Mikropropagasi Tunas Alfalfa ( Medicago sativa L.) pada Kombinasi Benzil amino purin (BAP) dan Thidiazuron (TDZ)
Alfalfa Shoot’s Micropropagation  at Combination of Benzil amino purin (BAP) and Thidiazuron (TDZ)
Diah Nurmaningrum 1 , Yulita Nurchayati 2 *,Nintya Setiari 2
1)Program Studi Biologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro
2)Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro
Jl. Prof. Soedarto, SH, Tembalang, Semarang
*Email : yulita.yoko@gmail.com
Diterima 3 Maret 2017 / Disetujui 20 Agustus 2017

## ABSTRAK
Teknologi kultur jaringan menjadi alternatif teknologi yang mampu menyediakan bibit secara massal, seragam dan  relatif  cepat.  Multiplikasi  tunas  dari  kultur  pucuk  merupakan  tahap  untuk  mendukung  pembentukan planlet dengan penambahan zat pengatur tumbuh (ZPT) sitokinin. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkaji pengaruh ZPT  Benzil Aminopurin (BAP) dan  thidiazuron (TDZ)  terhadap pembentukan tunas alfalfa pada media kultur serta mengetahui konsentrasi kedua ZPT dalam membentuk tunas secara optimal. Kultur pucuk diperoleh  dari  kecambah  aseptik  berumur  10  hari,  dan  ditumbuhkan  di  dalam  medium  Murashige&Skoog (MS). Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 kombinasi dari 2 faktor berupa 2 macam  sitokinin.  Faktor  pertama  adalah  BAP  dengan  konsentrasi  0;  0,3;  0,6:  0,9  mg/L  dan  faktor  kedua adalah TDZ dengan konsentrasi  0; 0,9; 0,6; 0,3 mg/L.  Data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA, dan dilanjutkan  dengan  uji  Duncan  pada  taraf  signifikansi  95%.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  waktu inisiasi tercepat (2,33 hari) terdapat pada perlakuan kombinasi BAP 0,3 mg/L dan TDZ 0,9 mg/L, sedangkan jumlah tunas terbanyak (8,00) diperoleh pada perlakuan kombinasi BAP 0,9 mg/L dan TDZ 0,3  mg/L. Tunas terpanjang  terdapat  pada  media  tanpa  ZPT  (kontrol).  Kesimpulannya  kombinasi  BAP  dan  TDZ  di  dalam media MS efektif mempercepat waktu inisiasi dan meningkatkan pertumbuhan tunas alfalfa.
Kata kunci : alfalfa (Medicago sativa), induksi pertunasan, BAP, TDZ

## ABSTRACT
Plant tissue culture technique  is one of the alternative way in producing seedling in large number with a short period  relatively.    Shoot  multiplication  of  shoot  tip  culture  is  stage  to  encourage  planlet  formation  by application  of  cytokinins. The  aim  of  this  experiment  was  to  study  the  effect  of  both  exogeneous  cytokinin Benzyl Aminopurin  (BAP) combined with Thidiazuron (TDZ),  on alfalfa’s shoot culture. The shoot culture was  initiated  from  10-day  old  axenic  seedling  and  grown  in  Murashige&Skoog  (MS)  medium.  This experiment  has  been  conducted  by  Completely  Randomized  Design  (CRD)  with  4    combination  of    2 factors,i.e. BAP and TDZ concentration : 0: 0,3: 0,6: 0,9 mg/L and  0; 0,9, 0,6; 0,3 mg/L, respectively.   The quantity and length of shoot,  and also number of leaves bud  were analyzed by ANOVA followed by Duncan test at 95% level. The results showed that  the highest number of shoots (8.00) was obtained at BAP 0,9 mg/L combined with TDZ  0,3 mg/L. The longest shoot was reached on the MS without cytokinins (control). It was concluded that both cytokinin  induce shoot formation effectively in vitro so enhanced growth  alfalfa
Key words: alfalfa ( Medicago sativa ), shoot culture, BAP, TDZ

## PENDAHULUAN
Budidaya  alfalfa  di  Indonesia  mengalami kendala  dalam  penyediaan  biji.  Biji  alfalfa  yang
dihasilkan  dari  tanaman  yang  ditumbuhkan  tidak dapat  dikecambahkan  karena  tidak  memiliki embrio (Rahmayati dan Sitanggang, 2008). Upaya
propagasi alfalfa perlu dilakukan untuk mendukung penyediaan bibit.
