Optimasi  Metode  KCKT-ELSD  dengan  Pemisahan  HILIC  untuk  Penetapan  Kadar  Glukosamin  Hidroklorida pada Suplemen Kesehatan
Etik Wahyuningsih 1 , Riesta Primaharinastiti 2 , Mochammad Yuwono 2 *
1 Program Studi S2 Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
2 Departemen Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
*Corresponding author:  yuwono05@yahoo.com
Submitted: 11 Februari 2020 Accepted: 15 April 2020 Published: 30 November 2020

## Abstract
Background: The analysis of  glucosamine hydrochloride in  dietary supplements posses several  challenges due to the lack of a sufficient UV chromophore and its high polarity. Objective: To get optimized condition of high performace liquid chromatography with evaporative light scattering detector (HPLC-ELSD) using a hydrophilic interaction liquid  chromatography column  (HILIC) for the separation of glucosamine hydrochloride in  dietary supplements. Methods: The  influence  of  the  concentration  of  ammonium  formate,  mobile  phase  pH,  and composition of acetonitrile as mobile phase on chromatographic separation of glucosamine hydrochloride in the dietary supplement  were investigated in detail. ZIC-HILIC 150 x 4.6 mm, 5 µm were used as column and ELSD was  used  as  detector. Results: The  best  separation  demonstrating  symmetrical  peak  of  glucosamine  was achieved under isocratic condition using mobile phase composition of acetonitrile : water : 30 mM ammonium formate  (77  :  3:  20,  v/v/v)  at  pH  of  4.5,  column  temperature  of  35°C,    flow  rate  of  1  mL/min,  and  injection volume of 5 µL. The temperatures of nebulization and evaporation  were 50°C and 80°C, respectively, and the flow  rate  of  nitrogen  was  at  1.10  standard  liter  per  minutes  (SLM). Conclusion: The  optimized  condition  of HPLC with ELSD by using HILIC mode proved to be selective and sensitive for the separation of glucosamine hydrochloride in dietary supplements.
Keywords: HPLC-ELSD, HILIC, method optimization, glucosamine hydrochloride, dietary supplements

## Abstrak
Pendahuluan: Analisis  glukosamin  hidroklorida  dalam  suplemen  kesehatan  memiliki  beberapa  kesulitan dikarenakan  rendahnya  absorpsi  pada  daerah  UV  dan  sifat  kepolarannya  yang  tinggi. Tujuan: Mendapatkan kondisi optimum metode kromatografi cair kinerja tinggi dengan detektor hamburan cahaya evaporatif (KCKT- ELSD)  menggunakan  kolom  kromatografi  cair  interaksi  hidrofilik  (HILIC)  untuk  pemisahan  glukosamin hidroklorida  dalam  suplemen  kesehatan. Metode: Optimasi  kondisi  KCKT  dilakukan  terhadap  pengaruh konsentrasi  amonium  format,  pH  fase  gerak,  dan  komposisi  asetonitril  dalam  fase  gerak  pada  pemisahan glukosamin hidroklorida dalam suplemen makanan. ZIC-HILIC 150 x 4,6 mm, 5 μm digunakan sebagai kolom. Optimasi  kondisi  ELSD  dilakukan  terhadap  pengaruh  suhu  nebulasi  dan  evaporasi. Hasil: Pemisahan  terbaik yang menghasilkan puncak simetris dari glukosamin hidroklorida dicapai dalam kondisi isokratik menggunakan komposisi  fase gerak asetonitril :  air :  30  mM ammonium  format (77 :  3 : 20, v/v/v) pada pH 4,5, suhu kolom 35°C, laju alir fase gerak 1 mL/menit, dan volume injeksi sampel 5 μL. Suhu nebulisasi dan evaporasi berturut- turut adalah 50°C dan 80°C, dengan laju aliran nitrogen adalah 1,10 standar liter per menit (SLM). Kesimpulan: Kondisi  optimum  KCKT-ELSD  dengan  mode  HILIC  yang  diperoleh  dalam  penelitian  ini  menghasilkan kromatogram dengan puncak glukosamin hidroklorida yang simetris, dan terpisah secara selektif dan sensitif dari komponen matriks suplemen kesehatan.
