## OPTIMISASI SEDIAAN KONSENTRAT EKSTRAK ETANOL 70% DAN 96% Herba kemangi  SEBAGAI FITOESTROGEN PADA TIKUS PUTIH BETINA (Rattus norvegicus)
E. Mulyati Effendi 1 , Hera Maheshwari 2 dan Evi Juliati Gani 3 1,3 Program Studi Biologi, FMIPA, Universitas Pakuan, Bogor
2 Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, Bogor.

## ABSTRAK
Perubahan  hormonal  pada  wanita  menopause  menimbulkan  berbagai  macam keluhan  seperti  keluhan  vasomotorik,  keluhan  fisiologis  dan  psikologis.  Untuk menangani  keluhan  semacam  biasanya  digunakan  terapi  sulih  hormon  estrogenik  baik hormon sintetik maupun hormon alami. Berdasarkan beberapa hasil penelitian, tanaman yang  diduga  memiliki  khasiat  estrogenik  diantaranya  adalah  herba  kemangi  .  Tujuan penelitian  ini  adalah  mengetahui  optimisasi  dan  potensi  estrogenik  dari  sediaan konsentrat ekstrak etanol 70%  dan ekstrak etanol 96% herba kemangi pada tikus putih betina ( Rattus norvegicus ). Ekstraksi menggunakan pelarut etanol 96% diharapkan dapat menghasilkan dosis yang optimal dibandingkan dengan ekstraksi menggunakan pelarut etanol  70%.  Penelitian  dilakukan  berdasarkan  metode whitten  effect menggunakan  32 ekor tikus putih betina  yang dibagi dalam 8 kelompok perlakuan (P1 sampai P8), setiap kelompok terdiri dari 4 ekor tikus. P1 adalah kontrol negatif  (perlakuan CMC-Na 0,5%), P2 kontrol positif (perlakuan etinil estradiol), P3 (perlakuan 0.7g/200g BB ekstrak etanol 70%),  P4  (perlakuan  0,8g/200g  BB  ekstrak  etanol  70%),  P5  (perlakuan  0,9g/200g  BB ekstrak  etanol  70%),  P6  perlakuan  (0,7g/200g  BB  ekstrak  etanol  96%),  P7  (perlakuan 0,8g/200g BB ekstrak etanol 96%) dan P8 (perlakuan 0,9g/200g BB ekstrak etanol 96%). Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian 0,7g/200g BB sediaan konsentrat ekstrak etanol 96% herba kemangi memiliki pengaruh yang sangat nyata terhadap bertambahnya lama  waktu   siklus  estrus, tingkat  vaskularisasi  dan  peningkatan  bobot  ovarium-uterus dibandingkan  kontrol  negatif  (P1)  serta  memiliki  pengaruh  yang  relatif  sama  dengan kontrol positif (P2).
Kata kunci: Optimisasi pelarut, herba kemangi, fitoestrogen
OPTIMIZATION OF PREPARATIONS of 70% AND 96%

## CONCENTRATED ETHANOLIC EXTRACT  of
Ocimum americanum L. AS PHYTOESTROGEN IN FEMALE WHITE RAT
(Rattus norvegicus)

## ABSTRACT
The hormonal changes in menopaused woman cause various health pains such as vasomotor, psychological and physiological complaints. These pain can be treated with Hormon Replacement Therapy (HRT) using   synthetic or natural hormones. According to previous research, basil herb ( Ocimum americanum L.) was believed to have potential estrogenic  effect.  The  purpose  of  this  research  was  to  determine  the  optimization  and estrogenic  potency  of  70%  and  96%  ethanol  extract  of  basil  herb  on  female  rats. Extraction of basil herbs using  96% ethanol was predicted to produce optimal dose than extraction with 70% ethanol. Thirty two pre-menopause female rats which divided into 8
treatment  groups  were  used  in  this  study.  The  animals  were  tested  with  whitten  effect method. Group P1 were administered with CMC-Na 0.5% as a negative control, group P2 were administered with 9x10 -3 g/200g BW ethynil estradiol as a positive control, group P3, P4 and P5  were administered with 0.7g/200g BW,  0.8g/200g  BW and 0.9g/200g BW of 70% ethanol extract of basil  herb respectively  meanwhile group P6, P7 and P8 were  administered  with  0.7g/200g  BW,    0.8g/200g  BW  and  0.9g/200g  BW  of  96% ethanol extract of basil  herb. The result shows that  administration of 0.7g/200g BW of 96% ethanol extract of basil herb had the most significant effect on the length of estrous cycle, the vascularisation of ovarium dan uterus and the increase in ovarium and uterus weight in female rats compared to the negative control (P1). This effect relatively similar to the effect of positif control (P2).
Keywords: Solvent optimization, Ocimum americanum , phytoestrogen

