Abstract : Anak dara plant (Croton oblongus Burm. F) has been used by the people of Sinjai, South Sulawesi for generations as traditional cosmetics. Several studies have proven that this plant has antioxidant activity and sunscreen activity. Tyrosinase inhibitors are used in cosmetics to prevent hyperpigmentation. Inhibitory activity of the enzyme tyrosinease Anak dara tree bark (Croton oblongus Burm. F) has never been reported. This study aims to find out the inhibitory activity of tyrosinease enzyme of methanol extract Anak dara tree bark (Croton oblongus  Burm.  F).  The  extraction  method  used  is  maceration.  Testing  was  carried  out  with  L-tyrosine  as  a substrate, a methanol extract of Anak dara tree bark (Croton oblongus Burm. F) with concentrations of 20 ppm, 40 ppm, 60 ppm, 80 ppm, and 100 ppm, and Cojic acid as a positive control and then measured absorption using a micro plate reader at a wavelength of 490 nm. The results showed that the extract of methanol  Anak dara tree bark (Croton oblongus Burm. F) has strong inhibitory activity of tyrosinase enzyme with an IC50 value of 76.80 μg/mL.
Keywords :  Tyrosinase enzyme; Croton oblongus Burm F.; Hyperpigmentation
Abstrak : Tanaman Anak dara ( Croton oblongus Burm. F) telah digunakan oleh masyarakat Sinjai, Sulawesi Selatan secara turun temurun sebagai kosmetik tradisional. Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa tanaman ini memiliki aktivitas antioksidan dan tabir surya. Inhibitor tirosinase digunakan dalam kosmetik sebagai  pencegah  terjadinya  hiperpigmentasi.  Aktivitas  penghambatan  enzim  tirosinase  klika  Anak  dara ( Croton oblongus Burm. F)   belum pernah dilaporkan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas penghambatan  enzim  tirosinase  ekstrak  metanol  klika  Anak  dara  ( Croton  oblongus Burm.  F).  Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Pengujian dilakukan dengan L-tirosin sebagai substrat, ekstrak metanol klika Anak dara ( Croton oblongus Burm. F) dengan konsentrasi 20 ppm, 40 ppm, 60 ppm, 80 ppm, dan  100  ppm,  dan  asam  kojat  sebagai  kontrol  positif  lalu  diukur  serapannya  menggunakan  micro  plate reader pada panjang gelombang 490 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak metanol klika Anak dara  ( Croton oblongus Burm. F) memiliki aktivitas penghambatan enzim tirosinase  yang kuat  dengan nilai IC 50 sebesar 76,80 µg/mL
Kata Kunci :  Enzim tirosinase; Croton oblongus Burm F. ; Hiperpigmentasi
AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM TIROSINASE EKSTRAK METANOL KLIKA ANAK DARA ( Croton oblongus Burm F. )
1|Afrisusnawati Rauf, 2|Surya Ningsi, 3|A. Hasriani, 4|Mukhriani Email Korespondensi : afrisusnawati.rauf@uin-alauddin.ac.id Jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Alauddin Makassar

