## EFEK IMUNOMODULATOR EKSTRAK AIR CINCAU HITAM ( Mesona palustris BL) TERHADAP KARSINOGENESIS MENCIT
[Immunomodulatory Effects of Water Extracts of Black Cincau ( Mesona palustris BL) on Carcinogenesis in Mice]
Tri Dewanti W. 1) *, Sukardiman 2) , Djoko Agus P. 3) , dan Win Darmanto 4)
1) Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya, Malang
2) Departemen Fitokimia dan Farmakognosi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya
3) Departemen Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya
4) Jurusan Biologi Fakultas Sain dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya
Diterima 14 Januari 2011 / Disetujui 12 Maret 2012

## ABSTRACT
Janggelan or black cincau (Mesona palustris BL) is commonly consumed as dessert and also used as herbal remedy in the folk medicine. This study aimed to test the potency of water extract of black cincau in inhibiting fibrosarcoma cancer induced by benzo(a)pyrene. Mice used in this study were divided into 6 groups. Solution of benzo(a)pyrene 0.3% was given during two days for five times to induce cancer. Water extract of black cincau at concentration  of 100,  500  and 1000  mg/kg BW was given daily for 2 weeks before initiation (induction of benzo(a)pyrene)  during the initiation and until 4 weeks after initiation. The IFN-γ was observed with IFN-y ELISA Kit immunosurveillance parameters while the CD 8 +, NK cells and  macrophages  were  observed  with  a  flow  cytometer.  Cancer  incidence  was  observed  by  palpation  every  week  until  10  weeks  after benzo(a)pyrene last induction. The results showed that a high dose of water extract of black cincau (1000 mg/kg BW) increased IFN-γ expression and immunosurveillance of CD 8 +, NK cells and macrophages of the mice. The treatment also increased cell apoptosis and reduced the cancer incidence in mice by 57%.
Key words: apoptosis, black cincau (Mesona palustris BL), IFN-γ, immunomodulator, immunosurveillance

## 1 PENDAHULUAN
Cincau hitam merupakan makanan tradisional yang sudah lama  dikenal  di  berbagai  daerah  Indonesia.  Cincau  hitam adalah  bahan  pangan  yang  biasa  digunakan  sebagai  campur- an  untuk  isian  minuman  segar (dessert) ,  berbentuk  gel  yang menyerupai agar-agar. Minuman cincau hitam tidak saja hanya dikenal  di  Indonesia  tetapi  juga  di  negara-negara  Asia  seperti China, Taiwan, Korea, Jepang, Singapura dan Malaysia. Sejak jaman dahulu cincau hitam selain sebagai bahan pangan juga diyakini mempunyai khasiat sebagai obat. Cincau hitam dilapor- kan  dapat  digunakan  sebagai  penurun  panas  dalam,  demam, sakit  perut  (perut  mual),  diare,  batuk,  sariawan,  pencegah gangguan  pencernaan,  dan  penurun  tekanan  darah  tinggi (Ruhnayat, 2002). Di Korea  Selatan, cincau hitam yang dibuat dengan  menambahkan  rempah-rempah  tertentu  ke  dalam adonannya,  dipromosikan  sebagai  makanan  kesehatan.  Di China  dan  Taiwan  cincau  hitam  yang  disebut hsian  tsao merupakan minuman herbal tradisional yang digunakan sebagai obat untuk hipertensi, diabetes dan liver (Hung dan Yen, 2002).
Hsian tsao adalah sejenis cincau hitam yang ada di China maupun  Taiwan  yang  dibuat  dari  simplisia  kering  tanaman Mesona procumbens Hemsl, sedangkan cincau hitam yang ada di Indonesia termasuk jenis Mesona palustris BL (Haryadi et al ., 2002). Hsian  tsao sudah  teridentifikasi  mengandung  senyawa
*Korespondensi Penulis : Email : tridewantiw@ub.ac.id
senyawa  yang  bersifat  antioksidan,  bahkan  aktivitas  anti- oksidannya  lebih  tinggi  dari  pada  α-tokoferol  (Hung  dan  Yen, 2001).  Antioksidan  merupakan  senyawa  yang  dapat  meng- hambat  spesies  oksigen  reaktif/spesies  nitrogen  reaktif (ROS/RNS) dan juga radikal bebas sehingga antioksidan dapat mencegah penyakit-penyakit yang dihubungkan dengan radikal bebas seperti karsinogenesis, kardiovaskuler dan penuaan dini (Halliwell  dan  Gutteridge,  2000).  Pada hsian-tsao ( Mesona procumbens Hemsl) senyawa bioaktif yang bersifat antioksidan adalah  senyawa  komponen  fenol  (polifenol),  triterpenoid (oleanolic  acid  dan  ursolic  acid),  sigmasterol  dan  β-sitosterol (Hung dan Yen, 2001; Hung dan Yen, 2002). Komponen fenol ekstrak hsian-tsao dominan  yang  telah  teridentifikasi  adalah protocatechuic acid, β-hydroxybenzoic acid, vanillic acid, caffeic acid dan syringic acid (Hung dan Yen, 2002).
