J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 27(2): 140-147 Th. 2016 ISSN: 1979-7788 Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012

## Cronobacter sakazakii MEMASUKI KONDISI VIABLE BUT NONCULTURABLE SELAMA PEMBENTUKAN BIOFILM
[Cronobacter sakazakii Enters Viable but Nonculturable State during Biofilm Formation]
Yesica M. R. Sinaga 1) , Ratih Dewanti-Hariyadi 2,3) *, dan Suliantari 2,3)
1) Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Southeast Asian Food and Agricultural Science and Tecnology Center, Institut Pertanian Bogor, Bogor .
3) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 26 September 2016 / Disetujui 15 November 2016

## ABSTRACT
Studies  show  that  nonsporeformer  food-borne  pathogens  may  enter  a  viable  but  nonculturable (VBNC) state under stress conditions. This research aimed to study the ability of Cronobacter sakazakii to enter  a  VBNC  state  during  biofilm  formation  on  stainless  steel  (SS)  surfaces  and  its  resuscitability.  C. sakazakii  YRt2a  pGFPuv  mutant  and  wildtype  (WT)  originally  isolated  from  powder  infant  formula  (PIF) were  used  in  this  study.  Biofilms  were  developed  on  SS  surfaces  in  1/10  Trypticase  Soy  Broth  (TSB). Culturability  of  the  biofilms  was  monitored  by  swabbing  and  plating  the  WT  or  mutant  sessile  cells  onto Trypticase Soy Agar (TSA) or TSA containing 100 μg/mL ampicillin (TSAA), respectively. Meanwhile, their viability  was  measured  using  direct  microscopic  (DMC)  count  based  on  green  fluorescence  for  mutant isolates and direct viable count (DVC) for the WT using a fluorescence microscope. Biofilm of C. sakazakii pGFPuv mutant on SS entered VBNC state after 25 days of incubation, while the WT C. sakazakii biofilms was still culturable until day 63. Sodium pyruvate in solid and liquid medium was not able to resuscitate the biofilm cells of C. sakazakii pGFPuv in VBNC state. C. sakazakii pGFPuv mutants enter VBNC state faster than the WT isolates. Depleted nutrient is thought to drive biofilm of C. sakazakii pGFPuv to enter VBNC.
Keywords: biofilm, Cronobacter sakazakii, pGFPuv, sodium pyruvate, viable but nonculturable

## ABSTRAK
Bakteri  patogen  pangan  bukan  pembentuk  spora  dilaporkan  dapat  memasuki  kondisi viable  but nonculturable (VBNC)  saat  mengalami  stres.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  kemampuan bakteri Cronobacter  sakazakii memasuki  kondisi  VBNC  selama  pembentukan  biofilm  pada  permukaan pelat stainless steel (SS) dan kemampuannya untuk diresusitasi. C. sakazakii YRt2a mutan pGFPuv dan wildtype (WT) yang sebelumnya diisolasi dari susu formula bubuk digunakan dalam penelitian ini. Biofilm dibentuk  pada  permukaan  SS  dalam  1/10 Trypticase  Soy  Broth (TSB).  Kulturabilitas  biofilm  diamati dengan menyeka dan menumbuhkan sel sesil WT dan mutan masing-masing di dalam media Trypticase Soy  Agar (TSA)  atau  TSA  yang  mengandung  100 μg/mL ampisilin  (TSAA).  Sementara  itu,  viabilitas  sel sesil  dihitung  menggunakan direct  microscopic  count (DMC)  berdasarkan  pendaran  hijau  untuk  isolat mutan dan direct viable count (DVC) untuk WT menggunakan mikroskop fluoresens. Biofilm C. sakazakii mutan  pGFPuv  pada  pelat  SS  memasuki  kondisi  VBNC  setelah  25  hari  inkubasi,  sementara  biofilm C. sakazakii WT masih dapat dikulturkan sampai hari ke-63. Natrium piruvat di dalam media padat dan cair tidak mampu meresusitasi sel biofilm C. sakazakii pGFPuv dalam kondisi VBNC. C. sakazakii mutan lebih cepat  memasuki  kondisi  VBNC  dibandingkan  isolat  WT.  Nutrisi  yang  semakin  berkurang  diduga mengakibatkan biofilm C. sakazakii pGFPuv memasuki VBNC.
Kata kunci: biofilm, Cronobacter sakazakii, natrium piruvat, pGFPuv , viable but nonculturable
PENDAHULUAN 1
Cronobacter  sakazakii adalah  salah  satu spesies Cronobacter spp  yang  merupakan  bakteri Gram  negatif,  berbentuk  batang,  fakultatif  anaerob
Naskah  telah  dipresentasikan  dalam  International  Conference 2016,  Food  Innovations:  AEC  Challenges,  21-22  September 2016, Jakarta.
*Penulis Korespondensi: E-mail: rdewantih@yahoo.com
dan  motil  (Healy et  al., 2010;  Iversen et  al., 2008). Cronobacter spp.  sebagai  bakteri  patogen  bawaan pangan  telah  diasosiasikan  dengan  penyakit  septi- semia,  meningitis  dan  enterokolitis  pada  bayi  yang baru lahir dan lansia (Emami et al., 2012; Townsend et  al., 2008).  Kasus  infeksi  pada  bayi  oleh Crono- bacter spp.  telah  dilaporkan  karena  konsumsi  susu formula bayi yang tercemar bakteri tersebut.
C.  sakazakii tergolong  bakteri  yang  dapat  ber- tahan  dalam  kondisi  tidak  ideal. Cronobacter spp. dilaporkan bertahan lebih baik pada serealia dengan Aw  rendah  selama  12  bulan  dibandingkan  dengan pada  Aw  tinggi  (Lin  dan  Beuchat,  2007).  Bakteri  ini diketahui  dapat  menempel  dan  membentuk  biofilm pada  permukaan  kontak  pangan  seperti  silikon, lateks,  polikarbonat,  dan stainless  steel (Lee et  al., 2012;  Pratomo,  2015).  Kemampuan  bakteri C. sakazakii ini  menempel  pada  peralatan  makan  bayi berpotensi menjadi sumber cemaran.
