## Identifikasi Molekuler Kapang Asosiasi Spons menggunakan Metode DNA Barcoding

## Stefanie Jessica Henny Larasati, Agus Sabdono, Mada Triandala Sibero*
Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia *Corresponding author, e-mail : madatriandalasibero@lecturer.undip.ac.id
ABSTRAK: Spons  merupakan  organisme  yang  memiliki  pori-pori  dan  termasuk  kedalam  filum Porifera. Hewan ini merupakan filter feeders dimana spons menyaring makanannya masuk kedalam rongga  tubuhnya,  sehingga  spons  dapan  memakan  partikel  organik  seperti  algae,  dan  mikroba, termasuk kapang. Kapang merupakan mikroorganisme eukariotik dari kingdom fungi, multiseluler, menghasilkan miselium tanpa pembentukan badan buah. Kapang dapat berfungsi sebagai penjaga keseimbangan ekosistem di perairan. Tujuan dari penelitian ini adalah mengidentifikasi dua isolat kapang yang telah diisolasi dari inang spons di ekosistem mangrove dengan menggunakan DNA barcoding. Metode dalam penelitian ini yaitu peremajaan isolat, karakterisasi morfologi yaitu warna koloni, tekstur, reverse , exudates , sclerotia , bentuk konidia, konidiofor, spora, dan septa. Identifikasi molekuler dari ekstraksi DNA, amplifikasi, elektroforesis, visualisasi DNA, sekuensing dan BLAST. Optimasi  suhu annealing dilakukan  pada  amplifikasi  DNA.  Berdasarkan  identifikasi  molekuler dengan menggunakan primer universal (ITS1 dan ITS4) dan persamaan homologi, isolat MKMS 2.1 merupakan Trichoderma  reesei (100%)  dan  PKMS  2.2  merupakan  spesies Fusarium  solani (99,81%).
Kata kunci: DNA Barcoding; Kapang; PCR; Spons
Molecular Identification of Sponge-associated Fungi using DNA Barcoding Methods
ABSTRACT: Sponge is an organism that has pores and belongs to the Porifera phylum. This animal is a filter feeder where the sponge filters its food into the body cavity, so the sponge can eat organic algae  particles,  and  microbes,  including  mold.  Mold  is  a  eukaryotic  microorganism  from  Fungi kingdom, multicellular, that forms mycelium without fruiting body formation. Mold has an important role in balancing the environmental quality in an ecosystem. The purpose of this study was to identify two molds that had been isolated from sponge in the mangrove ecosystem using DNA barcoding. The methods in this research were isolation refreshment, morphological characterization which were consisted of colony color, texture, reverse, exudates, sclerotia, conidia, conidiophores, spores, and septa.  Molecular  identification  consisted  of  DNA  extraction,  amplification,  electrophoresis,  DNA visualization,  sequences  and  BLAST.  Annealing  temperature  optimization  is  carried  out  on  DNA amplification.  Based  on  molecular  identification  using  universal  primers  (ITS1  and  ITS4)  and homological equations, MKMS 2.1 isolates were identified as Trichoderma reesei (100%) and PKMS 2.2 were identified as Fusarium solani (99.81%).

