ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 12 (3) (2009) : 66 – 71
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi Bakteri Termofilik Sumber Air Panas Gedongsongo dengan Media Pengaya Minimal YT (Yeast Tripton) serta Identifikasi

## Genotipik dan Fenotipik
Annisa Rachma a , Purbowatiningrum Ria Sarjono a* , Agustina L. N. Aminin a
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: purbowatining@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o

## A b s t r a c t
Keywords:
Thermophilic, DNA isolation, extracelullar enzymes The  exploration  of  novel  microorganisms  is  important  because  of  their  enormous potentials  as  source  of  biomolecules,  for  example  enzymes,  antimicrobial,  anticancer, bioremediation  agents,  and  biofuel  resources.  Up  until  now,  less  than  1  %  bacteria  in nature  are  cultivated.  The  industrial  demands  toward  biomolecules  that  can  stand  in extreme conditions are increased. One of biomolecule potential sources is thermophilic bacteria.  Indonesia  has  a  number  of  geothermic  regions,  however,  the  exploration  of thermophilic bacteria from Indonesian hot spring is very limited. The purposes of this research  are  to  isolate  the  thermophilic  bacteria  from  Gedong  Songo  hot  spring  using minimal YT ( Yeast Tripton) medium in anaerobic condition and analyzing the genotyphic and phenotypic character of the isolate. The thermophilic bacteria from Gedong Songo hot springs has been isolated using minimal YT medium in  anaerobe condition, named the isolate of GS YTan. The bacterial identification has been carried out within genotyphic and phenotypic characters. The genotyphic character has been analyzed based on nucleotide sequences of 16S rRNA gene. The phenotypic natures are analyzed toward morphological test  using  gram  staining  and  microscopic  method.  Besides,  the  isolate  of  GS  YTan  is analyzed  potential  extracellular  thermostable  enzymes,  include  amylase,  protease, β - galactosidase,  and  cellulase.  This  research  successfully  isolate  thermophilic  anaerobe bacteria, namely the isolate of GS YTan. This isolate has characteristic bacilli and gram positive.  Based  on  genotypic  nature,  the  isolate  of  GS  YTan  has  high  homology  with Anoxybacillus sp. groups with similarity rates about 97-99 %. This isolate has the closest relation  with Anoxybacillus  sp.  AF/04 and Anoxybacillus  sp.  HT14 .  This  isolate  also  has potential  extracellular  thermostable  enzymes,  include  amylase,  protease,  and β - galactosidase.

## A b s t r a k
Kata kunci: termofilik, isolasi DNA, enzim ekstraseluler Eksplorasi  mikroorganisme  baru  merupakan  suatu  hal  yang  penting,  karena mikroorganisme mempunyai potensi yang sangat luas sebagai sumber biomolekul baru seperti enzim, antimikroba, antikanker, agen bioremediasi, dan penghasil bahan bakar hayati.  Hingga  saat  ini,  kurang  dari  1%  bakteri  di  alam  yang  berhasil  dikultivasi. Kebutuhan industri terhadap biomolekul yang tahan terhadap kondisi ekstrem sangatlah tinggi. Salah satu sumber biomolekul yang potensial adalah bakteri termofilik. Indonesia kaya akan habitat termofilik, khususnya sumber air panas, namun eksplorasinya masih sangat  terbatas.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  isolat  tunggal  bakteri termofilik dari sumber air panas Gedong Songo dengan media minimal YT ( Yeast Tripton) dalam  kondisi  anaerob  serta  melakukan  identifikasi  bakteri  termofilik  tersebut  secara genotipik dan fenotipik. Pada penelitian ini dilakukan isolasi bakteri  termofilik sumber
air panas Gedongsongo dengan media pengaya minimal YT pada kondisi anaerob serta identifikasi  bakteri  secara  genotipik  dan  fenotipik.  Identifikasi  genotipik  dilakukan dengan  menggunakan  analisis  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA.  Identifikasi  fenotipik dilakukan melalui uji morfologi meliputi uji pewarnaan gram dan uji mikroskop. Selain itu dilakukan uji potensi enzim ekstraseluler termostabil, meliputi amilase, protease, β - galaktosidase,  dan  selulase. Hasil  penelitian  diperoleh  isolat  tunggal bakteri  termofilik anaerob  yang  diberi  nama  isolat  GS  Ytan,  dengan  karakteristik  bentuk  batang,  gram positif, dan memiliki kemiripan dengan bakteri kelompok Anoxybacillus sp. dengan tingkat kekerabatan  sebesar  97-99  %.  Isolat  GS  YTan  memiliki  hubungan  terdekat  dengan Anoxybacillus sp. AF/04 dan Anoxybacillus sp. HT14. Isolat GS YTan memiliki potensi enzim ekstraseluler termostabil amilase, protease dan β -galaktosidase.

