## Jurnal Sains dan Teknologi
Volume 12 Number 1, Tahun 2023, pp. 23-29 P-ISSN: 2303-3142 E-ISSN: 2548-8570 Open Access: https://doi.org/10.23887/jstundiksha.v12i1.51317

## A R T I C L E   I N F O
Article history: Received August 11, 2022 Revised August 12, 2022 Accepted January 14, 2023 Available online April 25, 2023

## Kata Kunci:
Antifungi, Bacillus subtilis, Athelia rolfsii, efektivitas.

## Keywords:
Anti-fungal, Bacillus subtilis, Athelia rolfsii, effectiveness.
This is an open access article under the CC BY-SA license.
Copyright © 2023 by Author. Published by Universitas Pendidikan Ganesha.
Optimasi  Proses  Fermentasi  Senyawa  Antijamur  Bacillus subtilis CAF3 Terhadap Athelia rolfsii (Curzi) C. C. Tu & Kimbr
Syukria Ikhsan Zam 1 * , Irwan Taslapratama 2 , Yusmar 3 , Dewi Febrina 4
1,2.3 Program Studi Agroteknologi, Universitas Islam Negeri Sultan Syarif Kasim Riau, Pekanbaru, Indonesia
4 Program Studi Peternakan, Universitas Islam Negeri Sultan Syarif Kasim Riau, Pekanbaru, Indonesia

## A B S T R A K
Bacillus subtilis CAF3 adalah bakteri endofit yang potensial dalam menghasilkan senyawa  antifungi.  Bakteri  ini  memiliki  senyawa  yang  dapat  menghambat pertumbuhan  Athelia  rolfsii.  Produksi  senyawa  antifungi  tersebut  dapat ditingkatkan  dengan  melakukan  optimasi  pada  proses  fermentasinya.  Pada penelitian  ini  dilakukan  pemilihan  media  fermentasi,  optimasi  konsentrasi inokulum, optimasi pH awal media dan optimasi agitasi, selain itu juga dilakukan uji  bioaktivitas  ektrak  hasil  fermentasi  serta  identifikasi  senyawa  dengan menggunakan  LC/MS.  Hasil  penelitian  menunjukkan  hasil  fermentasi  B.  subtilis CAF3 memiliki daya hambat tertinggi terhadap A. rolfsii pada media tryptic soy broth (90,59%), konsentrasi inokulum 5% (90,59%), pH awal media 7 (90,59%) dan agitasi 110 rpm (90,59%). Ektrak etil asetat menghasilkan jumlah senyawa terbanyak  (228  mg/L)  dan  memiliki  bioaktivitas  tertinggi  (100%). Hasil  LC/MS menunjukkan  terdapat  empat  senyawa  yang  berbeda  yaitu:  T1.86  (392  m/z), T2.24  (261,59  m/z),  T2.67  /mL  (436,04  m/z)  dan  T3.28  (282,23  m/z). Fermentasi senyawa antifungi oleh B. subtilis CAF3 terhadap A. rolfsii optimum pada medium TSB, konsentrasi inokulum 5%, pH awal media 7 dan agitasi 110 rpm. Senyawa yang dihasilkan oleh strain ini merupakan senyawa yang berbeda dengan senyawa yang umum dihasilkan oleh B. subtilis.

## A B S T R A C T
Bacillus  subtilis  CAF3  is  an  endophytic  bacterium  that  has  the  potential  to  produce  antifungal  compounds  that  can inhibit  the  growth  of  Athelia  rolfsii.  The  production  of  the  antifungal  compounds  can  be  increased  by  optimizing  the fermentation  process.  In  this  study,  the  selection  of  fermentation  media,  optimization  of  inoculum  concentration,  the initial pH of the media, and agitation were applied along with the bioactivity test of fermented extracts and identification of compounds using LC/MS. The results showed that fermentation by B. subtilis CAF3 had the highest inhibition against A. rolfsii in tryptic soy broth (90.59%) with pH 7 (90.59%), 5% inoculum concentration (90.59%), and 110 rpm agitation (90.59%). Ethyl acetate extract was the dominant compound (228 mg/L) and had the highest bioactivity (100%). The LC/MS results showed four compounds from the ethyl acetate extract that were T1.86 (392 m/z), T2.24 (261.59 m/z), T2.67/mL (436.04 m /z), and T3.28 (282.23 m/z).  Fermentation of antifungal compounds by B. subtilis CAF3 against A. rolfsii was optimum in TSB medium, 5% inoculum concentration, at 7 initial pH of medium and 110 rpm agitation. The compounds produced by this strain was different from the compounds commonly produced by B. subtilis.