Komponen  senyawa  fenol  dari  beberapa  tanaman  telah terbukti mempunyai efek positif terhadap respon proliferatif dan sitolitik pada sel limfosit tetapi bersifat antiproliferatif dan toksik terhadap  sel  kanker  (Tang  dan  Eisenbrand,  1992).  Polifenol juga dapat menghambat penurunan kuantitas dan kualitas sel- sel  imun  limfosit  T  CD4,  limfosit  B,  monosit/makrofag,  sel  NK dan sel lymphokine activated killer (LAK) yang disebabkan oleh radikal  bebas  sinar  ultraviolet,  bahan  karsinogenik  dan endotoksin  (Katiyar et  al .,  1999).  Hasil  penelitian  Yen et  al. (2000),  menunjukkan  bahwa  ekstrak hsian-tsao mampu  me- lindungi  sel  limfosit  dari  kerusakan  DNA  akibat  terpapar hidrogen  peroksida  dan  UV.  Yen et  al. (2004)  melanjutkan bahwa water  extract  of  hsian-tsao ternyata  juga  dapat  me-
lindungi  kerusakan  hati  tikus  yang  diinduksi  dengan  tert-butyl hydroperpxide. Yeh et al. (2008), meneliti efek w ater extract of hsian-tsao sebagai  antihipertensi  pada  tikus  dan  Yang et  al. (2008) meneliti aktivitas protektif tertadap renal pada tikus yang diabet.  Hasilnya  menunjukkan  w ater  extract  of  hsian-tsao memiliki aktivitas sebagai antihipertensi dan antidiabetes.
Berdasarkan  laporan  komponen  bioaktif  yang  dikandung dan sifat antioksidan serta aktivitas biologis dari ekstrak hsian- tsao ( Mesona  procumbens Hemsl)  tersebut,  maka  ekstrak  air cincau  hitam dari  Indonesia (Mesona  palustris BL)  diduga berpotensi  sebagai  imunomodulator  atau  dapat  meningkatkan sistim  imun  tubuh.  Dalam  hubungannya  dengan  sistem  imun, lebih  lanjut  Vinardell  dan  Mitjaans  (2008),  menyatakan  bahwa senyawa polifenol bersifat sebagai imunomodulator yaitu secara efektif dapat menghambat mitogen dan menstimulasi proliferasi peripheral  blood  mononuclear  cells (PBMC),  produksi  Ig,  IL-2 dan  interferon  gama  (IFN-γ).  IFN-γ  adalah  sitokin  utama  yang mengaktivasi  fagositosis  sel  mononuklear  terhadap  tumor (Cruse dan Lewis, 1999). IFN-γ juga sangat penting untuk men- stimulasi  komponen immunosurveillance yaitu  sel  NK,  sel  T sitotoksik  (CD  8+)  dan  makrofag  yang  berperan  terhadap proses killing dan apoptosis pada sel-sel kanker (Abbas et al., 2005).
Penelitian ini dilakukan secara in vivo terhadap mencit untuk menguji potensi ekstrak air cincau hitam ( Mesona palustris BL) sebagai  imunomodulator  dengan  peningkatan  ekspresi  IFN-γ dan  peningkatan  aktivitas  komponen immunosurveillance: sel NK, sel T sitotoksik (CD 8+) dan makrofag yang berperan dalam karsinogenesis  fibrosarkoma  pada  mencit  akibat  induksi benzo(a)pirena.  Hal  ini  juga  akan  dapat  menjadi  dasar  ilmiah untuk  pengembangan  ekstrak  air  cincau  hitam (Mesona palustris BL)  sebagai  bahan  pangan  fungsional  untuk  me- ningkatkan sistem imun tubuh dan pencegahan kanker.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Hewan  coba  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah mencit jantan galur BALB-C berumur 2–2,5 bulan dengan berat badan  antara  20–30  g  dari  Laboratorium  PUSVETMA Surabaya.  Mencit  dalam  keadaan  sehat  berdasarkan  penga- matan visual. Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah  simplisia  kering  dari  tanaman  cincau  hitam  atau janggelan ( Mesona palustris BL) yang terdiri dari seluruh bagian tanaman  (batang,  ranting  dan  daun).  Sampel  diambil  dari daerah  Magetan.  Senyawa  Benzo(a)pirena  untuk  karsino- genesis. Pada mencit reagen untuk analisis IFN-γ dari plasma darah mencit menggunakan Mouse IFN-γ ELISA Kit dari Bender Med-Systems .  Untuk  analisis  jumlah  sel  T  sitotoksis  (CD  8+), sel natural killer dan makrofag dari limfa mencit, membutuhkan: PBS,  antibody  monoclonal  untuk  sel  NK  (e  Bio  science  cat  # 1,5911,81),  CD  8+  (e  Bio  science  cat  #  11,0081,82)  dan makrofag ( Santa Crus Sc  # 52699) dan Apoptag Detection Kit ( Bio Vision Apo-BrdtU -IHC TM Kit).
Penyiapan  larutan  ekstrak  air  cincau  hitam  untuk dosis  uji  Induksi  karsinogenesis  dengan  benzo- (a)pirena
Ekstrak air cincau hitam  hasil ekstraksi secara infusa (200 garam serbuk cincau hitam dengan 5 liter air) kemudian dipekat- kan dengan rotary vacuum evaporator sampai kental (± 600 ml) baru  dilakukan Freeze  drying sampai  berbentuk  bubuk  halus atau  serbuk  dihitung  rendemennya  (Yen et  al .,  2004).  Serbuk ekstrak  air  cincau  hitam  untuk  diberikan  kepada  mencit  dibuat larutan  terlebih  dahulu  dengan  ditambahkan  aquades  dengan dosis 100;  500 dan 1000 mg/kg BB. Larutan dibuat saat akan diberikan  pada  mencit  sehingga  keadaan  larutan  selalu  baru. Banyaknya  larutan  ekstrak  air  cincau  hitam  yang  diberikan adalah 0,2 ml/30 g berat badan mencit.
