## Pengembangan Yoghurt Berisi Lactobacillus rhamnosus dan Pediococcus pentosaceus dan Viabilitasnya Selama Penyimpanan
Development of Yoghurt Containing Lactobacillus rhamnosus and Pediococcus pentosaceusand their Viability during Storage 1
Lilis Nuraida 1,2 , Qamariyah Nurdin 2 dan Antung Sima Firlieyanti 1,2
1 Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology Center (SEAFAST Center), LPPM, Institut Pertanian Bogor
2 Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor
Abstract . Yoghurt is a common vehicle to deliver probiotic bacteria. Compatibility between probiotics species is important for their survival during fermentation of yoghurt with multi probiotic bacteria. The aim of the research was to assess combination of Lactobacillus rhamnosus R23 and Pediococcus pentosa- ceus A38 in developing yoghurt. L. rhamnosus R23 and P. pentosaceus A38 isolated from breast milk were used as a single culture or in combination. Fermentation was carried out for 48 hrs at 37 o C. Effect of inulin on the growth of those lactic acid bacteria was also evaluated. Sugar was added in formulation of yoghurt to improve its taste. L. rhamnosus R23 grew well on skim milk while P. pentosaceus A38 did not sufficiently acidified the milk. L. rhamnosus was detrimental to Pediococcus when they were used as combined starter cultures. Reasonable number of Pediococcus in yoghurt containing Lactobacillus and Pediococcus was reached by mixing yoghurt after fermentation by each bacteria separately. Addition of 15% sucrose gave the most preferred yoghurt. During 32 days of refrigerated storage, all yoghurt still maintained high num- ber of viable LAB (>8 log CFU/ml) with Pediococcus count of >6 log CFU/ml. During storage, pH value also declined but it was still above 4. Yoghurt containing L. rhamnosus and P. pentosaceus with different functional properties could be developed by fermenting the milk separately prior to mixing. Refrigerated storage of mixed yoghurt could retain the number of lactic acid bacteria for 32 days.
Keywords: Breast milk, yoghurt, lactic acid bacteria, L. rhamnosus, P. pentosaceus, probiotic.
Abstrak . Yoghurt merupakan produk yang umum digunakan sebagai pembawa bakteri probiotik. Kompatibilitas antar species perlu diperhatikan dalam yoghurt yang berisi beberapa jenis bakteri probiotik. Penelitian ini mengkaji kombinasi L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38 dalam pembuatan yoghurt.
L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38 asal ASI digunakan untuk mengembangkan susu fermentasi sebagai kultur tunggal dan kultur campuran. Fermentasi dilakukan pada suhu 37 o C selama 48 jam. Pe- ngaruh inulin terhadap pertumbuhan BAL juga dievaluasi. Penambahan gula dilakukan dalam formulasi yoghurt untuk memperbaiki rasa. P. pentosaceus A38 tidak dapat mengasamkan susu dengan baik. L. rhamnosus menghambat pertumbuhan Pediococcus ketika digunakan sebagai kultur starter campuran. Jumlah Pediococcus dalam yoghurt berisi Lactobacillus dan Pediococcus dapat ditingkatkan dengan mencampurkan yoghurt yang difermentasi oleh masing-masing bakteri secara terpisah. Penambahan gula 15% menghasilkan yoghurt yang lebih disukai. Selama 32 hari penyimpanan pada suhu dingin, semua yoghurt masih mengandung BAL di atas 8 log CFU/ml, dengan jumlah Pediococcus di atas 6 log CFU/ ml. Selama  penyimpanan pH menurun tetapi masih di atas 4. Yoghurt yang berisi campuran L. rhamnosus dan Pediococcus dapat dibuat, namun susu harus difermentasi oleh masing-masing bakteri secara terpisah. Penyimpanan dingin dapat mempertahankan jumlah BAL selama 32 hari.
Kata kunci : ASI, bakteri asam laktat, L. rhamnosus , P. pentosaceus , probiotik, yoghurt
Aplikasi Praktis : Hasil penelitian ini memberikan informasi mengenai strategi pengembangan produk sejenis yoghurt yang berisi lebih dari satu jenis bakteri probiotik yaitu L. rhmanosus dan P. pentosaceus yang memiliki sifat fungsional berbeda namun tidak kompatible. Pembuatan yoghurt yang berisi kedua bakteri tersebut dapat dilakukan dengan cara mencampurkan yoghurt yang telah difermentasi oleh ma- sing-masing bakteri. Metode ini dapat menghasilkan yoghurt yang mengandung bakteri probiotik dalam jumlah yang cukup sampai dengan 32 hari penyimpanan pada suhu dingin.
