PENGEMBANGAN BIOSENSOR KONDUKTOMETRI UNTUK PENENTUAN KADAR ASAM URAT DALAM SERUM DARAH MENGGUNAKAN SCREEN PRINTED CARBON ELECTRODE (SPCE)-NATA DE COCO
(THE DEVELOPMENT OF CONDUCTOMETRIC BIOSENSOR FOR DETERMINATION OF URIC ACID CONCENTRATION IN HUMAN SERUM USING SCREEN PRINTED CARBON ELECTRODE (SPCE) – NATA DE COCO)
Abdi Naufal Ramadhan, Luluil Maknun, Noerma juli Azhari, Anggun Tanduwinata, Izma Fitria Yulasandini, Ani Mulyasuryani *
Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Brawijaya, Jl. Veteran, Malang 65145 telp. (0341) 575838
*email: mulyasuryani@ub.ac.id
Received 10 May 2015, Accepted 4 September, Published 01 September 2015

## ABSTRAK
Kontrol  kadar  asam  urat  penting dilakukan. Kadar  asam  urat  yang  tinggi menyebabkan penyakit gout, Oleh  karena  itu  diperlukan  suatu  metode  yang  sederhana, cepat  dan  akurat untuk  menentukan  kadar  asam  urat. Pada  penelitian  ini  telah dikembangkan  biosensor  konduktometri menggunakan  SPCE-Nata  de  coco untuk menentukan  kadar  asam  urat.  Biosensor  dioptimasi  agar  didapatkan  biosensor  dengan kinerja  yang  baik  dan  dapat  diaplikasikan  pada  serum  darah.Variabel  optimasi  yaitu pengaruh  konsentrasi  enzim,  ketebalan  membran  dan  pH  larutan.  Kisaran  konsentrasi enzim yang dipelajari pada 6 μg/mL; 12 μg/mL ; 18 μg/mL; 24 μg/mL , ketebalan membran pada 5μm ; 10  μm;  15  μm dan  pH  larutan  pada  pH 7;  7,5;  8;  8,5;  9.  Optimasi  dilakukan untuk  menghasilkan  biosensor  dengan  kinerja  yang  baik  dan  dapat diaplikasikan  pada sampel serum  darah.  Kondisi  optimum  biosensor  diperoleh  pada konsentrasi  enzim  18 µg/mL,  ketebalan  membran  5  µm dan  pH  8. Kisaran  konsentrasi  asam  urat yang  dapat diukur 0 – 1,2 ppm dengan kepekaan 7,74 µS/ppm dan batas deteksi 0 ppm. Biosensor ini telah diaplikasikan pada serum darah manusia dengan akurasi mencapai 95 %.
Kata Kunci: biosensor asam urat, konduktometri, SPCE-nata de coco

## ABSTRACT
The  control of  uric  acid  is  important. A  high  level  of  uric  acid  can  cause  gout disease. Therefore  a  simple,  fast, and  accurate method for  uric  acid  determination is required. In this research a conductometric biosensor has been developed by SPCE – Nata de coco for uric acid determination. The prepared biosensor was optimized to get a good performance  of  biosensor and it  is applicable for human  serum  samples.  The optimized variables  were enzyme  concentration,  membrane  thickness  and  pH  solution. The various enzyme  concentration were 6  μg/mL; 12  μg/mL; 18μg/mL; 2 4  μg/mL .  The  various membrane thickness were 5 μm ; 10 μm; 15 μm . Meanwhile, the various pH solution were 7;  7.5;  8;  8.5;  9. The  optimum  enzime  concentration  was  18  µg/mL  with  the  membrane thickness and pH were 5 µm and 8, respectively. The prepared biosensor can determine the uric acid concentration at range of 0 – 1.2 ppm with the sensitivity of 7.74 µS/ppm and the
limit detection is 0 ppm. The biosensor was applied to uric acid detection in human serum with accuracy of 95 %.

