J i I ~ i
! 1 I i
1 I I ! 1 ! I !
I 1
I I I I i ! I I I

## EKSPLORASI MIKROB PENGGUNA METANOL DARI TANAH DAN KOTORAN TERNAK, SEBAGAI SUMBER PROTEIN SEL TUNGGAL

## Exploration of Methanol Utilizing Microbes From Soil and
Dung, as Source of Single Cell Protein

## Fahrizal Hazra
Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Jl. Meranti, Kampus IPB  Darmaga, Bogor 16680

## ABSTRACT
The  objectives  of this  research  were  to  explore  methanol  utilizing  microbes  by  isolation.  selection  and collection  of methanol utilizing microbes from soil and dung. further it will be produced as single cell protein.
The  experiment covers two steps.  i.e.  I)  Sampling of soil and dungfrom  Bogor.  Cianjur and Karawang. 2) Laboratory activity.  consisted of:  isolation.  selection.  identification and collection.  The  microbes  were  isolated by using the  medium  of Tani.  et al (/982) and its  modification.  whereas the  methanol utilizing microbes were  identified by using standard method of Bergeys Manual of Determinative Bacteriology edition Ijh (/994) and Balow et al. (/99 I).  The  microbes were then proliferated by using  Medium  of Mimura  et al.  (1978)  and its  modification.  Furthermore  the  cell  were  harvested  and  measured its nitrogen  content.  The  collection  of methanol  utilizing  microbes  was  conducted  with  the  standard  procedure  of soil microbiology.
This research indicated that from 72 samples of soil and dung were  obtained 56 isolates of methanol utilizing microbes that diverse  in  number and types.  Most  of methanol utili:ing microbes were  isolated from  soil and dung by methanol medium 1% and /.5 % in pH 5 and 7.  From 56 isolates were chosen 12 isolates to be identified and made as a data base.  and then upt as  culture  collection  at  Indonesian  Center for  Biodiversity  and  Biotechnology  (ICBB).  Laboratory  of Microbiology and Environmental  Biotechnology  PPLH.  and Laboratory  of Soil Biology.  IPB.  From  the 12  isolates.  2  isolates  were  classified into  methylotrophic  group  and they  have  big potency to  be  exploited in  producing  single  cell protein.  i.e.  MelhylococCJIS capsulatus and Acidomonas methanolica.  Between 2 isolates.  Methylococcus capsulatus (T2M 1 P 1 Cianjur)  have a big potency to  be  used as  a  source  of single  cell protein.  due  to  their  high  content  of protein.  i.e. 6.4%. Both  of the  microbes were  not pathogenic for human and animal.
Keywords:  Methanol.  Microbe.  Methylotrophic group.  Single Cell Protein (SCP)

## PE~l>AHULUAN

## Latar Belakang
Sumber  daya  alam  Indonesia  memiliki  potensi  yang besar untuk  dieksplorasi  mikrobnya.  Lahan-Iahan  pertanian maupun non pertanian serta berbagai sumber lainnya seperti Iimbah  (kotoran  hewan),  belum  banyak  diketahui  dan dimanfaatkan  mikrobnya.  Metanol  merupakan  bahan  baku yang  banyak  digunakan  dalam  industri  fennentasi.  Hal  ini dikarenakan  metanol  memiliki  harga  yang  relatif murah, selain  itu  menurut  Snedecor  dan  Cooney  (1974)  metanol juga  memiliki  kemumian  yang  tinggi,  dapat  bereaksi dengan  air,  dan  dapat  digunakan  oleh  mikrob  tertentu sebagai  sumber  karbon.  Oleh  karena  itu  metanol  dapat dijadikan  sebagai  bahan  isolasi  mikrob  dari  berbagai sumber.
Mekanisme  penggunaan  (asimilasi  dan  disimilasi) metanol  oleh  mikrob  sangat  menarik  untuk  diteliti  lebih lanjut.  Pada  umumnya mikrob dapat menggunakan  metanol untuk  memproduksi  selnya.  Sel  mikrob  pengguna  metanol dapat  diproduksi  secara massal  sebagai  protein  sel  tunggal, yaitu  sel  mikrob  yang  tidak  patogen  dapat  dimanfaatkan sebagai sumber protein seperti  pakan temak.

