ANALISIS SEKUENS Gen mat K Sansevieria trifasciata var. Laurentii DAN var. Hahnii
Riano Rembet 1) , Johanis J. Pelealu 1) , Beivy J. Kolondam 1) , Trina E. Tallei 1*)
1) Jurusan Biologi FMIPA Universitas Sam Ratulangi
* trina_tallei@unsrat.ac.id

## ABSTRACT
Sansevieria  has  many  hybrids  and  horticultural  varieties  so  that  the  classification  of  this plant  in  the  genus  is  often  difficult  to  do.  In  the  Sansevieria  genera,  S.  trifasciata  is  the  most commercialized species. There are at least 20 cultivars of this species that have been sold around the world. Two varieties among S. trifasciata collected by ornamental plant collectors are var. Laurentii and var. Hahnii. Morphological characters of both plants are very distinct, so they may be considered as different species. Lack of information about the genetic variation in S. trifasciata encouraged this study.  This  study  aimed  to  assess  differences  in  matK  gene  sequences  between  S.  trifasciata  var. Laurentii and var. Hahnii, as well as to compare them with matK sequence of S. trifasciata obtained from GenBank. Total DNA was extracted from fresh leaves using innuPREP Plant DNA Kit (Analytik Jena)  in  accordance  with  the  protocol  provided.  DNA  obtained  was  used  for  the  PCR  process  to obtain the matK gene fragment. Primer pairs used for amplification and gene sequencing were 3F-r and 1R-f. The results showed that there were no differences among matK sequences of S. trifasciata var.  Laurentii,  S.  trifasciata  var.  Hahnii,  and  S.  trifasciata  obtained  from  GenBank.  In  conclusion, those plants are the same species.
Keywords :  matK  gene,  hybrid,  Sansevieria  trifasciata  var.  Laurentii,  Sansevieria  trifasciata  var. Hahnii, genetic variation, variety

## ABSTRAK
Sansevieria memiliki  banyak  sekali  hibrida  dan  varietas  hortikultur  sehingga  klasifikasi tumbuhan  ini  di  dalam  genusnya  seringkali  sulit  sekali  dilakukan.  Di  dalam  genus Sansevieria , S. trifasciata merupakan  spesies  yang  paling  dikomersilkan.  Paling  tidak  terdapat  20  kultivar  dari spesies  ini  yang  telah  dijual  di  seluruh  dunia.  Dua  di  antara  varietas S.  trifasciata yang  banyak dikoleksi oleh para kolektor Sansevieria yaitu S. trifasciata var. Laurentii dan var. Hahnii. Karakter morfologi  kedua  tumbuhan  ini  sangat  berbeda  sehingga  terdapat  kemungkinan  dianggap  sebagai spesies yang berbeda. Kurangnya informasi mengenai variasi genetik pada S. triafsciata mendorong dilakukannya  penelitian  ini.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menganalisis  sekuens  gen mat K S. trifasciata var. Laurentii dan S. trifasciata var. Hahnii , serta membandingkannya dengan S. trifasciata yang diperoleh dari GenBank. DNA total diekstraksi dari daun segar menggunakan innuPREP Plant DNA  Kit  (Analytik  Jena)  sesuai  dengan  protokol  yang  telah  disediakan.  DNA  yang  diperoleh digunakan  untuk  proses  PCR  untuk  mendapatkan  fragmen  gen mat K.  Pasangan  primer mat K  yang digunakan  untuk  amplifikasi  dan  sekuensing  yaitu  3F-r  dan  1R-f.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  tidak  terdapat  perbedaan  sekuens mat K  antara S.  trifasciata var.  Laurentii  dan S.  trifasciata var. Hahnii, maupun dengan S. trifasciata yang ada di GenBank. Kesimpulan dari penelitian ini yaitu tumbuhan-tumbuhan ini merupakan spesies yang sama.
Kata  kunci :  gen mat K,  hibrida, Sansevieria  trifasciata var.  Laurentii, Sansevieria  trifasciata var. Hahnii, variasi genetik, varietas

## PENDAHULUAN
Sansevieria merupakan genus yang  terdiri  atas  banyak  spesies. Tumbuhan  ini  merupakan  tumbuhan asli  Afrika,  Madagaskar  dan  Asia bagian  selatan  (Alfani et  al .,  1989) dan memiliki nama umum yaitu lidah mertua,  lidah  setan,  lidah  jin,  dan lidah  ular  (Takawira  dan  Nordal, 2002). Sansevieria sering dimasukkan  dalam  genus Dracaena di  dalam  sistem  klasifikasi  APGII
( Angiosperm  Phylogeny  Group II).