Kata kunci: KCKT-ELSD, HILIC, optimasi metode, glukosamin hidroklorida, suplemen kesehatan

## PENDAHULUAN
Hydrophilic  interaction  liquid  chromatography (HILIC)  merupakan  metode  pilihan  untuk  analisis senyawa polar yang saat ini banyak digunakan. HILIC pertama  kali  diperkenalkan  pada  tahun  1990  oleh Alpert,  menggunakan  fase  gerak  campuran  pelarut organik  khususnya  asetonitril.  Secara  prinsip  model pemisahan  dilakukan  seperti  pada  kromatografi  fase normal ( Normal Phase ) yaitu dengan kolom fase diam polar  sedangkan  fase  gerak  berupa  campuran  pelarut organik  (asetonitril  60-95%)  dan  pelarut  protik  yang umumnya  adalah  air  karena  mempunyai  sifat  eluasi yang  kuat  dan  garam  mudah  menguap  seperti ammonium asetat atau amonium format (Ikegami dkk., 2008).  Beberapa  penelitian  menyatakan  bahwa  HILIC merupakan  teknik  pemisahan  yang  efektif  untuk senyawa  polar  seperti  protein,  peptida,  nukleotida  dan sediaan farmasi (Guo, 2015). Secara prinsip mekanisme kerja HILIC adalah mekanisme partisi dari analit  diantara  lapisan  air  pada  fase  diam  dan  fase gerak.  Ketebalan  lapisan  air  berbeda-beda  tergantung pada tipe kolom (Dinh dkk., 2013). Untuk analit  yang mengalami  mekanisme  partisi,  ketebalan  lapisan  air memegang peranan penting. Selain  mekanisme partisi, interaksi ion-exchange ,  ikatan  hidrogen,  ikatan  dipol- dipol dan interaksi hidrofobik juga terjadi pada HILIC. Gaya  elektrostatik  analit  pada  fase  diam  juga memegang peranan penting (Alpert, 2008). Kompleknya  mekanisme  retensi  dan  tersedianya bermacam-macam  kolom  HILIC  mengindikasikan bahwa  pengembangan  dan  optimasi  metode  tersebut sangat diperlukan, karena adanya perbedaan hidrofobilitas  kolom,  interaksi  ion  dan  perbedaan struktur kimia analit (Kawachi dkk., 2011).
Glukosamin  hidroklorida  (Gambar  1)  merupakan senyawa  yang  memiliki  polaritas  tinggi  dengan  nilai pKa  8,23  dan  log  P  sebesar  -2,175  (Megantara  dkk., 2016).  Pemilihan  HILIC  untuk  pemisahan  glukosamin hidroklorida memiliki keunggulan dibandingkan kolom fase normal dan kolom fase terbalik. Pada kromatografi cair  kinerja  tinggi  (KCKT)  kolom  fase  terbalik ( reversed  phase ),  senyawa  glukosamin  hidroklorida dengan  polaritas  yang  tinggi  tersebut  tidak  teretensi kuat  pada  fase  diam  sehingga  analisis  menjadi  sulit karena puncak analit seringkali terganggu oleh matriks sampel.  Metode  KCKT  kolom  fase  terbalik  ( reversed phase )  sebelumnya  telah  dikembangkan  dengan menggunakan mode pasangan ion ( ion pairing ) dengan fase  gerak  yang  mengandung  pereaksi  seperti  garam heksana sulfonat atau oktana sulfonat untuk
meningkatkan  retensi  (Way  dkk.,  2000).  Penggunaan mode  pasangan  ion  memiliki  beberapa  keterbatasan antara  lain  mahalnya  pereaksi  pasangan  ion  dan  dapat mengurangi daya tahan kolom serta dibutuhkan  waktu ekuilibrasi yang relatif lama.
