## PENGARUH PROPORSI AIR DAN ETANOL SEBAGAI PELARUT TERHADAP AKTIVITAS ANTIOKSIDAN ANGKAK BIJI DURIAN DENGAN METODE PHOSPHOMOLYBDENUM DAN DPPH
(Effect of proportion of water and ethanol as solvent on antioxidant activity of durian seeds angkak with phosphomolybdenum and DPPH methods)
Christine Subianto a* , Ignatius Srianta a , Netty Kusumawati a
a Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya, Indonesia
* Penulis korespondensi Email: christine.subianto@gmail.com

## ABSTRACT
Angkak  is  rice  fermented  product  by  Monascus  sp.  Beside  rice,  durian  seeds  can  be  a  substrate  of Monascus sp. Monascus sp. produces some antioxidant metabolites during fermentation. The purpose of this research investigated the effect of proportion of water and ethanol as solvent for antioxidant activity of durian seeds angkak with phosphomolybdenum and DPPH method. The proportions of water and ethanol as  solvents  were  100:0  (E0)  ;  80:20  (E20)  ;  60:40  (E40)  ;  40:60  (E60)  ;  30:70  (E70)  ;  and  20:80  (E80) (v/v). ANO VA’s result (α=5%) showed that proportion of water and ethanol as solvent interacted pigment content and antioxidant activity of durian seeds angkak. Yellow pigment was dominant pigmen in durian seeds  angkak.  Ethanol  40%  was  most  effective  solvent  and  ethanol  80%  was  not  effective  solvent  to extraction  durian  seeds  angkak  pigment.  The  higher  antioxidant  activity  of  durian  seeds  angkak  was ethanol  40%  (0,5876  mg  AAE/g  sample  (wb))  for  DPPH  method  and  ethanol  0%  (6,7899  mg  AAE/g sample (wb) and 6,4247 mg GAE/g sample (wb)) for phosphomolybdenum method.
Keywords : water, ethanol, antioxidant activity, durian seeds angkak

## ABSTRAK
Angkak  merupakan  produk  fermentasi  dari  beras  oleh Monascus  sp. Substrat  selain  beras  yang  dapat digunakan yaitu biji durian. Monascus sp. selama fermentasi memproduksi senyawa metabolit, beberapa diantaranya  memiliki  aktivitas  antioksidan.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  pengaruh proporsi  air  dan  etanol  terhadap  aktivitas  antioksidan  angkak  biji  durian  dengan  metode phosphomolybdenum dan  DPPH.  Proporsi  air  dan  etanol  yang  digunakan  meliputi  100:0  (E0)  ;  80:20 (E20)  ;  60:40  (E40)  ;  40:60  (E60)  ;  30:70  (E70)  ;  dan  20:80  (E80)  (v/v).  Hasil  ANOVA  ( α  =  5%) menunjukkan adanya pengaruh antara perlakuan proporsi air dan etanol sebagai pelarut terhadap kadar pigmen  dan  aktivitas  antioksidan  angkak  biji  durian.  Hasil  pengujian  analisis  kadar  pigmen  didapatkan bahwa  pigmen  kuning  merupakan  pigmen  yang  paling  dominan  pada  angkak  biji  durian.  Pelarut  yang paling  efektif  untuk  melarutkan  pigmen  angkak  biji  durian  yaitu  etanol  40%,  sedangkan  pelarut  yang kurang efektif yaitu etanol 80%. Hasil pengujian analisis aktivitas antioksidan didapatkan bahwa aktivitas antioksidan angkak biji durian yang paling tinggi yaitu pada pelarut etanol 40% (0,5876 mg AAE/g sampel (wb)) untuk metode DPPH dan etanol 0% (6,7899 mg AAE/g sampel (wb) dan 6,4247 mg GAE/g sampel (wb)) untuk metode phosphomolybdenum .
