## Indonesian Journal of Chemical Research
http://ojs3.unpatti.ac.id/index.php/ijcr

## Sintesis Tetrapeptida Linear (DPAP) Menggunakan Metode Sintesis Peptida Fasa Padat (SPPS) Dan Aktivitas Insektisidanya Terhadap Ulat Krop Kubis
Synthesis of A Linear Tetrapeptide  (DPAP) Using Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) Methode and Insecticidal Activity Toward Cabbage Cluster Caterpillar
Eka Fitri Yanti 1,2 , Rani Maharani 3 *
1 Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Bondowoso, Jl. Diponegoro No.247 Bondowoso
2 Program studi Studi Farmasi Stikes Harapan Bangsa Jember, Jl. Slamet Riyadi No.64 Patrang-Jember
3 Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Padjadjaran Jl. Raya Bandung Sumedang KM.21, Jatinangor
* Corresponding Author: r.maharani@unpad.ac.id
Received: 2020-1-15
Received in revised: 2020-4-30 Accepted: 2020-5-1
Available online: 2020-5-31

## Abstract
Crop cabbage worm (Crocidolomia pavonana) is one of the pests that has a bad effect on  the  cabbage  production  in  Indonesia.  One  of  the  efforts  that  has  been  applied  to control this pest is by using bayrusil. However, the bayrusil can cause negative effects such  as  poisoning  and  environmentally  polluting  effects.  To  prevent  the  undesired effects, it has been developed the use of environmentally friendly insecticide and one of them is the use of insecticidal peptide. Tripsin-modulating oostatic factor (TMOF) and ist  analogues  is  one  of  the  peptides  that  has  an  insecticidal  activity.  The  aim  of  this research is to synthesise a linear tetrapeptide (DPAP) an analogues of TMOF and to test insecticidal activities against crop cabbage worm.  A DPAP has been synthesised by Solid Phase Peptide Synthesis on 2-chlorotrytil chloride resin. Fmoc strategy was applied on the synthesis and a combination DIC/Oxime was employed in the coupling reaction.The tetrapeptidyl resin was cleaved by TFA:water:EDT (90:5:5). The peptide was purified by reverse-phase column chromatography and characterized by TOF ES- MS  spectroscopy.  A  linear  peptide  was  biologically  tested  towards  the  C.  pavonana, showing percentage of mortality values at 1000 ppm.
Keywords: Tetrapeptide, TMOF, Solid phase peptide synthesis, 2-chlorotrytil chloride, Crocidolomia pavonana.

## Abstrak (Indonesian)
Ulat  krop  kubis  ( Crocidolomia  pavonana )  merupakan  salah  satu  hama  yang  dapat menurunkan  produksi  kubis  di  Indonesia.  Salah  satu  upaya  pengendalian  hama  ulat krop kubis adalah penggunaan bayrusil. Namun hal ini memiliki dampak negatif yaitu dapat  menimbulkan  pencemaran  udara,  gangguan  kesehatan  dan  residu  pada  produk pangan.  Salah  satu  upaya  untuk  mengurangi  dampak  tersebut  adalah  penggunaan insektisida  yang  ramah  lingkungan  seperti  insektisida  golongan  peptida.  Tripsin- modulating  oostatic  factor  (TMOF)  dan  analog  merupakan  salah  satu  peptida  yang memiliki  aktivitas  insektisida.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  menyintesis  linear tetrapeptida  (DPAP)  yang  merupakan  analog  dari  TMOF  serta  menguji  aktivitas insektisida  terhadap  ulat  krop  kubis.  DPAP  telah    berhasil  disintesis  menggunakan metode sintesis peptida fasa padat pada resin 2-klorotritilklorida. Dalam sintesis DPAP digunakan strategi gugus pelindung Fmoc dan kombinasi DIC/Okxima sebagai reagen kopling.  Pelepasan  peptida  dari  resin  menggunakan  TFA:air:EDT  (90:5:5),  dimana peptida  di  murnikan  menggunakan  metode  kromatografi  kolom  terbalik  dan dikarakterisasi dengan  spektroscopi TOF ES-MS.
Kata  Kunci:  Tetrapeptida,  TMOF,  sintesis  peptida  fasa  padat,  2-klorotritilklorida, Crocidolomia pavonana.

