Aspek Biomolekuler Apoptosis, Caspase-3 & RAK pada Pemberian Morinda Citrifolia L (Mengkudu) Tikus Sprague Dawley Diabetes Nefropati yang Diinduksi Streptocotocin (STZ)

## Indranila KS
Latar belakang : Nefropati diabetes (ND) adalah salah satu bentuk komplikasi  mikrovaskuler  yang  sering  dijumpai  pada  penderita diabetes  mellitus  (DM). Morindacitrifolia  L (MC)/mengkudu memiliki  komponen  zat  bioaktif  bersifat  imunomodulator, imunosupresif, anti inflamasi dan anti apoptosis yang diharapkan dapat  memperbaiki  fungsi  ginjal.  Tujuan  penelitian  ini  adalah membuktikan  peran  MC  dalam  memperbaiki  fungsi  ginjal berdasar  pengukuran  biomarker  RAK,  indeks  apoptosis,  dan caspase–3 pada tikus ND yang diinduksi Streptozotocin (STZ). Metode : Post test only control group design . Tiga puluh enam ekor tikus Sprague Dawley (SD) diinduksi STZ dosis 40 mg/kg BB selama 8 minggu, dibagi 6 kelompok, diberi MC dengan dosis 10 mg, 20 mg, 40 mg, dan 80 mg, dan kelompok kontrol yaitu STZ / kontrol (+) dan (-). Pada akhir penelitian diperiksa RAK, indeks apoptosis, caspase–3 .Data dianalisis dengan Mann Whitney dan regresi linier berganda.
Hasil  : Didapatkan  RAK  urin  kelompok  MC  20  mg  lebih  rendah dibanding  kelompok  kontrol  (+)  ( p =0,04).  Indeks  apoptosis kelompok MC 20 mg lebih rendah dibanding kontrol (+) dengan p =0,002.  Ekspresi caspase–3 jaringan  glomerulus  yang  tertinggi adalah pada kelompok yang mendapat STZ dan MC yang paling rendah  adalah  pada  kelompok  yang  mendapat  MC  20  mg. Didapatkan korelasi positif kuat antara ekspresi caspase–3 dengan indeks  apoptosis  pada  jaringan  glomerulus  dan  tubulus  ginjal ( p <0,001),  hal  ini  secara  tidak  langsung  dapat  menjelaskan apotosis yang terjadi pada jaringan nefron ginjal adalah melalui jalur caspase . Simpulan : Pemberian Morinda citrifolia L dosis 10, 20, 40, dan 80 mg/dL  dapat  menurunkan  status  albuminuri  berdasarkan pengukuran  RAK,  indeks  apoptosis  glomerulus,  dan  ekspresi caspase–3 .  Perbaikan  fungsi  ginjal  paling  bermakna  sekaligus berpengaruh paling kuat untuk perbaikan ND melalui apoptosis glomerulus  terhadap  penurunan  status  albuminuria  (RAK) didapatkan pada MC konsentrasi 20 mg/dL.
Kata kunci : nefropati diabetes, morinda citrifolia L, tikus SD, STZ, apoptosis, caspase–3 , RAK
Bagian Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro/RSUP Dr. Kariadi Semarang

## Abstrak
Background : Diabetic nephropathy (ND) is one form of a common microvascular  complications  in  patients  with  diabetes  mellitus (DM). Morinda  citrifolia L  (MC)  is  component  of  bioactive substances  which  are  immunomodulatory,  immunosuppressive, anti-inflammatory and antiapoptosis. MC is expected to improve kidney function in diabetic nephropathy of streptozotocin (STZ)- induced to Sprague Dawley rat model. The objective of the study was to proving the role of MC in the kidney tissue repair ND in STZ- induced SD rats.
Methods  : used  an  experimental  study  post-test  only  control group design. Thirty-six Sprague-Dawley rats were divided into 6 groups: control (-), control (+), STZ + MC (10, 20,40 and 80 mg/dL). Induction of STZ at a dose of 40 mg/kg for 8 weeks, then given a dose of MC 10, 20, 40 and 80 mg/dL over 2 weeks. At the end  of  the  study,  albumin  creatinine  ratio  (ACR),  an  index  of apoptosis, caspase–3 renal  tissue  were  examined.  Statistical analysis using the Kruskall Wallis test, Mann Whitney and multiple linear regression.
Results : Statistical test results showed ACR urine MC 20 mg group was lower than the control group (+) ( p =0.04). MC apoptosis index 20  mg  group  was  lower  than  control  (+)  ( p =0.002). Caspase–3 expression of glomerular tissue were highest for the group that received STZ and MC is the lowest in the group receiving 20 mg of MC.  There  was  strong  correlation  between  expression  of caspase–3 with apoptotic index in glomeruli and tubules of the kidney tissue ( p <0.001). This may indirectly explain apotosis that occurs  in  the  kidney  nephrons  network  is  via  caspase  pathway. Conclusions : MC extract dose of 10, 20, 40.80 mg/dL can improve renal  function  by  improving  glomerular  apoptotic  index, expression  of caspase–3 .  MC  dose  of  20  mg/mL  is  the  most optimal dose of MC.
Keywords : diabetic nephropathy, Morinda citrifolia L, apoptosis, caspase–3

## Abstract
The Effect of Morinda citrifolia L Extract on Kidney Function in Diabetic Nephropathy Streptozotocin-Induced to Sprague Dawley Rat Model

## Original Article
Med Hosp 2013; vol 1 (3) : 150-158

## Medica Hospitalia

## PENDAHULUAN
Nefropati  diabetes  (ND)  merupakan  salah  satu komplikasi  mikrovaskuler  diabetes  mellitus  (DM). Prevalensi  ND  menduduki  angka  teratas  sebagai penyebab penyakit gagal ginjal terminal, sebanyak 25% pada  penyakiit  DM–Tipe  1  dan  30%–40%  pada 1 DM–Tipe 2.  Deteksi dini laboratorium dan pengelolaan lebih  dini  menurunkan  insidens  ND  sehingga 2 menurunkan mortalitas dan moribiditas.
Rasio  albumin  kreatinin  (RAK)  merupakan 3 petanda  gangguan  fungsi  ginjal  pada  ND.   Tolok  ukur lain pada gangguan fungsi ginjal adalah apoptosis dan caspase-3 .  Apoptosis  adalah  kematian  sel  yang terprogram di mediatori oleh aktifasi jalur caspase , dalam hal  ini  terutama caspase-3 dengan  hasil  pemecahan protein  substrat  dan  fragmentasi  DNA.  Apoptosis merupakan petanda penting pada sel epitel tubulus dan 4 glomerulus yang mengalami peningkatan pada ND.
