## CURRENT BIOCHEMISTRY
ISSN: 2355-7877 e-ISSN: 2355-7931 Journal homepage: http://journal.ipb.ac.id/index.php/cbj Journal E-mail: current.biochemistry@gmail.com

## Analysis of Blood Hemoglobin Levels Using Biosensors Based on Heme
Oxygenase from Serratia marcescens
(Analisis Kadar Hemoglobin Darah Menggunakan Biosensor Berbasis Heme Oksigenase dari Serratia marcescens )
Ahmad Irvan Pratama 1 , Aisyah Sahara 2 , Sintia Intan Agsari 1
1 Departemen Biokimia, IPB University, Bogor, 16680, Indonesia 2 Department Biologi, IPB University, Bogor, 16680, Indonesia
Received: 22 August 2019; Accepted: 27 May 2020
Corresponding author : Ahmad Irvan Pratama, Departemen Biokimia, IPB University; Email: irvanpratama97@gmail.com

## ABSTRACT
Hemoglobin  levels  are influenced by nutrition, iron conditions,  and body metabolism.  One of  the  medical  disorders  related  to  human  blood,  especially  erythrocyte  levels  is  anemia.  This condition causes the need for effective and efficient methods of measuring blood hemoglobin levels, including  in  terms  of  cost.  One  alternative  measurement  of  hemoglobin  levels  that  can  be  used  is the heme oxygenase-based sensor from Serratia marcescens. This study aims to develop techniques to measure blood hemoglobin levels  by utilizing biological sensor based on heme oxygenase from Serratia  marcescens.  The  stages  of  the  experiments  include:  rejuvenation  and  production  of Serratia marcescens isolates, isolation of heme oxygenase, purification of enzymes with ammonium sulphate  45-65%  and  65-85%  saturation,  measurement  of  protein  content  and  enzyme  activity, enzyme immobilization to the surface of carbon electrodes, and assay of biosensor heme oxygenase kinetics.  Test  of  protein  content  and  enzyme  activity  produces  enzyme  specific  activity  at  45-65% fraction  of  0.0158  U/mg  and  at  65-85%  fraction  of  0.0069  U/mg,  so  the  fraction  to  be  used  in biosensors  is  45-65%  fraction.  The  biosensor  kinetics  test  results  in  a  hemoglobin  level  of  12.0, 13.8,  and  14.3  g/dL  in  blood  samples  A,  B,  and,  C,  while  the  hemoglobin  level  measured  in  a standard  laboratory  test  is  12.0,  13.8,  and  14.3  g/dL.  It  was  concluded  that  the  biosensors developed in this study can measure hemoglobin levels in blood samples with a precision of 0.8 and an accuracy of 96.04%.
Keywords: Biosensor, Heme Oxygenase, Hemoglobin, Serratia marcescens

## ABSTRAK
Kadar  hemoglobin  pada  manusia  dipengaruhi  oleh  gizi,  kondisi  zat  besi  dan  metabolisme dalam tubuh. Salah satu gangguan medis terkait darah manusia khususnya kadar  eritrosit adalah anemia.  Kondisi  ini  menyebabkan  perlunya  metode  pengukuran  kadar  hemoglobin  darah  yang efektif  dan  efisien  termasuk  dari  segi  biaya.  Salah  satu  alternatif  pengukuran  kadar  hemoglobin yang  dapat  digunakan  adalah  dengan  sensor  berbasis  heme  oksigenase  dari  Serratia  marcescens Penelitian  ini  bertujuan  mengembangkan  teknik  pengukuran  kadar  hemoglobin  darah  dengan memanfaatkan  sensor  hayati  berbasis  enzim  heme  oksigenase  dari  Serratia  marcescens.  Tahapan yang  dilalui  pada  penelitian  ini  adalah  peremajaan  dan  produksi  isolat  Serratia  marcescens, isolasi heme oksigenase, pemurnian parsial enzim dengan  larutan yang mengandung 45-65% dan 65-85%  amonium  sulfat  jenuh,  pengukuran  kadar  protein  dengan  metode  Bradford  dan  aktivitas enzim, amobilisasi enzim ke permukaan Screen Printed Carbon Electrode (SPCE), dan uji kinetika biosensor  heme  oksigenase.  Uji  kadar  protein  dan  aktivitas  enzim  menghasilkan  aktivitas  spesifik enzim  pada  fraksi  45-65%  sebesar  0.0158  U/mg  dan  pada  fraksi  65-85%  sebesar  0.0069  U/mg, sehingga  fraksi  yang  digunakan  pada  biosensor  adalah  fraksi  45-65%.  Uji  kinetika  biosensor menghasilkan kadar hemoglobin sebesar 12.0, 13.8, dan 14.3 g/dL pada sampel darah A, B, dan C, sedangkan  hasil  pengukuran  dengan  uji  laboratorium  standar  berturut-turut  sebesar  13.2,  13.4, dan 14.2 g/dL. Kesimpulan yang didapatkan dari penelitian ini ialah biosensor  yang telah dibuat dapat  mengukur  kadar  hemoglobin  pada  darah  sampel  dengan  presisi  sebesar  0.8  dan  akurasi 96.04%.
