Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.

## ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA ANTIBAKTERI DARI BULU BABI

## Isolation and Characterization of Antibacterial Compounds from Sea Urchin

## Febrina Olivia Akerina*, Tati Nurhayati,  Ruddy Suwandy
Departemen Teknologi Hasil Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor. Jalan Agatis Lingkar Akademik, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680.
Telepon : 0251-622915 Faks. : 0251-8622916 *Korespondensi: feraakerina@rocketmail.com Diterima 20 Februari 2015/Disetujui 20 April 2015

## Abstrak
Bulu babi merupakan biota perairan yang memiliki nilai gizi tinggi. Senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh  bulu  babi  memiliki  potensi  untuk  dimanfaatkan  sebagai  senyawa  antibakteri  alami.  Penelitian  ini bertujuan untuk mendapatkan ekstrak bulu babi menggunakan metode maserasi, menentukan aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi sumur; menentukan komponen gizi berdasarkan AOAC, komponen bioaktif menggunakan metode fitokimia dan toksisitas ekstrak bulu babi Diedema setosum menggunakan brine shrimp lethality test (BSLT). Bulu babi diperoleh dari Pulau Pramuka Kepulauan Seribu sebanyak 200 ekor. Ekstrak gonad bulu babi memiliki aktivitas antibakteri tertinggi dengan zona hambat (1,83 ± 0,74) mm terhadap bakteri Escherichia coli dan 1,5 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus . Komposisi kimia gonad bulu babi secara berurutan adalah kadar air (64,97 ± 0,08%); kadar abu (2,72 ± 0,13%); kadar lemak (19,73 ± 0,04%); kadar protein (12,26 ± 0,3%); dan kadar karbohidrat (0,33 ± 0,17%). Komponen bioaktif yang terdeteksi pada ekstrak n-heksana, etil asetat, dan metanol gonad bulu babi adalah golongan steroid, triterpenoid, dan saponin. Nilai LC 50 ekstrak gonad bulu babi dari masing-masing pelarut berturut-turut ekstrak n-heksana 471,861 ppm, etil asetat 563,226 ppm, dan metanol 577,531 ppm. Aktivitas antibakteri ekstrak gonad bulu babi terbaik diperoleh dari ekstrak etil asetat pada konsentrasi 2 mg dengan diameter zona hambat 2,71 mm terhadap bakteri S. aureus dan 4,13 terhadap bakteri E. coli .
Kata Kunci : Antibakteri, bulu babi, D. setosum , senyawa bioaktif

## Abstract
Sea urchin is highly valued seafood. Its bioactive compound also has a potential as natural antibacterial agent. The aim of this research was to screen the antibacterial activity using cup-plate method, toxicity potential  using  brine  shrimp  lethality  test  (BSLT)  method,  bioactive  compound  using  phytochemical method, and proximate composition by AOAC. This research was devided into two phases, the preliminary research was to determine the best body part of sea urchin showing antibacterial activity. Sea urchins were collected from Pramuka Island and extracted by meseration method. For the preliminary research, gonad extract showed the high antibacterial activity against E. coli and S. aureus at 1.83 ± 0.74  mm and 1.5 mm, respectively. The main research includes the determination of proximate composition, toxicity, bioactive compound, and antibacterial activity from the best body part of sea urchin. The proximate composition from gonad of sea urchin showed that water content 64.97 ± 0.08%; ash 2.72 ± 0.13%; lipid 19.73 ± 0.04%; protein 12.26 ± 0.3%, and 0.33 ± 0.17%, respectively. The detected bioactive compounds from the three different solvents of gonads extracts were steroid, triterpenoid and saponin. The result of lethal toxicity (LC 50 )  from the three gonads extract was 471.861 ppm  (n-hexane), 563.226 ppm (ethyl acetate) and 577.531 ppm (methanolic), respectively. Gonads ethyl acetate extracts showed the highest antibacterial activity than n-hexane and methanolic extract, its inhibition zone was  2.71 mm against S. aureu s and  4.13 against E. coli .
Keyword : Antibacteria, bioactive compound, D. setosum , sea urchin
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
tipe  baru  untuk  dikembangkan  dalam  bidang farmasi karena mengandung senyawa bioaktif.
Hewan-hewan  laut  tidak  terlindungi  dari bakteri-bakteri yang toleran terhadap konsentrasi tinggi,  jamur,  dan  virus,  yang  mungkin saja  bersifat  patogen  terhadap  organisme tersebut.  Pertahanan  dari  suatu  organisme tergantung  dari  efisiensi  senyawa  antimikroba yang  dihasilkan  untuk  dapat  melindungi dirinya  terhadap  infeksi  mikroba  tersebut (Abubakar et  al. 2012).  Li et  al. (2010) melaporkan  bahwa  43%    aktivitas  antimikroba berasal dari 83 spesies echinodermata yang tidak diidentifikasi  yang  diperoleh  dari  pantai  barat Baja California dan Teluk California sebesar 58% dari 36 spesies yang tidak diidentifikasi dari Laut Karibia juga menunjukkan aktivitas antimikroba. Bryana et al. (1997)  menyatakan bahwa di Teluk Meksiko,  80%  dari  22  spesies  echinodermata menunjukkan  aktivitas  antimikroba.  Penelitian lainnya yang dilaporkan oleh Haug et al. (2002) menunjukkan  bahwa  aktivitas  antibakteri ditemukan pada bagian tubuh yang berbeda dari green  sea  urchin dengan  menggunakan  bakteri uji Vibrio  anguillarum serotipe  O 2 (FT  1801), Escherichia  coli
(ATCC  15922)  dan Staphylococcus  aureus (ATCC  9144)  dan Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032).  Hasil    ini    menunjukkan  bahwa filum  echinodermata  salah  satunya  bulu  babi memiliki  potensi  sebagai  antimikroba  alami (Uma dan Parvathavarthini 2010).
Aprilia et  al. (2012)  menyatakan  duri  dan cangkang  bulu  babi  memiliki  potensi  sebagai antimikroba  karena  memiliki  kandungan senyawa  bioaktif  yang  bersifat  toksik,  senyawa tersebut  antara  lain  histamin,  serotoin, glikosida,  steroid,  bahan cholinergic ,  dan brandykinin-like  substances (Dahl et  al. 2010). Abubakar et  al. (2012)  menyatakan  bahwa berbagai  faktor  antimikroba  yang  berasal dari  echinodermata  yaitu  steroidal  glikosida (Andersson et  al. 1989),  sterol  polihidroksilat (Iorizzi et al. 1995), lisosom (Canicatti dan Roch, 1989;  Stabili  dan  Pagliara,  1994), complement- like substance (Leonard et al. 1990) dan peptida antimikroba (Beauregard et al. 2001).