Caspase-3 didalam  ruang  intra  membran mitokondria cytochrome-c memediatori aktivasi alosterik dan  hepta-ligomerisasi  dari  molekul  adaptor apoptosis- protease  activating  factor-1  (Apaf-1) membentuk  sebuah kompleks  apoptosom.  Masing-masing  apoptosom merekrut  tujuh  dimer caspase-9 dan  menyebabkan aktifasi enzim, membentuk proteolitik self-processing dan katalitik  maturasi  dari caspase-3 dan  secara  biokimia maupun  morfologi    mengaktifkan  apoptosis. Caspase-3 5 memegang peranan penting pada eksekusi apoptosis.
Penanganan ND dilakukan melalui berbagai cara antara  lain  menjaga  kesehatan  seoptimal  mungkin, menghindari komplikasi, dan menggunakan obat pilihan ND.  Namun  hal  ini  tergolong  cukup  mahal,  dan merupakan  kendala  yang  serius,  karena  ND  sering terjadi  pada  penderita  dengan  tingkat  sosial  ekonomi 6 rendah. Morinda citrifolia L mempunyai berbagai jenis zat bioaktif seperti polisakarida, glikosida flavon, vitamin A, vitamin  C,  dan  xeronin.  Kandungan  zat  bioaktif  yang lengkap  ini  bermanfaat  untuk  proses  perbaikan  fungsi g i n j a l   N D   a n t a r a   l a i n   s e b a g a i   a n t i o k s i d a n ,
7 imunomodulator, antiapoptosis. Pemberian Morinda citrifolia L dosis aman 10, 20, 40,  dan  80  mg/dL  perhari  pada  tikus  Sprague  Dawley (SD)  yang  diinduksi Streptozotocin (STZ),  merupakan dosis  yang  sering  digunakan,  diharapkan  dapat memperbaiki  fungsi  ginjal  yang  dideteksi  melalui 8 perbaikan RAK, indeks apoptosis, dan caspase-3 .
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  efek pemberian Morinda citrifolia terhadap fungsi ginjal tikus SD  yang  diinduksi Streptozotocin yang  diukur  dengan rasio albumin kreatinin, apoptosis, dan caspase–3 .

## METODE
Penelitian  eksperimental  dengan post  test  only  control group  design menggunakan  hewan  percobaan.  Subyek
penelitian  adalah  tikus  strain  Sprague  Dawley  yang diinduksi  dengan Streptozotocin (STZ),  Calbiochem® 40 mg/kgBB untuk menjadikan nefropati diabetes (ND) pada  minggu  ke  8.  Kriteria  inklusi  adalah  tikus berkelamin jantan dengan berat badan 150 – 300g, kondisi sehat, dan tidak ada kelainan anatomi. Kriteria eksklusi adalah  hewan  sakit,  diare  yang  ditandai  dengan  feses tidak  terbentuk.  Jumlah  sampel  dihitung  berdasarkan rumus besar sampel eksperimental Federer untuk tikus yaitu : (t-1) (r-1) < 15 , dengan t adalah jumlah perlakuan dan  r  adalah  jumlah  hewan  coba  tiap  kelompok perlakuan. Penelitian ini dengan dilakukan dengan 4 sub 9 kelompok perlakuan dan 1 kelompok kontrol.
Hewan percobaan sebanyak 36 ekor dibagi secara acak  menggunakan  rancangan  acak  lengkat (completely randomized design) dan randomisasi sederhana, menjadi 6  kelompok  yaitu  kelompok  yang  mendapat streptozotocin +  ekstrak  mengkudu (morinda  citrifolia) 10 mg (kelompok STZ + MC 10 mg), streptozotocin + ekstrak mengkudu 20 mg (kelompok STZ + MC 20 mg), + ekstrak mengkudu 40 mg (kelompok STZ + MC 40 mg), + ekstrak mengkudu  80  mg  (kelompok  STZ  +  MC  80  mg), kelompok  yang  hanya  mendapat streptozotocin tanpa ekstrak  mengkudu  (kelompok  STZ/kontrol +)  dan kelompok  yang  tidak  mendapat streptozotocin dan mengkudu (kelompok kontrol -). MC diberikan selama 2  minggu.  Keluaran (outcome) yang  diharapkan  adalah perbaikan fungsi ginjal melalui biomarker RAK (Eliza & kimiawi),  indeks  apoptosis  (TUNEL),  dan caspase-3 (IHC) .
Pemeliharan dan intervensi terhadap hewan coba dilaksanakan  di  LPPT  UGM  bidang  layanan  penelitian dan  pengembangan  hewan  percobaan.  Pemeliharaan semenjak  masa  seleksi  sampai  perlakuan  berlangsung dalam waktu 70 hari. Tikus diinduksi STZ 40 mg/kgBB dalam  0,1  N  citrat  buffer  sampai  pH  4,5.  Selanjutnya diambil sampel urin untuk diperiksa rasio albumin dan kreatinin, jaringan ginjal diambil setelah tikus di- sacrified , untuk  diperiksa  indeks  apoptosis  dan caspase–3 . Pemeriksaan RAK, indeks apoptosis, caspase–3 dilakukan pada  laboratorium  GAKY–UNDIP  Semarang  dan laboratorium Patologi Anatomi, Universitas Gajah mada Yogyakarta.
Data hasil penelitan yaitu RAK, indeks apoptosis, caspase-3 setelah  terkumpul  dilakukan cleaning,  coding dan  tabulasi  selanjutnya  di- entry ke  dalam  komputer. Analisis statistik dengan menggunakan uji beda. Data uji normalitas  dilakukan  dengan  menggunakan Shaphiro- Wilk  test . Bila  data  tidak  normal  dilakukan  tranformasi data, kemudian dilakukan uji beda one way anova dan uji post  hoc–LSD .  Uji  korelasi  RAK,  indeks  apoptosis, caspase-3 diuji  dengan  korelasi  Spearma.  Analisa  data kemudian  dilakukan  menggunakan Mann  Whitney dan regresi linier berganda sebagai uji multivariate, dengan tingkat kemaknaan 0,05. Analisis dilakukan dengan SPSS ver  15.0 .  Penelitian  ini  telah  mendapatkan  persetujuan
a 0,4 a < 0,001 a < 0,001 a Uji Wilcoxon;

## TABEL 1
Berat badan, kadar gula darah dan volume urin hewan coba sebelum dan setelah pemberian STZ (n=36)
Berat badan (gram) Parameter
Kadar gula darah (g/dL) Volume urin (ml/hari)
Sebelum
pemberian STZ Setelah pemberian STZ p ¥ 221,3 ± 18,55 84,8 ± 8,47 19,6 ± 9,05 195,5 ± 26,05 348,5 ± 150,67 58,4 ± 34,09
Aspek Biomolekuler Apoptosis, Caspase–3 & RAK pada Pemberian Morinda Citrifolia L (Mengkudu) Tikus Sprague Dawley Diabetes Nefropati yang Diinduksi Streptocotocin (STZ)
dari  Komisi  Etik  Kedokteran  dan  kesehatan  Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro dan RS. Dr. Kariadi Semarang.