Kata kunci : air, etanol, aktivitas antioksidan, angkak biji durian

## PENDAHULUAN
Stres  oksidatif  merupakan  keadaan karena  terjadi  perubahan  keseimbangan antara kapasitas pro-oksidan dan antioksidan.  Sel  dalam  tubuh  memiliki antioksidan  alami,  namun  saat  tubuh mengalami stres oksidatif diperlukan asupan antioksidan tambahan untuk menjaga  kecukupan  antioksidan  dalam tubuh.  Sumber-sumber  antioksidan  dapat berupa antioksidan sintetik maupun antioksidan  alami.  Salah  satu  bahan pangan  sumber  antioksidan  alami  yang banyak dikembangkan yaitu angkak.
Angkak  merupakan  produk  fermentasi  dari beras (substrat yang mengandung pati) oleh Monascus  sp. (Pattanagul et  al .,  2007). Monascus  sp. selama  fermentasi  akan menghasilkan  berbagai  macam  senyawa metabolit,  termasuk  senyawa  antioksidan. Angkak secara tradisional diproduksi secara fermentasi  padat  dengan  beras  sebagai substrat  yang  mengandung  pati  (Srianta et al .,  2012).  Banyak  substrat  lain  yang  dapat digunakan  sebagai  media  pertumbuhan Monascus , salah satunya yaitu biji durian. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui  aktivitas  antioksidan  angkak yang  diproduksi  dari  biji  durian.  Analisis antioksidan  yang  digunakan  yaitu  metode phosphomolybdenum dan  DPPH  (1,1- difenil-2-pikrilhidrazil). Metode DPPH merupakan  metode  yang  umum  digunakan dalam  menganalisis  aktivitas  antioksidan. Kedua metode ini memiliki mekanisme yang berbeda  saat  bereaksi  dengan  antioksidan, sehingga hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan kedua metode ini dapat digunakan  untuk  memprediksi  mekanisme kerja  senyawa  antioksidan  dalam  angkak biji durian.
Analisis
aktivitas antioksidan dilakukan  dengan  mengekstraksi  hasil metabolit  Monascus dalam  angkak  biji durian.  Pelarut  yang  digunakan  untuk mengekstrak  hasil  metabolit Monascus  sp. dalam  penelitian  ini  adalah  etanol  dalam berbagai macam konsentrasi. Etanol merupakan  pelarut  yang  sering  digunakan karena  harganya  yang  lebih  murah  dan
tidak  bersifat  toksik.  Konsentrasi  etanol yang digunakan yaitu 0, 20, 40, 60, 70, dan 80%.  Penetapan  konsentrasi  etanol  yang digunakan berdasarkan penelitian-penelitian lain  mengenai  angkak,  penelitian-penelitian tersebut  menggunakan  konsentrasi  etanol yang berbeda satu sama lain.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh proporsi  air  dan  etanol  sebagai  pelarut terhadap  aktivitas  antioksidan  angkak  biji durian dengan metode phosphomolybdenum dan DPPH.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam pembuatan dan ekstraksi angkak biji durian adalah  biji  durian  varietas  Petruk,  kultur murni Monascus sp. KJR 2, Sabouraud 4% Dextrose Agar (Merck 1.05438.0500), Sabouraud  2%  Dextrose  Broth (Merck 1.08339.0500),  larutan  Ca(OH) 2 5%  (b/v), akuades,  etanol  p.a  (Merck  1.00983.0000), alumunium  foil ,  kertas  saring  kasar,  kertas Whatman no.1  (Schleicher  &  Schuell),  dan kertas cokelat. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis meliputi: Saboraud 4%  Dextrose  Agar (Merck  1.05438.0500) dan  NaCl  0,85%,  metanol  p.a  (Merck 1.06009.2500), serbuk DPPH (Sigma Aldrich  D9132-1G),  asam  galat  (Merck 1.59630.0001),  vitamin  C  (Sigma  A5960- 100G), akuades, kertas lensa, dan alumunium  foil ,  asam  sulfat  pekat,  kristal Na 3 PO 4 ,  kristal  amonium  molibdat,  asam galat  (Merck  1.59630.0001),  dan  vitamin  C (Sigma A5960-100G).
