## Research Articles
Pengaruh Rasio Kitosan-Sodium Tripolifosfat Terhadap Pengendalian Antraknosa ( Colletotrichum gloeosporioides ) Pada Mangga Kultivar Manalagi
Y. Suryadi 1* , Dwi N. Susilowati 2 , dan  I.M. Samudra 1
1 Lab. Biokimia, BB Biogen, Jl Tentara Pelajar 3A Bogor 16111
2 Lab. Mikrobiologi, BB Biogen, Jl Tentara Pelajar 3A Bogor 16111

## Received 9 Mei 2020; Accepted 14 Agustus 2020; Published 7 September 2020
Keyword:
Anti fungi;
B. cepacia E76; Low molecular weight; Chitosan; Chitinase
ABSTRACT: Anthracnose disease caused by the fungus Colletotrichum gloeosporioides is one of the most important diseases on fruit trees. Chitosan material have been applied to many different application fields including disease biocontrol because of its  biocompatible and  biodegradable  effect.  This  research  was  aimed    to  synthesize  low  molecular  weight chitosan  (LMWC)  which  prepared  via  enzymatic  process  using  a  bacterium Burkholderia cepacia E76  and  ionic  gelation  method,  using  sodium  tripolyphosphate  (NaTPP),  and  to test  their  activity  against C.  gloeosporioides on  mangoes  fruits.  In  this  study  the  effect  of concentration  and  volume  ratio  of  LMWC  :  NaTPP  was  determined  based  on  particle characteristics, i.e particle size, polydispersity index, zeta potential and FTIR structure. The results  showed  that  LMWC  could  be  synthesized  by means  of  enzymatic  hydrolysis  using chitinase  originated  from B.  cepacia E76.  The  optimal  nanoparticle  conditions  was obtained by concentration of 0.3% LMWC, 0.1% TPP with volume ratio 5 : 1, stirring for 30- 60  min  incubation  with  the  particle  size  of    126.2  nm  and  ZP  value  of    25.5  +  6.1  mV. LMWC  and  nano  chitosan  product  could  be  evidenced  by  FTIR  analysis.  Nano  chitosan could inhibit the growth of C. gloeosporioides ranging from 61.28 – 96% under in vitro test. The  result  of in  vivo test  on  manggoes  fruit  cv  Manalagi,  showed  that  chitosan  nano particle  could  effectively  inhibit  the  growth  of  anthracnose  (74.5%)  at  concentration  of 0.3% LMWC, and 0.1% NaTPP with ratio 5:2 compared with control. @2020 Published by UP2M, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University
Kata Kunci:
Anti jamur;
B. cepacia E76;
Bobot molekul rendah; Kitosan;
Kitinase ABSTRAK: Penyakit  antraknosa  yang  disebabkan  oleh  jamur Colletotrichum gloeosporioides merupakan salah satu penyakit paling penting pada mangga. Kitosan telah diterapkan  pada  berbagai  bidang  termasuk  pengendalian  hayati  penyakit  karena  sifatnya yang  kompatibel  dan  mudah  terurai.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mensintesis  kitosan bobot  molekul  rendah  (KBMR)  yang  disiapkan  melalui  proses  enzimatik  menggunakan bakteri Burkholderia  cepacia E76  dan  metode  gelasi  ionik,  menggunakan  natrium tripolifosfat  (NaTPP),  serta  untuk  menguji  aktivitas  nya  terhadap C.  gloeosporioides pada buah mangga. Dalam penelitian ini pengaruh konsentrasi dan rasio volume KBMR: NaTPP ditentukan  berdasarkan  karakteristik  partikel,  yaitu  ukuran  partikel,  indeks  polidispersitas, zeta  potensial  dan  struktur  FTIR.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  KBMR  dapat disintesis  dengan  cara  hidrolisis  enzimatik  menggunakan  kitinase  yang  berasal  dari B. cepacia E76. Kondisi partikel nano optimal diperoleh dengan konsentrasi 0,3% KBMR, 0,1% NaTPP  dengan  rasio  volume  5:  1,  pengadukan  selama  30-60  menit  inkubasi  dengan ukuran partikel 126,2  nm dan nilai ZP sebesar  25,5 + 6,1 mV. Produk KBMR dan nano kitosan  dapat  dibuktikan  dengan  analisis  FTIR.  Nano  kitosan  dapat  menghambat pertumbuhan C. gloeosporioides dengan kisaran 61,28 – 93,75% pada uji in vitro . Hasil uji in vivo pada  buah  mangga  kultivar  Manalagi,  menunjukkan  bahwa  partikel  nano  kitosan efektif menghambat pertumbuhan antraknosa (74,5%) pada konsentrasi 0,3%  KBMR, dan 0,1%  NaTPP  rasio  5:  2  dibandingkan  kontrol.  @2020  Published  by  UP2M,  Faculty  of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University

## Jurnal Penelitian Sains
Journal Home Page: http://ejurnal.mipa.unsri.ac.id/index.php/jps/index
∗ Corresponding author. E-mail address: yshid@yahoo.co.uk
2597-7059 Online, 1410-7058 print/ @2020 Published by UP2M, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University

## PENDAHULUAN
Komoditas  hortikultura  terutama  buah mangga  memiliki  prospek  yang  baik,  jika dikembangkan  secara  intensif  dalam  skala agroindustri  karena  peluang  pasar  buah  juga meningkat  seiring  dengan  tingkat  komunitas masyarakat[1].
