## PENGARUH PERENDAMAN KULIT DALAM LARUTAN ASAM ASETAT TERHADAP SIFAT-SIFAT GELATIN BERBAHAN BAKU KULIT KAMBING BLIGON
(The effect of Curing Process in Acetic Acid on the Gelatin Properties of Blingon Goat Skin)
Muhammad Irfan Said 1 , Suharjono Triatmojo 2 , Yuny Erwanto 2 , Achmad Fudholi 3
1 Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin, Jl.Perintis Kemerdekaan Km.10, Makassar 90245 2 Fakultas Peternakan Universitas Gadjah Mada, Jl. Fauna 3 Bulaksumur, Yogyakarta 55281 3 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Sekip Utara Yogyakarta 55281 e-mail : irfanunhas@gmail.com

## ABSTRACT
Bligon goat is a cross between Kacang with Ettawah goat.  The skin of Bligon goat contains collagen protein compounds that have the potential to be processed into gelatin. Curing process is necessary to improve the properties of gelatin both quantitative and qualitative.  The purpose of this study was to identification of the best process time and level of acetat acid as curing materials of Blingon goat skin.  The skin of male Bligon goat age  ±1.5-2.5 years of old and acetic acid (CH3COOH 0.5 M) were used as material.  The experiment was run according to completely randomized design (CRD) with factorial pattern of 2x3 and three replications for each treatment.  Two processing time (48 and 96 hours) as first factor and three concentrations levels of acetic acid (3, 6 and 9%, v/v) as the second factor.   The data were analyzed by analysis of variance.  Yields, gel strength and viscosity were used as parameters. The results of this study showed that the processing time up to 96 hours and level of concentration up to 9% significantly affected (P<0.01 ) gel strength, but no significantly on the yields and viscosity. The combination of processing time of 96 hours with concentration level of 3% gave the best results compared to others.
Key words : Bligon goat skin, collagen, curing, acetat acid, gelatin

## ABSTRAK
Kambing Bligon merupakan jenis kambing hasil persilangan antara kambing Kacang dengan Ettawah .  Kulit kambing Bligon kaya akan senyawa protein khususnya kolagen yang berpotensi untuk  diproses  menjadi  gelatin.  Proses  perendaman  diperlukan  untuk  memperbaiki  sifat-sifat gelatin baik kuantitatif maupun kualitatif. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi waktu proses dan level terbaik penggunaan asam asetat sebagai bahan curing kulit kambing Blingon.  Materi utama berupa kulit kambing Bligon jantan umur ±1,5-2,5 tahun,  asam asetat (CH 3 COOH 0,5M). Desain penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) Pola Faktorial 2x3 dengan 3 kali ulangan.  Faktor I adalah dua  waktu proses (48 dan 96 jam), faktor II adalah tiga level konsentrasi (3%,  6%  dan  9%  (v/v)).  Data  dianalisis  secara  sidik  ragam.  Parameter  yang  diamati  meliputi rendemen, kekuatan gel dan viskositas gelatin.  Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbedaan waktu proses curing sampai pada taraf 96 jam dengan level konsentrasi sampai pada taraf 9% berpengaruh sangat nyata (P<0,01) terhadap nilai kekuatan gel gelatin yang menggunakan bahan baku kulit kambing Bligon, namun tidak berpengaruh nyata terhadap nilai rendemen maupun viskositas.  Kombinasi waktu proses 96 jam dengan level konsentrasi 3% (T2K1) memberikan hasil terbaik dibanding lainnya.
Kata Kunci : Kulit kambing Bligon, kolagen, perendaman, asam asetat, gelatin