## PENDAHULUAN
Pigmen  melanin  adalah  mekanisme  pertahanan  utama  terhadap  sinar  ultraviolet  dan berperan penting dalam pencegahan kerusakan kulit akibat sinar matahari (Pegard, 2016). Indonesia  adalah  negara  tropis  dengan  radiasi  sinar  matahari  yang  intens,  oleh  karena  itu produksi  melanin  di  kulit  dapat  terpicu  sehingga  dapat  menyebabkan  hiperpigmentasi. Melanin, pigmen utama yang terutama bertanggung jawab pada kulit, rambut dan pigmentasi mata  manusia,  diproduksi  oleh  melanosit  melalui  melanogenesis.  Melanogenesis  dan pigmentasi kulit adalah faktor fotoprotektif terpenting dalam menanggapi radiasi ultraviolet yang  merusak  dari  sinar  matahari  dan  fotokarsinogenesis  kulit.  Hilangnya  melanin  dan depigmentasi yang abnormal bisa menjadi masalah kecantikan dan dermatologis wajah yang serius (Zolghadri, 2019).
Proses  pembentukan  melanin  dapat  dikurangi  dengan  menghambat  enzim  tirosinase. Tirosinase  (EC  1.14.18.1)  adalah  enzim  yang  mengandung  tembaga  multifungsi,  yang mengatur melanogenesis di dalam melanosit. Oksidasi L-tirosin dan l-DOPA adalah langkah pertama  dari  melanogenesis  yang  dikatalisis  oleh  tirosinase.  Tirosinase  mengkatalis pembentukan  kuinon,  yang  digunakan  lebih  lanjut  untuk  sintesis  melanin  (Biswas,  2017). Inhibitor  tirosinase  adalah  senyawa  yang  dapat  menghambat  pembentukan  melanin Senyawa  ini  adalah  pendekatan  terbaru  yang  digunakan  untuk  mencerahkan  kulit.  Banyak senyawa  sintetis  telah  dibuktikan  menunjukkan  efek  penghambatan  terhadap  enzim tirosinase dan melanosit pada melanogenesis, seperti asam kojic, merkuri, hidrokuinon, dan arbutin.  Namun,  senyawa-senyawa  ini  memiliki  efek  samping  yang  berbahaya  dalam
penggunaan  jangka  panjang.  Oleh  karena  itu,  diperlukan  senyawa  bioaktif  dan  tidak berbahaya dari sumber alami dengan aktivitas penghambatan tirosinase (Dolorosa, 2019).
Beberapa  tanaman  yang  telah  dilakukan  uji  aktivitas  inhibitor  tirosinase  antara  lain:  kulit batang  nangka  (Juwita,  2013), Sophora  japonica L.  (Lai,  2014),  bengkoang  (Fitrah,  2015), Populus  nigra (Pegard,  2016),  rumput  laut  (Arifianti,  2017), Sargassum  plagyophyllum dan Eucheuma  cottonii (Dolorosa,  2019),  merbau  ( Instsia  palembanica )  (Batubara,  2010), alamanda (Yamauchi, 2011), akar manis (Noor, 2016), kulit buah nyirih (Gazali, 2014), daun pepaya (Sagala, 2019), daun bidara arab (Purnamasari, 2020)
Tanaman  Anak  dara  ( Croton  oblongus Burm.  F)  telah  digunakan  oleh  masyarakat  Sinjai, Sulawesi  Selatan  secara  turun  temurun  sebagai  kosmetik  tradisional  yaitu  masker  pada wajah. Masyarakat Dusun Bongkong Kabupaten Sinjai Tengah  telah menggunakan tanaman ini  sebagai  bedak  dingin  yang  dipercaya  memiliki  khasiat  mengencangkan  kulit.  Tanaman Anak  dara juga  dipercaya mampu  mengobati  beberapa penyakit  seperti  nyeri  haid,  kanker rahim dan penghilang bau badan (Awainah, 2016). Beberapa penelitian terkait tanaman ini antara lain potensi sebagai antimikroba (Mukhriani, 2015), aktivitas penghambatan terhadap sel  hela  (Tahar,  2015),  kandungan  senyawa  flavonoid,  terpenoid,  dan  fenolik  di  dalam tanaman Anak dara (Haeria, 2016), potensi sebagai tabir surya (Haeria, 2014), dan aktivitas antioksidan (Awaluddin, 2019).
Eksplorasi senyawa bioaktif yang potensial sebagai penghambat tirosinase yang berasal dari sumber-sumber  alami  ( natural  product )  masih  perlu  dilakukan.  Berdasarkan  hal  tersebut maka  dilakukan  penelitian  ini  yang  bertujuan  untuk  mengetahui  aktivitas  penghambatan enzim  tirosinase  ekstrak  metanol  klika  Anak  dara  ( Croton  oblongus Burm  F.).  Penelitian terhadap  penghambatan  enzim tirosinase yang  berasal dari  tumbuhan  khususnya  tanaman Anak dara ( Croton oblongus Burm F.) diharapkan dapat memberikan kontribusi besar dalam fomulasi kosmetik untuk mencegah hiperpigmentasi yang disebabkan oleh radiasi ultraviolet yang berasal dari matahari.

