## MEMPELAJARI VIABILITAS ENKAPSULASI SEL PROBIOTIK
(LACTOBACILLUS PLANTARUM DAN STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS)

## PADA ES KRIM

## ( Study Viability Encapsulation of Probiotic Cells (Lactobacillus plantarum and
Streptococcus thermophilus) on Ice Cream)
Maryati Bilang 1*) , Mulyati Tahir 1) , dan Darmayanti Haedar 1)
*) email Penulis Korespondensi: mariyati_tekpert@yahoo.com

## ABSTRAK
Enkapsulasi  adalah  salah  satu  metode  untuk  melindungi  bakteri  dalam  kondisi lingkungan  yang  tidak  menguntungkan  seperti  pengolahan,  penyimpanan  dan  pencernaan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki efek enkapsulasi Lactobacillus plantarum dan  Streptococcus  thermopillus  pada  es  krim  selama  penyimpanan  beku  (-28oC).  Penelitian ini juga untuk menyelidiki ketahanannya terhadap kondisi asam lambung (pH 2,0) dan garam empedu  (0,5%),  dan  efeknya  pada  es  krim  organoleptik  dan  overrun.  Enkapsulasi  dilakukan menggunakan teknik emulsi dengan natrium alginat sebagai pelapis. Resistensi bakteri dilihat dari  jumlah  total  Bakteri  Asam  Laktat  selama  penyimpanan.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan (P> 0,05) pada organoleptik es krim Lactic Acid Bacterial  yang  dienkapsulasi  dan  tidak  selama  penyimpanan.  Nilai  overrun  es  krim  asam laktat bebas lebih besar daripada es krim dalam bakteri asam laktat yang dienkapsulasi. Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  ada  perbedaan  yang  signifikan  (P  <0,05)  pada  viabilitas Bakteri  Asam  Laktat  yang  dikemas  dan tidak selama penyimpanan.  Lactobacillus  plantarum dan Streptococcus thermopillus tanpa enkapsulasi telah berkurang sebanyak 1,25CFU Log g- 1  (12%)  dan 2,56 CFU  Log  g-1  (25%).  Sedangkan Lactobacillus  plantarum dan Streptococcus  thermopillus dengan  encapsulated  orespectively  menurun  menjadi  0,20  log CFU g-1 (2%) dan 1.45CFU Log g-1 (14%) setelah penyimpanan delapan minggu. Demikian pula, dalam kondisi asam lambung pH 2 dan garam empedu 0,5%, Bakteri Asam Laktat yang dienkapsulasi  memiliki  ketahanan  yang  lebih  baik  daripada  bakteri  asam  laktat  yang  tidak dienkapsulasi.  Oleh  karena  itu,  bakteri  asam  laktat  yang  dienkapsulasi  memiliki  viabilitas yang lebih baik terhadap suhu beku, asam lambung dan garam empedu selama penyimpanan beku.
Kata  Kunci  : es  krim,  probiotik, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermopillus, enkapsulasi

## ABSTRACT
Encapsulation  is  one  of  the  methods  of  protecting  bacteria  in  unfavorable environmental conditions such as processing, storage and digestion. The aim of this research was  to  investigate  the  encapsulation  effect  of  Lactobacillus  plantarum  and  Streptococcus thermopillus on ice cream during frozen storage (-28oC). The study also was to investigate its resistance  to  stomach  acid  condition  (pH  2.0)  and  bile  salt  (0.5%),  and  its  effect  on organoleptic  and  overrun  ice  cream.  Encapsulation  was  performed  using  an  emulsion technique  with  sodium  alginate  as  a  coating.  Bacterial  resistance  was  seen  from  the  total amount  of  Lactic  Acid  Bacteria  during  storage.  The  results  showed  that  there  was  no significant  difference  (P>0.05)  on  the  organoleptic  ice  cream  Lactic  Acid  Bacterial  were encapsulated and not during storage. The value of overrun ice cream free lactic acid bacteria
1*) Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan Departemen Teknologi Pertanian Universitas Hasanuddin Makassar , Indonesia
is  greater  than  the  ice  cream  in  encapsulated  lactic  acid  bacteria.The  results  showed  that there  was  significant  difference  (P<0.05)  on  the  viability  Lactic  Acid  Bacteria  were encapsulated  and  not  during  storage.  Lactobacillus  plantarum  and  Streptococcus thermopillus  without  encapsulation  has  decreased  as  much  1.25CFU  Log  g-1(12%)and 2.56CFU Log g-1 (25%). While Lactobacillus plantarum and Streptococcus thermopillus with encapsulated  orespectively  decreased  to  0.20  log  CFU  g-1(2%)  and  1.45CFU  Log  g-1 (14%)after eight weeks storage. Similarly, in gastric acid conditions pH 2 and 0.5% bile salts, encapsulated  Lactic  Acid  Bacteria  have  better  resilience  than  unencapsulated  Lactic  Acid Bacteria.Therefore,  encapsulated  lactic  acid  bacteria  have  better  viability  to  freezing temperatures, gastric acid and bile salts during frozen storage.
Keywords  : ice  cream,  probiotic,  Lactobacillus  plantarum,  Streptococcus thermopillus, encapsulation

