Aktivitas Antagonis Bakteri yang Berasosiasi dengan Teritip ( Balanus sp.) terhadap Bakteri Escherichia coli dan Bacillus cereus
Gita Wismayanti, Sri Sedjati dan Agus Trianto *
Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedharto, SH, Tembalang Semarang Jawa Tengah 50275 Email: agustrianto.undip@gmail.com
Abstract
Antagonistic Activity of The Barnacle (Balanus sp.) Symbiotic Bacteria Against Escherichia coli and

## Bacillus cereus
Marine invertebrates are the most productive source of bioactive compounds.  However, most  of  the  compounds  originally  produced  by  the  microorganisms  living  associated  with  the invertebrates.  Barnacle is an invertebrate that has a unique interaction with bacteria. Escherichia coli and Bacillus cereus are the cause of the foodborne disease that causes of remarkedly losses in the food industry.  The barnacle was collected from Panjang Island, Jepara.  The bacterial isolates were obtained by serial dilution followed by isolation based on morphological characteristics.  The antagonistic assay to E. coli dan B. cereus was utilized for screened the isolates.  Then, the active isolates  were  cultured  for  the  further  test  with  the  disc  diffusion  agar  method  of  the  supernatant followed by the extracts.  The most active isolates were identified based on molecular method.  A total of 14 isolates were obtained from the Balanus sp., which six of them have activity against the E. coli and B. cereus.  The isolates TJ 5.4 and TJ 5.5 have the strongest activity the bacteria.  Base on the  analyses  of  the  BLAST  and  phylogenetic  tree  the  isolates  showed  99%  homology  the  Bacillus wiedmannii (TJ 5.4) and Lysinibacillus macroides (TJ 5.5).
Keyword: Associate bacteria; Balanus sp.; foodborne; antibacterial

## Abstrak
Invertebrata  laut  merupakan  salah  satu  sumber  bahan  bioaktif  yang  paling  produktif. Sebagian  senyawa  yang  terdapat  dalam  biota  laut,  sejatinya  diproduksi  oleh  mikroorganisme yang  hidup  berasosiasi  dengan  biota  laut  tersebut.    Teritip  merupakan  salah  satu  hewan invertebrata  yang  memiliki  berbagai  interaksi  unik  dengan  bakteri.  Bakteri  Escherichia  coli  dan Bacillus  cereus  merupakan  dua  dari  beberapa  bakteri  patogen  yang  sering  menjadi  agen penyebab foodborne disease.  Teritip dikoleksi dari Pulau Panjang, Jepara. Isolat bakteri diperoleh dengan  metoda  pengenceran  bertingkat  dan  dilanjutkan  isolasi  berdasarkan  karakteristik morfologis.  Uji antagonis terhadap  E. coli dan  B. cereus digunakan  untuk menskrining bioaktivitas isolat.  Isolat yang aktif dikultur untuk uji lanjut yaitu supernatant dan dilanjutkan ekstraknya dengan metoda  disc  diffusion  agar.    Bakteri  yang  paling  aktif  diidentifikasi  secara  molekuler  untuk mengetahui  spesiesnya.    Sebanyak  14  isolat  bakteri  diperoleh  dari  Balanus  sp.  dimana  enam diantaranya memiliki aktivitas terhadap bakteri uji.  Isolat TJ 5.4 dan TJ 5.5 memiliki aktivitas paling kuat  terhadap  E.  coli  dan  B.  cereus.  Berdasarkan  pengolahan  sekuen  dan  analisis  pohon filogenetik, dua isolat bakteri tersebut memiliki homologi 99% terhadap bakteri Bacillus wiedmannii (TJ 5.4) dan Lysinibacillus macroides (TJ 5.5).
Kata kunci : Bakteri Simbion; Balanus sp.;  foodborne; Uji Antagonis

## PENDAHULUAN
Invertebrata  laut  merupakan  sumber senyawa  bioaktif  utama  dari  ekosistem  laut
(Janakiram et al ., 2015).
Tingginya keanekaragaman invertebrata laut di kawasan Indo-Pasifik menjadi salah satu daya Tarik bagi peneliti dalam pencarian senyawa
Jurnal Kelautan Tropis Maret 2019 Vol. 22(1):49-56
bioaktif.  Namun  demikian,  senyawa  bioaktif yang terdapat pada hewan invertebrata laut umumnya  terdapat  dalam  konsentrasi  yang rendah  (Radjasa et  al .,  2007,  Trianto et  al , 2011).  Hal  ini  menjadi  masalah  yang  utama dalam pengembangan senyawa bioaktif dari alam untuk menjadi obat.
