## KARAKTERISASI ISOLAT  PESTALOTIOPSIS  PADA KARET

## ( ) MENGGUNAKAN KARAKTER MORFOLOGI DAN Hevea brasiliensis

## MOLEKULER
Characterization of Pestalotiopsis Isolate on Rubber (Hevea brasiliensis) Using Morphological and Molecular Characteristics
1 1
2
Tri Rapani FEBBIYANTI *, Radite TISTAMA , dan Yudiarto SARSONO
1 Pusat Penelitian Karet Sembawa. Jalan Raya Palembang – Pangkalan Balai KM 29 Sembawa, Banyuasin 30953, Sumatra Selatan
2 Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian Badan Karantina Pertanian, Kementerian Pertanian. Jalan Pemuda Nomor 64 Rawamangun Jakarta Timur 13220 *Email: trifebbi@yahoo.com
Diterima : 2 Maret 2021 / Disetujui : 12 Agustus 2021

## Abstract
Pestalotiopsis leaf fall disease caused by  Pestalotiopsis  sp.  on  rubber  plants  has been  a  detrimental  disease  since  2017  in Indonesian  rubber  plantations.  This  disease also attacks all clones and all stages of rubber plants  and  causes  a  decrease  in  latex production. Pathogenic information regarding morphological  and  molecular  characters  is needed to know the life cycle and biology of the  pathogen.  This  study  aims  to  detect  the Pestalotiopsis  species  that  attack  rubber plants  in  South  Sumatra  by  morphologically and molecularly. Leaf samples infected with leaf  fall  were  taken  from  the  Experimental Garden  of  the  Indonesian  Rubber  Research Institute,  South  Sumatra.  The  research  was carried out at the Protection Laboratory of the Indonesian Rubber Research Institute and the Laboratory of Mycology and Plant Quarantine Biomolecular-Center for Diagnostic Standard of  Agricultural  Quarantine,  Agricultural Quarantine  Agency  Jakarta  from  April  to December  2019.  The  method  in  this  study was initiated by taking samples from several symptomatic  host  plants,  isolated  on  PDA media,  purified,  morphological  identification of each isolate, PCR analysis, and sequencing for selected isolate. The results of this study showed that the morphology of Pestalotiopsis was differentiated based on the shape of the conidia, the size of the conidia, the number of
septates,  the  color  of  the  pigment,  and  the shape of the basal cells and the middle cells. Pestalotiopsis  species  obtained  based  on mo rp h o lo g ic a l  o b s e rv a tio n s   we re   P . microspora,  P.  linearis,  P.  quepinii,  P. kunmingensis,  P  clavate,  and  P.  cocos.  The results  of  amplification  of  this  rubber  leaf fungus  obtained  7  isolates  that  had  DNA bands between 525 to 550 basepare (bp), and obtained 2 types of leaf fall fungus from the s e q u e n c i n g   r e s u l t s ,   n a m e l y Pseudopestalotiopsis  coccos  strain  CBS 272.29 and Neopestalotiopsis cubana strain CBS 600.96
Keyword:  leaf  fall  diseases;  molecular; morphology;  Pestalotiopsis; rubber

## Abstrak
Penyakit  gugur  daun  Pestalotiopsis yang  disebabkan  oleh Pestalotiopsis sp. pada tanaman karet telah menjadi penyakit yang  merugikan  sejak  tahun  2017  di pertanaman karet Indonesia. Hampir semua klon  rekomendasi  dan  semua  stadia tanaman  karet  terserang  penyakit  yang mengakibatkan penurunan produksi lateks. Informasi  patogen  mengenai  karakter morfologi  dan  molekuler  diperlukan  untuk mengetahui  siklus  hidup  dan    biologi
Jurnal Penelitian Karet, 2022, 40 (1) : 15 - 26 Indonesian  J.  Nat. Rubb. Res., 2022, 40 (1) : 15 - 26 Doi : 10.22302/ppk.jpk.v39i2.798