Pembuatan  Kultur  Starter Monascus  sp. KJR 2
Monascus  sp. KJR  2  dalam  100  mL media SDB steril. SDB yang telah diinokulasi, kemudian  diinkubasi  pada  suhu kamar (30±1 o C) selama 10 hari.

## Pembuatan Angkak Biji Durian
Biji durian mula-mula disortasi, dicuci, ditimbang,  dan  direbus dalam  air kapur  5% (b/v):  air  yaitu  1:1.  Perebusan  dilakukan pada  suhu  85-90 o C  selama  10  menit.  Biji
Jurnal Teknologi Pangan dan Gizi Journal of Food Technology and Nutrition Vol 12 (2): 75-80, 2013.
durian kemudian dicuci (dengan air mengalir),  dikupas,  dipotong  (±  1  cm 3 ), ditimbang,  disterilisasi,  dan  didinginkan. Inokulasi  dilakukan  dengan  menambahkan 6%  (v/b)  kultur  starter  pada  biji  durian,  lalu diinkubasi  pada  suhu  kamar  (30±1 o C) selama 14 hari. Angkak biji durian kemudian dikeringkan pada suhu 45 o C selama 24 jam dan dilakukan pengecilan ukuran.
Ekstraksi  Angkak  Biji  Durian  dan  Biji Durian
Bubuk angkak biji durian dan biji durian mula-mula  ditimbang  dan  ditambahkan pelarut  (1:25)  berupa  akuades  (E0),  etanol 20%  (E20),  etanol  40%  (E40),  etanol  60% (E60),  etanol  70%  (E70),  dan  etanol  80% (E80).  Kemudian  dihomogenisasi  dengan shaking waterbath (30±1 o C, 200 rpm, 1 jam) dan  disentrifugasi  (27 o C,  5000  rpm,  30 menit).  Supernatan  kemudian  disaring dengan  kertas  saring Whatman no.1. Ekstrak  akan  digunakan  untuk  analisis kadar  pigmen,  analisis  total  fenol,  dan analisis antioksidan.

## Analisis Kadar Pigmen
Ekstrak angkak dan biji durian dengan berbagai macam konsentrasi etanol sebagai pelarut  masing-masing  sebanyak  ±  4  mL dimasukkan  dalam  kuvet  dan  diukur abso rbansinya  pada  λ  =  392  nm  (pigmen kuning),  λ  =  470  nm  (pigmen  oranye),  λ  = 501  nm  (pigmen  merah),  dan  λ  =  517  nm (untuk  koreksi  data  analisis  DPPH).  Data absorbansi  ini  kemudian  dinyatakan  dalam satuan Absorbance  Unit per  gram  sampel (AU/g).

## Analisis Aktivitas Antioksidan dengan metode DPPH
Sampel  (ekstrak  angkak  biji  durian dan  biji  durian)/standar  sebanyak  3,8  mL ditambahkan  0,2  mL  larutan  DPPH  (50  mg dalam100 mL atau 500 ppm) dalam tabung reaksi dan didiamkan (ruang gelap) selama 30  menit,  kemudian  diukur  absorbansinya pada λ = 517 nm. Standar yang digunakan dalam  analisis  ini  yaitu  vitamin  C  dengan
konsentrasi  0,  3,  4,  5,  10,  dan  15  ppm. Aktivitas  antioksidan  sampel  yang  diukur dinyatakan dalam ekuivalen miligram vitamin  C  per  gram  sampel  (mg  AAE/g (wb)).

