## Pemakaian Sel Hela dalam Uji Sitotoksisitas Fraksi Ethanol Biji Mimba ( Azadirachta indica )

## Ira Djajanegara dan Priyo Wahyudi

## Pusat Teknologi  Bioindustri BPPT

## Abstract
Traditionally, the neem ( Azadirachta indica ) seeds have been used as bioinsecticide.  It was also used and known for long time as a fungicide and anti bacterial agents.  Pre-toxicity experiment using brine shrimp lethality test (BSLT) method indicated that the ethanol fraction of the neem seeds was toxic to the shrimp larvae with LC50 38.79 μg/ml.  This experiment was done to further investigate the possible role of ethanol fraction of neem ( A. indica ) seeds as an anti cancer agent using   HeLa   cell   lines.   Experiment   was   initiated   by   extracting   the   seeds   using   n-hexane   by maceration.  The macerate was then macerated further using 70% ethanol as solvent.  The ethanol fraction was used in cytotoxicity assay using (cervix cancer) HeLa cell lines.   Cytotoxicity assay was done by using direct counting method.  The amount of living cells were observed and counted, death percentage was determined and probit analysis used to determine the LC 50 value. LC 50 value for ethanol fraction from the seeds of neem ( A. indica ) was 10.95 μg/ml for 24 hours; 7.33 μg/ml for 48   hours  and   4.37   μg/ml   for   72   hours  based   on   cytotoxicity   analysis   using   HeLa   cells.     This experiment concluded that the neem ( A. indica ) seeds have cytotoxicity toward HeLa cell lines which confirmed the previous toxicity experiment using brine shrimp lethality test (BSLT) method. Overall, this experiment indicated that neem ( A. indica ) seeds have anticancer activity.
Key words : seed, neem, citotoxicity, HeLa cell lines

## Pendahuluan
Telah banyak dilakukan penelitian tentang pemanfaatan obat tradisional antara lain farmakologi   eksperimental   toksisitas   dan   efek   samping   serta   isolasi   dan   penelaahan struktur zat kandungan dari tanaman obat yang ada di Indonesia  (Syukur dan Herman, 2001).  Saat ini  penelitian   dimaksudkan untuk mencari zat kandungan aktif dari suatu tanaman   obat   dalam   rangka   penemuan   obat-obatan   baru   dan   juga   bertujuan   untuk mendapatkan bahan dasar dalam pembuatan obat (Syamsul et al .,  1990).
Salah satu tanaman yang telah lama digunakan sebagai obat tradisional   adalah mimba ( A. indica ) ( Backer dan Brink, 1963).  Di Jawa, tumbuhan tersebut dikenal dengan nama mimba (Hyne,  1987) .  Adapun sebutan tumbuhan tersebut dalam bahasa Inggris antara lain adalah neem, nim, margosa, Indian lilac, bead tree, pride of china, holy tree dan persian lilac (Gruenwald et al ., 1998) .
Mimba mengandung senyawa triterpen dan tetraterpen (limonoid, protolimonoid dan kelompok genudin).  Pada minyak bijinya terdapat nimbolin A dan B, nimbin, dan gedunin. Sementara tanin dan minyak atsiri terdapat pada kulit kayu dan daunnya (Gruenwald et al., 1998).     Metabolit   yang   ditemukan   dari A.   indica antara   lain   disetil   vilasinin, nimbandiol, 3-desasetil salanin, salanol dan azadirachtin.
Selama ini, daun mimba  digunakan untuk penambah nafsu makan,  menanggulangi disentri,   borok,   malaria   dan   antibakteri.     Selain   itu   masyarakat   banyak   menggunakan minyak   mimba   untuk   eksema,   kepala   kotor,   dan   kudis,   sedangkan     kulitnya   untuk mengatasi gangguan lambung (Sudarsono et al .,  2002).
