BIOKATALIS LIPASE RHIZOPUS ORYZAE PADA REAKSI TRANSESTERIFIKASI LIPID TERSTRUKTUR KAYA ASAM LEMAK OMEGA -3
Wahyuningsih 1 , Edy Supriyo 2 , R. TD. Wisnu Broto 3
PSD III Teknik Kimia,Fak.Teknik, Undip, Jl Prof Sudharto SH,Semarang 50275, Indonesia wahyunimachin@gmail.com, edyspy2000@yahoo.co.id, vieshnoe@gmail.com

## Abstrak
Immobilisasi merupakan teknik recovery enzim yang menjadi perhatian dalam beberapa tahun belakangan, dilakukan  dengan  bantuan  support  sebagai  media  yang  dapat  mencegah  terlarutnya  enzim.  Metode  immobilisasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode adsorpsi, dengan menggunakan lipase rhizopus oryzae, reaksi yang  diamati  adalah  reaksi  transesterifukasi  Lipid  Terstruktur  kaya  omega-3.  Tujuan  Penelitian  ini  adalah, mengkaji  teknik    immobilisasi  enzim  lipase  dengan  bantuan  support  dengan  melakukan  pengamatan    teknik adsorpsi  fisik    dan  mengembangkan  penggunaan  enzim    lipase  Rhizopus  oryzae  immobile  sebagai    biokatalisator untuk  reaksi  transesterifikasi  minyak  ikan  tuna.  Optimalisasi  kondisi  operasi  proses  terhadap  produktifitas  lipid terstruktur kaya asam lemak omega-3, dengan kajian kecepatan reaksi. Tujuan utama dilakukan immobilisasi enzim adalah  untuk  melihat  apakah  enzim  tersebut  dapat  digunakan  kembali  dalam  reaksi  selanjutnya  (reuse).  Hasil penelitian menunjukkan kondisi optimum reaksi  pada suhu 50 o C, pH lipase 8 perbandingan ratio substrat (Minyak ikan  tuna  :  asam  laurat  )1:10  selama  6  jam.  Profil  gliserida  dari  hasil  asidolisis  enzimatis  adalah    78,1  % trigliserida, 32,2 % Digliserida dan 11,9% Monogliserida. Inkoorporasi asam laurat mencapai 62,8 mol %. Pada waktu  inkubasi  12  jam,  trigliserida  menurun  seiring  dengan  meningkatnya  waktu  inkubasi,  sedangkan  digliserida meningkat  seiring  dengan  meningkatnya  waktu  inkubasi.  Pada  suhu  reaksi  di  atas  50 o C,  trigliserida  menurun seiring  dengan  meningkatnya  suhu  reaksi.  Metode  interesterifikasi  ini  cukup  efektif  untuk  mensintesis  lipid terstruktur spesifik.
Kata kunci: Lipid terstruktur, immobilisasi lipase , minyak ikan tuna

## Abstract
Immobilization of an enzyme recovery techniques are a concern in recent years, carried out with the help of support as a medium that can prevent the dissolution of enzim. Method immobilization used in this study is the adsorption  method,  using  rhizopus  oryzae  lipase,  a  reaction  observed  was  a  reaction  transesterifikasi.  Structured Lipids rich in omega-3 the aim of this study is, reviewing techniques immobilization of lipase with the assistance of support  by  observing  techniques  physical  adsorption  and  develop  the  use  of  lipase  Rhizopus  oryzae  immobile  as biokatalisator for the transesterification reaction tuna fish oil optimization of operating conditions of the process to the  productivity  of  structured  lipids  rich  in  fatty  acids  omega-3,  with  an  assessment  of  the  speed  of  the  main reaction.  Purpose    do  immobilisation  of  enzymes  is  to  see  whether  the  enzyme  can  be  reused  in  a  subsequent reaction (reuse) the results of the research  showed the optimum reaction conditions at 50 ° C, pH 8 comparisons ratio  lipase  substrate  (tuna  fish  oil  :  lauric  acid)  1:10  for  6  hours.  Profil  gliseride  result  is  78.1%  asidolisis enzymatic  triglycerides,  32.2%  and  11.9%  diglycerides  Monogliserida.  Inkoorporasi  lauric  acid  reached  62.8 mol%.  %.  At  the  12  hour  incubation  period,  triglyceride  decreases  with  increasing  time  of  incubation,  whereas diglycerides  increased  with  increasing  incubation  time.  At  reaction  temperatures  above  50°  C,  triglycerides decreased  with  increasing  reaction  temperature.  Interesterification  method  is  quite  effective  to  synthesize  specific structured lipids.
