## Pola Pertumbuhan dan Aktivitas Degradasi Kafein oleh Konsorsium Bakteri Pendegradasi Kafein
Growth Pattern and Degradation Activity of Caffeine-degrading Bacteria Consortium
Nadhea Ayu Sukma, Esti Utarti, Sattya Arimurti *)
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember *E-mail: arimurti.fmipa@unej.ac.id

## ABSTRACT
Caffeine-degrading  bacteria  can  be  used  as  agents  to  degrade  caffeine,  thereby  reducing  the concentration  of  caffeine  in  organic  waste.  The  decomposition  process  is  carried  out  by  a  single bacterium  or    a  consortium  of  bacteria.  Caffeine-degrading  bacteria  from  Sempol,  Bondowoso, namely Acinetobacter  gerneri KAFS  47, Paracoccus  denitrificans KAFS  16  and Pseudomonas plecoglossicida KAFS 34, could be used as a bacterial consortium  to promote caffeine degradation. The  aim  of  this  study  was  to  analyze  associations  between  caffeine-degrading  bacteria  isolates, bacterial  resistance  to  antibiotics,  growth  patterns,  and  caffeine  degradation  of  a  consortium  of caffeine-degrading bacteria, and the correlation of bacterial growth with caffeine degradation. The research method used is an analysis of the association between isolates, the development of bacterial consortium growth patterns, and their analysis based on antibiotic resistance, patterning of caffeine degradation, and correlation test (Pearson) of bacterial growth with caffeine degradation. The result of the association test between bacteria showed that the three bacteria had the potential to be used as a consortium of caffeine-degrading bacteria. A. Gerneri , P. denitrificans , and P. plecoglossicida were resistant to the antibiotic cefixime (100 ppm), erythromycin (50 ppm), lincomycin (50 ppm), metronidazole (50 ppm), and sanprima (50 ppm). The growth of the bacterial consortium (54.779 CFU/mL) was higher than that of P. plecoglossicida ( 49.277 CFU/mL) and lower than that of A. gerneri (93.481  CFU/mL)  and P.  denitrificans (84.940  CFU/mL)  in  incubation  time  of  4  days. However, the consortium of bacteria and P. plecoglossicida were able to degrade caffeine 24 hours faster (3 days) than the other two single isolates (4 days) to degrade 2.5 g/L caffeine in media to 0%. Bacterial  growth  due  to  caffeine  degradation  has  a  perfect  correlation  value  (>0.  950)  and  is negative.
Keywords: Caffeine, degradation, consortium, association, resistance, growth.

## PENDAHULUAN
Kafein (1,3,7-trimetilxantin) merupakan
golongan  metilxantin  yang  secara  alami terkandung  pada  tumbuhan  diantaranya  beri, coklat, teh, dan kopi (Win et al. , 2019). Kafein pada limbah organik hasil industri teh dan kopi bersifat toksik terhadap bakteri  (Iswanto et al ., 2019) dan dapat memberikan  pengaruh  negatif pada pertumbuhan selada (Gomes et al ., 2013) dan  bunga  matahari  (Khursheed et  al .,  2009). Kandungan  kafein  pada  limbah  organik,  dapat diturunkan  dengan  memanfaatkan  bakteri pendegradasi kafein .
Bakteri pendegradasi kafein mampu memanfaatkan  kafein  sebagai  sumber  karbon dan nitrogen untuk pertumbuhannya (Summers et  al .,  2012).  Beberapa  genus  bakteri  yang dilaporkan  memiliki  kemampuan  degradasi kafein yaitu Acinetobacter, Acetobacter, Alcaligenes, Klebsiella, Pseudomonas, Rhodococcus, Serratia (Summers et al. , 2015).
Hasil  penelitian  (Arimurti et  al. ,  2021) didapatkan  tiga  isolat  bakteri  pendegradasi kafein asal Sempol, Bondowoso yaitu Acinetobacter  gerneri KAFS  47, Paracoccus denitrificans KAFS  16,  dan Pseudomonas plecoglossicida KAFS  34.  Ketiga  bakteri tersebut berpotensi digunakan sebagai konsorsium agen degradasi kafein pada limbah organik.
