## DETEKSI AKTIVITAS PROTEOLITIK ISOLAT BAKTERI ASAL AMPAS TAHU PADA SUBSTRAT BEKATUL
Baital Izzatul Badriyah, Tri Ardyati
Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Jalan Veteran Malang, Jawa Timur, Indonesia
Email: baital.izza@gmail.com

## ABSTRAK
Ampas  tahu  mengandung protein  sebesar  23,7 % dan kemungkinan terdapat bakteri  proteolitik. Bakteri  proteolitik dapat  meningkatkan  efisiensi  penggunaan  pakan  ternak. Penelitian  ini  bertujuan untuk memperoleh isolat bakteri proteolitik asal ampas tahu dan mempelajari aktivitas protease yang dihasilkan pada  substrat  bekatul. Penelitian  ini  menggunakan Rancangan  Acak  Kelompok  (RAK) dengan tiga ulangan. Tahapan penelitian meliputi isolasi bakteri proteolitik dari ampas tahu, pengujian aktivitas  bakteri  proteolitik  pada  media calcium  casseinate  agar (CCA),  karakterisasi  bakteri,  uji patogenisitas, pembuatan  kurva  pertumbuhan dan pengujian  aktivitas  proteolitik  bakteri  pada media bekatul 2 %. Data luas zona bening pada media CCA dianalisis ragam (Anova) dan dilanjutkan dengan uji  Tukey,  sedangkan aktivitas  protease isolat bakteri pada  media  bekatul  2  % dianalisis dengan uji Independent Sample T (α = 0,05) . Sepuluh isolat bakteri proteolitik diperoleh dari ampas tahu dengan isolat  TP5K1  dan  TP6K5 memiliki  aktivitas  proteolitik  (zona  bening)  terbesar  serta tidak patogen. Aktivitas protease tertinggi pada media bekatul 2 % untuk isolat TP5K1 sebesar 2,24 Unit/mL dengan jumlah sel bakteri 5,13 x 10 7 sel/mL, sedangkan isolat TP6K5 sebesar 2,37 Unit/mL dengan jumlah sel bakteri 5,26 x 10 7 sel/mL. Kata kunci: aktivitas protease, ampas tahu, bakteri, bekatul

## ABSTRACT
Tofu waste contains 23.7 % of protein and possible containing proteolytic bacteria. Proteolytic activity of bacteria could increase the efficiency of feed utilization. This research was carried out in order to get isolates bacteria  in tofu waste having proteolytic  activity and to study proteolitic  activity that produced in  rice bran substrate. Methods used  in  this research were isolation  of  proteolytic  bacteria from tofu  waste, assay  of  bacterial  protease activity on the  calcium  casseinate  agar  (CCA) medium, characterization of  pathogenicity,  preparation  of  bacterial growth  curve and protease  activity  assay was  performed  in  2 %  of  rice  bran  medium. The  wide  of  clear  zone  data of  isolates  bacteria  were analyzed using  Analysis  of  Variance  ( Anova)  and  continued  by  Tukey’s  Test  (α  =  0 .05),  whereas protease  activity  of  isolates  bacteria  on  2  %  rice  bran  medium  were  analyzed  using Independent Sample  T-Test (α = 0.05). Ten  isolates of proteolytic bacteria obtained  from tofu waste  and isolates TP5K1 and TP6K5 have the greatest proteolytic activity (clear zone) and no pathogens. The highest protease  activity of  isolate TP5K1 was 2.24  Unit/mL with  the cell number  of  bacteria is 5.13  x  10 7 cell/mL,  whereas  the  highest protease  activity of isolate  TP6K5  was  2.37  Unit/mL  with  the cell number was 5.26 x 10 7 cell/mL.
