## ISOLASI, IDENTIFIKASI SECARA MOLEKULER MENGGUNAKAN GEN 16S rRNA, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI BAKTERI SIMBION ENDOFIT YANG DIISOLASI DARI ALGA Halimeda opuntia
Castly Herny Rau 1) , Adithya Yudistira 1) , Herny E. I. Simbala 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Algae is one of the primary producers in marine ecosystem whose existence in Indonesia is quite  abundant.  Algae  is  the  living  place  of  various  microorganisms  that  are  symbiotic  with  it, included bacteria. Endophytic symbiont bacteria of algae has potential as a candidate of antibiotic producing  agent,  because  it  is  able  to  produce  bioactive  metabolite  that  can  inhibit  the  growth  of pathogenic  bacteria.  The  objective  of  this  study  is  to  isolate  and  test  the  antibacterial  activity  of endophytic symbiont bacteria of Halimeda opuntia, and to carry out molecular identification using 16S  rRNA  gene  to  identify  the  endophytic  bacteria  isolate  that  showing  the  greatest  antibacterial power. A total of 3 isolates of endophytic symbiont bacteria were obtained through the purification process.  The  results  of  antibacterial  activity  test  showed  that  all  the  supernatants  of  endophytic simbiont  bacteria  isolates  had  inhibitory  activity  against  the  growth  of  pathogenic  bacteria.  The mean  diameter  of  the  inhibitory  zone  against  Escherichia  coli  were:  Ho-B1  (6.86  mm)  and  Ho-B2 (8.53 mm) classified as intermediet, and Ho-B3 (4.36 mm) classified as weak. While the antibacterial activity  against  Staphylococcus  aureus  bacteria  were:  Ho-B1  (6,15  mm)  and  Ho-B2  (6,84  mm) classified as intermediet, and Ho-B3 (3,84 mm) classified as weak. The Ho-B2 isolate which had the highest inhibitory index in the antibacterial activity test was identified molecularly as Bacillus sp.
Keywords : Halimeda opuntia, endophytic symbiont bacteria, isolation, antibacterial activity, molecular identification, 16S rRNA gene

## ABSTRAK
Alga merupakan salah satu produsen primer di ekosistem perairan laut yang keberadaannya di  Indonesia  cukup  melimpah.  Alga  merupakan  tempat  hidup  berbagai  mikroorganisme  yang bersimbiosis dengannya, salah satunya ialah bakteri. Bakteri simbion endofit alga berpotensi sebagai kandidat  agensia  penghasil  antibiotik,  karena  mampu  menghasilkan  metabolit  bioaktif  yang  dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  dan melakukan pengujian aktivitas antibakteri dari bakteri simbion endofit alga Halimeda opuntia, serta melakukan  identifikasi  secara  molekuler  menggunakan  gen  16S  rRNA  terhadap  isolat  bakteri simbion  yang  menunjukkan  daya  antibakteri  terbesar.  Sebanyak  3  isolat  bakteri  simbion  endofit berhasil diperoleh melalui tahap purifikasi. Hasil pengujian aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa supernatan  ketiga  isolat  bakteri  simbion  endofit  memiliki  aktivitas  penghambatan  terhadap pertumbuhan bakteri uji. Diameter rata-rata zona hambat terhadap bakteri Escherichia coli yaitu: Ho- B1  (6,86  mm)  dan  Ho-B2  (8,53  mm)  tergolong  kategori  sedang,  dan  Ho-B3  (4,36  mm)  tergolong kategori  lemah.  Sedangkan  daya  antibakteri  terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus yaitu:  Ho-B1 (6,15  mm)  dan  Ho-B2  (6,84  mm)  tergolong  kategori  sedang,  dan  Ho-B3  (3,84  mm)  tergolong kategori  lemah.  Isolat  Ho-B2  yang  memiliki  indeks  penghambatan  tertinggi  dalam  pengujian aktivitas antibakteri teridentifikasi secara molekuler sebagai Bacillus sp.
Kata kunci : Halimeda opuntia , bakteri simbion endofit, isolasi, aktivitas antibakteri, identifikasi molekuler, gen 16S rRNA