## PENDAHULUAN
Indonesia  merupakan  negara  yang  terdiri  dari beribu-ribu  pulau  dengan  kekayaan  hasil  alamnya yang  memiliki  banyak  manfaat.  Penggunaan  bahan alam  dipercaya  dapat  menyembuhkan  penyakit, sehingga  masyarakat  banyak  memanfaatkan  sebagai pengobatan  (Aeni  dkk.,  2017).  Selain  itu  bahan  alam juga  dimanfaatkan  pada  sektor  pertanian.  Indonesia yang  beriklim  tropis  sangat  cocok  untuk  bidang pertanian.  Data  menunjukkan  lebih  dari  26,13  juta rumah  tangga  memiliki  usaha  di  bidang  pertanian. Jika  dibandingkan  dengan  data  tahun  2003,  jumlah tersebut  mengalami  penurunan  sebesar  5,04  juta rumah  tangga  (BPS,  2013).  Bidang  usaha  di  bidang pertanian  sangatlah  luas  dan  tentunya  menjadikan hasil pertanian sangat banyak dan beragam. Salah satu hasil pertanian yang melimpah adalah kubis ( Brassica oleracea ).
Berdasarkan  Pusat  Data  dan  Sistem  Informasi Pertanian  pada  tahun  2013,  produksi  kubis  di Indonesia pada tahun 2000-2011 mengalami peningkatan  sebesar  2,05%.  Namun,  di  pulau  Jawa pada tahun 2011 justru mengalami penurunan sebesar 0,33%.  Salah  satu  penyebab  penurunan  produksi kubis  tersebut  adalah  hama  ulat  krop  kubis ( Crocidolomia  pavonana ).  Ulat  krop  kubis  dapat menyebabkan  penurunan  produksi  kubis  sebesar 65,0% (Sari dan Prijono, 2004). Bahkan pada musim kemarau  penurunan  produksi  kubis  mencapai  100% (Uhan, 2007).
Upaya  yang  sudah  dilakukan  petani  dalam mengendalikan  ulat  krop  kubis  adalah  penggunaan insektisida  sintesis,  seperti  bayrusil  yang  merupakan golongan pestisida karbamat (Anonim, 1993). Namun hal  ini  memiliki  dampak  negatif  yaitu  dapat menimbulkan pencemaran udara, gangguan kesehatan dan residu pada produk pangan (Indraningsih, 2008).
Salah  satu  upaya  untuk  mengurangi  dampak tersebut  adalah  dengan  mengoptimalkan  penggunaan bahan  alam  yang  tersedia  (Sohilait  dkk.,  2013). Sehingga  penggunaan  bahan  alam  yang  memiliki aktivitas  insektisida  sangatlah  mungkin  karena  lebih ramah lingkungan dan berpotensi mengalami degradasi  secara  alami  (Arnason  dkk.,  1993). Salah satu  insektisida  yang  dapat  digunakan  adalah insektisida  dari  golongan  peptida  yaitu trypsin- modulating  oostatic  factor (TMOF).  TMOF  dan beberapa  analognya  telah  terbukti  memiliki  aktivitas insektisida  pada  larva  nyamuk  (Borovsky,  2003)  dan larva Tobacco  budworm ( Heliothis  virescens ; Lepidoptera)  (Nauen  dkk.,  2002)  yang  bekerja melalui penghambatan biosintesis tripsin.
TMOF  merupakan  suatu  dekapeptida  (Pro-Pro- Pro-Pro-Pro-Pro-Ala-Pro-Asp-Tyr) yang dapat diisolasi  dari  ovarium  nyamuk Aedes  aegypty betina (Borovsky  dkk.,  1993).  Namun,  Produksi  TMOF lebih  efisien  dengan  sintesis  dibandingkan  dengan mengisolasi  dari  ovarium  nyamuk A.  aegypty betina untuk  beberapa  alasan  di  antaranya  yaitu  prosedur kerja  yang  cukup  panjang  sehingga  membutuhkan waktu yang cukup lama.
TMOF telah berhasil disintesis dengan menggunakan  metode  sintesis  peptida  fasa  larutan (Borovsky dan Nauen, 2007). Namun sintesis TMOF dan analog menggunakan metode sintesis fasa larutan memiliki beberapa kelemahan, misalnya membutuhkan  material  awal  banyak,  secara  teknis menghabiskan  banyak  waktu  karena  setiap  tahap reaksi membutuhkan pemurnian, dan efisiensi kopling kurang dari 90% (Walker dan Rapley, 2008). Sintesis peptida  juga  dapat  dicapai  menggunakan  metode sintesis peptida fasa padat. Sintesis peptida fasa padat merupakan suatu teknik sintesis peptida menggunakan  penyangga  padat.  SPPS  memiliki beberapa  keuntungan  diantaranya    tidak  dibutuhkan pemurnian  pada  setiap  tahap  reaksi,  sehingga  waktu sintesis yang dibutuhkan lebih sedikit (Scott, 2009).
TMOF  dan  analog  (YDPAPPP,  PP,  PPPPPP, APPPPPP)  telah  berhasil  disintesis  menggunakan metode  SPPS.  TMOF  dan  analog  hasil  sintesis menunjukkan  aktivitas  insektisida  dengan  persentase mortalitas  sebesar  13,33%,  30%,  23,33%,  30%  dan 23,33%  terhadap Crocidolomia  pavonana (Maharani dkk.,  2015;  Maharani  dan  Yanti,  2016;  Maharani dkk.,  2016).  Berdasarkan  (Borovsky,  2003),  analog tetrapeptida  DPAP  (H-Asp-Pro-Ala-Pro-OH)  dari TMOF  memberikan  aktivitas  insektisida  terhadap larva  nyamuk  yang  cukup  signifikan.  Sehingga pemilihan  analog  DPAP  diharapkan  memiliki aktivitas  insektisida  yang  lebih  baik  dibandingkan TMOF dan analog lainnya yang telah disintesis.
Senyawa  DPAP  disintesis  menggunakan  metode sintesis fasa padat dengan strategi Fmoc, seperti yang diaplikasikan  pada  sintesis  TMOF  dan  analog ((YDPAPPP,  PP,  PPPPPP,  APPPPPP).  Senyawa DPAP  hasil  sintesis  akan  dimurnikan  menggunakan kromatografi fasa  terbalik  dan  dikarakterisasi  dengan spektroskopi  massa.  Sintesis  senyawa  tetrapeptida DPAP  menggunakan  metode  SPPS  belum  pernah dilakukan,  sehingga  diharapkan  dapat  memberikan informasi  baru  tentang  insektisida  dari  golongan peptida yang lebih mudah disintesis.

