## ANTIBACETRIAL ACTIVITY TEST OF EXTRACT AND FRACTIONS OF SPONGE Callyspongia aerizusa FROM THE MANTEHAGE ISLAND WATERS MANADO
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK DAN FRAKSI SPONS Callyspongia aerizusa DARI PERAIRAN PULAU MANTEHAGE MANADO
Meldha 1)* , Defny S. Wewengkang 1) , Karlah L.R. Mansauda 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT, 95115 * melda.dhg@gmail.com

## ABSTRACT
Callyspongia aerizusa is a type of sponge that has a compound with high activity and has a porous body surface  structure  so  that  it  is  included  in  the  phylum  of  porifera.  This  study  aims  to  determine  the presence  of  antibacterial  activity  from  the  extracts  and  fractions  of  Callyspongia  aerizusa  sponge collected from the Mantehage Island waters of the Manado against Escherichia coli and Staphylococcus aureus  bacteria.  The  samples  were  extracted  by  maceration  method  using  ethanol  solvent  and fractionated  using  solvent  of  methanol,  chloroform  and  n-hexane,  respectively.  Antibacterial  activity testing  was  carried  out  using  the  disc  diffusion  agar  method  of  Kirby  and  Bauer  with  a  slight modification.  The  results  showed  that  the  chloroform  fraction  had  antibacterial  activity  in  the  strong inhibitory  category,  while  the  methanol  fraction  had  antibacterial  activity  in  the  moderate  inhibitory category.
Keywords: Callyspongia aerizusa, Antibacterial, Escherichia coli, Staphylococcus aureus.

## ABSTRAK
Callyspongia  aerizusa ialah  salah  satu  jenis  spons  yang  memiliki  senyawa  dengan  aktivitas  tinggi  dan memiliki  struktur  permukaan  tubuh  yang  berpori  –  pori  sehingga  dimasukkan  kedalam  filum  porifera. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  adanya  aktivitas  antibakteri  dari  ekstrak  dan  fraksi  Spons Callyspongia aerizusa yang diperoleh dari perairan Pulau Mantehage Manado terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus . Sampel diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol dan difraksinasi  menggunakan  pelarut  metanol,  kloroform  dan  n-  heksan.  Pengujian  aktivitas  antibakteri dilakukan  dengan  metode disc  diffusion  agar oleh Kirby  dan  Bauer dengan  sedikit  modifikasi.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  fraksi  kloroform  memiliki  aktivitas  antibakteri  dengan  kategori  daya hambat  kuat,  sedangkan  fraksi  metanol  memiliki  aktivitas  antibakteri  dengan  kategori  daya  hambat sedang.
Kata Kunci : Callyspongia aerizusa , Antibakteri, Escherichia coli , Staphylococcus aureus.

## PENDAHULUAN
Indonesia sebagai Negara dengan keanekaragaman  hayati  laut  yang  besar  dapat memanfaatkan  kekayaan  bahari  tersebut  untuk diteliti  dan  dikembangkan  sebagai  bahan  dasar obat.  Di  Sulawesi  utara  tercatat  bahwa  1,33% yang  menutupi  terumbu  karang  ialah  spons  laut (Suraji et al ., 2015). Spons menjaga kelangsungan  hidup  dan  pertahanan  dirinya dengan  menghasilkan  metabolit  primer  dan metabolit  sekunder  (Liem et  al. ,  2019). Kandungan metabolit menangkal dan menghambat  bakteri  pathogen  pengganggunya. Hal  ini  membuat  spons  menjadi  salah  satu hewan  laut  yang  menarik  untuk  diteliti  karena berpotensi  besar  untuk  dikembangkan  dalam bidang  pengobatan  yaitu  sebagai  antibakteri (Suparno, 2005).
Callyspongia  aerizusa merupakan  salah satu jenis spons yang banyak tumbuh di perairan wilayah  Indonesia.  Isolat  dari  spons  ini dilaporkan memiliki aktivitas antikanker, antimikroba, dan antiparasit (Hanni et al. , 2005). Callyspongia  aerizusa ialah  salah  satu  famili spons  yang  memiliki  senyawa  dengan  aktivtas tinggi  dan  memiliki  struktur  permukaan    tubuh yang berpori-pori sehingga dimasukkan kedalam filum  porifera  (Sari et  al., 2014). Callyspongia aerizusa menghasilkan  metabolit  sekunder berupa steroid, alkaloid, flavonoid dan terpenoid yang  kedepannya  dapat  dimanfaatkan  sebagai bahan baku obat (Manggalea et al ., 2015) . Penelitian terhadap aktivitas suatu senyawa  baik  sebagai  antibakteri  merupakan suatu  langkah  awal untuk mengetahui  kegunaan senyawa  tersebut.  Adanya  senyawa  aktif antibakteri dibidang kesehatan merupakan informasi  penting  untuk  penanggulangan  suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri (Dwijendra et al .,  2014).  Salah satu organisme yang  sangat  berpotensi  sebagai  sumber  obat antibakteri adalah spons (Schunack et al., 1990). Staphylococcus  aureus merupakan  koloni yang sering terdapat pada kulit manusia. Bakteri ini dapat menyebabkan berbagai macam infeksi, kronik  dan  akut  (Fetsch,  2017).    Dalam perkembangannya, Staphylococcus  aureus telah resisten  terhadap  beberapa  antibiotik,  seperti golongan obat penicillin (WHO, 2014).
Escherichia  coli adalah  bakteri  Gram negative  yang  terdapat  pada  usus.  Bakteri  ini
adalah  bakteri  yang  dibutuhkan  manusia  dalam jumlah  tertentu,  tetapi  dapat  juga  menimbulkan penyakit  dalam  jumlah  besar.  Bakteri  ini menyebabkan  infeksi  saluran  kemih,  diare terutama  pada  bayi  dan  anak,  pneumonia, meningitis,  dan  infeksi  luka  didalam  abdomen (Brooks et al., 2004).
Menanggapi  permasalahan  diatas  peneliti bermaksud  untuk  menguji  aktivitas  antibakteri dari  ekstrak  dan  fraksi  spons  laut Callyspongia aerizusa yang  diambil  dari  perairan  Pulau Mantehage.

## METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan Desember  2020  sampai  bulan  Maret  2021  di Laboratorium  Farmasi  Lanjut  Program  Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, dan di  Laboratorium Hama dan  Penyakit  Tumbuhan,  Fakultas  Pertanian, Universitas Sam Ratulangi.

## Alat dan Bahan Alat
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini yaitu  masker,  sarung  tangan,  gunting,  pisau, tabung oksigen, snorkel, fins, kertas label, tissue , spidol permanen, zipper lock bag , botol, talenan, cool  box ,corong,  aluminium  foil,  erlenmeyer, timbangan  analitik, rotary  evaporator ,  spatula, corong pisah,jarum ose, gelas ukur, gelas kimia, cawan  petri,  autoklaf,  pinset,  pembakar  spritus, vortex, micro tubes , batang pengaduk, Laminary air  flow ,  tabung  reaksi,  rak  tabung  reaksi,  pipet tetes, lemari pendingin, inkubator, kertas cakram ( paper disc ), mikropipet, digital caliper.

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  yaitu  Spons Callyspongia  aerizusa, bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli , etanol  95% onemed ,  metanol merck ,  n-heksan merck ,  kloroform merck ,  aquades water  one, agar merck ,  pepton merck ,  ekstrak  daging  ( beef extract ) merck ,  natrium  klorida merck dan kloramfenikol paper disc.

## Pengambilan Sampel
Sampel  Spons Callyspongia  aerizusa diambil dari perairan Pulau Mantehage
Kabupaten Minahasa Utara
dengan menggunakan  alat  bantu  (masker,  tabung  udara, snorkel  dan  fins).  Sampel  difoto  kemudian diambil,  lalu  dimasukkan  kedalam zipper  lock bag dan disimpan didalam cool box . Kemudian sampel  langsung  dibawa  ke  Laboratorium Farmasi Lanjut Program Studi Farmasi
Universitas Sam Ratulangi.

## Ekstraksi
Sampel Spons Callyspongia  aerizusa diekstraksi  dengan  cara  maserasi.  Sampel dipotong  kecil-kecil  lalu  dimasukkan  kedalam botol  dan  direndam  dengan  etanol  95%  sampai sampel  terendam  secara  keseluruhan  selama  3 kali  24  jam  dan  setiap  24  jam  dilakukan penggantian  pelarut.  Ketiga  filtrat  dicampur menjadi satu kemudian disaring, lalu dievaporasi menggunakan rotary evaporator pada suhu 40 ℃ sehingga diperoleh ekstrak kasar Spons Callyspongia aerizusa . Kemudian ekstrak ditimbang dengan timbangan analitik, selanjutnya  ekstrak  yang  diperoleh  digunakan dalam fraksinasi dan pengujian antibakteri.

