## PERBEDAAN EFEK PEMBERIAN SECARA KOMBINASI DAN TUNGGAL EKSTRAK BIJI ANGGUR (Vitis vinifera L.) DAN
GLUTATION TERHADAP MOTILITAS, JUMLAH, DAN MORFOLOGI SPERMA TIKUS WISTAR YANG DIBERI PAPARAN ASAP ROKOK
DIFFERENT EFFECTS OF COMBINATION AND SINGLE OF GRAPE SEED (Vitis vinifera L.) AND GLUTATION EXTRACTS ON WISTAR RATS SPERM MOTILITY, AMOUNT, AND
MORPHOLOGY THAT CIGARETTE SMOKE EXPOSED
Conita Yuniarifa, Atina Hussaana, Mohamad Riza Departemen Farmakologi Fakultas Kedokteran, Universitas Islam Sultan Agung Korespondensi : Conita Yuniarifa. Email : conitayuniarifa@gmail.com

## ABSTRAK
Asap rokok menyebabkan peningkatan stres oksidatif dan menimbulkan infertilitas. Ekstrak biji anggur dan glutation dapat mencegah stres oksidatif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek pemberian secara kombinasi dan tunggal ekstrak biji anggur dan glutation terhadap motilitas, jumlah dan morfologi sperma pada tikus yang dipapar asap rokok. Penelitian ini eksperimental dengan post test only control group design. Subyek berjumlah 30 ekor tikus dibagi acak menjadi 5 kelompok. K(-) tidak diberikan asap rokok dan perlakuan, K(+) hanya diberi paparan asap rokok, PI diberi kombinasi ekstrak biji anggur dan glutation, PII diberi ekstrak biji anggur, PIII diberi glutation. Dosis ekstrak biji anggur 5,4 mg/ekor/hari dan glutation 1,8 mg/hari. Paparan asap rokok diberikan 3 batang/hari dilanjutkan perlakuan dilakukan selama 21 hari. Hari ke-22 dilakukan pengambilan sperma  untuk  meniliai  motilitas,  jumlah  dan  morfologi.  Data  dianalisis  parametik  dengan  tingkat  signifikasi p<0,05. Uji One Way Anova menunjukkan ada perbedaan bermakna yaitu pada morfologi sperma (p=0,000). Uji kruskal wallis menunjukkan ada perbedaan bermakna yaitu pada jumlah sperma (p=0,000) dan motilitas sperma (p=0,000). Rerata  tertinggi pada  morfologi sperma yaitu PI  (37,6 ± 1,23%), jumlah sperma  yaitu PIII (49,3 ± 1,06 sel/ml) dan motilitas sperma yaitu (64,2 ± 0,52%). Pemberian kombinasi ekstrak biji anggur dan glutation berefek paling baik  terhadap motilitas dan morfologi sperma,  dan pemberian glutation secara tunggal berefek paling baik terhadap jumlah sperma.
Kata Kunci : ekstrak biji anggur, glutation, motilitas, jumlah dan morfologi sperma.

## ABSTRACT
Cigarette  smoke  causes  an  increase  in  oxidative  stress  and  causes  infertility.  Grape  seed  extract  and glutathione  can  prevent  oxidative  stress.  This  study  to  determined  the  effect  of  the  combined  and  single administration of grape seed extract and glutathione on motility, number and morphology of sperm in rats exposed to cigarette smoke. This study was experimental with post test only control group design. Subjects totaling 30 rats were  randomly  divided  into  5  groups.  K(-)  was  not  given  cigarette  smoke  and  treatment,  K(+)  was  only  given exposure to cigarette smoke, PI was given a combination of grape seed extract and glutathione, PII was given grape  seed  extract  alone,  and  PIII  was  given  glutathione  alone.  The  dose  of  grape  seed  extract  was  5.4 mg/head/day  and  glutathione  1.8  mg/day.  Exposure  to  cigarette  smoke  was  given  3  sticks/day  followed  by treatment for 21 days. On the 22nd day, sperm were collected to assess motility, number and morphology. The data were analyzed parametrically with a significance level of p<0.05. One Way Anova test showed that there was a significant difference in sperm morphology (p=0.000). Kruskal Wallis test showed that there was a significant difference in sperm count (p=0.000) and sperm motility (p=0.000). The highest mean in sperm morphology was PI  (37.6  ±  1.23%),  sperm  count  was  PIII  (49.3  ±  1.06  cells/ml)  and  sperm  motility  was  (64.2  ±  0.52%).  The combination of grape seed extract and glutathione had the best effect on sperm motility and morphology, and the glutation administration alone had the best effect on sperm count.
Keywords: grape seed extract, glutathione, motility, sperm count and morphology.
