## STUDI PENDAHULUAN ENZIM KITINASE EXTRASELULER YANG DIHASILKAN OLEH ISOLAT BAKTERI ASAL MANADO 1)

## [Preliminary Study of Extracellular Chitinase Produced by Bacteria Isolated from Manado]
E.Y. Purwani 2) , A. Toharisman 2) , E. Chasanah 2) , J.F. Laksmi 2) , V. Welan 2) , M.T. Suhartono 2)
T. Purwadaria 3) , J.K Hwang dan Y.R. Pyun 4)
1) Makalah dipresentasikan pada Seminar Nasional PATPI, Semarang 9-10 Oktober 2001
2) PAU Bioteknologi IPB Jl. Puspa 1 Institut Pertanian Bogor, Bogor 16610
3) Balai Penelitian Ternak Ciawi, Bogor
4) Bioproduct Research Center, Yonsei University Seoul, Korea

## ABSTRACT
Chitinolytic bacteria were isolated from several exotic area in Manado Province. The most potential isolate, namely 13.26, was isolated from Tompaso. The isolate was cultured in the thermus medium containing colloidal chitin as a carbon source for 5 days at 55°C to produce chitinase. It was observed that chitinase was most active at 65°C and the optimum pH was 8 in boric acid-borax buffer. Ammonium sulfate (50% saturation) precipitation of the protein increased the specific activity of the enzyme from 0.20 unit/mg protein (in culture supernatant) to 0.28 unit/mg protein. The molecular weight as estimated by zymogram analysis was180 kDa.

## Key words : Chitin, and chitinase

## PENDAHULUAN
Kitin merupakan polimer rantai lurus yang tersusun atas  residu  N-acetylglucosamine  (GLcNAc)  melalui  ikatan -1,4.  Kitin  banyak  tersedia  di  alam,  nomor  dua  setelah selulosa.  Kontribusi  kitin  terbanyak  diberikan  oleh  hasil samping produk laut seperti kepiting, udang, cumi, kerang dan  sebagainya.  Diperkirakan  produksi  kitin  mencapai sekitar 80000 metrik ton per tahun (Patil et al., 2000).
Kitin  dan  produk  turunannya  antara  lain  berupa oligomer  kitin,  khitosan  dan  sebagainya  diketahui  bernilai ekonomi tinggi sehingga banyak penelitian mulai diarahkan padanya.  Produk-produk  turunan  kitin  telah  dimanfaatkan pada berbagai bidang, seperti kosmetik, biomedis, farmasi dan  pertanian.  Produk  turunan  kitin  tersebut  makin beragam  berkat  pemanfaatan  enzim-enzim  pendegradasi kitin.
Degradasi  kitin  secara  enzimatis  oleh  kitinase berlangsung  secara  bertahap.  Mula  mula  polimer  kitin dipecah  menjadi  oligomer  kitin  (umumnya  berupa  dimer) dan selanjutnya diuraikan menjadi monomer GLcNAc oleh -N-asetilglukosaminidase.  Kitinase  (E.C.  3.2.1.14) dihasilkan  oleh  berbagai  organisme  seperti  serangga, crustacea,  jamur  dan  bakteri.  Bakteri  penghasil  enzim kitinase dapat dideteksi dan diisolasi melalui terbentuknya zona  bening  pada  medium  selektif  agar  (David  dan Eveleigh 1984; Muzzarelli dan Ricardo, 1996).
Pada beberapa dekade terakhir, enzim yang stabil pada  kondisi  ekstrim  (terutama  pada  suhu  tinggi)  makin
banyak  diminati  oleh  kalangan  industri.  Pada  suhu  tinggi, resiko kontaminasi berkurang dan laju reaksi berjalan lebih cepat  sehingga  prosesnya  dirasa  makin  efisien.  Selain  itu enzim  yang  stabil  pada  suhu  tinggi  (termostabil)  telah menjadi  pusat  perhatian  banyak  peneliti  karena  struktur dan  sifatnya  yang  unik.  Enzim  termostabil  biasanya dihasilkan  oleh  mikroorganisme  yang  hidup  pada lingkungan yang bersuhu tinggi pula seperti kawah gunung berapi, sumur hidrotermal dan sebagainya.
Sebagai  negara  yang  memiliki  kekayaan  hayati tinggi,  Indonesia  tentunya  merupakan  salah  satu  habitat bagi mikroorganisme penghasil enzim kitinase. Daerah/kawasan  sumur  hidrothermal  merupakan  wilayah Indonesia  yang  belum  banyak  digali  potensinya.  Sejalan dengan  kondisi  di  atas,  penelitian  bertujuan  untuk mengisolasi  bakteri  yang  mampu  menghasilkan  enzim kitinase  termostabil  dan  mempelajari  karakteristik  enzim kitinase.

