ISOLASI DAN IDENTIFIKASI CAMPURAN SENYAWA β-SITOSTEROL DAN STIGMASTEROL DARI KULIT AKAR SLATRI ( Calophyllum soulattri Burm. f)
( ISOLATION AND IDENTIFICATION OF β-SITOSTEROL AND STIGMASTEROL
MIXTURE FROM ROOT BARK OF SLATRI ( Calophyllum soulattri Burm. f))
Doni Eko Saputra, Nestri Handayani dan Muhammad Widyo Wartono *
Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Sebelas Maret, Jl. Ir. Sutami 36 A, Kentingan Surakarta 57126 telp. (0271) 663375.
*email: m.widyo.wartono@gmail.com
Recieved 24 October 2013, Accepted 22 January 2014, Published 04 March 2014

## ABSTRAK
Telah  dilakukan  isolasi  dan  identifikasi  struktur  senyawa  kimia  dari  kulit  akar Calophyllum  soulattri Burm.  f.  yang  berasal  dari  daerah  Magelang.  Isolasi  dilakukan dengan  maserasi  menggunakan  pelarut  etil  asetat.  Ekstrak  etil  asetat  dipisahkan  dan dimurnikan dengan kromatografi  vakum cair dan kromatografi kolom flash yang dipandu dengan  kromatografi  lapis  tipis,  menghasilkan padatan  berwarna  putih  kekuningan. Identifikasi terhadap struktur senyawa dilakukan dengan metode spektroskopi seperti UV, FTIR, 1 H  NMR, 13 C  NMR,  DEPT,  HSQC  dan  HMBC  serta  dibandingkan  dengan referensi.  Berdasarkan  hasil  analisis  data,  senyawa  yang  diperoleh  merupakan  campuran antara β-sitosterol dan stigmasterol.
Kata Kunci : Calophyllum soulattri Burm. f, kulit akar, β-sitosterol dan stigmasterol

## ABSTRACT
Chemical isolation and identification of root bark of Calophyllum soulattri Burm. f. have been conducted. Isolation was conducted by maceration with ethyl acetate as solvent. Ethyl  acetate  extract  was  separated  and  purified  by  vacuum  liquid  chromatography  and flash chromatography which was guided by thin layer chromatography to obtain yellowish white  solid.  Isolated  compounds  were  determined  by  spectroscopy  methods  such  as  UV, FTIR, 1 H NMR, 13 C NMR, DEPT, HSQC,  HMBC and  were  compared  to the references. Based on the analysis result it’s known that the compounds are the mixture of β-sitosterol and stigmasterol.
Key words : Calophyllum soulattri , root barks, β-sitosterol and stigmasterol

## PENDAHULUAN
Tumbuhan  genus Calophyllum di  Indonesia  banyak  dimanfaatkan  dalam pengobatan traditional (Heyne, 1997). Bagian-bagian yang dimanfaatkan oleh masyarakat diantaranya  kayu,  getah,  gelam  kayu,  akar  dan  daun  untuk  mengobati  berbagai  penyakit. Pemanfaatan  tumbuhan  genus Calophyllum ini  tidak  terlepas  dari  senyawa  kimia  yang terkandung  di  dalamnya.  Kelompok  senyawa  bahan  alam  yang  telah  diisolasi  dari  genus
Calophyllum cukup beragam, dilihat dari golongan senyawa yang telah diisolasi terdiri dari senyawa turunan kumarin, santon, flavonoid, terpenoid dan steroid (Su et al ., 2008).
Salah  satu  spesies  dari  tumbuhan  dari Calophyllum adalah  slatri  ( Calophyllum soulattri ).  Tumbuhan  ini  dapat  ditemukan  diseluruh  Indonesia  (Heyne,  1987).  Senyawa kimia  yang  telah  diisolasi  dari C. soulattri diantaranya  yaitu  friedelin  dari  bagian  daun (Putra et al .,  2008).  Pada  kulit  batang C. soulattri yang  diambil  dari  daerah  Sarawak,
Malaysia  telah  diisolasi  senyawa  phylatrin,  soulattrin,  calosanton  C,  maklurasanton, brasisanton B, trapezifolisanton, friedelin, stigmasterol dan  β-sitosterol (Mah et al ., 2011; 2012). Senyawa lain yang telah dilaporkan diantaranya yaitu senyawa soulattron A dan β- sitosterol dari ekstrak n -heksan kulit akar C. soulattri (Nigam et al ., 1988). Pada paper ini kami  melaporkan  isolasi campuran senyawa  β-sitosterol dan  stigmasterol dari  ekstrak etil asetat kulit akar slatri ( C. soulattri ).

