Menara Perkebunan , 2007, 75(2), 106-115.
Produksi dan karakterisasi lakase Omphalina sp.
Production and characterization of Omphalina sp. laccase
SISWANTO 1) , SUHARYANTO 1) & Rossy FITRIA 2)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia
2) Departemen Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Indonesia,  Depok, Indonesia

## Summary
Omphalina sp.  a  white-rot  fungi  (WRF) originated from oil palm plantation has ability to  degrade  empty  fruit  bunches  of  oil  palm (EFBOP)  so  that  it  is  expected  to  produce laccase  with  high  activity.  The  ability  of Omphalina sp.  to  produce  laccase  enzyme  on liquid fermentation will be studied. The enzyme will also be partially purified and characterized. The research result showed that the  highest  enzyme  activity  (1.162  U/mL)  was obtained  using  glucose  malt  yeast  (GMY) medium  at  room  temperature  for  four  days. The  addition  of  2,5-xylidine  as  an  inducer produced  laccase  earlier  i.e  two  days,  but  the activity  of  laccase  was  less  active  after prolonged  incubation  compared  to  that  of control.  The  laccase  produced  on  medium containing  2%  EFBOP  reached  optimum activity  as  much  as  0.38  U/mL  after  10 th days of  incubation.  Partial  purification  of  laccase on  Sephacryl  S-200  HR  column  resulted 58.23% of yield recovery with twice purity than before.  The  optimum  pH  of  laccase  was  4.5. Laccase  activity  was  stable  even  after  heated on  50 o C  for  30  minutes,  but  then  decreased when  heated  until  60 o C.  The  laccase  has  K M and  V max as  much  as  0.15  mM  and  0.56  U/mL respectively.
[ Keywords: White-rot  fungi, Omphalina sp.,
laccase activity, submerged fermentation]

## Ringkasan
Omphalina sp., adalah fungi pelapuk putih (FPP)  hasil  isolasi  dari  kebun  kelapa  sawit yang  diketahui  mampu  mendegradasi  tandan kosong  kelapa  sawit  (TKKS)  dengan  cepat sehingga  diharapkan  mampu  menghasilkan lakase  dengan  aktivitas  tinggi.  Kemampuan Omphalina sp.  menghasilkan  enzim  lakase pada fermentasi cair akan dipelajari. Selain itu, lakase yang dihasilkan akan dimurnikan secara parsial  serta  dilakukan  karakterisasi  pH,  suhu, dan  konsentrasi  substrat  optimum.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa Omphalina sp. menghasilkan  lakase  dengan aktivitas  tertinggi (1,162 U/mL) pada medium glucose malt yeast (GMY)  yang  diinkubasikan  pada  suhu  ruang selama  empat  hari.  Penambahan  2,5-xilidin sebagai  induser  mempercepat  produksi  lakase lebih awal yaitu dalam waktu dua hari, namun aktivitasnya  masih  lebih  rendah  dibandingkan dengan  kontrol  pada  inkubasi  lebih  lanjut. Lakase  dari Omphalina sp.  juga  dapat diproduksi  pada  medium  yang  mengandung 2% TKKS dan aktivitasnya mencapai 0,38  U/mL  yang  diinkubasi  dalam  suhu  ruang selama  10  hari.  Pemurnian parsial  pada  kolom Sephacryl  S-200  HR  menghasilkan  rendemen sebesar 58,23% dengan kemurnian dua kalinya. Aktivitas  lakase  optimum  pada  pH  4,5    dan tetap stabil setelah pemanasan selama 30 menit pada  suhu  ruang  hingga  50 o C  dan  menurun tajam  pada  suhu  60 o C.  Lakase Omphalina sp. menghasilkan  nilai  K M dan  V maks masing- masing sebesar 0,15 mM dan 0,56 U/mL.
Siswanto et al.

