March 2017
AKTIVITAS KOMBINASI EKSTRAK ETANOL DAUN SIRSAK ( Annona muricata L.) DAN DAUN PEGAGAN ( Centella asiatica L.Urb) TERHADAP KELARUTAN KALSIUM BATU GINJAL SECARA IN VITRO

## ACTIVITIY OF ETHANOL EXTRACT COMBINATION BETWEEN
SOURSOP ( Annona muricata L.) LEAVES AND GOTU KOLA ( Centella asiatica L.Urb ) LEAVES  ON THE SOLUBILITY OF KIDNEY STONE CALCIUM IN VITRO
Ni Wayan Swintari * , Yuliet, Khildah Khaerati Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Tadulako, Palu.
Received 15 Juli 2016/Accepted 4 Oktober 2016

## ABSTRAK
Tanaman sirsak ( Annona muricata L.) dan pegagan ( Centella asiatica L.Urb) merupakan tanaman yang dapat dimanfaatkan sebagai obat peluruh batu ginjal. Hal ini karena adanya kandungan senyawa bioaktif antara lain  flavonoid  khususnya  dibagian  daun.  Penggunaan  kombinasi  ekstrak  daun  sirsak  dan  pegagan  dapat meningkatkan  efektivitasnya  untuk  meluruhkan  kalsium  batu  ginjal.  Oleh  karena  itu  penelitian  ini  bertujuan untuk mengetahui aktivitas serta menentukan kombinasi dosis ekstrak etanol daun sirsak (DS) dan daun pegagan (DP) yang efektif  untuk  melarutkan kalium batu ginjal. Ekstrak dibuat dengan  metode  maserasi  menggunakan pelarut etanol 96% kemudian selanjutnya dilakukan uji penapisan fitokimia dan profil KLT pada masing-masing ekstrak.  Hasil  kromatogram  menunjukkan  ekstrak  mengandung  flavonoid.  Pengujian  aktivitas  kombinasi ekstrak daun sisrak dan pegagan dilakukan dengan menggunakan tujuh perlakuan yaitu kombinasi 1(DS 1% + DP 7,5%), kombinasi 2 (DS 0,5% + DP 3,75%), kombinasi 3 (DS 0,25% + DP 1,875%), ekstrak tunggal daun sirsak  (1%),  ekstrak  tunggal  pegagan  (7,5%),  kontrol  negatif  (Aquades)  dan  kontrol  positif  (Batugin  eliksir). Batu ginjal kemudian dimasukkan sebanyak 100 mg ke dalam masing-masing perlakuan dan diinkubasi selama 6  jam  (37 ℃ ).  Hasil  filtrat  kemudian  didestruksi  dan  diukur  kadar  kalsium  terlarut  menggunakan Spektrofotometer Serapan Atom. Hasil penelitian menunjukkan kombinasi ekstrak etanol daun  sirsak dan daun pegagan  dengan  kombinasi  ekstrak  2  (DS  0,5%  +  DP  3,75%)  merupakan  kombinasi  yang  efektif  terhadap kemampuan melarutkan kalsium batu ginjal secara in vitro .
Kata kunci : Annona muricata L, Centella asiatica L.Urb, Batu ginjal, Kalsium

## ABSTRACT
Soursop ( Annona muricata L.) and gotu kola ( Centella asiatica L.Urb) is a plant that can be used as a laxative medicine kidney stones. This is because of the content of bioactive compounds including flavonoids, especially  the  leaf  section.  The  use  of  a  combination  of  soursop  leaf  extract  and  gotu  kola  can  improve  their effectiveness in order to remove calcium kidney stones. Therefore, this study aims to determine the activity and to determine dose combination soursop leaf ethanol extract (SS) and gotu kola leaf (GK) which is effective for dissolving  potassium  kidney  stones.  Extracts  prepared  by  maceration  method  using  ethanol  96%  then subsequently  tested  phytochemical  screening  and  thin  layer  chromatography  profiles  on  each  extract.  Results chromatogram showed the extract containing flavonoids. Testing the activity of the combination of soursop and gotu  kola  extract  performed  using  seven  treatments,  combination  1  (SS  1%  +  GK  7.5% ),  a  combination  of  2 (SS    0.5%  +  GK  3.75%),  the  combination  of  3  (SS  0,  25%  +  GK  1.875%),  single  soursop  leaf  extract  (1%), single gotu kola extract (7.5%), negative control (aquadest) and positive control (Batugin elixir). Kidney stones are  then  put  as  much  as  100  mg  in  each  treatment  and  incubated  for  6  hours  (37 ℃ ).  Results  filtrate  then didestruksi  and  dissolved  calcium  levels  measured  using  Atomic  Absorption  Spectrophotometer.  The  results showed  the  combination  soursop  leaf  ethanol  extract  and  gotu  kola  leaf  extract  with  a  combination  of  2  (SS 0.5% + GK 3.75%) is an effective combination of the ability to dissolve calcium kidney stones in vitro.
Keyword: Annona muricata L, Centella asiatica L.Urb, Kidney Stones, Calcium.
* Corresponding Author: Ni Wayan Swintari niwayan-swintari@yahoo.com (ph : +62-852-5636-3782)

