http://jurnal.farmasi.umi.ac.id/index.php/fitofarmakaindo/index

## Identifikasi Senyawa Bahan Alam Sebagai Inhbitor Tirosin Kinase EGFR: Skrining In Silico Berbasis Farmakofor Dan Molecular Docking
Frangky Sangande 1* , Jonly Piere Uneputty 1
1 Program Studi Farmasi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Prisma Manado
Article info Abstract History
Submission : 07-09-2019
Review : 19-10-2020 Accepted : 19-01-2021
* Email: frangky.sangande@prisma.ac.id
DOI: 10.33096/jffi.v8i1.539
Keywords: EGFR, in silico, pharmacophore modeling, molecular docking dsdfsdf
Epidermal  growth  factor  receptor  (EGFR)  is  one  of  tyrosine  kinase  that overexpressed in many types of cancer. The ihbiition of EGFR activity has known  as  a  rational  target  for  cancer  therapy.  However,    several  EGFR inhibitors have limitations related to resistance problems or reduced tumor response.  Therefore,  the  effort  to  develop  new  inhibitors  with  greater efficacy is very important to overcome the problems. In the present study, we  designed  a  computational  method  by  combining  ligand  based pharmacophore  modeling  and  molecular  docking  for  screening  the potential  natural  compounds  as  EGFR  inhibitors.  Validation  result  of ligand  based  pharmacophore  modeling  and  docking  molecular  by  ROC curves showed that both of these protocols had AUC ≥ 0.7. The Redocking erlotinib  to  EGFR  in  our  docking  protocols  gave  the  RMSD  <  2  Å. Therefore,  our  computational  method  could  be  applied  for  virtual screening. Initial screening based on pharmacophore modeling obtained 86 out of 179.816 compounds that could be mapped with the pharmacophore features.    Further  screening  through  molecular  docking  showed  two compounds  had  a  lower  docking  score  than  erlotinib,  i.e  ZINC00941342 and  ZINC72325782.  However,  by  careful  analysis  of  their  interaction profiles, only ZINC00941342 which formed hydrogen bonds with Met769, which is known as an EGFR key residue. Additionally, it was also found to form hydrogen with Cys773. Therefore, we recommend ZINC00941342 as a potential EGFR inhibitor.

## I. Pendahuluan
Kanker  merupakan  penyakit  global  yang menjadi penyebab utama morbiditas dan mortalitas di seluruh dunia (Nurcahyanti, 2016). Saat ini terapi kanker umumnya melibatkan tindakan pembedahan dan radiasi yang biasanya diikuti dengan kemoterapi sistemik  menggunakan  zat  sitotoksik  (Rayan et  al , 2017). Dalam penggunaannya, zat sitotoksik bekerja tidak  selektif  sehingga  sering  menimbulkan  efek samping.  Oleh  karena  itu,  hingga  saat  ini  terus dikembangkan  jenis  terapi  bertarget  dengan selektivitas yang lebih baik dibandingkan kemoterapi  sitotoksik  (Bagnyukova et  al ,  2010). Terapi bertarget bekerja dengan memblok penyebaran  dan  pertumbuhan  sel  kanker  dengan mempengaruhi  molekul  spesifik  atau  jalur  penting yang terlibat dalam pertumbuhan dan perkembangan sel kanker (Carrington, 2015), salah satunya adalah jalur  tansduksi  sinyal  intraseluler  yang  dimediasi oleh kelompok enzim tirosin kinase (Bagnyukova et al , 2010). Epidermal growth factor receptor (EGFR) merupakan  sub  kelompok  reseptor  tirosin  kinase yang  sering  dioverekspresikan  pada  beberapa jenis kanker  (Harari,  2004).  Penghambatan  aktivitas
EGFR merupakan salah satu strategi rasional dalam terapi  antikanker  (Seshacharyulu et  al ,  2012).
Inhibitor tirosin kinase EGFR generasi pertama yang telah  disetujui  oleh  FDA  adalah  gefitinib  dan erlotinib.  Obat  ini  merupakan  kelompok small molecule  tyrosine  kinase  inhibitor (TKI)  yang bekerja sebagai antagonis ATP di daerah intraseluler (Yewale et  al ,  2013).  Dalam  penggunaannya, inhibitor-inhibitor ini  memiliki  keterbatasan terkait dengan masalah resistensi atau berkurangnya respon tumor.  Oleh  karena  itu  upaya  mengembangkan inhibitor baru dengan peningkatan efikasi merupakan hal yang sangat penting untuk mengatasi masalah tersebut (Huang & Fu, 2015).