## METODE PENELITIAN
Ekstrak  kering  kulit  akar C.  soulattri disaring  menggunakan  penyaring  Buchner kemudian  dipekatkan  dengan rotary  evaporator  vacum (IKA-WERKE  HB4  basic)  dan pengeringan  ekstrak  kental  digunakan  desikator.  Isolasi  dan  pemurnian  senyawa  bahan alam  dari  kulit  akar C.  soulattri digunakan  kolom  vakum  (KVC)  dengan  diameter  9  cm, dan kolom kromatografi flash berdiameter 2 cm dan 1 cm. Analisis KLT digunakan lampu UV  dengan  λ  254  nm  dan  CeSO 4 sebagai  reagen  penampak  noda.  Elusidasi  struktur senyawa  isolat  dengan  metode  spektroskopi  UV-Vis  (spectrometer  UV/Vis  Lambda  25 Perkin  Elmer),  spektroskopi Fourier  Transform  Infrared (FTIR)  (spectrophotometer  IR Prestige-21 Shimadzu) dengan metode pelet KBr. Data 1 H NMR, 13 C NMR, DEPT, HSQC dan  HMBC  dianalisis  dengan  spektrofotometer  Agilent  VNMR  400  MHz  dengan menggunakan pelarut CDCl 3 .
Kulit akar C. soulattri diambil dari daerah Magelang, Jawa Tengah. Pelarut EtOAc, n -heksana,  dan  aseton  yang  digunakan  adalah  pelarut  teknis  yang  diredestilasi.  Pelarut CH 2 Cl 2 dan  CH 3 OH  yang  digunakan  adalah grade pro  analisis  dan  pereaksi  geser  yang digunakan  yaitu  larutan  NaOH  1M.  Fasa  diam  pada  KVC  digunakan  silika  gel  60  PF 254 ( merck ),  dan  untuk  kromatografi  kolom flash digunakan  silika  gel  60  (0,04-0,063  mm) 230-400 mesh ASTM ( merck ). Plat yang digunakan untuk analisis kromatografi lapis tipis (KLT)  adalah  plat  aluminium  berlapis  silika  gel  60  F 254 0,25  mm  ( merck ).  Impregnasi
sampel  digunakan  silika  adsorb  yaitu  silika  gel  60  (0,2-0,5  mm)  ( merck ).  Pereaksi penampak noda saat KLT digunakan Ce(SO 4 ) 2 2% dalam H 2 SO 4 1M.

## Metode isolasi
Tumbuhan C.  soulattri dideterminasi  di  Laboratorium  Taksonomi  Tumbuhan,
Fakultas  Biologi,  Universitas  Gajah  Mada  Yogyakarta.  Kulit  akar C.  soulattri dipotong tipis-tipis  kemudian  diangin-anginkan  dan  dibuat  serbuk.  Serbuk  kulit  akar C.  soulattri sebanyak  1,88  Kg  dimaserasi  dengan  8  L  EtOAc  pada  suhu  kamar  selama  2x24  jam. Solvent dievaporasi sampai diperoleh  ekstrak kental  sebanyak 54,2 g.  Ekstrak EtOAc (@
20g)    selanjutnya  difraksinasi  menggunakan  KVC  (2x)  menggunakan  eluen n - heksan:EtOAc dengan perbandingan (10:0), (9,5:0,5) (2x), (9:1) (4x), (8,5:1,5) (4x), (8:2) (2x),  (5:5),  (0:10)  masing-masing  sebanyak  150  mL.  Fraksi-fraksi  yang  diperoleh  dari KVC  I  dan  KVC  II  dianalisis  menggunakan  KLT  dengan  eluen  n-heksan:EtOAc  (9:1).
Fraksi  yang  memiliki  pola  spot  dan  pemisahan  yang  sama  digabung  sehingga  diperoleh sebanyak 10  fraksi utama  yaitu  fraksi  A (0,292 g), fraksi B (1,041 g), fraksi C (0,295 g), fraksi D (0,53 g), fraksi E (0,67 g), fraksi F (1,64 g), fraksi G (1,86 g), fraksi H (0,77 g), fraksi I (1,05 g) dan fraksi J (1,89 g).
