Deteksi gen major histocompatibility complex class II pada yuwana gurami sowang, Osphronemus goramy Lacepede, 1801 asal satu pemijahan
[Detection of major histocompatibility complex class II gene on sowang giant gourami ( Osphronemus goramy Lacepede, 1801) fingerling from one spawning]
Kusbiyanto 1  , Agus Nuryanto 1* , Petrus Hary Tjahja Soedibja 2
1 Fakutas Biologi Universitas Jenderal Soedirman
2 Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Jenderal Soedirman
Jalan Dr. Suparno No. 63 Purwokerto 53122 Tel:  +62 (0) 281 638794 Fax: +62 (0) 281 631700
Diterima: 12 Januari 2016; Disetujui: 19 Juli 2016

## Abstrak
Petani ikan percaya bahwa ikan  gurami ras sowang memiliki laju pertumbuhan  yang tinggi. Namun budi daya ras  tersebut  terkendala  oleh  kematian  yuwana  yang  tinggi  akibat  rendahnya  resistensi  terhadap  infeksi Aeromonas hydrophila . Resistensi merupakan sifat  yang diwariskan oleh induk ke anakan. Induk  resisten dapat diperoleh melalui seleksi menggunakan penciri molekuler terkait dengan sifat resisten, seperti Major Histocompatibility Complex kelas II (MHC II). Sebagai langkah awal, perlu dilakukan deteksi keberadaan gen MHC II pada yuwana gurami sowang. Tujuan penelitian ini adalah 1) mendeteksi keberadaan gen MHC II pada yuwana gurami sowang  dan 2) menganalisis tingkat resistensi yuwana ikan gurami sowang yang berasal dari satu pemijahan. Sebanyak 100 ekor ikan diinfeksi mengguna- kan  0,1  ml  bakteri Aeromonas hydrophila dengan  kepadatan  koloni  10 8 CFU.  DNA  diisolasi  menggunakan  Thermo- scienstific  DNA  easy  kit  dan  gen  MHC  II  dimplifikasi  menggunakan  dua  pasang  primer  dari  ikan stickleback .  Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif. Keberadaan gen MHC II ditentukan berdasarkan kemunculan pita DNA pa- da gel agarosa, sedangkan tingkat resistensi ditentukan berdasarkan jumlah ikan yang mati dan hidup pascainfeksi. Am- plifikasi gen MHC II dari individu yang mati menghasilkan fragmen DNA sepanjang 400 bp. Namun, amplifikasi gen MHC II dari individu yang tetap hidup pascainfeksi menghasilkan fragmen DNA sepanjang sekitar  400 pb dan 585 bp. Fragmen gen MHC II berukuran sekitar 585 bp merupakan marka molekuler spesifik untuk gurami sowang tahan infek- si A.  hydrophila .    Sebanyak  71%  ikan  mati  dan  29%  hidup  setelah  14 hari  pascainfeksi.  Hasil  tersebut  membuktikan bahwa yuwana gurami sowang memiliki resistensi berbeda terhadap Aeromonas hydrophila .
Kata penting: Aeromonas hydrophila , gurami sowang, MHC II, resistensi

## Abstract
The fish farmer belief that strain sowang of giant gourami has the high growth rate. Nevertheless, the culture of  this  strain  was  constrained  by  high  mortality  due  to  low  resistance  to Aeromonas  hydrophila infection. Resistance  is  a  genetically  inherited  character  from  their  parents.  Resistant  br ood  stock  can  be  obtained through selection using molecular marker that is associated with resistance, such as major histocompatibility complex class II (MHC II) gene. At first step, detection of MHC II gene on sowang strain needs to be done. The aims of this study were 1) to detect the presence of the MHC II gene on sowang strain and 2) to analyze the  resistance  level  of  sowang  strain  from  one  spawning.  A  total  of  100  individuals  of  sowang  strain fingerling  was  infected  with  0.1  ml  10 8 CFU  of A.  hydrophila .  Genomic  DNA  was  isolated  using  the thermoscienstific  DNA  easy  kit  and  the  fragmen  of  MHC  II  gene  was  amplified  using  two  different  primer  pairs  of stickleback fish. The presence of the MHC II gene was defined based on DNA band appearance on agarose gel,  while resistance  level  was  analyzed  descriptively  based  on  the  total  number  of  death  and  live  individuals  after  infection. Amplification of the MHC II gene using the second primer pair from death individuals results in approximately of 400 bp  fragment.    However,  MHC  II  gene  amplification  from  living  individuals  resulted  of  approximately  of  400  bp  and 585 bp length of DNA fragments. The 585 bp fragment of the MHC II gene is a specific molecular marker for sowang giant  gourami  strain  which  is  resitant  to A.  hydrophila infection.  A  total  of  71%  fingerling  was  death  and  29%  of fingerling was survived. This proved that the fingerling from one spawning have different resistance characteristic.
