Potensi Ekstrak Etanol Biji Kakao Terhadap Penghambatan Firing Tubul Nematosista Racun Physalia Utriculus Secara In Vitro
Potential of Cocoa Ethanol Extract Toward Nematocyst Tubul Firing Inhibition of Physalia Utriculus Toxin In Vitro
Sarwendah Siswi Winasis 1 , Al Munawir 2 , Adelia Handoko 3 1 Mahasiswa, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember
2 Departemen Patologi Anatomi dan Biomolekuler, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember
3 Departemen Fisiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember e-mail korespondensi: almunawir.fk@unej.ac.id

## Abstrak
Diperkirakan  150  juta  kasus  envenomasi  akibat  sengatan  ubur-ubur  terjadi  setiap  tahun  secara  global.  Terdapat 100 dari 10.000 spesies ubur-ubur di dunia diketahui berbahaya bagi manusia yang salah satunya adalah Physalia utriculus . Tujuan penelitian ini ialah mengetahui potensi ekstrak etanol biji kakao ( Theobroma cacao L.) terhadap penghambatan firing tubul  nematosista  racun  ubur-ubur  ( P.  utriculus )  secara in  vitro .  Metode  yang  digunakan ialah true  experimental  design dengan post  test  only  control  group  design. Penelitian  terdiri  atas  8  kelompok:  1 kontrol normal, 1 kontrol positif, 1 kontrol negatif, dan 5 perlakuan dengan pemberian ekstrak  etanol biji kakao berkonsentrasi 20%,  2%,  0,2%,  0,02%,  0,002%.  Pengamatan  dilakukan  dengan  menghitung  persentase  jumlah nematosista yang mengalami firing . Hasil penelitian didapatkan rata-rata persentase firing pada kelompok kontrol normal  sebesar  42,50  ±  3,18,  kelompok  kontrol  positif  sebesar  37,97  ±  5,57,  kelompok  kontrol  negatif  sebesar 52,44 ± 2,98, dan kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak etanol biji kakao 20%, 2%, 0,2%, 0,02%, 0,002% berturut-turut, yaitu 48,24 ± 5,37; 40,62 ± 7,10; 29,45 ± 5,39; 37,60 ± 9,78; 41,11 ± 3,92. Hasil uji statistik One Way Annova menujukkan nilai signifikansi 0,001 (p≤0,05). Kesimpulan dari penelitian ini ialah ekstrak etanol biji kakao dengan  konsentrasi  0,2%  paling  berpotensi  menghambat firing tubul  nematosista  racun  ubur-ubur  ( P.  utriculus ) secara in vitro .
Kata kunci: Physalia utriculus , kakao, racun, ubur-ubur

## Abstract
There  was  estimated  150  million  envenomation  cases  due  to  jellyfish  stings  occur  globally  every  year.  100  from 10,000 jellyfish species in the world known to be dangerous, one them is Physalia utriculus. The aim of this study was  to  determine  the  potential  of  cocoa  (Theobroma  cacao  L.)  ethanol  extract  toward  nematocyst  tubul  firing inhibition of jellyfish (Physalia utriculus) toxin in vitro. The method was true experimental design with post test only control group design. The study divided into 8 groups: 1 normal control, 1 positive control, 1 negative control, and 5 treatments  grups  by  giving  cocoa  ethanol  extract  with  concentration  20%,  2%,  0.2%,  0.02%,  0.002%.  The observation  was  made  by  calculating  the  percentage  number  of  firing  nematocysts.  The  result  showed  average percentage of firing nematocyst in the normal control group was 42.50 ± 3.18, positive control group was 37.97 ± 5.57, negative control group was 52.44 ± 2.98, and treatment group which given with cocoa ethanol extract 20%, 2%, 0.2%, 0.02%, 0.002% were 48.24 ± 5.37; 40.62 ± 7.10; 29.45 ± 5.39; 37.60 ± 9.78; 41.11 ± 3.92, respectively. The One  Way Annova  statistical results test  show  significance value 0.001 (p≤0.05). The conclusion of this  study was  the  cocoa  ethanol  extract  with  concentration  0.2%  has  most  potential  to  inhibit  the  jellyfish  (P.  utriculus) nematocyst tubule firing in vitro.
