## IDENTIFIKASI ISOLAT FUNGI ENDOFIT LBKURCC43 BERDASAR SEKUENS ITS rDNA DARI UMBI TANAMAN DAHLIA (DAHLIA VARIABILIS)
Sefni Hendris 1 , Titania T. Nugroho 2 , Saryono 2
1 Mahasiswa Program Studi S2 Kimia
2 Bidang Biokimia Jurusan Kimia FMIPA Universitas Riau Kampus Binawidya Pekanbaru, 28293, Indonesia
sefnihendris@yahoo.co.id saryono_ur@yahoo.com

## ABSTRAK
Fungi  LBKURCC43  merupakan  fungi  endofit  yang  diisolasi  dari  umbi  tanaman  dahlia  berbunga  ungu (Dahlia variabilis) di Padang Panjang, Sumatera Barat. Identifikasi secara morfologi isolat tersebut telah dilakukan  dan  hanya  mengidentifikasi  pada  tingkat  genus.  Identifikasi  secara  molekuler  dengan menggunakan  DNA  adalah  identifikasi  spesies  yang  lebih  tepat  digunakan.  Sebelum  dilakukan  analisis filogenetik  secara  molekuler  berdasarkan  sekuens  DNA  ribosomal  pada  daerah  ITS-1  dan  ITS-2, dilakukan ekstraksi DNA dan amplikasi PCR ITS rDNA yang baik untuk sekuensing. DNA kromosomal diisolasi menggunakan kit Wizard Genomic Purification ex Promega Co (Madison, USA) dari sel miselia berumur tiga hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa DNA berhasil diisolasi dari miselia yang berumur tiga  hari  sebelum  terbentuk  spora  dan  jumlah  yang  cukup  tinggi  untuk  PCR.  DNA  kromosomal  fungi LBKURCC43  memiliki  BM  (berat  molekul)  10.294  pb.  ITS  rDNA  berhasil  diamplifikasi  dengan  PCR menggunakan  pasangan  primer  ITS5  dan  ITS4,  suhu  annealing  untuk  44 0 C  dan  menghasilkan  produk PCR dengan  berat  molekul 455 pb. Hasil analisis filogenetik  daerah ITS-1, ITS-2 dan  5,8S rDNA  dari genom fungi LBKURCC43 menunjukkan bahwa spesies dari fungi LBKURCC43 adalah Hanseniaspora uvarum dengan kemiripan identitas mencapai 97%.
Kata Kunci : Endofit, PCR, ITS, rDNA, Hanseniaspora uvarum

## 1. PENDAHULUAN
Mikrob endofit adalah  mikrob yang seluruh atau sebagian hidupnya berada di dalam jaringan hidup tanaman inang tanpa menimbulkan gejala yang merugikan bagi tanaman inang itu sendiri. Mikrob seperti kapang, khamir dan bakteri dapat berasosiasi dengan tanaman membantu metabolisme  tanaman  inang  dan  menghasilkan metabolit  sekunder  yang  berpotensial  (Kumala et al .,  2006).  Beberapa  penelitian  juga menunjukkan  bahwa  endofit  memberikan keuntungan  bagi  tanaman  inangnya,  seperti melindungi dari serangan serangga, patogen dan hewan herbivora (Ding et al ., 2011).