Keywords : Aeromonas hydrophila , MHC II, resistance, sowang gourami
_____________________________  Penulis korespondensi Alamat surel: anuryanto2003@yahoo.com

## Pendahuluan
Ikan gurami ( Osprhronemus goramy Lac.) merupakan  ikan  air  tawar  yang  telah  banyak  di- budidayakan  oleh  petani  ikan.  Beberapa  sentra produksi gurami juga telah dibentuk baik di Jawa maupun di Sumatera (Tanjung et al . 2011).  Pro- duksi  ikan  gurami  nasional  mengalami  pening- katan  sebesar  19,86  %  per  tahun  sejak  tahun 2009 sampai dengan 2013. Tahun 2009, produksi gurami  mencapai  46.254  ton  dan  meningkat menjadi 94.605 ton pada tahun 2013. Kabupaten Banyumas  merupakan  salah  satu  pusat  produksi gurami  dengan  produksi  pada  tahun  2012  men- capai 3.057 ton atau  sekitar 20 % dari total pro- duksi  gurami  di  Provinsi  Jawa  Tengah  (Kemen- terian Kelautan & Perikanan  2014). Hal tersebut membuktikan bahwa budi daya ikan gurami  me- rupakan  usaha  yang  memiliki prospek tinggi  un- tuk dikembangkan. Hal  tersebut dikarenakan da- gingnya lezat, dan harga jual cukup tinggi dan re- latif  stabil.  Selain  itu,  biaya  pemeliharaan  ikan gurami relatif rendah dan ikan ini memiliki daya adaptasi  yang  tinggi  pada  lingkungan  dengan kandungan oksigen terlarut rendah (Setijaningsih et al . 2007).
Beberapa ras ikan gurami yang telah dibu- didayakan di Indonesia meliputi gurami  sowang, gurami  jepang,  gurami  paris,  gurami  bastar,  dan gurami  porselen  (Setijaningsih et  al .  2007).  Me- nurut  Nugroho et  al. (1993),  setiap  ras  gurami memiliki  potensi  pertumbuhan  berbeda.  Petani ikan percaya bahwa ras gurami sowang memiliki lajur pertumbuhan lebih tinggi daripada ras gura- mi lainnya.
Namun, sampai saat ini masih ada kenda- la  yang  menjadi  hambatan  dalam  peningkatan produksi  yaitu  tingginya  kematian  ikan  gurami sowang  akibat  serangan  berbagai  penyakit.  Me- nurut  Yu et  al .  (2004),  penyakit  yang  sering  di- temukan  dalam  budi  daya  ikan  air  tawar  dan
menjadi  penyebab  utama  kegagalan  budi  daya ikan  adalah  penyakit Motile  Aeromonad  Septi- cemia (MAS)  yang  disebabkan  serangan  bakteri Aeromonas hydrophila .  Dampak  serangan  bak- teri  terhadap  ikan  gurami  telah  dilaporkan  oleh Purwaningsih et  al .  (2014).  Pada  penelitian  ter- sebut  dilaporkan  bahwa  serangan A.  hydrophila dan Mycobacterium fortuitum telah menjadi ken- dala  dalam  produksi  gurami.  Infeksi  kedua  jenis bakteri  tersebut  dapat  menyebabkan  terjadinya penurunan  kualitas  produk  ikan  gurami (Purwa- ningsih et  al .  2014) . Lebih  lanjut  Tanjung et  al .
(2011) menyatakan bahwa setiap ras ikan gurami memiliki sifat resistensi berbeda terhadap serang- an bakteri A. hydrophila .
Oleh  karena  itu,  perlu  dilakukan  berbagai upaya  untuk  mendapatkan  yuwana  unggul  yang memiliki  resistensi  tinggi  terhadap  penyakit.  Sa- lah satu upaya awal yang dapat dilakukan adalah melalui  penelitian  seperti  deteksi  marka  mole- kuler  yang  terkait  dengan  sifat  ketahanan  (resis- tensi)  terhadap  penyakit  sebagai  dasar  pengem- bangan  seleksi  yuwana  tahan  penyakit  secara molekuler.
Salah  satu  penanda  molekuler  yang  dapat digunakan  adalah  penanda  DNA,  khususnya yang terkait dengan sifat ketahanan  terhadap pe- nyakit seperti gen major histocompatibility com- plex (MHC).  Keuntungan  dari  pemanfaatan  gen tersebut  dalam  studi  keragaman  genetik  adalah ekspresinya  terkait  langsung  dengan  sifat  pro- duksi  seperti  resistensi  terhadap  penyakit  (Kurtz et  al .  2004).  Gen  MHC    dibedakan  menjadi  dua kelompok  yaitu  MHC  I  dan  MHC  II  (Bingulac- Popovic et al . 1997). MHC kelas II memiliki lo- kus  A  dan  B  (Sultmann et  al .  1994).  Beberapa penelitian  terdahulu  telah  membuktikan  kebera- daan  gen  MHC  yang  berbeda  pada  beberapa spesies  ikan  teleostei  (Bingulac-Popovic et  al . 1997).