## METODOLOGI

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah tabung sintesis peptida fasa padat, freeze dryer, rotary evaporator,  shaking  incubator ,  desikator, analytical (RP-HPLC), spektrometer massa, dan alat gelas yang umum digunakan di laboratorium. Bahan-bahan yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  resin  2- klorotritil klorida, diklorometana (DCM), dimetilformamida (DMF), N-N -diisopropilkar- bodiimida  (DIC), N-N -diisopropiletilamina  (DIPEA), Fmoc-prolin-OH, Fmoc-alanin-OH, Fmoc-asam aspartat( t -Bu)-OH, trifluoroacetic  acid (TFA),  etil  2- siano-2-(hidroksiimino)asetat/oksima, eter, n -heksana, metanol,  piperidin,  kloroform,  asam  asetat,  kloranil, asetaldehid,  silica  GF 254 ,  ODS  RF18,  plat  ODS,  plat silica  GF 254 dan larva Crocidolomia  pavonana instar pertama .

## Prosedur kerja

## Penempelan asam amino pertama pada resin
Sebanyak 0,5 g resin 2-klorotritil klorida (1,0-1,6 mmol  klorida/g  resin)  disuspensikan  kedalam  ke dalam  larutan  DCM,  kemudian  dikocok  selama  5 menit  dan  disaring.  Larutan  0,5  mmol  Fmoc-P-OH dan 1,25 mmol DIPEA dilarutkan dalam 4 mL DCM ditambahkan ke resin yang kemudian dikocok selama 30  menit  pada  suhu  ruang.  Resin  disaring,  kemudian dicuci  dengan  DMF  dan  DCM.  Sebanyak  5  mL campuran  larutan  DCM/metanol/DIPEA  (80:15:5)  di tambahkan  ke  resin  yang  kemudian  dikocok  selama 10  menit.  Resin  di  saring  dan  perlakuan  diulangi sekali lagi. Resin dicuci dengan DMF dan DCM lalu disaring.

## Pelepasan gugus pelindung Fmoc
Reagen pelepas gugus pelindung Fmoc (piperidin 25%  dalam  DMF(v/v))  ditambahkan  hingga  resin terendam  dan  campuran  reaksi  dikocok  selama  2 menit yang kemudian reagen pelepas gugus pelindung dikeluarkan  dengan  cara  filtrasi.  Reagen  pelepas gugus  pelindung  yang  baru  ditambahkan  kembali, dikocok,  dan  dikeluarkan.  Perlakuan  ini  dilakukan hingga  4-5  kali.  Lepasnya  gugus  pelindung  Fmoc ditandai  dengan  tidak  adanya  noda  pada  uji  KLT  di bawah  sinar  UV  pada  panjang  gelombang  254  nm. Setelah itu resin dicuci dengan DMF dan DCM.