## 1. Pendahuluan
Eksplorasi  mikroorganisme  baru  merupakan  suatu hal  yang  penting  karena  mikroorganisme  mempunyai potensi yang sangat luas sebagai sumber biomolekul baru seperti enzim, antimikroba, antikanker, agen bioremediasi, dan penghasil bahan bakar hayati. Namun hingga  saat  ini,  eksplorasi  mengenai  mikroorganisme terutama  bakteri  masih  sangat  sedikit,  kurang  dari  1% bakteri di alam yang telah terkultivasi [1].
Kebutuhan industri terhadap biomolekul yang tahan kondisi  ekstrem  sangatlah  tinggi.  Hal  ini  karena kebanyakan  biomolekul  (misalnya  enzim)  tidak  dapat bertahan pada temperatur tinggi [2]. Berdasarkan alasan tersebut,  perlu  dilakukan  eksplorasi  biomolekul  yang bersumber dari organisme termofilik.
Bakteri  termofilik  merupakan  bakteri  ekstremofil yang  mampu  bertahan  hidup  pada  suhu  tinggi  [3]. Bakteri  termofilik  dapat  ditemukan  di  sumber  mata  air panas,  kawah  gunung  berapi,  serta  gunung  api  bawah laut [4]. Indonesia merupakan salah satu daerah tektonik di  dunia  dengan  lebih  dari  70  gunung  tektonik  aktif sebagai  salah  satu  habitat  hidup  bakteri  termofilik. Namun, eksplorasi dan publikasi bakteri termofilik yang berasal  dari  Indonesia  masih  sangat  terbatas  [5]. Beberapa bakteri temofilik yang telah berhasil diisolasi di Indonesia antara lain Bacillus thermophilus isolat BTC16 dari sumber air panas Cimanggu Bandung Jawa Barat [6] dan  Thermoanaerobacter  yonseiensis  sp.  strain  KB-1 yang diisolasi dari sumber air panas Sileri [7].
Aminin ,  dkk. [5]  telah  berhasil  mengidentifikasi adanya  bakteri-bakteri  baru  khas  sumber  air  panas Gedongsongo dengan menggunakan metode pendekatan minimal  media  dan  dalam  kondisi  anaerob.  Namun seluruhnya  masih  dalam  bentuk  kultur  campuran  dan belum diketahui potensinya, oleh karena itu diperlukan upaya  mengisolasi  untuk  mendapatkan  isolat  tunggal dan  menentukan  potensinya.  Pada  penelitian  ini dilakukan isolasi bakteri termofilik dari sumber air panas Gedongsongo  menggunakan  media  minimal  YT  (Yeast Tripton)  secara  anaerob  dan  identifikasi  jenis  bakteri termofilik menggunakan analisis urutan nukleotida gen 16S rRNA dan konstruksi pohon filogenetiknya. Selain itu dilakukan  identifikasi  fenotipik  melalui  uji  pewarnaan gram  serta  identifikasi  potensi  enzim  termostabil ekstraseluler meliputi amilase, protease,  - galaktosidase, dan selulase.

## 2. Metodologi Penelitian

## Alat
Alat-alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini meliputi  aotuklaf,  cawan  petri,  corong  gelas, Fotomikrograf, gelas beker, inkas, inkubator, jarum ose, kaca  preparat,  kertas  pH  indikator,  labu  erlenmeyer, Laminar  Air  Flow,  lampu  spiritus,  lemari  pendingin, Mesin  Gene  Amp  PCR  System  2400  (Perkin  Elmer), mikrosentrifus  (Hettich  Zentrifugen  Micro  200R), Mikroskop,  mikrotube,  neraca  analitik,  pipet  mikro, tabung reaksi bertutup, dan UV Transiluminator.