Mencit  jantan  dibagi  menjadi  6  kelompok  secara  random. Masing-masing kelompok terdiri dari 7 ekor mencit. Kelompok I merupakan perlakuan kontrol tanpa perlakuan ekstrak air cincau hitam dan tanpa diinduksi benzo(a)pirena hanya diberi aquades. Sedangkan Kelompok II – IV yaitu kelompok perlakuan ekstrak dengan  dosis  100,  500  dan  1000  mg/kg  BB,  diberikan  setiap hari  selama  14  hari  sebelum  inisiasi  (induksi  benzo(a)pirena) dan  selama  inisiasi  dan  dilanjutkan  sampai  4  minggu  sejak inisiasi.  Larutan  benzo(a)pirena  0,3%  di  induksi  setiap  2  hari sekali  selama  5  kali.  Kelompok  V  merupakan  kontrol  positif dengan  induksi  larutan  benzo(a)pirena  0,3%  dan  tanpa  per- lakuan  ekstrak  air  cincau  hitam  diganti  aquades.  Kelompok  VI adalah  perlakuan  dengan  menggunakan  obat  antikanker siklofosfamid dosis 50 mg/Kg BB selama inisiasi dan dilanjutkan sampai  4  minggu  sejak  inisiasi  dengan  induksi  larutan benzo(a)pirena 0,3% .
Setiap  hari  mencit  diberi  ekstrak  air  cincau  hitam  sesuai dosis perlakuan sebanyak 0,2 ml untuk setiap 30 g berat badan mencit  dengan  cara  disonde.  Induksi  larutan  benzo(a)pirena 0,3%  juga  diberikan  sebanyak  0,2  ml  untuk  setiap  30  g  berat badan  mencit  dengan  cara  disuntikkan  secara  subkutan  pada tengkuk mencit setiap 2 hari sekali selama 5 kali. Pakan berupa pelet AD2 yang diproduksi oleh PT COMFED Surabaya dan air minum  dalam  botol  diberikan  secara ad  libitum. Kandang  pe- meliharaan  dalam  kondisi  bersih  ditempatkan  pada  ruangan dengan  sirkulasi  udara  yang  cukup.  Setiap  minggu  dilakukan penimbangan  berat  badan  mencit  dan  palpasi.  Setelah  per- lakuan selesai mencit dikorbankan dengan petroleum eter atau kloroform,  diambil  benjolan  kanker  yang  terjadi  dan  dibedah bagian  dada  dengan  gunting  sehingga  terlihat  isi  perutnya. Darah dan limfanya diambil untuk digunakan pemeriksaan lebih lanjut.  Pemeriksaan  IFN-γ  dilakukan  dengan Mouse IFN-γ ELISA  Kit  dari Bender  Med-Systems .  dan  limfa  untuk  pe- meriksaan  sel  NK,  CD  8+  dan  makrofag  dengan  metode Flowcytometry.

## Isolasi darah dan limfosit dari limfa mencit
Mencit  dibius  menggunakan  eter  atau  kloroform.  Bagian dada  mencit  dibuka  dengan  menggunakan  gunting  sehingga terlihat  jantung  dan  isi  perutnya.  Darah  diambil  dari  vena dengan menggunakan syringe 1 ml dan dimasukkan tabung vac 5 ml yang telah diberi  EDTA K3. Tabung disentrifus 4000 rpm selama  7  menit  sehingga  sel-sel  darah  mengendap.  Bagian
yang bening diambil dan dimasukkan dalam tabung ependorf 1 ml untuk penentuan kadar IFN-γ menggunakan ELISA Kit.
Limfa  diambil  menggunakan  pipet  dan  diletakkan  pada cawan petri steril yang sudah diberi sPBS (steril PBS) pH 7,2. Limfa  ditekan-tekan  dengan  alat  penumbuk  steril  (ujung syringe),  disaring  menggunakan  filter  dan  dibuang  debrisnya. Suspensi  sel  dipindahkan  menggunakan  pipet  steril  ke  tabung sentrifus  15  ml  steril.  Dilakukan  sentrifus  1600  rpm  selama  5 menit  dan  diambil  supernatannya.  Diambil  sebanyak  1  ml  dan dilakukan sentrifus pada 5000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C. Supernatannya dibuang dan ditambahkan 400 uL PBS pH 7,2 dan sampel siap dianalisis.

## Penentuan kadar IFN- γ dengan metode ELISA
Untuk  menentukan  kadar  IFN-γ  dalam  penelitian  ini digunakan  ELISA  Kit  ( Mouse  IFN-γ ELISA  Kit ,  Bender  Med System ).  Prosedur  ELISA  pada  tahap  berikutnya  dilakukan mengikuti  metode  yang  dilakukan  oleh  Purwanto et  al .  (2005) dengan beberapa modifikasi.
Microplate  ELISA  (96 well )  dicuci  dengan  kira-kira  300  μl wash buffer . Untuk pembuatan kurva standar sebanyak 100 μl sampel  diluent  dimasukkan  pada  tiap well yang  digunakan standar (biasanya well A-1 sampai H-1 dan A-2 sampai H-2) (H- 1  dan  H-2  digunakan  untuk  blanko).  Ditambahkan  100  μl  ml IFN-γ standar pada well A-1 dan A-2 (duplo). Setelah dicampur, dari A-1 dan A-2 diambil 100 μl dan dimasukkan ke B-1 dan B- 2.  Setelah  dicampur,  dari  B-1  dan  B-2  diambil  100  μl  dan dimasukkan ke C-1 dan C-2 dan seterusnya hingga sanpai G-1 dan G-2 karena H-1 dan H-2 digunakan sebagai blangko.
