Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Sirsak ( Annona muricata Linn.) terhadap Peningkatan Jumlah Sel T CD4 + dan CD8 + pada Timus Mencit (Mus musculus)
Linda K. Dewi, Sri Widyarti, Muhaimin Rifa’i
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang Corresponding author : rifa123@ub.ac.id

## ABSTRAK
Imunomodulator  merupakan  suatu  senyawa  yang  dapat  mempengaruhi  sistem  imun  humoral  maupun  seluler.  Daun  sirsak ( Annona  muricata )  banyak  dikenal  sebagai  tanaman  berkhasiat  obat  karena  mempunyai  senyawa-senyawa  aktif  yang berperan  sebagai  agen  imunomodulator.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mengetahui  pengaruh  ekstrak  etanol  daun  sirsak terhadap  peningkatan  jumlah  sel  T  CD4 + dan  CD8 + pada  timus  mencit. . Daun  sirsak  diekstrak  dengan  metode  maserasi menggunakan etanol 95%.  Ekstrak etanol daun  sirsak dilarutkan dengan NaCMC 0.5%,  diberikan pada  mencit secara  oral selama  2  minggu  dengan  dosis  0,  25,  50,  dan  100  mg/kg  BB.  Sel  limfosit  diisolasi  dari  timus  dan  dilakukan  perhitungan jumlah absolut sel dengan Haemocytometer dan sel T yang mengekspresikan  CD4 + dan CD8 + menggunakan flowcytometry. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pemberian  ekstrak  etanol  daun  sirsak  dapat  meningkatkan  jumlah  sel  T  CD4 + dan CD8 + pada timus secara signifikan (p<0.05) pada dosis 25 mg/kg BB. Sel T CD4 + mengalami peningkatan sebesar 75% (3.6 juta sel) dan sel T CD8 + mengalami peningkatan sebesar 238% (3.1 juta sel).
Kata kunci : ekstrak etanol, daun sirsak, sel T CD4 + , sel T CD8 +

## ABSTRACT
Immunomodulator is a substance that can affect the humoral and cellular immune systems. Leaf of soursop ( Annona muricata ) is widely known as medicinal plants because it’s active compounds that act as immunomodulatory agents. This study aimed to determine the effect of ethanol extract of soursop leaf to the number of T cells CD4 + and CD8 + . Soursop leaves were extracted by  maceration  using  ethanol  95%  for  3x24  hours  and  dried  with  rotatory  evaporator.  The  extract  was  diluted  with  NaCMC 0.5%. Ethanol extract of soursop leaves is administrated to mice orally for 2 weeks at a dose of 0, 25 mg, 50 and 100 mg/kg BW. Thymocytes were isolated and calculated by flowcytometry and haemocytometry . The results showed that ethanol extract of soursop leaf can increase the number of CD4 + T and CD8 + T cells significantly (p <0.05) at a dose of 25 mg/kg BW. CD4 + T cells increased by 75% (3.6 million cells) and CD8 + T cells increased by 238% (3.1 million cells).
Keywords : ethanol extract, soursop leaf, CD4 + T cells, CD8 + T

## PENDAHULUAN
Aktivasi  sistem  imun  diperlukan  untuk  membantu tubuh terhadap bahan-bahan antigenik. Aktivasi sistem imun dapat distimulasi menggunakan imunomodulator [1].  Imunomodulator  adalah  substansi  atau  agen  yang dapat  membantu  memperbaiki  fungsi  sistem  imun terganggu.    Agen  imunomodulator  berpengaruh terhadap perkembangan dan aktivasi sel T [2].
Bahan  aktif  dari  tanaman  diduga  mempunyai kemampuan  sebagai  agen  imunomodulator  untuk terapi  beberapa  penyakit  seperti  kanker  dan  diabetes. Salah satu tanaman yang digunakan masyarakat untuk terapi adalah daun sirsak. Namun demikian, mekanisme  daun  sirsak  sebagai  imunomodulator belum  pernah  dikaji.  Ekstrak  etanol  daun  sirsak mengandung  senyawa  flavonoid  dari  golongan flavonol  [3,  4].  Flavonol  merupakan  ko-pigmen  yang banyak  tersebar  luas  di  bagian  daun  [5].  Flavonol berpotensi  sebagai  imunostimulan  karena  mampu meningkatkan  produksi  IL-2  yang  terlibat  dalam
aktivasi  dan  proliferasi  sel  T  [6].  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  ekstrak  etanol daun  sirsak  terhadap  peningkatan  jumlah  sel  T  CD4 + dan CD8 + pada timus mencit.

## METODE PENELITIAN

## Hewan coba
Hewan  coba  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  mencit  ( Mus  muculus) galur  Swiss,  umur  8 minggu, berat 20-25 g, dalam keadaan sehat dan tidak ada  kelainan  anatomis.  Penggunaan  hewan  coba  telah mendapatkan sertifikat Laik Etik No. 95-KEP-UB dari Komite Laik Etik Universitas Brawijaya Malang.

