Uji Aktifitas Biologis Fraksi Ethanol Daun Sambiloto (Andrographis paniculata)

## Terhadap Perubahan Kuantitatif Sel T Regulator Pada Mencit BALB/c (Mus musculus)
Uwais Al Qarni, Muhaimin Rifa’i
Laboratorium Perkembangan dan Fisiologi Hewan, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Jln. Veteran Malang 65145.
Email: alqarniu@yahoo.co.id

## ABSTRAK
Andrografolid  merupakan  senyawa  aktif  sejenis  diterpenoid  yang  terkandung  dalam  daun  sambiloto dan  berperan  sebagai  imunomodulator  di  dalam  sistem  imun.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  perubahan  kuantitatif  sel  T  regulator  setelah  pemberian  fraksi  ethanol  daun  sambiloto secara oral, mengetahui dosis optimum fraksi ethanol daun sambiloto dalam perubahan kuantitas sel T regulator,  dan  mengetahui  histopatologis  jaringan  hepar  setelah  pemberian  fraksi  ethanol  daun sambiloto. Metode meliputi ekstraksi daun sambiloto dengan pelarut ethanol 95%, perlakuan oral pada mencit BALB/c normal selama 2 minggu dengan dosis 0; 0,1; 0,5; dan 1 mg/g BB, isolasi sel limfosit organ  spleen,  analisis  kuantitatif  sel  limfosit  menggunakan  haemocytometer  dan  flowcytometry,  dan pembuatan  preparat  histologi  hepar  dengan  pewarnaan  HE.  Analisis  data  menggunakan  Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan uji ANOVA selang kepercayaan 95% menggunakan program SPSS 16 for  Windows.  Pemberian  fraksi  ethanol  daun  sambiloto  secara  oral  meningkatkan  jumlah  sel  T CD4 + CD25 + ,  pada  Dosis  1  (0,1  mg/g  BB)  dan  Dosis  2  (0,5  mg/g  BB),  selain  itu  terjadi  penurunan jumlah  sel  T  CD4 + ,  CD4 + CD62L + ,  dan  CD8 + CD62L + pada  Dosis  1  (0,1  mg/g  BB)  dan  Dosis  3  (1 mg/g BB). Dosis optimum fraksi ethanol daun sambiloto dalam peningkatan sel T regulator adalah 0,1 mg/g BB. Fraksi ethanol daun sambiloto dosis 1 mg/g BB menimbulkan efek toksik yang signifikan pada jaringan hepar.
Kata kunci: andrografolid, daun sambiloto, fraksi ethanol, histopatologi, imunomodulator

## ABSTRACT
Andrographolide is a diterpenoid similar active compound contained in the leaves of bitter and act as immunomodulators  in  the  immune  system.  This study  aims  to  determine the  quantitative  changes  in regulatory T cells after administration of ethanol fraction bitter leaf orally, find out the optimum dose of  bitter  leaf  fraction  ethanol  in  changes  in  the  quantity  of  regulatory  T  cells,  and  determine histopathologic liver tissue after administration of ethanol fraction bitter leaf. The method includes the extraction  of  bitter leaf  with  95%  ethanol  solvent,  oral  treatment in  BALB  /  c  mice  to  normal  for  2 weeks  at  a  dose  of  0,  0.1,  0.5,  and  1  mg  /  g  BW,  organ  spleen  lymphocyte  isolation,  quantitative analysis  of  cell  lymphocytes  using  a  haemocytometer  and  flowcytometry,  and  making  preparations liver histology  with  HE staining.  Analysis  of  the  data  using  a  completely  randomized  design  (CRD) with  ANOVA  test  95%  confidence  interval  using  SPSS  16  for  Windows.  Provision  of  bitter  leaf fraction ethanol orally increase the number of CD4 + T cells CD25 + , at dose 1 (0.1 mg / g BW) and dose 2 (0.5 mg / g BW), in addition to the decline in the number of CD4 + T cells, CD4 + CD62L + and CD8 + CD62L + in 1 dose (0.1 mg / g BW) and dose 3 (1 mg / g BW). The optimum dose of bitter leaf fraction  of  ethanol  in  the  increase  of  regulatory  T  cells  was  0.1  mg  /  g  BW.  Fraction  of  bitter  leaf ethanol dose of 1 mg / g BW significant cause toxic effects on the liver tissue.