## PENDAHULUAN
Ginjal  merupakan  organ  penting  pada manusia.  Ginjal  memiliki  banyak  fungsi  antara lain    seperti  pengatur  keseimbangan  air, konsentrasi kadar garam dalam darah, keseimbangan asam basa dalam darah, ekskresi zat  sisa  dan  kelebihan  garam  (Pearce,  2002). Ginjal  menjalankan  fungsi  vital  sebagai pengatur  volume  dan  komposisi  kimia  darah dan lingkungan dalam tubuh dengan mengekskresikan zat terlarut dan air seni secara selektif.  Fungsi  vital  ginjal  dicapai  dengan filtrasi plasma darah melalui glomerulus dengan reabsorpsi  sejumlah  zat  terlarut  dan  air  dalam jumlah  yang  sesuai  disepanjang  tubulus  ginjal. Kelebihan  zat  terlarut  dan  air  diekskresikan keluar  tubuh  dalam  urin  melalui  sistem pengumpulan urin (Price dan Wilson, 2005).
Salah  satu  masalah  kesehatan  yang menempati urutan ketiga setelah infeksi saluran kemih dan kelainan prostat pada sekian banyak penyakit saluran kemih yang akibat terburuknya dapat  menyebabkan  gagal  ginjal  adalah  batu ginjal (Wijaya dan Darsono, 2005). Batu ginjal merupakan  gangguan  kesehatan  pada  organ ginjal dimana terdapat batu-batu yang terbentuk di dalam ginjal akibat pengendapan yang terjadi di  urin  yang  bergerak  turun  ke  saluran  kemih (ureter). Batu dapat terbentuk di seluruh saluran kemih terutama pada tempat-tempat yang sering mengalami  hambatan  aliran  urin  (statis  urine) yaitu  pada  sistem  kalises  ginjal  atau  buli-buli. Bagian  dari  batu-batu  tersebut  seringkali terbawa  keluar  bersama  air  seni.  Kadangkala batu-batu  tersebut  menjadi  semakin  besar apabila  tidak  diobati.  Akibatnya  dari  batu-batu yang  membesar  ini  maka  keluarnya  air  seni terganggu, karena batu-batu tersebut bentuknya seperti  karang  yang  pinggir-pinggirnya  runcing sering  menimbulkan  pendarahan  pada  waktu buang  air,  rasa  pedih  dan  sakit  (Yasmine, 2007).
Batu  ginjal  dibagi  menjadi  beberapa jenis yaitu batu kalsium, batu infeksi, batu asam urat,  dan  batu  sistin.  Batu  kalsium  paling banyak  ditemukan,  yaitu  70-75%  dari  jumlah pasien batu ginjal. Penyebab terbentuknya batu ginjal  antara  lain  kurang  minum,  terlalu  lama menahan kencing, dehidrasi, infeksi ginjal, dan makanan  yang  mengandung  zat  yang  mudah mengkristal  (kalsium,  oksalat,  asam  urat) (Marshal, 2003).
Upaya  penyembuhan  batu  ginjal dengan pembedahan, endoskopi atau gelombang  ultrasonik  membutuhkan  biaya relatif  tinggi  sehingga  penggunaan  obat  yang dapat  mencegah  dan  meluruhkan  batu  ginjal lebih dipilih. Batu ginjal yang masih berukuran kecil sampai sedang masih dimungkinkan untuk dilarutkan  dengan  senyawa  tertentu.  Beberapa tanaman  dilaporkan  dapat  membantu  kelarutan batu ginjal tertentu dan meningkatkan air kemih sebagai  pembantu  pembuangan  melalui  urin. Tanaman  yang  telah  diuji  tentang  adanya pembentukan kompleks antara flavonoid dalam daun pandan wangi dengan kalsium dalam batu ginjal yang menyebabkan adanya daya melarutkan  infus  daun  pandan  wangi  terhadap kalsium  batu  ginjal  secara in  vitro oleh Rahardjo  (2003).  Andrianto  (2012),  telah meneliti  adanya  kemampuan  ekstrak  daun ciplukan  dalam  melarutkan  kalsium  batu  ginjal secara in  vitro dengan  adanya  pembentukan kompleks  antara  flavonoid  dalam  ekstrak  daun ciplukan.  Secara  normal,  pembentukan  batu ginjal  dihambat  oleh  flavonoid,  kalium, magnesium, dan asam sitrat
Pegagan Centella asiatica (L) merupakan  salah  satu  tumbuhan  liar  yang banyak  tumbuh  di  perkebunan  dan  memiliki beragam  manfaat  untuk  mengobati  berbagai masalah  kesehatan.  Khasiat  dan  manfaat pegagan antara lain karena pegagan mengandung  sejumlah  nutrisi  dan  komponen zat kimia yang memiliki efek terapeutik. Herba pegagan  dipilih  sebagai  bahan  utama  karena termasuk salah satu tanaman unggulan. Penelitian  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol daun  pegagan  mempunyai  aktivitas  diuretik pada dosis 500 mg/kg BB (Roopesh, 2011) dan pada  penelitian  Sri  Endah  Suhartatik  (1989) menyatakan bahwa infusa daun pegagan dengan kadar  7,5%  yang  paling  baik  untuk  melarutkan kalsium batu ginjal yaitu sebesar 153,7275 ± 1, 0155 mg/L.
Selain  pegagan,  daun  sirsak  juga merupakan  salah  satu  tanaman  yang  tumbuh  di Indonesia  yang  memiliki  banyak  manfaat  dan kegunaan.  Tiap  bagian  dari  tanaman  ini memiliki banyak manfaat, salah satunya adalah daunnya.  Daun  sirsak  telah  digunakan  oleh sebagian  masyarakat  Indonesia  sebagai  obat tradisional,  diantaranya  sebagai  obat  sakit pinggang,  mengurangi  rasa  nyeri,  gatal-gatal, reumatik,  obat  bisul,  dan  penurun  panas
(Mardiana,  2011).  Berdasarkan  penelitian Triana Susilawati (1999) tentang daya melarutkan  fraksi  air  dan  fraksi  etil  asetat ekstrak  etanol  daun  sirsak  terhadap  batu  ginjal kalsium, menyatakan bahwa ekstrak daun sirsak mampu  melarutkan  kalsium  batu  ginjal  dengan konsentrasi paling baik yaitu 1%.
Berdasarkan  uraian  diatas  mengenai khasiat  kandungan  kimia  daun  sirsak  dan  daun pegagan,    maka  peneliti  ingin  mengetahui aktivitas  ekstrak  etanol  daun  sirsak  ( Annona muricata )  yang  dikombinasi  dengan  pegagan ( Centella  asiatica )  untuk  melarutkan  kalsium batu  ginjal  secara  in  vitro  untuk  melihat efektivitas  kedua  ekstrak  tersebut  apakah memiliki  aktivitas  yang  sinergis  yang  akan berefek  potensiasi,  yaitu  kedua  ekstrak  saling memperkuat  khasiatnya  atau  efek  semakin berkurang  karena  terjadi  interaksi  antara  kedua ekstrak.

