## PENGARUH PEMANASAN BASAH DENGAN AUTOKLAF TERHADAP AKTIFITAS SENYAWA TOXALBUMIN PADA BIJI KEMIRI (Aleurites moluccana (L.) Willd)
Effect of Moist Heating Using Autoclav to Toxalbumine Activities in Candlenut (Aleurites moluccana (L.) Willd)
Mamang 1* , Mariyati Bilang 1 , Salengke 2
1 Department of Food Science and Technology Faculty of Agriculture, Hasanuddin University - Indonesia 2 Department of Agricultural Engineering Faculty of Agriculture, Hasanuddin University - Indonesia
*Corresponding author, e-mail: mamang.estepe@yahoo.com
Received: Nov. 2017 Published: Jan. 2018

## ABSTRACT
In addition to nutritional and  non-nutritional content, candlenut also contains toxalbumin, toxic compound that can inhibit protein synthesis. This study aims to inhibit toxalbumin activity in candlenut through moist heating treatment,  using  hemagglutination  method.  Defatted  candlenut  powder  was  being  treated  under  moist  heating using  autoclave  at  the  temperature  of  121 o C  for  5,10,  15  and  20  minutes  followed  by  oven  heating  at  the temperature of 70 o C for 7 hours and control, continued by dry heating using oven at the temperature of 70 o C for 7  hours  and  extraction  using  0.15  M  NaCl  at  room  temperature  then  precipitated  using  ammo nium  suplhate (60%) at room temperature for 4 hours. Supernatant was dialyzed with water and 0.15 M NaCl for 1 night each then  being  freeze  dried.  1  g  of  obtained  protein  fraction  was  purified  in  Sephadex  G-75  (10  cm  x  1.0  cm) column.  Resulted  extract  was  re-dried  using  freeze  dryer  for  hemagglutination  test  towards  A,  B,  AB  and  O blood  types.  The  result  shows  that  toxalbumin  acitivities  were  inhibited  by  moist  heating  in  autoclave  at  the temperature of 121 o C for 10 minutes followed by drying in oven 70 o C for 7 hours.
Keywords : Candlenut, moist heating, toxalbumin, hemagglutination.

