Tersedia online di: http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/bawal e-mail:bawal.puslitbangkan@gmail.com BAWAL WIDYA RISET PERIKANAN TANGKAP Volume 13 Nomor 3 Desember 2021 p-ISSN: 1907-8226 e-ISSN: 2502-6410 Nomor Akreditasi Kementerian RISTEK-BRIN: 148/M/KPT/2020
PENGGUNAAN DNA BARCODING DALAM MENGIDENTIFIKASI LARVA GAS- TROPODA (FAMILY CYMATIIDAE) DI PERAIRAN KEPULAUAN SANGIHE- TALAUD,

## SULAWESI UTARA

## DNA BARCODING TO IDENTIFY GASTROPOD LARVA (FAMILY CYMATIIDAE) IN THE SANGIHE-TALAUD ISLANDS, NORTH SULAWESI
Anna Rejeki Simbolon *1 , Medy Ompi 2 , Ernawati Widyastuti 1 dan Diah Anggraini Wulandari 3
1 Pusat Riset Oseanografi BRIN, Jalan Pasir Putih 1, Ancol Jakarta
2 Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Samratulangi
3 Pusat Riset Bioteknologi BRIN Teregistrasi I tanggal: 1 Oktober 2021; Diterima setelah perbaikan tanggal: 25 Januari 2022; Disetujui terbit tanggal: 28 Januari 2022

## ABSTRAK
Perairan Kepulauan Sangihe-Talaud merupakan wilayah pemijahan hewan laut, sehingga berbagai jenis larva hewan laut dapat ditemukan di wilayah ini. Identifikasi larva gastropoda secara morfologi sangat sulit dilakukan karena tingginya kesamaan morfologi antar spesies pada fase larva. DNA Barcoding dapat digunakan untuk mengidentifikasi larva berbagai hewan laut. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi larva gastropoda dari Family Cymatiidae di Perairan Kepulauan Sangihe-Talaud. Sampel larva diambil dengan menggunakan alat Issaac Kid Midwater Tramp (IKMT) di kedalaman 1000 m di bawah permukaan laut pada siang dan malam hari. Barcoding DNA menggunakan primer universal LCO 1490 dan HCO 2198, pengeditan dan alignment sekuen DNA dalam Geneious ver. 9 dan identifikasi menggunakan BLAST di GenBank NCBI. Pohon filogenetik dikonstruksi menggunakan metode neighbor joining (NJ) dan model Kimura-2i dalam MEGA X. Sebanyak 39 spesimen larva Cymatiidae terdiri atas 6 genus yaitu Reticutriton, Monoplex, Turritriton, Cymatium, Gutturnium , dan Ranularia ; lima spesies teridentifikasi: Reticutriton pfeifferianus, Monoplex aquatilus, Monoplex comptus , Cymatium cingulatum dan Gutturnium muricinum, dengan tingkat kesamaan 97,32-100%. Berdasarkan pohon filogenetik sebagian sekuen individu termasuk kelompok monofiletik sedangkan genus Monoplex bersifat polifiletik dan mengelompok dalam genus yang berbeda dengan nilai boostrap yang cukup tinggi. Jarak genetik antar spesies berkisar 0,0761-0,1737 dengan jarak genetik antar spesies terendah pada Monoplex comptus dan Reticutricon pfeifferianus . Penelitian ini menyimpulkan DNA barcoding dapat digunakan dalam mengidentifikasi larva Gastropoda khususnya family Cymatiidae. Identifikasi jenis hewan laut secara dini menjadi salah satu kunci penting dalam pengelolaan lestari jenis hewan laut. Identifikasi larva yang tepat akan berguna dalam pengelolaan konservasi suatu wilayah perairan.
Kata Kunci: DNA Barcoding; larva; Gastropoda; Cymatiidae; Sangihe-Talaud

## ABSTRACT
The seas around the Sangihe-Talaud Islands are a spawning ground for marine animals, so that the larva of many marine animals can be found in this area. Morphological identification of gastropod larvae is very difficult because of the high morphological similarities between species in the larval stage. DNA Barcoding can be used to identify the larvae of various marine animals. This study aims to identify gastropod larvae, especially the family Cymatiidae, in the waters around the Sangihe-Talaud Islands. Larvae samples were collected using an Isaac Kid Midwater Tramp (IKMT) at a depth of 1000m below sea level during the day and night. DNA barcoding used the universal primers LCO 1490 and HCO 2198. DNA sequences were edited and aligned in Geneious ver 9 and identified using the NCBI GenBank BLAST routine. A phylogenetic tree was constructed using the neighbor joining (NJ) method with the Kimura-2 model. A total of 39 Cymatiidae larvae were identified as belonging to 6 genera: Reticutriton, Monoplex, Turritriton, Cymatium, Gutturnium, and Ranularia; five species were identified: Reticutriton pfeifferianus, Monoplex aquatilus, Monoplex comptus, Cymatium cingulatum and Gutturnium muricinum, with a similarityof 97.32-100%. Based on the phylogenetic tree, some of the
Korespondensi penulis: annarejekisimbolon@gmail.com
DOI: http://dx.doi.org/10.15578/bawal.13.3.2021.145-155
individual sequences belong to monophyletic groups, while the Monoplex genus is polyphyletic and grouped into several genera with relatively high boostrap values. The genetic distance between species ranged from 0.0761- 0.1737 with the lowest inter-speies genetic distance between Monoplex comptus and Reticutricon pfeifferianus. This study concludes that DNA barcoding can be used to identify gastropod larvae, in particular the family Cymatiidae. Early identification of marine animal species is an important key to the sustainable management of marine animals. Identification of gastropod larvae can support the conservation management of marine waters.
Keywords: DNA Barcoding; larvae; Gastropods; Cymatiidae; Sangihe-Talaud

