Jurnal : Jurnal Kesehatan Prima Volume
: 9, No.1, Februari 2015, Halaman : 1419-1435
ISSN Print : 1978 – 1334, ISSN Online : 2460 – 8661

## ___________________________________________________________________________
Gunarti,  Lale  Budi  Kusuma,  Yunan  Jiwintarum  :  Jurusan  Analis  Kesehatan  Poltekkes  Kemenkes  Mataram,  Jl.  Prabu  Rangkasari  Dasan Cermen Sandubaya Mataram
GOLD IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY ( GICA) SEBAGAI IMUNOSENSOR MENDETEKSI ANTIBODI Bacillus Anthracis PENYEBAB PENYAKIT ZOONOSIS
Gunarti, Yunan Jiwintarum, Awan Dramawan, Lale Budi Kusuma Dewi
Abstract : The purpose of this study was to identify patterns of protein antigens full / secretory antigens may be antigenic protein (PA) of Bacillus anthracis by the use of SDS-PAGE method (Laemmli) which can be used as bioreseptor on the test device fabrication method for detecting antibodies GICA of Bacillus anthracis , identify patterns of proteins that are antigenic protein (PA) or indicate the nature of the reactivity of Bacillus anthracis by using Western blotting and Determining the specificity and sensitivity of the test method to detect antibodies GICA Bacillus anthracis when using the results of the ELISA method as a reference. This study is a descriptive observational  study.  Research  variable  antigenic  protein  of Bacillus  anthracis as  bioreseptor  and  Antibodies from Bacillus anthracis as imunosenssor. The test prototype test device made using 20 sample with ELISA as a reference for calculating the sensitivity and specificity. The results of this study were identified band – band of 92  kDa,  68  kDa,  54  kDa,  43  kDa,  29  kDa  and  18  kDa  that  can  be  used  as  bioreseptor  on  GICA,  identified  a pattern of proteins that are antigenic or indicate the nature of the reactivity of the Bacillus anthracis 68 kDa by Western blotting using the method, extract secretory antigen (SA) Bacillus anthracis can be used as a test device bioreseptor on GICA method for the detection of IgG antibodies against Bacillus anthracis and sensitivity and specificity of the test method to detect antibodies GICA Bacillus anthracis when using the results of the ELISA method as a reference each is 100% and 87.5% .
Kata Kunci : Immunosensor, Bacillus anthracis , Gold Immunochromatographic Assay (GICA).

## LATAR BELAKANG
Antraks  merupakan  penyakit  prototipe dalam  sejarah  mikrobiologi  yang  disebabkan  oleh Bacillus  anthracis. Antraks  terutama  merupakan penyakit pada biri-biri, sapi kuda dan hewan lainnya. Infeksi  pada  manusia  biasanya  dengan  masuknya spora melalui luka pada kulit atau selaput lendir dan dengan  inhalasi  spora  kedalam  paru-paru.    Spora tumbuh pada jaringan tempat masuk, dan pertumbuhan  organisme  vegetatif  mengakibatkan pembentukan edema gelatinosa dan kongesti. Bakteri kemudian  menyebar  melalui  getah  bening  ke  dalam aliran  darah  dan  berkembang  biak  dengan  bebas dalam  darah  dan  jaringan  segera  sebelum  dan sesudah kematian hewan. Tanah tercemar oleh spora
antraks  dari  bangkai  hewan  yang  mati  karena antraks.  Spora-spora  ini  dapat  tetap  hidup  selama puluhan    tahun  pada  pH  6,5  pada  suhu  yang  sesuai. Hewan  merumput  yang  terinfeksi  melalui  luka  pada selaput  lendir  menjadi  penyambung  rantai  terus menerus. Kontak dengan  hewan  yang terinfeksi atau dengan kulit dan bulunya  merupakan sumber infeksi pada manusia (Jawetz,1996).  Ada tiga bentuk klinis antraks  pada  manusia,  yaitu,  pertama,  antraks cutaneus  (kulit).  Sekitar  95  %  antraks  pada  manusia merupakan  antraks  kulit.  Kulit  yang  terkena  akan lecet,  menjadi  papula  kecil  berwarna  merah  dan menimbulkan  rasa  gatal,  yang  kemudian  menjadi gelembung  yang  berisi  cairan  (vesikel),  kemudian pecah  dan  bagian  tengahnya  berwarna  hitam.  Luka ini  tidak  nyeri.  Kuman  dapat  menjalar  ke  kelenjar
getah  bening  regional.  Apabila  penyakit  berlanjut menimbulkan kuman beredar dalam aliran darah dan menyebabkan  kematian.  Kedua,  antraks  inhalasi (saluran  pernafasan).  Antraks  inhalasi  dapat  terjadi karena  orang  menghirup  udara  yang  mengandung spora antraks. Sering terjadi pada pekerja pengumpul wool.  Dimulai  setelah  masa  inkubasi  1  -  6  hari dengan  gajala  yang  tidak  khas  seperti  lesu,  lelah, nyeri  otot  dan  demam.  Mungkin  juga  batuk  yang kering  dan  rasa  tidak  nyaman  pada  dada.  Kemudian disusul  dengan  sesak  nafas  dan  nyeri  dada  yang hebat.  Kematian  dapat  terjadi  secara  mendadak karena  lumpuhnya  otot  pernafasan  oleh  toksin antraks.  Angka  kematian  akibat  antraks  inhalasi sekitar  75  %.  Bahkan  antraks  jenis  ini  sering  terjadi pada  daerah  perang  yang  menggunakan  antraks sebagai  senjata  biologis  untuk  melawan  musuh. Ketiga, antraks gastrointestinal (saluran pencernaan). Terjadi  bila  orang  mengonsumsi  daging  yang terkontaminasi  kuman  antraks.  Masa  inkubasi  2-5 hari. Pasien akan  merasa sakit tenggorokan, demam, nyeri  menelan,  mual  dan  muntah  kemudian  menjadi nyeri  perut  yang  sangat  hebat  yang  dapat  disertai muntah  darah  dan  diare.  Angka  kematian  pada antraks gastrointestinal sampai 60 % (Priyonggo dan Budiono,  2007).  Indonesia  merupakan  daerah endemik  antraks,  menurut  laporan  Depkes  R.I  tahun 2003    tercatat  11  provinsi  endemis  anthraks  pada binatang, sedangkan 5  provinsi (Jabar, Jateng, NTB, NTT dan DI Yogyakarta) tercatat telah terjadi kasus antraks  pada  manusia.  Siregar  (2002),  Sumatera (kecuali  provinsi  Jambi),  Jawa  Barat,  Jawa  Tengah, Sulawesi  Selatan,  Sulawesi  Tengah,  Sulawesi  Utara, dan  Sulawesi  Tenggara;  Nusa  Tenggara  Barat  dan
