## Journal of Scientech Research and Development Volume 5, Issue 2, December 2023
P-ISSN 2715-6974 E-ISSN 2715-5846 Open Access at: https://idm.or.id/JSCR/index.php/JSCR
POTENSI MINYAK BULUS ( Amyda cartilaginea ) SEBAGAI ANTIAGING : STUDI

## IN SILICO TERHADAP COLLAGENASE
POTENTIAL  OF  BULUS  (Amyda  cartilaginea)  OIL  AS  ANTIAGING:  IN  SILICO STUDY ON COLLAGENASE
Dwiana Savitri 1 , Pradissa Avia Emeralda 2 1,2 Universitas Lambung Mangkurat Email: vinnadwiana@gmail.com

## INFO ARTIKEL ABSTRAK
Kata Kunci Anti Aging, Docking Molekuler, Asam Lemak, Collagenase Penuaan kulit akan berjalan secara intrinsik dan ekstrinsik. Salah satu molekul pemicu penuaan adalah senyawa oksigen reaktif. Senyawa ini akan memicu wrinkle melalui mekanisma cleavage dan pembentukan rantai  silang  abnormal  terhadap  protien  fibrous,  antara  lain  elastin, kolagen,  dan  glikosaminoglikan  hyaluronic  acid  di  matriks ekstraseluler  kulit.  Metalloproteinase  merupakan  enzim  yang bertanggung  jawab  untuk  degradasi  protein  fibrous.  Cleavage  asam hyaluronic  dilakukan  oleh  enzim  hyaluronidase  yang  mendegradasi molekul  polimerik.  Produksi  berlebih  pigmen  melanin  merupakan tanda penting penuaan kulit dan diatur oleh enzim tirosinase. Tujuan: Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menginvestigasi  potensi  minyak  bulus (Amyda  cartilaginea)  sebagai  antiaging  melalui  docking  molekuler terhadap  collagenase.  Penelitian  in  silico  secara  docking  molekuler. Ligand yang dilakukan docking adalah asam lemak dari minyak bulus (Amyda  cartilaginea).  Target  docking  adalah  collagenase  (PDB  ID 2D1N).  Dari  delapan  asam  lemak  minyak  bulus  yang  mempunyai energi  interaksi  paling  negatif  adalah  15-tetracosenoic  acid  methyl ester (-2.722 kcal/mol). Peta interaksi tersebut disusun oleh ikatan van Der  Waals  pada  THR130,  GLU  133,  SER132,  GLU135,  dan  LYS139. Selain itu juga disusun oleh ikatan hidrogen konvensional di ARG155 dan  Alkyl  di  LYS136.  Kesimpulan:  asam  lemak  dari  minyak  bulus (Amyda cartilaginea) berpotensi sebagai modulator enzim collagenase untuk antiaging.
Copyright © 2023 JSR. All rights reserved .

## ARTICLE INFO ABSTRACT
Keywords: Anti  Aging,  Molecular Docking Molekuler, Fatty Acid, Collagenase. Skin  aging  will  run  intrinsically  and  extrinsically.  One  of  the molecules  that  trigger  aging  is  reactive  oxygen  compounds.  This compound  will  trigger  wrinkles  through  a  cleavage  mechanism  and the  formation  of  abnormal  cross-chain  against  fibrous  proteins, including  elatin,  collagen,  and  hyaluronic  acid  glycosaminoglycans in  the  extracellular  matrix  of  the  skin.  Metalloproteinases  are enzymes  responsible  for  the  degradation  of  fibrous  proteins. Hyaluronic acid cleavage is carried out by the enzyme hyaluronidase which degrades polymeric molecules. Overproduction of the pigment melanin  is  an  important  sign  of  skin  aging  and  is  regulated  by  the enzyme  tyrosinase.  This  study  aims  to  investigate  the  potential  of turtle  oil  (Amyda  cartilaginea)  as  antiaging  through  molecular docking  of  collagenase.  Methods:  In  silico  research  by  molecular docking. The ligand that was docked was a fatty acid from turtle oil (Amyda  cartilaginea).  The  docking  target  is  collagenase  (PDB  ID 2D1N).  Of  the  eight  fatty  acids  of  turtle  oil,  the  one  with  the  most negative interaction energy was 15-tetracosenoic acid methyl ester (- 2,722  kcal/mol).  The  interaction  map  was  compiled  by  van  Der Waals bonds at THR130, GLU 133, SER132, GLU135, and LYS139. Apart from that it is also composed by conventional hydrogen bonds in ARG155 and Alkyl in LYS136. Conclusion: It was concluded that the fatty acids from turtle oil (Amyda cartilaginea) have the potential to act as modulators of the collagenase enzyme for antiaging.
Copyright © 2023 JSR. All rights reserved .