Keywords : Biosensor, Heme Oksigenase, Hemoglobin, Serratia marcescens

## 1. PENDAHULUAN
Hemoglobin  (Hb)  merupakan  protein utama  tubuh  manusia  yang  membuat  darah berwarna  merah.  Fungsi  fisiologi  hemoglobin ialah  mengatur  pertukaran  oksigen  dan karbondioksida,  menyuplai  nutrisi  ke  jaringan tubuh,  membantu  kestabilan  tahanan  tekanan terhadap  aliran  darah  dalam  pembuluh  darah perifer, sehingga sirkulasi darah yang dipompa ke  jantung  dapat  dipertahankan  dari  serangan virus dan bakteri patogen. Batas normal kadar hemoglobin untuk  kelompok umur 6-14 tahun dan  wanita  dewasa  ialah  12  g/100  ml,  untuk laki-laki  dewasa  13  g/100  ml,  dan  wanita hamil  11  g/100  ml  (Katanga et  al .  2015). Kadar  Hb  pada  manusia  ini  dipengaruhi  oleh gizi,  kondisi  besi,  dan  metabolisme  dalam tubuh.
Anemia
merupakan kondisi menurunnya  kadar  hemoglobin  darah  dalam tubuh.  Kondisi  ini  memerlukan  metode pengukuran  kadar  hemoglobin  darah  yang efektif,  efisien,  dan  ekonomis.  Metode pengukuran kadar hemoglobin secara
laboratorium  yang  dapat  digunakan  salah satunya  ialah  metode  cyanomethemoglobin. Metode  ini  dilakukan  dengan  membaca intensitas  warna  sampel  dengan  fotometer kemudian dibandingkan dengan standar. Metode  ini  memiliki  kekurangan  yaitu  harga fotometer masih tergolong mahal jika diterapkan di Indonesia karena masih diimpor, sehingga belum semua laboratorium memilikinya  (Rodak et  al .  2012).  Selain metode  pengukuran  secara  laboratorium,  saat ini  telah  dikembangkan  alat  pengukur  kadar hemoglobin  praktis  dengan  memanfaatkan prinsip  reaksi  elektrokimia  dalam  pembacaan kadar hemoglobin darah. Akan tetapi, pengadaan  alat  ukur  tersebut  masih  dengan cara  impor  dan  terbilang  mahal,  sehingga diperlukan alat yang merupakan produk buatan lokal tanpa impor dari negara lain.
Salah  satu  alternatif  pengukuran  kadar hemoglobin  yang  dapat  digunakan  dengan menggunakan  sensor  berbasis  enzim  yang didapatkan dari sumber-sumber lokal
(indigenous). Sensor berbasis enzim
merupakan jenis biosensor
yang memanfaatkan  reaksi  elektrokimia  dengan menggabungkan  senyawa  hayati  dengan  suatu tranduser  (Evtugyn  2014).  Menurut  Evtugyn (2014), metode elektrokimia memiliki keunggulan dibandingkan metode spektrofotometri,  yaitu  lebih  sensitif  dalam mendeteksi  sampel  dalam  jumlah  sedikit. Selain  itu,  penelitian  sebelumnya  yang dilakukan oleh Koga et al . (2013) menggunakan  enzim  heme  oksigenase  yang diisolasi  dari  tikus  dapat  mendeteksi  heme pada  konsentrasi  yang  sangat  kecil  yaitu kurang dari 10 nM.
Penelitian  ini  bertujuan  memanfaatkan enzim dalam pengembangan biosensor berbasis heme oksigenase dari bakteri hemolitik  isolat  lokal.  Salah  satu  bakteri hemolitik  yang  dapat  menghasilkan  heme oksigenase ialah Serratia marcescens (Contreras et  al .  2014). Serratia  marcescens dipilih  pada  penelitian  ini  karena  selain memiliki  kemampuan  menghasilkan  heme oksigenase (kemampuan melisis darah), bakteri  ini juga merupakan isolat  yang tingkat patogenitasnya rendah.