Keywords: Andrographolide, bitter leaf, ethanol fractions, histopathology, immunomodulatory

## PENDAHULUAN
Tanaman  berkasiat  obat  yang  cukup menarik  untuk  diteliti  yaitu  tanaman  Sambiloto. Tanaman  ini  memiliki  rasa  yang  sangat  pahit sehingga  banyak  yang  menyebutnya  “King  of Bitter”  atau  “Si  Raja  Pahit”.  Sambiloto (Andrographis paniculata Nees) memiliki senyawa  aktif  bernama  andrografolid,  dimana senyawa  ini  berperan  sebagai  imunomodulator khususnya imunostimulan yang mampu meningkatkan  kerja  sistem  imun.  Kandungan andrografolid  didalamnya  mampu  meningkatkan fungsi  sistem  pertahanan  tubuh  seperti  sel  darah putih  untuk  menyerang  bakteri  dan  antigen lainnya  (imunomodulator),  flavonoid  sebagai antiinflamasi, dan tanin sebagai antidiare [1].
Pemakaian tanaman obat sebagai imunostimulator  dengan  maksud  menekan  atau mengurangi infeksi virus dan bakteri intraseluler, untuk  mengatasi  imunodefisiensi  atau  sebagai perangsang  pertumbuhan  sel-sel  pertahanan tubuh  dalam  sistem  imunitas  [2].  Bahan  yang dapat menstimulasi sistem imun disebut biological  response  modifiers  (BRM),  dibagi menjadi  dua  kelompok  yaitu  bahan  biologis  dan sintetik. Yang termasuk bahan biologis diantaranya  adalah  sitokin  (interferon)  dan antibodi  monoklonal,  sedangkan  bahan  sintetik antara  lain  adalah  senyawa  muramil  dipeptida (MDP) dan levamisol [3].
Imunomodulator  adalah  substansi  yang dapat  memodulasi  fungsi  dan  aktivitas  sistem imun.  Imunomodulator  dibagi  menjadi  tiga kelompok:  i)  imunostimulator,  berfungsi  untuk meningkatkan  fungsi  dan  aktivitas  sistem  imun, ii)  imunoregulator,  artinya  dapat  meregulasi sistem  imun,  dan  iii)  imunosupresor  yang  dapat menghambat  atau  menekan  aktivitas  sistem imun.  Kebanyakan  tanaman  obat  yang  telah diteliti membuktikan adanya kerja imunostimulator, sedangkan untuk imunosupresor  masih  jarang  dijumpai  imunitas [2].
Oleh  karena  itu,  diperlukan  alternatif  lain yaitu  dengan  memanfaatkan  tanaman  tradisional yang termasuk dalam kelompok imunomodulator.  Pada  penelitian  ini  akan  diuji tentang peranan sambiloto (Andrographis paniculata  Nees)  sebagai  imunostimulan  dan mekanismenya  dalam  memodulasi  sistem  imun secara seluler.

## METODE PENELITIAN
Hewan  yang  digunakan  adalah  mencit jantan (Mus musculus) galur BALB/c berumur 6 minggu  dengan  kondisi  sehat,  bergerak  aktif, rambut  tidak  rontok,  tidak  memiliki  kecacatan. Penelitian dilakukan selama 14 hari menggunakan  4  perlakuan  yaitu  kontrol (tanpa pemberian  ekstrak  ethanol  daun  sambiloto), dosis I (perlakuan oral 0,1 mg/g BB), dosis II (perlaluan  oral  0,5  mg/g  BB),  dosis  III (perlakuan  oral  1  mg/g  BB)  sebanyak  satu kali  per  hari  pada  pagi  hari  dengan  masing- masing perlakuan 5 kali ulangan.
Ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan  pelarut  etanol  95%.  Serbuk simplisia kering daun sambiloto dalam maserator ditambahkan  pelarut  etanol  95%,  didiamkan selama  24  jam  sambil  terus  diaduk.  Setelah  24 jam maserat ditampung dan dipekatkan menggunakan  oven  suhu  60°C  sampai  terbentuk pasta. Pasta daun sambiloto kemudian dilarutkan dengan  akuades  steril  untuk  membuat  larutan stok  masing-masing  sebanyak  400  mg/100  ml (dosis  I),  2  g/100  ml  (dosis  II),  dan  4  g/100  ml (dosis III) dalam akuades steril.
Mencit perlakuan kemudian dibedah untuk diisolasi  organ  spleen,  spleen  dicuci  PBS kemudian  digerus  menggunakan  pangkal  spuit dalam  cawan  petri  berisi  PBS.  Setelah  halus kemudian  disaring  dengan  wire.  Suspensi  yang didapatkan  disentrifugasi  kecepatan  2500  rpm suhu  4°C  selama  5  menit.  Pelet  diresuspensi dengan  PBS  100-1000  µm  dan  dihomogenasi dalam eppendorf. Disentrifugasi kembali kecepatan  2500  rpm  suhu  4°C    selama  3  menit, kemudian  disimpan  pada  suhu  4°C  dalam  ice box. Suspensi pelet dari hasil isolasi organ spleen diambil  sebanyak  5  µl,  ditambahkan  95  µl Evan’s  Blue dan dihomogenkan. Sel yang hidup dihitung menggunakan haemocytometer.
Pelet  dari  hasil  isolasi  spleen  dalam eppendorf  ditambahkan antibodi  monoklonal anti-mouse  CD8-PE  (clone  53-6.7),  anti- mouse  CD4-FITC  (clone  GK1.5),  anti- mouse  CD62L-PE,  anti-mouse  CD25-FITC (clone PC61.5) lalu disimpan di dalam ice box. Kemudian  dilakukan  setting  software  BD  Cell Quest Pro TM dan running menggunakan alat BD Biosciences FACSCalibur TM flowcytometry.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Senyawa  Andrografolid  dalam  penelitian  ini dapat  rangsangan  peningkatan  ekspresi  molekul CD25 pada sel T. Ekspresi molekul CD4 + CD25 + merupakan salah satu penanda sel dengan fungsi yang bersifat regulasi. Pada mencit normal yang diberikan  perlakuan  oral  fraksi  ethanol  daun sambiloto menunjukkan sel T regulator meningkat  tetapi  tidak  signifikan  dengan perlakuan Dosis 1 mengalami peningkatan paling tinggi (Gambar 1).
Gambar  1.  Jumlah  absolut  sel  T  CD4 + CD25 + pada organ  spleen  perlakuan  oral  selama  2 minggu.
Sel  CD4 + CD25 + ini  diduga  adalah  sel konvensional  yang  mengekspresikan  molekul permukaan CD25 dan sel T regulator yang pasti akan  meningkat  seiring  dengan  masuknya senyawa asing yang dimasukkan ke dalam tubuh. Molekul  permukaan  CD25  dikenal  pula  sebagai reseptor  IL2- α ,  yang  dapat  diekspresikan  oleh sel-sel konvensional selain sel T CD4 + [4]. Sel T regulator CD4 + CD25 + memiliki kendali yang  dapat  meningkatkan  ekspresi  IL-10  dan IFN- γ . Sel T CD4 + CD25 + juga disebut sel pintar yang memiliki fungsi sebagai regulator sekaligus supresor,  menekan  aktivitas  sel  imun  lainnya akibat  dari  sekresi  sitokin  proinflamasi,  namun sel  T  CD4 + CD25 + akan  berhenti  proliferasinya saat  sistem  imun  tidak  lagi  mampu  mengatasi antigen yang menyerang tubuh. Sel T CD4 + CD25 + memiliki  kemampuan  sebagai regulator yang bisa mencegah perkembangan sel yang  bersifat  autoreaktif.  Molekul  permukaan yang  disebut  dengan  CD25  adalah  reseptor penting  dalam  merespon  keberadaan  IL-2  yang memiliki  tiga  jenis  reseptor  meliputi  alfa,  beta, dan  gamma.  Selain  itu  sel  CD4 + CD25 + mampu bertindak  sebaliknya  yaitu  berperan  sebagai  sel efektor  jika  tidak  mengekspresikan  Foxp3
(CD4 + CD25 + Foxp3-).  Tanpa  ekspresi  Foxp3 maka  sel  T  CD4 + CD25 + merupakan  sel konvensional  yang  telah  terpapar  antigen sehingga teraktivasi menjadi sel efektor [5].