## Pendahuluan
Fungi  pelapuk  putih  (FPP)  dari  kelas Basidiomycetes, Omphalina sp.  diketahui memiliki  kemampuan  dalam  mendegra- dasi lignin. Kemampuan tersebut disebab- kan  oleh  multi  enzim  ligninolitik  ekstra- seluler  yang  dihasilkan  FPP  (Kirk  & Chang,  1990;  Basuki,  1994).  Sekresi enzim  tersebut  akan  membantu  penetrasi hifa  FPP  ke  dalam  komponen-komponen kayu, mendegradasi lignin secara sempurna menjadi CO 2 dan H 2 O sehingga membentuk  rongga-rongga  kayu  dan meninggalkan  warna  putih  dari  selulosa (Cullen & Kersten, 1992).
Salah  satu  multi  enzim  ekstraseluler yang bertanggung jawab dalam permulaan proses  depolimerisasi  lignin  yaitu  enzim ligninolitik  yang  terdiri  atas  enzim  lignin peroksidase  (Li-P),  mangan  peroksidase (Mn-P),  dan  lakase  (Lac)  (Kirk  &  Farrel 1987).  Lakase  memiliki  kemampuan mendegradasi  beberapa  polutan  yang  ber- sifat persisten terhadap lingkungan seperti senyawa-senyawa aromatik golongan klorida, hidrokarbon heterosiklik
aromatik,  zat  warna  dan  polimer  sintetik (Bumpus et  al .,  1985).  Kemampuan  FPP dalam  proses  pendegradasian  tersebut diperkirakan  berhubungan  dengan  tinggi- nya  aktivitas  oksidatif  enzim  ligninolitik dan  sifat  kurang  spesifiknya  terhadap suatu substrat (Ohkuma et al ., 2001). Oleh karena  itu,  FPP  penghasil  lakase  sangat bermanfaat tidak hanya bagi proses indus- tri  seperti biopulping dan biobleaching tetapi juga bagi proses bioremediasi.
Enzim  ligninolitik  yang  dihasilkan oleh  FPP  bergantung  kepada  jenisnya, contohnya  fungi Phanerochaete  crhyso- sporium hanya  menghasilkan  enzim  Li-P dan  Mn-P  seperti  yang  dilaporkan  oleh Dosoretz et  al. (1990). Omphalina sp.
diketahui mampu mendelignifikasi material  lignoselulosa  dari  tandan  kosong kelapa  sawit  (TKKS),  sehingga  diharap- kan  dapat  dijadikan  alternatif  penghasil enzim  ligninolitik  ekstraselular  yang cukup  potensial  (Suharyanto  &  Siswanto, 2003).
Kondisi  kultur,  komposisi  medium dan  induser  mempengaruhi  produksi enzim.  Menurut  Pickard et  al. (1999) 2,5-xilidin diketahui sangat efisien digunakan sebagai induser dalam produksi enzim  lakase  pada  FPP.  Akan  tetapi, 2,5-xilidin  bersifat  toksik  dan  mencemari lingkungan.  Selain  2,5-xilidin,  veratril alkohol  dan  MnSO 4 juga  dapat  berfungsi sebagai  induser  enzim  lakase  (Eggert et al., 1996; Pickard et al., 1999). Medium konvensional  yakni glucose  malt  yeast extract (GMY)  dilaporkan  dapat  meng- hasilkan  pertumbuhan  FPP  dengan  baik akan  tetapi  enzim  ligninolitik  yang dihasilkan  rendah  (Mester et  al .  1996). Medium alami yang  murah seperti TKKS yang  tersedia  melimpah  sebagai  limbah padat  pabrik  minyak  kelapa  sawit  dapat dijadikan alternatif sebagai medium produksi enzim ligninolitik.
Karakterisasi  enzim  juga  perlu dilakukan  untuk  mengetahui  pengaruh berbagai  kondisi  terhadap  laju  reaksi diantaranya  suhu,  pH  dan  konsentrasi substrat  untuk  peningkatan  aktivitas  dan rendemen  enzim.  Penelitian  bertujuan untuk menetapkan potensi produksi lakase Omphalina sp.  pada  medium  cair  sintetik (GMY)  dan  alami  (TKKS)  serta  pemur- nian parsial dan karakterisasinya. Omphalina sp. yang digunakan merupakan FPP  asli  Indonesia  yang  diisolasi  dari pangkal  batang  pohon  kelapa  sawit  yang telah  melapuk  di  Kebun  Kertajaya  PTPN VIII, Banten.
Produksi dan karakterisasi lakase Omphalina sp.