## METODOLOGI

## Bahan kimia
Koloidal  kitin  dibuat  dari  kitin  komersial,  sesuai dengan  metoda  Arnold  dan  Solomon  (1986).  Glikol  kitin disiapkan  dari  glikol  kitosan  dengan  cara  yang  diuraikan oleh Rudel dan Asselin (1989). Bahan kimia lain diperoleh dan suplier yang ada di Bogor.
Isolasi  dan  Seleksi  Bakteri  Pendegradasi  Kitin (Kitinoliti k).
Contoh  (berupa  tanah  atau  air)  disuspensikan dalam  akuades  steril  dan  disebar  pada  cawan  agar  yang berisi:  0.7%  (NH 4 ) 2 SO 4 ,  0.1%  K 2 HPO 4 ,0.1%  NaCl,  0.01% MgSO 4 7H 2 O, 0.05% ekstrak khamir, 1.5% campuran agar dan gel rit, dan 2% koloidal kitin. Cawan diinkubasi selama 3-4  hari  pada  suhu  55 C.  Mikroorganisme  yang membentuk  zona  bening  diisolasi  dan  diseleksi kemampuan  kitinolitiknya  dengan  cara  menghitung  indeks kitinolitik (rasio antara diameter zona bening dan diameter koloni). Isolat dengan indeks kitinolitik tertinggi dipilih untuk penelitian selanjutnya.

## Produksi Enzim .
Starter  disiapkan  dengan  cara  menumbuhkan isolat  bakteri  di  dalam  10  ml  medium  cair  yang mengandung: (NH 4 ) 2 SO 4 0.7%, K 2 HPO 4 0.1%, NaC1 0.1%, MgSO 4 7H 2 O  0.0  1%,  ekstrak  khamir  0.05%,  bakto  tripton 0.1% dan koloidal kitin 0.5%; pH 7 selama 12-20 jam, pada 55 C. Sepuluh mililiter starter dipindahkan ke dalam 90 ml medium  cair  serupa,  dan  diinkubasi  selama  96  jam  55 C untuk produksi enzim kitinase.
Pemekatan Enzim. Medium  disentrifugasi  (4000  rpm,  10  menit). Supernatannya  dikumpulkan,  kemudian  ditambah  dengan amonium  sulfat  hingga  50%  jenuh  secara  bertahap, dibiarkan  semalam  pada  4 C.  Setelah  sentrifugasi  (4000 rpm,  15  menit),  endapan  diambil  dan  supernatannya dikumpulkan  untuk  pengendapan  tahap  II.  Endapan tersebut  dilarutkan  dalam  bufer  fosfat  50  mM,  pH  7  dan didialisis  di  dalam  bufer  yang  sama  (25  mM)  semalam, pada 4 C untuk mendapatkan enzim kasar Fraksi 50 (F50). Supernatan  yang  tersisa  diendapkan  lebih  lanjut  dengan amonium  sulfat  hingga  80%  jenuh  seperti  tahap sebelumnya. Enzim yang diperoleh disebut sebagai enzim kasar  Fraksi  80  (F80).  Enzim  selanjutnya  dipanaskan selama  45  menit  pada  55 C  untuk  mendapatkan  enzim kitinase tahan panas.