## PENDAHULUAN
Alga/rumput  laut  merupakan sejenis  tumbuhan  tingkat  rendah  yang keberadaannya  di  Indonesia  cukup melimpah.  Pemanfaatan  alga  dalam bidang  farmasi  selama  ini  masih terbatas,  sedangkan  potensi  alga  laut  di Indonesia  lebih  khusus  di  Sulawesi Utara  sangat  besar.  Potensi  alga  laut
Indonesia sangat besar untuk dikembangkan sebagai bahan baku obat karena  mengandung  senyawa  bioaktif yang  memiliki  banyak  manfaat.  Salah satu  contoh  alga  laut  ialah Halimeda opuntia (Purnama et al ., 2011; Widiastuti, 2003).
Mikroba  memiliki  jumlah  yang sangat  banyak  dibandingkan  dengan jumlah  makhluk  hidup  lain  di  bumi. Pertumbuhan mikroba, khususnya bakteri,  banyak  dijumpai  dengan  cara hidup  berasosiasi  dengan  berbagai organisme laut, salah satunya ialah alga (Wantania et al., 2016). Untuk
mengambil  senyawa  bioaktif  secara langsung  dari  tanamannya  dibutuhkan sangat  banyak  biomassa  atau  bagian dari tanaman tersebut. Untuk
mengefisienkan cara memperoleh senyawa bioaktif tersebut, maka digunakan  mikroba  endofit  spesifik yang  diperoleh  dari  bagian  dalam tanaman yang diharapkan mampu menghasilkan sejumlah
senyawa bioaktif  yang  dibutuhkan  tanpa  harus mengekstrak  dari  tanamannya.  Mikroba endofit  adalah  organisme  hidup  yang berukuran  mikroskopis  yang  hidup  di dalam  jaringan  tanaman  (xilem  dan floem),  daun,  akar,  buah,  dan  batang. Senyawa  yang  dihasilkan  oleh  mikroba
endofit  mirip  dengan  inangnya  dan diduga  sebagai  hasil  koevolusi  atau transfer  genetik  dari  inang  (Tan  dan Zou, 2001).
Pencarian  bakteri  endofit  yang
banyak terdapat pada tumbuhan dilakukan untuk menambah atau memperkaya koleksi mikroba.
Selanjutnya  mikroba  tersebut  perlu diidentifikasi  untuk  mengetahui  sifat pertumbuhan  dan  jenisnya,  sehingga lebih  lanjut  dapat  dimanfaatkan  di bidang  kesehatan  (Noverita et  al. , 2009). Dengan berkembangnya
identifikasi  mikroorganisme,  maka  saat ini  identifikasi  bakteri  dapat  dilakukan dengan  metode  berbasis  molekuler dengan menggunakan gen 16S rRNA.
Penelitian  ini  dilakukan  dengan tujuan  untuk  mengetahui  aktivitas antibakteri  dari  mikroba  endofit  yang diisolasi  dari  alga Halimeda  opuntia. Untuk  mengetahui  jenis  bakteri  endofit yang memiliki daya antibakteri terbesar, maka dilakukan analisis secara molekuler terhadap gen 16S rRNA.

## METODE PENELITIAN

## Alat
Masker,  sarung  tangan,  snorkel, fins, cooling box , zipper bag , erlenmeyer ( Iwaki ST Pyrex) , gelas ukur mL ( Iwaki ST Pyrex) , tabung reaksi, rak tabung  reaksi,  pipet  tetes,  timbangan analitik  ( ADAM) ,  lumpang  dan  alu, pisau,  cawan  petri  ( Iwaki  ST  Pyrex) , jarum  ose,  pinset, rotary  shaker incubator  (Infors  HT) ,  bunsen,  lemari pendingin,  cetakan  sumur  diameter  7
mm, laminar air flow (Biotek) , autoklaf (ALP),  mikropipet (Ecopipette) ,  tip, L- Glass, jangka  sorong,  kertas  label, plastik wrap , aluminium  foil ,  tisu, kapas,  kasa,  mikroskop  cahaya,  kaca objek, seperangkat  alat  PCR  ( Biometra T-Personal ) dan elektroforesis
( Biometra T-Personal ), alat fotografi.