## METODE PENELITIAN Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  daun  sirsak  ( Annona muricata L.),  daun  pegagan  ( Centella  asiatica L.Urb),  aquadest,  batu  ginjal  kalsium,  baku standar  kalsium,  etanol  96%,    HNO 3 ,  HCl pekat, metanol, kloroform, pereaksi Dragendroff, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, polisorbat  80,  FeCl 3, n -butanol,  asam  asetat glasial, AlCl 3 , ekstrak tempuyung yang beredar dipasaran  (Batugin  elixir ® ),  aluminium  foil, kapas,  kertas  label,  tissu  gulung,  kertas saring,H 2 SO 4 pekat.

## Sampel Uji
Batu  ginjal  yang  digunakan  dalam penelitian ini diidentifikasi kandungankalsiumnya  di  laboratorium  Klinik Prodia, Jalan S. Parman Palu.

## Metode Penelitian
Jenis  penelitian  ini  adalah  penelitian kuantitatif dengan menggunakan metode eksperimen  laboratorium  yaitu  yang  mana dilakukan pengukuran daya melarutkan kalsium batu ginjal secara in vitro.

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  berlangsung  dari  bulan September 2015 sampai Maret 2016.Pembuatan ekstrak  daun  sirsak  dan  daun  pegagan  di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia dan pengujian in  vitro dilakukan  di  Laboratorium
Farmakologi-Biofarmasi Jurusan Farmasi,
FMIPA, Universitas Tadulako, Palu dan di UPT Laboratorium Kesehatan, Palu, Sulawesi Tengah.

## Tahap Persiapan Bahan Uji
a. Pengumpulan  dan  Identifikasi  Daun  Sirsak dan Herba Pegagan
Daun  sirsak  ( Annona  muricata )  dan pegagan  ( Centella  asiatica )  yang  segar diperoleh  dari  Kecamatan  Balinggi  Jati Kabupaten  Parigi  Mautong  dan  dilakukan identifikasi  di  Unit  Pelaksanaan  Teknis (UPT)  Sumber  Daya  Hayati  Sulawesi Universitas
Tadulako
Palu untuk memastikan bahwa daun sirsak dan pegagan adalah  benar  jenis Annona  muricata dan Centella  asiatica .  Bagian  dari  tanaman  ini yang  digunakan  adalah  daun  yang  masih berwarna hijau.
b. Identifikasi Batu Ginjal Batu  ginjal  yang  digunakan  dalam pengujian  ini  terlebih  dahulu  digerus  dan diayak  dengan  ayakan  mesh  40  untuk mendapatkan  ukuran  partikel  yang  sama. Kemudian dianalisis secara kualitatif kandungan Ca.

## Tahap Ekstraksi
Daun  sirsak  dan  pegagan  yang  sudah kering masing-masing sebanyak 300 g dimasukkan  kedalam  wadah  maserasi  terpisah yang  berwarna  gelap  dan  direndam  dengan etanol 96% dan disimpan ditempat gelap sambil sesekali  diaduk.  Setelah  5  hari  dilakukan penyaringan  ampasnya  direndam  kembali. Penyarian  ini  dilakukan  sebanyak  3  kali. Maserat  dikumpulkan  dan  diuapkan  pelarutnya menggunakan rotary  evaporator sehingga didapat  ekstrak  kental  etanol  daun  sirsak  dan pegagan.  Kemudian  dihitung  rendemen  yang diperoleh.

## Tahap  Uji  Penapisan  Fitokimia  (Harbone, 1987)
Ekstrak  daun  sirsak  dan  pegagan  yang telah  didapatkan  kemudian  diuji  kualitatif terhadap  adanya  senyawa  tanin,  alkaloid, saponin, fenolik, flavonoid, dan steroid