Pada  saat  ini  banyak  peneliti  yang yang  mengeksplorasi    bahan  bioaktif  dari mikroorganisme  yang  hidup  berasosiasi dengan  invertebrata  (Habbu et  al .,  2016). Teritip  merupakan  salah  satu  hewan invertebrata yang memiliki berbagai interaksi terhadap  bakteri  simbion  yang  terdapat pada tubuhnya. Berdasarkan penelitian yang dilakukan  oleh  De  Gregoris et  al .  (2012), menunjukan  bahwa  bakteri  yang  terdapat pada  teritip  memiliki  peran  terbanyak  pada proses  penempelan  teritip  pada  substrat dibandingkan  dengan  bakteri  biofilm  pada substrat  batu.  Larva  teritip  diduga  dapat mendeteksi  biofilm  mikroba  yang  memiliki keterkaitan  parental  dan  menggunakan informasi  ini  untuk  menetap  dekat  dengan anggota spesiesnya sendiri.
Bakteri Escherichia  coli dan Bacillus cereus merupakan  dua  dari  beberapa bakteri  patogen  yang  sering  menjadi  agen penyebab  penyakit  bawaan  makanan (foodborne  disease)  (Wang et  al .,  2015). Escherichia  coli dan Bacillus  cereus adalah bakteri  yang  berbeda  gram. Escherichia  coli merupakan  bakteri  gram  negatif    (Scherrer, 1984),  sedangkan Bacillus  cereus adalah bakteri  gram  positif  (Griffiths  dan  Schraft, 2017). Seleksi kedua bakteri  tersebut didasarkan  atas  adanya  perbedaan  gram untuk mengetahui
klasifikasi
aktivitas antagonis
dari senyawa antibakteri
berdasarkan kemampuanya dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen yang  berbeda  gram  (Waluyo,  2007). Kontaminasi  mikrobiologis  oleh  bakteri E.  coli dan B.  cereus menyebabkan  terjadinya proses pembusukan pada makanan dengan cara membentuk formasi  biofilm. Keterikatan potensi pembusukan dan bakteri patogen ke permukaan  makanan  dan  formasi  biofilm selanjutnya merupakan tantangan serius bagi industri  makanan,  karena  hal  ini  dapat menyebabkan  kontaminasi  silang  produk, yang  mengakibatkan  umur  simpan  rendah
dan  penularan  penyakit  bawaan  makanan. Pada industri pengolahan makanan, mikroorganisme  seringkali  dikaitkan  dengan adanya komunitas multispesies yang kompleks, sementara itu interaksi bakteri telah terbukti memiliki peran kunci dalam keterikatan  dan  pelepasan  sel  dari  biofilm, dan juga resistensi komunitas biofilm terhadap  perlakuan  antimikroba  (Giaouris et al .,  2014).  Penelitian  yang  dilakukan  oleh Emmanuel et al . (2012), menunjukkan bahwa beberapa  isolat  bakteri  simbion  teritip memiliki aktivitas antibakteri terhadap sepuluh  bakteri  patogen  manusia  yaitu antaralain, Salmonella  parathypi,  Escherichia coli,  Bacillus  cereus,  Bacillus  subtilis,  Klebsiella pneumoniae,  Vibrio cholerae,  Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus  pneumoniae, Staphylococcus epidermis, dan Enterobacter aerogenes. Pada  tulisan  ini  akan  dibahas tentang  potensi  bakteri  yang  berasosiasi dengan  teritip  sebagai  sumber  senyawa antibakteri.

## MATERI DAN METODE
Materi yang
digunakan dalam penelitian  ini  adalah  bakteri  yang  diisolasi dari  teritip Balanus sp.  yang  diambil  dari perairan  Pulau  Panjang,  Kabupaten  Jepara. Kultur  bakteri  patogen,  purifikasi  bakteri simbion,  identifikasi  bakteri  simbion,  skrining, dan  uji  aktivitas  antibakteri  dilakukan  di Laboratorium  Mikrobiologi  dan  Bioteknologi Laut,  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan, Universitas  Diponegoro  Semarang.  Identifikasi molekular  dilakukan  di  Tropical  Marine Biotechnology,  Laboratorium  Kelautan  dan Oseanografi. Penelitian  dilakukan  dengan metode eksperimental laboratoris.
Pengambilan sampel teritip dilakukan di perairan  Pulau  Panjang,  Kabupaten  Jepara. Pengambilan sampel teritip tersebut dilakukan dengan metode purposive sampling. Pengambilan sampel teritip dilakukan  dengan  menggunakan  tatah  dan palu.  Sampel  teritip  diambil  dengan  cara menatah  sebagian  koloni  teritip  secara perlahan  kemudian  sampel  disimpan  di dalam  botol  sampel  yang  sudah  steril  guna meminimalisir  kontaminasi.  Botol  sampel kemudian  diberi  label  bertuliskan  lokasi sampel  dan  tanggal  pengambilan  sampel.
