## TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DAN APLIKASINYA DALAM EKSPLORASI MIKROBA LAUT
Dedi Noviendri *)

## ABSTRAK
Teknologi  DNA rekombinan  merupakan  teknik  penggabungan  DNA  dari  spesies yang  berbeda sehingga  akan  diperoleh organisme  baru  dengan  sifat-sifat  yang  diinginkan. Pada  pengembangan bioteknologi  kelautan  dan  perikanan,  teknik  DNA  rekombinan  ini  dapat  digunakan  antara  lain untuk  melakukan  eksplorasi  potensi  dan  biodiversitas  organisme  laut,  seperti  mikroba  laut. Mikroba  laut  yang  sebelumnya  hanya  merupakan  kekayaan  alam  laut  yang  potensial  dan  belum memberikan  nilai  tambah,  maka  dengan  teknologi  DNA  rekombinan  dapat  ditingkatkan  nilai tambahnya  untuk  menghasilkan  produk  yang  sangat  prospektif.  Secara  garis  besar,  teknologi DNA  rekombinan  (rekayasa  genetika)  melibatkan  penyisipan  informasi  genetik  baru  ke  dalam organisme,  biasanya  bakteri,  untuk  memberikan  kemampuan  baru.  Metode  ini  tidak  mengikuti rangkaian  prosedur  yang  pasti.  Pemilihan  metode  bergantung  kepada  gen  mana  yang  akan dipindahkan  dan  jenis  organisme  mana  yang  akan  menerima  informasi  genetik  baru.  Pilihan tersebut  bergantung  pada  sampai  sejauh  mana  keterlibatan  pilihan  pribadi  ilmuwan  yang bersangkutan.
KATA KUNCI:   teknologi DNA rekombinan, transformasi, kloning DNA
*) Peneliti  pada Balai  Besar  Riset Pengolahan  Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan dan  Perikanan

## PENDAHULUAN
Tingginya biodiversitas dan kelimpahan mikroba laut menunjukkan potensinya sebagai sumber yang paling menjanjikan dan memberikan peluang besar kepada  ahli-ahli  bioteknologi  kelautan  untuk menemukan  produk  alami  yang  bernilai  ekonomi. Menurut Dahuri (2003), khusus tentang biodiversitas laut, terdapat tidak kurang dari 782 spesies alga, 12 spesies lamun, 38 spesies mangrove , 850 spesies spons, 210 spesies karang lunak, serta ratusan ribu spesies berbagai biota lainnya, baik makro maupun mikro yang merupakan kekayaan alam lautan Indo- nesia.  Selain  spesies-spesies  tersebut,  kelompok organisme  yang  masih  sedikit  dieksplorasi  dan didayagunakan adalah berbagai jenis mikroba laut. Semua  itu  merupakan  potensi  luar  biasa  sebagai sumber  pangan,  obat-obatan,  bahan  diagnostika, maupun aneka produk industri bernilai ekonomi tinggi.
Sejak ditemukannya enzim endonuklease restriksi yang dapat mengkatalisis pemotongan molekul DNA pada bagian atau tempat spesifik pada tahun 1971, maka lahirlah teknologi baru dalam bidang biologi molekuler yang disebut teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika (Murdiyatmo, 1992). Teknologi DNA rekombinan merupakan teknik penggabungan DNA  dari  spesies  yang  berbeda  sehingga  akan diperoleh  organisme  baru  dengan  sifat-sifat  yang diinginkan  (Hala,  1999).  Pada  pengembangan bioteknologi  kelautan  dan  perikanan,  teknik  DNA rekombinan  ini dapat  digunakan  antara lain  untuk eksplorasi potensi dan biodiversitas organisme laut.
Organisme laut (dalam hal ini mikroba laut) yang sebelumnya hanya merupakan kekayaan alam laut yang potensial dan belum memberikan nilai tambah, maka  dengan  teknologi  DNA  rekombinan  dapat ditingkatkan nilai tambahnya menjadi produk yang sangat prospektif. Salah satu contohnya adalah dari suatu mikroorganisme (mikroba laut), dapat diisolasi gen-gen fungsionalnya yang menyandikan satu atau lebih  enzim-enzim  yang  potensial  yang  dapat digunakan di dalam dunia medis. Adapun enzim-enzim yang  dipandang  penting  di  dalam  dunia  medis  di antaranya adalah protease, lisozim, lipase, invertase, hem iselulase,  kol agenase,  glukoam inase, dekstranase dan katalase (Suhartono, 1989).
Dengan  kemajuan  teknologi  molekuler  ini, perpindahan gen dapat terjadi antar organisme yang sama sekali  tidak berkerabat dekat,  misalnya  gen manusia dipindahkan ke bakteri atau gen manusia dipindahkan  ke  ternak  babi  dan  lain  sebagainya (Muladno, 2002). Kemungkinan memindahkan gen dari satu organisme ke organisme lain merupakan prospek yang  sangat  memikat,  karena  rekayasa  genetika dapat  m engurangi  biaya  dan  m eningkat kan penyediaan  sejumlah besar  bahan  yang  sekarang dipergunakan  di    dalam  kedokteran,  f armasi (Murdiyatmo, 1992), pertanian, dan industri (Prentis, 1990), maupun bidang kelautan.

## TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
Berhasilnya suatu teknik DNA rekombinan sangat didukung oleh cara-cara bagaimana kita menangani,
Tabel 1. Komponen-komponen dari suatu eksperimen kloning
Sumber :  Stanfield et al. (1997)
mengembangkan  mikroorganisme  atau  fage  dari seleksi/kloning  dari  beberapa  strain  bakteri  yang digunakan dalam sistem ini (Artama, 1991). Menurut Brown (1991), bahwa molekul DNA plasmid dan fage mempunyai sifat-sifat dasar yang dibutuhkan sebagai vektor kloning.  Namun sifat-sifat ini tidak  berguna tanpa  adanya  teknik-teknik  eksperimen  untuk manipulasi  molekul  DNA  di  dalam  laboratorium. Langkah-langkah  dasar  dalam  kloning  gen/DNA membutuhkan beberapa keterampilan manipulasi. Beberapa keterampilan dasar yang diperlukan untuk melakukan  kloning  gen/DNA  secara  sederhana adalah: preparasi sampel DNA murni, pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi, analisis ukuran fragmen DNA, penggabungan molekul DNA dengan enzim ligase, memasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang (cara yang paling umum adalah dengan cara transformasi), dan identifikasi sel yang mengandung molekul DNA rekombinan hasil kloning.

## Komponen Eksperimen Kloning
Bila melakukan suatu eksperimen kloning, maka ada lima komponen utama yang harus dipenuhi agar suatu  eksperimen  dapat  berjalan  dengan  baik. Komponen-komponen yang harus dipenuhi tersebut adalah DNA donor ( insert ), endonuklease restriksi, vektor, DNA ligase, dan sel inang ( host cell ). Fungsi dari masing-masing komponen tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.
Dari kelima komponen eksperimen kloning yang disebutkan pada Tabel 1, hanya dua topik yang akan dijelaskan  pada  tulisan  in  mengingat  urgensinya
kepentingannya. Dua komponen eksperimen kloning tersebut adalah endonuklease restriksi dan vektor.

## Endonuklease restriksi
Endonuklease restriksi adalah enzim bakteri yang mengenal sekuen nukleotida spesifik dalam suatu molekul DNA double-stranded , dan memisahkan DNA pada lokasi tersebut. Enzim-enzim ini memotong DNA ke  dalam  fragmen-fragmen  dari  berbagai  ukuran, tergantung dari jumlah waktu situs pengenalan enzim yang berulang dalam molekul. Endonuklease restriksi merupakan  enzim  yang  umumnya  diisolasi  dari mikroorganisme prokariotik (Artama, 1991).
Menurut  Brown  (1991),  bahwa  ada  tiga  jenis endonuklease  restriksi  yang  telah  dikenal.  Ketiga enzim tersebut masing-masing dibedakan oleh cara kerjanya  yang  agak  berbeda  satu  sam a  lain. Endonuklease tipe I dan III agak kompleks dan hanya mempunyai  peran  yang  sangat  terbatas  dalam rekayasa  genetika.  Di  lain  pihak,  endonuklease restriksi tipe II adalah enzim pemotong yang begitu penting dalam rekayasa genetika (kegiatan kloning gen). Endonuklease tipe II  yang digunakan dalam eksperim en  kloning  memiliki  panjang  sekuen pasangan    basa  pengenalan  dari  4  sam pai  8 nukleotida.  Enzim ini dinamai berdasarkan sumber spesies    bakteri    asal  isolasinya.  Sebagai  contoh, endonuklease      restriksi Eco RI   artinya    adalah enzim restriksi  pertama   yang  diisolasi  dari  bakteri Escherichia coli strain R, dan enzim Hind III artinya, enzim  restriksi  ketiga  yang  diisolasi  dari  bakteri Haemophilus  influenzae  strain D  (Stanfield et  al., 1997) (Tabel 2).
Komponen kloning Fungsi DNA donor ( insert ) Sumber dari DNA atau gen yang diklon, salah satunya berasal dari mikroba laut Endonuklease restriksi Enzim digunakan untuk memotong DNA donor dan vektor pada lokasi spesifik, sehingga DNA donor dapat disambungkan ke dalam vektor Vektor Plasmid atau bakteriofage yang digunakan untuk mengintroduksi gen untuk diklonkan ke dalam suatu sel inang yang cocok DNA ligase Enzim yang digunakan untuk menggabungkan ujung sambungan ( splice ) dari vektor dan DNA donor, dan kemudian membentuk suatu vektor rekombinan Sel inang ( host cell ) Biasanya
suatu bakteri atau yeast. Tempat
diintroduksikan vektor rekombinan ke dalam sel inang.

## Tabel 2. Beberapa enzim restriksi dan situs pengenalannya
Na m a  e nzim Sum be r ba kte ri Situs pe nge na la nnya Alu I Arthrob acter luteus AG*CT Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G*GATCC Cla I Caryphanon latum AT*CGAT Eco RI Escherichia coli G*AATTC Hae III Haemophilus aegyptius GG*CC Hind III Haemophilus influenzae A*AGCT Kpn I Kleb siella pneumoniae GGTAC*C Not I Nocardia otidis-caviarum GC*GGCCGC Pst I Providencia stuartii
CTGCA *G
Sejak awal tahun 1970an, kira-kira sudah 300 jenis enzim restriksi telah ditemukan (Prentis, 1990). Enzim restriksi  ini  memiliki  dua  sifat  yang  membuatnya sangat  berm anf aat .  Sif at  pertam a  adalah kekhususannya.  Dalam hal ini tiap enzim mengenal dan memotong hanya urutan nukleotida tertentu pada DNA.  Sifat  kedua  adalah  kemampuan  sebagian mereka untuk menghasilkan potongan runcing atau dikenal dengan ujung bangku/ujung lengket ( sticky ends ) ketika mereka memotong DNA yang beruntai ganda (Marx, 1991).
