## Potensi metabolit sekunder produksi bakteri endofit dari tumbuhan laban (Vitex pubescens Vahl) sebagai antikanker

## Lenny Anwar*, Dedi Futra
Prodi Pendidikan Kimia, Fakultas FKIP, Universitas Riau Kampus Bina Widya KM 12,5 Simpang Baru, Pekanbaru e-mail: * lenny_an_war@yahoo.com
Diterima: 30 Oktober 2019 / Disetujui: 18 Desember 2019 / Dipublikasi online: 31 Desember 2019 DOI: https://doi.org/10.22437/chp.v4i2.7937

## ABSTRAK
Senyawa  bioaktif  metabolit  sekunder  yang  dihasilkan  oleh  mikroba  endofitik memiliki  kemampuan  mengobati  suatu  penyakit  hampir  sama  dengan  tanaman aslinya,  oleh  karena  itu,  pencarian  mikroba  endofitik  yang  berpotensi  sebagai antikanker sedang rutin dikembangkan. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri  endofit  yang  terdapat  di  dalam  jaringan  kulit  batang  Laban  (Vitex pubescens  Vahl),  dan  senyawa  bioaktifnya  diisolasi  dengan  pelarut  etil  asetat serta diuji kemampuan aktivitas sitotoksiknya terhadap sel kanker HeLa. Bakteri endofitik  diisolasi  dengan  cara  menanamkan  sampel  kulit  batan  Laban  di  atas permukaan  nutrian  agar  dan  diinkubasi  beberapa  hari  untuk  mendapat  koloni bakteri  endofitik.  Metoda  Micro  tetrazolium  (MTT)  digunakan  untuk  menetapkan aktivitas  sitotoksik  dari  ekstrak  etilasetat.  Bakteri  endofit  yang  berhasil  diisolasi sebanyak  3  isolat  yaitu  Bakteri-2A,  Bakteri  -3B  dan  Bakteri-6C.  Berdasarkan hasil  penapisan  dari  3  isolat  tersebut  didapatkan  dua  bakteri  yang  memiliki aktivitas  potensial  yang  baik  terhadap  sel  serviks  (HeLa)  yaitu  isolat  Bakteri–6C (IC 50 = 82.54 µg/mL) dan Bakteri-2A (IC 50 = 297.09 µg/mL).
Kata kunci: Vitex pubescens Vahl, bakteri endofit, sitotoksik, sel serviks (HeLa)

## ABSTRACT
Bioactive  compounds  of  secondary  metabolites  are  produced  by  endophytic microbes  have  ability  to  treat  a  disease  almost  the  same  as  original  plant, therefore,  search  for  endophytic  microbes  that  have  anticancer  potential  is  being routinely  developed.  Purpose  of  this  study  was  to  isolate  endophytic  bacterial contained  in  Laban  bark  tissue  (Vitex  pubescens  Vahl),  to  produce  bioactive compounds using solvent of ethyl acetate and to test ability of its cytotoxic toward HeLa cancer cells. The endophytic bacteria were immediately isolated from Laban plant by implanting samples of Laban bark tissue on surface of nutrient agar and carefully  incubated  for  several  days  to  obtain  a  colony  of  endophytic  bacteria. Micro  tetrazolium  (MTT)  method  was  used  to  determine  the  cytotoxic  activity  of ethyl acetate extract. The results of this work have successfully found three types of endophytic bacteria, namely Bakteri-2A, Bakteri-3B, and Bakteri-6C. Where, two of  the  three  endophytic  bacteria  have  good  potential  activity  toward  cervical  cell (HeLa). The bacterial isolates were Bakteri-6C (IC 50% = 82.54 µg/mL) and Bakteri- 2A (IC 50% = 297.09 µg/mL).
Keywords: Vitex pubescens Vahl, endophytic bacteria, cytotoxic, cercical cell (HeLa)

