Journal Syifa Sciences and Clinical Research Volume 5 Nomor 2, 2023
Journal Homepage: http://ejurnal.ung.ac.id/index.php/jsscr , E-ISSN: 2656-9612 P-ISSN:2656-8187 DOI : https://doi.org/10.37311/jsscr.v5i2.20341

## Isolasi, Karakterisasi, dan Uji Antioksidan Fungi Endofit dari Tanaman Batang Kunyit (Curcuma domestica Val.,)
Mahdalena Sy. Pakaya 1 , Nur Ain Thomas 2 , Hamsidar Hasan 3 , Ariani H. Hutuba 4 , Grasela Mbae 5
1,2,3,4,5 Jurusan Farmasi, Fakultas Olahraga dan Kesehatan, Universitas Negeri Gorontalo,
Jl. Jenderal Sudirman No. 06 Kota Gorontalo 96128, Indonesia
* Penulis Korespondensi.. Email: mahdalena@ung.ac.id

## ABSTRAK
Fungi  endofit  merupakan  fungi  yang  hidup  bersimbiosis  mutualisme  serta  dapat menghasilkan  senyawa  metabolit  sekunder  yang  sama  dengan  inangnya.  Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, karakterisasi, dan menguji aktivitas antioksidan pada metabolit sekunder batang kunyit. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dimana metode yang  digunakan  pada  tahap  isolasi  fungi  endofit  adalah  metode  tanam  langsung  dan  uji aktivitas  antioksidan  menggunakan  metode kualitatif  dan  kuantitatif  dengan  menggunakan DPPH ( 1,1-diphenyl- 2- picylhydrazyl ). Fungi yang diperoleh 1 isolat; dengan kode isolat fungi (BK).  Berdasarkan  hasil  karakterisasi  secara  makroskopis  dan  mikroskopis,  isolat  fungi  BK tersebut  menunjukkan  karakteristik  dari  kelas deuteromycota .  Hasil  uji  antioksidan  secara kualitatif  menunjukkan  bahwa  fraksi  isolat  fungi  endofit  BK  memiliki akivitas antioksidan ditandai  dengan  adanya  warna  kuning  pada  latar  ungu pada  plat  KLT  dilihat  pada  sinar tampak,  serta  aktivitas  antioksidan  masing-masing menunjukkan  nilai  IC 50 dari  fraksi  etil asetat, n- heksan sebesar 52,989 μg/ml; 89,725μg/ml; yang masuk kategori kuat sedangkan fraksi metanol sebesar 119,02μg/ml termasuk kategori sedang, dan untuk fraksi supernatan murni dengan  nilai sebesar 156,86μg/ml, termasuk kategori lemah.
Kata Kunci:
Curcuma domestica Val., Fungi endofit, Isolat Fungi, Antioksidan
Diterima: 17-01-2023 Disetujui: 22-03-2023 Online: 01-05-2023

## ABSTRACT
Endophytic fungi live in mutualistic symbiosis and can produce secondary metabolites similar to their host. This research aims to isolate, characterize, and test the antioxidant activity of secondary metabolites from turmeric stems. This research is experimental research where the method used for endophytic fungi isolation  is  the  direct  planting  method,  and  antioxidant  activity  is  tested  using  qualitative  and quantitative methods with DPPH (1.1-diphenyl-2-picylhydrazyl). One fungal isolate was obtained with the fungal isolate code (BK). Based on macroscopic and microscopic characterization, the BK fungal isolate indicates the Deuteromycota class's characteristics. The qualitative antioxidant test results indicate that the fraction of BK endophytic fungal isolate indicates antioxidant activity, indicated by the yellow color against a purple background on the TLC plate observed under visible light. The respective ICso values for the  ethyl  acetate  and  n-hexane  fractions  were  52.989  µg/ml  and  89.725  µg/ml,  categorized  as  strong antioxidants. The methanol fraction had an ICso value of 119.02 µg/ml, categorized as moderate, while the pure supernatant fraction had an ICso value of 156.86 µg/ml, categorized as weak antioxidant activity . Copyright © 2023 Jsscr. All rights reserved.
Keywords:
Curcuma domestica Val.; Endophytic Fungi; Fungal Isolate; Antioxidant
Received: 2023-01-17 Accepted: 2023-03-22 Online: 2023-05-01

## 1. Pendahuluan
Hampir semua tumbuhan diduduki oleh beragam macam mikroorganisme yang salah satunya dikenal sebagai fungi endofit. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman  diyakini  dipengaruhi  oleh  mikroba  yang  terdapat  dalam  tanaman. Pemanfaatan yang dapat menguntungkan dari mikroba terkait tanaman sangat penting pada  tingkat  yang  diterapkan,  untuk  meningkatkan  produksi  hasil  dari  tanaman pertanian, serta berguna untuk pengendalian hama tanaman, sejak abad ke-19 sampai saat ini para generasi ahli kimia dan bahan alam sudah menerapkan kemampuan serta ilmunya terhadap jutaan molekul yang berasal dari alam dan juga masyarakat meyakini bahwa  alam  berpotensi  besar  bagi  kehidupan.Interaksi  antara  jamur  endofit  dengan tumbuhan  inangnya  bersifat  simbiosis  mutualisme  atau  dengan  kata  lain  sifat  salin menguntungkan, dimana jamur endofit mendapatkan nutrisi dari tanaman inang dan tumbuhan  inang  terlindungi  dari  mikroba  penyebab  penyakit  pada  tumbuhan  serta meningkatkan pertahanan tanaman dari kekeringan [2].
Antioksidan adalah  senyawa  yang mampu  menangkap atau meredam  dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan didefenisikan sebagai inhibitor yang bekerja menghambat  oksidasi  dengan  cara  bereaksi  dengan  radikal  bebas  reaktif  yang membentuk radikal bebas tidak reaktif yang tidak stabil [18].
Pendekatan  secara  ilmiah  kunyit (Curcuma  domestica  Val.) berpotensi  sebagai antioksidan  dilihat dari kandungan beberapa senyawa yang ada pada ekstrak kunyit. Hal ini mendorong peneliti untuk menguji dan melihat pemanfaatan fungi endofit dari batang kunyit terhadap antioksidan. Pemilihan bagian batang juga dikarenakan masih sangat minimmnya studi terkait uji antioksidan dengan menggunakan bagian batang kunyit.  Berdasarkan  beberapa  uraian  diatas,  maka  akan  dilakukan  studi  penelitian berkaitan dengan isolasi karakterisasi dan uji antioksidan fungi endofit dari tanaman batang kunyit (Curcuma domestica Val,) .