## PENDAHULUAN
Wanita  pada  usia  40-50  tahun biasanya mengalami ketidakteraturan siklus  menstruasi  yang  ditandai  dengan tidak  terjadinya  ovulasi  selama  beberapa siklus  menstruasi  dan  setelah  beberapa tahun  siklus  berhenti  sama  sekali  yang kemudian  disebut  masa  menopause.  Pada saat  ini  produksi  hormon  estrogen  oleh ovarium  menurun  drastis  sehingga  tidak dapat  lagi  berperan  dalam  pembentukan hormon  perangsang  folikel  (FSH)  dan hormon luteinisasi (LH) yang cukup untuk memicu terjadinya ovulasi (Guyton, 1994). Perubahan  hormonal  yang  drastis  ini menimbulkan banyaknya keluhan di  masa menopause  seperti  keluhan  vasomotorik, keluhan fisiologis dan keluhan psikologis. Keluhan yang paling sering muncul adalah hot  flushes (semburan  rasa  panas  pada daerah-daerah  tertentu  seperti  dada,  leher dan  kepala),  kerusakan  kulit,  gangguan system urogenital, gangguan libido, osteoporosis dan hiperkolesterolemia (Badziad, 2003).
Untuk mengatasi masalah ini biasaya digunakan Hormone Replacement Therapy (HRT) atau terapi hormonal menggunakan estrogen  sintetis  seperti ethinyl  estradiol . Namun  penggunaan hormon  sintetis menimbulkan  efek  samping  yang  tidak diharapkan sehingga dewasa ini penggunaan  hormon  sintetis  beralih  pada
penggunaan  obat-obatan  asal  bahan  alam. Terdapat    beberapa  tanaman  yang  diduga memiliki  khasiat  estrogenik,  diantaranya adalah kemangi ( Ocimum americanum L.). Kemangi  memiliki  kandungan  aktif anetol, boron dan stigmaterol yang bersifat fitoestrogen  dapat  merangsang  sekresi estrogen,  senyawa  arginin  yang  dapat mencegah  kemandulan  dan  senyawa eugenol  yang  mampu  membunuh  jamur penyebab  keputihan.  Selain  itu  zat stigmasterol dalam kemangi dapat merangsang  pematangan  sel  telur,  tanin dan  seng dapat  mengurangi  sekresi cairan vagina, triptofan yang terkandung di dalam kemangi  dapat  menunda  menopause  serta kandungan  senyawa  boron  juga  berperan dalam  pencegahan  pengeroposan  tulang. Berdasarkan  pengalaman  empiris  juga diperoleh  data  bahwa  para  wanita  yang mengkonsumsi  kemangi  setiap  hari  dapat menunda  masa  menopause  (Gunawan, 2004). Kemangi juga memiliki kandungan flavonoid  (Vinca et  al .,  2004)  dan mempunyai  efek  estrogenik  yaitu  dapat bekerja  seperti  estrogen  dengan  cara menduduki reseptor estrogen (Satyaningtijas et al ., 2014).
Hasil  yang  diperoleh  dari  penelitian sebelumnya  menunjukkan bahwa aktivitas ekstrak  etanol  70%  herba  kemangi dosis
0,8 g/200gBB dapat meningkatkan aktivitas  estrogenik  tikus  putih (Rattus
norvegicus) betina  pre-menopause    setara dengan kontrol positif etinil estradiol 9×10 - 3 mg/200gBB  (Effendi et  al .,  2009).
Selanjutnya  penelitian  Anatria  (2011) terhadap ekstrak n-heksan herba kemangi, dan  menyatakan  bahwa  ekstrak  n-heksan herba kemangi dosis 0,2 g/200g BB dapat memperpanjang siklus estrus dan meningkatkan  bobot  ovarium  dan  uterus tikus  putih  usia  8-9  bulan  sebanding dengan kontrol positif etinil estradiol 9×10 - 3 mg/200g  BB.  Penggunaan  pelarut  n- heksan akan lebih banyak menarik zat aktif (stigmasterol)  dalam  herba  kemangi  dari pada pelarut etanol 96%, namun karena n- heksan  memiliki  sifat  toksik  lebih  tinggi dibandingkan dengan etanol 96% sehingga kurang  aman    digunakan  dalam  ekstraksi zat  aktif  yang    akan  diaplikasikan  pada manusia. Etanol dilih sebagai pelarut pada penelitian ini dibandingkan heksan  karena etanol  merupakan  jenis  bahan  kimia  yang termasuk kedalam food grade dan pharma grade . Berdasarkan  hasil-hasil  penelitian sebelumnya  seperti  yang  diuraikan  diatas, perlu  dilakukan  penelitian  lanjutan  untuk mengetahui dosis efektif sehingga sediaan cair  herba  kemangi  agar  didapatkan konsentrasi  minimal  dengan  efek  terapi maksimal.  Dosis  efektif  berkaitan  dengan efektifitas  ekstraksi  yang  tergantung  pada macam  pelarut  dan  tingkat  kepolaran pelarut  karena  tingkat  kepolaran  pelarut mempengaruhi proporsi senyawa-senyawa yang  tersari.  Menurut  Markham  (1988), ekstraksi pelarut etanol 96% dapat menarik senyawa  berpotensi  estrogenik  (salah satunya flavonoid) lebih banyak dibanding dengan  ekstraksi  menggunakan  pelarut 70%.  Dengan  demikian  dosis  pemakaian pada penelitian sebelumnya dapat diturunkan.

## METODE PENELITIAN
Pengumpulan Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian  ini adalah  herba kemangi,  yang
diambil dari perkebunan daerah Leuwiliang, Kabupaten Bogor.

## Pembuatan  Ekstrak  Etanol  70%  dan 96% Herba Kemangi
Sebanyak  masing-masing  0,5  kg serbuk  kering  herba  kemangi    yang  telah diayak  dengan  ayakan  mesh  ukuran  30 dimaserasi  dengan  l  L  etanol  70%  dan 96%.     dalam tabung  kaca selama  1 hari.
Selama perendaman dilakukan pengocokan setiap 6 jam sekali selama 15 menit.  Setelah  1  hari  rendaman    disaring, filtrat  diambil  dan  ampasnya  dimaserasi kembali sebanyak 4 kali dengan perlakuan yang sama. Filtrat yang diperoleh divakum sampai beratnya konstan dan menghasikan ekstrak kental  yang selanjutnya digunakan untuk uji estrogenik.
Nilai  rendemen  ekstrak  dihitung dengan membandingkan berat awal simplisia  dan  berat  akhir  ekstrak  yang dihasilkan. Rendemen merupakan parameter  standar  mutu  ekstrak  serta penentuan efesiensi ekstraksi.
Rendemen = bobot ekstrak yang diperoleh bobot awal simplisia x 100%

## Analisis Karakteristik Serbuk Simplisia dan Ekstrak
Penetapan Kadar Air Kadar air simplisia diukur menggunakan  alat moisture  balance. Kadar  air  simplisia  tidak  boleh  lebih  dari 10%  (DepKes  RI,  1995)  dan  kadar  air ekstrak  kental  tidak  lebih  dari  10% (Depkes RI, 2008).

