JKPK (JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA) , Vol. 2, No. 2, Tahun 2017
Program Studi Pendidikan Kimia  Universitas Sebelas Maret https://jurnal.uns.ac.id/jkpk
Hal. 97-102 ISSN 2503-4146 ISSN 2503-4154 (online)

## PENENTUAN KONDISI OPTIMUM AMOBILISASI XILANASE DARI Trichoderma viride PADA MATRIK ZEOLIT
TERAKTIVASI ASAM
Determination of Immobilization Optimum Conditions of Trichoderma viride ’s Xilanase on Acid-Activated Zeolite Matrix
Sutrisno 1,2* , Anna Roosdiana 1 , Sasangka Prasetyawan 1,2 dan Intan Permata Sari 1
1 Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya Jl. Veteran, Malang, Jawa Timur, Indonesia 65145
2 Kelompok Peneliti “Low Cost & Automated Method and Instrumentation Analysis (LCAMIA)”, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya,
Jl. Veteran, Malang, Jawa Timur, Indonesia 65145
* Untuk Korespondensi, Telp/Fax : 085649661044 , email: ris_mc@ub.ac.id Received: June 25, 2017 Accepted: August 31, 2017
Online Published: September 7, 2017
DOI : 10.20961/jkpk.v2i2.11912

## ABSTRAK
Xilanase  adalah  enzim  yang  menkatalisis  reaksi  hidrolisis  xilan  menjadi  xilosa.  Enzim bebas hanya dapat digunakan sekali, oleh karena itu perlu dibuat dalam bentuk amobil. Penelitian ini  bertujuan  untuk  menentukan  kondisi  optimum  amobilisasi  xilanase    menggunakan  zeolite teraktivasi  asam.  Amobilisasi  xilanase  dilakukan  pada  variasi    waktu  pengocokan  (1  -  5)  jam , variasi konsentrasi xilanase (2 - 4 mg/mL) menggunakan 0,1 g zeolit pada temperatur ruang dan kecepatan  pengocokan  100  rpm.  Jumlah  xilanase  yang  teradsorpsi  pada  zeolite  ditentukan secara  spektrofotometri  menggunakan  reagen  Biuret  dan  aktivitas  xilanase  amobil  yang terbentuk  ditentukan  secara  spektrofotometri  menggunakan  reagen  DNS.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  kondisi  optimum  amobilisasi  xilanase  pada  zeolite  tercapai  pada  waktu pengocokan  3  jam  dan  konsentrasi  xilanase  3,5  mg/mL  dengan  xilanase  teradsorbsi  sebesar 156,5 mg/g zeolit dan aktivitas 26,67 unit.
Kata kunci: metode adsorpsi, aktivitas, gula pereduksi, xilo-oligosakarida

## ABSTRACT
Xylanase is an enzyme that catalyzes the reaction of xylan hydrolysis into xylose. The free enzyme can be used only once, therefore it needs to be made in the form of immobilization. This study aims to determine the optimum conditions for immobilization of xylanase using an acid- activated zeolite. The xylanase immobilization was performed on variations of shaking time (1-5) hours, variation of xylanase concentration (2 - 4 mg / mL) using 0.1 g zeolite at room temperature and a shaking rate of 100 rpm. The amount of xylanase adsorbed on the zeolite was determined by spectrophotometry using the Biuret reagent and the immobilized xylanase activity formed was determined  spectrophotometrically  using  a  DNS reagent  The  results  showed  that the  optimum condition of xylanase immobilization at zeolite was achieved at 3 hrs shaking time and xylanase concentration 3.5 mg / mL with xylanase adsorbed of 156.5 mg/g zeolite and activity 26.67 units.
Keywords : adsorption methods, activity, reducing sugars, xilo-oligosaccharides

