pada 3500 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk diambil dan ditambahkan 3500  µL  akuades.  Setelah  itu,  supernatan  diinkubasi  dalam waterbath pada  suhu  100°C  selama  30  menit  dan didinginkan pada suhu ruang. Absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 532 nm.

## 2.8. Analisis Kadar Superoksida Dismutase (SOD)
Kadar SOD ditentukan berdasarkan prosedur Sholichah, dkk. [15]. Aktivitas SOD dilakukan pada jaringan paru-paru mencit setelah perlakuan selama 14 hari. Hasil pengukuran SOD dinyatakan dalam U/mL. Paru-paru sebanyak 100 mg gram  dipotong  kecil-kecil  dan  digerus  dalam  mortar  (homogenisasi).  Kemudian,  sampel  ditambahkan  1  mL  PBS. Homogenat dipindahkan ke dalam tabung mikro dan sentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 20 menit dan diambil supernatannya.  Campuran  antara  100  µL  xanthine,  100  µL  xanthine  oxidase,  dan  100  µL  NTB  ditambahkan  100  µL supernatan.  Campuran  tersebut  diinkubasi  pada suhu  30°C selama  30 menit  hingga terjadi  perubahan  warna  menjadi ungu, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit.  Supernatan diambil dan ditambah dengan PBS 3500 µL, selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 580 nm.

## 2.9. Histopatologi Paru-Paru Mencit
Analisis histopatologi paru-paru mencit didasarkan pada prosedur Abdulla dkk [16] dan Muntiha [17].

## 2.9.1. Fiksasi Paru-Paru
Sediaan organ paru-paru direndam dalam larutan BNF 10%. Kemudian, dilakukan pemotongan ( trimming ) dengan ketebalan ±3 mm dan dimasukkan ke dalam kaset.

## 2.9.2. Dehidrasi
Jaringan  yang  berada  di  dalam  kaset  dimasukkan  ke  dalam tissue  processor untuk  dilakukan  dehidrasi.  Proses dehidrasi dilakukan menggunakan alkohol dengan konsentrasi bertingkat yang terdiri dari alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, alkohol  absolut  I,  alkohol  absolut  II  dan  alkohol  absolut  III.  Selanjutnya,  dijernihkan  dengan  memasukkan sediaan  ke dalam xylol I, xylol II dan xylol III.

## 2.9.3. Embeding dan Blocking
Sediaan  yang  telah  didehidrasi  ditanam  dalam  cetakan  yang  telah  diisi  parafin  cair  setelah  dari  volumenya  dan sebelum membeku ditambahkan lagi dengan parafin cair sampai penuh lalu didinginkan pada cold plate . Hasil cetakan yang sudah mengeras dikeluarkan dari cetakan dan blok yang diperoleh dapat disimpan dalam pendingin sampai siap untuk dipotong dengan mikrotom.

## 2.9.4. Pemotongan
Sediaan dalam blok parafin dipotong menggunakan mikrotom dengan ketebalan 3-5 µm hingga berbentuk seperti pita  dan  diletakkan  di  atas  permukaan  air  hangat  untuk  mencegah  terjadinya  lipatan  pada  pita.  Sediaan  selanjutnya diletakkan diatas gelas objek dan dikeringkan pada suhu ruang. Sediaan kemudiaan diwarnai dengan hematoksilin-eosin (HE).

## 2.9.5. Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE)
Tahapan  yang  dilakukan dalam  pewarnaan  HE  dimulai  dengan  proses  deparafinisasi,  yaitu  penghilangan  parafin dengan memasukkan preparat ke dalam seri larutan xylol III, xylol II, dan xylol I. Kemudian, dillakukan proses rehidrasi dengan  memasukkan  preparat  ke  dalam  seri  larutan  alkohol  absolut  sampai  alkohol  70%  secara  berurutan.  Preparat direndam dalam air kran, kemudian dalam akuades. Preparat diwarnai dengan pewarna hematoksilin dilanjutkan dengan perendaman dalam akuades. Setelah itu, preparat diwarnai menggunakan eosin dan diikuti perendaman kembali dalam akuades.  Setelah  itu,  dilakukan  proses  dehidrasi  denganal  alkohol  bertingkat  secara  penjernihan  menggunakan xylol . Sediaan ditutup dengan cover glass ( mounting ) dan siap untuk dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1. Analisis in Vivo Kadar MDA dan SOD pada Paru-Paru Mencit
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian asap rokok memiliki pengaruh terhadap kadar MDA dan SOD paru- paru  mencit.  Pemberian  paparan  asap  rokok  dilakukan selama  14 hari.  Hasil  pengukuran  kadar  MDA  dan  SOD dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Kadar MDA dan SOD Paru-Paru Mencit Perlakuan Kadar MDA (ng/mL)* Kadar SOD (U/mL)* Kontrol Negatif (A1) 1294,0±16,6 b 2,15± 0,36 b Kontrol Positif (A2) 1504,6±36,0 a 1,33± 0,33 c Dosis 1 (57,6 mg/g bb/hari) (A3) 1264,0 ±14,0 bc 1,98± 0,25 bc Dosis 2 (115,2 mg/g bb/hari) (A4) 1227,1±28,2 cd 3,19± 0,08 a Dosis 3 (230,4 mg/g bb/hari) (A5) 1194,63±40,4 d 3,82± 0,27 a Dosis Vitamin E (0,86 mg/g bb/hari) (A6) 1204,00 ±29,8 cd 3,66± 0,54 a
*(dinyatakan dalam mean ± S.D), rata-rata diperoleh dari pengulangan n=4 kali. Huruf yang sama pada kolom menyatakan tidak berbeda nyata.