Kedua  genus  ini  termasuk  dalam famili Asparagaceae, subfamili Nolinoideae (sebelumnya Ruscaceae), dan juga pernah ditempatkan sebelumnya dalam famili Dracaenaceae (Lu dan
Clifford, 2014).
Sansevieria memiliki  banyak sekali hibrida dan varietas hortikultur sehingga  klasifikasi  tumbuhan  ini  di dalam  genusnya  seringkali  sulit sekali dilakukan (Acevedo- Rodríguez  dan  Strong,  2005).  Di dalam  genus Sansevieria ,  spesies S. trifasciata merupakan  spesies  yang paling  dikomersilkan.  Paling  tidak terdapat  20  kultivar  dari  spesies  ini yang  telah  dijual  di  seluruh  dunia (Henley et  al .,  1991).  Kultivar merupakan  sekelompok  tumbuhan yang  telah  diseleksi  berdasarkan  ciri tertentu  yang  khas  yang  dapat dibedakan secara jelas dari kelompok lainnya  dan  tetap  mempertahankan ciri  khas  ketika  diperbanyak,  baik secara  seksual  maupun  aseksual (Novita, 2007).
Sifat  genetik S.  trifasciata yang  tidak  stabil  mengakibatkan
adanya  perubahan  warna  guratan, bentuk, corak, dan warna daun, yang mungkin  disebabkan  oleh  adanya mutasi gen atau kromosom (Purwanto,2006). Pada genus Sansevieria terdapat banyak tumbuhan variegata  yang disebabkan oleh  variegasi  alamiah.  Variegasi alamiah  ini  sangat  stabil  sehingga identifikasi tumbuhan berbasis warna variegata sulit dilakukan. Pada tumbuhan  seperti  ini,  materi  genetik yang  pada  biji  akan  menghasilkan keturunan  yang  memiliki  variegasi yang  sama  atau  serupa  dengan induknya  (Stein,  2011). Sansevieria hargesiana merupakan  salah  satu contoh variegata alamiah. Adanya mutasi yang memungkinkan  hadirnya  varietas- varietas  baru  pada S.  trifasciata dan kurangnya informasi mengenai variasi  genetik  pada S.  triafsciata mendorong dilakukannya identifikasi lebih dalam dengan tujuan mengetahui  adakah  variasi  genetik pada  varietas S.  trifasciata .  Salah satu  metode  untuk  mempelajari adanya  variasi  genetik  yaitu  dengan menggunakan  DNA barcode (kode batang  DNA).  Kode  batang  DNA juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi  spesies  berdasarkan variasi  pada  sekuens  marka  kode batang  DNA  (Kress et  al .,  2005). DNA Barcode mampu  menyediakan identifikasi  yang  cepat  dan  akurat dari organisme  yang kode batangnya telah  terdata  di  pustaka  sekuens. Idealnya, DNA barcode yang digunakan  untuk  identifikasi  spesies memiliki variasi sekuens yang cukup
di antara spesies dan variasi intraspesifik  yang  rendah  (Kress  dan
Erickson, 2007).
Salah  satu  metode  untuk
mempelajari  adanya  variasi  genetik yaitu  dengan  menggunakan DNA
barcode (kode  batang  DNA).  Kode batang  DNA  juga  dapat  digunakan untuk mengidentifikasi spesies berdasarkan  variasi  pada  sekuens marka  kode  batang  DNA  (Kress  et al.,  2005). DNA  Barcode mampu menyediakan  identifikasi  yang  cepat dan akurat dari organisme yang kode batangnya  telah  terdata  di  pustaka sekuens.  Idealnya, DNA  barcode yang  digunakan  untuk  identifikasi spesies  memiliki  variasi  sekuens yang  cukup  di  antara  spesies  dan variasi  intraspesifik  yang  rendah (Kress  dan  Erickson,  2007).  Salah satu marka molekuler yang digunakan  dalam  kode  batang  DNA
yaitu  gen mat K.  Poliformisme  pada gen  matK  telah  umum  digunakan dalam  kajian  filogenetik  berbagai tumbuhan (Shaw et al., 2005).
