DOI: 10.6066/jtip.2015.26.2.222 Hasil Penelitian

## PERUBAHAN ALERGENISITAS PROTEIN KACANG KEDELAI DAN KACANG BOGOR AKIBAT PENGOLAHAN DENGAN PANAS

## [Allergenicity Changes of Soybean and
Bambara Groundnut Protein Due to Heat Processing]
Nurheni Sri Palupi 1,2) *, Sri Rebecca Sitorus 3) , dan Feri Kusnandar 1,2)
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor, Bogor
3) Badan Ketahanan Pangan, Kementerian Pertanian, Jakarta
Diterima 17 Juni 2015 / Disetujui 28 Desember 2015

## ABSTRACT
Legumes  contain  protein  as  a  potential  allergen.  Heating  process  was  expected  to  eliminate  the protein allergen. The aim of this study was to assess the changes  in molecular weight and allergenicty of soybean grobogan variety and bambara groundnut proteins due to heat processing, i.e. boiling, steaming, oven,  and  roasting  protein  isolate  was  prepared  by  pH  adjusting.  SDS-PAGE  method  was  used  to determine  the  profile  of  protein  molecular  weight and the alergenicity  was  determined by ELISA  method. Protein  molecular  weight  profile  of  grobogan  soybean  and  bambara  groundnut  that  have  been  boiled, steamed, ovened, and roasted for 30 minutes showed variations when compared to the unheated soybean and  bambara  groundnut  protein  isolate.  The  amount  of  protein  detected  was  reduced  compared  with unheated  soybean  and  bambara  groundnut.  The  protein  allergens  in  grobogan  soybean  had  molecular weight  110.0,  98.3,  84.5,  67.4,  and  60.2.  The  heat  treatment  for  30  minutes  removed  allergenicity  as indicated  by  no  detectable  protein  band  in  immunoblotting  results  and  the  smaller  Optical  Density  value compared with unheated soybean. Thus, the allergenicity of soybean protein due to heat processing was minimized.  Bambara  groundnut  had  protein  allergens  with  molecular  weight  113.1,  59.8,  and  25.2  kDa. Protein allergen with molecular weight 25.2 and 59.8 kDa were detected in bambara groundnut processed through boiling and steaming for 30 minutes, respectively, but ELISA result showed there were still protein allergen of bambara groundnut after the heat treatment for 30 minutes.
Keywords: allergy, bambara groundnut, heating process, protein, soybean

## ABSTRAK
1
Kacang-kacangan  adalah  bahan  pangan  yang  mengandung  protein  yang  berpotensi  sebagai alergen.  Proses  pemanasan  diharapkan  dapat  menghilangkan  komponen  alergen  tersebut.  Penelitian  ini bertujuan mengetahui perubahan berat molekul protein pada kacang kedelai  grobogan dan kacang bogor serta  perubahan  alergenisitasnya  sebagai  akibat  pengolahan  dengan  pemanasan,  yaitu  perebusan, pengukusan,  pemanasan  oven  dan  penyangraian.  Isolasi  protein  kacang  yang  telah  dipanaskan menggunakan metode pengaturan pH. Profil berat molekul protein setelah  pemanasan dianalisis dengan menggunakan  elektroforesis  SDS-PAGE,  sedangkan  pengujian  alergenisitas  menggunakan  uji  ELISA. Profil  berat  molekul  protein  kacang  kedelai  grobogan  dan  kacang  bogor  yang  dipanaskan  melalui perebusan, pengukusan, pemanasan oven, dan penyangraian selama 30 menit  menunjukkan variasi  jika dibandingkan  dengan  isolat  protein  kontrol  (tanpa  pemanasan).  Jumlah  protein  yang  terdeteksi  pun berkurang dibandingkan dengan isolat protein kontrol. Kacang kedelai  grobogan memiliki protein alergen dengan berat molekul 110,0; 98,3; 84,5; 67,4; dan 60,2 kDa, namun proses pemanasan selama 30 menit menghilangkan  alergenisitas  yang  ditunjukkan  dengan  tidak  terdeteksi  pita  protein  alergen  pada  hasil immunobloting .  Nilai optical  density (OD)  kacang  kedelai  yang  dipanaskan  selama  30  menit  lebih  kecil dibandingkan  kontrol  kacang  kedelai  yang  tidak  dipanaskan.  Dengan  demikian  alerginisitas  kacang kedelai  dapat  diminimalkan  dengan  proses  pemanasan.  Kacang  bogor  memiliki  protein  alergen  dengan berat  molekul  113,1;  59,8;  dan  25,2  kDa.  Setelah  proses  pemanasan  pada  kacang  bogor,  pita  protein alergen dengan berat molekul 25,2 kDa masih terdeteksi pada isolat protein dengan perebusan selama 30 menit  dan  pita  protein  59,8  kDa  terdeteksi  pada  pengukusan  selama  30  menit,  namun  uji  ELISA menunjukkan bahwa setelah proses pemanasan kacang  bogor selama 30 menit masih terdeteksi protein alergen.
Kata kunci: alergi, kacang bogor, kacang kedelai, proses pemanasan, protein
*Penulis Korespondensi: E-mail: hnpalupi@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Sistem  imun  merupakan  pertahanan  tubuh yang  dimiliki  oleh  manusia  untuk  melindungi  tubuh dari serangan mikroorganisme, seperti bakteri, virus, dan  jamur.  Sistem  imun  dapat  memberikan  respon yang tergantung dengan kemampuannya dalam me- ngenali molekul asing, yaitu antigen, dan menghasil- kan  reaksi  untuk  menghancurkan  antigen  tersebut (Kresno,  2001).  Pada  saat  sistem  imun  melemah, kemampuan  melindungi  tubuh  berkurang  sehingga mikroorganisme  dapat  berkembang  di  dalam  tubuh. Adanya  mikroorganisme  tersebut  menyebabkan sistem  imun  memberikan  respon  berlebihan  serta tidak  terkontrol  sehingga  menimbulkan  reaksi  hiper- sensitivitas  yang  dapat  merusak  jaringan  dan memicu terjadinya penyakit. Salah satu reaksi hiper- sensitivitas  yang  menimbulkan  manifestasi  klinis yang  cukup  serius  adalah  reaksi  alergi.  Alergi  ter- masuk  reaksi  hipersensitivitas  tipe  I  dan  umumnya merupakan reaksi cepat, karena reaksi terjadi hanya beberapa  menit  setelah  seseorang  terpapar  oleh alergen yang pada umumnya berupa protein pangan dan dimediasi oleh Imunoglobulin E atau IgE (Sun et al., 2008).