How To Cite: Yuniarifa, C.,  Hussaana,  A., &  Riza, M. (2022). PERBEDAAN EFEK PEMBERIAN SECARA KOMBINASI DAN TUNGGAL EKSTRAK BIJI ANGGUR (Vitis vinifera L.) DAN GLUTATION TERHADAP MOTILITAS, JUMLAH, DAN MORFOLOGI SPERMA TIKUS WISTAR YANG DIBERI PAPARAN ASAP ROKOK. Biomedika, 14(1), 20-32. doi:https://doi.org/10.23917/biomedika.v14i1.13449
DOI : https://doi.org/10.23917/ biomedika. v14i1.13449

## PENDAHULUAN
Merokok  adalah  salah  satu  kebiasaan yang  ditemui  dalam  kehidupan  sehari-hari  yang menimbulkan  masalah  kesehatan  (Promkes, 2010).  Perokok  memerlukan  antioksidan  untuk menurunkan stres  oksidatif .  Antioksidan  alami banyak terkandung dalam buah-buahan. Mengkonsumsi buah diharapkan mampu menurunkan  stres  oksidatif  di  dalam  sperma. Salah  satu  sumber  antioksidan  yang  memiliki efektivitas  tinggi  terkandung  dalam  biji  anggur. Biji  anggur  mengandung  fenol,  terutama proanthocyanidins (proanthocyanidins
oligomer).  Penelitian  ilmiah  telah  menunjukkan bahwa  kekuatan  antioksidan  proanthocyanidins adalah 20% lebih besar dari vitamin E dan 50% lebih besar dari vitamin C (Shi John, Yu Jianmei, 2003).  Antioksidan  glutation  juga  bagus diberikan  karena  secara  kimia  dapat  bereaksi dengan  singlet  oksigen,  radikal  superoksida, hidroksil,  dan  langsung  bisa  berperan  menjadi scavenger radikal bebas. Glutation juga berperan sebagai agen pereduksi yang mampu memanfaatkan  kembali  asam  askorbat  dari bentuk teroksidasi menjadi bentuk tereduksi oleh enzim  dehidroaskorbat  reduktase  (Winarsi, 2011).  Antioksidan  Vitamin  E  juga  dapat menetralisir  ROS  sehingga  perlu  diberikan,
dimana kemampuan tocopherol dalam menetralisir ROS lebih cepat dibandingkan lipid. Terjadinya  peroksidasi  lipid  pada  membran  sel dapat  dicegah  dan  dikurangi  oleh  vitamin  E (Jungwirth, A, et al, 2016). Penelitian mengenai kombinasi dan pemberian secara tunggal ekstrak biji  anggur (vitis  vinifera  l.) dan  glutation terhadap motilitas, jumlah dan morfologi sperma pada  tikus  putih jantan  galur  wistar  yang  diberi paparan  asap  rokok  belum  pernah  dilakukan sehingga  perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut untuk mengetahui manfaatnya.

## METODE
Penelitian  dilakukan  di  PAU  UGM,
Yogyakarta. Penelitian ini telah mendapat surat kelayakan etik dari Komisi Bioetika Penelitian Kedokteran/Kesehatan  Fakultas  Kedokteran Universitas  Islam  Sultan  Agung  Semarang Nomor  392/XI/2021/Komisi  Bioetik.  Jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratorium dengan pendekatan post test only control group design dengan menggunakan 30 ekor  tikus  putih  jantan  galur  wistar  yang dikelompokkan secara random. Kandang dalam penelitian  ini  telah  memenuhi  syarat.  Tikus yang digunakan yaitu berumur 8 minggu, berat badan  150-200  gram.  Jumlah  kelompok  pada penelitian  ini  adalah  5  kelompok  yang  terdiri
dari 2 kelompok kontrol yaitu K(-) dan K(+) dan 3 kelompok perlakuan yaitu P I, P II, dan P III. K(-) merupakan kelompok kontrol yang hanya diberikan  pelet+air,  kelompok  K(+)  hanya diberikan  paparan  asap  rokok,  kelompok  P  I diberikan  kombinasi  ekstrak  biji  anggur  5,4 mg/ekor/hari  dan  glutation  1,8  mg/hari,  P  II diberi ekstrak biji anggur 5,4 mg/ekor/hari, P III diberi glutation 1,8 mg/hari.  Dosis ekstrak biji anggur  hijau  yang  digunakan  dosis  5,4 mg/ekor/hari. Metode  pembuatan  ekstrak  biji anggur yaitu dengan cara simplisia biji anggur dicampur dengan aquades kemudian ditanggas dengan  suhu  80°C  selama  5  jam,  setelah  itu disaring sampai didapatkan ekstrak biji anggur. Pemberian ekstrak biji anggur diberikan secara sonde per oral setiap pagi hari selama 21 hari . Glutation  yang  digunakan  adalah  glutation sintetik.  Dosis  glutation  didapatkan  dari konversi  berat  badan  manusia  dewasa  (70  kg) ke berat badan tikus (200 g), yaitu 0,018. Dosis kebutuhan glutation pria dewasa per orang per hari  adalah  100  mg/hari.  Perhitungan  dosis glutation untuk tikus dengan berat 200 g yaitu 100 mg/hari x 0,018 = 1,8 mg/hari. Pemberian glutation  (1,8  mg/hari)  melalui  sonde  yang diberikan  ±  60  menit  setelah  pemaparan  asap rokok  (Kardi,  2015).  Semua  kelompok  diberi
paparan  asap  rokok  3  batang/hari  selama  21 hari. Berdasarkan penelitian paparan asap rokok 3 batang/hari sudah dapat menurunkan motilitas spermatozoa (Kardi, 2015).