## HASIL
Pada  penelitian  ini  digunakan  36  ekor  tikus  SD  yang dikelompokkan menjadi 6 kelompok seperti dijelaskan di metode.  Selama  perlakuan  tidak  dijumpai  hewan  coba yang mati.   Tabel 1 memperlihatkan berat badan, kadar gula darah dan volume urin tikus sebelum dan sesudah pemberian  STZ.  Rerata  kadar  gula  darah  hewan  coba sebelum  pemberian  STZ  adalah  dalam  batas  normal, namun saat 8 minggu setelah pemberian STZ adalah ± 4x lebih tinggi dibanding sebelum pemberian STZ, hasil uji statistik  menunjukkan  peningkatan  kadar  gula  darah tersebut adalah bermakna ( p <0,001).
Berdasarkan  adanya  peningkatan  kadar  glukosa darah,  peningkatan  volume  urin  maka  dapat disimpulkan  pemberian  STZ  40  mg/kgBB  telah  dapat menginduksi terjadinya nefropati diabetik pada hewan coba.
Kadar  albumin  urin  pada  hewan  coba  setelah pemberian  ekstrak  mengkudu  berbagai  dosis ditampilkan pada gambar 1.
Pada  gambar  2  tampak  bahwa  penurunan  RAK yang  terbesar  dijumpai  pada  pemberian  MC  dengan dosis 20 mg. Hal ini juga sesuai dengan hasil analisis pada kadar albumin urin yang juga menunjukkan pemberian MC 20 mg memberikan penurunan kadar albumin urin yang paling besar.
Hasil analisis pada RAK menunjukkan pemberian MC dengan dosis 20 mg dapat menurunkan RAK secara bermakna pada model tikus diabetes yang diinduksi STZ. Pemberian  dosis  40  mg  walaupun  dapat  menurunkan namun  penurunan  tersebut  adalah  tidak  bermakna, sedangkan dosis MC 10 dan 80 mg menyebabkan RAK yang  sedikit  lebih  tinggi  dibanding  K  (+)  namun  tidak bermakna.  Persen  penurunan  RAK  yang  terbesar dijumpai pada kelompok yang mendapat MC 20 mg.
Indeks apoptosis jaringan glomerulus ginjal pada masing-masing  kelompok  penelitian  ditampilkan  pada
Gambar  1. Perbandingan  kadar  albumin  urin  setelah perlakuan pada masing-masing kelompok penelitian. Nilai p menunjukkan  derajat  kemaknaan  perbedaan  kadar albumin  urin  pada  kelompok  yang  mendapat  ekstrak mengkudu dibanding kelompok kontrol (+).
0 200 MC 80 mg 50 100 150 MC 40 mg MC 20 mg MC 10 mg K (+) K (–) Kelompok A lb u m in u ri n ( m g /d L) 0 100 MC 80 mg 20 60 80 MC 40 mg MC 20 mg MC 10 mg K (+) K (–) Kelompok A lb u m in K re at in in R at io 40 p =0,04 p =0,2 p =0,9 p =0,9
Gambar 2. Perbandingan RAK  urin setelah perlakuan pada masing-masing kelompok penelitian. Nilai p menunjukkan derajat  kemaknaan  perbedaan  RAK  urin  pada  kelompok yang  mendapat  ekstrak  mengkudu  dibanding  kelompok kontrol (+).
gambar  4,  sedangkan  perbandingan  indeks  apoptosis jaringan  tubulus  ginjal  pada  masing-masing  kelompok penelitian ditampilkan juga pada gambar 4.
Ekspresi caspase–3 jaringan  glomerulus  ginjal pada  masing-masing  kelompok  penelitian  ditampilkan pada gambar 6. Ekspresi caspase–3 jaringan glomerulus yang  tertinggi  adalah  pada  kelompok  yang  mendapat STZ dan MC  yang paling rendah adalah pada kelompok yang mendapat MC 20 mg. Gambar 7 memperlihatkan
ekspresi caspase–3 jaringan tubulus ginjal pada masing- masing  kelompok . Berdasarkan  hasil  uji  statistik dijumpai  ekspresi caspase-3 jaringan  tubulus  ginjal kelompok MC 10, 20, 40 dan 80 mg adalah lebih rendah secara  bermakna  dibanding  kelompok  kontrol  (+) dengan nilai p masing-masing adalah p =0,002.
Disimpulkan  ekspresi caspase–3 nefron, glomerulus dan tubulus yang paling rendah adalah pada kelompok MC 20 mg dengan p =0,002.
Medica Hospitalia | Vol. 1, No. 3, Mei 2013
0 150 10 125 Dosis MC % A K R 100 75 50 25 20 40
80
Gambar  3. Persen  RAK  urin  hewan  coba  yang  mendapat pemberian  MC  dibanding  dengan  RAK  pada  kelompok kontrol (+).
0 15,0 MC 80 mg 2,5 MC 40 mg MC 20 mg MC 10 mg K (+) K (–) Kelompok In d e ks A p o p to si s G lo m e ru lu s 5,0 7,5 10,0 12,5 p =0,002 p =0,002 p =0,002 p =0,6
Gambar  4. Perbandingan  indeks  apoptosis  jaringan glomerulus  ginjal  pada  masing-masing  kelompok penelitian.  Nilai p menunjukkan  derajat  kemaknaan perbedaan  indeks  apoptosis  glomerulus  ginjal  pada kelompok  yang  mendapat  ekstrak  mengkudu  dibanding kelompok kontrol (+).
