Uji Sitotoksisitas Sediaan Baru Pasta Ca (Oh) 2 Terhadap Sel Fibroblas ( In Vitro )
Cytotoxicity Test Of New Preparation Ca (Oh) 2 Paste On Fibroblast Cell  ( In Vitro )
Laura Emily Sulistyo 1 , Eko Fibryanto 2 , Melaniwati 2
1 Program Sarjana Kedokteran Gigi, Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Trisakti
2 Departmen Konservasi Gigi, Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Trisakti Correspondence email to: eko.fibryanto@trisakti.ac.id

## ABSTRAK
Karies yang tidak dirawat dapat menyebabkan infeksi pulpa. Perawatan infeksi ini adalah perawatan saluran  akar.  Kegagalan  perawatan  ini  bisa  terjadi  karena  infeksi  yang  persisten  oleh E.  faecalis . Pemberian medikamen intrakanal merupakan upaya untuk menghilangkan persistensi mikroorganisme dalam saluran akar. Pasta Ca(OH) 2 merupakan obat yang umum digunakan. Sediaan baru pasta Ca(OH) 2 dibuat untuk meningkatkan efek antibakteri. Tujuan penelitian ini adalah melakukan uji sitotoksisitas untuk menilai sifat toksik sediaan baru ini sebelum menjadi produk jadi terhadap fibroblas. Sel fibroblas jaringan  gingiva  dikultur  dan  diberi  ekstrak  sediaan  baru  pasta  Ca(OH) 2 dan  Calcipex.  Percobaan dilakukan  dalam  tiga  pengulangan  dan  viabilitas  sel  dievaluasi  dengan  uji  MTT.  Analisis  statistik dilakukan dengan uji One-way ANOVA (p<0,05). Perbandingan viabilitas sel pada sediaan baru pasta Ca(OH) 2 dan Calcipex menunjukkan bahwa sel yang diberi sediaan baru pasta Ca(OH) 2 lebih banyak yang  hidup jika  dibandingkan  dengan  Calcipex  sebagai  kontrol  positif  (p<0,05).  Sediaan baru pasta Ca(OH) 2 dan Calcipex bersifat toksik ringan terhadap sel fibroblas. Kelompok sediaan 1 g Ca(OH) 2 merupakan kelompok yang memiliki efek toksisitas paling ringan.
Kata kunci: Sitotoksisitas, Sel fibroblas, MTT, Sediaan baru pasta Ca(OH) 2

## ABSTRACT
Untreated caries can lead to pulp infections. The treatment for this infection is root canal treatment. Failure  of  this  treatment  can  occur  due  to  persistent  infection  by E.  faecalis .  The  administration  of intracanal medicaments is an attempt to eliminate the persistence of microorganisms in the root canal. Ca(OH)2 paste is a widely used medication. The new formulation Ca(OH) 2 paste is made to increase the antibacterial effect. The purpose of this study is to assess the toxicity of this new formulation toward fibroblasts.  Gingival tissue  fibroblasts  cells  were  cultured  and  given  extracts  of  Ca(OH) 2 paste  new formulation and Calcipex paste. The experiment was carried out in three repetitions and cell viability was evaluated by the MTT assay. Statistical analysis was performed using the one-way ANOVA test (p<0,05). The cells given the Ca(OH) 2 paste were more viable than Calcipex (p<0.05). Ca(OH) 2 paste and Calcipex have mild toxicity against fibroblast cells. The 1 g Ca(OH) 2 group has the lowest toxic effect.