Variasi pada gen MHC IIB berkorelasi po- sitif dengan tingkat resistensi pada beberapa spe- sies  ikan  (Kurtz et  al .  2004  2006, Wegner et  al .
2006,  Consuegra  &  Leaniz  2008).  Penelitian  la- innya juga  telah  membuktikan adanya hubungan yang erat antara variasi  gen major histocompati-
bility complex (MHC)  dan sifat resistensi  seperti pada  ikan  Atlantic  salmon Salmo  salar (Landry
& Bernatchez 2001), sockeye salmon Oncorhyn- chus  nelka (Miller et  al .  2001),  dan  pada  ikan mas Cyprinus carpio (Rakus et al. 2009). Semen- tara  itu,  Azis et  al. (2015)  telah  memperoleh fragmen gen MHC I dengan panjang 300 bp, 500 bp,  dan  1000  bp  dari  ikan  lele Clarias sp.  yang masih  hidup setelah  uji  tantang dengan A.hydro- phila sehingga  ketiga  fragmen tersebut dapat di- jadikan  marka  molekuler  bagi  ikan  lele  tahan A. hydrophila .  Namun  keberadaan  gen  MHC  kelas II  pada  ikan  gurami  sowang  belum  pernah  dila- porkan. Oleh karena itu perlu dilakukan peneliti- an untuk melacak keberadaan gen pengkode pro- tein Major  Histo-compatibility  complex ,  khusus- nya gen Major Histocompatibility complex kelas II sehingga dapat digunakan sebagai dasar dalam pengembangan  metode  seleksi  molekuler  yuwa- na gurami tahan Aeromonas .
Tujuan penelitian ini adalah 1) untuk men- deteksi  keberadaan  gen  MHC  II  pada  yuwana gurami  sowang  dan  2)  menganalisis  perbedaan resistensi  di  antara  yuwana  ikan  gurami  sowang yang berasal dari satu pemijahan.

## Bahan dan metode
Penelitian  dilaksanakan  menggunakan metode  survei  eksplorasi  mulai  bulan  Maret sampai  November  2015.  Pengambilan  sampel gurami  sowang  dilakukan  secara purposive sampling yaitu  dari  Balai  Benih  Ikan  Sukamaju Kabupaten  Ciamis.  Ikan  gurami  sowang  yang digunakan  adalah  yuwana  berukuran  8  –  10  cm
yang berasal dari satu pemijahan. Ikan dipelihara di kolam Stasiun Percobaan Program DIII Biolo- gi  Fakultas  Biologi  Universitas  Jenderal  Soedir- man  (Unsoed).  Analisis  molekuler  dilakukan  di Laboratorium  Taksonomi  Hewan  Fakultas  Bio- logi Unsoed.
Pada hari ke 40 masa aklimatisasi yuwana ikan  gurami  sowang  diinfeksi  menggunakan  0,1 ml kultur cair bakteri A. hydrophila dengan kepa- datan  sel  10 8 CFU  (Mulia  2007,  Latifah et  al .
2014). Yuwana hasil infeksi dipelihara dalam ko- lam  uji  tantang.  Pengamatan  individu  yang  mati dilakukan setiap hari selama periode 14 hari. Jika ditemukan  ikan  yang  mati  maka  dilakukan  sam- pling jaring sirip ekor. Sementara itu, pada kolam kontrol  dipelihara  50  ekor  yuwana  ikan  gurami dari sumber yang sama tanpa diinfeksi bakteri A. hydrophila .  Pemeliharaan  ikan  pada  kolam  kon- trol  dilakukan  untuk  memastikan  bahwa  kemati- an ikan pada kolam uji tantang terjadi karena in- feksi  bakteri A.  hydrophila dan  bukan  karena faktor  lain.  Kedua  kolam  tersebut  terletak  ber- dampingan  namun  memiliki  sistem  saluran  air paralel  sehingga  tidak  saling  terhubung.  Sam- pling  jaringan  tubuh  ikan  yang  hidup  dilakukan 30  hari  setelah  infeksi.  Hal  ini  dilakukan  agar ikan  sudah  pulih  dari  luka  setelah  diinfeksi A. hydrophila . Jumlah ikan yang tetap hidup dicatat.
DNA genom diisolasi menggunakan DNA isolation  kit berdasarkan  protokol  dari  pabrik.
