Jurnal Pharmascience, Vol. 9, No. 1, Februari 2022, hal: 106-112 ISSN-Print. 2355 – 5386 ISSN-Online. 2460-9560 https://ppjp.ulm.ac.id/journal/index.php/pharmascience Research Article

## Optimasi Preparasi Sampel untuk Penetapan Kadar Protein Ekstrak Cacing Tanah (Lumbricus rubellus)
Ahmad Fauzi 1 , Wahyu Utami 1 * , Denny Vitasari 2 , Arifah Sri Wahyuni 1
1 Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta, Jawa Tengah, Indonesia
2 Program Studi Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta, Jawa Tengah, Indonesia Email: wahyu.utami@ums.ac.id

## ABSTRAK
Demam  tifoid  merupakan  salah  satu  penyakit  yang  menjangkit  masyarakat Indonesia  dengan  500  kasus  per  100.000  penduduk  dengan  angka  kematian  mencapai 5%. Pengobatan utama demam tifoid adalah menggunakan berbagai macam antibiotik. Namun  masyarakat  Indonesia  cenderung  lebih  memilih  pengobatan  alternatif  atau tradisional. Salah satu obat tradisional demam tifoid adalah ekstrak cacing (Lumbricus rubellus) yang mempunyai kandungan protein sampai 71%. Kandungan protein sangat tergantung  pada  proses  produksinya.  Untuk  itu  diperlukan  metode  preparasi  dan analisis untuk menentukan kadar protein yang bisa digunakan untuk menjamin mutu produk  ekstrak  cacing.  Metode  preparasi  yang  optimum    adalah  dengan  pemanasan pada  temperatur  50°C  selama  5  menit  kemudian  dianalisis  kadar  proteinnya  dengan metode Lowry menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 650,8 nm. Metode linier, akurat dan teliti dengan batas deteksi sebesar 0,18 mg/mL dan batas kuantifikasi sebesar 0,58 mg/mL.
Kata Kunci: Protein, Cacing Tanah, Spektrofotometri, Metode Lowry

## ABSTRACT
Typhoid fever is a disease that affects Indonesian people with 500 cases per 100,000 population with a mortality rate of 5%. The main treatment for typhoid fever is the use of various  antibiotics.  However,  Indonesian  people  prefer  to  use  alternative  or  traditional medicine.  One  of  the  traditional  medicines  for  typhoid  fever  is  earthworm  (Lumbricus rubellus)  extract  which  has  a  protein  content  of  up  to  71%.  Protein  content  is  highly dependent  on  the  production  process.  For  this  reason,  preparation  and  analysis  methods are  needed  to  determine  protein  levels  that  can  be  used  to  guarantee  the  quality  of  the worm  extract  products.  The  optimum  preparation  method  is  by  heating  at  50°C  for  5 minutes  and  then  the  protein  is  analyzed  using  the  Lowry's  method  using  a  UV-Vis
spectrophotometer  at  wavelength  of  650.8  nm.  The  method  is  linear,  accurat  and  presice with  detection limit of 0.18 mg/mL and quantification limit of 0.58 mg/mL.
Keywords: Protein, Earthworm, Spectrophotometry, Lowry Method

