Analisis Jumlah Sel Osteoblas pada Fraktur Femur Tikus Wistar Jantan yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Bayam Merah (Amaranthus tricolor L.)
Analysis of Osteoblast Cell Number on Femur Fractures Provided Red Spinach Extract (Amaranthus tricolor L.)
Ferdian Nugroho 1 , Aris Prasetyo 2 , Muhammad Hasan 3
1 Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran Universitas Jember
2 Laboratorium Fisiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Jember
3 Laboratorium Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas Jember Jalan Kalimantan No.37, Jember, Indonesia, 68121 e-mail korespondensi: aprasetyo08@gmail.com

## Abstrak
Fraktur  tulang  merupakan  cedera  muskuloskeletal  dengan  angka  kejadian  yang  cukup  tinggi.  Proses penyembuhan fraktur dapat terhambat oleh stres oksidatif, yang terjadi akibat Reactive Oxygen Species (ROS) yang melebihi kapasitas antioksidan dalam tubuh yang menetralisirnya. Antioksidan yang dimiliki bayam merah berpotensi menekan tingkat stres oksidatif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanol bayam  merah  terhadap  proses  penyembuhan  fraktur  pada  tikus  wistar  jantan  melalui  jumlah  sel  osteoblas. Sampel berjumlah 30 ekor tikus wistar jantan dibagi dalam lima kelompok; kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol positif, dan tiga kelompok perlakuan ekstrak etanol bayam merah dengan dosis 35,4 mg/150gBB, 70,8 mg/150Gbb dan 141,6 mg/150g BB diinduksi fraktur, dibidai, lalu diberi perlakuan selama satu minggu. Hasil Uji One Way Anova menunjukkan signifikansi 0,000 (p<0,05) di mana terdapat perbedaan bermakna julah osteoblas antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Hasil uji LSD antara kelompok P1 dengan kelompok P3 menunjukkan  hasil berbeda signifikan dimana  peningkatan jumlah sel osteoblas sejalan dengan peningkatan dosis ekstrak etanol bayam merah. Kesimpulannya adalah ektrak etanol bayam merah memiliki dampak yang positif selama proses penyembuhan fraktur dengan parameter jumlah sel osteoblas.
Kata kunci : Ekstrak etanol bayam merah, proses penyembuhan fraktur, osteoblas, stres oksidatif

## Abstract
Bone fracture is a musculoskeletal injury with a high incidence rate. The healing process of the fracture can be inhibited by oxidative stress, which occurs due to Reactive Oxygen Species (ROS) that exceeds the antioxidant capacity in the body that neutralizes it. Antioxidants that have red spinach have the potential to suppress the level of oxidative stress. This study aims to determine the effect of red spinach ethanol extract on the healing process of fracture in male Wistar rats through osteoblast cell count. A sample of 30 male Wistar rats was divided into  five  groups;  negative  control  group,  positive  control  group,  and  three  groups  of  red  spinach  ethanol treatment with doses of 35.4 mg / 150 g body weight (BW), 70.8 mg / 150 gBW, and 141.6 mg / 150gBW induced fracture, splinted, then treated for one week. One Way Anova test results showed a significance of 0.000 (p <0.05) in which there was a significant difference in the osteoblast level between the treatment group and the control group. The result of LSD test between P1 group and P3 group showed significantly different result where the increase of osteoblast cell number was in line with the increase of the dose of red spinach ethanol extract. The conclusion is that red  spinach ethanol extract has a positive  impact during the fracture healing process with osteoblast cell number parameters.
Keywords: Red spinach ethanolic extract, fracture healing process, osteoblast, oxidative stress