Dua  di  antara  varietas S. trifasciata yang  banyak  dikoleksi oleh para kolektor tanaman hias yaitu S.  trifasciata var.  Laurentii  dan  var. Hahnii.  Karakter  morfologi  kedua tumbuhan ini sangat berbeda sehingga terdapat kemungkinan dianggap sebagai spesies yang berbeda. Kurangnya informasi mengenai  variasi  genetik  pada S. triafsciata mendorong  dilakukannya penelitian  dengan  tujuan  mengetahui apakah terdapat variasi sekuens DNA mat K  pada S.  trifasciata var. Laurentii  dan  var.  Hahnii  dan membandingkannya  dengan  sekuens DNA mat K S.  trifasciata pada
GenBank. Metode Penelitian Spesimen Tumbuhan Spesimen Sansevieria trifasciata v  var.  Laurentii  (Gambar
1)  dan Sansevieria  trifasciata var.
Hahnii  (Gambar  2)  diperoleh  dari halaman  Jurusan  Biologi  FMIPA Universitas  Sam  Ratulangi.  Sampel yang digunakan yaitu spesimen daun segar berukuran 0,5 x 0,5 cm.
Gambar  1. S. trifasciata var. Laurentii (CABI, ) Gambar 2. S. trifasciata var. Hahnii (Nickrent, 2009)

## Ekstraksi DNA
DNA  total  diekstraksi  dari daun  segar  menggunakan  innuPREP Plant  DNA  Kit  (Analytik  Jena) sesuai  dengan  protokol  yang  telah disediakan.  DNA  yang  diperoleh
digunakan  untuk  proses  PCR  untuk mendapatkan fragmen gen mat K.
Amplifikasi Gen matK dan Sekuensing Amplifikasi gen mat K dilakukan  di  dalam  tabung  reaksi  50 μl  menggunakan  5XFirepol  PCR Master  Mix  Ready-to-Load  (Solis Biodyne)  yang  terdiri  atas  1x reaction  buffer ,  1,25  unit Taq polymerase ,  200  μM  masing-masing dNTP,  1,5  mM  MgCl 2 ,  10  pmol masing-masing  primer  dan    1  μl sampel  DNA.  (Kolondam,  2015). Pasangan  primer  yang  digunakan untuk amplifikasi dan sekuensinggen mat K yaitu 3F-r (5’ CGTACAGTACTTTTGTGTTTAC GAG 3’) dan 1R-f (5’ ACCCAGTCCATCTGGAAATCTT GGTTC  3’)  (Little  and  Stevenson 2007). Amplifikasi dilakukan
dengan kondisi  denaturasi  awal  pada 95°C selama 2 menit dan dilanjutkan dengan  35  siklus  yang  terdiri  atas denaturasi  pada  95°C  selama  30 detik,  penempelan primer pada  50°C selama  30  detik,  dan  polimerisasi pada  72°C  selama  50  detik.  Produk hasil amplifikasi dipisahkan
menggunakan elektroforesis di dalam 1%  gel  agarosa  (Kolondam,  2015). Proses  sekuensing  dilakukan  oleh Perusahaan  First  Base  Malaysia dengan  mengirim  hasil  PCR  beserta primer  untuk  dilakukan  sekuensing dua arah ( Bi-directional ).

## Analisis Data
Data  sekuens  dirakit  dan diedit  menggunakan  Genious  v  5.6 mengikuti prosedur Tallei dan Kolondam  (2015).  Sekuens  primer dikeluarkan dari sekuens lalu dijajarkan  menggunakan  multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multa lin/) dan semua gap dianggap sebagai karakter  yang  hilang  (Zhang  et  al. 2014),  kemudian  disesuaikan  secara manual  sesuai  panduan  Tallei  dan Kolondam  (2015).  Sekuens mat K digunakan  untuk  mencari  sekuens serupa  di Basic  Local  Alignment Search Tool (BLAST) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.c gi). Sekuens-sekuens mat K dijajarkan  menggunakan  Multalin V.5.4.1  yang  dikembangkan  oleh Corpet (1988) (http://multalin.toulouse.inra.fr/ multalin/).  Kedua  ujung  sekuens dipotong  pada  saat  penjajaran  untuk menghindari salah pembacaan sehingga  menyisakan  kira-kira  913- 914 nukleotida. Disebabkan pendeknya  beberapa  sekuens  yang diperoleh dari GenBank, maka semua  sekuens  dipotong  hingga menyisakan 648 nukleotida. Penjajaran akhir dan Matriks persentase  identitas (percent  identity matrix )  dibuat  menggunakan  Clustal 2.1 dari Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clu stalo/).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Keanekaragaman genetik dibutuhkan  agar  suatu  kelompok populasi dapat melanjutan kehidupannya. Kurangnya keanekaragaman genetik bisa berpotensi membahayakan suatu populasi (Zang et al ., 2014). Berbagai penanda molekuler digunakan  untuk  menginvestigasi keanekaragaman  genetik,  misalnya
gen mat K  yang  memiliki  panjang
1500  bp. Mat K  telah  digunakan dalam  sistematika  molekuler  dan evolusi  dan  terletak  di  dalam  intron gen trn K kloroplas pada bagian kopi- tunggal  yang  besar  yang  berdekatan dengan ulangan yang terbalik
( inverted repeat ).