Gambar 1.  Biji-biji mimba ( A. indica ) Figure 1. The neem seeds ( A. indica )
Meskipun   telah     diketahui   bahwa   tanaman   mimba   memiliki   banyak   kegunaan, namun kemungkinan penggunaan mimba sebagai zat anti kanker belum banyak diteliti. Penyakit   kanker   merupakan   salah   satu   ancaman   utama   terhadap   kesehatan.   Usaha pengobatan   kanker   secara   intensif   telah   dilakukan,   namun   hingga   saat   ini   belum ditemukan   obat   yang   dapat   mengatasi   penyakit   tersebut   secara   memuaskan.     Hal tersebut disebabkan  rendahnya selektivitas obat-obatan antikanker yang digunakan atau karena patogenesis kanker itu sendiri belum jelas benar.
Guna mendukung upaya pencarian obat kanker yang lebih spesifik, saat ini banyak dilakukan penggalian potensi dari bahan-bahan alami.   Salah satunya adalah penelitian sitotoksisitas biji mimba terhadap sel HeLa.   Sel HeLa merupakan continous cell lines yang   tumbuh   semi   melekat   sehingga   dapat   dipakai   untuk   mewakili   sel-sel   lain   yang sejenis.  Sel ini diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim ( cervix ) manusia.  Sel HeLa cukup aman dan merupakan sel manusia yang umum digunakan untuk kepentingan kultur sel (Khotimah,  2004).
Berdasarkan  penelitian  sebelumnya  dengan menggunakan  metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)   terhadap   larva Artemia   salina diperoleh   nilai   LC 50 biji   mimba sebesar 38.79  μg/ml (Sari, 2006)   Hasil tersebut menunjukkan adanya bioaktivitas dari ekstrak bici mimba sehingga perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan uji sitotoksisitas ekstrak   ethanol   70%   dari   biji   mimba  secara in   vitro .     Penelitian   ini   dilakukan   untuk mengetahui adanya efek sitotoksik beserta nilai LC 50 dari ekstrak ethanol 70% biji mimba sebagai   obat   antikanker   yang   diujikan   pada   sel   HeLa   sehingga   nantinya   dapat dkembangkan sebagai obat alternatif pada pengobatan kanker.

## Bahan dan Metode
Bahan   yang   digunakan   dalam   penelitian   ini   antara   lain     biji   mimba   dari   Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (BPTO) yang telah dideterminasi di Herbarium Bogoriensis, Bogor.  Beberapa bahan kimia yang dipakai untuk mengidentifikasi golongan kimianya (uji kandungan alkaloid, tanin, flavonoid, triterpenoid dan sterol) antara lain HCl, larutan   Bouchardat,   Dragendoroff   dan   Mayer,   NaCL,   FeCl 3 ,   gelatin-NaCl,   petroleum benzene   P,  serbuk   Mg,   pereaksi   Lieberman   Bouchard,   ethanol   96%,   methanol , ethyl asetat P, petroleum benzene P, H 2 SO 4 dan CH 3 COOH anhidrat.  Bahan-bahan lain adalah media RPMI 1640, larutan PBS (phospate buffer saline), larutan trypsin, larutan tripan biru,  DMSO,   penicillin-strepmisin   1%,   fungizon,   Natrum bikarbonat,   dinatrium  hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat, natrium klorida, doxorubicin dan cisplatin sebagai kontrol positif karena merupakan obat anti kanker golongan kompleks platinum.
Penelitian   dimulai   dengan   mengidentifikasi   golongan   kimia   dari   biji   mimba (Departemen   Kesehatan   RI,   1989;  Harborne,   1996) .     Hal   tersebut   dilakukan   untuk memastikan adanya kandungan alkaloid, triterpenoid, sterol, flavonoid dan tanin dalam biji mimba yang akan dipakai pada penelitian ini.