Keywords: structured lipids, immobilization of lipases, tuna fish oil

## PENDAHULUAN
Lipase  merupakan  enzim  yang  memiliki  peran penting dalam bioteknologi modern.
Banyak  industri  yang  telah  mengaplikasikan penggunaan enzim sebagai biokatalis.
Lipase  terkenal  memiliki  aktivitas  yang  tinggi dalam reaksi hidrolisis, esterifikasi dan transesterifikasi  (asidolisis),  alkoholisis  dan aminolisis candida dan Rhizopus yang merupakan  organisme  yang  paling  sering dipakai sebagai sumber sintesis penghasil lipase

## BIOKATALIS LIPASE …….                                                                                                  (Wahyuningsih, dkk)
(Jeyarani,  2010).  Enzim  lipase  yang  diamati berasal  dari  sekresi  mikroba rhizopus  oryzae yaitu  lipase  yang  bereaksi  secara  spesifik memutus  rantai fatty  acid trigliserol  pada  posisi sn  1  dan  sn  3,  sering  disebut  dengan lipase spesifik  region  1,3  (  Irimescu ,  2000).  Harga lipase  komersial  biasanya  sangat  tinggi  (  Rp  4 juta/  100  mg)  karena  proses  produksinya  yang sulit  dan  memakan  waktu.  Selain  itu,  dalam proses  reaksi  enzimatis,  lipase  tidak  dapat digunakan  kembali  karena  terlarut  dalam  media reaksi (Greyt , 2004) . Hal ini menyebabkan biaya reaksi yang dikatalisis lipase menjadi meningkat.  Perlu  adanya  penelitian  tentang teknik penggunaan kembali lipase, salah satunya adalah  teknik  reaksi  immobilisasi  dengan bantuan support sebagai  media  pembantu  yang dapat menahan enzim dalam struktur molekulnya,  diharapkan  enzim  dapat  digunakan kembali sehingga biaya produksi reaksi enzimatis dapat ditekan (Akoh , 2002)
Perlu  dilakukan  studi  lebih  lanjut  untuk melakukan  immobilisasi  enzim  untuk  berbagai reaksi enzimatis. Effektivitas reaksi immobilisasi dilihat dengan menggunakan reaksi asidolisis (Gandi , 2007 ). Pengamatan yang harus dilakukan adalah pemilihan support berdasarkan kemampuan  bahan  dalam  membantu  suatu reaksi  enzimatis,  dilihat  dari  konsentrasi  enzim yang  dapat  terserap  oleh support .  Reaksi transesterifikasi  diamati  sebagai  reaksi  dasar dalam melakukan reaksi dan dapat menghasilkan konversi yang baik (Greyt , 2004).
Sebelum  melakukan  immobilisasi,  enzim  lipase akan  dikarakterisasi  terlebih  dahulu,  dalam hubungannya dengan aktivitas enzimatis persatuan  waktu  ( biochemical  engineering  and biotechnology handbook ). Pengamatan dilakukan  untuk  mengetahui  konsentrasi  lipase yang  optimal,  kondisi  temperatur  yang  optimal dalam  reaksi  transesterifikasi,  dan  pengujian stabilitas  enzim  pada support yang  ditunjukkan dengan penggunaan kembali lipase
ter immobilisasi
untuk reaksi.Dari hasil
pengamatan ini,akan dibuat pemodelan matematika  sederhana  untuk  menggambarkan reaksi hidrolisis enzimatis lipase.

## METODE PENELITIAN

## Karakterisasi Minyak ikan
Karakterisasi  minyak  ikan  meliputi  beberapa sifat  fisik  dan  kimianya,  yaitu  kadar  air  dan senyawa volatil (AOCS, 1989), angka asam dan asam  lemak  bebas  (AOCS,  1989),  angka penyabunan  (AOCS,  1989),  Angka  peroksida
(FAO,  2001),  komposisi  gliserida  (Probondari, 2007), dan berat molekul rata-rata.
