Perbandingan Aktivitas Penghambatan Sel Kanker Payudara Fraksi Aseton dan Etil Asetat Kulit Buah Coklat ( Theobroma cacao )
Hartanti 1 , Iwan Sariyanto 2
1 Program Studi Sarjana Terapan Poltekkes Kemenkes Tanjungkarang
2 Program Studi D III  Poltekkes Kemenkes Tanjungkarang

## Abstrak
Kanker payudara merupakan kanker yang paling sering didiagnosis di kalangan wanita, berdampak pada 2,1 juta wanita setiap tahunnya. Kemoterapi masih menjadi penanganan utama kanker payudara. Akan terapi kemoterapi memiliki efek samping berbahaya bagi sel-sel normal. Oleh karena itu, masih diperlukan senyawa baru dengan potensi terapeutik yang lebih baik dan efek samping yang lebih rendah. Penelitian ini menggunakan kulit coklat sebagai kandidat penemuan senyawa obat kanker payudara.  Tujuan penelitian ini untuk  membandingkan  fraksi aseton  dan  etil  asetat  dalam  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker  payudara  MCF-7.  Metode  ekstraksi  yang digunakan adalah maserasi dan dilanjutkan dengan fraksinasi cair-cair. Uji aktivitas antikanker MCF-7 dilakukan dengan  metode MTT  assay menggunakan  sel  kanker  payudara  MCF-7  (ATCC  HTB  22).  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  Fraksi  etil  asetat  memiliki  kemampuan  penghambatan  pertumbuhan  sel  kanker  payudara MCF-7  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  fraksi  aseton.  Nilai  penghambatan  pertumbuhan  sel  kanker  MCF-7 tertinggi pada fraksi etil asetat diperoleh pada konsentrasi 50 μg/mL, yaitu 14,13%. Sedangkan, pada konsentrasi yang sama nilai persen inhibisi fraksi etanol hanya 7,9%. Berdasarkan nilai IC 50 ,baik fraksi aseton maupun etil asetat  kulit  coklat  memiliki  aktivitas  antikanker  yang  tergolong  lemah.  Perlu  dilakukan  optimasi  metode ekstraksi  untuk  mendapatkan  nilai  IC50  yang  lebih  optimal  dalam  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker payudara MCF-7
Kata Kunci : MCF-7, Kulit Coklat, CPH
Comparison of Breast Cancer Cell Inhibition Activity of Acetone and Ethyl Acetate Fractions from Cocoa Pod Husk ( Theobroma cacao )

## Abstract
Breast cancer is the  most commonly diagnosed cancer among  women, affecting  2.1  million  women each  year. Chemotherapy remains the primary treatment for breast cancer; however, it has harmful side effects on normal cells.  Therefore,  new  compounds  with  better  therapeutic  potential  and  fewer  side  effects  are  still  needed.  This study  uses  cocoa  peel  as  a  candidate  for  the  discovery  of  breast  cancer  drug  compounds.  This  study  aims  to compare  the  acetone  and  ethyl  acetate  fractions  in  inhibiting  the  growth  of  MCF-7  breast  cancer  cells.  The extraction  method  used  is  maceration  followed  by  liquid-liquid  fractionation.  The  anti-cancer  activity  test  on MCF-7 cells was carried out using the MTT assay method with MCF-7 breast cancer cells (ATCC HTB 22). The results showed that the ethyl acetate fraction had a higher ability to inhibit the growth of MCF-7 breast cancer cells  than  the  acetone  fraction.  The  highest  growth  inhibition  of  MCF-7  cells  in  the  ethyl  acetate  fraction  was obtained  at  a  concentration  of  50  μg/mL,  which  was  14.13%.  In  comparison,  at  the  same  concentration,  the inhibition  percentage  of  the  ethanol  fraction  was  only  7.9%.  Based  on  the  IC50  values,  the  acetone  and  ethyl acetate fractions of cocoa peel have weak anti-cancer activity. Optimization of the extraction method is needed to obtain a more optimal IC50 value in inhibiting the growth of MCF-7 breast cancer cells.
