Jurnal Farmasi Galenika ( Galenika Journal of Pharmacy ) 2018; 4 (2): 93 – 97 ISSN : 2442-8744 (electronic) http://jurnal.untad.ac.id/jurnal/index.php/Galenika/index
DOI : 10.22487/j24428744.10590
Sinergitas Aktivitas Antibakteri dari Kelopak Bunga Rosella dan Kitosan Terhadap Staphylococcus aureus
( Synergistic Antibacterial Activity of Roselle Calyx  and Chitosan against Staphylococcus aureus )

## Haeriah, Natsir Djide, Gemini Alam, Sartini
Fakultas Farmasi, Universitas Hasanuddin, Makassar, Indonesia, 90245
Article Info: Received: 24 Agustus 2018 in revised form: 20 September Accepted: 27 September 2018
Available Online:30 September 2018

## ABSTRACT
Currently,  the  antibacterial  research  is  increasingly  promoted  primarily from natural materials, due to the increasing number of pathogenic bacteria that  have  been  resistant  to  existing  antibiotics.  One  of  the  pathogenic bacteria  that  has  been  much  resistant  to  antibiotics  is Staphylococcus aureus. Roselle calyx ( Hibiscus sabdariffa L.) and chitosan are known to have  antibacterial  activity.  The  aim  of  this  study  to  find  out  the antibacterial  synergy  of  the  rosella  calyx  extract  and  chitosan  against . S.aureus ATCC  33592.  Roselle  calyx  was  extracted  by  maceration  using 80% ethanol, while chitosan  is obtained  from  deasetilation of  chitin  from shrimp husk. Test antibacterial synergism using checkboard assay method by  calculating  the  minimum  inhibitory  concentration  (MIC)  using microdilution assay. The results showed minimum inhibitory concentration (MIC) value of roselle calyx extract  and chitosan were 1250 ppm and 50 ppm,  respectively.    MIC  value  of  roselle  calyx  extract  in  the  presence  of chitosan was 625 ppm, while the value of MIC chitosan in the presence of roselle calyx  extract  was  <  0.19  ppm. Fractional  Inhibition  Concentration Index (FICI) was < 0.5 that mean the combination of roselle calyx extract with  chitosan  has  a  synergistic  antibacterial  effect  on S.aureus ATCC 33592.
Keywords : Hibiscus sabdariffa L.
Kitosan Staphylococcus aureus Sinergitas  antibakteri
Corresponding Author: Sartini
Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin Makassar 90245 sardj@farmasi.unhas.ac.id
Copyright © 2017 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.
How to cite (APA 6th Style):
Haeriah, et al. (2018). Sinergitas Aktivitas Antibakteri dari Kelopak Bunga Rosella dan Kitosan Terhadap Staphylococcus aureus . Jurnal Farmasi Galenika : Galenika Journal of Pharmacy, 4(2), 93-97. doi:10.22487/j24428744.2018.v4.i2.10590

## ABSTRAK
Saat  ini  pencarian  antibakteri  makin  digalakkan  utamanya  dari  bahan  alam,  disebabkan  makin  banyaknya antibiotika  yang  mengalami resistensi terhadap  bakteri patogen, antara  lain: Staphylococcus aureus. Kelopak bunga  Rosella  ( Hibiscus  sabdariffa L.)    dan    kitosan  diketahui  memiliki  aktivitas  antibakteri.  Tujuan  dari penelitian ini adalah mengetahui sinergitas antibakteri dari  ekstrak kelopak bunga rosella dan kitosan terhadap S.  aureus ATCC  33592.  Kelopak  bunga  rosella  diekstraksi  secara  maserasi  menggunakan  etanol  80%, sedangkan  kitosan  diperoleh  dari  deasetilasi  kitin  kulit  udang.  Kadar  hambat  minimal  (KHM)  dilakukan dengan  metode  mikrodilusi  dan  dilanjutkan  uji  sinergitas  antibakteri  menggunakan  metode microdilution checkboard  assay. Hasil  penelitian  diperoleh  nilai  KHM  (kadar  hambat  minimal)    ekstrak  kelopak  bunga rosella  dan  kitosan  berturut-turut  sebesar  1250  bpj  dan  50  bpj.  Nilai  KHM  ekstrak  kelopak  bunga  rosella dengan  adanya  kitosan  yaitu  625  bpj,  sedangkan  nilai  KHM  kitosan  dengan  adanya  ekstrak  kelopak  bunga rosella  yaitu  <0,19  bpj.  Indeks  Kadar  hambat  Fraksional  (FICI)    adalah  <  0,5  yang  disimpulkan  bahwa kombinasi  dari  ekstrak  kelopak  bunga  rosella  dengan  kitosan  memiliki  efek  antibakteri  sinergis  terhadap S.aureus ATCC 33592.
Kata Kunci : : Hibiscus sabdariffa L., kitosan, Staphylococcus aureus ,  sinergitas antibakteri

