PRODUKSI METABOLIT SEKUNDER STEVIOSIDA PADA KULTUR KALUS STEVIA (Stevia rebaudiana Bert. M.)  DENGAN PENAMBAHAN ZPT 2,4-D DAN PEG (Polyethylene Glykol) 6000 PADA MEDIA MS (Murashige & Skoog)
Fittriya Nur Laila, Evika Sandi Savitri*)
Jurusan Biologi- Fakultas Sains & Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang Email : evikasandi@yahoo.com

## ABSTRACT
Stevia rebaudiana is a member of the Asteraceae family, produce steviol glycosides (steviosida, rebaudiosida A, B, C, D, E and dulcosida A) which can be used as food additives such as food flavoring or sweetener in nutritional supplements. This study aims  to  determine  the  concentration  of  2,4-D  combination  and  PEG  6000  were effective  in  increasing  the  production  of  secondary  metabolites  in  callus  of  stevia (Stevia  rebaudiana  Bert.  M)  in  vitro.  PEG  6000  is  a  way  to  manipulate  media  in vitro to increase secondary metabolite.
This  research  used  Completely  Randomized  Design  (CRD)  with  12  factorial combination with three replications. The first factor is the provision of plant growth regulator  2,4-D  (1  mg  /  L,  2  mg  /  L,  and  3  mg  /  L)  and  the  second  factor  is  the provision of PEG 6000 (0 mg / L, 5 mg / L, 15 mg / L, and 25 mg / L). The emerging callus  (day),  percentage  (%)  of  explants  callus  (g),  weight  of  callus,  callus morphology (texture and color of the callus), and secondary metabolites steviosida were measured. Data were analyzed by analysis of variance (ANOVA) two way and to  find  a  significant  difference  test  Duncan's  Multiple  Range  Test  (DMRT)  at  5% significance  level.  Steviosida  secondary  metabolites  were  measured  using  High Performance Liquid Cromatography (HPLC).
The results showed that the combination treatment of 1 mg / L 2,4-D and 25 mg / L PEG 6000 is a combination of the most efficient way to get the amount of secondary metabolites  steviosida  4.792  mg  /  g.  Observations  callus  morphology  (texture  and color of the callus) showed that the compact callus textured and colored brown due to  osmotic  stress  of  PEG  6000  has  a  high  content  of  secondary  metabolites steviosida Keyword :  Stevia callus, steviosida, PEG 6000 LATAR BELAKANG
Tumbuhan merupakan salah satu mahluk  hidup  ciptaan  Allah  SWT  yang  banyak memberikan  manfaat  bagi  mahluk  hidup  yang lainnya,  baik  manusia  maupun  hewan.  Allah SWT  menganugrahkan  mahluknya  dengan berbagai  macam  tanaman,  salah  satunya  adalah tanaman  stevia  (Stevia  rebaudiana)  yang  dapat dimanfaatkan  sebagai  tanaman  obat  maupun sebagai  pemanis  untuk  makanan.  Allah  SWT berfirman dalam surat Asy-Syu’ara (26) ayat 7: Artinya:
“Dan  Apakah  mereka  tidak  memperhatikan bumi, berapakah banyaknya Kami tumbuhkan di bumi  itu  berbagai  macam  (tumbuh-tumbuhan) yang baik?” (QS. Asy-Syu’ara ayat 7).
Shihab  (2002)  memberikan  tafsiran bahwa  ayat  ini  mengundang  manusia  untuk mengarahkan pandangan hingga batas
kemampuannya  memandang  sampai  mencakup seantero  bumi,  dengan  aneka  tanah  dan tumbuhannya dan aneka keajaiban yang terdapat pada tumbuh-tumbuhannya.
Allah SWT telah menumbuhkan berbagai macam tumbuh-tumbuhan, salah satunya  tanaman  stevia  (Stevia  rebaudiana Bertoni)  yang  ditumbuhkan  oleh  Allah  dengan berbagai  manfaat.  Tanaman  ini  biasanya digunakan  oleh  masyarakat  sebagai  pengganti gula  sintetis  sebab  pada  daun  stevia  terdapat glikosida  dengan  tingkat  kemanisan  kurang lebih  200-300  kali  lebih  manis  dibandingkan gula  tebu  atau  sukrosa  serta  sifatnya  yang  non- kalori  sehingga  aman  jika  dikonsumsi  oleh penderita  diabetes  atau  orang  yang  sedang melakukan program diet.
Beberapa  negara  termasuk  indonesia stevia  sedang  dikembangkan  sebagai  pemanis
alami  alternatif  sebagai  pengganti  sakarin  dan siklamat  yang  diduga  beresiko  bagi  kesehatan, menurut  hasil  penelitian  kedua  pemanis  sintetis tersebut  dapat  menyebabkan  kanker  sehingga penggunaanya mulai dikurangi. Menurut Cahyadi  (2008)  dijelaskan  bahwa  pemanis sintetis  merupakan  bahan  tambahan  yang  dapat menyebabkan  rasa  manis  pada  pangan,  tetapi tidak  memiliki  nilai  gizi.  Bahan  sintetis  ini memiliki sifat yang karsinogenik yaitu penyebab  kanker.  Beberapa  pemanis  sintetis yang telah dikenal dan banyak digunakan adalah sakarin,  siklamat  dan  aspartam.  Berdasarkan penjelasan  tersebut  keberadaan  stevia  sangat sesuai  dengan  harapan  yang  diinginkan  oleh masyarakat,  mengingat  gula  merupakan  salah satu kebutuhan pokok masyarakat di Indonesia.