Penelitian  dilakukan  dengan  cara seluruh tikus dibagi 5 kelompok, sehingga tiap kelompok  terdiri  dari  6  ekor  tikus.  Tiap  ekor diletakkan dalam kandang tersendiri. Kelompok K(-) tidak diberi paparan asap rokok. Kelompok K(+), P I, P II, dan P III diberikan paparan asap rokok  3  batang  perhari  selama  21  hari  setelah dilakukan  uji  pendahuluan/adaptasi  selama  7 hari. Kelompok K(+), P I, P II, dan P III pada waktu pemberian paparan asap rokok, perkelompok  tikus  dipindakan  ke  dalam  1 kandang  khusus  untuk  pemberian  paparan masing-masing  3  rokok.  Kandang  tersebut kemudian  ditutup  menggunakan  plastik  dan dibuat satu lubang untuk aliran udara dan satu lubang  lagi  dari  bawah  kandang  untuk memasukkan  asap  rokok.  Asap  rokok  diambil dengan  menghisap  rokok  menggunakan  spuit injeksi  berukuran  30  ml  yang  ujungnya  diberi selang  sebagai  tempat  pangkal  rokok.  Setelah itu  asap  rokok  didapatkan  dengan  cara membakar  3  rokok  secara  berurutan  yang dimasukkan  kedalam  lubang  pada  bagian bawah  kandang.  Dilakukan  pada  kelompok
K(+),  P  I,  P  II,dan  P  III.  Kemudian  ditunggu dulu selama ± 60 menit lalu kelompok P I, P II, dan  P  III  diberikan  perlakuan.  Tikus  diberi makanan pelet merk AD II produksi PT. Japfa Comfeed Indonesia, Tbk dan diberi minum air mineral.  Perlakuan  dilakukan  selama  21  hari. Pada  hari  ke  22  setelah  perlakuan  kemudian dilakukan pengambilan semen dengan pemotongan  cauda  epididimis  hingga  ampula vas  deferens.  Epididimis  yang  sudah  dipotong kemudian  diletakkan  dalam  cawan  petri  yang telah diberi 0,5 cc larutan NaCl fisiologis 0,9%. Epididimis diurut dengan menggunakan spatula untuk mengeluarkan semen. Setelah itu sampel semen  yang  berisi  sperma  diperiksa  motilitas, jumlah, dan morfologi spermatozoa.
Pemeriksaan kualitas sperma dianalisis melalui motilitas  spermatozoa,  jumlah  spermatozoa, dan morfologi spermatozoa.

## Motilitas Spermatozoa
Motilitas spermatozoa adalah persentase spermatozoa  motil  yang  didapatkan  tiap  200 spermatozoa  pada  5  lapang  pandang,  dihitung dengan menggunakan rumus (WHO, 2010):
PR +NP x 100% 200
PR  = Progressive  motility (Spermatozoa bergerak aktif, baik dengan arah linier atau dalam lingkaran besar, tanpa melihat kecepatan)
NP  =  Non -progressive  motility (Spermatozoa bergerak  namun  tidak  progresif,  misalnya berenang  di  lingkaran  yang  kecil,  ekor spermatozoa  bergerak  namun  tidak  dapat mendorong  kepala,  atau  hanya  bagian  ekor spermatozoa yang tampak bergerak).