## I. PENDAHULUAN
Probiotik merupakan mikroorganisme hidup  yang di  konsumsi  oleh  manusia maupun  hewan  serta  bermanfaat  bagi kesehatan  seperti  mencegah  diare  karena dapat  melawan  rotavirus,  menstimulasi sistem  imun,  mencegah  pembengkakan usus  besar  (irritable  bowel  diseases), memberi  manfaat  bagi  penderita  intoleran laktosa,  mengatasi  alergi,  menurunkan resiko kanker, mencegah infeksi patogen di saluran  pernapasan,  mencegah  konstipasi, dan menurunkan kolesterol (Schmidt, 2006).
Mikroorganisme  probiotik  umumnya berasal  dari  Bakteri  Asam  Laktat  (BAL). Bakteri  asam  laktat seperti Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Leuconostoc sp., dan Pediococcus sp. Lactobacillus  plantarum merupakan  BAL gram  positif    homo fermentatif.  Bakteri  ini dapat  tumbuh  pada pH 3,0-4,6 memiliki kemampuan menghambat  bakteri  patogen  dan  lebih tahan  terhadap  asam  dari  pada  jenis Streptococcus
sp. Streptococcus thermophilus merupakan BAL yang bersifat termodurik,  homofermentatif  yang memilki pH  optimum  6,5  dan  akan  terhenti pertumbuhannya pada  pH  4,2-4,4. Selain menghasilkan  asam  laktat, Streptococcus thermophilusjuga menghasilkan enzim laktase  yang  berfungsi  mencerna  laktosa dalam  susu (Gilliland,  Staley,  &  Bush, 1984).
Es  krim  merupakan  hidangan  beku yang  memiliki  kandungan  gizi  tinggi dan
banyak  digemari  masyarakat. Penggunaan probiotik  pada  es  krim  dapat  berperan penting dalam mencegah berbagai permasalahan  saluran  pencernaan. Namun,
Selama proses pembekuan es krim kemungkinan dapat terjadi  kerusakan  sel BAL karena  perbedaan  sensitivitas  untuk setiap  jenis  mikroba  terhadap pembekuan. Kerusakan  akibat  proses  pembekuan  ini mengakibatkan  perubahan  morfologi  sel, struktur sel, perubahan fungsi sel BAL dan perubahan stabilitas genetik BAL atau daya tumbuh  kembali, sehingga saat  dikonsumsi dan di  dalam sistem  saluran  pencernaan jumlah BAL menurun dan tidak mencukupi ketika sampai di kolon.
Menurut (Krasaekoopt,  Bhandari,  & Deeth,  2003) dosis  yang  dibutuhkan  untuk mendapatkan efek kesehatan setelah mengonsumsi  probiotik  tergantung  dari strain  probiotik  yang  digunakan.  Secara umum  efek kesehatan  tersebut  akan diperoleh  bila  mengonsumsi  probiotik sekitar 10 6 -10 7 cfug -1 per hari. Jumlah yang cukup  menurut (FAO/WHO,  2002) adalah 10 6 -10 8 cfu/g  dan  diharapkan  dapat berkembang  menjadi  10 12 cfu/g  di  dalam kolon.  Sedangkan  menurut International Dairy  Federation (IDF)  standar  jumlah minimum  probiotik  hidup  sebagai  acuan adalah  10 6 koloni/ml  pada  produk  akhir. Oleh  karena  itu  viabilitas  probiotik  dalam produk dan  selama  penyimpanan perlu diperhatikan.
Enkapsulasi merupakan  suatu  cara untuk melindungi  bakteri  dari  faktor-faktor
lingkungan yang berbahaya (ekstrim)
seperti  pemanasan,  pembekuan  dan  pH rendah  bagi  bakteri  tersebut  melalui  proses penyalutan  atau  melapisi  suatu  zat  inti dalam  hal  ini  BAL  dengan  suatu  lapisan dinding  polimer. Keuntungan  enkapsulasi adalah  memiliki  membran  semipermeabel, bulat,  dan  kuat  sehingga  sel  bakteri  dapat bertahan pada kondisi ekstrim. Berdasarkan hal tersebut, maka penting untuk mengetahui  proses  mikroenkapsulasi  serta pengaruh  enkapsulasi terhadap  viabilitas BAL  (probiotik)  di  dalam  es  krim  selama
penyimpanan  beku  dan  setelah  diuji ketahanannya  terhadap simulasi asam lambung dan cairan empedu. Sehingga perlu dirumuskan bagaimana  viabilitas  dan  daya  tumbuh kembali sel probiotik Lactobacillus plantarum dan Streptococcus thermopillus terenkapsulasi  pada  es  krim  dan  selama penyimpanan beku,
pengaruh sel Lactobacillus  plantarum dan Streptococcus thermopillus terenkapsulasi  terhadap  cairan asam  lambung  dan  garam  empedu  secara imulasi serta pengaruh penambahan enkapsulasi  probiotik  atau  BAL terhadap nilai  overrun  es  krim  dan  bagaimana pengaruh penambahan enkapsulasi
probiotik atau BAL terhadap mutu organoleptik es krim. Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah mengkaji viabilitas sel probiotik Lactobacillus  plantarum dan Streptococcus thermopillus yang terenkapsulasi di  dalam es krim selama penyimpanan beku, mengetahui pengaruh ketahanan enkapsulasi terhadap BAL selama berada di dalam  simulasi  asam  lambung  dan  garam empedu, serta pengaruh penambahan enkapsulasi  terhadapat mutu  dan  daya terima  es  krim. Hasil  dari  penelitian  ini diharapkan dapat memberi informasi ilmiah mengenai  pengaruh  enkapsulasi  terhadap viabilitas sel probiotik Lactobacillus plantarum  dan  Streptococcus  thermophillus selama penyimpanan beku, di dalam sistem pencernaan serta terhadap mutu es krim.

## II. METODOLOGI PENELITIAN

## 2.1 Alat
Peralatan  yang digunakan  dalam penelitian  ini meliputi vortex,  timbangan analitik,  erlenmeyer,  gelas  piala, hot plate,magnetick  stirrer,  laminar  air  flow, autoklaf, inkubator, pH meter, pipet volume, cawan petri, tabung reaksi, corong penyaring, bunsen, jarum ose,tabung durham,Sentrifugator,  Mikroskop, shaker inkubator 2.2 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  natrium  alginat (food grade), kultur murni Lactobacillus plantarum (FMIPA-UH) dan Streptococcus thermopillus (UGM),aquades,CaCl 2 0.1  M, minyak  kedelai (Mazola),  NaCl (Merck), gliserol, lesitin nabati, bile
salt(Himedia),MRS-Broth (Merck),  MRS- Agar (Merck), kapas, aluminium foil, tissue, buffer fosfatpH 7, HCl 0,1 M, Alkohol 70%, NaOH.

## 2.3 Prosedur Penelitian
Penelitian  terdiri  atas pembuatan bakeri  asam  laktat  terenkapsulasi  dan pembuatan  es  krim  probiotik.  Kemudian pengamatan  terhadap  total  BALselama penyimpanan  pada  es  krim,  serta  pada simulasi  asam  lambung dan garam  empedu yang  disertai  uji  pH  dan  total  asam. Selain itu  dilakukan  pengamatan  organoleptik  dan overrun pada es krim probiotik.