Sampel  teritip  dimasukkan  ke  dalam cooler box sebagai media penyimpanan sementara kemudian  sampel  dibawa  ke  laboratorium (Emmanuel et al ., 2011). Parameter lingkungan  yang  diukur  meliputi  pH,  salinitas dan suhu perairan.
Identifikasi  morfologi  dan  determinasi teritip  dilakukan  untuk  menentukan  genus teritip  yang  ditemukan  di  lokasi  dengan mengacu  pada  buku  identifikasi  teritip “Zoologische  Verhandelingen”  (Henry  dan Patsy, 1975).
Isolasi  dan  Purifikasi  Bakteri  Simbion  Teritip Balanus sp.
Sampel  teritip  yang  telah  didapatkan dibilas  dengan  air  laut  steril  secara  merata untuk  meghilangkan  pengotor  dan  bakteri yang  hanya  menempel  pada  permukaan teritip.  Seluruh  bagian  teritip  baik  jaringan keras  maupun  jaringan  lunak  dihaluskan dengan mortar dan pestle yang  telah disterilkan  dan  dilanjutkan  dengan  proses pengenceran  bertingkat  (Emmanuel et  al ., 2011).  Isolasi  bakteri  simbion  dilakukan dengan  metode  agar  tuang  ( pour  plate ). Pengamatan terhadap karakteristik morfologi bakteri  simbion  teritip  meliputi  bentuk  koloni, tepi,  dan  warna  koloni  (Dwidjoseputro et  al ., 1993).  Setiap  koloni  yang  berbeda  diambil dan  dipisahkan  dengan  menggoreskan  ke permukaan  media  menggunakan  jarum  ose ke  media  marine  Zobell  2216E  yang  telah disiapkan di cawan petri.
Skrining  aktivitas  antagonis  dari  isolat bakteri  simbion  teritip  dilakukan  dengan menguji bakteri simbion terhadap dua bakteri patogen  ( Escherichia  coli dan Bacillus cereus ).  Metode  skrining  aktivitas  antibakteri dilakukan berdasarkan metode dari Emmanuel et  al .,  (2011)  yang  dimodifikasi. Skrining  isolat  bakteri  dilakukan  dengan  dua tahap,  yaitu  dengan  metode  agar overlay dan dikonfirmasi dengan metode difusi agar.

## Uji  Aktivitas  Antibakteri  Supernatan  Bakteri Simbion Teritip
Uji  aktivitas  antibakteri  secara  difusi dengan menggunakan paper disc dilakukan setelah tahapan skrining guna
mengkonfirmasi aktivitas antibakteri dari isolat bakteri simbion yang positif membentuk zona hambat. Bakteri simbion dikultur ke dalam 10 mL  media  Zobell  2216E  cair  kemudian diinkubasi  selama  48  jam.  Isolat  bakteri simbion  yang  telah  diinkubasi  kemudian disentrifugasi  dengan  kecepatan  3.500  rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke tabung steril untuk kemudian dilakukan  uji  aktivitas  antibakteri  (Emmanuel et al ., 2011).
Sebanyak  100  μL  biakan  bakteri patogen yang telah diinkubasi selama 24 jam diteteskan dan diratakan dengan menggunakan  spreader  pada  cawan  petri berisi media Zobell 2216E agar dan dibiarkan selama 30 menit agar bakteri dapat berdifusi ke dalam media. Supernatan bakteri simbion masing-masing  diambil  sebanyak  10  µL/disc dan  diteteskan  ke paperdisc ( Advantec paper  disc ,  dengan  diameter  6  mm). Kemudian, paperdisc diletakan  di  atas pemukaan agar secara aseptis dan diinkubasikan  pada  media  nutrient  agar pada suhu ruang untuk diamati pada 24 jam dan 48 jam.

## Ekstraksi dan Uji Bioaktivitas Ekstrak
Isolat  bakteri  simbion  yang  memiliki aktivitas antibakteri terbaik kemudian dikultur masal.  Kultur  bakteri  dengan  diekstrak menggunakan etil asetat dengan perbandingan  kultur  bakteri  :  pelarut sebanyak  1:1  (v/v).  Etil  asetat  dan  air merupakan  pelarut immicible sehingga dapat  digunakan  untuk  memisahkan  fraksi organik  dari  media  (Trianto  et  al,  2011). Fraksinasi  dilakukan  pada  corong  pemisah. Sampel digojok selama kurang lebih 10 menit dan didiamkan hingga terpisah menjadi dua fraksi.  Fraksi  semi  polar  dikoleksi  dan dipekatkan dengan rotary vacuum evaporator pada  sushu  35-40 o C.  Ekstrak bakteri simbion kemudian diencerkan dengan  pelarut  dimetil  sulfoksida  (DMSO) dengan  konsentrasi  100  μg/ml.  Kemudian  10 µL/disc dan diteteskan ke paperdisc untuk uji antibakteri. Prosedur selanjutnya sama seperti pada uji aktivitas supernatant.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) digunakan untuk  melihat  susunan  atau  komponen
senyawa  pada  ekstrak.    Eluen  yang digunakan  adalah  Ekstrak  etil  asetat  bakteri simbion  ditotolkan  menggunakan  pipa kapiler pada posisi 1 cm dari tepi bawah plat silika. Plat kemudian dielusi dengan kloroform- etil  asetat  =  9:1  (v/v)  berdasarkan  hasil  uji coba..  Proses  dihentikan  ketika  eluen  sudah mencapai  kira-kira  1  cm  dari  tepi  atas  plat silika.  Hasil  pemisahan  komponen  senyawa diamati  di  bawah  sinar  UV  365  nm.  Noda pada  plat  silika  yang  tampak,  kemudian diberi tanda (Julita, 2012).