## Penyusunan fragmen peptida
Sebanyak
0,8077 g Fmoc-Alanin-OH
(4  ekuivalen)  dan  0,3682  g  oksima  (4  ekuivalen) ditambahkan  5  mL  DMF  dan  dikocok  hingga  larut. Sebanyak 0,4456 mL DIC (4 ekuivalen) ditambahkan
dan  diaduk  secara  menyeluruh  hingga  larutan berwarna  kuning  dan  larutan  tidak  panas.  Larutan dicampurkan  dengan  resin  dalam  tabung  sintesis  dan diaduk  perlahan  selama  24  jam  (overnight). Keberhasilan sintesis ditunjukkan dengan uji kloranil. Hasil uji negatif (reaksi kopling sempurna) ditunjukkan  dengan  larutan  tidak  berwarna  dengan butiran resin berwarna kekuning-kuningan. Selanjutnya  resin  dicuci  menggunakan  DMF  dan DCM.  Lalu  dilanjutkan  ke  tahap  pelepasan  gugus Fmoc.    Urutan  asam  amino  berikutnya  yaitu,    Fmoc- prolin-OH dan Fmoc-Asp(t-bu)-OH, disusun menggunakan  prosedur  kopling  dan  pelepasan  gugus pelindung  Fmoc  hingga  didapatkan  rantai  peptida yang sesuai.
Pelepasan Peptida Dari Gugus Samping dan Resin Peptida yang telah disusun kemudian dilepas dari resin menggunakan 10 mL campuran TFA : air : EDT (90:5:5)  dalam  diklorometana  dan  diaduk  selama  45 menit  pada  suhu  ruang.  lepasnya  peptida  dari  resin ditandai  dengan  berubahnya  warna  resin  menjadi merah terang. Resin disaring dan dicuci menggunakan 7 mL TFA campuran TFA : air : EDT (90:5:5) dalam diklorometana.  Filtrat  yang  diperoleh  dipekatkan menggunakan  rotary  evaporator.  Padatan  peptida yang diperoleh kemudian dikarakterisasi menggunakan spektrofotometer massa.

## Uji Aktivitas Biologi Terhadap Ulat Krop Kubis
Uji  ini  bertujuan  untuk  menentukan  korelasi antara  konsentrasi  sampel  dengan  tingkat  kematian dari  larva  C.pavonana.  Sampel  diujikan  pada konsentrasi 1000 ppm. Dua pasang daun kubis dengan ukuran 4x4 cm direndam dalam campuran larutan dan dikeringkan.  Setelah  larutan  diuapkan,  dua  pasang daun ditempatkan dalam cawan petri dengan diameter 9 cm dan dibungkus dengan kertas saring. Kemudian setelah  10  detik,  larva  C.  pavonana  instar  pertama ditempatkan pada setiap cawan petri. Setiap hari larva diberi  makan  daun  tanpa  perlakuan  hingga  mencapai instar  4.  Observasi  selesai  setelah  perlakuan  selama 48 jam hingga larva mencapai instar ke 4.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sintesis  senyawa  tetrapeptida  (DPAP)  dilakukan dengan  menggunakan  metode  sintesis  peptida  fasa padat  dengan  strategi  Fmoc.  Skema  sintesis  peptida dengan  metode  SPPS  dilakukan  dengan  beberapa tahapan  yaitu loading  resin ,  deproteksi  gugus pelindung,  kopling  dan  pelepasan  peptida  dari  resin ( clevege ), seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.

## Gambar 1 Diagram alir SPPS (Walker dan Rapley, 2008)
Pada  sintesis  DPAP  fasa  padat  (resin)  yang digunakan  adalah  resin  2-klorotritil  klorida  yang memiliki  gugus  yang  meruah  sehingga  dapat mengurangi  terjadinya  rasemisasi  dan  menekan pembentukan  diketopiperazin  (Chan  dan  White, 2000).
Setiap  penyusunan  rantai  peptida  digunakan kombinasi  reagen  kopling  DIC/oksima.  Kombinasi DIC/oksima digunakan sebagai reagen kopling karena menghasilkan  intermediet O -asilisourea  yang  bersifat labil  dan  mudah  terbentuk  ester  aktif  yang memudahkan pembentukan ikatan peptida. Perpanjangan  rantai  peptida  dilakukan  dari  ujung-C ke ujung-N. Hal ini disebabkan perpanjangan dengan arah sebaliknya sangat rentan terhadap reaksi samping rasemisasi. Rasemisasi dapat menyebabkan perubahan konfigurasi  absolut  dari  asam  amino  penyusun peptida (Chan dan White, 2000).

