PEMURNIAN POLISAKARIDA DARI MIKROALGA BTM 11 SEBAGAI INHIBITOR RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C
Optimization of Polysaccharide Purification from Microalgae BTM 11 as RNA Helicase Hepatitis C Virus Inhibitor
Apon Zaenal Mustopa 1 *, Aksar Chair Lages 2 , Iriani Setyaningsih 2 , Muhamad Ridwan 1 , Rifqiyah Nur Umami 1 , Dwi Susilaningsih 1 , Delicia 1
1 Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
2 Departemen Teknologi Hasil Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor E-mail: azmustopa@yahoo.com
Diterima 22 Oktober 2012 /Disetujui 30 November 2012

## Abstract
Hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of chronic liver disease worldwide. Polysaccharide from microalgae  has  the  ability  against  HCV  infection.  Extract  of  microalgae  BTM  11  is  able  to  inhibit  RNA helicase  of  HCV.  The  study  aimed  to  purify  polysaccharide  from  microalgae  BTM  11  extract.  This  study included  isolation  of  HCV  RNA  helicase  from Escherichia  coli BL21  (DE3)  pLyss  carrier  of  NS3  helicase gene in pET 21b plasmid using affinity chromatography, and purification of polysaccharides from microalgae BTM 11 using gel filtration and ion-exchange chromatography. Inhibitor activity was measured using releasing of  phosphate  inorganic  in  colorimetricof  ATPase.  The  results  of  SDS-PAGE  showed  that  purified  RNA helicase  had  a  molecular  weight  of  54  kDa.  Gel  filtration  chromatography  could  purify  active  fraction  of polysaccharide for RNA helicase inhibitors with activity of 78.76% and sugar content of 2.97 mg/ mL, while using ion-exchange had inhibitor activity of 74.6% with sugar content of 3.21 mg/mL. Profile of the inhibitor on  thin  layer  chromatography  (TLC)  showed  one  spot of  the active  compound,  but  the  results  obtained from high  performance  liquid  chromatography  (HPLC)  showed  three  peaks  compounds  as  that  the  fractions  of inhibitor polysaccharide are still needed to be purified further.
Key words: chromatography, HCV, microalgae BTM 11, polysaccharide, RNA helikase

