## Original Article
Received December 2023 / Revised January 2024 / Accepted January 2024

## Spizaetus: Jurnal Biologi dan Pendidikan Biologi
p-ISSN: 2716-151X
e-ISSN: 2722-869X
Potensi  Bakteri  Lipolitik  sebagai  Biofertilizer  Secara In  Vitro dari Limbah Cair Pabrik Kelapa Sawit

## Potential of Lipolytic Bacteria as an In  Vitro  Biofertilizer from Palm Oil Mill Liquid Waste

## Widya Assura Putri*, Ulfayani Mayasari, Rasyidah
Program Studi Biologi, UIN Sumatera Utara, Deli Serdang, 20353, Indonesia *Corresponding author: widyaassura555@gmail.com
Abstrak. Limbah  cair  pabrik  kelapa  sawit  merupakan  salah  satu  jenis  limbah  organik  yang  dapat digunakan  sebagai  pupuk  karena  mengandung  unsur  hara.  Adapun  tujuan  penelitian  ini  yaitu  untuk mengetahui potensi bakteri lipolitik sebagai biofertilizer secara In vitro dari limbah cair pabrik kelapa sawit.  Metode  penelitian  ini  menggunakan  metode  kualitatif  dan  kuantitatif  yang  terdiri  dari  isolasi bakteri lipolitik, karakteristik bakteri lipolitik yaitu pengamatan makroskopi bakteri pada media lipid, uji aktivitas  kuantitatif  lipolitik,  uji  potensi  bakteri  lipolitik  sebagai  biofertilizer  meliputi  uji  penambat nitrogen,  kemampuan  melarutkan  fosfat  dan  kalium,  serta  pengamatan  fisiologi  bakteri  meliputi pewarnaan gram dan uji biokimia yang terdiri atas uji katalase, uji methyl red, ujimotilitas, uji indol dan uji  Triple  Sugar  Iron  Agar  (TSIA).  Hasil  isolasi  bakteri  lipolitik  menunjukkan  bahwa  isolat  BLCP  02, BLCP  04,  BLCP  07,  BLCP  08  dan  BLCP  09  mempunyai  kemampuan  lipolitik  terbesar  berdasarkan indeks zona bening yang dihasilkan yaitu BLCP 02 memiliki IL sebesar 0,56 mm, BLCP 04 memiliki IL sebesar 0,75 mm, BLCP 07 memiliki IL 0,63 mm, BLCP 08 memiliki IL sebesar 0,73 mm dan BLCP 09 memiliki IL sebesar 0,68. Uji potensi sebagai agen biofertilizer juga didapatkan pada isolat BLCP 02, BLCP 04, BLCP 07, BLCP 08 dan BLCP 09 karena kelima isolat tersebut memiliki kemampuan lipolitik, pemfiksasi  nitrogen,  dan  kemampuan  dalam  melarutkan  fosfat  dan  kalium.  Hasil  dari  identifikasi bakteri  lipolitik  terdapat  5  genus  bakteri  yang  dinyatakan  sebagai  genus  dari  bakteri  Lipolitik  yaitu BLCP 02 Genus Micrococcus, BLCP 04 Genus Paracoccus, BLCP 07 Genus Actinomycetes, BLCP 08 Genus  Bacillus  dan  BLCP  09  Genus  Lysinibasillus.  Penelitian  dapat  dijadikan  referensi  untuk  ke depannya  kepada  masyarakat  agar  dapat  memanfaatkan  bakteri  lipolitik  sebagai  biofertilisasi  dari limbah cair kelapa sawit.
Kata Kunci : Biofertilizer, Bakteri Lipolitik, Genus, Limbah Cair Kelapa Sawit
DOI: https://dx.doi.org/10.55241/spibio.v5i2.367

## 1.  Pendahuluan
Kelapa  sawit  merupakan  salah  satu tanaman  perkebunan  penting  yang mempunyai  peranan  penting  baik  di sektor pertanian secara umum maupun  di  sektor  perkebunan  pada khususnya.  Nilai  ekonomi  per  hektar kelapa sawit merupakan yang tertinggi
di  antara  semua  tanaman  penghasil minyak  atau  lemak.  Seiring  dengan perkembangan wilayah tersebut, output juga mengalami tingkat pertumbuhan  tahunan  sebesar  9,4%. Dari  tahun  2001  hingga  2004,  luas areal  dan  produksi  kelapa  sawit
mengalami tingkat pertumbuhan tahunan
masing-masing sebesar 3,97%  dan  7,25%,  sedangkan  ekspor mengalami
peningkatan tahunan sebesar 13,05%. Kelapa sawit merupakan  komoditas  andalan  di Indonesia
yang mengalami perkembangan signifikan[1].
Palm  Oil  Mill  Effluent (POME) merupakan  limbah  organik  yang dihasilkan  pada  saat  pengolahan  TBS jadi CPO di Pabrik Kelapa Sawit (PKS). Menurut Ermadani dan Ali[2], pengolahan  setiap  ton  TBS  bisa hasilkan  limbah  cair  sebesar  0,50 hingga  0,75  ton.  POME  merupakan limbah  cair  yang  berwarna  coklat  dan mengandung  padatan  terlarut  dan tersuspensi  berupa  koloid  dan  sisa minyak.  Ia  memiliki  konsentrasi  COD dan BOD, yakni berukuran 68.000ppm dan  27.000ppm.  POME  bersifat  asam, dengan  kisaran  pH  3,5  hingga  4. POME terdiri dari sekitar 95% air, 4-5% bahan  terlarut  dan  tersuspensi  seperti selulosa, protein, dan lemak, serta 0,5- 1%  residu  minyak,  terutama  di  bentuk emulsi.  Kadar  suspensi  padat  pada limbah cair industri kelapa sawit sangat tinggi,  berkisar  antara  1.330  hingga 50.700  mg/L.  Selain  itu,  limbah tersebut  mengandung  tembaga  (Cu) dengan  konsentrasi  0,89  ppm,  besi (Fe)  sebesar  46,5  ppm,  seng  (Zn) sebesar  2,3  ppm,  dan  amoniak sebesar 35 ppm.
Pemanfaatan limbah cair pabrik kelapa sawit  sebagai  pupuk  layak  dilakukan karena  komposisi  nutrisinya  yang meliputi  N,  P,  K,  dan  Mg  [3].  Pupuk hayati adalah pilihan ramah lingkungan yang dapat digunakan untuk mendorong pertumbuhan selama proses  pemupukan.  Mikroorganisme digunakan sebagai agen bioaktif dalam pupuk  hayati  dan  memiliki  fungsi penting  dalam  proses  pembuahan  [4].
Mikroorganisme memfasilitasi penguraian  komponen  tanah  menjadi bahan  kimia  yang  dapat  diserap  oleh akar tanaman [5].
Bakteri  lipolitik  adalah  sejenis  bakteri yang  menyintesis  enzim  lipase,  yang terlibat  dalam  hidrolisis  lipid  menjadi asam  lemak  dan  gliserol[6].  Minyak atau  lemak  merupakan  zat  kimia  non polar  yang  terdiri  dari  senyawa  ester triasilgliserol.  Limbah  pabrik  kelapa sawit mengandung minyak atau lemak. Biasanya,  keberadaan  minyak  atau lemak  di  permukaan  air  dapat menghambat penetrasi  sinar matahari, sehingga  menyebabkan  lingkungan kaya  oksigen,  sehingga  menghambat aktivitas  biologis  di  dalam  air.  Enzim lipase  yang  terdapat  pada  bakteri lipolitik memfasilitasi penguraian cepat zat  organik  yaitu  minyak  dengan  cara menghidrolisis ikatan ester triasilgliserol  menjadi  asam  lemak  dan gliserol yang larut dalam air[7].
Penelusuran  Khairani  dan  Kartika[8] menghasilkan  10  isolat  bakteri  lipolitik dari 3 sampel limbah cair kelapa sawit selama  isolasi  bakteri.  Isolat  dengan kode  BL1  mempunyai  indeks  lipolitik paling  besar  di  antara  10  jenisnya, yaitu  dengan  nilai  0,48  mm  dan  zona bening  8,6.  Isolat  dengan  indeks terendah adalah BL5 yang mempunyai diameter  0,14  mm  dan  diameter  zona bening 8,7.
Menurut penelitian yang dilakukan oleh Widyastuti dkk[6]tentang potensi mikroorganisme  yang  berasal  dari limbah cair pabrik kelapa sawit sebagai pupuk  hayati,  ditemukan  bahwa mikroorganisme  yang  berasal  dari limbah  itu  sendiri  lebih  efisien dibandingkan  dengan  mikroorganisme yang  diperoleh  dari  sumber  di  luar  air limbah.  Biodegradasi  limbah  cair difasilitasi  oleh  bakteri  tertentu,  antara
lain genus Micrococcus, genus Bacillus,  genus  Pseudomonas,  dan spesies Staphylococcusaureus . Bakteri mendapatkan  makanan  dengan  cara menguraikan  zat  organik  melalui serangkaian  peristiwa  metabolisme yang rumit[6].
Peneliti ini bertujuan untuk mengetahui potensi  bakteri  lipolitik  sebagai  pupuk hayati in vitro yang berasal dari limbah pabrik  kelapa  sawit  cair.  Tujuannya adalah untuk mengumpulkan informasi, mengisolasi bakteri, dan mengidentifikasi  jenis  bakteri  lipolitik spesifik  yang  ada  dalam  limbah.