## Bahan
Sampel  alga Halimeda  opuntia , bakteri  uji Escherichia  coli (ATCC
25922) dan Staphylococcus  aureus (ATCC  25923),  aquades,  etanol  70%, etanol  95%,  NaCl  0.9%,  Natrium Hipoklorit  (NaOCl)  5,25%,  media Nutrient  Agar ,  media Nutrient  Broth , antibiotik  amoksisilin  0,1  mg/mL, kristal violet, lugol, larutan safranin, kit isolasi  DNA  bakteri  (Geneaid),  primer set  (untuk  bakteri), Master  Mix untuk amplifikasi  DNA  (Bioline),  ddH 2 O,  gel agarosa,  TBE buffer 0.5x,    dan  etidium bromida.

## Pengambilan dan Penyiapan Sampel
Sampel  alga Halimeda  opuntia diambil dari perairan pantai Malalayang menggunakan alat bantu (masker, snorkel  dan  fins).  Sampel  dimasukkan ke  dalam zipper  bag dan  disimpan dalam cooling  box berisi  es  batu  untuk dibawa  ke  Laboratorium  Mikrobiologi Program Studi Farmasi Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam Universitas Sam Ratulangi. Sampel diidentifikasi (secara morfologi) kemudian dibersihkan dengan air
mengalir  untuk  menghilangkan  kotoran yang menempel dan dilakukan sterilisasi permukaan untuk menghilangkan pengotor maupun
mikroorganisme  epifit  lain  yang  dapat mengontaminasi.
Isolasi dan Purifikasi Bakteri Simbion Endofit Penanaman  bakteri  endofit  yang bersimbiosis  dengan  alga  dilakukan dengan metode sebaran menurut Madigan  (2012).  1  gram  sampel  alga yang  telah  disterilisasi  permukaannya dihancurkan dengan cara digerus dengan  lumpang  dan  alu  sampai  halus. Selanjutnya,  1  gram  sampel  yang  telah halus  tersebut  dimasukkan  ke  dalam  9 mL  aquades  steril  sehingga  diperoleh pengenceran sampel sebesar 10 -1 . Pengenceran bertingkat selanjutnya dilakukan untuk seri 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -
5 ,  10 -6 ,  dan  10 -7 .  Dari  masing-masing seri  kemudian  diambil  100  µL  dan disebarkan  ke  dalam  cawan  petri  steril yang  berisi  media  NA  dan  diinkubasi dalam  inkubator  pada  suhu  27-29ºC selama 1x24 jam. Koloni bakteri endofit yang  tumbuh  diamati  warna,  bentuk, elevasi,  tepian  dan  ukurannya.  Koloni- koloni bakteri  dipisahkan dengan jarum ose berdasarkan perbedaan karakteristik makroskopik  dan  mikroskopiknya  pada media  NA  baru  dalam  cawan  petri  dan diinkubasi  pada  suhu  27-29°C  selama 24  jam.  Isolat  yang  telah  murni kemudian  dipindahkan  dan  disimpan pada media NA miring.