## Tahap Pengujian Aktivitas Daya Larut Batu
Ginjal
a. Perendaman Batu Ginjal Kalsium
Perendaman  dilakukan  dengan  cara menimbang  100  mg  serbuk  batu  ginjal kemudian  dilarutkan  ke  dalam  masing- masing  larutan  uji  ekstrak  etanol  kombinasi daun  sirsak  dan  daun  pegagan  (kombinasi dosis  1+1  (1%  +  7,5%), 1 / 2 + 1 / 2 (0,5%  + 3,75%), 1 / 4 + 1 / 4 (0,25%  +  1,88%),  ekstrak tunggal  daun  sirsak  (1%)  dan  ekstrak tunggal  daun  pegagan  (7,5%).  Masing- masing  ditambahkan  polisorbat  80  untuk mendispersikan  ekstrak  dan  serbuk  batu ginjal  kemudian  dicukupkan  volume  hingga 25  ml,  kontrol  positif  (ekstrak  daun tempuyung  yang  beredar  di  pasaran)  25  ml dan  kontrol  negatif  akuades  25  ml  lalu diaduk  dan  diinkubasi  selama  3  jam  pada suhu 37 0 C dimana setiap 15 menit dilakukan penggojokan.
b. Identifikasi Kadar Kalsium yang Terlarut
Masing-masing  perlakuan  dipipet  10
ml dan dimasukkan dalam vial.
Ditambahkan 3 ml HNO 3 dibiarkan beberapa menit. Dipanaskan mula-mula dengan pemanasan yang rendah yaitu 4-5 kemudian dinaikkan  secara  perlahan-lahan,  setelah  30 menit  pemanasan  dinaikkan,  dihentikan sebentar.  Hasil  dekstruksi  didinginkan, kemudian  diencerkan  dengan  air  suling sampai volume 100 ml. Dilakukan pengukuran  kadar  kalsium  yang  terlarut dengan SSA pada panjang gelombang 422,7 nm.

## Analisis Data
Data  selisih  kadar  kalsium  terlarut hasil  perendaman  ekstrak  etanol  kombinasi daun sirsak dan pegagan, kontrol positif beserta kontrol  negatif  dianalisis  secara  statistik menggunakan  metode  One  Way  ANOVA  pada tingkat kepercayaan 95% dilanjutkan dengan uji lanjut  Duncan  untuk  melihat  perbedaan  nyata antar kelompok perlakuan.

## HASIL

## Hasil Ekstraksi
Simplisia  daun  sirsak  dan  pegagan sebanyak  300  gram  diekstraksi  dengan  metode maserasi  menggunakan  pelarut  etanol  96% masing-masing  sebanyak  3  liter.  Hasil  ekstrak kental  daun  sirsak  yaitu  19,45  gram  dengan rendemen 6,48% dan pegagan yaitu 17,17 gram dengan rendemen 5,72%

## Hasil Penapisan Fitokimia
Tabel 1. Hasil uji fitokimia ekstrak daun sirsak ( Annona  muricata L.)  dan  pegagan  ( Centella asiatica L.Urb)
Ket :   (+)   = Perubahan warna jelas pada pengujian (++) =  Perubahan  warna  sangat  jelas  pada pengujian
Tabel  2. Hasil  kromatografi  lapis  tipis senyawa  flavonoid  ekstrak etanol daun sirsak dan pegagan

## A B
Gambar 1 Hasil KLT Ekstrak Daun Sirsak dan Pegagan
Ket: A.   Fase gerak : metanol-kloroform (1:39); fase diam silika gel GF 254
deteksi flavonoid pada   panjang  gelombang  254 nm B. Fase gerak : metanol-kloroform (1:39);
fase diam silika gel GF 254 deteksi
flavonoid pada panjang gelombang  366 nm No Identifikasi Pengamatan Hasil KET Sirsak Pegagan positif 1 Flavonoid Warna kuning + ++ 2 Fenolik Warna  hijau tua + ++ positif 3 Saponin Terbentuk buih + ++ positif 4 Steroid Warna hijau ++ + positif 5 Alkaloid Warna  hijau tuaendapan coklat + ++ positif 6 Tanin
Warna hitam + ++ Positif Bahan uji Penampakan  dibawah lampu  UV  254  dengan AlCl 3
Penampakan  dibawah lampu  UV  366  dengan AlCl 3 Warna Nilai Rf Warna Nilai Rf Ekstrak  etanol daun sirsak Kuning tua 0,89 Kuning tua 0,89 Ekstrak  etanol pegagan Kuning tua 0,92 Kuning tua 0,92
Penentuan  Kadar    Kalsium  (Ca)  Pada  Batu

## Ginjal Setelah Perlakuan
Hasil perhitungan kadar kalsium
terlarut setelah direndam masing-masing dengan  aquadest  (kontrol  negatif);  batugin eliksir (kontrol positif);  ekstrak  tunggal  daun pegagan; ekstrak tunggal daun sirsak; kombinasi 1 dan  kombinasi  2  dilihat  pada Tabel 4.3:
Tabel  2  Kadar  kalsium  terlarut  kombinasi ekstrak  etanol  daun  sirsak  ( Annona  muricata L.) dan pegagan ( Centella asiatica L.Urb)
Perlakuan Rerata Kadar Ca Rerata Selisih (mg/L) ke t Sebelum (mg/L) Sesudah (mg/L) Kontrol negative 1.937 2060 129 a Rata-rata ±SD ±24,16 ±22,62 ±45,25 a Kontrol positif 6651 7609 661 Rata-rata ±SD ±31,11 ±250,632 ±49,49
bc
Ekstrak 1 (DS 1% + DP7,5%) 6744 8483 1739
Rata-rata ±SD ±1818,67 ±1172,38 ±646,29 d
Ekstrak 2 (DS0,5 + DP3,75) 2754 6781,5 4027,5 Rata-rata ±SD ±335,16 ±1175,9 ±840,7 ab Ekstrak3 (DS0,25% + DP1,875%) 2149,5 3009 859,5
Rata-rata ±SD
±31,81 ±36,76 ±4,94 ab Ekstrak tunggal daun sirsak 2218 3077,5 823,5 Rata-rata ±SD ±1,41 ±6010
±112,42
c Ekstrak tunggal daun pegagan 2686 4763 2077 Rata-rata ±SD ±110,30 ±50,91 ±161,22
Keterangan:
Abjad  yang  berbeda  menunjukkan  perbedaan  yang signifikan.
Abjad  yang  sama  menunjukkan  perbedaan  yang tidak signifikan.
Berdasarkan  hasil  diatas  kemudian  dapat dibuat  diagram  batang  yang  merupakan  hasil dari selisih kadar kalsium yang terlarut
Gambar 2. Grafik rerata kadar kalsium yang terlarut dengan menggunakan Spektrofotometer Serapan
Atom setelah perendaman selama 3 jam .
Ket:
Rata-rata selisih a = kontrol negatif b = kontrol positif
c = kombinasi  ekstrak 1 (DS 1%+DP 7,5%)
d = kombinasi ekstrak2 (DS 0,5% + DP 3,75%) e = kombinasi ekstrak3 (DS0,25% + DP 1,875%) f = ekstrak tunggal sisrak g = ekstrak tunggal pegagan .

