## OPTIMASI pH DAN SALINITAS MEDIA KULTUR TERHADAP PERTUMBUHAN DAN AKTIVITAS PROTEASE EKTRASELULER BAKTERI Bacillus firmus DARI EKOSISTEM PADANG LAMUN NUSA LEMBONGAN BALI

## OPTIMIZATION OF pH AND SALINITY OF CULTURE MEDIA ON GROWTH AND ACTIVITY OF EXTRACELLULAR PROTEASE BACTERIA Bacillus firmus FROM THE SEAGRASS PADANG ECOSYSTEM NUSA LEMBONGAN BALI
Muhammad Zainuddin 1,2 , Delianis Pringgenies 3. *, Ocky Karna Radjasa 4 , Haeruddin 5 , Aninditia Sabdaningsih 1 , dan Vivi Endar Herawati 6
1 Program Doktor Manajemen Sumber Daya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro
2 Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Sains dan Teknologi,
Universitas Islam Nahdlatul Ulama Jepara
Jl. Taman Siswa, Tahunan, Jepara, Jawa Tengah 59451 Indonesia
3 Departemen Ilmu Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto, S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia
4 Badan Riset dan Inovasi Nasional, Indonesia
Gedung B.J. Habibie, Jl. M.H. Thamrin No. 8, Jakarta Pusat 10340 Indonesia
5 Departemen Manajemen Sumber Daya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,
Universitas Diponegoro
6 Departemen Budidaya Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro
Jl. Prof. H. Soedarto, S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia Email: pringgenies@yahoo.com

## ABSTRAK
Spons merupakan organisme porifera yang hidup di dasar perairan.  Spons memiliki hubungan simbiotik dengan bakteri. Chalinula pseudomolitba merupakan jenis spons yang hidup di perairan Nusa Lembongan Bali  dan  memiliki  bakteri  simbion Bacillus  firmus . Bacillus  firmus memiliki  aktivitas  proteolitik  dengan menghasilkan  enzim  protease  ekstrasluler.  Bakteri  ini  memiliki  potensi  untuk  dikembangkan  menjadi probiotik  dalam  meremediasi  protein  pada  limbah  organik  sisa  pakan  tambak  budidaya  udang.  Dalam upaya produksi bakteri Bacillus firmus untuk probiotik maka diperlukan optimasi pH dan salinitas media kultur. Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan optimasi pH dan salinitas media kultur bakteri Bacillus firmus dari  simbion  sponge Chalinula  pseudomolitba yang  memiliki  aktivitas  proteolitik.  Penelitian menggunakan  metode  eksperimen  aboratoris.  Penelitian  telah  berhasil  melakukan  uji  optimasi  pH  dan salinitas  media  kultur  terhadap  pertumbuhan  dan  aktivitas  enzim  protease  ektraseluler  bakteri.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  bakteri Bacillus  firmus memiliki  laju  pertumbuah  dan  aktivitas  protease terbaik pada kondisi kultur dengan pH 8 yaitu dengan nilai sebesar 0,174 dan 31,763 IU/ml. Selain itu juga memiliki laju pertumbuah dan aktivitas protease terbaik pada salinitas media 30 ppt dengan nilai sebesar 0,186 dan 35,278 IU/ml.
Kata kunci : bakteri, simbion, sponge, pertumbuhan, protease

## ABSTRACT
Sponges are sponges that live on the bottom of the water. Sponges have a symbiotic relationship with bacteria. Chalinula pseudomolitba is a type of sponge that lives in the waters of Nusa Lembongan Bali and has  the  symbiotic  bacterium  Bacillus  firmus.  Bacillus  firmus  has  proteolytic  activity  by  producing extracellular  protease  enzymes.  These  bacteria  have  the  potential  to  be  developed  into  probiotics  in remediating protein in organic waste left over from shrimp pond feed. In an effort to produce Bacillus firmus
bacteria for probiotics, it is necessary to optimize the pH and salinity of the culture media. The purpose of this study was to optimize the pH and salinity of Bacillus firmus bacterial culture media from the symbiont sponge Chalinula pseudomolitba which has proteolytic activity. The research used aboratory experimental method. Research has succeeded in conducting tests to optimize pH and salinity of culture media on the growth and activity of extracellular protease enzymes in bacteria. The results showed that Bacillus firmus had the best growth rate and protease activity under culture conditions with a pH of 8 with values of 0,174 and 31,763 IU/ml, respectively. In addition, it also has the best growth rate and protease activity at media salinity of 30 ppt with values of 0,186 and 35,278 IU/ml.