Dalam upaya penemuan dan pengembangan  obat  baru,  senyawa  bahan  alam dengan  keragaman  kimia  dan  aktivitas  biologinya dapat  menjadi  sumber  obat  yang  baik  dan  telah menjadi fokus banyak penelitian karena dinilai jauh lebih aman ditinjau dari tingkat toksisitasnya (Yuan et  al ,  2016).  Mempertimbangkan  akan  adanya kebutuhan inhibitor tirosin kinase EGFR yang lebih poten  dengan  tingkat  keamanan  yang  lebih  baik, maka  dalam  peneltian  ini  akan  dilakukan  skrining
terhadap suatu database senyawa bahan alam untuk mengidentifikasi  inhibitor  tirosin  kinase  EGFR dengan  pendekatan Computer-Aided  Drug  Design (CADD). Pendekatan ini dinilai efisien karena dapat menghemat waktu dan biaya (Sliwoski et al , 2013). Penelitian  ini  merupakan  penelitian  eksperimental secara  komputasi  dan  merupakan  tahapan  awal dalam  proses  penemuan  dan  pengembangan inhibitor tirosin kinase EGFR baru dari bahan alam. Diharapkan  dari  penelitian  ini  dapat  diperoleh senyawa-senyawa hit , yang  pada  tahap  selanjutnya dapat  digunakan  sebagai  senyawa  penuntun  untuk mendesain inhibitor-inhibitor baru dengan aktivitas dan tingkat keamanan yang lebih baik.

## II. Metode Penelitian II.1 Pengumpulan Data
Struktur  kristal  EGFR  dalam  bentuk kompleksnya  dengan  erlotinib  diunduh  dari  RSCB Protein Data Bank dengan kode PDB 1m17(Stamos et  al ,  2002).  Kristal  EGFR  dipisahkan  dari  pelarut dan  ligan  menggunakan  UCSF  Chimera.  Hasil pemisahan  disimpan  dalam  format  .mol2.  Model farmakofor  dibangun  menggunakan  training  set yang    terdiri  dari  26  senyawa  aktif  seperti  yang dipublikasikan  oleh  Gupta et  al (2011).    Database senyawa  yang    akan  diskrining  adalah  senyawa- senyawa  bahan  alam  ( natural  product )  dari  ZINC database  (Irwin  &  Shoichet,  2005)  yang  diakses melalui  ZINCPharmer  (Koes  &  Camacho,  2012). Untuk  keperluan  validasi  model  farmakofor  dan fungsi  skor  DOCK  6.7  (Allen et  al ,  2015), digunakan database yang terdiri dari inhibitor EGFR dan decoy nya yang diunduh dari http://dude.docking.org (Mysinger et al , 2012).

## II.2 Pemodelan Farmakofor dan Validasi
Model farmakofor dibangun menggunakan Ligandscout  4.3  (Wolber  &  Langer,  2005). Sebanyak  26  senyawa  aktif  dibuat  struktur  3 dimensinya  dan  dioptimasi  dengan  Hyperchem  8.0 (Froimowitz, 1993) menggunakan metode semiempiris  (PM3)  dan  hasilnya  dsimpan  dalam format  .mol2.  Sejumlah  konformasi  untuk  setiap senyawa  dibangun  dengan  metode  iCon  best  pada Ligandscout  4.3  menggunakan default  setting dan selanjutnya  dibentuk  model-model  farmakofor berdasarkan hasil tumpang tindih konformasi setiap senyawa tersebut. 10 model farmakofor  dihasilkan pada tahap ini. Model pertama dipilih sebagai model terbaik dan divalidasi performanya dalam membedakan  antara  senyawa  aktif  dan decoy (senyawa  inaktif)  dengan  melakukan  skrining terhadap  DUDE  database  yang  terdiri  dari  830 inhibitor  EGFR  dan  35.411 decoy .  Hasil  skrining akan  diurutkan  berdasarkan fit  score ,  dibuat  kurva receiver  operating  characteristic (ROC),  dan dihitung nilai area's under the curve (AUC).