## 2.  Metode

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan Juni 2023, dan penelitian ini dilakukan di  Laboratorium  Mikrobiologi  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara.

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  yaitu  botol  sampel,  erlenmeyer, pipet  tetes,  tabung  reaksi,  rak  tabung, cawan petri, shaker, vortex, autoclave, oven, laminar  air  flow ,  jarum  ose, cawan petri, spatula, kulkas, timbangan analitik,  labu  ukur,  magnetik stirrer , bunsen,  kapas,  gelas  objek,  pipet mikro, inkubator, mikroskop, spektrofotometer, hot  plate ,  kertas label,  kertas  cakram,  jangka  sorong, dan  spidol,  kamera.  Bahan  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah Palm  Oil  Mill  Effluent  (POME)  kelapa sawit, Nutrient Agar (NA), NutrientBrooth  (NB),  minyak  zaitun, tween  80,  metil  merah,  Spirtus,  NaCl fisiologis  (NaCl  0,85%),  alkohol  70%, media  nitrogen  free  mineral,  media Pikovskaya, media alexandrove, gentian  violet,  iodine,  fucshin,  minyak imersi,  media  SIM  (SulfidIndolMotility), media  TSIA  (Triple  Sugar  Iron  Agar), reagen  Kovac’s,  media  MR -VP  dan Aquadest .

## Rancangan Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  teknik eksperimen  laboratorium  kualitatif  dan kuantitatif, yang disusun dan diterapkan secara sistematis.

## Prosedur
1. Pengambilan  Sampel Palm  Oil  Mill Effluent (POME) Kelapa Sawit Pengambilan sampel dilakukan dengan menggunakan  botol  steril.  Teknik pengumpulan  limbah  cair  dilakukan dengan  menempatkan  ujung  botol yang  telah  disterilkan  ke  dalam peralatan  sampel  limbah  cair.  Botol ditutup setelah terisi penuh. Selanjutnya  botol  sampel  di- warp dan dimasukkan kedalam coolbox .
2. Isolasi Bakteri Lipolitik Sampel limbah cair kelapa sawit diencerkan  sebanyak  10  ml  kemudian dicampur  dengan  90  ml  natrium klorida  (NaCl)  dalam  labu  Erlenmeyer. Campuran di homogenisasi menggunakan pusaran untuk menghasilkan  pengenceran  bertingkat mulai dari 10 ⁻ ¹ hingga 10 ⁻⁷ . Selanjutnya,  1  ml  suspensi  diekstraksi dari  seri  pengenceran  akhir.  Medium Nutrient  Agar  (NA),  bersama  dengan minyak zaitun dan Tween-80, diperkenalkan  menggunakan  teknik spreadplate .  Campuran  kemudian diinkubasi  selama  total  48  jam  pada suhu 37 ⁰ C [8].
3. Uji Kuantitatif Lipolitik
Bakteri yang telah dimurnikan diinkubasi dalam satu siklus selama 24 jam  dalam  5  ml  media  cair  yang mengandung  1%  NaCl,  1%  ekstrak ragi,  2%  pepton,  1%  Tween-80,  dan 2%  minyak  zaitun  steril.  Selanjutnya dipindahkan  ke  media  padat  yang terdapat  dalam  cawan  petri.  Media padat  terdiri  dari  bahan  berikut  per liter:  10  g  pepton,  5  g  NaCl,  0,1  g CaCl.2H2O,  20  g  Agar,  2,5%  Tween- 80,  dan  5%  minyak  zaitun  steril. Konsentrasi  metil merah  0,01% dimasukkan  ke  dalam  medium.  Plate diinkubasi selama 168 jam (7 x 24 jam) dan pada hari ke 7 ditentukan diameter zona bening dengan membagi seluruh diameter  melintang  zona  bening dengan diameter koloni bakteri[9]
4. Uji Kemampuan Penambat Nitrogen Bakteri  kemudian  diperiksa  kapasitas pengikatan nitrogennya dengan memberikan media agar mineral bebas nitrogen  yang  dilengkapi  dengan brontomiul  biru  (BTB)  dan  glukosa 0,7%.  Peralihan  warna  medium  dari biru ke kuning menandakan kemampuan  isolat  dalam  melakukan fiksasi nitrogen[10].
5. Uji Kemampuan Pelarut Kalium Isolat  bakteri  dimasukkan  ke  dalam kaldu  nutrisi  (NB)  volume  10  ml  dan diinkubasi  selama  24  jam,  dan ditempatkan pada media padat
Aleksandrov Pengujian yang dilakukan antara  lain  menghitung  rasio  zona bening dengan membandingkan diameter zona bening dengan diameter koloni pada suhu ruangan[11].
6. Uji Kemampuan Pelarut Fosfat
Isolat murni yang diperoleh dari media NA  dikultur  dalam  media  Pikovskaya agar dengan teknik spot dan dilakukan inkubasi  pada  suhu  30°C  selama  48 jam.  Selanjutnya  dilakukan  penilaian indeks zona bening[12].

