Submitted : 14 April Revised : 25 April Accepted : 28  April
KARAKTERISASI SENYAWA FLAVONOID EKSTRAK SAMBILOTO ( Andrographis paniculata ) YANG MEMPUNYAI AKTIVITAS INHIBISI TERHADAP ENZIM SIKLOOKSIGENASE-2 SECARA IN VITRO
Agus Rochmat 1*
1 Jurusan Teknik Kimia Fakultas Teknik, Universitas Sultan Ageng Tirtayasa Banten *Email: agus_rochmat@untirta.ac.id

## Abstrak
Sambiloto  ( Andigraphis  paniculata )  adalah  tanaman  medis  tradisional  digunakan  untuk  pengobatan  dingin, demam,  radang  tenggorokan  dan  beberapa  infeksi.  Beberapa  penelitian  menunjukkan,  sambiloto  memiliki aktivitas antiinflamasi. Kemampuan senyawa aktifnya memberikan efek penghambatan secara tetap dan sampel ekstrak memenuhi standar yang ditetapkan BPOM RI. Hasil esktraksi sambiloto dengan etanol dan air memberi informasi  sebagai  senyawa  flavonoid.  Hasil  uji  senyawa  flavonoid  dari  ekstrak  air  memiliki  penghambatan terhadap  enzim  COX-2  sebeasar  98,97  %  dan  ekstrak  etanol  memiliki  penghambatan  16,70  %.  Karakterisasi ekstrak  etanol  memiliki  spectrum  IR  dan  UV  sesuai  dengan  pola  senyawa  Flavon.  Sementara,  fraksi  etanol memberikan spektrum IR dan UV Pola untuk memperkirakan untuk polifenol senyawa.
Kata Kunci : Ekstrak, Enzim Siklooksigenase-2, Flavonoid, Sambiloto

## Abstract
Sambiloto (Andigraphis paniculata) is a medical plant traditionally used for the treatment cold, fever, laryngitis and several  infection.  Some  research  showed  that  samboloto  has  antiinflammation  activity.  The  reability  active compound gives consistency inhibition effect when extract sample has standarded to conform standard of BPOM RI. In this research Sambiloto that was extracted with water and ethanol solvent gave fraction of flavonoid compound. Abilty flavonoid compound from fraction of water extract has inhibition of 98,97 % dan fraction of ethanol extract has inhibition 16,70% to COX-2 enzym. characteristic of ethanol ekstract had IR and UV spectrum that showed the same  of  pola  with  flavon  compound.  Mean  while,  ethanol  fraction  had  IR  and  UV  spectrum  that  showed  the  pola which was can be used to estimate poliphenol compound.
Keywords: Extract, Cyclooxigenation-2 Enzym, Flavonoid, Sambiloto,

## 1. PENDAHULUAN
Sambiloto salah satu tanaman obat yang telah lama digunakan  sebagai  bahan  ramuan  obat  tradisional. Beberapa  uji  khasiat  sambiloto  terhadap  penyakit seperti  demam,  infeksi  lambung,  infeksi  pernafasan, demam  malaria,  repellent  serangga,  komplikasi diabetes,  melindungi  dari  penyakit  –  penyakit  hati, antiviral,  immunostimulator  dan  menekan  retenosis pada pasien angiosplastis.