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
Bakteri
simbion endofit disiapkan  dengan  cara  satu  ose  isolat bakteri  endofit  alga  diinokulasilan  ke dalam  5  mL  media  cair  NB  dan diinkubasi  selama  24  jam  dalam rotary shaker dengan  suhu  27-29ºC.  Masing-
masing  koloni  bakteri  simbion  endofit
dalam media cair kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge dan  disentrifugasi  dengan  kecepatan
3000  rpm  selama  30  menit.  Supernatan yang terbentuk diambil.
Pengujian dilakukan dengan metode  difusi  sumuran,  yaitu  dengan menuangkan  20  mL  media  NA  ke dalam  cawan  petri  steril  dan  dibiarkan memadat.  Pada  permukaan  lapisan media pertama tersebut kemudian diletakkan cetakan sumur secara aseptis, kemudian dituangkan 20 mL media NA
yang telah dicampurkan dengan suspensi  bakteri  uji  ke  atas  permukaan lapisan  media  pertama  dan  didiamkan hingga  memadat.  Selanjutnya,  cetakan sumur  diangkat  dan  ke  dalam  tiap sumur  dimasukkan  supernatan  bakteri simbion  endofit,  kontrol  positif,  dan kontrol negatif
masing-masing sebanyak 50 µL. Pengamatan dilakukan terhadap  zona  bening  yang  tebentuk  di sekitar sumuran setelah diinkubasi pada suhu 37ºC  selama 1x24 jam  dan diukur menggunakan  jangka  sorong  dengan ketelitian  0.05  mm  (Ortez,  2005). Diameter  zona  hambat  yang  terukur kemudian  dikategorikan  kekuatan  daya antibakterinya berdasarkan penggolongan kekuatan daya antibakteri menurut Davis dan Stout (1971).
Identifikasi  Bakteri  Endofit  Secara Molekuler
Isolasi dan Pemurnian DNA
Isolasi  DNA  Genomik  dari
kultur bakteri dilakukan dengan Genomic DNA Mini Kit (Geneaid) yang telah dimodifikasi.
Amplifikasi  Gen  16S  rRNA  dengan PCR
Amplifikasi  dilakukan  dengan menggunakan  mesin  PCR combi  block (whatman  biometra  Germany).  Primer yang digunakan untuk proses PCR yaitu pasangan  primer  BKXF  ( forward )  dan BKXR ( reverse ). Cetakan yang digunakan  untuk  amplifikasi  gen  16S rRNA yaitu DNA genomik bakteri yang telah  diisolasi.  Amplifikasi  dengan teknik  PCR  dilakukan  dengan  variasi komposisi  reagen  dan  kondisi  reaksi PCR yang telah dimodifikasi.

## Elektroforesis  Gel    Agarosa  dan
Visualisasi
DNA  yang  telah  diamplifikasi kemudian diseparasi dengan elektroforesis  gel  agarosa 1%.  Gel direndam  dalam campuran larutan Tris-
Borat-EDTA buffer dan etidium bromida.  Visualisasi  dilakukan  dengan sinar  UV  pada  UV-transiluminator. Hasil deteksi didokumentasikan.

## Sekuensing Gen 16S rRNA
Sekuensing dilakukan untuk menentukan  urutan  nukleotida  pada fragmen DNA yang terdeteksi dari hasil visualisasi  DNA  yang  teramplifikasi dalam proses PCR menggunakan mesin autosequencing . Proses sekuensing dilakukan  dengan  mengirim  sampel  ke First Base Pte. Malaysia.

## Pengolahan Data Sekuens DNA
Kromatogram DNA hasil sekuensing disunting menggunakan perangkat  lunak  Geneious.    Hasil sekuensing  DNA  kemudian  dianalisis
menggunakan  program  BLAST  melalui media online NCBI  untuk  mencari kesamaan  urutan  nukleotida  gen  16S rRNA  dalam  menentukan  jenis  isolat bakteri  endofit  dari  alga Halimeda opuntia yang  memiliki  daya  antibakteri terbesar.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Preparasi Sampel
Sampel yang diperoleh dilakukan  sterilisasi  permukaan  yang bertujuan untuk menghilangkan kotoran dan mikroorganisme epifit yang menempel  pada  permukaan  sampel, sehingga  koloni  yang  tumbuh  pada media  isolasi  merupakan  koloni  endofit (Strobel dan Daisy, 2003).