Gambar 1. Struktur kimia glukosamin hidroklorida
Ditinjau  dari  struktur  kimianya,  glukosamin hidroklorida  merupakan  gula  amino  yang  memiliki serapan  lemah  pada  daerah  ultraviolet/visual  (UV- VIS).  Metode  analisis  yang  secara  umum  digunakan untuk  analisis  glukosamin  hidroklorida  adalah  KCKT dengan  detektor  UV.  Masalah  yang  timbul  pada penggunaan  detektor  UV  adalah  deteksi  glukosamin hidroklorida  yang  rendah  sehingga  harus  dilakukan derivatisasi  lebih  dahulu  dengan  penambahan  pereaksi tertentu sebelum dilakukan analisis, sehingga memerlukan waktu yang lebih lama. Detektor lain yang dapat digunakan untuk pemisahan glukosamin hidroklorida  adalah  indeks  bias  refraktif  (RID),  tetapi sensitivitas  RID  lebih  rendah  dibandingkan  ELSD. Selain itu, detektor lain yang kurang umum digunakan untuk  analisis  rutin  dalam  laboratorium  pengujian adalah corona  charged  aerosol  detector (cCAD) (Chhavi dkk., 2019). Analisis glukosamin pada sediaan suplemen  dengan  kolom  ZIC-HILIC  metode  UPLC- QToF-MS juga dilaporkan (Zheng dkk., 2017), namun instrumen  tersebut  mahal  dan  butuh  keahlian  khusus dalam operasional instrumen.
Pada  penelitian  ini  dilakukan  pengembangan  dan optimasi  metode  KCKT  detektor  ELSD  mode  HILIC untuk  analisis  glukosamin  hidroklorida  pada  sediaan suplemen  kesehatan  sehingga  komponen  lain  dalam matriks  sampel  dapat  terpisah  dan  tidak  mengganggu selama proses analisis.

## BAHAN DAN METODE Bahan
Standar  glukosamin  HCl  (USP,  US/Canada), sampel  suplemen  kesehatan  diperoleh  dari  apotek  di Surabaya, amonium format (Sigma-Aldrich), asetonitril HPLC  grade  (Mallinckrodt),  air  HPLC  grade  (Merck, US/Canada),  asam  klorida  (Merck,  US/Canada),  asam format (Merck, US/Canada).

## Alat
Instrumen  KCKT  yang  digunakan  adalah  Agilent 1100 series HPLC dengan detektor ELSD Agilent 380 dan pemisahan zwitterion hydrophilic interaction liquid chromatography (ZIC-HILIC) column ukuran pori 200 Å  (SeQuant  ZIC-HILIC,  150  mm  x  4.6  mmx  5  µm, Merck  Millipore,  VIC,  Australia), ultrasonic  bath (Elma Transsonic TI-H-25).

## Metode

## Pembuatan larutan baku induk
Stok  larutan  standar  adalah  larutan  standar glukosamin  hidroklorida  pada  kosentrasi  1000  µg/mL yang  disiapkan  dari  10,0  mg  standar  glukosamin hidroklorida (99%) yang dilarutkan dalam air (v/v) dan dicukupkan sampai 10,0 mL dalam labu ukur.

## Preparasi sampel
Sebanyak  20  tablet  suplemen  kesehatan  yang mengandung 500 mg glukosamin hidroklorida ditentukan  keseragaman  bobotnya  kemudian  digerus hingga halus. Ditimbang seksama 200 mg sampel yang
telah  dihaluskan,  dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur 50  mL, ditambahkan air  hingga garis tanda, kemudian disonikasi  selama  20  menit  dan  disaring  dengan penyaring  membran  nilon 0,45 µm dan disuntikkan ke dalam sistem KCKT.