Keywords : bacteria, symbionts, sponges, growth, proteases

## PENDAHULUAN
Ekosistem  lamun  memiliki  organisme asosiatif bentik  seperti  spons. Spons  sebagai organisme  sederhana  memiliki  mekanisme pertahanan  diri  dan  adaptasi  terhadap perubahan  lingkungan  antara  lain  dengan menghasilkan  senyawa  metabolit  sekunder. Spons  memiliki  hubungan  simbiotik  dengan bakteri.  Hubungan  ini  mencakup  membantu pertahanan kimiawi, fiksasi nitrogen, fotosintesis  dan  penyediaan  nutrisi  dengan membantu translokasi metabolisme termasuk nitrifikasi.  Karena  peranan  ini  bakteri  yang bersimbiosis  dengan  spons  memiliki  aktivitas menghasilkan  enzim  ekstrasluler  protease. Salah  satu  bakteri  yang  memiliki  aktivitas proteolitik  tersebut  adalah  bakteri Bacillus firmus .  Bakteri Bacillus  firmus merupakan bakteri  yang  bersimbiosis  dengan  sponge Chalinula  pseudomolitba .  Sponge Chalinula pseudomolitba hidup  di  perairan  pantai dengan adanya Ekosistem Lamun. Sponge ini didapatkan di perairan Nusa Lembongan Bali – Indonesaia.
Pemberian pakan yang berlebihan dalam budidaya  udang  intensif  telah  menimbulkan permasalahan  akumulasi  sisa  pakan  di  dasar tambak  menjadi  limbah  organik.  Limbah organik pakan ini di manfaatkan oleh bakteri secara  anaerob  untuk  pertumbuhan  dan menghasilkan  produk  samping  senyawa amonia  dan  nitrit  yang  bersifat  racun  bagi udang  (El-Saadony et  al., 2021).  Limbah organik  pakan  ini  harus  didekomposisi  agar tidak merusak kualitas media budidaya udang (Holt et  al., 2019).  Proses  dekomposisi dilakukan  oleh  bakteri  penghasil  enzim protease ekstraseluler. Bakteri Bacillus firmus memiliki potensi untuk dikembangkan menjadi produk  probiotik  secara  komersil.  Bakteri probiotik  yang  diaplikasikan  pada  media budidaya  tambak  udang  dengan  fungsi sebagai  bioremediasi  limbah  organik  pakan. Dalam  upaya  tersebut  maka  diperlukan teknologi kultur yang optimal guna mendapatkan biomassa sel yang tinggi untuk aplikasi.
Upaya  peningkatan  produksi  biomassa sel  memerlukan  serangkaian  optimasi  dalam kultur,  diantaranya  adalah  optimasi  kondisi kultur.  Optimasi  kondisi  kultur  merupakan faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan dan biomassa sel bakteri (Oh et al., 2007; Zárate-Chaves et al., 2013). Suhu dalam kondisi kultur mempengaruhi pertumbuhan sel, sedangkan pH media kultur mempengaruhi produksi enzim (Rashmi et al. 2017). Penelitian ini memiliki tujuan mendapatkan  kondisi  optimal  dalam  kultur bakteri Bacillus  firmus untuk  produksi biomassa  bakteri.  Optimasi  kondisi  kultur tersebut  meliputi  suhu,  pH,  salinitas  dan agitasi.

## MATERI DAN METODE
Materi dalam penelitian ini adalah isolat bakteri Bacillus firmus . Bakteri Bacillus firmus yang  bersimbiosis  dengan  sponge Chalinula pseudomolitba (Gambar 1). Sponge Chalinula pseudomolitba yang didapatkan dari perairan pantai  dengan  adanya  Ekosistem  Lamun. Sponge  ini  didapatkan  di  perairan  Nusa Lembongan Bali – Indonesaia.

## Peremajaan Isolat
Biakan murni stok dilakukan peremajan  pada  media  Nutrient  Agar  (NA). Sebanyak  satu  ose  koloni  digores  dengan metode  kuadran  pada  media  Nutrient  Agar (NA) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C (Pringgenies et al., 2021; Wijaya et al., 2021).  Bakteri  yang  tumbuh  siap  untuk digunakan.

