## 1. Pendahuluan
Oksigen dibawa oleh darah untuk proses metabolisme di dalam tubuh. Oksigen dapat membantu  sel  mengubah  nutrisi  menjadi energi, namun oksigen ini dapat teroksidasi sehingga terbentuk molekul yang tidak stabil karena metabolisme di dalam tubuh maupun faktor luar seperti merokok, polusi, dan lain sebagainya. Molekul tidak stabil tersebut lalu berubah  menjadi  sebuah  radikal  bebas. Radikal  bebas  ini  sangat  reaktif,  sehingga menimbulkan  banyak  penyakit  degeneratif pada  manusia  seperti  kanker  dan  penyakit kardiovaskular  serta  dapat  menyebabkan oksidatif yang menyerang protein, DNA, dan lipid (Jacobi and Burri, 1996).
Karakteristik  utama  antioksidan  adalah kemampuan untuk menangkap radikal bebas. Radikal  yang  terkandung  dalam  sistem biologis  dapat  mengoksidasi  asam  nukleat, protein,  lipid  atau  DNA  dan  menimbulkan penyakit degenaratif. Komponen antioksidan
yang  terdapat  pada  tanaman  seperti  asam fenolat,  polifenol,  dan  flavanoid  akan menangkap radikal bebas seperti peroksida, hidroperoksida atau lipid peroksil, dan juga menghambat  mekanisme  oksidatif  yang menimbulkan penyakit degeneratif (Prakash, 2001).
I n d o n e s i a   k a y a   a k a n   b e r b a g a i keanekaragaman  hayati  yang  berpotensi untuk dikembangkan sebagai obat atau bahan baku  obat.  Survai  tentang  obat  di Amerika Serikat  yang  diakui  oleh Food  and  Drug Administration pada  periode  1983-1994 menunjukkan  bahwa  157  dari  520  (30%) jenis  obat  berasal  dari  bahan  alam  atau turunannya,  di  mana  61%  senyawa antikanker  yang  diakui  juga  berasal  dari bahan  alam  atau  turunannya.  Survei  ini menunjukkan  terdapat  119  senyawa  yang digunakan sebagai obat yang berasal dari 90 spesies tumbuhan di dunia, di mana 77% dari hasil penelitian, tumbuhan digunakan secara
JURNAL FARMASI SAINS DAN KOMUNITAS, Mei 2013, hlm. 51-60
ISSN : 1693-5683

## UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL
1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN BENALU ( Dendrophthoe pentandra L. Miq.) YANG TUMBUH DI POHON KEPEL ( Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook. f.)

## WILLIGIS DANU PATRIA DAN C.J.SOEGIHARDJO

## Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Abstract: Antioxidant has the ability to capture free radicals. These free radicals can oxidize nucleic acids, proteins, lipids or DNA, causing degenerative diseases. Antioxidants compound found in plants such as phenolic acids, polyphenols and flavanoids would capture free radicals such as peroxide, hydroperoxide or lipid peroxyl and also inhibit the oxidative mechanisms that show  degenerative  diseases.  Quercetin  and  quercetin  3-o-rhamnosida  as  constituents  of mistletoes  (Dendrophthoe  pentandra  (L.)  Miq.),  are  able  to  provide  antioxidant  activity. Mistletoes dried and extracted with 70% ethanol, followed by fractionation with ethyl acetate. Antioxidant activity of ethyl acetate fraction from ethanol extract was calculated using DPPH method  and  obtained  IC   values.  The  results  showed  that  the  ethyl  acetate  fraction  from 50 ethanolic mistletoes leaf extract has antioxidant activity with IC  value of (12.57 ± 0.7) mg / mL. 50
The content of total phenolic (13.76±0.9) mg gallic acid equivalents per gram of ethyl acetate fraction from ethanol extract of leaves of the mistletoes.
Keywords :  Antioxidant,  misletoes  leaf,  Dendrophthoe  pentandra,  ethyl  acetate  fraction, ethanolic extract, DPPH, total phenolic..
tradisional ( ethnomedicine ) (Cordell, 2000). Oleh  karena  itu,  perlu  adanya  eksplorasi a k t i v i t a s   t a n a m a n   o b a t   s e h i n g g a memperkaya informasi tanaman obat.
Benalu  adalah  tumbuhan  yang kurang diperhatikan karena sifatnya sebagai tumbuhan parasit. Tumbuhan benalu secara empiris memiliki khasiat sebagai antikanker. Benalu ( Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) juga  memiliki  aktivitas  antioksidan,  namun aktivitas  antioksidannya  dipengaruhi  oleh tanaman  inang  yang  ditumbuhinya.  Benalu ( Dendrophthoe  pentandra (L.)  Miq.)  pada inang mangga, teh, kenanga, dan belimbing memiliki  nilai IC yang  berbeda  (Artanti, 50 Widayati, dan Fajriah, 2009). Tanaman kepel diketahui  memiliki  aktivitas  antioksidan sangat kuat dengan IC sebesar 6,43 µg/mL 50 (Sunarni,  Pramono,  dan  Asmah,  2007). Berdasarkan  latar  belakang  tersebut,  maka dalam  penelitian  ini  ingin  mengetahui seberapa  besar  aktivitas  antioksidan  benalu ( Dendrophthoe  pentandra (L.)  Miq.)  pada tanaman kepel ( Stelechocarpus burahol (Bl) Hook . f . ). Untuk mendukung hasil aktivitas antioksidan  yang  didapatkan  maka  pada penelitian  ini  dilakukan  penentuan  jumlah fenolik total untuk mempresentasikan jumlah fenolik  yang  menyebabkan  aktivitas antioksidan.  Menurut  Huang,  Boxin, and Prior  (2005)  fenolik  total  ini  memiliki korelasi  yang  baik  dengan  aktivitas antioksidan  sehingga  dapat  dilakukan penelitian terhadap keduanya.