## Pengikatan asam amino pertama pada resin
Pengikatan asam amino Fmoc-Pro-OH pada resin 2-klorotritil  klorida  dilakukan  dengan  menambahkan campuran Fmoc-Pro-OH dan DIPEA dalam diklorometana  ke  resin,  dimana  sebelumnya  resin telah  dikembangkan  dalam  diklorometana.  Reaksi yang  terjadi  pada  proses  pengikatan  asam  amino pertama  tidak  melibatkan  aktivasi  gugus  karboksil sehingga  mencegah  rasemisasi.  Reaksi  yang  terjadi adalah reaksi asam basa antara DIPEA dan Fmoc-Pro- OH (Gambar 2). Selanjutnya nukleofil yang terbentuk akan menggantikan atom klorida pada atom kuartener resin 2-klorotritil klorida sehingga asam amino terikat pada  resin.  Resin  2-klorotritil  klorida  memiliki kemampuan  mencegah  terbentuknya  diketopiperazin seiring  dengan  meruahnya  gugus  aktif  pada  resin tersebut (Chan dan White, 2000).
Gambar 2. Reaksi pengikatan asam amino prolin sebagai ujung terminal C ke resin 2-klorotritil klorida (Chan dan White, 2000; Maharani dan Yanti, 2016)
Gambar 3. Reaksi pelepasan gugus Fmoc dari asam amino sehingga membentuk gugus amino bebas (Chan dan White, 2000).
Reaksi  pengikatan  asam  amino  pada  resin dilakukan  selama  4  jam.  Hal  ini  bertujuan  untuk memaksimalkan  pengikatan  asam  amino  pada  resin. Tahap  selanjutnya  adalah  menambahkan  metanol, yang bertujuan untuk menutup gugus aktif resin yang belum  berikatan  dengan  asam  amino  dengan  gugus metoksi. Pengikatan gugus metoksi ini bertujuan agar asam amino selanjutnya tidak terikat pada gugus aktif resin  yang  masih  tersisa,  melainkan  perpanjangan rantai  peptida  pada  asam  amino  prolin  yang  telah terikat pada resin.

## Pelepasan gugus pelindung Fmoc
Pelepasan  gugus  pelindung  Fmoc  dilakukan dengan  menambahkan  20%  piperidin  dalam  DMF selama  30  menit.  Reaksi  (Gambar  3)  dimulai  dengan pengambilan  atom  hidrogen  dari  cincin  fluoren  oleh piperidin  yang  berperan  sebagai  basa,  sehingga terbentuk  intermediet  aromatik  siklopentadiena. Intermediet  ini  mudah  terurai  menjadi  senyawa dibenzofulvena dan karbonkdioksida, sehingga dihasilkan suatu gugus amino bebas (Chan dan White, 2000).
Lepasnya gugus pelindung Fmoc dapat dimonitoring  dengan  tidak  adanya  noda  pada kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  dibawah  sinar  UV
(254 nm). Hal ini dikarenakan gugus pelindung Fmoc memiliki dua cincin benzena dengan elektron π yang terdelokalisasi diantara kedua cincin benzena tersebut. Delokalisasi  elektron  π  menyebabkan  gugus pelindung  Fmoc  berpendar  di  bawah  sinar  UV  (254 nm).