## PENDAHULUAN
Gatropoda merupakan kelas terbesar dari phylum Moluska serta salah satu kelompok hewan laut dengan keanekaragaman spesies dan kelimpahan yang tinggi (Zapata et al ., 2014). Jumlah gastropoda laut yang telah diteliti berkisar 32.000 hingga 40.000 spesies, meskipun jumlah teresebut diduga hanya sekitar 23-32% dari jumah total spesies gastropoda yang diestimasi (Appeltans et al ., 2012). Tingginya keanekaragaman spesies gastropoda belum diikuti dengan jumlah kajian mengenai taxonomi, sistematika hingga sejarah evolusi dan kekerabatan antar kelompok gastropoda. Identifikasi specimen umumnya hanya berdasarkan karakter morfologi dari cangkang, operculum dan radula (Barco et al ., 2016). Identifikasi spesies hanya berdasarkan karakter morfologi dapat menyebabkan terjadinya perkiraan spesies yang berlebih ( species overestimation ), karena beberapa kelompok Gastropoda memiliki plastisitas fenotipik yang tinggi, misalnya Littorina saxatilis yang memiliki kemampuan dalam mengubah fenotipenya sesuai dengan kondisi lingkungan sekitarnya; sebaliknya, penggunaan karakter morfologi tidak dapat membedakan spesies bersifat cryptic sehingga dapat pula terjadi pengurangan ( underestimation ) jumlah spesies yang sebenarnya (Borges et al ., 2016). Metode identifikasi spesies berdasarkan karakter morfologi juga sulit diterapkan pada stadium larva (Ran et al ., 2020).
Identifikasi molekular dapat digunakan untuk melengkapi kekurangan pada identifikasi secara morfologi (Simbolon et al ., 2021). Salah satu penanda molecular yang dapat digunakan dalam identifikasi spesies adalah DNA mitokondria cytochrome oxidase I (mtDNA COI) yang lazim disebut sebagai DNA barcode. COI cenderung sangat mirip ( conserved ) pada suatu spesies dan berbeda antar spesies sehingga dapat digunakan sebagai penanda spesies (Palanisamy et al ., 2020). DNA barcoding telah menjadi teknik identifikasi secara molecular yang umum digunakan (Hebert et al ., 2003). Dibanding metode morfologi, DNA barcoding lebih akurat dalam mengidentifikasi spesies kriptik, yaitu spesies dengan karakter morfologi yang sama (Simbolon et al ., 2021), dan juga berguna dalam identifikasi spesimen yang telah rusak (Yang et al ., 2010) serta untuk mengidentifikasi spesimen pada berbagai stadium pertumbuhan (telur, larva hingga dewasa) (Azmir et al ., 2017). DNA barcoding telah digunakan dalam mengidentifikasi gastropoda laut di
Perairan Pulau Robben, Afrika Selatan (Van Der Bank & Greenfield, 2015), keanekaragaman spesies gastropoda laut di pesisir Portugis (Borges et al ., 2016) dan digunakan dalam mengidentifikasi gastropoda laut stadium larva di Perairan Pulau Hainan, China (Ran et al ., 2020).
Sebagai salah satu negara di kawasan Segitiga Terumbu Karang ( Coral Triangle ), Indonesia merupakan negara kepulauan dengan tingkat keanekaragam hayati laut yang tinggi. Namun, rendahnya sikap kepedulian masyarakat dan kurangnya perhatian pemerintah terhadap kelestarian ekosistem pesisir membiarkan kawasan pesisir tercemar (Simbolon, 2017; Simbolon, 2018). Van der Meij (2009) menyebutkan pencemaran dan tekanan tinggi pada perairan pesisir dapat menyebabkan pergeseran struktur komunitas bentik dan hilangnya keanekaragaman.
Perairan Sangihe-Talaud terletak diantara Laut Sulawesi dan Samudra Pasifik. Di dasar perairan terdapat beberapa gunung bawah laut dan rekahan hidrotermal ( hydrothermal vents ) di sekitar Pulau Kawio dan Pulau Mangehetang serta pertemuan antara lempeng Filipina dan lempeng Eurasia yang membentuk ridge memanjang dari utara Pulau Kawio hingga Kepulauan Halmahera (Manini et al ., 2008). Adanya aktivitas gunung bawah laut menjadikan perairan ini sebagai sumber air hangat dan daerah pemijahan biota laut (Adams et al ., 2012). Wilayah perairan ini juga merupakan salah satu pintu masuk Arus Lintas Indonesia atau Arlindo (Feng et al ., 2015) yang akan membawa berbagai macam larva hewan laut masuk ke berbagai wilayah perairan Indonesia lainnya (Gordon & Fine, 1996).
Karakteristik perairan yang unik dan kompleks membuat perairan Kepulauan Sangihe-Talaud penting untuk dijaga dan dilestarikan. Namun, informasi mengenai keanekaragaman spesies di wilayah laut bagian utara kepulauan tersebut masih terbatas. Sebagai hewan laut dengan keanakeragaman yang tinggi, hampir 90% spesies Kelas Gastropoda belum terdokumentasikan secara molekular (Barco et al ., 2016).
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi larva Gastropoda di perairan sekitar Kepulauan Sangihe-Talaud melalui DNA barcoding serta menyusun pohon filogenetiknya. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi akurat berbasis analisis molekuler mengenai jenis-jenis larva Gastropoda di perairan
Simbolon, A.R., et al. / BAWAL. 13 (3) Desember 2021: 145-155
Kepulauan Sangihe Talaud, Sulawesi Utara, untuk mendukung pengelolaan lestari hewan laut khususnya Gastropoda.