## PENDAHULUAN
Prevalensi  penyakit  kanker  secara  nasional  pada  penduduk  semua  umur tahun  2013  sebesar  1,4%  atau  diperkirakan  sekitar  347.792  orang.  Penyakit kanker  serviks  merupakan  penyakit  kanker  dengan  prevalensi  tertingi  yaitu sebesar  0,8 % (98.692  orang)  disusul  kanker  payudara  sebesar  0,5%  (61.682 orang)  (Kementrian  Kesehatan  RI,  2015).  Lebih  dari  60%  obat-obat  antikanker berasal  dari  sumber  daya  alam.  Sebagian  besar  senyawa  obat  antikanker tersebut  diisolasi  dari  tumbuh-tumbuhan  dan  tanaman  laut  (Lichota,  dan Gwozdzinski, 2018)
Senyawa bioaktif yang terkandung didalam tanaman relatif dijumpai dalam jumlah  kecil,  sehingga  dibutuhkan  tanaman  yang  sangat  banyak  untuk memperoleh  senyawa  bioaktif  tersebut.  Efesiensi  dapat  dilakukan  dengan menggunakan  mikroba  endofit  spesifik  yang  diperoleh  dari  bagian  dalam tanaman  yang  diharapkan  mampu  menghasilkan  sejumlah  senyawa  bioaktif yang dibutuhkan tanpa harus mengekstrak  dari  tanamannya.  Beberapa  jenis bakteri  endofit  diketahui  mampu  menghasilkan  senyawa  aktif  yang  bersifat antibakteri, antimalaria, antikanker, tuberculosis (TBC) dan antifungi (Bac, et al., 2015;  Lie,  et  al.,  2012;  Singh,  et  al.,  2013;  Barry,  2014;  Kai,  et  al.,  2013). Senyawa  bioaktif  seperti  alkaloid,  steroid,  terpenoid,  peptida,  poliketon, flavonoid,  kuinol,  fenol  dan  azadirachtin  (insektisida  alami)  diproduksi  oleh bakteri endofit (Kusari et al. 2012; Molina et al. 2012).
Pemilihan  tumbuhan  inang  akan  mempengaruhi  keunikan  dan  aktivitas biologis produk yang dihasilkan oleh mikroba endofit tersebut (Yati et al, 2018). Salah  satu  strategi  dalam  pemilihan  tanaman  inang  untuk  diisolasi  endofitnya adalah  tanaman  yang  memiliki  sejarah  etnobotani  (digunakan  oleh  penduduk lokal untuk pengobatan) (Strobel dan Daisy, 2003).
V.  pubescens    (Laban)    merupakan  spesies  Vitex  dengan  distribusi terbanyak  di  Indonesia,  tumbuh  hampir  disemua  propinsi  di  Sumatera  dan Kalimantan (Setiawati 2017). Tumbuhan laban telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat sakit pinggang,  luka, menambah nafsu makan, disentri, gangguan pencernaan, antiinflamasi, antitumor, rhinitis, dan demam (Meena, et al., 2011). Pada  tanaman  ini  telah  diisolasi  senyawa  pinnatasteron,  20-hidroksiekdison, turkesteron, retusin, kaempferol trimetileter dan β-sitosterol (Padmalatha, et al., 2009).  Rudrapaul  et  al.,  (2014)  telah  melaporkan  adanya  luteolin,  asam  4- hidroksibenzoat  dan  asam  3,4-dihidroksibenzoat.  Dari  kulit  batang  juga  telah
diisolasi senyawa flavonoid (visciosida, apigenin dan luteolin), triterpenoid (asam betulinat  dan  asam  epibetulinat),  fenolik  (metil  p-hidroksibenzoat  dan  asam  p- hidroksibenzot)  dan  diterpenoid  (andrographolida,  14-deoksi  andrographolida dan neoandrographolida) (Athar, et al., 2009; Anwar, et al., 2015; Anwar, et al., 2019).  Senyawa  andrograpolida  dan  asam  betulinat  sangat  potensial  sebagai senyawa antikanker (Luo, et al., 2014; Ghaffari, et al., 2012).
Bakteri endofit yang berada dalam kulit batang laban kemungkinan besar mampu menghasilkan salah satu senyawa aktif tersebut atau senyawa lain yang bersifat  sitotoksik.  Sejauh  ini  belum  dilaporkan  adanya  isolasi  bakteri  endofit dari  tanaman  laban  serta  pengujian  terhadap  senyawa  aktif  yang  diproduksi bakteri endofit dari tanaman  tersebut. Penelitian ini dilakukan untuk mengkaji bagaimana  sifat  sitotoksik  metabolit  sekunder  yang  dihasilkan  oleh  bakteri endofitik  yang  terkandung  dalam  tumbuhan  laban.  Untuk  mengetahui  sifat  ini dilakukan isolasi bakteri endofitik dari kulit batang laban dan skrining aktifitas antikanker  metabolit  sekunder  yang  dihasilkannya.  P engujian  aktivitas antikanker dilakukan secara in vitro menggunakan sel line kanker serviks HeLa dengan metode Microculture Tetrazolium (MTT).