## 2. Bahan dan Metode
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini  adalah:  daun  benalu (Dendrophthoe pentandra L. Miq) yang diambil dari pohon kepel ( Stelechocarpus burahol (Bl) Hook. f. ) yang  terdapat  di  taman  Universitas  Sanata Dharma, Kampus III, Paingan (Yogyakarta); akuades  (Laboratorium  Kimia  Analisis Instrumental  Fakultas  Farmasi  Universitas Sanata  Dharma);  bahan  kualitas p.a. E. Merck,  yaitu:  metanol,  bahan  kualitas p.a. Sigma  Chem.  Co.,  USA,  yaitu:  DPPH, reagen  Folin-Ciocalteu,  asam  galat,  dan kuersetin;bahan kualitas teknis dari Brataco
Chemica,  yaitu:  wasbensin  dan  etil  asetat; bahan  kualitas  teknis  CV.  General Laboratorium,  yaitu:  etanol  70%;  dan aluminium foil .
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini adalah: neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath (labo-tech, Heraeus), vortex (Janke  &  Kunkel),  spektrofotometer UV-Vis (Perkin Elmer Lamda 20), blender , corong Buchner , oven ,  mikropipet  10- 1000 μ L;  1-10  mL  (Acura  825,  Socorex), tabung  reaksi  bertutup,  dan  alat-alat  gelas yang  lazim  digunakan  di  laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

## 2.  1.  Determinasi  tumbuhan  daun  benalu (Dendrophthoe pentandra L. Miq)
Determinasi tanaman benalu dilakukan di  Laboratorium  Farmakognosi  Fitokimia Universitas  Sanata  Dharma,  Fakultas Farmasi  Universitas  Sanata  Dharma. Determinasi tumbuhan ini untuk memastikan bahwa  tumbuhan  yang  digunakan  untuk penelitian  benar-benar  tumbuhan  benalu (Dendrophthoe pentandra L. Miq).

## 2.2.  Pembuatan  dan  penyiapan  bahan
(simplisia)
a.  Pengumpulan  bahan.Tanaman  benalu diperoleh  dari  halaman  Universitas  Sanata Dharma  (Yogyakarta).  Pengumpulan  pada musim  kemarau  bulan  Juli  tahun  2012. Pemanenan dilakukan pada tumbuhan yang menjelang berbunga pada saat pagi hari.
b. Sortasi basah. Bahan baku dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah, krikil,  rumput,  bagian  tanaman  yang  tidak dibutuhkan (tangkai, biji, dan bunga), bagian dari tanaman lain (tangkai, daun, bunga dan biji inang), bahan yang rusak dan lain-lain.
c.  Pencucian.  Pencucian  daun  benalu dilakukan dengan menggunakan air mengalir yang  berasal  dari  air  sumur.  Pencucian  ini dilakukan sebanyak tiga kali.
d. Pengeringan. Daun benalu yang masih basah dikeringkan pada sinar matahari secara tidak  langsung.  Cara  pengeringan  adalah bahan  dihamparkan  di  atas  nampan  bambu dengan  diatur  agar  tidak  terlalu  menumpuk
PATRIA, SOEGIHARDJO 52
dan  diusahakan  agar  bahan  (daun)  tidak menggulung,  kemudian  ditutup  kain  hitam dan  dilakukan  penjemuran  di  bawah  sinar matahari  pada  pukul  09.00  (pagi)  sampai pukul 15.00 (sore). Posisi daun harus sering dibalik  sehingga  pemanasan  dapat  merata. Akhir  pengeringan  ditandai  dengan  mudah hancur bila simplisia diremas dengan tangan.
e. Sortasi kering. Sejumlah simplisia yang sudah  kering  dipisahkan  dari  bahan-bahan pengganggu  seperti  bagian  tumbuhan  yang tidak  diperlukan  atau  daun  yang  rusak  dan lain-lain.
f.  Perajangan  atau  pembuataan  serbuk simplisia.  Daun  benalu    diserbuk  dengan blender  kemudian  di  ayak  dengan  ayakan nomor mesh 40.
g.  Pengepakan  dan  penyimpanan. Sejumlah  simplisia  yang  telah  halus kemudian  dibungkus  dengan  menggunakan kantong  plastik  kedap  udara  dengan  cara dibungkus rapat. Penyimpanan dilakukan di suhu ruangan terhindar dari cahaya matahari.

## 2.3. Ekstraksi simplisia
Simplisia  yang  telah  dihaluskan ditimbang  sebanyak  30  g  dan  dituang  ke dalam bejana maserasi, ditambah etanol 70% sampai  terendam  sempurna,  dan  dicampur homogen.  Campuran  dimaserasi  pada  suhu ruangan  selama  dua  hari.  Filtrat  diperoleh melalui  penyaringan  dengan  corong Buchner.  Ampas  penyaringan  diremaserasi dengan etanol 70% secukupnya selama 2 hari kemudian  disaring.  Lalu  hasil  penyaringan filtrat diuapkan pelarutnya hingga diperoleh ekstak etanol daun benalu.