## Febbiyanti, Tistama, dan Sarsono
patogen  tersebut.  Penelitian  ini  bertujuan mendeteksi  spesies Pestalotiopsis yang menyerang  tanaman  karet  di  wilayah Sumatra  Selatan  secara  morfologi  dan molekuler.  Sampel  daun  yang  terinfeksi penyakit  gugur  daun  diambil  dari    Kebun Percobaan  Pusat  Penelitian  Karet,  Desa Lalang  Sembawa,  Kabupaten  Banyuasin, Sumatra Selatan. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium  Proteksi  Pusat  Penelitian Karet  dan  Laboratorium  Mikologi  dan Biomolekuler  Karantina  Tumbuhan,  Balai Besar  Uji  Standar  Karantina  Pertanian (BBUSKP), Jakarta pada bulan April hingga Desember 2 0 19 . Metode pada penelitian ini diawali  pengambilan  sampel  dari  beberapa tanaman  inang  yang  bergejala,  kemudian dilakukan  isolasi  pada  media  PDA, d i m u r n i k a n ,   k e m u d i a n   d i l a k u k a n identifikasi  morfologi  pada  masing-masing isolat,  selanjutnya  dilakukan  analisa  PCR dan  hasil  PCR  yang  terpilih  dilanjutkan dengan sequencing .  Hasi  penelitian  ini menunjukkan  morfologi Pestalotiopsis dibedakan  berdasarkan  bentuk  konidia, ukuran  konidia,  jumlah  septat,  warna pigmen,  serta  bentuk  sel  basal  dan  sel tengah. Spesies Pestalotiopsis yang diperoleh berdasarkan pengamatan morfologi yaitu P. microspore,  P.  linearis,  P.  quepinii,  P. kunmingensis, P clavate, dan P. cocos .  Hasil amplifikasi  cendawan  daun  karet  ini diperoleh 7 jenis isolat yang memiliki ukuran pita DNA yang berbeda, dan diperoleh 2 jenis cendawan gugur daun dari hasil sequensing yaitu Pseudopestalotiopsis coccos strain CBS 272 , 29 dan Neopestalotiopsis cubana strain CBS 600 , 96 .
Kata  kunci:  karet;  molekuler;  morfologi; p e n y a k i t   g u g u r   d a u n ; Pestalotiopsis

## PENDAHULUAN
Sejak  2017,  perkebunan  karet  di I n d o n e s i a   k h u s u s n y a   d i   S u m a t r a mengalami  gugur  daun  terus  menerus sepanjang  tahun.  Penyakit  gugur  daun Pestalotiopsis  yang  disebabkan  oleh Pestalotiopsis sp.  pada tanaman karet telah
menjadi  penyakit  yang  merugikan  sejak tahun 2017 di pertanaman karet Indonesia. Luas  serangan  2018  mencapai  22.000 hektar  (Febbiyanti,  2019),  dan  menjadi 382.000    hektar  pada  bulan  Juni  2019 meliputi wilayah   Sumatra Utara, Sumatra Barat,  Riau,  Jambi,  Sumatra  Selatan, Bangka Belitung, Bengkulu, Lampung, Jawa Barat,  Jawa  Tengah,  Kalimantan  Selatan, Kalimantan  Barat,  dan  Sulawesi  Tengah. Penyakit ini juga terjadi di negara produsen karet  lainnya  yaitu  Malaysia,  Sri  Lanka, India,  dan  Thailand  (Febbiyanti  dan Fairuzah, 2019).
Hampir  semua  klon  karet  dapat diserang  oleh  penyakit  gugur  daun  ini. Patogen  ini  memiliki  kisaran  inang  yang sangat  luas  yaitu  dari  jenis  palma, m a n g r o v e ,   P l a n c h o n e l l a e ,   d a n Podocarpaceae , serta tersebar di lingkungan agroklimat yang bervariasi (Liu  et al. , 2010). Neopestalotiopsis dan Pestalotiopsis juga menyerang jambu biji (Solarte et al., 2018).
Pestalotiopsis menyerang  daun  dan buah dengan gejala nekrosis berwarna abu- abu atau coklat dikelilingi cokelat tua (Keith et al. , 2006). Gejala yang mirip juga terjadi pada  tanaman  karet,  gejala  penyakit  ini berupa    bercak    kecil  yang  terus  melebar, yang  kemudian  bercak  terus  berkembang menjadi nekrosis di bagian sekeliling bercak tersebut. Pada helaian dan tulang daun yang terinfeksi  akan  mengalami  perubahan warna  atau  bisa  juga  tidak  mengalami perubahan  warna  sama  sekali.    Kemudian daun  akan  gugur  secara  terus  menerus sehingga kanopi tanaman akan menjadi tipis atau  mengalami  peranggasan  (Febbiyanti dan  Fairuzah , 2019).  Perkembangan serangan Pestolotiopsis semakin  luas, s e r a n g a n   p a d a   t a n a m a n   t e h (Maharachchikumbura et al., 2016). P.  pini merupakan  jenis  baru  yang  menyerang tanaman  pinus  berdasarkan  analisis molekuler  (Silva  et  al.,  2020).  Analisis molekuler  dapat  membantu  secara  spesifik menentukan spesies Pestalotiopsis (Keith et al.,  2006).  Penelitian  ini  bertujuan mendeteksi  spesies Pestalotiopsis yang menyerang  tanaman  karet  dan  tanaman