## PENDAHULUAN
Tanaman  kemiri  (Aleurites  moluccana  (L.) Willd)  merupakan  salah  satu  tanaman  dari keluarga  Euphorbiaceae  (Lawrence,  1964)  yang tersebar  di  daerah  tropik  dan  subtropik (Purseglove,  1981).  Di  Indonesia  sendiri,  kemiri tersebar  ke  berbagai  propinsi  dan  dapat  tumbuh dengan  baik.  Kemiri  mengandung  zat  gizi  dan non  gizi.  Banyak  peneliti  telah  membuktikan bahwa  ketiga  komponen  ini  memiliki  arti  besar bagi  kesehatan.  Kandungan  zat  gizi  mikro  yang terdapat dalam kemiri adalah protein, lemak  dan karbohidrat.  Mineral  dominan  yang  terdapat dalam kemiri adalah kalium, fosfor, magnesium, dan  kalsium.  Dalam  kemiri  juga  terkandung  zat besi,  seng,  tembaga  dan  selenium  dalam  jumlah sedikit.  Kandungan  penting  lainnya  adalah vitamin,  folat,  serta  fitosterol  yang  dapat merusak  enzim pembentuk  kolesterol dalam  hati sehingga dapat menghambat pembentukan kolesterol.  Protein  pada  biji  kemiri  terdiri  dari asam  amino  essensial  maupun  non  esensial,
fungsi  asam  amino  esensial  antara  lain  untuk pertumbuhan  karena  asam  amino  terdapat  di semua  jaringan  dan  membentuk  protein  dan antibodi.  Asam  amino  non  esensial  yang menonjol  pada  kemiri  yaitu  asam  glutamate  dan asam  aspartat. Keberadaan asam  glutamate  yang memberikan rasa nikmat ketika kemiri digunakan  sebagai  bumbu  dapur  yang  dapat menjadi  pengganti  penyedap  masakan  seperti MSG (Wiyono dan Poedji, 1993).
Selain mengandung komponen gizi dan non gizi,  biji  kemiri  mengandung  senyawa  racun yaitu toxalbumin. Toxalbumin merupakan glikoprotein bersifat toksik yang dapat berpengaruh  pada  darah  yang  ditandai  dengan adanya aglutinasi atau penggumpalan pada darah (Aregheore, et  al ,  1998).  Toxalbumin  adalah fitotoxin  protein  (racun  yang  diproduksi  oleh tanaman)  yang  dapat  menghambat  sintesis protein.  Senyawa  ini  menjadi  salah  satu  faktor pembatas  pemanfaatan  kemiri  didalam  industri pangan.  Sementara  disatu  sisi  produksi  buah kemiri  yang  melimpah  merupakan  potensi  yang
sangat  besar  untuk  pegembangan  industri pengolahan  pangan,  termasuk  sebagai  bahan substitusi  kacang-kacangan  seperti  almond  dan kacang mete pada industri pengolahan cokelat.
Toxalbumin merupakan racun yang terdapat secara  alami  dalam  tanaman.  Ricin  merupakan salah  satu  senyawa  toxalbumin  yang  terdapat pada  biji  jarak  ( Ricinus  communis )  dan  tanaman yang  berasal  dari  family  Euphorbiaceae.  Ricin adalah protein  yang sangat berbahaya dan keras, racun  ini  dapat  menimbulkan  beberapa  penyakit pada beberapa organ yang berbeda dan kemudian akan  berakibat  pada  kematian  (Saeidnia  dan Abdollahi,  2013).  Aktifitas  hemaglutinasi  pada glikoprotein lectin yang  diekstrak  Cissus popluena  dalam  darah terhambat  dengan kenaikan  konsentrasi  glukosa  dan  fruktosa (Ayowinka and Dada, 2011)
Mekanisme  kerja  ricin  yang  merupakan senyawa  glikoprotein  pada  tanaman  jarak melibatkan  molekul  yang  terdiri  dari  rantai-A (32  Kda)  yang  bersifat  netral  terikat  dengan rantai-B (34 Kda) yang bersifat asam. Subunit-B mengikat glikoprotein pada permukaan sel epitel, sehingga memungkinkan subunit-A untuk masuk ke dalam sel melalui receptor-mediated endocytosis.  Sub  unit  ini  akan  menginaktivasi RNA ribosom dengan cara mendepurinasi residu ribosom  tertentu,  sehingga  menghambat  sintesis protein  (Lord  et  al.,  1994  dalam  Schep  et  al, 2009).  1  molekul  risin  dapat  menginaktivasi 2000  ribosom  per  menit  yang  secara  luar  biasa dapat  menyebabkan  kematian  sel  (Schep  et  al., 2009).  Pada  manusia,  500  µg  ricin  dapat menimbulkan  kematian  setelah  36  –  72    jam (Anonim, 2010).
Racun  toxalbumin  pada  biji  kemiri  dapat dihilangkan dengan perlakuan pemanasan sebelum  mengkonsumsi  biji  kemiri.  Masyarakat pada umumnya memberikan perlakuan pemanasan  singkat  seperti  pembakaran  ataupun penggorengan  pada  biji  kemiri  sebelum  diolah menjadi  bahan  campuran  makanan  (Paimin, 1997).    Dari  uraian  diatas  maka  perlu  dilakukan penelitian untuk mengetahui pengaruh pemanasan terhadap aktivitas senyawa toxalbumin  pada  biji  kemiri.  Pada  penelitian  ini pemanasan  yang  dilakukan  adalah  pemanasan basah  menggunakan  autoklaf  dengan  variasi waktu.