Mikropropagasi  merupakan  teknik  kultur jaringan  untuk  perbanyakan  tumbuhan  dalam medium  buatan  yang  dapat  digunakan  sebagai alternatif  pemecahan  masalah  tersebut  untuk menghasilkan  bibit  yang  banyak  dalam  waktu relatif singkat (Suryowinoto, 1996).
Salah  satu  teknik  mikropropagasi  yang dapat  dilakukan  adalah  melalui  kultur  pucuk. Kultur pucuk umumnya dipacu dengan penambahan zat pengatur tumbuh (ZPT)  sitokinin, karena dapat memacu inisiasi dan proliferasi tunas. Sitokinin  yang  sering  digunakan  di  dalam  kultur jaringan adalah Benzil Aminopurin dan Thidiazuron (Huetteman dan Preece, 1993).
Benzil  Aminopurin  merupakan  sitokinin sintetik  turunan  adenin  yang  sangat  aktif  dalam mendorong  pertumbuhan  kalus  tembakau.  Bentuk isomer  1- bensil  adenine mempunyai  aktivitas kimia  yang  rendah,  sehingga  untuk  dapat  aktif harus  diubah  menjadi  6- bensil  adenine .  Sitokinin BAP  berperan penting dalam menginduksi respon fisiologi seperti regulasi pembelahan sel, diferensiasi  jaringan  dan  organ  serta  biosintesis klorofil (Victor et al ., 1999).
Thidiazuron (N-phenyl-N (1,2,3-thidiazol-5- yl)  urea),  merupakan  turunan  fenilurea  sintetik yang  berperan  penting  dalam  meningkatkan biosintesis  dan  akumulasi  sitokinin  endogen (Victor et  al .,  1999).  Tefera  dan  Wannakrairoj (2006)  menjelaskan  bahwa  TDZ  memiliki  peran sebagai  inhibitor  sitokinin  oksidase  yang  dapat menghilangkan  keaktifan  sitokinin  tipe  adenine bebas.
Oleh  karena  itu  TDZ  dapat  meningkatkan kerja sitokinin lain, baik sitokinin eksogen ataupun endogen  (Lu,  1993).  Penggunaan  TDZ  pada konsentrasi  kurang  dari  1  μM  dapat  menginduksi tunas  pada  spesies  tanaman  berkayu  (Huetteman dan Preece, 1993)  maupun menginduksi kalus dan embrio somatik (Fiola et al . 1990).
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengkaji pengaruh  penambahan  BAP  dan  TDZ  dalam memacu  pembentukan  tunas  dan  mengetahui konsentrasi  BAP  dan  TDZ  dalam  menghasilkan tunas alfalfa dengan jumlah yang banyak.

## METODE PENELITIAN
Bahan  tanaman  yang  digunakan  adalah tunas  pucuk  dari  kecambah  aseptik  berumur  10 hari setelah semai dan berukuran panjang   ±1 cm. Biji  alfalfa  yang  akan  dikecambahkan  disterilisasi secara  kimia  menggunakan  larutan  Natrium hipoklorit 5% selama 30 detik,  selanjutnya dibilas dengan  akuades  steril.  Biji  dikecambahkan  dalam cawan  petri  beralaskan  tisu  basah  steril  dan diinkubasi  selama  10  hari.  Tunas  yang  tumbuh digunakan  sebagai  eksplan    sepanjang  1  cm ditanam  di  dalam  medium  perlakuan  yakni medium  MS  padat  yang  mengandung    BAP  dan TDZ  pada  konsentrasi  yang  berbeda  (0;  0,3;  0,6; 0,9  mg/L).  Kultur  pucuk  dinkubasi  pada  kondisi terang di bawah pencahayaan lampu 20 watt pada suhu 25 0 C.
