AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI-FRAKSI EKSTRAK SIRIH HIJAU ( Piper betle Linn)

## TERHADAP PATOGEN PANGAN
[ Antibacterial Activity of Fractionated Green Sirih (Piper betle Linn ) Extract Against Food Pathogenic Bacteria ]
Suliantari*, Betty S. L. Jenie, dan Maggy T. Suhartono
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 13 November 2010 / Disetujui 17 Desember 2012

## ABSTRACT
Fractionation of green sirih (Piper betle Linn) extract by chromatography colom using the mixture of several solvents i.e. chloroform, ethanol and acetic acid (4:1:1) resulted in 17 fractions. All fractions showed antibacterial activities but only 2 fractions (fraction 3 and fraction 4) showed the highest  inhibition  towards  the  six  tested  bacteria  Escherichia  coli,  Salmonella Typhimurium ,  Pseudomonas  aeruginosa,  Staphylococcus  aureus, Bacillus cereus and Listeria monocytogenes. Among the tested bacteria, all fractions of green sirih extracts showed the most effective inhibition against, Salmonella Typhimurium with inhibition zone diameters ranging from 10 mm to 26 mm. Identification using GC-MS found that fraction 3 and fraction 4 contained chavicol; dodecanoic acid, myristic, palmitic and oleic acid.
Keywords: antimicrobial, fractionation, pathogen, green sirih

## ABSTRAK
Fraksinasi ekstrak etanol sirih hijau ( Piper betle Linn) dengan kromatografi kolom pada silika gel dengan eluen kloroform, etanol dan asam asetat menghasilkan 17 fraksi yang umumnya mempunyai aktivitas antibakteri tetapi hanya dua (2) fraksi yaitu fraksi 3 dan 4 yang mempunyai aktivitas  penghambatan  yang  kuat  terhadap  semua  bakteri  uji  ( Escherichia  coli , Salmonella Typhimurium , Pseudomonas  aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus dan Listeria monocytogenes ). Diantara bakteri uji yang digunakan, fraksi-fraksi sirih tersebut paling efektif menghambat Salmonella Typhimurium dengan diameter penghambatan sekitar 10 mm sampai 26 mm. Hasil analisis GC-MS menunjukkan bahwa pada fraksi 3 dan fraksi 4 mengandung senyawa-senyawa kavikol; asam dodekanoat; miristat; palmitat dan oleat.
Kata kunci: antimikroba, fraksinasi, pathogen, sirih hijau
PENDAHULUAN 1
Salah  satu  tanaman  herbal  yaitu  sirih  ( Piper  betle Linn) telah lama diketahui dan digunakan secara turun temurun untuk pengobatan  obat  batuk,  sakit  gigi,  penyegar  dan  sebagainya. Bagian-bagian  dari  tanaman  sirih  seperti  akar,  biji  dan  daun berpotensi  untuk  pengobatan  tetapi  yang  paling  sering  di- manfaatkan  untuk  pengobatan  adalah  bagian  daunnya.  Pe- manfaatan  sirih  dalam  pengobatan  tradisional  ini  disebabkan adanya sejumlah zat kimia atau bahan alami yang mempunyai aktivitas sebagai senyawa antimikroba.