Ekstrak  sambiloto  diyakini  memiliki  kemampuan untuk  menghambat  antiradang.  Hal  ini  terlihat  pada ekstrak  sambiloto  yang  mampu  menginduksi  TNF-α
pada  ekspresi  adesi  interseluler  molekul-1  dan mengurangi  induksi  TNF  pada  adesi  endothelial- monocyte (Hebtemariam, 1998). Kemudian dipertegas dengan  kemampuan  Andrographolide  menghambat ekspresi  beberapa  protein  anti  radang  dengan menunjukkan  daya  inhibisi  nuclear  factor  kappa  B (NF- κ B) yang terikat pada DNA (Hidalgo et.,al , 2005). Sediaan  obat  antiinflamasi  non-steroid  (OAINS) dikenal  sebagai  inhibitor  enzim  COX-2  dalam menghambat  pembentukan  prostaglandin.  Obat antiradang ini biasanya digunakan untuk menghambat biosintesis prostaglandin, prostasiklin, dan

## JURNAL INTEGRASI PROSES
Website: http://jurnal.untirta.ac.id/index.php/jip
tromboksan    melalui  penghambatan  aktivitas  enzim siklooksigenase-2  (COX-2).  Peran  enzim  COX-2  dapat mengkatalisis  pembentukan  prostaglandin  yang menyebabkan  peradangan  (Dannhardt  and  Laufer, 2000).  Salah  satu  contoh  OAINS  adalah  asam  asetil salisilat,  dimana  kerja  asam  asetil  salisilat  mampu menghambat  dan  memblok  secara  irreversibel  enzim COX-2 melalui reaksi asetilasi residu serin-529 atau – 516  pada  enzim  tersebut  (Lawson  et.,al,  1999). Senyawa  –  senyawa  lain  yang  memiliki  peran menginhibisi  enzim  COX-2  seperti:  curcumin  (zhang et.,  al ,  1999),  γ-tokoferol  (Jiang et.,  al ,  2000),  asam ursolat (Subbarmaiah, e t., al , 2000) dan tricin (Cai et., al , 2005).
Kandungan bahan aktif pada suatu tanaman sangat dipengaruhi  oleh  mutu  simplisia,  sehingga  untuk menghasilkan  ekstrak  terstandar  diperlukan  metode ekstrasi  yang  tepat.  Apabila  perolehan  ekstrak sambiloto  terstandar  telah  didapatkan  metode produksinya,  maka  kebutuhan  bahan  baku  industri fitofarmaka  untuk  menghasilkan  formula  suatu  obat dapat  dipenuhi  baik  kualitas,  kuantitas  maupun kontinuitas keaktifannya.
Berdasarkan  pada  potensi  sambiloto  sebagai antiradang,  maka  tujuan  penelitian  ini  adalah melakukan  standarisasi  perolehan  ekstrak  air  dan ekstral  etanol  sambiloto  yang  memiliki  daya  inhibisi enzim  COX-2    secara in  vitro dan  melakukan karakterisasi senyawa aktif pada fraksi yang memiliki daya inhibisi ini.

## 2. BAHAN DAN METODE
2.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah satu set alat-alat gelas laboratorium, satu set alat freeze dryer , satu set alat uji KLT,  AA7000  shimadzu,  HPLC  Shimadzu  A20, Spektrofotometer
UV Vis 1700
shimadzu, Spektrofotometri FTIR, dan LC-MS/MS.
Bahan  yang  digunakan  adalah  daun  sambiloto, Etanol  95%,  H 2 SO 4 ,  HClO 4 ,  H 2 O 2 ,  n-heksana,  NaOH, logam Zn, HNO 3 , HCl, MgNO 3 , larutan baku Cu, larutan baku  Pb,  larutan  baku  Zn,  larutan  Molibdat,  SnCl 2 , larutan  baku  arsen,  NaBH 4 ,  etil  aquades,  aqua bidestilata, aluminium foil, dan tissue.

## 2.2 Metode Penelitian

## 2.2.1 standarisasi ekstrak sambiloto
Simplisia  yang  telah  memiliki  kadar  air  dibawah 10%  kemudian  dihaluskan  dengan  penggilingan  lalu diekstrak dengan cara maserasi menggunakan pelarut air  dan  pelarut  etanol,  selanjutnya  dilakukan penyaringan  (Aromdee et.al. ,  2005).  Filtrat  yang diperoleh  di freeze  drying hingga  menjadi  ekstrak kasar  dengan  kadar  air  dibawah  2%.  Kemudian, ekstrak  ini  dilakukan  pengujian  standarisasi  ekstrak yakni: organoleptik, senyawa penciri, kadar air, kadar abu,  cemaran  logam:  Pb;  Cd;  As,  cemaran  aflatoksin dan  cemaran  mikrobiologi:  angka  lempeng  total  dan angka kapang / khamir. Standarisasi ekstrak mengacu pada BPOM RI, 2004.
