ISSN Cetak         : 2087-9423
ISSN Elektronik : 2085-6695

## HISTOLOGI, EKSTRAKSI DAN KARAKTERISASI KOLAGEN GELEMBUNG RENANG IKAN CUNANG Muarenesox talabon

## THE HISTOLOGICAL, EXTRACTION AND CHARACTERIZATION COLLAGENS
YELLOW-PIKE CONGER Muarenesox talabon
Dewi Setiyowati Gadi * ,Wini Trilaksani, dan Tati Nurhayati Departemen Teknologi Hasil Perairan, FPIK-IPB Kampus IPB Dramaga, Jl. Agatis, Bogor 16680 Jawa Barat Telp. (0251) 8622909-8622907, Fax (0251) 8622907
* E-mail: dewisetiyowati44@gmail.com

## ABSTRACT
By product Muarenesox talabon swim bladders can be used as a raw material for desperately needed in the food, biomedical, pharmaceutical, and cosmeceuticals industries. The aims of the research were to  observed  the  histological  and  determine  chemical  characteristics  of  swim  bladder  including proximate and amino acids; extraction of acid soluble collagen and determine the characteristics of collagen including proximate, pH, heavy metals, microbial, amino acids, functional groups, molecular weights, and thermal stability. The morphology of cunang swim bladder consists of outer, middle, and inner layers containing  collagen fibers;  33.67±0.71%wb  and  protein  whichwere  dominated  by three amino acids that were glycine, proline, and alanine. Pretreatment by 0.1 M NaOH for 8 hours (K1T4) and acid extraction by 0.25 M acetic acid for 72 hours (M1T3) was the best treatment yielding 14.51± 0.43% of collagen; having 12.12±0.04% wb of moisture; 88.54±0.08% wb of protein; 1.31±0.23% wb of fat; 0.17±0.03% wb of ash. Not detected any heavy metals (Pb, Hg, As, Cd). Acidity pH was 4.31 and  negative  of  E.  coli  and  Salmonella.  The  main  amino  acids  detected  were  glycine  241.06  mg/g; proline 88.73mg/g; and alanine 86,98 mg/g; FTIR spectra were revealed the presence of triple helix structures;  electrophoresis  patterns  consisted  of  136  kDa  of  mol  weight  of  α1  and  117  kDa  of  mol weight of α2 were characterisedto be type I collagen; and which had T max of 195.59ºC and ΔH 7.8113 J/g.
Keywords: acid extraction, swim bladder, collagens, thermal stability

## ABSTRAK
Limbah  gelembung  renang Muarenesox  talabon dapat  digunakan  sebagai  bahan  baku  kolagen  yang sangat  dibutuhkan  pada  industri  makanan,  biomedis,  farmaseutikal,  dan  kosmeseutikal.  Tujuan penelitian  adalah  untuk  mengamati  histologi  dan  menentukan  karakteristik  kimia  gelembung  renang meliputi  proksimat  dan  asam  amino;  ekstraksi  kolagen  larut  asam  dan  menentukan  karakteristik kolagen meliputi proksimat, pH, logam berat, mikroba, asam amino, gugus fungsi, bobot molekul, dan stabilitas termal. Morfologi gelembung renang ikan cunang terdiri dari lapisan luar, tengah dan dalam yang  mengandung serabut-serabut kolagen; protein 33,67±0,71% bb yang didominasi oleh tiga asam amino  yaitu,  glisina,  prolina,  dan  alanina.  Pra  perlakuan  dengan  NaOH  0,1  Molar  selama  8  jam (K1T4)  dan  ekstraksi  asam  pada  konsentrasi  0,25  Molar  selama  72  jam  (M1T3)  adalah  perlakuan terbaik  menghasilkan  rendemen  kolagen  14,51±0,43%;  kadar  air  12,12±0,04%  bb;  protein 88,54±0,08% bb; lemak 1,31±0,23% bb; abu 0,17±0,03% bb; tidak terdeteksi logam berat (Pb, Hg, As, Cd);  pH  4,31;    negatif  cemaran E . coli dan Salmonella .  Asam  amino  utama  adalah  glisina  241,06 mg/g;  prolina  88,73  mg/g;  dan  alanina  86,98  mg/g;  spektrum  FTIR  yang  mengungkapkan  adanya struktrur triple helix ; pola elektroforesis terdiri dari 136 kDa (α1) dan 117 kDa (α2) yang mencirikan kolagen tipe I; serta memiliki T max 195,59ºC dan ΔH 7,8113 J/g.
Kata kunci: ekstraksi asam, gelembung renang ikan, kolagen, kestabilan termal

## I. PENDAHULUAN
Potensi  sumber  daya  perikanan  tang- kap  Indonesia  tahun  2014  mengalami  per- tumbuhan sebesar 6.50 juta ton dibandingkan tahun  2013  sebesar  6.04  juta  ton  (KKP, 2015).  Dinas  Kelautan  dan  Perikanan Kabupaten  Indramayu  melaporkan  bahwa potensi  produksi  ikan  cunang Muarenesox talabon sebesar  1607.6  ton  (tahun  2011), 1334.5  ton  (tahun  2012),  dan  1062.4  ton (tahun  2013).  Pemanfaatan  ikan  cunang terdiri  dari  bagian  daging  dan  kulitnya  di- gunakan  sebagai  bahan  baku  pembuatan nugget ,  ikan  kaleng  dan  kerupuk,  sedangkan bagian  jeroan  termasuk  gelembung  renang yang proporsinya sebesar 2% dari berat total ikan cunang belum dimanfaatkan secara baik. Menurut  informasi  yang  diperoleh  bahwa beberapa  masyarakat  di  Kabupaten  Indra- mayu memanfaatkan gelembung renang ikan cunang  dengan  cara  pengeringan  matahari untuk dijual.
Pemanfaatan  gelembung  renang  ikan di  Indonesia  sudah  mulai  dilakukan  sejak tahun  2006,  yaitu  pemanfaatan  gelembung renang  ikan  patin  sebagai edible  film (Riyanto,  2006;  Trilaksani et  al .,  2006)  dan sebagai  kolagen  (Djailani et  al .,  2016); Kartika  dan  Trilaksani,  2016).  Beberapa  ke- unggulan  dari  gelembung  renang  ikan sebagai  sediaan  kolagen,  yaitu  ketersediaan- nya  cukup  melimpah  sebagai  limbah  dari industri  pengolahan  ikan  dengan  kandungan protein cukup tinggi. Kandungan protein dari beberapa  jenis  gelembung  renang  ikan  yang sudah diteliti, seperti gelembung renang ikan patin  setelah  dikeringkan  adalah  76,75%  bk (Riyanto,  2006);  ikan  tuna  sirip  kuning Thunnus  albacares yaitu  72,53%  bk  (Kaew- dang et  al .,  2014)  dan  juga  ikan  cunang Muarenesox  talabon yaitu  93,39%  bk (Kartika  dan  Trilaksani,  2016).  Hal  ini menunjukkan bahwa gelembung  renang ikan memiliki  komponen  kolagen.  Limbah  yang dihasilkan pada saat pengolahan ikan (tulang, sisik,  kulit  dan  jeroan)  dapat  mencapai  20- 60%  dari  total  bahan  baku.  Proporsi
gelembung  renang  ikan  yaitu  2%  dari  satu ekor  ikan  dengan  kandungan  kolagen  yang tinggi (Riyanto, 2006; Trilaksani et al ., 2006; Kartika dan Trilaksani, 2016).
Penelitian-penelitian tentang ekstraksi kolagen  dari  sumber  yang  aman  mulai  ber- kembang, di antaranya ekstraksi kolagen dari limbah hasil perairan mulai berkembang, dari kulit,  tulang,  sisik,  dan  gelembung  renang (Nagai  dan  Zuzuki,  2000).  Metode  ekstraksi kolagen  juga  menerapkan  metode  ekstraksi kolagen  yang  digunakan  pada  mamalia  dan unggas,  di  antaranya  ekstraksi  kolagen  larut asam  ( acid  solubilized  collagen/ ASC)  dan ekstraksi  kolagen  larut  enzim  pepsin  ( pepsin soluble  collagen/ PSC)  atau  enzim  papain. Karakteristik  kolagen  yang  diisolasi  dari hasil  perairan  merupakan  kolagen  tipe  I  dan memiliki  bobot  molekul  yang  lebih  kecil dibandingkan  dengan  kolagen  yang  berasal dari mamalia (Liu et al ., 2012; Sinthusamran et  al .,  2013;  Liu et  al .,  2015;  Kaewdang et al .,  2015;  Djailani et  al .,  2016;  Kartika  dan Trilaksani,  2016).  Rendemen  kolagen  larut asam  (ASC)  dari  gelembung  renang  ikan telah  diidentifikasi,  di  antaranya  gelembung renang ikan mas Hypophthalmichthys nobilis 14,6% bk (Liu et al ., 2012); ikan kakap putih ( Lates calcarifer ) 85,3% bk (Sinthusamran et al .,  2013),  ikan yellow  fin tuna Thunnus albacares 1,07% bk (Kaewdang et al ., 2015); ikan cunang Muarenesox talabon 10,29% bk (Kartika  dan  Trilaksani,  2016).  Metode ekstraksi  kolagen  larut  asam  (ASC)  juga diterapkan pada kulit ikan, di antaranya kulit ikan  nila  hitam  ( Oreochromis  niloticus ) menggunakan asam asetat 0,75 M dan waktu ekstraksi 16 jam yang menghasilkan rendemen  5,96%  (Putra et  al .,  2013);  kulit ikan kakap putih ( Lates calcarifer ) 15,8% bk dan rendemen kolagen dari ekstraksi menggunakan  enzim  pepsin  (43,6%  bk)  dan papain  (44,0%  bk)  lebih  tinggi  jika  diban- dingkan  dengan  ekstraksi  menggunakan asam  (Jamilah et  al .,  2013).  Hal  ini menunjukkan  bahwa  perbedaan  spesies, habitat  dan  proses  ekstraksi  kolagen  juga berpengaruh  terhadap  rendemen,  karakter-
istik  fisik,  kimia  dan  mikrobiologi  kolagen yang dihasilkan.
Kolagen (C 102 H 149 N 31 O 38 ) merupakan protein fibrilar ,  terdiri  dari  tiga  rantai polipeptida  ( triple  helix )  sebagai  komponen utama  penyusun  kulit  dan  tulang  yang mewakili  sekitar  25%  dari  total  berat  kering mamalia dan sangat dibutuhkan pada industri makanan,  kosmetik,  biomedis  dan  farmasi (Ogawa et  al .,  2004).  Menurut  Liu et  al . (2015), produksi kolagen komersial biasanya bersumber  dari  kulit  dan  tulang  sapi,  babi serta  unggas.  Hal  ini  menimbulkan  beberapa isu  penggunaan  yang  kurang  tepat,  seperti kontaminasi  biologis  yang  dapat  menimbul- kan  beberapa  jenis  penyakit,  seperti bovine spongiform  encephalophaty (BSE), trans- missible  spongiform  encephalophaty (TSE), foot  and  mouth  disease (FMD),  dan  infeksi cacing pita sehingga mendapat reaksi negatif dari  konsumen  yang  sadar  akan  pentingnya kesehatan.
Menurut  Regenstein et  al .  (2003) bahwa masalah budaya dan kepercayaan juga menjadi  pertimbangan  utama  dalam  meng- gunakan  kolagen  yang  bersumber  dari  sapi dan babi. Oleh karena itu, sangat dibutuhkan sumber alternatif bahan baku lainnya sebagai penghasil kolagen.
Kolagen  dari  hasil  perairan  dapat menjadi  alternatif  yang  perlu  dikembangkan untuk  menghindari  penggunaan  kolagen  dari mamalia dan unggas karena alasan kesehatan dan  kehalalan.  Salah  satunya  adalah  gelem- bung  renang  ikan  cunang M.  talabon yang potensinya  cukup  banyak  di  Kabupaten Indramayu.  Gelembung  renang  ikan  cunang memiliki  kandungan  protein  96,16%  bk (Djailani et  al .,  2016)  yang  didalamnya terdapat  kolagen.  Penelitian  ini  perlu  dilaku- kan  sebagai  salah  satu  upaya  pemanfaatan limbah  hasil  perairan,  sehingga  dapat meningkatkan  nilai  tambah  dari  gelembung renang  ikan,  disamping  itu  untuk  memper- oleh  informasi  tentang  gambaran  dari morfologi gelembung renang ikan cunang M. talabon dan  karakteristik  kolagen  larut  asam (ASC) yang sesuai dengan syarat mutu.