Kebanyakan endonuklease restriksi akan berfungsi secara memadai pada pH 7,4 dan dalam kekuatan ionik,  biasanya  NaCl  serta  semua  endonuklease restriksi tipe II membutuhkan Mg 2+ untuk berfungsi (Brown,  1991;  Artama,  1991).  Selain  itu  aktivitas endonuklease tipe II ini seringkali dipacu pula oleh senyawa pereduksi seperti  2-merkaptoetanol atau ditiotretiol (Suhartono, 1989). Membuat kondisi yang tepat untuk aktivitas enzim adalah penting misalnya konsentrasi NaCl atau Mg 2+ , apabila tidak tepat maka kondisi  tersebut  dapat  menyebabkan  tidak  saja penurunan  aktivitas,  tetapi  dapat  juga  mengubah spesifisitas enzim, sehingga pemotongan DNA terjadi pada urutan pengenal tambahan yang tidak baku.

## Vektor
Sejumlah vektor dari prokariotik, eukariotik dan vektor sintesis telah banyak digunakan dalam sistem kloning DNA. Secara garis besar ada 4 vektor yang sering  digunakan  dalam  proses  pengklonan  gen (sebagai  v ektor  kloning),  yaitu  plasmid,  fage, kromosom buatan dari khamir (YAC= yeast artificial chromosome ) (Suharsono, 2000) dan kosmid (Artama, 1991). Menurut Suharsono (2000), penggunaan jenis
vektor tergantung dari tujuan pengklonan. Pembuatan pustaka  cDNA  biasanya  menggunakan  plasmid sebagai vektornya, sedangkan pembuatan pustaka genom  yang  mengandung  fragmen  DNA  besar biasanya menggunakan fage, kosmid atau YAC.
Vektor kloning harus memiliki situs pengenalan endonuklease  restriksi,  dimana  informasi  genetik dapat  disisipkan.  Beberapa  vektor  kloning  telah direkayasa untuk mengandung suatu situs  kloning ganda atau dikenal multiple cloning site (MCS), yang masing-masing mengandung beberapa situs restriksi yang  berbeda.  Karakteristik  penting  yang  harus dimiliki oleh suatu vektor kloning adalah: (1) stabil dalam  sel  inang,  (2)  mengandung  gen  resistensi antibiotik tertentu, sehingga memudahkan seleksi dari gen rekombinan (Artama, 1991), (3) memiliki titik ori (sebagai titik awal replikasi), sehingga bisa bereplikasi atau multiplikasi sendiri. Dengan kata lain, plasmid tersebut dapat berbiak autonom (Marx, 1991) serta dapat mengontrol replikasinya sendiri, (4) memiliki daerah  restriksi  atau  MCS,  yang  dapat  dipotong dengan  enzim  restriksi  endonuklease  tertentu (Artama, 1991), (5) berukuran kecil, (6) dipotong pada situs tunggal oleh endonuklease restriksi, (7) tidak ditransfer dengan konjugasi, (8) cirinya dengan mudah dideteksi, dan (9) dengan mudah  diisolasi dari  sel (Stanfield et al ., 1997).
Kem udian berdasar kan k em am puan memperbanyak diri secara alami maka plasmid dapat dibagi dua, yaitu: (1) plasmid stringent , yaitu plasmid dengan kontrol replikasi ketat, dimana hanya terdapat 1 kopi plasmid  tiap   genom  bakteri,  (2)   plasmid relaxed , yaitu plasmid dengan kontrol replikasi yang tidak  begitu  ketat,  sehingga  dalam  satu  sel  dapat dijumpai 1-20 kopi plasmid (Artama, 1991). Jumlah
Sumber :  Stanfield et al. (1997)
kopi suatu plasmid dapat merupakan relaxed-control (pengendalian yang lemah), yaitu dapat bereplikasi antara 10-200 kopi setiap sel. Tipe plasmid ini berguna untuk penelitian DNA rekombinan karena memiliki jumlah kopi yang banyak ( high copy number ). Plas- mid ini bereplikasi tidak tergantung pada replikasi DNA kromosom  sel  inang (Nicholl, 1994).  Sedangkan str ingent  c ontr ol (pengendalian  yang  kuat) memperbanyak diri dengan kecepatan yang hampir sama dengan kromosom selnya, dan terdapat hanya dalam  satu  atau  beberapa  kopi  plasmid  per  sel. Jumlah kopi ini menunjukkan jumlah molekul plas- mid masing-masing ditemukan dalam satu sel bakteri (Brown, 1991).

## Penanda Resistensi Antibiotik
Untuk mengetahui berbagai aktivitas bakteri di habitat (lingkungannya), baik itu bakteri hasil rekayasa genetika maupun bukan hasil rekayasa genetika, perlu adanya penanda molekuler dengan  menggunakan gen yang mudah di assai penampilan dan  ekspresinya. Gen merupakan suatu segmen DNA yang mampu menyandikan  protein  (enzim).  Banyak  penanda molekuler  yang  dapat  digunakan  untuk  menandai bakteri. Gen penanda ( marker gene ) tersebut nantinya dapat juga berperan sebagai gen pelapor ( reporter
gene )  yang  akan  menunjukkan  aktivitas  bakteri tersebut di habitatnya. Dengan demikian, aktivitas bakteri tersebut di lingkungan dapat dipantau sehingga langkah-langkah  apa  yang  akan  diambil  untuk kegiatan  selanjutnya  dapat  ditentukan  (Wahyudi, 1997).
