## PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ANTIBODI ANTI FIM-C Salmonella Typhi

## PADA MENCIT DDY
Umar Hasan 1
1 Anggota Peneliti Muda Utama Kelompok Peneliti Muda Universitas Negeri Jakarta Email : realism_painter@yahoo.com

## ABSTRAK
Tifus  merupakan  penyakit  yang  banyak  diderita  oleh  masyarakat  di  negara berkembang termasuk Indonesia. Sampai saat ini vaksin tifus masih terus dikembangkan. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi dan mengkarakterisasi antibodi anti Fim-C S.  typhi  secara  in  vivo  sebagai  kandidat  vaksin  pada  mencit  galur  ddY.  Metode  yang digunakan dalam penelitian adalah metode eksperimen. Antigen yang digunakan adalah Protein  rekombinan  Fim-C  S.  typhi  dalam  bentuk  murni  hasil  penelitian  sebelumnya. Mencit ddY sebagai hewan coba dikelompokkan menjadi 4, yaitu: Kelompok uji I (protein Fim-
-C  S. typhi), kelompok kontrol sakit 1 (FCA/FIA adjuvant), kelompok kontrol sakit 2 (PBS1x). Hasil  penelitian  dengan  metode  ELISA  (Enzyme  Linked  Immunosorbent  Assay) menunjukkan adanya respon antibodi yang diproduksi oleh mencit ddY setelah injeksi subkutan  dengan  protein  Fim-C+adjuvant  maupun  tanpa  adjuvant.  Respon  antibodi dengan  antigen  Fim-C+adjuvant  memberikan  nilai  yang  lebih  tinggi  dibandingkan antigen  Fim-C tanpa  adjuvant.  Hal  tersebut  dibuktikan  dengan  adanya  kenaikan  titer antibodi dari penyuntikan ke-1 hingga penyuntikan ke-4. Pada hasil penelitian dengan metode Western Blot menunjukkan terjadinya interaksi antigen spesifik Fim-C terhadap Antibodi  anti  Fim-C.  Dari  kedua  metode  tersebut,  data  ini  mengkonfirmasi  bahwa Protein Fim-C S. typhi memiliki imunogenisitas yang tinggi. Sehingga dapat disimpulkan bahwa protein Fim-C S. typhi dapat dijadikan sebagai kandidat vaksin rekombinan yang potensial untuk melawan penyakit tifus.

## Kata Kunci
Salmonella typhi, Penyakit tifus, Protein Fim-C, Antibodi, Vaksin Rekombinan.

## ABSTRACT
Typhus  is  a  disease  that  affect  many  people  in  developing  countries  including Indonesia. Until now typhoid vaccine is still being developed. This research is doing to produce and characterize anti fim-C antibodies of Salmonella typhi in vivo as a vaccine candidate strain ddY mice. The method used in the research is experimental method. The antigen  used  is  a  fim-C  recombinant  protein  in  its  pure  form  the  results  of  previous research.  The  ddY  mice  as  experimental  animals  were  grouped  into  four,  namely: experiment  group  1  (Fim-C  protein+Freund's  Complete/Incomplete Adjuvant), experiment group 2 (Fim-C protein S. typhi), ill control group 1 (FCA/FIA adjuvants), ill  control  group  2  (PBS1x).  The  results  with  ELISA  (Enzyme  Linked  Immunosorbent Assay)  method  showed  that  the  antibody  response  produced  by  ddY  mice  after subcutaneous  injection  of  the  protein  Fim-C+adjuvant  or  without  adjuvant.  Antibody responses with  Fim-C Antigen+adjuvant  gives  a  higher  value  than the  Fim-C antigen without  adjuvant.  This  is  evidenced  by  the  increase  in  antibody  titer  from  the  first injection  until  the  fourth  injection.  The  results  with  western  blot  method  showed  an interaction between antigen spesific Fim-C and antibodi anti Fim-C. These data confirm that  fim-C  protein  S.  typhi  has  a  high  immunogenicity  of  both  methods.  It  can  be
concluded that the Fim-C protein S. typhi can be used as a potential recombinant vaccine candidate against typhoid fever.

## Keywords
Salmonella typhi, Typhus Disease, Fim-C Protein, Antibody, Recombinant vacci
Pendahuluan
Tifus merupakan salah satu penyakit  yang  banyak  diderita  oleh masyarakat di negara-negara berkembang termasuk Indonesia,
khususnya  terjadi  pada  usia-usia  muda dan  menjadi  masalah  kesehatan  yang sangat  penting  dan  membutuhkan penanganan  lebih.  Angka  kejadian penyakit  tifus  di  Indonesia  rata-rata sekitar  900.000  kasus/tahun  dengan angka  kematian  lebih  dari  20.000  dan 91% dari kasus tersebut terjadi pada usia 3-19 tahun, hingga menunjukkan terjadinya  peningkatan  angka  kematian setiap  tahunnya  [1].  Penyakit  ini disebabkan  oleh  bakteri Salmonella typhi . Salmonella  typhi memiliki  Protein Fim-C  atau  yang  disebut  fimbriae sebagai faktor virulensi yang berpotensi imunogenik  untuk  mencegah  infeksi tifus. Protein Fim-C merupakan protein polimer  pada  permukaan  sel  bakteri sebagai mediator penting yang digunakan untuk interaksi atau penempelan  dirinya  terhadap  sel  inang [2].  Protein-protein  yang  ada  pada permukaan  seperti  Fim-C  ini  dapat dijadikan sebagai antigen dan menginduksi respon imun dengan baik. Sehingga  telah  diduga  bahwa  protein Fim-C  pada Salmonella  typhi dapat berpotensi  untuk  dijadikan  vaksin rekombinan pencegah penyakit tifus.
Dalam  beberapa  kasus,  pemberian vaksinasi  merupakan  salah  satu  cara penanganan  atau  pencegahan  penyakit tertentu  seperti  tifus  [3].  Penelitian  ini mengarah  pada  vaksin  rekombinan, yaitu  vaksin  yang  dibuat  dengan
teknologi  rekombinan  (bioteknologi) dengan  memanfaatkan  gen  pengkode antigen dari virus atau bakteri penyebab penyakit,  bukan  menggunakan  virus atau bakteri utuh [3]. Pemilihan vaksin rekombinan dikarenakan tingkat keamanannya lebih tinggi dibandingkan vaksin non rekombinan/konvensional yang menggunakan virus (yang telah dilemahkan). Vaksin rekombinan memiliki keuntungan yaitu tidak ada kesempatan tubuh terserang dari virus, produksi  protein  virus  dapat  dilakukan dalam  jumlah besar,  dan  menghasilkan respon imun yang lebih spesifik.
