## Validasi Metode Analisis LC-MS/MS Pada Penetapan Kadar Isoniazid  Dalam Serum Tikus

## Validation of Analytical Method LC MS/MS for Determination Isoniazid in Rats Serum
Andi Suhendi 1,2* , Abdul Rohman 3 , Djoko Wahyono 4 , Arief Nurrochmad 4 , Tasya F Manggo 2 1 Doctoral Student, Faculty of Pharmacy, University of Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia
2 Pharmaceutical Chemistry Department, Faculty of Pharmacy, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta, Indonesia
3 Pharmaceutical Chemistry Department, Faculty of Pharmacy, University of Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia
4 Pharmacology and Clinical Pharmacy Department, Faculty of Pharmacy, University of Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia *Corresponding author : abdulkimfar@gmail.com
Received: 1 Desember 2023; Accepted: 26 Desember 2023; Published: 30 Desember 2023

## Abstrak
Penetapan kadar isoniazid untuk therapeutic drug monitoring harus menghasilkan nilai yang valid, sehingga validasi metode analisis dengan LC-MS/MS perlu dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan parameter-parameter  validasi  metode  yaitu  akurasi,  presisi,  linieritas,  LOQ  dan  LOD.  Preparasi  sampel dilakukan  dengan  metode  ektraksi  cair-cair  menggunakan  asetonitril  dan  metanol  (2:1).  Sistem kromatografi dikembangkan dengan kolom C18 (ACQUITY UPLC® HSS T3 1,8 µm, 2,1 × 100 mm), fase gerak adalah asetonitril 70% dengan 0,1% asam format (A), air dengan 0,1% asam format (B), serta metanol (C) dengan laju alir 0,3 mL/menit, dengan gradient, deteksi dioperasikan  pada mode ESI+ dengan multiple reaction monitoring (MRM) pada transisi 138 m/z → 121 m/z. Hasil penelitian diperoleh bahwa metode akurat dengan % recovery  96% - 113% dan RSD 2,4 ± 0, 9%. Nilai presisi  diperoleh dengan rerata RSD 3,7 ± 2,4% untuk intra hari dan 4,1 ±  2,3% untuk antar hari. Linieritas menunjukkan hasil yang baik dengan nilai  koefisien  korelasi  sebesar  0,9956  pada  uji  dengan  5  konsentrasi  berbeda.  Nilai  LOQ  dan  LOD didapatkan  dari  persamaan  regresi  linier  berturut-turut  sebesar  0,1987  µg/mL  dan  0,0656  µg/mL.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  metode  analisis  LC-M/MS  valid  untuk  penetapan  kadar  isoniazid  dalam serum tikus.
Kata Kunci : Validasi, LCMS/MS, isoniazid, Multiple Reaction Monitoring (MRM), serum tikus

## Abstract
Determination of isoniazid concentration for therapeutic drug monitoring must  produce valid  values,  so validation of the analytical method of LC-MS/MS needs to be carried out. This research aims to obtain valid method of LCMS/MS in order to determination isoniazid in rats serum. Sample preparation was carried out using  the  liquid-liquid  extraction  method  using  acetonitrile  and  methanol  (2:1).  The  chromatography system was developed with a C18 column (ACQUITY UPLC® HSS T3 1.8 µm, 2.1 × 100 mm), the mobile phase was 70% acetonitrile with 0.1% formic acid (A), water with 0.1% formic acid (B), as well as methanol (C) with a flow rate of 0.3 mL/min, with gradient elution, detection in ESI+ mode with multiple reaction monitoring (MRM) at the transition 138 m/z → 121 m/z. The research results showed that the method was accurate with a % recovery of 96 - 113% and an RSD of 2.4 ± 0.9%. The precision value was obtained with an average RSD of 3.7 ± 2.4% for intra-day and 4.1 ± 2.3% for inter-day. Linearity showed good results with a correlation coefficient of 0.9956 in tests with 5 different concentrations. The LOQ and LOD values obtained  from  the  linear  regression  equation  were  0.1987  µg/mL  and  0.0656  µg/mL  respectively.  The results showed that the LC-M/MS method was valid for determining isoniazid levels in rat serum. Keywords: validation, LCMS/MS, isoniazid, Multiple Reaction Monitoring (MRM), rats serum