## Keywords: conductometric, SPCE-nata de coco, uric acid biosensor

## PENDAHULUAN
Asam  urat  merupakan  hasil  metabolisme  purin dalam  tubuh  manusia yang  kadar normalnya berkisar 2,6 – 6 mg/dL untuk wanita dan 3,5 – 7 mg/dL untuk pria. Jika kadar asam urat melebihi 7 mg/dL dapat menyebabkan penyakit gout. Pada kondisi yang kronis, gout  akan  menyebabkan  seseorang  mengalami  kesulitan atau  bahkan kehilangan kemampuan  bergerak  karena  rasa  sakit  yang  ditimbulkan  akibat  terbentuknya  kristal  urat (Nabena,  2013;  Khasanah,  2012; Starkebaum,  2013). Oleh  karena  itu  perlu  dilakukan pengecekan kadar  asam  urat  secara berkala.  Pengecekan  kadar  asam  urat umumnya dilakukan  dengan metode  spektrofotometri,  namun  metode  ini  memerlukan  keahlian khusus dan waktu yang cukup lama sehingga diperlukan metode alternatif yang sederhana, cepat dan akurat yaitu biosensor.
Biosensor  asam  urat dikembangkan  berdasarkan reaksi  oksidasi  asam  urat  yang dikatalisis oleh urikase menjadi CO 2 , H 2 O 2 dan allantoin. Berdasarkan reaksi tersebut telah dilakukan  deteksi  secara  elektrokimia yaitu  amperometri,  potensiometri  dan konduktometri.  Deteksi  asam  urat  secara amperometri  didasarkan  pada  pengukuran  arus dari  H 2 O 2 hasil  reaksi  atau  jumlah O 2 yang  terpakai,  sedangkan  secara potensiometri didasarkan  pada  perbedaan  potensial  pada  elektroda (Zhao et  al., 2009; Ali et  al., 2011; Ivekovic et al., 2012). Biosensor  konduktometri didasarkan  pada  perubahan  daya  hantar dalam larutan akibat ionisasi H 2 CO 3 dalam air. Biosensor konduktometri asam urat yang telah dikembangkan yaitumenggunakan urikase yang diamobilkan pada membran Nata de Coco dengan  elektroda  Pt  dan  film  komposit  polianilin – poli (n – butil  methacrylate) (Mulyasuryani and Srihardiastuti, 2011; Castillo-Ortega et al.,  2002). Pada  penelitian  ini dikembangkan  biosensor menggunakan SPCE (Screen  Printed Carbon Electrode) - Nata de Coco yang  sederhana  dan  dapat  digunakan  untuk  menentukan  kadar  asam  urat  dalam serum darah pada volume sampel kurang dari 1 mL.
Secara  teori  kinerja  biosensor  dipengaruhi  oleh  aktivitas  katalitik  enzim,  ketebalan membran dan pH larutan. Aktivitas katalitik enzim berhubungan dengan kecepatan reaksi. Menurut  persamaan  Michaelis-Menten  kecepatan  reaksi  berbanding  lurus  dengan konsentrasi enzim. pH berhubungan dengan jenis ion dalam larutan (Prayoga et al., 2014; Mulyasuryani and Srihardiastuti, 2011). Pada  pH ≥ 6,  H 2 CO 3 terdisosiasi  menghasilkan
H 3 O + dan HCO 3 - sedangkan H 3 O + dan CO 3 2- terbentuk pada pH ≤ 11 (Skoog et al., 2014). Kondisi keasamaan (pH) juga mempengaruhi kecepatan reaksi karena enzim hanya bekerja optimum  pada  pH  tertentu. Enzim  dapat  dijaga  aktivitasnya  dengan  mengamobilkannya pada  membran.  Ketebalan  membran  akan  mempengaruhi  laju  difusi  ion-ion  hasil  reaksi menuju  permukaan  elektroda (Prayoga et  al.,  2014;  Mulyasuryani and Dhofir,  2014; Mulyasuryani and Srihardiastuti, 2011). Oleh  karena  itu  pada  penelitian ini dipelajari pengaruh konsentrasi enzim, ketebalan membran dan pH larutan agar didapatkan biosensor dengan kinerja optimum dan dapat digunakan untuk mengukur kadar asam urat pada serum darah.

## METODE PENELITIAN
Bahan  yang digunakan dalam penelitian ini antara lain  enzim urikase hasil isolasi dari Candida Utilis 1139,212 ppm (0,0285 U/mg), Nata de coco (produk lokal),  NaOH 1 M (merck), KH 2 PO 4 0,01 M (merck), K 2 HPO 4 0,01 M (merck), padatan asam urat (merck), aqua DM (air bebas mineral), dan sampel serum darah dari laboratorium klinik.

## Pembuatan Biosensor
Screen  Printed  Carbon  Electrode (SPCE)  dengan  luas  permukaan  elektroda 1 mm × 5 mm dibatasi dengan selotip untuk menentukan area yang akan dilapisi membran. Membran nata de coco dipreparasi menggunakan NaOH 1 M. Elektroda dilapisi membran Nata  de  Coco  yang  mengandung  enzim  urikase  pada  berbagai  konsentrasi  6 µg/mL;  12 µg/mL; 18 µg/mL dan 24 µg/mL serta diatur pada ketebalan membran 5 μm, 10 μm dan 15 μm selanjutnya dikeringkan dan disimpan pada temperatur 4 o C.

