## Aktifitas Antifungi Kitosan Hasil Hidrolisis Enzimatik Terhadap Penyakit Antraknosa
Yadi Suryadi *1 , Dwiningsih Susilowati 2 , dan I Made Samudra 3
*e-mail penulis koresponden: yshid@yahoo.co.uk
1,2,3 Lab. Mikrobiologi dan Biokimia, BB Biogen, Jl Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111

## ABSTRACT
Anthracnose disease caused by Colletotrichum gloeosporioides is one of an important fungal pathogen on mango fruits during the pre harvest or post harvest stage. The use of  chitosan  as  an  alternative  method  to  control  the  disease  is  necessary  due  to  its biodegradable,  biocompatible  and  non-toxic  effect.  Chitosan  tripolyphosphate  (C- TPP)  showed  higher  inhibition  to  C.  gloeosporioides  compared  with  that  of  low molecular weight (LMW) chitosan as affected by its particle size. The best of disease inhibitory activity was revealed by C-TPP B [0.2% LMW : 0.1% TPP; (5: 2)] and C [0.2%  LMW:  0:08%  TPP;  (5:  1)]  treatments  based  on    in  vitro  and  in  vivo  test. Because  of  the  concentration  of  chitosan  and  TPP  may  affect  to  particle  structure, hence  the  C-TPP  formation  needs  further  to  be  optimized  so  that  the  size  is  getting smaller and stable.
Keywords: anthracnose, chitosan, C.gloeosporioides, chitinase

## ABSTRAK
Penyakit  antraknosa  yang  disebabkan  oleh  Colletotrichum  gloeosporioides  adalah salah  satu  fungi  patogen  penting  pada  buah    mangga  selama  tahap  pra  panen  atau pasca  panen.  Penggunaan  kitosan  sebagai  metode  alternatif  untuk  mengendalikan penyakit  diperlukan  karena  efeknya  yang  dapat  terbiodegradasi,  biokompatibel,  dan tidak beracun. Kitosan tripolifosfat (K-TPP) menunjukkan penghambatan lebih tinggi terhadap  C.  gloeosporioides  dibandingkan  dengan  kitosan  dengan  berat  molekul rendah  (BMR)  karena  dipengaruhi  oleh  ukuran  partikelnya.  Aktivitas  penghambatan penyakit terbaik ditunjukkan oleh perlakuan K-TPP B [0,2% LMW: 0,1% TPP; (5: 2)] dan C [0,2% LMW: 0: 08% TPP; (5: 1)] berdasarkan uji in vitro dan in vivo. Karena konsentrasi  kitosan  dan  TPP  sangat  berpengaruh  terhadap  struktur  partikel,  maka pembentukan  K-TPP  perlu  dioptimalkan  lebih  lanjut  sehingga  ukurannya  semakin kecil dan stabil.
Kata kunci: antraknosa, kitosan, C. gloeosporioides, kitinase
PENDAHULUAN
Salah  satu  kendala  yang  dihadapi oleh  eksportir  buah  mangga  adalah  buah banyak mengalami kerusakan di penyimpanan.  Buah mangga hanya dapat bertahan  hingga  7  hari  pada  suhu ruangan, selebihnya mangga akan mengalami  kerusakan  selama  proses pematangan  fisiologis  buah.  Kerusakan
buah  mangga  akibat  fungi  penyebab penyakit  yang  paling  utama  diantaranya adalah serangan antraknosa yang disebabkan fungi Colletotrichum gloeosporioides (Hu et al., 2014).
Pengendalian  antraknosa  pada buah pascapanen  biasa  dilakukan dengan pemberian  fungisida  sintetik  seperti
Aktifitas  Antifungi  Kitosan...,..Yadi  S.,  Dwiningsih  S.,  dan  I  Made  S..,...Sainmatika,...Volume  16,...No.2,...Desember 2019,...88-97
copper  hydroxide,  mancozeb,  copper sulfate,  prokloraz dan  azoxystrobin (strobilurinbenomil) atau dikombinasikan dengan perlakuan-perlakuan lainnya (Sharma  &  Kulshrestha,  2018).  Namun, fungisida  tersebut  selain  bersifat  toksik dan  mencemari  lingkungan,  juga  bersifat resisten terhadap patogen dan membahayakan  kesehatan  manusia,  oleh karena itu diperlukan alternatif pengendalian yang lebih aman.