## PENDAHULUAN
Resistensi  antibiotika  menjadi  salah  satu  masalah yang  sangat  serius.  Saat  ini,  banyak  bakteri  yang telah  mengalami  resisten  terhadap  berbagai  jenis antibiotika,  salah  satunya  adalah Staphylococcus aureus .    Salah  satu  peluang  yang  dapat  digunakan untuk  menekan  terjadinya    bakteri  yang    resisten terhadap  antibiotika  yang  ada  adalah  pemanfaatan bahan  alam  sebagai  alternatif  antibakteri.  Penelitian- penelitian bahan alam sebagai antibakteri, antara lain: kelopak  bunga  rosella  (Borrás-Linares  et  al.,  2015) dan kitosan (Kong, Chen, Xing, & Park, 2010).
Tanaman rosella ( Hibiscus sabdariffa L.)
mengandung senyawa fenolik, antara lain: antosianin (delphinidin-3- O -sambubioside  dan  Cyanidin--3- O - sambubioside), flavonoid (kuersetin, luteolin, gossipetin),  asam  protokatekuat    (Borrás-Linares  et al.,  2015;  Jabeur  et  al.,  2017;  Sindi,  Marshall,  & Morgan,  2014) . Penelitian  yang  dilakukan  Borrás- Linares et al. (2015), diperoleh bahwa ekstrak dari 25 varitas  kelopak    bunga  rosella  memiliki  aktivitas antibakteri terhadap bakteri gram negatif ( Escherichia coli, Salmonella enteritidis) dan bakteri gram  positif (Staphylococcus  aureus,  Micrococcus luteus). Penelitian  Liu,  Tsao,  &  Yin,  (2005) memperoleh  ekstrak  air  kelopak  bunga  rosella memiliki  kadar  hambat  minimal  32+8  bpj terhadap Methicillin Resistant Staphylococcus aureus.
Kitosan  dapat  diperoleh  salah  satunya  dari  limbah kulit  udang  dengan  cara  melakukan  deasetilasi  kitin (Goy,  Britto,  &  Assis,  2009).  Produksi  kitosan  dari kitin limbah kulit udang telah dilakukan Haeriah et al (2017)  dan  memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap Staphylococcus  aureus. Kitosan  yang  berasal  dari limbah  kulit  udang  memiliki  aktivitas  antibakteri yang lebih tinggi terhadap bakteri gram positif seperti S.aureus dibandingkan  bakteri  gram  negatif  seperti Escherichia  coli dan a ktivitas  antibakteri  senyawa kitosan  tidak  berbeda  nyata  dengan  kontrol  positif Vankomisin.  kitosan  pada  konsentrasi  288  bpj memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap S.  aureus sebesar 14 mm,  konsentrasi hambat minimal (KHM) dari senyawa kitosan terhadap bakteri S. aureus yaitu sebesar 20 bpj (Goy, Morais, & Assis, 2016).
Kombinasi dua bahan antibakteri biasanya dilakukan untuk  mengurangi  dosis  yang  dibutuhkan  atau  untuk mengurangi  efek  samping  jika  diberikan  dalam bentuk  tunggal.  Permasalahannya  adalah  apakah kombinasi  ekstrak  kelopak  bunga  rosella  dengan kitosan  memiliki  efek  sinergis  sebagai  antibakteri terhadap bakteri uji S.aureus ATCC 33592.
Tujuan  penelitian  ini  untuk  mengetahui  efek sinergitas      kombinasi  ekstrak  kelopak  bunga  rosella ( Hibiscus  sabdariffa L.)  dengan  kitosan  terhadap penghambatan  pertumbuhan Staphylococcus  aureus ATCC 33592 .

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Biosafety  cabinet ( Envirco ® ),  oven  ( Ecocell ® ), inkubator ( Memmert ® ), autoklaf (25X-2 ® ), timbangan analitik ( Sartorius ® ), mikropipet ( Memmert ® ), kitosan,      simplisia  kelopak  bunga  rosella,  etanol 80%,  medium Muller  Hinton  Btroth (MHB)
Triphenyltetrazolium chloride ( Merck ® ), well microplate 96,  air  suling  steril,  asam  asetat  glasial 1%, Staphylococcus. aureus ATCC 33592,d ll.

