## MEDIA KULTUR ALTERNATIF IN VITRO PADA NEMATODA ENTOMOPATOGEN
Alternative In Vitro Culture Media for Entomopathogenic Nematodes
Iqbal Erdiansyah 1 * , Rio Yudha Pratama 1 , Trisnani Alif 1 , Tirto Wahyu Widodo 1
1 Jurusan Produksi Pertanian, Politeknik Negeri Jember
Diterima redaksi:  21 Februari 2024/ Direvisi: 09 Mei 2024/ Disetujui: 21 Mei 2024 / Diterbitkan online: 31 Mei 2024 DOI: 10.21111/agrotech.v10i1.11599
Abstrak. Nematoda entomopatogen (NEP) merupakan agensia hayati prospektif. Kendala perbanyakanya NEP yaitu  terbatasnya  akses  pembelian  dan  mahalnya  harga  media  perbanyakan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  pengaruh  komposisi  media  alternatif  terhadap  kepadatan  populasi  NEP.  Penelitian  ini  dilakukan pada bulan Agustus-Desember 2022 menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan 7 perlakuan yaitu MA (4g tepung bekatul padi), MB (4g ampas kelapa), MC (4 g tepung keong mas), MD (2 g tepung bekatul padi + 2 g ampas kelapa), ME (2 g tepung bekatul padi + 2 g tepung keong mas), MF(2 g ampas kelapa + 2 g tepung keong mas), MG(2 g tepung bekatul padi + 1 g ampas kelapa +  1  g tepung keong mas) dan diulang sebanyak 4 kali. Variabel  yang  diamati  yaitu  populasi  nematoda.  Data  yang  diperoleh  dianalisis  menggunakan  ANOVA  dan dilanjut dengan uji Tukey 5%.  Hasil penelitian menunjukkan media alternatif berpengaruh terhadap kepadatan populasi NEP. Media pertumbuhan MG merupakan media terbaik dengan rata-rata jumlah populasi pada minggu pertama (1044.25J/0.25ml), kedua (1120.75 J/0.25ml), ketiga (177J/0.25ml) dan keempat (89.25J/0.25ml).
Kata Kunci: Media, populasi, ampas kelapa, bekatul, keong mas.
Abstract. Entomopathogenic nematodes (ENPs) are prospective biological agents. The obstacles multiplication of NEP are limited access to purchasing and the high price of multiplication media. This research aims to determine effect of alternative media composition on the population density of Entomopathogenic Nematodes. This research was conducted in August-December 2022 using a completely randomized Design (CRD) with 7 treatments, its MA (4g rice bran), MB (4g coconut pulp), MC (4 g golden snail), MD (2 g rice bran + 2 g coconut pulp), ME (2 g rice bran + 2 g golden snail), MF (2 g coconut pulp + 2 g golden snail), MG (2 g rice bran + 1 g coconut pulp + 1 gram golden snail) was repeated 4 times. The observed variable is densitiy of Nematodes Population. The data obtained were analyzed using ANOVA and continued with the 5% Tukey test. The results  showed a significant effect of alternative medium on the NEP population with the best treatment on MG medium, the average population in 1st week (1044.25J/0.25ml), 2st week (1120.75J/0.25ml), 3st week (177J/0.25ml) and 4st week (89.25J/0.25ml)
Keywords: medium, population, coconut pulp, rice bran, golden snail.
* Korespondensi email: iqbal@polije.ac.id Alamat : Jl. Mastrip, Krajan Timur, Sumbersari, Kec. Sumbersari, Kabupaten Jember, Jawa Timur

## PENDAHULUAN
Nematoda yang bersifat endoparasit pada  serangga  dikenal  dengan  istilah Nematoda  Entomopatogen  (NEP).  Jenis Nematoda potensial seperti Steinernema sp .