## Preparasi Inokulum
Satu ose biakan miring diinokulasikan ke dalam  20  ml  medium  zobell  221E  cair, kemudian  diinkubasi  pada  suhu  30 o C  selama 24  jam.  Selanjutnya  dilakukan  scale  up  ke dalam medium zobell 221E cair 200 ml dalam erlenmeyer  500  ml,  dan  diinkubasi  dengan suhu  30 o C  dan  diseker  150  rpm  selama  24 jam (Ayuningtyas et al., 2021; Pringginies et al., 2020).

## Optimasi pH
Medium  zobell  2216E  cair  ditambah substrat  susu  skim,  ko-substrat  karbon  dan nitrogen  dengan  konsentrasi  optimum  yang diperoleh  dari  eksperimen  sebelumnya. Selanjutnya  ditambahkan  starter  isolat  yang memberikan  OD  0,01  pada  A 600 .  pH  medium diatur  pada  variasi  6,  7  dan  8  dengan penambahan  larutan  HCl  1N  atau  NaOH  1N. Salinitas 30 ppt dan inkubasi pada suhu ruang. selanjutnya pada inkubasi jam ke- 0, 2, 4, 6, 12,  18,  24,  30,  36,  42,  dan  48  dilakukan pengamatan  terhadap  petumbuhan  bakteri, aktivitas  protease  ekstraseluler  dan  kadar protein (Avcioglu et al., 2021)/
Pengukuran pertumbuhan bakteri dilakukan dengan cara sebanyak 10 ml sampel disentrifugasi  dengan  kecepatan  3000  rpm selama  10  menit.  Supernatan  di  buang  dan natan  yang  didapatkan  dilarutkan  dengan larutan PBS sebanyak  10 ml lalu di divortex. Selanjutnya  diamati  nilai  OD-nya  dengan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang 600  nm  (Setyati et  al., 2014).  Data  hasil pengukuran  OD  pada  A600  kemudian  di konversi  dengan  persamaan  standart  Mc Farland  menjadi  satuan  sel/ml.  Nilai  sel/ml tersebut digunakan untuk menghitung jumlah generasi  (g),  waktu  generasi  (Tg)  dan  laju pertumbuhan (µ) bakteri.
Substrat  yang  digunakan adalah kasein 1%  dilarutkan  ke dalam  buffer fosfat  (50 mM,    pH    8).    1  ml    substrat    direaksikan dengan 1 ml sampel selama  10  menit pada suhu  awal  37 o C. Reaksi  dihentikan  dengan penambahan  1  ml  trichloroacetic  acid  (TCA) 10% lalu inkubasi selama 10 menit pada suhu 37 o C.  Kemudian  disentrifugasi  dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Pada 1 ml supernatan di tambahkan Na 2 CO 3 0,5 M dan pereaksi folin ciocalteus (1:2), campuran diinkubasi  30  menit  pada  suhu  37 o C. Absorbansi  dibaca  pada  panjang  gelombang
660 nm (Setyati et al., 2015). Data absorbansi protease  konversi  ke  satuan  mM  dengan menggunakan  persamaan  kurva  standar tirosin. Setelah di ketahui nilai mM selanjutnya dilakukan perhitungan AP (aktivitas protease) dengan  satuan  (IU/ml)  dan  TAP  (total protease)  dengan  satuan  (IU).  kadar  protein ditentukan  dengan  metode  Bradford  (1976) dengan  menggunakan  bovin  serum  albumin (BSA)  sebagai  protein  standar  pada  kisaran 0.01-0.1 mg/mL dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang (λ) = 595 nm. Data absorbansi protein digunakan untuk  penentuan  nilai  KP  (kadar  protein) satuan  (gram/ml)  dengan  menggunakan persamaan standart BSA. Selanjutnya dilakukan  penentuan  nilai  TP  (total  protein) dengan  satuan  gram.  Berdasarkan  data aktivitas  protease  (U/ml)  dan  kadar  protein (gram/ml)  tersebut  berikutnya  dilakukan penghitungan AS (IU/mg).