Kitosan  merupakan  salah  satu alternatif  pengendalian  antraknosa  yang aman bagi manusia untuk karena bersifat biodegradabel,  biokompatibel,  dan  non- toksik  (Ing  et  al.,    2012).  Kitosan  [(1,4)- 2-amino-2-deoksi-D-glukan]  merupakan polisakarida berasal dari limbah kulit/cangkang Crustaeceae. Senyawa ini merupakan biopolimer alami yang bersifat  polikationik  sebagai  hasil  dari deasetilasi kitin (Ali et al., 2013). Karena sifat  polikationik  tersebut  kitosan  dapat dimanfaatkan  sebagai  antibakteri  dan antifungi.  Kitosan  antara  lain  memiliki aktifitas  antifungi  terhadap  Aspergillus niger, Alternaria  alternata (Zhong et al., 2007)  dan  Rhizopus  stolonifer  (Lauzardo et  al.,  2009).  Aktivitas  kitosan  terhadap fungi  C.  gloeosporioides  setelah  diteliti secara in vivo terhadap buah naga (Ali et al., 2013) dan pepaya (Hewajulige et al., 2009)  dan  terbukti  dapat  menghambat pertumbuhan fungi tersebut.
Hasil penelitian  menunjukkan bahwa aktivitas antifungi kitosan dipengaruhi  oleh  bobot  molekul  (BM), derajat substitusi, konsentrasi, jenis fungi, dan  tipe  gugus  fungsi  pada  rantai turunannya.  Kitosan  dapat  dipreparasi menjadi  kitosan  bobot  molekul  rendah (K-BMR) hingga berukuran nanopartikel. Semakin  kecil  ukurannya  maka  aktivitas kitosan akan mengalami kenaikan (Ali et al.,  2013).  Preparasi  K-BMR  dapat dilakukan  dengan  bantuan  enzim  hasil metabolit  sekunder  bakteri  Bacillus firmus  (E-65).  Isolat  tersebut  diketahui memiliki  aktivitas  kitinase  yang  tinggi
dalam mendegradasi kitin (Suryadi et al., 2013) sehingga dapat dimanfaatkan untuk mendegradasi  kitosan  menjadi  K-BMR (Mulyaningtyas  et  al.,  2016).  Degradasi molekul  secara  enzimatik  mempunyai beberapa  kelebihan,  yaitu  lebih  ramah lingkungan, lebih spesifik terhadap substrat  tertentu,  dan  K-BMR  yang dihasilkan lebih baik strukturnya.
Molekul  dengan  ukuran  partikel mikro  dan  atau  nano  akan  terbentuk secara  spontan  apabila  ke  dalam  larutan kitosan  dengan  konsentrasi  tertentu ditambahkan  dengan  larutan  polianion seperti  tripolifosfat  yang  disertai  dengan pengadukan  terus  menerus.  Ukuran partikel kitosan yang terbentuk ditentukan  antara  lain  oleh  perbandingan konsentrasi  kitosan  dengan  TPP  (Ing  et al.,  2012). Penelitian ini bertujuan mendapatkan  kondisi  optimum  preparasi partikel  kitosan  dengan  karakteristik terbaik  untuk  mengendalikan  penyakit antaknosa pada mangga melalui pengujian in vivo dan in vitro.

## BAHAN DAN METODE
Preparasi bakteri dan pengujian aktivitas kitinase secara kuantitatif Isolat  bakteri Bacillus  firmus E65 (BiogenCC)  dibiakkan  pada  media  Luria Bertani  (LB)  cair  selama  18  jam. Kemudian  1  mL  media  LB  cair  yang berisi  biakan  bakteri  diinokulasikan  ke dalam media kitin cair. Biakan diinkubasi selama  7  hari  pada  suhu  ruangan  sambil digoyang  dengan  putaran  75  rpm menggunakan  orbital  shaker  (IKA  K- 260). Media kitin  cair  yang berisi  biakan bakteri  disentrifugasi  dengan  kecepatan 10.000 rpm (Hettich D-78532) selama 20 menit  pada  suhu  4 o C.  Supernatan merupakan ekstrak kasar enzim.
Presipitasi  enzim  dilakukan  dengan mencampurkan  amonium  sulfat  70%  ke dalam  supernatan  dengan  volume  yang sama  sambil  diaduk  pada  suhu  >10 o C.
Aktifitas  Antifungi  Kitosan...,..Yadi  S.,  Dwiningsih  S.,  dan  I  Made  S..,...Sainmatika,...Volume  16,...No.2,...Desember 2019,...88-97
Selanjutnya campuran tersebut
disentrifugasi  lagi  dengan  kecepatan 10.000  rpm  selama  30  menit  pada  suhu 4 o C.  Pelet  enzim  kemudian  dilarutkan dalam  PBS  pH  6.8  dalam  jumlah  yang minimal.  Enzim  tersebut  selanjutnya disimpan dalam freezer sebelum digunakan.