Salah  satu  kendala  dalam  budidaya mangga adalah adanya penyakit antraknosa yang disebabkan  oleh  jamur  patogen Colletotrichum gloeosporioides Penz.  [2].  Penyakit  ini  biasanya terjadi  pada  periode  pasca  panen  walaupun serangan  sudah  dimulai  sejak  di  lapangan sehingga  menurunkan  kuantitas  dan  kualitas buah.  Jamur C.  gloeosporioides dikenal  sebagai jamur  yang  polifag,  dimana  banyak  komoditas buah-buahan lainnya juga dapat terinfeksi jamur ini.  Gejala  serangan  pada  buah  berupa  bercak coklat  atau  hitam,  sedikit  cekung  dan  seringkali bercak terlihat pada pangkal buah [3].  Kerugian serangan penyakit tidak hanya terhadap kuantitas tetapi juga kualitas di mana buah yang terinfeksi menjadi tidak layak untuk konsumsi; Oleh karena itu,  perlu  dikaji  alternatif  penghambat  penyakit antraknosa  yang  efektif,  murah  dan  ramah lingkungan.
Sampai  saat  ini,  untuk  mengurangi kerugian akibat akibat penyakit antraknosa (baik sebagai  preventif  maupun  kuratif),  penggunaan fungisida sintetik paling banyak digunakan dalam perlindungan  tanaman,  tetapi  hal  ini  bisa menyebabkan  resistensi  patogen  terhadap beberapa  residu  fungisida  (benomyl,  quintozen) pada  hasil  pertanian,  dan  biaya  tinggi  [4].  Oleh karena  itu,  alternatif  pengendalian  untuk mengurangi  intensitas  penyakit  sebagai  metode perlindungan  tanaman  yang  lebih  berkelanjutan dan  aman  bagi  konsumen  perlu  dikembangkan [5].
Pendekatan  terpadu  dengan  memasukkan beberapa  metode  pengendalian,  yang  ramah lingkungan,  aman  dan  relatif  murah  sangat dianjurkan  untuk  mendukung  pengendalian penyakit.  Salah  satu  penghambat  penyakit antraknosa yang ramah lingkungan, yaitu kitosan. Kitosan adalah polisakarida yang terdiri dari glukosamin dan N-asetilglukosamin yang berfungsi  untuk  menginduksi  respons  resistensi tanaman  terhadap  infeksi  patogen  [6].  Kitosan
dapat  mengurai  kitin,  unsur  utama  dinding  sel jamur [7].
Partikel  nano  kitosan  telah  digunakan dalam berbagai aplikasi, termasuk dalam aplikasi farmasi,  dan  pengendali  hayati  penyakit  karena memiliki luas permukaannya yang tinggi dan sifat aktivitas  anti-jamur  [8;  9]).  Tujuan  pembuatan nanopartikel, antara lain, meningkatkan stabilitas senyawa  aktif  terhadap  degradasi  lingkungan. Selain  itu,  modifikasi  ukuran  partikel  dan  sifat permukaan,  bertujuan  untuk  mengoptimalkan efek  terapi  obat  [10;11]).  Mekanisme  antijamur kitosan  dapat  terjadi  pada  tingkat  ekstraseluler dan  intraseluler    [12].  Kelebihan  kitosan  adalah bersifat  anti  mikroba,  penyembuh  luka,  tidak beracun,  murah,  biokompatibel,  mudah  terurai secara  biologis,  dan  larut  dalam  air  [13]. Efektivitas  kitosan  sebagai  fungisida  dapat ditingkatkan dengan mengurangi ukuran partikel menjadi ukuran nano yang disebut partikel nano kitosan.  Partikel  nano  juga  dapat  didefinisikan sebagai sistem koloidal submikron (<1 μ m).
Laporan  tentang  aktivitas  antijamur partikel  nano  kitosan  terhadap  patogen  mangga terutama penyakit antraknosa ( C. gloeosporioides ) relatif masih terbatas [14]. Aktivitas partikel  nano kitosan  sangat  dipengaruhi  oleh  beberapa parameter  seperti  suhu,  waktu  pengadukan, konsentrasi,  pH,  pelarut,  jenis  jamur,  dan  berat molekul kitosan, sehingga perlu untuk menentukan  formula  yang  tepat  dalam menghambat pertumbuhan jamur C. gloeosporioides.
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk mendapatkan  formula  nano  kitosan  dengan karakteristik  terbaik  untuk  mengendalikan penyakit  antraknosa  melalui  pengujian in  vitro pada    media  PDA  dan, in  vivo pada  mangga kultivar  Manalagi.  Dalam  tulisan  ini,  dilaporkan nano  kitosan  yang  diperoleh  dengan  perlakuan beberapa konsentrasi KBMR dengan gelasi ionik. Selain  itu,  dijelaskan  perbedaan  karakteristik partikel  sebagai  anti-jamur  dalam  hal  morfologi ukuran dan daya hambat.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di laboratorium Mikrobiologi BB Biogen dengan melakukan aktifitas perbanyakan  isolat  E76  koleksi  Biogen  CC, ekstraksi  enzim  kitinase,  formulasi  kitosan  dan karakteristiknya  dengan  PSA  dan  FTIR  serta  uji efektifitas formula ( in vitro dan in vivo )  (Gambar 1).
Gambar 1. Flowchart penyiapan formulasi kitosan termodifikasi  enzim  kitinase  dan  NaTPP  serta karakteristiknya terhadap C.gloesosporioides
Perbanyakan  Bakteri B.  cepacia (E-76) dan Jamur C. gloeosporioides Inokulasi bakteri B. cepacia E 76 dilakukan pada  laminar  yang  telah  disterilkan  dengan alkohol.  Sebanyak  1  ose  bakteri  disuspensikan dalam  media  kaldu  nutrisi.  Peremajaan  jamur dilakukan  pada  media  potato  dextrose  agar (PDA).  Media  PDA  dilubangi  di  tengah  dengan bor gabus, kemudian diinokulasi C. gloeosporioides ke  dalam  lubang,  dan  jamur kemudian diinkubasi selama 7-14 hari.