Keywords: Cytotoxicity, Fibroblast cells, MTT, Ca(OH) 2 new formulation paste

## PENDAHULUAN
Prevalensi karies di Indonesia tergolong tinggi. Berdasarkan data Riset kesehatan dasar (Riskesdas)  tahun  2018,  prevalensi  karies  di Indonesia  adalah  sebesar  88,8% 1 .  Jika  tidak ditangani, karies dapat mengakibatkan kerusakan  pada  jaringan  keras  gigi,  penyakit periodontal, dan peradangan pulpa yang dapat menyebabkan infeksi saluran akar dan nekrosis pulpa 2 – 4 .  Infeksi  saluran  akar  dapat  ditangani dengan  perawatan  saluran  akar  (PSA). Keberhasilan  PSA  cukup  dapat  diprediksi dengan  tingkat  keberhasilan  yang  dilaporkan hingga  86-98%,  tetapi  masih  terdapat  kasus- kasus yang mengalami kegagalan dalam PSA. Faktor  utama  yang  mempengaruhi  kegagalan PSA  adalah  persistensi  mikroorganisme, terutama  bakteri Enterococcus  faecalis  (E. faecalis) 5 – 7 . Salah satu cara untuk mengurangi jumlah  mikroorganisme  dari  sistem  saluran akar adalah  dengan  menggunakan medikamen intrakanal 8 .
Medikamen  intrakanal  yang  banyak
digunakan adalah kalsium hirdoksida (Ca(OH) 2 ).  Kelebihan  Ca(OH) 2 antara  lain: bersifat  bakterisidal  saat  awal  penggunaan kemudian  bersifat  bakteriostatik  dengan toksisitas yang rendah, merangsang penyembuhan dan perbaikan, memiliki potential  of  hydrogen  (pH)  tinggi  yang  akan menstimulasi  pembentukan  sel  fibroblas, menghentikan  resorpsi  interna,  dan  dapat menetralkan  pH  asam  yang  rendah 8 . Sediaan pasta Ca(OH) 2 paling banyak dipakai daripada yang  berbentuk  bubuk  karena  lebih  mudah diaplikasikan  atau  diinsersikan    pada  saluran akar 9 .  Pasta  Ca(OH) 2 dibuat  dengan  cara mencampurkan  bubuk  Ca(OH) 2 dengan  bahan pencampur.  Bahan  pencampur  yang  dapat digunakan  adalah  bahan  pencampur  dengan konsistensi  encer,  kental,  atau  dengan kandungan minyak 10 .
Bahan pencampur yang digunakan dalam pembuatan sediaan baru pasta Ca(OH) 2 adalah propylene  glycol dan  barium  sulfat  (BaSO 4 ). Propylene  glycol adalah  senyawa  organik alifatik yang memiliki dua gugus hidroksil per molekul  atau  alkohol  dihidrat 11 . Propylene glycol berbentuk cairan tidak berwarna dengan bau  tajam,  memiliki  rasa  manis,  memiliki toksisitas  yang  rendah,  dan  dapat  berdifusi melalui  tubulus  dentin 12,13 .  Jika propylene glycol dan  Ca(OH) 2 dikombinasikan  dapat meningkatkan efek antimikroba pada
medikamen saluran akar 13 . Barium sulfat adalah endapan garam yang memiliki batas kelarutan sangat  rendah  dan  endapannya  bersifat  keras dan padat 14 . BaSO 4 memiliki kemampuan untuk menyerap  sinar  X  sehingga  saat  pemeriksaan radiografi  dilakukan  akan  terlihat  gambaran yang  lebih  radiopak  daripada  jaringan  di sekelilingnya 15 . Bahan ini tidak bersifat toksik pada  saluran  akar  karena  sulit  larut  dalam  air dan jarang menimbulkan alergi 15 – 17 .
Pada  penelitian  sebelumnya,  telah dilakukan  uji  antibakteri  sediaan  baru  pasta Ca(OH) 2 terhadap  bakteri E.  faecalis. Hasil penelitian  tersebut  menunjukkan  formulasi yang efektif dalam menekan jumlah koloni E. faecalis adalah  kelompok  formulasi  baru dengan bubuk Ca(OH) 2 murni sebanyak 1 g 18 . Oleh karena itu, pengembangan pasta Ca(OH) 2 buatan  dalam  negeri  perlu  dilakukan. Serangkaian uji masih harus dilakukan sebelum produk dapat diproduksi, salah satunya adalah uji sitotoksisitas.

## METODE PENELITIAN
Jenis penelitian ini adalah eksperimental murni  laboratoris  ( in  vitro )  dengan  rancangan penelitian  adalah posttest  only  control  group design .  Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium BioCore Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Trisakti.