Dengan  demikian  terjadi  pengenceran  dengan  kadar  ml IFN-γ standar berturut-turut 1000, 500, 250, 125, 63, 32, dan 16 pg/ml. Kemudian diambil dan dimasukkan 50 μl sample diluent pada well sampel dan ditambahkan 50 μl sampel. Ditambahkan 50 μl biotin conjugate dan diinkubasi ( shaker 200 rpm) selama 2 jam pada suhu ruang. Well microplate dicuci 3 x dengan wash buffer 300 μl, kemuduan ditambahkan 100 μl Streptavidin-HRP pada  setiap  sampel,  diinkubasi  1  jam  pada shaker 200  rpm dengan  suhu  ruang. Well microplate dicuci  3  x  dengan wash buffer dan  di  tambahkan  100  μl  TMB  substrat  solution  pada semua well dan  diinkubasi  10  menit  pada  suhu  ruang. Ditambahkan  stop  solution  100  μl  untuk  menghentikan  reaksi. Setelah  itu  diukur  kadar  IFN-γ  dengan  menggunakan  ELISA reader  pada  panjang  gelombang  450  nm  setelah  diinkubasi selama 30 menit.
Pemeriksaan  aktivitas  sel  NK,  limfosit  T  sitotoksik (CD8+) dan makrofag dengan metode Flowcytometry
Untuk  pemeriksaan  dengan flowcytometry sesuai  protokol, FACS CaliburTM flow-cytometer (BD-Biosciences). Diambil 1 ml supernatan  dari  sampel  hasil  isolasi  limfosit  dilakukan sentrifugasi  pada  5000  rpm  selama  10  menit  pada  suhu  4°C. Dibuang supernatannya dan ditambahkan 400 uL sPBS pH 7,2 kemudian ditambahkan 100 µL antibodi primer (2 ng/ml) sesuai dengan  sel  yang  akan  dianalisis  yaitu  sel  CD8+,  sel  NK  dan makrofag. Diinkubasikan selama 20 menit pada keadaan gelap dan sorting sel dibaca pada flowcytometry dengan mesin FACS CaliburTM  flowcytometer,  BD-Biosciences,  San  Jose,  CA (Atochina dan Harn, 2005).
Pewarnaan  imunohistokimia  untuk  penentuan  jumlah sel yang mengalami apoptosis dengan metode Tunel Assay
Prinsip  dari  metode  ini  adalah  perpaduan  antara  reaksi molekuler  dengan  imunohistokimia.  Reaksi  molekuler  ditandai adanya ligasi antara fragmen DNA dengan degoxigenin melalui bantuan  enzym  TdT  (Terminal  deoxinucleotide  Transferase), reaksi  positif  pada  pemeriksaan  imunohistokimia  ditandai  ada- nya  reaksi  antigen  antibodi  dan  reaksi  kimiawi  antara  enzym dengan  substrat.  Reagen  yang  dipakai  adalah  dari  Bio  Vision Apo-BrdU-IHC TM Kit ( Apotag Detection Kit).
Prosedur  pemeriksaan  imunohistokimia  apoptosis  adalah sebagai  berikut:  Sampel  berupa  blok  parafin  jaringan  kanker yang  telah  difiksasi  dengan buffer formalin  ditempatkan  pada rak pengecetan, dilakukan dewax (deparafinisasi) dengan xylol sebanyak  3  kali  masing-masing  selama  5  menit.  Dilakukan hidrasi  dengan  alkohol  absolut  100%  selama  5  menit,  alkohol 96%  selama  5  menit,  alkohol  70%  selama  5  menit.  Dilakukan pencucian  dengan  PBS.  Diinkubasi  dalam  citrat buffer PH  6 dalam  microwave,  didinginkan  pada  suhu  ruang  selama  20 menit.  Dicuci  dengan  PBS  dua  kali  masing-masing  5  menit. Diinkubasi  dalam  Proteinase-K  selama  15  menit.  Dicuci  PBS dua  kali  masing-masing  5  menit.  Inkubasi  dalam  H2O2  3% selama  10  menit,  dicuci  kembali  dengan  PBS  2  x  @  5  menit. Inkubasi Equilibrium Buffer minimal 10 detik lalu dihisap cairan equilibrium buffer di  sekitar  jaringan  tanpa  dicuci.  Diinkubasi dalam working  strength TdT  Enyme  selama  1  jam.  Dicuci working  strength  stop/wash buffer digetarkan  selama  15  detik dan  diinkubasi  selama  10  menit,  dicuci  PBS  2  x  @  5  menit. Diinkubasi  dengan  Anti-Degoxigenin  conjugate  selama  30 menit, dicuci dengan PBS 2 x @ 5 menit. Diinkubasikan dalam Peroxidase  Substrat  selama  6  menit,  dicuci  dengan aquadestilata 2 x @ 5 menit. Diinkubasi dalam Methyl Green 10 menit, dicuci dengan aquadestilata 2 x @ 5 menit, lalu dilakukan Mounting .  Preparat  slide  hasil  pewarnaan  imunohistokimia diamati  dengan  menggunakan  mikroskop  perbesaran  40  x  10 lapangan  pandang.  Sel  yang  positif  apoptosis  berwarna  ke- coklatan (Liu et al ., 2001; Gregoraszczuk, 2008).

## Pengolahan data dengan uji statistik SPSS
Data  yang  diperoleh  dianalisis  dengan  menggunakan ANOVA untuk mengetahui pengaruh perlakuan dosis ekstrak air cincau  hitam  terhadap  kadar  IFN-γ,  Sel  CD  8+,  sel  NK  dan makrofag  dan  apoptosis.  Uji  korelasi  dilakukan  untuk  me- ngetahui hubungan kadar IFN-γ dengan peningkatan sel CD 8+, sel NK dan makrofag.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hubungan interferon gama (IFN-γ) dengan komponen immune surveillance Persamaan  kadar  IFN-γ  standar  dan  absorbansi  yang  di- tentukan adalah: Y = 0,060 X + 0,122 dan nilai R 2 = 0,953. Hal ini  menunjukkan  bahwa  koefisien  korelasi  (R)  yang  diperoleh sebesar  95,3%.  Penentuan  kadar  IFN-γ  pada  plasma  dihitung dari persamaan regresi tersebut.