## Analisis Aktivitas Antioksidan dengan
Metode Phosphomolybdenum . 4 mL mixed solution (0,6 M H 2 SO 4 , 28 mM Na 3 PO 4 , dan 4 mM Amonium Molibdat) dimasukkan  dalam  tabung  reaksi  dan ditambahkan 0,4 mL sampel/standar, kemudian  dihomogenisasi  dan  diinkubasi selama  60  menit  pada  suhu  95 o C.  Setelah inkubasi,  dilakukan  pengukuran  absorbansi sampel  pada  λ  =  725  nm.  Standar  yang digunakan  untuk  analisis  yaitu  asam  galat dan vitamin C dengan konsentrasi 100, 200, 300, 400, dan 500 ppm. Aktivitas antioksidan  dalam  angkak  biji  durian dinyatakan dalam miligram ekuivalen miligram  asam  galat  (GAE)  per  gram sampel (mg GAE/g) dan vitamin C per gram sampel (mg AAE/g (wb)).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  (Gambar 1.  dan  Tabel  1.),  didapatkan  bahwa  pigmen kuning  merupakan  pigmen  yang  paling dominan  dibandingkan  pigmen  yang  lain pada  angkak  biji  durian.  Puspitadewi  (2012) dalam penelitiannya juga menyatakan pigmen  kuning  merupakan  pigmen  yang dominan  diproduksi  oleh Monascus  sp. KJR 2 pada media biji durian Petruk. Pelarut yang paling  efektif  untuk  melarutkan  pigmen angkak  biji  durian  yaitu  etanol  40%  (v/v). Ankaflavin  (pigmen  kuning)  merupakan senyawa polar, dimana senyawa ini memiliki atom  O  yang  dapat  berikatan  dengan  atom H yang ada pada etanol 40% dengan ikatan hidrogen.  Menurut  Timotius  (2004),  pigmen merah, kuning, dan oranye memiliki kelarutan  yang  rendah  dalam  air.  Jika pigmen-pigmen  tersebut  bereaksi  dengan gugus amino akan menghasilkan cincin piran sehingga  larut  dalam  air.  Dengan  demikian diduga  bahwa  pigmen  yang  diproduksi  oleh
Monascus  sp. Selama  fermentasi  bereaksi dengan  gugus  amino  pada  biji  durian  yang mengandung  protein  sebesar  2,6%  (Srianta et al. , 2012) sehingga kelarutannya dalam air meningkat.  Namun  keterbatasan  jumlah gugus amino dalam biji durian menyebabkan kelarutan  dalam  air  tidak  terlalu  tinggi, sehingga lebih larut pada etanol 40%. Selain itu  juga  terdapat  pigmen-pigmen  lain  yang larut pada etanol 40%.
Tabel 1. Kadar Pigmen Angkak Biji Durian
Perlakuan Pigmen Kuning (AU/g) Pigmen Oranye (AU/g) Pigmen Merah (AU/g) E0 E20 E40 E60 E70 E80
1,1213 d
1,1033 d 1,1784 e
0,8153 c
0,6910 b 0,5107 a 0,6038 d 0,6008 d 0,6198 e
0,4253 c 0,3800 b 0,2865 a 0,4643 c
0,5483 d
0,6075 e
0,4788 c
0,4340 b
0,3458 a Keterangan: Notasi yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata pada α = 5%
Gambar 1. Analisis Kadar Pigmen Angkak Biji Durian Aktivitas antioksidan angkak biji durian dengan  metode  DPPH  yang  paling  tinggi yaitu  0,5876  mg  AAE/g  sampel  (wb)  pada pelarut  etanol  40%  (v/v)  (E40)  (Tabel  2). Dengan  demikian  pelarut  yang  paling  efektif untuk melarutkan senyawa-senyawa antioksidan  pada  angkak  biji  durian  yaitu etanol  40%,  sedangkan  pelarut  yang  kurang efektif untuk melarutkan yaitu etanol 0% atau akuades  ketika  diuji  dengan  metode  DPPH. Hal  tersebut  berkaitan  dengan  kelarutan seyawa antioksidan, struktur antioksidan, dan kepolaran  senyawa  antioksidan  tersebut. Menurut Kurnia (2010) daya melarutkan yang tinggi berhubungan dengan kepolaran pelarut dan  kepolaran  senyawa  yang  diekstraksi.