## Pengukuran Daya Hantar
Biosensor  yang  telah  dibuat  digunakan  untuk  mengukur  larutan asam  urat pada kisaran konsentrasi 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1 ppm pada pH 7; 7,5; 8; 8,5; 9. Pengondisian pH larutan menggunkan buffer fosfat 0,01 M. Pengukuran  dilakukan dengan mencelupkan permukaan elektroda  kerja  kedalam  larutan. Hasil  pengukuran  daya  hantar  dibuat  kurva hubungan  antara  konsentrasi  asam  urat  terhadap  daya  hantar  kemudian  dari  persamaan y = ax+b untuk menentukan kepekaan masing masing perlakuan.

## Karakterisasi
Karakterisasi  yang  dilakukan  meliputi  kisaran  konsentrasi  yang  dapat  diukur, kepekaan  dan  batas  deteksi.  Karakterisasi  dilakukan  dengan  mengukur  larutan  asam  urat
pada  kisaran  konsentrasi  0 – 2  ppm  menggunakan  biosensor  dengan  konsentrasi  enzim sebesar 18 μg/mL, ketebalan membran 5 μm dan pH pengukuran pada pH 8 .

## Validasi Biosensor
Validasi  diakukan dengan  menentukan  kadar  asam  urat  pada serum  dari  sampel darah  dengan metode  adisi  standar menggunakan  biosensor.  Hasil  pengukuran  kemudian dibandingkan  dengan  data yang  didapatkan  dari  laboratorium  klinik  untuk  menentukan akurasi (%) biosensor.

## PEMBAHASAN

## Pengaruh Konsentrasi Enzim
Berdasarkan  hasil  penelitian, enzim  berpengaruh  terhadap  kepekaan  biosensor seperti terlihat pada Gambar1. Konsentrasi  enzim  optimum  dicapai  pada  konsentrasi  18 µg/mL  dengan  kepekaan  sebesar  3,04 μS/ppm .  Hasil  tersebut  diperoleh  dengan  kondisi pengukuran pada ketebalan membran 5 μ m dan pH larutan sebesar 7,5.

## Gambar 1. Kepekaan biosensor pada berbagai konsentrasi enzim.
Pada  konsentrasi enzim 6  µg/mL  sampai  18  µg/mL ditunjukkan adanya peningkatan  kepekaan  biosensor (Gambar  1). Hal  ini  sesuai  dengan  hukum Michaelis Menten  bahwa  peningkatan  konsentrasi  enzim  akan  meningkatkan  kecepatan  reaksi.  Jika kecepatan reaksi meningkat, maka pada konsentrasi asam urat dan waktu pengukuran yang sama, pengukuran dengan biosensor yang mengandung konsentrasi enzim lebih tinggi akan menghasilkan  ion-ion  hasil  reaksi  yang  lebih  banyak  sehingga  akan  menghasilkan  sinyal yang  lebih  tinggi.  Besarnya  perubahan  sinyal  yang  dihasilkan  pada  pengukuran  per  ppm konsentrasi  substrat  menunjukkan  kepekaan  biosensor,  sehingga  peningkatan  konsentrasi enzim akan meningkatkan kepekaan biosensor. Namun pada konsentrasi enzim 24 µg/mL terjadi  penurunan  kepekaan. Hal  ini  terjadi  karena  permukaan  SPCE  yang  dilapisi membran hanya memiliki luas permukaan 5 mm 2 dengan ketebalan membran sebesar 5 μ m
sehingga  pada  konsentrasi  enzim  24 µg/mL,  tidak  semua  enzim  terserap  ke  dalam  pori membran,  akibatnya  terjadi  akumulasi  enzim  di  permukaan  elektroda yang menghalangi difusi  ion-ion  hasil  reaksi  oksidasi  asam  urat  menuju permukaan elektroda yang menyebabkan penurunan kepekaan.