## BAHANDANMETODE

## Teknik Pengambilan Sampel
Penelitian ini adalah bagian dari kegiatan Ekspedisi Widya Nusantara (EWIN) dengan menggunakan kapal riset Baruna Jaya VIII yang dilakukan oleh Pusat Penelitian Oseanografi LIPI pada Oktober 2018. Pelayaran dilakukan selama 19 hari pada 5-24 Oktober 2021. Pengambilan sampel dilakukan pada 33 stasiun dengan jarak 30-50 mil antar stasiun di perairan sekitar Kepulauan Sangihe-Talaud dan Pulau Miangas mulai dari perairan Bitung menuju Maluku, melintasi Pulau Miangas dan kembali ke Bitung melalui sisi timur kepulauan Sangihe-Talaud (Gambar 1). Sampel larva diambil dengan menggunakan alat Issaac Kid Midwater Tramp (IKMT) pada kedalaman 1000 m di bawah permukaan laut pada siang dan malam hari. Larva Gastropoda disortir dengan pinset larva, difoto dan dimasukan ke dalam microtube yang berisi larutan ethanol absolut untuk proses DNA barcoding. Terdapat 39 spesimen larva Gastropoda dari Famili Cymatiidae yang berhasil dianalisa.

## Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA larva Gastropoda menggunakan kit Qiagen DNEasy dengan protokol standar (No catalog ID 69506). Larva gastropoda utuh ditempatkan dalam tabung microcentrifuge 1,5 mL yang berisi 180 ìL larutan buffer ATL ( tissue lysis buffer ) kemudian larva dihaluskan dengan menggunakan gunting bedah. Sampel ditambahkan 20 ìL proteinase K dan divortex selama satu menit, kemudian diinkubasi selama semalam pada suhu 56°C di dalam thermostat waterbath . Sampel yang telah diinkubasi divortex lagi selama 15 detik dan ditambahkan 200 ìL buffer AL dan 200 ìL ET-OH (96%-100%) lalu divortex selama dua menit. Selanjutnya, sampel dipindahkan ke dalam DNEasy mini spin column yang sudah ditempatkan dalam collection tube 2 mL. Sampel disentrifugasi pada 8.000 rpm selama satu menit. Hasil sisa residu sentrifugasi ( supernatant ) dibuang dan DNEasy spin column dengan pellet DNA dipindahkan dalam 2 mL collection tube yang baru. Selanjutnya ditambahkan 500 ìL buffer AW1 ( buffer wash 1) dan disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama satu menit. Spin column ditempatkan dalam 2 mL collection tube baru dan ditambahkan 500 ìL buffer AW2 ( buffer wash 2); kemudian disentrifugasi pada 14.000 rpm selama tiga menit. Selanjutnya spin column dipindahkan ke dalam tabung microcentrifuge 1,5 mL baru. Elutasi DNA dilakukan dengan menambahkan 200 ìL buffer AE ( elution buffer ) lalu diinkubasi selama satu menit pada suhu ruang
dan disentrifugasi pada 8.000 rpm selama satu menit. Konsentrasi dan kualitas ekstrak DNA diukur dengan nanophotometer IMPLEN dan disimpan di freezer pada suhu -80°C.

## Amplifikasi DNA
Segmen gen COI dari genom mitokondria diamplifikasi menggunakan pasangan universal primer khusus DNA barcoding yaitu primer forward LCO 1490 (5’-
GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’) dan primer reverse HCO 2198 (5’-
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’) (Folmer et al ., 1994). Amplifikasi DNA melalui prosedur PCR dilakukan dengan pembuatan larutan PCR yang terdiri dari 19,7 ìLddH2O; 3 ìLTaq buffer; 3 ìLMgCl2; 0,6 ìLdNTPmix; 0,5 ìL BSA, 1 ìL primer forward ( LCO 1490) dan primer reverse (HCO 2198); 0,2 ìL Taq DNA; serta 1 ìL DNA template (± 100 ng).
Proses amplifikasi mengikuti protokol standar di laboratorium untuk amplifikasi barcode pada invertebrata mengacu pada Folmer et al., 1994. Profil PCR mengatur suhu mesin PCR seperti berikut: suhu pre-denaturation 95°C selama lima menit; 35 siklus dengan masing-masing denaturasi pada suhu 95°C selama 1 menit, annealing pada suhu 40°C selama 1 menit; serta extenstion pada suhu 72°C selama satu menit 30 detik; dan diakhiri dengan post extension pada suhu 72°C selama lima menit. Visualisasi hasil PCR menggunakan eletroforesis pada gel agar-agar 2% di bawah UV transluminator. Produk PCR yang teramplifikasi dari semua sampel kemudian dikirim ke Macrogene Singapura untuk dilakukan sekuensing DNA (Sanger sequencing ).

