## PERUBAHAN FISIKO-KIMIAWI, MIKROBIOLOGI DAN HISTAMIN BAKASANG IKAN CAKALANG SELAMA FERMENTASI DAN PENYIMPANAN
[Physico-Chemical, Microbiological, and Histamine Changes in Skipjack Bakasang During Fermentation and Storage]
Sri Purwaningsih 1) *, Joko Santoso 1) dan Rahmatia Garwan 2)
1) Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Dinas Kelautan dan Perikanan Provinsi Maluku Utara, Ternate
Diterima 03 Februari 2012 / Disetujui 28 November 2013

## ABSTRACT
Bakasang is a salted fermentation product made from viscera of skipjack (Katsuwonus pelamis , Lin ) or tuna (Thunnus sp) which tastes sour and is usually used as a complementary dish for local people in Ternate, North Maluku, Indonesia. The research aimed to study the changes in protein and histamine levels of bakasang made from skipjack viscera during fermentation and during storage at room temperature. The experiment consisted of preparation and characterization of raw materials, fermentation for 0, 2, 4, 6, and 8 days, and storage of  the resulted product at room temperature for 0, 30, 60, and 90 days. The best bakasang obtained from this experiment was compared with a commercial bakasang produced by local people in Ternate. Fermentation time gave significant effects on the moisture, protein, histamine, and total microbes but did not affect pH and Salmonella count. Bakasang with the best characteristics was obtained after 4 days of fermentation. The product  contained protein, pH, histamine, and  log total microbe of 50.87% (db), 5.78, 24.56 ppm, 4.86 log CFU/g, respectively.  During room temperature storage, the level of moisture, protein, and histamine as well as pH and total bacteria changed significantly. Bakasang stored for 30 days had the best characteristics. It contained protein, histamine, and log total microbes of 46.98% (db), 28.97 ppm, and 4.66 log CFU/g, respectively. The characteristics of bakasang in this study were better than commercial bakasang which had protein, histamine, and log microbes of 44.48% (db), 303.37 ppm and 7.36 log CFU/g, respectively.
Keywords: bakasang, histamine, physico-chemical properties, skipjack viscera

## ABSTRAK
Bakasang  merupakan  produk  fermentasi  yang  umumnya  dibuat  dari  jeroan  ikan  cakalang  ( Katsuwonus  pelamis )  atau  tuna  ( Thunnus sp), dengan penambahan garam, rasanya asam dan biasanya disajikan sebagai pelengkap lauk terutama bagi penduduk yang tinggal di Kota Ternate Provinsi  Maluiku  Utara.  Penelitian  ini  bertujuan  mempelajari  perubahan  kandungan  protein  dan  kadar  histamin  selama  fermentasi  dan penyimpanan bakasang pada suhu ruang. Tahapan dalam penelitian ini adalah preparasi dan karakterisasi bahan, fermentasi jeroan (0, 2, 4, 6, 8 hari), penyimpanan produk pada suhu ruang (0, 30, 60, 90 hari), dan membandingkan bakasang hasil penelitian terbaik dengan produk komersial yang dibuat oleh masyarakat Kota Ternate. Lama fermentasi memberikan pengaruh nyata terhadap kadar air, kadar protein, kadar histamin, dan total  mikroba;  tetapi  tidak  berpengaruh  terhadap  nilai  pH  dan  jumlah Salmonella .  Karakteristik  bakasang  terbaik  adalah  bakasang  yang difermentasi  selama  4  hari  dengan  kdungan  protein,  pH,  histamin,  dan  log  total  mikroba  sebesar  50.87%  (bk),  5.78,  24.56  ppm,  dan  4.86  log CFU/g. Selama penyimpanan pada suhu kamar, kadar air, protein, pH, histamin, dan total mikroba bakasang berubah secara nyata. Penyimpanan bakasang  selama  30  hari  pada  penelitian  ini  menghasilkan  karakteristik  terbaik  yaitu  dengan  kandungan  protein,  histamin,  dan  total  mikroba berturut-turut sebesar 46.98% (bk), 28.97 ppm dan 4.66 log CFU/g . Hal ini lebih baik bila dibandingkan dengan karakteristik bakasang komersial berturut-turut  44.48% (bk), 303.37 ppm dan 7.36 log CFU/g.
Kata kunci: bakasang, histamin, jeroan ikan cakalang, sifat fisiko-kimia

## PENDAHULUAN
1
Berdasarkan data Statistik Perikanan Tangkap DKP (2007 a ) produksi  ikan  di  Kota  Ternate  didominasi  oleh  ikan  cakalang sebesar  40.6  ribu  ton/tahun,  teri  12.7  ribu  ton/tahun,  tuna  7.9 ribu  ton/tahun,  tongkol  7.8  ribu  ton/tahun,  dan  kakap  541.40 ton/tahun. Ikan cakalang selain sebagai komoditas ekspor, juga
*Penulis Korespondensi:
E-mail : sripurwa65@yahoo.com;  rwa65@gmail.com; Telp.: 08128520065
dimanfaatkan secara tradisional oleh masyarakat Ternate. Pada umumnya proses pengolahan ikan cakalang hanya memanfaat- kan  bagian  dagingnya  saja,  sedangkan  bagian  lainnya  yaitu jeroan dimanfaatkan sebagai bahan baku bakasang. Bakasang merupakan  pangan  tradisional  yang  biasa  dikonsumsi  oleh masyarakat di Maluku dan Sulawesi Utara.
Bakasang merupakan salah satu produk fermentasi, umum- nya  dibuat  dari  jeroan  ikan  cakalang,  dimana  ikan  cakalang termasuk  golongan  scombroid  yang  berasal  dari  famili Scombroidae. Menurut McLauchlin et al. (2005) dan Jiang et al .
(2007)  ikan  golongan  scombroid  banyak  mengandung  histidin bebas  di  dalam  jaringan  daging  maupun  jeroan,  yang  dapat diubah  menjadi  histamin  melalui  dekarboksilasi  dan  aktivitas bakteri penghasil histamin.
Produk  tradisional  sejenis  bakasang  dijumpai  di  beberapa negara  antara  lain: nampla (Thailand), yu-lu (China), patis (Philippines), ngapi (Burma), shottshuru (Japan), colombo-lumre (India dan Pakistan), aekjeot (Korea), budu (Malaysia), feseekh (Mesir), lanhouin (Benin),  dan dayok (Arab).  Kajian  ilmiah tentang  produk  sejenis  telah  banyak  dilakukan  misalnya: tentang profil fermentasi rusif dari ikan teri oleh Yuliana (2007), lanhouin oleh  Anihouvi et  al. (2006),  karakteristik  organoleptik bakasang  oleh  Purwaningsih et  al. (2011), dayok oleh  Bases (2012) yang menyarankan bahwa garam yang digunakan untuk fermentasi  hendaknya  lebih  dari  17.5%  karena  dapat  me- ngurangi  kadar  histamin.  Rabie et  al. (2009)  meneliti  tentang komposisi  asam  amino  dan  komponen  amin  biogenik  pada fermentasi feseekh yang kandungan histaminnya masih tinggi. Penelitian  pada  produk  fermentasi  secara  tradisional  di beberapa  negara  menunjukkan  bahwa  produk  tersebut  me- ngandung  histamin  tinggi,  hal  ini  dapat  membahayakan konsumen.  Di  Indonesia  sampai  saat  ini  belum  ada  kajian tentang perubahan sifat fisiko-kimiawi, mikrobiologis, dan kadar histamin dari bakasang  jeroan cakalang ( Katsuwonus pelamis, L )  yang  biasa  dikonsumsi  oleh  masyarakat  Maluku,  sehingga perlu  dilakukan  penelitian  tentang  kandungan  histamin  serta komponen penyebab meningkatnya kadar histamin baik secara fisiko-kimiawi maupun mikrobiologis. Hipotesis dari penelitian ini adalah  lama  fermentasi  dan  lama  penyimpanan  bakasang mempengaruhi  sifat  fisiko-kimiawi,  mikrobiologis,  dan  histamin dari  bakasang  jeroan  cakalang  ( Katsuwonus  pelamis,  L ). Pendekatan  penyelesaian  masalah  yang  dilakukan  pada penelitian  ini  adalah  membuat  bakasang  seperti  yang  biasa dilakukan  masyarakat  Maluku,  untuk  diteliti  karakteristik  fisiko- kimiawi, mikrobiologis, termasuk kadar histaminnya, serta mem- bandingkannya  dengan  bakasang  komersial  yang  dibuat  oleh masyarakat  Maluku.  Hasil  penelitian  diharapkan  dapat  mem- berikan  informasi  pada  masyarakat  Maluku  tentang  waktu fermentasi  terbaik  dan  lama  penggunaan/penyimpanan  dari bakasang yang masih aman dikonsumsi oleh masyarakat.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah jeroan  (usus,  hati,  jantung,  paru  dan  telur)  ikan  cakalang ( Katsuwonus  pelamis ,  Lin)  yang  diperoleh  dari  Tempat Pelelangan  Ikan  (TPI)  Muara  Angke,  Jakarta  Utara.  Bahan- bahan kimia yang digunakan meliputi bahan kimia untuk analisis TVB, proksimat, histamin, total mikroba dan uji Salmonella .