## PEMBAHASAN
Batu ginjal merupakan gangguan kesehatan  pada  organ  ginjal  dimana  terdapat batu-batu  kecil  yang  terbentuk  di  dalam  ginjal akibat  pengendapan  yang  terjadi  di  urin bergerak  turun  ke  saluran  kemih  (ureter). Bagian  dari  batu-batu  tersebut  seringkali terbawa  keluar  bersama  dengan  air  seni. Kadangkala batu-batu tersebut menjadi semakin besar  yang  akan  mengganggu  keluarnya  air seni, karena batu-batu tersebut bentuknyaseperti karang  yang  pinggir-pinggirnya  runcing  sering menimbulkan pendarahan, rasa pedih, dan sakit (Yasmin, 2007).
Penelitian  ini  dilakukan  bertujuan untuk  mengetahui  aktivitas  kombinasi  ekstrak etanol  daun  sirsak  ( Annona  muricata L.)  dan pegagan  ( Centella  asiatica L.  Urb)  dalam melarutkan  kalsium  batu  ginjal  secara in  vitro . Batu ginjal yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari pasien yang  telah  melakukan operasi batu ginjal. Berdasarkan hasil identifikasi  yang  dilakukan  di  Klinik  Prodia, diketahui  bahwa  batu  ginjal  yang  digunakan
129 661 1739 4027 859 823 2077 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 a b c d e f g K a d a r C a Ter la ru t (mg /L ) Perlakuan
dalam  penelitian  ini  positif  mengandung kalsium.
Proses  pembuatan  ekstrak  dilakukan dengan cara maserasi. Metode   maserasi dipilih  karena  pengerjaannya  sederhana  dan mudah.  Selain  itu  bahan  uji  yang  digunakan berupa  daun  yang  teksturnya  lunak  dan  mudah mengembang  dalam  cairan  penyari.  Selain  itu, maserasi  merupakan  cara  penyarian  yang sederhana karena cairan penyari akan menembus  dinding  sel  dan  masuk  ke  dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif ini akan larut dan adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam dengan di luar sel  menyebabkan  larutan  yang  terpekat  keluar hingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan  di  dalam  dengan  di  luar  sel.  Maserasi simplisia  daun  sirsak  dan  pegagan  dilakukan dengan  menggunakan  etanol  96%.  Hal  ini karena  flavonoid  dalam  tanaman  umumnya berada dalam bentuk glikosida yang dapat larut dalam  campuran  air  dan  pelarut  seperti  etanol. Menurut  Markham  (1988),  metanol,  etanol, butanol  dan  lain-lain  yang  sering  digunakan untuk  ekstraksi  glikosida  flavonoid.  Beberapa aglikon flavonoid kemungkinan juga dapat larut dalam campuran air-etanol (etanol 96%). Selain itu  etanol  96%  lebih  selektif,    kapang  sulit tumbuh  dalam  etanol  20%  ke  atas,  tidak beracun,  netral,  memerlukan  panas  yang  lebih sedikit  untuk  proses  pemekatan,  dan  zat pengganggu yang larut terbatas.
Penapisan  fitokimia  merupakan  uji kualitatif  golongan  senyawa  kimia  yang terdapat dalam ekstrak etanol (96%) daun sirsak ( Annona muricata L.)  dan  pegagan ( Centella asiatica L.Urb). Data hasil penapisan fitokimia  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol tersebut mengandung golongan senyawa flavonoid,  fenolik,  saponin,  steroid,  alkaloid dan  tanin.
Analisis KLT flavonoid dalam penelitian ini bertujuan untuk   mengetahui adanya  senyawa  golongan  flavonoid  yang terkandung dalam ekstrak daun sirsak dan daun pegagan.  Flavonoid  merupakan  senyawa  polar yang  dapat  membentuk  kompleks  dengan  ion logam. Berdasarkan sifat tersebut, maka dipilih fase diam dan fase gerak yang polar. Fase diam yang  digunakan  dalam  pemisahan  flavonoid adalah silika gel agar dapat dipisahkan, maka  flavonoid  harus  dapat  terbawa  oleh  fase gerak saat melewati fase diam.  Fase gerak yang digunakan  dalam  penelitian  inadalah  campuran methanol : kloroform (1:39) v / v (Gritter, 1991).
Pada  pemeriksaan  flavonoid  secara  kualitatif menggunakan  metode  kromatografi  lapis  tipis (KLT)  seperti  pada  Gambar  4.1  menunjukkan etika diamati dibawah sinar UV 366 nm terlihat ada  noda  yang  tampak  berfluoresensi  dengan latar  gelap.  Ketika  disemprot  dengan  larutan 5%  AlCl 3 dalam  etanol,  masing-masing  noda semakin  lebih  jelas  ketika  diamatidi  bawah sinar UV 366 nm. Noda memberikan perubahan warna menjadi lebih terang/berfluoresensi.Perubahan  yang  terjadiini disebabkan  adanya  flavonoid.  Reaksi  antara AlCl 3 dengan  golongan  flavonoid  membentuk kompleks  dengan  gugus  hidroksi  dan  karbonil. Pereaksi  semprot  AlCl 3 bila  disemprotkan  pada klat  KLT  yang  telah  dikeringkan  menunjukkan semua  5-hidroksi-flavonoid  sebagai  bercak berfluoresensi  kuning  dengan  pengamatan dibawah sinar UV 366 nm.