## Jumlah Spermatozoa
Pemeriksaan jumlah spermatozoa dengan  cara  semen  yang  telah  diaduk  dengan baik,  diencerkan  dengan  pipet  leukosit  dengan larutan George (100 ml Natrium sitrat 3%, 1 ml formalin 40% dan 0,6 g eosin B) 1:20, kemudian semen  dipindahkan  ke  hemositometer  standar yaitu kamar hitung Neubauer yang telah ditutup dengan menggunakan gelas penutup selama 15- 20  menit  agar  semua  sel  mengendap.  Jumlah spermatozoa (n)  dihitung  dalam  kamar  hitung seluas  1  mm 2 ,  di  bawah  mikroskop  cahaya dengan  menggunakan  pembesaran  400  kali. Jumlah  spermatozoa  (juta/ml)  dihitung  dengan rumus : n x 20 x 10 4 (WHO, 2010)

## Morfologi Spermatozoa
Morfologi spermatozoa diperiksa dengan menghitung  persentase  morfologi  spermatozoa
yang  memenuhi  kriteria  normal.  Persentase diperoleh  dengan  cara  dihitung  dari  200 spermatozoa sesuai dengan bentuknya, di bawah mikroskop cahaya dengan menggunakan pembesaran  400  kali.  Penilaian  morfologi spermatozoa,  nilainya  tidak  boleh  lebih  rendah dari  4%.  Penilaian  morfologi  segera  setelah apusan  semen  kering  dilakukan  fiksasi  dan pengecatan  supaya  bisa  melihat  spermatozoa secara detail. Pengecatan yang direkomendasikan adalah  Papanicolaou,  Shorr  atau  Diff-Quick. Ketiga  pengecatan  tersebut  apabila  dilihat dengan  mikroskop  hasilnya  yaitu  kepala spermatozoa akan berwarna biru pucat pada regio akrosomal dan berwarna biru tua pada regio post akrosomal,  pada  bagian  tengah  berwarna kemerahan sedangkan bagian ekor akan berwarna  biru  atau  kemerahan  (WHO,  2010).
Sperma normal memiliki beberapa kriteria yaitu: bentuk  kepala  oval  dengan  garis  bentuk  halus, dan ukuran panjang kepala kira-kira 4-5 µm dan lebar  2,5-3  µm.  Total  ratio  panjang  dan  lebar
harus  1,5-1,75.  Selain  itu,  harus  memiliki wilayah  akrosom  yang  terdefinisi  dengan  baik yang  terdiri  dari  40%  -70%  dari  daerah  kepala. Ekor  harus  lurus,  seragam,  tidak  bergulung  dan memiliki  panjang  sekitar  45  µm  (Franken  and Oehninger, 2012).

## Analisis Statistik
Semua  data  dilakukan  uji  normalitas Shapiro Wilk dan uji homogenitas menggunakan uji Levene test (p> 0,05). Data morfologi sperma mempunyai  distribusi  normal  dan  homogen, kemudian dianalisis uji one way anova p< 0,05.
Data  motilitas  sperma  dan  jumlah  sperma hasilnya  tidak  normal  dan  atau  tidak  homogen dilakukan uji kruskal wallis p< 0,05.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Morfologi spermatozoa
Morfologi  spermatozoa  (normal)  yang diamati  menggunakan  mikroskop  pembesaran 1000  x  setelah  21  hari  intervensi  pada  tiap kelompok ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil Uji Deskriptif, Normalitas, Homogenitas Varian Dan Uji Beda Rerata Morfologi Spermatozoa Dengan One Way Anova Kelompok n Mean ± SD (%) p-value Shapiro-Wilk One Way Anova K(-) 6 37,9 ± 0,86 0,454 0,000 K(+) 6 21,4 ± 1,77 0,452 P I 6 37,6 ± 1,23 0,209 P II 6 34,7 ± 0,75 0,269 P III 6 36,3 ± 0,90 0,437 Hasil uji homogenitas dengan Levene test ( p= 0,184>0,05)
Berdasarkan  Tabel  1  diketahui  bahwa rerata  morfologi  spermatozoa  tertinggi  (37,9  ± 0,86 %) terdapat pada kelompok K (-), sedangkan yang  terendah  pada  K  (+)  yaitu  sebesar  21,4  ± 1,77%.  Rerata  morfologi  spermatozoa  di kelompok P I (37,6 ± 1,23%), P II (34,7 ± 0,75%) dan  P  III  (36,3  ±  0,90%)  terlihat  lebih  tinggi daripada  di  K  (+)  dan  cenderung  lebih  tinggi daripada K (-).
Uji Shapiro Wilk pada tiap kelompok dan homogenitas  varian  kelima  kelompok  diperoleh nilai p> 0,05 menunjukkan bahwa distribusi data
morfologi  spermatozoa  tiap  kelompok  adalah normal  dan  varian  data  kelima  kelompok homogen. Perbedaan rerata morfologi spermatozoa pada kelima kelompok diuji dengan one  way  anova dan  diperoleh  nilai  p  sebesar 0,000 (p< 0,05) artinya terdapat perbedaan rerata morfologi  spermatozoa  yang  signifikan  pada kelima  kelompok.  Uji  lanjut  untuk  mengetahui kelompok  mana  yang  menunjukkan  perbedaan rerata  morfologi  spermatozoa  dilakukan  dengan uji post hoc LSD dan diperoleh hasil sebagaimana ditampilkan pada Grafik 1a.