## Abstrak
Infeksi  virus  hepatitis  C  (HCV)  merupakan  penyebab  utama  penyakit  hati  kronis  di  seluruh  dunia. Polisakarida  dari  mikroalga  memiliki  kemampuan  melawan  infeksi  HCV.  Ekstrak  mikroalga  BTM  11 mampu  melawan  HCV  dengan  cara  menghambat  RNA  helikase.  Penelitian  ini  ditujukan  untuk memurnikan  polisakarida  dari  ekstrak  mikroalga  BTM  11. Tahapan  penelitian  ini  meliputi  isolasi  RNA helikase HCV dari bakteri Escherichia coli BL21 (DE3) pLyss yang membawa gen NS3 helikase dalam plasmid pET 21b menggunakan kromatografi afinitas, dan  pemurnian polisakarida dari mikroalga BTM 11 dengan kromatografi gel filtrasi dan ion-exchange . Aktivitas inhibitor diketahui dari besarnya aktivitas ATPase yang dimiliki oleh RNA helikase. Analisis SDS-PAGE menunjukkan RNA helikase terpurifikasi dengan bobot molekul 54 kDa. Kromatografi gel filtrasi menghasilkan fraksi aktif polisakarida inhibitor RNA  helikase  dengan  aktivitas  sebesar  78,76%  dan  kandungan  gula  sebesar  2,97  mg/mL,  sedangkan kromatografi ion-exchange memiliki  aktivitas  polisakarida  inhibitor  sebesar  74,6%  dengan  kandungan gula  sebesar  3,21  mg/ mL.  Profil  inhibitor  pada  kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  menunjukkan  satu  spot senyawa aktif, namun hasil kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) diperoleh tiga puncak senyawa yang menunjukkan bahwa hasil fraksi polisakarida inhibitor belum murni .
Kata kunci: HCV, kromatografi, mikroalga BTM 11, polisakarida, RNA helikase
*Korespondensi: Jl. Raya Bogor Km 46, Cibinong, Bogor 16911, E-mail: azmustopa@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Infeksi virus hepatitis C (HCV) merupakan  penyebab  utama  penyakit  hati kronis  di  seluruh  dunia.  Jumlah  penderita hati kronis di seluruh dunia hampir mencapai 200  juta  jiwa  (EASL  2011).  Kementerian Kesehatan  menyebutkan  bahwa  pada  tahun 2010  jumlah  penderita  hepatitis  C  di Indonesia mencapai 7 juta jiwa (Kementerian Kesehatan Republik Indonesia 2010).
Pengobatan  yang  dilakukan  terhadap penderita hepatitis C selama ini adalah terapi dengan pemberian interferon yang dikombinasikan  dengan  ribavirin.  Terapi  ini memiliki  tingkat  efektivitas  yang  tidak  lebih dari  50%  terhadap  infeksi  HCV  genotip  1 dan  4,  dan  tidak  lebih  dari  80%  terhadap genotip  2  dan  3.  Terapi  ini  juga  dapat menimbulkan  efek  samping  berupa  flu, depresi  dan  anemia  (Clercq  2004),  oleh karena  itu  diperlukan  suatu  obat  baru  yang dapat mengatasi infeksi virus hepatitis C.
Upaya dalam menemukan obat HCV terus dilakukan  dengan  mencari  senyawa  antiviral yang  melawan  virus  dengan  cara  menghambat enzim  yang  penting  bagi  HCV  salah  satunya adalah ribonucleid  acid (RNA)  helikase.
Borowski et  al .  (2008)  menjelaskan  bahwa enzim  RNA  helikase  berperan  dalam  proses replikasi  virus  HCV,  yaitu  membuka  ikatan dupleks  RNA  virus  agar  dapat  direplikasikan. Utama et al . (2000) menjelaskan bahwa apabila proses  pembukaan  ikatan  dupleks  RNA  virus sebagai  induk  (template)  genetik  tidak  dapat dilakukan,  maka  proses  translasi  informasi genetik  tidak  dapat  berjalan  sehingga  siklus hidup HCV terhenti.
Borowski et al. (2002) menjelaskan bahwa selain membuka ikatan dupleks, RNA helikase juga memiliki aktivitas ATPase, yaitu aktivitas yang menguraikan ATP ( adenosine triphosphate ) menjadi ADP ( adenosine diphosphate )  dan  Pi  (fosfat  anorganik).  Proses penguraian  ini  menghasilkan  energi  yang digunakan  untuk  menguraikan  pasangan  DNA atau RNA. Hal ini menjelaskan bahwa
penghambatan terhadap aktivitas enzim RNA helikase  dianggap  lebih  potensial  sebagai target obat hepatitis C.
Inhibitor  enzim  RNA  helikase  dapat diperoleh  dari  senyawa  metabolit,  misalnya metabolit  dari  mikroalga. Setyaningsih et  al . (2005) menjelaskan bahwa mikroalga merupakan  produsen  alami  dari  ekosistem perairan  yang  dapat  menghasilkan  metabolit yang sangat
bermanfaat, sehingga keberadaannya  sebagai  organisme  hidup yang mikroskopis sudah mulai banyak dikaji.
Ye et  al .  (2008)  menjelaskan  bahwa mikroalga memiliki banyak komponen bioaktif  yang  sangat  berpotensi  sebagai  obat antiinflamasi,  antitumor,  antimikroba,  dan antivirus.  Sanchez et  al .  (2007)  menjelaskan bahwa  biomassa  mikroalga  mengandung beberapa  komposisi  kimia  yang  potensial, misalnya protein, karbohidrat, pigmen (klorofil  dan  karotenoid),  asam  amino,  lipid dan hidrokarbon. Karbohidrat yang dihasilkan  dapat  ditemukan  dalam  bentuk pati,  glukosa,  gula  dan  polisakarida  lainnya. Obyek yang umum dijadikan target penemuan  obat  adalah  senyawa  kimia  dan jarang  yang  memfokuskan  pada  polisakarida sebagai antivirus hepatitis C.
Laboratorium  Bakteriologi  dan  Virologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI Cibinong  telah  melakukan  penapisan  terhadap 30  isolat  mikroalga  dengan  pelarut  metanol. Hasilnya  menunjukkan  bahwa  ekstrak  kasar mikroalga BTM 11 memiliki aktivitas penghambatan tertinggi terhadap RNA helikase
HCV  dan  bersifat  stabil  dibandingkan  isolat lainnya, namun dalam pengembangan polisakarida  dari  mikroalga  BTM  11  sebagai inhibitor  RNA  helikase  HCV  dibutuhkan informasi  awal  mengenai  teknik  pemurnian yang  terbaik  dalam  menghasilkan  aktivitas inhibisi  yang  optimum,  oleh  karena  itu  perlu adanya optimalisasi dalam pemurnian polisakarida  dari  mikroalga  BTM  11  sehingga dapat  diaplikasikan  sebagai  inhibitor  RNA helikase HCV.