II.3. Protokol Docking dan Validasi Protokol docking menggunakan DOCK 6.7 diawali  dengan  preparasi  makromolekul  (EGFR) dan  ligan  terlebih  dahulu  menggunakan  program USCF Chimera. Dalam tahap preparasi, makromolekul  dan  ligan  akan  ditambahkan  atom hidrogen.  Muatan  ditambahkan  dengan  metode AM1-BCC. Hasil preparasi disimpan dalam format .mol2.  Selanjutnya  disiapkan  permukaan  enzim menggunakan  EGFR  tanpa  atom  hidrogen  yang sebelumnya  dibuat  dengan  program  DMS  bawaan USCF  Chimera.  Spheres  di  sekitar  permukaan enzim  EGFR  diatur  dengan  radius  minimum  dan maksimum masing-masing 1,4 Å dan 4,0 Å. Spheres yang mewakili sisi aktif enzim EGFR diidentifikasi berdasarkan lokasi ligan natifnya (erlotinib) dengan RMSD 8.0 Å dari setiap atomnya. Kotak di sekitar sisi  aktif  diatur  dengan  margin  5  Å  ke  6  arah pembentuk sisi kotak. Selanjutnya protokol docking ini  divalidasi  dengan  melakukan redocking ligan natif  erlotinib  pada  EGFR.  Selanjutnya  dihitung nilai root mean square deviation (RMSD) dari pose ligan  terbaik  hasil redocking tersebut.  Untuk menentukan kehandalan DOCK 6.7 dalam membedakan  senyawa  aktif  dan  inaktif,  database DUDE  ditambatkan  pada  EGFR  menggunakan protokol docking yang  telah  dibuat  sebelumnya, kemudian dibuat daftar peringkat berdasarkan nilai skor  masing-masing  senyawa.  Dari  nilai  skor tersebut  juga  kembali  dibuat  kurva receiver operating  characteristic (ROC)  dan  dihitung  nilai AUCnya.
II.3. Skrining In Silico Skrining in silico diawali dengan mengunggah  model  farmakofor  terpilih  ke  dalam ZINCPharmer.  Beberapa  parameter  tambahan ZINCPharmer  diatur  sebagai  berikut: Maximum  of root  mean  square  deviation  (RMSD)  from  sphere centers  =  0,5  Å;  rotatable  bonds  cut-off    =  10; molecular weight < 500 Daltons . Selanjutnya ZINC database  yang terdiri dari 179.816 senyawa bahan alam  dipilih  untuk  proses  skrining  menggunakan model  farmakfor  dan  parameter  yang  telah  diatur sebelumnya. Hasil skrining diunduh untuk diskrining lanjut menggunakan protokol docking .

## III. Hasil dan Pembahasan
Dalam  penelitian  ini  proses  skrining diawali  dengan  pemodelan  farmakofor,  dengan tujuan  untuk  memperoleh  senyawa-senyawa  bahan alam  yang  memiliki  gugus  farmakofor  penting dalam  aktivitas  farmakologi  sebagai  inhibitor EGFR.  Untuk  maksud  tersebut,  dibangun  sebuah model  farmakofor  dari  26  senyawa  yang  diketahui sebagai  inhibitor  EGFR.  Model  farmakofor  ini divalidasi terlebih dahulu untuk memastikan bahwa model  tersebut  dapat  membedakan  antara  senyawa yang aktif dan tidak aktif. Seperti yang ditunjukkan pada  Gambar  1,  model  farmakofor  terpilih memberikan  kurva  ROC  dengan  nilai  AUC 100% =
0,78.  Suatu  model  dinilai  mampu  membedakan antara  dua  karakter  yang  berbeda  dalam  hal  ini apakah senyawa itu bersifat aktif atau tidak aktif jika nilai  AUC  kurva  ROC  >  0,7  (Hosmer,  2013). Dengan  demikian,  model  farmakofor  yang  terdiri dari  1  gugus  hidrofobik,  3  gugus  aromatik,  2 akseptor ikatan hidrogen, dan 1 hidrogen bond donor ini  (Gambar  1)  dinyatakan  valid  dan  dapat
digunakan untuk proses skrining. Dari hasil skrining awal  ini  diperoleh  86  senyawa  yang  memenuhi kriteria  fitur-fitur  farmakofor  yang  dipersyaratkan dan pada tahap selanjutnya akan diskrining kembali menggunakan molecular docking .