Konsorsium  bakteri  merupakan  kumpulan populasi  bakteri  yang  hidup  bersimbiosis (Kumar  &  Jagadeesh,  2016).  Konsorsium bakteri  menunjukkan  asosiasi  positif,  yaitu terjadi  interaksi  bersifat  sinergis  yang  ditandai dengan tidak adanya zona hambat antar bakteri (Rifai et  al. ,  2020).  Beberapa  penelitian menunjukkan  konsorsium  bakteri  memiliki efektivitas  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan isolat tunggal. Penelitian Poszytek et al . (2016) menunjukkan  konsorisum  bakteri  selulolitik mampu  menghidrolisis  silase  jagung  secara efisien dan meningkatkan produksi biogas 38%
dibandingkan  dengan  isolat  tunggalnya  (16%). Konsorsium bakteri pendegradasi minyak yang terdiri  atas Bacillus sp., Corynebacterium sp., Flavobacterium sp, Micrococcus sp.,  dan Pseudomonas sp.,  menunjukkan  aktivitas degradasi  pada  substrat  minyak  sampai  78% dibandingkan  dengan  isolat  tunggalnya  (41- 66%)  (Hamzah et  al .,  2013).  Menurut  Resti et al. (2018)  konsorsium  bakteri  endofit  mampu menekan perkembangan Ralstonia solanacearum (patogen)  dengan  adanya  zona hambat (6-9,25cm). Penggunaan konsorsium bakteri pendegradasi  kafein  untuk  degradasi  kafein belum  pernah  dilaporkan.  Perlu  dilakukan analisis potensi
konsorsium bakteri pendegradasi  kafein A.  gerneri KAFS  47, P. denitrificans KAFS  16,  dan P.  plecoglossicida KAFS  34  berdasarkan  pola  pertumbuhan  dan pola  degradasi  pada  media  kafein.  Hal  ini mendukung pengembangan agen hayati degradasi kafein pada limbah organik.

## METODE
Penelitian  dilaksanakan  pada  Januari  sampai  April 2021.  Tempat  penelitian  dilakukan  di  Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Universitas  Jember. Bahan  yang  digunakan  diantaranya:  isolat  bakteri pendegradasi  kafein  ( A.  gerneri  KAFS  47,  P. denitrificans KAFS 16, dan P. plecoglossicida KAFS 34 ); media M9; 0,25% kafein ( sigma-aldrich ); media nutrient agar (NA); media nutrient broth (NB); dan NaCl  (0,85%);  dan  antibiotik  (ampisilin,  cefadroxil, tetrasiklin, lincomisin, sanprima, rifampicin, colcacentin,  eritromisin,  ofloxacin,  metronidazole,
dan cefixime). Prosedur penelitian ini diawali dengan peremajaan  bakteri  pendegradasi  kafein  ( A.  gerneri KAFS  47,  P.  denitrificans  KAFS  16,  dan  P. plecoglossicida  KAFS  34 ).  Peremajaan  dilakukan pada media miring M9+2,5 g/L kafein dan diinkubasi selama  3-4  hari  pada  suhu  30℃.  Hasil  peremajaan kemudian dilakukan uji asosiasi antar isolat bakteri. Uji  ini  dilakukan  berdasarkan  pada  kemampuan tumbuh isolat bakteri  satu pada supernatan bebas sel isolat  bakteri  yang  lain  dengan  metode  difusi sumuran.  Masing-masing  kultur  ditumbuhkan  pada 10  mL  media  NB  dan  dinkubasi shaker (125  rpm) sampai  didapatkan  kepadatan  selnya  OD  0,4  pada panjang gelombang 600. Sebanyak 100 μL inokulum masing-masing  bakteri  diinokulasikan  pada  15  mL media NA dengan metode cawan tuang ( pour plate ). Media yang memadat kemudian dilubangi menggunakan corkborer steril  dengan  ukuran diameter 5 mm sebanyak 4 lubang. Supernatan bebas sel didapatkan dari filtrasi menggunakan milipore 0,2 μm. Sebanyak 20 µL supernatan bebas sel dari bakteri lain  diletakkan  pada  lubang  yang  telah  dibuat  pada
media NA. Uji asosiasi ini menggunakan media NB sebagai  kontrol  positif  dan  antibiotik  ofloxacin  (50 ppm)  sebagai  kontrol  negatif.  Uji  asosiasi  positif ditandai  dengan  tidak  adanya  zona  hambat  yang menunjukkan bahwa supernatan bebas sel isolat satu tidak  menghambat  pertumbuhan    bakteri  lain  yang disebar  ( pour  plate ).  Hasil  uji  asosiasi  ini  menjadi dasar  untuk  menentukan  konsorsium  bakteri  yang akan  dilakukan.