Prosedur  kerja  penelitian  ini  adalah  sel fibroblas jaringan gingiva dikultur dengan cara menanam  sel  pada  medium  lengkap  yang terbuat dari campuran yang dibuat dengan cara mencampurkan Dulbecco's  Modified  Eagle Medium (DMEM)  20%, Amphotericin  B- Penicillin-Streptomycin (APS),  dan Fetal Bovine Serum (FBS) dan diinkubasi selama 2-7 hari.  Sel  dipanen  dengan  cara  pembuangan medium  lengkap,  pencucian  sel  dengan Phosphate  Buffer  Saline (PBS),  penambahan tripsin-EDTA  0,25%,  dan  dilakukannya sentrifugasi  sel  selama  2  menit.  Sel  diberikan pewarnaan dengan tryptanblue dan dimasukkan ke dalam slide card untuk dihitung jumlahnya dibawah mikroskop cahaya dengan hemositometer.  Sel  dipindahkan  ke  mikroplat 96-sumuran dan diinkubasi selama 72 jam. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan metode 3-[4,5- Dimethylthiazol-2-yl]-2,5  diphenyl  tetrazolium bromide (MTT).
Kelompok uji pada penelitian ini terdiri dari sediaan baru pasta Ca(OH) 2 dengan berat 1 g, 1,5 g, dan 2 g, kontrol positif yang merupakan
kelompok  ekstrak  Ca(OH) 2 produk  jadi (Calcipex,  Japan),  dan  kontrol  negatif  berupa kelompok  sel  fibroblas  jaringan  gingiva  tanpa perlakuan.  Setiap  kelompok  uji  dimasukan  ke dalam  mikroplat  96-sumuran  dan  diinkubasi selama  24  jam.  Pengulangan  dilakukan sebanyak  tiga  kali.  Larutan  MTT  dimasukkan ke setiap sumuran dan dihentikan aktivitasnya dengan acidified isopropanol . Hasil absorbansi diukur  dengan ELISA  reader ,  panjang gelombang  595  nm.  Hasil  pengukuran  dari ELISA reader berupa optical density . Viabilitas sel dihitung menggunakan rumus:
% viabilitas sel =
Mean optical density eksperimen
Mean optical density kontrol ×100%
Hasil  pengukuran  yang  diperoleh diintepretasikan sesuai dengan Tabel 1.
Tabel 1. Klasifikasi toksisitas berdasarkan
viabilitas sel 19 .
% viabilitas sel Toksisitas > 90 % 60 - 90 % 30 - 59 % < 30 % Biokompatibel Toksik ringan Cukup toksik Sangat toksik
Alat yang digunakan terdiri dari laminar
flow , mikropipet, mikroplat 96-sumuran, ELISA reader , orbital  shaker , conical  tube , dish , cryotubes , liquid  nitrogen  chamber ,  inkubator CO 2 5%, centrifuge tube , centrifuge , slide card , mikroskop cahaya, dan hemositometer.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  ekstrak  pasta  Ca(OH) 2 .  Ekstrak dibuat  dengan  cara  melarutkan  sediaan  baru pasta Ca(OH) 2 dan DMEM 20% (perbandingan 1:1),  medium  lengkap,  sel  fibroblas  jaringan gingiva,  larutan  MTT,  pasta  Ca(OH) 2 produk jadi (Calcipex, Japan), Penicillin-Streptomycin
(penstrep), PBS, tripsin-EDTA 0,25%,
tryptanblue , acidified isopropanol , dan alkohol. Hasil  penelitian  dianalisis  normalitas data  menggunakan  uji Shapiro-wilk, diketahui bahwa  data  terdistribusi  normal  (p>0,05). Selanjutnya data dianalisis dengan uji One-way ANOVA dan Post-hoc Tukey (p<0,05).

## HASIL PENELITIAN
Berdasarkan  analisis  data  diketahui adanya  pengaruh  sediaan  baru  pasta  Ca(OH) 2
terhadap  viabilitas  sel  fibroblas  jaringan gingiva (p<0,05) ditunjukkan pada Tabel 2.