Protein  pangan  yang  bersifat  alergen  pada seseorang  belum  tentu  berakibat  sama  terhadap orang  lain.  Individu  yang  menunjukkan  kecende- rungan  untuk  mengalami  alergi  disebut  individu atopik.  Individu  atopik  memproduksi  IgE  lebih banyak  sebagai  respon  terhadap  stimulasi  antigen tertentu.  Pada  umumnya  protein  yang  masuk  ke dalam tubuh dicerna oleh usus halus menjadi asam- asam  aminonya.  Apabila  terdapat  pori-pori  pada membran  sel  mukosa  usus  halus,  maka  protein yang  belum  tercerna,  termasuk  protein  alergen, dapat terserap dan dikenali oleh IgE sebagai protein asing.  Reaksi  alergi  dapat  menyebabkan  produksi lendir  yang  berlebih  pada  hidung, gatal-gatal  merah di  tubuh,  diare,  muntah,  gangguan  saluran  nafas, penurunan  tekanan  darah  secara  tiba-tiba,  bahkan dapat berakibat kematian (Brown, 2004).
Bahan  pangan  yang  dikenal  mengandung protein  alergen  adalah  ikan,  susu,  kacang  kedelai, kacang  tanah,  kerang,  telur,  gandum,  dan  udang (Bowman  dan  Selgrade,  2008).  Produk  kedelai beserta  turunannya  banyak  digunakan  dalam  pe- ngolahan pangan karena kandungan nutrisinya yang cukup tinggi, namun kacang kedelai memiliki protein alergen  yang  dapat  berikatan  dengan  IgE  penderita alergi  kedelai.  Salah  satu  kacang  kedelai  varietas lokal  yang  memiliki  bentuk  dan  ukuran  yang  me- nyerupai  kedelai  impor  adalah  kedelai  grobogan. Kacang kedelai ( Glycine max ) mengandung minimal 16  jenis  protein  yang  dapat  berikatan  dengan  IgE penderita alergi kedelai. Protein alergen utama pada kedelai adalah Gly m Bd 30K atau P34 dengan berat molekul  30-34  kDa,  Gly  m  Bd  28K  dengan  berat
molekul  26  kDa,  dan  Gly  m  Bd  60  K  dengan  berat molekul  63-67  kDa  (Ogawa et  al., 2000).  Selain kacang  kedelai,  kacang  bogor  untuk  dikembangkan menjadi berbagai pangan olahan sebagai salah satu sumber protein alternatif, namun kacang  bogor juga diduga  mengandung  protein  alergen.  Astuti  (2012) melaporkan  bahwa  kacang  bogor  mengandung beberapa  protein  yang  dapat  berikatan  dengan  IgE penderita  alergi  kacang,  yaitu  protein  dengan  berat molekul 30; 42,9; 44,7; 56; 62; 64; dan 69 kDa.
Sifat  alergenisitas  suatu  bahan  pangan  dapat dipengaruhi  oleh  proses  pemanasan,  fermentasi, hidrolisis  enzimatik,  konjugasi  dengan  karbohidrat, rekayasa  genetika  dan  proses  ekstrusi  (Wilson et al., 2005).  Proses  pemanasan  dapat  menyebabkan denaturasi  protein,  pembentukan  ikatan  baru,  ag- regasi,  penyusunan  ulang  ikatan  disulfida,  maupun modifikasi  konformasi  lainnya,  yang  dapat  menye- babkan  perubahan  pada  alerginisitas  (Mondoulet et al., 2005).  Selama  proses  pengolahan,  sifat  alerge- nisitas  juga  dapat  dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor seperti  waktu  penyimpanan,  teknik  persiapan,  pro- ses  pemanasan,  pencucian,  dan  interaksi  dengan komponen pangan lainnya (Van Putten et al., 2011). Beberapa  penelitian  telah  dilakukan  untuk  menge- tahui pengaruh proses pengolahan terhadap alerge- nisitas  bahan  pangan.  Proses  pemanasan  dari protein  alergen  kacang  tanah  Ara  h  2/6  pada  suhu ekstrim dapat menurunkan kapasitas pengikatan IgE (Vissers et  al., 2011).  Proses  denaturasi  dapat  me- rusak  epitop  konformasi  dari  protein  alergen  yang mengakibatkan  penurunan  pengikatan  IgE  (Kindt et al., 2007).
Proses  pengolahan  yang  memungkinkan  ter- jadinya reaksi glikosilasi dan glikasi diduga juga ber- pengaruh  pada  sifat  alergenisitas.  Glikosilasi  me- rupakan  reaksi  pengikatan  gugus  gula  pada  gugus lateral  asam  amino  dalam  suatu  protein  secara enzimatis,  sedangkan  glikasi  merupakan  reaksi  non enzimatis (Wang et al., 2009). Dalam proses pengo- lahan  bahan  pangan  lebih  sering  melibatkan  reaksi glikasi  dibandingkan  dengan  reaksi  glikosilasi,  yang terjadi karena adanya ikatan kovalen molekul protein atau  lipida  dengan  molekul  gula,  seperti  fruktosa atau  glukosa  tanpa  adanya  aktivitas  enzim.  Secara tidak  langsung  derajat  glikasi  dapat  ditunjukkan dengan  sifat  hidrofobisitas  suatu  protein  yang bereaksi  dengan  karbohidrat  dan  turunannya  pada kondisi tertentu.
Penelitian ini bertujuan untuk menguji pengaruh proses  pemanasan  yang  umum  dilakukan  dalam pengolahan pangan (perebusan, pengukusan, penyangraian,  dan  pengeringan)  terhadap  berat molekul  protein  pada  kacang  kedelai  dan  kacang bogor  serta  perubahan  alergenisitasnya.  Proses pemanasan  dapat  menyebabkan  terjadinya  glikasi yang sifat alergenisitas kacang kedelai serta kacang bogor.  Dengan  mengetahui  ada  atau  tidaknya
protein  alergen  pada  kacang  kedelai  dan  kacang bogor setelah pengolahan serta potensi alergenitas- nya,  maka  dapat  dipilih  teknologi  pengolahan kacang  kedelai  dan  kacang  bogor  yang  dapat  me- minimalisasi  kejadian  alergi  akibat  mengonsumsi- nya.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Kacang  kedelai  ( Glycine  max )  varietas  lokal grobogan  yang  sudah  dikeringkan  diperoleh  dari Rumah Tempe Indonesia, Bogor sedangkan kacang bogor  segar  ( Vigna  subterranea )  diperoleh  dari pedagang  di  Pasar  Anyar,  Bogor.  Serum  penderita alergi  kacang  dan  bukan  penderita  alergi  diperoleh dari klinik di Bandung. Bahan kimia ANS (1-anilin-8- naftalen sulfonat), coomasie brilliant blue G-250 dan substrat  DAB  (3,3’-diaminobenzidin)  berasal  dari Sigma-Aldrich.  Akrilamid,  N,N ’-metilen-bisakrilamid berasal dari BIO-RAD. Analisis berat molekul protein dengan  SDS-PAGE  menggunakan  Thermo  Scien- tific  Spectra  Multicolor  Broad  Range  Protein  Ladder yang mengandung 10 protein dengan berat molekul 10-260  kDa.  Antibodi  sekunder HRP  Conjugated Mouse  anti-Human  IgE diperoleh  dari  ICL  Lab dengan  substrat  peroksidase TMB  (3,3’,5,5’-tetra- metilbenzidin) berasal dari BIO-RAD.