## 2.4. Pembuatan fraksi etil asetat
Ekstrak  etanol  daun  benalu  ditambah 300  mL  air  hangat  dan  di  ekstraksi  dengan corong  pisah,  yaitu  cair-cair  menggunakan wasbensin  dengan  perbandingan  larutan ekstrak  wasbensin  (1:1  v/v),  kemudian didiamkan hingga terpisah sempurna. Hasil partisi  diperoleh  dua  fraksi,  yaitu  fraksi wasbensin dan fraksi air. Selanjutnya, fraksi air  diekstraksi  cair-cair  lagi  menggunakan etil asetat dengan perbandingan larutan fraksi
air-etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi  etil  asetat  diuapkan  dengan vacuum rotary  evaporator dan waterbath hingga didapatkan  ekstrak  kental.  Lalu  hasil  fraksi tersebut  digunakan  untuk  analisis  lebih lanjut.

## 2.5.  Pembuatan  larutan  pembanding  dan larutan uji
a.  Pembuatan  larutan  DPPH.  DPPH sebanyak  15,7  mg  diambil  dan  dilarutkan metanol  p.a  ke  dalam  labu  ukur  100  mL sehingga  diperoleh  larutan  DPPH  dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil agar terlindung dari cahaya dan harus selalu dibuat baru.
b.  Pembuatan  larutan  stok  kuersetin. Kuersetin diambil 2,5 mg ke dalam labu takar 10,0  mL,  kemudian  dilarutkan  dengan metanol p.a sampai batas tanda.
c.  Pembuatan  larutan  pembanding. Larutan stok kuersetin diambil sebanyak 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL, kemudian ditambahkan metanol  p.a  sampai  10,0  mL,  sehingga diperoleh  konsentrasi  larutan  standar kuersetin  sebesar  5,0;  7,5;  10,0;  12,5;  dan 15,0 μ g/mL. d. Pembuatan larutan uji
1) Larutan  uji  untuk  aktivitas antioksidan.  Fraksi  etil  asetat  ditimbang sebanyak 25,0 mg ke dalam labu takar 25,0 mL, kemudian dilarutkan dengan metanol p.a sampai  batas  tanda  sebagai  larutan  stok. Larutan  stok  diambil  sebanyak  2  mL  ke dalam  labu  takar  10,0  mL,  kemudian ditambahkan metanol p.a sampai batas tanda sebagai  larutan  intermediet.  Larutan intermediet  diambil  sebanyak  0,6;  0,9;  1,2; 1,5;  1,8  mLke  dalam  labu  takar  10,0  mL, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai batas tanda. Konsentrasi larutan uji sebesar 6,05; 9,07; 12,10; 15,12; 18,14 μ g/mL.
2) Larutan  uji  untuk  penentuan kandungan  fenolik  total.  Fraksi  etil  asetat ditimbang sebanyak 10,1 mg ke dalam labu takar 10,0 mL, lalu ditambahkan metanol p.a sampai  batas  tanda  sehingga  diperoleh
PATRIA, SOEGIHARDJO
konsentrasi larutan uji sebesar 141,7 μ g/mL. e. Pembuatan larutan asam galat. Larutan asam  galat  dibuat  dengan  konsentrasi  500 μ g/mL  dalam  akuades  -  metanol  (1:1). Larutan  asam  galat  diambil  sebanyak  1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL ke dalam labu takar 10,0 mL, kemudian ditambahkan akuades - metanol (1:1) sampai batas tanda, sehingga diperoleh  konsentrasi  larutan  baku  asam galat  sebesar  50;  75;  100;  125;  dan  150 μ g/mL.

## 2.6. Uji pendahuluan
a.  Uji  fenolik.Larutan  uji  dengan konsentrasi  750,0 μ g/mL  dan  larutan pembanding asam galat 150,0 μ g/mL diambil sebanyak 0,5 mL kemudian ditambahkan 2,5 mL  pereaksi  Folin-Ciocalteu  yang  telah diencerkan  dengan  akuades  (1:10  v/v) kedalam  tabung  reaksi  lalu  didiamkan selama 10 menit. Larutan natrium karbonat 1 M ditambahkan sebanyak 7,5 mL, kemudian diamati warna larutan tersebut.
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan. Larutan  DPPH  diambil  sebanyak  1  mL dimasukan  ke  dalam  masing-masing  tiga tabung  reaksi.  Larutan  DPPH  ditambahkan masing-masing  dengan  1  mL  metanol  p.a, larutan  pembanding  kuersetin  37,5 μ g/mL, dan  larutan  uji  200,0 μ g/mL.  Selanjutnya, larutan  tersebut  ditambahkan  dengan  3  mL metanol  p.a.  Larutan  tersebut  kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, amati  warna  yang  terjadi  dalam  larutan tersebut.

