## EKSPRESI PROTEIN P53 PADA SEL TIG-3 SETELAH PERLAKUAN

## SINAR UV DAN EKSTRAK BIJI JUWET (Syzygium cumini)
Roudlotul Jannah 1) , Widodo 2)
1), 2) Jurusan Biologi Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya Malang
1) jannahroudlotul92@gmail.com , 2) dodot134@gmail.com

## ABSTRAK
Tubuh  terlindungi  dari  lingkungan  luar  karena  adanya  kulit.  Adanya  paparan  lingkungan  luar, seperti  sinar  UV  dapat  mempengaruhi  sel  pada  kulit.  Dalam  jangka  pendek  dapat  menyebabkan  kulit terbakar serta dalam jangka panjang menyebabkan kanker atau penuaan dini. Salah satu cara yang biasa digunakan  untuk  melindungi  sel  kulit  dari  paparan  sinar  UV  adalah  dengan  penggunaan  antioksidan. Jambolan  (S.  cumini)  merupakan  salah  satu  tumbuhan  yang  memiliki  kandungan  antioksidan  yang tinggi. Protein p53 merupakan salah satu protein yang bertugas dalam melindungi DNA dari kerusakan yang ditimbulkan setelah sel kulit terpapar sinar ultraviolet (UV). Penelitian ini bertujuan untuk melihat ekspresi  protein  p53  pada  sel  fibroblast  TIG-3  setelah  dipapar  sinar  UV  serta  pemberian  ekstrak  biji juwet. Sel dikultur dan dipapar sinar UV 30mJ/cm 2 lalu diberi ekstrak biji juwet dengan dosis 0,1% dan 10%. Pemberian ekstrak biji juwet mampu meningkatkan ekspresi protein p53 pada sel TIG-3.
Kata kunci: ellagitannin, fibroblas, jambolan, p53, UV.

## ABSTRACT
Skin protects our body from the external environments. Ultraviolet (UV) light is one of the external environment that can induce alteration in skin cells. Short term effect is sunburn, but in long term it can cause skin cancer also aging. Commonly people use antioxidant to protects their skin from UV. Jambolan is one of the herbal that rich of antioxidant. p53 is one of protein that can protects DNA fom DNA damage after  UV  irradiation.  Expression  of  p53  is  monitored  in  this  study.  TIG-3  cells  were  cultured  then irradiated  by  30mJ/cm 2 UV  lights  and  treated  by  jambolan  seed  extract.  Jambolan  seed  crude  extract treatment upregulated the p53 expression on TIG-3 cells.
Key words: ellagitannin, fibroblast, jambolan, p53, UV.

## PENDAHULUAN
Kulit  merupakan  organ  utama  yang terlibat  dalam  sistem  integumen  dan  melapisi seluruh  bagian  permukaan  tubuh  makhluk hidup. Selain itu, dengan adanya kulit sel dalam tubuh  akan  dapat  melakukan  aktivitasnya dengan  baik  tanpa  ada  gangguan  dari  luar. Salah  satu  faktor  yang  dapat  mempengaruhi aktifitas sel adalah radiasi sinar UV dari cahaya matahari [1,2]
Dalam  kondisi  yang  berlebih,  sinar  UV dapat menimbulkan beberapa masalah terhadap kulit,  mulai  kulit  kemerahan  bahkan  dalam jangka  waktu  lama  menyebabkan  risiko  kanker kulit. Efek buruk tersebut timbul karena adanya stress  oksidatif  yang  terjadi  setelah  adanya paparan sinar UV[3].
Salah  satu  cara  yang  biasa  digunakan untuk  menangkal  efek  buruk  dari  sinar  UV adalah  dengan  menggunakan  antioksidan. Tumbuh-tumbuhan merupakan salah satu sumber  antioksidan.  Jambolan  (S.  cumini) merupakan salah satu tumbuhan berkhasiat obat yang  memiliki  kandungan  antioksidan  tinggi. Ellagitannin  merupakan  salah  satu  antioksidan
dalam  biji  jambolan  yang  mampu  melindungi sel  fibroblast  kulit  dari  kerusakan  akibat paparan sinar UV [4, 5].