Proses  pemanasan  kacang  kedelai  dan  kacang bogor
Sebelum  dipanaskan  sampel  kacang  kedelai dan  kacang  bogor  dianalisis  proksimat  untuk mengetahui kandungan gizinya. Kacang kedelai dan kacang  bogor  mentah  dipanaskan  melalui  perebu- san,  pengukusan,  penyangraian  dan  pengeringan oven  masing-masing  selama  30  menit.  Perebusan dilakukan  pada  air  mendidih  dengan  perbandingan 1:2 (w/v).  Air mendidih juga digunakan pada proses pengukusan  selama  30  menit.  Pada  proses  pe- nyangraian,  sampel  dimasukkan  pada  wajan  yang telah  dipanaskan  sampai  dengan  suhu  110°C  dan kemudian  dilakukan  pengadukan  secara  kontinyu selama  30  menit.  Pengeringan  menggunakan  oven dilakukan  pada  suhu  170°C.  Kacang  kedelai  dan kacang bogor tanpa pengolahan digunakan sebagai kontrol.
Pengujian hidrofobisitas (H 0 )
Indeks  hidrofobisitas  diukur  dengan  metode Alizadeh-Pasdar  dan  Li-Chan  (2000).  Seri  Isolat protein  kacang  kedelai  dan  kacang  bogor  dibuat dengan  konsentrasi  0,005%  sampai  0,025%  (g/mL) dalam  10  mM  buffer  fosfat  (pH  7)  dan  konsentrasi ANS  yang  digunakan  adalah  8  mM  dalam  buffer fosfat. Sebanyak 20 µL 8 mM ditambahkan ke dalam 4 mL larutan protein kemudian didiamkan selama 15
menit  dalam  ruangan  gelap.  Intensitas  fluoresens dari  masing-masing  larutan  protein  diukur  dengan spektrometer  Ocean  Optics  USB4000-FL.  Indeks hidrofobisitas (H 0 ) merupakan nilai slope dari persa- maan  regresi  yang  menghubungkan  nilai  intensitas fluoresensi  relatif  (IFR)  dengan  konsentrasi  protein (%).

## Isolasi protein
Kacang  kedelai  dan  kacang  bogor  yang  telah dipanaskan  digiling  dan  diayak  dengan  ayakan  60 mesh dan kemudian dihitung rendemen tepung yang dihasilkan.  Isolasi  protein  sampel  diawali  dengan penghilangan lemak (Liu et al., 2007). Sampel  yang telah  dihaluskan  direndam  dalam  heksana  teknis (rasio  1:5  w/v)  selama  1  jam  pada  suhu  kamar, kemudian disentrifus (8000 g selama 15 menit pada suhu  4°C).  Supernatan  yang  diperoleh  dibuang, sedangkan  endapannya  diekstrasi  kembali  se- banyak  dua  kali  untuk  menghilangkan  kandungan lemak  yang  masih  tersisa.  Rendemen  isolat  protein dihitung berdasarkan berat tepung hasil pemanasan. Isolasi protein menggunakan metode pengaturan pH (Speroni et  al., 2010).  Teknik  isolasi  protein  ini diharapkan  dapat  menghasilkan  rendemen  yang lebih tinggi dibandingkan teknik lainnya.
Sampel bebas lemak dicampur dengan akuades  (rasio  1:10  w/v),  kemudian  pH  suspensi dinaikkan  sampai  8  dengan  menggunakan  NaOH  1 N  (Merck,  Germany),  diaduk  selama  90  menit  pada suhu  ruang  dan  disentrifus  (10,000  g  selama  30 menit  pada  suhu  4°C).  Nilai  pH  supernatan  yang diperoleh diturunkan sampai 4,5 dengan mengguna- kan  HCl  1  N  (Merck,  Germany),  lalu  disentrifus selama  20  menit.  Supernatan  yang  diperoleh  di- buang,  sedangkan  endapan  proteinnya  diambil  dan dikeringkan dengan pengering beku.

## Pengujian berat molekul isolat protein
Elektroforesis  SDS-PAGE  dilakukan  dengan stacking  gel 5%  (pH  6,8)  dan separating  gel 12% (pH  8,8)  menggunakan  perangkat  SDS-PAGE  dari BIO-RAD.  Proses  elektroforesis  dilakukan  selama 180  menit  dengan  sumber  listrik  dijaga  konstan pada  70  V  sampai  migrasi  pewarna  tersisa  sekitar 0,5  cm  dari  dasar.  Sebanyak  40  µL  sampel  ditam- bahkan  dengan  10  µL  buffer  sampel.  Sampel  isolat protein  diinjeksikan  ke  dalam  sumur  menggunakan mikropipet  dan  pada  salah  satu  sumur  ditempatkan protein  ladder.  Setelah  proses running selesai, dilakukan  pewarnaan  gel  menggunakan  coomasie brilliant blue G-250.
Pengujian alergenisitas metode immunobloting Gel  hasil  elektroforesis  yang  tidak  diwarnai ditransfer  ke  membran  nitroselulosa  0,45  µm  (BIO- RAD) untuk proses bloting. Bloting dilakukan selama 1.5  jam  pada  90  V.  Membran  difiksasi  dengan
metanol  50%  lalu  diblok  dengan  menggunakan Bloto.  Bloto  terdiri  dari  5%  susu  skim  ditambah dengan Phosphate  Buffer  Saline (PBS)  (Sigma- Aldrich)  selama  1  jam  pada  suhu  kamar.  Membran dicuci  dengan Phospate  Buffer  Saline-Tween 20 (PBST)  0,05%  (Sigma-Aldrich)  sebanyak  3  kali, masing-masing selama 5 menit. Membran ditambah- kan  serum  penderita  alergi  yang  telah  diencerkan dua  kali  dalam  Bloto  dan  diinkubasi  selama  1  jam pada suhu kamar. Pencucian dilakukan lagi dengan menggunakan  PBST  sebanyak  tiga  kali  masing- masing  selama  5  menit,  kemudian  ditambahkan antibodi HRP  Conjugated  Mouse  anti-Human  IgE (pengenceran  1:2000  dalam  Bloto)  dan  diinkubasi selama  1  jam  sambil  digoyang.  Hasil  deteksi  kom- pleks protein alergen dengan serum secara kualitatif akan  terlihat  setelah  diberikan  substrat  DAB,  ditan- dai  dengan  terjadinya  kompleks  berwarna  coklat pada membran nitroselulosa.