## Identifikasi Molekular Bakteri
Identifikasi  molekular  bakteri  simbion teritip  meliputi  ekstraksi  DNA,  amplifikasi  PCR sekuen  gen  16S  rDNA,  sekuensing  DNA,  dan analisis filogenetik. Ekstraksi DNA dilaksanakan dengan  menggunakan  metode Chelex 100. Ada beberapa kelebihan dari metode chelex 100  yaitu  memiliki  prosedur  yang  sederhana, cepat,  melibatkan  pelarut  non  organik,  dan tidak  memerlukan  banyak  tabung  untuk mentransferkan berbagai jenis sampel (Walsh et  al .,  1991).  Selanjutnya,  proses  amplifikasi dilakukan  sesuai  dengan  metoda  yang digunakan  Lee et  al. (2006).    Ekstrak  DNA untuk  sekuen  16  rDNA  diamplifikasi  dengan PCR  menggunakan  primer  universal  27F (5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') dan primer spesifik  1492R  (5’TACGGTTAACCTTGT  TACGA CTT-3').  Total  volume  dalam  tabung  PCR adalah  50  µl  yang  terdiri  dari  larutan campuran  Kappa  Kit  Master  (25  µL),  primer universal  27F  (2  µL),  primer  1492R  (2  µL), ddH2O  (18,5  µL),  dan  dNTP  (2,5  µL).  PCR dilakukan  dengan  tahapan  sebagai  berikut: denaturasi  pada  suhu  95 o C  selama  3  menit sebagai pemanasan awal, kemudian 30 siklus (denaturasi pada suhu 95 o C selama 1 menit); annealing pada  suhu  55 o C  selama  1  menit; extension pada  suhu  72 o C  selama  7  menit, kemudian  produk  yang  dihasilkan  oleh  PCR dianalisa  menggunakan  gel  elektroforesis  1% dan hasilnya divisualisasikan oleh UVIDoc.
Sekuensing  DNA  bakteri  simbion  teritip dilakukan  pada  PT.  Genetika  Science Indonesia,  Jakarta  Barat.  Hasil  sekuen kemudian  dianalisis  homologinya  dengan menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) database pada National Center for  Biotechnology  Information,  National
Institute for Health,
USA (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al ., 1997).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampel  teritip  yang  diambil  di  Pulau Panjang,  Kabupaten  Jepara,  pada  titik koordinat  S  06o34’37.4”  dan  E  110o37’51.4” sebanyak  satu  koloni.  Berdasarkan  hasil identifikasi menggunakan  buku “Zoologische Verhandelingen”  (Henry  dan  Patsy,  1975), sampel  teritip  yang  diperoleh  termasuk dalam  genus  Balanus.  Ciri  genus Balanus adalah  adanya  strip  longitudinal  yang  khas tampak  mengelilingi  bagian  cangkang teritip.  Corak  garis  yang  tampak  di  sekeliling cangkang  berwarna  ungu  atau  lavender dan  diselingi  dengan  garis  tebal  berwarna putih. Pada bagian scutum tampak berwarna ungu. Kemudian pada tepi tergum tampak garis berwarna ungu.
Isolasi  bakteri  yang  berasosiasi  dengan teritip  dari  Perairan  Pulau  Panjang  diperoleh sebanyak  14  isolat  dengan  menggunakan media marine Zobell 2216E. Hasil uji antagonis terhadap E.  coli dan B.  cereus menunjukan dari  14  isolat  bakteri  enam  diantaranya memiliki  aktivitas  terhadap  bakteri  uji  yang ditandai dengan munculnya zona hambat di sekitar area dotting .