## II. METODE PENELITIAN

## 2.1. Waktu Penelitian  dan Lokasi Pengambilan Sampel
Penelitian  ini  telah  dilakukan  pada bulan  Februari  sampai  Juni  2016  di Laboratorium  Biokimia  Hasil  Perairan, FPIK-IPB,  Laboratorium  Bahan  Baku  Hasil Perairan  Teknologi  Hasil  Perairan,  FPIK- IPB,  Laboratorium  Pendidikan  dan  Diag- nostik FKH-IPB,  Laboratorium Bioteknologi Pusat  Antar  Universitas-IPB,  Laboratorium Departemen  Ilmu  dan  Teknologi  Pangan IPB,  Laboratorium  Pusat  Studi  Biofarmaka IPB,  dan  Laboratorium  Pusat  Penelitian Bioteknologi dan Bioindustri Indonesia.

## 2.2. Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dalam dua tahap, yaitu: preparasi dan karakterisasi bahan baku gelembung  renang  ikan  cunang,  dan  pra perlakuan,  optimasi  ekstraksi  dan  karak- terisasi fisik, kimia dan mikrobiologi kolagen larut asam (ASC).

## 2.2.1. Preparasi, Karakterisasi dan Histologi Gelembung Renang Ikan Cunang
Preparasi  dan  karakterisasi  gelem- bung renang ikan cunang, meliputi pencucian dengan akuades dan pengecilan ukuran 2 x 2 cm 2 menggunakan  gunting  dengan  tujuan untuk  mempermudah  dalam  tahapan  pra perlakuan  dan  ekstraksi.  Gelembung  renang ikan  cunang  juga  dipreparasi  menjadi preparat  histologi melalui tiga tahapan,  yaitu fiksasi  jaringan  dengan  larutan paraformal- dehide selama 1 minggu dan parafinisasi, pe- motongan  jaringan  serta  pewarnaan  dengan hematoksilin-eosin (HE) dan casson’s trichrome (CT).  Pewarnaan  HE  bertujuan untuk  menampilkan  struktur  morfologi  dan pewarnaan  CT  untuk  mengidentifikasi  ke- beradaan  protein  kolagen  pada  organ  gelem- bung  renang  ikan  cunang  dengan  teknik pewarnaan yang menggunakan dua atau lebih pewarna  anionik  yang  berhubungan  dengan phosphomolybdic atau asam fosfat. Asam ini
dapat  dicampurkan  dengan  pewarna  atau larutan  dari  reagen  yang  digunakan  dan kolagen  diwarnai  secara  selektif  oleh  salah satu  pewarna. phosphotungistic  acid dan orange  G berperan  dalam  mewarnai  sito- plasma  dan  inti  sel  (Kiernan,  1990).  Histo- logi merupakan suatu ilmu yang mempelajari struktur  dan  sifat  jaringan  secara  detail menggunakan mikroskop pada jaringan  yang dipotong tipis. Gambaran mikroskopik jaringan  gelembung  renang  ikan  cunang diawali dengan pembuatan preparat histologi. Pewarnaan  dan  pengamatan  preparat  histo- logi  bertujuan  untuk  melihat  gambaran  mor- fologi organ gelembung renang ikan cunang. Karakterisasi  kimia  gelembung  renang  ikan cunang,  meliputi  analisis  proksimat  (AOAC, 2005)  dan  kandungan  asam  amino  (Nollet, 1996).

## 2.2.2. Pra Perlakuan dan Optimasi Ekstraksi Kolagen
Pra  perlakuan  menggunakan  larutan alkali  (NaOH)  dan  ekstraksi  kolagen  larut asam  yaitu  menggunakan  asam  asetat (CH 3 COOH). Gelembung renang ikan cunang  yang  sudah  dipreparasi,  kemudian ditimbang  sebanyak  30  gram  dan  direndam dalam  larutan  NaOH  konsentrasi  0,1,  0,15 dan  0,2  M  selama  12  jam  pada  suhu  4°C (rasio  1:10  b/v).  Larutan  perendaman  NaOH diganti  setiap  dua  jam  kemudian  diukur protein  terlarutnya  dengan  metode  Bradford (1976).  Sampel  dinetralisasi  dengan  akuades untuk  menghilangkan  residu  larutan  NaOH (pH 7). Pra ekstraksi gelembung renang ikan cunang  terpilih  berdasarkan  hasil  analisis protein terlarut, kemudian dilanjutkan dengan optimasi ekstraksi kolagen larut asam.
Tahapan optimasi ektraksi atua hidrolisis  kolagen  larut  asam  (ASC)  meng- gunakan  larutan  CH 3 COOH  dengan  konsen- trasi 0,25, 0,50 dan 0,75 Mselama 24, 48 dan 72 jam pada suhu 4°C (rasio 1:6 b/v). Filtrat disaring, kemudian dipresipitasi dengan NaCl (2,6  M)  terhadap  0,5  M  buffer  trishidroksi- metilaminometana  pH  7,5  dan  disimpan selama  24  jam  pada  suhu  4°C.  Presipitat
dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan  10.000  rpm  (6.910xg)  selama  1 jam.  Pelet  dilarutkan  ke  dalam  0,5  M  asam asetat  (rasio  1:2  b/v)  dan  didialisis  terhadap 0,1  M  asam  asetat  dan  akuades  selama  24 jam  (rasio  1:10  b/v).  Dialisat  kemudian diliofilisasi  ( freeze dried ) untuk  memperoleh kolagen larut asam dalam bentuk kering.
Karakterisasi  fisik,  kimia  dan  mikro- biologi  kolagen  ekstraksi  asam,  meliputi pengukuran  kelarutan,  rendemen  liofilisasi, gugus  fungsi  dengan fourier  transform  infra red /FTIR  ( Belbachir et  al .,  2009 ),  bobot molekul  dengan sodium  dodecyl  sulphate- polyacrylamide  gel  electrophoresis /SDS- PAGE  (Laemmli,  1970),  analisis  proksimat (AOAC,  2005),  derajat  keasaman  (pH), logam berat yaitu arsen (As), kadmium (Cd), timbal  (Pb)  dan  merkuri  (Hg)  (SNI  I  01- 4866-1998,  SNI  01-2354.6-2006,  SNI  01- 2354.7-2006,  SNI  7387-2009),  cemaran mikrobiologi  yaitu  bakteri Escherichia  coli (SNI  01-2332.1-2006)  dan Salmonella (SNI 01-2332.2-2006),  asam  amino  dengan ultra performance liquid chromatography (UPLC) (Nollet,  1996),  stabilitas  termal  dengan diffrential  scanning  calorimetry (DSC) (Budrugeac et  al .,  2010).  Tujuan  dari karakterisasi  fisika,  kimia  dan  mikrobiologi kolagen  adalah  untuk  mengetahui  kuantitas dan  kualitas  kolagen  larut  asam  (ASC)  yang dihasilkan.

