Isolasi, Populasi, dan Karakterisasi Bakteri Rhizobium pada Daerah Perakaran dan Tanah dari Bengkulu, Sumatra

## Sri Purwaningsih
Bidang Mikrobiologi, Puslit Biologi-LIPI, Bogor

## Abstract
A   study   was   conducted   in   order   to   know   the   isolation,   population   and characterization of Rhizobium bacteria on the soil and rhizosphere plant from Bengkulu, Sumatra. The purpose of the study to know the population of Rhizobium bacteria from rhizosphere plant, and the get pure culture. The sample was taken from 25 sample soil from rhizosphere of plant. Isolation was done in Rhizobium standart medium (YEMA) and the population was done with plate count methods. Incubation in room temperature of 27- 28 0 C, after 7 days. The results showed that the population of Rhizobium bacteria the range 18-87 X 10 5 CFU/g soil. The highest population from the rhizosphere of Zea mays plant. Seventy five gave of pure culture.
The   growth   characteristic   the   culture   pure was observed by using YEMA medium mixed respectively with Brom Thymol Blue and Congo Red as indicators. Seventy five gave of culture pure, nine isolates can be grouped slow growing, while sixty six can be grouped as fast growing.
Key words: Isolation, population , characterization YEMA medium, Rhizobium

## Pendahuluan
Bengkulu   merupakan   salah   satu  Propinsi   di   Sumatra   yang   berbatasan   langsung dengan Samudra India, bagian Barat merupakan dataran rendah yang sempit, sedangkan bagian Timur merupakan dataran tinggi yang berbukit-bukit dan subur. Kawasan seperti ini   memiliki   nilai   keanekaragaman   hayati   yang   cukup   tinggi.   Usaha   untuk   menggali sumber daya hayati sudah banyak dilakukan, namun untuk jenis mikrobanya, terutama mikroba   tanah   belum   banyak   informasi   yang   diungkapkan,   sehingga   perlu   dilakukan eksplorasi mengenai jenis mikroba tersebut diatas, terutama jenis bakteri tanahnya.
Pengetahuan dan peningkatan kesuburan tanah dan produktivitas lahan di kawasan Bengkulu perlu didukung data dan informasi tentang bakteri tanah yang ada di kawasan tersebut   terutama   bakteri   penambat   nitrogen   (bakteri Rhizobium) .   Bakteri Rhizobium merupakan jasad renik yang bersimbiosis dengan tanaman leguminosa yang berfungsi menambat   N 2 yang   melimpah   di   udara   (Allen   &   Allen,   1981)   Peran   utama   bakteri Rhizobium adalah   menfiksasi   nitrogen   dengan   adanya   aktivitas   nitrogenase.   Tinggi rendahnya aktivitas nitrogenase menentukan banyak sedikitnya pasokan ammonium yang diberikan Rhizobium kepada tanaman. Semakin aktif nitrogenase makin banyak pasokan nitrogen bagi tanaman, sehingga dapat memperbaiki pertumbuhan tanaman (Young et al. , 1990;  Hammerschmidt  dan Smith-becker, 1999).  Penambatan nitrogen secara biologis diperkirakan   menyumbang   lebih   dari   170   juta   ton   nitrogen   ke   biosfer   per  tahun,   80% diantaranya   merupakan   hasil   simbiosis   antara   bakteri Rhizobium dengan   tanaman leguminosa (Peoples et al. , 1997 dalam Prayitno et al. , 2000). Dalam lingkungan yang memenuhi   persyaratan   tumbuh,   simbiosis   yang   terjadi   mampu   memenuhi   50%   atau bahkan   seluruh   kebutuhan   N   tanaman   yang   bersangkutan   dengan   cara   menambat nitrogen   bebas   (Saono,   1981).   