## PENDAHULUAN
Bulu babi merupakan salah satu  jenis biota perairan yang berasal dari filum echinodermata. Penyebaran bulu babi terlihat hampir di seluruh zona perairan. Suwignyo et al. (2005) menyatakan bahwa ada 950 spesies bulu babi yang tersebar di seluruh dunia. Penyebaran bulu babi di perairan Indonesia,  Malaysia,  Filipina,  dan  wilayah Australia  Utara  sekitar  316  jenis,  sedangkan  di perairan Indonesia sendiri sekitar 84 jenis yang berasal dari 48 marga dan 21 suku (Aziz 1987).
Diadema  setosum merupakan  salah  satu jenis  bulu  babi  yang  penyebarannya  di  seluruh zona  terumbu  karang  antara  lain  pada  zona pasir,  zona  pertumbuhan  alga,  zona  lamun sampai  daerah  tubir  (Zakaria  2013).  Populasi spesies  lebih  banyak  ditemukan  pada  daerah karang yang kondisinya telah rusak. Spesies ini hidupnya  mengelompok  dengan  tujuan  untuk mempertahankan diri dari ancaman musuh. Satu kelompok  terdiri  dari  20-40  individu,  dan  bisa mencapai  ratusan  individu  dimana  kelompok tersebut  dapat  berpindah-pindah.  Bulu  babi secara umum merupakan hewan nokturnal yang aktif pada malam hari, sepanjang siang mereka bersembunyi  di  celah-celah  karang  dan  keluar pada malam hari untuk mencari makan. Secara umum  bulu  babi  memakan  alga  coklat,  alga hijau  dan  lamun  sebagai  makanan  utamanya sedangkan D. setosum , karena hidupnya di bawah batas surut terendah maka sumber makanannya berasal  dari  berbagai  jenis  alga  serta  partikel organik/detritus (Ratna 2002).
Bulu  babi  memiliki  cangkang  yang  keras dan bagian dalamnya bersisi lima simetris. Bulu babi  jenis  tertentu  memiliki  cangkang  yang dilapisi  oleh  pigmen  cairan  hitam  yang  stabil. Selain  memiliki  cangkang  yang  keras,  95% bagian  tubuh  bulu  babi  didominasi  oleh  duri- duri yang sangat rapuh dan sedikit beracun. Duri ini digunakan untuk bergerak, melindungi diri, serta mencapit  makanan, dan untuk jenis-jenis tertentu  mengandung  racun.  Abubakar et  al. (2012) menyatakan bahwa toksin yang dihasilkan oleh  organisme  salah  satunya  bulu  babi  dapat dimanfaatkan  dalam  bidang  pengobatan  yang berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai antibiotik
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
Penelitian mengenai isolasi dan karakterisasi komponen  bioaktif  dari  bulu  babi  di  Indonesia belum banyak dilakukan, penelitian lebih banyak diarahkan pada uji toksisitas, asam lemak, asam amino, logam berat, dan sebagainya. Potensi bulu babi  sebagai  antibakteri  perlu  dikembangkan karena  dapat  dimanfaatkan  sebagai  bahan obat  dalam  bidang  farmasi. Penelitian  ini bertujuan  untuk  mendapatkan  ekstrak  bulu  babi menggunakan  metode  maserasi,  menentukan aktivitas  antibakteri  menggunakan  metode  difusi sumur;  menentukan  komponen  gizi  berdasarkan
AOAC, komponen bioaktif menggunakan metode fitokimia dan toksisitas ekstrak bulu babi Diedema setosum menggunakan brine  shrimp  lethality  test (BSLT).

## BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  bulu  babi  jenis Diadema  setosum yang diambil dari Pulau Pramuka, Kepulauan Seribu, Jakarta. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi  adalah  metanol  (Merck),  etil  asetat (Merck), dan n-heksana (Merck). Bahan lain yang digunakan untuk analisis adalah bakteri Escherichia  coli (ATCC  8739)  dari  IPBCC,
Staphylococcus aureus (ATCC 6538) dari LIPI Cibinong, Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), Mueller Hinton Agar (MHA), akuades, larva Artemia salina . Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  antara  lain, orbital  shaker (WideShake  SHO-1D), vacum  rotary evaporator (Eyela  OSB-2110),  autoklaf (Yamato  SM  52),  spektrofotometer  (UV  VIS RS 2500), inkubator (Yamato IS900), laminar, oven sterilisasi (Yamato SH62), oven pengering (EHRET), vial BSLT.

## Prosedur Penelitian
Penelitian ini dibagi menjadi dua bagian yakni penelitian pendahuluan dan penelitian utama.  Penelitian  pendahuluan  terdiri  dari proses  ekstraksi  dan  pengujian  aktivitas antibakteri  bulu  babi.  Penelitian  utama meliputi  analisis  proksimat,  yakni  kadar  air, kadar  abu,  kadar  protein,  kadar  lemak  dan
kadar  karbohidrat  ( by  difference );  analisis fitokimia  yakni  steroid-terpenoid,  flavonoid, alkaloid,  saponin,  fenol  hidrokuinon,  dan ninhidrin;  analisis brine  shrimp  lethality  test (BSLT);  analisis  aktivitas  antibakteri  metode difusi sumur.

## Ekstraksi
Ekstraksi  dilakukan  dengan  cara sebanyak  50  g  sampel  direndam  dalam pelarut  n-heksana,  etil  asetat  dan  metanol dengan perbandingan 1 : 3 selama 3 x 24 jam. Ekstrak disaring menggunakan kertas saring kemudian  dievaporasi  dengan vacum  rotary evaporator pada  suhu  37-40ºC,  selanjutnya ekstrak  disimpan  pada  suhu chiling (0-4ºC) sebelum dianalisis.
Analisis aktivitas antibakteri (Moorthy et al. 2007)
Pengujian  aktivitas  antibakteri  terhadap bakteri  uji  menggunakan  metode  difusi sumur.  Sumur  dengan  kedalaman  ±  3  mm dibuat  pada  MHA  yang  telah  dicampurkan dengan  20  μL  inokulum  bakteri  uji  dengan menggunakan  pipet  tetes  steril.  Ekstrak dengan  konsentrasi  0,5  mg,  1  mg,  dan 2  mg  ditetes  ke  dalam  sumur  sebanyak 20 μL. Perlakuan kontrol positif menggunakan antibiotik kloramfenikol, dan kontrol negatif menggunakan pelarut metanol, etil asetat, dan n-heksana. Media diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam, pengamatan terhadap aktivitas antibakteri  dilakukan  tiap  dua  jam  untuk menentukkan  sifat  ekstrak  terhadap  bakteri uji.  Aktivitas  antibakteri  ditandai  dengan terbentuknya  zona  bening  di  sekitar  sumur dan diukur menggunakan penggaris.
Analisis Toksisitas (BSLT) (Mayer et al. 1982) Pengujian  dilakukan  dengan  cara  telur Artemia  salina diretaskan  di  dalam  air  laut selama  24-48  jam,  selanjutnya  larva  siap digunakan  sebagai  hewan  uji. A.  salina dimasukkan  dalam  vial  (sumur)  yang  telah berisi  ekstrak  bulu  babi  terbaik  dengan konsentrasi  masing-masing  0,  50,  100,  200,
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
bagian  lain.  Bulu  babi  merupakan  hewan laut  yang  sebagian  besar  tubuhnya  dilapisi dengan  cangkang  dan  duri.  Cangkang  bulu babi  (endoskleton)  merupakan  kerangka kapur  dan  tersusun  dari  kalsium  karbonat. Penyusun utama duri bulu babi adalah kalsium karbonat dan magnesium. Ukuran duri bulu babi  berbeda-beda  tergantung  jenis.  Duri D.  setosum tajam  dan  lebih  mudah  rapuh. Selain digunakan sebagai pertahanan terhadap musuh, duri bulu babi juga digunakan untuk berpindah-pindah (Vimono 2007).