Gambar 1. Kurva ROC protokol skrining berbasis farmakofor dan fitur farmakofor terpilih yang ditumpang tindihkan pada erlotinib
Gambar 2. Pose hasil redocking erlotinib ditumpang tindihkan dengan pose kristalogrfinya dan kurva ROC protokol docking DOCK 6.7
Gambar 3. Profil ikatan hidrogen erlotinib (kiri) dan ZINC00941342 (kanan) dalam kompleksnya dengan EGFR
Untuk skrining berbasis molecular docking , dalam penelitian ini digunakan DOCK 6.7 yang sebelumnya divalidasi terlebih dahulu dengan melakukan redocking erlotinib  ke  sisi  aktif  EGFR untuk  menjamin  keakuratan  pose  geometrik  yang dihasilkan.  Selain  itu,  dilakukan  juga  vaidasi terhadap  fungsi  skornya  dengan  menghitung  nilai AUC kurva ROC setelah dilakukan proses docking senyawa-senyawa  aktif  dan  inaktif  dari  DUDE database  pada  target  EGFR.  Pose  geometrik  hasil redocking dikatakan  akurat  jika  orientasi  pose tersebut  sesuai  dengan  pose  kristalografinya  yang ditunjukkan dengan nilai root mean square deviation (RMSD)  kurang  dari  2  Å  (Hevener et  al, 2009). Seperti  yang  ditampilkan  pada  Gambar  2, berdasarkan perhitungan RMSD, redocking erlotinib  menggunakan  DOCK  6.7  diperoleh  nilai RMSD =  1,44 Å, sedangkan hasil perhitungan kurva ROC  diperoleh  nilai  AUC  =  0,838.  Dengan demikian, protokol docking ini dinyatakan valid dan dapat digunakan untuk proses virtual screening . Untuk memilih senyawa-senyawa hit pada tahap  ini, docking  score erlotinib  dengan  pose terbaik  (-64,26)  digunakan  sebagai  nilai  batasnya. Berdasarkan hasil skrining terdapat 2 senyawa, yaitu ZINC00941342 dan ZINC72325782 yang memiliki docking  score lebih  kecil  dibandingkan  erlotinib. Hal  ini  megindikasikan  bahwa  afinitas  kedua senyawa terhadap EGFR diprediksi akan lebih baik dibandingkan  erlotinib.  Dari  hasil  analisis  profil interaksinya  (Tabel  1),  kedua  senyawa  berhasil menempati  kantung  ikatan  EGFR  dan  berintraksi dengan  beberapa  residu  yang  sama  seperti  yang dijumpai pada profil interaksi erlotinib. Akan tetapi, setelah  dianalisis  lebih  lanjut  hanya  senyawa ZINC00941342  yang  membentuk  ikatan  hidrogen dengan  residu  Met769  (Gambar  3)  seperti  yang
dijumpai  pada  profil  interaksi  erlotinib.  Residu  ini merupakan residu penting untuk aktivitas penghambatan EGFR (Nasab et al , 2018).