## 7. Pewarnaan Gram
Pewarnaan  gram  dilakukan  untuk mengetahui  apakah  bakteri  tersebut gram positif atau gram negatif [13].

## 8. Uji Katalase
Uji  ini  digunakan  untuk  memastikan kemampuan bakteri dalam menyintesis enzim katalase[14].
9. Uji Methyl Red (MR)
Uji  metil  merah  (MR)  dilakukan  pada media  MR-VP.  Hasil  yang  baik ditentukan  oleh  adanya  perubahan warna  pada  media  yaitu  menjadi merah yang menandakan terbentuknya asam. Sebaliknya, hasil negatif ditunjukkan  dengan  tidak  adanya perubahan warna pada medium[15].

## 10. Uji Motilitas
Uji ini akan memperlihatkan nilai positif yang  ditunjukkan  dengan  melebarnya bekas  tusukan  pada  media  yang menandakan  bahwa  bakteri  tersebut bersifat  motil.  Dan  hasil  negatif  (non motil)  jika  hanya  terdapat  garis sepanjang tusukan saja[16].
11. Uji Indol
Tujuan  uji  indol  adalah  untuk mengetahui
keberadaan enzim triptofanase pada bakteri, yang memungkinkan  bakteri  mengubah
asam  amino  triptofan  menjadi  indol melalui  oksidasi.  Hasil  yang  baik ditunjukkan dengan terbentuknya lapisan  merah  pada  permukaan kultur[17].

## 12. Uji TSIA
Pergeseran  warna  hitam menunjukkan adanya  Hidrogen  Sulfida  (H 2 S),  dan peningkatan warna media menunjukkan  kemampuan bakteri dalam menghasilkan gas[17]

## Analisis Data
Analisis  data  dilaksanakan  dengan mengamati  morfologi  koloni  bakteri lipolitik,  mengukur  diameter  zona bening  kuantitatif  lipolitik,  uji  potensi bakteri  lipolitik  sebagai  biofertilizer, analisis  deskriptif  pewarnaan  Gram dan  uji  biokimia  dilakukan,  dan hasilnya  disajikan  dalam  tabel  dan gambar. Hasil ini kemudian dibandingkan  dan  dicocokkan  dengan informasi  yang  diberikan  dalam Bergey's  Manual  of  Determinative Bacteriology untuk menentukan genus bakteri tersebut[18].

## 3.  Hasil dan Pembahasan
Isolasi Bakteri Lipolitik pada Limbah Cair Pabrik Kelapa Sawit
Berdasarkan  penelitian  yang telah  dilakukan,  telah  terbukti  bahwa 12 isolat bakteri memiliki potensi untuk mendegradasi lipid yang diperoleh dari pabrik  kelapa  sawit  yang  berlokasi  di Kecamatan  Galang,  Kabupaten  Deli Serdang, Sumatera Utara. Pengamatan  ini  dilakukan  dengan melakukan  empat  kali  ulangan  pada media  lipid  dengan  pengenceran  10- ⁶ dan  10- ⁷ .  Pengamatan  dilaksanakan sesudah masa inkubasi selama 48 jam.

## Karakterisasi Morfologi Bakteri
Karakterisasi  morfologi  bakteri dapat dideteksi pada tingkat makroskopis dan mikroskopis. Sebanyak dua belas isolat bakteri yang berbeda  yang  menunjukkan  aktivitas
lipolitik diidentifikasi. Selanjutnya, karakteristik morfologi termasuk bentuk  koloni,  tepi  koloni,  permukaan koloni, dan warna koloni dipelajari. Ke- 12  isolat  bakteri  telah  diperoleh dengan  proses  mempelajari  ciri-ciri masing-masing.
Tabel  1  menjelaskan  bahwa setiap  isolat  memiliki  bentuk  koloni, tepi  koloni,  permukaan  koloni,  dan warna  koloni  yang  berbeda-beda. Menurut  Putri  dkk,  [19],  pengamatan makroskopis  dapat  dilakukan  dengan menggunakan media lipid pada cawan petri untuk memeriksa dan
menganalisis bentuk morfologi. Ochman  dkk.  [20]  menyatakan  bahwa ciri-ciri  bakteri  tidak  tetap,  sehingga memungkinkan  bakteri  yang  sama menunjukkan  bentuk  morfologi  yang bervariasi.
Tabel 1. Karakteristik Morfologi Isolat Bakteri Secara Makroskopik
Isolat Bentuk Margin Elevasi Warna BLCP 01 Circular Entire Convex Putih Kekuningan BLCP 02 Irregular Undulate Convex Putih Kekuningan BLCP 03 Irregular Curled Flat Putih BLCP 04 Rhizoid Rhizoid Flat Putih Kekuningan
BLCP 05 Irregular Lobate Convex Putih Kekuningan BLCP 06 Irregular Undulate Convex Putih Kekuningan BLCP 07 Irregular Undulate Convex Putih BLCP 08 Irregular Undulate Flat Putih BLCP 09 Irregular Curled Flat Putih BLCP 10 Irregular Lobate Convex Putih BLCP 11 Circular Entire Convex Putih Kekuningan BLCP 12 Irregular Undulate Flat Putih Kekuningan
Keterangan : BLCP (Bakteri Limbah Cair Pupuk)