Sel  bakteri  ketika  mengalami  stres  akan  mem- beri  respon  yang  berbeda,  bergantung  tingkat  ke- parahan  stres.  Ketika  berada  pada  lingkungan  sub- optimal  untuk  pertumbuhan,  bakteri  dapat  me- ngalami  stres  adaptif.  Paparan  terhadap  stres  yang lebih  besar  selanjutnya  dapat  mengakibatkan  injuri pada  bakteri.  Bakteri  yang  mengalami  injuri  dengan keparahan  rendah,  atau  disebut  juga  mengalami injuri  subletal,  dapat  dipulihkan  dengan  mudah dalam  media  nonselektif  atau  dalam  media  kaya nutrisi.  Injuri  bakteri  dengan  keparahan  yang  lebih tinggi lagi, dimana pemulihannya memerlukan media dan  lingkungan  yang  lebih  kompleks,  dapat  meng- akibatkan  masuknya  bakteri  ke  kondisi viable  but nonculturabe (VBNC) (Ray dan Bhunia, 2014). Bakteri  yang  tidak  memiliki  kemampuan  mem- bentuk  spora  umumnya  dapat  memasuki  kondisi VBNC  sebagai  mekanisme  pertahanan  pada  ling- kungan  yang  tidak  menguntungkan  (Pinto et  al., 2011).  Bakteri  dalam  kondisi  VBNC  masih  memiliki viabilitas  yang  ditandai  dengan  adanya  integritas membran,  respirasi,  metabolisme,  dan  memper- tahankan transkripsi mRNA tetapi tidak dapat mem- bentuk  koloni  pada  media  agar  (Pinto et  al., 2013). Keberadaan bakteri Cronobacter spp. dalam kondisi VBNC  dapat  menjelaskan  hasil  negatif  yang  diper- oleh  pada  pengujian  sampel  susu  formula  bubuk atau  produk  lainnya  yang  terkontaminasi  bakteri tersebut (Farmer, 2015).
Estimasi  jumlah  bakteri  patogen  pada  sampel pangan  yang  lebih  rendah  dari  sebenarnya  dan kegagalan  mengidentifikasi  bakteri  patogen  saat dikulturkan dapat menimbulkan risiko terkait keama- nan  pangan  (Ramamurthy et  al., 2014).  Beberapa bakteri  dalam  kondisi  VBNC  masih  dapat  mem- pertahankan sifat virulensinya. Campylobacter jejuni yang  lebih  baik  dalam  mempertahankan  kondisi VBNC  memiliki  virulensi  yang  lebih  tinggi  (Magajna dan  Schraft,  2015).  Sementara E.  coli pada  kondisi VBNC  masih  dapat  menghasilkan  sejumlah  kecil verotoksin  (Dinu  dan  Bach,  2011).  Meskipun demikian, belum ada laporan mengenai hal tersebut terkait C.  sakazakii . C.  sakazakii YRt2a  yang  di- isolasi dari susu formula bubuk (Meutia et al., 2008) dan  galur  mutannya  dilaporkan  memiliki  pola partumbuhan  yang  sama  (Nurjanah et  al., 2014). Selama pembentukan biofilm pada berbagai
permukaan  kontak  pangan  di  dalam  media  nutrisi rendah, C. sakazakii mutan  memberikan  hitungan mikroskopik  hingga  2  Log  sel/cm 2 lebih  tinggi daripada  hitungan  cawan  (Pratomo,  2015).  Oleh karena itu diduga bakteri ini dapat memasuki kondisi VBNC  (Pratomo,  2015).  Bakteri  dalam  kondisi VBNC  dapat  kembali  ke  kondisi  dapat  dikulturkan ( culturable )  jika  berada  pada  kondisi  yang  me- nguntungkan.  Perubahan  sel  bakteri  dari  kondisi VBNC  ke  kondisi  dimana  bakteri  dapat  dikulturkan disebut  resusitasi  (Pinto et  al., 2011).  Sel  VBNC Vibrio cholera dan Escherichia coli dapat diresusitasi pada  media  yang  mengandung  natrium  piruvat  dan katalase (Imamura et al., 2015; Na et al., 2006).
Tujuan  penelitian  ini  adalah  mengevaluasi apakah C.  sakazakii WT  dan  mutan  pGFPuv  dapat memasuki  kondisi  VBNC  selama  pembentukan biofilm  di  dalam  media  nutrisi  rendah.  Selain  itu, penelitian  ini  juga  bertujuan  untuk  mengetahui apakah sel VBNC yang terbentuk pada penelitian ini dapat diresusitasi dengan natrium piruvat.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bakteri  yang  digunakan  adalah Cronobacter sakazakii wildtype (WT)  YRt2a  (SEAFAST  Center, Indonesia)  yang  diisolasi  dari  susu  formula  bubuk (Meutia et  al., 2008)  dan Cronobacter  sakazakii pGFPuv  mutan  YRt2a  (SEAFAST  Center,  Indo- nesia)  yang  ditransformasi  menggunakan  metode CaCl 2 (Nurjanah et al., 2014).

