Tersedia online di http://journal.ipb.ac.id/index.php/jhi

## Analisis Cluster dan Seleksi Primer SSR (Simple Sequence

## Repeats) untuk Sifat Toleran Aluminium pada Cabai
Cluster Analysis and SSR (Simple Sequence Repeats) Primers Selection for Aluminium Tolerance on Hot Pepper
Catur Herison 1 *, Rustikawati 2 , Ria Meita 3 , dan Hasanudin 4
Diterima 10 Desember 2018/Disetujui 07 Januari 2020

## ABSTRACT
High yielding and Al tolerant variety of hot pepper is one of the best solutions to overcome the problem of low hot pepper production on acidic dry land. The identification of tolerant parents and SSR markers are useful in increasing the effectiveness of plant breeding programs to develop varieties tolerance to aluminum stress. SSR primer selection is an important initial step in development of molecular markers. The objective of this study was to determine aluminum tolerant genotypes based on the similarity of tolerance to aluminum stress and to determine SSR primers feasible in developing markers for tolerance to aluminum stress in hot pepper  plants.  The  experiment  was  conducted  to  evaluate  the  tolerance  of  27  hot  pepper  genotypes  to aluminum  stress  employing a  wick system hydroponic with  AB mix nutrient  supplemented with 500 ppm AlCl 3 .6H 2 O. The next step is to evaluate 20 SSR primers in amplifying representative tolerant and sensitive DNA genome. The cluster analysis on the tolerance characteristics of 27 hot pepper genotypes resulted in 7 groups of aluminum tolerance. Genotypes of PBC396 and PBC518 were very tolerant to aluminum stress and were unique so that they were the most prospective parents in the development of aluminum tolerant cultivars. SSR primers of TMS7 and CAMS358 were potential to produce polymorphic markers for tolerance to aluminum stress in hot pepper. The primers must then be further tested on the DNA genome of mapping population to determine the ones which can be used as a marker for aluminium tolerance.
Keywords: Capsicum annuum, NTSYS, grouping assessment, adaptive to acidic

## ABSTRAK
Perakitan  varietas  unggul  cabai  merah  toleran  Al  (Aluminium)  merupakan  solusi  terbaik  untuk mengatasi persoalan rendahnya produkvitas cabai di lahan kering masam. Identifikasi tetua toleran dan marka SSR  ( Simple  Sequence  Repeats )  sangat  bermanfaat  dalam  meningkatkan  efektifitas  program  pemuliaan tanaman untuk merakit varietas toleran terhadap cekaman aluminium. Seleksi primer SSR adalah bagian awal yang  penting  dalam  pengembangan  marka  molekuler  tersebut.  Penelitian  bertujuan  untuk  menentukan kelompok genotipe toleran alumunium dan menentukan primer prospektif dalam pengembangan marka SSR untuk sifat toleran terhadap Al pada tanaman cabai. Evaluasi tingkat toleransi 27 genotipe cabai terhadap cekaman  aluminium  dilakukan  menggunakan  hidroponik  sistem  sumbu  dengan  larutan  hara  AB  mix ditambah 500 ppm AlCl 3 .6H 2 O. Tahap selanjutnya adalah menguji 20 primer SSR dalam mengamplifikasi DNA genom cabai toleran dan peka yang mewakili. Hasil analisis cluster sifat toleransi terhadap 27 genotipe cabai menghasilkan 7 kelompok tingkat toleransi terhadap aluminium. Individu PBC396 dan PBC518 adalah genotipe  yang  sangat  toleran  terhadap  cekaman  aluminium  yang  unik  sehingga  keduanya  sangat  baik digunakan  sebagai  tetua  dalam  pengembangan  cabai  toleran  aluminium.  Primer  SSR  yang  potensial menghasilkan marka polimorfik untuk sifat toleran terhadap cekaman aluminium pada cabai adalah TMS7 dan CAMS358. Primer tersebut selanjutnya harus diuji pada mapping population untuk menentukan pita yang dapat digunakan sebagai penanda toleransi terhadap aluminium.
Kata kunci: Capsicum annuum , NTSYS, sidik gerombol, tenggang masam
1 Fakultas Pertanian, Universitas Bengkulu Jl. WR Supratman, Kandang Limun, Bengkulu 38371 E-mail : catur_herison@unib.ac.id (*penulis korespondensi)

## PENDAHULUAN
Semakin  berkurangnya  lahan  subur, sekarang  ini  lahan  sub-optimal  bercekaman menjadi alternatif untuk meningkatkan produksi berbagai jenis tanaman. Lahan kering marginal  di  Indonesia  didominasi  oleh  tanah asam,  terutama  jenis  tanah  Ultisol,  yang menyumbang  sekitar  25%  dan  hampir  48  000 000  ha  (Prasetyo  dan  Suriadikarta,  2006). Ultisol  ditandai  oleh  tingkat  keasaman  tanah yang  tinggi,  Al + yang  tinggi  dan  ketersediaan nutrisi  P  yang  rendah,  bahan  organik  yang rendah,  dan  secara  keseluruhan  tingkat kesuburannya rendah (Ifansyah, 2014). Kelarutan ion aluminium di dalam tanah yang tinggi  menyebabkan  tanaman  tidak  dapat tumbuh dengan baik.
Cekaman  aluminium  pada  berbagai tanaman menghambat pertumbuhan dan mengganggu  produktivitas.  Pada  tanaman cabai,  produktivitas  tanaman  di  lahan  masam ultisol jauh lebih rendah dibandingkan dengan di  lahan  andosol  (Herison et  al. ,  2017).  Oleh karena  itu,  untuk  mendapatkan  produksi  yang tinggi  pada  tanah  masam  dibutuhkan  aplikasi bahan pembenah tanah (Choudhary dan Kumar, 2015; Putri, 2016; Hartatik dan Purwani, 2017; Lestari et  al. ,  2017).  Cekaman  aluminium secara efektif dapat dikurangi melalui peningkatan  pH  tanah  dengan  aplikasi  kapur (Bhargavaramireddy  dan  Subramanian,  2016). Namun  demikian,  aplikasi  kapur  untuk menyeimbangkan pH tanah secara teknis tidak mudah  dan  tidak  ekonomis  terutama  pada wilayah  yang  jauh  dari  sumber  kapur.  Oleh karena  itu,  penelitian  yang  berfokus  pada peningkatan sifat genetik tanaman untuk toleran terhadap cekaman aluminium sangat dibutuhkan. Program  pemuliaan  untuk  merakit varietas toleran cekaman alumunium memerlukan  informasi  genetika  toleransi terhadap aluminium dan tetua toleran. Toleransi terhadap  alumunium  dikendalikan  secara kuantitatif  (Abate et  al. ,  2013)  yang  berarti terdapat  banyak  gen  yang  berkontribusi terhadap  sifat  toleransi  tersebut.  Gen-gen pengendali  sifat  toleran  tersebut  kemungkinan terdapat  pada  tetua-tetua  yang  berbeda. Pemilihan tetua-tetua yang memiliki kekerabatan  genetik  yang  jauh  dibutuhkan untuk mengumpulkan sifat yang berbeda dari berbagai tetua (Zhu et al ., 2015).