Tanaman dahlia ( Dahlia variabilis ) merupakan  bunga  berumbi  yang  digunakan sebagai  tanaman  hias  atau  bunga  potong. Tanaman  dahlia  dapat  digunakan  sebagai  obat-
obatan  manusia  karena  memiliki  potensi  dalam menghasilkan  senyawa  bioaktif.  Ekstrak  umbi dahlia  diketahui  mengandung  senyawa  fenolik, flavonoid,  dan  saponin  yang  memiliki  aktivitas antimikroba Escherichia coli, Bacillus subtilis, dan Staphylococcus aureus (Suryadi, 2007). Pada  penelitian  sebelumnya,  telah  diisolasi jamur  endofit  dari  umbi  dahlia  berbunga  ungu yang  berasal  dari  Padang  Panjang,  Sumatera Barat diidentifikasikan secara morfologi sebagai Sporothrix  sp.  LBKURCC43  (Lorenita,  2013). Subjek  berhasil  diisolasi  dan  ditentukan genusnya  secara  makroskopis  dan  mikroskopis. Untuk  skirining  aktivitas  antimikroba  dan  uji fitokimia dari
Fungi LBKURCC43
menunjukkan  aktivitas  antimikroba  dengan media produksi Huang et al. (2007). LBKURCC 43  menunjukkan  adanya  aktivitas  antibakteri
terhadap Escherichia coli dan Staphlococcus aureus setelah di inkubasi hingga hari ke-20 dan hasil  uji  fitokimia  menunjukkan  bahwa  Fungi LBKURCC43  positif  mengandung  saponin (Fitriyah,  2013).  Senyawa  saponin  memiliki peran  alami  dalam  tanaman  sebagai  pelindung terhadap patogen dan hama (Turk, 2005).
Identifikasi  fungi  LBKURCC43  telah dilakukan  secara  morfologi  berupa  warna, diameter  koloni,  dan  pigmen  koloni.  Hal  ini lebih  tepat  untuk  identifikasi  hingga  tingkat genus,  dan  belum  dapat  memberikan  kepastian untuk  identifikasi  pada  tingkat  spesies. Identifikasi morfologi tersebut belum memberikan kepastian spesies maupun hubungan  kekerabatan  dengan  spesies.  Oleh karena itu perlu dilakukan suatu cara identifikasi yang  lebih  tepat  berdasarkan  sekuens  DNA ribosomal  (rDNA)  pada  daerah  ITS  (Internal Transcribed  Spacer)  (Hutapea,  2007).  Secara ekstensif metode ini digunakan untuk mengetahui basa-basa nukleotida informasi total genom dalam suatu sel atau organisme (Muslim, 2003).  Daerah  ITS  tersebut  harus  diamplikasi terlebih  dahulu  sebelum  dilakukan  sekuens  ITS rDNA untuk identifikasi spesies Fungi. Ada dua daerah ITS rDNA yang bersifat diagnostik yang dapat digunakan untuk identifikasi spesies fungi, karena  memiliki  keragaman  tinggi.  Kedua daerah  tersebut  adalah  ITS-1  dan  ITS-2 (Druzhinina  dkk.,  2005).  Verifikasi  hasil pemeriksaan morfologi dan identifikasi fungi di tingkat spesies, dapat dilakukan  dengan  analisis filogenetika  menggunakan  sekuens  ITS-1  dan ITS-2  gen  DNA  ribosomal  (rDNA)  lainnya. Dalam  kebanyakan  kasus,  data  sekuens  dan hubungan
filogenetika memungkinkan identifikasi  pada  tingkat  spesies  (Wiese  dkk. 2011).
Isolasi  DNA  merupakan  tahap  pertama  dari berbagai  teknologi  analisis  DNA.  Isolasi  DNA diperlukan untuk mendapatkan DNA murni yang akan  digunakan  untuk  amplifikasi Polimerase Chain Reaction (PCR).  Amplifikasi  DNA menggunakan  PCR  di  daerah  ITS  rDNA  dari templat  DNA  kromosomal  diperlukan  untuk memudahkan  penentuan  sekuens  DNA  ITS tersebut. Hal ini disebabkan bila tidak dilakukan amplifikasi,  maka  sekuens  DNA  kromosomal lain  akan  mengganggu  penentuan  sekuens  ITS rDNA.  Daerah  ITS  rDNA  hanya  mencakup 0,0002%  dari  keseluruhan  kromosom,  jadi  bila tidak  dilakukan  amplifikasi  daerah  DNA  yang akan  di  sekuens,  gangguan  sekuens  lain  terlalu besar.
Penelitian  ini  akan  dilakukan  suatu identifikasi  yang  tepat  berdasarkan  sekuens DNA  ribosomal  pada  daerah  ITS  (Internal Transcribed  Spacer)  yang  dilengkapi  dengan analisis  filogenetik  mengenai  Fungi  tersebut. Wiese  dkk  (2011)  mengatakan  bahwa  untuk mengidentifikasi spesies  Fungi dapat digunakan sekuens daerah ITS-1 dan ITS-2 rDNA-nya.