Paparan  sinar  UV  dan  pemberian antioksidan  dapat  menginduksi  aktivasi  protein p53.  Fosforilasi  protein  p53  sebagai  faktor transkripsi beberapa protein yang terlibat dalam proses  DNA  repair  salah  satunya  disebabkan oleh Ɣ -H2AX.  Aktivasi  protein  p53  akan menyebabkan  penghambatan  proliferasi  dengan menghentikan  siklus  sel  untuk  memaksimalkan proses DNA repair [6].

## METODE PENELITIAN
Ekstraksi Kasar Biji Juwet. Buah juwet diperoleh  di  wilayah  kampus  Universitas Brwaijaya.  Biji  dipisahkan  dari  buah  yang telah  masak  atau  berwarna  ungu  kehitaman. Biji  kemudian  dikeringkan  pada  suhu  60°C. Setelah  biji  kering  kemudian  dihaluskan hingga  menjadi  bubuk.  Ekstraksi  dimulai dengan  menambahkan 25ml  aquades  ke dalam botol polipropilen (falcon) berisi 5gram bubuk biji  juwet.  Ekstraksi  dilakukan  dengan  cara slow  shaking  selama  semalam  pada  suhu  40°-
50°C.  Ekstrak  didiamkan  pada  suhu  ruangan dan  dilakukan  penyaringan  dengan  kertas Whatman  dan  kemudian  disentrifugasi dengan kecepatan  10.000  rpm  selama  20  menit  dan kemudian  dilakukan  penyringan  dengan  filter 0.45 µm [7].
Kultur  Sel  TIG-3.  Ekspresi  protein  p53 diukur  menggunakan  metode  western  blotting. Sel  TIG-3  dikultur  pada  cawan  kultur  berisi  6 sumuran  lalu  dipapar  sinar  UV  dengan meletakkannya dalam UV cross-linker (funakoshi) dengan dosis 30mJ/cm 2 . Medium sel diganti  dengan  ekstrak  biji  juwet  dengan  dosis yang  telah  diketahui  memiliki  efek  toksik terhadap sel yaitu 10% serta yang tidak memiliki efek  toksik  dan  mampu  menghambat  pelepasan protein Ɣ -H2AX  sehingga  dapat  diketahui perbedaan ekpresi p53 pada sel.
Western  Blotting.  Sel  yang  telah  diberi perlakuan  selama  24  jam  kemudian  dilisiskan menggunakan  larutan  RIPA  buffer  (Thermo scientific). Protein hasil lisis diestimasi menggunakan  metode  Bradford  lalu  diseparasi pada SDS-PAGE. Hasil elektroforesis kemudian diblot  pada  membrane  nitroselulosa  (Millipore) secara  semi  dry.  Identifikasi  protein  dilakukan dengan menambahkan mouse anti-actin antibody dan  rabbit  anti-p53  primary  antibody  (santa cruz). Visualisasi dilakukan dengan mengidentifikasi goat anti rabbit alexa conjugated  antibody  dan  rat  anti  mouse  alexa conjugated  antibody  (santa  cruz).  Kuantifikasi silakukan dengan menggunakan software ImageJ [7].
Gambar  1.  Peta  perlakuan  pada  kultur  sel  TIG-3  untuk persiapan  pengecekan  ekspresi  protein  p53 setelah  paparan  UV  30mJ/cm 2 dan  pemberian ekstrak  biji  juwet  dosis  tinggi  (10%)  dan  dosis efektif (0,1%).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Adanya  paparan  sinar  UV  terhadap  kulit menyebabkan  adanya  stress  oksidatif  pada  sel. Radikal bebas yang dihasilkan akan menyebabkan  adanya  kerusakan  DNA,  salah satunya  terbentuk  DSBs  yang  ditandai  dengan terfosforilasinya  protein  histon  H2AX  menjadi
Ɣ -H2AX.  Pelepasan Ɣ -H2AX  akan  membantu menginduksi protein p53 sebagai faktor transkripsi dari beberapa protein yang terlibat di dalam proses DNA repair. Aktivasi p53 di dalam sel  akan  menyebabkan  terhentinya  siklus  sel pada  fase  G1  sehingga  DNA  yang  mengalami mutasi  tidak  ikut  tereplikasi  bersama  dengan proses proliferasi sel. Dalam kasus mencit p53-/- ketika  sel  terpapar  oleh  radiasi  maka  akan menyebabkan  sel  terpacu  untuk  melakukan proliferasi secara terus-menerus yang berpotensi menjadi  sel  kanker.  Pelepasan Ɣ -H2AX  tidak mampu  menginduksi  proses  DNA  repair sehingga  DNA  yang  termutasi  tetap  ikut tereplikasi dalam siklus sel [6, 8, 9, 10].