Ekstrak  sirih  ( Piper  betle Linn)  mengandung  beberapa komponen  aktif  yang  mempunyai  aktivitas  antibakteri, diantaranya adalah safrol dan kavibetol asetat (Arambewela et al., 2005).  Hasil  penelitian  dari  Row  dan  Ho  (2009),  fenolik merupakan  komponen  yang  berperan  sebagai  bahan  anti- mikroba  sedangkan  menurut  Chakraborty  dan  Shah  (2011) yang  berperan  sebagai  bahan  antimikroba  dari  sirih  adalah sterol.  Selain  eugenol,  komponen  lain  yang  dapat  ditemukan
*Korespondensi Penulis : Email : suli_tari@yahoo.com
pada  ekstrak  daun  sirih  adalah  d-germakren,  lepidosen, kariopilen,  elemen,  murolen,  selinenol,  kadine  dan  sineol (Periyanayagam et al., 2011), Bhattacharya et al. (2005) ekstrak sirih mengandung komponen aktif kavibetol dan alilpirokatekol. Menurut  Friedman et  al. (2002),  komponen  dalam  daun  sirih yang  aktif  sebagai  bahan  antimikroba  adalah  karvakrol, eugenol,  kavibetol  dan  isomer  eugenol.  Selain  hidroksikavikol, dalam daun sirih juga terdapat asam stearat dan palmitat yang mempunyai  aktivitas  antimikroba  (Nalina  dan  Rahim,  2007). Penelitian  dari  Sugumaran et  al. (2011);  Gandhi  dan Sugumaran  (2012),  selain  eugenol  komponen  lain  dalam ekstrak sirih varietas Sirugamani 1 dan vellaikodi yang berfungsi sebagai  bahan  antimikroba  adalah  5-[2-propenil]–1,3 bensodioksol, 2-metoksi-4-[2-propenil] asetat.
Kemampuan  menghambat  dari  masing-masing  fraksi berbeda  dan  diduga  disebabkan  karena  adanya  kandungan senyawa  kimia  yang  berbeda  dari  masing-masing  fraksi tersebut.  Fraksi-fraksi  sirih  disusun  oleh  beberapa  senyawa- senyawa yang diduga mempunyai aktivitas antimikroba. Dalam tulisan ini akan dikaji lebih lanjut aktivitas antibakteri dari fraksi- fraksi yang terdapat dalam ekstrak etanol sirih hijau.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak etanol  daun  sirih  hijau.  Bakteri  uji  yang  digunakan  adalah Bacillus  cereus (FNCC  057), Staphylococcus  aureus, (FNCC 047) Listeria  monocytogenes (FNCC  0156 ),  Pseudomonas aeruginosa (FNCC  063)  dan Salmonella Typhimurium (FNCC 0734) yang diperoleh dari Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi  UGM; Escherichia  coli (ATCC) yang  diperoleh  dari Laboratorium  Mikrobiologi  Seafast  ( South  East  Asia  Food  and Agricultural  Science  and  Technology) Center  IPB;  silika  gel (Merck),  nitrogen  cair,  media  nutrien  agar  (NA)  dan  Nutiren broth  (NB)  dari  OXOID,  pelarut-pelarut  etanol,  kloroform  dan asam asetat dari Merck.

## Pembuatan ekstrak sirih
Daun sirih yang telah dikeringkan dan dihaluskan kemudian diekstraksi menggunakan etanol dengan perbandingan 1 bagian sirih  dan  4  bagian  etanol  dengan  cara  dihomogenisasi  dalam shaker  (platform  shaker  Innova  2300)  selama  24  jam  dengan kecepatan  rotasi  150  rpm.  Filtrat  tersebut  kemudian  diuapkan dalam  rotavapor  (Buchi,  210)  pada  suhu  50°C  dan  kemudian dihilangkan  sisa  pelarutnya  dengan  gas  nitrogen,  selanjutnya ekstrak siap digunakan untuk analisis.

## Persiapan bakteri uji
Bakteri  uji  yang  digunakan  untuk  pengujian  aktivitas  anti- bakteri  dari  ekstrak  terpilih  adalah Staphylococcus  aureus , Escherichia  coli,  B.  cereus,  Salmonella Typhimurium ,  Listeria monocytogenes dan Pseudomonas aeruginosa. Sebelum diper- gunakan  bakteri-bakteri  uji  yang  telah  ditumbuhkan  dalam media agar miring NA dan disimpan pada suhu 10°C tersebut terlebih dahulu disegarkan dalam media cair Nutrient broth (NB) dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C.