## PENDAHULUAN
Kulit  adalah  organ  struktural  multilapis,  berupa  lapisan  dasar  (dermis)  sebagai matriks  dan  epidermis  fungsional  empat  lapisan  saling  berdekatan  di  permukaan terluar.  Epidermis  kaya  akan  keratinosit  yang  menghasilkan  proten  keratin struktural  dan  terstratifikasi  ke  permukaan  luar  untuk  bertindak  sebagai  barrier. Dermis  sebagai  lapisan  terdalam  dikemas  dengan  fibroblas  yang  mensekresikan berbagai komponen struktural untuk kepentingan reparasi dan penyembuhan luka. Selain  itu,  lapisan  ini  juga  membantu  pengaturan  volume  cairan  interstitial  dan matrik ekstraseluler (Eun et al., 2020; Altyar et al., 2020).
Penuaan  kulit  akan  berjalan  secara  intrinsik  dan  ekstrinsik.  Proses  intrinsik merupakan peristiwa ilmiah akibat produk samping metabolisme di sel kulit. Proses ekstrinik  terjadi  akibat  pengaruh  lingkungan.  Salah  satu  molekul  pemicu  penuaan adalah  senyawa  oksigen  reaktif.  Senyawa  ini  akan  memicu wrinkle melalui mekanisma cleavage dan  pembentukan  rantai  silang  abnormal  terhadap  protein fibrous,  anatara  lain  elatin,  kolagen,  dan  glikosaminoglikan  hyaluronic  acid  di matriks  ekstraseluler  kulit  (Matos  et  al.,  2019).  Kolagen  dan  elastin  merupakan komponen  utama  jaringan  ikat  dan  kulit.  Kolagen  merupakan  pendukung  70-80% dari berat kulit. Collagenase adalah enzim utama yang berperan dalam dehidrasi dan pembentukan wrinkle di  permukaan  kulit  (Hyong  et  al.,  2014).  Dengan  demikian, inhibitor  kimia  yang  mentarget  enzim  tersebut  menjadi  strategi  yang  tepat  untuk menghambat penuaan kulit.
Bulus  ( amyda  cartilaginea )  atau  yang  lebih  umum  dikenal  oleh  masyarakat  dengan sebutan labi-labi merupakan satu-satunya spesies dari marga Amyda. Bulus sebagian besar hidup di perairan tawar seperti sungai, danau, rawa, dan genangan air, hewan ini dapat pula hidup di kolam yang suhu airnya berkisar 25ºC-30ºC bulus umumnya dijumpai  di  perairan  yang  tenang  dan  berarus.  Minyak  bulus  merupakan  minyak yang  diperoleh  dari  hasil  ekstraksi  hewan  bulus.  Hasil  observasi  lapangan menunjukan bahwa penggunaan minyak bulus banyak digunakan oleh masyarakat sebagai  alternatif  pengobatan.  Sepengetahuan  peneliti  belum  ada  penelitian  yang mengaplikasikan  potensi  minyak  bulus  sebagai  anti-aging.  Oleh  karena  itu, penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengivestigasi  potensi  minyak  bulus  ( Amyda cartilaginea ) sebagai antiaging melalui docking molekuler terhadap kolagenase.