## 2.7.  Optimasi  metode  uji  aktivitas antioksidan
a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum.  Larutan  DPPH  dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL pada 3 labu ukur  10  mL.  Ditambahkan  larutan  tersebut dengan metanol hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080  mM.  Larutan  tersebut  kemudian divortex  selama  30  detik.  Diamkan  selama OT .  Lalu  dilakukan scanning panjang gelombang  serapan  maksimum  dengan spektrofotometer  visibel  pada  panjang gelombang 400-600 nm.
b.  Penentuan operating  time ( OT ). Larutan DPPH sebanyak 2 mL dimasukkan ke  dalam  masing-masing  tiga  labu  ukur  5 mL,  ditambahkan  masing-masing  dengan  1 mL larutan pembanding kuersetin 5, 10, dan 15 μ g/mL.  Selanjutnya,  larutan  tersebut ditambahkan  dengan  metanol  p.a  hingga tanda  batas.  Larutan  tersebut  kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu, dibaca absorbansinya  dengan  spektrofotometer visibel  pada  panjang  gelombang scanning hasil dari serapan panjang gelombang selama 1  jam.  Dilakukan  demikian  juga  untuk larutan uji 6, 12, dan 18 μ g/mL.
2.8. Uji aktivitas antioksidan
a.  Pengukuran  absorbansi  larutan  DPPH (kontrol).  Larutan  DPPHdimasukkan sebanyak 2 mL dalam labu ukur 10,0 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. K e m u d i a n   l a r u t a n   t e r s e b u t   d i b a c a absorbansinya  pada  saat OT dan  panjang g e l o m b a n g   m a k s i m u m .   P e n g e r j a a n dilakukan  sebanyak  tiga  kali.  Larutan  ini digunakan  sebagai  kontrol  untuk  menguji larutan pembanding dan larutan uji.
b.  Pengukuran  absorbansi  larutan pembanding  dan  uji.  Larutan  DPPH sebanyak  2  mL  dimasukkan  ke  dalam  labu ukur 10,0 mL kemudian ditambah dengan 2 mL  larutan  pembanding  dan  uji  pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat. Selanjutnya,  larutan  tersebut  ditambah dengan metanol hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan  didiamkan  selama OT .  Larutan  dibaca absorbansinya  dengan  spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali replikasi.

## 2.9. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
O p t i m a s i   m e t o d e   p e n e t a p a n kandungan  fenolik  total  ditentukan  dengan menggunakan  metode  spektrofotometri sesuai dengan penelitian Rollando ( 2012).
a.  Penentuan OT. Larutan  asam  galat sebanyak  0,5  mL  50;  100;  dan  150 μ g/mL ditambahkan  dengan  5  mL  reagen  Folin-
PATRIA, SOEGIHARDJO 54
Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan  4,0  mL  natrium  karbonat  1  M. Setelah  itu,  dibaca  absorbansinya  dengan spektrofotometer  visibel  pada  panjang gelombang 750 nm selama 30 menit.
b.  Penentuan  panjang  gelombang maksimum.  Larutan  asam  galat  diambil sebanyak  0,5  mL  50,  100,  dan  150 μ g/mL ditambahkan  dengan  5  mL  reagen  Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1  v/v).  Larutan  selanjutnya  ditambahkan dengan  4,0  mL  natrium  karbonat  1  M. Diamkan  selama OT, absorbansinya  dibaca pada λ maksimum dengan spektrofotometer visibel  pada  panjang  gelombang  600-800 nm.
2.10. Penetapan kandungan fenolik total a.  Pembuatan  kurva  baku  asam  galat. Larutan asam galat diambil sebanyak 0,5 mL 50, 75, 100, 125, dan 150 μ g/mL ditambah dengan  5  mL  reagen  Folin-Ciocalteu  yang telah  diencerkan  dengan  air  (1:1  v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium  karbonat  1M.  Setelah OT, absorbansinya  dibaca  pada λ maksimum terhadap  blanko  yang  terdiri  atas  akuades  - metanol p.a (1:1),  reagen  Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaan dilakukan tiga kali.
c.  Estimasi  kandungan  fenolik  total larutan  uji.  Diambil  0,5  mL  larutan  uji  750 μ g/mL,  lalu  masing-masing  dimasukkan  ke dalam  labu  takar  10,0  mL  dan  dilanjutkan sebagaimana  perlakuan  pada  pembuatan kurva baku asam galat . Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat). Lakukan tiga kali replikasi.