## Penetapan Kadar Abu
Kadar abu total simplisia tidak lebih dari  13,1%  (DepKes  RI,  2008).  Untuk mengukur  kadar  abu,  sebanyak  2-3g simplisia dipijarkan dalam tanur pada suhu 700 o C  sampai  menjadi  abu  dan  bobotnya tetap.  Kadar  abu  dihitung  dengan  rumus sebagai berikut:
% kadar abu = bobot abu yang diperoleh bobot awal simplisia x 100%

## Pembuatan Sediaan Konsentrat
Sediaan  konsentrat  dibuat  dengan cara  mencampurkan  masing-masing  70  g, 80 g dan 90 g ekstrak etanol 70% dan 96% dengan CMC 0,5% dan 100  mL aquadest yang telah dipanaskan.
Selanjutnya masing-masing konsentrat disimpan dalam
lemari  pendingin  sampai  saat  digunakan. Dosis  pemakaian  konsentrat  adalah  1mL dimana  dalam  masing-masing  1  mL tersebut  mengandung  ekstrak  etanol  70% dan 96% sebesar 700mg/200gBB (P3 dan P6),  800mg/200gBB  (P4  dan  P7)  dan 900mg/200gBB (P5 dan P8). Tabel 1. Sediaan Konsentrat Perlakuan Zat Aktif CMC- Na 0,5% P1 - add 100mL
P2 Etinilestradiol
9x10 -3 g/200g BB P3 700 mg ekstrak etanol 70% herba kemangi P4 800 mg ekstrak etanol 70% herba kemangi P5 900 mg ekstrak etanol 70% herba kemangi P6 700 mg ekstrak etanol 96% herba kemangi P7 800 mg ekstrak etanol 96% herba kemangi P8 900 mg ekstrak etanol 96% herba kemangi Penentuan Aktifitas Estrogenik Dengan
Metode Whitten Effect
Penelitian ini menggunakan
rancangan  percobaan  RAL  (Rancangan Acak Lengkap) menggunakan 8 kelompok tikus betina Rattus  norvegicus pre menopause, masing-masing  kelompok terdiri dari 4 ekor tikus. Tikus diaklimatisasi selama dua minggu sebelum uji estrogenik dilakukan.
Metode Whitten  Effect dilakukan dengan  cara  meletakkan  kandang  tikus jantan  diletakkan  di  atas  kandang  tikus betina. Whitten  effect berfungsi  untuk
sinkronisasi  birahi  pada  tikus  betina dengan mencium bau feromon yang keluar bersama  urin  tikus  jantan.  Ketika  tikus betina  tidak  mencium  bau  feromon  tikus jantan,  maka  tikus  mengalami  fase anestrus, sedangkan pada saat tikus betina mencium  bau  feromon  yang  ikut  keluar bersama  urin  tikus  jantan,  maka  hari  ke  3 berikutnya  tikus  betina  mengalami  masa estrus,  ciri-ciri  hewan  estrus  dapat  dilihat dari  keadaan  vulva yang  bengkak,
berwarna merah dan basah (Hafez, 1980). Pengambilan dan Pemeriksaan Preparat Ulas Vagina Sebelum dilakukan penelitian, hewan  percobaan  diamati  terlebih  dahulu ciri-ciri siklus estrusnya melalui
pemeriksaan  preparat  ulas  vagina  ( vagina smear )  dengan  pewarnaan  Giemsa,  yang dilaksanakan 2 kali setiap 12 jam yaitu pagi pada  pukul  06.00  WIB  dan  malam  pada pukul  18.00  WIB  untuk  mengamati perubahan-perubahan  yang  terjadi  pada epitel vagina.
Pengambilan  sampel  preparat  apus vagina  dilakukan  dengan  cara  sebagai berikut:
1. Dilakukan  sinkronisasi  birahi  tikus- tikus  tersebut  melalui  metode Whitten Effect .  Pada  hari  ke-3,  tikus-tikus diperiksa siklus birahi  melalui vaginal smear .
2. Cutton bud yang telah dibasahi dengan NaCl  fisiologis  diulaskan    ke  dalam lubang  vagina  tikus  untuk  mengambil selaput lendir vagina.
3. Sampel yang didapat kemudian
diusapkan di atas gelas objek kemudian preparat difiksasi menggunakan methanol 10% selama 5 menit.
4. Setelah  itu  preparat  ulas  diwarnai dengan  cara  dicelupkan  pada  bak pewarna  Giemsa  selama  30  menit, kemudian dicuci dengan aquadest dan dikeringkan.  Warna  yang  dihasilkan merah dadu.
5. Pemeriksaan  preparat  ulas  vagina untuk menentukan fase siklus reproduksi  dilakukan  menggunakan mikroskop  dengan  pembesaran  okuler 10x  dan  objektif  40x.  Penentuan  fase siklus  reproduksi  (proestrus,  estrus, metestrus,  dan  diestrus)  dilakukan dengan  mengamati  ciri  khas  yang terdapat pada siklus reproduksi seperti tertera pada Tabel 4 (Hafez, 1980).
6. Apabila  tikus-tikus  tersebut  sudah dalam  keadaan  fase  estrus,  kemudian diberikan perlakuan pemberian sediaan konsentrat  ekstrak  herba  kemangi sesuai  dengan  dosis  sesuai  kelompok masing-masing  (kelompok  P1  sampai P8).
Uji  Efek  Estrogenik  Ekstrak  Herba Kemangi
Pemberian sediaan konsentrat ekstrak  herba  kemangi  dilakukan  sekali setiap hari pada jam 06.00 WIB selama 14 hari  berturut-turut  setelah  tikus-tikus diperiksa fase estrus melalui cara makroskopis  dan  mikroskopis.  Waktu estrus  tersebut  dicatat  yang  kemudian pemeriksaan fase estrus dilanjutkan setiap hari,  dua  kali  sehari  yaitu  pagi  jam  06.00 WIB  dan  malam  pada  pukul  18.00  WIB selama  masa  perlakuan.  Pada  hari  ke-15 dilakukan  dekapitasi  hewan-hewan  coba tersebut  untuk  mengamati  vaskularisasi uterus  dan  menimbang  bobot  ovarium- uterusnya  serta  dilakukan  penyimpanan ovarium  dan  uterus  tersebut  di  dalam larutan etanol 70%.
Pengukuran Lama Siklus Estru Pengukuran lama fase estrus
dilakukan  secara  mikriskopis  dengan metode  preparat  ulas  vagina  ( vaginal smear )  dan  tanda-tanda  estrus  secara
makroskopis.  Pembuatan  preparat  ulas vagina  dilakukan  setiap  hari,  dua  kali sehari, pagi dan sore hari selama perlakuan, sekaligus melihat  tanda-tanda  estrus meliputi keadaan vulva dan vagina
Gambar 1. Fase-fase Siklus Estrus,
Fase Proestrus 12jam (a), Estrus 12jam (b), Metestrus 21jam (c) dan Dietrus 57jam (d)
.