dan Heterorhabditis  sp. yang bersimbiosis dengan  bakterti Xenorhabdus sp.  Bakteri tersebut  merupakan  agensia  hayati  yang memiliki kemampuan
untuk
mengendalikan hama pada ordo

## Gontor AGROTECH Science Journal
Vol. 10 No. 1, Juni 2024: 36-41 http://ejournal.unida.gontor.ac.id/index.php/agrotech
Lepidoptera,  Coleoptera,  dan  Diptera dengan rentang waktu 24-48 jam menggunakan inang  serangga yang berkualitas.  Perbanyakan  secara in  vivo dinilai kurang praktis dan cenderung lebih mahal  apabila  dilakukan  dalam  skala produksi    besar  selain  itu  keterbatasan serangga  inang  (Kranti  dkk,  2020) Perbanyakan  alternatif  lain  yaitu  secara invitro. Dalam perkembangannya perbanyakan secara invitro dengan menggunakan  media  semi  padat  dengan komposisi  media  kaya  protein  dan  lemak hewani,  namun  dalam  skala  komersial diketahui tidak ekonomis karena peningkatan  kapasitas  produksi  sejalan dengan  peningkatan  biaya  operasional, waktu  yang  dibutuhkan,  serta  rendahnya hasil  nematoda  (Kranti,  dkk.  2020). Kualitas media sangat tergantung dengan komposisi pada media.
Sehingga
dibutuhkan  solusi  komposisi  media perbanyakan  secara  invitro  yang  bernilai ekonomis dan dapat meningkatkan kerapatan populasi nematoda.

## METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan Agustus-Desember  2022  di  Laboratorium Fitopatologi  Program  Studi  Proteksi Tanaman  Fakultas  Pertanian  Universitas Jember.

## Rancangan Penelitian
Penelitian  ini  Menggunakan    Rancangan Acak Lengkap (RAL) non faktorial dengan
7 perlakuan dan 4 ulangan meliputi : MA : 4 g tepung bekatul padi MB : 4 g ampas kelapa MC : 4 g tepung keong mas MD : 2 g tepung bekatul padi + 2 g ampas kelapa ME : 2 g tepung bekatul padi + 2 g tepung keong mas MF : 2  g  ampas  kelapa  +  2  g tepung keong mas MG : 2 g tepung bekatul padi + 1 g  ampas  kelapa  +    1    g tepung keong mas Data yang diperoleh dianalisis menggunakan    ANOVA  dan  diuji  lanjut menggunakan uji Post Host Test 5%.

## Pengambilan sampel
Pengambilan  sampel  tanah di  lahan Pertanian  Organik  Dusun  Kopang  Krajan Desa Darsono,
Jember, dengan menggunakan  metode  Hade,  dkk  (2020) yang  telah  dimodifikasi  yaitu  paralon (diameter  7.5  cm)  yang  dibenamkan  di daerah  perakaran  tanaman  ±  20  cm  dari permukaan  tanah  dan  tanah  yang terangkat  disimpan  dalam  plastik  yang berlubang.

## Pembuatan Media alternatif
Masing-masing  media  perlakuan ditambahkan  27  ml  aquades,  dipanaskan dan  diaduk  hingga  homogen,  lalu ditambahkan spon polyurethane ukuran 1 x 1 cm 2 dengan ketebalan 2  cm sebanyak 12 spon. Didinginkan dan dilakukan sterilisasi  media  menggunakan  autoklaf suhu  121°C tekanan  1.5  Atm  selama  30 menit.  pengukuran  pH  media  dilakukan sebelum  dan  akhir  perlakuan  dengan menggunakan kertas lakmus yang dicelupkan  pada  media  dan  diamkan  1-2 detik,  warna  yang  keluar  dari  kertas lakmus  kemudian  dibandingkan  dengan indikator  warna  yang  ada  didalam kemasan  kertas  lakmus  (Erdiansyah  dkk. 2022).

## Isolasi agensia
Teknik isolasi dengan menggunakan insect baiting  method (Vintyas  &  Purnomo,  2022;
Afifah, dkk 2013). Dengan cara menimbang  Tanah  ditimbang  200  gr sampel tanah dan membenamkan 10 ekor Tenebrio  molitor dalam  wadah  plastik tembus  udara  yang  telah  dibalut  dengan kain kasa.Larva yang mati (± 7-14 hari
I Erdiansyah, R., Y Pratama, T Alif, T., W Widodo
pembenaman)  dibilas  dengan  aquadest dan  dipindahkan  ke  tempat  perangkap nematoda ( white trap ). Ekstraksi nematoda dilakukan  dengan  meletakkan T.molitor diatas  kertas  saring  pada  cawan  petri (diameter  15  cm)  yang  berisi  cawan  petri (diameter 9 cm) dalam posisi terbalik lalu ditambahkan aquades steril hingga mencapai  setengah  diameter  cawan  petri (diameter  9cm).  Inkubasi white  trap dilakukan selama 14 hari pada suhu ruang. Infektif  juvenil  nematoda  yang  tumbuh pada larva T. molitor keluar dan bermigrasi ke dalam air.  Warna kulit pada T. molitor yang terdapat dalam white trap akan luruh bersama air dan ± dua minggu setelahnya dapat  dilakukan  pemanenan  nematoda dan dilakukan identifikasi morfometrik.