Di  dalam  laboratorium,  penanda  resistensi antibiotik sering digunakan sebagai suatu selectable marker untuk memastikan bahwa suatu bakteri dalam kultur mengandung gen penyandi antibiotik tertentu (Brown, 1991). Penanda resistensi antibiotik adalah penanda  yang  paling  sering  digunakan  dan  telah banyak dibuat sebagai dasar untuk pengembangan teknik penanda yang lainnya. Keuntungan dari teknik ini adalah dimungkinkan untuk menyeleksi populasi bakteri  yang  hidup dari  bakteri  yang  ditandai,  dan teknik  ini  dapat  dilakukan  hanya  dengan  teknik pencawanan dengan menggunakan  menggunakan antibiotik yang sesuai.

## Transformasi
Secara alami plasmid dapat dipindahkan ke sel inang baru melalui proses konjugasi atau dengan cara lain, tetapi di dalam laboratorium dapat dipindahkan secara  artifisial,  dengan  proses  yang  disebut transformasi,  yaitu  plasmid dimasukkan  ke  dalam
Gambar  1.  Peta  vektor plasmid  pUC18/19 (A),  dan  tahap-tahap  kloning  DNA  (B)
(http://www.accessexcellence.org/AB/GG/plasmid.html).
(A) (B)
bakteri  yang  dibuat  kompeten,  sehingga  untuk sementara dinding sel bersifat permiabel dan dapat dilewati molekul  DNA kecil (Artama,  1991). Untuk memudahkan plasmid masuk ke dalam  sel inang, maka sel inang harus dibuat kompeten terlebih dahulu. Dengan kata lain, sel yang digunakan dalam proses transformasi  ini  biasanya  disebut  dengan  sel kom peten  (Muladno,  2002).  Dalam   proses transformasi, sel kompeten yang dicampur dengan molekul DNA hasil penggabungan  akan mengalami tiga  kemungkinan,  yaitu:  (1)  sel  kompeten  tidak kemasukan molekul DNA apapun, (2) sel kompeten kemasukan DNA vektor yang membawa gen target, dan (3) sel kompeten kemasukan DNA vektor yang membawa  gen  target  (yaitu  DNA  rekombinan) (Muladno, 2002) (Gambar 1B).
Menurut Seno &  Wirahadikusumah (1992), bahwa sel  inang  dapat  dibuat  kompeten  dengan  cara menginokulasi 30 mL media Luria Bertani (LB) dengan 1% biakan E. Coli yang berumur semalam, kemudian dikocok  pada  suhu  30 o C  sampai  pertumbuhan disekitar  fase  log  (±  3  jam).  Pasta  sel  dipisahkan dengan sentrifugasi dingin selama 10 menit pada 8000 rpm, lalu dicuci 2 kali dengan volume yang sama CaCl 2 0,1 mM, serta sentrifugasi lagi dalam kondisi yang sama dan endapan sel dilarutkan dengan ½ volume larutan 30% sukrosa dalam CaCl 2 0,1 mM.
Untuk mendeteksi tingkat keberhasilan terjadinya transformasi, maka perlu dihitung efisiensi transformasi yang  terjadi.  Ef isiensi  transf orm asi  dihitung berdasarkan rumus berikut (Anwar, 1999) :

## Seleksi Biru Putih
Kebanyakan  vektor  kloning  modern,  memiliki suatu MCS dalam gen lacZ . Gen ini dalam keberadaan suatu  induser  seperti  IPTG  (isopropi l- β -D- tiogalak tosida)  ak an  m enghasilkan  enz im β - galaktosidase,  yang  akan  mengkonversi  laktosa menjadi  galaktosa  dan  glukosa.  Enzim  ini  dalam kondisi normal akan disintesis oleh E.coli jika ada laktosa, dan merubah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa (Stryer, 2000). Bagaimanapun, induksi dapat terjadi jika suatu senyawa analog laktosa seperti IPTG digunakan (Nicholl, 1994).
Jika segmen dari DNA donor disisipkan pada si- tus kloning ganda (MCS), dalam hal ini pada posisi gen lacZ , maka tidak akan dihasilkan suatu enzim fungsional yaitu enzim β -galaktosidase. Fenomena ini dikenal dengan dengan insertional inactivation . Hal ini sering digunakan untuk mendeteksi rekombinan- rekombinan dengan metode skrining  yang  dikenal sebagai skrining koloni biru putih ( blue-white colony screening ).