## Analisis Data Hasil Sekuen
Sekuens yang dihasilkan diedit dan diurutkan ( alignment ) dengan menggunakan program Geneious Prime. Hasil editan kemudian dicocokan dengan sekuens yang telah tersimpan sebagai accession pada basis data nukleotide GenBank NCBI dengan menggunakan fasilitas Basic Local Assignment Search Tool (BLAST). Prinsip identifikasi atau validasi spesies menggunakan BLAST adalah mencocokan sekuen yang diperoleh dengan sekuens spesies ( accession ) yang memiliki tingkat kesamaan tertinggi. Konstruksi pohon filogenetik dalam program MEGA X (Kumar et al., 2018) menggunakan sekuens yang dihasilkan dari sampel serta sekuens- sekuens dari GenBank dengan tingkat kesamaan tertinggi. Analisis filogenetik dilaksanakan berdasarkan metode neighbor joining (NJ) dengan model Kimura-2 parameter dan menggunakan 1.000x bootstrap (Keskin &Atar, 2013). Outgroup yang digunakan adalah Peracle reticulata ( Accession KC774089.1).
Gambar 1. Lokasi pengambilan sampel di Perairan Kepulauan Sangihe-Talaud, Sulawesi Utara Figure 1. Sampling locations in the waters around the Sangihe-Talaud Islands, North Sulawesi

## HASIL DAN BAHASAN Hasil
Diperoleh sekuens DNA barcode dari sebanyak 39 spesimen larva Cymatiidae yang berhasil di ekstraksi dan diamplifikasi dengan pasangan universal primer LCO 1490 dan HCO 2198. Keberhasilan amplifikasi DNA ditandai dengan munculnya pita (band) dengan panjang produk PCR sekitar 770 bp (Gambar 2). Tidak ditemukan stop kodon pada sekuens sehingga tidak terjadi bias pada analisa yang dilakukan (Barco et al ., 2016). Dari alignment
dihasilkan 39 sekuens dengan panjang 647 bp yang dapat dianalisa lebih lanjut.
Hasil BLAST menunjukkan bahwa sampel yang diperoleh terdiri dari 6 genus yaitu Reticutriton , Monoplex , Turritriton , Cymatium , Gutturnium , dan Ranularia , dengan tingkat kesamaan sekuens 90-100%. Proses BLAST hanya mampu mengidentifikasi hingga tingkat spesies sebanyak 8 spesimen dengan tingkat kesamaan 97-100%. (Tabel 1). Morfologi larva yang teridentifikasi disajikan pada Gambar 3.
770 bp 850 bp 5000 bp
Gambar 2. Hasil amplifikasi gen COI menggunakan barcode DNA universal primer LCO 1490 dan HCO 2198 berupa produk PCR sebesar ±770 bp
Figure 2. COI gene amplification PCR product of ±770 bp obtained using universal DNA barcode primers LCO 1490 and HCO 2198