Korespondensi: lilis@seafast.org

## PENDAHULUAN
Susu fermentasi terutama yoghurt dan produk sejenisnya merupakan produk yang paling banyak di- gunakan sebagai pembawa mikroorganisme probiotik. Probiotik adalah mikroorganisme hidup pada pangan yang jika dikonsumsi dalam jumlah yang cukup dapat memberikan manfaat bagi kesehatan inangnya (FAO/ WHO, 2002). Mikroorganisme yang umum digunakan sebagai probiotik terutama bakteri asam laktat (BAL) dari genus Lactobacillus dan Bifidobacterium . Berbagai persyaratan   harus   dipenuhi  oleh mikroorgansime un- tuk dapat dikelompokkan sebagai probiotik, antara lain toleransi terhadap asam lambung dan empedu, mampu bertahan dalam saluran pencernaan, mampu menempel pada permukaan usus dan memiliki sifat antimikroba terhadap bakteri patogen (FAO/WHO, 2002). Berbagai hasil penelitian telah membuktikan bahwa probiotik dapat mencegah atau menyembuhkan diare yang diakibatkan oleh infeksi patogen, virus maupun diare yang disebabkan oleh konsumsi antibiotik (de Vrese dan Marteau, 2007; Zanini et al . 2007; Nuraida et al .  2012). Kemampuan pro- biotik untuk mencegah atau mengobati diare merupakan fungsi probiotik yang paling banyak diaplikasikan (Reid et al. 2003; de Vrese dan Marteau, 2007). Sifat fungsio nal lainnya dari probiotik adalah kemampuan menurunkan kolesterol ( Liong and Shah, 2005, Nuraida et al . 2011a), anti infeksi oleh bakteri patogen (Ballongue, 2004, Mike- lsaar et al . 2004) dan meningkatkan sistem imun (Drakes et al. 2004, Diaz-Ropero et al . 2007, Kotani et al . 2010).
L. rhamnosus dan Pediococcus pentosaceus (Nuraida et al . 2011b dan 2012b) yang diisolasi dari ASI ibu menyusui di Bogor memiliki potensi sebagai bakteri probiotik. L. rhamnosus R23 menunjukkan kemampuan untuk mencegah diare yang disebabkan karena infeksi Enteropathogenic E. coli (EPEC) dibandingkan dengan L. rhamnosus lainnya yang diisolasi dari ASI (Nuraida et al. 2012a ). P. pentosaceus A38 yang juga diisolasi dari ASI memiliki kemampuan untuk menurunkan kolesterol dengan mekanisme asimilasi dan dekonyugasi garam empedu (Nuraida et al. 2011a). Yoghurt merupakan produk fermentasi susu yang secara konvensional menggunakan Lactobacillus delbrueckii subs bulgaricus dan Streptococcus salivarius subs thermophilus sebagai starter. Namun, kedua bakteri tersebut tidak dapat bertahan melewati saluran pencernaan manusia sehingga tidak dapat digolongkan ke dalam probiotik (Agrawal, 2005). Sebaliknya kondisi untuk fermentasi yoghurt belum tentu sesuai dengan kondisi untuk pertumbuhan bakteri probiotik. Pengembangan produk fermentasi yang berisi bakteri probiotik dapat dilakukan dengan menggunakan bakteri probiotik sebagai kultur starter (Tamime et al. 2007). Yoghurt probiotik dengan berbagai kultur probiotik, baik tunggal maupun campuran atau dikombinasikan dengan kultur starter yoghurt konvensional telah dikembangkan (Lourens- Hattingh dan Viljoen, 2001). Dalam pengembangan
yoghurt probiotik, viabilitas selama fermentasi dan selama penyimpanan menjadi isu utama (Mortazavian et al . 2007; Bandiera et al. 2013), karena untuk memberikan manfaat kesehatan, bakteri probiotik harus berada dalam produk minimum 10 6 CFU/g (Tamime et al . 2007). Pengembangan produk probiotik yang dibuat dengan menggunakan lebih dari satu kultur dengan sifat fungsional yang berbeda, perlu mempertimbangkan kompatibilitas kultur (Tamime et al. 2007). L. rhamnosus, B. animalis dan kultur starter yoghurt menghambat L. acidophilus ketika ditumbuhkan bersama-sama (Saccaro et al. 2009). L. acidophilus merupakan kultur yang paling terhambat ketika ditumbuhkan bersama-sama dengan BAL lainnya dalam fermentasi susu (Vinderola et al. 2002). Oleh karena itu interaksi antar strain atau species probiotik perlu dievaluasi untuk menjamim jumlah yang cukup. L. rhamnosus yang diisolasi dari ASI dapat digunakan sebagai kultur starter tunggal sementara P. pentosaceus harus digunakan bersama-sama dengan S. thermophillus (Nuraida et al . 2012b). Interaksi L. rhamnosus dan P. pentosaceus dalam memfermentasi yoghurt penting untuk diketahui untuk mengembangkan produk probiotik multikultur berisi isolat lokal.
Penggunaan probiotik pada produk pangan fungsional seringkali disertai dengan penambahan prebiotik. Hal ini dilakukan untuk mendukung pertumbuhan bakteri probiotik yang digunakan dan sekaligus memperoleh manfaat dari prebiotik yang ditambahkan. Prebiotik didefinisikan  sebagai  bahan  pangan  yang  tidak  dapat dicerna (oleh manusia) dan memiliki manfaat yang menguntungkan dengan menstimulasi pertumbuhan dan aktivitas beberapa bakteri yang terdapat pada usus sehingga dapat meningkatkan kesehatan inang (Kolida dan Gibson; 2007, Roberfroid, 2007). Inulin, fruktooligosakarida (FOS), galaktooligosakarida (GOS) merupakan oligosakarida yang telah terbukti berfungsi sebagai prebiotik (Roberfroid, 2007). Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan yoghurt menggunakan BAL kandidat probiotik, L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38 yang diisolasi dari ASI, baik sebagai kultur starter tunggal maupun kultur campuran, dengan penambahan inulin serta mengevaluasi viabilitasnya selama penyimpanan dingin. Kedua bakteri kandidat probiotik tersebut memiliki sifat fungsional yang berbeda, masing-masing dapat mencegah diare (Nuraida et al. 2012a) dan menurunkan kolesterol (Nuraida et al. 2011a).