Kemudian plasmid yang dipakai sebagai vektor untuk kloning semula berasal dari plasmid relaxed yang telah dimodifikasi menjadi berbagai jenis plasmid yang terdapat bebas di pasaran seperti pBR322, pUC19 dan derivat-derivatnya. Contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen adalah plasmid pUC18/19 (Gambar 1A). Plasmid ini merupakan pengembangan dari pBR322. Plasmid pUC18/19  mengandung  gen lacZ yang  dapat m enyandikan  enzi m β -galak tosi dase.  Bi la menggunakan  plasmid  pUC18/19  sebagai  vektor, maka  koloni  yang  membawa  plasmid  rekombinan dapat  dideteksi  dengan  menggunakan media tumbuh yang  mengandung  X-gal.  Koloni  bakteri  yang mengandung plasmid pUC18/19 akan berwarna biru karena   plasmid pUC18/19 mengandung gen lacZ yang  dapat    menghasilkan β -galaktosidase.  Oleh karena itu koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC18/19 akan berwarna biru bila ditumbuhkan pada media pertumbuhan yang mengandung X-gal. Hasil pengam atan  k oloni  pada  m edia  t ersebut memperlihatkan  adanya  koloni  berwarna  biru
menunjukkan  terekspresikan    gen lacZ tersebut (Wahyudi,  1997). Warna biru ini disebabkan karena enzim β -galaktosidase  yang disandikan oleh gen lacZ yang  dikandung  pUC18/19  m em punyai kemampuan untuk menghidrolisis X-gal (5-kloro-4- bromo-3-indolil- β -D-galaktopiranosida) suatu substrat kromogenik inert yang tidak berwarna menjadi  derivat indigo yang berwarna biru (Artama, 1991). Enzim ini memecah  X-gal  menjadi  galaktosa  dan  indoksil derivatif. Senyawa indoksil derivatif ini akan teroksidasi dengan adanya udara membentuk senyawa indigo yang berwarna biru. Reaksi hidrolisis senyawa X-gal yang tidak berwarna menjadi  suatu senyawa yang
Efisiensi Transformasi (cfu/µg) Jumlah koloni tumbuh (cfu) ng DNA vector–sisipan 1000 ng 1 µg x FP = x
FP  : Faktor pengenceran cfu : Colony forming unit
berwarna biru dengan adanya enzim β -galaktosidase dapat dilihat pada Gambar 2B.
Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC18/19 telah disisipi oleh DNA asing pada bagian gen lacZ. Dalam hal ini gen lacZ menjadi tidak berfungsi (tidak akan menghasilkan β -galaktosidase)  karena telah disisipi  DNA  asing.  W arna  putih  pada  koloni diakibatkan adanya kerusakan pada gen lacZ yang disisipi gen target. Terbentuknya koloni berwarna putih berarti sel kompeten membawa DNA rekombinan (DNA plasmid dan gen target). Adapun koloni berwarna biru berarti sel kompeten yang tumbuh membawa DNA plasmid  saja  (tidak  disisipi  gen  terget)  (Muladno, 2002) (Gambar 2A).
Dengan kata lain, bila gen lacZ -nya rusak atau dirusak  maka  sel  akan  membentuk  koloni  yang berwarna  putih.  Jadi,  dengan mata  telanjang  bisa disimpulkan bahwa apabila sel bakteri membentuk koloni  berwarna  biru  berarti  gen lacZ -nya  masih berfungsi, sedangkan apabila koloninya berwarna putih gen lacZ -nya  sudah  rusak  dan  tidak  berfungsi (Muladno, 2002). Bentuk ini menurut Nicholl (1994) adalah  dasar  untuk  metode  skrining  rekombinan secara  langsung  menggunakan  X-gal  substrat kromogenik.

## APLIKASI TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
Penggunaan teknologi DNA  rekombinan  untuk eksplorasi  mikroba,  terutama  mikroba  laut  telah banyak dilakukan.  Tujuan dari penggunaan teknologi
ini terhadap mikroba laut bermacam-macam. Seiring dengan penggunaan metode ini dengan tujuan yang bermacam-macam, maka secara tidak langsung ada modifikasi-modifikasi metode yang dilakukan. Metode ini tidak mengikuti rangkaian prosedur yang pasti. Pemilihan metode bergantung kepada gen mana yang akan dipindahkan dan jenis organisme mana yang akan menerima informasi genetik baru. Pilihan tersebut akan  bergantung  pada  sam pai  sejauh  m ana keterlibatan pilihan pribadi ilmuwan yang bersangkutan (Prentis, 1990). Namun pada prinsipnya, teknologi DNA rekombinan yang dilakukan adalah sama.
Dalam prakteknya, penggunaan teknologi ini pada m ikroba  laut  telah  banyak  dilakukan  orang, diantaranya  untuk  konstruksi  pustaka  gen  (Liebl, 2006),  konstruksi  gen  klaster  yang  menyandikan enzim poliketida sintase I (PKS-I) (Grozdanov et al ., 2006), untuk  menemukan  senyawa  metabolit anti- tumor (Calle, 2006), senyawa sitotoksik, (Webb et al ., 2006), inhibitor likopen β -siklase (suatu senyawa antioksidan) (Tofighi et al ., 2006), enzim baru yang memiliki  aktivitas  antimikrobial  (Eck et  al .,  2006), senyawa  eksopolisakarida  (EPS)  baru  (Delbarre- Ladrat et al ., 2006), untuk perbandingan keragaman genetik  (biodiv ersitas)  (Suwanto,  2004),  untuk keperluan bioremediasi, dalam hal ini menemukan dan menghasilkan  mikroba  yang  dapat  mendegradasi tumpahan minyak di laut, selain itu untuk menemukan mikroba penghasil bahan baku plastik biodegradable, contohnya poli- β -hidroksialkanoat (PHA) (Noviendri, 2004).  Jadi  dengan  demikian,  mikroba  laut  yang
(A)
(B)
Gambar  2.    Contoh  seleksi  koloni  bakteri  rekombinan  dengan  menggunakan  X-gal (dikenal dengan seleksi biru putih)(A), Reaksi hidrolisis X-gal oleh enzim β -galaktosidase (B).
semula hanya sebagai penghuni laut yang merupakan kekayaan alam laut potensial, maka dengan adanya teknologi DNA rekombinan dapat ditingkatkan nilai tambahnya untuk menghasilkan suatu produk yang sangat prospektif.