Keywords:  : MCF-7, cocoa pod husk, CPH
Korespondensi: Hartanti,  SSi.,  MSi  Prodi  Sarjana  Terapan,  Poltekkes  Kemenkes  Tanjungkarang,  Jalan Soekarno-Hatta  No.  1  Hajimena  Bandar  Lampung, mobile 085714890697, e-mail hartanti@poltekkes-tjk.ac.id

## Pendahuluan
Kanker payudara merupakan jenis kanker yang paling banyak terjadi pada wanita. Kanker ini  menyebabkan  kematian  dan  kecacatan dengan  kasus  523.000  kematian  dan  15,1  juta hidup  dengan  disabilitas.  Kanker  payudara dipengaruhi  oleh  faktor  hormonal,  seperti  usia, kesuburan, usia saatpertama melahirkan, menyusui,  dan  terapi  hormon  (Yahya et  al. 2021). Terdapat beberapa metode yang digunakan dalam pengobatan dan terapi kanker payudara, yaitu pembedahan tumor, radioterapi, imunoterapi,  kemoterapi,  vaksinasi  kanker, terapi  fotodinamik,  dan  transformasi  stem  sel. Metode  pengobatan  tersebut  menimbulkan beberapa efek samping bagi penderita, diantaranya  adalah  pengobatan  bersifat  toksik bagi  sel  normal,  keterbatasan  bioavailabilitas, efek  obat  tidak  spesifik  pada  sel  kanker,dan menimbulkan  resistensi  obat  (Nsor-Atind et  al. 2012;  Kumari et  al. 2016).  Berbagai  efek samping dan keterbatasan tersebut
menyebabkan  perlu  dilakukannya  pencarian obat  anti  kanker  yang  bersumber  dari  bahan alami.
Selama  beberapa  dekade  terakhir,  telah banyak  laporan  mengenai  senyawa  metabolit sekunderyang  berasal  dari  tanaman  yang memiliki  aktivitas  antikanker.  Kandungan fitokimia  dari  tanamanobat  dapat  menghambat dan  mematikan  pertumbuhan  sel  kanker (Manye et  al. 2023).  Salah  satu  sumber bahanalam  yang  mulai  banyak  diteliti  adalah kandungan  kulit  buah  coklat  yang  memiliki aktivitas  dalam  menghambat  pertumbuhan beberapa selkanker, antara lain sel kanker kolon dan  sel  kanker  sel  kanker  payudara  MCF-7 (Baharum et al. 2014; Indrianingsih et al 2021; Belwal et  al. 2022).  Aktivitas  antikanker tersebut disebabkan adanya kandungan senyawafenolik  dan  flavonoid  (Hidayah et  al. 2022).  Potensi  senyawa  antikanker  payudara yang  terkandung  dalam  kulit  buahcoklat  dapat terus  dikembangka.  Kedepannya  diharapkan dapat  menjadi  alternatif  pengobatanyang  aman tanpa  efek  samping.  Penelitian  yang  telah  ada sejauh  ini  masih  menguji  aktivitasantikanker payudara MCF-7 hanya pada ekstrak kasar saja dan  belum  ada  yang  melakukan  penelitian mengenai  korelasi  antara  aktivitas  anti  kanker kulit buah coklat dengan kandungan metabolitnya.
Berdasarkan  latar  belakang  tersebut, maka  permasalahan  yang  di  teliti  dalam penelitian  ini  adalah  bagaimana  aktivitas  anti kanker payudara MCF-7 antara fraksi etil asetat
dan  fraksi  aseton.  Penelitian  ini  diharapkan dapat menjadi penelitian dasar untuk pengembangan  senyawa  antikankerdari  kulit buah coklat yang kedepannya dapat memberikan manfaat untuk pengobatan kankerpayudaratanpa  efeksamping.  Penelitian ini  bertujuan  untuk  membandingkan  fraksi aseton  dan  etil  asetat  dalam  menghambat pertumbuhan sel kanker payudara MCF-7.

## Metode
Penelitian  ini  berjenis  eksperimental dengan  menggunakan  Kulit  Buah  Coklat ( Theobroma cacao L.Pod Husk) sebagai sampel penelitian.Perlakuan  yang  digunakan  sebanyak 5  konsentrasi  dengan  tiga  kali  pengulangan. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September-November  2023.  Esktraksi  dan fraksinasi  dilakukan  di  Laboratorium  Kimia Universitas  Lampung,  sedangkan  uji  aktivitas antikanker  payudara  dilakukan  di  Pusat  Studi Satwa Primata, LPPM IPB.