## Persiapan bakteri uji
Isolat C.  sakazakii pGFPuv  dan  WT  dari  stok manik-manik  beku  disegarkan  dalam  BHI  (Oxoid Ltd,  UK)  dengan  penambahan  ampisilin  (PT.  Erita Farma,  Indonesia )  (100  μg/mL)  (BHIA)  untuk  isolat mutan  pGFPuv  dan  tanpa  penambahan  ampisilin (BHI)  (Oxoid  Ltd,  UK)  untuk  isolat  WT.  Bakteri diinkubasi  dalam  inkubator  (Heraeus,  Germany) selama  24  jam  pada  suhu  37°C.  Kultur  yang  telah disegarkan  dikonfirmasi  dengan  menumbuhkan bakteri  pada  media  TSA  (Oxoid  Ltd,  UK)  dengan penambahan  ampisilin  100  μg/mL  (TSAA)  untuk bakteri  mutan  pGFPuv  dan  DFI  (Oxoid  Ltd,  UK) untuk  isolat  WT,  kemudian  bakteri  diinkubasi  pada suhu 37°C selama 24 jam. Pengamatan koloni yang tumbuh  pada  media  TSAA  (Oxoid  Ltd,  UK) dilakukan di bawah lampu UV (Desaga, Heidelberg, Germany)  dengan  panjang  gelombang  366  nm. Isolat  yang  telah  dikonfirmasi  pada  TSAA  dan  DFI masing-masing diambil satu ose dan dimasukkan ke dalam BHIA (Oxoid Ltd, UK) atau BHI lalu diinkubasi pada  suhu  37°C  selama  16-17  jam  sampai  fase logaritmik  akhir  sehingga  diperoleh  kultur  dengan populasi  sel  sekitar  10 8 -10 9 CFU/mL  (Nurjanah et
al., 2013).  Sebelum  diinokulasikan  ke  dalam  media yang  akan  digunakan  untuk  menginduksi  kondisi VBNC,  masing-masing  1  mL  kultur  dari  BHIA  dan BHI  disentrifugasi  (HERMLE  Z383K,  Germany) dengan kecepatan 4500 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C untuk mendapatkan massa sel. Kemudian dilakukan pencucian dengan 1 mL BPW (Oxoid Ltd, UK)  dan  disentrifugasi  kembali    selama  4  menit pada  kecepatan  4500  rpm  suhu  4°C.  Pelet  diresus- pensi  dalam  1  mL  BPW.  Masing-masing  inokulum siap digunakan untuk induksi kondisi VBNC.

## Pembentukan biofilm untuk menginduksi kondisi VBNC
Pembentukan  biofilm  dilakukan  pada stainless steel (SS) berukuran 1 cm x 1 cm. Sebelum diguna- kan pelat direndam dalam larutan deterjen komersial selama  1  jam  kemudian  dibilas  dengan  akuades. Pelat  dikeringkan  lalu  dibersihkan  dengan  alkohol 70%  (Merck,  USA).  Setelah  proses  sanitasi  pelat dikeringkan  pada  suhu  55°C  selama  1  malam menggunakan  inkubator  (H.ORTH  GmbH,  West Germany) (Marques et al., 2007).
Pembentukan  biofilm  dilakukan  berdasarkan Pratomo  (2015)  dengan  modifikasi.  Modifikasi  yang dilakukan adalah konsentrasi media yang digunakan (dari  1/5  TSB  menjadi  1/10  TSB)  dan  jumlah mikroba  awal  dari  (dari  10 5 CFU/mL  menjadi  10 7 CFU/mL).  Media  dengan  nutrisi  rendah  (1/10  dari takaran pembuatan TSB  yang  ditetapkan produsen) 200  mL  yang  telah  berisi  pelat  SS  disterilisasi  pada suhu  121°C  selama  15  menit  (ALP  Co.,Ltd,  Tokyo, Japan).  Masing-masing  inokulum C.  sakazakii pGFPuv dan WT hasil sentrifugasi yang telah disiap- kan  sebelumnya,  sebanyak  2  mL  diinokulasikan  ke dalam  media  tersebut  sehingga  diperoleh  jumlah mikroba  awal  10 7 CFU/mL. Sampel  diinkubasi  pada suhu  kamar  (28-30°C)  dengan  agitasi  70  rpm (Innova TM 2300,  New  Brunswick  Scientific,  New Jersey, USA). Pada interval waktu tertentu pelat SS diambil  dan  dilakukan  penghitungan  viabilitas  dan kulturabilitas sel biofilm.

## Pengamatan  viabilitas  dan  kulturabilitas  sel biofilm
Viabilitas  sel  biofilm  diamati  menggunakan mikroskop  fluoresens  (Olympus  CH3O,  Olympus Corporation, Center Valley, PA, USA) pada panjang gelombang  395  nm  dan  emisi  509  nm.  Biofilm C. sakazakii pGFPuv  pada  permukaan  SS  dibilas menggunakan  garam  fisiologis  (GF)  (Merck,  USA) 0,85%  steril  dan  ditiriskan  kemudian  diamati  di bawah  mikroskop  fluoresens  (Pratomo,  2015).  Sel yang  berfluoresens  saat  pengamatan  kemudian dihitung  dengan  metode  DMC  (Parizzi et al., 2004). Untuk biofilm C. sakazakii WT pengamatan viabilitas dilakukan dengan metode DVC (modifikasi Du et al., 2007).  Modifikasi  yang  dilakukan  yaitu  perubahan
suhu  inkubasi  dari  26°C  menjadi  suhu  ruang  (28- 30°C)  dan  waktu  inkubasi  dari  16  jam  menjadi  18 jam. Setelah biofilm pada SS dibilas, pelat direndam dalam  larutan  yang  mengandung yeast  extract (Oxoid Ltd, UK) dan asam nalidiksat (Sigma-Aldrich, USA)  dengan  konsentrasi  masing-masing  0,025% dan  0,002%  pada  suhu  ruang  dan  kondisi  gelap selama  18  jam.  Berikutnya  pelat  dibilas  dengan  GF 0,85%  steril  dan  dilanjutkan  dengan  pewarnaan menggunakan acridine  orange 0,0026%  (Sigma- Aldrich,  USA)  selama  5  menit  (Pratomo,  2015). Pelat  SS  kemudian  diamati  di  bawah  mikroskop fluoresens.  Sel  viabel  adalah  sel  yang  mengalami perubahan  bentuk  memanjang  atau  membesar  (Du et  al., 2007).  Untuk  setiap  penghitungan  viabilitas, jumlah  pelat  SS  yang  diamati  sebanyak  2  pelat. Sebanyak  10  bidang  pandang  diamati  di  bawah mikroskop  fluoresens  untuk  setiap  pelat  (Parizzi et al., 2004). Hasil perhitungan yang diperoleh dinyata- kan dalam bentuk Log sel/cm 2 .
Kulturabilitas diamati dengan menghitung koloni pada  media  agar.  Biofilm  pada  permukaan  SS dibilas  dengan  GF  0,85%  steril  dan  diusap  dengan kapas  steril.  Hasil  usapan  biofilm C.  sakazakii pGFPuv  atau  WT  masing-masing  dimasukkan  ke dalam tabung  yang berisi  9 mL BPW dan 1 mL Na- heksametafosfat 0,1% (Sigma-Aldrich, USA) (Pratomo, 2015). Tabung kemudian divortex (Vortex Genie 2, Scientific Industries Inc., USA), dan 0,1 mL masing-masing  isolat  tersebut  disebar  dalam  media TSAA  atau  TSA  dalam  cawan  yang  diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Koloni yang tumbuh kemudian dihitung. Kondisi VBNC dianggap tercapai jika  bakteri  sudah  tidak  membentuk  koloni  pada media  agar  tetapi  masih  dapat  dihitung  dengan DMC atau DVC (Pinto et al., 2013).