Ekstraksi  Kitinase  dari B.  cepacia E76 dan Pengujian Aktivitas Kitinase Bakteri  dikultur  pada  medium  cair  Luria Bertani  (LB)  selama  18  jam  menggunakan hot plate stirrer (Hitachi). Kemudian 1 mL  media LB cair yang mengandung kultur bakteri diinokulasi ke  dalam  media  kitin  cair.  Kultur  diinkubasi selama  48  jam  pada  suhu  kamar  sambil  digojok pada  75  rpm  menggunakan  alat orbital  shaker (IKA  K260).  Media  kitin  cair  yang  mengandung kultur  bakteri  disentrifugasi  menggunakan  alat sentrifugasi  (Hitachi  D  78532)  pada  kecepatan 8.400x g selama  20  menit  pada  suhu  4  °C. Supernatan,  yang  merupakan  ekstrak  kasar enzim,  kemudian  dicampur  dengan  amonium sulfat 70% pada volume yang sama sambil diaduk pada  suhu  10  °C.  Selanjutnya  campuran disentrifugasi  selama  30  menit  pada  suhu  4  °C
pada  kecepatan  8.400x g dan  pelet  kemudian dilarutkan  dalam  PBS  pH  6.8.  Aktivitas  enzim kitinolitik  diuji  secara  kuantitatif  dengan mengukur  konsentrasi  N-asetil-D-glukosamin (GlcNAc)  yang  terbentuk  [15].  Penentuan konsentrasi  didasarkan  pada  standar  GlcNAc (Sigma Aldrich), dan sampel diukur menggunakan  spektrofotometer  (Hitachi  U2800)
pada λ 420 nm .

## Pembuatan  KBMR,  Sintesis  Formulasi Partikel  Nano  Kitosan  Metode  Gelasi Ionik dan Karakteristiknya
Kitosan  (2  g)  dilarutkan  dalam  100  mL larutan  asam  asetat  1%  yang  memiliki  pH  3,5. Campuran  diaduk  menggunakan  pengaduk magnetik  selama  24  jam  sehingga  kitosan  larut, kemudian disaring  dan diatur pH ke 5,3 dengan penambahan  NaOH.  Sebanyak  20  mL  larutan kitosan dihidrolisis menggunakan 0,2 mL kitinase pada  suhu  37 o C  dan  waktu  inkubasi  selama  2 jam.  Proses  hidrolisis  dihentikan  dengan memanaskan  100 o C  selama  5  menit,  kemudian NaOH  2  N  ditambahkan  dengan  volume  reaksi yang  sama.  Kitosan  hasil  hidrolisis  diendapkan menggunakan  alat  sentrifugasi  (Hitachi  D78352) pada kecepatan 8.400 x g selama 10 menit. Pelet yang  merupakan  KBMR  kemudian  dicuci beberapa kali dengan air suling hingga pH netral [9].
Analisis  ukuran  partikel  dan  nilai  zeta potensial  (ZP)  dilakukan  dengan  alat  pengukur partikel (PSA) dan Zetasizer (Malvern). Selain itu, partikel kitosan / nano kitosan ditentukan melalui analisis  struktural  dengan Fourier-transform infrared  spectroscopy (FTIR).  Sampel  KBMR berupa  sampel  partikel  gel,  dan  kitosan  dalam bentuk  larutan  disiapkan  dalam  bentuk  partikel padat  granular,  kemudian  spektrum  diukur menggunakan FTIR Spectrophotometer (Shimadzu  8400).  Perbedaan  sinyal  yang dihasilkan dari tiga sampel spektra FTIR kitosan, KBMR,  dan  partikel  nano  kitosan  kemudian dibandingkan.
Konsentrasi  formulasi  nano  kitosan  yang diuji  dilakukan  mengikuti  panduan  sebelumnya [8].    KBMR  dilarutkan  dalam  asam  asetat  1% menjadi  larutan  KBMR  0,1%,  0,2%  dan  0,3%, kemudian  diaduk  menggunakan  pengaduk magnetik. Kedalam larutan ditambahkan 0,25 mL
Sintesis KBMR termodifikasi NaTPP (uji rasio)
Uji aktivitas enzim kitinase Karakterisasi : FTIR dan PSA Ekstraksi enzim  kitinase dari bakteri B cepacia E76 Uji in vitro
Uji in vivo
larutan  Tween  80  0,2%  secara  perlahan  dengan waktu  pengadukan  selama  30-60  menit. Selanjutnya  0,1%  larutan  natrium  tripolifosfat (NaTPP)  ditambahkan  ke  dalam  larutan  KBMR sambil  diaduk  pada  suhu  kamar  untuk  proses pengikatan silang yang sempurna. Perbandingan (rasio)  volume  antara  larutan  KBMR:  NaTPP untuk  membentuk  suspensi  partikel  nano  yang diuji adalah 5: 1 dan 5: 2 [16].
Pengujian Penghambatan Nano Kitosan Jamur Patogen Secara In Vitro Metode  pelat  tuang  ( pour    plate ) digunakan pada uji in vitro penghambatan nano kitosan terhadap jamur C. gloeosporioides . Media PDA  hangat  dalam  cawan  petri  dicampur dengan  1  mL  formula  nano  kitosan,  kemudian media  dibiarkan  mengeras.  Media  PDA  dalam cawan  Petri  yang  memiliki  diameter  9  cm dilubangi di bagian tengahnya dengan bor gabus. Kemudian  isolat C.  gloeosporioides ditempatkan ke  dalam  lubang  dan  diinkubasi  selama  6  hari. Perlakuan  kontrol disiapkan hanya mengandung PDA dan C. gloeosporioides saja. Efektivitas daya hambat patogen ditentukan oleh rumus:
DH = (lk-lp) / lk x 100%, di  mana:  DH=  daya  hambat,  lk  =  luas pertumbuhan  jamur  pada  kontrol,  lp  =  luas pertumbuhan jamur pada perlakuan.