Interesterifikasi enzimatis minyak ikan dengan asam laurat pada berbagai pH lipase terimmobilisasi
Interesterifikasi  dilakukan  pada  berbagai  pH lipase  terimmobilisasi  (  4-9)  untuk  mengetahui pH  lipase  terimmobilisasi  terhadap  effisiensi inkorporasi dan profil gliserida yang diperoleh.Reaksi  dilakukan  dalam  Erlenmeyer tertutup yang diinkubasi dalam waterbath shaker dengan  kecepatan  120  rpm  pada  suhu  40 o C selama  12  jam.  Hasil  reaksi  selanjutnya diperlakukan seperti pada prosedur interesterifikasi  enzimatis  pada  berbagai  suhu reaksi.  Untuk  mengetahui  tingkat  keasaman substrat  dilakukan  pengukuran  pH  dengan  pH meter
Preparasi FAME (Park dan Goins, 1994) dan analisis  dengan gas  chromatography untuk menentukan inkorporasi asam laurat Sebanyak 200 µl lipid terstruktur dimasukkan ke dalam  tabung  reaksi  lalu  ditambahkan  50µl (konsentrasi  0,1  g/ml)  internal  standar  asam heptadekanoat,  100µl  metilen  klorida  dan  1ml NaOH  0,5  N  dalam  metanol.  Ke  dalam  tabung diberi  gas  nitrogen  sebelum  dipanaskan  pada suhu  90 o C  selama  10  menit.  Setelah  dingin ditambah  1ml  BF 3 14%  dalam  metanol, kemudian  dipanaskan  lagi  selama  10  menit. Setelah  dingin  ditambahkan  1mL  aquades  dan 200-500  µl  heksana  dan  divorteks  untuk mengekstrak  metil  ester  asam  lemak.  Fraksi heksana  merupakan  FAME  dan  siap  untuk dianalisis dengan GC.
Kromatografi gas (GC) yang digunakan dilengkapi  dengan  kolom  HP  5  (5%  Phenyl Methil  Siloxone)  panjang  30m.  Temperatur kolom mula-mula 180 o C ditahan selama 2 menit kemudian  dinaikkan  10 o C/menit  sampai  suhu mencapai 280 o C. Temperatur injektor 280 o C dan detektor  yang  digunakan  adalah  FID  dengan suhu 300 o C. Gas Helium digunakan sebagai gas pembawa dengan aliran 10 mL/menit.
Interesterifikasi enzimatis minyak ikan dengan  asam  laurat  pada  berbagai  suhu reaksi
Waktu reaksi yang optimal kemudian digunakan untuk  mengkaji  pengaruh  suhu  reaksi  dengan variasi  suhu  30,  40,  50,  60,70  dan  80 o C. Sebanyak  1,43  gram  minyak  ikan  dicampur dengan 4 gram asam laurat (rasio molar minyak ikan  :  asam  laurat  1:10)  dalam  erlenmeyer,  lalu ditambahkan  lipase  0,543 gram rhizopus  oryzae (10% dari substrat) dan 8,1 mL heksana (1,5 kali berat  substrat).  Erlenmeyer  ditutup  rapat  lalu
diinkubasi  dalam waterbath  shaker pada  suhu tervariasi  dengan  kecepatan  120  rpm  selama  12 jam.  Setelah  direaksikan  selama  12  jam, campuran  hasil  reaksi  selanjutnya  diperlakukan seperti  pada  prosedur  interesterifikasi  enzimatis pada berbagai waktu reaksi Pada  percobaan  ini,  dijalankan  dengan  ratio minyak  kelapa  sawit  dan  minyak  ikan  tuna sebesar  30  –  60  %  w/w.  Transesterifikasi enzimatis  ini,  dilakukan  dalam  bioreaktor enzimatis  pada  berbagai  variabel  proses  yang telah ditentukan.
