## Skrining Fitokimia dan Ekstraksi Senyawa Azadirachtin dari Ampas Biji Mimba
Ananda Pratama Juanda, Ismail* 1 , Ikhsan Guswenrivo 2 , Heru Subakti Dwiko Laksono 1
1 Prodi Analisis Kimia, Politeknik AKA Bogor
2 Pusat Penelitian Biomaterial, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI)
*E-mail: ismail.abusyafiq@gmail.com (Received: 12 Mei 2023; Accepted: 22 Juli 2023; Published: 31 Juli 2023)

## Abstrak
Mimba atau juga dikenal sebagai Azadirachta indica A. Juss , adalah tanaman yang mengandung zat azadirachtin, yang berfungsi sebagai bioinsektisida.  Metode penting untuk memberikan gambaran tentang kelompok senyawa yang terkandung dalam tanaman yang akan diteliti adalah identifikasi senyawa fitokimia. Dengan menggunakan pelarut polar, semi polar, dan nonpolar, penelitian ini bertujuan untuk mengekstraksi senyawa metabolit sekunder, terutama  senyawa  azadirachtin  yang  ditemukan  pada  ampas  biji  mimba.  Penelitian  ini  juga  berfokus  pada kemungkinan  penggunaan  azadirachtin  sebagai  bioinsektisida  sebagai  pengganti  pestisida  sintetis.  Fitokimia ampas biji mimba dilihat dari fraksinya. Fraksi n-heksana positif mengandung saponin dan triterpenoid, fraksi etil asetat  positif  mengandung  tanin,  alkaloid,  flavonoid,  saponin,  dan  steroid,  dan  fraksi  metanol  sisa  positif mengandung tanin, alkaloid, flavonoid, saponin, dan steroid. Hasil analisis dengan HPLC menunjukkan bahwa ada  kandungan  azadirachtin  sebesar  20,2978  mg/L  pada  fraksi  n-heksana  dan  132,6840  mg/L  pada  fraksi  etil asetat.
Kata kunci: biji mimba, fitokimia, azadirachtin, n-heksana, etil asetat

## Abstract
Mimba is also known as Azadirachta indica A. Juss, is a plant containing the substance azadirachtin, which acts as a bioinsecticide.  An important method to give an idea of the group of compounds contained in the plants to be studied is the identification of phytochemical compounds. By using polar, semi-polar, and nonpolar solvents, the study aims to extract the secondary metabolite compounds, the azadirachtin compound found in embryonic seeds. The study also focused on the possibility of using azadirachtin as a bioinsecticide as a substitute for a synthetic pesticide. The phytochemistry of pregnancy seeds is seen from its fraction. The positive n-hexane fraction contains saponins and triterpenoids, the positive ethyl acetate fractions contain tanins, alkaloids, flavonoids, saponines, and steroids, and the residual positive methanol fraction includes tanins, alkaloid, flawonoid, saponin and steroid. The  results  of  HPLC  analysis  showed  an  azadirahtin  content  of  20.2978  mg/l  in  the  n-hexane  fraction  and 132.6840 mg/L in the ethyl acetate fraction.
Keywords: mimba seed, fitokimia, azadirachtin, n-heksana, ethyl acetate

## PENDAHULUAN
Mimba  ( Azadirachta  indica  A.  Juss )  adalah tanaman  yang  mengandung  senyawa  azadirachtin, yang  dapat  digunakan  sebagai  bioinsektisida. Tanaman  mimba  terutama  mengandung  beberapa komponen  dari  produksi  metabolit  sekunder,  seperti azadirachtin,  salanin,  meliantriol,  nimbin,  dan nimbidin  (Sumaryono  et  al.,  2013).  Komponen- komponen ini dianggap sangat bermanfaat baik dalam industri  pertanian  (untuk  membuat  pestisida  dan pupuk)  maupun  farmasi  (untuk  membuat  kosmetik dan obat-obatan) (Aradilla, 2009).
Salah  satu  metabolit  sekunder  tanaman mimba  ( Azadirachta  indica  A.  Juss )  adalah
azadirachtin, menurut Samsudin (2013). Metabolit ini termasuk  dalam  kelompok  triterpenoid  yang  telah digunakan  sebagai  insektisida  nabati,  dan  telah terbukti  memiliki  kemampuan  untuk  mengendalikan lebih  dari  300  spesies  serangga  hama.  Azadirachtin berfungsi sebagai zat penolak makan, atau antifeedant, dengan menciptakan stimulan penolak makan tertentu dan  menghentikan  seseorang  dari  menganggap  ada rangsangan untuk makan. Azadirachtin menghentikan serangga  berganti  kulit  ( ecdysone  blocker ),  yang menghambat pertumbuhan dan perkembangan serangga.  Azadirachtin  juga  berfungsi  sebagai insektisida  yang  mematikan  secara  langsung  pada beberapa  jenis  serangga.  Serangga  yang  dimaksud
mungkin  mati  dalam  beberapa  hari,  tergantung  pada siklus  hidupnya.  Struktur  azadirachtin  dapat  dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Struktur Azadirachtin
Ekstraksi  azadirachtin  pada  ampas  biji mimba  menggunakan  metode  maserasi  yaitu  dengan perendaman menggunakan pelarut metanol pada suhu kamar. Maserat selanjutnya difraksinasi dengan teknik ekstraksi  cair-cair  untuk  memisahkan  senyawa berdasarkan  kelompok  polaritas.  Fraksinasi  ini menggunakan berbagai pelarut berdasarkan kepolarannya,  diawali  dari  pelarut  dengan  kepolaran yang rendah yang dilanjutkan dengan kepolaran yang lebih tinggi.
Metode penting untuk memberikan gambaran tentang kelompok senyawa yang terkandung  dalam  tanaman  yang  akan  diteliti  adalah identifikasi  senyawa  fitokimia.  Skrining  fitokimia dilakukan  dengan  menggunakan  pereaksi  untuk mengamati  reaksi  pengujian  warna  dan  endapan (Palupi  et  al.,  2016).  Identifikasi  golongan  senyawa yang  terkandung  pada  ampas  biji  mimba  meliputi alkaloid, flavonoid, saponin, triterpenoid, steroid, dan tanin.
Penelitian ini dimaksudkan untuk mengekstraksi  senyawa  metabolit  sekunder  terutama senyawa  azadirachtin  yang  terkandung  pada  ampas biji  mimba  menggunakan  pelarut  polar,  semi  polar, dan nonpolar. Penelitian ini berfokus pada kemungkinan  pemanfaatan  azadirachtin  sebagai bioinsektisida pengganti pestisida sintetis.