Uji  ketahanan  bakteri  terhadap  antibiotik dilakukan  untuk  menentukan  penanda  pertumbuhan isolat  bakteri  pada  suatu  konsorsium.  Uji  ini dilakukan  dengan  metode  difusi  sumuran.  Masing- masing isolat bakteri dengan OD 0,4 diambil 100 µL dan  diinokulasikan  pada  15  mL  media  NA  dengan metode  cawan  tuang  ( pour  plate ).  Masing-masing media  dibuat  tujuh  lubang  menggunakan  corkborer steril  (diameter  5  mm).  Masing-masing  lubang  diisi dengan  antibiotik  yang  berbeda  sebanyak  20  µL. Antibiotik yang digunakan yaitu ampisilin (20 ppm, 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm); cefadroxil (20 ppm, 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm); cefixime (50 ppm, 75 ppm, 100  ppm);  colsancetine  (20  ppm);  eritromisin  (20 ppm,  50  ppm);  lincomisin  (20  ppm,  50  ppm); ofloxacin  (50  ppm);  dan  metronidazole  (50  ppm); rifampicin  (20  ppm);  sanprima  (20  ppm,  50  ppm); tetrasiklin  (20  ppm);  serta  akuades  sebagai  kontrol negatif.  Parameter  uji  ketahanan  bakteri  terhadap antibiotik  berdasarkan  sensitivitas  bakteri  yang ditunjukkan dengan ada tidaknya zona hambat.
Pembuatan starter konsorsium bakteri dilakukan berdasarkan hasil asosiasi antar isolat bakteri. Starter bakteri (OD 0,4) diinokulasikan pada 100 mL media cair  M9+2,5  g/L  kafein.  Biakan  diinkubasi menggunakan  shaker  (125  rpm)  pada  suhu  ruang selama  7  hari. Pengamatan  dilakukan  menggunakan spektrofotometer  untuk  mengukur  jumlah  sel  (λ  = 600  nm)  dan  konsentrasi  kafein  dalam    media  (λ  = 272,5 nm) pada interval waktu 24 jam. Hal yang sama juga  dilakukan  pada  isolat  tunggal  sebagai pembanding  pertumbuhan  dan  degradasi  kafein. Analisis  data  statistik  menggunakan  uji  korelasi Pearson.  Uji  ini  dapat  dilakukan  apabila  data terdistridibusi  normal melalui  uji  normalitas Kolmogorov-Smirnov dengan nilai signifikansi 0,05 .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil uji asosiasi antar isolat bakteri pendegradasi kafein P. denitrificans KAFS 16, P.  plecoglossicida KAFS  34,  dan A.  gerneri KAFS 47 yang menggunakan supernatan bebas sel menunjukkan bahwa ketiga bakteri tersebut tidak memiliki daya antagonis (Gambar 1). Hal ini dibandingkan dengan kontrol positif (media NB) tidak menunjukkan zona hambat, sedangkan  pada  kontrol  negatif  (ofloxacin  50 ppm)  yang  menunjukkan  zona  hambat  pada masing-masing  bakteri.  Media  NB  merupakan media  pembiakan  bakteri,  sehingga  tidak menghambat  pertumbuhan  bakteri  (Mulyadi et
al ., 2017). Ofloxacin termasuk dalam antibiotik kuinolon yang
memiliki mekanisme menghambat sintesis asam nukleat dan bersifat bakterisida,  sehingga mampu membunuh bakteri (Triono & Purwoko, 2012).
Daerah supernatan bebas sel yang tidak ada zona hambat menunjukkan bahwa ketiga isolat bakteri  berasosiasi  positif,  sehingga  berpotensi digunakan sebagai konsorsium bakteri pendegradasi kafein. Menurut Rifai et al . (2020) hubungan  sinergis  yang  ada  pada  konsorsium bakteri  menunjukkan  perilaku  kooperatif  antar bakteri  karena  antar  bakteri  dapat  saling mendukung pertumbuhan.
Antibiotik  merupakan  senyawa  yang  dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri  dengan mekanisme  penghambatan  yang  berbeda-beda.
Penghambatan pertumbuhan
bakteri ditunjukkan  dengan  adanya  zona  hambat  di sekitar  antibiotik  pada  media  yang  telah mengandung  suspensi  bakteri.  Ketahanan masing-masing bakteri terhadap penghambatan pertumbuhan  oleh  antibiotik  bersifat  spesifik dan  dapat  digunakan  sebagai  penanda  pada pembuatan  konsorsium  bakteri.  Hasil  uji ketahanan antibiotik menunjukkan P. denitrificans KAFS  16  tidak  tahan  terhadap antibiotik  ampisilin  (50  ppm,  75  ppm,  100 ppm);  cefadroxil  (50  ppm,  75  ppm,  100  ppm); ofloxacin  (50  ppm);  rifampicin  (20  ppm),  dan tetrasiklin  (20  ppm). P.  plecoglossicida KAFS
34 tidak tahan terhadap ofloxacin (50 ppm dan tetrasiklin (20 ppm), serta A. gerneri KAFS 47 tidak tahan oleh antibiotik cefadroxil (50 ppm, 75  ppm,  100  ppm),  colsancetine  (20  ppm), ofloxacin  (50  ppm)  dan  tetrasiklin  (20  ppm) karena dapat dihambat pertumbuhannya. Ketiga bakteri tersebut tidak tahan terhadap tetrasiklin dan ofloxacin (Tabel 1).