Gen parsial mat K dari genom
kloroplas S. trifasciata var. Hanii dan var.  Laurentii  berhasil  diamplifikasi menggunakan  PCR  (Gambar  3). Ukuran  masing-masing  amplikon kira-kira  900  bp.  Setelah  disunting menggunakan  program  Geneious, sekuensnya digunakan untuk mencari sekuens  yang  serupa  pada  GenBank. Daerah  gen mat K  dari Sansevieria trifasciata var.  Hanii  dan  Laurentii yang  diamplifikasi  terletak  pada nukleotida  494  -    1377  dari  1557 pada  genom  kloroplas Sansevieria
trifasciata yang diperoleh dari GenBank. Hasil penyuntingan sekuensing S.  trifasciata var.  Hanii dan  var.  Laurentii  yaitu  856  bp dengan  kandungan  GC  31,89%. Hasil  ini  mendekati  hasil  penelitian yang  dilakukan  oleh  Guisinger e.al . (2010)  yang  melaporkan  bahwa
genom  plastid  yang  utuh  dari T. Latifolia memiliki  kandungan  GC 33,8%. Pada pencarian menggunakan BLAST,  sekuens  yang  memiliki identitas  yang  paling  serupa  dengan S. trifasciata var.  Hanii maupun var.
Laurentii dengan S. trifasciata
JQ276422.1 dan S. trifasciata HM640584.1 dengan kemiripan 100%. Gambar  3.  Hasil  amplifikasi  gen mat K parsial
menggunakan sepasang primer 3F-r dan 1R-f. Hasil penjajaran sekuens
mat K S.  trifasciata var Hanii,  S. trifasciata var Laurentii,S. trifasciata
JQ276422.1 dan S. trifasciata HM640584.1 menggunakan Multalin version  5.4.1  dapat  dilihat  pada Gambar  4.  Keempat  sekuens  tidak memiliki  variasi  sehingga  persentase identitasnya  100%.  Hal  yang  serupa ditemukan oleh Lawodi et al. (2013) bahwa  tidak  ada  perbedaan  sekuens mat K  pada  tomat  keriting  dan  tomat
apel,  dan  juga  di  antara  tomat  ceri (buah kecil), yang keempatnya
merupakan  spesies  yang  sama  yaitu Solanum  lycopersicum .  Tallei  dan Kolondam (2015) menemukan bahwa  tidak  terdapat  perbedaan sekuens mat K pada Myristica
fragrans , M. fatua , M. maingayi , dan M.  globosa .  Hasil  ini  menunjukkan
bahwa  gen mat K  saja  tidak  mampu membedakan  spesies  pada  beberapa spesies Myristica ,  meskipun  tingkat pembeda mat K lebih tinggi dibandingkan  dengan  gen rbc L. Dengan  demikian  gen mat K  tidak dapat  digunakan  untuk  membedakan sekuens intraspesies pada Sansivieria .
Gambar 4. Hasil penjajaran sekuens mat K S.  trifasciata var.  Hanii ,  S. trifasciata var. Laurentii , S. trifasciata JQ276422.1  dan S. trifasciata HM640584.1 menggunakan Multalin version 5.4.1  Persentase  identitas  semua sekuens yaitu 100. Jarak genetik intraspesies pada S.  trifasciata yaitu  0.000. Sebagai  perbandingan,  jarak  genetik mat K kelompok tumbuhan
Astragalus ,  rata-rata  minimal  jarak intraspesies  ( intraspecific  distance )
yaitu  0.0014  ±  0.0022  (Zheng et  al ., 2014). Uji variasi genetik berdasarkan  jarak  K2P  untuk mat K tumbuhan-tumbuhan  medisinal  di Afrika  Selatan  menunjukkan  jarak interspesies  (intermedian  =  0,232) yang  secara  signifikan  lebih  tinggi dibandingkan dengan jarak intraspesies (intermedian = 0,00).

## KESIMPULAN
Penelitian  ini  menunjukkan bahwa mat K  tidak  dapat  digunakan untuk membedakan variasi intraspesies pada Sansevieria trifasciata karena  tidak  terdapat perbedaan  sekuens mat K  antara S. trifasciata var. Laurentii , S. trifasciata var Hahnii dan S. trifasciata yang diperoleh dari GenBank,  yang  ditunjukkan  dengan jarak genetik 0.

