# Korespondensi:  Balai  Riset  Perikanan  Budidaya  Air  Tawar  dan Penyuluhan  Perikanan.
Jl.  Sempur  No.  1,  Bogor  16129  Indonesia. Tel.  + 62  251  8313200 E-mail:  uni_fish@yahoo.com
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra

## IDENTIFIKASI DAN  KARAKTERISASI BAKTERI  Edwardsiella  ictaluri  PENYEBAB  PENYAKIT
Enteric Septicemia of Catfish (ESC) PADA IKAN PATIN (Pangasius sp.)
Uni  Purwaningsih # ,  Hessy  Novita,  Desy  Sugiani,  dan  Septyan  Andriyanto
Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan Jl. Sempur  No. 1, Bogor 16154
(Naskah diterima: 29 Januari 2018; Revisi final: 4 April 2019; Disetujui publikasi: 4 April 2019)

## ABSTRAK
Penyakit Enteric Septicemia of Catfish (ESC) merupakan salah satu kendala pada budidaya ikan patin yang disebabkan oleh bakteri Edwardsiella ictaluri. E. ictaluri termasuk kelompok golongan bakteri gram negatif. Infeksi ESC ditandai dengan gejala klinis antara lain bercak putih pada organ internal, pendarahan pada pangkal sirip dan ekor. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan karakterisasi isolat E. ictaluri, serta  mengetahui  tingkat  patogenitasnya  pada  ikan  patin  (Pangasius  sp).  Sampel  ikan  patin  sakit  yang terduga terinfeksi ESC diperoleh dari tiga lokasi budidaya yaitu dari Jatiluhur, Sukabumi, dan Sukamandi. Berdasarkan hasil  uji karakterisasi  secara biokimia  diperoleh delapan  isolate; masing-masing  satu isolat dari Jatiluhur, tiga isolat dari Sukabumi, dan empat isolat dari Sukamandi, yang definitif sebagai E. ictaluri. Hal ini juga didukung dengan diagnosa Polymerase Chain Reaction dan sekuensing DNA dari delapan isolat menunjukkan berat molekul pada 2.000 bp dan memiliki tingkat simiarlity sebesar 97%-99%. Berdasarkan uji patogenitas diperoleh hasil bahwa isolat E. ictaluri dengan kode PJh-01 asal Jatiluhur sebagai isolat yang memiliki patogenitas tinggi dengan nilai LD 50 sebesar 3,23 x 10 7 cfu.
KATA KUNCI: E. ictaluri; patin; patogenitas; identifikasi; karakterisasi
ABSTRACT: Identification and characterisation of bacteria Edwardsiella ictaluri causing Enteric Septicemia of Catfish (ESC) on catfish (Pangasius sp.). By: Uni Purwaningsih, Hessy Novita, Desy Sugiani, and Septyan Andriyanto
Infection of Enteric Septicemia of Catfish (ESC) in catfish is caused by bacteria Edwardsiella ictaluri. E. ictaluri belongs to gram-negative bacteria. ESC infection was characterized by clinical symptoms such as whitish spots on internal organs and bleeding at the base of the fins and tail. The study aimed to identify and characterize E. ictaluri isolates and to determine its pathogenicity on catfish (Pangasius sp.). The sample of diseased catfish and suspected infected fish by of ESC was collected from three sites of catfish aquaculture (Jatiluhur, Sukabumi, and Sukamandi). Biochemical characterization revealed that eight isolates, i.e.; one isolate from Jatiluhur, three isolates from Sukabumi, and four isolates from Sukamandi, were identified as E. ictaluri. This finding was confirmed by the result of Polymerase Chain Reaction and DNA sequencing that all eight isolates had a molecular weight of 2,000 bp and showed a similarity level of 97%-99% to E. ictaluri. Based on the pathogenicity test, it was found that E. ictaluri isolate with code of PJh-01 collected from Jatiluhur has the higest pathogenicity LD50 value of 3.23 x 107 cfu.
KEYWORDS: E. ictaluri; catfish; pathogenicity; identification; characterization

## PENDAHULUAN
Enteric Septicemia of Catfish (ESC) merupakan salah satu  jenis  penyakit  yang  cukup  serius  dan  banyak menyerang budidaya ikan patin yang disebabkan oleh bakteri Edwardsiella ictaluri. Kematian ikan patin akibat
infeksi  bakteri  E.  ictaluri  menjadi  penghambat keberhasilan  produksi  budidaya.  Di  Indonesia dilaporkan, E.  ictaluri  pertama  kali  ditemukan  telah menginfeksi  ikan  patin  siam  (Pangasius hypophthalmus) di Provinsi Jambi pada bulan Januari 2002 (Panigoro  et  al.,  2005). Penyakit  ESC  pertama kali  dikenal  pada  tahun  1976  sebagai  menyebab kematian pada benih channel catfish (Ictalurus punctatus) di  Alabama  dan  Georgia,  USA.  Bakteri  penyebab penyakit ini diidentifikasi sebagai spesies E. ictaluri. E. ictaluri juga dilaporkan telah menginfeksi walking
catfish (Clarias batrachus) yang dibudidayakan di Thai- land pada tahun 1987.
Keskin et al. (2004) juga melaporkan terjadi infeksi E.  ictaluri  pada  ikan  Rainbow  Trout  (Oncorhynchus mykiss).  Infeksi  E.  ictaluri  menyerang  industri  ikan patin di Vietnam dan menyebabkan kerugian ekonomi yang besar akibat angka kematian tinggi, kerentanan terhadap penyakit lain, serta biaya pengobatan yang tinggi (Plumb, 1999; Wagner et al., 2002 ; Crumlish et al., 2002). E. ictaluri sebagai penyebab utama Enteric Septicemia  dapat  mengakibatkan  kematian  10%-50% pada catfish. Pada infeksi akut, kematian dapat terlihat pada hari ke-4 sampai hari ke-12. E. ictaluri umumnya menyerang  golongan  catfish  dan  dikenal  dengan penyakit Hole in the Head Disease karena menyebabkan lesi terbuka pada daerah kepala (Keskin et al., 2004). Hawke et al. (2013) juga melaporkan kejadian infeksi Edwardsiellosis sebagai penyebab kematian pada ikan zebrafish (Danio rerio). Soto et al. (2012) meneliti kasus E. ictaluri sebagai penyebab kematian pada ikan nila tilapia.
Menurut  Inglis  et  al.  (1993),  E.  ictaluri  dapat bertahan hidup pada kolam berlumpur selama lebih dari  90  hari  pada  25°C.  Bakteri  ini  diduga  bersifat karier dalam usus ikan yang terinfeksi. Pada penelitian channel catfish yang terinfeksi ESC mortalitas tertinggi terjadi pada suhu 25°C, terendah pada suhu 23°C dan 28°C, sedangkan pada suhu 17°C, 21°C, atau 32°C tidak ada kematian. Pasnik et al. (2007) menyatakan bahwa ikan white perch Morone americana, chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha, dan rainbow trout O. mykiss dapat terinfeksi secara buatan oleh bakteri ini. Masing- masing  ikan  mempunyai  kerentanan  yang  berbeda terhadap infeksi E. ictaluri. Ikan nila dapat mengalami kematian  sampai  40%  pada  infeksi  bakteri  dengan konsentrasi 10 3 cfu/mL (Soto et al., 2012) dan kematian mencapai 50% pada ikan ayu jika diinfeksi 10 4 cfu/mL (Sakai et al., 2008). Selain itu, Suanyuk et al. (2014) melaporkan bahwa konsentrasi E. ictaluri 10 6 cfu/mL menimbulkan  kematian  50%  ikan  lele  hibrid  dan menurut laporan Pasnik et al. (2007) bahwa kematian ikan white perch terjadi sampai 100% pada infeksi E. ictaluri 10 7 cfu/mL.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi dan  mengkarakterisasi  isolat  E.  ictaluri,  serta menentukan tingkat patogenitasnya pada ikan patin (Pangasius  sp).