## Tabel 1. Identifikasi larva Cymatiidae berdasarkan BLAST terhadap DNA barcode
Table 1.
Identification of Cymatiidae larvae based on DNA barcode BLAST results.
No Kode DNA Identitas sekuens terdekat hasil BLAST % Identik Nil ai E Nomor Accession Justifikasi Spesies (97-100%) 1 ML1 Reticutriton pfeifferianus 94,49 0 MH581362.1 Reticutriton sp 2 ML13 Reticutriton pfeifferianus 94,67 0 MH581362.1 Reticutriton sp 3 ML20 Reticutriton pfeifferianus 94,9 0 MH581362.1 Reticutriton sp 4 ML21 Reticutriton pfeifferianus 93,2 0 MH581362.1 Reticutriton sp 5 ML36 Reticutriton pfeifferianus 94,54 0 MH581362.1 Reticutriton sp 6 ML40 Reticutriton pfeifferianus 93,93 0 MH581362.1 Reticutriton sp 7 ML47 Reticutriton pfeifferianus 94,49 0 MH581362.1 Reticutriton sp 8 ML86 Reticutriton pfeifferianus 94,82 0 MH581362.1 Reticutriton sp 9 ML90 Reticutriton pfeifferianus 94,35 0 MH581362.1 Reticutriton sp 10 ML126 Reticutriton pfeifferianus 93,82 0 MH581362.1 Reticutriton sp 11 ML150 Reticutriton pfeifferianus 93,66 0 MH581362.1 Reticutriton sp 12 ML151 Reticutriton pfeifferianus 93,78 0 MH581362.1 Reticutriton sp 13 ML152 Reticutriton pfeifferianus 94,35 0 MH581362.1 Reticutriton sp 14 ML165 Reticutriton pfeifferianus 94,54 0 MH581362.1 Reticutriton sp 15 ML147 Reticutriton pfeifferianus 94,44 0 MH581362.1 Reticutriton sp 16 ML194 Reticutriton pfeifferianus 93,97 0 MH581362.1 Reticutriton sp 17 ML196 Reticutriton pfeifferianus 94,13 0 MH581362.1 Reticutriton sp 18 ML17 Reticutriton pfeifferianus 94,72 0 MH581362.1 Reticutriton sp 19 ML29 Reticutriton pfeifferianus 94,3 0 MH581362.1 Reticutriton sp 20 ML185 Reticutriton pfeifferianus 99,45 0 MH581362.1 Reticutriton pfeifferianus 21 ML186 Reticutriton pfeifferianus 93,35 0 MH581362.1 Reticutriton sp 22 ML167 Reticutriton pfeifferianus 94,35 0 MH581362.1 Reticutriton sp 23 ML192 Reticutriton pfeifferianus 94,28 0 MH581362.1 Reticutriton sp 24 ML180 Reticutriton pfeifferianus 94,28 0 MH581362.1 Reticutriton sp 25 ML31 Monoplex aquatilis 100 0 MH581344.1 Monoplex aquatilis 26 ML166 Monoplex aquatilis 100 0 MH581344.1 Monoplex aquatilis 27 ML118 Monoplex aquatilis 100 0 MH581344.1 Monoplex aquatilis 28 ML22 Monoplex comptus 97,32 0 MH581345.1 Monoplex comptus 29 ML53 Monoplex comptus 91,98 0 MH581345.1 Monoplex sp 30 ML193 Monoplex comptus 93,97 0 MH581345.1 Monoplex sp 31 ML62 Turritriton labiosus 92,69 0 MH581381.1 Turritriton sp. 32 ML63 Turritriton labiosus 93,01 0 MH581381.1 Turritriton sp. 33 ML144 Turritriton labiosus 92,24 0 MH581381.1 Turritriton sp. 34 ML32 Turritriton tenuiliratus 91,88 0 MH581382.1 Turritriton sp. 35 ML16 Ranularia caudata 94,32 0 MH581360.1 Ranularia sp 36 ML137 Cymatium sp 90,06 0 JX241359.1 Cymatium sp 37 ML99 Cymatium cingulatum 100 0 HQ834114.1 Cymatium cingulatum 38 ML141 Gutturnium muricinum 99,06 0 MH581338.1 Gutturnium muricinum 39 ML148 Gutturnium muricinum 99,45 0 MH581338.1 Gutturnium muricinum
Pohon filogenetik family Cymatiidae yang dihasilkan disajikan pada Gambar 4. Individu mengelompok pada 6 genus yang seluruhnya termasuk Family Cymatiidae. Selain genus Monoplex , semua individu dari setiap genus termasuk kelompok monofiletik dan individu dari spesies yang sama membentuk suatu cabang. Namun genus
Monoplex terdiri atas tiga cabang dengan jarak relatif besar. Jarak genetik antar sampel berkisar 0,0761-0,1737 dengan jarak genetik antar spesies terendah pada Monoplex comptus dan Reticutricon pfeifferianus yaitu 0,0761 dan tertinggi pada Cymatium sp dan Turritriton sp yaitu 0,1737 (Tabel 2).
Reticutriton Monoplex aquatilus Monoplex comptus
Cymatium cingulatum
Gutturnium muricinum
Gambar 3. Morfologi larva gastropoda (Family Cymatiidae) yang teridentifkasi dengan DNA barcoding Figure 3. Morphology of gastropod larvae (Family Cymatiidae) identified through DNA barcoding
ML118 Monoplex aquatilus ML137 Cymatium sp ML141 Gutturnium muricinum ML144 Turritriton sp ML16 Ranularia sp ML185 Reticutricon pfeifferanus ML22 Monoplex comptus ML32 Turritr iton sp ML62 Turritri ton sp ML63 Turritriton sp ML137 Cymatium sp 0,1539 ML141 Gutturnium muricinum 0,1189 0,1320 ML144 Turritriton_sp 0,1591 0,1509 0,1641 ML16 Ranularia_sp 0,1258 0,1067 0,1395 0,1251 ML185 Reticutricon pfeifferanus 0,1213 0,1042 0,1280 0,1251 0,1046 ML22 Monoplex comptus 0,1327 0,1205 0,1232 0,1112 0,1231 0,0761 ML32 Turritriton sp 0,1446 0,1295 0,1324 0,1103 0,1158 0,1184 0,1113 ML62 Turritriton sp 0,1715 0,1737 0,1643 0,0924 0,1502 0,1347 0,1277 0,1243 ML63 Turritriton sp 0,1689 0,1711 0,1517 0,0833 0,1353 0,1299 0,1277 0,1123 0,0157 ML99 Cymatium cingulatum 0,1125 0,1295 0,1124 0,1323 0,1303 0,0979 0,1000 0,1376 0,1445 0,1371
Tabel 2. Jarak genetik antar larva famili Cymatiidae di Perairan Sangihe-Talaud Sulawesi Utara
Table 2.
Genetic distance between larvae of the family Cymatiidae from Sangihe-Talaud, North Sulawesi
Simbolon, A.R., et al. / BAWAL. 13 (3) Desember 2021: 145-155
Reticutricon Monoplex Ranularia Gutturnium Monoplex Cymatium Turritriton
Gambar 4. Pohon Filogenetik Gastropoda (Family Cymatiidae) menggunakan metode neighbor joining (NJ) model Kimura 2 parameter, dan 1.000 replikasi bootstrap.
Figure 4. Cymatiidae phylogenetic tree using the neighbor joining (NJ) method with Kimura-2 parameter model and 1000 bootstrap replications.