Penanda genetik  yang digunakan dalam peneliti- an  ini  adalah  gen Major  histocompatibility  com- plex kelas  II.  Fragmen  ekson  2  gen  tersebut  di- amplifikasi  menggunakan  dua  pasang  primer, yakni  forward:  5’-AAC  TCC  ACT  GAG  CTG AAG  GAC  AT-3’  dan  reverse  primer  5’-CAG TGA AGC CGA CAW ACT TCC-3’, sedangkan pasangan primer kedua terdiri atas forwards:  5’- ATGGAAGATGAAATCGCCGC-3’’ dan rever- se: 5’-TGCCAGATCTTCTCCATGTCG-3’
(Wegner et  al .  2006).  Reaksi  PCR  dilakukan dengan  volume  total  25  µl.  Campuran  untuk  re- aksi  PCR  meliputi  air  ultrapure  (ddH 2 O)  seba- nyak  18,5  µl;  10X  PCR  buffer  2,5  µl;  volume masing-masing  primer  sebanyak  0,2  mM,  0,2 mM  untuk  masing  dNTP,  1  U  Taq  polymerase, dan 01 µl DNA template. Rejim suhu ditentukan dengan fase awal predenaturasi 95°C selama dua menit  diikuti  dengan  35  siklus  sebagai  berikut. Denaturasi  pada  suhu  95°C  selama  30  detik, annealing  pada  suhu  41°C  selama  45  detik  dan pemanjangan  rantai  pada  suhu  72 o C  selama  satu menit serta diikuti proses pemanjangan akhir pa- da suhu 72 o C selama 5 menit. Produk PCR divi- sualisasikan pada gel agarose 1.2%.
Penentuan  yuwana ikan  yang  resisten ter- hadap  serangan A.  hydrophila dilakukan  dengan jumlah  ikan  yang  masih  tetap  hidup  setelah  in- feksi Aeromonas .  Penentuan  ada  tidaknya  gen major  histocompatibility  complex kelas  II  diten- tukan  secara  deskriptif  berdasarkan  kemunculan pita DNA pada gel elektroforesis hasil amplifika- si DNA menggunakan primer spesifik.

## Hasil
Deteksi  gen  major  histocompatibility  complex (MHC) II
Amplifikasi  gen  MHC  menggunakan  pa- sangan  primer  pertama  seperti  tersebut  pada  pa- ragraf tiga bab bahan dan metode, yakni forward: 5’-AAC TCC  ACT GAG  CTG  AAG  GAC  AT- 3’ dan reverse  primer 5’-CAG  TGA AGC CGA CAW  ACT  TCC-3’  tidak  menghasilkan  ampli- kon  atau  produk  amplifikasi.  Hasil  serupa  tetap muncul meskipun telah dilakukan berbagai modi- fikasi  kondisi  suhu  dan  waktu  penempelan  pri- mer ( annealing ) serta konsentrasi masing-masing reagen (Gambar 1).
Amplifikasi  gen  MHC  II  menggunakan pasangan  primer  ke  dua  menghasilkan  fragmen DNA dengan ukuran panjang sekitar 400 bp dari sampel  ikan  yang  mati  pascainfeksi  bakteri A. hydrophila (Gambar  2).  Sementara  itu,  amplifi- kasi gen MHC II dari ikan yang hidup dihasilkan dua fragmen DNA dengan ukuran sekitar 400 pb dan sekitar 585 pb (Gambar 3).
Gambar  1.  Visualisasi  hasil  amplifikasi  gen  MHC  II  dari  yuwana  gurami  sowang  menggunakan  pasang primer pertama. M: DNA ladder 1 kb. 1 – 7: sampel ikan yang mati 1 False product 250bp 2 3 4 5 6 7
M
Gambar 2. Hasil amplifikasi gen MHC II dari  yuwana gurami sowang menggunakan pasangan primer ke- dua. M = DNA ladder 100 pb, 1 & 7= sampel ikan gurami sowang yang mati pada hari kesatu, 2 & 8 = sampel ikan gurami sowang yang mati pada hari kedua, 3 & 9 = sampel ikan gurami so- wang yang mati pada hari ketiga, 4 & 10 = sampel ikan gurami sowang yang mati pada hari ke- empat , 5 & 11 = sampel ikan gurami sowang yang mati pada hari kelima, 6 & 12 = sampel ikan gurami sowang yang mati pada hari keenam, - = kontrol negatif
Gambar 3. Hasil amplifikasi gen MHC II pada yuwana gurami sowang hidup pascainfeksi. M: DNA ladder 100 bp. 1 – 8: sampel ikan hidup. - : kontrol negatif
Resistensi  yuwana  gurami  sowang  terhadap  in- feksi Aeromonas hydrophila
Pengamatan  terhadap  resistensi  ikan  dila- kukan  sejak  hari  pertama  sampai  14  hari  pasca- infeksi.  Pengamatan  dihentikan  setelah  pada  ko- lam uji tantang tidak ada lagi ikan yang mati. Se- banyak  tiga  individu  ikan  dalam  kolam  uji  tan- tang  ditemukan  telah  mengalami  kematian  pada durasi  24  jam  pascainfeksi.  Sampai  minggu  ke- dua  (hari  ke  14)  pascainfeksi  bakteri A.  hydro- phila , sebanyak 71 individu ikan mati.  Sementa- ra  itu,  semua  ikan  yang  dipelihara  dalam  kolam kontrol memiliki sintasan hidup sebesar 100% .