## Optimasi kondisi
Metode pengembangan menggunakan dapar   5, 20 atau 30 mM amonium format dilakukan pada berbagai pH 4,0, 4,5 and 6,0 (fase gerak A), air HPLC 3% (fase gerak  B)  dan  berbagai  komposisi  asetonitril  (60%, 62%, 5%, 72,5 % and 77 %) (fase gerak C). Fase gerak kemudian disaring dengan Millipore vacuum menggunakan  filter  0,45  µm  and  disonikasi  selama 10  menit  sebelum  digunakan.  Kondisi  ELSD  adalah temperatur  nebulasi  diatur  pada  50°C,  temperatur evaporasi  diatur  pada  80°C  dengan  laju  alir  gas nitrogen  sebesar  1,10  standar  liter  per  menrit  (SLM). Optimasi  kondisi  analisis  glukosamin  hidroklorida dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 . Optimasi kondisi pada analisis glukosamin hidroklorida Kondisi I II III IV Konsentrasi asetonitril 60% 62,5% 72,5 % 77% pH 4,0 4,5 6,0 - Konsentrasi dapar 5 mM 20 mM 30 mM -

## HASIL DAN PEMBAHASAN Optimasi komposisi asetonitril
Asetonitril  direkomendasikan  sebagai  pelarut organik  pada  HILIC,  karena  memiliki  kemampuan membentuk  ikatan  hidrogen  dan  mudah  menguap. Pengaruh  perbedaan  komposisi  asetonitril  terhadap pemisahan, waktu retensi  dan area puncak glukosamin hidroklorida tersaji pada Gambar 2. Pada penelitian ini dilakukan  variasi  komposisi  asetonitril  dari  60  -  77% (Gambar 2 A, B, C, D). Ketika asetonitril diubah pada kosentrasi  60%,  62,5%,  dan  72,5%,  area  puncak glukosamin hidroklorida terlihat melebar (Gambar 2 A, B,  C).  Ketika  komposisi  asetonitril  ditingkatkan  77%, maka resolusi juga meningkat (Gambar 2.D).
Penambahan  persentase  air  pada  fase  gerak  akan meningkatkan  waktu  retensi,  namun  menurunkan resolusi  (Gambar  2).  Air  membentuk  lapisan pseudo- stationary pada  fase  polar  kolom  ZIC-HILIC (Sentkowska  dkk.,  2013),  sehingga  air  merupakan bagian  penting  pada  HILIC  dan  diperlukan  minimal 2%  dari  volume  fase  gerak  (Lifford  dkk.,  2009). Glukosamin  hidroklorida  merupakan  senyawa  polar dan teretensi pada lapisan pseudo-stationary yang kaya akan  air.  Penurunan  komposisi  asetonitril  dari  80%  -
65%  memberikan  interaksi  yang  lemah  pada  lapisan pseudo-stationary, sehingga menurunkan waktu retensi glukosamin (Hao dkk., 2008).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa komposisi  asetonitril  77%,  3%  air  dan  20%  amonium format  30  mM  memberikan  hasil  yang  optimum (Gambar  2  D)  dengan  resolusi  >  1,5.  Dibandingkan dengan  metode  analisis  glukosamin  hidroklorida  pada sediaan  suplemen  dengan  fase  gerak  metanol  dengan penambahan  pereaksi  pasangan  ion  garam  oktana sulfonat  (Way  dkk.,  2000),  metode  pemisahan  HILIC dalam  penelitian  ini  memiliki  keunggulan  tidak diperlukannya  pereaksi  pasangan  ion  sehingga  dapat meningkatkan daya tahan kolom, hasil pemisahan yang lebih  baik dengan resolusi > 1,5  dan dapat  mengatasi interferensi  komponen  matrik  sampel  (Gambar  3). Dibandingkan  dengan  metode  derivatisasi  dengan Phenylisothiocyanate dengan  fase gerak  metanol  asam fosfat  pada  analisis  glukosamin  hidroklorida  pada sediaan  suplemen  (David  dkk.,  2005)  dan  metode capillary  electrophoretic (CE)  dengan  derivatisasi menggunakan o-phtalaldehyde (Shigeki  &  Takao, 2012),  metode  pemisahan  HILIC  menghasilkan resolusi yang baik tanpa derivatisasi.
