Profil Sensitivitas Antibiotik dan Identifikasi Patogen Oportunis Pantoea agglomerans Dari Perairan Pekalongan, Jawa Tengah
Yolanda Christia S(1,2), Subagiyo(1), Mada Triandala Sibero(1,2*)
1Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro, Jawa Tengah
2Laboratorium Natural Product, UPT Laboratorium Terpadu, Universitas Diponegoro, Jawa Tengah
yolandachristias@students.undip.ac.id (1), Subagiyo@lecturer.undip.ac.id (2), madatriandalasibero@lecturer.undip.ac.id (Ca*)

## ABSTRAK
Peningkatan  jumlah  konsumsi  antibiotik  serta  pencemarannya  yang  bersumber  dari  pemukiman  penduduk, kegiatan  sektor industri perikanan, perternakan, hingga kesehatan  memicu terjadinya peningkatan resistensi bakteri  patogen  oportunistik  di  lingkungan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  profil  sensitivitas antibiotik dan identifikasi isolat bakteri koleksi Laboratorium Natural Product Universitas Diponegoro yang sebelumnya diisolasi dari Perairan Slamaran, Pekalongan. Isolat dikarakterisasi dengan pewarnaan gram dan uji  biokimia,  serta  diidentifikasi  secara  molekuler.  Selanjutnya  sensitivitas  antibiotik  isolat  diuji  dengan metode  standar  CLSI  2017.  Dua  isolat  yang  berkode  G  dan  J  teridentifikasi  sebagai  bakteri  gram  negatif, memiliki  kemampuan  untuk  memfermentasi  glukosa,  bersifat  motil,  dan  memiliki  kemampuan  untuk mengubah  urease  menjadi  amoniak.  Kedua  isolat  diidentifikasi  sebagai Pantoea  agglomerans berdasarkan identifikasi molekuler sekuens 16s rRNA dengan percent identity 99,79% untuk isolat G, dan 98,18% untuk isolat J serta query cover sebesar 100% untuk isolat G dan 98% untuk isolat J. Hasil AST isolat menunjukkan bahwa kedua isolat termasuk dalam kriteria susceptible terhadap delapan antibiotik yang digunakan. .
Kata Kunci : Antibiotik, Pantoea agglomerans , Pekalongan, Resisten

## ABSTRACT
The  increase  in  the  consumption  of  antibiotics  and  their  pollution  originating  from  residential  areas,  the activities  of  the  fishing  industry,  livestock,  and  health  have  led  to  an  increase  in  the  resistance  of opportunistic pathogenic bacteria in the environment. This study aims to determine the antibiotic sensitivity profile  and  identify  bacterial  isolates  from  the  Natural  Product  Laboratory  of  Diponegoro  University collection  which  were  previously  isolated  from  Slamaran  Waters,  Pekalongan.  The  isolates  were characterized by gram staining and biochemical tests, and identified molecularly. Furthermore, the antibiotic sensitivity of the isolates was tested using the 2017 CLSI standard method. Two isolates coded G and J were identified  as  gram-negative  bacteria,  had the  ability  to  ferment  glucose,  were  motile,  and  had  the  ability  to convert  urease  into  ammonia.  Both  isolates  were  identified  as Pantoea  agglomerans based  on  molecular identification of 16s rRNA sequences with a percent identity of 99.79% for isolate G, and 98.18% for isolate J and a query cover of 100% for isolate G and 98% for isolate J. AST results for isolates showed that both isolates were included in the susceptible criteria for the eight antibiotics used.
Keywords : Antibiotics, Pantoea agglomerans , Pekalongan, Resistant