## 2.3.1 Proses Mikroenkapsulasi
Masing-masing biomassa kultur murni  Lactobacillus  plantarum  (10,27  Log CFU/ml)  dan  Streptococcus thermopillus (10,33  Log  CFU/ml)sebanyak 12  mL dimasukkan ke dalam 60 ml larutan natrium alginat  4%  steril  dan  di  homogenkan. Campuran kultur murni dan natrium alginat ditambahkan  ke  dalam  100  mL  minyak kedelaiyang mengandung 0.2% lesitin yang diputar konstan dengan pengaduk magnetik (200 rpm). Setelah 5 menit, 100 mL larutan CaCl2  0.1  M  ditambahkan  untuk  memecah
emulsi  selama  30  menit.  Kapsul-kapsul yang  telah  terbentuk  kemudian  dipisahkan dengan  cara  disentrifugasi (350  rpm) selama 10 menit pada suhu 4oC dan dicuci dua  kali  dengan  akuades.  Manik-manik dipisahkan  dengan  kertas  saring  lalu  dicuci kembali dengan 0,85% NaCl yang mengandung 5% gliserol, kemudian dipindahkan ke dalam cawan petri steril dan disimpan dalam refrigerator (7-1oC). Bakteri  asam  laktat setelah  dienkapsulasi dihitung  melalui  disitegrasi  pada  buffer fosfat pH 7.0 selama 5 menit menggunakan vortex,  lalu  dilakukan  pengenceran  dan diinkubasi  pada  MRSA  ke  dalam  cawan petri pada suhu 37oC selama 48 jam.

## 2.3.2 Pembuatan Es Krim
Es  krim  di  buat  dengan komposisi ekstrak terung belanda 10%, susu skim 30%, susu  fullcream bubuk 29%,whypedceram 12%, gula  16%,  0,5% karagenan  dan kuning  telur.  Bahan-bahan dihomogenisasi menggunakan mixer(1000 rpm) dan
kemudian  dipasteurisasi pada  suhu  80°C selama  30  detik. Campuran  didinginkan pada suhu 5°C selama 4 jam. Es krim dimix kembali selama 15 menit. Dua kultur murni Bakteri Asam Laktat Lactobacillus plantarum dan Streptococcus thermophillus
tanpa  di enkapsulasi dan terenkapsulasi masing-masing di inokulasi  ke  dalam campuran  es  krim  sebanyak  4% kemudian di inkubasi  pada suhu 37°C hingga  selama 4  jam.  Setelah  4  jam,  es  krim  disimpan pada suhu -28 o C.

## 2.3.3 Parameter Pengamatan
Penelitian berdasarkan pengaruh viabilitas BAL selama penyimpanan 56 hari dengan selang waktu pengamatan setiap 14
hari. Parameter  yang  diamati  dalam penelitian  terdiri  dari:  (1) Total  Bakteri Asam  Laktat  menggunakan  metode Total Plate  Count (TPC),  (2) Derajat  Keasaman (pH),  (3)  Total  Asam  Tertitrasi, (4) Ketahanan  pada  simulasi  asam  lambung (pH 2), (5) Ketahanan pada Garam Empedu (0.5%),  (6) Overrun  (tanpa  penyimpanan), (7) uji organoleptik (uji hedonik).

## 2.3.4 Desain Penelitian
Desain penelitian menggunakan Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  pola faktorial berdasarkan  dua  faktortial  dengan dua  kali  ulangan. Faktor  pertama adalah penggunaan  jenis  BAL  (Lactobacillus plantarum bebas  (LpB), Lactobacillus plantarum enkapsulasi (LpE), Streptococcus  thermopillus bebas  (StB), dan Streptococcus thermopillus enkapsulasi (StE)). Faktor kedua adalah lama penyimpanan es krim probiotik(0 (kontrol), 14, 28, 42, dan 56 hari). Sehingga diperoleh kombinasi perlakuan 4 × 5 × 2 atau sebanyak 40  perlakuan.  Penjabaran  perlakuan  dapat dilihat  pada  tabel  1  matriks  perlakuan penelitian
BAL P0 P1 P2 P3 P 4 LpB LpB. P0 LpB. P1 LpB. P2 LpB. P3 Lp B.P 4 LpE LpE. P0 LPE. P1 LpE. P2 LpE. P3 LpE .P4 StB StB. P0 StB. P1 StB. P2 StB.P 3 StB .P4 StE StE. P0 StE. P1 StE. P2 StE.P 3 StE. P4 2.3.5 Analisa Data Data dianalisis dengan metode deskripsi  kuantitatif  antar  perlakuan.  Data secara  statistik  diolah  menggunakan  sidik ragam  ANOVA,  apabila  terdapat  pengaruh yang  nyata maka dilanjutkan dengan  uji Duncan  untuk  mengetahui  perbedaan  antar perlakuan

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1 Total Bakteri Asam Laktat
Pengujian  total  bakteri  asam  laktat (BAL)  pada  es  krim  bertujuan  mengetahui banyaknya  BAL  yang  dapat  bertahan  pada suhu  beku  selama  penyimpanan.  Hasil  dari pengujian  total  bakteri  asam  laktat  dapat dilihat  pada  Gambar  01. Hasil analisa ANOVA penyimpanan beku  menunjukkan
bahwa lama penyimpanan berpengaruhnyata  (P<0,05) terhadap  total BAL.Berdasarkan  Gambar  01 total  bakteri asam laktat selama penyimpanan.
Lactobacillus  plantarum dan Streptococcus thermopillus bebas  mengalami  penurunan dan  viabilitas masing-masing  sebesar  1.25 Log  CFU  g -1 (12%) dan  2.56  Log  CFU  g -1 (25%). Sedangkan Lactobacillus plantarum dan Streptococcus
thermopillus
terenkapsulasi  mengalami  penurunan dan viabilitas 0.20  Log  CFU  g -1 (2%) dan  1,45 Log CFU g -1 (14%).