## 1. PENDAHULUAN
Athelia rolfsii (Curzi) C.C. Tu & Kimbr. sebelumnya dikenal sebagai Sclerotium rolfsii Sacc. adalah fungi fitopatogen yang tersebar luas di alam. Fungi ini dapat menginfeksi tanaman pangan, bahan pangan mentah dan produk olahan, sehingga mengakibatkan kerugian ekonomi dan juga keamanan pangan. Oleh karena  itu  fungi  ini  perlu  dikendalikan.  Salah  satu  opsi  pengendalian  yang  ramah  lingkungan  adalah dengan  menggunakan  mikroorganisme  antagonis (Zhao  et  al.,  2011). Beberapa  mikroorganisme dilaporkan  memiliki  aktivitas  antagonis  dan  dapat  menghasilkan  senyawa  penghambat  pertumbuhan (Rautela  et  al.,  2014). Bakteri  endofit  merupakan  mikroorganisme  yang  banyak  dilaporkan  memiliki aktivitas  antagonis  terhadap  fungi  fitopatogen (Dalal  &  Kulkarni,  2013). Salah  satu  genus  bakteri  yang ditemukan sebagai endofit adalah Bacillus . Genus ini diketahui memiliki kemampuan dalam menghasilkan senyawa  antimikroba  yang  kuat (Li  et  al.,  2014) dan  dapat  dimanfaatkan  dalam  perlindungan  tanaman (Chung  et  al.,  2008;  Hadiwiyono  &  Widono,  2012). Salah  satu  anggota  genus Bacillus yang  banyak dilaporkan  sebagai  bakteri  endofit adalah B.  subtilis .  Species  ini  dapat  menghasilkan  senyawa  antifungi dengan spektrum yang luas, sehingga potensial dikembangkan sebagai pengendali fitopatogen (Ahmad et al.,  2019;  Awan  &  Shoaib,  2019). B.  subtilis CAF3  merupakan  salah  satu  strain  bakteri  endofit  yang
berhasil diisolasi dari daun Citrus aurantifolia Swingle. Bakteri ini memiliki aktivitas antifungi terhadap A.rolfsii (Zam  et  al.,  2019;  Ahmad  et  al.,  2019). Penemuan  dan  pengembangan  senyawa  antifungi fitopatogen  sangat  penting  untuk  diteliti,  agar  diperoleh  senyawa  yang  sangat  efektif  dan  memiliki toksisitas yang rendah terhadap manusia dan ramah lingkungan (Thomashow, Bonsall, & Weller, 2008). Hal tersebut dapat dicapai dengan melakukan optimasi dalam proses fermentasi yang meliputi: pemilihan media,  konsentrasi  inokulum,  pH  awal  medium  dan  agitasi.  Proses  optimasi  fermentasi  dan  identifikasi senyawa  antifungi  oleh  strains  ini  belum  pernah  dilaporkan,  sehingga  perlu  diteliti.  Penelitian  ini merupakan  penelitian  pendahuluan  dalam  proses  fermentasi  karena  masih  menggunakan  labu  kocok. Diharapkan  dari  hasil  penelitian  ini  dapat  dilanjutkan  dengan  melakukan  optimasi  proses  fermentasi dengan menggunakan fermentor untuk mendapatkan hasil yang lebih optimal.

## 2. METODE
Tahapan  pertama  yang  dilakukan  dalam  penelitian  ini  adalah  sterilisasi  alat  dan  bahan.  Bahan dan alat tahan panas disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C dengan tekanan 15 lbs selama  15  menit.  Peralatan  yang  tidak  tahan  panas  disterilisasi  dengan  menggunakan  alkohol  90%, sedangkan untuk  bahan cair hasil fermentasi  disterilisasi dengan menggunakan membran filter 0,2 µm. Pembuatan sumber inokulum dilakukan dengan  mengadaptasikan isolat pada  medium tryptic soy  broth (TSB).  Adaptasi  dilakukan  dengan  cara  menginokulasikan  satu  Ose  biakan  murni  isolat B.  subtilis CAF3 dari  medium tryptic  soy  agar (TSA)  miring  ke  dalam  Labu  Erlenmeyer  berisi10  mL  medium  TSB, selanjutnya  diinkubasikan  pada  suhu  27 o C  dengan  agitasi  120  rpm  selama  24  jam.  Hasil  adaptasi selanjutnya diinokulasikan sebanyak 5% (v/v) dengan jumlah sel 10 6 CFU/mL ke dalam Labu Erlenmeyer berisi  medium  TSB  dan  diinkubasikan  pada  suhu  27 o C  dengan  agitasi  120  rpm  selama  10  jam  dan selanjutnya digunakan dalam tahapan optimasi.