## Fraksinasi
Sebanyak  2  gr  ekstrak  etanol  Spons Callyspongia  aerizusa dimasukkan  kedalam Erlenmeyer, kemudian dilarutkan dengan metanol 80% sebanyak 100 mL. Setelah sampel larut, sampel dimasukkan kedalam corong pisah lalu ditambahkan pelarut n-heksan sebanyak 100 mL  setelah  itu  dikocok  berulangkali  sampai homogen.  Dibiarkan  sampai  terbentuk  lapisan MeOH  dan  heksan.  Masing-masing  lapisan ditampung  dalam  wadah  yang  berbeda.  Lapisan heksan  selanjutnya  dievaporasi  menggunakan rotary evaporator hingga kering, lalu ditimbang dan  ini  disebut  fraksi  heksan.  Selanjutnya lapisan  MeOH  ditambahkan  dengan  aquades sebanyak  100  mL  dipartisi  dengan  pelarut kloroform dengan perbandingan 1:1 v/v,dikocok dalam corong pisah hingga homogen. Dibiarkan sampai  terbentuk  dua  lapisan  yaitu  lapisan MeOH  dan  kloroform.  Masing-masing  lapisan ditampung  dalam  wadah  yang  berbeda.  Lapisan kloroform  dalam  wadah  selanjutnya  dievaporasi menggunakan rotary  evaporator hingga  kering lalu  ditimbang.  Ini  disebut  fraksi  kloroform. Lapisan  MeOH  yang  ditampung  pada  wadah yang  lain  kemudian  dievaporasi  menggunakan
rotary  evaporator hingga  kering  lalu  ditimbang berat  sampel.  Ini  disebut  fraksi  MeOH.  Ketiga fraksi  tersebut  digunakan  dalam  pengujian antibakteri.

## Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian  aktivitas  antibakteri  ini  disterilkan terlebih  dahulu.  Alat-alat  gelas  disterilkan dengan autoklaf pada  suhu 121˚C dan tekanan 1 atm  selama  15  menit,  pinset  dibakar  dengan pembakaran  diatas  api  langsung  dan  media disterilkan  diautoklaf  pada  suhu  121˚C  dan tekanan 1 atm selama 15 menit.

## Pembuatan Media Cair
Pepton  0,5  g,  ekstrak  daging  ( beef extract ) 0,3 g, natrium klorida 0,3 g dan aquades sebanyak  100  mL  diaduk  sampai  rata  kemudian dibuat  homogen  menggunakan magnetic  stirrer lalu diautoklaf pada suhu 121 ℃ selama 15 menit, ukur  pH  dengan  menggunakan  kertas  pH. Dipipet 1 mL media cair  kemudian dimasukkan dalam  tabung  reaksi  dan  ditutup  dengan aluminium  foil.  Media  cair    siap  digunakan sebagai media kultur bakteri (Ortez, 2005).

## Kultur Bakteri
Bakteri  yang  digunakan  dalam  penelitian ini yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Bakteri    yang  akan  dikultur  diambil  dari lemari  pendingin  kemudian  diambil  sebanyak 100  μL  kedalam  masing-masing  tabung  reaksi berisi  media  cair  sebanyak  1  mL,  kemudian ditutup  dengan  menggunakan  aluminium  foil dan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37˚C selama 24 jam (Ortez, 2005).

## Pembuatan Media Agar
Pepton 0,5 g, beef extract 0,3 g, NaCl 0,3 g  ,  agar  1,5  g,dan  akuades  sebanyak  100  ml diaduk  sampai  rata  kemudian  dibuat  homogen menggunakan magnetic  stirrer lalu  diautoklaf pada  suhu  121 ℃ selama  15  menit.  Lakukan pengujian pH dengan kertas pH. Media agar siap digunakan untuk uji aktivitas antibakteri (Ortez, 2005).

## Pembuatan Larutan Uji
Larutan  uji  dibuat  dengan  cara  1  mg ekstrak  kasar  Spons Callyspongia  aerizusa
dilarutkan  dalam  200  μL  metanol  dan  dikocok hingga homogen menggunakan vortex. Perlakuan  yang  sama  dilakukan  pada  fraksi  n- heksan,  fraksi  kloroform  dan  fraksi  metanol (Ortez, 2005).

## Pembuatan  Kontrol  Positif  dan  Kontrol Negatif
Kontrol positif dalam pengujian aktivitas
antibakteri ini mengunakan Kloramfenikol paper  disc .  Sedangkan  kontrol negatif  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini yaitu menggunakan pelarut metanol, dengan cara membuat larutan stok metanol dengan mengambil sebanyak 200 μL metanol kemudian ditotolkan pada paper disc.