Key words: bacteria, protease activity, rice bran, tofu waste

## PENDAHULUAN
Eksplorasi bakteri yang  potensial  untuk diaplikasikan  dalam  bidang  industri  perlu dilakukan  secara  terus  menerus [1].  Salah  satu produk industri yang penting dan bernilai tinggi yang  dihasilkan  oleh bakteri adalah  enzim. Adanya bakteri yang  unggul  merupakan  salah satu faktor penting dalam usaha produksi enzim
[2]. Enzim  memegang  peranan  penting  dalam dunia  industri,  salah  satu  di antaranya  yaitu protease [3]. Protease merupakan enzim yang digunakan  secara  luas  pada  industri pakan ternak dan telah  hampir  mencapai  65 %  dari total  penjualan  enzim  di  dunia [4]. Salah  satu fungsi  protease  yaitu berperan  dalam degradasi protein menjadi asam amino, sehingga
menjadikan  pakan  ternak  lebih  mudah  diserap oleh pencernaan hewan ternak [5]. Penggunaan enzim  pada  pakan  ternak  ditujukan  untuk mengurangi  faktor-faktor  antinutrisi  dalam pakan,  meningkatkan  daya  cerna  pakan, meningkatkan ketersediaan zat-zat gizi tertentu, serta mengurangi masalah polusi kotoran ternak [6].
Salah satu sumber bakteri yang berpotensi  memiliki  aktivitas  proteolitik yaitu ampas  tahu yang mengandung  protein  sebesar 23,7  % [7]. Bakteri asal  ampas  tahu  perlu diketahui  potensi  aktivitas proteasenya karena dapat  diaplikasikan  pada  industri  pakan  ternak sebagai  campuran  bekatul. Bekatul mengadung protein  11,5-17,2  % [8]. Melihat  potensi aplikasi  bakteri  proteolitik yang  menjanjikan pada  bidang  industri  pakan  ternak,  maka penelitian  ini  penting  untuk  dilakukan. Hal  ini dilakukan agar  diperoleh  isolat  bakteri  yang berpotensi  tinggi  dalam  menghasilkan  aktivitas proteolitik  dan  dapat  diaplikasikan  pada  pakan ternak (bekatul).

## METODE PENELITIAN
Isolasi, Pemurnian,  dan  Karakterisasi Bakteri Proteolitik dari Ampas Tahu. Ampas tahu  diperoleh  dari  Pabrik  Tahu  73  Sukun-
Malang. Bakteri
poteolitik diisolasi menggunakan  media calsium  casseinate  agar (CCA) dengan metode pour plate. Isolat bakteri proteolitik yang menghasilkan  zona  bening dimurnikan hingga  diperoleh  koloni  tunggal dan ditumbuhkan  pada  media agar miring sebagai  stok  [9]. Isolat bakteri  proteolitik dikaraterisasi secara
makroskopis yaitu pengamatan karakter morfologi serta
dikarakterisasi secara  mikroskopis  dengan pewarnaan  Gram  dan  endospora,  uji  katalase dan uji oksidase.
Uji Kualitatif Aktivitas Protease Isolat Bakteri. Uji aktivitas protease  isolat  bakteri proteolitik pada  media  CCA menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan tiga ulangan. Data luas zona bening dianalisis ragam (Anova)  dan  dilanjutkan  dengan  uji  Tukey. Luas zona  bening  yang  terbentuk  di  sekitar koloni diukur menggunakan  jangka  sorong digital [10].
Uji  Patogenisitas. Satu oose  kultur murni  bakteri  berumur  24 jam digores pada media blood  agar dengan  metode streak plate.
Isolat  bakteri  diinkubasi  pada  suhu  37  ºC selama 48 jam [11]. Medium di sekitar koloni diamati  ada  atau  tidak  zona  bening  yang menunjukkan aktivitas hemolis/patogen.
Starter Isolat Bakteri Proteolitik pada Media  Bekatul. Satu  oose  isolat  bakteri proteolitik  diinokulasikan  ke  dalam  10  mL media calsium  casseinate broth (CCB)  dan diinkubasi  pada suhu 37 o C, 120  rpm, dan 24
jam. Lima mililiter kultur
bakteri diinokulasikan  ke  dalam  45  mL  media  bekatul sebagai  stok  inokulum dan diinkubasi pada suhu 37  ºC, 120  rpm, selama  24  jam. Lima belas mililiter kultur dengan  densitas 10 7 sel/mL bakteri diinokulasikan ke dalam 135 mL media bekatul 2 % dan diinkubasi pada suhu 37 ºC, 120  rpm, 48  jam. Suspensi  kultur bakteri pada  jam  ke  0,  1,  2,  4,  6,  12,  18,  24  dan  48 dihitung menggunakan
hemositometer.
