## EVALUASI IN VITRO TERHADAP KEMAMPUAN ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT ASAL AIR SUSU IBU UNTUK MENGASIMILASI KOLESTEROL DAN MENDEKONJUGASI GARAM EMPEDU
[In Vitro Evaluation of Cholesterol Assimilation and Bile Salt Deconjugation by Lactic Acid Bacteria Isolated from Breast Milk]
Lilis Nuraida 1,2) *, Siti Winarti 2) , Hana 1,3) , dan Endang Prangdimurti 1,2)
1) South East Asian Food and Agriculture Science and Technology Center IPB
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian IPB
3) Program Studi Ilmu Pangan Pasca Sarjana IPB
Diterima 05 Mei 2011 / Disetujui 12 Agustus 2011

## ABSTRACT
Hypercholesterolemia is a risk factor for cardiovascular disease, the leading cause of death in many countries. Several studies have shown that reduction of excessive levels of cholesterol in the blood decreases the risk of cardiovascular disease. It is therefore important to develop ways of reducing serum cholesterol. Based on in vitro and in vivo studies, some of lactic acid bacteria (LAB) having potential probiotic properties can reduce total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol levels. The aim of this study was to evaluate the ability of LAB isolated from breast milk in reducing cholesterol by assimilation and by bile salt deconjugation activity in vitro.Thirteen strains of LABs were evaluated for their acid and bile salt resistance  and  selected  to  test  their  ability  to  assimilate  cholesterol  and  to  deconjugate  bile  salt  (natrium  taurocholate)  in  vitro.  Cholesterol assimilation  activity  was  determined  by  measuring  the  difference  between  the  remaining  cholesterol  in  broth  medium  inoculated  with  LAB  with cholesterol in control after incubation. Bile salt deconjugation activity was determined by measuring free cholic acid released in broth medium after incubation  with  LAB.  The  results  shows  that  most  of  the  isolates  was  susceptible  to  low  pH  and  all  isolates  used  were  able  to  survive  in  the presence  of 0.5% bile salt. The  LAB were also able to assimilate cholesterol at varying levels ranging from  0.86-14.97 µg/ml, with the highest activity  showed  by  Pediococcus  pentosaceus  1-A38,  Pediococcus  pentosaceus  2-B2  and  Pediococcus  pentosaceus  2-A16.  Taurocholate deconjugation assay showed that the isolates have weak bile salts deconjugation activity as indicated by free cholic acid released ranging from 0.06-0.25 µmol/ml, with the highest release in Pediococcus pentosaceus 1-A38 and Pediococcus pentosaceus 1-A22. The present study suggest that Pediococcus pentosaceus 1-A38 was potential for the development of probiotic products with specific benefit to reduce cholesterol through cholesterol assimilation and deconjugation of bile salt.
Keywords : breast milk isolate, probiotics, lactic acid bacteria, cholesterol assimilation, bile salt deconjugation

## 1 PENDAHULUAN
Beberapa  penelitian  telah  menunjukkan  bahwa  beberapa bakteri asam laktat (BAL) dapat menurunkan kolesterol secara in vitro maupun in vivo (Usman dan Hosono, 1999; Ngatirah et al ., 2000; Kusumawati, 2002; Liong dan Shah 2005; Lye et al ., 2010).  Pada  subjek  yang  hiperlipidemik  umumnya  efek  yang diberikan  dari  konsumsi  probiotik  adalah  penurunan  kadar kolesterol,  sedangkan  pada  subjek  yang  normal,  efek  yang umumnya  terjadi  adalah  penurunan  kadar  trigliserida  (Pereira dan Gibson, 2002).
Pengaruh laktobasili terhadap penurunan kolesterol diduga karena  kemampuannya  dalam  mengasimilasi  kolesterol  dalam usus  halus  dan  mendekonjugasi  garam  empedu.  Asam  lemak rantai  pendek  yang  diproduksi  oleh  laktobasili  dapat menghambat sintesis kolesterol hepatik dan distribusi kolesterol di  dalam  plasma  dan  hati  (Collado,  2009).  Dekonjugasi  asam empedu  telah  dinyatakan  sebagai  salah  satu  aktivitas  utama mikroba  usus  yang  dapat  dipertimbangkan  sebagai  probiotik (FAO/WHO, 2002). Asam empedu disintesis di dalam hati dari
* Korespondensi Penulis : Email : lilis@seafast.org
kolesterol dan disekresikan sebagai konjugat dari glisin maupun taurin  ke  dalam  usus  dua  belas jari  dan  akan  berperan  dalam memfasilitasi  penyerapan  lemak  dan  mengikuti  sirkulasi enterohepatik (Hofmann, 1984). Selama sirkulasi dalam saluran pencernaan,  garam  empedu  dapat  mengalami  modifikasi  oleh mikrobiota  usus,  yaitu  dekonjugasi  garam  empedu  oleh  enzim hidrolisis  garam  empedu  ( bile  salt  hydrolase- BSH)  dengan melepaskan  residu  asam  amino  dan  terbentuk  asam  empedu terdekonjugasi (terutama jenis kolat dan quenodeoksikolat).