## Bahasan
Individu-individu di dalam suatu spesies memiliki persentase kesamaan (nilai similaritas) barcode yang tinggi. Maduppa et al. (2017) mengatakan nilai identitas yang mendekati 100% serta nilai E = 0 menunjukkan spesies yang sama dengan tingkat kepercayaan tinggi; sementara itu, kesamaan barcode di bawah 97% umumnya menunjukkan spsesies yang berbeda (Hebert et al. , 2003). Penelitian ini menghasilkan sekuens barcode dari 39 spesimen larva Cymatiidae, dimana 8 spesimen teridentifikasi hingga spesies dengan jarak kesamaan 97- 100% yaitu Reticutriton pfeifferianus, Monoplex aquatilis, Monoplex comptus, Cymatium cingulatum dan Gutturnium muricinum . Spesimen lain teridentifikasi hingga tingkat genus dengan tingkat (atau persentase) kesamaan kurang dari 97% dengan sekuens yang tersimpan di GenBank. Penelitian Puillandre et al . (2009) juga mendapatkan hasil serupa dimana dari 24 spesimen larva gastropoda DNA barcoding hanya dapat mengidentifkasi 1 spesimen hingga tingkat spesies. Akurasi penggunaan DNA barcoding dalam proses identifikasi larva sangat bergantung pada kelengkapan basis data GenBank (Puillandre et al., 2009). Namun membuat basis data sekuens referensi yang lengkap dan akurat adalah hal yang sulit karena sulitnya mengidentifikasi larva secara morfologi pada hewan dengan tingkat variasi spesies yang tinggi namun mirip secara morfologi pada fase larva (Kusbiyanto et al ., 2020), sehingga pengkayaan berupa identifikasi secara morfologi pada fase juvenil atau dewasa perlu dilakukan sebagai referensi dalam identifikasi pada fase larva.
Pohon filogenetik menjadi salah satu cara mengidentifikasi hubungan atau kekerabatan antar taksa ketika pembandingan sekuens sampel dengan basis data sekuens GenBank menghasilkan sekuens terdekat dengan nilai similaritas yang rendah (Puillandre et al., 2009). Berdasarkan pohon filogenetik, sebagian besar sekuens spesimen termasuk dalam salah satu kelompok monofiletik dan setiap spesies mengelompok dalam salah satu diantara 6 genus yaitu Reticutriton , Monoplex , Turritriton, Ranularia , Cymatium , dan Gutturnium . Tingginya nilai bootstrap menunjukkan bahwa struktur pohon memiliki validitas atau tingkat akurasi yang baik (Dharmayanti, 2011). Kemudian setiap sekuen sampel mengelompok dengan sekuen GenBank dengan nilai bootstrap yang tinggi. Pengelompokan monofiletik dengan nilai bootsrap yang tinggi mengindikasikan DNA barcoding, khususnya dengan menggunakan sekuens mtDNA COI, dapat digunakan untuk mengindentifikasi larva famili Cymatiidae dengan tingkat kepercayaan relatif tinggi. Hal yang sama ditemukan pada larva gastropoda di Perairan Pulau Hainan, China (Ran et al ., 2020).
Cymatiidae merupakan salah satu family pada kelompok Tonnoidea dengan klasifikasi yang masih diperdebatkan hingga saat ini, dengan adanya sinonim pada beberapa genus misalnya Biplex hingga perlunya revisi taksonomik pada genus Monoplex, salah satu genus dari kelompok Tonnoidea yang bersifat polifiletik, bahkan subset dari genus ini berada pada satu clade yang sama dengan genus monotipe Gutturnium , (Strong et al ., 2019). Pada penelitian ini, genus Monoplex bersifat polifiletik dan terdiri dari tiga cabang (Gambar 3). Oleh karena belum adanya revisi taksonomik, dan belum jelas clade yang mana seharusnya disebutkan sebagai genus Monoplex (Strong et al ., 2019), identifikasi spesimen yang tergolong dalam genus tersebut masih bersifat sementara.
Jarak genetik dapat digunakan untuk mengetahui perbedaan genetik antar individu, dimana jarak genetik cenderung meningkat seiring dengan kenaikan perbedaan klasifikasi tingkat taksonomi (Ran et al ., 2020). Penelitian ini menunjukkan bahwa Reticutriton pfeifferianus dan Monoplex comptus memiliki jarak genetik antar spesies terendah. Rendahnya jarak genetik yang mengindikasikan sedikitnya perbedaan genotip antar spesies disertai tingginya kesamaan morfologi antar spesies, dimana morfologi larva Reticutriton pfeifferianus dan Monoplex comptus hampir sama (Gambar 2). Strong et al. (2019) mengemukakan Monoplex comptus sebagai kelompok saudara ( sister group ) dari Reticutriton pfeifferianus. Rendahnya jarak genetik antar spesies kemungkinan terkait dengan tingginya kesamaan morfologi, kesamaan morfologi yang tinggi akan menyulitkan identifikasi spesies secara morfologi (Simbolon et al ., 2021).
Penelitian ini merupakan penelitian pertama tentang identifikasi larva Cymatiidae dengan menggunakan DNA barcoding di perairan Kepulauan Sangihe dan Talaud. Famili Cymatiidae tergolong gastropoda predator yang umumnya hidup di perairan subtropis hingga tropis (Strong et al., 2019). Reticutriton pfeifferianus merupakan spesies dengan kelimpahan yang tinggi dibandingkan spesies lain di perairan laut; R. pfeifferianus umum ditemukan di perairan Singapura (Tan & Woo, 2010), dan ditemukan di Perairan Zona Ekonomi Eksklusif Serawak, Malaysia pada kedalaman 29-74 m (Morni et al ., 2017). Monoplex sp terdistribusi di sebagian besar lautan tropis dunia dari Afrika Timur dan Laut Merah ke Hawai, laut India hingga Atlantik (referensi?). Sementara itu, Gutturnium muricinum tersebar di seluruh wilayah perairan Indo-Pasifik Barat (Beu et al ., 2012).
Reticutriton, Monoplex, Turritriton, Ranularia, Cymatium , dan Gutturnium merupakan anggota kelompok gastropoda Tonnoidea dengan kelimpahan tinggi dan terdistribusi luas di perairan laut dibandingkan jenis
Simbolon, A.R., et al. / BAWAL. 13 (3) Desember 2021: 145-155
moluska lainnya. Hal ini disebabkan sifat planktotrophic larvanya dimana durasi fase larva dapat berlangsung hingga berbulan-bulan; Scheltema (1971) memperkirakan fase larva pada beberapa spesies dari genus Monoplex dapat berlangsung selama lebih dari satu tahun. Selama fase planktonik, larva gastropoda tersebut menghasilkan sangat sedikit kalsium karbonat ke cangkangnya (Pechenik et al., 1984).
Identifikasi spesies secara dini, khususnya di daerah pemijahan hewan laut, diperlukan agar pengelolaan spesies dapat dilakukan secara tepat; namun identifikasi larva secara morfologi cenderung sangat sulit dilakukan, dikarenakan tingginya kesamaan morfologi pada fase larva (Kusbiyanto et al., 2020). DNA barcoding telah digunakan dalam mengidentifikasi hewan laut antara lain larva Krustasea (Kusbiyanto et al ., 2020); larva Nudibranchia (Hirose et al ., 2014); larva ikan (Pereira et al., 2013) dan larva Decapoda (Palero et al ., 2016). Penelitian ini menunjukkan bahwa DNA barcoding dapat digunakan untuk mengidentifikasi sedikitnya sebagian larva Gastropoda, khususnya Cymatiidae, hingga tingkat spesies. Namun demilian, proporsi terbesar hanya teridentifkasi pada tingkat genus, hal yang menujukkan pentingnya adanya upaya barcoding moluska pada fase juvenil dan atau dewasa yang lebih mudah diidentifikasi secara morfologi untuk memperkaya basis data sebagai referensi untuk identifikasi fase larva.

## KESIMPULAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa DNA barcoding dapat digunakan untuk mengidentifikasi larva gastropoda dari family Cymatiidae. Di Perairan Kepulauan Sangihe Talaud, Sulawesi Utara, dari 39 spesimen larva Cymatiidae sebanyak 8 spesimen teridentifikasi pada tingkat spesies ( Reticutriton pfeifferianus, Monoplex aquatilis, Monoplex comptus, Cymatium cingulatum dan Gutturnium muricinum ) dengan tingkat kesamaan 97,32 – 100%. Hasil BLAST serta pohon filogenetik menunjukkan bahwa ke-39 specimen tersebut terdiri dari 6 genus yaitu Reticutriton , Monoplex , Turritriton , Ranularia , Cymatium dan Gutturnium . Reticutriton pfeifferianus dan Monoplex comptus memiliki jarak genetik terendah serta kesamaan morfologi yang tinggi. Penelitian ini mengonfirmasi bahwa perairan Kepulauan Sangihe Talaud merupakan wilayah pemijahan hewan laut. Diperlukan pengayaan basis data barcode dengan menggunakan individu juvenil atau dewasa yang telah memiliki ciri morfologi yang memungkinkan untuk diidentifikasi dengan baik sebagai referensi pada identifikasi fase larva. Identifikasi larva hewan laut, khususnya Gastropoda, pada fase larva diharapkan dapat mendukung pengelolaan lestari jenis hewan laut tersebut di wilayah tersebut.

## PERSANTUNAN
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Kepala Pusat Penelitian Oseanografi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang mengizinkan penelitian ini berlangsung. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Pak Riyana dan (Alm) Pak Jhon yang telah membantu dalam pengambilan sampel. Terima kasih kepada Pak Abu yang telah membantu membuat peta lokasi sampel. Penelitian ini dibiayai oleh Pusat Penelitian Oseanografi LIPI melalui hibah DIPA LIPI-EWIN 2018.

