## POTENSI ANTIMIKROBA DARI EKSTRAK DAN FRAKSI SPONS
APLYSINA sp. TERHADAP MIKROBA UJI Escherichia coli, Staphylococcus aureus DAN Candida albicans.
Marcelinda Nike Kotel, 1) Defny S. Wewengkang, 1) Herny. Simbala 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Sponge  Aplysina  sp. is one of  the marine biota , which  has bioactive  compounds  that can be used  as medicinal ingredients. This study aims to determine the antimicrobial  potential of the extracts and fractions  of  sponge Aplysina  sp., against  microbes tested of  Escherichia coli, Staphylococcus aureus,  and    Candida  albicans.  Aplysina    sp.,  sponge  was  extracted    using  maceration  method  with ethanol  solvent  and  fractionated  using  methanol,  n-hexan  and  chloroform  solvents.  To  test    the antimicrobial    activity  carried    out  by  disk  diffusion  agar  method  and  observations  carried  out  24 hours  incubation  period,  with  inhibition  zones  measured  using  a  digital  caliper.  The  results  showed that  samples  of    Aplysina    sp.,    proved  to  have  antimicrobial  compounds    to  inhibit    Gram  –positive bacteria    Staphylococcus  aureus,  and  Gram-  negative  bacteria    Escherichia  coli,  with    the  highest inhibitory    zone  activity,  and  found    in  Gram  –positive  Staphylococcus  aureus  bacteria      with measurements of 7,37 mm.
Keywords : Sponge Aplysina  sp, Antimicrobial, Extraction,  Fractionation.

## ABSTRAK
Spons Aplysina sp merupakan salah satu  biota laut yang memiliki senyawa bioaktif yang dapat dijadikan    sebagai  bahan  obat.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  potensi  antimikroba  dari Ekstrak  dan  Fraksi    Spons Aplysina sp Terhadap  Mikroba  Uji Echerichia  coli,  Staphylococcus aureus, dan Candida albicans. Spons Aplysina sp diekstraksi  menggunakan metode maserasi dengan pelarut  etanol  dan  difraksinasi    menggunakan    pelarut  methanol,  n-hexan,  dan  Kloroform.  Untuk pengujian  aktivitas  antimikroba  dilakukan  dengan  metode    difusi  agar    dan    pengamatan  dilakukan 1x24  jam  masa inkubasi,  dengan zona hambat diukur menggunakan digital caliper. Hasil penelitian menunjukkan    bahwa  sampel    Spons Aplysina sp  terbukti  memiliki  senyawa  antimikroba  untuk menghambat bakteri Gram positif Staphylococcus aureus dan  bakteri  Gram  negatif Echerichia coli, dengan aktivitas zona hambat  tertinggi,  terdapat  pada  bakteri  Gram  positif Staphylococcus  aureus dengan hasil pengukuran  7,37 mm.
Kata Kunci : Spons Aplysina sp, Antimikroba, Ekstraksi, Fraksinasi.

## PENDAHULUAN
Spons adalah hewan yang  hidup menetap pada  suatu  habitat  pasir,  batu-batuan  atau karang-karang  mati  didalam  laut  yang  bersifat menyaring makanan. Spons memiliki kemampuan 77% untuk menyaring bakteri yang ada  disekitarnya  dengan  pemanfaatan  makanan yang  dicerna  secara  enzimatik.  Ekstrak  dari Spons  dipercaya  memiliki  senyawa  bioaktif yang  mempunyai  sifat  sitotoksin,  anti  tumor, antivirus,  dan  anti  inflamasi.  Selain  memiliki senyawa  bioaktif,  Spons  juga  melekat  atau menempel  pada  beberapa  benda  keras  bawah laut seperti karang, dan bebatuan (Haedar,2016).  Menurut  Wilkinson  (1980) Spons Aplysina sp  memiliki  senyawa  bioaktif.
Spesies Aplysina adalah  penghuni  umum perairan  laut  tropis  dan  sub  tropis  dangkal. Seperti  Spons  pada  umumnya  Spesies  ini memiliki  tubuh  yang  berpori  dan  permukaan yang  keras  seperti  batu.  Spons Aplysina sp merupakan  spons  besar  dengan  warna  kuning kehijau-an.  Beberapa  Spons  memiliki  warna yang  berbeda,  Spons  yang  hidup  dilingkungan yang  gelap  warnanya  akan  berbeda  dengan spons  yang  hidup  dilingkungan  yang  terang. Mikrosimbion pada Spons, umumnya Cyanophita ( Cyanobacteria dan  Eukariot  alga seperti Dinoflagella atau zooxanthella ).
Fotosintesa mikrosimbion mempengaruhi warna pada Spons.