Analisis jumlah  relatif  sel T  CD4 + dan  CD8 + juga  digunakan  untuk  mengetahui  pengaruh aktifitas  biologis  pemberian  fraksi  ethanol  daun sambiloto  terhadap  peningkatan  kuantitas  sel CD4 + dan  CD8 + yang  bisa  digunakan  sebagai parameter  tingkat  kesehatan  dari  hewan  coba (Gambar  2).  Peningkatan  jumlah  sel  T  CD4 + disebabkan  karena  sel  T  CD4 + yang  telah teraktivasi  mampu  mengekspresikan  beberapa molekul permukaan seperti CD8 atau CD25 yang berperan  dalam  meregulasi  aktifitas  sel-sel efektor  yang  telah  mengalami  aktivasi  akibat adanya  paparan  antigen.  Akibat  adanya  paparan antigen  menyebabkan  terjadinya  interaksi  antara sel T CD4 + dan CD8 + . Sel CD4 + akan mengenali suatu antigen yang masuk dalam pembuluh darah dan  mengaktifkan  makrofag  dalam  membunuh antigen tersebut. Sedangkan CD8 + akan mengenali  sitoplasma  suatu  sel  yang  telah terinfeksi  antigen  dan  membunuh  sel  yang  telah terinfeksi.  CD8 + dibutuhkan  dalam  kontrol sitokin proinflamasi dan membantu kinerja sel T CD4 + ketika CD4 + tidak mampu lagi menangani antigen  yang  masuk  ke  dalam  tubuh,  hal  ini menyebabkan  proliferasi  dan  deferensiasi  sel limfosi  T  menjadi  sel  T  sitotoksik  tidak mengalami peningkatan [6].
Gambar 2. Profil persentase jumlah relatif sel T CD4 + dan  CD8 + hasil  analisis  flowcytometry pada organ spleen
Analisis tambahan yang dilakukan menunjukkan  adanya  penurunan  jumlah  sel  T CD4 + CD62L + setelah  pemberian  fraksi  ethanol
1,47 1,72 1,58 1,55 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 C D 4 + C D 2 5 + ( x 1 0 7 se l) Perlakuan
daun  sambiloto  yang  menunjukkan  penurunan pada  seluruh  perlakuan  dosis  dibandingkan dengan kontrol (Gambar 3). Hal ini kemungkinan senyawa aktif dalam fraksi ethanol daun  sambiloto  mampu  merangsang  terjadinya deferensiasi  sel  T  naive  menjadi  sel  efektor dimana  CD62L  sebagai  marker  aktivasi  sel.  Sel T CD4 + CD62L + akan berubah menjadi subset sel T CD4 + .