Uji In  Vivo Nano  Kitosan  terhadap C. gloeosporioides pada  Mangga  Kultivar Manalagi
Mangga  kultivar  “Manalagi”  hasil  panen  yang ukuran  buahnya  relatif  seragam,  dicuci  bersih dengan  air  steril  kemudian  dikeringkan.  Uji in vivo dilakukan dengan merendam buah mangga dalam larutan nano kitosan selama 60 menit, dan dikeringkan. Selanjutnya buah tersebut diinokulasi  patogen  dengan  cara  dilukai menggunakan  jarum  steril  dan  kemudian direndam dalam suspensi konidia C. gloeosporioides (10 6 konidia  mL -1 )  selama  30 menit  dan  dikeringkan.  Perlakuan  kontrol dilakukan  dengan  cara  yang  sama,  tetapi  nano
kitosan  diganti  dengan    air  suling  steril.  Buah mangga disimpan pada baki steril dan dibungkus dengan plastik bening untuk menjaga kelembaban.  Pengujian  yang  sama  diulang sebanyak    2  kali.  Pengamatan  dilakukan  setelah 5-6 hari inokulasi, dan efektivitas penghambatan nano  kitosan  diukur  dengan  menghitung  tingkat keparahan penyakit.
Tingkat  keparahan  penyakit  antraknosa pada  mangga  diamati  berdasarkan  skor keparahan  penyakit  sebagai  berikut:  0  = 0<x<1%; 1 = 2<x<20%; 2 = 21<x< 40%;  3 = 41<x<  60%;  4  =  61<x<  80%;  dan  5  = 81<x<100%  [17].
Rumus  Tingkat  hambat  relatif  (THR) terhadap penyakit antraknosa dinyatakan sebagai berikut: THR = (Kpk-Kpp) /Kpk x 100%, di  mana:  THR=Tingkat  hambat  relatif,  Kpk  = tingkat  keparahan    pada  kontrol,  Kpp  =  tingkat keparahan  pada perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Aktivitas Kitinase
Pengujian aktivitas enzim kitinase dilakukan  untuk  menunjukkan  aktivitas  enzim kitinase  yang  diekstraksi  dari  bakteri B.  cepacia E76  [14].  Aktivitas  enzim  kitinase  ditunjukkan oleh  produksi  senyawa  GlcNAc.  Reagen  schales (berwarna  hijau),  berfungsi  sebagai  indikator yang  mengukur  konsentrasi  GlcNAc  secara kuantitatif.  Semakin  banyak  GlcNAc  terbentuk, warna  yang  dihasilkan  akan  memudar. Pembentukan GlcNAc akan mengurangi intensitas  warna  hijau.  Aktivitas  sampel  kitinase yang dihasilkan dari tiga ulangan masing-masing sebesar  45,1190;  39,1667;  dan  55,2380  ppm, dengan  konsentrasi  rata-rata  sebesar  46,50  + 8,12 (Tabel 1). Data aktivitas enzim kitinase yang diperoleh  cukup  tinggi,  karena B.  cepacia E76 adalah  bakteri  kitinolitik  yang  sebelumnya dilaporkan  menghasilkan  enzim  kitinase  dan berfungsi  untuk  mendegradasi  kitosan  menjadi KBMR [14; 18].
Tabel 1. Aktivitas kitinase menggunakan standar GlcNAc
Sampel Absorbansi Konsentrasi (ppm) Sampel 1 0,343 45,1190 Sampel 2 0,293 39,1667 Sampel 3 0,428 55,2380 Rata rata  + Standar deviasi 46,50 +  8,12
Larutan  kitosan  direaksikan  dengan kitinase  yang  diekstraksi  dengan  masa  inkubasi 30-60 menit pada suhu 37 °C. Produk dari reaksi depolimerisasi  ini  adalah  kitosan,  tetapi  bobot molekulnya  lebih  rendah.  Proses  ini  didasarkan pada proses hidrolisis enzimatik dengan memutus ikatan  kitosan  1,4- β -glikosidik  [19].  Sebanyak  10 mL kitosan 2% dihidrolisis menggunakan kitinase dari B.  cepacia E76  dan  menghasilkan  produk KBMR 0,3706 g dalam bentuk pelet [18]. Kitosan memiliki peran dalam menghambat pertumbuhan  mikroorganisme  dan  bersifat antijamur,  tetapi  kitosan  ini  perlu  didegradasi menjadi  nano  partikel  untuk  meningkatkan efektivitas sebagai antijamur.

## Karakteristik  Formulasi  KBMR-NaTPP untuk Agen Pelapis Buah Mangga
KBMR  selanjutnya  dikonversi  menjadi partikel kitosan yang lebih kecil dan efektif dalam menghambat pertumbuhan jamur C. gloeosporioides .  Partikel  nano  kitosan  memiliki luas  permukaan  yang  lebih  luas  yang meningkatkan  adsorpsi  dan  efektifitas  sebagai agen antijamur.
Dalam  pembuatan  nanokitosan  perlu ditambahkan larutan kitosan (KBMR) dan sodium tripolifosfat  (NaTPP)  agar  dapat  membentuk partikel  dan  meningkatkan  stabilitas  partikel. Penggunaan  polimer  tersebut  membutuhkan optimasi  untuk  mendapatkan  formula  partikel yang  optimal  [20].  Perbandingan  KBMR  dan
NaTPP  dibuat  bervariasi  untuk  mengetahui perbandingan  yang  paling  efektif  untuk menghasilkan  partikel  nanokitosan.  Formula partikel  kitosan  dibuat  dengan  konsentrasi  0,1%; 0,2%;  dan  0,3%  dengan  perbandingan  masing- masing KBMR: NaTPP adalah 5: 1, dan 5: 2 (rasio volume kecil).
Partikel  nano  kitosan  terbentuk  secara spontan karena pengadukan mekanis pada suhu kamar.  Mekanisme  pembentukan  kitosan  nano berdasarkan  interaksi  elektrostatik  antara  gugus amina  kitosan  (-NH2)  dan  muatan  negatif  pada polianion seperti tripolifosfat (TPP). Kompleksitas interaksi  antar  muatan  yang  berbeda  ini menghasilkan  kitosan  yang  mengalami  gelasi ionik dan diendapkan untuk membentuk partikel [21].