## METODE PENELITIAN

## Penyiapan sampel
Sampel yang digunakan adalah klika Anak dara ( Croton oblongus Burm F.). Sampel yang telah kering dan dihaluskan kemudian ditimbang sebanyak 100 gram  lalu dimasukkan ke dalam wadah  penyarian.  Teknik  penyarian  yang  digunakan  adalah  maserasi.  Sampel  yang  telah dimasukkan  ke  dalam  wadah  kemudian  direndam  dengan  cairan  penyari  metanol  dengan perbandingan 1 gram sampel : 10 ml pelarut selama 12 jam sebanyak tiga kali. Ekstrak yang diperoleh  lalu  disaring  dengan  filter  Whatman  dan  dipekatkan  menggunakan  rotary evaporator (Batubara, 2010).

## Analisis Fitokimia

## Alkaloid
Sebanyak 0,5 gram ekstrak metanol klika Anak dara ( Croton oblongus Burm F.) dimasukkan ke  dalam  tabung  reaksi  dan  ditambahkan  2  ml  HCl  2N  kemudian  dipanaskan  selama  2-3 menit, didinginkan dan ditambahkan NaCl lalu disaring. Ditambahkan 2 ml HCl 2N ke dalam filtrat.  Ekstrak  dibagi  menjadi  3  bagian  dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi.  Tabung reaksi  (I)  ditambahkan dragendorf  menghasilkan  endapan  merah  jingga,  tabung  reaksi  (II) ditambahkan  mayer  menghasilkan  endapan  putih  kekuningan,  dan  tabung  reaksi  (III) ditambahkan wagner menghasilkan endapan coklat.

## Flavonoid
Sebanyak 0.5 gram ekstrak metanol klika Anak dara ( Croton oblongus Burm F.) ditambahkan aquades  dan  heksan  lalu  dikocok.  Campuran  akan  terpisah  menjadi  2  lapisan.  Ekstrak metanol  dalam  air  akan  berada  di  bawah  dan  lapisan  heksan  akan  berada  di  atas.  Lapisan heksan dipisahkan sementara lapisan air ditambahkan etanol kemudian dipisahkan menjadi
2  bagian.  Bagian pertama ditambahkan  0,5  ml  HCl  pekat,  lalu dipanaskan di  atas penangas selama 15 menit. Positif bila berwarna merah terang atau violet. Bagian kedua ditambahkan 0,5 ml HCl pekat selanjutnya ditambahkan 3 - 4 potong magnesium, amati perubahan warna yang  terjadi  pada  tiap  lapisan.  Jika  warna  merah  berarti  positif  mengandung  flavonoid. Merah pucat-merah tua mengandung flavon.

## Glikosida
Sebanyak 0,2 gram ekstrak metanol klika Anak dara ( Croton oblongus Burm F) diuapkan di atas  penangas  air,  lalu  ditambahkan  3  ml  asam  asetat  dengan  sedemikian  pemanasan, kemudian didinginkan. Selanjutnya, larutan ini ditambah larutan besi (III) klorida 0,3M, lalu dengan hati-hati ditambahkan campuran 3 ml asam sulfat dan 1 tetes besi (III) klorida 0,3M sehingga  akan  terbentuk  cincin  warna  merah  cokelat  pada  batas  cairan.  Setelah  beberapa menit di atas cincin akan berwarna biru hijau, ini menunjukkan adanya glikosida dan glikon gula 2- deoksi
Saponin
Sebanyak 0,5 gram ekstrak metanol klika Anak dara ( Croton oblongus Burm F.) ditambahkan 10  ml  air  panas  kemudian  didinginkan,  selama  10  detik  larutan  dikocok  dengan  kuat  lalu didiamkan selama 10 detik. Terbentuk buih setinggi 1-10  cm dan buih tidak hilang bahkan setelah penambahan 1 tetes HCl 2N jika ekstrak positif mengandung saponin.