Gambar 5. Perbandingan indeks apoptosis jaringan tubulus ginjal  pada  masing-masing  kelompok  penelitian.  Nilai p menunjukkan  derajat  kemaknaan  perbedaan  indeks apoptosis  tubulus  ginjal  pada  kelompok  yang  mendapat ekstrak mengkudu dibanding kelompok kontrol (+).
0 15,0 MC 80 mg 2,5 MC 40 mg MC 20 mg MC 10 mg K (+) K (–) Kelompok In d e ks A p o p to si s Tu b u lu s 5,0 7,5 10,0 12,5 p =0,002 p =0,002 p =0,002 p =0,5
Gambar  6. Perbandingan  ekspresi caspase–3 jaringan glomerulus  ginjal  pada  masing-masing  kelompok penelitian.  Nilai p menunjukkan  derajat  kemaknaan perbedaan ekspresi caspase–3 glomerulus pada kelompok yang  mendapat  ekstrak  mengkudu  dibanding  kelompok kontrol (+).
0 15,0 MC 80 mg 2,5 MC 40 mg MC 20 mg MC 10 mg K (+) K (–) Kelompok C a sp a se G lo m e ru lu s 5,0 7,5 10,0 12,5 p =0,7 p =0,004 p =0,002 p =0,2
Analisis  untuk  menilai  faktor-faktor  yang berpengaruh  terhadap  perbaikan  fungsi  ginjal  yang dinilai  berdasarkan  AKR  urin  dilakukan  dengan  uji regresi berganda yang  ditampilkan pada tabel 2.
Berdasarkan  hasil  analisis  uji  multivariat  pada tabel  2  dapat  diketahui  indeks  apoptosis  glomerulus merupakan  faktor  utama  yang  berpengaruh  terhadap rasio albumin kreatinin  urin.
Mekanisme  perbaikan  fungsi  ginjal  setelah pemberian  MC  khususnya  dosis  20  mg  secara  tidak langsung  dapat  disimpulkan  bahwa  pengaruh  MC terhadap terjadinya apoptosis pada sel glomerulus dan tubulus ginjal tikus diabetes yang diinduksi oleh STZ.

## PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  RAK  urin  tikus  ND yang  mendapat  pemberian  MC  20  mg  adalah  lebih
rendah  secara  bermakna  dibanding  kelompok  kontrol (+). Dosis MC 10 mg tampak belum dapat menurunkan RAK,  sedangkan  dosis  40  dan  80  mg  tampak  dapat menurunkan  RAK  namun  penurunannya  belum bermakna. Hasil ini menunjukkan bahwa hipotesis MC dapat menurunkan RAK pada tikus ND yang diinduksi dengan  STZ  adalah  terbukti,  MC  dapat  memberikan penurunan  RAK  urin  sehingga  mendekati  nilai kelompok kontrol (-) adalah 20 mg.   Hasil penelitian ini juga  ditunjang  dengan  hasil  pengamatan  pada  kadar albumin urin. Kelompok tikus ND yang mendapat MC 20 mg mempunyai kadar albumin urin yang lebih rendah secara  bermakna  dibanding  kelompok  kontrol  (+). Berbeda  dengan  hasil  pengamatan  pada  RAK, kadar albumin urin kelompok yang mendapat MC 10 mg dan 40 mg adalah lebih rendah dibanding kelompok kontrol (+),  namun  hasil  uji  statistik  menunjukkan  penurunan tersebut  adalah  tidak  bermakna.  Pada  kelompok  yang mendapat MC 80 mg justru kadar albumin urin adalah lebih tinggi dibanding kelompok kontrol (+). Penelitian ini  merupakan  penilitian  pertama  yang  melaporkan pengaruh pemberian MC terhadap RAK tikus ND yang diinduksi dengan STZ. Hasil penelitian ini sejalan dengan hasil  penelitian  sebelumnya  oleh  Padmavaty  yang melaporkan  pemberian  MC  pada  tikus  ND  yang diinduksi  oleh  STZ  dapat  menurunkan  rasio  albumin 12 kreatinin urin.
Mikroalbuminuria  pada  diabetes  berhubungan dengan kerusakan jaringan organ sistem kardiovaskuler dan  ginjal.  Disfungsi  endotel  merupakan  kondisi  yang mendasari kerusakan organ pada sistem kardiovaskuler 13 dan  ginjal. Mikroalbuminuria  disebabkan  karena peningkatan  aliran  albumin  pada  kapiler  glomerulus. Peningkatan  aliran  albumin  ini  tidak  disebabkan  oleh peningkatan  tekanan  pada    kapiler  glomerulus  namun lebih  utama  karena  perubahan  ultrastruktur  endotel glomerulus  akibat  disfungsi  endotel.  Hasil  penelitian pada  model  diabetes  binatang  menunjukkan  kelainan yang  dijumpai  pada  mencit  dengan  proteinuria  adalah kelainan  pada  selektifitas  terhadap  muatan  listrik molekul albumin. Sel endotel glomerulus menghasilkan beberapa proteoglikan, hyaluronan dan kondroitin sulfat berperan  dalam  memelihara  selektifitas-muatan  listrik pada  membran  filtrasi  glomerulus  (MFG).  Pada  ND dijumpai  adanya  penurunan  produksi  heparin-sulfat proteoglikan yang menyebabkan perubahan pada fungsi 14 MFG.   Beberapa  peneliti  sebelumnya  belum  dapat menjelaskan  mekanisme  terjadinya  mikroalbuminuria pada ND. Hasil penelitian dewasa ini menunjukkan bawa stress  oksidatif  merupakan  mekanisme  utama  dalam 15 terjadinya  komplikasi  diabetes.   Hiperglikemia meningkatkan  stress  oksidatif  melalui  peningkatan produksi  spesies  oksigen  reaktif  (SOR)  melalui  rantai elektron transport pada mitokondria. SOR memiliki efek langsung  terhadap  sel  melalui  peningkatan  aktifitas NF-ĸB, peningkatan stress oksidatif dan interaksi dengan
Gambar  7. Perbandingan  ekspresi caspase–3 jaringan tubulus  ginjal  pada  masing-masing  kelompok  penelitian. Nilai p menunjukkan  derajat  kemaknaan  ekspresi perbedaan caspase–3 tubulus ginjal pada kelompok yang mendapat ekstrak mengkudu dibanding kelompok kontrol (+).