## PENDAHULUAN
Xilanase  merupakan  enzim  ekstra- seluler  yang  mampu  meningkatkan  reaksi hidrolisis  ikatan  β-1,4  glikosidik  pada  xilan menjadi  xilosa  dan  xilo-oligosakarida[1]. Xilanase  dihasilkan  oleh  sejumlah  mikro- organisme  seperti  bakteri,  ragi  dan  jamur. Xilanase yang dihasilkan dari jamur Trichoderma  inhamatum stabil  pada  tem- peratur  kurang  dari  55 o C,  dan  memiliki temperatur optimum 50 o C. Stabil pada pH 4,0 - 8,0 dan memiliki pH optimum 5,0  - 5,5 [2]. Xilanase  memiliki  peranan  penting  dalam dunia industri, seperti industri kertas, farmasi, pakan dan pangan.
Penggunaan  enzim  dalam  bentuk bebas  memerlukan  biaya  mahal  karena enzim mudah rusak dan sulit dipisahkan dari campuran  reaksi  sehingga  tidak  dapat digunakan secara berulang. Untuk menekan biaya dapat dilakukan dengan cara membuat enzim dalam bentuk amobil. Cara sederhana untuk  membuat  enzim  amobil  yaitu  dengan cara  menempelkan  enzim  pada  permukaan adsorben  [3,  suklha,2003].  Pada  penelitian ini  xilanase  ditempelkan  pada  permukaan zeolite  yang  telah  diaktivasi  dengan  HCl. Zeolit  adalah  mineral  dengan  struktur  Kristal aluminasilikat  yang  memiliki  struktur  tiga dimensi,  mempunyai  rongga  dan  saluran serta  mengandung  ion-ion  logam  seperti Na,K,Mg,Ca  dan  Fe  serta  molekul  air [4] . Zeolit tahan terhadap panas, selektif permukaan dan mudah dimodifikasi sehingga banyak  digunakan  sebagai  adsorben [5] .
Aktivitas  zeolite  alam  cenderung  rendah karena  masih  banyak  pengotor,  untuk  itu perlu dilakukan aktivasi.
Jumlah  xilanase  yang  teradsorpsi pada  permukaan  zeolite  dipengaruhi  oleh lama  kontak  dan  banyaknya  xilanase  yang digunakan  saat  amobilisasi.  Oleh  karena  itu kedua hal ini dipelajari.

## METODE PENELITIAN
T.  viride diperoleh  dari  Laboratorium Mikrobiologi  Jurusan  Biologi  FMIPA  Univer- sitas Brawijaya.
Bahan  kimia  yang  digunakan  dengan kualitas for  microbiology seperti  pepton, tepung  agar,  xilan,  kasein,  tepung  klobot jagung,  dan  kentang  (pasar  lokal).  Bahan kimia  lain  yang  digunakan  memiliki  kualitas pro analisis, antara lain asam oleat, dextrosa, asam  asetat  glasial,  zeolite,  CH 3 COONa, CaCl 2 .2H 2 O,BaCl 2 , KH 2 PO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 , MgSO 4 .7H 2 O,HCl, NaKC 4 O 6 H 4 , glukosa anhidrat,  Na 2 SO 3 ,  kristalin  fenol,  asam dinitrosalisilat, NaOH.
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini antara lain seperangkat alat gelas, neraca analitik  (Mettler  Toledo  AL  204),  neraca analitik  (Bosch  PE  620),  laminar  air  flow, inkubator (Heraeus Type B 5042), pH meter (Inolab  WTW),  penangas  air  (Memmert  W 200),  autoklav  (LS-C35L),  shaker  (Edmund Buhler  SM  2524B),  sentrifuse  dingin  (Juan MR  1889),  pemanas  listrik  (Janke-Kunkel), Spectronic  Genesys  20  (Thermo  Scientific Genesys 20), kuvet, lemari pendingin, jarum ose, ayakan 120 mesh, 150 mesh, pengaduk magnet,  oven,  alumunium  foil,  kapas  steril, kantong  selofan,  pH  universal,  dan  kertas saring Whatman no.40.

## 1. Produksi Xilanase
T.  viride yang  telah  ditumbuhkan dalam  media  padat  agar  miring  selama  144 jam (pH 5 dan 30 o C) disuspensikan ke dalam 10  mL  akuades  steril  menggunakan  jarum ose.  Suspensi  diambil  sebanyak  2  mL  dan ditanam  pada  13  mL  media  cair  steril. Diinkubasi  dengan  shaker  kecepatan  putar 150  rpm  pada  temperatur  ruang  selama  36 jam.  Inokulum T.  viride ditumbuhkan  dalam 150 mL media pertumbuhan pada temperatur kamar, digoyang dengan kecepatan 150 rpm hingga  jam  ke-60.  Media  hasil  fermentasi ditambahkan  15  mL  buffer  asetat  pH  5  dan disentrifugasi  dengan  kecepatan  3000  rpm selama  30  menit,  temperatur  4 o C.  Super- natan  yang  diperoleh  merupakan  ekstrak kasar  xilanase.  Ekstrak  kasar  xilanase dimurnikan  menggunakan  amonium  sulfat dengan  tingkat  kejenuhan  40-80%,  di- lanjutkan  dengan  dialisis  menggunakan kantong  selofan.  Xilanase  hasil  pemurnian diuji kadar protein dan aktivitasnya.