Stevia  rebaudiana  Bertoni  (Famili- Asteraceae) adalah satu dari 154 jenis stevia dan satu  dari  dua  spesies  yang  menghasilkan pemanis  steviol  glikosida  (Madan,  2010., Jitendra,  2012).  Glikosida  dalam  daun  stevia terdiri  dari  steviosida,  beberapa  rebaudiosida termasuk  rebau-diosida  A  (reb-A),  dulkosida, dan  beberapa  senyawa  lainnya  (Geuns,  2003). Glikosida tidak mengandung kalori dan mempunyai  indeks  glikemat  hampir  nol sehingga  sesuai  untuk  penderita  diabetes  dan seseorang yang sedang melakukan diet makanan untuk menurunkan berat badan. Stevia digunakan  pada  minuman  ringan  rendah-kalori, bahan  makanan,  pasta  gigi,  bahan  kosmetika, antioksidan, antihipertensi, dan berbagai produk lain (Sumaryono dkk, 2011)
Sesuai  dengan  Chatsudthipong  (2009) steviosida  adalah  glikosida  diterpenoid,  yang terdiri  dari  aglikon  (steviol)  dan  tiga  molekul glukosa.  Fatima  (2010)  menambahkan  senyawa pemanis diisolasi dari daun Stevia. Senyawa ini disebut  sebagai  "stevioside"  yang  terdiri  dari tiga molekul komplek glukosa dan satu molekul aglikon steviol, alkohol karboksilat diterpenik.
Berdasarkan  banyaknya  manfaat  dari tanaman  stevia  inilah  yang  mendasari  untuk dilakukannya kultur jaringan yaitu kalus. Kultur kalus  juga  menjadi  suatu  alternatif  untuk meningkatkan  sintesa  metabolit  sekunder  yang mempunyai  nilai  komersial  tinggi.  Teknik  in vitro  mempunyai  keuntungan  antara  lain produksi  metabolit  sekunder  dapat  dilakukan sepanjang  tahun  dan  tanpa  dipengaruhi  oleh cuaca, serta dapat dikembangkan untuk produksi biomassa metabolit secara besar-besaran, sehingga  kultur  merupakan  cara  yang  dapat digunakan dalam meningkatkan sintesis
metabolit  sekunder.    Kelebihan  penggunaan kultur jaringan dalam produksi senyawa bioaktif dibanding dengan budidaya tanaman secara utuh antara  lain  adalah  tidak  adanya  keterbatasan iklim,  tidak  memerlukan  lahan  yang  luas,  dan senyawa  bioaktif  dapat  dihasilkan  secara  terus menerus  dalam  keadaan  yang  terkontrol (Habibah, 2009).
Produktivitas tumbuhan dalam menghasilkan metabolit sekunder dapat ditingkatkan  dengan  beberapa  cara,  yaitu mengoptimasi faktor fisiologi lingkungan hidup sel  diantaranya  memanipulasi  nutrisi  media tumbuh,  zat  pengatur  tumbuh,  prekusor  dan elisitor untuk sintesis metabolit sekunder (Zhao, 2005  dalam  Yulinda  2010).  Pada  penelitian  ini menggunakan  cara  manipulasi  nutrisi  media tumbuh untuk meningkatkan kandungan metabolit sekunder.
Menurut  Rahayu  (2005)  dalam  Yulinda (2010)  melaporkan  PEG  adalah  senyawa  yang dapat  menurunkan  potensial  osmotik  larutan melalui aktivitas matriks sub-unit etilena oksida yang  mampu  mengikat  molekul  air  dengan ikatan  hidrogen.  Karena  turunnya  potensial osmotik  larutan,  air  yang  ada  pada  medium tidak  dapat  diserap  oleh  tanaman,  sehingga tanaman mengalami stress osmosis.
Pemberian  PEG  akan  menyebabkan kekurangan  air  sehingga  akan  menginduksi protein,  mengkode  gen-gen  pembentuk  enzim yang  terlibat  dalam  biosintesis  metabolisme sekunder.  Dengan  meningkatnya  kandungan enzim dalam jaringan tanaman maka diharapkan kandungan metabolit sekunder dapat meningkat. Aktivitas  enzim  dipengaruhi  antara  lain  oleh adanya  prekusor,  senyawa  yang  bersangkutan dan  akumulasi  produk  metabolisme  sekunder tersebit (Ernawati, 1992)
Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  dari Hartanti  (2013)  pada  tanaman  tembakau (Nicotiana tabacum var. Prancak 95) melaporkan  bahwa  tekstur  kalus  yang  dibentuk oleh eksplan pada medium (induksi kalus) yang ditambahkan  polyethilene  glicol  (PEG)  berbeda dengan tekstur kalus yang dibentuk oleh eksplan pada  kontrol.  Tekstur  kalus  pada  perlakuan dengan polyethylene glicol (PEG) adalah remah. Sedangkan  penambahan  PEG  6000  pada  media subkultur menyebabkan kalus bertekstur kompak.  Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian Zulhilmi  (2012)  pada  Kalus  Gatang  (Spilanthes acmella Murr.)  melaporkan  bahwa  semua  kalus yang  diperlakukan  (ditambahkan  PEG  6000
pada  media  subkultur)  berstruktur  kompak  dan berwarna putih kekuningan.