## Penyusunan Peptida Linear
Penyusunan rantai peptida menggunakan kombinasi  reagen  kopling  DIC/oksima.  Penggunaan reagen  kopling  DIC/oksima  dipilih  karena  memiliki
kemampuan  menekan  rasemisasi  dan  memiliki efisiensi  kopling  tinggi.  Langkah  pertama  yang dilakukan yaitu menambahkan reagen kopling oksima ke  asam  amino  kedua  (Fmoc-Ala-OH),  serta melarutkan  kedua  campuran  tersebut  dalam  pelarut DMF.  Selanjutnya  DIC  ditambahkan  ke  dalam campuran  reaksi  dan  dikocok  hingga  terjadi perubahan warna, suhu dan kekentalan. Perubahan ini menunjukkan  bahwa  ester  aktif  oksima  asam  amino Fmoc-Ala-OH telah terbentuk.
Keberhasilan kopling ditunjukkan dengan berubahnya  warna  resin  menjadi  biru  pada  uji kloranil.  Hal  ini  disebabkan  gugus  NH  (amina sekunder) telah bereaksi dengan  kloranil. Sedangkan
Tabel 1. Uji aktivitas insektisida senyawa DPAP terhadap C. Pavonana
perlakuan 0 jam 24 jam 48 jam 72 jam 96 jam Mortaliti (%) Hidup   mati  Hidup   mati  Hidup   mati  Hidup   mati  Hidup   mati Kontrol 30 0 30 0 30 0 30 0 29 1 3,33 DPAP 30 0 30 0 30 0 28 2 28 2 13,33
Gambar 4. Skema sintesis DPAP (a) 25% piperidin dalam DMF, 30 menit (b) (1) Fmoc-Pro, DIC/oksima, DMF (2) 25% piperidin dalam DMF, 30 menit (c) (1) Fmoc-Ala, DIC/oksima, DMF (2) 25% piperidin dalam DMF, 30 menit (d) Fmoc-Asp, DIC/oksima, DMF (2) 25% piperidin dalam DMF, 30 menit (e) TFA:air:EDT (90:5:5)
pada  uji  KLT  kesempurnaan  reaksi  ditandai  dengan munculnya  noda  pada  panjang  gelombang  254  nm yang  berasal  dari  gugus  pelindung  Fmoc  dari  asam amino  kedua.  Hasil  identifikasi  uji  kloranil  dan  KLT yang  saling  mendukung  menunjukkan  reaksi  kopling sudah sempurna. Langkah selanjutnya adalah deproteksi  Fmoc  menggunakan  piperidin  20%  dalam DMF.
Penambahan  dua  asam  amino  selanjutnya dilakukan  dengan  tahapan  reaksi  yang  sama  dengan sebelumnya  (kopling  dan  deproteksi  Fmoc).  Skema sintesis  senyawa  tetrapeptida  DPAP  secara  lengkap ditunjukkan pada Gambar 4.

## Pelepasan Peptida Dari Gugus Samping dan Resin
Sebelum  pelepasan  peptida  dari  resin,  dilakukan sampling  resin-Pro-Ala-Pro-Asp-NH  ditambahkan beberapa  tetes  TFA  :  air  :  EDT  (90:5:5)  dalam diklorometana. Kemudian larutan dianalisis menggunakan TOF ES-MS yang memberikan puncak ion  molekul  senyawa  DPAP  [M+H] + pada  399,0171. Adanya puncak senyawa DPAP menunjukkan sintesis berhasil  sehingga  peptida  siap  untuk  dilepaskan  dari resin.
Senyawa  tetrapeptida  dilepaskan  dari  resin menggunakan  10  mL  campuran  TFA  :  air  :  EDT (90:5:5)  dalam  diklorometana  selama  45  menit. Lepasnya  peptida  dari  resin  ditandai  dengan berubahnya warna resin menjadi merah terang. Filtrat yang  diperoleh  disaring  dan  dipekatkan,  sehingga didapatkan  krud  sebanyak  205  mg.  Selanjutnya, sampling sedikit krud dari peptida untuk dilakukan uji