## Pendahuluan
Fraktur tulang merupakan salah satu jenis trauma di  bidang  ortopedi.  Trauma  ini  termasuk  dalam kategori permasalahan kesehatan dengan prevalensi  cukup  tinggi  di  Indonesia.  Tulang  yang fraktur  akan  mengalami  mekanisme  proses penyembuhan  secara  alami  melalui  lima  tahapan, yaitu  fase  hematoma,  proliferasi,  pembentukan kalus, konsolidasi,  dan remodeling. Pada saat fase inflamasi,  komponen  inflamasi  seperti  sitokin, leukosit terutama neutrofil, dan komponen lainnya akan bermigrasi ke area fraktur. Tujuan dari proses tersebut  adalah  menstimulasi  diferensiasi  dan proliferasi mesenchymal stem cells (MSCs) menjadi sel  osteogenik  seperti  osteoblas  dan  osteoklas.  Di sisi  lain,  komponen  inflamasi  ini  juga  dapat menginduksi peningkatan Reactive Oxygen Species (ROS)  di  area  fraktur.  Radikal  bebas  dalam  tubuh dihasilkan  dari  aktivitas  fragmen  tulang  yang bereaksi  dengan  kolagen  dan  oksigen,  serta aktivitas osteoklas dalam penyembuhan fraktur.
Stres oksidatif dapat ditekan oleh suplai antioksidan dari luar tubuh . Bayam merah (Amaranthus tricolor L.) berpotensi  menjadi  sumber  terapi  antioksidan pada  fraktur  tulang  dengan  tingginya  kadar antioksidan yang dimilikinya.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui pengaruh  ekstrak  etanol  bayam  merah  terhadap proses  penyembuhan  tulang  fraktur  pada  tikus wistar  jantan  yang  diukur  melalui  jumlah  sel osteoblas.

## Metode Penelitian
Jenis  penelitian  ini  adalah true  experimental laboratories dengan  rancangan post  test  only control group design. Penentuan sampel penelitian menggunakan  metode Simple  Random  Sampling dengan jumlah 30 ekor tikus Rattus novergicus galur  wistar  jantan  dengan  berat  150- 200  gram  dan  umur 2-3 bulan.  Sampel  dibagi menjadi lima kelompok, masing-masing terdiri dari 6  ekor;  kelompok  kontrol  negatif  (K(-)),  kelompok kontrol positif (K(+)), dan tiga kelompok perlakuan ekstrak bayam merah P1 dosis 35,4 mg/150gBB, P2 70,8  mg/150gBB,  dan  P3  141,6  mg/150gBB. Kelompok  kontrol  negatif  diberi tween  80 1%. Kelompok kontrol positif diberi vitamin C 2 mg.
Proses  pematahan  didahului  dengan  anestesi kombinasi  ketamin  dan  cylazine.  Seluruh  sampel dipatahkan  tulang  femurnya  dengan  cara  induksi manual  dan  dibidai  dengan  gips  leukodur.
Pengecekan  apakah  telah  terjadi  fraktur  dengan cara look,  feel,  and  move serta  adanya false movement dan juga krepitasi. Seluruh sampel diberi perlakuan sesuai kelompok masing-masing dengan cara penyondean selama satu minggu. Selanjutnya dilakukan  terminasi  untuk  pengambilan  tulang femur  tikus  yang  dijadikan  preparat  histopatologi untuk pemeriksaan jumalh sel osteoblas.
Data  hasil  penelitian  dianalisis  menggunakan  uji normalitas Shapiro-Wilk dan  uji  homogenitas Levene’s  tes t .  Apabila  data  yang  didapatkan terdistribusi normal dan homogen, maka dilanjutkan dengan uji komparatif One-way Anova dan dilanjutkan dengan post hoc test LSD. Apabila data yang diperoleh tidak terdistribusi normal dan homogen,  dilanjutkan  dengan  uji Kruskal-Wallis
dan Mann-Whitney .

## Hasil Penelitian
Rata-rata  MDA  serum  semua  kelompok  dapat dilihat  pada  tabel  1.  Hasil  rata-rata  dan  standar deviasi  sel  osteoblas  masing-masing  kelompok didapatkan  untuk  kelompok  K(-)  sebesar  7.83  ± 0.75, kelompok K(+) sebesar 17.00 ± 1.80, kelompok P1 sebesar 8.83 ± 1.74, kelompok P2 sebesar 13.5 ± 1.05, kelompok P3 sebesar 16.00 ± 0.89. Kelompok K(-) dengan pemberian tween 80 1% memiliki rata- rata  sel  osteoblas  terendah,  yaitu  7.83  ±  0.75. Sedangkan  kelompok  K(+)  dengan  pemberian vitamin  C  2  mg  memiliki  rata-rata  sel  osteoblas tertinggi, yaitu 17.00 ± 1.80.