## Resusitasi di dalam media padat dan cair
Resusitasi  menggunakan  media  padat  di- lakukan  dengan  menumbuhkan  sebanyak  0,1  mL sel  biofilm  hasil  usapan  dalam  tabung  yang  berisi BPW+Na-heksametafosfat seperti yang sudah dijelaskan  sebelumnya  ke  dalam  media  agar  TSAA dan TSA yang mengandung natrium piruvat 0,1% (9 mM)  (Sigma-Aldrich,  USA)  (Imamura et  al., 2015). Cawan  yang  berisi  media  agar  kemudian  diinkubasi selama  24  jam.  Sementara  itu,  resusitasi  meng- gunakan  media  cair  dilakukan  dalam  BPW  yang mengandung  natrium  piruvat  0,1%  (9  mM)  (modifi- kasi  Wai et  al., 2000).  Modifikasi  yang  dilakukan adalah perubahan air steril menjadi BPW. Resusitasi dalam  media  cair  dilakukan  hanya  untuk  isolat mutan  saja.  Hasil  usapan  biofilm  dalam  tabung BPW+Na-heksametafosfat  sebanyak  0,1  mL  di- masukkan  pada  10  mL  media  cair  dan  diinkubasi selama  24  jam  untuk  resusitasi  pada  suhu  37°C (Heraeus,  Germany).  Sebanyak  0,1  mL  suspensi bakteri  hasil  inkubasi  disebar  pada  media  TSAA
0,10 0,15 0,00 0,01 0,15 0,22 0,54 0,00 0 1 2 3 4 5 6 7 15 21 25 J u m la h Se l (L o g Se l/c m 2 a ta u L o g CFU/c m 2 ) Hari ke-
Viabilitas sel Kulturabilitas sel
untuk  melihat  ada  tidaknya  pembentukan  koloni. Jika  setelah  inkubasi  24  jam  resusitasi  belum  ber- hasil,  inkubasi  diperpanjang  hingga  72  jam  kemu- dian ditumbuhkan kembali pada media TSAA.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Viabilitas dan kulturabilitas Cronobacter sakazakii pGFPuv dan Cronobacter sakazakii WT selama pembentukan biofilm
Sel biofilm C. sakazakii pGFPuv yang terbentuk pada  permukaan  SS  menunjukkan  viabilitas  dan kulturabilitas  yang  baik  pada  hari  ke-7  dengan jumlah  sel  viabel  0,8  Log  sel/cm 2 lebih  tinggi  di- bandingkan  jumlah  sel  yang  dapat  dikulturkan (Gambar  1).  Bakteri  sesil  mutan  ini  terlihat  ber- pendar  hijau  di  bawah  mikroskop  fluoresens  pada panjang  gelombang  396  nm  yang  menandakan viabilitas  (Gambar  2)  sesuai  Shimomura  (2009). Penggunaan  GFP  untuk  mengamati  kondisi  VBNC juga  telah  dilakukan  pada E.  coli (Dinu  dan  Bach, 2011).  Dengan  bertambahnya  waktu  inkubasi, perbedaan  antara  jumlah  sel  viabel  dan  jumlah  sel yang  dapat  dikulturkan  semakin  besar  (Gambar  1). Pada  hari  ke-15  jumlah  sel  viabel  mencapai 4,4±0,15  Log  sel/cm 2 sementara  jumlah  sel  yang dapat  dikulturkan  turun  menjadi  1,4±0,22  Log CFU/cm 2 hingga  akhir  pengamatan  (hari  ke-25) jumlah  sel  viabel  mencapai  3,9±0,01  Log  sel/cm 2 tetapi  tidak  mampu  lagi  membentuk  koloni  saat ditumbuhkan dalam media TSAA.
Gambar 1.  Viabilitas  (Log  sel/cm 2 )  dan  kultur- abilitas  (Log  CFU/cm 2 ) C.  sakazakii mutan  pGFPuv  selama  pembentukan biofilm
Perbedaan  antara  jumlah  sel  yang  viabel dengan sel  yang dapat dikulturkan mengindikasikan bakteri  berada  dalam  kondisi  VBNC  (Oliver,  2009). Hasil penelitian ini menunjukkan biofilm C. sakazakii pGFPuv  memasuki  kondisi  VBNC  pada  hari  ke-25 inkubasi  di  dalam  media  1/10  TSB.  Masuknya bakteri  dalam kondisi  VBNC merupakan  respon  ter-
hadap  nutrisi  yang  berkurang  selama  waktu inkubasi. Selain itu, kondisi di dalam struktur biofilm sendiri  juga  memberikan  stres  berupa  ketersediaan nutrisi  yang  terbatas  dibanding  lapisan  luar  biofilm (Stewart  dan  Franklin,  2008).  Sel  biofilm  yang memasuki  kondisi  VBNC  belum  pernah  dilaporkan untuk  bakteri C.  sakazakii tetapi  sudah  dilaporkan pada  bakteri  lain.  Sel  biofilm Campylobacter  jejuni memasuki  kondisi  VBNC  akibat  stres  berupa inkubasi  di  dalam  media  nutrisi  rendah phosphate buffered  saline (PBS)  dan  suhu  rendah  4°C (Magajna  dan  Schraft,  2015).  Sel  biofilm C.  jejuni tersebut  memasuki  kondisi  VBNC  dalam  10-20  hari inkubasi.  Sel  biofilm Staphylococcus  aureus yang diinkubasi pada suhu 37°C dalam media minimal M9 tanpa  glukosa  memasuki  kondisi  VBNC  setelah  40 hari inkubasi (Pasquaroli et al., 2013).