## Inokulasi NEP
Metode ini
menggunakan Sivaramakrishnan  and  Razia  (2021) yang telah dimodifikasi yaitu dengan cara hasil isolasi NEP disterilkan dengan NaCLO 1% selama 15 menit dan dibilas menggunakan air steril. Hasil endapan sebanyak 0.25 ml dimasukkan  pada  masing-masing  media. Kepadatan  populasi  NEP  dihitung  mulai dari  minggu  pertama  hingga  keempat dengan rumus (Indriyanti
and Muharromah, 2016):
Populasi  NEP (J/ml) = 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑎𝑖𝑟 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 (𝑚𝑙)
𝑠𝑢𝑏 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑜ℎ  (𝑚𝑙) x ∑ NEP

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  pengamatan  mofometrik (tabel  1)  menunjukkan  morfologi  genus
Steinernema  sp pada  J3  dengan  panjang tubuh  kisaran  779-841  (µm),  lebar  tubuh kisaran 27-41 (µm), dan ekor kisaran 68-78 (µm)  (Flores,  dkk.  2021).  Media  alternatif yang digunakan sebagai media perbanyakan  NEP  memiliki  pH  yang berbeda-beda  (tabel  2).  Perbedaan  pH diawal dan diakhir minggu pada masing- masing  media  berasal  dari  aktifitas
pertumbuhan NEP serta  kandungan dari masing-masing  media.  Perubahan  pH pada media perbanyakan NEP dikarenakan adanya aktivitas nutrisi pada bahan    yang  memiliki  kandungan ammonia  menyebabkan  perubahan  pH menjadi basa, yaitu sekitar 5-9 masih dapat ditoleransi  untuk  perbanyakan  NEP (Indriyanti & Muharromah, 2016).
Tabel  1.  Rerata  Populasi  NEP  setiap minggu Nematoda entomopatogen Rerata (µm) Panjang tubuh 857,42 Lebar tubuh 37,02 Ekor 80,46 Tabel 2. pH pada media Perlakuan Perlakuan pH Minggu awal Minggu akhir MA 5 7 MB 5 7 MC 6.5 8 MD 5 7 ME 6 7.5 MF 7 8.5 MG 5.5 7.5
Perbanyakan  NEP  secara  in  vitro  pada berbagai  media  perlakuan  menunjukkan hasil  yang  berbeda-beda.    Pada  minggu pertama  semua  media  mengalami  media peningkatan  populasi    NEP  bagai  media perlakuan menunjukkan hasil yang berbeda-beda.    Pada  minggu  pertama semua  media  mengalami        peningkatan populasi  NEP  bagai  media  perlakuan menunjukkan  hasil  yang  berbeda-beda. Pada  minggu  pertama  semua  media mengalami  peningkatan  populasi  NEP dari  inokulasi  awal  (108  J/0.25  ml). berdasarkan  uji  ANOVA  rata-rata  jumlah NEP  menunjukkan  hasil  berbeda  nyata, dilanjutkan dengan uji Tukey taraf 1%
populasi  nematoda  setiap  minggu  sangat beragam (tabel 3).