Dari  100  ekor  ikan  yang  diinfeksi  bakteri Aeromonas ,  sebanyak  29  ekor  tetap  hidup  dan pulih  dari  luka  (sakit)  sampai  hari  ke  30  pasca- infeksi.  Sebanyak  12  individu  ikan  mengalami luka pascainfeksi dan ketika sembuh menyisakan lekukan pada bekas luka dan  dikelompokkan  se- bagai individu abnormal. Sementara itu, 17 indi- vidu  ikan  tidak  mengalami  luka  pascainfeksi  se- hingga  ketika  pengamatan  berakhir  pada  ikan tersebut tidak nampak adanya lekukan bekas luka dan  dikelompokkan  sebagai  individu  normal (Gambar 4).
1 2 ± 585 pb ± 400 pb 600 pb 400 pb 500 pb 5 3 M 4 8 6 7 - M 400 pb 3 2 1 4 5 6 7 8
9  10  11  12  -
400 pb
A

## B
Gambar 4. Ikan gurami setelah 30 hari pascainfeksi. A. yuwana hidup abnormal; B. yuwana hidup normal; 1. abnormalitas

## Pembahasan
Deteksi  gen  major  histocompatibility  complex (MHC) II
Amplifikasi  gen  MHC  II  menggunakan pasangan  primer  pertama  tidak  memperoleh  am- plikon sesuai yang diharapkan. Hal tersebut didu- ga  terjadi  karena  pada template DNA  individu- individu tersebut tidak terdapat situs penempelan bagi  primer  yang  digunakan.  Kondisi  tersebut sangat mungkin terjadi karena setiap individu da- lam satu  spesies  memperlihatkan adanya  variasi. Keberhasilan  primer  dalam  mengamplifikasi template DNA  dipengaruhi  oleh  situs  komple- menter,  kondisi  termal,  bahan-bahan  reaksi  da- lam PCR serta  kondisi  mesin PCR  yang diguna- kan (Jakaria et al . 2007).
Pada  penelitian  ini,  amplifikasi  gen  MHC menggunakan  pasangan  primer  kedua  memper- oleh  amplikon  sesuai  dengan  yang  diharapkan. Hal  ini  sesuai  dengan  pendapat  Wegner et  al . (2006)  bahwa  amplifikasi  gen  MHC  dari  total genom menggunakan primer
forwards:
5’ATGGAAGATGAAATCGCCGC3’  dan  re- verse: 5’TGCCAGATCTTCTCCATGTCG3’
akan  menghasilkan  produk  lebih  kurang  sekitar 400  pb  (Gambar  2).  Hasil  ini  mendekati  hasil penelitian  Wegner et  al. (2006)  yang  berhasil mengamplifikasi gen MHC II three-spine stickle- back (Gasterosteus  aculeatus) sepanjang  sekitar 360 pb. Hasil penelitian ini berbeda dengan hasil amplifikasi  gen  yang  sama  dari  ikan  stickleback betina  yang  hanya  mampu  mengamplifikasi
MHC II sepanjang sekitar 120 pb exon 2 (Reusch et  al .  2001)  dan  mengamplifikasi  exon  2  sepan- jang  105  pb  dari three-spine  stickle-back (Weg- ner et al . 2006). Perbedaan tersebut diduga terja- di  karena  DNA  template  yang  digunakan  berbe- da. Pada penelitian ini digunakan template DNA dari  total  genom,  sedangkan  pada  penelitian Reusch et  al .  (2001)  dan  Wegner et  al .  (2006)
template  DNA  yang  digunakan  merupakan cDNA hasil transkripsi balik dari RNA. Menurut Wegner et  al .  (2006)  amplikon  yang  dihasilkan dari  proses  amplifikasi  menggunakan  primer yang  sama  tetapi  menggunakan  template  DNA dari  cDNA  dan  total  genom  akan  berbeda  ukur- an.  Dari  three-spine  stickleback,  Wegner et  al . (2006)  memperoleh  amplikon  gen  MHC  II  se- panjang  sekitar  260  pb  ketika  menggunakan cDNA sebagai template DNA. Sementara itu, ke- tika  menggunakan  total  genom  sebagai  cetakan DNA,  amplikon  yang  dihasilkan  memiliki  ukur- an sekitar 360 pb yang berarti 100 pb lebih pan- jang  dibandingkan  ketika  menggunakan  cDNA sebagai  template  DNA.  Perbedaan  ukuran  frag- men  yang  diperoleh  dari  yuwana  gurami  pada penelitian  ini  dan  dari  ikan three-spine  stickle- back Wegner et  al .  (2006)  diduga  karena  setiap spesies  ikan  memiliki  ukuran  gen  yang  berbeda termasuk ukuran gen MHC II antara ikan gurami dan  ikan  three-spine  stickleback.  Dugaan  terse- but  diperkuat  oleh  adanya  bukti  dari  Hayuning- tyas et al. (2013), Aryanto et al. (2015), dan Su- priyanto & Dharmawantho (2015) yang memper- oleh  amplikon  gen  MHC  II  sepanjang  300  pb dari ikan  mas Rajadanu.  Oleh karena itu,  meski- pun  produk  amplifikasi  yang  dihasilkan  sedikit lebih panjang daripada amplikon yang dihasilkan dari  three-spine  stickleback,  penelitian  ini  telah berhasil mendeteksi keberadaan gen MHC II pa- da ikan gurami sowang.