Langkah   selanjutnya   adalah   mengekstrak   bahan   aktif   dari   biji   mimba   dengan maserasi   bertingkat   menggunakan   n-heksan   diikuti   70%   ethanol. Sebanyak   1   kg simplisia kering direndam dengan 2 liter n-heksan dalam toples kaca yang bermulut lebar, dibiarkan   selama   3   hari.   Selama   perendaman   dilakukan   pegadukan   beberapa   kali, kemudian disaring dengan kertas saring.   Perendaman n-heksan dilakukan sebanyak 2
kali.  Setelah perendaman akan diperoleh maserat heksan dan ampas.  Maserat heksan diabaikan,   sedangkan     ampas   kembali   direndam   dengan   2   liter   ethanol   70%.     dan dibiarkan   selama   3   hari.   Selama   perendaman   dilakukan   pengadukan   beberapa   kali, kemudian disaring menggunakan kertas saring.  Perendaman dengan ethanol dilakukan sebanyak 2 kali.   Maserat ethanol yang diperoleh dipekatkan dengan penguap vakum sehingga diperoleh ekstrak ethanol yang kemudian disimpan pada suhu ruang.  Fraksi ini kemudian   dikeringkan   menggunakan   oven   pada   suhu   105°C   selama   1   jam   hingga diperoleh bobot tetap (Departemen Kesehatan RI,  1995).   Fraksi ethanol 70% tersebut kemudian dihitung rendemen dan bobot jenisnya.    Fraksi tersebut diatas juga dihitung susut pengeringannya sesuai cara yang dilakukan Departemen Kesehatan (Departemen Kesehatan RI, 1989) .
Pembuatan   larutan   uji   ekstrak   ethanol   70%   dari   biji   mimba   dilakukan   dengan mengambil masing-masing ekstrak sebanyak 50 mg untuk dilarutkan dalam labu ukur 10 ml sehingga diperoleh konsentrasi induk 5000 μg/ml dengan 0.25% DMSO.  Dari larutan induk tersebut, dibuat pengenceran dengan konsentrasi 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.62 dan 7.81 μg/ml.  Cisplatin, yang dipakai sebagai kontrol positif, dibuat konsentrasi 30, 25, 20, 15, 12.5, 10, 8 dan 6 μg/ml.   Sedangkan kontrol positif lain yaitu doxorubicin dibuat konsentrasi 30, 25, 20, 15, 12.5, 10, 5 dan 2.5 μg/ml.
Pembuatan   media   RPMI   1640,   larutan   phosphate   saline   buffer   (PBS),   larutan trypsin dan larutan tripan biru dilakukan sesuai metoda yang dilakukan oleh  Freshney (1987).   Pengaktifan, pembiakan dan pengembangan sel HeLa dilakukan sesuai metode yang dipakai oleh oleh  Freshney (1987).   Kepadatan sel HeLa dihitung   meggunakan haemocytometer. Sebelum dihitung,    20 μl suspensi sel dicampur dengan 180 μl  biru tripan.   Penghitungan   dilakukan   di   bawah   mikroskop   pada   perbesaran   100   X. Penghitungan sel dilakukan pada 4 bilik hitung yang masing-masing terdiri dari 16 kotak dan   diambil   rata-ratanya,   kemudian   dikalikan   dengan   faktor   pengenceran   dan   faktor koreksi untuk setiap bidang besar (volumenya 10 -4 ml).
Jumlah sel dihitung dengan rumus : sel/ml 10 4 4   P n
dimana n = jumlah sel dalam 4 bilik 4 = jumlah bilik haemocytometer yang dihitung 10 4 = 1 ml per kapasitas haemocytometer P = faktor pengenceran
Uji sitotoksisitas secara in vitro ini dilakukan karena lebih cepat, murah dan hanya membutuhkan   sedikit   bahan   uji   jika   dibandingkan   dengan   pengujian   secara in   vivo . Perhitungan   sel   menggunakan   metode   penghitungan   langsung   yang   selanjutnya dilakukan doubling   time dengan   masa   inkubasi   24,   48   dan   72   jam.     Kepadatan   sel dihitung dengan haemocytometer setelah pemberian warna dengan tripan biru sebanyak 50 μl ke dalam tiap sumuran sel.   Prinsip pewarnaan dengan tripan biru yaitu sel yang telah mati akan terlihat berwarna biru karena sel yang telah mengalami lisis maka protein dalam plasmanya berikatan dengan tripan biru (Gambar 2). Data yang diperoleh berupa sel   yang   mati   dan   hidup,   namun   perhitungan   untuk   mendapatkan   persen   kematian dihitung dari persen viabilitas, sebab sel yang mudah dilihat dan dihitung adalah sel yang hidup karena bentuknya masih utuh dan terlihat bening.  Sedangkan sel yang mati akan lebih sulit dihitung karena sel mengalami lisis dan nekrosis sehingga bentuknya sudah tidak beraturan. Cara penghitungan dengan haemocytometer yaitu sel yang menyinggung garis batas sebelah kiri atau garis atas dihitung, sedangkan sel yang menyinggung garis batas   sebelah   kanan   atau   garis   bawah   tidak   dihitung   (Gambar   3).     Seri   konsentrasi dilakukan sebanyak tiga kali untuk mendapatkan hasil yang lebih valid. Persen kematian dihitung dari data jumlah sel yang hidup kemudian ditransformasikan ke tabel probit untuk menentukan LC 50.