Tabel  3.  Rerata  Populasi  NEP  setiap minggu Perla- kuan Populasi NEP (J/0.25ml) M1 M2 M3 M4 MA 401.8a    146.8a 74.5a 22.25a MB 599.3b    702.3b  117.8b 52.25b MC 282.0c 461.0c 132.5bc  64.25bc MD 703.8d    768.5b  135.8bc  70.25c ME 386.3a    534.5c   136.5bc  79.75ce MF 843.5e 896.5d  146.5c 32.25a MG 1044.3f 1120.8e 177.0d 89.25e * Angka yang diikuti huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji tukey 5%
Hasil  pengamatan  minggu  pertama menunjukkan  perbedaan  yang  signifikan dan  terjadi  peningkatan  (awal  108 J/0.25ml) di masing-masing media perlakuan.  Rerata  tertinggi  pada  media tepung  bekatul,  ampas  kelapa  dan keongmas  (1044.25  J/0.25ml)  dan  rerata terendah  pada  media  keongmas  (282 J/0.25ml).  tingkat  kompleksitas  nutrisi pada  masing-masing  media  memiliki pengaruh
penting dalam
perkembangbiakan
NEP.
Semakin kompleks  nutrisi  yang  dikandung  pada media  semakin  baik  untuk  perbanyakan NEP.  Secara  umum  kandungan  nutrisi lemak,  karbohidrat  dan  protein  memiliki peranan  penting.  Nutrisi  dasar  lemak merupakan nutrisi kunci yang dibutuhkan oleh  siklus  hidup  NEP  sebagai  sumber energi terutama pada fase Juvenil 1 (Belur &  Malan,  2021).  Selain  itu,  lingkungan sekitar pertumbuhan NEP turut berpengaruh  yaitu  kelembapan  yaitu sebesar  65-85%,  Intensitas  cahaya  4.8-34 Lux, suhu 29.2-10°C (Indriyanti, 2015).
Pada  minggu  kedua  populasi  NEP cenderung  meningkat  di  semua  media perlakuan kecuali pada media MA (145.75 J/0.25  ml).  Rerata  tertinggi  didapatkan pada  perlakuan  MG  (1120.75  J/0.25ml)
dimana  nutrisi  yang  dibutuhkan  untuk perkembangbiakan
NEP tersedia melimpah sehingga memungkinkan
percepatan  perkembangan  biakan  dan pertumbuhan  populasi  NEP  (Indriyanti, dkk. 2014).  Penurunan populasi NEP pada media  tepung  bekatul  diduga  karena berkurangnya  sumber  nutrisi  utama berupa  lemak  yang  digunakan  sebagai pertahanan  hidup  terhadap  cekaman lingkungna (Selvan, dkk. 1993).
Pada  minggu  ketiga  dan  ke  empat trend  populasi  NEP  cenderung  menurun. Penurunan ini berkolerasi dengan kebutuhan nutrisi dalam
perkembangbiakan  NEP  terhadap  siklus hidup.  Pemenuhan  Kebutuhan  nutrisi dengan  baik  akan  mempercepat  siklus hidup NEP dan jika nutrisi tidak terpenuhi maka  akan  memperpanjang  siklus  hidup NEP (Ramakuwela, dkk. 2016).
Dari keseluruhan pengamatan setiap  minggu  media  dengan  komposisi campuran ampas kelapa, bekatul padi dan tepung keong mas merupakan media yang memiliki  populasi  NEP  paling  bagus. Kombinasi komposisi dari sumber hewani maupun  nabati  merupakan  komposisi terbaik  untuk  perkembangbiakan  NEP. Populasi NEP yang bersumber dari media kelapa  memiliki  jumlah  populasi  yang sangat  banyak    (Kalita,  dkk.  2019).  Media Pertumbuhan  NEP  dengan  nutrisi  lipid yang  tinggi  sangat  berpengaruh  pada pertumbuhan  dan  perkembangan  NEP (Somwong dan Petcharat, 2012).

## KESIMPULAN
Media  alternatif  berpengaruh  terhadap kepadatan Populasi NEP dengan perlakuan  paling  baik  pada  media campuran bekatul padi, ampas kelapa dan keong  mas  cenderung  lebih  besar  rerata kepadatan  populasinya  dibandingkan dengan media pertumbuhan yang lain.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terimakasih penulis ucapkan kepada beberapa partisipan yaitu supervisor, teknisi, dan kolega yang ada di Politekni  Negeri  Jember  yang  telah membantu penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Abd  El-Rah,  A.M.,  A.  M.  Abdelazeem,  H. Elbrense,  &  S.  Vergara-i.  (2022).