Rancangan  percobaan  yang  digunakan adalah  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan empat  kombinasi  BAP  dan  TDZ  masing-masing dengan  3  ulangan.  Perlakuan-perlakuan  tersebut adalah  sebagai  berikut:  B 0,3 T 0,9 penambahan  BAP 0,3 mg/L dan TDZ 0,9 mg/L; B 0,6 T 0,6 penambahan BAP  0,6  mg/L  dan  TDZ  0,6  mg/L;  B 0,9 T 0,3 penambahan  BAP  0,9  mg/L  dan  TDZ  0,3  mg/L; B 0,0 T 0,0 penambahan  BAP  0  mg/L  dan  TDZ  0 mg/L.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Waktu Inisiasi
Waktu  inisiasi  merupakan  salah  satu  faktor penting  di  dalam  perbanyakan  tanaman  dengan metode  kultur  jaringan.  Semakin  cepat  waktu inisiasi  maka  semakin  cepat  dihasilkan  bahan untuk perbanyakan tanaman. Gambar 1. menunjukkan  bahwa  pemberian  kombinasi  BAP dan  TDZ  ke  dalam  media  tidak  berpengaruh terhadap  waktu  inisiasi  tunas.  Perlakuan  B 0,3 T 0,9 menunjukkan  waktu  inisiasi  yang  relatif  cepat (2,33  hari).  Waktu  inisiasi  yang  relatif  lambat dihasilkan  oleh  perlakuan  B 0,0 T 0,0 dan  B 0,9 T 0,3 . Pemberian  BAP  dan  TDZ  tidak  berpengaruh terhadap waktu inisiasi diduga karena pembelahan awal  tunas  belum  dipengaruhi  oleh  sitokinin eksogen.  Sitokinin  endogen  yang  terkandung dalam  eksplan  diduga  sudah  dapat  memacu
pembentukan  tunas.  George  dan  Sherrington (1984)  mengungkapkan  bahwa  sitokinin  alami yang  terkandung  di  dalam  eksplan  dapat  memacu eksplan  tersebut  untuk  membentuk  tunas.  Hal  ini
diduga sitokinin eksogen yang ditambahkan dalam media  pada  awal  penanaman  belum  berinteraksi dengan eksplan, sehingga sitokinin endogen dalam eksplan yang memacu inisiasi tunas.
Gambar 1. Rata-rata waktu inisiasi tunas (hari) pada berbagai perlakuan konsentrasi BAP dan TDZ

## Jumlah Tunas
Jumlah  tunas  diamati  pada  akhir  penelitian yaitu  20  hari  setelah  tanam  (hst).  Jumlah  tunas yang  dihasilkan  dalam  kultur  jaringan  dapat diindikasikan sebagai keberhasilan dalam multiplikasi.  Berdasarkan  hasil  ANOVA,  tampak bahwa  pemberian  BAP  dan  TDZ    pada  berbagai konsentrasi dalam media MS menghasilkan jumlah tunas yang lebih banyak dibandingkan pada media MS  tanpa  penambahan  BAP  dan  TDZ      (Gambar 2.).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  BAP  dan  TDZ yang  ditambahkan  ke  dalam  media  mampu
memacu  pembentukan  tunas  dari  pucuk  alfalfa. Sadik  dkk  (2006),  mengungkapkan  bahwa  BAP berperan dalam  menstimulasi pembelahan sel dan diferensiasi  sel,  serta  TDZ  berperan  dalam menstimulasi  produksi  dan  akumulasi  sitokinin pada  sel-sel  meristematik.  Hasil  yang  diperoleh menunjukkan bahwa perlakuan B 0,9 T 0,3 menghasilkan  rata-rata  jumlah  tunas  yang    relatif lebih  banyak  dibandingkan  dengan  perlakuan lainnya  yaitu  sebanyak  8,00  buah.  Jumlah  tunas yang  relatif  sedikit  dihasilkan  pada  perlakuan B 0,0 T 0,0 dan B 0,6 T 0,6 yaitu sebanyak 3,33 buah.