Grafik  1. a.  Perbandingan  morfologi  spermatozoa  antar  kelompok.  b.  Perbandingan  jumlah  spermatozoa  antar kelompok.  c.  Perbandingan  motilitas  spermatozoa  antar  kelompok.  Ket:  **=  p<0,01;  ***=  p<0,001;  ****= p<0,0001
Perbandingan morfologi spermatozoa antar 2  (dua)  kelompok  yang  signifikan  (p<0,05) ditunjukkan antara K (-) dengan K (+) dan P II, antara K (+) dengan P I, P II dan PIII, serta antara P  I  dengan  P  II.  Morfologi  spermatozoa  di kelompok  K  (-)  secara  signifikan  lebih  tinggi daripada  kelompok  K  (+)  menunjukkan  bahwa paparan asap rokok selama 21 hari menurunkan persentase morfologi spermatozoa yang normal. Morfologi spermatozoa di kelompok P I, P II, dan P  III  secara  signifikan  lebih  tinggi  daripada  di kelompok K (+) menunjukkan bahwa pemberian ekstrak biji anggur dan glutation masing-masing secara  tunggal  maupun  kombinasi  berpengaruh meningkatkan persentase morfologi spermatozoa yang normal pada tikus yang dipapar asap rokok. Morfologi  spermatozoa  di  P  I  secara  signifikan lebih  tinggi  daripada  P  II  menunjukkan  bahwa efek kombinasi ekstrak biji anggur dan glutation terhadap  peningkatan  persentase  morfologi spermatozoa normal pada tikus yang dipapar asap rokok lebih baik daripada efek pemberian ekstrak biji  anggur  saja.  Efek  peningkatan  morfologi spermatozoa  normal  oleh  P  II  masih  di  bawah kondisi normal (K (-)). Perbandingan morfologi spermatozoa antar 2 (dua) kelompok yang tidak signifikan  (p>  0,05)  ditunjukkan  antara  K  (-) dengan P I dan P III, antara P I dengan P III, dan
antara  P  II  dengan  P  III.  Pemberian  kombinasi ekstrak biji anggur dan glutation, atau pemberian glutation  saja  efektif  meningkatkan  persentase morfologi  spermatozoa  normal  hingga  setara dengan  kondisi  normal.  Efektifitas  keduanya relatif serupa (P I dan P III).
Kelompok yang berpengaruh paling baik dalam  meningkatkan  morfologi  sperma  adalah kombinasi ekstrak biji anggur dan glutation (P I) dibandingkan dengan kelompok lainnya. Hal ini sesuai  dengan  penelitian  Pramesemara  (2015) yang  menyebutkan  bahwa  pemberian Growth Hormone meningkatkan jumlah sel Spermatogenesis, sel Leydig, dan sel Sertoli pada mencit  ( Mus  Musculus )  tua  (Pramesemara, 2015). Kombinasi  P  I.  sebagai  antioksidan mampu  bekerja  lebih  baik  dibandingkan kombinasi lain dalam menghambat terbentuknya ROS  sehingga  apoptosis  sel  tersebut  dapat dicegah  sehingga  tidak  terjadi  kerusakan morfologi  spermatozoa  pada  saat  proses spermatogenesis (Tremallen, 2008).

## Jumlah spermatozoa
Jumlah spermatozoa yang dihitung dengan hemocytometer  Neubauer ,  dengan  pengenceran 20  X  dan  dilihat  di  bawah  mikroskop  pada perbesaran  400  kali  setelah  21  hari  intervensi pada tiap kelompok ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil uji deskriptif, normalitas, homogenitas varian dan uji beda rerata jumlah spermatozoa dengan uji Kruskal Wallis Kelompok n Mean ± SD (sel/ml) p-value Shapiro-Wilk Kruskal Wallis K(-) 6 48,5 ± 1,17 0,745 0,000 K(+) 6 22,6 ± 1,55 0,456 P.I 6 48,1 ± 1,49 0,029 P.II 6 46,5 ± 0,33 0,394 P.III 6 49,3 ± 1,06 0,893 Hasil uji homogenitas dengan Levene test ( p = 0,047<0,05)
Berdasarkan  Tabel  2  diketahui  bahwa rerata jumlah spermatozoa tertinggi (49,3 ± 1,06 sel/ml) terdapat pada kelompok P III, sedangkan terendah  pada  K  (+)  yaitu  sebesar  22,6  ±  1,55 sel/ml. Rerata jumlah spermatozoa di kelompok P I (48,1 ± 1,49 sel/ml), P II (46,5 ± 0,33 sel/ml), P III dan K(-) (48,5 ± 1,17 sel/ml) terlihat lebih tinggi daripada di K (+).