## Prosedur

## Ekstraksi Kelopak Bunga Rosella
Simplisia serbuk kelopak bunga rosella sebanyak 100 gram  diayak  menggunakan  nomor  mesh  20 selanjutnya diekstraksi secara maserasi menggunakan 1 L etanol 80 %. Hasil ekstraksi diuapkan pelarutnya dengan evaporator, sehingga diperoleh ekstrak kental.
Analisis  kadar  total  polifenol  ekstrak  kelopak bunga rosella .
Ekstrak  kelopak  bunga  rosella  sebanyak  100  mg dalam  metanol  P  hingga  volume  mencapai  10  ml (10.000 bpj). Kemudian sebanyak 0,4 ml dari larutan stok  diambil  dan  ditambahkan  2,5  ml  reagen  Folin- Ciocalteau, diamkan selama 8 menit dan ditambahkan  2  ml  larutan  natrium  hidroksida, kemudian  dicukupkan  dengan  air  suling  hingga volume  menjadi  5  ml  (800  bpj).  Setelah  itu, diinkubasi  selama  30  menit  pada  suhu  ruangan  lalu diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang 648  nm.  Sebagai  larutan  standar  digunakan  asam gallat konsentrasi 1,5 - 15 bpj (Kemenkes, 2011).
Penentuan  Kadar  Hambat  Minimal  ekstrak rosella,  kitosan  dan  kombinasnya  terhadap S. aureus
Efek  sinergitas  ekstrak  rosella  dengan  kitosan  dari limbah  kulit  udang  dilakukan  dengan  menggunakan metode Microdilution  Checkerboard  Assay menurut metode Valgas,  Souza, Smânia, &  Smânia Jr,  (2007) dan Olga,  Petar,  Jelena,  &  Srdjan,  (2008) dengan beberapa  modifikasi . Dibuat  seri  konsentrasi  ekstrak dengan  perbedaan  antar  konsentrasi  2  kalinya,  yaitu untuk  rosella  :  312,5  bpj  s/d  5000  bpj  ,  sedangkan kitosan  dimulai    0,19  bpj  s/d  100  bpj. Volume  total setiap well yaitu 100 µl yang terdiri atas 5 µl larutan
ekstrak  rosella  atau  5  µl  larutan  kitosan,  90  µl medium Muller  Hinton  Broth (MHB) yang mengandung Staphylococcus  aureus setara  dengan McFarland  10 5 CFU/ well Kemudian microplate diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1x24 jam. Setelah inkubasi  ditambahkan  reagen  Triphenyltetrazolium chloride  (TTC)  sebanyak  5  µL  kemudian  diinkubasi selama  30  menit .  Microplate dapat  diamati  secara visual  dengan  melihat  warna  merah  muda  yang terbentuk dalam menentukan nilai KHM. Konsentrasi terendah  yang  memperlihatkan  warna  bening  dan tidak  berwarna  merah  muda  merupakan  nilai  KHM nya.  Adanya  perubahan  warna  pada  medium  yang ditumbuhi  bakteri  tersebut  didasarkan  atas  reduksi dari  reagen  TTC  oleh  enzim  dehidrogenase    yang dihasilkan  oleh  bakteri  yang  hidup.  Reduksi  TTC tersebut  membentuk  senyawa  trifenilformazan  yang berwarna merah /pink (Olga et al., 2008).
Penentuan fractional  inhibition  concentration index (FICI)
Penentuan  nilai  FICI  dari  kombinasi  antara kombinasi  ekstrak  kelopak  bunga  rosella  dengan kitosan  dapat  dilakukan  dengan  menggunakan  rumus sebagai berikut:
FICI = FIC (A) + FIC (B)
𝐹𝐼𝐶  𝐴  = (𝐾𝐻𝑀 𝑅𝑜𝑠𝑒𝑙𝑙𝑎  𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚  𝑘𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑠𝑖  𝑑𝑒𝑛𝑔𝑎𝑛  𝐾𝑖𝑡𝑜𝑠𝑎𝑛 ) 𝐾𝐻𝑀  𝑅𝑜𝑠𝑒𝑙𝑙𝑎 𝐹𝐼𝐶  𝐵  = (𝐾𝐻𝑀 𝐾𝑖𝑡𝑜𝑠𝑎𝑛  𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚  𝑘𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑠𝑖  𝑑𝑒𝑛𝑔𝑎𝑛  𝑅𝑜𝑠𝑒𝑙𝑙𝑎 )