## 2.3. Rancangan Penelitian dan Analisis Data
Rancangan  percobaan  yang  diguna- kan  adalah  Rancangan  Acak  Lengkap  pe- ngamatan berulang (RAL in time ). Tahap pra perlakuan  meliputi  pemberian  konsentrasi NaOH  dengan  taraf  0,1;  0,15;  dan  0,2  M sebagai  faktor utama dan waktu  perendaman (2,  4,  6,  8,  10,  dan  12  jam)  sebagai pengamatan  berulang.  Respon  yang  diukur adalah  nilai  konsentrasi  protein  terlarut (mg/mL).  Tahap  optimasi  ekstraksi  meliputi pemberian  konsentrasi  asam  asetat  dengan taraf    0,25,  0,50  dan  0,75  M  dengan  satuan waktu  perendaman  24,  48  dan  72  jam.
Respon  yang  diamati  pada  tahap  optimasi ekstraksi asam asetat adalah kelarutan (gram) dan  persentasi  rendemen  kolagen  liofilisasi. Semua  perlakuan  diulang  sebanyak  3  kali. Data hasil penelitian yang diperoleh dianalisis  menggunakan  program  SAS  9.3 untuk mengetahui ragam (ANOVA) dan jika terdapat pengaruh nyata pada taraf perlakuan, maka dilanjutkan dengan uji duncan multiple range  test (DMRT)  pada  taraf  kepercayaan 95%.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1. Karakteristik Gelembung renang Ikan Cunang
3.1.1. Gambaran Mikroskopik Jaringan Hasil  pengamatan  dari  mikroskopik jaringan gelembung renang ikan cunang  dari pewarnaan hematoksilin-eosin (HE) disajikan pada  Gambar  1(a),  menunjukkan  bahwa gelembung  renang  ikan  cunang  terdiri  dari tiga  lapisan  yaitu  lapisan  luar,  tengah  dan dalam,  dengan  ciri  khas  masing-masing. Lapisan  luar  terbentuk  seperti  lapisan  tebal, tersusun  atas  serabut-serabut  halus  yang padat.  Lapisan  tengahmemiliki  serabut- serabut panjang dan tebal, serta memiliki inti sel  yang  ditunjukkan  dengan  warna  biru
kecoklatan.  Warna  merah  mendominasi lapisan  luar  dan  tengah,  sementara  untuk lapisan  dalam  didominasi  oleh  warna  biru dan  memiliki  serabut-serabut  yang  tipis  dan panjang.
Gambar  1  (b)  menunjukkan  jaringan gelembung  renang  ikan  cunang  setelah diwarnai  dengan casson’s  thricrome (CT). Warna  biru  berasal  dari  pewarnaan aniline blue yang mempertahankan warnanya setelah dilakukan  pencucian  dengan  alkohol  dan penjernihan  dengan  larutan xylol .Warna  biru yang  tertinggal  setelah  proses  dehidrasi  atau pemucatan warna casson’s trichrome menun- jukkan  jaringan  gelembung  renang  ikan cunang  mengandung  protein  kolagen.  Gam- bar  1  (b)  memperlihatkan  warna  biru  pada hampir  seluruh  lapisan  gelembung  renang, baik  di  lapisan  luar,  tengah  dan  dalam. Lapisan  dalam  memperlihatkan  beberapa spot  berwarna  merah  yang  menunjukkan jaringan gelembung renang ikan cunang juga memiliki jaringan otot polos. Dominan warna biru  pada  jaringan  gelembung  renang  ikan cunang  mengindikasikan  bahwa  organ  ge- lembung  renang  ikan  cunang  mengandung protein  kolagen,  sehingga  dapat  digunakan sebagai  sumber  bahan  baku  alternatif penghasil kolagen.
Gambar  1.  Visualisasi  sayatan  melintang  gelembung  renang  ikan  cunang,  (a)  pewarnaan hematoksilin-eosin (HE) dan (b) casson’s trichrome (CT).
3.1.2. Komposisi Proksimat
Analisis proksimat gelembung renang ikan  cunang  bertujuan  untuk  mengetahui kandungan  gizi  secara  kasar  ( crude )  dan menjadi  acuan  untuk  menentukan  proses  pra perlakuan  dan  ekstraksi  kolagen.  Karak- teristik kimia gelembung renang ikan cunang secara proksimat disajikan pada Tabel 1.
Limbah  gelembung  renang  ikan cunang  berpotensi  digunakan  sebagai  bahan baku  untuk  menghasilkan  kolagen  karena memiliki  kandungan  protein  cukup  tinggi, yaitu  33,67±0,71%  basis  basah  (bb)  atau 96,20%  basis  kering  (bk)  dibandingkan dengan  gelembung  renang  ikan  ikan yellow fin tuna Thunnus  albacares dan  gelembung renang ikan patin Pangasisus sp. (Kaewdang et  al .,  2014;  Riyanto,  2006).  Jonsson  and Vidarsson (2016) menyatakan bahwa, protein gelembung  renang  ikan  didominasi  oleh kolagen.  Kolagen  (C 102 H 149 N 31 O 38 )  adalah salah  satu  protein  yang  keberadaannya kurang  lebih  30%  dari  seluruh  protein  yang terdapat  di  tubuh  dan  merupakan  struktur organik  pembangun  tulang,  gigi,  sendi,  otot, dan kulit (Voet et al ., 2013).
Gelembung  renang  ikan  cunang  hasil penelitian memiliki kadar air 35,00±0,64%
bk  lebih  rendah  dibandingkan  dengan gelembung renang ikan yellow fin tuna, patin, dan bighead  carp (Kaewdang et  al .,  2014; Riyanto  2006;  Liu et  al .  2012).  Kadar  air dalam  suatu  bahan  terdiri  atas  air  bebas  dan air  terikat  secara  kimia,  dan  kadar  air  yang terukur  merupakan  air  bebas  dalam  bahan baku.  Kandungan  air  juga  ikut  menentukan kesegaran  dan  daya  tahan  suatu  bahan. Holma et al . (2013) menyatakan bahwa pada umumnya  ikan  terdiri  atas  70  sampai  84% air,  15-24%  protein,  0,1-22%  lemak  dan  1- 2%  mineral.  Kadar  lemak  (0,86±0,49%  bk), abu  (0,49±0,21%  bk)  dan  karbohidrat (2,43±0,31%  bk)  berhubungan  dengan  tahap pra  ekstraksi  yang  akan  diterapkan  pada proses  ekstraksi  gelembung  renang  yang akan  memberikan  keuntungan  di  antaranya efektif  dan  ekonomis  dari  sisi  waktu  dan biaya.  Tahapan  pra  ekstraksi  yang  dimaksud adalah  penghilangan  komponen  protein  non kolagen  ( deproteinase ),  lemak  ( defatting ), dan  mineral  ( demineralisasi ).  Komponen proksimat  menunjukkan  gambaran  bahwa gelembung  renang  ikan  cunang  sangat  ber- potensi  dimanfaatkan  mengingat  komponen utamanya  protein  (kolagen)  sebagai  sumber kolagen  terbarukan  dari  limbah  perairan.
Tabel 1. Komposisi proksimat limbah gelembung renang ikan.
Komposisi Proksimat Sumber Gelembung Renang Ikan (% Basis Basah) Cunang ( Muarenesox talabon ) 1 Cunang ( Congresox talabon ) 2 Cunang ( Muarenesox talabon ) 3 Tuna ( Thunnus albacares ) 4 Patin ( Pangasisus sp.) 5 Air 65,00±0,09 58,28±1,21 73,88±0,22 83,33 78,34 Protein 33,67±0,71 40,12±1,25 24,74±0,75 12,09 14,73 Lemak 0,31±0,11 0,43±0,05 0,50±0,05 1,44 0,03 Abu 0,17±0,04 0,47±0,06 0,27±0,03 0,29 0,05 Karbohidrat * 0,85±0,05 0,70±0,06 1,28±0,36 2,85 4,22
Keterangan: 1 Data penelitian, rerata ± SD dari 3 ulangan pada sampel yang sama;
2 Djailani et al . (2016);
3 Kartika dan Trilaksani (2016);
4 Kaewdang et al . (2014);
5 Riyanto (2006), dan
* by difference .

## 3.1.3. Komposisi Asam Amino
Kandungan  protein  pada  gelembung renang  ikan  cunang  tersusun  atas  17  jenis asam  amino  yang  dianalisis  sesuai  standar yang  ada  seperti  disajikan  pada  Tabel  2. Asam-asam  amino  merupakan  kumpulan peptida-peptida  yang  membentuk  suatu ikatan  sebagai  komponen  utama  penyusun protein.  Berdasarkan  strukturnya,  asam amino  (NH 2 )  terdiri  dari  sebuah  gugus amino,  gugus  karboksil  (COOH),  sebuah atom  hidrogen  (H),  dan  gugus  radikal  (R) yang terikat pada sebuah atom C atau dikenal sebagai  karbon  α  (Voet et  al .,  2013).  Asam amino  glisina,  prolina  dan  hidroksiprolina merupakan  asam  amino  utama  pembentuk kolagen  yang  jarang  ditemukan  pada  protein lain  selain  pada  kolagen  dan  elastin  (Katilli, 2009).  Tabel  2  menunjukkan  komponen asam  amino  utama  penyusun  kolagen  dalam gelembung  renang  ikan  cunang  yaitu  glisina
95,48 mg/g, prolina 40,37 mg/g, dan alanina 42,99 mg/g yang lebih tinggi jika dibanding- kan  dengan  asam  amino  gelembung  renang ikan cunang dari hasil penelitian Kartika dan Trilaksani  (2016)  yaitu  glisina  56,36,  mg/g, prolina 24,48 mg/g, dan alanina 23,21 mg/g. Asam glutamat juga cukup tinggi yaitu 40,34 mg/g yang hampir sama dengan asam  amino prolina.  Asam  amino  prolina  merupakan asam  amino  non  esensial  yang  dapat  disin- tesis  oleh  tubuh  manusia  dari  asam  glutamat dengan  bantuan  prekursor  suatu  asam  imino melalui reaksi kimia dengan bantuan -NADH ( Ngili,  2009 ).  Asam  amino  glisina  merupa- kan  asam  amino  yang  paling  dominan  pada bahan  baku  yang  mengandung  kolagen. Menurut  Katili  (2009),  asam  amino  glisin dapat bergabung dengan lisina dan vitamin C sehingga  membentuk  jaringan  kolagen, sedangkan  alanina  berfungsi  untuk  memper- kuat  membran  sel  dan  membantu  metabolis-
Tabel 2. Komponen asam amino gelembung renang ikan cunang ( Muarenesox talabon ).
Jenis Asam Amino Kadar Asam Amino (mg/g) M. talabon 1 M. talabon 2 Glisina ( Gly ) 95,98±0,23 56,36 Prolina ( Pro ) 40,87±0,81 24,48 Alanina ( Ala ) 42,99±0,73 23,21 Asam glutamat Glu ) 40,34±0,14 20,12 Asam aspartat ( Asp ) 23,33±0,34 11,40 Arginina ( Arg ) 38,97±0,44 19,27 Valina ( Val ) 11,10±0,28 6,05 Isoleusina ( Ile ) 5,23±0,12 2,92 Histidina ( His ) 4,45±0,83 2,60 Treonina ( Thr ) 14,33±0,79 7,24 Tirosina ( Tyr ) 2,37±0,50 1,31 Fenilalanina ( Phe ) 11,27±0,64 5,12 Serina ( Ser ) 12,19±0,57 6,50 Lisina ( Lys ) 20,17±0,42 10,41 Leusina ( Leu ) 10,87±0,40 6,05 Sisteina ( Cys ) 0,12±0,01 0,00 Metionina ( Met ) 8,76±0,69 5,25
Keterangan: 1 Data penelitian, 2 Kartika dan Trilaksani (2016).
me  glukosa  energi  tubuh.  Alanina,  aspartat, glutamat,  dan  serina  dibentuk  oleh  transami- nasi oksoacid yang sesuai. Asam amino non- esensial  lainnya  kemudian  diturunkan  oleh keempat asam amino ini (Ngili, 2009).