Selain   itu Rhizobium yang   bereaksi   dengan   tanaman legum mampu menfiksasi 100-300 kg/ha dalam satu musim tanam dan meningkatkan sejumlah   N   untuk   tanaman   berikutnya.   Bakteri Rhizobium ini   merupakan   mikroba simbiotik yang mempunyai prospek di bidang pertanian dan kehutanan, yang mempunyai peranan sebagai biofertilizer, sehingga dapat meningkatkan efisiensi penggunaan pupuk sintetik,   yang   akhirnya   sangat   menunjang   system   pertanian   yang   berwawasan lingkungan. Permasalahan yang perlu diperhatikan adalah efisiensi inokulan Rhizobium
untuk jenis tanaman tertentu. Tanggapan tanaman sangat tergantung pada kondisi tanah dan efektivitas populasi asli (Sutanto,2002) Selain itu faktor jenis tanah, reaksi pH, faktor lingkungan juga sangat berpengaruh (Sprent, 1976)
Sebagai upaya untuk mengetahui keberadaan bakteri Rhizobium tersebut diatas, maka   dilakukan   inventarisasi   dan   isolasi   bakteri   tersebut,   dengan   harapan   akan didapatkan  bakteri yang  potensial,   yang nantinya  dapat   dikembangkan  sebagai  pupuk hayati guna meningkatkan kesuburan tanah.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui keberadaan bakteri Rhizobium , dan untuk mendapatkan isolat murni yang potensial, yang nantinya dapat dikembangkan sebagai pupuk hayati guna meningkatkan kesuburan tanah, terutama di daerah Bengkulu.

## Materi dan Metode
Sampel   tanah   dari   kedua   desa   tersebut   diatas   dilakukan   isolasi.   Media   yang digunakan untuk isolasi bakteri Rhizobium adalah media YEMA (Yeast Ekstrak Mannitol Agar) (Vincent, 1970) yang terdiri atas K 2 HPO 4 0,5 g, MgSO 4 7H 2 O 0,2 g, NaCl 0,1 g, CaCO 3 3 g, Mannitol 10 g, Yeast Extract 3 g, Agar 20 g, Aquadest 1000 ml, dengan  pH 6,8.
Isolasi   dilakukan   dengan   cara   pengenceran,   sebanyak   1   g   sampel   tanah dimasukkan dalam 9 ml larutan garam fisiologis (NaCl 0,85%) dalam tabung reaksi kecil, kemudian divortek, dibuat seri pengenceran dengan cara memipet larutan sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam  9 ml larutan NaCl  0,85%,  dan seterusnya sampai diperoleh  seri pengenceran 10 -1 – 10 -7 , dipipet 0,1 ml dituangkan dalam petridish yang telah berisi media YEMA tersebut diatas, dan diratakan dengan spatula, kemudian diinkubasikan pada suhu kamar   (27-28 0 C),   setiap   hari   diamati   pertumbuhannya   dan   dihitung   jumlah   koloninya. Penghitungan jumlah koloni dilakukan dengan metode cawan hitung ( plate count ) (Lay, 1994). Isolat yang didapat dipindahkan dalam media miring, kemudian dimurnikan sampai mendapatkan isolat yang murni (yang terdiri dari 1 koloni).
Pemurnian dilakukan dengan cara koloni diambil dengan Ose (1 Ose) dimasukkan dalam aquadest steril dalam tabung reaksi kecil (5 ml), kemudian divortek, dipipet 0,1 ml dimasukkan   dalam   petridish   yang   berisi   media   YEMA,   diratakan   dengan   spatula, kemudian diinkubasikan pada suhu kamar (27-28 0 C), koloni yang tumbuh (single koloni) ditanam dalam media YEMA miring dalam tabung reaksi (sebagai kultur murni).. Untuk pengujian karakterisasi isolat bakteri Rhizobium ditumbuhkan dalam media selektif yang dibuat dengan cara memodifikasi media dasar (YEMA) dengan pemambahan beberapa jenis pewarna sebagai indikator yaitu Congo Red dan Brom Thymol Blue (Somasegaran, 1984) kemudian diamati pertumbuhan dan perubahan warnanya.