## 𝐾𝐻𝑀  𝐾𝑖𝑡𝑜𝑠𝑎𝑛
Kemudian  hasil  dari  perhitungan  nilai  FICI kombinasi  kedua  ekstrak  dapat  menunjukkan  efek yang  dihasilkan  pada  kombinasi  kedua  ekstrak tersebut.  Adapun  hasilnya  dapat  diinterpretasikan sebagai berikut: Sinergis : FICI ≤0,5;    Antagonis    : FICI>4 Aditif :  >0,5 FICI  ≤ 1  berbeda : >1 FICI ≤ 4 (Bakarnga-Via et al., 2016).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  ekstraksi  dan  penentuan  kadar  polifenol  total dari  ekstrak  kelopak  bunga  rosella  diperoleh  ekstrak dengan  konsistensi  kental  dengan  rendemen  ekstrak 22,99 %  dan kadar total polifenolnya adalah 10.10 ± 0.2  mg  ekivalen  asam  gallat  (EAG)  /  gram  ekstrak, sedangkan    penelitian  yang  dilakukan  oleh  Jung, Kim,  &  Joo,  (2013)  didapatkan  hasil  bahwa  ekstrak kelopak  bunga  rosella  konsentrasi  7.27  ±  0.20  mg
EAG / g ekstrak . Adanya perbedaan kadar polifenol yang  diperoleh  dapat  disebabkan  karena  perbedaan konsentrasi  etanol  yang  digunakan,  rasio  simplisia  / cairan penyari, dan jenis dan umur tanaman.
Hasil  uji  KHM  dan  uji  sinergitas  dengan  metode microdilution  checkboard  assay diperoleh  hasil seperti pada tabel 1.
Tabel 1. Konsentrasi hambat minimal (KHM) ekstrak kelopak  bunga  rosella  dan  kitosan  tunggal  dan kombinasinya terhadap S. aureus
Sampel Uji KHM (bpj) Ekstrak Kelopak Bunga Rosella 1250 Ekstrak Kelopak Bunga Rosella dengan adanya Kitosan  0,19 bpj 625 Kitosan 50 Kitosan dengan adanya Ekstrak Kelopak Bunga osella 625 bpj <0,19
Nilai    KHM  dari  ekstrak  kelopak  bunga  rosella terhadap S.  aureus diperoleh  1250  bpj,  sedangkan penelitian  (Liu  et  al.,  2005)  memperoleh  ekstrak  air kelopak  bunga  rosella  memiliki  KHM  32+8  bpj terhadap Methicillin Resistant Staphylococcus aureus. Adanya perbedaan ini antara lain disebabkan adanya  perbedaan  jenis  kelopak  bunga  rosella,  jenis cairan penyari, galur bakteri uji yang digunakan. Nilai  KHM  Ekstrak  Kelopak  bunga  rosella  dengan adanya  kitosan  0,19  bpj  adalah  625  bpj,  menurun  2 kalinya  dengan  kata  lain  aktivitasnya  meningkat  2 kalinya.
Nilai KHM kitosan terhadap S. aureus 50 bpj , hasil penelitian  oleh  No,  Park,  Lee,  &  Meyers,  (2002) diperoleh  KHM  kitosan      500    s/d  1000  bpj tergantung  dari  jenis  bakteri  dan  bobot  molekul kitosan.   Nilai KHM kitosan dengan adanya ekstrak rosella  625  bpj  adalah        0,19  bpj  ,  artinya  KHM kitosan  oleh  adanya  ekstrak  rosella  menurun  250 kalinya.  Menurut  Raafat,  Bargen,  Haas,  &  Sahl, (2008) Hasil perhitungan berdasarkan nilai KHM dari Tabel 1 di atas maka diperoleh nilai FICI ( Fractional Inhibition  Concentration  Index) dari  kombinasi kedua  bahan  tersebut  yaitu  <  0,50  yang  berarti aktivitas  antibakteri  terhadap S.  aureus bersifat sinergis.

## KESIMPULAN
Aktivitas  antibakteri  dari  kombinasi  ekstrak  kelopak bunga  rosella  ( Hibiscus  sabdariffa L.)  dan  kitosan terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus
menunjukkan  efek  sinergis  dengan  nilai Fractional Inhibition Concentration Index (FICI) sebesar <0,5.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terima kasih atas fasilitas sarana dan prasarana dari laboratorium Biofarmaka Fakultas Farmasi UNHAS, sehingga penelitian ini dapat terlaksana.