Pengujian  alergenisitas  metode enzyme  linked immunosorbent assay (ELISA) Metode  ELISA  yang  digunakan  adalah indirect ELISA (Rupa et al., 2008) . Sebanyak 100 µL/sumur isolat  protein  sampel  (100  µg/mL)  yang  terlarut dalam bufer karbonat (0,05 M, pH 9,8) dilapiskan ke dalam lempeng mikrotiter (Nunc Maxisorb). Inkubasi dilakukan selama 18 jam pada suhu 4°C, lalu dicuci sebanyak  tiga  kali  dengan  PBST  (200  µL/sumur). Selanjutnya  lempeng  mikrotiter  diblok  dengan larutan Bloto sebanyak 200 µL/sumur dan diinkubasi selama  1  jam  pada  suhu  37°C.  Lempeng  mikrotiter kemudian  dicuci  sebanyak  tiga  kali  dengan  PBST (200  µL/sumur).  Serum  penderita  alergi  yang  telah diencerkan  1:5  dalam  Bloto  ditambahkan  pada lempeng  mikrotiter  sebanyak  100  µL/sumur  dan diinkubasi  selama  1  jam  pada  suhu  37°C.  Setelah inkubasi,  lempeng  mikro-titer  dicuci  sebanyak  tiga kali  dengan  PBST  (200  µL/sumur).  Penambahan antibodi  sekunder  dilaku-kan  setelah  sebelumnya telah  diencerkan  1:6000  dalam  Bloto.  Antibodi sekunder  yang  ditambahkan  ke  dalam  lempeng mikrotiter  sebanyak  100  µL/  sumur  diinkubasi  pada suhu 37°C selama 1 jam, dicuci dengan PBST (200 µL/sumur)  sebanyak  tiga  kali,  lalu  ditambahkan substrat TMB ( 3,3’,5,5’-tetra-metilbenzidin)  se- banyak 100 µL/sumur, dan diinkubasi lagi selama 20 menit pada suhu 37°C. Hasil positif ditandai dengan timbulnya  warna  biru.  Reaksi  dihentikan  dengan menggunakan  H 2 SO 4 2M  sebanyak  50  µL/sumur dan  larutan  berubah  warna  menjadi  kuning  cerah. Optical  Density (OD)  diukur  dengan  menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pengolahan kacang kedelai dan kacang bogor
Hasil analisis proksimat kacang kedelai varietas lokal  grobogan  dan  kacang  bogor  pada  Tabel  1 menunjukkan  bahwa  kedua  kacang  tersebut  me- miliki  kandungan  protein  yang  cukup  tinggi,  yaitu 35,87%  (bk)  untuk  kacang  kedelai  dan  22,11%  (bk) untuk  kacang  bogor.  Proses  pengolahan  kacang kedelai  dengan  melibatkan  pemanasan  banyak  di- gunakan dalam pembuatan berbagai produk, seperti tahu,  tempe,  dan  susu  kedelai.  Selain  untuk  meng- inaktivasi  antinutrisi  seperti trypsin  inhibitor ,  pe- ngolahan  dengan  panas  pada  kedelai  juga  diguna- kan  untuk  meningkatkan  daya  cerna  protein,  mem- berikan  karakteristik  flavor,  meningkatkan  sifat fungsional protein (pembentukan gel, busa, dan sifat emulsifikasi) serta mengurangi aktivitas alergenisitas produk berbahan dasar kedelai (L’Hocine dan Boye, 2007).
Tabel 1.  Hasil  analisis  proksimat  kacang  kedelai dan kacang bogor Komposisi % (bk)* Kacang Kedelai Kacang bogor Air Lemak Protein Karbohidrat 9,07 ± 0,06 22,89 ± 0,05 35,87 ± 0,01 35,63 ± 0,07 56,74 ± 0,05 11,16 ± 0,10 22,11 ± 0,50 61,68 ± 0,74
Keterangan: *Data merupakan nilai rata ± standar deviasi
Tabel 2 menunjukkan rendeman tepung kacang hasil  pemanasan  basah  (perebusan  dan  pengukus- an)  dan  pemanasan  kering  (pemanasan  oven  dan penyangraian)  selama  30  menit.  Tepung  kacang yang  dihasilkan  dari  pengolahan  basah  lebih  sedikit dibandingkan  dengan  hasil  dari  pengolahan  kering. Hal  ini  dapat  disebabkan  oleh  adanya  komponen yang  terlarut  dalam  air  selama  proses  perebusan dan pengukusan.
Tabel 2.  Rendemen  tepung  setelah  proses  pe-
ngolahan basah dan kering Proses Pemanasan (30 menit) % Rendemen (bb)* Kacang Kedelai Kacang bogor Perebusan 44,55 ± 0,78 42,70 ± 0,99 Pengukusan 52,92 ± 2,72 54,70 ± 0,99 Pemanasan oven 78,06 ± 0,37 57,46 ± 1,05 Penyangraian 81,3 ± 1,84 49,96 ± 0,18
Keterangan: *Data merupakan nilai rata ± standar deviasi

## Isolat protein kacang
Sampel kacang kedelai dan kacang bogor yang telah  mengalami  pemanasan  diisolasi  proteinnya dengan  menggunakan  metode  pengaturan  pH. Teknik  isolasi  protein  ini  diharapkan  dapat  meng- hasilkan  rendemen  yang  lebih  tinggi  dibandingkan isolasi  protein  dengan  metode isoelectric  precipi-
41,42 ±0,41 35,41 ±0,34 60,36 ±0,51 40,50 ±0,43 15,43 ±0,14 0 10 20 30 40 50 60 70 Kontrol Kukus Rebus Sangrai Oven In de k s H idro fo bi s ita s (H 0 ) x 1 0 0 0 Pemanasan 30 Menit (Tanpa Pemanasan)
tation , aqueous  precipitation ,  dan alcohol  precipi- tations (Wu et  al., 2009).  Rendemen  isolat  protein berdasarkan berat tepung kacang dapat dilihat pada Tabel  3.  Proses  pemanasan  dengan  air  dapat  me- nyebabkan  adanya  komponen  protein  yang  terlarut dalam  air.  Selain  itu  proses  pengadukan  dalam waktu  yang  lama  pada  saat  proses  isolasi  juga dapat menyebabkan adanya komponen protein yang berkurang.