A.  gerneri KAFS  47  dan P.  denitrificans KAFS  16  tidak  tahan  terhadap  antibiotik cefadroxil  (50  ppm,  75  ppm,  100  ppm). Cefadroxil termasuk dalam golongan sefalosporin  yang  memiliki  mekanisme  kerja menghambat  sintesis  dinding  sel,  bersifat bakteriosid  (Wasitaningrum,  2009;  Wilarsih, 2019).  Antibiotik  ini  dapat  digunakan  sebagai penanda pertumbuhan P. plecoglossicida KAFS 34  karena  hanya  bakteri  ini  yang  tahan  ketika diberi cefadroxil yang ditunjukkan dengan tidak adanya zona hambat disekitar sumuran.
Ampisilin dapat digunakan sebagai penanda pertumbuhan A.  gerneri KAFS  47  dan P. plecoglossicida KAFS 34. Hal ini karena hanya P. denitrificans KAFS 16 tidak tahan terhadap antibiotik  ampisilin  (50  ppm,  75  ppm,  100 ppm).  Ampisilin  termasuk  dalam  golongan penisilin dengan mekanisme kerjanya menghambat  sintesis  dinding  sel  bakteri memiliki spektrum yang luas, bersifat bakteriosid (Yunensa, 2016; Wilarsih, 2019).
Gambar  1.    Uji  asosiasi  antar  isolat  bakteri  pendegradasi  kafein  pada  pengukuran  daya  hambat supernatan bebas sel (a) P. denitrificans KAFS 16; (b) P. plecoglossicida KAFS 34; dan (c) A. gerneri KAFS 47. 16: supernatan bebas sel P. denitrificans KAFS 16; 34: supernatan bebas sel P. plecoglossicida KAFS 34; 47: supernatan bebas sel A. gerneri KAFS 47; NB: kontrol positif (media NB); zona hambat (tanda panah pada gambar) oleh kontrol negatif yaitu antibiotik ofloxacin 50 ppm (AB)
Tabel 1. Ketahanan bakteri pendegradasi kafein terhadap antibiotik
No. Jenis Antibiotik [  ] AB Daya Hambat Antibiotik (ppm) Acinetobacter gerneri KAFS 47 Paracoccus denitrificans KAFS 16 Pseudomonas plecoglossicida KAFS 34 1 Ampisilin 20 R R R 50 R 1,03 ± 0,03 mm R 75 R 1,54 ± 0,25 mm R 100 R 2,06 ± 0,04 mm R 2 Cefadroxil 20 R R R 50 1,08 ± 0,07 mm 1,07 ± 0,05 mm R 75 1,62 ± 0,03 mm 1,60 ± 0,03 mm R 100 2,16 ± 0,02 mm 2,14 ± 0,06 mm R 3 Cefixime 50 R R R 75 R R R 100 R R R 4 Colsancetine 20 0,95 ± 0,20 mm R R 5 Eritromisin 20 R R R 50 R R R 6 Lincomisin 20 R R R 50 R R R 7 Ofloxacin 50 1,89 ± 0,05 mm 2,06 ± 0,03 mm 1,12 ± 0,04 mm 8 Metronidazole 50 R R R 9 Rifampicin 20 R 0,88 ± 0,02 mm R 10 Sanprima 20 R R R 50 R R R 11 Tetrasiklin 20 2,34 ± 0,05 mm 2,13 ± 0,02 mm 0,82 ± 0,01 mm *(R): resisten terhadap antibiotik Colsancetine  termasuk  dalam  antibiotik kloramfenikol  dengan  dengan  mekanisme kerjanya menghambat sintesis protein , memiliki spektrum  yang  luas  dan  bersifat  bakteriostatik (Wasitaningrum,  2009). A.  gerneri KAFS  47 tidak tahan terhadap antinotik colsacentine (20 ppm)  sementara P. denitrificans KAFS 16 dan P. plecoglossicida KAFS 34 tahan. Oleh karena itu,  antibiotik  ini  dapat  digunakan  sebagai penanda pertumbuhan P. denitrificans KAFS 16 dan P. plecoglossicida KAFS 34.
