## IDENTIFIKASI  POLIFENOL PADA  KULTUR IN VITRO KALUS
Camellia sinensis UNTUK  BAHAN MINUMAN  FUNGSIONAL
(Identification of polyphenols  in in vitro culture of camellia sinensis callus as  functional beverage )
Sutini *)
Jurusan Agroteknologi F.P. UPN ‘Veteran’ Jatim Surabaya.
Email :tien_basuki@yahoo.com

## Abstract
Polyfenol  included  secondary  bioactive  metabolite  had  a  function  to  reduce  degenerative syndrome. Polyfenol contained in tea act as bioactive syntesis from hydroksil part and could be act as functional drinking and  control human organ as biological metabolism. Problem in  gain polyfenol productfrom tea plantation / camellia sinensis L  for intance : depent on season, need  a large area for  cultivication,  and  low  contain  for  productivity.For  thesepurpose  there  were  main  idea  to ncrease polyfenol  productivity  by  mean  of  in  vitro  culture  technique.  These  technique  could  reduce  all problem  above.  The  main  purpose  of  these  research  were  to  find  production  technique  by  mean callus  culture.    Method  to  gain  the  purose  were  :  (1)  callus  induction  by  cultify  part  of tea  leaves  in many variance  grown culture , (2)  Sub culture callus  using same culture  media  as callus   induction (3)  Morphologycal  check  for  callus  (4)  Kualitative  analisys  callus  polyfenol.Result  of these  research were  callus with hand time retention (tR) on High Performace Liquid Chromatography for 14 minutes with a same time of standart poyfenol.  Polyfenol had potential to support  the retention of functional beverage.
Key words : Polyphenols,  in vitro culture of  callus , Camellia sinensis

## Abstrak
Polifenol termasuk senyawa bioaktif metabolit sekunder berguna diantaranya  untuk mengatasi penyakit  degeneratif.    Polifenol  dalam      teh    bertindak  sebagai  senyawa  bioaktif  karena  memiliki gugus  hidroksil  dan  dapat  sebagai  kandidat  minuman  fungsional.  Termasuk    minuman  fungsional karena  dapat  mengatur  metabolisme  tubuh  secara  biologis.  Kendala  memperoleh Polifenol dari tanaman  teh  / Camellia  sinensis diantaranya:  sangat  tergantung  musim,  memerlukan  lahan  yang luas, dan  tingkat produksinya relatif rendah. Oleh karena itu produksi  polifenol perlu dikembangkan dengan  teknik kultur in vitro . Teknik ini dapat  mengatasi kendala-kendala tersebut  di atas. Tujuan penelitian  secara  umum  adalah  memperoleh  teknik  produksi  polifenol secara  in  vitro  melalui  teknik kultur  kalus . Metode  yang  dilakukan  untuk  mencapai    tujuan  tersebut  adalah:  (1)  induksi  kalus dengan  menanam  eksplan  potongan  pucuk  daun  teh  pada  media  dengan  berbagai  zat  pengatur tumbuh, (2) Sub kultur  kalus menggunakan media yang sama seperti saat induksi (3) Pemeriksaan morfologis kalus. (4) Analisis kualitatif senyawa polifenol kalus. Hasil penelitian ini berupa kalus yang memiliki  waktu retensi (t R )  pada High-Performance Liquid Chromatography   selama 14 menit   yang sama  dengan    waktu  retensi  polifenol  standar.    Senyawa  polifenol  ini    berpotensi    menunjang ketahanan minuman  fungsional .
Kata kunci: Polifenol , kultur kalus in vitro , Camellia sinensis
PENDAHULUAN Teh ( Camellia sinensis L)
diantaranya mengandung komponen bioaktif    polifenol,  berperan  besar  dalam pencegahan  berbagai  macam  penyakit. Polifenol  teh  dalam  mencegah  berbagai penyakit    bekerja  dalam  tiga  cara. Pertama, polifenol mencegah radikal bebas  merusak    DNA  dan    menghentikan perkembangan  sel-sel  liar  yang  akan berkembang menjadi kanker dan meningkatkan  system  imun  (Nindia  Dewi, 2008).  Kedua,  polifenol    mengontrol pertumbuhan  sel-sel  yang  tak  terkendali dan  menghambat  perkembangan  kanker. Ketiga, polifenol tertentu dapat menghancurkan  kanker  tanpa  merusak sel-sel  di  sekitarnya.    Hasil  penelitian Sibuea  (2007)  menyatakan  bahwa  teh dapat  dikategorikan  sebagai  minuman fungsional  karena  mengandung  senyawa aktif  yaitu  flavonoid  /polifenol    (Caffin, 2004)    yang  mampu  berperan  sebagai antioksidan  alami,  menjaga  tubuh  dari serangan radikal bebas. Kendala ketersediaan  polifenol  teh  dari  tanaman dipengaruhi:    musim,    curah  hujan,  suhu 24.4ºC  (Williges,  2004),    kadar  senyawa yang  relatif  rendah  sekitar  1-3  %  (Ruan, 2005) memerlukan lahan luas, memerlukan  pemeliharaan  intensif  seperti penyiangan,pemangkasan,
pemberantasan  gulma,  pemberantasan hama-penyakit (Setiti Edy, 2000) sehingga biaya  pembudidayaan  akan  mahal.  Oleh karena  itu  produksi  metabolit  sekunder bioaktif    polifenol  perlu  dikembangkan dengan  teknik kultur in vitro . Teknik kultur in  vitro mempunyai  keuntungan  dalam produksi    metabolit  dibandingkan  dengan tanaman utuh karena kecepatan pertumbuhan  sel  dan  biosintesis  dalam kultur  yang  diinisiasi  dari  eksplan  sangat tinggi  dan  dalam  periode  yang  sangat singkat.    Beberapa  keuntungan  dari pemakaian  teknik  kultur in  vitro untuk produksi  metabolit  sekunder  antara  lain: tidak  tergantung  musim,  sistem  produksi dapat  diatur  sesuai  kebutuhan,  lebih konsisten,  dan  mengurangi  penggunaan lahan  (Watimena,  1992).    Kultur in  vitro juga  lebih  ekonomis  untuk  tanaman  yang memerlukan  waktu  lama  untuk  mencapai kemasakan fisiologis. Penelitian ini
bertujuan  untuk  mengidentifikasi  polifenol dari  teknik    kultur in  vitro sebagai  upaya untuk  mendapatkan  bahan  bioaktif    yang berperan  untuk  menunjang  keberadaan minuman fungsional