Pada  penelitian  sebelumnya  telah dilakukan  kloning  dan  subkloning  gen Fim-C Salmonella  typhi pada  vektor kloning  dan  vektor  ekspresi,  serta purifikasi  protein  rekombinan  Fim-C [4].  Oleh  karena  itu  penelitian  ini dilanjutkan  untuk  memproduksi  dan mengkarakterisasi  antibodi  anti  Fim-c Salmonella typhi, apakah dapat dijadikan  sebagai  kandidat  vaksin rekombinan untuk pencegahan penyakit tifus  sehingga  dapat  meningkatkan kualitas kesehatan pada masyarakat.
Untuk mendukung pengujian produksi dan karakterisasi antibodi anti Fim-C tersebut, akan dilakukan menggunakan hewan uji mencit terlebih dahulu.  Sehingga  dari  hasil  tersebut diharapkan
nantinya mampu
menghasilkan penyediaan produk vaksin tifus yang aman untuk masyarakat.

## Metodologi Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksploratif dan eksperimen,  melalui  beberapa  tahapan
meliputi : produksi antibodi anti Fim-C S.typhi ,  analisis  titer  antibodi  dengan ELISA,  analisis  spesifikasi  antibodi dengan western blot [5,6,7,8].
Produksi  antibodi  anti  Fim-C

## S.typhi
Produksi  antibodi  anti  Fim-C Salmonella typhi terdiri atas, penyiapan mencit sebagai hewan produksi,
penyiapan protein rekombinan Fim-C S. typhi sebagai antigen, proses immunisasi, dan isolasi serum mencit/antibodi  anti-FimC S.  typhi [5,6,7,8,9].
Penyiapan  hewan  percobaan ;
Produksi  antibodi  anti-Fim  C S.  typhi dilakukan  pada  mencit  jantan,  galur ddY, umur 6-8  minggu dan berat 17-24 gram.  Sejumlah  32  ekor  mencit digunakan untuk produksi antibodi anti- Fim  C S.  typhi .  Mencit  dipelihara  di kandang yang ditempatkan pada
ruangan  dengan  kondisi  suhu  20-25 0 C selama
seminggu.
Selama
pengkondisian  dilakukan  penimbangan berat badan pada hari ke 0, hari, ke 3 dan hari  ke  5.  Selain  itu  dilakukan pemantauan  terhadap,  pakan,  kandang, kesehatan dan aktivitas mencit. Setelah proses pengkondisian, dilakukan pengambilan  pre-immune  serum  dari mata  sebanyak  100-200  mL.  Sehari sebelum pengambilan pre-immune serum  mencit  dipuasakan  tetapi  tetap masih diberi minum.
Masing masing
mencit dikelompokan  menjadi  dua  kelompok besar, yaitu kelompok eksperimen (KP) dan  kelompok  sakit  (KS).  Kelompok eksperimen memiliki dua sub kelompok yaitu kelompok yang disuntikan campuran  protein  Fim-C  dan Freund complete/Incomplete adjuvan  (KP1) yang  terdiri  dari  8  ekor    mencit  dan kelompok yang disuntikan oleh protein Fim-C  (KP2)  yang  terdiri  dari    8  ekor mencit.  Kelompok  kontrol  sakit  terdiri dari dua sub kelompok yaitu kelompok
yang disuntikan Freund Complete/Incomplete Adjuvan  (KS1)
terdiri dari 8 ekor mencit, dan kelompok yang  disuntikan  oleh  Phosphate  Buffer Saline  (KS2)  yang  terdiri  dari  8  ekor mencit.  Kelompok  eksperimen  dan kelompok  kontrol  sakit  diuji  imunitas untuk dilihat pembentukan antibodinya.
Penyiapan antigen protein rekombinan  Fim  C  S.  typhi  untuk imunisasi ; Sebanyak 25-100 µg protein Fim-C S.  typhi hasil  pemurnian  dalam bentuk  inclusion  bodies  dilarutkan dengan bufer PBS 1x dalam Eppendorf 1,5 mL sehingga memiliki total volume 100  µL.  Selanjutnya  ditambahkan
(FCA) atau (FIA) dengan  perbandingan  1:1.  Kemudian dilakukan homogenisasi campuran dengan vorteks sampai warna campuran berwarna putih [5,8].
Proses imunisasi ; Imunisasi dilakukan pada bagian punggung mencit bagian  depan  dekat  kepala  secara subkutan  dan  sebanyak  2-3  titik  untuk satu  kali  penyuntikan.  Imunisasi  awal yaitu  20  µg  protein  Fim  C  yang  telah disiapkan  sebagai  antigen  dicampur dengan nt . Satu  minggu  setelah  penyuntikan  awal dilakukan pengambilan darah dari mata dan selanjutnya darah tersebut dipreparasi  untuk  diambil  serumnya. Setelah  satu  minggu  dari  penyuntikan awal  dilakukan boosting dengan  40  µg Fim-C  dicampur  dengan incomplete  Adjuvant . Boosting kedua dan ketiga dilakukan dengan 60 µg Fim- C setelah satu minggu dari penyuntikan kedua  dan  ke  tiga  sampai  didapatkan jumlah antibodi yang optimal [5,7].
Isolasi  serum  mencit/antibodi anti-protein  rekombinan  S.  typhi ; Darah yang berasal dari mata dikumpulkan  pada  tabung  sentrifuga steril. Darah diinkubasi pada suhu 37 0 C selama  30-60  menit  sampai  terlihat
pemisahan  antara  serum  dan platelet. Sentrifuga  dilakukan  selama  10  menit dengan kecepatan  5.000  g  pada  suhu 4 0 C.  Cairan  bening/serum  diambil  dan dimasukkan dalam Eppendorf . Kemudian serum disimpan pada  20 0 C [5,9].