## METODE PENELITIAN Alat
Alat-alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini yaitu masker, sarung tangan, gunting, pisau, tabung  oksigen,  snorkel,  fins, zipper lock bag , botol,  talenan, cool  box ,  cawan  petri,  autoklaf, pinset,  pembakar  spritus, vortex  mixer , micro tubes ,  batang  pengaduk,    kamera underwater ,
erlenmeyer,  pyrex  corong,  oven , timbangan analitik, spatula, corong pisah, gelas ukur, gelas kimia  (Pyrex), Laminar  air  flow, rak  tabung reaksi,  tabung  reaksi,  lemari  pendingin, inkubator,  cakram  ( paper  disc) ,  mikropipet, digital caliper , kertas label, spidol permanen.

## Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  Spons Aplysina sp, mikroba  Uji, Escherichia  Coli, Staphylococcus aureus , dan Candida albicans , aquades, etanol, metanol,  kloroform,  n–heksan,  kloramfenikol, pepton ,  beef  extract , natrium  klorida,    agar, paper  disc , tissue, aluminium  foil , plastic wrap , kertas  saring, es batu.

## Prosedur Kerja Pengambilan Sampel
Sampel  Spons Aplysina sp  diambil  dari Selat  Lembeh  Bitung   menggunakan  alat  bantu (masker  snorkel, dan  tabung  oksigen). Sampel yang  didapat dimasukkan ke dalam zipper lock bag selanjutnya    diletakkan  didalam cool  box , kemudian  langsung  dibawa  ke  Laboratorium Farmakognosi  dan  Fitokimia  Program  Studi Farmasi  Universitas  Sam  Ratulangi.  Sampel difoto  dan  diberi  label  serta  nomor  selanjutnya dideterminasi.

## Ekstraksi
Spons Aplysina sp  sebanyak  430  g diekstraksi  dengan  cara  maserasi.  Sampel dibersihkan kemudian dipotong kecil- kecil dan dimasukan  ke  dalam  botol.  Pelarut  etanol kemudian ditambahkan sampai sampel terendam  semuanya  dan  dibiarkan  selama  24 jam.  Sampel  yang  direndam  selama  24  jam selanjutnya disaring menggunakan kertas saring dan    menghasilkan    filtrat  1  dan  Debris  1. Debris 1 kemudian diremaserasi dengan pelarut
etanol sampai terendam semuanya dan dibiarkan  selama  24  jam,  setelah  24  jam, sampel  disaring  dengan  menggunakan  kertas saring  menghasilkan  filtrat  2  dan  Debris  2. perlakuan  yang  sama  dilakukan  pada  Debris 2,untuk  mendapatkan  filtrat  3,  dan  Debris  3. Filtrat  1,2,dan  3  selanjutnya  dicampur  menjadi satu  kemudian  disaring  dengan  kertas  saring, lalu  dikeringkan    menggunakan  oven  dengan suhu  40 0 C  .  Ekstrak  yang  didapat  dari  hasil pengeringan  menggunakan  oven  selanjutnya ditimbang  dan  didapatlah  ekstrak  etanol sebanyak  1,36  g  yang  selanjutnya  akan digunakan  dalam  fraksinasi  dan  pengujian antimikroba.