Keywords : Physalia utriculus, cocoa, toxin, jellyfish

## Pendahuluan
Terdapat 100 dari 10.000 spesies ubur-ubur di dunia diketahui  berbahaya  bagi  manusia  (Cegolon et  al ., 2013;  Duarte et  al .,  2014).  Diperkirakan  150  juta kasus envenomasi akibat sengatan ubur-ubur terjadi setiap  tahun  secara  global.  Di  Indonesia  khususnya, selama  kurun  waktu  2005  hingga  2009  didapati laporan sebanyak 13 kasus envenomasi ubur-ubur, 7 diantaranya  diakibatkan  oleh Physalia  utriculus ( Bluebottle )  yang  setiap  kasusnya  telah  mengenai puluhan  hingga  ratusan  korban.  Tercatat  tahun 2008,  terdapat  2  korban  jiwa  di  Kabupaten Situbondo,  Jawa  Timur  dan  1  korban  jiwa  berlokasi di  Kecamatan  Jebus,  Kepulauan  Bangka  Belitung (Mujiono,  2010).  Envenomasi  ubur-ubur  terjadi akibat proses firing tubul nematosista.
Firing tubul  berfungsi  untuk  melumpuhkan  mangsa dan  sebagai  mekanisme  pertahanan  diri.  Kendati firing tubul  nematosista  merupakan  reaksi  fisiologis yang menguntungkan bagi ubur-ubur, sengatan yang diakibatkan  menjadi  suatu  permasalahan  penting dalam  bidang  toksikologi  karena  merugikan manusia. Firing tubul spesies Physalia utriculus perlu diwaspadai  karena  dapat  menembus  lapisan integumen hanya dalam waktu 3 mili detik sehingga menyebabkan  gangguan  sistemik  secara  cepat  dan tiba-tiba dengan berbagai tingkat keparahan berupa rasa gatal, hemolisis, sitolisis, neurotoksik, kardiotoksik, bahkan hingga berefek letal (Slaughter et al., 2009; Kitatani et al., 2015; Calton et al ., 1978; Hessinger dan Lenhoff, 1988; Alam dan Qasim, 1991; Tibballs et al., 2011). Pelbagai cara penanggulangan telah  dilakukan  sedari  onset  pertama  sengatan dengan  harapan  dapat  menyelamatkan  kehidupan dan  mencegah  suatu  keparahan  melalui  pemberian asam  asetat  (cuka),  etanol,  natrium  bikarbonat, alumunium  sulfat,  air  hangat,  air  dingin,  air  laut, bahkan  urin  (Giordano et  al .,  2005;  Loten et  al ., 2006;  Yoshimoto  dan  Yanagihara,  2002;  Wilcox  dan Yanagihara, 2016; Bais et al ., 2017; Remigante et al ., 2018).
Dekade  ini  penelitian  obat  berbasis  bahan  herbal kian  dikembangkan.  Salah  satu  tumbuhan  yang dikenal  dan  terbukti  memiliki  banyak  khasiat  di bidang kesehatan ialah kakao ( Theobroma cacao L.). Kakao,  terutama  bijinya,  memiliki  persentase kandungan  fitokimia  yang  melimpah  apabila dibandingkan dengan komponen lainnya  (Belitz dan Grosch, 1999). Meskipun memiliki banyak kandungan  fitokimia,  hanya  senyawa  polifenol ( procyanidins, (─)- epicatechin ,  dan catechins ),
mineral  (Ca 2+ ,  Zn,  dan  Co), dan  asam  organik  (asam asetat, asam sitrat, dan asam oksalat) yang terbukti dapat  memengaruhi  mekanisme firing (Lubbock et al .,  1981;  Lubbock  dan  Amos,  1981;  Salleo et  al ., 1996; Novak et al., 1993; Morabito et al ., 2014).