## Fenolik
Sebanyak 0,2 gram ekstrak metanol klika Anak dara ( Croton oblongus Burm F.) ditambahkan dengan larutan FeCl3 1%. Hasilpositif  ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau, merah, ungu, biru tua, biru, biru kehitaman, atau hijau kehitaman

## Pembutan larutan dapar fosfat
Ditimbang  sebanyak  2,7  g  KH 2 PO 4 dan  dilarutkan  dalam  air  suling,  sedikit  demi  sedikit hingga mencukupi volume 400 mL. Selanjutnya pH larutan diukur dengan menggunakan pH meter.  Ditimbang  5,6  g  KOH  dan  larutkan  dalam  100  mL  air  suling.  Larutan  KOH ditambahkan  kedalam  larutan  KH 2 PO 4 hingga  mencapai    pH  6,8.  Larutan  dapar  fosfat disimpan pada lemari pendingin untuk pendapat yang digunakan pada larutan enzim karena enzim stabil pada suhu -20 o C.

## Pembuatan larutan L- Tirosin
Sebanyak 18,2 mg L-Tirosin dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 mL, ditambahkan dapar fosfat  sedikit  demi  sedikiti,  dan  dihomogenkan.  Volumenya  dicukupkan  hingga    100  mL dengan larutan dapar fosfat.

## Pembuatan larutan enzim tirosinase
Sebanyak 1 mg enzim tirosinase dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL dilarutkan dalam 10 mL larutan dapar fosfat yang telah didinginkan. Larutan enzim tirosinase diletakkan pada wadah yang berisi es agar suhu enzim tetap stabil pada suhu dingin saat pengerjaan.
Pembuatan larutan uji ekstrak metanol klika Anak dara ( Croton oblongus Burm F.)
Sebanyak  5  mg  ekstrak  metanol  klika  Anak  dara  ( Croton  oblongus Burm  F.)  ditimbang kemudian  dilarutkan  dengan  bantuan  DMSO  sebanyak  50  µl,  dihomogenkan  lalu ditambahkan dengan dapar fosfat sampai 1000 µl sehingga diperoleh larutan stok 1000 ppm. Larutan stok lalu diencerkan sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan, sehingga diperoleh larutan  ekstrak dengan  konsentrasi  masing-masing  20  ppm,  40  ppm,  60  ppm,  80  ppm  dan 100 ppm.

## Pembuatan larutan kontrol positif Asam kojat
Sebanyak  5 mg asam kojat dimasukkan kedalam tabung ependorf  dan dilarutkan dalam 5 ml dari  50  Mm  larutan dapar  fosfat  (pH,6,5).  Kemudian  larutan  asam  kojat  diencerkan hingga diperoleh larutan asam kojat dengan konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, dan 100 ppm.

## Uji aktivitas penghambatan enzim tirosinase
Sebanyak  50  µl  L-Tirosin  1  mM,  50  µl  larutan  dapar  fosfat  50  mM  (pH  6,8),  20  µl  larutan enzim tirosinase dan 100 µl larutan sampel dimasukkan ke dalam sumuran pada microplate . Campuran  tersebut  diinkubasi  selama  5  menit  pada  suhu  kamar,  kemudian  diukur serapannya  menggunakan microplate  reader (ELISA)  pada  panjang  gelombang  490  nm. Dilakukan  pengujian  blanko  tanpa  penambahan  enzim  yaitu  digunakan  sebanyak  170  µl larutan dapar fosfat (pH 6,8), 50 µl L-Tirosin 1 mM.  Kontrol negatif menggunakan campuran tersebut  diatas  tanpa  penambahan  sampel  dan  untuk  kontrol  positif  menggunakan  asam kojat. Pengujian dilakukan secara triplo.