Gambar 2. Pengaruh komposisi asetonitril pada penetapan kadar glukosamin hidroklorida menggunakan ZIC HILIC column (150, 4,6 mm), 200 Å 5 µm, fase gerak berbagai komposisi asetonitril (pada kromatogram), 30 mM amonium format 77%, Air 3%, pH 4,5; temperatur kolom 35°C, detektor ELSD, flow rate 1 mL/menit, volume injeksi 5 µL
Gambar 3. Kromatogram standar glukosamin hidroklorida (A) dan sampel (B) pada fase gerak asetonitril : air : amonium format 30 mM (77 : 3 : 20, v/v/v), pH 4,5, temperatur kolom 35°C, detektor ELSD, flow rate 1 mL/menit, volume injeksi 5 µL

## Optimasi pH dapar
Pengaruh  pH  dapar  pada  penelitian  ini  dilakukan pada  rentang  pH  4  -  6.  Pada  dapar  pH  =  4,  resolusi menurun  dan  puncak  melebar  (Gambar  4  A),  namun jika  pH  ditingkatkan  menjadi  6,  maka  tidak  muncul puncak  glukosamin  hidroklorida  walaupun  waktu analisis  diperpanjang  sampai  30  menit.  Hal  ini disebabkan  oleh  retensi  yang  lebih  lama  pada  kolom (Gambar 4 B). Resolusi optimum diperoleh pada dapar
pH = 4,5 (Gambar 4 C). Analit yang mudah terionisasi, waktu retensi dipengaruhi oleh pH (Hana dkk., 2014). Analit  bermuatan  lebih  hidrofilik  dan  lebih  teretensi dalam teknik pemisahan HILIC. Glukosamin hidroklorida  memiliki  nilai pKa sebesar 8,23 sehingga dengan  peningkatan  pH  dapar  (pH  4  –  6)  glukosamin hidroklorida  bermuatan  positif  dan  akan  terjadi interaksi  elektrostatik  dengan  fase  diam  pada  HILIC yang  berakibat  meningkatkan  retensi.  pH  dapar  juga
mempengaruhi muatan pada fase diam dimana pH > 5, silanol akan terdeprotonasi, sehingga permukaan silika
bermuatan  negatif  dan  menyebabkan  analit  dengan muatan positif teretensi lebih lama.
Gambar 4. Pengaruh pH pada pemisahan glukosamin hidroklorida menggunakan ZIC HILIC column (150, 4,6 mm), 200 Å 5µm, berbagai  pH (pada kromatogram), fase gerak asetonitril : air : amonium format 30 mM (77 : 3 : 20, v/v/v), temperatur kolom 35°C, detektor ELSD, flow rate 1 mL/menit, volume injeksi 5 µL

## Optimasi komposisi amonium format
Pada  penelitian  ini  diamati  pengaruh  amonium format terhadap proses pemisahan glukosamin hidroklorida.  Konsentrasi  yang  digunakan  adalah  5  – 30 mM (Gambar 5).
Pada  konsentrasi  amonium  format  5  mM  area puncak  glukosamin  hidroklorida  tidak  tampak,  karena glukosamin  hidroklorida  teretensi  lebih  lama  pada kolom  (Gambar  5  B).  Ketika  konsentrasi  amonium format  ditingkatkan  menjadi  20  mM,  resolusi
meningkat dan waktu retensi lebih lama (20,31 menit). Pada peningkatan konsentrasi amonium format menjadi 30  mM,  waktu  retensi  lebih  singkat  yaitu  18,53  menit (Gambar  5  C).  Untuk  menentukan  konsentrasi  dapar dengan kondisi terpilih dilakukan penyuntikan masing- masing 6 kali pada penggunaan dapar amonium format 20  mM  dan  30  mM  dengan  kondisi  terpilih  pada kosentrasi 600 µg/mL. Hasil dapat dilihat pada Tabel 2 dan Tabel 3.