2.2.2 Uji daya inhibisi terhadap enzim siklooksigenase-2 secara in vitro
Uji  daya  inhibisi  dilakukan  dengan  metode  ELISA, dengan menggunakan COX Inhibitor Sreening Assay Kit (Cayman  Chemical  Catalog  No.  560131) pada konsentrasi  900  µg/ml.  Sebanyak  0,1  ml  dan  0,05  ml bufer  EIA  dimasukkan  ke  dalam  sumur  NSB  dan  B 0 secara  berurutan.  Larutan  standar  prostaglandin  diisi ke dalam sumur S8-S1. Sumur BC diisi dengan larutan background,  sumur  (‡)  diisi  dengan  larutan  aktivitas awal  COX-2,  sumur  (  )  diisi  dengan  larutan  ekstrak air, ekstrak dan fraksi teraktif..
Setiap  sumur  ditambahkan  PG  AchE tracer kecuali sumur  TA  dan  Blk,  kemudian  setiap  sumur ditambahkan  antiserum  prostaglandin  kecuali  sumur TA  dan  NSB.  Plat  ditutup  dan  diinkubasi  selama  18 jam  pada  suhu  ruang.  Setelah  inkubasi,  plat  dicuci dengan  bufer  pencuci,  kemudian  setiap  sumur ditambahkan  pereaksi  Ellman,  dan  sumur  TA  diisi dengan tracer .  Plat  ditutup  dan  dibiarkan  bereaksi selama  90  menit.  Pembacaan  plat  dilakukan  dengan menggunakan  ELISA reader pada  panjang  gelombang 405 dan 415 nm.

## 2.2.3  Karakterisasi  senyawa  aktif  flavonoid  yang memiliki peran sebagai inhibisi enzim siklooksigenase – 2 secara in vitro
Karakterisasi  dilakukan  terhadap  fraksi  teraktif yang  memiliki  daya  inhibisi  terbesar.  Untuk mengetahui jenis komponen/gugus fungsi di dalamnya,  fraksi  diidentifikasi  pola  spektrumnya dengan Fourier  Transformation  Infra  Red (FT-IR) Spectroscopy, dan UV-Vis spectroscopy
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Standarisasi Ekstrak Air dan Etanol Sambiloto
Penelitian ini diawali dengan pengujian standarisasi  ekstrak  yakni:  organoleptik,  senyawa penciri,  kadar  air,  kadar  abu,  cemaran  logam:  Pb;  Cd; As,  cemaran  aflatoksin  dan  cemaran  mikrobiologi: angka lempeng total dan angka kapang / khamir yang mengacu pada standarisasi ekstrak BPOM RI, 2004.
Sample  simplisia  sambiloto  dilakukan  maserasi menggunakan pelarut air dan pelarut etanol selama 3 hari.  Semua  pelarut  dipisahkan  dari  ampasnya kemudian dilakukan freeze drying untuk mendapatkan ekstrak kasar.
Adanya
senyawa penciri andrographolide  ditunjukkan  pada  uji  HPLC  yang muncul pada t R 6,7.
Hasil  pada  esktrak  kasar  didapat  kandungan  air 2,4%  -  2,8%.  Kandungan  air  dalam  suatu  bahan  ini akan mempengaruhi daya tahannya terhadap serangan  mikroba,  sehingga  dapat  diperkirakan  cara penanganan terbaik bagi sampel dalam hal tempat dan waktu  penyimpanan.  Bila  kandungan  air  yang terkandung  dalam  suatu  bahan  berkisar  3%  -  7%, maka  kestabilan  optimum  bahan  akan  tercapai, pertumbuhan mikroba dapat dikurangi dan memperpanjang  masa  simpan  tanaman  kering (Winarno,  1997).  Ini  dibuktikan  dengan  hasil  uji cawan tuang yang memiliki nilai kecil.
Pada kadar abu yang diperoleh sedikit lebih besar dari  yang  ditetapkan  yakni  1,03%  -  1,15%.  Hal  ini dikarena  proses  pengabuan  yang  kurang  sempurna dengan ditandai dengan bentuk abu yang tidak semua berwarna putih.