## Analisis data
Penentuan persentase penghambatan aktivitas tirosinase berdasarkan rumus :
% penghambatan Tirosinase = A−B A ×  100%
Keterangan : A = Absorbansi sampel tanpa penambahan inhibitor. B = Absorbansi sampel dengan penambahan inhibitor. Aktivitas penghambatan dari sampel uji ditentukan dengan IC 50 yaitu konsentrasi sampel uji menghambat  aktivitas  tirosinase  sebesar  50%.  IC 50 dihitung  dengan  menggunakan persamaan  regresi  linier,  log  konsentrasi  sampel  sebagai  sumbu  x  dan  probit  %  inhibisi sebagai sumbu y, dari persamaan y = bx ± a dapat dihitung nilai IC 50 . Rumus IC 50 y = ax + b x = (50 – a) : b Keterangan: a = slope b = intersep

## HASIL PENELITIAN
Tabel 1. Hasil identifikasi golongan senyawa ekstrak metanol klika Anak dara ( Croton Oblongus Burm F. ) Golongan Senyawa Ekstrak metanol Klika Anak Dara ( Croton Oblongus Burm F ) Alkaloid - Flavonoid + Glikosida - Saponin + Fenolik + Tabel 2. Aktivitas penghambatan ekstrak metanol klika Anak dara ( Croton Oblongus Burm F. ) dengan Asam kojat sebagai kontrol positif Sampel Konsentrasi Persen (%) penghambatan Nilai IC 50 (µg/mL) Ekstrak metanol klika Anak dara 20 ppm 39,46 % 76,80 40 ppm 41,80 % 60 ppm 45,95 % 80 ppm 52,02 % 100 ppm 54,14 % Asam kojat 20 ppm 38,82 % 65,29 40 ppm 41,27 % 60 ppm 55,42 % 80 ppm 56,27 % 100 ppm 57,23 %
Gambar 1. Kurva konsentrasi ekstrak vs persen penghambatan
Gambar 2. Kurva konsentrasi asam kojat vs persen penghambatan

## DISKUSI

## Hasil Analisis Fitokimia
Analisis  Fitokimia  merupakan  salah  satu  cara  untuk  mengetahui  kandungan  metabolit sekunder pada suatu sampel. Identifikasi golongan senyawa ekstrak metanol klika Anak dara ( Croton  Oblongus Burm  F.)  dilakukan  terhadap  senyawa  alkaloid,  flavonoid,  glikosida, saponin  dan  fenol.  Hasil  identifikasi  menujukkan  bahwa  ekstrak  metanol  klika  anak  dara positif  mengandung  senyawa  flavonoid,  saponin  dan  fenol.  Penelitian  yang  dilakukan  oleh (Haeria,  2016)  juga  mendapatkan  hasil  positif  terdapat  kandungan  flavonoid  serta  fenolik pada ekstrak n-heksan klika Anak dara.
Flavonoid  dianggap  sebagai  antioksidan  hidrofilik  yang  bertindak  sebagai  antimikroba, fotoreseptor  dan  bertanggung  jawab  untuk  fungsi  penting  pada  tumbuhan  seperti
y = 0.1979x + 34.8 R² = 0.9752 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 120 % P en gh am b at an Konsentrasi Kurva ekstrak y = 0.2444x + 34.029 R² = 0.9558 0 10 20 30 40 50 60 70 0 20 40 60 80 100 120 % P en gh am b at an Konsentrasi Kurva Asam Kojat
pigmentasi,  perlindungan  UV  dan  pertahanan  terhadap  pathogen  (Rui-Min  Han,  2012) (Bubols,  2013).  Dalam  kesehatan  manusia,  senyawa  fenolik  ini  memiliki  efek  potensial menguntungkan  karena  kemampuannya  dalam  membersihkan  radikal  bebas  yang  terkait beberapa penyakit seperti kanker dan penyakit kardiovaskular (Fereidoon Shahidi, 2015).