Pengujian  aktivitas  kombinasi  ekstrak daun sirsak dan pegagan dalam melarutkan batu ginjal kalsium dalam penelitian ini menggunakan  7  perlakuan  dengan  beberapa konsentrasi  yaitu  kombinasi  1  (DS  1%+DP 7,5%),  kombinasi  2  (DS  0,5%+DP  3,75%), kombinasi  3  (DS  0,25%+DP  1,88%),  ekstrak tunggal  sirsak  (1%)  dan  ekstrak  tunggal pegagan (7,5%). Kontrol positif dalam penelitian  ini  digunakan  batugin  eliksir  yang mengandung  ekstrak  daun  tempuyung.  Kontrol positif batugin eliksir yang mengandung ekstrak daun  tempuyung  dan  daun  keji  beling digunakan  karena  merupakan  salah  satu  obat yang  digunakan  dalam  pengobatan  batu  ginjal dengan  mekanisme  kerja  memecahkan  atau menghancurkan batu urin atau batu saluran kemih sehingga lebih mempermudah pengeluaran  dari  dalam  tubuh  (Wahyudi, 1986).Kontrol  negatif  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  akuades.  Akuades  dipilih karena  merupakan  pelarut  yang  digunakan dalam  melarutkan  ekstrak  etanol  dan  kontrol positif Batugin eliksir, selain itu  penggunaan akuades  disini  untuk  melihat  banyaknya kalsium  yang  terlarut  dalam  akuades  selama proses inkubasi dan pengadukan.
Proses  inkubasi  dilakukan  pada  suhu 37 ℃ selama 3 jam dan digojog setiap 15 menit. Hal  ini  dimaksudkan  agar  kondisi  percobaan sedapat mungkin dibuat sama dengan kondisi di dalam tubuh. Alasan dipilihnya suhu 37 ℃ adalah  karena  pada  umumnya  manusia normal memiliki suhu tubuh 37 ℃ . Berdasarkan penelitian Sri Endah (1989) mengenai kelarutan batu  ginjal  dengan  menggunakan  pegagan,
diperoleh  bahwa  hasil  bahwa  waktu  inkubasi yang optimal adalah 3 jam, sehingga digunakan waktu  selama  3  jam  untuk  proses  inkubasi. Adapun  maksud  dari  proses  pengocokan  atau pengadukan  setiap  15  menit  adalah  untuk mendapatkan  hasil  yang  optimal  seperti  yang terjadi  di  dalam  tubuh  saat  batu  ginjal mengalami  pergerakan.  Batu  ginjal  yang  ada didalam  ginjal  mengalami  gerakan-gerakan akibat  aliran  urin,  maupun  gerakan-gerakan akibat  aktivitas  dari  tubuh  manusia  (Nisma, 2011).
Hasil  inkubasi  selama  3  jam  diambil. sebanyak  10  ml  kemudian    didestruksi  dan dicukupkan  volumenya  sampai  100  ml.  Proses dekstruksi  bertujuan  untuk  memecah  atau memutus  ikatan  unsur  logam  dengan  lainnya, selain  itu  proses  ini  juga  bertujuan  agar  terjadi pemecahan  kalsium  oksalat  menjadi  kalsium murni  yang  terukur  pada  alat  spektrofotometer serapan atom (Sastroharmidjojo, 2001). Dekstruksi  dimulai  dengan  pemanasan  rendah yaitu  50-60 0 C  kemudian  ditinggikan  perlahan- lahan  sampai  sampel  larut  sempurna.  Proses pemanasan  yang  dilakukan  bertujuan  agar membantu  mempercepat  proses  pelarutan  atau pemutusan  ikatan  organik.  Metode  destruksi yang digunakan adalah metode destruksi basah. Metode  ini  digunakan  karena  pengerjaannya lebih   sederhana,  oksidasi  kontinyu  dan  cepat dan  unsur-unsur  yang  diperoleh  mudah  larut sehingga  dapat  ditentukan  dengan  metode analisis  tertentu  (Rasyid,  Roslinda,  2011). Proses  dekstruksi  ini  menggunakan  asam  nitrat sebagai  pengoksidasi.  Kesempurnaan  proses destruksi  ini  ditandai  dengan  diperolehnya larutan jernih yang  menunjukkan bahwa semua konstituen telah larut sempurna.
Larutan  jernih  hasil  destruksi  ini kemudian  diencerkan  dengan  menggunakan akuades  sampai  100  ml  dengan  tujuan  agar serapannya dapat terbaca pada alat spektrofotometer  serapan  atom  dan  masih berada   dalam  range  kurva  baku.  Pengukuran kadar kalsium yang terlarut dilakukan  pada panjang  gelombang  422,7  nm,  karena  logam kalsium dapat terbaca pada alat spektrofotometer  serapan  atom  pada  panjang gelombang 422,7 nm.
Pada  penelitian  ini  digunakan  metode spektrofotometer  serapan  atom  karena  metode ini  tepat  untuk  melakukan  penetapan  kadar secara  kuantitatif  suatu  logam  dengan  adanya bantuan  lampu  katoda  spesifik  sebagai  sumber radiasi  yang  mengemisikan  sinar  pada  panjang
gelombang  yang  tepat  dan  sama  pada  proses absorbansi  sehinggadapat  menentukan  kadar suatu  atom  tertentu  karena  memang  prinsip kerja  alat  ini  berdasarkan  pada  absorbansi cahaya  oleh  atom  dalam  fase  uap  (Muljadan Suharman,1995). Spektrofotometerserapan atom  dapat  mendeteksi  kalsium  hingga  kadar paling rendah 0,002 ppm. Pengukuran absorbansi  larutan  standar  dilakukan  untuk memperoleh  persamaan  kurva  baku  yang digunakan  untuk  menghitung  kadar  kalsium yang  terlarut.  Data  absorbansi  yang  telah didapatkan  kemudian  dibuat  kurva  kalibrasi larutan baku kalsium (Lampiran 3).