Konsentrasi  PEG  6000  yang  digunakan pada  penelitian  ini  yaitu  0  mg/L,  5  mg/L,  15 mg/L,  dan  25  mg/L.  Penetapan  konsentrasi tersebut  berdasarkan  pada  penelitian  Hartanti (2013)  pada  tanaman  tembakau  (Nicotiana tabacum  var.  Prancak  95),  yaitu  dengan konsentrasi  0  mg/L,  15  mg/L,  20  mg/L,  25 mg/L,  dan  30  mg/L.  Berdasarkan  hasil penelitiannya dapat disimpulkan bahwa konsentrasi PEG yang ditoleransi eksplan untuk membentuk kalus adalah 25 mg/L dengan kalus yang  terbentuk  berwarna  coklat  dan  tekstur remah.  Pada  penelitian  Hartanti  penambahan PEG  ditambahkan  secara  langsung  pada  media induksi  kalus  (bukan  subkultur).  Sedangkan penggunaan  konsentrasi  dalam  persentase  (%) tidak  digunakan  karena  ditakutkan  konsentrasi PEG terlalu besar sehingga dapat menyebabkan kalus  tidak  tumbuh  dan  mati.  Penggunaan konsentrasi dalam bentuk persentase (%) sering digunakan pada media subkultur.
Berdasarkan  penelitian  Zulhilmi  (2012) pada  Kalus  Gatang  (Spilanthes  acmella  Murr.) menunjukkan  perlakuan  PEG  2%  dan  5% meningkatkan sintesis  alkaloid sedangkan kandungan terpenoid meningkat pada perlakuan 3  %  dan  4  %  PEG.  Adapun  senyawa  fenolik hanya muncul pada perlakuan PEG 4%. Yulinda (2010) melaporkan bahwa kandungan  metabolit sekunder  triterpenoid  pada  tanaman  Centella asiatica meningkat dengan penambahan 1 dan 2 %  PEG.  Sedangkan  penelitian  Fakhri  (2010) pada  tanaman  Theobroma  cacao  menunjukkan kandungan metabolit sekunder katekin terbanyak  dihasilkan  pada  penambahan  PEG 1%.
Berdasarkan uraian diatas, penelitian ini diharapkan  dapat  meningkatkan  kandungan metabolit  sekunder  (steviosida)  pada  tanaman Stevia  rebaudiana  dengan  menginduksi  kalus pada  media  MS  yang  ditambahkan  berbagai konsentrasi ZPT 2,4-D dan PEG 6000.

## METODOLOGI
Penelitian  ini  merupakan  penelitian eksperimental  yang  menggunakan  Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial yaitu pemberian zat  pengatur  tumbuh  2,4-D  (1  mg/L,  2  mg/L, dan  3  mg/L)  pada  media  MS  (Murashige  & Skoog)  yang  merupakan  faktor  pertama  dan pemberian  PEG  6000  (0  mg/L,  5  mg/L,  15 mg/L,  dan  25  mg/L)  yang  merupakan  faktor kedua.  Dengan  demikian,  dalam  penelitian  ini
terdapat  4  X  3  kombinasi  atau  12  kombinasi dengan  3  ulangan.  Sehingga  secara  keseluruan terdapat  36  unit.  Faktor  pertama  adalah konsentrasi 2,4-D yang terdiri dari 3 taraf:  K1 = 2,4-D  dengan  konsentrasi  1  mg/L,  K2  =  2,4-D dengan konsentrasi 2 mg/L, K3 = 2,4-D dengan konsentrasi  3  mg/L.  Faktor  kedua  adalah kosentrasi  PEG  6000  yang  terdiri  dari  4  taraf: P1 = PEG 6000 dengan konsentrasi 0 mg/L, P2 =  PEG  6000  dengan  konsentrasi  5  mg/L,  P3  = PEG  6000  dengan  konsentrasi  15  mg/L,  P4  = PEG 6000 dengan konsentrasi 25 mg/L
Media MS ditimbang sebanyak 4,43 gr, serta  gula  ditimbang  sebanyak  30  gr,  kemudian ditambahkan  ke  dalam  masing-masing  beaker glass  yang  telah  berisi  aquades,  PEG  6000  dan ZPT.  Dihomogenkan  dan  diukur  pH  larutan media  dengan  pH  meter,  yaitu    5,8.  Agar ditimbang  sebanyak  7  gr  dan  ditambahkan dalam  masing-masing  beaker  glass  yang  berisi aquades,  PEG  6000,  MS,  gula,  dan  ZPT. Kemudian media dimasak pada hot plate dengan stirer  hingga  mendidih  serta  homogen.  Media yang  telah  mendidih  dituang  ke  dalam  botol kultur ± 20 ml, kemudian ditutup dengan pastik dan diikat dengan karet serta di beri kertas label.

## Tahap Pengamatan
Pengamatan dilakukan dengan 3 tahap: Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat ada atau tidaknya perkembangan dan munculnya kalus  pertama  kali  pada  eksplan,  serta  ada tidaknya kontaminasi pada eksplan. Pengamatan kedua  yaitu  pengamatan  interval  2  minggu sekali  untuk  mengetahui  tekstur  dan  warna kalus.  Pengamatan  ketiga  yaitu  pengamatan akhir  yang  dilakukan  setelah  4  minggu penanaman  terdiri  dari  pengamatan  prosentase eksplan  membentuk  kalus,  berat  kalus  dan  uji kadar steviosida pada kalus Stevia rebaudiana.

## Parameter pengamatan:
Pengamatan  munculnya  kalus  pertama  kali dinyatakan  dalam  HST  (Hari  Setelah  Tanam) yang  ditandai  dengan  pembengkakan  eksplan. Pengamatan  warna  kalus  yang  dilakukan  setiap hari  dengan  diamati  perubahan  warna  yang terjadi  pada  setiap  kalusnya.    Pengamatan kontaminasi dengan mengamati secara langsung yang terjadi pada media dan eksplan yang dapat diakibatkan oleh mikroorganisme. Tekstur kalus diamati  secara  visual  pada  penampakan  kalus yaitu  kalus  remah,  kalus  kompak,  dan  kalus intermediet.