## I. PENDAHULUAN
Demam  tifoid  merupakan  salah satu penyakit yang menjangkit masyarakat Indonesia  baik  di  perkotaan  maupun  di pedesaan.  Menurut  Kementrian  Kesehatan RI  (Kemenkes,  2006),  angka  kejadian demam tifoid yaitu 500 kasus per 100.000 penduduk, dengan angka kematian mencapai 5%. Menurut WHO tahun 2019, secara  global  demam  tifoid  menyebabkan 128.000  –  161.000  kematian  setiap tahunnya (WHO, 2020).
Pengobatan utama dalam penanganan  demam  tifoid  yaitu  dengan penggunaan  antibiotik.  Penatalaksanaan terapi pada penderita demam tifoid dengan menggunakan  ampisilin,  kloramfenikol, siprofloksasin,  seftriakson,  sefotaksim, aztreonam  dan  azitromisin  (Stark,  2003).
Semakin  banyaknya  kasus  resistensi  dan perubahan  paradigma  masyarakat  yang cenderung  lebih  memilih  pengobatan tradisional  menyebabkan  meningkatnya kebutuhan  masyarakat  pada  obat-obat tradisional.  Salah  satu  pengobatan  yang digunakan  untuk  membantu  mengobati demam tifoid adalah cacing tanah
( Lumbricus rubellus ) (Cooper et al., 2012;
Prabha  &  Shathya,  2014).  Penelitian sebelumnya  secara in  vivo ,  cacing  tanah
terbukti  dapat  mengobati  demam  tifoid (Waluyo,  Wahyuni,  &  Utami,  2019) menurunkan  panas  (antipiretik)  (Waluyo, Wahyuni,  &  Nuri,  2019),  antiinflamasi (Dewi  &  Mahendra,  2020),  antibakteri terutama bakteri Salmonella typhi
(Ayuwardani  &  Susliowati,  2019),  dan sebagai antioksidan (Samatra et al., 2017). Cacing  tanah mempunyai  kandungan aktif protein  yang  cukup  tinggi  yaitu  berkisar antara  58–71%  pada  cacing  yang  sudah dikeringkan (Sun & Jiang, 2017).
Pada  perkembangannya,  industri obat  tradisional  memanfaatkan  cacing tanah yang disiapkan dalam sediaan kapsul ekstrak  dan  sudah  diproduksi  secara massal.  Kandungan  protein  pada  ekstrak cacing  sangat  dipengaruhi  oleh  proses produksinya,  di  mana  kualitas  protein dapat terpengaruh oleh temperatur dan pH (Hidayat  &  Utami,  2018),  sehingga memungkinkan adanya perbedaan kandungan protein antar produk. Untuk itu diperlukan  suatu  metode  penetapan  kadar protein  untuk  menjamin  mutu  produk ekstrak  cacing  sehingga  mempunyai  efek yang sesuai dengan tujuan penggunaannya. Prosedur  yang  umum  digunakan  untuk penetapan  kadar  protein  adalah  metode Lowry  (Lowry  et  al.,  1951).  Pada
penelitian  ini,  kami  mengembangkan metode  Lowry  untuk  penetapan  kadar protein  pada  sampel  ekstrak  cacing.
Pengembangan  yang  kami  lakukan  adalah dengan  optimasi  ekstraksi  pada  saat preparasi  sampel  ekstrak  cacing.  Metode ini  diharapkan  dapat  digunakan  untuk standardisasi  kadar  protein  pada  kapsul ekstrak cacing yang beredar di pasaran.

## II. METODE

## A. Optimasi Metode Ekstraksi Sampel
Ekstraksi  protein  kapsul  cacing dilakukan  dengan  cara  melarutkan  dalam air dengan pemanasan dan tanpa pemanasan.  Ditimbang  1  gram  ekstrak cacing yang sudah dikeluarkan dari kapsul, dilarutkan  dalam  10,0  mL  aquades  dan dimasukkan  dalam  sonifikator  (Branson 1510)  selama  10  menit.  Dilakukan  empat variasi  suhu  pemanasan  yaitu  tanpa pemanasan,  suhu  40°C,  50°C,  dan  60°C kemudian dimasukkan dalam inkubator air (Memert  Incubator  Waterbath)  selama  5 menit pada masing masing suhu tersebut.
Masing-masing hasil ekstraksi kemudian  disaring,  diambil  1,0  mL supernatan  ditambahkan  0,9  mL  pereaksi Lowry  A  (Merck)  dan  0,1  mL  pereaksi Lowry B (Merck) selanjutnya diinkubasi 5 menit  pada  suhu  ruang.  Selanjutnya ditambahkan  3,0  mL  reagen  Lowry  C (Supelco)  dan  diinkubasi  kembali  selama 15  menit.  Sampel  kemudian  dibaca
serapannya  dengan  spektrofotometer  UV- Vis  (Shimadzu  1280)  pada  panjang gelombang  650,8  nm.  Kadar  protein ditetapkan  menggunakan  kurva  baku dengan Bovine  Serum  Albumin (Sigma-
Aldrich) sebagai standar.

