J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 32(2): 148-156 Th. 2021 ISSN: 1979-7788 Terakreditasi Ristekdikti: 51/E/KPT/2017
SIMPLEKS DAN MULTIPLEKS PRE-ENRICHMENT -PCR UNTUK DETEKSI
Salmonella Enteritidis DAN Typhimurium PADA KARKAS AYAM
[Simplex and Multiplex Pre-Enrichment –PCR for Salmonella Enteritidis and
Typhimurium Detection from Chicken Carcasses]
Siti Nurjanah 1,2) *, Winiati P. Rahayu 1,2) , Ratih Dewanti-Hariyadi 1,2) , Ni Gusti Ayu Made Widyatari Asthiti 1) , dan Rahadina Praba Melati 1)
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB University, Bogor
2) South East Asian Food and Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center, IPB University, Bogor
13 November 2020 / Disetujui 27 November 2021

## ABSTRACT
A  PCR  assay  has  been  developed  and  applied  to  detect  Salmonella  contamination  in  chicken carcasses.  However,  a  concentration  fewer  than  3  cells  per  gram  lead  to  false-negative  results  due  to difficulties  in  the  DNA  extraction.  The  objective  of  this  study  was  to  evaluate  of  the  influence  of  pre- enrichment on the sensitivity of simplex and multiplex PCR methods the detection of for Salmonella spp., S. Enteritidis  and  S.  Typhimurium  in  chicken  carcasses.  Artificial  contamination  was  done  using  very  low number of Salmonella Hadar, S. Enteritidis dan S. Typhimurium and pre-enrichment was carried out by 8 hours  incubation  in  non-selective  (BPW)  medium.  The  results  showed  that  simplex  PCR  could  detect Salmonella spp., S. Enteritidis and S. Typhimurium at initial numbers of  2.3, 0.9 and 2.3 MPN/mL of cells in  broth  medium,  respectively.  A  multiplex  PCR  could  detect  mixed  culture  of  the  three  Salmonella serovars  at  an  initial  number  of  0.73  MPN/mL  of  cells.  When  compared  to  non-enrichment  treatment, simplex pre-enrichment-PCR gave an increase in the percentage of positive results in chicken carcasses (n= 12), from 75 to 100% for Salmonella spp., from 8 to 58% for S. Typhimurium, and from 58 to 75% for S. Enteritidis.  Increasing  in  the  positive  percentage  was  also  occurred  at  multiplex  pre-enrichment-PCR, however  the  concentration  of  S.  Enteritidis  primer  was  not  optimum  for  detection.  Pre-enrichment  step significantly increases the sensitivity of PCR-based assay for detection Salmonella.
Keywords: chicken carcass, PCR, pre-enrichment, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium

## ABSTRAK
1
Metode  PCR  telah  dikembangkan  dan  diaplikasikan  untuk  mendeteksi  cemaran Salmonella  spp. pada karkas ayam. Cemaran Salmonella spp. dengan jumlah di bawah 3 sel per gram dapat menimbulkan kesalahan negatif analisis karena kesulitan mendapatkan ekstrak DNA.  Tujuan penelitian ini untuk melihat pengaruh perlakuan pre-enrichment pada sensitivitas metode analisis simpleks dan multipleks PCR untuk deteksi Salmonella spp., Salmonella Enteritidis  dan Salmonella Typhimurium  pada  karkas  ayam. Konfirmasi  limit  deteksi  dilakukan  dengan  kontaminasi  artifisial Salmonella Hadar, S. Enteritidis  dan S. Typhimurium  dengan  jumlah  yang  sangat  rendah  dan pre-enrichment dilakukan  pada  media  cair  non- selektif Buffered  Peptone  Water (BPW)  yang  diinkubasi  selama  8  jam.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  simpleks pre-enrichment -PCR  mampu  mendeteksi Salmonella spp., S .  Enteritidis  dan S . Typhimurium pada jumlah awal 2,3; 2,3; dan 0,9 MPN/mL. Multipleks dapat mendeteksi campuran bakteri tersebut  pada  jumlah  awal  0,73  MPN/mL.  Dibandingkan  dengan  tanpa enrichment, simpleks pre- enrichment -PCR memberikan peningkatan persentase hasil positif Salmonella spp., dari  75 menjadi 100%, positif S .  Typhimurium  dari  8  menjadi  58%,  dan  positif S .  Enteritidis  dari  58  menjadi  75%.  Peningkatan presentase hasil positif juga terjadi pada multipleks pre-enrichment- PCR, namun penggunaan konsentrasi primer S . Enteritidis belum mampu mendeteksi serovar tersebut secara optimal . Dapat disimpulkan bahwa penggunaan tahap pre-enrichment dapat meningkatkan sensitivitas metode PCR secara signifikan.
Kata kunci: karkas ayam, PCR, pre-enrichment , Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium
*Penulis Korespondensi: E-mail: sity_nr@apps.ipb.ac.id

## PENDAHULUAN
Karkas  ayam  merupakan  komoditi  daging dengan  tingkat  konsumsi  yang  tinggi  di  Indonesia. Berdasarkan  hasil  Survei  Konsumsi  Bahan  Pokok (VKBP)  tahun  2017  dan  Survei  Sosial  Ekonomi Nasional  (Susenas)  tahun  2019  yang  dilaksanakan BPS RI, konsumsi daging ayam ras adalah sebesar 12,79  kg/kapita/tahun  (Kementan,  2020),  dengan penggunaan  untuk  konsumsi  langsung,  HOREKA (hotel,  restoran,  kafe)  dan  industri.  Data  produksi yang  tercatat  di  BPS  tahun  2020  sebesar  3,3  juta ton.  Karkas  ayam  yang  dijual  di  Indonesia  belum lepas  dari  bahaya  bakteri Salmonella spp.  (Bakara et  al., 2014).  Penelitian  Safitri et  al. (2019) menunjukkan  sebanyak  32,14%  (9  dari  28  sampel) karkas  ayam  dari  pasar  tradisional  di  Pangkal Pinang  tercemar Salmonella spp. Salmonella spp. merupakan bakteri penyebab penyakit salmonellosis yang  merupakan foodborne  diarrheal  disease dan bersifat zoonosis. Sumber utama infeksi Salmonella spp.  berasal  dari  pangan  hewani  seperti  babi, unggas,  dan  hewan  ternak  (Eng et  al., 2015). Keberadaan Salmonella spp. dapat menjadi indikator  higienitas  pengolahan  ayam  potong  (Utari et  al., 2016).  Jenis Salmonella spp.  yang  paling banyak  menginfeksi  manusia  adalah  jenis S. Typhimurium  dan S. Enteritidis  dengan  prevalensi infeksi  sebesar  79%  dari  total  infeksi Salmonella di dunia (WHO, 2014).