## Tabel 1. Hasil rata-rata kadar MDA
No. Perlakuan Rata-rata  ±  Standar Deviasi 1. Kontrol Negatif 7.83 ± 0.75 2. Kontrol Positif 17.00 ± 1.80 3. Kelompok P1 8.83 ± 1.74 4. Kelompok P2 13.5 ± 1.05 5. Kelompok P3 16.00 ± 0.89
Hasil  rata-rata  jumlah  sel  osteoblas  dianalis persebaran data dengan menggunakan uji Saphiro- Wilk dan  homogenitasnya  menggunakan  uji Levene’s  test .  Hasil  kedua  analisis  tersebut menunjukkan  p>0,05. Hal  ini menunjukkan  bahwa data terdistribusi normal dan memiliki varian yang sama. Hasil rata-rata jumlah sel osteoblas kemudian dianalisis  menggunakan One  Way  Anova untuk mengetahui  perbedaan  yang  signifikan  antar kelompok.
Hasil  uji One  Way  Anova didapatkan  nilai signifikansi sebesar p = 0,000 (p<0,05) menunjukkan  bahwa  terdapat  minimal  dua kelompok  yang  memiliki  rata-rata  jumlah  sel osteoblas yang berbeda signifikan. Uji lanjutan Post Hoc LSD  digunakan  untuk  mengetahui  perbedaan antar  kelompok.  Hasil  uji  analisis Post  Hoc LSD berdasarkan  Tabel  2  didapatkan  data  antar kelompok signifikan (p<0,05).
Tabel 2. Hasil Uji Post Hoc LSD

## Pembahasan
Hasil  Uji One  Way  ANOVA jumlah  sel  osteoblas menunjukkan  signifikansi  0,000  (p<0,05)  yang berarti  terdapat  perbedaan  secara  bermakna jumlah  sel  osteoblas  antara  kelompok  kontrol negatif dan positif dengan kelompok perlakuan.
Pada kelompok kontrol negatif jumlah radikal bebas meningkat  melebihi  jumlah  antioksidan  endogen sehingga terjadi stres oksidatif yang dapat memicu peroksidasi  lipid,  terbukti  dengan  rendahnya  hasil jumlah  sel  osteoblas.  Disisi  lain,  pada  kelompok perlakuan  yang  diberikan  eksrak  etanol  daun bayam  merah  efek  radikal  bebas  dapat  ditekan dengan  adanya  asupan  antioksidan  yang  terdapat dalam ekstrak etanol daun bayam merah sehingga bisa meningatkan jumlah sel osteoblas.
Berdasarkan  uji  analisis  LSD  antara  kelompok  K(-) dengan K(+) didapatkan hasil yang signifikan, yang berarti  terdapat  perbedaan  secara  bermakna jumlah  sel  osteoblas  antara  K(-)dengan  K(+). Perbedaan  yang  bermakna  ini  dikarenakan antioksidan  pada  vitamin  C  yang  diberikan  pada kelompok kontrol positif cukup  untuk menghambat radikal bebas pada fraktur tulang (Kristoyadi, 2013).