## METODOLOGI PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Kulit  batang  tumbuhan  V.  pubescens  Vahl  yang  digunakan  dalam penelitian ini diambil di area kampus  Universitas Riau. Bahan yang digunakan untuk  isolasi  dan  pengembangan  bakteri  endofitik  adalah  nutrien  agar  (NA), nutrient board (NB), etanol (C 2 H 5 OH), sodium hipoklorida (NaOCl), plastik tahan panas.    Bahan  untuk  uji  sitotoksik  terdiri  dari  sel  kanker  HeLa,  media  kultur (RPMI-1640), Dimetil sulfoksida (DMSO), MTT, Phosphate Buffered Saline ( PBS),
Sodium Dodecyl Sulphate ( SDS) 10% dalam 0,1 N HCl, Tissue.
Alat yang digunakan adalah laminar air flow cabinet (Gelman Sciences PTY. LTD), cawan petri, jarum inokulum/ose, batang penyebar, skalpel, pinset, botol duran,  lampu  spiritus,  mikro  pipet,  sentrifugasi,  tabung  sentrifus  (10  ml), erlenmeyer  (250  mL),  pH  meter,  inkubator  bakteri,  Shaker  dan  autoklap. Peralatan  untuk  uji  sitotoksik  terdiri  dari:  pipet  mikro,  tabung  reaksi,  rak tabung kecil, 96-wel plate, conical tube, yellowtip, blue tip dan ELISA reader.
Peralatan,  media  agar  dan  medium  air  pertumbuhan  disterilkan  terlebih dahulu  dengan  cara  autoklap  120 0 C,  pada  tekanan  5  Psi  selama  20  menit
sebelum  digunakan.  Semua  bahan  kimia  yang  digunakan  berkualitas  analisis tanpa dilakukan pemurnian.

## Isolasi Bakteri Endofit
Sampel berupa kulit batang dicuci  dengan air mengalir sampai bersih ± 5 menit. Sampel tumbuhan yang telah bersih direndam dalam larutan etanol 70% (v/v)  selama  5  menit  dan  selanjutnya  direndam  dalam  larutan  sodium hipoklorida  (4%)  selama  3  menit  (Shweta  et  al.,  2013). Permukaan  sampel jaringan  tumbuhan  yang  telah  steril  dicuci  tiga  kali  dengan  aquades  steril selama  2  menit  untuk  menghilangkan  agen  pensteril  dan  dikeringkan.  Sampel yang  telah  steril  dipotong  membujur  secara  aseptik,  kemudian  ditanam  pada cawan petri yang berisi media nutrien agar (NA). Media yang sudah mengandung sampel  diinkubasi  pada  suhu  ruang  dan  diamati  sampai  ada  pertumbuhan koloni.  Bakteri  endofit  yang  tumbuh  dimurnikan  satu  per  satu.  Isolat  bakteri endofit  yang  telah  murni  diidentifikasi  secara  morfologi  berdasarkan  warna koloni,  bentuk  tepian  koloni,  elevasi  koloni  dan  konsistensi  koloni  serta kecepatan pertumbuhan koloni (Desriani et al., 2013).