## Tahapan penelitian
Penelitian  dibagi  menjadi  empat  tahap.  Tahap  pertama adalah  preparasi  dan  karakterisasi.  Pada  tahap  ini  dilakukan pemisahan  jeroan,  pengecilan  ukuran,  pencucian,  penirisan, dan penimbangan. Analisa yang dilakukan adalah kadar air dan protein  (AOAC,  2005),  nilai  pH  (Apriyantono et  al. 1989),  TVB
(Apriyantono et al. 1989), kadar histamin (BSN, 1996), dan total mikroba (BSN, 2006).
Tahap  kedua  adalah  fermentasi  jeroan  ikan  cakalang menggunakan garam 25% (b/b) dengan lama fermentasi 0, 2, 4, 6,  dan  8  hari  dalam  wadah  tidak  tertutup  rapat.  Proses  ini mengacu pada proses fermentasi yang biasa dilakukan secara tradisional  oleh  penduduk  Ternate.  Analisa  yang  dilakukan adalah  kadar  air  dan  protein,  nilai  pH,  kadar  histamin,  total mikroba, dan uji Salmonella (BSN, 2007).
Tahap  ketiga  adalah  penyimpanan  bakasang  hasil fermentasi terpilih selama 0, 30, 60, dan 90 hari. Analisa yang dilakukan  pada  tahap  ini  adalah  protein,  nilai  pH,  kadar histamin,  total  mikroba.  Tahap  terakhir  adalah  perbandingan bakasang  hasil  penelitian  dengan  bakasang  komersial.  Pada tahap  ini  bertujuan  membandingkan  bakasang  hasil  penelitian terbaik  dengan  bakasang  komersial  (dibuat  secara  tradisional) yang  sudah  disimpan  selama  satu  bulan.  Hal  ini  dilakukan karena  bakasang  yang  diproduksi  secara  tradisional  oleh masyarakat  biasanya  masih  dikonsumsi  selama  satu  bulan. Pada tahap ini dilakukan uji secara mikrobiologis (total mikroba) dan kimiawi (protein, nilai pH, TVB, kadar histamin), pada kedua bakasang tersebut.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik  jeroan  ikan  cakalang  sebagai  bahan  baku bakasang
Kadar  air  jeroan  hasil  penelitian  adalah  77.38%  (bb)  dan kadar  protein  52.23%  (bk).  Tingginya  kadar  air  menyebabkan jeroan cakalang sesuai untuk diolah menjadi produk fermentasi. Kadar  protein  yang  tinggi  menguntungkan  dalam  pembuatan bakasang,  karena  jeroan  merupakan  sumber  enzim  proteolitik yang  tinggi  terutama  pada  bagian  pilorikaeka,  lambung  dan usus (seperti enzim tripsin, kimotripsin dan pepsin). Data hasil penelitian  tentang  karakteristik  bahan  baku  yang  digunakan disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Karakteristik bahan baku Komposisi Nilai Kadar air (% bb) 77.38±1.67 Kadar Protein (% bk) *) 52.23±1.92 Nilai pH 6.22±0.13 Nilai TVB (mg N/100g) 22.61±0.56 Histamin (ppm) 19.38±3.01 Total mikroba/TPC (CFU/g) 4.17 x 10 4
Keterangan: *) Persen basis kering, nilai rata-rata ± SD, n = 3
Ikan hidup mempunyai nilai pH 7, namun setelah mati sisa glikogen  diuraikan  menjadi  asam  piruvat,  kemudian  menjadi asam laktat. Nilai pH tubuh ikan pada fase ini menurun menjadi 6.2-6.6. Purwaningsih et al. (2006) menyatakan bahwa nilai pH ikan bergantung pada jumlah glikogen yang ada dan kekuatan penyangga  ( buffering  power )  pada  daging  ikan.  Kekuatan penyangga  pada  daging  ikan  disebabkan  oleh  ketersediaan protein,  asam  laktat,  asam  fosfat, trimethyl  amine  oxyde (TMAO),  dan  basa-basa  volatil.  Fase  ini  disebut  fase rigormortis .  Nilai  pH  jeroan  ikan  cakalang  yang  digunakan
sebagai bahan bakasang 6.22 menandakan kondisi bahan baku berada pada fase rigormortis .
Berdasarkan  tingkat  kesegarannya,  jeroan  ikan  cakalang yang digunakan tergolong segar karena memiliki nilai TVB <30 mg N/100 g. Batas maksimum untuk produk perikanan dan hasil laut seperti udang, ikan, oyster , dan scallop yang bermutu baik adalah  30  mg  N/100 g  (Direktorat  Jenderal  Perikanan,  1986). Menurut Mah dan Hwang (2009) pembentukan TVB disebabkan oleh peruraian Trimethyl Amine (TMA) dan asam amino menjadi senyawa basa nitrogen yang mudah menguap seperti amonia, monoamin,  dimetilamin,  trimetilamin,  dan  senyawa  biogenik amin lainnya oleh aktivitas mikroba dan enzim yang berasal dari bahan baku.
Parameter  lain  yang  perlu  diperhatikan  dari  bahan  baku adalah  kadar  histamin.  Histamin  merupakan  senyawa  amin biogenik yang terdapat dalam daging dan bagian lainnya seperti jeroan  yang  dapat  menyebabkan  keracunan.  Kadar  histamin yang  dihasilkan  dari  pengujian  jeroan  ikan  cakalang  (19.38 ppm)  masih  dalam  batas  aman.  Batas  kandungan  histamin yang ditetapkan oleh Ditjen P2HP DKP (2007 b ) adalah 100 ppm untuk  hasil  dan  produk  perikanan.  Menurut  McLauchlin et  al . (2005)  pembentukan  histamin  pada  jeroan  berkaitan  dengan jumlah  bakteri  alami  yang  terdapat  pada  jeroan  dan  aktivitas enzim  histidin  dekarboksilase  penghasil  histamin.  Park et  al . (2010)  menyatakan  bahwa  salah  satu  cara  yang  paling  efektif untuk menghambat perkembangan histamin  untuk bahan baku adalah  dengan  penyimpanan  pada  suhu  -4°F  (4.4°C)  selama penanganan sampai ke konsumen. Oleh karena itu, melakukan rantai  dingin  pada  saat  penanganan  sampai  ke  konsumen merupakan  faktor  yang  kritis. Commission  Regulation (2005) menetapkan  bahwa  suhu  pada  saat  penanganan  hasil perikanan dan hewan maksimum adalah 0-1°C.
Total  mikroba  pada  jeroan  yang  digunakan  sebagai  bahan baku  masih  memenuhi  persyaratan  kesegaran  ikan,  yaitu dengan  total  mikroba  <10 5 CFU/g.  Hal  ini  sesuai  dengan standar  (BSN,  2006),  batas  maksimum  TPC  untuk  ikan  segar adalah 5.0x10 5 CFU/g. Akan tetapi, hasil penelitian Prester et al. (2010)  menyimpulkan bahwa  karakteristik secara mikrobiologis yang  baik  belum  tentu  menunjukkan  kondisi  bahan  baku  baik, karena indeks amin biogenik (histamin, putressin, tyramin, dan kadaverin) mempunyai korelasi yang tinggi terhadap kandungan endotoksin  dari  cumi-cumi  (r=0.978  dengan  p<0.001)  dan musky  octopus (r=0.874  dengan  p<0.01),  bahkan  kandungan endotoksin  yang  tinggi  berkorelasi  dengan  dekomposisi  bahan dan  peningkatan  kandungan  histamin.  Hal  ini  yang  perlu
diwaspadai  pada  pengolahan  bahan  pangan,  khususnya  hasil perikanan.

## Karakteristik hasil fermentasi
Penelitian  ini  menggunakan  kadar  garam  25%,  sesuai dengan  kebiasaan  masyarakat  di  Maluku  dalam  pembuatan bakasang  pada  interval  25-30%,  dan  berdasarkan  penelitian pada  produk  yang  sejenis  ( dayok )  penggunaan  garam  untuk fermentasi terbaik 25%.  Penelitian terhadap produk fermentasi jeroan  ikan  tuna  ( Thunnus  albacares )  dikenal  dengan dayok pada konsentrasi garam yang berbeda (10.00, 17.50 dan 25%) selama 7 hari pada suhu kamar yang dilakukan oleh Besas dan Dizon  (2012),  menunjukkan  bahwa  nilai  TPC,  bakteri  asam laktat,  dan  histamin  menurun  seiring  dengan  peningkatan konsentrasi  garam.  Kadar  histamin  selama  fermentasi  dengan garam 17.5% mendekati standar dari FDA yaitu 50 ppm, tetapi untuk konsentrasi 25% kadar histamin produk di bawah standar FDA.  Penggunaan  garam  untuk dayok disarankan  ≥17.5% karena dapat meminimalkan kandungan histamin produk.
Hasil  analisa  kimia  dan  mikrobiologi  pada  jeroan  ikan cakalang  selama  fermentasi  disajikan  pada  Tabel  2.  Selama proses  fermentasi  terjadi  perubahan  secara  nyata  terhadap kadar  air,  protein,  histamin,  dan  log  total  mikroba,  sedangkan pH dan jumlah Salmonella tidak dipengaruhi secara nyata. Hasil analisa statistik menunjukkan bahwa lama fermentasi memberikan  pengaruh  nyata  terhadap  kadar  air.  Dalam penelitian  ini  kadar  air  mengalami  penurunan  dari  77.38% menjadi  71.57%.  Hasil  uji  lanjut  Duncan  menunjukkan  bahwa bakasang  yang  diperoleh  dari  lama  fermentasi  6  dan  8  hari memiliki  kadar  air  lebih  rendah  daripada  bakasang  yang difermentasi  selama  2  dan  4  hari.  Hal  ini  disebabkan  oleh penetrasi  garam  ke  jeroan  ikan  semakin  sempurna  dengan semakin lama waktu fermentasi sehingga menurunkan kadar air jeroan  ikan.  Hal  ini  sesuai  dengan  hasil  penelitian  yang dilakukan  oleh  Rabie et  al. (2009)  bahwa  kandungan  air  dari produk  fermentasi  tradisional feseekh di  Mesir  selama pengolahan (20 hari) dan penyimpanan (40-60 hari) mengalami penurunan.