Suspensi  kultur  bakteri  pada fase  pertumbuhan logaritmik  dengan  densitas  yang  diharapkan digunakan sebagai starter [12].
Deteksi Aktivitas Protease Isolat Bakteri  pada  Substrat  Bekatul 2  %. Uji aktivitas  protease dilakukan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan tiga ulangan. Data  aktivitas  proteolitik  dianalisis dengan uji Independent  Sample  T. Aktivitas protease  dideteksi  dengan  cara  lima  mililiter sampel bakteri dalam media produksi yaitu jam ke 0, 1, 2, 4, 6, 12, 18, 24 dan 48 disentrifugasi pada 10.000  rpm, 15  menit, 4  ºC.  Supernatan sebanyak  500  μL  ditambahkan  dengan  500  μL 0,05  M  buffer  fosfat  pH  7.  Suspensi dipreinkubasi  pada  suhu  37  ºC  selama  lima menit  dan  ditambahkan  substrat  sebanyak  500 μL  (dua  persen  kasein  dalam  0,05  M  buffer fosfat pH  7).  Larutan  enzim  diinkubasi  pada suhu  37  ºC selama 10  menit  kemudian ditambah satu mililiter 0,4 M asam trikhloroasetat (TCA) dan didiamkan selama 30 menit  pada  suhu  ruang.  Larutan  disentrifugasi dengan  kecepatan  4000  rpm,  selama  15  menit, pada  suhu  4  ºC.  Supernatan  (crude  enzyme) diambil satu mililiter kemudian dimasukkan ke dalam  tabung  reaksi  dan  diencerkan  dengan Tris  HCl  hingga  total  volume  menjadi  dua mililiter.  Larutan  diukur  absorbansinya  pada panjang  gelombang  275  nm.  Nilai  aktivitas protease diukur  dari  kadar  tirosin yang diperoleh pada kurva  baku  tirosin menurut rumus [13].
Aktivitas enzim = [tirosin] x v    x fp p x q
v : volume  total  sampel  percobaan  pada  tiap tabung (mL); p : jumlah enzim (mL); q: waktu inkubasi (menit) dan fp: faktor pengenceran.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Lima isolat bakteri dari ampas tahu yang memiliki  aktivitas proteolitik yaitu  TP5K1, TP6K4,  TP6K5,  TP6K8, dan  TP6K9 (Gambar 1).  Adanya aktivitas  protease  ekstraselular bakteri  menyebabkan  kasein  pada  media  CCA terhidrolisis  menjadi  peptida dan  asam  amino. Zona bening merupakan indikator bahwa isolat bakteri  mampu  memanfaatkan  kasein  pada media sebagai sumber nutrisinya [14].
Dua  isolat  TP5K1  dan  TP6K5 dipilih karena  tidak  patogen  yang  ditunjukkan tidak menghasilkan aktivitas  hemolisis (tidak ada zona bening) di sekitar koloni pada media blood agar. Kedua  isolat  bakteri termasuk  dalam hemolisis γ ,  yaitu  tidak  mampu  menghemolisis darah [15]. Isolat TP5K1 berbentuk batang (p = 1,5 μm) sedangkan TP6K5 berbentuk bulat (p = 1  μm), tetapi  keduanya Gram  positif  dan  tidak membentuk  endospora (Tabel  1).  Kedua  isolat menunjukkan  katalase  positif  dan  oksidase negatif yang menunjukkan bersifat aerob [16]. Tabel  1.  Karakter  pertumbuhan  isolat  bakteri proteolitik asal ampas tahu
Keterangan: (+) memiliki dan (-) tidak memiliki karakter yang disebutkan
Aktivitas protease isolat  bakteri  TP5K1 dan TP6K5 tidak berbeda selama masa inkubasi (p>0,05).  Aktivitas  protease  tertinggi pada isolat  TP5K1 sebesar 2,24  Unit/mL dan isolat TP6K5 sebesar 2,37 Unit/mL yang terjadi pada jam  kedua (awal  fase  logaritmik) dengan jumlah sel secara berturut-turut sebanyak 7,64 x 10 7 sel/mL dan 7,68  x  10 7 sel/mL (Gambar 2). Bakteri memiliki aktivitas  proteolitik yang tinggi  pada  fase  logaritmik karena  sel  berada dalam kondisi optimum untuk metabolisme dan perkembangbiakan [17].