Pengamatan  prosentase  kalus  yang  dilakukan dengan  menghitung  banyaknya  eksplan  yang membentuk  kalus  dibandingkan  dengan  total eksplan  yang  ditanam  dilakukan  di  akhir pengamatan.
% Eksplan berkalus = Eksplan berkalus tiap perlakuanTotal eksplan tiap perlakuan x 100% .
Pengamatan  berat  kalus  dilakukan  secara destruktif  pada  minggu  keempat  menggunakan timbangan analitik untuk mengetahui berat akhir kalus kemudian.
Berat kalus/Ulangan = Berat akhir – Berat eksplan awal tiap botol / Jumlah kalus yang tumbuh pada setiap botol
Rata-rata berat kalus = Jumlah berat kalus seluruh ulangan/ Ulangan
Pengamatan kandungan metabolit sekunder (steviosida) dengan menggunakan metode HPLC atau KCKT.

## Tahap Uji Metabolit Sekunder
Pengujian  senyawa  fitokimia  hasil  metabolit sekunder dilakukan dengan menggunakan metode  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi (KCKT)  atau  yang  sering  disebut  dengan  High Performance Liquid Cromatography (HPLC).

## Analisis Data
Data  pengamatan  berupa  data  kualitatif dan kuantitatif. Data kualitatif berupa pengamatan  secara  visual  meliputi  morfologi kalus,  dan  hari  muncul  kalus,  sedangkan  data kuantitatif  berupa  persentase  kalus  berat  kalus, dan  kadar  steviosida.  Data  dianalisis  dengan menggunakan analisis  variansi (ANAVA) faktorial  untuk  mengetahui  adanya  pengaruh pemberian  ZPT  2,4-D  dan  PEG  6000  pada media  MS  terhadap  kandungan  steviosida  pada kalus Stevia rebaudiana secara in vitro. Apabila terdapat  perbedaan  yang  nyata  maka  dilanjut dengan DMRT pada taraf 5%.

## HASIL
Penelitian  Janarthanam  (2010)  tentang kultur  kalus  untuk  biosintesis  steviosida menggunakan eksplan daun stevia yang menggunakan medium MS dengan penambahan 2,4-D,  NAA  yang  dikombinasikan  dengan  BA menghasilkan  kalus  berwarna  hijau  kekuningan dengan  struktur  kalus  kompak  dan  keras.
Sedangkan pada penelitian ini warna kalus yang dominan  adalah  coklat,  warna  coklat  ini diperoleh  karena adanya  penambahan  zat  kimia berupa  PEG  6000  sebagai  osmotikum  pada media  induksi  kalus.  Berdasarkan  analisis HPLC  untuk  uji  kadar steviosida  yang  tertinggi didapatkan pada kalus berwarna coklat.
Perubahan warna kalus menjadi kecoklatan  atau  coklat  menunjukkan  terjadinya senyawa  fenolik.  Menurut  Naz  (2008)  fenol yang  teroksidasi  akan  membentuk  kuinon  dan kuinon  adalah  senyawa  yang  menyebabkan warna coklat pada kultur kalus. Intensitas warna coklat  berkorelasi  positif  dengan  hiperaktivitas enzim  oksidatif.  Peningkatan  enzim  tersebut terkait  dengan  reaksi  pertahanan  jaringan  dari stres  oksidatif.  Menurut  Matheka  et  al.,  (2008) dalam Zulhimi (2012) pada kalus gantang untuk meningkatkan  kandungan  metabolit  sekunder dengan  PEG,  menyatakan  bahwa  pencoklatan eksplan  merupakan  efek  dari  hilangnya  air akibat sel mangalami cekaman osmotik.
Menurut  Ariningsih  (2003)  perubahan warna  pada  kalus  juga  tergantung  pada  media perkembangannya.  Cekaman  yang  diberikan oleh media pada kalus mengindikasi kalus akan berubah  warna  lebih  tua  dari  kalus  segar. Dengan demikian semakin tua perubahan warna kalus  pada  suatu  media  menunjukkan  adanya aktifitas  biosintesis  metabolit  sekunder  lebih tinggi dan lebih besar.
Menurut Hendaryono (1994)
menyatakan bahwa warna kalus yang bervariasi disebabkan  oleh  adanya  pigmentasi,  pengaruh cahaya  dan  bagian  tanaman  yang  dijadikan sebagai  sumber  eksplan.  Hal  ini  sesuai  dengan hasil  penelitian  ini,  dimana  awal  terbentuknya kalus  berwarna  hijau  atau  hijau  kekuningan yang  lama  kelamaan  berubah  menjadi  kuning kecoklatan  atau  coklat  yang  disebabkan  oleh cekamanosmosis  dari  PEG  6000  dalam  media tumbuh. Berdasarkan penelitian Zulhilmi (2012) pada  kalus  gantang  didapatkan  hasil  dari  segi warna,  kalus  yang  diberi  perlakuan  PEG  0-3% berwarna kuning kecoklatan pada bagian bawah dan  putih  pada  bagian  atas.  Bagian  putih menunjukkan  sel-sel  yang  baru  terbentuk. Sedangkan  kalus  yang  diberi perlakuan  PEG  4- 5% berwarna coklat.
Pengaruh Konsentrasi 2,4-D dan PEG 6000 terhadap Kadar Steviosida Kalus Stevia
(Stevia rebaudiana Bert.)