Analisis perkembangan pembentukan antibodi anti Fim-C S. typhi dengan teknik ELISA Pada analisis jumlah
pembentukan  antibodi  sebagai  antibodi primer  digunakan  antibodi  mencit  dari Bleed I- Bleed IV. Berikut ini diuraikan analisis  jumlah  pembentukan  antibodi anti-protein  Fim-C S.  typhi mulai  dari hari  ke-0  ( pre-immune serum,  sebelum dilakukan  penyuntikan  dengan  antigen protein Fim-C S. typhi ) sampai minggu ke 5 dengan teknik ELISA.
Antigen (30 300 ng protein Fim-
C S.  typhi dalam  50  µL  bufer  garam fosfat,  PBS  1x,  per  sumur)  diinkubasi dalam sumur microtiter plate (IWAKI) pada suhu ruang selama semalam. Tiap sumur  dicuci  masing-masing  3  kali dengan  PBS  1x  yang  mengandung  1 mM MgCl 2 dan 0,05% (v/v) Tween-20 (bufer pencuci). Sesudah dicuci, ditambahkan 150 µL 5% blotto (5 g susu skim dalam 100 mL PBS 1x) pada tiap sumur,  kemudian microtiter  plate diinkubasi  pada  suhu  37 0 C  selama  1 jam. Setelah inkubasi dilakukan pencucian  lagi  sebanyak  3  kali  dengan bufer  pencuci.  Sebanyak  50  µL  serum mencit  (berasal  dari bleed I  (hari  ke- 0/ pre-immune serum) - bleed V (minggu ke-5),  dengan  pengenceran  100x  dan 300x  ditambahkan  pada  tiap  sumur sesuai  dengan  rancangan  ELISA  yang telah  disiapkan,  selanjutkan  diinkubasi pada suhu 37 0 C selama satu jam. Sumur microtiter  plate dicuci  kembali  dengan bufer  pencuci  sebanyak  tiga  kali. Setelah  proses  pencucian  ke  dalam sumur  ditambahkan  masing-masing  50
µL  antibodi  sekunder  ( anti  IgG-mice- HRP yang  telah  diencerkan  5000x dengan  PBS  1x)  (Biogen,  2013), kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37 0 C selama  1  jam.  Setelah  inkubasi,  sumur microtiter  plate dicuci  kembali  dengan bufer  pencuci  sebanyak  tiga  kali. Sebanyak 100 µL larutan substrat TMB -Tetramethylbenzidine) ditambahkan pada tiap sumur, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama satu jam  (akan  menghasilkan  warna  biru). Kemudian  reaksi  dihentikan  dengan H 2 SO 4 2M menghasilkan warna kuning. Sesudah inkubasi, dilakukan pembacaan absorbansi  pada  alat ELISA-Reader ( Microplate  Reader )  pada  panjang gelombang  450  nm  [6,7,9].  Setelah diketahui  pembentukan  antibodi  yang maksimal, selanjutnya dilakukan pengambilan serum dalam jumlah besar atau bleeding terminal  sebanyak  10-20 mL darah.
Analisis  spesifikasi  antibody  anti protein Fim-C dengan Western Blot Karakterisasi antibodi anti Fim-C S.  typhi dilakukan  dengan  SDS-PAGE terhadap antibodi, dan Western immunoblotting untuk melihat interaksi antibodi  anti  Fim-C  dengan  antigen protein Fim-C S. typhi .
Karakterisasi antibodi anti protein  Fim-C  dengan  SDS-PAGE ; Penyiapan gel dan proses elektroforesis yang  dilakukan  untuk  karakterisasi protein  hasil  pemurnian  sama  dengan tahap karakterisasi protein hasil overekspresi.  Sampel  yang  digunakan pada  tahap  ini  adalah  serum  yang mengandung  IgG  Fim-C S.  typhi . Sebanyak  10  µL  antibodi  dimasukkan dalam  tabung Eppendorf 1,5  mL kemudian  ditambahkan  buffer  sampel 5x. Campuran ditambah air steril sampai konsentrasi akhir bufer sampel menjadi 1x. Langkah proses SDS-PAGE meliputi  penyiapan  gel  poliakrilamid,
penyiapan  sampel  protein  Fim-C S. typhi ,  proses  elektroforesis,  pewarnaan gel, dan pengeringan gel. Penyiapan gel poliakrilamid .  Jenis  gel  poliakrilamid pada  proses  ini  adalah separating gel dan stacking gel. Separating gel berfungsi  untuk pemisahan  protein dan stacking gel  berfungsi  sebagai  tempat sampel  yang  akan  dipisahkan  massa molekulnya. Separating gel  dibuat  dari 10% akrilamid (Amersham-Pharmacia),
-metilen-bis-akrilamid (Amersham-Pharmacia), 0,1% SDS dan buffer  Tris-HCl  0,375  M  pH  8,8. Campuran  dihomogenkan,  selanjutnya -tetra- etilen-diamin  (TEMED)  dan  0,05% amonium  persulfat  sebagai  inisiator polimerisasi.  Campuran  dituangkan dalam casting gel  yang  telah  disiapkan (Miniprotean  II Bio-Rad ).  Kemudian ditambahkan  air  pada  bagian  atas campuran  agar  permukaan separating gel  menjadi  rata.  Campuran  diinkubasi pada  suhu  ruang  selama  30  menit sampai  polimerisasi  terjadi  dengan sempurna atau gel mengeras.
Selanjutnya disiapkan stacking gel yang - metilen-bis-akrilamid, 0,1% SDS, Tris- HCl 0,125 M pH 6,8, 0,1% TEMED dan 0,05%  amonium  persulfat.  Campuran dihomogenkan,  kemudian  dituangkan diatas separating gel yang berada dalam casting gel  diatas.  Setelah stacking gel dimasukkan kemudian pada casting gel tersebut  dipasang  sisir  untuk  tempat sampel  yang  akan  dielektroforesis. Campuran  diinkubasi  pada  suhu  ruang selama  30  menit  sampai  polimerisasi stacking gel  sempurna. Penyiapan sampel protein Fim-C S. typhi . Sampel protein  (15-25  µg)  dimasukkan  dalam tabung Eppendorf 1,5  mL  kemudian ditambahkan buffer sampel  5x (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 25% gliserol, 2% SDS, 14,4  mM  2-mercaptoetanol  dan  0,1% bromphenolblue).  Campuran  ditambah
air steril sampai konsentrasi akhir buffer sampel menjadi 1x. Kemudian didenaturasi pada suhu 100 0 C selama 10 menit. Setelah itu, dilakukan sentrifuga dengan microcentrifuge Eppendorf pada 10.000  g  selama  30  detik.  Sampel protein  tersebut  siap  untuk  proses elektroforesis. Proses  elektroforesis .