Nuraida et al. (2007) telah mengisolasi beberapa BAL dari air  susu  ibu  (ASI).  Beberapa  diantaranya  menunjukan ketahanan yang baik terhadap asam dan atau garam empedu. Ketahanan  terhadap  asam  dan  garam  empedu  merupakan prasyarat  suatu  mikroorganisme  dapat  digunakan  sebagai probiotik  karena  mengindikasikan  kemampuannya  bertahan hidup dalam saluran pencernaan. Isolat lokal asal ASI potensial untuk  dikembangkan  lebih  lanjut  sebagai  agen  probiotik  yang memberikan  manfaat  kesehatan.  Tujuan  penelitian  ini  adalah untuk  menguji  kemampuan  isolat  BAL  untuk  mengasimilasi kolesterol dan mendekonjugasi garam empedu berupa natrium taurokolat  asal  ASI,  melalui  penelitian  ini  diuji  pula  ketahanan isolat-isolat tersebut terhadap asam dan garam empedu.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bakteri asam laktat asal ASI berasal dari koleksi SEAFAST Center,  IPB.  Bakteri  asam  laktat  isolat  ASI  yang  digunakan berjumlah  13  isolat,  yang  terdiri  dari  11  isolat Pediococcus ( Pediococcus pentosaceus 1 - A8, Pediococcus pentosaceus 2-
A16, Pediococcus pentosaceus 1-A20, Pediococcus pentosaceus 1-A22, Pediococcus pentosaceus 1-A23, Pediococcus pentosaceus 1-A38, Pediococcus pentosaceus 2- B2, Pediococcus pentosaceus 2-B11, Pediococcus pentosaceus 2-B13, Pediococcus R1, Pediococcus R9), 1 isolat Leuconostoc (R3), dan 1 isolat Lactobacillus (A6).
Isolat-isolat  tersebut  di  atas  terdiri  atas  isolat homofermentatif  ( Pediococcus dan Lactobacillus )  dan  isolat heterofermentatif  ( Leuconostoc ).  Bahan  kimia  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  yaitu  medium  cair  dan  medium  agar  de Mann  Rogosa  Sharpe  (MRSB  dan  MRSA)  (Oxoid),  akuades, natrium tioglikolat (Sigma), kolesterol murni 95% (Sigma), oxgall (Merck),  etanol  (Merck),  2-propanol  (Merck),  KOH  (Merck),  n- heksana (Merck), gas nitrogen, asam asetat glasial (Merck), o - ftalaldehida  (Sigma),  H 2 SO 4 pekat  (Merck),  NaCl  (Merck),  HCl 37%  (Merck).  Alat-alat  yang  dipergunakan  dalam  penelitian  ini adalah  peralatan  gelas  laboratorium,  timbangan,  vorteks, refrigerator,  spektrofotometer  Shimadzu  2450,  sentrifus berpendingin,  inkubator,  penangas  air,  otoklaf,  serta  per- lengkapan laboratorium lainnya.
Uji ketahanan terhadap pH rendah (Ngatirah et al ., 2000) Sebanyak 1% (10 6 -10 7 cfu/ml) kultur yang telah disegarkan dalam MRSB selama 24 jam masing-masing diinokulasikan ke dalam MRSB  yang terlebih dahulu diatur pH-nya sampai pH 2 menggunakan  HCl  37%,  kemudian  diinkubasi  selama  5  jam pada suhu 37ºC. Hal ini disesuaikan dengan lamanya makanan berada di dalam lambung, yaitu 2-6 jam (Gropper et al., 2009). Pada  awal  dan  akhir  inkubasi  (0  dan  5  jam)  dilakukan perhitungan  jumlah  total  BAL  dengan  menggunakan  metode hitungan  cawan  pada  media  MRSA.  Semakin  banyak penurunan  jumlah  sel  setelah  inkubasi  maka  semakin  tidak tahan bakteri tersebut terhadap pH rendah.
Uji ketahanan terhadap garam empedu (Modifikasi Ngatirah et al ., 2000)
Pengujian  ini  dilakukan  sesuai  dengan  prosedur  yang dilakukan Ngatirah et al . (2000), namun jumlah bakteri dihitung menggunakan metode hitungan cawan. Sebanyak 1%  (10 6 -10 7 cfu/ml)  kultur  yang  telah  disegarkan  dalam  MRSB  selama  24 jam ditumbuhkan dalam media MRSB yang mengandung 0,5% oxgall,  kemudian  diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu  37ºC. Pada  awal  dan  akhir  inkubasi  (0  dan  24  jam)  dilakukan perhitungan  jumlah  total  BAL  dengan  menggunakan  metode hitungan  cawan  pada  media  MRSA.  Semakin  banyak penurunan  jumlah  sel  setelah  inkubasi  maka  semakin  tidak tahan bakteri tersebut terhadap garam empedu.
Uji asimilasi kolesterol secara In Vitro (Modifikasi Kimoto et al., 2002)
Uji  asimilasi  kolesterol  pada  penelitian  ini  menggunakan metode Kimoto et al . (2002) dengan modifikasi pada jumlah dan pelarut  kolesterol  yang  digunakan.  Dalam  penelitian  ini digunakan 2-propanol untuk melarutkan kolesterol. MRSB yang mengandung 0,2% natrium tioglikolat (b/v) dan 0,3% oxgall (b/v) ditambah  dengan  larutan  kolesterol  steril  (2,5  mg/ml  dalam  2- propanol) sehingga konsentrasi akhir kolesterol dalam broth 95 µg/ml.  Sebanyak  10  ml  campuran  tersebut  diinokulasi  dengan 100 µl kultur BAL, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 jam. Setelah diinkubasi, sel  dipisahkan dari larutan dengan sentrifugasi  selama  10  menit  pada  12000  x  g  dan  suhu  4°C. Kemudian  dianalisis  jumlah  kolesterol  yang  diasimilasi  ber- dasarkan metode modifikasi Gilliland et al . (1985).
