## KARAKTERISASI FRAKSI TERAKTIF SENYAWA ANTIBIOTIK ISOLAT KP 13 DENGAN METODE DENSITOMETRI DAN KLT-SEMPROT
Alfian Syarifuddin 1 *, Nanik Sulistyani 2
1 Program Studi S1 Farmasi, Universitas Muhammadiyah Magelang, Magelang, Indonesia
2 Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta, Indonesia *Email: alfiansyarifuddin08@gmail.com
Artikel diterima: 5 Desember 2018; Disetujui: 14 Maret 2019

## ABSTRAK
Eksplorasi  mikroorganisme  Actinomycetes  dapat  menghasilkan  senyawa antibiotik. Salah satu bakteri yang dapat menghasilkan senyawa antibiotik adalah isolat bakteri KP13. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui karakter fraksi terakitf  senyawa  antibiotik  isolat  KP13  menggunakan  metode  densitometri  dan reaksi semprot/ pewarnaan hasil elusi kromatografi lapis tipis. Panjang gelombang yang  digunakan  untuk  densitometri  210  nm  serta  pereaksi  semprot  yang digunakan meliputi ninhidrin , Dragendorff , 2,4-dinitrofenil hidrazin (2,4-DNPH), dan  anisaldehid  asam  sulfat.  Hasil  penelitian  menggunakan  densitometri  pada panjang gelombang 210 nm menunjukkan kromatogram puncak tertinggi pada Rf 0,78.  Senyawa  yang  diduga  bertanggung  jawab  pada  nilai  Rf  0,78  mempunyai karakteristik senyawa Terpenoid, alkaloid, dan karbonil.
Kata kunci: Densitometri, Isolat KP13, KLT-semprot

## ABSTRACT
Exploration  of  microorganisms  Actinomycetes  can  produce  antibiotic compounds.  One  of  the  bacteria  that  can  produce  antibiotic  compounds  is  the KP13 bacterial isolate. The purpose of this study was to determine the character of  the  fraction  of  KP13  isolates  using  the  densitometry  method  and  the  spray  / colouring  reaction  of  thin  layer  chromatography  elution.  The  wavelengths  used for densitometry 210 nm and spray reagents used include ninhydrin, Dragendorff, 2,4-dinitrophenyl  hydrazine  (2,4-DNPH),  and  sulfuric  acid  anisaldehyde.  The results  of  the  study  using  densitometry  at  a  wavelength  of  210  nm  showed  the highest  peak  chromatogram  at  Rf  0.78.  The  compound  that  is  thought  to  be responsible  for  the  Rf  value  of  0.78  has  the  characteristics  of  Terpenoid compounds, alkaloids, and carbonyl.

## Keywords: Densitometry, Isolate KP13, TLC-spray reagents

## PENDAHULUAN
Eksplorasi
mikroorganisme sebagai agen terapetik sudah dimulai sejak  abad  ke-20.  Kemampuannya menghasilkan  senyawa  antibiotik dapat  bermanfaat  dalam  mengatasi berbagai penyakit infeksi yang disebabkan  oleh  bakteri  patogen. Actinomycetes  dapat  menghasilkan senyawa  bioaktif  antibiotika  (70%), fungi  (20%)  dan  bakteri  (10%) (Rante  &  Murti,  2010).  Saat  ini banyak  penelitian  difokuskan  pada Actinomycetes  yang  diindikasikan sebagai bakteri yang mampu menghasilkan  metabolit  sekunder antibiotik persentase terbanyak.
Metabolit terbagi menjadi
metabolit  primer  dan  metabolit sekunder (Demain & Sanchez, 2009). Metabolit sekunder tidak bisa digunakan untuk kebutuhan hidup sel tersebut dan sebagai karakter spesifik kelompok organisme (Bérdy, 2005).