## Fraksinasi ekstrak sirih (Sutedja dan Agustina, 1994)
Fraksinasi ekstrak etanol  sirih dilakukan dengan cara elusi pada kromatografi Kolom. Sebanyak 30 gram silika gel (Merck) dibuat bubur dengan menambahkan kloroform kemudian bubur kloroform tersebut dimasukkan ke dalam corong gelas dengan diameter 2,5 cm dan panjang 30 cm, pelarut dialirkan sehingga diperoleh  adsorben  silika  dan  dibiarkan  semalam.  Selanjutnya ke  dalam  kolom  tersebut  ditambahkan  ekstrak  sirih,  kemudian kolom di elusi dengan campuran eluent terpilih yang diperoleh dari hasil penelitian kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang meng- hasilkan  spot  terbanyak  yaitu  campuran  kloroform,  etanol  dan asam asetat dengan perbandingan 4 : 1: 1.
Fraksi-fraksi  yang  diperoleh  kemudian  diuapkan  dan  di- hilangkan pelarutnya menggunakan gas N 2 . Volume awal fraksi yang diperoleh sebanyak 10 ml, setelah diuapkan volume fraksi yang diperoleh disamakan yaitu 3 ml.
Pengujian aktivitas antibakteri (Garriga et al., 1993) Kemampuan  aktivitas  antibakteri  fraksi-fraksi  ekstrak  sirih hijau diuji terhadap enam jenis bakteri meliputi Gram positif dan Gram  negatif  seperti Bacilus  cereus,  Staphylococcus  aureus,
Listeria  monocytogenes,  Escherichia  coli,  Salmonella Typhimurium dan Pseudomonas  aeruginosa .  Sebelum  diper- gunakan isolat bakteri diaktifkan terlebih dahulu dengan terlebih dadulu  ditumbuhkan  dalam  media  cair  Nutrient  broth  (NB) selama 24 jam.
Pengujian  aktivitas  antibakteri  dilakukan  dengan  meng- gunakan metode difusi sumur dengan mengukur diameter peng- hambatan dari ekstrak tersebut terhadap masing-masing bakteri uji.  Media  nutrient  agar  (25  ml)  yang  mengandung  bakteri  uji sebanyak  10 7 CFU/ml  dituangkan  ke  dalam  cawan  petri  steril dan  dibiarkan  membeku.  Setelah  membeku,  kemudian  pada media  tersebut  dibuat  lubang-lubang  atau  sumur  dengan diameter  6  mm.  Ke  dalam  lubang  tersebut  dimasukkan  50  µl masing-masing  fraksi  ekstrak  sirih  hijau  yang  diperoleh. Selanjutnya  cawan  diinkubasikan  dalam  inkubator  suhu  37°C selama 24–48 jam.

## Analisis GC-MS
Analisis  dengan  GC-MS  (Gas  Chromatography  Mass Spectrofotometri,  Shimadzu  QP  5000)  dilakukan  terhadap fraksi–fraksi ekstrak sirih dengan daya hambat terkuat (fraksi 3 dan fraksi 4). Contoh (0,2 µl) disuntikkan pada GC-MS (kondisi alat  telah  diprogram)  dengan  spesifikasi:  kolom  yang  diper- gunakan kolom kapiler GL Sciences TC-17 (0,25 mm x 30 m), gas  pembawa  Helium,  suhu  awal  50°C  (ditahan  selama  5 menit),  suhu  akhir  250°C  dengan  laju  kenaikan  suhu  4°C  per menit; tekanan 40-45 Kpa, suhu interface 230°C dengan energi ionisasi  120  Kv  (kisaran  massa  33-400).  Interpretasi  spektrum massa  hasil  analisis  dilakukan  dengan  membandingkan spektrum massa pada data base NIST 62.