Proses  ekstraksi  dilakukan  dengan  metode maserasi guna mencegah rusaknya senyawa metabolit
sekunder  yang  tidak  tahan  terhadap  suhu  tinggi. Maserasi  dilakukan  dengan  2  pelarut  yakni  air  dan etanol, dilakukan selama 3 hari dan setiap hari diganti dengan  pelarut  yang  baru.  Sementara  pelarut  yang telah  digunakan,  dikumpulkan  dan  dikeringkan dengan  menggunakan freeze  drying . Secara  umum hasil standarisasi ekstrak dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Perbandingan Standar Ekstrak Sambiloto Uji BPOM Hasil Penelitian Organoleptik: Bentuk ekstrak Warna Bau Rasa
Kental
Hijau kecoklatan Khas Pahit Kental agak menggumpal Hijau  (ekstrak etanol) Kecoklatan (ekstrak air) Khas Pahit Senyawa penciri: Andrographolid Ada Ekstrak Etanol : ada Ekstrak Air      : ada Kadar Air Ekstrak << 4 % 2,4% – 2,8% Kadar Abu total << 1% 1,03% – 1,15% Cemaran Pb Cd As Aflatoksin Angka lempeng total Angka Kapang/Khamir
<< 10 mg/kg 0,3 mg/kg
10  µg/kg 20  µg/kg << 10 koloni/gram
<< 10 koloni/gram
0,0149 mg/kg 0,0007 mg/kg 1,8 µg/kg B 1 : nil;   B 2 : nil G 1 : nil;   G 2 : nil 14 kol/g     ekstrak etanol 34 kol/g     ekstrak air 22  kol/g   ekstrak etanol
16  kol/g   ekstrak air
3.2  Penentuan  Daya  Inhibisi  Ekstrak  Air  dan Ekstrak  Etanol  Sambiloto  terhadap  Enzim  COX-2 secara In Vitro
Uji fitokimia pendahuluan dilakukan pada simplisia untuk  melihat  adanya  metabolit  sekunder  flavonoid.
Kemudian dilakukan uji fitokimia pada ekstrak etanol, ekstrak air dan fraksi - fraksi yang memiliki rendemen tinggi  untuk  memastikan  bahwa  fraksi  yang  didapat termasuk  golongan  flavonoid.  Hasil  uji  fotokimia tersaji pada Tabel 2.
Tabel 2. Uji Fitokimia EKSTRAK ETANOL EKSTRAK AIR NO Flavonoid Warna NO Flavonoid Warna F-1-E F-1-A ++ Kemerahan F-2-E + Kekuningan F-2-A F-3-E + Kemerahan F-3-A F-4-E F-4-A F-5-E F-5-A ++ Kekuningan F-6-E ++ Kemerahan F-6-A + Kekuningan F-7-E F-7-A + Kekuningan F-8-E + Kekuningan F-8-A + Kekuningan F-9-E + Kekuningan F-9-A + Kekuningan F-10-E ++ Kekuningan F-11-E - bening `
Fraksinasi  ekstrak  kasar  flavonoid  dilakukan secara  bergradien  dengan  tingkat  kepolaran  rendah hingga  kepolaran  tinggi  pada  kisaran  penggunaan komponen  eluen  terbaiknya.    Dari  sini  diharapkan akan  terjadi  pola  pemisahan  yang  lebih  sempurna, fraksi yang didapatkan akan lebih murni, dan senyawa aktif  didapat  akan  lebih  banyak  terisolasi.  Eluen
terbaik  yang  didapat  adalah  campuran  CHCl 3 :MeOH, 8:2.
Penggunaan  CHCl 3 :MeOH  sebagai  eluen  pada pemisahan flavonoid menggunakan penjerap silika gel pernah dilaporkan dan berhasil dengan perbandingan 15:1  sampai  3:1  dengan  senyawa  yang  diperoleh golongan  flavon,  flavonol,  flavonoid  aglikon  dan isoflavon (Markham, 1988).