Tabel 3.  Rendemen  isolat  protein  (berdasarkan berat tepung kacang)
Proses Pemanasan % Rendemen (bb)* Kacang Kedelai Kacang bogor Perebusan 30 menit 5,28 ± 1,66 0,26 ± 0,04 Pengukusan 30 menit 6,38 ± 0,18 0,22 ± 0,08 Pemanasan oven 30 menit 0,950 ± 0,001 0,94 ± 0,20 Penyangraian 30 menit 2,15 ± 0,34 0,26 ± 0,02 Tanpa pemanasan 24,48 ± 1,45 3,06 ± 0,08
Keterangan: *Data merupakan nilai rata ± standar deviasi
Isolasi  protein  menggunakan  pengaturan  pH dimaksudkan  untuk  mendapatkan  rendemen  isolat protein  dalam  jumlah  tinggi,  namun  pada  penelitian ini  rendemen  isolat  protein  yang  diperoleh  setelah proses pemanasan relatif  kecil.  Secara umum isolat protein  kacang  kedelai  dan  kacang  bogor  diperoleh melalui  dua  proses  utama  yaitu  ekstraksi  dan koagulasi  protein.  Isolasi  dan  koagulasi  protein sangat  dipengaruhi  oleh  sifat-sifat  protein  yang terkandung dalam bahan akibat proses pemanasan. Proses pemanasan dapat mengakibatkan terjadinya perubahan pH titik isoelektriknya (pI) sehingga jenis protein  yang  dapat  terisolasi  dapat  berubah. Keadaan  ini  yang  menyebabkan  rendemen  isolat protein  yang  diperoleh  menurun  setelah  pemanas- an.  Sebagian  besar  protein  kedelai  merupakan kelompok  protein  globulin  yang  mempunyai  titik isoelektrik  4,1-4,6.  Pada  umumnya  protein  globulin akan  mengendap  pada  pH  4,1,  sedangkan  protein- protein lainnya seperti albumin dan prolamin bersifat larut  dalam  air.  Penurunan  kadar  protein  selama pemanasan  diduga  disebabkan  terlepasnya  ikatan dalam  struktur  protein  yang  mengakibatkan  ter- larutnya  komponen  protein  dalam  air.  Penurunan rendemen  konsentrat  protein  akibat  pemanasan juga ditunjukkan pada hasil ekstraksi protein kacang komak ketika suhu dan waktu ekstraksi ditingkatkan (Purwitasari et al., 2014).
Indeks hidrofobisitas (H 0 ) 1-anilin-8-naftalen  sulfonat  (ANS)  merupakan pewarna  fluoresen  yang  banyak  digunakan  dalam analisis  perubahan  konformasi  protein.  ANS  akan berkonjugasi  dengan  grup  hidrofobik  dari  protein yang terekspos ke permukaan akibat adanya pema-
nasan. Bagian hidrofobik dari protein yang terekspos ke  permukaan  memegang  peranan  penting  pada interaksi  hidrofobik  dan  berpengaruh  pada  sifat emulsi  dan  pembentukan  busa  pada  pangan  yang berasal  dari  protein  (Kato  dan  Nakai,  1980).  Indeks hidrofobisitas  (H 0 )  dari  isolat  protein  kacang  kedelai dan kacang bogor dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2.
Gambar 1. Indeks hidrofobisitas (H 0 ) kacang kedelai setelah pemanasan selama 30 menit
Gambar 2. Indeks  hidrofobisitas  (H 0 )  kacang  bogor setelah pemanasan selama 30 menit
Proses  pemanasan  mengubah  indeks  hidrofo- bisitas  isolat  protein  kacang  kedelai  dan  kacang bogor.  Pada  sampel  isolat  protein  kacang  kedelai (Gambar  1),  nilai  H 0 hasil  pemanasan  lebih  rendah daripada  H 0 isolat  protein  kacang  kedelai  kontrol, kecuali  pada  perebusan  selama  30  menit.  Sedang- kan  pada  sampel  isolat  protein  kacang  bogor (Gambar  2),  nilai  H 0 hasil  pemanasan  lebih  rendah daripada isolat protein kacang bogor kontrol, kecuali pada  penyangraian  selama  30  menit.  Sebagaimana telah  dijelaskan  sebelumnya,  jenis  protein  dapat terisolasi  sangat  dipengaruhi  oleh  sifat  protein  yang
15,65 ±0,13 2,51 ±0,27 5,15 ±0,61 26,33 ±0,33 13,28 ±0,16 0 5 10 15 20 25 30 Kontrol Kukus Rebus Sangrai Oven
In d e k s Hid ro fo b is ita s (H 0 ) x 1 0 0 0 Pemanasan 30 Menit (Tanpa Pemanasan)
dapat  berubah  akibat  pemanasan.  Pemanasan dapat mengakibatkan perubahan kelarutan pada pH titik  isoelektriknya  (pI)  sehingga  jenis  protein  yang terisolasi  tidak  sama  dan  berakibat  pada  terjadinya perubahan  hidrofobisias.  Hidrofobisitas  memiliki peran  penting  dalam  menentukan  konformasi protein.  Protein  yang  mengalami  denaturasi  antara lain  dapat  dilihat  dari  perubahan  struktur  fisiknya. Protein  yang  terdenaturasi  biasanya  mengalami pembukaan  lipatan  pada  bagian-bagian  tertentu dalam  strukturnya.  Selain  itu,  protein  yang  ter- denaturasi  akan  berkurang  kelarutannya.  Lapisan molekul  yang  bersifat  hidrofobik  akan  mengalami perubahan posisi dalam lipatan proteinnya, dari arah dalam  ke  arah  luar,  sehingga  akan  menyebabkan terjadinya  perubahan  kelarutan.  Nilai  hidrofobisitas isolat  protein  kedelai  yang  dipanaskan  lebih  tinggi dibandingkan isolat protein tanpa pemanasan (Shen dan  Tang,  2012).  Xue et  al .  (2013)  melakukan pemanasan  kering  pada  isolat  protein  kedelai  yang dikonjugasikan  dengan  maltodekstrin  dan  gum acacia  dan  diperoleh  nilai  hidrofobisitas  dari  isolat protein  yang  dipanaskan  lebih  besar  daripada  isolat protein  tanpa  pemanasan,  namun  proses  konjugasi dapat  menurunkan  nilai  hidrofobisitas  isolat  protein kedelai.  Hal  ini  disebabkan  proses  konjugasi  meng- hambat  pengikatan  ANS  dengan  gugus  hidrofobik sehingga nilai hidrofobisitas menurun.

## Profil berat molekul protein berdasarkan elektro- foresis SDS-PAGE
Berat  molekul  fraksi  isolat  protein  dapat diketahui dengan menggunakan elektroforesis SDS- PAGE.  Analisis  ini  menggunakan  Sodium  Dodesil
Sulfat  (SDS)  yang  dapat  merusak  ikatan  non kovalen (seperti ikatan hidrofobik, ionik, dan van der Waals)  dan  -merkaptoetanol  yang  dapat  merusak ikatan  disulfida  pada  rantai  polipeptida  sehingga protein  berada  dalam  bentuk  polipeptida  tunggal. Profil  berat  molekul  isolat  protein  kacang  kedelai setelah  pemanasan  basah  dan  pemanasan  kering dapat  dilihat  pada  Gambar  3A  sedangkan  profil berat  molekul  isolat  protein  kacang  bogor  dapat dilihat pada Gambar 3B.