## BAHAN DAN METODE

## Nekropsi  Sampel  Ikan  Patin  Sakit
Pengambilan sampel ikan sakit yang menunjukkan gejala  klinis  terhadap  infeksi  E.  Ictaluri  berasal  dari daerah Jatiluhur  (tiga ekor),  Sukabumi (enam  ekor),
dan Sukamandi (16 ekor). Nekropsi dilakukan untuk mengisolasi organ target yaitu ginjal. Isolasi dengan cara  mengkultur  goresan  ose  dari  organ  target  ke media BHIA (Brain Heart Infusion Agar) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28°C. Koloni yang tumbuh selanjutnya  dimurnikan  3-4  kali  dengan  metode goresan ose secara bertingkat pada media yang sama sampai diperoleh koloni yang seragam.

## Identifikasi  dan  Karakterisasi  Isolat  Bakteri dengan Metode  Biokimia dan API  20E
Kultur murni bakteri hasil isolasi yang diperoleh selanjutnya  diidentifikasi  dan  karakterisasi menggunakan media uji biokimia kit API 20E. Bakteri dikultur pada media BHIA, kemudian diinkubasi pada suhu  28°C  selama  24  jam.  Sebanyak  1-2  ose  kultur bakteri dimasukan NaCl fisiologis 0,85%; diencerkan sampai kepadatan standar kekeruhan Mac Farland 4. Suspensi bakteri dimasukan ke kolom API hingga batas kolom yang ditentukan, khusus untuk parameter ADH, LDC,  ODC,  H 2 S,  dan  Urea  ditambahkan  parafin  cair terlebih dahulu sebelum diinkubasi. Inkubasi dilakukan pada suhu 36°C ± 2°C selama 18-24 jam. Pada param- eter TDA, Indole dan VP, masing-masing ditambahkan reagen TDA (Ref. 70 402), reagen James (Ref. 70 542), dan  reagen  VP1  +  VP2  (Ref.  70  442)  sebelum pembacaan  (Popovic  et  al.,  2009).  Interpretasi pembacaan untuk API 20E ditunjukkan dengan adanya perubahan warna. Hasil API 2OE selanjutnya dianalisis menggunakan program API sistem untuk menentukan spesies bakteri yang diperoleh.

## Amplifikasi  DNA  Isolat  Bakteri  dengan
Polymerase  Chain  Reaction
DNA  isolat  bakteri  diamplifikasi  menggunakan Polymerase  Chain  Reaction  dengan  mengembangkan metode  yang  telah  dilakukan  oleh  Williams  & Lawrence (2010). Preparasi isolasi DNA diawali dengan mengkultur bakteri dalam media BHI Broth pada vol- ume 10 mL. Hasil kultur disentrifus pada 10.000 rpm (10 menit) dan pellet yang terbentuk merupakan ma- terial  uji  untuk  isolasi  DNA.  Pelet  dilarutkan  dalam 200  µL  DNA free  water  (NFW)  dan  disentrifus  pada 10.000 rpm (10 menit), serta dipanaskan pada suhu 98°C  selama  10  menit.  Supernatan  yang  diperoleh merupakan DNA hasil ekstraksi. Tahap pertama dalam amplifikasi DNA untuk mendeteksi genus Edwardsiella, berdasarkan Williams & Lawrence (2010) digunakan primer 16 S-flank (5’-TAT CTA ATC CTG TTT GCT CCC C-3’) dan 23 S-F (5’-GAC GTT GAT AGG CTG GGT GT- 3’).  Analisis  PCR  tahap  kedua  adalah  membedakan spesies  E.  ictaluri  dan  E.  tarda,  digunakan  primer spesifik IVS (5’-TTA AAG TCG AGT TGG CTT AGG G- 3’)  dan  IRS  (5’-TAC  GCT  TTC  CTC  AGT  GAG  TGT  C- 3’). Siklus suhu amplifikasi yang digunakan untuk semua
tahapan  identifikasi  dengan  PCR  adalah  suhu predenaturasi  95°C  selama  empat  menit  kemudian suhu denaturasi 95°C selama 30 detik, sedangkan suhu anneling 55°C selama 30 detik dan elongasi pada 72°C selama dua  menit. Siklus  denaturasi, annealing,  dan elongasi  diulang  sebanyak  30  kali  dan  dilanjutkan dengan satu siklus final elongasi pada 72°C selama 10 menit.

## Sekuensing Hasil  PCR dari  DNA  Isolat  Bakteri
Produk  DNA  yang  dihasilkan  disekuen menggunakan jasa  perusahaan sekuensing  1st Base Singapura.  Alignment  Multiple  analysis  kelompok dilakukan  mengacu  pada  data  genbank  dengan  pro- gram BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) pada level nukleotida. Pohon hubungan kekerabatan filogenik  strain  isolat  bakteri  dibuat  dengan menggunakan program MEGA (Molecullar Evolusionare Genetic Analysis software version 7.1).

## Uji  Patogenitas
Ikan  uji  menggunakan  ikan  patin  (Pangasius  sp.) berukuran  11-12  cm.  Ikan  yang  digunakan  harus memenuhi  asumsi  Spesifik  Pathogen  Free  (SPF)  dan melewati masa aklimatisasi selama 14 hari. Pengujian sifat  SPF  dilakukan  dengan  pemeriksaan  secara bakteriologi dan PCR. Kelompok ikan patin uji masing- masing  diinjeksi  secara  intraperitoneal  dengan kandidat  isolat  bakteri  yang  terindikasi  sebagai  E. Ictaluri  dipilih  empat  isolat  dari  delapan  isolat terseleksi berdasarkan asal, yaitu isolat dengan kode PJh-01,  PCr-01,  PSkm-07,  dan  PSkm-11.  Bakteri  uji dikultur pada media Brain Heart Infusion Broth (BHIB). Pengujian  menggunakan  rancangan  acak  kelompok (RAK)  dengan  lima  perlakuan  dan  tiga  ulangan. Perlakuan yang digunakan adalah perbedaan jumlah sel bakteri yang diinfeksikan yaitu 10 4 , 10 6 , 10 8 , dan 10 10 , untuk  kelompok  kontrol  dinjeksi  dengan  NaCl fisiologis  0,85%.  Dosis  injeksi  masing-masing perlakuan  adalah  0,1  cc.  Pengamatan  dilakukan terhadap  tingkat  mortalitas  harian  selama  14  hari. Menurut  Taukhid  &  Pur waningsih  (2011), penghitungan nilai LD 50 dapat dihitung menggunakan statistik analisis regresi linier sederhana dengan pro- gram SPSS  versi 11.0. Model persamaan  regresi lin- ear sederhana adalah seperti berikut ini:
di mana:
Y = variabel  response atau variabel  akibat  (dependent) X = variabel predictor atau variabel faktor penyebab (independent) a = konstanta b = koefisien regresi (kemiringan)

## HASIL DAN BAHASAN
Hasil pemeriksaan terdapat 25 ekor ikan patin sakit yaitu tiga ekor dari Jatiluhur, enam ekor dari Sukabumi, dan 16 ekor dari Sukamandi. Hasil kultur murni tar- get organ (ginjal) pada BHI Agar menunjukkan bahwa delapan sampel terduga  terinfeksi bakteri E.  ictaluri yang yaitu  satu ekor berasal  dari Jatiluhur,  tiga dari Sukabumi,  dan  empat  dari  Sukamandi  (Tabel  1). Karakteristik  pertumbuhan  yang  khas  E.  Ictaluri ditunjukan  pada  media  BHI  Agar  yaitu  koloni  putih halus, kecil terpisah, bentuk bulat, elevasi cembung, dan memiliki ukuran 0,5-1,0 x 1.0-3 µm.