## Analisis statistik
Untuk  mengetahui  adanya  perbedaan  nyata  atau  tidak kemampuan  menghambat  dari  masing-masing  fraksi  terhadap masing-masing bakteri uji dilakukan uji statistik ANOVA (SPSS 11) dan uji lanjut Duncan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Fraksi ekstrak sirih dan aktivitas antibakteri
Dengan  menggunakan  cara  elusi  kromatografi  kolom  dari ekstrak etanol sirih hijau dengan menggunakan eluen campuran kloroform, etanol dan asam asetat (4 : 1 : 1) diperoleh sebanyak 17  fraksi.  Dan  dari  17  fraksi  tersebut  diuji  aktivitas  antibakteri- nya  terhadap  6  bakteri  uji.  Dari  hasil  yang  diperoleh,  pada umumnya semua fraksi–fraksi etanol sirih mampu menghambat pertumbuhan  satu  atau  beberapa  bakteri  uji  dengan  diameter penghambatan berkisar antara 10 mm sampai dengan 27 mm (Tabel 1).
Dari data diameter penghambatan yang diperoleh (Tabel 1), kemampuan  penghambatan  dari  fraksi–fraksi  sirih  berbeda untuk masing-masing bakteri uji karena ada fraksi tertentu yang tidak  mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri  (diameter penghambatan  0  mm)  yaitu  fraksi  5  sampai  fraksi  17  (kecuali fraksi  14).  Kemampuan  menghambat  fraksi  1  dan  fraksi  2 terhadap bakteri Gram positif lebih tinggi dari pada bakteri Gram
negatif.  Fraksi  3  mempunyai  kemampuan  menghambat  yang sama antara bakteri Gram positif dan Gram negatif sedangkan fraksi  4  kemampuan  menghambat  pertumbuhan  bakteri  Gram negatif  lebih  tinggi  dari  bakteri  Gram  positif.  Terhadap S. Typhimurium,  semua  fraksi-fraksi  yang  diperoleh  efektif  meng- hambat pertumbuhan bakteri tersebut.
Diameter penghambatan terendah adalah pada fraksi 5, 6, 7 dan  fraksi  17  sedangkan  fraksi  yang  mempunyai  kemampuan menghambat tertinggi untuk S. Typhimurium adalah fraksi 3 dan fraksi 4. Terhadap bakteri uji yang lainnya seperti B. cereus, E. coli;  S.  aureus;  P. aeruginosa dan L.  monocytogenes ada beberapa  fraksi  yang  tidak  mampu  menghambat  pertumbuhan bakteri-bakteri tersebut. Seperti misalnya fraksi 5, fraksi tersebut mampu  menghambat  pertumbuhan  beberapa  bakteri  uji  yang digunakan kecuali terhadap E. coli dan S. aureus ; fraksi 6 tidak mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri S.  aureus ;  fraksi  7 menghambat semua bakteri uji kecuali terhadap P. aeruginosa sedangkan fraksi 9 hanya efektif menghambat pertumbuhan S . Typhimurium. Kemampuan menghambat dari fraksi 1, 2, 3 dan fraksi 4 terhadap bakteri S. aureus dapat dilihat pada Gambar 1. Dengan  uji  statistik  lebih  lanjut,  aktivitas  antibakteri  dari fraksi  1,  2,  3  dan  4  terhadap  pertumbuhan E.  coli ; S . Typhimurium  dan L.  monocytogenes memberikan  perbedaan yang  nyata  pada  taraf  signifikasi  α<0,5.  Fraksi  1  berpengaruh nyata  terhadap  pertumbuhan S. aureus ;  fraksi  1  dan  3  ber- pengaruh  nyata  terhadap  pertumbuhan B.  cereus pada  taraf signifikasi  α<0,5.  Untuk  bakteri P.  aeruginosa ,  dengan  uji statistik kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri fraksi 1 dan  4  memberikan  perbedaan  yang  nyata.  Perbedaan  ke- mampuan  menghambat  dari  masing-masing  fraksi  ini  diduga disebabkan  karena  adanya  kandungan  senyawa  kimia  yang berbeda  dari  masing-masing  fraksi  tersebut  dan  adanya  efek yang  saling  mempengaruhi  (antagonis  atau  sinergis)  dari masing-masing komponen penyusun ekstrak sirih.