Viabilitas sel dihitung untuk menentukan persentase jumlah sel yang hidup setelah diberi paparan 20 .  Hasil  perhitungan  viabilitas  sel terdapat  dalam  Tabel  3.  Sediaan  baru  pasta Ca(OH) 2 dengan  kandungan  1  g  bubuk Ca(OH) 2 memiliki  persentase  viabilitas  sel tertinggi.  Calcipex  sebagai  kontrol  positif memiliki persentase viabilitas sel terendah.
Data  dianalisis  dengan  uji post-hoc Tukey (p<0,05). Hasil uji post-hoc Tukey dapat dilihat  pada  Gambar  1.  Hasil  uji  ini menunjukkan  bahwa  tidak  ada  perbedaan bermakna nilai optical density antara kelompok sel  fibrobras  dengan  kelompok  sediaan  1  g Ca(OH) 2 .  Pada  kelompok  kontrol  negatif  ada perbedaan  bermakna  nilai optical  density dengan  kelompok  sediaan  1,5  g  Ca(OH) 2, 2  g Ca(OH) , dan  kelompok  Calcipex  sebagai kontrol positif.
Tabel 2. Nilai rerata, simpang baku, dan kemaknaan pengaruh sediaan Ca(OH) 2 terhadap optical density sel fibroblas. Kelompok uji  Rerata ± SB p Kontrol (-) 0,35700 + 0,005292 <0,001* 1 g Ca(OH) 2 + 2 mL
propylene glycol + 0,1 g BaSO 4 0,31900 +
0,012530 1,5 g Ca(OH) 2 + 2
mL propylene glycol + 0,2 g BaSO 4 0,27600 + 0,006083
2 g Ca(OH) 2
+ 2 mL propylene
glycol + 0,2 g BaSO 4 0,31667 + 0,016503 Kontrol (+) 0,26800 + 0,002000 * One-way  ANOVA (p<0,05);  SB:  Simpangan Baku
Tabel 3. Viabilitas sel fibroblas (%) setelah diberi perlakuan selama 24 jam. Kelompok uji % viabilitas sel Kontrol (-) 100% 1 g Ca(OH) 2 + 2 mL
propylene glycol + 0,1 g BaSO 4 89,36%
1,5 g Ca(OH) 2 + 2 mL
propylene glycol + 0,2 g BaSO 4 77,31%
2 g Ca(OH) 2 + 2 mL
propylene glycol + 0,2 g
BaSO 4 88,80% Kontrol (+) 75,07% Gambar 1. Optical density kelompok uji setelah paparan selama 24 jam pada uji sitotoksisitas MTT.

## DISKUSI
Prevalensi karies di Indonesia tergolong tinggi 1 . Jika  tidak  ditangani,  karies  dapat mengakibatkan  infeksi  saluran  akar.  Infeksi saluran  akar  dapat  ditangani  dengan  PSA 5 . Penyebab  utama  kegagalan  PSA  adalah persistensi  mikroorganisme,  terutama E. faecalis 7 .  Salah  satu  cara  untuk  mengurangi jumlah  mikroorganisme  dari  saluran  akar adalah  dengan  menggunakan  medikamen saluran  akar.  Medikamen  yang  sering  dan efisien  digunakan  adalah  Ca(OH) 2 berbentuk pasta 8,9 .  Pada  penelitian  sebelumnya  telah berhasil  ditemukan  formulasi  baru  pasta Ca(OH) 2 yang  efektif  mengurangi  jumlah koloni E. faecalis 18 . Maka dari itu, uji toksisitas dilakukan
untuk menganalisis biokompatibilitas  sediaan  baru  terhadap  sel fibroblas.
Persentase viabilitas
sel menunjukkan pertumbuhan dan jumlah sel yang hidup 21 . Uji MTT mudah dilakukan, memerlukan waktu yang relatif singkat, memiliki keakuratan yang  baik,  dan  dapat  digunakan  untuk mengukur sampel dalam jumlah besar. Prinsip uji  MTT  dalam  menentukan  viabilitas  sel adalah  penentuan  fungsi  mitokondria  dengan mengukur  aktivitas  enzim  mitokondria  seperti enzim  suksinat  dehidrogenase. Nicotinamide adenine  dinucleotide  hydrogen (NADH)  akan mereduksi  garam  MTT  menjadi  kristal formazan  ungu  yang  tidak  larut  dalam  air 22,23 .