Fraksi G dipilih untuk dipisahkan lebih lanjut dengan kromatografi kolom flash (2 cm)  dan  dielusi  menggunakan  eluen n -heksana:aseton:  (9:1;  8,5:1,5;  8:2;  7:3  dan  0:10) masing-masing dalam 150 mL. Dari hasil kromatografi kolom flash diperoleh sebanyak 11 fraksi utama  yaitu  fraksi G 1 (0,014 g), fraksi G 2 (0,006 g), fraksi G 3 (0,041 g),  fraksi  G 4
(0,001 g), fraksi G 5 (0,272 g), fraksi G 6 (0,190 g), fraksi G 7 (0,121 g), fraksi G 8 (0,216 g), fraksi  G 9 (0,114  g),  fraksi  G 10 (0,340  g),  dan  fraksi  G 11 (0,384  g).  Fraksi  G 5 kemudian dipilih  untuk  dimurnikan  lebih  lanjut  menggunakan  kromatografi  kolom flash dengan diameter  kolom  1  cm  menggunakan  eluen n -heksan:EtOAc  dibuat  dengan  perbandingan (9,5:0,5)  dalam  50  mL  dan  (9:1;  8,5:1,5;  8:2)  dalam  100  mL.  Diperoleh  8  fraksi  utama yaitu  fraksi  G 5a (0,005 g), G 5b (0,004 g), G 5c (0,005 g), G 5d (0,018 g), G 5e (0,128 g), G 5f (0,048 g), G 5g (0,033 g), dan G 5h (0,024 g). Dari kedelapan fraksi, Fraksi G 5e dipilih untuk dilakukan  uji  kemurnian  karena  memperlihatkan  satu  spot.  Uji  kemurnian  menggunakan KLT  dengan  menggunakan  variasi  eluen  yaitu n -heksana:EtOAc:aseton  (9:0,5:0,5); n - heksana:CH 2 Cl 2 :aseton  (8:1:1); n -heksana:CH 2 Cl 2 :EtOAc  (7:2:1); n -heksana:aseton  (8:2) kemudian diidentifikasi menggunakan spektroskopi UV, FTIR dan NMR.
Campuran  senyawa  β-sitosterol  dan  stigmasterol.  Padatan  berwarna  putih kekuningan. UV (MeOH) λ max nm:  210; 279. UV (MeOH + NaOH) λ max nm:  215; 255;
285; 255. IR ν max :  3432;  2959;  1624;  1459;  1381;  1057 cm -1 ; 13 C  NMR  β-sitosterol  dan stigmaserol dapat dilihat pada Tabel 1. 1 H dan HMBC  β-sitosterol dan stigmasterol dapat dilihat pada Tabel 2.

## PEMBAHASAN
Spektra  UV  menunjukkan  adanya  serapan  kuat  pada  λ maks 210  nm  dan  serapan lemah  pada  279  nm,  hal  ini  menunjukkan  adanya  sistem  alkena  yang  tidak  terkonjugasi. Pada data ini tidak menunjukkan adanya sistem aromatik. Penambahan reagen geser NaOH tidak  memberikan  efek  pergeseran  bathokromik,  sehingga  senyawa  yang  diperoleh dimungkinkan adalah senyawa kelompok terpenoid atau suatu steroid.
Tabel 1. Geseran kimia karbon senyawa β-sitosterol dan stigmasterol.
No. C δC (ppm) β-sitosterol  δC (ppm) stigmasterol 1 37,23 37,23 2 31,61 31,61 3 71,78 71,78 4 42,25 42,25 5 140,71 140,71 6 121,68 121,68 7 31,88 31,88 8 31,88 31,88 9 50,11 50,11 10 36,48 36,48 11 21,06 21,06 12 39,75 39,66 13 42,30 42,20 14 56,78 56,84 15 24,34 24,32 16 28,22 28,89 17 56,02 55,93 18 11,84 12,02 19 19,37 19,37 20 36,12 40,46 21 18,76 21,15 22 33,92 138,28 23 26,06 129,29 24 45,81 51,21 25 29,13 31,88 26 19,79 21,06 27 19,02 19,79 28 23,05 25,38 29 11,98 12,22
Spektra  FTIR  menunjukkan  bahwa  terdapat  serapan  gugus  hidroksi  (OH)  pada daerah  3432  cm -1 ,  pada  daerah  1624  cm -1 muncul  serapan  C=C  alkena,  sedangkan  pada
daerah  1057  cm -1 terdapat  serapan  C-O  dan  pada  daerah  2959  cm -1 merupakan  serapan gugus C-H. Data ini memperkuat data sebelumnya bahwa tidak ada gugus aromatik namun suatu gugus alkena pada senyawa hasil isolasi.