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
Metode yang digunakan dalam penelitian  ini  yaitu  metode  difusi  agar  ( disc diffusion  Kirby  and  Bauer ).  Pada  pengujian aktivitas  antibakteri  ini,  cakram  ( paper  disc ) yang  digunakan  berukuran  6  mm  dengan  daya serap  50  μL  tiap  cakram.  Sampel  yang  telah ditentukan  konsentrasinya  (250  μg/50  μL) ditotolkan  pada  masing-masing  cakram  dengan menggunakan mikropipet. Untuk media cair agar yang  sudah  diautoklaf  pada  suhu  121 ℃ selama 15  menit,  kemudian  didinginkan  sampai  suhu 40 ℃ .  Media  agar  dituangkan  ke  cawan  petri. Diambil  100  μL  bakteri  yang  telah  dikultur dalam  tabung  reaksi,  dipipet  dan  diinokulasi pada  media  agar  dan  ditunggu  sampai  media agar  mengeras.  Masing-masing  cawan  petri diberi  label  dan  nomor  sampel  yang  sesuai. Diletakkan  kertas  cakram  yang  telah  ditotolkan sampel  uji Spons Callyspongia aerizusa dengan pinset  didalam  cawan  petri  lalu  diinkubasi selama  1  x  24  jam  (Ortez,  2005).  Jarak  antara paper disc dengan paper disc yang lain 2 cm dan 2 cm dari tepi plate (Bhaskara, 2012).

## Pengamatan dan Pengukuran Diameter Zona Hambat
Pengamatan  dilakukan  setelah  24  jam masa  inkubasi.  Daerah  pada  sekitaran  cakram menunjukkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik atau bahan antibakteri yang digunakan sebagai  bahan  uji  yang  dinyatakan  dengan diameter  zona  hambat/bunuh.  Diameter  zona hambat  diukur  dalam  satuan  millimeter  (mm)
menggunakan jangka sorong dengan cara diukur diameter  total  zona  bening/keruh  cakram. Kemudian  diameter  zona  hambat  tersebut dikategorikan  kekuatan  daya  anti  bakterinya berdasarkan  penggolongan  (David  dan  Stout, 1971).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebanyak 450 g sampel Spons Callyspongia aerizusa diekstraksi dengan metode maserasi, kemudian dievaporasi sehingga diperoleh ekstrak kasar etanol sebanyak 2,58 g lalu diambil sebanyak 2 g untuk difraksinasi. Hasil perhitungan rendemen ekstrak dan  fraksi  Spons Callyspongia  aerizusa dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel  1. Rendemen  ekstrak  dan  fraksi  Spons Callyspongia aerizusa
No Sampel Massa Ekstrak (g) Rendemen (%) Warna 1 Ekstrak Etanol 2,58 0,57 Cokelat pekat 2 Fraksi Kloroform 0,73 36,5 Putih keruh 3 Fraksi n- Heksan 0,37 18,5 Putih keruh 4 Fraksi Metanol 0,75 37,5 Kuning
Setelah  dilakukan  pengujian  aktivitas antibakteri ekstrak dan fraksi Spons Callyspongia aerizusa terhadap bakteri Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus, diperoleh hasil yang dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel  2. Hasil  pengukuran  diameter  zona  bening  ekstrak  dan  fraksi  Spons Callyspongia  aerizusa terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus EtOH ChCl3 n-Hxn MeOH C+ C- - 13,23 - 10,14 Ec - 10,18 - 8,80 28,63 - - 11,39 - 8,64 Jumlah - 34,8 - 27,58 Rata-rata - 11,6 - 9,19 - 15,01 - 9,57 Sa - 12,67 - 8,31 30,38 - - 12,13 - 9,67 Jumlah - 39,81 - 27,55 Rata-rata 13,27 - 9,18
Keterangan : Ec = Escherichia coli Sa = Staphylococcus aureus C+ = Kontrol Positif C- = Kontrol Negatif