## Pengujian Gram Bakteri dan Katalase
Pengujian  gram  bakteri  endofik  dilakukan  dengan  cara  mengambil sebanyak 2 tetes KOH 3% diletakkan pada object glass steril. Selanjutnya koloni tunggal  bakteri  endofit  diambil  dengan  jarum  ose  dan  diletakkan  pada  kaca objek steril dan diaduk secara merata dengan jarum ose. Jika terbentuk lender, ini  menanda  bakteri  tersebut  adalah  gram  negative,  jika  tidak  berlendir mengindikasi bakteri gram positif (Forbes et al., 2007).
Pengujian  katase  dilakukan  dengan  cara  mengambil  sebanyak  2-3  tetes H 2 O 2 3%  diletakkan  pada  kaca  preparat  steril.  Jarum  Ose  steril  digunakan untuk  mengambil  isolat  bakteri  dan  dipindahkan  ke  atas  kaca  objek  untuk dicampurkan dengan larutan H 2 O 2 . Pengujian bernilai positif jika terbentuknya gelembung-gelembung  oksigen  dan  negatif  ditandai  dengan  tidak  adanya gelembung oksigen pada isolat bakteri (Reiner, 2016).

## Fermentasi Produksi Senyawa Antimikroba
Fermentasi  cair  dilakukan  dengan  menggunakan  medium  fermentasi Nutrient  Board  (NB)  sebanyak  250  ml  dalam  erlemeyer  500  mL.  Inkubasi dilakukan pada suhu ruang (27°C) selama 2 hari dengan kecepatan shaker 170 rpm. Biomassa sel dipanen dengan menggunakan sentrifuge berpendingin 3000
rpm selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan dari hasil sentrifuge  dipartisi dengan etilasetat, dievaporasi dan digunakan untuk uji hayati.

## Uji Hayati
Sel  HeLa  (koleksi  Laboratorium  Parasitologi,  UGM)  dikultur  dalam  media RPMI  1640  yang  mengandung  10%  fetal  bovine  serum  (FBS)  dan  1%  antibiotik penicilin-streptomicin.  Selanjutnya  sel  diinkubasikan  dalam  inkubator  CO 2 5% pada temperatur  37 o C selama 24 jam.
Sel  (1  x  10 4 sel/mL,  100  µL)  didistribusikan  pada  96-well  plate.  Setelah ditumbuhkan  selama  24  jam,  pada  kultur  tersebut  ditambahkan  larutan senyawa uji. Setelah diinkubasi selama 24 jam ditambahkan 10 µL larutan MTT dan  dinkubasi  kembali  selama  4  jam.  Sel  yang  hidup  akan  bereaksi  dengan larutan  MTT  membentuk  warna  ungu.  Reaksi  MTT  dihentikan  dengan  reagen stopper  (HCl  10%  dalam  SDS),  diinkubasi  semalam  pada  suhu  kamar. Selanjutnya plat 96 sumuran dibaca absorbansinya dengan ELISA reader  pada λ 595 nm (Putri, 2013).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi bakteri endofit
Isolasi  yang  dilakukan  untuk  mendapatkan  bakteri  endofit  dari  kulit batang laban dilakukan dengan metode tanam langsung ke dalam medium agar. Sebanyak  tiga  isolat  bakteri  endofit  telah  berhasil  diisolasi  dari  kulit  batang laban  yang  berasal  dari  Pekanbaru,  Riau.  Morfologi  koloni,  bau  medium  dan kecepatan  tumbuh  bakteri  endofit  hasil  isolasi  diringkaskan  pada  Tabel  1. Morfologi  bakteri  endofit  dilihat  dari  aspek  tepian  bentuk  bergerigi,  halus,  dan licin. Sedangkan dari bentuk elevasi, bakteri endofit memiliki permukaan datar dan  memiliki  warna  koloni  putih.  Kecepatan  tumbuh  bakteri  endofit dikategorikan  dari  cepat  hingga  sedang.  Secara  umum,  isolat  bakteri  endofit hasil  isolasi  menunjukkan  keragaman  dari  segi  tepian,  bau  medium  dan kecepatan pertumbuhan.
Keragaman bakteri endofit dalam suatu tanaman dipengaruhi oleh kondisi pertumbuhan  tanaman,  khususnya  kondisi  tanah.  Pada  beberapa  kasus, tanaman  dengan  jenis  atau  spesies  yang  sama  memiliki  bakteri  endofit  yang tidak  selalu  sama  (Bhore  dan  Sathisha  2010).  Bakteri  endofit  pada  umumnya berkolonisasi di jaringan intraseluler sedangkan jamur endofit dapat ditemukan dalam jaringan inter maupun intraseluler (Compant, et al., 2010).