## METODOLOGI

## Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah, biji kemiri, aluminium foil, NaCl,  ammonium  sulfate,  PBS  (Phospat  Buffer Saline)  pH  7.4,    n-heksan,  kloroform,  dialysis sach 12 kDa,  darah manusia golongan A, B, AB dan O.

## Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah autoklaf, timbangan analitik, oven,  pipet volumetric 5 ml,  sentrifuge, tabung eppendorph, gelas piala, labu ukur 50 dan 100 ml, mikropipet, well  plate,  erlenmeyer,  magnetic  stirrer,  tabung reaksi,  pipet  volume,  freeze  dryer,  alat  press lemak.

## Perlakuan penelitian
Perlakuan pada penelitian ini meliputi tanpa pemanasan  sebagai  kontrol  (P0),  pengeringan dalam oven 70 o C selama 7 jam (P1), pemanasan basah  dengan  autoklaf    121 o C  selama  5  menit (P2),  pemanasan  basah  dengan  autoklaf    121 o C selama  10  menit  (P3),  pemanasan  basah  dengan autoklaf    121 o C  selama  15  menit  (P4), pemanasan  basah  dengan  autoklaf    121 o C selama  20  menit  (P5).  Untuk  P2,  P3, P4 dan  P5 masing-masing  dilanjutkan  dengan  pengeringan pada oven dengan suhu 70 o C selama 7 jam.

## Prosedur penelitian
Preparasi biji kemiri Sebanyak 0,1 gram ekstak kemiri ditambahkan dengan 10 ml PBS, dihomogenisasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit atau 2  x  2,5  menit  berturut-turut.  Selama  selang waktunya, sampel disimpan dalam es atau air es. Homogenat  kemudian  disentrifugasi  pada  3500g selama  10  menit.  Supernatan  diambil  dan dimasukkan dalam tabung eppendorph . Disentrifugasi  pada  9500g  selama  5  menit. Supernatan diambil dan digunakan sebagai untuk pengujian hemagglutinasi dengan beberapa serial pengenceran  larutan  PBS.  Prosedur  diatas dilakukan  pada  masing-masing  biji  kemiri  hasil perlakuan.

## Preparasi sel darah merah
Sebanyak  2  ml  darah  dimasukkan  kedalam tabung  15  ml  ditambahkan  PBS  sampai  tanda batas,  kemudian  disentrifugasi  pada  800  rpm
selama  10  menit.  Supernatan  dikeluarkan,  pellet (sel  darah  merah)  dicuci  dengan  menambahkan 12  ml  PBS,    dicampurkan  dengan  membalikkan tabung,  disentriugasi  pada  800  rpm  selama  5 menit.  Proses  pencucian  ini  diulangi  2  kali. Supernatan setelah pencucian terakhir dikeluarkan,  sel  darah  merah  ditambahkan dengan PBS secukupnya sampai diperoleh 10 % larutan sel darah merah. Kemudian dibuat 0,5 % larutan  sel  darah  merah  (SDMs)  dalam  PBS, yang  akan  digunakan  pada  tahap  analisa selanjutnya.  Prosedur  diatas  dilakukan  pada masing-masing  sampel  darah  (golongan  A,  B, AB dan O).