## PENDAHULUAN
Gelatin  merupakan  produk  hidrokoloid yang merupakan hasil hidrolisis dari komponen protein  kolagen  hewan  atau  ternak  yang dilakukan secara parsial (Jaswir, 2007).  Gelatin
impor  hampir  90%  diantaranya  diduga diproduksi  dari  bahan  baku  kulit  dan  tulang pada babi (Hidaka dan Liu, 2002 ; Grobben et al ., 2004) .    Terkait  dengan  pemanfaatannya  dalam bidang pangan, tentunya hal ini menjadi sebuah permasalahan  bagi  negara  yang  mayoritas
muslim.  sehingga  diperlukan  upaya  untuk mencari bahan baku alternatif yang halal.  Salah satu bahan baku yang berpotensi  besar sebagai bahan  baku  subtitusi  adalah  kulit  kambing, mengingat  kulit  kambing  juga  kaya  akan senyawa  kolagen  yang  merupakan  komponen utama dalam proses produksi gelatin.
Kambing  Bligon  atau  yang  lazim  dikenal sebagai  kambing  Jawa  Randu,  merupakan kambing  hasil  persilangan  antara  kambing Kacang  dengan  Ettawah  yang  banyak ditemukan di pulau Jawa.  Di pulau Jawa, kulit kambing  Bligon  banyak  dimanfaatkan  sebagai bahan  baku  pada  industri  kulit.    Bahan  baku kulit kambing yang masuk ke perusahaan kulit dan  berkategori  afkir  diantaranya  ternyata jumlahnya  bisa  mencapai  30-40%  (Soehadji, 1995).    Hal  ini  diidentifikasi  karena  adanya kerusakan secara fisik baik sebelum pemotongan ( antemortem )  maupun  setelah  pemotongan ternak ( postmortem ) sehingga nilai ekonominya menjadi sangat rendah (Karyadi, 1995). Pemanfaatan kulit kambing kategori afkir dapat  diarahkan  sebagai  bahan  baku  gelatin sebagai  pensubtitusi  kulit  dan  tulang  babi, namun  tentunya  masih  membutuhkan  kajian- kajian  yang  lebih  mendalam  lagi  khususnya terkait  dengan  teknologi  proses  produksinya. Larutan  asam  banyak  dimanfaatkan  oleh  para peneliti untuk meningkatkan kelarutan protein (Verheul et al ., 1998). Penggunaan bahan asam dalam  praproses  produksi  gelatin  memiliki peran  sebagai  agen  “pemecah”  ikatan  silang antar  molekul  asam  amino  pada  struktur protein  kolagen  (Zeugolis et  al ., 2008).    Proses reaksi  antara  komponen  protein  bahan  baku dengan  larutan  asam  dapat  dilakukan  melalui teknik  perendaman  ( curing ).    Pada  proses  ini memungkinkan dapat terjadi reaksi yang antara komponen  protein  pada  kulit  dengan  larutan asam yang diberikan (Wang et al ., 2008). Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengidentifikasi  dan  menentukan  waktu proses  dan  level  konsentrasi  terbaik  untuk diterapkan dalam proses produksi gelatin yang menggunakan  kulit  kambing  Bligon  sebagai bahan baku.

## MATERI DAN METODE

## Materi penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  10  lembar kulit kambing Bligon jantan dari seluruh bagian permukaan  tubuh  (utuh)  tanpa  bulu  dengan umur potong pada kisaran 1,5-2,5 tahun.  Bahan
curing  menggunakan  asam  asetat  (CH 3 COOH 0,5 M). Peralatan utama yang digunakan dalam proses  produksi  gelatin  antara  lain:  water bath  ( Memmert  Tipe  WNB7-45 ),  oven  digital ( Memmert ),  timbangan  analitik  ( Sartorius  TE 214S ), labu ukur, beker glass, erlemenyer, corong gelas,  gelas  ukur  dan  termometer.    Peralatan- peralatan pendukung untuk proses uji kualitas antara lain: Universal Testing Machine ( Zwick/Z 0,5 ), Stromer Viscometer Coulette , GT Stirer 333- 4000 rpm ( Glas-Col Terre Haute, USA ), dan pH meter ( Hanna NI 8520 ).

## Metode penelitian

## Proses penyiapan larutan curing
Larutan  curing    dari  bahan  asam  asetat (CH 3 COOH  0,5  M)  dibuat  menjadi  3level konsentrasi , yakni 3% (v/v), 6% (v/v) dan 9% (v/v).  Sebanyak 3 ml, 6 ml, dan 9 ml asam asetat dimasukkan ke dalam labu ukur bervolume 100 ml  dan  ditambahkan    aquades  hingga  batas volume.

## Rancangan penelitian
Penelitian  dilaksanakan  secara  eksperi- mental menggunakan rancangan dasar berupa Rancangan Acak Lengkap (RAL) Pola Faktorial 2 x 3 dengan 3 kali ulangan.  Pada penelitian ini diterapkan 2 faktor, yakni waktu proses peren- daman (Faktor I)  dan level konsentrasi larutan curing (Faktor II).  Faktor I terdiri atas 2 waktu proses perendaman yakni 48 jam dan 96 jam, se- dangkan Faktor II terdiri atas 3 level konsentrasi larutan perendam yakni yakni 3% ; 6%  dan 9% (v/v).