## B. Validasi Metode
Validasi  metode  didasarkan  pada
petunjuk  dari International  Conference  of Harmonization
(ICH) (European
Medicines  Agency,  2006)  dan  Farmakope Indonesia  Edisi  VI  (FI  VI)  (Kementrian Kesehatan RI, 2020). Parameter-parameter validitas  yang  digunakan  antara  lain: linieritas,  batas  Deteksi  (LOD),  batas kuantifikasi (LOQ), akurasi, dan presisi.

## C. Analisis Data
Dilakukan  uji  statistik  one-way ANOVA  untuk  membandingkan  antara metode ekstraksi  sampel  tanpa  pemanasan dan  dengan  pemanasan  pada  suhu  40°C, 50°C, dan 60°C.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi  kapsul  cacing  dilakukan dengan empat metode yaitu tanpa pemanasan, pemanasan suhu 40°C,
pemanasan  suhu  50°C,  dan  pemanasan suhu  60°C.  Pemilihan  suhu  ini  didasarkan bahwa  protein  mudah  terdegradasi  pada suhu  diatas  70°C  (Huang  et  al.,  2011; Jiang et al., 2018). Sampel yang digunakan
adalah kapsul merk  X sebanyak 60 kapsul dengan nomor batch yang sama. Pemilihan sampel  dengan  nomor  batch  sama  artinya sampel  diproduksi  dengan  proses  dan waktu yang sama, sehingga dapat mengurangi  bias  dalam  penetapan  kadar protein kapsul ekstrak cacing.
Hasil  ekstraksi  pada  berbagai  suhu
(Tabel  I)  menunjukkan  bahwa  metode dengan  pemanasan  50°C  selama  5  menit memberikan  hasil  yang  paling  besar  yaitu sebesar  (14,58  ±  0,33)  %.  Hal  ini disebabkan  karena  pada  metode  tanpa pemanasan,  protein  belum  terekstraksi sempurna  karena  banyak  yang  masih terhalang  oleh  matriks  dari  ekstrak.  Pada metode  pemanasan  suhu  40°C  jumlah protein  terdeteksi  semakin  bertambah.
Dengan  adanya  sumber  panas,  protein yang  tertahan  dalam  matriks  ekstrak cacing  dapat  terekstraksi  dengan  baik.
Selanjutnya pada pemanasan 50°C, semakin  banyak  protein  yang  terdeteksi.
Pada  metode  pemanasan  60°C,  terjadi penurunan  kadar  protein  terdeteksi  yang kemungkinan  karena  pada  suhu  60°C sebagian protein mulai terdegradasi karena panas yang berlebih.
Selanjutnya  dilakukan  uji  statistik
one-way ANOVA dengan nilai signifikansi (p<0,05) untuk
membandingkan  antara  metode  ekstraksi.
Hasil  uji  statistik  menunjukkan  ada perbedaan  yang  bermakna  antara  metode