Gambar 2. Rata-rata jumlah tunas pada berbagai perlakuan konsentrasi BAP dan TDZ
Hasil  percoabaan  menunjukkan  bahwa konsentrasi  TDZ  yang  rendah  lebih  memacu pembentukan tunas dibandingkan pada konsentrasi yang  tinggi.  Penggunaan  konsentrasi  TDZ  yang tinggi  dapat  mengakibatkan  pertumbuhan  tunas terhambat,  vitrifikasi  eksplan,  serta  malformasi tunas dan daun yang dihasilkan (Shan dkk., 2000). Konsentrasi  TDZ  yang  dibutuhkan  lebih  rendah dikarenakan  sitokinin  tersebut    menstimulasi sintesis  sitokinin  endogen  atau  menghambat degradasi  sitokinin  karena  TDZ  resisten  terhadap enzim    sitokinin  oksidase    (Thomas  dan Katterman, 1986).
Perlakuan  B 0,9 T 0,3 menghasilkan  rata-rata jumlah tunas terbanyak (8,00) dan  meskipun tidak berbeda  signifikan  dengan  perlakuan  B 0,9 T 0,3 .  Hal ini  menunjukkan  adanya  sinergisme  antara  kedua jenis  ZPT  yang  diaplikasikan  sehingga  mampu memacu  multiplikasi  tunas  ke  arah  yang  lebih banyak. Thidiazuron merupakan kelompok sitokinin  yang  berfungsi  dalam  menginduksi pembelahan  sel  dan    proliferasi  tunas  aksiler  (Lu, 1993).  Media  dengan  dua  jenis  sitokinin  yang berbeda  dapat  meningkatkan  jumlah  tunas  yang dihasilkan  dibandingkan  dengan  penggunaan  satu jenis  sitokinin  saja  (Nielsen et  al .,  1995).
Penggunaan  kombinasi  TDZ  (0,1  mg/L)  dengan BAP  (0,5  mg/L)  pada  kultur in  vitro tapak  dara ( Catharanthus roseus ), dapat meningkatkan multiplikasi  tunas  (Yelnititis et  al .,  2000).  Hasil yang  sama    didapatkan    pada  kultur in  vitro tanaman daun encok (Yelnititis et al ., 1996).
Perlakuan  B 0,6 T 0,6 menghasilkan  rata-rata jumlah  tunas  yang  relatif  sedikit.  Hal  ini  diduga karena  konsentrasi  TDZ  yang  tinggi  dalam  media dapat  menurunkan  jumlah  tunas  yang  terbentuk karena  terikat  dengan Cytokinin  Binding  Protein (CBP). Hal  ini  menyebabkan  konformasi  tempat pengikatan  sitokinin  tipe  adenin  sehingga  BAP tidak  dapat  berikatan  dengan  CBP  dan  efek sitokinin tertekan yang menyebabkan pembentukan tunas terhambat. Nielsen dkk. (1995) menyatakan  bahwa  kandungan  TDZ  yang  cukup tinggi  akan  menyebabkan  gugus  adenin  sitokinin berubah  menjadi  tipe  adenin  yang  tidak  berikatan pada  gugusnya,  sehingga  peningkatan  pemberian TDZ  tidak  efektif  dalam  meningkatkan  jumlah tunas.  Wattimena et al .  (1992)  menambahkan konsentrasi  sitokinin  eksogen  yang  tinggi  dalam media akan menyebabkan eksplan jenuh, sehingga cenderung tidak memiliki respon lagi
Gambar 3. Tunas alfalfa yang tumbuh pada berbagai media dengan berbagai konsentrasi ZPT; a. daun; b. tunas; c: kotiledon
Berdasarkan  Gambar  3.  secara  umum terlihat  bahwa  perlakuan  B 0,9 T 0,3 memiliki  jumlah tunas  yang  lebih  banyak  dibandingkan  dengan perlakuan  yang  lain,  dan  berbentuk  roset. Huetteman  dan  Preece  (1993)  menyatakan  pada
umumnya  media  yang  mengandung  TDZ  akan menghasilkan  tunas  yang  berbentuk  roset.  Hal  ini karena TDZ menginduksi dan mengaktifkan etilen endogen  yang  memberikan  respon  terhadap penghambatan pemanjangan batang terutama pada
Mikropropagasi Tunas Alfalfa (Medicago sativa L.) pada Kombinasi Benzil amino purin (BAP) dan Thidiazuron (TDZ)
tanaman  dikotil  (Salisbury  dan  Ross,  1995). Thidiazuron yang  terdapat  di  dalam  media menyebabkan  sel  aktif  untuk  membelah,  sehingga jumlah  tunas  yang  dihasilkan  banyak  namun menghambat  pemanjangan  tunasnya.  Lu  (1993) menambahkan  umumnya  eksplan  yang  dikultur dalam  media  yang  mengandung  TDZ  dapat menimbulkan  gejala  keabnormalan  pada  tanaman. Hal  yang  sama  ditemui  pada  penelitian in  vitro tapak  dara,  yaitu  penggunaan  TDZ  konsentrasi tinggi  menimbulkan  penampilan  roset  pada  kultur (Kristina et al ., 2004).