## METODE PENELITIAN
Kultur
Lactobacillus rhamnosus R23 dan Pediococcus pentosaceus A38 yang diisolasi dari Air Susu Ibu (ASI) diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi SEAFAST Center IPB.
Fermentasi Yoghurt dengan kultur starter tunggal dan campuran
Yoghurt dibuat dalam dua jenis yaitu yoghurt yang difermentasi dengan kultur campuran L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38 (Yog Lac+Ped) dan yoghurt yang difermentasi dengan menggunakan kultur tunggal. Susu skim (Sunlac TM yang diperoleh dari Supermarket di Bo- gor) 12% yang telah direkonstitusi (12%) dipasteurisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 100 o C selama 30 menit. Untuk susu yang difermentasi oleh P. pento- saceus , ditambahkan sukrosa sebanyak 3% (Nuraida et al. 2011b). Setelah itu, didinginkan dan diinokulasikan dengan masing 2% L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38 (kedua kultur ditumbuhkan pada media yang sama pada suhu 37 o C selama 48 jam) dengan rasio Lac:Ped 1:0, 1:1, 1:2 dan 0:1. Rasio 1:0 dan 0:1 masing-masing merupakan yoghurt kultur tunggal L. rhamnosus dan P. pentosaceus . Fermentasi dilakukan pada suhu 37 o C sela- ma 48 jam. Analisis dilakukan terhadap pH, total asam (AOAC, 1994), total BAL pada media MRSA (Oxoid TM ), jumlah Pediococcus pada media MRSA yang ditam- bahkan antibiotik nystatin (50,000 U/l) dan ampicillin (1 mg/l) ( Dabour et al. 2009 ) , dan uji organoleptik ber- dasarkan kesukaan terhadap rasa, tekstur, aroma dan keseluruhan dengan menggunakan 69 panelis dan skala penilaian 1-7. Nilai 1, sangat tidak suka, 2 tidak suka, 3 agak tidak suka, 4 netral/biasa, dan 5 agak suka, 6 suka, dan 7 sangat suka. Perhitungan jumlah BAL dan Pedio- coccus dilakukan berdasarkan BAM-FDA ( Maturin dan Peeler, 2001).
Pengaruh penambahan inulin terhadap pertumbuhan bakteri asam laktat
Masing-masing kultur L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38 ditumbuhkan pada susu skim yang telah direkonstitusi (12%) dengan penambahan inulin (Fibruline R Instant) 5%. Untuk P. pentosaceus ditambah- kan sukrosa sebesar 3%. Kondisi fermentasi dilakukan sama dengan fermentasi yoghurt kultur tunggal. Analisis dilakukan terhadap total BAL pada media MRSA.

## Formulasi Yoghurt
Perbandingan Yoghurt Lactobacillus dan Yoghurt Pediococcus. Formulasi yoghurt dilakukan dengan mem- buat yoghurt campuran ( Yog Lac+Yog Ped) yaitu dengan mencampurkan dua jenis yoghurt yang masing-masing difermentasi oleh L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38. Kondisi fermentasi sama seperti fermentasi yoghurt kultur tunggal. Kedua yoghurt kultur tunggal kemudian dicampurkan dengan rasio Yog Lac:Yog Ped 1:1, 1:2, dan 2:1. Campuran yoghurt dihomogenisasi menggu- nakan homogenizer selama 3 menit. Analisis organoleptik dilakukan berdasarkan uji kesukaan terhadap rasa, tekstur, aroma dan keseluruhan dengan menggunakan 69 panelis dengan skala penilaian 1-7 seperti di atas.
Pengaruh penambahan gula pasir. Penambahan gula pasir sebesar 10 dan 15% dilakukan terhadap cam-
puran yoghurt kultur tunggal (Yog Lac+Yog Ped) dengan dan tanpa penambahan inulin. Penambahan gula pasir di- lakukan setelah proses fermentasi, dengan menambahkan sirup gula pasir (5 kali konsentrasi akhir pada yoghurt). Penambahan larutan gula dilakukan sebelum homogenisa- si. Analisis organoleptik dilakukan terhadap rasa, aroma, tekstur, dan overall (keseluruhan) dengan menggunakan 70 panelis dengan skala penilaian 1-7 seperti di atas.