## BAHAN DAN METODE
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan  ini  meliputi  bahan  uji  dan  bahan  kimia. Bahan  uji  yang  digunakan  adalah  ampas  biji  mimba didapatkan  dari  gudang  kompos  LIPI.  Bahan  kimia yang  digunakan  untuk  ekstraksi  adalah  metanol (CH 3 OH)  merek  Merck,  heksana  (C 6 H 14 )  merek Merck,  dan  etil  asetat  (CH 3 CH 2 OC(O)CH 3 )  merek Merck. Pada percobaan fitokimia bahan-bahan kimia yang digunakan meliputi: asam sulfat (H 2 SO 4 ) pekat, asam sulfat (H 2 SO 4 ) 2N, kloroform (CHCl 3 ), amoniak (NH 4 OH),  pereaksi  Dragendorff,  etanol  (C 2 H 5 OH), serbuk logam Mg, asam klorida (HCl) pekat, natrium hidroksida  (NaOH)  10%,  asam  asetat  (CH 3 COOH) glasial,  metanol  (CH 3 OH),  dan  larutan  besi  klorida
(FeCl 3 ).  Peralatan  yang  digunakan  meliputi  alat  uji dan  alat  pendukung.  Alat  uji  yang  digunakan  adalah High  Performance  Liquid  Chromatography  Photo Iode Array (HPLC-PDA) kolom Zorbax Eclipse Plus Agilent  C18.  Alat  pendukung  yang  digunakan meliputi rotary  evaporator BUCHI  R-300,  oven, neraca analitik Shimadzu AP225WD, cawan porselen, corong  pemisah,  vacuum,  corong  Buchner,  tabung reaksi, mikropipet 1 mL, mikropipet 5 mL, pipet tetes, pipet  volumetri,  pipet  Mohr,  kertas  saring,  filter membran  0,45  µm  erlenmeyer,  spatula,  desikator, gelas piala, dan gelas ukur.

## Penentuan Kadar Air
Kadar  air  ampas  biji  mimba  ditentukan dengan  metode  gravimetri.  Cawan  porselen  kosong dipanaskan  dalam  oven  pada  suhu  105 ° C  selama  30 menit, didinginkan dalam desikator selama 15 menit, lalu  ditimbang  (W 0 ).  Ampas  biji  mimba  sebanyak  3 gram  dimasukan  pada  cawan  porselen,  ditimbang (W 1 ),  lalu  dikeringkan  dalam  oven  pada  suhu  105 ° C selama  24  jam.  Didinginkan  dalam  desikator  selama 30  menit,  kemudian  cawan  porselen  dan  ampas  biji mimba  ditimbang (W 2 ). Kadar air dihitung berdasarkan rumus:
%𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑖𝑟 = (𝑤1−𝑤0)−(𝑤2−𝑤0) 𝑤1−𝑤0 (1)
Keterangan: w 0 : berat cawan porselen kosong w 1 : berat cawan porselen + ampas biji mimba
(sebelum pemanasan)
w 2 : berat cawan porselen + ampas biji mimba (setelah pendinginan)
Ekstraksi  Minyak  Ampas  Biji  Mimba  dengan Pelarut Metanol
Ampas  biji  mimba  sebanyak  1000  gram ditambahkan pelarut metanol (polar) hingga terendam,  direndam  selama  24  jam,  kemudian disaring. Tahap tersebut diulang sebanyak empat kali dengan  perendaman  kembali  residu  menggunakan pelarut  metanol  baru.  Maserat  digabung  dan dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator BUCHI R-300 . Rendemen ditentukan dengan rumus:
%𝑟𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 = 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙−(𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 ×𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑖𝑟) × 100% (2)