Karakter  genotipe  toleran  atau  peka secara fenotipik sangat dipengaruhi lingkungan. Di sisi lain, karakterisasi molekuler lebih akurat karena dapat dapat mengidentifikasi perbedaan pada  tingkat  lokus.  Salah  satu  penanda molekuler  yang  sering  digunakan  dalam pemuliaan  tanaman  adalah Simple  Sequence Repeats (SSR).  SSR  adalah  sekuen  berulang DNA  yang  mewakili  bagian  signifikan  dari genom eukariot dan dapat menyajikan penanda genetik yang dapat mendeteksi perbedaan antar genotipe.  SSR  dapat  dikerjakan  relatif  cepat, sederhana, bersifat polimorfik, kodominan dan stabil (Swapna dan Srivastava, 2012). SSR telah digunakan  untuk  mempelajari  variasi  dan karakteristik genotipe dalam program pemuliaan  tanaman  padi  (Prabakaran et  al. , 2010; Sajib et al. , 2012); gandum (Sehgal et al. ,
2012) dan buncis (Silva et al. , 2003). SSR juga telah  terbukti  dapat  mendeteksi  ketahanan tanaman  tomat  terhadap  penyakit  layu Fusarium (Parmar et al. , 2013), dan ketahanan terhadap  penyakit  blas  pada  tanaman  padi (Ashkani et al., 2011).
Studi  terdahulu  terkait  kekerabatan genetik pada umumnya dilakukan menggunakan  karakter  morfologi  dan  marka molekuler SSR  (Agyare et al ., 2016; Baba et al ., 2016; Carvalho et al ., 2017; Herison et al .,
2018;    Sharmin et  al .,  2018).  Namun  sangat sedikit informasi penggunaan karakter toleransi  terhadap  aluminium  dalam  studi kekerabatan  genetik.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mengelompokkan  genotipe-genotipe berdasarkan  kemiripan  sifat  toleransi  terhadap cekaman  aluminium  dan  menentukan  primer SSR  yang  layak  untuk  pengembangan  marka molekuler  yang dapat  mendeteksi sifat  toleran cekaman aluminium pada cabai merah.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  dilakukan  di  rumah  kaca Jurusan Budidaya Pertanian Fakultas Pertanian,  Universitas Bengkulu, dan analisis molekuler di Laboratorium Agronomi, Fakultas Pertanian dan Laboratorium Molekuler  Fakultas  Kedokteran,  Universitas Bengkulu. Penelitian dimulai bulan September 2017 sampai April 2018.

## Assay Cekaman Aluminium
Media  tanam  yang  digunakan  adalah pasir  kali  yang  dicuci  bersih,  kemudian dimasukkan  ke  dalam  bak  media  yang  diberi sumbu  kapiler  yang  dihubungkan  dengan  bak penampung larutan hara ( Wick system hydroponic ) (Kuntz, 2013). Bak media maupun bak  penampung  larutan  hara  berbentuk  persegi panjang dengan ukuran lebar 30 cm, panjang 50 cm  dan  tinggi  20  cm.  Bak  media  diletakkan  di atas bak penampung  larutan  hara.  Larutan hara yang  digunakan  dari  larutan  AB mix .  Sebagai kontrol  adalah  perlakuan  tanpa  penambahan aluminium ke dalam media dan pH dipertahankan pada 6.0-6.5. Perlakuan cekaman dilakukan  dengan  menambahkan  500  ppm AlCl 3 .6H 2 O  ke  dalam  larutan  hara,  mengikuti metode Dalimunthe et al. (2015), dan pH larutan dipertahankan  pada  4.0-4.5.  Media  tanaman yang  digunakan  berupa  pasir  kali  yang  telah dicuci bersih.
Benih  dikecambahkan  dalam  media kertas  lembab  hingga  muncul  radikula, kemudian ditanam di nampan pembibitan hingga tumbuh kotiledon. Kecambah kemudian dipindah-tanam pada bak media dengan jarak 5 cm  x  5  cm.  Pengaturan  pH  larutan  dilakukan dengan  menambahkan  0.1  M  HCl  atau  0.1  M NaOH  sesuai  keperluan.  Pengaturan  pH dilakukan  setiap  dua  hari  sekali.  Larutan  hara diganti  setiap  lima  hari  sekali.  Ketika  berumur empat minggu, seluruh tanaman dicabut dengan cara menyemprotkan air ke dalam media tanam hingga  akar  tanaman  dapat  diangkat  tanpa kerusakan.

## Penentuan  Indeks  Toleransi  terhadap Cekaman (ITC)
Dua  puluh  tujuh  genotipe  cabai  yang diuji  meliputi:  Tanaka  Tsung  (TS),  PBC155,
PBC622, PBC402, PBC518, PBC396, PBC401,  Keriting  Hitam  (KH),  Laris,  Hot Pepper  (HP),  PBC157,  PBC621,  PBC266, PBC592, PBC140, PBC146, PBC067, Kopay, Romario,  Ferosa,  Mario,  Lokal  Payakumbuh (LPK), Sempurna, Bogota, PBC398, PBC137, dan PBC521. Jumlah tanaman uji tiap genotipe adalah  15  tanaman.  Nilai  rata-rata  setiap variabel  digunakan  untuk  menentukan stress tolerance  index (STI)  atau  indeks  toleransi terhadap  cekaman  (ITC).  Variabel  yang
diamati  meliputi  tinggi  tanaman,  diameter batang,  panjang  akar,  volume  akar,  bobot segar  akar,  bobot  kering  akar,  bobot  segar tanaman,  bobot  kering  tanaman.  Penentuan ITC dilakukan menggunakan rumus sebagaimana  dalam  penelitian  El-Hashash et al. (2018).