## Uji Aktifitas Enzim.
Aktifitas khitinase dianalisis dengan menggunakan substrat  koloidal  kitin  (Ueda  dan  Arai,  1992)  dengan beberapa modifikasi. Campuran terdiri dari 300  1 substrat (0.3%  koloidal  kitin),  150  1  bufer  dan  150  1  enzim diinkubasi pada suhu 55 C atau 60 C selama 30 menit.
Campuran  segera  disentrifugasi  (10000  rpm,  4 menit), dan gula reduksi yang berada di dalam supernatan diukur  dengan  metoda  Schales  (Imoto  dan  Yagashita, 1971),  dengan  GLcNAc  sebagai  standar.  Aktifitas  kitinase (dinyatakan  dalam  unit)  didefinisikan  sebagai  jumlah
GLcNAc ( mol) yang dibebaskan setiap menit pada kondisi analisis yang ditentukan.

## Kadar protein.
Kadar  protein  diukur  dengan  metoda  Bradford (1976)  dengan  standar  serum  albumin  (Bovine  Serum Albumin= BSA).

## Elektroforesis.
Elektroforesis  gel  Poliakrilamida  (SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electroforesis) dikerjakan  menurut  metoda  Laemli  (1970)  dengan beberapa  modifikasi.  Analisis  zimogram  dikerjakan mengikuti  metoda  Morimoto  et  al.,  (1997).  Langkah  yang dilakukan sebagai berikut: contoh protein dicampur dengan bufer  contoh  (Tris-HCl  60  mM,  gliserol  25%,  SDS  2%,  2- merkaptoetanol  14,4  mM, bromophenol  blue 0.1%), kemudian  dipanaskan  70 C  selama  30  menit.  Protein dipisahkan  dengan  cara  elektroforesis  di  dalam  gel poliakrilamida  (8%)  yang  berisi  substrat  glikol  kitin  0.1%, dilanjutkan  dengan  renaturasi  protein  semalam  (4 C)  di dalam  bufer  renaturasi  yang  berisi  Tris-HCI  50  mM  [pH 7.5],  merkaptoetanol  5  mM  dan  EDTA  1mM.  Gel dipindahkan  ke  dalam  bufer  serupa  (segar),  diinkubasi selama 1 jam untuk memberi kesempatan enzim mencerna substrat, kemudian diwarnai dengan Congo Red 0.1% (15 menit) dan dicuci dengan NaCl 1M.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi  dan  Seleksi  Isolat  Bakteri  Pendegradasi Kitin Contoh  berasal  dari  daerah  sumur  hidrothermal yang  ada  di  Propinsi  Sulawesi  Keempat  lokasi  tersebut berbeda terutama dalam hal keasamannya (Tabel 1).
Tompaso  mewakili  daerah  agak  asam  (pH  4-  7), Lahendong  daerah  asam  (pH  1-4),  Karumenga  daerah netral  (pH  7)  dan  Likupang  daerah  agak  basa  (pH  8). Bakteri  termofilik  berhasil  dikulturkan  dari  contoh  asal Tompaso  dan  Lahendong.  Diantara  ratusan  bakteri termofilik asal Tompaso, hanya 41 koloni saja (sekitar 10%) yang menunjukkan aktifitas kitinolitik. Penapisan lebih lanjut menghasilkan  lima  isolat  dengan  indeks  kitinolitik  tinggi (lebih  dari  1.5).  Dari  Tabel  2.  tampak  bahwa  isolat  13.26 memiliki  indeks  khitinolitik  terbesar  dan  oleh  karenanya isolat ini dikulturkan lebih lanjut di dalam medium cair untuk menghasilkan enzim kitinase ekstra selular.
Tabel 1. Jumlah isolat bakteri asal Menado yang berhasil dikulturkan pada suhu 55 C
Asal isolat Jumlah koloni Kondisi lingkungan Isolat termofilik non kitinolitik Isolat termofilik kitinolitik Tompaso 335 41 pH 4-7, suhu 40-90 C Lahendong 8 - pH 1-4, suhu 35-85 C Karumenga - - pH 7, suhu 30-85 C Likupang - - pH 8, suhu 30-85 C Tabel 2. Indeks kitinolitik beberapa isolat bakteri termofilik Kode isolat Indeks kitinolitik Kondisi Lingkungan Isolat 13.26 2.40 Suhu 50 C, pH 6 Isolat 12.2 2.25 Suhu 80 C, pH 6 Isolat 13.30 2.20 Suhu 50 C, pH 6 Isolat 13.5 1.90 Suhu 50 C, pH 6 Isolat 13.9 1.75 Suhu 50 C, pH 6