Kadar  protein  bakasang  juga  dipengaruhi  oleh  lama fermentasi.  Hasil  uji  lanjut  menunjukkan  bahwa  bakasang dengan lama fermentasi 0, 2, dan 4 hari berbeda dengan 6 dan 8  hari.  Hal  ini  dimungkinkan  karena  proses  fermentasi  meniru proses  yang  biasa  dilakukan  oleh  masyarakat,  yaitu  meng- gunakan  wadah  yang  tidak  tertutup  rapat,  sehingga  me- mungkinkan  peruraian  protein  terjadi  dan  nitrogen/senyawa turunannya  menguap  saat  fermentasi  selama  6  dan  8  hari.
Tabel 2.  Karakteristik kimia dan mikrobiologi jeroan dan perubahannya selama proses fermentasi
Parameter Lama Fermentasi (Hari ke-) 0 2 4 6 8 Kadar air  (% bb) 77.38±1.67 a 74.56±1.35 ab 72.79±0.76 bc 72.14±0.96 c 71.57±0.63 c Kadar protein (% bk) 52.23±1.92 a 50.94±1.72 a 50.87±0.25 a 49.26±0.57 b 48.72±0.59 b Nilai pH 6.02±0.06 a 5.76±0.07 a 5.78±0.09 a 5.81±0.07 a 5.83±0.01 a Histamin  (ppm) 19.38±1.30 a 22.46±1.38 a 24.56±1.35 a 28.26±1.31 b 30.18±1.34 b Log total mikroba (CFU/g) 4.62±0.66 a 4.82±0.15 ab 4.86±0.08 ab 5.05±0.03 b 5.15±0.06 b Salmonella Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif
Keterangan: Angka-angka pada baris yang sama diikuti huruf superscript yang berbeda (a,b,c) menunjukkan hasil yang berbeda nyata ( p <0.05), nilai rata-rata ± SD, n = 3
Chen et  al .  (2010)  menyatakan  bawa  selama  proses fermentasi,  garam  yang  masuk  ke  dalam  jaringan  jeroan menimbulkan  berbagai  perubahan  kimia  yang  mengakibatkan beberapa  komponen  seperti  protein  terekstrak,  lemak  dan karbohidrat  diubah  menjadi  senyawa  lebih  sederhana  oleh enzim  yang  terdapat  dalam  jeroan  ataupun  oleh  mikro- organisme  yang  tumbuh.  Segera  setelah  penarikan  air, sebagian  protein  dalam  jaringan  ikan  terlarut  ke  dalam  cairan garam, atau bahkan menguap jika telah terbentuk N bebas atau turunannya. Hasil riset Rabie et al. (2009) menunjukkan bahwa produk  fermentasi  dari  ikan  dengan  menggunakan  garam  di Mesir ( feseekh ) selama pengolahan (20 hari) dan penyimpanan (40-60 hari)  mempunyai kandungan total amin biogenik antara 84  ppm  sampai  1.633  ppm.  Amin  biogenik  utama  yang terdeteksi adalah kadaferin dengan konsentrasi 21 sampai 997 ppm,  dan  kandungan  histamin  211  ppm.  Asam  amino  bebas yang dominan adalah leusin, asam glutamat, lisin, alanin, valin, asam aspartat, isoleusin dan sitrullin.
Nilai pH jeroan selama proses fermentasi berubah dari 6.02 pada  awalnya  menjadi  5.83  pada  akhir  fermentasi,  tetapi kisaran  nilai  tersebut  masih  dalam  kondisi  sedikit  asam.  Pada penelitian  ini  nilai  pH  tidak  dipengaruhi  oleh  lama  fermentasi. Selama  fermentasi  terbentuk  asam-asam  organik  terutama asam laktat dari golongan bakteri asam laktat dan bakteri pem- bentuk  asam  lainnya.  Kondisi  tersebut  sejalan  dengan  hasil penelitian yang dilakukan Ennouali et al. (2006) bahwa pH pada fermentasi  limbah  ikan  yang  disimpan  pada  suhu  ruang  (30- 33°C)  turun  di  awal  fermentasi  dan  stabil  setelah  hari  ke  tiga yaitu  4.2.  Kandungan  bakteri  mesofilik  adalah  2.4x10 6 sampai 4.58x10 7 CFU  dan  ragi  1.30x10 3 sampai  1.59x10 5 .  Bakteri anaerobic  sulphur-reducing (ASR)  turun  dari  1.9x10 4 menjadi menjadi nol, sedangkan untuk total coliforms dan fecal coliforms adalah nol. Menurut Ndaw et al. (2008) untuk produk fermentasi nilai pH turun dari 6.08 menjadi 4.3 setelah minggu ke 2, bebas dari  bakteri Coliforms dan  tidak  ada  pertumbuhan  bakteri Staphylococcus  aureus , Salmonella spp.,  serta Sulphyte- Reducing  Clostridia (SRC).  Hasil  penelitian  Griswold et  al. (2006)  menemukan  bakteri  asam  laktat  dapat  menghasilkan energi  dari  metabolisme  dan  meningkatkan  keasaman  melalui jalur  katabolik,  asam  amino  diubah  menjadi  komponen  amin biogenik, meliputi: histamin, tiramin, putresin, cadaverin, dan β- phenilethilamin,  hasil  dari  dekarboksilasi  histidin,  tirosin, ornithin, lisin dan β-phenilalanin.
Kadar  histamin  juga  meningkat  selama  proses  fermentasi yaitu  semula  19.38  menjadi  31.18  ppm,  tetapi  nilai  tersebut masih dalam batas aman karena masih berada di bawah batas nilai  yang  ditetapkan  oleh  Ditjen  P 2 HP  DKP  (2007 b )  yaitu  100 ppm  untuk  hasil  dan  produk  perikanan.  Keberadaan  histamin selama  proses  fermentasi  pada  saat  pembuatan  bakasang memang  perlu  dipantau  karena  bahan  baku  yang  digunakan adalah  dari  famili  scombroidae  yang  biasanya  banyak  me- ngandung histidin. Histidin dalam bahan pangan, terutama hasil perikanan,  diubah  menjadi  histamin  jika  ada  enzim  histidin dekarboksilase. Hal ini terjadi jika  penanganan bahan tersebut tidak  baik,  atau  bila  ada  bakteri  yang  mampu  menguraikan histidin  menjadi  histamin,  yang  merupakan  komponen  pe- nyebab  keracunan.  Hal  ini  didukung  oleh  Dissaraphong et  al. (2006)  dan  Jiang et  al. (2007)  yang  menyatakan  bahwa
keberadaan  histamin  dalam  jumlah  besar  pada  ikan  golongan scombroid  dapat  menyebabkan  keracunan  bahkan  kematian. Ikan-ikan  tersebut  antara  lain  adalah skipjack  tuna , mackerel , yellowfin , bluefin , dan tuna albacore . Menurut  Hsu et  al. (2009)  bakteri  dalam  fermentasi  ikan, khususnya Pediococcus  acidilactid , Holobacterium ,  dan Staphylococcus; sangat  potensial  dalam  membentuk  histamin. Penelitian lain yang mendukung adalah Tsai et al. (2006) yang berhasil  mengidentifikasi  bakteri  pembentuk  histamin  paling banyak  yaitu  dari  golongan Enterobacter sp., Klebsiella pneumonia dan Proteus  morganii .  Menurut  Jiang et  al. (2007) peningkatan kandungan histamin pada yu-lu berkorelasi positif dengan  adanya  mikroba  pembentuk  enzim  histidin  dekar- boksilase  dalam  jumlah  yang  banyak  seperti Staphylococcus pasteur dan Bacillus meganterium .