## Isolasi  dan  Purifikasi  Bakteri Simbion Endofit
Sampel  yang  telah  disterilisasi permukaan kemudian dihancurkan dengan  cara  digerus  sampai  halus, dengan  tujuan  untuk  memperbesar  luas permukaan  jaringan  dalam  alga  yang terbuka  dan  mengoptimalkan  proses penanaman bakteri simbion endofit dari
alga.
Pengenceran menggunakan aquades  dilakukan  agar  bakteri  yang dihasilkan tidak terlalu pekat. Pemurnian  (purifikasi)  koloni-koloni bakteri  yang  tumbuh  dilakukan  untuk memisahkan  koloni-koloni  bakteri  agar mendapatkan  isolat  bakteri  yang  murni, yaitu  kultur  koloni  bakteri  murni  yang hanya  mengandung  satu  karakteristik morfologi yang sama.
Dari hasil pemurnian diperoleh 3 (tiga)  isolat  bakteri  murni.  Masing- masing  isolat  diberi  kode  Ho-B1,  Ho- B2,  dan  Ho-B3.  Setiap  isolat  dibuat duplo sebagai working culture dan stock culture (Noverita et al., 2009).
Karakterisasi biakan bakteri endofit dilakukan terhadap ketiga isolat. Karakterisasi dilakukan melalui pengamatan makroskopik dan mikroskopik.  Pengamatan  karakteristik makroskopik  dilakukan  pada  ketiga isolat bakteri dengan menentukan perbedaan  sifat-sifat  koloni  dalam media  padat  meliputi  bentuk,  elevasi, tepian, warna, dan ukuran koloni. Untuk pengamatan karakteristik secara mikroskopik  dilakukan  dengan  metode pewarnaan Gram. Tabel 1. Hasil Karakterisasi Makroskopik Isolat Bakteri Simbion Endofit Kode Isolat Karakteristik Morfologi Koloni Bentuk Elevasi Tepian Warna Ukuran Ho-B1 Bulat Serupa kawah  Berombak Bening Kecil Ho-B2 Tak- teratur Mendatar Berbenang Putih Sedang Ho-B3 Bulat Mencembung Utuh Putih- Kekuningan Sedang

## Tabel 2. Hasil Karakterisasi Mikroskopik Isolat Bakteri Simbion Endofit
Kode Isolat Karakteristik Bakteri Bentuk Sel Gram Ho-B1 Basil Positif Ho-B2 Basil Positif Ho-B3 Basil Negatif Pengujian Aktivitas Antibakteri
Dalam  pengujian  ini,  hasil  yang diperoleh  yaitu  terbentuknya  zona hambat  yang  ditandai  dengan  area bening  di  sekeliling  lubang  sumuran berukuran  7  mm.  Hal  ini  menunjukkan adanya  kepekaan  bakteri  uji  terhadap cairan supernatan hasil sentrifugasi  dari
masing-masing  isolat  bakteri  endofit yang  diisolasi  dari  alga Halimeda opuntia serta  sumuran  berisi  antibiotik Amoksisilin (kontrol positif). Pengujian ini  dilakukan  pengulangan  sebanyak  3 (tiga)  kali  dengan  tujuan  untuk  lebih mengakuratkan  hasil  pengujian  yang diperoleh.
Gambar 1. Diagram Perbandingan Rata-rata Diameter Zona Hambat Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri

## Gambar 2. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri
Kemampuan penghambatan pertumbuhan bakteri uji yang direpresentasikan  oleh  terbentuknya zona  bening  pada  pengujian  aktivitas
antibakteri  dari  supernatan  bakteri simbion  endofit  alga Halimeda  opuntia disebabkan oleh kemampuan dari bakteri
simbion endofit untuk
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 Ho-B1 Ho-B2 Ho-B3 Kontrol + Kontrol - Dia m eter zo n a h am b at (m m ) Escherichia coli Staphylococcus aureus Pengulangan 1 Pengulangan 1 + + - - Pengulangan 2 Pengulangan 2 + + - - Pengulangan 3 Pengulangan 3 Ket.: 1 = Isolat Ho-B1
+ = Kontrol positif 2 = Isolat Ho-B2  = Kontrol negatif 3 = Isolat Ho-B3 + + - -
menghasilkan senyawa metabolit sekunder  yang  merupakan  senyawa bioaktif  dan  dapat  berfungsi  untuk menghambat  pertumbuhan  dari  bakteri patogen. Bakteri simbion endofit mampu menghasilkan senyawa
metabolit  sekunder  seperti  alkaloid, terpen, steroid, flavonoid, kuinon, fenol, dan  lain  sebagainya.  Senyawa-senyawa ini  sebagian  besar  mempunyai  potensi sebagai senyawa bioaktif (Tan dan Zou, 2001).
Berdasarkan
penggolongan kekuatan  daya  antibakteri  menurut Davis  dan  Stout  (1971),  maka  diameter rata-rata  daya  antibakteri  supernatan bakteri  simbion  endofit  dari  alga Halimeda  opuntia terhadap  bakteri Escherichia  coli yaitu:  Ho-B1  (6,86 mm)  dan  Ho-B2  (8,53  mm)  tergolong kategori  sedang,  dan  Ho-B3  (4,36  mm) tergolong kategori lemah. Daya antibakteri  supernatan  bakteri  simbion endofit  dari  alga Halimeda  opuntia terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus yaitu:  Ho-B1  (6,15  mm)  dan  Ho-B2 (6,84  mm)  tergolong  kategori  sedang, dan  Ho-B3  (3,84  mm)  tergolong kategori lemah.