## 2. Uji kadar protein
Larutan    enzim  sebanyak  2  mL ditambah  8  mL  reagen  Biuret  dan  2  mL larutan kasein 5000 ppm, kemudian dikocok dan  diinkubasi  selama  30  menit  pada temperatur  50°C.  Diukur  serapannya  pada panjang  gelombang  maksimum  kasein  (550 nm).  Kadar protein  diketahui dengan memplotkan  nilai  serapan  pada  persamaan regresi  kurva  baku  kasein  yang  telah  dibuat sebelumnya.

## 3. Penentuan aktivitas xilanase [6,7]
Penentuan aktivitas xilanase dilakukan dengan cara mereaksikan 1 mL substrat xilan
1%  (b/v)  yang  telah  diinkubasi  pada temperatur 60 o C selama 15 menit dengan 1 mL enzim, 1 mL buffer asetat pH 5 dan 1 mL air  bebas  reduktor.  Campuran  diinkubasi pada  temperatur  60 o C  selama  55  menit selanjutnya dipanaskan dalam penangas air mendidih  selama  15  menit  dan  didinginkan dengan  air  mengalir,  ditambahkan  2  mL reagen  DNS  dan  dipanaskan  pada  100°C selama  15  menit  kemudian  didinginkan dengan air mengalir. Larutan yang dihasilkan diukur serapannya pada panjang gelombang 495  nm.  Kadar  gula  pereduksi  yang dihasilkan  selama  reaksi  ditentukan  dengan cara  mengeplotkan  serapan  yang  diperoleh ke dalam persamaan regresi kurva baku gula pereduksi yang telah dibuat sebelumnya.
Satu  unit  aktivitas  enzim  bebas diartikan sebagai 1 μg xilosa yang dihasilkan per menit per mL enzim. Pada enzim amobil, satu unit aktivitas amobil diartikan sebagai 1 μg xilosa yang dihasilkan per menit per gram enzim amobil.

