## Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Journal Homepage : http://jurnal.unpad.ac.id/ijpst/
UNPAD

## Molecular Docking of Active Compounds Piper crocatum on The Alpha- Glucosidase Enzyme as Antidiabetic

## Mustika Weni*, Mega Safithri, Djarot S.H. Seno
Department of Biochemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Bogor Agricultural University, Bogor 16680,West Java Indonesia
Submitted 16 March 2019; Revised 27 March 2020; Accepted 30 March 2020; Published 10 June 2020 *Corresponding author:mustikaweni261192@gmail.com

## Abstract
Ethanol  extract  of  Piper  crocatum  leaves  has  inhibitory  activity  of  α-glucosidase  enzyme.  Ethyl acetate fraction from Piper crocatum leaves has the highest antioxidant activity and has an inhibition of α-glucosidase containing 6XO32ZSP1D, Ethyl L-serinate hydrochloride compound, Schisandrin B  compound,  Columbin  compound,  4-(4-methoxy-phenylamino)-2  compound,  3-dihydro-1H-4a, 9-diazacyclopenta (b) fluorine-10-carbonitrile, compound 6-Amino-4-[3-(benzyloxy)phenyl] -3-tert- butyl-2,4-dihydropyrano [2, 3-c] pyrazole-5-carbonitrile, compound 4-{{4.6-Bis [(3R, 5S)-3,5-diamino- 1-piperydinyl] -1,3,5-triazine-2-yl}amino) benzenesulfonamide and compound 1.1'-(1,4-butanediyl) bis {2,6-dimethyl-4-[(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H) ylidene) methyl]pyridinium. This study aims to obtain the interaction between bioactive compounds contained in ethyl acetate fraction of Piper crocatum leaves with α-glucosidase enzyme in In Silico using AutoDock Vina, Columbin shows the lowest binding energy with binding sites with amino acids Ser240, Asp242, His280, Arg315, Glu411, Phe159, Arg442, Tyr158 and Phe303. Columbin has the stability and inhibits the α-glucosidase enzyme from S. cerevisiae better than the seven other compounds, because it has OH and CH 3 groups which play a role in the interaction with around the active side of the α-glucosidase enzyme.
Keywords: Columbin, in Silico, α-Glucosidase
Penambatan Molekuler Senyawa Aktif Daun Sirih Merah (Piper Crocatum) terhadap Enzim Αlfa-Glukosidase sebagai Antidiabetes

## Abstrak
Ekstrak  etanol  daun  sirih  merah  memiliki  aktivitas  penghambatan  enzim  α-glukosidase.  Fraksi etil asetat daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dan memiliki penghambatan terhadap    α-glukosidase    dengan      kandungan    6XO32ZSP1D,  Ethyl  L-serinate  hydrochloride, Schisandrin  B,  Columbin,  4-(4-methoxy-phenylamino)-2,3-dihydro-1H-4a,9-diazacyclopenta(b) fluorine-10-carbonitrile, 6-Amino-4-[3-(benzyloxy)phenyl]-3-tert-butyl-2,4-dihydropyrano[2,3-c] pyrazole-5-carbonitrile,  4-({4,6-Bis[(3R,5S)-3,5-diamino-1-piperydinyl]-1,3,5-triazin-2-yl}amino) benzenesulfonamide dan 1,1’-(1,4-butanediyl)bis{2,6-dimethyl-4-[(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H) ylidene)methyl]pyridinium. Penelitian bertujuan untuk mempelajari interaksi antara senyawa bioaktif yang terkandung dalam fraksi etil asetat daun sirih merah dengan enzim α-glukosidase secara In Silico dengan menggunakan AutoDock Vina, Columbin menunjukkan energi pengikatan terendah dengan situs  pengikatan  dengan  asam  amino  Ser240, Asp242,  His280, Arg315,  Glu411,  Phe159, Arg442, Tyr158 dan Phe303. Columbin mempunyai stabilitas dan menginhibisi enzim α-glukosidase dari S. cerevisiae lebih baik daripada ketujuh senyawa lain, karena memiliki gugus OH dan CH 3 yang berperan dalam interaksi dengan sekitar sisi aktif dari enzim α- glukosidase.