Spektra 13 C  NMR  (Tabel  1)  memperlihatkan  adanya  58  sinyal  karbon,  hal  ini menunjukkan adanya  suatu sistem campuran senyawa yang memiliki struktur yang mirip. Ini ditunjukkan dengan intensitas dari perbandingan beberapa puncak karbon. Sinyal-sinyal karbon  tersebut  merupakan  sinyal  dari  6  karbon  alkena  dan  52  karbon  alkana.  Spektrum DEPT NMR menunjukkan terdapat 12 karbon metil, 6 karbon kuartener, 20 karbon metin dan  20  karbon  metilen.  Spektra 1 H  NMR  menunjukkan  terdapat  kelompok  proton  alkana pada 0,67-3,51 ppm sedangkan untuk proton alkena pada 5,01-5,33 ppm. Pada pergeseran proton  0,67  dan  0,69  ppm  terdapat  puncak  singlet  yang  berhimpitan,  hal  tersebut menunjukkan  bahwa  terdapat  komponen  senyawa  lain  yang  strukturnya  hampir  sama dengan komponen utamanya.
HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 HO 1 2 Gambar 1 . Struktur senyawa (1) β-sitosterol dan (2) stigmasterol.
Spektrum  HSQC  menunjukkan  hubungan  proton  dan  karbon  yang  mempunyai jarak satu ikatan sehingga mengetahui jenis karbon dari senyawa tersebut diantaranya yaitu 121,68 ppm-5,33ppm; 138,28-5,13ppm; 129,29-5,01ppm; 71,78 ppm-3,51 ppm dan 56,78- 1,12 ppm. Spektrum HMBC menunjukkan hubungan korelasi antara proton dengan karbon yang  berjarak  2-3  ikatan  (Tabel  2.)  korelasi  penting  dari  kedua  senyawa  ini  juga ditunjukkan  dalam  Gambar  2.  Interpretasi  data  NMR  diperoleh  campuran  dua  senyawa yaitu β-sitosterol ( 1 ) dan stigmasterol ( 2 ) (Gambar 1.)
H 3 C HO H H H H 28,22 56,02 42,30 33,92 1,29;1,00 36,12 1,34 18,76 0,90 1,01 26,06 45,81 HO 42,20 28,89 55,93 H 3 C H 1,01 21,15 40,46 138,28 2,02 H 1,11 1 2
Gambar 2 . Korelasi penting proton dengan karbon dari data HMBC senyawa (1) β- sitosterol dan (2) stigmasterol.
Tabel 2. Geseran kimia proton  β-sitosterol dan  stigmasterol ( 2 ),  dan korelasinya dengan karbon pada data HMBC.