Sebelum proses elektroforesis berlangsung,  gel  yang  telah  dibuat dipasang pada bagian dari alat MiniProtean  II  Biorad  yang  memiliki kawat penghantar arus listrik. Gel yang telah  terpasang  dimasukkan  dalam Chamber atau  tangki  elektroforesis MiniProtean II Bio-Rad. Chamber diisi dengan  300  mL running  buffer 1x  (25 mM  Tris-HCl  pH  8,3,  0,1%  SDS  dan 192  mM  glisin).  Sampel  protein  dan protein  marker  dimasukkan  dalam sumur-sumur pada bagian stacking gel. Selanjutnya dilakukan proses
elektroforesis  dengan 150  volt  selama 45-60 menit pada suhu ruang. Pewarnaan  protein  pada  gel  hasil elektroforesis . Setelah proses elektroforesis  selesai,  gel  dikeluarkan dan dimasukkan dalam larutan staining {0,1% Comassie-blue R250, 45% (v/v) metanol,  dan  10%  (v/v)  asam  asetat glacial}.  Gel  dalam  larutan staining tersebut  diagitasi  selama  satu  jam sampai satu malam (sampai terlihat pita protein)  pada  suhu  ruang.  Selanjutnya gel dipindahkan pada larutan destaining
{40% (v/v) metanol dan 10% (v/v) asam asetat  glasial}  sampai warna  biru  pita protein pada gel terlihat jelas. Pengeringan  gel  hasil  elektroforesis . Pengeringan  gel  dilakukan  dengan meletakkan  gel  diantara  dua  selopan, kemudian dikeringkan dengan gel dryer pada  suhu  50 0 C  selama  satu  jam.  Gel dapat juga dikeringkan dengan meletakkan  diantara  dua  selopan  yang diapit  oleh  dua  bingkai  foto,  kemudian dibiarkan  pada  suhu  ruang  selama  satu malam.
Interaksi antibodi  anti  Fim-C S. typhi dengan Western immunoblotting Western  immunoblotting  digunakan untuk uji spesifisitas antibodi antiprotein  Fim-C.  Langkah  awal Western immunoblotting adalah
pemisahan protein Fim-C murni dengan elektroforesis  gel  poliakrilamid.  Proses elektroforesis  dilakukan  sama  dengan langkah  yang  dilakukan  pada  proses- proses sebelumnya. Kemudian dilakukan transfer protein dari gel hasil elektroforesis ke membran
nitrocellulose  pada  voltase  200  volt selama  1  jam  pada  suhu  4 0 C  dalam buffer  transfer  yang  mengandung  25 mM  Tris,  192  mM  glisin  dan  20% metanol pada pH 8,3 (Mini transblot II, Biorad, 1999). Setelah transfer,
membran nitrocellulose dibloking
dengan blocking buffer selama satu jam pada  suhu  ruang  sambil  dilakukan agitasi.  Antibodi  anti-protein  Fim-C ditambahkan  kedalam  larutan  blocking tersebut (pengenceran 100x), diinkubasi lagi  selama  1  jam  dan  setelah  itu ditambahkan  Tween-20  (konsentrasi 0,5%  (v/v)).  Inkubasi  dan  agitasi dilanjutkan  30-60  menit  pada  suhu ruang.  Membran  kemudian  dicuci dengan  PBS  sebanyak  3x  masing- masing 5-10 menit pada suhu ruang dan diagitasi. Selanjutnya membran
dimasukkan lagi dalam larutan blocking yang  baru,  diinkubasi  dan  agitasi  lagi pada  suhu  ruang  selama  satu  jam. Setelah itu ditambahkan antibodi sekunder  (HRP  anti  IgG-Mice  yang telah diencerkan 5000x), dan Tween-20. Proses  dilanjutkan  dengan  pencucian seperti langkah sebelumnya. Pewarnaan membran dilakukan dengan
memasukkan membran kedalam larutan
-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride)-(Thermo
Scientific, 2013), sampai terlihat adanya pita protein berwarna cokelat.
Selanjutnya membran dikeringkan
diatas  kertas  tissue  pada  suhu  ruang [5,9,10].

## Hasil dan Pembahasan
Penelitian  ini  bertujuan  untuk menghasilkan  produk  antibodi  spesifik anti  Fim-C Salmonella  typhi pada hewan  uji  dan  menghasilkan  informasi tentang  karakteristik  antibodi  spesifik anti  Fim-C Salmonella  typhi sebagai kandidat  vaksin  rekombinan  yang potensial.  Hasil  penelitian  diuraikan menjadi beberapa bagian sebagai berikut  :  Hasil  pemantauan  hewan percobaan dan pengambilan pre- immune serum, Pengambilan  serum darah,  Penyuntikan  antigen,  Analisis perkembangan  jumlah  pembentukan antibodi  anti  Fim-C S.typhi ,  Analisis spesifikasi  antibodi  anti  protein  Fim-C dengan Western Blot
Hasil Pemantauan Hewan Percobaan dan Pengambilan Pre-immune Serum Hasil pemantauan kesehatan mencit  dilakukan  dengan  penimbangan berat  badan,  pengamatan  pola  makan, dan pengamatan kondisi fisik. Sedangkan  pemantauan  kondisi  ruang pemeliharaan dilakukan dengan pengukuran suhu ruang, sirkulasi udara, kebersihan,  dan  kelembaban  ruangan. Proses  produksi  antibodi  anti  Fim-C dilakukan  di  LABTIAP  (laboratorium Pengembangan Teknologi Industri
Agrikultur dan Biomedis) BPPT (Badan Pengkajian  dan  Penerapan  Teknologi)- Serpong.
Terjadi  penurunan  berat  badan mencit  pada  hari  ke-3  dari  semua kelompok. Hal ini dikarenakan adaptasi awal dari mencit terhadap kondisi/lingkungan yang baru ditempati membuat  mencit  tersebut  mengalami stress.  Sedangkan  hari  ke-5  terjadi kenaikan  berat  badan  lagi,  karena pemberian pakan yang cukup dan proses adaptasi yang cukup.