## METODE PENELITIAN

## Senyawa Aktif Minyak Bulus
Kami  melakukan  studi  bioinformatika in  silico menggunakan  perangkat  lunak AutoDock. Ligan yang digunakan pada studi ini adalah asam lemak yang terdapat pada minyak bulus ( Amyda cartilaginea ). Senyawa aktif minyak bulus yang menjadi fokus penelitian adalah asam lemak. Berdasarkan temuan terdahulu (Nuwahidah et al.,  2020),  dipilih  delapan  asam  lemak  yang  akan  dilakukan  docking  molekuler terhadap protein target, meliputi 7-Hexadecyne, 9-octadecenoic acid methyl ester, 13- Docosenoic  acid,  methyl  ester,  15-Tetracosenoic  acid,  methyl  ester,  Hexadecanoic acid,15-methyl-methyl ester, Methyl_laurate, Nonadecanoic acid methyl ester, trans- 11-Octadecenoic acid methyl ester. Sedangkan, proses docking asam lemak dilakukan pada  kolagenase  (PDB  ID  2D1N).  Energi  interaksi  pada  setiap  proses docking dianalisa  untuk  menentukan  pengaruh  minyak  bulus  ( Amyda  cartilaginea )  terhadap proses penuaan yang berkaitan dengan aktivitas kolagenasae.

## Mencari Urutan Asam Amino
Urutan asam amino yang menyusun kompleks collagenase (PDB ID; 2D1N) diperoleh dari database The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (https://www.rcsb .org). Struktur 3D protein diunduh dalam format file *.pdb.

## Mencari Struktur Senyawa Aktif
Struktur  3D  asam  lemak  dari Amyda  cartilaginea diperoleh  dari  PubChem  Open Chemistry Database. Struktur 3D berbagai senyawa dalam format file*.sdf kemudian diubah menjadi file*.pdb menggunakan perangkat lunak OpenBabel (O’Boyle et al., 2011).
Docking dan Visualisasi Interaksi Protein-Ligan
Simulasi  docking  antara  asam  lemak  dari Amyda  cartilaginea dan  protein  target dilakukan  dengan  software  Hex  8.0.  (Laskowski et  al.,  2011),  dan  hasil  docking kemudian divisualisasikan dengan software Discovery Studio 4.1.