Antibiotik yang bersumber dari metabolit  sekunder  bakteri,  menurut struktur  dan  jenis  biosintesisnya dapat diklasifikasikan menjadi antibiotik  derivat  peptida,  derivat poliketida  dan  golongan  lainnya. Kandungan  kimia  dalam  metabolit
sekunder Actinomycetes lainnya mengandung  senyawa  kimia  dari beberapa  jalur  biosintesis,  seperti asam  amino  dan  alkaloid  yang berasal  dari  jalur  asam  sikimat ( shikimate pathway ), senyawa poliketida,  fenolik  dan  asam  lemak yang  berasal  dari  jalur  asam  asetat- malonat ( acetate/acylpolymalonate pathway ),  dan  senyawa  terpenoid yang berasal dari jalur asam mevalonat  ( mevalonic  pathway )  dan senyawa  lainnya  yang  berasal  dari jalur biosintesis yang berbeda
(Taddei et al. , 2006).
Syarifuddin & Sulistyani
(2018)  telah  melakukan  uji  aktivitas antibiotik  isolat  KP13  terhadap bakteri Escherichia coli dan melakukan analisis mekanisme molekuler  antibiotik  isolat  KP13 dengan  meninjau  dari  kebocoran  sel pada  bakteri  tersebut.  Selain  itu, Syarifuddin  &  Sulistyani  (2018) melakukan uji KLT-bioautografi fraksi  teraktif  isolat  KP13  dan memperoleh  bercak  aktif  pada  Rf 0,77. Oleh karena itu, dalam penelitian ini perlu dianalisis karakter  senyawa  aktif  dan  analisis kualitatif senyawa tersebut.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan Penelitian
Alat  yang  digunakan  adala: ose,  mikropipet, yellow  tip , blue  tip , white  tip ,  alat  gelas,  timbangan analitik,  lampu  bunsen, magnet stirer , hootplate ,  mikro  pipet, cotton but steril,  inkubator,  enkas,  autoklaf,
plat KLT silika gel F 254, Densitometri, GC-MS ( Gass Chromatography Mass Spectrometry ),  lampu UV.
Bahan  yang  digunakan  adalah media  SNB,  media Mueller  Hinton ,
NaCl  0,9%,  BHI,  Standard  Mc Farland  (10 8 CFU/mL),  Gliserol
25%, NaCl, KNO 3 , K 2 HPO 4 ,
MgSO 4 .7H 2 O,  FeSO 4 .7H 2 0, E.coli ATCC 25922 , Heksan,  Etil  asetat, Etanol 70%, dan metanol. Tahapan Penelitian

## Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis dilakukan  dengan  cara  menotolkan ekstrak  pada  plat  dengan  bantuan pipa kapiler 5 µL.  Ekstrak etil  asetat sebanyak  8  mg  dilarutkan  dengan metanol  40  µL.    Selanjutnya,  dielusi dengan larutan pengembang di dalam wadah tertutup rapat.Fase diam yang digunakan adalah silica gel F 254 . Fase
gerak yang digunakan adalah kloroform  :etil  asetat  :  metanol (4:1:0,5).  Sebelum  memasukkan  plat KLT  ke  dalam chamber ,  fase  gerak/ eluen  dibiarkan  hingga  jenuh  di dalam chamber .  Setelah  dielusi,  plat KLT  dikeringkan.  Untuk  melihat pola  pemisahannya,  kromatogram tersebut  dideteksi  dengan  lampu  UV 254  nm  dan  366  nm,  kemudian ditentukan nilai  Rfnya  (Moncheva et al .,  2012).  Fraksi  yang  mempunyai profil  spot  dengan  nilai  Rf  yang sama,  digabung  dan  dikelompokkan menjadi satu kelompok.
Analisis Densitometri dan

## Identifikasi Senyawa Kimia
Kromatogram kemudian dianalisis menggunakan Densitometer CANMAG-4
kemudian  disemprot  menggunakan beberapa pereaksi, antara lain ninhidrin, Dragendorff, 2,4- dinitrofenil hidrazin (2,4-DNPH) dan anisaldehid  asam  sulfat.  Setelah  itu dikeringkan  dengan  oven  pada  suhu 105 o C  kemudian  amati  perubahan bercak.