## BAHAN dan METODE
Bahan jaringan daun muda dan kalus Cameliia  sinensis  L , media  Murashige  & Skoog      (MS),  2.4-diklorofenoksi-asetat (2,4D),  kinetin,    etanol,  Na-hypoklorit, akuades  steril,  larutan  banlate  5%. Untuk ekstraksi:  metanol,  akuades,  kloroform,etil asetat. Untuk  HPLC:  asam  asetat,
metanol-aqua pro injeksi ( 15:85)
Alat-alat  yang  digunakan  diantaranya:
(1)
High-performance liquid chromatography  (HPLC)  Agilent  1100 series  low  pressure  gradient  dengan detektor  Spektrofotometer  UV-ST  diode array,  kolom  RP - 18 Waters  µ  Bo u ndapak 10  µm,  3.3  x  300mm.  (2)  Neraca  analitik Direct Reading micro Balance (Shimadzu), kepekaan 0,001 mg dan “ Nylon membran filter “ 0,2 μm

## Metode  Penelitian
Eksplan dipetik dari pucuk daun teh posisi  1,  2,  3  (Simanjuntak,    T,    2004) dicuci  dengan  air  yang  mengalir  selama sepuluh  menit.  Sterilisasi  direndam  sambil dikocok  pelan  dalam    larutan  5,25% NaOCL  30  menit.  Dibilas  dengan  akuades steril,  sambil  dikocok  pelan  5  menit, pembilasan    diulangi  3  kali.  Dipindahkan pada  cawan    petri,  hilangkan  tulang  dan tepi daun, kemudian potong-potong ukuran 0,5-1  cm  untuk  induksi  kalus.  Potongan ditanam sebanyak 4-5 eksplan. Botol kultur diinkubasi  di  ruang  suhu  25 o C,  kalus  yang terbentuk disubkultur untuk memperbanyak jumlah kalus.
Kalus  dipotong  menjadi  4-5  bagian dan dipindahkan pada  media  baru secara aseptis, diinkubasi dalam ruang  suhu 25 o C selama  4  minggu  dengan  pencahayaan. Setelah  4  minggu  kalus  dipilih  yang berwarna  putih  kehijauan    kemudian dipanen. Setelah  dipanen  dilakukan identifikasi kalus secara kualitatif.
Identifikasi  dilakukan    secara  mikroskopis, dan identifikasi menggunakan High- performance liquid chromatography
(HPLC).  Kromatogram    HPLC  berupa
waktu  retensi    (t R )    standar  polifenol  dan waktu  retensi    kalus  polifenol.  Sebelum identifikasi  menggunakan  HPLC  dilakukan ekstraksi menggunakan methanol.
Ekstraksi  dengan  cara  dilarutkan  dalam metanol (Thomson Leonor 2004) disonikasi selama 5 menit untuk menghilangkan  gas-gas  yang  terdapat dalam  larutan  agar  tidak  menyumbat kolom,  kemudian  larutan  disaring  dengan membran  filter  Whatmann  0,2  m.  Untuk memperjelas  puncak  kromatogram,  pada larutan kalus ditambahkan standar polifenol    15  ppm.  Sampel    dan  standar disuntikkan  sebanyak  20  µL  pada  HPLC. Kondisi  operasional  HPLC:  (1)  Suhu diseting  30ºC,    (2)  Panjang  gelombang 274,8  nm  (Peter,  2002),    (3)  Detector: Diode Array Detector (4)  Fase gerak terdiri dari methanol 20%- air 75 %- asam asetat 5  %,    (5)  Aliran  fase  gerak    1  ml  /  menit, (6) Kolom :RP C-18 u Bondopak.