## Tabel 1. Morfologi koloni, bau medium dan kecepatan pertumbuhan isolat
bakteri  endofit dari kulit batang laban.
Kode isolat Morfologi Koloni Bau Medium Kecepatan tumbuh* Tepian Elevasi Warna Bakteri-2A Licin Datar Putih Berbau Cepat Bakteri-3B  Bergerigi, halus Datar Putih Berbau kuat Sedang Bakteri-6C Bergerigi, licin Datar Putih Berbau Cepat
Keterangan: *Cepat = 1 hari, sedang = 2 hari dan lama = 3 hari.

## Karakterisasi Bakteri Endofit Tumbuhan Laban
Karakterisasi  bakteri  endofit  tumbuhan  laban  dilakukan  dari  aspek pengujian  gram  dan  sifat  katalasenya.  Hasil  pengujian  gram  dan  katalase ditunjukkan dalam Tabel 2. Pengujian gram bakteri endofit didapatkan bakteri- 2A  dan  bakteri-6C  digolongkan  bakteri  gram  negatif  (berlendir),  sedangkan bakteri-3B  digolongkan  bakteri  gram  positif  (tidak  berlendir).  Bakteri-2A  dan bakteri-6C  menimbulkan  lendir  pada  waktu  pemberian  KOH.    Ini  menandakan bahwa  bakteri  ini  memiliki  peptidoglikan  yang  tipis  pada  dinding  selnya, sehingga pada saat pemberian KOH dinding sel  rusak dan menyebabkan getah dalam  sel  bakteri  keluar,  dan  menghasilkan  lendir  saat  ditarik  dengan  jarum inokulum (Forbes et al., 2007; Hinton and Ingram 2006). Sedangkan bakteri-3B memiliki  peptidoglikan  yang  tebal,  sehingga  KOH  tidak  bisa  merusak  dinding selnya.

## Tabel 2. Pengujian gram dan katalase bakteri endofitik kulit batang tumbuhan
Laban Kode Isolat Karakteristik Bakteri Endofit Gram Katalase Bakteri-2A - + Bakteri-3B + + Bakteri-6C - +
Pengujian  katalase  terhadap  bakteri  endofit  didapatkan  semua  isolat menghasilkan  reaksi  positif.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  enzim  yang  secara alami  terdapat  dalam  sel  bakteri  endofit  telah  mengkatalisa  penguraian  H 2 O 2 menjadi H 2 O dan gas O 2 . Dimana, molekul H 2 O 2 terbentuk saat sel melakukan metabolisme secara aerob, sehingga bakteri tumbuh dalam kondisi aerob dapat menguraikan molekul H 2 O 2 menjadi H 2 O dan O 2 (Reiner, 2016).