## DAFTAR PUSTAKA
Bakarnga-Via,  I.,  Yande,  H.  K.,  Kouipou,  R.  M.  T., Kanko,  M.  I.  M.,  Boyom,  F.  F.,  Kammalac,  T. N., & Boyom, F. F. (2016). Effect of Combined Extracts  from  Different  Plant  Parts  of  Annona senegalensis  on  Antibacterial  and  Antifungal Activities. International Journal of Pharmacognosy  and  Phytochemical  Research , 8 (1), 162–166.
Borrás-Linares,  I.,  Fernández-Arroyo,  S.,  Arráez- Roman,  D.,  Palmeros-Suárez,  P.  A.,  Del  Val- Díaz,  R.,  Andrade-Gonzáles,  I.,  …  Segura- Carretero,  A.  (2015).  Characterization  of phenolic compounds , anthocyanidin , antioxidant  and  antimicrobial  activity  of  25 varieties of Mexican Roselle (Hibiscus sabdariffa). Industrial  Crops  &  Products , 69 , 385–394. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2015.02.053 Goy, R. C., Britto, D. De, & Assis, O. B. G. (2009).
A  Review  of  the  Antimicrobial  Activity  of Chitosan. Ciência  E  Tecnologia , 19 (3),  241– 247.
Goy,  R.  C.,  Morais,  S.  T.  B.,  &  Assis,  O.  B.  G. (2016).  Evaluation  of  the  antimicrobial  activity of chitosan and its quaternized derivative on E . coli and S . aureus growth. Revista Brasileira de
Farmacognosia , 26 (1), 122–127. https://doi.org/10.1016/j.bjp.2015.09.010
Haeriah, Rahmatullah, M., Indardaya, A., Utomo, E.,
Novianti,  &  Sartini.  (2017).  The  Production  of Chitosan  from  Shrimp  Shell  Waste  and  Its Formulation  in  Patch  Dosage  Form  Combined with  Aloe  vera  Extract  as  Antiinfection  Agent. International  Journal  of  Applied  Biology , 1 (1),
22–31.
Jabeur,  I.,  Pereira,  E.,  Barros,  L.,  Calhelha,  R.  C., Soković, M., Oliveira, M. B. P. P., & Ferreira, I. C.  F.  R.  (2017).  Hibiscus  sabdariffa  L.  as  a source  of  nutrients,  bioactive  compounds  and colouring  agents. Food  Research  International , 100 , 717–723.
Jung, E., Kim, Y., & Joo, N. (2013). Physicochemical properties  and  antimicrobial  activity  of  Roselle
( Hibiscus sabdariffa L .). Journal Science Food Agriculture , (93), 3769–3776.
Kong,  M.,  Chen,  X.  G.,  Xing,  K.,  &  Park,  H.  J. (2010). Antimicrobial properties of chitosan and mode  of  action:  A  state  of  the  art  review. International  Journal  of  Food  Microbiology , 144 (1), 51–63.
Liu,  K.,  Tsao,  S.,  &  Yin,  M.  (2005).  In  vitro
Antibacterial  Activity  of  Roselle  Calyx  and Protocatechuic  Acid. Phtyotherapy  Research ,
19 (11), 942–945.
No,  H.  K.,  Park,  N.  Y.,  Lee,  S.  H.,  &  Meyers,  S.  P. (2002).  Antibacterial  activity  of  chitosans  and chitosan  oligomers  with  different  molecular weights. International Journal of Food
Microbiology , 74 (1-2), 65–72.
Olga,  P.,  Petar,  K.,  Jelena,  M.,  &  Srdjan,  R.  (2008).
Screening method for detection of hydrocarbon- oxidizing  bacteria  in  oil-contaminated  water and  soil  specimens. Journal  of  Microbiological Methods , 74 , 110–113.
Raafat,  D.,  Bargen,  K.  Von,  Haas,  A.,  &  Sahl,  H. (2008).  Insights  into  the  Mode  of  Action  of Chitosan  as  an  Antibacterial  Coumpound. Applied  and  Environmental  Microbiology ,
74 (12), 3764–3773.
Sindi,  H.  A.,  Marshall,  L.  J.,  &  Morgan,  M.  R.  A.
(2014). Comparative Chemical and Biochemical  Analysis  of  Extracts  of  Hibiscus sabdariffa. Food Chemistry , 164 , 23–29.
Valgas,  C.,  Souza,  S.  M.  De,  Smânia,  E.  F.  A.,  &
Smânia  Jr,  A.  (2007).  Screening  Methods  To Determine  Antibacterial  Activity  of  Natural Products. Brazilian  Journal  of  Microbiology ,
(38), 369–380.