Pola pertumbuhan konsorsium bakteri relatif lebih  rendah  dibandingkan  dengan  pola pertumbuhan  masing-masing  bakteri  sebagai isolat  tunggal.  Hasil  penelitian  menunjukkan pola pertumbuhan konsorsium bakteri (54,779 x 10 7 ±  1,739  CFU/mL)  lebih  rendah  dari P. denitrificans KAFS  16  (84,940  x  10 7 ±  2,118 CFU/mL)  dan A.  gerneri KAFS  47  (93,481  x 10 7 ± 2,981 CFU/mL), serta lebih tinggi dari P. plecoglossicida KAFS 34 (49,277 x 10 7 ± 0,733 CFU/mL)  pada  media  M9  +  kafein  2,5  g/L dalam waktu inkubasi 4 hari (Tabel 2). Pertumbuhan konsorsium bakteri
menunjukkan  fase  eksponensial  pada  awal inokulasi sampai hari ke-3 (55,181 x 10 7 ± 2,539
CFU/mL)  dengan  waktu  generasi  40  jam, selanjutnya  diikuti  fase  stasioner  (Gambar  2). P.  denitrificans KAFS  16  mencapai  fase  akhir eksponensial  pada  waktu  inkubasi  hari  ke-4 (84,940 x 10 7 ± 2,118 CFU/mL) dengan waktu generasi  40  jam.  Penelitian  Irsyadah  (2020) menunjukkan jumlah sel P. denitrificans KAFS 16  pada  fase  akhir  eksponensial  pada  waktu inkubasi  48  jam  (7,41  x  10 7 CFU/mL)  dengan waktu  generasi  5  jam.  Fase  eksponensial P. plecoglossicida KAFS 34 pada waktu inkubasi hari  ke-2  (35,141  x  10 7 ±  0,387  CFU/mL) dengan  waktu  generasi  paling  cepat  yaitu  26 jam. Penelitian Malasari (2020) menyebutkan P. plecoglossicida KAFS  34  mengalami  fase eksponensial pada jam ke-12 sampai jam ke-54 (7,9  x  10 7 CFU/mL). A.  gerneri KAFS  47 mengalami fase eksponensial dimulai pada hari ke-1  dan  mencapai  puncak  fase  eksponensial pada  inkubasi  hari  ke-3  (55,181  x  10 7 ±  2,539 CFU/mL)  dengan  waktu  generasi  paling  lama yaitu  43  jam.  Penelitian  Sindiana  (2020) menyatakan fase eksponensial akhir A. gerneri KAFS 47 pada waktu inkubasi jam ke 66 dengan jumlah  sel  81,9  x  10 7 CFU/mL  dengan  waktu generasi 7 jam.
Gambar 2. Pola pertumbuhan konsorsium bakteri dan isolat tunggal pendegradasi kafein pada media M9 + kafein 2,5 g/L
Tabel 2. Viabilitas isolat tunggal pada konsorsium bakteri pada media yang mengandung penanda antibiotik Waktu Inkubasi (hari) Ampisilin 75 ppm ( P. plecoglossicida KAFS 34 dan A. gerneri KAFS 47) Cefadroxil 75 ppm ( P. plecoglossicida KAFS 34) Colsancetine 20 ppm ( P. denitrificans KAFS 16 dan P. Plecoglossicida KAFS 34) 0 + + + 1 + + + 2 + + + 3 + + + 4 + + + 5 + + + 6 + + + 7 + + +
* (+) isolat bakteri tumbuh
Berdasarkan  Gambar  2 P.  plecoglossicida KAFS  34  diduga  lebih  berperan  dalam  pola pertumbuhan  konsorsium  bakteri.  Hal  ini didukung  dengan  pola  pertumbuhan  dan  pola degradasi kafein pada P. plecoglossicida KAFS 34 yang tidak jauh berbeda dengan konsorsium. Namun,  berdasarkan  hasil  uji  asosiasi  antar isolat  bakteri  menunjukkan  tidak  adanya  daya antagonis,  yang  mana  uji  ini  dilakukan berdasarkan  daya  penghambatan  supernatan bebas sel. Supernatan bebas sel ini mengandung metabolit yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain (Afriani, 2017). Namun, berdasarkan  pola  pertumbuhannya  ketika bakteri  ditumbuhkan  sebagai  konsorsium menunjukkan  dua  bakteri  ( P.  denitrificans KAFS 16 dan A. gerneri KAFS 47) lebih tinggi pertumbuhannya. Hal ini dimungkinkan terjadi
kompetisi  nutrisi  ketika  bakteri  ditumbuhkan sebagai konsorsium karena sumber karbon yang sama, sehingga ada bakteri yang pertumbuhannya terhambat. Menurut Rifai et al.
(2020)  kompetisi  antar  bakteri  dapat  terjadi apabila ditumbuhkan pada medium yang sama. Kompetisi tersebut akan saling bersaing terkait nutrisi, tempat, udara, dan air.
Hasil  uji  viabilitas  isolat  tunggal  pada konsorsium bakteri pendegradasi kafein berdasarkan penanda ketahanan terhadap antibiotik  dapat  dilihat  pada  Tabel  3.  Analisis viabilitas  masing-masing  isolat  bakteri  pada konsorsium  bakteri  dapat  dilakukan  dengan penanda ketahanan terhadap antibiotik. Penanda ketahanan  bakteri  setiap  bakteri  terhadap antibiotik  bersifat  spesifik  karena  antibiotik memiliki  mekanisme  penghambatan  yang
berbeda-beda.  Uji  ini  dilakukan  berdasarkan penanda antibiotik dari masing-masing bakteri.