## Aktivitas penghambatan enzim tirosinase
Tirosinase atau sering disebut juga polifenol oksidase  merupakan enzim yang mengandung atom  Cu  yang  berperan  sebagai  katalisator  pada  dua  reaksi  yang  berbeda  dalam pembentukan  melanin.  Reaksi  yang pertama  yaitu  hidroksilasi  L-Tyrosine  menjadi L-DOPA dalam  aktivitas  monofenolase  sedangkan  reaksi  kedua  yaitu  oksidasi  L-DOPA  menjadi dopaquinon (senyawa kuinon) dalam aktivitas difenolase (Mun˜oz-Mun˜oz, 2010).
Pengujian  aktivitas  penghambatan  enzim  tirosinase  oleh  ekstrak  metanol  klika  anak  dara ( Croton  Oblongus Burm  F.)  dilakukan  dengan  menggunakan  L-Tirosin  sebagai  substrat  dan asam kojat sebagai kontrol positif. Asam kojat dipilih karena merupakan inhibitor tirosinase yang memiliki daya hambat dan kestabilan paling tinggi dalam suatu kosmetik pencerah kulit (Tamura,  2007).  Asam  kojat  mempunyai  kemampuan  untuk  mengkelat  logam  tembaga  di situs aktif enzim tirosinase.
Hasil uji aktivitas  penghambatan enzim tirosinase ekstrak metanol  klika Anak dara ( Croton Oblongus Burm F.) dengan berbagai konsentrasi yakni 20 ppm, 40 ppm, 60 ppm, 80 ppm, dan 100 ppm diperoleh hasil berturut-turut sebesar 39,46 %, 41,80 %, 45,95 %, 52,02 %, 54,14 %. Sedangkan asam kojat sebagai kontrol positif dengan berbagai konsentrasi yaitu 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, dan 100 ppm diperoleh hasil berturut-turut sebesar 37,65 %, 38,82 %,  41,27  %,  56,27  %,  dan  57,23  %.    Hasil  tersebut  diperoleh  dari  perhitungan  nilai absorbansi  yang  dilakukan  secara  triplo  untuk  setiap  konsentrasi.  Adapun  hasil  yang diperoleh  dalam  bentuk  persentase  bertujuan  untuk  mengetahui  skala  perbandingan aktivitas inhibitor enzim pada setiap konsentrasi sampel.
Setelah persentase  penghambatan ekstrak metanol  klika Anak dara ( Croton Oblongus Burm F.)  dan  asam  kojat  diketahui,  selanjutnya  dilakukan  penentuan  nilai  IC 50 .  IC 50 adalah konsentrasi  suatu  inhibitor  yang  dibutuhkan  untuk  menghambat  setengah  dari  aktivitas enzim  dalam  kondisi  teruji  (Chang,  2009).  Besarnya  penghambatan  ditentukan  dengan mengukur  absorbansi  pembentukan  dopakrom  menggunakan  microplate  reader  pada panjang  gelombang  490  nm.  