## 3.2. Kadar Malonaldehida (MDA) pada Paru-Paru Mencit
Pengukuran  kadar MDA (Malondialdehida) paru mencit  menunjukkan peningkatan kadar  yang  signifikan (p<0,05) pada  kontrol  positif  (A2)  yaitu  pemberian  asap  tanpa  adanya  terapi  ekstrak  dengan  rerata  1504,6±36,0  ng/mL dibandingkan  yang  tidak  diberi  paparan  asap  rokok  dengan  rerata  1294,0±16,6 ng/mL.  Peningkatan  kadar  MDA  yang signifikan  pada  kontrol  positif  disebabkan  karena  stres  oksidatif  akibat  paparan  asap  rokok  tanpa  diimbangi  oleh pemberian antioksidan eksogen (dari luar tubuh) sehingga aktivitas peroksida lipid tetap berlanjut.
Peningkatan kadar MDA setelah diberi paparan asap rokok dibandingkan dengan kontrol negatif (A1) disebabkan adanya  faktor  peningkatan  kadar  peroksida  lipid  akibat  senyawa  radikal  bebas  asap  rokok.  Kenaikan  kadar  MDA menunjukan banyaknya jumlah radikal bebas.  Asap rokok merupakan sumber radikal bebas yang dapat meningkatkan kadar  MDA  dalam  tubuh  [18].  Apabila  tubuh  sering  terpapar  asap  rokok,  maka  radikal  bebas  di  dalam  tubuh  akan bertambah banyak dan mengakibatkan adanya peningkatan kadar MDA. Kenaikan signifikan kadar MDA pada kelompok yang  hanya  dipapar  asap  memberikan  rata-rata  MDA  1504,6±36,0  ng/mL  dibandingkan  kontrol  negatif  (A1)  sebesar 1294,0±16,6 ng/mL. Hal ini terbukti bahwa asap rokok mengandung radikal bebas dapat meningkatkan kadar MDA organ tubuh.
Peningkatan kadar MDA akibat radikal bebas dapat dicegah dengan pemberian senyawa antioksidan. Antioksidan ini  dapat  membantu  menetralisir  senyawa  radikal  bebas  dan  mencegah  adanya  kerusakan  seluler  sehingga  dapat mencegah kenaikan kadar atau jumlah MDA. Hasil percobaan menunjukkan bahwa bahwa ada perbedaan yang nyata antara kelompok mencit yang diberi suspensi ekstrak etanol sirih merah dan vitamin E terhadap kontrol  negatif. Hal ini dapat  dikatakan  bahwa  ekstrak  etanol  daun  sirih  dan  vitamin  E  mampu  memberikan  efek  antioksidan  yang  signifikan dalam mencegah stres oksidatif.
Pemberian ekstrak etanol daun sirih merah dan vitamin E mampu menekan kenaikan kadar MDA paru-paru mencit. Hal ini terbukti pada semua kelompok yang selain dipapar asap rokok yang diberi terapi ekstrak etanol daun sirih merah (A3,  A4  dan  A5)  dan  terapi  vitamin  E  (A6)  dibandingkan  pada  perlakuan  A2  yang  hanya  diberi  paparan  asap  rokok. Pemberian  terapi  ekstrak  berbagai  dosis  dan  vitamin  E sebagai  antioksidan  dapat  mencegah  kerusakan membran sel paru-paru  akibat  paparan  asap  rokok  sehingga  senyawa  SOD  tidak  mengalami  penurunan.  Pemberian  ekstrak  etanol daun sirih merah dan vitamin E mampu mengkondisikan jaringan paru-paru menuju kondisi normal. Menurut Osfor dkk [19],  vitamin  E  adalah senyawa  penetralisir  radikal  bebas  lipofilik  dan  bersifat  antioksidan.  Vitamin  E  dapat  mencegah asap rokok  untuk menjadi  radikal  bebas  di  dalam  membran  sel  paru-paru  sebelum  menjadi  peroksidasi  lipid sehingga menjadi stabil dan tidak bersifat reaktif.