## Fraksinasi  Minyak  Ampas  Biji  Mimba  dengan Pelarut N-heksana
Ekstrak metanol sebanyak 90 mL dicampur dengan  n-heksana  (non-polar)  dengan  perbandingan 1:1, dikocok dalam  corong pemisah,  dan didiamkan hingga terbentuk dua fasa. Fasa n-heksana dipisahkan dari fasa metanol. Fraksinasi diulang sebanyak  tujuh kali  hingga  fasa  n-heksana  jernih.  Hasil  fraksinasi digabung dan disaring dengan kertas saring whatman No  42 .  Filtrat  dipekatkan  dengan vacuum  rotary evaporator BUCHI R-300 .
Fraksinasi  Minyak  Ampas  Biji  Mimba  dengan Pelarut Etil Asetat
Dalam corong pemisah, ekstrak metanol sisa dari  fraksinasi  n-heksana  sebanyak  55  mililiter dicampur  dengan  etil  asesat  (semi  polar)  dengan perbandingan  1:1  dan  didiamkan  hingga  terbentuk dua fasa. Fasa etil asetat selanjutnya dipisahkan dari fasa  metanol.  Fraksinasi  diulang  sebanyak  12  kali hingga  fasa  etil  asetat  jernih.  Hasil  fraksinasi digabung dan disaring dengan kertas saring whatman No  42 .  Filtrat dipekatkan  dengan vacuum  rotary evaporator BUCHI R-300.

## Skrining Fitokimia
Pemeriksaan Alkaloid
2  mL  kloroform  dan  2  mL  amoniak dicampur  dengan  masing-masing  fraksi,  kemudian dipanaskan,  dikocok,  dan  disaring.  Lima  tetes  asam sulfat  2N  ditambahkan  ke  filtrat  dan  kemudian dikocok  dan  didiamkan.  Lima  tetes  pereaksi Dragendorff  ditambahkan  ke  bagian  atas  masing- masing  filtrat.  Adanya  alkaloid  menunjukkan terbentuknya endapan jingga.

## Pemeriksaan Flavonoid
2  mL  fraksi  masing-masing  dicampur dengan  2  mL  etanol.  Kemudian  dicampur, dipanaskan,  dan  dikocok  lagi.  Selanjutnya,  pada masing-masing filtrat ditambahkan serbuk Mg 0,2 g dan tiga tetes asam klorida pekat. Adanya flavonoid menunjukkan bahwa ada warna jingga atau merah.

## Pemeriksaan Saponin
2  mL  fraksi  natrium  hidroksida  10% ditambahkan dan dididihkan dengan 20 mL air dalam penangas  air.  Dianalisis  dan  diamati  perubahan. Adanya  saponin  menunjukkan  terbentuknya  busa yang stabil.

## Pemeriksaan Steroid
2 mL fraksi masing-masing dicampur dengan 2 mL kloroform, kemudian 10 tetes asam asetat glasial dan 3 tetes asam sulfat pekat. Perubahan diamati. Jika warnanya  berubah  menjadi  biru  atau  hijau,  hal  itu berarti terdapat steroid didalamnya.

## Pemeriksaan Triterpenoid
2 mL fraksi masing-masing dicampur dengan 2  mL  kloroform  dan  2  mL  asam  sulfat  pekat. Perubahan diamati. Adanya triterpenoid menunjukkan warna merah kecokelatan pada permukaan.

## Pemeriksaan Tanin
Untuk  masing-masing  fraksi  2  mL,  1  mL metanol dan beberapa tetes feriklorida 1% ditambahkan.  Dikocok  dan  diamati  perubahannya. Adanya  tanin  menunjukkan  terbentuknya  warna coklat kehijauan.
Analisis dengan High Performance Liquid Chromatography

## Preparasi Standar Azadirachtin 500 mg/L
Standar  azadirachtin  0,005  gram  ditimbang dan dilarutkan dengan 10 mL metanol.

## Preparasi Sampel Azadirachtin
Masing-masing  fraksi  sebanyak  5  mL disaring  dengan  filter  membran  ukuran  0,45  µm  dan diambil filtratnya untuk diuji.

## Pengujian
Masing-masing sampel dan standar azadirachtin  diinjeksikan  sebanyak  10  µL  ke  dalam High  Performance  Liquid  Chromatography  Photo Diode  Array (HPLC-  PDA).  Pengkondisian  alat HPLC-PDA ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Pengkondisian HPLC-PDA Kondisi Keterangan Merk Shimadzu Volume injeksi  10 µL Kolom ZORBAX Eclipse 4 C18 (4,6 mm × 150 mm, particle size 5 μm) Suhu kolom 40°C Detector λ214 nm Laju alir 1 mL/menit Waktu akhir 30 menit Fase gerak asetonitril/air (40:60)
Untuk  mengetahui  konsentrasi  larutan  sampel,  luas area  sampel dibandingkan dengan  luas  area  standar.
Perhitungan kadar azadirachtin sebagai berikut:
𝐶𝑥 = 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 × 𝐶 𝑠 (3)
keterangan:
C x : konsentrasi sampel C s : konsentrasi standar (mg/L)

## HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan Kadar Air
Kadar  air  yang  diperoleh  adalah  sebesar 9,20%.  Nilai  kadar  air  ini  digunakan  sebagai  faktor koreksi  berat  sampel  ampas  biji  mimba  untuk menentukan  rendemen.  Menurut  Mailuhu  et  al. (2017), kandungan air pada biji mimba harus rendah, setidaknya  10%,  karena  hal  itu  dapat  menyebabkan peluang  hidup  mikroorganisme  yang  tinggi,  yang berdampak  pada  kandungan  kimia  dalam  sampel. Kadar air dalam ampas biji mimba juga mempengaruhi  aktivitas  mikroba  dan  ketahanan
penyimpanan, sedangkan kadar air yang rendah akan menyebabkan penyimpanan tidak bertahan lama.

## Ekstraksi Pelarut Metanol
Menurut  Jannah  et  al.  (2020),  metode maserasi dilakukan dengan merendam ampas sampel dengan pelarut organik. Perbedaan tekanan di dalam dan  di  luar  sel  memicu  pemecahan  membran  dan dinding sel. Akibatnya, metabolit sekunder di dalam sampel akan terlarut dengan pelarut organik. Sebagai pelarut  universal,  metanol  dapat  melarutkan  analit polar  dan  non  polar,  menurut  Astrina  et  al.  (2013). Alkaloid, triterpenoid, steroid, saponin, dan flavonoid dapat  diambil  dari  tanaman  oleh  metanol.  Menurut Romadanu et al. (2014), tingginya rendemen pelarut metanol  menunjukkan  bahwa  pelarut  tersebut memiliki  kemampuan  untuk  mengekstrak  lebih banyak  bahan  bioaktif  dengan  sifat  kepolaran  yang lebih tinggi.
Gambar 2 Ekstrak Metanol
Ampas  biji  mimba  di  maserasi  dengan metanol  4  ×  24  jam  untuk  mengekstrak  senyawa metabolit  sekunder  terutama  senyawa  azadirachtin yang  termasuk  golongan  triterpenoid.  Maserat dipekatkan  untuk  mengurangi  pelarut  metanol  dari maserat. Berdasarkan perhitungan diperoleh 138,9462-gram  pasta  berwarna  cokelat  ekstrak metanol  dengan  rendemen  15,30%,  seperti  yang ditunjukkan  pada  Gambar  2.  Hasil  rendemen  dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2.   Hasil Rendemen Ekstrak Metanol, Fraksi
N-heksana, Etil Asetat, dan Metanol Sisa Nama Berat (gram) Rendemen (%) Ekstrak metanol 138,9462 15,30 Fraksi n-heksana 40,5640 4,47 Fraksi etil asetat 44,4409 4,89 Fraksi metanol sisa 20,2043 2,22
Fraksinasi Pelarut non polar n-heksana dapat mengekstrak lilin, lipid, minyak, dan senyawa kimia lainnya  yang  mudah  menguap  (Putri et  al., 2015). Menurut Artini et al. (2013), etil asetat, senyawa semi polar  dengan  rumus  CH 3 CH 2 OC(O)CH 3 ,  memiliki kemampuan  untuk  menarik  analit-analit  baik  polar maupun nonpolar.
Penyaringan  pada  fraksi  n-heksana  dan  etil asetat untuk memisahkan padatan halus yang terbawa saat pemisahan masing-masing fasa dari fasa metanol setelah  proses  fraksinasi.  Ekstrak  metanol  sisa  hasil fraksinasi  n-heksana  didapatkan  ±  57  mL  namun digunakan  sebanyak  55  mL  untuk  difraksinasi  oleh etil  asetat.  Fraksi  n- heksana yang dapat dilihat pada Gambar 3(a) diperoleh berupa pasta berwarna kuning kecokelatan seberat 40,5640 gram dengan rendemen sebesar  4,47%.  Fraksi  etil  asetat  yang  dapat  dilihat pada  Gambar  3(b)  diperoleh  berupa  cairan  kental berwarna  cokelat  kehitaman  seberat  44,4409  gram dengan rendemen sebesar 4,89%. Fraksi metanol sisa yang dapat dilihat pada Gambar 3(c) diperoleh berupa cairan  residu  berwarna  cokelat  kehitaman  seberat 20,2043  gram  dengan  rendemen  sebesar  2,22%. Fraksinasi berulang pelarut n-heksana dan etil asetat menghasilkan  fraksi  metanol  sisa  yang  kecil,  yang ditunjukkan dalam Tabel 2.
(a) (b) (c)
Gambar 3.   (a)  Fraksi  N-heksana,  (b)  Fraksi  Etil Asetat, (c) Fraksi Metanol Sisa