## Pelaksanaan penelitian
Sebanyak 400 g bahan baku kulit kambing Bligon  dimasukkan  masing-masing  ke  dalam beker glass yang berisi larutan curing yang telah ditentukan (3%, 6% dan 9% (v/v) ).  Kulit disim - pan selama 48 jam dan 96 jam pada refrigerator suhu ± 5-10 o C.  Bahan baku kulit dimasukkan ke  dalam  erlemenyer  dan  ditambah  dengan aquades  untuk  menjalani  proses  ekstraksi  ( ex- traction ),  hasilnya  kemudian  dilakukan  proses penyaringan ( filtration ).  Hasil fraksi dihomoge- nkan dan dipekatkan pada suhu 70 o C selama 2 jam.    Hasilnya  didinginkan  dalam  refrigerator suhu ± 5-10 o C selama 30 menit.  Fraksi gelatin cair dikeringkan di dalam oven suhu 55 o C sela- ma 18-20.  Gelatin padat dikemas dengan plastik klip untuk uji kualitas.

## Analisis data
Data yang diperoleh dianalisis secara sidik ragam berdasarkan RAL Pola Faktorial dengan bantuan program statistik SPSS. Perlakuan yang menunjukkan pengaruh yang nyata, selanjutnya dilakukan  uji  beda  nyata  dengan Duncan’S Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5% (Steel dan Torrie, 1991).
Cara analisis:
Rendemen 1. (Giménez et  al .,  2005b).      Nilai rendemen  dihitung  dengan  persamaan  :
rendemen (%) = berat akhir produk/berat awal bahan baku) x100%. Kekuatan  gel 2. (Muyonga et  al., 2004) (Modifikasi). Kekuatan  gel  diukur  dengan alat  Universal  Testing  Machine  (Zwick/ Z  0,5)  dilengkapi  Teflon  plunger  silinder (diameter  13  mm).    Perhitungan  nilai kekuatan  gel  dilakukan  dalam  satuan gram Bloom .    Nilai  Fmax  dengan  satuan N/cm 2 dapat  dikonversi  ke  satuan  gram
Bloom dengan  menggunakan  persamaan :    Kekuatan  gel  ( dyne/cm 2 )  (D)  =  (F/G)  x 980, dan Kekuatan gel (gram Bloom ) = 20 + 2.86.10 -3 D.  Dalam hal ini, F = tinggi grafik sebelum patah, G = konstanta (0,07) dan D = kekuatan gel ( dyne/cm 2 ).
Viskositas 3. (Arnesen  dan  Gildberg,  2002) (Modifikasi).    Viskositas  sampel  diukur dengan  alat  Stromer  Viscometer  Coulette. Nilai  viskositas  (cP)  ditentukan  dengan persamaan A x waktu putar rata-rata sampel (detik)/  B,  dimana  A  =  nilai  viskositas minyak jarak pada suhu 28 o C (5,21 cP) dan B = waktu putar rata-rata minyak jarak hasil kalibrasi (detik)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Rendemen ( Yields )
Menurut  Giménez et al . (2005a),  rendemen gelatin  merupakan  jumlah  gelatin  kering  ( dry gelatin )  yang  dihasilkan  dari  sejumlah  bahan baku kulit yang diproses melalui suatu proses ekstraksi.    Perbandingan  nilai  rendemen  yang diperoleh  dari  beberapa  kombinasi  perlakuan selengkapnya disajikan pada Gambar 1.
Berdasarkan  hasil  analisis  sidik  ragam data  pada  Gambar  1  menunjukkan  bahwa, perbedaan  waktu  proses  dan  konsentrasi asam  asetat  maupun  interaksi  keduanya  tidak menunjukkan  pengaruh  yang  nyata    terhadap nilai  rendemen.    Hal  ini  dapat  disebabkan karena  bahan  curing  asam  belum  mampu menghidrolisis  dan  memecah  struktur  ikatan peptida  pada  protein  kulit  walaupun  waktu proses  sudah  mencapai  96  jam  dengan konsentrasi bahan 9% (v/v).   Ketidakmampuan larutan  asam  untuk  meningkatkan  rendemen dalam  proses  produksi  dapat  disebabkan  oleh masih rendahnya konsentrasi yang digunakan, sedangkan  konsentrasi  larutan  sangat  besar pengaruhnya  dalam  meningkatkan  nilai rendemen  gelatin.  Menurut  Muyonga et  al . (2003) bahwa laju hidrolisis juga mempengaruhi nilai  rendemen.    Laju  hidrolisis  yang  semakin cepat cenderung meningkatkan jumlah molekul kolagen  yang  terkonversi  dan  pada  akhirnya juga akan mempengaruhi nilai rendemen.