## Bahan dan Metode

## Penyiapan inokulum
Isolat Omphalina sp.  A1  untuk produksi lakase berasal dari koleksi kultur Balai  Penelitian  Bioteknologi  Perkebunan Indonesia  (BPBPI)  dipelihara  dalam potato  dextrose  agar (PDA)  miring,  dan disubkultur  setiap  3-4  minggu.  FPP dikulturkan  pada  medium  PDA  dalam cawan  Petri  selama  tujuh  hari,  kemudian empat  potongan  agar  dan  miselia  masing- masing dengan luas   ± 1 cm 2 diinokulasi- kan  ke  dalam  medium  GMY  50  mL. Kultur  diinkubasikan  pada  suhu  ruang sambil  diguncang  di  atas shaker pada kecepatan  150  rpm  selama  empat  hari. Kultur  miselium  tersebut  setelah  dihomo- genkan dengan vortex, selanjutnya diguna- kan untuk sumber inokulum.

## Produksi enzim
Inokulum  sebanyak  10%  (v/v)  ditam- bahkan  pada  medium  fermentasi  GMY  + MnSO 4 0,2 mM + veratril alkohol 0,1 mM, dan  GMY  +  2,5-xilidin  (0,1  mM).  Kultur kemudian  diinkubasikan  pada  suhu  ruang sambil  diguncang  dengan  kecepatan 150  rpm  selama  10  hari.  Selain  dengan medium  sintetik,  produksi  enzim  juga dilakukan  menggunakan  medium  alami yaitu  TKKS.  TKKS  dikeringkan,  dihan- curkan    dengan  blender  lalu  disaring dengan saringan 50 mesh sehingga dihasil- kan  serbuk  halus.  Sebanyak  2  dan  5% (b/v)  serbuk  TKKS  dalam  60  mM  bufer Na-fosfat pH 6 digunakan sebagai medium fermentasi.
Sampel  kultur  disentrifugasi  dengan kecepatan  3.300  g,  suhu  4 o C  selama  20 menit.  Filtrat  kultur  yang  dihasilkan merupakan   ekstrak   enzim  kasar     dan
selanjutnya  ditentukan  aktivitas  enzim lakasenya.  Aktivitas  Lakase  ditetapkan menurut Perez  &  Jeffries (1992).  Bufer asetat  pH  5  dengan  konsentrasi  0,5  M sebanyak 0,5 mL dan 1 mM 2,2'-azino-bis (3-etilbenzthiazolin-6-asam sulfonat) (ABTS)  sebanyak  0,1  mL  dimasukkan  ke dalam kuvet, kemudian dimasukkan filtrat enzim  uji  sebanyak 0,4  mL.  Volume  total dengan  campuran  1  mL  diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 30 menit selanjut- nya  dikocok  dan  absorbansinya  dibaca pada  spektrofotometer  pada  λ  540  nm. Satu  unit  aktivitas  lakase  didefinisikan sebagai  banyaknya  enzim  yang  dibutuh- kan untuk mengoksidasi 1 nmol ABTS per menit.  Kadar  protein  (µg/mL)  diukur dengan  metode  Lowry et  al. (1951) dengan  bovin  serum  albumin  (BSA) sebagai standar.

## Pemurnian parsial
Filtrat  kultur Omphalina sp.  yang ditumbuhkan  pada  medium  TKKS  2%, pada suhu ruang selama 15 hari digunakan untuk  pemurnian  parsial  enzim.    Filtrat kultur  disentrifugasi  4.000  g  pada  suhu 4 o C  selama  15  menit    untuk  memisahkan substrat  TKKS  dari  suspensi  miselium. Filtrat  jernih  pada  kondisi  tersebut memiliki  aktivitas  lakase  0,39  U/mL. Ekstrak  enzim  kasar  dipekatkan  dengan cara  presipitasi  menggunakan  aseton dingin dengan perbandingan 2:1. Presipitat dipisahkan  dengan  sentrifugasi  pada kecepatan  12.000,  suhu  4 o C  selama  15 menit.  Endapan  dilarutkan  dengan  0,5  M bufer asetat pH 5 kemudian dilewatkan ke dalam  kolom  berisi  Sephacryl  S-200  HR dan  dielusi  dengan  0,5  M  bufer  asetat pH 5 dengan laju alir 2 mL/menit, setiap 2 mL fraksi  yang  terbentuk  dianalisis  aktivitas enzim dan kadar proteinnya.
Siswanto et al.