## Fraksinasi
Ekstrak kasar spons Aplysina Sp sebanyak 1g dimasukkan kedalam  erlenmeyer, kemudian dilarutkan  dengan  campuran  metanol  air (MeOH:  H 2 O  )  (80  :  20)  sebanyak    100  ml.
Setelah    larut,  sampel  dimasukan  kedalam corong    pisah  dan  ditambahkan  pelarut  n- heksan    sebanyak  100  ml  setelah  itu  dikocok berulang  kali  dalam  corong  pisah  sampai homogen.  Dibiarkan  hingga  terbentuk    lapisan metanol  dan  lapisan  n-heksan,  kemudian masing- masing lapisan yang terbentuk ditampung dalam wadah yang berbeda. Lapisan n-heksan selanjutnya dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 40 0 C, selanjutnya ditimbang dan diperoleh jumlah ekstrak   yang  dihasilkan fraksi  n-  heksan  0,03  g  .  Selanjutnya    lapisan metanol ditambahkan akuades 100 ml kemudian  dipartisi  dengan    pelarut  kloroform dengan  perbandingan  1:1  v/v  setelah  itu dikocok  kembali  sampai  homogen.  Dibiarkan sampai  tebentuk  dua  lapisan  yaitu  lapisan metanol  dan    kloroform,  dan  Masing-masing lapisan  tersebut  ditampung  dalam  wadah  yang berbeda.Lapisan kloroform selanjutnya
dikeringkan  menggunakan  oven  dengan  suhu 40 0 C,    lalu  ditimbang  dan  diperoleh  hasil sebanyak  1,6  g  fraksi    kloroform.  Lapisan metanol  kemudian  dikeringkan    menggunakan oven  dengan  suhu 40 0 C  lalu  ditimbang  dan diperoleh  fraksi  metanol  sebanyak  3,9  g.  Hasil dari  ketiga  fraksi  akan  digunakan  dalam pengujian antimikroba.

## Sterilisasi  Alat
Dalam  proses  penelitian,  alat-alat  yang akan  digunakan  harus  disterilisasi  terlebih dahulu  untuk  membebaskan  semua  peralatan dari  semua  mikroorganisme.  Pada  pengujian antimikroba alat-alat disterilkan dengan menggunakan  autoklaf    pada    suhu  121 o C selama  15  Menit,  pinset  dibakar  dengan pembakaran  diatas  api  langsung  dan  media disterilkan  diautoklaf  pada  suhu  121˚C  selama 15 menit  (Mpila, 2012).

## Kultur Mikroba
Mikroba  yang  digunakan    yaitu Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. sebanyak 100 μL  menggunakan  mikropipet    Masing-masing mikroba  diambil  dari  biakan  murni  .  kemudian dimasukan kedalam tabung  reaksi  yang  berisi media  cair  B1  sebanyak  1  ml  sebelum  di inkubasi  dalam  incubator  dengan  suhu  37 0 C selama  1  x  24  jam,  tabung  reaksi  ditutup menggunakan aluminium foil  (Ortez, 2005).

## Pembuatan Media Uji
Pepton  0,5  g, beef  extract 0,3  g,  natrium klorida 0,3 g, agar 1,5 g dan akuades sebanyak 100  ml  aduk  sampai  homogen  kemudian sterilkan  di  autoklaf    pada  suhu  121˚C  selama 15 menit (Dwijendra et al , 2014).

## Pembuatan Larutan Uji
Dalam  200  μL    metanol,  1mg    ekstrak spons Aplysina sp  dilarutkan    dan  dikocok
hingga homogeny menggunakan vortex.
Perlakuan  yang sama di-lakukan  pada fraksi  n- heksan,  fraksi  kloroform  dan  fraksi  metanol (Ortez, 2005).

## Pembuatan  Kontrol  Positif  dan  Kontrol Negatif
Kontrol  positif  dalam  pengujian  potensi antimikroba  ini  meng  gunakan  kloramfenikol paper  disc .  Kontrol  negatif  yang  digunakan yaitu  pelarut  metanol.  sebanyak  200  μL metanol  diambil  untuk  membuat  larutan  stok metanol    kemudian    di  totolkan    pada paper disc (Lalamentik, 2017).