Optimasi  proses  fermentasi  dilakukan  secara  bertingkat.  Optimasi  yang  dilakukan  meliputi:  1) Pemilihan media.  Media yang digunakan, yaitu:  TSB,  Luria-Berthani (LB), glukosa tepung kedelai  (GTK) dan rendaman jagung (RJ) steril dengan pH 7,0. Proses fermentasi dimulai dengan menginokulasikan 5% (v/v)  inokulum  dengan  jumlah  sel  10 6 CFU/mL  ke  dalam  labu  Erlenmeyer  berisi  media  yang  akan digunakan  dalam  proses  fermentasi  dan  diinkubasikan  pada  suhu  27 o C  dengan  agitasi  120  rpm;  2) Konsentrasi inokulum. Optimasi dilakukan dengan menggunakan inokulum  dengan konsentrasi 5, 10 dan 15%. Masing-masing konsentrasi dengan jumlah sel 10 6 CFU/mL ditambahkan ke dalam Labu Erlenmeyer yang berisi media TSB steril dengan pH 7,0, selanjutnya diinkubasikan pada suhu 27 o C dengan agitasi 120 rpm;  3)  pH  awal  media.  pH  awal  media  TSB  diatur  pada  nilai  6,0;  7,0  dan  8,0.  Penurunan  nilai  pH dilakukan dengan penambahanHCl 0,1M, sedangkan peningkatan nilai pH dilakukan dengan penambahan NaOH 0,1M. Labu Erlenmeyer yang berisi media TSB steril dengan pH yang telah ditetapkan, selanjutnya diinokulasikan dengan inokulum  sebanyak 5% (v/v) dengan  jumlah  sel 10 6 CFU/mL  dan  diinkubasikan pada  suhu  27 o C  dengan  agitasi  120  rpm;  dan  4)  Agitasi.  Proses  optimasi  agitasi  dilakukan  dengan  cara menginokulasikan inokulum ke dalam Labu Erlenmeyer yang berisi medium TSB dengan pH 7,0 sebanyak 5% (v/v) dengan jumlah sel 10 6 CFU/mL. Masing-masing medium yang telah  berisi inokulum B, subtilis CAF3  tersebut  kemudian  diunkubasikan  pada  agitasi  yang  berbeda  (110,  120  dan  130  rpm)  pada  suhu 27 o C.  Pada  setiap  tahapan  optimasi  dilakukan  pengukuran  efektivitas  hambatan  filtrat  hasil  fermentasi terhadap A.  rolfsii .  Pengukuran  efektivitas  hambatan  filtrat  hasil  fermentasi  terhadap A.  rolfsii menggunakan food poisoning technique (Kambar, Manasa, Vivek, & TR,  2014) dengan konsentrasi filtrat 5% (v/v) di dalam PDA. (Nor Irham Nor Azan et al., 2020).
Hasil fermentasi selanjutnya diektraksi. Ekstraksi senyawa dilakukan dengan merujuk (de Melo et al.  (2009) yang  dimodifikasi.  Hasil  fermentasi  disentrifugasi  pada  4.000  rpm selama  45  menit  dan supernatan yang diperoleh digunakan untuk ekstraksi bertingkat dengan heksana, diklorometan dan etil asetat  (1:1)  menggunakan  labu  pemisah  dan  diulang  sebanyak  tiga  kali.  Masing-masing  fraksi  organik diambil  dan  dikeringkan  dengan  Na 2 SO 4 anhidrat  dan  dievaporasikan  dengan rotary  evaporator .  Hasil ekstraksi yang telah kering kemudian ditimbang dan diuji bioaktivitasnya terhadap A. rolfsii menggunakan food  poisoning  technique (Kambar  et  al.,  2014) dengan  konsentrasi  ekstrak  0,1%  (v/v)  di  dalam  PDA. Ektrak yang memiliki efektivitas tertinggi selanjutnya diidentifikasi dengan LC-MS. Ekstrak dari fraksi etil asetat  diidentifikasi  dengan  LC-MS.  LC-MS  yang  digunakan  adalah Mariner  Biospectrometry yang dilengkapi  dengan  pompa  biner.  HPLC  dihubungkan  dengan Q-tof  mass  spectrometer dan  dilengkapi dengan sumber ESI. Mode fullscan dari 100 sampai 1200 m / z dilakukan pada suhu 140°C. Kolom HPLC yang digunakan untuk analisis  adalah  Phenomenex 5 μ C8, 150  × 2 mm. Pelarut  yang digunakan adalah metanol  80%  dengan  0,3%  asam  format.  Pelarut  dihantarkan  dengan  laju  alir  0,2  mL/min.  