## Analisis  FTIR  dan  Ukuran  Partikel Nano Kitosan
Karakterisasi  FTIR  dalam  penelitian  ini digunakan  untuk  mengetahui  perbedaan  sinyal yang dihasilkan oleh partikel kitosan, KBMR, dan nano  kitosan  (Gambar  2).  Spektrum  warna partikel  nano  kitosan  menunjukkan  beberapa puncak  khas  yang  menunjukkan  karakteristik struktur  kitosan  misalnya  pada  puncak  bilangan gelombang  3400cm -1 yang  menunjukkan  gugus alkohol,  gugus  amina  1600cm -1 dan    gugus karbonil 1740cm -1 .
Tabel 2. Data analisis FTIR pada kitosan, KBMR, dan nano kitosan
Jenis Vibrasi Bilangan Gelombang (cm -1 ) Kitosan KBMR Partikel nano kitosan (KBMR: NaTPP) OH 3412,86 3366,21 3432,87 R-NH 2 1656,37 1597 1570,8 CH(-CH 2 ) 2921,08 2876,48 2852,12 C=O 1725,96 1650,54 - CH 1382,8 1421,51 1384,4 C-O 1068,92 1078,17 1094,98
Secara umum, spektrum inframerah dapat mengidentifikasi  konten  kelompok  fungsional dalam senyawa. Gugus fungsional khas yang ada dalam  partikel  kitosan  murni  adalah  gugus hidroksil  (-OH)  dan  gugus  amida  (-NH2)  [23].
Gugus  fungsi  hidroksil  dalam  kitosan  muncul pada  bilangan  gelombang  3450-3200  cm -1 , sedangkan  gugus  fungsi  amida  muncul  pada bilangan gelombang 1660-1500 cm -1 .
A.Spektrum FTIR kitosan
B.Spektrum FTIR KBMR
C.Spektrum FTIR partikel nano kitosan
Gambar 2. Spektra FTIR pada kitosan (A), KBMR (B) dan nano kitosan (C)
Berdasarkan Tabel 2,  pada partikel kitosan tidak ada gugus fungsional karbonil (C = O) dan perubahan  jumlah  gelombang  dari  tiga  sampel. Ini  menunjukkan  interaksi  antara  gugus  fungsi karena  penambahan  TPP  dan  proses  deasetilasi kitosan  menjadi  partikel  nano  kitosan.  Proses degradasi  kitosan  ditandai  dengan  pergeseran jumlah gelombang dan hilangnya gugus karbonil (Gambar. 2).
Penentuan  ukuran  partikel  nano  dalam penelitian  ini  menggunakan  analisis Particle  Size Analyzer (PSA)  (Gambar  3).  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  dalam  kondisi  penyiapan konsentrasi  kitosan  0,3%,  NaTPP  0,1%  (5:  1), partikel  nano  kitosan  membentuk  ukuran  126,2 nm  dengan  nilai  ZP  sebesar    25,5  +  6,1  mV (Gambar  3). Hasil  analisis  PSA  menunjukkan bahwa partikel kitosan yang disiapkan pada rasio volume  5:  1  umumnya  menunjukkan  pola distribusi  puncak.  Pada  rasio  volume  besar  5:2, partikel-partikel  yang  terbentuk  dari  reaksi elektrostatik  antara  kitosan  dan  Na  TPP  sangat
banyak  dan  padat,  dan  dikelompokkan  untuk membentuk agregat menjadi partikel > 200 nm.
Ukuran rata-rata formulasi partikel kitosan meningkat  dengan  rasio  volume  KMBR  dan NaTPP  [22].  Dalam  penelitian  ini,  rasio  KBMR dan  volume  NaTPP  5:  1  menghasilkan  rata-rata ukuran  partikel  terkecil  126,2  nm  dengan  nilai indeks  polidispersitas  (IP)  0,447,  dan  nilai  zeta potensial (ZP) 25,5 + 6,1 mV. Nilai IP masih jauh di bawah nilai 1 sehingga dapat diartikan tingkat keseragamannya cukup baik.  Partikel nano yang disiapkan  pada  rasio  5:  1  menunjukkan  bahwa partikel  nano  yang  terbentuk  memiliki  kisaran distribusi  ukuran  pendek  atau  dengan  kata  lain tingkat keseragaman yang baik.  Nilai ZP sebesar 25,5 + 6,1 mV sangat relevan dan memperkuat pola distribusi data dengan nilai IP. Partikel nano pada  ukuran  sangat  kecil  dan  IP  rendah menunjukkan potensi nilai tinggi (hampir 30 mV) yang  berarti  cukup  stabil.  Berdasarkan  analisis semakin  kecil  rasio  volume  KBMR  terhadap NaTPP  dan  waktu  pengadukan,  maka  ukuran partikel yang diperoleh semakin kecil.
A B
Gambar.3. Karakteristik formula nano kitosan  dengan analisis PSA (A), dan Zeta Potensial (B)
Uji Penghambatan C. gloeosporioides In Vitro
Hasil uji in vitro menunjukkan bahwa nano kitosan  mampu  menghambat  pertumbuhan C. gloeosporioides .  Secara  umum,  hasil  rata-rata pengukuran koloni C. gloeosporioides dalam uji in vitro menunjukkan  perbedaan  daerah  koloni antara  perlakuan  kontrol  dan  formula  nano kitosan.  Perlakuan in  vitro nano  kitosan  mampu menghambat  pertumbuhan C.  gloeosporioides dengan  daya  hambat  berkisar  antara  61,28%  - 93,75% (Tabel 3).