Metabolit  sekunder  adalah  salah  satu tujuan  dalam  teknik  kultur  jaringan  tanaman,
dimana diharapkan dapat meningkatkan kandungan  metabolit  sekunder  lebih  tinggi  dari pada yang diperoleh secara langsung dari alam. Dalam  hal  ini  terdapat  suatu  cara  yang dinamakan elisitasi untuk meningkatkan kandungan metabolit sekunder. Dimana menurut Mattel  dan  Smith  (1993)  dalam  Pandiangan (2011), agar produksi metabolit sekunder tinggi maka  perlu  optimasi  faktor-faktor  internal  dan eksternal.  Optimasi  faktor  tersebut  dapat dilakukan  dalam  dua  tahap  yaitu  tahap pertumbuhan  dan  tahap  produksi.  Pada  tahap pertumbuhan,  kondisi  kultur  diarahkan  untuk memproduksi  biomassa  sel  dalam  waktu  dekat, sedangkan tahap produksi dilakukan pemindahan  biomassa  sel  ke  dalam  medium produksi  dengan  tujuan  pengkondisian  kultur untuk produksi metabolit sekunder.
Berdasarkan keterangan tersebut, penelitian  ini  untuk  meningkatkan  kandungan metabolit sekunder menggunakan metode cekaman abiotik (osmotikum) yang mengakibatkan  kalus  mengalami  stres  abiotik dengan  PEG  6000  yang  ditambahkan  pada media  MS  induksi  kalus  stevia.  Dalam  hal  ini, untuk  mengetahui  pengaruh  konsentrasi  2,4-D dan  PEG  6000  terhadap  kandungan  metabolit sekunder steviosida kalus stevia (Stevia rebaudiana Bert.) dilakukan dengan menggunakan
metode
HPLC (High Performance  Liquid  Chromatography).  Adapun hasil  analisa  Kandungan  Metabolit  Sekunder pada  Kalus  stevia  (Stevia  rebaudiana  Bert.) dengan penambahan 2,4-D dan PEG 6000 dapat dilihat pada tabel dibawah ini.
Tabel  1.  Kadar  Steviosida  pada  kalus  (Stevia rebaudiana Bert.) setelah Pengamatan Selama 4 Minggu setelah tanam
Data  yang  diperoleh  pada  tabel    diatas memperlihatkan  bahwa  pemberian  ZPT  2,4-D dan  PEG  6000  ke  dalam  media  tumbuh  kalus dapat  meningkatkan  konsentrasi  metabolit
sekunder  secara  umum.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  pemberian  PEG  6000  menyebabkan kalus  mengalami  stress  sehingga  memacu pembentukan  metabolit  sekunder.  Menurut Rahayu (2005) dalam Zulhilmi (2012) kehadiran PEG pada medium dapat menurunkan potensial osmotik  larutan  sehingga  ketersediaan  air  bagi tanaman akan berkurang. Berkurangnya ketersediaan  air  bagi  tanaman  ini  mengganggu berbagai proses metabolisme.
Berdasarkan  hasil  penelitian  terbukti bahwa  dengan  metode  teknik  kultur  jaringan mampu  meningkatkan  kandungan  metabolit sekunder  steviosida  pada  kalus  stevia,  dimana berdasarkan  hasil  uji  HPLC  (Tabel  4.5) kandungan  steviosida  pada  daun  stevia  (0,5  g) didapatkan  hasil  4,113  mg/g,  sedangkan kandungan  steviosida  kalus  (0,2  g)  pada  media yang  perlakuan  kultur  kalus  didapatkan  kisaran 4,297 mg/g hingga 4,846 mg/g.
Menurut  penelitian  Shirwaikar  (2011) dari  hasil  uji  HPLC  dengan  menggunakan sampel bubuk stevia (5 mg/ml) dan ekstrak daun stevia (5 mg/ml) ditemukan kandungan steviosida  ditemukan  8,859  %  dan  3,703  %. Sedangkan  menurut  Madan  (2010)  menyatakan bahwa dalam daun stevia terkandung steviosida (6-18  %  bobot  segar  dalam  daun)  yang merupakan  glikosida  manis  dan  telah  diuji tingkat  kemanisannya  300 kali  lebih  manis  dari sukrosa.  Dibawah  ini  merupakan  grafik  kadar steviosida:

## Gambar  1.  Grafik  kadar  steviosida  pada  kalus Stevia rebaudiana
Berdasarkan  grafik  kadar  steviosida pada  kalus  Stevia  rebaudiana  Bert. (Gambar  1) dapat  diketahui  bahwa  kandungan  metabolit sekunder  steviosida  pada  kalus  stevia  (Stevia rebaudiana  Bert.)  yang  lebih  tinggi  dihasilkan oleh perlakuan K3P3 (3 mg/L 2,4-D + 15 mg/L PEG 6000) yaitu sebesar 4,846 mg/g, dan K2P4
(2  mg/L  2,4-D  +  25  mg/L  PEG  6000)  yaitu sebesar  4,835  mg/g,  tetapi  jika  dilihat  dari perlakuan K1P4 (1 mg/L 2,4-D + 25 mg/L PEG 6000)  didapatkan  hasil  yang  tidak  berbeda jauh yaitu  4,792  mg/g,  sehingga  penggunaan konsentrasi  2,4-D  dan  PEG  6000  yang  lebih efisien  didapatkan  pada  perlakuan  K1P4  (1 mg/L  2,4-D  +  25  mg/L  PEG  6000),  hal  ini didasarkan pada  penggunaan  dari 2,4-D mengingat  harga  2,4-D  lebih  mahal  dari  pada PEG  6000.  Sedangkan  kandungan  metabolit sekunder  steviosida  yang  terendah  didapatkan
dariperlakuan  K2P1  (2  mg/L  2,4-D  +  0  mg/L PEG  6000)  yaitu  sebesar  4,264  mg/g.  Maka berdasarkan  Gambar  1  dapat  diamati  bahwa kandungan steviosida meningkat seiring dengan peningkatan 2,4-D yang dikombinasikan dengan PEG  6000  dan  menunjukkan  kandungan steviosida  yang  lebih  rendah  seiring  dengan rendahnya  konsentrasi  2,4-D  tanpa  PEG  6000. Kualitas  kalus  ditunjukkan  pada  Gambar  2, kalus  berwarna  hijau  sebelum  perlakuan  dan berubah  berwarna coklat  setelah  perlakuan,  dan menunjukkan tekstur kompak.