## Viabilitas  Lactobacillus dan Pediococcus selama pe- nyimpanan
Campuran yoghurt (Yog Lac+Yog Ped) dengan ra- sio 1:2, dengan atau tanpa penambahan gula dan inulin disimpan pada lemari pendingin dengan suhu <10 o C se- lama 32 hari. Analisis total BAL, jumlah Pediococcus dan pH dilakukan setiap 4 hari.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Fermentasi Yoghurt dengan kultur tunggal dan cam- puran
Nilai pH dan total asam yoghurt yang difermentasi oleh kultur campuran L. rhamnosus R23 dan P. pento- saceus A38 (rasio Yog Lac+Ped 1:1 dan 1:2) maupun tunggal (Yog Lac 1:0 atau Yog Ped 0:1) disajikan pada disajikan pada Gambar 1. Nilai pH yoghurt yang berisi L . rhamnosus di bawah 4 (pH 3.68-3.82), sementara nilai pH yoghurt kultur tunggal P. pentosaceus A38 (rasio 0:1) di atas 5. Nilai pH semua yoghurt yang dibuat dengan L. rhamnosus berada di bawah pH yoghurt konvension- al yaitu 4.4-4.5 (Fadela et al. 2009; Sarocca et al . 2009) yang mengindikasikan yoghurt L. rhamnosus lebih asam dari yoghurt konvensional. Hasil penelitian terdahulu menggunakan P. pentosaceus A16, menunjukkan bak- teri ini tidak dapat membentuk asam dengan baik pada susu, sebaliknya L. rhamnosus R21 dapat digunakan se- bagai kultur starter tunggal (Nuraida et al. 2012b). Total asam (Gambar 1) yoghurt kultur campuran dengan rasio Lac:Ped 1:1 dan 1:2, serta yoghurt kultur tunggal L. rham- nosus R23 (1:0) memenuhi standar SNI yoghurt (BSN, 2009) yang berkisar antara 0,5-2% (b/b), namun tidak ada standar pH dalam SNI yoghurt. Yoghurt P. pentosaceus A38 (0:1) memiliki nilai total asam yang lebih rendah dari standar SNI. Hal ini kemungkinan karena lemah- nya aktivitas β–galaktosidase dan berbagai enzim untuk metabolisme susu pada P. pentosaceus (Tzanetakis dan Litopoulou-Tzanetaki 1989).
Total BAL dan total Pediococcus yoghurt kultur cam- puran (rasio Lac:Ped 1:1 dan 1:2) maupun tunggal (Yog Lac 1:0 atau Yog Ped 0:1) setelah fermentasi disajikan pada Gambar 2. Total BAL tertinggi dicapai pada yo- ghurt L. rhamnosus R23 (1:0) (9,38 log CFU/ml). Nilai ini tidak berbeda jauh dengan yoghurt kultur campuran dengan rasio Lac:Ped 1:2 dan 1:1. Sedangkan total BAL paling rendah diperoleh pada yoghurt P. pentosaceus A38, walaupun masih diatas 8 log CFU/ml. Pada yoghurt yang difermentasi dengan kultur campuran, jumlah Pediococ-
cus lebih rendah, yaitu 6,38 log CFU/ml (rasio kultur Lac: Ped 1:1) dan 6,49 log CFU/ml (rasio kultur Lac:Ped 1:2)  dibandingkan  dengan  pada  yoghurt  kultur  tunggal. Lebih rendahnya jumlah Pediococcus menunjukkan adanya penghambatan pertumbuhan P. pentosaceus oleh L. rhamnosus . Interaksi antar bakteri probiotik dapat menjadi penghambat pertumbuhan salah satu probiotik (Tamime et al. 2007). Jumlah bakteri probiotik setelah fermentasi tergantung pada jenis bakteri yang bersa- ma-sama berada pada saat fermentasi. Starter komersial L. acidophilus terhambat pertumbuhannya oleh starter komersial L. delbrueckii subsp. bulgaricus (Dave dan Shah, 1996), sementara L. acidophilus terhambat oleh L. rhamnosus , B. animalis dan starter yoghurt konvensional (Saccaro et al . 2009). Penelitian Nuraida et al . (2011b) menunjukkan bahwa P. pentosaceus (A16) asal ASI mem- punyai karakteristik yang tidak tahan asam sedangkan L. rhamnosus (R21) yang juga asal ASI diduga mempunyai ketahanan terhadap asam yang lebih baik serta kemam- puan proteolitik dan peptidase yang tinggi.