## Karakterisasi Isolat  Pestalotiopsis  pada Karet (hevea Brasiliensis) Menggunakan Karakter Morfologi dan Molekuler
inang  lainnya  di  wilayah  Sumatra  Selatan secara morfologi dan molekuler

## METODOLOGI

## Tempat dan Waktu
Sampel  daun  yang  terinfeksi  oleh penyakit  gugur  daun  (PGD)  Pestalotiopsis diambil  dari    Kebun  Percobaan  Pusat Penelitian  Karet,  Desa  Lalang  Sembawa, Kabupaten  Banyuasin,  Sumatra  Selatan. Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium Proteksi  Pusat  Penelitian  Karet  dan Laboratorium  Mikologi  dan  Biomolekuler Karantina  Tumbuhan,  Balai  Besar  Uji Standar  Karantina  Pertanian  (BBUSKP), Jakarta pada bulan April hingga Desember 2 0 19 .

## Alat  dan Bahan
Isolat  diperoleh  dari  sampel  daun yang terserang oleh PGD dari beberapa klon karet   AVROS , IRR 05 , BPM 24 , IRR 39 , IRR 301 , PR 255 , IRR 112 , manggis, dan kelapa sawit . Bahan  untuk  isolasi  menggunakan media potato  dextrose  agar (PDA). Identifikasi  jamur  secara  morfologi menggunakan pewarnaan lactophenol cotton blue menggunakan  mikroskop  cahaya (Shamly  et  al. , 2014).  Spesies  jamur d i i d e n t i f i k a s i   s e c a r a   m o l e k u l e r menggunakan Primer ITS1/ITS4 dan primer BOT15/16  spesifik  untuk  identifikasi  jenis jamur (Legiastuti dan Aminingsih, 2012).

## Isolasi Daun yang Bergejala PGD
Potongan  daun  yang  terinfeksi  PGD disterilisasi  permukaan  menggunakan klorox 5% selama 5 menit dan dibilas dengan air  steril,  kemudian  direndam  dengan  70% etanol  selama  60  detik.  Setelah  dibilas d e n g a n   a i r   s t e r i l ,   p o t o n g a n   d a u n dikeringkan  di  atas  tissue  steril  dan diletakkan  di  atas  media  PDA.  Setelah  2 minggu jamur dipindahkan ke media baru.
Kultur  spora  tunggal  digunakan  untuk i d e n t i f i k a s i   m o r f o l o g i   d a n   a n a l i s i s molekuler.