## 2.11. Analisis Hasil
Aktivitas  penangkapan  radikal  DPPH (%) dihitung dengan rumus :
Data  aktivitas  tersebut  dianalisis  dan dihitung nilai IC menggunakan persamaan 50 regresi  linear  dengan  sumbu  x  adalah
konsentrasi larutan uji maupun pembanding, sedangkan  sumbu  y  adalah  % IC .  Lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada  atau  tidak  adanya  perbedaan  bermakna antara IC larutan  pembanding  dan  larutan 50 uji.
Uji  kandungan  fenolik  dinyatakan dengan mg ekivalen asam galat dalam per g fraksi  etil  asetat.  Nilai  tersebut  didapatkan dari analisis regresi linier dengan data kurva baku secara intrapolasi.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Determinasi  tanaman  bertujuan  untuk mengetahui  dan  memastikan  kebenaran identitas  tanaman  yang  akan  digunakan dalam  penelitian  untuk  menghindari terjadinya  kesalahan  dalam  pengambilan sampel analisis fitokimia. Hasil determinasi menunjukkan  bahwa  tanaman  yang digunakan  adalah  benalu  ( Dendrophthoe pentandra (L.) Miq).
Daun  benalu  diperoleh  dari  beberapa pohon  kepel  yang  ditumbuhi  tumbuhan parasit  benalu  di  kompleks  Kampus Universitas  Sanata  Dharma,  Desa  Paingan, Kecamatan  Maguwoharjo,  Kabupaten Sleman,  Yogyakarta.  Daun  benalu  dipanen dengan  kriteria-kriteria  berikut  ini,  yaitu pada  musim  kemarau  pada  bulan  Juli,  saat tumbuhan  berbunga  pada  pagi  hari. Tumbuhan benalu dikumpulkan dan diambil daunnya  yang  masih  segar,  tidak  kuning tanpa ada klasifikasi umur tanaman.
Penelitian  ini  digunakan  sampel  daun yang  telah  dikeringkan  karena  untuk mengurangi  kerusakan  senyawa  dengan adanya enzim pada tanaman segar, selain itu k a n d u n g a n   a i r   y a n g   t i n g g i   a k a n m e n i n g k a t k a n   p e r t u m b u h a n   m i k r o - organisme.  Proses  pengeringan  dilakukan setelah  penyortiran  dan  pencucian  yang bertujuan  untuk  mengurangi  kontaminasi dari benda asing yang mungkin akan menjadi pengacau dalam penelitian baik berupa debu, a t a u   b a g i a n   t a n a m a n   l a i n .   P r o s e s pengeringan  dengan  cara  diangin-anginkan dan  ditutup  dengan  kain  hitam.  Tumbuhan
PATRIA, SOEGIHARDJO
ditutup  kain  hitam  bertujuan  untuk mengurangi  UV  yang  mungkin  dapat merusak senyawa antioksidan yang terdapat pada tanaman tersebut (Andayani, Lisawati dan  Maimunah,  2008).  Pengeringan dihentikan ketika daun sudah kering dengan tanda rapuh dan mudah diremas. Daun yang telah  kering  tersebut  kemudian  diserbuk dengan menggunakan blender sampai halus. Kemudian  serbuk  diayak  dengan  ayakan nomor mesh 40.
Kesuksesan  dari  hasil  pengambilan komponen  aktif  dari  tumbuhan  didasarkan dari  tipe  pelarut  yang  digunakan  dalam prosedur  ekstraksi.  Etanol  dipilih  sebagai pelarut  karena  lebih  mempresentasikan j u m l a h   p o l i f e n o l   y a n g   l e b i h   b a i k dibandingkan  dengan  ekstrak  air,  lebih efisien  dalam  menembus  dinding  sel  dan menarik  polifenol  untuk  keluar  dalam  sel, dan  bersifat preservative terhadap mikroorganisme  (Lapornik et  al., 2005). Etanol dengan konsentrasi 70% dengan 30 % air  dipilih  karena  komponen  bioaktif flavonoid  memiliki  konsentrasi  lebih  besar dibandingkan  dengan  etanol  secara  murni. Maserasi  dipilih  sebagai  metode  ekstraksi karena  metode  yang  baik  dalam  ekstraksi tanpa  bantuan  panas . Bobot  ekstrak  etanol yang  didapat  adalah  14,7  g  dan  rendemen yang didapat dari ekstrak etanol daun benalu adalah  16,34  %.  Hasil  ekstrak  yang  berupa ekstrak  kental  tersebut  disimpan  di  lemari pendingin untuk menjaga agar ekstrak tetap baik selama penyimpanan sampai dilakukan tahap selanjutnya.
Setelah didapatkan ekstrak kental etanol kemudian  dilakukan  ekstraksi  kembali dengan wasbensin . Hal ini dimaksudkan agar menghilangkan  senyawa-senyawa  yang tidak diinginkan pada tumbuhan seperti lipid dan  klorofil. Wasbensin memiliki  indeks polaritas  3,8  yang  berarti  bersifat  sangat  non polar,  sehingga  dapat  digunakan  untuk mengekstraksi  senyawa  non  polar  seperti klorofil,  vitamin,  minyak,  lemak  dan  aglikon flavonoid  yang  non  polar  misalnya  aglikon isoflavon dan termetoksilasi (Harborne, 1987).
Fase  air  yang  didapat  kemudian  di  fraksinasi kembali  dengan  menggunakan  etil  asetat. Fraksi etilasetat kemudian diuapkan dengan menggunakan vaccum  rotary  evaporator untuk  mendapatkan  ekstrak  yang  pekat. Fraksi  etil  asetat  yang  sudah  dibungkus dimasukkan  didalam  desikator  agar  tidak terpapar  lembab  dan  ditumbuhi  jamur  atau mikroba. Bobot fraksi etil asetat yang didapat sebesar 0,73 g dan rendemen fraksi etil asetat yang didapat adalah 0,81%.

## 3.1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Tujuan  dilakukan  uji  pendahuluan  ini adalah  untuk  mengetahui  secara  kualitatif aktivitas  antioksidan  dari  fraksi  etil  asetat ekstrak etanolik daun benalu ( Dendrophthoe pentandra  ( L).  Miq.).  Prinsip  dari  metode DPPH  dalam  mengetahui  aktivitas antioksidan  adalah  didasarkan  dari  reaksi reduksi  dari  radikal  DPPH.  Hasil  uji pendahuluan menunjukkan warna larutan uji memberikan  warna  yang  sama  dengan kuersetin  (kontrol  positif)  (Gambar  1).  Ini berarti  fraksi  etanolik  daun  benalu mempunyai  aktivitas  antioksidan  secara kualitatif.