Gambar 5. Pengaruh komposisi amonium format pada pemisahan glukosamin hidroklorida menggunakan ZIC HILIC column (150, 4,6 mm), 200 Å 5 µm, berbagai komposisi amonium format (pada kromatogram), fase gerak asetonitril : air : amonium format 30 mM (77 : 3 : 20, v/v/v), pH 4,5; temperatur kolom 35°C, detektor ELSD, flow rate 1 mL/menit, volume injeksi 5 µL
Tabel 2. Harga Rt, area, Theoritical Plate (N), resolusi (Rs), selektivitas (α) dan symmetry pada kosentrasi dapar amonium format 20 mM Rep Glukosamin hidroklorida Amonium format 20 mM Rt (menit) Area N Rs > 1.5 α > 1 Tf ≤ 2.0 1 20,23 3669 8195 10,70 1,57 0,53 2 20,24 3747 9355 11,38 1,57 0,55 3 20,26 3678 9617 12,02 1,57 0,47 4 20,24 3631 9519 11,88 1,57 0,48 5 20,24 3714 9471 10,96 1,57 0,49 6 20,24 3757 9255 10,98 1,57 0,50 Mean 20,24 3699,33 - - - - SD 0,01 48,70 - - - - RSD 0,05 1,32 - - - -
Tabel 3. Harga Rt, area, Theoritical Plate (N), resolusi (Rs), selektivitas (α) dan symmetry pada kosentrasi dapar amonium format 30 mM Rep Glukosamin hidroklorida Amonium format 30 mM Rt (menit) Area N Rs > 1.5 α > 1 Tf ≤ 2.0 1 18,66 4023 7455 12,05 1,61 0,73 2 18,57 4115 8152 11,73 1,60 0,60 3 18,53 4039 8771 12,29 1,60 0,64 4 18,48 4149 7297 11,50 1,60 0,70 5 18,35 4109 6861 11,00 1,61 0,73 6 18,42 4123 7198 11,86 1,60 0,60 Mean 18,50 4093,00 - - - - SD 0,11 50,18 - - - - RSD 0,59 1,23 - - - -
Pengaruh  kosentrasi  dapar  dalam  fase  gerak  pada kosentrasi 20 mM dan 30 mM memberikan nilai faktor selektivitas (α) > 1 , resolusi  (Rs) > 1,5 dan bilangan lempeng  teoritis  (N)  >  2000.  Dapar  pada  HILIC berperan  sangat  penting  untuk  menurunkan  interaksi elektrostatik antara analit  yang  bermuatan dengan  fase diam. Peningkatan konsentrasi dapar akan menurunkan retensi  analit  yang  bermuatan  berlawanan  dengan muatan  pada  fase  diam  (Dinh  dkk.,  2013).  Fenomena tersebut  dapat  diamati  dari  retensi  glukosamin hidroklorida  yang  menurun  dengan  meningkatnya konsentrasi  dapar.  Peningkatan  konsentrasi  amonium format  tidak  dilakukan,  karena  larutan  dapar  akan berinteraksi  dengan  gugus  sulfonat  pada  fase  diam sehingga mengurangi usia kolom.
Waktu  retensi  pada  penggunaan  dapar  30  mM lebih  singkat  rata-rata  18,50  menit  dengan  nilai  RSD 0,59%  sedangkan  pada  pemakaian  dapar  20  mM diperoleh  waktu  retensi  rata-rata  20,24  menit  dengan nilai RSD 0,05%. Area puncak analit pada penggunaan dapar  30  mM  memberikan  hasil  yang  lebih  tinggi dengan rata-rata 4093 dan nilai RSD 1,23%, sedangkan pada  penggunaan  dapar  20  mM  area  puncak  yang diperoleh rata-rata 3699,33 dengan nilai RSD 1,32%.
Dibandingkan dengan metode KCKT menggunakan detektor  corona  charged  aerosol detector (cCAD) kolom ZIC-HILIC dengan komposisi asetonitril  65%  dan  35%  amonium  asetat  100  mM (Chhavi  dkk.,  2019),  pada  metode  KCKT-ELSD dengan  kolom  ZIC-HILIC  menggunakan  dapar amonium  format  30  mM  20%  menghasilkan  resolusi yang  baik.  Pada  pemakaian  dapar  amonium  asetat 100  mM,  konsentrasi  yang  tinggi  dapat  berinteraksi dengan  gugus  sulfonat  pada  fase  diam  yang  dapat mengurangi daya tahan kolom.