## Hasil dan Pembahasan
Populasi   bakteri Rhizobium yang   didapat   sangat   bervariasi   pada   masing-masing perakaran tanaman. Sampel tanah dan perakaran dari desa Suro Muncang, Kecamatan Ujan   Mas,   Kabupaten   Kapahiang,   Propinsi   Bengkulu   sebanyak   15   sampel.  Populasi bakteri Rhizobium berkisar antara 18 – 61 X 10 5 CFU/g, tertinggi pada sampel tanah dari perakaran tanaman Melinjo ( Gnetum gnemon )(Tabel 1).
Sampel   tanah   dari   desa   Bukit   Peninjauan,   Kecamatan   Sukaraja,   Kabupaten Seluma,   Propinsi   Bengkulu   sebanyak   10   sampel.   Populasi   bakteri Rhizobium berkisar antara 38 –87 X 10 5 CFU/g, tertinggi pada sampel tanah dari perakaran tanaman Jagung ( Zea mays) (Tabel 2).
Dilihat   dari   keseluruhan   populasi   bakteri Rhizobium pada   beberapa   perakaran tanaman   (Tabel   1   dan   2)   menunjukkan   bahwa   populasi   bakteri Rhizobium termasuk kurang,   hal   ini   menunjukkan   bahwa   kondisi   tanah   di   daerah  tersebut   diatas  termasuk kurang subur, karena tanah pertanian yang subur mengandung lebih dari 100 juta mikroba per gram tanah. Berbagai bakteri penambat nitrogen telah banyak diisolasi  dari rhizosfer dan rhizoplane tanaman non leguminosae, namun efisiensi penambatan nitrogen masih rendah,   hal   ini   mungkin   disebabkan   karena   bakteri Rhizobium yang   hidup   di   daerah rhizosfer harus berkompetisi dengan mikroba tanah yang lain untuk mendapatkan eksudat
yang dapat digunakan untuk kelangsungan hidupnya (Kirchhof et al. , 1997; James et al. , 2001).   Selain   itu   Alexander   (1977)   mengemukakan   bahwa   jumlah   bakteri   di   daerah perakaran tanaman melimpah hingga 10 9 sel per gram tanah daerah perakaran.
Tabel   1.   Populasi   bakteri Rhizobium dari   desa   Suro   Muncang,   Kecamatan   Ujan   Mas, Kabupaten   Kapahiang, Propinsi Bengkulu.
Table 1. Population of Rhizobium bacteria from Suro Muncang Village, District of Ujan Mas, Kapahiang Regency, Bengkulu Province
No sampel perakaran tanaman Populasi bakteri Rhizobium (CFU X 10 5 )/g tanah bakteri Rhizobium jumlah isolat 1   BKL Jagung (Zea mays) 39 3 2   BKL Pisang ( Musa paradisiaca ) 46 3 3   BKL Singkong ( Manihot utilissima ) 33 3 4   BKL Alpukat ( Persia americana Mill) 52 3 5   BKL Jeruk ( Citrus sp.) 31 3 6   BKL Kedondong ( Spondias sp.) 18 3 7   BKL Merica ( Piper nigrum ) 27 3 8   BKL Melinjo ( Gnetum gnemon ) 61 3 9   BKL Gamal (Glyciridia sp . ) 25 3 10 BKL Buncis ( Vigna sinensis ) 44 3 11 BKL Kopi ( Coffea sp.) 49 3 12 BKL Pepaya ( Carica papaya ) 38 3 13 BKL Dadap ( Erythrina sp.) 59 3 14 BKL Padi ( Oryza sativa ) 44 3 15 BKL Hutan lindung Saba Penanjung 37 3
Tabel 2.  Populasi bakteri Rhizobium dari desa Bukit Peninjauan, Kecamatan Sukaraja, Kabupaten Seluma, Propinsi Bengkulu. Table   2.   Population   of Rhizobium bacteria   from   Bukit   Paninjauan   Village,   District   of Sukaraja, Kapahiang Seluma, Bengkulu Province
No sampel perakaran tanaman populasi bakteri Rhizobium (CFU X 10 5 )/g tanah bakteri Rhizobium jumlah isolat 16 BKL Padi ( Oryza sativa ) 76 3 17 BKL Jagung ( Zea mays ) 87 3 18 BKL Semangka ( Citrulus lanatus ) 47 3 19 BKL Lamtoro ( Leucaena leucocephala ) 62 3 20 BKL Pisang ( Musa paradisiaca ) 69 3 21 BKL tanpa tanaman 38 3 22 BKL Kelapa sawit ( Elais guinensis ) 67 3 23 BKL Ubi jalar ( Ipomea batatas ) 52 3 24 BKL Karet ( Hevea brasilensis ) 75 3 25 BKL Singkong ( Manihot utilissima ) 64 3