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah akuabides, akuades, bacto agar, buffer TBE (Tris Borat  EDTA),  CMC,  ekstrak  ragi,  etanol  70%,  etanol absolut,  EtBr  (etidium  bromida),  gelatin,  gel  agarosa, isoamil alkohol, isopropanol, kloroform, laktosa, larutan Iodin  dalam  KI,  larutan  kristal  violet,  MMB  (Mega  Mix Blue) PCR kit, NaCl, natrium EDTA, natrium fosfat, pati, primer  8-27F,  primer  1492R,  proteinase  K,  safranin, sampel  dari  sumber  air  panas  Gedongsongo,  SDS, tripton, Tris-HCl.

## Pembiakan Bakteri
Air  sampel  dibiakkan  dalam  media  minimal menggunakan  media  pengaya  YT.  Kultivasi  dilakukan pada  suhu  55  oC  dan  dalam  kondisi  anaerobik  (kondisi tanpa oksigen) dengan cara media biakkan ditempatkan pada  tabung  reaksi  bertutup,  kemudian  dimasukkan  ke dalam  wadah  tertutup  yang  berisi  nyala  lilin  (simple candle  jar  methode).  Inkubasi  dihentikan  saat  timbul kekeruhan. Kultur yang telah tumbuh kemudian diisolasi untuk mendapatkan koloni tunggal.

## Isolasi DNA Kromosom
DNA  diisolasi  menggunakan  metode  Zhou  yang dimodifikasi  [8] .  Pellet  sel  dicampur  dengan  300  μL larutan ekstraksi DNA (100 mM Tris-HCl [pH 8], 100 mM natrium EDTA [pH 8], 100 mM natrium fosfat [pH 8] dan 1,5  M NaCl). Larutan  kemudian ditambah  dengan 10  μL proteinase  K  (20  mg/mL)  dan  pasir  steril,  kemudian digojog  selama  10  menit.  Langkah  selanjutnya  adalah penambahan 30 μL SDS (Sodium Dodesil Sulfonat) 20 % dan  sampel  diinkubasi  pada  suhu  60  oC  selama  1  jam dengan  digojog  setiap  10-20  menit.  Supernatan  yang dikumpulkan  setelah  sentrifugasi  dengan  kecepatan
5000 rpm selama 10 menit pada temperatur kamar dan dipindahkan  ke  dalam  mikrotube  baru.  Supernatan ditambahkan  kloroform-isoamil  alkohol  (24:1,  v/v) sejumlah volume yang sama dengan volume supernatan, kemudian disentrifugasi pada 5000 rpm selama 10 menit pada temperatur ruang. Penambahan kloroform-isoamil alkohol  diulangi  sampai  3  kali  pengulangan  (triplo). Supernatan dikumpulkan dan dipindahkan ke mikrotube baru  untuk  selanjutnya  ditambahkan  isopropanol sejumlah volume yang sama dengan volume supernatan, lalu didiamkan selama 15 menit pada temperatur ruang. Setelah  didiamkan,  supernatan  disentrifugasi  dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada temperatur kamar.  Endapan  hasil  sentrifugasi  diambil  dan  dicuci dengan etanol 70% dingin, kemudian dicampur kembali dengan  akuabides,  untuk  memperoleh  volume  akhir 50 μL.

## Amplifikasi Fragmen Nukleotida Gen 16S rRNA
Sampel DNA yang diperoleh dari proses isolasi DNA menggunakan metode Zhou [8] selanjutnya diamplifikasi  gen  16S  rRNAnya  secara  in  vitro  dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Gen 16S rRNA diamplifikasi  menggunakan  1  set  primer  27F-1492R. Pasangan  primer:  5’  AGAGTTTGATCCTGGCTCAG  3’ (posisi 8- 7, penomoran E. coli) dan 5’ GGTTACCTTGTTACGACTT  3’  (posisi  1492,  penomoran urutan basa E. coli). PCR dikerjakan menggunakan DNA Taq  polimerase.  Pada  5  L  sampel  hasil  ekstraksi  DNA ditambahkan 43  L MMB (Mega Mix Blue) PCR kit, 1  L primer  8-27F,  dan  1  L  primer  1492R.  Amplifikasi dilakukan dalam 30 putaran. Temperatur dan waktu PCR yang diatur adalah denaturasi pada suhu 94 oC selama 45 detik,  annealing  pada  suhu  54  oC  selama  30  detik,  dan extension primer pada suhu 72 oC selama 2 menit. Pada akhir extention putaran 30, suhu PCR diturunkan secara drastis hingga 4 o C.