## 3.2. Pra Perlakuan dan Optimasi
Ekstraksi Kolagen Larut Asam (ASC)

## 3.2.1. Pra Perlakuan Gelembung Renang Ikan Cunang
Pra  perlakuan  sampel  gelembung renang  ikancunang  dilakukan  sebelum  eks- traksi  kolagen  untuk  mengeliminasi  protein non-kolagen, lemak, mineral, pigmen dan pe- ngotor lainnya sehingga  memudahkan  dalam proses  ekstraksi  kolagen.  Menurut  Sinthu- sarman et  al .  (2013),  proses  pra  perlakuan protein  non-kolagen  dapat  menggunakan larutan  alkali  seperti  natrium  hidroksida (NaOH). Larutan NaOH mampu meminimal- kan  kelarutan  protein  kolagen  dan  dapat menyebabkan terjadinya pembengkakan ( swelling )  pada  sampel  sehingga  memung- kinkan masuknya air  yang mampu memecah sebagian  besar  daerah  telopeptida  yang  ada di  dalam  matriks  kolagen  (Liu et  al .,  2015; Zhou  and  Regenstein,  2005).  Hasil  uji protein  terlarut  pada  larutan  perendaman NaOH setiap 2 jam disajikan pada Gambar 2.
Hasil  sidik  ragam  menunjukkan bahwa  interaksi  antara  konsentrasi  NaOH
dan  waktu  perendaman  berpengaruh  signifi- kan p <0,05)  terhadap  kadar  protein  terarut. Tahap  pra  perlakuangelembung  renang  ikan cunang  dipilih  berdasarkan  hasil  uji  lanjut DMRT  yang  berbeda  nyata  yaitu  pada  inter- aksi perlakuan konsentrasi larutan NaOH 0,1 M  dan  lama  waktu  perendaman  8  jam (K1T4), dikarenakan cukup stabil dan efektif untuk melarutkan protein non-kolagen dibandingkan  dengan  konsentrasi  lainnya (NaOH 0,15 M dan NaOH 0,2).  Konsentrasi NaOH  yang  tinggi  dengan  waktu  peren- daman  yang  lama  akan  mengakibatkan jumlah  protein  terlarut  semakin  meningkat, sehingga  yang  diduga  bukan  hanya  protein non-kolagen  yang terlarut  tetapi  juga protein kolagen.

## 3.2.2. Optimasi  Ekstraksi  Kolagen  Larut Asam (ASC)
Optimasi ekstraksi kolagen larut asam dilakukan  setelah  mendapatkan  konsentrasi dan  waktu  perendaman  larutan  NaOH  ter- pilih.  Hasil  sidik  ragam  menunjukkan  in- teraksi antara asam asetat dengan lama waktu perendaman  (MT)  berpengaruh  signifikan terhadap  kelarutan  kolagen  ( p <0,05)  dan  uji lanjut  DMRT  menunjukkan  berbeda  nyata pada perlakuan konsentrasi asam asetat (M1, M2 dan M3) dan lama waktu perendaman 72 jam (T3).
Gambar  2.  Kadar  protein  terlarut  dalam  larutan  NaOH  sisa  pra  ekstraksi  gelembung  renang ikan  cunang setiap perendaman 2 jam. NaOH 0,1 M (   ); NaOH 0,15 M (   );  dan NaOH 0,2 M  (   ). Huruf superscript yang berbeda  menunjukkan hasil perlakuan yang berbeda nyata ( p <0,05).
Gambar  3.  Persentase  kelarutan  kolagen  gelembung  renang  ikan  cunang  dalam  asam  asetat 0,25  M  (M1),  0,50  M  (M2)  dan  0,75  M  (M3).  Lama  perendaman  24  jam  (    ), 48  jam  (    )  dan  72  jam  (    ).  Huruf superscript yang  berbeda  menunjukkan  hasil perlakuan yang berbeda nyata ( p <0,05).
Rerata  persentase  kelarutan  kolagen gelembung  renang  ikan  cunang  yaitu  99% (Gambar  3).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa asam  asetat  memiliki  kemampuan  yang  baik untuk  melarutkan  atau  melepaskan  rantai polipeptida  penyusun  kolagen  yang  terdapat dalam  matriks  menjadi  tropokolagen.  Asam asetat dipilih sebagai pelarut dalam ekstraksi kolagen karena dapat membantu peningkatan H + sehingga  mengakibatkan  air  lebih  mudah berpenetrasi  ke  dalam  serat  kolagen  melalui gaya  elektrostatik  antara  ikatan  hidrogen (gugus polar) dan  antara atom dengan gugus non-polar  (Sinthusamran et  al .,  2013;  Liu et al ., 2015).
Hasil  sidik  ragam  (ANOVA)  ren- demen  kolagen  gelembung  renang  ikan cunang (liofilisasi) menunjukkan lama waktu
perendaman  (T)  berpengaruh  nyata  terhadap kelarutan  kolagen  gelembung  renang  ikan cunang  ( p <0,05).  Uji  lanjut  DMRT  menun- jukkan  perlakuan  konsentrasi  asam  asetat (M1,  M2  dan  M3)  dan  lama  waktu  peren- daman 72 jam (T3) berbeda nyata.
Gambar  4  menunjukkan  rendemen kolagen  meningkat  seiring  dengan  bertam- bahnya  waktu  ekstraksi  asam  asetat.  Proses ekstraksi  juga  dipengaruhi  oleh  waktu  untuk perpindahan molekul suatu zat selama proses difusi  (Wang et  al .,  2008).  Proses  ekstraksi yang berbeda kemungkinan dapat menghasil- kan  karakteristik  kolagen  yang  berbeda sesuai dengan kelarutannya (Liu et al., 2015). Perbedaan  spesies  dan  habitat  juga  sangat mempengaruhi  proses  pra  perlakuan  dan ekstraksi.
Gambar  4.  Persentase  rendemen  kolagen  liofilisasi  gelembung  renang  ikan  cunang.  Waktu ekstraksi dengan asam asetat 0,25 M (M1); 0,50 M (M2) dan 0,75 M (M3) selama 24  jam  (    ),  48  jam  (    )  dan  72  jam  (    ).  Huruf superscript yang  berbeda menunjukkan hasil perlakuan yang berbeda nyata ( p <0,05).
Rendemen  kolagen  yang  diperoleh  belum cukup  menggambarkan  bahwa  kolagen tersebut  merupakan  kolagen  yang  murni. Oleh  karena  itu,  dilakukan  analisis  terhadap gugus  fungsi  (Tabel  3),  protein  terlarut  dan bobot molekul (Gambar 5 dan Gambar 6).
3.2.3. Gugus Fungsi ( Fourier Transform Infra Red /FTIR) Kolagen Kolagen  M1T3  merupakan  produk terpilih  yang  diuji  FTIR.  Karakteristik  dari kolagen M1T3 memiliki gugus fungsi dengan puncak  serapan  amida  A,  amida  B,  amida  I, amida II dan amida III yang mengindikasikan struktur-struktur  penyusun  pada  protein kolagen  (Tabel  3).  Menurut  Muyonga et  al. (2004)  bahwa  kisaran  puncak  serapan  amida A yaitu 3400-3440 cm -1 , amida B yaitu 2925- 2935 cm -1 dan amida I yaitu 1600-1700 cm -1 , amida  II  berkisar  antara  1550-1600  cm -1 (Ahmad  and  Benjakul,  2010),  amida  III berkisar  antara  1220-1320  cm -1 (Benjakul et al., 2010).  Hasil  FTIR  kolagen  larut  asam dengan  perlakuan  konsentrasi  asam  asetat dan  lama  waktu  perendaman  (M1T1,  M2T1, M3T1,  M1T2,  M2T2,  M3T2,  M1T3,  M2T3 dan  M3T3)  ditunjukkan  pada  Tabel  3. Kolagen  M1T3  merupakan  FTIR  dari  per-
lakuan  terpilih  yaitu,  menunjukkan  puncak- puncak  serapan  yang  tersebar  pada  wilayah amida  A,  amida  B,  amida  I,  amida  II,  dan amida III.
Keberadaan  amida  A  pada  kolagen M1T3  ditunjukkan  dengan  puncak  wilayah serapan  pada  bilangan  gelombang  3441,50 cm -1 .  Amida  A  merupakan  gugus  khas kolagen dengan puncak wilayah serapan pada bilangan  gelombang  3400–3440  cm -1 yang menunjukkan NH stretching (Muyonga et al ., 2004). Spektra FTIR kolagen juga menunjuk- kan  puncak  wilayah  serapan  pada  bilangan gelombang  2922,53  cm -1 yang  tergolong dalam  gugus  amida  B.  Coates  (2006)  me- nyatakan  bahwa  serapan  amida  B  ini terbentuk  dari  asimetrikal stretching CH 2 dengan  wilayah  serapan  pada  bilangan gelombang antara 2935-2915 cm -1 .
Gugus  fungsi  amida  I  pada  kolagen M1T3  berada  pada  puncak  wilayah  serapan dengan  bilangan  gelombang  1649,69  cm -1 yang  menunjukkan  C=O stretching .  Hal  ini juga  ditemukan  pada  kolagen  gelembung renang  ikan T.  albacares ,  yaitu  pada  1648 cm -1 (Kaewdang et al ., 2014). Menurut Kong dan  Yu  (2007)  amida  I  memiliki  wilayah serapan  pada  kisaran    1690-1600  cm -1 yang
Tabel 3. Gugus fungsi (FTIR) kolagen gelembung renang ikan cunang ( M. talabon ).
Kode Sampel Daerah Serapan Bilangan Gelombang (cm -1 ) Amida A Amida B Amida I Amida II Amida III M1T1 1 3441,39 2922,00 1649,69 1539,74 1338,85 M1T2 1 3560,06 2991,03 1648,68 1523,15 1229,53 M1T3 1 3441,50 2922,53 1649,93 1512,96 1316,20 M2T1 1 3443,92 2343,33 1646,26 1516,42 1228,01 M2T2 1 3445,34 2364,86 1653,65 1541,91 1230,03 M2T3 1 3420,36 2120,10 1649,32 1520,33 1232,18 M3T1 1 3618,08 2344,63 1645,15 1515,41 1226,20 M3T2 1 3617,45 2345,63 1644,77 1515,09 1227,14 M3T3 1 3618,08 2344,63 1645,15 1515,41 1228,04 Standar 2 3300 3100 1600-1690 1480-1575  1229-1301 Standar 3 3400-3440 2925-2935 1600-1700 1550-1600  1220-1320 Standar 4 3303 2920 1648 1549 1454
Keterangan: 1 Data penelitian; 2 Kong dan Yu (2007); 3 Muyonga et al . (2004); 4 Kaewdang et al . (2014).
menunjukkan vibrasi C=O stretching . Muyonga et  al .  (2004)  menyatakan  bahwa amida I terdiri atas empat komponen struktur sekunder  protein,  yaitu α - heliks,  β-sheet,  β- turn ,  dan random  coil yang  saling  ber- tumpang  tindih.  Puncak  wilayah  serapan komponen α-heliks (1654  cm -1 dan  1658 cm 1 ), β-sheet (1624  cm -1 dan  1642  cm -1 ), β- turn (1666 cm -1 , 1672 cm -1 , 1680 cm -1 , 1688 cm -1 ),  dan random  coil (1648  cm -1 ).  Ber- dasarkan  puncak  serapan  Amida  I  pada kolagen  M1T3  menunjukkan  bahwa  kolagen memiliki  struktur β-sheet sebagai  komponen penyusun kolagen.
Spektra FTIR kolagen M1T3
memiliki  bilangan  gelombang  1516,22  cm -1 (amida  II)  dan  1339,01  cm -1 (amida  III). Amida  II  dan  amida  III  berada  pada  puncak wilayah  serapan  1480-1575  cm -1 dan  1229- 1301  cm -1 yang  menunjukkan  interaksi intermolekuler  pada  kolagen  dengan  adanya gugus CN stretching dan NH bending (Kong and Yu, 2007).  Kaewdang et  al . (2014) juga menemukan  amida  II  dan  amida  III  pada puncak wilayah serapan 1549 cm -1 dan 1454 cm -1 (ASC)  dengan  rasio  serapan  mendekati nilai 1 antara amida III menunjukkan struktur triple  helix .  Intensitas  amida  III  berkaitan
dengan struktur triple helix (Muyonga et  al ., 2004).  Kolagen  yang  terdenaturasi  menjadi gelatin diindikasikan dengan hilangnya struk- tur triple  helix akibat  perubahan α-heliks menjadi  struktur random  coil ( single  heliks ), dan memiliki nilai  bilangan gelombang pada kisaran  1235  cm -1 (Nikko et  al .,  2011).  Hal ini  berarti  bahwa  ekstraksi  kolagen  gelem- bung renang ikan cunang dengan asam asetat 0,25  Mdan  waktu  perendaman  72  jam (M1T3)  pada  suhu  4°C  belum  terdegradasi menjadi bentuk gelatin.