Uji  analisis  LSD  antara  K(-)  dengan  P1  didapatkan hasil  yang  signifikan  berarti  terdapat  perbedaan secara  bermakna  jumlah  sel  osteoblas,  hal  ini disebabkan  suplai  antioksidan  yang  tinggi  dalam ekstrak bayam merah bisa meningkatkan jumlah sel osteoblas yang tinggi pada kelompok K(-).
Uji  analisis  LSD  antara  P1  dengan  P2  didapatkan hasil tidak berbeda signifikan, berarti kemampuan dosis  ekstrak  bayam  merah  kelompok  P2  hampir sama  dengan  kemampuan  dosis  ekstrak  bayam merah  kelompok  P1  dalam  meningkatkan  jumlah sel osteoblas. Berbeda halnya dengan dosis ekstrak bayam merah kelompok P3, uji analisis LSD antara P1 dengan P3 menunjukkan hasil berbeda signifikan yang berarti kelompok P3 sudah bisa meningkatkan jumlah sel osteoblas secara signifikan. Hal ini juga menunjukkan  bahwa  peningkatan  jumlah  sel osteoblas sejalan dengan peningkatan dosis ekstrak bayam merah.
Uji  analisis  LSD  antara  K(+)  dengan  P3  didapatkan hasil  tidak  berbeda  signifikan,  hal  ini  disebabkan rata-rata jumlah sel osteoblas kelompok P3 hampir mendekati kelompok (+). Jadi, dosis ekstrak bayam merah pada kelompok P3 sudah hampir menyamai kemampuan  vitamin  C  kelompok  K(+)  dalam menekan stres oksidatif serta meningkatkan jumlah sel osteoblas pada fraktur tulang.
Adanya  peningkatan  jumlah  sel  osteoblas  pada kelompok  perlakuan  yang  diberi  ekstrak  etanol daun  bayam  merah  dibanding  dengan  kelompok kontrol  negatif  menunjukkan  adanya  suplai antioksidan dari ekstrak bayam merah yang mampu menekan  stres  oksidatif  yang  terjadi  pada  proses fraktur.  Stres  oksidatif  yang  ditandai  dengan peningkatan  radikal  bebas  menjadi  masalah  pada kasus  fraktur  tulang  karena  menghambat  proses penyembuhan tulang dan menyebabkan kerusakan sel.  Kerusakan  sel  yang  terjadi  diakibatkan  oleh proses peroksidase lipid yang terjadi.
Flavonoid  yang  terkandung  dalam  bayam  merah berperan  dalam  mencegah  terjadinya  proses peroksidasi  lipid  tersebut.  Flavonoid  bertindak sebagai scavenger radikal peroksil (ROO - ) yang akan diregenerasi  menjadi  ROOH  yang  bersifat  lebih stabil.
ROO• + PPH ROOH + PP•