## Optimasi Salinitas
Medium  zobell  2216E  cair  ditambah substrat  susu  skim  dan  ko-substrat  dengan konsentrasi  optimum,  diinokulasi  dengan starter isolat yang memberikan OD 0,01 pada A 600 . pH media diatur pada pH optimum sesuai dengan hasil penelitian sebelumnya. Salinitas medium diatur pada variasi 15 o / oo , 20 o / oo , 25 o / oo dan  30 o / oo .  Kultur  diinkubasi  pada  suhu ruang. Selanjutnya  pada inkubasi jam ke-  0, 2,  4,  6,  12,  18,  24,  30,  36,  42,  dan  48 dilakukan pengamatan terhadap petumbuhan bakteri,  aktivitas  protease  ekstraseluler  dan kadar protein (Kopperi et al ., 2021).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Optimasi pH
Optimasi pH dilakukan terhadap perbedaan  level  yaitu  pH  6,  pH  7  dan  pH  8. Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan
bahwa  perlakuan  optimasi  pH  berpengaruh signifikan  (α  <  0,05)  terhadap  pertumbuhan bakteri Bacillus  firmus .  Pengaruh  perlakuan perbedaan pH terhadap respon pola polynomial  pertumbuhan  bakteri  dari  yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah pH 6, pH 7 dan pH 8 dengan nilai kepadatan bakteri  pada  puncak  polynomial  sebesar 1,557;  2,815  dan  23,361  x  10 8 sel/ml (Gambar  2).  Perlakuan  pH  8  adalah  yang terbaik  terhadap  pertumbuhan  dengan  pola polynomial y = -0,0274x 2 + 1,6332x - 3,5799; R 2 = 0,9667; R = 0,983.
Perlakuan  perbedaan  pH  berpengaruh signifikan terhadap pertumbuhan mutlak, laju pertumbuhan,  jumlah  generasi  dan  waktu generasi  bakteri.  Nilai  pertumbuhan  mutlak bakteri  secara  berurutan  dari  terendah  ke tertinggi adalah pH 6, pH 7 dan pH 8 dengan nilai  1,422  a,  2,699  b  dan  23,190  c  x  10 8 sel/ml  (Gamabr  3).  Nilai  laju  pertumbuhan bakteri  secara  berurutan  dari  terendah  ke tertinggi adalah pH 6, pH 7 dan pH 8 dengan nilai 0,087 a, 0,113 b dan 0,174 c. Nilai jumlah generasi  secara  berurutan  dari  terendah  ke tertinggi adalah pH 6, pH 7 dan pH 8 dengan nilai 3,521 a, 4,599 b dan 7,032 c. Nilai waktu
generasi  secara  berurutan  dari  terendah  ke tertinggi adalah pH 8, pH 7 dan pH 7 dengan nilai 4,035 a, 6,153 b dan 7,956 c.
Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan perbedaan pH berpengaruh  signifikan  (α <  0,05)  terhadap aktivitas  protease  dan  aktivitas  spesifik protease  bakteri Bacillus  firmus .  Pengaruh perbedaan pH terhadap respon pola polynomial  aktivitas  protease  bakteri  dari yang  terendah  ke  tertinggi  secara  berurutan adalah  pH  6,  pH  7  dan  pH  8  dengan  nilai aktivitas  protease  pada  puncak  polynomial sebesar  20,429  a,  26,936  b  dan  31,763  c IU/ml.  Perlakuan  pH  8  adalah  yang  terbaik terhadap  aktivitas  protease  dengan  pola polynomial y = -0,0336x 2 + 1,9373x - 4,1803; R 2 = 0,8391; R = 0,916. Pengaruh perbedaan pH  terhadap  respon  pola  polynomial  kadar protein bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah pH 6, pH 8 dan pH 7 dengan nilai kadar protein pada inkubasi jam ke- 30 sebesar 11,232 a, 11,315 a dan 11,667 a mg/ml. Perlakuan pH 8 adalah yang terbaik terhadap kadar protein dengan pola polynomial y = 0,0030x 2 - 0,2653x + 16,630; R 2 = 0,9956; R = 0,998.