Karakterisasi risiko Salmonella spp. mencemari daging ayam dapat dilakukan melalui deteksi keber- adaan Salmonella spp.  beserta  identifikasi  serotipe- nya  pada  karkas  ayam.  Karakterisasi  risiko  diguna- kan  untuk  membuat  skala  prioritas  berdasarkan jenis  risiko  dari  serotipe Salmonella .  Serotipe  yang berbeda  dapat  menimbulkan  gejala  yang  berbeda, sebagai contoh S . Typhimurium yang dapat menun- jukkan gejala penyakit baik pada manusia dan ayam sedangkan S .  Enteritidis  hanya menunjukkan gejala penyakit pada manusia dan tidak menunjukkan geja- la pada ayam (Crump dan Wain, 2017). Keberadaan asymptomatic  carrier tersebut  dapat  mempersulit kontrol  dalam  pencegahan  infeksi  (Maciel et  al., 2011). Kuantifikasi  selanjutnya  dapat  dilakukan  ter- hadap  risiko  tersebut  sehingga  tindakan  pence- gahan  dapat  dapat  dilakukan  lebih  efektif.  Oleh karena  itu,  karakterisasi  risiko  membutuhkan  meto- de  deteksi  cepat  dan  spesifik  seperti  PCR  ( polyme- rase  chain  reaction ).  Metode PCR  menggunakan prinsip  penggandaan  DNA  secara in  vitro sehingga ketika  divisualisasi  dengan  gel  elektroforesis  dapat terlihat pita dari DNA tersebut (kualitatif) yang dapat dibedakan  berdasarkan  mobilitas  fragmen  DNA (Radji et  al., 2010;  Triyani et  al., 2016).  Primer spesifik  untuk S .  Typhimurium  digunakan  adalah STM4497  yang  merupakan  bagian  dari  gen  pe- nyandi  fimbrial  yang  diduga  kuat  merupakan  gen
protein pada sitoplasma S. Typhimurium (Tortajada- Genaro et  al., 2015).  Sistem  multipleks  digunakan untuk  mendeteksi  beberapa  strain  sekaligus  dalam satu  kali  reaksi  PCR,  sehingga  dapat  diketahui serotipe Salmonella dengan cepat.
Deteksi Salmonella spp.  menggunakan  PCR pada  sampel  bahan  pangan  memerlukan  adanya tahapan enrichment karena pada umumnya protokol PCR  memerlukan  konsentrasi  mikroorganisme  tar- get  yang  sangat  tinggi  yang  biasanya  diperoleh hanya  setelah  pengayaan  sampel  (Myint et  al., 2006).  Metode  deteksi  menggunakan  PCR  pada Salmonella spp.  yang  dilakukan  tanpa pre-enrich- ment membutuhkan  konsentrasi  mikroorganisme awal  yang  tinggi  agar  dapat  terdeteksi  yaitu  10 4 - 10 5 sehingga dapat menimbulkan kesalahan analisis negatif  (Afendy  dan  Son,  2012;  Saeki et  al., 2012; Yosua,  2018). Salmonella tidak  dapat  berkompetisi dengan  baik  terhadap  bakteri-bakteri  perusak  yang mengontaminasi  pangan,  oleh  karena  itu  berdasar- kan ISO 6579 (2017) tahap enrichment dalam media non-spesifik Buffered  Peptone  Water (BPW)  atau disebut juga tahap pre-enrichment dibutuhkan untuk membantu  memperbaiki  sel  bakteri  yang  rusak, melarutkan  zat  penghambat  atau  zat toksik  lainnya, dan juga menyediakan kecukupan nutrisi khususnya bagi Salmonella . BPW mengandung pepton sebagai sumber nutrisi berupa nitrogen, karbon, vitamin, dan mineral  serta  NaCl  untuk  mempertahankan  keseim- bangan osmotik dan fosfat sebagai buffer (Taskila et al., 2012). Deteksi dengan  kuantifikasi dapat dilaku- kan dengan menggunakan quantitatif PCR atau real- time PCR (Nurjanah et al., 2018).
Kemampuan  deteksi  adalah  parameter  penting untuk  metode  deteksi  bakteri  secara  kualitatif  dan akan  meningkat  dengan  memberikan  kesempatan sel  memperbanyak  diri  pada  perlakuan  prapenga- yaan  atau pre-enrichment. Dalam  penelitian  ini  ke- mampuan  deteksi  ditentukan  dengan  pengujian sejumlah  sampel  dan  dinyatakan  dengan  persen- tase  positif  terhadap  jumlah  sampel  total.  Tujuan penelitian  ini  untuk  mengukur  peningkatan  kemam- puan  deteksi  PCR  terhadap Salmonella Enteritidis dan Salmonella Typhimurium  secara  simpleks  dan multipleks dengan perlakuan pre-enrichment .

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan dalam penelitian ini adalah karkas ayam ras (dalam kondisi segar)  yang diperoleh dari pasar swalayan  dan  pasar  tradisional  di  daerah  Bogor  di- gunakan  untuk  tahapan  evaluasi  sensitivitas  dan sampel  analisis  untuk  tahapan  aplikasi  metode deteksi. Bakteri utama yang digunakan untuk penen- tuan  limit  deteksi  antara  lain Salmonella enterica subspesies  Hadar  (BCC  B2908)  dari  Balai  Besar
Penelitian  Veteriner  (Bbalitvet)  yang  mewakili  jenis Salmonella spp.  selain S. Typhimurium  dan S. Enteritica, S. Typhimurium  (ATCC  14028)  dari Laboratorium  Mikrobiologi  SEAFAST  Center,  IPB Bogor,  dan S. Enteritidis  (ATCC  13076)  dari  Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) yang berupa stock freeze .