KLT  yang  bertujuan  kemurnian  peptida  yang dihasilkan.
Hasil  uji  KLT  menunjukkan  banyaknya  noda sehingga menunjukkan senyawa peptida belum murni, sehingga dilakukan pemurnian menggunakan kromatografi  fasa  terbalik  dengan  ODS  (oktadesil) yang  bersifat  non  polar.  Penggunakan  kromatografi fasa  terbalik  karena  peptida  yang  memiliki  banyak gugus  polar  berpotensi  membentuk  ikatan  hidrogen dengan  gugus  silanol  pada  silika  gel  dan  terbentuk ekor  yang  lebar,  sehingga  peptida  akan  sulit  terpisah dari pengotornya.
Oleh sebab itu digunakan ODS yang  merupakan gugus  non  polar  (C 18 ).  Pada  struktur  ODS  masih memiliki  gugus  SiO  yang  berpotensi  berikatan hidrogen  dengan  peptida.  Namun  dalam  hal  ini
ditambahkan  TFA  pada  eluen  yang  bertujuan  untuk memprotonasi  gugus  silan  sehingga  menekan  adanya ikatan hidrogen (Chan dan White, 2000).
Gambar 5. Hasil uji KLT dengan ODS dari DPAP
Peptida  hasil  pemurnian  selanjutnya  diuji  KLT menunjukkan  adanya  satu  noda  yang  berarti  peptida telah murni (Gambar 5). Senyawa peptida murni yang didapatkan berupa serbuk putih dengan berat 86,4 mg.
Peptida  murni  tersebut  selanjutnya  di  analisis menggunakan  TOF  ES-MS,  larutan  dianalisis menggunakan TOF ES-MS yang memberikan puncak ion molekul [M+H] + pada 399,0171 (Gambar 6). Data tersebut  sesuai  dengan  penelitian  sebelumnya  yaitu
senyawa  tetrapeptida PADY. Kedua senyawa tetrapeptida ini hanya memiliki satu asam amino yang berbeda  yaitu  tirosin  pada  PADY  digantikan  dengan prolin pada DPAP. Pada sintesis PADY menunjukkan adanya  puncak  ion  molekul  [M+H] + pada  465,1917 dan  [M+Na] + 487,1471  (Sumiarsa  dkk.,  2019). Dengan  demikian,  hasil  karakterisasi  spektroskopi massa  telah  dapat  memastikan  bahwa  senyawa target (DPAP)  telah  berhasil  disintesis  menggunakan metode SPPS dengan rendemen 10,85%.
Senyawa  peptida  H-Pro-Ala-Pro-Asp-NH  murni kemudian  dilakukan  uji  hayati  terhadap  ulat  krop kubis  ( C.  pavonana ).  Konsentrasi  senyawa  peptida yang  digunakan  adalah  1000  ppm  dengan  dosis  200 µL  yang  dioleskan  pada  daun  kubis  berukuran  4x4 cm. Observasi dilakukan selama 48 jam hingga larva mencapai instar ke 4. Persentasi mortalitas penghambatan  pertumbuhan  ulat  krop  kubis  oleh senyawa peptida sebesar 13,33% (Tabel 1).  Hasil ini
menunjukkan bahwa senyawa peptida H-Pro-Ala-Pro- Asp-NH  tidak  efektif  dalam  mengontrol  dan menghambat  pertumbuhan  ulat  krop  kubis    ( C. pavonana ).
Gambar 6. Hasil analisis spektrofotometer massa (TOF ES-MS) senyawa H-Pro-Ala-Pro- Asp-NH yaitu adanya puncak ion molekul [M+H] + pada 399,0171.