Selama  proses  fermentasi  terjadi  peningkatan  log  total mikroba  dari  4.62  (4.17x10 4 )  CFU/g  menjadi  5.15  (1.42x10 5 ) CFU/g.  Hasil  analisa  ragam  menunjukkan  bahwa  lama fermentasi memberikan pengaruh nyata terhadap total mikroba yang tumbuh. Peningkatan total mikroba disebabkan oleh peng- gunaan garam tinggi menyebabkan hanya mikroorganisme ter- tentu  yang  mampu  tumbuh.  Hal  ini  sesuai  dengan  pernyataan Ichimura et  al. (2003)  bahwa  fermentasi  dapat  terjadi  karena aktivitas mikroba pada substrat organik yang sesuai. Penelitian lain yang dilakukan oleh Kilinc et al. (2006) menunjukkan bahwa semakin  tinggi  konsentrasi  glukosa  yang  digunakan  dalam fermentasi, maka semakin tinggi  jumlah bakteri asam laktat dan halofilik.  Penelitian  Thienchai  dan  Chaiyanan  (2012)  berhasil mengisolasi  bakteri  asam  laktat  dari  produk  fermentasi  ikan. Jenis bakteri yang diidentifikasi adalah Lactobacillus pantarum, merupakan  bakteri yang diisolasi dari ka-pi (produk fermentasi dari  udang)  dan Tetragenococcus  halophilus adalah  bakteri yang diisolasi dari fermentasi ikan anchovy . Salmonella merupakan  bakteri  Gram  negatif  yang  bersifat anaerobik  fakultatif.  Pengujian  jumlah Salmonella terhadap bahan  pangan  sangat  penting,  karena  bakteri  tersebut  dapat menyebabkan  sakit  pada  manusia.  Menurut  Bouchrif et  al. (2009) penyebaran Salmonella sangat luas dan dapat bertahan dengan  baik  pada  beberapa  jenis  bahan  pangan  hasil peternakan, perikanan dan makanan sehari-hari. Penelitian Pui et  al. (2011)  menunjukkan  penyakit  yang  disebabkan  oleh bakteri Salmonella telah merambah seluruh dunia dan memberi- kan  efek  negatif  pada  perekonomian.  Penelitian  lain  yang dilakukan  oleh  Boyen et  al. (2008)  menunjukkan  bahwa  tiga jenis Salmonella yang  sering  berjangkit  mengenai  manusia setiap  tahun  adalah Salmonella  Enteritidis , Salmonella Typhimurium dan Salmonella  Heidelberg .  Kothari et  al. (2008) menyatakan  bahwa  penderita  karena Salmonella di  Indonesia jika  dibandingkan  dengan  negara  lain  masih  tinggi,  yaitu  pada tahun 2008 laju insiden penderita 81.7 per 100.000 populasi, di India  2214.2  per  100.000  populasi,  di  Singapura  4.7  per 100.000  populasi,  di  Malysia  0.77  per  100.000  populasi, sedangkan di Vietnam 22.3 per 100.000 populasi. Newell et al . (2010)  menyatakan  bahwa Salmonella  Typhi dan Salmonella Paratyphi A  tidak  ditemukan  dalam  perut  binatang,  infeksi Salmonella terjadi  karena  mengonsumsi  makanan  yang penanganannya tidak benar sehingga bisa menginfeksi secara individual.
Hasil  uji  terhadap Salmonella pada  penelitian  ini  selama fermentasi  menunjukkan  hasil  yang  negatif,  hal  ini  meng- indikasikan  bahwa  bahan  baku  jeroan  ikan  yang  digunakan tidak terkontaminasi oleh Salmonella . Kemungkinan lain adalah Salmonella tidak  mampu  tumbuh  pada  media  garam  tinggi karena  dalam  fermentasi  bakasang  digunakan  kadar  garam 25%.  Hal  ini  didukung  oleh  penelitian  Sarojnalini  dan  Suchitra (2009) dalam fermentasi pembuatan Ngari selama 40 hari dan dilanjutkan  5  sampai  6  bulan,  mempunyai  kandungan  TPC 1.0x10 8 CFU/g,  tetapi  tidak  ada  bakteri Coliforms , Escherichia coli dan Salmonella selama  fermentasi.  Menurut  Amagliani (2011)  bahwa  kondisi  pertumbuhan  bakteri Salmonella adalah pada  suhu  5  sampai  45°C  dan  mampu  bertahan  pada pembekuan atau mati dalam waktu yang cukup lama, dan tanpa mempengaruhi  karakteristik  fisik  dari  makanan. Salmonella sensitif  terhadap  suhu  tinggi  dan  bisa  dimatikan  pada  suhu ≥70°C. Salmonella hidup pada pH 4 sampai dengan 9, dengan pH optimum 6.5 sampai 7.5 dengan aktivitas air (a W ) tinggi yaitu 0.94  sampai  0.99  namun  masih  dapat  bertahan  pada  a W <0.2 seperti pada pangan yang kering. Penghambatan terbaik untuk bakteri Salmonella adalah  pada  suhu  >70°C,  pH  <3.8  dan aktivitas air (a W ) <0.94. Berdasarkan pada hasil pengujian baik secara  kimia  maupun  secara  mikrobiologis,  ditentukan  bahwa bakasang terbaik untuk dilakukan penyimpanan atau penelitian lanjut adalah bakasang yang difermentasi selama 4 hari.

## Penambahan karakteristik selama penyimpanan bakasang
Bakasang terpilih kemudian disimpan selama 0, 30, 60, dan 90  hari,  yang  selanjutnya  dilakukan  analisa  pada  masing- masing  sampel  berdasarkan  lama  penyimpanannya.  Hasil analisa  kimia  dan  mikrobiologi  pada  bakasang  yang  telah  di- fermentasi selama penyimpanan disajikan pada Tabel 3.
Hasil  analisa  statistik  menunjukkan  bahwa  lama  pe- nyimpanan  memberikan  pengaruh  nyata  terhadap  kandungan air  bakasang.  Hasil  uji  lanjut  menunjukkan  bahwa  kadar  air produk yang disimpan selama 0 hari berbeda dengan kadar air yang  lain,  dan  peningkatan  kadar  air  selama  penyimpanan bakasang diperoleh selama pengamatan. Hal ini diduga selama penyimpanan  telah  terjadi  penguraian  senyawa  organik makromolekul  oleh  enzime  hidrolase  dengan  menghasilkan molekul air.
Tabel 3.  Karakteristik kimia dan mikrobiologi jeroan dan perubahannya selama penyimpanan Parameter Lama Penyimpanan (Hari) 0 30 60 90 Kadar air (%) 75. 02± 1.67 a 76.45± 1.34 b 77.25± 0.88 b 77.25± 1.23 b Kadar protein (% bk) 48.68± 0.76 a 46.98± 0.81 b 45.47± 1.02 c 43.68± 0.87 d Nilai pH 5.72± 0.57 a 5.78± 0.86 a 6.13± 0.58 b 6.99± 0.87 bc Histamin (ppm) 23.23± 1.03 a 28.97± 1.32 b 35.58± 1.45 c 48.43± 0.97 d Log total mikroba CFU/g) 2.38± 0.56 a 4.66± 0.61 b 7.14± 0.77 c 8.14± 0.86 d
Keterangan: Angka-angka pada baris yang sama diikuti huruf superscript yang berbeda  (a,b,c)  menunjukkan hasil  yang  berbeda nyata  ( p <0.05),  nilai  rata- rata ± SD, n = 3
Faktor lama penyimpanan juga memberikan pengaruh nyata terhadap  kandungan  protein  bakasang.  Penyimpanan  me- nyebabkan  penurunan  kandungan  protein  bakasang.  Hasil  uji lanjut  menunjukkan  bahwa  kadar  protein  bakasang  yang disimpan  selama  0,  30,  60,  dan  90  hari  masing-masing berbeda. Hal ini disebabkan oleh adanya perubahan sifat fisiko- kimia maupun mikrobiologi, sehingga pemecahan makromolekul protein,  peptida  dan  asam  amino  berubah  menjadi  senyawa yang  lebih  sederhana  oleh  enzim  yang  terdapat  dalam  jeroan atau  oleh  mikroba  karena  disimpan  pada  suhu  kamar. Penurunan ini didukung oleh penelitian Mojica et al. (2005) yang melaporkan  bahwa  fermentasi  menyebabkan  perubahan  pada struktur protein seperti fragmentasi, cross-linking , agregasi, dan oksidasi,  serta  berbagai  efek  dari  perubahan  protein  secara natural,  kondisi  fisik,  organoleptik  dari  produk.  Penelitian  lain yang  mendukung  dilakukan  oleh  Al-Bulushi et  al .  (2009)  yang menemukan bahwa proses penyimpanan terhadap produk yang telah  diolah  dapat  menyebabkan  protein  dan  lemak  terurai menjadi  komponen-komponen  turunannya  yang  mempunyai berat  molekul  rendah  dan  berkontribusi  terhadap flavour . Penelitian  lain  yang  dilakukan  oleh  Taorem  dan  Sarojnalini (2012) bahwa selama proses fermentasi ngari terjadi perubahan protein  yang  disebabkan  oleh  aktivitas  mikroba  dari  inokulum untuk  fermentasi  dan  mikroba  tersebut  menggunakan  protein untuk aktivitas metabolismenya. Kehilangan komponen nitrogen dalam produk fermentasi dari ikan dimungkinkan karena adanya dekomposisi  protein  dalam  jaringan  ikan.  Proses  degradasi  ini menimbulkan karakteristik flavour pada produk akhir. Degradasi protein  ikan  yang  difermentasi  juga  menghasilkan  komponen volatil dari asam amino. Penurunan kadar protein ini juga diikuti oleh  kenaikan  kadar  histamin  selama  penyimpanan;  semakin lama  produk  disimpan,  maka  kadar  histamin  semakin  besar. Menurut Spano et al. (2010) perubahan komponen daging ikan digolongkan  berdasarkan  struktur  kimianya  menjadi:  golongan alifatik (putressin, kadaverin, spermin, dan spermidin), golongan aromatik (tiramin dan fenil etilamin), serta golongan heterosiklik (histamin dan triptamin); sedangkan penggolongan berdasarkan jenis amin menjadi monoamin (tiramin dan fenil etilamin), diamin (putressin  dan  cadaverin)  atau  poliamin  (spermin  dan spermidin).