## Ekstraksi Bulu Babi
Proses  ekstraksi  dilakukan  untuk mendapatkan  senyawa  bioaktif  dari  bagian tertentu  suatu  bahan  dan  proses  ini  sangat tergantung  pada  kadar  air  yang  terkandung dalam  bahan  dan  tekstur  bahan  yang  akan diekstraksi serta jenis zat yang akan diisolasi (Harborne  1984).  Alkohol  merupakan pelarut yang baik digunakan untuk ekstraksi pendahuluan  karena  dapat  mengekstraksi habis komponen aktif. Pelarut metanol dapat mengekstrak komponen alkaloid,  komponen fenolik, karotenoid, tanin, gula, asam amino, dan glikosida. Ekstraksi bulu babi dilakukan terhadap tiga bagian berbeda yaitu cangkang, duri,  dan  gonad  menggunakan  pelarut metanol.  Rendemen  ekstrak  masing-masing bagian bulu babi dapat dilihat pada Tabel 1. Bagian  bulu  babi  yang  menghasilkan rendemen  tertinggi  adalah  gonad  yakni 7,10% dan terendah adalah duri yakni 0,94%. Rendemen  gonad  bulu  babi  yang  tinggi mengindikasikan  banyak  komponen  bioaktif yang mampu diekstrak oleh pelarut metanol.
500, dan 1000 ppm dengan 3 kali ulangan. Vial tersebut kemudian diinkubasi selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan melihat jumlah A. salina yang mati pada masing-masing vial (sumur).  Penentuan  LC 50 dilakukan  dengan analisis  probit  dengan  selang  kepercayaan 95% pada program  SPSS 22.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Morfometrik dan Rendemen Bulu Babi
Diadema  setosum (Gambar  1)  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  diambil dari  Pulau  Pramuka,  Kepulauan  Seribu. Pengukuran  diameter  dan  berat  bulu  babi dilakukan  terhadap  30  ekor  bulu  babi,  rata- rata  diameter  bulu  berkisar  antara  5,8-7,0 cm,  dengan  berat  berkisar  antara  57-63  g. Hubungan  pertumbuhan  diameter  dengan pertambahan berat bulu babi adalah isometrik, sedangkan  pertambahan  berat  cangkang dan  berat  total  tidak  secepat  pertambahan tinggi  cangkang  (Tuwo  1995).  Dincer  dan Cakli (2007) menyatakan bahwa meningkatnya  berat  gonad  (telur)  seiring dengan  meningkatnya  berat  total  bulu  babi, tapi  hubungan  ini  terjadi  hanya  pada  saat proses  bertelur  ( spawning )  dari  bulu  babi tersebut. Rendemen merupakan persentase perbandingan  antara  berat  bagian  bahan yang  digunakan  dengan  berat  total  bahan. Berat  total  bulu  babi  30  ekor  adalah  610  g dengan  presentase  masing-masing  yakni duri 17,37%, cangkang 46,72%, gonad 8,03%, dan  bagian  lainnya  16,88%.  Cangkang  dan duri  merupakan  bagian  dengan  persentase rendemen tertinggi dibandingkan gonad dan
Gambar 1 Diadema setosum
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
Kadar air yang tinggi juga diduga merupakan faktor  lain  yang  mempengaruhi  tingginya rendemen gonad bulu babi, karena gonad bulu babi  tidak  dikeringkan  sebelum  diekstraksi, berbeda  dengan  cangkang  dan  duri.  Pelarut metanol  merupakan  pelarut  polar  yang mampu mengekstrak komponen dalam bahan termasuk air (Rahayu 1999).

## Aktivitas Antibakteri Bulu Babi
Adanya  aktivitas  antibakteri  terhadap bakteri uji ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambat. Zona hambat yang  ditampilkan telah dikurangi diameter sumur sebesar 6 mm (Tabel 1). Zona hambat tertinggi ditunjukkan pada  ekstrak  gonad  bulu  babi  yaitu,  1,83  ± 0,74 mm terhadap E. coli dan 1,5 mm terhadap S. aureus , dibandingkan ekstrak cangkang dan duri bulu babi. Hasil ini sejalan dengan hasil yang diperoleh Abubakar et al. (2012), yakni ekstrak metanol gonad babi memiliki aktivitas antibakteri tertinggi terhadap bakteri E. coli dan S. aureus secara berurutan 16 mm dan 13 mm.
Proses pengeringan yang dilakukan terhadap cangkang  dan  duri  diduga  mempengaruhi
aktivitas  zona  hambat  yang  terbentuk. Wang  dan  Weller  (2006)  menyatakan  bahwa secara  umum  komponen  bioaktif  cepat mengalami  kerusakan  karena  sifatnya  yang tidak tahan panas ( thermolabile ).
Daya  hambat  ekstrak  bulu  babi  dapat ditentukan  oleh  diameter  zona  hambatnya. Davis  dan  Stout  (1971)  menyatakan  bahwa terdapat  3  kategori  daerah  hambatan  zat aktif  berdasarkan  diameter  zona  hambatnya yakni  untuk  kategori  lemah  diameter  zona hambatnya  <5  mm,  kategori  sedang  yakni 5–10 mm, dan kategori kuat yakni 10–20 mm. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa daya hambat  ekstrak  bulu  babi  termasuk  kategori lemah.