## 4. Amobilisasi xilanase pada matrik zeolit

## a.  Aktivasi Zeolit
Zeolit  terlebih  dahulu  dikeringkan dalam  oven  pada  tempertur  105oC.  Zeolit yang  sudah  dioven  dimasukkan  kedalam Erlenmeyer  250  mL.  Kemudian  ditambah- kan 200 mL larutan HCl 0,4 M dan dikocok dengan  shaker  pada  temperatur  ruang selama 4 jam dengan kecepatan pengocokan  100  rpm.  Kemudian  zeolit disaring dengan kertas Whatman no. 40 dan dicuci  dengan  akuades  hingga  pH  filtrat netral.  Setelah  itu  zeolit  dikeringkan  pada temperatur  105oC  hingga  berat  konstan. Zeolit  yang  telah  diaktivasi  kemudian
dikalsinasi pada temperatur 500 oC selama
4 jam.
b.  Penentuan waktu pengocokan
optimum amobilisasi xilanase
Xilanase hasil pemurnian dipipet 2 mL, lalu  ditambahkan  buffer  asetat  pH  5  hingga volume 5 mL. Larutan enzim dimasukkan ke dalam  erlenmeyer  50  mL  yang  berisi  0,1 gram  zeolite  teraktivasi  HCl.  Campuran diinkubasi  dalam  shaker  pada  temperatur ruang dengan kecepatan 100 rpm selama (1, 2,  3,  4,  5)  jam,  kemudian  disaring  dengan kertas  saring Whatman no.  40.  Xilanase amobil  yang  didapat  diuji  aktivitasnya  dan filtrat diukur kadar proteinnya.
c.  Penentuan konsentrasi xilanase optimum amobilisasi xilanase
Tahapan  amobilisasi  pada  variasi konsentrasi enzim dilakukan seperti langkah amobilisasi variasi lama pengocokan.
Perbedaannya  terletak  pada  jumlah  enzim hasil  pemurnian  yang  digunakan  yaitu  (2,0; 2,5;  3,0;  3,5;  dan  4,0)  mg/mL.  Campuran diinkubasi selama waktu pengocokan optimum  dalam  shaker  dengan  kecepatan 100 rpm. Xilanase amobil  yang didapat  diuji aktivitasnya dan filtrat diukur kadar proteinnya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Penentuan Waktu Pengocokan Optimum
Pada  penelitian  ini  ditentukan  kondisi optimum amobilisasi xilanase meliputi waktu pengocokan optimum dan konsentrasi xilanase optimum. Waktu pengocokan optimum  adalah  waktu  yang  diperlukan enzim  untuk  berinteraksi  dengan  matriks.
Pengocokan  akan  menyebabkan  laju  difusi xilanase menuju matriks akan semakin cepat, sehingga  kesetimbangan  adsorpsi  cepat tercapai.  Waktu  pengocokan  optimum  di- tentukan dengan cara mengukur banyaknya xilanase  yang teradsorpsi  pada matrik zeolit dan aktivitas xilanase amobil yang terbentuk pada  variasi  waktu  pengocokan.  Hasil  yang diperoleh ditampilkan pada Gambar 1 dan 2
Gambar  1.  Pengaruh  waktu  pengocokan terhadap jumlah xilanase teradsorpsi
Gambar  1.  menunjukkan  bahwa  se- cara  umum  terjadi  peningkatan  jumlah xilanase teradsorpsi secara signifikan seiring bertambahnya  waktu  pengocokan  sampai  3 jam dan setelah itu terjadi sedikit penurunan, ini  menunjukkan  bahwa  interaksi  antara xilanase  dengan  matrik  zeolite  memerlukan waktu  dan  pada  3  jam  waktu  pengocokan seluruh  permukaan  zeolite  dipenuhi  oleh xilanase.  Penurunan  tidak  signifikan  terjadi pada waktu pengocokan melebihi 3 jam, hal ini  menunjukkan  bahwa  pada  3  jam  waktu pengocokan  sudah  terjadi  kesetimbangan adsorpsi,  sehingga  permukaan  zeolite  tidak mampu  lagi  mengadsorpsi  xilanase  dalam jumlah lebih banyak.
6.0 6.5 7.0 7.5 0 2 4 6 Ju m lah xil an as e t e rad so rp si (m g) Waktu pengocokan (jam)
Waktu  pengocokan  optimum  amo- bilisasi xilanase adalah waktu yang diperlukan  agar  xilanase  amobil  yang terbentuk  mempunyai  aktivitas  maksimum. Oleh  karena  itu  untuk  menentukan  waktu pengocokan optimum perlu juga diperhatikan aktivitas xilanase amobil yang terbentuk.
Gambar  2.  Pengaruh  waktu  pengocokan terhadap aktivitas xilanase amobil
Dari  Gambar  2.  menunjukkan  bahwa grafik  aktivitas  xilanase  amobil  pada  variasi waktu  pengocokan  mempunyai  profil  sama dengan  grafik  jumlah  xilanase  teradsorpsi. Hal ini menunjukkan aktivitas xilanase amobil sebanding  dengan  jumlah  xilanase  amobil dan  amobilisasi  dengan  metode  adsorpsi memungkinkan xilanase amobil masih dapat bekerja  dengan  baik  untuk  mengkatalisis reaksi.  Dari  hasil  penelitian  menunjukkan bahwa waktu pengocokan optimum amobilisasi  xilanase  terjadi  pada  3  jam pengocokan dengan jumlah xilanase teradsorpsi  sebanyak  73,70  mg/g  zeolit  dan aktivitas xilanase amobil 22,677 unit
Penentuan konsentrasi xilanase optimum  amobilisasi  dilakukan  dengan mengukur  jumlah  xilanase  yang  teradsorpsi pada  matriks  dan  aktivitas  xilanase  amobil
yang  terbentuk  pada  variasi  konsentrasi xilanase dengan waktu pengocokan optimum yang  telah  diketahui.  Data  penelitian  yang diperoleh  ditampilkan  pada  Gambar  3  dan Gambar 4.
Gambar  3.  Pengaruh  konsentrasi  xilanase terhadap jumlah xilanase teradsorpsi
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa pada  waktu  pengocokan  optimum  pening- katan konsentrasi xilanase  saat amobilisasi menyebabkan jumlah xilanase yang teradsorpsi  pada  matriks  meningkat.  Kon- sentrasi  xilanase  optimum  adalah  kon- sentrasi  xilanase  saat  xilanase  amobil  yang dihasilkan mempunyai aktivitas maksimum.
Gambar  4.  Pengaruh  konsentrasi  xilanase terhadap aktivitas xilanase amobil
20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 0 2 4 6 A kt iv itas xi lan ase (u n it) Waktu pengocokan (jam) 0 5 10 15 20 1.5 2.5 3.5 Ju m lah xi lan ase te rad sor p si (m g)
Konsentrasi xilanase (mg/mL)
20 22 24 26 28 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 A kt iv itas xi lan ase (u n it)
Konsentrasi xilanase (mg/mL)
Dari  data  diketahui  bahwa  jumlah xilanase  yang teradsorpi paling tinggi terjadi saat  konsentrasi  xilanase  3,5  mg/mL.  Pada matriks  zeolite  teraktivasi  asam  besarnya aktivitas  xilanase  amobil  sebanding  dengan jumlah  xilanase  yang  teradsorpsi  pada matrik.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  kerja enzim  tidak  mengalami  gangguan  dan subtrat  mudah  berinteraksi  dengan  sisi  aktif enzim. Konsentrasi xilanase optimum dicapai pada  saat  aktivitas  xilanase  amobil  mak- simum.  Dari  Gambar  3  dan  4  diketahui bahwa  konsentrasi  xilanase  optimum  terjadi saat konsentrasi xilanase 3,5 mg/mL dengan jumlah xilanase teradsorp 156,5 mg/mg zeolit dan aktivitas enzim amobil 26,67 unit.