## Elektroforesis Gel Agarosa
Gel  agarosa  (1  %)  dibuat  dengan  melarutkan  0,2 gram agarosa ke dalam buffer TBE (Tris Borat EDTA) 5X hingga volume 20 mL lalu dididihkan. Proses selanjutnya yaitu penambahan EtBr (Etidium Bromida) ke dalam gel dan  gel  dimasukan  ke  dalam  cetakan  yang  sudah terpasang sisir untuk membuat sumur-sumur gel (well). Gel  yang  telah  memadat  dimasukkan  ke  dalam  alat elektroforesis  dan  direndam  dengan  buffer  TBE. Sejumlah  5  L  unit  DNA  hasil  amplifikasi  kemudian dimasukkan  kedalam  sumur  gel.  Elektroforesis  dimulai dengan arus 400 mA dan tegangan 100 V dan dihentikan apabila  perpindahan  sampel  telah  sampai  pada  batas yang  ditentukan.  Gel  hasil  elektroforesis  diamati  di bawah sinar UV menggunakan UV Transiluminator.

## Analisis Sekuensing
Fragmen  DNA  hasil  PCR  disekuensing  untuk menentukan urutan nukleotidanya. Sekuensing dilakukan  di  Korea  oleh  Macrogen  Sequencing  Service menggunakan ABI PrismR 3100 Genetic Analyzer.
Hasil sekuensing diperoleh berupa urutan nukleotida  DNA  yang  masing-masing  diterjemahkan menggunakan  2  buah  primer,  yaitu  primer  8-27R  dan
1492F.  Urutan  nukleotida  hasil  sekuensing  disambung menggunakan program EditSeq menghasilkan keluaran berupa  file  yang  akan  dimasukkan  ke  dalam  program SeqMan  (kedua  program  tersebut  terdapat  dalam program  DNASTAR).  Hasil  keluaran  program  SeqMan berupa  urutan  nukleotida  yang  utuh  untuk  selanjutnya dibandingkan dengan data base GenBank dan dilakukan studi Filogeni.

## Studi Filogeni
Urutan  nukleotida  hasil  sekuensing  dibandingkan dengan  data  base  GenBank  menggunakan  program BLASTN  pada  Website  NCBI  (National  Center  for Biotechnology  Information).  Perbandingan  urutan nukleotida  hasil  sekuensing dengan  data  base GenBank kemudian dijajarkan menggunakan program CLUSTAL W dan diperoleh hasil keluaran dalam format aln dan phy dengan  file  keluaran  dalam  format  phy  akan  dilakukan analisis  selanjutnya  menggunakan  program  Phylip (Phylogeni  Inference  Package)  3.68  ed.  Program  Phylip 3.68  ed.  yang  digunakan  untuk  menganalisis  urutan nukleotida adalah seqboot, dnapars dan consense. Hasil keluaran  program  Phylip  3.68  berupa  file  newick  yang akan dimasukkan kedalam website Phylodendron. Hasil keluaran  program  Phylodendron  berupa  pohon filogenetik.

## Uji Pewarnaan Gram
Kaca  preparat  dibersihkan  dengan  menggunakan alkohol  kemudian  dipanaskan  di  dekat  nyala  api.  Isolat bakteri  diteteskan  di  atas  kaca  preparat,  kemudian dipanaskan  di  dekat  nyala  api  hingga  isolat  bakteri kering.  Langkah  selanjutnya  yaitu  penetesan  larutan kristal ungu pada isolat bakteri, lalu didiamkan selama 1 menit, dicuci dengan akuades mengalir dan dikeringkan di  dekat  nyala  api.  Hasil  pewarnaan  kristal  ungu diteteskan  larutan  iodin,  didiamkan  selama  1  menit, dicuci dengan akuades mengalir dan dikeringkan di dekat nyala  api.  Hasil  pewarnaan  iodin  diteteskan  dengan etanol  absolut,  didiamkan  selama  15-30  detik,  dicuci dengan akuades mengalir dan dikeringkan di dekat nyala api.  Langkah  terakhir,  hasil  pewarnaan  dengan  etanol absolut  ditetesi  dengan  safranin,  didiamkan  selama  2 menit, dicuci dengan akuades mengalir, dan dikeringkan di dekat nyala api. Setelah kering, hasil pewarnaan gram di amati dibawah mikroskop.