## PENDAHULUAN
Isoniazid  atau  dikenal  juga  sebagai  INH merupakan salah satu first line drug theraphy antituberkulosis  yang  paling  efektif  untuk mengatasi  penyakit  tuberculosis  (WHO, 2023). Namun, terdapat beberapa kasus telah dilaporkan mengenai pasien yang mengalami kegagalan terapi, kekambuhan, dan resistensi obat  selama  menjalani  terapi  (Chegou  et  al., 2011; Lei et al., 2019).  Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Pasipanodya et al., (2013), keberhasilan dalam terapi tuberkulosis dengan INH dipengaruhi oleh beberapa faktor, salah  satunya  adalah  konsentrasi  obat  dalam darah.  Beberapa  penelitian  lainnya  juga melaporkan  bahwa  konsentrasi  INH  dalam darah yang rendah tidak hanya menyebabkan kegagalan terapi dan kekambuhan, tetapi juga menyebabkan resistensi terhadap obat (Heysell  et  al.,  2010;  Prahl  et  al.,  2014). Berdasarkan  hal  tersebut,  pemantauan  kadar obat  diperlukan  untuk  menjamin  tercapainya tujuan  terapi  dan  meminimalkan  terjadinya kegagalan pengobatan dengan cara mengoptimalkan    konsentrasi  INH  (Alsultan and Peloquin, 2014; Babalik et al., 2011).
Penetapan  kadar  INH  penting  untuk menentukan bioavailabilitasnya, dengan  nilai kadar  puncak  (Cmax)  INH  berada  pada rentang 3–6 µg/mL sehingga dalam penentuannya diperlukan metode yang sensitif.  Penggunaan  INH  dalam  terapi tuberkulosis umumnya tersedia dalam bentuk fixed dose combination sehingga metode yang selektif  sangat  dibutuhkan  (Alsultan  and Peloquin,  2014;  Pratima  and  Gadikar,  2018; Vyas et al., 2022; Xing et al., 2021; Zheng et al., 2020).  Metode lain yang sering digunakan adalah HPLC-UV  (Jiang et al., 2022; Liu et al., 2013; Pouplin et al., 2016), namun metode ini tidak memiliki sensitivitas, selektivitas dan waktu yang cepat seperti LCMS .
Analisis dengan LC-MS/MS memberikan  keuntungan  karena  cakupan senyawa  yang    dianalisis  begitu  luas mencakup senyawa thermolabile dan senyawa dengan polaritas tinggi (Harmita et al., 2019).
Validasi  metode  analisis  penting  untuk memastikan  bahwa  metode  yang  digunakan sudah valid serta kesalahan yang kemungkinan  terjadi  dalam  proses  pengujian masih  dalam  batas  toleransi  (Bhagat  and Saudagar,  2019;  Vyas  et  al.,  2022).  Validasi metode analisis memiliki beberapa parameter seperti  presisi,  akurasi,  linieritas,  batas identifikasi dan batas kuantifikasi. Penelitian- penelitian  tersebut  menunjukkan  bahwa penetapan kadar obat dalam serum dan untuk studi farmakokinetik diperlukan metode yang tervalidasi.  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini ditujukan untuk menetapkan validitas metode analisis  LC-MS/MS  untuk  penetapan  kadar INH    dalam  serum  tikus  dengan  perolehan parameter-paremeter validasi metode analisis.