Kekuatan gel ( Gel Strength )
Menurut Kolodziejska et al . (2003), kekuatan gel  merupakan  salah  satu  parameter  untuk
Gambar 1.  Grafik perbandingan nilai rendemen (%) gelatin yang diperoleh dari beberapa kombinasi perlakuan proses curing ; T1 = waktu proses 48 jam ; T2 waktu proses 96 jam ; K1 = level konsentrasi asam asetat 3% (v/v) ; K2 = level konsentrasi asam asetat  6% (v/v) ; K3 = level konsentrasi asam asetat 9% (v/v).
mengetahui  kualitas  fisik  pada  suatu  produk gelatin.  Sifat fisik dipengaruhi oleh konsentrasi bahan dan waktu curing.   Perbandingan nilai kekuatan gel gelatin yang mendapat perlakuan proses  curing  berbeda  disajikan  pada  Gambar 2. Hasil  analisis  sidik  ragam  terhadap  data pada Gambar 2 menunjukkan bahwa penerapan waktu proses dan konsentrasi asam asetat yang berbeda  maupun  interaksinya  menunjukkan pengaruh yang sangat nyata (P<0,01) terhadap nilai kekuatan gel gelatin.
Peningkatan  waktu  proses  curing  dan level  konsentrasi  sangat  nyata  menurunkan kekuatan  gel.    Terjadinya  penurunan  nilai kekuatan gel disebabkan oleh terjadinya proses pemutusan  rantai  polimer  asam  amino  secara berlebihan  dengan  meningkatnya  konsentrasi asam,  sehingga  ikatan  antar  molekul-molekul polimer  penyusun  kolagen  yang  terkonversi menjadi  gelatin  terpecah  menjadi  rantai monomer yang sangat pendek hingga akhirnya mengalami kerusakan dan menyebabkan proses pembentukan  gel  menjadi  terbatas.    Kekuatan gel  sangat  tergantung  pada  ikatan  hidrogen antara molekul air dengan kelompok hidroksil bebas  dari  kelompok  asam  amino,  ukuran rantai protein, konsentrasi serta distribusi berat molekul kolagen (Arnesen dan Gildberg, 2002); Bhat dan Karim, 2008). Berdasarkan  standar GMIA (Anonim, 2001), sifat  gelatin  yang  dihasilkan  dari  proses  asam masih memenuhi standar yang dipersyaratkan yakni 50-300 gram Bloom , sedangkan  Ockerman dan  Hansen  (2000)  mempersyaratkan  75-300
gram Bloom .    Kekuatan  gel  dipengaruhi  oleh ikatan  hidrogen  antara  molekul  air  dengan kelompok hidroksil bebas dari kelompok asam amino, ukuran rantai protein, konsentrasi serta distribusi berat molekul (Arnesen dan Gildberg, 2002;  Bhat  dan  Karim,  2008).    Penggunaan konsentrasi  bahan  yang  tinggi  dalam  proses produksi  gelatin  dapat  menyebabkan  nilai kekuatan  gel  meningkat  maupun  menurun (Ockerman  dan  Hansen,  2000)  sedangkan kualitas  gelatin  yang  dihasilkan  dari  suatu proses produksi sangat tergantung pada proses ekstraksi  yang  dilakukan  terhadap  protein kolagen (Kasankala et al ., 2007). Secara deskriptif terlihat  bahwa  kombinasi  waktu  proses  96 jam  dengan  level  konsentrasi  3%  memberikan nilai  kekuatan  gel  tertinggi  dibanding  yang kombinasi yang lainnya.