Sampel  kulit  buah  coklat  yang  diperoleh dari wilayah Lampung Barat, Provinsi Lampung. Sel Kanker Payudara MCF-7 (ATCC HTB  22)  yang  digunakan  merupakan  koleksi Pusat  Studi  Satwa  Primata,  LPPM  IPB.  Kulit buah  coklat  yang  digunakanadalah  sisa  panen biji coklat yang sudah tidak dimanfaatkan.Sampel dibersihkan dengan airmengalir,  kemudian  di  potong-potong  untuk selanjutnya  dikeringkan  dengan  oven  pada suhu50 o C  selama  5  hari.  Setelah  dikeringkan, sampel  di  haluskan  dan  diestraksi  dengan  cara maserasimenggunakan  pelarut  metanol  dengan perbandingan 1:10 selama 3 hari. Ekstrak kasar metanol  yang  diperoleh,  kemudiandifraksinasi denganpelarut  etil  asetatdanaseton.  Fraksinasi dilakukan dengan metode cair-cair(1:1).
Sel MCF-7 (ATCC HTB 22)
ditumbuhkan  dengan  konsentrasi  5000  sel dalam  100μL  media  penumbuh  (RPMI  1640) yang  disuplementasi  dengan  Fetal  Bovine Serum  (FBS)  10%  dan  Penicillin  l00  U/mL, Streptomycin
100
ug/mL). Ekstrak
ditambahkan  setelah  sel  konfluen  50%  (24 jam).  Uji  MTT  dilakukan  pada  hari  ke  3, dengan menambahkan MTI (5mg/mL) sebanyak  10  μI  per  sumur  dengan  masing- masing  konsentrasi  sampel  10,  20,  30,  40, 50μg/mL,  kemudian  diinkubasi  4  jam  pada suhu  37°C.  Kristal  formazan  dilarutkan  dalam etanol.  Pembacaan  nilai  absorbansi  dilakukan pada panjang gelombang 595 nm.

## Hasil
Uji aktivitas antikanker payudara fraksi aseton  dan  etil  asetat  kulit  coklat  dinyatakan dalam  persen  inhibisi,  yaitu  kemampuan  fraksi dalam  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker payudara  MCF-7.  Berdasarkan  hasil  penelitian diperoleh  rata-rata  persen  penghambatan  pada masing-masing  konsentrasi  dapat  dilihat  pada Tabel 1.

## Tabel 1 Rerata Persen Inhibisi pada Setiap Konsentrasi Uji
Konsentrasi Rerata Persen Inhibisi (μg/mL) Aseton Etil Asetat 10 5,00 11,92 20 10,93 11,92 30 11,80 11,81 40 8,81 12,72 50 7,90 14,13
Berdasarkan Tabel di atas terlihat bahwa fraksi  etil  asetat  kukit  coklat  memiliki  rerata kenaikan nilai penghambatan sebanding dengan meningkatnya  konsentrasi  larutan  uji.  Hal tersebut  berbeda  dengan  nilai  rerata  persen inhibisi  pada  fraksi  aseton  yang  memiliki  pola data  tidak  linier  terhadap  kenaikan  konsentrasi larutan  uji.  Perbandingan  rerata  persen  inhibisi antara  fraksi  aseton  dan  etil  asetat  kulit  coklat dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Persen inhibisi fraksi aseton danetil asetat kulit  coklat  terhadap  pertumbuhan  sel kanker payudara MCF-7.
Fraksi  etil  asetat  memiliki  rata-rata persen  inhibisi  yang  lebih  tinggi  dibandingkan dengan fraksi aseton. Pada konsentrasi terendah,  yaitu  10  μg/mL,  fraksi  etil  asetat sudah  mampu  menghambat  pertumbuhan  sel
kanker  sebesar  11,92%,  sedangkan  pada  fraksi aseton  hanya  5μg/mL.  Nilai  penghambatan pertumbuhan  sel  kanker  MCF-7  tertinggi  pada fraksi  etil  asetat  diperoleh  pada  konsentrasi  50 μg/mL,  yaitu  14,13%.  Sedangkan,  pada konsentrasi  yang  sama  nilai  persen  inhibisi fraksi  etanol  hanya  7,9%.  Tidak  adanya aktivitas  penghambatan  (persen  inhibisi  nol) pada  sel  kontrol  (sel  tanpa  perlakuan  fraksi) menandakan bahwa penghambatan
pertumbuhan  sel  kanker  MCF-7  pada  setiap konsentrasi disebabkan oleh penambahan fraksi aseton maupun etil asetat.