Setelah pengkondisian, kemudian mencit  diambil  darahnya  sebagai pre- immune serum.  Tujuan  pengambilah
pre-immune serum  adalah  sebagai kontrol  negatif  pembentukan  antibodi anti  Fim-C,  hal  ini  dilakukan  untuk memastikan  bahwa  tidak  ada  interaksi yang terjadi antara antigen protein Fim- C  dengan  antibodi  mencit  sebelum dilakukan
imunisasi/penyuntikan antigen. Hasil pengambilan pre-immune serum  dari sinus  orbitalis mata menghasilkan  0,5-1  mL  darah,  serum yang  dihasilkan  adalah  0,2-0,5  mL serum  dari  total  darah  yang  diambil. Hasil tersebut disimpan pada suhu -20 o C untuk keperluan lanjutan.
Pengambilan Serum Darah
Proses pengambilan darah dilakukan untuk analisa produksi antibodi.  Proses  pengambilan  darah dilakukan pada mata untuk mendapatkan  volume  darah  yang  lebih banyak dibandingkan dengan
pengambilan darah melalui ekor. Sebelum  pengambilan  darah,  mencit yang akan diambil darahnya dipuasakan terlebih dahulu selama satu malam agar glukosa  tidak  mengganggu  pada  saat analisa,  tetapi  mencit  tetap  diberikan minum untuk mencegah kematian.
Serum  darah  yang  dihasilkan disimpan pada suhu -20 o C untuk proses analisa  antibodi menggunakan  metode ELISA.

## Penyuntikan Antigen
Antigen  yang  digunakan  adalah Protein  Fim-C+Adjuvan,  Protein  Fim- C+PBS,  Adjuvan+PBS,  dan  PBS  aja. Fungsi  dari  adjuvan  ini  adalah  untuk merangsang  pembentukan  antibodi  dan menjaga  protein  dari  katabolisme  yang berlangsung  begitu  cepat,  sehingga protein dapat merangsang pembentukan antibodi  spesifik  yang  diinginkan. Kelompok perlakuan ini adalah
kelompok yang diberikan protein Fim-C dicampur dengan
Complete/Incomplete  Adjuvan yaitu kelompok  KP1.  Perlakuan  lain  yaitu dengan  menyuntikan  antigen  Fim-C yang  dicampur  dengan  PBS  yaitu kelompok KP2. Kontrol dari kelompok KP1  adalah  kelompok  yang  hanya diberikan  Adjuvan  yang  dilarutkan dalam  PBS  (KS1).  Sedangkan  kontrol dari  kelompok  KP2  adalah  kelompok yang hanya diberikan PBS saja (KS2).
Antigen yang dipreparasi disesuaikan dengan dosis yang dibutuhkan kemudian dicampur dengan
complete Adjuvan atau PBS (sesuai kelompok). Hasil dari percampuran  protein  dan
Complete/Incomplete
Adjuvan
menghasilkan  emulsi  protein  dalam mineral oil berwarna putih.
Proses  penyuntikan  dilakukan pada mencit secara subkutan, yaitu pada bagian  punggung,  antigen  dimasukkan kebawah  kulit. Penyuntikan  ke-1 dengan  dosis  20  µg/mL,  penyuntikan ke-2 dengan dosis 40 µg/mL, penyuntikan  ke-3  dengan  dosis  60 µg/mL.  Penyuntikan  ke-4,  dosis  hanya mencapai 24 µg/mL. Hal ini dikarenakan ketersediaan produksi protein yang konsentrasinya tidak cukup tinggi.
Analisis Perkembangan Jumlah Pembentukan  Antibodi  Anti  Fim-C
S.typhi
Serum  antibodi  Vi-spesifik  telah dimonitor pada mencit secara subkutan yang diimunisasi dengan Protein Fim-C +  Adjuvant  (Kelompok  perlakuan  1, KP1), Protein Fim-C + PBS (Kelompok Perlakuan  2,  KP2),  Adjuvant  +  PBS (Kelompok  kontrol  Sakit  1,  KS1),  dan PBS  saja  (Kelompok  kontrol  Sakit  2, KS2). Serum yang telah didapat tersebut dapat  diketahui  perkembangan  jumlah pembentukan antibodinya dengan
metode ELISA ( enzym-linked immunosorbent assay ). Skema pengikatan antibodi ditunjukkan  pada  gambar  1.  Pada Kelompok  perlakuan  1  (KP1)  dan kelompok perlakuan 2 (KP2) menghasilkan  warna  kuning  diakhir reaksi,  sedangkan  kelompok  kontrol sakit  1  dan  2  (KS1  dan  KS2)  tidak menghasilkan warna. Hal ini
dikarenakan pada KP1 dan KP2 terjadi interaksi  antara  antigen  Fim-C  dan antibodi anti Fim-C, sedangkan
KS1  dan  KS2  tidak  terjadi  interaksi antara antibodi spesifik Fim-C terhadap antigennya.
Desain  ELISA  yang  digunakan adalah konsentrasi 0 ng, 100 ng, dan 300 ng, dengan  pengenceran  antibodi  100x dan  300x.  Antigen  akan  berinteraksi dengan serum yang mengandung antibodi  spesifik.  Hasil  uji  ELISA dengan  variasi  konsentrasi antigen dari mencit disajikan pada tabel 1-4.
Tabel 1. Data  Nilai  Absorbansi Pembentukan Antibodi Anti  Protein  Fim-C S.
typhi (Inclusion  Bodies) dengan Antigen (Fim-C + Adjuvan).
Tabel 2.
Data  Nilai  Absorbansi Pembentukan Antibodi Anti  Protein  Fim-C S.
typhi (Inclusion  Bodies)
dengan Antigen (Fim-C + PBS). Tabel 3.
Data  Nilai  Absorbansi Pembentukan Antibodi
Anti  Protein  Fim-C S. typhi (Inclusion  Bodies) dengan
Antigen (Adjuvan + PBS). Penyuntikan Ke- Jumlah antigen 100 ng 300 ng Bleed-0 0,0288 0,0775 Bleed-1 0,0848 0,1215 Bleed-2 0,1093 0,1508 Bleed-3 0,2043 0,278 Bleed-4 0,2373 0,501 Hari ke Jumlah antigen 100 ng 300 ng Bleed-0 0,027 0,0288 Bleed-1 0,0183 0,0393 Bleed-2 0,0235 0,0498 Bleed-3 0,056 0,1418 Bleed-4 0,0578 0,2345
Tabel 4. Data  Nilai  Absorbansi
Pembentukan Antibodi Anti  Protein  Fim-C S. typhi (Inclusion  Bodies) dengan Antigen (PBS).