## 2. Metode

## Desain Penelitian
Desain  penelitian  yang  dipakai  pada  penelitian  ini  merupakan  penelitian eksperimental laboratorium, alasan penelitian eksperimental dimana di lakukan isolasi, karakterisasi dan  uji antioksidan  fungi  endofit  dari  tanaman  batang kunyit  ( Curcuma domestica Val. ) secara kualitatif dan kuantitatif.
Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  autoklaf  (Hirayama®), batang  pengaduk,  bunsen,  cawan  petri  (Normax®),  corong,  erlenmeyer,  enkas,  gelas kimia, gelas ukur, hot plate dan strirer (Kenko®), jarum ose, kuvet, lemari pendingin (Sanken,  Indonesia),  mikroskop  (Yazumi),  neraca  analitik  ( Kern®) ,  oven (Memmert® ), pipet,  pinset,  pipa  kapiler,  pisau  steril,  rotary  evaporator,  sendok  tanduk,  shaker inkubator  (Carbolite®),  spektrofotometri  UV-Vis  (Thermo),  tabung  reaksi,  tabung sentrifugasi (Onemed).
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  Alkohol  70%  (Onemed) Aquadest, Aluminium foil ( Total warp ), DPPH ( 1,1–diphenyl-2- picylhydrazyl) (Himedia), imersi oil , Kertas HVS, Kertas saring (whatman) , Kapas, Kloramfenikol ( Sanbe), Korek
api, Metanol pro analisa, Natrium hipoklorit 0,5%, Pelarut etil asetat (Alkemi), Pelarut n-heksan (Alkemi), Pelarut methanol  (Alkemi), Potato  Dextrose  Agar (PDA)  (Nitra  Kimia),  PDB (Potato  Dextrose Broth) (Nitra Kimia), Plastik wrap, Sampel batang kunyit ( Curcuma domestica Val. ), Plat KLT (Nitra Kimia), Tissue steril. Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi  alat  disterilisasi  menggunakan  oven  selama  1  jam.  Bahan  disterilkan dalam  autoklaf  pada  suhu  121 0 C  selama  15  menit,  jarum  ose  dan  pinset  dipijarkan dengan lampu bunsen[3].

## Isolasi Fungi Endofit Dari Batang Kunyit
Batang  Kunyit  dicuci  menggunakan  air  mengalir  selama  5  menit,  kemudian dipotong dengan ukuran 1 x 1 cm 2 , diilakukan secara sterilisasi didalam enkas. Sampel dilakukan sterilisasi permukaan secara berurutan menggunakan alkohol 70% selama 1 menit, larutan natrium hipklorit 5 % selama 5 menit, alkohol 70% selama 1 menit, dan dibilas dengan aquadest ±3 menit diulang dua kali.
Diambil sampel yang telah dikeringkan , menggunakan pinset dan ditanamkan 3 potong sampel dengann cara meletakkan pada posisi tertelungkup ke dalam cawan petri yang berisi media PDA ( Potato Dextrose Agar) yang sudah ditambahkan Kloramfenikol. Diinkubasi pada suhu 25 0 -27 0 C selama 7 hari dan diamati pertumbuhan fungi setiap hari sampai  tampak  fungi  yang  hidup  dalam  media    isolasi  PDA,  diinokulasikan  dalam cawan petri yang isinya media PDA, disimpan pada suhu 25 0 C hingga 5 hari sampai didapatkan koloni murni [15].

## Karakterisasi Fungi Endofit Batang Kunyit
Karakterisasi dari jamur endofit dilakukan dengan mengamati morfologinya baik secara  makroskopik  maupun  mikroskopik.  Pengamatan  makroskopik  dilakukan dengan mengamati warna koloni, warna sebalik, permukaan koloni (granular, seperti tepung, menggunung, licin, ada atau tidak tetes-tetes eksudat), diameter pertumbuhan koloni jamur, dan lingkaran-lingkaran konsentris. Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan menggunakan mikroskop, dengan cara pada kaca objek diletakkan sedikit hifa lalu diteteskan dengan aquadest setelah itu di keringkan sedikit di atas api bunsen lalu teteskan Imertion Oil setelah itu dilakukan pengamatan identifikasi isolat jamur endofit [11].

## Pembuatan Fermentasi Stater Fungi Endofit
Isolat fungi selanjutnya diinokulasi ke dalam ke dalam labu erlenmeyer ukuran 50 mL yang berisi 20 mL media yang berisi media fermentasi PDB steril dan diletakkan di suhu ruangan 3-5 hari [4].