## Karakterisasi lakase
Fraksi-fraksi
dengan aktivitas
tertinggi (fraksi 19-23) digabungkan untuk karakterisasi  suhu,  pH  dan  konsentrasi substrat  optimum.  Variasi  suhu  meliputi suhu  kamar,  37,  45,  50  dan  60 o C  selama 30  menit.  Variasi  pH  yakni  4,0;  4,5;  5,0; 5,5;  6,0;  6,5  dan  7,0.  Sedangkan  variasi kosentrasi  substrat  yakni  0,1;  0,25;  0,5; 1,0;  1,5  dan  2  mM.  Parameter  kinetika reaksi  ditentukan  dengan  menginkubasi- kan enzim dengan variasi substrat tersebut dalam  bufer  asetat  pH  5,0,  suhu  37 o C. Angka konstanta Michaelis ditetapkan dari persamaan Lineweaver-Burk (1934).
Keterangan: Vo    = kecepatan awal; K M = konstanta Michaelis-Menten; V max = kecepatan maksimum;
S      = konsentrasi substrat

## Hasil dan Pembahasan

## Produksi enzim
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa miselium Omphalina sp.  tumbuh  dengan baik  pada  medium  GMY  (Gambar  1)  dan aktif  menghasilkan  lakase  setelah  diinku- basikan selama empat hari yaitu mencapai 1,162  U/mL  (Gambar  2).  Inkubasi selanjutnya  yaitu  sampai  dengan  10  hari menyebabkan  aktivitas  lakase  sedikit menurun.  Penambahan  bahan  induser mempercepat  produksi  lakase  lebih  dini yaitu pada hari kedua setelah inkubasi. Hal
Gambar  1.  Pertumbuhan  miselium Omphalina sp.  setelah  enam  hari  di  dalam medium GMY.
Figure 1. Growth   of Omphalina sp.  mycelia on GMY media after six  days.
tersebut  kemungkinan  terjadi  karena  kon- sentrasi  induser  cukup  untuk  mengaktif- kan  produksi  lakase.  Namun,  peningkatan aktivitas  lakase  pada  inkubasi  selanjutnya masih  di  bawah  aktivitas  lakase  kontrol. Penambahan  induser  veratril  alkohol +  MnSO 4 bahkan  menyebabkan  aktivitas lakase  turun  drastis  (48,36  %).  Induser 2,5-xilidin telah banyak digunakan karena kemampuannya  yang relatif efektif meng- induksi  aktivitas  lakase  di  antaranya  pada Pleurotus  erygii (Muñoz et.al .,  1997)  dan Pycroporus  cinnabarius (Eggert et  al ., 1996).  Menurut  Xavier et  al. (2007),  2,5 xilidin pada Trametes versicolor menekan metabolisme  glukosa,  karena  xilidin merupakan  senyawa cincin  aromatik yang bersifat  xenobiotik,  sehingga  memicu aktivitas  enzim  oksidase untuk mendegra- dasi senyawa tersebut. Penurunan kembali aktivitas  lakase  belum  diketahui  penye- babnya secara pasti, tetapi diduga konsen- trasi  xilidin  tidak  cukup    untuk  meng- induksi  lebih  lanjut.  Akan  tetapi  penam- bahan  2,5-xilidin  pada  percobaan  ini  ke dalam  medium  kultur Omphalina sp. menghasilkan aktivitas lakase yang masih
1
V K M V max [S] + = 1 1 V
Produksi dan karakterisasi lakase Omphalina sp.
rendah dibandingkan dengan kultur Omphalina sp.  kontrol.  Penghambatan aktivitas  lakase  tersebut  belum  diketahui dengan    pasti.   Walaupun       demikian, konsentrasi  penambahan  tersebut  perlu dioptimasi.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa pada  medium  5%  TKKS,  aktivitas  lakase
Omphalina sp.  sangat  rendah  dibanding- kan  dengan  medium  2%  TKKS  (Gambar 3).  Aktivitas  lakase  maksimum  pada  5% TKKS hanya sebesar 0,06 U/mL sedangkan  pada  medium  2%  TKKS maksimum  sebesar  0,39  U/mL  pada inkubasi  selama  delapan  hari  atau  sekitar enam  kalinya.  Aktivitas  lakase  pada medium  TKKS  lebih  rendah  dibanding dengan  aktivitas  lakase  yang  diperoleh dengan  medium  sintetik  GMY.  Hal  ini dapat  dipahami,  karena  nutrisi  dalam GMY  lebih  kaya  daripada  nutrisi  dalam TKKS.
Gambar  2.  Kurva  produksi  lakase Omphalina sp.  dalam  medium  cair  GMY  dengan  dan  tanpa penambahan induser yang diinkubasikan pada suhu ruang selama 10 hari.
Figure 2. Production  curve  of Omphalina sp.  laccase  on  liquid  media  of  GMY  with  and  no  inducer addition incubated at room temperature for 10 days.
Gambar 3. Kurva produksi lakase pada medium cair 2 dan 5% TKKS.
Figure 3.  Laccase production curve on liquid media of 2 and 5% EFBOP.
GMY (kontrol / control ) GMY + MnSO4+ V.alk GMY+2,5-2,5-xylidine 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 2 4 6 8 10 Waktu inkubasi (hari) Incubation (days) A k ti v it as l ak as e (U /m L ) L a cc a se a ct iv it y (U /m L ) 2               4               6               8             10 0,5 0,3 0,1 0,0 -0,1 A k ti v it as l ak as e (U /m L ) L a cc a se a ct iv it y (U /m L ) Waktu inkubasi (hari) Incubation (days) 2% TKKS ( EFBOP ) 5% TKKS ( EFBOP )