## Pengujian Aktivitas Antimikroba
Dalam pengujian potensi antimikroba digunakan  metode  difusi  agar    ( disc  diffusion Kirby  and  Bauer ).  Mikroba  Sebanyak  100  μL yang  telah  dikultur,  dipipet  dan  diinokulasi pada  100  ml  media  agar  lalu  diaduk  hingga homogen  dan  kemudian  dituangkan    ke  dalam cawan    petri    dan  tunggu  sampai    media  agar mengeras.  masing-masing  cakram  ditotolkan dengan  larutan    uji  yang  telah  disiapkan menggunakan mikropipet. Setelah agar mengeras, kertas  cakram yang telah ditotolkan sampel  spons Aplysina sp,  kontrol  positif  dan kontrol  negatif    diletakkan  ke  dalam  cawan petri dengan menggunakan pinset.  Selanjutnya, cawan  petri  diberi  label  dan  diinkubasi  dalam inkubator  pada  suhu    37 0 C  selama  1  x  24  Jam (Ortez,2005).

## Pengamatan  dan  Pengukuran  Diameter Zona Bening
Pengamatan dilakukan setelah 24 jam masa inkubasi. Daerah di  sekitar kertas  cakram  yang menunjukkan  zona  bening  kemudian  diukur menggunakkan  digital  caliper  dengan  cara diukur  diameter  zona  bening  horizontal ditambahkan  dengan  diameter  zona  bening
vertikal lalu dibagi dua. Kemudian zona bening yang  telah  diukur,  Kekuatan  daya  antimikroba dikategorikan  berdasarkan  pedoman  Davis  dan Stout (1971) yaitu < 5 dikategorikan lemah,  5- 10  dikategorikan  sedang  ,10-20  dikategorikan kuat,  dan > 20 dikategorikan sangat kuat.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi dan  Fraksinasi
Spons Aplysina sp  diekstraksi  untuk menarik  senyawa-senyawa  aktif    yang  terdapat pada  Spons.  Proses  ekstraksi  bertujuan  untuk memisahkan  satu  atau  dua  komponen  yang terdapat  pada  bahan  alam  dengan  bantuan pelarut (Suryanto,2012). Ekstraksi yang dilakukan  menggunakan  metode  maserasi dengan  cara  perendaman  sampel  menggunakan pelarut etanol. Pelarut etanol, digunakan karena pelarut ini mampu mengekstrak senyawa secara optimum (Depkes Ri,1986).
Keberhasilan  dari  ekstraksi  dipengaruhi oleh pelarut. Pelarut yang akan digunakan harus memperhatikan  faktor  selektivitas,  kelarutan, dan  titik    didih.  Proses  ekstraksi  dihentikan ketika  tercapai  keseimbangan  antara  kosentrasi senyawa  dalam  pelarut    dengan  kosentrasi  sel dalam sel tanaman (Mukriani, 2014).