## Pengujian hemaglutinasi
Disiapkan microtiter plate 96-well. Kedalam setiap well (lubang) baris pertama diisi dengan  50  μl  PBS.  Pada well pertama, ditambahkan  50  µl  ekstrak  glikoprotein  kemiri yang  telah  disiapkan  sebelumnya,  kemudian diencerkan  menggunakan  mikropipet  dengan cara menghisap dan menekannya lalu dipindahkan 50 µl ke well kedua. Dicampur  dan diencerkan  lagi  kemudian  pindahkan  50    µl  ke well ketiga,  diulangi  pada well selanjutnya sampai  pada well 12.  Pada well 12  diambil  dan dibuang  50  µl.  Selanjutnya,  kedalam  masing- masing well ditambahkan  50  µl  0.5  %  SDMs dalam  PBS,  digoyang  selama  1  menit  dan dibiarkan  pada  suhu  kamar  selama  30  –  60 menit. Kemudian dilakukan pengamatan.
Gambar 1 Hasil uji hemaglutinasi
Hasil  uji  hemaglutinasi  dinyatakan  positif jika pada dasar microtiter plate tampak presipitat halus  seperti  pasir  yang  berarti  terjadi  aglutinasi (penggumpulan)  sel  darah  merah  (Batson  dalam Haryanto, dkk., 2012), sebagaimana terlihat pada Gambar 1.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji  hemaglutinasi  merupakan  suatu  uji untuk mengetahui keberadaan antigen virus yang dapat  mengaglutinasi  sel  darah  merah.  Pada penelitian  ini  uji  hemaglutinasi  dimaksudkan untuk mengetahui efektifitas perlakuan pemanasan  basah  terhadap  keberadaan  senyawa toxalbumin  dengan  melihat  daya  aglutinasi senyawa tersebut pada sel darah merah. Hasil uji hemaglutinasi  ekstrak  biji  kemiri  dari  berbagai perlakuan pada  sel darah merah A, B, AB dan O dapat  dilihat  pada  masing-masing    pada Gambar 2.
Berdasarkan  Gambar  2,  terlihat  bahwa daya  aglutinasi  ekstrak  biji  kemiri  pada  sel darah  merah  golongan  darah  A  dan  AB mulai  tidak  terlihat    pada  pengenceran  ke-7 (n7)  perlakuan  P3.  Hal  ini  berarti  perlakuan pemanasan basah dengan autoklaf pada suhu 121 o C  selama  10  menit  dan  dilanjutkan dengan  pengeringan  pada  oven  suhu  70 o C selama 7 jam (P3) sudah mampu menghambat  aktifitas  senyawa  toxalbumin pada  biji  kemiri.  Hasil  uji  hemaglutinasi pada  golongan  darah  B,  memperlihatkan bahwa pada pengenceran ke-8 (n8) perlakuan pemanasan basah dengan autoklaf pada  suhu  121 o C  selama  10  menit  dan dilanjutkan  dengan  pengeringan  pada  oven suhu  70 o C  selama  7  jam  (P3)  tidak menunjukkan  terjadinya  aglutinasi  sel  darah merah,  yang  berarti    bahwa    perlakuan tersebut telah menghambat aktifitas senyawa toxalbumin pada biji kemiri. Begitupun dengan hasil uji
hemaglutinasi  pada  golongan  darah  O, diketahui  bahwa  senyawa  toxalbumin  pada biji  kemiri  perlakuan  pemanasan  basah dengan autoklaf pada suhu 121 o C selama 10 menit  dan  dilanjutkan  dengan  pengeringan pada  oven  suhu  70 o C  selama  7  jam  (P3) pada pengenceran ke-6 (n6) sudah tidak aktif lagi. Hal ini ditandai dengan tidak terjadinya aglutinasi pada sel drah merah.