## 2. METODOLOGI PENELITIAN
Kultur  fungi LBKURCC41  dari  umbi dahlia  berbunga  kuning  koleksi  Laboratorium Biokimia-FMIPA,  Universitas  Riau  yang diisolasi  dari  umbi Dahlia variabilis yang diambil di Padang Luar, Sumatera Barat. Media SDA  (Sabouraud  4%  dextro  agar)  keluaran Merck.  Litikase  keluaran  SIGMA-Aldrich Chemical  Co.St.  Louis,  USA(Nomor  catalog  L- 2524),  larutan  Ethidium  Bromide  keluaran  Bio- rad,  10  mg/ml  (Nomor  catalog  161-0433),  Kit Wizard genomic Purification keluaran Promega, Madison,  Wi,  USA  (Nomor  catalog  A-1120),  1 Kb  DNA  Ladder  keluaran  Promega,  Madison, WI,  USA  (Nomor  catalog  G-5711),  sebagai standar  DNA.  Go  Taq TM PCR  Core  system  I keluaran  Promega,USA  (No.  Kat.  M7660), untuk  reaksi  amplifikasi  DNA.  Primer-primer ITS1, ITS2, ITS3, ITS4, dan ITS5 produksi PT. Sentra Biosains Dinamika, Jakarta sesuai dengan sekuens  yang  dipublikasi  oleh  White  dkk., (1990),  Buffer  tris-base,  EDTA,  CH 3 COOH, HCL,  NaOH,  bromphenol  blue,  dan  Gel Agarosa.
Kultur  fungi  LBKURCC  41  dari  umbi dahlia  berbunga  kuning , diremajakan  pada media  pertumbuhan.  Isolasi  DNA  dilakukan dengan  metode  kit  Wizard  genomic  yang menggunakan  enzim  litikase  dan  bahan-bahan dari  Kit  Wizard  genomic  DNA  purification (Promega).  Hasil  ekstrasi  DNA  kemudian dielektroforesis  dengan  menggunakan  gel agarosa  0.8%  dan  pemisahan  DNA  tersebut difoto dengan menggunakan camera digital Sony Cyber-shot DSC- W610 14,1 megapixels. DNA yang  berhasil  diisolasi  ditentukan  berdasarkan pita  DNA  yang  terlihat  dan  akan  dijadikan templat  pada  amplifikasi  dengan  metode Polymerase Chain Reaction (PCR).  Untuk menentukan  sekuens  daerah  ITS-1  dan  ITS-2 digunakan primer ITS-4 dan ITS- 5, maka akan dicoba  pasangan  primer  ITS  lain  yang  cocok.
Kecocokan  pasangan  primer-primer  ini  dapat dilihat berdasarkan pita DNA yang terlihat pada
UV  transimulator  setelah  dielektroforosis dengan  gel  agarosa  1.2%.  Fragmen  PCR  ini kemudian
ditentukan
urutan DNA-nya berdasarkan  proses  sekuensing  dengan  metode Sanger

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
a. Isolasi DNA
Miselium yang terbaik untuk isolasi DNA
LBKURCC40  adalah  berumur  3  hari  (Gambar
1). Isolasi DNA dilakukan menggunakan metode kit Wizard ex Promega Corp. adanya pita DNA tunggal  yang  terlihat  dengan  bantuan  sinar  UV pada  gel  elektroforesis  menunjukkan  bahwa adanya pita DNA. Untuk miselium LBKURCC41  waktu  yang  terbaik  untuk dilakukan  isolasi  DNA  adalah  berumur  3  hari. Adanya  pita  berflouresensi  dengan  ukuran kisaran  10.000  sampai  12.000  pb  menandakan DNA  LBKURCC41  telah  berhasil  diisolasi (Gambar 2).