A.

## B.
Gambar 2. Tekstur dan warna kalus sebelum perlakuan  (A), setelah perlakuan (B)

## PEMBAHASAN
PEG  merupakan  kimia  organik  yang digunakan sebagai osmotikum dan menyebabkan  stres  air  pada  tanaman.  Senyawa kimia tersebut mempunyai sifat tidak aktif, tidak bermuatan  ion,  kelarutan  dalam  air  tinggi walaupun  mempunyai  cincin  rantai  tinggi  lebih dari  4000  dapat  menginduksi  stres  air  pada tanaman  dengan  menurunkan  potensial  larutan nutrien, polietilen glikol tidak terserap dan tidak mengakibatkan  keracunan  pada  tanaman  (Dami dan Hughes, 1997).
Penggunaan  PEG  6000  dalam  jangka panjang pada tanaman relatif aman, karena PEG 6000  tidak  dapat  masuk  ke  dalam  jaringan tanaman  atau  dinding  selulosa.  Senyawa  PEG dengan  berat  molekul  6000  dipilih  karena mampu  bekerja  lebih  baik  pada  tanaman daripada  PEG  dengan  berat  molekul  yang  lebih rendah  dan  yang  lebih  tinggi.  PEG  di  bawah 6000  diduga  kurang  efektif  karena  kemampuan dalam  mengikat  air  terlalu  kecil.  Besarnya kemampuan  larutan  PEG  dalam  mengikat  air bergantung pada berat molekul dan konsentrasinya,  akan  tetapi  PEG  dengan  berat molekul  lebih  tinggi  dari  6000  akan  mengikat air yang terlalu besar sehingga tanaman semakin
sulit  menyerap  air  mengakibatkan  stresosmosis yang berlebihan dan tanaman bisa mati. Hal ini sesuai  dengan  yang  ditulis  oleh  Sulastri  (2010) pada  penelitiannya  tentang  tanaman  alfalfa, yaitu  alasan  digunakan  PEG  6000  MW  karena sifatnya  sebagai  polimer  yang  non  ionik  dapat berikatan  dengan  molekul  air  melalui  dua ikatan: ikatan hidrogen dan ikatan van der waals (menurunkan  nilai  potensial  air).  Sehingga diharapkan dengan terikatnya molekul air dalam media  oleh  PEG  6000  ketersediaan  air  untuk diserap  kalus  stevia  semakin  sedikit.  PEG  juga bersifat  tidak  toksik  dan  dengan  berat  molekul yang  besar,  yaitu  6000  g/mol,  maka  PEG  6000 tidak akan mudah melakukan penetrasi kedalam jaringan tanaman.
Secara  garis  besar  diduga  bahwa  PEG 6000  akan  mengaktifkan  signal  yang  berfungsi menginduksi  gen-gen  yang  berperan  dalam produksi  senyawa  steviosida  yang  terjadi melalui  jalur  biosintesis  yaitu  jalur  asam mevalonat.  Menurut  Sulastri  (2010)  dalam penelitiannya  pada  kalus  alfalfa  menuliskan bahwa  tanaman  memiliki  respon  yang  berbeda untuk  beradaptasi  pada  kondisi  stress  osmotik. Mekanisme  ini  salah  satunya  dikendalikan  oleh osmoregulator.  Hal  ini  mungkin  terjadi  pada
kalus  yang  ditumbuhkan  pada  media  dengan penambahan  PEG.  Pada  beberapa  tanaman ditemukan  glycine  betain  dan  prolin  sebagai osmoprotektan. Beberapa penelitian menunjukkan behwa molekul-molekul
terakumulasi dalam sel tanaman selama mengalami kondisi stres osmotik akan mencegah kerusakan sel karena dehidrasiseluler dengan menjaga keseimbangan tekanan osmotik dalam sitoplasma dan lingkungan.
Pemberian  PEG  akan  mempengaruhi penyerapan air sehingga kalus mengalami stres. Kekurangan  air  menurunkan  tekanan  turgor pada  dinding  sel.  Kehilangan  tekanan  turgor pada sel yang dikulturkan di medium perlakuan diindikasikan pula sebagai signal bagi membran plasma  untuk  mengaktifkan  protein  tertentu yang  mendorong  sintesis  ABA  (Asam  absisat). Keberadaan ABA pada akhirnya akan merangsang terbentuknya protein yang berperan sebagai  mekanisme  toleransi  terhadap  cekaman kekeringan  (protein  osmoprotektan)  (Hartanti, 2013). Protein osmoprotektan dapat berinteraksi dengan  reseptor  sistem  membran  plasma (Konstantinova,  2002  dalam  Hardiawan,  2013) menyebabkan  peningkatan  Ca2+  interseluler yang bertindak sebagai second messenger untuk menginduksi  transkripsi  dan  translasi  enzim- enzim  yang  terlibat  dalam  jalur  metabolit sekunder (Dmitrev, 1996 dan Silalahi, 1999).