Gambar 2.  Kurva pertumbuhan  dan  aktivitas protease isolat bakteri  proteolitik pada media bekatul 2 %
Protease dari  mikroba merupakan  enzim konstitutif  atau  indusibel  parsial. Enzim konstitutif  selalu  tersedia  di  dalam  sel  mikroba Karakter Koloni TP5 K1 TP6K5 Bentuk koloni: - Bulat + - - Tidak teratur - + - Menyeluruh + - - Lobate - + Permukaan koloni: - Smooth + - Konfigurasi koloni: - Lobate - + Elevasi: - Raised + - - Flat - + Konsistensi koloni: - Seperti mentega + + Ciri optik  koloni: - Berkilat + + Warna koloni: - Kuning + + Gram + + Membentuk Endospora - - Katalase + + Oksidase - - Patogenisitas - - Hidrolisis protein + +
Gambar 1.  Luas  zona  bening  isolat  bakteri proteolitik pada media CCA
TP5K1
TP6K5
Aktivitas enzim = [tirosin] x v    x fp p x q
v : volume  total  sampel  percobaan  pada  tiap tabung (mL); p : jumlah enzim (mL); q: waktu inkubasi (menit) dan fp: faktor pengenceran.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Lima isolat bakteri dari ampas tahu yang memiliki  aktivitas proteolitik yaitu  TP5K1, TP6K4,  TP6K5,  TP6K8, dan  TP6K9 (Gambar 1).  Adanya aktivitas  protease  ekstraselular bakteri  menyebabkan  kasein  pada  media  CCA terhidrolisis  menjadi  peptida dan  asam  amino. Zona bening merupakan indikator bahwa isolat bakteri  mampu  memanfaatkan  kasein  pada media sebagai sumber nutrisinya [14].
Dua  isolat  TP5K1  dan  TP6K5 dipilih karena  tidak  patogen  yang  ditunjukkan tidak menghasilkan aktivitas  hemolisis (tidak ada zona bening) di sekitar koloni pada media blood agar. Kedua  isolat  bakteri termasuk  dalam hemolisis γ ,  yaitu  tidak  mampu  menghemolisis darah [15]. Isolat TP5K1 berbentuk batang (p = 1,5 μm) sedangkan TP6K5 berbentuk bulat (p = 1  μm), tetapi  keduanya Gram  positif  dan  tidak membentuk  endospora (Tabel  1).  Kedua  isolat menunjukkan  katalase  positif  dan  oksidase negatif yang menunjukkan bersifat aerob [16]. Tabel  1.  Karakter  pertumbuhan  isolat  bakteri proteolitik asal ampas tahu
Keterangan: (+) memiliki dan (-) tidak memiliki karakter yang disebutkan
Aktivitas protease isolat  bakteri  TP5K1 dan TP6K5 tidak berbeda selama masa inkubasi (p>0,05).  Aktivitas  protease  tertinggi pada isolat  TP5K1 sebesar 2,24  Unit/mL dan isolat TP6K5 sebesar 2,37 Unit/mL yang terjadi pada jam  kedua (awal  fase  logaritmik) dengan jumlah sel secara berturut-turut sebanyak 7,64 x 10 7 sel/mL dan 7,68  x  10 7 sel/mL (Gambar 2). Bakteri memiliki aktivitas  proteolitik yang tinggi  pada  fase  logaritmik karena  sel  berada dalam kondisi optimum untuk metabolisme dan perkembangbiakan [17].