## Keywords: DNA Barcoding; Fungi; PCR; Sponge

## PENDAHULUAN
Spons merupakan salah satu invertebrata laut filum Porifera yang memiliki rongga dan struktur tubuhnya  masih  sangat  sederhana.  Spons  hidup  di  lingkungan  pesisir  dan  laut  dalam.  Spons merupakan  salah  satu  invertebrata  yang  diketahui  memiliki  peran  penting  dalam  siklus  nitrogen, silika,  dan karbon; pembentuk ekosistem terumbu karang; pengkonversi dissolved organic matter (DOM)  menjadi particulate  organic  matter (POM);  hingga  menjadi bioeroders (Bell,  2008; FAO, 2017).  Spons  merupakan  hewan sessile karena  sebagian  besar  spons  hidup  menetap  pada substrat , bersifat filter feeder, dan diketahui menghasilkan berbagai chemical substances sebagai
Journal of Marine Research Vol 10, No.1 Februari 2021, pp. 48-54
bentuk pertahanan diri dari predator (Burns et al ., 2003). Bentuk pertahanan diri dari predator juga dapat melalui mikroba simbion yang menetap pada tubuh spons (Thoms et al ., 2007). Mikroba yang berasosiasi dengan inangnya memiliki fungsi ekologis yang dapat berkontribusi untuk kelangsungan hidup mikroba itu sendiri maupun untuk inangnya. Oleh karena itu perlu diketahui keanekaragaman kapang yang berasosiasi dengan spons.
Kapang merupakan mikroorganisme multiseluler berfilamen dan membentuk miselium (Miranti et  al .,  2015).  Kapang  berasal  dari  kingdom  fungi  yang  tidak  membentuk  badan  buah,  berukuran mikrosopis,  dan  bersifat heterotrof  karena  kapang  memperoleh makanan  dengan  cara  menyerap nutrisi dari inang asosiasinya (Richards et al ., 2012). Mikroorganisme ini mempunyai peran penting di  perairan.  Kapang  berperan  dalam  menjaga  keseimbangan  ekosistem  di  perairan.  Proses dekomposisi yang sangat kompleks dan rumit di laut membutuhkan peranan mikroorganisme, salah satunya adalah kapang. Kapang dapat membantu proses degradasi serasah dan batang mangrove karena  kapang  menghasilkan  selulase  (Anindyawati,  2010).  Kapang  berperan  dalam  melakukan penguraian lignin dan sellulosa (Kunarso, 1988). Selain itu, kapang juga hidup berasosiasi dengan organisme laut.
Sebagai mikroorganisme, proses identifikasi kapang secara morfologi sudah dianggap tidak terlalu efektif karena organisme ini bersifat cryptic karena sangat susah untuk membedakan antar spesies jika hanya menggunakan pendekatan morfologi (Sibero et al ., 2018). Salah satu cara untuk meningkatkan keakuratan identifikasi adalah menggunakan pendekatan DNA barcoding . Penelitian ini dilakukan dengan tujuan mengidentifikasi dua kapang asosiasi spons asal ekosistem mangrove di Karimunjawa yang menjadi koleksi Sibero Project , Laboratory of Natural Product , Undip.

## MATERI DAN METODE
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  laboratorium Tropical  Marine  Biotechnology Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Diponegoro pada bulan Mei-Juni 2019. Pengolahan data serta analisa sampel dari hasil penelitian dilaksanakan pada Juni-Juli 2019.

## Peremajaan Isolat
Stok kapang yang  tersimpan  pada  gliserol  dilakukan  peremajaan  pada cawan  petri  dengan media Potato Dextrose Agar (PDA) kemudian dilakukan inkubasi selama 7 x 24 jam (Gobalakrishnan & Bhuvaneswari, 2019).

## Identifikasi Makroskopik dan Mikroskopik
Kapang  berfilamen  diidentifikasi  berdasarkan  karakteristik  makroskopis  (kolonial)  dan mikroskopisnya.  Deskripsi  kolonial  termasuk  karakteristik  koloni  seperti  warna  ,  tekstur,  margin, ketinggian dan karakteristik hifa udara. Teknik slide culture dari Sibero et al . (2017) digunakan untuk pemeriksaan mikroskopis isolat kapang yang mencakup morfologi spora, warna, bentuk, ornamen atau  tekstur  dinding,  ukuran,  pembentukan  konidia  dan  karakteristik  terkait  lainnya  seperti  pola phialide  dan  konidiasi.  Deskripsi  kapang  di MycoBank  (www.mycobank.com)  digunakan  sebagai panduan untuk identifikasi lebih lanjut dari isolat kapang.

## Ekstraksi DNA
Metode chelex dimulai dengan mengisolasi DNA dengan metode saponin (Sibero et al . 2018). Miselia kapang diambil dan dimaukkan ke dalam microtube steril dan ditambahkan 1 mL saponin dan 100 µL dd H 2 O dan PBS, kemudian disimpan pada suhu 4 ̊C selama 24 jam.
Sampel microtube dicuci dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 12.000 r.p.m. selama 10 menit,  selanjutnya  supernatannya  dibuang  dan  ditambahkan dd H 2 O  steril  yang  baru  kemudian dicampur  menggunakan vortex .  Proses  ini  dilakukan  sebanyak  2-3  kali  dengan  tujuan menghilangkan residu saponin. Pelet yang diperoleh dari hasil pencucian selanjutnya ditambahkan 100 µL Chelex 100 20% kemudian dipanaskan menggunakan heating block pada suhu 85 ̊C selama 5 menit kemudian dicampur lagi menggunakan vortex lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit. Sampel kembali dipanaskan lagi dengan suhu dan waktu yang sama dan disentrifugasi.