0 16 MC 80 mg 4 MC 40 mg MC 20 mg MC 10 mg K (+) K (–) Kelompok C a sp a se T u b u lu s 8 12 p =0,002 p =0,002 p =0,002 p =0,002 0,32 - 0,39
0,167
-0,19

## TABEL 2
Hasil uji regresi linier berganda faktor-faktor yang berpengaruh terhadap RAK urin model tikus diabetik yang diinduksi dengan STZ

## Indeks apoptosis glomerulus

## Faktor pengaruh
Indeks apoptosis tubulus
Ekspresi caspase–3 glomerulus Ekspresi caspase–3 tubulus Koefisien regresi p 0,03 0,6 0,5
0,6
Aspek Biomolekuler Apoptosis, Caspase–3 & RAK pada Pemberian Morinda Citrifolia L (Mengkudu) Tikus Sprague Dawley Diabetes Nefropati yang Diinduksi Streptocotocin (STZ)
ke–4  jalur  kerusakan  akibat  hiperglikemi  seperti  yang 16 disebut  diatas.   NF–ĸB  merupakan  protein  pengikat DNA yang diperlukan untuk proses transkripsi sebagian besar  molekul  proinflamasi  termasuk  molekul  adhesi,
17 enzim,  sitokin  dan  kemokin. Selain  SOR,  beberapa kondisi  lain  yang  terjadi  pada  diabetes  mengaktifkan NF–ĸB  antara  lain  adalah  hiperglikemia  dan  TNF–α. NF–ĸB dapat disemua jaringan termasuk jaringan nefron ginjal (glomerulus dan sistem tubulus). Aktivasi NF–ĸB pada  jaringan  nefron  ginjal  menyebabkan  terjadinya 18 proses inflamasi dan apoptosis.  Perubahan glomerulus yang  terjadi  adalah  penebalan  membran  basal  kapiler, proliferasi  mesangial  dan  nodular  glomeruloskelorosis 19 yang merupakan ciri patologi ND.  Pada model diabetes hewan  peningkatan  NF-ĸB  berhubungan  dengan peningkatan  ekspresi  gen monocyte  chemoattractant protein-1 (MCP-1) dan infiltrasi makrofag pada jaringan ginjal. NF–B juga diatur oleh angiotensin II (Ang II). Ang II  melalui  jalur  NF–ĸB  menyebabkan  proliferasi  sel, apoptosis, fibrosis dan respon inflamasi.
Berdasarkan  uraian  diatas  apoptosis  sel glomerulus dan tubulus ginjal mempunyai peran penting dalam  patofisiologi  ND.  Apoptosis  pada  sel  podosit glomerulus  dilaporkan  sebagai  hal  yang  mendasari terjadi  hilangnya  podosit.  Podosit  merupakan  sel  yang berfungsi  khusus  untuk  mengatur  filtrasi  glomerulus dan  berperan  dalam  integritas  struktur  kapiler g l o m e r u l u s .   A p o p t o s i s   p o d o s i t   s e l a n j u t n y a menyebabkan  deplesi  podosit  secara  masif.  Hilangnya podosit  akan  menyebabkan  perubahan  pada  MFG. Apoptosis  podosit  merupakan  peristiwa  yang mendahului  terjadinya  apoptosis  pada  sel  tubulus  dan 20 kapiler peritubulus.  Peningkatan glukosa ekstraseluler memicu  pembentukan  SOR  melalui  jalur  NADPH oksidase.  SOR  melalui  jalur  NADPH  oksidase  dan mitokondria menyebabkan aktivasi protein proapoptosis p38 mitogen-aktivated  protein  kinase (MAPK)  dan 21 caspase–3 .
Pada  penelitian  ini  dijumpai  pada  kelompok kontrol (+) terjadi peningkatan indeks apoptosis pada sel glomerulus maupun tubulus kurang lebih 5 x lebih tinggi dibanding kontrol (-). Penelitian sebelumnya pada tikus diabetes  yang  diinduksi  oleh  STZ  juga  menjumpai apoptosis  sel  glomerulus  (podosit).  Berkurangnya podosit  menyebabkan  ekspansi  mesangial  dan 22 glomerulosklerosis.   Penelitian  lain  melaporkan apoptosis  tidak  hanya  terjadi  pada  sel  glomerulus, namun  juga  pada  sel  tubulus.  Penelitian  tersebut menjumpai adanya over ekspresi katalase pada tubulus proksimal mencit diabetes yang diinduksi STZ. Katalase merupakan  suatu  antioksidan  endogen  yang  memecah H2O2  menjadi  komponen  yang  tidak  aktif  sehingga mengurangi  pembentukan  SOR.  Hal  ini  merupakan bukti adanya pembentukan SOR pada tubulus proksimal 23 yang  lebih  banyak  dibanding  pada  glomerulus.   Hasil penelitian  tersebut  menjelaskan  indeks  apoptosis  pada
sel tubulus yang lebih tinggi dibanding glomerulus pada penelitian  ini  karena  stress  oksidatif  pada  sel  tubulus adalah lebih besar dibanding sel glomerulus.
P e n e l i t i a n   s e b e l u m n y a   m e l a p o r k a n penghambatan  NADPH  oksidase  dilaporkan  dapat menghambat  terjadinya  apoptosis  dan  mengurangi terjadinya  deplesi  podosit,  miroalbuminuria  dan 24 ekspansi mesangial matriks.
Pada  penelitian  ini  dijumpai  kelompok  yang mendapat  MC  dosis  20,  40  dan  80  mempunyai  indeks apoptosis  glomerulus  dan  tubulus  lebih  rendah  secara bermakna dibanding kontrol (+). Pemberian MC dosis 10  mg  tidak  memberikan  penurunan  indeks  apoptosis yang  bermakna.  Selanjutnya  hasil  penelitian  ini  juga menunjukkan  adanya  peningkatan  ekspresi caspase–3 pada  sel  glomerulus  dan  tubulus.  Hal  yang  menarik adalah ekspresi caspase–3 pada sel tubulus tampak lebih tinggi dibanding pada glomerulus. Hal ini sejalan dengan penelitian  sebelumnya  yang  menjumpai  pembentukan SOR  lebih  banyak  pada  tubulus  ginjal  dibanding glomerulus. Caspase–3 merupakan caspase utama  yang berperan  dalam  terjadinya  apoptosis.  Pada  diabetes caspase–3 berperan  dalam  terjadinya  apoptosis  sel  β pankreas.  Penelitian  Brezniceanu  dkk  melaporkan caspase–3 juga berperan pada terjadinya apoptosis pada 25 tubulus ginjal.