Tabel 1.  Kemampuan  fraksi-fraksi  sirih  dalam  menghambat  per-
tumbuhan bakteri uji Fraksi Rata-rata Diameter Penghambatan (mm) St Pa Bc Ec Sa Lm 1 21 19,30 23 16 22,70 19,60 2 18 20,30 25,30 17 22 20,30 3 23 20 26,70 26 23 17,30 4 26 26,60 25,30 25,60 23 12 5 10,60 15 12,30 0 0 13,60 6 10 11 11 10 0 10 7 10,60 0 10,10 15,30 11,30 10 8 15,30 17,3 0 0 0 0 9 15 0 0 0 0 0 10 14 0 12 11 0 0 11 20 0 0 12 0 11 12 19,60 0 21 23 14 10,30 13 18 25,30 11,70 14,70 10 0 14 14 21,70 18 15 11,30 10,30 15 16,70 21,30 12,70 0 0 12 16 18 21 0 0 0 0 17 11 0 13,30 19,30 0 14,30 Keterangan: 0: Tdak ada kemampuan menghambat (diameter penghambatan 0 mm); St : S. Typhimurium; Pa : P. aeruginosa; Bc : B. cereus; Ec : E. coli ; Sa: S. aureus; Lm : L. monocytogenes
Menurut  Naidu  (2000),  aktivitas  antimikroba  dipengaruhi oleh  beberapa  faktor  diantaranya  adalah  komposisi  kimia. Pepeljnajk et al . (2005), fraksi-fraksi yang diperoleh satu ekstrak
mempunyai  aktivitas  antimimkroba  berbeda  terhadap  bakteri Staphylococcus sp. dan khamir Candida lusitaniae .
Kemampuan  menghambat  dari  fraksi–fraksi  etanol  sirih terhadap  masing-masing  bakteri  uji  berbeda  bila  dibandingkan dengan  ekstrak  etanol  sirih.  Karena  ada  beberapa  fraksi  yang tidak mampu menghambat pertumbuhan bakteri tertentu. Fraksi 3  dan  4  mempunyai  kemampuan  menghambat  pertumbuhan bakteri  uji  (kecuali L.  monocytogenes )  yang  lebih  kuat  di- bandingkan  dengan  ekstrak  etanol  sirih.  Ekstrak  etanol  sirih mempunyai  kemampuan  menghambat  pertumbuhan S.aureus (24 mm); S. Typhimurium (19,80 mm); B. Cereus (16,80 mm); P. aeruginosa ( 16,90 mm) dan untuk L. monocytogenes (16,60 mm).

## Keterangan : a:  fraksi 1;  b :  fraksi 2;  c :  fraksi 3;  d :  fraksi 4
Gambar 1.  Kemampuan  fraksi  sirih  menghambat  pertumbuhan S. aureus

## Komponen aktif dari fraksi-fraksi ekstrak sirih
Identifikasi  komponen  aktif  dilakukan  terhadap  fraksi-fraksi ekstrak  sirih  hijau  yang  mempunyai  kemampuan  menghambat yang tinggi terhadap semua bakteri uji khususnya fraksi 3 dan fraksi 4.