Prosedur  percobaan  dilakukan  dengan  cara mengamati  kandungan  asam  lemak  setiap  30 menit.  Pengamatan  ini  akan  dilakukan  selama beberapa  hari  sampai  kemampuan  enzim  lipase menurun  untuk    transesterifikasi  trigliserida. Pada percobaan ini juga dibandingkan pengaruh pH, suhu dan waktu reaksi

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakterisasi minyak ikan  tuna dilakukan untuk mengetahui  komposisi  dan  kondisi  minyak  ikan tuna  yang  digunakan  untuk  sintesa  Lipid Terstruktur.  Hasilnya  terlihat  pada  Tabel  1. Kadar  air  minyak  ikan  tuna  sangat  rendah (0,05%).  Hal  ini  sesuai  dengan  standar  yang ditetapkan  oleh  FAO/WHO/CAC/RS  19-1981 rev  (1989)  yaitu  sebesar  0,2%.  Kadar  air  yang tinggi  akan  menyebabkan  penurunan  kualitas minyak  ikan  tuna  yang  disebabkan  oleh hidrolisis  asam  lemak  bebas  dari  kerangka gliserida  selama  penyimpanan.  Biasanya  kadar air tidak berubah selama penyimpanan Angka asam dan asam lemak bebas dari minyak ikan  tuna  berdasarkan  EPA  sebagai  penyusun asam  lemak  yang  dominan  adalah  masing- masing 1,06 dan 0,55%. Berdasarkan FAO/WHO/CAC/RS (9-198) rev.1.(1989),
angka asam minyak ikan lebih tinggi dibandingkan  dengan  standar  yang  ditentukan untuk  minyak  ikan  (0,6).  Untuk  angka saponifikasi  ditentukan  berdasarkan  jumlah  mg KOH  yang  dibutuhkan  untuk  saponifikasi  1  g minyak  atau  lemak.  Angka  saponifikasi  dapat mengindikasikan  rata-rata  BM  lemak  atau minyak (Akoh, 2002).
Gliserida  minyak  ikan  yang  digunakan  ternyata tidak  semuanya  berupa  trigliserida  (hanya 70,40%), sedangkan sisanya berupa monogliserida dan digliserida. Hal ini sebenarnya  tidak  dikehendaki  untuk  keperluan reaksi  transesterifikasi  karena  kerangka  gliserol minyak ikan terkandung beberapa gugus OH dan gugus ini dapat mengalami reaksi
transesterifikasi  dengan  asam  laurat  bebas  yang menghasilkan air.
Gambar  1 . Profil  gliserida  lipid  terstruktur akibat pengaruh suhu reaksi, grafik garis dan blok
Gambar  2.Profil  gliserida  lipid  terstruktur karena pengaruh pH  lipase, grafik blok
MG TG 0 10 20 30 40 50 60 70 80 30 40 50 60 70 MG DG TG MG 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1 5 10 15 20 MG DG TG
Gambar  1  secara  umum  menunjukkan  bahwa pada  suhu  diatas  50 o C  komponen  trigliserida menurun dengan naiknya suhu reaksi. Penurunan  tersebut  menandakan  terjadinya esterifikasi partial komponen trigliserida menghasilkan  produk  antara  digliserida  dan monogliserida Hal tersebut mungkin disebabkan oleh terjadinya migrasi  gugus  asil  yang  menyebabkan  reaksi asidolisis tidak sempurna (Pandey, 2009). Migrasi  asil  merupakan  berpindahnya  asil  dari trigliserida  dari  posisi  Sn  2  ke  posisi  sn-1  atau sn-3. Berpindahnya asil tersebut dapat menyebabkan  posisi  sn-2  kosong  sehingga terbentuk digliserida ataupun monogliserida. Migrasi  asil  dapat  dipicu  oleh  tingginya  suhu reaksi, kadar air, dan ratio substrat.
Selanjutnya  juga  diketahui  bahwa  suhu  reaksi dan  waktu  reaksi  memicu  terbentuknya  1,3- diasilgliserol  lebuh  besar  dari  pada  1,2 diasilgliserol (Pandey, 2009).
Dengan terbentuknya 3-diasigliserol maka lipase spesifik  1,3  dari Rhizopuos  oryzae tentu  tidak dapat  atau  sulit  untuk  mengkatalis  asidolisis pada posisi sn-2. Dengan demikian ,hal tersebut dapat  menurunkan  komponen  trigliserida  dan justru  meningkatkan  digliserida    ataupun monogliserida
Gambar  2  menunjukkan  Pengaruh  pH  lipase terhadap  profil  gliserida  lipid  terstruktur ditunjukkan pada Gambar 2.