## 3.2. Uji pendahuluan fenolik
Tujuan  dari  uji  ini  adalah  untuk mengetahui  secara  kualitatif  kandungan senyawa  fenolik  dalam  fraksi  etil  asetat ekstrak etanolik daun benalu. Prinsip uji ini adalah  reaksi  oksidasi  dari  senyawa  fenol oleh  reagen  molibdotungstat  menghasilkan suatu  produk  yang  berwarna  biru  disekitar panjang  gelombang  745-750  nm.  Hasil  uji menunjukkan warna larutan uji memberikan warna yang sama dengan asam galat (kontrol positif)  (Gambar  2).  Ini  berarti  secara kualitatif  fraksi  etanolik  daun  benalu mengadung senyawa fenolik.

## 3.3. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas
Antioksidan
3.3.1.  Penentuan  panjang  gelombang serapan maksimum ( λ maks)
P e n e n t u a n   p a n j a n g   g e l o m b a n g maksimum  dilakukan  untuk  mendapatkan
PATRIA, SOEGIHARDJO 56
daerah  serapan  maksimum  DPPH  atau absorbsi  maksimum  untuk  mendapatkan hasil  lineritas  dari  pengukuran  kurva  baku. Penentuan  panjang  gelombang  maksimum dilakukan pada tiga konsentrasi, yaitu pada konsentrasi tinggi, tengah dan rendah, yaitu 0,020;  0,040;  dan  0,080  mM.  Rata-rata panjang  gelombang  yang  didapatkan  dari ketiga konsentrasi tersebut adalah 515,5 nm. Seperti  yang  telah  digunakan  515,5  nm (Soegihardjo  and  Rollando,  2012),  515  nm (Bondet, et al. , 1997).

## 3.3.2. Penentuan Operating Time
Penentuan operating  time dilakukan dengan  tujuan  untuk  mendapatkan  waktu optimum  dimana  reaksi  antara  baku pembanding  (kuersetin)  dan  larutan  uji (fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol)  terhadap reagen  (DPPH)  yang  diberikan.  Penentuan Operating  time didasarkan  dari  waktu  di mana absorbansi dari baku pembanding dan larutan uji terhadap reagen mulai stabil atau selisih absorbansi mulai kecil antara selang waktu yang diujikan. OT yang didapat adalah
30 menit pada λ maksimal 515,5 nm.

## 3.4. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH
Uji  aktivias  antioksidan  dilakukan dengan metode penangkapan radikal ( radical scavenging )  terhadap  radikal  2,2-difenil-1- pikril  hidrazil  (DPPH).  Prinsip  metode  ini adalah  melihat  kemampuan  antioksidan dengan  mengukur  pengurangan  intensitas warna  dari  DPPH  akibat  penangkapan elektron radikal DPPH oleh antioksidan yang menjadi  berikatan  dengan  hidrogennya DPPH-H. Hasil dari pengurangan warna ini merupakan stokiometri terhadap jumlah dari elektron  yang  ditangkap  (Bondet, et  al ., 1997).
DPPH l + AH ↔ DPPHH + A l
Sebagai  blangko  adalah  pelarut  yang digunakan  dalam  mengukur  dengan spektrofotometri  visibel.  Pelarut  yang digunakan  adalah  metanol.  Digunakan metanol  karena  metanol  terbukti  tidak mengganggu  (interferensi)  dalam  reaksi DPPH  (Molyneux,  2004).  Pengukuran dilakukan  dalam  panjang  gelombang maksimum  hasil scanning ,  yaitu  515,5  nm. Berkurangnya  intensitas  warna  DPPH berjalan dengan stokiometri, yaitu sebanding dengan  konsentrasi  senyawa  antioksidan. Parameter  yang  digunakan  untuk  aktivitas antioksidan  dengan  metode  penangkapan radikal  DPPH  ini  adalah IC yakni 50, konsentrasi  senyawa  uji  yang  dibutuhkan untuk  mengurangi  radikal  DPPH  sebesar 50%.
Dalam  pembacaan  hasil  digunakan  uji kebermaknaan untuk membandingan antara faktor  eksperimental  dengan  statistik  agar keputusan yang diambil benar. Software yang dipakai  dalam  pengujian  dengan  statistik adalah R 2.14.1. Uji yang pertama dilakukan adalah  uji  normalitas  Shapiro-Wilk.  Hasil statistik menunjukkan nilai p sebesar 0,9488 dan  0,4029  masing-masing  untuk IC 50 kuersetin  dan  fraksi  etil  asetat.  Dapat disimpulkan  bahwa IC kuersetin  maupun 50 fraksi etil asetat mengikuti distribusi normal.
PATRIA, SOEGIHARDJO
Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas 57 B A C B A C
Gambar 1. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif [blanko], B = larutan uji
[fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu]+DPPH, C =kontrol positif [kuersetin] +DPPH
Gambar 2. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = kontrol negatif [blanko], B = larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu]+Folin Ciocalteu dan Na2CO3, C =kontrol positif [asam galat])
Sesuai dengan jenis penelitian uji parametrik yang  digunakan  adalah  uji  t  tidak berpasangan. Dari hasil perhitungan dengan program R tersebut didapatkan nilai p adalah 0,0079. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa  nilai  rerata IC kuersetin  berbeda 50 dengan IC fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol 50 daun benalu.
Perbandingan IC benalu dari berbagai 50 inang  ditunjukkan  pada  tabel  II.  Aktivitas fraksi etil asetat ekstrak   etanol daun benalu masih di bawah benalu pada inang mangga, duku,  kenanga,  duku,  teh.    Perbedaan aktivitas antioksidan benalu ini dipengaruhi
tanaman  inang  yang  ditumbuhinya,  karena sifatnya benalu yang semi parasit.
Fraksi  etilasetat  ekstrak  etanolik  daun benalu  memiliki  aktivitas  yang  sangat  kuat (< 50  µg/mL) walaupun  memiliki  aktivitas antioksidan  yang  lebih  kecil  dari  pada kuersetin    dan  benalu  yang  tumbuh  dari berbagai  inang  seperti  mangga,  dan  teh dilihat dari nilai Ic . 50