## MATERIAL DAN METODE Bahan dan Alat
Bahan-bahan  yang  digunakan  meliputi bakteri Escherichia  coli BL21  (DE3)  pLysS yang  membawa  gen  NS3  RNA  helikase  virus hepatitis  C  dalam  plasmid  pET  21b  (koleksi Andi  Utama,  Puslit  Bioteknologi  LIPI)  dan isolat  mikrolaga  BTM  11  (koleksi  Dwi Susilaningsih, Laboratorium Biorekayasa
Lingkungan,  Puslit  Bioteknologi  LIPI).  Media yang  digunakan  adalah  Luria  Bertani  (LB) sebagai  media  pertumbuhan  bakteri,  media IMK- Sea  Water sebagai  media  pertumbuhan mikroalga, dan bahan-bahan kimia lainnya.
Alat-alat  yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  ultrasentrifus  (Sorvall  RC-26  plus), sonikator, waterbath ,  tabung  sentrifus,  labu Erlenmeyer, inkubator, rotator, microtiter plate, microplate  reader (Multiscan  EX  Thermo), pipet  mikro,  oven,  kolom  kromatografi,  SDS- PAGE,  tabung  vial, hot  plate  magnetic  stirrer , dan timbangan digital.

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  dalam  beberapa tahap. Tahap satu yaitu preparasi RNA helikase HCV yang meliputi (1) ekspresi RNA helikase dengan cara menumbuhkan bakteri E.coli BL21 (DE3)  pLysS  yang  membawa  gen  NS3  RNA helikase HCV dalam plasmid pET 21b (Utama et  al .  2000),  dan  (2)  pemurnian  RNA  helikase yang  telah  terekspresi  pada  sel  bakteri menggunakan  kromatografi  afinitas  (Utama et al .  2000).  Tahap  dua  meliputi  (1)  kultivasi mikroalga  BTM  11  dalam  media  IMK- Sea Water pada  suhu  ruang  dengan  pencahayaan 4800  lux,  dan  (2)  ekstraksi  polisakarida  dari biomassa  mikroalga  BTM  11  (Wang et  al . 2004).  Tahap  tiga  meliputi  (1)  pemurnian ekstrak  polisakarida  menggunakan  teknik kromatografi  gel  filtrasi  dan  kromatografi ion- exchange ,  dan  (2)  penentuan  profil senyawa polisakarida  inhibitor yang  paling  aktif menggunakan  kromatografi  lapis  tipis  dan kromatografi cair kinerja tinggi.
Analisis  yang  dilakukan  dalam  penelitian ini meliputi (1) penentuan bobot molekul RNA
helikase  murni  menggunakan  SDS-PAGE,
(2) uji aktivitas penghambatan RNA helikase HCV  menggunakan  uji  kolorimetri  ATPase terhadap  ekstrak  polisakarida  dan  fraksi polisakarida  termurnikan,  (3)  penentuan kandungan  gula  pada  fraksi  polisakarida murni yang memiliki aktivitas penghambatan yang tinggi terhadap RNA helikase HCV.