Berdasarkan  hasil  viabilitasnya  pada  medium yang mengandung antibiotik tersebut menunjukkan  semua  isolat  bakteri  yang dikonsorsiumkan masing-masing bakteri masih tetap bisa tumbuh. Hal ini diduga pertumbuhan bakteri  tunggal  ada  yang  terhambat,  namun masih  bisa  tumbuh  dengan  jumlah  sel konsorsium  bakteri  lebih  rendah  dibandingkan dengan isolat tunggalnya.
Hasil degradasi kafein oleh bakteri pendegradasi  kafein  yang  dilakukan  sebagai isolat  tunggal  maupun  sebagai  konsorsium terlihat  pada  Gambar  3.  Hasil  penelitian menunjukkan pertumbuhan konsorsium bakteri diikuti  dengan  penurunan  konsentrasi  kafein
pada  media.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa konsorsium  bakteri  mampu  memanfaatkan kafein  dalam  media  untuk  pertumbuhannya, yang  didukung  dengan  jumlah  sel  konsorsium bakteri mencapai 20,683 x 10 7 CFU/mL ± 0,347 dalam  waktu  inkubasi  1  hari.  Persentase degradasi  kafein  oleh  konsorsium  bakteri semakin meningkat hingga 100% dalam waktu inkubasi  3  hari  yang  didukung  dengan peningkatan  jumlah  sel  konsorsium  bakteri (55,181 x 10 7 CFU/mL ± 2,539). Hal ini sejalan dengan  penelitian  Win et  al. (2019)  yang menyatakan bahwa pemanfaatan sumber karbon dan  nitrogen  oleh  bakteri  pendegradasi  kafein yang  digunakan  untuk  pertumbuhan  bakteri dapat  menurunkan  konsentrasi  kafein  pada media.
Gambar 3. Pola degradasi kafein oleh konsorsium bakteri dan isolat tunggal bakteri pendegradasi kafein
Pola  degradasi  kafein  oleh  konsorsium bakteri  dan P.  plecoglossicida KAFS  34 berdasarkan Gambar 3 menunjukkan pola yang tidak jauh berbeda. P. plecoglossicida KAFS 34 mampu  mendegradasi  kafein  mencapai  100% pada  waktu  inkubasi  3  hari  dengan  jumlah  sel 49,598  x  10 7 ±  0,487  CFU/mL.  Menurut penelitian  Malasari  (2020) P.  plecoglossicida KAFS  34  mampu  mendegradasi  kafein mencapai 98,15% dalam waktu inkubasi 3 hari. P. denitrificans KAFS 16 (84,940 x 10 7 ± 2,118 CFU/mL)  dan A.  gerneri KAFS  47  (93,481  x 10 7 ± 2,981 CFU/mL) memiliki pola degradasi kafein  yang  hampir  sama  dengan  waktu inkubasi  4  hari  mampu  mendegradasi  kafein 100%.  Menurut  Irsyadah  (2020)  degradasi kafein oleh P. denitrificans KAFS 16 mencapai 100%  pada  waktu  inkubasi  2  hari.  Penelitian Sindiana  (2020)  melaporkan  bahwa A.  gerneri KAFS  47  mampu  mendegradasi  kafein  100% dalam waktu inkubasi 2,5 hari.
Pertumbuhan  konsorsium bakteri (54,779 x 10 7 ±  1,739  CFU/mL)  dan P.  plecoglossicida KAFS 34 (49,277 x 10 7 ± 0,733 CFU/mL) pada waktu inkubasi 4 hari lebih rendah dibandingkan dengan P. denitrificans KAFS 16 (84,940 x 10 7 ± 2,118 CFU/mL) dan A. gerneri KAFS  47  (93,481  x  10 7 ±  2,981  CFU/mL). Namun,  aktivitas  degradasi  kafein  oleh konsorsium  bakteri  dan P.  plecoglossicida KAFS 34 lebih tinggi, yaitu lebih cepat 24 jam dibandingkan dengan P. denitrificans KAFS 16 dan A.  gerneri KAFS  47.  Berdasarkan  hasil tersebut  menunjukkan  pola  pertumbuhan  dan degradasi kafein oleh konsorsium bakteri dan P. plecoglossicida KAFS  34  hampir  sama.  Oleh karena itu, perlu adanya pertimbangan penggunaan konsorsium bakteri sebagai pendegradasi  kafein  karena  memiliki  potensi degradasi  kafein  yang  tidak  jauh  berbeda dengan isolat tunggal ( P. plecoglossicida KAFS 34).