## Siswanto et al.

## Pemurnian parsial
Hasil pemurnian menunjukkan bahwa aktivitas  lakase  tertinggi  terdapat  pada fraksi 19 sampai 23 (Gambar 4). Aktivitas lakase  dari  filtrat  kultur  yang  semula 0,39  U/mL  meningkat  menjadi  0,42- 0,53 U/mL pada fraksi 19-23 dan kemudi-
an  menurun  kembali  pada  fraksi  24-36. Hal ini berarti fraksi-fraksi 19-23 mengan- dung  subunit  molekul  lakase.  Kualitas hasil pemurnian ditunjukkan pada pening- katan  aktivitas  spesifik  yang  mencapai hampir dua kali lipat (Tabel 1). Perolehan kembali  ( yield  recovery )  didapat  sebesar 58,23% dengan kemurnian dua kalinya.
Gambar  4.  Aktivitas  dan  kadar  protein  lakase Omphalina sp.  dari  hasil  pemurnian  parsial  dengan Sephacryl S-200.
Figure  4.      Laccase  activity  and  protein  percentage  of Omphalina sp.  from  partial  purification  with Sephacryl S-200.
Tabel 1. Pemurnian parsial lakase Omphalina sp.
Table 1. Partial purification of Omphalina sp. laccase
Tahapan ( Steps ) Volume (mL) Aktivitas  total Total activity (U) Protein total Total protein (mg) Aktivitas spesifik Specific activity (U/mg) Rendemen Recovery yield (%) Kemurnian (kali) Purity (times) Ekstrak kasar Crude extract 40 15,8 5,46 2,89 100 1,0 Eluat Sephacryl S-200 HR (no.19-23) 20 9,2 1,64 5,61 58,23 2,0
0,6
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 A k ti v it as l ak as e (U /m L ) L a cc a se a ct iv it y (U /m L ) 0  2    4    6    8    10  12  14  16  18  20  22  24  26  28 30  32  34  36  38   40 120 100 80 60 40 20 -20 K ad ar p ro te in (µ g /m L ) P ro te in c o n te n t( µ g /m L ) Fraksi ( Fraction )
Aktivitas ( Activity )             Protein (mg/mL)
Produksi dan karakterisasi lakase Omphalina sp.