## Identifikasi  Jamur
1.  Pengamatan  karakteristik  Morfologi  dan Koloni Jamur a . Pengamatan  Secara  Langsung  ( Direct Inspection )
Sampel  daun  karet  bergejala hawar  daun  diperoleh  dari  Pusat Penelitian Karet Sembawa diuji secara langsung  ( dirrect  inspection )  di Laboratorium  Mikologi  Karantina Tumbuhan,  Balai  Besar  Uji  Standar K a r a n t i n a   P e r t a n i a n , J a k a r t a . Pengujian ini   mencakup karakteristik makro dan mikro jamur target .
Seluruh  sampel  daun  karet bergejala  diperiksa  secara  langsung dengan  menggunakan  mikroskop stereo  untuk  melihat  ada  atau tidaknya  hifa , konidia , tubuh  buah ( pycnidia ) , dan  sorus.  Semua  jamur yang ditemukan dibuat preparat pada objek  gelas  dengan  setetes  larutan siere  dan  ditutup  dengan cover  glass .
P r e p a r a t   t e r s e b u t   k e m u d i a n diidentifikasi  secara  morfologi  dan morfometri  dengan  menggunakan mikrokop  kompon.  Hasil  identifikasi selanjutnya  didokumentasikan  dalam bentuk foto .
b.  Pengamatan  Tidak  Langsung  dengan Menggunakan  Metode  Kertas  Saring ( Blotter Test )
Seluruh  sampel  daun  karet bergejala hawar dibilas air biasa yang m e n g a l i r , d i p o t o n g   k e c i l - k e c i l , direndam klorox 1% (± 1 - 2 menit) dan dicuci  dengan  air  akuades  steril . Kemudian diletakkan ke dalam cawan petri  yang  berisi  kertas  saring  yang telah dilembapkan dengan air akuades steril . Selanjutnya  diletakkan  dalam ruang inkubasi pada temperatur sejuk selama  ±  7 - 14  hari  di  bawah penyinaran Near Ultra Violet (NUV) 12 jam  terang - gelap . Setelah  diinkubasi ,
seluruh  sampel  daun  karet  bergejala hawar  dalam  cawan  petri  diperiksa untuk melihat ada atau tidaknya hifa , konidia , tubuh  buah  ( pycnidia ) , dan sorus.  Semua  jamur  yang  ditemukan dibuat  preparat  pada  objek  gelas dengan  setetes  larutan  siere  dan ditutup cover gelas. Preparat tersebut kemudian  diidentifikasi  secara morfologi  dan  morfometri  dengan menggunakan  mikrokop  kompon . H a s i l   i d e n t i f i k a s i   s e l a n j u t n y a didokumentasikan dalam bentuk foto . c.  Pengamatan  Tidak  Langsung  dengan Menggunakan Kultur Seluruh  sampel  daun  karet bergejala hawar dibilas air biasa yang mengalir , direndam  klorox  1%  (±  1 - 2 menit) , dicuci  dengan  air  akuades s t e r i l   d a n   d i k e r i n g a n g i n k a n . Selanjutnya seluruh sampel diperiksa secara  langsung  menggunakan mikroskop  stereo  untuk  melihat  ada atau  tidaknya  hifa,  konidia , tubuh buah  ( pycnidia ) , dan  sorus . Semua jamur yang ditemukan (dalam bentuk hifa , konidia , tubuh  buah  ( pycnidia ) , dan sorus )  dibiakkan  dalam  media PDA  secara  tunggal  dan  dilakukan dalam  keadaan  steril . Selanjutnya diletakkan dalam ruang inkubasi pada temperatur sejuk selama ± 7 - 14 hari di bawah  penyinaran Near  Ultra  Violet (NUV  )  12  jam  terang - gelap . Hasil k u l t u r   d i p e r i k s a   d a n didokumentasikan.
2 . Identifikasi Molekuler a. Ekstraksi DNA Identifikasi  secara  molekuler d e n g a n   m e m a n f a a t k a n   P C R dilakukan     terhadap     isolat     jamur target     yang diperoleh dari daun karet
bergejala Pestalotiopsis asal  klon AVROS,  IRR 0 5,  BPM  24,  IRR  39,  IRR 3 0 1,  PR  255,  IRR  112,  dan  sebagai pembanding  menggunakan  isolat  asal manggis  dan  kelapa  sawit.  Isolat diperoleh  dari  biakan  kultur  murni masing  masing  klon  berumur  1 0 hari. Kemudian  miselium  dari  setiap  isolat yang  ditumbuhkan  pada  temperatur
O 26 C,  selanjutnya  dipindahkan  ke dalam  labu  erlenmeyer  berisi  5 0 ml media kentang dekstrosa (24 g/l ) dan digoyang  pada  6 0 rpm  dalam  suhu kamar  selama  5  hari . Kemudian miselium disaring menggunakan ketas saring  dan  dicuci  dua  kali  dengan akuades  steril , dibiarkan  mengering selanjutnya diambil 25 0 mg dan digerus dengan  mikro  mortal  dalam  tabung kerucut mikro centrifuge 1 , 5 ml dengan penambahan  nitrogen  cair . Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan Mini Kit Plant DNeasy®  dari  Qiagen  GMBH (Jerman)  dan  sesuai  protokol  dari produsen.  Konsentrasi  DNA  yang dihasilkan  diukur  menggunakan Nanodrop 2000 , kemudian DNA murni diencerkan  menggunakan  Aquabides (dd H 0 ) steril hingga konsentrasi DNA 2 mencapai 1 µg/µl dan siap digunakan untuk reaksi lebih lanjut .
Setelah memperoleh DNA total m a k a   d i l a k u k a n   p e n g u j i a n menggunakan  PCR  dengan  primer universal  ITS - 1  dan  ITS - 4  sebagai  uji awal atau optimasi untuk memperkuat daerah  ITS-I  dan  ITS - II  dari  DNA ribosom , meliputi gen rRNA 5 , 8S (White et  al ., 1990).  Dengan  mengikuti komposisi  pencampuran  untuk  reaksi PCR seperti pada Tabel 1.