## Identifikasi Enzim Amilase Termostabil
Identifikasi  enzim  amilase  dilakukan  dengan membuat  media  agar  yang  ditambahkan  dengan  pati, kemudian dituang ke dalam cawan petri dan didiamkan hingga  memadat.  Isolat  bakteri  diteteskan  pada  media yang  telah  memadat  kemudian  diinkubasi  pada  suhu 55°C. Inkubasi dilakukan hingga tumbuh koloni bakteri. Media yang telah ditumbuhi bakteri kemudian digenangi dengan larutan iodin dan didiamkan sekitar 1 menit agar iodin bereaksi.

## Identifikasi Enzim Protease Termostabil
Isolat  bakteri  diinokulasikan  ke  dalam  media  agar yang  sudah  ditambahkan  gelatin,  kemudian  diinkubasi pada  suhu  55°C.  Inkubasi  dilakukan  hingga  timbul
kekeruhan. Hasil inkubasi kemudian disimpan di lemari es selama 24 jam.
Identifikasi enzim  - Galaktosidase Termostabil
Identifikasi  enzim  -  Galaktosidase  dilakukan dengan menginokulasikan bakteri ke dalam media yang sudah  ditambahkan  dengan  laktosa,  kemudian diinkubasi  hingga  timbul  kekeruhan  yang  merupakan tanda  telah  tumbuhnya  bakteri.  Setelah  diinkubasi,  ke dalam  media  ditambahkan  larutan  ONPG,  kemudian diinkubasi kembali selama 5 jam.

## Identifikasi enzim Selulase Termostabil
Identifikasi  enzim  selulase  dilakukan  dengan menginokulasikan  bakteri  ke  dalam  media  agar  yang sudah  ditambahkan  dengan  CMC,  kemudian  diinkubasi pada  suhu  55  oC.  Inkubasi  dilakukan  hingga  tumbuh koloni bakteri. Media hasil inkubasi kemudian digenangi dengan  larutan  Congo  red  selama  20  menit,  kemudian dicuci  dengan  larutan  NaCl.  Adanya  aktivitas  enzim selulase  ditandai  dengan  terbentuknya  zona  bening  di sekitar koloni bakteri.

## Pengaruh Waktu Karbonisasi terhadap Sintesis Porous Carbon
Pengambilan  pelet  yang  belum  dikarbonisasi sebelumnya,  kemudian  ditimbang  masing-masing beratnya  dan  dimasukkan  ke  dalam  furnace  yang  telah dialiri dengan gas nitrogen, variasi waktu yang dilakukan adalah  30  menit,  60  menit,  90  menit,  120  menit,  150 menit  dan  180  menit.  Hasil  karbonisasi  kemudian diambil,  ditimbang  dan  dianalisis  dengan  Scanning Electron Microscopy (SEM) dan Bruanuer Emmet Teller (BET).