Aktivitas  kitinase  dari  enzim kitinolitik  asal  Bacillus  firmus  E65  diuji secara  kuantitatif  dengan  mengukur konsentrasi N-asetil-D-glukosamin
(GlcNAc) yang terbentuk mengacu prosedur  (Toharisman  et  al.,  2015). Pengukuran absorbansi sampel dilakukan dengan  mencampurkan  450  µL  enzim, 450  µL  PBS  pH  7,  dan  900  µL  koloid kitin  kemudian  dikocok  dengan  vortex dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit pada inkubator (Memmert INE500). Campuran tersebut
disentrifugasi  dengan  kecepatan  5  000 rpm  selama  5  menit.  Supernatan  yang telah diperoleh diambil sebanyak 500 µL kemudian  ditambahkan  dengan  500  µL akuades  dan  1  mL  pereaksi  Schales, campuran  didihkan  pada  100 o C  selama 10  menit.  Setelah  didinginkan,  sampel diukur dengan spektrofotometer (Hitachi) pada absorbansi λ 420 nm .
Pembuatan  K-BMR,  dan  preparasi kitosan  tripolifosfat  (K-TPP)  metode gelasi ionik
Pembuatan K-BMR mengacu pada  penelitian  (Kumar  et  al.,  2007). Masing-masing sebanyak 2 g, 0.25 g, 0.5 g,  1.0  g,  dan  1.25  g  kitosan  (derajat deasetilasi  93.8%),  dilarutkan  dalam  100 mL  larutan  asam  asetat  1%,  pH  3.5. Campuran tersebut diaduk selama 24 jam menggunakan  pengaduk  magnetik  agar kitosan  larut.  Larutan  kitosan  yang  telah larut  disaring  dan  diatur  pH-nya  menjadi 5.3  dengan  ditambahkan  NaOH.  Larutan kitosan  sebanyak  20  mL  dihidrolisis menggunakan  0.2 mL kitinase pada suhu 37 o C  serta  waktu  inkubasi selama 2 jam. Proses  hidrolisis  dihentikan  dengan
pemanasan  100 o C  selama  5  menit. Hidrolisat selanjutnya dipresipitasi dengan  sentrifugasi  10.000  rpm  selama 10  menit,  peletnya  dicuci  beberapa  kali dengan  air  destilasi  hingga  pH  netral. Pelet  tersebut  merupakan  K-BMR.  Pelet hasil  presipitasi  disimpan  dalam  lemari pendingin  sampai  dilakukan  pengujian selanjutnya.
K-TPP dipreparasi dengan memodifikasi  metode  (Mardliyati  et  al., 2012).  K-BMR  dilarutkan  dalam  asam asetat 1% sehingga konsentrasinya menjadi  0.1%  dan  0.2%,  kemudian diaduk  menggunakan  pengaduk  magnet pada kecepatan sedang. Larutan ditambahkan  0.25  mL  tween  80  0.2% setes  demi  setetes  dengan  tetap  diaduk selama  30  menit.  Sementara  itu,  larutan TPP  0.1  %  dan  0.08  %  dibuat  dengan melarutkan  TPP  ke  dalam  air  deionisasi. Larutan  TPP  pada  berbagai  variasi  rasio volume ditambahkan setetes demi setetes sambil  tetap  diaduk  pada  suhu  ruang. Perbandingan volume (v/v) antara larutan K-BMR:TPP  adalah  (5:1)  dan  (5:2). Pengadukan terus dilanjutkan sampai satu jam agar proses ikat silang antara NaTPP dan  K-BMR  berlangsung  sempurna. Suspensi partikel yang terbentuk kemudian  disimpan  dalam  lemari  es hingga dilakukan pengujian.
Analisis struktur K-BMR dan K-TPP Sebanyak  2  mg  serbuk  contoh dicampur  dengan  100  mg  KBr  untuk dijadikan pelet.
Pelet dibuat menggunakan handPress Shimadzu dengan  tekanan  8  psi  selama  15  menit.
Spektrum diukur
dengan spektrofotometer  FTIR  pada  kisaran bilangan  gelombang  4000  sampai  400 cm -1 (FTIR  Tensor  37,  Bruker).  Ukuran partikel  K-TPP  diukur  menggunakan PSA  (Particle  Size  Analyzer)  (Zetasizer Malvern, UK).
Pengujian daya hambat terhadap fungi secara in vitro dan in vivo
Aktifitas  Antifungi  Kitosan...,..Yadi  S.,  Dwiningsih  S.,  dan  I  Made  S..,...Sainmatika,...Volume  16,...No.2,...Desember 2019,...88-97
Metode tuang secara in vitro yang digunakan pada uji daya hambat nanokitosan  terhadap  fungi  merupakan modifikasi  metode  (  Palma-Guerrero  et al., 2008). Sebanyak 1 mL larutan kitosan pada  berbagai  variasi  rasio  ditambahkan ke media PDA  yang masih hangat dalam cawan petri, kemudian dibiarkan mengeras. Media PDA dalam cawan petri berdiameter 9 cm, pada bagian tengahnya dilubangi  dengan  alat  cork  borrer. Kemudian isolat C. gloesporioides diletakan ke lubang tersebut dan diikubasi  selama  4  hari.  Perlakuan kontrol  hanya  berisi  PDA  dan  C. gloesporioides.