## KESIMPULAN
Senyawa  tetrapeptida  linear    (DPAP)  berhasil disintesis  menggunakan  metode  sintesis  peptida  fasa padat  (SPPS)  dengan  rendemen  yang  dihasilkan sebesar  10,85%.  Keberhasilan  sintesis  ditunjukkan dengan  analisis  menggunakan  TOF  ES-MS  yang memberikan  puncak  ion  molekul  senyawa  DPAP [M+H] + pada  399,0171.  Senyawa  tetrapeptida  linear (DPAP)  tidak  efektif  dalam  mengontrol  dan menghambat  pertumbuhan  larva  ulat  krop  kubis  ( C. pavonana ) dengan persentasi mortalitas 13,33%.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada  Indonesian  Toray  Science  Foundation  (ITSF) yang telah memberikan hibah penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Arnason,  J.  T.,  Mackinnon,  S.,  Durst,  A.,  Philogene, B.  J.  R.,  Hasbun,  C.,  Sanchez,  P.,  Poveda,  L., Roman,  L.  S.,  Isman,  M.  B.,  Satasook,  C., Towers,  G.  H.  N.,  Wiriyachitra,  P.,  and McLaughlin, J. L., 1993. Insecticides in Tropical Plants  with  Non-neurotoxic  Modes  of  Action.
Conference
Proceedings .
Phytochemical
Potential  of  Tropical  Plants,  Downum  K.R., Romeo  J.T.,  Stafford  H.A.:  Springer,  Boston, MA, 107-131.
Borovsky,  D.,  2003.  Trypsin-Modulating  Oostatic Factor:  a  Potential  New  Larvicide  for  Mosquito Control. J.  Experimental  Bio., 206  (21),  3869- 3875.
Borovsky,  D.,  Carlson,  D.  A.,  Griffin,  P.  R., Shabanowitz,  J.,  and  Hunt,  D.  F.,  1993.  Mass Spectrometry  and  Characterization  of Aedes Aegypty Trypsin  Modulating  Oostatic  Factor (TMOF) and Its Analogs. Insec Biochem. Molec.
Biol, 23 (6), 703-712.
Borovsky,  D.,  and  Nauen,  R.,  2007.  Biological  and
Biochemical Effec Of Organo-Synthetic
Analogues  Of  Tripsin  Modulating  Oostatic Factor  (TMOF)  on Aedes  aegypty , Heliothis virescent and Plutella  xylostella , Pestycydy, 3
(4), 17-26.
BPS.,  2013. Data  Sosial  Ekonomi  [Laporan Bulanan], Badan  Pusat  Statitik,  Republik Indonesia, Jakarta.
Chan,  W.  C.,  and  White,  P.  D.,  2000. Fmoc  Solid Phase  Peptide  Synthesis. New  York:  Oxford University Press.
Aeni H.M., N., Soekamto, N. H., dan Firdaus., 2017.
Uji  Fitokimia  dan  Toksisitas  Ekstrak  Kloroform
Kulit  Batang Melochia  umbellata (Houtt.)  Stapf var.  Visenia  dengan  Metode Bhrine  Shrimp Lethality Test (BSLT). Indo. J. Chem. Res., 4 (2), 382-385.
Indraningsih, 2008. Pengaruh Penggunaan Insektisida Karbamat  Terhadap  Kesehatan  Ternak  dan Produknya, Wartazoa, 18 (2), 101-114. Anonim,  1993. Budidaya  Tanaman  Kubis . Lembar  Informasi  Pertanian  (LIPTAN)  BIP Irian Jaya, Jayapura .
Maharani, R., Hardianto, A., Ishmayana, S., Yanti, E. F., M, D.  I. M., Sihotang,  D., Puspitasari, L. T., and  Dono,  D.,  2016.  Synthesis  Of  Three Analogues  Of  Trypsin-Modulating  Oostatic Factor  (TMOF)  And  Screening  Of  Their Insecticidal Properties Towards Cabbage Cluster Caterpillar, Inter.  J.  Scientific  &  Tech.  Res., 5 (05), 147-150.
Maharani,  R.,  dan  Yanti,  E.  F.,  2016.  Sintesis Heptapeptida  Linear  (H-Tyr-Asp-Pro-Ala-Pro- Pro-Pro-OH) Dengan Menggunakan DIC/Oksima  Sebagai  Reagen  Pengkopling. Al- Kimia, 4 (1), 1-12.
Maharani, R., Yanti, E. F., M, D. I. M., and Sihotang, D.,  2015.  Synthesis  of  Trypsin-modulating Oostatic  Factor  (TMOF)  and  its  analogues  by Solid-phase Peptide Synthesis Using DIC/Oxyma  as  Coupling  Reagent, Procedia Chem., 17, 125-131. Nauen,  R.,  Sorge,  D.,  Sterner,  A.,  and  Borovsky,  D., 2002. TMOF-Like Factor Controls the
Biosynthesis  of  Serine  Proteases  in  the  Larval Gut  of Heliothis  virescens, Archives  of  Insect Biochem. and Phy., 49, 65.
Sari, N. J., and Prijono, D., 2004. Perkembangan dan Reproduksi Crocidolomia pavonana (F.)
(Lepidoptera:  Pyralidae)  pada  Pakan  Alami  dan Semi  Buatan, Hama  dan  Penyakit  Tumbuhan Tropika, 4 (2): 53-61.
Scott, P. J. H., 2009. Linker Strategies in Solid-Phase Organic  Synthesis, Wiley  &  Sons  Ltd. Chichester.
Sohilait, M. R., Sohilait, H. J., dan Fransina, E., 2013.
Sintesis  Senyawa  Tabir  Surya  3,4-metilendioksi Isoamil  Sinamat  Dari  Minyak  Kulit  LAwang. Indo. J. Chem. Res., 1 (1), 1-5.
Sumiarsa,  D., Marpaung, C.,  Zainuddin,  A.,  Hidayat, A.  T.,  Harneti,  D.,  Nurlelasari,  Supratman,  U., dan  Maharani,  R.,  2019.  Sintesis  Tetrapeptida PADY  menggunakan  Metode  fasa  Padat  dan Aktivitas  Antioksidannya, J.  Kimia  Valensi, 5 (1), 87-96.
Uhan, T. S., 2007. Efikasi Ekstrak Kasar Baculovirus Crocildolomia  Pavonana  terhadap  Ulat  Krop Kubis di Rumah Kaca, Hort, 17 (3), 253-260.
Walker,  J.  M.,  and  Rapley,  R.,  2008. Molecular Biomethods  Handbook,  2 nd Edition. Humana Press. Totowa.