Seleksi  isolat  tahap  awal  dari  hasil  kultur  yang tumbuh sebelum dilakukan karakterisasi dengan API- 20E dilakukan dengan melihat kemampuan tumbuh, warna koloni, bentuk koloni, dan sudut elevasi. Isolat yang  menunjukkan  warna  koloni  putih  kekuningan transparan,  halus,  bulat,  dan  cembung  ramping keseluruhan tepi, dipilih untuk diuji dengan Kit API- 20E. Sebanyak delapan isolat diperoleh sebagai isolat yang  definif  E.  ictaluri  berdasarkan  pemeriksaan  uji karakterisasi biokimia dan API-20 (Tabel 3) yaitu isolat PJh-01,  PCr-01,  PCr-02,  PCr-05,  PSKm-04,  PSkm-07, PSkm-08,  dan  PSkm-11.  Hal  ini  sesuai  dengan  hasil penelitian-penelitian  yang  telah  dilakukan; menunjukkan bahwa E. ictaluri adalah bakteri fakultatif anaerob, batang Gram negatif termasuk famili Entero- bacteriaceae,  non-spora,  motil,  katalase  positif, oksidase  negatif,  fermentasi  glukosa  (Keskin  et  al., 2004). Karakteristik biokimia E. ictaluri pertama kali digambarkan oleh Hawke et al. (1981) dan dipelajari lebih lanjut oleh Waltman et al. (1986) dengan menguji 119 isolat E. ictaluri dan ditemukan 100% positif dalam pengujian  metil  red,  nitrat  reduktase,  lisin dekarbosilase, ornithin dekarbosilase, dan katalase. Selain itu, hasil pengujian menyatakan 100% negatif dalam  pengujian  sitrat,  malonat,  Voges  Proskauer, phenylalanin,  indol,  arginin  dihidrolase,  sitokrom oksidase,  â-galactosidase,  dan  hydrolyzing  urea. Karakteristik dari E. ictaluri adalah bergerak dengan flagella, tidak berspora, dan tidak berkapsul, batang, pleomorfik,  Gram  negatif,  berukuran  0,75-2,5  ìm; koloni kecil, bulat transparan, tidak berwarna, suhu optimum  28°C-30°C,  oksidase  -,  katalase  +,  H2S  -, Indol - (dari tryptophan), fermentatif, 0/129 resistan, lysin dekarboksilase +, arginin dihidrolase -, ornithin +, Gelatin -, Urea -, Citrate -, VP -, Glukosa +, Inosi- tol -, Sorbitol -, Rhamnose -, Mannitol -, Arabinose - , Sukrose -, fakultatif anaerob (Austin & Austin, 1987; Crumlish et al., 2002; World Organization for Animal Health,  2006a;  Holt  et  al.,  1994).  Masa  inkubasi  E. ictaluri adalah 36-48 jam, tampak sebagai koloni non- pigmen  yang  halus,  bundar  (diameter  1-2  mm),
bX a Y  
cembung ramping sampai keseluruhan tepi. E.ictaluri dengan  mudah  dapat  dibedakan  dari  E.  tarda  dari ketidakmampuannya untuk memproduksi indol dan H 2 S (E. tarda mampu memproduksi keduanya.
Konfirmasi menggunakan analisis molekuler PCR juga dilakukan terhadap ke-8 isolat E. ictaluri dengan kode PJh-01, PCr-01, PCr-02, PCr-05, PSKm-04, PSkm- 07,  PSkm-08,  dan  PSkm-11,  mengacu  pada  metode yang dikembangkan oleh Williams & Lawrence (2010). Semua isolat yang diujikan menunjukkan pita gen yang teramplifikasi  pada  1.300  bp,  menandakan  sebagai genus Edwardsiella (Gambar 1A). Dari hasil analisis PCR semua  isolat  yang  diujikan  menunjukkan  definitif sebagai E. ictaluri ditandai dengan pita pada 2.000 bp (Gambar 1B).
Dari  kedelapan  isolat  selanjutnya  dipilih  empat isolat  yaitu  PJh-01,  PCr-01,  PSkm-07,  dan  PSkm-11 berdasarkan asal isolat dan waktu pengambilan sampel untuk analisis sekuensing DNA. Analisis sekuensing dari  produk  PCR  empat  isolat  yaitu  PJh-01,  PCr-01, PSkm-08, dan PSkm-11 dilakukan oleh rekanan swasta dengan menggunakan primer 16S-flank dan 23S-F. Align- ment multiple analysis  kelompok dilakukan  mengacu pada data bank gen dengan program BLASTN (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) pada level nukleotida. Pohon hubungan kekerabatan pilogenik dibuat dengan menggunakan program MEGA software version 7.1.
Sekuensing  menggunakan  primer  16S-flank  dan 23S-F menunjukkan bahwa isolat yang digunakan pada penelitian  ini  termasuk  dalam  kelompok  E.  ictaluri dengan  indeks  kemiripan  sebesar  97%-99%  yang merupakan anggota kelompok pilogenik dari genus Edwardsiella, hal tersebut dapat dilihat pada Tabel 3. Tingkat  kedekatan  dihitung  dengan  menggunakan metode  neighbour-joining.  Isolat  E.  ictaluri  yang diperoleh di atas memiliki kemiripan 97%-99% dengan E. ictaluri 93-146 asal gen bank. William et al. (2012)
meneliti  bahwa  E.  ictaluri  93-146  merupakan  isolat yang menyebabkan wabah penyakit Enteric Septicemia of Catfish pada ikan chanel catfish di Amerika Serikat. Panangala et al. (2005) melakukan analisis sekuensing dengan primer 16S-23S untuk deteksi E. ictaluri yang berasal dari ikan menunjukkan hasil kemiripan 97%- 98% dengan E. ictaluri gen bank. Menurut Wang et al. (2009),  E.  ictaluri  secara  filogenik  dekat  dengan kelompok  bakteri  enterobacteriae  Salmonella  sp. karena sama-sama menyebabkan enteric septicemia.
Hasil  analisis  pilogenik  menunjukkan  terbentuk tiga kluster dari empat isolat lokal sampel E. ictaluri ikan patin. E. ictaluri kode PCr-01 dan PSKm-11 berada dalam satu kluster masih berdekatan dengan E. ictaluri kode PJh-01 meskipun berbeda kluster dan ketiganya sangat  berbeda  dengan  E.  ictaluri  PSkm-07  yang terletak  pada  kluster  lain,  namun  masih  memiliki kemiripan dengan E. ictaluri (gen bank kode 93-146) complete  genome  dan  berbeda  jauh  dengan  E.  tarda (strain  Kc-Pc1  16S  ribosomal  RNA  gene).  Perbedaan isolat E. ictaluri ikan patin yang berasal dari tiga daerah sentra budidaya (Jatiluhur, Sukabumi, dan Sukamandi) yang  ditunjukkan  oleh  posisi  kluster  yang  berbeda kemungkinan  adalah  E.  ictaluri  dengan  strain  yang berbeda oleh karena pengaruh lingkungan dan habitat hidup yang menyebabkan mungkin tidak ada gen flow dari masing-masing habitat (Gambar 2).
Perbedaan kluster yang terbentuk terjadi karena ada beberapa basa nukleotida tunggal yang berbeda antara ke-4 sampel E. ictaluri maupun dengan E. ictaluri dari  gen  bank  (kode  93-146)  dengan  separasi nukleotida yang lengkap (complete genome). Berdasarkan analisis  perbandingan  sekuen  DNA  dengan menggunakan program bioedit menunjukkan adanya perbedaan  basa  nukleotida  tunggal  mulai  posisi kelompok 5-25, 965, dan 1.085-1.365. E. ictaluri PCr- 01  dan  PSkm-11  menunjukkan  kemiripan  sekuen
Tabel 1. Hasil kultur bakteri pada Agar BHI dari organ ginjal ikan uji di tiga lokasi budidaya ikan patin (Jatiluhur, Sukabumi, dan Sukamandi)
Table 1. The  result  of  bacteria  cultured  in  BHI  Agar collected  from  kidney  of  sampled  fish  from  three farming locations (Jatiluhur, Sukabumi, and Sukamandi) Lokasi sampel Sampling sites Kultur bakteri organ ginjal pada BHIA Bacteria culture from kidney samples Koloni  tumbuh Growth colony Koloni terduga E. ictaluri Suspected colony of  E. ictaluri Jatiluhur 3 3 1 Sukabumi 6 5 3 Sukamandi 16 10 5 Total sampel 25 18 8
Tabel 2. Hasil uji karakteristik biokimia dengan API-20E pada isolat bakteri yang diisolasi dari ikan patin pada lokasi yang bebeda
Table 2.