Contoh penggunaan teknologi DNA rekombinan yang telah berhasil dilakukan adalah kloning gen pro- tease Bacillus stearothermophillus DSM297 ke dalam Escherichia coli DH5 alfa (Suhartono et al. , 1995). Adapun  tahap-tahap  kloning  gen  yang  telah
dilakukannya tersebut dapat dilihat pada Gambar 3 dan 4.

## PENUTUP
Pada pengembangan bioteknologi kelautan dan perikanan,  teknologi  DNA  rekombinan  ini  dapat digunakan untuk eksplorasi potensi dan biodiversitas organisme laut. Organisme laut (dalam hal ini mikroba laut) yang sebelumnya hanya merupakan kekayaan
Gambar  3.  Diagram  alir  tahap  isolasi  DNA  kromosom  (A),  dan  isolasi  DNA  plasmid  (B),  (Suhartono et  al., 1995).
Keterangan:
LB          : Luria bertani TE          : Bufer Tris EDTA SDS      : Sodium dodesil sulfat EtOH      : Etanol
(A). Isolasi DNA kromosom B . stearothermophillus
Kultur bakteri ditumbuhkan dalam media LB, semalam
Inokulasi pada media LB yang baru, 4 jam
Kultur disentrifus Endapan disuspensi dalam TE, SDS, proteinase K, selama 1 jam Ditambahkan isopropanol dingin pada supernatannya Ditambahkan campuran fenol/kloroform/isoaminalkohol, dan disentrifus Dicuci dengan alkohol Diendapkan dengan sentrifus, 10’ DNA kromosom yang diperoleh dilarutkan dalam TE Disentrifus 3’, dikeringkan (B). Isolasi DNA Plasmid Koloni pembawa plasmid ditumbuhkan dalam media LB yang mengandung antibiotik yang sesuai Diinkubasi semalam, diendapkan dengan sentrifus selama 2’
Pelet dilarutkan dalam Tris/EDTA/Glukosa
Diinkubasi selama 30’ pada 0 o C
Ditambahkan NaOH/SDS, diinkubasi selama 5’ pada 0 o C
Ditambahkan fenol/kloroform/isoaminalkohol
(25:24:1) kedalam supernatan, diforteks, disentrifus selama 3’ Lapisan atas diambil, ditambahkan EtOH absout dingin, dikocok
Diinkubasi selama 15’ pada -20 o C, disentrifus selama 3’
Pelet dicuci dengan EtOH 70% dingin,
dikeringkan
DNA palsmid yang diperoleh dilarutkan
dalam TE (A). Isolasi DNA kromosom
B . stearothermophillus
Kultur bakteri ditumbuhkan dalam media LB, semalam
Inokulasi pada media LB yang baru, 4 jam
Kultur disentrifus Endapan disuspensi dalam TE, SDS, proteinase K, selama 1 jam Ditambahkan isopropanol dingin pada supernatannya Ditambahkan campuran fenol/kloroform/isoaminalkohol, dan disentrifus Dicuci dengan alkohol Diendapkan dengan sentrifus, 10’ DNA kromosom yang diperoleh dilarutkan dalam TE Disentrifus 3’, dikeringkan (A). Isolasi DNA kromosom B . stearothermophillus
Kultur bakteri ditumbuhkan dalam media LB, semalam
Inokulasi pada media LB yang baru, 4 jam
Kultur disentrifus Endapan disuspensi dalam TE, SDS, proteinase K, selama 1 jam Ditambahkan isopropanol dingin pada supernatannya Ditambahkan campuran fenol/kloroform/isoaminalkohol, dan disentrifus Dicuci dengan alkohol Diendapkan dengan sentrifus, 10’ DNA kromosom yang diperoleh dilarutkan dalam TE Disentrifus 3’, dikeringkan (B). Isolasi DNA Plasmid Koloni pembawa plasmid ditumbuhkan dalam media LB yang mengandung antibiotik yang sesuai Diinkubasi semalam, diendapkan dengan sentrifus selama 2’
Pelet dilarutkan dalam Tris/EDTA/Glukosa
Diinkubasi selama 30’ pada 0 o C
Ditambahkan NaOH/SDS, diinkubasi selama 5’ pada 0 o C
Ditambahkan fenol/kloroform/isoaminalkohol
(25:24:1) kedalam supernatan, diforteks, disentrifus selama 3’ Lapisan atas diambil, ditambahkan EtOH absout dingin, dikocok
Diinkubasi selama 15’ pada -20 o C, disentrifus selama 3’
Pelet dicuci dengan EtOH 70% dingin,
dikeringkan
DNA palsmid yang diperoleh dilarutkan
dalam TE (B). Isolasi DNA Plasmid Koloni pembawa plasmid ditumbuhkan dalam media LB yang mengandung antibiotik yang sesuai Diinkubasi semalam, diendapkan dengan sentrifus selama 2’
Pelet dilarutkan dalam Tris/EDTA/Glukosa
Diinkubasi selama 30’ pada 0 o C
Ditambahkan NaOH/SDS, diinkubasi selama 5’ pada 0 o C
Ditambahkan fenol/kloroform/isoaminalkohol
(25:24:1) kedalam supernatan, diforteks, disentrifus selama 3’ Lapisan atas diambil, ditambahkan EtOH absout dingin, dikocok
Diinkubasi selama 15’ pada -20 o C, disentrifus selama 3’
Pelet dicuci dengan EtOH 70% dingin, dikeringkan
DNA palsmid yang diperoleh dilarutkan dalam TE
Gambar 4.     Diagram alir tahap  pemotongan DNA dengan  enzim restriksi  (A), ligasi DNA  kromosom dan  plasmid (B), dan  transformasi  (C)  (Suhartono et  al., 1995).