## Uji Kuantitatif Aktivitas Lipolitik
Indeks  lipolitik  koloni  yang mampu  menghasilkan  zona  bening ditentukan  dengan  membandingkan diameter zona bening dengan diameter koloni bakteri[21] Keberadaan  enzim  lipase  pada  12 isolat  telah  terbukti,  yang  ditunjukkan dengan  terbentuknya  zona  bening yang mengelilingi koloni bakteri selama
pertumbuhan.  Bakteri  lipolitik  memiliki kemampuan untuk mengkatalisis hidrolisis  lipid  yang  ada  dalam  media lemak  NA  +  yang  dimodifikasi, menghasilkan asam lemak dan gliserol. Menurut  Khairani[8],  isolat  dapat dikatakan bersifat lipolitik jika menunjukkan terbentuknya zona bening  yang  berbeda  di  sekeliling koloni lipolitik.
Tabel 2. Hasil Pengujian dan Pengukuran Zona Bening Bakteri Lipolitik Sampel Limbah Cair Kelapa Sawit Secara Kuantitatif Isolat Diameter zona bening Diameter koloni Indeks Lipolitik BLCP 01 6,3 mm 13,7 mm 0,45 mm BLCP 02 6,2 mm 10,9 mm 0,56 mm BLCP 03 6,2 mm 9,7 mm 0,02 mm BLCP 04 6,3 mm 8,3 mm 0,75 mm BLCP 05 6,7 mm 14,9 mm 0,44 mm BLCP 06 7,2 mm 21,1 mm 0,34 mm BLCP 07 6.3 mm 9,9 mm 0,63 mm BLCP 08 6,5 mm 8,8 mm 0,73 mm BLCP 09 7,3 mm 10,7 mm 0,68 mm BLCP 10 8,7 mm 33,0 mm 0,26 mm BLCP 11 2,3 mm 10,1 mm 0,22 mm BLCP 12 1,3 mm 9,7 mm 0,13 mm
Keterangan : BLCP (Bakteri Limbah Cair Pupuk)
Berdasarkan  Tabel  2.  Isolat BLCP  02,  BLCP  04,  BLCP  07,  BLCP 08, dan BLCP 09 menunjukkan indeks lipolitik  yang  paling  besar,  isolat dengan  kode  BLCP  04  menunjukkan indeks lipolitik tertinggi, yaitu 0,75 mm. Isolat  dengan  indeks  lipolitik  yang besar  akan  di  uji  coba  sebagai  agen pupuk  hayati.  Menurut  Chairunnisa[7] pertumbuhan  bakteri  di  dalam  daerah zona bening menandakan kemampuan
bakteri dalam mendegradasi
lipid/lemak. Keberadaan enzim lipase memainkan  peran  penting  dalam degradasi  minyak  oleh  bakteri  pada limbah  cair  kelapa  sawit.  Enzim  akan mengalami  sekresi  dan  mengkatalisis hidrolisis  trigliserida,  menghasilkan pembentukan  gliserol  dan  tiga  asam lemak  rantai  panjang.  Koloni  bakteri memiliki kemampuan untuk
menyintesis enzim lipase yang
memfasilitasi  hidrolisis  minyak  zaitun. Aktivitas  enzimatik  ini  menghasilkan pembentukan  daerah  transparan  yang berbeda  di  sekitar  pertumbuhan bakteri. Bakteri lipolitik akan menunjukkan  pembentukan  daerah transparan  yang  berbeda  di  sekitar koloni  bakteri.  Daerah  ini  terbentuk karena kapasitas isolat untuk mengkatalisis hidrolisis tween-80, menghasilkan asam lemak dan sekresi enzim  lipase.  pengamatan  endapan putih  buram  yang  terdiri  dari  asam lemak  dan  ion  kalsium  terlihat  jelas  di sekitar  koloni  bakteri[8].  Menurut Khairani[8] zona bening dapat dipengaruhi  oleh  faktor  media  dan lingkungan.
Diameter  koloni  lebih  besar dibandingkan  dengan  diameter  zona
bening.  Ada  beberapa  faktor  yang mempengaruhi  diameter  zona  hambat pertumbuhan  bakteri  yaitu  kekeruhan suspensi bakteri. Jika suspensi kurang keruh  maka  diameter  zona  hambat akan  lebih  besar,  dan  sebaliknya  jika suspensi  lebih  keruh  diameter  zona hambat akan semakin kecil.
Temperatur  inkubasi  juga  dapat menjadi  faktor  yang  mempengaruhi diameter  zona  hambat  pertumbuhan bakteri. Untuk memperoleh pertumbuhan  yang  optimal,  inkubasi dilakukan  pada  suhu  35 ° C.  Tebalnya media  agar-agar  juga  dapat  menjadi salah  satu  faktor  yang  mempengaruhi diameter  zona  hambat  pertumbuhan bakteri[22].
Gambar 1 . Zona bening pada media padat lipolitik Panah Merah (Diameter Zona Bening); Panah Kuning (Diameter Koloni)

## Uji Kemampuan Fiksasi Nitrogen
Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  kelima  isolat  bakteri  tersebut menunjukkan kemampuan untuk melakukan  fiksasi  nitrogen.  Kelima strain bakteri  tersebut  ditetapkan sebagai BLCP 02, BLCP 04, BLCP 07, BLCP  08,  dan  BLCP  09,  secara berurutan.  Kapasitas  bakteri  ini  dalam melakukan  fiksasi  nitrogen  dapat diamati  melalui  kemampuannya  dalam menginduksi  perubahan  warna  pada media,  yaitu  dari  warna  biru  menjadi warna  kuning  (Gambar  2).  Menurut
Asrul  dkk.[10],  bakteri  penambat nitrogen  memiliki  kemampuan  untuk melepaskan  asam  organik  ke  dalam media  di  sekitarnya  tanpa  adanya unsur  nitrogen,  sehingga  terjadi perubahan  warna  yang  nyata  pada media.  Pengujian  ini  bersifat  kualitatif, semata-mata  menilai  kapasitas  bakteri untuk  fiksasi  nitrogen.  Fiksasi  nitrogen dilakukan  karena  ketiadaan  komponen nitrogen  dalam  komposisi  media, sehingga  perlu  adanya  penyediaan nutrisi  alternatif  yang  dibutuhkan  oleh bakteri[23].

## Gambar 2 . Uji Kemampuan Fiksasi Nitrogen

## Uji Kuantitatif Pengikat Nitrogen
Hasil  uji  kuantitatif  dari  lima bakteri penambat
nitrogen menunjukkan  bahwa  isolat  BLCP  08 menunjukkan  kemampuan  penambat nitrogen terbaik dengan nilai absorbansi  1,326  (Gambar  4),  diikuti oleh  BLCP  07  dengan  nilai  1,063. Kapasitas  pengikatan  nitrogen  yang tinggi  yang  diamati  dari  bakteri  BLCP 08 diyakini disebabkan oleh penggunaan  dekstrosa  (L-glukosa) sebagai  sumber  karbon  dalam  media Peptone  Broth.  Sumber  karbon  ini telah terbukti secara
efektif meningkatkan aktivitas enzim
nitrogenase  pada  bakteri  BLCP  08,
sehingga  meningkatkan  kemampuan fiksasi nitrogennya.
Bakteri  memiliki  kemampuan untuk  melakukan  fiksasi  nitrogen karena  adanya  enzim  nitrogenase, yang  beroperasi  di  dalam  organisme bakteri  ini[24].  Hasil  uji  kuantitatif  dari empat  bakteri  penambat  nitrogen lainnya  menunjukkan  nilai  yang  lebih rendah  dibandingkan  dengan  BLCP 08. Perbedaan ini mungkin disebabkan oleh  ketidaksesuaian  sumber  karbon dekstrosa (L-glukosa) dalam memfasilitasi aktivasi enzim nitrogenase yang optimal pada keempat bakteri tersebut.
0.673 0.884 1.063 1.326 0.861 0 0.5 1 1.5 BLCP 02 BLCP 04 BLCP 07 BLCP 08 BLCP 09 H as il Spek tro fot om e ter (Ab s)