Tubuh  pada  dasarnya  mempunyai  kemampuan  untuk melawan  benda  asing  yang  masuk  tubuh  termasuk  kanker. Pada  hakekatnya immune  surveillance adalah  respon  imun yang  melindungi  tubuh. Immune  surveillance merupakan kegiatan  imunologik  yang  melindungi  tubuh  dari  penyakit, seperti halnya pada reaksi imunopatologik yang lain. Sel yang terlibat  dalam immune  surveillance terutama  sel  NK,  sel  T sitotoksik (CD 8+), dan makrofag (Abbas et al. , 2005). Interferon gama  adalah  limfokin  yang  dapat  mengaktivasi  komponen Immune  surveillance seperti  sel NK , sel  CD8 + ,  makrofag  dan sel  LAK  (Baratawidjaja  dan  Rengganis,  2010).  Hubungan  ini dapat dilihat dengan koefisien korelasi yang cukup kuat antara IFN-γ dengan CD8+ (0,756); IFN-γ dengan sel NK (0,775) ; IFN- γ  dengan  makrofag  (0,921).  Korelasi  antara  variabel  IFN-γ dengan  sel  NK,  sel  CD8 + ,  makrofag  sangat  bermakna  dapat dilihat pada Tabel. 1.
Tabel  1.    Hasil  uji  korelasi  antara IFN-γ  dengan  komponen immune surveill a nce pada mencit yang diinduksi benzo(a)pirena
Komponen yang Diuji Hasil Uji Korelasi IFN-γ dengan CD8 + Pearson correlation = 0,757 p = 0,00 IFN-γ dengan NK sel Pearson correlation = 0,775 p = 0,00 IFN-γ dngn Makrofag Pearson correlation = 0,921 p = 0,00
Pengaruh  dosis  ekstrak  air  cincau  hitam  pada  IFN-γ dan komponen immune surveillance Perlakuan  induksi  benzo(a)pirena  pada  mencit  menyebab- kan terjadinya proses karsinogenesis.  Benzo(a)pirena merupa- kan karsinogen yang sangat kuat untuk menimbulkan terjadinya kanker  fibrosarkoma  pada  mencit.  Mencit  yang  diinduksi benzo(a)pirena  dan  tanpa  perlakuan  pemberian  ekstrak  air cincau  hitam  pada  percobaan  ini  semuanya  mengalami  kar- sinogenesis.  Sedangkan  mencit  yang  diberi  perlakuan  ekstrak air  cincau  hitam  terjadi  proses  penghambatan  karsinogenesis bahkan  ada  yang  tidak  terjadi  proses  karsinogenesis.  Peng- hambatan proses karsinogenesis  dapat terjadi karena peranan IFN-γ dan komponen immune surveillance (Abbas et al ., 2005; Kresno, 2001).
Tabel 2.    Pengaruh perlakuan dosis ekstrak air cincau hitam terhadap rerata  IFN-γ  plasma  darah  mencit  yang  diinduksi benzo(a)pirena
Kelompok Perlakuan N Rerata IFN-γ SD Kenaikan IFN-γ Brown Forsythe Hasil Kesim- pulan 0 5 8,24 0,17 - F= 31,54
p= 0,00
Berbeda nyata
100 5 10,96 1,37 turun 500 5 17,0 2,20 1,33 kali 1000 5 29,60 4,85 2,33 kali Kanker BP 5 12,70 0,44 - Obat antikanker (siklofos- famid) 5 19,08 4,98 1,50 kali
Pemberian  ekstrak  air  cincau  hitam  (dosis  500  dan  1000 mg/kg BB) pada mencit yang diinduksi benzo(a)pirena ternyata dapat  meningkatkan  kadar  IFN-γ  secara  bermakna  (p<0,05). Perlakuan  ekstrak  air  cincau  hitam  dosis  1000  mg/kg  BB  me- nunjukkan  peningkatan  IFN-  γ  paling  tinggi  diantara  perlakuan termasuk  perlakuan  dengan  obat  kanker  siklofosfamid  (Tabel 2).  Ekstrak  air  cincau  hitam  mengandung  senyawa  polifenol yang  cukup  dominan  yaitu  17,33%  (Widyaningsih,  2009). Menurut  Vinardell  dan  Mitjaans  (2008)  polifenol  mempunyai efek sebagai antioksidan, anti radang, dan antikanker. Mekanis- me  antikanker  pada  polifenol  yang  telah  diteliti  sebelumnya antara  lain  menghambat  sekresi  interleukin - 10  dan  memicu sekresi interleukin - 12 (Tosetti et al ., 2002). Interleukin - 12 (IL-12) akan  memicu  sekresi  IFN-γ  (Abbas et  al. ,  2005).  Selain senyawa  polifenol  senyawa  bioaktif  yang  bersifat  antioksidan pada hsian  tsao sejenis  cincau  hitam  dari  China  adalah senyawa  triterpenoid  (oleanolic  acid  dan  ursolic  acid), sigmasterol  dan  β-sitosterol  (Hung  dan  Yen,  2001;  Hung  dan Yen,  2002).  Senyawa–senyawa  bioaktif  ini  terbukti  dapat meningkatkan IFN-γ melalui sekresi IL-12 (Chiang et al ., 2003). Dari hasil analisis (Tabel 3, 4 dan 5) diperoleh peningkatan dosis  ekstrak  air  cincau  hitam  ternyata  juga  menyebabkan kenaikan  komponen immune  surveillance ,  yaitu  CD8+,  Sel  NK dan  makrofag  dibandingkan  dengan  yang  tanpa  pemberian ekstrak air cincau hitam (perlakuan kanker maupun kontrol). Hal ini  karena  semakin  tinggi  dosis  ekstrak  air  cincau  hitam  kan- dungan senyawa bioaktifnya juga semakin meningkat sehingga menyebabkan  kemampuan  untuk  mensekresi  IFN-γ  juga meningkat.  Selanjutnya  IFN-γ  akan  mengaktivasi  komponen immune  surveillance yaitu CD8+,  sel  NK  dan  makrofag sehingga jumlahnya akan meningkat juga (Abbas et al., 2005). Gambar  1  menunjukkan  pengaruh  dosis  ekstrak  air  cincau hitam terhadap komponen immune surveillance.