## Panjang Tunas
Pemberian  kombinasi  BAP  dan  TDZ  tidak mempengaruhi  rata-rata  panjang  tunas  (  Gambar 4).  Hal  ini dikarenakan  proses pemanjangan tunas alfalfa  tidak  memerlukan  penambahan  sitokinin eksogen, diduga sitokinin endogen yang terkandung  dalam  eksplan  sudah  cukup  dalam pemanjangan  tunas.  Salisbury  dan  Ross  (1995)
menambahkan bahwa tunas yang sedang memanjang tidak memerlukan penambahan sitokinin  eksogen  dalam  konsentrasi  tinggi, dikarenakan  kandungan  sitokinin  endogen  dalam jaringan  sudah  mencukupi  untuk  pemanjangan jaringan  tersebut.  Gambar  4.  Juga  menunjukkan bahwa  perlakuan  tanpa  ZPT  menghasilkan  tunas yang  relatif  lebih  panjang  daripada  perlakuan lainnya.
Tunas  yang  dihasilkan  memiliki  panjang yang  berbanding  terbalik  dengan  jumlah  tunas. Jumlah  tunas  yang  banyak  akan  menghasilkan tunas  yang  pendek  dan  jumlah  tunas  yang  sedikit akan  menghasilkan  tunas  yang  panjang.  Hal  ini diduga  karena  adanya  persaingan  antar  tunas dalam  memperoleh  nutrisi  dan  ruang  tumbuh. Peningkatan kompetisi antar tunas dalam memperoleh  nutrisi  dan  ruang  tumbuh  sebanding dengan dengan peningkatan jumlah tunas. Sitompul dan Guritno (1995) menyatakan kompetisi  dapat  terjadi  diantara  bagian-bagian tanaman pada tanaman yang sama.
Gambar 4. Rata-rata panjang tunas (cm) pada berbagai kombinasi konsentrasi BAP dan TDZ

## Jumlah Daun
Daun  yang  dihitung  merupakan  daun  yang telah  terbuka  penuh  dan  yang  masih  menempel pada  tunas.  Pertumbuhan  daun  terjadi  sejak minggu  pertama    (6  HST),  namun  demikian  tidak semua tunas tumbuh daun.
Hasil  pengamatan  terhadap    jumlah  daun yang  terbanyak  diperoleh  pada  perlakuan  B 0,0 T 0,0 ,
yang  tidak  signifikan  dengan  perlakuan  B 0,3 T 0,9 namun  berbeda  sgnifikan  dengan  perlakuan B 0,6 T 0,6 . Perlakuan pemberian kombinasi BAP dan TDZ  yang  menghasilkan  jumlah  daun  terbanyak terdapat  pada  perlakuan  B 0,3 T 0,9 (1,33  helai). Diduga    B 0,3 T 0,9 merupakan  konsentrasi  yang optimum dalam pembentukan daun. Pada perlakuan lainnya menghasilkan jumlah daun yang
relatif  sedikit  dan  tunas  pada  perlakuan  B 0,3 T 0,9 belum tampak tumbuh daun.
Jumlah  daun  terbanyak  dihasilkan  pada perlakuan  B 0,0 T 0,0 yaitu  2,67  helai.  Hal  ini dikarenakan medium tanpa ZPT telah menghasilkan  tunas  yang  panjang  dan  menjadi tempat  sintesis  sitokinin  endogen.  Tunas  yang
tumbuh  dalam  medium  MS  sudah  cukup mendukung  pembentukan  daun.  Selain  itu,  unsur magnesium  yang  terkandung  dalam  media  MS diduga  mendukung  untuk  pembentukan  daun. Magnesium  (Mg)  berperan  penting karena berkaitan dengan proses fotosintesis (Salisbury dan Ross, 1992).