Alat  ini  dipilih  karena  memiliki  sensitifitas  yang  tinggi, pengoperasian alat yang halus, kecepatan deteksi yang tinggi, dan sangat akurat. Dari hasil perhitungan diperoleh nilai IC 50 ekstrak metanol klika Anak dara ( Croton Oblongus Burm F.) yaitu 76,80 µg/mL sedangkan IC 50 untuk Asam kojat yaitu 65,29 µg/mL. Nilai tersebut lebih besar jika dibandingkan dengan nilai IC 50 dari asam kojat. Hasil tersebut menunjukkan bahwa asam  kojat  lebih  baik  dalam  menghambat  enzim  tirosinase  dibandingkan  dengan  ekstrak metanol  klika  Anak  dara  ( Croton  Oblongus Burm  F.).  Semakin  kecil  nilai  IC 50 ,  maka kemampuan untuk menghambat enzim tirosinase semakin kuat.
Nilai    IC 50 dibawah  100  µg/mL  menunjukkan  potensi  penghambatan  aktivitas  enzim tirosinase yang paling kuat, nilai IC 50 100-450 µg/mL menunjukkan potensi penghambatan yang kurang kuat, dan nilai IC 50 450-700 µg/mL menunjukkan potensi penghambatan sangat lemah (Batubara, 2010).  Dari hasil pengujian dapat diketahui bahwa  ekstrak metanol klika Anak  dara  ( Croton  Oblongus Burm  F.)  memiliki  potensi  penghambatan  aktivitas  enzim tirosinase yang kuat.
Klika  Anak  dara  ( Croton  Oblongus Burm  F.)    dapat  berperan  sebagai  penghambat  enzim tirosinase  karena  adanya  kandungan  senyawa  flavonoid  dalam  bagian  tanaman  ini. Mekanisme  penghambatan yang terjadi  adalah  penghambatan  kompetitif  untuk  oksidasi  L- DOPA  oleh  enzim  tirosinase  dan  bagian  3-hidroksi4-keto  dari  struktur  flavonoid  yang berperan  sebagai  pengelat  logam  tembaga  (Cu)  dari  struktur  enzim  tirosinase.  Pada umumnya satu molekul enzim tirosinase mengandung dua atom Cu yaitu Cu A dan Cu B yang
terikat dengan tiga asam amino histidin (Chang, 2009). Logam Cu berperan sebagai kofaktor pada  aktivitas  enzim  tirosinase.  Kemampuan  katalitik  enzim  tirosinase  menjadi  berkurang dengan hilangnya Cu dari situs aktif enzim, sehingga dopakrom tidak terbentuk. Produk yang dihasilkan  dari  reaksi  dengan  substrat  adalah  dopakrom  yang  berwarna  jingga  tua sampai merah  sedangkan  produk  yang  dihasilkan  dari  penggunaan  penghambat  tidak  berwarna, sehingga persen penghambatan tirosinase dapat dihitung dengan cara mengurangi serapan yang  terbentuk  tanpa  penghambat  dengan  serapan  yang  terbentuk  dengan  penambahan penghambat.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan,  maka  dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak  metanol klika  Anak  dara  ( Croton  oblongus Burm  F.)  memiliki  aktivitas  penghambatan  enzim tirosinase yang kuat dengan nilai IC 50 sebesar 76,80 µg/mL.