Adanya  penghambatan  pada  apoptosis  dan caspase-3 oleh MC menunjukkan mekanisme terjadinya penghambatan  apoptosis  pada  sel  glomerulus  dan tubulus  ginjal  adalah  melalui  jalur caspase–3 .  Selain  uji korelasi juga menunjukkan adanya korelasi positif antara indeks  apoptosis  dengan caspase–3 .  Hal  ini  berarti semakin tinggi caspase–3 maka indeks apoptosis semakin tinggi. Mekanisme lain yang perlu diteliti adalah manfaat MC  sebagai  antioksidan.  Ada  kemungkinan  peran  MC sebagai  antioksidan  menghambat  pembentukan  SOR sehingga  menghambat  aktivasi  NF-B  yang  selanjutnya 26 memicu  apoptosis.   Pada  penelitian  pendahuluan tentang peran NO sebagai antioksidan didapatkan hasil yang  kurang  bermakna  ( p =0,4).  Meskipun  demikian terdapat  fenomena  bahwa caspase–3 sebagai  indikator apoptosis  pada  dosis  tinggi  tidak  bermakna,  hal  ini berarti  ada  kemungkinan  efek  MC  terhadap caspase–3 dipengaruhi oleh hal lainnya seperti Bcl–2 dan Bax, serta adanya  mekanisme  pengaruh  jalur  intrarenal  aktivasi rennin-angiotensin  sistem.  Seperti  telah  disebutkan diatas  hiperglikemia  pada  diabetes  menyebabkan terjadinya respon inflamasi.  Pada penelitian ini terbukti ekspresi  IL–1  pada  kelompok  kontrol  (+)  adalah  lebih tinggi  5  X  lipat  dibanding  kontrol  (-).  Hal  ini menunjukkan  adanya  peran  faktor  inflamasi  pada jaringan glomerulus ginjal tikus ND.  Hasil penelitian ini sejalan  dengan  hasil  penelitian  sebelumnya  yang  juga menjumpai adanya peningkatan IL–1 pada tikus diabetes yang  diinduksi  dengan  STZ.  Paparan  hiperglikemia jangka  panjang  menyebabkan  peningkatan  sitokin
proinflamasi seperti IL–1 dan TNF–α. Kedua sitokin ini menghambat  fungsi  dan  menyebabkan  apoptosis  sel  β 2 7 pancreas.   Penelitian  lain  menjumpai  adanya peningkatan IL–1 pada jaringan glomerulus dan tubulus ginjal.  Peningkatan  IL–1  ini  menyebabkan  peningkatan sintesis  kolagen,  ekspansi  mesangial  dan  sekresi 28 prostaglandin.   Hasil  penelitian  ini  menunjukkan kelompok yang mendapat MC dosis 10, 20, 40 dan 80 mg memiliki  ekspresi  IL–1  lebih  rendah  secara  bermakna dibanding  kontrol  (+).  Hal  ini  membuktikan  MC mempunyai potnsi untuk menghambat proses inflamasi pada jaringan glomerulus ginjal.
Pada  diabetes  selain  terjadi  peningkatan  sitokin proinflamasi  juga  dijumpai  penurunan  IL–10  yang 29 merupakan  sitokin  anti  inflamasi.   Hasil  penelitian  ini menjumpai ekspresi IL–10 kelompok kontrol (+) adalah lebih  rendah  secara  bermakna  dibanding  kontrol  (-). Pada  kelompok  yang  mendapat  MC  10  mg  tampak ekspresi  IL–10  jaringan  glomerulus  adalah  lebih  tinggi secara bermakna dibanding kelompok kontrol (+) namun perbedaan yang tidak bermakna dijumpai pada  tubulus. Namun  pemberian  MC 20  mg,  40  dan  80  mg/dl menyebabkan peningkatan eskpresi IL–10 tubulus secara bermakna.
IL–10  merupakan  produk  dari  monosit  dan limfosit  dan  dipandang  sebagai  anti  inflamasi  yang utama. IL–10 berperan mengatur sekresi sitokin-sitokin proinflamasi.  Sekresi  IL–10  biasanya  terjadi  karena terpicu oleh   sekresi sitokin proinflamasi. Hal ini   yang menyebabkan terjadinya peningkatan IL–10 pada pasien 30 ND.  Hasil penelitian ini membuktikan pemerikan MC dosis 20, 40 dan 80 mg/dl dapat meningkatkan respon antiinflamasi.  Hal  ini  menunjukkan  MC  mempunyai potensi sebagai imunomodulator.
Efek  bifasik  terlihat  pada  kurva  berbentuk (U-shaped curve) pada AKR, apoptosis, caspase–3 . Hal ini menunjukkan efisiensi pengobatan optimal pada dosis 20  mg/dL  atau  diantara  dosis  10,  40,  dan  80  mg/dL. Penting  bagi  klinisi  memperhatikan  terhadap  dosis optimal. Diperlihatkan pada aktifitas zat bioaktif Morinda citrifolia L dengan adanya biphasic dose-respons curve , perlu diberikan secara proporsional, dimana pada pemberian dosis yang lebih besar akan menurunkan aktifitas, bifasik efek  akan  memberikan  konfigurasi U-shape .  Penelitian menunjukkan adanya konsep hormesis sebagai dasar dose- response dalam  biomedik  dan  toksikologi.  Hormesis penting dalam menentukan efek obat, dimana terdapat variasi inter-individual seperti variasiusia, latar belakang 30,31 keluarga,  status  nutrisi,  dan  faktor  lain. Hormesis berkontribusi  terhadap  interaksi  kimia.  Hal  ini disebabkan  karena Morinda  citrifolia L  melebihi  dosis efektif  dapat  bersifat  toksik,  menyebabkan  terjadinya pengurangan  respons  imun  karena  mekanisme 28-31 imunosupresan dari sitem imun tersebut.
Penelitian  pendahuluan  oleh  Indranila  dkk, terhadap  perbaikan  fungsi  ginjal  pada  pemberian
Morinda citrifolia L melalui albuminuria , VEGF, TGF β, NO  menunjukkan  adanya  korelasi  antara  status albuminuria dan nitrit oksida (NO) dengan nilai p =0,4; VEGF dengan nilai p =0,3, dan korelasi bermakna TGF-β ( p =0,06). Zeisberg  dkk mengatakan terdapatnya pengaruh penurunan TGF–β terhadap   perbaikan injury 32 ginjal.   Demikian  juga  peningkatan  IL–10  pada pemberian  MC  dosis  20  mg/dL  secara  bermakna 33 tersokong  oleh  penelitian  terdahulu.   TGF–β  sebagai sitokin growth factor memiliki efek sinergis dengan  IL–10 sebagai sitokin antiinflamasi.