Oleh karena itu, sebelum mengukur absorbansi, diperlukan  pelarut  organik  seperti  SDS  atau isopropanol untuk melarutkan kristal. Hasil dari uji  MTT  dibaca  dengan ELISA  reader dan diukur dengan absorbansi cahaya pada panjang
gelombang 595 nm. Konsentrasi formazan ungu dapat  ditentukan  dengan  spektrofotometri visibel. Konsentrasi formazan berbanding lurus dengan jumlah sel hidup. Semakin besar daya absorbansi maka semakin banyak juga jumlah sel  yang  hidup 24 .  Perubahan  garam  MTT menjadi formazan ungu dipengaruhi oleh durasi inkubasi.  Semakin  lama  durasi  inkubasi  akan menghasilkan akumulasi warna dan peningkatan  sensitivitas  hingga  batas  tertentu. Namun,  waktu  inkubasi  memiliki  batasan durasi  karena  terdapat  sifat  sitotoksik  dari reagen  MTT  jika  diinkubasi  melebihi  batas waktu tertentu. Sel yang mati akan kehilangan kemampuan  untuk  mengubah  garam  MTT menjadi  formazan  ungu  sehingga  perubahan warna menjadi indikator viabilitas sel 25 . Hasil  pembacaan  dari ELISA  reader adalah optical  density . Optical  density adalah rasio  intensitas  logaritmik  dari  cahaya  yang jatuh  pada  material  dengan  cahaya  yang ditransmisikan  ke  suatu  material 26 .  Hasil penelitian  pada  Tabel  2  menunjukkan  nilai optical density . Nilai optical density dari yang tertinggi  hingga  terendah,  yaitu  kelompok sediaan  1  g  Ca(OH) 2 ,  2  g  Ca(OH) 2 ,  1,5  g Ca(OH) 2 ,  yang  terendah  pada  kelompok Calcipex.
Viabilitas sel dihitung untuk menentukan persentase jumlah sel yang hidup setelah diberi paparan 20 .  Hasil  perhitungan  viabilitas  sel terdapat  dalam  Tabel  3.  Persentase  viabilitas tertinggi hingga terendah, yaitu yaitu kelompok sediaan  1  g  Ca(OH) 2 ,  2  g  Ca(OH) 2 ,  1,5  g Ca(OH) 2 ,  yang  terendah  pada  kelompok Calcipex.
* * * * * * *
Berdasarkan  klasifikasi  pada  Tabel  1, kelompok sediaan 1 g Ca(OH) 2 , 1,5 g Ca(OH) 2 , 2  g  Ca(OH) 2 ,  dan  Calcipex  bersifat  toksik ringan.  Calcipex  bersifat  paling  toksik  jika dibandingkan dengan kelompok uji lainnya dan berbeda signifikan dengan kontrol sel fibroblas jaringan  gingiva.  Kelompok  sediaan  1  g Ca(OH) 2 bersifat  toksik  paling  ringan  jika dibandingkan dengan kelompok uji lainnya dan tidak  berbeda  signifikan  dengan  kelompok kontrol sel fibroblas jaringan gingiva.
Kemungkinan penyebab viabilitas Calcipex  hanya  sebesar  75,07%  dan  lebih rendah  dari  kelompok  sediaan  1  g  Ca(OH) 2 adalah  lebih  banyaknya  kandungan  Ca(OH) 2 . Kalsium  hidroksida  bersifat  toksik  dalam saluran  akar 13,19 . Propylene  glycol bersifat toksik,  namun  sangat  rendah 27 .  BaSO 4 tidak bersifat  toksik 28 .  Semakin  banyak  kandungan Ca(OH) 2 maka  semakin  tinggi toksisitas  pasta Ca(OH) 2 .  Viabilitas  kelompok  sediaan  2  g Ca(OH) 2 lebih  tinggi  dari  kelompok  sediaan 1,5  g  Ca(OH) 2 mungkin  disebabkan  oleh adanya kelemahan dalam uji MTT, yaitu dapat terjadinya  gangguan  latar  belakang  karena masuknya partikel saat pembuatan sediaan atau saat  pembuatan  ekstrak.  Gangguan  ini  dapat menyebabkan  pengukuran  viabilitas  sel  yang terlalu  tinggi 22 .  Efektivitas  pasta  Ca(OH) 2 terhadap  bakteri  dinilai  berdasarkan  pH. Potential  of  Hydrogen  yang  tinggi  akan menstimulasi  pembentukan  sel  fibroblas  dan dapat  menetralkan  pH  asam  yang  rendah 8 . Semakin banyak kandungan Ca(OH) 2 efektivitas  dalam  membunuh  bakteri  semakin tinggi.  Dengan  demikian,  efektivitas  pasta Ca(OH) 2 berbanding terbalik dengan toksisitas pasta Ca(OH) 2 .