The result of characterization of bacteria isolates using API-20E test on catfish isolated from differ- ent locations Jatiluhur PJh-01 PCr-01 PCr-02 PCr-05 PSkm-04 PSkm-07 PSkm-08 PSkm-11 Pewarnaan gram Gram staining Gram negatif Gram negative
Gram negatif
Gram negative
Gram negatif
Gram negative
Gram negatif Gram negative Gram negatif Gram negative Gram negatif Gram negative Gram negatif
Gram negative Gram negatif Gram negative Katalase + + + + + + + + Oksidase - - - - - - - - Motility + + + + + + + + TSIA Tumbuh lambat Slowly growth Tumbuh lambat Slowly growth Tumbuh lambat Slowly growth Tumbuh lambat Slowly growth Tumbuh lambat Slowly growth Tumbuh lambat Slowly growth Tumbuh lambat Slowly growth Tumbuh lambat Slowly growth O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Novobiocin + + + + + + + + TSA Tumbuh Grow Tumbuh Grow Tumbuh Grow Tumbuh Grow Tumbuh Grow Tumbuh Grow Tumbuh Grow Tumbuh Grow Warna koloni Colony color Transparan Transparent Transparan Transparent Transparan Transparent Transparan Transparent Transparan Transparent Transparan Transparent Transparan Transparent Transparan Transparent Motil 28°C Bergerak lambat Moving slowly Bergerak lambat Moving slowly Bergerak lambat Moving slowly Bergerak lambat Moving slowly Bergerak lambat Moving slowly Bergerak lambat Moving slowly Bergerak lambat Moving slowly Bergerak lambat Moving slowly Motil 37°C - - - - - - - - Indole - - - - - - - - H2S - - - - - - - - Malonate - - - - - - - - Arabinose - - - - - - - - Mannitol - - - - - - - - Sukroe - - - - - - - - Trehalose - - - - - - - - API 20E ONPG - - - - - - - - ADH - - - - - - - - LDC - - - - - - - - ODC - - - - - - - - CIT - - - - - - - - H2S - - - - - - - - URE - - - - - - - - TDA + + + + + + + + Indole - - - - - - - - VP + + + + + + + + Gel - - - - - - - - Gw + + + + + + + + Man - - - - - - - - IND - - - - - - - - SOR - - - - - - - - RHA + + + + + + + + SaC - - - - - - - - MCL + + + + + + + + AMY - - - - - - - - ARA + + + + + + + +
Sukamandi Sukabumi
Karakteristik
Characteristics
Keterangan (Note): + = tumbuh (grow); - = tidak tumbuh (not grow)
1  2  3   4  5 6  7   89M                  M 123 45  6  7  8
(A) (B) Marker 1 Kb (Fermentas Generuler) 1     2     3    4     5      6     7     8    9     M                                    M     1      2      3      4     5     6     7     8
Gambar 1. Amplifikasi DNA dengan polymerase chain reaction (PCR) pada delapan isolat bakteri yang terindikasi sebagai Edwardsiella (A) dan Edwardsiella ictaluri (B) yang diisolasi dari organ ginjal ikan patin (Pangasius sp.). M= marker 1 kb; 1= bakteri kode PJh-01; 2= PCr-01; 3= PCr-02; 4= PCr-05; 5= PSkm-04; 6= PSkm-07; 7= PSkm-
08; 8= PSkm-11; 9= kontrol negatif (A. hydrophila).
Figure 1. The DNA amplification with polymerase chain reaction (PCR) from eight isolates sus- pected  as  Edwardsiella  (A)  and  Edwardsiella  ictaluri  (B)  isolated  from  kidney  of catfish. M= marker; 1= bacteria PJh code 01; 2= PCr code 01; 3= PCr code 02; 4= PCr code 05; 5= PSkm code 04; 6= PSkmcode 07; 7= PSkm code 08; 8= PSkm code 11,  9=  negative  control  (A.  hydrophila).  (A)  PCR  primer-flank  16S  and  23  S-F,  (B)
PCR primer IVS and IRS.
Tabel 3. Hasil sekuensing isolat E. ictaluri dengan primer 16S-flank dan 23S-F
Table 3. The sequencing result of E. ictaluri by 16S-flank and 23S-F primer
Isolat Isolate Kemiripan Identity  (%) Gen bank Gene bank E. ictaluri kode PCr-01 (E. ictaluri code PCr-01 ) 97 E. ictaluri  93-146, complete genome E. ictaluri  kode PJh-01 (E. ictaluri code PJh-01 ) 99 E. ictaluri  93-146, complete genome E. ictaluri  kode PSkm-07 (E. ictaluri code PSkm-07 ) 99 E. ictaluri  93-146, complete genome E. ictaluri  kode PSkm-11 (E. ictaluri code PSkm-11 ) 99 E. ictaluri  93-146, complete genome
Gambar 2. Hubungan  filogenik  keempat  isolat  E.  ictaluri  ikan  patin  (Pangasius  sp.)  yang  berasal  dari Jatiluhur, Sukabumi, dan Sukamandi.
Figure 2. The  phylogenetic  neigbouring-joining  of  four  isolates  E.  ictaluri  of  catfish  (Pangasius  sp.)  from Jatiluhur,  Sukabumi,  and  Sukamandi.
E. ictaluri code PCr-01 E. ictaluri code PSkm-11
E. ictaluri code PJh-01
E. ictaluri code PSkm-07
Edwardsiella strain KC-Pc-1 16S ribosomal RNA gene partial sequence
CP001600.2 Edwardsiella ictaluri 93-146 complete genome
Gambar 3. Perbandingan  sekuen  antar keempat  sampel  E.  ictaluri  dan dengan  E.  ictaluri  gen  bank kode 93-146 (warna kuning: basa nukleotida sama; merah: basa nukleotida yang berbeda; biru: basa nukleotida yang hilang).
Figure 3. The sequences comparison between four E. ictaluri samples and with E. ictaluri gen bank code 93-146 (yellow: the same nucleotide base; red: the different nucleotide base; blue: the missing nucleotide base).