## Karakteristik Enzim Kitinase
Suhu  dan  pH  optimum  enzim  kitinase  ditentukan pada  contoh  yang  berupa  kultur  bebas  sel  (broth).  Hasil analisis  menunjukkan  bahwa  enzim  kitinase  yang
dihasilkan  oleh  isolat  13.26  sangat  aktif  pada  suhu  65°C (Gambar  1)  dan  pH  8  dalam  bufer  asam  borat  borax (Gambar 2).
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 50 55 60 65 70 75 Suhu (oC) A kt ifi ta s re la tif ( % )
Gambar 1. Aktifltas enzim kitinase yang diuji pada berbagai suhu
0 20 40 60 80 100 120 4 5 6 7 8 9 10 pH A kt ifi ta s re la tif ( % )
Gambar 2. Aktifitas kitinase di dalam berbagai pH pada suhu 65 C: bufer citrat 50 mM (pH 4,5), bufer phosphat 50 mM (pH 6,7), bufer Mc Ilvaine (pH 7,2), bufer asam borat-borax (pH 8,9), bufer Glisin-NaOH 50 mM (pH10).
Suhu optimum enzim kitinase yang dihasilkan oleh isolat  13.26  ini  sebanding  dengan  laporan  sebelumnya. Rahayu  et  al.,  (2000)  melaporkan  bahwa  enzim  kitinase yang  dihasilkan  oleh  kelompok Bacillus  sp yang  diisolasi dari  kawah  Kamojang  aktif  pada  suhu  55 o C, sedangkanenzim kitinase yang dihasilkan oleh isolat bakteri dari  kawah  Tangkuban  Perahu  aktif  pada  suhu  70 C. Enzim kitinase bakterial pada umumnya aktif pada kisaran suhu 40-60 C (Hiraga et al., 1997).
Enzim  kitinase  yang  dihasilkan  oleh  isolat  di  atas aktif pada kondisi agak basa (pH 8), dan ini mirip dengan enzim  serupa  yang  dihasilkan  oleh Alteromonas  sp strain O7  (Tsujibo  et  al . ,  1992  disitir  oleh  Hiraga  et  al.,  1997). Namun  kondisi  tersebut  sangat  berbeda  dengan  enzim kitinase  yang  dihasilkan  oleh  isolat  bakteri  yang  diperoleh dari  Kawah  Kamojang  yang  aktif  di  pH  7  (Rahayu  et  al., 2000)  atau  isolat  yang  diperoleh  dari  Kawah  Tankuban Perahu yang aktif di pH 5 (Natsir et al . , 2000).
Pemekatan Protein Protein (enzim) dipekatkan dengan metoda “salting out”,  dengan  menambahkan  amonium  sulfat  pada  tingkat kejenuhan 50% (F50) dan 80% (F80) yang dikombinasikan dengan  pemanasan  selama  45  menit  pada  55 C.  Hasil analisis  menunjukkan  bahwa  aktifitas  spesifik  enzim kitinase  pada  F50  tanpa  atau  dengan  pemanasan meningkat  sekitar  1.4  kali  lebih  tinggi  dibanding  aktifitas enzim  serupa  yang  ada  di  dalam  kultur  bebas  sel  (broth), sedangkan  pada  F80  aktifitas  spesifiknya  relatif  sama dengan yang ada di broth (Tabel 3).
Dari  hasil  tersebut  tampak  bahwa  penambahan  amonium sulfat sebanyak 50% belum mampu mengendapkan semua protein yang memiliki aktifitas kitinase.
Aktifitas  spesifik  enzim  kitinse  yang  dihasilkan  oleh isolat  13.26  di  dalam  medium  kultivasi  (0.20  unit/mg peotein) ini relatif lebih tinggi dibandingkan aktifitas spesifik enzim  serupa  yang  dihasilkan Pseudomonas  aeroganosa (0.15  unit/mg  protein)  seperti  yang  dilaporkan  oleh  Wang
dan  Chang  (1997).  Namun  demikian,  teknik  pemekatan protein  yang  diterapkan  masih  betum  efektif  dibanding teknik yang dilaporkan oleh peneliti sebelumnya. Wang dan Chang  (1997)  mampu  meningkatkan  aktifitas  kitinase  dan 0.15  unit/mg  protein  menjadi  0.25  unit/mg  protein  dengan penambahan  amonium  sutfat  hingga  kejenuhan  80%. Sedangkan Ohishi et al., (1996) memanfaatkan teknik ultra filtrasi untuk memekatkan protein (enzim) kitinase.