## Persiapan kultur
Kultur  murni Salmonella yang  telah  diinkubasi selama  18  jam  dan  dikonfirmasi  jumlah  mikroba awalnya.  Jumlah  yang  ditambahkan  adalah  seba- nyak  1  mL  untuk  metode  simpleks  dan  total  1  mL untuk  metode  multipleks  dari  masing-masing  sero- var  pengenceran  10 -9 dan  10 -10 yang  jumlahnya  di- konfirmasi  dengan  metode  MPN  3  tabung.   Jumlah awal setelah dikonfirmasi ke dalam Tabel Most Pro- bable  Number (MPN)  mencapai  0,9-2,3  MPN/mL. Semua  sampel  kemudian  ditambahkan  media  BPW (Oxoid) sebanyak 225 mL.
Evaluasi sensitivitas deteksi teknik pre- enrichment (Myint et al., 2006)
Evaluasi  sensitivitas  deteksi  dilakukan  dengan: 1) melakukan kontaminasi artifisial, 2) inkubasi sela- ma 8 jam pada 35°C, dan 3) ekstraksi DNA dari 225 mL  larutan  BPW  pada  sampel  daging  ayam  ter- kontaminasi  artifisial  yang  telah.  Waktu  inkubasi  8 jam  mengacu  pada  penelitian  Myint et  al .  (2006), tidak dilakukan optimasi penggunaan waktu inkubasi. Kontaminasi  artifisial  kultur Salmonella dilakukan dengan  merujuk  pada  Myint et  al. (2006),  yaitu  de- ngan  menggunakan  25  g  sampel  daging  ayam, kemudian didekontaminasi dengan cara dimasukkan ke  dalam  plastik  steril  dan  dicelupkan  ke  dalam  air mendidih  selama  30  detik  dan  segera  didinginkan pada  air  es.  Daging  ayam  yang  telah  didekontami- nasi sederhana tersebut dilumuri (di- spike ) dengan 1 mL  kultur  yang  telah  disiapkan  (konsentrasi  0,9-2,3 MPN/mL),  sehingga  diperkirakan  cemaran  0,9-2,3 MPN/25 g.
Ekstraksi  DNA  (Reyes-Escogido et  al., 2010; Nurjanah et al., 2017) DNA diekstraksi menggunakan metode Chelex- 100  dengan  modifikasi  pada  waktu  pemanasan. Larutan  BPW  pada  sampel  kemudian  dimasukkan ke  dalam  tabung  sentrifus  50  mL  dan  disentrifugasi (kecepatan  805  xg,  suhu  4°C,  selama  15  menit). Supernatan  yang  ada  sebagian  dibuang  dan  se- banyak  2  mL  sel  bakteri  yang  mengendap  (pelet) dipindahkan  ke  tabung microcentrifuge 2  mL  dan disentrifugasi kembali menggunakan microcentrifuge (Hettich  Mikro  22R , DJB  LabCare,  UK)    (kecepatan 6000  xg,  suhu  4 o C,  selama  5  menit).  Supernatan kembali  dibuang  dan  pelet  diresuspensi  dengan 1000  μL  TE buffer (10  mM  TRIS-base  (Sigma- Aldrich)  pH  7,5;  1  mM  EDTA  pH  8,0),  lalu  divortex
hingga  homogen.  Campuran  tersebut  kemudian disentrifugasi (kecepatan  8000  rpm,  suhu  4°C, selama 5 menit). Pelet yang dihasilkan di-resuspensi dengan  100  μL  TES buffer lisis  (10  mM  TRIS-base (Sigma-Aldrich)    pH  7,5;  1  mM  EDTA  pH  8,0;  0.5% SDS),  lalu  diinkubasi  pada  suhu  65°C  selama  5 menit.  Kemudian  ditambahkan  dengan  segera  150 μg  proteinase-K  dan  20  μL  RNAse.  Setelah  itu, campuran  diinkubasi  pada  suhu  65°C  selama  5 menit  kemudian  pada  suhu  ruang  selama  2  menit. Selanjutnya  campuran  ditambahkan  150  μL  cam- puran  25  mg  Chelex-100  dalam buffer TE.  Cam- puran  diinkubasi  kembali  (suhu  65°C,  selama  5 menit),  kemudian  disentrifugasi  (kecepatan  10.000 rpm,  suhu  4°C,  selama  5  menit).  Lapisan  bagian atas  diambil  secara  perlahan  dengan  mengukur volumenya untuk dipresipitasi dengan sodium asetat 3M sebanyak 0,1 x volume  yang diambil dan etanol 95% sebanyak 2,5 x volume yang diambil, kemudian campuran  diinkubasi  pada  suhu  -20°C  selama  20 jam.  Setelah  itu,  DNA  disentrifugasi  (kecepatan 10.000 rpm, suhu 4°C, selama 10 menit). Pelet yang dihasilkan  ditambahkan  500-100 0  μL  etanol  70%, lalu  disentrifugasi  kembali  (kecepatan  10.000  rpm, suhu  4°C,  selama  10  menit).  Supernatan  dibuang dan  pelet  yang  dihasilkan  dikeringkan  pada  suhu ruang,  lalu  dilarutkan  dalam  50- 100  μL Nuclease Free  Water (NFW) (Promega  no.  katalog  P1195). Campuran  disimpan  sebagai  DNA template pada suhu -20°C sampai digunakan untuk analisis dengan PCR.