Kadar MDA jaringan paru-paru kelompok perlakuan yang mendapat ekstrak etanol (A3, A4 dan A5) dan vitamin E (A6) lebih rendah dibandingkan dengan kontrol positif (A2). Hasil penelitian menunjukkan bahwa kelompok yang diberi paparan  asap  rokok  dan  disertai  dengan  pemberian  ekstrak  dan  vitamin  E  menunjukkan  adanya  penuranan  terhdap kadar  MDA  paru  mencit  karena  oksidasi  lipid  pada  asam  lemak  tidak  jenuh  rantai  panjang  ( Polyunsaturated  Fatty Acid/PUFA) dapat  ditekan.  Hasil  sidik  ragram  dilanjutkan  dengan  BNJ  pada  taraf  5%  menunjukkan  bahwa  pemberian terapi  ekstrak  etanol  berbagai  dosis  dan  terapi  vitamin  E  berpengaruh  signifikan  (α=0,05)  terhadap  penurunan  kadar MDA  paru-paru  mencit  yang  dipapar  asap  rokok.  Semakin  besar  dosis  yang  digunakan  memberikan  pengaruh  yang signifikan terhadap penurunan kadar MDA.
Perlakuan  dosis  2  ekstrak  etanol  (115,2  mg/g)  dan  vitamin  E  (0,86  mg/g)  memberikan  hasil  yang  tidak  berbeda dalam penurunan kadar MDA dibandingkan dengan kontrol positif. Kedua dosis ini juga memberikan penurunan kadar MDA dibawah kontrol negatif. Pada perlakuan dosis 1 (57,6 mg/g) dan dosis 3 (230,4 mg/g  bb/hari) menurunkan kadar MDA yang berbeda dibandingkan dengan kontrol positif. Perlakuan dosis (A4) dengan dosis vitamin E (A6) memberikan hasil yang tidak berbeda. Semua perlakuan (dosis 1, 2, 3 dan vitamin E) memberikan pengaruh penurunan kadar MDA paru-paru mencit akibat paparan asap rokok. Semakin tinggi dosis ekstrak daun sirih merah dan vitamin E yang diberikan, penurunan kadar MDA paru-paru mencit juga semakin signifikan. Hal ini membuktikan ekstrak etanol daun sirih merah dan vitamin E mampu bekerja sebagai senyawa antioksidan. Dosis 3 mampu menurunkan kadar MDA yang paling baik dibandingkan dosis 1, 2, dan Vitamin E.
Penurunan  kadar  MDA  paru-paru  mencit  dimungkinkan  adanya  senyawa  golongan  flavonoid  dan  fenolat  dalam ekstrak. Hasil skrining fitokimia menyatakan ekstrak etanol daun sirih merah mengandung senyawa fenol dan flavonoid. Ghazemzadeh  &  Ghasemzadeh  [20]  menyatakan  golongan  fenol  merupakan  senyawa  antioksidan  yang  lebih  efektif dibandingkan  dengan  vitamin  C  dan  E  serta  karotenoid.  Penurunan  kadar  MDA  paru-paru  mencit  juga  didukung penelitian  Adyttia  dkk  [14]  yang  menyatakan  pemberian  ekstrak  etanol  70%  daun Premma  cordifia pada  tikus  yang dipapar  asap  rokok  mampu  menurunkan kadar  MDA  yang  signifikan  dengan  dosis  600  mg/g  BB.  Dugaan  penurunan kadar  MDA  ini  disebabkan  oleh  senyawa  flavonoid  yang  ada  pada  ekstrak  daun Premma  cordifia. Selewa  dkk  [21] menyatakan senyawa flavonoid memiliki  peran penting dalam antioksidan. Penelitian Zou dkk [22] dan Rasyid dkk [23] juga  menyebutkan  bahwa  flavonoid  merupakan  senyawa  antioksidan  eksogen  yang  mampu  untuk  menurunkan  kadar MDA.

## 3.3. Kadar Superoksida Dismutase (SOD) pada Paru-Paru Mencit
Peningkatan radikal bebas di dalam tubuh dapat menurunkan kadar SOD tubuh. Perlakuan pemberian ekstrak yang semakin  tinggi  dan  vitamin  E  mampu  meningkatkan  aktivitas  enzim  SOD  (Tabel  1).  Perlakuan  kontrol  negatif  (A1) memiliki kadar SOD sebesar 2,15 U/mL, setelah dipapar asap rokok menurun menjadi 1,33 U/mL (A2). Ini membuktikan paparan asap rokok mampu menurunkan enzim endogen dalam tubuh (SOD). Hasil sidik ragram dilanjutkan dengan BNJ pada  taraf  5%  menunjukkan terapi  ekstrak  berbagai  dosis  dan terapi  vitamin  E memberikan pengaruh  yang  signifikan (α=0,05) terhadap kenaikan kadar SOD paru mencit yang dipapar asap rokok.
Asap rokok mampu menurunkan kadar SOD paru-paru mencit karena dalam asap rokok sebagai radikal terdapat senyawa-senyawa yang dapat merusak aktivitas enzim endogen yang berperan sebagai prooksidan. Penurunan kadar SOD akibat paparan asap rokok didukung penelitian Hritchu dkk [24] dimana dalam asap rokok yang mengandung nikotin dan diberikan pada tikus dapat menurunkan aktivitas SOD dan GPX.  Penelitian Arumugam dkk [25] yang menyatakan penurunan  tingkat  SOD  merupakan  perwujudan  dalam  kerusakan  hepatoseluler  akibat  adanya  peningkatan  produksi ROS ( Reactive Oxygen Species ) pada tingkat yang melebihi kemampuan akibat induksi etanol jangka panjang.