## METODE PENELITIAN Alat dan bahan
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah  LC-MS/MS  (Waters  Xevo  TQD) kolom  C18  (2,1  ×  100  mm,  1,8  µm) (ACQUITY UPLC® HSS T3).
Bahan  yang  digunakan  yaitu  isoniazid  (LKT Labs,  USA),  metanol  (LCMS  grade,  Tedia, USA), asetonitril (LCMS grade, Tedia, USA), Ultra  pure  water  (PT.  Kromtekindo),  asam format  (Pro  analytical,  Merck)  dan  serum blank  tikus  (Laboratorium  Farmakologi, Fakultas Farmasi UMS).

## Fase gerak
Fase Gerak;  fase gerak A: asetonitril  + asam format 0,%;  fase gerak B: air + asam format 0,1%,  dan  fase  gerak  C:  metanol.  Sistem gradient dengan variasi komposisi diatur pada 0-0,5; 0,5-1; 1-1,5; 3-4; dan 5-7 menit dengan laju alir 0,3 mL/menit ( Tabel 1 ).

## Setting MS (Mass Spectrometry
Electrospray  ionisation (ESI),  ESI+(positif), cappilary  cone 35 V, collision  energy 18 V dan dessolvation temperature 600ºC. Detektor
massa dilakukan dengan reaksi ganda (MRM) pada transisi 138 m/z → 121 m/z

## Pembuatan kurva baku
Kurva  baku  dibuat  menjadi  lima  tingkat dengan variasi konsentrasi berbeda yaitu 0,05; 0,1; 0,3; 0,5 dan 1 µg/mL. Preparasi dilakukan dengan diambil serum blank sejumlah 100 µL, larutan  standar  INH  100  µL  (dibuat  pada masing-masing  konsentrasi),  ditambahkan fase  geraknya  sampai  volume  1000  µL. Campuran  dihomogenisasi  dengan  vortek selama  20  detik.  Campuran  didiamkan  di dalam  freezer  selama  ±  5  menit,  untuk optimalisasi  pengendapan,  dan  disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipisahkan  dan  disaring  dengan  ukuran  0,2 µm, dan ditampung pada vial.

## Akurasi dan presisi
Pengukuran akurasi dilakukan dengan uji pada 5 titik konsentrasi yaitu 0,05; 0,1; 0,3; 0,5 dan 1,0 µg/mL. Setiap titik dilakukan replikasi sebanyak  3  kali.  Larutan  dibuat  dengan  cara seperti pada prosedur kurva baku. Penentuan akurasi  pada  tiap  konsentrasi  dilihat  dalam nilai  persen  perolehan  kembali  (%  recovery) dengan  nilai  keberterimaan  berada  dalam  ± 15%    dari  nilai  nominal  konsentrasi  (EMA, 2022; FDA, 2018).
Nilai presisi didapatkan dari uji dengan 3 variasi konsentrasi yaitu pada 0,05; 0,3; dan 1
µg/mL, yang direplikasi 3 kali dan dikerjakan pada 3 hari yang berbeda.  Presisi dinyatakan dalam relative standard deviation (RSD) dari sejumlah sampel yang diuji. Nilai keberterimaan  presisi  yaitu  RSD  ≤  15% (EMA, 2022; FDA, 2018).