## 2. METODOLOGI
Alat-alat yang digunakan pada penelitian  ini  yaitu  seperangkat  peralatan gelas,  sentrifus, shaker ,  pengaduk  magnetik, jarum  ose,  pengukur  suhu,  autoklaf,  cawan petri,  pengukur  pH,  mortar,  potensiostat eDAQ, Elektroda Pasta Karbon (EPK) dengan menggunakan Screen Printed Carbon Electrode (SPCE).
Bahan-bahan yang digunakan  pada  penelitian  ini  yaitu  media Luria  Bertani (LB) bubuk, darah domba steril (pengambilan dan penyimpanan dalam kondisi steril) yang didapatkan dari Fakultas Kedokteran  Hewan  IPB,  2,2-Bipiridil  2  mM, 50 mM  bufer Tris-HCl pH 7.0, 1 mM  EDTA, isolat  bakteri  hemolitik  yang  didapat  dari  IPB Culture  Collection ,  air  deionisasi,  larutan NaOH  0.2  g/mL,  glutaraldehida  2.5  %, NADPH 0.1 mM, Phenylmethylsulfonyl
Fluoride (PMSF)  1  mM,  dan  biliverdin hidroklorida.

## Prosedur Penelitian
Peremajaan  dan  Perbanyakan  Kultur Bakteri (modifikasi Karama et al . 2008) Media dan alat-alat gelas yang digunakan  untuk  peremajaan  isolat  disterilkan terlebih dahulu  dengan menggunakan autoklaf pada  suhu  121 o C  dan  tekanan  1  atm.  Media yang  digunakan  adalah  media Luria  Bertani (LB)  darah  cair  (5  gram  media  LB  bubuk,  5 mL  darah  domba  steril)  sebanyak  100  mL dengan  penambahan  2,2-bipiridil,  dan  media agar darah (komposisi seperti media darah cair dengan tambahan 1.5 gram agar). Isolat bakteri dari  agar  miring  diambil  menggunakan  jarum ose,  kemudian  digoreskan  ke  media  agar darah. Isolat tersebut diinkubasi selama selama 24  jam  pada  suhu  37 o C.  Koloni  bakteri  dari cawan  diambil  dengan  menggunakan  jarum ose lalu dimasukkan ke dalam media LB darah cair  dan  diinkubasi  selama  12  jam  pada  suhu 37 o C dengan menggunakan shaker . Tahap ini menghasilkan  isolat  bakteri  dalam  media  cair darah  yang  ditandai  perubahan  warna  media darah menjadi lebih gelap dan keruh.
Pembuatan  Kurva  Pertumbuhan Serratia marcescens
Kurva pertumbuhan S.marcescens dibuat  dengan  terlebih  dahulu  dilakukan pengambilan isolat  seluas 1 cm 2 dari diameter cawan dengan menggunakan jarum  ose.  Isolat tersebut kemudian dimasukkan ke dalam 5 mL media  cair  LB.  Media  yang  telah  berisi  isolat tersebut  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  pada shaker  incubator selama  24  jam.  Selanjutnya, sebanyak  0.05  mL  larutan  yang  berisi  isolat bakteri  tersebut  dimasukkan  ke  dalam  botol vial  masing-masing  sebanyak  10  buah  lalu ditambahkan  media  cair  LB  steril  hingga volume  5  mL.  Isolat  dalam  10  botol  vial tersebut lalu diinkubasi pada suhu 37 o C. Tahap selanjutnya  adalah  pengukuran  densitas  optik dengan  menggunakan  spektrofotometer UV- Visible dengan  panjang  gelombang  620  nm setiap  3  jam,  dimulai  pada  jam  ke-0  hingga
absorbansi  yang  terbaca  relatif  tidak  lagi mengalami  kenaikan.  Larutan blanko yang digunakan adalah media cair LB steril.
Isolasi  Heme  Oksigenase  (modifikasi  Wilks dan Schmitt 1998)
Isolat hasil inkubasi 24 jam pada suhu 37 o C  disentrifus  dengan  kecepatan  8000  x  g selama  20  menit  kemudian  diambil  peletnya. Pelet  yang  berisi  sel  bakteri  kemudian dihancurkan  dengan  menggunakan  sonikator dan  penambahan  50  mM  bufer  Tris  pH  7.0,  1 mM  PMSF,  dan  1  mM  EDTA.  Homogenat kemudian disentrifus  dengan kecepatan 21000 x  g  selama  60  menit.  Supernatan  yang dihasilkan  merupakan  ekstrak  kasar  heme oksigenase.