## Vaskularisasi  dan  Penimbangan  Bobot Ovarium dan Uterus Tikus
Pengamatan  vaskularisasi  ovarium dan  uterus  pada  tikus  betina  dilakukan dengan cara mematikan tikus yang sedang mengalami  masa  estrus  dengan  eter,  lalu dibedah untuk mengeluarkan ovarium dan uterusnya, setelah itu dilihat warna mukosa pada ovarium dan uterus tikus.
Pengamatan vaskularisasi dinyatakan dengan scoring ,  sesuai  dengan  modifikasi metode Rugh (1968), dimana :
Skor 1  Sedikit Merah Skor 2  Merah Skor 3  Sangat Merah
Setelah  pengamatan  vaskularisasi kemudian  dilakukan  penimbangan  bobot ovarium  dan  uterus  secara  terpisah menggunakan timbangan analitik.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Maserasi Herba Kemangi Dengan Etanol 70% dan 96%
Ekstrak kental hasil maserasi menggunakan  etanol  70%  memiliki  nilai randemen 10,65% dan ekstrak kental hasil
b d c a b d
maserasi menggunakan etanol 96%
memiliki  nilai    randemen  10,78%. Randemen  merupakan  parameter  standar mutu  ekstrak  serta  penentuan  efisiensi ekstraksi.  Dari  data  yang  diperoleh diketahui  bahwa  maserasi  menggunakan etanol  96%    menghasilkan  rendemen dengan nilai yang tidak berbeda nyata.
Gambar 2. A. Simplisia basah herba kemangi; B.Simplisia Serbuk; C. Ekstrak Kental.

## Karakteristik Simplisia dan Ekstrak Nilai Kadar Air dan Abu
Penetapan kadar air simplisia serbuk dilakukan  menggunakan  alat moisture balance, sedangkan ekstrak kental menggunakan metode gravimetri (DepKes, 2000). Hasil penetapan kadar air disajikan pada Tabel 2.
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh, kadar  air  serbuk  simplisia  dan  ekstrak herba  kemangi  memenuhi  persyaratan (DepKes  RI,  1989)  yaitu  kadar  air  tidak lebih dari 10 %. Semakin kecil kandungan air  dalam  suatu  simplisia,  maka  akan sangat  berguna  untuk  memperpanjang daya  tahan  serbuk  simplisia  selama penyimpanan.  Namun  kadar  air  yang terlalu  kecil  juga  dapat  merusak  senyawa aktif  yang  terkandung  dalam  suatu simplisia,  sehingga  proses  pengeringan simplisia harus dilakukan secara optimal. Hasil  penentuan  kadar  abu  pada  simplisia herba kemangi dapat dilihat pada Tabel 2. Hasil ini memenuhi syarat yang ditetapkan Departemen Kesehatan (2008) yang
menyatakan  bahwa  kadar  abu  total simplisia tidak lebih dari 13.1%. Pengotor mineral yang melebihi batas akan mempengaruhi kualitas senyawa aktif yang terkandung  dalam  simplisia.  Kadar  abu
yang terkandung dalam ekstrak etanol 70% dan ekstrak etanol 96% memberikan  hasil yang relatif sama serta kadar abunya lebih kecil  dari  kadar  abu  simplisia,  hal  ini dikarenakan sebagian senyawa mineral dan senyawa anorganik tidak ikut tersari dalam proses ekstraksi.
Tabel 2. Kadar  Air  dan  Abu  Simplisia dan Ekstrak Bahan Kadar Air (%) Kadar Abu (%) Simplisia 7,93 10,04 Ekstrak Etanol 70% 9,00 5,68 Ekstrak Etanol 96% 5,00 5,52

## Hasil Kandungan Senyawa Fitokimia
Penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui  golongan  senyawa  metabolit sekunder  yang  terkandung  pada  kemangi baik  simplisia  dan  ekstrak.  Pengujian fitokimia merupakan suatu parameter yang spesifik dari suatu ekstrak (DepKes, 2000). Berdasarkan  hasil  uji  fitokimia  yang dilakukan Khoirani (2013) herba kemangi mengandung  alkaloid,  saponin,  tanin, flavonoid, steroid, triterpenoid, dan minyak atsiri.
Menurut Vinca, et al . (2004) bahwa hasil fitokimia dari daun kemangi mengandung senyawa triterpenoid. Steroid dalam  tumbuhan  dikenal  dengan  nama fitosterol  yaitu  sitosterol  (kolesterol  asal tanaman)  dan  stigmasterol.  Selain  itu kemangi  juga  mengandung  anetol  dan boron  yang  dapat  merangsang  produksi hormon estrogen (Gunawan, 2004).
Kandungan  kemangi  golongan  senyawa steroid  (sitosterol)  dapat  berubah  menjadi estrogen melalui proses aromatisasi sehingga dapat meningkatkan dan memperpanjang  waktu  siklus  estrus  yang disebut  sebagai  fitoestrogen  (Wicaksono, 2013). Menurut Raharjo (2009), fitoestrogen  adalah  estrogen  lemah  yang
didapatkan pada tanaman.
Istilah fitoestrogen berhubungan dengan beberapa kelas senyawa diantaranya senyawa kimia seperti  flavon,  flavonon,  isoflavon,  lignan dan kumestan.
Pengaruh  Estrogenik  Ekstrak  Etanol 70% dan 96% Herba kemangi