Gambar 1. Pola pemisahan  KLT ekstrak kasar sambiloto  dengan CHCl 3 :MeOH (8:2) yang dibaca pada  254 nm
Hasil  eluen  terbaik  ini  dilanjutkan  dengan fraksinasi  menggunakan  KLT  Preparatif.  Pola  yang dihasilkan  antara  ekstrak  etanol  dan  air  memberikan jumlah spot yang berbeda. Ekstrak etanol memberikan 11 spot dan ekstrak air memberikan 9 spot, sementara spot  warna  hijau  yang  berada  paling  atas  diduga klorofil.
Tabel 3. Profil Hasil KLT Preparatif Ekstrak Sambiloto EKSTRAK ETANOL EKSTRAK AIR NO % rendemen NO % rendemen F-1-E 1,79 F-1-A 0,99 F-2-E 1,82 F-2-A 0,63 F-3-E 2,73 F-3-A 0,22 F-4-E 1,46 F-4-A 0,78 F-5-E 1,20 F-5-A 0,85 F-6-E 2,26 F-6-A 0,81 F-7-E 1,75 F-7-A 1,82 F-8-E 2,00 F-8-A 0,66 F-9-E 7,36 F-9-A 0,76 F-10-E 3,42 F-11-E 1,89
Sample yang ditotolkan dari ekstrak etanol sebesar 1,2745  gram  dan  ekstrak  air  sebesar  1,6961  gram. Meski  yang  ditotolkan  ke  KLT  Preparatif    berbeda jauh,  namun  hasil  rendemennya  sangat  jauh  berbeda. Hal  ini  dikarenakan,  banyaknya  fraksi  flavonoid  yang tidak  ikut  terekstrak  oleh  air  dan  dibuktikan  jumlah spot  antara  ektrak  air  lebih  sedikit  dibanding  ekstrak etanol pada eluen kloroform:metanol
3.3  Uji  Inhibisi  Ekstrak  dan  Fraksi  terhadap Aktivitas Enzim Siklooksigenase-2 Secara In vitro
Uji  ini  yang  dilakukan  berdasarkan  kemampuan ekstrak  dan  fraksi  dalam  menghambat  sintesis prostaglandin,  dimana  asam  arakidonat  berperan dalam  sintesis  prostaglandin  yang  akan  dikatalisis oleh  enzim  COX-2  (Darmawi,  2008).  Semakin  banyak jumlah  prostaglandin  yang  direduksi  oleh  SnCl 2 maka semakin  banyak  Prostaglandin  G 2 (PGG 2 )  yang tereduksi.
Gambar 2. Reaksi inhibisi siklooksigenase pada asam arakidonat menjadi PGG 2
Uji in vitro daya inhibisi ekstrak etanol, ekstrak air dan fraksi flavonoid dari sambiloto terhadap aktivitas enzim  COX-2  dilakukan  dengan  menggunakan konsentrasi  900  µg/ml.  Fraksi  yang  terpilih  ini didasarkan  pada  besarnya  %  rendemen  dan  uji fitokimia flavonoid.
Hasil uji daya inhibisi ekstrak dan fraksi sambiloto terhadap  aktivitas  COX-2  secara in  vitro (Gambar  3) menunjukkan  bahwa  fraksi  ekstrak  air  F-1-A
memberikan  daya  inhibisi  tertinggi  98,97  %.    Sedang pada  sambiloto  fraksi  ekstrak  etanol  F-10-E  hanya memberikan  daya  inhibisi  16,70  %.  Semakin  besar  % inhibisinya  maka  PGG 2 semakin  sedikit.  Banyak tidaknya  kandungan  PGG 2 pada  larutan  uji,  terlihat secara  visual.  Semakin  banyak  PGG 2 ,  larutan  uji semakin  berwarna  kekuningan  dan  semakin  sedikit warnanya lebih bening.
Gambar 3. Daya Inhibisi Ekstrak Air, Ekstrak Etanol dan Fraksi Sambiloto pada Enzim COX-2 secara In Vitro

## 3.4 Karakterisasi Senyawa Flavonoid dalam Fraksi Teraktif
Fraksi  yang  dianalisis  menggunakan  metode spektroskopi UV-Vis dan spektroskopi IR dipilih fraksi yang memiliki nilai daya inhibisi yang tinggi terhadap enzim COX-2 secara in vitro , yaitu fraksi ekstrak air F- 1-A dan fraksi ekstrak etanol F-10-E.