## I. PENDAHULUAN

## 1. Latar Belakang
Antibiotik  merupakan  obat  yang  digunakan  untuk  mengobati  penyakit  yang  diakibatkan oleh  infeksi  bakteri  (Lucien et  al., 2021).  Namun,  konsumsi  antibiotik  berlebih  dan  tidak bertanggungjawab  dapat  menimbulan  ternyadinya  resistensi  terhadap  berbagai  golongan antibiotik pada bakteri (Usman et al., 2020). Peningkatan resistensi antibiotik pada bakteri patogen menyebabkan masalah kesehatan yang lebih serius seperti menurunnya efektivitas dan  pilihan  obat  yang  dapat  digunakan,  penurunan  angka  kesembuhan  dan  perpanjangan waktu kesembuhan, hingga meningkatkan angka kematian (Mathers et al ., 2015). Laporan WHO  mengenai  peningkatan  jumlah  sensitivitas  bakteri  berada  pada  tingkat  yang mengkhawatirkan.  Sejumlah  negara  melaporkan  tingkat  resitensi  bakteri  terhadap antibiotik  yang  biasa  digunakan  untuk  mengobati  infeksi  umum  yang  cukup  tinggi. Resistensi  bakteri  yang  dilaporkan  umumnya  dari  kelas Enterobacteariceae  dengan  genus Pseudomonas , Enterococcus , Klebsiella , Salmonella , Shigella ,  dan Pantoea (Fasugba et al. , 2015).  Resistensi antibiotik berhubungan erat dengan banyaknya akumuasi dari limbah antibiotik.  Limbah  antibiotik  yang  tersebar  di  lingkungan  khususnya  perairan  berbentuk senyawa yang terbawa oleh air yang berasal dari limbah domestik dan limbah klinis yang berasal dari fasilitas kesehatan (Falgenhauer et al ., 2019). Senyawa limbah antibiotik yang tidak terdegradasi selanjutnya dilepaskan ke perairan dan terakumulasi di muara atau hilir. Limbah  antibiotik  yang  terus  meningkat  dan  terakumulasi  di  hilir  dapat  menimbulkan beberapa dampak salah satunya peningkatan resistensi bakteri perairan terhadap antibiotik (Ben et al ., 2019). Perairan Slamaran, Pekalongan merupakan salah satu muara atau hilir di kota  Pekalongan  yang  berbatasan  langsung  laut  utara  Jawa.  Perairan  Slamaran  juga berperan  dalam  mengalirkan  limbah  kota  Pekalongan  yang  dialirkan  dari  sungai  hingga muara di perairan Slamaran (Mratihatani dan Susilowati, 2013). Adanya akumulasi limbah di  perairan  Slamaran,  Pekalongan  mengakibatkan  munculnya  probabilitas  terjadinta dampak  tingginya  tingkat  sensitivitas  antibiotik  bakteri  di  perairan  Slamaran  (Raharjo et al ., 2016).

## 2. Perumusan Masalah
Perumusan  masalah  pada  penelitian  ini  adalah  bagaimana  hasil  uji  profil  sensitivitas antibiotic  dan  identifikasi  pathogen  oportunis Pantoea  agglomerans dari  perairan Pekalongan Jawa Tengah?.

## 3. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mengidentifikasi  isolat  bakteri  G  dan  J  yang  diisolasi dari  perairan  Slamaran, Pekalongan
2. Mengetahui  profil  resistensi  antibiotik  isolat  bakteri  G  dan  J  yang  diisolasi dari perairan Slamaran, Pekalongan
4. Manfaat Penelitian
Penelitian ini dapat bermafaat memberikan informasi dalam bidang mikrobiologi mengenai karakteristik  dan  profil  resistensi  antibiotik  dua  isolat  bakteri dari  perairan  Slamaran, Pekalongan.

## II. METODE
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan  Mei  hingga  Desember  2021  secara ex  situ di Laboratorium  Teknik  Lingkungan  Universitas  Diponegoro  dan  Laboratorium  Terpadu
Universitas  Diponegoro.  Isolat  menggunakan  koleksi  dari  isolasi  bakteri  air  dan  sedimen Perairan Slamaran, Pekalongan.