Amplifikasi  gen  MHC  II  ikan  yang  mati dan  tetap  hidup  pascainfeksi A.  hydrophyla menghasilkan  pola  pita  yang  berbeda.  Pada  ikan yang mati hanya diperoleh fragmen gen MHC II dengan  ukuran  sekitar  400  bp.  Sementara  pada ikan  yang  hidup,  amplifikasi  menggunakan  pri- mer  yang sama diperoleh fragmen  gen MHC se- banyak dua buah, yakni fragmen berukuran seki- tar 400 bp dan sekitar 585 bp (Gambar 3). Hasil amplifikasi berupa dua  fragmen DNA juga tetap diperoleh  meskipun  kondisi  termal,  khususnya suhu annealing diubah-ubah untuk menghasilkan kondisi  optimum.  Konsistensi  hasil  amplifikasi pada  ikan  yang  tetap  hidup  pascainfeksi A.  hy- drophila membuat peneliti yakin bahwa fragmen hasil amplifikasi berupa gen MHC II. Keyakinan tersebut  muncul  karena  amplifikasi  dilakukan menggunakan primer spesifik untuk gen MHC II. Dihasilkannya  dua  pita  DNA  dari  individu  yang hidup  pascainfeksi  membuktikan  bahwa  gen MHC  II  dapat  digunakan  sebagai  marker  mole- kuler  untuk  membedakan  ikan  gurami  sowang yang  tahan  dan  tidak  tahan A.  hydrophila .  Frag- men  dengan  ukuran  sekitar  585  bp  merupakan marka molekuler spesifik sebagai penciri gurami tahan  infeksi A.  hydrophila .    Hasil  serupa  dila- porkan Azis et al . (2011) yang memperoleh frag- men MHC I berukuran 300 bp, 500 bp, dan 1.000 bp pada ikan lele pascauji tantang A. hydrophila .

## Resistensi yuwana ikan gurami sowang terhadap infeksi Aeromonas hydrophila
Kematian  yuwana  ikan  gurami  sowang yang  terjadi  pada  hari  pertama  pascainfeksi membuktikan dua hal. Pertama, bakteri A. hydro- phila bersifat sangat ganas sehingga sudah mam- pu  menyebabkan  terjadinya  kematian  yuwana ikan  dalam  waktu  yang  sangat  singkat.    Kedua, yuwana ikan gurami yang berasal dari satu pemi- jahan  memiliki  resistensi  yang  berbeda  terhadap serangan  bakteri A.  hydrophila .  Hasil  tersebut
berbeda  dengan  hasil  penelitian  Tanjung et  al.
(2011)  yang  menyatakan  bahwa  kematian  ikan gurami yang disebabkan oleh serangan bakteri A. hydrophila mulai  terjadi  pada  hari  ke  3  sampai hari ke 10 pascainfeksi. Perbedaan tersebut didu- ga karena dua hal, yakni yuwana ikan gurami dan bakteri A. hydrophila yang digunakan pada pene- litian  ini  berasal  dari  sumber  yang  berbeda  de- ngan yang digunakan Tanjung et al. (2011).
Pengamatan  sampai  minggu  kedua  pasca- infeksi A. hydrophila memperoleh informasi bah- wa  sebagian  besar  yuwana  gurami  sowang  telah mengalami  kematian.    Hasil  tersebut  memper- kuat bukti bahwa A. hydrophila merupakan bak- teri  yang  sangat  ganas  sehingga  mampu  menye- babkan  kematian  masal  dalam  waktu  singkat. Kondisi  tersebut  sama  dengan  hasil  penelitian Kamiso  (1997)  pada  ikan  lele  dumbo  bahwa  se- rangan bakteri A. hydrophila dapat menyebabkan kematian ikan dalam waktu 1-2 minggu pascain- feksi  dengan  sebagian  besar  atau  semua  ikan mengalami  kematian.  Sementara  itu,  menurut Ibrahem et  al .  (2008)  serangan  bakteri Aero- monas dapat  menyebabkan  kematian  ikan  budi daya sebesar 10% sampai 80% populasi.