Pemanasan  kacang  menyebabkan  profil  berat molekul  isolat  protein  bervariasi.  Berdasarkan  hasil elektroforesis  SDS-PAGE,  kedelai  kontrol  (tanpa pemanasan)  dengan  varietas  lokal  grobogan  me- miliki  isolat  protein  dengan  berat  molekul  antara 9,6 –114,7 kDa dengan pita protein yang cukup tebal pada  berat  molekul  54,0  kDa  yang  termasuk  dalam fraksi  7S-globulin  dan  pita  19,6  kDa  yang  termasuk dalam  fraksi  2S  globulin  (Ogawa et  al., 1991).  Pita alergen  utama  dengan  berat  molekul  30-34  dan  26 kDa  tidak  terlihat  pada  kedelai  grobogan.  Proses pemanasan  basah  dan  kering  menyebabkan  profil berat  molekul  protein  kedelai  bervariasi  dan  pada umumnya jumlah protein yang terdeteksi berkurang. Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  proses  pema- nasan menyebabkan terjadinya perubahan kelarutan protein,  sehingga  mempengaruhi  jumlah  dan  jenis protein  yang  dapat  terekstrak  dalam  proses  isolasi protein.  Isolat  protein  kacang  bogor  kontrol  (tanpa pemanasan)  memiliki  berat  molekul  protein  8,5- 115,4 kDa dengan pita yang cukup tebal pada berat molekul 71,0; 62,9; dan 25,3 kDa.
Gambar 3.  Profil berat molekul isolat protein kacang kedelai (A) dan kacang bogor (B) setelah pemanasan selama 30 menit
A B Kontrol Kedelai 114,7 85,4 54,0 24,6 19,6 16,6 12,4 9,6
Rebus 30 Menit
54,0
44,4 24,6 19,0 14,6 12,8 9,2 Kukus 30 Menit 85,4 54,0 14,6 Sangrai 30 Menit 85,4 54,0 50,6 32,9
25,0
16,6 12,4
Oven  30 Menit 85,4 47,8 24,6 19,6 12,4 9,6 Kontrol Kcg bogor 115,4 71,0 62,9 46,4
36,4 32,2
25,3
13,4
10,8
8,5 Rebus 30 Menit 71,0
62,9 36,4 32,2 21,1 13,4
Kukus 30 Menit 71,0
62,9 25,3 Sangrai
30 Menit
62,9 25,3
Oven  30 Menit
62,9 36,4
Astuti  (2012)  melaporkan  hasil  elektroforesis SDS-PAGE isolat kacang bogor memiliki profil berat molekul  protein  66,1;  63,4;  55,7;  43;  27;  dan  19,2 kDa.  Proses  pemanasan  pada  kacang  bogor  juga menyebabkan  profil  berat  molekul  isolat  protein kacang  bogor  bervariasi  dan  pada  umumnya  ber- kurang.

## Profil  protein  alergen  berdasarkan  pengujian immunobloting
Alergenisitas  isolat  protein  kacang  yang  telah mengalami  pemanasan  dianalisis  dengan  teknik immunobloting dengan  menggunakan  serum  pen- derita  alergi  kacang.  Hasil immunobloting isolat protein kacang kedelai dan kacang bogor yang telah mengalami pemanasan basah dan kering selama 30 menit terdapat pada Gambar 4A dan 4B.
Kacang  kedelai  memiliki  alergen  utama  Gly  m Bd  30K  atau  disebut  juga  P34,  Gly  m  Bd  28K,  dan Gly m Bd 60K dengan berat molekul masing-masing 30-34,  26,  dan  63-67  kDa  (Ogawa et  al., 2000). Selain  itu  terdapat  protein  alergen  lainnya  pada kedelai  yang  dapat  berikatan  dengan  IgE  penderita alergi kedelai, yaitu protein dengan berat molekul 26 dan 68 kDa (Astuti, 2012). Pada hasil immunobloting isolat  protein  kedelai  kontrol  (tanpa  pemanasan), terdapat 5 protein  yang dapat berikatan dengan IgE serum penderita alergi kedelai, yaitu protein dengan berat molekul 110,0; 98,3; 84,5; 67,4; dan 60,2 kDa. Jika  dibandingkan  dengan  hasil  elektroforesis  SDS- PAGE  kacang  kedelai  (Gambar  3A),  tidak  terlihat pita  dari  protein-protein  tersebut.  Hal  ini  menunjuk- kan  bahwa  alergenisitas  suatu  protein  tidak  ber- gantung  pada  konsentrasi  proteinnya.  Protein dengan  berat  molekul  67,4  dan  60,2  kDa  termasuk dalam protein utama Gly m Bd 60K.
Pada hasil immunobloting isolat protein kacang kedelai  yang  mengalami  perebusan,  pengukusan, pemanasan  oven,  dan  penyangraian  selama  30 menit,  tidak  terlihat  adanya  pita  protein  yang  me- nunjukkan  bahwa  tidak  ada  protein  yang  berikatan dengan  IgE  serum  penderita  alergi.  Hal  ini  me- nunjukkan  bahwa  proses  perebusan,  pengukusan, pemanasan oven, dan penyangraian kacang kedelai selama  30  menit  dapat  menghilangkan  alergenitas isolat protein kedelai grobogan.
Isolat  protein  kacang  bogor  tanpa  proses  pe- manasan  memiliki  protein  yang  dapat  berikatan dengan  IgE  serum  penderita  alergi  kacang,  yaitu protein  dengan  berat  molekul  113,1;  59,8;  dan  25,2 kDa  (Gambar  4B).  Penelitian  yang  dilakukan  Astuti (2012) menunjukkan bahwa kacang kedelai memiliki protein alergen dengan berat molekul 69; 64; 62; 56; 44,7;  42,9; dan 30 kDa. Isolat protein kacang  bogor yang  telah  mengalami  pemanasan  basah  masih memperlihatkan  pita  yang  menunjukkan  terdapat protein dapat berikatan dengan IgE serum penderita alergi  kacang,  yaitu  protein  dengan  berat  molekul 59,8  kDa  pada  kacang  bogor  yang  direbus  selama 30 menit dan protein dengan berat molekul 25,2 kDa pada  kacang  bogor  yang  dikukus  selama  30  menit. Perebusan dan pengukusan selama 30 menit belum dapat  menghilangkan  alergenisitas  kacang  bogor yang  dapat disebabkan  karena  rendahnya  suhu  pe- manasan maupun waktu pemanasan yang dilakukan hanya selama 30 menit. Namun pada kacang  bogor yang  telah  mengalami  pemanasan  oven  dan  pe- nyangraian  selama  30  menit  tidak  terlihat  pita protein  alergen,  yang  menunjukkan  bahwa  proses pemanasan  kering  dapat  menghilangkan  alerge- nisitas isolat protein kacang bogor.