Metode pengujian in vivo dilakukan  dengan    memodifikasi  metode (Gonzalez-Aguilar  et  al.,  2008).  Buah yang  digunakan  adalah  mangga  jenis Indramayu dengan ukuran yang seragam, kemudian  dicuci  bersih  dengan  air  steril dan  dikeringanginkan.  Buah  mangga kemudian direndam dalam larutan K-TPP dan  dikeringanginkan.  Selanjutnya  buah ditusuk-tusuk  dengan  jarum  steril  dan diimersi  dengan  suspensi  konidia  C. gloeosporioides  (10 7 konidia/mL)  dan dikeringanginkan. Perlakuan kontrol dilakukan  dengan  cara  sama  tetapi nanokitosan diganti akuades steril. Semua perlakuan dilakukan duplo. Buah disimpan  di  atas  baki  steril  dan  ditutup dengan  plastik  bening  untuk  menjaga kelembapan. Pengamatan keparahan penyakit  pada  perlakuan  buah  mangga dilakukan  setelah  4  hari.  Skor  keparahan penyakit  antraknosa  dinilai  berdasarkan skala  0  –  5  sebagai  berikut:  skor  0  = 0≤x<1  %;  1  =  1  ≤x≤20  %;  2  =  21≤x≤40 %; 3 = 41≤x≤60 %; 4 = 61≤x≤80 %; dan 5  =  81≤x≤100  %  buah  tertutupi  oleh patogen.
Daya  hambat  (DH)  terhadap patogen  fungi  dihitung  dengan  rumus sebagai berikut:
dimana  Ik=intensitas  penyakit  pada kontrol;  Is=  intensitas  penyakit  pada perlakuan (Suryadi et al., 2017).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivitas kitinase secara kuantitatif Hasil  pengukuran  aktivitas  enzim asal  bakteri  isolat  E65  menunjukkan konsentrasi  NAcGlc  sebesar  24.331  + 1.840  (mg/mL).  Perolehan  aktivitas enzim  ini  sudah  cukup  untuk  digunakan dalam menghidrolisis kitosan lebih lanjut menjadi kitosan dengan BM lebih rendah.
Analisis Struktur K-BMR dan K-TPP Analisis  FTIR  dilakukan  untuk menganalisa  gugus fungsi  yang  ada pada K-BMR dan K-TPP. Spektrum FTIR dari K-BMR  memiliki pita serapan yang khas dari  gugus  hidroksil,  eter,  dan  amina primer  yang  terdapat  pada  strukturnya (Brugnerotto  et  al.,  2001).  Gambar  1 menunjukkan  puncak-puncak  spesifik pada  K-BMR.  Pada  bilangan  gelombang 3395  cm- 1 terdapat  pita  serapan  dari gugus  OH  dan  pada  2924  cm -1 terdapat pita serapan dari CH alifatik. Pita serapan dari  N-H  tekuk  pada  amina  primer ditunjukkan  pada  1652  cm -1 ,  selanjutnya pita  serapan  C-H  tekuk  terdapat    pada 1443 cm -1 . Gugus eter (C-O-C) ditunjukkan  oleh  puncak  serapan  pada 1068 cm -1 .
Spektrum  FTIR  K-TPP  memiliki perbedaan  dengan  spektrum  K-BMR. Pada  K-TTP  bilangan  gelombang  3434 cm -1 menunjukkan  intensitas  serapan gabungan  dari  gugus  NH 2 dan  OH  dari kitosan.  Puncak  serapan  tersebut  lebih tajam  dibandingkan  dengan  puncak serapan  dari  K-BMR  yang  menunjukkan semakin banyaknya ikatan hidrogen yang terbentuk.  Tambahan  ikatan  hidrogen berasal  dari  gugus  hidroksil  pada  TPP sebagai hasil dari reaksi crosslinking (ikat silang)  antara  kitosan  dan  TPP.  Ikatan CH  ditunjukkan  oleh  intensitas  serapan pada  2921  cm -1 (CH  simetris)  dan  2852
Aktifitas  Antifungi  Kitosan...,..Yadi  S.,  Dwiningsih  S.,  dan  I  Made  S..,...Sainmatika,...Volume  16,...No.2,...Desember 2019,...88-97
cm -1 (CH  asimetris).  Pada  bilangan gelombang 1630 cm -1 puncak serapan N- H  pada  K-TPP  lebih  tajam  dibandingkan dengan  K-BMR  yang  menunjukkan derajat  deasetilasi  K-TPP  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  K-BMR.  Adanya
proses ikat silang antara TPP dan kitosan ditunjukkan dengan pita serapan baru dari K-TPP  pada  bilangan  gelombang  1262 cm -1 yang berasal dari gugus P=O.