Penurunan kadar SOD paru-paru mencit akibat paparan asap rokok dapat dicegah dengan pemberian antioksidan dari ekstrak daun sirih merah. Pemberian ekstrak daun sirih merah berbagai dosis dan vitamin E dapat membantu kinerja enzim  SOD  dalam  melawan  senyawa  radikal  bebas  sehingga  penurunan  kadar  SOD  dalam  tubuh  akibat  asap  rokok
dapat  dihambat.  Komponen  senyawa  fenolat  dan  flavonoid  ekstrak  daun  sirih  merah  dapat  bekerja  secara  sinergis bersama enzim endogen SOD dalam menetralisir radikal bebas sehingga kadar SOD paru mengalami penurunan.
Analisis aktivitas enzim pada jaringan paru-paru menunjukkan kadar SOD masing-masing perlakuan memberikan nilai yang berbeda (Tabel 1). Peningkatan dosis ekstrak 56,7-230,4 mg/g bb/hari dan Vitamin E dosis 0,86 mg/g bb/hari menunjukkan  perbedaan  yang  signifikan  (P<0,05)  pada  kadar  SOD  paru-paru  mencit  dibandingkan  kontrol  positif. Semakin  tinggi  dosis  ekstrak  yang  diberikan  maka  semakin  tinggi  aktivitas  enzim  SOD.  Analisis  ragram  menunjukkan pemberian ekstrak dosis 2, 3 dan vitamin E (0,86 mg/g) memiliki pengaruh (tidak berbeda) terhadap kenaikan SOD paru mencit, tetapi memberikan pengaruh yang signifikan dibandingkan dengan kontrol positif dalam menaikkan kadar SOD paru mencit.
Pemberian ekstrak dosis 1 (57,6 mg/g) berpengaruh signifikan terhadap kenaikan kadar SOD dibandingkan kontrol positif,  tetapi  tidak  berbeda  nyata  terhadap  atau  kontrol  negatif  (A1).  Perbedaan  signifikan  kadar  SOD  akibat  terapi ekstrak  dan  vitamin  E  dibandingkan  kontrol  positif  dikarenakan  antioksidan  endogen  mampu  mempertahankan aktivitasnya dalam tubuh, selain dari senyawa eksogen yang bekerja secara sinergi dengan senyawa endogen. Semakin besar dosis ekstrak, semakin tinggi kadar SOD.
Penurunan kadar SOD pada paru mencit setelah diberi paparan asap rokok dibandingkan dengan kontrol negatif disebabkan oleh adanya faktor peningkatan kadar peroksida lipid akibat adanya senyawa radikal bebas dari asap rokok. Oleh  karena itu,  penurunan kadar  SOD  dikatakan menunjukan banyaknya  jumlah  radikal  bebas. Apabila  tubuh  sering terpapar asap rokok, maka radikal bebas di dalam tubuh akan bertambah banyak dan mengakibatkan adanya penurunan kadar SOD di dalam tubuh. Pada kelompok mencit A2 yang dipaparkan dengan asap rokok dan tanpa pemberian ekstrak serbuk daun sirih merah, penurunan kadar SOD lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol perlakuan terapi ekstrak serbuk daun sirih merah dan obat vitamin E.
Vitamin E bersifat antioksidan yang berperan dalam pencegahan radikal bebas karena dapat bereaksi dengan ROS dan  radikal  bebas  lain.  Dalam  proses  ini  vitamin  E  berperan  sebagai  radikal  bebas  yang  tidak  reaktif  sehingga  dapat berikatan  dengan  elektron  bebas  dari  radikal  bebas  reaktif  lain.  Pemberian  paparan  asap  rokok  dan  terapi  vitamin  E menunjukkan  hasil  kadar  SOD  jaringan  paru  lebih  tinggi  bila  dibandingkan  dengan  perlakuan  A2  (pemberian  paparan asap saja). Jadi, keberadaan antioksidan non-enzimatik (vitamin E) diperlukan untuk mengatasi stres oksidatif sehingga radikal bebas yang dibentuk akibat paparan asap rokok bisa di stabilkan dan tidak bersifat reaktif lagi.
Dalam  penelitian  ini  belum  diketahui  jenis  senyawa  flavonoid  dan  senyawa  fenolik  yang  berperan  dalam menurunkan kadar MDA dan meningkatkan kadar SOD dalam paru. Senyawa alkaloid, saponin dan triterpenoid diduga memiliki  aktivitas  dalam  menurunkan  kadar  MDA  dan  menaikkan  kadar  SOD  paru  mencit.  Menurut  Moura  dkk [26] menyatakan  bahwa  senyawa  alkaloid  merupakan  senyawa  yang  bertindak  sebagai  penangkap  radikal  bebas  dan mencegah  peroksidasi  lipid  pada  hepatik  mikrosomal.  Senyawa  alkaloid  terutama  indol,  memiliki  kemampuan menghentikan reaksi rantai radikal bebas. Senyawa radikal turunan dari amina ini memiliki tahap terminasi yang sangat lama.  Senyawa  alkaloid  lain  yang  bersifat  antioksidan  adalah  kafein  yang  dapat  bertindak  sebagai  peredam  radikal hidroksil.