ITC = (Y n *Y c )/(Y n 2 )
di mana ITC, Y n , dan Y c berturut-turut adalah indeks  toleransi  terhadap  cekaman,  nilai pengamatan  pada  kondisi  tidak  tercekam (kontrol)  dan  nilai  pengamatan  pada  kondisi tercekam. Nilai indeks toleransi pada masing- masing  peubah  selanjutnya  dibagi  menjadi  5 kelas  secara  proporsional  untuk  menentukan sub karakter tingkat toleransi, yaitu ST= sagat toleran,  T  =  toleran,  AT  =  agak  toleran,  P  = peka dan  SP  =  sangat  peka.  Dari  11  karakter yang  diamati  diperoleh  55  sub  karakter. Analisis  data  yang  dilakukan  adalah  analisis cluster berdasarkan  UPGMA  ( Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean ).

## Analisis SSR
Analisis  SSR  dilakukan  terhadap  DNA cabai yang mewakili kelompok toleran dan peka hasil  analisis cluster .  Data  pita  DNA  yang diperoleh dari amplifikasi setiap genom genotipe terpilih  ditabulasi  sebagai fingerprint data individu.  Analisis  data  dilakukan  secara kualitatif dengan melihat polimorfisme pita SSR yang diperoleh pada setiap genotipe.
Isolasi  DNA  menggunakan  metode CTAB  suhu  rendah  melalui  dua  kali pemurnian  DNA  genom  mengikuti  prosedur Herison et  al. (2012)  dengan  modifikasi penambahan PVP ( polyvinylpyrrolidone ) dalam  proses  penggerusan  sampel  untuk menghilangkan  senyawa  fenol  (Kumar et  al ., 2015).  Amplifikasi  mengunakan  20  primer SSR  yang  terbukti  dapat  mengamplifikasi genom  Solanaceae  (Parmar et  al. ,  2013; Haquarsum,  2016)  (Tabel  1).  Tahapan  PCR dan  visualisasi  hasil  elektroforesis  mengikuti Haquarsum (2016).  PCR dilakukan dalam 20 µL  campuran  reaksi  yang  mengandung  4  µL Buffer , 0.4 µL MgCl 2 , 0.4 µL dNTP, 0.08 µL KAPA 2G, 5.12 µL aquabides, 5 µL DNA, dan 5 µL primer SSR.
Tabel 1. Daftar primer SSR yang digunakan, urutan basa dan suhu annealing-nya No Marka SSR Repeat Sequence Urutan Nukleotida Ta ( 0 C) 1 TMS1 (AT)8(GT)16 F: CGCTCCCTTTTTGAATTGAG R: TTGCTGTTGTGGTTTTCGAT 59.1 2 TMS2 (GT)41 (TA)6 (CT)9 F: TCTTTCATTTCATGTCACGA R: AGGAGACCTTATGATTCAAGG 54.7 3 TMS4 (CT)12 (GATA)12 ATAT (AC)10 F: CGATTAGAGAATGTCCCACAG R: TTACACATACAAATATACATAGTCTG 49.7 4 TMS6 (GATA)45 F: CTCTCTCAATGTTTGTCTTTC R: GCAAGGTAGGTAGCTAGGGA 57.5 5 TMS7 (TA)31 (GATA)13 F: ACAAACTCAAGATAAGTAAGAGC R: GTGAATTGTGTTTTAACATGG 57.2 6 TMS8 (GATA)87 F: GCGCACCCAAAGTTGAAG R: CCTCATAGGGACGCACATAC 58.0 7 TMS9 (GATA)24 F: TTGGTAATTTATGTTCGGGA R: TTGAGCCAATTGATTAATAAGTT 54.3 8 TMS17 (GATA)24 (AT)8 (GT)25 F: AATGTAACAACGTGTCATGATTC R: AAGTCACAAACTAAGTTAGGG 50.2 9 SSR-67 (AGA)2 (AAG)7 F: GCACGAGACCAAGCAGATTA R: GGGCCTTTCCTCCAGTAGAC 59.0 10 Tom-144 (TAT)15 (TGT)4 F: CTGTTTACTTCAAGAAGGCTG R: ACTTTAACTTTATTATTGCGACG 54.1 11 CAMS 024 (TG)14TT(TG)3 F: TGTTGAGGCTTGGGAAAAAC R: CAAGATAATGGGTAGAAAGGCAAC 55.0 12 CAMS 117 (TG)21(TA)3 F: TTGTGGAGGAAACAAGCAAA R: CCTCAGCCCAGGAGACATAA 55.0 13 CAMS 191 (AC)10A(TA)4 F: CCCGAATCCAAGTCATTGAG R: TAAATCCGGTTCCCTTTCCT 55.0 14 CAMS 207-2 (AC)4AT(AC)8(AT)3 F: CTCACGAGCCACTTGAACAC R: GCCTTGTTTCCTATCCCAAC 55.0 15 CAMS 358 (TG)7 F: GACCCTTCTCCCCTTTTTCTT R: CACATGGACGGATCCTTTTT 55.0 16 CAMS 309 (GA)12 F: GAAAATCGACCCGTTTTGAA R: TCAATTCGGACAAAATTAGCAA 51.0 17 CACCEL1 i (AT)16 F: CTCTAATAGGCAATAGCTCACATGC R: GCAGTCTCCCAGAACGTTGTCC 51.0 18 SLM6 49 TA)24 F: ATTGATGGATTGGCGTTCTC R: AAAATCAGGGGTGAATTTAACG 51.0 19 CM 0011 (AC)5(TA)8 F: TCTGCTTTAAAAACACATACAT R: CATTCTTAACTGAAATTGCATG 51.0 20 CA 514272 (CCG)6 F: ATCTATTTTCCTCCGGCGAC R: CGGTAAGCTGCCTTGATCTC 51.0
Keterangan: F= forward , R= reverse.