## Tempat penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  di Laboratorium Fisiologi Hewan, Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam,  dan Laboratorium Biomedik, Fakultas Kedokteran,
Universitas Brawijaya, Malang.

## Antibodi
Antibodi  yang  digunakan  adalah  FITC  Rat  Anti- Mouse  CD4  Clone  GK  1-5  (BD  Pharmigen™)  dan FITC  Rat  Anti-Mouse  CD8  Clone  S3-67  (BD Pharmigen™).

## Ekstraksi Daun Sirsak
Daun sirsak dicuci bersih, dikeringkan, dihaluskan dengan  blender,  dimaserasi  menggunakan  etanol  95% (1:3), dan didiamkan 3x24 jam pada suhu kamar. Hasil maserasi  diuapkan  dengan    rotatori  evaporator  pada suhu  50-60°C.  Hasil  yang  didapatkan  dilarutkan dengan NaCMC 0,5% [7].

## Isolasi Organ Limfoid
Mencit  dibunuh  dengan  cara  dislokasi  leher, dibedah untuk pengambilan timus. Homogenat timosit dipindahkan  ke  dalam tube dan  disentrifugasi  2500 rpm, suhu 4°C selama 5 menit. Pelet hasil sentrifugasi diresuspensi  dengan  1  ml  PBS  steril  dan  digunakan untuk  analisa  menggunakan Haemocytometer dan Flowcytometry.

## Perhitungan Jumlah Absolut Sel Limfosit
Suspensi pelet timosit sebanyak 20 μl ditambah 80 μl tryphan blue dan dihitung menggunakan haemocytometer untuk  mendapatkan    jumlah  absolut sel.
Perhitungan Jumlah Sel T CD4 + dan CD8 +
Pelet  timosit  diresuspensi  dengan  50  µl  antibodi (1:50) dalam  PBS  steril,  kemudian  dipindah  ke dalam kuvet  dan dipasang  pada nozzle  flowcytometer ( BD FACS  Calibur TM ) . Dilakukan setting pada  komputer dengan  software BD  Cell  Quest  Pro TM dan  dilakukan koneksi dengan flowcytometer ( acquiring mode ).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Jumlah Relatif Sel T CD4 + dan CD8 + pada Timus Analisis jumlah relatif sel T CD4 + dan CD8 + pada penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh pemberian  ekstrak  etanol  daun  sirsak  terhadap peningkatan sel  T  CD4 + dan  CD8 + .  Selain itu, jumlah relatif  ini  juga  dipakai  untuk  memperkirakan  kondisi mencit setelah perlakukan berdasarkan karakter sistem imunnya.
Jumlah  sel T  CD4 + dan  CD8 + menunjukkan  bahwa persentase  jumlah  relatif  sel  CD4 + lebih  tinggi  jika dibandingkan dengan sel CD8 + ( Gambar 1 dan 2). Hal ini  menunjukkan  bahwa  mencit  yang  mendapat perlakuan ekstrak etanol daun sirsak secara oral dalam kondisi sehat.
Gambar  1.  Hasil  analisa flowcytometry menunjukkan persentase  jumlah  relatif  sel  T  CD4 + dan  CD8 + pada timus (K= Kontrol, P1= 25 mg/kg BB, P2= 50 mg/kg BB, P3= 100 mg/kg BB).
Gambar  2. Jumlah relatif sel  T  CD4 + dan CD8 + pada  timus mencit  setelah  pemberian  ekstrak  etanol  daun sirsak selama 2 minggu secara oral.
Jumlah Absolut Sel CD4 + dan CD8 + pada Timus Sel  T CD4 + dan CD8 + merupakan subset dari sel T yang mengalami pematangan di organ timus. Jumlah absolut  sel  T  CD4 + dan  CD8 + pada  timus  mengalami peningkatan  secara  signifikan  (p<0.05)  pada  dosis  25 mg/kg  BB  (Gambar  3).  Sel  T  CD4 + mengalami peningkatan sebesar 75% (3.6 juta sel) dan Sel T CD8 + mengalami peningkatan sebesar 238% (3.1 juta sel).
Gambar  3.  Jumlah  absolut  sel  T  CD4 + dan  CD8 + timus mencit  setelah  pemberian  ekstrak  etanol  daun sirsak secara oral selama 2 minggu.
Peningkatan  jumlah  sel  T  CD4 + dan  CD8 + tersebut  mengindikasikan  bahwa  senyawa  yang terkandung  dalam  ekstrak  etanol  daun  sirsak  bersifat imunostimulan.  Hal  ini  diduga  senyawa  flavonol bersifat  dalam  daun  sirsak  menstimulasi  peningkatan sintesis  IL-2  sehingga  terjadi  aktivasi  dan  proliferasi sel T [6].
Senyawa-senyawa  flavonol  glikosida  merupakan glikoprotein  asal  tanaman  yang  bersifat  mitogenik. Mitogen  adalah  substansi  yang  menginduksi  mitosis sel. Mitogen menginduksi timosit untuk meningkatkan transkripsi  interferon-γ  (IFN-  γ)  dan tumor  growth factor -β  (TGF-  β).  Induksi  transkripsi  IFN-  γ  dan TGF-  β  akan  meningkatkan  ekspresi  reseptor  sel  T (TCR)  yang  matang  [8].  Senyawa  mitogenik  juga menginduksi  sintesis  IL-2.  Sel  T  yang  terpapar mitogen  akan  meningkatkan  ekspresi  mRNA  IL-2 dalam  waktu  4  jam  dan  mencapai  puncaknya  setelah 12  jam.  Selanjutnya,  IL-2  akan  menstimulasi proliferasi sel T [1].
Mekanisme  kerja  CD4 + sebagai  modulasi  sistem imun  jangka  panjang  antara  lain  melalui  aktivasi  dari beberapa sitokin yang mampu memfasilitasi perkembangan  dan  pematangan  sel  T  CD8 + .  Sitokin tersebut  antara  lain  IL-1,  IL-2 dan  IFN  γ [9]. Peningkatan sel T CD4 + berpengaruh terhadap aktivasi sel T CD8+. Respon CD8+ ini akan semakin aktif dan fungsinya  lebih  optimal  dengan  adanya  berbagai sitokin yang dilepaskan oleh sel T CD4 + [10].