## Isolat

## Gambar 3. Uji Kuantitatif pengikat Nitrogen

## Uji Kemampuan Pelarut Kalium
Hasil dari isolat BCLP 02, BCLP 04,  BCLP  07,  BCLP  08  dan  BCLP  09 menunjukkan pembentukan
zona
bening  yang  berbeda  pada  media Alexandrove selama masa inkubasi 48 jam.
Kelima isolat tersebut
menunjukkan  variasi  dalam  hal  zona
bening dan ukuran koloni.
Tabel 3. Zona Bening Uji Pelarut Kalium Menggunakan Media Alexandrove Isolat Zona Bening (mm) BLCP 02 8,5 mm BLCP 04 9,3 mm BLCP 07 9,1 mm BLCP 08 12,0 mm BLCP 09 9,7 mm
Di  antara  lima  isolat  yang  diperoleh, terlihat  bahwa  isolat  BLCP  08 menunjukkan  zona  bening  terbesar, berukuran 12,0 mm. Hal ini diikuti oleh isolat  BLCP  09,  yang  menunjukkan zona  bening  sebesar  9,7  mm.  Isolat BLCP  04  menunjukkan  zona  bening sebesar  9,3  mm,  sedangkan  isolat BLCP  07  menunjukkan  zona  bening sebesar 9,1 mm. Terakhir, zona bening terkecil  diamati  pada  isolat  BLCP  02, berukuran  8,5  mm.  Pemanfaatan bakteri  pelarut  kalium  sebagai  agen pupuk  hayati  pada  tanah  yang kekurangan  unsur  hara,  seperti  tanah gambut, sangat menjanjikan. Penelitian yang  ada  mengenai  potensi  bakteri pelarut kalium yang berasal dari tanah gambut  saat  ini  masih  terbatas. Namun,  bakteri  tertentu  yang  telah diisolasi  dari  rizosfer  menunjukkan kapasitas  untuk  melarutkan  kalium dalam  keadaan  asam,  seperti  yang terlihat  di  lingkungan  tanah  gambut. Proses  pelarutan  kalium  dipengaruhi oleh  berbagai  faktor  lingkungan, termasuk kadar oksigen, suhu, dan pH.
Bakteri pelarut kalium sering menunjukkan  kondisi  pertumbuhan yang  optimal  dalam  kisaran  pH  6 hingga  7  dan  kisaran  suhu  25  hingga 30 ºC[25].

## Uji Kemampuan Pelarut Fosfat
Isolat BLCP 02, BLCP 04, BLCP 07, BLCP 08, dan BLCP 09 selanjutnya di  uji  kemampuan  pelarut  Fosfat.  lima isolat menunjukkan pembentukan zona bening  yang  berbeda  pada  media pikovskaya agar setelah masa inkubasi selama  48  jam.  Kelima  isolat  tersebut menunjukkan variasi dalam hal morfologi  koloni,  meliputi  bentuk  dan ukuran  yang  berbeda  (Gambar  4). Zona  bening  dapat  terbentuk  karena kemampuan  isolat  bakteri  untuk melarutkan  fosfat  yang  ada  dalam media pikovskaya, khususnya Ca3(PO4)3OH.  Kemampuan  bakteri menghidrolisis  fosfat  pada  media pikovskaya  agar  dibuktikan  dengan terbentuknya daerah bening di sekeliling  koloni  bakteri,  sebagai  hasil dari aktivitas enzim fosfatase[12].

## Gambar 4. Zona Bening Pelarut Fospat Dengan Medium Pikovskaya Agar
Pemeriksaan indeks zona bening yang dihasilkan  oleh  kelima  isolat  tersebut menunjukkan  bahwa  isolat  BLCP  02 menunjukkan  indeks  zona  bening tertinggi,  yaitu  1,92  dan  indeks  zona bening  terkecil  teramati  pada  isolat BLCP  07,  yaitu  1,0.  Temuan  ini menunjukkan  bahwa  isolat  bakteri BLCP 02 menunjukkan tingkat aktivitas tertinggi  dalam  hal  pelarutan  fosfat. Terbentuknya  zona  bening  berfungsi sebagai  indikasi  kapasitas  bakteri untuk  melarutkan  komponen  fosfor.
Bakteri pelarut fosfat memiliki kemampuan  untuk  mengubah  unsur fosfor  (P)  menjadi  H ₂ PO4ˉ,  sehingga membuatnya  dalam  bentuk  fosfat terlarut  yang  dapat  dengan  mudah diasimilasi  oleh  tanaman.  Peristiwa  ini berkaitan  dengan  keterlibatan  enzim fosfatase  yang  berasal  dari  mikroba, yang  memfasilitasi  konversi  unsur fosfor  menjadi  bentuk  yang  dapat diakses dan digunakan oleh tanaman[12].
Gambar 7. Indeks Zona Bening Isolat Bakteri Pelarut Fosfat

## Pewarnaan Gram
Tujuan pewarnaan  Gram  adalah  untuk mengevaluasi  karakteristik  morfologi sel bakteri disajikan pada Tabel 4.Isolat bakteri  BLCP  02,  04,  dan  09 menunjukkan karakteristik yang konsisten dengan bakteri gram negatif, yang dibuktikan dengan adanya koloni bakteri yang berwarna merah. Sebaliknya,  isolat  BLCP  07  dan  08 menunjukkan ciri-ciri yang
mengindikasikan  bakteri  gram  positif, yang  ditandai  dengan  adanya  koloni berwarna  ungu.  isolat  BLCP  07 menunjukkan morfologi sel Monobacillus,  sedangkan  isolat  kode BLCP  08  menunjukkan  morfologi  sel Streptobacillus  dan  isolat  BLCP  02, BLCP  04,  dan  BLCP  09  memiliki morfologi  sel  yang  sama,  yaitu Monococcus. Machmud
[26]
mengemukakan  bahwa  bentuk  kokus
BLCP 02 BLCP 04 BLCP 07 BLCP 08 BLCP 09
dari bakteri ditandai dengan bentuknya yang bulat, menyerupai bola-bola kecil. Bakteri  kelas  khusus  ini  ditemukan lebih  sedikit  dibandingkan  dengan basil.  Morfologi  basil  pada  bakteri ditandai  dengan  struktur  berbentuk batang  yang  menyerupai  balok  kecil, yang  cenderung  berkumpul  dan menyatu  menjadi  koloni.  Lay  [27] menyatakan  bahwa  keberadaan  koloni
ungu dapat dikaitkan dengan persistensi  kompleks  pewarna  kristal violet-iodin,  yang  tetap  utuh  setelah terpapar  larutan  alkohol.  Rona  merah yang diamati pada koloni gram negatif adalah  hasil  dari  pelarutan  kompleks ketika  terpapar  larutan  alkohol,  yang mengarah  pada  pembentukan  warna merah  yang  berasal  dari  safranin.
Tabel 4. Pewarnaan Gram Isolat Bakteri Lipolitik
Kode Isolat Penataan Gram BLCP 02 Monococcus - BLCP 04 Monococcus - BLCP 07 Monobasil + BLCP 08 Streptobasil + BCLP 09 Monococcus -
Keterangan : BLCP (Bakteri Limbah Cair Pupuk