## Produksi Supernatan Fungi Endofit Batang Kunyit
Isolat fungi selanjutnya diinokulasi ke dalam ke dalam labu Erlenmeyer ukuran 500 mL yang berisi 250 mL media yang berisi media fermentasi PDB steril di fermentasi menggunakan incubator shaker kemudian, diinkubasi kultur fungi endofit pada suhu 27 0 C dalam shaker inkubator 170 rpm selama 18 hari.
Kemudian supernatan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 60 menit. Hasil  dari  sentrifugasi  diambil  supernatannya  kemudian  diekstraksi  menggunakan metode partisi cair-cair dengan menggunakan pelarut organik n-heksan,pelarur organik etil asetat, dan pelarut organik metanol secara bertingkat [5].
Kemudian  dilakukan  metode  partisi  perbandingan  1:1  pertama  menggunakan pelarut  n-heksan  sebagai  pelarut  non  polar,  lalu  didiamkan  selama  20  menit,  setelah terpisah menjadi dua lapisan kemudian dilanjutkan pada tahap partisi menggunakan
pelarut etil asetat sebagai pelarut semi polar dan lakukan perlakuan yang sama dengan menggunakan pelarut metanol sebagai pelarut polar.
Selanjutnya, hasil partisi dari masing-masing pelarut di evaporasi pada suhu 40 0 C agar  mendapatkan  ekstrak  kental.  Fraksi  dari  masing-masing  hasil  ekstraksi  yang diperoleh dan supernatan murni yang tidak diekstraksi kemudian diuji antioksidannya dengan metode DPPH ( 1,1–diphenyl-2- picylhydrazyl) secara kualitatif dan kuantitatif [9].

## Uji Bebas Metanol
Sebelum  diuji  antioksidan,  dilakukan  uji  bebas  pelarut  salah  satunya  uji  bebas metanol untuk membuktikan bahwa ekstrak tersebut telah bebas dari metanol. Uji bebas pelarut metanol dilakukan dengan cara satu tetes ekstrak ditambahkan 1 tetes larutan asam sulfat pekat kemudian tambahkan 1 tetes larutan KMnO 4 pekat diamkan 10 menit, tambahkan  tetes  demi  tetes  larutan  Na 2 S 2 O 3 pekat.  Dikatakan  bebas  metanol  apabila tidak ada perubahan warna permangat (coklat) pada sampel [16].

## Uji Bebas Etil Asetat
Uji  bebas  pelarut  etil  asetat  dilakukan  dengan  menggunakan  pereaksi  NaOH, asam asetat dan H 2 SO 4 dengan cara 2 tetes ekstrak  supernatan  dimasukan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 2 NaOH, 2 ml asam asetat dan 2 ml H 2 SO 4. Lalu mengamati perubahan bau yaitu jika tidak berbau etil asetat maka ekstrak sudah terbebas dari etil asetat dan jika masih berbau etil asetat maka perlu di uapkan kembali [16].

## Uji Bebas N-heksan
Uji  bebas  pelarut  n-heksan  dilakukan  dengan  cara  2  tetes  ekstrak  dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu dibakar. Dikatakan bebas n-heksan apabila tidak ada api dan asap yang terbentuk, tetapi jika ada api dan asap maka ekstrak perlu di uapkan [16].

## Uji Aktivitas Antioksidan
Uji Kualitatif
Dilakukan  dengan  pembuatan  pereaksi  semprot  DPPH,  dengan  menimbang DPPH sebanyak 2 mg dimasukkan dalam botol coklat kemudian dilarutkan dalam 50 ml metanol p.a. Setelah DPPH larut kemudian dibungkus dengan aluminium foil dan disimpan ditempat gelap yang terhindar dari cahaya matahari lalu plat KLT diberikan tanda  terlebih  dahulu  pada  batas atas dan  bawah,  pada  batas  bawah diberikan  jarak antar sampel 0,5 cm dan pada jarak atas 0,5 cm. Kemudian fraksi fungi endofit batang kunyit (Curcuma domestica Val,.) ditotolkan pada plat KLT menggunakan pipa kapiler. Proses elusi dilakukan dengan   cara plat KLT dimasukkan dalam erlenmeyer yang telah berisi eluen yakni n-heksan : etil asetat (6:4 ; 7:3 ; 8:2, 10:2) dan telah dijenuhkan lalu  eluen  dibiarkan  terelusi  hingga mencapai  batas  plat yang  telah  ditandai.  Setelah selesai, plat KLT dikeluarkan dari erlen meyer dan diamati dibawah lampu UV 366 nm. Setelah itu, plat KLT disemprotkan dengan larutan DPPH 0.2mM. Noda pada plat KLT yang memiliki aktivitas antioksidan berubah menjadi warna putih kekuningan dilihat pada sinar tampak [20].

## Uji Kuantitatif
Pembuatan Larutan DPPH
Serbuk DPPH 2 mg dilarutkan dengan methanol kemudian dimasukan  kedalam metanol  kemudian  dimasukan  kedalam  labu  ukur  50  ml,  volumenya  di  cukupkan dengan metanol p.a sampai pada tanda batas [9].

