## VALIDASI METODE FLOODING DOSE UNTUK MENGUKUR LAJU SINTESIS PROTEIN PADA SEL CACO-2

## Ulyarti
Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Jambi

## ABSTRAK
Metode flooding dose adalah salah satu teknik yang digunakan untuk mengukur laju sintesis protein. Metode  ini  menggunakan  asam  amino  yang  diberi  label  radioaktif  bersamaan  dengan  asam  amino yang tidak berlabel radioaktif dalam jumlah yang besar.  Penelitian ini dilakukan untuk memvalidasi metode flooding dose yang digunakan untuk mengukur laju sintesis protein pada sel Caco-2. Penelitian ini  berhasil  menunjukkan  tercapainya  ekuilibrium  antara  aktifitas  spesifik  phenylalanine  bebas intraseluler pada sel Caco-2 dan aktifitas spesifik phenylalanine bebas ekstraseluler pada media untuk menumbuhkan  sel  Caco-2.    Pencapaian  ekuilibrium  ini  adalah  validasi  metode flooding  dose untuk mengukur laju sintesis protein pada sel Caco-2.
Kata kunci: flooding dose , laju sintesis protein, Caco-2

## ABSTRACT
Flooding  dose  method is one  technique that  usually  used  for  measuring  protein synthesis  rate.   This method  uses  labelled  amino  acid  together  with  large  amount  of  unlabelled  amino  acid.    This experiment was done to validate the flooding dose method used in measuring protein synthesis rate in Caco-2 cells. The results showed that there were equilibrium between intracellular free phenylalanine and extracellular free phenylalanine in media used to grow Caco-2 cells.   This is a validation of the flooding method used in measuring protein synthesis rate in Caco-2 cells.

## Keywords: flooding dose, protien synthesis rate, Caco-2

## PENDAHULUAN
Laju sintesis protein dapat ditentukan dengan  mengukur  laju  pengikatan  asam amino  yang  telah  diberi  label  radioaktif kedalam  protein.    Pengukuran  laju  sintesis protein  rata-rata  memerlukan  pengukuran aktifitas  spesifik  asam  amino  yang  telah terikat  pada  protein  dan  aktifitas  spesifik asam  amino  bebas  yang  bertindak  sebagai prekursor  dan  terdapat  pada  lokasi  sintesis protein.    Aktifitas  spesifik  ( specific  activity) adalah  kuantifikasi  jumlah  radioaktif  yang dalam  penelitian  ini  aktifitas  spesifik  adalah kuantifikasi  asam  amino  yang  berlabel radioaktif.
Pengukuran  aktifitas  spesifik  asam amino  yang  terikat  pada  protein  dapat dilakukan  dalam  2  tahap  yaitu  hidrolisis protein  untuk  melepaskan  asam  amino  yang terikat  dan  diikuti  dengan  pengukuran aktifitas spesifik asam amino hasil hidrolisis. Pengukuran  aktifitas  spesifik    asam  amino bebas  yang  bertindak  sebagai  precursor sintesis  protein  dapat  dilakukan  dengan mengukur aminoacyl t-RNA, namun pengkuran  precursor  ini  sulit  dilakukan karena  precursor  ini  terdapat  dalam  jumlah yang sangat kecil sehingga sulit terdeteksi. 1,2)
Selain  itu,  aminoacyl  t-RNA  mengalami
turn-over  yang  tinggi  sehingga  diperlukan waktu  yang  sangat  singkat  untuk  mengukur jumlahnya.
Kesulitan ini kemudian diatasi dengan  menggunakan  asam  amino  bebas didalam  sel  (intraseluler)  atau  asam  amino bebas  didalam  plasma  (extraseluler)  sebagai acuan prekursor sintesis protein.  Metode ini hanya dapat dilakukan dengan asumsi bahwa aktifitas  spesifik  prekursor-prekursor  ini berada  dalam  keadaan  ekuilibrium  dengan aktifitas spesifik aminoacyl t-RNA.
Pencapaian ekuilibrium antara precursor yang diukur dengan precursor yang sebenarnya  dilakukan  dengan  menggunakan dua  metoda  yaitu constant  infusion dan flooding  dose .    Metode constant  infusion menggunakan asam amino dengan konsentrasi  yang  rendah  namun  dilakukan dalam waktu yang cukup lama (infuse hingga 6 jam).  Metode flooding dose menggunakan asam  amino  dengan  konsentrasi  yang  tinggi namun  dilakukan  dalam  waktu  yang  singkat (kurang  lebih  10  menit).    Masing-masing metode  dapat  digunakan  dalam  pengukuran laju  sintesis  protein  untuk  sampel  yang sesuai 3 .  Penelitian  ini  dilakukan  dengan tujuan  untuk  memvalidasi  metode flooding dose dalam  pengukuran  laju  sintesis  protein pada  sel  Caco-2.    Metode  ini  dinyatakan dapat  digunakan  untuk  mengukur  laju sintesis protein apabila terbentuk ekuilibrium antara asam amino bebas intraseluler dengan asam amino bebas  ekstraseluler.