## Karakterisasi Lakase
Karakterisasi lakase dilakukan dengan menggunakan  filtrat  enzim  yang  berasal dari  fraksi 19-23.  Hasil  percobaan terlihat bahwa  aktivitas  lakase  meningkat  setelah pemanasan  selama  30  menit  pada  suhu kamar  hingga  50 o C,  selanjutnya  menurun tajam  pada  suhu  60 o C  (Gambar  5). Aktivitas  optimum  terdapat  pada  suhu 50 o C.  Pengamatan  pH  optimal  aktivitas lakase  pada  kisaran  pH  4-7  dalam  0,5  M bufer  natrium  fosfat  pada  suhu  37 o C menunjukkan bahwa Omphalina sp. menghasilkan  aktivitas  lakase  dengan  pH optimum  4,5  (Gambar  6).  Munoz et  al .
(1997)  juga  melaporkan  bahwa  aktivitas lakase P.  eryngii optimum  pada  suhu 65 o C dan pH 4,5.
Pengaruh  konsentrasi  substrat  ABTS terhadap  aktivitas  lakase  menunjukkan bahwa  aktivitas  lakase  meningkat  dari konsentrasi  substrat  0,1  mM  hingga 0,5  mM  (Gambar  7).  Pada  konsentrasi substrat  yang  tinggi  yakni  1,5  dan  2  mM, aktivitasnya  relatif  konstan.  Hubungan persamaan  Lineweaver-Burk  (Gambar  8) dengan konsentrasi substrat ABTS menghasilkan harga V maks sebesar 0,56  U/mL  dengan  harga  K M sebesar 0,15  mM.  Dari  hasil  tersebut  diketahui bahwa  dengan  0,1  mM  sudah  dapat menghasilkan  aktivitas  lakase.    Prasad et  al. (2005)  juga  melaporkan  bahwa lakase P.  ostreatus aktif  pada  substrat
ABTS berkonsentrasi rendah.
Gambar 5. Pengaruh suhu terhadap aktivitas lakase pada pH 5,0, konsentrasi substrat 1 mM.
Figure 5. Effect of temperature on laccase activity at pH 5.0, substrate concentration 1 mM.
25 30        35         40          45         50         55         60
Suhu ( Temperature ) o C 0,7 A k ti v it as l ak as e (U /m L ) L a cc a se a ct iv it y (U /m L ) 0,0 0,2 0,4 0,6
Siswanto et al.
Gambar 6.  Pengaruh pH terhadap aktivitas lakase pada suhu 37 o C, konsentrasi substrat 1mM.
Figure 6.   Effect of  pH on laccase activity at temperature 37 o C, substrate concentration  1 mM.
Gambar 7.  Pengaruh konsentrasi substrat ABTS terhadap aktivitas lakase pada pH 5,0, suhu 37 o C.
Figure 7.    Effect of ABTS substrate concentration on laccase activity at pH 5.0, temperature 37 o C
Gambar 8. Korelasi antara 1/S dan 1/V dalam persamaan Lineweaver-Burk.
Figure 8. Correlation between 1/S and 1/V on Lineweaver-Burk equation.
0,38 0,37 0,35 0,33 4,0          4,5            5,0              5,5           6,0             6,5         7,0 pH A k ti v it as l ak as e (U /m L ) L a cc a se a ct iv it y (U /m L ) Konsentrasi substrat ( Substrate concentration ) [ABTS] (mM) 0                   0,5                    1,0                  1,5                 2,0 0,6 0,4 0,2 0,0 A k ti v it as l ak as e (U /m L ) L a cc a se a ct iv it y (U /m L ) 6000 4000 2000 0 0                              5                              10 1/V 1/[S] y = 0,2693x+1,7986 R 2 = 0,9891
Produksi dan karakterisasi lakase Omphalina sp.
Kesimpulan
Produksi lakase
Omphalina sp. tertinggi  diperoleh  pada  medium glucose malt  yeast (GMY)  sebesar  1,162  U/mL pada  inkubasi  hari  keempat.  TKKS  2%
dapat digunakan untuk substrat
Omphalina sp.  dalam  produksi  lakase dengan aktivitas sebesar 0,385 U/mL pada inkubasi  hari  ke-10.  Pemurnian  parsial  di dalam  kolom  Sephacryl  S-200  HR menghasilkan recovery enzim  lakase sebesar 58,23% dengan kemurnian meningkat  dua  kalinya.  Aktifitas  lakase optimum  pada  suhu  50 o C  dan  pH  4,5.
Pengaruh  variasi  konsentrasi  substrat ABTS terhadap
aktivitas lakase menghasilkan  harga  K M sebesar  0,15  mM dengan V maks sebesar 0,56 U/mL.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian  ini  dibiayai  dengan  dana DIPA  APBN  2005  Balai  Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia.