Photorhabdus and Xenorhabdus as Symbiotic  Bacteria  for  Bio-Control Housefly ( Musca domestica L.). Pak. J. Biol. Sci., 25(7):586 – 601 doi: 10.3923/pjbs.2022.586.601. Afifah,  L.,  Tri  Rahardjo,  B.  &  Tarno,  H. (2013). Eksplorasi Nematoda Entomopatogen pada Lahan Tanaman Jagung, Kedelai, dan Kubis di Malang serta Virulensinya terhadap Spodoptera  litura  Fabricius . Jurnal HPT , 1(2), pp. 1 – 9.
Bultum, L.E., S. A. Emire, and Y. T. Wolde.
(2016). Influence of Full Fat Rice Bran
From Ethiopian Rice Milling Industries  on  Nutritional  Qualities, Physicochemical and Sensory Properties  of  Bread  and  Biscuits.  J .
Food  Meas.  Charact .,  14(4):2253 – 2261, doi: 10.1007/s11694-020-00472-7.
Chaerani.  (2011).  Pembiakan  nematode pathogen seta (Rhabditida: Heterorhabditis dan Steinernema ) pada media  semi  padat. J.HPT  Tropika. 1(1):69-77
Chitra,  P.,  Sujatha,  K.  and  Jeyasankar,  A. (2017). Entomopathogenic Nematode  as  a    Biocontrol  Agent – Recent Trends – A Review.
International  Journal  of  Advanced Research in Biological Sciences , 4(1), pp.
9 – 20. doi:10.22192/ijarbs.
Dunn, M.  D.,    P.  D.  Belur  &  A.  P.  Malan.
(2020).  A  Review  of  The  In  Vitro
Liquid Mass Culture of Entomopathogenic Nematodes.
Biocontrol Sci. Technol .31(1): 1 – 21. doi:
10.1080/09583157.2020.1837072.
Elbrense,H.,    A.  M.  A.  Elmasry,  M.  F.
Seleiman,  M.  S.  AL-Harbi,  &  A.  M.
Abd El-Raheem. (2021). Can Symbiotic Bacteria ( Xenorhabdus and Photorhabdus ) be more Efficient than Their Entomopathogenic Nematodes against  Pieris  rapae  and  Pentodon algerinus Larvae. Biology . 10(10):999. doi: 10.3390/biology10100999.
Erdiansyah, I., Taufika, R., Widodo, T. W.,
Jannah, D. D., & Prayitno, H. (2022). Viability  of  biofertilizer  bacteria Rhizobium spp  based  on  household waste.  In  IOP  Conference  Series: Earth  and  Environmental  Science. 980(1). IOP Publishing.
Flores, P., Alvarado. A., Lankin, G., Lax, P.,
Prondan,  S.,  &  Aballay,  E.  (2021). Morphological, molecular and ecological  characterization  of  a native  isolate  of Stenernema  felriae (Rhabditida:Steinernematidae)  from southern  Chile. Parasites    vectors . 14(45):1-13
Hade,  W.S.,  Djamilah.,  &  Priyatningsih.
(2020).  Entomopatogen  nematode exploration  and  virulency  against Spodoptera  frugiperda J.E  Smith. Agritropica. 3(2):70-81
Herlina,  E.,  D.  Widiastuti,  &  N.  S.  Dewi. (2020).  Diversification  of  Tapioka Flour  in  the  Making  of  Food  Fiber Enriched  Flakes  ( Dietary  Fiber )  of Coconut Flour.ADRI Int. J. Eng. Nat. Sci. 5(2):1 – 6 doi: 10.29138/aijens.v5i2.11.
Indriyanti,  D.  R.    &  N.  L.  Muharromah.
(2016). Mass Cultivation of
Entomopathogenic  Nematode  in Artificial  Media. Biosaintifika J.  Biol.
Biol.  Educ .  8,  (1):113 – 120.  doi:
10.15294/biosaintifika.v8i1.5579.
Joko,  T.,    S.  Sulistiyani,  O.  Setiani,  M. Rahardjo,  &  I.  S.  Arumdani.  (2023). Life  Cycle  Analysis  on  Pesticide
Exposure  and  Residues  in  the Environment  of  Brebes  County
Shallot  Farms  and  Farmers. J.  Ecol. 24(3):76 – 89 doi: 10.12911/22998993/157424.