Pada  penelitian  pendahuluan  MC  pada  dosis 20  mg/dL  dengan  berbagai  zat  bioaktif  senyawa flavonoid mampu menghambat terbentuknya NO, AGES sehingga  mengurangi  densitas  HS–PG.  Peningkatan laminin  pada  membran  basalis  karena  berkurangnya HS–PG  akibat  biosintesis  glikoprotein.  Sebagai antioksidan , flavonoid berperan menghambat produksi
34 VEGF, TGF–β dan NO.  MC mengurangi ekspresi VEGF, senyawa  flavonoid  memiliki  ikatan  lemah  terhadap ikatah  HIf–1α  dibandingkan  dengan  ikatan  ATP  pada proteinkinase, sehingga ekspresi VEGF tidak dihambat. MC  memacu  angiogenik  dapat  dilihat  dari  skor  yang mencerminkan  interaksi  senyawa  dan  protein  target yang  memiliki  aktifitas  penghambatan  angiogenesis. Jalur  sinyal  TGF–β  pada  penyakit  ginjal  merangsang perspektif terapi dan penatalaksanaan akan pencegahan progresifitas ND, melalui normalisasi disfungsi sel dan 35 produksi  TGF–β  pada  tikus  SD  yang  diinduksi  STZ. Flavonoid mencegah cedera akibat radikal bebas melalui berbagai  cara,  salah  satunya  melalui radical  scavenger , mengurangi  radikal,  menstabilkan  ROS  melalui  ikatan reaktivasi  radikal  bebas. Menurut  Steer,  2006, Morinda citrifolia L  pada  dosis  20  mg/dL  memiliki  efek  pro- inflamsi   dengan IFN–γ dan sitokin IL–1 dan sebaliknya 36 memiliki  efek  anti  inflamasi  dengan  sitokin  Il–10. Morinda  citrifolia dosis  20  mg/dl  menurunkan  RAK. Pemberian Morinda citrifolia L melebihi dosis efektif 20  mg/dL  merupakan  dosis  melebihi  dosis  yang 37 dianjurkan,  mungkin  bersifat  toksik,   hal  ini  masih memerlukan pembuktian pada penelitian lebih lanjut.

## SIMPULAN
Pemberian ekstrak Morinda citrifolia L pada dosis  tertentu terbukti  memperbaiki  fungsi  ginjal  pada  tikus Sprague- Dawley ND yang diinduksi Streptozotocin . Hal ini terbukti bahwa: MC pada konsentrasi 10 mg, 20 mg, 40 mg, dan 80 mg /dL dapat memperbaiki fungsi ginjal ND.
a. Pemberian Morinda citrifolia L dosis 10, 20, 40, 80  mg/dL  dapat  menurunkan  status  albuminuri berdasarkan pengukuran RAK, menurunkan  indeks apoptosis , ekspresi caspase–3 , secara bermakna.
b. Pemberian  ekstrak Morinda  citrifolia L  dapat memperbaiki   fungsi   ginjal paling   bermakna pada konsentrasi  20 mg/dL.
Aspek Biomolekuler Apoptosis, Caspase–3 & RAK pada Pemberian Morinda Citrifolia L (Mengkudu) Tikus Sprague Dawley Diabetes Nefropati yang Diinduksi Streptocotocin (STZ)
c. Pemberian Morinda citrifolia L memberikan pengaruh paling kuat untuk perbaikan ND melalui apoptosis glomerulus terhadap penurunan status albuminuria berdasarkan pengukuran RAK pada dosis 20 mg. Saran  pemberian  dosis Morinda  citrifolia L  (MC)    yang dianjurkan  adalah    20  mg/dL  pada  tikus,  penggunaan MC perlu dipantau pemeriksaan rasio albumin kreatinin (RAK), serta  perlu  dilakukan    penelitian  lanjutan  pada manusia,  dengan  dosis  100  mg/dL/kgBB,  yang merupakan hasil konversi dosis 20 mg/dL pada tikus.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kepada Dirjen Dikti yang telah memberikan bantuan sehingga terselesaikannya penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Bandiara  R.  Penatalaksanaan  nefropati  diabetik.  Dalam simposium  endokrinologi  klinik  VII.  Bandung,  Unpad,  2010, hal 48–72.
2. Remuzzi  G,  Perico  N,  Macia  M,  Ruggenenti  P.  The  role  of rennin-angiotensisn aldosterone system in the progression of chronic kidney disease. Kidney Int 2005;68:S57–65.
3. Okada H, Kalluri R. Cellular and molecular pathways that lead to progression and regression of renal fibrogenesis. Curr Mol Med 2005;5:467–74
4. Suztak K, Raff AC, Schiffer M, Bottinger EP. Glucose-Induced Reactive Oxygen Species caused Apoptosis of Podocytes and Podocyte  depletion  at  the  onset  of  diabetic  nephropathy. Diabetes 2006;55:225–33.
5. Alikhani  Z,  Alikhani  M,  Boyd  CM,  Nagao  K,  Trackman  PC, Graves  DT.  Advanced  glycation  end  products  enhace expression  of  pro-apoptotic  genes  and  stimulate  fibroblast apoptosis through cytoplasmic and mitochondrial pathways. J Biol Chem 2005; 280:12087–95.
6. Zuhud.  Kembali  kealam  memanfaatkan  obat  asli  Indonesia, suatu kajian etnofarmakologi. Seminar Nasional Biologi XVI. Himpunan Biologi Indonesia, Bandung 2000.
7. Wang  MY,  West  BJ,  Jensen  CJ,  Nowicki  D,  Su  C,  Palu  AK, Anderson G. Morinda citrifolia (Noni): a literature review and recent  advances  in  noni  research.  Acta  Pharmacol  Sin 2002;23:1127–41.
8. Potterat  O,  Hamburger  M.  Morinda  citrifolia  (Noni)  Fruit- Phytochemistry,  Pharmacology,  Safety.  Planta  Med 2007;73:191–9.
9. Wang  M,  Kikuzaki  H,  Jin  Y,  Nakatani  N,  Zhu  N,  Caiszar  K, Boyd C, Rosen RT, Ghai G,  Ho CT. Novel glycosides from noni (Morinda citrifolia ). J Nat Prod 2000;63:1182–3.