Gambar 4.  Profil  protein  alergen  isolat  kacang  kedelai  (A)  dan  kacang  bogor  (B)  setelah  pemanasan  30 menit
A
Rebus 30 Menit Kukus 30 Menit Sangrai 30 Menit Oven 30 Menit Protein
Marker 260 140 100 70 50 40 35 25 15 10 98,3 64,4 Kontrol Kedelai 110,0 84,5 60,2 B Sangrai 30 Menit Oven
30 Menit Protein
Marker 260 140 100
70
50 40 35 25 15
10 Kontrol Kcg bogor
113,1 59,8
25,2
Rebus 30 Menit 59,8
Kukus 30 Menit 25,2
0,40 0,42 0,22 0,18 0,32 0,42 0,08 0,12 0,15 0,18 - 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 Tanpa Kukus Rebus Sangrai Oven O p ti c a l Den s ity (O D) Pemanasan 30 Menit Pemanasan Kontrol negatif SIgE kacang kedelai 0,20 0,10 0,10 0,10 0,17 0,26 0,14 0,15 0,12 0,25 - 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 Tanpa Kukus Rebus Sangrai Oven
O p ti c a l Den s ity (O D) Pemanasan 30 menit Pemanasan
Kontrol negatif SIgE kacang bogor
Reaktivitas  imunologi  isolat  protein  kacang  ber- dasarkan uji ELISA
Enzyme  Linked  Immunosorbent  Assay (ELISA) digunakan  untuk  pengujian  alergenisitas  protein kacang  yang  telah  mengalami  pemanasan.  Pada pengujian  sensitivitas  ini,  digunakan  serum  yang berasal dari penderita alergi kacang dan serum dari penderita non alergi sebagai kontrol negatif. Masing- masing  serum  diikatkan  dengan  isolat  protein kacang  dan  kemudian  dideteksi  dengan  antibodi sekunder  yang  berlabel  enzim.  Nilai Optical  Density (OD)  pada  panjang  gelombang  450  nm  protein kacang  yang  telah  mengalami  pemanasan  terdapat pada Gambar 5 (A) dan (B). Nilai OD yang diperoleh berbanding  lurus  dengan  konsentrasi  IgE  (Frias et al., 2008).
Gambar 5. Reaktivitas imunologi isolat protein kacang kedelai (A) dan kacang bogor (B) setelah pemanasan
Pada  hasil  uji  ELISA  isolat  protein  kacang kedelai  (Gambar  5A)  dapat  dilihat  bahwa  nilai  OD
yang  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  kontrol negatif  hanya  terdapat  pada  serum  yang  berikatan dengan  protein  kedelai  kontrol  (tanpa  pemanasan). Hal ini menunjukkan bahwa terdapat protein alergen kedelai  yang  dapat  berikatan  dengan  IgE  serum penderita  alergi  kacang.  Pada  isolat  protein  kedelai yang  telah  dipanaskan  tidak  terdeteksi  adanya protein  alergen  yang  ditunjukkan  dengan  nilai  OD yang  lebih  kecil  dari  kontrol  negatif.  Maleki et  al. (2000)  menunjukkan  bahwa  protein  kacang  tanah yang  disangrai  mengikat  IgE  lebih  tinggi  dibanding- kan dengan kacang tanah mentah yang disebabkan adanya modifikasi protein akibat reaksi Mailard. Van de Lagemaat et al. (2007)  melaporkan bahwa  isolat protein  kedelai  yang  terglikasi  dengan  penambahan fruktosa  maupun  frukto-oligosakarida  melalui  reaksi Maillard,  menunjukkan  adanya  penurunan  group asam  amino  primer.  Sifat  antigenisitas  protein  ter- glikasi  juga  mengalami  penurunan  sampai  dengan 90%  dibandingkan  dengan  bentuk  yang  tidak terglikasi.
Hasil  uji  ELISA  isolat  protein  kacang  bogor (Gambar  5B)  menunjukkan  bahwa  semua  isolat kacang  bogor  dengan  pemanasan  selama  30  menit memiliki  nilai  OD  yang  lebih  tinggi  daripada  kontrol negatif.  Jika  dibandingkan  dengan  hasil immuno- bloting isolat  protein  kacang  bogor  (Gambar  4B), deteksi  positif  terdapat  pada  isolat  protein  kacang bogor  kontrol  serta  isolat  protein  kacang  bogor dengan  perebusan  30  menit  dan  pengukusan  30 menit.  Tidak  terdapatnya  deteksi  positif  pada  isolat protein  kacang  bogor  dengan  pemanasan  oven  30 menit dan penyangraian 30 menit dapat disebabkan IgE  yang  berikatan  dengan  protein  alergen  tidak cukup  memberikan  warna,  sehingga  hasil immuno- bloting terlihat negatif.

## KESIMPULAN
Proses  perebusan,  pengukusan,  pemanasan oven,  dan  penyangraian  mempengaruhi  profil  berat molekul  protein  isolat  kacang.  Isolat  protein  kacang kedelai  grobogan  tanpa  pemanasan  memiliki  pita- pita  protein  dengan  berat  molekul  9,6 –114,7  kDa, sedangkan  kacang  bogor  memiliki  pita  protein dengan  berat  molekul  8,5  kDa  sampai  115,4  kDa. Setelah  pemanasan  selama  30  menit,  baik  pada isolat protein kacang kedelai maupun kacang bogor, terbentuk protein dengan berat molekul lebih rendah pada  masing-masing  pengolahan.  Kacang  kedelai grobogan  memiliki  protein  alergen  dengan  berat molekul 110,0; 98,3; 84,5;  67,4; dan  60,2 kDa  yang dapat  berikatan  dengan  IgE  serum  penderita  alergi kacang, namun proses pemanasan selama 30 menit dapat meminimalisasi alergenisitas yang ditunjukkan dengan  tidak  terdeteksi  pita  protein  pada  hasil immunobloting dan nilai OD setiap pemanasan yang
A
B
lebih  kecil  daripada  kontrol  pada  hasil  ELISA. Kacang bogor memiliki protein alergen dengan berat molekul  113,1;  59,8;  dan  25,2  kDa.  Setelah  proses pemanasan pada kacang bogor, pita protein alergen dengan  berat  molekul  25.2  kDa  terdeteksi  pada isolat  protein  dengan  perebusan  selama  30  menit dan  pita  protein  59,8  kDa  terdeteksi  pada  pengu- kusan  selama  30  menit  dan  tidak  terdeteksi  pada pemanasan  secara  kering.  Berdasarkan  hasil ELISA,  masih  terdeteksi  protein  alergen  setelah proses  pemanasan  kacang  bogor  yang  menunjuk- kan  bahwa  pemanasan  basah  dan  kering  pada kacang  bogor  selama  30  menit  belum  mampu menghilangkan alergenisitas kacang bogor.

## DAFTAR PUSTAKA
Alizadeh-Pasdar N,
Li-Chan ECY. 2000.
Comparison  of  protein  surface  hydrophobicity measured  at  various  pH  values  using  three different  fluorescent  probes.  J  Agr  Food  Chem 48: 328-334. DOI: 10.1021/jf990393p.
Astuti  RM.  2012.  Isolasi  dan  Karakterisasi  Protein Kacang  Kedelai,  Kacang  Tanah,  dan  Kacang Bogor untuk Pembuatan Isolat Alergen. [Tesis]. Bogor:  Fakultas  Teknologi  Pertanian,  Institut Pertanian Bogor.
Bowman  CC,  Selgrade  MK.  2008.  Failure  to  induce oral  tolerance  in  mice  is  predictive  of  dietary allergenic potency among foods with sensitizing capacity.  Toxicol  Sci 106:  435 –443.  DOI: 10.1093/toxsci/kfn200.