## Simpleks dan multipleks PCR
Simpleks  dengan  primer  InvA  (Soumet et  al. , 1999),  prot6E  (Hadjinicolaou et  al., 2009)  dan STM4497  (Park et  al., 2009)  masing-masing  pada PCR  terpisah Salmonella Hadar, Salmonella Enteri- tidis  dan Salmonella Typhimurium  seperti  tertera dalam  Tabel  1,  dan  multipleks  dilakukan  dengan campuran  tiga  primer  pada  satu  tabung  PCR,  de- ngan  konsentrasi  yang  berbeda  (Tabel  1).  Kondisi running  PCR  (Applied  Biosystems  GeneAmp  9700 PCR  System,  USA)  adalah  pra-denaturasi  pada suhu  95°C  selama  3  menit,  denaturasi- annealing - ekstensi  selama  30  siklus  dengan  suhu  dan  waktu yang  tertera  pada  Tabel  1,  dan  diakhiri  dengan ekstensi  akhir  pada  suhu  72°C  selama  5  menit, dengan  menggunakan  PCR  GoTaq  Green  Master Mix (Geneaid) yang terdiri dari Taq DNA polimerase, MgCl2,  dan  dNTP  (masing-masing  dATP,  dCTP, dGTP, dan dTTP), Nuclease Free Water (NFW).
Aplikasi  metode  untuk  analisis  sampel  karkas ayam ras (Myint et al., 2006) Deteksi  cemaran Salmonella spp.  dilakukan pada karkas ayam ras yang diperoleh dari swalayan dan  pasar  tradisional,  dengan  jumlah  sampel  sim- pleks (n= 12) dan multipleks (n= 9).
Tabel 1. Kondisi running PCR pada metode simpleks dan multipleks
Simpleks PCR 1 Multipleks PCR 2 Salmonella spp. S. Enteritidis S. Typhimurium Salmonella spp. S. Enteritidis S. Typhimurium Suhu denaturasi (°C) 95 95 95 95 Ta (°C) 58 52 1 52 1 52 2 Suhu ekstensi (°C) 72 72 72 72 Target gen InvA Prot6E STM4497 InvA Prot6E STM4497 Primer ST11-f ST15-r 438-f 572-r STM4497M2-f STM4497M2-r ST11-f ST15-r 438-f 572-r STM4497M2-f STM4497M2-r Ukuran (bp) 429 135 311 492 135 311 Konsentrasi primer (µM) 0,500 0,400 0,400 0,120 Keterangan: 1 = Yosua (2018); 2 = Asthiti (2019)
Karkas ayam utuh dimasukkan ke dalam plastik steril,  direndam  dengan  450  mL  BPW,  dan  didiam- kan  selama  3-5  menit.  Seluruh  BPW  kemudian  di- masukkan  ke  dalam  tabung centrifuge 50  mL. Sebanyak 225 mL BPW dalam tabung centrifuge 50 mL  diinkubasi  pada  35°C  selama  8  jam  sebagai perlakuan  dengan pre-enrichment ,  sementara  225 mL  BPW  lainnya  langsung  dilakukan  ekstraksi  DNA dengan langkah awal disentrifugasi (kecepatan 3000 rpm,  suhu  4°C,  selama  15  menit).  Selanjutnya,  se- bagian  supernatan  hasil  sentrifugasi  dibuang  dan disisakan  0,5-1,0  mL,  lalu  dipindahkan  dan  diga- bungkan  dengan  hasil  sentrifugasi  dari  tabung  lain ke  dalam  tabung microcentrifuge 2  mL.  Ekstraksi DNA  dilakukan  terhadap  larutan  dengan  metode Chelex-100,  lalu  hasil  ekstraksi  DNA  dianalisis  de- ngan  PCR  (Applied  Biosystem),  Produk  PCR  divi- sualisasi dengan  elektroforesis gel (Bio-Rad) meng- gunakan  agarosa  2%  dan  pita  DNA  divisualisasi melalui Geldoc (Bio-Rad).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Sensitivitas metode simpleks
Karkas  ayam  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  mungkin  mengandung Salmonella, sehingga dalam  mengevaluasi  sensitivitas  metode  dalam mendeteksi Salmonella perlu  dihilangkan  mikroba tersebut.  Adanya  mikroba indigenous pada  permu- kaan  sampel  ayam  dapat  mengganggu  cemaran artifisial  yang  diinokulasikan  secara  sengaja  se- hingga  dapat  mengganggu  proses recovery dalam media enrichment (Matias et al., 2010). Berdasarkan hal  tersebut,  pada  pengujian  dengan  menggunakan kontaminasi  artifisial  perlu  dilakukan  tahap  dekon- taminasi  dan  dievaluasi  efektivitasnya.  Proses  de- kontaminasi yang dilakukan terhadap sampel karkas ayam  dengan  pemberian  air  mendidih  (100°C) selama  30  detik  dilanjutkan cold  shock pada  air  es telah  efektif  menghilangkan  bakteri indigenous dari karkas ayam (Data tidak ditampilkan).
Primer  telah  diuji  spesifisitasnya  pada  pene- litian  sebelumnya  dengan  melakukan  analisis  ter- hadap  sekuen  parsial  gen  yang  dihasilkan  dan  di-
konfirmasi  dengan  sekuen  referens  pada GenBank (Wulan et  al., 2021).  Primer  tersebut  telah  merujuk dengan  tepat  pada  serovar Salmonella target, sehingga  dalam  penelitian  ini  tidak  lagi  dikonfirmasi dengan uji serologi.