Gambar 2.  Sel biofilm C. sakazakii YRt2a  pGFPuv hari  ke-25  di  bawah  mikroskop  fluore- sens  (1000x).  Tanda  panah  menunjuk- kan sel yang berfluoresens
Pengamatan  viabilitas  isolat  WT  di  bawah mikroskop  fluoresens  disajikan  pada  Gambar  3. Viabilitas  ditandai  dengan  adanya  sel  yang  me- manjang  sesuai  dengan  Na et  al .  (2006)  yang  juga mengamati  sel  VBNC E.  coli dengan  metode  DVC. Dengan metode ini, yeast extract yang ditambahkan berperan  sebagai  sumber nutrisi  yang  akan  dimeta- bolisme  oleh  sel  yang  viabel  sementara  asam  nail- diksat  berperan  sebagai  inhibitor  spesifik  replikasi DNA  yang  mencegah  pembelahan  sel  sehingga dihasilkan  sel  yang  memanjang  atau  membesar (Babu et al., 2014).
Berbeda  dengan  isolat  mutan,  viabilitas  dan kulturabilitas sel biofilm isolat C. sakazakii WT pada hari ke-7 menunjukkan perbedaan lebih besar  yakni 2  Log  (Gambar  4).  Meskipun  demikian,  viabilitas isolat WT relatif  lebih  stabil  selama  56  hari  inkubasi dengan  jumlah  sel  biofilm  berkisar  antara  4,1-4,3 Log  sel/cm 2 .  Penurunan  dalam  jumlah  kecil  sel viabel (0,4 Log) terjadi pada akhir pengamatan (hari ke-63).  Sementara  itu  kulturabilitas  isolat  WT  yang pada  awal  pengamatan  berjumlah  2,1±0,34  Log CFU/cm 2 menunjukkan  penurunan  seiring  bertam- bahnya  waktu  inkubasi  meski  dalam  jumlah  kecil (0,8  Log  selama  63  hari  inkubasi).  Pada  akhir
0,13 0,08 0,03 0,06 0,22 0,07 0,34 0,60 0,55
0,41 0,54 0,20 0 1 2 3 4 5 7 14 21 28 56 63 J u m la h Se l (L o g Se l/c m 2 a ta u L o g CFU/c m 2 ) Hari ke- Viabilitas sel
Kulturabilitas sel
pengamatan (hari ke-63) sel biofilm WT masih dapat dikulturkan mencapai 1,3±0,20 Log CFU/cm 2 meski- pun  jumlah  ini  lebih  kecil  dibandingkan  viabilitas biofilm WT yang mencapai jumlah 3,9±0,07 Log sel/ cm 2 .  Perbedaan  antara  viabilitas  dan  kulturabilitas sel  bakteri  yang  mengalami  stres  dapat  menimbul- kan  kesalahan  penghitungan  jumlah  bakteri  pada pengujian  pangan  dengan  metode  hitungan  cawan seperti  yang  diungkapkan  Farmer  (2015).  Oleh sebab itu keberadaan bakteri yang mengalami stres, seperti  kondisi  VBNC  perlu  diwaspadai  saat  me- lakukan pengujian pangan.
Gambar 3.  Sel  biofilm C.  sakazakii WT  pada  hari ke-63  yang  diamati  menggunakan metode  DVC  di  bawah  mikroskop  fluo- resens  (1000x).  Tanda  panah  menun- jukkan sel yang memanjang
Gambar 4.  Viabilitas  (Log  sel/cm 2 )  dan  kultura- bilitas  (Log  CFU/cm 2 ) C.  sakazakii mutan  pGFPuv  selama  pembentukan biofilm
Sel  biofilm  mutan  sudah  memasuki  kondisi VBNC pada  hari ke-25 sedangkan biofilm isolat WT masih  dapat  dikulturkan  hingga  hari  ke-63.  Per- bedaan  respon  sel  biofilm  mutan  dan  WT  terhadap stres  berupa  kekurangan  nutrisi  mungkin  di-pe- ngaruhi  oleh  penyisipan  GFP  pada  bakteri  mutan. Allison  dan  Sattenstall  (2007)  melaporkan  bahwa GFP  yang  disisipkan  pada  bakteri Escherichia  coli memiliki  efek  signifikan  terhadap  sifat  fisiologis
bakteri tersebut dan mengakibatkan bakteri menjadi lebih  rentan  terhadap  stres  senyawa  antimikroba dibandingkan  dengan  bakteri  WT.  Adanya  protein GFP  dapat  menimbulkan  stres  fisiologis  pada bakteri  dengan  mengalihkan  fungsi-fungsi  seluler penting  bakteri  untuk  mereplikasi  protein  asing tersebut dalam jumlah tinggi. Oleh karena itu diduga protein  GFP  pada  bakteri C.  sakazakii mutan  mem- berikan  pengaruh  pada  pertumbuhan  bakteri  saat menghadapi  stres  sehingga  menunjukkan  perbeda- an  dengan  isolat  WT  yang  tidak  disisipi  GFP. Nurjanah et al . (2014) memperlihatkan tidak adanya perbedaan  yang  signifikan  antara  kurva  per- tumbuhan  sel  planktonik C.  sakazakii isolat  mutan dan  WT.  Akan  tetapi,  pengujian  pertumbuhan  isolat mutan  dan  WT  ini  dilakukan  pada  kondisi  per- tumbuhan optimal yaitu dalam media BHI yang tidak memberikan stres nutrisi rendah.
Resusitasi C. sakazakii pGFPuv dan C. sakazakii WT di dalam media padat dan cair Resusitasi  sel  VBNC  bakteri C.  sakazakii pGFPuv  pada  hari  ke-26  di  dalam  media  padat TSAA  yang  disuplementasi  natrium  piruvat  tidak mampu  mengembalikan  kemampuan  bakteri  untuk membentuk  koloni  (Tabel  1).  Penggunaan  media cair  BPW  yang  disuplementasi  dengan  natrium piruvat  juga  tidak  berhasil  meresusitasi  sel  VBNC bakteri C.  sakazakii pGFPuv  bahkan  setelah  per- panjangan  inkubasi  72  jam  di  dalam  media  cair (Tabel 1).