## 3.4. Histologi Jaringan Paru-Paru (Alveoli)
Pengamatan  sediaan  preparat  pada  Gambar  1  menunjukkan  adanya  gambaran  kerusakan  alveolar  berupa pembengkakan yang membentuk bula atau bintik-bintik hitam disertai dengan pembesaran duktus dan sakus alveolus. Gambaran  mikroskopis  jaringan  paru  pada  preparat  sediaan  pada  alveolus ditemukan pelebaran/pembengkakan  dan adanya  bintik-bintik  hitam yang menebal.  Ada  perbedaan  mikroskopis  pada kelompok  kontrol  (positif  dan  negatif)  dan kelompok perlakuan terapi ekstrak (A2, A3, A4 dan A5) serta terapi obat vitamin E (A6) akibat paparan asap rokok. Asap rokok memicu adanya stres oksidatif dan menimbulkan kerusakan pada muccociliary clearance , bulu getar dan makrofag alveolar tidak dapat berfungsi untuk membuang partikel atau berbagai bakteri yang masuk ke dalam paru-paru sehingga dapat meningkatkan terjadinya resiko infeksi/inflamasi paru-paru. Berdasarkan penelitian Banerjee dkk [27], asap rokok mengakibatkan  stres  oksidatif  dan  merusak  alveolus  paru-paru.  Senyawa  oksidan  rokok  menyebabkan  kerusakan oksidatif yang signifikan pada protein mikrosom dan meningkatkan proteolisis akibat ketidakseimbangan antara protease dan  anti  protease.  Proteolisis  dan  kerusakan  oksidatif  menyebabkan  rusaknya  dinding  alveolus  dan  berujung  pada rusaknya seluruh paru.
Penelitian pada kelompok kontrol positif dan perlakuan dosis ekstrak serta vitamin E terdapat gambaran kerusakan ringan.  Hal  ini  disebabkan  adanya  terapi  ekstrak  dengan  berbagai  dosis  dan  vitamin  E,  kerusakan  yang  minim  juga disebabkan  karena  induksi  asap  yang  kurang  lama  sehingga  kerusakaan  yang  ditimbulkan  kurang  begitu  signifikan. Gambaran  kerusakan  yang  tidak  signifikan  disebabkan  juga  oleh  adanya  variabel  luar  yang  tidak  bisa  dikendalikan seperti kondisi phisikologi dari mencit, daya imun mencit, daya regenerasi pada mencit dan lain-lain.
Ada perbedaan yang nyata pada perlakuan A1, A2 dan perlakuan ekstrak (dosis 1, 2 dan 3) dan dosis vitamin E (A6) terhadap mikroskopis jaringan alveoli paru mencit. Asap sebagai radikal merusak dinding alveoli paru-paru. Terapi ekstrak dan Vitamin E menyebabkan perubahan struktur organ paru terutama bagian alveoli menuju ke arah perbaikan atau normal. Radikal bebas asap rokok yang dipaparkan direduksi dan dicegah pembentukannya oleh antioksidan dari ekstrak daun sirih merah dan vitamin E. Senyawa antioksidan yang terdapat pada daun sirih merupakan golongan radical scavenging antioxidant yang memiliki fungsi sebagai senyawa yang berperan dalam mencegah (inhibitor) terbentuknya suatu radikal bebas dan mereduksi suatu radikal yang terbentuk. Potensi antioksidan dari ekstrak daun sirih merah dan vitamin E dapat mengurangi terjadinya stres oksidatif akibat paparan asap rokok dan mencegah kerusakan jaringan paru mencit.
Gambar A merupakan mikroskopis jaringan paru-paru (alveoli) yang tidak mendapatkan perlakuan apapun (kontrol negatif). Jaringan dalam keadaan normal, dinding alveoli terlihat kompak dan tidak terdapat peradangan atau pelebaran. Pada gambar B merupakan organ jaringan paru-paru (alveoli) dengan kondisi paparan asap rokok dan tidak diberikan terapi ekstrak daun sirih merah. Pada Gambar 1, Gambar mikroskopis (B) terlihat jelas pada sekitar dinding alveoli terjadi pembengkakan atau peradangan dan terdapat bintik-bintik hitam yang menebal.
Gambar C merupakan gambar mikroskopis paru-paru mencit (alveoli) dengan perlakuan pemberian terapi ekstrak dengan dosis 1 yaitu 57,6 mg/g bb/hari. Pemberian dosis ekstrak 1 memberikan gambaran mikroskopis yang berbeda terhadap permukaan dinding alveoli, pembengkakan dan pelebaran alveoli berkurang dibandingkan dengan kontrol positif (Gambar B), tetapi dinding permukaan masih terlihat tebal  ditunjukkan dengan area sekitar dinding yang terlihat bintik- bintik hitam yang tebal. Perbaikan pembengkakan dan pelebaran ini masih jauh dari kontrol negatif.