Nusa  Tenggara  Timur  masih  erupakan  daerah  yang mempunyai  kecenderungan  muncul  wabah  antraks secara  periodik.  Seringnya  terjadi  wabah  penyakit, memerlukan  usaha  pengendalian  penyakit  yang terencana,  termasuk  cara  diagnosa  penyakit  yang cepat  dan  tepat  agar  penyakit  dapat  segera  diatasi (Siregar,E.A,2002;Depkes R.I,2003). Salah satu cara untuk  pencegahan  timbulnya  prevalensi  antraks adalah  pada  daerah  bebas  antraks,    tindakan karantina  berupa  pelarangan  masuknya  hewan  dari daerah  tertular  ke  daerah  bebas  antraks.  Tindakan preventif lainnya adalah  hewan yang akan masuk ke dalam suatu wilayah  bebas antraks diperiksa dahulu sebelum  diberi  ijin  masuk  wilayah  tersebut (Priyonggo  dan  Budiono,  2007).  Test  diagnostik laboratorium yang biasa digunakan untuk indentifikasi  adanya Bacillus  anthracis adalah dengan  :  Pewarnaan  sediaan  kering  dengan  teknik pewarnaan  immunofluoresensi  akan  terlihat  bakteri berbentuk  batang  dengan  penataan  berantai.  Bahan pemeriksaan  yang  diperlukan  untuk  pewarnaan  ini adalah  lesi  lokal  atau  darah  hewan  yang  mati.  Test ini  cepat  dan  mudah  tapi  membutuhkan  ketrampilan dan pengalaman dari pemeriksa. Bahan pemeriksaan berupa  cairan  atau  nanah  dari  lesi  lokal,  darah  dan dahak  dibiakkan  dalam  media  yang  sesuai  dalam masa  inkubasi  tertentu.  Setelah  dibiakkan,  biakan Bacillus  anthracis  disuntikkan  pada  marmot  atau kelinci  secara  intraperitoneal  untuk  mengetahui virulensinya.  Cara  ini  sangat  akurat  mengingat  hasil yang  dikeluarkan  bisa  sampai  pada  virulensi  bakteri dan  sensitivitasnya  terhadap  obat.  Test  serologi menggunakan  prinsip  reaksi  antara  antigen  dan antibodi spesifik. Reaksi antara antibodi pada hewan
atau manusia yang terinfeksi atau divaksinasi dengan antigen  yang sesuai akan  memperlihatkan presipitasi atau  hemaglutinasi.  Metode  ini  mudah  tetapi  mahal dan  cenderung  sulit  diterapkan  di  lapangan  karena reagensia  yang digunakan  harus dalam suhu  tertentu (4-8 o C)    (Jawetz,  1996).  Berdasarkan  kelemahan  – kelemahan  dari  teknik  diagnostik Bacillus  anthracis maka  perlu  dipikirkan  membuat  suatu  perangkat  uji sederhana yang sensitif dan selektif dapat mendeteksi keberadaan  antibodi  terhadap Bacillus  anthracis sangat  diperlukan  oleh  masyarakat,  terutama  di daerah  Nusa  Tenggara  Barat  yang  masyarakatnya banyak  peternak  Sapi,  Kambing,  Kuda,  Kerbau  dan komsumsi  daging  hewan  –  hewan  tersebut  pada masyarakat  umum  adalah  tinggi.  Pemeriksaan serologi,  baik  untuk  mendeteksi  antiodi  maupun antigen,  masih  merupakan  pilihan  diagnostik  yang sangat  penting  di  bidang  kedokteran,  kedokteran hewan  dan  ilmu  –  ilmu  biologi.  Salah  satu  teknik yang  sangat  berkembang  pesat  dan  paling  banyak diterapkan  adalah  tes  imunokromatografi  yang  salah satunya adalah metode
Gold Immunochromatographic  Assay (GICA).  Format pemeriksaan deteksi antibodi atau antigen  yang baru Gold Immunochromatographic Assay (GICA) adalah merupakan  sebuah  teknik  imunokromatografi  baru yang  menggunakan membrane  selulose sebagai pembawa  dan  koloidal  emas  berlabel  antigen  atau antibodi  digunakan  sebagai tracer .  Teknologi  ini memiliki  banyak  keuntungan  dibandingkan  dengan imunoassay  yang  lain,  seperti  prosedur  yang sedehana,  operasional  yang  cepat,  hasil  yang  cepat, harga  murah,  tidak  membutuhkan  teknisi  dengan kemampuan  yang  khusus  atau  peralatan  mahal  dan
dapat  digunakan  untuk  mendeteksi  adanya  antigen atau  antibodi  secara  cepat  dan  yang  paling  penting dapat  digunakan  oleh  semua  golongan  masyarakat. Protein  antigenik  yang  baik  dan  terbukti  mampu berikatan  secara  spesifik  dengan  antibodi Bacillus anthracis adalah galactose/N-acetylglucosamine polysaccharide yang  merupakan  komponen  dari dinding  sel Bacillus  anthracis ,  dari  hasil  presipitat Bacillus  anthracis yaitu  dalam  ekstrak  guanidine, yang  dicuci  2  kali  dengan  1  volume  aquadest  dan dikering  bekukan  didapatkan  hasil  analisa  SDS- PAGE  menunjukkan  berat  molekul  91  kDa  dan proten antigenik yang menentukan virulensi Bacillus anthracis terdapat  pada  kapsul  yaitu  toksin  anthraks dan poly-γ-D-Glutamic  acid (PGA)  kapsul  (Lyli  N dan  Rahmat  SA,2008).  Penelitian  ini  bertujuan membuat  sebuah  perangkat  uji  berdasarkan  prinsip Gold  Immunochromatographic  Assay (GICA)  untuk mendeteksi  antibodi  (imunosensor)  dari Bacillus anthracis dengan  menggunakan  antigen  penuh  dari Bacillus  anthracis sebagai  bioreseptor  yang  diujikan pada serum hewan coba Sapi. Pemilihan hewan coba ini  karena  banyak  terdapat  diseluruh  wilayah  NTB, merupakan  sumber  penularan  penyakit  Anthrax  ke manusia (penyakit zoonosis) dan banyak dikomsumsi oleh  masyarakat.    Jenis  penelitian  ini  adalah onservasinal analitik. Analisa data untuk mengetahui sensitivitas dan spesifitas perangkat uji GICA dengan pembanding menggunakan hasil pemeriksaan ELISA sebagai  referensi.  Hasil  penelitian  ini  diharapkan bermanfaat  bagi  masyarakat  luas  karena  dapat menghasilkan perangkat uji yang sederhana, spesifik dan  sensitif  untuk  identifkasi  antibodi Bacillus
anthracis yang  dapat  digunakan  sebagai  metode alternatif terhadap antibodi Bacillus anthracis .

## METODE PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian observasional  deskriptif  yaitu  penelitian  yang menggambarkan  kemampuan  imunosenssor  dari ekstrak antigen  penuh  /  sekretori  antigens  dari Bacillus anthracis dapat digunakan sebagai bioreseptor  pada  pembuatan  perangkat  uji  metode GICA  untuk  mendeteksi  antibodi  dari Bacillus anthracis dan menentukan spesifisitas dan sensitivitas  perangkat  uji  metode  GICA  untuk mendeteksi antibodi Bacillus anthracis bila menggunakan  hasil  pemeriksaan  metode  ELISA sebagai  referensi.  Populasi  dan  sampel  dalam penelitian  ini  adalah  menggunakan  serum  koleksi Unit  Riset  Biomedik  RSUP  NTB.  Jumlah  sampel yang digunakan adalah 20 serum koleksi.