## Terhadap Lama Siklus Estrus
Hasil  penelitian  tentang  pengaruh estrogenik  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol 70% dan 96% terhadap lama siklus estrus  dilakukan  12  jam  sekali  dengan mengamati  sel-sel  epitel  (pemeriksaan sitologi)  yang  ditemukan  dalam  preparat vaginal smear .
Hasil penentuan aktivitas estrogenik terhadap  lama  siklus  estrus  (Gambar  3) menunjukkan  bahwa  pemberian  sediaan konsentrat ekstrak etanol 96% dan ekstrak etanol  70%  herba  kemangi    pada  tikus putih  betina  cenderung  memperpanjang siklus estrus tikus. Tikus-tikus  yang diberi sediaan  konsentrat  ekstrak  etanol  70% herba  kemangi  0,9g/200g  BB  (P5)  dan pemberiaan  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  96%  herba  kemangi  0,9g/200g  BB (P8) menunjukkan lama siklus estrus yang paling  panjang  dibandingkan  dengan kelompok perlakuan yang lain.
Hasil analisis data statistik menunjukan  pengaruh  perlakuan  sediaan konsentrat  ekstrak  etanol  70%  dan  96% herba kemangi  yang sangat berbeda nyata terhadap  lama  siklus  estrus  hal  ini dibuktikan  pada  tabel  ANOVA  dengan nilai  sig  =  0,000  (P  <  0,01).  Untuk mengetahui  perbedaan  antar  perlakuan dilakukan uji lanjut Duncan.
Gambar 3. Histogram Lama Siklus Estrus
Keterangan:
Huruf  superscript  yang  berbeda,  menyatakan pengaruh  yang  sangat  berbeda  nyata  pada  setiap perlakuan (P<0,01).
P1  :  kontrol negatif, diberi CMC 0,5% sebanyak 3 mL.
P2  :  kontrol positif diberi peroral etinil estradiol dengan dosis 9x10 -3 gr/200g BB sebanyak 3 mL (Effendi, et al ., 2009).
P3  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  70%  kemangi  0,7g  dosis  pemakaian 1mL/200g BB tikus.
P4  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  70%  kemangi  0,8g  dosis  pemakaian 1mL/200g BB tikus.
P5  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  70%  kemangi  0,9g  dosis  pemakaian 1mL/200g BB tikus.
P6  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  96%  kemangi  0,7g  dosis  pemakaian 1mL/200g BB tikus.
P7  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  96%  kemangi  0,8g  dosis  pemakaian 1mL/200g BB tikus.
P8  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  96%  kemangi  0,9g  dosis  pemakaian 1mL/200g BB tikus.
Uji  Duncan  menunjukkan    bahwa semua  perlakuan  memberikan  pengaruh yang sangat nyata terhadap kontrol negatif serta  memberikan  pengaruh  yang  relatif sama  dengan  kontrol  positif.  Maka  dapat dinyatakan bahwa pemberian dosis terendah  ekstrak  etanol  70%  herba kemangi  0,7g/1mL/200gBB  (P3)  dan ekstrak  etanol  96%  herba  kemangi 0,7g/1mL/200gBB (P6) sudah memberikan pengaruh yang lebih baik dari kontrol  positif  (P2),  tetapi  antara  ke  dua jenis  dosis  dari  ekstrak  yang  berbeda memiliki  aktivitas  yang  sama    dan memiliki  nilai  rata-rata  yang  sama  dalam diagram  Gambar  3.  Semakin  tinggi  dosis ekstrak  etanol  96%  herba  kemangi, kecenderungan adanya peningkatan aktivitas  estrogenik  dibandingkan  dengan ekstrak etanol 70% herba kemangi. Hal ini dapat dilihat diagram batang nilai rata-rata lama siklus estrus pada Gambar 4, P8 lebih tinggi  dari  pada  P5  namun  dalam  uji
101 a 123 b 135 bc 141 bcd 159 d 135 bc 147 cd 162 d 0 100 200 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 Lama Siklus Estrus
Duncan  hasil  relatif  sama  pengaruhnya terhadap lama siklus estrus.
Gambar 4. Histogram Tingkat
Vaskularisasi Peningkatan hasil aktivitas estrogenik pada tikus yang diberi perlakuan  ekstrak  etanol  96%  herba kemangi  dibanding  dengan  ekstrak  etanol 70%  herba  kemangi  dipengaruhi  oleh kandungan senyawa perangsang keluarnya hormon estrogen (anetol, boron, stigmasterol  dan  flavonoid)  lebih  banyak tertarik  oleh  pelarut  etanol  96%.  Hal  ini dapat  diketahui  melalui  pemeriksaan sitologi  vagina  dengan  melihat  perubahan sel  epitel  vagina  atau  vulva  pada  setiap perubahan tahapan siklus estrus pada tikus putih. Pada fase luteal sel epitel dari vagina akan  dikombinasikan  oleh  sel  parabasal, sedangkan memasuki fase estrus sel epitel berubah  menjadi  sel  superfisial  dan  sel tanduk  (kornifikasi)  yang  menandakan bahwa tikus dalam keadaan puncak estrus (Madalina et al ., 2009).
Pengaruh  Estrogenik  Ekstrak  Etanol 70% dan 96% Herba kemangi Terhadap  Vakularisasi  Ovarium  dan Uterus Pengujian tingkat vaskularisasi organ  reproduksi  (ovarium  dan  uterus) tikus  menggunakan  modifikasi  metode Rugh  (1968)  berdasarkan scoring setelah pemberian  perlakuan  ekstrak  etanol  70% dan  96%    herba  kemangi  .  Pemberian
ekstrak  etanol  70%  dan  96%  herba kemangi    mempengaruhi  warna  pada mukosa  uterus  dan  ovarium  tikus.  Data skor  warna  vaskularisasi  ovarium  dan uterus dipaparkan Gambar 5.
Gambar 5. Penampang Ovarium-Uterus
Keterangan:
Huruf  superscript  yang  berbeda,  menyatakan pengaruh  yang  sangat  berbeda  nyata  pada  setiap perlakuan (P<0,01).
Skor 1 = Sedikit Merah Skor 2 = Merah Skor 3 = Sangat Merah P1  :  kontrol negatif, diberi CMC 0,5% sebanyak 3 mL.
P2  :  kontrol positif diberi peroral etinil estradiol dengan  dosis  9x10 -3 gr/200gBB  sebanyak  3 mL (Effendi, et al ., 2009).
P3  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  70%  kemangi  0,7g  dosis  pemakaian 1mL/200gBB tikus.
P4  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  70%  kemangi  0,8g  dosis  pemakaian 1mL/200gBB tikus.
P5  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  70%  kemangi  0,9g  dosis  pemakaian 1mL/200gBB tikus.
P6  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  96%  kemangi  0,7g  dosis  pemakaian 1mL/200gBB tikus.
P7  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  96%  kemangi  0,8g  dosis  pemakaian 1mL/200gBB tikus.
P8  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  96%  kemangi  0,9g  dosis  pemakaian 1mL/200gBB tikus.
Hasil analisis data statistik menunjukkan  bahwa  pada  perlakuan pemberian  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  70%  dan  96%  herba  kemangi memberikan pengaruh yang sangat berbeda nyata terhadap tingkat
vaskularisasi  ovarium  dan  uterus.  Hal  ini dibuktikan  pada  tabel  ANOVA  dengan nilai sig = 0,000 (P < 0,01) sehingga untuk mengetahui  perbedaan  antar  perlakuan dilakukan uji lanjut Duncan.
1 a 2.25 b 2.5 b 2.75 b 2.75 b 2.5 b 3 b 3 b 0 1 2 3 4 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 Tingkat Vaskularisasi Skor 1 Skor 2 Skor 3
Hasil  Uji  Duncan  menunjukkan bahwa  pemberian  sediaan  konsentrat ekstrak etanol 96% (P6, P7 dan P8) herba kemangi  memiliki  aktivitas  estrogenik yang  sangat  berbeda  nyata  dengan perlakuan  pemberian  CMC-Na  0,5% sebagai kontrol negatif (P1) serta memberikan  pengaruh  yang  relatif  sama dengan  kontrol  positif.  Semua  perlakuan pemberian  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  96%  herba  kemangi  memberikan pengaruh  yang  sangat  nyata  dan  paling baik dibandingkan dengan semua perlakuan  pemberian  sediaan  konsentrat ekstrak  etanol  70%  herba  kemangi terhadap tingkat vaskularisasi ovarium dan uterus pada tikus putih betina.
Tingkat  vaskularisasi  dapat  dinilai secara  makroskopik  pada  permukaan ovarium untuk setiap tikus yang mendapatkan perlakuan pemberian sediaan konsentrat  dan  terlihat  permukaan  yang kasar  dan  dipenuhi  benjolan-benjolan sebagai  penanda  adanya  perkembangan folikel  pada  ovarium.  Perkembangan folikel  dipicu  hormon  FSH  ( Follicle
Stimulating Hormone) dari kelenjar hipofisa  anterior  (Adenohipofisa).  Folikel yang
sedang berkembang
akan mengeluarkan  estrogen  sehingga  ukuran ovarium  lebih  besar  dari  biasanya  diikuti dengan uterus  yang terlihat membengkak akibat  akumulasi  cairan.  Selama  fase folikular dalam siklus, estrogen menstimulasi proliferasi endometrium sehingga  uterus  terjadi  pembengkakan (Neal, 2006).
Terjadinya  penebalan  uterus  telah membuktikan  bahwa  sediaan  konsentrat ekstrak  etanol  herba  kemangi  memiliki potensi estrogenik dan dapat menigkatkan kadar estrogen dalam darah. Efek estrogenik  herba  kemangi    terhadap jaringan  epitel  vagina  dapat  dilihat  pada aktivitas mitogenik sel-sel epitel uterus dan vagina.  Aktivitas  mitogenik  tersebut berupa proliferasi maupun diferensiasi sel- sel  epitel.  Aktivitas  mitogenik  sel  epitel
dapat terjadi secara langsung maupun tidak langsung. Estrogen dapat berikatan langsung dengan REα epitel ataupun secara tidak  langsung  dengan  REα  stroma. Proliferasi  yang  terjadi  pada  sel-sel  epitel endometrium  uterus  dan  epitel  vagina terjadi secara tidak langsung yang dibantu oleh  faktor  parakrin  yang  dihasilkan  sel stroma akibat induksi estrogen (Buchanan et al ., 1998).
Ketebalan  lapisan  epitel  vagina kemungkinan juga dipengaruhi oleh adanya  diferensiasi  sel-sel  epitel  vagina. Diferensiasi merupakan perubahan struktural  maupun  fungsional  sel  menuju kematangan ( maturity ). Diferensiasi dapat terjadi  secara  langsung  maupun  tidak langsung melalui pengikatan estrogen pada masing-masing  RE  α  yang  terdapat  pada sel  stroma  dan  sel  epitel.  Mekanisme diferensiasi  sel-sel  epitel  lebih  rumit  dan belum  jelas  sampai  saat  ini,  namun diketahui  bahwa  rangkaian  peristiwa diferensiasi  epitel  vagina  memerlukan proses  proliferasi  epitel  terlebih  dahulu (Buchanan et  al .,  1998).  Diferensiasi  sel dapat  dilihat  dari  perubahan  sitologi  sel epitel  vagina,  yaitu  sel-sel  parabasal menjadi sel  superfisial pada  lapisan epitel vagina.  Hal  tersebut  yang  kemudian menyebabkan  keratinisasi  pada  lapisan bagian  atas  epitel  vagina  sehingga  daerah epitel  bagian  vagina  dan  uterus  menjadi tebal.
Pengaruh  Estrogenik  Ekstrak  Etanol
70% dan 96% Herba kemangi
Terhadap Bobot Ovarium dan Uterus. Pengujian pengaruh konsentrat ekstrak  etanol  70%  dan  96%  herba kemangi  terhadap peningkatan bobot total ovarium  dan  uterus  dilakukan  setelah terjadinya  estrus  hingga  estrus  siklus selanjutnya  dengan  cara  menimbang ovarium  dan  uterus  masing-masing  tikus putih betina dari setiap perlakuan menggunakan neraca analitik.
Gambar 6. Histogram Nilai Rata-rata Bobot Total Ovarium dan Uterus
Keterangan:
Huruf  superscript  yang  berbeda,  menyatakan pengaruh  yang  sangat  berbeda  nyata  pada setiap perlakuan (P<0,01).
P1  :  kontrol negatif, diberi CMC 0,5% sebanyak
3 mL.
P2  :  kontrol positif diberi peroral etinil estradiol dengan  dosis  9x10 -3 gr/200gBB  sebanyak  3 mL (Effendi, et al ., 2009).
P3  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  70%  kemangi  0,7g  dosis  pemakaian 1mL/200gBB tikus.
P4  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  70%  kemangi  0,8g  dosis  pemakaian 1mL/200gBB tikus.
P5  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  70%  kemangi  0,9g  dosis  pemakaian 1mL/200gBB tikus.
P6  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  96%  kemangi  0,7g  dosis  pemakaian 1mL/200gBB tikus.
P7  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol  96%  kemangi  0,8g  dosis  pemakaian 1mL/200gBB tikus.
P8  :  diberi  peroral  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol 96%  kemangi 0,9g dosis pemakaian 1mL/200g BB tikus.
Hasil  analisis  data  statistik  yang diperoleh menunjukkan bahwa pemberiaan konsentrat  ekstrak  etanol  70%  dan  96% herba  kemangi    mempengaruhi  bobot ovarium  dan  uterus  seperti  terlihat  pada Gambar  6.  Perlakuan  CMC-Na  0,5% sebagai kontrol negatif (P1), etinil estradiol sebagai kontrol positif (P2), ekstrak etanol 70%  herba  kemangi  0,7g/200gBB  (P3), ekstrak  etanol  70%  herba  kemangi 0,8g/200gBB  (P4),  ekstrak  etanol  70%
herba kemangi 0,9g/200gBB (P5), ekstrak etanol  96%  herba  kemangi  0,7g/200gBB (P6),  ekstrak  etanol  96%  herba  kemangi 0,8g/200gBB (P7) dan ekstrak etanol 96% herba  kemangi  0,9g  /200gBB  (P8) memberikan pengaruh yang sangat berbeda nyata terhadap pengamatan bobot ovarium  dan  uterus.  Hal  ini  dibuktikan pada  tabel  ANOVA  dengan  nilai  sig  =
0,006  (P  <  0,01)  sehingga  untuk mengetahui  perbedaan  antar  perlakuan dilakukan uji lanjut Duncan.
Uji  Duncan  menunjukan  bahwa semua  perlakuan  memberikan  hasil  yang sangat  berbeda  nyata  terhadap  kontrol negatif  (P1)  dan  memiliki  pengaruh  yang relatif  sama  dengan  kontrol  positif  (P2). Pemberian  konsentrat  ekstrak  etanol  96% dengan  dosis  pemakaian  0,7g/1mL/200g BB  merupakan  dosis  terendah  yang  dapat memberikan  pengaruh  yang  sama  dengan kontrol  positif  (P2).  Sedangkan  untuk pemberian  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol 70% dosis pemakaian 0,9g/1mL/200gBB (P5), sediaan konsentrat  ekstrak  etanol  96%  dosis pemakaian  0,8g/1mL/200gBB  (P7)  dan dosis  pemakaian  0,9g/1mL/200gBB  (P8) memberikan pengaruh yang sangat berbeda  nyata  dan  lebih  baik  dari  kontrol positif  (P2).  Berbeda  dengan  pemberian sediaan  konsentrat  ekstrak  etanol  70%, dosis  pemakaian  0,7g/1mL/200gBB  (P3) dan  dosis  pemakaian  0,8g/1mL/200gBB (P4)  menunjukkan  hasil  nilai  rata-rata bobot  ovarium-uterus  yang  lebih  kecil dibanding kontrol positif (P2) tetapi karena terletak pada subset Duncan yang sama, itu berarti P3 dan P4 memiliki pengaruh yang relatif sama dengan kontrol positif (P2).
Adanya  peningkatan  bobot  ovarium dan  uterus  tikus  dikarenakan  potensi estrogenik  dalam  herba  kemangi  yang mengandung  senyawa  steroid  berupa stigmasterol  berperan  sebagai  prekursor hormon seks steroid, salah satunya adalah estrogen.  Hal  ini  disebabkan  adanya kemiripan struktur senyawa steroid dengan
0.403 a
1.027 b 0.969 b 1.012 b 1.093 b 1.063 b 1.091 b 1.443 b 0 0.5 1 1.5 2 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