Tabel  1. Skrining  aktivitas  antagonis  isolat bakteri  simbion Balanus amphitrite terhadap Escherichia  coli dan Bacillus cereus
No. Kode Isolat E. coli B.cereus 1 TJ 5.1 - - 2 TJ 5.2 - - 3 TJ 5.3 - + 4 TJ 5.4 + + 5 TJ 5.5 + + 6 TJ 3.6 - - 7 TJ 3.7 - - 8 TJ 4.8 - - 9 TJ 4.9 - - 10 TJ 3.10 + + 11 TJ 4.11 - + 12 TJ 5.12 + + 13 TJ 3.13 - - 14 TJ 6.14 - -
Keterangan  :  (+) : aktif; (–) : tidak aktif
Gambar 1. Teritip Tampak Apikal. Sc : scutum ; Tr  : tergum ;  R  : rostrum ;  L:  lateral;  Cl  : carina lateral .
Keberadaan  bakteri  yang  berasosiasi dengan teritip menjadi salah satu faktor yang mempengaruhi  kehidupan  teritip.  Biofilm mikroba pada biota teritip berfungsi sebagai penyedia informasi kekerabatan antarspesies teritip. Biofilm merupakan salah satu chemical cue bagi  larva  teritip  untuk  menempel (Chlayon  et  al.,  2018).    Pada  koloni  yang sudah  matang,  penempelan  larva  teritip dipicu oleh feromon yang disebut settlement- inducing  protein  complex (SIPC)  (Zazzaro  et al. 2018).
Banyak  penelitan  yang  membuktikan bahwa  bakteri  laut  baik  yang  berasosiasi dengan  invertebrate  maupun free  living bakateri merupakan penghasil bahan bioaktif dengan berbagai bioaktivitas (Schinke et  al., 2017).    Namun,  eksplorasi bahan  bioktif  pada  teritip  masih  sangat sedikit  dilakukan.    Pada  berbergai  penelitin teritip    justru  sebagai  indicator  mengingat teritip  adalah  biota  penempel  yang  banyak menimbulkan kerugian (Wang et al. , 2017).
Hasil uji antibakteri supernatan menunjukkan  bahwa  isolat  bakteri  TJ  5.4 memiliki aktivitas antagonis tertinggi terhadap bakteri B.  cereus ,  dengan  zona  hambat sebesar  2,96  ±0,88  mm  dan  1,90  ±0,09  mm terhadap  bakteri E.  coli .  Sedangkan  isolat bakteri  simbion  TJ  5.5  memiliki  aktivitas tertinggi  terhadap E.  coli dengan  diameter zona hambat sebesar 2,06 ±0,67 mm dan 1,68 ±0,45 mm terhadap B. cereus . Diameter zona hambat dari kedua bakteri tersebut mengalami  penurunan  di  masa  inkubasi  48 jam.  Zona  hambat  isolat  TJ  5.4  menurun
menjadi  2,63  ±0,73  mm  terhadap  bakteri B.cereus dan 0,43 ±0,83 mm terhadap bakteri E.  coli .  Sedangkan  isolat  TJ  5.5  mengalami penurunan  diameter  zona  hambat  menjadi 1,97  ±0,94  mm  terhadap E.  coli dan  zona hambat  nihil  (0,00  ±0,00  mm)  terhadap bakteri B.  cereus .  Kedua  isolat  bakteri tersebut,  kemudian  dikultur  untuk  diekstraksi dan  diuji  bioaktivitasnya.  Pada  penelitian kami  yang  terdahulu  juga  menunjukan beberapa  bakteri  mengalami  penurunan atau  kehilangan  bioaktivitasnya  setelah  48 jam (Trianto et al ., 2019).
Hasil uji bioaktivitas ekstrak bakteri isolat TJ  5.4  konsentrasi  1.000  μg/disc  menunjukkan nilai  tertinggi  dengan  zona  hambat  sebesar 13,64  ±0,76  mm  terhadap  bakteri B.  cereus dan  9,10  ±2,10  mm  terhadap  bakteri E.  coli . Pada  konsentrasi  ekstrak  bakteri  dan  waktu inkubasi  yang  sama,  isolat  TJ  5.5  memilki diameter  zona  hambat  sebesar  8,55  ±0,08 mm  terhadap B.  cereus dan  4,65  ±0,75  mm terhadap  bakteri E.  coli .  Zona  hambat  yang terbentuk  pada  kedua  ekstrak  bakteri cenderung  membentuk  gradasi  dari  bening di  sekitar  paperdisc  hingga  keruh  dan  tidak menunjukkan  daerah  clearing  zone    yang terlihat  nyata.  Zona  hambat  pada  kedua ekstrak  mengalami  penyempitan  di  masa inkubasi  48  jam.  Zona  hambat  dengan karakteristik  tersebut,  dapat  diklasifikasikan bahwa  zat  antibakteri  yang  ada  di  dalam ekstrak  bakteri  tergolong  zat  antibakteri berspektrum luas karena dapat menghambat  (bakteriostatik)  pertumbuhan bakteri gram negatif E. coli dan bakteri gram positif B.  cereus (Kohanski  et.al.,  2007).  Besar kecilnya  zona  hambat  yang  terbentuk dipengaruhi  oleh  berbagai  faktor:  (1) konsentrasi zat, semakin tinggi konsentrasi zat antibakteri  maka  diameter  zona  hambat yang  terbentuk  semakin  besar  (Waluyo, 2007);  (2)  pengorganisasian  dinding  sel bakteri  juga  merupakan  faktor  penting  yang dapat mempengaruhi tingkat efisiensi antibakteri.  Bakteri  gram  negatif  biasanya memiliki  membran  luar  terorganisir  dan  lebih kompleks  daripada  bakteri  gram  positif,  dan kehadiran  membran  luar  yang  tersusun  atas lipopolisakarida  yang  padat  membuat bakteri  gram  negatif  lebih  tahan  terhadap desinfektan  daripada  bakteri  gram  positif (Wang et al ., 2015).