Tabel 3.    Pengaruh perlakuan dosis ekstrak air cincau hitam terhadap rerata  CD8+  plasma  darah  mencit  yang  diinduksi benzo(a)pirena
Kelompok Perlakuan N Rerata CD8+ SD Kenaikan CD8+ ANOVA Hasil Kesim- pulan 0 5 53,16 4,51 - F = 112,93 p = 0,00 Ber- beda nyata 100 5 46,20 5,20 1,29 kali 500 5 56,81 7,17 1,59 kali 1000 5 103,72 5,94 2,91 kali Kanker BP 5 35,65 6,76 - Obat antikanker (siklofos- famid) 5 96,41 5,24 2,70 kali
Sel  T  sitotoksik  atau  sel  CD8+  adalah  sel  yang  paling berperan  dalam  menghancurkan  infeksi  virus,  mikroba  dan tumor/kanker. Pemberian ekstrak air cincau hitam dosis 500 dan 1,000 mg/kg BB selama perlakuan induksi benzo(a)pirena dapat meningkatkan  jumlah  sel  CD8+ secara  bermakna  (p<0,05) . Peningkatan sel CD8+ dapat juga sebagai indikator peningkat- an  sistem  imun.  Sel  NK  memegang  peranan  alamiah  dan
kemampuan  membunuh  sel  kanker.  IFN-γ  dan  IL-2  men- stimulasi  sel  NK  secara  langsung  sehingga  meningkatkan kemampuan  sitotoksiknya.  Pemberian  ekstrak  air  cincau  hitam dosis  500  dan  1000  g/kg  BB  selama  perlakuan  induksi benzo(a)pirena ternyata  juga  dapat  meningkatkan  jumlah  sel NK secara bermakna (p<0,05).
Makrofag merupakan komponen immune surveillance yang bertindak sebagai fagosit. Makrofag dapat membunuh sel tumor apabila  telah  diaktifkan  oleh  IFN-γ  (Abbas et  al .,  2005).  Pem- berian  ekstrak  air  cincau  hitam  100,  500  dan  1000  g/kg  BB selama  perlakuan  induksi  benzo(a)pirena  ternyata  juga  dapat meningkatkan  jumlah  makrofag  secara  bermakna  (p<0,05). Dosis  ekstrak  air  cincau  hitam  1000  mg/kg  BB  bahkan  dapat meningkatkan  makrofag  hingga  9  kali  lipat  dibandingkan  per- lakuan dengan obat antikanker siklofosfamid dosis 50 mg/Kg.
Tabel 4.    Pengaruh perlakuan dosis ekstrak air cincau hitam terhadap rerata sel NK limfe mencit yang diinduksi banzo(a)pirena
Kelompok Perlakuan N Rerata Sel NK SD Kenaikan Sel NK Brown Forsythe * Hasil Kesim- pulan 0 5 36,39 3,76 - F= 108,11 p= 0,00 Ber- beda nyata 100 5 31,19 2,46 1,10 kali 500 5 57,09 11,75 2,02 kali 1000 5 84,85 3,70 2,99 kali Kanker BP 5 28,29 1,59 - Obat antikanker (siklofos- famid) 5 80,79 1,01 2,85 kali
Tabel 5.    Pengaruh perlakuan dosis ekstrak air cincau hitam terhadap rerata makrofag limfe mencit yang diinduksi banzo(a)pirena
Kelompok Perlakuan N Rerata makro- fag SD Kenaikan Makrofag Brown Forsythe * Hasil Kesim- pulan 0 5 55,59 4,27 - F= 89,94 p= 0,00
Ber- beda nyata 100 5  106,51 7,50 2,85 kali 500 5  136,30 14,27 3,65 kali 1000 5  355,73 64,73 9,54 kali Kanker BP 5 37,26 3,95 - Obat antikanker (siklofos- famid) 5  229,42 18,33 6,15 kali

## Pengaruh  pemberian  ekstrak  air  cincau  hitam ter- hadap insidensi kanker dan apoptosis
Perlakuan  kanker  (induksi  benzo(a)pirena  tanpa  perlakuan ekstrak  air  cincau  hitam)  setelah  3  minggu  induksi  menyebab- kan  terjadinya  karsinogenesis  yang  terlihat  dari  nodul  yang mulai membesar pada semua sampel mencit (100%). Sedang- kan  perlakuan  induksi  benzo(a)pirena  dan  pemberian  ekstrak air  cincau  hitam  dengan  dosis  100,  500  dan  1000  mg/kg  BB
terjadinya  karsinogenesis  membutuhkan  waktu  yang  lebih panjang  (5–6  minggu  setelah  induksi).  Insidensi  atau  peng- hambatannya  juga  lebih  rendah  karena  tidak  semua  sampel mengalami karsinogenesis (Tabel 6).