## Pembuatan Larutan Blanko
Larutan DPPH ( 1,1–diphenyl-2-picylhydrazyl) 0,2 mM sejumlah 2 mL     dituangkan ke dalam vial, kemudian dituangkan pelarut metanol pro analisis sampai tanda batas 5 mL, dishaker menggunakan vortex sampai tercampur rata, kemudian diinkubasi selama 30 dalam ruangan gelap.
Hasil  fraksi  (n-heksan,  etil  asetat  dan  metanol)  dan  supernatan  hasil  metabolit sekunder fungi endofit dari batang kunyit ( Curcuma domestica Val. ) ditimbang masing- masing  ekstrak  2  mg,  dan  2  mg  (DPPH)  ( 1,1–diphenyl-2- picylhydrazyl) ditambahkan pelarut metanol pro analisis lalu dituang ke dalam gelas kimia 50 ml, cukupkan dengan metanol pro analisis hingga tanda batas yang ditentukan [9]. Sebanyak 2 mL larutan DPPH  ditambahkan  dengan  dengan  2 mL  ekstak  fungi  endofit  batang kunyit dalam berbagai konsentrasi  5, 10, 25, 50 dan 100 ppm , kemudian didiamkan selama 30 menit dalam tempat gelap. Larutan induk hasil dari fraksi (n-heksan, etil asetat, metanol dan supernatan  murni)  metabolit  sekunder  fungi  endofit  dari  batang  kunyit  ( Curcuma domestica Val. ) masing-masing dipipet 50, 100, 250, 500, 1000 (μL), dimasukkan ke dalam vial 10 mL, volume dicukupkan dengan metanol sampai tanda batas[9]. Pengukuran Serapan Dengan Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis . Larutan  uji  ekstrak  metabolit  sekunder  fungi  endofit  batang  kunyit (Curcuma domestica Val.) masing-masing fraksi dan supernatan murni, diambil dari masing-masing konsentrasi diambil sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam vial, ditambahkan larutan DPPH ( 1,1–diphenyl- 2-picylhydrazyl) 0,2 mM sampai tanda batas 5 mL, dishaker dengan vortex  hingga  tercampur  rata,  semua  materi  analisis  di  inkubasi  dalam  ruang gelap selama 30 menit [9]. Selanjutnya, serapan diukur pada panjang          gelombang  517 nm.

## Analisis Data
Data  hasil  absorbansi  sampel  digunakan  untuk  mencari  %  inhibisinya.  Rumus untuk mencari % inhibisi adalah sebagai berikut [20]:
%inhibisi = absorban blanko−absorban sampel 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 X100%
Keterangan:
Ablanko= Absorbansi pada DPPH tanpa sampel Asampel= Absorbansi pada DPPH setelah ditambah sampel Persamaan linier yang diperoleh digunakan untuk menentukan nilai IC50.  Nilai IC50  adalah  konsentrasi  yang  didapatkan  pada  saat  nilai  %  inhibisi  sebesar  50  dari persamaan Y= aX+b, pada saat % Inhibisi = 50, maka rumus untuk menentukan nilai IC50 persamaannya menjadi [20].
50 = a X + b = 50−b a X

## 3. Hasil Pembahasan Isolasi Fungi Endofit
Pada metode isolasi fungi endofit ini, didapatkan hanya 1 isolat fungi endofit batang  kunyit  dengan diberi  kode  (BK),  dimana  tumbuh  pada media Potato  Dextrose Agar (PDA).  Proses  isolasi  terlebih  dahulu  yang  harus  diperhatikan  adalah  sterilisasi permukaan sampel. Hal ini bertujuan supaya menghilangkan bakteri kontaminan yang terdapat pada sampel bagian tanaman kunyit (daun, batang dan rimpang) yang telah diambil dilakukan sterilisasi permukaan secara berurutan menggunakan alkohol 70% selama 30 detik, larutan natrium hipoklorit 5% selama lima menit, alkohol 70% selama 30 detik, lalu dibilas dengan aquades steril selama tiga menit, desinfeksi dilakukan pada sampel bertujuan agar menghilangkan kotoran, beserta mikroorganisme patogen yang terdapat  pada  sampel  supaya  saat  menananamkan  sampel  tidak  akan  ditumbuhi mikroorganisme lain pada media tetapi hanya menumbuhkan isolat jamur endofit yang berasal dari jaringan tanaman sampel [12].
Tabel  1. Hasil  Isolasi  Fungi  Endofit  Dari  Tanaman  Batang  Kunyit Sampel Tanaman Media Pertumbuhan Mikroba NA PDA Daun - - Batang - + Rimpang - -
Ket: (+) =  Adanya pertumbuhan fungi endofit (-)  =  Tidak adanya pertumbuhan fungi endofit
Kemudian  dilakukan  pembilasan  sampel  menggunakan  aquadest  setelah disterilisasi di ulangi sebanyak dua kali, setelah itu dikeringkan pada tisu steril. setelah itu bagian kunyit yang telah diambil dipotong menjadi bagian kecil dengan ukuran 1 cm pada kondisi aseptis menggunakan pisau steril.
Potongan, daun, batang, rimpang yang telah disterilisasi ditanam langsung PDA secara aseptis menggunakan Enkas. Sebelumnya sampel dipotong 1 cm menggunakan pisau     steril secara vertikal, posisi bekas potongan yang menampakkan jaringan ditanam pada  permukaan  media  sehingga  mikroba  yang  hidup  dalam  jaringan  tanaman mendapatkan nutrisi dari media PDA.  Sebelum digunakan,  media PDA ditambahkan kloramfenikol 0.01%. Kemudian diinkubasi selama dan 3-5 hari pada suhu 28°C untuk pertumbuhan  jamur.  Setelah  masa  inkubasi,  h asil  isolasi  fungi  endofit  diperoleh sebanyak 1 isolat yaitu  isolat dari bagian batang.