## Febbiyanti, Tistama, dan Sarsono
R e a k s i   a m p l i f i k a s i   D N A dilakukan menggunakan mesin PCR dilakukan  pada  volume  total  25  ml dengan kondisi PCR sebagai berikut 0 satu siklus 3 menit pada suhu 94 C, dan  kemudian  dalam  satu  siklus amplifikasi  adalah  denaturasi
0 selama  1  menit  pada  suhu  94 C 0 (denaturasi), 1 menit pada suhu 37 C 0 (annealing), 2 menit pada suhu 72 C ( e k s t e n s i ) .   S e l u r u h   p r o d u k amplifikasi  DNA  dilengkapi  dengan ekstensi selama 10 menit pada suhu 0 72 C.
K e m u d i a n   h a s i l   P C R d i l a n j u t k a n   d e n g a n   p r o s e s e l e k t r o f o r e s i s .   A g a r o s e   y a n g digunakan  sebanyak  2%  dalam volume 200 ml 1 x buffer TAE dengan menggunakan  tegangan  listrik  80 volt  selama  45  menit.    Gel  agarose d i l e t a k k a n   p a d a   U V t r a n s i l l u m i n a t o r ,   k e m u d i a n dilakukan  dokumentasi  hasil pita/band  molekul  DNA  (GeneRuler 1 00 bp  DNA  Ladder  dan  1  kb  DNA ladder marker (Fermentas, USA).
b . Perunutan dan Analisis DNA
Sekuensing  dari  hasil  produk PCR dilakukan oleh pihak ketiga (First Base di Kuala Lumpur , Malaysia) . Hasil sekuensing produk PCR berupa urutan basa  DNA  sampel  yang  selanjutnya dibaca  serta  diedit  dan  diurutkan dengan menggunakan program MEGA versi 7 .0 (Tamura et al ., 2 00 7) . Urutan sekuen  fragmen  gen  yang  diperoleh
selanjutnya  diupload  ke  Bank  Gen melalui  program  BLAST  pada  website www.ncbi.nlm.nih.gov.  Visualisasi hubungan pohon filogenik hasil BLAST diolah dengan menggunakan program Clustal W2 .

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakterisasi Morfologi
Konidia Pestalotiopsis memiliki beberapa tipe morfologi. Secara umum dapat dibedakan  bentuk  konidia,  jumlah,  warna septa,  ada  tidaknya spathulate  tips. Karakteristik  makro  berupa  tubuh  buah (subepidermal piknidia disertai sorus) yang berwarna hitam yang berkembang di sekitar bercak  lesi  di  tengah  daun  (umumnya  ke arah  pertulangan  daun)  berwarna  coklat hingga  coklat  tua,  sedangkan  karakteristik mikro  berupa  konida  dan  hifa.  Konidia Pestalotiopsis dicirikan  empat  septa  dan warna  pigmen  di  median  sel  dengan  2-4 anggota  sel  muncul  pada  bagian  apical sebagai  ekstensi  tubular  sel  apikal  dan sebuah  anggota  bagian  basal.  Hal  ini  juga dikemukakan oleh Jeewon et al . (2002) yang menganilisis  beberapa Pestalotiopsis . Namun  demikian  karakter  morfologi  ini dipengaruhi  oleh  kecepatan  pertumbuhan dan struktur konidiospora (Karakaya, 2001). P e r t u m b u h a n   k o l o n i P e s t a l o t i o p s i s d i p e n g a r u h i   o l e h   s u h u   r u a n g a n . Pestalotiopsis juga bisa tumbuh pada suhu
O O
15 C – 30 C (Keith et al., 2006).
Karakterisasi Isolat  Pestalotiopsis  pada Karet (hevea Brasiliensis) Menggunakan Karakter Morfologi dan Molekuler
Fungi
Sepuluh  jenis  isolat Pestalotiopsis asal klon AVROS, PB 26 0 , IRR 3 0 1 , IRR 112, PR 255, IRR 39 , BPM 24 , IRR 05 , serta inang lain  yaitu    kelapa  sawit  dan  manggis. Berdasarkan morfologi dan ukuran konidia, jenis jamur dari masing-masing isolat tersaji pada Tabel 2 dan Gambar 2 . Enam isolat asal klon  karet  yang  terserang  ditemukan  6 spesies Pestalotiopsis yang  berbeda. Serangan  penyakit  gugur  daun  (PGD) Pestalotiopsis  yang  luas  dan  cepat kemungkinan  disebabkan  keragaman Pestalotiopsis yang cukup luas. Keragaman P e s t a l o t i o p s i s y a n g   l u a s   i n i   j u g a
menyebabkan  belum  ada  klon  karet  yang toleran  terhadap  PGD  ini.  Pertanyaannya adalah  apakah  setiap  spesies  menyerang s p e s i f i k   k l o n .   B e b e r a p a   p e n e l i t i a n menyebutkan bahwa hasil isolasi dari daun yang  menunjukkan  gejala Pestalotiopsis d i p e r o l e h   b e b e r a p a   s p e s i e s   j a m u r Pestalotiopsis (Maharachchikumbura  et al., 2016; Liu et al., 2017; Solarte et al. , 2018) . Dengan  demikian    diduga  serangan  PGD merupakan  kerja  sama  antara  beberapa spesies Pestalotiopsis yang  melakukan infeksi  secara  bersaaman  atau  berurutan atau dengan jamur lainnya.