## Bobot Total Ovarium-Uterus
estrogen (Ismadi, 1993). Menurut Nikov et al .,  (2000)  dalan  keadaan  tidak  adanya hormon  estrogen,  reseptor  estrogen  akan bersifat inaktif dan berada di dalam inti sel target  dan  berikatan  dengan  reseptor estrogen  (RE)  yang  berada  di  inti  dan menyebabkan  reseptor  estrogen  menjadi aktif.  Kompleks  ikatan  estrogen-reseptor dengan estrogen  responsive  element akan menginduksi terjadinya transkripsi mRNA. mRNA kemudian akan ditranslasi menjadi protein  yang  akan  menghasilkan  respons estrogenik pada sel target dan menginduksi produksi  serta  proliferasi  sel-sel  ovarium yang  akan  meningkatkan  masa  ovarium. Penambahan  bobot  ovarium  diperkirakan berasal  dari  sel-sel  mesenkim  dan  sel-sel folikular ovarium disertai dengan peningkatan  kadar  cairan  dalam  ovarium, cairan ini berupa transudat dari serum dan mukopolisakarida  yang  disekresikan  oleh sel-sel  granulosa.  Menurut  Hafez  (1980), pada  tikus  yang  sedang  estrus  terdapat akumulasi  cairan  di  dalam  lumen  uterus yang  akan  meningkatkan  berat  basah organ.
Senyawa  estrogenik  selain  steroid (stigmasterol),  anetol  dan  boron,  senyawa flavonoid ikut berperan sebagai estrogenik. Satyaningtijas et  al .,  (2014)  menyebutkan bahwa  flavonoid  yang  bersifat  estrogenik akan  menduduki  reseptor  estrogen  yang berada di dalam tubuh. Lain halnya dengan steroid yang merupakan prekursor hormon testosteron yang kemudian diubah menjadi estrogen yang didukung dengan pernyataan dari Syarif, et al ., (2007) yang menyatakan  bahwa  golongan  senyawa fitoestrogen  yang  termasuk  kedalam estrogenik nonsteroid antara lain flavonoid,  isoflavon  (misalnya  genistein) dan  kumestan  yang  mekanisme  kerjanya menyerupai  senyawa  estrogenik  sintetik nonsteroid yaitu dietilstilbestrol (DES).
Berdasarkan  hasil  penelitian  secara menyeluruh  perlakuan  pemberian  sediaan konsentrat  ekstrak  etanol  96%  herba kemangi  dapat  meningkatkan  pengaruh
estrogenik  terhadap  lama  siklus  estrus, tingkat vaskularisasi ovarium-uterus, bobot  total  ovarium-uterus  dan  ketebalan uterus  dibandingkan  dengan  sediaan konsentrat  ekstrak  etanol  70%  herba kemangi,  sehingga  ekstrak  etanol  96% dapat menurunkan dosis pemakaian daripada esktrak etanol 70%. Hal ini dapat diduga  flavonoid  lebih  banyak  tertarik pada  pelarut  etanol  96%  dibandingkan pelarut etanol 70% seperti penelitian yang dilakukan  oleh  Lusiana  (2014)  yang menyatakan  bahwa  jenis  pelarut  etanol 96%  dapat  menyari  senyawa  flavonoid lebih banyak dibandingkan dengan pelarut etanol  70%.  Demikian  halnya  dengan tertariknya  senyawa  estrogenik  selain flavonoid.  Maka  dapat  dikatakan  bahwa etanol  96%  merupakan  jenis  pelarut pengekstraksi yang terpilih untuk pembuatan  ekstrak  sebagai  bahan  baku sediaan herbal medicine .

## SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
1. Pemberian  sediaan  konsentrat  ekstrak etanol 96% herba kemangi  memberikan pengaruh  yang  sangat  nyata  dalam meningkatkan aktivitas estrogenik pada tikus putih betina.
2. Sediaan  konsentrat  ekstrak  etanol  96% herba  kemangi  0,7g/200g  BB  (P6) memiliki  pengaruh  yang  sangat  nyata terhadap  lama  siklus  estrus,  tingkat vaskularisasi, peningkatan bobot ovarium-uterus  dibandingkan  kontrol negatif (P1) dan memperpanjang siklus estrus dibandingkan kontrol positif (P2) sehingga  memiliki  pengaruh  relatif sama dengan kontrol positif (P2).
3. Sediaan  konsentrat  ekstrak  etanol  96% herba  kemangi  0,7g/1mL/200g  BB merupakan dosis efisien yang memberikan pengaruh yang relatif sama dengan kontrol positif (P2) dan sediaan konsentrat  ekstrak  etanol  96%  herba kemangi  0,9g/1mL/200g  BB  adalah dosis  efektif  yang  memiliki  pengaruh
sangat  nyata  dibandingkan  semua perlakuan  terhadap  lama  siklus  estrus, tingkat vaskularisasi, peningkatan bobot ovarium-uterus.