## KESIMPULAN
Waktu  pengocokan  dan  konsentrasi xilanase  berpengaruh  terhadap jumlah xilanase  yang  teradsorpsi  dan  aktivitas xilanase amobil. Kondisi optimum amobilisasi xilanase pada matrik zeolite teraktivasi asam dicapai  pada  waktu  pengocokan  3  jam  dan konsentrasi  xilanase  3,5  mg/mL  dengan jumlah xilanase teradsorpsi 156,5 mg/g zeolit dan aktivitas 26,67 unit.

## DAFTAR RUJUKAN
[1]  Gaur,  R.,Tiwari,  S.,  Rai,  P.  and Srivastava, V., 2015,  Isolation, Produc- tion,  and  Characterization  of  Thermo- tolerant Xylanase from Solvent Tolerant
Bacillus vallismortis RSPP-15, International Journal of Polymer Science, Volume 2015. [2]  Silva, L.A.O., Terrasan, C.R.F., Carmona,  E.C.,  2015,  Purification  and characterization  of  xylanases  from Trichoderma inhamatum, Electronic
Journal of Biotechnology, 18, 307 - 313
[3]  Suklha,  S.  S.,  Dorris  K.  L.,  Suklha  A., dan Margrave J. L., 2003, Adsorpstion of Chromium  from  Aqueous  Solution  by Maple  Sawdust, Journal  Haz  Mater ., Vol. 12, hal. 1-3.
[4]  Cheetam,D., A., 1992,Solid State Compound,Oxford university press, 234-237.
[5]  Astarina,  N.,  2008,Zeolitisasi  Mineral Kaolin  dengan  Metoda  Peleburan, Skripsi, Universitas Brawijaya, Malang.
[6]  Isil,  S.  and  N.  Aksoz,  2005,  Xylanase Production from Trichoderma harzianum 1073  D3 with  Alternative  Carbon  and Nitrogen  Sources , Brazilian  Journal  of Biology and Technology 43(1) 37-40.
[7]  Huang, X., Ge, J., Fan, J., Chen, X., Xu, X., Li, J., Zhang, Y. And Zhou, D., 2013, Characterization  and  optimization  of xylanase and endoglucanase production by Trichoderma  viride HG  623  using response  surface  methodology  (RSM), African Journal of Microbiology Research, Vol. 7(36), pp. 4521 - 4532