## Pengaruh Ketebalan Membran
Berdasarkan  hasil  penelitian, diketahui  bahwa ketebalan  membran  mempengaruhi kinerja  biosensor. Berdasarkan  Tabel  1,  kepekaan  biosensor  menurun  seiring  dengan meningkatnya  ketebalan  membran. Ketebalan  membran  optimum  dicapai  pada  ketebalan paling kecil  yaitu 5 μm dengan kondisi pengukuran konsentrasi enzim 18 μ g/mL dan pH larutan  sebesar  7,5. Ketebalan  membran  akan  mempengaruhi  kecepatan  difusi  ion  hasil reaksi  ke  permukaan  elektroda.semakin  tebal  membran  maka  laju  difusi  semakin  lambat. Hal  ini  berarti,  pada  konsentrasi  asam  urat  dan  waktu  pengukuran  yang  sama,  biosensor yang memiliki  membran  lebih  tebal  akan  menghasilkan  sinyal  yang  lebih  rendah  karena difusi ionnya lebih lambat sehingga menyebabkan kepekaan biosensor semakin rendah.
Tabel 1. Kepekaan biosensor pada berbagai ketebalan membran
Ketebalan m embran (μm) Kepekaan (μS/ppm) 5 9,16 10 1,99 15 0,44

## Pengaruh pH
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pH mempengaruhi kepekaan biosensor seperti yang  ditunjukkan  pada Gambar 2. Salah  satu  komponen  penting  dalam  biosensor  yaitu enzim  yang  hanya  bekerja  pada  pH  tertentu. Enzim  tidak  dapat  bekerja  optimal pada kondisi pH yang tidak sesuai dengan pH kerja enzim. Kerja enzim yang tidak optimal akan menyebabkan  reaksi  oksidasi  asam  urat  menjadi  tidak  sempurna sehingga  akan menurunkan  jumlah  produk  reaksi. Penurunan  jumlah  produk  reaksi  inilah  yang  akan mempengaruhi  kepekaan  biosensor. Pada  penelitian  ini  pH  optimum  dicapai  pada  pH  8 dengan kepekaan sebesar 4,41 μS/ppm sedangkan kondisi pengukurannya pada konsentrasi enzim  18 μ g/mL dan  ketebalan  membran  5 μ m.  pH  optimum  ini  berbeda  dengan  pH optimum enzim bebas urikase (pH 8,5). Hal ini disebabkan adanya perubahan konformasi enzim akibat adanya interaksi antara gugus amina pada enzim urikase dengan gugus – OH pada  membran  nata  de  coco sehingga  mempengaruhi  aktivitasnya.  Selain  itu  pada  pH  8 asam  karbonat  terdisosiasi  lebih  banyak  (> 90 %) menghasilkan  ion  H + dan  HCO 3 - ,
sehingga  akan  meningkatkan  sinyal  yang  berpengaruh  pada  peningkatan  kepekaan biosensor.

## Gambar 2. Kepekaan biosensor pada berbagai pH.

## Karakterisasi Biosensor dan Aplikasi Pada Sampel Darah
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pada  kisaran konsentrasi asam  urat 0 - 1,2 ppm,  daya  hantar  terus  mengalami  kenaikan  kemudian  pada  konsentrasi  1,4  ppm  daya hantar  turun  dan  kemudian  konstan. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  diatas  konsentrasi  1,2 ppm  biosensor  tidak  mampu  mendeteksi  perubahan  daya  hantar  yang  terjadi  di  dalam larutan sehingga didapatkan bahwa kisaran konsentrasi yang dapat dideteksi oleh biosensor adalah 0 sampai 1,2 ppm. Biosensor memiliki kepekaan sebes ar 7,74 μS/ppm.
Hasil  penelitian  ini  telah  diaplikasikan  pada  sampel  berupa  serum  darah  yang didapatkan  dari  laboratorium  klinik. Konsentrasi  normal  asam  urat  dalam  tubuh  manusia berkisar 2,6 – 6 mg/dL (26 – 60 ppm) untuk wanita dan 3,5 – 7 mg/dL (35 – 70 ppm) untuk pria,  sehingga agar biosensor  dapat  digunakan  pada  sampel  nyata,  harus  dilakukan pengenceran sampel sebanyak seratus kali. Berdasarkan hasil pengukuran dengan metode adisi standar, biosensor asam urat SPCE – nata de coco memiliki tingkat akurasi mencapai 95 % jika dibandingkan dengan data pengukuran dari laboratorium klinik (Tabel 2).
Tabel 2. Kadar asam urat hasil pengukuran laboratorium klinik dan biosensor
Kode sampel konsentrasi asam urat (mg/dL) Akurasi (%) Biosensor laboratorium klinik A 6,4 5,7 95,1 B C D E 4,3 2,4 2,3 0,74 4,1 4,3 6,1 5,1 87,7 55,8 37,7 14,5
Berdasarkan Tabel 2,  biosensor  SPCE – Nata  de  coco telah  memiliki tingkat akurasi  yang  cukup  baik,  walaupun  pada  beberapa  sampel  menunjukkan  tingkat  akurasi dibawah  55 %.  Hal  ini dikarenakan  kondisi  sampel  yang  berbeda  beda  yang  dapat mempengaruhi kerja enzim urikase pada biosensor serta difusi ion ion hasil reaksi menuju permukaan  elektroda,  sehingga  sebelum  dilakukan  pengukuran  dengan  biosensor  perlu adanya preparasi pada serum darah untuk mengurangi jumlah ion pengganggu.