Hasil  rerata  kadar  kalsium  yang terlarut,  dilakukan  pengolahan  data  dengan menggunakan   metode  statistik  One  Way ANOVA pada taraf kepercayaan 95%. Kemudian dilanjutkan dengan pengujian Duncan  untuk  mengetahui  adanya  perbedaan nyata  antar  perlakuan.  Hasil  analisis  statistik analisis  variansi  (ANOVA)  diperoleh  nilai  p  < 0,05  (p=0,000)  yang  berarti  adanya  perbedaan yang  signifikan  antar  perlakuan.  Hal  ini menunjukkan  adanya  pengaruh  perlakuan terhadap  kelarutan  kalsium  yang  terlarut  dan dilanjutkan  dengan  uji  beda  rata-rata  Duncan untuk  mengetahui  perbedaan  yang  bermakna dari  rerata  kadar  kalsium  yang  terlarut  pada setiap perlakuan.
Hasil analisis statistik uji beda rata-rata Duncan menunjukkan bahwa pemberian ekstrak tunggal  sirsak  (1%),  kombinasi  ekstrak  3  (DS 0,25%+DP  1,88%)  dan  kontrol  positif  Batugin eliksir menunjukkan perbedaan tidak signifikan dengan  kontrol  negatif.  Namun  apabila  dilihat berdasarkan  kadar  kalsium  terlarut  ketiga perlakuan tersebut lebih besar   dibandingkan dengan  kontrol  negatif.  Hal  ini  disebabkan variasi  data  kadar  kalsium  terlarut  masing- masing  replikasi  berbeda  cukup  besar sehingga hasil uji statistik berbeda tidak signifikan.
Ekstrak tunggal pegagan dan kombinasi 1  (DS  1%+DP  7,5%)  menunjukkan  hasil  yang berbeda  tidak  signifikan  namun  berbeda signifikan  dengan  ekstrak  tunggal  sirsak, kombinasi  3  dan  kontrol  positif  dimana  kadar kalsium  terlarutnya  lebih  besar.  Hal  ini menunjukkan  efek  yang  lebih  baik  terhadap peluruhan kalsium batu ginjal.
Kombinasi  2  (DS  0,5%+DP  3,75%) menunjukkan  hasil  yang  berbeda  signifikan dengan perlakuan lainnya dengan kadar kalsium terlarut  yang  paling  besar  dan  lebih  baik efeknya  dibandingkan  kontrol  positif.  Efek
peluruhan  kalsium  batu  ginjal  yang  optimal diperoleh pada   kombinasi 2 karena zat bioaktif dalam jumlah yang tepat sehingga memberikan efek yang optimal.
Kombinasi  3  (DS  0,25%+DP  1,88%) belum memberikan efek yang   lebihbaik karena  kandungan  senyawa  bioaktifnya  yang masih  rendah  sedangkankombinasi  1  (DS  1%+ DP  7,5%)  efeknya  juga  tidak  sebaik  yang kombinasi  2  (DS  0,5%+  DP  3,75%)    diduga karena  adanya  zat  lain  yang  ikut  tertarik  pada saat proses ekstraksi sehingga mengurangi efek peluruhan kalsium batu ginjal.
Ekstrak tunggal pegagan  memiliki efek yang  lebih  besar  dibandingkan  dengan  ekstrak tunggal  sirsak  diduga  karena  kadar  flavonoid total  pada  ekstrak  pegagan  lebih  besar dibandingkan  ekstrak  sirsak.  Hal  ini  sejalan dengan  penelitian  oleh  Ayu  (2015)  yang menyatakan  bahwa  kadar  flavonoid  total ekstrak  daun  sirsak  sebesar  0,663  mg/100  g simplisia sedangkan penelitian oleh Chew et al (2011)  kadar  flavonoid  total  pada  ekstrak  daun pegagan sebesar 181,25 mg/100 g simplisia.
Kemampuan  kombinasi  ekstrak  daun sirsak  dan  pegagan  dalam  melarutkan  kalsium batu  ginjal  diduga  karena  adanya  kandungan flavonoid yang terdapat didalamnya sesuai hasil uji  penapisan  fitokimia.  Ion  kalsium  penyusun batu ginjal dapat membentuk senyawa kompleks  dengan  gugus  hidroksil  karbonil dengan  molekul  flavonoid  dengan  membentuk Ca-flavonoid.  Senyawa  kompleks  ini  diduga lebih  mudah  larut  dalam  air,  sehingga  air  yang ada  dalam urin akan membantu kelarutan batu tersebut (Suharjo , 2009).
Senyawa  yang  diduga  berperan  dalam peluruh  batu  ginjal  selain  flavonoid  adalah kalium. Kalium menyebabkan tumbuhan berkhasiat  sebagai  diuretik.  Kalium  akan bereaksi  dengan  batu  ginjal  yang  berupa kalsium  karbonat  ,  karena  kalium  akan menyingkirkan kalsium untuk bergabung dengan  oksalat  yang  merupakan  pembentuk batu  ginjal.  Endapan  batu  ginjal  tersebut akhirnya  larut  dan  keluar  bersama  urin(Rasyid, 2011).  Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa, kombinasi ekstrak  etanol  daun  sirsak  ( Annona  muricata L.)  dan  pegagan  ( Centella  asiatica L.Urb) memiliki  aktivitas  dalam  melarutkan  kalsium batu  ginjal  secara in  vitro ,kombinasi  ekstrak etanol  daun  sirsak Annona  muricata L.  dan pegagan Centella  asiatica L.Urb  yang  efektif melarutkan  kalsium  batu  ginjal  secara in  vitro
adalah  kombinasi  ekstrak  2  (DS  0,5%+DP 3,75%).