## METODE

## Bahan
Zat kimia untuk menumbuhkan kultur sel,  lisis,  pengukuran  aktifitas  spesifik  asam amino  dan  pengukuran  protein  dibeli  dari Sigma  Chemicals .    Zat  kimia  untuk menumbuhkan  kultur  sel    terdiri  dari Dulbecco’s  Modified  Eagle’s  Medium (DMEM),  trypsin,  Fetal  Bovine  Serum (FBS),  penicillin  dan  glutamin.    Protease inhibitor,  sodium  duodecyl  sulphate  (SDS), dan Phosphate Bufer Saline (PBS) digunakan untuk lisis.  PBS dibuat pada pH 7.4.  Buffer untuk lisis sel  dibuat dengan komposisi PBS : protease inhibitor cocktail : SDS 10% sama dengan 100 : 1 : 1.
Zat  kimia  untuk  mengukur  aktifitas spesifik  asam  amino  bebas  terdiri  dari phenylethylamine (20µM), L-tyrosine decarboxylase  (1.4  unit/ml),  sodium  citrate (0.5M, pH 6.3), pyridoxal phosphate (0.5mg/ml enzyme suspension), d,l- leucylalanine (2mM), phenylalanine (15mM),  NaOH  (3M),  H 2 SO 4 (0.01M), chloroform,  campuran  chloroform  dan  n- heptana  dengan  proporsi  1  :  3,  K 2 HPO 4 (1.5M, pH 8.0), dan ninhydrin.
Suspensi  enzim  1.4  unit/ml  dibuat dengan mengencerkan L-tyrosine decarboxylase powder menggunakan  sodium citrate  (0.5M  pH  6.3)  dan  penambahan  0.5 mg/ml  pyridoxal  phosphate.    Reagen  untuk pengukuran  fluorimetric  phenylethylamine adalah larutan ninhydrin yang terdiri dari 210
ml  K 2 HPO 4 (1.5M,  pH  8.0),  30  ml  d,l- leucylalanine (2mM), dan 0.55 g ninhydrin.
Untuk  pengukuran  protein  digunakan perchloric  acid,  tripotassium  citrate  (jenuh), NaOH  (0.3M),  Bovine  Serum  Albumin (BSA,  0.5mg/ml),  lysis  buffer  (PBS  : protease inhibitor cocktail : SDS 10%  = 100 :  1  :  1),    Bradford  reagent  (20%),  dan  HCl (0.01M).    Perchloric  acid  5%  digunakan untuk  presipitasi  protein  dan  2%  larutan  ini digunakan untuk mencuci protein.
Amino  acid  berlabel  yang  digunakan adalah L-phenylalanine [ring-2,4 3 H].  Zat ini dibeli dari Vitrax radiochemicals. Radioactive ini memiliki aktifitas spesifik 35 Ci/mol.