## Viskositas ( Viscosity )
Menurut  Schrieber  dan  Gareis  (2007), viskositas  adalah  kemampuan  menahan  dari suatu  cairan  untuk  mengalir.    Proses  alir  dari suatu zat cair dipengaruhi oleh kekentalan atau viskositas  yang  terjadi akibat adanya adsorbsi dan pengembangan koloid.  Perbandingan nilai viskositas dari kombinasi waktu proses curing dengan level konsentrasi bahan disajikan pada Gambar 3.
Berdasarkan data pada Gambar 3 diperoleh hasil  uji  statistik  yang  menunjukkan  bahwa perbedaan  waktu  proses  curing  dan  level konsentrasi  asam  asetat  tidak  menunjukkan pengaruh yang nyata terhadap nilai viskositas
Keterangan :
a,b,c,d : Superskrip yang berbeda pada setiap diagram menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01)
Gambar 2.  Grafik perbandingan nilai kekuatan gel (g Bloom) gelatin yang diperoleh dari be - berapa kombinasi perlakuan proses curing ; T1 = waktu proses 48 jam ; T2 waktu proses 96 jam ; K1 = level konsentrasi asam asetat 3% (v/v) ; K2 = level konsentrasi asam asetat  6% (v/v) ; K3 = level konsentrasi asam asetat 9% (v/v).
gelatin.  Hal ini dapat disebabkan karena level konsentrasi  yang  diterapkan  dalam  proses produksi  belum  mampu  menghidrolisis  dan memecah struktur ikatan peptida pada protein kulit.    Peningkatan  nilai  viskositas  dapat dipengaruhi oleh struktur molekul asam amino yang  menyusun  protein  gelatin.    Susunan asam  amino  yang  semakin  panjang  akan meningkatkan  nilai  viskositas  gelatin  (Leiner, 2002). Peningkatan level konsentrasi asam asetat dalam proses produksi gelatin cenderung dapat menurunkan nilai viskositas.  Hal ini disebabkan karena  bahan  curing  telah  “memecah”  ikatan peptida  asam  amino  menjadi  rantai  molekul yang  sangat  pendek  sehingga  viskositasnya menurun.  Dilain pihak peningkatan konsentrasi bahan  curing  dapat  pula  meningkatkan  nilai viskositas  apabila  bahan  curing  mampu “memecah”  ikatan  peptida  pada  ikatan  yang tepat dengan molekul yang lebih panjang.  Nilai viskositas gelatin yang diproduksi relatif tidak jauh berbeda dengan nilai viskositas gelatin yang diperoleh    oleh  Songchotikunpan et  al .  (2007), yakni gelatin dari ikan Nila Tilapia ( Oreochromis niloticus ) sebesar 1,78 cP

## KESIMPULAN
Kombinasi  waktu  proses  96  jam  dengan level konsentrasi 3% dalam proses perendaman menggunakan  larutan  asam  asetat  merupakan kombinasi  terbaik  untuk  diterapkan  terkait dengan aplikasinya pada bidang pangan.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2001. Gelatin. Gelatin Manufacturers Institute of  America  (GMIA). http://www.gelatin_gmia.
com/html/gelatine.html. [Diakses  3  Pebruari
2014] Anonim. 2008. Gelatin sebagai Bahan Pembuat Kapsul. http://www.pkesinteraktif.com. [Diakses 3
Pebruari 2014]
Arnesen, J. A and A. Gildberg.  2002.  Preparation and characterization of gelatine from the skin of harp seal  ( Phoca  groendlandica ).    Biores.Tech.,  82:  191- 194.
Bhat, R and A. A.Karim.   2008.  Ultraviolet irradiation improves  gel  strength  of  fish  gelatin.  Food Chemist., 113 : 1160-1164.
Giménez,  B.,  M.  C.Gómez-Guillén,  and  P.  Montero.
2005 a .  The  role  of  salt  washing  of  fish  skins  in chemical  and  rheological  properties  of  gelatin extracted. Food Hydrocolloids, 19: 951-957.
Giménez, B., M.C.Gómez-Guillén, and P.Montero.  2005 b . Storage of dried fish skins on quality characteristics of extracted gelatin. Food Hydrocolloids, 19: 958- 963.
Grobben, A. H., P. J. Steele, R. A. Somerville, and D.
M.  Taylor.  2004.    Inactivation  of  the  bovine- spongiform-encephalopathy (BSE) agent by the acid and alkali processes used in the manufacture of bone gelatine. Biotech. Appl. Biochem., (39): 329-338.
Hidaka, S and S. Y. Liu.  2002.  Effect of gelatins on calcium  phosphate  precipitation:  a  possible application  for  distinguishing  bovine  bone gelatin  from  porcine  skin  gelatin.  J.  Food Composition and Analysis, 16: 477-483.
Jaswir,  I.    2007.    Memahami  Gelatin.    Artikel  Iptek. www.beritaiptek.com  [Diakses  2  November 2008].
Gambar 3.   Grafik perbandingan nilai viskositas (cP) gelatin yang diperoleh dari beberapa kombinasi perlakuan proses curing ; T1 = waktu proses 48 jam ; T2 waktu proses 96 jam ; K1
= level konsentrasi asam asetat 3% (v/v) ; K2 = level konsentrasi asam asetat  6% (v/v) ; K3 = level konsentrasi asam asetat 9% (v/v).