Bahan Penelitian : Protein antigenik dari whole sel /  sekretori  antigens Bacillus  anthracis yang didapatkan  dari  koleksi  isolat  Unit  Riset  Biomedik RSUP  NTB,  Serum  coba  (serum  negatif  dan  serum kontrol  positif). Instrumen  Penelitian  : Pipet mikro, sonicator , centrifuge ,  mikroskop,  BioJet TM 3000, cutter kinematic  automation  PS-360, oven,  apparatus  mini-gel  (Bio-Rad,  Richmond, California). Reagen  Penelitian  : 1).    Reagen  yang digunakan  untuk  preparasi  antigen  adalah  PBS.2). Reagen  yang  digunakan  untuk  elektroforesis  dan western  blott adalah  Tris-HCL  pH  6,8,  SDS, β- mercaptoethanol (ME),  marker  BM, bromphenol blue dye, comassie brilliant blue, aquades, acrylamid,  APS,  TEMED, Tris-buffered  saline-
Tween (TBST) ,  Tris-buffered  saline (TBS) bovine serum  albumin,  alkaline  phospatase-conjugated antihuman  IgG  Fab  spesific  (anti-human  IgG conjugated, Sigma), 5-bromo-4-chloro-3- indolylphosphate (BCIP-AP), nitroblue  tetrazolium, alkaline  phospatase  substrate  buffer. 3).  Reagen yang  digunakan  dalam  pembuatan  perangkat  uji adalah Tris-buffered salin-Tween , protein A – koloid emas,  goat    anti  mouse,  protein  membrane Bacillus anthracis sebagai bioreseptor.
Cara  pembuatan  perangkat  uji  metode  GICA untuk mendeteksi antibodi dari Bacillus anthracis :
1. Komponen penting dalam pembuatan GICA :
a) Membran Nitrocellulose  sebagai  tempat immobilisasi  antigen  dan  Goat  anti-Mouse IgG  membentuk  garis  tes  dan  garis  kontrol, dengan  Spesifikasi  Immunopore  FP  (Ref. 78336403)  1  Rolle/Roll.R  :  II/4.  Ukuran  :  25 mm  x  50  mm,  dengan  ukuran  pori  :  5  µm, dengan persyaratan daya kapilaritas 110 – 150 s / 4 cm 2 , warna putih bersih (tidak ada bercak atau noda) dan bersifat Hidrofilik.
b) Signal  Reagent  Pad/Polyesther  tempat dilekatkannya Signal  Reagent (SR)  berupa protein  A- Colloidal  Gold ,  dengan  spesifikasi Rapid  24  (Cat.  No.  8131.1750)  ,  ukuran  17 mm x 50  mm,  ukuran  maximal pori : 22 µm, ketebalan : 340 µm, kapasitas penyerapan : 55 mg/cm, dengan persyaratan kapasitas penyerapan  :  55  mg/cm,  persentase Gold- Conjugate yang  dilepaskan  setelah  90  detik  :
89 % serta daya kapilaritas : 38 s/4 cm 2 .
c) Absorbent  Paper  Menyerap  sisa  –  sisa sampel  dan buffer /  larutan  dapar.  Spesifikasi Absorbent  type  CF6 (Cat.  No.  81162750), ukuran  27  mm  x  50  mm  dengan  ketebalan 1370  µ.  Persyaratannya  Daya  kapilaritas  65
s/4  cm 2 .  Daya  serap  air  128  mg/cm 2 dan bersifat hidrofilik.
d) Buffer  Larutan  dapar  (penyangga  pH), pencuci,  menghilangkan  ikatan  non  spesifik. Spesifikasi  adalah  larutan  penyangga  pH sekaligus pembersih (deterjen) karena mengandung  campuran Tween 20  dengan konsentrasi  1%  dan  tris  0,1  M.  Persyaratan mampu meminimalisir ikatan  – ikatan protein penganggu  yang  menghalangi  berikatannya Signal  reagent dan  antigen  dengan  antibodi spesifik.
e) Antigen  Merupakan  Protein  antigenik  dari whole  sel  /  sekretori  antigens Bacillus anthracis .  Persyaratan  merupakan  antigen spesifik, berupa larutan antigen yang mengandung kadar protein 2,5 µg/µl.
f) Goat  Anti-Mouse  Antibodi  sekunder  yang mengikat sejumlah
besar rantai Immunoglobulin  G.  Persyaratan  mampu berikatan  baik  dengan Signal  Reagen (SR)  ≥
90%.
g) Signal  Reagen (SR)  Merupakan  suspensi dari  partikel  emas  dengan  protein  A,
berukuran  10  –  50  nm  dan  diameter  15  nm. Pada  keadaan  basa,  suspensi  ini  akan mengalami  perubahan  warna  menjadi  merah, dengan  suhu  penyimpanan  yang  baik  4 o C.
Persyaratan tidak bersifat toxic/beracun, dapat
dikonjugasikan untuk berbagai macam molekul seperti protein / antibodi, polypeptida,
karbohidrat, polymer, polysakarida,  enzim,  dan  asam  nukleat.
Memberikan sensitifitas yang tinggi (≥ 90%).
h) Kartu  Kertas dengan ketebalan ± 0,05 cm, yang  permukaanya  sedikit  mengkilap,  terdiri dari  2  lapisan  yang  direkatkan,  ukuran panjang  13  cm,  lebar  7,5  cm.  Pada  bagian depan  kartu  terdapat  jendela  pengamatan berukuran  1,2  cm  x  1,5  cm.  Persyaratan memiliki  daya  rekat  yang  baik,  memiliki ketebalan  yang  cukup  (tidak  melebihi  0,05 mm) dan kuat/tidak mudah lapuk.
i) Silica  gel  Berbentuk  butiran  mirip  kaca yang  bersifat  tidak  elastis,  dengan  kemasan  1 gram. Persyaratan mampu mencegah terbentuknya  kelembaban  yang  berlebih hingga  50%  tanpa  merubah  kondisi  zatnya. Kejenuhannya dapat diamati langsung dengan melihat perubahan warna butiran yang semula biru/ungu menjadi merah muda.
j) Botol  Buffer  Terbuat  dari  bahan  plastik HDPE berdiameter ± 1,5 cm. Berwarna putih dan  ringan,  dengan  lubang  tetes  berdiameter 0,3  cm.  Persyaratan  kuat  namun  sedikit lentur,praktis,ringan.  Aliran  buffer  keluar dalam  bentuk  tetesan,  sehingga  volume  dapat terukur 30 µl.
k) Aluminium  Foil  Lembaran  metal  yang tipis,  nampak  mengkilap,  dan  ringan,  dengan ketebalan  ±  0,006  mm.  Persyaratan  tidak robek, tidak berlubang dan praktis.
2. Format  test  dalam  pembuatan  perangkat  uji GICA :
Format  test  Gold  Immunochromatographic Assay (GICA),  sampel  yang  diuji  berupa  serum, luas strip : 1,25 cm 2 (0,5 cm x 2,5 cm), hasil atau garis  yang  terbentuk  dapat  langsung  diamati dengan  makroskopis.  Terdiri  dari  3  komponen penting  yaitu  Strip  antigen, Signal  reagent  Pad/ Polyesther, Absorbance Paper . Pada strip antigen
( membrane Nitrocellulose ) terdapat 2 garis, salah satunya  dilekatkan  cairan Goat  Anti-Mouse pada penanda  garis  tes.  Penambahan Signal  Reagent
(SR)  pada Signal  Reagen  Pad dan  pemberian buffer  pada  bantalan  sampel  dan Signal  reagent
Pad .