Konsentrasi Salmonella spp., S. Enteritidis dan S. Typhimurium dipersiapkan serendah mungkin de- ngan  melakukan  pengenceran  (sepersepuluh)  se- cara  bertahap  sampai  9  dan  10  kali  pengenceran. Perhitungan  dengan  metode  MPN  3  seri  tabung  di- lakukan  agar  mampu  mendeteksi  jumlah  yang  ren- dah  dan  konversi  dalam  Tabel  MPN  menunjukkan jumlah  awal Salmonella spp.  dan S. Enteritidis dengan  jumlah  2,3  MPN/mL  dan S. Typhimurium dengan jumlah 0,9 MPN/mL, yang kemudian di spike ke  dalam  25  g  daging  ayam.  Setelah  dilakukan simpleks  PCR,  ketiga  serovar Salmonella dengan konsentrasi tersebut menunjukkan pita elektroforesis dengan  amplikon  yang  sesuai  gen  target  masing- masing,  yaitu  429  bp  ( Salmonella Hadar,  yang mewakili  genus Salmonella  spp. ),  135  bp  ( S. Enteritidis) dan 311 bp ( S. Typhimurium) (Gambar 1). Pita  spesifik  yang  baik  yaitu  terlihat  tebal,  ukuran yang  sesuai  target,  tidak  ada  pembentukan  primer dimer dan tidak smear (Maksum et al., 2018). Tahap pre-enrichment di media BPW selama 8 jam  pada  suhu  35°C  efektif  untuk  mendeteksi cemaran Salmonella spp.  pada  jumlah  yang  sangat rendah melalui metode simpleks PCR, dibandingkan dengan  penelitian  Yosua  (2018)  yang  mampu men- deteksi pada limit 10 3 CFU/g. Hasil tersebut senada dengan  penelitian  yang  dilakukan  Krämer et  al. (2011)  yang  menunjukan  limit  deteksi Salmonella spp.  1,4  CFU/10  g  menggunakan  metode  PCR  de- ngan tahap pre-enrichment 8 jam.

## Sensitivitas metode multipleks
Senada dengan hasil simpleks pre-enrichment- PCR,  multipleks pre-enrichment- PCR  juga  menun- jukkan    sensitivitas  yang  tinggi  atau  mampu  men- deteksi  campuran  ketiga  serovar  dengan  jumlah sangat  rendah.  Hasil  perhitungan  MPN  yang  dila- kukan  untuk  konfirmasi  jumlah  bakteri  dari  cam- puran  3  serovar  kultur Salmonella dan  di spike ke dalam  25  g  karkas  ayam  (sekitar  0,73  MPN/25  g)
1  2 6 7 8  9 3  4  5
10 11  12 13  14 429 bp
311 bp
135 bp
yang menunjukkan jumlah sel awal yang sangat ren- dah. Setelah  dilakukan  multipleks  PCR,  hasil  elek- troforesis  pada line yang  sama  menunjukkan  kom- binasi  ukuran  pita  yang  sesuai  gen  target  masing- masing,  yaitu  429  bp  ( Salmonella Hadar,  yang  me- wakili genus Salmonella spp. ), 135 bp ( S. Enteritidis) dan 311 bp ( S. Typhimurium) (Gambar 2).  Tahapan pre-enrichment selama  8  jam  menunjukkan  hasil
positif atau dapat terdeteksi pada ketiga jenis target gen  (Gambar  2).  Oleh  karena  itu,  pada  sampel daging  ayam  yang  diduga  memiliki  cemaran  dalam jumlah sangat rendah, tahapan pre-enrichment pada suhu  35°C  selama  8  jam  sebelum  deteksi  menggu- nakan  multipleks  PCR  harus  dilakukan  terlebih dahulu.
Keterangan: line 1,6= ladder 1200 bp; 2-5= primer InvA, bakteri S . Hadar, perkiraan konsentrasi bakteri  (10 9 CFU/25 g, tanpa  bakteri,  10  CFU/25  g,  1  CFU/25  g);  7-10=  primer  STM4497,  bakteri S. Typhimurium,  perkiraan  konsentrasi bakteri   (10 9 CFU/25  g,  tanpa  bakteri,  10  CFU/25  g,  1  CFU/25  g);  11-14=  primer  Prot6E,  bakteri S .  Enteritidis, perkiraan konsentrasi bakteri  (10 9 CFU/25 g, tanpa bakteri, 10 CFU/25 g, 1 CFU/25 g)
Gambar 1.   Visualisasi  DNA  menggunakan  gel  elektroforesis  hasil  uji  evaluasi  sensitivitas  deteksi Salmonella spp. dengan metode simpleks PCR
Keterangan:  line  1  DNA  ladder;  2-5  sampel  dengan  kontaminasi  artifisial  perkiraan  konsentrasi  bakteri   1  CFU/25  g dengan ulangan; 6-8 sampel tanpa kontaminasi artifisial
Gambar 2.   Hasil amplifikasi multipleks PCR pada daging ayam yang dikontaminasi artifisial dengan jumlah total Salmonella sangat rendah
3000 bp 429 bp (invA) 311 bp (STM4497) 135 bp (prot6E) 1 2 6 7 8 3 4 5 100 bp
100% 58% 75% 75% 8% 58% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% Salmonella spp. Salmonella Typhimurium Salmonella Enteritidis
Persentase Sampel Positif, n=12
Tanpa pre-enrichment
Pre-enrichment 8 jam
Metode multipleks PCR dapat dipengaruhi oleh beberapa parameter selama analisis termasuk kom- binasi primer spesifik dari serovar yang ingin diiden- tifikasi  secara  bersamaan,  diperlukan  desain  primer dengan  karakteritik  kondisi running yang  mendekati kondisi primer lainnya yang sudah diketahui (Chiang et  al .,  2018).  Protokol  multipleks  harus  dioptimasi untuk  setiap  kombinasi  gen  target,  belum  ada  pro- tokol baku dalam prinsip kerja PCR yang dapat digu- nakan  untuk  setiap  kondisi  terutama  dalam  metode multipleks  PCR  (Liu et  al., 2012).  Kombinasi  kon- sentrasi  primer  yang  digunakan  untuk  target  gen invA  sebesar  0,400  µM,  Prot6E  sebesar  0,400  µM dan  STM4497  sebesar  0,120  µM  telah  diuji  sebe- lumnya  dengan  menggunakan template DNA  yang berasal  dari  kultur  murni Salmonella serovar  dan menghasilkan 3 pita yang spesifik.