## Gambar 1 Perubahan total bakteri asam laktat selama penyimpanan
Penggunaan  enkapsulasi  pada  BAL menunjukkan  jumlah  BAL  yang  mampu bertahan  selama  penyimpanan  beku  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  BAL  tanpa enkapsulasi.  Alginat sebagai  penyalut enkapsulasi  memberi  perlindungan  BAL sehingga  tidak  terjadi  kontak  langsung antara  BAL  dan  lingkungan  es  krim  atau suhu  beku  dan  sebagian  besar  sel  BAL mampu  bertahan  selama  penyimpanan.  Hal tersebut  sesuai  dengan (Chávarri  et  al., 2010), bahwa enkapsulasi bertujuan melindungi bakteri dari factor-faktor lingkungan berbahaya bagi bakteri.
Sedangkan  BAL  tanpa  enkpasulasi (bebas) mengalami kontak langsung dengan pembekuan  menyebabkan  permeabilitas membran sel bakteri menurun bahkan rusak akibat  perubahan  lingkungan. Perubahan permeabilitas  sel  menyebabkan  larutan intraseluler terutama air dari sel keluar yang berakibat pada terjadinya kerusakan
osmotik  sel  dan  sel  menjadi  stress kemudian kehilangan  keseimbangan.  Hal ini  sesuai  dengan  pernyataan (Cahyanti, 2008) bahwa Temperatur ekstrim menyebabkan  inaktivasi  enzim-enzim  dan fungsi  struktur  sel.  Kematian  BAL  akibat pembekuan  dapat  disebabkan  oleh  bakteri mengalami stressakibat kondisi  lingkungan yang  jauh  berbeda  dari  suhu  optimum pertumbuhannya  sehingga  mempengaruhi ketahanan hidupnya.
ViabilitasLactobacillus plantarumterenkapsulasi selama penyimpanan lebih besar dari Streptococcus thermopillusterenkapsulasi. Hal ini disebabkan oleh perbedaan laju pertumbuhan  sel  masing-masing  BAL  dan lama penyimpanan beku. Laju Streptococcus  thermopillus lebih  cepat  dari Lactobacillus plantarum.Lactobacillus plantarum membutuhkan  waktu  empat  jam untuk melewati fase adaptasi pada lingkungannya sedangkan Streptococcus thermopillushanya  membutuhkan  waktu dua  jam  untuk  melewati  fase  adaptasi  dan memasuki  fase  eksponensial. Pada  fase adaptasi  terjadi  pembelahan  sel  secara lambat  dalam  rangka  penyesuaian  diri terhadap  lingkungan  baru  BAL.  Setelah melewati fase adaptasi bakteri akan tumbuh membelah  diri  secara  eksponensial  dan menghasilkan  banyak  asam  laktat  sebagai hasil  metabolit  BAL. Hal  ini  menyebabkan perbedaan hasil asam laktat yang dihasilkan dari  kedua  bakteri pada  saat pemeraman dalam  es  krim selama  empat  jam. Streptococcus  thermopillus menghasilkan lebih  banyak  asam  laktat  menyebabkan matriks penyalut merenggang dan pori-pori penyalut  membesar. Selain  itu,  selama penyimpanan kemungkinan terjadi pemutusan  sebagian  matriks  sehingga mempengaruhi BAL. Menurut (Ellenton,  1998) bahwa semakin  lama  penyimpanan  maka  jumlah sel  yang  diimobil  juga  semakin  menurun. Penurunan  jumlah  sel  yang  terimobil disebabkan  karena  gel  dari beads yang terbentuk  dipengaruhi  oleh  adanya  ion kalsium yang kekokohannya akan menurun
7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 0 1 4 2 8 4 2 5 6 To ta l B ak te ri As am La kt at (L og CF U /g r)
Lama Pemyimpanan (Hari ) Lactobacillus plantarum bebas
Lactobacillus plantarum enkapsulasi
Streptococcus thermhopillus bebas Streptococcus thermhopillus enkapsulasi
apabila  berada  pada  kondisi  dimana terdapat agen pengkelat atau ion monovalen yang mengabsorb ion kalsium seperti asetat, laktat  dan  fosfat. (Florenzia,  2014) juga memaparkan bahwa  selama  penyimpanan suhu  rendah  terjadi  pemutusan  Ca-alginat, sehingga  matriks  sel  imobil  menjadi longgar.

## 3.2 Nilai pH
Pengukuran  derajat  keasaman  es  krim untuk mengetahui tingkat keasaman es krim selama masa penyimpanan es  krim.  Prinsip pengukuran nilai  pH  yaitu  pengukuran konsntrasi ion H+ oleh elektroda pH meter.

## Gambar 2 Derajat keasaman (pH) Es krim selama penyimpanan 56 hari
Hasil analisa ANOVA menunjukkan bawa lama penyimpanan berpengaruh nyata (P<0.05) terhadap derajat keasaman es krim. Berdasarkan Gambar 02 secara keseluruhan, terjadi  kenaikan  pH  selama  penyimpanan hari  ke-0  hingga  hari  ke-56.  Peningkatan nilai  pH  disebabkan  perubahan  aktifitas BAL.
Selama masa penyimpanan beku BAL mengalami  dorman  dan  kematian  akibat tekanan  osmotik  selama  penyimpanan, menyebabkan BAL tidak mampu melakukan aktifitas metabolisme dan menghasilkan asam laktat selama penyimpanan  beku.  BAL  terenkapsulasi memiliki pH yang relatif konstan disebabkan  penyalut  enkapsulasi  yang membatasi  hasil  metabolit  sel  berupa  asam laktat  keluar  dari  penyalut  enkapsulasi.
BAL tanpa perlakuan enkapsulasi
mengalami kontak langsung dengan
lingkungan  beku.  Suhu  beku  menyebabkan BAL  mengalami  perubahan  membran  sel yang  menyebabkan  terjadinya  osmotic injury pada  protein  sel  dan  mengakibatkan kematian sel. Rendahnya sel BAL bertahan hidup menurunkan jumlah ion H+ terdisosiasi pada es krim. Sehingga nilai pH mengalami kenaikan. Hal ini sesuai dengan pernyataan (Soro  &  Thonart,  2010), bahwa penurunan  konsentrasi  ion  H+  dalam medium  pertumbuhan  mikroba  pada  suhu pembekuan disebabkan terganggunya keseimbangan  sifat  permeabilitas  selektif pada membran sel terhadap elektrolit antara sel dengan lingkungannya. Hal ini mengakibatkan perubahan osmolaritas internal  sel  yang  selanjutnya  berdampak pada  kematian  sel.  Peningkatan  persentase elektrolit  dalam  sel  yang  erat  hubungannya dengan  penurunan  persentase  sel  yang hidup.