Pemanfaatan  ekstrak  etanol  biji  kakao  berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai pengobatan  lini  pertama  sengatan  ubur-ubur.  Tata laksana  dengan  pemberian  obat  alternatif  ekstrak etanol  biji  kakao  diharapkan  dapat  menjaga integritas  sel  nematosista  supaya  racun  tidak mengalami  eksositosis.  Belum  ada  penelitian maupun  jurnal  yang  membahas  pemanfaatan ekstrak  tersebut  sebagai  inhibitor firing tubul nematosista. Oleh sebab itu, penelitian ini bertujuan untuk  mengetahui  potensi  ekstrak  etanol  biji  kakao ( T.  cacao L.)  terhadap  penghambatan firing tubul nematosista racun Physalia utriculus secara in vitro .

## Metode Penelitian
Jenis  penelitian  yang  digunakan  ialah true experimental  design dan  rancangan  penelitian  yang digunakan  ialah post  test  only control group design . Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium  Kimia Fakultas  Teknologi  Hasil  Pangan  Politeknik  Negeri Jember dan Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran  Universitas  Jember  pada  bulan  Januari 2019.  Subjek  yang  digunakan  oleh  peneliti  berupa racun  ubur-ubur  ( Physalia  utriculus )  yang  disimpan dalam  bentuk  kristal  kemudian  dilarutkan  dengan ringer laktat hingga didapati konsentrasi 100 mg/ml. Pada  penelitian  ini  secara  keseluruhan  terdapat  32 sampel  yang  dibagi  menjadi  8  kelompok,  yaitu kelompok  kontrol  normal  (N)  dengan  air  laut, kelompok  kontrol  positif  (K+)  dengan  asam  asetat 5%,  kelompok  kontrol  negatif  (K-)  dengan isopropanolol, dan 5 kelompok perlakuan (P) dengan pemberian  ekstrak  etanol  biji  kakao  ( Theobroma cacao L.) berturut-turut  konsentrasi 20%; 2%; 0,2%; 0,02%;  0,002%.  Penelitian  ini  telah  mendapat persetujuan  uji  kelayakan  etik  dari  Komisi  Etik Fakultas Kedokteran Universitas Jember.
Variabel bebas dalam penelitian ini ialah konsentrasi ekstrak  etanol  biji  kakao  ( T.  cacao L.)  yang  terdiri atas 5 konsentrasi, yaitu 20%, 2%, 0,2%, 0,02%, dan 0,002%.  Variabel  terikat  dalam  penelitian  ini  ialah jumlah nematosista yang mengalami firing .
Penelitian  dilakukan  dengan  menghomogenisasi setiap sampel menggunakan vortex selama 10 detik. Seluruh  sampel  dikondisikan  dalam  suhu  ruang.
Setelah  homogen,  sampel  diteteskan  pada object glass kemudian ditutup cover slide 18x18 mm 2 . Pada pengamatan  ini  menggunakan  lapang  pandang seluas  9x18  mm 2 dari  total  luas cover  slide .  Sampel diamati  menggunakan  mikroskop  cahaya  (Olympus CKX31,  perbesaran  200x)  yang  dilengkapi  kamera digital  (AmScope  MU500-HS)  pada  bagian  lensa okulernya.  Jumlah  nematosista  yang  mengalami firing dihitung  dengan  memasukkan  gambar  yang telah  dikalibrasi  pada  aplikasi  AmScope (Kitatani et al. ,  2015;  Jouiaei et  al. ,  2015;  Yanagihara et  al ., 2016).  Teknik  pengumpulan  data  dilakukan  secara eksperimental  laboratoris.  Nilai  rata-rata  diperoleh dari  hasil  penghitungan  persentase  jumlah firing tubul  nematosista  racun Physalia  utriculus yang berkonsentrasi 100 mg/ml .