## Penentuan Kadar Logam Cd pada Sampel
Gambar 2   Hasil uji hemaglutinasi dari berbagai perlakuan pemanasan basah pada berbagai golongan darah
Hasil  penelitian  yang  diperoleh  sejalan dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh  Situru  M (2014),  yang  melaporkan  bahwa  senyawa toxalbumin  pada  biji  kemiri  sudah  berkurang yang  ditandai  dengan  sudah  tidak  terjadi  lagi aglutinasi  pada  sel  darah  merah  dengan pemanasan  basah  suhu  121 o C,  15  menit kemudian  pengeringan  suhu  80 o C,  8  jam, begitupun    dengan  penelitian  Anggareni  (2014) melaporkan  bahwa  hasil  uji  hemaglutinasi ekstrak  biji  kemiri  yang  telah  dipanaskan  pada suhu  121 o C,  15  menit  tidak  menunjukkan aglutinasi.  Aregheore et  al (1998),  melaporkan hasil  uji  hemaglutinasi  lektin  inaktif  dengan pemanasan  pada  suhu  121 o C  selama  10  -  40 menit.  Lektin  ini  merupakan  salah  satu  senyawa glikoprotein  yang  bersifat  toksik  yang  terdapat pada tanaman jarak.
Dari  hasil  penelitian,  diketahui  bahwa aktifitas  senyawa  toxalbumin  pada  biji  kemiri dengan  konsentrasi  yang  rendah  pada  semua golongan  darah  (A,  B,  AB  dan  O)  sudah  dapat dihambat  dengan  perlakuan  pemanasan  basah dengan  autoklaf  pada  suhu  121 o C  selama  10 menit  dan  dilanjutkan  dengan  pengeringan  pada oven  suhu  70 o C  selama  7  jam  (P3).  Pada
golongan  darah  A  dan  B  sudah  terhambat  pada pengenceran  ke-7,  golongan  darah  AB  pada pengenceran  ke-8  dan  golongan  darah  O  pada pengenceran ke-6.
Hasil  penelitian  juga  menunjukkan  bahwa jenis golongan darah tidak memberikan pengaruh terhadap  aktifitas  senyawa  toxalbumin  pada  biji kemiri.  Hal  ini  sesuai  dengan  hasil  penelitian Ayowinka  dan  Dada  (2011),  bahwa  aktivitas hemaglutinasi  lectin  (senyawa  glikoprotein Cissus  populnea)  terhadap  sel  darah  manusia tidak selektif terhadap jenis golongan darah.
Ikatan  yang  menghubungkan  antara  gula dan  asam  amino  pada  kebanyakan  glikoprotein adalah ikatan hidrogen.     Ikatan hidrogen sangat dipengaruhi oleh peningkatan suhu, dimana pada suhu  tinggi  ikatan  hidrogen  akan  putus  (Jaya dkk.,  2016;  Taufik  2011).  Hal  ini  menyebabkan molekul  gula  dan  asam  amino  akan  terpisah sehingga  kemampuan  untuk  mengaglutinasi darah  akan  hilang.    Menurut  Lord  et  al.,  1994 dalam Schep et al., 2009,  mekanisme kerja ricin yang  merupakan  senyawa  glikoprotein  pada tanaman  jarak    melibatkan  molekul  yang  terdiri dari rantai-A (32 Kda) yang bersifat netral terikat dengan  rantai-B  (34  Kda)  yang  bersifat  asam. Subunit-B mengikat glikoprotein pada permukaan  sel  epitel,  sehingga  memungkinkan subunit-A  untuk  masuk  ke  dalam  sel  melalui receptor-mediated endocytosis. Sub unit ini akan menginaktivasi  RNA  ribosom  dengan  cara mendepurinasi residu ribosom tertentu, sehingga menghambat sintesis protein.

## KESIMPULAN
Aktivitas  senyawa  toxalbumin  pada  biji kemiri terhambat dengan  pemanasan basah pada autoklaf  suhu  121 o C  selama  10  menit dilanjutkan  dengan  pengeringan  dalam  oven suhu  70 o C  selama  7  jam  dan  tidak  selektif terhadap jenis golongan darah.