## Komponen Kimia Gonad Bulu Babi
Komponen  gizi  dalam  suatu  bahan sangat  menentukan  mutu  dari  bahan tersebut. Analisis proksimat bertujuan untuk mengetahui komposisi kimia gonad bulu babi yang  meliputi  kadar  air,  kadar  abu,  lemak, protein, abu, dan karbohidrat ( by difference ). Hasil analisis proksimat gonad bulu babi dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 1 Hasil analisis ekstrak bulu babi Bagian bulu babi Rendemen ekstrak metanol (%) Antivitas antibakteri (mm) S. aureus E. coli Cangkang 1,64 1,25 ± 0,25 1,63 ± 0,63 Duri 0,94 - 1,5 Gonad 7,10 1,5 1,83 ± 0,74 Bagian lain - - - Keterangan: Konsentrasi ekstrak yang digunakan 10000 ppm Tabel 2 Komposisi kimia gonad bulu babi Bagian bulu babi Komposisi kimia (%) Komposisi kimia (*%) Kadar air 64,97 ± 0,08 73,4 Kadar abu 2,72 ± 0,13 2,1 Kadar lemak 19,73 ± 0,04 3,5 Kadar protein 12,26 ± 0,34 15,1 Kadar karbohidrat 0,33 ± 0,17 - Keterangan: *Zlatanos et al. (2009)
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
McAlister dan Moran (2012) menyatakan bulu babi memiliki tiga komponen biokimia yang  penting  yaitu  protein,  lemak,  dan karbohidrat. Ketiga komponen ini merupakan penyedia energi bagi bulu babi dan penyusun struktur  elemen  dalam  proses  pembentukan dan perkembangan telur.
Kadar  lemak  gonad  bulu  babi  pada penelitian  ini  yaitu  19,73%.  Bulu  babi  jenis D . setosum merupakan  salah  satu  jenis  bulu babi dengan larva planktotrofik, dimana larva memperoleh nutrisi dari organisme plankton dan detritus (Jablonsky dan Lutz 1983). Hasil yang diperoleh sejalan dengan penelitian yang dilakukan McAlister dan Moran (2012), yakni kadar lemak tertinggi ditunjukkan pada bulu babi Echinometra  lucunter yang  merupakan bulu babi planktotrofik 30,7%.
Faktor  yang  mempengaruhi  kandungan lemak  dalam  gonad  bulu  babi  salah satunya  adalah  makanan.  McAlister  dan Moran  (2012)  menyatakan  bahwa  terdapat 2  jenis  sumber  bahan  makanan  bulu  babi yaitu  non-planktonik  yang  bukan  berasal dari  plankton  tapi  berasal  dari  kuning  telur induknya dan planktotrofik yang berasal dari fitoplankton  maupun zooplankton. Faktor lain  yang  juga  mempengaruhi  tingginya kadar  lemak  yaitu  ukuran  gonad,  gonad bulu  babi  yang  berukuran  besar  secara proporsional  mengandung  lemak  yang lebih  banyak.  Kandungan  lemak  yang  tinggi cenderung  menghasilkan  volume  gonad yang  besar,  sehingga  dapat  dimanfaatkan sebagai  cadangan  energi  untuk  proses perkembangannya  (Byrne et al. 2008) Bulu babi diketahui merupakan salah satu hasil  perikanan  yang  memiliki  kandungan protein  tinggi.  Fungsi  protein  sangat  khas yakni  membangun  serta  memelihara  sel-sel dan  jaringan  tubuh  makhluk  hidup,  fungsi ini tidak dapat digantikan oleh zat gizi yang lain.  Kadar  protein  gonad  pada  penelitian ini  yaitu  12,2%.  Hasil  ini  berbeda  dengan penelitian  yang  dilakukan  oleh  McAlister dan Moran (2012), bahwa kadar protein bulu babi planktotrofik berkisar antara 57,4-69,4%,
hal  ini  dikarenakan  perbedaan  metode  yang digunakan  yakni  modifikasi  metode  Lowry sedangkan  penelitian  ini  menggunakan metode  Kjeldahl.    Kamizake et  al. (2003) menyatakan  bahwa  analisis  total  protein menggunakan metode spektofotometri diantaranya  metode  Bradford  dan  Lowry digunakan  pada  bidang  analisis  biokimia, fisiologi, analisis klinik dan penelitian medis lebih  baik  dibandingkan  bidang  lainnya, serta  menunjukkan  hasil  yang  lebih  baik dibandingkan  metode  Kjeldahl,  dalam penerapannya metode Kjeldahl memiliki dua masalah  utama  yakni  membutuhkan  waktu yang lama dan dilakukan untuk menentukan perbedaan  antara  non-protein  nitrogen dan  total  nitrogen  protein,  yang  secara  luas digunakan  pada  bidang  ilmu  pangan  dan teknologi.
Walker et  al. (2007)  menyatakan  gonad bulu  babi  terdiri  atas  2  bagian  yakni  sel-sel germinal (sel-sel reproduksi) dan sel-sel nutrisi. Protein,  lemak,  dan  karbohidrat  (glikogen) merupakan  bagian  dari  sel-sel  nutrisi  gonad bulu babi. Dalam proses pematangan gonad, protein,  lemak,  dan  karbohidrat  (glikogen) ini  akan  mengalami  penurunan  sedangkan kadar  air  akan  mengalami  peningkatan. Karena ketiga zat gizi ini yang dipakai selama proses  pematangan  gonad.  Setelah  proses pematangan  gonad  ini,  maka  gonad  siap untuk  melakukan  proses  pemijahan.  Gonad yang telah matang atau dewasa akan ditandai dengan volume gonad yang memenuhi bagian dalam cangkang dan ukurannya yang berkisar antara 80 -100 μm.
Kandungan  air  gonad  bulu  babi dalam  penelitian  lebih  rendah  yakni 64,9%  dibandingkan  hasil  penelitian Zlatanos et  al. (2009)  dalam  gonad  bulu babi  merupakan  salah  satu  komponen utama  penyusun  bulu  babi.  Isengard  (2001) menyatakan  bahwa  stabilitas  dan  masa simpan  suatu  bahan  sangat  ditentukan  oleh kandungan air di dalamnya. Tingginya kadar air dapat menyebabkan bahan pangan mudah mengalami kemunduran mutu salah satunya
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
akibat  aktivitas  mikroorganisme,  sehingga diperlukan penanganan yang cepat dan tepat dengan mempertahankan rantai dingin.
Kadar  abu  merupakan  akumulasi  dari semua jenis mineral dan komponen anorganik yang  ada  pada  suatu  bahan  pangan  salah satunya  adalah  bulu  babi.  Kadar  abu  sampel tidak  berbeda  jauh  dibandingkan  dengan Zlatanos et al. (2009) yakni 2,72%. Kadar abu dari  masing-masing  spesies  berbeda-beda, tergantung  dari  lokasi,  ketersediaan  mineral pada  daerah  tumbuh  bulu  babi.  Walaupun diperlukan dalam jumlah sedikit, mineral juga diperlukan  untuk  proses  metabolisme  dan pertumbuhan (Hammer et al. 2006).
Darsono (1986) menyatakan gonad bulu babi berkualitas baik memiliki tekstur kompak dan  padat,  namun  pada  saat  telah  mencapai fase  matang  (dewasa)  tekstur  gonad  lebih lunak  dan  berlendir  ini  diduga  disebabkan karena tingginya kadar air pada gonad. Fase yang  tepat  untuk  proses  pemanenan  bulu babi  juga  sangat  mempengaruhi  proses keberlanjutan bulu babi itu sendiri. Fase yang tepat untuk proses pemanenan bulu babi ini pada  saat  fase  pijah  lanjut  ( post  spawning / recovery ) dan pada fase ini juga tekstur gonad bulu babi kompak dan padat sehingga dapat dimanfaatkan sebagai bahan makanan bergizi. Kualitas  bulu  babi  tidak  bergantung  pada perkembangan  proses  gametogenesisnya tetapi tergantung dari akumulasi nutrien pada gonad bulu babi tersebut.