## Hasil Penelitian
Macam-macam  gambaran  mikroskopik  nematosista intak  maupun  nematosista  yang  mengalami firing pasca  diberi  perlakuan  dapat  diamati  pada  Gambar 1. Hasil penghitungan jumlah firing tubul nematosista  pada  masing-masing  kelompok  dapat dilihat pada Tabel 1 dan Gambar 2.
(a) dan (b) adalah nematosista intak sedangkan (c) dan (d) adalah nematosista yang mengalami firing tubul.
Gambar 1. Macam-macam  penampakan  nematosista intak dan nematosista yang mengalami firing tubul
Uji  normalitas  dan  uji  homogenitas  menunjukkan nilai  signifikan  (p>0,05)  yang  menunjukkan  bahwa data  penelitian  terdistribusi  normal  dan  memiliki varian sama. Uji One Way ANOVA menunjukkan nila signifikan  0,001  (p<0,05)  yang  berarti  bahwa terdapat perbedaan jumlah firing tubul nematosista
secara  bermakna  pada  masing-masing  kelompok. Pada  uji Post  Hoc  Bonferroni menunjukkan  nilai signifikan  0,000  (p<0,05)  antara  kelompok  kakao 0,2%  (P3)  dengan  kelompok  isopropanolol  (K-)  dan juga  antara  kelompok  asam  asetat  5%  (K+)  dengan kelompok isopropanolol (K-) yang menunjukkan nilai signifikansi sebesar 0,048 (p<0,05).
Tabel 1.  Rata-rata dan standar deviasi jumlah firing tubul nematosista setiap kelompok (%) No. Kelompok Rata-rata ± Standar Deviasi (%) 1. Normal 42,50 ± 3,18 2. K Positif 37,97 ± 5,57 3. K Negatif 52,44 ± 2,98 4. Kakao 20% 48,24 ± 5,37 5. Kakao 2% 40,62 ± 7,10 6. Kakao 0,2% 29,45 ± 5,39 7. Kakao 0,02% 37,60 ± 9,78 8. Kakao 0,002% 41,11 ± 3,92
Gambar 2.  Grafik  hasil  rata-rata  dan  standar  deviasi jumlah firing tubul  nematosista  setiap kelompok (%)

## Pembahasan
Asam  asetat  5%  atau  cuka  telah  digunakan  sebagai standar  pertolongan  pertama  pada  kasus  sengatan ubur-ubur selama kurun waktu 40 tahun (Yanagihara et  al .,  2016).  Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa asam  asetat  5%  maupun  ekstrak  kakao  memiliki pengaruh  yang  signifikan  terhadap  penghambatan firing tubul  nematosista  racun  ubur-ubur  ( Physalia utriculus )  secara in  vitro .  Berdasar  hasil  analisis statistik  kelompok  P3  (kakao  0,2%)  memiliki  nilai rata-rata firing tubul  nematosista  lebih  rendah  dari pada kelompok kontrol positif (asam asetat 5%).
Kandungan  fitokimia  dalam  biji  kakao  dan  terbukti dapat  memengaruhi  mekanisme firing tubul,  yaitu polifenol  ( procyanidins, (─)- epicatechin , catechins ), mineral  (Ca 2+ ,  Zn,  Co),  dan  asam  organik  (asam asetat,  asam  sitrat,  asam  oksalat)  (Lubbock  dan Amos,  1981;  Salleo et  al .,  1996;  Novak et  al., 1993; Morabito et al ., 2014).