Gambar 2.  Kurva pertumbuhan  dan  aktivitas protease isolat bakteri  proteolitik pada media bekatul 2 %
Protease dari  mikroba merupakan  enzim konstitutif  atau  indusibel  parsial. Enzim konstitutif  selalu  tersedia  di  dalam  sel  mikroba Karakter Koloni TP5 K1 TP6K5 Bentuk koloni: - Bulat + - - Tidak teratur - + - Menyeluruh + - - Lobate - + Permukaan koloni: - Smooth + - Konfigurasi koloni: - Lobate - + Elevasi: - Raised + - - Flat - + Konsistensi koloni: - Seperti mentega + + Ciri optik  koloni: - Berkilat + + Warna koloni: - Kuning + + Gram + + Membentuk Endospora - - Katalase + + Oksidase - - Patogenisitas - - Hidrolisis protein + + 6.90 7.20 7.50 7.80 8.10 8.40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Ju m lah S el ( lo g 10 S el /m L ) Waktu Jumlah Sel/mL Aktivitas Enzim 7.50 7.80 8.10 8.40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Ju m lah S el ( L o g 10 S el /m L ) Waktu (Jam) Jumlah Sel Aktivitas Enzim ab a b 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 TP5K1 TP6K4 TP6K5 TP6K8 L u a s Z o n a B e n in g (m m 2 ) Isolat Gambar 1.  Luas  zona  bening  isolat  bakteri proteolitik pada media CCA TP5K1
TP6K5
Aktivitas enzim = [tirosin] x v    x fp p x q
v : volume  total  sampel  percobaan  pada  tiap
tabung (mL); p : jumlah enzim (mL); q: waktu inkubasi (menit) dan fp: faktor pengenceran.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Lima isolat bakteri dari ampas tahu yang memiliki  aktivitas proteolitik yaitu  TP5K1, TP6K4,  TP6K5,  TP6K8, dan  TP6K9 (Gambar 1).  Adanya aktivitas  protease  ekstraselular bakteri  menyebabkan  kasein  pada  media  CCA terhidrolisis  menjadi  peptida dan  asam  amino. Zona bening merupakan indikator bahwa isolat bakteri  mampu  memanfaatkan  kasein  pada media sebagai sumber nutrisinya [14].
Dua  isolat  TP5K1  dan  TP6K5 dipilih karena  tidak  patogen  yang  ditunjukkan tidak menghasilkan aktivitas  hemolisis (tidak ada zona bening) di sekitar koloni pada media blood agar. Kedua  isolat  bakteri termasuk  dalam hemolisis γ ,  yaitu  tidak  mampu  menghemolisis darah [15]. Isolat TP5K1 berbentuk batang (p = 1,5 μm) sedangkan TP6K5 berbentuk bulat (p = 1  μm), tetapi  keduanya Gram  positif  dan  tidak membentuk  endospora (Tabel  1).  Kedua  isolat menunjukkan  katalase  positif  dan  oksidase negatif yang menunjukkan bersifat aerob [16]. Tabel  1.  Karakter  pertumbuhan  isolat  bakteri proteolitik asal ampas tahu
Keterangan: (+) memiliki dan (-) tidak memiliki karakter yang disebutkan
Aktivitas protease isolat  bakteri  TP5K1 dan TP6K5 tidak berbeda selama masa inkubasi (p>0,05).  Aktivitas  protease  tertinggi pada isolat  TP5K1 sebesar 2,24  Unit/mL dan isolat TP6K5 sebesar 2,37 Unit/mL yang terjadi pada jam  kedua (awal  fase  logaritmik) dengan jumlah sel secara berturut-turut sebanyak 7,64 x 10 7 sel/mL dan 7,68  x  10 7 sel/mL (Gambar 2). Bakteri memiliki aktivitas  proteolitik yang tinggi  pada  fase  logaritmik karena  sel  berada dalam kondisi optimum untuk metabolisme dan perkembangbiakan [17].