## Febbiyanti, Tistama, dan Sarsono
Karakterisasi Isolat  Pestalotiopsis  pada Karet (hevea Brasiliensis)

## Menggunakan Karakter Morfologi dan Molekuler

## Karakterisasi Secara Molekuler
H a s i l   p e n g u j i a n   m o r f o l o g i dilanjutkan  dengan  uji  PCR  menggunakan primer  universal  ITS1/ITS4.    Pengujian dilakukan terhadap enam belas jenis isolat d engan  komposisi    primer    ITS  1 Forward dan  primer  ITS  4 Reverse, selanjutnya dilakukan  amplifikasi  menggunakan  PCR dengan    volume  total  25  µl  dalam  siklus termal sesuai program ITS1F/ITS4R.   Hasil amplifikasi ITS1/ITS4 universal , bagian atas
nampak pita DNA jelas dan tebal garis pada isolat jamur nomor 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9, 10 , dan 11 serta kode A, B, C, D, E1, E2, E3.   Hasil amplifikasi   jamur gugur   daun   diperoleh isolat nomor 2 , 3 , 4 , 5 , 7 , dan1 0 dan C yang layak  uji      karena  memenuhi  persyaratan antara  lain  tebal  dan  jelas  serta  memiliki kisaran  pita  DNA  antara    525  hingga  550 basepare  (bp) Dalam  marker  penanda  1 kilobasepare  (Kbp).  Pita-pita  DNA  hasil amplikasi  PCR  selengkapnya  tersaji  pada Gambar 3 .

## Febbiyanti, Tistama, dan Sarsono
Pestalotiopsis , Pseudopestalotiopsis , dan Neopestalotiopsis (Gambar  4).  Ketiga genus utama tersebut juga telah dilaporkan pada  tanaman  teh.  Liu  et  al.  (2017) melaporkan  bahwa  bercak  daun  pada tanaman  teh  diketahui  sebagai  kumpulan t i g a   g e n u s   y a i t u P e s t a l o t i o p s i s , Pseudopestalotiopsis , dan Neopestalotiopsis .
Ketiga  genus  tersebut  dapat  dibedakan dengan  mengidentifikasi  bentuk  konidia, w a r n a , d a n   u k u r a n n y a (Maharachchikumbura  et  al.,  2014). Serangan genus patogen ini juga menyerang tanaman karet dilaporkan oleh Kusdiana et al., 2020).

## Karakterisasi Isolat  Pestalotiopsis  pada Karet (hevea Brasiliensis) Menggunakan Karakter Morfologi dan Molekuler
Isolat  nomer  3  dan  10  berdasarkan urutan    sekuennya  termasuk  ke  dalam spesies yang berbeda yaitu isolat 3 masuk ke d a l a m   k e l o m p o k   s p e s i e s P s e u d o p e s t a l o t i o p s i s   t h e a e d a n Pestalotiopsis  theae ,  atau Pestalotiopsis simitheae. Sedangkan  isolat  nomer  10 t e r m a s u k   d a l a m   k e l o m p o k   s p e s i e s Pseudopestalotiopsis cocos . Selain itu isolat nomer 3 juga dekat kekerabatannya dengan P .   s i m i t h e a e , P s e u d o p e s t a l o t i o p s i s avicennniae , dan P . elasticae .  Sementara
Pseudopestalotiopsis  cocos lebih  spesifik terpisah  dari  kelompok  spesies  lain, meskipun  demikian  isolat  nomer  10  juga masih satu kelompok dengan P curvatispora, P  rhizophorae , dan P  thailandica . P.  theae dilaporkan  menjadi  penyebab  penyakit b e r c a k   d a u n   p a d a   k e l a p a   s a w i t (Suwannarach et al. , 2013). Spesies ini dapat sebagai  endofitik  atau  saprofitik  dan s e m i n i c o l o u s   d a n   d i k e t a h u i   d a p a t menginfeksi  biji Diospyros  crassiflora (Meli dan Langer , 2009).
Isolat  4  dan  C  termasuk  spesies Neopestalotiopsis  cubana berkelompok t e r d e k a t   d e n g a n N e o p e s t a l o t i o p s i s ellipsospora .  Secara  genetik  genus  ini berbeda  jauh  secara  genetik  dibandingkan Pestalotiopsis maupun Pseudopestalotiopsis
(Solarte  et  al. , 2018).  Beberapa  laporan menyebutkan  bahwa  jamur  ini  umum ditemukan  bersama  pada  daun  yang menunjukkan  serangan Pestalotiopsis (Maharachchikumbura et al. , 2016; Solarte et al. , 2018; Norphanphoun et al., 2019).