## 1. Pewarnaan gram
Isolat usia 1 x 24 jam diinokulasikan pada kaca preparat lalu  difiksasi dengan api bunsen. Isolat  pada  kaca  preparat  ditetesi  merata  dengan Crystal  violet dan  didiamkan  selama  1 menit kemudian dibilas dengan air mengalir.
2. Uji Biokimia

## 2.1. Uji TSIA
Uji glukosa, sukrosa, dan laktosa dilakukan dengan media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) miring dalam tabung reaksi. Isolat kemudian diinokulasikan dengan jarum ose. Jarum ose yang  diinokulasikan  ke  dalam  media  kemudian  dilakukan streak pada  bagian  miring media.
2.2 Uji SIM
Uji motilitas, indole , dan H 2 S dilakukan dengan menginokulasikan isolat kedalam tabung reaksi  yang  berisikan  media Sulfide  Indole  Motility (media  SIM)  dengan  menggunakan jarum ose.
2.3 Uji Sitrat
Isolat diinokulasikan kedalam tabung reaksi yang berisikan media miring Simmon Citrate Agar (media SCA).
2.4 Uji Urease
Uji urease dilakukan dengan menginokulasikan isolat ke dalam media urea base agar .
3. Identifikasi Molekuler
Ektraksi DNA dilakukan dengan metode Chelex dengan modifikasi prosedur. Koloni isolat yang  berusia  1  x  24  jam  dimasukkan  ke dalam  50-100µl  ddH2O  dan  1  ml  saponin  0,5% dalam Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) lalu didiamkan selama satu malam di suhu 4°C.
4. Antibiotic Susceptibility Test (AST)
Antibiotic  Susceptibility  Test dilakukan  dengan  metode disc  diffusion .  Isolat  bakteri diinokulasikan  ke  dalam  media Natrium  Broth dan  dengan  menggunakan  standar McFarland untuk menentukan kekeruhan inokulum 0,5.

## III. HASIL PENELITIAN

## 1.Sumber dan Morfologi
Hasil  pengamatan  karakterisasi morfologi  isolat  G  dan  J  yang  tumbuh  pada  media  dalam waktu  1  x  24  jam.  Isolat  yang  tumbuh  kemudian  diamati  untuk  mengidentifikasi bentuk, elevasi, dan margin dari tiap koloni yang tumbuh pada media.
Tabel 1. Sumber dan morfologi isolat
No. Kode Sumber Bentuk Elevasi Margin 1. G Air circular convex entire 2. J Sedimen circular convex entire

## 2.Pewarnaan dan Uji Biokimia
Hasil  uji  biokimia  yang  diperoleh  berdasarkan  uji  gram  bakteri,  motilitas,  indole,  sitrate, H2S,  dan  fermentasi  gula.  Masing  masing  isolat  menunjukkan  hasil  uji  biokimia  yang serupa, sehingga isolat-isolat tersebut diduga memiliki spesies yang sama . Tabel 2 . Hasil pewarnaan gram dan uji biokimia (TSIA, SIM, Sitrat, dan Urease)
Isolat Gram TSIA
Motility Indole H 2 S Sitrat Urease
Glukosa Laktosa Sukrosa
G
Negatif + - - + - - + +
J Negatif + - - + - - + +

## 3. Identifikasi molekuler
Gen  16S  rRNA  dari  isolat  G  dan  J  diamplifikasi  dengan Polymerase  Chain  Reaction (PCR).  Hasil  dari  PCR  yang  telah  disekuens  yang  kemudian  ditentukan  spesies  yang berdekatan dengan menggunakan BLAST.
Tabel 3 . Hasil Identifikasi molekuler Isolat Closest Simalirity  Similarity Query cover Accession G Pantoea agglomerans 99.79% 100% NR111998.1 J Pantoea agglomerans 98.18% 98% NR111998.1