Hasil pengujian organoleptik untuk yoghurt yang di- buat dengan beberapa perbandingan kultur L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38 dapat dilihat pada Gambar 3. Rasa yoghurt kultur campuran yang difermentasi dengan kultur L. rhamnosus R23 dengan porsi lebih banyak, le- bih disukai jika dibandingkan dengan P. pentosaceus A38. Citarasa yoghurt dihasilkan dari komponen seperti asam laktat, asam asetat, asetaldehida, aseton, diasetil yang di- peroleh dari aktivitas kultur yoghurt yang memfermentasi laktosa. Nilai pH yang lebih rendah pada Yog Lac menun- jukkan L. rhamnosus R23 lebih cepat dan efektif dalam
Gambar 1 . Nilai pH (a) dan total asam (b) yoghurt yang difermentasi menggunakan kultur campuran L. rhamno- sus R23 dan P. pentosaceus A38 dengan rasio Lac: Ped 1:1, 1:2, 1:0, dan 0:1 pada suhu 37 o C selama 48 jam
proses fermentasi laktosa jika dibandingkan dengan P. pentosaceus A38, sehingga cita rasa yang terbentuk pada yoghurt P. pentosaceus A38 kurang. Rasa, aroma, teks- tur dan overall yoghurt kultur tunggal L. rhamnosus R23 (1:0) paling disukai panelis, namun tidak berbeda nyata dengan yoghurt kultur campuran rasio Lac:Ped 1:1 na- mun berbeda nyata dengan yoghurt kultur campuran rasio Lac:Ped 1:2. Penambahan kultur P. pentosaceus A38 yang lebih banyak, menurunkan tingkat kesukaan panelis terha- dap yoghurt. Berdasarkan penilaian organoleptik, yoghurt kultur campuran dapat dibuat dengan menggunakan rasio kultur Lac:Ped 1:1. Namun dengan penggunaan kultur campuran sebagai starter, kultur Pediococcus terhambat pertumbuhannya selama fermentasi sehingga jumlahnya dalam produk hanya 10 6 CFU/ml. Peningkatan jumlah Pediococcus dapat dilakukan dengan mencampurkan yoghurt kultur tunggal masing-masing bakteri, sehingga tidak mengalami pertumbuhan yang dapat menyebabkan terhambatnya salah satu kultur.
Tabel 1 . Pengaruh penambahan inulin 5% terhadap per tumbuhan L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38 di dalam yoghurt yang difermentasi pada suhu 37 o C selama 48 jam Kultur starter Inulin 5% Jumlah BAL (log CFU/ml) L. rhamnosus R23 √ 9,49+0,13 - 9,47+0,04 P. pentosaceus A38 √ 7,96+0,23 - 7,58+0,25
Gambar 2 . Total BAL (a) dan total Pediococcus (b) pada yoghurt yang difermentasi pada suhu 37 o C selama 48 jam menggunakan kultur campuran L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38  dengan rasio Lac:Ped 1:1, 1:2, 1:0, dan 0:1 (Total Pediococcus dihitung hanya pada yoghurt dengan kultur starter campuran).
Pengaruh penambahan inulin terhadap jumlah bak- teri asam laktat
Penambahan inulin terhadap susu skim sebelum fer- mentasi oleh L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38 tidak berpengaruh terhadap jumlah BAL dalam yoghurt kultur tunggal (Tabel 1). Inulin merupakan oligosakarida yang sulit untuk difermentasi sehingga BAL lebih memi- lih sumber karbon lain seperti laktosa untuk mendukung pertumbuhannya pada susu. Inulin digolongkan sebagai prebiotik karena tidak terserap pada saluran pencernaan bagian atas dan dapat mendukung pertumbuhan bakteri probiotik pada kolon (Roberfroid, 2007). Karena inulin
Gambar 3 . Hasil uji organoleptik yoghurt yang difermentasi pada suhu 37 o C selama 48 jam menggunakan kultur campuran L. rhamnosus R23 dan P. pentosaceus A38 dengan rasio Lac:Ped 1:0, 1:1, 1:2, dan 0:1
Gambar 4 . Hasil uji organoleptik yoghurt campuran dengan rasio Yog Lac:Yog Ped 2:1, 1:2, dan 1:1
masih tersedia dalam jumlah cukup pada yoghurt, maka setelah yoghurt dikonsumsi diharapkan inulin dapat menunjang pertumbuhan bakteri probiotik dengan me- manfaatkannya sebagai sumber karbon di dalam usus setelah sumber karbon lainnya telah habis (Nuraida et al . 2011c).

## Formulasi Yoghurt yang Mengandung L. rhamnosus dan P. pentosaceus
Penentuan rasio yoghurt L. rhamnosus dan yoghurt P. Pentosaceus. Seperti disampaikan di atas bahwa jumlah Pediococcus pada yoghurt yang difermentasi de-
ngan kultur campuran jauh lebih rendah dibandingkan dengan yoghurt kultur tunggal. Untuk mengatasi hal tersebut maka formulasi yoghurt dilakukan dengan mencampurkan yoghurt L. rhamnosus R23 (Yog Lac) dan yoghurt P. pentosaceus A38 (Yog Ped) dengan berbagai rasio 1:2, 1:1 dan 2:1. Yoghurt campuran yang paling disukai adalah yoghurt campuran dengan rasio Yog Lac:Yog Ped 2:1 (Gambar 4), namun tidak berbeda nyata dengan rasio Yog Lac: Yog Ped 1:2. Yoghurt campuran dengan rasio Yog Lac: Yog Ped 1:2 paling disukai oleh panelis namun tidak berbeda nyata dengan yoghurt rasio 1:1. Penambahan yoghurt P. pentosaceus A38 menghasilkan tekstur yang lebih disukai oleh panelis. Aroma dan penilaian keseluruhan yoghurt campuran Yog Lac+Yog Ped tidak menunjukkan perbedaan yang nyata antar rasio yang digunakan (Gambar 4). Dibandingkan dengan penggunaan kultur campuran sebagai starter, pembuatan yoghurt yang mengandung
Gambar 5 . Hasil uji organoleptik yoghurt campuran dengan rasio Yog Lac:Yog Ped 1: dengan penambahan gula
Gambar 6 . Perubahan jumlah bakteri asam laktat  selama  penyimpanan  yoghurt  campuran Yog Lac+Yog Ped pada suhu dingin
L. rhamnosus dan Pediococcus dengan mencampurkan kedua yoghurt starter tunggal menghasilkan yoghurt dengan sifat organoleptik yang lebih disukai, sehingga memberikan peluang untuk mengembangkan yoghurt yang mengandung L. rhamnosus R23 dan P. pentosa- ceus A38. Penambahan yoghurt Pediococcus yang lebih banyak (rasio Yog Lac:Yog Ped, 1:2) akan membantu mempertahankan keberadaan Pediococcus dalam jumlah tinggi karena kemungkinan Pediococcus terhambat oleh L. rhamnomsus pada saat penyimpanan. Sifat organo- leptik secara keseluruhan untuk yoghurt dengan rasio Yog Lac:Yog Ped 1:2, tidak berbeda nyata dengan rasio 1:1 dan 2:1. Pencampuran yoghurt kultur tunggal untuk memperoleh yoghurt berisi multi strain merupakan teknik yang dapat diterapkan jika kultur tersebut tidak kompati- ble (Tamim et al. 2007).