Kata Kunci: Columbin, in Silico, α-Glukosidase

## 1. Pendahuluan
Diabetes melitus adalah suatu penyakit yang ditandai dengan penurunan sekresi dan resistensi insulin atau keduanya karena kelainan metabolik yang menyebabkan naiknya kadar glukosa darah (hiperglikemia) pada kondisi normal. 1 Terdapat  dua  jenis prevalen dari penyakit ini, yang biasa dikenal dengan diabetes melitus tipe 1 dan tipe 2. DM tipe 2 ini lebih umum, mencapai 90-95% dari populasi DM. 2 Pengobatan yang paling umum untuk DM 2 adalah dengan menghambat Enzim  α-glukosidase.  Enzim  α-glukosidase adalah  enzim  yang  berperan  dalam pemecahan  karbohidrat  menjadi  glukosa dan dapat meningkatkan kadar glukosa darah, sehingga untuk mencegah naiknya gula darah maka dibutuhkan suatu inhibitor enzim α-glukosidase. Inhibitor α-glukosidase menghambat  enzim  α-glukosidase  yang menguraikan pati dalam usus halus sehingga menunda penyerapan glukosa hasil pemecahan karbohidrat di dalam usus halus sehingga dapat menurunkan kadar gula darah postprandial. 3 Inhibitor  enzim  α-glukosidase standar yang telah diakui oleh WHO dan IDF adalah akarbose dan miglitol, 4 namun obat ini juga dilaporkan menyebabkan berbagai efek samping seperti kembung, mual,  diare dan flatulensi.  Hal  ini  menyebabkan  penelitian tentang  senyawa  inhibitor  α-glukosidase dari bahan alam yang minim efek samping menjadi penting.
Indonesia merupakan negara tropis yang  kaya  dengan  berbagai  jenis  tanaman. Terdapat  banyak  tumbuhan  obat  yang dilaporkan bermanfaat dan digunakan sebagai agen antidiabetes secara empiris. Kandungan senyawa kimia dalam tumbuhan dilaporkan aman untuk penderita DM. 5 Rebusan daun sirih merah secara turun temurun dipercaya dapat menurunkan kadar glukosa darah. Daun sirih  merah  (Piper  crocatum)  mengandung senyawa  aktif  seperti  flavonoid,  alkaloid, tanin, minyak atsiri, 6 fenol dan saponin. 7
Berdasarkan penelitian yang dilakukan secara in vitro dan in vivo, daun sirih merah dapat memberikan efek hipoglikemik sebagai inhibitor α-glukosidase. Kandungan senyawa senyawa kimia yang terdapat didalam daun
sirih merah tersebut memiliki aktivitas antidiabetes  ditunjukkan  dengan  pemberian dosis  1350  mg/kg  BB  menurunkan  kadar glukosa darah tikus yg diinduksi streptozotocin sebesar  38.95%, 8 Pemberian ekstrak etanol sirih  merah  dosis  200  mg/kg  bb  dapat menurunkan kadar glukosa darah pada tikus Wistar  jantan  model  hiperkolesterolemia. 9 Alfarabi et al. menyatakan bahwa daun sirih merah  (Piper  crocatum)  dengan  kandungan bioaktif  fenol,  flavonoid,  alkaloid,  dan triterpenoid mampu menghambat aktivitas α-glukosidase  sebesar  39.62%. 10 Sebagai awal dari pencarian obat antidiabetes baru, dilakukan penelitian dengan pendekatan in silico (molecular docking) untuk mengetahui interaksi penambatan molekuler senyawa aktif fraksi etil asetat daun sirih merah dengan enzim  α-glukosidase,  dimana  interaksi penghambatan enzim berkerja pada sisi aktif enzim  α-glukosidase  yaitu  Asp69,  His112, Arg213,  Asp215,  Glu277,  His351,  Arg442 dan Asp352. 11
Berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Weni et al. menyatakan bahwa fraksi etil asetat daun sirih merah memiliki aktivitas terhadap enzim α-glukosidase yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol 70%, 12 Fraksi air dan Fraksi  n-heksan  daun  sirih  merah  dengan nilai IC 50 sebesar  743.80  μg/ml.  Senyawa aktif yang terkandung didalam daun sirih merah  telah  dianalisis  dengan  LCMS, diperoleh  8  senyawa  :  6XO32ZSP1D, Ethyl  L-serinate  hydrochloride,  senyawa Schisandrin B, senyawa Columbin, senyawa
4-(4-methoxy-phenylamino)- 2,3-dihydro-1H-4a,9-diazacyclopenta(b) fluorine-10-carbonitrile,  senyawa  6-Amino- 4-[3-(benzyloxy)phenyl]-3-tert-butyl-2,4- dihydropyrano[2,3-c]pyrazole-5carbonitrile, senyawa  4-({4,6-Bis[(3R,5S)-3,5-diamino- 1-piperydinyl]-1,3,5triazin2yl}amino) benzensulfonamide dan 1,1’-(1,4-butanediyl) bis{2,6-dimethyl-4-[(3-methyl-1,3- benzothiazol-2(3H)ylidene)methyl] pyridinium. 13 Namun demikian penelitian secara komputasi terhadap  kedelapan senyawa untuk melihat interaksi antara ligan dengan residu katalitik α-glukosidase belum
pernah  dilakukan.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mengetahui  afinitas  ligan  terhadap enzim glukosidase dan mempelajari interaksi antara senyawa bioaktif yang terkandung dalam fraksi etil asetat daun sirih merah dengan  enzim  α-glukosidase  secara  In Silico dengan menggunakan AutoDock Vina.  Adapun  manfaat  dari  penelitian  ini diharapkan memperoleh informasi tambahan mengenai senyawa yang berpotensi sebagai inhibitor enzim glukosidase.