## Pemurnian Fungi Endofit
Selanjutnya isolat fungi yang telah muncul di permukaan media PDA selanjutnya akan dimurnikan secara aseptis dengan cara memindahkan tiap satu koloni pada media yang  baru  sehingga  mendapatkan  isolat  tunggal.  Isolat  yang  diperoleh,  diambil sebanyak 1 ose kemudian akan dipindahkan ke media baru pada tabung reaksi steril dan  dibiarkan  padat dengan  posisi  yang  dimiringkan  sebagai stock  kultur dan  kultur kerja. Stock  kultur fungi  endofit  batang  kunyit  disimpan  di  dalam  lemari  pendingin dengan suhu 4º C yang akan di uji aktivitas antioksidan [19].
Tabel  2. Hasil  Karakterisasi  Makroskopis Fungi  Endofit
Pada hasil karaterisasi secara makroskopis pada isolat fungi endofit diperoleh warna miselium muda berwarna putih yang semakin tua berubah warna, elevasinya datar, garis radial ada, warna sebalik ada.
Karakteristik Kode Isolat BK Warna Miselium Miselium muda berwarna putih yang semakin tua berubah warna Elevasi Koloni Datar Garis Radial Ada Warna Sebalik Berwarna putih, Kecoklatan, dan Kekuningan
Tabel  3. Hasil  Karakterisasi  Mikroskopis Fungi  Endofit
Pada hasil karakterisasi secara mikroskopis padaisolat fungi endofit diperoleh hifa  panjang  bercabang  dan  bersepta, konidia  berbentuk  lonjong  dan  ada  yang  bulat serta transparan, bentuk spora silindris .
Gambar 1. Hasil  uji karakterisasi fungi endofit isolat (BK) dari batang kunyit secara a.)    mikroskopis, (b) secara mikroskopis (Perbesaran 100x)

## Karakterisasi Secara Makroskopis dan Mikroskopis
Fungi endofit yang telah diperoleh dikarakterisasi secara mikroskopis dengan cara mengambil  kaca  objek  tetesi  dulu dengan  aquadest  lalu  keringkan diatas api  bunsen dengan gerakan zig zag , selanjutnya diambil  sebanyak 1 ose kemudian diletakkan diatas kaca  objek  lalu  tetesi imersi  oil. Alasan  kenapa  ditetesi imersi  oil adalah  untuk memperjelas  objek  dan  melindungi  preparat  dari  gesekan  lensa.  Selain  itu jika  tidak menggunakan  minyak  imersi  maka  hasil  pengamatan  akan  terlihat  kabur  atau  tidak jelas [14].

## Produksi Supernatan Untuk Uji Aktivitas Antioksidan
Tahap yang dilakukan setelah karakterisasi yaitu untuk memproduksi metabolit sekunder  yaitu  proses  fermentasi.  Tetapi  sebelum  itu dilakukan  dulu  pembuatan fementasi starter terlebih dahulu dengan dengan cara membuat media fermentasi cair Potato  Dextrose  Broth (PDB)  disterilisasi  dalam  autoklaf  pada  suhu  121 o C  selama  15 menit, kemudian inokulasikan fungi endofit sebanyak 3 kali kemudian disimpan disuhu ruangan selama 3-5 hari[1].
Setelah mencapai 5 hari, media yang telah ditumbuhi fungi endofit  dipindahkan ke media PDB yang baru untuk difermentasi selama 18 hari. Setelah mencapai 18 hari proses  fermentasi  dihentikan,  selanjutnya  dimasukkan  ke  dalam  tabung  sentrifugasi, lalu  disentrifugasi  pada  kecepatan  3000rpm  selama  60  menit  dengan  tujuan  untuk memisahkan biomassa dan supernatan.
Karakteristik Kode Isolat BK Hifa Panjang, bercabang dan bersepta Konidia Berbentuk lonjong, dan ada yang bulat serta transparan Bentuk Spora Silindris a.) b.)
Dalam proses fermentasi isolat yang digunakan merupakan biakan fungi endofit yang telah berumur 7 hari setelah dilakukan peremajaan isolat, dengan tujuan agar pada saat  proses  fermentasi  isolat  fungi  endofit  berada  dalam  fase  pertumbuhan  log  atau biasa  disebut  dengan  fase  eksponensial,  dimana  fase  ketika  mikroba aktif  membelah kecepatan maksimum, sehingga jumlah sel metabolit sekunder terbentuk dalam jumlah banyak, proses fermentasi dilakukan secara aseptik agar tidak terjadi kontaminasi[6].
Goyangan  berfungsi  untuk  meningkatkan  aerasi  dan kultur  fermentasi.   Aerasi bertujuan  untuk  memberikan  pasokan  oksigen  yang  memadai  agar  dapat mempertahankan kondisi aerobik serta membuang gas karbon dioksida yang dihasilkan selama fermentasi berlangsung, serta meratakan penyebaran mikroorganisme, nutrien, dan oksigen dalam medium fermentasi [20].
Pemilihan  metode  partisi  cair-cair  karena  pelarut  yang  digunakan  secara bertingkat  dari  mulai  non  polar,  semi  polar,  dan  polar  tujuannya  agar  senyawa metabolit sekunder yang tertarik  sesuai dengan tingkat kepolaran [7].
Tahap  selanjutnya  yang  dilakukan  yaitu pengujian  bebas  pelarut  pada  ekstrak supernatan  murni    yang  bertujuan  untuk  mengetahui  apakah  ekstrak  masih mengandung  pelarut  atau  tidak  serta  ekstrak  supernatan  murni  yang  diperoleh merupakan ekstrak yang murni tanpa ada kontaminasi.
Tabel 4. Hasil Uji bebas Pelarut Pada Supernatan Batang Kunyit Identifikasi Pereaksi Hasil Bebas Metanol 1  tetes  larutan  asam  sulfat pekat,  1  tetes  larutan KMnO4 diamkan 10 menit, Tetes demi tetes larutan Na2S2O3 (-) Negatif, Tidak ada warna permangat (coklat) Bebas Etil Asetat 2 mL NaOH, 2 mL Asam asetat, 2 mL H2SO4 (-) Negatif, Tidak ada bau ester Bebas N- Heksan Dibakar ekstraknya (-) Negatif, Tidak menghasilkan api dan asap
Pada  uji  bebas  pelarut  diperoleh  hasilnya  yaitu  hasil  uji  bebas  pelarut  metanol tidak  terdapat  warna  permangat  (Coklat).  Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  [16], menyatakan bahwa hasil dari  bebas pelarut metanol yaitu tidak ada warna permangat (Coklat), hasil uji bebas pelarut etil asetat yang diperoleh yaitu tidak adanya tercium bau ester,  hal  ini  menandakan  bahwa  ekstrak  sampel  benar-benar  bebas dari  pelarut  etil asetat.  Sedangkan  hasil  uji  bebas  pelarut  n-heksan  yang  diperoleh  yaitu  tidak menghasilkan  api  dan  asap  setelah  dibakar  di  atas  api  bunsen,  hal  ini  menandakan bahwa  ekstrak  sampel  benar-  benar  bebas  dari  pelarut  etil  asetat.  Ekstrak  dikatakan bebas dari pelarut n-heksan apabila tidak tidak menghasilkan api dan asap [20].