Nilai  pH  bakasang  mengalami  peningkatan  seiring  dengan lama  penyimpanan.  Peningkatan  nilai  pH  setelah  awal fermentasi  terlampaui  berkaitan  dengan  nilai  log  total  mikroba yang  tinggi.  Mikroba  tersebut  mampu  mendegradasi  protein, peptida  dan  asam  amino  menjadi  derivatnya.  Hal  ini  didukung oleh penelitian dari Kilinc et al. (2006) yang menyatakan bahwa peningkatan  nilai  pH  selama  penyimpanan  pada  produk fermentasi berhubungan dengan degradasi protein, peptida dan asam amino menjadi derivatnya yang bersifat basa-basa volatil seperti amonia, indol, H 2 S, merkaptan, fenol, kresol dan skatol. Lebih  lanjut  dinyatakan  bahwa  pengaruh  lama  penyimpanan terhadap  peningkatan  dan  penurunan  nilai  pH  berhubungan dengan kandungan nitrogen dan adanya glukosa yang diguna- kan dalam fermentasi sebagai sumber karbon.
Hasil analisa statistik menunjukkan bahwa lama penyimpan- an  memberikan  pengaruh  nyata  terhadap  kandungan  histamin bakasang.  Hasil  uji  lanjut  menunjukkan  bahwa  kadar  histamin bakasang yang disimpan selama 0, 30, 60, dan 90 hari masing-
masing  berbeda.  Kadar  histamin  bakasang  meningkat  seiring dengan  lama  penyimpanan.  Peningkatan  nilai-nilai  tersebut masih dalam batas aman berdasarkan standar yang ditetapkan Ditjen P2HP DKP (2007 b ), maksimum kadar histamin pada hasil dan  produk  perikanan  adalah  100  ppm.  Peningkatan  kadar histamin  berkolerasi  positif  dengan  peningkatan  total  mikroba. Hal ini juga didukung oleh penelitian yang dilakukan oleh Zarei et  al. (2012),  yang  menyatakan  bahwa  kandungan  histamin yang tinggi pada produk sejenis kecap ikan ( Iranian fish sauce ) berkorelasi  positif  dengan  jumlah  bakteri  terutama Enterobacteriaceae dan bakteri asam laktat.
Peningkatan  kadar  histamin  pada  produk  yang  disimpan selama  90  hari  diduga  karena  suhu  penyimpanan  pada  suhu kamar. Hal ini dimaksudkan supaya dapat memberikan gambar- an kepada masyarakat dan hasil penelitian ini bisa diaplikasikan oleh  masyarakat.  Penelitian  lain  yang  mendukung  dilakukan oleh Hsu et al. (2009) yang menyatakan bahwa suhu optimum pembentukan histamin adalah 26-28°C. Penelitian lain tentang histamin  dilakukan  Chong et  al. (2011)  menemukan  bahwa penanganan  bahan  pangan  yang  kurang  baik  meningkatkan kandungan  histamin  pada  bahan  dan  produk.  Menurut Dissaraphong et al . (2006) peningkatan histamin terkait dengan keberadaan  dan  kelimpahan  asam  amino  bebas  histidin, keberadaan  mikroorganisme  yang  mampu  mendekarboksilasi asam amino histidin, kondisi pH dan suhu yang memungkinkan bakteri  dapat  tumbuh  dan  memproduksi  enzim  selama  proses fermentasi  dan  penyimpanan.  Menurut  Kimura et  al .  (2003) bakteri penghasil histamin yang diisolasi dari produk fermentasi didominasi  oleh  bakteri  asam  laktat,  yaitu: Staphylococcus epidermidis,  Staphylococcus  captitis, dan Tetragenococcus muriaticus .
Hasil analisa statistik menunjukkan bahwa lama penyimpan- an  memberikan  pengaruh  nyata  terhadap  kandungan  log  total mikroba bakasang. Hasil uji lanjut menunjukkan bahwa log total mikroba bakasang yang disimpan selama 0, 30, 60, dan 90 hari masing-masing berbeda; log total mikroba bakasang meningkat seiring  dengan  lamanya  penyimpanan.  Mengacu  pada  BSN (1996), batas maksimum TPC untuk produk petis udang adalah 10 5 CFU/g.  Artinya,  nilai  pada  akhir  penyimpanan  bakasang selama  90  hari  sudah  melebihi  standar  yang  ditetapkan.  Total mikroba yang tinggi berkaitan dengan karakteristik bahan baku (jeroan) yang banyak mengandung mikroflora alami. Pada awal penyimpanan,  pertumbuhan  mikroba  berada  dalam  fase  lag (adaptasi), bakteri belum melakukan pembelahan, tetapi terjadi peningkatan massa-volume (ukuran sel berubah, bukan jumlah sel).  Pada  fase  tersebut  bakteri  lebih  banyak  melakukan adaptasi  dengan  lingkungan.  Selanjutnya  setelah  lama  pe- nyimpanan  30  hari  sampai  akhir  penyimpanan,  total  mikroba secara tajam mengalami lonjakan jumlah biomassa sel karena ketersediaan nutrisi dan oksigen masih cukup untuk dimanfaat- kan  oleh  mikroorganisme  untuk  berkembang  biak.  Kandungan total  mikroba  yang  tinggi  ketika  lama  penyimpanan  60  dan  90 hari  diduga  karena  pertumbuhan  bakteri  halofilik  dan halotoleran  yang  menyebabkan  peningkatan  nilai  pH  dan kandungan  histamin  serta  penurunan  kandungan  protein bakasang. Hal ini didukung oleh penelitian yang dilakukan oleh Taorem  dan  Sarojnalini  (2012)  yang  menunjukkan  bahwa selama  fermentasi  terjadi  peningkatan  TPC,  karena  bakteri
memainkan  peran  penting  dalam  proses  fermentasi  ikan. Menurut  Kung et  al .  (2005)  selama  penyimpanan  protein, peptida  dan  asam  amino  terurai  oleh  aktivitas  mikroorganisme yang  menghasilkan  produk-produk  basa  volatil  dengan  berat molekul  rendah.  Beberapa  jenis  bakteri  pembentuk  histamin dari hasil perikanan yang berhasil diidentifikasi oleh  Tsai et al. (2007) adalah golongan Enterobacter sp, Klebsiella pneumonia , Proteus morganii , Corynebacterium, dan Micrococcus . Menurut Kanki et  al. (2007),  bakteri Raoultella  planticola , Morganella morganii , Hafnia  alvei ,  dan Photobacterium  phosphoreum, Photobacterium  damselae yang  diisolasi  dari  ikan  laut merupakan  bakteri  halotoleran.  Adapun  bakteri  halotoleran penghasil  histamin  seperti Photobacterium  phosphoreum dan Raoultella planticola mempunyai histidine decarboxylase (HDC) yang  mengubah  histidin  menjadi  histamin.  Faktor  yang  me- nentukan  akumulasi  histamin  adalah  produksi  HDC  pada  saat autolysis dan  kosentrasi  bakteri  penghasil  histamin  yang tumbuh.  Dua  jenis  enzim  HDC  yang  mengkatalisa  proses dekarboksilasi dari histidin menjadi histamin yaitu α-pyridoxal-5′- phosphate  (PLP)-dependent  enzyme dan pyruvoyl-dependent enzyme .  Bakteri  Gram  negatif  seperti Enteric  bacteria dan Photobacterium mempunyai enzim PLP-dependent . Enzim  HDC  mampu  bekerja  pada  kadar  garam  tinggi.  Hal ini  didukung  oleh  penelitian  pada  kecap  ikan  yang  dilakukan oleh  Kimura et  al. (2003),  pembentukan  histamin  pada  kecap ikan  terjadi  dan  tidak  dapat  dicegah  sampai  pada  konsentrasi NaCl  20%.  Jenis  bakteri  yang  teridentifikasi  adalah Tetragenococcus  muriaticus dan T.  Halophillus. Penelitian  lain yang mendukung temuan ini dilakukan oleh Jiang et al. (2007) pada yu-lu (produk  fermentasi  ikan  dari  China)  yang  di- fermentasi  menggunakan  garam  30%  selama  187  hari,  terjadi peningkatan kadar histamin secara nyata pada hari ke-60.

## Perbandingan dengan produk komersial
Pada  tahap  ini  dilakukan  perbandingan  antara  bakasang komersial  yang  diperoleh  dari  pengrajin  bakasang  lokal  di Ternate  yang  sudah  disimpan  selama  30  hari  dengan  produk terbaik  hasil  penelitian  yang  juga  sudah  disimpan  selama  30 hari  pada  kondisi  penyimpanan  sama.  Dalam  penelitian  ini pembuatan bakasang dilakukan di laboratorium dengan meniru proses  pembuatan  bakasang  yang  biasa  dilakukan  oleh masyarakat  secara  tradisional,  tetapi  berbeda  dalam  hal  asal bahan  baku  dan  kondisi  air  pencucian.  Bahan  baku  bakasang komersial berasal dari daerah Maluku, sedangkan bahan baku bakasang penelitian berasal dari Muara Baru, Jakarta. Air yang digunakan dalam proses pencucian bahan baku pada bakasang komersial,  adalah  air  yang  belum  diketahui  kelayakannya sebagai  air  minum,  sedangkan  bakasang  penelitian  dicuci dengan  air  bersih/PDAM.  Hasil  analisa  perbandingan  produk secara kimiawi dan mikrobiologi disajikan pada Tabel 4.