Hasil  uji  normalitas  menunjukkan  bahwa data  terdistribusi  normal  yaitu  0,566  ( P. denitrificans KAFS 16); 0,960 ( P.
plecoglossicida KAFS  34;  0,998  ( A.  gerneri KAFS 47); dan 0,481 (konsorsium bakteri). Uji korelasi  Pearson  dilakukan  untuk  mengetahui hubungan pertumbuhan bakteri dengan degradasi kafein pada medium oleh bakteri. Uji ini  dilakukan  jika  data  terdistribusi  normal dengan nilai signifikansi 0,05. Nilai signifikansi pada P. denitrificans KAFS 16, P. plecoglossicida KAFS 34, A. gerneri KAFS 47, dan  konsorsium  bakteri  tersebut  0,000.  Nilai
signifikansi < 0,05 yang berati terdapat korelasi yang signifikan antara jumlah sel bakteri dengan persentase  degradasi  kafein  dengan  nilai korelasi > 0,950. Menurut Yanti & Akhri (2021) nilai  kriteria  korelasi  0,81-1,00  menunjukkan korelasi  sempurna.  Hubungan  korelasi  bernilai negatif yang menunjukkan semakin meningkatnya pertumbuhan bakteri, konsentrasi kafein  dalam  medium  semakin  menurun (Gambar 4). Hal ini menunjukkan pertumbuhan bakteri memanfaatkan media yang mengandung kafein,  sehingga  konsentrasi  kafein  menurun dari 100% sampai 0% (Subagiyo et al ., 2016).
a) b) c) d)
Gambar 4.  Hubungan jumlah sel bakteri dengan persentase degradasi kafein oleh a) P. denitrificans KAFS 16; b) P. plecoglossicida KAFS 34; c) A. gerneri KAFS 47; dan d) konsorsium bakteri

## KESIMPULAN
Bakteri P.  denitrificans KAFS  16, P. plecoglossicida KAFS 34, dan A. gerneri KAFS 47  memiliki  asosiasi  positif,  sehingga  dapat digunakan sebagai konsorsium bakteri pendegradasi  kafein.  Pertumbuhan  konsorsium bakteri  memiliki  jumlah  sel  yang  lebih  rendah dibandingkan dengan P. denitrificans KAFS 16 dan A.  gerneri KAFS  47,  tetapi  lebih  tinggi daripada P. plecoglossicida KAFS 34 pada fase eksponensial  pada  media  kafein.  Ketiga  isolat menunjukkan  pertumbuhan  pada  konsorsium berdasarkan  uji  viabilitas  ketahanan  terhadap antibiotik. Konsorsium bakteri memiliki kemampuan degradasi kafein sebesar 100% dan mirip dengan P. plecoglossicida KAFS 34 yaitu serta lebih tinggi dari P. denitrificans KAFS 16 dan A. gerneri KAFS 47. Korelasi pertumbuhan bakteri dengan degradasi kafein pada
konsorsium bakteri menunjukkan nilai korelasi sempurna (> 0,950) dan bersifat negatif.

## DAFTAR PUSTAKA
Afriani N, Yusmarini & Pato U. 2017. Aktivitas Antimikroba Lactobacillus  plantarum 1 yang Diisolasi dari Industri Pengolahan Pati Sagu terhadap Bakteri Patogen Escherichia coli Fncc-19  dan Staphylococcus  aureu s Fncc-15. JOM FAPERTA. 4 (2): 1-12. Arimurti  S,  Oktavianawati  I  &  Suharjono  S.
2021.  Isolation  and  Screening  Caffeine- Degrading Bacteria. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science . 743 (1). Gomes T,  Pereira JA,  Ramalhosa E,  Casal S,
&    Baptista  P.  2013.  Effect  of  Fresh  and Composted  Spent  Coffee  Grounds  on Lettuce  Growth,  Photosynthetic  Pigments and  Mineral  Composition VII  Congreso
Ibérico  de  Agroingenieria  y  Ciencias Horticolas . VII : 1372-1376.
Hamzah A,  Phan CW,  Abu Bakar NF &  Wong KK. 2013. Biodegradation of Crude Oil by Constructed  Bacterial  Consortia  and  the Constituent  Single  Bacteria  Isolated  from Malaysia. Bioremediation Journal . 17 (1): 1- 10. Irsyadah A. 2020. Analisis Pola Pertumbuhan, Degradasi  Kafein,  dan  Profil  Protein
Bakteri  Paracoccus  denitrificans  KAFS  16 pada  Media  Kafein. [Skripsi,  Universitas Jember] . Iswanto T,  Shovitri M,  Altway A,  Widjaja T, Kusumawati  DI  &  Lisdiyanti  P.  2019. Isolation  and  Identification  of  Caffeine- degrading  Bacteria  from  Soil,  Coffee  Pulp Waste and Excreted Coffee Bean in Luwak Feces. Biodiversitas . 20 (6): 1580-1587.