Gambar 2.   a) Sel HeLa yang masih hidup terlihat jernih; b) Sel HeLa yang mati bereaksi dengan biru tripan
Figure 2. a) Life HeLa cell; b) Death HeLa cell reacted with tripan blue
Uji sitotoksisitas menggunakan metode penghitungan langsung ( viable cell count ) dilakukan dengan cara membagi 5 kelompok pengujian yaitu media ditambah sel sebagai kontrol negatif, sel ditambah pelarut (yaitu DMSO) sebagai kontrol pelarut, sel ditambah cisplatin sebagai kontrol positif yang dibuat sebanyak 8 konsentrasi yaitu 30, 25, 20, 15, 12.5,   10,   8   dan   6   μg/ml.     Sedangkan   kontrol   positif   lainnya,   yaitu   doxorubicin   dibuat sebanyak 8 konsentrasi yaitu 30, 25, 20, 15, 12.5, 10, 5 dan 2.5 μg/ml. Pengujian ekstrak ethanol  70%  dilakukan  dengan   8  konsentrasi   yaitu  1000,  500,  250,   125,  62.5,   31.25, 15.62 dan 7.81 μg/ml.  Sel diinkubasi selama 24, 48 dan 72 jam untuk mendapatkan nilai LC 50 pada   berbagai   konsentrasi.     Masing-masing   konsentrasi   tersebut   dimasukkan   ke dalam   lempeng   dengan   96   sumuran   sebanyak   100   μl   dan   ditambahkan   suspensi   sel sebanyak 100 μl.   Seri kadar diulang tiga kali ( triplo ) agar lebih valid.   Kultur kemudian diinkubasi  sesuai   waktu  inkubasi   yang  telah  ditentukan  pada   37°C.     Jumlah  sel  yang hidup (berwarna kuning) dan mati (berwarna biru) dihitung dengan cara mengambil 50 μl dan direaksikan dengan tripan biru sebanyak 50 μl selama 3 menit.  Hasil reaksi tersebut disuspensi   dan  diambil   10  μl   untuk  dihitung   jumlah   selnya.     Presentase   kematian   sel dihitung menggunakan metode  penghitungan langsung ( viable cell count ) sesuai rumus yang dipakai oleh Doyle dan Griffith (2000) yaitu :
% viabilitas = 100% mati hidup yang sel jumlah hidup yang sel jumlah  
% kematian = 100% - % viabilitas
Nilai  persen kematian  yang diperoleh  dari masing-masing konsentrasi diubah  ke dalam angka probit dengan menggunakan tabel probit.   Selanjutnya, dibuat persamaan regresi   linier   untuk   melihat   hubungan   antar   perlakuan   dengan   kematian   sel   HeLa. Perhitungan dengan cara probit ini diulangi dengan memasukkan angka 5 sebagai probit ke  dalam   persamaan   regresi   linier,  hasilnya   kemudian   disubsitusi   dan   dianti-logaritma untuk mendapatkan nilai LC 50 .

## Hasil dan Pembahasan
Metode ekstraksi yang dipakai dalam uji sitotoksisitas ini adalah metode maserasi. Metode tersebut dilakukan dengan tujuan untuk menarik zat-zat berkhasiat yang berada dalam simplisia, selain itu juga cara pengerjaan dan peralatannya mudah serta sederhana digunakan.     Maserasi   dilakukan   dengan   menggunakan   pelarut   n-heksan   terlebih   dulu untuk   menarik   senyawa   yang   non   polar   sehingga   diperoleh   senyawa   bersifat   polar. Menurut penelitian sebelumnya senyawa polar dari biji mimba   lebih toksik dibandingkan dengan yang non polar (Sari,  2006).   Setelah penarikan senyawa non polar dengan n- heksan, kemudian dilakukan hal yang sama dengan 70% ethanol.  Penggunaan ethanol dikarenakan ethanol merupakan cairan penyari yang mudah menguap sehingga waktu yang dibutuhkan   untuk  memekatkan  dan mengeringkan  ekstrak  menjadi  lebih   singkat. Ethanol juga membantu melindungi ekstrak dari kontaminasi oleh mikroba.