## Analisis Data
Untuk mengetahui adanya aktivitas antibakteri dari isolat
Actinomycetes  pada  sampel  pasir Gunung  Slamet  terhadap  bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis
dilakukan  dengan  cara  menganalisis zona  hambat  yang  dihasilkan  oleh masing-masing bakteri. Analisis potensiantibakteri  menurut  Lee,  J., and Hwang,  (2002),  dibedakan menjadi  3  kategori  yaitu  kategori kuat dengan ukuran diameter hambat lebih  dari  atau  sama  dengan  20  mm, kategori  sedang  dengan  ukuran diameter  10-19  mm,  dan  kategori
lemah  dengan  ukuran  diameter  5-9 mm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis hasil elusi KLT menggunakan densitometer CANMAG 4 scanner dengan menggunakan  panjang  gelombang 210  nm  dan  366  nm.  Pada  panjang gelombang 210 nm menghasilkan 12 spot yang  ditunjukkan  pada  Gambar 1 dan Tabel 1.
Gambar 1. Analisis kromatogram hasil elusi KLT fraksi kelompok 1 menggunakan CANMAG-4 Scanner pada panjang gelombang 210 dan 360 nm
Hasil pembacaan KLT- densitometri dengan panjang gelombang  210  nm  pada  Rf  0,78 menunjukkan%  area  27,92%  diduga bercak  yang  berpotensi  sebagai antibiotik  ditinjau  dari  nilai  Rf  yang
mendekati nilai  Rf hasil bioautografi dan  nilai%  areanya  .  Hal  tersebut diperkuat  dengan  hasil  bioautografi yang  disajikan  pada  Gambar  1. Bercak  aktif  hasil  uji  bioautografi mempunyai nilai Rf 0,77.
Berdasarkan  dari  hasil  analisis menggunakan KLT-Densitometer CANMAG  4-Scanner,  bercak  yang aktif sebagai  antibiotik  dapat  terbaca pada  panjang  gelombang  210  nm tetapi  tidak  terbaca  pada  panjang gelombang 366 nm. Puncak tertinggi/dominanpada profil
kromatogram  yang  dihasilkan  dari hasil pembacaan pada panjang gelombang  210nm  diduga  sebagai puncak  senyawa  yang  berpotensi sebagai  antibiotik.  Puncak  tersebut muncul  pada  kisaran  Rf  0,7-0,8  dari
masing-masing  panjang  gelombang yang digunakan. Hal tersebut diperkuat  dengan  hasil  bioautografi pada  Gambar  1  yang  menunjukkan bercak aktif yang dapat menghambat pertumbuhan  bakteri Escherichia coli muncul  pada  nilai  Rf  0,775. Selain  itu,  pemisahan  senyawa  aktif yang dihasilkan belum menghasilkan senyawa  murni  ditunjukkan  dengan data%  area pada bercak  yang diduga sebagai  antibiotik  dengan  nilai  tidak mendekati  angka100%  dan  masih muncul bercak-bercak dari zat pengotor  yang  terbaca  dari  hasil scanning  selain  senyawa  yang  aktif sebagai  antibiotik  pada  hasil  elusi plat Kromatografi Lapis Tipis
(KLT).