Pada  semua  kelompok  perlakuan  ada  mencit  yang  mati sebelum waktu pengamatan  berakhir. Kematian terjadi  setelah minggu  ke  6  sehingga  dapat  disimpulkan  kematian  mencit karena  kanker.  Penghambatan  karsinogenesis  tertinggi  terjadi pada pemberian ekstrak air cincau hitam dosis 1000 mg/kg BB (57%) bahkan sama dengan penghambatan perlakuan dengan obat  kanker  (siklofosfamid  dosis  50  mg/Kg  BB).  Berdasarkan pengamatan sampai 10 minggu, mencit dengan perlakuan pem- berian  ekstrak  air  cincau  hitam  dosis  1000  mg/kg  BB  yang mengalami  karsinogenesis,  terjadi  pengeringan  pada  nodul kankernya  sama  dengan  perlakuan  obat  anti  kanker siklofosfamid.  Senyawa  bioaktif  pada  ekstrak  air  cincau  hitam terbukti dapat menghambat  insidensi kanker dan menghambat proses  karsinogenesis  pada  mencit  yang  diinduksi  benzo (a)pirena.  Penghambatan  insidensi  kanker  dan  karsinogenesis oleh ekstrak air cincau hitam terjadi karena kandungan senyawa bioaktifnya yang bersifat antioksidan dan imunomodulator.
Tabel  6.      Jumlah  insidensi  karsinogenesis  pada  berbagai  perlakuan tahap inisiasi dengan karsinogen benzo(a)pirena
Kelompok Perlakuan Jum- lah Mencit Jum- lah Mencit Kanker Insidensi Kanker (%) Waktu Latensi (Minggu) Jum- lah Mencit Mati Peng ham- batan (%) Kanker – B(a)P 7 7 100 3 2 - Dosis 100 7 6 85 5 2 15 Dosis 500 7 5 70 5 1 30 Dosis 1000 7 4 43 6 1 57 Obat antikanker (siklofosfa mid) 7 4 43 6 1 57
Apoptosis pada mencit dengan perlakuan ekstrak air cincau hitam  dosis  1000  mg/kgBB  menunjukkan  jumlah  yang  paling tinggi (Tabel 7), penampakan karsinogenesisnya  juga berbeda dengan  perlakuan  yang  tanpa  ekstrak  air  cincau  hitam.  Pada perlakuan ekstrak air cincau hitam dosis 1000 mg/kg BB kanker yang  timbul  mengering  sedangkan  yang  tanpa  ekstrak  air cincau hitam membesar dan basah.
Peningkatan jumlah sel yang mengalami apoptosis disebab- kan  karena  peran  komponen immune  surveillance. Interaksi antara CD8+ dan juga sel NK dengan sel kanker akan memicu aktivasi  gen  supresi  sehingga  terjadi  kematian  sel  secara apoptosis  (Dotti et  al .,  2005).  Apoptosis  juga  dapat  diinduksi oleh  CD8+  dan  sel  NK  yang  diinduksi  baik  oleh nonsecretory induced,  ligand-induced, dan secretory  induced dengan granzyme  melalui  perantaraan  sekresi  perforin  (Soini et  al ., 1998;  Abbas et  al .,  2005).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa perlakuan ekstrak air cincau hitam dosis 1000 mg/kg BB dapat memicu  terjadinya  apoptosis  yang  dapat  menghambat karsinogenesis.
Tabel 7.    Pengaruh perlakuan dosis ekstrak air cincau hitam terhadap apoptosis  pada  karsinogenesis  mencit  yang  diinduksi benzo(a)pirena Kelompok Perlakuan N Rerata apop- tosis SD Kenaikan Apoptosis ANOVA Hasil Ke- simpu- lan 0 5 5,80 1,48 -
F= 120,5 0 p= 0,00
Ber- beda Nyata 100 5 13,00 2,34 2,95 kali 500 5 18,44 2,07 4,19 kali 1000 5 34,40 3,50 7,81 kali Kanker BP 5 4,40 1,14 - Obat antikanker (siklofosfamid) 5 30,40 3,64 6,90 kali
Keterangan: A = perlakuan kontrol, EACH=0; B = perlakuan EACH 100 mg/kg  BB;  C  =  perlakuan  EACH  500  mg/kg  BB;  D  =  perlakuan EACH  1000  mg/kg  BB;  E  =  perlakuan  kontrol  negatif  benzo (a)pirena;  F  =  perlakuan  kontrol  positif  (obat  anti  kanker siklofosfamid 50 mg/Kg BB); Tanda panah menunjukkan sel yang mengalami  apoptosis.  Perbesaran  400  x  EACH  =  Ekstrak  Air Cincau Hitam
Gambar 1.  Apoptosis jaringan kulit dengan A popt a g Detection Kit
Gambar  1,  memperlihatkan  terjadinya  apoptosis  pada jaringan  kulit  mencit.  Perlakuan  perlakuan  dengan  ekstrak  air cincau  hitam  1000  mg/kg  BB  dan  perlakuan  dengan  obat antikanker  siklofosfamid  50  mg/kg  BB  memperlihatkan  banyak terjadi apoptosis.

## KESIMPULAN
Ekstrak  air  cincau  hitam  ( Mesona  palustris BL)  bersifat imunomodulator  dengan  meningkatnya  ekspresi  kadar  IFN-γ dan  komponen immune  surveillance (sel  NK,  sel  T  sitotoksik (CD8+),  dan  makrofag)  pada  mencit  yang  diinduksi benzo(a)pirena.  Ekstrak  air  cincau  hitam  mempunyai  potensi dapat  mencegah  terjadinya  karsinogenesis  pada  mencit  yang diinduksi  dengan  karsinogen  benzo(a)pirena.  Hal  ini  juga ditunjang  dengan  terjadinya  apoptosis  pada  mencit  yang  me- ngalami  karsinogenesis.  Perlakuan  ekstrak  air  cincau  hitam dosis 1000 mg/kg BB menunjukkan kenaikan jumlah apoptosis yang  paling  tinggi  dengan  persentase  penghambatan  karsino- genik sampai 57%.