Pemilihan ethanol 70% sebagai pelarut diharapkan dapat menarik zat-zat berkhasiat yang terdapat dalam simplisia.   Dari hasil uji identifikasi golongan kimia terbukti bahwa ekstrak ethanol 70% yang akan diujikan mengandung beberapa senyawa yang berkhasiat seperti alkaloid, triterpenoid, sterol, flavonoid, dan tanin.  Biji mimba mengandung 20% - 50%   minyak  (Sutamo   dan   Atmowidjojo,     2000).     Kandungan   yang   paling   banyak ditemukan   dalam   biji   mimba   adalah   tetranortriterpenoid   yang   salah   satunya   adalah azadirachtin dan senyawa ini yang diduga berpotensi sebagai anti kanker (Sari,  2006).
Sel HeLa merupakan jenis sel yang semi melekat pada flask karean terdapat protein membran   matriks   ekstraseluler   pada   permukaan   sel   yang   melekat   pada flask ,   maka diperlukan   tripsin   untuk   memecah   ikatan   peptida   dari   protein   matriks   ekstraseluler tersebut sehingga sel akan terlepas dari flask dan melayang dalam media.  Dalam kondisi seperti ini larutan bahan uji akan terekspos sempurna ke semua bagian sel.
Gambar 3.  a) Sel HeLa yang mati; b) Sel HeLa yang masih hidup Figure 3. a) Death HeLa cell; b) Life HeLa cell
Uji sitotoksisitas yang dilakukan memperlihatkan bahwa cisplatin lebih toksik dari pada doxorubicin terhadap sel HeLa, hal ini terlihat dari nilai LC 50 cisplatin yang sebesar 0.42  μg/ml  dibandingkan   doxorubicin   yang   sebesar   0.6  μg/ml.     Tidak   mengherankan cisplatin   merupakan   obat   terpilih   untuk   pengobatan   kanker   serviks.     Cisplatin   dan doxorubicin merupakan obat yang berpengaruh pada siklus sel nonspesifik yang dapat menghambat sintesis DNA dan RNA dari sel kanker pada saat siklus sel, khususya ketika sel berada pada fase G1 dan S.  Di sisi lain, doxorubicin bekerja pada fase S dari siklus sel (Siswandono dan Sukarjo,  2000).
Pada larutan uji ekstrak ethanol 70% diperoleh  LC 50 sebesar 10.95  μg/ml; 7.33 μg/ml   dan   4.37   μg/ml   untuk   masa   inkubasi   selama   24;   48   dan   72   jam.     Dari   hasil penelitian ini terlihat bahwa semakin lama masa inkubasi maka akan diperoleh nilai LC 50 yang   semakin   kecil   yang   berarti   sitotoksisitas   meningkat   dengan   meningkatnya   lama inkubasi.  Suatu zat dikatakan sitotoksik dan berpotensi antikanker apabila nilai LC 50 < 30 μg/ml (Meyer et al .,  1982) .  Dalam hal ini maka dapat disimpulkan bahwa ekstrak ethanol dari biji mimba bersifat sitotoksik sehingga dapat dikembangkan lebih lanjut sebagai obat antikanker.
Mekanisme kerja produk tanaman sebagai antikanker misalnya alkaloid dari Vinca sp. umumnya bekerja menghambat pembentukan komponen mikrotubuli pada kumparan mitosis   sehingga   metafase   terhenti.     Pada   golongan   diterpenoid   yang   diekstrak   dari tanaman   bekerja   sebagai   zat   antikanker   dengan   meningkatkan   polimerisasi   tubulin dimana kestabilan yang berlebih dari polimer mikrotubuli menyebabkan hambatan mitosis pada fase G 2 dan M (Siswandono dan Sukarjo, 2000) .  Dari hasil penelitian ini golongan triterpenoid yang terdapat pada ekstrak ethanol biji mimba     diduga menghambat siklus sel sehingga bersifat sitotoksik.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak 70% ethanol dari biji mimba  dapat digunakan   sebagai   obat   antikanker   terhadap   kanker   serviks   yang   tidak   menutup kemungkinan juga dapat digunakan pada kanker-kanker lainnya.  Untuk memisahkan zat yang bersifat sitotoksik tersebut maka perlu dilakukan isolasi lebih lanjut sehingga daya kerja bahan alami dari biji mimba dapat lebih efektif.