## Ekstraksi
Sampel  Spons Callyspongia  aerizusa dipotong kecil-kecil dengan ukuran ± 1 cm 2 , ini bertujuan  untuk  memperluas  permukaan  sampel karena  semakin  luas  permukaan  sampel  maka interaksi  antara  sampel  dan  pelarut  semakin besar,  sehingga  proses  ekstraksi  dapat  berjalan secara  optimal  (Ncube et  al. ,  2008).  Sampel kemudian  diekstraksi  dengan  menggunakan metode  maserasi.  Metode  maserasi  digunakan karena  peralatan  yang  digunakan  sederhana  dan pengerjaannya  yang  mudah  dilakukan.  Proses perendaman sampel pada metode maserasi dapat membuat  dinding  sel  pecah  karena  adanya perbedaan  konsentrasi  didalam  dan  diluar  sel, sehingga senyawa yang terdapat didalam sampel dapat tertarik oleh pelarut. Konsentrasi diluar sel lebih  tinggi  dari  konsentrasi  didalam  sel, sehingga dinding sel menjadi pecah karena tidak dapat menahan tekanan dari perbedaan konsentrasi (Harborne, 1987).
Sampel  Spons Callyspongia  aerizusa dimaserasi  menggunakan  etanol  95%,  karena etanol  merupakan  larutan  penyari  yang  bersifat universal,  tidak  toksik,  mudah  didapat  dan selektif sehingga penyarian menggunakan etanol diharapkan  dapat  menarik  semua  senyawa  yang bersifat  polar    maupun  non  polar  yang
terkandung  didalam  sampel  (Oeiyano et  al. , 2019).
Maserasi dilakukan selama 3 x 24 jam dan setiap  24  jam  ekstrak  disaring  dan  dimaserasi kembali  dengan  menggunakan  pelarut  yang baru,  hal  ini  disebut  dengan  remaserasi. Remaserasi  dilakukan  dengan  tujuan  untuk mendapatkan penyarian yang maksimal (Khopkar, 2008).
Filtrat yang diperoleh kemudian dievaporasi  menggunakan rotary  evaporator pada suhu 40 ℃ . Suhu 40 ℃ bertujuan untuk tetap menjaga senyawa bioaktif yang terdapat didalam filtrat  karena  biasanya  senyawa  bioaktif  tidak tahan  terhadap  suhu  pemanasan  yang  tinggi (Kowal et  al. ,  2018).  Setelah  dievaporasi diperoleh ekstrak kasar etanol sebanyak 2,58 g.

## Fraksinasi
Setelah  diperoleh  ekstrak  kasar  dari proses maserasi, selanjutnya dilakukan fraksinasi dengan menggunakan metode fraksinasi  cair-cair  yang  merupakan  metode pemisahan  dengan  menggunakan  dua  pelarut dalam satu corong pisah sehingga senyawa tidak saling bercampur karena memiliki sifat kepolaran  yang  berbeda  (Watupongoh et  al. , 2019).  Pelarut  yang  digunakan  pada  proses fraksinasi  yaitu  n-heksan,  kloroform,  dan
metanol.  Pelarut  n-heksan  untuk  melarutkan senyawa  yang  bersifat  non  polar,  pelarut kloroform  untuk  melarutkan  senyawa  yang bersifat  semi  polar  dan  pelarut  metanol  untuk melarutkan senyawa yang bersifat polar (Pitoy et al. ,  2019).  Proses  fraksinasi  dilakukan  secara bertingkat berdasarkan tingkat kepolaran pelarut yaitu  mulai  dari  pelarut  non  polar,  selanjutnya semi  polar  dan  terakhir  pelarut  polar  (Engka, 2016).  Pada  saat  proses  fraksinasi  akan terbentuk  2  lapisan  pelarut,  dimana  pelarut dengan massa jenis yang lebih besar akan berada dibagian  bawah  dan  pelarut  dengan  massa  jenis yang lebih kecil akan berada dibagian atas. Massa  fraksi  serta  rendemen  yang  dihasilkan dari proses fraksinasi dapat dilihat pada Tabel 1. Hasil  fraksinasi  yang  diperoleh  menunjukkan bahwa  fraksi  metanol  memiliki  rendemen  yang lebih  besar  yaitu  37,5%  dibandingkan  fraksi  n- heksan dan fraksi kloroform. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat banyak komponen senyawa  yang  bersifat  polar  dalam  sampel Spons Callyspongia  aerizusa. Perbedaan  nilai rendemen  ini  disebabkan  oleh  perbedaan  jenis pelarut  yang  digunakan.  Pelarut  yang  berbeda akan melarutkan senyawa-senyawa yang berbeda  tergantung  tingkat  kepolarannya.  Oleh sebab  itu,  jumlah  ekstrak  yang  dihasilkan tergantung  jenis  pelarutnya  (Mujipradana et  al. , 2018).