Fraksinasi  adalah  proses  pemisahan  dan pengelompokan senyawa-senyawa pada ekstrak berdasarkan  tingkat  kepolaran  (Hawkins  and Rahn). Sifat-sifat  atau golongan senyawa yang akan  dipisahkan  merupakan  salah  satu  faktor yang  harus  diperhatikan  dalam  menentukan pemilihan metode pemisahan kandungan kimia. Secara  selektif  masing-masing  pelarut  akan memisahkan    kandungan  kimia  yang  ada. Dalam  proses  pemisahan  menggunakan  pelarut polar,  non  polar,  dan  semi,  polar  (Harbone, 1987).
Pelarut yang digunakan dalam melakukan fraksinasi  didasarkan  pada  tingkat  kepolaran
dan  dimaksudkan  untuk  mengelompokan  lebih spesifik senyawa yang akan ditarik dari ekstrak etanol.Pelarut  yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya metanol, n-heksan dan kloroform.  Dimana  pelarut  MeOH  bersifat polar,  pelarut  heksan  bersifat  non  polar  dan kloroform  bersifat  semi  polar.  Ekstrak  kasar etanol 1g dipartisi dengan metanol-air (MeOH), n-hexan,  dan  kloroform.  Dari    fraksinasi  ini, didapatlah 3 fraksi dengan  filtrat  yang berbeda yaitu  fraksi  n-hexan  menghasilkan  filtrat berwarna  orange  pekat  dengan  ekstrak  kental yang  didapat  0,03  g,  fraksi  kloroform menghasilkan  filtrat  berwarna  kuning  keruh dengan  ekstrak  kental  yang  didapat  1,6  g. Fraksi metanol menghasilkan filtrat putih keruh dengan ekstrak kental yang didapat 3,9 g. Dari  metode  ekstraksi  dan  fraksinasi diperoleh  hasil  rendemen  yang  disajikan  pada Tabel 1.
Tabel  1.  Hasil  Rendemen  Ekstrak  dan  Fraksi Spons Aplysina sp. No Sampel Rendemen % Warna Sampel
1 2 3 4 EKE FH FK FM 0,3 3 160 390 Orange Pekat Orange Pekat Kuning Keruh Putih  Keruh
Dari  hasil  yang  diperoleh  pada  Tabel  1, menunjukkan adanya perbedaan nilai rendemen.  Perbedaan  nilai  rendemen  ini disebabkan oleh penggunaan jenis pelarut  yang berbeda, tergantung tingkat kepolarannya. Oleh sebab  itu  jenis  pelarut  yang  akan  digunakan menentukan jumlah ekstrak yang akan dihasilkan.  Berdasarkan  nilai  rendemen  yang dihasilkan  jumlah  nilai  rendemen  terbesar ditunjukkan  pada  pelarut  fraksi  kloroform  dan pelarut fraksi metanol. Tingginya nilai rendemen  ini    disebabkan    karena  hasil  fraksi kloroform  dan  fraksi  metanol  yang  diperoleh
pada saat fraksinasi melebihi nilai ekstrak kasar etanol  yang  digunakan.  Hal  ini  dikarenakan pelarut kloroform dan metanol yang dikeringkan,  tidak  menguap  secara  sempurna sehingga menghasilkan ekstrak kental.