Pemurnian Parsial Heme Oksigenase
dengan Fraksinasi Ammonium Sulfat (modifikasi Hammami et al . 2013)
Pemurnian  dilakukan  dengan  teknik pengendapan bertingkat menggunakan amonium sulfat. Ekstrak kasar enzim dimurnikan  dengan  penambahan  amonium sulfat jenuh 45-65%, dan 65-85%. Penambahan amonium sulfat di setiap konsentrasi  ditambahkan  sedikit  demi  sedikit sambil diaduk menggunakan pengaduk magnetik pada suhu 4 o C. Ekstrak kasar enzim kemudian  dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan  8000  x  g  selama  20  menit.  Pelet yang  didapat  dari  setiap  tingkat  pemurnian diresuspensi dengan 50 mM bufer Tris pH 7.0, 1  mM  PMSF,  dan  1  mM  EDTA  kemudian diukur  aktivitas  dan  kadar  protein  totalnya untuk mengetahui aktivitas optimumnya.
Pengukuran  Kadar  Protein  (modifikasi Cheng et al . 2016)
Kadar protein diukur dengan mencampur sebanyak 0.05 mL sampel ekstrak enzim  dengan  2.5  mL  reagen  Bradford  lalu dihomogenkan  dengan  menggunakan  vortex. Campuran  kemudian  diinkubasi  selama  2 menit,  kemudian  diukur  nilai  absorbansinya dengan  menggunakan  spektrofotometer UV- Vis pada panjang gelombang 595 nm.  Larutan
blanko yang  digunakan  adalah  2.5  mL  reagen Bradford  ditambahkan  0.05  mL  bufer  Tris  50 mM pH 7.0, PMSF 1 mM, dan EDTA 1 mM. Kurva standar protein dibuat dengan menggunakan  larutan Bovine  Serum  Albumin (BSA)  dengan  konsentrasi  0.1-1.0  mg/mL. Persamaan  garis  kurva  standar  digunakan untuk menentukan kadar protein pada sampel.
Uji  Aktivitas  Heme  Oksigenase  (Modifikasi Hammami et al . 2013)
Aktivitas  heme  oksigenase  diukur dengan memasukkan 0.1 mL ekstrak enzim ke dalam tabung reaksi yang berisi 1.5 mL larutan hemoglobin  0.5%  b/v  dan  NADPH  0.1  mM lalu  dihomogenkan  menggunakan  vortex. Larutan  kemudian  diinkubasi  selama  5  menit. Setelah  diinkubasi  tepat  2  menit,  larutan diukur nilai absorbansinya dengan menggunakan  spektrofotometer UV-Vis pada panjang  gelombang  663  nm.  Kurva  standar heme oksigenase dibuat dengan menggunakan larutan biliverdin hidroklorida dengan konsentrasi  0.01-0.2  mg/mL.  Kontrol  negatif yang  digunakan  pada  pengukuran  ini  adalah larutan  bufer  pH  7.0  sebanyak  5  mL  yang dicampur dengan 1 mL ekstrak enzim.
Amobilisasi  Heme  Oksigenase  pada  SPCE (modifikasi Evtugyn 2014; Kurniasih 2014)
Sebanyak 10 µL enzim heme oksigenase dari fraksi dengan aktivitas spesifik terbaik  dicampur  dengan  1  mg  BSA,  50  µL bufer  kalium  fosfat  pH  7.0,  dan  30  µL glutaraldehida 2.5%. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro dan dikocok perlahan. Campuran lalu diteteskan  ke  atas  permukaan  SPCE  sebanyak 10 µL. Heme oksigenase yang telah teramobil di  permukaan  elektroda  tersebut  dikeringkan pada  suhu  4 o C.  Setelah  elektroda  kering, elektroda  dicuci  dengan  menggunakan  bufer kalium  fosfat  pH  7.0  untuk  menghilangkan enzim  sisa  yang  tidak  teramobil.  Elektroda disimpan dalam lemari pendingin 4 o C.