Gambar  3.  Profil  persentase  jumlah  relatif  sel  T CD4 + CD62L + hasil analisis
flowcytometry pada organ spleen
CD62L + atau  L  selektin  merupakan  molekul adhesi  yang  berfungsi  perlekatan  dan  rolling pada  sel  endotel  pembuluh  darah.  Molekul tersebut  mampu  diekspresikan  oleh  sel  T  naive CD4 + CD62L + maupun  CD8 + CD62L + .  Sel  T naive  ini  akan  mengalami  sirkulasi  di  dalam darah,  spleen,  dan  lymphnode  periferal  hingga suatu  saat  bertemu  dengan  suatu  antigen.  Jika sudah bertemu dengan suatu antigen maka sel T naive  akan  teraktifasi  dan  kehilangan  molekul CD62L + . Molekul
CD62L + mampu diekspresikan  oleh  sel  T  naive  dalam  individu normal  yang  sehat  lebih  dari  80%.  Sedangkan pada  individu  tidak  sehat  sel  T  naive  akan mengalami  penurunan  ekspresi  CD62L + pada organ  lymphnode  periferal  dan  sel  T  akan teraktivasi. Selanjutnya molekul CD62L + melakukan down regulated pada sel T yang akan menghalangi  masuk  ke  lymphnode  dalam  sel endotel. Hal ini untuk mencegah killing terhadap APC  sel  dendritik  karena  adanya  aktivasi  sel  T CD8 + dan  peningkatan  sel  T  untuk  melawan antigen yang masuk [7].
Pengamatan struktur histologi hepar menggunakan  pewarnaan  Hematoksilin-Eosin (Gambar  4)  digunakan  untuk  perbandingan antara  sel  normal  dan  kerusakan  sel  seperti  sel
piknotik,  sel  karioreksis,  dan  sel  kariolisis. Pengamatan ini dilakukan untuk mengetahui efek toksisitas  fraksi  ethanol  daun  sambiloto  setelah diperlakukan  secara  oral  pada  hewan  coba mencit.  Pengamatan  preparat  yang  dilakukan menunjukkan perlakuan oral fraksi ethanol daun sambiloto  Dosis  3  (1  mg/g  BB)  mengalami kerusakan sel hepar yang signifikan dibandingkan dengan kontrol.
Gambar  4.  Persentase  perubahan  sel  hepar  perlakuan oral  selama  2  minggu.  Keterangan  : Kontrol = tanpa perlakuan dosis; Dosis 1 =  0,1  mg/g  BB;  Dosis  2  =  0,5  mg/g  BB; Dosis 3 = 1 mg/g BB
Perubahan  pada  sel  yang  terjadi  pada sitoplasma  dan  organel-organel  sel  lainnya  yang meliputi  sel  piknotik,  sel  karioreksis,  dan  sel kariolisis.  Ciri  sel  piknotik  yaitu  inti  sel  yang mati  akan  menyusut,  menjadi  padat,  batasnya tidak teratur dan berwarna gelap. Selanjutnya inti sel  hancur  dan  meninggalkan  pecahan-pecahan zat  kromatin  yang  tersebar  di  dalam  sel  dan disebut sel karioreksis. Kemudian dilanjutkan sel kariolisis  yaitu  inti  sel  yang  mati  akan menghilang [8].
Saponin  merupakan  senyawa  kimia  yang dapat  menyebabkan  sel  darah  merah  terganggu akibat dari kerusakan membran sel, menurunkan kolesterol plasma. Saponin berpengaruh terhadap permiabilitas membran sel. Peningkatan permiabilitas  membran  sel  dapat  menyebabkan cairan elektrolit di luar sel akan mudah masuk ke dalam  sel,  akibatnya  sel  akan  membengkak  dan mudah pecah [9].
Senyawa saponin ini mampu masuk ke dalam sel  hepar  karena  saponin  mampu  beredar  dalam pembuluh  darah  dan  nantinya  akan  masuk  dalan hepar.  Senyawa  saponin  memiliki  sifat  toksik yang mampu merusak endotel dinding pembuluh darah jika terdapat dalam konsentrasi yang besar. Rasa  saponin  yang  pahit  mampu  menyebabkan
0,88 (a) 1,06 (a) 0,84 (a) 4,1 (b) 0 1 2 3 4 5 6 7 Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 K e ru sak an s e l h e p ar ( % ) Perlakuan
hemolisis  terhadap  eritrosit,  memiliki  berat molekul yang cukup besar, mengandung senyawa  gula  yang  bisa  menyebabkan  iritasi saluran pencernaan dan ketika terserap pembuluh darah akan menyebabkan kerusakan hepar [10].