## Pengujian  Aktivitas Antimikroba
Pada  pengujian  aktivitas  antimikroba dilakukan  dengan  metode  difusi  agar.  Menurut Mpila (2012) metode ini mudah dan serbaguna untuk  pertumbuhan bakteri yang tumbuh cepat. Selain  itu  metode  difusi  agar  sering  digunakan dalam  uji  kepekaan  antibiotik.  Metode  ini dilakukan  dengan  cara  melakukan  pengamatan dan  pengukuran  disekitar    kertas  cakram  yang memiliki  kepekaan  dalam  menghambat  atau membunuh  mikroba  yang  ditunjukkan  dengan adanya zona bening.
Pada  pengujian  ini  ,    pengamatan    dan pengukuran    dilakukan    1x  24  jam    masa inkubasi  pada suhu 37 o C , dengan mikroba  uji yang digunakan bakteri Escherichiacoli mewakili  bakteri Gram negatif, Staphylococcus aureus mewakili  bakteri  Gram  positif    dan Candida  albicans mewakili    jamur.  Mikroba uji ini digunakan untuk mengetahui kemampuan  daya  hambat  dari  ekstrak  dan fraksi spons Aplysina sp. Pengulangan sebanyak   3 kali dilakukan untuk  mendapatkan hasil yang lebih akurat.
Tabel  2.    Hasil    pengukuran    diameter    zona hambat    Ekstrak  dan  Fraksi  Spons Aplysina sp.
Rata-Rata Diameter Zona Hambat  (mm)
Mikroba EE FH FK FM +   - E.coli S. aureus Candida albicans 0,00 0,00 0,00 0,00 0, 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 7,32 7,37 0,00 1  8,49 18,47 15,00 0,00 0,00 0,00
Volume 8 Nomor 2 Mei 2019
Pada    pengujian  aktivitas  antimikroba, kekuatan  antimikroba  sampel  Spons Aplysina sp  dikategorikan  menurut  kategori  kekuatan daya  antimikroba  Davis  and  Stout  (1971)  yang disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3. Kategori kekuatan daya antimikroba sampel Spons Aplysina sp.
Kategori Diameter zona bening (mm) Sangat Kuat > 20 Kuat 10-20 Sedang 5-10 Lemah < 5
Pada  ekstrak  kasar  etanol,  fraksi  heksan, dan  fraksi  kloroform,  dalam  pengujian  ini menunjukkan tidak adanya aktivitas antimikroba  pada  bakteri Escherchia  coli , Staphylococcus  aureus dan Candida  albicans. hal  ini  menujukkan    bahwa    ekstrak  kasar etanol, fraksi heksan, dan fraksi kloroform tidak memiliki senyawa daya hambat.
Pada fraksi metanol berdasarkan hasil yang diperoleh,  bahwa  fraksi  ini  menunjukkan aktivitas  antimikroba  pada  bakteri Escherichia coli, dan  bakteri Staphylococcus  aureus, namun    tidak  menunjukkan  adanya    aktivitas antimikroba pada jamur . Hal  ini menunjukkan bahwa  fraksi  metanol  dari  Spons Aplysina sp memilki  spektrum  kerja  yang  sempit  karena hanya  mampu  mengahambat  pertum      buhan bakteri dan tidak memiliki aktivitas menghambat  jamur.  Fraksi  metanol    pada bakteri Staphylococcus  aureus (Gram positif ) kekuatan    aktivitas    zona  hambat  yang dihasilkan  dikategorikan  sedang  dengan hasil pengukuran  yang  diperoleh  yaitu  (7,37  mm) lebih besar dari pada  hasil yang  diperoleh pada bakteri Escherichia  coli (Gram  negatif)  yaitu (7,32  mm)  dengan  kategori  sedang  untuk kekuatan  zona  hambatnya. Hasil  ini  sesuai
dengan penelitian  Pelezar dan Chan (1986) dan Fardiaz (1989) yang menyatakan bahwa bakteri Gram  negatif    memiliki  struktur  dinding  sel yang kompleks, sedangkan bakteri Gram positif memiliki  struktur  dinding  sel  yang  lebih sederhana.
Dalam  pengujian  ini  kontrol  positif  yang digunakan yaitu antibiotik  kloramfenikol.  Dari hasil      pengukuran    yang    diperoleh, menunjukkan    bahwa    aktivitas  zona  hambat tertinggi yaitu (18,49 mm) terdapat pada bakteri Escherichia  coli dibandingkan  dengan  zona hambat  yang  dihasilkan  pada    bakteri Staphylococcus  aureus yaitu  (18,  47  mm).  Hal ini  disebabkan  karena  bakteri    Gram  negatif memiliki kepekaan terhadap kloramfenikol dan hanya membutuh kan 0,2-0,5 μg/mL kosentrasi, untuk  menghambat  bakteri  sedangkan  pada bakteri Gram  positif  pada umumnya dihambat pada  kosentrasi    1-10  μg/mL  (Katzung,  2004). Selain  itu  Kontrol  positif  dari  kloramfenikol memiliki  kemampuan  dalam  menghambat pertumbuhan Candida    albicans dengan  hasil pengukuran  (15,00  mm).    Hasil    ini  sesuai dengan  peneltian  (Katzung,  2004)    yang menyatakan bahwa kontrol positif dari antibiotik  kloramfenikol  memiliki  spektrum kerja  yang  luas  sehingga  mampu  menghambat pertumbuhan bakteri dan jamur .