## Amplifikasi DNA
DNA  kapang  yang  telah  diisolasi  selanjutnya  diamplifikasi  secara in  vitro menggunakan polymerase chain reaction (PCR) (Sibero et al ., 2018). Campuran PCR yang digunakan terdiri atas 12.5 µL PCR mix master , 1 µL primer forward (ITS1), 1 µL primer reverse (ITS4), 1 µL DNA kapang dan 9.5 µL dd H 2 O steril sehingga volume maksimal PCR tube adalah 25 µL. Protokol kondisi PCR untuk amplifikasi DNA akan sebanyak 30 kali siklus, yang terdiri atas:  denaturasi DNA: 95 ̊C, selama 1 menit; annealing : suhu optimasi, selama 1 menit; ekstensi : 72 ̊C, selama 1 menit

## Pengecekan Kualitas Produk PCR
Pengecekan kualitas produk PCR dilakukan menggunakan elektroforesis dengan buffer Tris base,  asam  asetat  dan  EDTA  (TAE)  1X.  Agarose  direndam  di  dalam  larutan  pewarna ethidium bromide (Etbr)  selama  30  menit.  Agarose  selanjutnya  dimasukkan  ke  dalam gel  documentation untuk disinari dengan lampu UV. Sampel dengan band DNA selanjutnya dikirim untuk disekuensing (Sibero et al ., 2018). Tahapan sekuensing dilakukan oleh 1 st Base Malaysia.