Brown  SGA.  2004.  Clinical  features  and  severity grading  of  anaphylaxis.  J  Allergy  Clin  Immun 114: 371-376. DOI: 10.1016/j.jaci.2004.04. 029.
Frias  J,  Song  YS,  Martinez-Villaluenga  C,  de  Mejia EG,  Vidal-Valverde  C.  2008.  Immunoreactivity and  amino  acid  content  of  fermented  soybean products.  J  Agr  Food  Chem 56:  99-105.  DOI: 10.1021/jf072177j.
Kato  A,  Nakai  S.  1980.  Hydrophobicity  determined by  a  fluorescence  probe  method  and  its correlation  with  surface  properties  of  proteins. Bba-Protein  Struct  M 624:  13 –20.  DOI: 10.1016/0005-2795(80)90220-2.
Kindt  TJ,  Goldsby  RA,  Osborne  BA.  2007. Immunology. New York: Sara Tenney.
Kresno  SR.  2001.  Imunologi:  Diagnosis  dan  Pro- sedur  Laboratorium.  Jakarta:  Fakultas  Kedok- teran Universitas Indonesia.
L'Hocine  L, Boye  JI.  2007.  Allergenicity  of  soybean: New developments in identification of allergenic proteins, cross-reactivities and hypoallergeniza- tion  technologies.  Crit  Rev  Food  Sci 47:  127- 143.
Liu C, Wang H, Cui Z, He X, Wang X, Zeng X, Ma H. 2007.  Optimization  of  extraction  and  isolation for  11S  and  7S  globulins  of  soybean  seed storage  protein.  Food  Chem  102:  1310 –1316.
DOI: 10.1016/j.foodchem.2006.07.017.
Maleki SJ, Chung SY, Champagne ET, Raufman JP. 2000.  The  effects  of  roasting  on  the  allergenic properties  of  peanut  proteins.  J  Allergy  Clin Immun  106:  763-768.  DOI:  10.1067/mai.2000. 109620.
Mondoulet  L,  Paty  E,  Drumare  MF,  Ah-Leung  S, Scheinmann P, Willemot RM, Wal JM, Bernard H. 2005. Influence of thermal processing on the allergenicity  of  peanut  proteins.  J  Agric  Food Chem 53: 4547 –4553. DOI: 10.1021/jf050091p.
Ogawa  T,  Bando  N,  Tsuji  H,  Okajima  H,  Nishikawa K,  Sasaoka  K.  1991.  Investigation  of  the  IgE- binding proteins in soybeans by immunoblotting with  the  sera  of  the  soybean-sensitive  patients with  atopic  dermatitis.  J  Nutr  Sci  Vitaminol  37: 555-565. DOI: 10.3177/jnsv. 37.555.
Ogawa  T,  Samoto  M,  Takahashi  K.  2000.  Soybean allergens and hypoallergenic soybean products. J  Nutr  Sci  Vitaminol  46:  271 –279.  DOI: 10.3177/jnsv.46.271.
Purwitasari A, Hendrawan Y, Yualianingsih R. 2014. Pengaruh  suhu  dan  waktu  ekstraksi  terhadap sifat  fisik  kimia  dalam  pembuatan  konsentrat protein  kacang  komak (Lablab  purpureus  (L.) sweet). J Bioproses Komoditas Tropis 2: 42-53.
Rupa  P,  Hamilton  K,  Cirinna  M,  Wilkie  BN.  2008.
Porcine IgE in the context of experimental food allergy:  Purification  and  isotype-specific  anti- bodies.  Vet  Immunol  Immunop  125:  303-314. DOI: 10.1016/j.vetimm.2008.05.028.
Speroni  F,  Milesi  V,  Anon  MC.  2010.  Interactions between  isoflavones  and  soybean  proteins: Application  in  soybean  protein  isolate  pro- duction. LWT-Food Sci Technol 43: 1265-1270. DOI: 10.1016/j.lwt.2010.03.011.
Shen  L,  Tang  CH.  2012.  Microfluidization  as  a potential technique to modify surface properties of  soy  protein  isolate.  Food  Res  Int 48:  108- 118. DOI: 10.1016/j.foodres.2012.03.006.
Sun P, Li D, Li Z, Dong B, Wang F. 2008. Effects of glycinin  on  IgE-mediatedincrease  of  mast  cell numbers  and  histamine  release  in  the  small intestine.  J  Nutr  Biochem  19:  627 –633.  DOI:
10.1016/j.jnutbio.2007.08.007.
Van de Lagemaat J, Manuel SJ, Javier MF, Agustin O,  Dolores  MC.  2007.  In  vitro  glycation  and antigenicity  of  soy  proteins.  Food  Res  Int  40: 153-160. DOI: 10.1016/j.foodres.2006.09.006.
Van Putten MC, Kleter GA, Gillisen LJWJ, Gremmen B,  Wichers  HJ,  Frewer  LJ.  2011.  Novel  food
and  allergy:  Regulations  and  risk-benefit assessment.  Food  Cont 22:  143-157.  DOI: 10.1016/j.foodcont.2010.08.002.
Vissers  YM,  Blanc  F,  Skov  PS,  Johnson  PE,  Rigby NM,  Przybylski-Nicaise  L,  Bernard  H,  Wal  JM, Ballmer-Weber B, Zuidmeer-Jongejan L, Szepfalusi  Z,  Ruinemans-Koerts  Janneke, Jansen  APH,  Savelkoul  HFJ,  Wichers  HJ, Mackie  AR,  Mills  CEN,  Adel-Patient  K.  2011. Effect  of  heating  and  glycation  on  the allergenicity  of  2S  albumins  (Ara  h  2/6)  from peanut.  PLoS  One  6:  e23998.  DOI:  10.1371/ journal.pone.0023998.
Wilson  S,  Blaschek  K,  de  Mejia  E.  2005.  Allergenic proteins  in  soybean:  Processing  and  reduction of  P34  allergenicity.  Nutr  Rev 63:  47-58.  DOI: 10.1301/nr.2005.feb.47-58.
Wang  J,  Sun  B,  Cao  Y,  Tian  Y.  2009.  Protein glycation  inhibitory  activity  of  wheat  bran feruloyl oligosaccharides. Food Chem 112: 350- 353. DOI: 10.1016/j.foodchem.2008.05.072.
Wu  H,  Wang  Q,  Ma  T,  Ren  J.  2009.  Comparative studies  on  the  functional  properties  of  various protein  concentrate  preparations  of  peanut protein.  Food  Res  Int  42:  343 –348.  DOI:
10.1016/j.foodres.2008.12.006.
Xue  F,  Li  C,  Zhu  X,  Wang  L,  Pan  S.  2013. Comparative  studies  on  the  physicochemical properties  of  soy  protein  isolate-maltodextrin and  soy  protein  isolate-gum  acacia  conjugate prepared  through  Maillard  reaction.  Food  Res Int 51:  490-495.  DOI:  10.1016/j.foodres.2013. 01.012.