## Stabilitas Panas
Enzim  kasar  tahan  panas,  F50,  diuji  stabilitasnya pada  suhu  55 C  dan  65 C  selama  beberapa  jam.  Hasil analisis menunjukkan bahwa setelah pemanasan selama 3 jam  pada  suhu  55 C,  aktifitas  enzim  masih  tersisa  lebih dan 80% (Gambar 3). Sebaliknya, hanya dalam tempo satu jam  saja,  pemanasan  pada  suhu  65 C  telah  merusak aktifitas enzim hingga 90% (data tidak disajikan). Implikasi dari  hasil  eksplorasi  ini  adalah  bahwa  isolat  13.26  dapat dijadikan  alternatif  sumber  gen  bagi  enzim  kitinase  tahan panas.  Di  lain  fihak,  masih  diperlukan  upaya  lain  untuk meningkatkan  stabilitas  panas  enzim  kitinase  pada  suhu lebih dari 55 C.

## SDS-PAGE dan Analisis Zimogram
Hasil  pemisahan  protein  dengan  SDS-PAGE menunjukkan bahwa berat molekul dari kitinase yang dapat dari  broth  bervariasi  antara  kurang  53  kDa  hingga  sekitar 116  kDa.  Dengan  kata  lain  tingkat  kemurniannya  sangat rendah.  Perlakuan  panas  tidak  mempengaruhi  protein fraksi F50.
Di  lain  fihak  perbedaan  pola  pita  protein  justru terdeteksi  pada  fraksi  F80  tanpa  dipanaskan  dengan  F80 yang  dipanaskan.  Pita  protein  berukuran  sekitar  116  kDa tampak  pada  contoh  F80  yang  dipanaskan  (Gambar  4). Gejala  ini  masih  perlu  diteliti  dan  dikonfirmasi  lebih  lanjut.
Tabel 3. Aktifitas enzim kitinase yang dihasilkan oteh isolat 13.26 pada tahap pemekatan
Tahap Protein Aktifitas Kelipatan mg/ml unit/ml unit/mg protein Broth 0.02 3.94 x l0 -3 0.20 1 Amonium sulfat 50% (F50) 0.12 3.40 x l0 -2 0.28 1.4 F50, dipanaskan 55 C, 45 menit a) 0.08 2.l6 x 10 -2 0.27 1.4 Amonium sulfat 80% (F80) 0.16 3.11 x l0 -2 0.19 1 F80 dipanaskan 55 C, 45 menit 0.097 2.05 x 10 -2 0.21 1
a) Disebut sebagai enzim kasar F50
0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 Pemanasan di 55 o C (Jam) S is a A k ti v it a s (% )
Gambar 3. Stabilitas panas fraksi F 50 tahan panas pada suhu 55 C. Sisa aktifitas kitinase diukur pada suhu 65 C di dalam bufer borat pH 8.
Gambar 4. Hasil pemisahan protein dengan SDS-pAGE
Ukuran protein yang memiliki aktifitas kitinase diukur dengan  menggunkaan  teknik  zimogram.  Dalam  teknik  ini
protein  dipisahkan  dengan  cara  elektroforesis  di  dalam  gel poliakrilamida yang berisi substrat glikol kitin.