## Penentuan  Parameter  Kinetika  Biosensor Heme Oksigenase
Parameter  kinetika  ditentukan  dengan penentuan  aktivitas  enzim  pada  variasi konsentrasi  hemoglobin  dalam  larutan  bufer Tris-HCl  pH  7.0.  Larutan  hemoglobin  dibuat menjadi  beberapa  konsentrasi  yang  berbeda yaitu 0.00%, 0.05%, 0.10%, 0.15%, dan 0.20% (v/v).  Masing-masing  larutan  hemoglobin tersebut  kemudian diuji pengaruhnya terhadap aktivitas  enzim  heme  oksigenase  secara elektrokimia  dengan  menggunakan  Biosensor teramobil Heme Oksigenase yang telah dibuat. Hasil  pengukuran  tersebut  kemudian  dibuat kurva  standar  hemoglobin  untuk  digunakan sebagai dasar penghitungan konsentrasi hemoglobin darah. Pengukuran kadar hemoglobin  darah  dilakukan  dengan  terlebih dahulu  melakukan  pengenceran  darah  sampel 100x yaitu dengan melarutkan darah sebanyak 0.1  mL  ke  dalam  bufer  Tris-HCl  pH  7.0 sebanyak  9.9  mL.  Larutan  darah  tersebut kemudian  diukur  arus  yang  ditimbulkannya dengan  menggunakan  Biosensor  yang  telah dibuat.  Nilai  kuat  arus  yang  dihasilkan
kemudian dikonversi ke dalam nilai konsentrasi  hemoglobin  darah.  Nilai  kadar hemoglobin yang terukur kemudian dibandingkan  dengan  nilai  kadar  hemoglobin yang  dilakukan  dengan  uji  laboratorium standar.

## 3. HASIL
Kurva Pertumbuhan Serratia marcescens
Hasil yang didapatkan pada pembuatan kurva pertumbuhan bakteri Serratia marcescens menunjukkan  fase  pertumbuhan bakteri  mulai  dari  fase lag , log ,  dan  fase stationary .  Fase lag berlangsung  antara  jam ke-0  hingga  jam  ke-3,  fase log dimulai  pada jam ke-3 hingga jam ke-18, dan fase stationary terjadi  di  atas  jam  ke-18  (Gambar  1). Berdasarkan  kurva  pertumbuhan  tersebut, waktu  inkubasi  kultur  sel  yang  optimum dimulai  pada  jam  ke-18  karena  kultur  berada pada  titik  awal  dari  puncak  jumlah  biomassa selnya, sehingga jumlah heme oksigenase yang terdapat  pada  koloni  bakteri  berada  pada puncaknya.
Gambar 1 Kurva Pertumbuhan Serratia marcescens
Heme Oksigenase Hasil
Fraksinasi

## Amonium Sulfat
Biomassa  sel  yang  didapatkan  dari kultivasi kultur bakteri  pada jam ke 18  adalah sebanyak  1.6042  gram.  Tahapan  berikutnya setelah  isolasi  enzim  adalah  fraksinasi  ekstrak kasar  enzim.  Fraksinasi  heme  oksigenase dilakukan  dengan  pengendapan  bertingkat pada  konsentrasi  amonium  sulfat  45-65%  dan 65-85%.  Bobot  endapan  yang  didapat  pada fraksi 45-65% adalah 0.3788 gram, sedangkan bobot  endapan  pada  fraksi  65-85%  adalah 0.1874  gram  (Tabel  1).  Hasil  fraksi  yang didapatkan akan digunakan dalam pengukuran kadar  protein  dan  uji  aktivitas  enzim  pada tahap selanjutnya.
Kadar Protein dan Aktivitas Heme
Oksigenase
Kadar protein diketahui dengan menentukan  kurva  standar  protein  dengan beberapa  konsentrasi  yang  diketahui.  Kurva
standar  protein  dibuat  dengan  menggunakan larutan  BSA  dengan  konsentrasi  0.0,  0.2,  0.4, 0.6, 0.8, dan 1.0 mg/mL. Kadar protein sampel yang  didapatkan  dari  fraksi  45-65%  adalah sebesar  1.0725  mg/mL,  sedangkan  kadar protein  dari  fraksi  65-85%  adalah  sebesar 0.9229 mg/mL. Aktivitas enzim dapat diketahui  melalui  pengukuran  konsentrasi biliverdin  yang  terbentuk  dari  hasil  reaksi enzimatis.  Kurva  standar  biliverdin  dibuat dengan menggunakan larutan biliverdin konsentrasi  0.04,  0.08,  0.12,  0.16,  dan  0.20 mg/mL. Hasil yang didapat berupa konsentrasi biliverdin  yang  kemudian  dikonversi  menjadi unit enzim (konsentrasi produk yang terbentuk per menit). Hasil tersebut menunjukkan bahwa fraksi  amonium  sulfat  45-65%  memiliki aktivitas  spesifik  enzim  yang  terbesar,  yaitu senilai 0.0158 unit/mg dibandingkan fraksi 65- 85% yang hanya senilai 0.0069 unit/mg (Tabel 2).