## Analisis Interaksi Pengikatan antara Protein dan Ligan
Hasil analisis docking kemudian divisualisasikan menggunakan software Discovery Studio 4.1 (Macindoe et al., 2020). Interaksi antara protein dan ligan dipelajari untuk menganalisis  jumlah  dan  jenis  ikatan,  seperti  ikatan  hidrogen,  hidrofobik,  dan  van der Waals.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Nilai  energi  afinitas  ikatan  dari  berbagai  asam  lemak  minyak  bulus  ( amyda cartilaginea )  terhadap collagenase dapat  dilihat  di  Tabel  1.  Dari  delapan  asam  lemak minyak  bulus  ( Amyda  cartilaginea )  yang  mempunyai  energi  interaksi  paling  negatif adalah 15-tetracosenoic acid methyl ester (-2.722 kcal/mol).
Tabel 1. Nilai energi afinitas ikatan antara berbagai asam lemak minyak bulus
( Amyda cartilaginea ) dengan collagenase Asam Lemak Nilai Energi Afinitas Ikatam 7-Hexadecyne -0,8305 9-octadecenoic acid methyl ester -0,7635 13-Docosenoic acid, methyl este -1,321 15-Tetracosenoic acid, methyl ester -2,722 Hexadecanoic acid,15-methyl-methyl ester -1,575 Methyl_laurate -0,9947 Nonadecanoic acid methyl ester -0,1752 trans-11-Octadecenoic acid methyl este -0,2715
Gambar  1.  menampilkan  peta  interaksi  antara  asam  lemak  minyak  bulus  ( Amyda cartilaginea ) dengan collagenase (PDB ID: 2D1N). Peta interaksi tersebut disusun oleh ikatan van Der Waals pada THR130, GLU 133, SER132, GLU135, dan LYS139. Selain itu juga disusun oleh ikatan hidrogen konvensional di ARG155 dan Alkyl di LYS136.
Gambar 1. Peta interaksi asam lemak minyak bulus ( Amyda cartilaginea ) dengan asam amino collagenase
Kolagen  dan  elastin  adalah  biomolekul  esensial  di  ekstraseluler  matriks  yang diperlukan  untuk  menjaga  elastisitas,  kelenturan,  dan  kekuatan.  Ekspresi  berlebih
kolagenase  (MMP13)  dan  elastase  (MMP12)  menyebabkan  degradasi  kolagen  dan elastin.  Beberapa  laporan  membuktikan  efek  stimulasi  elastase  pada  enzim metalloproteinase  lainnya,  yang  mengarah  pada  percepatan  degradasi  matriks proteolitik  lebih  lanjut.  Saat  kerutan  mulai  terbentuk,  enzim  elastase  disekresikan oleh  fibroblas,  sehingga  menurunkan  elastisitas  kulit,  dan  meningkatkan kekencangan serat elastis, yang merupakan dua peristiwa awal dalam pembentukan wrinkle (Deniz  et  al.,  2020)(Hyong  et  al.,  2014).  Oleh  karena  itu,  memblokir  target enzim collagenase dan elastase akan menjaga elastisitas kulit dan mencegah penuaan kulit.
Secara  spesifik, collagenase akan  mencerna  kolagen  natif  pada  pH  dan  temperatur fisiologis. Collagenase akan  memotong  semua  rantai  alpha  di  tropokolagen membentuk  peptida  dengan  ukuran  sepertiga  atau  seperempat  dari  kolagen  asli. Produk  ini  peka  terhadap  berbagai  protease  nonspesifik  (Agren  et  al.,  1992).  Pada penelitian ini kami melakukan investigasi docking molekuler antara asam lemak dari minyak  bulus  terhadap collagenase .  Asam  lemak  pada  minyak  bulus  ( Amyda cartilaginea ) memiliki interaksi negatif dengan kolagenase dalam permodelan in silico . Meskipun  belum  ada  studi  serupa  yang  telah  dilakukan,  terdapat  studi-studi  yang mengamati hubungan antara asam lemak dengan aktivitas kolagenase.