## KESIMPULAN
Biosensor  asam  urat  SPCE – Nata  de  coco  memiliki    kinerja  optimum  pada konsentrasi enzim 18 μg/mL, ketebalan membran nata de coco 5 μm dan pH pengukuran pada  pH  8.  Kisaran  konsentrasi  yang  dapat  dideteksi  0 – 1,2  ppm  dengan  kepekaan  7,74 μS/ppm  dan  batas  deteksi  sebesar  0  ppm.  Biosensor  dap at  digunakan  untuk  mengukur kadar asam urat dalam serum darah dengan akurasi mencapai 95 %.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih  kepada  DIKTI  yang  telah  memberikan  hibah  dana untuk  penelitian  melalui Universitas Brawijaya dalam Program Kreativitas Mahasiswa tahun pendanaan 2015.

## DAFTAR PUSTAKA
Ali, S.U.,  Alvi, N.U.H.,  Ibupoto, Z.H., Nur, O., Willander, M., and Danielsson, B., 2011, Selective Potentiometric  Determination  Of  Uric  Acid  With  Uricase  Immobilized On Zno Nanowires, 2011, Sensors and Actuators B Chemical, vol. 152, no.
2, pp. 241-247.
Castillo-Ortega,  M.M.,  Rodriguez  D.E.,  Encinas  J.C.,  Plascencia  M.,  F.A.  Mendez- Velarde,  and  Olayo  R.,  2002,  Conductometric  Uric  Acid  and  Urea  Biosensor Prepared from Electroconductive
Polyaniline – poly (n-butylmethacrylate)
Composites, Sensors and Actuators B Chemical, vol. 85, pp. 19 – 25.
Ivekovic,  D.,  Japec, M., Solar, M.,  and Zivkovic, N., 2012,  Amperometric  Uric  Acid Biosensor with Improved Analytical Performances Based on Alkaline-stable H 2 O 2 Transducer, International  Journal  of  Electrochemical  Science, vol. 7, pp. 3252 – 3264.
Khasanah,  M.,  2012, Pengambangan  Metode  Voltametri  Lucutan  untuk  Analisis  Asam Urat Melalui Pelapisan Elektroda dengan Cetakan Molekul, Jurusan Kimia FMIPA UGM, Yogyakarta.
Nabena,  E.  2013, Karakteristik  Biosensor  Asam  Urat  Berelektroda  Kaki  Lengkung Berbasis  Film  Tebal  Hibrid  Polimer  Polyaniline  dan  Polypyrrote, Universitas Pendidikan Indonesia, Jakarta
Mulyasuryani,  A.,  and  Dofir,  M.,  2014,  Enzyme  Biosensor  for  Detection  of Organophospate  Pesticide  Residues  Base  on  Screen  Printed  Carbon  Electroda (SPCE)-Bovine  Serum  Albumin  (BSA), Enginering,  vol.  6,  pp.  230 – 235, http://dx.doi.org/10.4236/eng.2014.65027.
Mulyasuryani, A.,and Srihardiastuti, A., 2011, Conductimetric Biosensor for the Detection of Uric Acid by Immobilization Uricase on Nata de Coco Membrane Pt Electrode, Analitycal Chemistry Insight, vol. 6, pp. 47-51.
Prayoga,  I.,  Mulyasuryani,  A.,  and  Prasetyawan,  S.,  2014,  Construction  and Characterization of Conductometric Biosensor for Determination of Diazinon Concentration, Makara Journal of Science, vol. 18, no. 1, pp 26 – 30.
Skoog,  D.A.,  West,  D.M.,  Holler,  F.J.,  Crouch,  S.R.,  2014,  Fundamentals  of  Analytical Chemistry Ninth Edition, Brooks/Cole Cengage Learning, USA
Starkebaum,  G.A.,  2013, Medical  Encylopedia  :  Gout,  diakses  pada  5  juni  2015, (http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/000422.htm).
Zhao, C.,Wan, L., Wang, Q.,Liu, S., and  Jiao,  K., 2009, Highly  Sensitive  ad  Selective Uric Acid Biosensor Based on Direct Electron Transfer of Hemoglobin-encapsuled Chitosan-modified Glassy Carbon Eectrode, Analytical Sciences, vol. 25, p. 1013.