Kakao  yang  dimanfaatkan  dalam  bentuk  ekstrak etanol  biji  kakao  dan  diaplikasikan  sebagai  terapi kuratif  sengatan  ubur-ubur  dapat  menghambat firing oleh  karena  memiliki  efek  antioksidan  dan sitoproteksi (Andujar et al. , 2012; Oteiza et al ., 2005; Engel et  al .,  2002).  Efek  antioksidan  yang ditimbulkan  oleh  senyawa  polifenol  bekerja  dengan menurunkan  produksi  nitrit  oxida  (NO)  sehingga menyebabkan  semakin  sedikit  NO  yang  berikatan dengan  reseptor  silia  atau  cnidosit  di  permukaan membran  nematosista.  Senyawa  polifenol  dalam ekstrak  etanol  biji  kakao  juga  dapat  berikatan dengan nematocyst  outer  wall  antigen (NOWA) (materi penyusun dinding luar) sehingga memberikan efek sitoproteksi terhadap nematosista dari  stimulus  luar  yang  bersifat  destruktif (Tarahovsky et al. , 2008; Oteiza et al ., 2005; Engel et al .,  2002).  Penghambatan firing tubul  nematosista juga  dapat  ditimbulkan  oleh  komponen  mineral serta keadaan pH asam oleh karena komponen asam organik  dalam  ekstrak  kakao  tersebut.  Mineral  dan asam  organik  bekerja  dengan  cara  mengeblok  dan mengganggu  sistem  transpor  kanal  ion  membran nematosista.  Keadaan  asam  juga  mengakibatkan nematosista mengalami kolaps sehingga mengurangi kemampuan firing nya (Morabito et al ., 2014).

## Kesimpulan
Kesimpulan penelitian ini adalah pemberian ekstrak etanol  biji  kakao  ( Theobroma  cacao L.)  dengan konsentrasi  0,2%  paling  berpotensi  menghambat firing tubul  nematosista  racun  ubur-ubur  ( Physalia utriculus ) secara in vitro .

## Daftar Pustaka
Alam JM dan Qasim R. 1991. Toxicology of Physalia’s (Portugese  man-o’war)  Venom .  Pakistan Journal  of  Pharmaceutical  Sciences.  4(2): 159–168.
Andujar  I,  et  al.  2012. Cocoa  Polyphenols  and  Their Potential  Benefits  for  Human  Health .
Oxidative  Medicine  and  Cellular  Longevity. 2012: 1–23.
Bais  DS,  et  al.  2017. Envenomation  with  Skin Manifestations and Treatments . Toxicol Open Access. 3(3): 132.
Belitz HD dan Grosch W. 1999. Food Chemisty . Edisi 2. New York: Springer.
Calton  GJ,  Burnett  JW,  dan  Vader  W.  1978. A  Study of  the  Nematocyst  Venoms  of  the  Sea Anemone,  Bolocera  Tuediae .  Toxicon.  16(5):
443–451.
Cegolon  L,  et  al.  2013. Jellyfish  Stings  and  Their Management:  A  Review .  Marine  Drugs. 11(12): 523–550.
Duarte  CM,  Pitt  KA,  dan  Lucas  CH.  2014.
Introduction:  Understanding  Jellyfish  Blooms. Dalam  Jellyfish  Blooms .  Edisi  1.  Editor  K.  Pitt dan Lucas C. Dordrecht: Springer.
Engel  U,  et  al.  Holstein.  2002. NOWA,  a  Novel Protein  with  Minicollagen  Cys-Rich  Domains, is Involved in Nematocyst Formation in Hydra .
Journal of Cell Science. 115: 3923–3934.
Giordano AR, Vito L, dan Sardella PJ. 2005. Complication  of  a  Portuguese  Man-of- War  Envenomation  to  the  Foot:  A  Case Report .  The  Journal  of  Foot  and  Ankle Surgery. 44(4): 297–300.
Hessinger DA dan Lenhoff HM. 1988. The Biology of Nematocysts . Edisi 1. Philadelphia: Elsevier.