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
5          15         25         35         45         55 E. ictaluri code PCr01           GGAAATTCTG A-CGTC-GTC TTCGTCCAGG AGGCCGCCTT CGCCACCGGT ATTCCTCCAG E. Ictaluri code PJh01           GGAAATCCTG A-CGTA-GTC TTCGTCCAGG AGGCCGCCTT CGCCACCGGT ATTCCTCCAG E. ictaluri code PSkm07          GGAAATCCGG A-CGTA-GTC TTCGTC-AGG AGGCCGCCTT CGCCACCGGT ATTCCTCCAG E. ictaluri code PSkm11          GGAAATCCGG A-CGTA-GTC TTCGTCCAGG AGGCCGCCTT CGCCACCGGT ATTCCTCCAG Edwardsiella ictaluri 93-146     ------CCTG AGCGTCAGTC TTCGTCCAGG AGGCCGCCTT CGCCACCGGT ATTCCTCCAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
65         75         85         95        105        115
E. ictaluri code PCr01           ATCTCTACGC ATTTCACCGC TACACCTGGA ATTCTACCTC CCTCTACGAG ACTCTAGCTT E. ictaluri code PJh01           ATCTCTACGC ATTTCACCGC TACACCTGGA ATTCTACCTC CCTCTACGAG ACTCTAGCTT E. ictaluri code PSkm07          ATCTCTACGC ATTTCACCGC TACACCTGGA ATTCTACCTC CCTCTACGAG ACTCTAGCTT E. ictaluri code PSkm11          ATCTCTACGC ATTTCACCGC TACACCTGGA ATTCTACCTC CCTCTACGAG ACTCTAGCTT Edwardsiella ictaluri 93-146     ATCTCTACGC ATTTCACCGC TACACCTGGA ATTCTACCTC CCTCTACGAG ACTCTAGCTT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
125        135        145        155        165        175
E. ictaluri code PCr01           GCCAGTCTTG GATGCAGTTC CCAGGTTAAG CCCGGGGATT TCACATCCAA CTTAACAAAC E. ictaluri code PJh01           GCCAGTCTTG GATGCAGTTC CCAGGTTAAG CCCGGGGATT TCACATCCAA CTTAACAAAC E. ictaluri code PSkm07          GCCAGTCTTG GATGCAGTTC CCAGGTTAAG CCCGGGGATT TCACATCCAA CTTAACAAAC E. ictaluri code PSkm11          GCCAGTCTTG GATGCAGTTC CCAGGTTAAG CCCGGGGATT TCACATCCAA CTTAACAAAC Edwardsiella ictaluri 93-146     GCCAGTCTTG GATGCAGTTC CCAGGTTAAG CCCGGGGATT TCACATCCAA CTTAACAAAC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
185        195        205        215        225        235
E. ictaluri code PCr01           CGCCTGCGTG CGCTTTACGC CCAGTAATTC CGATTAACGC TTGCACCCTC CGTATTACCG E. ictaluri code PJh01           CGCCTGCGTG CGCTTTACGC CCAGTAATTC CGATTAACGC TTGCACCCTC CGTATTACCG E. ictaluri code PSkm07          CGCCTGCGTG CGCTTTACGC CCAGTAATTC CGATTAACGC TTGCACCCTC CGTATTACCG E. ictaluri code PSkm11          CGCCTGCGTG CGCTTTACGC CCAGTAATTC CGATTAACGC TTGCACCCTC CGTATTACCG Edwardsiella ictaluri 93-146     CGCCTGCGTG CGCTTTACGC CCAGTAATTC CGATTAACGC TTGCACCCTC CGTATTACCG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
245        255        265        275        285        295
E. ictaluri code PCr01           CGGCTGCTGG CACGGAGTTA GCCGGTGCTT CTTCTGTAGG TAACGTCAAT TGTGAACGCT E. ictaluri code PJh01           CGGCTGCTGG CACGGAGTTA GCCGGTGCTT CTTCTGTAGG TAACGTCAAT TGTGAACGCT E. ictaluri code PSkm07          CGGCTGCTGG CACGGAGTTA GCCGGTGCTT CTTCTGTAGG TAACGTCAAT TGTGAACGCT E. ictaluri code PSkm11          CGGCTGCTGG CACGGAGTTA GCCGGTGCTT CTTCTGTAGG TAACGTCAAT TGTGAACGCT Edwardsiella ictaluri 93-146     CGGCTGCTGG CACGGAGTTA GCCGGTGCTT CTTCTGTAGG TAACGTCAAT TGTGAACGCT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
305        315        325        335        345        355
E. ictaluri code PCr01           ATTAACGCTC ACACCTTCCT CCCTACTGAA AGTACTTTAC AACCCGAAGG CCTTCTTCAT E. ictaluri code PJh01           ATTAACGCTC ACACCTTCCT CCCTACTGAA AGTACTTTAC AACCCGAAGG CCTTCTTCAT E. ictaluri code PSkm07          ATTAACGCTC ACACCTTCCT CCCTACTGAA AGTACTTTAC AACCCGAAGG CCTTCTTCAT E. ictaluri code PSkm11          ATTAACGCTC ACACCTTCCT CCCTACTGAA AGTACTTTAC AACCCGAAGG CCTTCTTCAT Edwardsiella ictaluri 93-146     ATTAACGCTC ACACCTTCCT CCCTACTGAA AGTACTTTAC AACCCGAAGG CCTTCTTCAT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
365        375        385        395        405        415
E. ictaluri code PCr01           ACACGCGGCA TGGCTGCATC AGGCTTGCGC CCATTGTGCA ATATTCCCCA CTGCTGCCTC E. ictaluri code PJh01           ACACGCGGCA TGGCTGCATC AGGCTTGCGC CCATTGTGCA ATATTCCCCA CTGCTGCCTC E. ictaluri code PSkm07          ACACGCGGCA TGGCTGCATC AGGCTTGCGC CCATTGTGCA ATATTCCCCA CTGCTGCCTC E. ictaluri code PSkm11          ACACGCGGCA TGGCTGCATC AGGCTTGCGC CCATTGTGCA ATATTCCCCA CTGCTGCCTC Edwardsiella ictaluri 93-146     ACACGCGGCA TGGCTGCATC AGGCTTGCGC CCATTGTGCA ATATTCCCCA CTGCTGCCTC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
425        435        445        455        465        475
E. ictaluri code PCr01           CCGTAGGAGT CTGGACCGTG TCTCAGTTCC AGTGTGGCTG GTCATCCTCT CAGACCAGCT E. ictaluri code PJh01           CCGTAGGAGT CTGGACCGTG TCTCAGTTCC AGTGTGGCTG GTCATCCTCT CAGACCAGCT E. ictaluri code PSkm07          CCGTAGGAGT CTGGACCGTG TCTCAGTTCC AGTGTGGCTG GTCATCCTCT CAGACCAGCT E. ictaluri code PSkm11          CCGTAGGAGT CTGGACCGTG TCTCAGTTCC AGTGTGGCTG GTCATCCTCT CAGACCAGCT Edwardsiella ictaluri 93-146     CCGTAGGAGT CTGGACCGTG TCTCAGTTCC AGTGTGGCTG GTCATCCTCT CAGACCAGCT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
485        495        505        515        525        535
E. ictaluri code PCr01           AGGGATCGTC GCCTAGGTGA GCCATTACCC CACCTACTAG CTAATCCCAT CTGGGTTCAT E. ictaluri code PJh01           AGGGATCGTC GCCTAGGTGA GCCATTACCC CACCTACTAG CTAATCCCAT CTGGGTTCAT E. ictaluri code PSkm07          AGGGATCGTC GCCTAGGTGA GCCATTACCC CACCTACTAG CTAATCCCAT CTGGGTTCAT E. ictaluri code PSkm11          AGGGATCGTC GCCTAGGTGA GCCATTACCC CACCTACTAG CTAATCCCAT CTGGGTTCAT Edwardsiella ictaluri 93-146     AGGGATCGTC GCCTAGGTGA GCCATTACCC CACCTACTAG CTAATCCCAT CTGGGTTCAT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
545        555        565        575        585        595
E. ictaluri code PCr01           CTGATGGCAT GAGGCCCGAA GGTCCCCCAC TTTGGTCTTG CGACGTTATG CGGTATTAGC E. ictaluri code PJh01           CTGATGGCAT GAGGCCCGAA GGTCCCCCAC TTTGGTCTTG CGACGTTATG CGGTATTAGC E. ictaluri code PSkm07          CTGATGGCAT GAGGCCCGAA GGTCCCCCAC TTTGGTCTTG CGACGTTATG CGGTATTAGC E. ictaluri code PSkm11          CTGATGGCAT GAGGCCCGAA GGTCCCCCAC TTTGGTCTTG CGACGTTATG CGGTATTAGC Edwardsiella ictaluri 93-146     CTGATGGCAT GAGGCCCGAA GGTCCCCCAC TTTGGTCTTG CGACGTTATG CGGTATTAGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 605        615        625        635        645        655