## Kultur Sel
Sel  Caco-2  ditumbuhkan  pada  T25 plastics flasks pada suhu 37 o C menggunakan DMEM  media  yang  mengandung  10%  Fetal Bovine  Serum,  100  U/ml  penicillin,  dan  2.5 mM  glutamin.   Untuk eksperiment  sebanyak 200.000  sel  ditumbuhkan  pada  masing- masing  6  buah  T25  flask  yang  telah  diisi  4 ml  media.  Media  untuk  kultur  disegarkan setiap dua hari sekali selama 7 hari.
Pada  hari  pelaksanaan  eksperimen, semua  sel  di  pre-inkubasi  selama  2  jam dengan  media  DMEM  yang  bebas  serum. Keenam  buah  flasks  kemudian  diinkubasi dengan  DMEM  media  yang  mengandung 10%  Fetal  Bovine  Serum,  100  U/ml penicillin,  dan  2.5  mM  glutamine  selama  24
jam  pada  suhu  37 o C.    Pada  akhir  masa inkubasi, media disegarkan dengan menggunakan 4 ml media yang sama dengan penambahan 15 mM phenylalanine dan 10µl phenylalanine  yang  telah  diberi  label (aktifitas  spesifik  sama  dengan  35  Ci/mmol) dengan  total  radioactivitas  5  µCi  didalam flask  dengan  aktifitas  spesifik  kurang  lebih 0.083  Ci/mmol.    Inkubasi  dalam  media radioaktif  dilakukan  selama  beberapa  waktu hingga maksimum 4 jam.
Selama  masa  4  jam  inkubasi  ini,  3 aliquots  sebanyak  masing-masing  20  µl media dipipet  dan ditransfer kedalam tabung eppendorf.  Media  dipipet  setelah  diinkubasi selama  0,  15,  30,  60,  120,  and  240  menit. Meida  kemudian  dibekukan  pada    -20 o C sampai dilakukan pengukuran aktifitas spesifik asam amino bebas ekstraseluler.
Pada  akhir  masa  inkubasi  semua media kemudian dipipet, sel kemudian dicuci menggunakan  1  ml  PBS  sebanyak  dua  kali dan  langsung  dilakukan  lisis  untuk  ekstraksi protein  dan  pengukuran  aktifitas  spesifik fenilalanin bebas intraseluler.

## Analisis aktifitas spesifik fenilalanin bebas intraseluler
Sel pada dasar flask diambil kemudian  dilisis  menggunakan  1.5  ml  lysis buffer. Lisis dilakukan dengan menghancurkan  sel  menggunakan glass  rod selama  15  detik  diikuti  dengan  inkubasi didalam ice  bath selama  10  menit.    Setelah
lisis  homogenate  kemudian  disentrifus  pada 13.000  rpm  selama  5  menit.  Kedalam supernatant  supernatant  ditambahkan  1.5  ml 5% (w/v) HClO 4 dingin dan disentrifus pada 2800 rpm selama 15 menit untuk mempresipitasi protein. Protein ini kemudian  digunakan  untuk  pengukuran kadar protein. Supernatant yang mengandung phenylalanine  dimasukkan  kedalam  1.5  ml tripotassium citrate jenuh untuk mengendapkan  potassium  perchlorate  dan disentrifus  pada  2800  rpm  selama  15  menit. Supernatant ini digunakan untuk pengukuran aktifitas spesifik fenilalanin bebas intraseluler.
Prinsip  pengukuran  aktifitas  spesifik fenilalanin  bebas  intraseluler  adalah  dengan mengukur  hasil  konversi  fenilalanin  menjadi phenylethylamine  (PEA)  melalui  konversi enzimatik menggunakan L-tyrosine decarboxylase.    Konsentrasi  PEA  dilakukan dengan  menggunakan  fluorimetric  assays pada  390  nm  –  495  nm.    Standar  yang digunakan  berkisar  antara  0  ml  sampai  1  ml PEA 20 µM yang dibuat dengan menggunakan H 2 SO 4 0.01 M.
Aktifitas  spesifik  fenilalanin  bebas intraseluler (S a- intra )  dihitung  dengan menggunakan rumus dibawah ini:
phenylalanine counts (dpm) S a- intra = phenylalanine (nmol)
Analisis aktifitas spesifik fenilalanin bebas ekstraseluler
Analisis  aktifitas  spesifik  fenilalanin bebas ekstraseluler dilakukan dengan menggunakan  metode  Garlick  et  al  (1980). Metode  yang  digunakan  sama  dengan fenilalanin bebas intraseluler dengan perbedaan pada volume larutan organic yang digunakan  untuk  ekstraksi  PEA  dalam H 2 SO 4 .    Volume  untuk  ekstraksi  fenilalanin bebas  ekstraseluler  adalah  5  ml  sedangkan pada  fenilalanin  bebas  intraseluler  adalah  8 ml.
Aktifitas  spesifik  fenilalanin  bebas ekstraseluler (S a-extra) dihitung dengan menggunakan rumus dibawah ini:
phenylalanine counts (dpm) S a, extra = phenylalanine (nmol)
Analisis  aktifitas  spesifik  fenilalanin  yang terikat pada protein
Endapan protein dicuci dengan menggunakan  5  ml  perchloric  acid  2% hingga  asamnya  memiliki radioactivity counts  yang  rendah.    Sampel  kemudian diresuspensi  dalam  1  ml  0.3  M  NaOH. Sebanyak  200  µl  larutan  ini  kemudian digunakan untuk liquid scintillation counting dan 200 µl lagi digunakan untuk pengukuran konsentrasi  protein  menggunakan  metode Bradford.  Standard yang digunakan adalah 0 hingga 200 µl BSA 0.5 mg/ml.   Lysis buffer digunakan untuk membuat larutan standard Konsentrasi  fenilalanin  yang  terikat  pada protein dihitung dengan menggunakan asumsi  2.76%  (w/w) kadar phenylalanine
didalam  protein  (McCance  and  Widdowson, 1980) . Aktifitas  spesifik  fenilalanin  yang terikat pada protein (S b ) dihitung sbb:
radioactive counts untuk fenilalanin yang terikat pada protein (dpm)
S b =
Fenilalanin  yang  terikat  pada  protein (nmol)