Pelarut yang bersifat polar mampu mengekstrak  senyawa  alkaloid  kuartener, komponen  fenolik,  karotenoid,  tanin,  gula, asam amino, dan glikosida (Harborne, 1987). Selain  itu,  senyawa  golongan  flavonoid bersifat  polar,  sehingga  larut  pelarut  yang bersifat polar.
Aktivitas  antioksidan  angkak  biji  durian yang paling tinggi yaitu pada etanol 0% (v/v) (E0)  dengan  nilai  6,7899  mg  AAE/g  sampel (wb)  dan  6,4247  mg  GAE/g  sampel  (wb). Sedangkan  aktivitas  antioksidan  yang  paling rendah  ditunjukkan  pada  etanol  80%  (v/v) (E80) dengan nilai 3,9452 mg AAE/g sampel (wb)  dan  3,8150  mg  GAE/g  sampel  (wb) (Tabel 2). Hal tersebut dikarenakan perbedaan jumlah dan senyawa yang terlarut dalam  tiap-tiap  pelarut.  Selama  pengujian dengan  metode phosphomolybdenum terjadi pemanasan  yaitu  pada  tahap  inkubasi  pada suhu  95 o C  selama  60  menit.  Berdasarkan adanya  pemanasan  tersebut,  maka  diduga bahwa  senyawa  antioksidan  yang  terdapat dalam angkak biji durian yang diukur aktivitas antioksidannya dengan metode phosphomolybdenum merupakan  senyawa antioksidan  yang  tahan  panas,  seperti lovastatin dan pigmen kuning. Tabel 2. Aktivitas Antioksidan Angkak Biji Durian dengan Metode DPPH dan Phosphomolybdenum Perlakuan DPPH (mg AAE/g (wb)) Phosphomolybdenum mg AAE/g (wb) mg GAE/g (wb) E0 E20 E40 E60 E70 E80 0,3366 a 0,4314 b 0,5876 e 0,5292 c 0,5609 d 0,5061 c 6,7899 e 6,3796 d 6,1514 d 5,5519 c 5,1357 b 3,9452 a 6,4247 e 5,9753 d
5,7253 d
5,5747 c
5,1188 b 3,8150 a Keterangan:  Notasi  yang  berbeda  pada kolom  yang  sama  menunjukkan  perbedaan nyata pada α = 5%
Berdasarkan  Tabel  3.  dan  Tabel  4. didapatkan  bahwa  kadar  pigmen  kuning, oranye,  merah,  serta  aktivitas  antioksidan dengan metode DPPH pada biji durian lebih rendah  dibandingkan  pada  angkak  biji durian.  Hal  ini  membuktikan  bahwa  selama
Jurnal Teknologi Pangan dan Gizi Journal of Food Technology and Nutrition Vol 12 (2): 75-80, 2013.
fermentasi, Monascus  sp. menghasilkan senyawa  metabolit  berupa  pigmen  dan senyawa-senyawa antioksidan.
Berdasarkan  Tabel  4.,  didapatkan bahwa  pada  pelarut  etanol  0,  20,  40,  dan 60%, aktivitas antioksidan biji durian dengan metode phosphomolybdenum lebih  tinggi dibandingkan angkak biji durian. Sedangkan pada pelarut 70 dan 80% aktivitas antioksidan  angkak  biji  durian  lebih  tinggi dibandingkan biji durian. Hal ini dikarenakan senyawa-senyawa antioksidan yang terkandung  dalam  biji  durian  maupun  yang
diproduksi  oleh Monascus  sp. selama fermentasi memiliki karakteristik yang berbeda  yaitu  peka  terhadap  pH,  cahaya, panas  serta  kelarutan  yang  berbeda. Berdasarkan  data  yang  didapat,  biji  durian mengandung  senyawa  antioksidan  berupa senyawa  fenol  yang  diduga  memberikan kontribusi  aktivitas  antioksidan  pada  angkak biji  durian.  Dengan  demikian  senyawa antioksidan yang ada pada angkak biji durian selain berasal dari hasil metabolit Monascus sp., juga berasal dari biji durian.