Pelarut berjalan dengan elusi isokratik.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  medium  fermentasi,  konsentrasi  inokulum,  pH  awal medium dan agitasi  berpengaruh terhadap produksi senyawa antifungi. Hal tersebut  diperlihatkan oleh data  efektifitas  hambatan  terhadap A.  rolfsii dari  filtrat  yang  diujikan.  Efektivitas  hambatan  filtrat  hasil fermentasi B. subtilis CAF3 terhadap A. rolfsii pada pemilihan media berkisar antara 23,53 – 90,59%, dapat dilihat  pada Gambar  1A. Efektivitas  hambatan  tertinggi  diperoleh  pada  medium  TSB  sebesar  90,59%, diikuti oleh medium LB sebesar 65,88%, medium GTK sebesar 32,93% medium RJ sebesar 23,53%. Hasil optimasi  konsentrasi  inokulum  menunjukkan  bahwa,  peningkatan  konsentrasi  menurunkan  efektivitas hambatan  filtrat  hasil  fermentasi  terhadap  pertumbuhan A.  rolfsii .  Hasil  pengukuran  menunjukkan konsentrasi  inokulum  5%  memiliki  efektivitas  hambatan  sebesar  90,59%,  konsentrasi  inokulum  10% memiliki  efektivitas  hambatan  sebesar  80,00%  dan  konsentrasi  15%  memiliki  efektivitas  hambatan sebesar  66,71%.  Hasil  ini  dapat  dilihat  pada Gambar  1B. Hasil  penelitian  ini  menunjukkan,  bahwa  pH awal medium mempengaruhi efektivitas hambatan filtrat hasil fermentasi. Hal tersebut diperlihatkan oleh efektivitas  hambatan  pada  pH  7  sebesar  90,59;  diikuti  oleh  pH  8  sebesar  77,65%  dan  pH  6  sebesar 76,47%, dapat dilihat pada Gambar 1C. Produksi senyawa antifungi terhadap A. rolfsii oleh B. subtilis CAF3 juga dipengaruhi oleh  agitasi. Hal ini  terlihat  bahwa agitasi 110 rpm memberikan  efektivitas hambatan tertinggi  sebesar  94,12%;  diikuti  oleh  agitasi  120  rpm  sebesar  90,54%  dan  agitasi  130  rpm  sebesar 82,35%, dapat dilihat pada Gambar 1D.
Gambar 1. Efektivitas  Hambatan  Terhadap Pertumbuhan A. rolfsii pada  Optimasi  Proses Fermentasi. a. Pemilihan Media; b. Konsentrasi Inokulum; c. pH Awal Media; d. Agitasi
Untuk Ektrak etil asetat memiliki jumlah ektrak terbanyak, diikuti oleh ekstrak diklorometan dan ekstrak  n-heksana  berturut-turut  yaitu  228  mg/L,  142  mg/L  dan  64  mg/L,  hasil  ini  dpaat  dilihat  pada Gambar 2A . Hasil uji bioaktivitas menunjukkan ektrak etil asetat memiliki bioaktivitas tertinggi terhadap A. rolfsii sebesar 100%, diikuti oleh ekstrak diklorometan sebesar 59,50% dan ekstrak n-heksana sebesar 3240%, Hasil ini dapar dilihat pada Gambar 2B.
A B C D Ef ekti vi ta s ( %) Media Ef ekti vi ta s (%) Konsentrasi Inokulum (%) Ef ekti vi ta s ( %) pH Ef ekti vi ta s ( %) Agitasi (rpm)
Gambar  2. Ekstrak  Hasil  Fermentasi  dengan  Menggunakan  Pelarut  Heksana,  Diklorometan  dan  Etil Asetat. a. Jumlah Ekstrak yang Diperoleh; b. Efektivitas Hambatan
Hasil  LC-MS  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etil  asetat  memiliki  empat  senyawa.  Spektra  ESI memperlihatkan  senyawa  yang  dihasilkan  memiliki  berat  yang  berbeda,  dapat  dlihat  pada Gambar  3 . Senyawa  T1.86  memiliki  berat  senyawa  392  m/z  dengan  konsentrasi  58  ng/mL,  hasil  ini  dapat  dilihat pada Gambar 3A , senyawa T2.24 memiliki berat senyawa 261,59 m/z dengan konsentrasi 52 ng/mL dapat dilihat  pada Gambar  3B ,  senyawa  T2.67  memiliki  berat  senyawa  436,04  m/z  dengan  konsentrasi  82 ng/mL  tersedia  pada Gambar  3C dan  senyawa  T3.28  memiliki  berat  senyawa  282,23  m/z  dengan konsentrasi 38 ng/mL dpat dilihat pada Gambar 3D.