## Kesimpulan
Dari   hasil   penelitian     dapat   disimpulkan   bahwa   ekstrak   70%   ethanol   biji   mimba ( memiliki sifat sitotoksik terhadap sel HeLa dengan nilai LC 50 pada masa inkubasi 24 jam sebesar   10.95  μg/ml,   48   jam   sebesar    7.32    μg/ml   dan   pada   masa   inkubasi   72   jam sebesar   4.36   μg/ml.     Semakin   lama   masa   inkubasi   maka   semakin   meningkat   daya sitotoksisitas dari ekstrak 70% ethanol yang diujikan.

## Daftar  Pustaka
Backer, C. and Brink, V.,  1963.  Flora of Java, Vol II, N.V.P. Noordhoff Gronongen.  The Netherland.  Hal 117-120.
Departemen   Kesehatan   RI.,  1989.     Materia   Medika   Indonesia,   jilid   V.     Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Departemen   Kesehatan   RI.,  1995.     Materia   Medika   Indonesia,   jilid   II.     Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Doyle, A. and Grififths, J.B., 2000.  Cell and Tissue Culture for Medical Research. John Wiley & Sons, LTD. New York. Hal 12 – 16, 48 – 49, 409.
Freshney, R.I.,  1987. Animal Cell Culture, A Practical Approach. 1 st Edition. IRL Press.
Washington DC. Hal 3, 38, 183 – 188, 309 – 312, 329 – 330, 336 – 337.
Gruenwald, J., Brendler, T.,  and Jeanicke, C.,   1998.   Physician’s Desk Reference for Herbal Medicine, 1 st edition.  Medical Economic Company, Montvale, NJ.
Harborne,  1996.   Metode   Fitokimia.   Terbitan   kedua.Terjemahan   dari:   Phytochemical methods. Oleh: Padmawinata, Kosasih, Iwan S. ITB. Bandung. Hal. 6, 147.
Hyne,  A.,    1987.    Tumbuhan   Berguna   Indonesia,   jilid   III.     Badan   Litbang   Kehutanan, Jakarta.
Khotimah, K.,   2004.  Uji sitotoksisitas dan antiproliferasi fraksi petroleum eter dan fraksi ethanol   kulit   batang   kamboja   ( Plumeria   acuminata )  terhadap   sel   HeLa.     Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta.  Hal. 21.
Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobson, L.B., Nicholas, D.E., and McLaugnin, J.L.,  1982.  Brine shrimp : A convinient general bioassay for active plant constituent. Planta Medica 45:  31 – 34,.
Sari, A.,  2006.  Uji toksisitas ekstrak ethanol 70% biji mimba ( Azadirachta indica ) fraksi n- heksan, fraksi etil-asetat dan fraksi air terhadap Artemia salina .  Skripsi.  UHAMKA, Jakarta
Siswandono dan Sukarjo, B.,  2000.  Kimia Medisinal, edisi II.  Airlangga University Press, Surabaya.  Hal.  163 – 165.
Sudarsono, Gunawan, D., dan Wahyono, S.,   2002. Tumbuhan Obat II, Hasil Penelitian, Sifat-sifat dan Penggunaan.  Pusat Studi Obat Tradisional Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.
Sutamo,   H.   dan   Atmowidjojo,   S.,     2000.     Pengenalan   dan   Pemanfaatan   Tumbuhan Penunjang, seri 2.  Prosea Bogor, Indonesia.  Hal. 56 – 57.
Syukur, C. dan Herman, 2001.  Budidaya Tanaman Obat Komersial.  Penebar Swadaya, Jakarta.
Syamsul, A.A., 1990.  Flavonoid and Phytome Diaca.  Kegunaan dan Prospek I (2):  120 -127.