Konsentrasi  kolesterol  terasimilasi  ditentukan  berdasarkan selisih konsentrasi kolesterol yang terdapat pada media kontrol (media  yang  tidak  diinokulasi  kultur)  dengan  media  uji (diinokulasi dengan kultur). Konsentrasi kolesterol pada masing- masing  media  diukur  dengan  menggunakan  reagen o - ftalaldehida  (0,5  mg o -ftalaldehida  dalam  1  ml  asam  asetat glasial)  berdasarkan  metode  Gilliland et  al .  (1985)  dengan modifikasi  jumlah  supernatan  yang  dianalisis  menjadi  dua  kali lipat.  Metode  ini  merupakan  analisis  konsentrasi  kolesterol secara kimiawi. Prinsip metode o -ftalaldehida adalah terjadinya reaksi antara kolesterol dengan o -ftalaldehida dan asam sulfat pekat  membentuk  senyawa  kompleks  yang  berwarna.  Warna yang  terbentuk  diukur  pada  panjang  gelombang  550  nm. Intensitas  warna  berbanding  lurus  dengan  konsentrasi kolesterol.
Sebanyak  1  ml  supernatan  dimasukkan  ke  dalam  tabung reaksi (dibuat duplo untuk masing-masing sampel). Selanjutnya ke  dalam  tabung  tersebut  ditambahkan  3  ml  etanol  95%, divortex,  ditambah  2  ml  KOH  50%,  lalu  divortex  kembali. Tabung tersebut dipanaskan di atas penangas air bersuhu 60°C selama 10 menit, lalu dibiarkan sampai suhu kamar dan setelah itu  ditambah  dengan  5  ml  n-heksana.  Setelah  penambahan heksana, tabung berisi larutan divortex, selanjutnya ditambah 3 ml akuades dan divortex kembali. Larutan dibiarkan selama 15 menit pada suhu kamar agar terjadi pemisahan.
Sebanyak  2,5  ml  lapisan  heksana  yang  terpisah dipindahkan ke dalam tabung reaksi lain, kemudian dievaporasi pada  suhu  60°C  di  bawah  aliran  gas  nitrogen.  Setelah evaporasi,  ke  dalam  masing-masing  tabung  ditambahkan  4  ml reagen o -ftalaldehida. Tabung dibiarkan selama 10 menit pada suhu  kamar,  kemudian  ditambahkan  2  ml  asam  sulfat  pekat (dipipet secara perlahan).
Selanjutnya  isi  tabung  segera  divortex  dan  dibiarkan kembali  selama  10  menit  pada  suhu  kamar.  Larutan  dibaca absorbansinya  menggunakan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang  550  nm.  Konsentrasi  kolesterol  ditentukan  ber- dasarkan  kurva  standar.  Selisih  konsentrasi  kolesterol  yang terdeteksi pada sampel yang diinokulasi dengan BAL isolat ASI dan  kontrol  (tidak  diinokulasi  dengan  BAL  isolat  ASI  ) dinyatakan sebagai kolesterol yang diasimilasi oleh BAL dalam µg/ml.
Uji  dekonjugasi  natrium  taurokolat  (Usman  dan  Hosono, 1999)
Natrium  taurokolat  digunakan  sebagai  asam  empedu terkonjugasi.  Pengujian  dekonjugasi  natrium  taurokolat dilakukan  dengan  menggunakan  medium  cair  MRS  yang disuplementasikan  dengan  0,2%  natrium  tioglikolat  dan  0,2% natrium taurokolat. Medium cair tersebut diinokulasikan dengan kultur  BAL  sebanyak  1%  dan  diinkubasikan  pada  suhu  37 o C selama  24  jam  dan  selanjutnya  dianalisis  jumlah  asam  kolat bebas yang dilepaskannya.
Analisis asam kolat bebas dilakukan dengan teknik berikut ini. Sebanyak 20 ml kultur diatur pHnya pada 7,0 dengan NaOH 1N.  Kemudian  volumenya  ditepatkan  menjadi  25ml  dengan akuades  dan  disentrifugasi  pada  12000  x  g  selama  10  menit pada  suhu  1 o C  untuk  memisahkan  sel.  15  mililiter  supernatan yang dihasilkan ditepatkan pHnya menjadi pH 1 menggunakan HCl  10N  dan  selanjutnya  ditepatkan  menjadi  24ml menggunakan  akuades.  Tiga  ml  sampel  dan  9  ml  etil  asetat 99,5%  ditempatkan  pada  tabung  berpenutup  kaca,  campuran dicampur  rata  dan  dibiarkan  sampai  terjadi  pemisahan  fase. Tiga  ml  lapisan  etil  asetat  dari  tiap  tabung  kemudian dipindahkan pada tabung lain dan dievaporasikan sampai kering pada  suhu  60 o C  dengan  aliran  gas  nitrogen.  Setelah penambahan  1ml  NaOH  0,1N,  ditambahkan  juga  6ml  16N H 2 SO 4 dan  1ml  furfuraldehid  1%  (wt/vol)  dan  dicampur  rata. Tabung kemudian dipanaskan pada suhu 65 o C selama 13 menit dan  didinginkan  sampai  suhu  kamar,  5ml  asam  asetat  glasial kemudian  ditambahkan  dan  dicampur  rata.  Selanjutnya  diukur absorbansi  larutan  pada  panjang  gelombang  660nm menggunakan spektrofotometer. Konsentrasi asam kolat bebas ditentukan  menggunakan  kurva  standar.  Medium  yang  tidak diinokulasi bakteri digunakan sebagai kontrol. Hasil pengukuran dihitung dalam satuan  mol asam kolat per ml.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Ketahanan BAL Isolat ASI terhadap pH rendah
Salah  satu  syarat  mikroorganisme  dikatakan  sebagai probiotik  adalah  kemampuannya  untuk  dapat  bertahan  dalam kondisi  saluran  pencernaan  seperti  ketahanan  terhadap  pH rendah  dan  garam  empedu.  Menurut  Wildman  dan  Medeiros (2000)  lambung  memiliki  pH  sekitar  2.  Uji  ketahanan  terhadap pH rendah diperlukan untuk mengetahui kemampuan kultur BAL isolat ASI untuk dapat bertahan terhadap asam lambung.