Tabel 1. Analisis hasil elusi KLT fraksi kelompok 1 menggunakan CANMAG-4 Scanner pada panjang gelombang 210 nm. peak Rf Area (%) λmax (nm) 1 -0,07 0,20 285 2 -0,04 0,75 284 3 -0,01 1,20 285 4 0,02 5,95 284 5 0,11 2,46 283 6 0,20 0,60 285 7 0,36 8,63 200 8 0,56 12,73 200 9 0,67 4,54 200 10 0,78 27,92 200 11 0,88 16,73 200 12 0,93 18,28 234
Tabel 2. . Analisis hasil elusi KLT fraksi kelompok 1 menggunakan CANMAG-4 Scanner pada panjang gelombang 366 nm peak Rf Area (%) λmax (nm) 1 -0,02 1,72 290 2 0,04 1,41 200 3 0,50 3,55 200 4 0,62 4,66 200 5 0,70 42,09 200 6 0,88 19,26 200 7 0,94 17,82 200 8 1,11 9,49 200 Antibiotik yang bersumber dari
metabolit  sekunder  bakteri,  menurut struktur  dan  jenis  biosintesisnya dapat diklasifikasikan menjadi beberapa  kelompok,  yaitu  antibiotik derivat  peptida,  derivat  poliketida dan  golongan  lainnya.  Kandungan kimia  dalam  metabolit  sekunder Actinomycetes  lainnya  mengandung banyak  senyawa  kimia  yang  berasal dari beberapa jalur biosintesis, seperti  asam  amino  dan  alkaloid yang  berasal  dari  jalur  asam  sikimat ( shikimate pathway ), senyawa poliketida,  fenolik  dan  asam  lemak yang  berasal  dari  jalur  asam  asetat- malonat ( acetate/acylpolymalonate pathway ),  dan  senyawa  terpenoid yang berasal dari jalur asam mevalonat  ( mevalonic  pathway )  dan senyawa  lainnya  yang  berasal  dari jalur biosintesis yang berbeda (Taddei et  al .,  2006).  Oleh  karena
itu,  pola  pemisahan  senyawa  yang terkandung  dalam  ekstrak  di  plat KLT  dapat  dilakukan  pengamatan secara visual di bawah lampu UV254 nm dan UV366 nm, sedangkan untuk mengidentifikasi senyawa pada fraksi  kelompok  1,  maka  setelah pemisahan  senyawa  dapat  dilakukan penyemprotan  oleh  reagen  semprot yaitu  Dragendorff  untuk  menguji kandungan  alkaloid,  Ninhidrin untuk golongan  peptida,  anisaldehid-asam sulfat  untuk  uji  kandungan  senyawa steroid  dan  terpenoid,  serta  2,4- Dinitrophenyl  Hidrazyn (2,4-DNPH) untuk uji kandungan karbonil, khususnya aldehid dan keton (Gritter et  al., 1991  dalam  Gandjar and Rohman,  2007).  Hasil  uji  KLT semprot  disajikan  pada  Gambar  2, sedangkan hasil pengamatan kromatogram  dapat  diamati  pada Tabel 3.
a b c d e f g
Gambar 2. Hasil Elusi KLT Fraksi kelompok 1 Isolat KP13 Keterangan : a= Hasil elusi KLT; b = Hasil elusi KLT pada UV 254nm; c = Hasil elusi KLT pada UV 366 nm; d= pada pereaksi anisaldehid asam sulfat; e = Ninhidrin; f = Dragendroff; g = 2,4 DNPH.
Pemadaman  bercak  di  bawah lampu  UV  254  mengindikasikan adanya  penyerapan  cahaya  UV  oleh senyawa.  Penyerapan  sinar  UV disebabkan  karena  adanya  molekul kromofor yang terdiri ikatan rangkap dua atau ikatan rangkap 3 dan ikatan rangkap tersebut terkonjugasi.
Senyawa-senyawa  aromatik  yang mempunyai  cincin  benzen  akan menyerap  sinar  UV  pada  panjang gelombang  254  nm.  Salah  satu
senyawa yang terdeteksi pada analisis GC-MS
adalah Cycloheptatriene yang  mempunyai ikatan  rangkap  terkonjugasi  atau molekul  kromofor.  Oleh  karena  itu, fraksi  kelompok  1  dari  isolat  KP  13 yang  mengalami  pemadaman  pada bercak hasil elusi pada KLT mengandung ikatan rangkap terkonjugasi dari senyawa cycloheptatriene.
1
0.75
0.5 0.25 0
Tabel 3. Tabel pengamatan kromatogram KLT-semprot fraksi kelompok 1
Rf UV 254 UV 366 Anisaldehid asamsulfat Ninhidrin Dragendroff 2,4 DNPH interpretasi 0,66 padam biru merah muda
ungu kuning orange Terpenoid, peptida, alkaloid, karbonil 0,69 - biru merah muda - - - Terpenoid 0,75 padam - merah muda - - orange Terpenoid, karbonil 0,77 padam - merah muda - kuning orange Terpenoid, alkaloid, karbonil 0,8 padam biru merah muda - kuning - Terpenoid, alkaloid 0,94 padam pink- ungu merah muda - Kuning - Terpenoid, alkaloid 0,96 padam - - - - - Gugus kromofor
Plat KLT setelah dielusi dibaca pada  lampu  UV  366  nm  terdapat bercak  yang  berflouresensi    menjadi warna  pink-ungu.  Flouresensi  atau berpendarnya  bercak  pada  sinar lampu  UV  366  nm  karena  adanya interaksi  lampu  UV  dengan  gugus kromofor yang terikat oleh ausokrom (Gibbons,  2006).  Gugus  kromofor yang  terikat  oleh  ausokrom  meliputi ─OH;  O;  ─NH 2 ;  dan  ─OCH 3 sehingga  mengakibatkan  pergeseran pita  absorpsi  menuju  ke  panjang gelombang  yang  lebih  besar  dan terjadi peningkatan intensitas  (Abdul Rohman, 2007).