Komponen  TG  (trigliserida)  meningkat  seiring dengan meningkatnya konsentrasi lipase (hingga mencapai  pH  8).  Hal  ini  disebabkan  karena lipase rhizopuos oryzae terimmobil sangat spesifik  untuk  asam  laurat  (Jeyarani,  2010)  dan memiliki  aktivitas  relative  rendah  terhadap PUFA terutama DHA (Greyt, 2004).
Ketika  pH  lipase  rendah  maka  kecenderungan reaksi  berjalan  kekanan  cukup  lemah  dan kemampuan  lipase  untuk  mengkatalis  untuk proses asidolisis juga relative kecil. Komponen TG (trigliserida ) justru menurun jika pH  lipase  dinaikkan,  Hal  ini  mungkin  berkaitan dengan  aktivitas  lipase  yang  menurun  dengan semakin banyaknya asam lemak bebas.
Asam  lemak  bebas  menyebabkan  desorbsi  air dari  interface  kemudian  mengambil  bagian interface  air  disekitar  enzim  dan  meningkatkan kelarutannya dalam air sehingga akan membatasi masuknya substrat pada interface. Akibat  penurunan  akivitas  lipase  tersebut menyebabkan  terbentuknya  produk  intermediate dan  menyebabkan  reaksi  Transesterifikasi  tidak sempurna.
Gambar  3.Pengaruh  pH  lipase  terhadap inkorporasi asam laurat
Gambar 3 menunjukkan bahwa inkorporasi asam laurat  pada  lipid  terstruktur  (42%)  meningkat sampai  pH  lipase  8  jika  konsentrasi  dinaikkan lagi mengakibatkan penurunan tingkat inkoorporasinya  (  32  %  untuk  lipase  15%).  Hal ini  dapat  disebabkan  oleh  beberapa  hal,  antara lain:  (1)  kompetisi  asam  laurat  dan  asam  lemak bebas  lain,(2)  penurunan  pH  larutan  dengan penambahan  asam  laurat,  (3)  Substrat  inhibitor dan (4) desorbsi air pada interface
Gambar 4. Pengaruh suhu terhadap inkoporasi  asam  laurat  pada  waktu  inkubasi 12  jam
Reaksi kimia membutuhkan panas dalam jumlah tertentu sebesar energy aktivasi untuk mencapai tahap  transisi  kemudian  membentuk  produk. Keterlibatan  enzim  lipase  sebagai  biokatalis menurunkan  level  energy  aktivasi  (Idris,  2005), Hal  ini  berakibat  menurunnya  kebutuhan  panas
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25
Pengaruh pH lipase pada proses inkoporasi asam laurat
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 20 40
60 80
dan  mempercepat  reaksi  dibandingkan  dengan reaksi tanpa katalis.
Archenius  menyatakan  bahwa  laju  reaksi meningkat dengan meningkatnya suhu reaksi (Bajpai,  2003).  Naiknya  suhu  reaksi  berakibat menurunkan viskositas campuran reaksi, sehingga  membantu  mobilisasi  molekul  substrat untuk bereaksi (Akoh, 2002).
Namun  demikian  karena  enzim  adalah  protein yang  terdenaturasi  secara irreversible  pada  suhu tinggi  maka  kenaikan  suhu  reaksi  teratas  pada temperatur rendah (Akoh, 2002).
Menurut  Probondari,  2007,  suhu  optimum lipase immobile adalah 30-62 o C.
Dari  reaksi  asidolisis  minyak  ikan  tuna  dengan asam  laurat  dengan  biokatalis  lipase  Rhizopous Oryzae immobile , diperoleh pada suhu optimum 50 o C, waktu 12 jam.

## KESIMPULAN
Lipase  rhizophous  Oryzae immobile ,  dapat digunakan  dengan  baik  untuk  sintesa  Lipid terstruktur  dari  minyak  ikan  tuna  dengan  asam laurat.