Ekstraksi dilakukan
dengan menggunakan  pelarut  etil  asetat.  Telah disebutkan  pada  penelitian  sebelumnya bahwa  bakteri  simbion  teritip  yang  diekstrak dengan  pelarut  semi  polar  etil  asetat  dapat mengekstrak  senyawa  bioaktif  yang  paling unggul  dibandingkan  dengan  pelarut  air, butanol,  dietil  eter,  dan  kloroform  dalam melawan  10  bakteri  patogen  manusia termasuk  di  dalamnya E.  coli dan B.  cereus (Emmanuel et al ., 2011).
Senyawa  metabolit  sekunder  isolat bakteri  simbion  teritip  TJ  5.4  dan  TJ  5.5 diekstrak  dengan  menggunakan  pelarut  etil asetat (Ahmed, 2012). Eluen yang digunakan yaitu,  etil  asetat-kloroform  sebanyak  1  :  9 (v/v).  Menurut  Julita  (2012),  sistem  eluen dengan  perbandingan  etil  asetat-kloroform sebanyak  1  :  9  (v/v)  merupakan  sistem  yang digunakan  untuk  menentukan  senyawa golongan flavonoid. Hasil
visualisasi pendugaan  senyawa  menunjukkan  kedua
Tabel 2. Uji  antibakteri  supernatan  bakteri  simbion  teritip  terhadap  bakteri Bacillus  cereus dan Escherichia coli.
No. Kode Isolat Diameter Zona Hambat (mm) B. cereus E. coli 24 jam 48 jam 24 jam 48 jam 1. TJ 5.3 1,36±0,68 0,00±0,00 1,90±0,09 0,00±0,00 2. TJ 5.4 2,96±0,88 2,63±0,73 1,84±0,47 0,43±0,83 3. TJ 5.5 1,68±0,45 0,00±0,00 2,06±0,67 1,97±0,94 4. TJ 3.10 2,21±0,38 0,54±0,76 1,40±0,54 1,57±1,12 5. TJ 4.11 2,18±0,88 2,17±0,45 1,72±0,38 1,83±0,27 6. TJ 5.12 1,60±1,32 0,61±0,86 1,96±0,10 0,57±0,83
Tabel 3. Bioaktivitas  ekstrak  bakteri  simbion Balanus sp.  terhadap B.  cereus dan E.  coli pada konsentrasi 1000 µg/disc.
No. Kode Isolat Konsentrasi ( g/ disc ) Diameter zona hambat (mm) B. cereus E. coli 24 jam 48 jam 24 jam 48 jam 1  TJ 5.4 500 9,22±0,38 6,00±1,27 7,60±1,87 4,73±2,61 1.000 13,64±0,76 9,05±1,10 9,10±2,10 6,78±0,38 2  TJ 5.5 500 6,92±0,12 4,83±1,02 2,42±0,68 1,92±0,22 1.000 8,55±0,08 6,87±1,57 4,65±0,75 3,01±0,69
Gambar 2. Zona hambat yang dihasilkan dari ekstrak bakteri simbion Balanus sp. selama 24 jam. a. Bioaktivitas  ekstrak  terhadap  bakteri E.  coli ;  b.  Bioaktivitas  ekstrak  terhadap  bakteri B. cereus ; A
, B ,
Gambar 3. Profil pemisahan senyawa sampel dengan menggunakan eluen etil asetat : kloroform (1:9). a. Pengamatan secara langsung; b. pengamatan dengan bantuan sinar UV.
ekstrak  bakteri  simbion  teritip  menampakan dua  noda  terpisah  pada  plat  silika  yang diamati di bawah sinar UV.