Hasil  pemisahan  menunjukkan  bahwa  pewarnaan dengan  comassie  blue  tidak  memberikan  pita  protein  yang cukup jelas, meskipun total protein yang dimasukkan di dalam sumur  cukup  tinggi  (lebih  dari  0.2  g).  Hal  ini  diduga  akibat adanya glikol kitin di dalam gel yang menghalangi pewarnaan protein oleh Comassie Blue.
Di  lain  fihak,  aktifitas  protein  dapat  dikembalikan  di dalam  bufer  renaturasi  yang  mengandung  merkaptoetanol  5 mM  maupun  50  mM,  yang  ditunjukkan  oleh  munculnya daerah  bening  (pita).  Aktifitas  total  protein  yang  dimasukkan ke  dalam  setiap  sumur  gel  tampaknya  ikut  menentukan  ada tidaknya  pita  protein  aktif.  Pita  protein  tidak  terdeteksi  di dalam  broth.  Hasil  evaluasi  menunjukkan  bahwa  aktifitas protein  di  dalam  gel  dapat  terdeteksi  apabila  protein mempunyai  aktifitas  total  minimal  sebesar  10  unit  (Tabel  4). Hasil  evaluasi  lebih  lanjut  menunjukkan  bahwa  perubahan glikol  kitin  dari  0.1%  menjadi  0.05%  di  dalam  gel  tidak mempengaruhi  pemisahanan  pita  protein  (Gambar  tidak disajikan).
Berat  molekul  protein  dengan  aktifitas  kitinase ditentukan  dari  berbagai  contoh  (Gambar  5).  Berdasarkan
data  tersebut,  diduga  enzim  kitinase  mimiliki  berat  molekul sekitar  180  kDa.  Berat  molekul  enzim  kitinase  bervariasi tergantung  pada  sumbernya.  Ueda  dan  Arai  (1992) melaporkan  bahwa Aeromonas sp  menghasilkan  enzim kitinase  dengan  berat  molekul  antara  112-115  kDa, sedangkan  Ueda  et  al.,  (1995)  menyatakan  bahwa mikroorganisme serupa mampu menghasilkan enzim kitinase yang berat molekulnya berukuran antara 89 hingga 115 kDa.
Berat molekul enzim kitinase diduga mencapai lebih dan 180 kDa.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  merupakan  bagian  dari  kerjasama antara  PAU  Bioteknologi  IPB  dengan  Bioproduct  Research Center Yonsei University, Seoul, Korea.
Tabel 4. Pemisahan pita protein di dalam gel poliakrilamida yang diwarnai dengan comassie blue dan zymogram
Contoh Protein total ( g) Aktifitas total (unit) Gel I Gel II CB Zimogram 1 CB Zimogram 1 Broth 0.40 8 x 10 -5 tidakjelas - tidakjelas - F50 2.40 6.72 x 10 -4 tidakjelas + tidakjelas + F50 , dipanaskan 1.50 4.05 x 10 -4 tidakjelas + tidakjelas + Keterangan: CB : Gel diwarnai dengan Comassie Blue
Zimogram 1 : Renaturasi dalam bufer ranaturasi berisi merkaptoetanol 5 mM Zimogram 2 : Renaturasi dalam bufer renaturasi berisi merkaptoetanol 50 mM
Gambar 5. Zimogram enzim khitinase yang dihasilkan oleh Isolat 13.26.