3. Tahapan –  tahapan  kerja  pembuatan perangkat uji GICA :
1) Sonikasi  Protein  membrane Bacillus anthracis .
Isolat murni Bacillus anthracis yang telah di tanam  pada  media  BAP  sebanyak  10  plate dipanen  dalam  larutan  PBS,  selanjutnya dilakukan  sonikasi  dengan  alat sonicated sambil digetarkan untuk mendapatkan
protein  membrane  antigenik.  Hasil  sonikasi dipusingkan  pada  4000  rpm  4 o C  selama  15 menit.  Supernatan  diambil  dan  dilakukan pencucian  dengan  cara  pellet  disuspensi ulang  dengan  PBS  dan  disentrifus  10000 rpm  selama  1  jam.  Pencucian  dilakukan sebanyak  3  kali.  Setelah  itu,  pellet diresuspensi  dengan  PBS,  disimpan  sebagai protin  antigenic  membrane  sel Bacillus anthracis untuk  uji  selanjutnya  sehingga
dapat  digunakan  sebagai  bioreseptor  pada GICA.
2) Pemisahan  fraksi  protein  dengan  SDS- PAGE (Laemmli)
Protein  yang  diperoleh  dipisahkan  menurut bobot
molekulnya
menggunakan SDS_PAGE dalam apparatus mini-gel (Bio-
Rad, Richmond, California). Sebelum dilakukan elektroforesis, protein dan marker dipanaskan pada suhu 100 o C selama 5 menit dalam  buffer  Tris-HCL  pH  6,8  yang mengandung 2% SDS dan 5% β- mercaptoethanol (ME).  Konsentrasi  gel yang digunakan adalah 4,5% untuk stacking gel dan  11%  untuk separating  gel ,  protein yang dipisahkan sebanyak 20µl. Satu sumur diisi dengan 10 µl marker BM (SDS-PAGE molecular  weight  standards,  brood  range, Bio-Rad).  Migrasi  protein  dilakukan  di dalam  tegangan  listrik  30  volt  hingga bromphenol  blue  dye mencapai  tepi  gel. Kemudian  dilakukan  pengecatan  dengan comassie brilliant blue selama 24 jam.

## 3) Western blotting
Protein  yang  telah  menjadi  fraksi  protein, dipindahkan  ke  membran polyvinylidene difluorida (PVDF)  menggunakan semi-dry blotter dalam  arus  konstan  100  volt  selama 60  menit.  Membran  blot  kemudian  dicuci dengan Tris-buffered  salin-Tween  (TBST) 0,05 % dengan  agitasi  selama  10  menit,  dan diblocking  dengan blocking  buffer  TBST 0,1% yang  mengandung bovine  serum albumin  1  % semalam  pada  suhu  4 o C.
Setelah  itu  membran  dicuci  3x  dengan TBST  0,05%  masing-masing  selama  10 menit  agitasi.  Membran  blot  diinkubasi dengan  serum  studi  pengenceran  1:100 selama  1  jam  pada  suhu  kamar  dengan agitasi pelan, kemudian dicuci 3 kali dengan TBST  0,05%  masing-masing  selama  10 menit  dengan  agitasi.  Selanjutnya  membran blot diinkubasi dengan alkaline phospatase- conjugated  antihuman  IgG  Fab  spesific (anti-human IgG conjugated, Sigma) pengenceran 1:5000 selama 2 jam pada suhu kamar  dengan  agitasi  pelan,  kemudian dicuci 3 kali dengan TBST 0,5% dilanjutkan 1 kali dengan TBS selama 10 menit dengan agitasi.  Langkah  selanjutnya,  membran  blot yang telah berisi hibridisasi antigen-antibodi dideteksi dengan 5-bromo-4-chloro-3- indolylphosphate (BCIP-AP) sebagai substrat  dan nitroblue  tetrazolium sebagai indikator kromogenik dalam alkaline
phospatase  substrate  buffer pada  ruangan gelap,  suhu  kamar,  dengan  agitasi  pelan selama  1-10  menit  sampai  muncul  pita pertama.  Reaksi  dihentikan  dengan  cara menuang  BCIP-AP substrate  buffer dan mencuci membran dengan aquabidest dalam agitasi pelan selama 5 menit.
4) Immunodot assay
Immunodot assay
merupakan
uji pendahuluan  sebelum  antigen  digunakan sebagai  bioreseptor  pada  perangkat  uji dengan  prinsip  GICA.  Apabila  dengan ekstrak  antigen  sekretori  antigens  (SA)
dapat  memberikan  hasil  positif  terhadap serum positif dan memberikan hasil negative  terhadap  serum  negative  atau memberikan  hasil  negative  pada  kontrol negative  yaitu  immunodot  assay  tanpa antigen,  maka  antigen  tersebut  dapat digunakan sebagai bioreseptor pada perangkat  uji  GICA.  Adapun    teknik kerjanya adalah sebagai berikut : Diteteskan 5 µl protein membrane antigenic
/  sekretori  antigen Bacillus  anthracis pada permukaan membran nitroselulose, kemudian
dikeringkan menggunakan inkubator  selama  1  jam  pada  suhu  37 o C. Sebanyak  10  µl  serum  diteteskan  pada sumuran, dibiarkan hingga meresap kemudian  diteteskan  2  µl  bufer  dan dibiarkan  hingga  meresap,  selanjutnya diteteskan  5  µl signal reagent ( Gold coloidal )  dan  diamati  pembentukan  spot berwarna merah (Peng rt all, 2007).
5) Rancangan alat yang dibuat sebagai mapping  pemuatan  perangkat  uji Bacillus anthracis adalah  menggunakan  rancangan yang  ada  di  Laboratorium  PT  Bioramp  di Mataram yang digambarkan sebagai berikut:
Gambar 1 :   Rancangan alat perangkat uji Bacillus anthracis
Mekanisme  kerja  perangkat  uji  adalah  : Mula  –  mula  disiapkan  kartu  sepanjang 300  nm  yang  terdiri  atas  membran nitroselulose yang akan digunakan sebagai  tempat  aplikasi  antigen  dan kontrol,  pada  sisi  atas  dan  bawah membran ditempeli poliester dengan lebar 1  cm,  dengan  sedikit  menutupi  membran selulose.    Antigen  di  aplikasikan  secara linear  di  atas  membran  nitroselulose sebagai  garis  tes  menggunakan  BioJet TM 3000  dengan  konsentrasi  2,5  ug/ul dengan  ketebalan  1  ul/mm  membentuk garis sepanjang 280 mm (garis tes = garis line).  Sejajar  dengan  garis  tes, goat  anti mouse-IgG diaplikasikan
dengan disemprotkan berjarak 5 mm dari garis tes dan  akan  membentuk    garis  kontrol. Selanjutnya
membran
nitroselulosa tersebut  dipotong  berbentuk  strip  dengan lebar  5  mm  menggunakan  Kinematic
Automation PS-360. Membran nitroselulosa, absorben paper dan poliester  dirakit  pada  kartu  tes  seperti pada  gambar  rancangan  alat.  Diteteskan sebanyak 10 µl larutan gold coloidal pada poliester  di  atas  jendela  pengamatan  dan dikeringkan  dengan  menggunakan  oven pada  suhu  37 o C  selama  30  menit  sampai dengan  1  jam,  kartu  dipotong  –  potong selebar 5 mm bentuk strip, dan ditempelkan  pada  kartu  tes.  Kartu diletakkan  dengan  posisi  terbuka  di  atas tempat  yang  datar.  Sebanyak    20  µl sampel  serum  diteteskan  pada  bantalan poliester di dekat zona  kontrol. Sebanyak 1  tetes  larutan  buffer  diteteskan  pada bantalan  yang  sama  dan  2  tetes  buffer pada  bantalan  poliester  tempat signal reagen gold coloidal , selanjutnya diinkubasi  beberapa  saat  sampai  sampel dan  buffer  meresap  sampai  garis  batas. Kartu test segera ditutup dan diamati hasil pemeriksaan  dari  jendela  pengamatan  15 sampai 20  menit  kemudian.   Hasil positif jika muncul 2 garis berwarna merah pada garis  kontrol  dan  garis  test.  Hasil  negatif jika muncul 1 garis berwarna merah pada garis  kontrol.  Hasil invalid jika  tidak muncul  garis  sama  sekali  atau  hanya muncul  garis  pada  tes  (Bioramp,2009). Hasil SDS PAGE dan Western – Blooting disajikan dalam bentuk deskriptif.