Apabila dibandingkan antar jenis tanaman populasinya sangat bervariasi, adanya perbedaan   populasi   antar   marga   dan   spesies   tanaman   tersebut   mungkin   disebabkan karena   aktivitas   metabolisme   akar   dari   masing-masing   tanaman   berbeda,yang menyebabkan perbedaan komposisi eksudat. Komposisi eksudat yang berbeda ini yang akan menentukan populasi bakteri pada daerah perakaran. Seperti pada hasil penelitian Stolassa dan Ernest (1905) dalam Waksman (1952) bahwa populasi bakteri pada daerah perakaran tanaman semuanya jauh lebih banyak dari pada tanaman biji-bijian, 1 gram tanah dari perakaran tanaman mengandung 7 sampai 8 juta bakteri, sedangkan pada
tanaman Barley mengandung 5 sampai 6 juta dan tanaman gula beets 1 sampai 2 juta. Penelitian ini juga ditunjang oleh hasil penelitian Hoffman (1914) dalam Waksman (1952) bahwa   27   dari   32   sampel   tanah   permukaan   sekitar   perakaran   tanaman   mempunyai populasi bakteri lebih banyak dibandingkan dengan tanah di dalam dan di luar perakaran. Selain itu faktor kesuburan tanah, kandungan O 2 , unsur hara, serta faktor fisik dan biologi tanah juga mempengaruhi populasi bakteri tanah (Sprent,1976).
Tabel 3.  Pertumbuhan bakteri Rhizobium pada media selektif pada sampel tanah dari desa   Suro  Muncang,   Kecamatan   Ujan   Mas,   Kabupaten   Kapahiang,   Propinsi Bengkulu
Table 3. Growth   of   Rhizomium   on   selective   media   isolated   from   soil   samples  at   Suro
Muncang Village, District of Ujan Mas, Kapahiang Regency, Bengkulu Province Nomor isolat YEMA YEMA + CR YEMA + BTB 1   BKLY(1) ++ Merah Muda Kuning 1   BKLY (2) +++ Merah Muda Kuning 1   BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 2   BKLY (1) ++ Merah Muda Kuning 2   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 2   BKLY (3) +++ Merah Muda Kuning 3   BKLY (1) + Merah Muda Biru 3   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 3   BKLY (3) +++ Merah Muda Kuning 4   BKLY (1) +++ Merah Muda Kuning 4   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 4   BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 5   BKLY (1) + Merah Muda Biru 5   BKLY(2) ++ Merah Muda Kuning 5   BKLY(3) +++ Merah Muda Kuning 6   BKLY (1) +++ Merah Muda Kuning 6   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 6   BKLY (3) +++ Merah Muda Kuning 7   BKLY (1) ++ Merah Muda Kuning 7   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 7   BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 8   BKLY(1) + Merah Muda Biru 8   BKLY (2) +++ Merah Muda Kuning 8   BKLY (3) +++ Merah Muda Kuning 9   BKLY (1) ++ Merah Muda Kuning 9   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 9   BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 10 BKLY (1) +++ Merah Muda Kuning 10 BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 10 BKLY (3) + Merah Muda Biru 11 BKLY (1) ++ Merah Muda Kuning 11 BKLY (2) +++ Merah Muda Kuning 11 BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 12 BKLY (1) ++ Merah Muda Kuning 12 BKLY (2) + Merah Muda Biru 12 BKLY (3) +++ Merah Muda Kuning 13 BKLY(1) ++ Merah Muda Kuning 13 BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 13 BKLY (3) +++ Merah Muda Kuning 14 BKLY (1) + Merah Muda Biru 14 BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning
14 BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 15 BKLY (1) +++ Merah Muda Kuning 15 BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 15 BKLY (3) +++ Merah Muda Kuning
Tabel 4.  Pertumbuhan bakteri Rhizobium pada media selektif pada sampel tanah dari desa   Bukit   Peninjauan,   Kecamatan   Sukaraja,   Kabupaten   Seluma,   Propinsi Bengkulu.