Gambar 2. Optimasi pH terhadap Polynomial pertumbuhan, aktivitas proteasen kadar protein dan aktivitas spesifik protease bakteri Bacillus firmus
Gambar 3. Pengaruh perbedaan pH terhadap pertumbuhan mutlak, laju pertumbuhan, jumlah dan waktu generasi bakteri Bacillus firmus
Pengaruh perbedaan pH terhadap respon pola  polynomial  aktivitas  spesifik  protease bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah pH 6, pH 7 dan pH 8 dengan nilai  aktivitas  spesifik  protease  pada  puncak polynomial  sebesar  1,811  a,  2,325  b  dan 2,817  c  IU/mg.  Perlakuan  pH  8  adalah  yang terbaik  terhadap  aktivitas  spesifik  protease dengan  pola  polynomial  y  =  -0,0028x 2 + 0,1682x - 0,4673; R 2 = 0,8224; R = 0,907. Berdasarkan  penelitian  perbedaan  pH maka dapat disimpulkan bahwa perlakuan pH 8  adalah  yang  terbaik  dalam  kultur  bakteri Bacillus  firmus .  pH  lingkungan  berpengaruh terhadap  pertumbuhan  bakteri.  Sedang  pH mempengaruhi  kecepatan  aktivitas  enzim dalam  mengkatalis  suatu  reaksi.  Hal  ini disebabkan konsentrasi ion hidrogen mempengaruhi  struktur  tiga  dimensi  enzim dan  aktivitasnya.  Setiap  enzim  memiliki  pH optimum  di  mana  pada  pH  tersebut  struktur tiga  dimensinya  paling  kondusif  untuk mengikat  substrat.  Bila  konsentrasi  ion hidrogen  berubah  dari  konsentrasi  optimal, aktivitas enzim secara progresif hilang sampai pada akhirnya enzim menjadi tidak fungsional (Sun et al. , 2020).

## Optimasi salinitas
Optimasi  salinitas  dilakukan  terhadap perbedaan level yaitu 15, 20, 25 dan 30 ppt. berdasarkan  hasil  penelitian  menunjukkan
bahwa perlakuan optimasi salinitas berpengaruh  signifikan  (α<0,05)  terhadap pertumbuhan bakteri
Bacillus firmus. Pengaruh  perlakuan  perbedaan  salinitas terhadap respon
pola polynomial pertumbuhan  bakteri  (Gambar  5)  dari  yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah 15, 20, 25 dan 30 ppt dengan nilai kepadatan bakteri  pada  puncak  polynomial  sebesar 1,941; 3,109; 7,898 dan 40,327 x 108 sel/ml. Perlakuan salinitas 30 ppt adalah yang terbaik terhadap pertumbuhan dengan pola polynomial y=-0,0549x2 + 3,1163x - 8,9856; R2=0,9347; R= 0,967. Perlakuan perbedaan salinitas berpengaruh signifikan terhadap pertumbuhan mutlak,  laju  pertumbuhan,  jumlah  generasi dan waktu generasi bakteri. Nilai pertumbuhan mutlak bakteri secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah salinitas 15, 20, 25 dan 30 ppt dengan nilai 1,786 a, 2,974 ab,  7,744  bc  dan  40,147  c  x  108  sel/ml (Gambar  6).  Nilai  laju  pertumbuhan  bakteri secara  berurutan  dari  terendah  ke  tertinggi adalah salinitas 15, 20, 25 dan 30 ppt dengan nilai 0,087 a, 0,111 b,  0,138 c dan 0,186 d. Nilai  jumlah  generasi  secara  berurutan  dari terendah ke tertinggi adalah salinitas 15, 20, 25 dan 30 ppt dengan nilai 3,529 a, 4,524 b, 5,578  c  dan  7,542  d.  Nilai  waktu  generasi secara  berurutan  dari  terendah  ke  tertinggi adalah salinitas 30, 25, 20 dan 15 ppt dengan nilai 3,767 a, 5,042 b, 6,191 c dan 8,052 d.
Gambar 4. Pengaruh  perbedaan  pH  terhadap  aktivitas  protease,  kadar  protein,  aktivitas spesifik dan total aktivitas protease bakteri Bacillus firmus
Gambar  6 .  Pengaruh  perbedaan  salinitas  terhadap  pertumbuhan  mutlak,  laju  pertumbuhan, jumlah dan waktu generasi bakteri Bacillus firmus
Berdasarkan hasil penelitian
menunjukkan  bahwa  perlakuan  perbedaan salinitas  berpengaruh  signifik an  (α  <  0,05) terhadap  aktivitas  protease,  kadar  protein dan  aktivitas  spesifik  protease  bakteri Bacillus firmus . Pengaruh perbedaan salinitas  terhadap  respon  pola  polynomial aktivitas protease bakteri dari yang terendah ke  tertinggi  secara  berurutan  adalah salinitas 15, 20, 25 dan 30 ppt dengan nilai aktivitas  protease  pada  puncak  polynomial sebesar  22,532  a,  27,282  b,  30,028  c  dan 35,278 d IU/ml (Gambar 7).