Sensitivitas dan spesifisitas hasil pemeriksaan  Antibodi  terhadap Bacillus
Antigen Bacilllus anthracis
anthracis menggunakan  perangkat  uji metode  GICA  dibandingkan  dengan  hasil pemeriksaan IgG terhadap Bacillus anthracis menggunakan  metode  ELISA sebagai  referensi  diukur  berdasarkan  : Cara  menghitung  sensitivitas  adalah proporsi  antara  hasil  uji  positif  terhadap sampel  positif  menggunakan  metode GICA dengan hasil uji positif
menggunakan metode ELISA. Spesifisitas
adalah  proporsi  antara  hasil  uji  negatif terhadap  sampel  negatif  menggunakan GICA dengan hasil uji negatif
menggunakan  metode  ELISA  (Budiarto,
2004).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
a. Hasil
1. Hasil SDS-PAGE (Laemmli).
Hasil  analisa    protein  SDS  –PAGE menunjukkan  bahwa  hasil  Analisa  SDS  –  PAGE protein  yang  menunjukkan  pofil  pemisahan  protein yang  terbaik  adalah  perbandingan  antara  Protein Antigenik  (PA)  dari Bacillus  anthracis dengan reducing Sampel Buffer (RBS) dengan perbandingan 1:  1.  Pita  –  pita  protein  yang  terbentuk  masih  utuh dan jelas dengan urutan 92 kDa, 68 kDa, 54 kDa, 43 kDa, 29 kDa, dan 18 kDa sehingga dapat digunakan sebagai bioreseptor pada GICA.
2. Hasil Western blotting metode dari Towbin.
Analisa Western  blotting metode  dari Towbin bertujuan  untuk  mendapatkan  jenis  protein
yang diharapkan sebagai bioreseptor yang menunjukkan  reaktivitas  dengan  antisera  serum kontrol Bacillus anthracis. Adapun hasil dari Analisa Western  blotting metode  dari Towbin dari  protein antigenik Bacillus anthracis yang pertama adalah :
Gambar 2. Hasil dari Analisa Western blotting metode dari Towbin dari protein antigenik Bacillus anthracis yang pertama
Gambar  2.  menunjukkan  hasil Western  blotting pertama.  Hasil  ini  menunjukkan  terdapat  dua  pita protein  yang  diharapkan  bersifat  reaktif  dan diharapkan  dapat  digunakan  sebagai  bioreseptor dalam perangkat uji metode GICA untuk mendeteksi antibodi dari Bacillus anthracis . Satu pita meragukan terlihat  tebal  (1)  pita  92  kDa  yang  diperkirakan galactose/N-acetylglucosamine  polysaccharide dari dinding  sel Bacillus  anthracis dan  satu  pita  protein yang jelas (2) pita 68 kDa yang diperkirakan poly-γ- D-glutamic  acid (PDA)  dari  kapsul Bacillus anthracis .  Kedua  protein  antigenik  yang  muncul  ini dapat  digunakan  untuk  kandidat  bioreseptor  dalam perangkat  uji.  Untuk  mendapatkan  hasil  yang  lebih baik  dari  protein  yang  dinginkan  untuk  protein antigenik  dalam  perangkat  uji  maka  dilakukan analisa Western  blotting kedua.    Adapun  hasil  uji Western blotting kedua adalah sebagai berikut :
92 kDa
68 kDa 1
2
Gambar 3. Hasil dari Analisa Western blotting metode dari Towbin dari protein antigenik Bacillus anthracis yang kedua
Gambar  3.  menunjukkan  hasil Western  blotting kedua yang lebih jelas yang memperlihatkan satu pita protein  yang  jelas  yaitu  pita  68  kDa  reaktif  yang bersifat  antigenik,  diperkirakan poly-γ-D-glutamic acid (PDA) dari kapsul Bacillus anthracis yang dapat digunakan untuk kandidat bioreseptor dalam perangkat uji.
3. Hasil Immunodot assay
Hasil Immunodot assay dengan menggunakan  ekstrak  sekretorik  antigen  (SA), memberikan reaksi positif dengan serum positif yang ditandai  dengan  tebentuknya  warna  merah  atau  spot merah  pada  membran  nitroselulosa  dan  sampel negatif  memberikan  hasil  negatif  yang  ditandai dengan  tidak  terbentuknya  warna/spot  merah  pada membra nitroselulosa. Immunodot assay merupakan uji  pendahuluan  sebelum  antigen  digunakan  sebagai
bioreseptor pada perangkat uji dengan prinsip GICA. Apabila  dengan  ekstrak  antigen  sekretori  antigens (SA) dapat  memberikan  hasil positif terhadap  serum positif  dan  memberikan  hasil  negative  terhadap serum  negative  atau  memberikan  hasil  negatif  pada kontrol negatif yaitu immunodot assay tanpa antigen, maka  antigen  tersebut  dapat  digunakan  sebagai bioreseptor pada perangkat uji GICA.
4. Hasil  optimalisasi  kadar  antigen  yang ditempelkan  pada  perangkat  uji Bacillus anthracis metode GICA
Optimalisasi  dilakukan  pada  jumlah  dan kadar  antigen Bacillus  anthraci s  yang  akan ditempelkan  pada  perangkat  uji  dengan  cara  larutan antigen yang telah dipreparasi diencerkan menggunakan  buffer  carbonat  pH  9,6  sehingga diperoleh  serial  kadar  protein  1,0;  1,5;  2,0  ;  2,5  dan 3,0  ng/ul.  Antigen  ditempelkan  pada  membran nitrosellulosa  menggunakan  mesin  dispenser  Biodot (USA)  yang  akan  membentuk  garis  tes.  Sedangkan garis  kontrol  berisi  goat-anti-mouse  IgG.  Membran nitrosellulosa  kemudian  dikeringanginkan  untuk kemudian  dipotong  membentuk  strip.  Adapun  hasil Optimalisasi  tersebut  adalah  seperti  terlihat  pada tabel 1.