Penelitian  ini  juga  menentukan  nilai IC 50 ( Inhibition Concentrartion 50 ), yaitu konsentrasi  fraksi  aseton  dan  etil  asetat  yang dapat  menghambat  50%  pertumbuhan  sel kanker  payudara  MCF-7.  Semakin  kecil  nilai IC 50 maka  semakin  tinggi  kemampuan  fraksi tersebut  dalam  menghambat  pertumbuhan  sel kanker.  Nilai  IC 50 untuk  kedua  fraksi  disajikan pada Gambar 2. Fraksi etil asetat memiliki nilai IC 50 yang  lebih  kecil  dibandingkan  dengan fraksi aseton. Nilai IC 50 untuk fraksi aseton dan etil  asetat  berturut-turut  sebesar  11,4  x 10 3 μg/mL  dan  7,4  x  10 3 μg/mL.  Berdasarkan nilai  IC 50 ,baik  fraksi  aseton  maupun  etil asetatkulit  coklat  memiliki  aktivitas  antikanker yang tergolong lemah.
Gambar 2. Perbandingan nilai IC 50 fraksi aseton dan etil asetat kulit coklat.

## Pembahasan
Penelitian ini menggunakan fraksi aseton dan  etil  asetat  dari  ekstrak  kasar  metanol.  Hal ini  didasarkan  pada  penelitian  Yahya et  al.
(2022), yang menghasilkan bahwa ekstrak kasar metanol  memiliki  aktivitas  antikanker  yang tergolong  kuat,  dengan  nilai  persen  inhibisi sebesar  97,62%.  Oleh  karena  itu,  untuk meningkatkan  aktivitas  antikankernya,  maka dilakukan fraksinasi dari ekstrak kasar metanol. Fraksinasi bertujuan memisahkan senyawa aktif berdasarkan kepolaran pelarut.
Uji aktivitas antikanker fraksi aseton dan etil  asetat  kulit  coklat  terhadap  sel  kanker payudara  MCF-7  (ATCC  HTB  22)  dilakukan dengan  metode  MTT assay .  Uji  MTT  ini merupakan  metode  umum  yang  digunakan untuk  menentukan  aktivitas  antikanker  suatu senyawa (Zainal et al .2014). Prinsip metode ini dengan  mereduksi  garam  tetrazolium  MTT ((3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5  difeniltetrazolium bromida)  oleh  enzim  suksinat  reduktase  dalam mitokondria  sel  yang  masih  hidup  akan menghasilkan  kristal  formazan  berwarna  ungu. Penambahan  SDS  dalam  HCl  akan  melarutkan kristal  formazan  berwarna  ungu  tersebut sehingga absorbansinya dapat diukur menggunakan ELISA reader (Zainal et al. 2014)
Hasil  uji  aktivitas  antikanker  pada penelitian  ini  dinyatakan  dalam  kurva  persen inhibisi  yang  di  plotkan  dengan  konsentrasi fraksi  kulit  coklat  yang  di  ujikan.  Hasil penelitian  menjunjukkan  bahwa  pada  fraksi aseton  nilai  rerata  persen  inhibisi  tidak  linier seiring  dengan  peningkatan  konsentrasi  larutan uji.  Hal  ini  mungkin  terjadi  karena  kandungan metabolit  sekunder  yang  berperan  terhadap penghambatan  pertumbuhan  sel  kanker  MCF-7 pada  fraksi  ini  proporsinya  tidak  sama  pada setiap  konsentrasi.  Sehingga  memungkinkan konsentrasi  yang  lebih  rendah  mengandung lebih  banyak  komponen  zat  aktif  yang menghambat pertumbuhan sel kanker.