Tahapan  PCR  meliputi  pre  denaturasi pada suhu 94 0 C selama 5 menit, 45 kali siklus yang  terdiri:  denaturasi  pada  suhu  94 0 C selama  55  detik, annealing pada  suhu  sesuai primer  selama  30  detik,  dan  elongasi  pada suhu  72 0 C  selama  1  menit,  dan  terakhir berupa  elongasi  akhir  selama  10  menit  pada suhu 72 0 C. Hasil amplifikasi dielektroforesis horizontal  menggunakan agarose 1.5%  dan buffer TAE  0.5%  dengan  tegangan  90  volt selama  50  menit.  Pewarnaan  dilakukan menggunakan ethidium bromide dan visualisasi menggunakan UV transluminator .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Toleransi  terhadap  Cekaman  Alumunium pada Cabai
Hasil  penghitungan  indeks  toleransi terhadap  cekaman  (ITC)  pada  setiap  peubah menunjukkan bahwa dalam 27 genotipe yang diuji  terdapat  variasi  tingkat  toleransi  yang cukup  tinggi  berkisar  antara  15.0%  -  81.8% (Tabel  2).  Variasi  tingkat  toleransi  yang termasuk  dalam  kelompok  rendah  diperoleh pada  peubah  tinggi  tanaman,  jumlah  daun, kehijauan daun, diameter batang dan panjang akar.  Variasi  sedang  diperoleh  pada  peubah
volume akar dan luas daun. Variasi yang tinggi diperoleh  pada bobot  segar  akar,  bobot  segar tajuk,  dan  bobot  segar  tanaman.  Sedangkan variasi  yang  sangat  tinggi  diperoleh  pada bobot kering tanaman.
Nilai  indeks  toleransi  pada  setiap peubah  yang  diamati  juga  menggambarkan bersarnya penurunan hasil pengamatan akibat cekaman alumunium. Tinggi tanaman mengalami penurunan akibat cekaman aluminium berkisar dari 46% (IT=0.54) hingga 72% (IT=0.28). Penurunan yang paling tinggi terlihat pada genotipe Bogota dan yang paling rendah pada Tanaka Tsung. Berdasarkan pada peubah  jumlah  daun,  Lokal  Payakumbuh dengan penurunan jumlah daun terendah yaitu hanya  16%  (IT=0.84),  sedangkan  genotipe PBC402  adalah  yang  paling  peka  karena penurunan jumlah daun berkurang hingga 58% IT=0.42).
Pada  beberapa  genotipe,  cekaman aluminium ternyata menyebabkan peningkatan  kehijauan  daun,  sebagaimana terlihat  pada  genotipe  PBC622,  PBC592,
Mario,  dan  PBC396  dengan  nilai  indeks toleransi terhadap cekaman lebih besar dari 1, sedangkan  genotipe  PBC621  mengalami penurunan kehijauan daun terbesar yaitu 37%. Berdasarkan diameter batang, genotipe Tanaka  Tsung  adalah  yang  paling  toleran dengan  penurunan  nilai  sebesar  49%  dan genotipe  PBC402  adalah  yang  paling  peka dengan penurunan nilai hingga 75%. Berdasarkan  peubah  panjang  akar,  genotipe PBC  622  adalah  yang  paling  toleran sedangkan  genotipe  Bogota  adalah  yang paling peka. Berdasarkan peubah volume akar dan bobot segar akar, genotipe PBC396 adalah yang  paling  toleran,  sedangkan  yang  paling peka  berturut-turut  adalah  PBC  402  dan PBC398.  Jika  dilihat  pada  luas  daun,  bobot segar  tajuk  dan  bobot  segar  tanaman,  maka PBC140 adalah yang paling toleran, sedangkan PBC402 dan PBC137 adalah yang paling  peka.  Sedangkan  berdasarkan  bobot kering  tanaman,  maka  genotipe  PBC592 adalah yang paling toleran dan PBC137 adalah yang paling peka.
Tabel 2. Nilai indeks toleransi terhadap cekaman alumunium 27 genotipe cabai
Keterangan: TT= Tinggi tanaman; JD= Jumlah daun; KD= Kehijauan daun; DB= Diameter batang;  PA= Panjang akar; VA=Volume akar; BSA= Bobor segar akar; BST= Bobot segar tajuk; BSTan= Bobot segar tanaman; BKTan= Bobot kering tanaman; LD= Luas daun.
Genotipe TT JD KD DB PA VA BSA BST BSTan BKTan LD PBC067 0.31 0.72 0.81 0.44 0.71 0.33 0.30 0.14 0.15 0.07 0.12 PBC137 0.30 0.61 0.92 0.27 0.64 0.25 0.10 0.05 0.05 0.01 0.15 PBC140 0.49 0.65 0.84 0.45 0.91 0.75 0.13 0.36 0.42 0.10 0.37 PBC146 0.41 0.73 0.78 0.41 0.67 0.30 0.11 0.13 0.12 0.04 0.20 PBC155 0.34 0.65 0.72 0.32 0.82 0.44 0.43 0.15 0.16 0.05 0.13 PBC157 0.33 0.45 0.92 0.35 0.78 0.34 0.19 0.11 0.12 0.04 0.14 PBC266 0.37 0.64 0.72 0.45 0.84 0.28 0.17 0.16 0.16 0.03 0.08 PBC396 0.42 0.73 1.03 0.40 0.88 0.76 0.78 0.25 0.28 0.08 0.25 PBC398 0.39 0.61 0.70 0.26 0.52 0.30 0.06 0.08 0.08 0.02 0.19 PBC401 0.36 0.81 0.82 0.38 0.72 0.37 0.27 0.11 0.12 0.02 0.09 PBC402 0.31 0.42 0.83 0.25 0.58 0.20 0.15 0.07 0.07 0.02 0.07 PBC518 0.35 0.69 0.83 0.41 0.72 0.62 0.41 0.19 0.21 0.06 0.20 PBC521 0.37 0.71 0.89 0.37 0.75 0.32 0.34 0.16 0.17 0.04 0.24 PBC592 0.45 0.71 1.12 0.42 0.50 0.42 0.48 0.34 0.35 0.23 0.25 PBC621 0.31 0.44 0.63 0.31 0.64 0.34 0.08 0.12 0.15 0.06 0.16 PBC622 0.32 0.80 1.17 0.41 0.91 0.43 0.30 0.10 0.11 0.04 0.19 BOGOTA 0.28 0.54 0.86 0.30 0.49 0.34 0.26 0.13 0.14 0.06 0.15 FEROSA 0.34 0.58 0.64 0.41 0.61 0.23 0.14 0.10 0.11 0.03 0.15 Hot Pepper 0.32 0.53 0.92 0.27 0.63 0.25 0.13 0.11 0.11 0.04 0.13 K. Hitam 0.39 0.60 0.89 0.36 0.79 0.31 0.28 0.15 0.16 0.04 0.17 KOPAY 0.31 0.66 0.95 0.46 0.61 0.24 0.21 0.11 0.12 0.03 0.14 LARIS 0.42 0.69 0.79 0.35 0.67 0.32 0.28 0.15 0.16 0.07 0.13 LPK 0.29 0.84 0.90 0.33 0.59 0.23 0.21 0.18 0.18 0.09 0.19 MARIO 0.41 0.61 1.02 0.35 0.66 0.24 0.13 0.06 0.07 0.01 0.10 ROMARIO 0.40 0.66 0.93 0.38 0.52 0.35 0.43 0.12 0.14 0.04 0.18 SEMPURNA 0.37 0.67 0.92 0.29 0.78 0.29 0.08 0.07 0.07 0.04 0.07 TS 0.54 0.62 0.78 0.51 0.81 0.36 0.31 0.10 0.11 0.13 0.19 Rerata 0.37 0.64 0.86 0.37 0.69 0.36 0.25 0.14 0.15 0.06 0.16 CV (%) 16.78 16.24 15.02 18.76 17.77 40.54 63.29 53.15 55.61 81.81 39.76