## HASIL dan PEMBAHASAN
Hasil

## Morfologi kalus
Setelah  induksi,    morfologi  kalus terbentuk  pada  tepi    yang  dipotong kemudian  melebar  keseluruh  permukaan eksplan.  Hasil  induksi  kalus  dari  daun  teh dengan  media  MS  ditambah  zat  pengatur tumbuh  auksin  dan  sitokinin    (Sutini  2008) dapat dilihat pada Gambar 1.
Umur  4 minggu dari masa

## Analisis kualitatif  polifenol kalus.
Analisis  kualititatif  polifenol  dengan High-performance  liquid  chromatography. Hasil  analisis  kualititatif  kalus  polifenol dapat  dilihat  pada  pada  Gambar  2  B    dan pengamatan  standar  dapat  dilihat  pada pada Gambar 2 A.

## Pengamatan Morfologis
Pengamatan morfologis secara mikroskopis  menggunakan    mikroskop fluoresen,  cahaya  UV  (   2500-4000  A 0 ) perbesaran  400×  (Widyarti  Sri,  2007) tampak bentuk sel standar polifenol hampir sama  dengan  bentuk  sel    dari  kalus (Gambar 3 A-B).
Gambar    1.  Morfologi  kalus  teh  dengan media MS + auksin dan sitokinin   umur 4 minggu  kalus  terbentuk  pada  tepi    yang dipotong kemudian melebar hampir keseluruh permukaan eksplan.
Waktu retensi /t R (menit) R esp o n d etek to r Waktu retensi /t R (menit) R esp o n d etek to r Gambar2:(A)Kromatogram polifenol
standar, (B) Kromatogram polifenol kalus
A B

## PEMBAHASAN
Gambar  1,    tampak  eksplan  daun menggembung  mulai  dari  tepi  eksplan yang  terpotong  hal  ini  disebabkan  tepi yang  terpotong  mengambil  nutrisi  dari media  untuk  membentuk  kalus,  hingga seluruh  eksplan  membentuk  kalus  secara keseluruhan.
Gambar  2,  Pada  kromatogram tampak  waktu  retensi  standar  sepanjang 14,  84    menit  dan  kalus  sepanjang  14,  89 menit  terdapat  selisih  5  detik  hal  ini dikarenakan  pada  kalus  kemungkinan masih  terdapat  senyawa  lain  misalnya kafein.
Senyawa  utama  yang  terkandung di dalam teh adalah  polifenol ( Anonimous. 2010)  dan    banyak  memiliki  gugus  fungsi hidroksil.  Lima  fungsi  yang  dipenuhi  oleh polifenol    dalam  teh,  sehingga  berpotensi menjadi  minuman  fungsional  (Anonimous. 2010)    yaitu:  (1)  Teh  akan  meningkatkan sistem pertahanan biologis tubuh terhadap kanker.  (2)  Teh  mencegah  timbulnya penyakit,  seperti  mengendalikan  diabetes dan  tekanan  darah  tinggi.  (3)  Teh membantu penyembuhan penyakit, misalnya mencegah
peningkatan
kolesteroldarah.  (4)  Teh  dapat  mengatur gerak  fisik  tubuh  dengan  mengaktifkan sistemsaraf.  (5)  Katekin  teh  merupakan antioksidan yang kuat dan akan menghambat proses penuaan.