## Analisis Sekuens dan Pembuatan Pohon Filogenetik
Sekuens  yang  diperoleh  selanjutnya  diolah  menggunakan software MEGA  X.  Untuk mengetahui spesies kapang maka sekuens yang diterima dari 1 st Base Malaysia dicocokkan pada pangkalan  data  di GenBank menggunakan Basic  Local  Alignment  Search  Tool (BLAST)  yang terdapat di https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
Pohon  filogenetik  dilakukan  dengan  cara  mensejajarkan  seluruh  sekuens  dan  sekuens pembandingnya.  Analisis  algortima  dilakukan  menggunakan  metode Neighbor  Joining (NJ) kemudian pengujian dilakukan dengan nilai bootstrap 10000 kali.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebelum  adanya  penemuan  teknik  DNA barcoding ,  identifikasi  kapang  dilakukan menggunakan pengamatan makroskopis koloni dan mikroskopis  dengan mikroskop. Penelitian ini menggabungkan  pendekatan  identifikais  morfologi  dan  DNA barcoding untuk  memberikan  hasil yang  lebih  akurat.  Tabel  1-2  dan  Gambar  1-2  menunjukkan  hasil  karakterisasi  makro  dan mikroskopsi  kedua  isolat  kapang. Hasil  karakterisasi  morfologi  yang  mencakup  identifikasi makroskopik  dan  mikroskopik  menunjukkan  bahwa  kapang  MKMS  2.1  ketika  diamati  dibawah mikroskop  memiliki  konidiofor  yang  bercabang  ( branching ),  memiliki  sekat  ( septa ),  dan  tipe  flask pada  fialidnya  dengan  konidia  yang  tidak  beronamen  ( smooth ).  Secara  makroskopik,  isolat mempunyai teksur miselia dengan tutupan serta konidia yang sangat banyak ( powdery ). Koloni isolat ini berwarna hijau dengan pola radial hijau dan kuning. Berdasarkan karakterisasi inilah, isolat ini diduga berasal dari genus Trichoderma .
Hal ini sesuai dengan penelitian Suanda (2019) yang menyatakan bahwa genus Trichoderma memiliki ciri ciri morfologis; tekstur powdery dengan warna koloni kuning-hijau, reverse color kuning- hijau,  tidak  terdapat  sclerotia  dan  exudates.  Sedangkan  pada  penelitian  Ghazanfar et  al. (2018); Waghunde et  al. (2016),  menyatakan  bahwa  genus Trichoderma memiliki  bentuk  konidia  smooth atau ellipsoidal, bentuk konidiofor yang bercabang, memiliki tipe hifa yang bersekat, dan bentuk fialid seperti flask. Genus Trichoderma adalah kapang berfilamen dalam fase aseksual teleomorph milik urutan Hypocreales divisi Ascomycota. Fungsi ekologis Trichoderma sebagai dekomposer residu di lingkungan. Beberapa spesies dari Trichoderma menghasilkan enzim selulase yang baik sehingga Trichoderma mempunyai peran penting dalam bidang boteknologi. Misalnya, beberapa spesies dari genus ini memiliki kemampuan antagonis untuk melawan kapang patogen. Strain Trichoderma yang memiliki  kemampuan  antagonis  pada  patogen  tanaman  dapat  menjadi  kandidat  potensial  untuk agen  biokontrol  (Kredics et  al .,  2003).  Menurut  Gultom  (2008)  mekanisme  antagonis  kapang Trichoderma seperti  a)  kompetisi  nutrisi  dalam  jumlah  terbatas  tetapi  tidak  diperlukan  oleh organisme/mikroorganisme  pathogen,  b)  antibiosis  sebagai  produk  metabolit  sekunder  yang dihasilkan ketika merasa terancam, dan c) predasi, hiperparasitisme, dan mikroparasitisme. Genus Trichoderma termasuk kapang cosmopolitan karena hampir ditemukan di seluruh wilayah.  Hal ini
dapat dikarenakan spora kapang genus Trichoderma yang dapat menyebar melalui udara dan kolom air, sehingga dapat sampai keperairan dan ditangkap oleh spons.
Secara makroskopik, isolat PKMS 2.2 mempunyai teksur miselia powdery . Warna koloni  adalah putih.  Warna reverse mayoritas  adalah  putih  menuju  kuning  kecokelatan. Isolat  ini  ketika  diamati dibawah mikroskop semuanya memiliki tipe konidiofor branching , dengan tipe konidia yaitu mikro konidia,  tipe  hifa  yang  bersekat  dan fialid  bertipe  monofialid.  Dari  pengamatan  tersebut,  isolat  ini berasal dari genus Fusarium (Hafizi et al ., 2013). Spesies Fusarium dapat menghasilkan tiga jenis spora yang disebut macroconidia , microconidia , dan chlamydospores . Macroconidia diproduksi di sporodochum (struktur  khusus)  diproduksi  dalam  struktur  khusus  yang  disebut  sporodochium. Microconidia diproduksi di aerial misselia. Microconidia dapat di produksi di kepala atau rantai tiruan pada fialid. Chlamydospores , yaitu spora berdinding tebal yang berisi lipid dan akan berfungsi untuk berpindah tempat ketika kondisi inang tidak cocok (Nelson et al. , 1994).