## 3.3 Total Asam Tertitrasi
Analisa  total  asam  dilakukan  pada  es krim  adalah  berdasarkan  banyaknya  asam- asam  yang  bereaksi  dengan  NaOH  dari keseluruhan  jenis  asam, baik  asam  yang terurai  (terdisosiasi)  maupun  yang  tidak terurai(tidak terdosiasi) dalam es krim

## Gambar 3 Total asam tertitrasi Es krim selama penyimpanan 56 hari
Hasil  analisa  ANOVA  menunjukkan lama  penyimpanan  es  krim  probiotik berpengaruh  nyata  (P<0.05)  terhadap  total asam  tertitrasi. Berdasarkan Gambar  03, bakteri asam laktar terenkapsulasi memiliki
4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 0 1 4 2 8 4 2 5 6 N ilai p H Lama Penyimpanan (Hari) Lactobacillus plantarum Bebas Lactobacillus plantarun enkpsulasi
Streptococcus thermophillus bebas Streptococcus thermophillus enkapsulasi 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0 1 4 2 8 4 2 5 6 To tal A sam T er tit ras i ( % ) Lama Penyimpanan (Hari)
Lactobacillus plantarum Bebas Lactobacillus plantarun enkpsulasi Streptococcus thermophillus bebas Streptococcus thermophillus enkapsulasi
nilai  total  asam  yang  relative  stabil.  Hal tersebut  disebabkan penyalut  alginat  yang melindungi BAL membatasi keluar masuknya  nutrisi  dan  hasil  metabolit  sel sehingga asam laktat pada BAL terenkapsulasi  tidak  sepenuhnya  tertitrasi. Sedangkan  pada  BAL  bebas  mengalami penurunan  nilai  total  asam.  Penurunan tersebut sejalan dengan kenaikan angka pH atau  derajat  asam  pada  es  krim.  Penurunan total asam juga disebabkan selama penyimpanan beku BAL mengalami dorman  dan  sebagian  sel  mengalami kematian.  Kematian  dipicu  akibat  tekanan osmotik  lingkungan.  Hal  ini  sesuai  dengan pernyataan (Soro  &  Thonart,  2010) bahwa pembekuan mengakibatkan perubahan osmolaritas  internal  sel  yang  selanjutnya berdampak  pada  kematian  sel. Menurut (Mulyani  S,  Legowo,  &  Mahani,  2008) kadar  asam  menurun  seiring  dengan menurunnya  aktivitas  bakteri,  ditandai dengan  semakinberkurangnya  jumlah  BAL yang masih hidup (beraktivitas).

## 3.4 Ketahanan  pada  Simulasi  Asam Lambung (pH2)
Salah satu syarat diperolehnya manfaat probiotik dari Bakteri Asam Lambung ialah mampu  bertahan  selama  melewati  saluran pencernaan, diantaranya asam lambung dan garam  empedu.  Dalam  penelitian  ini kondisi asam lambung secara simulasi yaitu pH  2.  Sebagaimana dengan  pernyataan (Banyuaji, Rahayu, & Utami, 2009), bahwa kondisi  asam  (pH2)  merupakan  kondisi yang  hampir  sama  dengan  kondisi  asam lambung yang mana terdapat sekresi HCl.
Gambar 4 Total Bakteri Asam Laktat es krim dalam simulasi asam lambung (pH2)
Hasil  analisa  ANOVA  menunjukkan bahwa  lama  penyimpanan  berpengaruh nyata  (P<0.05)  terhadap  viabilitas  BAL pada  simulasi  asam  lambung  (pH2). Gambar  04.  Memperlihatkan  jumlah  BAL mengalamai  penurunan selama  berada dalam pH rendah.
Sel BAL tanpa  enkapsulasi  (bebas) mengalami penurunan yang lebih besaryaitu Lactobacillus  plantarum 4,11 Log CFU gr -1 dan Streptococcus thermopillus 3.96  Log  CFU  gr -1 dengan presentase  penurunan  viabilitas  masing- masing  bakteri  adalah31%  dan  38%. Sedangkan BAL terenkapsulasi yaitu Lactobacillus plantarummengalami
penurunan  2.98  Log  CFU  gr -1 dan Streptococcus  thermopillus 3.56  Log  CFU gr -1 dengan  presentase  penurunan  viabilitas kedua  bakteri  sebesar  24%  dan  37%. Hal ini  disebabkan  Sel tanpa  enkapsulasi  akan mengalami  kontak  langsung  pada  kondisi pH  rendah  sehingga  angka  kematian  sel lebih banyak dibandingkan dengan sel yang terenkapsulasi. Lamanya penyimpanan menyebabkan terjadi penurunan permeabilitas  dan  viabilitas  sel  sehingga selama  berada  dalam  pH  rendah  BAL  sulit melakukan  aktifitas  metabolisme  dan  tidak mampu  bertahan.  Asam  seperti  HCl  yang ditemukan dalam lambung manusia merupakan  oksidator  kuat  yang  dapat mengoksidasi dan mengganggu
keseimbangan biomolekuler sel.
Sel  terenkapsulasi  juga  mengalami penurunan disebabkan membran dari matrik kalsium  alginat  terdegradasi  pada  kondisi asam  rendah  dan  kehilangan  kestabilannya akibat  senyawa  laktat  yang  dihasilkan bakteri selama  penyimpanan.  Kalsium alginat yang kehilangan kestabilan
menyababkan ikatan kalsium alginat merenggang  dan  BAL  mudah  keluar  dari penyalut  serta  cairan  asam  lebih  mudah masuk  dan  menyebabkan  kerusakan  sel. Hal ini sesuai dengan pernyataan (Krasaekoopt et al., 2003), bahwa membran kalsium alginat mudah terdegradasi dengan cepat  pada  pH  rendah  dan  kehilangan kestabilannya jika terdapat senyawa
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 0 1 4 2 8 4 2 5 6
To ta l Ba kt er i A sa m La kt at P ad a pH 2 Se la m a 2 Ja m (L og C FU/ gr ) Lama Penyimpanan (Hari) Lactobacillus plantarum bebas Lactobacillus plantarum enkapsulasi Streptococcu s thermhopillu s bebas
pengkelat  seperti  fosfat,  laktat,  dan  sitrat. Hasil penelitian (Krasaekoopt, Bhandari, & Deeth,  2004) dengan  menggunakan  TEM (transmission electronmicroscopy) perbesaran  6000X  menunjukkan  bentuk permukaan beads yang  hanya  diselubungi oleh  satu  matrik,  yaitu  natrium  alginat menunjukkan  masih  banyaknya  rongga yang tidak menutupi permukaan enkapsulasi sehingga  bakteri  dapat  keluar atau  menjadi  jalan  masuknya  asam  dan merusak sel bakteri.