## RO• + PPH
ROH + PP•
Flavonoid  akan  mendonorkan  ion  hidrogen  pada radikal  bebas  untuk  membentuk  senyawa  yang lebih  stabil  sedangkan,  radikal  fenoksil  yang
Negat if Positi f P1 P2 P3 Negatif 0,000 * 0,05 9 0,000*  0,000 * Positif 0,000 * 0,00 0* 0,000*  0,059 P1 0,059 0,000 * 0,000*  0,000 * P2 0,000 * 0,000 * 0,00 0* 0,023 * P3 0,000 * 0,059 0,00 0* 0,000*
terbe ntuk  (PP•)  menjadi  kurang  reaktif  (Astuti, 2008).
Radikal fenoksil (PP•) juga berperan  dalam proses terminasi  dari  peroksidase  lipid.  Radikal  fenoksil akan  berinteraksi  dengan  senyawa  radikal  bebas lainnya.

## ROO• + PP• ROPP

## RO• + PP• ROPP
Flavonoid  sebagai  antioksdian  tidak  hanya berperan  sebagai radical  scavenger ,  namun  juga berperan  sebagai chelating  ion logam  sehingga kerusakan  sel  akibat  radikal  hidroksil  yang dihasilkan dari reaksi hidroperoksida (H 2 O 2 ) dengan ion logam dapat diredam. Logam transisi seperti Fe dan  Cu  memiliki  elektron  yang  tidak  berpasangan sehingga sangat reaktif dalam mengkatalisis reaksi redoks tubuh. Flavonoid juga mampu menghambat kerja enzim CYP dalam menghasilkan radikal bebas (Kumar dan Pandey, 2013).
Selain itu, Katekin (salah satu jenis flavonoid dalam bayam merah) memiliki sifat radical scavenger yang sangat kuat karena cincin B  flavonoid mempunyai gugus  katekol  dengan  radikal ortho  semiquinon yang  stabil  untuk  mengikat  radikal  bebas  (Kumar dan  Pandey,  2013).  Katekin  juga  berperan  dalam menstabilkan  molekul  kolagen  sebagai  penyusun kartilago  pada  proses  osteogenesis endochondral dengan  meningkatkan  resistensinya  terhadap kolagenase  (Choi,  2003).  Kartilago  ini  akan mengalami  kalsifikasi  dan  resorpsi  menjadi  kalus yang akhirnya berubah menjadi lamellar (Mountziaris, 2008).
Vitamin  C  sebagai radical  scavenger mampu menyumbangkan dua elektronnya sehingga terbentuk  radikal  askorbil  yang  akan  teroksidasi dan menghasilkan asam dehidroaskorbat (McDowell et  al .,  2007).  Vitamin  C  dan  flavonoid dapat  meningkatkan  kadar  antioksidan  endogen seperti  katalase  (CAT),  superoksida  dismutase (SOD),  dan  glutation  (GSH)  (Katose et  al .,  2015).
Beta karoten dan klorofil berperan sebagai pemberi pigmen yang kaya akan antioksidan sebagai radical scavenger .  Beta  karoten  termasuk  dalam  vitamin antioksidan  yang  larut  dalam  lemak  sehingga mampu  melindungi  membran  sel  (Mueller  dan Boehm,  2011).  Klorofil  sebagai  antioksidan  sama halnya  dengan  flavonoid,  tidak  hanya  berperan sebagai radical  scavenger, namun  juga  berperan sebagai chelating ion logam (Hsu et al ., 2013).
Jenis flavonoid lain yang terdapat pada daun bayam Amaranthus  tricolor  L. adalah  kuersetin  (Noori et
al .,  2015).  Kuersetin  khususnya  dikenal  sebagai chelating ion Fe dengan menstabilkan Fe agar tidak berikatan  dengan  H 2 O 2 membentuk  OH - yang termasuk dalam radikal bebas yang sangat reaktif.
Kadar  kandungan  antioksidan  flavonoid  yang  ada dalam  bayam  merah  jauh  lebih  besar  daripada antioksidan  yang  lainnya.  Flavonoid  dapat mengoptimalkan  proses  penyembuhan  tulang dengan  mengatasi  stres  oksidatif  pada  fraktur tulang.  Stres  oksidatif  yang  ditandai  dengan peningkatan  jumlah  radikal  bebas  dapat  berasal dari aktivitas fragmen tulang yang bereaksi dengan kolagen  dan  oksigen,  serta  aktivitas  osteoklas dalam  penyembuhan  fraktur  (Sheweita  dan Khosshal, 2007).
Dengan demikian, pada penelitian ini menunjukkan bahwa  pemberian  ekstrak  etanol  daun  bayam merahyang berfungsi sebagai antioksidan eksogen dapat mengatasi stres oksidatif dan mengoptimalkan proses penyembuhan tulang. Hal ini  dibuktikan  dengan  hasil  pemberian  ekstrak bayam  merah  dapat  meningkatkann  jumlah  sel osteoblas tikus wistar model fraktur.

## Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dan analisis data dapat disimpulkan  bahwa  pemberian  ekstrak  bayam merah berpengaruh bermakna terhadap penurunan jumlah sel osteoblas tikus wistar jantan model  fraktur.  Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut mengenai efek ekstrak etanol bayam merah dengan rentang dosis yang lebih luas.

