PERBEDAAN  WAKTU  PAPARAN  MENGUBAH  POLA  INTERAKSI MOLEKULAR  ANTIGEN-RECEPTOR-ANTIBODI  - Sebuah  Contoh Penggunaan Model Kompleks Glikoprotein Virus (HHV-6B), Host Receptor dan Monoklonal Antibodi
Bernadette Dian Novita*)
*) Seluruh rangkaian penelitian ini dilakukan di Divisi Clinical Virology Kobe University Graduate School of Medicine

## ABSTRACT
A binding interaction between aforeign glycoprotein molecule (antigen)  and a receptor molecule on  one  or more  antibodies  (immunoglobulins)  are  the  major soluble  molecules produced to know the pattern of specific and avid of inhibition the antibody to  virus replication,  as  effective defensive role for the antibody response.  This  antibody also has molecular competitive pattern of antibody - receptor  to  antigen  complex  bind.  However,  incubation  time  differences  could alter the patterns  of those  interaction.  An antibody that has  got neutralizing effect and high index of binding affinity could be considered as anti virus candidate.
Keywords: antigen-receptor-antibody interaction,  binding affinity,  time exposure

## ABSTRAK
Ikatan  interaksi  glikoprotein  asing  (antigen)  dan  molekul  reseptor  terhadap  satu  atau  lebih antibodi  (immunoglobulin)  membentuk  molekul  soluble mayor  yang  dapat  digunakan  untuk memprediksi  kemampuan  antibodi  tersebut  menghambat  replikasi  antigen  dan  menghambat ikatan  antigen pada reseptor.  Perubahan lama waktu inkubasi dapaat mengubah pola interaksi protein  antigen-virus  dan  antibodi.  Antibodi  yang  memiliki  kemampuan  neutralizing  dan memiliki binding affinity yang tinggi terhadap virus dapat dipertimbangkan untuk dikembangkan sebagai kandidat antivirus.
Kata kunci :  interaksi antigen-receptor antibodi,  binding affinity,  waktu paparan
*)  Departemen Farmakologi dan Terapi, Fakultas Kedokteran Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya
Email korespondensinovita@ukwms.ac.id

## PENDAHULUAN
Virus  dapat melakukan attachment dan masuk  ke  dalam  sel  host  (misal  makrofag, sel T),  bila terdapat reseptor pada sel  hostl - 3 •
Penghambatan  attachment  dapat  dilakukan, salah satunya dengan cara menghambat ikatan virus (antigen) pada reseptor.
Monoklonal antibodi memiliki
kontribusi  menetralisir  dan  peran  penting dalam  menghambat  attachment  virus  pada reseptor",sHHV-6  variant  A  (HHV-6A,  hal ini  dibuktikan  dengan  hasil  neutralizing assay. Interaksi  yang  mengikat  glikoprotein asing  (antigen),  reseptor  dan  antibodi (imunoglobulin)  merupakan  molekul  soluble
utama yang diproduksi  untuk  mengetahui pola  interaksi ini. Interaksi antigen  spesifik dan  antibodi , merupakan repons  imun  yang
berperan  defensif.  Mengetahui efek  antibodi pada penghambatan  replikasi virus dan pola kompetitif molekul antibodi - reseptor untuk mengikat  kompleks antigen merupakan informasi penting.
Untuk mengetahui kemampuan antibodi dalam menghambat  replikasi virus dana  tau menghambat attachment  virus pada ho st reseptor, maka  terdapat  beberapa  hal yang perlu dilakukan  pada penelitian in v itro yang kualitatif farmakokinetik adalah :
1. Neutralizing  assay untuk menilai  ke- mampuan  netralisir  antibodi  terhadap VIr us
2.  Afinitas  ikatan  molekul  glikoprotein kompleks (antigen) dan molekul rese- ptor;  serta afinitas  molekul  glikopro- tein kompleks  (antigen)  dan  molekul antibodi  menggunakan sw1ace plas- mon resonance (SP R) ;
3.  Kompetitif assay  untuk  mengetahui pol a  interaksi  molekuler dalam  be- berapa  rangkaian  paparan  waktu  dan dideteksi menggunakan western blot assay  (WBA). Kompetitif assay ini digunakan  untuk  mengetahui  respons immediate,  intermediate dan  lambat terhadap  ikatan  molekul glikoprotein kompleks (antigen), molekul reseptor dengan atau tanpa molekul antibodi.