Kalita,  R.  M.,  J.  George.,  L.  Khataniar.,  G.
Devi.,  &  B.  Bhattacharyya.  (2019). Mass
multiplication
of entomopathogenic  nematodes  in artificial media. Journal of Entomology and Zoology Studies . 7(5):215-219
Kranti  K.V.V.S.,  K.,  Yadav,  S.  &  Patil,  J.
(2020). Mass Multiplication of
Entomopathogenic Nematodes on In
Vitro  Solid  Media. Journal  of
Entomology  and  Zoology  Studies ,  8(3): 565 – 570. doi: 10.20546/ijcmas.2018.707.382. Kumari, B. (2022). Use of Entomopathogenic  Nematodes  in Recent  Trends :  A  Review. Pharma Innov. J . 11(4):30 – 38.
Orozco-Hidalgo,  M.  T.,    B.  Quevedo- Hidalgo,  and  A.  Sáenz-Aponte.
(2019). Growth Kinetics and Pathogenicity of Photorhabdus
luminescens subsp.  akhurstii  SL0708. Egypt.  J.  Biol.  Pest  Control .  29(1)  :71, doi: 10.1186/s41938-019-0172-2.
P.  Somwong  dan  J.  Petcharat.  (2012). Culture  Of  The  Entomopathogenic Nematode Steinernema  carpocapsae (WEISER)  On  Artificial  Media. ARPN  Journal  of  Agricultural  and Biological Science . 7(4):229-232
Pérez-Campos  S.-J.,  A.-I.  Rodríguez- Hernández,  Ma.  del-Rocío  López- Cuellar,  A.  Zepeda-Bastida,  and  N. Chavarría-Hernández.  (2018).  In- Vitro Liquid Culture of The Entomopathogenic Nematode, Steinernema  colombiense ,  in  Orbitally
Shaken Flasks. Biocontrol Sci. Technol . 28(9):901 – 911 doi:
10.1080/09583157.2018.1499872. Ramakuwela  T,  Hatting  J,  Laing  M  D, Hazir  S  &    Thiebaut  N.  (2016).
Biological  characterization  of  the entomopathogenic nematode,
Steinernema  innovationi :  a  South African isolate. Journal of nematology . 4(50):507-516
Siahaan,  V.  N.  S.,  T.H.  Wahyuni,  A.H. Daulay  &  S.R.  Lubis.  (2020). Utilization  Of  Golden  Snail  Flour (GSF) on Ration of Quail . J. Peternak. Integratif . 8(3):194 – 201. doi: 10.32734/jpi.v8i3.5098. Sivaramakrishnan, S. and M. Razia. (2021). Entomopathogenic  Nematodes  and Their Symbiotic
Bacteria : A
Laboratory  Manual.  in  Springer Protocols  Handbooks.  New  York, NY: Springer US,. doi: 10.1007/978-1- 0716-1445-7.
Vintyas, R.M. & Purnomo, H. (2022). Larva Hermetia  iilucens dan Alphitobius diaperinus terhadap Produksi Nematoda Entomopatogen Steinernema spp. Jurnal  penelitian agronomi . 24(1):63-67
Zhang,  F.,  Makirita,  Winisia  E.,  Wu,  L.,
Gou, Y., Liu, Y., Peng, L., Chacha, M., Mbega, E. R., Li, X., He, N., & Liu, T. (2019). Effects of Growth Conditions on  the  Forms  of Xenorhabdus nematophila :  A  Symbiotic  Bacterium of the Entomopathogenic Steinernema carpocapsae. J.  Biobased  Mater. Bioenergy , 13(3): 346 – 352. doi: 10.1166/jbmb.2019.1867.
Zhen, S., Yang, L., , Yanli, H.,, Xinghui G.,,
Limeng,  Z.,  Weibin,  R.,  &  David,  S. (2018). Enhanced Entomopathogenic Nematode  Yield  and  Fitness  via
Addition of Pulverized Insect
Powder  to  Solid  Media. J.  Nematol . 50(4): 495 – 506. https://doi.org/ 10.21307/jofnem- 2018-050