## Uji Aktivitas Antioksidan
Uji Kualitatif Menggunakan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Uji  kualitatif  antioksidan  dilakukan  menggunakan  kromatografi  lapis  tipis (KLT)  dengan  menyemprotkan  DPPH  ( 1,1–diphenyl-2-  picylhydrazyl) .  Sebelum disemprotkan dengan DPPH pertama-tama sampel ekstrak isloat fungi endofit batang kunyit (Curcuma domestica Val.,) ditotol pada lempeng kromatogram lalu dielusi dengan
eluen N-heksan : Etil asetat (6:4, 7:3, 8:2, 10:2). Hasil positif ditandai dengan pemudaran warna dari warna ungu menjadi putih kekuningan kemudian dihitung nilai RF pada noda yang menunjukan positif antioksidan ( noda kuning ).
Tabel 5. Hasil uji aktivitas antioksidan secara kualitatif
Ekstrak BK Supernatan + Metanol + Etil Asetat + N-heksan +
Keterangan : ( + ) = Positif beraktivitas sebagai antioksidan
Pada pengujian secara kualtatif diperoleh hasil positif pada ekstrak supernatan, metanol, etil asetat, n-heksan ditandai dengan  latar ungu dengan noda kuning yang memudar. Uji kualitatif antioksidan dilakukan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT)  dengan  menggunakan  metode  DPPH  ( 1,1–diphenyl-2- picylhydrazyl) .  Karena merupakan metode sedehana, cepat, mudah dan menggunakan sampel dalam jumlah yang sedikit dengan waktu yang singkat. DPPH pada uji ditangkap oleh antioksidan yang melepaskan hidrogen, sehingga membentuk DPPH tereduksi. Warna berubah dari ungu gelap menjadi memudar.
Gambar 2. Hasil analisis kualitatif antioksidan metabolit sekunder isolat fungi endofit batang kunyit (Curcuma domestica Val.,)
Penampakan noda diamati di bawah lampu UV 366 nm. Pada lampu UV 366 noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna. Setelah itu disemprotkan dengan larutan  DPPH  0,2  mM.  Hasil  positif  ditandai  dengan  pemudaran  warna  dari  warna ungu  menjadi  putih  kekuningan  kemudian  dihitung  nilai  RF  pada  noda  yang menunjukan  positif  antioksidan  (noda  kuning),  terbentuknya  bercak  kuning  setelah penyemprotan  DPPH  0,2  mM  disebabkan  oleh  adanya  senyawa  yang  dapat mendonorkan atom hidrogen di dalam ekstrak, sehingga dapat mengakibatkan molekul DPPH  tereduksi  yang  diikuti  dengan  perubahan  warna  ungu  dari  larutan  DPPH menjadi kuning bening[13]. Yang menunjukan 8 nilai RF isolat BK, pada sampel ekstrak supernatan  0,2,  sampel  ekstrak  n-heksan  0,6;0,2,  sampel  ekstrak  etil  asetat  0,8;0,6;0,2 kemudian pada sampel metanol 0,4;0,2.