Penambahan  zat  kimia  (PEG  6000) sebagai  osmotikum  mampu  meningkatkan aktivitas enzim yang berperan dalam biosintesis (Mathius, 2006). Pemberian PEG akan menyebabkan  kekurangan  air  sehingga  akan menginduksi protein, mengkode gen-gen pembentuk enzim yang terlibat dalam biosintesis  metabolisme  sekunder.  Dengan meningkatnya kandungan enzim dalam jaringan tanaman maka diharapkan kandungan  metabolit sekunder  dapat  meningkat  pula.  Diduga  enzim yang  dapat  memacu  pembentukan  senyawa terpenoid  antara  lain  adalah  enzim  asetil  CoA asetiltransferase,  HMG-CoA  reeduktase,  enzim mevalonat  kinase  dan  enzim  fosfomevalonat kinase.  Enzim  lain  yang  berperan  dalam memacu pembentukan senyawa terpenoid khususnya  steviosida  adalah  CPP  synthase, kaurene  sintase,  ent  kaurene  oxidase,  ent- Kaurenoic Acid 13-Hydroxylase.
Menurut  Larcher  dalam  Salisbury  dan Ross (1995), tumbuhan yang mulai mendapatkan  faktor  cekaman  mengalami  reaksi tanda  bahaya  yang  ditandai  dengan  mulai terganggunya  fungsi  fisiologis  dari  biasanya.
Kemudian  berlangsung  tahap  resistensi  yaitu organisme  beradaptasi  pada  faktor  cekaman. Tahap  selanjutnya  akan  terjadi  kematian  jika faktor cekaman meningkat atau terus berlangsung.
Meningkatnya  kandungan  steviosida selain  dipengaruhi  oleh  PEG  6000,  juga dipengaruhi oleh ZPT dalam hal ini adalah 2,4- D.  Menurut  Salisbury  dan  Ross  (1995) dijelaskan  bahwa  zat  pengatur  tumbuh  (2,4-D) terikat  pada  membran  protein  penerima  di membran  plasma  sel.  Kompleks  ikatan  ini mengaktifkan  enzim  fosfolipase  C  (PLC). Enzim PLC ini menghidrilisis fosfatidil inositol 4,5-bifosfat (P1P2) menghasilkan inositol 1,4,5- trifosfat  (IP3)  dan  diasil  gliserol  (DAG).  IP3 bergerak menuju vakuola sehingga menyebabkan  terlepasnya  Ca2+  simpanan masuk ke dalam sitosol. Meningkatnya konsentrasi Ca2+ di sitosol menyebabkan empat buah  Ca2+  bergabung  membentuk  kompleks dengan kalmodulin tidak aktif menjadi kalmodulin aktif, hal ini mengaktifkan beberapa enzim  yang  berperan  dalam  sintesis  saponin seperti  enzim  kinase.  Skualen  sintasedan  enzim NADH+  kinase.  Sedangkan  DAG  yang  tidak larut  dalam  air  berfungsi  dalam  membran plasma.  DAG  mengaktifkan  enzim  pada membran  yaitu  protein  kinase  C  (PKC).  Enzim ini  menggunakan  ATP  untuk  memfosforilasi beberapa  enzim  tertentu  yang  mengatur  pada tahap-tahap metabolisme.
Berdasarkan  penelitian  kadar  steviosida kalus stevia (Stevia rebaudiana Bert.) dilakukan dengan  menggunakan  metode  HPLC  (High Performance  Liquid  Chromatography)  maka dapat disimpulkan bahwa pemberian konsentrasi ZPT  2,4-D  yang  lebih  rendah  tanpa  adanya kombinasi  dengan  PEG  6000  menunjukkan hasil metabolit sekunder steviosida yang rendah, tetapi  seiring  dengan  pemberian  peningkatan konsentrasi  ZPT  2,4-D  yang  dikombinasikan dengan PEG 6000 dapat meningkatkan kandungan  metabolit  sekunder  steviosida  dari induksi kalus stevia (Stevia rebaudiana).
Perlu diingat juga, pemberian konsentrasi  PEG  6000  yang  terlalu  tinggi  pada kalus  menyebabkan  kalus  sulit  menyerap  air mengakibatkan  stres  osmosis  yang  berlebihan dan tanaman bisa mati. Kemampuan kalus dapat bertahan  hidup  pada  media  selektif  PEG tergantung  dari  konsentrasi  PEG, jenis tanaman dan  lamanya  kalus  mengalami  tekanan  seleksi dalam media yang diberi cekaman osmosis.

## KESIMPULAN
Produksi  metabolit  sekunder  steviosida yang  tinggi  diperoleh  dari  perlakuan  3  mg/L 2,4-D  dan  15  mg/L  PEG  6000)  yaitu  sebesar 4,846 mg/g. Tetapi yang lebih efisien diperoleh pada perlakuan 1 mg/L 2,4-D dan 25 mg/L PEG 6000  yaitu  sebesar  4,792  mg/g.  Pengamatan morfologi  kalus  (tekstur  dan  warna  kalus) menunjukkan  bahwa  kalus  bertekstur  kompak dan  berwana  coklat  akibat  cekaman  osmosis PEG  6000  memiliki  kandungan  metabolit sekunder steviosida tinggi.