Keterbatasan dalam penelitian ini adalah pembuatan  sediaan  baru  pasta  Ca(OH) 2 yang dilakukan secara manual menggunakan spatula metal  di  atas glass plate sehingga memungkinkan terjadinya kontaminasi.

## SIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian,  sediaan baru  pasta  Ca(OH) 2 dan  Calcipex  sebagai kontrol  positif  bersifat  toksik  ringan  terhadap sel  fibroblas  jaringan  gingiva.  Kelompok sediaan  1  g  Ca(OH) 2 merupakan  kelompok yang memiliki efek toksisitas paling ringan dan tidak  berbeda  signifikan  dengan  kelompok kontrol negatif.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut mengenai bahan tambahan dan suhu penyimpanan  yang  tepat  agar  pada  kelompok sediaan  1  g  Ca(OH) 2 tidak  mengendap  dalam tiga hari jika disimpan dalam syringe .

## DAFTAR PUSTAKA
1.   Kemkes  RI. Riset  Kesehatan  Dasar: Badan  Penelitian  Dan  Pengembangan Kesehatan .; 2019.
2.   Veiga NJ, Aires D, Douglas F, et al. Dental caries:  A  review. J  Dent  Oral  Heal . 2016;2(5):1-3.
3.   Egasari Winahyu KM, Turmuzi A, Hakim F.  Risiko  Kejadian  Karies  Gigi  Ditinjau dari Konsumsi M akanan Kariogenik pada Anak  Usia  Sekolah  di  Kabupaten Tangerang. Faletehan Heal J . 2019;6(1):25-29.
4.   Conrads  G.  Pathophysiology  of  dental caries. In: Caries Excavation: Evolution of Treating  Cavitated  Carious  Lesions .  Vol 27. Karger Publishers; 2018:1-10.
5.   Tabassum  S,  Khan  FR.  Failure  of endodontic treatment: The usual suspects. Eur J Dent . 2016;10(01):144-147.
6.   Kumar  A,  Tamanna  S,  Iftekhar  H. Intracanal  medicaments – Their  use  in modern endodontics: A narrative review. J Oral Res Rev . 2019;11(2):94.
7.   Sakko  M,  Tjäderhane  L,  Rautemaa- Richardson R. Microbiology of root canal infections. Prim Dent J . 2016;5(2):84-89.
8.   Kim  D,  Kim  E.  Antimicrobial  effect  of calcium  hydroxide  as  an  intracanal medicament  in  root  canal  treatment:  a literature  review-Part  I.  In  vitro  studies. Restor Dent Endod . 2014;39(4):241-252.
9.   Kusuma ARP. Pengaruh lama aplikasi dan jenis  bahan  pencampur  serbuk  kalsium hidroksida  terhadap  kekerasan  mikro dentin  saluran  akar. Odonto  Dent  J . 2016;3(1):48-54.
10.   Widiadnyani NKE, Mulyawati E, Dayinah HS.  Pengaruh  Lama  Kontak  Kalsium Hidroksida  dengan  Bahan  Pencampur Klorheksidin  Diglukonat  2%,  Salin,  dan Lidokain Hcl 2% sebagai Bahan Sterilisasi Terhadap  pH  Dentin  pada  Segmen Sepertiga  Apikalsaluran  Akar. J  Kedokt Gigi . 2018;5(2):176-188.