Keterangan: SMMLA      : Skim Milk Modified Luria Agar IPTG          : Isopropil- β -D-tiogalaktosida
alam laut yang potensial dan belum memberikan nilai tambah, maka dengan teknologi DNA rekombinan dapat  di tingk atkan  nil ai  tam bahnya  untuk menghasilkan suatu produk yang sangat prospektif.

## DAFTAR PUSTAKA
Anwar,  S.  1999. Pengklonan  Gen-Gen  yang  Diinduksi oleh  Aluminium  pada  Kedelai  (Gly cine  max  (L)
Merryl) . Disertasi Program Pascasarjana. IPB. Bogor .
28 pp.
Artama,  W.  T.  1991. Rekayasa  Genetika .  Pusat  Antar Universitas-Bioteknologi.  UGM,  Jogjakarta.  148  pp.
Brown,  T.  1991. Pengantar  Kloning  Gena .  Yayasan Essentia  Medica,  Yogyakarta.    274  pp.
Calle,    F.    D.  L.    2006.    Drug      discovery    of    marine microorganisms    as    source    of      new    antitumor compounds    at    pharmaMar. Conference : From
(A). Pemotongan DNA dengan dengan enzim restriksi
DNA kromosom atau plasmid, ditambahkan dH 2 O dan bufer yang sesuai untuk endonuklease
Ditambahkan endonuklease restriksi ( EcoR I atau
Hind III)
Suspensi dikocok, diinkubasi pada 37 o C, selama 4- 14 jam
Inkubasi pada suhu 70 o C, selama 20’, dinginkan pada suhu kamar Campuran tersebut siap untuk proses ligasi (B). Ligasi DNA kromoson dan DNA plasmid DNA kromoson atau plasmid yang telah dipotong dengan endonuklease tertentu
Dicampur dengan dH 2 O dan bufer T4 DNA ligans
Suspensi dikocok, inkubasi pada 12-16 o C, semalam
Campuran ligasi siap digunakan untuk proses transformasi
(C). Transformasi
Sel inang (E.Coli) yang telah kompeten
Ditambahkan kedalam 50 uL DNA pada tabung mikro
Campuran diinkubasi selama 30’ pada 0 o C
Campuran dikejutpanaskan selama 2’ pada 42 o C
Segera inkubasi selama 60’ pada 0 o C
Transforman diseleksi pda media SMMLA + IPTG, yang mengandung antibiotik yang sesuai, plus X-gal untuk seleksi biru putih
(A). Pemotongan DNA dengan dengan enzim restriksi
DNA kromosom atau plasmid, ditambahkan dH 2 O dan bufer yang sesuai untuk endonuklease
Ditambahkan endonuklease restriksi ( EcoR I atau
Hind III)
Suspensi dikocok, diinkubasi pada 37 o C, selama 4- 14 jam
Inkubasi pada suhu 70 o C, selama 20’, dinginkan pada suhu kamar
Campuran tersebut siap untuk proses ligasi
(A). Pemotongan DNA dengan dengan enzim restriksi DNA kromosom atau plasmid, ditambahkan dH 2 O dan bufer yang sesuai untuk endonuklease
Ditambahkan endonuklease restriksi ( EcoR I atau
Hind III)
Suspensi dikocok, diinkubasi pada 37 o C, selama 4- 14 jam
Inkubasi pada suhu 70 o C, selama 20’, dinginkan pada suhu kamar Campuran tersebut siap untuk proses ligasi (B). Ligasi DNA kromoson dan DNA plasmid DNA kromoson atau plasmid yang telah dipotong dengan endonuklease tertentu
Dicampur dengan dH 2 O dan bufer T4 DNA ligans
Suspensi dikocok, inkubasi pada 12-16 o C, semalam
Campuran ligasi siap digunakan untuk proses transformasi (B). Ligasi DNA kromoson dan DNA plasmid DNA kromoson atau plasmid yang telah dipotong dengan endonuklease tertentu
Dicampur dengan dH 2 O dan bufer T4 DNA ligans
Suspensi dikocok, inkubasi pada 12-16 o C, semalam
Campuran ligasi siap digunakan untuk proses transformasi
(C). Transformasi
Sel inang (E.Coli) yang telah kompeten
Ditambahkan kedalam 50 uL DNA pada tabung mikro
Campuran diinkubasi selama 30’ pada 0 o C
Campuran dikejutpanaskan selama 2’ pada 42 o C
Segera inkubasi selama 60’ pada 0 o C
Transforman diseleksi pda media SMMLA + IPTG, yang mengandung antibiotik yang sesuai, plus X-gal untuk seleksi
biru putih (C). Transformasi Sel inang (E.Coli) yang telah kompeten
Ditambahkan kedalam 50 uL DNA pada tabung mikro
Campuran diinkubasi selama 30’ pada 0 o C
Campuran dikejutpanaskan selama 2’ pada 42 o C
Segera inkubasi selama 60’ pada 0 o C
Transforman diseleksi pda media SMMLA + IPTG, yang mengandung antibiotik yang sesuai, plus X-gal untuk seleksi biru putih
Functional  Genomics  to  Natural  Products  of  Marine Microorganism .    June      21-24,    2006.    Greifswald, Germany.
Dahuri,  R.  2003. Keanekaragaman  Hayati  Laut .  PT
Gramedia  Pustaka  Utama.  412  pp.
Delbarre-Ladrat,  C.,  Noel.  J.,  Ratiskol.  J.,  Sinquin,  C.,
Dion,  M.  and  Jouault,  S.  C.  2006.  Enzyme  for  The Engineering  of  marine  bacterial  exopolysaccharides.