No. C δH (ppm, m ) β- sitosterol ( 1 ) Korelasi 1 H- 13 C (HMBC) δH (ppm, m ) stigmasterol ( 2 ) Korelasi 1 H- 13 C (HMBC)
1 1,02; 1,81, dd C3;C5;C10 1,02; 1,81, dd C3;C5;C10 2 1,47; 1,81, dd C3;C4;C10 1,47; 1,81, dd C3;C4;C10 3 3,51, m - 3,51, m - 4 2,18; 2,26, dd C2;C3;C5 2,18; 2,26, dd C2;C3;C5 5 - - - - 6 5,33, t C4;C7;C10 5,33, t C4;C7;C10 7 1,93; 1,98, dd C5;C6;C8;C9 1,93; 1,98, dd C5;C6;C8;C9 8 1,42, m C7;C9;C14 1,42, m C7;C9;C14 9 0,92, m C8;C10;C19 0,92, m C8;C10;C19 10 - - - - 11 1,49, m C8;C9;C12;C13 1,49, m C8;C9;C12;C13 12 1,14; 1,99, dd C9;C11;C18;C13 1,14; 1,99, dd C9;C11;C18;C13 13 - - - - 14 1,12, t C13;C16;C17;C18 1,12, m C13;C16;C18 15 1,54, m C8;C13;C14 1,54, m C8;C14 16 1,83, m C13;C17;C20 1,70, m C13;C17 17 1,01, m C12;C17 1,11, m C16;C20;C22 18 0,67, s C12;C13;C14;C17 0,69, s C12;C13;C14;C17 19 0,99, s C1;C5;C9;C10 0,99, s C1;C5;C9;C10 20 1,34, m C21;C22 2,02, m C13;C16;C17;C21;C22 ;C23 21 0,79, d C24;C25;C26 1,01, d 22 1,00; 1,29, dd C17;C20;C23;C24 5,13, dd C17;C20;C21;C23;C24 23 1,14, m C25 5,01, dd C20;C22;C24;C25;C28 24 0,91, m C22;C25;C27;C29 1,51, m - 25 1,64, m C24;C26;C27;28 1,42, m C25 26 0,81, d C24;C25;C27 0,83, d - 27 0,79, d C24;C25;C27 0,79, d C24;C25;C27 28 1,24, m C23;C24;C25;C29 1,41, m C25;C29 29 0,83, t C24;C28 0,79, t C28
Senyawa  hasil  isolasi  dari  ekstrak  etil  asetat  merupakan  campuran  senyawa  β- sitosterol  dan  stigmasterol  yang  merupakan  golongan  steroid.  Senyawa  ini  banyak ditemukan pada tumbuhan, kedua senyawa tersebut sebelumnya telah diisolasi dari ekstrak n -heksan kulit batang C. soulattri (Mah et al ., 2012) dan dari ekstrak petroleum eter serbuk rhizome dari Stylochiton lancifolius (Pateh et al ., 2009).

## KESIMPULAN
Senyawa  steroid  yang  diisolasi  dari  kulit  akar C.  soulattri merupakan  campuran senyawa β-sitosterol dan stigmasterol.

## DAFTAR PUSTAKA
Heyne,  K.,  1987, Tumbuhan  Berguna  Indonesia, Jilid  3,  Terjemahan  Badan  Litbang Kehutanan, Departemen Kehutanan, Jakarta.
Mah, SH., Ee, GCL., Rahmani, M., Yap, YHT., Sukari,  MA., and Teh, SS., 2011, A New Pyranoxanthone from Calophyllum soulattri , Molecules , vol. 16, pp. 3999-4004.
Mah,  SH.,  Ee,  GCL.,  Teh,  SS.,  Rahmani,  M.,  Lim,  YM.,  and  Go,  R.,  2012,  Phylattrin,  a New Cytotoxic Xanthone from Calophyllum soulattri , Molecules , vol 17, pp. 8303- 8311.
Nigam,  S.  K.,  Banerji,  R.,  Rebuffat,  S.,  Cesario,  M.,  Pascard,  C.,  and  Bodo,  B.,  1988, Soulattrone A, A  C24 Terpenoid  from Calophyllum  soulattri , Phytochemistry ,  vol. 27, no. 2, pp, 527-530.
Pateh, U. U., Haruna, AK.,  Garba, M., Iliya, I., Sule, IM., Abubakar, MS., and Ambi, AA., 2009,  Isolation  of  Stigmasterol,  β-sitosterol  and  2-Hydroxyhexadecanoic  Acid Methyl  Ester  from  The  Rhizomes  of Stylochiton  Lancifolius Pyer  and  Kotchy (Araceae), Nigerian Journal of Pharmaceutical Sciences , vol 8, no. 1, pp. 19-25.
Putra,  D.  P.,  Noveliandi,  and  Elidahanum  H.  2008,  Friedelin,  a  Triterpenoid  Pentacyclic from  the  Leaves  of Calophyllum  soulattri Burm.  F.  (Guttiferae), Jurnal  Sains  dan Teknologi Farmasi , vol. 13, no. 2, pp. 49-52.
Su,  X.H.,  Zhang,  ML.,  Li,  LG.,  Huo,  CH.,  Gu,  YC.,  and  Shi,  QW.,  2008,  Chemical Constituent of the Plants of the Genus Calophyllum , Chemistry & Biodirversity , vol. 5, pp. 2579-2608.