Gambar 5. Jumlah daun pada berbagai perlakuan konsentrasi BAP dan TDZ
Kombinasi BAP dan TDZ yang menghasilkan jumlah daun relatif banyak diperoleh  pada  perlakuan  B 0,3 T 0,9 .  Hal  ini  karena konsentrasi  TDZ  pada  media  lebih  tinggi. Thidiazuron  merupakan  sitokinin  yang  memiliki aktivitas  biologi  yang  lebih  tinggi  dibandingkan BAP.  Lu  (1993)  dan    Yelnititis et  al .  (1999), mengemukakan  bahwa  TDZ  dapat  meningkatkan akumulasi sitokinin endogen sehingga memberikan  respon  ganda  terhadap  pertumbuhan jumlah daun. Medium MS yang mengandung TDZ 0,9  mg/L  menghasilkan  jumlah  daun  terbanyak dan tunas yang relatif tinggi.
Perlakuan  B 0,6 T 0,6 menghasilkan  jumlah daun  yang  relatif  sedikit.  Penambahan  BAP  yang lebih  tinggi  (<  0,3  mg/l)  tidak mampu meningkatkan  jumlah  daun.  Harminingsih  (2007) mengemukakan  bahwa  peningkatan  konsentrasi BAP  pada  media  akan  menghasilkan jumlah  daun yang  sedikit.  Arniputri et . al .  (2003)  berpendapat bahwa tingginya konsentrasi BAP dapat menghambat  pemanjangan  tunas,  karena  BAP yang tinggi akan menghasilkan jumlah tunas yang banyak  sehingga  pemanjangan  tunas  dihambat
oleh  tunas  baru.  Pemanjangan  tunas  yang terhambat  akan  menyebabkan  pertumbuhan  daun juga terhambat. Strabala et al . (1996) menyatakan bahwa  auksin  dan  sitokinin  berperan  dalam perkembangan  primordia  daun,  sedangkan  posisi inisiasi  primordia  daun  dipengaruhi  oleh  transport auksin.

## KESIMPULAN
Pemberian  kombinasi  BAP  dan TDZ  dalam media  MS  dapat  menginduksi  pembentukan  dan perbanyakan tunas alfalfa. Jumlah tunas terbanyak diperoleh  pada  kombinasi  0,9  mg/L  BAP  dengan 0,3 mg/L TDZ.

## DAFTAR PUSTAKA
Arniputri,  R.  B.,  Praswanto  dan  D.  Purnomo. 2003.  Pengaruh  Konsentrasi  IAA  dan  BAP terhadap  Pertumbuhan  dan  Perkembangan Tanaman  Kunir  Putih  ( Kaempferra rotunda L.) Secara In vitro. Agrosains . 5 (2) : 48-51
Fiola, J. A., Hanssan M A., Swartz H. J., Bors R.
H.,  and  R.  McNicole.  1990.  Effect  of
Mikropropagasi Tunas Alfalfa (Medicago sativa L.) pada Kombinasi Benzil amino purin (BAP) dan Thidiazuron (TDZ)
Thidiazuron,  Light  Influence  Rate  and Canamycin on In Vitro Shoot Organogenesis from Excised Rubus Cotyledons and Leave. Plant Cell Tiss. Org.
Cult . 20: 223–228.
George,  E.  F.  dan  P.  D.  Sherrington.  1984.  Plant Propagation  by  Tissue  Culture.  Handbook and  Directory  of  Comercial  Laboratories.
Exegetics Ltd., Everslay. Basingtoke. England. 709 p.
Harminingsih, I. 2007. Pengaruh Konsentrasi BAP
Terhadap  Multiplikasi  Tunas  Anthurium ( Anthurium  andraeanum Linden)  Pada
Beberapa  Media  Dasar  Secara  In  Vitro. Skripsi S1 Fakultas Pertanian UNS.