## Tabel 1 Bobot Protein Hasil Fraksinasi Amonium Sulfat
No Fraksi Bobot protein (gram) 1 45-65% 0.3788 2 65-85% 0.1874 Tabel 2 Aktivitas Enzim Heme Oksigenase Sampel Kadar protein (mg/mL) [biliverdin] (mg/mL) Unit  enzim (U) Unit aktivitas (U/mL) Aktivitas spesifik (U/mg) Ekstrak kasar 4.1912 0.0073 0.0015 0.0146 0.0034 Fraksi 45-65% 1.0725 0.0085 0.0017 0.0170 0.0158 Fraksi 65-85% 0.9229 0.0032 0.0006 0.0064 0.0069
Kinetika Biosensor Heme Oksigenase Teramobil Parameter
yang diukur pada pengukuran  kinetika  biosensor  adalah  kadar hemoglobin  darah  yang  ditunjukkan  oleh  kuat arus yang  terbaca  pada  potensiometer. Pengukuran  kadar  hemoglobin  dilakukan dengan terlebih dahulu membuat kurva standar hemoglobin  dengan  menggunakan  biosensor pada  konsentrasi  0.05,  0.10,  0.15,  dan  0.20 g/dL.  Arus  listrik  hasil  pengukuran  sampel darah  kemudian  dikonversi  menjadi  satuan
kadar  hemoglobin  berdasarkan  kurva  standar hemoglobin  (Gambar  2).  Hasil  pengukuran kadar  hemoglobin  dengan  menggunakan Biosensor yang telah dibuat pada sampel A, B, dan  C  berturut-turut  sebesar  12.0,  13.8,  dan 14.3 g/dL, sedangkan hasil pengukuran dengan uji  laboratorium  standar  berturut-turut  sebesar 13.2, 13.4, dan 14.2 g/dL (Tabel 3). Presisi alat yang  terhitung  berdasarkan  hasil  pengukuran yaitu  sebesar  0.8,  sedangkan  tingkat  akurasi alat adalah sebesar 96.04%.
Tabel 3 Kadar Hemoglobin Dengan Uji Biosensor Dan Uji Laboratorium Standar Sampel Kadar Hb rata-rata (g/dL) Uji biosensor Uji laboratorium A 12.0 ± 1.62 13.2 ± 0.09 B 13.8 ± 0.21 13.4 ± 0.16 C 14.3 ± 0.76 14.2 ± 0.12
Gambar 2 Kurva standar hemoglobin

## 4. PEMBAHASAN
Berdasarkan  kurva  pertumbuhan  yang didapat,  waktu  inkubasi  kultur  sel  yang optimum  adalah  dimulai  pada  jam  ke-18 karena  kultur  berada  pada  titik  awal  dari puncak  jumlah  biomassa  selnya.  Quinn et  al . (2011)  menyebutkan  bahwa  metabolit  primer seperti asam amino, enzim, dan vitamin sangat
dibutuhkan  oleh  mikroba  dalam  menunjang proses  pertumbuhannya,  sehingga  metabolit tersebut  diproduksi  dalam  jumlah  besar  pada saat  fase  pertumbuhan  terjadi.  Berdasarkan kurva  pertumbuhan  tersebut,  waktu  inkubasi kultur  sel  yang  optimum  adalah  dimulai  pada jam ke-18 karena kultur berada pada titik awal dari puncak jumlah biomassa selnya, sehingga
0 0,0431 0,0667 0,0904 0,1284 y = 0,6082x + 0,0049 R² = 0,987 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 K u a t Ar u s Te rk o re k si (m A)
Konsentrasi Hb (%)
jumlah  heme  oksigenase  yang  terdapat  pada koloni bakteri berada pada puncaknya. Letoffe et  al .  (1994)  juga  menyebutkan  bahwa  heme oksigenase  sangat  dibutuhkan  pada  fase pertumbuhan  bakteri  untuk  menghasilkan suplai  zat  besi  yang  dapat  membantu  proses pertumbuhan koloni bakteri.