11.   Sirous M, Sinning N, Schneider TR, Friese
U,  Lorenz  J,  Engel  AK.  Chemosensory event-related  potentials  in  response  to nasal propylene glycol stimulation. Front Hum Neurosci . 2019;13:99.
12.   Fiume MM, Bergfeld WF, Belsito D V, et al.  Safety  Assessment  of  Propylene Glycol, Tripropylene Glycol, and PPGs as Used in Cosmetics. J Toxicol . 2012;31(2):245S-260S. doi:10.1177/1091581812461381
13.   Srinivas  S,  Jibhkate  NG,  Baranwal  R, Avinash A, Tandil Y, Rathi S. Propylene Glycol:  A  New  Alternative  for  an Intracanal  Medicament. J  Int  Oral  Heal . 2016;8(5):611-614.
14.   Ali  AM,  Messaoud  H.  Barium  Sulphate
Deposits. Energy
Procedia .
2019;157:879-891.
15.   Collares  FM,  Klein  M,  Santos  PD,  et  al. Influence  of  Radiopaque  Fillers  on Physicochemical  Properties  of  a  Model Epoxy  Resin-based  Root  Canal  Sealer. J Appl Oral Sci . 2013;21(6):533-539.
16.   Ba-Hattab  R,  Al-Jamie  M,  Aldreib  H, Alessa L, Alonazi M. Calcium Hydroxide in  Endodontics:  An  Overview. Open  J Stomatol . 2016;6(12):274-289.
17.   Aronson  JK. Meyler’s  Side  Effects  of Drugs: The International Encyclopedia of Adverse Drug Reactions and Interactions. 16th Ed. Elsevier; 2016.
18.   Berlianti S. Efek Pengembangan Formulasi  Pasta  Kalsium  Hidroksida Terhadap  Jumlah  Koloni  Enterococcus Faecalis  Sebagai  Medikamen  Saluran Akar  (Penelitian  Ex  Vivo).  [Skripsi]. Universitas Trisakti; 2021.
19.   Jahromi  MZ,  Ranjbarian  P,  Shiravi  S. Cytotoxicity  Evaluation  of  Iranian Propolis  and  Calcium  Hydroxide  on Dental  Pulp  Fibroblasts.  2014;8(3):130- 133.
20.   Mahfur. Uji  Sitotoksik  Fraksi  Etil  Asetat Ekstrak  Etanol  Akar  Pasak  Bumi (Eurycoma Longifolia Jack) Terhadap Sel Kanker  T47D  Dengan  Metode  3-(4,5
Dimetiltiazol -2-Il)- 2,5 Difenil Tetrazolium Bromide (MTT) .; 2009.
21.   Khan Y. Characterizing the Properties of Tissue  Constructs  for  Regenerative Engineering.  In: Reference  Module  in Biomedical  Sciences .  Vol  3rd  Ed. Elsevier; 2019:542-543.
22.   Aslantürk  Ö.  In  Vitro  Cytotoxicity  and Cell Viability Assays: Principles, Advantages,  and  Disadvantages.  In: editors.    [Internet].  InTech;  2018  [cited 2021  Jul  6].  Available  from:  In: Larramendy  M,  Soloneski  S,  eds. Genotoxicity - A Predictable Risk to Our
Actual World . ; 2018.
doi:10.5772/intechopen.71923 23.   Ernawati F. Uji sitotoksik Isolat Aktif dari Ekstrak  Kloroform  Rumput  Mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk.) terhadap Sel HELA dan SIHA . Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam; 2010.
24.   Septisetyani EP, Ningrum RA, Romadhani Y,  Wisnuwardhani  PH,  Santoso  A. Optimization of Sodium Dodecyl Sulphate as a Formazan Solvent and Comparison of 3-(4,-5-dimethylthiazo-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) Assay with WST-1 Assay in MCF-7 Cells. Indones J Pharm . 25(4):245-254.
25.   Riss  TL,  Moravec  RA,  Niles  AL,  et  al. Cell  Viability  Assays. Assay  Guid  Man . Published  online  July  1,  2016.  Accessed April 6, 2023. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NB K144065/