## HASIL DAN PEMBAHASAN RNA Helikase Virus Hepatitis C
Enzim  RNA  helikase  HCV  terekspresi secara intraseluler pada sel E. coli BL21 (DE3) pLysS  sehingga  untuk  memurnikannya  harus dilakukan  pemecahan  dinding  sel  terlebih dahulu  agar  komponen  intraseluler  termasuk RNA helikase HCV dapat keluar dari dalam sel E.  coli .  Hasil  pemecahan  sel  bakteri  ( cell lysate )  diduga  telah  mengandung  enzim  RNA helikase  HCV  sehingga  harus  dimurnikan menggunakan kromatografi afinitas. Metode ini didasarkan  pada  pengikatan  spesifik  logam Ni 2+ atau  Co 2+ yang  dimiliki  resin  TALON dengan  label  6xHis- tag ( tag protein  dengan enam  histidin)  yang  terdapat  pada  ujung  RNA helikase.  Petty  (1996)  menjelaskan  bahwa histidin akan berikatan secara selektif ke logam Co 2+ resin  TALON  meskipun  dalam  resin tersebut terdapat ion metal bebas lainnya.
Hasil  SDS-PAGE  menunjukkan  pita protein  tunggal  dengan  bobot  54  kDa  pada hasil  elusi  dengan  imidazole  sehingga  dapat dikatakan  bahwa  RNA  helikase  HCV  telah berhasil dipurifikasi (Gambar 1). Hal ini sesuai dengan hasil yang telah dilaporkan Utama et al .
(2000) yang menyatakan bahwa bobot molekul RNA helikase yang dimiliki oleh virus hepatitis C  adalah  sebesar  54  kDa.  BD  Bioscience Clontech (2003) menjelaskan bahwa konsentrasi  imidazole  hingga  lebih  dari  200 mM  menyebabkan  protein  yang  memiliki residu His- tag terdisosiasi karena tidak mampu lagi bersaing untuk berikatan dengan resin.

## Biomassa Mikroalga BTM 11
Mikroalga  BTM  11  merupakan  salah satu ganggang atau fitoplankton yang
Gambar  1  Analisis  SDS-PAGE  pemurnian  RNA helikase  HCV.  P:  pelet  sel,  S:  superna- tan  hasil  lisis,  IV:  inner  volume  (super- natan  binding),  W1:  pencucian  per- tama,  W2:  pencucian  kedua,  E1  &  E2: RNA helikase HCV, M: marker protein .
diisolasi  dari  Perairan  Laut  Batam,  dengan lokasi spesifik yaitu pada titik/stasiun ke-11 di area  pengamatan.  Kultur  mikroalga  BTM  11 sebanyak 30 liter selama 14 hari menghasilkan biomassa  basah  hasil  panen  sebesar  338  g (1,13%  bobot  basah).  Mikroalga  BTM  11 dipanen sebelum mencapai fase stasioner (fase pertumbuhan) (Gambar 2). Hal ini berdasarkan pada waktu pembentukan makromolekul polisakarida  dalam  sel  mikroalga.  Arad et  al . (1985)  menjelaskan  bahwa  aktivitas  optimum pembentukan  polisakarida  terjadi  pada  fase stasioner,  namun  pembentukan  polisakarida pada  fase  stasioner  dilakukan  bersamaan dengan  sekresi  polisakarida  tersebut  oleh mikroalga ke media tumbuh yang dapat dilihat dari  peningkatan  viskositas  media  tumbuh mikroalga.