## Gambar 1. Spektrum FTIR dari K-BMR dan K-TPP
Uji Penghambatan in vitro Hasil  uji  penghambatan  secara  in vitro menunjukkan bahwa K-TPP dan K- BMR  mampu  menghambat  pertumbuhan fungi  C.  gloeosporioides  masing-masing dengan  kisaran  penghambatan  20.99  – 95.06%  dan  7.07  –  28.26%.  Kitosan dapat menghambat pertumbuhan konidia, buluh  kecambah,  kelebatan  hifa,  panjang dan  lebar  hifa,  serta  melisis  hifa  pada fungi (Lauzardo et al., 2009).
Aktivitas  antifungi  salah  satunya dipengaruhi  oleh  konsentrasi  kitosan. Pada  konsentrasi  K-BMR    yang  lebih rendah  aktifitas  antifungi  cenderung mengalami  penurunan  yang  ditunjukkan dengan nilai DH yang semakin menurun. Hal  tersebut  kemungkinan  disebabkan oleh konsentrasi molekul-molekul kitosan yang  terlarut  relatif  rendah  sehingga belum mampu untuk menghambat pertumbuhan  fungi  dengan  sempurna.
Konsentrasi  K-BMR  yang  paling  efektif dalam  menghambat  C.  gloeosporioides adalah  1.0%  dengan  nilai  DH  sebesar 88.89%  (Tabel  1).  Akan  tetapi  pada konsentrasi  K-BMR  yang  lebih  tinggi, yaitu  pada  1.25%  aktivitas  antifungi justru mengalami penurunan. Hal tersebut dapat  disebabkan  pada  konsentrasi  yang tinggi  viskositas  dari  larutan  juga semakin  tinggi  sehingga  menghalangi interaksi  antara  molekul  kitosan  dengan permukaan  sel  fungi.  Hal  tersebut  sesuai dengan  penelitian  dari  Li,  et  al.,  (2008) yang menyatakan bahwa pada konsentrasi kitosan yang lebih tinggi dari konsentrasi optimumnya, daya penghambatannya akan semakin menurun ditunjukkan dengan koloni yang tebal dan memenuhi cawan petri.
Kitosan-tripolifosfat (K-TPP) memiliki  rataan  aktivitas  antifungi  yang lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  K-
Aktifitas  Antifungi  Kitosan...,..Yadi  S.,  Dwiningsih  S.,  dan  I  Made  S..,...Sainmatika,...Volume  16,...No.2,...Desember 2019,...88-97
BMR.  Aktifitas  tertinggi  diperoleh  pada perlakuan K-TPP B dan K-TPP C dengan daya penghambatan masing-masing sebesar 95.06%. Aktifitas terendah ditunjukkan  perlakuan  K-TPP  A,  K-TPP D,  dan  K-TPP  G  dengan  nilai  DH masing-masing  sebesar  20.99%  (Tabel 1).  Rendahnya  aktifitas  antifungi  pada tiga  perlakuan  tersebut  kemungkinan diakibatkan  rendahnya  interaksi  antara kitosan  dengan  permukaan  sel  fungi akibat  terhalang  oleh  molekul  TPP
sebagai  hasil  proses  ikat  silang  yang belum sempurna. Disamping itu distribusi molekul  kitosan  yang  mungkin  tidak merata pada media juga menjadi penyebab rendahnya aktivitas penghambatan  kitosan.  Hal  tersebut dibuktikan pada ketiga perlakuan tersebut terdapat  sisi-sisi  yang  tidak  ditumbuhi oleh fungi,  walaupun ruang di  sekitarnya sudah  dipenuhi  oleh  hifa  dari  fungi tersebut (Gambar 2).