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pengujian  aktivitas  antibakteri  dilakukan dengan  menggunakan  metode  difusi  agar  ( Disk diffusion Kirby and Bauer yang telah dimodifikasi).  Metode  difusi  agar  merupakan metode  yang  dilakukan  dengan  pengukuran  dan pengamatan diameter zona bening yang terbentuk  disekitar  cakram  yang  berisi  zat antibakteri  yang  diletakkan  pada  media  agar yang  telah  diinokulasi  bakteri  (Lalamentik, 2017).
Pengujian  dilakukan  terhadap  bakteri Escherichia  coli yang  mewakili  bakteri  Gram negatif  dan  bakteri Staphylococcus  aureus yang mewakili  bakteri  Gram  positif.  Penggunaan kedua  jenis  bakteri  ini  bertujuan  untuk mengatahui  apakah  ekstrak  dan  fraksi  Spons Callyspongia aerizusa memiliki aktivitas antibakteri,  serta  untuk  mengetahui  spektrum aktivitas  antibakteri  apakah  memiliki  spektrum
luas yang dapat membunuh bakteri Gram positif maupun  Gram  negatif,  atau  memiliki  spektrum sempit  yang  hanya  dapat  membunuh  salah  satu jenis bakteri.
Gambar a. Hasil pengujian pada Escherichia coli
Gambar b. Hasil pengujian pada Staphylpcoccus aureus
Ket : Hasil Uji Aktivitas Antibakteri ekstrak dan fraksi  Spons Callyspongia  aerizusa :  (a) Escherichia  coli, (b) Staphylococcus aureus, (1)  Ekstrak  Etanol,  (2)  Fraksi Kloroform,  (3)  Fraksi  n  -  Heksan,  (4) Fraksi  Metanol,  (5)  Kontrol  Positif,  (6) Kontrol Negatif.
Hasil  yang  diperoleh  ditandai  dengan terbentuknya  zona  bening  disekeliling  cakram ( paper  disc )  yang  berukuran  6  mm,  hal  ini menunjukkan  bahwa  adanya  kepekaan  bakteri terhadap  ekstrak  dan  fraksi  Spons Callyspongia aerizusa. Pengamatan dilakukan setelah diinkubasi  selama  1  x  24  jam  pada  suhu  37 ℃ dengan  tiga  kali  pengulangan  pada  masing- masing ekstrak dan fraksi.
Pengulangan dilakukan untuk mengakuratkan hasil yang diperoleh (Mujipradana et  al. ,  2018). Pada  pengujian aktivitas  antibakteri  ini,  penggolongan  daya hambat  dari  kontrol  uji  dan  bahan  uji  Spons Callyspongia  aerizusa digolongkan  berdasarkan kriteria  kekuatan  daya    antibakteri  menurut
David  dan  Stout  (1971)  yang  ditunjukkan  pada Tabel 3.
Tabel 3. Kategori kekuatan daya antibakteri
Diameter Zona Bening (mm) Kategori > 20 Sangat Kuat 10-20 Kuat 5-10 Sedang < 5 Lemah
Dalam  pengujian  ini,  digunakan  kontrol positif  dan  kontrol  negatif  sebagai  pembanding. Kontrol positif yang digunakan adalah Kloramfenikol paper  disc karena  kloramfenikol merupakan  antibiotik  spektrum  luas  yang  dapat membunuh  bakteri  Gram  positif  maupun  Gram negatif. Kontrol positif berfungsi sebagai kontrol dari  zat  uji  dengan  membandingkan  diameter daerah hambat yang terbentuk (Dwijendra et al., 2014).  Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan Kloramfenikol  memiliki  aktivitas  antibakteri yang lebih besar terhadap bakteri uji dibandingkan ekstrak dan fraksi Spons Callyspongia  aerizusa .  Diameter  zona  hambat yang  dihasilkan  kloramfenikol  pada  bakteri Escherichia  coli yaitu sebesar  28,63  mm  dan pada  bakteri Staphylococcus  aureus yaitu sebesar 30,38 mm.