## 2.  Metode
2.1.  Alat Peralatan yang digunakan yaitu seperangkat laptop dengan menggunakan Software  yang  terdiri  dari Autodock  Tools, Autodock  Vina,  Discovery  Studio  dan Ligplot. Protein Data Bank (http://www.rcsb. org/pdb),  PubChem  (http://PubChem.ncbi. nlm.nih.gov).
2.2.  Bahan Struktur 3D α-glukosidase yang diunduh dari Protein Data Bank dengan format .pdb dengan kode PDB (PDB ID : 3a4a). Struktur 3D ligan yang dipakai adalah 6XO32ZSP1D, Ethyl L-serinate hydrochloride, Schisandrin  B,  Columbin,  4-(4-methoxy- phenylamino)-2,3-dihydro-1H-4a,9- diazacyclopenta(b)fluorine-10-carbonitrile, 6-Amino-4-[3-(benzyloxy)phenyl]-3- tert-butyl-2,4-dihydropyrano[2,3-c] pyrazole-5-carbonitrile, 4-({4,6-Bis[(3R,5S)- 3,5-diamino-1-piperydinyl]-1,3,5-triazin- 2-yl}amino)benzenesulfonamide dan 1,1’-(1,4-butanediyl)bis{2,6-dimethyl-4- [(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)ylidene) methyl]pyridinium  yang  diunduh  dari PubChem dengan format .pdb.
2.3.  Prosedur Rinci 14
Penyiapan struktur protein dan struktur ligan. Pengunduhan makromolekul α-glukosidase dari Protein Data Bank dengan format .pdb (PDB ID : 3a4a). Pengunduhan molekul ligan dari PubChem dengan format .pdb. Penentuan  Grid  box. Tahapan penambatan molekuler dilakukan antara
situs  aktif  α-glukosidase  yaitu  daerah yang berinteraksi dengan ligan. Sebelum melakukan penambatan molekul, perlu disiapkan ukuran Grid Box dalam Autodock Tools  1.5.6.  Penentuan  grid  box  dilakukan untuk mengetahui titik koordinat pada active site dari a-glukosidase dengan menggunakan software Autodock Tools.
Preparasi  file  penambatan  molekul. Merubah format file ligan menjadi .pdbqt dan reseptor yang dioptimasi dengan penambahan atom  hidrogen  menjadi  .pdbqt  dengan menggunakan software Autodock Tools. Data disimpan di drive C: dari windows. Penambatan molekul dengan Autodock Vina. Ligan dan protein yang telah tersimpan  dalam  format  .pdbqt  dicopy  ke dalam folder vina, kemudian config file vina diketik pada notepad, disimpan dengan nama .conf.  File  config  berisi  data  terkait  dengan nama reseptor, ligan, ukuran box, dan center box. Proses penambatan molekul dengan vina dijalankan melalui command prompt dengan parameter yang sesuai.
Penambatan  molekuler. Penambatan molekul  (docking)  menggunakan  aplikasi Vina  dan  memerlukan  file  enzim,  ligan  dan config. Penambatan molekul mulai dijalankan di Command prompt dalam folder yang terdapat  file  enzim,  ligan  dan  file  config. Proses  penambatan  molekul  dijalankan dalam program vina. Setelah docking selesai akan diperoleh hasil beberapa mode docking beserta nilai Affinity (kkal/mol). Analisis hasil penambatan molekuler. Analisis hasil docking meliputi nilai affinity dari beberapa mode hasil docking yang dapat dilihat  dalam  file  Log.txt  yang  diperoleh. Analisis kedua yaitu melihat posisi ligan dari beberapa mode tersebut menggunakan software pymol. File enzim, ligan dan output docking dibuka dalam software pymol. Mode yang paling mirip dengan posisi ligan asli merupakan mode dengan pose terbaik.
Visualisasi. Visualisasi interaksi antara enzim    dengan  ligan  dapat  dilihat  pada software Ligplot. Visualisasi yang dilakukan dengan  melihat  residu-residu  asam  amino yang dihasilkan.