Biomassa  sel  yang  diperoleh  dari kultivasi kultur bakteri dilisis dengan menggunakan  teknik  sonikasi  dan  sentrifugasi untuk  mengisolasi  enzim  heme  oksigenase yang  terdapat  di  dalamnya.  Penggunaan sonikator efektif dalam melisis sel bakteri. Sel bakteri  yang  telah  hancur  ditandai  dengan berkurangnya  viskositas  suspensi  yang  dapat diamati  secara  kasat  mata.  Penggunaan  teknik sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 21000 g selain  dapat  membantu  penghancuran  sel, juga dapat memisahkan enzim heme oksigenase  dari  debris  sel  bakteri  (Fang et  al . 2012).  Tahapan  berikutnya  setelah  isolasi enzim  adalah  fraksinasi  ekstrak  kasar  enzim. Fraksinasi  heme  oksigenase  dilakukan  dengan pengendapan  bertingkat  pada  konsentrasi amonium sulfat 45-65% dan 65-85%. Tahapan fraksinasi amonium sulfat dapat meningkatkan konsentrasi  enzim  dan  kemurnian  enzim.  Hal tersebut berdampak pada aktivitas enzim yang lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  ekstrak kasar sebelum dilakukan fraksinasi. Amonium sulfat digunakan pada proses fraksinasi karena sifatnya  yang  dapat  membentuk  kejenuhan bertingkat,  sehingga  dapat  mengendapkan protein  terlarut  pada  tingkat  kejenuhan  yang diinginkan.  Berdasarkan Hammami et  al .
(2013), heme oksigenase
dari Corynebacterium  diphteriae dapat  diisolasi pada  tingkat  kemurnian  amonium  sulfat sebesar  60-85%.  Hasil  fraksi  yang  didapatkan akan  digunakan  dalam  pengukuran  kadar protein  dan  uji  aktivitas  enzim  pada  tahapan selanjutnya
Pengukuran kadar protein ekstrak kasar enzim  dari  masing-masing  fraksi  amonium sulfat  dan  pengukuran  aktivitas  berfungsi
untuk  menghitung  aktivitas  spesifik  enzim. Menurut  Evtugyn  (2014),  enzim  merupakan salah  satu  biomolekul  jenis  protein  yang berfungsi  sebagai  biokatalis  untuk  reaksi- reaksi  kimia.  Pemurnian  enzim  berfungsi untuk  meningkatkan  aktivitas  spesifik  enzim. Aktivitas  spesifik  merupakan  nilai  rasio aktivitas  enzim  dengan  bobot  protein  sampel. Aktivits  enzim  dapat  diamati  berdasarkan kenaikan  konsentrasi  biliverdin  dalam  sistem reaksi.  Biliverdin  merupakan  produk  hasil reaksi  enzimatik  dari  heme  oksigenase  yang akan  semakin  cepat  pembentukannya  seiring dengan peningkatan jumlah enzim (Yanatori et al .  2019).  Berdasarkan  nilai  aktivitas  spesifik enzim  yang  didapatkan  tersebut,  fraksi amonium  sulfat  45-65%  akan  digunakan dalam  pembuatan  biosensor  pada  tahapan selanjutnya.
Amobilisasi  enzim  pada  permukaan lapisan karbon elektroda berfungsi agar enzim dapat  bekerja  menguraikan  substrat  yang menempel  pada  lapisan  karbon  (Kurniasih 2014). Parameter yang diukur pada pengukuran  kinetika  biosensor  adalah  kadar hemoglobin  darah  yang  ditunjukkan  oleh  kuat arus  yang  terbaca  pada  potensiometer.  Heme oksigenase  yang  teramobil  akan  memicu terjadinya  reaksi  enzimatik  di  permukaan elektroda.    Menurut  Yanatori et  al .  (2019), heme  oksigenase  dapat  menimbulkan  reaksi pengubahan heme menjadi molekul biliverdin. Pengubahan tersebut diiringi oleh terbentuknya  ion  Fe 2+ atau  Fe 3+ serta  elektron bebas  sebagai  hasil  samping  reaksi  enzimatik. Terbentuknya  elektron  bebas  tersebut  dapat menciptakan  aliran  arus  listrik  apabila  diukur dengan  potensiometer  (Yanatori et  al .  2019). Berdasarkan  prinsip  tersebut,  maka  dapat diketahui  bahwa  peningkatan  arus  listrik  yang terbaca akan selaras dengan kenaikan konsentrasi  hemoglobin.  Presisi  alat  yang terhitung  berdasarkan  hasil  pengukuran  yaitu sebesar  0.8,  sedangkan  tingkat  akurasi  alat adalah sebesar 96.04%. Strambini et al . (2015)
menyebutkan bahwa nilai  akurasi di  atas 95% termasuk  dalam  kategori  baik,  yang  berarti
hasil  pengukuran  alat  cukup  akurat  dalam mengukur kadar hemoglobin darah.