## 3.2.4. Protein Terlarut dan Bobot Molekul
Hasil  sidik  ragam  (ANOVA)  protein terlarut  kolagen  gelembung  renang  ikan cunang  menunjukkan  bahwa  interaksi  (MT) berpengaruh  sangat  nyata  ( p >0,05)  dan  hasil uji  lanjut  DMRT  menunjukkan  berbeda nyatapada perlakuan asam asetat 0,25 M dan waktu  perendaman  72  jam  (M1T3),  yaitu memiliki  rerata  protein  terlarut  1,08  mg/mL. Gambar  5  menunjukkan  rerata  protein terlarut  dari  kolagen  gelembung  renang  ikan cunang  hasil  ekstraksi  asam  asetat  dengan lama waktu perendaman (MT).
Gambar 5. Rerata protein terlarut dari kolagen gelembung renang ikan cunang hasil ekstraksi asam aseta dengan lama waktu peredaman. M1T1 = 0,25 M asam asetatselama 24 jam;  M1T2  =  0,25  M  asam  asetat  selama  48  jam;  M1T3  =  0,25  M  asam  asetat selama 72 jam; M2T1 = 0,50 M asam asetat selama 24 jam; M2T2 = 0,50 M asam asetat selama 48 jam; M2T3 = 0,50 M  asam asetat selama 72 jam; M3T1 = 0,75 M asam asetat selama 24 jam; M3T2 = 0,75 M asam asetat selama 48 jam; M3T3 = asam asetat selama 72 jam.
b b a b b b b b b 0,92 0,94 0,96 0,98 1,00 1,02 1,04 1,06 1,08 1,10 M1T1 M1T2 M1T3 M2T1
M2T2 M2T3 M3T1 M3T2 M3T3 J um la h P ro tein Terla rut
(m g /m l) Kombinasi Perlakuan
Kelarutan  protein  kolagen  menunjuk- kan  bahwa  perlakuan  M1T3  merupakan perlakuan  terpilih.  Menurut  Wang et  al . (2014),  peningkatan  kadar  protein  terlarut berkaitan  dengan  perubahan  jumlah  struktur ikatan  asam  amino  yang  menyusun  protein kolagen.  Jumlah  protein  terlarut  yang  tinggi menyebabkan  kadar  protein  dalam  kolagen juga cenderung meningkat.
Bobot  molekul  protein  yang  diukur menggunakan  prinsip  elektroforesis Sodium Dodecyl  Sulphate  PolyacrilamideGel  Elec- trophoresis (SDS-PAGE)  yang  digunakan untuk  memisahkan  protein  berdasarkan  pe- misahan  komponen  atau  molekul  bermuatan berdasarkan  perbedaan  tingkat  migrasi  dan berat molekulnya dalam sebuah medan listrik (sifat electrophoretic  mobility )  (Rosenberg, 1996).  Bobot  molekul  (BM)  kolagen  dengan ekstraksi asam asetat pada Gambar 6.
Bobot  molekul  (BM) protein  kolagen dengan  ekstraksi  asam  asetat  pada  semua perlakuan  konsentrasi  asam  asetat  dan  lama waktu  perendaman  memiliki  pita  utama  α1 dan α2 dengan BM masing-masing 136 kDa dan  117  kDa.  Menurut  Ogawa et  al .  (2004), keberadaan  rantai  α  menunjukkan  bahwa kolagen  tersebut  merupakan  kolagen  tipe  I. Kolagen  tipe  I  merupakan  kolagen  bentuk dasar  yang  dapat  ditemukan  pada  bagian tendon  dan  jaringan  ikat  lainnya.  Demikian halnya  dengan  gambaran  mikroskopik  ge- lembung  renang  ikan  cunang  yang  menun- jukkan struktur jaringan ikat kolagen dengan dominan  warna  biru  (Gambar  1b).  Molekul kolagen  tipe  I  mempunyai  BM  rata-rata  290 kDa  dan  mengandung  3  rantai  polipeptida, masing-masing  94  kDa.  Ketiga  polipeptida ini  diketahui  sebagai  rantai  α,  yang  masing- masing    melingkari  rantai    lainnya  seperti
Gambar 6. Pola pita protein kolagen larut asam gelembung renang ikan cunang. (M) Marker; (1) konsentrasi asam asetat 0,25 M dan waktu ekstraksi 24 jam (M1T1); (2) konsentrasi asam asetat 0,50 M dan waktu ekstraksi 24 jam (M2T1); (3) konsentrasi asam asetat 0,75 M dan waktu ekstraksi 24 jam (M3T1); (4) konsentrasi asam asetat 0,25 M dan waktu ekstraksi 48 jam (M1T2);
(5) konsentrasi asam asetat 0,50 M dan waktu ekstraksi 48 jam (M2T2);
(6) konsentrasi asam asetat 0,75 M dan waktu ekstraksi 48 jam (M3T2);
(7) konsentrasi asam asetat 0,25 M dan waktu ekstraksi 72 jam (M1T3);
(8) konsentrasi asam asetat 0,50 M dan waktu ekstraksi 72 jam (M2T3); dan (9)  konsentrasi asam asetat 0,75 M dan waktu ekstraksi 72 jam (M3T3).
untaian  tali  sehingga  mempunyai  struktur triple  helix .  Hal  inilah  yang  membuat molekul  kaku  dan  bentuknya  seperti  batang (Shoulders and Raines, 2009).
Hasil  penelitian  menunjukkan  ke- sesuaian  dengan  penelitian  kolagen  larut asam (ASC) dari hasil perairan lainnya, yaitu memiliki  dua  rantai  alfa  (α1  dan  α2)  dan rantai beta (β) yang tergolong kolagen tipe I, seperti  kolagen  gelembung  renang  ikan yellow  fin tuna  (Kaewdang et  al .,  2014); gelembung renang ikan bighead carp (Liu et al ., 2012); dan gelembung renang ikan kakap putih (Sinthusamran et al ., 2013).
Berdasarkan pengamatan secara visual terhadap kolagen  yang dihasilkan dari gelembung  renang  ikan  cunang,  tidak ditemukan  benda  asing  seperti  kotoran  dan benda  asing  lainnya,  serta  kolagen  memiliki tekstur  seperti  serat  kapas.  Kolagen  terpilih berdasarkan  kelarutan,  jumlah  rendemen liofilisasi,  gugus  fungsi  dan  bobot  molekul adalah  kolagen  M1T3,  yaitu  kolagen  hasil ekstraksi asam asetat 0,25 molar dengan lama waktu ekstraksi 72 jam (3 hari).