## Tujuan Penelitian
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengeksplorasi  mikrob pengguna  metanol  dengan  cara  isolasi,  seleksi,  identifikasi dan  koleksi  mikrob tersebut dari  tanah dan  kotoran ternak. kemudian diproduksi  sebagai  protein set  tunggal.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  ini  dimulai  dengan  pengambilan  sampel berupa  tanah  dan  kotoran  temak  dari  Bogor,  Cianjur,  dan Karawang.  Mikrob  yang  dapat  menggunakan  metanol diisolasi  dari  semua  sampel  dengan  metode "plate  count" dengan  teknik "enrichment  culture",  kemudian  diinkubasi pada  suhu  30°C  dengan  seri  pengencerannya.  Medium  A dan  B  dengan  moditikasinya  (Tabel  1)  digunakan  untuk mengisolasi  mikrob  (Tani et  al.,  1982).  Oengan  demikian mikrob  diisolasi  dalam  4  medium  yang berbeda, yaitu  : Medium Al  (metanol  1 % dengan  pH  5), A2 (metanol  1.5% dengan pH  5), B 1 (metanol  1 % dengan  pH  7), dan Medium B2  (metanol  1.5% dengan  pH  7).
Hazra,  F.  2005.  Eksplorasi  mikrob  pengguna  metanol  dari  tanah  dan  kotoran  ternak,  sebagai  sumber  protein  sel  tunggal. J. TtmIIh 71 Lingk., 7(2):  71-75
I 1 i ~ I I ! , j I i J j 1, ! I j
I I I I I i I
I j I ~ I I i I I i I
I