ekstraksi.  Setelah  dilakukan  uji  post-hoc, metode  pemanasan  50°C  mempunyai perbedaan  yang  bermakna  dibanding metode  lainnya.  Sehingga  disimpulkan metode  ekstraksi  dengan  air  pada  suhu 50°C  selama  5  menit  merupakan  metode yang  optimal  dalam  preparasi  penetapan kadar protein dalam ekstrak cacing.
Tabel I. Hasil ekstraksi protein kapsul cacing Metode Ekstraksi Kadar (%) Tanpa Pemanasan 3,39 ± 0,05 Pemanasan 40°C 10,41 ± 0,47 Pemanasan 50°C 14,58 ± 0,33* Pemanasan 60°C 9,51 ± 0,46 Keterangan : *menunjukkan hasil yang berbeda signifikan dengan metode yang lainnya (p<0,05)
Validasi  metode  yang  pertama adalah linieritas. Metode linieritas menggunakan sampel Bovine Serum
Albumin (BSA)  dengan  7  titik  konsentrasi dari  0,15  –  10  mg/mL.  Uji  linieritas dihitung dengan plotting kadar (mg/mL) vs respon  (Abs)  didapatkan  persamaan  kurva baku  y  =  0,1748x  +  0,1033  dengan  R 2 =
0,9806 (Gambar 1).
Gambar 1. Grafik uji linieritas
Hasil  uji  linieritas  menunjukkan adanya  perubahan  respon  alat  seiring bertambahnya kadar analit. Nilai koefisien R 2 ≥  0,98,  dengan  demikian  dapat disimpulkan  penetapan  kadar  protein pemanasan  50°C  menghasilkan  linieritas yang  baik  dengan  rentang  0,15  –  10 mg/mL.  Selanjutnya  batas  deteksi  (LOD) diperoleh 0,18 mg/mL dan batas kuantifikasi (LOQ) diperoleh 0,58 mg/mL.
Uji  akurasi  menggambarkan  hasil uji  dengan  nilai  sebenarnya,  parameter yang  diukur  adalah  %  perolehan  kembali.
Prosedur yang dilakukan adalah
penambahan  standar  pada  sampel  dengan konsentrasi  12,  15  dan  18  mg/mL.  Hasil didapatkan  %  perolehan  kembali  sebesar
84,54  –  107,93  %  (Tabel  II).  Hasil  ini memenuhi persyaratan % perolehan kembali yaitu 80 -120 %.
Tabel II. Hasil uji akurasi
Penambahan Zat Aktif (ZA) %Recovery Penambahan ZA 12 mg/mL 107,93 ± 1,25 Penambahan ZA 15 mg/mL 97,38 ± 2,33 Penambahan ZA 18 mg/mL 84,54 ± 2,12
Parameter  uji  selanjutnya  adalah
uji presisi/ripitabilitas. Pengujian ini
bertujuan  untuk  melihat  respon  alat  pada pengukuran yang berulang-ulang. Hasil uji ripitabilitas menunjukkan ketelitian pengukuran  yang  baik,  %CV  ( Coefficient
of  Variation )  kurang  dari  5%  (Tabel  III).
Hal  ini  menunjukkan  bahwa  setiap pengulangan  pengukuran  pada  sampel yang sama memberikan hasil yang sama.
Tabel III. Hasil uji repitabilitas Pengujian Ke- Kadar (mg/mL) Rata-rata %CV
1 14,80 15,1 ± 0,6 4,4 2 14,27
3 15,60 4 14,14 5 15,26 6 15,58 7 15,78