Tabel 3. Daya hambat formula nano kitosan terhadap pertumbuhan jamur C. gloeosporioides secara in vitro
Perlakuan  Rasio
Luas koloni pertumbuhan C. gloeosporioides (cm 2 ) Tingkat hambat relatif  (THR) (%) Kontrol   (tanpa aplikasi) 63,58 - KBMR 0.1 % : NaTPP 0.1 %  (5:1) 8,94 85,94 KBMR 0.1 % : NaTPP 0.1 %  (5:2) 15,89 75,0 KBMR 0.2 % : NaTPP 0.1 %  (5:1) 11,3 82,2 KBMR 0.2 % : NaTPP 0.1 %  (5:2) 24,62 61,28 KBMR 0.3 % : NaTPP 0.1 %  (5:1) 15,89 75,0 KBMR 0.3 % : NaTPP 0.1 %  (5:2) 3,97 93,75
Keterangan: THR= Lk kontrol- Lk perlakuan   x 100%
Lk kontrol
Kitosan  mampu  menginduksi  respon resistensi tanaman terhadap infeksi patogen  [24]. Kemampuan  untuk  menghambat  pertumbuhan C.  gloeosporioides diduga  disebabkan  oleh aktivitas  kitinase,  glukanase,  dan  senyawa antijamur lainnya dalam nano kitosan [25].
Uji In  Vivo Nano  Kitosan  terhadap C. gloeosporioides pada  Mangga  Kultivar Manalagi
Perlakuan in  vivo nano  kitosan  terhadap penghambatan C.  gloeosporioides pada  buah mangga  kultivar  Manalagi  menunjukkan  tingkat keparahan  penyakit  yang  berbeda  antara
perlakuan,  berkisar  antara  20,5  hingga  80,5%  (Tabel 4). Tabel  4.  Daya  hambat  formula  nano  kitosan  terhadap  pertumbuhan  jamur C.  gloeosporioides pada mangga kultivar  Manalagi secara in vivo
Perlakuan Rasio Rerata keparahan penyakit (%) Tingkat hambat relatif (THR) % Kontrol (tanpa aplikasi) 80,5 a - KBMR 0.1 % : NaTPP 0.1 %  (5:1) 40,5 bc 49,7 KBMR 0.1 % : NaTPP 0.1 %  (5:2) 50,5 b 37,3 KBMR 0.2 % : NaTPP 0.1 %  (5:1) 50,5 b 37,3 KBMR 0.2 % : NaTPP 0.1 %  (5:2) 50,5 b 37,3 KBMR 0.3 % : NaTPP 0.1 %  (5:1) 50,5 b 37,3 KBMR 0.3 % : NaTPP 0.1 %  (5:2) 20,5 c 74,5
Keterangan:  Angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama  tidak  berbeda  nyata  menurut  uji  DMRT  pada P=0.05.
THR= Kp kontrol- Kp perlakuan   x 100% Kp kontrol
Tingkat keparahan penyakit yang disebabkan  oleh C.  gloeosporioides pada perlakuan kontrol lebih besar daripada perlakuan partikel  kitosan  (Tabel  4).  Hal  ini  menunjukkan bahwa  variabel  konsentrasi  sangat  berpengaruh terhadap  efektivitas  daya  hambat  penyakit antraknosa  sehingga  perlu  dilakukan  uji  lebih lanjut  untuk  menemukan  formula  nano  kitosan yang optimal untuk aplikasi selanjutnya.
Tingkat  keparahan  penyakit  antraknosa dalam  perlakuan  antijamur    pada  mangga kultivar  Manalagi  berkisar  antara  20,5  hingga 50,5%. Mangga yang diperlakukan dengan nano kitosan  masih  menunjukkan  pertumbuhan C. gloeosporioides ,  tetapi  tidak  separah  perlakuan kontrol.  Kitosan  mampu  menghambat  laju respirasi dan kandungan etilen buah, memperpanjang usia simpan buah,  menginduksi lignifikasi  dan  pembentukan  kalosa  dalam epidermis  kulit  buah,  dan  menginduksi peningkatan kadar senyawa fenol total dan total kandungan protein kasar buah [6].
Persentase daya hambat jamur paling baik ditunjukkan  partikel  kitosan  pada  konsentrasi KBMR 0,3% dan NaTPP 0, 1% (rasio 5: 2) dengan rerata tingkat keparahan penyakit 20,5%. Partikel- partikel kitosan pada rasio 5: 2 memiliki kekuatan penekanan  patogen  dengan  penghambatan sebesar  74,5%  (Tabel  4).  Hasil  penelitian  lain melaporkan  bahwa  tingkat  penghambatan kitosan  pada  konsentrasi  20-150  mg  terhadap jamur  patogen Phomopsis  asparagi adalah sebesar  80%,  dan  90%  masing-masing  terhadap Fusarium  oxysporum,  Cucumernum  owen, Rhizoctonia solani dan Fusarium oxysporum [26].
Berdasarkan  data  yang  diperoleh,  partikel kitosan yang digunakan sebagai pelapis ( coating ) buah merupakan agen penghambat pertumbuhan  yang  sangat  baik  untuk  jamur C. gloeosporioides karena  ramah  lingkungan  dan mudah  terurai  secara  hayati.  Kitosan  asal  kulit udang  atau  kepiting  mempunyai  bobot  molekul (BM)  rendah  sebesar  2000  g/mol  [27].  Kitosan mampu  menghambat  pertumbuhan C.  musae melalui penghambatan perkecambahan konidium, mengurangi lebar hifa, dan menyebabkan  lisis  hifa  [28],  sehingga  kitosan memiliki  potensi  untuk  mengendalikan  penyakit antraknosa.
Kitosan mampu menghambat laju respirasi dan  tingkat  etilen  buah,  memperpanjang  umur simpan  buah,  dan  menginduksi  peningkatan kadar  total  senyawa  fenol  dan  total  kandungan protein kasar buah [28].  Mekanisme penghambatan  nano  kitosan  adalah  interaksi dengan  membran  sel,  dimana  kitosan  polikation dapat  berikatan  dengan  muatan  negatif  dari membran  sel  melalui  interaksi  elektrostatik, sehingga mempengaruhi permeabilitas membran sel  dan  mengakibatkan  kebocoran  bahan intraseluler seperti enzim, protein, bahan genetik lainnya.  Selain  itu,  inaktivasi  enzim  sangat penting,  kitosan  berikatan  dengan  DNA  dan menghambat  mRNA  dalam  sintesis  protein. Nano  kitosan  mampu  menghancurkan  bahan genetik  mikroba,  dimana  kitosan  sebagai pengkelat  logam  mampu  mengikat  ion  logam kedalam  larutan  intraseluler  yang  memainkan peran  penting  untuk  kelangsungan  hidup  sel mikroba [29].