## LOQ (limit of quantification)
Batas  kuantifikasi  atau  LOQ  merupakan nilai konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang  dapat  diidentifikasi  pada  kondisi operasional metode yang digunakan. Penentuan batas kuantifikasi dilakukan secara statistik dengan rumus :
LOQ =  10σ⁄S    …………………………(1) Keterangan: σ :  standar  deviasi  respon;  S  : kemiringan,  atau  nilai  slope  (b)  pada persamaan linieritas.
LOD (limit of detection)
Batas  deteksi    merupakan  konsentrasi terendah  analit  yang  masih  dapat  terdeteksi, namun  tidak  harus  terkuantisasi  (Harmita  et al.,  2019).  Batas  deteksi  analit  dihitung menggunakan rumus: LOD= 3,3σ⁄S    ………………………..(2).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Fase  gerak  asetonitril,  metanol  dan  air sangat  kompatibel  untuk  kolom  C18  karena bersifat  lebih  polar  daripada  fase  diam (Harmita  et  al.,  2019).  Pemisahan  dengan sistem  kromatografi  tersebut  menghasilkan
Tabel 1. Komposisi fase gerak (A), (B), dan (C) dengan sistem gradien
Waktu (menit) Laju alir (mL/menit) Fase gerak A (%) Fase gerak B (%) Fase gerak C (%) 0,50 0,300 2,0 95,0 3,0 1,00 0,300 30,0 25,0 45,0 1,50 0,300 27,0 17,0 56,0 3,00 0,300 32,0 3,0 65,0 4,00 0,300 1,0 97,0 2,0 5,00 0,300 2,0 97,0 1,0 7,00 0,300 2,0 97,0 1,0 Gambar 1. Kromaotgram isoniazid dalam serum, C18 (2,1 × 100 mm, 1,8 µm; HSS T3), air:methanol:asetonitril secara gradien, ESI+,
MRM pada transisi 138 m/z → 121 m/z
waktu  retensi  INH  terdeteksi  di  0,89  menit dengan  puncak  yang  tajam  ( Gambar  1 ). Asam format ditambahkan untuk mengoptimalkan proses ionisasi. Asam format
umum digunakan sebagai tambahan pada fase gerak  karena  menyediakan  proton  dengan menghasilkan  ion  [M + H] + dalam  mode ionisasi positif (Kafeenah et al., 2019).
Tipe  ionisasi  dan  kondisi  MS  yang memberikan respon sensitif dilakukan dengan nama  tunning.  Hasilnya  didapatkan  bahwa ionisasi  yang  memberikan  sensitivitas  yang tinggi yaitu ESI positif. Hal ini sejalan dengan penelitian-penelitian  sebelumnya,  dimana mode  ESI  yang  digunakan  adalah  ESI+ (Kumar et al., 2023; Luyen et al., 2018; Xing et al., 2021). Selain itu, kondisi yang penting saat  tunning  adalah  penentuan capilary  cone dan dessolvation temperature untuk mendapatkan parent ion serta collision energy untuk  mendapatkan daughter  ion .  Hasil
tunning  didapatkan  mode  ESI  pada  ESI  + (positif) , cappilary cone 35 V, collison energy 18  V  dan dessolvation  temperature 600ºC. Berdasarkan  struktur  INH,  terdapat  gugus
fungsional  amino  yang  mengandung  atom  N sehingga mudah menerima  ion H + (Luyen  et al., 2018).  Hasil  proses tunning  ( Gambar  2 ) didapatkan  parent  ion  yaitu  138  m/z  dan
daughter ion 121 m/z.
Sistem deteksi dilakukan dengan multiple reaction  monitoring (MRM)  karena  dapat bekerja  dengan  memantau  secara  bersamaan beberapa  ion  prekursor  atau  dikenal  juga dengan parent  ion ,  dengan  pemindaian  nilai rasio m/z yang cepat dan sesuai dengan obat, metabolitnya  ataupun  standar  internal  yang terdapat  dalam  sampel  penelitian  (Banerjee and  Mazumdar,  2012).  Pada  penelitian  ini, sistem MS beroperasi dengan triple quadrupole  analyzer ,  dimana quadrupole pertama (Q1) digunakan untuk memilih parent
Gambar 2. Hasil tunning parent ion (kiri) dan daughter ion (kanan) ESI+(positif), cappilary cone  35 V, collision energy 18 V dan dessolvation temperature 600ºC
Tabel 2. Nilai perhitungan uji akurasi isoniazid (n=3)
Kadar teoritik terukur (µg/mL) Rerata Kadar terukur (µg/mL) ± SD Perolehan kembali (%) ± SD RSD (%) 0,05 0,057 ± 0,001 113,0 ± 1,0 0,9 0,1 0,092 ± 0,002 96,3 ± 3,2 3,3 0,3 0,273 ± 0,016 99,7 ± 2,5 2,5 0,5 0,557 ± 0,027 99,7 ± 2,5 2,5 1,0 1,038 ± 0,131 99,7 ± 2,5 2,5
ion,  yang akan dipecah dalam sel tumbukan pada quadrupole kedua (Q2) atau cell collison sehingga  menghasilkan  ion  produk  atau daughter  ion. Quadrupole ketiga  (Q3)  untuk dianalisis  massa  (Pitt,  2009).  Beberapa penelitian  sebelumnya  yang  menggunakan mode ionisasi positif juga menunjukkan hasil deteksi parent  ion INH  pada  138  m/z  dan daughter ion pada 121 m/z (Daher et al., 2015; Hee et al., 2015; Luyen et al., 2018). Gambar 3 , menggambarkan pola fragmentasi senyawa INH yaitu, ion produk INH yang teramati pada 121 m/z karena hilangnya NH 3 netral dan 79 m/z  akibat  hilangnya    CONH 2 (Felipe  et  al., 2017).