## 3. Hasil
3.1. Penambatan  Molekuler  Ligan  dengan Enzim α-Glukosidase Analisis data kromatogram yang dilakukan pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Wedaswari dengan menggunakan  LC-MS,  terdapat  delapan senyawa  yang  teridentifikasi,  dua  senyawa yang memiliki kelimpahan paling banyak adalah schisandrin B dan Columbin yang diduga berpotensi sebagai inhibitor glukosidase  (Tabel  1).  Delapan  senyawa tersebut kemudian dianalisis dengan metode komputasi (Penambatan Molekuler). Simulasi  penambatan  molekuler  (docking)
pada penelitian ini dilakukan dalam kondisi ligan  fleksibel.  Kondisi  fleksibel  digunakan untuk penyesuaian struktur ligan yang paling stabil berinteraksi dengan reseptor. Parameter kestabilan yang diamati adalah energi bebas Gibbs  (∆G).  Semakin  negatif  nilai  ∆G menunjukan  tingkat  kestabilan  yang  baik antara ligan dan reseptor, sehingga ikatan yang  terbentuk  akan  semakin  kuat.  Tabel  1 menunjukan  energi  bebas  Gibbs  (∆G)  hasil simulasi docking, diperoleh hasil bahwa senyawa  Columbin  dan  memiliki  afinitas yang  tinggi  terhadap  enzim  ditunjukkan dengan  nilai  ∆G  yang  rendah  yaitu  -9  kcal. mol.
Gambar 1. Ikatan hidrogen dan hidrofobik  yang terbentuk antara Columbin dengan Enzim α-Glukosidase
Gambar 2. (a) Columbin, (b) Schisandrin B
(a)
(b)
3.2. Visualisasi  Penambatan  Ligan  dengan Enzim α-Glukosidase dengan LigPlot Untuk mengetahui interaksi ligan dengan reseptor, maka dilakukan visualisasi dengan  menggunakan  LigPlot.  Visualisasi hanya dilakukan terhadap senyawa Columbin yang merupakan senyawa yang memiliki interaksi yang kuat dengan enzim glukosidase. Hasil uji senyawa Columbin terhadap enzim α-glukosidase  (Gambar  1)  menunjukkan bahwa, residu asam amino yang berinteraksi adalah  Ser240,  Asp242,  His280,  Arg315, Glu411, Phe159, Arg442, Tyr158 dan Phe303. Ikatan  hidrogen  terjadi  dengan  asam  amino Ser40  dengan  jarak  ikatan  3.29  Å  dan  2.70 Å, Asp242  dengan  jarak  ikatan  3.08  Å  dan His280 dengan jarak ikatan 2.97 Å. Analisis interaksi hidrofobik mengungkapkan senyawa Columbin memiliki interaksi hidrofobik dengan asam amino Arg315, Glu411, Phe159, Arg442, Tyr158 dan Phe303 (Gambar 1).

## 4. Pembahasan
4.1. Analisis Penambatan Molekuler Ligan

## dengan Enzim α-Glukosidase
Sebelum dilakukan simulasi docking perlu  dilakukan  pengecekan  sifat-sifat  dari ligan yang digunakan, apakah memenuhi aturan  Lipinski.  Adapun  aturan  lipinski tersebut adalah suatu molekul dapat dilanjutkan  simulasi  docking  apabila  (1) berat  molekul  kurang  dari  500  Da  (2)  nilai logP kurang dari 5, (3) jumlah donor ikatan hidrogen kurang dari 5 dan (4) jumlah akseptor ikatan hidrogen kurang dari 10. 15 Aturan Lipinski  dapat  menentukan  sifat  fisikokimia ligan untuk menentukan karakter hidrofobik/ hidrofilik suatu senyawa untuk dapat melalui membran sel oleh difusi pasif. Nilai log P menyatakan koefisien kelarutan dalam lemak/ air  yang  memiliki  rentang  -0,4  –  5.  Berat molekul yang lebih dari 500 Da tidak dapat berdifusi menembus membran sel. Semakin besar nilai log P, maka semakin hidrofobik molekul tersebut. Molekul yang memiliki sifat terlalu hidrofobik cenderung memiliki tingkat toksisitas yang tinggi karena akan tertahan lebih lama pada lipid bilayer dan terdistribusi
Tabel 1. Parameter ligan untuk memenuhi aturan Lipinski dan ikatan afinitasnya (kkal/mol) dengan Saccharomyces cerevisiae α-glukosidase