Gambar  3. Spektra  ESI  LC-MS.  a.  Spektra  ESI  T1.86;  b.  Spektra  ESI  T2.24;  c.  Spektra  ESI  T2.67;  dan  e. Spektra ESI T3.28.

## Pembahasan
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  medium  mempengaruhi  produksi  senyawa  metabolit antifungi. Peningkatan produksi senyawa metabolit antifungi ditunjukkan oleh efektivitas hambatan hasil fermentasi terhadap A. rolfsii . Semakin banyak senyawa metabolit antifungi yang dihasilkan, maka akan semakin  tinggi  efektifitas  hambatannya.  Kesesuaian  komposisi  medium  fermentasi  berperan  dalam memenuhi kebutuhan dasar biomasa dan produksi metabolit (Costa et al., 2002; Peighami-Ashnaeli et al., 2009;  Tahir  et  al.,  2012;  Yánez-mendizábal  et  al.  2012). Hasil  penelitian  ini  juga  menunjukkan  setiap strain B.  subtilis memiliki  medium  fermentasi  optimum  yang  berbeda. B.  subtilis AAF2  memperoleh efektivitas  hambatan  tertinggi  terhadap A.  rolfsii dengan  menggunakan  medium  rendaman  jagung
A B Jum la h ( m g/ L) Ekstrak Ef ekti vi ta s (%) Ekstrak A B C D Int ensi ta s (%) Massa (m/z) Int ensi ta s (%) Massa (m/z) Int ensi ta s (%) Massa (m/z) Int ensi ta s (%) Massa (m/z)
(Djamaan  et  al.,  2018), sedangkan B.  subtilis CAF3  memiliki  efektifitas  habatan  tertinggi  pada  medium TSB. Faktor lain yang berperan dalam fermentasi senyawa antifungi adalah konsentrasi inokulum ( Zhang et al., 2021). Proses fermentasi bakteri akan optimal pada rentang konsentrasi 2 – 10% (Stanbury et al., 2016). Pada  umumnya  konsentrasi  inokulum  5%  merupakan  konsentrasi  inokulum  optimum  dalam proses  fermentasi  senyawa  antifungi (de  Calvalho  et  al.,  2010). Hasil  yang  diperoleh  juga  sama  dengan penelitian  lainnya.  pH  awal  medium  sangat  mempengaruhi  produksi  senyawa  antifungi,  sehingga mempengaruhi  efektivitas  hambatan  hasil  fermentasi (Huang  et  al.,  2014). Strain  ini  memiliki  pH  awal media optimum yang sama dengan strain B. subtilis lainnya (Islam et al., 2012;  Zhao et al., 2016; Putri et al.,  2021). Beberapa  peneliti  melaporkan B.  subtilis memiliki  aktivitas  antifungi  optimum  pada  pH  awal media  dengan  rentang  6,5 – 7,5 (Oyedele  &  Ogunbanwo,  2014), 6 – 8 (Sidorova  et  al.,  2020),  dan  11 (Nalisha et al., 2006). Hal tersebut menunjukkan bahwa setiap strain memiliki pH awal media optimum yang berbeda dalam produksi senyawa antifungi.
Hasil  optimasi  agitasi sangat mempengaruhi keberhasilan proses fermentasi (Tian  et al., 2016), karena  agitasi  berperan  dalam  difusi  oksigen  dan  kontak  bakteri  dengan  substrat. B.  subtilis CAF3 memiliki agitasi optimum yang lebih rendah dibandingkan B. subtilis B29 (Li et al., 2009) dan B. subtilis CPA-8 (Yánez-mendizábal  et  al.,  2012) dengan  agitasi  150  rpm, B.  subtilis 20B  dengan  agitasi  160  rpm (Joshi, Bharucha, & Desai, 2008), dan B. subtilis EIR-J dengan agitasi 200 rpm (Wang et al., 2016) dalam menghasilkan  senyawa  antifungi.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  proses  optimasi  fermentasi perlu  dilakukan,  karena  setiap  strain  memiliki  kondisi  yang  optimum  yang  berbeda-beda.  Ektrak  yang dihasilkan B.  subtilis CAF3  lebih  banyak  dibandingkan  dengan  ektrak  yang  dihasilkan  oleh B.  pumilus MAIIIM4A (de  Melo  et  al.,  2009), begitu  juga  dengan  ekstrak  yang  dihasilkan  oleh  tumbuhan (Hanson, 2003). Pada umumnya ekstrak etil asetat memiliki jumlah dan bioaktivitas yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak  lainnya (Bhoonobtong  et  al.,  2012;  Battu  &  Reddy,  2009). Karena  jumlah  ektrak  dan bioaktivitasnya tinggi, maka banyak peneliti yang hanya menggunakan etil asetat dalam proses ekstraksi (Handayani  et  al.,  2015;  Kaaria  et  al.,  2012;  Niyaz,  2012). Hasil  MS  memperlihatkan  senyawa  yang dihasilkan  oleh B.  subtilis CAF3  berbeda  dengan  senyawa  yang  umum  dihasilkan  oleh  species  ini.  Pada umumnya B. subtilis menghasilkan surfaktin dengan berat 994 – 1.062 m/z (Wu, Park, & Ahn, 2013), iturin dengan berat 1.028 – 1.109 m/z dan fengisin 1.421 – 1.566 m/z (He et al., 2017; Wu et al., 2013; Zhao et al., 2016), basilomisin dengan berat (He et al., 2017), dan subtilisin dengan berat 3.399 – 3.473 m/z (Wu et  al.,  2013). Hasil  penelusuran  yang  dilakukan  pada  database  menunjukkan  senyawa  yang  dihasilkan adalah senyawa baru, sehingga perlu diidentifikasi lebih lanjut.