## Hasil preparasi sampel
Ekstraksi  analit  dalam  sampel  bisa dilakukan  dengan  bantuan  SPE  ( Solid  Phase Extraction ) ataupun ekstraksi cair-cair (Hansen  et  al.,  2020).    Preparasi  dengan ekstraksi  cair-cair  menggunakan  pelarut organik  maka  protein  dalam  sampel  serum akan  mengalami  denaturasi.  Secara  umum proses  denaturasi  bisa  terjadi  karena  adanya perubahan  pH,  temperatur,  dan  penambahan senyawa  organik,  umumnya  etanol,  metanol dan asetonitril (Harmita et al., 2019). Pelarut organik  yang  digunakan  pada  penelitian  ini yaitu  metanol  dan  asetonitril.  Kelebihan asetonitril  yaitu  menghasilkan  presentasi pengendapan  tertinggi  dengan  rasio  volume terhadap plasma terendah. Namun, asetonitril dapat  menghasilkan  supernatant  yang  keruh atau  agak  gelap  dan  recovery  yang  kurang baik, sehingga dikombinasikan dengan
metanol, dimana metanol dapat menghasilkan supernatant  yang  lebih  jernih,  dan  hasil recovery yang baik (Harmita et al., 2019; Kay et al., 2008).

## Uji Linieritas
Linieritas  menunjukkan  bahwa  hasil pengukuran  data  bahan  uji  berbanding  lurus dengan  respon  metode.  Linieritas  ( Tabel 2) dinyatakan  dengan  kurva  kalibrasi  yang menghubungkan  antara  respon  (y)  dengan konsentrasi  (x).  Hasil  didapatkan  persamaan garis    y  =  47424x–1049,8  dengan  koefisien korelasi adalah r2= 0,9956 ( Gambar 4 ). Hasil ini  telah  memenuhi  persyaratan  untuk  nilai linearitas yaitu ≥ 0,98.

## Uji Akurasi
Akurasi atau ketepatan adalah kedekatan antara  nilai  yang  terukur  dengan  nilai sebenarnya,  yang  dinyatakan  dalam  % recovery. Nilai keberterimaan akurasi berada dalam rentang 85% - 115% atau ± 15%  dari nilai nominal (EMA, 2022; FDA, 2018). Hasil perhitungan  %  recovery  ( Tabel  2 )  diperoleh pada rentang 96-113% dan RSD 2,4%. Hasil
Tabel 3. Nilai perhitungan presisi intra hari isoniazid (n=3) Kadar teoritik (µg/mL ) Rerata Kadar terukur (µg/mL) RSD (%) 0,05 0,057 ± 0,010 1,83 0,10 0,092 ± 0,002 1,69 0,30 0,273 ± 0,016 5,96 0,50 0,540 ± 0,035 6,53 1,00 0,990 ± 0,025 2,47 Rerata RSD ± SD 3,7 ± 2,4
Tabel 4. Nilai perhitungan uji presisi antar hari  isoniazid Hari-1 Hari-2 Kadar teoritik (µg/mL) Rerata Kadar terukur (µg/mL) RSD (%) Rerata Kadar terukur (µg/mL ) RSD (%) 0,05 0,051 ± 0,003 5,53 0,052 ± 0,002 2,61 0,10 0,087 ± 0,004 4,30 0,095 ± 0,002 2,83 0,30 0,302 ± 0,026 8,53 0,304 ± 0,007 2,16 0,50 0,518 ± 0,017 3,21 0,480 ± 0,016 3,37 1,00 0,991 ± 0,069 6,94 1,009 ± 0,015 1,53 5,7 ± 2,1 2,5 ± 0,7
ini telah menunjukan bahwa uji akurasi telah memenuhi persyaratan yang ditentukan.