Gambar 3 Reaksi pembentukan biliverdin dari heme (Wilks dan Schmitt 1998)

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  terima  kasih kepada  Dirjen  BELMAWA  Kemenristekdikti yang  telah  mendanai  penelitian  ini  dalam Program  Kreativitas  Mahasiswa  (PKM)  2019. Penulis  juga  mengucapkan  terima  kasih kepada  Ibu  Dr.  Suryani,  SP,  M.Sc  selaku dosen  pendamping  yang  telah  memberikan dukungan  selama  penelitian  ini  berlangsung. Ucapan  terima  kasih  juga  penulis  sampaikan kepada PKM Center IPB, Direktorat Kemahasiswaan  dan  Pengembangan  Karir IPB,  serta  semua  pihak  yang  terlibat  dalam penyelesaian dan keberhasilan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Cheng  Y,  Wei  H,  Sun  R,  Tian  Z,  Zheng  X. 2016.  Rapid  method  for  protein quantitation  by  Bradford  assay  after elimination  of  the  interference  of polysorbate 80. Anal. Biochem . 494:37-
39.
Colak O, Arslan H, Zengin H, Zengin G. 2012. Amperometric  detection  of  glucose  by polyaniline-activated carbon composite carbon  paste  electrode. Int.  J.  Elect.
Sci. 7:6988-6997.
Evtugyn  G.  2014. Biosensors:  Essentials .
Berlin (DE): Springer-Verlag.
Fang  J,  Qin  H,  Nakamura  H,  Tsukigawa  K,
Shin  T,  Maeda  H.  2012.  Carbon monoxide, generated by heme oxygenase-1,  mediates  the  enhanced permeability  and  retention  effect  in solid tumors. Cancer. Sci .
103(3):535-541. Hammami  I,  Siala  R,  Jridi  M,  Ktari  N,  Nasri M, Tiki MA. 2013. Partial purification  and  characterization  of chilO8,  a  novel  antifungal  chitinase produced  by Bacillus  cereus IO8. J Applied Microbiol . 115:358-366.
Karama M, Johnson RP, Holtslander R, Gyles
CL.  2008.  Phenotypic  and  genotypic characterization of verotoxin- producing Eschericia  coli O103:H2 isolates  from  cattle  and  humans. J. Clinical. Microbiol. 46(11):3569- 3575.
Katanga  J,  Mgongo  M,  Hashim  T,  Stray- Pedersen  B,  Msuya  SE.  2015. Screening  for  syphilis,  HIV,  and hemoglobin  during  pregnancy  in moshi  municipality,  tanzania:  how  is the health system performing [komunikasi  singkat]. Sci.  J.  Pub.
Health. 3(1):93-96.
Kurniasih R. 2014. Glukosa oksidase teramobil glutaraldehida pada
elektroda  pasta  karbon  termodifikasi nanoserat polianilin sebagai biosensor glukosa [skripsi]. Bogor (ID):  Institut Pertanian Bogor.
Quinn  PJ,  Markey  BK,  Leonard  FC,
FitzPatrick  ES,  Fanning  S,  Hartigan
PJ.  2011. Veterinary  Microbiology and Microbial Disease . Oxford (UK): Wiley-Blackwell.
Rodak  BF,  Fritsma  GA,  Keohane  EM.  2012.
Hematology:  Clinical  Principles  and Applications . Missouri (US): Elsevier
Inc.
Strambini  LM,  Longo  A,  Scarano  S,
Prescimone  T,  Palchetti  I,  Minunni M,  Giannessi  D,  Barillaro  G.  2015.
Self-powered
microneedle-based biosensors for pain-free high- accuracy  measurement  of  glycaemia in  interstitial  fluid. Biosensors  and
Bioelectronics . 66:162-168.
Wilks,  A  dan  Schmitt,  MP.  1998.  Expression
and  characterization  of  a  heme oxygenase (HmuO) from Corynebacterium  diphtheriae . The  J of Biol Chem . 273(2):837-841.
Yanatori I, Richardson DR, Toyokuni S, Kishi
F.  2019.  How  iron  is  handled  in  the course of heme catabolism: integration  of  heme  oxygenase  with intracellular iron transport
mechanisms  mediated  by  poly  (rC)- binding  protein-2. Arch.  Biochem.
Biophys. 672:1-8.