Data  yang  diperoleh  menjadi  bukti  ilmiah bahwa  ikan  yang  dihasilkan  dari  satu  pemijahan memperlihatkan  adanya  variasi  sifat  resistensi terhadap  infeksi Aeromonas .  Yuwana  gurami yang  berasal  dari  satu  pemijahan  dan  digunakan dalam  penelitian  ini  hanya  sebagian  kecil  yang bersifat  resisten  terhadap Aeromonas .  Hal  ini dapat  menjadi  penyebab  menurunnya  kualitas dan  produksi  ikan  gurami  karena  kematian  yang tinggi.  Menurut  Purwaningsih et  al .  (2014) A. hydrophila merupakan salah satu bakteri patogen penyebab  kematian  pada  ikan  gurami  di  daerah Parung,  Bogor.  Kondisi  tersebut  memperkuat argumentasi  tentang  pentingnya  seleksi  calon
induk tahan Aeromonas agar  di  masa datang da- pat dikembangkan gurami tahan Aeromonas .
Agar  proses  seleksi  tidak  perlu  dilakukan melalui  infeksi Aeromonas maka  perlu  dikem- bangkan  teknik  seleksi  secara  langsung  terhadap kualitas yuwana ikan yang ada di pasaran. Salah satu  metode  seleksi  yang  dapat  ditawarkan  ada- lah  seleksi  molekuler  menggunakan  karakter spesifik  terkait  sifat  resistensi  seperti  gen  MHC II.

## Kesimpulan
Gen  MHC  II  berhasil  diamplifikasi  dari yuwana  gurami  sowang  menggunakan  primer dari  ikan  three-spine  stickleback.  Fragmen  gen MHC II 585 bp  merupakan penciri spesifik ikan gurami  sowang  tahan infeksi A. hydrophila . Yu- wana  gurami  sowang  yang  berasal  dari  satu  pe- mijahan memiliki resistensi terhadap Aeromonas hydrophila yang berbeda dengan jumlah individu resisten lebih sedikit.

## Persantunan
Ucapan  terima  kasih  penulis  sampaikan kepada Direktorat Penelitian dan Pengabdian ke- pada Masyarakat, Dirjen Pendidikan Tinggi yang telah mendanai penelitian ini melalui skim Pene- litian  Fundamental  tahun  2015,  Universitas  Jen- deral  Soedirman  yang  telah  menyediakan  ber- bagai  fasilitas  sehingga  penelitian  ini  dapat  ber- langsung, mahasiswa yang telah membantu sela- ma  penelitian  di  laboratorium,  dan  tukang  yang membantu  selama  proses  infeksi  dan  sampling jaringan sirip ikan.

## Daftar Pustaka
Aryanto  D,  Hayuningtyas  EP,  Syahputra  K. 2015.  Hubungan  antara  keberadaan  gen Major histocompatibility complex class II (MHC-II)  ketahanan  terhadap  penyakit, dan pertumbuhan pada populasi ikan  mas
Ras  Rajadanu. Jurnal  Riset  Akuakultur ,
10(4): 461 – 469.
Azis,  Alimuddin,  Sukenda,  Junior  MZ.  2015. Identifikasi kandidat MHC I pada ikan le- le  ( Clarias sp.)  tahan  infeksi Aeromonas hydrophila . Jurnal  Riset  Akuakultur 10(2): 261-269.
Bingulac-Popovic  J,  Figueroa  F,  Sato  A,  Talbot AS,  Johnson  AL,  Gates  M,  Postlethwait JH, Klein J. 1997. Mapping of MHC class I  and  class  II  regions  to  different  linkage groups  in  the  zebrafish, Danio  rerio . Immunogenetics 46(2): 129-134.
Consuegra S, de Leaniz CG. 2008. MHC-media- ted  mate  choice  increases  parasite  resis- tance in salmon. Proceedings of the Royal Society B 275(1641): 1397-1403.
Hayuningtyas  EP,  Ariyanto  D,  Syahputra  K.
2013.  Hubungan  antara  pertumbuhan  de- ngan  keberadaan  gen  tahan  penyakit  ma- jor  histocompatibility  complex  (MHC) pada  ikan  mas  (Cyprinus  carpio). Jurnal Riset Akuakultur , 8 (3) 383 -  391.
Ibrahem  M,  Mostafa  M,  Arab  RMH,  Rezk  MA. 2008. Prevalence of Aeromonas hydrophi- la  i nfection  in  wild  cultured  Nile  tilapia ( Oreochromis  niloticus )  in  Egypt.  8 th
International  Symposium  on  Tilapia  in Aquaculture 2008. pp 1257-1271.
Jakaria, Duryadi D, Noor RR, Tappa B, Martojo H.  2007.  Hubungan  polimorfisme  gen hormon  pertumbuhan  MSP  I  dengan  bo- bot  badan  dan  ukuran  tubuh  sapi  Pesisir Sumatera Barat. Journal of the Indonesian Tropical Animal Agriculture, 32(1): 33-40
Kamiso  HN.  1997.  Uji  lapang  penggunaan  vak- sin Aeromonas hydrophila pada lele dum- bo ( Clarias gariepinus ). Jurnal Perikanan 1(2): 17-24.