Tabel 1.  Resusitasi C.  sakazakii pGFPuv  dalam media padat dan cair Jenis Media Resusitasi Media padat TSAA+natrium piruvat - TSAA kontrol - Media cair BPW+natrium piruvat 24 jam - BPW kontrol - BPW+natrium piruvat 48 jam - BPW kontrol -
Keterangan: - = tidak ada pertumbuhan
Sel  biofilm  isolat  WT  hari  ke-63  juga  tidak mengalami  peningkatan  jumlah  sel  yang  dapat dikulturkan  saat  ditumbuhkan  pada  media  yang ditambahkan  piruvat  (Gambar  5).  Tidak  ada  per- bedaan  jumlah  koloni  yang  terbentuk  pada  media TSA  dengan  (1,2±0,20  Log  CFU/cm 2 )  atau  tanpa penambahan  piruvat  pada  hari  ke-63  (1,3±0,20  Log CFU/cm 2 ).  Penambahan  natrium  piruvat  hanya dilakukan  pada  media  pertumbuhan  padat  untuk isolat WT karena sel biofilm masih dapat dikulturkan hingga  hari  ke-63.  Hasil  penelitian  ini  memper- lihatkan natrium piruvat tidak dapat digunakan untuk mempermudah  deteksi  bakteri C.  sakazakii yang berada  pada  kondisi  VBNC.  Oliver  (2009)  men- jelaskan  bahwa  H 2 O 2 baik  yang  diproduksi  oleh  sel
1,3 1,2 0 0.5 1 1.5 2 Resusitasi padat J u m la h Ba k te ri
(L o g CFU/c m 2 ) Kontrol Piruvat
bakteri  ketika  dicawankan  atau  yang  secara  alami terdapat  pada  media  agar,  berpengaruh  pada kondisi  VBNC Vibrio  vulnificus .  Pada  kondisi  stres suhu  rendah,  ekpresi  gen  katalase  ( katG )  menurun seiring  dengan  kemampuan  pembentukan  koloni yang  juga  menurun.  Natrium  piruvat  merupakan senyawa yang dapat mereduksi H 2 O 2 (Reissbrodt et al., 2002).  Oleh  sebab  itu  natrium  piruvat  dapat digunakan  untuk  resusitasi  sel  VBNC.  Selain  itu piruvat  juga  diketahui  sebagai  penyedia  sumber energi  yang  dimetabolisme  dengan  cepat  dan efisien (Guccione et al., 2008).
Gambar 5.  Resusitasi C.  sakazakii WT  di  dalam media padat TSA
Pada  penelitian  ini,  penambahan  natrium piruvat  dalam  media  TSAA  atau  TSA  tidak  dapat meningkatkan  kulturabilitas  baik  sel  biofilm  isolat mutan  maupun  WT.  Hal  ini  diduga  terjadi  karena masuknya  sel  biofilm  ke  dalam  kondisi  VBNC  tidak disebabkan  oleh  sel  yang  sensitif  terhadap  H 2 O 2 . Ketidakmampuan  senyawa  pereduksi  H 2 O 2 dalam resusitasi  sel C.  sakazakii VBNC  memberikan  bukti bahwa  kondisi  VBNC  pada  bakteri  tidak  hanya disebabkan oleh sensitivitas sel terhadap akumulasi H 2 O 2 yang  mencegah  sel  untuk  dikulturkan  (Lleo et al., 2001).  Ketidakberhasilan  resusitasi  sel  VBNC  di dalam  media  yang  disuplementasi  senyawa  anti- oksidan  seperti  katalase  maupun  natrium  piruvat sudah  dilaporkan  pada  sel Listeria  monocytogenes yang  memasuki  VBNC  setelah  inkubasi  dalam  air Milli-Q  pada  suhu  4°C  (Lindback et  al., 2010)  sel VBNC E.  coli yang  diinkubasi  dalam  air  keran  pada suhu  23°C  (Aurass et  al., 2011)  dan  sel  biofilm S. aureus yang  memasuki  kondisi  VBNC  setelah  40 hari  inkubasi  dalam  media  nutrisi  rendah  M9  tanpa glukosa  (Pasquaroli et  al., 2013).  Meskipun  demi- kian  beberapa  penelitian  lainnya  menunjukkan  sel VBNC  dapat  diresusitasi  menggunakan  senyawa antioksidan.  Media  yang  mengandung  natrium piruvat  berhasil  meresusitasi  sel  biofilm  VBNC Campylobacter  jejuni yang  memasuki  VBNC  dalam 10-20  hari  (Magajna  dan  Schraft,  2015)  dan  sel biofilm S.  aureus yang  memasuki  kondisi  VBNC  ≤
30  hari  akibat  inkubasi  dalam  media  M9  tanpa glukosa  yang  mengandung  antibiotik  vankomisin atau dalfopristin (Pasquaroli et al., 2013).
Hasil penelitian Pinto et al . (2011) menunjukkan bahwa  sel  VBNC  yang  tidak  mampu  diresusitasi dengan  natrium  piruvat  dapat  diresusitasi  dengan senyawa  lain  seperti  asam  amino  dan  AI  ( auto- inducer) dari  Enterobacteriaceae.  Selain  itu  faktor- faktor lain yang dapat meresusitasi sel VBNC adalah sel  eukariotik  (Senoh et  al., 2010)  dan  senyawa antioksidan  lainnya  seperti  ferrioxamine  E  dan oksirase (Reissbrodt et al., 2002) juga telah dilapor- kan.  Senyawa-senyawa  atau  faktor-faktor  yang dapat meresusitasi sel  yang berada dalam keadaan VBNC  akan  mempermudah  deteksi  bakteri  VBNC pada pangan.

## KESIMPULAN
C.  sakazakii pGFPuv  dapat  memasuki  kondisi VBNC  selama  pembentukan  biofilm  di  dalam media dengan  nutrisi  rendah  1/10  TSB.  Pada  hari  ke-25 biofilm C.  sakazakii pGFPuv  sudah  memasuki kondisi  VBNC  dengan  jumlah  sel  viabel  3,9  Log sel/cm 2 . Sementara C. sakazakii WT hingga hari ke- 63  masih  memiliki  sel  yang  dapat  dikulturkan dengan jumlah 1,3 Log CFU/cm 2 dan sel viabel ber- jumlah  3,9  Log  sel/cm 2 .  Resusitasi  yang  dilakukan dengan  menambahan  natrium  piruvat  ke  dalam media  padat  dan  cair  tidak  berhasil  meningkatkan jumlah  koloni  sel  biofilm C.  sakazakii .  Perlu dilakukan  penelitian  lanjutan  untuk  mendapatkan senyawa  yang  dapat  meresusitasi  sel  VBNC C. sakazakii sehingga  mempermudah  deteksi  bakteri tersebut dalam bahan pangan.