## Ekstrak Gonad Bulu Babi
Proses  ekstraksi  gonad  bulu  babi dilakukan dengan metode maserasi bertingkat. Senyawa  bioaktif  yang  berikatan  dengan bahan akan ditarik oleh pelarut berdasarkan tingkat  kepolaran.  Pelarut  yang  digunakan adalah n-heksan (non polar), etil asetat (semi polar),  dan  metanol  (polar).  Warna  ketiga esktrak  berbeda,  untuk  ekstrak  n-heksan berwarna  coklat  keemasan  dan  agak  cair. Ekstrak etil asetat berwarna coklat kehitaman dan berbentuk pasta sedangkan untuk pelarut metanol berwarna coklat kekuningan.
Ekstraksi  dengan  menggunakan  pelarut yang  berbeda  menghasilkan  ekstrak  dengan bobot yang berbeda, yakni ekstrak etil asetat dengan  persentasi  tertinggi  16,25%,  ekstrak metanol 4,31%, dan ekstrak n-heksan 1,72%. Bahan  kimia  pelarut  memiliki  kemampuan yang  berbeda-beda  untuk  mengekstrak komponen bioaktif tertentu dari suatu bahan. Tingginya  rendemen  pada  ekstrak  etil  asetat berkaitan dengan senyawa semi polar dalam gonad bulu babi yang larut dalam pelarut etil asetat.  Rahayu  (1999)  menyatakan  bahwa pelarut  semi  polar  mampu  melarutkan senyawa-senyawa yang berasal dari golongan alkaloid,  dan  aglikon  (alkoholik,  fenolik, steroid,  flavonoid,  dan  saponin),  sedangkan pelarut  n-heksana  menghasilkan  rendemen lebih  rendah  dibandingkan  kedua  pelarut lainnya,  ini  diduga  karena  gonad  bulu  babi mengandung  sedikit  senyawa  non-polar. Hougthon  dan  Raman  (1998)  menyatakan bahwa pelarut non polar mampu melarutkan senyawa  yang  berasal  dari  golongan trigliserida, minyak atsiri, dan asam lemak.