Hasil identifikasi molekuler menunjukkan bahwa  isolat  dengan  kode  TJ  5.4  memiliki homologi  99%  terhadap  bakteri Bacillus wiedmannii dan  isolat  TJ  5.5  memiliki homologi  99%  terhadap  bakteri Lysinibacillus macroides . Bacillus  wiedmannii merupakan bakteri  probiotik  (Miller  et.al,  2018).  Isolat bakteri simbion
TJ 5.5 ( Lysinibacillus macroides )  diduga  berperan  terhadap pembentukan  kalsium  karbonat  (CaCO 3 ) pada  teritip.  Hasil  penelitian  Banarjee  dan Josh  (2014)  menemukan  bakteri Lysinibacillus macroides yang  dapat  membentuk  biofilm dan  memiliki  peran  utama  dalam  proses kalsifikasi  di  alam.  Berdasarkan  hasil  uji antagonis, zona hambat oleh bakteri Bacillus wiedmannii lebih  luas  dibandingkan  dengan diameter zona hambat
Lysinibacillus macroides .  Hal  tersebut  terjadi  karena  pada bakteri Bacillus wiedmannii diduga mangandung  senyawa  yang  lebih  toksik apabila  dibandingkan  dengan  bakteri Lysinibacillus macroides .

## KESIMPULAN
Sebanyak 14 isolat bakteri yang berhasil diisolasi  dari  teritip Balanus sp.,  dua diantaranya terbukti memiliki aktivitas antagonis tertinggi terhadap bakteri Escherichia  coli dan Bacillus  cereus ,  yaitu bakteri dengan kode isolat  TJ 5.4 dan TJ 5.5. Zona hambat terbesar dihasilkan oleh ekstrak bakteri  simbion  TJ  5.4  (1000  μg/disc)  sebesar 13,64  ±0,76  mm  terhadap  bakteri B.  cereus dan  7,60  ±1,87  mm  terhadap  bakteri E.  coli . Zona  hambat  yang  dihasilkan  oleh  ekstrak
bakteri  simbion  TJ  5.5  (1000  μg/disc)  sebesar 6,92 ±0,12 mm terhadap bakteri B. cereus dan 2,42  ±0,68  mm  terhadap  bakteri E.  coli .  Hasil BLAST  homologi  sekuen  16S  rRNA  bakteri simbion  teritip  TJ  5.4  memiliki  homologi sebesar 99% dengan bakteri Bacillus wiedmanni, sedangkan bakteri simbion teritip TJ 5.5 memiliki homologi sebesar 99% dengan bakteri Lysinibacillus macroides .

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmed,  N.  2012.  Isolation  and  Identification of  Secondary  Metabolites  Producing Organisms from Marine
Sponge.
Discovery, 1(1):14-17.
Altschul,  S.F.,  Thomas  L.M.,  Alejandro  A.S.,
Jinghui Z., Zheng Z, Webb M., &  David J. L.  1997.  Gapped  BLAST  and  PSI-BLAST:  a new  generation  of  protein  database search  programs. Nucleic  Acids  Res. 25(17):3389–3402.
Banarjee, S., & Joshi, S.R.  2014. Ultrastructural Analysis  of  Calcite  Crystal  Patterns Formed  by  Biofilm  Bacteria  Associated with  Cave  Speleothems. J.  Microscop.
Ultrastruct. 2:217–223. Chlayon,  T.,  Mitsuyasu  I.,  Nobuhiro  C.  2018.
Combined
protective action of barnacles  and  biofilm  on  concrete surface  in  intertidal  areas. Construction and Building Materials, 179:477–487. De  Gregoris,  T.B.,  L.  Khandeparker,  A.C.  Anil, E.  Mesbahi,  J.G.  Burgess,  &  A.S.  Clare. 2012.  Characterisation  of    The  Bacteria Associated with Barnacle, Balanus amphitrite,  Shell  and  Their  Role  in Gregarious Settlement of Cypris larvae. J.
Exp. Mar. Biol. Ecol. 413:7-12. Dwidjoseputro,
D. 1993. Dasar-Dasar
Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
TJ 5.4 TJ 5.5
Emmanuel, S., Joshua J., & Murugan, A. 2011.
Antagonistic  Activity  of  the  Barnacle ( Balanus amphitrite)  Associated  Bacteria Against  Human  Bacterial  Pathogens. World App. Sci. J. 12(2):202-207.
Giaouris,  E.,  Even,  H.,  Michel,  H.,  Nikos,  C., Solveig  L.,  Trond  M.,  &  George-John,  N. 2014.  Attachment  and  biofilm  formation by foodborne bacteria in meat processing
environments:
causes, implications, role of bacterial interactions and  control  by  alternative  novel methods. Meat Sci. 97(3):298-309.
Griffiths,  M.W.,  &  Schraft,  H.  2017. Bacillus cereus food  poisoning.  In  Foodborne Diseases (Third Edition); 395-405.
Habbu, P., Warad, V., Shastri, R., Madagundi, S.  &  Kulkarni,  V.H.,  2016.  Antimicrobial metabolites from marine microorganisms. Chinese J. Nat. Med. 14 (2):101-116.