## Pengujian Sitotoksisitas Supernatan Isolat Bakteri Endofit
Untuk  pengujian  sitotoksisitas,  sel  kanker  servik  (sel  HeLa)  ditambahkan secara langsung kepada seri konsentrasi ekstrak etilasetat bakteri endofit dari 6–
400  µg/mL.  Berbagai  konsentrasi  ekstrak  etilasetat  bakteri  endofit  yang ditambahkan  pada  sel  kanker  serviks  dilukiskan  pada  Gambar  1.  Respon sitotoksisitas yang tinggi untuk membunuh sel kanker teramati pada bakteri-6C. Sedangkan  respon  sitotoksisitas  dengan  katergori  sedang  dan  rendah  didapati pada bakteri-2A dan bakteri-3B. Pada konsentrasi ekstrak etilasetat rendah (6- 13  µg/mL,  Bakteri-6C)  ditambahkan  pada  sel  kanker  dan  diperoleh  sel  kanker mati < 10%. Pada konsentrasi yang ditingkatkan menjadi 25-400 µg/mL, sinyal kematian sel terjadi secara drastis dan diamati sel kanker hidup mendekat nol (~0%  sel  hidup).  Nilai  IC 50 ekstrak  etilasetat  bakteri  endofit  terhadap kemampuan  membunuh  sel  kanker  ditemukan  untuk  Bakteri-6C,  Bakteri-2A dan Bakteri-3B masing-masing secara berturut-turut adalah 82,53; 297,09; dan 920,57 µg/mL (Tabel 3).

## Gambar  1.  Efek  berbagai  konsentrasi  ekstrak  etilasetat  bakteri  endofit  yang ditambahkan kepada sel HeLa
Pada  konsentrasi  supernatan  isolat  tinggi  ditemukan  sel  kanker  hidup mendekati 0%. Hal ini mengindikasikan bahwa ekstrak etil asetat bakteri endofit mengandung  senyawa  metabolit  sekunder  yang  aktif  dan  membawa  kematian pada  sel  kanker  (Susanty,  et  al  2018).  Disamping  itu,  faktor  yang  lain  yang menyebabkan  kematian  sel  kanker  dikontribusikan  oleh  senyawa  metabolit sekunder yang bersifat lipofilitas yang mengandung gugus nonpolar pada cincin aromatik dapat mempengaruhi proses transformasi pasif antar komponen dalam sel kanker, sehingga membawa kematian pada sel kanker (Nurani, 2011).
0 20 40 60 80 100 120 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 Sel hidup (% ) Konsentrasi  ( 𝛍 g/mL) Bakteri - 2A
Bakteri - 3B Bakteri - 6C
Tabel  3.  Nilai  IC 50 ekstrak  etilasetat  bakteri  endofit  terhadap  kemampuannya membunuh sel HeLa Kode isolat Nilai IC 50% (µg/mL) % RSD Bakteri – 2A 297,09 4,093 Bakteri – 3B 920,57 3,836 Bakteri – 6C 82,54 3,919

## KESIMPULAN
Isolasi  bakteri  endofit  dari  tanaman  laban  (V.  pubescens  Vahl)  berhasil diperoleh  3  bakteri  endofit.  Uji  penapisan  3  ekstrak  etilasetat  bakteri  endofit terhadap  sel  HeLa  menunjukkan  bahwa    2  isolat  memiliki  potensi  untuk dikembangkan  sebagai  sumber  senyawa  sitotoksik  yaitu  isolat  bakteri–6C  dan bakteri–2C  dengan  IC 50 82,54  dan  297,09  µg/mL.  Meski  demikian,  penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengidentifikasi spesies isolat potensial dan mengisolasi  senyawa  kimia  yang  berpontensi  sebagai  obat  kanker  yang dihasilkan oleh isolat bakteri–6C.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terima  kasih  disampaikan  kepada  Universitas  Riau  atas  pemberian  dana DIPA  LPPM  melalui  Penelitian  Dosen  Muda  dengan  nomor  kontrak 642/UN19.5.1.3/PT.01.03/2019 .