## Metode, HasH dan Interpretasi
Bahan: Medium Roswell Park Memorial In- stitute (RPM!)  merupakan  media yang men- gandung bicarbonate  buffering system dan digunakan  untuk  kultur sel pada  penelitian ini; Fetal Bovine Serum (FBS)  10% dan Inter- leukin-2 (2ng/mL); mamalian  sel  line - met-
allothionein  4 (MT4);  virus, pada  penelitian ini  menggunakan  HHV-6  strain  HST ya ng dipropaganda  dengan cord blood mononu- clear cells  (CBMCs); host  receptor CD134 yang diproduksi oleh Immunotech dan mono- clonal  antibodi , produksi  G.  Campadelli-Fi- ume , University of Bologna,  Bologna , Italy , yang memiliki efek menghambat  pertun1bu- han virus S - 7 gH / gLlgQ lIgQ2, is a viral ligand
for its cellular receptor, hwnan  CD46. How- ever , whether complex formation or one com- ponent  of the  complex  is  required for  CD46 binding and how  the complex is  transported in  cells  are  open questions. Furthermore , in HHV-6-infected  cells  the gQl protein modi- fied with N-linked glycans is expressed in two forms with different molecular masse s: an 80- kDa form  (gQ J-80K .

## 1. Neutralizing assay
Untuk menilai kemampuan netralisir antibodi terhadap virus maka  dilakukan neutralizing
assay.  Prinsip  kerja antibodi  dalam beberapa  konsentrasi diinkubasikan dengan sel  prokariotik  yang  telah diinfeksi virus kemudian dilakukan  pengamatan setiap  24
jam selama 3 x 24 jam . Tahap (Dialisis Antibodi): Antibodi yang hendak dinilai telah  didialisis (overnight  dialysis) menggunakan medium RPMI ,
kemudian  diukur  konsentrasi yang
tersisa  pasca  dial isis.  Konsentrasi ditentukan  mulai yang terendah kemudian ditingkatkan. Antibodi
yang memiliki  daya  ham bat yang baik  bila  efeknya  meningkat seturut dengan  penambahan  konsentrasi 8 , 9 an oncogenic gammaherpesvirus, causes
acute infectious mononucleosis
(AIM.
Tahap 2 (Persiapan mammalian  sel):
sel  MT 4  telah  diregenasikan  dan dipersiapkan  IxI0 5 CFU.
Hasil (Pembesaran mikroskop  IOOx) DAP I Virus infected
Ce ll s Ab . A Fab cone . 0 . 03 mgldL
Gambar 1 : Hasii Ne utrali z ing As s a y
Tahap  3 (Neutralizing assay) : kultur mengandung  1xI0 5 CFU sel MT4, virus , antibodi.  Setiap  kultur plate mengandung  I  konsentrasi antibodi.
Ab . AFab conc . 0 , 12 mg / dL Ab . AFab conc . 0 , 96 mgldL
Interpretasi  hasil gambar 1:  Proses infeksi berhasil , antibodi  (Ab.  A)  memiliki efek neutraliz- ing , terbukti  dengan peningkatan  konsentrasi , jumlah virus yang dapat menginfeksi sel mam- malian berkurang atau virus gagal bereplikasi.