Gambar.  1 Morfologi  koloni  isolat  fungi  endofit LBKURCC43  berumur  3  hari  sebelum isolasi DNA.
Gambar.  2 Hasil  elektroforesis  isolat  DNA LBKURCC40  (jalur  2),  LBKURCC41 (jalur  5),  LBKURCC43  (jalur  6),  dan Standar DNA ladder (jalur 4).

## b. Amplifikasi PCR
Gambar.  3 Foto  hasil  elektroforesis  produk amplifikasi PCR DNA Jamur
LBKURCC43  pada  suhu annealing 44 0 C.  Jalur  3:  DNA Ladder, Jalur  5: DNA  LBKURCC63,  Jalur  8:  Produk amplifikasi  rDNA  LBKURCC43  pita dengan ukuran 455 pb.
Gambar 3 menunjukkan hasil elektroforesis amplifikasi PCR dengan kombinasi    ITS4  dan  ITS  5  diperoleh  berat molekul  berdasarkan  persamaan  regresi  linier diatas,  Hasil  amplifikasi  PCR  dielektroforesisi pada  gel  agarosa  1.2%  dan  diwarnai  dengan Etidium  Bromida  agar  berflouresensi  di  bawah sinar  UV,  hasil  yang  tampak  pada  gambar  2 (LBKURCC43). Sama halnya dengan penentuan berat molekul pada isolat, hasil amplifikasi PCR diperoleh  dengan  mengukur  jarak  migrasi standar. Persamaan regresi yang diperoleh untuk LBKURCC43  adalah  y  =  -0,0351x  +  4,762. Persamaan  regresi  ini  yang  akan  digunakan dalam  menentukan  berat  molekul  sampel  hasil PCR  maka  untuk  berat  molekul  Untuk LBKURCC43  dengan  jarak  migrasi  59  mm adalah 455 pb.
c. Pengurutan  DNA  Produk  Amplifikasi PCR Identifikasi secara molekuler berdasarkan urutan DNA ribosomal pada daerah ITS  ( Internal Transcribe Spacer )  merupakan salah  satu  usaha  untuk  mengidentifikasi  dan membuka informasi genetik suatu Fungi. Setelah produk  amplikasi  PCR  diperoleh,  kemudian produk  tersebut  ditentukan  urutan  DNA-nya yaitu  pada  daerah  ITS1  dan  ITS2  rDNA menggunakan gabungan  primer ITS4  dan ITS5. Penentuan  urutan  DNA  Fungi  LBKURCC41

## >Urutan DNA LBKURCC-43 (5’ – 3’)
TGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCTCATCGTAGGTGAACCCTGCGGAAGGATCATTAACATAATATTCTTA CACAGCTGTTTTTTTACAACAAAACAAATCTATCTAAAAACAATTCTTTACAAGAAATTCTTAAAACTTTCAAC AACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATACGAATCGCAGCTCTCG GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACCATTGGGTATTCCCAATGGTATGCTTGTTTGAGCGAATACTTCC CTAATCCTCACGGATTGTATTGTGTTTGCACGAAAATAATGACGACAGTACTCTACAAAACGGTACCGTCAGTA CACTCATTTTTTTTCCTCAAATCAAGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAATCTAA GGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA
dilakukan  dengan  mengunakan  jasa  sekuensing pada  Lembaga  Sekuensing  Eijkman  di  Jakarta. Data  yang  diperoleh  diverifikasi  secara  manual mengacu  pada  spektrogram,  dengan  membaca puncak-puncak.
Spektrogram  hasil  sekuensing  memiliki 4  warna  yaitu  merah  untuk  Timin  (T),  warna biru  untuk  Citosin  (C),  warna  hitam  untuk Guanin  (G),  dan  warna  hijau  untuk  Adenin (Lampiran  2).  Setelah  dilakukan  pembacaan secara  visual,  kemudian  hasil  pengurutan dicocokkan  secara  manual  dalam  arah  yang berlawanan  dari  kedua  rantai  DNA  dengan tujuan verifikasi.