Tabel 3. Kadar Pigmen Biji Durian dan Angkak Biji Durian Perlakuan Pigmen Kuning (AU/g) Pigmen Oranye (AU/g) Pigmen Merah (AU/g) Angkak Biji Angkak Biji Angkak Biji E0 E20 E40 E60 E70 E80 1,1213 1,1033 1,1784 0,8153 0,6910 0,5107 0,2773 0,2866 0,2568 0,1618 0,1351 0,0823 0,6038 0,6008 0,6198 0,4253 0,3800 0,2865 0,1505 0,1740 0,1380 0,0890 0,0865 0,0667 0,4643 0,5483 0,6075 0,4788 0.4340 0,3458 0,1263 0,1430 0,1110 0,0868 0,0720 0,0559
Tabel 4. Aktivitas Antioksidan Biji Durian dan Angkak Biji Durian dengan Metode DPPH dan
Phosphomolybdenum Perlakuan DPPH Phosphomolybdenum Angkak Biji Angkak Biji Angkak Biji mg AAE/g (wb) mg AAE/g (wb) mg GAE/g (wb) mg AAE/g (wb) mg GAE/g (wb) E0 E20 E40 E60 E70 E80 0,3366 0,4314 0,5876 0,5292 0,5609 0,5061 0,2362 0,3243 0,4942 0,4980 0,4922 0,4940 6,7899 6,3796 6,1514 5,5519 5,1357 3,9452 6,4247 5,9753 5,7253 5,5747 5,1188 3,8150 9,1568 7,5902 8,0114 5,8552 5,0295 2,3970 9,0170 7,3012 7,7625 5,4009 5,0025 2,1193

## KESIMPULAN
Pigmen  kuning  merupakan  pigmen dominan  dalam  angkak  biji  durian.  Pelarut yang paling efektif untuk melarutkan pigmen angkak  biji  durian  yaitu  etanol  40%. Aktivitas  antioksidan  angkak  biji  durian dengan  metode  DPPH  yang  paling  tinggi yaitu 0,5876 mg AAE/g sampel pada pelarut etanol  40%,  sedangkan  dengan  metode phosphomolybdenum yaitu  pada  etanol  0% dengan nilai 6,7899 mg AAE/g (wb) sampel dan 6,4247 mg GAE/g (wb) sampel.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada
Direktorat Penelitian dan Pengabdian  Masyarakat  (DP2M)  DIKTI Departemen  Pendidikan  Nasional  yang telah membiayai penelitian ini melalui Hibah Bersaing  2012  dengan  nomor  kontrak 0006/SP2H/PP/K7/KL/II/2012.

## DAFTAR PUSTAKA
Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia Edisi Kedua. Bandung: ITB.
Kurnia, R. 2010. Ekstraksi dengan Pelarut.
http://lordbroken.wordpress.com/2010/02/17 /ekstraksi-pelarut/ (8 November 2012) Pattanagul,  P.,  R.  Pinthong,  dan  A.
Phianmongkhol. 2007. Review of Angkak Production ( Monascus purpureus ). Chiang Mai Journal
Science. 34(3):319-328.
Puspitadewi,  S.R.D.  2012.  Pola  Produksi Pigmen Monascus  sp. KJR  2  pada Media  Biji  Durian  Varietas  Petruk melalui  Fermentasi  Padat.  Skripsi  S-1. Fakultas Teknologi Pertanian.
Universitas  Katolik  Widya  Mandala Surabaya. Surabaya. Srianta,  I.,  B.  Hendrawan,  N.  Kusumawati, dan  P.J.  Blac.  2012.  Study  on  Durian Seed  as  A  New  Substrate  For  Angkak Production. International Food Research
Journal. 19(3):941-945.
Timotius,  K.H.  2004.  Produksi  Pigmen
Angkak oleh Monascus . Jurnal
Teknologi dan Industri Pangan. 15(1):1- 8.