Kontrol  negatif  yang  digunakan  pada pengujian  ini  adalah  metanol.  Kontrol  negatif berfungsi  untuk  mengetahui  ada  tidaknya pengaruh  pelarut  terhadap  pertumbuhan  bakteri Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus. Metanol  digunakan  sebagai  kontrol  negatif karena pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak  dan  fraksi  adalah  metanol.  Hasil  yang diperoleh  kontrol  negatif  tidak  memiliki  daya hambat terhadap bakteri uji, hal ini menunjukkan  bahwa  aktivitas  yang  ditimbulkan oleh  ekstrak  dan  fraksi  Spons Callyspongia aerizusa adalah  murni  dari  senyawa  yang terkandung  didalamnya  dan  bukan  dari  pelarut yang digunakan.
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh,  pada ekstrak  etanol  tidak  terdapat  zona  bening  yang terbentuk  disekitar  cakram  baik  pada  bakteri Escherichia coli maupun bakteri Staphylococcus aureus. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pada
ekstrak  etanol  Spons Callyspongia  aerizusa tidak memiliki aktivitas antibakteri.
Pada  fraksi  kloroform  menunjukkan adanya  zona  bening  yang  terbentuk  disekitar cakram  pada  bakteri Escherichia  coli maupun bakteri Staphylococcus  aureus, masing-masing dikategorikan  kuat  dengan  rata-rata  diameter zona bening masing-masing 11,6 mm dan 13,27 mm. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang terdapat  dalam  fraksi  kloroform  memiliki aktivitas antibakteri dan berspektrum luas karena dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri  Gram negatif dan Gram positif.
Pada  fraksi  n-heksan  tidak  menunjukkan adanya  zona  bening  yang  terbentuk  disekitar cakram  baik  pada  bakteri Escherichia  coli maupun  bakteri Staphylococcus  aureus .  Hal  ini menunjukkan  bahwa  senyawa  yang  terdapat dalam  fraksi  n-heksan  tidak  memiliki  aktivitas antibakteri.
Pada fraksi metanol menunjukkan adanya zona  bening  yang  terbentuk  disekitar  cakram pada bakteri coli maupun bakteri Staphylococcus aureus, masing-masing  dikategorikan  sedang dengan  rata-rata  diameter  zona  bening  masing- masing  9,19  mm  dan  9,18  mm.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  senyawa  yang  terdapat dalam  fraksi  n-heksan  memiliki  aktivitas antibakteri  dan  memiliki  spektrum  luas  karena dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri  Gram negatif dan Gram positif.
Hasil  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini menunjukkan bahwa sampel Spons Callyspongia  aerizusa hanya  memiliki  aktivitas antibakteri  pada  fraksi  kloroform  dan  fraksi metanol  dengan  kategori  kuat  dan  sedang  yang ditandai  dengan  terbentuknya  zona  bening disekitar  cakram.  Terbentuknya  zona  bening dipengaruhi oleh kandungan senyawa aktif yang terdapat  didalam  Spons Callyspongia  aerizusa. Berdasarkan  penelitian  Krisyuninda  (2012), didapatkan  adanya  kandungan  senyawa  steroid, alkaloid, flavonoid dan terpenoid didalam Spons Callyspongia aerizusa.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan  bahwa  sampel  Spons Callyspongia aerizusa yang  diambil  dari  perairan  Pulau Mantehage  hanya  memiliki  aktivitas  antibakteri pada  fraksi  kloroform  dengan    kategori  daya
hambat  kuat  dengan  rata-rata  diameter  zona bening  11,6  pada  bakteri Escherichia  coli dan 13,38 pada bakteri Staphylococcus aureus , serta pada  fraksi  metanol  dengan  kategori  daya hambat  sedang  dengan  rata-rata  diameter  zona bening  9,19  pada  bakteri Escherichia  coli dan 9,18 pada bakteri Staphylococcus aureus.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut mengenai  senyawa  aktif  yang  terkandung didalam  Spons Callyspongia  aerizusa terlebih khusus  pada  fraksi  kloroform  serta  uji  aktivitas lainnya  untuk  mengetahui  manfaat  lain  selain antibakteri.