Verifikasi  untuk  daerah  ITS-1  rDNA  dengan pasangan  primer  ITS5  dan  ITS2,  maka  ITS5 menjadi forward dan ITS2 menjadi reverse. Pada daerah ITS-2 rDNA, ITS3 menjadi forward dan ITS4 menjadi reverse. Proses ini dilakukan pada ketiga  sampel  LBKURCC40,  LBKURCC41, dan LBKURCC43. Untuk mempermudah proses verivikasi  dilakukan  dengan  penggunakan perangkat  lunak  (software)  Bioedit.  Data-data urutan  DNA  hasil  pairwaise  aligment  pada program  Bioedit  dapat  dilihat  masing-masing pada gambar 4.
Gambar. 4 Urutan DNA LBKURCC43 hasil verifikasi pada program Bioedit
d. Analisis  filogenetik  pada  sekuens  daerah ITS-1 dan ITS-2 rDNA
Analisis  sekuens  daerah  ITS-1  5,8S  rDNA  dan
ITS-2  LBKURCC40  dibandingkan  terhadap daerah  yang  sama  yang  dimiliki  7  galur
Saccharomyces, dan kerabat dekat yang diakses
pada  data  GenBank  NCBI  (tabel  1),  pada
tanggal  29  Agustus  2014.  Hasil  penyejajaran dengan  program  Clustal  X  versi  2.09,  generasi pohon N.J Bootstrapping ditampilkan  software TreeView  sebagai  pohon  dendogram  dan filogram  tak  berakar  yang  ditunjukkan  di Gambar 4 dan Gambar 5.
Tabel. 1 Nama spesies, kode akses dan referensi dari basis data Gen Bank NCBI yang digunakan untuk menentukan hubungan filogenetik terhadap jamur LBKURCC43.
Nama spesies Kode Akses Gen Bank Strain Referensi % Identitas hasil BLAST Kodamaea ohmeri FJ215865.1 - 99 % Pichia ohmeri AY168786.1  ST-3 Wang.,(2002) 99 % Hanseniaspora uvarum DQ666349.1  WZ1 Hiringthugoda dkk.,(2006) 97 % Pichia guillermondi FM178323.1  - Serena, C.,(2009) 99% Kodamaea anthophila HM156510.1  CBS 8494 Groenewald dkk.,(2011) 96% Saccharomy cetales EF060692.1 LM378 Mahdi dkk,.(2008 97 %

## CC43 HASIL AKHIR
Hanseniaspora uvarum DQ666349.1
8113
Pichia guilliermondii FM178323.1
Kodamaea anthophila HM156510.1
Sporothrix schencki AB122052.1 10000 9742 Saccharomycetales sp EF060692.1 Kodamaea ohmeri FJ215865.1 9992 Pichia ohmeri AY168786.1 6384 TRICHOTOMY
Gambar. 5 Dendogram Jamur LBKURCC43 dengan 7 galur terdekat berdasarkan sekuens daerah ITS-1 5,8S rDNA dan ITS-2.

## CC43 HASIL AKHIR
Hanseniaspora uvarum DQ666349.1
8113 Pichia guilliermondii FM178323.1 Kodamaea anthophila HM156510.1 Sporothrix schencki AB122052.1 10000 9742 Saccharomycetales sp EF060692.1 Kodamaea ohmeri FJ215865.1 9992 Pichia ohmeri AY168786.1 6384 TRICHOTOMY 0.1 Gambar. 6 Hubungan Filogenetik LBKURCC43 dengan 6 galur terdekat, berdasarkan sekuens DNA ITS-1, 5,8S rDNA dan ITS-2.