Perlakuan salinitas 30 ppt adalah yang terbaik  terhadap  aktivitas  protease  dengan pola polynomial y = -0,0388x 2 + 2,2319x - 5,0285; R 2 = 0,8537; R = 0,924. Pengaruh perbedaan  salinitas  terhadap  respon  pola polynomial  kadar  protein  bakteri  dari  yang terendah  ke  tertinggi  secara  berurutan adalah  salinitas  15,  20,  30  dan  25  ppt dengan nilai kadar protein pada inkubasi jam ke- 30 sebesar 12,269 a, 12,603 ab, 12,730 ab dan 13,433 b mg/ml. Perlakuan salinitas
30 ppt adalah yang terbaik terhadap  kadar protein dengan pola polynomial y= 0,0021x 2 - 0,2037x + 17,035; R 2 = 0,9682; R = 0,984. Pengaruh perbedaan salinitas terhadap respon  pola  polynomial  aktivitas  spesifik protease  bakteri  dari  yang  terendah  ke tertinggi  secara  berurutan  adalah  salinitas 15, 20, 25 dan 30 ppt dengan nilai aktivitas spesifik  protease  pada  puncak  polynomial sebesar 1,833 a, 2,167 b, 2,239 b dan 2,776 c  IU/mg.  Perlakuan  salinitas  30  ppt  adalah yang  terbaik  terhadap  aktivitas  spesifik protease  dengan  pola  polynomial  y=- 0,0029x 2 + 0,1709x - 0,4610; R 2 = 0,8369; R=0,915. Berdasarkan penelitian perbedaan salinitas  maka  dapat  disimpulkan  bahwa perlakuan  salinitas  30  ppt  adalah  yang terbaik dalam kultur bakteri Bacillus firmus . Mekanisme bakteri yang hidup pada salinitas tinggi  akan  beradaptasi  dengan  tekanan osmotik.  Selain  itu  sel  bakteri  harus mempunyai  komponen  konsentrasi  garam yang rendah dalam sitoplasmanya (Saberi et al. , 2020).
Gambar 7.   Pengaruh perbedaan salinitas terhadap aktivitas protease, kadar protein, aktivitas spesifik dan total aktivitas protease bakteri Bacillus firmus

## KESIMPULAN
Penelitian telah berhasil melakukan uji optimasi  pertumbuhan  dan  aktivitas  enzim protease ektraseluler bakteri Bacillus firmus simbion  sponge Chalinula  pseudomolitba . Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri Bacillus  firmus memiliki  laju  pertumbuah dan aktivitas protease  terbaik pada kondisi pH 8 yaitu dengan nilai sebesar 0,174 c dan 31,763 c IU/ml. Serta pada kondisi salinitas media 30 ppt dengan nilai sebesar 0,186 d dan 35,278 d IU/ml.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih kepada  DIKTI  yang  telah  memberikan beasiswa  program  doktor  BPPDN  dan  dana penelitian sekema
PDD. Peneliti mengucapkan  terima  kasih  atas  dukungan fasilitas  penelitian  dari  Laboratorium  Prodi Budidaya Perairan UNISNU Jepara,
Laboratorium  MSTP  UNDIP  Jepara  dan BBPBAP Jepara.

## REFERENSI
Avcioglu,  N.H.,  Birben,  M.  &  Bilkay,  I.S. 2021. Optimization and physicochemical
characterization  of  enhanced  microbial cellulose production with a new Kombucha consortium. Process  Biochemistry ,  108: 60-68.
Ayuningtyas,  E.P.,  Sibero,  M.T.,  Hutapea, N.B., Frederick, E.H., Murwani, R., Zilda, D.S.,  Wijayanti,  D.P.,  Sabdono,  A., Pringgenies,  D.  &  Radjasa,  O.K.  2021, May. Screening of extracellular enzyme from Phaeophyceae-associated fungi. In IOP  Conference  Series:  Earth  and Environmental Science , 750(1): p.012005. El-Saadony,  M.T.,  Alagawany,  M.,  Patra,
A.K., Kar, I., Tiwari, R., Dawood, M.A., Dhama, K. & Abdel-Latif, H.M. 2021. The functionality  of  probiotics  in  aquaculture: an overview. Fish & Shellfish Immunology , 117:36-52.