## 2.  Surface Plasmon Resonance (SPR)
Tujuan lmtuk  mengetahui  kekuatan
afillitas kompleks ikatan protein virus dengan protein reseptor dan  protein virus dengan antibodi. Konsentrasi kompleks ligan-
reseptor [LR]  sama dengan produk k + I  atau minus produk k - I 1 0 - 12. Potensial antibodi yang
pada  saat neutralizing  assay  memberikan
hasil  penghambatan,  kebanyakan  memiliki afinitas  ikatan  mengganggu  replikasi  virus dibandingkan ikatan virus dengan reseptornya. Untuk SPR, protein reseptor, protein antibodi dan protein virus harus dipisahkan dari Fc .
CMR  5  merupakan  bagian  chip yang menilai  afinitas  ikatan , CMR5  berikatan dengan  protein  A  yang  kemudian  diikat dengan  protein virus ditambahkan  protein reseptor atau protein antibodi .
Table  1  SPR :  Complex  glycoprotein (Antigen) to protein A in resonance chip Analyte kon Koff KD (nM) (lIM.s) (1/s) Receptor 1 , 1 x 10 6 1 , 6 X 10 . 2 14 Antibody 3 , 5x10 4 6 , 6 x 10 . 4 19 A Antibody 8 , 5 x 10 4 3,9 X 10 . 4 46 B
Interpretasi  hasil tabel 2:  ikatan protein virus dengan  protein  reseptor  lebih  kuat dibandingkan  ikatan  protein  virus  dengan antibodi.  Meskipun  virus  telah  dihambat oleh  antibodi,  ikatan  tersebut  dapat  digeser oleh  protein reseptor.  Salah  satu  faktor  yang mempengaruhi adalah waktu paparan,  hal  ini yang dibuktikan pada langkah berikutnya .

## 3.  Kompetitif Assay
Kompetitif  assay  dilakukan  untuk mengetahui pola interaksi molekuler protein  antigen,  protein  reseptor  dan  protein antibodi  dengan  rangkaian  paparan  waktu (tim e series)lO , 13California", "title"  :  "The Pharmacological  Basis  of  Therapeutics- Goodman & Gillman-Ed" , "type"  :  "book"
}, "uris"  :  [  .. http://www.mendeley.com /
documents/?uuid=26b07b 11 - 47 dc - 46e2 -
ae20-6dbd23111 0 1 b"  ]  },  {  "id"  :  "ITEM-
2",  "itemData"  :  {  "DOl"  :  "10.1128 /
AAC.00153-08",  "ISSN"  :  "1098-6596",
"PMID"
"18591268", "abstract"
"Intracellular  concentrations  of  isoniazid and  rifabutin  resulting  from  administration of  inhalable  micropartic1es  of  these  drugs to  phorbol-differentiated  THP-l  cells  and the  pharmacokinetics  and  biodistribution  of these drugs upon inhalation of micropartic1es or  intravenous  administration  of free  drugs to  mice  were  investigated.  In  cultured  cells, both  micropartic1es  and  dissolved  drugs established  peak  concentrations  of isoniazid (  approximately  1.4  and  1.1  microgIl0(6.
Perbedaan  waktu  inkubasi  bertujuan  untuk mengetahui pola ikatan terhadap lama paparan immediate (30  menit),  intermediate  (4  jam) dan  lambat  (24  jam) 1O, 1 4 California",  "title"  :
"The Pharmacological Basis of Therapeutics- Goodman & Gillman-Ed",  "type"  :  "book"
}, "uris"  :  [  .. http: // www.mendeley.com/
documents/?uuid=26b07b 11-47 dc-46e2- ae20-6dbd23111 0 1 b" ] }, { "id" : "ITEM-2",
" itemData": {"DOl": " 10 . 1128/AAC.06059-
11 ",  "ISSN"  :  "1098-6596",  "PMID"  : "22330931 ", "abstract" : "For drug-compliant patients,  poor responses to  tuberculosis  (TB.
Protein antigen harus  tetap  memiliki  Fc agar dapat  berikatan  dengan protein  G,  kemudian diinkubasi  bersama  protein  reseptor  tanpa Fc  dengan  waktu  inkubasi  yang  sarna. Setelah protein  antigen  dan reseptor dibuang dan  protein  G  dicuci  maka  ditambahkan protein  antibodi  tanpa  F c  dengan  perbedaan waktu  inkubasi.  Supernatant  dan  elution (yang  diambil  dari  sisa  protein  G)  diperiksa menggunakan  metode  wet  transfer  western blot assay (WBA).
30 minutes i ncubation -Immediate
•
Response
• S u p ernatant El utio n i " I 2 3 4 5 2 3 4 5 lSO .... -_ ... '" 1 0 0 -- 7 5 Bagan  1
(4 h ou r s incubation) -Inte r mediate Response
• Su p ernatant El u ti on
i " r 2 3 4 5 2 3 4 5 1 50 100 ~ _ _ 7 S Bagan 2 • (24 hours incubation) - Late  Response
S u pernatant Elutio n i * I 2 3 4 5 2 3 4 tO O