## Analisis Kuantitatif Antioksidan Metode DPPH
Pada hasil pengukuran absorbansi larutan blanko, didapatkan rata-rata hasil dari absorbansi blanko yaitu 0,463A. Diperoleh hasil dari pengukuran nilai absorbansi dari masing-masing sampel. Kemudian dihitung nilai %inhibisi dari masing-masing sampel,
diperoleh  yaitu  sampel  n-heksan  dengan  konsentrasi  5,  10,  25,  50  dan  100ppm mempunyai nilai %inhibisi berturut-turut sebesar 19,87%; 25,26 %; 29,58%; 41,03% dan 51,40%.  Sampel  etil  asetat  dengan  konsentrasi  5, 10, 25, 50  dan  100  ppm mempunyai nilai  %inhibisi  berturut-turut  sebesar  21,81%;  34,77%;  42,98%;  54,42%  dan 65,44%. Sampel metanol dengan konsentrasi 5, 10, 25, 50 dan 100 ppm mempunyai nilai  %inhibisi berturut-turut  sebesar  1,70%;  9,07%;  17,06%;  24,83%  dan 41,25%.  Sedangkan sampel supernatan  murni  dengan  konsentrasi  5,10,  25,  50  dan  100  ppm  mempunyai  nilai %inhibisi berturut-turut sebesar 16,84%;  19,00%; 22,46%; 26,99% dan 37,79%.
Tabel 4. Hasil pengukuran nilai absorbansi metode DPPH Bahan Panjang Gelombang Maksimum Absorbansi (A) Rata-rata absorbansi blanko (A) 1 2 3 Blanko (DPPH) 517 nm 0,463 0,463 0,463 0,463
Dari hasil perhitungan nilai % inhibisi, hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak n- heksan dan etil asetat memiliki nilai %inhibisi yang baik dibandingkan dengan ekstrak metanol dan supernatan murni. Hal ini berhubungan dengan diduga adanya kandungan senyawa  metabolit  yang  dapat  mampu  menghasilkan  aktivitas  antioksidan.  Ekstrak fraksi etil asetat pada isolat fungi endofit BK memiliki nilai aktivitas antioksidan lebih tinggi dari pada ekstrak n-heksan, metanol dan supernatan murni [17].
Tabel 5. Hasil Pengukuran Absorbansi Sampel Dan %Inhibisi
Setelah  itu  di  hitung  nilai  IC 50 dengan  diperoleh  bahwa  sampel  fraksi  etil asetat merupakan  fraksi  unggul  yang  mempunyai  kemampuan  untuk  menangkap  radikal bebas  yang  diselaraskan  dengan  nilai  IC 50 .  Hasil  analisis  menunjukkan  bahwa sampelfraksi n-heksan mampu menangkap radikal bebas sebesar 89,72 µg/mL fraksi etil asetat  sebesar  52,98µgmL  ini  termasuk  kategori  kuat,  sedangkan  metanol  sebesar 119,02µgmL  dan  supernatan  murni  yaitu  sebesar  156,86  µg/mL.  Nilai  IC 50 menggambarkan  kekuatan  aktivitas  antioksidan  yang  dihasilkan  oleh  jamur  endofit dalam menghasilkan senyawa bioaktif yang mampu menangkap radikal bebas sebesar 50%. Semakin kecil nilai IC 50 maka  senyawa uji tersebut mempunyai keefektifan sebagai penangkap radikal bebas yang lebih baik [13]. Secara  spesifik, suatu senyawa dikatakan memiliki akivitas antioksidan yang sangat kuat bila IC 50 bernilai 50-100 ppm, sedang bila IC 50 101-250 ppm, dan lemah bila IC 50 251-500 ppm.

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  Hasil  Penelitian  yang  telah  ilakukan,  maka  dapat  ditarik kesimpulan  pada Batang Kunyit ( Curcuma domestica Val.) terdapat 1 isolat fungi endofit yaitu isolat (BK). Isolat fungi endofit yang berhasil diisolasi menunjukkan  karakteristik yaitu  termasuk  kategori deuteromycetes dengan  bentuk  batang  memiliki  konidia (spora),  konidiofor,  serta memiliki  hifa  bersepta. Pada uji kualitatif fraksi metabolit sekunder fungi endofit Batang Kunyit (Curcuma domestica Val.) positif memiliki aktivitas antioksidan  pada  sinar  tampak,  serta  uji  secara  kuantitatif  ekstrak memiliki aktivitas antioksidan yaitu n-heksan,etil asetat, metanol dan supernatan murni masing - masing sebesar  89,725  µg/mL,  52,989  µg/mL;  119,02µg/mL  dan  156,86  µg/mL.  Nilai  ini menunjukkan  bahwa  ekstrak  n-heksan  dan  esktrak  etil  asetat  termasuk  kategori antioksidan kuat, lalu metanol termasuk kategori sedang dan supernatan lemah.