Pada  beberapa  genotipe,  cekaman aluminium ternyata
menyebabkan peningkatan  kehijauan  daun,  sebagaimana terlihat  pada  genotipe  PBC622,  PBC592,
Mario,  dan  PBC396  dengan  nilai  indeks toleransi terhadap cekaman lebih besar dari 1, sedangkan  genotipe  PBC621  mengalami penurunan kehijauan daun terbesar yaitu 37%. Berdasarkan diameter batang, genotipe Tanaka  Tsung  adalah  yang  paling  toleran dengan  penurunan  nilai  sebesar  49%  dan genotipe  PBC402  adalah  yang  paling  peka dengan penurunan nilai hingga 75%. Berdasarkan  peubah  panjang  akar,  genotipe PBC  622  adalah  yang  paling  toleran sedangkan  genotipe  Bogota  adalah  yang paling peka. Berdasarkan peubah volume akar dan bobot segar akar, genotipe PBC396 adalah yang  paling  toleran,  sedangkan  yang  paling peka  berturut-turut  adalah  PBC  402  dan PBC398.  Jika  dilihat  pada  luas  daun,  bobot segar  tajuk  dan  bobot  segar  tanaman,  maka PBC140 adalah yang paling toleran, sedangkan PBC402 dan PBC137 adalah yang paling peka. Sementara itu berdasarkan bobot kering  tanaman,  maka  genotipe  PBC592 adalah yang paling toleran dan PBC137 adalah yang paling peka.
Cekaman  aluminium  menyebabkan tanaman berkurang pertumbuhan dan produktivitasnya. Keracunan aluminium mengganggu serapan hara dan diferensiasi sel (Silva et al. , 2010) sekalipun pembelahan sel meningkat  (Cao et  al. ,  2011).  Keracunan aluminium juga meningkatkan ketebalan daun (Konarska,  2010)  dan  akar  (Alvarez et  al. , 2012). Genotipe-genotipe yang toleran memiliki  karakteristik  yang  relatif  tidak berbeda  pada  kondisi  tercekam  dibandingkan pada  kondisi  tidak  tercekam.  Mekanisme toleransi terhadap keracunan aluminium dapat berlangsung  secara  eksternal,  yaitu  terjadi detoksifikasi Al akibat tanaman mengeluarkan sekresi  asam  oksalat  dari  akar,  dan  secara internal yaitu melalui detoksifikasi Al dengan membentuk  senyawa  kompleks  Al  dengan asam  organik  sehingga  tidak  beracun  bagi tanaman dan menyimpannya di dalam vakuola (Wang et al. , 2015). Kemampuan mengeluarkan  senyawa  oksalat  yang  dapat menetralisir Al dan
kemampuan mengakumulasi  Al  di  dalam  vakuola  sangat
bervariasi  antar  spesies  bahkan  antar  varietas dalam satu spesies yang menyebabkan tingkat toleransi  yang  bervariasi  (Pattanayak  dan Pfukrei, 2013).
Penentuan  genotipe yang toleran terhadap cekaman aluminium seringkali tidak mudah  karena  tergantung  dari  peubah  yang digunakan.  Beberapa  peneliti  menggunakan peubah utama panjang akar untuk menentukan tingkat toleransi (Khu et al. , 2012; Wang et al. ,
2015;  Awasthi et  al. ,  2017).  Hal  tersebut didasarkan  bahwa  penurunan  panjang  akar adalah yang paling awal teramati jika tanaman keracunan  aluminium  (Abate et  al. ,  2013).
Dalam  penelitian  ini  penentuan  genotipe- genotipe toleran dilakukan dengan pendekatan clustering dengan UPGMA ( Unweighted Pair Group  Method  with  Arithmetic  Mean ) berdasarkan  nilai  indeks  toleransi  terhadap cekaman  pada  seluruh  peubah  yang  diamati, dengan  demikian  maka  seluruh  peubah berkontribusi  dalam  menyusun  nilai  tingkat toleransi.
Clustering Tingkat Toleransi Cabai terhadap Cekaman Aluminium Analisis cluster dilakukan
menggunakan  cara  pengelompokkan  Ahmad et al. (2013) tetapi dimodifikasi menggunakan data nilai STI ( stress tolerance index ). Analisis menggunakan  program  aplikasi  NTSYS  2.0 dengan  metode  UPGMA  dengan  tingkat kemiripan  ( similarity  coefficient )  72%,  27 genotipe  yang  diuji  mengelompok  menjadi  7 kelompok. Kelompok I terdiri atas 9 genotipe yang  meliputi  PBC  067,  Laris,  PBC401, PBC521PBC146,  PBC137,  Keriting  Hitam, Romario,  dan  Tanaka  Tsung.  Kelompok  II meliputi 5 genotipe,  yaitu PBC155, PBC266, PBC621,  Bogota,  dan  Lokal  Payakumbuh (LPK).  Kelompok  III  terdiri  atas  8  genotipe, yaitu  PBC137,  Hot  Pepper  (HP),  PBC402, Ferosa, Kopay, PBC398, Mario, dan Sempurna.  Kelompok  IV  hanya  memiliki  1 genotipe,  yaitu  PBC622.  Kelompok  V meliputi  2  genotipe,  yaitu  PBC140  dan PBC592 (Gambar 1), sedangkan kelompok VI dan  VII  masing-masing  beranggotakan  1 genotipe yaitu, secara berturut-turut, PBC518 dan PBC396.