## Ekstrak Polisakarida Mikroalga BTM 11
Hasil  ekstraksi  dari  2  g  biomassa  kering menghasilkan  50  mg  ekstrak  polisakarida. Ekstrak  kasar  polisakarida  inhibitor  kemudian diuji aktivitas penghambatannya  menggunakan uji  ATPase.  Hasil  pengujian  menunjukkan ekstrak  kasar  polisakarida  BTM  11  dapat menghambat  aktivitas  ATPase  dari  RNA helikase  HCV  sebesar  64,65%.  Nilai  ini menunjukkan bahwa inhibitor menghambat
Gambar 2 Kurva pertumbuhan mikroalga BTM 11.
sebesar  64,65%  aktivitas  enzim  per  1 molekul RNA helikase dalam menghidrolisis ATP menjadi ADP dan fosfat anorganik.
Aktivitas  inhibisi  (Tabel  1)  fluktuatif selama  proses  ekstraksi  polisakarida.  Hasil maserasi  tahap  akhir  oleh  NaCl  0,9% memiliki  aktivitas  penghambatan  terhadap RNA helikase lebih besar dari 100%, hal ini dikarenakan  masih  terdapatnya  senyawa- senyawa  yang  dalam  aktivitasnya  secara in vitro dapat  menghambat  aktivitas  RNA
helikase. Tahap selanjutnya, yaitu deproteinasi menggunakan TCA 10%
menunjukkan  aktivitas  penghambatan  yang lebih  rendah  dari  sebelumnya,  hal  ini  dapat terjadi karena sebagian senyawa terendapkan oleh  TCA  sehingga  filtrat  hasil  presipitasi tersebut  memiliki  aktivitas  yang  rendah.  Ye et al . (2008) menjelaskan bahwa
penambahan  TCA  dapat  menghilangkan protein yang terkandung dalam sampel.
Ekstrak  kasar  polisakarida  memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan hasil deproteinasi.  Hal  ini  dikarenakan  pemekatan dengan freeze  dryer dari  hasil  deproteinasi yang menyebabkan konsentrasi ekstrak

## Tabel 1 Aktivitas inhibisi ekstrak polisakarida
Tahapan Aktivitas inhibisi (%) Maserasi akhir 103,4 Deproteinasi TCA 35,1 Pemekatan dengan freeze dry 64,6
meningkat  sehingga  aktivitas  penghambatan terhadap  RNA  helikase  pun  ikut  meningkat karena minimnya pengaruh dari pelarut. Zhang et  al .  (2012)  menjelaskan  bahwa  pelarut  dapat mempengaruhi nilai aktivitas antivirus sehingga pelarut  harus  dihilangkan  agar  dapat  diketahui besarnya  aktivitas  penghambatan  yang  murni dimiliki oleh inhibitor.

## Pemurnian  Polisakarida  Inhibitor  RNA Helikase

## Kromatografi Gel Filtrasi
Pemurnian polisakarida BTM 11 dilakukan menggunakan  kolom  kromatografi  Sepharose 4B.  Matriks  gel  Sepharose  4B  menggunakan fase  gerak  etanol:air  (3:7)  menghasilkan penghambatan tertinggi terhadap RNA helikase HCV  sebesar  78,76%  pada  fraksi  ke-13 (Gambar  3)  dengan  konsentrasi  penghambatan sebesar 0,7615 mM. Nilai ini sudah merupakan nilai  murni  penghambatan  karena  sudah dikurangi  dengan  kontrol  negatif.  Kontrol negatif  digunakan  untuk  mengetahui  pengaruh dari  pelarut  yang  digunakan.  Kontrol  positif tidak  digunakan  karena  belum  ditemukannya obat atau vaksin yang sesuai untuk infeksi virus hepatitis C.
Hasil fraksinasi dengan aktivitas
penghambatan tertinggi yang diperoleh
tergolong  cukup  efektif,  dan  lebih  tinggi  jika dibandingkan dengan hasil penelitian
sebelumnya.  Mori et  al .  (2012)  melaporkan bahwa polisakarida yang diisolasi dari makroalga Cladosiphon  okamuranus memiliki aktivitas penghambatan terhadap replikasi HCV sebesar 60%. Perbedaan ini karena
penggunaan metode ekstraksi dan pemurnian yang digunakan berbeda sehingga kandungan polisakarida  yang  aktif  menghambat  virus hepatitis C juga berbeda.