Pengaruh penambahan gula. Sebagai pemanis yoghurt campuran Yog lac:Yog Ped dengan rasio 1:2,
ditambahkan sirup gula pasir sehingga konsentrasi gula pada yoghurt sebesar 10% dan 15%. Penambahan gula 15% lebih disukai dibandingkan 10% (Gambar 5).  Penambahan  flavor  atau  pemanis  ke  dalam  yoghurt memperbaiki keseimbangan flavor atau mengurangi flavor asetaldehide untuk meredam keasaman produk (Rashid dan Thakur, 2012). Tekstur yoghurt campuran dengan penambahan inulin lebih disukai dibandingkan dengan yoghurt yang hanya ditambah gula. Namun adanya inulin dan gula pada yoghurt tidak mempengaruhi penilaian terhadap aroma. Berdasarkan penilaian keseluruhan, penambahan gula 15% pada yoghurt lebih disukai daripada penambahan gula 10%. Penambahan inulin tidak mempengaruhi penilaian terhadap sifat organoleptik secara keseluruhan. Secara keseluruhan penambahan gula memperbaiki penerimaan terhadap yoghurt dari kisaran netral menjadi agak suka.
Gambar 7 . Perubahan jumlah Pediococcus selama penyimpanan yoghurt campuran Yog Lac+ Yog Ped pada suhu dingin
Gambar 8 . Perubahan nilai pH selama penyimpanan yoghurt campuran Yog Lac+Yog Ped pada suhu dingin

## Viabilitas Bakteri Asam Laktat Selama Penyimpanan Dingin
Total bakteri asam laktat (BAL) pada yoghurt campuran dengan dan tanpa penambahan gula atau inulin masih di atas 8 log CFU/ml setelah penyimpanan dingin selama 32 hari (Gambar 6). Hasil ini sebanding dengan viabilitas L. casei pada yoghurt yang disimpan pada suhu 4 o C selama 21 hari (Bandiera et al . 2013) dan le- bih tinggi dari L. acidophilus pada yoghurt yang berisi Lactobacillus rhamnosu LBA and Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL-04 setelah disimpan pada suhu 4 o C selama 21 hari yang jumlahnya kurang dari 5 log CFU/ ml) (Saccaro et al. 2009). Total BAL relatif stabil selama penyimpanan, sementara total Pediococcus mengalami penurunan terutama setelah 20 hari, namun masih di atas 6 log CFU/mL (Gambar 7). Hasil ini konsisten dengan penghambatan Pediococcus oleh L. rhamnosus
selama fermentasi. Perubahan viabilitas probiotik selama penyimpanan   merupakan fungsi dari suhu penyimpanan dan tergantung pada species atau strain yang digunakan (Motrazavian et al. 2013). Jumlah BAL dan Pediococcus setelah penyimpanan selama 32 hari masih berada pada kisaran 10 6 -10 8 CFU/ml yang merupakan jumlah yang disarankan berada pada produk untuk memberi manfaat kesehatan (FAO/WHO, 2002; Champagne et al . 2011). Viabilitas BAL dan Pediococcus selama penyimpanan tidak berbeda antara yoghurt dengan penambahan inulin (I), penambahan inulin dan gula (IG), penambahan gula (G) dan kontrol (Gambar 6 dan 7). Stabilitas bakteri probiotik pada yoghurt komersial bervariasi tergantung pada species probiotik yang digunakan (Micanel et al. 1997) dan setelah disimpan banyak produk yang tidak memenuhi jumlah probiotik yang direkomendasikan (Champagne et al. 2011).
Nilai pH yoghurt campuran pada saat awal penyim- panan antara 5,03- 4,48, sedikit lebih tinggi dari yoghurt konvensional (4,4-4.5) (Fadela et al . 2009; Saccaro et al. 2009). Penurunan pH selama penyimpanan (Gambar 8) menunjukkan adanya peningkatan jumlah asam. Hingga akhir masa penyimpanan, keempat jenis yoghurt memi- liki nilai pH sekitar 4,1-4,4, dengan pH tertinggi (pH 4.4) pada yoghurt G. Penurunan pH sampai mendekati 4 selama penyimpanan pada suhu 4 o C juga terjadi pada yoghurt yang berisi starter konvensional dan L. aci- dophilus, L. rhamnosus serta B. animalis (Saccaro et al. 2009).  Penurunan  pH  selama  penyimpanan  dingin  mem- pengaruhi stabilitas probiotik (Micanel et al. 1997).