## 4. SIMPULAN
Fermentasi senyawa antifungi oleh B. subtilis CAF3 terhadap A. rolfsii optimum pada medium TSB, konsentrasi inokulum 5%, pH awal media 7 dan agitasi 110 rpm. Senyawa yang dihasilkan oleh strain ini merupakan senyawa yang berbeda dengan senyawa yang umum dihasilkan oleh B. subtilis .

## 5. DAFTAR PUSTAKA
Ahmad,  A.  M.,  Attia,  A.  G.,  Mohamed,  M.  S.,  &  Elsayed,  H.  E.  (2019).  Fermentation  ,  formulation  and evaluation of PGPR Bacillus subtilis isolate as a bioagent for reducing occurrence of peanut soil- borne diseases.
Journal of Integrative Agriculture , 18 (9), 2080 – 2092. https://doi.org/10.1016/S2095-3119(19)62578-5.
Ahmadzadeh,  M.,  &  Behboudi,  K.  (2009).  Interaction  Of  Different  Media  On  Production  And  Biocontrol Efficacy Of Pseudomonas Fluorescens P-35 And Bacillus Subtilis B-3 Against Grey Mould Of Apple, 91 , 65 – 70.
Awan,  Z.  A.,  &  Shoaib,  A.  (2019).  Current  Plant  Biology  Combating  early  blight  infection  by  employing Bacillus  subtilis  in  combination  with  plant  fertilizers. Current  Plant  Biology , 20 (September), 100125. https://doi.org/10.1016/j.cpb.2019.100125. Bacillus licheniformis. (2012), 01 (04), 498 – 510.
Battu, P., & Reddy, M. (2009). Isolation of secondary metabolites from Pseudomonas fluorescens and its Characterization. Asian Journal of Research in Chemistry , 2 (1), 26 – 29.
Bhoonobtong, A., Sawadsitang, S., & Sodngam, S. (2012). Characterization of Endophytic Bacteria , Bacillus Amyloliquefaciens  for  Antimicrobial  Agents  Production. International  Proceedings  of  Chemical, Biological & Environmenta , 40 , 6 – 11.
Chung, S., Kong, H., Buyer, J. S., Lakshman, D. K., Lydon, J., Kim, S., & Roberts, D. P. (2008). Isolation and partial  characterization  of  Bacillus  subtilis  ME488  for  suppression  of  soilborne  pathogens  of cucumber and pepper, 115 – 123. https://doi.org/10.1007/s00253-008-1520-4.
Dalal,  J.,  &  Kulkarni,  N.  (2013).  Antagonistic  and  Plant  Growth  Promoting  Potentials  of  Indigenous Endophytic Bacteria of Soybean ( Glycine max ( L ) Merril ), 1 (2), 62 – 69. de Melo, F. M. P., Fiore, M. F., de Moraes, L. A. B., Silva-Stenico, M. E., Scramin, S., Teixeira, M. de A., & de Melo,  I.  S.  (2009).  Antifungal  compound  produced  by  the  cassava  endophyte  Bacillus  pumilus
MAIIIM4A. Scientia Agricola , 66 (5), 583 – 592. https://doi.org/10.1590/s0103- 90162009000500002.
Farizan, N. (2006). Production of Bioactive Compounds by Bacillus subtilis against Sclerotium rolfsii, 2 (2),
19 – 23.
Hadiwiyono, H., & Widono, S. (2012). Endophytic Bacillus : the potentiality of antagonism to wilt pathogen and promoting growth to micro-plantlet of banana in vitro. Biomirror , 3 (June), 1 – 4.