## 3.5 Ketahanan  pada  Garam  Empedu
(0.5%)
Pengujian  ketahanan  pada  garam empedu bertujuan untuk mengetahui pengaruh  garam  empedu  pada  konstenrasi 0.5%  selama  dua  jam  pada bakteri  asam laktat  (BAL) es  krim selama penyimpanan. Pengujian  ini  dilakukan  berdasarkan  total bakteri  asam  laktat  (BAL)  setelah  berada dalam garam empedu. Menurut (Adawiyah, Hafsan,  &  Fatmawati,  2015) ketahanan terhadap garam empedu merupakan karakteristik  yang  penting  bagi  bakteri asam  laktat,  sebab  berpengaruh  terhadap aktivitasnya  dalam  saluran  pencernaan, terutama  saluran  usus  bagian atas  tempat empedu disekresikan.
Gambar 5 Total Bakteri Asam Laktat (BAL) dalam simulasi garam empedu
Hasil  analisa  sidik  ragam  ANOVA lama  penyimpanan  berpengaruh  nyata (P<0.05)  terhadap  viabilitas  BAL  pada 0.5%  garam  empedu.  Berdasarkan  gambar 05 secara  keseluruhan,  bakteri  asam  laktat baik bebas maupun terenkapsulasi
mengalami  penurun  selama  berada  dalam garam  empedu  0.5%  selama  2  jam. Sel BAL tanpa  enkapsulasi  (bebas) mengalami penurunan yang lebih besar yaitu Lactobacillus plantarum 2,97 Log CFU gr -1 dan Streptococcus  thermopillus 3,17  Log CFU  gr -1 dengan  presentase  penurunan viabilitas  masing-masing  bakteri  adalah 30% dan 32%. Sedangkan BAL terenkapsulasi yaitu Lactobacillus plantarum mengalami  penurunan  1,97  Log CFU  gr -1 dan Streptococcus  thermopillus
2,53  Log  CFU  gr -1 dengan  presentase penurunan  viabilitas  kedua  bakteri  sebesar 21% dan 26%. Penurun disebabkan selama penyimpanan  sel  bakteri  telah  mengalami penurunan permeabilitas sel terlebih dahulu sehingga  sel  ketika  masuk  pada  kondisi garam empedu sel tidak mampu mentoleransi sifat racun dari garam empedu.
Penurunan  jumlah  sel  mengindikasikan bahwa sebagian sel mengalami lisis sebagai dampak  dari  garam  empedu.  Struktur amphipatik dari taurachlorate dan glycholate yang  merupakan  senyawa  aktif mengemulsi lemak bereaksi dengan membrane  sitoplasma  bakteri  sehingga struktur  bakteri  mengalami  perubahan  dan berujung  pada  terjadinya  lisis  bakteri.
Keragaman  struktur  asam lemak  pada membran  sitoplasma  bakteri  menyebabkan perbedaan permeabilitas dan karakteristiknya sehingga
mungkin mempengaruhi  ketahannya  terhadap  garam empedu dan keberadaan  garam  empedu bagi mikroorganisme  di  dalam  usus  halus dapat  juga  disebut  “ Biological detergents ” yaitu  cairan  yang  memiliki  kemampuan untuk  melarutkan  fosfolipid,  kolesterol  dan protein.  Sebagian  besar  dari  senyawa tersebut  dapat  menyusun  membran  sel, sehingga menyebabkan sel mikroorganisme menjadi  hancur  (lysis).  Konsentrasi  garam empedu yang  tinggi  akan  menjadi  racun dan zat antimikrobia yang sangat keras.

## 3.6 Uji Organoleptik
3.6.1 Rasa 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 0 1 4 2 8 4 2 5 6 KE TA HA N AN P AD A GA RA M
EM PE DU (0. 5% ) S EL AM A 2 JA M JUM LA H SE L (C FU /g r) LAMA PENYIMPANAN (HARI) Lactobacillus plantarum bebas Lactobacillus plantarum enkapsulasi Streptococcus thermhopillus bebas Streptococcus thermhopillus enkapsulasi
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 1 1 5 3 0 4 5 6 0 SK O R T IN GK AT K ES UK
AA N
RA SA (1 -5 ) LAMA PENYIMPANAN (HARI) Lactobacill us plantarum Bebas Lactobacill us plantarum Enkapsula si Streptococ cus thermopill us Bebas 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 1 1 5 3 0 4 5 6 0 SK O R T IN GK AT K ES UK AA N
AR O M A (1 -5 ) LAMA PENYIMPANAN (HARI) Lactobacill us plantarum
Bebas
Lactobacill us plantarum Enkapsulas i Streptococ cus thermopill us Bebas
Pengujian  organoleptik  rasa  es  krim dilakukan  berdasarkan  tingkat  kesukaan panelis  terhadap  rasa  es  krim  selama penyimpanan

## Gambar 6 Tingkat kesukaan rasa es krim selama penyimpanan
Hasil  analisis  sidik  ragam  ANOVA menunjukkan  lama  penyimpanan  es  krim probiotik  menunjukkan  tidak  berpengaruh nyata (P>0.05) terhadap daya terima rasa es krim  probiotik.  Berdasarkan  gambar  06 Skor rasa rata-rata diperoleh 3,22
menunjukkan  adanya  daya  terima  panelis terhadap  es  krim.  Rasa  manis  dari  es  krim menutupi  rasa  asam  dari  es  krim  setelah pemeraman  sehingga  daya  terima  panelis cukup  tinggi  pada  es  krim.  Selama penyimpanan bakteri tidak mampu menghasilkan  asam  laktat  akibat  suhu pembekuan,  sehingga  kadar  asam  pada  es krim tidak mengalami kenaikan.
Tingkat  penerimaan panelis  secara keseluruhan pada produk fermentasi dengan starter BAL sangat dipengaruhi oleh tingkat keasaman produk, dimana tingkat keasaman yang semakin  meningkat akan  semakin menurunkan tingkat penerimaan panelis.