## Febbiyanti, Tistama, dan Sarsono
Gejala  serangan Pestalotiopsis pada tanaman  karet  mulai  nampak  jelas  pada daun  tua.  Uji  infeksi  buatan  dengan  isolat murni Pestalotiopsis lebih  efektif  apabila daun terlebih dahulu dilukai. Kemungkinan infeksi  kelompok  jamur  ini  membutuhkan bantuan  jamur  lain  untuk  membantu menginfeksi  jaringan  daun.  Seperti diketahui  bahwa  pada  awal  pembentukan daun karet, beberapa penyakit daun seperti O i d i u m d a n C o l l e t o t r i c h u m b a n y a k menginfeksi daun dan menimbulkan bercak atau  lisis  dinding  sel.  Kimaru  et  al.  (2018) melaporkan  bahwa  serangan  bercak  daun p a d a   t a n a m a n   a l p u k a t   d i k e t a h u i d i s e b a b k a n   o l e h C o l l e t o t r i c h u m g l o e o s p o r i o i d e s , C .   b o n i n e n s e ,   d a n Pestalotiopsis  microspore.  C.  acutatum ditemukan pada bercak daun karet bersama Pestalotiopsis .

## KESIMPULAN
Morfologi Pestalotiopsis dibedakan berdasarkan  bentuk  konidia,  ukuran konidia,  jumlah  septat,  warna  pigmen, bentuk  sel  basal , dan  sel  tengah.  Hasil pengamatan    morfologi  diperoleh  6  spesies namun berbeda dengan hasil analisa secara molekuler yang memperoleh 2 spesies yaitu Pseudopestalotiopsis  coccos strain  CBS 272 , 29 dan Neopestalotiopsis cubana strain CBS 600 , 96 .

## DAFTAR PUSTAKA
Febbiyanti, T. R. (2019).   Severe outbreak of Pestalotiopsis  leaf  disease  in  South Sumatra.  Disampaikan  pada  MRB- IRRDB Workshop, Melaka, Malaysia,
9th-10th April 2019.
Febbiyanti,  T.  R.,  &  Fairuza,  Z.  (2019). Identifikasi  penyebab  kejadian  luar biasa  penyakit  gugur  daun  karet  di Indonesia. Jurnal  Penelitian  Karet,
3 7 ( 2 ) :   1 9 3 - 2 0 6 .   D O I : 10.22302/ppk.jpk.v37i2.616
Jeewon , R ., Liew , E.  C.  Y ., &  Hydea , K.  D. (2 00 2).   Phylogenetic relationships of Pestalotiopsis and  allied  genera inferred  from  ribosomal  DNA sequences  and  morphological characters .  Molecular  Phylogenetics and  Evolution,  25 (3):378-392. Doi: 10.1016/S1055-7903(02)00422-0.
Karakaya, A. (2001). First report of infection of  kiwifruit  by Pestalotiopsis sp.  in Turkey. Plant Disease, 85:1028.
Keith,  L.  M.,  Maile,  E.  V.,  &  Francis,  T.  Z. ( 2 0 0 6 ) .   I d e n t i f i c a t i o n   a n d characterization  of Pestalotiopsis spp.  causing  scab  disease  of  guava, Psidium  guajava ,  in  Hawaii. Plant Disease , 90(1):16-23.
Kimaru, S. K., Monda, I. E., Cheruiyot, R. C., Mbaka,  &  Alakonya,  A.  (2018). M o r p h o l o g i c a l   a n d   m o l e c u l a r identification  of  the  causal  agentof anthracnose  disease  of  avocado  in Kenya .  International  Journal  of M i c r o b i o l o g y , ( 4 ) : 1 - 1 0 .   D O I : 10.1155/2018/4568520
Kusdiana, A. P. J., Sinaga, M. S., & Tondok, E.  T.  (2020).  Diagnosis  penyebab penyakit  gugur  daun  baru  ( Hevea brasiliensis Muell.  Arg.). Jurnal
Penelitian  Karet ,  38(20):  165-178. d o i :
https://doi.org/10.22302/ppk.jpk.v 2i38.728.
Legiastuti,  T.  S.,  &  Aminingsih,  T.  (2012). I d e n t i f i k a s i   j a m u r   e n d o f i t menggunakan  teknik  Polymerase Chain  Reaction. Jurnal  Fitopatologi Indonesia , 8(2): 31-32.
Liu , A. R., Chen , S. C., lin , X. M., Wu , S. Y., Xu. , T.,  Cai , F.  M.,  &  Jeewon , R.
(2010).  Endopytic Pestalotiopsis species  associated  with  plants  of p a l m a e ,   R h i z o p h o r a c e a e , Planchonellae and Podocarpaceae in Hainan,  China. African  J.  of  Microb. Res ., 4(24): 2661 - 2669.
Karakterisasi Isolat  Pestalotiopsis  pada Karet (hevea Brasiliensis)