## Bagan 3
Gambar  2  (Bagan  1-3):  Determinasi Kompetitive Assay Antibodi menggunakan western bloth untuk mengetahui pengaruh waktu inkubasi
i * = input  protein  antigen  ;  Al = negative control protein (y, non neutralizing antibody);
A2-5 = concentration  dependent  of protein antibodi
Interpretasi hasil gambar 2:
Bagan  1  :  Antibodi  dapat  menghambat ikatan  antigen  terhadap  reseptor  pada waktu inkubasi singkat (30 menit) Bagan 2 dan 3:  Hambatan antibodi tidak bertahan  lama,  setelah  paparan  dibuat lebih  lama  (dalam  jam)  pola  berubah, beberapa  antigen  tidak  lagi  berikatan dengan  antibodi.  Hal  ini  terkait  dengan afinitas  ikatan  protein  antigen  dan reseptor  lebih  besar  dibanding  dengan ikatan antibodi dan antigen (tabel  1).
Kesimpulan  :  Studi  ini  memberikan  bukti kemampuanluarbiasadariSPRdan WBAuntuk mengetahui  pol a  interaksi  molekuler  protein antigen  - reseptor dan  antibodi.  Kemampuan kompetitif  antibodi  dalam  menghambat ikatan  antigen  dan  reseptor  bergantung  pada kekuatan  afinitasnya.  Hasilnya menunjukkan bahwa  afinitas  ikatan  antigen  - reseptor yang  lebih  kuat  dibandingkan  afinitas ikatan  antigen  - antibodi  membuat  interaksi menjadi  tidak  stabil.  Berdasarkan  hasil  di atas  dapat  disimpulkan  meskipun  antibodi memiliki neutralizing effect, kekuatan afinitas  menentukan  kemampuan  antibodi tersebut  menghambat  antigen  berikatan dengan reseptor.  Penelitian ini  sesuai  dengan hasil  penelitian pada Epstein-Barr  Virus  dan
Human  Immunodeficiency  Virus (HIV)15 , 16.
Penelitian  lebih  lanjut perlu dilakukan untuk mengembangkan  antibodi  dengan  kekuatan afinitas  lebih  besar  dibandingkan  ikatan antigen - reseptor.