Peningkatan presentase hasil positif metode pre - enrichment untuk  deteksi Salmonella spp.  pada karkas ayam
Karkas  ayam  ras  digunakan  sebagai  sampel dalam  penelitian  ini,  karena  jumlah  produksi  dan konsumsi  yang  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan ayam  kampung.  Kontaminasi Salmonella spp.  pada karkas  ayam  ras  dapat  terjadi  akibat  adanya  kon- taminasi  oleh  mikroorganisme  sebelum  ayam  dipo- tong  (pencemaran  primer)  dan  sesudah  ayam  di- potong (pencemaran sekunder) (Aerita et al., 2014). Penyembelihan  ayam  dianggap  sebagai  sumber utama  kontaminasi Salmonella spp.  pada  karkas dan  kondisi  penanganan  yang  tidak  terkontrol  de-
ngan  baik  terutama  saat  karkas  ayam  dijual  dapat menyebabkan meningkatnya jumlah Salmonella spp. yang  telah  ada  sebelumnya  (Hoelzer,  2011;  El- Sharkawy et al., 2017). Penggunaan metode PCR dengan pre- enrichment dibandingkan  dengan  tanpa enrichment dilakukan  untuk  menganalisis  sampel  karkas  ayam yang  sama.  Kedua  metode  ini  menunjukkan  hasil persentase  positif  cemaran Salmonella spp.  yang berbeda  (Gambar  3).  Dibandingkan  dengan  tanpa enrichment, simpleks pre-enrichment -PCR memberi- kan  peningkatan  persentase  hasil  positif.  Secara rinci,  uji  coba  metode  simpleks  pada  karkas  ayam (n=  12)  tanpa enrichment dan  penggunaan pre- enrichment masing-masing memberikan  hasil  positif Salmonella spp.,  9  (75%)  dan  12  (100%),  positif S . Typhimurium  1  (8%)  dan  7  (58%),  dan  positif S . Enteritidis 7 (58%) dan 9 (75%) (Gambar 3). Pening- katan  persentase  positif  juga  terjadi  pada  hasil multipleks pre-enrichment -PCR.  Uji  coba  metode multipleks  pada  karkas  ayam  (n=9)  tanpa enrich- ment dan  penggunaan pre-enrichment masing- masing  memberikan  hasil  positif Salmonella spp.,  7 (77%)  dan    9  (100%)  dan  positif S .  Typhimurium  1 (11%)  dan  5  (56%).  Namun  kondisi  multipleks  yang diaplikasikan  di  dalam  sampel  dengan  kontaminan alami  belum  menunjukkan  kemampuan  mendeteksi S .  Enteritidis  secara  optimum,  diduga  karena  kon- sentrasi S .  Enteritidis  di  dalam  sampel  tersebut  ter- lalu  rendah,  sehingga  primer  sulit  mencapai  target- nya.
Gambar 3.   Perbandingan  hasil  positif  dengan pre-enrichment 8  jam  dan  tanpa pre-enrichment simpleks PCR deteksi kontaminasi Salmonella spp., S. Typhimurium, dan S . Enteritidis pada karkas ayam
Enteritidis Salmonella Typhimurium Salmonella spp. Tanpa 8 jam
Secara umum, penggunaan tahap pre- enrichment dapat  mengurangi  false  negatif  baik pada  simpleks  maupun  menggunakan  multipleks. Penggunaan  multipleks  PCR  memberi  keuntungan cepatnya  hasil  deteksi  serovar  yang  berbeda  di- antara  campuran  kontaminan Salmonella ,  tetapi memberikan  persentase  hasil  yang  lebih  rendah dibandingkan  dengan  simpleks  PCR.  Berdasarkan penelitian  Gandra et  al .  (2016),  metode  multipleks PCR  menurunkan  sensitivitas  deteksi  dibandingkan dengan  metode  simpleks  PCR,  karena  pada  multi- pleks PCR dapat terjadi kompetisi amplifikasi antara satu target gen dengan target gen lainnya sehingga amplifikasi tidak dapat berjalan dengan baik.
Pengujian  menggunakan  metode  multipleks PCR dengan tahap pre-enrichment dapat membantu mendeteksi Salmonella spp., S . Typhimurium dan S . Enteritidis  dalam  jumlah  awal  yang  sangat  rendah. Efektifitas  metode enrichment dapat  ditingkatkan dengan menggunakan medium yang dapat mengeli- minasi  bakteri  Gram  negatif  lainnya  yang  masih dapat  tumbuh  pada  media  BPW.  Keberadaan bakteri  Gram  negatif  lainnya  dapat  memengaruhi reaksi  PCR  dan  visualisasi  pada  gel  elektroforesis, salah  satunya  dalam  membentuk background pita atau smear (Tran et  al., 2013).  Kombinasi  media dalam  tahap enrichment juga  direkomendasikan untuk  memastikan  isolasi  berbagai  jenis  strain  dari sampel  dengan  matriks  yang  kompleks  (Gorsk, 2012).

## KESIMPULAN
Salmonella spp.  dengan  jumlah  rendah  (<3 CFU/25  g)  yang  diberi  perlakuan pre-enrichment dalam  media  BPW  selama  8  jam  mampu  dideteksi dengan metode PCR. Tahap pre-enrichment penting dilakukan  dalam  upaya   mengurangi  kesalahan  ne- gatif.  Aplikasi  metode  PCR  dengan  penambahan tahap pre-enrichment menunjukkan  peningkatan hasil  positif  kontaminasi Salmonella spp..  Diban- dingkan  dengan  tanpa enrichment, simpleks pre- enrichment -PCR  memberikan  peningkatan  persen- tase  hasil  positif Salmonella spp.,  dari    75  menjadi 100%,  positif S .  Typhimurium  dari  8  menjadi  58%, dan positif S . Enteritidis dari 58 menjadi 75%. Pada multipleks  PCR,  penggunaan pre-enrichment mem- berikan  peningkatan  hasil  positif Salmonella spp., dari  77  menjadi  100%  dan  hasil  positif S .  Typhimu- rium dari 11 menjadi 56%. Namun kondisi multipleks yang  dilakukan  dalam  penelitian  ini  belum  optimum untuk  mendeteksi S .  Enteritidis  ketika  diaplikasikan ke dalam sampel karkas ayam.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Tim Peneliti mengucapkan terima kasih kepada Kementerian Riset, Teknologi, dan Pendidikan Tinggi Republik  Indonesia  atas  pembiayaan  penelitian dalam  skema  hibah  Penelitian  Dasar  Unggulan Perguruan Tinggi (PDUPT) tahun 2019.