Pereaksi Dragendorff
merupakan  pereaksi  yang  digunakan
untuk  mendeteksi  senyawa  alkaloid dan  senyawa  lain  yang  mengandung nitrogen  (Wall,  2000).  Hasil  positif alkaloid pada uji Dragendorff ditandai  dengan  terbentuknya  bercak coklat  muda,  orange  sampai  kuning (Katavic,  2005).  Regaen  dragendorff akan  menghasilkan  bercak  warna orange  dengan  amin  tersier  dan garam  amonium  quartener.  Bercak kuning  yang terbentuk pada Rf 0,66; 0,75;  0,77;  0,8  dan  0,94  sebagai alkaloid. Berikut reaksi uji Dragendorff. Pereaksi Dragendorff tidak bisa memastikan positif terdapat keberadaan alkaloid, hal ini dikarenakan hasil positif juga
diberikan terhadap senyawa
nitrogenous seperti  peptida  atau senyawa non-nitrogenous yang mengandung  oksigen  (Habib,  1980 dalam  Katavic,  2005)  Oleh  karena itu,  bercak  orange  pada  plat  KLT pada  nilai  Rf  0,66;  0,75;  0,77;  0,8 dan  0,94  bahwa  isolat  diduga mengandung  senyawa  dengan  amin tersier/garam amonium seperti alkaloid ataupun senyawa
nitrogenous seperti peptida.
Beberapa  asam  amino  melalui ikatan  peptida  membentuk  suatu molekul disebut peptida. Keberadaan senyawa  peptida  dalam  fraksi  dapat dideteksi  oleh  pereaksi  Ninhidrin. Ninhidrin  akan  memberikan  warna merah  keunguan  pada  bercak  solut bila  bereaksi  dengan  asam  amino, amina  primer,  dan  amina  sekunder
(Gandjar and Rohman, 2007). Bercak yang terbentuk setelah
penyemprotan berwarna ungu
dengan  nilai  Rf  0,66  dan  diduga mengandung senyawa peptida.
Reaksi  ini  dapat  diamati  pada Gambar 2. Amina tersier tidak dapat dideteksi  oleh  pereaksi  ninhidrin,
namundapat dideteksi dengan
Dragendorff, sehingga fungsi
penggunaan  kedua  pereaksi  semprot ini  saling  melengkapi.  Maka,  dapat disimpulkan bahwa bercak aktif pada Rf 0,77 setelah hasil uji bioautografi mengandung senyawa alkaloid tetapi tidak terdapat peptida.
Pereaksi 2,4-dinitrofenil hidrazin (2,4-DNPH) merupakan reagen semprot spesifik untuk mendeteksi  adanya  gugus  fungsi karbonil, khususnya keton dan aldehid pada suatu senyawa. Pereaksi ini akan menghasilkan warna kuning, orange  hingga  merah  pada  bercak KLT,  bila  bereaksi  dengan  senyawa karbonil keton  dan aldehid  (Wagner, H.,  1996).  Hasil  uji  semprot  KLT menggunakan
Pereaksi 2,4-
dinitrofenil hidrazin (2,4-DNPH) pada  Rf  0,66;  0,75;  dan  0,77 mengindikasikan  isolat  mengandung senyawa  diduga  bergugus  fungsi karbonil,  khususnya  keton  atau aldehid.