## DAFTAR PUSTAKA
Acevedo-Rodríguez, P., Strong, M.T. 2005. Monocots and gymnosperms  of  Puerto  Rico and the Virgin Islands. Contributions  from  the  United States National Herbarium
52:1-416.
http://botany.si.edu/Antilles/PR Flora/monocots/ Alfani,  A.,  Ligrone,  R.,  Fioretto,  A., Virzo  de  Santo,  A.  1989. Histochemistry,  ultrastructure and  possible  significance  of dead  parenchyma  cells  with specializedwalls in the leaf and rhizome  of  Sansevieria. Plant Cell  and  Environment 12:  249
–259 Guisinger,    M.M.,  Chumley,  T.W.,
Kuehl, J.V., Boore, J.L. Jansen,
R.K.  2010.  Implications  of  the plastid    genome  sequence  of Typha  (Typhaceae,  Poales)  for understanding genome evolution  in  Poaceae.  J  Mol Evol. 70:149–166. Henley,  R.W.  1982.  Sansevieria  in Florida  -  Past  and  Present. Proceedings  of  the  Florida State Horticultural Society 95:295-298. ISSG. 2012. Global Invasive Species Database  (GISD).  Auckland,
New  Zealand:  University  of Auckland.http://www.issg.org/ database Kolondam,  B.J.  2015.  Applying
mat K gene for identification of Liliopsida  plant  species  from
North Sulawesi through BOLD systems.  International  Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology 6(2):242-245. Lawodi,  E.N.,  Tallei,  T.E.,  Mantiri, F.R.,  Kolondam,  B.J.  Variasi genetik  tanaman  tomat  dari beberapa  tempat  di  Sulawesi berdasarkan gen Mat K. Pharmacon Jurnal Ilmiah Farmasi 2(4): 114-121 Lu,  P-L.  dan  Clifford,  W.  2014. Phylogenetic relationships among Dracaenoid genera (Asparagaceae: Nolinoideae)
inferred from chloroplast DNAl. Systematic Botany 39(1):90-104. Napoli,  C.,  Lemiex,  C.  &  Jorgensen R.  1990.  Introduction  of  a chimeric  chalcone  synthase gene  into  petunia  results  in reversible  co-suppression  of homologous genes in trans. The Plant Cell 2(4): 279-289 Nickrent,  D.L.  2009.  Potted  Plant, Vegetative. http://www.phytoimages.siu.ed u/imgs/paraman1/r/Ruscaceae_ Sansevieria_trifasciata_17077. html Shaw,  J.,  Lickey,  E.B.,  Beck,  J.T.,
Farmer,  S.B.,  Liu,  W.,  Miller, J., Siripun, K.C., Winder, C.T., Schilling,  E.E.,  Small,  R.L. 2005. The tortoise and Hare II: relative  utility  of  21noncoding chloroplast DNA sequences for phylogeneticanalysis  . Am.  J. Bot. 92:142-166.
Stein, G. 2011. Variegation in Plants. http://davesgarden.com/guides/ articles/view/3423. Diakses tanggal 27 April 2016. Takawira,  R.,  Nordal,  I.  2002.  The genus Sansevieria( family Dracaenaceae)in Zimbabwe .Acta  Horticulturae (572): 189-198.
Tallei,  T.E.,  Kolondam,  B.J.  2015. DNA  barcoding  of  Sangihe nutmeg  ( Myristica  fragrans ) using mat K  Gene. HAYATI Journal of Biosciences 22(1):41-47. DOI: 10.4308/hjb.22.1.41 USDA. 2015. United State Department  of  Agriculture, Natural Resources Conservation Services. http://plants.usda.gov/ Zhang,  X.,  Xuan,  Gu.,  Guo,  Z.,  Li, L., Song, X., Liu, S., Zang, Y.,
Li,  Y.,  Liu,  C.,  Wei,  S.  2014. Genetic diversity and population  structure  of  Rheum tanguticum (Dahuang) in
China. Chin  Med .  2014;  9:  26.
doi:  10.1186/1749-8546-9-26 Zheng,  S.H.,    Ren,  W.G.,    Wang, Z.H.,    Huang,  L.F.  2015.  Use
of  chloroplast  DNA  barcodes to  identify  Osmunda  japonica and its adulterants. Plant Systematics  And  Evolution, 301(7):1843–1850.