Pada  Gambar  1  dapat  dilihat  bahwa  semua  isolat mengalami  penurunan  jumlah  sel  setelah  inkubasi  5  jam  pada pH  2.  Nilai  penurunan  tersebut  berbeda  untuk  setiap  isolat dengan  kisaran  penurunan  sebesar  0,57-7,24  log  cfu/ml.  Dari 13  isolat  BAL  yang  diuji,  hanya  isolat Leuconostoc R3  yang mengalami penurunan jumlah sel kurang dari 1 unit log (paling tahan). Nilai ini berbeda nyata (p<0,05) dengan nilai perubahan jumlah  sel  pada  isolat  lainnya  berdasarkan  hasil  analisis statistik. Perubahan jumlah sel yang berbeda pada semua isolat yang  diuji  menunjukkan  bahwa  kemampuan  untuk  bertahan pada kondisi asam berbeda untuk setiap isolat. Kemampuan ini bersifat strain  dependent .  Hal  ini  kemungkinan  terjadi  karena perbedaan  membran  sitoplasma  setiap  bakteri.  Keragaman
tersebut  mempengaruhi  karakteristik  serta  permeabilitas membran.  Cotter  dan  Hill  (2003)  menyebutkan  bahwa perbedaan toleransi asam pada beberapa spesies BAL asal oral berhubungan  dengan  permeabilitas  relatifnya  terhadap  proton. Permeabilitas  sel  terhadap  proton  salah  satunya  ditentukan melalui  aliran  proton  keluar  yang  aktif  ( active  outflow )  yang dilakukan  melalui  ATPase  membran  translokasi  proton. Perbedaan  pH  optimum  enzim ATPase  masing-masing  bakteri akan  menentukan  permeabilitas  proton  masing-masing  bakteri tersebut.  Semakin  rendah  pH  optimum  enzim  tersebut  maka toleransi bakteri terhadap asam akan lebih baik. Cotter dan Hill (2003)  juga  menyebutkan  bahwa  beberapa  BAL  dapat menginduksi  respon  toleransi  asam  ( acid  tolerance  response ) terhadap  perlakuan  asam  yang  ringan.  Respon  tersebut  akan menginduksi  sistem  pH  homeostatis,  perlindungan  dan mekanisme perbaikan.
Gambar 1.   Perubahan  jumlah  BAL  isolat  ASI  setelah  inkubasi  pada media  yang  memiliki  pH  2  selama  5  jam  (angka-angka yang  diikuti  oleh  huruf superscript yang  sama menunjukkan  nilai  yang  tidak  berbeda  nyata  pada  uji Duncan (p>0,05))

## Ketahanan BAL isolat ASI terhadap garam empedu
Derajat  toleransi  terhadap  garam  empedu  merupakan karakteristik  yang  penting  bagi  BAL  karena  hal  tersebut berpengaruh  terhadap  aktivitasnya  dalam  saluran  pencernaan. Gambar  2  menunjukkan  perubahan  jumlah  sel  pada  semua bakteri  isolat  ASI  yang  ditumbuhkan  pada  media  yang mengandung garam empedu (0,5% oxgall). Dari 13 isolat yang diuji,  sebanyak  6  isolat  mengalami  penambahan  jumlah  sel setelah  inkubasi  selama  24  jam  dengan  kisaran  0,22-0,32  log cfu/ml.  Sebaliknya,  7  isolat  lainnya  mengalami  penurunan jumlah  sel  dengan  kisaran  0,01-0,22  log  cfu/ml. Leuconostoc R3, Pediococcus pentosaceus 1-A20,  dan Pediococcus pentosaceus 2-A16  merupakan  isolat  yang  mempunyai ketahanan  paling  tinggi  terhadap  garam  empedu  jika  di- bandingkan dengan isolat lainnya berdasarkan analisis statistik. Isolat-isolat ini mampu tumbuh setelah inkubasi 24 jam dengan penambahan jumlah sel masing-masing sebesar 0,26, 0,31, dan 0,32 log cfu/ml. Namun, penambahan jumlah sel tersebut tidak berbeda  nyata  (p>0,05)  dengan penambahan  jumlah  sel  isolat Pediococcus pentosaceus 2-B11, Pediococcus pentosaceus 2- B2, dan Pediococcus pentosaceus 2-B13.
-4,16 c -6,87 a -6,92 a -3,95 c -6,77 a -6,06 ab -5,15 bc -3,85 c -3,73 c -4,52 c -4,36 c -0,57 d -7,24 a -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 A6 A8 A16 A20 A22 A23 A38 B2 B11 B13 R1 R3 R9
Pe ru ba ha n Σ se l ( L og c fu /m l)
Kode Isolat
Gambar  2.  Perubahan  jumlah  BAL  isolat  ASI  setelah  inkubasi  pada media yang mengandung 0.5% garam empedu selama 24 jam (angka-angka yang diikuti oleh huruf superscript yang sama  menunjukkan  nilai  yang  tidak  berbeda  nyata  pada uji Duncan (p>0,05))
Cairan  empedu  merupakan  campuran  dari  asam  empedu, kolesterol,  asam  lemak,  fosfolipid,  pigmen  empedu,  dan sejumlah xenobiotik terdetoksifikasi. Kombinasi tersebut bersifat bakterisidal  bagi  mikroorganisme  komensal  dalam  tubuh manusia,  kecuali  bagi  beberapa  genus  penghuni  usus  yang tahan  terhadap  empedu  (Hill,  1995).  Perbedaan  ketahanan pada  isolat-isolat  yang  diuji  menunjukkan  bahwa  ketahanan terhadap garam empedu bersifat strain dependent . Kimoto-Nira et  al .  (2007)  melaporkan  bahwa  terdapat  hubungan  antara komposisi  asam  lemak  setiap  bakteri  dengan  kemampuannya untuk  dapat  bertahan  terhadap  garam  empedu.  Perbedaan komposisi asam lemak pada setiap bakteri inilah yang mungkin menjadi  penyebab  perbedaan  ketahanan  pada  bakteri-bakteri tersebut.