## 3.2.5. Komposisi  Proksimat,  pH,  Logam Berat, dan Mikrobiologi Kolagen
Berdasarkan  analisis  kelarutan,  jum- lah  rendemen,  dan  hasil  karakterisasi  gugus fungsi,  protein  terlarut  dan  bobot  molekul kolagen  gelembung  renang  ikan  cunang  me- nunjukkan  bahwa  karaktersitik  dari  kolagen M1T3  adalah  kolagen  terpilih  sebagai perlakuan  terbaik.  Hasil  analisis  proksimat, pH,  logam  berat,  dan  mikrobiologi  kolagen M1T3 disajikan pada Tabel 4.
Komposisi  proksimat  kolagen  M1T3 menunjukkan  kadar  protein  86,74±0,20%  bb yang  merupakan  komponen  paling  dominan dibandingkan  dengan  komponen  lainnya, seperti  kadar  air  12,12±0,04%  bb,  kadar  abu 1,31±0,13% bb, kadar lemak 0,17±0,03% bb, yaitu masih berada pada kisaran standar SNI (BSN,  2014).  Kadar  protein  kolagen  M1T3 lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  protein kolagen dari daging teripang gamma (Alhana et  al .,  2015)  dan  hampir  sama  dengan
kolagen kulit ikan pari Pastinachus solocirostris (Nur’aenah,  2013).  Rendahnya kadar  lemak  dan  abu  pada  kolagen  M1T3 menunjukkan  keberhasilan  dari  proses  pra ekstraksi  gelembung  renang  ikan  cunang dalam  larutan  basa  (NaOH)  cukup  efektif untuk  mengurangi  lemak,  mineral-mineral dan  pengotor  dalam  gelembung  renang  ikan. Hal  ini  sejalan  dengan  pendapat  Hinter- waldner  (1977)  bahwa  penggunaan  larutan basa mampu menghancurkan sebagian ikatan kovalen,  peptida  dan  hidrogen  pada  struktur kolagen, sehingga mampu meluruhkan lemak,  pigmen,  kotoran  dan  protein  non- kolagen.  Kadar  air  dalam  kolagen  turut  me- nentukan  daya  tahan  dan  penerimaan  ter- hadap suatu bahan, sedangkan kadar abu juga turut  menjadi  penentu  kandungan  mineral dalam kolagen yang dihasilkan.
Karakteristik  kimia  lainnya  dari kolagen  M1T3  adalah  nilai  pH  yaitu  4,31 lebih  rendah  dibandingkan  dengan  ASC  dari gelembung  renang  ikan T.  Albacares (Kaewdang et  al .,  2014).  Kolagen  M1T3 tergolong  sebagai  kolagen  yang  bersifat asam.  Nilai  pH  kolagen  penting  diketahui karena  berkaitan  dengan  tingkat  kelarutan kolagen. Hal ini terjadi karena kolagen M1T3 merupakan  kolagen  yang  diekstraksi  meng- gunakan  larutan  asam  asetat  dan  tidak dilakukan  pengadukan  saat  proses  dialisis. Dennison  (2002)  menyatakan  bahwa  laju difusi  ditentukan  oleh  konsentrasi  molekul pelarut  yang  akan  keluar  dari  kantung dialisis,  luas  permukaan  kantung  dialisis (membran)  yang  digunakan,  volume  pelarut, dan  pengadukan  dapat  mempercepat  laju transfer osmosis melewati membran.
Komponen  logam  berat  juga  ditentu- kan  oleh  kadar  abu  dari  kolagen.  Logam berat  yang  dianalisis  pada  kolagen  M1T3, yaitu  timbal  (Pb),  merkuri  (Hg),  arsen  (As), dan  kadmium  (Cd)  yaitu  berada  di  bawah ambang  batas  kandungan  logam  berat  pada sediaan  kolagen  (BSN,  2014).  Hasil  analisis mikrobiologi terhadap E. coli dan Salmonella juga  negatif.  Keseluruhan  hasil  analisis komponen  kimia  dan  mikrobiologi  kolagen
Tabel 4. Komposisi proksimat, pH, logam berat, dan mikrobiologi kolagen larut asam (ASC) dari gelembung renang ikan cunang ( Muarenesox talabon ).
Parameter Uji Satuan Kolagen Gelembung Renang M. talabon 1 Syarat Mutu Kolagen Air %bb 12,12±0,04 < 12 (BSN 2014) Protein %bb 86,74±0,20 > 75 (BSN 2014) Lemak %bb 0,17±0,03 < 1 (BSN 2014) Abu mg/kg 1,31±0,13 < 1 (BSN 2014) pH - 4,31 6,5 – 8 (BSN 2014) Pb mg/kg 0,009 * < 0,4 (BSN 2014) Hg mg/kg 0,004 * < 0,5 (BSN 2014) As mg/kg 0,008 * < 1 (BSN 2014) Cd mg/kg 0,00011 * < 0,1 (BSN 2014) E.  coli /0,1 gram 0,000 < 3 (BSN 2014) Salmonella /10 gram 0,000 Negatif (BSN 2014) Keterangan  : 1 Data  penelitian,  rerata  ±  SD  dari  3  ulangan  pada  sampel  yang  sama,
* limit deteksi atomic absorption spectroscopy (ASS).
larut  asam  dari  gelembung  renang  ikan cunang (M1T3) menunjukkan bahwa kolagen yang  dihasilkan  sudah  memenuhi  standar sesuai  dengan  syarat  mutu  kolagen  (BSN, 2014),  hanya  nilai  pH  yang  masih  belum memenuhi syarat mutu BSN (2014). Menurut spesifikasi fish  collagen  powder untuk  kos- metik  ditinjau  dari  komponen  kimia,  yaitu susut  pengeringan  <8%,  total  nitrogen (protein) >16%, pH 5,5-6,5,  logam berat Pb <10  ppm  (mg/kg),  As  <1  ppm,  dan  mikro- biologi  yaitu  bakteri coliform <3 MPN /g (Thai Nippon RABJ Co., Ltd.).

## 3.2.6. Komposisi Asam Amino Kolagen
Komposisi  asam  amino  berperan dalam  menentukan  stabilitas  termal  dari kolagen,  karena  setiap  asam  amino  mem- punyai  karakteristik  yang  berbeda-beda. Komposisi  asam  amino  kolagen  larut  asam gelembung renang ikan cunang (M1T3) yang dianalisis  berdasarkan  17  standar  disajikan pada Tabel 5.
Protein  kolagen  merupakan  protein fibrosa  yang  mengandung  35%  glisina  dan sekitar  11%  alanina  serta  kandungan  prolina yang  cukup  tinggi  (Van  der  Rest  and Garrone,  1991).  Menurut  Katili  (2009)
bahwa  kolagen  mempunyai  kekuatan  ren- tang,  struktur  istimewa  yang  mengandung hidroksilisin dan hidroksiprolin, yakni asam- asam  amino  yang  tidak  terdapat  dalam protein lain. Kolagen juga merupakan protein yang  dapat  menghasilkan  gelatin,  melalui proses  pemanasan.  Pemanasan  pada  suhu 40ºC  belum  mengakibatkan  putusnya  ikatan kovalen  yang  ada  pada  kolagen,  tetapi kolagen  akan  mengalami  transformasi  struk- tur  dari  bentuk  untaian  menjadi  rusak  secara permanen  apabila  suhu  pemanasan  naik menjadi  60ºC  atau  lebih  (Shoulders  and Raines, 2009).
Kolagen M1T3 memiliki asam amino glisina 241,06 mg/g, prolina 88,73 mg/g, dan alanina 86,98 mg/g. Menurut Regenstein dan Zhou  (2007)  bahwa  glisina  merupakan  asam amino  yang  mewakili  hampir  sepertiga  dari total  residu,  danitu  didistribusikan  secara merata  di  tiap  residu  ketiga  dalam  urutan asam amino sebagai syarat dalam pembentuk struktur triple  helix kolagen.  Struktur triple helix kolagen dirakit dari polipeptida spesifik rantai  α  dengan  posisi Gly- X-Y,  dimana posisi X diisi dengan asam amino prolina dan pada  posisi  Y  diisi  dengan  asam  amino hidroksiprolina  atau  juga  hisdroksilisina
(Shoulders  and  Raines,  2009).  Hidroksi- prolina  berasal  dari  prolina  yang  dikatalisis oleh  enzim  prolin  hidroksilase  dan  mem- butuhkan  vitamin  C  sebagai  kofaktornya, sedangkan  hidroksilisin  berasal  dari  hidrok- silasi  lisin  oleh  enzim  lisil  dan  memerlukan vitamin  C  sebagai  kofaktor  (Van  der  Rest and  Garrone,  1991).  Asam  amino  prolina merupakan  asam  amino  yang  dapat  men- ciptakan  belokan  pada  struktur  α-heliks  dan hidroksiprolina  berfungsi  dalam  meningkat- kan  stabilitas  kolagen  (Voet et  al .,  2013). Asam  amino  alanina,  aspartat,  glutamat,  dan serina merupakan asam amino yang dibentuk oleh  transaminasi oksoacid yang  sesuai. Keempat  jenis  asam  amino  ini  berfungsi membentuk  asam  amino  nonesensial  lainnya (Ngili, 2009).
Kolagen  M1T3  juga  mengandung asam amino arginina yang cukup tinggi, yaitu
94,41 mg/g lebih tinggi dibandingkan dengan asam  amino  arginina  pada  kolagen  ge- lembung  renang  ikan T.  albacares yaitu  56 mg/g  (Kaewdang et  al .,  2014)  dan  kolagen gelembung renang ikan L. calcarifer yaitu 53 mg/g  (Sinthusaamran et  al .,  2013).  Asam amino  arginina  disintesis  dari  aspartat  dan ornitin  selama  pembentukan  urea  (Ngili, 2009).  Argininosuksinat  sintetasa  dan  ar- gininosuksinat  liase  mengkatalisis  reaksi kondensasi  dan  pemotongan  yang  meng- akibatkan  pembentukan  arginina.  Asam  glu- tamat  pada  kolagen  M1T3  yaitu  67,25  mg/g lebih  rendah  dibandingkan  dengan  asam glutamat  pada  gelembung  renang  ikan cunang  hasil  hidroekstraski  dan  ekstraksi asam,  yaitu  masing-masing  95,51  g/g  dan 88,0 mg/g (Djailani et al ., 2016; Kartika dan Trilaksani, 2016).
Tabel 5. Komponen asam amino kolagen gelembung renang ikan (mg/g).
Jenis Asam Amino Kadar Asam Amino Gelembung Renang Ikan (mg/g) Muareneso x  talabon 1 (ASC) Congresox talabon 2 (Hidroekstraksi) Muareneso x talabon 3 (ASC) Thunnus albacares 4 (ASC) Lates calcarife r 5 (ASC) Glisina ( Gly ) 241,06 266,06 260,3 225 326 Prolina ( Pro ) 88,73 108,96 100,5 80 111 Alanina ( Ala ) 86,98 112,92 106,8 102 134 Asam glutamat ( Glu ) 67,25 95,51 88,0 97 71 Asam aspartat ( Asp ) 35,89 53,82 49,0 69 46 Arginina ( Arg ) 94,41 125,84 85,8 56 53 Valina ( Val ) 23,39 24,25 25,2 38 22 Isoleusina ( Ile ) 10,00 9,33 11,3 25 9 Histidina ( His ) 12,56 18,16 12,3 12 5 Treonina ( Thr ) 29,75 34,08 35,4 42 24 Tirosina ( Tyr ) 6,12 8,17 1,00 15 5 Fenilalanina ( Phe ) 27,60 22,68 27,4 22 13 Serina ( Ser ) 25,04 40,78 30,1 50 27 Lisina ( Lys ) 28,89 37,91 37,5 44 25 Leusina ( Leu ) 21,14 21,57 25,4 47 23 Sisteina ( Cys ) 0,00 0,00 0,0 0 1 Metionina ( Met ) 0,00 19,96 20,6 18 14
Keterangan  : 1 Data  penelitian, 2 Djailani et  al .  (2016), 3 Kartika  dan  Trilaksani  (2016),
4 Kaewdang et al . (2014), 5 Sinthusamran et al . (2013).
Berdasarkan kandungan
asam aminonya,  kolagen  M1T3  termasuk  kolagen tipe  1.  Menurut  Nalinanon et  al. (2011) bahwa  kolagen  dengan  asam  amino  glisina, alanina,  dan  prolina  yang  tinggi,  serta tirosina  dan  histidina  yang  rendah  termasuk kolagen  tipe  1.  Hal  ini  dipertegas  juga dengan  hasil  analisis  gugus  fungsi  (FTIR) dan  bobot  molekul  kolagen,  yaitu  memiliki gugus amida A, amida B, Amida I, amida II, dan amida III (Tabel 3) serta memiliki rantai α1, rantai α2 (Gambar 6).
3.2.7. StabilitasTermal ( Differential Scanning Calorimetry /DSC)