## DAFTAR PUSTAKA
Anwar,  L.,  Ibrahim,  S.,  Putra,  D.P.,  Efdi,  M.  2015.  Labdane-Type  Diterpenoid And  Phenolic  From  The  Stem  Bark  Of  Vitex  Pubescens  Vahl. Journal_of_Chemical_and_Pharmaceutical_Research. 7(10):290-294.
Anwar,  L.,  Santoni,  A.,.  Putra,  D.P.,  Efdi,  M.,  2019.  Structure  Elucidation  of  a Pentacyclic  Triterpenoid  and  Phenolic  from  Stem  Bark  of  Vitex  Pubescens Vahl. Journal of Chemical Natural Resources. 1(1):68-74
Bae  M,  Chung  B,  Oh  KB,  Shin  J,  Oh  DC.  2015.  Hormaomycins  B  and  C:  New Antibiotic Cyclic Depsipeptides from a Marine Mudﬂat-derived Streptomyces sp. Mar Drugs. 13:5187–5200.
Barry, CE. 2014. Tuberculosis Drug Discovery Goes au Naturel. Nature. 27:436– 437.
Bhore  SJ,  Sathisha  G.  2010.  Screening  of  endophytic  colonizing  bacteria  for cytokinin-like  compounds:  crude  cell-free  broth  of  endophytic  colonizing bacteria is unsuitable in cucumber cotyledon bioassay. World J. Agric. Sci. 6 (4): 345-352.
Compant, S., Reiter, B., Sessitch, A., Nowak, J., Clement, C., Barka, A.E. 2010. Endophytic  Colonization  of  Vitis  vinifera  L.  by  Plant  Growth-promoting Bacterium  Burkholderia  sp.  strain  PsJN.  Applied  and  Environmental Microbiology 71 : 1685 – 1693.
Desriani, Kusumawati DE, Rivai A, Hasanah N, Amrinola W, Triratna L, Sukma A.  2013.  Potential  endophytic  bacteria  for  increasing  paddy  var  rojolele productivity. Int. J. on Adv. Sci.,  Eng. and Information Tech. 3 (1): 76-78. Ganapaty,  S.,  dan  Vidyadhar,  K.N.,  Phytoconstituents  and  Biological Activities of Vitex-a Review, Journal of Natural Remedies,  5(2):75-95.
Forbes,  B.A.,  Sahm,  D.F.,  Weissfeld,  A.S.,  2007.Bailey  and  Scott’s  Diagnostic Microbiology, 12 th Edition, Elsevier. New York. 80 -81
Ghaffari,  M.M.,  Ahmad,  F.,  Samzadeh-Kermani,  A.  2012.  Biological  activity  of betulinic acid: A review. Pharmacology & Pharmacy. 3:119-123
Hinton, A, Ingram, K.D. 2006. Antimocrobial activity of potassium hydroxide and lauric  acid  against  microorganisms  associated  with  poultry  processing. Journal of Food Protection. 69(2): 1611-1615
Kai H, Yamashita M, Takase S, Hashimoto M, Muramatsu H, Nakamura I.  2013. KB425796-A,  a  Novel  Antifungal  Antibiotic  Produced  by  Paenibacillus  sp. 530603. J Antibiot. 66:465–471.
Kementrian  Kesehatan  RI.  2015.  Infodatin,  Pusat  Data  dan  Informasi Kementrian Kesehatan RI. Kementrian Kesehatan. Jakarta.
Kusari  S,  Verma  VC,  Lamshoeft  M,  Spiteller  M.  2012.  An  Endophytic  Fungus from  Azadirachta  Indica  A.  Juss.  that  Produces  Azadirachtin.  World  J Microbiol Biotechnol. 28:1287–1294