## Daftar Pustaka
Al-Dosari, M., 2010. The Effectiveness of Ethanolic Extract of Amaranthus tricolor L. : a Natural Hepatoprotective  Agent. American  Journal of Chinese Medicine . 38(6): 1051-1064.
Cadenas,  E.  dan  L,  Packer.  2002. Handbook  of antioxidant.  2 nd Ed .  St  Louis,  Missouri: Mosby-Year Book Inc.
Corbett, S.A. 1999.  Nitric Oxide in Fracture Repair Differential  Localisation,  Expression  And Activity Of Nitric Oxide Synthases. The Jurnal Of Bone And Joint Surgery . 81 (3): 531-537.
Ghasemzadeh, A., M. Azarifar, O. Soroodi, dan H. Z. E.  Jaafar.  2012.  Flavonoid  Compounds  and Their Antioxidant Activity in Extract of Some Tropical  Plants. Journal  of  Medicinal  Plants Research. 6(13): 2639-2643.
Gokturk, Turgut, Baycu, Gunai, Saber, Gulbas. 1995. Oxygen-free  Radicals  Impair  Fracture Healing  in  Rats. Acta  Orthop  Scand. 66(5): 473-475.
Hsu, C. Y., P. Y. Chao, S. P. Hu, dan C. M. Yang. 2013.
The Antioxidant and Free Radical Scavenging Activities  of  Chlorophylls  and  Pheophytins. Food and Nutrition Sciences. 4:5.
Katose D. M., S. S. Katyare, M. V. Hedge, dan H. Bae. 2015.  Significance  of  Antioxidant  Potential of  Plants  and  its  Relevance  to  Therapeutic Applications. International  Journal  of Biological Sciences. 11(8): 982-991.
Kumar, S., dan A. K. Pandey. 2013. Chemistry and Biological  Activities  of  Flavonoid:  an Overview. Hindawi. 1-16.
Mahartha,  R.A.,  Maliawan,  S.,  dan  Kawiyana,  K.S. 2013.  Manajemen  Fraktur  pada  Trauma Muskuloskeletal.  Bali:  Fakultas  Kedokteran Universitas Udayana.
McDowell,  L.  R.,  N.  Wilkinson,  R.  Madison,  dan  T. Felix.  2007.  Vitamins  and  Minerals Functioning as Antioxidants with Supplementation  Considerations. Florida Ruminant Nutrition Symposium. 3-5.
Mueller,  L.  dan  V.  Boehm.  2011.  Antioxidant
Activity  of  β -carotene  Compounds  in Different in  vitro assays. Molecules. 16: 1055-1069.
Noori,  M.,  M.  Talebi,  dan  Z.  Nasiri.  2015.  Seven
Amaranthus  L.  (Amaranthaceae) Taxa Flavonoid Compounds from Tehran Province,  Iran. International  Journal  of
Modern Botany. 5(1): 9-17.
Notoatmodjo. 2005. Metodelogi Penelitian
Kesehatan . Jakarta: Rineka Cipta
Novelandi, R. 2010. Karakteristik Penderita Fraktur Rawat Inap di Rumah Sakit Umum Daerah dr. Pringadi Medan Tahun 2009. Skripsi. Medan: Fakultas  Kesehatan  Masyarakat  Universitas Sumatera Utara.
Nugraheni, Ellisma Swandini. 2011. Extracts Giving of Purple Eggplant (Solanum melongena L.) orally  Can  Lower  Blood  Serum  Levels  of Malondialdehyde  of  White  Rat  (Rattus Novergicus)  Wistar  Diabetes  Mellitus Induced  by  Aloxan .  Final  Assignment. Malang: Brawijaya University.
Nurmasari,  P.D.  2013. Peranan  Ekstrak  Bangle (zingiber  cassumunar  roxb.)  terhadap Produksi  Nitric  Oxide  dan  Malondialdehyde pada  Mencit  yang  dinfeksi  Plasmodium berghei . Skripsi. Jember: Universitas Jember.
Rajalakshmi,  K.,  T.  Haribabu,  dan  P.  Sudha.  2011.
Toxicokinetic  Studies  of  Antioxidant  of Amaranthus tricolor and Marigold
(Calendula  oficenalis  L.) Plants  Exposed  to Heavy  Metal  Lead. International  Journal  of Plant,  Animal  and  Enviromental  Science. 1(2): 105-109.
Sheweita,  SA  &  K.I.  Khoshal.  2007.  Calcium Metabolism  and  Oxidative  Stress  in  Bone Fractures:  Role  of  Antioxidants.  Scaffold Mesenchymal Cell (Regenerative of Massive Bone  Defect  with  Bovine  Hidroxypatite  as Scaffold  of  Mesenchymal  Stem  Cells). JBP ; 13 (3): 519-525.
Solomon,  L.,  D.  Warwick,  dan  S.  Wayagam.  2010. Apley’s  System  of  Orthopaedics  and Fractures,  Ninth  Edition .  United  Kingdom: University of Bristol.
Suhardjono, D. 1994. Percobaan Hewan Laboratorium. Yogyakarta:  Gadjah  Mada University Press.