## 3.5. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total 3.5.1. Penentuan Operating time (OT)
Penentuan operating  time dilakukan dengan  tujuan  untuk  mendapatkan  waktu
PATRIA, SOEGIHARDJO
58
Kuersetin Replikasi IC 50 (µg/mL) Rerata (µg/mL) SD CV Interval kepercayaan (95%) I 11,60 11,42 0,16 0,42 0,40 II 11,28 III 11,40 Fraksi etil asetat Replikasi IC 50 (µg/mL) Rerata (µg/mL) SD CV Interval kepercayaan (95%) I 12,43 12,57 0,28 2,26 0,70 II 12,38
III 12,90
No Sampel
Ekstrak EtOH
80% IC 50 (µg/mL) Fraksi etil asetat ekstrak EtOH 70% (µg/mL) 1 Benalu Belimbing* 21,0 2 Benalu Mangga* 6,4 3 Benalu Kenanga* 10,7 4 Benalu Duku* 9,6 5 Benalu Sirsak* 38,7 6 Benalu Cemara** 9,4 7 Benalu Mahkota Dewa* 25,2 8 Benalu Teh* 11,1 9 Benalu Kepel 12,57
Tabel I. Hasil perhitungan IC 50 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu
Tabel II. Perbandingan IC benalu dari berbagai inang
50
* (Artanti, Darmawan, dan Fajriah, 2006) , ** (Darmawan, Artanti, Hanafi, 2006)
optimum  dimana  reaksi  antara  baku pembanding  (asam  galat)  dan  larutan  uji (fraksi etil asetat ekstrak etanolik) terhadap reagen  (DPPH)  yang  diberikan.  Panjang gelombang maksimum yang dipakai adalah panjang  gelombang  yang  telah  didapatkan dalam penetapan lamda maks. Teoritis, yaitu 750  nm. Dari  hasil  ditunjukan OT yang didapatkan dari asam galat adalah 10 menit.
3.5.2.  Penentuan  panjang  gelombang serapan maksimum ( λ maks)
P e n e n t u a n   p a n j a n g   g e l o m b a n g maksimum  dilakukan  bertujuan  untuk mendapatkan  daerah  serapan  maksimum DPPH  atau  absorbsi  maksimum  untuk mendapatkan hasil lineritas dari pengukuran kurva  baku.  Dalam  penentuan  panjang gelombang  maksimum  dilakukan  pada  tiga konsentrasi, yaitu konsentrasi tinggi, tengah dan rendah, yaitu 50, 100, dan 150 µg/mL. Rata-rata  panjang  gelombang  yang didapatkan  dari  ketiga  konsentrasi  tersebut adalah 750 nm.

## 3.5.3. Estimasi Kandungan Fenolik Total
Senyawa  yang  berperan  utama  dalam aktivitas  antioksidan  adalah  senyawa f e n o l i k .   S e n y a w a   f e n o l i k   b a n y a k terdistribusi  dalam  tanaman,  maka  perlu dilakukan  perhitungan  kandungan  fenolik total  yang  mungkin  tedapat  pada  fraksi  etil asetat  ekstrak  etanolik  pada  daun  benalu tersebut.  Prinsip  metode  kolorimetri  Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi yang cepat dari  fenol  dengan  menggunakan  alkali (biasanya  natrium  karbonat),  di  mana  nilai yang  didapat  signifikan  dengan  konsentrasi ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011).
Kompleks  biru  yang  terbentuk terjadi  dengan  reaksi  oksidasi  reduksi  dari ion  fenolat  senyawa  uji  dengan  pereaksi
fenol Folin-Ciocalteu. Dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat dengan  produk  warna  biru  sekitar  panjang gelombang  745-750  nm  (Ronald, et  al., 2005).
Dari  ketiga  persamaan  yang  telah didapatkan  dari  tiga  replikasi  dipilih persamaan  yang  paling  linear  yang ditunjukkan  oleh  nilai  r  nya.  Persamaan regresi linear yang paling baik diperoleh dari replikasi III dengan y = 0,004x + 0,1296 dan r sebesar  0,999.  Berdasarkan  perhitungan intrapolasi  persamaan  regresi  linear  y  = 0,004x  +  0,1296;  maka  didapatkan kandungan  fenolik  total  fraksi  etil  asetat ekstrak  etanolik  daun  benalu  sebesar (13,76±0,92)  mg  ekivalen  asam  galat  per  g fraksi etil asetat dengan nilai CV sebesar 3,67 %  yang  termasuk  baik  karena  kurang  dari 20% (Kingstone, 2004)

## 5.  Kesimpulan
Nilai  aktivitas  antioksidan  fraksi  etil asetat  ekstrak  etanolik  daun  benalu  dengan menggunakan  radikal  bebas  DPPH  yang dinyatakan  sebagai IC 50  sebesar  (12,57 ±0,7 ) μ g/mL (taraf kepercayaan 95%).
Kandungan fenolat total pada fraksi etil asetat  ekstrak  etanol  daun  benalu  yang dinyatakan  dengan  massa  ekivalen  asam galat sebesar (13,76±0,9) mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanol daun  benalu  (taraf  kepercayaan  95%). Metode kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu belum tervalidasi.