## IV. KESIMPULAN
Metode yang optimal untuk penetapan  kadar  protein  dalam  kapsul ekstrak  cacing  adalah  dengan  metode pemanasan  50°C  selama  5  menit  yang menghasilkan  deteksi  protein  yang  lebih banyak  dibandingkan  pemanasan  suhu 40°C, 60°C, dan tanpa pemanasan. Metode yang  optimal  sudah  tervalidasi  dengan linieritas  R 2 ≥  0,98  pada  rentang  kadar
0,15 – 10 mg/mL, LOD 0,18 mg/mL, LOQ
0,58  mg/mL,  %  Perolehan  kembali berkisar  antara  84,54  –  107,93  %,  dan  uji ripitabilitas  menghasilkan  CV  kurang  dari
5%.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih kepada LPMPP  UMS  yang  telah  mendanai penelitian  ini  melalui  skema  Hibah Pengabdian Masyarakat UMS batch  tahun
2021/2022    yang  tertuang  dalam  Surat
Penetapan  Ketua  LPMPP  UMS  Nomor: 376/A.3-III/LPMPP/XI/2021.

## DAFTAR PUSTAKA
Ayuwardani,  N.,  &  Susliowati,  A.  A.
(2019).  Antibacterial  Activity  of Salmonella  Typhi  in  Combination of Earth-Worms Extract (Lumbricus rubellus) and Turmeric Rhizoma  Extract  (Curcuma  Longa L.) In Vitro Novi. Aloha
International  Journal  of  Health
Advancement  (AIJHA) , 2 (4),  76– 79.
Cooper,  E.  L.,  Balamurugan,  M.,  Huang, C.  Y.,  Tsao,  C.  R.,  Heredia,  J.,
Tommaseo-Ponzetta, M., & Paoletti, M. G. (2012). Earthworms dilong: Ancient, inexpensive, noncontroversial  models  may  help clarify  approaches  to  integrated medicine emphasizing neuroimmune  systems. Evidence- Based Complementary
and
Alternative Medicine , 2012 .
Dewi,  N.  W.  S.,  &  Mahendra,  A.  N.
(2020). The in-vivo anti- inflammatory effect of red earthworm  (Lumbricus  rubellus) ethanolic  extract  from  organic farmland  in  Bali,  Indonesia. Bali Medical Journal , 9 (3), 545–548.
European  Medicines  Agency.  (2006).
International Conference on Harmonisation. ICH Q2 R1 , 2 (June 1995), 1070–1072.
Hidayat,  N.,  &  Utami,  R.  N.  (2018).  The effects  of earthworm  concentration and extraction time on solubility of protein. Advances in Food Science, Sustainable Agriculture and
Agroindustrial  Engineering , 1 (1), 15–18.
Huang, F., Huang, M., Xu, X., & Zhou, G.
(2011). Influence of heat on protein degradation, ultrastructure and eating  quality  indicators  of  pork.
Journal of the Science of Food and Agriculture , 91 (3), 443–448.
Jiang, Q., Han, J., Gao, P., Yu, L., Xu, Y., & Xia, W. (2018). Effect of heating temperature  and  duration  on  the texture  and  protein  composition  of bighead  carp  (Aristichthys  nobilis) muscle. International  Journal  of Food  Properties , 21 (1),  2110– 2120. Kementerian Kesehatan RI (2006). Pedoman  Pengendalian  Demam Tifoid.  Pada Keputusan  Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 364 (p. 41). Kementerian Kesehatan RI. (2020). Farmakope  Indonesia  Edisi  VI . Kementrian Kesehatan RI.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., & Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. The  Journal  of  Biological Chemistry , 193 (1), 265–275.
Prabha,  M.  L.,  &  Shathya,  S.  (2014).
Earthworm-An alternative approach  to  biomedicine. Int  J Curr Sci , 13 , 6–8. Samatra, D. P. G. P., Mahadewa Tjokorda, G.  B.,  Sukrama,  D.  M.,  Dewi,  N. W.  S.,  Praja,  R.  K.,  Nurmansyah, D.,  &  Widyadharma,  I.  P.  E. (2017).  Extract  of  earthworms (Lumbricus rubellus) reduced malondialdehyde  and  8-hydroxy- deoxyguanosine  level  in  male wistar  rats  infected  by  salmonella typhi.
Biomedical and Pharmacology Journal , 10 (4), 1765–1771.
Stark,  A.  C.  (2003).  Treatment  of  typhoid fever. British  Medical  Journal ,
2 (2347), 1677.
Sun,  Z.,  &  Jiang,  H.  (2017).  Nutritive Evaluation  of  Earthworms  as Human Food. Future Foods .
Waluyo,  J.,  Wahyuni,  D.,  &  Nuri,  N. (2019). Antipyretic effects of dried earthworm (Pheretima Javanica K.) In male white rat (Rattus Norvegicus)  with  typhoid  fever.
International  Journal  of  Scientific and  Technology  Research , 8 (8), 243–246.
Waluyo, J.,  Wahyuni, D., & Utami, W. S.
(2019).  Healing  effects  of  fresh earthworms  (Pheretima  Javanica K.)  for  typhoid  fever  induced  in
male  white  rat  (Rattus  norvegicus L.). International Journal of Recent Technology and Engineering , 8 (2), 2012–2014. WHO. (2020). Typhoid and other invasive salmonellosis (Vaccine- Preventable Diseases) . 1–13.