## Acknowledgment
Terima  kasih  pada  Prof.  Yasuko  Mori,
MD.,PhD  yang  telah  memperkenankan  saya melakukan  penelitian  ini  di  laboratorium Divisi  Clinical  Virology  Kobe  University Graduate  School  of Medicine.  Terima  kasih pula saya ucapkan pada Huamin Tang,  PhD, Mitsuhiro Nishimura,  PhD, Akiko Kawabata PhD  dan  Aiko  Wakata,  PhD  yang  telah membimbing  dan  membantu  saya  dalam penelitian ini.
Daftar Referensi :
1.  Abbas,  A. K. & Lichtman,  A. Cellular and  Molecular  Immunology.  (Saunders,
2012).
2.  Lopez-Cortes,  L. F. et  al.  Efavirenz trough  levels  are  not associated  with  vi- rological  failure  throughout therapy with 800 mg daily and a rifampicin-containing antituberculosis  regimen. J  Antimicrob. Chemother.  58, 1017-23 (2006).
3.  Saleri,  N. et al . Systemic  exposure to  ri- fampicin  in  patients  with  tuberculosis and advanced HIV disease  during highly active  antiretroviral  therapy  in  Burkina Faso. J  Antimicrob.  Chemother.  67,469- 72  (2012).
4.  Oyaizu, H. et al.  Complementation of the
Function  of Glycoprotein  H  of Human Herpesvirus 6 Variant A by Glycoprotein H of Variant B in the Virus Life Cycle. J Virol.  86,8492-8498 (2012).
5.  Tang,  H. et al.  Human herpesvirus  6  en- coded  glycoprotein Q 1 gene  is  essential for  virus  growth. Virology  407,  360 - 367 (2010).
6.  Tang,  H.,  Hayashi,  M.,  Maeki, T., Ya- manishi, K. & Mari, Y. Human  Herpes- virus 6 Glycoprotein Complex Formation Is  Required  for  Folding  and  Trafficking
of the gHlgLlgQ1/gQ2 Complex  and Its Cellular  Receptor  Binding. J Virol . 85, 11121-11130 (2011).
7.  Mori,  Y,  Yang,  X.,  Akkapaiboon,  P., Okuno, T. & Yamanishi, K. Human her- pesvirus  6 variant A glycoprotein H -gly- coprotein  L-glycoprotein  Q  complex  as- sociates  with human  CD46. J Virol . 77, 4992-9 (2003).
8.  Ogembo,  G.  G. et  al.  A  chimeric  EBV gp350/220-based  VLP  replicates  the  vi- rion  B-cell  attachment  mechanism  and elicits  long-lasting  neutralizing  antibod- ies in mice. J Trans I . Med.  13, (2015) .
9.  Servat, E. et al . Identification ofthe criti- cal  attribute(s)  of  EBV  gp350  antigen required  for  elicitation  of a  neutralizing antibody  response  in  vivo. Vaccine  33, 6771-6777 (2015).
10. Brunton,  L.,  Chapner,  B . & Knollmann, B.  The  Pharmacological  Basis  of Ther- apeutics-Goodman & Gillman-Ed.  (Mc Graw Hill Medical, 2011).
11.  Singhal,  J. et al.  Suppression  of dendrit- ic  cell-mediated  responses  by  genes in calcium  and  cysteine  protease  pathways during  Mycobacterium  tuberculosis  in- fection. J Bioi.  Chem.  287,  11108 - 21
(2012) .
12. Green,  J.  A. et al.  Mycobacterium tuber- culosis upregulates microglial matrix me- talloproteinase-1  and  -3  expression  and secretion  via  NF-kappaB- and Activator Protein-I-dependent monocyte networks. J Immunol.  184,6492-503 (2010).
13. Verma,  R.  K.,  Kaur,  J. , Kumar,  K.,  Ya- dav, A.  B. & Misra, A.  Intracellular time course,  pharmacokinetics,  and  biodistri- bution  of isoniazid  and rifabutin  follow- ing pulmonary  delivery  of inhalable  mi- cropartic1es  to  mice. Antimicrob.  Agents Chemother.  52, 3195 -201 (2008).
14. Requena-Mendez,  A. et al . Pharmacoki- netics  of rifampin  in Peruvian tuberculo- sis  patients  with  and  without  comorbid diabetes or my. Antimicrob . Agents Che- mother.  56,2357-63 (2012).
15. Kanekiyo, M. et al.  Rational Design of an Epstein-Barr Virus Vaccine Targeting the Receptor-Binding  Site. Cell  162,  1090- 1100 (2015).
16. Young, K.A., Herbert,A. P., Barlow, P. N . , Holers, Y. M. & Hannan,  J.  P.  Molecular Basis of the Interaction between Comple- ment  Receptor Type  2 (CR2/CD21) and Epstein-Barr  Virus  Glycoprotein  gp350. J Virol. 82, 11217 - 11227 (2008).
49