Senyawa Dugaan Bobot Molekul (m/z) Log P Jumlah Donor Ikatan H Jumlah Akseptor Ikaatn H Binding affinity (kcal.mol) RMSD Ethyl L-serinate hydrochloride 170,06 2,85 3 6 -4,4 1,71 Schisandrin B 401,19 0,37 3 4 -3,0 1,23 Columbin 359,15 2,48 2 6 -9,0 1,42 4-(4-methoxy- phenylamino)-2,3- dihydro-1H-4a,9- diaza-cyclopenta(b) fluorine-10-carbonitrile 355,16 4,35 5 1 -7,8 1,37 6-Amino-4-[3-(benzyloxy) phenyl]-3-tert-butyl-2,4- dihydropyrano[2,3-c] pyrazole-5-carbonitrile 401,19 4,71 2 4 -7,5 2,18 4-({4,6-Bis[(3R,5S)-3,5- diamino-1-piperydinyl]- 1,3,5-triazin-2-yl}amino) benzenesulfonamide 478,25 -4,33 11 13 -7,9 1,71 1,1’-(1,4-butanediyl) bis{2,6-dimethyl-4-[(3- methyl-1,3-benzothiazol- 2(3H)-ylidene)methyl] pyridinium 593,28 -1,14 0 4 -4,7 0,24
lebih luas di dalam tubuh sehingga selektifitas ikatan  terhadap  enzim  target  menjadi berkurang. Nilai log P yang terlalu negatif juga tidak baik karena jika molekul tersebut tidak dapat melewati  membran lipid bilayer. Jumlah donor dan akseptor ikatan hidrogen mendeskripsikan semakin tinggi kapasitas ikatan hidrogen, maka semakin tinggi energi yang dibutuhkan agar proses absorpsi dapat  terjadi.  Secara  umum  aturan  Lipinski menggambarkan solubilitas senyawa tertentu untuk menembus membran sel oleh difusi pasif  (Kunnumakkara  2008).  Berdasarkan Tabel  1,  ligan  yang  tidak  sesuai  dengan aturan lipinski adalah 4-({4,6- Bis [ (3R,5S) -3,5-diamino-1-piperydinyl  ]-1,3,5-triazin- 2-yl}  amino)  benzene  sulfonamide  dan 1,1’-(1,4-  butanediyl)  bis  {2,6-dimethyl-4- [(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene) methyl ] pyridinium. Validasi dilakukan untuk mendapatkan metode yang dapat dipercaya dan handal. Parameter yang digunakan yaitu RMSD (Root Mean Square Deviation), Bentuk ligan yang dipakai ditentukan berdasarkan besaran RMSD hasil perhitungan. Bentuk ligan dengan RMSD terkecil digunakan sebagai representasi bentuk interaksi antara ligan uji  dengan  protein.  Hasil  validasi  metode didapatkan nilai RMSD ≤ 2 Å (Tabel 1). Hasil tersebut  menunjukkan  hasil  perhitungan docking antara protein dan ligan memberikan hasil yang hampir serupa karena memiliki nilai ≤ 2 Å. 16 Simulasi docking dilakukan dengan menggunakan Autodock Vina. Reseptor yang digunakan dalam melakukan docking adalah struktur kristal dari S. cerevisiae (Kode PDB 3A4A) dengan melakukan penambatan molekuler di sekitar sisi aktif dari enzim, yaitu :  Asp69,  His112,  Arg213,  Asp215,  Glu277, His351, Arg442  and Asp352. 17 Letak gridbox berada  dikoordinat  X=24,  Y=28  Z=36 dan  dimensi  sebesar  X=21.272  Y=-0.763 Z=18.640.  Gridbox  merupakan  daerah  yang membatasi ligan untuk berinteraksi dengan enzim,  sehingga  ligan  melakukan  docking secara terarah didaerah sekitar sisi aktif dari  enzim.  Sruktur  ligan  yang  digunakan diambil dari PubChem yang disimpan dalam bentuk .sdf kemudian diubah dalam bentuk
.pdb  menggunakan  discovery  studio.  Hasil simulasi docking yang dilakukan sebanyak 8 kali memiliki 8 pose hasil docking yang memiliki  energi  ikatan  masing-masing. Adapun energi ikatan yang diambil adalah yang paling negatif karena memiliki interaksi yang  kuat.  Binding  affinity  merupakan ukuran kemampuan obat untuk berikatan dengan reseptor. Semakin kecil nilai binding affinity maka afinitas antara reseptor dengan ligan semakin tinggi begitu pula sebaliknya jika semakin besar nilai binding maka afinitas antara  reseptor  semakin  rendah.  Hasil  data seperti  yang  diperlihatkan  pada  Tabel  1. Dari  Tabel  1  dapat  diketahui  hasil  dari  uji in silico aktivitas senyawa daun sirih merah dengan  enzim  glukosidase  memprediksikan bahwa ligan yang lebih stabil terhadap enzim glukosidase adalah senyawa Columbin dengan  nilai  energi  ikatan  yaitu  -9.0  kcal. mol. Hal ini dikarenakan adanya gugus-gugus fungsi polar pada ligan seperti metil (-CH 3 ), hidroksil (-OH) dan amina (-NH 3 ) pada ligan. Senyawa-senyawa bioaktif yang terkandung didalam fraksi etil asetat, beberapa diantaranya telah diketahui memiliki aktivitas