## Uji Adsoptivitas Porous Carbon Hasil Sintesis
Pengambilan  masing-masing  0,1  gram  porous carbon hasil karbonisasi dengan variasi waktu 30 menit, 60 menit, 90 menit, 120 menit, 150 menit dan 180 menit. Kemudian  dimasukkan  ke  dalam  cawan  porselin  dan dilakukan pengovenan dalam temperatur 120°C selama 1 jam,  hasil  pengovenan  kemudian  ditimbang  dan diletakkan  ke  dalam  desikator  yang  sudah  diletakkan cawan  porselin  berisi  benzena  di  dalamnya  dan didiamkan  selama  24  jam  di  dalam  desikator  tersebut. Porous  carbon  yang  sudah  mengadsopsi  benzena tersebut kemudian ditimbang.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Isolat  tunggal  bakteri  termofilik  (isolat  GS  YTan) diidentifikasi  secara  genotipik  berdasarkan  urutan nukleotida  gen  16S  rRNA.  Untuk  keperluan  tersebut dilakukan isolasi DNA kromosom menggunakan metode Zhou [8] yang dimodifikasi.
Isolasi DNA kromosom menggunakan metode Zhou [8], pemecahan dinding sel dilakukan secara fisik dengan penambahan  pasir  steril,  dan  kimiawi  dengan penambahan larutan pelisis dinding sel, proteinase K dan SDS.
Proses  selanjutnya  adalah  pemurnian  DNA.  Proses pemurnian DNA dilakukan dengan ekstraksi menggunakan kloroform-isoamil alkohol. Penambahan kloroform-isoamil  alkohol  mengakibatkan  denaturasi protein,  namun  proses  ini  tidak  akan  mendenaturasi DNA. DNA akan terlarut dalam lapisan yang lebih polar (lapisan  isoamil  alkohol)  sesuai  prinsip  pelarutan, like dissolves  like .  Selain  itu  isoamil-alkohol  juga  berfungsi mengurangi pembentukan busa selama proses ekstraksi [9].
Supernatan  yang  mengandung  DNA  didalamnya akan  diendapkan  DNA  nya  dengan  penambahan isopropanol.  DNA  yang  mengendap  dibersihkan  dari pengotor-pengotornya dengan penambahan etanol.
DNA  yang  telah  diisolasi  dari  isolat  GS  YTan kemudian  diamplifikasi  (digandakan)  gen 16S  rRNAnya menggunakan  metode  PCR.  Templat  DNA  yang  akan digandakan  dibatasi  oleh  sepasang  primer  (8-27F  dan 1492R).  Primer  akan  membatasi  amplifikasi  gen  16S rRNA pada posisi nukleotida 8-27 dan 1492-1510 sesuai penomoran E. coli .
Fragmen  DNA  hasil  amplifikasi  (amplikon) dianalisis  menggunakan  metode  elektroforesis  gel agarosa. Prinsip elektroforesis adalah memisahkan DNA berdasarkan perbedaan ukuran oleh medan listrik [9].
Fragmen gen 16S rRNA kemudian disekuensi untuk menentukan urutan nukleotidanya menggunakan primer 8-27F  dan  1492R  menghasilkan  dua  potong  urutan nukleotida.  Potongan  nukleotida  tersebut  kemudian disambung menggunakan program EditSeq dan SeqMan yang  terdapat  pada  program  DNASTAR  menghasilkan urutan  keseluruhan  nukleotida  gen  16S  rRNA  isolat  GS YTan.
Urutan  nukleotida  isolat  GS  YTan  kemudian dibandingkan  dengan  data base  GenBank pada  website NCBI  menggunakan  BLASTN.  Dari  data  BLASTN diperoleh  data  perbandingan  nukleotida  dengan  99 spesies  pembanding  dengan  tingkat  homologi  sebesar 97-99 % seperti ditunjukkan pada tabel 1.
Mayoritas  bakteri  pembanding  berasal  dari kelompok Anoxybacillus sp., sebagian kecil lainnya berasal dari  kelompok Geobacillus,  sp. , Uncultured  bacterium, Thermal  soil  bacterium,  dan  Bacillus,  sp. .  Data  urutan nukleotida dengan pembandingnya kemudian dijajarkan menggunakan  program  Clustal  W  untuk  digunakan merekonstruksi pohon filogenetik.
Gambar 1 Urutan keseluruhan nukleotida  gen 16S rRNA isolat GS Ytan