Gambar 5 jamur LBKURCC43 dibandingkan dengan 7. Dari gambar digolongkan 2 subkluster yaitu:
1. Subkluster  A  mencakup  2  galur  yaitu Hanseniaspora uvarum dan  jamur LBKURCC43.
2. Subkluster  B  mencakup Kodamaea anthophila dan Sporothrix schencki.
3. Subkluster  C  mencakup  2  galur  yaitu Saccharomyceteles sp dan  Kodamaea ohmeri.
Galur  sub  kluster  A  memiliki  nenek moyang yang sama yaitu Haseniaspora uvarum dengan  jamur  LBKURCC43  sehingga  boleh dikatakan  memiliki hubungan kekerabatan yang lebih  dekat  dengan  angka  percabangan  8113. Persentase  hasil  BLAST  pada  akses  database GenBank  menunjukkan  homologi  yang  tinggi antara  LBKURCC43  dengan  5  galur  yang lainnya  adalah  berkisar  96%  sampai  99%.  Hal ini disebabkan oleh kromatogram sekuens DNA pada  daerah  ITS-1  dan  ITS-2  pada  jamur
LBKURCC43  terbaca  dengan  menggunakan ITS5  (forward)  maupun  ITS4  (reverse). Sedangkan  subkluster  B  merupakan  kerabat dekat dari Kodamaea anthophila dan Sporohtrix schencki serta  subkluster  C  merupakan  kerabat dekat dari Saccharomyceteles sp dan Kodamaea ohmeri . Penyejajaran  jamur  LBKURCC43  pada ke-5  galur  dengan  tes  Bootstrap  N-J  tree dilakukan  pengulangan  10000  kali  ubtuk menguji  kebenaran  percabangan  dan  pohon filogenetika.  Angka  percabangan  antara  jamur LBKURCC43  dengan Haseniaspora uvarum sebesar  8113  pada  subkluster  B,  artinya  angka percabangannya  berada  diatas  50%  (cukup tinggi.  Jadi  galur  ini  merupakan  kerabat  yang sangat  dekat  dan  kedua sekuens  DNA  memiliki kesamaan namun strain berbeda.
Pada  saat  dilakukanya  analisis  BLAST menunjukkan  kemiripan  dengan  kelompok khamir  yaitu Hanseniaspora uvarum .  Dimana jamur Hanseniaspora uvarum ini  dikategorikan khamir dalam filum Ascomycota dan Basidiomycota.  Beberapa  khamir  dilaporkan dapat  menghambat  patogen  tanaman,  khusunya patogen yang berada di dalam buah dan sayuran, serta  beberapa  produk  komersial  lainnya (Janisiewicz  dan  Korsten,  2002).  Diketahui bahwa Hanseniaspora uvarum dapat  digunakan untuk mengendalikan berbagai patogen penyebab  pembusukan  pada  jeruk,  buah  pome, dan tomat (Chalutz & Wilson, 1990).

## 4. KESIMPULAN
Dari  hasil  penelitian  tentang  analisis filogenetik dapat disimpulkan bahwa isolat DNA Fungi  endofit  LBKURCC43  memiliki  10.294 pb. Daerah rDNA yang mengandung ITS-1, 5,8S rDNA  dan  ITS-2  dari  genom  Fungi  dapat diamplikasi dengan PCR menggunakan pasangan primer ITS4 dan ITS5. Hasil amplikasi pasangan  primer  ini  diperoleh  untuk  Fungi LBKURCC43 adalah 455 pb.
Hasil  persentasi  dengan  BLAST  pada database GenBank untuk  Fungi LBKURRCC41 menunjukkan bahwa sekuesn DNA diidentifikasikan  sebagai  Fungi Saccharomyces sp, yang  memiliki  kemiripan  identifikasi  97%.
Pada  saat  hasil  penjajaran  dengan  ke-7  galur spesies terdekat menunjukkan adanya hubungan filogenetik antar spesies Hanseniaspora uvarum , hal  ini  juga  diperlihatkan  oleh  angka
bootstrapping  yang  tinggi  dengan  10000  kali pengulangan  pada  tiap  percabangannya.    Jadi dapat  diprediksikan  kemungkinan  besar  kerabat dekat pada masing-masing spesies.

## DAFTAR PUSTAKA
Chalutz, E. and Wilson, C. L. 1990. Postharvest biocontrol of green and blue mold and sour rot  of  citrus  by  Debaryomyces  hansenii.
Plant Dis, 74: 134-137.