## DAFTAR PUSTAKA
Aerita  AN,  Pawenang  ET,  Mardiana.  2014.  Hubu- ngan  higiene  pedagang  dan  sanitasi  dengan kontaminasi Salmonella pada  daging  ayam potong. Unnes J Public Health 3: 9-16.
Afendy ATM, Son R. 2015. Pre-enrichment effect on PCR detection of Salmonella Enteritidis in artifi- cally-contaminated  raw  chicken  meat.  Int  Food Res J 22: 2571-2576.
Asthiti  NGAM.  2019.  Peningkatan  Sensitivitas  De- teksi  Cemaran Salmonella spp., S. Typhimu- rium, dan S. Enteritidis menggunakan Multiplex PCR  dengan  Tahap  Pre-enrichment . [skripsi]. Bogor:  Fakultas  Teknologi  Pertanian,  Institut Pertanian Bogor.
Bakara  VFS,  Tafsin  M,  Hasnudi.  2014.  Analisis bakteri Salmonella spp.  pada  daging  ayam  po- tong  yang  dipasarkan  pada  pasar  tradisional dan  pasar  modern  di  Kota  Medan.  J  Peter- nakan  Integratif  3:  71-83.  DOI:  10.32734/jpi. v3i1.2746.
Chiang  Y-C,  Wang  H-H,  Ramireddy  L,  Chen  H-Y, Shih, C-M, Lin C-K, Tsen H-Y. 2018. Designing a  biochip  following  multiplex  polymerase  chain reaction  for  the  detection  of Salmonella sero- vars  Typhimurium,  Enteritidis,  Infantis,  Hadar, and  Virchow  in  poultry  products.  J  Food  Drug Anal  26:  58-66.  DOI: 10.1016/j.jfda.2016.11.0 19.
Crump  JA,  Wain  J.  2017. Salmonella .  International Encyclopedia of Public Health 2: 425-433. DOI: 10.1016/B978-0-12-803678-5.00394-5.
El-Sharkawy  H,  Tahoun  A,  El-Gohary  AEGA,  El- Abasy  M,  El-Khayat  F,  Gillespie  T,  Kitade  Y, Hafez  HM,  Neubar  H,  El-Adawy  H.  2017.  Epi- demiological,  molecular  characterization  and antibiotic  resistance  of Salmonella  enterica serovars  isolated  from  chicken  farms  in  Egypt. Gut Pathog  9: 1-12. DOI:  10.1186/s13099-017- 0157-1.
Eng  S-K,  Pusparajah  P,  Ab-Mutalib  N-S,  Ser  H-L, Chan K-G, Lee L-H. 2015. Salmonella : a review on  pathogenesis,  epidemiology  and  antibiotic resistance. Front Life Sci 8: 284-293. DOI: 10.1 080/21553769.2015.1051243.
Gandra  EA,  Fernandez  MA,  Silva  JA,  da  Silva WP. 2016.  Detection  by  multiplex  PCR  of Staphylo- coccus aureus , S. intermedius and S. hyicus in artificially  contaminated  milk.  Ciênc  Rural  46: 1418-1423.  DOI:  10.1590/0103-8478cr201513 91.
Gorski L. 2012. Selective enrichment media bias the types  of Salmonella enterica strains  isolated from mixed strain cultures  and complex enrich- ment  broths.  PLoS  ONE  7:  1-8. DOI: 10.1371/ journal.pone.0034722.
Hadjinicolaou A, Dmetriou VL, Emmanuel MA, Kako- yiannis  CK,  Kostrikis  LG.  2009.  Molecular beacon-based  real-time  PCR  detection  of  pri- mary  isolates  of Salmonella Typhimurium  and Salmonella Enteritidis  in  environmental  and  cli- nical samples. BMC Microbiol 9: 1-14. DOI: 10. 1186/1471-2180-9-97.
Hoelzer  K,  Switt  AIM,  Wiedmann  M.  2011.  Animal contact  as  a  source  of  human  non-typhoidal salmonellosis. Vet Res 42: 1-28. DOI: 10.1186/1297-9716-42-34.
[ISO] International Organization for Standardization. 2017. ISO 6579:1 Detection of Salmonella spp.. Switzerland (CH): ISO.
[Kementan  RI]  Kementerian  Pertanian  Republik Indonesia.  2020.  Statistik  Peternakan  dan Kesehatan  Hewan  2020.  Direktorat  Jenderal Peternakan dan Kesehatan Hewan, Jakarta.
Krämer N,  Löfström C,  Vigre H, Hoorfar J, Bunge C, Malorny  B.  2011.  A  novel  strategy  to  obtain quantitative  data  for  modelling:  Combined  en- richment and real-time PCR for enumeration of salmonellae  from  pig  carcasses.  Int  J  Food Microbiol 145: 86-96. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro. 2010.08.026.
Liu B, Zhou X, Zhang L, Liu W, Dan X, Shi C, Shi X. 2012.  Development  of  a  novel  multiplex  PCR assay  for  the  identification  of Salmonella enterica Typhimurium  and  Enteritidis.  Food Control  27:  87-93.  DOI:  10.1016/j.foodcont.201 2.01.062.
Maciel  BM,  Dias  JCT,  Romano  CC,  Sriranganathan N, Brendel M, Rezende RP. 2011. Detection of Salmonella Enteritidis  in  asymptomatic  carrier animals:  comparison  of  quantitative  real-time PCR and becteriological cultue methods. Genet Mol Res 10: 2578-2588.
Maksum  IP,  Suhaili,  Amalia  R,  Kamara  DS,  Rach- man  SD,  Rachman  RW.  2018.  PCR  Multiplex untuk  identifikasi Mycobacterium  tuberculosis resisten terhadap isoniazid dan rifampisin pada galur  lokal  balai  laboratorium  kesehatan Provinsi  Jawa  Barat.  J  Kimia Valensi  4:  107- 118. DOI: 10.15408/jkv.v4i2.7226.
Matias BG, Pinto PSA, Cossi MVC, Silva JA, Vanetti MCD,  Nero  LA.  2010.  Evaluation  of  a  PCR protocol for the detection of Salmonella species directly  from  superficial  samples  of  chicken carcasses  and  pre-enrichment  broth.  Poultry Sci  89:  1524-1529.  DOI:  10.3382/ps.2009-003 68.