Gambar  1. Gambaran  perbedaan  mikroskopis  pada  jaringan  paru-paru  mencit  (alveoli)  perbesaran  100x.  A  (Kontrol Negatif), B (Kontrol Positif), C (Dosis 1), D (Dosis 2), E (Dosis 3) dan F (Dosis Vitamin E).
Kontrol  ekstrak  dengan  dosis  2  (gambar  D)  sebesar  115,2  mg/g  bb/hari  memberikan  hasil  yang  nyata  terhadap dinding sel alveoli, pembengkakan dan perubahan (pelebaran) dinding sel berkurang. Lapisan dinding lebih terlihat bersih, bintik-bintik hitam kelihatan lebih menipis dibandingkan dengan kontrol positif (B) dan perlakuan dengan dosis 1 (gambar C). Pemberian ekstrak dosis 2 memberikan hasil yang nyata, tetapi masih memberikan visual di bawah kontrol negatif. Perlakuan ekstrak dosis 3 (Gambar E) yaitu 230,4 mg/g bb/hari memberikan hasil signifikan terhadap kondisi alveoli paru.
C E D F A B
Pemberian  dosis  3  mengurangi  radang  dinding  alveoli,  kondisi  dinding  alveoli  yang  melebar  dan  penebalan  dinding alveoli  yang  terlihat  hitam  berubah  menjadi  lebih  tipis  dan  bersih,  pembengkakan  atau  pelebaran  lebih  menurun dibandingkan dengan  kontrol  negatif  (A),  kontrol positif  (B),  perlakuan  dosis  1  (C)  dan  perlakuan dosis  2  (D).  Dosis  3 memberikan hasil yang paling baik. Kondisi paru tampak lebih baik dengan diameter alveolus yang tidak melebar dan kepadatan  yang  mendekati  normal  jika  dibandingkan  dengan  kontrol  negatif  (Gambar  B).  Hal  ini  juga  didukung  oleh analisis  MDA  dan  SOD  yang  memberikan  hasil  bahwa  MDA  kontrol  negatif  masih  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan ekstrak  dosis  3  (230,4  mg/g  bb/hari),  begitu  pula  dengan  kadar  SOD  pada  dosis  3 memberikan  nilai  yang  lebih  tinggi dibandingkan dengan kontrol negatif.
Gambar  F  adalah  gambar  mikroskopis  paru  (alveoli)  perlakuan  dosis  Vitamin  E  (0,86  mg/g  bb/hari).  Pemberian vitamin E menunjukkan hasil di bawah perlakuan pemberian ekstrak dosis 3, artinya perlakuan dosis 3 lebih memberikan pengaruh yang  nyata  dibandingkan  dengan  dosis  Vitamin  E.  Kontrol  vitamin  E  memberikan pengaruh yang  lebih  baik dibandingkan dengan perlakuan dosis 1 dan dosis 2. Perlakuan pemberian dosis vitamin E, secara mikroskopis dinding alveoli  sudah  menipis  akibat  pembengkakan.  Radang  pada  alveoli  berkurang,  tetapi  bagian  dinding  sel  alveoli  sedikit masih dalam warna hitam. Dapat disimpulkan bahwa dosis yang paling berpengaruh dalam perbaikan dinding sel paru- paru, penurunan derajat pembengkakan dan penurunan pelebaran alveoli adalah dosis 3 sebesar 230,4 mg/g bb/hari.
Umumnya  pembengkakan  atau  peradangan  dan  penebalan  pada  setiap  tepi  dinding  alveolus  lebih  menipis  dan bersih setelah adanya terapi ekstrak daun sirih merah dan vitamin E.  Hal ini membuktikan bahwa terapi ekstrak serbuk daun sirih merah dan vitamin E mampu memperbaiki jaringan yang bengkak (melebar) dan membersihkan setiap tepi dari dinding alveoli pada paru mencit. Kemungkinan senyawa yang berperan adalah golongan senyawa flavonoid dan fenolat. Senyawa flavonoid dapat digunakan dalam terapi inflamasi sel. Hal ini didukung dengan pernyataan  Kalt [28] senyawa golongan  flavonoid  dapat  mengramankan  sel  dari  serangan  senyawa  ROS.  Berdasarkan  gambaran  mikroskopis  pada Gambar 1, terlihat bahwa peradangan atau pembengkakan sel alveoli mengalami penipisan atau pengecilan dan daerah dinding alveoli terlihat lebih bersih.
Pemberian  terapi  ekstrak  daun  sirih merah  dan  Vitamin  E  dapat  mengurangi  bintik-bintik  hitam  akibat  akumulasi radikal  asap sehingga  terlihat  lebih  tipis  dan  lebih  bersih.  Penelitian  Comalada  dkk. [29]  menyatakan bahwa flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan melalui aktivitasnya sebagai scavenger dan Lenzatti dkk. [30] menyebutkan bahwa flavonoid  memiliki  fungsi  dalam  inhibitor  protease.  Dengan  adanya  senyawa  flavonoid,  asap  rokok  yang  mengandung senyawa radikal masuk ke dalam tubuh akan memicu proses inflamasi dan menyebabkan terjadinya ketidakseimbangan antara  protease  dengan  antiprotease  yang  terdapat  pada  jaringan  alveolar  paru-paru  sehingga  menyebabkan  adanya degradasi  pada  jaringan  paru-paru.  Keberadaan  senyawa  flavonoid  dapat  menghambat  kerja  protease  dalam mengelastisitas  organ  paru-paru  sehingga  organ  tersebut  akan  mengalami  perbaikan  dari  adanya  peradangan  atau pelebaran alveolus.