## Tabel 1 Sebagian Hasil Perbandingan Nukleotida dengan Metode BLASTN
Gambar 2 Pohon filogeni Isolat GS YTan mengunakan metode parsimony dalam bentuk tree diag. Bakteri yang memiliki kekerabatan sangat dekat (biru), bakteri yang memiliki kekerabatan cukup dekat (hitam)
Konstruksi pohon filogenetik dilakukan
menggunakan  program  Phylip  ( Philogeny  Inference Package )  3.68  ed.  dengan  metode parsimony .  Pohon filogeni  yang  dihasilkan  menunjukkan  kekerabatan isolat GS YTan dengan 99 spesies lainnya.
Berdasarkan pohon filogeni dari 100 spesies bakteri tersebut  dipilih  24  spesies  bakteri  yang  memiliki kekerabatan  terdekat  dengan  isolat  GS  YTan  untuk dibandingkan lebih lanjut dan dihasilkan pohon filogeni yang lebih spesifik dari 25 spesies bakteri.
Berdasarkan hasil uji pewarnaan gram, isolat GS YT an  merupakan  bakteri  yang  berbentuk  batang  ( bacilli ) dan gram positif . hal ini terlihat dari terbentuknya warna ungu  pada  akhir  pewarnaan  gram.  Warna  ungu  yang dihasilkan merupakan hasil pewarnaan dari kristal violet yang diperjelas dengan adanya iodin. Pemberian pewarna kristal ungu dan iodin akan membentuk kompleks kristal ungu-iodin  yang  terjerap  pada  lapisan  peptidoglikan. Penambahan  etanol  absolut  hanya  akan  mendehidrasi sedikit  lapisan  peptidoglikan  dan  menyebabkan  pori peptidoglikan mengkerut sehingga mencegah terlepasnya  kompleks  kristal  ungu-iodin.  Pemberian safranin  tidak  memberikan  pengaruh  apa-apa,  karena dinding sel tetap berwarna ungu [10].
Berdasarkan  identifikasi  enzim  ekstraseluler termostabil,  isolat  GS  YTan  memiliki  potensi  enzim amilase, protease dan  -galaktosidase. Namun, isolat GS YTan tidak memiliki potensi enzim selulase.

## 4. Kesimpulan
Isolat tunggal bakteri termofilik anaerob yang diberi mana isolat GS YTan yang memiliki karakteristik bentuk batang,  gram  positif,  dan  memiliki  kemiripan  dengan bakteri  kelompok Anoxybacillus  sp. dengan  tingkat kekerabatan sebesar 97-99 %. Isolat GS YTan memiliki hubungan  terdekat  dengan Anoxybacillus  sp.  AF/04 dan Anoxybacillus  sp.  HT14. Isolat  GS  YTan  memiliki  potensi enzim ekstraseluler termostabil amilase, protease dan β - galaktosidase.

## 5. Daftar pustaka
[1]  Rudolf  I.  Amann,  Wolfgang  Ludwig,  Karl-Heinz Schleifer,  Phylogenetic  identification  and  in  situ detection  of  individual  microbial  cells  without cultivation, Microbiological reviews, 59 (1995) 143- 169.
[2]  Michael  T  Madigan,  John  M  Martinko,  Jack  Parker, Biology  of  microorganism,  Prentice  Hall,  England, 1997.
[3]  Sarah  Maloney,  Extremophiles,  Bioprospecting  For Antimicrobials,  in,  International  Medical  Press, Carleton College, 2002.
[4]  S.M.  Friedman,  Biochemistry  of  thermophily, Academic Press, 1978.
[5]  Agustina  Lulustyaningati  Nurul  Aminin,  Fida Madayanti Warganegara, Pingkan Aditiawati, Simple enrichment  and  independent  cultures  to  expand bacterial community analysis from gedongsongo hot
spring, Journal of bioscience and bioengineering, 106 (2008) 211-214.
[6]  I.N  Tika,  Studi  Biokimia  Enzim  DNA  Poilmerase Termostabil Dari Bakteri Termofilik Isolat Lokal, in, ITB Central Lab, Bandung, 2005.
[7]  Byoung-Chan  Kim,  Ralf  Grote,  Dong-Woo  Lee, Garabed
Antranikian, Yu-Ryang Pyun, Thermoanaerobacter  yonseiensis  sp.  nov.,  a  novel extremely thermophilic, xylose-utilizing bacterium that  grows  at  up  to  85  degrees  C,  International journal of systematic and evolutionary microbiology, 51 (2001) 1539-1548.
[8] Jizhong Zhou, Mary Ann Bruns, James M Tiedje, DNA recovery from soils of diverse composition, Applied and environmental microbiology, 62 (1996) 316-322.
[9] J Sambrook, Molecular cloning: a laboratory manual- /Joseph Sambrook, David W. Russell;[assoc. ed.: Nina Irwin, Kaaren A. Janssen], (2001).
[10]  K  Todar,  Todar's  Online  Textbook  of  Bacteriology. University  of  Wisconsin-Madison  Department  of Bacteriology.  Retrieved  September  27,  2005,  in, 2004.