## Kolagen
Stabilitas  termal  merupakan  salah satu  sifat  kolagen  yang  berkaitan  langsung dengan  suhu  denaturasi  kolagen.  Suhu denaturasi  menunjukkan  ketahanan  kolagen terhadap perlakuan suhu tertentu. Hasil peng- ukuran  DSC  terhadap  kolagen  M1T3  pada rentang  suhu  20°C-300°C  dengan  laju  pe- manasan  10°C/menit  menunjukkan  bahwa suhu  puncak  pelelehan  195,59ºC  (T max ) dengan  tinggi  puncak  0,4878  mW,  dan  me- miliki  suhu  awal  pelelehan  (T onset )  189,79ºC dan suhu akhir pelelehan (T end ) 203,17ºC. Kolagen  gelembung  renang  ikan cunang (M1T3) menunjukkan suhu maksimal transisi  (T max )  kolagen  yang  tinggi,  yaitu 195,59ºC  dengan  ΔH  7,8113  J/g  dibanding- kan  dengan  kolagen  gelembung  renang  ikan cunang  hasil  ekstraksi  asam  (ASC)  dan hidrotermal,  dengan  nilai  T max (T transisi ) masing-masing  103,37ºC  dan  101,70ºC (Kartika  dan  Trilaksani,  2016).  Benjakul et al .  (2007)  menyatakan  bahwa  komposisi asam  amino  juga  turut  berperan  dalam menentukan stabilitas termal dari suatu bahan karena  setiap  asam  amino  mempunyai karakteristik  termal  yang  berbeda-beda  dan akan secara simultan mempertahankan denaturasi apabila bahan diberikan kalor dari luar.  Suhu  transisi  maksimal  (T max )  dari beberapa spesies memiliki perbedaan, seperti T max dari  ASC  gelembung  renang  dan  kulit ikan L. calcarifer adalah 35,02ºC dengan ΔH
0,918 J/g  dan 33,33ºC dengan  ΔH 0,860 J/g (Sinthusamran et  al .,  2013),  T max dari  ASC dan  PSC  gelembung  renang  ikan T. albacares adalah  32,97ºC  dengan  ΔH  1,786 J/g  dan  33,92ºC  dengan  ΔH  0,354  J/g (Kaewdang et  al .,  2014),  T max dari  PSC gelembung renang ikan Hypo-phthalmichthys nobilis yaitu 37,3 ºC dengan ΔH 1,39 J/g (Liu et  al .,  2012).  Sinthusamran et  al .  (2013) menyatakan bahwa semakin  tinggi  nilai  T max dan  ΔH  menunjukkan  tingkat  stabilitas termal  yang  tinggi.  Perbedaan  lingkungan hidup  juga  turut  mempengaruhi  kestabilan termal, yaitu kolagen dari spesies yang hidup di perairan dingin memilki tingkat kestabilan termal rendah dibanding-kan dengan kolagen dari  spesies  ikan  yang  hidup  di  perairan panas atau hangat.  Sta-bilitas termal kolagen juga  ditentukan  oleh  rantai pyrrolidine dari asam imino (prolina dan hidroksiprolina) dan sebagian  oleh  ikatan  hidrogen  melalui kelompok  hidroksil  dari  hidroksiprolina (Benjakul et al ., 2010).