## 4. Kesimpulan
Uji ekstrak secara in vivo , ekstrak etanol 90% memberikan pengaruh terhadap penurunan kadar MDA dan kenaikan kadar SOD organ jaringan paru-paru mencit akibat paparan asap rokok. Dosis ekstrak yang optimal untuk terapi dalam mencit  stress  oksidatif  yang  dipapar  asap  rokok  adalah  230,4  mg/g  BB/hari  yang  mampu  menurunkan  kadar  MDA, menaikan kadar SOD, mengurangi peradangan dinding sel alveoli dan memperbaiki dinding sel alveoli.

## Daftar Pustaka
[1] D.  M.  Burns,  “Nicotine  Addiction,”  in Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine, 16th  ed.  New  York:  McGraw-Hill Education, 2004.
[2] R. F. Tyndale & E. M. Sellers, “Variable CYP2A6-Mediated Nicotine Metabolism Alters Smoking Behavior and Risk,” Drug Metabolism and Disposition , vol. 29, no. 4, pp. 548-552, 2001.
[3] J.  Hukkanen,  P.  Jacob,  &  N.  L.  Benowitz,  “Metabolism  and  Disposition  Kinetics  of  Nicotine,” Pharmacological Reviews, vol. 57, no. 1, pp. 79-115, 2005.
[4] M. Pignone & R. Salazar, “Disease Prevention and Health Promotion,” in Current Medical Diagnosis and Treatment, 47th ed. New York: McGraw-Hill, 2008.
[5] J. Fowles & M. Bates, “The Chemical Constituents in Cigarettes and Cigarette Smoke: Priorities for Harm Reduction, Epidemology and Toxicology Group,” ESR: Kenepuru Science Center, Porirua, New Zealand, 2000.
[6] I. Fidrianny,  I.  Supradja,  &  A.  A.  Soemardji,  “Analisis Nikotin  dalam  Asap  dan  Filter Rokok,” Acta Pharmaceutica Indonesia , vol. 29, no. 3, pp. 100-104, 2004.
[7] K.  Aoshiba  &  A.  Nagai,  “Oxidative  Stress, Cell Death,  and  Other  Damage to  Alveolar  Epithelial  Cells Induced by Cigarette Smoke,” Tobacco Induced Disease , vol. 1, no. 3, pp. 219-226, 2003.
[8] B. Halliwell & J. M. C. Gutteridge, Free Radicals in Biology and Medicine , 4th ed. New York: Oxford University Press, 2006.
[9] D. S. Beattie, “Bioenergetics and Oxidative Metabolism,” in Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 5th ed. New York: Wiley-Liss, 2002.
[10] S.  Khotimah,  “Pengaruh  Pemberian  Ekstrak  Jinten  Hitam  ( Nigella  sativa )  terhadap  Kadar  GSH  Paru  dan  Hepar Tikus  Wistar  yang  Dipapar  Asap  Rokok:  Penelitian  Eksperimental  Laboratoris,”  Tesis,  Pascasarjana  Ilmu Kedokteran Dasar, Universitas Airlangga, Surabaya, 2005.
[11] G. C. Cochrane, “Cellular Injury by Oxidants,” American Journal of Medicinal, vol. 30, no. 91(3C), pp. 23S-30S, 1991.
[12] Z.  Rasheed,  N.  Akhtar,  A.  N.  Anbazhagan,  S.  Ramamurthy,  M.  Shukla,  &  T.  M.  Haqqi,  “Polyphenolic-rich Pomegranate  Fruits  Extract  (POMx)  Suppresses  PMACI-induced  Expression  of  Pro-Inflammatory  Cytokines  by Inhibiting the Activation of MAP Kinase and NF- k B in Human Ku812 Cells,” Journal of Inflammation , vol. 6, no. 1, 2009.
[13] O.  M.  Prameswari  &  S.  B.  Widjanarko,  “Uji  Efek  Ekstrak  Air  Daun  Pandan  Wangi  terhadap  Penurunan  Kadar Glukosa Darah dan Histopatologi Tikus Diabetes,” Jurnal Pangan dan Agroindustri , vol. 2, no. 2, pp. 16-27, 2014.
[14] A. Adyttia, E. K. Untari, & S. Wahdaningsih, “Efek Ekstrak Etanol Daun Premma cordifolia terhadap Malondialdehida Tikus yang Dipapar Asap Rokok,” Pharmaceutical Sciences & Research , vol. 1, no. 2, pp. 104-115, 2014.