Li  J,  Zhao  GZ,  Varma  A,  Qin  S,  Xiong  Z,  Huang  HY.  2012.  An  Endophytic Pseudonocardia Species Induces the Production of Artemisinin in Artemisia annua. PLoS One. 7:e51410.
Luo,  X.,  Luo,  W.,  Lin,  C.,  Zhang,  L.,  Li,  Y.  2014.  Andrographolide  Inhibits Proliferation of Human Lung Cancer Cells and the Related Mechanisms. Int J Clin Exp Med. 7(11):4220-4225
Meena,  A.  K.,  Niranjan,  U.S.,  Rao,  M.M.,  Padhi,  M.M.  dan  Babu,  R.,  2011,  A Review  of  the  Important  Chemical  Constituents    and    Medicinal  Uses  of Vitex Genus, Asian Journal of Traditional Medicines, 6(2).
Molina G, Pimentel MR, Bertucci TCP, Pastore GM. 2012. Application of Fungal Endophytes in Biotechnological Processes. Chem Eng Trans. 27:289–294
Nurani L.H. 2011. Uji Sitotoksisitas dan Antiproliferatif Fraksi Etilasetat Ekstrak Etanol  Biji  Jinten  Hitam  (Nigella  sativa,  Lour)  terhadap  Sel  Mieloma. Farmasains. 2(1): 11-21.
Padmalatha,  K.,  Jayaram,  K.,  Raju,  N.L.,  Prasad,  M.N.V.,  Arora,  R.,  2009, Ethnopharmacological  and  Biotechnological  Significance  of  Vitex, Bioremediation, Biodiversity and Bioavailability, 3(1):6-14.
Putri,  H.  2013.  Protokol  uji  sitotoksik  metode  MTT,  Cancer  Chemoprevention Research Center (CCRC). Yogyakarta:Fakultas Farmasi, UGM.
Reiner,  K.  2016.  Catalase  test  protocol.  In:  ACM  Microbelibrary  -  Laboratory protocols. American Society for Microbiology, Washington, USA.
Setiawati.  2017.  Utilization  of  Laban  wood  (Vitex  pubescens  Vahl)  as  raw materials  traditional  charcoal  by  communitis;  a  case  study  at  Jembayan village  East  Kalimantan.  International  Juournal  of  Scientific  and Technology Research. 6(2); 122-125
Shweta,  S.,  Bindu,  J.  H.,  Raghu,  J.,  Suma,  H.  K.,  Manjunatha,  B.L.,  Kumara, P.M.,  Ravikanth,  G.,  Nataraja,  K.N.,  Ganeshaiah,  K.  N.,  Shaanker,  R.  U. 2013.    Isolation  of  endophytic  bacteria  producing  the  anti-cancer  alkaloid camptothecine  from  Miquelia  dentata  Bedd.  (Icacinaceae).  Phytomedicine. 20: 913–917.
Singh  S,  Bindu  H,  Raghu  J,  Suma  HK,  Manjunatha  BL,  Kumara  PM.  2013. Isolation  of  Endophytic  Bacteria  Producing  the  Anticancer  Alkaloid Camptothecine  from  Miqueliadentata  Bedd.  (Icacinaceae).  Phytomedicine 20:913–917.
Susanty, Dachriyanus,  Yanwirasti,  F.S.  Wahyuni,  H.  Fadhli,  P.A.  Aswan.  2018. Aktivitas  Sitotoksik  Ekstrak  Etil  Asetat  Daun  Tampa  Badak  (Voacanga foetida (Bl.) K.Schum) pada Kanker Kolon HTB-38. Jurnal Sains Farmasi & Klinis. 5(2): 142-146
Yati,  S.J.,  Sumpono,  Candra,  I.N.  2018.  Potensi  activitas  antioksidan  metabolit sekunder  dari  bakteri  endofit  pada  daun  Maringa  oleifera,  L.  Jurnal Pendidikan dan Ilmu Kimia. 2(1): 82-87.