Kondisi optimum reaksi adalah pada suhu 50 o C, pH lipase 8 perbandingan ratio substrat (Minyak ikan  tuna  :  asam  laurat)  1:10  selama  12  jam. Profil  gliserida  dari  hasil  asidolisis  enzimatis adalah :
- 78,1 % trigliserida,
- 32,2 % Digliserida
- 11,9% Monogliserida.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan Terma kasih dan penghargaan ditujukan pada:
Dekan  Fakultas  Teknik  Undip  yang  telah memberikan  dana  untuk  penelitian  ini,  Ketua Program  Studi  Diploma  III  Teknik  Kimia  yang sudah memberikan fasilitas  Laboratorium

## DAFTAR PUSTAKA
Akoh,C  C.  2002. Structured  lipids .  In: Food
Lipids,  Chemistry,  nutrition,  and Biotechnology. West Virginia University, morgantowa. West Virginia. Marcel Dekker Inc. Newyork AOCS. 1989. Official Methods and
Recommended Practices of the American Oil Chemistry Society . 4 th ed.  Broadmaker    Drive, Champaign. Illinois
Bajpai,  I.  C.,  P.  T.  Quinlan,  dan  G.  PMcNeill. 2003. Lipase-Catalyzed  Synthesis  of Chiral  Triglycerides. J.  Am.  Oil. Chem. Soc. 75: 1513 – 518
FAO/WHO/CAC/RS  2001  rev.1,  2009.  In:
Guidelines  for  Characterizing  Food- Grade Fish Oil . Inform, Vol. 9. no. 5. 473-481
Gandi,  J.  R.,  D.  H.  Pence,  S.  Scheinsach,  P.  R. D’Amelia,  L.  P.  Klemann,  N.  H. Wilson,  and  J.  W.  Finkey.  2007. Review  of  Triacilglycerols  Digestion, Absorption,  and  Metabolism  With Respect  to  Salatrim  Triacylglycerols .
J. Agri. Food. Chem. 42,473-483
Greyt, R. ,M.Yasui,Y.Iwasaki, N. Shimidzu, and
T. Yamane. 2004. Enzymatic Synthesis of 1,3-Dicapryloyl-2-
Eicosapentaenoylglycerol. J.  Am.  Oil. Chem. Soc. 78 (7) :743 – 748
Idris, R.,  K. Furihata, K. Hata, Y. Iwasaki, and T.  Yamane.  2005 . Utilization  Of Reaction Medium - Dependent Regiospecifity  Of  Candida  Antartica Lipase (Novozyme  435)          For  The Synthesis Of 1,3-Dicapryloyl-2- Docosahexaenoyl (Or Eicosapentaenoyl)    Glycerol. J.  Am. Oil. Chem. Soc. 78 (3) :285 – 289
Irimescu,  R.,    K.  Furihata,  K.  Hata,  Y.  wasaki,
and  T.  Yamane.  2000. Two  -  Step Enzymatic Synthesis of Docosahexaenoic Acid - Rich Symmetrically Structured Triacilglycerols Via 2- Monoacylglycerols . J.  Am.  Oil. Chem. Soc. 78 (7) :743 – 748
Jeyarani,  S.,  Y.  Iwasaki,  and    C.  T.  Hou.  2010.
Study  of  Ethanolysis  to  2-MAG Immobilized Candida Antartica Lipase and Synthesis of Symmetrically  Structured TAG .  J. Am. Oil. Chem. Soc. 79 (9) 879 – 883
Pandey,  P.  W.  and  R.  E.  Goins.2009. In  Situ Preparation  of  Fatty  Acids  Metil Ester  for  Analysis  of  Fatty  Acids Composition  in  Food. J.  of  Food Science. 59 (6): 1262 – 1266
Probondari,  R.,  B.  Manohar,  K.  Sambiah,  and B.  R.  Lokesh.  2007. Enzymatic Acidolysis  in  to  Produce  n-3  or  n-6

## BIOKATALIS LIPASE …….                                                                                                  (Wahyuningsih, dkk)
FA-Enriched  Structured  Lipids  from
Coconut Oil: Optimization of Reactions by Response Surface Methodology . J.  Am.  Oil.  Chem.  Soc. 70 (9) : 885 – 890