## Presisi intra dan antar hari
Presisi menyatakan nilai kedekatan antara serangkaian  pengukuran  yang  diperoleh  dari seri  sampel  yang  dianalisis.  Nilai  yang disyaratkan untuk presisi yaitu < 15%  (EMA, 2022;  FDA,  2018).  Hasil  uji  didapatkan %RSD  presisi  intra  dan  inter-hari  berturut- turut sebesar 3,7% dan 4,1% ( Tabel 3 dan 4 ).
Hasil  uji  menunjukkan  presisi  yang baik kerena telah memenuhi syarat keberterimaan  %  RSD  dimana  nilai  yang diperoleh berada di bawah 15%.

## LOQ dan LOD
Batas  kuantifikasi  merupakan  nilai konsentrasi analit terkecil dalam sampel yang dapat  diidentifikasi  pada  kondisi  operasional untuk  mendapatkan  nilai  presisi  dan  akurasi yang baik. Batas deteksi merupakan parameter yang menunjukkan konsentrasi terendah analit yang dapat terdeteksi di dalam sampel, namun tidak harus terkuantitasi. Hasil perolehan nilai batas  kuantifikasi  dan  batas  deteksi  berturut- turut yaitu 0,1987 µg/mL dan 0,0656 µg/mL ( Tabel 5 ).

## KESIMPULAN
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa metode analisis LC-MS/MS untuk penetapan kadar  isoniazid  dalam  serum  tikus  adalah valid.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  Lembaga  Pengelola Dana Pendidikan (LPDP) atas beasiswa studi pada Program Doktor Ilmu farmasi, Fakultas Farmasi UGM.