## IV. KESIMPULAN
Morfologi  gelembung  renang  ikan cunang M.  talabon memiliki  tiga  lapisan yaitu  lapisan  luar,  tengah  dan  dalam  yang tersusun atas serabut-serabut kolagen. Karak- teristiknya  mengandung  protein  yang  tinggi dengan  tiga  komponen  asam  amino  yang dominan  (glisina,  prolina,  dan  alanina). Kolagen terpilih (M1T3) memiliki rendemen liofilisasi  14,50%  dengan  kasrakteristik gugus  fungsi  dan  bobot  molekul  yang  ter- golong  kolagen  tipe  I,  komposisi  proksimat (kadar  air,  protein,  lemak,  abu),  logam  berat (Pb,  Hg,  As,  Cd)  dan  cemaran  mikrobiologi ( E. coli dan Salmonella )  yang sesuai  dengan syarat  mutu  kolagen,  sedangkan  nilai  pH masih  tergolong  asam.  Komponen  asam amino kolagen M1T3 yang dominan (glisina, prolina,  alalnina)  dan  kestabilan  termal  yang tinggi  sehingga  dapat  diaplikasikan  pada industri  makanan,  biomedis,  farmaseutikal, dan kosmeseutikal.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  disampaikan  kepada Rektor  dan  Yayasan  Universitas  Kristen Artha  Wacana  (UKAW)  Kupang  yang  telah mendanai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad,  M.  and  S.  Benjakul.  2010. Extraction  and  characterization  of pepsin soluble collagen from the skin of  unicorn  leatherjacket  ( Aluterus monocerous ). J.  Food  Chemistry , 120:817-824.
Alhana,  P.  Suptijah,  dan  K.  Tarman.  2015. Ekstraksi  dan  karakterisasi  kolagen dari  daging  teripang  gamma  ( Sti- chopus  variegatus ). J.  Pengolahan Hasil  Perikanan  Indonesia ,  18(2): 150-161.
Association  of  Official  Analytical  Chemist
(AOAC).  2005.  Official  methods  of analysis.  18 th ed.  Association  of Official  Analytical  Chemist  Inc.
Mayland USA. 26p.
Badan Standardisasi Nasional (BSN). 2006a. Cara  uji  mikrobiologi-bagian  1: Penentuan coliform dan Escherichia coli pada  produk  perikanan:  SNI  01- 2332.1-2006. BSN. Jakarta. 23hlm.
Badan Standardisasi Nasional (BSN). 2006b.
Cara  uji  mikrobiologi-bagian  2:
Penentuan Salmonella pada  produk perikanan: SNI 01-2332.2-2006. BSN. Jakarta. 25hlm.
Badan  Standardisasi  Nasional  (BSN).  2009. Batas  maksimum  cemaran  logam berat  dalam  pangan:  SNI  7387:2009. BSN. Jakarta. 25hlm.
Badan  Standardisasi  Nasional  (BSN).  2014. Kolagen  kasar  dari  sisik  ikan-syarat mutu  dan  pengolahan:  SNI  8076- 2014. BSN. Jakarta. 10hlm.
Belbachir, K., R. Noreen, G. Gouspillou, and C.  Petibois.  2009.  Collagen  types analysis  and  differentiation  by  FTIR spectroscopy. Analytical  and  Bio-
analytical Chemistry ,    200:1-10. doi: 10.1007/s00216-009-3019-y.
Benjakul,  S.,  Y.  Thiansilakul,  W.  Visessa- nguan, S. Roytrakul, H. Kishimura, T. Prodpran,  and  J.  Meesane.  2010. Extraction  and  characterization  of pepsin-solubilised  collagens  from  the skin  of  bigeye  snapper Priacanthus tayenus and Priacanthus  macracan- thus . J.  Science  Food  Agriculture , 90:132-138.
Bradford,  M.M.  1976.  A  rapid  and  sensitive method  for  the  quantitation  of  micro gram  quantities  of  protein  utilizing the  principle  of  protein-dye  binding.
Analytical Biochemistry , 72:248-254. Budrugeac, P., E. Badea, G.D. Gatta, L. Miu, and  A.  Comanescu.  2010.  A  DSC study  deterioration  caused  environ- mental  chemical  pollutans  to  parch- ment,  a  collagen-based  material. J. Thermochimica Acta , 500:51-62.
Coates,  J.  2006.  Interpretation  of  infrared spectra a practical  approach. In : John Miley  and  Sons.  (ed.).  Encyclopedia of Analytical Chemistry. 1-23pp.
Dennison,  C.  2002.  A  guide  to  protein isolation.  Kluwer  Academic  Publish- ers. New York. 186p.
Dinas Kelautan dan Perikanan. 2014. Potensi produksi  ikan  cunang  ( Muarenesox talabon ).  Dinas  Kelautan  dan  Per- ikanan  Kabupaten  Indramayu,  Jawa Barat. Indramayu. 255hlm.
Djailani, F., W. Trilaksani, dan T. Nurhayati. 2016.  Optimasi  ekstraksi  dan  kara- kterisasi  kolagen  dari  gelembung renang  ikan  cunang  dengan  metode asam-hidro-ekstraksi. J.  Pengolahan Hasil  Perikanan  Indonesia ,  19(2):
156-167.
Food  Agricultural  Organization  (FAO). 1974.  Species  identification  sheets. Fishing  areas  57,71E  Ind.  Ocean,  W. Cent. Pacific. 3p.
Hinterwaldner,  R.  1977.  Raw  material. In :
Ward  A.G.  and  Courts  A.  ( ed .).  The Science  and  Technology  of  Gelatin.
Academic  Press.  New  York  (US). 295-314pp.
Holma,  K.  Ayinsa,  and  B.K.  Maalekuu. 2013.  Effect  of  traditional  fish processing  methods  on  the  proximate composition  of  red  fish  stored  under ambient room conditions. American J. of Food Nutrition , 3(3):73-82.
Jamilah,  B.,  M.R.  Umi  Hartina,  D.  Mat Hashim,  and  A.Q.  Sazili.  2013. Properties  of  collagen  from  barra- mundi  ( Lates  calcarifer )  skin. Inter- national  Food  Research  J. ,  20(2): 835-842.
Jonsson,  A.  and  J.R.  Vidarsson.  2016.  By products  from  whitefish  processing. Skyrsla Matis. USA. 36p.
Katilli,  A.S.  2009.  Struktur  dan  fungsi protein  kolagen. J.  Pelangi  Ilmu , 2(5):10-29.
Kaewdang,  O.,  S.  Benjakul,  T.  Kaewmanee, and  H.  Kishimura.  2014.  Charac- teristics  of  collagens  from  the  swim bladders  of  yellow  fin  tuna  ( Thunnus albacares ). J. Food Chemistry , 155:264-270.
Kementerian Kelautan dan Perikanan (KKP).
2014.  Kelautan  dan  Perikanan  dalam Angka  Tahun  2015.  Pusat  Data Statistik  dan  Informasi  KKP.  Jakarta. 305hlm.
Kementerian Kelautan dan Perikanan (KKP). 2015.  Laporan  kinerja  satu  tahun kemeterian  kelautan  dan  perikanan, KKP. Jakarta. 98hlm.
Kartika,  I.W.D.  and  W.  Trilaksani.  2016. Karakterisasi  kolagen  dari  limbah gelembung  renang  ikan  cunang  hasil ekstraksi  asam  dan  hidrotermal. J. Pengolahan  Hasil  Perikanan  Indo- nesia , 19(3):222-232.
Kiernan, J.A. 1990. Histological and histochemical  methods:  theory  and practice.  4 th ed.  Pergamon  Press. Oxford, Inggris. 344p. Kittiphattanabawon,  P.  and  S.  Benjakul. 2010. Isolation adn properties of acid- and-pepsin-soluble  collagen  from  the
skin  of  blacktip  shark  ( Carcharhinus limbatus ). Eur  Food  Res  Technol , 230:475-483.
Kong, J. and S. Yu. 2007. Fourier transform infrared  spectroscopic  analysis  of protein  secondary  structures. Acta Biochemica  et  Biophysica  Sinica , 39(8):549-559.
Laemmli,  U.K.  1970.  Cleavage  of  structural protein  during  the  assembly  of  head of  bacteriophage  T4. Nature ,  277:
680-685. Doi:10.1038/227680a0.
Liu,  D.,  L.  Liang,  J.M.  Regenstein,  and  P. Zhou. 2012. Extraction and character- isation  of  pepsin-solubilised  collagen from  fins,  scales,  skins,  bones  and swim  bladders  of  bighead  carp ( Hypopthalmichthys  nobilis ). J.  Food Chemistry , 133:1441-1448.
Liu, D., X. Zhang, T. Li, H. Yang, H. Zhang, J.M.  Regenstein,  and  P.  Zhou.  2015. Extraction  and  characterization  of acid  and  pepsin  soluble  collagens from  the  scales,  skins  and  swim bladders  of  grass  carp Ctenopharyn- godon  idella . J.  Food  Bioscience , 9:68-74.
Mattjik,  A.A.  dan  I.M.  Sumertajaya.  2013.
Perancangan percobaan dengan aplikasi  SAS  dan  minitab.  Ed  ke-2. Institut  Pertanian  Bogor  (IPB)  Press. Bogor. 172hlm.
Muyonga,  J.H.,  C.G.B.  Cole,  K.G.  Duodu.
2004.  Fourier  transform  infrared (FTIR)    spectroscopic  study  of  acid soluble  collagen  and  gelatin  from skins  and  bones  of  young  and  adult nile  perch  ( Lates  niloticus ). J.  Food Chemistry , 86:325-332.
Nalinanon,  S.,  S.  Benjakul,  W.  Vises- sanguan,  and  H.  Kishimura.  2007. Use  of  pepsin  for  collagen  extraction from  the  skin  of  bigeye  snapper Priacanthus tayenus . J. Food Chemis- try , 104:593–601.
Ngili,  Y.  2009.  Biokimia  metabolisme  dan bioenergetika.  Ed  ke-1.  Graha  Ilmu. Yokyakarta. 328hlm.
Nollet,  L.M.L.  1996.  Handbook  of  Food Analysis:  Physical  characterization and  nutrient  analysis.  2 nd ed.  CRC Press LLC. New York. 2041p. Nur’aenah,  N.  2013.  Ekstraksi  dan  karak- terisasi  kolagen  dan  nanopartikel kolagen dari kulit ikan pari ( Pastinachus  solocirostris )  sebagai bahan  baku  kosmetik.  Tesis.  Institut Pertanian Bogor. Bogor. 79hlm.
Ogawa,  M.,  R.J.  Portier,  M.W.  Moody,  J. Bell,  M.A.  Schexnayder,  and  J.N. Losso.  2004.  Boichemical  properties of  bone  and  scale  collagens  isolated from  the  subtropical  fish  black  drum ( Pogonis  cromis )  and  sheepshead seabream Archosargus  probatocep- halus . J.  Food  Chemistry ,  88:495- 501.
Putra, A.B.N., L. Sahubawa, dan N. Ekantri. 2013.  Ekstraksi  dan  karakterisasi kolagen  dari  kulit  ikan  nila  hitam Oreochromis niloticus . J. Pascapanen dan  Bioteknologi  Kelautan  dan  Per- ikanan , 8(2):171-180.
Regenstein,  J.M.,  M.M.  Chaudry,  and  C.E. Regenstein.  2003.  The  kosher  and halal  food  laws. Comprehensive Reviews  in  Food  Science  and  Food Safety , 2:111-117.
Rosenberg,  I.M.  1996.  Protein  analysis  and purification. 2 nd ed. Springer Science. Boston (US). 384p.
Riyanto,  B.  2006.  Pengembangan  pelapis edible dari isinglass dan  aplikasinya untuk  mempertahankan  mutu  udang masak. Tesis. Institut Pertanian Bogor. Bogor. 77hlm.
Sinthusamran,  S.,  S.  Benjakul,  and  H.
Kishimura.  2013.  Comparative  stdy on  molecular  characteristics  of  acid soluble collagens from skin and swim bladder  of  seabass  ( Lates  calcarifer ).
J. Food Chemistry , 138:2435-2441.
Shoulders  M.D.  and  R.T.  Raines.  2009.
Collagen structure and stability. Annu Rev  Biochem ,  78:929-958.  Doi:10.
1146/annurev.biochem.77.032207.12 0833.
Trilaksani,  W., Nurjanah, dan H. W. Utama. 2006. Pemanfaatan gelembung renang ikan  patin Pangasisus  hypophtha- lmus . Buletin Teknologi Hasil Perikanan , 9(1):12-25.
Trilaksani,  W.,  R.  Bambang,  dan  N.
Rimadianti.  2008.  Karakteristik edi- ble  film dari isinglasss dengan penambahan  sorbitol  sebagai pals- ticizer . J.  Perikanan  dan  Kelautan , 13(1):52-63.
Van  der,  R.M.  and  R.  Garrone.  1991.
Collagen  family  of  proteins. J. FASEB , 5:2814-2823.
Voet,  D.,  J.G.  Voet,  and  C.W.  Pratt.  2013. Principles  of  biochemistry,  inter- national  student  version.  4 th ed.  John Wiley and Sons, Inc. Singapor. 105p. Wang,  L.,  X.  An,  F.  Yang,  Z.  Xin,  L.  Zhao, and  Q.  Hu.  2008. Isolation  and characterisation of collagens from the skin,  scale  and  bone  of  deep-sea redfish  ( Sebastes  mantella ). J.  Food Chemistry , 108:616-623.
Wang,  L.,  Q.  Liang,  T.  Chen,  Z.  Wang,  J.
Xu,  and  H.  Ma.  2014.  Charac- terization of collagen from the skin of Amur  sturgeon Acipenser  schrenckii .
J. Food Hydrocolloids , 38:104-109. Zhou,  P.  and  J.M.  Regenstein.  2005.  Effects of alkaline and acid pra perlakuans on Alaska  Pollock  skin  gelatin  extrac- tion. J.  of  Food  Science ,  70(6):392- 396.
Diterima : 29 April 2017 Direview : 25 Mei 2017 Disetujui : 30 November 2017