Protein p53 merupakan sebuah suppressor tumor  gene  dan  memiliki  peran  penting  dalam proses  DNA  repair.  Dalam  keadaan  normal, protein p53 akan mengalami inaktivasi di dalam sel dan  diikat  oleh inhibitornya.  Ketika  terdapat suatu  gangguan,  salah  satunya  radiasi  UV  yang menyebabkan  terfosforilasinya  protein  H2AX menjadi Ɣ -H2AX  yang  akan  terlepas  dan mengaktivasi  protein  p53  sehingga  dan  menuju inti.  Protein  p53  akan  menuju  ke  promoter beberapa  protein  yang  berperan  dalam  proses DNA  repair,  salah  satunya  adalah  protein  p21. Upregulasi  protein  p21  akan  menyebabkan  sel tidak  dapat  memasuki  sistem  check  point  untuk memasuki  fase  S,  dengan  demikian  makan perbaikan  DNA  dapat  berlangsung  dengan  baik dan  mengurangi  risiko  tereplikasinya  DNA mutan. Terhentinya siklus sel akan menyebabkan  proliferasi  sel  menjadi  terhambat [11, 12, 13].
Sel  TIG-3  yang  dipapar  sinar  UV  akan mengalami  peningkatan  ekspresi  protein  p53 yang diperlukan untuk induksi DNA repair. Pada dosis  0.1%  baik  yang  diberi  paparan  sinar  UV ataupun tidak, menunjukkan ekpresi protein p53 yang  relatif  sama  dengan  kontrol.  Hal  tersebut berkaitan dengan kemampuan antioksidan dalam ekstrak kasar biji juwet yang mampu menetralisir  radikal  bebas  yang  dihasilkan setelah  pemaparan  sinar  UV.  Ellagitannin merupakan  salah  satu  antioksidan  yang  terdapat dalam  buah  juwet  dan  telah  diketahui  mampu mengaktifkan  p53  di  dalam  sel.  Tidak  adanya pelepasan Ɣ -H2AX  pada  sel  yang  diberi perlakuan  dosis  0,1%  menyebabkan  tidak adanya aktivasi protein p53 sehingga ekspresinya sama dengan kontrol non UV.
Antioksidan dalam dosis yang tinggi juga dapat bersifat radikal bebas sehingga menimbulkan  efek  toksik  pada  sel.  Hal  tersebut terlihat pada tingginya ekspresi protein p53 pada sel yang diberi perlakuan dosis 10% ekstrak biji
juwet dan  dipapar  sinar  UV.  Pemberian  ekstrak pada  dosis  tinggi  akan  menambah  jumlah radikal bebas di dalam sel sehingga menginduksi  ekspresi  p53  sesuai  dengan kerusakan yang ditimbulkan. Tingginya ekspresi protein  p53  akan  menghambat  pertumbuhan  sel bahkan  jika  kerusakan  yang  ditimbulkan  tidak dapat diatasi lagi maka sel akan diinduksi untuk melakukan  apoptosis.  Hal  tersebut  terlihat  pada efek  toksik  pada  sel  yang  diberi  perlakuan ekstrak biji juwet pada dosis 10%.