## Radioactive counting
Radioactive counting dilakukan menggunakan  Beckman  LS  6500  Multi- purpose  scintillation  counter.    Sebanyak  10 ml scintillation  fluid (Ecoscint  A  LS-273) ditempatkan dalam scintillation vial bersama dengan  media  yang  akan  diukur  aktifitas spesifiknya.  Pada  eksperimen  ini  digunakan sebanyak  1  ml  larutan  sampel  fenilalanin bebas  intracellular  dan  ekstraseluler  dan  200 µl untuk sampel fenilalanin yang terikat pada protein.

## Perhitungan laju sintesis protein
Laju sintesis protein (FSR) pada sel  dihitung dengan menggunakan rumus dibawah ini:
(S b2 -  S b1 )        24
FSR (%/day) =                  x              x 100
S a t 2 – t 1
Dimana:
S b1 adalah  aktifitas  spesifik  fenilalanin  yang terikat pada protein pada t 1
S b2 adalah  aktifitas  spesifik  phenylalanine yang terikat pada protein pada  t 2 S a adalah rata-rata aktifitas spesifik fenilalanin  bebas  intracellular  (S a-intra )  or extracellular (S a-extra )  dari t 1 hingga t 2 .
t 1 dan t 2 adalah waktu inkubasi (dalam jam)

## PEMBAHASAN
1.  Prekursor Intraseluler
dan

## Ekstraseluler
Aktifitas  spesifik  fenilalanin  bebas intraseluler mencapai nilai maksimum segera setelah  proses  flooding  pada  kultur  Caco-2 dengan [ring2,4 3 H]phenylalanine.  Setelah 15 menit,  aktifitas  spesifik  fenilalanin  bebas intraseluler  stabil  hingga  4  jam  masa inkubasi (Gambar 1). Hasil ini menunjukkan bahwa proses flooding fenilalanin didalam sel telah berhasil dicapai. Dengan dicapainya kestabilan aktifitas spesifik  fenilalanin bebas intraseluler selama inkubasi,  pengukuran  laju  sintesis  protein dapatdilakukan dengan menggunakan prekursor ini.
Gambar  1.    Perubahan  aktifitas  spesifik fenilalanin bebas intraseluler pada sel Caco-2 setelah flooding dengan
[ring2,4 3 H]phenylalanine.
Perubahan aktifitas spesifik fenilalanin bebas ekstraseluler  pada  sel  Caco-2  mencapai kestabilan  segera  setelah  proses  flooding
dengan  [ring2,4 3 H]phenylalanine  (Gambar 2).
Gambar  2.    Time  course  of  the  change  in specific activity of extracellular free phenylalanine  in  Caco-2  cells  grown  in control  medium;  values  were  means  ±  SD, n=3.