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas A, Lichtman AH, Pober JS. 2005. Cells and Tissue of the Immune System in Cellular and Molecular Immunology. 5 th ed. Elsevier-Saunders. Philadelphia.
Atochina,  Harn.  2005.  LNFPIII/LeX-Stimulated  Macrophages Activate  Natural  Killer  Cells  via  CD40-CD40L  Interaction. Clin Vaccine Immunol 12: 1041-1049.
Baratawidjaja  KG,  Rengganis  I.  2010.  Imunologi  Dasar.  Balai Penerbit  Fakultas  Kedokteran  Universitas  Indonesia.
Jakarta.
Chiang  LC,  Ng  Lean  T,  Chiang  W,  Chang  MY,  Lin  CC.  2003. Immunomodulatory activities of flavonoids, monoterpenoids, triterpenoids, iridoid glycosides and phenolic compounds of plantago species. Planta Med 69: 600-604.
Cruse JM, Lewis RE. 1999. Cytokines. In: Atlas of immunology.
CRC Press. Boca Raton.
Dotti  G,  Savoldo  B,  Pule  M,  Karin  C  Straathof,  Biagi  E,  Yvon,
Vigouroux S, Brenner, Rooney CM. 2005. Human cytotoxic T  lymphocytes  with  reduced  sensitivity  to  Fas-induced apoptosis. Blood 105: 4677-4684.
Gregoraszczuk.  2008.  Modulatory  effect  of  ghrelin  in prepubertal  porcine  ovarian  follicles.  J  Physiol  Pharmacol 59: 781-793.
Halliwell B, Gutteridge JMC. 2000. Fee Radical Ini Biology And Medicine. Oxford University Press. New York.
Haryadi Purnamo D, Bangun P  Nuswantoro. 2002. Purification of gel forming component extracted from janggelan ( Mesona palustris BL) and characterization of the resulted gel. Dalam Proseding Seminar PATPI, Malang. Juli 30-31.
Hung  CY,  Yen  GC.  2001.  Extraction  and  Identification  of Antioxidative  Components  of  Hsian-Tsao  ( Mesona
A B C D E F
Procumbens Hemsl).  Academic  Press.  http://www.idea- library.com [18 September 2008].
Hung  CY,  Yen  GC.  2002.  Antioxidant  activity  of  phenolic compounds  isolated  from Mesona  Procumbens Hemsl.  J Agric Food Chem 50: 2993-2997.
Katiyar  SK,  Matsui  MS,  Elmets  CA,  Mukhtar  H.  1999: Polyphenolic  antioxidant  (-)  epigallocatechin-3-gallate  from green  tea  reduces  UVB-induced  inflammatory  responses and  infiltration  of  leukocytes  in  human  skin.  Photochem Photobiol 69: 148–153.
Kresno  Siti  B.  2001.  Imunologi:  Diagnosis  dan  Prosedur Laboratorium. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Liu  S,  Edgerton  SM,  Moore  DH,  Thor  AD.  2001.  Measures  of cell  turnover  (proliferation  and  apoptosis)  and  their Association with survival in breast cancer. Clin cancer res 7: 1716-23.
Purwanto  Agus  D,  Retno  PR,  Toto  P.  2005.  Peningkatan Ekspresi  Gen  IFN-γ  dan  Aktivasi  Fungsi  Immuno surveillance oleh Ekstrak Air Teh Hijau. Laporan Penelitian Lembaga Penelitian Universitas Airlangga.
Ruhnayat  A.  2002.  Cincau  Hitam  Tanaman  Obat  Penyembuh. Penebar Swadaya. Jakarta.
Soini Y, Paakko P, Lehto V. 1998. Histopathological evaluation of apoptosis in cancer. American J of Pathology 153: 1041- 1053.
Tang W, Einsenbrand G. 1992. Chinese Drugs of Plant Origin : Chemistry,  Pharmacology  and  Use  in  Traditional  and Modern Medicine. Spring-Verlag. New York. Pp 1011-1015.
Tosetti F, Ferrari N, Deflora S, Albini A. 2002. Angioprevention: angiogenesis  is  a  common  key  target  for  cancer  chemo- preventive agents. FASEB J 16: 2-14.
Vinardell  MP,  Mitjaans.  2008.  Immunomodulatory  effects  of polyphenols. EJEAF Che 7: 3356-3362.
Widyaningsih  TD.  2009.  Potensi  cincau  hitam  sebagai  bahan pangan fungsional yang bersifat imunomodulator. Proseding Seminar  Pengembangan  Teknologi  Berbasis  Bahan  Baku Lokal. LIPI.
Yang M, Xu ZP, Meng J, Ding QG, Zhang MX, Weng Y. 2008. Renal  protective  activity  of  hsian-tsao  extracts  in  diabetic rats. Biomedical and Enviromental Sci 21: 222-227.
Yeh CT, Huang WH, Yen GC. 2008. Antihypertensive effects of hsian-tsao  and  its  active  compound  in  spontaneously hypertensive rats. J Nutr Biochem in Sci Direct.
Yen GC, Hung YL, Hsieh LC. 2000. Protective effect of extracts of Mesona procumbens Hemsl. on DNA damage in human lymphocytes  exposed  to  hydrogen  peroxide  and  UV irradiation. Food Chem Toxicol 38: 747-754.
Yen  GC,  Yeh  TC,  Chen  J  Yen.  2004.  Protective  effect  of Mesona  procumbens against  tert-butyl  hydroperoxide- induced  acute  hepatic  damage  in  rats.  J  Agric  and  Food Chem 52: 4121-4127.