## Komponen Bioaktif Gonad Bulu Babi
Analisis  komponen  bioaktif  dilakukan dengan  metode  fitokimia  (Tabel  3).  Metode ini digunakan untuk mengetahui kandungan metabolit  sekunder  dari  suatu  bahan. Pengujian  dilakukan  terhadap  ekstrak metanol,  ekstrak  etil  asetat,  dan  ekstrak n-heksan gonad bulu babi. H Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa ketiga  jenis  ekstrak  mengandung  senyawa bioaktif  dari  golongan  steroid,  triterpenoid, dan saponin. Penelitian yang dilakukan oleh Septiadi et  al. (2013)  dengan  menggunakan sampel  dari  filum  echinodermata  (teripang) memperoleh  hasil  yang  sesuai  dengan penelitian  ini  yakni  ekstrak  teripang mengandung komponen bioaktif triterpenoid, steroid,  dan  saponin  pada  ekstrak  etil  asetat dan metanol, dan tidak terdeteksi pada ekstrak n-heksana.
Saponin  ( steroid  oligoglycosides )  bersifat larut  dalam  air  dan  etanol  dan  tidak  larut
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
dalam  eter.  Saponin  juga  memiliki  peran dalam antibakteri dengan mekanisme kerjanya mengganggu  permeabilitas  membran  sel bakteri,  sehingga  terjadi  bakterilisis  pada sel  bakteri  yang  ditandai  dengan  pecahnya membran  sel  (Pranoto et  al. 2012).  Saponin terdapat  pada  tumbuhan  terestrial  namun pada  binatang  saponin  secara  eksklusif terdapat pada echinodermata. Fungsi biologi saponin  pada  echinodermata  berhubungan dengan sistem pertahanan diri terhadap fungi laut,  predator,  dan  parasit.  Senyawa  ini  juga berperan dalam proses reproduksi untuk jenis lain  dari  echinodermata  yakni  bintang  laut dan teripang (Stonik dan Elyakov 1988).
Steroid  dan  triterpenoid  merupakan salah satu komponen dari golongan terpenoid. Senyawa bioaktif yang berasal dari golongan steroid dan triterpenoid juga memiliki potensi sebagai  antibakteri.  Pertumbuhan  bakteri akan  dihambat  dengan  cara  penghambatan sintesis protein dan menyebabkan perubahan komponen-komponen  penyusun  sel  bakteri itu sendiri. Rosyidah et al. (2010) menyatakan bahwa  terpenoid  mudah  larut  dalam  lipid, sifat inilah yang menyebabkan komponen ini lebih mudah menembus dinding sel bakteri.
Toksisitas Ekstrak Gonad Hasil analisis toksisitas BSLT menunjukkan  bahwa  nilai  LC 50 masing- masing  ekstrak  sebagai  berikut,  ekstrak
n-heksana  471,861  ppm,  ekstrak  etil  asetat 563,226  ppm,  dan  ekstrak  metanol  577,531 ppm.  Hasil  ini  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  Bragadeeswaran et  al. (2013), yakni  nilai  LC 50 ekstrak  air Temnopleurus toreumaticus sebesar  0,12  mg/mL  (120  μg/ mL), hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak air T.  toreumaticus lebih  aktif  dibandingkan dengan ekstrak gonad D. setosum . Perbedaan hasil  ini  karena  perbedaan  pelarut  yang digunakan. Albuntana et al. (2011) menyatakan bahwa fraksi air bersifat sangat aktif terhadap BSLT  karena  sifatnya  yang  sangat  polar, sehingga  senyawa  aktif T.  toreumaticus lebih banyak terkonsentrasi pada pelarut air.
Toksisitas  dari  suatu    senyawa  sangat menentukan  penggunaannya  dalam  aplikasi bidang  obat-obatan  yakni  penentuan  dosis. Déciga-Campos et  al. (2007)  menyatakan bahwa  kriteria  toksisitas  berdasarkan  nilai LC 50 terdiri  atas  3  yakni  LC 50 >1000  μg/mL (non toksik), > 500 ≤ 1000 μg/mL (toksisitas lemah) dan < 500 μg/mL (toksik). Firdayani  (2003)  menyatakan  bahwa suatu ekstrak yang bersifat toksik yakni nilai LC 50 <1000 ppm maka dapat dikembangkan ke arah pengembangan obat alternatif antikanker untuk  mengisolasi  senyawa  sitotoksiknya, sedangkan ekstrak tidak bersifat toksik apabila nilai LC 50 >1000 ppm, maka penelitian dapat dilanjutkan dengan melihat potensi lain dari ekstrak tersebut dengan menggunakan hewan uji seperti tikus atau mencit. Tabel 3 Hasil analisis komponen bioaktif gonad bulu babi Bagian bulu babi Pelarut n-heksana Etil asetat Metanol Alkaloid - - + Flavonoid + + - Fenol-hidrokuinon - + - Steroid + + + Triterpenoid +
+ + Tanin - - - Saponin +
+ +
Keterangan: (-) = tidak terdeteksi, (+) = terdeteksi
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Gonad  Bulu
Babi Zona hambat yang terbentuk menunjukkan  adanya  aktivitas  ekstrak untuk  menghambat  pertumbuhan  bakteri. Pengamatan  dilakukan  tiap  2  jam  selama  24 jam, tujuannya untuk melihat sifat dari bakteri uji.  Hasil  yang  ditampilkan  pada  Gambar  2 merupakan pengamatan  jam ke-6 sampai jam ke-12. Hasil  menunjukkan  bahwa  diameter zona  hambat  tertinggi  terdapat  pada  ekstrak etil  asetat  yakni  4,13  mm  terhadap  bakteri E. coli dan 2,71 mm terhadap bakteri S. aureus pada konsentrasi 2 mg dibandingkan dengan ekstrak  n-heksana  dan  metanol.  Hasil  yang diperoleh  juga  menunjukkan  bahwa  ekstrak gonad bulu babi bersifat bakteristatik terhadap bakteri  uji,  karena  zona  hambat  terbentuk hanya pada jam ke-6 sampai jam ke-12.
Penelitian  antibakteri  pada  bulu  babi telah  dilakukan,  beberapa  diantaranya  yakni Shamsudin et  al. (2010)  yang  menyatakan bahwa  ekstrak  etanol  bulu  babi D.  savignyi menujukkan  aktivitas  antibakteri  terbaik dibandingkan  dengan  pelarut  metanol dan  buffer  fosfat  yakni  12  mm  terhadap bakteri S. aureus ,  sedangkan  Uma  dan Parvathavarthini (2010) menyatakan bahwa  ekstrak  n-heksan  bulu  babi Temnopleurus alexandri menunjukkan
aktivitas  antibakteri  tertinggi  pada  bakteri
Bacillus subtilis dan Pseudomonas aeruginosa dengan    diameter  zona  hambat  secara berurutan 16 mm dan 15 mm pada konsentrasi 5000 ppm. Hasil ini menunjukkan bahwa bulu babi memiliki kemampuan sebagai antibakteri terhadap berbagai jenis bakteri.
Aktivitas  antibakteri  dalam  suatu  bahan dipengaruhi  oleh  komponen  bioaktif  yang ada  di  dalamnya.  Komponen  bioaktif  yang berperan dalam menghambat aktivitas bakteri umumnya  berasal  dari  golongan  saponin, terpenoid,  steroid,  alkaloid,  dan  flavonoid dengan  mekanisme  kerjanya  yakni  merusak membran  sel  bakteri  (Darsana et  al. 2012). Pendapat  ini  sejalan  dengan  hasil  yang diperoleh  yakni  senyawa  bioaktif  yang terdeteksi  pada  ekstrak  gonad  bulu  babi berasal  dari  golongan  senyawa  saponin, steroid, dan triterpenoid. Bulu babi ditemukan juga  memiliki  aktivitas  antimikroba terhadap  bakteri,  virus,  dan  fungi  yang dikenal  dengan antimicrobial  peptides (AMPs)  yang  terdapat  pada  cairan coelomic dan  memiliki  berat  molekul  kecil  yakni <10 kDa serta asam amino tidak lebih dari 100 (Scihillaci dan Arizza 2013).
Zona  hambat  yang  terbentuk  diketahui bahwa  aktivitas  antibakteri  ekstrak  gonad bulu  babi  termasuk  dalam  kategori  lemah. Davis  dan  Stout  (1971)  menyatakan  bahwa terdapat  3  kategori  daerah  hambatan  zat aktif  berdasarkan  diameter  zona  hambatnya
Gambar 2 Aktivitas antibakteri ekstrak gonad bulu babi (      ) 0,5 mg, (      ) 1 mg, (      ) 2 mg
Zo na ha m ba t (mm)
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
yakni  untuk  kategori  lemah  diameter  zona hambatnya  <5  mm,  kategori  sedang  yakni 5–10 mm, dan kategori kuat yakni 10–20 mm.

## KESIMPULAN
Ekstrak  gonad  bulu  babi  menunjukkan aktivitas  antibakteri  tertinggi  dengan  zona hambat    1,83  ±  0,74    mm  terhadap  bakteri E. coli dan 1,5 mm terhadap bakteri S. aureus pada  konsentrasi  2  mg.  maka  gonad  bulu babi  yang  digunakan  sebagai  sampel  pada penelitian  utama.  Komposisi  kimia  gonad bulu  babi  adalah  kadar  air  (64,97  ±  0,08%), kadar abu (2,72 ± 0,13%), kadar lemak (19,73 ± 0,04%), kadar protein (12,26 ± 0,3%), dan kadar karbohidrat (0,33 ± 0,17%). Komponen bioaktif yang terdeteksi pada gonad bulu babi adalah steroid, triterpenoid, dan saponin. Nilai LC 50 ekstrak  gonad  bulu  babi  yaitu  ekstrak n-heksana  471,861  ppm,  ekstrak  etil  asetat 563,226  ppm,  dan  metanol  577,531  ppm. Uji  aktivitas  antibakteri  ekstrak  gonad  bulu babi tertinggi pada ekstrak etil asetat dengan diameter  zona  hambat  2,71  mm  terhadap bakteri S.  aureus dan  4,13  mm  terhadap bakteri E. coli .