## Eksplorasi Mikrob  Pengguna Metanol (F. Hazra)
Sampel  sebanyak  10  gram  dimasukkan  ke  dalam  90 ml  medium  A  dan  B  pada  erlenmeyer  500  ml  dan diinkubasi  dengan cara dikocok selama 4-7  harL  Kemudian dengan  teknik  "enrichment culture"  akan  terisolasi  mikrob yang  dapat  menggunakan  metanol  sebagai  sumber  karbon satu-satunya.  Penghitungan jumlah  mikrob  dengan  metode hitungan  cawan  ("plate  count")  dengan  masa  inkubasi  7 harLKultur  murni  diperoleh  dari  seri  pengenceran  dan dicawankan  berulang pada  medium  A  dan  B  dengan penambahan 2% agar.
Seluruh hasil isolasi diidentifikasi berdasarkan jenisnya.  Mikrob  diidentifikasi  dengan  menggunakan "Bergeys  Manual  of  Determinative  Bacteriology"  (1994) edisi  ke-9  dari  sifat  morfologi  dan  fisiologi  yang  penting untuk  mikrob  pengguna  metanol  dan  tambahan  acuan lainnya dari Balows et al. (1991).
Mikrob  ditumbuhkan  pada  medium  yang  baik  untuk pertumbuhannya  yang  dikembangkan  oleh  Mimura et al.
(1978).  Komposisi  per Iiternya adalah : (NH4hHP04 3.0 g, Urea 10 g,  KH2P04 2.0 g,  K2HP047.0 g,  MgS04.7H 2 0  0.5 g, FeS04.7H20 0.03  mg, MnCh.4H 2 0  0.04 mg, NaCI  0.1  g, Yeast  extract  1  g,  Metanol  16  ml,  dan  pH  dibuat  menjadi 7.0.  "Crude  protein"  selnya  dianalisis  dengan  metode Kjeldahl dengan mengukur total nitrogennya.
Bakteri  yang  dapat  menggunakan  metanol  sebagai sumber  karbon  satu-satunya  disimpan  (koleksi)  dengan metode  standar  penyimpanan  bakteri.  Koleksi  bakteri disimpan  pada "culture  collection" di  ICBB,  PPLH-IPB dan  Laboratorium  Bioteknologi  Tanah,  Fakultas  Pertanian IPB,  Bogor.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi
Isolat  yang  dihasilkan  pada  inkubasi  tahap  awal beragam  dan  terdiri  dari  beberapa  mikrob  yang  belum
diketahui  jenisnya.  Sebanyak  56  isolat  berhasil  diisolasi dari  72  sampel  yang  berasal  dari  tanah  dan  kotoran  ternak. Masing-masing  sam pel  berasal  dari  lokasi  yang  berbeda. Sembilan  belas  isolat  berasal  dari  Bogor,  16  isolat  dari Cianjur, dan 21  isolat berasal dari  Karawang.
Data jumlah  mikrob  yang  dihasilkan  beranekaragam, tergantung  dari  komposisi  medium  dan  asal  sampel  yang digunakan.  Medium  isolasi  yang  digunakan,  yaitu  medium A  dan  B  yang  dimodifikasi  (Tani et al., 1982).  Pada medium  tersebut  metanol  dengan  komposisi  yang  berbeda- beda  digunakan  oleh  mikrob  sebagai  sumber  karbon  satu- satunya.
Sel memperoleh energi dari nutrien melalui serangkaian  reaksi  kimiawi,  beberapa  diantaranya  adalah proses  oksidasi.  Metanol  dioksidasi  dengan  bantuan  enzim metanol  dehidrogenase  menjadi  formaldehida,  kemudian dikonversi  menjadi  asam  format  dan  sebagai  hasil  akhir terbentuk CO2 (Gam bar 1).
Selama  oksidasi,  energi dilepaskan  dan  dapat terbentuk  ikatan-ikatan  kimiawi  kaya  energi  (A TP)  untuk menyimpan energi yang dilepaskan itu.  Data jumlah mikrob yang dihasilkan dapat digunakan sebagai "data base" untuk penelitian  selanjutnya.  Bila  digambarkan  dalam  bentuk grafik,  jumlah  mikrob  dari  masing-masing  lokasi  dapat dilihat pada Gambar 2, 3, dan 4.
Berdasarkan  jenis  sampel  yang  digunakan,  jumlah mikrob  terbesar  untuk  lokasi  Bogor  terdapat  pada  kotoran kuda  (di  dalam  medium  M2P2),  yaitu  sebesar  2.40  x  10 6 sel/ml,  sedangkan  untuk  jumlah  mikrob  terkecil  terdapat pada  kotoran  kambing  (di  dalam  medium  MIP2),  yaitu sebesar 2.6 x  10 4 sel/ml. (Gam bar 2).