## Skrining Fitokimia
Aminah et al., (2001) menyatakan bahwa uji fitokimia  dilakukan  terhadap  bahan  alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, dan fenol yang ditemukan pada  mimba.  Untuk  memastikan  bahwa  senyawa tersebut  ada  di  ekstrak  yang  diperoleh,  pengujian warna  diperlukan  untuk  mengidentifikasi  senyawa tersebut.  Metode  skrining  fitokimia  pada  ampas  biji mimba didasarkan pada jurnal penelitian sebelumnya dengan  penyesuaian  (Palupi et  al. ,  2016).  Tabel  3 menunjukkan hasil skrining fitokimia.
Tabel 3.  Hasil  Skrining  Fitokimia  Fraksi  N- heksana, Etil Asetat, dan Metanol Sisa
Golongan Senyawa Hasil Pengamatan Acuan Hasil Positif
Fraksi N- heksana Fraksi Etil Asetat Fraksi Metanol Sisa Alkaloid (-) Tidak ada endapan (+) Endapan jingga (+) Endapan jingga Endapan jingga Flavonoid (-) Tidak ada perubahan warna (+) Larutan jingga (+) Larutan jingga kecokelatan Jingga atau merah Saponin (+) Adanya busa stabil (+) Adanya busa stabil (+) Adanya busa stabil Adanya busa  stabil Steroid (-) Larutan merah kecokelatan (-) Larutan merah kecokelatan (+) Cincin biru kehijauan Warna biru atau hijau Triterpenoid (+) Merah kecokelatan (+) Merah kecokelatan (-) Tidak ada perubaha n warna Merah kecokelatan pada antar permukaan Tanin (-) Larutan cokelat muda (+) Larutan cokelat kehijauan (+) Larutan cokelat kehijauan Cokelat kehijauan

## Pemeriksaan Alkaloid
Reaksi  pengendapan  yang  terjadi  akibat penggantian ligan adalah inti dari pendekatan analisis ini.  Atom  nitrogen  dengan  pasangan  elektron  bebas pada alkaloid dapat berfungsi sebagai pengganti ion iodo  dalam  pereaksi-pereaksi.  Dalam  larutan  asam asetat  glasial,  reaksi  Dragendorff  mengandung kalium iodida dan bismut nitrat (Ergina et al., 2014).
Penambahan  amoniak  yaitu  membantu melarutkan sampel yang terekstraksi dalam kloroform.  Penambahan  asam  sulfat  2N  untuk meningkatkan kelarutan alkaloid. Setelah itu, masing- masing fraksi ditambahkan pereaksi spesifik alkaloid yaitu  reagen  Dragendorff.  Berdasarkan  hasil percobaan yang dapat dilihat pada Tabel 3 fraksi etil asetat dan metanol sisa positif mengandung senyawa alkaloid  dengan  terbentuknya  endapan  jingga, sedangkan fraksi n-heksana tidak terbentuk endapan jingga  menunjukkan  hasil  negatif.  Endapan  jingga terbentuk karena nitrogen membentuk ikatan kovalen koordinat dengan ion K + membentuk kalium alkaloid. Reaksi alkaloid dapat dilihat pada Gambar 4 berikut:
Gambar 4 Reaksi Alkaloid
Pada  tumbuh-tumbuhan,  alkaloid  biasanya dalam  bentuk  garam,  sehingga  hanya  dapat  larut dalam  pelarut  organik  seperti  kloroform,  etil  asetat, aseton,  benzena,  alkohol,  etanol,  dan  metanol. Namun,  alkaloid  sulit  larut  dalam  air  (Romadanu  et al., 2014).

## Pemeriksaan Flavonoid
Ergina et  al., (2014)  menyatakan  bahwa flavonoid  adalah  senyawa  dengan  dua  cincin aromatik  dengan  gugus  hidroksil  lebih  dari  satu. Senyawa  fenol  dengan  gugus  hidroksil  semakin banyak  memiliki  tingkat  kelarutan  dalam  air  yang lebih  tinggi  atau  bersifat  polar,  sehingga  dapat diekstrak  dalam  pelarut  polar.  Tanaya et  al .,  (2015) menyatakan  bahwa  pelarut  etil  asetat  adalah  pelarut yang digunakan untuk mengekstrak senyawa dengan polaritas  menengah  seperti  flavonoid  dalam  bentuk O-glikosida.
Pada  percobaan  ini  masing-masing  fraksi ditambahkan etanol dan pemanasan untuk melarutkan senyawa  flavonoid.  Berdasarkan  hasil  percobaan yang  dapat  dilihat  pada  Tabel  3  fraksi  metanol  sisa menghasilkan  larutan  jingga  kecokelatan  sedangkan fraksi  etil  asetat  menghasilkan  larutan  jingga  yang menandakan mengandung senyawa golongan flavonoid.  Ergina et  al .,  (2014)  menyatakan  bahwa tujuan penambahan logam Mg dan HCl adalah untuk mengurangi  inti  benzopiron  yang  terdapat  dalam struktur  flavonoid,  sehingga  terbentuk  garam flavilium  berwarna  jingga  atau  merah.  Reaksi flavonoid dapat dilihat pada Gambar 5 berikut:

## Pemeriksaan Saponin
Menurut Agustina et al., (2017) uji saponin menghasilkan  busa  karena  glikosida  yang  memiliki gugus  hidrofob,  yaitu  aglikon  (steroid  atau triterpenoid),  terhidrolisis  menjadi  glukosa  dan senyawa  lainnya.  Karena  metode  ini  mudah dilakukan,  cepat,  dan  tidak  memerlukan  peralatan atau  bahan  yang  rumit,  metode  identifikasi  dengan pengocokan  dan  melihat  terbentuknya  busa  stabil digunakan.
Hasil percobaan menunjukkan bahwa fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol sisa berkontribusi pada  pembentukan  busa  yang  stabil;  fraksi  metanol sisa menghasilkan banyak busa, dan fraksi n-heksana dan  etil  asetat  menghasilkan  sedikit  busa  pada permukaan  larutan,  seperti  yang  ditunjukkan  dalam Tabel  3.  Penambahan  natrium  hidroksida  untuk menghidrolisis  glikosida  menjadi  aglikon  dan glukosa  menggunakan  basa  kuat.  Reaksi  saponin dapat dilihat pada Gambar 6 berikut:

## Gambar 6 Reaksi Saponin

## Pengujian Steroid
Sari et  al., (2017)  menyatakan  bahwa senyawa steroid dapat memberikan warna hijau biru melalui reaksi dengan asam sulfat pekat dalam pelarut asam  asetat  anhidrat.  Sifat  non  polar  steroid disebabkan  oleh  isopren-isopren  rantai  panjang hidrokarbon. Menurut Robinson (1995) dan Sholikhah  (2016),  beberapa  senyawaan  steroid mengandung gugus –OH yang dikenal sebagai sterol, yang  menyebabkan  sifatnya  lebih  polar.  Steroid alkohol  dan  sterol  adalah  beberapa  turunan  steroid penting.  Fitosterol  adalah  steroid  dalam  jaringan tumbuhan, sedangkan kolesterol adalah steroid dalam jaringan hewan. Gambar struktur steroid ditunjukkan pada Gambar 7 berikut:
Gambar 7 Struktur Steroid
Menurut  hasil  percobaan  pada  Tabel  3, fraksi metanol sisa membentuk cincin biru kehijauan pada permukaan larutan, menunjukkan bahwa larutan mengandung senyawa steroid. Sebaliknya, n-heksana dan etil asetat menunjukkan hasil negatif karena tidak menghasilkan  warna  hijau  atau  biru.  Membentuk
turunan  asetil  dicapai  melalui  penggunaan  asam asetat glasial sebagai pengganti asam asetat anhidrat. Jumlah  air  pada  asam  asetat  glasial  memengaruhi proses asetilasi; jika ada air yang tinggi, reaksi tidak dapat  terjadi.  Untuk  dehidrogenasi  air,  asam  sulfat pekat ditambahkan. Reaksinya dengan turunan asetil memberikan warna biru atau hijau.

## Pemeriksaan Triterpenoid
Sifat  non  polar  dan  polar  dimiliki  oleh triterpenoid  karena  rantai  panjang  hidrokarbon  C30 membuatnya non polar dan memiliki gugus hidroksil yang  membuatnya  polar  (Jannah et  al. ,  2020). Dibandingkan dengan fraksi n-heksana, etil asetat dan fraksi  n-heksana  menghasilkan  warna  merah kecokelatan  yang  menunjukkan  bahwa  mereka mengandung senyawa triterpenoid, sedangkan fraksi metanol sisa menghasilkan larutan dua fasa dan tidak menghasilkan  warna  merah  kecokelatan.  Robinson (1995) dalam Supriyanto (2017) menyatakan bahwa penambahan  pereaksi  asam  klorosulfonat  atau pereaksi Brieskorn dan Briner, yang sering digunakan untuk  membedakan  secara  khusus  triterpenoid berwarna  merah,  menyebabkan  daerah  antarmuka berwarna  merah  kecokelatan.  Struktur  triterpenoid ditunjukkan pada Gambar 8:

## Gambar 8 Struktur Triterpenoid

## Pemeriksaan Tanin
Dengan menggunakan feriklorida,  uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui apakah sampel mengandung  gugus  fenol.  Setelah  ditambahkan dengan FeCl3, gugus fenol ditunjukkan dengan warna hijau  kehitaman  atau  biru  tua  (Ergina et  al .,  2014). Karena  banyaknya  gugus  -OH  pada  senyawa  tanin yang menyebabkan sifatnya polar, metanol berfungsi untuk  melarutkan  senyawa  tanin  dalam  pelarut metanol.  Karena  terbentuknya  senyawa  kompleks antara tanin dan Fe3+, yang menunjukkan perubahan warna  hijau,  fraksi  etil  asetat  dan  metanol  sisa menghasilkan warna cokelat kehijauan, menurut hasil eksperimen, yang dapat dilihat pada Tabel 3. Reaksi tanin dapat dilihat pada Gambar 9 berikut.
Gambar 9 Reaksi Tanin
Golongan  polifenol  yang  disebut  tanin memiliki  sifat  polar  dan  dapat  larut  dalam  pelarut polar  (Romadanu et  al .,  2014).  Uji  tanin menunjukkan  bahwa  fraksi  etil  asetat  menghasilkan senyawa kompleks berwarna hijau kehitaman, ungu, biru,  atau  hitam.  Perubahan  warna  ini  disebabkan oleh ikatan koordinasi antara ion Fe 3+ dengan atom O- dari  gugus  -OH  senyawa  tanin,  yang  melepaskan atom H (Tanaya et al., 2015).
Analisis High Performance Liquid Chromatography Analisis
HPLC-PDA menggunakan pengukuran  azadirachtin  yang  dimodifikasi.  Kolom Zorbax Eclipse Plus Agilent C18 (250 mm x 4,6 mm, 5  μm)  digunakan  untuk  kromatografi  fase  terbalik isokratik  menggunakan  asetonitril/air  (40:60),  aliran 1,0 mL/menit, dan deteksi pada 214 nm (PAULA et al., 2015). Dengan menggunakan standar azadirachtin 500  mg/L  dalam  metanol,  kandungan  azadirachtin dinilai (PRIANTO et al., 2019).
Tabel 4.  Hasil  Analisis  Senyawa  Azadirachtin
High Performance Liquid Chromatography Nama Waktu Retensi (menit) Luas Area Kadar (mg/L) Standar Azadirachtin 5,559 497690 500 Fraksi metanol sisa Tidak ada Tidak ada Tidak ada Fraksi n- heksana 5,738 20204 20,2978 Fraksi etil asetat 5,615 132071 132,6840
Kadar  azadirachtin  dapat  dihitung  menggunakan HPLC  dengan  melihat  kesamaan  waktu  retensi masing-masing  fraksi  dengan  standar  azadirachtin. Ini  dilakukan  dengan  membandingkan  luas  area sampel  dengan  luas  area  standar.  Karena  perbedaan suhu  kolom  dan  kolom,  waktu  retensi  dari  acuan
dengan penelitian yang dilakukan berbeda. Senyawa azadirachtin  keluar  lebih  cepat  ketika  suhu  kolom analisis adalah 40°C. Hasil analisis kadar azadirachtin dapat dilihat pada Tabel 4.
Analisis  kuantitatif  HPLC  menunjukkan bahwa  kadar  azadirachtin  pada  fraksi  n-heksana adalah  20,2978  mg/L  dan  fraksi  etil  asetat  adalah 132,6840  mg/L.  Karena  fraksi  n-heksana  dan  fraksi etil  asetat  telah  terekstrak  sempurna,  fraksi  metanol sisa tidak menunjukkan adanya senyawa azadirachtin. Namun, senyawa azadirachtin memiliki gugus  -OH  yang  memungkinkannya  untuk  ditarik dari etil asetat.

## SIMPULAN
Fitokimia  ampas  biji  mimba  dilihat  dari fraksinya.  Fraksi  n-heksana  positif  mengandung saponin  dan  triterpenoid,  fraksi  etil  asetat  positif mengandung tanin, alkaloid, flavonoid, saponin, dan steroid,  dan  fraksi  metanol  sisa  positif  mengandung tanin, alkaloid, flavonoid, saponin, dan steroid. Hasil analisis  dengan  HPLC  menunjukkan  bahwa  ada kandungan  azadirahtin  sebesar  20,2978  mg/L  pada fraksi n-heksana dan 132,6840 mg/L pada fraksi etil asetat.