Penghambatan pertumbuhan C.
gloeosporioides oleh kitosan diduga terjadi karena kandungan  sifat  antijamur  dari  spektrum  luas gugus  amino  dalam  bentuk  asetil  amino (HCOCH 3 )  dan  glukosamin  (C 6 H 9 NH 2 ).  Gugus amino  dapat  mengikat  bagian  makromolekul bermuatan  negatif  dari  polikationik  alami  pada permukaan  sel  jamur,  sehingga  pertumbuhan jamur  akan  terhambat  [27].  Selama  penelitian, kondisi lingkungan sangat sesuai untuk terjadinya infeksi C. gloeosporioides , sebagaimana dilaporkan bila interaksi inang-patogen kompatibel  pada  permukaan  permukaan  buah, akan  mengakibatkan  hilangnya  pertahanan mekanis buah [6;7].
Dari  hasil  penelitian  ini  masih  diperlukan analisis  lain  seperti  uji  viskositas  untuk menentukan bobot molekul (BM) kitosan, dan uji scanning  elektron  mikroskopi  (SEM)  untuk mengamati  kerusakan  dinding  sel  jamur  oleh partikel nano kitosan. Selain penerapan formulasi partikel  nano  kitosan  yang  lebih  efektif,  maka penambahan  variabel  lain  seperti  metabolit sekunder  sebagai  antifungi  juga  perlu  dipelajari lebih lanjut.

## KESIMPULAN
• Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  partikel nano  kitosan    (KBMR  0,3%,  NaTPP  0,1%  rasio 5:1) mempunyai ukuran 126,2 nm dan nilai ZP 25,5 + 6,1 mV.
• Pengamatan in vitro formula nano kitosan dapat menghambat  pertumbuhan C.  gloeosporioides pada kisaran penghambatan 61,28 – 93,75%.
• Formula  nano  kitosan  terbaik  untuk  menekan C.  gloeosporioides secara in  vivo pada  buah mangga  kultivar  Manalagi  adalah  pada  rasio volume  KBMR  (0,3%):  NaTPP  (0,1%)  5:  2 dengan tingkat hambat relatif sebesar 74,5%.
• Untuk kajian selanjutnya, perlu diuji penambahan variabel lain diantaranya optimasi formula  partikel  nano  kitosan  agar  diperoleh ukuran dan stabilitas partikel yang lebih baik.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  dibiayai  APBN  2015  (RPTP Dr. I Made Samudra). Penghargaan disampaikan kepada Sdr. Mitha Ekaputri serta tim teknisi Lab. Mikrobiologi  yang  telah  membantu  kelancaran penelitian.

## REFERENSI
[1] Rebin, Karsinah, dan A. Soemargono, 2013, Peningkatan  produktivitas  dan  kualitas mangga komersial indonesia melalui pemuliaan  dan  pengelolaan  tanaman. http://www.mada.gov.my/documents/10124/ b71dcdba-2310-497d-a7a3-ddd65049b757.
[2] Semangun,  H.  2000,  Penyakit-penyakit Tanaman Hortikultura di Indonesia. Edisi ke- 4. Yogyakarta (ID): UGM Press.
[3] Pracaya.  2008,  Bertanam  Mangga.  Depok (ID): PT Penebar Swadaya.
[4] Koul, O, S. Walia,  and  G.S. Dhaliwal. 2008, Essential  oils  as  green  pesticides:  potential and constraints. Biopest. Int Vol. 4, No. 1, p. 63-84]
[5] Abd-Elsalam,  K.A.,  and  M.A.,  Alghuthaymi. 2015, Nanobiofungicides: are they the next- generation  of  fungicides?.  J.  Nanotechnol. and Material Sci. Vol. 2, No.1, p.1-3
[6] Bautista-Banos  S.,  A.N.H,  Lauzardo.,  M.H.L Vallea,  M.H.  Lopez,  E.A.  Barkab,  E.B. Molinac, and C.L. Wilson. 2006, Chitosan as a potential natural compound to control pre and  postharvest  diseases  of  horticultural commodities. Crop Prot. Vol.25, p.108-118.
[7] Gonzalez-Aguilar  G.A.,  J.J.  Cellis.,  R.R. Sotelo-Mundo., L.A. De La Rosa., G.J.Rodrigo,  and  P.E.  Alvarez.  2008, Physiological  and  biochemical  changes  of different fresh-cut mango cultivars stored at 5oC. Int J Food Sci Techno. Vol. 43, p. 91- 101.
[8] Agnihotri S.A., N. Nadagounda, Mallikarjuna,  M.  Tejraj,  and  Aminabhavi. 2004,  Recent  advances  on  chitosan  based micro and nanoparticles in drug delivery. J. Control Release Vol. 100, p.5-28.
[9] Kumar A.B.V., M.C. Varadaraj, L.R. Gowda, and R.N. Tharanathan. 2007, Low molecular weight  chitosan-preparation  with  the  aid  of
pronase, characterization and their bactericidal  activity  towards  Bacillus  cereus and  Escherichia  coli.  Biochimica  et Biophysica Acta. Vol. 1770, p. 495-505.
[10] Tiyaboonchai, W. 2003, Chitosan nanoparticles:  A  promising  system  for  drug delivery.  Naresuan  University  Journal  Vol. 11, No. 3, p. 51 – 66.
[11] Sing  R,  and  J.W.  Lillard.  2009,  Review nanoparticle-based  targeted  drug  delivery. Experimental and Molecular Pathology. Vol. 86, p. 215-223.