## Referensi
[1]. Adefira,  E.,(2021) ., ՙՙ Produk  Esktraseluler  Isolat  Kapang  Endofit  C.1.1  dan  C.3.3  dari Ranting  Cempaka  Kuning  (Michelia  champaca  L.)sebagai  Antimikroba” Jurnal  Ilmu Kefarmasian Indonesia , April 2021, hlm. 131-138 Vol. 19, No. 1 ISSN:1693-1831, E-ISSN: 2614-6495.
[2]. Akmalasari, I., Purwati, E. S., & Dewi, R. S.  (2013). ՙՙ Isolasi dan identifikasi jamur endofit  tanaman  manggis  (Garcinia  mangostana  L)”. Biosfera,  30(2),  82–89. Antimikroba Ekstrak Etil Asetat Jamur Endofit dari Daun Matoa (Pometia pinnata). Jurnal Farmasi Higea, 12(1).
[3]. Ariyono,  R.  Q..Djauhari.,  (2014) . ՙՙ Keanekaragaman  Jamur  Endofit  Kangkung  Darat (Ipomea reptans Poir) pada Lahan Pertanian Organik Konvensional” Jurnal Hama dan Penyakit Tanaman 2 (1) :1-10 ISSN : 2338- 4366 .
[4]. Deya  Apriliana,  Wahyu  Widayat,  Rolan  Rusli .,( 2016) “Isolasi  Jamur  Endofit Rimpang  Temu  Kunci  (Boesenbergia  pandurata)  Dan  Uji  Aktivitas Antioksidan”. Penelitian  dan  Pengembangan  Farmaka  Tropi  Fakultas  Farmasi Universitas Mulawarman, Samarinda, Kalimantan Timur,. Hal: 72-77.
[5]. El-Mansi, T, E.M., El-Mansi, E.M.T., Bryce, C.F.A., Demain, A.L., dan  Allman, A.R., 2012. ”Fermentation Microbiology and Biotechnology”, Third Edition, 3 edition. ed. CRC Press, Boca Raton, FL.
[6]. Fajrina, A., Bakhtra, D. D. A., Mawarni, A. E., & . 2020. Isolasi dan Uji Aktivitas Antimikroba  Ekstrak  Etil  Asetat  Jamur  Endofit  dari  Daun  Matoa  (Pometia  pinnata). Jurnal Farmasi Higea, 12(1)
[7]. Kanifah, U., M. Lutfi dan B. Susilo. 2015 . Karakterisasi Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper  Crocatum)Dengan  Metode  Ekstraksi  Non-Thermal  Berbantukan  Ultrasonik (Kajian  Perbandingan  Jenis  Pelarut  Dan  Lama  Ekstraksi). Jurnal  Bioproses Komoditas Tropis. Volume 3 (1) : 73-79.
[8]. Khomsan.,2014. Pangan  dan  Gizi  untuk  Kesehatan. Jakarta:  PT  Raja  Grafindo Persada.
[9]. Komala, Oom. 2015 . Uji Efektivitas Esktrak Etanol Daun Lidah Mertua (Sansevieria trifasciata Prain) Terhadap Khamir Candida albican. Universitas Pakuan: Bogor.
[10]. Munawaroh,  S.  2012. "Ekstraksi  Minyak  Daun  Jeruk  Purut  (Citrus  hystrixD.C.) Dengan  Pelarut  Etanol  dan  N-Heksana ".Jurnal  Teknik  Kimia.  Universitas  Negeri Semarang:Semarang, Vol. 2, No.1.
[11]. Pakaya,  M.  S.,  Uno,  W.  Z.,  Papeo,  D.  R.  P.,  &  Moo,  D.  R.  2022. Isolasi  dan Karakterisasi  Jamur  Endofit  Lamun  (Thalassia  hemprichii)  Dari  Kawasan  Teluk Tomini. Journal Syifa Sciences and Clinical Research, 4(3).
[12]. Priharta. (2018) . “Isolasi, Karakterisasi dan Uji Aktifitas Antibiotik Bakteri Endofit dari Tumbuhan Eceng Gondok (Eichornia crassipes) di Danau Maninjau, Sumatera Barat”. Jurnal Farmasi. 4(2): 41-50.
[13]. Prakash,  A.,  (2014) ,  Antioxidant  Activity,  Medallion  Laboratories  Analytical Progress, vol. 19, No.2.
[14]. Reihani  dan  Oddershede.  2016 .  Screening  Minyak  Nabati  Untuk  Minyak  Imersi Mikroskop Optik. Institut Teknologi Sepuluh Nopember: Surabaya
[15]. Rianto, A., Isrul, M., Anggarini, S., & Saleh, A. (2018 ). Isolasi Dan Identifikasi Fungi
Endofit Daun Jambu Mete (Anacardium occidentale L.) Sebagai Antibakteri Terhadap Salmonella typhimurium. Jurnal Mandala Pharmacon Indonesia, 4(02), 109–121
[16]. Ristiyani,  E.  (2015). Perbandingan  Efektifitas  Antibakteri  Ekstrak  Maserasi  Dan Soxhletasi  Daun  Pandan  Wangi  (Pandanus  amaryllifolius  Roxb.)  Terhadap  Bakteri Bacillus subtillis. Politeknik Harapan Bersama, Tegal.
[17]. Rizka Dwi Widya Putri, Nuniek Herdyastuti.(2021), Potensi Senyawa Antioksidan Yang  Dihasilkan  Bakteri  Endofit  Pada  Daun  Jambu  Biji  (Psidium  guajava  L.), Departement  of  Chemistry,  Faculty  of  Matematics  and  Natural  Sciences, Universitas Negeri Surabaya
[18]. Salmia,  S.  (2016) .  Analisis  Kadar  Flavonoid  Total  Ekstrak  Kulit  Batang  Kedondong Bangkok (Spondias Dulcis) dengan Metode Spektrofotometri Uv-Vis. Thesis. [Skripsi]. Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar. Hal 48 .
[19]. Siburian.,  Elfrida,T.,(2012) .,Pengaruh  Suhu  dan  Waktu  Penyimpanan  Terhadap
Pertumbuhan  Bakteri  dan  Fungi  Ikan  Bandeng., Biologi  Unnes  Journal  Of  Life Science.ISSN 2252-6277 Hal: 101:105.
[20]. Wahdaningsih,  S.,  Wahyuono,  S.,  &  Styowati,  E.P.,  (2013) :  Isolation  And Identification Of Antioxidant Compounds In Fern Stems (Alsophila Glauca J.Sm) Using Dpph Method (2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl). Department Of Biology, Faculty Of Pharmacy , Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia ; ISSN : 1410-5918.