Inhibitor-inhibitor EGFR khususnya turunan 4-aminoquinazolin seperti erlotinib membentuk ikatan hidrogen dengan Met769 melalui atom N pada cincin quinazolinnya sebagai akseptor hidrogen.  Pada  desain  obat  inhibitor  EGFR  tipe  1 yang  bekerja  sebagai  kompetitor  ATP,  cincin heterosiklik  seperti  quinazolin,  pirimidin,  purin, imidazol,  pirazol,  oxindol,  dan  quinolin  sering digunakan  untuk  menggantikan  posisi  cincin  purin dari ATP dan juga berperan sebagai kerangka untuk menempelnya rantai samping yang akan menempati daerah hidrofobik pada daerah katalitik (Zhang et al , 2009). Berdasarkan kerangka strukturnya, ZINC00941342  merupakan  golongan  senyawa flavon. Senyawa ini memiliki cincin chromen-4-one yang  dapat  berperan  sebagai  cincin  heterosiklik seperti cincin quinazolin pada erlotinib. Menariknya, struktur cincin ini mampu membentuk 3 ikatan hidrogen dengan residu Met769 dibandingkan erlotinib yang hanya dapat membentuk  1  ikatan  hidrogen.  Selain  itu  terdapat juga  tambahan  ikatan  hidrogen  dengan  residu Cys773  melalui  gugus  samping  pada  posisi  C7. Berdasarkan  studi  yang  dilakukan  oleh  Li et  al (2013),  adanya  tambahan  ikatan  hidrogen  dengan residu  Cys773  sangat  direkomendasikan  dalam upaya  mengoptimalkan  aktivitas  inhibisi  ligan ujinya terhadap EGFR. Oleh karena itu ZINC00941342  diprediksi  berpotensi  besar  dalam penghambatan aktivitas EGFR dan direkomendasikan  untuk  dilakukan  pengujian lanjutan  pada  tahap in  vitro untuk  membuktikan aktivitas inhibisinya.
Met769 Cys773 Met769 Cys773
Tabel 1. Stuktur 2D dan profil interaksi erlotinib, ZINC00941342, ZINC72325782 dengan EGFR
Ligan Struktu 2D Docking Score Ikatan Hidrogen Interaksi Hidrofobik Erlotinib -64.26 Met769 Leu694, Ala719, Lys721, Leu764, Leu820 ZINC00941342 -69.15 Me769, Cys773 Leu694, Val702, Ala719, Lys721, Leu 820 ZINC72325782 -65.59 - Leu694, Val702, Ala719, Leu764, Phe771
IV. Kesimpulan
Berdasarkan  kesesuaian  fitur  farmakofor , docking score dan profil interaksinya dengan EGFR diprediksi senyawa ZINC00941342 mampu menghambat  aktivitas  proliferasi  EGFR.  Akan tetapi,  masih  diperlukan  pengujian  aktivitas  secara in vitro untuk memverifikasi hasil skrining in silico ini.

## V. Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada Direktorat  Riset  dan  Pengabdian  Masyarakat, Kementrian  Riset,  Teknologi,  dan  Pendidikan Tinggi  atas  dukungannya  berupa  bantuan  dana penelitian.

## Daftar Pustaka
Allen,  W.J.,  Balius,  T.E.,  Mukherjee,  S.,  Brozell,
S.R.,  Moustakas,  D.T.,  Lang,  P.T.,  Case, D.A.,  Kuntz,  I.D.,  Rizzo,  R.C.  (2015). DOCK  6:  Impact  of  New  Features  and Current  Docking  Performance, Journal  of Computational  Chemistry , 36 (15),  1132- 1156.
Bagnyukova,  T.,  Serebriiskii,  Zhou,  Y.,  Hopper- Borge, E. A., Golemis, E. A., Astsaturov, I. (2010). Chemotherapy and Signaling How can  Targeted  Therapies  Supercharge Cytotoxic  Agents?, Cancer  Biology  &
Therapy , 10 (9), 839-853.
Carrington,  C.  (2015).  Oral  Targeted  Therapy  for Cancer, Australian Prescriber , 38(5), 171-
176.
Froimowitz,  M.  (1993).  Hyperchem:  A  Software Package for Computational Chemistry and Molecular  Modeling, Bio  Techniques , 14 (6), 1010-1013. Gupta,  A. K., Bhunia, S. S.,  Balaramnavar, V. M., Saxena,  A.  K.  (2011).  Pharmacophore Modelling, Molecular Docking and Virtual Ccreening  for  EGFR  (HER  1)  Tyrosine Kinase  Inhibitors, SAR  and  QSAR  in Environmental Research , 22 (3), 239-263.
Harari P. (2004). Epidermal Growth Factor Receptor Inhibition Strategies in Oncology,
Endocrine-Related  Cancer , 11 (4),  689- 708.
Hevener, K.E., Zhao, W., Ball, D.M., Babaoglu, K.,
Qi,  J.,  White,  S.W.,  Lee,  R.E.  (2009). Validation of Molecular Docking Programs for Virtual Screening
against Dihydropteroate  Synthase, Journal  of Chemical  Information  and  Modeling , 49 (2), 444-460.