Tabel 1. Hasil Optimalisasi kadar antigen yang ditempelkan pada perangkat uji  GICA
Jumlah Antigen (Ag) yang ditempelkan (ng/ul) Sampel Garis Kontrol Garis tes 3,0 Blanko (Tris buffer) + +/- 2,5 Blanko + - 2,0 Blanko + - 1,5 Blanko + - 1,0 Blanko + - 68 kDa
Jurnal : Jurnal Kesehatan Prima Volume
: 9, No.1, Februari 2015, Halaman : 1419-1435
ISSN Print : 1978 – 1334, ISSN Online : 2460 – 8661

## ___________________________________________________________________________
Gunarti,  Lale  Budi  Kusuma,  Yunan  Jiwintarum  :  Jurusan  Analis  Kesehatan  Poltekkes  Kemenkes  Mataram,  Jl.  Prabu  Rangkasari  Dasan Cermen Sandubaya Mataram
Tabel  1.  menunjukkan  hasil  optimalisasi perangkat uji terhadap kadar antigen yang ditempelkan.  Hasil  tersebut  memberikan  gambaran bahwa  kelebihan  jumlah  antigen  akan  menimbulkan garis  artefak  sehingga  menjadi  positif  palsu.  Kadar antigen 2,5 ng/ul adalah kadar maksimal dari antigen yang  ditempelkan  yang  akan  digunakan.Sedangkan dari haasil optimalisasi kadar yang terbaik memberikan hasil adalah kadar 1 ug/ul.
5. Hasil Optimalisasi pada volume serum panel serum negatif dan panel serum positif.
Optimalisasi  pada  volume  serum  dilakukan dengan  menggunakan  variasi  volume serum 5 ul, 10 ul, 20 ul dan 30 ul. Untuk test menggunakan volume serum yang masih terbatas pada serum koleksi orang normal untuk panel serum negatif sebanyak 5 tabung dan  serum  kontrol  positif  untuk  panel  serum  positif sebanyak  5  tabung.  Adapun  hasil  optimalsasi perangkat uji terhadap volume serum sebagai sampel seperti terlihat pada tabel 2.

## Tabel  2. Hasil Optimalisasi volme serum yang digunakan pada perangkat uji  GICA
No. Serum Volume serum Garis kontrol Garis tes N1 5 -/+ - 10 + - 20 + - 30 + -/+ N2 5 - - 10 + - 20 + - 30 + - N3 5 -/+ - 10 + - 20 + - 30 + - N4 5 - - 10 + - 20 + - 30 + - N5 5 + - 10 + - 20 + - 30 + -/+ K1 5 + + 10 + + 20 + + 30 + -/+ K2 5 -/+ -/+ 10 + + 20 + + 30 + + K3 5 + + 10 + + 20 + -/+ 30 + -/+ K4 5 + + 10 + + 20 + + 30 -/+ -/+ K5 5 + +
10
+ +
20 + -/+ 30 -/+ -/+
Keterangan : N 1-5  Serum normal 1-5, K1-5  Serum kontrol positif 1-5
Tabel  2.  menunjukkan  hasil  optimalisasi  perangkat uji  terhadap  volume  serum/  volume  sampel.  Hasil tersebut  memberikan  gambaran  bahwa  volume  yang terlalu  sedikit  menyebabkan  garis  kontrol  tidak muncul. Sebaliknya kelebihan volume sampel serum menyebabkan  garis  artefak  pada  garis  test,  sehingga menyebabkan  hasil  positif  palsu.  Volume  serum optimal yang digunakan adalah 10 ul.

## 6. Hasil uji coba protipe perangkat uji  metode
GICA  untuk  mendeteksi  antibodi  dari

## Bacillus anthracis.
Uji coba protipe perangkat uji pada pada 20 serum  uji  (serum  negatif  dan  serum  kontrol  positif) yang dirandom dari 30 serum uji (serum negatif dan serum  kontrol  positif)  dengan  pemeriksaan  ELISA sebagai  referensi  untuk  menghitung  Sensitifitas  dan Spesifitas  dari  perangkat  uji  perangkat  uji  ekstrak antigen  penuh/  sekretorik  antigen  dari Bacillus anthracis metode  GICA.  Adapun  hasil  uji  tersebut dapat dilihat pada Tabel .3.
Tabel 3.  Data hasil uji coba protipe perangkat uji  metode GICA untuk mendeteksi antibodi dari Bacillus anthracis.
No Kode Serum Hasil ELISA Hasil ICT Bacillus anthracis metode GICA Pos. Neg. Pos. Neg. 1. 01-11 (+) (+) 2. 02-11 (+) (+) 3. 09-11 (-) (-) 4. 23-11 (-) (-) 5. 26-11 (+) (+) 6. 30-11 (+) (+) 7. 11-11 (+) (+) 8. 15-11 (+) (+) 9. 18-11 (-) (+) (-) 10. 21-11 (+) (+) 11. 03-11 (-) (-) 12. 07-11 (+) 13. 13-11 (+) 14. 24-11 (-) (-) 15. 27-11 (-) (-) 16. 29-11 (+) (+) 17. 06-11 (+) (+) 18. 04-11 (+) (+) 19. 28-11 (-) (+) 20. 22-11 (-) (-) Jumlah 12 8 13 7
Tabel  3    menunjukkan  hasil  bahwa  dari  20 serum  yang di periksa dengan menggunakan  metode
ELISA,  12  sampel  serum  (60%)  dinyatakan  positif dan  8  sampel  serum  (40%)  dinyatakan  negatif.