Handayani, D., Sandrawaty, N., Murniati, M., & Regina, R. (2015). Screening of endophytic bacteria isolated from  marine  sponge  Haliclona  fascigera  for  inhibition  against  clinical  isolates  of  methicillin resistant  Staphylococcus  aureus  (MRSA). Journal  of  Applied  Pharmaceutical  Science , 5 (9),  139 – 142. https://doi.org/10.7324/JAPS.2015.50926. Hanson, J. (2003). Tutorial Chemistry Texts -- Natural Products: The Secondary Metabolites, 154.
He,  C.  P.,  Fan,  L.  Y.,  Wu,  W.  H.,  Liang,  Y.  Q.,  Li,  R.,  Tang,  W.,  …  Zheng,  F.  C.  (2017).  Identification  of lipopeptides  produced  by  Bacillus  subtilis  Czk1  isolated  from  the  aerial  roots  of  rubber  trees. Genetics and Molecular Research , 16 (1), 1 – 13. https://doi.org/10.4238/gmr16018710.
Huang,  J.,  Wei,  Z.,  Tan,  S.,  Mei,  X.,  Shen,  Q.,  &  Xu,  Y.  (2014).  Suppression  of  Bacterial  Wilt  of  Tomato  by Bioorganic  Fertilizer  Made  from  the  Antibacterial  Compound  Producing  Strain  Bacillus amyloliquefaciens HR62.
Islam, R., Jeong, Y. T., Lee, Y. S., & Song, C. H. (2012). Isolation and identification of Antifungal compounds from bacillus subtilis C9 Inhibiting the growth of plant pathogenic fungi. Mycobiology , 40 (1), 59 – 66. https://doi.org/10.5941/MYCO.2012.40.1.059.
Joshi,  S.,  Bharucha,  C.,  &  Desai,  A.  J.  (2008).  Production  of  biosurfactant  and  antifungal  compound  by fermented  food  isolate  Bacillus  subtilis  20B. Bioresource  Technology , 99 (11),  4603 – 4608. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2007.07.030.
Kaaria, P., Matiru, V., & Ndungu, M. (2012). Antimicrobial activities of secondary metabolites produced by endophytic  bacteria  from  selected  indigenous  Kenyan  plants. African  Journal  of  Microbiology Research , 6 (45), 7253 – 7258. https://doi.org/10.5897/AJMR12.785
Kambar, Y., Manasa, M., Vivek, M., & TR, P. K. (2014). Inhibitory Effect of Some Plants of Western Ghats of Karnataka against. Science, Technology and Arts Research Journal , 3 (2), 76 – 82. Lacerda, A., De Carvalho, U., Henri que, F., Corrêa De Oliveira, P., De Lima, R., Mariano, R., … Souto -Maior, A. M.  (2010).  BRAZILIAN  ARCHIVES  OF  BIOLOGY  AND  TECHNOLOGY  Growth,  Sporulation  and Production of Bioactive Compounds by Bacillus subtilis R14. Arch. Biol. Technol. V , 53353 (3), 643 – 652.
Li, J., Yang, Q., Zhao, L. H., Zhang, S. M., Wang, Y. X., & Zhao, X. Y. (2009). Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29. Journal of Zhejiang University: Science B , 10 (4), 264 – 272. https://doi.org/10.1631/jzus.B0820341. Mao,  X.  L.  J.  Y.  Z.  (2014).  Enhancement  of  Biocontrol  Activities  and  Cyclic  Lipopeptides  Production  by Chemical Mutagenesis of Bacillus subtilis XF-1 , a Biocontrol Agent of Plasmodiophora brassicae and Fusarium solani. https://doi.org/10.1007/s12088-014-0471-y.
Niyaz, A. (2012). Isolation and identification of secondary metabolites producing organisms from marine sponge. Discovery , 1 (1), 14 – 17.
Nor Irham Nor Azan, M., Kamal, P. N. S. M. M., Rasmadi, M. A. A., Adzhar, M. H., Zakaria, M. A., Taufek, A. S.
A., … Alikasturi, A. S. (2020). Production of biodiesel from palm oil refinery pilot plant waste using
Ni/CaO (ES) catalyst. Materials Today: Proceedings , 31 , 292 – 299. https://doi.org/10.1016/j.matpr.2020.06.012.
Omowumi, A., & Samuel, T. (2014). Antifungal activities of Bacillus subtilis isolated from some condiments and soil, 8 (18), 1841 – 1849. https://doi.org/10.5897/AJMR2013.6162.