(a) (b) (c) (d)
Gambar 1 .  Isolat  Kapang PKMS 2.2.  (a); tampak depan isolat, (b);  tampak belakang isolat  Isolat Kapang MKMS 2.1 (c); tampak depan isolat, (d); tampak belakang isolat Isolat
Gambar 3. Karakterisasi mikroskopik konidiofor isolat PKMS 2.2
Tabel 1 . Karakterisasi Makroskopik Isolat Karakteristik Makroskopik Colony color Colony texture Mycellium Exudates Reverse Sclerotia MKMS 2.1 White Granular Green No Green No PKMS 2.2 White Wolly White No White No Tabel 2. Karakterisasi Mikroskopik
Isolat Karakteristik Mikroskopik Conidiophore Conidia Phialides Hyphae MKMS 2.1 Branching Ellipsoidal Flask Septum PKMS 2.2 Branching Microconidia Monofialid Septum
DNA barcoding dilakukan setelah pengamatan morfologi untuk mengkonfirmasi dugaan awal genus kedua  isolat.  Hasil  sekuens  dipengaruhi  oleh  keberhasilan  proses  PCR  sampai  dengan elektroforesis. Keberhasilan amplifikasi ini dipengaruhi oleh banyak faktor, antara lain keberhasilan ekstraksi DNA, kemurnian DNA, komposisi larutan PCR, kondisi reaksi dan suhu yang digunakan saat proses annealing atau penempelan primer. Kualitas pita DNA untuk menentukan konsentrasi primer optimum dapat dipengaruhi oleh konsentrasi DNA template dan konsentrasi primer itu sendiri. Kualitas PCR dan spesifisitas tergantung pada konsentrasi primer optimal yaitu 0.1-2.0 µM (Loffert et al ., 1999).
Optimasi suhu annealing dilakukan dengan menggunakan gradient annealing saat PCR. Suhu annealing yang optimal adalah 55 º C. Artinya, penempelan primer optimal pada suhu 55 º C dan DNA dapat  teramplifikasi.  Hasil  identifikasi  berdasarkan  persamaan BLAST homology didapatkan kesamaan isolat MKMS 2.1 dengan Trichoderma reesei (MT421898.1) sebesar 100% dengan query cover 100%. Hal ini menunjukkan bahwa kesamaan basa yang dimiliki isolat dengan Trichoderma ini  sangat  mirip  sehingga  dapat  dikatakan  bahwa  isolat  ini  adalah  spesies Trichoderma  reesei . Sedangkan  isolat  PKMS  2.2  berdasarkan  persamaan BLAST homology merupakan  spesies Fusarium solani (MK961121.1) dengan prosentase query cover 100% dengan prosentasi identifikasi 99,82%.
Konstruksi pohon filogenetik menggunakan Aureobasidium melanogenum sebagai outgroup (KP965486.1)  (Gambar 4).    PKMS  2.2 memiliki  kesamaan  dengan Fusarium  solani dengan  hasil bootstrap  95%  dimana  artinya  95%  pembentukkan  cabang  pohon  filogenetik  akan  membentuk cabang  yang  sama.  Metode bootstrap merupakan  analisis  pengujian  baik  atau  tidaknya  set  data model.  Artinya,  sebagai  validitas  terhadap  penyusunan  cabang  untuk  memprediksi  tingkat resampled dalam  membentuk  cabang  dan  ranting  pohon  filogenetik.  Jarak  genetik  pada  pohon filogenetik menunjukan nilai sebesar 0.20, dimana nilai ini menunjukkan adanya perbedaan 20 basa dalam  setiap  100  basa  tiap  sekuensnya.  Dalam  konstruksi  filogenetik  menggunakan  metode neighbor joining dan analisis bootstrap (10000 kali ulangan) dan menghasilkan nilai sebesar 90% yang berarti sekuens isolat ini berbeda nyata dengan outgrup karena memiliki urutan pasangan basa
Journal of Marine Research Vol 10, No.1 Februari 2021, pp. 48-54
yang berbeda jauh (Dharmayanti, 2011). Konstruksi pohon filogenetik adalah hal terpenting untuk menentukan jarak evolusi pada spesies tertentu. Filogenetik dapat diartikan sebagai klasifikasi dari organisme secara taksonomi dan pusat dari evolusi biologi, dimana terdapat paradigma keseluruhan bagaimana  organisme  berkembang  dan  hidup  di  alam.  Analisis  filogenetik  ini  dapat  dilihat berdasarkan gap yang  terbentuk  setelah  proses multiple  alignment . Gap yang  terbentuk  dapat menunjukan delusi atau  inersi  dari satu atau lebih sekuens selama evolusi. Hal ini dapat diartikan pula sebagai mutasi genetik dalam sekuens.  Metode neighbor joining adalah metode akurat untuk pohon  yang  memiliki  cabang  yang  pendek.  Cabang  panjang  yang  terbentuk  bertendensi menurunkan kepercayaan dari prediksi.
Gambar 4 . Pohon  filogenetik  dua  isolat  kapang  asosiasi  spons  asal  ekosistem  mangrove (Rekonstruksi dilakukan menggunakan urutan nukleotida pada region parsial 18S, ITS1, 5.8S, ITS 2 dan parsial 26S rDNA)