Pada  Gambar  3  dapat  terlihat  bahwa  medium  yang ditambahkan  kotoran  kambing  ke  dalamnya,  yaitu  medium M2P2  memiliki  jumlah  mikrob  terbesar  (1.20x10 6 sel/ml) dibandingkan  jenis  sam pel  lainnya.  Sebaliknya,  kotoran sapi  dalam  medium  MIPI  memiliki jumlah mikrob terkecil (8.1  x  10 4 sel/ml).
Tabel 1. Komposisi Medium A dan Medium B (Tani et al.,  1982)
Jenis Bahan
(NH4hHP04 KH 2 P0 4
MgS04.7H 2 0
CaCh.2H 2 0
FeS04.7H 2 0
ZnS04.7H 2 0
MnCI 2 .4H 2 0 CuS04.5H 2 0
Larutan vitamin Metanol Aquadest Medium A pH dibuat menjadi 7.0 Jumlah 3.0 g 4.0 g 0.2 g 20mg 20mg 5.0mg 2.0 mg 0.5  mg 0.1 ml 10  ml & 15  ml 1.000 ml Jenis Bahan (NH4hHP04 KH 2 P0 4 MgS04.7H 2 0 CaCI 2 .2H 2 0 FeS04.7H 2 0 ZnS04.7H 2 0 MnCh.4H 2 0
CuS04.5H 2 0
Larutan vitamin Metanol Aquadest Medium B pH dibuat menjadi 5.0 Jumlah 3.0 g 4.0 g 0.2 g 20mg 20mg 5.0mg 2.0 mg 0.5  mg 0.1 ml
IOml & 15  ml 1.000 ml
Komposisi dari  larutan vitamin: Biotin, 2 mg; Kalsium pantotenat,4oomg; Piridoksin-HCL, 400 mg;; Tiamin-HCL, 400 mg;  P-aminobenzoic acid, 200 mg; Folic acid, 2 mg; Inositol,  2 g; Nicotinic acid, 400 mg;  Riboflavin, 200 mg;  Aquadest  1.000 ml.
NAt(  .!ADH+H'
NA~ ~DH+H' CH)OH metanol dehidrogenase" HCHO ..  HCOOH  - - ..  CO 2
~
YbUI""-S-P
,Iycin< Allulosa-6-P Serin ! !
lalur riboulose-P lalur serin
Garnbar I. Skema Katabolisme  Metanol oleh  Bakteri Metilotrof(Doelle,  1981).
140 120 .a _ e... 100 ~E E'ij .ell) J9b E ... ::I  )( ...,- T1 T2 K1 K2 K3
Sampel K4 1 ILl M1P1 m M1P2 lSI M2P1 E:I M2P2
T1) Tanah Non Sawah T2) Tanah Sawah K1)  Kotoran Ayam K2)  Kotoran  Kambing K3)  Kotoran  Kuda K4)  Kotoran Sapi M1) Metanol1% M2) Metanol 1.5%
P1) pH 5 P2) pH 7
Garnbar 2.  Jumlah Rata-rata Mikrob Pengguna Metanol dari  Bogor.
300 250 b .... 200 )( .!r 150 e .... ~E ~1 100 .e - .!!! E ::I 50 ..., 0
Sampel
T1 T2 K1 K2 K3 K4 IOM1P1  imM1P2 ~M2P1 I§l3M2P21
T1) Tanah Non Sawah T2) Tanah Sawah K1) Kotoran Ayam K2) Kotoran Kamblng K3) Kotoran Kuda K4) Kotoran Sapi M1)  Metanol1% M2) MetanoI1.5% P1)  pH 5 P2)  pH 7
Garnbar 3.  Jumlah Rata-rata Mikrob Pengguna Metanol dari Cianjur.
200 ,Q ~ e ... ..L.. 150 ~E EQj ~ III 100 cu. E~ ::I >< ..... ~ 50 0
T1 T2 K1
K2 K4 K5 Sampel
T1) Tanah Non Sawah T2) Tanah Sawah K1)  Kotoran Ayam K2) Kotoran Kambing K4) Kotoran Sapl K5) Kotoran  Oomba M1)  Metanol1% M2) Metanol  1.5% P1) pH 5
P2) pH  7
1 81  M1P1  EI  M1P2 ~ M2P1 ra M2P21
Gambar 4.  lumlah Rata-rata Mikrob Pengguna Metanol dari Karawang.
PenguJlan Mikrob Sebagal Bahan Protein Sel Tunggal
Hasil  pengukuran  kadar  N  dan  protein  menunjukkan babwa  masing-masing  mikrob  memiliki  kadar  N  dan protein yang berbeda (TabeI3).
Diantara  keduabelas  spesies  terse but, Methylococous capsulatus dan Acidomonas methanolica memiliki  potensi yang  terbesar  untuk  diproduksi  sebagai  protein  sel  tunggal karena  dilaporkan  tidak  bersifat  pathogen  (Anthony,  1982 dan  Urakami et  al.. 1989),  sedangkan  mikrob  lainnya seperti Klebsiella  pneumonia mungkin  bersifat  patogen. Kedua  mikrob  tersebut  termasuk  kelompok  bakteri metilotrofik.  Dari  kedua  isolat  tersebut  yang  paling  besar produksi  protein  sel  tunggalnya  adalab Methylococous capsulatus (T2MIPI  Cianjur)  yaitu  6.4  %. Methylococous capsulatus melakukan  proses  asimilasi  karbonnya  melalui Iintasanljalur  RuMP.  Menurut  Anthony  (1982),  bakteri yang  demikian  merupakan  bakteri  yang  terbaik  untuk memproduksi  PST.  Penggunaan Protein  Sel  Tunggal  (PST) memiliki  arti  penting  dalam  meningkatkan  ketersediaan protein bagi  manusia dan temak.