Sampel  serum  yang  dilakukan  pemeriksaan  dengan perangkat  uji  metode  GICA  menunjukkan  hasil  13 sampel serum (65%) dinyatakan positif dan 7 sampel serum  (35%)  dinyatakan  negatif.  Diantara  8  sampel serum  yang  dinyatakan  negatif  engan  ELISA,  2 diantaranya  dinyatakan  positif  dengan  perangkat  uji GICA. Teknologi ELISA digunakan sebagai referensi  dalam  penelitian  ini,  karena  teknologi ELISA  merupakan  teknologi  diagnosis  paling  utama digunakan  dewasa  ini  dalam  pemeriksaan  serologis. Hal  ini  disebabkan  tidak  hanya  sensitivitas  dan spesifisitas  yang  lebih  tinggi  dibanding  teknik  lain tetapi  juga  keluasan  aplikasi  aplikasi  untuk  berbagai tujuan  cukup  memadai.  Salah  satu  keterbatasan utama  dari  ELISA  adalah  tidak  mampu  mendeteksi antigen  atau  antibodi  terhadap Bacillus  anthracis dalam  jumlah  yang  kecil  pada  serum  maupun jaringan.  Pengembangan  yang  lebih  sederhana  saat ini juga telah dikembangkan uji cepat imunokromatografi  dengan  menggunakan  ekstrak protein  maupun  rekombinan.  Kemampuan  uji serologis  yang  berbasis  pada  teknik  ELISA  tersebut dilaporkan memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang setara dengan teknik ELISA secara umum. Walaupun demikian  kelemahan  dari  teknik  imunokromatografi adalah  tidak  bersifat  kuantitatif  seperti  ELISA (Subekti  dkk.,  2005).  Cara  menghitung  sensitivitas adalah  proporsi  antara  hasil  uji  positif  terhadap sampel  positif  menggunakan  metode  GICA  dengan hasil  uji  positif  menggunakan  metode  ELISA. Spesifisitas  adalah  proporsi  antara  hasil  uji  negatif terhadap sampel negatif menggunakan GICA dengan hasil  uji  negatif  menggunakan  metode  ELISA
(Budiarto,  2004).  Adapun  hasil  perhitungannya  dari hasil uji protipe adalah :
12 Sensitivitas  =                   x 100  =  100 % 12
7
Spesifisitas  = x 100  =  87.5 % 8

## B. Pembahasan
Penyakit antraks merupakan penyakit bakteri  akut  atau  per  akut  yang  disebabkan  oleh Bacillus  anthracis .  Penyakit  antraks  di  Indonesia sudah menyebabkan kerugian ekonomi dan mengancam  keselamatan  manusia.    Indonesia merupakan daerah endemik antraks, menurut laporan Depkes R.I tahun 2003  tercatat 11 provinsi endemis anthraks pada binatang, sedangkan 5  provinsi (Jabar, Jateng, NTB, NTT dan DI Yogyakarta) tercatat telah terjadi  kasus  antraks  pada  manusia.  Siregar  (2002), Sumatera (kecuali provinsi Jambi), Jawa Barat, Jawa Tengah,  Sulawesi Selatan,  Sulawesi  Tengah, Sulawesi  Utara,  dan  Sulawesi  Tenggara;  Nusa Tenggara  Barat  dan  Nusa  Tenggara  Timur  masih merupakan  daerah  yang  mempunyai  kecenderungan muncul  wabah  antraks  secara  periodik.  Seringnya terjadi wabah penyakit, memerlukan usaha pengendalian penyakit yang terencana, termasuk cara diagnosa penyakit yang cepat dan tepat agar penyakit dapat segera diatasi (Siregar,E.A,2002;Depkes R.I,2003).  Usaha  pengendalian  dan  pengawasan penyakit  antraks  yang  sangat  membahayakan kesehatan masyarakat, harus diusahakan dibuat suatu perangkat  uji  yang  mampu  mendeteksi  anthraks dengan  cepat.  Metode  isolasi  dan  identifikasi
Bacillus  anthracis dengan  media  biakkan,  uji biokimia,  uji  Ascoli  precipitin  test  dan  uji  biologis menggunakan  marmot  atau  mencit  tidak  praktis. Kelemahan uji tersebut diperlukan waktu yang cukup lama  untuk  mengetahui  hasil  uji.  Seringkali  juga pada usaha isolasi dan pembiakan Bacillus anthracis di  laboratorium  mengalami  kegagalan  walaupun gejala klinis pada hewan atau manusia sudah tampak jelas. Bacillus  anthracis tidak  dapat  diisolasi  atau ditumbuhkan  (terutama  pada  manusia)  jika  bakteri sudah  mati  karena  terhadap  penderita  sudah diberikan  pengobatan  antibiotika.  Penelitian  – penelitian terdahulu menunjukkan keunggulan immunofluorescence  assay ,  yang  didasarkan  pada pembatan  antibodi  poliklonal  terhadap  antigen permukaan  sel Bacillus  anthracis ,adalah  mampu mengidentifikasi  isolat  –  isolat,dan  juga  mampu secara  langsung  mengidentifikasi Bacillus  anthracis dari  hewan  yang  terinfeksi.  Namun  keterbatasan dalam  uji  yang  telah  dikembangkan,yaitu  adanya reaksi  silang  dengan  kelompok  bakteri Bacillus cereus (Helgason et  al ,2000).    Penelitian  ini bertujuan  mengidentifikasi  pola  protein  antigen penuh / sekretori antigen  yang dapat bersifat protein antigenik  (PA)  dari Bacillus  anthracis dengan menggunaan  metode  SDS-  PAGE  (Laemmli)  yang dapat digunakan sebagai bioreseptor pada pembuatan perangkat  uji  metode  GICA  untuk  mendeteksi antibodi  dari Bacillus anthracis.  Mengidentifikasi pola protein yang bersifat protein antigenik (PA) atau menunjukkan sifat reaktivitas dari Bacillus anthracis dengan menggunakan metode Western Blotting . Dan Menentukan  spesifisitas  dan  sensitivitas  perangkat uji metode GICA untuk mendeteksi antibodi Bacillus
anthracis bila  menggunakan  hasil  pemeriksaan metode  ELISA  sebagai  referensi.  Analisa Western blotting pertama  dari  penelitian  ini  menunjukkan terdapat  dua  pita  protein  yang  diharapkan  bersifat reaktif  dan  diharapkan  dapat  digunakan  sebagai bioreseptor dalam perangkat uji metode GICA untuk mendeteksi antibodi dari Bacillus anthracis . Satu pita meragukan  terlihat  tebal  (1)  pita  92  kDa  yang diperkirakan galactose/N-acetylglucosamine polysaccharide dari  dinding  sel Bacillus  anthracis dan satu pita protein yang jelas (2) pita 68 kDa yang diperkirakan poly-γ-D-glutamic  acid (PDA)  dari kapsul Bacillus  anthracis .  Kedua  protein  antigenik yang  muncul  ini  dapat  digunakan  untuk  kandidat bioreseptor  dalam  perangkat  uji.    Keberadaan komponen  protein  antigenik  ini  di  perkuat  oleh penelitian  Lyli  N  dan  Rahmat  SA  tahun  2008  yang mengidentifikasi  adanya  protein  antigenik  pada dinding  sel Bacillus  anthracis yaitu galactose/N- acetylglucosamine  polysaccharide yang  digunakan untuk membuat antibodi yang akan digunakan dalam pembuatan perangkat uji Cell wall- Direct Fluorescent  Assay (CW-DFA)    dan poly-γ-D- glutamic  acid (PDA)  dari  kapsul Bacillus  anthracis . Yang digunakan dalam perangkat uji Capsule-Direct Fluorescent  Assay  (CAP-  DFA) .  Berat  molekul  dari galactose/N-acetylglucosamine polysaccharide sedikit berbeda dengan hasil penelitian yaitu 91 kDa. Selisih dari berat molekul ini mungkin terjadi karena perkiraan  berat  molekul  berdasarkan  perkiraan  yang didasarkan dari perbandingan marker yang digunakan. Protein antigenik galactose/N- acetylglucosamine  polysaccharide yang  terdapat pada  dinding  sel Bacillus  anthracis bersifat  sebagai