Hasil  uji  statistik  menunjukkan  bahwa  kadar  protein, histamin,  total  mikroba,  dan  nilai  pH  berbeda  nyata  antara bakasang hasil penelitian dengan bakasang  komersial, kecuali kadar air.  Kadar air penting dalam bahan pangan karena dapat mempengaruhi  tekstur,  penampakan,  dan  citarasa  makanan. Pada  peneltian  ini  kadar  air  bakasang  hasil  penelitian  tidak berbeda dengan kadar air dari bakasang komersial. Kandungan protein  dalam  bahan  pangan  bervariasi  baik  dalam  jumlah
maupun jenisnya. Kandungan protein bakasang hasil penelitian (46.98%  bk)  lebih  tinggi  dibandingkan  bakasang  yang  dibuat menurut  metoda  komersial  yang  biasa  dikonsumsi  oleh masyarakat Maluku Utara (42.48% bk). Perbedaan ini disebab- kan  oleh  perbedaan  perubahan  secara  fisiko-kimia  pada  saat proses  pemasakan  jeroan  ikan  cakalang  dan  selama  pe- nyimpanan.  Jumlah  kandungan  protein  berbanding  terbalik dengan  kandungan  histamin  dari  produk  masing-masing bakasang.  Bakasang  hasil  penelitian  mempunyai  kandungan protein  lebih  tinggi  dengan  kadar  histamin  yang  lebih  rendah (28.97±3.73 ppm); sebaliknya, bakasang tradisional mempunyai kandungan  protein  yang  lebih  rendah  tetapi  mengandung histamin sangat tinggi (303.37±3.73 ppm).
Tabel 4.  Perbandingan  bakasang  hasil  penelitian  dengan  bakasang komersial Parameter Perlakuan/Penelitian Fermentasi 4 Hari (30 Hari) Komersial (30 Hari) Kadar air (% bb) 76.45±1.12 a 74.26±1.09 a Kadar protein (% bk) 46.98±1.16 a 42.48±1.06 b Nilai pH 4.78±0.02 a 6.21±0.02 b Histamin (ppm) 28.97±1.37 a 303.37±1.33 b Log total mikroba (CFU/g) 4.66±0.03 a 7.36 ±0.06 b
Keterangan: *) Persen basis kering, nilai rata-rata ± SD, n = 3
Derajat  keasaman  (pH)  merupakan  salah  satu  faktor penting  dalam  penentuan  mutu  bahan  pangan,  demikian  pula selama  proses  fermentasi  nilai  pH  bahan  juga  sangat  me- nentukan  mutu.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  nilai  pH bakasang  penelitian  rendah,  sedangkan  bakasang  komersial menghasilkan  pH  lebih  tinggi,  tetapi  nilai  ini  masih  dalam kisaran  normal.  Hal  ini  didukung  oleh  Anihouvi et  al. (2006), yang  meneliti lanhouin yang  diambil  dari  pasar  menunjukkan nilai  pH  rata-rata  7,  a W berkisar  antara  0.65-0.87,  kadar  air antara  50.1-56.6%  serta  protein  antara  24.6-26.5%.  Hasil penelitian  Mohamed et  al. (2012)  menunjukkan  bahwa budu yang  diperoleh  dari  pasar  di  Malaysia  mempunyai  nilai  pH antara  4.50  dan  4.92.  Produk  tersebut  mengandung  44 komponen volatil, diantaranya sebagai komponen aroma adalah 3-methyl-1-butanol , 2-methylbutanal , 3-methylbutanal , dimethyl disulfide,  3-(methylthio)-propanal, asam 3-methylbutanoic dan benzaldehye .  Penelitian  lain  yang  dilakukan  Kopermsub  dan Yunchalard  (2008)  menunjukkan  bahwa  fermentasi  produk pangan tradisional Thailand yaitu plaasom, mempunyai nilai pH bahan  6.3  dan  saat  proses  fermentasi  nilai  pH  turun  dengan cepat  sampai  mencapai  4.5  karena  proses  penyempurnaan fermentasi.  Pada  tahap  kesempurnaan  fermentasi  nilai maksimum  untuk total  viable  counts (TVC)  adalah  6.83  log CFU/g dan lactic acid bacteria (LAB) adalah 6.72 log CFU/g. Pengujian  kadar  histamin  merupakan  bagian  penting  pada hasil perairan. Kadar hitamin bakasang hasil penelitian masih di bawah standar yang diizinkan, tetapi  kadar histamin bakasang komersial  sudah  di  atas  ambang  batas  aman  sebagai  bahan pangan.  Kadar  histamin  dari  produk  bakasang  komersial  yang tinggi  mengindikasikan  penanganan  bahan  baku  dan  cara pengolahan  produk  yang  kurang  baik,  terkait  dengan  sanitasi dan hiegene, sehingga mendukung pertumbuhan bakteri peng- hasil  histamin  untuk  berkembang  biak.  Menurut  Zaman et  al. (2009) keracunan histamin akibat dari konsumsi ikan scombroid
(tuna,  bonito,  dan  mackerel)  yang  kaya  akan  histidin  sering disebabkan oleh penanganan yang tidak baik sehingga bakteri penghasil histamin memproduksi histamin dalam jumlah besar. Menurut  Borade et  al. (2007)  selama  fermentasi  bakteri mengubah asam amino histidin menjadi histamin. Implikasi dari toksin  yang  dihasilkan  oleh  ikan  famili  scombroidae dan scomberesocidae  (tuna, mackerel , skipjack , bonito )  dan non- scombroid  fish ( mahi-mahi , bluefish , herring , anchovies , sardines ) adalah sama.
Menurut CDC (2010) makanan yang mengandung histamin tinggi dapat menimbulkan reaksi alergi atau keracunan. Waktu yang  dibutuhkan  hingga  terjadi  keracunan  histamin  beberapa menit  sampai  3  jam  setelah  konsumsi  ikan  yang  mengandung histamin  lebih  dari  500  mg/kg,  hal  ini  dapat  bervariasi  ber- gantung  pada  kesensitifan  masing-masing  individu.  Tanda- tanda  keracunan  histamin  kadang  mirip  dengan  gejala keracunan akibat dari Salmonella dan alergi makanan lainnya. Menurut  Gonzaga et  al. (2009)  keracunan  histamin  dari makanan  yang  mengandung  histamin  tinggi  tidak  dapat dikurangi  karena  histamin  stabil  dalam  temperatur  tinggi.  Oleh karena  itu,  perilaku  konsumen  merupakan  kunci  utama  dalam memutuskan rantai keracunan ini.
Beberapa  penelitian  terhadap  produk  fermentasi  ikan  di beberapa  negara  menunjukkan  kadar  histamin  melewati  batas yang  ditentukan.  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Tsai et  al . (2006)  pada  produk  tradisional  yang  ada  di  pasar  Taiwan berupa  produk  fermentasi  dari  ikan  (kecap  ikan,  terasi,  dan terasi udang) mengandung histamin berturut-turut sebesar 394, 263, dan 382 ppm. Penelitian lain yang dilakukan oleh Naila et al. (2011)  terhadap  produk  fermentasi  ikan  di  Maladewa menunjukkan bahwa tiga jenis kecap ikan, dua jenis terasi, dan dua  jenis  terasi  udang  mempunyai  kandungan  histamin  tinggi yaitu lebih dari 500 ppm. Selain itu, sekitar 7.4% sampel produk fermentasi  ikan  mempunyai  histamin  lebih  dari  1.000  ppm, bahkan  salah  satu  jenis  bumbu  berupa  pasta  ikan  ( rihaakuru ) yang berasal dari ikan tuna mengandung histamin sangat tinggi, yaitu 5.487 ppm. Kandungan histamin dari rihaakuru yang tinggi dikarenakan  oleh  bakteri  Gram  negatif  yang  tumbuh  sebelum proses  atau  pada  saat  proses  awal  fermentasi.  Penelitian  lain yang dilakukan oleh Zhai et al. (2012) terhadap tiga jenis produk yang  sering  dikonsumsi  di  China  Selatan  yaitu  ikan  yang digarami dan difermentasi, ikan kaleng, dan ikan yang dikemas, menunjukkan  bahwa  49  sampel  produk  yang  dibeli  dari  pasar mengandung  histamin  sebesar  167.86-484.42  ppm.  Penelitian terhadap  kadar  histamin  pada  produk  fermentasi  ikan  yang dilakukan oleh Huang et al. (2010) menunjukkan bahwa kadar histamin  pada  fermentasi  ikan  yang  dibuat  dari anchovies adalah  155–579 ppm,  sedangkan  kadar  histamin  pada  produk ikan kering secara umum yaitu 63.1–479.0 ppm.