Gambar 2. Contoh daya hambat secara in vitro,  K-BMR A (a), K-TPP D (b),
K-TPP B (c), kontrol (d) Tabel 1. Uji daya hambat (DH) KTTP dan K-BMR secara in vitro Perlakuan [K- BMR] (%) [TPP] (%) Perbandingan volume (v/v) Luas koloni fungi (cm 2 ) DH (%) Kontrol - - - 63.59 0.00 K-TPP A 0.2 0.1 5:1 50.24 20.99 K-TPP B 0.2 0.1 5:2 3.14 95.06 K-TPP C 0.2 0.08 5:1 3.14 95.06 K-TPP D 0.2 0.08 5:2 50.24 20.99 K-TPP E 0.1 0.1 5:1 19.63 69.14 K-TPP F 0.1 0.1 5:2 44.16 30.56 K-TPP G 0.1 0.08 5:1 50.24 20.99 K-TPP H 0.1 0.08 5:2 15.90 75.00 K-BMR A  0.25 - - 28.26 55.56 K-BMR B 0.5 - - 15.90 75.00 K-BMR C 1.0 - - 7.07 88.89 K-BMR D  1.25 - - 19.63 69.14 Uji Penghambatan in vivo Hasil  uji  in  vivo  pada  buah mangga  setelah  4  hari  masa  inkubasi menunjukkan bahwa K-TPP  lebih efektif
dalam  menghambat  pertumbuhan  fungi. Hal  tersebut  diduga  diakibatkan  oleh ukuran  dan  berat  molekul  K-TPP  yang lebih  kecil.  Adanya  proses  ikat  silang
(a) (b)                                       (c)                                           (d)
Aktifitas  Antifungi  Kitosan...,..Yadi  S.,  Dwiningsih  S.,  dan  I  Made  S..,...Sainmatika,...Volume  16,...No.2,...Desember 2019,...88-97
antara kitosan dengan TPP menyebabkan struktur  K-TPP  menjadi  kompak,  padat, dan  akhirnya  membentuk  struktur  tiga dimensi yang berukuran nano atau mikro. Permukaan pada partikel ini kaya dengan muatan  positif  sehingga  lebih  efektif untuk berikatan dengan plasma membran sel yang bermuatan negatif (Jovanović et al.,  2016).  Muatan  NH 3 + dari  kitosan akan  berkompetisi  dengan  ion  Ca 2+ dari membran sel sehingga stabilitas sel fungi menjadi  terganggu  (Goy  et  al.,2009). Hasil  ini  juga  selaras  dengan  penelitian Ing  et  al.,  (2012),  dimana  dinyatakan aktifitas  kitosan  yang  berukuran  nano atau  mikro  akan  mempunyai  aktifitas antifungi  yang  lebih  besar  dibandingkan dalam  bentuk  polimernya.  Selain  itu
dengan  ukuran  yang  kecil,  K-TPP  lebih mudah berdifusi kedalam sel fungi untuk mengganggu  aktifitas  sintesis  DNA  dan RNA-nya (Ing et al., 2012).
Daya  hambat  K-TPP  diharapkan dapat  mempunyai  aktifitas  yang  tinggi pada  ukuran  molekul  yang  lebih  kecil. Ukuran molekul ini antara lain dipengaruhi  oleh  konsentrasi  kitosan, TPP,  dan  rasio  volume  antar  keduanya (Mardliyati  et  al.,  2012)  Konsentrasi kitosan  yang  besar  akan  memberikan daya  hambat  yang  lebih  besar.    Hal  ini terlihat  pada  K-TPP  dengan  konsentrasi 0.2% yang memiliki aktifitas penghambatan yang optimum dibandingkan  dengan  K-TPP  dengan konsentrasi 0.1% (Tabel 2).
Tabel 2. Uji daya hambat K-TPP terhadap antraknosa pada buah mangga secara in vivo
Perlakuan [K-BMR] (%) [TPP] (%) Perbandingan volume (v/v) Rata-rata  Intensitas keparahan (%) DH (%) Kontrol - - - 70,5 0,00 K-TPP A 0,2 0,1 5:1 20,5 70,92 K-TPP B 0,2 0,1 5:2 5,25 92,55 K-TPP C 0,2 0,08 5:1 5,25 92,55 K-TPP D 0,2 0,08 5:2 40,5 42,55 K-TPP E 0,1 0,1 5:1 20,5 70,92 K-TPP F 0,1 0,1 5:2 10,5 85,11 K-TPP G 0,1 0,08 5:1 20,5 70,92 K-TPP H 0,1 0,08 5:2 5,25 92,55 Konsentrasi TPP juga berpengaruh terhadap K-TPP yang terbentuk,  hasil  menunjukkan  bahwa konsentrasi  TPP yang  lebih kecil membuat K-TPP yang terbentuk memiliki  DH  yang  lebih  besar.  Hal  ini dapat  terlihat  pada  K-TPP  G  dan  H memiliki  rata-rata  DH  yang  lebih  besar dibandingkan  dengan  rata-rata  DH  K- TPP  E  dan  F.  Rasio  volume  antara kitosan  dan  TPP  juga  berpengaruh, kitosan  dengan  volume  yang  lebih  besar akan  memberikan  nilai  DH  yang  lebih besar.  Akan  tetapi,  terlihat  bahwa  pada
rasio  5:2  memberikan  rata-rata  nilai  DH yang  hampir  serupa  dengan  rasio  5:1. Hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa  pada penelitian  ini  kedua  rasio  tersebut  tidak terlalu berpengaruh pada daya hambat K- TPP yang terbentuk.
K-TPP  B  dan  C  paling  efektif dalam  menghambat  pertumbuhan  fungi dengan  nilai  DH  sebesar  92.55%  (Tabel 2).  Hasil  analisa  PSA  (Particle  Size Analyzer)  menunjukkan  bahwa  rata-rata ukuran  molekul  B  dan  C  sebesar  143,7 nm  dan  142,1  nm.  Walaupun  demikian nilai  indeks  polidispersitas  (IP)  dari  K-
Aktifitas  Antifungi  Kitosan...,..Yadi  S.,  Dwiningsih  S.,  dan  I  Made  S..,...Sainmatika,...Volume  16,...No.2,...Desember 2019,...88-97
TPP B cukup rendah yaitu sebesar 0.488, sedangkan untuk K-TPP C nilai IP masih kurang,  yaitu  0.638.  Nilai  IP  ini menunjukkan  distribusi  molekul  dalam larutan,  semakin  tinggi  nilai  IP  maka molekul-molekulnya semakin tidak seragam.  Keseragaman  molekul  akan berpengaruh terhadap
efektivitas penghambatan, umumnya semakin rendah nilai IP maka efektivitas penghambatannya  semakin  besar   (Ing et al., 2012). Akan tetapi pada penelitian ini nilai  IP  tersebut  tidak  berpengaruh terhadap  DH  yang  dihasilkan.  Hasil penelitian uji PSA sebelumnya melaporkan  bahwa  perbandingan  K-TPP (3:1)  menunjukkan nilai rata-rata ukuran nano kitosan yaitu 228,74 nm (Mulyaningtyas et al., 2016).
KESIMPULAN K-TPP menunjukkan aktifitas penghambatan terhadap C. gloeosporioides yang lebih besar dibandingkan  dengan  K-BMR.  Aktifitas ini  dipengaruhi  oleh  ukuran  K-TPP  yang lebih kecil dibandingkan dengan K-BMR.
Aktifitas  penghambatan  terbaik secara  in  vitro  dan  in  vivo  diperoleh  dari perlakuan    K-TPP  B  [0.2  %  K-BMR  : 0.1% TPP; (5:2)] dan K-TPP C [0.2 % K- BMR : 0.08% TPP; (5:1)].
Hasil  analisa  PSA  (Particle  Size Analyzer)  menunjukkan  bahwa  rata-rata ukuran  molekul  B  dan  C  sebesar  143,7 nm dan 142.1 nm.
Perlu dilakukan optimasi terhadap K-TPP  agar  ukuran  yang  terbentuk semakin  kecil.  Selain  itu,  analisis viskositas,  bobot  molekul,  dan  pH  juga perlu  dilakukan  karena  hal  tersebut  juga menentukan validasi terhadap struktur K- TPP yang terbentuk.
Ucapan Terima Kasih Penulis mengucapkan terima
kasih  kepada  Sdr.  Rosidah  Rahman  dan teknisi  Lab.  Nanoteknologi  BB  Pasca
Panen serta Biofarmaka IPB atas bantuan dalam analisis nanopartikel dan FTIR.

## DAFTAR PUSTAKA
Ali,  A.,  Zahid,  N.,  Manickam,  S.,  & Siddiqui,  Y.  (2013).  Effectiveness of  submicron  chitosan  dispersions in  controlling  anthracnose  and maintaining quality of dragon fruit. Postharvest Biology and Technology, 86, 147–153. Brugnerotto, J., Lizardi, J., Goycoolea, F. M., Argüelles-Monal, W.,
Desbrières,  J.,  &  Rinaudo,  M. (2001). An infrared investigation in relation  with  chitin  and  chitosan characterization.  Polymer,  42(8), 3569–3580. https://doi.org/10.1016/S0032- 3861(00)00713-8 Gonzalez-Aguilar,  G.  A.,  Celis,  J., Sotelo-Mundo,  R.  R.,  De  La  Rosa,
L.  A.,  Rodrigo-Garcia,  J.,  & Alvarez-Parrilla, E. (2008).
Physiological and biochemical changes  of  different  fresh-cut mango  cultivars  stored  at  5°C. International  Journal  of  Food Science and Technology, 43(1), 91– 101.  https://doi.org/10.1111/j.1365- 2621.2006.01394.x
Goy, R. C., Britto, D. De, & Assis, O. B. G.  (2009).  A  review  of  the antimicrobial  activity  of  chitosan.
Polimeros:Ciencia  et  Tecnologia.
19(3),
241- 247.https://doi.org/10.1590/S0104-
14282009000300013
Hewajulige,  I.,  Sultanbawa,  Y.,  & Wijeratnam, S. W. (2009). Mode of action  of  chitosan  coating  on anthracnose  disease  control  in papaya.  Phytoparasitica.  37,  437– 444.
https://doi.org/10.1007/s12600-
009-0052-5
Hu, M., Yang, D., Huber, D. J., Jiang, Y., Li,  M.,  Gao,  Z.,  &  Zhang,  Z. (2014).  Reduction  of  postharvest
Aktifitas  Antifungi  Kitosan...,..Yadi  S.,  Dwiningsih  S.,  dan  I  Made  S..,...Sainmatika,...Volume  16,...No.2,...Desember 2019,...88-97
anthracnose  and  enhancement  of disease resistance in ripening mango fruit by nitric oxide treatment.  Postharvest  Biology  and Technology, 97, 115–122. https://doi.org/10.1016/j.postharvbi o.2014.06.013
Ing,  L.  Y.,  Zin,  N.  M.,  Sarwar,  A.,  &
Katas, H. (2012). Antifungal activity  of  chitosan  nanoparticles and  correlation  with  their  physical properties.  International  Journal  of Biomaterials, 2012, 1–9. https://doi.org/10.1155/2012/63269 8
Palma-Guerrero  J.,    Jansson  H.B.,
Salinas,  J.,  &  Liorca,  L.V.L.