Berdasarkan  hasil  ELISA,  pada sampel  antigen  (Fim-C  +  Adjuvan) Salmonella  typhi secara  signifikan pembentukan antibodi anti Fim-C 100x dan  pengenceran  antibodi  sekunder 1:5000. Ketika konsentrasi antigen 300 ng  terlihat  kenaikan  absorbansi  mulai
0,0775 - 0,501. Saat konsentrasi antigen
100  ng  secara  umum  mengalami kenaikan  absorbansi  0,0288  - 0,2373. Nilai  absorbansi  terbesar  terdapat  pada pengambilan  darah  terakhir,  yaitu  hari ke-49.  Grafik  hasil  uji  ELISA  sebagai penjelasan  dari  tabel  1  disajikan  pada gambar 3 dan 4.
Sedangkan  pada  sampel  Fim-C Salmonella  typhi dengan  antigen (Fim- C  +  PBS),  hasil  uji  ELISA  dengan variasi  konsentrasi  antigen  dari  mencit disajikan pada tabel 2.
Berdasarkan  hasil  ELISA  pada sampel  antigen  (Fim-C  +  PBS) Salmonella  typhi secara  signifikan
pembentukan antibodi anti Fim-C 100x dan  pengenceran  antibodi  sekunder 1:5000. Ketika konsentrasi antigen 300 ng,  terlihat  kenaikan  absorbansi  mulai 0,0288 - 0,2345.  Saat  konsentrasi antigen 100 ng, secara umum mengalami kenaikan absorbansi 0,027 - 0,0578. Grafik hasil uji ELISA sebagai penjelasan  dari  tabel  2.  disajikan  pada gambar 3 dan 4.
Sedangkan untuk Kelompok
Sakit  (KS1  dan  KS2)  untuk  tiap kandang,  memberikan  nilai  absorbansi yang  rendah yaitu tidak  mencapai  nilai absorbansi diatas 0,1. Hal ini dikarenakan  kelompok  sakit  tidak memiliki antibodi yang spesifik terhadap antigen Fim-C. Data disajikan
pada tabel 3 dan 4, serta gambar 3 dan 4. Telah  diketahui  pada  uji  ELISA pembentukan  warna  merupakan  hasil reaksi substrat
- Tetramethylbenzidine) dengan  enzim Horse Radish Peroksidase yang terkonjugasi  pada  antibodi  anti-IgG mouse /antibodi  sekunder. Peroksidase mengkatalisis  H 2 O 2 melalui  proses oksidasi. Benzidine dan senyawa terkait sudah dikenal oleh substrat horseradish
Hari ke Jumlah antigen 100 ng 300 ng Bleed-0 0,06 0,0215 Bleed-1 0,034 0,022 Bleed-2 0,0055 0,003 Bleed-3 0,003 0,0025 Bleed-4 0,007 0,0065 Hari ke Jumlah antigen 100 ng 300 ng Bleed-0 0,0335 0,0105 Bleed-1 0,0465 0,0365 Bleed-2 0,0095 0,0095 Bleed-3 0,002 0,0095 Bleed-4 0,0645 0,0585
peroksidase.  Reaksi  yang  terjadi  dapat menghasilkan prod uk yang mengalami kesetimbangan  dengan  kation  radikal. Penambahan
hidrogen equimolar peroksida menghasilkan diimine
kuning,  yang  merupakan  produk  stabil pada pH  asam  [11].  Warna  yang terbentuk  adalah  warna  kuning  yang terbaca  pada  panjang  gelombang  450 nm.
Proses  pembentukan  warna  pada ELISA  ini  juga  terjadi  karena  adanya interaksi  antigen  dan  antibodi.  Ikatan antibodi dengan antigen bersifat reversibel dan ikatannya berbentuk non- kovalen.  Interaksi  elektrostatik  terjadi antara  rantai  asam  amino  bermuatan, sebagai bentuk jembatan garam.
Interaksi  juga  terjadi  antara  muatan listrik  yang  mempunyai  dua  kutub berbeda,  seperti  pada  ikatan  hidrogen, atau  dapat  melibatkan  ikatan  van  der walls.
Intensitas  warna  yang  terbentuk setara  dengan  kenaikan  titer  antibodi primer,  sehingga  kenaikan  absorbansi dari hasil ELISA tersebut berarti bahwa terjadi  interaksi  antara  antigen  protein Fim-C S.  typhi dengan  antibodi  yang diproduksi  oleh  mencit. Kenaikan  titer ini sesuai dengan mekanisme pembentukan antibodi yang menyatakan bahwa  pada  saat  tubuh  terinfeksi  oleh zat  asing  atau  antigen  maka  tubuh membentuk  sel  B  memori.  Sel  ini bersifat  spesifik  terhadap  antigen,  jika antigen  yang sama  dimasukkan  secara berulang    maka  dengan  adanya  sel  B memori, tubuh akan membentuk antibodi  terhadap  antigen  tersebut. Makin  sering  antigen  dimasukkan  ke dalam tubuh, maka IgG yang terbentuk juga  semakin  banyak.  Peningkatan jumlah  IgG  ini  dideteksi menggunakan antibodi sekunder anti-IgG mouse yang tercermin  dari  meningkatnya  nilai absorbansi hasil uji ELISA. Grafik hasil
uji ELISA sebagai penjelasan dari tabel 1 sampai 4. disajikan pada gambar 4.