## KESIMPULAN
L. rhamnosus R23 menghambat pertumbuhan P. pentosaceus A38 selama fermentasi susu, oleh karena itu kedua bakteri tersebut tidak dapat digunakan sebagai kultur starter campuran. Fermentasi yoghurt dengan kultur tunggal yang dilanjutkan dengan pencampuran kedua   yoghurt merupakan metode terbaik untuk mem- buat yoghurt yang berisi kedua bakteri kandidat probiotik tersebut. Penambahan inulin sebagai prebiotik tidak mem- pengaruhi jumlah BAL. Penambahan gula memperbaiki penerimaan terhadap yoghurt yang berisi L. rhamnosus dan P. pentosaceus , dengan konsentrasi yang paling disu- kai sebesar 15%. Penyimpanan pada suhu dingin masih dapat mempertahankan jumlah BAL pada yoghurt yang berisi L. rhamnosus dan P. pentosaceus untuk memenuhi persyaratan jumlah minimum sebagai probiotik.

## DAFTAR PUSTAKA
Agrawal, R. 2005. Probiotics: An emerging food supplement with health benefits, Food Biotech. 19:227-246.
Ballongue, J. 2004. Bifidobacteria and probiotic action, in Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects, 3rd Edition, Revised and Expanded, eds Salm- inen, S., von Wright, A., Ouwehand, A. Marcel Dekker
Inc, New York.
Bandiera, N.S., Carneiro I., da Silva A.S., Honjoya, E.R., de Santana E.H., Aragon-Alegro L.C, de Souza C.H. 2013. Viability of probiotic Lactobacillus casei in yoghurt: defining  the  best  processing  step  to  its  addition. Arch Latinoam Nutr. 63(1):58-63
[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2009. SNI 2981: 2009. Standar Mutu Yoghurt . BSN. Jakarta.
AOAC.  1994.  Official  Methods  of Analysis  of  The Asso- ciation  of  Offical  Analytical  Chemistry.  AOAC.  Int: Washington D.C.
Champagne, C.P., Ross, R.P., Saarela, M., Hansen, K.F., Ken Flemming Hansen, Charalampopoulos, D. 2011. Re- view recommendations for the viability assessment of probiotics as concentrated cultures and in food matrices. Inte.  J.  Food  Microbiol.  149:185–193.  doi:10.  1016/j. ijfoodmicro.2011.07.005
Dave, R.I. dan Shah. N.P. 1997. Viability of yoghurt and probiotic bacteria in yoghurts made from commercial starter cultures. Int. Dairy J. 7:31-41.
Dabour, N.S., Zihler, A., Kheadr, E., Lacroix, C., Fliss, I.
2009. In vivo study on the effectiveness of pediococin PA-1 and Pediococcus acidilactici UL5 at inhibiting Listeria monocytogenes . Int J Food Microbiol. 133: 225-233.
De Vrese M., Marteau, P.R. 2007. Probiotics and prebiotics:
effects on diarrhea. J Nutr 137: 803S–811S. Díaz-Ropero, M.P., Martín, R., Sierra, S., Lara-Villoslada, F., Rodríguez, J.M., Xaus, J., Olivares, M. 2007. Two Lac- tobacillus strains, isolated from breast milk, differently modulate the immune response, J. Appl. Microbiol.102 (2):337-43.
Drakes, M., Blanchard, T., Czinn, S. 2004. Bacterial probiot- ic modulation of dendritic cells. Infection and Immun. , 72 (6):3299-3309.
Fadela, C. Abderrahim, C. and Ahmed B., 2009. Sensorial and physicochemical characteristics of yoghurt manu- factured with ewe’s and skim Milk. World J. Dairy & Food Sci. 4 (2): 136-140.
FAO/WHO [Food and Agriculture Organization/World Health Organization] (2002) Guidelines for the evalua- tion of probiotics in foods, Report of a Joint FAO/WHO Working Group, London, Ontario, Canada,April 30 and May 1 2002.
Kolida, S., Gibson G. R. 2007. Prebiotic capacity of inu- lin-type fructans. J. Nutr. 137: 2503S–2506S
Kotani, Y., Shinkai, S., Okamatsu, H., Toba, M., Ogawa,K., Yoshida, H., Fukaya, T., Fujiwara, Y., Chaves, P.H.M., Kakumoto, K., Kohda, N. 2010. Oral intake of Lac- tobacillus pentosus strain b240 accelerates salivary immunoglobulin A secretion in the elderly: A random- ized, placebo-controlled, double blind trial. Immunity& Ageing. 7:11
Lourens-Hattingh,A. dan Viljoen, B.C.2001. Review: Yogurt as probiotic carrier food. Int. Dairy J. 11:1–17
Liong, M.T., Shah, P. 2005. Optimization of cholesterol removal by probiotics in the presence of prebiotics by
using a response surface method. Appl. Environ. Mico- biol. 71(4):1745-1753.