Rerata  penghambatan  pertumbuhan  sel kanker MCF-7 pada fraksi etil asetat menghasilkan  nilai  liniearitas  yang  lebih  baik. Hal ini terlihat semakin tinggi konsentrasi, nilai penghambatan  semakin  meningkat,  kecuali pada  konsentrasi  30  μg/mL.  Pada  konsentrasi tersebut  dimungkinkan  komponen  zat  aktif penghambat sel kanker lebih rendah dibandingkan  konsentrasi  di  20  μg/mL,  yang memiliki rerata penghambatan lebih tinggi.
Berdasarkan nilai persen inhibisi diketahui  bahwa  fraksi  etil  asetat  memiliki kemampuan  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan fraksi  aseton  dalam  menghambat  pertumbuhan sel  kanker  payudara  MCF-7.  Hal  ini  sejalan dengan hasil perhitungan nilai IC 50 kedua fraksi tersebut,  dimana  fraksi  etil  asetat  kulit  coklat memiliki nilai IC 50 yang lebih rendah dibandingkan dengan fraksi aseton.
Kemampuan fraksi etil asetat kulit coklat dalam  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker payudara  MCF-7  diduga  berhubungan  dengan kandungan  total  fenolik  dalam  kedua  fraksi tersebut.  Berdasarkan  penelitan  sebelumnya diketahui  bahwa  kandungan  senyawa  fenolik
fraksi  etil  asetat  kulit  coklat  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  fraksi  aseton  (Hartanti  & Sariyanto 2023). Beberapa penelitian melaporkan  bahwa  senyawa  fenolik  pada  kulit coklat  berperan  dalam  kemampuan  suatu senyawa sebagai antikanker, inflamasi, penyakit kardiovaskular, dan beberapa penyakit degeneratif.
Kemampuan  antikanker  suatu  ekstrak berhubungan  dengan  kandungan  senyawa metabolit  sekundernya.  Berdasaranpenelitian sebelumnya,  hasil  analisis  GC-MSsenyawa metabolit  pada  fraksi  etil  asetat  dan  fraksi aseton  diketahui  bahwa  fraksi  etil  asetat mengandung  lebih  banyak  senyawa  yang  telah diketahui memiliki aktivitas antikanker, diantaranya  adalah  myristicine,  Isoelemicin, hexadecanoic acid, Ethyl P-Methoxycinnamate, 1 ,2-Propanediol, 3-chloro-, 1,2- Propanediol, 3- chloro-,  N-Hydroxymethylacetamide,  Eugenol, Phenol,2,6-dimethoxy-4-(2-propenyl), 9,12- Octadecanoic  acid,  methyl  ester,  E-3,3- Dimethoxy-4,4-dihydroxystilbene,  Benzene,  1, 2-dimethoxy-4-(1-  propenyl)-,  dan  piperine (Hartanti  &  Sariyanto  2023).  Myristicine  dan Isoelemicin  merupakan  senyawa  yang  dapat menghambat  proliferasi  sel  kanker  melalui stimulasi  jalur  Caspase-3  (Rachmawati et  al. 2018). Senyawa n-Hexadecanoic acid diketahui memiliki  sifat  sitotoksik  terhadap  sel  kanker melalui interkasinya dengan enzim topoisomerase 1(Ravi  Khrisnan 2017).
Ethyl  P-Methoxycinnamate  diketahui sebagai agen Anti-Metastasis Aktif (Lallo et al . 2022). Selain itu berdasarkan beberapa literature  bahwa 1 ,2-Propanediol,  3-chloro-, 1,2- Propanediol, 3-chloro-, N- Hydroxymethylacetamide,  Eugenol,  Phenol,  2, 6-dimethoxy-4-(2-propenyl), 9, 12-
Octadecanoic  acid,  methyl  ester,  E-3,3- Dimethoxy-4,4-dihydroxystilbene,  Benzene,  1, 2-dimethoxy-4-(1-  propenyl)-,  dan  piperine sebagai  senyawa  antikanker  (Begum et  al. 2022;  Aziz et  al .  2019;  Ok  Ban et  al. 2007; Rather & Bhagat 2018). Senyawa Theobromine merupakan  senyawa  khas  yang  terkandung dalam  tanaman  coklat  termasuk  bagian  buah dan kulit coklat. Senyawa ini hanya teridentifikasi  dalam  frakasi  aseton.  Senyawa ini  diketahui  memiliki  aktivitas  antikanker (Cadona et al. 2020).