## Uji Katalase
Tujuan  dari  uji  katalase  adalah untuk memastikan kemampuan bakteri dalam menyintesis enzim yang memfasilitasi penguraian atau degradasi  hidrogen  peroksida  (H ₂ O ₂ ). Sebanyak  lima  isolat  bakteri,  yaitu BLCP  02,  BLCP  04,  BLCP  07,  BLCP 08, dan BLCP 09, diperoleh berdasarkan  hasil  uji  katalase  yang dilakukan pada bakteri lipolitik. Adanya gelembung  udara  yang  teramati  pada penambahan  1-2  tetes  larutan  H ₂ O ₂ menandakan  hasil  yang  baik  untuk
kemampuan  isolat  bakteri  dalam memproduksi enzim katalase. Pengamatan ini menunjukkan kemampuan sampel untuk
mendegradasi  hidrogen  peroksida (H ₂ O ₂ ), produk sampingan dari respirasi  bakteri  aerobik.  Kehadiran H ₂ O ₂ dapat
menghambat pertumbuhan bakteri karena kualitasnya  yang  beracun.  Akibatnya, bakteri  secara  enzimatis  memecah komponen  ini  untuk  mengurangi toksisitasnya[28].
Gambar 8. Uji Katalase

## UJI TSI Agar
Hasil uji TSIA yang dilakukan terhadap isolat  bakteri  lipolitik  menunjukkan bahwa  lima  isolat  spesifik,  yaitu  BLCP 02, BLCP 04, BLCP 07, BLCP 08, dan BLCP 09, menunjukkan sifat asam. Hal ini dibuktikan dengan adanya perubahan  warna  media  menjadi kekuningan  pada  permukaan  media. Pengamatan  ini  menunjukkan  bahwa
isolat-isolat
tersebut
memiliki kemampuan untuk melakukan fermentasi  glukosa,  sukrosa,  dan laktosa.  Hasil  uji  TSIA  dapat  dikaitkan dengan kemampuan penggunaan gula yang  berbeda  dari  spesies  bakteri yang  beragam,  dengan  beberapa menunjukkan  kemampuan  fermentasi sementara yang lain tidak[8].

## BLCP 02       BLCP 04        BLCP 07      BLCP 08       BLCP 09
Gambar 9. Hasil Uji TSI Agar
Uji Methyl Red Berdasarkan  temuan  yang  disajikan pada  Gambar  10  dari  uji  MR,  terlihat bahwa hanya empat isolat, yaitu BLCP 02, BLCP 04, BLCP 07, dan BLCP 08, yang  menunjukkan  perubahan  warna yang  jelas  menjadi  merah.  Perubahan warna  ini  menandakan  hasil  tes  MR positif, yang menunjukkan kemampuan isolat  bakteri  ini  untuk  memfermentasi
glukosa  dan  kemudian  menghasilkan asam. Akibatnya, pH media pertumbuhan berkurang hingga mencapai  4,0  atau  di  bawahnya. Sebaliknya,  satu  isolat,  khususnya BLCP  09,  memberikan  hasil  negatif, karena  tidak  ada  perubahan  warna yang dapat diamati pada tabung reaksi setelah  penambahan  reagen  metil merah.
BLCP 02     BLCP 04     BLCP 07    BLCP 08   BLCP 09
Gambar 10. Hasil Uji Methyl
Uji  metil  merah  digunakan  untuk menilai  kapasitas  bakteri  dalam menjalankan  fermentasi  glukosa,  yang menghasilkan  produksi  asam  yang dapat dideteksi. Hal ini dicapai dengan memasukkan  reagen  metil  merah, yang  menyebabkan  perubahan  warna pada  kultur  menjadi  merah.  Hasil positif  pada  uji  MR  menunjukkan bahwa  bakteri  mampu  melakukan fermentasi asam campuran, sedangkan kurangnya perubahan warna menandakan uji MR negatif[29].
Uji Motilitas ( SulfideIndoleMotility ) Tujuan dari uji motilitas, khususnya  uji Motilitas  SulfidIndol , adalah  untuk  mengamati  pergerakan bakteri  di  dalam  media  kultur  yang telah diinokulasi. Tes ini memungkinkan  identifikasi  motilitas bakteri,  yang  dapat  bersifat  pasif  atau aktif.  Menurut  Kosasi  dkk.,  [30]  hasil negatif  dalam  uji  motilitas  diamati ketika  pertumbuhan  bakteri  gagal menyebar  dan  meluas  secara  linier  di sepanjang  lokasi  tusukan.  Sebaliknya, hasil yang baik menunjukkan pertumbuhan bakteri yang meluas dari daerah  tusukan  dan  menyebar  ke seluruh  permukaan  media[30].  Hasil yang  diperoleh  terdiri  dari  lima  isolat,
yaitu  BLCP  02,  BLCP  04,  BLCP  07, BLCP  08,  dan  BLCP  09,  yang teridentifikasi  positif  memiliki  motilitas. Hal  ini  ditunjukkan  dengan  adanya pertumbuhan  yang  menyebar  di sekitar tusukan ose.