## Menggunakan Karakter Morfologi dan Molekuler
Liu , F.,  Hou , L.,  &  Cai , L.  (2017). Pestalotiopsis and allied genera from Camellia, with description of 11 new species  from  China. Sci.  Rep ., 7(1):866. Doi: 10.1038/s41598-017- 00972-5 .
Maharachchikumbara , S. S. N ., Hyde , K. D ., Groenewald , J.  X,  &  Crous,  P.  W. (2014) Pestalotiopsis revisited . Studies in Mycology, 79:121 - 186.
Maharachchikumbura , S. S. N., Guo , L. D., Liu , Z. Y ., Liu, & Hyde , K. D. (2016). Pseudopestalotiopsis  ignota and Ps. camelliae spp.  nov.  associated  with grey  blight  disease  of  tea  in  China. Mycology Progress , 15(22) .
Maharachchikumbura, S. S. N., Rignon, P., Hyde K. D., Al Sadi, A. M., & Liu, Z. Y. ( 2 0 1 6 ) .   C h a r a c t e r i z a t i o n   o f Neopestalotiopsis, Pestalotiops is and Truncatella species  associated  with grapevine  trunk  diseases  in  France. Phytopathologia Mediterranea, 55(3): 380−390.
Meli , C.  D.,  &  Langer , E.  (2009). Pestalotiopsis  theae (Ascomycota, Amphisphaeriaceae)  on  seeds  of Diospyros  crassiflora (Ebenaceae). Mycotaxon .107: 441 - 448.
Norphanphoun,  C.,  Jayawardena,  R.  S., Chen, Y., Wen, T. C., Meepol, W., & Hyde,  K.  D.  (2019).    Morphological and phylogenetic characterization of novel Pestalotioid species associated with  mangroves  in  Thailand. Mycosphere, 10(1): 531–578.
Shamly,  V.,  Kali,  A.,  Srirangaraj,  S.,  & Umadevi,  S.  (2014).  Comparison  of microscopic  morphology  of  fungi using lactophenol cotton blue (lpcb), iodine  glycerol  and  congo  red formaldehyde staining. J. Clin. Diagn. R e s . , 8 ( 7 ) . D o i : 10.7860/JCDR/2014/8521.4535
Silva, A. C., Diogo, E., Henriques J., Ramos A.  P.,  Sandoval-Denis,  M.,  Crus,  P. W.,  &    Bragança,  H.  (2020). Pestalotiopsis  pini sp.  nov.,  an emerging  pathogen  on  stone  pine ( Pinus pinea L.). Forests, 11(805): 1- 17. Doi:10.3390/f11080805.
S o l a r t e , F . ,   M u n o z , C .   G . , Maharachchikumbura,  S.  S.  N.,  & Alvarez,  E.  (2018).  Diversity  of Neopestalotiopsis and Pestalotiopsis spp., causal agents of guava scab in Colombia. Plant Disease , 102: 49 - 59.
Suwannarach , N . , Sujarit , K., & Lumyong , S. (2013).  First  report  of  leaf  spot disease  on  oil  palm  caused  by Pestalotiopsis theae in Thailand. J. of General Plant Path . 79: 277 - 279.
Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., & Kumar, S.
( 2 0 0 7 ) .   M E G A 4 :   m o l e c u l a r evolutionary  genetics  analysis (MEGA)  software  version  4.0. Molecular  Biology  and  Evolution,
24(8): 1596-1599.
White, T. J., Bruns, T. D., Lee, S. B., & Taylor, J. W. (1990). Amplification and direct sequencing  of  fungal  RNA  genes  for phylogenetics. In M. A. Innis & D. H. Gelfand (Ed.). PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications (pp. 315- 322).

## Febbiyanti, Tistama, dan Sarsono