## Asimilasi kolesterol
Kemampuan  mengasimilasi  kolesterol  merupakan  salah satu karakteristik BAL yang dapat digunakan untuk melakukan seleksi  terhadap  kultur  yang  akan  dikembangkan  sebagai probiotik  penurun  kolesterol.  Berdasarkan  penelitian  yang dilakukan  Gilliland et  al .  (1985),  proses  asimilasi  hanya  terjadi jika kultur ditumbuhkan secara anaerobik dengan adanya garam empedu  pada  media  pertumbuhannya.  Jumlah  garam  empedu yang dibutuhkan agar kultur mampu mengambil kolesterol dari medium  pertumbuhan  setara  dengan  jumlah  garam  empedu yang secara normal terdapat di dalam usus.
Dalam  penelitian  ini,  media  yang  digunakan  mengandung 0,3%  garam  oxgall  sebagai  garam  empedu  dan  0,2%  natrium tioglikolat  untuk  menciptakan  kondisi  anaerob  (Kimoto et  al ., 2002),  sehingga  mendekati  kondisi  di  dalam  usus.  Hasil pengujian menunjukkan bahwa ketiga belas kultur bakteri asam laktat  isolat  ASI  yang  diuji  memiliki  kemampuan  untuk mengasimilasi kolesterol secara in vitro .
Jumlah  kolesterol  yang  diasimilasi  oleh  setiap  kultur berbeda-beda  dengan  kisaran  0,86-14,97  µg/ml,  seperti  yang terlihat  pada  Gambar  3. Pediococcus pentosaceus 1-A38, Pediococcus pentosaceus 2-B2, dan Pediococcus pentosaceus
2-A16  merupakan  isolat  dengan  aktivitas  asimilasi  terbesar, yaitu  masing-masing  14,97,  14,27,  dan  14,03  µg/ml.  Adapun isolat  yang  memiliki  aktivitas  asimilasi  terendah  yaitu Pediococcus pentosaceus 1-A23  dengan  aktivitas  asimilasi sebesar 0,86 µg/ml.
Gambar  3.  Jumlah  kolesterol  yang  diasimilasi  oleh  BAL  isolat  ASI setelah  inkubasi  20  jam  pada  suhu  37°C  (angka-angka yang  diikuti  oleh  huruf superscript yang  sama menunjukkan  nilai  yang  tidak  berbeda  nyata  pada  uji Duncan (p>0,05))
Dilihat dari jenis bakteri berdasarkan aktivitas metabolisme- nya,  baik  bakteri  homofermentatif  maupun  heterofermentatif keduanya  dapat  mengasimilasi  kolesterol.  Dari  hasil  penelitian ini  juga  terlihat  bahwa  keragaman  aktivitas  asimilasi  kolesterol tidak  berhubungan  dengan  perbedaan  spesies  tertentu  akan tetapi tergantung dari masing-masing strain ( strain dependent ). Perbedaan  dalam  pengikatan  kolesterol  tersebut  kemungkinan dipengaruhi  oleh  sifat  kimia  dan  struktural  dari  peptidoglikan dinding  sel  masing-masing  strain  yang  mengandung  asam amino  yang  mampu  mengikat  kolesterol  (Kimoto-Nira et  al., 2007).
Besarnya  aktivitas  asimilasi  pada  isolat-isolat  yang  diuji dalam penelitian ini tergolong rendah jika dibandingkan dengan aktivitas asimilasi pada bakteri yang telah diuji sebelumnya oleh beberapa  peneliti,  yaitu  berkisar  antara  8,2-42,68  µg/ml (Gilliland et  al. (1985);  Buck  dan  Gilliland  (1994);  Noh et  al . (1997);  Kusumawati  (2002);  Ngatirah et  al .  (2000);  Kimoto et al. (2002); Liong dan Shah (2005)).
Menurut  Kusumawati  (2002),  perbedaan  kemampuan mengasimilasi  kolesterol  mungkin  juga  disebabkan  oleh perbedaan sumber kolesterol yang digunakan dalam pengujian. Gilliland et  al .  (1985)  menggunakan  fraksi  serum pleuro- pneumonia  like  organism (PPLO)  sebagai  sumber  kolesterol, Buck dan Gilliland (1994) dan Noh et al . (1997) menggunakan misel  kolesterol-fosfatidilkolin,  sedangkan  Liong  dan  Shah (2005) menggunakan polioxyethanyl cholesteryl (kolesterol larut air)  sehingga  memiliki  kelarutan  yang  baik  dalam  media  yang digunakan untuk pengujian (MRSB).