## DAFTAR PUSTAKA
Bhaskara,  I.B.M.,  Ketut,B.  dan  Ketut  T.PG. 2012.  Uji  Kepekaan Eschericia  coli sebagai  Penyebab    Kolibasilosis  pada Babi Muda terhadap Antibiotika Oksitetrasiklin, Streptomisin, Kenamisin  dan  Gentamisin. Indonesia Medicus Veterinus. 2 : 186-201.
Brooks,  G.F.,  Carrol,  K.C.,  Butel,  J.S.,  dan Morse,  S.A.  2004. Jawetz,  Melnick, Adelberg’s  Medical  Microbiology.
London: McGraw-Hill Medical.
David,  W.W.,  T.R.  Stout.  1971.  Disc  Plate Method  of  Microbiological  Assay. Journal of Microbiology . 22: 659-665.
Dwijendra,  I.M.,  D.  S.  Wewengkang.,  dan  F. Wahentou. 2014. Aktivitas Antibakteri dan  Karakterisasi  Senyawa  Fraksi Spons Lamellodysidea herbacea yang diperoleh dari Teluk Manado. Pharmacon. 3(4):1-9.
Engka,  T.  2016.  Aktivitas  Antioksidan  dan Penentuan  Kandungan  Total  Fenolik dan Flavonoid dari Umbi Kuso Mafola ( Drynaria  quercifolia L.)  [skripsi]. Program Studi Farmasi FMIPA Universitas Sam Ratulangi, Manado. Fetsch,  A.  2017. Staphylococcus  aureus.
Germany: Academic press.
Hanni,E.,  Munim  A.,  Sekarini  R.  2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam  Spons Callyspongia  sp. dari kepulauan Seribu. Majalah Ilmu Kefarmassian . 2(1): 27-33. Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Modern Menganalisis Tumbuhan Edisi Kedua. Diterjemahkan oleh Kosashi Padmawinata  dan  Iwang  Soedira.
Bandung: ITB Press.
Khopkar,  S.M.  2008 .  Konsep  Dasar  Kimia Analitik . Jakarta : UI press.
Kowal, A., Esther, A., Nickson, K., Kurniati, K., Henky,  M.,  Deiske,  H.  2018.Potensi antibakteri  karang  lunak lobophytum sp.  Dari  perairan  pangalisang  pulau bunaken terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa dan
Staphylococcus  aureus . Jurnal  Ilmiah Platax . 6(2).
Krisyuninda,  M.  2012.  Uji  toksisitas  fraksi spons Callyspongia sp  dengan  metode shrimp  test  dari  perairan  pasir  putih situbondo. Surabaya : Institut
Teknologi Sepuluh November.
Lalamentik,  G.  2017.  Aktivitas  Antibakteri Ekstrak  Karang  Lunak Klyxum  sp . yang  Diperoleh  dari  Teluk  Manado. [Skripsi].  Program  Studi  Farmasi FMIPA  Universitas  Sam  Ratulangi, Manado.
Liem,  J.W.,  Robert  A.B.,  Deiske  A.S.  2019. Bioprospeksi Antibakteri beberapa jenis  Spons  dari  Perairan  Pangalisang Bunaken. Jurnal  Pesisir  dan  Laut Tropis. 1(1):7-12.
Manggalea,  F.P.,  J.Posangi,  M.P.  Wowor,  Bara R.  2015  Uji  Efek  Antibakteri  Jamur Endosimbion  Spons  Laut  terhadap bakteri Pseudomonas  aeruginosa dan Escherichia coli . Ebm . 3(1): 277.
Mujipradana, V.N., D. S. Wewengkang., dan E.
Suryanto. 2018. Aktivitas Antimikroba dari  Ekstrak  Ascidian Herdmania momus pada Mikroba Patogen
Manusia. Pharmacon . 7(3): 338-347.
Ncube,  N.S.,  Afolayan,  A.J.,  Okoh,  A.I. 2008.  Assesement  Techniques  of
Antimicrobial Properties of Natural Compounds of Plant Origin: Current Methods and Future Trends. Africa Journal of Biotechnology . 7(12): 30-32.
Oeiyano,  W.E.,  Herny,  E.S.,  Henky,  R.,  2019. Uji  aktivitas  antimikroba  ekstrak  dan fraksi  Spons Liosina  paradoxa dari perairan desa tumbak Minahasa tenggara terhadap pertumbuhan Mikroba Staphylococcus aureus,
Eschericia coli, dan Candida albicans . Pharmacon. 8(5): 629-638.
Ortez,  J.H.    2005. Disk Diffusion  Testing  in Manual of Antimicrobial Susceptibility . Marie B. Coyle (Coord.Ed).  American  society  for Microbiology.
Pitoy,  N.A,  Adithya,  Y.,  Defny,  W.  2019.  Uji antimikroba ekstrak dan fraksi Tunikata Didemnum  molle terhadap pertumbuhan Escherichia coli, Staphylococcus  aureus dan Candida albicans yang  dikoleksi  di  Selat Lembeh  Bitung. Pharmacon. 8(5)  : 275-283.
Sari,  N.I.,  Ahmad  A.,  Dali  S.  2014. Isolasi  dan karakterisasi  protein  bioaktif  dari spons  Callyspongia  sp.  sebagai  zat antioksidan .  Makassar:  Universitas Hasanuddin.
Schunack,  W.,  Mayer  K.,  Haake  M.  1990. Senyawa  obat .Penerjemah  Wattimena J.R.  dan  Subito.  Yogyakarta:  UGM Press.
Suparno.  2005. Kajian  Bioaktif  Spons  Laut (Porifera: Demospongiae)Suatu Peluang  alternative  pemanfaatan Ekosistem Karang Indonesia dalam bidang  Farmasi .  Bogor:  Institut Pertanian Bogor.
Suraji, Rasyid N, Kenyo A.S., et al. 2015. Profil kawasan  konservasi  Provinsi  Sulawesi Utara. Jakarta:  Kementrian  Kelautan dan Perikanan.
Watupongoh,  C.C.A,  Defny,  S.W,  Henki,  R. 2019. Aktivitas antimikroba dari ekstrak  dan  fraksi  organisme  laut Spons Stylissa  carteri yang  dikoleksi dari  perairan  Selat  Lembeh  kota Bitung. [Skripsi]. Program Studi
Farmasi,  FMIPA,  Universitas  Sam Ratulangi Manado.
WHO.  2014. Antimicrobial  Resistance  :  Global Report  on  Surveilance. Switzerland: World Health Organization.