## DAFTAR PUSTAKA
Allison  DG,  Sattenstall  MA.  2007.  The  influence  of green  fluorescent  protein  incorporation  on bacterial  physiology:  a  note  of  caution.  J  Appl Microbiol  103:  318-324.  DOI:  10.1111/j.1365- 2672.2006.03243.x.
Auras  P,  Prager  R,  Flieger  A.  2011.  EHEC/EAEC O104:H4  strain  linked  with  the  2011  German outbreak of haemolytic uremic syndrome enters into  the  viable  but  non-culturable  state  in response  to  various  stresses  and  resuscitates upon  stress  relief.  Environ  Microbiol  13:  3139- 3148. DOI: 10.1111/j.1462-2920.2011.02604.x.
Babu  D,  Kushwaha  K,  Juneja  VK.  2014.  Viable  but nonculturable. Encyclop Food Microbiol 3: 686- 690. DOI:  10.1016/B978-0-12-384730-0.00424- 9.
Dinu LD, Bach S. 2011. Induction of viable but non- culturable Escherichia  coli O157:H7  in  the
phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Appl Environ Microb 77: 8295-8302. DOI: 10.11 28/AEM.05020-11.
Du  M,  Chen  J,  Zhang  X,  Li  A,  Li  Y,  Wang  Y.  2007. Retention  of  virulence  in  a  viable  but  non- culturable Edwardsiella  tarda isolate.  Appl Environ  Microb  73:  1349-1354.  DOI:  10.1128/ AEM.02243-06.
Emami CN, Mittal R, Wang L, Ford HR, Prasadarao NV.  2012.  Role  of  neutrophils  and  macro- phages  in  the  pathogenesis  of  necrotizing enterocolitis  caused  by Cronobacter  sakazakii . J  Surg  Res  172:  18 –28.  DOI:  10.1016/j.jss.20
11.04.019.
Farmer  JJ.  2015.  Review:  My  40-year  history  with Cronobacter/Enterobacter  sakazakii –  lessons learned,  myths  debunked,  and  recommenda- tions –  a  review.  Front  Pediatric  3:  1-12.  DOI: 10.3389/fped.2015.00084.
Guccione E, Leon-Kempis MD, Pearson BM, Hitchin E, Mulholland F, van Diemen PM, Stevens MP, Kelly  DJ.  2008.  Amino  acid-dependent  growth of Campylobacter jejuni : key roles for aspartase (AspA)  under  microaerobic  and  oxygen-limited conditions  and  identification  of  AspB  (Cj0762), essential for growth on glutamate. Mol Microbiol 69:  77-93.  DOI:  10.1111/j.1365-  2958.2008.0 6263.x.
Healy B, Cooney S, O’Brien S, Iversen C, Whyte P, Nally  J,  Callanan  JJ,  FanningS.  2010. Crono- bacter ( Enterobacter  sakazakii ):  An  oppurtu- nistic  foodborne  pathogen.  Foodborne  Pathog Dis 7: 339-350. DOI: 10.1089/fpd.2009.0379.
Imamura D, Mizuno T, Miyoshi S, Shinoda  S. 2015.
Stepwise  changes  in  viable  but  nonculturable Vibrio  cholerae cells.  Microbiol  Immunol  59: 305-310. DOI: 10.1111/1348-0421.12246.
Iversen C, Mullane N, McCardell B, Tall BD, Lehner A,  Fanning  S,  Stephan  R,  Joosten  H.  2008. Cronobacter gen.  nov.,  a  new  genus  to accomodate  the  biogroups  of Enterobacter sakazakii , and proposal of Cronobacter sakazakii gen.  nov.,  comb.  nov., Cronobacter malonaticus sp.  nov., Cronobacter turicensis sp.  Nov., Cronobacter muytjensii sp.  nov., Cronobacter dublinensis sp.  nov., Cronobacter genomospecies  1,  and  of  three  subspecies, Cronobacter dublinensis subsp. Dublinensis subsp  nov., Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis subsp.  nov.  And Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi subsp.  Int  J  Syst Evol  Micr  58:  1442-1447.  DOI:  10.1099/ ijs.0.65577-0.
Lee  YD,  Park  JH,  Chang  H.  2012.  Detection, antibiotic  susceptibility  and  biofilm  formation  of Cronobacter spp.  from  various  foods  in  Korea.
Food  Control  24:  225-230.  DOI:  10.1016/j.food cont.2011.09.023.
Lin  LC,  Beuchat  LR.  2007.  Survival  of Enterobacter sakazakii in  infant  cereal  as  affected  by composition,  water  activity,  and  temperature. Food  Microbiol  24:  767-777  DOI:  10.1016/j.fm. 2007.02.001.
Lindback  T,  Rottrnberg  ME,  Roche  S,  Rorvik  LM. 2010. The ability to enter into an avirulent viable but  non-culturable  (VBNC)  form  is  widespread among Listeria  monocytogenes isolates  from salmon, patients and environment. Vet Res 41: 08. DOI: 10.1051/vetres/2009056.
Lleo  MM,  Bonato  B,  Tafi  MC,  Signoretto  C,  Boaretti M,  Canepari.  2001.  Resuscitation  rate  in  dif- ferent  enterococcal  species  in  the  viable  but nonculturable  state.  J  Appl  Micobiol  91:  1095- 1102. DOI: 10.1046/j.1365-2672.2001.01476.x.
Magajna  BA,  Schraft  H.  2015. Campylobacter  jejuni biofilm  cells  become  viable  but  nonculturable (VBNC)  in  low  nutrient  conditions  at  4 o C  more quickly than their planktonic counterparts. Food Control  50:  45-50.  DOI:  10.1016/j.foodcont.20 14.08.022.