## 2. Laju Sintesis Protein
Seperti  yang  diharapkan,  terjadi peningkatan  aktifitas  spesifik  fenilalanin yang  terikat  pada  protein.  Gambar  3 menampilkan  pola  inkorporasi    fenilalanin kedalam protein  yang meningkat  namun  non linier.  Ini menunjukkan bahwa terjadi proses sintesis  protein  yang  berasal  dari  precursor baik itu intraseluler maupun ekstraseluler.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 30 60 90 120 150 180 210 240 Specific activity (dpm/nmol) Incubation time (minutes)
Gambar 3. Aktifitas spesifik fenilalanin yang terikat  pada  protein  pada  sel  Caco-2  setelah flooding dengan [ring2,4 3 H]phenylalanine.
Dari perhitungan dengan menggunakan  precursor  intraseluler,  sel Caco-2 memiliki laju sintesis protein sebesar
333  %/hari  sedangkan  perhitungan  dengan menggunakan  precursor  ekstraseluler  sel Caco-2 memiliki laju sintesis protein sebesar 262  %/hari.    Laju  sintesis  protein  tertinggi dicapai  pada  awal  inkubasi  dan  menurun selama  masa  4  jam  flooding  dengan [ring2,4 3 H]phenylalanine. Nilai ini sangat tinggi bila dibandingkan dengan hasil yang didapat oleh Le  Bacquer  yang  menggunakan  sel  yang sama  namun  menggunakan  asam  amino leucine  dan  metode trace  dose. 4) Pengaruh flooding dose terhadap ketersediaan fenilalanin  untuk  sintesis  protein  tidak  dapat digunakan  untuk  menjawab  fenomena  ini karena  tingginya  jumlah  fenilalanin  yang digunakan dalam metode flooding dose tidak menstimulasi  laju  sintesis. 5) Perbedaan  jenis asam  amino  yang  digunakan  sebagai  acuan prekursor sintesis protein mungkin merupakan  salah  satu  penjelasan  tentang perbedaan    nilai  laju  sintesis  protein  yang didapat dalam penelitian ini.

## KESIMPULAN
Metode flooding dose dapat digunakan  untuk  mengukur  laju  sintesis protein  pada  sel  Caco-2,  yaitu  dengan dicapainya ekuilibrium antara aktifitas spesifik precursor fenilalanin bebas intraseluler  dan  ekstraseluler.    Pengukuran laju  sintesi  protein  yang  dihitung  selama  4 jam menunjukkan bahwa laju
sintesis  protein  sel  Caco-2  sebesar  262%  - 333% per hari.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  McNurlen, M., Tomkins, A. & Garlick, P.,
1979 ,  The  effect  of  starvation  on  the  rate of  protein  synthesis  in  rat  liver  and  small intestine. Biochemistry , 373-379.
2.  Davis,  T.,  Fiorotto,  M.,  Nguyen,  H.  & Burrin,  D., 1999 ,  Aminoacyl-tRNA  and tissue  free  amino  acid pools  are equilibrated  after  a  flooding  dose  of phenlalanine. American Journal of Physiol Endocrinol Metab , 103-109.
3.  Coeffier,  M. et  al. , 2003 ,  Enteral Glutamine  Stimulates  Protein  Synthesis and  Decreases  Ubiquitin  mRNA  level  in human gut muccosa. American Journal of Physiol Gastrointest Liver , 266-273.
4.  Bacquer, L., Laboisse, C. & Darmaun, D.,
2003 , Glutamine preserve protein synthesis  and  paracelluler  permeability  in Caco-2  cells  submitted  to  ''luminal fasting''. American  Journal  of  Physiol Gastrointest Liver , 128-136.
5.  Caso, G. et al. , 2006 , The increase in huan muscle  protein  synthesis  induced  by  food intake  is  smiliar  when  assessed  with constant influsion and flooding technique.
Journal of Nutrion 6, 1504-1510.