## KESIMPULAN
I.  Sebagian  besar  mikrob  pengguna  metanol  dapat terisolasi  dari  tanab  dan  kotoran temak dengan  medium metanoll% dan  1.5% pada pH 5 dan pH  7.
2.  Dari  keragamannya  diperoleh "data  base" eksplorasi mikrob  pengguna  metanol  dari  berbagai  sumber, terutama dari keragaman jumlabnya.
3.  Terdapat  12  (dua  bel as)  isolat  yang  teridentifikasi dan yang  terpenting  adalah Acidomonas  methanolica dan Methylococous s capsulatus.
4.  Diantara  ke  dua  isolat  tersebut  yang  paling besar produksi  protein  sel  tunggalnya  adalah Methylococous capsulatus (T2MIPI  Cianjur) yaitu 6.4%.
5.  Semua  isolat  pengguna  metanol  sebagai  sumber karbon satu-satunya disimpan  pada "culture collection" dengan menggunakan  medium gliserol sehingga taban  lama dan sewaktu-waktu  dapat  dimanfaatkan  untuk  penelitian lanjutan.
lumal Tanah dan  Lingkungan,  Vol.  7 No.2,  Oktober 2005: n-76
Tabel 2.  Karakterisasi  Morfologi, Pewamaan, dan Fisiologi Mikrob yang Dapat Menggunakan  Metanol dengan Sampel dari  Bogor,Cianjur, dan Karawang
Lokul Bocor Clanjur No.1 . . , 1 J 5 6 7 •
9 10 II IZ KodeSUlDber ..... ' nMIP2 KIMIPI K2MIPI K3M2P2 K4M2P2 nMIPI K3MIPI K4MIPt' nM2P2 KIMIP2 K2M2PI KSMIP2 Mortotoal Koloal : Wama Elevui Tepian BenIUk Konsislen
Pew81'1U1aD :
Gram Spora Tehan ASlIn
BenlukSeI
Peacarall 02
Moll6 ...
FiIIoJocl Koloal : Lysin Omilhine H2S Glucose Mannitol Xylose ONPO' Indole Urease V.P.·' Cilrale TDA'" Gelatine Malonate Inositol Sorbitol Rhamnose Sucrose Lactose Arabinose Adonitol Raffinose Salicin Arginine
Rapt .....
Karbolaldra' : Oksic!ase KIIIaIase NilJal KOH KE Timbul Licin Bundar TIdak Basil + + + + + + + + + + + + + + PO PO
PO
Cembung  Cembung Cembung Licin Bundar TJdak
+
Basil Aerob
+ + +
+ + +
+
+
+ + + +
Licin Bundar TJdak Basil Aerob +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ +
Licin Bundar TIdak Basil Aerob +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + +
PO PS
PO PO POK PG PO PO Cembung Cembung Cembung  Cembung Timbul Tdk Beraturan Tdk Beraturan Cembung Cernbuns C ........ g Licin Licin KORSCIItris  Bundar Tidak Tidak + + + Basil Kokus Aerob Aerob +
+ + + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + +
+ + + + + + + +
Licin Bundar TIdak Basil Aerob + +
+
+
+
+ + +
Licin
Bundar Tidak Tidak + + Licin LiciJo Licioo Bundar Buodar B ...... Tidak Konsislell Ticlot Diplobasil  Basil  Besar  Basil  Kecil  Kokus Besar Kobs Aemb Aerob Aerob Aerob + + + + + +
+ + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + +
Keterangan (KE)  Kuning  Emas,  (PG)  Putih  Gading,  (PS)  Putih  Susu,  (PGK)  Putih  Gading  Kering,  (I)  Aeromonas  salmonicida,(2)  E'*'Obacter liquefaciens.  (3)  Klebsiella  pneumonia,(4)  Enterobacter  aggiomerans.  (5)  Basillus  mycoides.  (6)  Methylokolcus  capslllotus.  (7)  Moraxella (Moraxella)  bovis.  (8)  Ancylobacter  aquaticus.  (9)  Basillus  pumilus,  (10)  Acidomonas  methanolica.  (II)  Methylokohs capsuIDtar. (12) Moraxella  (Branhamella)  ovis.  (OONPG) 0  - nitrophenyl P - D - galactopyranoside  Hydrolysis, (00 V.P.)  Voges  Proskauer,  ( ••• IDA) Trytophan Diaminase.
I I ! I j I i
I I I , I
Eksplorasi Mikrob  Pengguna Metanol (F. Hazra)
Tabel3.  Kadar N dan Kadar protein dari  Mikrob  yang Dapat Menggunakan Metanol  Sebagai Sumber Protein Sel Tunggal
No.  Isolat Lokasi Kode Sumber Spesies Kadar protein KadarN Isolat (%) (%) Bogor T2MIP2 Aeromonas salmonicida 2.5 0.40 2 Bogor KIMIPI Enterobacter liquefaciens 6.26 1.00 3 Bogor K2MIPI Klebsiella pneumonia 8.66 1.39 4 Bogor K3M2P2 Enterobacter agglomerans 1.75 0.28 5 Bogor K4M2P2 Basillus mycoides 5.41 0.87 6 Cianjur T2MIPI Methylokokus capsulatus 6.4 1.02 7 Cianjur K3MIPI Moraxella (Moraxella)  bovis 7.63 1.22 8 Cianjur K4MIPI Ancylobacter aquaticus 4.45 0.71 9 Karawang T2M2P2 Basillus pumilus 3.39 0.54 10 Karawang KIMIP2 Acidomonas methanolica 3.18 0.51 11 Karawang K2M2Pl Methylokokus capsulatus 2.19 0.35 12 Karawang K5MIP2 Moraxella (Branhamella)  ovis 4.41 0.71