Studi di Austria yang dilakukan dengan mengamati efek dua spesies alga ( Porphyra sp. , Palmaria  palmata )  terhadap  kolagenase  yang  ada  pada Chlostridium  histolyticum menunjukkan  bahwa  terdapat  inhibisi  moderat  yang  bergantung  dengan  dosis. Selain itu, studi yang sama juga menyebutkan bahwa kandungan asam lemak pada alga  memberikan  inhibisi  kompetitif  terhadap  situs  aktif  dari  kolagenase.  Asam lemak juga diketahui  memberikan efek inhibisi terhadap matriks metalloproteinase (MMP) -2 dan -9 (Hartmann et al., 2015).
Hal  yang  serupa  juga  diungkapkan  oleh  studi  yang  dilakukan  di  Inggris.  Didapati bahwa  asam  lemak  n-3  menginhibisi  ekspresi  dan  aktivitas  berbagai  macam  MMP pada  kartilago  manusia  (Curtis  et  al.,  2002).  Studi  di  Amerika  Serikat  menemukan bahwa  asam  hidroksamik  yang  merupakan  salah  satu  komponen  asam  lemak memiliki  efek  inhibisi  terhadap  kolagenase  fibroblas  dan  termolisin  pada  kulit manusia serta elastase pada Pseudomonas aeruginosa . Inhibisi pada ketiga substansi ini terjadi  dikarenakan  asam  hidroksamik  merupakan  analog  stereokimia  dari  ketiga substansi tersebut (Grobelny et al., 1992).
Studi  yang  dilakukan  di  Jerman  menunjukkan  bahwa  asam  lemak  bebas menginhibisi aktivitas kolagenase yang diproduksi oleh Clostridium histolyticum (EC 3.4.24.3)  dan  elastase  neutrofil  manusia  (EC  3.4.21.37).  Studi  tersebut  menemukan bahwa  pada  asam  lemak  terdapat  konsentrasi  inhibisi  kolagenase  dan  elastase sebesar  50 – 500  mikromol  dan  0,5 – 50  mikromol  secara  berurutan.  Diketahui  bahwa asam  lemak  jenuh  C(16) – C(19)  merupakan  jenis  yang  paling  poten  dan  dikaitkan dengan penurunan aktivitas kolagenase yang paling signifikan (Rennet et al., 2002). Studi  yang  dilakukan  di  India  mengamati  efek  ekstrak  buah  campuran Punica granatum,  Ginkgo  biloba,  Ficus  carica, dan Morus  alba terhadap  proses  penuaan. Diketahui  bahwa  asam  lemak  yang  terkandung  dalam  campuran  tersebut  turut berperan  dalam  menginhibisi  kolagenase,  menurunkan  aktivitas  oksidase,  serta menurunkan  angka  kejadian  keriput  (Ghimeray  et  al.,  2015).  Dari  delapan  asam lemak  minyak  bulus  yang  mempunyai  energi  interaksi  paling  negatif  adalah 15- tetracosenoic acid methyl ester (-2.722 kcal/mol). Hal ini mengindikasikan bahwa asam
lemak collagenase paling mudah berinterakasi dengan collagenase dibandingkan asam lemak  yang  lain.    Selanjutnya,  peta  interaksi  tersebut  disusun  oleh  ikatan van  Der Waals pada THR130, GLU 133, SER132, GLU135, dan LYS139. Selain itu juga disusun oleh ikatan hidrogen konvensional di ARG155 dan Alkyl di LYS136.