Dengan  menggunakan  GC-MS  dari  fraksi  3  dan  fraksi  4 ditemukan adanya senyawa kavikol, asam dodekanoat, miristat, palmitat  dan  oleat  yang  diduga  ada  hubungannya  dengan aktivitas penghambatan dari fraksi-fraksi tersebut. Pada fraksi 3 kandungan komponen dari yang terendah ke tertinggi berturut- turut  adalah  oleat  (8,9%);  kavikol  (10,2%);  asam  miristat (16,5%); palmitat (24,3%) dan asam dodekanoat (40,1%). Pada fraksi 4, kandungan komponen  dari yang terendah ke tertinggi berturut-turut  adalah  kavikol  (8,8%);  asam  miristat  (10,5%); palmitat (21,8%); asam dodekanoat (30,4%) dan oleat (28,5%). Dari  penelitian  Nalina  dan  Rahim  (2007),  ekstrak  sirih  selain mengandung  hidroksikavikol  juga  ditemukan  adanya  asam stearat  dan  palmitat  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan mikroba. Komponen dalam daun sirih yang bersifat antimikroba adalah  karvakrol,  eugenol,  kavibetol  dan  alilpirokatekol (Bhattacharya et al., 2005 dan Friedman et al., 2002). Jenie et al. (2001) dalam daun sirih ditemukan adanya kavikol, kavibetol, tanin,  eugenol,  karvakrol,  kariofilene  dan  asam  askorbat  yang mempunyai  aktivitas  antibakteri.  Dari  hasil  penelitian  yang dilakukan oleh Hinton dan Ingram (2000) dan Dilika et al. (2000) asam  oleat  mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri  gram
a c b d
positif  dan  bersifat  bakterisidal  terhadap  beberapa  bakteri patogen dan pembusuk.  Yanti et al. (2000), ekstrak daun  sirih mengandung  4-alil-1,2-diasetoksi  bensen  dan  derivat  asam bensoat seperti 2,4-dimetil dan  3,5-dimetil asam bensoat yang mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri  pembusuk Pseudomonas fluorescens .

## KESIMPULAN
Fraksinasi  ekstrak  etanol  sirih  hijau  ( Piper  betle Linn) dengan  kromatografi  kolom  silika  gel  dan  pelarut  campuran kloroform, etanol dan asam asetat diperoleh 17 fraksi.  Dari ke 17  fraksi  yang  diperoleh,  tidak  semua  fraksi  mempunyai kemampuan menghambat pertumbuhan semua bakteri uji yang digunakan  yaitu E.  coli,  P.  aeruginosa,  S. Typhimurium, L. monocytogenes , S. aureus dan B. cereus . Fraksi –fraksi 1, 2, 3, 4 dan fraksi 14 dapat  menghambat ke enam bakteri uji dengan diameter penghambatan antara 10 mm sampai 27 mm. Dari ke enam bakteri uji yang digunakan, bakteri yang efektif dihambat oleh  fraksi-fraksi  sirih  hijau  berturut-turut  dari  yang  tertinggi rendah  berturut-turut  adalah B.  cereus , S.  aureus,  P. aeruginosa,  S .  Typhimurium, L.  monocytogenes dan E.  coli . Bakteri  uji  yang  paling  efektif  dihambat  pertumbuhannya  oleh semua  fraksi  sirih  adalah  bakteri S. Typhimurium  dengan diameter penghambatan antara 10-26 mm.
Dengan GC-MS, fraksi-fraksi eksrak etanol sirih khususnya fraksi yang mempunyai aktivitas penghambatan tertinggi (fraksi 3  dan  fraksi  4)  mengandung  senyawa–senyawa  yang  mem- punyai  aktivitas  antimikroba  yaitu  kavikol;  asam  dodekanoat; miristat;  palmitat  dan  oleat.  Ekstrak  dan  fraksi-fraksi  dari  sirih dapat  digunakan  sebagai  pengawet  alami  terhadap  bakteri patogen dan pembusuk pangan.

## DAFTAR PUSTAKA
Arambewela  L,  Kumaratunga  KGA,    Dias  K.  2005.  Studies  on Piper  betle of  Sri  Lanka.  J  Natn  Sci  Foundation  Sri  Lanka 33: 133-139. DOI: 10.4038/jnsfsr.v33i2.2343 .
Bhattacharya  S,  M  Subramanian,  S  Roychauolhury,  Bauri  AK, Kamat  JP,  Chatttopadhyay  S,  Bandyopadhyay  SK.  2005. Radioprotective  property  of  the  ethanoloc  extract  of  piper betle  leaf.  J  Radiat  Res  46:  165-171. DOI: 10.1269/jrr.46.165 .
Chakraborty D,  Shah B. 2011. Antimicrobial, anti-oksidative and anti-hemolytic  activity  of Piper  betel leaf  extracts.  Int  J  of Pharm and Pharmaceutical Sci 3: 192-199.