Mikroba merupakan salah satu penyebab utama gangguan kesehatan  yang  berasal  dari  pangan.  Nilai  log  total  mikroba pada  bakasang  hasil  penelitian  ini  masih  aman,  sedangkan untuk  bakasang  komersial  sudah  melewati  batas  yang ditetapkan  oleh  BSN  (2007).  Hal  ini  mengindikasikan  bahan baku  yang  digunakan  oleh  pengolah  bakasang  tradisional kurang  segar  dan  tidak  ditangani  dengan  baik.  Waktu fermentasi pada bakasang komersial dibandingkan penelitian ini lebih  pendek,  yaitu  2  hari.  Adapun  faktor-faktor  yang  mem-
pengaruhi  pertumbuhan  bakteri  adalah  waktu  dan  suhu inkubasi,  pH,  kandungan  nutrisi,  cahaya,  media  (garam,  gula, dan  asam),  serta  oksigen.  Hal  lain  yang  menyebabkan  pe- ningkatan  total  mikroba  diduga  karena  perlakuan  pemasakan jeroan  yang  kurang  sempurna  sehingga  menyebabkan  per- tumbuhan  mikroorganisme  yang  ada  dalam  bahan  pangan (bakasang) mengalami peningkatan. Kandungan mikroba yang tionggi  pada  produk  komersial  ini  berkorelasi  positif  dengan tingginya  kandungan  histamin  mengindikasikan  kemungkinan pada  produk  komersial  banyak  mengandung  bakteri  penghasil histamin. Menurut Zaman et al. (2009) beberapa bakteri peng- hasil histamin adalah Raoultella planticola , Morganella morganii , Hafnia  alvei ,  dan Photobacterium  phosphoreum . Enteric bacteria seperti R.  planticola dan M.  morganii merupakan bakteri  dominan  pada  ikan,  selain  jenis P.  phosphoreum dan

## Photobacterium damselae.
Manfaat  dari  penelitian  ini  secara  ilmiah  adalah  dapat mengetahui  perubahan  kadar  histamin  dan  total  mikroba  pada produk  bakasang.  Adapun  batasan  kandungan  histamin  yang aman  pada  produk  tuna  yang  biasa  digunakan  adalah  30 mg/100  g,  bila  kurang  dari  5  mg/100  g  aman  untuk  dimakan, dan 5-20 mg/100 g tidak beracun dan aman untuk dikonsumsi, 20-100 mg/100 g ada kemungkinan beracun, pada kandungan lebih  dari  100  mg/100  g  beracun  dan  tidak  boleh  dikonsumsi selain  pertimbangan  sensitivitas  konsumen  terhadap  histamin (Rahimi, 2012).

## KESIMPULAN
Lama  fermentasi  memberikan  pengaruh  nyata  terhadap kadar  protein,  kadar  air,  total  mikroba,  dan  kadar  histamin bakasang.  Kadar  protein  bakasang  menurun  selama  proses fermentasi  dari  52.23%  menjadi  48.72%,  sedangkan  kadar histamin  bakasang  meningkat  dari  19.38  ppm  menjadi  31.18 ppm  tetapi  masih  dalam  batas  aman.  Lama  penyimpanan bakasang pada suhu kamar memberikan pengaruh nyata pada kadar  air,  protein,  dan  histamin,  demikian  pula  pH  serta  total mikroba.  Kadar  protein  bakasang  menurun  selama  proses fermentasi  dari  48.68%  menjadi  43.68%,  sedangkan  kadar histamin  bakasang  meningkat  dari  23.23  ppm  menjadi  48.43 ppm.  Bakasang hasil penelitian mempunyai kandungan protein lebih  tinggi,  sedangkan  kandungan  histamin  dan  mikrobanya lebih  rendah  dibandingkan  bakasang  komersial  yang  dibuat oleh  masyarakat  Ternate.    Bakasang  hasil  penelitian  memiliki kandungan  histamin  (28.97±3.73  ppm)  di  bawah  batas  aman yang  ditetapkan  oleh  Ditjen  P2HP  DKP  (2007 b )  dan  standar FDA, dengan nilai TPC (4.56 x 10 4 CFU/g) masih sesuai dengan standar  (BSN,  1996  dan  BSN,  2007).  Metode  pembuatan bakasang  pada  penelitian  ini  dapat  direkomendasikan  untuk diaplikasikan  pada  masyarakat.  Berdasarkan  hasil  penelitian, waktu fermentasi yang baik dalam pembuatan bakasang adalah 4 hari, dengan lama penyimpanan produk maksimal 30 hari.

## DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2005. Official Method of Analysis of The Association of Official Analytical
of  Chemist.  The  Association  of  Official  Analytical  Chemist, Inc.Arlington, Virginia, USA.
Al-Bulushi  I,  Poole  S,  Deeth  HC,  Dykes  GA.  2009.  Biogenic amines  in  fish:  roles  in  intoxication,  spoilage,  and nitrosamine  formation  –  a  review.  Crit  Rev  Food  Sci  49: 369-377. DOI: 10.1080/10408390802067514.
Amagliani G, Brandi G, Schiavano GF. 2011. Incidence and role of Salmonella in  seafood  safety.  Food  Res  Int  10:  30-45.
DOI: 10.1016/ j.foodres.2011.06.022.
Anihouvi  V,  Ayernor  GS,  Hounhouigan  JD,  Sakyi-Dawson  E. 2006.  Quality  characteristic  of  lanhouin:  A  traditionally processed  fermented  fish  product  in  the  Republic  of Benin. Afr J Food Agric Nutr Develop 6: 1-15.
Apriyantono A, Fardiaz D, Puspitasari N, Yasni S, Budiyanto S. 1989. Analisis Pangan. 76-79. IPB Press. Bogor.
Kilinc  B,  Cakli  S,  Tolasa  S,  Dincer  T.  2006.  Chemical, microbiologcal  and  sensory  changes  associated  with  fish sauce  processing.  Eur  Food  Res  Technol  222:  604-613. DOI: 10.1007/s00217-005-0198-4.
Besas  JR,  Dizon  EI.  2012.  Influence  of  salt  concentration  on histamine  formation  in  fermented  tuna  viscera  (Dayok). Food Nutr Sci 3: 201-206. DOI: 10.4236/fns.2012.32029.
Borade  PS,  Ballary  CC,  Lee  DKC.  2007.  A  fishy  cause  of sudden  near  fatal  hypotension.  Resuscitation  72:  158-160. DOI: 10.1016/j.resuscitation.2006.05.021.
Boyen F, Haesebrouck F, Maes D, Van Immerseel F, Ducatelle R, Pasmans F. 2008. Non-typhoidal Salmonella infections in pigs:  A  closer  look  at  epidemiology,  pathogenesis  and control.  Vet  Microbiol  130:  1-19.  DOI:  10.1016/j.vetmic. 2007.12.017.
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 1996. SNI: 01-2718-1996. Petis Udang. Badan Standardisasi Nasional. Jakarta.
[BSN]  Badan  Standardisasi  Nasional.  2006.  SNI:  01-2332.1- 2006. Penentuan Coliform dan Escherchia coli pada Produk Perikanan. Badan Standardisasi Nasional. Jakarta.
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2007. SNI: 01-2338-2007. Pengujian  Mikroba  Kontaminan  pada  Produk  Perikanan. Badan Standardisasi Nasional. Jakarta.
Bouchrif B, Paglietti B, Murgia M, Piana A, Cohen N, Ennaji M, Rubino  S,  Timinouni  M.  2009.  Prevalence  and  antibiotic- resistance  of Salmonella isolated  from  food  in  Morocco.  J Infect Dev Countrie 28: 35-40.
[CDC] Center for Disease Control. 2010. Epidemiological notes and reports on scombroid fish poisoning. Atlanta,GA, USA: center  for  disease  control  and  prevention.  www.cdc.gov/ mmwr.htm. [22 January 2010].
Chen HC, Huang YR, Hsu HH, Lin CS, Chen WC, Lin CM, Tsai YH. 2010. Determination of histamine and biogenic amines in  fish  cubes  ( Tetrapturus  angustirostris )  implicated  in  a food-borne  poisoning.  Food  Control  21:  13–18.  DOI: 10.1016/j.foodcont.2009.03.014.
Chong  CY,  Bakar  FA,  Russly  AR,  Jamilah  B,  Mahyudin  NA. 2011.  The  effects  of  food  processing  on  biogenic  amines formation. Int Food Res 18: 867–876.
[CR] Commission Regulation. 2005. Directives concerning food hygiene and health conditions for the production and placing on the market of certain products of animal origin intended for human consumption. Official J Eur Union L 388: 28-59.
Direktorat  Jenderal  Perikanan.  1986.  Kumpulan  Standar  Mutu Hasil Perikanan. Jakarta.
Dissaraphong S, Benyakul  S,  Vissessanguan  W, Kishimura H. 2006.  The  influence  of  storage  conditions  of  tuna  viscera before  fermentation  on  the  chemical,  physical  and microbiological  changes  in  fish  sauce  during  fermentation. Bioresource  Technol  97:  2032-2040.  DOI:  10.1016/j. biortech.2005.10.007.
[DKP] Dinas  Kelautan dan Perikanan.  2007 a . Laporan  Statistik Perikanan Tangkap. Dinas Kelautan dan Perikanan Provinsi Maluku Utara, Ternate.
[DKP]  Departemen  Kelautan  dan  Perikanan.  2007 b .  Program Monitoring Hasil Perikanan. Direktorat Jenderal Pengolahan dan Pemasaran Hasil Perikanan (Ditjen P 2 HP), Jakarta.
Ennouali  M,  Elmoualdi  L,  Iabioui  H,  Ouhsine  M,  Elyachioui  M. 2006.  Biotransformation  of  the  fish  waste  by  fermentation. Afr J Biotech 5: 1733-1737.
Gonzaga  VE,  Lescano  AG,  Huaman  AA,  Mulanovich  GS, Blazes  DL.  2009.  Histamine  levels  in  fish  from  markets  in Lima, Peru. J Food Prot 72: 1112-1115.
Griswold AR, Jameson-Lee M, Burne RA. 2006. Regulation and physiologic  significance  of  the  agmatine  deiminase  system of Streptococcus mutans UA159. J Bacteriol 188: 834–841. DOI: 10.1128/JB.188.3.834-841.2006.