## Daftar Pustaka
Basuki,  T.  (1994).  Biopulping,  Biobleaching dan Biodegradasi limbah Industri pulp dan kertas oleh Fungi Basidiomycetes Phanerochaete  chrysosporium . Laporan Penelitian . Bandung , PAU, ITB.
Bumpus, J.A., M. Tien, D. Wright & S.D. Aust (1985).  Oxidation  of  persistent  environ- mental  pollutants  by  a  white  rot  fungus. Science , 228 (4706), 1434-1436.
Cullen,  D.  &  P.J.  Kersten  (1996). Enzymology
and Molecular Biology of Lignin Degradation. The Mycota III
Biochemistry  and  Molecular  Biology Brambl/Marzluf  (Eds.) .  Berlin,  Springer- Verlag. p. 295-306.
Dosoretz, C.G, A.H.C. Chen & H.E. Grethlein
(1990).  Effect of  environmental  condition on  extracelluler  protease  activity  in ligninolitic cultures Phanerochaete crhysosporium . Appl. Environ. Microbiol .,
56 , 395-400.
Eggert,  C.,  U.  Temp  &  K.E.  Eriksson  (1996). The  Ligninolytic  system  of  the  white  rot fungus Pycroporus
cinnabarinus : purification  and  characterization  of  the laccase. Appl.  Environ.    Microbiol ., 62 , 1151-1158.
Kirk,  T.K  &  R.L.  Farrel  (1987).  Enzymatic “combustion”  the  microbial  degradation of  lignin. Annv.  Rev.  Microbiol ., 41 ,  465- 565.
Kirk,  T.  K.  &  H.  M.  Chang  (1990).
Biotechnology in Pulp and Paper Manufacture .  New  York,  Butterworth- Heinemann.
Lowry,  O.H.,  N.J.  Rosebrough,  A.L.  Farr  & R.J.  Randall  (1951).Protein  measurement with  the  folin  phenol  reagent. J  Biol.
Chem. 193, 265-75.
Lineweaver,  H.  &  D.  Burk  (1934).  The determination  of  enzyme  dissociation constants". Jour.  Am.  Chem.  Soc. , 56,
658–666
Mester,  T.,  M.  Pena  &  J.A.  Field  (1996). Nutrient regulation of extracellular peroxidases  in  the  white  rot  fungus Bjerkondera sp.  Strain  BOS55. Appl. Microbiol. Biotechnol ., 44 , 778-784.
Muñoz,  C.,  F.  Guillén,  A.T.  Martínez  & Martínez (1997). Induction and characterization of laccase in the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii . Cur. Microbiol ., 34 , 1-5.
Ohkuma, M., Y. Maeda, T. Johjima & T. Kudo (2001).  Lignin  degradation  and  roles  of white  rot  fungi:  Study  on  an  efficient symbiotic system in fungus-growing
Siswanto et al. termites and its application to bioremediation. RIKEN Rev. Foc. Ecomolec. Sci. Res., 42 , 39-42.
Perez, J. & Jeffries T.N. (1992). Mineralization of 14 CO 2 ringlabeled  synthetic  lignin correlates  with  the  production  of  lignin peroxidase,    not  manganese  or  laccase. Appl. Environ. Microbiol ., 58 , 1806-1812.
Pickard,  M.A.,  H.  Vandetrol.,  R.  Ramon  & R. Vazquez-Duhalt (1999). High production  of  ligninolitic  enzymes  from white  rot  fungi  in  cereal  bran  liquid medium. Can. J. Microbiol ., 45 , 627-631.
Prasad,  K.,  S.V.  Mohan,    Y.V.  Bhaskar, S.V. Ramanaiah, V.L. Babu,  B.R. Pati &
P.N.  Sarma  (2005).  Laccase  production using pleurotus ostreatus 1804
immobilized  on  PUF  cubes  in  batch  and packed  bed  reactors:  influence  of  culture conditions. J. Mirobiol. , 43 (3), 301-307.
Suharyanto  &  Siswanto  (2003).  Produksi enzim ligninolitik dari fungi pelapuk putih untuk  biodegradasi  dan  biotransformasi tandan  kosong  kelapa  sawit. Laporan Akhir Penelitian Tahun 2003, APBN/ADB  1526-INO.  Bogor,  Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. 65p.
Xavier, A.M.R.B., A.P.M. Tavares, R. Ferreira,
&  F.  Amado  (2007). Trametes  versicolor growth  and  laccase  induction  with  by- products of pulp and paper industry. Elec. J. Biotech. , 10 (3), 444-451.