Table 4.  Growth of Rhizomium on selective media isolated from soil samples  at Bukit
Paninjauan Village, District of Sukaraja, Seluma Regency, Bengkulu Province Nomor isolat YEMA YEMA + CR YEMA + BTB 16   BKLY (1) ++ Merah Muda Kuning 16   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 16   BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 17   BKLY (1) +++ Merah Muda Kuning 17   BKLY (2) +++ Merah Muda Kuning 17   BKLY (3) + Merah Muda Biru 18   BKLY (1) +++ Merah Muda kuning 18   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 18   BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 19   BKLY (1) +++ Merah Muda Kuning 19   BKLY (2) +++ Merah Muda Kuning 19   BKLY (3) +++ Merah Muda Kuning 20   BKLY (1) +++ Merah Muda Biru 20   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 20   BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 21   BKLY (1) ++ Merah Muda Kuning 21   BKLY (2) + Merah Muda Biru 21   BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 22   BKLY (1) +++ Merah Muda Kuning 22   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 22   BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 23   BKLY (1) ++ Merah Muda Kuning 23   BKLY (2) +++ Merah Muda Kuning 23   BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 24   BKLY (1) + Merah Muda Biru 24   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 24   BKLY (3) ++ Merah Muda Kuning 25   BKLY (1) +++ Merah Muda Kuning 25   BKLY (2) ++ Merah Muda Kuning 25   BYLY (3) +++ Merah Muda Kuning
Keterangan: +        = kurang subur           YEMA = Yeast Ekstrak Mannitol Agar ++     = subur                        CR       = Congo Red +++   = sangat subur            BTB     = brom Thymol Blue
Setelah   dilakukan   pemurnian   didapatkan   isolat   bakteri Rhizobium sebanyak   75 isolat murni. Dari 75 isolat bakteri Rhizobium , 10 isolat pertumbuhannya kurang subur yang   ditandai   (+),   41   isolat   pertumbuhannya   subur   yang   ditandai   (++)   dan   24   isolat pertumbuhannya   sangat   subur   yang   ditandai   (+++).   Setelah   dilakukan   karakterisasi menunjukkan bahwa dalam media YEMA yang ditambah Congo Red semuanya berwarna merah   muda   yang   berarti   tidak   menyerap   warna   merah   dari   indikator   Congo   Red, keadaan   ini   menunjukkan   cirikas   dari   bakteri Rhizobium .   Seperti   yang   dikatakan   oleh
Soekartadiredja (1992) bahwa salah satu cirikas bakteri Rhizobium tidak meyerap warna merah pada media yang mengandung Congo Red. Dari 75 isolat dalam media YEMA yang ditambah dengan Brom Thymol Blue menujukkan bahwa 9 isolat termasuk dalam kelompok tumbuh lambat (slow growing) yang ditandai dengan perubahan warna menjadi biru, sedangkan 66 isolat termasuk dalam kelompok tumbuh cepat ( fast growing ) yang ditandai perubahan warna menjadi kuning.