Hsu  HH,  Chuang  TC,  Lin  HC,  Huang  YR,  Lin  CM,  Kung  HF, Tsai  YH.  2009.  Histamine  content  and  histamine-forming bacteria  in  dried  milkfish  ( Chanos  chanos )  products.  Food Chem  114:  933–938.  DOI:  10.1016/  j.foodchem.2008.10. 040.
Huang YR, Liu K J, Hsieh HS, Hsieh CH, Hwang DF, Tsai YH.
2010.  Histamine  level  and  histamine-forming  bacteria  in dried  fish  products  sold  in  Penghu  Island  of  Taiwan.  Food Control  21:  1234–1239.  DOI:  10.1016/j.foodcont.2010. 02.008.
Ichimura T, Hu J, Duong QA, Maruyama S.  2003. Angiotensin inconverting enzyme inhibitory activity and insulin secretion stimulaitve  activity  of  fermented  fish  sauce.  Biosci  Bioeng 96: 496-499. DOI: 10.1016/S1389-1723(03)70138-8.
Jiang JJ, Qing XZ, Zhi WZ, Li YZ. 2007. Chemical and sensory changes associated  Yu-lu–atradisional Chinese fish sauce. Food  Chem  104:  1629-1634.  DOI:  10.1016/j.foodchem. 2007.03.024.
Kanki  M,  Yoda  T,  Tsukamoto  T,  Baba  E.  2007.  Histidine decarboxylases and their role in accumulation of histamine in  tuna  and  dried  saury.  Appl  Environ  Microbiol  73:  1467– 1473. DOI: 10.1128/AEM.01907-06.
Kimura  B,  Konagaya  Y,  Fujii  T.  2003.  Histamine  formation  by Tetragenococcus  muriaticus,  a  halophilic  lactic  acid bacterium isolated from fish sauce. J Food Microbiol 70: 71- 77. DOI: 10.1016/S0168-1605(01)00514-1.
Kopermsub  P,  Yunchalard  S.  2008.  Safety  control  indices  for plaa-som , a Thai fermented fish product. Afr J Microbiol Res 2: 018-025.
Kothari  A,  Pruthi  A,  Chugh  TD.  2008.  The  burden  of  enteric fever.  J  Infect  Developing  Countries  2:  253-259.  DOI: 10.3855/jidc.218.
Kung  HF,  Tsai  YH,  Hwang  CC,  Lee  YH,  Hwang  JH,  Wei  CI, Hwang  DF.  2005.  Hygienic  quality  and  insidence  of histamine  forming Lactobacillus species  in  natural  and processed cheese in Taiwan. J Food Drug Anal 13: 51-56.
Mah JH, Hwang HJ. 2009. Inhibition of biogenic amine formation in  a  salted  and  fermented  anchovy  by Staphylococcus xylosus as a protective culture. Food Control 20: 796–801.
DOI: 10.1016/j.foodcont.2008.10.005.
McLauchlin  J,  Little  CL,  Grant  KA,  Mithani  V.  2005. Scombrotoxic fish poisoning. Public Health 28: 61-62. DOI: 10.1093/pubmed/fdi063.
Mohamed HN, Man YC, Mustafa S, Manap YA. 2012. Tentative identification  of  volatile flavour compounds  in  commercial budu, a Malaysian fish sauce, using GC-MS. Molecules 17: 5062-5080. DOI: 10.3390/ molecules17055062.
Mojica  ERE,  Nato  AQ,  Ambas  MET,  Feliciano  CP,  Francisco MLDL,  Deocaris  CC.  2005.  Application  of  irradiation  as pretreatment  method  in  the  production  of  fermented  fish paste. J Appl Sci Res 1: 90-94.
Naila  A,  Flint  S,  Fletcher  GC,  Bremer  PJ,  Meerdink  G.  2011.
Biogenic amines and potential histamine – forming bacteria in  rihaakuru  (a  cooked  fish  paste).  Food  Chem  128:  479– 484. DOI: 10.1016/j.foodchem.2011.03.057.
Newell DG, Koopmans M, Verhoef L, Duizer E, Aidara-Kane A, Sprong H, Opsteegh M, Langelaar M, Threfall J, Scheutz F, Giessen  JVD,  Kruse  H.  2010.  Food-borne  diseases-the challenges  of  20  years  ago  still  persist  while  new  ones continue to emerge. Int J Food Microbiol 139: S3-S15. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2010.01.021.
Ndaw  A,  Zinedine  A,  Faid  M,  Bouseta  A.  2008.  Effect  of controlled  lactic  acid  bacteria  fermentation  on  the microbiological  and  chemical  quality  of  Moroccan  sardines ( Sardina pilchardus ). Acta Microbiol Immunol Hung 55: 21- 27. DOI: 10.1556/AMicr.55.2008.3.2.
Park  JS,  Lee  CH,  Kwon  EY,  Lee  HJ,  Kim  JY,  Kim  SH.  2010. Monitoring the contents of biogenic amines in  fish and fish products consumed in Korea. Food Control 21: 1219-1226. DOI: 1 0.1016/j.foodcont.2010.02.001.
Prester  L,  Orct  T,  Macan  J,  Vukusic  J,  Kipcic  D.  2010. Determination  of  biogenic  amines  and  endotoxin  in  squid, musky octopus, norway lobster, and mussel stored at room temperatur.  Archiv  Indust  Hygiene  Toxicol  61:  389-397. DOI: 10.2478/10004-1254-61-2010-2049.
Pui  CF,  Wong  WC,  Chai  LC,  Tunung  R,  Jeyaletchumi  P,
Hidayah NMS, Ubong A, Farinazleen MG, Cheah YK, Son R. 2011. Salmonella : A foodborne pathogen. Int Food Res J 18: 465-473.
Purwaningsih  S,  Garwan  R,  Santoso  J.  2011.  Karakteristik organoleptik  bakasang  jeroan  Cakalang  ( Katsuwonus
pelamis ,  Lin)  sebagai  pangan  tradisional  Maluku  Utara.  J Gizi dan Pangan 6: 13-17.
Purwaningsih  S,  Heni  T,  Kurnia  G.  2006.  Kandungan  gizi  dan mutu  ikan  tenggiri  ( Scomberomorus  commersonii )  selama transportasi.  J  Pascapanen  Biotek  Kelautan  Perikanan  2: 86-91.
Rabie  M,  Sarkadi  LS,  Siliha  H,  El-seedy  S,  El-Badawy  AA. 2009. Changes in free amino acids and biogenic amines of Egyptian  salted-fermented  fish  (Feseekh)  during  ripening and  storage.  Food  Chem  115:  635–638.  DOI:  10.1016/j. foodchem.2008.12.077.
Rahimi  E,  Nayebpour  F,  Alian  F.  2012.  Determination  of histamine  in  canned  tuna  fish  using  ELISA  method. American-Eurasian J Toxicol Sci 4: 64-66.
Sarojnalini, Suchitra T. 2009. Microbial profile of starter culture fermented fish product 'Ngari' of Manipur. Indian J Fish 56: 123-127.
Spano  G,  Russo  P,  Funel  AL,  Lucas  P,  Alexandre  H, Grandvalet  C,  Coton  E,  Coton  M,  Barnavon  L,  Bach  B, Rattray  F,  Bunte  A,  Magni  C,  Lendero  V,  Alvarez  M, Fernandez  M,  Lopez  P,  Palencia  PF,  Corbi  A,  Trip  H, Lolkema  JS.  2010.  Biogenic  amines  in  fermented  foods. Euro J Clin Nutr 64: S95–S100. DOI:10.1038/ejcn.2010.218.
Taorem  S,  Sarojnalini  CH.  2012.  Effect  of  temperature  on biochemical  and  microbiological  qualities  of  ngari.  Nat  Sci 10: 32-40.
Thienchai  S,  Chaiyanan  S . 2012.  Anchovy  paste  production from  lactic  acid  fermentation  of  Anchovy  fish  found  in  the Gulf of Thailand. KKU Res J 17: 556-564.
Tsai YH, Lin CY, Chien LT, Lee TM, Wei CI, Hwang DF. 2006. Histamine  contents  of  fermented  fish  products  in  Taiwan and isolation of histamine-forming bacteria. Food Chem 98: 64–70. DOI: 10.1016/j.foodchem.2005.04.036.
Yuliana N. 2007. Profil fermentasi rusif yang dibuat dari ikan teri ( Stolephorus sp). Agritech 27: 12-17.
Zaman MZ, Abdulamir AS, Bakar FA, Selamat J, Bakar J. 2009. A  Review:  microbiological,  physicochemical  and  health impact of high level of biogenic amines in fish sauce. Appl Sci 6: 1199-1211.
Zarei  M,  Najafzadeh  H,  Eskandari  MH,  Pashmforoush  M,
Anayati  A,  Gharibi  D,  Fazlara  A.  2012.  Chemical  and microbial  properties  of  mahyaveh,  a  traditional  Iranian  fish sauce. Food Control 23: 511–514. DOI: 10.1016/ j.foodcont. 2011.08.023.
Zhai  H,  Yang  X,  Li  L,  Xia  G,  Cen  J,  Huang  H,  Hao  S.  2012. Biogenic amines in commercial fish and fish products sold in southern China. Food Control 25: 303–308. DOI: 10.1016/j. foodcont.2011.10.057.