## Kesimpulan
Berdasarkan    hasil    penelitian  yang dilakukan  maka  disimpulkan  bahwa  sampel Spons Aplysina sp, memiliki senyawa antimikroba  untuk  menghambat  bakteri  Gram positif Staphylococcus  aureus dengan  hasil pengukuran    (7,37  mm) dan    bakteri  Gram negatif Escherichia  coli dengan  hasil  (7,32 mm ) .  Dari  hasil    pengujian  yang  dilakukan, diperoleh  aktivitas  zona    hambat    tertinggi terdapat    pada    bakteri    Gram    positif
Staphylococcus    aureus dengan    hasil pengukuran  (7,37 mm).

## DAFTAR PUSTAKA
Davsis,    W.,    Stout.,  T.R.    1971.  Dise      Plate Methode    of    Microbiological  Antibiotik Assay  , Journal  Microbiology .  22  ( 4) : 659-665.
DeLeo.  F.R.  Diep,  B.A.,  Otto,  M.  2009. Host defense and pathogenesi Staphylococcus aureus infection , Journal Dent, 23:17-34.
Depkes  RI.1986. Sediaan  Galenik,    2  &  10. Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Dwijendra,    I.M.,    D.S.      Mewengkang,    F.S. Wehantow.  2014.  Aktivitas  Antibakteri dan  Karakteristik  Senyawa  Fraksi  Spons Lamellodysidea  herbacea yang    Diperoleh dari  Teluk  Manado. Pharmacon    Jurnal Ilmiah Farmasi 4 :2302- 2493.
Haedar,  Baru  Sadarun,  Ratna  Diyah  Palupi,
2016.  Potensi    keanekaragaman    Jenis dan    Sebaran  Spons    di    Perairan    Pulau Saponda  Laut,  Kabupaten    Konawe, Jurnal Sapa Laut Vol. 1 ( 1 ):1-9
Harbone,J.B. 1987. Metode Fitokima: Penuntuncara modern menganalisis Terjemahan dari: Phytochemical Methods.
Hawkins, D.W & D.W. Rahn. 1997.
Pharmacotheraphy  A.    Phatophysiologyc Approach,    3  th  Ed. Stampfor:  Aplleton and Lange
Katzung,  Betram  G.2004 ,    Farmakologi  Dasar dan  Klinik  Edisi  4. Alih    Bahasa:
Staf Dosen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya Jakarta; EGC:709-719
Lalamentik,  G.  J.  2017. Aktivitas  Antibakteri Ekstrak    Karang    Lunak    Klyxumsp. Yang diperoleh dari Teluk Manado 6 ( 3 ) : 46-56
Mpila,D.  A.  2012. Uji  Aktivitas    Anti  bakteri Ekstrak Etanol Daun Mayana aureus dan
Escherichia coli dan Pseudumonas aeruginosa  secara  in  vitro [skripsi]. Program Studi Farmasi FMIPA Universitas Sam Ratulangi.
Mukriani,2014 .Ekstraksi,  Pemisahan  Senyawa dan    Identifikasi    Senyawa    Aktif jurnal Kesehatan  Kesehatan  Vol.  7  .  No  2.  Hal: 361-367
Ortez,  J.  H.  2005. Disk  Diffusion  testing inmanual  of  antimicrobial    susceptibility testinMarie B. Coyle (Coord. Ed). American  society  for    Microbiology dan America.
Pelezar, M.J., Chan, E. C.S. 1986 . Dasar-dasar Mikrobiologi 2 Hadi-
oetomo  R.  S.,Imas,T.,  Tijtrosomo  dan angka s, L . Jakarta
Suryanto, E. 2012. Fitokimia Antioksidan . Putra Media Nusantara, Surabaya. Soest R. Van, 2008. World  Porifera  Database .  [di  akses 14 Oktober 2018]
Wilkinson,  C.R.1980.  Cyanobacteria  sym- biotik in marine sponges. In SCHWEMMLER et al  (Eds).  Endo  - cytobiology : endosymbiosis and cell