## DAFTAR PUSTAKA
Arifianti, A. E. (2017). Aktivitas Penghambatan Tirosinase Dan Antioksidan Serbuk Rumput Laut Dari Sargassum Plagyphyllum Segar Dan Kering. JPHPI, 20 (3), 488-493. Awainah, N. (2016). Standarisasi Ekstrak Metanol Klika Anak Dara (Croton oblongus Burm F.).
Makassar: Program Studi Farmasi UIN Alauddin Makassar.
Awaluddin, N. (2019). Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Methanol Klika Anak Dara (Croton Oblongus Burm) Menggunakan Metode Dpph. Jurnal Farmasi FKIK UINAM, 2 , 38-45.
Batubara.  (2010).  Potency  of  Indonesian  Medicinal  Plants  as  Tyrosinase  Inhibitor  and Antioxidant Agent. Journal of Biological Sciences, 10 (2), 138-144.
Biswas,  R.  (2017).  Tyrosinase  inhibitory  mechanism  of  betulinic  acid  from  Dillenia  indica.
Food Chemistry, 232 , 689-696.
Bubols, G. B. (2013). The Antioxidant Activity of Coumarins and Flavonoids. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 13 , 318-334. Chang,  T.-S.  (2009).  An  Updated  Review  of  Tyrosinase  Inhibitors. Int.  J.  Mol.  Sci,  10 ,  2440- 2475.
Dolorosa,  M.  T.  (2019).  Tyrosinase  inhibitory  activity  of  Sargassum  plagyophyllum  and Eucheuma cottonii methanol extracts. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science .
Fereidoon Shahidi, P. A. (2015). Phenolics and polyphenolics in foods, beverages and spices: Antioxidant activity and health effects –A review. Journal of functional foods, 18 , 820– 897.
Fitrah,  S.  (2015).  Pengaruh  Pemberian  Umbi  Bengkuang  (Pachyrrhizus  Erosus  L  Urban) Terhadap  Jumlah  Pigmen  Melanin  Kulit  Mencit  (Mus  Musculus)  Yang  Dipaparkan Sinar Matahari. Jurnal e-Biomedik (eBm), 3 (1).
Gazali,  M.  (2014).  Potency  of  waste  fruit  peel  of  Xylocarpus  granatum  as  a  tyrosinase inhibitor. Depik, 3 (3), 187-194.
Haeria.  (2014).  Penentuan  Potensi  Tabir  Surya  Ekstrak  Klika  Anak  Dara  (Croton  Oblongus Burm F.). JF FIK UINAM, 2 (1), 1-5.
Haeria.  (2016).  Fraksinasi  dan  Identifikasi  Senyawa  Ekstrak  n-heksan  Klika  Anak  Dara (Croton oblongus Burm F.). Pharmauho, 2 (1), 13-16.
Juwita, N. K. (2013). Uji Penghambatan Tirosinase Dan Stabilitas Fisik Sediaan Krim Pemutih Yang Mengandung Ekstrak Kulit Batang Nangka (Artocarpus heterophyllus). Majalah Ilmu Kefarmasian, 8 (2), 57-124. Lai, J.-S. (2014). Tyrosinase Inhibitory Activity and Thermostability of the Flavonoid Complex from  Sophora  japonica  L  (Fabaceae). Tropical  Journal  of  Pharmaceutical  Research, 13 (2), 243-247.
Mukhriani.  (2015).  Fraksinasi  Senyawa  Antimikroba  Daun  Anak  Dara  (Croton  Oblongus Burm F.). JF FIK UINAM, 3 (4), 193-200.
Mun˜oz-Mun˜oz,  J.  L.  (2010).  Suicide  Inactivation  of  the  Diphenolase  and  Monophenolase Activities of Tyrosinase. IUBMB Life, 62 (7), 539–547.
Noor,  S.  U.  (2016).  Formulation  Of  Liquorice  Root  Extract  (Glycyrrhiza  Glabra  L.)  As  Skin Whitening Cream. Jurnal Tumbuhan Obat Indonesia, 9 (2), 93-99.
Pegard,  M.  A.  (2016).  Populus  nigra  (Salicaceae)  absolute  rich  in  phenolic  acids, phenylpropanoïds and flavonoïds as a new potent tyrosinase inhibitor. Fitoterapia . Purnamasari,  D.  R.  (2020).  Test  Of  Tyrosinase  Enzyme  Inhibitor  Activity  Of  Bidara  Arab Leaves  Ethanol  Extract  (Ziziphus  Spina-Christi  L.)  By  In  Vitro. Іndоnеѕіа  Nаturаl Rеѕеаrсh Рhаrmасеutісаl Jоurnаl, 5 (1), 35-44.
Rana,  J.  (2013).  Inhibition  of  Melanin  Content  by  Punicalagins  in  The  Super  Fruit Pomegranate (Punica granatum). Journal of Cosmetics Sciences, 64 (6), 445-453.
Rui-Min  Han,  J.-P.  Z.  (2012).  Reaction  Dynamics  of  Flavonoids  and  Carotenoids  as Antioxidants. Molecules, 17 , 2140-2160.
Sagala, Z. (2019). Uji Aktivitas Inhibisi Terhadap Enzim Tirosinase Dari Ekstrak Etanol Daun Pepaya (Carica papaya L.) Secara In Vitro. Jurnal Penelitian Farmasi Indonesia, 7 (2), 2656-3614.
Tahar,  N.  (2015).  Uji  Aktivitas  Penghambatan  Fraksi  Non  Polar  Ekstrak  Klika  Anak  Dara (Croton Oblongus Burm F.) Terhadap Sel Kanker Hela. JF FIK UINAM, 3 (3), 129-133. Yamauchi,  K.  (2011).  Isolation,  Identification  and  Tyrosinase  Inhibitory  Activities  of  the Extractives from Allamanda cathartica. Natural Resources, 2 , 167-172. Zolghadri,  S.  (2019).  A  comprehensive  review  on  tyrosinase  inhibitors. Journal  of  Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 34 (1), 279–309.