Gambar 2.  Kurva pertumbuhan  dan  aktivitas protease isolat bakteri  proteolitik pada media bekatul 2 %
Protease dari  mikroba merupakan  enzim konstitutif  atau  indusibel  parsial. Enzim konstitutif  selalu  tersedia  di  dalam  sel  mikroba Karakter Koloni TP5 K1 TP6K5 Bentuk koloni: - Bulat + - - Tidak teratur - + - Menyeluruh + - - Lobate - + Permukaan koloni: - Smooth + - Konfigurasi koloni: - Lobate - + Elevasi: - Raised + - - Flat - + Konsistensi koloni: - Seperti mentega + + Ciri optik  koloni: - Berkilat + + Warna koloni: - Kuning + + Gram + + Membentuk Endospora - - Katalase + + Oksidase - - Patogenisitas - - Hidrolisis protein + + 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 40 44 48 52 A k ti vi tas E n zi m ( U n it /m L ) Aktivitas Enzim 0.00 0.30 0.60 0.90 1.20 1.50 1.80 2.10 2.40 40 44 48 52 A k ti vi tas E n zi m ( U n it /m L ) Aktivitas Enzim ab ab TP6K8 TP6K9 Gambar 1.  Luas  zona  bening  isolat  bakteri proteolitik pada media CCA TP5K1 TP6K5
dalam  jumlah  yang  relatif  konstan, sedangkan enzim  induktif disintesis  bila  ada  induksi substrat dalam medium. Sintesis enzim induktif meningkat  seiring  peningkatan  konsentrasi substrat terutama  bila  substratnya merupakan satu-satunya sumber karbon [18].
Komposisi  media,  pH, dan  aerasi merupakan variabel penting yang memengaruhi produksi  enzim  pada submerged  fermentation [19]. Penurunan  aktivitas proteolitik bakteri dapat  terjadi karena berkurangnya  jumlah substrat [20]. Penurunan aktivitas protease yang ditunjukkan  oleh  isolat  TP5K1  dan  TP6K5 kemungkinan akibat  konsentrasi  protein  yang terkandung  pada  media  bekatul  2  % terlalu sedikit  sehingga  cepat  habis. Jika  konsentrasi substrat  rendah  maka  enzim  tidak  mencapai aktivitas maksimum  akibat  sulitnya  enzim menemukan  substrat  yang  akan direaksikan [21]. Aktivitas  protease  meningkat  seiring dengan  meningkatnya  konsentrasi  substrat sampai pada konsentrasi maksimum. Kecepatan reaksi  juga  akan  meningkat dengan makin cepatnya substrat terikat pada enzim [22].

## KESIMPULAN
Dua  isolat TP5K1  dan TP6K5 diantara lima  isolat bakteri  dari  ampas  tahu memiliki aktivitas  proteolitik  tertinggi  pada media  CCA dan  tidak  patogen.  Isolat  TP5K1  dan  TP6K5 memiliki aktivitas protease secara berturut-turut 2,24  Unit/mL  dengan  jumlah  sel  5,13  x  10 7 sel/mL  dan 2,37 Unit/mL dengan  jumlah  sel 5,26 x 10 7 sel/mL.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terima kasih disampaikan kepada Suharjono dan Osfar Sjofjan yang telah banyak membantu dalam proses penyelesaian
penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]. Sutandi, C. 2003. Analisis Potensi Enzim Protease Lokal. http://repository.
ipb.ac.id. Diakses tanggal 21 April 2012.
[2]. Akhdiya,  A.  2003.  Isolasi  Bakteri Penghasil Enzim Protease Alkalin
Termostabil.  Buletin  Plasma  Nutfah.
Vol.9 No.2.
[3]. Muchtadi,  S.,  Nurleni  & Made.  1992. Enzim  dalam  Industri  Pangan.  Institut Pertanian Bogor. Bandung.
[4]. Huang, G., Ying, T., Huo, P. & Jiang, J. 2006. Purification and characterization of a  protease from  thermophilic Bacillus strain HS08. Biotechnol. 5:2433-2438.