## KESIMPULAN
Diperoleh  waktu  retensi    (t R )    standar polifenol  dan  ekstrak  kalus  antara  14.84- 14.89,    harga    waktu  retensi    (t R )    hampir sama  yaitu  sekitar  14  menit,  dapat disimpulkan bahwa ekstrak kalus megandung polifenol.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Kepada: 1. DP2M Ditjen Dikti telah mendanai  Hibah  bersaing  ini    TH 2006/2008. 2. Teman-teman di Laboratorium  F.  Farmasi Unair. 3. Teman- teman di Laboratorium F.Pertanian Unibraw.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonimous.  2010.  Prospek  Teh  Indonesia Sebagai Minuman Fungsional.http://blog.ub.ac.id/devy dhua/2010/05/29/prospek-teh- indonesia-sebagai-minuman- fungsional/. (25 April 2012).
Anonimous.  2010.  Teh  hijau  (green  tea) .http://wartawarga.gunadarma.ac.i d/2010/01/teh/. (25 April 2012).
Caffin,  N.,  B. D’Arcy,  L.  Yao,  and    G. Rintoul.    2004.  Developing  an index  of  quality  for  Australian  tea,
Rural  Industries  Research  and Development Corporation, http://www.rirdc.gov.au Nindia Dewi, VA. 2008. Pengaruh Pemberian  Polifenol  Teh  Hijau terhadap Sebukan Sel Mononuklear Adenokarsinoma . Mammae Mencit  C3H. Skripsi
Fakultas Kedokteran UniversitasDiponegoro Semarang
Peter  W.L.  2002.  Biochemical  analysis  for identification of quality in black tea ( Camellia sinensis ). Disertasi.
Faculty of Natural and Agricultural Sciences. Departement of Biochemistry. University of Pretoria. Petroria.  South Africa, p. 42. A B
Gambar  3.    Pengamatan  morfologis  dengan mikroskup  fluoresen    perbesaran  400x: :(A)morfologis  sel    polifenol  standar,  (B) morfologis sel  polifenol kalus
http://upetd.up.ac.za/thesis/available/etd- 03012005
084935/unrestricted/00dissertatio n.pdf
Simanjuntak,    T.    2004.  Pemanfaatan Pengetahuan  Bioteknologi      pada Teh hijau, Cakrawala Medan.
Setiti  E,  2000.  Prospek  Aplikasi  Teknik Kultur  Jaringan  Dalam  Agrobisnis. Prospek  Agrobisnis  Menyongsong
OtonomiDaerah. Prosiding Fakultas MIPA Unair Surabaya, p. 1-6. Sibuea P. 2007. Minum Teh dan Khasiatnya Bagi Kesehatan. http://www.  sinarharapan.co.id. Sutini, 2008. Meningkatkan Produksi Flavan-3-ol  Melalui  kalus    Camellia sinensis  l  dengan  Elisitor    CU  2+.
Journal  of  Biological  Researches (14):39-44
Thomson  Leonor.  2004.  Enrichment  of Biologically Active Compounds from
Selected  Plants  Using  Adsorptive
Bubble Separation, Dissertation
Fakultät
WissenschaftszentrumWeihensteph an für Ernährung, Landnutzung und Umwelt  Technischen  Universität München. http://www.google.co.id/search?hl=i d&q=production+catechin++from+c allus+camellia+sinensis+leaf+pdf+
%2Bfree+purchase+research+&met a=
Watimena, GA, 1992. Bioteknologi Tanaman.  Pusat  antar  Universitas. IPB Bogor. Widyarti Sri, 2007. Memisahkan Komponen  Seluler  Sel  Tanaman Dengan Sentrifusi. Petunjuk praktikum.Bioteknologi.  Universitas Brawijaya. Williges,  U.  2004.  Status  of  organic agriculture in Sri Lanka with special emphasis on tea production systems  ( Camellia  sinensis (L.) O.
Kuntze). Disertasi.  Faculty  of  Plant Production, Justus-Liebig- University of Giessen. P. 4. http://geb.unigiessen.de/geb/volltex te/2005/2315/pdf/WilligesUte-2005-
02-10.pdf.