Marques  SC,  Rezende  JGOS,  de  Freitas  Alves  LA, Silva  BC,  Alves  E,  de  Abreu  LR,  Piccoli  RH. 2007.  Formation  of  biofilms  by Staphylococcus aureus on stainless  steel and  glass  surfaces and  its  resistance  to  some  selected  chemical sanitizers.  Brazil  J  Microbiol  38:  538-543.  DOI: 10.1590/S1517-83822007000300029.
Meutia  YR,  Dewanti-Hariyadi  R,  Estuningsih  S. 2008.  Karakteristik  gen  penyandi  16S  rRNA Enterobacter  sakazakii yang  diisolasi  dari  susu formula.  Dipresentasikan  pada  Pertemuan Tahunan  Perhimpunan  Ahli  Teknologi  Pangan, Palembang, Oktober 2008.
Na  SH,  Miyanaga  K,  Unno  H,  Tanji  Y.  2006.  The survival  response  of Escherichia  coli K12  in  a natural  environment.  Appl  Microbiol  Biotechnol 72: 386-392. DOI: 10.1007/s00253-005-0268-3.
Nurjanah  S,  Suhartono  MT,  Dewanti-Hariyadi  R,
Estuningsih  S.  2013.  Aplikasi  mutan  ber- fluoresens  untuk  mempelajari  ketahanan  hidup kolonisasi  dan  penetrasi  isolat Cronobacter sakazakii selama pengeringan jagung. J Teknol Industri Pangan 24: 184-193. DOI: 10.6066/jtip. 2013.24.2.184.
Nurjanah  S,  Dewanti-Hariyadi  R,  Estuningsih  S, Suhartono T. 2014. Stability and growth charac- teristic  of  GFPuv-labeled Cronobacter  saka- zakiii isolated  from  foods.  Food  Science Biotechnol  23:  1491-1496.  DOI:  10.1007/s100 68-014-0204-3.
Oliver  JD.  2009.  Recent  findings  on  the  viable  but nonculturable  state  in  pathogenic  bacteria –  a review. FEMS Microbiol Rev 34: 415-425. DOI: 10.1111/j.1574-6976.2009.00200.x.
Parizzi  SQF,  Andrade  NJd,  Silva  CAdS,  Soares NdFF,  Silva  EAMd.  2004.  Bacterial  adherence to  different  inert  surfaces  evaluated  by  epi- fluorescence  microscopy  and  plate  count method.  Braz  Arch  Biol  Technol  Microbiol  47: 77-83.  DOI:  10.1590/S1516-891320040001000 11.
Pasquaroli  S,  Zandri  G,  Vignaroli  C,  Vuotto  C, Donelli G, Biavasco F. 2013. Antibiotic pressure can induce the viable but nonculturable state in Staphylococcus  aureus growing  in  biofilms.  J Antimicrob Chemoth 68: 1812-1817. DOI: 10.10 93/jac/dkt086.
Pinto  D,  Almeida  V,  Santos  MA,  Chambel  L.  2011. Resuscitation  of Escherichia  coli VBNC  cells depends  on  a  variety  of  environmental  or chemical  stimuli.  J  Appl  Microbiol  110:  1601- 1611. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2011.05016.x.
Pinto D,  Santos  MA,  Chambel  L. 2013.  Thirty  years of  viable  but  nonculturable  state  research: Unsolved  molecular  mechanisms  [review].  Crit Rev  Microbiol  41:  1-16.  DOI:  10.3109/1040841 X.2013.794127.
Pratomo YA. 2015. Penggunaan Mutan C. sakazakii untuk  Kajian  Pembentukan  Biofilm  Multi- spesies.  [Tesis].  Bogor:  Fakultas  Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Ramamurthy  T,  Ghosh  A,  Pazhani  GP,  Shinoda  S. 2014.  Current  perspective  on  viable  but  non- culturable (VBNC) pathogenic bacteria. Frontier Public  Health  2:  1-9.  DOI:  10.3389/fpubh.20 14.00103.
Ray  B,  Bhunia  A.  2014.  Fundamental  Food  Micro- biology  5 th Ed.  99-115.  CRC  Press,  New  York, US.
Reissbrodt  R,  Rienaecker  I,  Romanova  JM,  Free- stone  PPE,  Haigh  RD,  Lyte  M,  Tschape  H, Williams PH. 2002. Resuscitation of Salmonella enterica Serovar  Typhimurium  and  entero- hemorrhagic Escherichia  coli from  the  viable but  nonculturable  state  by  heat-stable  entero- bacterial  autoinducer.  Appl  Environ  Microbiol 68: 4788-4794. DOI: 10.1128/AEM.68.10.4788- 4794.2002.
Senoh M, Ghosh-Banerjee, Ramamurthy T,
Hamabata  T,  Kurakawa  T,  Takeda  M,  Colwell RR,  Nair  GB,  Takeda  Y.  2010.  Conversion  of viable  but  nonculturable Vibrio  cholerae to  the culturable  state  by  co-culture  with  eukaryotic cells.  Microbiol  Immunol  54:  502-507.  DOI: 10.1111/j.1348-0421.2010.00245.x.
Shimomura O. 2009. Discovery of green fluorescent protein  (GFP)  (nobel  lecture).  Angew  Chem  Int Ed  48:  5590-5602.  DOI:  10.1002/anie.20090 2240.
Stewart  PS,  Franklin  MJ.  2008.  Physiological heterogeneity  in  biofilms.  Nat  Rev  Microbiol  6: 199-210. DOI: 10.1038/nrmicro1838.
Townsend  SM,  Hurrell  E,  Caubilla-Barron  J,  Loc- Carrillo C, Forsythe SJ. 2008. Virulence studies of Enterobacter  sakazakii isolates  associated with  a  neonatal  intensive  care  unit  outbreak. BMC Microbiol 8: 64. DOI: 10.1186/1471-2180- 8-64.
Wai SN, Mizunoe  Y, Takade  A,  Yoshida  S.  2000. A comparison of solid and liquid media for resus- citation  of  starvation-  and  low-temperature- induced  nonculturable  cells  of Aeromonas hydrophila .  Arch  Micorbiol  173:  307-310.  DOI: 10.1007/s002030000142.