Gambar  3  menunjukkan  bahwa grafik  A  (kelompok  perlakuan  KP1) yang disuntikkan dengan antigen Fim-C +  Adjuvan  memberikan  hasil  yang paling  tinggi  dibandingkan  dengan kelompok  lainnya.  Adjuvan  dapat merangsang  pembentukan  antibodi  dan menjaga  protein  dari  katabolisme  yang berlangsung  begitu  cepat,  sehingga protein dapat merangsang pembentukan antibodi  spesifik.  Kelompok  perlakuan KP2  yang  disuntikan  dengan  antigen Fim-C+PBS  tetap  memberikan  nilai absorbansi  yang  cukup  pada  grafik  B. Hasil ini dapat memberikan data bahwa protein Fim-C terbukti dapat memproduksi  antibodi  spesifik  pada mencit.  Kelompok  kontrol  sakit  KS1 pada  grafik  C  dan  Kelompok  kontrol
sakit  KS2  pada  grafik  D  memberikan data  absorbansi  rendah.  Data  ini dijadikan  sebagai  kontrol  karena  tidak dapat  memproduksi  antibodi  spesifik anti Fim-C.
Gambar  4  menunjukkan  grafik perbandingan  antibodi  anti  Fim-C S.typhi dengan  konsentrasi  300  ng  dan 100  ng.  Konsentrasi  antigen  300  ng memberikan nilai absorbansi yang lebih tinggi  dibandingkan  dengan  antigen konsentrasi 100 ng. Hal ini dikarenakan pada  konsentrasi  yang  lebih  tinggi, ikatan  antara  antigen  dan  antibodi spesifik  lebih  banyak.  Sehingga  nilai absorbansi  yang  dihasilkan  semakin tinggi.  Data  tersebut  menunjukkan bahwa  induksi  oleh  antigen  (Fim- C+Adjuvan)  menunjukkan  produksi antibodi yang lebih besar dibandingkan induksi  oleh  antigen  (Fim-C+PBS), antigen (Adjuvan+PBS), dan PBS saja.
Analisis  Spesifikasi  Antibodi  Anti Protein Fim-C dengan Western Blot Analisis  menggunakan  teknik western blot bertujuan
untuk menganalisis  protein  spesifik  pada sampel dan untuk membuktikan apakah antibodi yang diproduksi secara in vivo pada  mencit  merupakan  antibodi  anti Fim-C.  Prinsip  dasar  teknik  ini  adalah melakukan  analisis  protein  dengan teknik  SDS-PAGE  ( sodium  deodecyl sulphate polyacrilamid gel ) dan didapatkan protein dengan berat
molekul berbeda terpisah pada area gel, kemudian ditransfer dari gel poliakrilamid ke membran nitroselulosa dengan  teknik  Western  Blot.  Hal  ini dibuktikan dengan antigen dan antibodi spesifik yang akan berinteraksi, ditandai dengan  warna  yang  muncul  pada membran.
Teknik Western Blot diawali oleh elektroforesis  protein  dengan  teknik
SDS-PAGE. Pembuatan
gel elektroforesis  terbagi  menjadi  2,  yaitu
separating gel d an stacking gel . Fungs i dari separating  gel adalah  sebagai media pemisahan ukuran-ukuran molekul  protein  dengan  berat  yang berbeda-beda, sehingga dihasilkan berat molekul  Fim-C  yang  berukuran  + 31 kDa.  Fungsi  dari stacking  gel adalah sebagai media penyangga untuk memasukkan  protein  kedalam well elektroforesis.
Protein pada sampel akan memiliki muatan yang sama dengan muatan SDS yang negatif sehingga bergerak menuju elektroda positif melalui jaring-jaring akrilamid. Protein yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat melewati jaring-jaring akrilamid. Perbedaan kecepatan pergerakan ini akan terlihat pada pita-pita yang tergambar pada tiap jalur.
Hasil  dari  elektroforesis  protein dengan  SDS-PAGE  memberikan  data yang menunjukkan bahwa protein Fim- C  berukuran  + 31  kDa  sesuai  dengan penelitian  sebelumnya  [4].  Untuk mendapatkan berat molekul yang tepat, diperhitungkan  dengan  marker  protein yang  berkisar  antara  (6,5  - 200  kDa). Hasil  elektroforesis  gel  protein  SDS- PAGE Ditunjukkan pada gambar 5.
Berdasarkan hasil analisis dengan teknik SDS-PAGE kemudian dilanjutkan karakterisasi protein dengan teknik Western Blot dan didapatkan pita spesifik.  Posisi  protein  antigen  pada membran  dapat  dilihat  dari  ikatan protein  antigen  dengan  antibodi  anti Fim-C S.typhi .  Setelah  melalui  tahap elektroforesis  protein  dengan  SDS- PAGE,  kemudian  dilanjutkan  pada tahap  transfer  protein  dari  gel  ke membran nitroselulose. Teknik transfer ini menggunakan larutan buffer dan arus listrik  ( electroblotting )  untuk menarik protein-protein
ke membran nitroselulosa.
Antigen Fim-C akan terikat pada membran nitroselulosa,
kemudian
antigen akan berinteraksi dengan antibodi primer yang didapatkan pertama  kali  dari  serum  mencit. Membran  diinkubasi  selama  1  jam.
Lalu,  kertas  membran  dibilas  terlebih dahulu dengan PBS,  barulah diinkubasi dengan  antibodi  sekunder.  Antibodi anti-IgG mouse yang  berikatan  dengan enzim horseradish  peroksidase (HRP) sebagai  antibodi  sekunder  ini  akan menguatkan sinyal yang dihasilkan oleh antibodi primer. Metode yang
digunakan  untuk  mendeteksi  interaksi yang terjadi adalah metode colorimetric detection . Metode ini digunakan karena substrat  DAB  ( -Diaminobenzidin Tetrahidroklorida) akan berikatan dengan enzim HRP (Horseradish
Peroksidase)  pada  antibodi  sekunder sehingga  menghasilkan  pita  yang berwarna  cokelat  pada  membran  [12]. Berdasarkan  reaksi  tersebut  dapat diketahui bahwa H 2 O 2 mengalami reaksi oksidasi  yang  dikatalisa  oleh  enzim HRP.  Proses  katalisa  HRP  melibatkan substrat  untuk  mendonorkan  elektron, sehingga substrat dapat berubah
menjadi  produk  dan  menghasilkan warna cokelat.
Gambar 8(b) menunjukkan bahwa  protein  yang  terdapat  pada  gel elektroforesis  telah  tertransfer  pada kertas  membran  nitroselulosa  sehingga
pada  proses  pewarnaan  dengan  larutan stainning tidak  terdapat  pita  protein berwarna biru.