## Kromatografi Ion-Exchange
Pemurnian ini menggunakan sistem elusi gradien.  Eluen  yang  dipakai  adalah  NaCl dengan  konsentrasi  dimulai  dari  0,1-1  M. Aktivitas  penghambatan  tertinggi  adalah sebesar  74,6%  dengan  konsentrasi  0,7205 mM  pada  fraksi  ke-10  (Gambar  4).  Nilai  ini merupakan nilai murni
aktivitas
penghambatan karena sudah dikurangi dengan  kontrol  negatif  yaitu  NaCl  0,25  M. Aktivitas penghambatan ini lebih rendah dari hasil  kromatografi  gel  filtrasi.  Hal  ini kemungkinan  diduga  karena  interaksi  yang lebih  kuat  antara  eluen  dengan  polisakarida inhibitor  pada  kromatografi  gel  filtrasi, sehingga  zat  aktif  akan  lebih  mudah  terelusi oleh fase gerak. Rinaudo (2006) menjelaskan polisakarida  berikatan  kuat  dengan  molekul polar  dengan  cara  membentuk  ikatan hidrogen dari gugus –OH yang dimilikinya.

## Kandungan Gula
Fraksi aktif dalam penghambatan terhadap RNA  helikase  HCV  pada  tiap  teknik kromatografi  dianalisis  untuk  menentukan konsentrasi  gula  penyusun  polisakarida  pada sampel.  Gula  penyusun  polisakarida  yang dianalisis  dalam  penelitian  ini  adalah  glukosa. Fraksi 13 kromatografi gel filtrasi dengan nilai aktivitas  penghambatan  tertinggi  terhadap RNA helikase HCV memiliki konsentrasi
Gambar 3 Inhibisi polisakarida fraksi gel filtrasi terhadap aktivitas ATPase RNA helikase HCV.
Gambar 4 Inhibisi polisakarida fraksi ion-exchange terhadap aktivitas ATPase RNA helikase HCV.
gula  sebesar  2,97  mg/mL,  sedangkan  fraksi 10  kromatografi ion-exchange memiliki konsentrasi  gula  sebesar  3,21  mg/mL  (Tabel 2).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  kandungan gula tidak selalu berkorelasi dengan aktivitas penghambatan  dari  polisakarida  inhibitor. Hal  ini  disebabkan  analisis  hanya  dilakukan terhadap glukosa yang merupakan salah satu penyusun polisakarida sehingga tidak tertutup kemungkinan bahwa glukosa berikatan  dengan  senyawa  lain  dalam menghambat RNA helikase HCV.
Kemurnian  Fraksi Aktif Polisakarida Inhibitor
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi  lapis  tipis  dilakukan  untuk melihat profil kimiawi dari fraksi 13 kromatografi  gel  filtrasi  yang  memiliki aktivitas  penghambatan  paling  besar  terhadap RNA  helikase  HCV.  Hasil  KLT  (Tabel  3) menunjukkan  bahwa  fraksi  13  mempunyai  1 spot  dengan  nilai  Rf  sebesar  0,832.  Nilai  ini mendekati  spot  yang  ditunjukkan  oleh  standar glukosa yang digunakan dengan
nilai  Rf  sebesar  0,834  sehingga  diduga  bahwa komponen  aktif  yang  terdeteksi  merupakan senyawa  glukosa.  Hasil  penelitian  lain  yang dilaporkan Biringanine et al . (2012)
menunjukkan  bahwa  polisakarida  inhibitor HCV  dari  tumbuhan Plantago  palmata
memiliki kandungan monosakarida jenis ramnosa,  arabinosa  dan  glukosa  dengan  nilai Rf  pada  KLT  sebesar  0,3;  0,5  dan  0,65. Perbedaan nilai Rf dapat dipengaruhi oleh fase gerak  yang  digunakan.  Soczewinski  dan Wawrzynowics  (2003)  menjelaskan  bahwa senyawa yang berikatan lebih kuat dengan fase diam  akan  terpisah  paling  akhir  dikarenakan daya  serap  adsorben  dengan  komponen- komponen  senyawa  tidak  sama  sehingga senyawa  tersebut  akan  bergerak  dengan kecepatan  yang  berbeda  berdasarkan  tingkat kepolarannya.

## Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Fraksi dengan aktivitas tertinggi (fraksi 13) dari hasil fraksinasi gel filtrasi dianalisis kemurniannya menggunakan teknik kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT/ Tabel 2 Analisis kandungan gula Sampel Aktivitas inhibisi (%) Kandungan gula (mg/mL) Kromatografi gel Fraksi 12 71,23 3,51 Fraksi 13 78,76 2,97 filtrasi Fraksi 14 65,77 0,45 Kromatografi ion- Fraksi 10 74,57 3,21 Fraksi 11 72,94 3,50 exchange Fraksi 12 70,42 3,77
Tabel 3 Nilai R f senyawa aktif polisakarida
Sampel R f Fraksi 13 kromatografi gel filtrasi 0,832 Standar glukosa 0,834 HPLC).  Fraksi  13  memiliki  tiga peak (Gambar
5),  satu peak tajam  yang  menunjukkan retention time (Rt) sebesar 4,072 dan dua peak lainnya  yang  terdeteksi  dengan  Rt  4,706  dan 5,530. Hal ini  menunjukkan bahwa hasil fraksi aktif yang didapat tersebut belum murni karena masih terdapat senyawa lain.
Senyawa-senyawa  yang  terdeteksi  diduga berperan  dalam  penghambatan  aktivitas  RNA helikase  virus  hepatitis  C,  namun  belum diketahui  aktivitas  inhibisi  dari  masing-masing senyawa  tersebut.  Mekanisme  inhibitor  RNA helikase  meliputi  (1)  inhibitor  menempel  pada RNA  helikase  tidak  pada  sisi  aktifnya,  namun terjadi  perubahan  konformasi  bentuk  enzim yang  mengakibatkan  berkurangnya  interaksi enzim dengan substrat (Borowski et al . 2008),
(2) inhibitor  berikatan  pada  sisi  aktif  enzim (RNA  b inding-site )  sehingga  ATP  tidak  dapat berikatan  dengan  enzim,  menyebabkan  enzim tidak  memiliki  cukup  energi  untuk  membuka untai ganda RNA (Yamashita et al . 2012).

## KESIMPULAN
Kultur mikroalga BTM 11 dapat tumbuh pada media IMK- Sea Water dengan menghasilkan biomassa basah sebesar 1,13%
pada  umur  panen  14  hari.  Polisakarida  yang memiliki  aktivitas  inhibisi  tertinggi  terhadap RNA  helikase  HCV  diperoleh  melalui pemurnian  menggunakan  kromatografi  gel filtrasi, dengan  aktivitas sebesar 78,76% dan kandungan  gula  sebesar  2,97  mg/mL.  Hasil pemurnian  lanjutan  menggunakan  KLT menghasilkan satu spot senyawa aktif dengan nilai  Rf  sebesar  0,832.  Hasil  analisis  fraksi aktif  dengan  KCKT  diperoleh  3  puncak senyawa  yang  menandakan  bahwa  hasil fraksi polisakarida belum murni.