## DAFTAR PUSTAKA
Anggareni,  A.,  2014, Pengaruh  Pemanasan Basah  dan  Pemanasan  Kering  terhadap Kadar  Toxalbumin  dan  Mutu  Biji  Kemiri (Aleurites  moluccana) .  Skripsi.  Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan,
Universitas Hasanuddin.
Anonim,  2015a,  Ricin  Toxin  from  Castor  Bean Plant,  Ricinus  communis.  Diakses  20  Mei
Keterangan :
P0 : Kontrol (tanpa pemanasan)
P1 : Tanpa pemanasan basah, pengeringan dalam oven 70 0 C, 7 jam P2 : Pemanasan basah dengan autoklaf  121 o C, 5 mnt dan pengeringan dlm oven 70 o C, 7 jam P3 : Pemanasan basah dengan autoklaf  121 o C, 10 mnt dan pengeringan dlm oven 70 o C, 7 jam P4 : Pemanasan basah dengan autoklaf  121 o C, 15 mnt dan pengeringan dlm oven 70 o C, 7 jam P5 : Pemanasan basah dengan autoklaf  121 o C, 20 mnt dan pengeringan dlm oven 70 o C, 7 jam ni  : Pengenceran ke-i (+) : Teraglutinasi
2015.Available from: http://www.ansci. cornell.edu/plants/toxicagents/ricin. html. Anonim,  2015b,  Hemagglutination  (HA)  Assay Protocol.  Diakses  20  Mei  2015.  Available from : http://www.VIRAPUR.com
Aregheore,  E.M.,  Makkar,  H.P.S,  Bekker,  K.,
1998,  Assessment  of  Lectin  Activity  in  A tonic  and  a  Non-Tonic  Variety  of  Jatropha curcas  using  Latex  Agglutination  and haemagglutination Methods
and Inactivation of Lectin by Heat Treatments, J Sci Food Agric . 1998, 77. 349-352.
Awoyinka,  O.A.,  Dada,  O.O.,  2011,  Partial Purification  and  Characterization  Lectin from  the  Seeds  of Cissus  popluena.
European  Journal  of  Medicinal  Plants. 1(4): 130-139, 2011.
Haryanto,  A.,  Kristanti,  B.,  Irianingsih,  S.H.,
Yudianingtyas,  D.W.,  2012, Diagnosis Molekuler  Virus  Flu  Burung-A  Subtipe  H5 Berdasarkan  Amplifikasi  Gen  M  dan  H5 dengan  Metode Onestep  Simplex RT-PCR. Jurnal Veteriner. 13(2): 92-101.
Jaya,  R.S.,  Ginting,  S.,  Ridwansyah,  2016,
Pengaruh  Suhu  Pemanasan  dan  Lama Penyimpanan  Terhadap  Perubahan  Kualitas Nira  Aren, Jurnal  Rekayasa  Pangan  dan
Pertanian , 4(1). Lawrence,  1964, Taxonomi  of  Vascular  Plants , New York: The MC Milan Co.
Paimin,  F.R.,  1997, Kemiri  :  Budidaya  dan Prospek Bisnis, Penebar Swadaya. Jakarta.
Purseglove,  J.W.,  1981, Aleurites  Moluccana Wild, Tripocal  Crops  Dicotyledons, Vol  1. The  Print  house  (Pte)  Ltd,  Singapore  L: 140-144.
Schep,  L.J.,  Temple,  W.A.,  Butt,  G.A.,  Beasley, M.D.,  2009,  Ricin  as  a  Weapon  of  Mass Terror-Separating Fact From Fiction, Environment International . 35 (2009) 1267- 1271.
Situru,  M.  2014, Studi  Pengaruh  Pemanasan Basah  dan  Pemanasan  Kering  Terhadap Kandungan  Toxalbumin  Pada  Biji  Kemiri (Aleurites  mollucana) . Skripsi .    Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Universitas Hasanuddin, Makassar.
Taufik,  M.,  2011,  Kajian  Potensi  Kulit  Kaki
Ayam  Broiler  sebagai  Bahan  Baku  Gelatin dan Aplikasinya dalam Edible Film Antibakteri, Disertasi ,  Fakultas  Peternakan Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Wiyono,  B.,  Poedji  H.,  1993,  Pengaruh
Perlakuan Pendahuluan Biji Kemiri
Terhadap  Rendemen  dan  Sifat  Minyaknya, Jurnal  Penelitian  Hasil  Hutan .  11(5)  173- 174.