Holt, C.C., Bass, D., Stentiford, G.D. & van der Giezen, M. 2021. Understanding the role  of  the  shrimp  gut  microbiome  in health and disease. Journal of invertebrate pathology , 186: p.107387. Kopperi, H., Amulya, K. & Mohan, S.V. 2021.
Simultaneous  biosynthesis  of  bacterial polyhydroxybutyrate (PHB) and extracellular polymeric substances
(EPS):  Process  optimization  and  Scale- up. Bioresource  Technology ,  341: p.125735.
Oh, Y.J., Jo, W., Yang, Y.  & Park, S. 2007. Influence  of  culture  conditions  on Escherichia  coli  O157:  H7  biofilm formation  by  atomic  force  microscopy. Ultramicroscopy , 107(10-11):869-874. Pringgenies, D., Girsang, P.H., Yudiati, E. & Santosa, G.W. 2020. Exploration of sea cucumber  intestinal  symbiont  microbe as  probiotic  microbe  candidate  in healthcare products. Journal of Fisheries and Marine Research , 4(1):27-34.
Pringgenies, D., Setyati, W.A., Djenaedi, A.,
Pramesti,  R.,  Rudiyanti,  S.  &  Ariyanto, D.  2021.  Exploration  of  antimicrobial potency  of  mangrove  symbiont  against multi-drug  resistant  bacteria. Jurnal Ilmiah  Perikanan  dan  Kelautan ,  13(2):
102-112.  DOI:  10.20473/jipk.v13i2.14 725
Rashmi, B.S. & Gayathri, D. 2017. Evaluation and Optimization of Extracellular Digestive  Enzymes  from  Bacillus  spp. Isolated  from  Curds .  Maternal  and Pediatric Nutrition , 3(118):2472-1182. Saberi,  F.,  Marzban,  R.,  Ardjmand,  M., Shariati,  F.P.  &  Tavakoli,  O.  2020. Optimization  of  culture  media  to enhance  the  ability  of  local  Bacillus thuringiensis var. tenebrionis. Journal of the  Saudi  Society  of  Agricultural Sciences , 19(7): 468-475. DOI: 10.1016/j.jssas.2020.08.004
Setyati, W.A. 2014. Selection, identification and  optimization  of  the  growth  water probiotic  consortium  of  mangrove ecosystems  as  bioremediation  and
biocontrol  in  shrimp  ponds. Jurnal Pengolahan  Hasil  Perikanan  Indonesia , 17(3): 242-252.
Setyati,  W.A.,  Martani,  E.  &  Zainuddin,  M., 2015.  Kinetika  Pertumbuhan  dan Aktivitas  Protease  Isolat  36k  dari Sedimen Ekosistem Mangrove, Karimunjawa,  Jepara. Ilmu  Kelautan:
Indonesian  Journal  of  Marine  Sciences , 20 (3): 163-169
Sun, F., Hu, Y., Yin, X., Kong, B. & Qin, L., 2020.  Production,  purification  and biochemical  characterization  of  the microbial protease produced by Lactobacillus  fermentum  R6  isolated from  Harbin  dry  sausages. Process Biochemistry , 89:37-45. DOI: 10.1016/
j.procbio.2019.10.029
Wijaya,  P.A.,  Pringgenies,  D.  &  Yudiati,  E.,
2021. Antibacteria Activity of Gastropod Association  Bacteria  From  Mangrove Ecosystem  Against  Bacillus  Cereus  and Escherichia  Coli  and  It’S  Potency  of Application  for  Belanak  Fish  (Mugil Subviridis). Journal  of  Fisheries  and Marine Research , 5(1): 15-21. Zárate-Chaves,  C.A.,  Romero-Rodríguez, M.C., Niño-Arias, F.C., Robles-Camargo, J.,  Linares-Linares,  M.,  Rodríguez- Bocanegra,  M.X.  &  Gutiérrez-Rojas,  I., 2013. Optimizing a  culture  medium  for biomass  and  phenolic  compounds production  using  Ganoderma  lucidum. Brazilian  Journal  of  Microbiology ,  44: 215-223.