sebagai antidiabetes, yaitu  Schisandrin  B  (SchB)  dan  Columbin. Schisandrin  B  (SchB)  adalah  salah  satu turunan  dibenzocyclooctadiene  yang  paling banyak dan aktif yang ditemukan di buah Schisandra chinensis. SchB dilaporkan dapat meningkatkan aktivitas superoksida dismutase (SOD), meningkatkan kemampuan antioksidan dan radikal bebas oksigen, mengurangi tingkat peroksidasi lipid dan juga  ekspresi  GLUT4  mRNA  ditingkatkan dalam jaringan otot, sehingga meningkatkan transportasi kapasitas glukosa, mengurangi glukosa darah, memperbaiki fungsi hati sebagai  antiinflamasi  dan  antioksidan. 18 Kemampuan schisandrin B sebagai antioksidan ini berperan dalam melindungi sel beta pankreas sehingga dapat meningkatkan sekresi insulin. Senyawa columbin mengatur sintesis kolesterol dan glikolisis. Meningkatkan aktivitas glukokinase hati, yaitu  enzim  yang  mengkatalisis  glukosa menajdi  glukosa  6  fofat.  Columbin  juga berperan menurunkan aktivitas glukosa 6
fosfat dan fosfoenolpiruvat karboksikinase, hal ini menyebabkan peningkatan glikogen di hati dan menurunkan kadar glukosa dalam darah. 19 Dari kedua struktur senyawa yang diduga  berperan  dalam  menghambat  enzim α-glukosidase, dapat diketahui bahwa gugus hidroksi yang terdapat pada columbin (gambar 2a) dan schisandrin B (gambar 2b) dapat meningkatkan kemampuan inhibisi enzim  α-glukosidase,  gugus  OH,  CH3  dan NH3  berperan  dalam  interaksi  dengan  sisi aktif dari enzim α- glukosidase melalui ikatan hidrogen 20 (Gambar 2).
4.2. Interaksi  Ikatan  Hidrogen  dan Hidrofobik  Ligan  dengan  Enzim α-Glukosidase Fraksi aktif yang dipilih adalah fraksi etil asetat. Semua senyawa yang diisolasi (Tabel 1) dievaluasi dengan metode docking untuk  mengetahui  interaksi  antara  Ligan dengan  enzim  glukosidase.  Senyawa Columbin menunjukkan paling kuat aktivitas penghambatan terhadap enzim α-glukosidase. Visualisasi  selanjutnya  dilakukan  untuk mengetahui interaksi senyawa Columbin di  dalam  kantong  sisi  aktif  enzim  target. Visualisasi  interaksi  senyawa-senyawa  uji di  dalam  kantong  sisi  aktif  enzim  target dengan  LigPlot 21 menunjukkan  interaksi ikatan  (non  kovalen)  dengan  residu  asam amino pada kantong sisi aktif yang secara hipotesis mempengaruhi aktivitas biologis penghambatan 22 dan juga interaksi hidrofobik yang menilai kestabilan interaksi konformasi struktur  3D  senyawa  uji  dalam  lingkungan konformasi terbuka kantong sisi aktif enzim target. 23 Columbin  mengandung  gugus  OH dan  CH 3 . Kedua gugus ini bisa terbentuk ikatan hidrogen dengan residu asam amino kompleks reseptor. Interaksi ikatan hidrogen  dan  panjang  ikatan  Columbin divisualisasikan  dan  dihitung  oleh  Ligplot (Gambar  1).  Interaksi  yang  mengikat  dapat mengakibatkan penghambatan enzim. Energi pengikatan Columbin dengan residu yang berinteraksi baik berupa ikatan hidrogen maupun hidrofobik beserta panjang ikatannya dengan  struktur  kristal  dari  α-glukosidase
yang disajikan pada Gambar 1, yaitu  Ser240, Asp242,  His280,  Arg315,  Glu411,  Phe159, Arg442,  Tyr158  dan  Phe303.  Terdapat empat ikatan H antara Columbin dan enzim glukosidase, yaitu His280 dengan jarak 2.97 Å,  Asp242  dengan  jarak  3.08  Å,  Ser240 dengan  jarak  3.29  Å  dan  2.70  Å.  Analisis interaksi hidrofobik mengungkapkan senyawa Columbin memiliki interaksi hidrofobik dengan asam amino Arg315, Glu411, he159, Arg442, Tyr158 dan Phe303 (Gambar 1). Senyawa Columbin berinteraksi dengan residu katalitik His280, Asp242 dan Ser240. Senyawa Columbin membentuk empat ikatan hidrogen dengan Asp242, Ser240 dan His280, ikatan tersebut menstabilkan komplek ligan dengan protein. Senyawa Columbin mengikat dibantu secara dominan melalui kontak hidrofobik yang berkontribusi terhadap energi ikatnya sehingga mencerminkan aktivitas penghambatannya. Fenomena ini dapat menyebabkan substrat tidak terikat di situs aktif enzim, yang dapat memperlambat aktivitas protein. 