Nilai  IC 50 fraksi  etil  asetat  pada penelitian  ini  memiliki  nilai  IC 50 >  1000. Sitotoksisitas  suatu  ekstrak  berdasarkan  nilai IC 50 digolongkan menjadi 3 yaitu: sitotoksisitas potensial  (IC 50 <  100  μg/L),  sitotoksisitas sedang  (IC 50 <  1000  μg/L)  dan  rendah  (IC 50 >
1000 μg/L) (Prayong, 2008). Dengan demikian,
berdasarkan
pengelompokan tersebut, kemampuan  dalam  menghambat  pertumbuhan sel  kanker  payudara  MCF-7  dari  fraksi  etil asetat  kulit  coklat  pada  penelitian  ini  masih tergolong rendah. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa hal, diantaranya adalahterlalu rendahnya konsentrasi larutan uji dari fraksi etil asetat  dan  aseton  kulit  coklat  yang  digunakan. Peningkatan konsentrasi larutan uji berpengarih nyata terhadap peningkatan kemampuan senyawa  sebagai  antikanker.  Berdasarkan penilitin  Yahya et  al (2020),  diketahui  bahwa ekstrak kasar metanol memiliki kenaikan persen penghambatan  dari  yang  semua  28,35%  pada konsentrasi 125 μg/mL menjadi 97,65% setelah konsentrasinya  dinaikkan  menjadi  250  μg/mL. Selain  itu,  rendahkan  aktivitas  antikanker  pada fraksi  aseton  dan  etil  asetat  kulit  coklat mungkin juga disebabkan oleh kurang optimalnya  metode  ekstraksi  yang  digunakan, ukuran sampel, waktu ekstraksi, dan penyimpanan  sampel.  Quiroz-Reyes et  al.
(2013)  melaporkan  bahwa  ekstraksi  dengan metode ultrasonic radiasi dapat mengoptimalkan  penarikan  senyawa  polofenol dalam  kulit  coklat.  Sementara  Mellinas et  al
2020,  menemukan  bahwa  metode  ekstraksi kulit coklat dengan microwave-assisted extraction (MAE) dapat menghasilkan kandungan senyawa antioksidan tertinggi dibandingkan dengan maserasi (metode soxhletasi).
Simpulan  dalam  penelitian  ini  adalah fraksi  etil  asetat  kulit  coklat  memiliki  aktivitas penghambatan  sel  kanker  payudara  MCF-7 lebih  besar  dibandingkan  dengan  fraksi  aseton. Aktivitas  antikanker  fraksi  etil  asetat  masih tergolong  rendah.  Dengan  demikian  perlu dilakukan  beberapa  optimasi  seperti  optimasi metode  esktraksi  dan  fraksinasi.  Disarankan untuk penelitian selanjutnya dapat
menggunakan konsentrasi larutan uji yang lebih tinggi dan dapat menggunakan metode ekstraksi yang berbeda guna mengoptimalkan kemampuan fraksi etil asetat kulit coklat dalam menghambat  pertumbuhan sel  kanker  payudara MCF-7.

## Daftar Pustaka
Aziz,  A.,  Hanif,  F.,  Majeed,  S.,  Iftikhar,
K.,Simjee, S.U. (2019). N-(2- hydroxyphenyl) acetamide (NA-2) elicits potent  antitumor  effect  against  human breast cancer cell line (MCF-7).
Toxicology in Vitro. doi:10.1016/j.tiv.2019.06.011
Baharum et  al .  2014.  In  Vitro  Antioxidant  and Antiproliferative Activities of Methanolic Plant  Part  Extracts  of  Theobroma  cacao. Molecules 2014(19): 1831718331.doi:10.3390/molecules1911 18317.
Begum et  al. 2022.  A  comprehensive  and systematic review on potential anticancer activities  of  eugenol:  From  pre-clinical evidence  to  molecular  mechanisms  of action. Phytomedicine .107(2022: 154456
Belwal et al . 2022. Bioactive Compounds from Cocoa  Husk:  Extraction,  Analysis  and Applications  in  Food  Production  Chain. Foods . 11(6):2022.
Cadona et  al .  2020.  Chapter  2  -  Natural product–based  nanomedicine:  polymeric nanoparticles as delivery cargoes of food bioactives and nutraceuticals for anticancer purposes. AcademicPress . 2020: 37-67.