Maturin, L., J. T. Peeler . 2001. Bacteriological Analytical Manual: Aerobic Plate Count. Food and Drug Ad- ministration. http://www.fda.gov/Food/FoodScience Research/LaboratoryMethods/ucm063346.htm.
Mikelsaar, M., Mandar, R., Sepp, E., Annuk, H. 2004. Hu- man  lactic  acid  microflora  and  its  role  in  the  welfare of the host, in Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, 3rd Ed, eds Salminen, S., von Wright, A., Ouwehand, A. Marcell Dekker, Inc, New York.
Micanel N., Hayness, I.N., Playne, M.J. 1997. Viability of probiotic culture in commercial Australian yoghurts. The Austr. J.Dairy Tech. 52: 24-27
Motarzavian, Am. Ehsani, MR., Mousavi, SM., Rezafi, K., Sohrabvandi, S., Reinheimer, J.A. 2013. Effect of refrig- erated storage temperature on the viability of probiotic micro ‐ organisms in yogurt. Int J. Dairy Tech. 60(2):123 - 127. DOI:10.1111/j.1471-0307.2007.00306.x
Nuraida L., Winarti S., Hana, Prangdimurti E. 2011a. Eva- luasi in vitro terhadap kemampuan isolat bakteri asam laktat asal air susu ibu untuk mengasimilasi kolesterol dan mendekonjugasi garam empedu. J. Teknol Ind. Pa- ngan. 22:46-51.
Nuraida L, Rizka R.B, Nurjanah, S. 2011b. Evaluasi lactobacillus berpotensi sebagai probiotic yang diiso- lasi  dari  ASI  untuk  fermentasi  yoghurt.  Seminar  Peran Teknologi dalam Pengembangan Pangan yang Aman, Bermutu, dan Terjangkau bagi Masyarakat. 15-17 Sep- tember 2011, Manado, Sulawesi Utara.
Nuraida, L, Mardiana, N.R., Faridah, D.N., Hana. 2011c. Metabolisme prebiotik oleh kandidar probiotik isolat ASI sebagai dasar pengembangan produk sinbiotik. J. Teknol Ind. Pangan, 22 (2): 156:163.
Nuraida L., Hana. Hartanti A.W, and Prangdimurti, E. 2012a. Evaluasi potensi Lactobacillus yang diisolasi dari air susu ibu untuk mencegah diare karena infeksi E. coli K.1.1. J. Teknol. Ind. Pangan, 23:158-165.
Nuraida,L., Susanti, Palupi, N.S., Hana, Bastomi, R.R., Pris- cilia, D., Nurjanah,S. 2012b. Evaluation of probiotics properties of lactic acid bacteria isolated from breast milk and their potency as starter culture for yoghurt fer- mentation. Int J. Food, Nutr & Public Health,5:33-60.
Reid, G., Jass, J., Sebulsky, M.T., McCormick, J.K. 2003.
Potential uses of probiotics in clinical practice. clini- cal microbiol. Rev 16: 658-672. DOI: 10.1128/CMR. 16.4.658–672.2003.
Roberfroid, M. 2007. Prebiotics: The Concept Revisited. J. Nutr. 137: 830S–837S.
Saccaro, D.M., Tamine, A., Pilleggi, A.L.O.P.S. dan Olivei- ra, M. 2009. The viability of three probiotic organisms grown with yoghurt starter cultures during storage for 21 days at 4 o C. Int. J. Dairy Tech. 62 (3): 397-404. doi: 10.1111/j.1471-0307.2009.00497.x
Tamime, A.Y., Saarela, M., Sondergaard, K. A., Mistry, V.V.,
Shah, N.P. 2007. Production and maintenance of via- bility of probiotic microorganisms in dairy product, in Probiotic Dairy Product, ed, Tamime, A.Y., Blackwell Publishing. Pp: 39-72.
Rashid, A., Thakur, Er.S.N., 2012 . Studies on quality param- eters of set yoghurt prepared by the addition of honey. Int J Sci and Res Publ. 2(9): 1-10.
Tzanetakis N, Litopoulou-Tzanetaki. 1989. Biochemical activities of Pediococcus pentosaceus isolates of dairy origin. J. Dairy Sci. 72:859-863
Vinderola G.C., Mocchuitti, P. and Reinheimer A. J. 2002.
Interactions among lactic acid starter and probiotic bac- teria used for fermented dairy products. J. Dairy Scie. 85:721–729.
Zanini, K., Marzotto, M., Castellazzi, A., Borsari, A., Del- laglio, F., Torriani, S. 2007. The effects of fermented milks with simple and complex probiotic mixtures on the intestinal microbiota and immune response of healthy adults and children. Int. Dairy J. 17: 1332–1343. DOI: 10.1016/j.idairyj.2007.01.017.
JMP03-14-006 - Naskah diterima untuk ditelaah pada 15 Maret 2014. Re- visi makalah disetujui untuk dipublikasi pada 10 April 2014. Versi Online: http://jurnalmutupangan.com/index1.php?view&id=7