Khursheed T,  Ansari MYK &  Shahab D. 2009. Studies on the Effect of Caffeine on Growth and Yield Parameters in Helianthus annuus L.  Variety  Modern. Biology  and  Medicine. 1 (2): 56-60.
Kumar  KH  &  Jagadeesh  KS.  2016.  Microbial Consortia-mediated  Plant  Defense  Against Phytopathogens and Growth Benefits. South Indian Journal of Biological Sciences. 2 (4): 395-403.
Malasari  V.  2020. Analisis  Pertumbuhan  dan Profil Protein Bakteri Pendegradasi Kafein Pseudomonas  plecoglossicida  KAFS  34 . [Skripsi, Universitas Jember] Mulyadi  M  &    Ria  SP.  2017.  Konsentrasi
Hambat  Minimum  (KHM)  Kadar  Sampel Alang-Alang  ( Imperata  cylindrica )  dalam Etanol  Melalui  Metode  Difusi  Cakram. Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi . 20 (3):130- 135. Poszytek K,  Ciezkowska M,  Sklodowska A. & Drewniak  L.  2016.  Microbial  Consortium with  High  Cellulolytic  Activity  (MCHCA) for  Enhanced  Biogas  Production. Frontiers in Microbiology. 7 .
Resti Z, Sulyanti E & Reflin. 2018. Endophytic Bacterial Consortium as Biological Control to Ralstonia  solanacearum and  Growth Promoter  for  Chili  Plant. PROS  SEM  NAS MASY BIODIV INDON. 4 (2): 208-214. Rifai MR,  Widowati H &  Sutanto A. 2020. Uji Sinergis  Konsorsia  Bakteri  Indigen  LCN
Berkonsorsia  Bakteri  Tanah  di  Kebun Percobaan  Universitas  Muhammadiyah Metro untuk Penyusunan Panduan
Praktikum Mikrobiologi . http://scholar.ummetro.ac.id/index.php/biol ova/ Sindiana I. 2020. Pola Pertumbuhan dan Profil Protein Bakteri Pendegradasi Kafein
Acinetobacter  gerneri  KAFS  47 .  [Skripsi
Universitas Jember]
Subagiyo  S,    Margino  S  &  Triyanto  T.    2016. Pengaruh  Penambahan  Berbagai  Jenis Sumber  Karbon,  Nitrogen  dan  Fosfor  pada Medium deMan, Rogosa and Sharpe (MRS) terhadap Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat Terpilih  yang  Diisolasi  dari  Intestinum Udang  Penaeid. Jurnal  Kelautan  Tropis .
18 (3): 127.
Summers RM,  Louie TM,  Yu CL,  Gakhar L,
Louie KC &  Subramanian M. 2012. Novel, Highly  Specific  N-demethylases  Enable Bacteria  to  Live  on  Caffeine  and  Related Purine  Alkaloids. Journal  of  Bacteriology .
194 (8): 2041-2049.
Summers RM,  Mohanty  SK,  Gopishetty S  & Subramanian M. 2015. Genetic Characterization of Caffeine Degradation by
Bacteria  and  Its  Potential  Applications.  In
Microbial Biotechnology. 8 (3): 369-378.
Triono    AA  &  Purwoko  AE.  2012.  Efektifitas Antibiotik  Golongan  Sefalosporin  dan Kuinolon  terhadap  Infeksi  Saluran  Kemih.
Mutiara Medika . 12 (1): 6-11. Wasitaningrum  IDA.  2009. Uji  Resistensi
Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dari Isolat Susu Sapi Segar Terhadap  Beberapa  Antibiotik. [Skripsi Universitas Muhammadiyah Surakarta]. Wilarsih  R.  2019.  Profil  Penggunaan  Obat Antibiotik  pada  Pasien  Paviliun  Shofa  di Rumah  Sakit  Muhammadiyah  Lamongan.
Encephale . 53 (1): 59-65.
Win  YY,    Singh  M,    Sadiq  MB  &    Anal  AK.
2019.  Isolation  and  Identification  of Caffeine-degrading  Bacteria  from  Coffee Plantation Area. Food Biotechnology . 33 (2):
109-124.
Yanti  CA  &  Akhri  I.  2021.  Perbedaan  Uji Korelasi  Pearson,  Spearman  dan  Kendall Tau  dalam  Menganalisis  Kejadian  Diare.
Jurnal Endurance . 6 (1): 51-58. Yunensa  KS.  2016. Pengaruh  Kombinasi Antibiotik Ampisilin dan Mnyak Atsiri Kulit
Batang Kayu Manis (Cinnamomum burmanni) terhadap Staphylococcus aureus Multiresisten. [Skripsi, Universitas Muhammadiyah Surakarta].