Jouiaei  M,  et  al.  2015. Firing  the  Sting:  Chemically Induced  Discharge  of  Cnidae  Reveals  Novel Proteins  and  Peptides  from  Box  Jellyfish (Chironex  fleckeri)  Venom .  Toxins.  7(3):  936– 950.
Kim  J,  et  al.  2014. Cocoa  Phytochemicals:  Recent Advances  in  Molecular  Mechanisms  on Health .  Critical  Reviews  in  Food  Science  and Nutrition. 54(11): 1458–1472.
Kitatani  R,  et  al.  2015. Length  is  Associated  with Pain:  Jellyfish  with  Painful  Sting  Have  Longer Nematocyst  Tubules  than  Harmless  Jellyfish . PLOS ONE. 10(8): e0135015.
Loten  C,  et  al.  2006. A  Randomised  Controlled  Trial of  Hot  Water  (45  Degrees  C 0 )  Immersion Versus  Ice  Packs  for  Pain  Relief  in  Bluebottle Sting s. Med J Aust. 184(7): 329–33.
Lubbock R, Gupra BL, dan Hall TA. 1981. Novel Role of  Calcium  in  Exocytosis:  Mechanism  of Nematocyst  Discharge  as  Shown  by  X-Ray Microanalysis . Cell Biology. 78(6): 3624–3628.
Lubbock  R  dan  Amos  WB.  1981. Removal  of  Bound Calcium  from  Nematocyst  Contents  Causes Discharge . Nature. 290: 500–501.
Morabito  R,  et  al.  2014. Heavy  Metals  Affect Nematocysts Discharge Response and Biological  Activity  of  Crude  Venom  in  the Jellyfish Pelagia noctiluca (Cnidaria, Scyphozoa) . Cellular Physiology and
Biochemistry. 34(2): 244–254.
Mujiono N. 2010. Jellyfish Sting: An Indonesian Case Report . Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan. 2(1): 1–9.
Novak I,  et  al.  1993. Advances  in  Comparative  and Environmental  Physiology:  Mechanics  of Nematocyst  Discharge .  Edisi  15.  Springer. 165: 45–76.
Oteiza  PI,  et  al.  2005. Flavonoid-Membrane Interactions:  A  Protective  Role  of  Flavonoids at  the  Membrane  Surface? Clinical  & Developmental Immunology. 12(1): 19–25.
Remigante  A,  et  al.  2018. Impact  of  Scyphozoan Venoms  on  Human  Health  and  Current  First Aid Options for Stings . Toxins. 10(4): 133.
Salleo  A,  et  al.  1996. The  Discharge  Mechanism  of Acontial Nematocytes Involves the Release of Nitric  Oxide .  The  Journal  of  Experimental Biology. 199: 1261–1267.
Slaughter  RJ,  et  al.  2009. New  Zealand’s  Venomous Creatures . The New Zealand Medical Journal.
122(1290): 83–97.
Tarahovsky  YS.  2008. Plant  Polyphenols  in  Cell-Cell
Interaction and Communication . Plant
Signaling & Behavior. 3(8): 609–611.
Tibballs  J,  et  al.  2011. Immunological  and
Toxinological  Responses  to  Jellyfish  Stings . Inflammation  &  Allergy-Drug  Targets.  10: 438–446.
Wilcox CL dan Yanagihara AA. 2016. Heated Debates: Hot-Water Immersion or Ice Packs as First Aid for  Cnidarian  Envenomations? Toxins  (Basel). 8(4): 97.
Yanagihara  AA,  et  al.  2016. Experimental  Assays  to Assess  the  Efficacy  of  Vinegar  and  Other Topical  First-Aid  Approaches  on  Cubozoan (Alatina  alata)  Tentacle  Firing  and  Venom Toxicity . Toxins. 8(1): 1–21.
Yoshimoto  CM  dan  Yanagihara  AA.  2002. Cnidarian (Coelenterate)  Envenomations  in  Hawai'i Improve  Following  Heat  Application .  Trans  R Soc Trop Med Hyg. 96(3): 300–3.