## Kesimpulan
Hasil   penelitian   dapat   disimpulkan   bahwa   jumlah   bakteri Rhizobium pada   kedua desa sangat bervariasi. Jumlah bakteri berkisar antara 18-87 X 10 5 CFU/g tanah. Setelah dikarakterisasi   dari     75   isolat   yang   didapat,10   isolat   tumbuh   kurang   subur,   41   isolat tumbuh subur dan 24 isolat tumbuh sangat subur. Dalam media YEMA yang ditambah Brom Thymol Blue menujukkan bahwa 9 isolat termasuk dalam kelompok tumbuh lambat (slow growing) yang ditandai dengan perubahan warna menjadi biru, sedangkan 66 isolat termasuk dalam kelompok tumbuh cepat (fast growing) yang ditandai perubahan warna menjadi kuning.

## Daftar Pustaka
Alexander. M., 1977. Soil Microbiology. 2 nd ed. John Wiley and Sons Inc, New York. 472p.
Allen. O.N and E. K. Allen., 1981. The Leguminosae. The University of Winconsin Press, Madison. 812 p.
Hammerschmidt. R and J.A. Smith-Becker. 1999. The role of salicylic acid in desease resiatence. In agrawal, A.A. S. Tuzun and E. Bent (Eds) induced plant defenses against pathogen and herbivores: Biochemestry, ecology & agriculture pp,37-53.
James. E.K, f.L. Olivers, A.L.M. de Oliviera, F.B. dos Reis. J.R., L.G. da silva and V.M.
Reis.2001.   Further     observations   on   the   interaction   between   sugarcance   and Gluconacetobacter   diazotrophicus   under   laboratory   and   greenhouse   condition. Jurnal of Experimental Botani 52,547-760.
Kirchhof.   G.,   V.M.   reis.,   J.L.   badani.,   B.   Eckert.,   J.   dobreiner   and   a.   Hartman.   1997. Accurrence, physiological and molekuler analysis of endophitic diazothropic bacteria in gramineous. Plant and Soil 194, 45-55.
Lay. B.W. 1994. Analisis Mikroorganisme di Laboratorium.  P.T. Raja Grafindo Persada. 168 h.
Prayitno. J., J.J. Weinman., M.A.  Djordjevic & B.G. Rolfe.  2000.  Pemanfaatan Protein Pendar   Hijau   (Green   Fluorescent   Protein)   Untuk   Mempelajari   Kolonisasi   Bakteri Rhizobium. Prosiding Seminar Nasional Biologi XVI h, 272-377.
Saono.   S.   1981.   Mikrobiologi   di   Indonesia.  Kumpulan   Makalah   Konggres   Nasional Mikrobiologi III, Jakarta pp; 348-354.
Sprent, J.L. 1976. Symbiotic Nitrogen Fixation in Plant. P.S. Nutman (Ed). Combridge. Univ. Press, Combridge 584 p.
Soekartadiredja.  E.M. 1992. Perubahan Inefektivitas dan Efektivitas Penambatan pada galur Rhizobium setelah perlakuan pasasi in Vivo. Thesis. Univ. Padjadjaran. 231 h.
Somasegaran.   P   and   H.J.   Hoben.   1984.   Methods   in   legume Rhizobium Technology.
University of Hawaii. NIFTAL. Project and Mircen. 387 h.
Sutanto. R. 2002. Penerapan Pertanian Organik. Kanisius, Yogyakarta.
Young. C.C., C.L. Chen & C.C. Chao. 1990. Effect of Rhizobium , vesicular arbuscular mycorrhiza  and phosphate solubilizing  bacteria  on  yield and mineral  phosphorus
uptake of crops in subtropical-tropical soils. Trans Int. Congr. Soil. Sci. 14 th August 12-18. 1990. Kyoto, Japan. p: 55-60.
Vincent.   J.M.   1970.   A   Manual   of   the   Practical   study   of   the   root   Nodule   Bacteria International Biological Programme. London. Handbook No 15. 164 p.
Waksman. S.A. 1952. Soil Microbiology. John Wiley and Sons. Inc, New York, London.