Anisaldehid asam sulfat adalah pereaksi  semprot  yang  digunakan untuk mengidentifikasi senyawa terpenoid. Terpenoid merupakan suatu  senyawa  yang  tersusun  atas isopren CH 2 =C(CH 3 )-CH=CH 2 (Harbone, 1996). Bercak yang positif
mengandung  terpenoid/steroid  akan timbul warna merah atau ungu ketika direaksikan  dengan  menggunakan Anisaldehid  asam  sulfat  (Wagner, 1996).  Bercak  hasil  KLT  yang membentuk  warna  merah  ketika disemprot menggunakan Anisaldehid asam sulfat, antara lain pada nilai Rf 0,66; 0,69; 0,75; 0,77; 0,8; 0,94; dan 0,96.  Penelitian  yang  dilakukan  oleh Bahi  (2012),  yang melakukan isolasi dan  karakterisasi  senyawa  metabolit
sekunder dari bakteri laut Streptomyces sp. dari ekstrak kasarnya memperlihatkan bercak berwarna  violet,  merah,  coklat  dan hitam  setelah  disemprot  dengan pereaksi  anisaldehid/  asam  sulfat sehingga  positif  terdapat  kandungan terpenoid atau steroid.

## KESIMPULAN
Berdasarkan pendekatan
menggunakan  hasil  densitometri  dan uji KLT-semprot pewarnaan, nilai Rf
yang aktif berpotensi sebagai antibiotik  adalah  nilai  Rf  0,77  yaitu diduga  senyawa  terpenoid,  alkaloid, dan karbonil.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lanjutan sehingga menemukan molekul antibiotik baru.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdul  Rohman,  I.  G.  G.  (2007). Kimia Farmasi Analisis . yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Bérdy, J. (2005). Bioactive Microbial
Metabolites:  A  Personal  View.
The  Journal  of  Antibiotics , 58 (1), 1–26. https://doi.org/10.1038/ja.2005. 1 Demain,  A.  L.,  &  Sanchez,  S. (2009). Microbial drug discovery: 80 years of progress. The Journal of
Antibiotics , 62 (1), 5–16.
https://doi.org/10.1038/ja.2008. 16
Gibbons,  S.  (2006). An  Intoduction to  Planar  Chromatography .
Totowa  New  Jersey.:  Humana Press.
Harbone, J.B. (1996). Metode Fitokimia, Terbitan ke-2.
Bandung: Penerbit ITB.
Katavic,  P.L.  (2005). Chemical
Investigation  of  the  Alkaloids from  the  plants  of  the  family Elaeocarpaceae,
Natural Product  Discovery  (NPD), .
Faculty  of  Science,  Griffith University, Australia.
Lee, J., H., B. .. K. (2002). Diversity of Antifungal Actinomycetes in Various  Vegetative  Soils  of
Korea, (39), 254–264.
Moncheva, P., Tishkov, S.,
Dimitrova,  N.,  Chipeva,  V.,
Antonova-Nikolova, S., & Bogatzevska, N. (t.t.). CHARACTERISTICS OF SOIL ACTINOMYCETES FROM ANTARCTICA, 12.
Rante,  H.,  &  Murti,  Y.  B.  (2010).
Purifikasi dan karakterisasi senyawa  anti-  bakteri  dari actinomycetes  asosiasi  spons terhadap bakteri patogen resisten, 8. Syarifuddin,  A.,  &  Sulistyani,  N. (2018).  Aktivitas  Antibiotik Isolat Bakteri Kp13 dan
Analisa Kebocoran Sel  Bakteri
Escherichia coli, 16 , 8.
Taddei, A., Valderrama,
M.,
Giarrizzo,  J.,  Rey,  M.,  &
Castelli,  C.  (2006).  Chemical screening:  A  simple  approach to  visualizing  Streptomyces diversity  for  drug  discovery and  further  research. Research in  Microbiology , 157 (3),  291– 297.
https://doi.org/10.1016/j.resmic
.2005.07.007
Wagner, H., S. B. (1996). Plant Drug Analysis; A Thin Layer
Chromatography  Atlas.  2nd Edition. Berlin  Heidelberg: Springer.
Wall, P.E. (2000). Chromatoghrapy : Thin  Layer  (Planar)  Spray Reagents .  United  Kingdom: Academic Press.