24 Adanya interaksi hidrofobik dengan asam amino Arg315, Glu411, Phe159, Arg442,  Tyr158  dan  Phe303  menyebabkan penutupan kantong untuk mencegah pintu masuk  substrat,  yang  selanjutnya  bertindak sebagai sifat penghambat kompetitif. Hal ini diperkuat dengan penelitian yang dilakukan oleh Shivanagoudra terhadap ekstrak etil asetat buah melon cina dimana senyawa 25-isopropenylchole-5,(6)-ene-3-O-β- Dglucopyranoside  (IDG)  yang  terkandung didalam ekstrak etil aseat buah melon cina terikat pada residu Leu313, Asp242, Pro312, Val308,  Val319  dan  His280  di  katalitik situs glukosidase. 25 IDG  menghasilkan  pose docking terbaik dibandingkan senyawa lain, yaitu  25-trihydroxycucurbita-5,  23(E)-dien- 19-al  (TCD)  and  charantaB  yang  diisolasi dari ekstrak etil asetat daun M. Charantina dengan  energi  ikat  minimum  -10,58  kkal  / mol.  Ligan  dikelilingi  oleh  residu  katalitik Asp 242 dan interaksi itu mungkin penting untuk penghambatan glukosidase. Tiga ikatan hidrogen terbentuk dengan asam amino Leu313 (3,94 dan 4,98 Å) dan Asp242 (5,16 Å). Ikatan hidrogen ini memperkuat interaksi antara  IDG  dan  glukosidase.  Penelitian  lain
yang serupa masing-masing. Hal ini diperkuat dengan penelitian yang dilakukan oleh Sari et al. terhadap akarbose, dimana situs aktif di sekitar akarbose divisualisasikan dan dihitung dengan  PyMOL  dan  Ligplot.  Akarbose dikelilingi oleh 18 residu asam amino sebagai situs aktifnya: Asp69, Tyr72, Tyr158, Phe159, Phe178,  Asp215,  Val216,  Glu277,  Glu279, Phe303,  Asp307,  Thr310,  Ser311,  Arg315, Asp352, Glu411 dan Arg442. 25 Interaksi yang mengikat dapat mengakibatkan penghambatan enzim. Peningkatan energi ikat meningkatkan simultan dalam energi ikat sehingga menyebabkan  akarbose  menghambat  enzim α-Glukosidase secara kompetiti. 26

## 5. Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian dapat diambil kesimpulan bahwa interaksi senyawa Columbin  terhadap  enzim  α-glukosidase dengan nilai energi bebas terendah yaitu, -9,0  kcal/mol.    Situs  pengikatan  senyawa Columbin dengan asam amino Ser240, Asp242,  His280,  Arg315,  Glu411,  Phe159, Arg442, Tyr158 dan Phe303.
Daftar Pustaka
1. [ADA]  American  Diabetes  Association. 2012.  Diagnosis  and  classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 2012;35:S64–71
2. Tripathi,  B.  K.  &  Srivastava,  A.  K. Diabetes mellitus: Complications and therapeutics, Med Sci Monit. 2006; 12 (7):131-138.
3. Rais,  I.R.,  A.G.  Samudra,  S.  Widyarini dan A.E. Nugroho. Penentuan Aktivitas Isolat Andrografolid Terhadap a-Amilase dan a-Glukosidase Menggunakan Metode Apostolid dan Mayur. Jurnal Tradisional Medis. 2013; 18(3):162-166.
4. Inzucchi  SE,  Bergenstal  RM,  Buse JB, Diamant M, Ferrannini E, Nauck M, Matthews DR. Management of hyperglycemia in type 2 diabetes : a patient-centered approach:
update to a position statement of the American Diabetes Association and the European Association for the study of diabetes. Diabetes Care. 2015;38(1): 140-
149.
5. Malviya N, Jain S, Malviya S. Antidiabetic potential of medicinal plants. Acta Poloniae  Pharmaceutica-Drug  Research. 2010; 67(2): 113-118.
6. Joelijanto  R.  The  Potential  of  Red Betel  (Piper  crocatum  Ruiz)  as  a Space Maintainer Natural Cleanser in Orthodontic  Treatment.  The  Indonesian Journal of Dental Research. 2012.
7. Pujiastuti P, Lestari S. Perbedaan efektivitas antibakteri ekstrak daun sirih merah (Piper  crocatum)  pada  Porphyromonas gingivalis dan Sterptococcus viridans. Jurnal Stomatognati. 2015;1(1):1-6.