Gambar 1. Dendrogram toleransi terhadap aluminium pada 27 genotipe cabai merah
Kelompok I, II dan III adalah kelompok yang  meliputi  paling  banyak  variasi  genotipe sedangkan lainnya relatif sedikit. Kelompok I dan  II  adalah  kelompok  peka,  kelompok  III agak toleran, kelompok IV dan V toleran dan kelompok  VI  dan  VII  sangat  toleran.  Hasil analisis  cluster  tersebut  menunjukkan  bahwa beberapa  genotipe  yang  termasuk  dalam kategori toleran dan sangat toleran adalah unik yang  berbeda  dengan  genotipe  lainnya. Misalnya genotipe PBC396 dan PBC518, yang membentuk kelompok yang berbeda. Genotipe sangat  toleran  yang  unik  tersebut  sangat berguna  sebagai  tetua  donor  sifat  toleran dalam  program  pemuliaan  untuk  merakit kultivar  yang  toleran  terhadap  cekaman  (Sun et  al. ,  2013).  Toleransi  terhadap  cekaman aluminium  dikendalikan  oleh  banyak  gen (Abate et  al. ,  2013)  maka  kemungkinan  gen pengendali  sifat  tersebut  tersebar  pada beberapa
genotipe tetua toleran.
Menggabungkan  gen  toleransi  dari  berbagai tetua donor yang berkerabat jauh ke dalam satu genotipe  melalui  piramidisasi  menjadi  lebih efektif.  Marka  molekuler  telah  diakui  sangat membantu untuk mempercepat proses seleksi dan  memisahkan  individu  berdasarkan  sifat yang secara morfologis tidak tampak. Seleksi primer  merupakan  tahapan  yang  sangat penting dalam pengembangan marka molekuler untuk sifat tertentu.
Seleksi  Primer  SSR  pada  Cabai  untuk Cekaman Aluminium
Berdasarkan  hasil  analisis clustering (Gambar 1) ditetapkan 6 genotipe yang mewakili kelompok  toleran  dan  peka  untuk  dilakukan fingerprint menggunakan  marka  SSR.  Keenam genotipe  cabai  tersebut  adalah  PBC396  dan PBC622  yang  mewakili  genotipe  toleran, PBC398  (agak  toleran)  serta  Keriting  Hitam, PBC146, Laris (peka). Amplifikasi menggunakan  20  primer  SSR  diperoleh informasi  bahwa  hanya  13  primer  yang  sesuai dengan  DNA  genom  cabai  yang  diuji.  Primer yang tidak  sesuai  untuk  cabai adalah  SLM649, CM0011, CA514272, TMS4, SSR-67 dan Tom- 144.  Seluruh  primer  yang  digunakan  dalam penelitian ini telah digunakan dalam karakterisasi  cabai  (Ulhoa et  al. ,  2014). Perbedaan  hasil  ini  kemungkinan  berkaitan dengan materi genetik yang berbeda.
Jumlah pita yang dihasilkan dari masing- masing primer berkisar antara 3 hingga 18 pita. Contoh visualisasi hasil amplifikasi menggunakan  primer  TMS  2,  TMS  6,  TMS  7 dan  TMS  8  ditunjukkan  pada  Gambar  2. Tigabelas primer SSR yang mampu mengamplifikasi DNA cabai menghasilkan 117 marka dan 38 diantaranya adalah polimorfik. Di antara  marka  polimorfik  tersebut  terdapat  25 yang  polimofik  untuk  sifat  toleran  terhadap aluminium,  yaitu  pita  muncul  pada  individu tanaman  toleran  tetapi  tidak  muncul  pada tanaman peka.
I II II I IV V VI VII
Gambar 2. Visualisasi hasil amplifikasi DNA menggunakan primer SSR TMS2, TMS6, TMS 7 dan TMS8 terhadap  DNA  genom  cabai  Keriting  Hitam  (1),  PBC622  (2),  PBC396  (3),  PBC146  (4), PBC398 (5), dan Laris (6). Elektroforesis menggunakan agarose 1.5%.
Tabel 3. Karakteristik marka SSR dari primer yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA cabai
Primer Jumlah Total Pita Jumlah Pita Monomorfik Jumlah Pita Polimorfik Jumlah Pita Polimorfik Toleran CAMS024 11 10 1 1 CAMS117 10 8 2 2 CAMS191 7 7 0 0 CAMS207-2 3 3 0 0 CAMS358 14 5 9 7 CAMS309 5 5 0 0 CACCEL1i 5 3 2 1 TMS2 8 6 2 2 TMS6 7 6 1 1 TMS7 18 5 13 8 TMS8 11 10 1 1 TMS9 12 8 4 2 TMS17 6 3 3 0 Jumlah 117 79 38 25
Primer  yang  menghasilkan  marka polimorfik toleran terbanyak adalah TMS7 yang menghasilkan  8  marka,  diikuti  oleh  primer CAMS358  yang  menghasilkan  marka  toleran yang  banyak  yaitu  7  marka  (Tabel  3).  Seleksi primer  merupakan  tahapan  yang  penting dalam pengembangan marka untuk membantu dalam  seleksi  ( marker  assisted  selection- MAS). (Mutai et al. , 2016) melakukan tahapan seleksi  primer  dalam  upaya  mengembangkan MAS  untuk  toleransi  tanaman  teh  terhadap kekeringan  dan  (Mondal et  al. ,  2013)  pada pengembangan MAS untuk toleransi terhadap salinitas  pada  padi.  Primer-primer  yang menghasilkan  marka  polimorfik  untuk  sifat toleran  selanjutnya  dapat  dijadikan  kandidat untuk  analisis bulk  segregation  analysis (BSA)  menggunakan mapping  population pada  tahap  selanjutnya.  Dengan  demikian maka,  dari  20  primer  yang  diseleksi,  TMS7 dan  CAMS358  adalah  primer  terbaik  yang
berpotensi menghasilkan marka untuk toleransi terhadap cekaman aluminium.