Conference : From  Functional  Genomics  to  Natural Products of Marine Microorganism . June 21-24, 2006.
Greifswald,  Germany.
Eck,  J.,  Meurer.  G.,  Schulze,  R.,  and  Lorenz,  P.  2006.
Accesing  metagenomes  for  industrial  applications. Conference : From  Functional  Genomics  to  Natural Products of Marine Microorganism . June 21-24, 2006. Greifswald,  Germany.
Grozdanov, L., Fieseler, L., Piel, J. and Hentschel, U. 2006.
Metagenomic    analysis    of    secondary    metabolic gene    clusters      from  marine    sponge  associated microbial  consortia. Conference : From  Functional Genomics          to    Natural        Products    of      Marine Microorganism .          June  21-24,  2006.    Greifswald, Germany.
Hala,  Y.  1999. Penggunaan  Gen  Penanda  Molekular untuk  Deteksi  Pelekatan  dan  Kolonis asi  Vibrio harv ey i  pada  Larva  Udang  Windu  (Penaeus monodon) .  Tesis  Program  Pascasarjana  IPB,  Bogor. 16 pp.
Liebl,    W.    2006.  Extremophiles:    from    genomes    to enzymes. Conference : From  Functional  Genomics to  Natural  Products  of  Marine  Microorganism .  June 21-24,  2006.  Greifswald,  Germany.
Marx, J. L. 1991. Revolusi Bioteknologi . Edisi 1. Yayasan Obor  Indonesia,  Jakarta.  513  pp.
Muladno.  2002. Seputar Teknologi  Rekayasa  Genetika . Pustaka  W irausaha  Muda,  Bogor. 123  pp.
Murdiyatmo,  U.  1992. Kloning  dan  ov er  ek s pres i struktural dehalogenase dari  Pseudomonas cepacia MBA4  pada  E.  c oli. Prosiding  Seminar  Has il Penelitian  dan  Pengembangan  Bioteknologi .  Pusat Penelitian  dan  Pengembangan  Bioteknologi.  LIPI. Bogor. p. 98-109.
Nicholl,    D.  S.  T.  1994. An    Introduction    to    Genetic Engineering . Cambridge University Press,  USA. 168 pp.
Noviendri,  D.  2004. Isolasi  dan  Karakterisasi  Bakteri Penghasil  Poli-â-hidroksialkanoat  (PHA)  Sebagai Bahan Baku Plastik Biodegradabel dan Deteksi Gen
Peny andi  Enzim  PHA  Sintas e .  Tesis  Program Pascasarjana.  IPB.  Bogor.  78  pp.
Prentis,  S.  1990. Bioteknologi  Suatu  Revolusi  Industri yang  Baru .  Erlangga,  Jakarta.  200  pp.
Seno, D.  S.  H  dan W irahadikusumah, M. 1992. Kloning Gen Penisilin G As karta. 279 pp.
Stanfield,  W.  D.,  Colome,  J.  S.  and  Cano,  R.  J.  1997.
Theory and Problems of Molecular and Cell Biology. Schaum’s  outline  series .  McGraw-Hill.  p186-195. Stryer,    L.  2000. Biokimia .  Ed  4.  Vol.  3.  Penerbit  Buku Kedokteran, EGC.  Jakarta. 279  pp
Suharsono,  S.  2000. Penuntun  Praktikum  Pelatihan Teknik Pengklonan Gen dan Pengurutan DNA . Pusat Antar  Universitas IPB,  Bogor. 100  pp.
Suhartono,  M.  T.  1989. Enzim  dan  Biotek nolgi. Departemen  Pendidikan  dan  Kebudayaan.  Dirjen DIKTI. PAU-IPB, Bogor. 322 pp.
Suhartono, M. T., Chandra, K. P., Suwanto, A., Wu, I. M dan  Junaidi,  B.  1995.  Kloning  gen  protease Bacillus stearothermophillus DSM297  ke  dalam Escherichia coli DH5 alfa dan telaah ekspresinya. Lap. Pen. Dikti- Dikbud. PAU-IPB, Bogor. 62 pp.
Suwanto, A.  2004.  Bioteknologi  untuk  menggali  potensi mikroorganisme  laut. Forum  Bioteknologi  Kelautan
dan Perik anan Indones ia: “Optimalisas i Pemanfaatan Sumberday a Laut Melalui
Pengembangan  Bioteknologi  Kelautan  dan Perikanan” ,  Jakarta,  25  Maret  2004.
Tofighi,    H.,      Fazeli,    M.    R.    and    Mirzae,    S.    2006.
Computer  aided  test  and  selection  for  lycpene â- cyclase  inhibitors:  Molecular  docking  of  Structurally diverse herbicidal Inhibitors in Dunaliella salina CCaP 19/18. Conference : From  Functional  Genomics  to Natural Products of Marine Microorganism . June 21- 24,  2006.  Greifswald,  Germany.
W ahyudi,  A.  T.  1997.  Gen  penanda  molekuler  pada bakteri  ( Molecular Marker Gene  in  Bacteria ). Hayati . 4(1):  27-29.
Webb,    V.  L.,    Kilimnik,    A.  Y.,  Hulston.  D. A.,  Hopf.  S., Hinkley.  S.,    Reader,    S.    and    Thomson,  A.    2006. Screening    for    cytotoxic    compounds    for    marine bacteria. Conference : From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism . June 21- 24,  2006.  Greifswald,  Germany.