## M. I. Said, dkk.
Karyadi, D.  1995.  Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Mutu Kulit Mentah.  Proceedings Seminar Mutu Kulit dan Produk Kulit untuk Ekspor. Balai Besar Penelitian  dan  Pengembangan  Industri  Barang Kulit, Karet dan Plastik, Yogyakarta,  62-67.
Kasankala, L. M.,  Y. Xue, Y. Weilong, S. D. Hong, and Q. He.  2007.  Optimization of gelatine extraction from grass carp ( Catenopharyngodon idella ) fish skin by  response  surface  methodology.  Biores.  Tech., 98 : 3338-3343.
Kolodziejska, I., K. Kaczorowski,  B. Piotrowska,  and M. Sadowska.   2003.  Modification of the properties of gelatin from skins of Baltic cod ( Gadus morhua ) with  transglutaminase.  Food  Chemist.,  86:  203- 209.
Leiner, P. B. 2002. The Physical and Chemical Properties of  Gelatin.    http://www.pbgelatin.com  [26  Juni 2005]
Muyonga, J. H.,  C. G. B. Cole and K. G. Duodu 2003.
Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopic study of acid soluble collagen and gelatin from skins and bones of young and adult Nile perch ( Lates niloticus ). Food Chemist., 86(3): 325-332.
Muyonga, J. H.,  C. G. B. Cole and K. G. Duodu.  2004. Extraction and physico-chemical characterization of  Nile  perch  ( Lates  niloticus )  skin  and  bone gelatin. Food Hydrocolloids, 18: 581-592.
Ockerman, H. W and C. L.Hansen, C. L.  2000.  Animal By Product Processing and Utilization.  CRC Press, USA.
Schrieber,  R  and  H.  Gareis.  2007.  Gelatine  Handbook, Wiley-VCH GmbH & Co, Weinhem.
Soehaji.  1995.  Potensi Penyediaan Bahan Baku Kulit untuk  Industri.    Proceedings.    Seminar  Mutu Kulit dan Produk Kulit untuk Ekspor. Balai Besar Penelitian  dan  Pengembangan  Industri  Barang Kulit, Karet dan Plastik, Yogyakarta, 1-8.
Songchotikunpan,  P.,  J.  Tattiyakul,  and  P.  Supaphol.
2007.  Extraction  and  electrospinning  of  gelatin from  fish  skin.  Int.  J.  Biol.  Macromolecules,  42: 247-255.
Steel,  R.  G.  D  and  J.  H.  Torrie.    1991.    Principle  and Procedure of Statistics. 2 nd .ed.  International Book Company, Tokyo.
Verheul,  M.,  S.  P.  F.  M.  Roefs  and  C.  G.  de  Kruif. 1998.    Kinetics  of  heat-induced  aggregation  of β-lactoglobulin,  J.  Agric  and  Food  Chem.,  46: 896–903.
Wang, L., B.Yang, R. Wang and X. Du.  2008. Extraction of  pepsin-soluble  collagen  from  grass  carp ( Ctenopharyngodon idella ) skin using an artificial neural network.  Food Chem., 111(3): 683-686.
Zeugolis, D. I., S. T. Khew, E. S. Y. Yew, A. K. Ekaputra,
Y.  W.  Tong,  L.  L.  Yung,  D.  W.  Hutmacher,  C. Sheppard and Michael.  2008.  Electro-spinning of pure collagen nano-fibres – Just an expensive way  to  make  gelatin?  Biomaterials,  15:  2293- 2305.