## KESIMPULAN
Analisis cluster terhadap sifat toleransi terhadap  27  genotipe  cabai  menghasilkan  7 kelompok  yang  memiliki  tingkat  toleransi terhadap  aluminium  yang  berbeda.  Individu PBC396  dan  PBC518  adalah  genotipe  yang sangat  toleran  dan  masing-masing  unik. Primer  SSR  TMS7  dan  CAMS358  adalah primer  yang  potensial  menghasilkan  marka polimorfik  untuk  sifat  toleran  terhadap cekaman aluminium pada cabai merah.
TMS 2 TMS 6 TMS 7 TMS 8 M 500 1000 M 500 1000 1  2 3 4 5 6 1  2 3 4 5 6 1  2 3 4 5 6 1  2 3 4 5 6

## DAFTAR PUSTAKA
Abate, E., S. Hussien, M. Laing, F. Mengistu. 2013.  Aluminium  toxicity  tolerance  in cereals:  Mechanisms,  genetic  control and  breeding  methods.  AJAR.  8(9): 711-722.
Agyare,  R.Y.,  R.  Akromah,  M.S.  Abdulaic. 2016.  Assessment  of  genetic  diversity in  pepper  ( Capsicum sp.)  landraces from  Ghana  using  agro-morphological characters.  Journal  of  Experimental Agriculture International. 1-16.
Ahmad,  M.,  A.  Shahzad,  M.  Iqbal,  M.  Asif, A.H.  Hirani.  2013.  Morphological  and molecular genetic variation in wheat for salinity  tolerance  at  germination  and early  seedling  stage.  Aus.  J.  Crop  Sci. 7(1): 66-74.
Alvarez, I., O. Sam, I. Reynaldo, P. Testillano,
M.C.  Risueño,  M.  Arias . 2012.
Morphological  and  cellular  changes  in rice  roots  ( Oryza  sativa L.)  caused  by Al stress. Bot. Studies. 53(1):67-73.
Ashkani,  S.,  M.Y.  Rafii,  M.  Sariah,  N.A.A. Siti, I. Rusli. 2011. Analysis of simple sequence  repeat  markers  linked  with blast  disease  resistance  genes  in  a segregating  population  of  rice  ( Oryza sativa ).  Genet.  Mol.  Res.  10(3):1345- 1355.
Awasthi, J.P., B. Saha, P. Regon, S. Sahoo, U. Chowra,  A.  Pradhan,  A.  Roy,  S.K. Panda . 2017.  Morpho-physiological analysis  of  tolerance  to  aluminum toxicity  in  rice  varieties  of  North  East India.  PloS  one.  12(4):e0176357. https://doi.org/10.1371/journal.pone.01 76357.
Baba,  V.Y.,  K.R.  Rocha,  G.P.  Gomes,  C.  de Fátima Ruas, P.M. Ruas. 2016. Genetic diversity of Capsicum chinense accessions based on fruit morphological characterization  and  AFLP  markers.
Genetic Resources and Crop Evolution. 63(8):1371-1381.
Bhargavaramireddy, C.H., K.S. Subramanian. 2016.  Nano-lime  for  remediation  of  soil acidity:  Synthesis  and  characterization. Curr. Adv. Agric. Sci. 8(1):39-43.
Cao, Y., Y. Lou, Y. Han, J. Shi, Y. Wang, W. Wang, F. Ming . 2011. Al toxicity leads to  enhanced  cell  division  and  changed photosynthesis  in Oryza  rufipogon L. Mol.  Biol.  Rep.  38(8):48394846.  doi: 10.1007/s11033-010-0618-9.
Carvalho,  S.I.C.,  L.B.  Bianchetti,  C.F.
Ragassi, C.S.C. Ribeiro, F.J.B. Reifschneider. 2017. Genetic
variability  of  a  Brazilian  Capsicum frutescens  germplasm  collection  using morphological  characteristics  and  SSR markers.  Embrapa  Hortaliças-Artigo em periódico indexado (ALICE).
Choudhary, V.K., P.S. Kumar. 2015. Amelioration  of  Acidic  Soil  and Production Performance of Cowpea by the  Application  of  Different  Organic Manures in Eastern Himalayan Region, India.  Comm.  Soil  Sci.  Plant  Anal.
46(20):2523-2533.
doi:10.1080/
00103624.2015.1081928.
Dalimunthe, S.R., A.B. Arif, I.B. Jamal. 2015. Uji ketahanan terhadap aluminium dan pH  rendah  pada  jagung  ( Zea  mays L) varietas  pioneer  dan  srikandi  secara in vitro . J. Pert. Trop. 2(3):292-299.
El-Hashash,  E.F.,  R.Y.A.  EL-Agoury,  K.M. El-Absy,  S.M.I.  Sakr.  2018.  Genetic parameters,  multivariate  analysis  and tolerance  indices  of  rice  genotypes under  normal  and  drought  stress environments.  Asian  J.  Res.  Crop  Sci. 1(3):1-18.
Haquarsum,  E.J.V.  2016.  Seleksi  dan  Studi Pewarisan  serta  Pengembangan  Marka SSR  Penanda  Ketahanan  terhadap Penyakit  Layu  Bakteri  ( Ralstonia Solanacearum )  pada  Tomat.  Tesis. http://repository.ipb.ac.id/xmlui/handle /123456789/82697 (8 Desember 2018).
Hartatik,  W.,  J.  Purwani.  2017.  Peningkatan produktivitas  kedelai  ( Glycine max L.) pada  Typic  Kanhapludults  dengan aplikasi  pembenah  tanah  dan  pupuk
NPK.  J.  Tanah  dan  Iklim.  41(2):123- 134. doi: 10.2017/jti.v41i2.6168.
Herison,  C.,  M.  Handajaningsih,  F.  Fahrurrozi, R. Rustikawati. 2017. Wet season trials on  growth  and  yield  of  six  newly developed chili pepper hybrids at three different  locations.  Ijaseit.  7(5):  1913- 1919. doi:10.18517/ijaseit.7.5. 2515.
Herison, C., S. Winarsih, M. Handayaningsih, Rustikawati.  2012.  DNA  marker- assisted and morphological selection on
BC3 genotypes shortcut the
introgression  of  CMV  tolerance  genes on chili pepper. Agrivita. J. Agric. Sci. 34(3):215-224.
Herison,  C.,  S.H.  Sutjahjo,  I.  Sulastrini, Rustikawati,  S.  Marwiyah.  2018. Genetic diversity analysis in 27 tomato accessions  using  morphological  and molecular  markers.  Agrivita,  J.  Agric.