Adapun sumber kolesterol yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  kolesterol  murni,  seperti  pada  penelitian  yang dilakukan  Ngatirah et  al .  (2000)  dan  Kusumawati  (2002). Menurut Kusumawati (2002), kolesterol murni tidak dapat larut dengan  baik  pada  media  MRSB  yang  merupakan  media berbasis  air,  karena  kelarutan  kolesterol  dalam  air  sangat
-0,04 ab -0,22 a 0,26 d 0,31 d -0,12 a -0,21 a -0,08 a 0,22 bcd 0,22 bcd 0,24 cd -0,08 a 0,32 d -0,01 abc -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 A6 A8 A16 A20 A22 A23 A38 B2 B11 B13 R1 R3 R9 Pe ru ba ha n Σ se l ( Lo g cf u/ m l) Kode Isolat 1,76 a 3,50 ab 14,03 d 9,55 bcd 9,92 bcd 0,86 a 14,97 d 14,27 d 11,92 cd 6,82 abc 5,31 ab 5,67 abc
2,26 a 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 A6 A8 A16 A20 A22 A23 A38 B2 B11 B13 R1 R3 R9 Ko le ste ro l y an g di as im ila si ( g/m l) Kode Isolat
rendah.  Hal  tersebut  mungkin  berpengaruh  terhadap  jumlah kolesterol yang dapat diasimilasi oleh bakteri.
Jika  dikaitkan  dengan  ketahanan  masing-masing  isolat terhadap garam empedu (Gambar 2), berdasarkan hasil analisis statistik  (uji  korelasi  Pearson)  tidak  ada  hubungan  yang signifikan  (p>0,05)  antara  kemampuan  asimilasi  kolesterol dengan ketahanan terhadap garam empedu (koefisien korelasi linier=0,466). Hal ini menunjukkan hubungan yang lemah antara ketahanan  terhadap  garam  empedu  dengan  kemampuan mengasimilasi kolesterol.
Isolat  yang  memiliki  ketahanan  tinggi  terhadap  garam empedu  belum  tentu  memiliki  kemampuan  yang  tinggi  dalam mengasimilasi  kolesterol.  Hasil  ini  sesuai  dengan  penelitian yang  dilakukan  oleh  Usman  dan  Hosono  (1999),  dimana  tidak ada  hubungan  yang  signifikan  antara  ketahanan  terhadap garam  empedu  pada Lactobacillus  gasseri dengan kemampuannya dalam mengikat kolesterol.
Pereira dan Gibson (2002) melaporkan bahwa L. johnsonii memiliki  ketahanan  yang  lebih  tinggi  terhadap  garam  empedu dibanding L.  casei  shirota ,  namun L.  johnsonii tidak  dapat mengasimilasi  kolesterol  sebanyak  yang  diasimilasi  oleh L. casei shirota.
Dalam  proses  asimilasi,  diduga  sebagian  kolesterol  yang diambil  oleh  sel  bakteri  bergabung  dengan  membran  seluler bakteri  tersebut.  Penelitian  yang  dilakukan  Noh et  al .  (1997) mengindikasikan bahwa kolesterol telah mengubah dinding sel atau membran seluler lactobacilli sehingga lebih tahan terhadap gangguan sonikasi. Kimoto et al. (2002) menemukan perbedaan pola distribusi asam lemak pada sel yang tumbuh pada media yang  mengandung  kolesterol  dan  yang  tidak  mengandung kolesterol. Diduga kolesterol bergabung ke dalam membran sel dan mengubah komposisi asam lemak dalam sel.

## Dekonjugasi Natrium Taurokolat
Dekonjugasi  garam  empedu  oleh  enzim bile  salt  hidrolase (BSH)  yang  dihasilkan  oleh  BAL  berhubungan  dengan penurunan  kolesterol  dalam  darah.  Chikai et  al. (1987). menerangkan  bahwa  dekonjugasi  asam  empedu  dapat membantu menurunkan kadar kolesterol pada manusia karena asam empedu terdekonjugasi dikeluarkan lebih cepat daripada bentuk  terkonjugasi.  Dalam  penelitian  ini  dilakukan  pengujian dekonjugasi natrium taurokolat sebagai sumber garam empedu terkonjugasi.  Natrium  taurokolat  merupakan  bentuk  utama garam empedu di dalam tubuh manusia dan karnivora (Uchida et al. 1977).
Hasil  uji  dekonjugasi  natrium  taurokolat  isolat  BAL menunjukkan  bahwa  isolat-isolat  BAL  memiliki  daya dekonjugasi  natrium  taurokolat  yang  relatif  lemah.  Hal  ini ditunjukkan dengan hasil pengukuran absorbansi pada panjang gelombang  660nm  yang  rendah  dan  tidak  nampak  berbeda dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).
Hasil  perhitungan  nilai  absorbansi  menunjukkan  bahwa isolat-isolat  BAL  asal  ASI  hanya  memiliki  kemampuan dekonjugasi  natrium  taurokolat  (membebaskan  asam  kolat) sebesar  0,06-0,25  µmol  asam  kolat/ml  kultur  (Gambar  4), dengan  kemampuan  terbesar  pada  isolat Pediococcus pentosaceus 1-A38 dan Pediococcus pentosaceus 1-A22.
Gambar  4.  Jumlah  asam  kolat  yang  dibebaskan  oleh  BAL  isolat  ASI setelah  inkubasi  24  jam  pada  suhu  37°C  (angka-angka yang  diikuti  oleh  huruf superscript yang  sama menunjukkan  nilai  yang  tidak  berbeda  nyata  pada  uji Duncan (p>0,05))
Hasil  pengujian  tersebut  di  atas  menunjukkan  bahwa kemampuan  isolat  BAL  asal  ASI  tergolong  lemah.  Usman  dan Hosono  (1999)  meneliti  kemampuan  dekonjugasi  natrium taurokolat  28  isolat L.  gasserii ,  hasilnya  menunjukkan  bahwa isolat-isolat  tersebut  dapat  mendekonjugasi  natrium  taurokolat dan  membebaskan  asam  kolat  dalam  kisaran  1,24-1,94 µmol/ml.  Pato et  al. (2005)  meneliti  kemampuan  dekonjugasi asam  taurokolat  oleh  isolat  BAL  yang  berasal  dari  dadih. Ditemukan  bahwa  enam  isolat  mampu  mendekonjugasi  asam taurokolat  dengan  membebaskan  asam  kolat,  aktivitas dekonjugasi berkisar antara 0,21  mol/ml (oleh L. lactis subsp. lactis I-2775) sampai dengan 0,45  mol/ml (oleh L. lactis subsp. lactis K-5).