E. ictaluri code PCr01           TACCGTTTCC AGTAGTTATC CCCCTCCATC AGGCAGATCC CCAGACATTA CTCACCCGTC E. ictaluri code PJh01           TACCGTTTCC AGTAGTTATC CCCCTCCATC AGGCAGATCC CCAGACATTA CTCACCCGTC E. ictaluri code PSkm07          TACCGTTTCC AGTAGTTATC CCCCTCCATC AGGCAGATCC CCAGACATTA CTCACCCGTC E. ictaluri code PSkm11          TACCGTTTCC AGTAGTTATC CCCCTCCATC AGGCAGATCC CCAGACATTA CTCACCCGTC Edwardsiella ictaluri 93-146     TACCGTTTCC AGTAGTTATC CCCCTCCATC AGGCAGATCC CCAGACATTA CTCACCCGTC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 665        675        685        695        705        715
E. ictaluri code PCr01           CGCCGCTCGT CAGCGGAGAA AGCAAGCTTT CTCCCTGCTA CCGCCCGACT TGCATGTGTT E. ictaluri code PJh01           CGCCGCTCGT CAGCGGAGAA AGCAAGCTTT CTCCCTGCTA CCGCCCGACT TGCATGTGTT E. ictaluri code PSkm07          CGCCGCTCGT CAGCGGAGAA AGCAAGCTTT CTCCCTGCTA CCGCCCGACT TGCATGTGTT E. ictaluri code PSkm11          CGCCGCTCGT CAGCGGAGAA AGCAAGCTTT CTCCCTGCTA CCGCCCGACT TGCATGTGTT Edwardsiella ictaluri 93-146     CGCCGCTCGT CAGCGGAGAA AGCAAGCTTT CTCCCTGCTA CCGCCCGACT TGCATGTGTT
namun berbeda dengan E. ictaluri gen bank kode 93- 146 complete genome. E. ictaluri PJh-01 menunjukkan perbedaan  dengan ketiga  isolat sampel  maupun   E. ictaluri gen bank kode 93-146 complete genome. E. ictaluri PSkm-07  menunjukkan  perbedaan  basa  nukleotida tunggal yang jauh berbeda dengan ketiga isolat sampel
yang ada maupun E. ictaluri gen bank kode 93-146 com- plete  genome.  Hasil  perbandingan  sekuen  basa menunjukkan bahwa keempat sampel isolat E. ictaluri memiliki polimorfisme nukleotida tunggal pada setiap isolat yang diuji. Ini adalah salah satu bentuk paling umum  dari  variasi  genetik.  Menurut  Clancy  (2008),
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 725        735        745        755        765        775 E. ictaluri code PCr01           AAGCCTGCCG CCAGCGTTCA ATCTGAGCCA TGATCAAACT CTTCAATTAA AAGCTTGATG E. ictaluri code PJh01           AAGCCTGCCG CCAGCGTTCA ATCTGAGCCA TGATCAAACT CTTCAATTAA AAGCTTGATG E. ictaluri code PSkm07          AAGCCTGCCG CCAGCGTTCA ATCTGAGCCA TGATCAAACT CTTCAATTAA AAGCTTGATG E. ictaluri code PSkm11          AAGCCTGCCG CCAGCGTTCA ATCTGAGCCA TGATCAAACT CTTCAATTAA AAGCTTGATG Edwardsiella ictaluri 93-146     AAGCCTGCCG CCAGCGTTCA ATCTGAGCCA TGATCAAACT CTTCAATTAA AAGCTTGATG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
785        795        805        815        825        835
E. ictaluri code PCr01           CTCAAAGAAA TTAAACTGTT TATTCGTAAT GAATTAACTG CTGTCACTCT TCAAGACTTT E. ictaluri code PJh01           CTCAAAGAAA TTAAACTGTT TATTCGTAAT GAATTAACTG CTGTCACTCT TCAAGACTTT E. ictaluri code PSkm07          CTCAAAGAAA TTAAACTGTT TATTCGTAAT GAATTAACTG CTGTCACTCT TCAAGACTTT E. ictaluri code PSkm11          CTCAAAGAAA TTAAACTGTT TATTCGTAAT GAATTAACTG CTGTCACTCT TCAAGACTTT Edwardsiella ictaluri 93-146     CTCAAAGAAA TTAAACTGTT TATTCGTAAT GAATTAACTG CTGTCACTCT TCAAGACTTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
845        855        865        875        885        895
E. ictaluri code PCr01           AAGTATTTTG GCATTCCAAG GAATGCTTGA TACGAATCTT GCGAGTGCCC ACACAGATTG E. ictaluri code PJh01           AAGTATTTTG GCATTCCAAG GAATGCTTGA TACGAATCTT GCGAGTGCCC ACACAGATTG E. ictaluri code PSkm07          AAGTATTTTG GCATTCCAAG GAATGCTTGA TACGAATCTT GCGAGTGCCC ACACAGATTG E. ictaluri code PSkm11          AAGTATTTTG GCATTCCAAG GAATGCTTGA TACGAATCTT GCGAGTGCCC ACACAGATTG Edwardsiella ictaluri 93-146     AAGTATTTTG GCATTCCAAG GAATGCTTGA TACGAATCTT GCGAGTGCCC ACACAGATTG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
905        915        925        935        945        955
E. ictaluri code PCr01           TCTGATAATT TGTTAAAGAG CAGTGACTTA GCAAGTTATC CTTACTAAGT CGAGGTGGCG E. ictaluri code PJh01           TCTGATATTT TGTTAAAGAG CAGTGACTTA GCAAGTTATC CTTACTAAGT CGAGGTGGCG E. ictaluri code PSkm07          TCTGATATTT TGTTAAAGAG CAGTGACTTA GCAAGTTATC CTTACTAAGT CGAGGTGGCG E. ictaluri code PSkm11          TCTGATATTT TGTTAAAGAG CAGTGACTTA GCAAGTTATC CTTACTAAGT CGAGGTGGCG Edwardsiella ictaluri 93-146     TCTGATATTT TGTTAAAGAG CAGTGACTTA GCAAGTTATC CTTACTAAGT CGAGGTGGCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
965        975        985        995        1005       1015
E. ictaluri code PCr01           TATATTACGC TTTCCTCAGT GAGTGTCAAC CGCTAATTTA GCAGTTTCAC CTCATTTCGA E. ictaluri code PJh01           TATACTACGC TTTCCTCAGT GAGTGTCAAC CGCTAATTTA GCAGTTTCAC CTCATTTCGA E. ictaluri code PSkm07          TATACTACGC TTTCCTCAGT GAGTGTCAAC CGCTAATTTA GCAGTTTCAC CTCATTTCGA E. ictaluri code PSkm11          TATACTACGC TTTCCTCAGT GAGTGTCAAC CGCTAATTTA GCAGTTTCAC CTCATTTCGA Edwardsiella ictaluri 93-146     TATACTACGC TTTCCTCAGT GAGTGTCAAC CGCTAATTTA GCAGTTTCAC CTCATTTCGA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1025       1035       1045       1055       1065       1075
E. ictaluri code PCr01           AAGATCACTA AAAAATGATC TTTGGAAATG GATGCCTGGC AGTTCCCTAC TCTCGCATGG E. ictaluri code PJh01           AAGATCACTA AAAAATGATC TTTGGAAATG GATGCCTGGC AGTTCCCTAC TCTCGCATGG E. ictaluri code PSkm07          AAGATCACTA AAAAATGATC TTTGGAAATG GATGCCTGGC AGTTCCCTAC TCTCGCATGG E. ictaluri code PSkm11          AAGATCACTA AAAAATGATC TTTGGAAATG GATGCCTGGC AGTTCCCTAC TCTCGCATGG Edwardsiella ictaluri 93-146     AAGATCACTA AAAAATGATC TTTGGAAATG GATGCCTGGC AGTTCCCTAC TCTCGCATGG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1085       1095       1105       1115       1125       1135
E. ictaluri code PCr01           GGGAGACCCC ACACTACCAT CGGCGCTACG GCGTTTCACT TCTGAATTCG GCATGGGGTC E. ictaluri code PJh01           GGAGA-CCCC ACACTACCAT CGGGGCTACG GCGTTTCACT TCTGAGTTCG GCATGGGGTC E. ictaluri code PSkm07          GGAGAACCCC AAACTACCAT CGGGGCTACG GGGTTTCACT TCTGAATTCG GCATGGGGTC E. ictaluri code PSkm11          GGAGAACCCC AAACTACCAT CGGGGCTACG GGGTTTCACT TCTGAATTCG GCATGGGGTC Edwardsiella ictaluri 93-146     GG-AGACCCC ACACTACCAT CGGCGCTACG GCGTTTCACT TCTGAGTTCG GCATGGGGTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1145       1155       1165       1175       1185       1195