Gambar 2. Pemberian ekstrak biji juwet dalam dosis 10%  menyebabkan    tingginnya  ekspresi protein  p53  pada  sel  yang  diberi  UV. Pemberian  ekstrak  dengan  dosis  0,1% memiliki  kesamaan  ekspresi  protein  p53 dengan  kontrol  negatif  atau  sel  tanpa paparan sianr UV dan pemberian ekstrak biji juwet.

## KESIMPULAN
Ekstrak  biji  juwet  mampu  meningkatkan ekspresi  protein  p53  pada  sel  TIG-3  setelah pemaparan  sinar  UV.  Pada  dosis  rendah, ekspresi  protein  p53  pada  sel  TIG-3  memiliki kesamaan  dengan  kontrol  negatif.  Dalam  dosis tinggi  (10%)  ekstrak  biji  juwet  memiliki  efek toksik terhadap sel.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  dapat  berlangsung  dengan baik dengan  dukungan Program Hibah Kompetisi  UB  beserta  Bapak  Widodo  yang telah  membimbing  hingga  penelitian  ini berjalan dengan baik.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Tortora,  G.  J.  dan  B.  Derrickson.  2009. Principles  of  Anatomy  and  Physiology.
United States of America: John Wiley and Sons Inc.
[2]   Marieb,  E.  N.  2003.  Human  Anatomy  and Physiology. New York: Pearson Education.
[3]   Saladi, R.N., dan Persaud, A.N., 2005. The causes of skin cancer: a comprehensive review drug. (41):37–53.
[4]  Agyare,  C.,  dkk.  2011.  Ellagitannins from Phyllanthus muellerianus (Kuntze)
Exell.:  Geraniin  and  furosin  stimulate cellular activity, differentiation and collagen synthesis of human skin keratinocytes  and dermal fibroblasts. Journal of Phytomedicine. 18 (7): 617-624.
[5]  Chaudhary,  B.  dan  K.  Mukhopadhyay. Syzygium  cumini  (L.)  Skeels.  A  Potential Source  of  Nutraceuticals.  International Journal  of  Pharmacy  and  Biological Science. 2(1):46-53.
[6]   Lu,  H.,  R.  A.  Forbes,  A.  Verma.  2002. Hypoxia-inducible  factor  1  activation  by aerobic  glycolysis  implicates  the  warburg effect in carcinogenesis. Biological
Chemistry. 277: 23111-23115.
[7]  Wadhwa,  R.,  dkk.  2013.  Water  Extract  of Ashwaganda Leaves Has Anticancer Activity:  Identification  of  an  Active Component  and  Its  Mechanism  of  Action. PLOS ONE. 8(10):e77189.
[8]  Hseu,  Y.  C.,  dkk.  2012.  Ellagic  acid protects human keratinocyte (HaCaT) cells against  UVA-induced  oxidative  stress  and apoptosis  through  the  upregulation  of  the HO-1  andNrf-2  antioxidant  genes.  Journal of  Food  and  Chemical  Toxicology. (50):1245-1255.
[9]  Rothkamm,  K.  dan  S.  Horn.  2009. Ɣ - H2AX  as  protein  biomarker  for  radiation exposure.  ANN  IST  SUPER  SANITA. (45):265-271.
[10] Halicka,  H.  D.,  dkk.  2005.  Histone  H2AX Phosphorylation  after  Cell  Irradiation  with UV-B. Cell-Cycle. 4(2):339-345.
[11] Adimoolam,  S.  dan  J.  M.  Ford.  2003.  P53 and regulation of DNA damage recognition during  nucleotide  excition  repair.  DNA Repair 2 ELSEVIER. (2003): 947-954.
[12] Kastan,  M.  B.,  dkk.  1991.  Participation  of p53  protein  in  the  cellular  response  to DNA damage. Cancer research. (51):6304- 6311.
[13] Li, T. M., dkk. 2005. Ellagic Acid Induced p53/p21  Expression,  G1  Arrest  and Apoptosis  in  Human  Bladder  Cancer  T24 Cells. Anticancer Research. (25): 971-980.
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0 0.10% 10% L e v e l p 5 3 Ekstrak Kasar Biji Juwet UV non UV p53 aktin