## DAFTAR PUSTAKA
Agustina,  W.,  Nurhamidah  &  D.  Handayani.  2017. Skrining fitokimia dan Aktivitas Antioksidan Beberapa  Fraksi  dari  Kulit  Batang  Jarak (Ricinus communis L.). Jurnal Pendidikan dan Ilmu Kimia. 1(2):117-122.
Aminah.  2001  S.  Lerak,  D  Metel  dan  E.  Prostata Sebagai  Larvasida  Aedes  aegypti.  Cermin Dunia  Kedokteran  No.131.  Jakarta:  Grup  PT Kalbe Farma.
Aradilla, A. 2009. Uji Efektivitas Larvasida Ekstrak Ethanol  Daun  Mimba  (Azadirachta  Indica) Terhadap  Larva  Aedes  Aegypti.  Skrpsi. Universitas Diponegoro. Semarang.
Artini, P. E. U. D., Astuti, K. W & Warditiani, N. K. 2013.  Uji  Fitokimia  Ekstrak  Etil  Asetat Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.). Jurnal Udayana. 1-7.
Astarina, N. W. G., Astuti, K. W & Warditiani, N. K. 2013.  Skrining  Fitokimia  Ekstrak  Metanol Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.). Jurnal Farmasi Udayana. 1-7.
Ergina, Siti. N., & Indarini D. P. 2014. Uji Kualitatif Senyawa  Metabolit  Sekunder  Pada  Daun Palado (Agave angustifolia) yang Diekstraksi dengan Pelarut Air dan Etanol. J. Akad. Kim. 3:165-172.
Jannah, N., C. Saleh & D. R. Pratiwi. 2020. Skrining Fitokimia  Ekstrak  Etanol  dan  Fraksi-Fraksi Daun  Alamanda  (Allamanda  Catharica  L.). hlm.  81-85.  Prosiding  Seminar  Nasional Kimia Berwawasan Lingkungan 2020. Jakarta.
Javandira, C., K. Widnyana & G. A. Suryadarmawan.
2016.  Kajian  Fitokimia  dan  Potensi  Ekstrak Daun Tanaman Mimba (Azadirachta indica A. Juss)  Sebagai  Pestisida  Nabati.  Seminar Nasional 2016. 402-406.
Mailuhu,  M.,  M.  R.  J.  Runtuwene  &  H.  S.  J. Koleangan.  Skrining  Fitokimia  dan  Aktivitas Antioksidan  Ekstrak  Metanol  Kulit  Batang Soyogik  (Saurauia  bracteosa  DC).  Chem. Prog. 1(10):1-6.
Palupi,  D.,  E.  Kusdiyantini.,  R.  Rahadian.,  A.  H. Prianto. 2016. Identifikasi Kandungan Senyawa  Fitokimia  Minyak  Biji  Mimba (Azadirachta Indica, A. Juss). Jurnal Biologi. 5:23-28.
Paula, J.A.M., L. F. Brito., K. L. F. N. Caetano., M. C. M. Rodrigues., L.   L.   Borges   &   E.   C. Conceicao.      2016.  Ultrasound-assisted Extaction  of  Azadirachtin  from  Dried  Entire Fruits  of  Azadirachtin  Indica  A.  Juss.
(Meliaceae)  and  its  Determination  by  a Validated  HPLC-PDA Method.  149:77- 84.
Talanta.doi:
10.1016/j.talanta.2015.11.005. [diakses tanggal 2 Juli 2021 pukul 20.58 WIB]. Prianto,  A.  H.,  Budiawan.,  Y.  Yulizar  &  P.
Simanjuntak. 2019. Pengaruh Sinergi Azadirachtin  dan  Komponen  Minor  Dalam Minyak  Biji  Mimba  Terhadap  Aktivitas
Antifeedant Spodoptera Litura. Buletin Penelitian Tanaman Rempah dan Obat. 30:27- 38.
Putri,  H.  L.,  R.  Retnowati  &  Suratmo.  2015.  Fraksi
N-heksana  dari  Ekstrak  Metanol  Daun Mangga Kasturi (Mangifera Casturi
Koesterm) Dan Uji Fitokimia. Kimia Student Journal. 1(1):772-777. Robinson,  Trevor.  1995.  Kandungan  Organik Tumbuhan Tinggi. Institut Teknologi Bandung. Bandung.
Romadanu, S. H. Rachmawati & S. D. Lestari. 2014. Pengujian  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak Bunga  Lotus  (Nelumbo  Nucifera).  Fishtech.
3:1-7.
Samsudin.  2013.  Biosintesa  Dan  Cara  Kerja Azadirachtin Sebagai Bahan Aktif Insektisida Nabati. https://balittro.litbang.pertanian.go.id/ ?p=631 [diakses tanggal 18 Juni 2021 pukul 03:06 WIB].
Sari, I & R. Nursanty. 2017. Skrining Fitokimia dan Uji  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  N-heksana dan  Metanol  dari  Daun  Tutup  Bumi (Elephantopus scaber) Terhadap Pertumbuhan Bakteri  Methicillin  Resistant  Staphylococcus aureus  (MRSA),  hlm  397-402.  Di  dalam Pendidikan  Sains  Islami  dalam  Konteks Pengaplikasian Etnobiologi untuk Mewujudkan Generasi Berkarakter. Prosiding Seminar Nasional Biotik 2017. Program Studi Pendidikan  Biologi  Fakultas  Tarbiyah  dan Keguruan UIN Ar-Raniry.
Sholikhah,  R.  M.  2016.  Identifikasi  Senyawa Triterpenoid  dari  Fraksi  N-  Heksana  Ekstrak Rumput Bambu (Lophatherum gracile Brongn.) dengan Metode UPLC-MS. Skripsi. Universitas  Islam  Negeri  Maulana  Malik Ibrahim. Malang.
Sumaryono,  Latifah  &  S.  M.  R.  Sedyawati.  2013. Identifikasi  dan  Uji  Toksisitas  Azadirachtin dari  Daun  Mimba  Sebagai  Bioinsektisida Walang  Sangit.  Indonesian  Journal  of Chemical Science. 2:46-50.
Supriyanto,  W.  B.  Simon.,  M.  Rifa’i  &  Yunianta
2017. Uji Fitokimia Dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Mimba
(Azadirachta  Indica  Juss),  hlm.  523-528.  Di dalam Strategi Pengembangan Perekonomian Masyarakat  Melalui  Gerakan  Starup  Digital. Prosiding  Seminar  Nasional  Teknologi  dan Informatika. Universitas Muria Kudus. Kudus.
Tanaya,  V.,  R.  Retnowati  &  Suratmo.  2015.  Fraksi Semi Polar Daun Mangga Kasturi (Mangifera casturi  Kosterm).  Kimia  Student  Journal. 1(1):778-784