Ding,  T.,  Jing,  T.,  &  Zhou,  J.  2010.  Evaluation of  antimicrobial  activity  of  endophytic fungi from Camptotheca acuminata (Nyssaceae).    Journal  Genetics  and
Molecular Research 9 (4): 2104-2112
Druzhinina,  I.  S.,  Monika,  K.Z.,  Ismail,  A., Jaklitsch,  W.,  Mullaw,  T.,  Samuels,  G.J., and  Kubicek,  C.  P.  2012.  Molecular phylogeny  and  species  delimitation  in  the section  Longibrachiatum  of  Trichoderma.
Fungal  Genetics  and  Biology  49  (2012) 358–368.
Fitriyah,  D.  2013.  Penentuan  Media  Optimum
Produksi  Senyawa  Antimikrob  Dari  Jamur Endofit Tanaman Dahlia (Dahlia variabilis).  Tesis.  Jurusan  Kimia  FMIPA.
Universitas Riau. Pekanbaru. Huang, W.Y., Cai, Y.Z., Hyde, K.D., Corke, H.,
&  Sun,  M.  2007.  Endophytic  fungi  from Nerium  oleander  L  (Apocynaceae)  main constituents and antioxidant activity. World Journal of Microbiology and Biotechnology 23:9:1253-1263.
Janisewicz,  W.  J.,  Korsten,  L.  2002.  Biological control  of  postharvest  diseases  of  fruits. Annual  Review  of  Phytopathology.  Vol. 40: 411-441.
Kumala, S., Agustina, E., & Wahyudi, P. 2006. Uji  aktivitas  antimikrobial  metabolit sekunder kapang endofit tanaman trengguli (Cassia  fistula  L).  Jurnal  Bahan  Alam Indonesia ISSN. 2 (6):46-48.
Lorenita,  M.  2013.,  Haryani,  Y.,  Puspita,  F.,
Trihartomo,  D.,  Sikumbang,  S.,  2013. Screening  of  endophytic  fungi  from  tubers of Dahlia variabilis. Journal of Agricultural Technology. 9(3): 565-570.
Muslim. C. 2003. Biologi Molekular Sel. UNIB
Press. Bengkulu.
Suryadi,  A.E.  2007.  Ekstraksi  dan  uji  aktivitas antimikrob  ekstrak  umbi  dahlia  (Dahlia variabilis). Skripsi. Jurusan Kimia FMIPA. Universitas Riau. Pekanbaru.
Turk,  F.M.  2006.  Saponins  versus  plant  fungal pathogens.  Journal  of  Cell  and  Molecular Biology 5:13-17.
Weiese,  J.  Ohlendorf,  B.,  Schmaljohann,  R.,
Imhoff, J. S. Phylogenetic Identifacation of
Fungi  Isolated  from  the  Marine  Sponge Tethya aurantium and Identification of therr Secondary  Metaboliter.  Marine  Drugs.  9: 516-585. Daya kecambah dan pertumbuhan Mucuna  bracteata  melalui  pematahan dormansi  dan  pemberian  zat  pengatur tumbuh  giberalin  (GA3).  Jurnal  Online Agroteknologi. Vol.2, No.2; Hal 630-644.
Sutopo,.L.  2002.  Teknologi  Benih.  Fakultas Pertanian.  Universitas  Brawijya.  PT.  Raja
Grafindo Persada. Jakarta
Hartutiningsih  dan  Utami.  1999.  Manipulasi
KNO3 dalam upaya meningkatkan
perkecambahan biji palem merah (Chrystotachys  iakka  Becc).  Prosiding Seminar Nasional Konservasi Flora Nusantara.  Balai  Pengembangan  Kebun Raya. Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Bogor Mugnisjah,.W.Q  dan  A.  Setiawan.  1990. Produksi  Benih.  Bumi  Aksara  dan  Pusat Antar Universitas. IPB. Bogor
Sulaiman,.F  dan  Gozali,.K  2004.  Pengaruh
Pematahan dormansi terhadap
perkecambahan  benih  dan  pertumbuhan bibit  keranji  (Dialium  indum  L.)  Jurnal Tanaman Tropika Vol 7 (2); Hal 78-84.