(2008).  Effect  of  chitosan  on hyphal growth and spore germination  of  plant  pathogenic and  biocontrol  fungi,  J.  of  Applied Microbiology 104, 541–553. https://doi.org/10.1111/j.13652672. 2007.03567.x Jovanović, G. D., Klaus, A. S., & Nikšić,
M. P. (2016). Antimicrobial activity  of  chitosan  coatings  and films against Listeria monocytogenes  on  black  radish. Revista Argentina de
Microbiología,  48(2),  128–136.
https://doi.org/10.1016/j.ram.2016.
02.003
Kumar, A.B.V., Varadaraj, M.C., Gowda, L.R.,  &  Tharanathan,  R,N.  (2007). Low  molecular  weight  chitosan- preparation with the aid of pronase,
characterization
and their bactericidal activity towards
Bacillus  cereus  and  Escherichia coli.  Biochimica  et  Biophysica Acta. 1770: 495-505. (2007).
Lauzardo,  A.N.H.,  Del  Valle,  M.G.V., Castelan,    L.V.,  Giorgana,  G.E.M, &  Sánchez,  M.G.G.  (2009).  Effect of  chitosan  on  three  isolates  of Rhizopus  stolonifer  obtained  from
peach,  papaya  and  tomato,  Fruits
65(4),
245–253.
https://doi.org/10.1051/fruits/20100 20
Li,  X.F.,  Feng,  X.Q.,  Yang,  S.,  Wang, T.P.,  & Su,  Z.X. (2008). Effects of molecular weight and concentration of  chitosan  on  antifungal  activity against  Aspergillus  niger.  Iranian Polymer Journal, 17(11), 843–852.
Mardliyati,  E.,  Sjaikhurrizal  E.M,  Damai R.S.  2012.  Sintesis  nanopartikel kitosan-trypoly  phosphate  dengan metode  gelasi  ionik:  Pengaruh konsentrasi  dan  rasio  volume terhadap karakteristik partikel. Prosiding  Pertemuan  Ilmiah  Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Bahan; 2012  (Okt  3);  Serpong,  Indonesia. Serpong (ID): BPPT. hlm  90-93. Sharma,  M  &  Kulshrestha,  S.  (2018).
Colletotrichum gloeosporioides : An  anthracnose  causing  pathogen of fruits and vegetables, Biosciences Biotechnology Research Asia,12 (2),1-14.
https://doi.org/10.13005/bbra/1776 Mulyaningtyas,  D.,  A,  Purwantisari,  S., Kusdiyantini,  E.,  &  Suryadi,  Y. (2016).  Produksi  kitosan  secara enzimatik  oleh Bacillus  firmus E65 untuk pengendalian penyakit antraknosa  pada  buah  mangga (Mangifera  Indica  L.).  Jurnal
Biologi, 5(4), 8–17.
Suryadi,  Y.,  Priyatno,  T.  P.,  Samudra,  I. M.,  Susilowati,  D.  N.,  Patricia,  & Irawati,  W.  (2013).  Karakterisasi dan identifikasi isolat bakteri endofitik penghambat jamur patogen  Padi.  Buletin  Plasma Nutfah, 19(1), 25–32.
Suryadi,  Y.,  Priyatno,  T.  P.,  Samudra,  I. M., Susilowati, D., & Sriharyani, T. S.  (2017).  Control  of  anthracnose disease ( Colletotrichum
gloeosporioides) using nano chitosan  hydrolyzed  by  chitinase derived  from  Burkholderia  cepacia isolate  E76,  J.  Agrobiogen  13(2), 111–122.
Aktifitas  Antifungi  Kitosan...,..Yadi  S.,  Dwiningsih  S.,  dan  I  Made  S..,...Sainmatika,...Volume  16,...No.2,...Desember 2019,...88-97
Toharisman.  (2015).  Purification  and characterization  of  a  thermostable chitinase from Bacillus licheniformis  Mb-2.  World  Journal of Microbiology and Biotechnology, 21, 733–738. https://doi.org/10.1007/s11274- 004-4797-1
Zhong, Z., Chen, R., Xing, R., Chen, X., Liu,  S.,  Guo,  Z.,  &  Li,  P.  (2007).
Synthesis  and  antifungal  properties of  sulfanilamide  derivatives  of chitosan.  Carbohydrate  Research. 342 (16): 2390–2395. https://doi.org/10.1016/j.carres.200 7.07.015