Gilliland  dan  Speck  (1977)  mengukur  daya  dekonjugasi beberapa  isolat Lactobacillus secara  kualitatif  terhadap  dua jenis  garam  empedu  yaitu  taurokolat  dan  glikokolat,  hasil pengujian  tersebut  menunjukan  bahwa  19  dari  36  isolat  dapat mendekonjugasi  glikokolat,  sedangkan  11  dari  36  isolat diketahui mampu mendekonjugasi taurokolat.
Mandal et  al .  (2009)  meneliti  aktivitas  dekonjugasi  garam empedu  dan  potensi  hipokolesterolemik  isolat  BAL  dari  jenis Pediococcus  acidilactici .  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa Pediococcus  acidilactici LAB  5  memiliki  aktivitas  dekonjugasi garam empedu. Pemberian sinbiotik berupa P. acidilactici LAB 5 dan  sorbitol  selama  1  bulan  mampu  menurunkan  kolesterol plasma  darah  mencit  ( swiss  albino  mice )  (176,34 g/ml) dibanding dengan kontrol (208,76 g/ml).
Kemampuan  dekonjugasi  garam  empedu  diduga  menjadi faktor  yang  memungkinkan  suatu  isolat  dapat  memiliki ketahanan  terhadap  garam  empedu.  Proses  dekonjugasi mungkin menurunkan tingkat toksisitas dari garam empedu ter- konjugasi terhadap bakteri (De Smet et al ., 1995). Akan tetapi pada  penelitian  ini  ditemukan  bahwa  tidak  terdapat  hubungan yang  signifikan  antara  ketahanan  suatu  isolat  terhadap  garam empedu  dengan  kemampuannya  mendekonjugasi  garam empedu.
Koefisien  korelasi  linear  antara  kemampuan  dekonjugasi natrium taurokolat dengan ketahanan terhadap garam empedu
0,19 cde 0,17 bcde
0,14 abc 0,20 cde 0,22 de 0,14 abcd 0,25 e 0,11 ab 0,09 a 0,18 bcde 0,06 a 0, 11 ab 0,08 a 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 A6 A8 A16 A20 A22 A23 A38 B2 B11 B13 R1 R3 R9 As am k ola t d ib eb as ka n (m ol/ m l) Kode Isolat
adalah  sebesar  sebesar  -0,205.  Demikian  juga,  tidak  ada korelasi  antara  kemampuan  dekonjugasi  natrium  taurokolat dengan  ketahanan  terhadap  pH  rendah  (koefisien  korelasi linear=-0,190).  Hal  ini  menunjukkan  hubungan  yang  lemah antara  ketahanan  terhadap  pH  dan  garam  empedu  dengan kemampuan  dekonjugasi  natrium  taurokolat.  Nilai  koefisien korelasi  linier  yang  negatif  menunjukkan  kecenderungan hubungan yang berbanding terbalik antara ketahanan terhadap pH rendah dan garam empedu.

## KESIMPULAN
Sebanyak 13 isolat BAL asal ASI memiliki ketahanan yang tinggi terhadap garam empedu, namun hanya satu isolat yang memiliki  ketahanan  tinggi  terhadap  pH  rendah,  yaitu Leuconostoc R3 . Hasil pengujian menunjukkan bahwa 13 isolat yang  diujikan  memiliki  kemampuan  untuk  mengasimilasi kolesterol  yaitu  pada  kisaran  0,86-14,97 g/ml. Pediococcus pentosaceus 1-A38, Pediococcus pentosaceus 2-B2  dan Pediococcus  pentosaceus 2-A16  memiliki  aktivitas  asimilasi kolesterol terbesar.
Isolat  BAL  asal  ASI  memiliki  daya  dekonjugasi  natrium taurokolat  yang  lemah,  jumlah  asam  kolat  yang  dibebaskan berkisar  antara  0,06-0,25  µmol/ml,  dengan  kemampuan mendekonjugasi terbesar pada isolat Pediococcus pentosaceus 1-A38 dan Pediococcus pentosaceus 1-A22. Tidak ada korelasi antara  ketahanan  terhadap  garam  empedu  dan  pH  dengan kemampuan  asimilasi  kolesterol  atau  dekonjugasi  natrium taurokolat.
Berdasarkan  hasil  tersebut  di  atas, Pediococcus pentosaceus 1-A38  merupakan  isolat  yang  paling  potensial untuk digunakan pada pengembangan produk probiotik dengan sifat  fungsional  spesifik  untuk  menurunkan  kolesterol  dengan mekanisme asimilasi dan dekonyugasi garam empedu. Namun demikian kajian dalam penelitian ini terbatas pada pengujian in vitro ,  sehingga  masih  diperlukan  kajian  lebih  lanjut  (kajian in vivo )  sebagai  dasar  aplikasi  isolat  ini  pada  pengembangan produk probiotik.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis menyampaikan terimakasih kepada pihak Direktorat Jenderal  Pendidikan  Tinggi  Departemen  Pendidikan  Nasional yang  telah  mendanai  penelitian  ini  melalui  program  Hibah Kompetensi Tahun Anggaran 2010.