## 3.6.2 Aroma
Uji  oranoleptik  parameter  aroma  es krim  probiotik  dilakukan  berdasarkan tingkat  kesukaan  panelis  terhadap  es  krim probiotik selama penyimpanan. Hasil analisa  hedonik  pada  aroma  es  krim probiotik  dapat  dilihat  pada  gambar  07. Hasil  analisa  ANOVA  lama  penyimpanan tidak  berpengaruh  nyata  (P>0.05)  terhadap daya  terima  aroma  es  krim  probiotik Berdasarkan  gambar  07.  Keseluruhan  skor
aroma es krim adalah 3.13. Skor menunjukkan  aroma  es krim cukup  disukai oleh panelis.

## Gambar 7 Tingkat kesukaan aroma es krim selama penyimpanan
Aroma  didominasi  oleh  aroma  susu full  cream dan  aroma terung belanda. Aroma  khas  terung  memberi  nilai  tambah pada  aroma  es  krim.  Selain  itu,  Komponen bahan  penyusun  es  krim  berperan  terhadap pembentukan  aroma  es  krim.  Interaksi antara  komponen  protein,  lemak,  gula  dan buah  senyawa  volatile  buat  terung  belanda membentuk  aroma  yang  disukai  oleh panelis. komposisi  lemak  yang  tepat  pada bahan pangan akan mempengaruhi keseimbangan dari beberapa reaksi pembentukan  flavour  dan  selanjutnya  akan mempengaruhi  flavour  dan  aroma  secara keseluruhan dari makanan. Dan dilanjutkan oleh (Winarno,  2004),  bahwa komponen pembentuk aroma pada buah-buahan adalah senyawa-senyawa ester yang bersifat mudah menguap atau senyawa volatile.

## 3.6.3 Warna
Pengujian  organoleptik  warna  es  krim dilakukan  berdasarkan  tingkat  kesukaan panelis  terhadap  warna  es  krim  selama penyimpanan .
Gambar 8 Tingkat kesukaan aroma es krim selama penyimpanan
Hasil  analisa  ANOVA  menunjukkan lama penyimpanan tidak berpengaruh nyata (P>0.05)  antara  tingkat  kesukaan  warna panelis terhadap penambahan BAL es krim selama  penyimpanan.  Berdasarkan  gambar 08. es krim cukup diterima dan disukai oleh panelis  dengan  skor  rata-rata  3,13.  Warna es  krim  yang  dihasilkan  adalah  warna merah  mudah.  Warna  sebagian  besar diperoleh  dari  warna  susu  dan terung belanda.  Warna  enkapsulasi  yang  sama dengan  warna susu  bubuk  full cream mampu  tertutupi  dengan  penambahan warna merah pekat dari daging buah terung belanda. Terung belanda  memberi  warna alami pada es krim sehingga dapat diterima oleh panelis.

## 3.6.4 Tekstur
Tekstur merupakan  salah  satu  faktor sensori yang  berkaitan  dengan  tingkat kekerasan dan kelembutan es krim.
Pengujian  organoleptik  tekstur  es  krim dilakukan  berdasarkan  tingkat  kesukaan panelis  terhadap  warna  es  krim  selama penyimpanan.

## Gambar 9 Tingkat kesukaan tekstur es krim selama penyimpanan
Hasil  analisa  ANOVA  menunjukkan lama penyimpanan tidak berpengaruh nyata (P>0.05)  terhadap  daya  terima  tekstur  es krim probiotik. Berdasarkan gambar 09. Es krim  memiliki  nilai  rata-rata  3.44  yaitu cukup  disukai  oleh  panelis.  Es  krim memiliki  daya  kelembutan  yang  hampir sama walaupun dengan penambahan enkapsulasi BAL. Partikel enkapsulasi yang kecil  tidak  begitu  mempengaruhi  daya terima panelis. Kecilnya ukuran enkapsulasi membuat panelis tidak meyadari penanmbahan  enkapsulasi  pada es  krim. Hal  tersebut  menunjukkan  es  krim  masih memiliki  tekstur  yang  baik  walaupun dengan  penambahan  enkapsulasi.  Hal  ini sesuai  dengan (Haryanti  &  Zueni,  2015), bahwa tekstur  yang  baik  pada  es  krim sehingga dapat disukai oleh panelis.

## 3.7 Overrun
Uji Overran bertujuan untuk
mengetahui  pengaruh  enkapsulasi  terhadap perubahan  volume es  krim  selama. Nilai overrun merupakan  salah  satu syarat  mutu dari  es  krim. Nilai  overran  menunjukkan nilai  penambahan  volume  es  krim  setelah proses pengadukan. Berdasarkan gambar 10, nilai  overrun  es  krim  dengan  penambahan BAL  tanpa  enkapsulasi  memiliki  nilai overrun yang lebih tinggi.

## Gambar 10 Pengaruh enkapsulasi terhadap nilai overrun es krim
Hasil  analisa  sidik  ragam  ANOVA terhadap  perlakuan  bakteri  menunjukkan berpengaruh  nyata  (P<0.05).  Nilai  overrun dipengaruhi oleh susunan bahan padatan es
1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 1 1 5 3 0 4 5 6 0 SK O R TI N GK AT K ES UK
AA N W AR N A (1 -5 ) LAMA PENYIMPANAN (HARI) Lactobacill us plantarum
Bebas Lactobacill us plantarum Enkapsula si Streptococ cus thermopill us Bebas

## 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 1 1 5 3 0 4 5 6 0 SK O R TI N GK AT K ES UK AA N
TE KS TUR (1 -5 ) LAMA PENYIMPANAN (HARI) Lactobacillus plantarum Bebas Lactobacillus plantarum Enkapsulasi Streptococcus thermopillus Bebas Streptococcus thermopillus Enkapsulasi 65 67
59 62 Lactobacillus plantarum Streptococcus thermopillus N ila i Ov erru n (% ) PERLAKUAN Tanpa Enkapsulasi Terenkapsulasi
krim. Penambahan enkapsulasi membuat es krim  tidak  mengembang  sempurna  pada saat  pengocokan  akibat  dari  sedikitnya udara  yang  tertangkap.  Hal  ini  sesuai dengan pernyataan (Farida, 2005), meningkatnya julah padatan adonan mengakibatkan nilai overran menurun.
Nilai  overran  es  krim  dengan penambahan enkapsulasi memenuhi standar nilai  overrun  es  krim  khususnya  dalam skala  rumah  tangga.  Hal  ini  sesuai  dengan syarat  mutu  es  krim  oleh ([BSN].  Badan Standardisasi  Nasional,  1995),  yaitu 35- 50% untuk skala rumah tangga, sedangkan70-80% untuk skala industri.