E. ictaluri code PCr01           AGGTGGGACC ACCGCGCTAT CCCCCCCCAG GCAAATTCTG TTTTACCAAC CGCCATCAAG E. ictaluri code PJh01           AGGTGGGAAC ACCGGGCTAT CGCCGCC-AG GCAAATTCTG TTTTACCAAC CGCCATCAAG E. ictaluri code PSkm07          AGGTGGGACC ACCCG-CTAT CGCCGCC-AG GCAA-TTCTG TTT-ACCAAC CGCCATCAAG E. ictaluri code PSkm11          AGGTGGGACC ACCGCGCTAT CGCCGCC-AG GCAAATTCTG TTTTACCAAC CGCCATCAAG Edwardsiella ictaluri 93-146     AGGTGGGACC ACCGCGCTAT CGCCGCC-AG GCAAATTCTG TTTTACCAAC CGCCATCAAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
1205       1215       1225       1235       1245       1255
E. ictaluri code PCr01           GCCATCGGTT CCAATCTTGA ACAAGCTTAA TTC-GGCTTC TTAAAAACCC TTCCGGGGTT E. ictaluri code PJh01           GCCATCGGTT CCAATCTTGA ACAAGCTTAA TTCCGTTCCT CTAAAAACCC TTCGGGGG-T E. ictaluri code PSkm07          GCCATCGGTT CCAATCTTGA AAAAGCTTAA TTC-GTCCTC CTAAAAACCC TTCCGGGG-T E. ictaluri code PSkm11          GCCATCGGTT CCAATCTTGA AAAAGCTTAA TTC-CGCCCT CTAAAAACCC TTCC-GGGTG Edwardsiella ictaluri 93-146     GCCATCGGTT CCAATCTTGA ACAAGCTTAA TTC-GTCTCT CTAAAACACC TTC--GGTGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1265       1275       1285       1295       1305       1315
E. ictaluri code PCr01           TGAAGGGTAA ACCCTTCCGG AACATTAAGA AC-GGGTTAG GCAAAAGGTA CCGTACCCTT E. ictaluri code PJh01           TGAAGGGTAA ACCCTCC-GG AAC-CTATGA AC-GGGTTAG GCCACCGATT CC-TTCCCTT E. ictaluri code PSkm07          TGAAAGGTAA ACCCTCCCGA AAC-TTAAAA CC-GGGTTAG CCCACCGTTC CC-TCCCCTT E. ictaluri code PSkm11          TGAAGGGTAA ACCCTCCCGG AACCTTAAGA ACCGGGTTAG CTCAACGAT- CCGTTCCCTT Edwardsiella ictaluri 93-146     TGTAAGGTTA AGCCTCTCGG A--------- ---------- ---------- ---------- ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....| 1325       1335       1345       1355       1365 E. ictaluri code PCr01           AACCCCGGCC TTCCTTTAAA CGCTCAACCG GGGCTTTTAT ATGCG E. ictaluri code PJh01           AACCCCGCCC CTCC-TTAAA CGCT-A-CATTTCATTTTTT TTTT- E. ictaluri code PSkm07          AACCCCGCTA CT---TTAAA CGTC-AATAG ATTATTTTAT TT--- E. ictaluri code PSkm11          AACCCCCCCC TCTTTCTTAA CGTTAAAAAA GGGCCCG--- ----- Edwardsiella ictaluri 93-146     ---------- ---------- ---------- ---------- -----

## Gambar 3. Lanjutan
Figure 3. Continued
polimorfisme  biasanya  terjadi  akibat  subtitusi nukleotida tunggal atau disebut juga single nucleotide polymorphism (SNP) yang merupakan variasi sekuens DNA yang terjadi ketika ada nukletioda tunggal atau satu nukleotida A, T, C, atau G di dalam genom yang berbeda dengan suatu spesies biologis. Polimorfisme nukleotida  tunggal  menyebabkan  variasi  strain  dari spesies yang sama. Variasi strain terjadi karena bakteri sangat mudah sekali mengalami mutasi.
Uji patogenitas keempat isolat E. ictaluri dilakukan menggunakan rancangan acak kelompok (RAK). Pola kematian akibat infeksi dari keempat isolat tersebut berbeda  tergantung  dosis  yang  diberikan,  semakin tinggi dosisnya, kematian yang terjadi lebih cepat dan gejala klinis juga lebih terlihat cepat. Pada kelompok kontrol  tidak  diperoleh  kematian  ikan  uji.  Ikan  uji kelompok  perlakuan  dengan  jumlah  sel  bakteri  10 9 cfu  menunjukkan  kematian  akibat  infeksi  E.  ictaluri mulai  hari  keempat  pascainfeksi.  Gejala  klinis  yang terlihat  adalah  pembengkakan  pada  daerah  bekas suntikan, luka pada pangkal sirip dan luka pada bagian kepala. Kematian tertinggi sebesar 100% terjadi pada perlakuan ikan patin uji yang diinfeksi dengan isolat E.  ictaluri  PJh-01  dengan  jumlah  sel  bakteri  sebesar 10 9 cfu pada hari ke-12. Infeksi E. ictaluri PJh-01 dengan
Gambar 4. Kematian  komulatif  harian  dari  berbagai  perlakuan  ikan  patin  yang  diinjeksi  dengan isolat E. ictaluri yang  berbeda dengan jumlah  sel bakteri  yang berbeda (A  = 10 9 cfu; B= 10 7 cfu; C= 10 5 cfu; D= 10 3 cfu).
Figure 4. Daily cumulative mortality of catfish after infection with different E. ictaluri isolates in differ- ent number of cells bacteria (A= 10 9 cfu; B= 10 7 cfu; C= 10 5 cfu; D= 10 3 cfu).
jumlah  sel  bakteri  sebesar  10 7 cfu  menyebabkan kematian 50% pada hari ke-10 pascainfeksi. Isolat E. ictaluri  PJh-01  merupakan  isolat  yang  memiliki  nilai patogenitas tinggi dibanding ketiga isolat lainnya. Pada isolat Kematian masing-masing perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.
Berdasarkan  nilai  rataan  persen  mortalitas kumulatif  yang  diperoleh  selama  proses  uji patogenisitas.  Formulasi  matematis  dari  masing- masing isolat bakteri selengkapnya disajikan pada Tabel 5.  Pemilihan  kandidat  isolat  bakteri  E.  ictaluri  yang digunakan  untuk  preparasi  vaksin  didasarkan  pada pendekatan patogenisitas, oleh karena itu, isolat kode PJh-01  digunakan  sebagai  sumber  antigen  dalam pembuatan vaksin anti E. ictaluri pada tahap selanjutnya karena memiliki derajat patogenisitas lebih tinggi dari ketiga isolat lainnya.

## KESIMPULAN
Hasil  identifikasi  dan karakterisasi  isolat  bakteri yang  diisolasi  dari  ikan  patin  (Pangasius  sp.) berdasarkan  uji  biokimia  dan  molekuler  diperoleh sebanyak  delapan  isolat  dengan  nama  species Edwardseilla ictaluri. Isolat bakteri E. ictaluri kode PJh- 01 asal  Jatiluhur memiliki  tingkat patogenitas  lebih
0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 K em at ian k o m u lat if h ar ian D au ly c om m ul at iv e m or ta lit y (% ) Hari (Days) A. PJh-01
B. PJh-01 C. PJh-01 D. PJh-01 A. PCr-01 B. PCr-01 C. PCr-01 D. PCr-01 A. PSkm-07 B. PSkm-07 C. PSkm-07 D. PSkm-07 A. PSkm-11 B. PSkm-11 C. PSkm-11 D. PSkm-11
tinggi dari isolat lain yang diuji dengan nilai LD 50 yaitu sebesar 3,23 x 10 7 cfu/mL.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini telah terlaksana dengan sumber dana dari DIPA BPPBAT TA 2016 Kementerian Kelautan dan Perikanan. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Setiadi, Edy Farid Wadjdy, Ahmad Wahyudi, dan Johan  Afandi  yang  telah  membantu  secara  teknis kegiatan penelitian ini.