Putri,  R.  E.,  Mubarik,  N.  R.,  Ambarsari,  L.,  &  Wahyudi,  A.  T.  (2021).  Antagonistic  activity  of  glucanolytic bacteria  Bacillus  subtilis  W3.15  against  fusarium  oxysporum  and  its  enzyme  characterization. Biodiversitas , 22 (9), 4067 – 4077. https://doi.org/10.13057/biodiv/d220956. Rautela, R., Kumar, A., & Abha, S. (2014). Lipopeptides from Bacillus strain AR2 inhibits biofilm formation by Candida albicans. https://doi.org/10.1007/s10482-014-0135-2.
Sidorova, T. M., Asaturova,  A. M., Homyak, A. I., Zhevnova, N. A., Shternshis, M. V.,  & Tomashevich,  N. S.
(2020).  Optimization  of  laboratory  cultivation  conditions  for  the  synthesis  of  antifungal metabolites  by  bacillus  subtilis  strains. Saudi  Journal  of  Biological  Sciences , 27 (7),  1879 – 1885. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.05.002.
Stanbury,  P.  F.,  Whitaker,  A.,  &  Hall,  S.  J.  (2016).  Principles  of  Fermentation  Technology:  Third  Edition. Principles of Fermentation Technology: Third Edition , 1 – 803.
Thomashow,  L.  S.,  Bonsall,  R.  F.,  &  Weller,  D.  M.  (2008).  Detection  of  Antibiotics  Produced  by  Soil  and Rhizosphere Microbes In Situ, 23 – 36.
Tian, Y., Fan, Y., Liu, J., Zhao, X., & Chen, W. (2016). Effect of nitrogen , carbon sources and agitation speed on acetoin production of Bacillus subtilis SF4-3. EJBT , 19 , 41 – 49. https://doi.org/10.1016/j.ejbt.2015.11.005. Uaac, A. A. F., Djamaan, A., Agustien, A., Zam, S. I., Jannah, M., Lalfari, R. S., … Suci, R. P. (2018). Research Article, 9 (8), 21 – 26. https://doi.org/10.7897/2230-8407.098158.
Usall,  J.,  Atare,  E.,  Vin,  I.,  Costa,  E.,  &  Teixido,  N.  (2002).  The  effect  of  nitrogen  and  carbon  sources  on growth of the biocontrol agent Pantoea agglomerans strain CPA-2, 117 – 120.
Wang, N. N., Yan, X., Gao, X. N., Niu, H. J., Kang, Z. S., & Huang, L. L. (2016). Purification and characterization of a potential antifungal protein from Bacillus subtilis E1R-J against Valsa mali. World Journal of Microbiology and Biotechnology , 32 (4), 1 – 10. https://doi.org/10.1007/s11274-016-2024-5. Wu, W. J., Park, S. M., & Ahn, B. Y. (2013). Isolation and characterization of an antimicrobial substance from Bacillus  subtilis  BY08  antagonistic  to  Bacillus  cereus  and  Listeria  monocytogenes. Food  Science and Biotechnology , 22 (2), 433 – 440. https://doi.org/10.1007/s10068-013-0098-5.
Yánez-mendizábal,  V.,  Viñas,  I.,  Usall,  J.,  Torres,  R.,  Solsona,  C.,  &  Teixidó,  N.  (2012).  Production  of  the postharvest biocontrol agent Bacillus subtilis CPA-8 using low cost commercial products and by- products, 60 , 280 – 289. https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2011.12.001.
Zam, S. I., Agustien, A., Djamaan, A., & Mustafa, I. (2019). The Diversity of Endophytic Bacteria from the Traditional  Medicinal  Plants  Leaves  that  Have  Anti-phytopathogens  Activity, 9 (1),  53 – 63. https://doi.org/10.11594/jtls.09.01.08.
Zhang,  Y.,  Wang,  X.,  Liang,  S.,  Shi,  Y.,  Chen,  X.,  Liu,  J.,  &  Wang,  A.  (2021).  Fermentation  optimization, fungistatic effects and tomato growth promotion of four biocontrol bacterial strains. Agriculture (Switzerland) , 11 (7), 1 – 18. https://doi.org/10.3390/agriculture11070686.
Zhao, Q., Dong, C., Yang, X., Mei, X., Ran, W., Shen, Q., & Xu, Y. (2011). Biocontrol of Fusarium wilt disease for  Cucumis  melo  melon  using  bio-organic  fertilizer. Applied  Soil  Ecology , 47 (1),  67 – 75. https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2010.09.010.
Zhao,  Q.,  Mei,  X.,  Xu,  Y.,  &  Engineering,  N.  (2016).  Isolation  and  Identification  of  Antifungal  Compounds Produced  by  Bacillus  Y-IVI  for  Suppressing  Fusarium  Wilt  of  Muskmelon, 52 (3),  167 – 175. https://doi.org/10.17221/70/2015-PPS.