## DAFTAR PUSTAKA
[AOAC].  2005.  Association  of  Official Analytical  Chemist.  Official  Method  of Analysis  of  The  Association  of  Official Analytical  of  Chemist.  Arlington  (US).
Published  by  The  Association  of  Official
Analytical Chemist. Inc.
Abubakar  L,  Wangi  C,  Uku  J,  Ndirangu  S. 2012.  Antimicrobial  activity  of  various extracts  of  the  sea  urchin Tripneustes gratilla ( Echinoidea ). African  Journal  of Pharmacology  and  Therapeutics 1(1):19- 23. Albuntana A, Yasman, Wardhana W. 2011. Uji toksisitas ekstrak empat jenis teripang suku Holothuriide dari Pulau Penjaliran Timur
Kepulauan  Seribu,  Jakarta  menggunakan brine  shrimp  lethality  test (BSLT). Jurnal
Ilmu dan Teknologi Tropis 3(1):65-72.
Aminur RM, Arshad A, Yusoff FM. 2014. Sea
urchins (echinodermata: Echinoidea): their biology, culture and bioactive compounds.
International  Conference  on  Agricultural,
Ecological  and  Medical  Sciences 39-48. doi:10.15242/iicbe.c714075. Andersson  L,  Bohlin  L,  Iorizzi  M,  Riccio R,  Minale  L,  Moreno-Lopez  W.  1989. Biological  activity  of  some  saponins  and saponin-like compounds from starfish and brittle-stars. Toxicon 27(2):179–188.
Aprilia  HA,  Pringgenies  D,  Yudiati  E.  2012. Uji toksisitas ekstrak kloroform cangkang dan  duri  landak  laut  ( Diadema  setosum ) terhadap  mortalitas Nauplius artemia sp. Journal of Marine Research 1(1):75-83.
Arias-Forero  D,  Hayashida  G,  Aranda  M, Araya S, Portilla T, García A, Díaz-Palma P.  2013.  Protocol  for  maximizing  the triglycerides-enriched  lipids  production from Dunaliella salina SA32007 biomass, isolated  from  the  Salar  de  Atacama (Northern  Chile). Advances  in  Bioscience and Biotechnology 04(08):830-839. doi:10.4236/abb.2013.48110. Aziz  A.  1987.  Makanan  dan  cara  makan berbagai jenis bulu babi. Journal of Oseana 29(4):91-100
Aziz  A.  1993.  Beberapa  catatan  tentang perikanan  bulu  babi. Journal  of  Oseana 18(2):65-75. Beauregard KA, Truong NT, Zhang HY, Lin WY, Beck G. 2001. The detection and isolation of  a  novel  antimicrobial  peptide  from the  echinoderm, Cucumaria  frondosa . Advances  in  Experimental  Medicine  and Biology 484: 55–62.
Bragadeeswaran  S,  Kumaran  SN,  Sankar  PP,
Prabahar R. 2013. Bioactive potential of sea urchin Temnopleurus  toreumaticus from
Devanampattinam,  Southeast  coast  of India. Journal of Pharmacy and Alternative Medicine 2(3): 9-18. Bryana PJ, McClintock JB, Hopkins TS. 1997.
Structural  and  chemical  defenses  of echinoderms  from  the  northern  Gulf  of
Mexico. Journal  of  Experimental  Marine Biology and Ecology 210(2):173-186.
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
Byrne  M,  Sewell  MA,  Prowse  TAA.  2008. Nutritional  ecology  of  sea  urchin  larvae: influence  of  endogenous  and  exogenous nutrition  on  echinopluteal  growth  and phenotypic  plasticity  in Tripneustes gratilla . Functional Ecology 22(4):643–648. Canicatti C, Roch P. 1989. Studies on Holothuria polii ( Echinodermata ) antibacterial proteins.  I.  Evidence  for  and  activity  of a  coelomocyte  lysozyme. Experientia 45(8):756–759.
Dahl  WJ,  Jebson  P,  Louis  DS.  2010.  Sea urchin injuries to the hand: A case report and  review  of  the  literature. The  Iowa Orthopaedic Journal 30:153-156.
Darsana  IGO,  Besung  INK,  Mahatmi
H.  2012.  Potensi  daun  binahong ( Anredera  cordifolia (Tenore)  Steenis) dalam menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia Coli secara In vitro. Indonesia Medicus Veterinus 1(3):337-351. Darsono  P.  1986.  Gonad  bulu  babi. Oseana 11(4):151-162. Davis WW, Stout T R. 1971. Disc plate method of  microbiological  antibiotic  assay.  II. Novel  procedure  offering  improved accuracy. Applied Microbiology 22(4):666- 670.
Déciga-Campos  M,  Rivero-Cruz  I,  Arriaga-
Alba  M,  Castaneda-Corral  G,  Angeles-
Lopez GE, Navarrete A, Mata R. 2007. Acute toxicity and mutagenic activity of Mexican plants  used  in  traditional  medicine.
Journal of Ethnopharmacology 110(2):334-
342. doi:10.1016/j.jep.2006.10.001.
Dincer T, Cakli S. 2007. Chemical composition and  biometrical  measurements  of  the Turkish sea urchin ( Paracentrotus lividus ,
Lamarck,  1816). Critical  Reviews  in
Food  Science  and  Nutrition 47(1):21-26.
doi:10.1080/10408390600550265.
Facchini  PJ.  2001.  Alkaloid  biosynthesis in  plants:  Biochemistry,  cell  biology,
molecular  regulation,  and  metabolic engineering  applications. Annual  Review of Plant Biology 52(1):29-66. Firdayani,  Agustini  K,  Kusumaningrum  S. 2003.  Uji  sitotoksisitas  ekstrak  methanol spons Gelliodes  fibulatus terhadap A.  salina . Jurnal  Farmasi  Indonesia 1(3):141-145. Hammer  H,  Hammer  B,  Watts  S,  Lawrence A, Lawrence J. 2006. The effect of dietary protein  and  carbohydrate  concentration on  the  biochemical  composition  and gametogenic  condition  of  the  sea urchin Lytechinus  variegatus . Journal of  Experimental  Marine  Biology  and Ecology 334(1):109-121.  doi:10.1016/j. jembe.2006.01.015. Harborne  JB.  1984.  Phytochemical  Methods:
A  guide  to  modern  technique  of  plant analysis. (2 nd edition). Chapman and Hall.
London. 19:137–168.
Haug  T  Kjuul  AK,  Styrvold  OB,  Sandsdalen E,  Olsen  ØM,  Stensvåga  K.  2002.
Antibacterial activity in Strongylocentrotus droebachiensis (Echinoidea), Cucumaria frondosa (Holothuroidea),  and Asterias rubens (Asteroidea). Journal of Invertebrate Pathology 81(2):94-102. Heim  KE,  Tagliaferro  AR,  Bobilya  DJ.  2002. Flavonoid  antioksidan  chemistry  : Metabolism,  and  structure  activity relationships. Journal  of  Nutritional Biochemistry 13(10):572-584.