Uji Shapiro Wilk data jumlah spermatozoa pada kelompok P I tidak berdistribusi normal (p< 0,05)  dan  homogenitas  varian  data  jumlah spermatozoa  kelima  kelompok  juga  tidak homogen  (p<  0,05).  Perbedaan  rerata  jumlah spermatozoa pada kelima kelompok diuji secara nonparametrik  dengan  uji Kruskal  Wallis dan diperoleh nilai p sebesar 0,000 (p< 0,05) artinya terdapat  perbedaan  rerata  jumlah  spermatozoa yang signifikan pada kelima kelompok. Uji lanjut untuk  mengetahui  kelompok  mana  yang menunjukkan perbedaan rerata jumlah spermatozoa dilakukan dengan uji Mann Whitney dan  diperoleh  hasil  sebagaimana  ditampilkan pada Grafik 1 b.
Perbandingan jumlah spermatozoa antar 2 (dua)  kelompok  yang  signifikan  (p<  0,05) ditunjukkan antara K (-) dengan K (+) dan P II, antara  K  (+)  dengan  P  I,  P  II,  dan  P  III,  serta antara P II dengan P III. Jumlah spermatozoa di kelompok  K  (-)  secara  signifikan  lebih  tinggi daripada  kelompok  K  (+)  menunjukkan  bahwa paparan asap rokok selama 21 hari menurunkan jumlah  spermatozoa.  Jumlah  spermatozoa  di kelompok  P  I,  P  II  dan  P  III  secara  signifikan lebih  tinggi  daripada  di  kelompok  K  (+) menunjukkan  bahwa  pemberian  ekstrak  biji anggur  dan  glutation  masing-masing  secara tunggal maupun kombinasi berpengaruh meningkatkan  jumlah  spermatozoa  pada  tikus yang dipapar asap rokok. Jumlah spermatozoa di P.II  secara  signifikan  lebih  rendah  daripada  di P.III  menunjukkan  bahwa  efek  pemberian glutation terhadap peningkatan jumlah spermatozoa pada tikus yang dipapar asap rokok lebih  baik  daripada  efek  pemberian  ekstrak  biji anggur.
Perbandingan jumlah spermatozoa antar 2 (dua) kelompok yang tidak signifikan antara K(- )  dengan  P  I  dan  P  III  artinya  pemberian kombinasi ekstrak biji anggur dan glutation, atau pemberian  glutation  saja  efektif  meningkatkan jumlah  spermatozoa  hingga  setara  dengan kondisi normal. Perbandingan jumlah spermatozoa antara P I dengan P II dan P III yang tidak  signifikan  (p>  0,05)  artinya    efektifitas ketiga jenis pemberian (ekstrak biji anggur atau glutation  saja  atau  kombinasinya)  dalam meningkatkan  jumlah  spermatozoa  pada  tikus yang dipapar asap rokok adalah serupa.
Kelompok yang berpengaruh paling baik dalam  meningkatkan  jumlah  sperma  adalah pemberian  glutation  secara  tunggal  (P  III) dibandingkan dengan kelompok lainnya. Hal ini sesuai  dengan  penelitian  Kardi  (2015)  yang menyebutkan  bahwa  pemberian  glutathion  pada mencit  jantan  dewasa  yang  terpapar  asap  rokok dapat meningkatkan motilitas progresif
spermatozoa (Kardi, 2015). Pemberian glutation pada kelompok P III sebagai antioksidan terbukti lebih  baik  dibandingkan  pemberian  yang  lain dalam  fungsinya  bekerja  menekan  terbentuknya ROS  sehingga stres  oksidatif berkurang  dan kerusakan  membran  DNA  spermatozoa  dapat dicegah  dan  tidak  terjadi  penurunan  jumlah spermatozoa.  Antioksidan  ini  mampu  berperan dalam pertumbuhan dan replikasi sel, kematangan organ seks, fertilitas dan reproduksi sehingga bisa memperbaiki jumlah sel spermatozoa  yang  rusak  akibat  paparan  asap rokok (Nugroho, 2010).

## Motilitas spermatozoa
Motilitas  spermatozoa  yang  dihitung  dari persentase progressive dan nonprogressive motility terhadap total spermatozoa yang diamati menggunakan mikroskop pada perbesaran 400 X (Gambar  1)  setelah  21  hari  intervensi  pada  tiap kelompok ditunjukkan pada Tabel 3.
a b
Tabel 3. Hasil uji deskriptif, normalitas, homogenitas varian dan uji beda rerata motilitas spermatozoa dengan uji Kruskal Wallis Kelompok n Mean ± SD (%) p-value Shapiro-Wilk Kruskal Wallis K(-) 6 63,9 ± 0,52 0,126 0,000 K(+) 6 27,3 ± 1,93 0,614 P.I 6 64,2 ± 0,52 0,941 P.II 6 60,7 ± 0,82 0,597 P.III 6 64,1 ± 1,11 0,031 Hasil uji homogenitas dengan Levene test (p: 0,137>0,05)
Berdasarkan  Tabel  3  diketahui  bahwa rerata  motilitas  spermatozoa  tertinggi  (64,2  ± 0,52%)  terdapat  pada  kelompok  P  I,  sedangkan terendah pada K (+) yaitu sebesar 27,3 ± 1,93%. Rerata motilitas spermatozoa di kelompok P II, K (-)  dan  P  III  secara  berturut-turut  adalah  60,7 ± 0,82%, 63,9 ± 0,52% dan 64,1 ± 1,11%.