## 4.AST
Isolat yang telah diidentifikasi molekuler kemudian dilakukan Antibiotic Susceptibility Test untuk  melihat  tingkat  resistensi  isolat  terhadap  antibiotik.  Hasil  diameter  zona  hambat didapat setelah dilakukannya inkubasi selama 24 jam pada suhu 35ºC.
Tabel 4. Hasil pengukuran breakpoint diameter zona Antibiotik CLSI, 2017 Isolat G Isolat J S I R Streptomycin ≥15 13-14 ≤12 13,35 12,15 Ampicillin ≥15 12-14 ≤11 13, 7 16,15 Ceftriaxone ≥23 20-22 ≤19 23,35 22,85 Gentamicin ≥15 13-14 ≤12 13,1 14,65 Kanamycin ≥18 14-17 ≤13 16,15 16 Ciprofloxacin ≥21 16-20 ≤15 20,75 15,8 Tetracycline ≥15 12-14 ≤11 19,8 21,85 Chloramphenicol ≥18 13-17 ≤12 19,6 25,1
Hasil pewarnaan gram pada isolat G dan J menunjukkan hasil bahwa isolat menunjukkan sel  berwarna  merah.  Hal  ini  mengkategorikan  bahwasanya  isolat  G  dan  J  merupakan bakteri  gram  negatif.  Bakteri  gram  negatif  memiliki  struktur  sel  yang  kompleks  dan membrannya terdiri dari fosfolipid, protedin, dan lipopolisakarida.
(a) (b)
Gambar 1 . (a) Gambar isolat G, (b) Gambar isolat J
(a) (b)
Gambar 2 . (a) Hasil uji SIM isolat G, (b) Hasil uji SIM isolat J
Uji  sitrat  menunjukkan  bahwa  kedua  isolat  dalam  uji  sitrat  mengalami  perubahan warna. Hal  ini  menandakan  bahwa  seluruh  isolat  dikatakan  positif.  Uji  sitrat  dilakukan  untuk mengetahui bakteri yang memiliki kemampuan untuk menggunakan sitrat sebagai sumber energi, khususnya pada bakteri kelompok Enterobactericeae. Hal ini memberikan indikasi pada media yaitu bromothymol blue yang akan mengubah warna awal yaitu hijau menjadi warna biru (Ayitso dan Onyango, 2016).
(a) (b)
Gambar 3. (a) hasil uji sitrat isolat G, (b) hasil uji sitrat isolat G

## IV. KESIMPULAN
Kedua  isolat  memiliki  karakteristik  biokimia  berikut  ini:  positif  pada  uji  motilitas,  sitrat, urease  dan  fermentasi  glukosa.  Identifikasi  molekuler  menkonfirmasi  bahwa  kedua  isolat G  dan  J  adalah P . agglomerans .  Bakteri  ini diketahui  tidak  resisten  terhadap  kelas antibiotik  yang  digunakan  namun  beberapa  diantaranya  tercatat  sebagai intermediate sehingga berpotensi resisten di masa mendatang.