Kementerian Kelautan dan Perikanan. 2014.  Bu- didaya  gurami,  penggerak  perekonomian daerah  dan  meningkatkan  kesejahteraan. [Online]  tersedia  di  http://www.  djpb. kkp.go.id [diakses 5 Januari 2015]
Kurtz J, Kalbe M, Aeschlimann PB, Haberli MA,
Wegner  KM,  Reusch  TBH,  Milinski  M. 2004.  Major  histocompatibility  complex diversity  influences  parasite  resistance and innate immunity in sticklebacks. Pro- ceedings  of  the  Royal  Society  London  B . 271(1535): 197-204
Kurtz  J,  Wegner  KM,  Kalbe  M,  Reusch  TBH, Schaschi  H,  Hasselquist  D,  Milinski  M. 2006.  MHC  genes  and  oxidative  stress  in sticklebacks:  an  immuno-ecological  ap-
proach. Proceedings  of  the  Royal  Society B 273(1592): 1407-1414
Landry  C,  Bernatchez  L.  2001.  Comparative analysis  of  population  structure  across environments  and  geographical  scales  at major  histocompatibility  complex  and microsatellite  loci  in  Atlantic  salmon ( Salmo salar ). Molecular Ecology 10(10):
2525-2539.
Latifah  AD,  Sarjito,    Prayitno  SB.  2014.  Karak- terisasi  bakteri  dan  gambaran  histopato- logi  pada  ikan  gurami  ( Osphronemus gouramy )  yang  terserang  penyakit  mata belo. Journal of Aquaculture Management and Technology , 3(4): 93-100.
Miller KM, Kaukinen KH, Beacham TD, Withler RE.  2001.  Geographic  heterogeneity  in natural  selection  on  an  MHC  locus  in sockeye  salmon. Genetica. 111(1):  237- 257.
Mulia  DS.  2007.  Keefektifan  vaksin Aeromonas hydrophila untuk mengendalikan penyakit MAS  ( Motile  Aeromonas  Septicemia )  pa- da  gurami  ( Osphronemus  gouramy Lac.). Jurnal Pembangunan Pedesaan, 7(1): 43- 52.
Nugroho E, Satyani D, Rusmaedi. 1993. Evalusi potensi genetik dari beberapa ras gurame. Buletin Penelitian Perikanan Darat 12(1): 30-36.
Purwaningsih  U,  Indrawati  A,  Lusiastuti  AM. 2014.  Proteksi  vaksin  monovalen  dan koktail selutuh terhadap ko-infeksi Myco- bacterium  fortuitum dan Aeromonas  hy- drophila pada ikan gurame, Osphronemus gouramy . Jurnal  Riset  Akuakultur, 9(2): 283- 294.
Rakus  KL,  Wiegertjes  GF,  Jurecka  P,  Walker PD,  Pilarczyk  A,  Irnazarov  I.    2009.  Ma- jor  histocompatibility  (MH)  class  II  B gene  polymorphism  influences  resistance of  common  carp  ( Cyprinus  carpio L.) Aquaculture 288 (1): 44 – 50.
Reusch  TBH,  Haberli  MA,  Aeschlimann  PB, Milinski  M.  2001.  Female  sticklebacks count alleles in a strategy of sexual select- ion  explaining  MHC  polymorphism.
Nature, 414: 300-302.
Setijaningsih  L,  Arifin  OZ,  Gustiano  R.  2007. Karakterisasi  tiga  ras  ikan  gurame    ( Os- phronemus  gouramy Lac.)  berdasarkan metode  truss  morfometriks. Jurnal  lktio- logi Indonesia , 7(1): 23-30
Sultmann  H,  Meyer  WE,  Figueroa  F,  O’hUigin C,  Klein  J.  1994.  Organization  of  MHC
class  II  B  gene  in  the  zebrafish  ( Brachy- danio rerio ). Genomics , 23 (1): 1-14.
Supriyanto, Dharmawantho L. 2015. Deteksi gen major  histocompatibility  complex  (MHC) pada  beberapa  ras  ikan  mas  ( Cyprinus carpio L.)  dengan  menggunakan  metode polymerase chain reaction (PCR). Buletin Teknik  Litkayasa  Akuakultur, 13  (1):  33- 37.
Tanjung  LR,    Triyanto,  Sadi  NH,  Haryani  GS, Said  DS.  2011.  Uji  ketahanan  beberapa ras gurami terhadap penyakit Aeromonas.
Limnotek 18 (1): 58 – 71.
Wegner  KM,  Kalbe  M,  Rauch  G,  Kurtz  J, Schaschl  H,  Reusch  TBH.  2006.  Genetic variation  in  MHC  class  II  expression  and interactions  with  MHC  sequence  poly- morphism  in  three-spined  sticklebacks.
Molecular Ecology, 15(4): 1153-1164.
Yu HB, Rao PSS, Lee HC, Vilches S, Merino S, Tomas  JM,  Leung  KY.  2004.  A  type  III secretion  system  is  required  for Aeromo- nas  hydrophila AH-1  patogenesis. Infect- ion  and  Immunity ,  72  (3):  1248-1256