## Uji Indol
Indol  adalah  bahan  kimia nitrogen beraneka ragam yang disintesis  oleh  bakteri  melalui  proses degradasi  protein.  Aktivitas  enzimatik triptofanase pada bakteri, yang memfasilitasi  oksidasi  asam  amino triptofan, menghasilkan produksi produk  metabolisme  dalam  bentuk indol[31].  Reaksi  negatif  dari  isolat bakteri  lipolitik  (BLCP  02,  BLCP  04, BLCP  07,  BLCP  08,  dan  BLCP  09) pada  uji  indol,  ketika  terpapar  dengan pereaksi
Kova'c, teramati bermanifestasi dalam bentuk pengembangan  lapisan  cincin  kuning pada  permukaan  media.  Kurangnya pertumbuhan  bakteri  yang  diamati pada bekas tusukan dan adanya sulfur positif  bertanggung  jawab  atas  hasil yang  buruk.  Uji  indol  positif  dapat diidentifikasi  dengan  terbentuknya lapisan alkohol merah yang menyerupai cincin pada permukaan[29]. Tabel 5. Uji Biokimia Isolat Bakteri Lipolitik Isolat Katalase TSI Agar MR Motilitas Indol Genus BLCP 02 - A/K gas (+) H2S (-) + + - Micrococcus BLCP 04 + K/K gas (+) H2S (-) + + - Paracoccus BLCP 07 - A/K gas (-) H2S (-) + + - Actinomycetes BLCP 08 + K/K gas (+) H2S (-) + + - Bacillus BLCP 09 + K/K gas (-) H2S (-) - + - Lysinibacillus
Keterangan : BLCP (Bakteri Limbah Cair Pupuk)
Tabel  5  menyajikan  hasil  uji biokimia  yang  dilakukan  pada  sampel limbah  cair  kelapa  sawit,  bersama dengan pengamatan mikroskopis, yang menunjukkan adanya lima genus yang  berbeda.  Berdasarkan  buku
Bergey's  Manual  of  Determinative Bacteriology ,  edisi  ke-7.  Isolat  BLCP 02  yang  termasuk  dalam  genus Micrococcus. ciri-ciri Gram-negatif dan memiliki  morfologi  berbentuk  kokus, sering muncul berpasangan. Bakteri ini
tidak  memiliki  kemampuan  untuk membuat spora. Selain
itu,
Micrococcus
menunjukkan kemampuan untuk memfermentasi tiga gula  yang  berbeda  sebagai  sumber karbon. Genus Micrococcus umumnya ditemukan  di  rizosfer  tanaman  dan memiliki kemampuan untuk meningkatkan ketersediaan fosfat tanah.  Isolat  dengan  kode  BLCP  04 yang  secara  spesifik  termasuk  ke dalam  genus  Paracoccus,  memiliki karakteristik sel yang diamati termasuk bentuk  bulat  atau  bentuk  batang pendek,  dengan  diameter  sel  berkisar antara  0,5  hingga  1,1  μm.  Sel -sel  ini biasanya  ditemukan  sebagai  sel individu  atau  berpasangan,  dan  tidak memiliki kemampuan
untuk
menghasilkan  endospora.  Selain  itu,
mereka
menunjukkan reaksi pewarnaan  Gram  positif  dan  mampu
melakukan motilitas. Kode isolat BLCP 07  genus  Actinomycetes.  Menurut Procop dkk[32], Actinomycetes menunjukkan  sifat  bakteri  gram  positif dan  menampilkan  morfologi  sel  yang ditandai  dengan  bentuk  kokus  (bulat) dan  basil  (batang).  isolat  BLCP  08 dapat  dikategorikan  dalam  genus Bacillus.  Genus  Bacillus  memiliki morfologi  berbentuk  batang  dan umumnya  ditemukan  di  beberapa habitat  lingkungan,  termasuk  tanah, air, dan bahkan lautan. Beberapa jenis organisme  tertentu  memiliki  enzim ekstraseluler yang memiliki kemampuan  untuk  memecah  protein dan  polisakarida  kompleks.  Selain  itu, jenis  organisme  ini  menunjukkan aktivitas  katalase  yang  positif.  Isolat BLCP  09  termasuk  dalam  genus Lysinibacillus[32].

## 4.  Simpulan
Hasil
isolasi bakteri lipolitik menunjukkan  bahwa  isolat  BLCP  02, BLCP  04,  BLCP  07,  BLCP  08  dan BLCP  09  mempunyai  kemampuan lipolitik  terbesar  berdasarkan  indeks zona  bening  yang  dihasilkan  yaitu BLCP  02  sebesar  0,56  mm,  BLCP  04 sebesar  0,75  mm,  BLCP  07  sebesar 0,63  mm,  BLCP  08  sebesar  0,73  mm dan  BLCP  09  IL  sebesar  0,68.  Uji potensi  sebagai  agen  biofertilizer  juga didapatkan  pada  isolate  BLCP  02, BLCP  04,  BLCP  07,  BLCP  08  dan BLCP  09  karena  kelima  isolate tersebut  memiliki  kemampuan  lipolitik, pemfiksasi nitrogen, kemampuan dalam  melarutkan  fosfat  dan  kalium.
Hasil  dari  identifikasi  bakteri  lipolitik terdapat  5  genus  bakteri  yang dinyatakan  sebagai  genus  dari  bakteri Lipolitik  yaitu  BLCP  02  Genus Micrococcus, BLCP 04 Genus Paracoccus, BLCP 07 Genus Actinomycetes,  BLCP  08  Genus Bacillus  dan  BLCP  09  Genus Lysinibasillus.
Investigasi  lebih  lanjut  penting  untuk mengeksplorasi kemanjuran agen pupuk  hayati  dalam  konteks  uji kemampuan asam indol-3-asetat (IAA), dan selanjutnya, penggunaan praktisnya  pada  tanaman  untuk memastikan hasil yang nyata.