[15] N.  A.  Sholichah,  Aulanni’am,  &  C.  Mahdi,  “Efek  Terapi  Ekstrak  Air  Daun  Kedondong  ( Lannea  coromandelica) terhadap  Kadar  Malondialdehid  (MDA)  dan  Aktivitas  Protease  pada  Ileum  Tikus  Putih  ( Rattus  norvegicus ) Inflammatory  Bowel  Disease (IBD)  Akibat  Paparan  Indometasin,” Veterinaria  Medika ,  vol.  5,  no.  3,  pp.  187-194, 2012.
[16] M. A. Abdulla, F. H. Al-Bayaty, L. T. Younis, & M. I. A. Hassan, “Anti-ulcer Activity of Centella asiatica Leaf Extract against  Ethanol-Induced  Gastric Mucosal Injury  in  Rat,” Journal  of  Medicinal  Plants Research , vol. 4,  no.  13,  pp. 1253-1259, 2010.
[17] M. Muntiha, “Teknik Pembuatan Preparat Histopatologi dari Jaringan Hewan dengan Pewarnaan Hemaktoksilin dan Eosin (H&E),” Temu Teknis Fungsional Non Peneliti , pp. 156-163, 2001.
[18] Y. Yueniwati & M. Ali, “Pengaruh Paparan Asap Rokok Kretek terhadap Peroksidasi Lemak dan Sistem Proteksi Superoksid Dismutase Hepar Tikus Wistar,” Jurnal Kedokteran Yarsi , vol.
12, no. 1, pp. 85-92, 2004.
[19] M. M. H. Osfor, H. S. Ibrahim, Y. A. Mohamed, S. M. A. A. S. Abd El Azeem, & A. M. Hegazy, “Effect of Alpha Lipoic Acid and Vitamin E on Heavy Metals Intoxication in Male Albino Rats,” Journal of America Science, vol. 6, no. 8, pp. 56-63, 2010.
[20] A.  Ghasemzadeh  & N.  Ghasemzadeh,  “Review Flavonoids  and  Phenolic  Acids:  Role  and  Biochemical  Activity  in Plants and Human,” Journal of Medicinal Plants Research, vol. 5, no. 31, pp. 6697-6703, 2011.
[21] W.  Selewa,  M.  R.  J.  Runtuwene,  &  G.  Citraningtyas,  “Kandungan  Flavonoid  dan  Kapasitas  Antioksidan  Total Ekstrak Etanol Daun Binahong ( Anredera cordifolia (Ten.) Steenis,” Pharmacon , vol. 2, no. 1, pp. 18-22, 2013.
[22] Y. Zou, Y. Lu, & D. Wei, “Hypercholesterolemic Effects of a Flavonoid-rich Extract of Hypericum perforatum L. in Rats Fed a Cholesterol-rich Diet,” Journal of Agricultural and Food Chemistry , vol. 53, pp. 2462-2466, 2005.
[23] H. N. Rasyid, Y. D. Ismiarto, & R. Prasetia, “The Efficacy of Flavonoid Antioxidant from Chocolate: Bean Extract: Prevention  of  Myocyte  Damage  Cause  by  Reperfusion  Injury  in  Predominantly  Anaerobic  Sports,” Malaysian Orthopedic Journal , vol. 6, no. 3, pp. 3-6, 2012.
[24] L.  Hritcu,  A.  Ciobica,  &  L.  Gorgan,  “Nicotine-induced  Memory  Impairment  by  Increasing  Brain  Oxidative  Stress,” Central European Journal of Biology , vol. 4, no. 3, pp. 335–342, 2009.
[25] S.  Arumugam,  P.  Srinivasan,  S.  Manikandaselvi,  &  R.  Thinagargab,  “Protective  Effect  and  Antioxidant  Role  of Achyranthus  aspera L.  againts  Ethanol-induced Oxidative  Stress  in Rats,” International Journal  of  Pharmacy  and Pharmaceutical Sciences , vol. 4, no. 3, pp. 280-284, 2012.
[26] D.  J.  Moura,  M.  F.  Richter,  J.  M.  Boeira,  J.  A.  P.  Henriques,  &  J.  Saffi,  “Antioxidant  Properties  of  β-Carboline Alkaloids are Related to Their Antimutagenic and Antigenotoxic Activities,” Mutagenesis , vol. 22, no. 4, pp. 293-302, 2007.
[27] S. Banerjee, P. Maity, S. Mukherjee, A. K. Sil, K. Panda, D. Chattopadhyay, & I. B. Chatterjee, “Black Tea Prevents Cigarette Smoke-induced Apoptosis and Lung Damage,” Journal of Inflammation , vol. 4, no. 3, 2007 .
[28] W. Kalt, “Health Functional Phytochemicals of Fruits,” Horticultural Reviews , vol. 27, 2002.
[29] M. Comalada et al., “Inhibition of Pro-inflammatory Markers in Primary Bone Marrow-derived Mouse Macrophages by Naturally Occurring Flavonoids: Analysis of the Structure–Activity Relationship,” Biochemical Pharmacology, vol. 72, no. 8, pp. 1010-1021, 2006.
[30] M.  Lenzatti  et  l.,  “Mate  Tea  Ameliorates  Ebmphysema  in  Cigarette  Smoke-exposed  Mice,” Experimental  Lung Research, vol. 37, no. 4, pp. 246-257, 2011.