Uji Shapiro Wilk data motilitas spermatozoa  pada  kelompok  P  III  tidak berdistribusi  normal  (p<  0,05),  sedangkan  pada keempat  kelompok  lainnya  berdistribusi  normal
(p>  0,05).  Homogenitas  varian  data  motilitas spermatozoa  kelima  kelompok  diperoleh  varian homogen  (p>  0,05).  Perbedaan  rerata  motilitas spermatozoa pada kelima kelompok diuji secara nonparametrik  dengan  uji Kruskal  Wallis dan diperoleh nilai p sebesar 0,000 (p< 0,05) artinya terdapat  perbedaan  rerata  motilitas  spermatozoa yang signifikan pada kelima kelompok. Uji lanjut untuk  mengetahui  kelompok  mana  yang menunjukkan perbedaan rerata motilitas spermatozoa dilakukan dengan uji Mann Whitney
Gambar 1. Foto sperma masing-
masing kelompok di bawah mikroskop cahaya perbesaran
400X Keterangan: a. K (-) b. K (+) c. P I
d. P II e. P III e c d
dan  diperoleh  hasil  sebagaimana  ditampilkan pada Grafik 1 c.
Perbandingan  motilitas  spermatozoa  antar 2  (dua)  kelompok  yang  signifikan  (p<  0,05) ditunjukkan antara K (-) dengan K (+) dan P II, antara K (+) dengan P I, P II dan P III, serta antara P II dengan P I dan P III. Motilitas spermatozoa di kelompok K (-) secara signifikan lebih tinggi daripada  kelompok  K  (+)  menunjukkan  bahwa paparan asap rokok selama 21 hari menurunkan motilitas spermatozoa. Motilitas spermatozoa di kelompok  P  I,  P  II  dan  P  III  secara  signifikan lebih  tinggi  daripada  di  kelompok  K  (+) menunjukkan  bahwa  pemberian  ekstrak  biji anggur  dan  glutation  masing-masing  secara tunggal maupun kombinasi berpengaruh meningkatkan  motilitas  spermatozoa  pada  tikus yang dipapar asap rokok. Motilitas spermatozoa di P II secara signifikan lebih rendah daripada di P I dan P III menunjukkan bahwa efek pemberian ekstrak  biji  anggur  terhadap  peningkatan motilitas  spermatozoa  pada  tikus  yang  dipapar asap rokok lebih rendah daripada efek pemberian glutation.
Perbandingan  motilitas  spermatozoa  antar 2 (dua) kelompok yang tidak signifikan antara K (-)  dengan  P  I  dan  P  III  artinya  pemberian kombinasi ekstrak biji anggur dan glutation, atau
pemberian  glutation  saja  efektif  meningkatkan motilitas  spermatozoa  hingga  setara  dengan kondisi normal. Perbandingan motilitas spermatozoa  antara  P  I  dengan  P  III  yang  tidak signifikan (p> 0,05) artinya  efektifitas kombinasi ekstrak  biji  anggur  dan  glutation  atau  glutation saja dalam meningkatkan  motilitas spermatozoa pada  tikus  yang  dipapar  asap  rokok  adalah serupa.
Kelompok yang berpengaruh paling baik dalam  meningkatkan  motilitas  sperma  adalah kombinasi ekstrak biji anggur dan glutation (P I) dibandingkan dengan kelompok lainnya. Hal ini sesuai  dengan  penelitian  Kardi  (2015)  yang menyebutkan  bahwa  pemberian  glutathion  pada mencit  jantan  dewasa  yang  terpapar  asap  rokok dapat meningkatkan motilitas progresif spermatozoa (Kardi, 2015).Kombinasi P.I. dapat melindungi  spermatozoa  dari  kerusakan  oleh stres oksidatif dengan cara menetralkan hidroksil, superoksida dan radikal hidrogen peroksida dan mencegah  aglutinasi  spermatozoa.  Vitamin  C mampu  melindungi  lipid  sperma  yang  mudah teroksidasi  dari  reaksi  oksidasi  yang  akan menurunkan  motilitas  spermatozoa  sedangkan vitamin  E  dapat  menurunkan  kadar  MDA  pada spermatozoa  dan  dapat  meningkatkan  motilitas spermatozoa.  Glutation  dan  zink  mampu
melindungi  spermatozoa  dari  kerusakan  radikal bebas.  Kombinasi  ini  mampu  meningkatkan motilitas  spermatozoa  dan  berperan  dalam mengurangi  fragmentasi  DNA  spermatozoa (Costa, 2010).