## Saran
1. Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut mengenai  aktivitas  folikel  melalui pembuatan preparat histologis ovarium.
2. Perlu dilakukan penelitian teknik formulasi sediaan farmasi untuk mendapatkan  dosis  optimal  dalam bentuk  konsentrat  ekstrak Ocimum americanum L.

## DAFTAR PUSTAKA
Anatria, K. 2011. Kajian Potensi Estrogenik  Ekstrak  n-Heksan  Herba kemangi    pada  Tikus  Putih  Betina ( Rattus norvegicus ). Skripsi . Universitas Pakuan. Bogor. Badzaid A. 2003. Endokrinologi
Ginekologi . Media Aesculapius. FK- UI. Jakarta.
Buchanan,  D.L.,  T.  Kurita,  J.A  Taylor, D.B.  Lubahn,  G.R.  Cunha  dan  P.S. Cooke.  1998.  Role  of  stromal  and epithelial  estrogen  receptors  in vaginal epithelial proliferation, stratification and cornification.
Journal  of  Endocrinology .  139: 4345-4352.
DepKes  RI.  1995. Materia  Medika Indonesia. Jilid VI. Direktorat
Jenderal  Pengawasan  Obat  dan
Makanan. Jakarta
______.  2000. Parameter  Standar  Umum
Ekstrak  Tumbuhan  Obat .  Direktorat
Jenderal  Pengawasan  Obat  dan
Makanan. Jakarta
______. 2008. Farmakope Herbal Indonesia. Edisi I. Direktorat Jenderal  Pengawasan  Obat  dan
Makanan. Jakarta
Effendi, E.M., H. Maheswari., dan Listya, M. 2009. Aktifitas Estrogenik Ekstrak  Etanol  70%  Herba  kemangi
pada Tikus Putih (Rattus norvegicus)
Betina  Pre-Menopause . Fitofarmaka 1(1): 11-17.
Gunawan,  D.  2004. Ramuan  Tradisional
Untuk  Keharmonisan  Suami  Istri. Penebar Swadaya. Jakarta.
Guyton,  A.C.  1994. Buku  Ajar  Fisiologi Kedokteran. Edisi VII. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Hal:  330- 331, 334-335.
Hafez, E.S.E. 1980. Reproduction In Farm Animals .  6 th ed.  Lea  &  Febiger. Philadephia.
Ismadi, M. dan S.D.  Ismadi Dalam: R. R.
Montgomery,  T.W.  Conway  dan A.A. Spector. 1993. Biochemistry: A Case-Oriented Approach . UGM Press. Yogyakarta. Hal: 1377.
Khoirani, N. 2013. Karakterisasi Simplisia dan  Standarisasi  Ekstrak  Etanol Herba  kemangi  .  Skripsi.  Program
Studi Farmasi. UIN Syarif Hidayatullah. Jakarta. Lusiana,  A.,  O  D  Rice  Disi  dan  Idha  K. 2014. Pengaruh Jenis Pelarut Pengekstraksi Terhadap Kadar Sinensetin  Dalam  Ekstrak  Daun
Ortosiphon Stsmineus Benth. Journal Planta Husada. (2)1: 1-4.
Madalina, M., F.P. Carmen and P. Mitrut.
2009. Correlations between gonadotropins level, vaginal cytology  and  menopausen  vessel- active  phenomena . craiova. Journal Morphology and Embryology. 50(4):
631-637. Markham, K. R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid (Terjemahan). Penerbit ITB. Bandung.
Neal, M.J. 2006. At a Glance Farmakologi Medis. Erlangga. Jakarta. Hal. 74-75.
Nikov, G.N., M. Eshete, S. R.V Rajnarayan dan W.L. Alworth. 2001.
Interactions  of    synthetic  estrogens with  human  estrogen  receptors . Journal of Endocrinology. 170: 137- 145.
Raharjo, H. Pengaruh diet vegan terhadap insiden  terjadinya  kanker  payudara. 2009. Jurnal Kesehatan . 1(2): 1-9. Rugh,  R.  1968.  The Mouse  Reproduction and Development . Burgess
Publishing  Company.  Menneapolis. USA Satyaningtijas,  A.S.,  H.  Maheswari,  P. Achmadi,  W.A.  Pribadi,  S.  Hapsari, D.  Jondriatno,  I.  Bustamin  dan  B. Kiradani.  2014.  Kinerja  Reproduksi Tikus  Bunting  Akibat  Pemberian Ekstrak  Etanol  Purwoceng. Jurnal Kedokteran Hewan . 8 (1): 35-37. Syarif,  A., Ascobat,  P.,  Estuningtyas,  A., Setiabudy, R., Setiawati, A.,
Muchtar, A. et al ., 2007. Farmakologi  dan  Terapi .  Edisi  5. Departemen Farmakologi
dan
Terapeutik.  Fakultas  Kedokteran. Universitas Indonesia. Jakarta.
Vinca, M., W.R. Komar dan N. As’ari N.
2004. Telaah Fitokimia Daun Kemangi  ( Ocimum  americanum L.). Sekolah Farmasi ITB. Bandung. Wicaksono , A.  W.,  I.G.N.G.  Trilaksana
dan D.N.D.I. Laksmi. 2013.
Pemberian  Ekstrak  Daun  Kemangi ( Ocimum basilicum ) Terhadap Lama Siklus  Estrus  Pada  Mencit .  Jurnal Indonesia  Medicus  Veterinus. 2(4). 369-374.