Henry,  D.P.,  &  Patsy.  1975.  Zoologische Verhandelingen:  The Balanus amphitrite Complex  (Cirripedia,  Thoracica),  Brill, Leiden.
Janakiram, N.B.,  Altaf M., & Chinthalapally V.
R.  2015.  Sea  Cucumbers  Metabolites  as Potent  Anti-Cancer  Agents. Mar.  Drugs. 13(5):2909-2913.
Julita,  N.  2012.  Aktivitas  Antibakteri  Senyawa Flavonoid  dari  Tumbuhan  Paku  Perak ( Pityrogramma
calomelanos ) (Antibacterial  Activity  Of  Flavonoid Compound From Silver Fern (Pityrogramma  calomelanos)). Unesa  J.
Chem. 1(1):75–79.
Kar, Ashutosh.  2009.  Farmakognosi  & Farmakobioteknologi Edisi 2. Buku
Kedokteran EGC, Jakarta.
Kohanski,  M.A.,  Dwyer,  D.J.,  Hayete,  B.,
Lawrence,  C.A.  &  Collins,  J.J.,  2007.  A common  mechanism  of  cellular  death induced  by  bactericidal  antibiotics. Cell , 130(5):797-810.
Lee, J. W., Douglas D. B., Max J. Paape, Ming- Kuei H, & Xin Z. 2006. Characterization of Cytokine  Expression  in  Milk  Somatic  Cells During  Intramammary  Infections  with Escherichia  coli or  Staphylococcus aureus by Real-Time PCR. Veterinary Res. 37(2):219–229.
Miller, Jihaui J., Sarah M. B., Martin W., & Jasna
K.  2018.  Intraclade  Variability  in  Toxin Production  and  Cytotoxicity  of Bacillus
cereus Group  Type  Strains  and  Dairy-
Associated Isolates. App. Environ.
Microbiol. 84(6):e02479-17
Radjasa,  O.K.,  Siti  I.O.S.,  Agus  S.,  Jutta  W., Johannes  F.I.,  Lammler,  C.,  &  Risk,  M.J. 2007.    Antibacterial  Activity  of  Marine Bacterium  Pseudomonas  sp.  Associated with  Soft  Coral Sinularia  polydactyla against Streptococcus  equi Sub  sp. zooepidemicus. Int.J. Pharm. 3(2):170-174. Scherrer,  R.  1984.  Gram's  staining  reaction,
Gram  types  and  cell  walls  of  bacteria. Trends in Biochem. Sci. 9(5):242-245. Schinke C., Thamires M., Sonia C. N. Q., Itamar S.  Melo,  and  Felix  G.  R.  2017. Antibacterial  Compounds  from  Marine Bacteria, J. Nat. Prod . 80:1215−1228 Trianto,  A.,  Idam  H.,  Nicole  J.  D.  V.,  and Junichi  T.  2011.  Halioxepine,  A  New Meroditerpene  from  An  Indonesian Sponge Haliclona sp. Chem. Pharm. Bull . 59(10):1311-1313 .
Trianto  A.,  Ocky  K.R.,  Agus  S.,  Sakti  I.M.,
Rachmat  A.,  Sulistiowati,  Septhy  K.  R.,
Phillip  C.  &  Erin,  M.  2019.  Exploration Culturable Bacterial Symbionts of
Sponges  from  Ternate  Islands,  Indonesia.
Biodiversitas . 20 (3):776-782. Walsh,  P.S.,  David  A.M.,  &  Russell  H.  1991. Chelex  100  as  a  Medium  for  Simple Extraction  of  DNA  for  PCR-Based  Typing from  Forensic  Material. BioTechniques 10(4):506-513.
Waluyo,  L.  2007.
Mikrobiologi  Umum. Universitas Muhammadiyah Malang, Malang.
Wang, X., Margaret I., Albert W. L., Zhengrong Y., Pan W., Baoting Z, ... & Chuanshan X. 2015.  Sonodynamic  Action  of  Curcumin on  Foodborne  Bacteria Bacillus  cereus and Escherichia coli . Ultrasonics , 62:75-79. Wang, J., Pei S., Qiong G., Wei D.L. , Jia L. G. , Wei  Q.,  Dan  Q.F.  &  Sheng  A.T.  2017. Antifouling Activity Against Bryozoan and Barnacle  by  Cembrane  Diterpenes  from The  Soft  Coral  Sinularia  Flexibilis. Int. Biodeteriorat.  Biodegradat., 120:97-103.
Zazzaro D., Katya R. & Andrew J. 2018. Use of Extract  from  Adults  of  the  Triangle Barnacle, Balanus  trigonus ,  for  Reducing Fouling  in  Mussel  Farms. Aquaculture , 483:223–229.