## KESIMPULAN
Lima  isolat  bakteri  pendegradasi  khitin  berhasil diisolasi  daerah  Menado,  satu  diantaranya  (Isolat  13.26) dikulturkan  di  dalam  medium  cair  untuk  menghasilkan enzim kitinase.
Enzim  kitinase  yang  dihasilkan  oleh  isolat  13.26 sangat aktif pada suhu 65 C, pH 8 di dalam bufer phosphat 50 mM, meskipun demikian stabilitasnya justru terjadi pada suhu  55 C.  Inkubasi  enzim  selama  3  jam  pada  suhu tersebut masih menyisakan aktifitas lebih dan 80%.
Ucapan  terima  kasih  juga  disampaikan  kepada  Ir.  Ika Malikha  dan  Sdr.  Eni  atas  bantuan  teknis  dalam pelaksanaan penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Arnold,  L.  D.,  and  NA.  Solomon.  1986 .  Manual  of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology.
Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantification  of  microgram  quantities  of  protein dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254.
David,  B.  and  Eveleigh,  D.E.  1984. Chitosanase:  The occurance,  production  and  immobilization.  In Zikakis  JP  editor.  Chitin,  chitosan  and  related enzymes. Academic Press. Orlando. P. 161-179.
Hiraga, K., L. Shou, M. Kita S. Takahashi, M. Shimada, R.  Sato  and  K.  Oda.  1997 .  Isolation  and characterization  of  chitinase  from  a  fiake-chitin degrading marine bacterium, Aeromonas hydrophila H-2330.  Biosci.  Biotech.  Biochem.  6 1(1): 174-176.
Imoto,  1.  and  Yagashita,  K.  1971. A  simple  activity measurement  of  lysozyme.  Agric.  Biol.  Chem., 35:1154-1156.
Laemli,  U.K.  1971 .  Cleveage  of  structural  protein  during the  assembly  of  the  head  of  bacteriophage  T4. Nature 227:680-685.
Morimoto,  K.,  S.  Karita,  T.  Kimura,  K.  Sakka  and  K. Ohmiya.  1997 .  Cloning,  sequencing  and expression of the gene encoding C. paraputrificum chitinase  ChiB  and  analysis  of  the  functions  of novel  cadherin-like  domains  and  a  chitin-binding domain. Journal of Bacteriology, 7306-7314.
Muzzarelli  and  Ricardo,  A.A.  1996 .  Chitosan  based dietary  foods.  Carbohydrate  polymers,  29:  309- 316.
Natsir, H., D. Tjandra, Y. Rukayadi, M.T. Suhartono, J.K.
Hwang  and  P.R.  Pyun.  2000 .  Characterization and purification of the chitinase enzymes from the acidophillic bacteria of Kamojang Crater Indonesia. Prosiding  Seminar  Nasional  Rekayasa  Kimia  dan Proses,  Kimpunan  Mahasiswa  Teknik  Kimia UNDIP Semarang.
Ohishi,  K.,  M.  Yamagishi,  T.  Ohta,  M.  Suzuki,  H. Izumida,  H.  Sano,  M.  Nishijima  and  T.  Miwa. 1996 . Purification and properties of two chitinases from Vibrio  alginolyticus H-8.  Journal  of Fermentation and Bioengineering 82(6):598-600.
Rahayu,  S.,  F.  Tanuwidjaja,  P.  Lestari,  I.  Malikha,  Y. Rukayadi,  A.  Suwanto,  M.T.  Suhartono,  J.K. Hwang  and  YR.  Pyun.  2000 .  Biochemical characterization  of  the  thermostable  chitinase enzymes  from  the  Indonesian  thermophilles. Prosiding  Seminar  Nasional  Rekayasa  Kimia  dan Proses,  Himpunan  Mahasiswa  Teknik  Kimia UNDIP Semarang.
Trudel,  J.  and  Asselin.  1989 .  Detection  of  chitinase activity  after  polyacrilamide  gel  electrophoresis. Analytical Biochemistry. 178:302-306.
Ueda,  M.  and  M.  Arai.  1992 .  Purification  and  some properties  of  chitinases  from Aeromonas sp.  No. 1OS-24.  Biosci.  Biotech  and  Biochem.  56(3):460- 464.
Ueda, M., A. Fujiwara, T. Kawaguchi and M. Arai. 1995 . Purification  and  some  properties  of  six  chitinases from  Aeromonas sp  No.  10S-24.  Biosci.  Biotech. Biochem. 59(11):21262-2164.
Wang,  S.L.  and  W.T.  Chang.  1997 .  Purification  and characterization
of
two bifunctional chitinases/lysozyme  extracellularly  produced  by Pseudomonas  aeruginosa K-187  in  a  shrimp  and crab  shell  medium.  Appl.  Environ.  Microbial 63(2):380-386.