## Daftar Pustaka (References)
Alsultan,  A.,  Peloquin,  C.A.,  2014.  Therapeutic  Drug  Monitoring  in  the  Treatment  of Tuberculosis: An Update. Drugs 74, 839–854. https://doi.org/10.1007/s40265-014-0222- 8
Babalik, A., Mannix, S., Francis, D., Menzies, D., 2011. Therapeutic Drug Monitoring in the Treatment of Active Tuberculosis. Can. Respir. J. 18, 225–229. https://doi.org/10.1155/2011/307150
Banerjee, S., Mazumdar, S., 2012. Electrospray ionization mass spectrometry: a technique to access the information beyond the molecular weight of the analyte. Int. J. Anal. Chem. 2012, 282574. https://doi.org/10.1155/2012/282574
Bhagat,  R.,  Saudagar,  R.B.,  2019.  A  Review  on  Analytical  method  Development  and Validation. J. Drug Deliv. Ther. 9, 1064–1067. https://doi.org/10.22270/jddt.v9i3-s.2957
Chegou,  N.N.,  Hoek,  K.G.P.,  Kriel,  M.,  Warren,  R.M.,  Victor,  T.C.,  Walzl,  G.,  2011. Tuberculosis assays: past, present and future. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 9, 457–469. https://doi.org/10.1586/eri.11.23
Daher, A., Pitta, L., Santos, T., Barreira, D., Pinto, D., 2015. Using a single tablet daily to treat latent  tuberculosis  infection  in  Brazil:  Bioequivalence  of  two  different  isoniazid formulations  (300  mg  and  100  mg)  demonstrated  by  a  sensitive  and  rapid  high-
Tabel 5. Data hasil uji batas kuantifikasi dan
batas deteksi Parameter Nilai Simpangan baku residual (SD) 942,625 Slope persamaan regresi (b) 47424 Limit kuantifikasi (LOQ) 0,1987 µg/mL Limit deteksi (LOD) 0,0656 µg/mL
performance  liquid  chromatography-tandem  mass  spectrometry  .  Mem.  Inst.  Oswaldo Cruz 110, 543–550. https://doi.org/10.1590/0074-02760140458
EMA, 2022. ICH guideline M10 on bioanalytical method validation and study sample analysis.
FDA, 2018. Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry.
Felipe, G., Regina, H., Salgado, N., Leandro, J., 2017. Isoniazid : A Review of Characteristics ,  Properties  and  Analytical  Methods.  Crit.  Rev.  Anal.  Chem.  47,  298–308. https://doi.org/10.1080/10408347.2017.1281098
Hansen, F., Øiestad, E.L., Pedersen-Bjergaard, S., 2020. Bioanalysis of pharmaceuticals using liquid-phase microextraction combined with liquid chromatography–mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 189, 113446. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113446
Harmita,  K.,  Harahap,  Y.,  Supandi,  2019.  Liquid  Chromatography-Thandem  Mass Spectrometry (LC-MS/MS). ISFI Penerbit, Jakarta.
Hee, K.H., Seo, J.J., Lee, L.S., 2015. Development and validation of liquid chromatography tandem  mass  spectrometry  method  for  simultaneous  quantification  of  first  line tuberculosis  drugs and metabolites in  human plasma and its application in  c. J. Pharm. Biomed. Anal. 102, 253–260. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2014.09.019
Heysell, S.K., Moore, J.L., Keller, S.J., Houpt, E.R., 2010. Therapeutic Drug Monitoring for Slow  Response  to  Tuberculosis  Treatment  in  a  State  Control  Program,  Virginia,  USA. Emerg. Infect. Dis. 16, 1546–1553. https://doi.org/10.3201/eid1610.100374
Jiang, Z., Huang, L., Zhang, L., Yu, Q., Lin, Y., Fei, H., Shen, H., Huang, H., 2022. A Simple and  Sensitive  UPLC–UV  Method  for  Simultaneous  Determination  of  Isoniazid, Pyrazinamide, and Rifampicin in Human Plasma and Its Application in Therapeutic Drug Monitoring. Front. Mol. Biosci. 9. https://doi.org/10.3389/fmolb.2022.873311
Kafeenah,  H.I.S.,  Osman,  R.,  Bakar,  N.K.A.,  2019.  Effect  of  Mobile  Phase  pH  on  the Electrospray Ionization Efficiency and Qualitative Analysis of Pharmaceuticals in ESI + LC-MS/MS. J. Chromatogr. Sci. 57, 847–854. https://doi.org/10.1093/chromsci/bmz061