## DAFTAR  ACUAN
Amanu,  S.  (2007).  Komunikasi  pribadi.  Bagian Mikrobiologi  Fakultas  Kedokteran  Hewan  UGM. Yogyakarta. [2-07-2007, Yogyakarta].
Austin, B. & Austin, D.A. (1987). Bacterial fish patho- gens : Disease in farmed and wils fish. England: John Willy and Sons Ltd.
Clancy, S. (2008). Genetic mutation. Nature Education, 1(1).
Crumlish, M., Dung, T.T., Turnbull, J.F., Ngoc, N.T.N., &  Ferguson,  H.W.  (2002).  Identification  of Edwardsiella ictalurifrom diseased freshwater cat- fish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. J. of Fish Disease, 25, 733-736.
Hawke,  J.P.,  McWhorter,  A.C.,  Steigerwait,  A.G.,  & Brenner, D.J. (1981). Edwardsiella ictaluri, the caus- ative agent of enteric septicaemia of catfish. Int. J. Syst. Bacteriol., 31, 396-400.
Hawke,  J.P.,  Kent,  M.,  Rogge,  M.,  Baumgartner,  W., Wiles, J., Shelley, J., Sarolainen, L.C., Wagner, R., Murray, K., & Peterson, F.S. (2013). Edwardsiellosis cause by Edwardsiella ictaluri in laboratory popula- tions of zebrafish Danio rerio. J. Aquat. Anim. Health, 25(3), 171-183.
Inglis, V., Roberts, R.J., & Bromage, N.R. (1993). Bac- terial disease of fish. Institute of Agriculture. Ox- ford, London: Blackwell Scientific Publication, p. 61-79.
Holt,  J.G.,  Krieg,  N.R.,  Sneath,  P.H.A.,  Staley,  J.T.,  & Williams,  S.T.  (1994).  Bergey’s  manual  of  deter- minative  bacteriology.  Ninth  Edition.  Baltimore: Williams & Wilkins, p. 175-289.
Keskin,  O.,  Secer,  S.,  Izgur,  M.,  Turkyilmaz,  S.,  & Mkakosya, R.S. (2004). Edwardsiella ictaluri Infec- tion in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Turk. Journal Veterinary Animal Science, 28, 649-653.
Panangala, V.S., Van Santen, V.L., Shoemaker, C.A., & Klesius, P.H. (2005). Analysis of 16S-23S intergenic spacer  regions  of  the  rRNA  operons  in Edwardsiella ictaluri and Edwardsiella tarda isolates from  fish.  Journal  of  Applied  Microbiology,  99, 657-669.
Panigoro, N., Bahnan, M., Kholidin, E.B., & Yuasa, K. (2005). Pathogenecity of Edwardsiella ictaluri. http:/ / w w w . w a s . o r g / m e e t i n g s / - sessionAbstract.asp?MeetingCode=  WA2005  & Session =55– 24k [11-08-2006].
Pasnik, D.J., Evans, J.J., & Klesius, P.H. (2007). Experi- mental Edwardsiella ictaluri infection causes mor- tality in white perch  Morone Americana. Journal of Animal and Veterinary Advances, 6, 646-649.
Plumb, J.A. (1999). Health maintenance and principle microbial diseases of cultured fishes. Iowa State University Press. Ames, Iowa, 344 pp.
Popovic,  N.T.,  Rakovac,  R.C.,  &  Perovic,  I.S.(2009). Commersial  phenotypic  tests  (API  20E)  in  diag- nosis of fish bacteria: A review. Journal of Veterinarni Medicina, 52(2), 49-53.
Sakai,  T.,  Kamaishi,  T.,  Sano,  M.,  Tensha,  K.,  Arima, T., Iida, Y., Nagai, T., Nakai,  T., & Lida, T. (2008).
Tabel 4. Formulasi  analisis  regresi  linier  sederhana  dengan  program  SPSS
versi 11.0 dan nilai LD 50 dari empat isolat bakteri E. ictaluri Table 4.
The formulations of simple linear regression analysis with SPSS version 11.0 and LD 50 value from four E. ictaluri isolates Jenis bakteri Type of bacteria Kode isolat Code of isolates Formula nilai LD 50 Value formula LD 50 Nilai LD 50 Value LD 50 E. Ictaluri PJh-01 Y = 21.7 + 5.33x 3.23 x 10 7 cfu E. Ictaluri PCr-01 Y = 8.3 + 10.3x 0.53 x 10 7 cfu E. Ictaluri PSkm-07 Y = 3.33 + 10.3x 3.04 x 10 7 cfu E. Ictaluri PSkm-11 Y = 35.0 + 9.0x 2.30 x 10 7 cfu

## Outbreaks of Edwardsiella ictaluri infection in ayu
Plecoglossus altivelis in Japanese Rivers. Fish Pathol- ogy, 43, 152-157.
Soto, E., Griffin, M., Arauz, M., Riofrio, A., Martinez,
A.,  &  Cabrejos,  M.E.  (2012).  Edwardsiella  ictaluri as the causative agent of mortality in cultured nile tilapia. Journal of Aquatic Animal Health, 24, 81-90. Suanyuk, N., Rogge, M., Thune, R., Watthanaphiromsakul,  M.,  Champhat,  N.,  & Wiangkum, W. (2014). Mortality and pathology of hybrid  catfsh,  Clarias  macrocephalus  (Günther)  x Clarias  gariepinus  (Burchell),  associated  with Edwardsiella ictaluri infection in southern Thailand. Journal of Fish Diseases, 37, 385-395.
Taukhid & Purwaningsih, U. (2011). Penapisan isolat bakteri Streptococcus  spp.  sebagai  kandidat  anti- gen  dalam  pembuatan  vaksin,  serta  efikasinya untuk pencegahan penyakit streptococcosis pada ikan  nila,  Oreochromis  niloticus.  Jurnal  Riset Akuakultur, 6(1), 103-118.
Wagner, B. A., Wise, D.J., Khoo, L. H., & Terhune, J.S. (2002). The Epidemiology of Bacterial Diseases in Food- Size  Channel  Catfish.  Journal  of  Aquatic  Animal Health,  14(4),  263-272. doi:10.1577/1548- 8667(2002)014<0263:teobdi>2.0.co;2.
Waltman, W.D., Shotts, E.B., & Hsu, T.C. (1986). Bio- chemical  characteristics  of  Edwardsiella  ictaluri.
Applied  and  Environmental  Microbiology,  51(1), 101-104.
Wang, Q., Yang, M., Xiao, J., Wu, H., Wang, X., Lv, Y., Xu, L.,  Zheng, H.,  Wang, S., Zhao,  G., Liu,  Q., & Zhang, Y. (2009). Genome sequence of the versa- tile fish pathogen Edwardsiella tarda provides in- sights  into  its  adaptation  to  board  host  ranges and intracellular niches. www.plosone.org. Volume 4/issue10/e7646.
Williams, M.L. & Lawrence, M.L. (2010). Verification of an Edwardsiella ictaluri specific diagnostic PCR. Journal Applied Microbiology, 50, 153-157.
Williams, M.L., Gillaspy, A.F., Dyer, D.W., Thune, R.L., Waldbieser,  G.L.,  Schuster,  G.C.,  Gibson,  J., Zaitshik, J., Landry, C., Banes, M.M., & Lawrence M.L.  (2012).  Genome  sequence  of  Edwardsiella ictaluri 93-146, a strain associated with a natural channel catfish outbreak of enteric septicemia of catfish. Journal of Bacteriol., 193(3), 740-741.
World Organization for Animal Health. (2006a). Manual of  diagnostic  tests  for  aquatic  animals:  Enteric septicaemia of  catfish (Edwardsiella ictaluri).  OIE, p. 214-220.
Ye,  S.,  Qiao,  H.L.G.,  &  Li,  Z.  (2009).  First  case  of Edwardsiella  ictaluri  infection  in  China  Farmed- yellow  catfish  Pelteobagrus  fulvidraco.  Journal  of Aqua-culture, 292,