## Identifikasi  Bakteri  Endofit  dengan Analisis Gen 16S rRNA
Identifikasi  secara  molekuler dilakukan  pada  isolat  bakteri  simbion endofit  dari  alga Halimeda  opuntia yang  memiliki  daya  hambat  terbesar pada  pertumbuhan  kedua  bakteri  uji, yaitu isolat Ho-B2.
Identifikasi bakteri diawali dengan ekstraksi DNA dengan
menggunakan Genomic  DNA  Mini  Kit (Geneaid). Proses lisis (perusakkan atau
penghancuran  membran  dan  dinding sel)  dilakukan  menggunakan buffer GP1.  Suhu  pemanasan  yang  dilakukan ialah 60ºC selama 15 menit. Buffer GP2 berfungsi  sebagai buffer penetral,  dan buffer GP3 berfungsi mengikat DNA ke buffer serta spin  column. Proses pencucian  dilakukan  secara  berturut- turut  menggunakan buffer W1  (untuk menghilangkan  sisa-sisa  protein  yang menempel  pada  DNA), Wash  Buffer
(untuk  mencuci  garam-garam buffer sebelumnya), dan terakhir DNA
dilarutkan  dalam elution  buffer (untuk melepaskan DNA dari membran).
Hasil  ekstraksi  DNA  kemudian diamplifikasi  dengan  PCR  ( Polimerase Chain  Reaction )  dengan  menggunakan primer  untuk  gen  16S  rRNA  BKXF ( forward )  dan  BKXR  ( reverse )  yang  dapat mengamplifikasi  gen  16S  rRNA  sepanjang 1.200 bp (Kolondam, in press ). Pada proses amplifikasi  ini,  terjadi  perbanyakan  DNA pada  daerah  tertentu  yang  dibatasi  oleh primer.  Hasil  PCR  ini  yang  kemudian digunakan  untuk  tahap  sekuensing  DNA (Rahayu dan Nugroho, 2015).
Produk  PCR  berupa  DNA  yang
telah teramplifikasi
kemudian dielektroforesis  sebagai  uji  kualitatif untuk mengukur konsentrasi DNA yang diperoleh  dari  proses  PCR.  Dari  hasil elektroforesis diketahui terdapat fragmen  DNA  yang  berukuran  berkisar 1.200 bp yang terseparasi dibandingkan dengan  marka  DNA  yang  merupakan fragmen DNA standar yang digunakan.

## Gambar 3. Hasil Elektroforesis Produk PCR
Proses  sekuensing  dilakukan dengan mengirim produk PCR DNA ke First  Base  Pte. Malaysia.  Data  hasil sekuensing  yang  diperoleh  selanjutnya dibuka dan disunting dengan menggunakan perangkat lunak Geneious. Berdasarkan  hasil  visualisasi dalam perangkat lunak Geneious , dipilihlah segmen DNA dengan kualitas pembacaan  terbaik.  Urutan  nukleotida tersebut  (sekuens query )  kemudian disalin  untuk  dianalisis  menggunakan program BLAST ( Basic Local Alignment  Search  Tool )  yang  diakses secara online melalui  website  NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Hasil  analisis  BLAST  menunjukkan nama  bakteri  dan  tingkat  kesamaan urutan  nukleotida  dari  DNA  isolat dengan  urutan  nukleotida  dari  spesies bakteri  yang  sesuai  dalam database GeneBank.  Berdasarkan  hasil  analisis BLAST  yang  diperoleh  dari  sekuens DNA  isolat  Ho-B2,  diketahui  bahwa isolat  Ho-B2  dengan  nilai score 725, query coverage 100%, maximum identity 97%, dan e-value 0.0 merupakan bakteri Bacillus sp.