## DAFTAR PUSTAKA
Buck  ML,  Gilliland  SE.  1994.  Comparison  of  freshly  isolated strains  of Lactobacillus  acidophilus of  human  intestinal origin  for  ability  to  assimilate  cholesterol  during  growth.  J Dairy Sci 77:2925–2933.
Chikai T, Nakao H, Uchida K. 1987. Deconjugation of bile acids by  human  intestinal  bacteria  implanted  in  germ  free  rats. Lipids 22:669-671.
Collado  MC.  2009.  Role  of  probiotics  in  health  and  diseases. Dalam  Lee,  YK  dan  Salminen,  S  (Eds.).  Handbook  of Probiotics  and  Prebiotics.  John  Wiley  and  Sons,  Inc., Hoboken, New Jersey.
Cotter  PD,  Hill  C.  2003.  Surviving  the  acid  test:  responses  of Gram-positive  bacteria  to  low  pH.  Microbiology  and Molecular Biology Reviews 67(3):429-453.
De Smet I, Hoorde LV, Woestyne MV, Christiaens H, Verstraete W.  1995.  Significance  of  bile  salt  hydrolytic  activities  of lactobacilli. J App Bacteriol 79:292–301.
FAO/WHO  [Food  and  Agriculture  Organization/World  Health Organization].  2002.  Guidelines  for  the  evaluation  of probiotics  in  foods.  Report  of  a  Joint  FAO/WHO  Working Group, London, Ontario, Canada, April 30 and May 1 2002.
Gilliland  SE,  Speck  ML.  1977.  Deconjugation  of  bile  acids  by intestinal Lactobacilli .  Applied  and  Environmental Microbiology 33(1):15-18.
Gilliland  SE,  Nelson  CR,  Maxwell  C.  1985.  Assimilation  of cholesterol  by Lactobacillus  acidophilus .  Applied  and Environmental Microbiology 49(2):377-381.
Gropper SS, Smith JL, Groff JR. 2009. Advanced Nutrition and Human Metabolism . Wadsworth, USA.
Hill  MJ.  1995.  Role  of  Gut  Bacteria  in  Human  Toxicology  and Pharmacology. Taylor and Francis, New York.
Hofmann AF. 1984. Chemistry and enterohepatic circulation of bile acids. Hepatology 4:4S–14S.
Kimoto H, Ohmomo  S, Okamoto T. 2002. Cholesterol removal from media by Lactococci . J Dairy Sci 85:3182–3188.
Kimoto-Nira H, Mizumachi K, Nomura M, Kobayashi M, Fujita Y, Okamoto  T.  2007. Lactococcus  sp .  as  potential  probiotic lactic  acid  bacteria.  Japan  Agricultural  Research  Quarterly 41:181–189.
Kusumawati  N.  2002.  Seleksi  Bakteri  Asam  Laktat  Indigenus sebagai Genus Probiotik Dengan Kemampuan
Mempertahankan  Keseimbangan  Mikroflora  Feses  dan Mereduksi  Kolesterol  Serum  Darah  Tikus.  Tesis.  Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.
Liong  MT,  Shah  NP.  2005.  Acid  and  bile  tolerance  and cholesterol removal ability of Lactobacilli strains. J Dairy Sci 88:55-66.
Lye HS,  Ali GRR, Liong MT. 2010. Mechanisms of cholesterol removal  by  lactobacilli  under  conditions  that  mimic  the human gastrointestinal tract. Int Dairy J 20:169-175.
Mandal  V,  Sen  SK,  Mandal  NC.  2009.  Effect  of  prebiotics  on bacteriocin  production  and  cholesterol  lowering  activity  of Pediococcus acidilactici LAB 5. World J Microbiol Biotechnol 25(10):1837-1847.
Ngatirah,  Harmayani  E,  Rahayu  ES,  Tyas  U.  2000.  Seleksi bakteri  asam  laktat  agensia  probiotik  yang  berpotensi menurunkan kolesterol. Seminar Nasional Industri  Pangan. PATPI. Surabaya, 10-11 Oktober 2000.
Noh DO, Kim SH, Gilliland SE.  1997. Incorporation cholesterol into  the  cellular  membrane  of Lactobacillus  acidophilus ATCC 43121. J Dairy Sci 80:3107-3113.
Nuraida L, Susanti, Hartanti AW. 2007. Lactic acid bacteria and Bifidobacteria  profile  of  breast  milk  and  their  potency  as probiotics.  10 th ASEAN  Food  Conference.  Food  for Mankind-Contribution  of  Science  and  Technology.  21-23 August. Kuala Lumpur, Malaysia.
Pato  U,  Ali  M,  Parlindungan  AK.  2005.  Taurocholate deconjugation and  cholesterol binding by indigenous dadih lactic acid bacteria. Hayati 12(3):103-107. Pereira  DI,  Gibson  GR.  2002.  Effects  of  consumption  of probiotics  and  prebiotics  on  serum  lipid  levels  in  humans. Crit Rev Biochem Mol Biol 37(4):259-81.
Uchida  K,  Okuno  I,  Takse  H,  Nomura  Y,  Kadowaki  M.  1977. Distribution of bile acids in rats. Lipids 13:42-48.
Usman,  Hosono  A.  1999.  Bile  tolerance,  taurocholate deconjugation,  and  binding  of  cholesterol  by Lactobacillus gasseri Strains. J Dairy Sci 82: 243-248.
Wildman REC, Medeiros DM. 2000. Advanced Human Nutrition. CRC Press LLC., Boca Raton, New Jersey.