## DAFTAR PUSTAKA
Ayitso,  A.  S.,  dan  Onyango,  D.  M.  2016.  Isolation  and  Identification  by  Morphological and  Biochemical  Methods  of  Antibiotic Producing  Microorganisms  from  the  gut of Macrotermes michaelseni in Maseno , Kenya. 4 (01), 27–33. https://doi.org/10.7324/JABB.2016.40105
Ben,  Y.,  C.  Fu,  M.  Hu,  L.  Liu,  M.  H.  Wong,  dan  C.  Zheng.  2019.  Human  Health  Risk Assesment  of  Antibiotic  Resistance  Associated  with  Antibiotic  Residues  in  the Environment. Environment Research., 169: 483 – 493.
Chakraborty,  S.  P.,  S.  K.  Mahapatra,  dan  S.  Roy.  2011.  Biochemical  characters  and antibiotic  susceptibility  of  Staphylococcus  aureus  isolates.  Asian  Pacific  Journal Tropical  Biomedicine.  1(3):  212-216.  CLSI.  2017.  Performance  Standards  for Antimicrobial Susceptibility Testing . 30th ed. CLSI Supplement M100. 3(1).
Falgenhauer, L., C. Imirzalioglu, K. Oppong, C. W. Akenten, B. Hogan, R. Krumkamp, S.
Poppert,  O.  Dabo,  J.  May,  dan  D.  Eibach.  2019.  Detection  and  Characterization  of ESBL  Producing  Escherichia  coli  from  Humans  and  Poultry  in  Ghana.  Frontiers Microbiology, 15
Fasugba,  O.,  A.  Gardner,  B.  G.  Mitchell,  dan  G.  Mnatzaganian.  2015.  Ciproflaxin Resistance in Community and Hospital Acquired Eschericjia coli Urinary Infections: a  Systematic  Review  and  Meta  Analysis  of  Observational  Studies.  BMC  Infectious Disease., 15 : 1-16.
Lucien,  M.A.B.,  Canarie,  M.F.,  Kilgore,  P.E.,  Jean-Denis,  G.,  Fénélon,  N.,  Pierre,  M., Cerpa, M., Joseph, G.A., Maki, G., Zervos, M.J. dan Dely, P., 2021. Antibiotics and Antimicrobial  Resistance  in  the  COVID-19  Era. International  Journal  of  Infectious Diseases.
Malanovic, N., dan K. Lohner. 2016. Gram-Positive Bacterial Cell Envelopes: The Impact on the Activity of  Antimicrobial Peptides. Biochimica et Biophysica  Acta (BBA)  – Biomembranes., 1858(5): 936-946.
Mathers,  A.  J.,  G.  Peirano,  dan  J.  D.  D.  Pitout.  2015.  The  Role  of  Epidemic  Resistance Plasmids  and  International  HighRisk  Clones  in  the  Spread  of  Multidrug-Resistant Enterobacteriaceae. Clinical Microbiology Review , 28 (3): 566- 594. Mratihatani, A. S., dan I. Susilowati. 2013. Menuju Pengelolaan Sungai Bersih di Kawasan Industri  Batik  yang  Padat  Limbah  Cair.  (Studi  Empiris:  Watershed  Sungai Pekalongan di Kota Pekalongan). Diponegoro Journal of Economics., 2(2): 1-12.
Qamsari, E. M., R. K. Kermanshahi, dan Z.M. Nejad. 2011. Isolation and Identification of a Novel, Lipase-Producing Bacterium, Pseudomnas aeruginosa KM110. Iran Journal of Microbiology., 3(2): 92–98.
Raharjo,  M.,  Muslim,  dan  L.  Maslukah.  2016.  Sebaran  Konsentrasi  Nitrat,  Fosfat,  dan Klorofila  di  Perairan  Pantai  Slamaran  Pekalongan.  Journal  of  Oceanography, 5 (4): 462-469.
Schaffer, J. N., dan M. M. Pearson. 2015. Proteus mirabilis and Urinary Tract Infections. Microbiology Spectrum Journal., 3(5): 1-66.
Sibero, M.T., O.K. Radjasa,  A. Sabdono, A. Trianto, D.W. Triningsih dan  I.D.  Hutagaol. 2018.  Antibacterial  activity  of  indonesian  sponge  associated  fungi  against  clinical pathogenic multidrug resistant bacteria. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 8(2): 088–094.
Talaiekhozani,  A.,  N.  Jafarzadeh,  M.A.  Fulazzaky,  M.  R.Talaie,  dan  M.  Boheshti.  2015. Kinetics  of  Substrate  Utilization  and  Bacterial  Growth  of  Crude  Oil  Degraded  by Pseudomonas  aeruginosa.  Journal  of  Environmental  Health  Science  and Engineering., 13(64):1-8.
Usman,  M.,  M.  Farooq,  dan  K.  Hanna.,  2020.  Environmental  Side  Effects  of  The Injudicious  Use  of  Antimicrobials  in  The  Era  of  COVID-19 . Science  of  The  Total Environment. 745:1-3.
Accepted Date Revised Date Decided Date Accepted to Publish 10 Juni 2022 11 Juni  2022 12 Juni 2022 Ya