## KESIMPULAN
Identifikasi  molekuler  menunjukkan  bahwa  isolat  MKMS  2.1  adalah Trichoderma  reesei (MT421898.1) yang mempunyai persamaan BLAST homology sebesar 100% dengan query cover 100% dan isolat PKMS 2.2. merupakan Fusarium solani (MK961121.1) dengan persamaan BLAST homology sebesar 99,82% dan query cover sebesar 100%.

## DAFTAR PUSTAKA
[FAO] Food and Agriculture Organization of the United Nation. 2017. Sponge and their role in the marine environment.
Anindyawati, T. 2010. Potensi selulase dalam mendegradasi lignoselulosa limbah pertanian untuk pupuk organik. Jurnal Selulosa , 45(02):70-77
Bell, J.J. 2008. The functional roles of marine sponges. Estuarine , Coastal , and Shelf Science 79: 341-353. Doi: 10.1016/j.ecss.2008.05.002.
Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J.R. & Ilan, M. 2003. Comparison of anti-predatory defenses of  Red  Sea  and  Caribbean  sponges.  I.  Chemical  defense. Marine  Ecology  Progress Series , 252:105-114.
Dharmayanti,  N.L.P.I.  2011.  Filogenetika  molekuler:  metode  taksonomi  organisme  berdasarkan sejarah evolusi. Wartazoa , 21(1):1-10.
Ghazanfar,  M.U.,  Raza,  M.,  Raza,  W.,  &  Qamar,  M.I.  2018.  Trichoderma  as  potential  biocontrol
MH855640.1 Fusarium phaseoli KJ026700.1 Fusarium oxysporum
LT746248.1 Fusarium ensiforme MK828121.1 Fusarium proliferatum MH864903.1 Fusarium striatum PKMS 2.2
MK961121.1 Fusarium solani
MF108990.1: Trichoderma cf. harzianum EU816400.1 Trichoderma aureoviride MT348603.1 Trichoderma crassum HQ596981.1 Trichoderma citrinoviride
MT421898.1: Trichoderma reesei
MKMS 2.1 KP965486.1 Aureobasidium melanogenum 99 96 63 99 100 95 87 100 85 84 86
agent, its exploitation in agriculture: a review. Plant Protection , 2(3):109-135
Gultom,  J.M.,  2008.  Pengaruh  Pemberian  Beberapa  Jamur  Antagonis  dengan  Berbagai  Tingkat Konsentrasi  Untuk  Menekan  Perkembangan  Jamur  Phytium  sp  Penyebab  Rebah  Kecambah pada Tanaman Tembakau ( Nicotiana tabaccum L.) http://repository.usu.ac.id.pdf. Diakses 20 Mei 2020
Kredics, L., Antal, Z., Dóczi, I., Manczinger, L., Kevei, F. & Nagy, E.. 2003. Clinical Importance Of The Genus Trichoderma . Acta microbiologica et immunologica Hungarica , 50(2-3):105-117.
Kunarso, D.H. 1988. The importance of heterotrophic bacteria in marine ecosystem. Oseana
Loffert, D., Karger, S., Twieling, G., Ulber, V. & Kang, J. 1999. Optimization of multiplex PCR. Qiagen news. 2:5-8.
Miranti, A.K., Rukmi, M.I. & Suprihadi, A. 2015. Diversitas Kapang Serasah Daun Talok (Muntingia calabura  L.)  Di  Kawasan  Desa  Sukolilo  Barat,  Kecamatan  Labang,  Kabupaten  Bangkalan, Madur. Bioma: Berkala Ilmiah Biologi , 16(2):58-64.
Richards,  T.A.,  Jones,  M.D.M.,  Leonard,  G.  &  Bass,  D.  2012.  Marine  fungi:  their  ecology  and molecular diversity. Annual Reviews of Marine Science, 4:495-522.
Sibero, M.T., Tarman, K., Radjasa, O.K., Sabdono, A., Trianto, A. & Bachtiarini, T.U. 2018. Produksi Pigmen dan Identifikasi Kapang Penghasilnya Menggunakan Pendekatan DNA Barcoding. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia , 21(1):99-108.
Sibero,  M.  T.,  Sabdaningsih,  A.,  Cristianawati,  O.,  Nuryadi,  H.,  Radjasa,  O.  K.,  Sabdono,  A.,  & Trianto, A. 2017. Isolation, identification, and screening antibacterial activity from marine sponge associated-fungi  against  multidrug-resistant  (MDR)  Escherichia  coli. IOP  Conf.  Series:  Earth and Environmental Science, 55:012028.
Suanda,  I.W.  2019.  Karakterisasi  Morfologis  Trichoderma  Sp.  Isolat  Jb  Dan  Daya  Hambatnya Terhadap Jamur Fusarium Sp. Penyebab Penyakit Layu Dan Jamur Akar Putih Pada Beberapa Tanaman. Jurnal Widya Biologi , 10(02):99-112.
Thoms, C., Schupp, P.J., Custódio, M.R., Lôbo-Hajdu, G., Hajdu, E. & Muricy, G. 2007. Chemical defense  strategies  in  sponges:  a  review. Porifera  research:  biodiversity,  Innovation  and sustainability , 28:627-637.
Waghunde,  R.R.,  Shelake,  R.M.,  &  Sabalpara,  A.N.  2016.  Trichoderma:  A  significant  fungus  for agriculture and environment. African Journal of Agricultural Research , 11(22):1952-1965.