[5]. Kurniawati,  W.    2008.  Implementasi hasil penelitian Biologi. Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas  Sebelas  Maret.  Surakarta. Skripsi. [6]. Gunroro,  S.,  Yasa,  I.  M.  D.  R.,  Suyasa, N.  &  Parwati,  I.  A.  P.  2000.  Pengaruh Penggunaan Enzim Terhadap Produktivitas Telur Ayam Buras. Seminar Nasional Peternakan dan
Veteriner.
[7]. Siregar,  S.  1995.  Sapi  Perah:  Jenis, Teknik Pemeliharaan dan Analisis Usaha. Penebar Swadaya: Jakarta.
[8]. Damayanthi, E., Tjing, L. T. & Arbianto, L.  2007.  Rice  Bran.  Panebar  Swadaya. Depok.
[9]. Cappuccino, J. G. 1983. Microbiology: A Laboratory  Manual.  Addison-Wesley: USA.
[10]. Amelia,  G.,  Rini,  H.,  Iwan,  S.,  Tatik,  K. & Abdul, C. 2005. Isolasi  dan pengujian aktivitas  enzim  amilase  dan  protease mikroba  terasi  asal Kalimantan  Timur. Laporan  Teknik.  Bidang  Mikrobiologi. Pusat Penelitian Biologi-LIPI. Bogor.
[11]. Chang,  Chin-I.,  Wen-Yu  Liu  &  Chung- Zen  Shyu.  2000.  Use  of  prawn  blood agar  hemolysis  to  screen  for  bacteria pathogenic  to  cultured  tiger  prawns Penaeus  monodon. Dis  Aquat  Org.
43:153 – 157.
[12]. Saxena, R. & Singh, R. 2011. Characterization  of  a  metallo-protease produced in solid state fermentation by a newly  isolated Bacillus strain. Acta
Biologica Szegediensis. 55(1):13-18.
[13]. Enggel,  J.,  Meriandini,  A. &  Natalia,  L.
2004. Karakterisasi protease ekstraseluler Clostridium bifermentans R14-1-b.
Jurnal Mikrobiologi  Indonesia. 9(1):  9-
12.
[14]. Widhyastuti,  N.  &  Dewi,  R.  M.  2001. Isolasi  bakteri  proteolitik  dan  optimasi produksi protease. Laporan Teknik Proyek  Inventarisasi  dan  Karakterisasi Sumberdaya  Hayati.  Pusat  penelitian Biologi. LIPI.
[15]. Port,  T.  2008.  Blood  Agar  (BAP)
Bacterial  Growth  Medium  Differential
Medium to Identify β -hemolytic
Streptococcus. http://suite-101.com/. Diakses tanggal 02 Januari 2013. [16]. Marlina. 2009. Identifikasi bakteri Vibrio parahaemolitycus dengan  metode biolog dan  deteksi  gen ToxR nya  secara  PCR. Jurnal  Sains  dan  Teknologi  Farmasi.
Vol. 13. No. 1.
[17]. Yunita,  S.  P.  2012. Skrining dan  Uji Aktivitas  Enzim Protease Bakteri  dari Limbah  Rumah  Pemotongan  Hewan. Biologi.  Fakultas  Sains  dan  Teknologi.
Universitas Airlangga. Jurnal Skripsi.
[18]. Lidya & Djenar. 2000.  Dasar  Bioproses Direktorat  Pembinaan  dan  Fenolinin  dan Pengabdian Masyarakat Direktorat
Jenderal Pendidikan  Tinggi.  Departemen Pendidikan Nasional: Jakarta.
[19]. Maurer, K. 2004. Cur. Opin. Biotechnol. 15:330-334.
[20]. Pakpahan,  R.  2009. Isolasi  Bakteri  dan Uji Aktivitas Bakteri Protease Termofilik dari  Sumber  Air  Panas  Sipoholon Tapanuli Utara  Sumatera  Utara.  Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara.
Tesis.
[21]. Pelczar, M. J.  & Chan, E. C. S. 2005. Dasar-dasar  Mikrobiologi. Jakarta:  UI- Press.
[22]. Pratiwi, S. T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga: Jakarta.