## KESIMPULAN
Asam  lemak  dari  minyak  bulus  ( Amyda  cartilaginea )  berpotensi  sebagai  modulator enzim collagenase untuk  antiaging.  Dengan  demikian  minyak  bulus  ( Amyda cartilaginea )  sangat  berpotensi  unuk  menjadi  kandidat  produk  alam  sebagai  anti aging. Diperlukan studi lanjutan dengan tingkat kepercayaan bukti yang lebih baik ( invivo ) untuk  mengkonfirmasi  temuan  yang  diperoleh  pada studi  ini  agar  mampu laksana dan mampu diterapkan pada populasi terkait.

## DAFTAR PUSTAKA
Agren, M. S., Taplin, C. J., Woessner, J. F., Jr, Eaglstein, W. H., & Mertz, P. M. (1992). Collagenase  in  wound  healing:  effect  of  wound  age  and  type. The  Journal  of Investigative Dermatology , 99 (6), 709 – 714. doi:10.1111/1523-1747.ep12614202
Altyar,  A.  E.,  Ashour,  M.  L.,  &  Youssef,  F.  S.  (2020).  Premna  odorata:  Seasonal metabolic variation in the essential oil composition of its leaf and verification of  its  anti-ageing  potential  via  in  vitro  assays  and  molecular modelling. Biomolecules , 10 (6), 879. doi:10.3390/biom10060879
Curtis, C., Little, C., Rees, S., Flannery, C., Hughes, C., & Otterness, I. (2002). N-3 fatty acids  inhibit  expression  and  activity  of  MMPs  in  human  osteoarthritic cartilage.  In 48th  Annual  Meeting  of  the  Orthopaedic  Research  Society .  Texas: Orthopaedic Research Society.
Deniz, F. S. S., Salmas, R. E., Emerce, E., Cankaya, I. I. T., Yusufoglu, H. S., & Orhan, I.  E.  (2020).  Evaluation  of  collagenase,  elastase  and  tyrosinase  inhibitory activities  of  Cotinus  coggygria  Scop.  through  in  vitro  and  in  silico approaches. Suid-Afrikaanse  Tydskrif  Vir  Plantkunde  [South  African  Journal  of Botany] , 132 , 277 – 288. doi:10.1016/j.sajb.2020.05.017
Ghimeray, A. K., Jung, U. S., Lee, H. Y., Kim, Y. H., Ryu, E. K., & Chang, M. S. (2015).
In vitro antioxidant, collagenase inhibition, and in vivo anti-wrinkle effects of combined  formulation  containing  Punica  granatum,  Ginkgo  biloba,  Ficus carica,  and  Morus  alba  fruits  extract. Clinical,  Cosmetic  and  Investigational Dermatology , 8 , 389 – 396. doi:10.2147/CCID.S80906
Grobelny, D., Poncz, L., & Galardy, R. E. (1992). Inhibition of human skin fibroblast collagenase,  thermolysin,  and  Pseudomonas  aeruginosa  elastase  by  peptide hydroxamic acids. Biochemistry , 31 (31), 7152 – 7154. doi:10.1021/bi00146a017
Hartmann, A.,  Gostner, J.,  Fuchs,  J.  E.,  Chaita,  E.,  Aligiannis,  N.,  Skaltsounis,  L., & Ganzera, M. (2015). Inhibition of collagenase by mycosporine-like amino acids from  marine  sources. Planta  Medica , 81 (10),  813 – 820.  doi:10.1055/s-0035- 1546105
Hong,  Y.-H.,  Jung,  E.  Y.,  Noh,  D.  O.,  &  Suh,  H.  J.  (2014).  Physiological  effects  of formulation  containing  tannase-converted  green  tea  extract  on  skin  care: physical  stability,  collagenase,  elastase,  and  tyrosinase  activities. Integrative
Medicine Research , 3 (1), 25 – 33. doi:10.1016/j.imr.2013.12.003
Laskowski,  R.  A.,  &  Swindells,  M.  B.  (2011).  LigPlot+:  multiple  ligand-protein interaction  diagrams  for  drug  discovery. Journal  of  Chemical  Information  and Modeling , 51 (10), 2778 – 2786. doi:10.1021/ci200227u
Macindoe,  G.,  Mavridis,  L.,  Venkatraman,  V.,  Devignes,  M.-D.,  &  Ritchie,  D.  W.
(2010). HexServer: an FFT-based protein docking server powered by graphics processors. Nucleic Acids Research , 38 (Web Server issue), W445-9.
doi:10.1093/nar/gkq311
Matos, M. S., Romero-Díez, R., Álvarez, A., Bronze, M. R., Rodríguez-Rojo, S., Mato, R.  B., …  Matias,  A.  A.  (2019).  Polyphenol -rich  extracts  obtained  from winemaking  waste  streams  as  natural  ingredients  with  cosmeceutical potential. Antioxidants (Basel, Switzerland) , 8 (9), 355.
doi:10.3390/antiox8090355
N Eun, L. K., Bharadwaj, S., Yadava, U., & Gu, K. S. (2020). Evaluation of caffeine as inhibitor  against  collagenase,  elastase  and  tyrosinase  using  in  silico  and  in vitro approach. Journal Og Enzyme Inhibition Medicinal Chemistry , 109 , 927 – 936.
Nuwahidah,  T.,  Mardiana,  F.,  &  Setiyabudi,  L.  (2020).  Karakterisasi  dan  analisis minyak  bulus  dalam  minyak  kelapa  menggunakan  spektroskopi  fourier transform infrared (FTIR). Jurnal Ilmu Kefarmasian , 55 – 61.
O’Boyle, N. M., Banck, M., James, C. A., Morley, C., Vandermeersch, T., & Hutchison, G.  R.  (2011).  Open  Babel:  An  open  chemical  toolbox. Journal  of Cheminformatics , 3 (1), 33. doi:10.1186/1758-2946-3-33
Rennert, B., & Melzig, M. F. (2002). Free fatty acids inhibit the activity of Clostridium histolyticum collagenase and human neutrophil elastase. Planta Medica , 68 (9),
767 – 769. doi:10.1055/s-2002-34411