Myint  MS,  Johnson  YJ,  Tablante  NL,  Heckert  RA. 2006.  The  effect  of  pre-enrichment  protocol  on the  sensitivity  and  specificity  of  PCR  for  detec- tion of naturally contaminated Salmonella in raw poultry compared to conventional culture.  Food Microbiol  23:  599-604.  DOI:  10.1016/j.fm.2005. 09.002
Nurjanah  S,  Rahayu  WP,  Komalasari  E.  2017. Sensitivity  of multiplex real-time PCR assay for detection  of  pathogenic E.  coli on  ice  sample. November  14-17  2017.  Ho  Chi  Minh  City, Vietnam. Ho Chi Minh City (VI): Proceedings of the  15th  ASEAN  Conference  on  Food  Science and Technology.
Nurjanah  S,  Rahayu  WP.  Mutaqin  LA.  2018. Detection  method  for Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis  using  real-time polymerase chain reaction. Int J Eng Technol 7: 302-306. DOI: 10.14419/ijet.v7i4.14.27661.
Park SH, Kim HJ, Cho WH, Kim JH, Oh MH, Kim SH,
Lee BK, Ricke SC, Kim HY. 2009. Identification of Salmonella enterica subspecies I, Salmonella enterica  serovars  Typhimurium,  Enteritidis  and Typhi  using multiplex PCR.  FEMS  Microbiol Lett  30:  137-146.  DOI:  10.1111/j.1574-6968.20 09.01809.x.
Radji M, Puspaningrum A, Sumiati A. 2010. Deteksi cepat bakteri Escherichia coli dalam sampel air dengan  metode  polymerase  chain  reaction menggunakan primer 16e1 dan 16e2. Makara J Sci 14: 39-43. DOI: 10.7454/mss.v14i1.474.
Reyes-Escogido  L,  Balam-Chi  M,  Rodriguez-Buenfil I,  Valdés  J,  Kameyama  L,  Martinez-Pérez  F. 2010.  Purification  of  bacterial  genomic  DNA  in less than 20 mins using chelex-100 microwave: examples  from  stains  of  lactic  acid  bacteria isolated  from  soil  samples.  Anton  Leeuw  98: 465-474. DOI: 10.1007/s10482-010-9462-0.
Saeki  EK,  Alves  J,  Bonfante  RC,  Hirooka  EY,  de Oliveira  TCRM.  2012.  Multiplex  PCR  (mPCR) for  detection  of Salmonella spp.  and  the  diffe- rentiation  of  Typhimurium  and  Enteritidis  sero- vars in chicken meat.  J Food Safety  33: 25-29. DOI: 10.1111/jfs.12019.
Safitri  E,  Hidayati  NA,  Hertati  R.  2019.  Prevalensi bakteri Salmonella pada  ayam  potong  yang dijual  di  pasar  tradisional  pangkalpinang. Ekotomia:  J  Penelitian  Biologi,  Botani,  Zoologi,
dan  Mikrobiologi 4:  25-30.  DOI:  10.33019/ ekotonia.v4i1.1012.
Soumet  C,  Ermel  G,  Rose  N,  Rose  V,  Drouin  P, Salvat G, Colin P. 1999. Evaluation of multiplex PCR  assay  for  simultaneous  identification  of Salmonella spp., Salmonella Enteritidis  and Salmonella Typhimurium  from  environmental swabs of poultry houses. Lett Appl Microbiol 28: 113-117.  DOI:  10.1046/j.1365-2672.1999.0048 8.x.
Taskila  S,  Tuomola  M,  Ojamo  H.  2012.  Enrichment cultivation  in  detection  of  food-borne Salmo- nella . Food Control 26: 369-377. DOI: 10.1016/ j.foodcont.2012.01.043.
Tortajada-Genaro  LA,  Rodrigo  A,  Hevia  E,  Mena  S, Niñoles  R,  Maquieira  Á.  2015.  Microarray  on digital  versatile disc for identification  and geno- typing  of Salmonella and Campylobacter in meat  products.  Anal  Bioanal  Chem  407:  7285- 7294. DOI: 10.1007/s00216-015-8890-0
Tran HH, Trinh KTL, Lee NY. 2013. Pressure-driven one-step  solid  phase-based  on-chip  sample preparation  on  a  microfabricated  plastic  device and  integration  with  flow-through  polymerase chain reaction (PCR). J Chromatogr B 936: 88- 94. DOI: 10.1016/j.jchromb.2013.06.037.
Triyani Y, Nafsi N, Yuniarti L, Sekarwana N, Sutedja E,  Gurnida  DA,  Parwati  I,  Alisjahbana  B.  2016. Rancangan  primer  spesifik  gen  macrophage mannose  receptor  (MMR)  untuk  Polymerase Chain Reaction (PCR) dan sekuensing Deoxyri- bose  Nucleic  Acid  (DNA).  Indonesian  J  Clin Pathol  Med  Lab  22:  158-162.  DOI:  10.24293/ ijcpml.v22i2.1120.
Utari  LK,  Riyanti,  Santosa  PE.  2016.  Status  mikro- biologis daging broiler di pasar tradisional kabu- paten Pringsewu. J Ilmiah  Peternakan Terpadu 4: 63-66.
Wulan  HA,  Nurjanah  S,  Rahayu,  WP.  2021.  Sensi- tivity of enrichment-PCR method for Salmonella enterica serovar  Typhimurium  and Salmonella enterica serovar  Enteritidis  analysis  in  chicken carcasses.  Food  Res  5:  54-61.  DOI:  10.26656/ fr.2017.5(2).429.
Yosua  A.  2018.  Deteksi Salmonella Hadar, Salmonella Typhimurium, dan Salmonella Ente- ritidis  menggunakan  Polymerase  Chain  Reac- tion (PCR). [Skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
[WHO]  World  Health  Organization.  2014.  WHO Global  Salmonella  survey:  Progress  Report 2008-2013. World Health Organization.