[12] Hernandez-Lauzardo A.N.,  M.G. Velazquez- del  Vale.  L.Veranza-Castelan.,G.E.Melo- Giorgana, and M.G. Guerra-Schancez. 2010, Effect  of  chitosan  on  three  isolates  of Rhizopus  stolonifer  obtained  from  peach, papaya,  and  tomato.  J  Fruits.  Vol.  65,  p. 245-253.
[13] Rismana  E.,  S.  Kusumaningrum,  I.  Rosidah, Nizar,  and  E.  Yulianti.  2013,  Pengujian stabilitas  sediaan  antiacne  berbahan  baku aktif  nanopartikel  kitosan/ekstrak  manggis- pegagan.  Balai  Penelitian  Kesehatan.  Vol. 41, No. 4, p. 207-216.
[14] Suryadi Y, T.P. Priyatno, I M. Samudra, Dwi N. Susilowati,T.S. Sriharyani, and Syaefudin. 2017,  Control  of  anthracnose  disease [Colletotrichum gloeosporioides] using nano chitosan  hydrolyzed  by  chitinase  derived from  Burkholderia  cepacia  Isolate  E76. Jurnal AgroBiogen. vol.13, No.2, p. 111 – 122
[15] Toharisman  A,  M.T.  Suhartono,  Spindler- Barth,  Hwang,  and  Y.R.  Pyun.  2005,
Purification and characterization of thermostable chitinase from Bacillus licheniformis  Mb-2.  World  J.  Microbiol, Biotechnol Vol. 21, p. 733-738.
[16] Chattopadhyay  D.P,  and  M.S.  Inamdar. 2012, Studies on synthesis. characterization. and  viscosity  behaviour  of  nano  chitosan. Research  Journal  Of  Engineerng  Sciences. Vol. 1, No. 4, p. 9-15.
[17] James.  W.C.  1971,  An  illustrated  series  of assessment  keys  for  plant  diseases,  their preparation and usage. Can. Plant Dis. Surv. June, Vol. 51, No.2, p. 1-65.
[18] Suryadi,  Y.,  Priyatno,  T.P.,  Samudra,  I.M., Susilowati, D.N.,Nurzulaika, H. and
Syaefudin.  2016,Waktu  inkubasi  pada derajat distilasi kitosan enzim dan efektivitas penghambatannya terhadap penyakit
antraknosa.  Jurnal  Fitopatologi  Indonesia, vol.12, No. 6,  p. 209 – 217.
[19] Li  J,  Y.  Du,  J.  Yang,  P.  Feng,  A.  Li,  and  P. Cheng.
2005, Preparation and characterization  of  low  molecular  weight chitosan  and  chito-olygomers  by  a commercial  enzyme.  Polymer  Degradation and Stability. Vol. 87, p. 441-448.
[20] Guaix  M.,  C.  Carbonell.  J.Comenge,  Garcia Fernandez,  A.  Alarcon  and  Casals.  2008, Nanoparticles for cosmetics. Contribution to science. Vol. 4, No. 2, p.213-217.
[21] Xu  Y,  and  Du  Y.  2003,  Effect  of  molecular structure  of  chitosan  on  protein  delivery properties  of  chitosan  nanoparticles.  Int.  J. Pharmaceutics Vol. 250, No. 1, p. 215-226.
[22] Mardliyati E, S.E. Muttaqien, D.R. Setyawati, I.  Rosidah,  and  Sriningsih.  2012,  Preparasi dan  aplikasi  nanopartikel  kitosan  sebagai sistem  penghantar  insulin  secara  oral.  Di dalam:  Mardliyati  E,  Muttaqien  SE, Setyawati  D.R.,  Rosidah  I,  Sriningsih,  (eds).
Prosiding Pertemuan Ilmiah Ilmu Pengetahuan  dan  Teknologi  Bahan;  2012 Okt 3; Serpong, Indonesia.Prosiding InSiNas. hlm 90-93.
[23] Firdaus  F.  Darmawan  E,  dan  S. Mulyaningsih  2008,  Karakteristik  spectra infrared  (IR)  kulit  udang,  kitin,  dan  kitosan yang dipengaruhi oleh proses demineralisasi,  deproteinisasi,  deasetilasi  I, dan deasetilasi II. Jurnal Ilmiah Farmasi Vol. 4, p.11-22.
[24] Hadrami E.A, L.R. Adam, E.I. Hadrami, and F. Daayf. 2010, Chitosan in plant protection. Marine Drugs. Vol. 8, No. 4, p. 968-987.
[25] Vasyukova N.I, S.V. Zinoveva, L..I. Iiinskaya, E.A.  Perekhod,  G.I.  Chalenko,  N.G. Gerasimova,  A.V.  llina,  V.P.  Varlamov,  and O.L.  Zeretskovskaya.  2001,  Modulation  of plant resistance ti diseases by water soluble chitosan  and  polyphenols.  Food  Sci  Tech Int. Vol. 13, No. 4, p. 317-322.
[26] Goy, R.C, D, Brino,  and O.B.G.  Assis. 2009, A  review  of  the  antimicrobial  activity  of chitosan. Ciência e Tecnologia. Vol. 19, No. 3, p. 241-247.
[27] Restuati M. 2008, Perbandingan kitosan kulit udang dan kulit kepiting dalam
menghambat pertumbuhan kapang Aspergillus  flavus.  Prosiding  Seminar Nasional Sains dan Teknologi; 2008 Nov 17; Bandar  Lampung.  Bandar  Lampung  (ID):
Satek. Hlm. 582-590.
[28] Pamekas  T.  2009,  Induksi  Ketahanan  Buah Pisang  Ambon  Curup  terhadap  Penyakit Pascapanen  Antraknos  dan  Penundaan Kematangan  dengan  Aplikasi  Kitosan. Yogyakarta (ID): Fakultas Pertanian UGM.
[29] Vellingiri,  K.,  T.  Ramachandran,  and  M. Senthilkumar. 2013, Eco-friendly application of nano chitosan in antimicrobial coatings in the textile industry. Nanosci. and Nanotechnol.  Vol.  3,  No.  4,  p.75-89.