Hartanti,  Sariyanto  I.  2023.  Comparative analysis of total flavonoid, total phenolic content,  and  antioxidant  activity  of Theobroma  cacao  Pod  Husk  extract  and its derived fractions. GSC Biological and Pharmaceutical  Science .  25(03),  159– 166.
Hidayah et  al. 2022.  Determination  of  Total Phenolic, Total Flavonoid, and Antioxidant  Activity  of  India  Onion Extract. Indo. J. Chem.Sci. 11(2):2022
Indrianingsih et  al. 2021.  In  vitro  studies  of antioxidant, antidiabetic, and antibacterial  activities  of  Theobroma cacao,  Anonna  muricata  and  Clitoria ternatea. Biocatalysis  and  Agricultural Biotechnology. 2021:33 .
Lallo et  al. 2022.  P-Methoxycinnamate:  An Active Anti-Metastasis Agent and Chemosensitizer  Targeting  NFκB  from Kaempferia galanga for Melanoma Cells. Life. 12(337): 2022. https://doi.org/10.3390/life12030337
Lesmana et  al. 2022.  Potential  Molecular Interaction  of  Nutmeg’s  ( Myristica fragrans ) Active Compound
via
Activation  of  Caspase-3. Indonesian Journal  of  Science  &  Technology. 7( 1):159-170.
Manye et  al. 2023.  Phytochemical  screening and in-vitro antioxidant  activities  of aqueous  and  methanol  extracts  of Aloe vera. Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine .8(2023):100291. MellinasA.C.,Jiménez  A,  GarrigósM.C.2020. Optimization of microwave-assisted
extraction  of cocoa  bean  shell  waste  and evaluation of its antioxidant, physicochemical and functional
properties. Food  Science  andTechnology .
2020
Nsor-Atind  et  al.,  2012.  Antioxidant  Action  of Moringa  oleifera  Lam.  (Drumstick)
Against  Antitubercular  Drugs  Induced
Lipid  Peroxidation  in  Rats. Journal  of Medicinal Food .2003:255259.
Ok  Ban et  al .  2007.  Anti-proliferate  and  pro- apoptotic  effects  of  2,3-  dihydro-3,5- dihydroxy-6-methyl-4H- pyranone through inactivation of NF-κB in Human Colon CancerCells. Archives
ofPharmacal  Research. 30(2007):1455– 1463
Rachmawaty  et  al.,  2018.  Active  Compounds
Extraction of Cocoa Pod Husk (Thebroma  Cacao  l.)  and  Potential  as Fungicides. J. Phys.: Conf.Ser.
1028:012013.
Rather  RA  and  Bhagat  M.  2018.  Cancer Chemoprevention and Piperine: Molecular  Mechanisms  and  Therapeutic Opportunities. Front. Cell Dev.
Biol .6(10).doi:10.3389/fcell.2018.00010
Ravi  &  Khrisnan.  2017.  Cytotoxic  potential  of N-hexadecanoic  acid  extracted  from Kigelia pinnataleaves . Asian J. Cell Biol ., 12: 20-27.
S.  Kumari,  M.D.R.  Elancheran,  J.  Kotoky,  R.
Devi,  In  vitro  and  in  vivo  antioxidant, anti-hyperlipidemic properties and chemical  characterization  of  Centella
asiatica  (L.)  extract, Front.  Pharmacol .7 (2016):400.
Prayong et  al. 2008.  Cytotoxic  activity screening  of  some  indigenous  Thai plants. Fitoterapia . 79(7-8):598-601
Quiroz-Reyes  C  N,  Aguilar-Méndez  M  A, Ramírez-Ortíz  M  E  and  Ronquillo-De Jesus  E.  (2013).  Comparative  study  of ultrasound and maceration techniques for the extraction of polyphenols from cocoa beans  (Theobroma  cacao  L.). Revista Mexicana  deIngeniería  Química. 12(1):
11–18.
Yahya  et  al.  2021.  In-vitro  screenings  for biological  and  antioxidant  activities  of water  extract  from  theobroma  cacao  l. Pod  husk:  Potential  utilization  in  foods. Molecules .26(22): 2022
Zainal et al . 2014. Anticancer agent from non- edible parts of Theobroma cacao. Nat Prod Chem Res .2(4): 2014.