## IV. KESIMPULAN
Kesimpulan  yang  diperoleh  dari penelitian ini adalah sebagai berikut 1.  Enkapsulasi  berpengaruh  nyata  pada viabilias sel BAL yang ditambahkan ke dalam  es  krim.  Enkapsulasi  mampu melindungi BAL dari suhu beku selama delapan minggu. Hasil penelitian terhadap total BAL menunjukkan viabilitas  sel  terenkapsulasi  lebih  baik dibandingkan  sel  tanpa  enkapsulasi selama penyimpanan beku.
2.  Enkapsulasi  pada  BAL  cukup  mampu menghambat  kerusakan  dan  kematian sel  BAL  selama  berada  dalam  kondisi asam  lambung  dan  garam  empedu secara simulasi.
3.  Es  krim  dengan  penambahan  BAL terenkapsul  memiliki  skor  daya  terima yang sama dengan BAL tanpa enkapsulasi  dan  cukup  disukai  oleh panelis baik yaitu segi rasa 3,22, aroma
3,13, warna 3,28dan tekstur 3,44.
4. Penambahan BAL terenkapsulasi menurunkan nilai overrun pada es krim.

## DAFTAR PUSTAKA
[BSN]. Badan Standardisasi Nasional.
(1995). SNI 01-3713-1995. Es Krim. Jakarta: Badan Standardisasi Nasional.
Adawiyah,  Hafsan,  &  Fatmawati.  (2015). Ketahanan  Bakteri  Asam  Laktat  Asal
Dangke  Terhadap  Garam  Empedu Sebagai Kandidat Probiotik. Prosidimg Seminar Nasional Mikrobiologi Kesehatan Dan Lingkungan  Jurusan Biologi, Fakultas Sains  Dan  Teknologi,  UIN  Alauddin Makassar, 164 – 173.
Banyuaji,  Rahayu,  &  Utami.  (2009). Viabilitas Lactobacillusacidopillus SNP  dalam  Es  Krim. Jurnal  Agritech, 28(4). Cahyanti. (2008). Karakteristik Susu Kambing  Fermentasi  Menggunakan Starter Probiotik Lactobacillus acidophilus  Pada  Lama  Penyimpanan yang Berbeda. Universitas Diponegoro. Semarang. Chávarri, M., Marañón, I., Ares, R., Ibáñez, F. C., Marzo, F., & Villarán, M. del C.
(2010). Microencapsulation of a probiotic  and  prebiotic  in  alginate- chitosan capsules improves survival in simulated  gastro-intestinal  conditions.
International Journal of Food Microbiology. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2 010.06.022 Ellenton. (1998). Encapsulation Bifidobacteria. University of Guelph. FAO/WHO.  (2002).  Guidelines  for  the evaluation  of  probiotics  in  food.  Food and  Agriculture  Organization  of  the United  Nations  and  World  Health Organization  Group  Report.(London Ontario,  Canada). FAO  Food  and Nutrition Paper 85.
Farida.  (2005). kekerasan  dan  Overrum  Es Krim yang Dibuat Menggunakan Susu Sapi  Maupun  Susu  Kambing  dengan
Persentase Gula yang Berbeda. Universitas Jenderal Soedirman Fakultas Peternakan. Purwokerto. Florenzia.  (2014). Pengaruh  Penambahan Isomalt danLama Penyimpanan terhadap  Ketahanan  Lactobacillus acidophilus Fncc 0051 Terimobildalam  Gel  Alginat  pada Asam  Lambung  danGaram  Empedu Secara  In  Vitro. Universitas  Katolik
Widya Mandala Surabaya. Surabaya.
Gilliland, S. E., Staley, T. E., & Bush, L. J.
(1984).  Importance  of  Bile  Tolerance of Lactobacillus acidophilus Used as a Dietary  Adjunct. Journal  of  Dairy Science. https://doi.org/10.3168/jds.S0022- 0302(84)81670-7 Haryanti,  N.,  &  Zueni,  A.  (2015). Identifikasi  Mutu  Fisik  ,  Kimia  Dan Organoleptik  Dengan  Variasi  Susu Krim. Agritepa.
Krasaekoopt, W., Bhandari, B., & Deeth, H. (2003).  Evaluation  of  encapsulation techniques  of  probiotics  for  yoghurt. International Dairy Journal. https://doi.org/10.1016/S0958-
6946(02)00155-3
Krasaekoopt, W., Bhandari, B., & Deeth, H.
(2004).  The  influence  of  coating materials  on  some  properties  of alginate  beads  and  survivability  of microencapsulated  probiotic  bacteria.
International Dairy Journal. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2004.0 1.004
Mulyani  S,  A.  M.,  Legowo,  A.  A.,  &
Mahani.  (2008). Viabilitas  Bakteri Asam  Laktat,  Keasaman  Dan  Waktu Pelelehan EsKrim Probiotik Menggunakan  Starter  Lactobacillus casei  dan  Bifidobacterium  bifidum. Universitas Diponegoro. Semarang. Schmidt,  A.  (2006).  Cytostatic  factor:  an activity that puts the cell cycle on hold. Journal
of Cell Science. https://doi.org/10.1242/jcs.02919 Soro, & Thonart. (2010). An improved test to  study  the  changes  in  membran permeability  during  rehydration  of freeze-dried Weissella paramesenteroides. The Open Biotechnology Journal, 4, 8 – 13. Winarno.  (2004). Kimia  Pangan  dan  Gizi. Jakarta: gramedia Pustaka Utama.