## Daftar Pustaka
[1] S.  H.  Nasution,  H.  Chairani,  dan  G.  Jasmani,  “PertumbuhanBibitKelapaSawit (ElaeisGuineensis  Jacq.)  Pada  Berbagai  Perbandingan  Media  Tanam  Solid  Decanter Dan  Tandan  Kosong  Kelapa  Sawit  Pada Sistem  Single  Stage,” J.  Online Agroekoteknologi , vol. 2, no. 2, hlm. 691 – 701, 2014.
[2] Ermadanidan A. Muzar, “Pengaruh Aplikasi Limbah Cair Pabrik Kelapa Sawit terhadap Hasil Kedelai dan Perubahan Sifat Kimia Tanah Ultisol,” J. AgronIndones. , vol. 39, no. 3, hlm. 160 – 167, 2011.
[3] I.  Nursanti,  .“Karakteristik Limbah  Cair  Pabrik  Kelapa  Sawit  Pada  Proses  Pengolahan Anaerob Dan Aerob,” J. Ilm. Univ. Batanghari Jambi , vol. 13, no. 4, hlm. 67 – 73, 2013.
[4]  B. Manguntingi, A. A. Rian, A. A. Muhammad, Asmawati, E. P. Kurniawan, dan A. Tegar, “Endonesia  (Endophyte  For  Indonesia):  Biofertilizer Mikroba  Endofit  Guna Meningkatkan  Kualitas  Pembibitan  Budidaya  Kelapa  Sawit  (Elaeis  guineensis)  Di Indonesia,” J. Biota , vol. 3, no. 1, hlm. 44 – 52, 2018.
[5]  R.  B.  Sukmadi dkk. ,  “Kajian  Proses  Produksi Pupuk  Hayati  Bio-Srf  Dan  Pengujian Efektivitasnya Pada Tanaman Bawang Merah,” J. Bioteknol. BiosainsIndones. , vol. 3, no. 1, hlm. 20 – 27, 2019.
[6] L.  Widyastuti,  Y.  Sulistiyanto,  A.  Jaya,  Y.  Jagau,  dan  L.  Neneng,  “Potensi Mikroorganisme  sebagai  Biofertilizer  dari  Limbah  Cair  Pabrik  Kelapa Sawit,” J.  Surya Med. , vol. 5, no. 1, hlm. 1 – 12, 2019, doi: 10.33084/jsm.v5i1.941.
[7] Chairunnisa,  Riyanto,  dan  K.  Abdul,  “Isolasi  Dan  Uji Bakteri  Lipolitik  Dalam Mendegradasi  Minyak  Pada  Limbah  Cair  Kelapa  Sawit  Di  Kebun  Marihat,  Pematang Siantar,” J. Ilm. Biol. Uma , vol. 1, no. 2, hlm. 44 – 52, 2019.
[8] Khairanidan  Kartika,  “Isolasi  Dan  Identifikasi Bakteri  Lipolitik  Dari  Limbah  Cair  Kelapa Sawit (Elaeis q uineensis Jacq.),” J. Pendidik. Biol. Dan Sains , vol. 6, no. 1, hlm. 1 – 13,
2023.
[9] M. Zainuddin, W. A. Setyati, dan P. P. Renta, “ Zona Hidrolisis Dan Pertumbuhan Bakteri Proteolitik  Dari  Sedimen  Ekosistem  Mangrove  Rhizophoramucronata  Telukawur – Jepara ,” Akuatik  J.  Sumberd.  Perair. ,  vol.  11,  no.  2,  hlm.  31 – 35,  Agu  2018,  doi: 10.33019/akuatik.v11i2.241.
[10] Asruldan  I.  Nyoman,  “Isolasi  Dan  Identifikasi Bakteri  Penambat  Nitrogen  Untuk Pembuatan Biofertilizer,” J. Viabel Pertan. , vol. 15, no. 1, hlm. 16 – 23, 2018.
[11] R. N. Safitri, M. Shovitro, dan A. Hidayat, “Potensi Bakteri Koleksi Sebagai Biofertilizer,” J. Sains Dan Seni ITS , vol. 7, no. 2, hlm. 53 – 56, 2018.
[12]  R. Nugraha, T. Ardyati, dan Suharjono, “Eksplorasi Bakteri Selulolitik Yang Berpotensi Sebagai  Agen Biofertilizer  Dari  Tanah  Perkebunan  Apel  Kota  Batu,  JawaTimur,” J. Biotropika , vol. 2, no. 3, hlm. 159 – 163, 2014.
[13] W. Rahmatullah, E. Novianti, dan A. D. L. Sari, “Identifikasi Bakteri Udara Menggunakan Teknik Pewarnaan Gram,” J. Ilmu Kesehat. Bhakti Setya Med. , vol. 6, no. 2, hlm. 84 – 92, 2021.
[14] K. Handayni, C. N. Ekowati, dan N. Pakpahan, “Karakterisasi Fisiologi dan Pertumbuhan Isolat  Bakteri  Bacillus  thuringiensis  dari  Tanah  Naungan  di  Lingkungan  Universitas Lampung,”  dipresentasikan pada  Seminar  Nasional  Sainsdan  Teknologi,  Lampung: Universitas Lampung, 2013.
[15] Febryana, “Isolasi dan Identifikasi Bakteri Potensial Probiotik Pada Saluran Pencernaan Ikan Mas (Cyprinuscarpio),” Skripsi, Universitas Sumatera Utara, Sumatera Utara, 2017.
[16] M. H. Madini, “Dinamika Kelimpahan Bakteri Terkait Kemunculan Penyakit Ice-Ice Pada RumputLaut  (Kappaphycu salvarezii),”  Skripsi,  InstitutTeknologiSepuluh  November, Surabaya, 2016.
[17] Y. S. Ismail, C. Yulvizar, danPutriani, “Isolasi, Karakterisasi dan Uji Aktivitas Antimikroba Bakteri  Asam  Laktat  dari  Fermentasi  Biji Kakao  (Theobrama  cacao  L.),” J.  Bioleuser , vol. 1, no. 2, hlm. 45 – 53, 2017.
[18]  R. E. Buchanadan N. E. Gibbons, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology , 8 ed. Baltimore: The Williams and Wilkins Company, 1974.
[19] A. A. Putri, M. M. Rustama, dan W. S. Putranto, “SkriningBakteriAsamLaktat Dan Khamir Potensial  Proteolitik  Ekstraseluler  Dan  Milk  Clotting  Activity  Dari  Ekstrak  Dan  Fresh Cheese  Nanas  (Ananascomosus  (L.)  Merr.),” J.  Teknol.  Has.  Peternak. ,  vol.  4,  no.  2, hlm. 187, Sep 2023, doi: 10.24198/jthp.v4i2.49924.
[20] H. Ochman, E. Lerat, dan V. Daubin, “Examining bacterial species under the specter of gene transfer and exchange,” Proc. Natl. Acad. Sci. , vol. 102, no. suppl_1, hlm. 6595 – 6599, Mei 2005, doi: 10.1073/pnas.0502035102.
[21] L.  Kurniawati,  E.  Kusdiyantini,  dan  W.  Wijanarka,  “PengaruhVariasiSuhu  Dan  Waktu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Selulase Dari Bakteri Serratiam arcescens,” Bioma Berk. Ilm. Biol. , vol. 23, no. 1, hlm. 33 – 42, Jun 2021, doi: 10.14710/bioma.23.1.33-42.
[22] P. Zeniusa, M. R. Ramadhian, S. H. Nasution, dan N. Karima, “Uji Daya Hambat Ekstrak Etanol  Teh  Hijau  Terhadap Escherichia  coli  Secara  In  Vitro,” Majority ,  vol.  8,  no.  2, 2019.
[23] O.  Nurosiddan  P.  Lestari,  “Kemampuan Azospirillum  sp.  JG3  dalam  Menghasilkan Lipase pada Medium Campuran Dedak dan Onggok dengan Waktu Inkubasi berbeda,” Universitas Soedirman, Purwokerto, 2008.
[24] P.  W.  Ludden,  “Nitrogenase  Complex,” Encyclopedia  of  life  sciences .  USA,  hlm.  1 – 8,
2001.
[25] H.  E.  Y.  Alamdan  Z.  Enny,  “Studi Literatur  Potensi  Bakteri  Endogenik  Lahan  Gambut Sebagai Biofertilizer untuk Memperbaiki Nutrisi Lahan,” J. Sains Dan Seni ITS , vol. 9, no. 2, 2020.
[26] M. Machmud, “Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba,” Bul. AgroBio , vol. 4, no. 1, hlm. 24 – 32, 2001.
[27]  B. W. Lay, Analisis Mikroba di Laboraturium . Jakarta: PT. GradindoPersada, 1994.
[28] L.  R.  Rahmawati,  S.  Adlina,  dan  A.  Yuliana,  “Isolasi dan  Identifikasi  Bakteri  Penghasil Protease  Ekstraseluler  dari  Limbah  Cair  Tahu Putih,” J.  IlmuKeperawatan  Anal. Kesehat. Dan Farm. , vol. 21, no. 2, hlm. 187 – 193, 2021.
[29] R.  N.  Hakiki,  “Identifikasi Bakteri  Pada  Tempat-Tempat  Penampungan  Air  Habitat Nyamuk Aedesaegypti,”  Skripsi,  Universitas  Islam  Negeri Alauddin  Makassar, Makassar, 2016.
[30] C. Kosasi, W. A. Lolo, dan S. Sedewi, “Isolasi Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Bakteri Yang  Bersasosiasi  Dengan  Alga  Turbinari  aornata  (Turner)  J.  Agard  Serta  Identifikasi Secara Biokimia,” J. Pharmacon , vol. 8, no. 2, hlm. 351 – 359, 2019.
[31]  Hafsan, Mikrobiologi Analitik . Makassar: Alaudin University Press, 2014.
[32]  G. W. Procop dkk. , Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology , 8 ed. Philadelphia: Wolters Kluwer Health, 2017.