## UCAPAN TERIMAKASm
Penelitian  ini  dibiayai  oleh  QUE  Project  Departemen IImu  Tanah dan Sumberdaya  Lahan,  Fakultas  Pertanian IPB,  sehingga  kami  mengucapkan  terima  kasih  yang sebesar-besarnya  kepada  Manajemen  QUE  Departemen I1mu  Tanah  dan  Sumberdaya  Lahan,  Fakultas  Pertanian IPB.

## DAFfAR PUSTAKA
Anthony, C.  1982. The Biochemistry of Methylotrophs. Academic Press Inc. Ltd. London.
Balows, A, O. T.  Hans,  D.  Martin,  H.  Wim, T.  N. O. Karl, and  S. Heinz.  1991.  The  Prokaryotes.  2nd  ed.  A  Handbook  on Biology of Bacteria. Springer-Verlag.
Doelle, H.W.  1981. Basic Metabolic Processes. In  Rehrn. HJ. and Reed, O. (eds): Biotechnology,  Vol.  I,  Microbial Fundamentals. Verlag Chemie, Weinheim.
Holt  J.O.,  N.  R.  Krieg,  P.  H.  A.  Sneath,  J.  T.  Staley, and S.  T.
Williams.  1994.  Bergey's  Manual Determinative of Bacteriology. 9 1h ed. William and  Wilkins. BaJtimore.
Mimura,  A.,  M.  Wada  and  H.  Sakashita.  1978.  Isolation and characterization  of a gram positive  methanol  assimilating bacterium. J. Ferment.  Technol.,  56 (4):243-252.
Snedecor,  B.,  and C. L. Cooney.  1974.  Thennophilic  mixed culture  of  bacteria  utilizing  methanol  for growth. Appl. Microbiol.,27:1112-1117.
Kato, N., T.  Higuchi, C. Sakazawa, T.  Nishizawa, Y.  Tani, and H. Yamada.  1982.  Purification and properties ofa transketolase responsible  for  formaldehyde  fixation  in a methanol- utilizing  yeast.  Candida  baidinii  (Kloeckera  sp.)  No.  2201. Biochem.  Biophys.  Acta,.  715:143-150.
Tani,  Y.,  T.  Urakami, I. Terao,  and I. Nagai.  1982.  Isolation and cultivation  of  methanol-utilizing  bacteria. J.  Ferment. Technol., 60(4):287-295.
Urakami,  T.,  H.  Tamaoka, J. Suzuki, and K.  Komagata.  1989. Acidomonas gen. nov., incorporating Acetobocter methanolicus as  Acidomonas methanolica comb. nov. Int. J. Syst.  Bacteriol.,  39:50-55.