8. Safithri M, Yasni S, Yasni S, Bintang M, Ranti AS. Antihyperglycemic Activity of Piper crocatm Leaves and Cinnamomum burmannii Bark Mixture Extract in Streptozotocin-induced  Diabetic  Rats. Journal of Mathematical and Fundametal Sciences. 2016;48(2):178-191
9.  Puspa SD, Ita NA. Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Sirih Merah terhadap Kadar Glukosa Darah pada Tikus Wistar Jantan  Model  Hiperkolesterolemia. Kartika Jurnal Ilmiah Farmasi 2014;2
(2):7-13 7 ISSN 2354-6565
10. Alfarabi M. Bintang M. Suryani. Safitri  M.  The  Comparative  Ability  of Antioxidant Activity of Piper crocatum in Inhibiting Fatty Acid Oxidation and Free Radical  Scavenging.  Hayati  Journal  of Biosciences. 2010; 17(4) :201-204
11. Yamamoto,  K.,  Miyake,  H.,  Kusunoki, M.,  and  Osaki,  S.  Crystal  structures of isomaltase from Saccharomyces cerevisiae and in complex with its competitive inhibitor maltose, FEBS J.
2010;277 (20):4205–4214
12. Weni  M  et  al.  Studi  In  Vitro  dan Penambatan Molekuler Senyawa Bioaktif Ekstrak dan Fraksi Daun Sirih Merah (Piper  crocatum)  sebagai  Inhibitor α-Glukosidase  [laporan  penelitian]. Bogor(ID): IPB. 2018.
13. Wedaswari IAI. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol dan Fraksi Daun Sirih Merah  (Piper  crocatum) dengan  Metode Rancimat  dan  Identifikasi  dengan  LC-
MS.  [skripsi].  Bogor:  Institut  Pertanian Bogor.2018.
14. Setiawan  T.  Studi  molecular  docking ekstrak kurkuminoid asal wonogiri sebagai inhibitor enzim dna topoisomerase II [skripsi]. Bogor(ID): IPB. 2015.
15. Kunnumakkara A.B, Anand P, Aggarwal, BB. Curcumin Inhibots Proliferation, Invasion, Angiogenesis and Metastasis of Different Cancers Through Interaction with Multiple Cell Signaling Proteins. 2008.
16. Mihasan M. What in silico molecular docking  can  do  for  the  bench-working biologists. J. Biosci. 2012;37(6) .
17. Kwan HY, Wu J, Su T, Chao XJ, Yu H, Liu B, Fu X, Tse AKW, Chan CL, Fong WF, Yu Z. 2017. Schisandrin B regulates lipid metabolism in subcutaneous adipocytes. Scientific Reports. 7: 10266. DOI: 10.1038/s41598-017-10385- z 18. Bharti SK, Krishnan S, Kuwar A, Kumar
A. Antidiabetic phytoconstituents and their mode of action on metabolic pathways.  Ther  Adv  Endocrinol  Metab. 2018;9(3):81-100
19. Xu H. Inhibition Kinetics of Flavonoids on  Yeast  a-Glucosidase  Merged  with Docking Simulation. 2010;17(10): 1270- 1279.
20. Thomas  G.  Fundamentals  of  Medicinal Chemistry. John Wiley & Sons Ltd. UK.
2013.
21. Preziosi,  L.  Cancer  Modelling  and Simulation.  Chapman  &  Hall/CRC. Florida. 2003.
22. Hubbard,  R.E.,  dan  Haider,  M.K.  2010. Hydrogen  Bond  in  Protein:  Role  and Strength”. [diakses 2 Maret 2019].  Wiley Online Library
23. Lavle,  N.;  Shukla,  P.;  Panchal,  A. ROLE of flavonoids and saponins in the treatment of diabetes mellitus. J. Pharm. Sci. Bioscientific Res 2016;6:535–541.
24. Shivanagoudra  R,  Perera  WH,  Perez JL.  Cucurbitane-type  compounds  from Momordica charania : Isolation, in Vitro  Antidiabetic,  Anti-Inflammatory Activities and in Silico Modeling Approaches. J.Bioorganic Chemistry. 2019;87 : 31-42
25. Sari BL, Mun’im A, Yanuar A, Riadhi R. Screening  of  α-Glukosidase  Inhibitors From Terminalia Catappa L. Fruits Using Molecular Docking Method and In Vitro Test.  Int  J  Pharm  Sci  2016;8(12)  :  184- 189
26. Prenca C, Freitas M, Ribeiro D et al. α-Glucosidase  inhibition  by  flavonoids: an  in  vitro  and  in  silico  structure– activity  relationship  study.  J.  of  Enzym Inhibition and   Medical  Chemistry.  . 2017;32(1):1216-1228