## PATRIA, SOEGIHARDJO
Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas 59
Gambar 3. Kurva kalibrasi asam galat dalam penetapan fenolik total
Replikasi fenolik total (mg ekivalen) rata- rata SD CV (%) Rentang kepercayaan 95% I 13,89 II 14,05 13,76 0,3724 2,7065 0,92
III 13,34
Tabel III. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu

## Saran
P e r l u   d i l a k u k a n   p e n g e m b a n g a n formulasi  yang  tepat  dari  fraksi  etil  asetat ekstrak  etanol  daun  benalu Dendrophthoe pentandra. Perlu  dilakukan  pengujian antioksidan  pada  batang  dan  bunga  benalu. Perlu  dilakukan  uji  korelasi  lebih  lanjut melalui uji statistik antara kandungan fenolat total  dengan  aktivitas  antioksidan.  Perlu dilakukan  uji  akurasi  sebagai  validasi metode dalam kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu.

## Daftar Pustaka
Andayani,  R.,  Lisawati  Y.,  dan  Maimunah,  2008, Penentuan  Aktivitas  Abtioksidan  Kadar  Fenolat Total  dan  Likopen  Pada  Buah  Tomat  (Solanum L y c o p e r s i c u m
L . ) ,
http://ffarmasi.unand.ac.id/pub/JSTFFeb2009% 20_regina_.pdf,  diakses  tanggal  20  Desember 2012
Artanti,  N.,  Darmawan A.,  Hanafi  M.,  2006,  Isolasi dan  Identifikasi  Senyawa Aktif Antioksidan  dari Ekstrak  Air  Daun  Benalu (Dendrophthoe pentandra  L.  Miq.)  yang  Tumbuh  pada  Cemara. jurnal.pdii.lipi.go.id, 43-51 .
Artanti,  N.,  Widayati,  R.,  dan  Fajriah,  S.,  2009,
Aktivitas Antioksidan dan Toksisitas Ekstrak Air dan Etanol Daun Benalu ( Dendrophtoe petandra L. Miq) yang tumbuh pada berbagai inang, JKTI, vol 11 No 1, 38-40.
Bondet, V., Brand-Williams, W. and Berset, C., 1996, Kinetics and Mechanisms of Antioxidant Activity using the DPPH Free Radical Method, Lebensm.- Wiss. U.-Technol ., vol. 30, 609–615. Cicco, N., and Lattanzio, V., 2011, The Influence of Initial  Carbonate  Concentration  on  the  Folin- Ciocalteu Micro-Method for the Determination of Phenolics with Low Concentration in the Presence of Methanol: A Comparative Study of Real-Time Monitored Reactions, Am. J. Anal. Chem., pp.840- 845.
Cordell,  G.A.,  2000,  Biodiversity  and  Drug D i s c o v e r y – a   S y m b i o t i c   R e l a t i o n s h i p . Phytochemistry , vol 55, 463–380
Harborne,  J.B.,  1987, Metode  Fitokimia  :  Cara Modern  Menganalisis  Tumbuhan, Ed.  2, diterjemahkan  oleh  Padmawinata,  K.,  Penerbit ITB, Bandung, pp.47-109.
Huang,  D.,  Boxin,  O., and Prior,  R.L.,  2005,  The Chemistry Behind Antioxidant Capacity Assays. J. Agr. Food Chem. , pp.53, 1841-1856. Jacobi, R.A., and Burri, B.J. 1996, Oxidative damage and defense. Am. J. Clin. Nutr., 63 , 985–990. Kingston,  2004, Guidelines  for  The  Validation  of Analytical  Methods  for  Active  Constituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products , APVMA.
Lapornik,  B.,  Prosek,  M.,  Wondra,  A.  G.,  2005, Comparison of Extracts Prepared From Plant by- Products Using Different Solvents and Extraction Time. J. Food Eng., 214–222.
Molyneux, P., 2003,The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol. , Vol. 26, No. 2, Mar.-Apr. 2004, pp. 212-217 Prakash, A., 2001, Antioxidant Activity, takes you into the Heart of a Giant Resource Volume 19 Number 2, 1,2.
Soegihardjo,C.J.  and  Rollando,  2012, Antioxidant activity  by  DPPH  Method  and  Total  Phenolic Content of Water Fraction of Methanolic   Extract of Piper  betle L.  Leaf  , Proceeding  of  The International  Conference  on  Medical  Plants (ICMP) ,  October  11-13,  2012  in Purwokerto , Indonesia.
Ronald, L. Prior, Wu, Xianli, and Schaich, K., 2005, Standardized  Methods  for  the  Determination  of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements, J. Agr. Food Chem., 4290- 4302.
Sunarni  T.,  Pramono  S.,  dan  Asmah  R.,  2007, Antioxidant-free  Radical  Scavenging  of Flavonoid  from  The  Leaves  of Stelechocarpus burahol (BI.) Hook. F. and Th., Majalah Farmasi Indonesia, 18(3), 111-116.
PATRIA, SOEGIHARDJO 60