## KESIMPULAN
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pemberian ekstrak  etanol  daun  sirsak  ( Annona  muricata )  dapat meningkatkan jumlah sel T CD4 + dan CD8 + pada timus secara  signifikan  (p<0.05)  pada  dosis  25  mg/kg  BB. Sel  T  CD4 + mengalami  peningkatan  sebesar  75%  (3.6 juta  sel)  dan  sel  T  CD8 + mengalami  peningkatan sebesar 238% (3.1 juta sel).

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  ucapan  terima  kasih kepada  kedua  orang  tua  dan  pembimbing  (Ibu  Dr.  Sri Widyarti,  M.Si  dan  Bapak  Muhaimin  Rifa’i  S.Si, Ph.D.Med.Sc.). Antibodi yang dipakai dalam
penelitian  ini  disediakan  oleh  Bapak  Muhaimin  Rifa’i S.Si, Ph.D.Med.Sc.

## REFERENSI
1. Bellanti, J.A. 1993. Immunologi III . Georgetown University School of Medicine: Washington. D.C.
2. Baratawidjaya,  K.G.  2000. Imunologi  Dasar . Balai Penerbit FK UI. Jakarta.
3. Lai,  J.H.  2002,  Immunomodulatory  effects  and mechanisms  of  plant  alkaloid  tetrandrine  in autoimmune  diseases. Acta  Pharm  Sin 23(12):
1093-1101.
4. Takahashi JA, Pereira CR, Pimenta LP,
Boaventura  MA,  Silva  LG.  2006.  Antibacterial activity of eight Brazilian Annonaceae plants. Nat Prod Res . 20(1):21–26.
5. Ideasanti,  Soetarno,  S.  &  Kusmardiyani,  S.  1995. Telaah  Senyawa  Fenolik  Daun  Sirsak, Annona muricata L.,  Annonaceae.  Jurusan  Farmasi  ITB:
Bandung. Tidak dipublikasikan
6. Ohashi,  K.,  M.  Mukai,  P.  Simanjutak  &  P.  H. Shibuya.  2003.  Cancer  Cell  Invasion  Invasion Inhibitory Effects of Chemical Constituents in the Parasitic Plant
Scurrula artopurpurea (Lorantaceae). Chem Phar Bulletin 51(3):343-345. 7. Lyu,  S.Y.  &  Park,  W.B.  2005.  Production  of cytokine and NO by RAW 264.7 macrophages and PBMC in  vitro incubation  with  flavonoids. Arch. Pharm. Res.28 , 573-581.
8. Adewole, S.O. & Ezekiel A.C.M. 2006. Morphological Changes and Hypoglycemic Effects  of Annona  Muricata Linn.  (Annonaceae) Leaf  Aqueous  Extract  on  Pancreatic  Β-Cells  of Streptozotocin-Treated  Diabetic  Rats. African Journal of Biomed Research 9: 173 – 187
9. Peters,  B.,  Schneider-Stock  R,  Boltze  C,  Jäger  V, Epplen  J,  Landt  O,  Rys  J,  &  Roessner  A.  2003. Elevated telomerase activity, c-MYC-, and hTERT mRNA  expression:  association  with  tumour progression  in  malignant  lipomatous  tumours. J Pathol , 199:517-525.
10. Zili,  Z.,  Yi  Liu,  L.  Wu.  2008.  Enhancement  of innate and adaptive immune functions by multiple echinacea spesies. J.Med Foot 18(4) 257-70.
11. Cheng  T,  Ting  Chang,  Sheng  W,  Po  Jen,  Ching Tai,  &  Angel  C.  2006.    Maintenance  of  CD8 effector  T  cells  by  CD4  Helper  T  cells  eradicates growing tumors and promote long term immunity. Journal of Science Direct 24: 6199-207