Spektra infra merah menunjukkan bahwa fraksi F- 1-A  kemungkinan  mengandung  gugus  fungsi  –OH (3434,48  cm -1 )  yang  didukung  munculnya  serapan pada  daerah  bilangan  gelombang  1060,42  cm -1 untuk ikatan  C-O  alkohol.  C-H alifatik  muncul  pada  bilangan gelombang  2923,03  cm -1 dan  diperkuat  dengan munculnya  serapan  bending  pada  daerah  bilangan gelombang  1423,84  dan  1455,30  cm -1 .  Gugus  ikatan C=C  alkena  dan  aromatik  ditunjukkan  dengan munculnya serapan pada 1631,47 cm-1.
Ikatan  hidrogen  pada  gugus  OH  selalu  muncul pada  flavon  dengan  memberikan  nilai  vibarasi  ulur pada  bilangan  gelombang  3400  dan  diperkuat  pada 1100,  sementara  gugus  fungsi  alkena  dan  aromatik sering  muncul  pada  ekstraksi  flavonoid  dengan menggunakan  pengekstrak  polar  (Andersen,  2006). Bilangan – bilangan gelombang ini mengarahkan pada kelompok flavonoid golongan flavon.
Hal  ini  diperkuat  dengan  informasi  spektrum  UV- Vis  bahwa  fraksi  F-1-A  memberikan  serapan  puncak spektrum  yang  kuat  pada  211  nm.  Sementara  itu, serapan  puncak  lemah  terjadi  pada  276  nm  dan  315 nm. Secara umum, serapan spektrum pada 276 nm ini mengacu  pada  ciri  golongan  flavonoid  yang  memiliki serapan sistem cincin benzoil yang berada pada 270 – 290  nm  dan  serapan  lemah  pada  325  nm  mengacu pada serapan sistem cincin cinamoil yang berada pada 310 – 330 nm (Markham, 1988).
Gambar 5. Spektrum FTIR dan UV fraksi F-10-E
Spektra infra merah menunjukkan bahwa fraksi F- 10-E  kemungkinan  mengandung  gugus  fungsi  –OH (3434,48  cm -1 )  yang  didukung  munculnya  serapan pada  daerah  bilangan  gelombang  1110,13  cm -1 untuk ikatan  C-O  alkohol.  C-H alifatik  muncul  pada  bilangan gelombang  2924,21  cm -1 dan  2855,33  yang  diperkuat dengan  munculnya  serapan  bending  pada  daerah bilangan gelombang 1423,84 dan 1455,30 cm -1 . Gugus ikatan  C=C  aromatik  ditunjukkan  dengan  munculnya serapan pada 1632,02 cm -1 dan 1563,12 cm -1 . Gugus – C=C-  aromatik  muncul  pada  serapan  gelombang 1632,02  cm -1 ;  1563,12  cm -1 ;  1457,01cm -1 ,  yang diperkuat  munculnya  –C-H  aromatik  pada  serapan gelombang 461,91 cm -1 ; 618,00 cm -1 ; dan 792,23 cm -1 . Pada  tiga  bilangan  gelombang  1737,  1632  dan 1563 secara nyata lebih mengarahkan pada spektrum yang  kuat  untuk  senyawaan  alkaloid,  turunan  flavon dan senyawa karbonil (Andersen, 2006).
Hasil  analisa  spektrum  UV-Vis  memberikan informasi  bahwa  fraksi  F-10-E  hanya  memberikan serapan  puncak  spektrum  yang  kuat  pada  252  nm. Fraksi  ini  diduga  termasuk  golongan  senyawa polifenol,  dimana  senyawa  polifenol  memiliki  2 karakteristik  absorbsi  pada  240  –  285  nm  dan  330  – 550 nm (Andersen, 2006). Padahal pada di 330  – 550 nm, F-10-E tidak muncul serapan spektrum.