Suhu  kolom,  laju  alir  fase  gerak,  kondisi  ELSD antara  lain  suhu  nebulasi  dan  evaporasi  serta  laju  alir gas  nitrogen  mempengaruhi  resolusi  dan  mekanisme retensi  dari  analit  sehingga  perlu  dilakukan  optimasi lebih  lanjut.  Pada  kondisi  ELSD,  suhu  nebulisasi  dan ukuran  tetesan  aerosol  (berkisar  antara  4  hingga 40  µm)  mempengaruhi  respons  detector  (Lafosse  & Herbreteau, 2002). Pembentukan aerosol membutuhkan  gas  inert  sebagai  contoh  nitrogen, helium atau argon. Laju alir gas mempengaruhi ukuran tetesan  ( droplet )  yang  terbentuk  pada  saat  nebulasi. Aliran gas yang tinggi akan menghasilkan droplet yang kecil dan penguapan akan lebih mudah, namun droplet
yang  terlalu  kecil  memiliki  efektifitas  yang  rendah terhadap  hamburan  cahaya  sehingga  menghasilkan respon  yang  rendah  (Laksmi  dkk.,  2012).  Optimasi kondisi  ELSD  pada  analisis 2-Deoxy  D-Glucose dengan HILIC pada suhu drift tube 30 - 50°C dan laju alir nitrogen 1,5 – 2,5 mL/menit telah dilaporkan. Hasil yang  optimum  diperoleh  pada  laju  alir  nitrogen 1,5  mL/menit  dan  suhu drift  tube 30°C.  Peningkatan laju  alir  nitrogen  lebih  besar  dari  2,0  mL/menit menurunkan respon detektor (Laksmi dkk., 2012). Pada analisis karbohidrat, optimasi kondisi ELSD dilakukan pada  suhu  nebulasi  antara  70°C  -  85°C,  suhu evaporator  antara  85°C  -  100°C  dan  laju  alir  nirogen antara 0,6 - 1,2 SLM. Kondisi optimum diperoleh pada suhu  nebulizer  88,8°C,  suhu  evaporator  77,9°C  dan laju alir nitrogen sebesar 1,1 SLM (Luis dkk., 2015).
Pengaturan  suhu  evaporasi  ditujukan  untuk menguapkan  fase  gerak.  Beberapa  contoh  fase  gerak yang  dapat  digunakan  adalah  TFA  ( triflouro  acetic acid ),  amonium  format,  amonium  asetat,  asam  asetat, amonium  karbonat  dan  amonium  hidroksida  (Lucena dkk.,  2007). Pada analisis glukosamin dan karbohidrat dengan  detektor  ELSD  secara  umum  fase  gerak  yang sering  digunakan  adalah  amonium  format  dan amonium asetat (Hubert dkk., 2010).

## KESIMPULAN
Metode  KCKT-ELSD  dengan  mode  pemisahan Hydrophilic  interaction  liquid  chromatography untuk analisis glukosamin hidroklorida pada sediaan suplemen  kesehatan  didapatkan  kondisi  optimum dengan      penggunaan  kolom    ZIC  HILIC  (150, 4,6  mm), 200  Å 5  µm,  fase gerak asetonitril : 30  mM amonium  format  :  air  (77  :  20  :  3,  v/v/v)  secara isokratik, temperatur kolom 35°C, pH 4,5, laju alir fase gerak 1 mL/menit, volume injeksi 5 µL dengan kondisi detektor  ELSD  suhu  nebulasi  dan  evaporator  50°C  : 80°C, flow rate Nitrogen 1,10 SLM.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Unit Layanan  Pengujian  dan  Departemen  Kimia  Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Airlangga atas dukungan sarana.

## DAFTAR PUSTAKA
Alpert, A. J. (2008). Electrostatic Repultion
Hydrophylic  Interaction  Chromatography  for
Isocratic  Separation  of  Charged  Solutes  and
Selective Isolation of Phosphopeptide.
Analytical Chemistry ; 80; 62-77.
Chhavi, A., Gregory, M. P, Mandhur, S. & Rahul, P. P. (2019). Development and Validation of a Novel High  Performance  Liquid  Chromatography- Coupled with Corona Charged Aerosol Detector Method  for  Quantification  of  Glucosamine  in Dietary Supplements. PLosOne; 14; 1-20 . David, J., Lingjun, Z., Jianhai, C. & Emily, P. (2005). Precolumn Derivatization Liquid
Chromatography  Method  for  Analysis  of Dietary  Supplements  for  Glucosamine:  Single Laboratory  Validation  Study. Journal  of  AOAC International; 88; 413-417.
Dinh,  N.  P.,  Jonsson,  T.  &  Irgum,  K.  (2013).  Water Uptake  on  Polar  Stationary  Phases  Under
Conditions for Hydrophilic Interaction
Chromatography  and  Its  Relation  to  Solute Retention. Journal of Chromatography A; 1320; 33-47.
Guo,  Y.  (2015).  Recent  Progress  in  the  Fundamental Understanding of Hydrophilic Interaction Chromatography  (HILIC). Analyst;  140; 6652- 6466.
Hana, V., Katerina, J., Katerina, S., Helena, T., Petr, S. &  Lucie,  N.  (2014).  Study  of  the  Retention Behavior of Small Polar Molecules on Different Types of Stationary Phases Used in Hydrophilic Interaction  Liquid  Chromatography. Journal  of Separation Science; 37; 1-11.