10. Rao  UM,  Subramanian  S.  Biochemical  evaluation  of antihyperglicemic anti oxidative effects of Morinda citrifolia; fruit  extract  studied  in  Streptozotocin  induced  diabetic  rats. Medicinal Chem Res 2009;18:433–66.
11.  Olajide  OA,  Awe  SO,  Makinde  JM,  Morebise  OLUG. Evaluation  of  the  anti-diabetic  property  of  Morinda  lucida leaves  in  Streptozotocin-diabetic  rats.  J  of  Pharmacy  and Pharmacol 1999;51:1321–4.
12.  Lenzen  S.  The  mechanisms  of  alloxan  and  streptozotocin induced diabetes. Diabetologia 2008;51:216–26.
13.  Cha DR, Kim NH, Yoon JW, Jo SK, Cho WY, Kim HK, Won NH. Role  of  vascular  endothelial  growth  factor  in  diabetic nephropathy. Kidney Int 2000;77:S104–12.
14.  Brownlee  M.  Biochemistry  and  molecular  cell  biology  of diabetic complications. Nature 2001;414:813–20.
14.  Sanz  A,  Santamaria  B,  Ruiz-Ortega  M,  Egido  J,  Ortiz  A. Mechanisms of renal apoptosis in health and disease. J Am Soc nephrol 2008:19: 1634–42.
15. Breyer M, Harris R. Diabetic nephropathy. In Mount Db, Pollak MR,  editors.  Molecular  and  genetic  basis  of  renal  disease. Philadelphia: Saunders Elsevier, 2008:p391–417
16. Bursell SE, King GL. Protein kinase-C activation, development of  diabetic  vascular  complications,  and  role  of  vitamin  E  in preventing  these  abnormalities.  Diabetes  Management, 2000:241–63.
17. MM, Husein AM, Sherif IO, Ali SS and Mohamed HE. Renal ischemia/reperfusion  injury  in  type  II  DM:  Possible  role  of proinflamatory cytokines, apoptosis, and nitric oxide. J Physiol and Patophysiol 20111; 2(1):6–7
18. Viberti GC. Hypertension and the renal vascular complications of  diabetes:  a  structural  basis  to  guide  management.  Schwiz Med Wochenschr 1994;124:1938–40.
19. Baba T, Neugebauer S, Watanabe T. Diabetic nephropathy. Its retlationship  to  hypertension  and  means  of  pharmacological intervention. Drugs 1997;54:197-234.
20. Saikumar  P,  Venkatachalam  MA.  Role  of  apoptosis  in hypoxic/ischemic  damage  in  the  kidney.  Semin  Nephrol 2003;23:511–21.
21. Mattix  HJ,  Hsu  CY,  Shaykevich  S,  Curhan  G.  Use  of  the albumin/creatinine  ratio  to  detect  microalbuminuria: implication of sex and race. J Am Soc Nephrol 2002;13:1034–39
22. Liadis N, Murakami K, Eweida M, Elford AR, Sheu L, Gaisano HY, Hakem R, Ohashi PS, and Woo M. Caspase-3-dependent β- cell  apoptosis  in  initiation  of  autoimmune  diabetes  mellitus. Moll and cell Biol 2005;25(9):3620-9.
23. Savill  J.  Apoptosis  and  the  kidney.  J  Am  Soc  Nephrol  1994; 5:12–21
24. Heinicke R. The  pharmacologically active ingredient of Noni. Bulletin of the National Trop Botanical Garden 1985;15:10–4.
25.  Frigo DE, Duong BN, Melnik LI, Schief LS, Collins-Burow BM, Pace  DK.  Flavonoid  Phytochemicals  Regulate  activator protein-1  signal  transduction  pathway  in  endometrial  and kidney stable cell lines. J of Nutrition 2002;132:1848–53
26.  Kitamura  M,  Ishikawa  Y.  Oxidant  induced  apoptosis  of glomerular cells: intracellular signaling and its intervention by bioflavonoid. Kidney Int. 1999;56:1223–29.
27. Kashihara  N,  Sugiyama  H,  and  Makino  H.  Mechanisms  for induction of apoptosis and glomerular disease. Nephrol Dial Transplant 1999;14:52–4.
28. Meier M, Menne J, Heller H. Targetting the protein kinase C family  in  diabetes  kidney.  Lessons  from  analysis  of  mutant mice. Diabetologia 2009;52:765–75.
29. Hirazumi  A,  Furusawa  E.  An  immunomodulatory polysaccharide-rich substance from the fruit juice of Morinda citrifolia  (noni)  with  antitumour  activity.  Phytotherapy Research 1999;13:380–7
30. Calabrese  EJ,  and  Baldwin.  Defining  hormesis.  Human  & experimental Toxicology 2001;21:91–97.
31. M a t t s o n   M P .   H o r m e s i s   D e f i n e d . A v a i l a b l e   a t www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/srticles/PMC2248601.
32. Indranila KS, Judiono and Theophillus W. Effect of Multidoses of Streptozotocin diabetogenic induced Sprague Dawley rats on  hyperglycemia  and  microalbuminuria.  In  Novel  material and  drug  design  international  seminar  on  chemistry. Departement of Chemistry Diponegoro University 2010.
33.  Li RW, Myers SP, Leach DN, Lin GD, Leach G. A cross-cultural study : anti-inflammatory activity of Australian and Chinese plants. J Ethnopharmacol 2003;85:25–32.
34.  Lukacinova A, Mojzis J, Benacka R, Keller J, Maguth T, Kutila P, Vasko L, Racz O, and Nistiar F. Preventive Effects of flavonoids on  Alloxan-Induced  diabetes  Mellitus  in  rats.  Actavet.BRNO 2008;77:175–82.
35. Kim  MH.  Flavonoids  inhibit  VEGF/bFGF-induced angiogenesis  in  vitro  by  inhibiting  the  matrix-degrading proteases. J Cell Biochem 2003;89(3):529–38.
36.  Steer SA, Scarim AL, Chambers KT, and Corbett JA. Interleukin 1 Stimulates β-Cell Necrosis and Release of the Immunological Adjuvant HMGB1. Plos Med. 2006;3(2):17.
37. Nelson SC. Morinda citrifolia (Noni) Species profiles for pacific Island Agroforesty . Available at www.traditionalree.org.
Aspek Biomolekuler Apoptosis, Caspase–3 & RAK pada Pemberian Morinda Citrifolia L (Mengkudu) Tikus Sprague Dawley Diabetes Nefropati yang Diinduksi Streptocotocin (STZ)