## 4. SIMPULAN
Standarisasi  ekstrak  air  dan  ekstrak  sambiloto pada  penelitian  ini  memenuhi  standar  ekstrak  yang ditetapkan  oleh  BPOM  RI,  2004  kecuali  cemaran mikrobiologi.  Pada konsentrasi 900 µg/ml, ekstrak air dan  ekstrak  etanol  tidak  memiliki  kemampuan  untuk menginhibisi  enzim  COX-2  secara in  vitro ,  sementara fraksi  no  1  ekstrak  air  memiliki  kemampuan menginhibisi  98,97%  dan  fraksi  no  10  ekstrak  etanol memiliki  kemampuan  menginhibisi  16,70  %.Diduga fraksi  kesatu  ekstrak  air  ini  merupakan  golongan senyawa  flavonoid,  sedangkan  fraksi  kesepuluh ekstrak etanol diduga golongan polifenol.

## 5. DAFTAR PUSTAKA
Andersen  Oyvin  M,  Kenneth  R  Markham.  Flavonoid: Chemistry,  Biochemistry  and  Application.  CRC Press. London. 2006.
[Anonim],  COX  Inhibitor  screening  assay.  Catalog  No. 560131. [Journal]. Cayman chemical company. Ann Arbor, MI, All rights  reserved. USA.  Planta med: 1- 11. [26 Februari 2007].
Badan  POM  RI,  Monografi  Ekstrak  Tumbuhan  Obat Indonesia,  Volume  1,  Cetakan  Pertama,  Jakarta, 2004.
Cai  Hong,  Muhammad  Al  Fayez,  Richard  G  Tunstall,
Sharon  Platton,  Peter  Greaves,  William  P  Stewart, Andreas  J  Gescher.,  The  Rice  Bran  Constituent Tricin Potently Inhibit Cyclooxygenase Enzyme and Interferens  with  Intestinal  Carcinogenesisi  in Apc Min Mice,  Molecular  Cancer  Journal,  American Assosiation for Cancer Research, USA, 2005.
Dannhardt,  G.,  Laufer  S..  Structural  Approach  to Explain the Selectivity of COX-2 Inhibitors: Is There a  Common  Pharmacophore.  Curr.  Med.  Chem.. 2000, (7), 1101–1112.
Jiang, Q., Elson Schwab, I., Courtemance, C., Ames, B.N.,
Gammatocopherol  and  its  major  metabolite,  in contras to alpha tocopherol, inhibit cyclooxygenase activity  in  macrophages  and  epithelial  cell. Canadian  Journal  Anestheologist  Society,  USA, 2000.
Lambart,  Joseph  B.,  Herbert  E  Shurvell,  David  A Lightner,  R  Graham  Cooks.  Organic  Structural Spectroscopy, Prentice Hall Inc. New Jersey, 1998.
Li  Menkui,  Xudong  Xu,  Hongjie  Zhang,  Cuiying  Ma,
Harry  Fong,  Richard  Van  Breemen,  John  Fitzloff. Secondary
Metabolites from Andrographis paniculata,  Chemical  Pharmacy  Bulletin,  2007,  55
(3), 455 – 458.
Mishra  K  Siddharta,  Neelam  S  Sangwah,  Rajender  S Sangwan,  Phcog  Rev.:  Plant  Review.  Andrographis paniculata  (Kalmegh):  A  Review.  Pharmacognosy Reviews. Central Institute of medical and Aromatic Plants (CIMAP), India, 2007, 1(2).
Markham  K.R.,  Cara  Mengidentifikasi  Falvonoid. Diterjemahkan  oleh  Padmawinata,  ITB  Bandung, 1998.
Subbaramaiah  Kotha,  Pedro  Michaluart,  Michael  B Sporn, Andrew j Dannenberg,  Ursolic Acid Inhibits Cyclooxygenase Transcription in Human Mammary Ephitelial Cell, Cancer Research, New York, 2000.
Zhang  Fan,  Nasser  K  Altorki,  Juan  R  Mestre,  Kortha Subbaramaiah,  Andrew  J  Dannenberg,  Curcumin Inhibits  Cyclooxygenase2  Transcription  in  Bile
Acid and
Phorbol Ester-treated Human Gastrointestinal  Ephitel  Cell,  Carcinogenesis,  New
York, 1999, 20(3).