Gambar 8(c) menunjukkan bahwa kelompok
perlakuan  1  dengan  antigen  Fim- C+adjuvan dapat dikenali oleh antibodi primer  spesifik  anti  Fim-C,  ditandai dengan  pita  hasil  western  blot  yang berwarna  cokelat  pada  ukuran  molekul + 31  kDa.  Begitupun  juga  kelompok perlakuan  dengan  antigen  Fim-C  saja. Data menunjukkan bahwa terjadi proses interaksi  antara  antigen  dan  antibodi spesifik  anti  Fim-C  yang  ditandai dengan  pita  warna  cokelat  pada membran  nitroselulose.  Hasil  Western Blot  Kelompok  Perlakuan  2  ditujukan pada gambar 9.
Gambar  10  digunakan  untuk membandingkan  kelompok  perlakuan dengan kelompok kontrol sakit. Terlihat bahwa  terdapat  perbedaan  antara  ke- empat  kelompok.  Kelompok  perlakuan terdapat  pita  garis  berwarna  cokelat
yang  menandakan  terjadinya  interaksi antigen  dan  antibodi  spesi fik.  Namun, kelompok  kontrol  sakit  tidak  memiliki pita  garis  berwarna  cokelat.  Hal  ini disebabkan  pada  kelompok  kontrol sakit,  antigen  yang  digunakan,  bukan antigen  Fim-C,  sehingga  tidak  dapat dikenali oleh antibodi primernya.
Secara keseluruhan hasil Western  Blot  menunjukkan  bahwa antibodi  anti  Fim-C  yang  dihasilkan selama produksi dapat mengenali Fim-C sebagai  antigennya.  Hal  ini  juga menunjukkan  bahwa  dalam  serum mencit  telah  dihasilkan  antibodi  anti Fim-C  sebagai  respon  imun  terhadap protein  Fim-C  yang  diinduksikan  ke mencit.

## Kesimpulan
Hasil
penelitian telah
menunjukkan antibodi anti Fim-C dapat diproduksi  secara  in  vivo  dalam  tubuh
mencit sehingga memberikan be berapa informasi  bahwa  antigen  Fim-C  yang telah  diproduksi  dapat  membangkitkan respon  imun  spesifik.  Antibodi  yang dihasilkan  juga  dapat  dikarakterisasi menggunakan  metode  ELISA  dan Western  Blot.  Metode  ELISA  telah dibuktikan dengan warna yang menunjukkan  adanya  interaksi  antara antigen Fim-C dan antibodi spesifik anti Fim-C yaitu terlihat dari kenaikan nilai absorbansi  yang  menunjukkan  antibodi anti  fim-C  yang  diproduksi  meningkat. Sementara melalui metode western blot dapat  diketahui  bahwa  antibodi  anti Fim-C telah berhasil mengenali antigen spesifiknya  yang  ditandai  dengan terbentuknya warna cokelat pada membran nitroselulosa. Penelitian ini menghasilkan antigen Fim-C dari kelompok perlakuan yang memberikan kekuatan dan
perbedaan respon imun antibodi spesifik secara  kuantitatif  dibandingkan  dengan antigen  tanpa  Fim-C  pada  kelompok kontrol sakit. Data ini lebih mendukung kesesuaian Protein Fim-C sebagai calon vaksin  yang  menjanjikan  terhadap S. typhi .

## Penghargaan
Peneliti  mengucapkan  terima kasih  terhadap  Penelitian  Strategis Nasional  2012  (DIKTI)  yang  telah
mendukung
pendanaan sehingga
penelitian ini berhasil dilakukan. Terima kasih juga  kepada  Jurusan  Kimia FMIPA  UNJ,  Jurusan  Biologi  FMIPA UNJ, serta seluruh rekan-rekan Laptiab- BPPT  Serpong  atas  kerjasama  dan bantuannya.

## Daftar Pustaka
[1] Verry.  2011. Waspada  Gejala Tifus, Segera Periksa Diri Anda! . http://www.prodiakalimantan.co m/artikel-kesehatan/100-
waspadai-gejala tifus-segera- periksakan-diri-anda.html (Diakses pada tanggal 3 Agustus pukul 21.35 WIB).
[2] Burrows, L. L. 2005. Weapons of Mass Refraction. Mol Microbiol ; 57 :878-888.
[3] Hamdani.  2013. Jenis  Vaksin . http://catatankimia.com/catatan/j enis-vaksin.html (Diakses  pada tanggal  5  Agustus  2013  pukul 21.17 WIB).
[4] Pratiwi, E., D. 2013. Subkloning dan Ekspresi Gn fim -C Salmonella typhi [Skripsi]. Jakarta  :  Fakultas  Matematika dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam,
Universitas Negeri Jakarta.
[5] Harlow,  E.,  dan  D,  Lane.  1998. Antibodies A Laboratory Manual . USA  :  Cold  Spring  Harbor Laboratory.
[6] Deutcher,  P,  M.  1990. Guide  To Protein  Purification, Methods  In Enzymology , Vol. 182.
[7] Noer, A, S., Marzuki dan Allison, W., S,. 1992. Antipeptide
Antibodies  To  The  Carboxy Terminal and the DCCD Binding Region  of  Human Mithocondrial ATP  Synthetase  Beta  Sub-Unit. Biochem, Biophys, Acta .
1099:123-130
[8] Jenings, V., M. 1995. Review of
Selected  Adjuvants  Used  In
Antibody Production, ILAR Journal ; 37, 3:119-132.
[9] Muktiningsih. 2005. Produk Gen carA Salmonella typhi Berukuran 42  kDa  yang  Dideteksi  dengan Antibodi Anti-Protein Fusi . Disertasi  Program  Pascasarjana. Bandung  :  Institut  Teknologi Bandung. [10] Sambrook,  J,  F  dan  Maniatis,  T. 1989. Molecular Cloning Laboratory Manual, Second
Edition,  Volume  3 .  USA  :  Cold Spring Harbour Laboratory Press.
[11] Josephy, P. D., Eling, T., Mason, R.  P.  1982.  The  Horseradish Peroxidase-catalyzed  Oxsidation
- Tetramethylbenzidine,
The Journal of Biological Chemistry ; 257, 7:3669-3675 [12] Andrews, AT. 1986. Electrophoresis Theory, Techniques,  Biochemical  and Clinical  Application .  Oxford  :
Clarendon press.