Vitamin C, vitamin E yang ada di dalam ekstrak  biji  anggur (vitis  vinifera  l.) saling berhubungan. Vitamin E sendiri diubah menjadi radikal. Radikal ini segera beregenerasi menjadi vitamin  aktif  melalui  proses  biokimia  yang melibatkan  vitamin  C  dan  glutation.  Vitamin  E melindungi asam lemak tak jenuh pada membran fosfolipid.  Radikal  peroksil  bereaksi  1000  kali lebih  cepat  dengan  vitamin  E  dari  pada  dengan asam  lemak  tak  jenuh  dan  membentuk  radikal tokoferoksil. Radikal ini selanjutnya berinteraksi dengan  antioksidan  yang  lain  seperti  vitamin  C (Almatsier, 2010).
Vitamin  C  merupakan  antioksidan  yang berasal  dari  luar  tubuh  (eksogen)  yang  dapat langsung menetralkan radikal bebas yang berasal dari asap rokok dengan cara vitamin C merubah radikal  tokoferol  menjadi  tokoperol  dan  radikal vitamin  C,  kemudian  radikal  vitamin  C  akan dioksidasi  dengan  glutation  yang  menghasilkan vitamin  C  kembali  dan  glutation  teroksidasi (GSSG),  kemudian  enzim  glutation  reduktase akan  mereduksi  GSSG  menjadi  glutation
tereduksi (GSH). GSH adalah radikal yang sudah tidak  reaktif  lagi  (Robert  K.  Murray,  Daryl  K. Granner, 2014).

## SIMPULAN
Pemberian kombinasi ekstrak biji anggur dan  glutation  berefek  paling  baik  terhadap motilitas dan morfologi sperma, serta pemberian glutaion  secara  tunggal  berefek  paling  baik terhadap  jumlah  sperma  pada  tikus  putih  jantan galur wistar yang diberi paparan asap rokok.

## DAFTAR PUSTAKA
Almatsier.  2010. Prinsip  Dasar  Ilmu  Gizi . Gramedia Pustaka Utama. Jakarta
Harris MP, Williamson S, Fallon JF,  Meinhardt
H, and Prum RO. 2005. Molecular evidence for  an  activator-inhibitor  mechanism  in development of embryonic feather branching. Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A . 102(33). Pp: 11734-9. doi:
10.1073/pnas.0500781102.
Franken  DR  and  Oehninger  S.  Semen  analysis and sperm function testing. Asian J Androl.
2012;14(1):6-13. doi:10.1038/aja.2011.58
Jungwirth, A., Diemer, T., Dohle, G., Kopa, Z., Krausz, C., Tournaye, H. 2016. Guidelines on Male Infertility. Eur. Assoc. Urol. 46, 1–
24. https: //doi.org/10.1007/978-1-60761- 193-6
Kardi.  2016.  Pemberian  Glutation  pada  Mencit Jantan Dewasa yang Terpapar Asap Rokok dapat  Meningkatkan  Motilitas  Progresif Spermatozoa. Jurnal Sangkareang Mataram . Volume 2. Nomor 2. Pp: 23-8 Nugroho,  C.  A.  2009.  Pengaruh  Minuman Beralkohol  Terhadap  Jumlah  Lapisan  Sel Spermatogenik dan Berat Vesikula
Seminalis  Mencit . Widya  Warta  Jurnal
Ilmiah . Volume 33. Nomor 1.
Pramesemara, I. G. N. (2015). Pemberian Growth
Hormone Meningkatkan Jumlah Sel Spermatogenesis,  Sel  Leydig,  dan  Sel Sertoli  pada  Mencit  (Mus  Musculus)  Tua. Program Pascasarjana Universitas Udayana Denpasar . Promkes,  T.  2010. Masalah  Merokok  di Indonesia . http://www.promkes.depkes.go.id.
Robert K. Murray, Daryl K., and Granner, V. W. R.  2014. Biokimia  Harper .  Edisi  29.
EGC.Jakarta
Shi John, Yu Jianmei, P. J. 2003. Optimization of
the  Extraction  of  Polyphenols  from  Grape Seed  Meal  by  Aqueous  Ethanol  Solution. Food, Agriculture & Environment . 1(2). Pp: 42–7.
Tremallen, K. (2008). Oxidative Stress and Male Infertility – A Clinical Perspective. Human Reproduction Update .
WHO.  2010. WHO  Laboratory  Manual  for  the Examination  and  Processing  of  Human
Semen . 5 th edition. World Health Organization.
Winarsi.  2011. Antioksidan  alami  dan  radikal bebas . Edisi 7. Kanisius.