antigen  spesifik,  menurut  Choudhury et  al ,2006 bahwa  struktur  dari  polisakarida  utama  dinding  sel Bacillus  anthracis adalah  species  specific.  Secara keseluruhan,  dinding  sel Bacillus  anthracis terdiri atas peptidoglican, suatu kompleks heterepolisakarida  yang  terbuat  dari  rantai  glycan yang  dihubungkan  oleh  peptida  –  peptida  kecil. Bahan ini  membentuk suatu jaringan  yang  menutupi seluruh  bakteri,  dan  merupakan  40%  dari  seluruh masa  sel.  Rantai glycan terdiri  atas  unit N- acetylglucosamine dan N-acetylmuramic acid. Rantai glycan terhubung oleh peptida – peptida kecil membentuk  bagian  glycan  dalam  dinding  sel. Komposisi  utama  dari  polisakarida  dinding  sel Bacillus anthracis terutama terdiri atas Galactose-N- acetylglucosamine  polisaccharide yang  sangat  unik untuk  galur  –  galur Bacillus  anthracis dan  tebukti sangat  potensial  untuk  membedakan  dari  spesies bacilli  lainnya  (Choudhury et  al ,2006).    Hasil Analisa Western  blotting kedua  dari  penelitian  ini yang  lebih  jelas    memperlihatkan  satu  pita  protein yaitu  pita  68  kDa  reaktif  yang  bersifat  antigenik, diperkirakan poly-γ-D-glutamic  acid (PDA)  dari kapsul Bacillus  anthracis yang  dapat  digunakan untuk  kandidat  bioreseptor  dalam  perangkat  uji.  Hal ini  di  dukung  oleh  pendapat  Fouet et  al tahun  1999 dan  Mesnage et  al tahun  2000 Bacillus  anthracis yang  virulen  membentuk  kapsul  in  vivo  dalam kondisi anaerobik, atau lingkungan yang mengandung  5%  CO 2 atau  media  yang  mengandung bikarbonat.  Sel  vegetatif  akan  mensekresikan  kapsul polipeptida  (PGA)  dan  membentuk  koloni  yang bersifat  mukoid.  Antigen  ini  bersifat  spesifik  karena keberadaanya  dapat  membedakan Bacillus  anthracis
dengan  bacilli  lainnya  yang  tidak  menghasilkan polimer  kapsul  ini.    Hasil  uji  coba  perangkat  uji menggunakan kandidat protein antigenik dari antigen penuh Bacillus  anthracis berdasarkan  hasil  analisa Western  blotting terdeteksi  satu  pita  92  kDa  yang diperkirakan galactose/N-acetylglucosamine polysaccharide dari  dinding  sel Bacillus  anthracis dan  satu  pita  protein  yang  jelas  yaitu  pita  68  kDa, diperkirakan poly-γ-D-glutamic  acid (PDA)  dari kapsul Bacillus  anthracis yang  digunakan  dalam pembuatan perangkat uji menggambarkan kemampuan  imunosenssor  dari  ekstrak antigen penuh/sekretori  antigens  dari Bacillus  anthracis sebagai  bioreseptor  metode  GICA  yang  berguna untuk  mendeteksi  antibodi  dari Bacillus  anthracis menunjukkan  hasil  Sensitivitas  dan  spesifisitas perangkat  uji  metode  GICA  untuk  mendeteksi antibodi Bacillus  anthracis bila  menggunakan  hasil pemeriksaan metode ELISA sebagai referensi masing – masing adalah 100 % dan 87,5 %.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
1. Teridentifikasi  Pita  –  pita  protein  yang terbentuk  masih  utuh  dan  jelas  dengan menggunakan  analisa  SDS-PAGE,  dengan urutan  92  kDa,  68  kDa,  54  kDa,  43  kDa,  29 kDa,  dan  18  kDa  sehingga  dapat  digunakan sebagai bioreseptor pada GICA.
2. Teridentifikasi  satu  pola  protein  yang  bersifat antigenik  atau  menunjukkan  sifat  reaktivitas dari Bacillus  anthracis yaitu  68  kDa  dengan menggunakan metode Western Blotting .
3. Ekstrak  sekretorik  antigen  (SA) Bacillus anthracis dapat  digunakan  sebagai  bioreseptor
pada  pembuaan  perangkat  uji  metode  GICA untuk  mendeteksi  IgG  terhadap Bacillus anthracis .
4. Sensitivitas  dan  spesifisitas  perangkat  uji metode  GICA  untuk  mendeteksi  antibodi Bacillus  anthracis bila  menggunakan  hasil pemeriksaan  metode  ELISA  sebagai  referensi masing – masing adalah 100 % dan 87,5 %.

## Saran
Perlu penelitian lanjutan mengenai kestabilan  dan  daya  tahan  perangkat  uji  metode GICA pada Suhu dan kelembaban yang bervariasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Bioramp,2009. Manual  Test  Immunokromatografi Bio M Pylori ,Mataram.
Budiarto,E.2004. Metodologi Penelitian Kedokteran . Sebuah pengantar.EGC, Jakarta.
Choudrury,B.,C.Leoff,E.Saile,P.Wilkins,C.P.Quinn,
E.L.Kannenberg  and  R.W.Carlson.2006.
The  structure  og  major  cell  wall polysaccharide  of  Bacillus  anthracis  is species specific . J.Biol.Chem.10:1074.
Depkes  R.I,2003. Pedoman Tata Lausana Kasus dan Pemeriksaan  Laboratorium Penyakit  Ántrax di  Rumah  Sakit.  Dirjen  Pemberantasan Penyakit Menular
dan Penyehatan Lingkungan. Depkes R.I.
Fouet,A,.S.  Mesnage,E.Tosi-Couture,P.Gounon  and
M.  Mock.1999.  Bacillus  anthracis  surface: capsule and S
layer.J.Appl.Microbiol.87:251-255.
Helgason,E.D,  H.  Caugant,A.Johansen,M.Fouet  and M.Mock,2000. Bacillus  anthracis , Bacillus cereus  and    Bacillus  thuringensis  –  one species on the basis of genetic
evidence.Appl  Environ.  Microbio. 66:2627- 2630.
Jawetz,  Melnick  dan  Adelberg,  1996, Mikrobiologi Kedokteran ,  Edisi  20,  Penerbit  Buku Kedokteran EGC, Jakarta, Hal. 194-196.
Lily  N  dan  Rahmat  SA,2008.  Identifikasi  Cepat
Bacillus anthracis dengan Direct Flourescent Antibody Assay yang menggunakan  Componen  dinding  sel  dan kapsul.  Balai  Besar  Penelitian  Veteriner Bogor.Dalam Jornal JITV volume 13 no.2.
Mesnage,S.,T. Fontaine,T.Mignot,M.Delepierre,M.Mock and  A.  Fouet.2000.  Bacterial  SLH  domain proteins  are  noncovalently  anchored  to  the cell  surface  via  a  conserved  mechanisms involving  wall polysaccharide pyruvylation. EMBO J.19:4473-4484.
Priyonggo,
Budiana, www.indomedia.com/poskup/2007/05/edisi 28/opini.htm ,  sitasi  tanggal  25  Oktober
2005.
Sacher,  Mc  Pherson,  2004, Tinjauan  Klinis  Hasil
Pemeriksaan Laboratorium, Edisi 11, Penerbit  Buku  Kedokteran  EGC,  Jakarta, Hal.
Siregar,E.A,2002.  Anthraks:  Sejarah  masa  lalu, situasi  pada  saat  ini,  sejarah  diagnosa  dan kecenderungan perkembangan ilmu di masa depan. Simposium sehari Penyakit Anthraks: Anthraks di Indonesia, masa lalu, masa  kini  dan  masa  depan.  Balitvet,Bogor, 17 Juli 2002.
Subekti,D.T.,W.T.Artama  dan  T.  Iskandar,2005. Perkembangan Kasus dan diagnosis Zoonosis.  Lokakarya  Nasional  Pnyakit Zoonosis.
Peng,D.P.S.S,
Hu,Y.Hua,Y.C.Xiao,Z.L.Li,X.L. Wang and D.R. Bi.2007. Comparison of a new gold-immunochromatographic  assay  for  the detection  of  antibodies  againt  avian  influenza
virus with hemagglutination inhibition and agar gel  immunodiffusion  assays .  Veter  Immunol
Immunop 117;17-25.