Huetteman dan Preece, IA. 1993. Thidiazuron : A Potent  Cytokinin  For  Woody  Plant  Tissue Culture. Plant  Cell  Tissue  And  Organ Culture 33: 105-119.
Kristina,  N.N.,  N.  Bermawie,  Amalia  dan Nursalam,  2004.  Konservasi  in  vitro tanaman  rempah  dan  obat.  Laporan  teknis Balittro (tidak dipublikasi). hal. 20-85.
Lu, C. Y. 1993. The Use of Thidiazuron in Tissue Culture  . In  vitro  Cell.  Dev.  Biol .  29:  92-
96.
Nielsen  J.  M.,  Hansen  J.,  Brandt  K.  (1995).
Synergism of Thidiazuron and Benzyladenine  in  Axillary  Shoot  Formation Depends  on  Sequence  of  Application  in
Miscanthus  and  Ogiformis  ‘Giganteus’.
Plant  Cell,  Tissue  and  Organ  Culture .  41  : 65-70.
Rahmayanti, E dan Sitanggang, S. 2008. Taklukan
Penyakit  dengan  Klorofil  Alfalfa.    Agro Media Pustaka. Jakarta.
Sadik, K., P. R. Rubaihayo, M. J. S. Magambo dan
M.  Pillay.  2006.  Generation  of  cell suspensions  of  East  African  highland bananas  through  scalps. African  Journal  of
Biotechnology 6(11) : 1352-1357.
Salisbury,  F.  B  dan  Ross,  C.  W.  1995.  Fisiologi Tumbuhan.(Diterjemahkan  oleh  Diah  R.  L. dan Sumaryono). Penerbit ITB, Bandung.
Shan,  X.,  D.Li,  dan  R.Qu.  2000.  Thidiazuron promotes  In  vitro  Regeneration  of  Wheat and  Barley  In  vitro  Cellular  Developmental Biology. Plant . 36:207-210
Sitompul,  S.  M.  dan  B.  Guritno.1995.  Analisis Pertumbuhan  Tanaman.  UGM  Press, Yogyakarta.
Strabala  TJ,  Yan  HW  and  Yi  L.  1996.  Combined
Effect  of  Auxin  Transport  Inhibitor  and Cytokinin : Alterations of Organ
Development  in  Tobacco. Plant  Cell Physiol . 37(8): 1177-1182.
Suryowinoto,  M.  1996.  Pemuliaan  Tanaman Secara in vitro. Penerbit Kanisius.
Yogyakarta.
Tefera, W dan S. Wannakrairoj. 2006. Synergistic Effects of Some Plant Growth Regulators In Vitro  Shoot  Proliferation  of  Korarima ( Aframomum  corrorima (Braun  Jansen). Afrika  Journal  of  biotechnology 5  (10):
1984-1901
Victor,  J.M.R.,  S.J.  Murch,  S.  Krishna  Raj,  and P.K. Saxena. 1999. Somatic Embryogenesis and  Organogenesis  in  Peanut:  The  Role  of Thidiazuron  and  N6-Benzylaminopurine  in The  Induction  of  Plant  Morphogenesis.
Plant Growth Regulation 28: 9–15.
________.  1992.  Kultur  Jaringan  Tanaman, Bioteknologi Tanaman, Pusat Antar Universitas. IPB, Bogor. Yelnititis.  1996.  Pengaruh  BA,  Thidiazuron  dan Auksin (IAA dan IBA) terhadap multiplikasi  tunas  dan  perkaran  in  vitro encok.  Prosiding  Simposium  Nasional Tumbuhan  Obat  dan  romatik.  APINMAP. Bogor. Hal 278-283.
________ , N., Bermawie, dan Syafaruddin, 1999. Perbanyakan  klon  Lada  Varietas  Panniyur secara  In  Vitro. Jurnal  penelitian  Tanaman Industri . 5 (3) : 109-114.
________  dan  D.  Surachman.  2000.  Pengaruh BAP  dan  Thidiazuron  terhadap  inisiasi  dan multiplikasi  tunas  tapak  dara. Buletin Penelitian  Tanaman  Rempah  dan  Obat .  XI (2) : hal. 11 – 18.