Isengard HD. 2001. Water content, one of the most  important  properties  of  food. Food
Control 12(7):395-400. Iorizzi  M,  Bryan  P,  McClintock  J,  Minale  L,
Palagiano  E,  Maurelli  S,  Riccio  R  and Zollo  F.  1995.  Chemical  and  biological investigation  of  the  polar  constituents of  the  starfish Luidia  clathrata ,  collected in the Gulf of Mexico. Journal of Natural
Product 58(5):653–671. Jablonski  D,  Lutz  AR.  1983.  Larval  ecology of marine benthic invertebrates: Paleobiological  implications. Journal  of Biology Evolutionary 58(1):21-89
Kamizake  NKK,  Gonçalves  MM,  Zaia  CTBV,
Zaia  DAM.  2003.  Determination  of  total protein  in  cow  milk  powder  samples:  a comparative  study  between  the  Kjeldahl
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
method and spectrophotometric methods. Journal of Food Composition and Analysis 16(4):507-516 Kenneth  L,  Rinehart  J,  Shaw  PD,  Shield  LS, Gloer  JB,  Harbour  GC,  Koker  MES, Samain D, Schwartz RE, Tymiak AA, et al. 1981. Marine natural products as sources of antiviral, antimicrobial and antineoplastic agents. Pure  and  Appi.  Chern 53(4):795- 817.
Leonard  LA,  Strandberg  JD,  Winkelstein  JA. 1990. Complement-like activity in the sea star Asterias  forbesi . Developmental  and Comparative Immunology 14(1): 19–30.
Li C, Haug T, Stensvåg K. 2010. Antimicrobial peptides  in  echinoderms. Invertebrate
Survival Journal 7:132-140. Mayer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB,  Nichols  DE,  McLauchlin  JL.  1982.
Brine  shrimp:  a  convenient  general bioassay  for  active  plant  constituents. Journal of Medical Plants Research 45:31- 34.
McAlister  JS,  Moran  AL.  2012.  Relationships among  Egg  Size,  Composition,  and Energy: a comparative study of geminate sea urchins. Journal of Pone 7(7):1-9 Middleton  JE,  Kandaswami  C,  Theoharides TC.  2000.  The  effects  of  plant  flavonoids on  mammalian  cells:  Implications  for inflammation,  heart  disease,  and  cancer. The  American  Society  for  Pharmacology and Experimental Therapeutics 52(4):673-
751.
Moorthy  K,  Srinivasan  K,  Subramanian  C, Mohanasundari C, Palaniswamy M. 2007. Phytochemical screening and antibacterial evaluation  of  stem  bark  of Mallotus philippinensis var.  Tomentosus. African
Journal of Biotechnology 6(3):1521-1523.
Pranoto EN, Ma’ruf WF, Pringgenies D. 2012.
Kajian  aktivitas  bioaktif  ekstrak  teripang pasir  ( Holothuria scabra) terhadap  jamur Candida albicans . Jurnal Perikanan 1(2):1- 8.
Rahayu WP. 1999. Kajian aktivitas antimikroba ekstrak  dan  fraksi  rimpang  lengkuas ( Alpinia  galanga L.  Swartz)  terhadap mikroba  patogen  perusak  pangan [disertasi].  Bogor:  Institut  Pertanian
Bogor.
Ratna  DF.  2002.  Pengaruh  penambahan  gula dan lama fermentasi terhadap mutu pasta gonad bulu babi Diadema setosum dengan
Lactobacillus  plantarum sebagai  kultur starter. [skripsi]. Bogor: Institut Pertanian
Bogor.
Rosyidah  K,  Nurmuhaimina  SA,  Komari  N, Astuti  MD.  2010.  Aktivitas  antibakteri fraksi saponin dari kulit batang tumbuhan kasturi  ( Mangifera  casturi ). Alchemy 1(2):53-103. Schillaci  D,  Arizza  V.  2013.  Echinoderm antimicrobial peptides to contrast human pathogens. Natural Product Chemistry and Research 1(2):1-4
Septiadi T, Pringgenies D, Radjasa OK. 2013. Uji  fitokimia  dan  aktivitas  antijamur ekstrak  teripang  keling  ( Holoturia  atra ) dari  pantai  Bandengan  Jepara  terhadap jamur Candida albicans . Journal of Marine Research 2(2):76-84 Service M, Wardlaw AC. 1984. Echinochrome-A as a bactericidal substance in the coelomic fluid  of Echinus  esculentu s  (L.).  Comp.
Biochem. Physiol B(79): 161–165. Shamsuddin  AA,  Hakim  MD,  Kumari  GM, Noraznawati.  2010.  Antibacterial  activity of  threee  species  of  sea  urchin  extracts from  Pulau  Bidong,  Terengganu. Journal of Sustainability Science and Management
5(1):116-124 Stabili  L,  Pagliara  P  1994.  Antibacterial protection in Marthasterias glacialis eggs - characterization of lysozyme-like activity. Comparative  Biochemistry B(109):709– 713.
Stonik  VA,  Elyakov  GB.  1988.  Secondary metabolites  from  echinoderms  as chemotaxonomic  markers  Di  dalam: Scheuer  PJ  (editor)    Bioorganic  Marine Chemistry. Honolulu, Hawai, Springer.
Suwignyo S, Widigdo B, Wardiatno Y, Krisanti M. 2005. Avertebrata Air . Depok: Penebar
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri, Akerina et al.
Swadaya Tuwo  A.  1995.  Aspek  biologi  bulu  babi  jenis Tripneustes  gratilla di  Pulau  Kapoposan, Dati II Pangkep, Sulawesi Selatan. Oseana
20(1):21-29.
Uma B, Parvathavarthini R. 2010. Antibacterial effect  of  hexane  extract  of  sea  urchin, Temnopleurus  alexandri (Bell,  1884).
International  Journal  of  PharmTech Research 2(3):1677-1680. Vimono  IB.  2007.  Sekilas  mengenai  landak laut. Oseana 32(3):37-46. Walker CW, Unuma T, Lessera MP. 2007. Edible sea urchin: Biology and ecology. Florida, USA: Elsevier Wang L, Weller CL. 2006. Recent advances in extraction  of  nutraceuticals  from  plants. Trend  in  Food  Science  and  Technology 17:300-312
Zakaria  IJ.  2013.  Komunitas  bulu  babi ( Echonoidea )  di  Pulau  Cingkuak,  Pulau Sikuai  dan  Pulau  Setan  Sumatera  Barat. Prosiding SEMIRATA. Universitas Lampung 10-12 Mei 2013. 1(1)381-387. Zlatanos  S,  Laskaridis  K,  Sagredos  A.  2009.
Determination of proximate composition, fatty acid content and amino acid profile of five lesser-common sea organisms from the Mediterranean  Sea.  International Journal of Food Science and Technology 44(8):1590- 1594.doi:10.1111/j.1365-2621.2008.01870 .