## KESIMPULAN
1. Terdapat 3 (tiga) jenis bakteri endofit yang  berhasil  diisolasi  dari  alga Halimeda  opuntia .  Masing-masing isolat  diberi  kode  Ho-B1,  Ho-B2, dan Ho-B3. 2. Ketiga  isolat  bakteri  simbion  endofit dari alga Halimeda opuntia menunjukkan  adanya  kemampuan aktivitas  antibakteri  terhadap  bakteri uji.  Diameter  rata-rata  zona  hambat terhadap  bakteri Escherichia  coli yaitu:  Ho-B1  (6,86  mm),  Ho-B2 (8,53  mm),  dan  Ho-B3  (4,36  mm). Sedangkan  daya  antibakteri  terhadap bakteri Staphylococcus  aureus yaitu:
Ho-B1  (6,15  mm),  Ho-B2  (6,84 mm), dan Ho-B3 (3,84 mm).
3. Bakteri  endofit  yang  memiliki  daya antibakteri  terbesar  ialah  isolat  Ho- B2  yang  berdasarkan  analisis  secara molekuler  dengan  menggunakan  gen 16S  rRNA  teridentifikasi  sebagai Bacillus sp.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut  untuk  identifikasi  dan  purifikasi senyawa  bioaktif  yang  dihasilkan  oleh bakteri  simbion  endofit  alga Halimeda opuntia , serta pengujian aktivitas antibakteri dengan menggunakan bakteri uji yang berbeda.

## DAFTAR PUSTAKA
Davis , W . W . dan  Stout , T . R . 1971. Disc Plate Methods of Microbiological Antibiotic Assay . Microbiology . 22 ( 4 ) : 659-665.
Kolondam , B . J . Primer  BKXF  dan BKXR , (siap terbit) .
Madigan , J ., David , A . S ., David , P . C . 2012. Biology of Microorganism 13 th  Edition .
Benjamin Cummings , USA .
Noverita , Fitria , D ., Sinaga , E . 2009. Isolasi dan Uji Aktivitas Antibakteri  Jamur  Endofit  dari Daun  dan  Rimpang Zingiber ottensii Val . Jurnal  Farmasi
Indonesia . 4 ( 4 ) : 171-176.
Ortez , J . H . 2005. Disk Diffusion Testing in  Manual  of  Antimicrobial Susceptibility Testing . American Society For Microbiology , USA .
Purnama , R ., Melki , Wike , A . E . P ., Rozirwan . 2011. Potensi Ekstrak Rumput Laut Halimeda  rencii dan Euchema cotonii sebagai Antibakteri Vibrio sp . Maspari  Journal . 2 : 82-88.
Rahayu , D . A . dan Nugroho , E . D . 2015. Biologi Molekuler dalam Perspektif Konservasi . Plataxia , Yogyakarta .
Strobel , G . A . dan  Daisy , B . 2003.
Bioprospecting  for  Microbial Endophytes  and  Their  Natural Products . Microbiology  and Molecular Biology Review . 67 ( 4 ) : 491-502.
Tan , R . X . dan  Zou , W . X . 2001. Endophytes : A  Rich  Source  of Functional Metabolites . Natural  Product Reports . 18 : 448-459. Wantania , L . L ., Ginting , E . L ., Wullur , S . 2016. Isolasi Bakteri Simbion  dengan  Spons  dari Perairan  Tongkeina , Sulawesi Utara . Jurnal  LPPM  Bidang Sains  dan  Teknologi . 1 ( 3 ) : 57- 65.
Widiastuti , H . N . 2003. Uji  Aktivitas Metabolit Sekunder dari Rumput Laut Halimeda macroloba sebagai  Senyawa Bioaktif  Antijamur Candida albicans dan Torula histolutica . Ilmu Kelautan . 8 ( 2 ) : 114-118.