Hosmer,  D.  W.,  Lemeshow,  S.,  Sturdivant,  R.  X. (2013). Applied  Logistic  Regression,  3rd Edition . USA: John Wiley & Sons.
Huang, L., Fu, L. (2015). Mechanisms of Resistance to  EGFR  Tyrosine  Kinase  Inhibitor, Acta Pharmacetica Sinica B , 5 (5), 390-401.
Irwin, J. J., Shoichet, B. K. (2005). ZINC – A Free Database  of  Commercially  Available Compounds for Virtual Screening’, Journal  of  Chemical  Information  and Modeling , 45 (1), 177-182.
Koes, D. R., Camacho, C, J. (2012). ZINCPharmer:
Pharmacophore  Search  of  the  ZINC Database, Nucleic Acids Research , 40, 409- 414.
Li, D-D., Qin, Y-J., Sun, J., Li, J-R., Fang, F., Du,
Q-R.,  Qian,  Y.,  Gong,  H-B.,  Zu,  H-L. (2013).  Optimization  of  Substituted  6- Salicyl-4-Anilinoquinazoline  Derivatives as  Dual  EGFR/HER2  Tyrosine  Kinase Inhibitors, PLoS ONE 8 (8), e69427. Mysinger, M. M., Carchia, M., Irwin, J. J., Shoichet, B. K. (2012). Directory of Useful Decoys, Enhanced  (DUD-E):  Better  Ligands  and Decoys for Better Benchmarking’, Journal of  Medicinal  Chemistry , 55 (14),  6582- 6594. Nasab,  R.  R.,  Mansourian,  M.,  Hassanzadeh,  F., Shahlaei,  M.  (2018).  Exploring  the Interaction  between  Epidermal  Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase and some of  the  Synthesized  Inhibitors  using Combination  of  In-Silico  and  In-Vitro Cytotoxicity Methods, Research in Pharmaceutical Science , 13 (6), 509-522. Nurcahyanti, A. (2016). Cervical Cancer: The Case in  Indonesia  and  Natural  Product-Based Therapy, Journal  of  Cancer  Biology  & Research , 4 (1), 1078. Rayan, A., Raiyn, J., Falah, M. (2017). Nature is the Best Source of Anticancer Drugs: Indexing  Natural  Products  for  Their Anticancer Bioactivity, PloS ONE , 12 (11), 1-12. Seshacharyulu, P., Ponnusamy, M. P., Haridas,  D., Jain,  M.,  Ganti,  A.,  Batra,  S.  K.  (2012). Targeting the EGFR Signaling Pathway in Cancer  Therapy, Expert  Opinion  on Therapeutic Targets , 16 (1), 15-31. Sliwoski, G., Kothiwale, S., Meiler, J., Lowe, E. W. (2013).  Computational  Methods  in  Drug Discovery, Pharmacological Reviews ,
66 (1), 334-395. Stamos, J., Sliwkowski, M.X., Eigenbrot, C. (2002). Structure  of  the  Epidermal  Growth  Factor Receptor  Kinase  Domain  Alone  and  in Complex  with  a  4-anilinoquinazoline Inhibitor, The  Journal  of  Biological Chemistry , 277 (48), 46265-46272. Wolber,  G.,  Langer,  T.  (2005).  LigandScout:   3-D Pharmacophores  Derived  from  Protein- Bound  Ligands  and  Their  Use  as  Virtual
Screening  Filters,  Journal  of  Chemical Information and Modeling, 45 (1), 160-169. Yewale, C., Baradia, D., Vhora, I., Patil, S., Misra, A.  (2013).  Epidermal  Growth  Factor
Receptor Targeting in Cancer: a Review of Trends  and  Strategies, Biomaterials , 34 (34), 8690-8707. Yuan,  H.,  Ma,  Q.,  Ye,  L.,  Piao,  G.  (2016).  The Traditional Medicine and Modern
Medicine from Natural Product, Molecules , 21 (5), 2-18.
Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. (2009). Targeting Cancer  with  Small  Molecule  Kinase Inhibitors, Nature  Reviews  Cancer , 9 (1), 28-39.