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  Staf  UPT  Laboratorium Kesehatan,  yang  membantu  identifikasi  kadar kalsium.

## DAFTAR PUSTAKA
Andrianto.  (2012). Pengaruh  Ekstrak  Daun Ciplukan  (Physallis  peruviana  L.)
Terhadap Kelarutan Batu Ginjal Kalsium  Secara  In  Vitro .  Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa.
Program  Keahlian  Analisis  Kimia
Direktorat  Program  Diploma.  IPB.
Bogor.
Ayu,  K.S  (2015). Penetapan  kadar  Polifenol Total,  Flavanoid  Total,  dan  Uji Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Etanol Daun  Sirsak  ( Annonamuricata )Dari Jember  Pada  Ketinggian  Tanah  Yang Berbeda .  Skripsi  Fakultas  Farmasi Universitas Jember.
Chew.  K.K.  (2011). Effect  Of  Ethanol Concentration,  Extraction  Time  and
Extraction Temperature On The Recovery  Of  Phenolic  Compound  and Antioxidant Capacity  Of Centella asiatica  Extracts.  Internationan  Food Research Journale.
Gritter,RJ. Bobbit.JM, dan Saharting.AE, (1991), Pengantar  Kromatografi  Edisi Kedua , Penerbit ITB, Bandung.
Harbone. (1987). Tumbuhan Berguna Indonesia (Vol.III). Jakarta: Badan Litbang Kehutanan.
Mardiana, L. Dan Ratnasari, J. (2011). Ramuan dan  Khasiat  Sirsak .  Jakarta:  Penebar Swadaya.
Markham,K.R.  (1988), Cara  Mengidentifikasi
Flavonoid ,  diterjemahkan  oleh  Kosasi Padmawinata,15. Penerbit ITB. Bandung.
Marshall, Eftinger,B., (2003). Medical Management of Urolithiasis in Stone Disease . Public Health. Hal 138-142. Nisma, Fatimah. (2011). Pengaruh Penambahan Ekstrak Etanol 70% Buah
Anggur Biru (Vitis vinifera L.)
Terhadap  Kelarutan  Kalsium  Batu Ginjal .  Farmasi  FMIPA  UHAMKA. Jakarta.
Rahardjo.  (2003 ).  Pengaruh  Infusa  Daun Pandan Wangi (Pandanus amaryllifolius Roxb) Terhadap Kelarutan  Kalsium  Batu  Ginjal  Secara In Vitro Menggunakan Spektrofotometer Serapan Atom (Skripsi). Fakultas Farmasi Univesrsitas
Sanata Darma. Yogyakarta
Rasyid,  Roslinda,  Mahyuddin,  Agustin  M. (2011). Pemeriksaan  Kadar  Kalsium Dan Natrium Herba Pegagan (Centella asiatica  L.Dengan  Metode  Fotometri Nyala .  Fakultas  Farmasi.  Universitas Andalas.
Roopesh,  Citrala,  Salomi, Ruth,  Nagarjuna  dan Reddy.(2011). Diuretic  Activity  Of Methanolic  And  Ethanolic  Ekstract Centella  asiatica  Leaves  In  Rats . Research Journal  Of  Pharmacy  2  (11), 163-165 . Antapur, India.
Suhartatik, E. sri (1989). Pengaruh Infus Daun Pegagan (Centella asiatica L) Terhadap  Daya  Larut  Batu  Ginjal Kalsium . Fakultas farmasi UGM. Yogyakarta.
Susilawati  Triana.  (1999). Daya  Melarutkan Fraksi  Air  dan  Fraksi  Etil  Asetat
Ekstrak  Etanol  Daun  Sirsak  Terhadap
Batu  Ginjal  Kalsium .  Fakultas  Farmasi UGM. Yogyakarta.
Pearce, C. Evelyn.(2002). Anatomi Dan Fisiologi  Untuk  Para  Medic .  Jakarta: Penerbit PT Gramedia Pustaka   Utama.
Wijaya,  Sumi  dan  Farida  L.  Darsono,  (2005). Uji  Daya  Antikalkuli  Perasan  Buah Ketimun (Cucumis sativus L) Terhadap Tikus  Putih  Jantan  Dengan  Metode Kalkuli . Majalah Farmasi Indonesia .
Yasmin, Elizabeth., (2007). At a Glance Sistem
Ginjal. (Terjemahan).
Penerbit Erlangga. Jakarta.