Dilika  F,  Bremmer  D,  Meyer  JJ.  2000.  Antibacterial  activity  of linoleic  and  oleic  acids  isolated  from Helichrysum pedunculatum :  a  plant  used  during  circumcision  rites.
Fitoperapia 71: 450-452. DOI: 10.1016/S0367- 326X(00)00150-7 .
Friedman M, Henika PR, Mandrell RE. 2002. Bacterial activities of plant essential oil and some of their isolated constituent against Campylobacter  jejuni , Eschericia  coli,  Listeria monocytogenes and Salmonella enterica . J Food Protection 65: 1545-1560.
Gandhi  MS,  Sugumaran  M.  2012.  Comparison  of  GC-MS analysis  and  antimicrobial  activity  of  volatile  oil  in  three varieties of Piper Betle Leaves. Int J of Pharmacy Res 1: 1-
7.
Garriga M, Aymerich HM, Monfort JM. 1993. Bacteriocinogenic activity  of  lactobacilli  from  fermentor  sausages.  J  Appl Bacteria 75: 142-148. DOI: 10.1111/j.1365- 2672.1993.tb02759.x .
Hinton  A,  Ingram  KD.  2000.  Use  of  oleic  acid  to  reduce  the population  of  bacterial  flora  of  poultry  skin.  J  Food Protection 63: 1282-1286.
Jenie BSL, Andarwulan N, Puspitasari Nienaber NL, Nuraida L.
2001.  Antimicrobial  activity  of Piper  betle Linn  extract towards  foodborne  pathogens  and  spoilage  micro- organisms. Http//ift.Confex.com//ift/2001/technoprogram/ paper.9068.html. [15 Juni 2004].
Nalina T, Rahim ZHA. 2007. The crude aqueous extract of Piper betle L  .  and  its  antibacterial  effect  towards Streptococcus mutans . American J of Biotech and Biochemi 3: 10-15. Naidu  AS.  2000.  Natural  Food  Antimicrobial  Systems.  CRC Press. London.
Pepeljnajk S, Kalodera Z, Zovko M. 2005. Antimicrobial activity of  flavonoid  from Pelargonium  radula (Cav.)  L’Herit.  Acta Pharm 55: 431-435.
Periyanayagam  K,  Mubeen  M,  Sakeem,  Mohamed  M,  Basha, Sathik  S.  2011.  Phytochemichal  studies  and  GC/MS analysis on the isolated essential oil from the leaves of Piper betle var.  Siguramanil  1  (SGM1).  J  Pharm  Res  4:  2411- 2413.
Row  LCM,  Ho  JC.  2009.  The  Antimicrobial  activity,  mosquito larvicidal  activity,  antioxidant  property  and  tyrosinase inhibition of Piper betle .  J Chinese Chem Society 56: 653- 658.
Sutedja L, Agustina. 1994. Ekstraksi dan Fraksinasi Komponen Bioaktif  Antimikroba  dalam  Biji  dan  Daun  Lada.  JKTI  4. Desember, 1994.
Sugumaran  M,  Gandhi  S,  Sankarnatayanen  M,  Yokesh  M,
Poornime  M,  Rajasekhar  SM.  2011.  Chemical  composition and antimicrobial activity of vellaikodi variety of Piper betle Linn leaf oil against dental pathogens. Int J Pharm Tech Res 3: 2135-2139.
Sugumaran  M,  Pornima  M,  Venkatraman  S,  Lakshmi  M, Srinivikasan  S.  2011.  Chemical  composition  and  anti- microbial activity of sirugamani 1 variety of Piper betle Linn leaf oil. J Pharm Res 4: 3424-3426.
Yanti  R,  Suyitno,  Harmayani  E.  2000.  Identifikasi  komponen ekstrak  sirih  ( Piper  betle Linn)  dari  beberapa  pelarut  dan pemanfaatannya  untuk  pengawetan  ikan.  J  Agrosains  8: 239-250.