## DAFTARPUSTAKA
Adams, D.K., S.M. Arellano, & B. Govenar. (2012). Larval dispersal: Vent life in the water column. Oceanography 25(1):256–268. doi:https://doi.org/10.5670/ oceanog.2012.24.
Appeltans, W., Ahyong, S. T., Anderson, Gl. (2012). The magnitude of global marine species diversity. Current Biology , 22, 2189–2202. Doi: 10.1016/j.cub.2012.09.036.
Azmir, I.A., Esa, Y.,Amin, S.M.N., Md Yasin, I.S., Md Yusof, F.Z. (2017). Identification of larval fish in mangrove areas of Peninsular Malaysia using morphology and DNA barcoding methods. J. Appl. Ichthyol, 33, 998– 1006. Doi: https://doi.org/10.1111/jai.13425.
Barco, A., Michael, J., Raupach., Silke, L., Hermann., Neumann., & Thomas, K. N. (2016). Identification of North Sea molluscs with DNA barcoding. Molecular Ecology Resources , 16, 288–297. Doi: 10.1111/1755- 0998.12440
Beu, A.G., Bouchet, P., & Tröndlé, J. (2012). Tonnoidean gastropods of French Polynesia. Molluscan Research , 32(2), 61–120.
Borges, L.M.S., Claudia, H., Jorge, L., Ana, M.C., Ana, P.V., Gonc’alo, C., Rita, C., Ana, C. C., Maria, S. G. F., Maria, H. C., Filipe, O.C. (2016). With a little help from DNA barcoding: investigating the diversity of Gastropoda from the Portuguese coast. Scientific RepoRts , 6, 20226, 1-11. Doi: 10.1038/srep20226.
Feng, M., Zhang, N., Liu, Q., & Wijffels, S. (2018). The Indonesian throughflow, its variability and centennial change. Geosci. Lett ., 5, (3), 1-10. Doi: 10.1186/s40562- 018-0102-2.
Frezal, L., & Leblois, R. (2008). Four years of DNA barcoding: current advances and prospects. Infect. Genet. Evol . 8, 727–736.
Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., Vrijenhoek, R.
(1994). DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mol Mar Biol Biotechnol , 3(5), 294– 299.
Gordon, A. L., & Fine, R.A. (1996). Pathways of water between the Pacific and Indian oceans in the Indonesian seas. Nature , 379(2): 146- 149
Hebert, P.D.N., Cywinska, A., Ball, S.L., deWaard, J.R. (2003). Biological identifications through DNA barcodes. Proc R Soc Lond B Biol Sci , 270, 313–321. Doi: 10.1098/rspb.2002.2218.
Hirose, M., Hirose, E., Kiyomoto, M. (2014). Identification of five species of Dendrodoris (Mollusca: Nudibranchia) from Japan, using DNA barcode and larval characters. Marine Biodiversity, 45(4), 1-12. Doi: 10.1007/s12526-014-0288-2
Keskin, E., & Atar, H.H. (2013). DNA barcoding commercially important aquatic invertebrates of Turkey. Mitochondrial DNA , 24(4), 440–450. Doi: 10.3109/19401736.2012.762576
Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., & Tamura, K. (2018). MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547–1549. Doi: 10.1093/ molbev/msy096
Kusbiyanto, Dian, B., Agus, N. (2020). DNA barcoding of crustacean larvae in Segara Anakan, Cilacap, Central Java, Indonesia using cytochrome c oxidase gene. Biodiversitas , 21(10),4878-4887.Doi:10.13057/biodiv/d211054
Manini, E., Luna, G.M., Corinaldesi, C.Z.D., Bortoluzzi, G., Caramanna, G., Raffa, F., & Danovaro, R. (2008). Prokaryote diversity and virus abundance in shallow hydrothermal vents of the Mediterranean Sea (Panarea Island) and the Pasific Ocean (North Sulawesi-
Indonesia). MicrobEcol, 55, 626-639.
Morni, W. Z.W., Siti, A. K. A. Rahim., Richard, R., Jamil, M., & Ruhana, H. (2017). Checklist of Gastropods from the Exclusive Economic Zone (EEZ), Sarawak, Malaysia. Tropical Life Sciences Research, 28(1), 117– 129. Doi: https://doi.org/10.21315/tlsr2017.28.1.8
Palanisamy, S. K., Prasanna, K., Purushothaman, P., & Umamaheswari, S. (2020). Molecular approach to the identification and phylogenetic biogeography of snail Telescopium telescopium using mt-COI gene sequences. Regional Studies in Marine Science , 35, 1-17. doi:101016/j.rsma.2020.101109.
Palero, F., Genis-Armero, R., Hall, M.R., Clark, P.F. (2016). DNA barcoding the phyllosoma of Scyllaridessquammosus (H. Milne Edwards, 1837) (Decapoda: Achelata: Scyllaridae). Zootaxa, 4139 (4), 481-498. doi:10.11646/zootaxa.4139.4.2.
Pereira, L.H.G., Hanner, R., Foresti, F., Oliveira, C. (2013). Can DNA barcoding accurately discriminate megadiverse Neotropical freshwater fish fauna?. BMC Genet , 12, 20.
Pechenik, J.A., Scheltema, R.S., & Eyster, L.S. (1984) Growth stasis and limited shell calcification in larvae of Cymatium parthenopeum during trans-Atlantic transport. Science, 224,1097–1099.
Puillandre,N., Strong, E., Bouchet, P., Boisselier, M.C.,
Couloux, A., Samadi, S. (2009). Identifying gastropod spawn from DNA barcodes: possible but not yet practicable. Molecular Ecology Resources , 9 (5), 1311- 1321. doi:10.1111/j.1755-0998.2009.02576.x.
Ran, K., Li, Q., Qi, L., Li, W., & Kong, L. (2020). DNA barcoding for identification of marine gastropod species from Hainan island, China. Fisheries Research ,
225, 105504, 1-7. doi:105504. 10.1016/
j.fishres.2020.105504
Scheltema, R.S. (1971) Larval dispersal as a means of genetic exchange between geographically separated populations of shallow-water benthic marine gastropods. The Biological Bulletin, 140, 284–322.
Simbolon, A.R. (2017). Karakteristik dan sikap peduli lingkungan masyarakat Pesisir Kawasan Cilincing DKI Jakarta. Jurnal Pro-Life, 4(3), 456-466.
Simbolon, A.R. (2018). Analisis Risiko Kesehatan Pencemaran Timbal (Pb) Pada Kerang Hijau (Perna viridis) di Perairan Cilincing Pesisir DKI Jakarta. OLDI, 3(3), 187-208. Doi: 10.14203/oldi.2018.v3i3.207.
Simbolon, A.R., Masteria, Y. P., & Ismiliana, W. (2021). Identifikasi spesies menggunakan DNA barcoding dalam menunjang budidaya dan konservasi teripang di Perairan Lampung. Jurnal Riset Akuakultur, 16 (1), 31-37. Doi: http://dx.doi.org/10.15578/jra.16.1.2021.31- 37.
Strong, E.E., Nicolas, P., Alan, G. B., Magalie, C, Philippe, B. (2019). Frogs and tuns and tritons – A molecular phylogeny and revised family classification of the predatory gastropod superfamily Tonnoidea (Caenogastropoda). Molecular Phylogenetics and Evolution , 130, 18–34. doi: https://doi.org/10.1016/ j.ympev.2018.09.016.
Tan, S. K., & Woo, H.P.M. (2010). A preliminary checklist of the Molluscs of Singapore. Raffles Museum of Biodiversity Research, National University of
Singapore , 32– 48.
Van der Meij, S. E. T., Moolenbeek, R.G., & B.W.Hoeksema, B.W. (2009). Decline of the Jakarta Bay molluscan fauna linked to human impact. Marine Pollution Bulletin , 59, 101-107. doi: https://doi.org/10.1016/ j.marpolbul.2009.02.02.
Van Der Bank, H., & Greenfield, R. (2015).Apioneer survey and DNA barcoding of some commonly found
gastropod molluscs on Robben Island. Zookeys , 481,
15-23. doi:https://doi.org/10.3897/z00keys.481.8188.
Yang, R., Wu, X.B., Yan, P., & Li, X.Q. (2010). Using DNA barcodes to identify a bird involved in a bird strike at a Chinese airport. Mol. Biol. Rep . 37, 3517–3523.
Zapata, F., Wilson, N.G., Howison, M., Andrade, S.C.S., Jo rger, K.M., Schro dl, M., Goetz, F.E., Giribet, G., & Dunn, C.W. (2014) Phylogenomic analyses of deep gastropod relationships reject Orthogastropoda. Proc. R. Soc. B , 281, 20141739, 1-9. doi:http://dx.doi.org/10.1098/ rspb.2014.1739