## KESIMPULAN
Pemberian  fraksi  ethanol  daun  sambiloto secara  oral  meningkatkan  jumlah  sel  T CD4 + CD25 + dan  CD8 + ,  selain  itu  terjadi penurunan jumlah sel T CD4 + dan CD4 + CD62L + . Dosis  optimum  fraksi  ethanol  daun  sambiloto dalam  peningkatan  sel  T  regulator  adalah  0,1 mg/g BB. Fraksi ethanol daun sambiloto dosis 1 mg/g  BB  menimbulkan  efek  toksik  yang signifikan pada jaringan hepar.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  penulis  ucapkan  kepada Bapak  Dr.  Ir.  Moch.  Sasmito  Djati,  MS  dan Bapak  Drs.  Aris  Soewondo,  M.Si.  sebagai penguji atas saran dan masukan dalam penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Sumaryono,  W.  2002.  Penelitian  Obat
Tradisional Indonesia dan Strategi Peningkatannya. Prosiding Seminar Nasional  Tumbuhan  Obat  Indonesia  XXI. Surabaya. hlm. 1–8.
[2]      Block,  K.I.  &  M.N.  Mead.  2003.  Immune system  effects  of  Echinacea,  Ginseng  and Astragalus:  A  review.  Integrative  cancer therapies. 2(3):247–267.
[3]  Tizard,  I.R.  2000.  Immunology:  An Introduction.  6th  Ed.  Saunders  College Publishing. New York.
[4]   Lee. J.H., H.H. Yu, L.C. Wang, Y.H. Yang, Y.T. Lin, & B.L. Chiang. 2006. The level of
CD4 + CD25 +
Regualtory T Cells In Paediatric  Patients  With  Allergic  Rhinitis and  Bronchial  Asthma.  Departement  of
Pediatrics,  National  Taiwan  University Hospital,  Taipei,  Taiwan,  China  and Graduate  Institute  of  Clinical  Medicine, National  Taiwan  University  College  of
Medicine, Taipei, Taiwan, Cina.
[5]    Rifa’i,  M.  2011.  Alergi  dan  Hipersensitif. Jurusan  Biologi,  Fakultas  Matematika  dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Braijaya, Malang.
[6]  Wahyuni,  N.  2009.  Perubahan  Kadar Interleukin-2,  Jumlah  Relatif  Sel  T  CD4 + dan  CD8 + ,  dan  Histopatologi  Usus  Halus
Mencit  (BALB/c)  Splenectomy  Paparan Salmonella  typhi.  Jurusan  Biologi  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Universitas Brawijaya.
[7]      Tedder,  T.F.,  D.A.  Steeber,  A.  Chen,  &  P. Engel.  1995.  The  Selectins:  Vascular Adhesion Molecules. FASEB J. 9, 866–873.
[8]    Lesson.  1990.  Buku  Ajar  Histologi.  EGC Kedokteran. Jakarta
[9]   Mitaine AC, Marouf A, Haquei B, Bilirakis N, & Lacaille MA, 2001. Two Triterpenoid and  Saponin  from  Achyrantes  Bidentata. Chem.  Pharm  Bull.  (Tokyo).  49(11):1492– 1494.
[10]  El-Torki,  M.  A.,  A.W.  Mehdi,  A.  I. Mohammed,  N.A.  Al-Jiboori.  2010.  Liver and Kidney Functions in Adult Male Rats Following Multiple
Subcutaneous Injections  of  Non-Lethal  Doses  of  Datura metel  Leaves  Aqueous  Extract.  Zoology Departement, Faculty of Science,
Garyounis University, Benghazi, Libya.