Kay, R., Barton, C., Ratcliffe, L., Matharoo-Ball, B., Brown, P., Roberts, J., Teale, P., Creaser, C.,  2008.  Enrichment  of  low  molecular  weight  serum  proteins  using  acetonitrile precipitation  for  mass  spectrometry  based  proteomic  analysis.  Rapid  Commun.  Mass Spectrom. RCM 22, 3255–3260. https://doi.org/10.1002/rcm.3729
Kumar, L.M.S., Azeemuddin, M.M., Routhu, K.C., Priya, K., Babu, U.V., Pai, S.R., 2023. A validated LC-MS/MS method for simultaneous quantification of antitubercular drugs in rat plasma and its application for a pharmacokinetic interaction study with Immusante®. J. Appl. Pharm. Sci. 13, 151–158. https://doi.org/10.7324/JAPS.2023.118956
Lei,  Q.,  Wang,  Hao,  Zhao,  Y.,  Dang,  L.,  Zhu,  C.,  Lv,  X.,  Wang,  Hui,  Zhou,  J.,  2019. Determinants  of  serum  concentration  of  first-line  anti-tuberculosis  drugs  from  China. Medicine (Baltimore) 98, e17523. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000017523
Liu, P., Fu, Z., Jiang, J., Yuan, L., Lin, Z., 2013. Determination of isoniazid concentration in rabbit  vertebrae  by  isotope  tracing  technique  in  conjunction  with  HPLC.  Biomed. Chromatogr. 27, 1150–1156. https://doi.org/10.1002/bmc.2920
Luyen, L.T., Hung, T.M., Huyen, L.T., Tuan, L.A., Huong, D.T.L., Duc, H.V., Tung, B.T., 2018. Simultaneous Determination of Pyrazinamide, Rifampicin, Ethambutol, Isoniazid
and Acetyl Isoniazid in Human Plasma by LC-MS/MS Method. J. Appl. Pharm. Sci. 8, 061–073. https://doi.org/10.7324/JAPS.2018.8910
Pasipanodya, J.G., McIlleron, H., Burger, A., Wash, P.A., Smith, P., Gumbo, T., 2013. Serum Drug Concentrations Predictive of Pulmonary Tuberculosis Outcomes. J. Infect. Dis. 208, 1464–1473. https://doi.org/10.1093/infdis/jit352
Pitt,  J.J.,  2009.  Principles  and  applications  of  liquid  chromatography-mass  spectrometry  in clinical biochemistry. Clin. Biochem.
Rev. 30, 19–34.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19224008
Pouplin,  T.,  Bang,  N.D.,  Toi,  P.V.,  Phuong,  P.N.,  Dung,  N.H.,  Duong,  T.N.,  Caws,  M., Thwaites, G.E., Tarning, J., Day, J.N., 2016. Naïve-pooled pharmacokinetic analysis of pyrazinamide, isoniazid and rifampicin in plasma and cerebrospinal fluid of Vietnamese children with tuberculous meningitis. BMC Infect. Dis. 16, 144. https://doi.org/10.1186/s12879-016-1470-x
Prahl, J.B., Johansen, I.S., Cohen, A.S., Frimodt-Møller, N., Andersen, Å.B., 2014. Clinical significance  of  2  h  plasma  concentrations  of  first-line  anti-tuberculosis  drugs:  a prospective  observational  study.  J.  Antimicrob.  Chemother.  69,  2841–2847. https://doi.org/10.1093/jac/dku210
Pratima,  N.A.,  Gadikar,  R.,  2018.  Liquid  Chromatography-Mass  Spectrometry  and  Its Applications:  A  Brief  Review.  Arch.  Org.  Inorg.  Chem.  Sci.  1,  001–009. http://dx.doi.org/10.32474/AOICS.2018.01.000103
Vyas, A.K.J., Mishra, S.B., Patel, A.B., Patel, N.K., Shah, S.R., Sheth, D.B., 2022. A Brief Review  on  Liquid  Chromatography-  Mass  Spectrometry/LCMS  and  its  Application. Asian J. Pharm. Anal. 12, 203–210. https://doi.org/10.52711/2231-5675.2022.00034
WHO, World Health Organization., 2023. Global Tuberculosis Report 2023. WHO.
Xing, Y., Yin, L., Le, X., Chen, J., Zhang, Lin, Li, Y., Lu, H., Zhang, Lijun, 2021. Simultaneous determination  of  first-line  anti-tuberculosis  drugs  and  one  metabolite  of  isoniazid  by liquid  chromatography/tandem  mass  spectrometry  in  patients  with  human immunodeficiency virus-tuberculosis coinfection. Heliyon 7, 1–11. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07532
Zheng, Y., Xu, N., Hu, X., Zhang, Q., Liu, Y., Zhao, Q., 2020. Development and Application of  a  LC-MS/MS  Method  for  Simultaneous  Quantification  of  Four  First-Line Antituberculosis  Drugs  in  Human  Serum.  J.  Anal.  Methods  Chem.  2020,  1–10. https://doi.org/10.1155/2020/8838219