Sci. 40(1):36-44.
Ifansyah,  H.  2014.  Soil  pH  and  solubility  of aluminum,  iron,  and  phosphorus  in Ultisols:  the  roles  of  humic  acid.  J. Tanah Trop. 18(3):203-208.
Khu,  D.M.,  R.  Reyno,  E.C.  Brummer,  M.J.
Monteros. 2012. Screening methods for aluminum tolerance in alfalfa. Crop Sci. 52(1): 161167. doi:10.2135/ cropsci2011.05.0256.
Konarska,  A.  2010.  Effects  of  aluminum  on growth  and  structure  of  red  pepper ( Capsicum  annuum L.)  leaves.  Acta Physiol. Plant. 32(1):145. doi:10.1007/ s11738-009-0390-4.
Kuntz, L.B. 2013. Wick irrigation systems for subsistence  farming.  http://dspace.mit. edu/handle/1721.1/83726  (8  Oktober 2017).
Lestari,  T.,  Trikusumaningtyas,  S.W.  Ardie, D.  Sopandie.  2017.  The  Role  of
Phosphorus  in  Improving  Sorghum Tolerance  to  Aluminum  Stress.  J. Agron. Indonesia. 45(1):43-48.
Mondal, U., M.S.R. Khanom, L. Hassan, S.N.
Begum.  2013.  Foreground  selection through SSRs markers for the development of salt tolerant rice variety. J. Bangladesh Agric. Univ. 11(1):67-72.
Mutai,  C.,  S.M.  Kamunya,  R.C.  Muoki,  S. Runo, A.J. Mgutu, M. Wamalwa, T.K. Maritim,  F.N.  Wachira,  R.K.  Korir . 2016.  Development  of  EST-SSR primers  for  marker-assisted  selection for  drought  tolerance  in  tea  ( Camellia sinensis (L.) O.  Kuntze). Tea. 37(1/2): 129-138.
Parmar, P., A. Sudhir, R. Preethi, B. Dave, K. Panchal,  R.B.  Subramanian,  A.  Patel, K.B. Kathiria, . 2013. Identification of a SSR  marker  (TOM-144)  linked  to Fusarium  wilt  resistance  in Solanum lycopersicum .  Amer.  J.  Mol.  Biol. 3:241-247.
Pattanayak, A., K. Pfukrei. 2013. Aluminium toxicity tolerance in crop plants: Present status  of  research.  African  J.  Biotech. 12(24):3752-3757.
Prabakaran, A., K. Paramasivam, T. Rajesh, D. Rajarajan. 2010. Molecular characterization of rice land races using
SSR markers. Electron. J. Plant Breed. 1(4):512-516.
Prasetyo,  B.H.,  D.A.  Suriadikarta.  2006. Karakteristik,  potensi,  dan  teknologi pengelolaan tanah Ultisol untuk pengembangan  pertanian  lahan  kering di  Indonesia.  J.  Litbang  Pertanian. 25(2): 39-46.
Putri,  T.N.  2016.  Pengaruh  Dosis  Pupuk Organonitrofos Plus, Pupuk Anorganik, dan Biochar terhadap Pertumbuhan dan Produksi Tanaman Jagung  Manis  ( Zea Mays  Saccharata L.)  pada  Tanah Ultisols  Taman  Bogo.  Skripsi  Unila. http://digilib.unila.ac.id/id/eprint/24457.
Sajib,  A.M.,  M.  Hossain,  A.  Mosnaz,  H. Hossain,  M.  Islam,  S.  Ali,  S.H. Prodhan.  2012.  SSR  marker-based molecular  characterization  and  genetic diversity analysis of aromatic landreces of  rice  ( Oryza  sativa L.).  J.  BioSci. Biotech. 1(2):107-116.
Sehgal,  S.A.,  R.A.  Tahir,  M.  Nawaz.  2012. Molecular  characterization  of  wheat genotypes  using  SSR  markers.  Int.  J. Bioautomation. 16(2):119-128.
Sharmin,  A.,  M.E.  Hoque,  M.M.  Haque,  F. Khatun.  2018.  Molecular  diversity analysis of some chilli ( Capsicum spp.) genotypes using SSR markers. American  Journal  of  Plant  Sciences.
9(3):368-379.
Silva,  G.F.  da,  J.B.  dos  Santos,  M.A.P. Ramalho.  2003.  Identification  of  SSR and  RAPD  markers  linked  to  a resistance allele for angular leaf spot in the common bean ( Phaseolus vulgaris ) line  ESAL  550.  Genetics  Mol.  Biol.
26(4):459-463.
Silva, S., O. Pinto-Carnide, P. Martins-Lopes, M. Matos, H. Guedes-Pinto, C. Santos . 2010.  Differential  aluminium  changes on  nutrient  accumulation  and  root differentiation  in  an  Al  sensitive  vs. tolerant  wheat.  Environ.  Exp.  Bot. 68(1):91-98.
Sun,  J.,  H.  Luo,  J.  Fu,  B.  Huang.  2013. Classification  of  genetic  variation  for drought  tolerance  in  tall  fescue  using physiological  traits  and  molecular markers. Crop Sci. 53(2):647-654.
Swapna, M., M.S. Srivastava. 2012. Molecular Marker  Applications  for  Improving Sugar  Content  in  Sugarcane.  Springer, London.
Ulhoa,  A.B.,  T.N.  Pereira,  R.N.  Silva,  C.F. Ragassi,  R.  Rodrigues,  M.G.  Pereira, F.J. Reifschneider . 2014.
Caracterização  molecular  de  linhagens de  pimenta  do  tipo  jalapeño  amarelo. Horticultura  Brasileira  32(1):35-40. doi: 10.1590/hb.v32i01.197.
Wang, H., R.F. Chen, T. Iwashita, R.F. Shen,
J.F. Ma.
2015. Physiological characterization of aluminum tolerance and  accumulation  in  tartary  and  wild buckwheat.  New  Phytol.  205(1):  273- 279. doi: 10.1111/nph.13011.
Zhu, Z., X. Xu, B. Cao, C. Chen, Q. Chen, C. Xiang,  G.  Chen,  J.  Lei.  2015. Pyramiding  of  AtEDT1/HDG11  and Cry2Aa2 into pepper ( Capsicum annuum L.) enhances drought tolerance and  insect  resistance  without  yield decrease. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 120(3):919-932.