Hao,  Z.,  Xiao,  B.  &  Weng,  N.  (2008).  Impact  of Column Temperature and Mobile Phase
Components  on  Selectivity  of  Hydrophilic Interaction  Chromatography  (HILIC Journal  of Separation Science; 31; 1449-1464.
Hubert,  C.,  Hovan,  S.,  Locamte,  F.,  Houbart,  V., Deeby,  C.  D.,  Fillet,  M.  &  Piel,  G.  (2010). Development  &  Validation  of  a  Sensitive  Solid Phase  Extraction/HILIC/MS  Method  for  the Accurate  of  Glucosamine  in  Dog  Plasma. Journal  of  Chromatography  A;  1217; 3275- 3281.
Ikegami, T., Tomomatsu, K., Takubo, H., Horie, K.  &
Tanaka,  N.  (2008).  Separation  Efficiencies  in Hydrophilic Interaction Chromatography. Journal of Chromatography A ; 1184 ; 474–503. Kawachi,  Y.,  Ikagemi,  T.,  Tokubo,  H.,  Ikagemi,  Y., Muyamoto, M. & Tanaka, N. (2011).
Chromatographic Caracterization of Hydrophilic Interaction  Liquid  Chromatography  Stationary
Phase:  Hydrophilicity, Charge Effect, Structural Selectivity  and  Separation  Effeciency. Journal of Chromatography A; 1218; 5903-5919.
Lafosse,  M.  &  Herbreteau,  B.  (2002).  Carbohydrate Analysis  by  LC  and  SFC  Using  Evaporative
Light Scattering Detection. Journal of
Chromatography; 66; 1101–1134.
Laksmi,  N.  C.,  Subrahmanyam,  D.  &  Dubey,  P.  K.
(2012).  A  Novel  LC-ELSD  Method  for  the Quantification  of  2-Deoxy  D-glucose  Using HILIC  Chromatoghraphy. Schoolar  Research Library; 4; 591-598.
Lifford,  R.  M.,  Ye,  B.,  Nancy,  J.  B.  &  Shuhong,  Z.
(2009).  Comparison  of  the  Sensitivy  of Evaporative  Universal  Detector  and  LC/MS  in the HILIC and the Reversed-phase HPLC Mode.
Journal of Chromatography B; 877; 4133-4139. Lucena,  R.,  Cárdenas,  S.  &  Valcárcel,  M.  (2007).
Evaporative  Light  Scattering  Detection:  Trends in Its Analytical Uses. Analytical and Bioanalytical Chemistry; 388; 1663–1672.
Luis, C,  H., Elena, P.  L.  &  Pilar, R. (2015). Improved Evaporative  Light  Scattering  Detection  for Carbohydrate  Analysis. Food  chemistry;  180;
265-271.
Megantara,  S.,  Mutakin,  M.  &  Levita,  J.  (2016).
Prediction  of  Log  P  and  Spectrum  Quersetin,
Glucosamine  and  Andrographolide  and  Its Corellation with Laboratory Analysis. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science; 8; 33-37.
Sentkowska  A.,  Biesaga  M.  &  Pyrzynska  K.  (2013). Effects  of  the  Operation  Parameters  on  HILIC Separation  of  Flavonoids  on  Zwitterionic Column. Talanta; 115; 284-90.
Shigeki,  A.  &  Takao,  A.  (2012).  Development  of  a Simple  Capillary  Electrophoretic  Determination of  Glucosamine  in  Nutritional  Supplements Using  In-Capillary  Derivatisation  with O- Phthalaldehyde . Food  chemistry;  130; 1137- 1141.
Way,  W.  K,  Gibson,  K.  G.  &  Breite,  A.  G.  (2000). Determination  Glucosamine in  Nutritional Supplement  by  RP-ion  Pair  HPLC. Journal Liquid  Chromatography  &  Real  Technology; 23; 2861-2871.
Zheng, L., Kim, M., Han, P.  &  Quigley, C. L. (2017).
Determination Glucosamine in Food Supplement by HILIC-ESI-MS. Europan
Pharmaceutical Review; 22; 62-65.