## DAFTAR PUSTAKA
Ariningsih, Ika, Sholichatun, & Anggarwulan E. 2003.  Pertumbuhan  Kalus  dan  Produksi Antrakuonin
Mengkudu (Morinda citrofolia) pada Media Murashige-Skoog
(MS) dengan Penambahan Ion Ca 2+ dan
Cu 2+. Jurnal Biofarmasi 1(2): 39-43. Chatsudthipong,  V.,  &  Chatchai  M.  2009.
Stevioside  and  Related  Compounds: Therapeutic Benefits Beyond Sweetness.
Pharmacology  &  Therapeutics.  121
(2009) 41–54.
Ernawati, A. 1992. Produksi Senyawa-Senyawa Metabolit Sekunder dengan Kultur Jaringan  Tanaman  I.  Wattimena  G  A. Gunawan  L  W.  Matjik  N  A.  Syamsudin E,  Wiendi  NMA,  Ernawati  A,  Editor.
Bioteknologi  Tanaman  I.  Bogor:  PAU Bioteknologi IPB. Hlm, 160-220.
Fakhri,  A.  2010.  Kultur  In  Vitro  Tanaman Theobroma cacao dengan Variasi
Polietilen  Glikol  (PEG)  6000  dan Potensinya  Untuk  Produksi  Metabolit Sekunder  Katekin.  Skripsi.  Jurusan Kimia.  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Andalas.
Padang.
Fatima,  A  &  Shaista  J.K.  2010.  Some  factors affecting  the  in  vitro  growth  of  Stevia rebaudiana  Bertoni.  Iranian  Journal  of Plant Physiology 1 (2), 61-68.
Geuns,  Jan  M.C.  2003.  Molecules  of  Interest
Stevioside.  Phytochemistry  64:  913– 921.
Habibah,  N.  A.  2009.  Efektivitas  Penambahan
Elisitor Asam Jasmonik dalam
Peningkatan  Sintesis  Senyawa  Bioaktif Andrografolid  pada  Kultur  Suspensi  Sel Sambiloto. Biosaintifika 1(1): 11-18.
Hartanti,  M.  F.;  Nurhidayanti.  T.;  Muryono  M.
Budidaya Tanaman Tembakau
(Nicotiana  tabacum.  L.  var.  Prancak  95)
pada  Cekaman  Kekeringan  Polyethylene Glykol (PEG) Secara In Vitro. https://www.google.com/digilib.its.ac.id/ ITSUndergraduate-18903-Paper- 305304.pdf (diakses tgl 15 April 2013). Hendaryono,  D.P.  Sriyanti  &  Ari  W.  1994.
Teknik  Kultur  Jaringan  Pengenalan  dan Petunjuk  Perbanyakan  Tanaman  Secara Vegetatif-Modern. Yogyakarta: Kanisius.
Janarthanam,  B.,  M.  Gopalakrishnan  and  T.
Sekar.  2010.  Secondary  Metabolite Production  in  Callus  Cultures  of  Stevia rebaudiana  Bertoni.  Banglades  Journal of  Scientific  and  Industrial  Researc.
45(3): 243-248.
Jitendra, M et all. 2012. Micropropagation of an Anti  diabetic  Plant  -  Stevia  rebaudiana Bertoni,  (Natural  Sweetener)  in  Hadoti Region  of  South-East  Rajasthan,  India. ISCA  Journal  of  Biological  Sciences.
Vol. 1(3), 37-42.
Madan,  S.  2010.  Stevia  rebaudiana  (Bert.)
Bertoni  –  A  Review.  Indian  Journal  of Natural  Products  and  Resources.  Vol.  1 (3), pp. 267-286.
Pandiangan, M, Nainggolan, N. 2006. Prningkatan  Kandungan  Katarantin  pada Kultur  Kalus  Chatarantus  roseus  dengan Pemberian  Naphtalene  Acetic  Acid. Jurnal Hayati. 13(3): 90-94.
Salisbury,  F.B.  dan  C.W.  Ross.  1995.  Fisiologi Tumbuhan. Jilid 3. Penerjemah: Lukman, D.R. dan Sumaryono. Bandung: Penerbit ITB.
Shirwaikar, Annie, Vinit P, Jay B & Saleemulla
K. 2011. Identification and estimation of stevioside  in  the  commercial  samples  of stevia  leaf  and  powder  by  HPTLC  and HPLC.  Research  Article.  2(9):  0976- 7126.
Sulastri.  2010.  Pengembangan  Alfalfal  Tropis Kekeringan  Hasil  Radiasi  Sinar  UV-C: Seleksi  In  Vitro,  In  Vivo,  dan  Uji Multilokasi.  Laporan  Akhir.  Program Intensif Terapan.
Yulinda,  E.  2010.  Kultur  In  Vitro  Tanaman Centella asiatica dengan Beberapa Konsentrasi  Polietilen  Glikol  (PEG) 6000  dan  Potensinya  Untuk  Produksi Metabolit Sekunder Triterpenoid. Skripsi Sarjana  Kimia.  Jurusan  Kimia.  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam. Universitas Andalas. Padang.
Zulhilmi,  S  &  Netty  W.S.  2012.  Pertumbuhan dan  Uji  Kualitatif  Kandungan  Metabolit
Sekunder  Kalus  Gatang  (Spilanthes acmella Murr.) dengan Penambahan PEG untuk Menginduksi Cekaman Kekeringan Pertumbuhan dan Uji Kualitatif Kandungan Metabolit Sekunder  Kalus  Gatang  (Spilanthes acmella Murr.) dengan Penambahan PEG untuk Menginduksi Cekaman Kekeringan.  Jurnal  Biologi  Universitas
Andalas (J. Bio. UA.) 1(1): 1-8.