## DAFTAR PUSTAKA
Arad  SM,  Adda  M,  Cohen  E.  1985.  The potential  of  production  of  sulfated polysaccharides  from Porphyridium. Plan and Soil 89: 117-127.
BD  Bioscience  Clontech.  2003. BD  TALON TM  Metal  Affinity  Resins  User  Manual . Becton: Dickinson & Company. 47 hlm. BiringanineG,OuedraogoM,VrayB,Samuelsen AB,  Duez  P.  2012.  Partial  chemical characterization  of  immunomodulatory polysaccharides  from Plantago  palmata. International  Journal  of  Carbohydrate Chemistry : 1-7.
Borowski P,  Niebuhr  A,  Schmitz  H,  Hosmane
RS, Bretner M, Siwecka MA, Kulikowski T.  2002.  NTPase/helicase  of  Flaviviridae: inhibitors  and  inhibition  of  the  enzyme. Acta Biochimica Polonica 49: 597-614.
Borowski  P,  Heising  MV,  Miranda  IB,  Liao CL, Choe J, Baier A. 2008. Viral NS3
Gambar 5 Kromatogram KCKT fraksi 13.
helicase activity is inhibited by peptides reproducing  the  Arg-rich  concerved motif  of  the  enzyme  (motif  VI). Biochemical Pharmacology 76: 28-38.
Clercq  ED.  2004.  Antivirals  and  antiviral strategies. Nature Review: Microbiology
2: 704-720.
[EASL]  European  Association  for  the  Study of  the  Liver.  2011.  EASL  Clinical Practice  Guidelines:  Management  of hepatitis  C  virus  infection. Journal  of Hepatology 55: 245-264.
Kementerian  Kesehatan  Republik  Indonesia. 2010. Menkes  Meluncurkan  Program Pendataan  Penyakit  Hepatitis  C  Tahap I I. [terhubung berkala]
http://www.depkes. go.id/ [1 Juni 2012]. Mori N, Nakasone K, Tomimori K, Ishikawa
C.  2012.  Beneficial  effects  of  fucoidan in  patient  with  chronic  hepatitis  C  virus infection. World Journal of Gastroenterology 18(18): 2225-2230. Petty KJ. 1996. Metal-chelate affinity chromatography.  Dalam:  Coligan  JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, dan Wingfi  led  PT,  editor. Current  Protocols in Protein  Science .  Washington:  John
Wiley & Sons Inc. 610 hlm.
Rinaudo  M.  2006.  Non-covalent  interaction  in polysaccharide  systems. Macromoleculer.
Bioscience . 6: 590-610.
Sanchez-Moyano JE,  Garcia-Asencio  IM, Garcia-Gomez  JC.  2007.  Effect  of temporalvariation of the seaweed Caulerpa prolifera cover on the associated crustacean
community.
Marine Ecology 28: 324-337.
Setyaningsih I, Desniar, Sriwardani T. 2005.
Konsentrasi hambatan minimum ekstrak Chlorella sp. terhadap bakteri dan
kapang. Buletin Teknologi Hasil Perikanan 8(1): 25-34.
Soczewinski E, Wawryznowicz T. 2003. Gel filtration  chromatography.  Di  dalam Jack  Cazes,  editor. Encyclopedia  of Chromatography .  New  York:  Marcel Dekker. 1679 hlm.
Utama  A,  Shimizu  H,  Morikawa  S,  Hasebe  F, Morita K, Igarashi A, Hatsu M, Takamizawa K,  Miyamura  T.  2000.  Identification  and characterization of the RNA helicase activity of  japanese  enchepalitis  virus  NS3  protein. FEBS Letter 456:74-78.
Wang  Y,  Zhang  M,  Ruan  D,  Shashkov  AS, Kilcoyne  M,  Savage  AV,  Zhang  L.  2004. Chemical  component  and  molecular  mass of  six  polysaccharides  isolated  from  the sclerotium  of Poria  cocos.  Carbohydrate Research 339: 327-334.
Yamashita  A,  Salam  KA,  Furuta  A,  Matsuda Y, Fujita O, Tani H, Fujita Y, Fujimoto Y, Ikeda  M,  Kato  N,  Sakamoto  N,  Maekawa S, Enomoto N, Nakakoshi M, Tsubuki M, Sekiguchi  Y,  Tsuneda  S,  Akimitsu  N, Noda  N,  Tanaka  J,  Moriishi  K.  2012. Inhibition  of  hepatitis  C  virus  replication and  viral  helicase  by  ethyl  acetate  extract of the marine feather star Alloeocomatella polycladia. Marine Drugs 10: 744-761. Ye H, Wang K, Zhou C, Liu J, Zeng X. 2008.
Purification,  antitumor  and  antioxidant activities  in  vitro  of  polysaccharide  from the  brown  seaweed Sargassum  pallidum . Food Chemistry 111: 428-432.
Zhang T, Wu Z, Du J, Hu Y, Liu L, Yang F, Jin Q. 2012. Anti-Japanese-encephalitis- viral  effects  of  kaempferol  and  daidzin and  their  RNA-binding  characteristics. PLOS One 7(1): 1-16.
Masyarakat Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia