## TOKSISITAS 2-METHOXYETHANOL PADA SPERMATOGENESIS MENCIT BALB-C
Putu Oky Ari Tania Bagian Biomedik
Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya

## Abstract
The  research  was  designed  to  find  out  the  toxicity  of  2-methoxyethanol  (2-ME)  to  the number  of  spermatogenic  cells.  Ten  mice  divided  into  2  groups,  control  group  was administered by 0.5 % CMC (negative control) and treatment group were administered by 2-ME  dose  100  mg/kg  body  weight.  Days  thirteenth  until  sixty  thirth,  the  mice  were administered by aquabides orally, andat  the end of the treatment, the mice were sacrified. The number of spermatogenic cells were observated histologically with  Hematoxylin-Eosin staining.  The  observation  shows  that  2-ME  decreases  the  number  of  spermatogenic  cells, especially  spermatocyte  I.  Exposure  of  2-ME  destructs  anatomy  of  tubulus  seminiferusin testicular, which is affects degradation of ephitellium and atopy of testicular.
Keyword :  Spermatogenic  cells,  spermatogonium,  spermatocyte  I,  round  spermatid,  2- Methoxyethanol

## PENDAHULUAN
Akumulasi  sejumlah  bahan  toksik  di  lingkungan,  terjadi  seiring  meningkatnya industri dan pabrik. Bahan toksik  yang terakumulasi tersebut dapat mengganggu kesehatan manusia dengan berbagai hambatan metabolisme tubuh. Dua methoxyethanol (2-ME) adalah salah  satu  contoh  senyawa glycol  ether yang  juga  dikenal  sebagai ethylene  glycol monomethyl  ether (EGME).  Senyawa  ini  secara  luas  digunakan  sebagai  pelarut  bahan organik berbahan dasar air  pada industri dan peralatan rumah tangga (Starek et al., 2010).
Senyawa 2-ME tidak ditemukan secara alamiah di lingkungan karena keberadaannya di  alam  merupakan  hasil  aktivitas  industry  dan  pabrik.  Senyawa  ini  dapat  masuk  ke  dalam tubuh  melalui  beberapa  cara  yaitu  melalui  kulit,  inhalansi  atau  terhirup,  tercampur  pada bahan makanan. Di dalam tubuh 2-ME mengalami metabolisme menjadi methoxyacetic acid (MAA) dengan bantuan katalisator alkohol dehidrogenase (ADH) dan aldehid dehidrogenase (ALDH). Metabolit 2-ME yang berupa MAA inilah yang bersifat toksik (Irnidayanti, 2010).
Pemaparan  MAA  pada  hewan  jantan  dapat  menyebabkan  gangguan  pada  sistem reproduksi  khususnya  pada  testis.  Gangguan  terutama  pada  proses  spermatogenesis, degenerasi  epitel  germinal,  infertilitas,  morfologi  spermatozoa  yang  abnormal,  juga  dapat menyebabkan apoptosis pada spermatosit (Yoon et al ., 2001, Tirado et al ., 2003).
Spermatogenesis  merupakan  proses  perubahan  dari  spermatogonia  menjadi spermatozoa  matur  yang  terspesialisasi  di  dalam  testis.  Spematogenesis  adalah  proses  yang terjadi  dalam rangka produksi gamet jantan (Wistuba et  al., 2007).  Pada testis, MAA dapat menghambat  sintesis  DNA  terutama  spermatosit  pakiten.  Pada  testis  tikus  prepubertal, kematian  sel  yang  paling  mencolok  pada  sel  spermatosit  pakiten.  Induksi  MAA  juga mengakibatkan apoptosis dengan target utama pada spermatosit pakiten (Barone et al., 2005). Spermatosit  pakiten  merupakan  sel  yang  paling  aktif  mensintesis  RNA,  dan  memerlukan laktat  sebagai  energinya.  Keberadaan  MAA  dapat  mengganggu  produksi  laktat  pada  sel Sertoli (Hayati et al ., 2005).
Kematian  sel  germinal  dengan  jalur  apoptosis  akibat  2-ME  selama  spermatogenesis mengakibatkan  peningkatan  protein  kinase,  selain  itu  juga  dapat  meningkatkan    aktivasi voltage-operated  calcium  channel (VOCC)  tipe  P/  Q  pada  sel  Sertoli  (Jindo, et  al., 2001). Beberapa  peneliti  menyatakan  bahwa  apoptosis  dipengaruhi  oleh  sintesis  makromolekular. Apoptosis  ini  diregulasi  oleh  beberapa  jalur  sinyal  transduksi  intraseluler,  diantaranya  ion kalsium, protein kinase A (PKA) dan protein kinase C (PK) (Jindo, et al ., 2001).
Pemberian MAA menyebabkan terjadinya peningkatan protein kinase. Protein kinase menyebabkan terjadinya diferensisasi, pertumbuhan, metabolisme dan apoptosis sel. Menurut Barone  (2005),  Jalur  apoptosis  spermatosit  oleh  MAA  terjadi  karena  meningkatnya  protein kinase  yang  dipengaruhi  oleh  konsentrasi  Ca 2+ yaitu myosin  light-chain  kinase (MLCK). Peningkatan  MLCK  ini  diimplikasikan  dengan  peningkatan  Ca 2+ dalam  sel  ( overload Ca 2+ ) sehingga dapat  mengganggu  keseimbangan ion  Ca 2+ di  dalam sel.  Gangguan keseimbangan ion  Ca 2+ dapat  menurunkan  metabolisme  sel  yang  pada  akhirnya  menyebabkan  apoptosis. Selain  itu  peningkatan  Ca 2+ intraseluler  juga  dapat  memodulasi  aktivitas  Calmodulin  (Ca 2+ yang  dapat  mengatur  aktivitas  kinase).  Calmodulin  berfungsi  untuk  memediasi  translokasi protein pro apoptotic (protein Bad), sehingga dapat mengakibatkan apoptosis sel.
Apoptosis yang diinduksi oleh 2-ME  melalui jalur voltage-operated calcium channel (VOCC).  Pemberian  MAA  dapat  mengaktivasi  VOCC  tipe  P/  Q  pada  sel  Sertoli.  Aktivasi
tersebut  mengakibatkan  terjadinya  transfer  aktif.  Clusterin  adalah  protein  yang  diproduksi oleh sel  Sertoli  dan berasosiasi  terhadap kerusakan sel,  juga  sebagai  indikator apoptosis  sel germinal.  Apabila  terjadi  aktivasi  VOCC  pada  sistem  reproduksi,  akan  mengakibatkan terjadinya transfer protein Clusterin dari sel Sertoli ke sel germinal. Transfer protein tersebut menyebabkan terjadinya akumulasi protein pada sitoplasma spermatosit  yang mengakibatan terjadinya apoptosis (Barone et al ., 2005).
Apoptosis  yang  terjadi  pada  spermatosit  dapat  menurunkan  jumlah  sel  spermatozoa dan  pada  akhirnya  dapat  mengakibatkan  penurunan  kualitas  spermatozoa  yang  mungkin berdampak  pada  infertilitas.  Selanjutnya  penelitian  ini  dilakukan  untuk  membuktikan toksisitas 2-ME pada spermatogenesis mencit BALB-C, terutama pada histologi testisnya.

## BAHAN DAN METODE

## BAHAN
Penelitian ini menggunakan hewan coba yaitu mencit ( Mus musculus ) jantan dewasa yang  berumur  6  -  8  minggu,  strain  BALB/C  dan  rentang  berat  badan  25-35  g  sebanyak  10 ekor, yang diperoleh dari bagian pemeliharaan hewan percobaan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.  Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  senyawa  2-ME,  produksi Wako Co., Jepang, akuabides. Bahan untuk pembuatan preparat histologi yaitu bahan fiksasi neutral  buffered  formaline ,  akuades,  etanol  bertingkat  yaitu  70%,  80%,  dan  96%,  akuades, xylol, parafin, alkohol asam, pewarna ganda Harris’s Hematoxylin-Eosin, albumin, entellan

## ALAT
Alat  yang  digunakan  selama  penelitian  ini  adalah  timbangan  elektrik  digital  merek OHAUS  Adventurer, rotary  vacuum  evaporator , paraffin  bath merek  Sakura, rotary microtome merek  Microm  HM  315,  mikroskop  cahaya  merek  Olympus  cx  21,  dan hand counter, waterbath merek Julabo TW8, paraffin oven merek Sakura.

## METODE

## Gambar 1. Skema pembagian kelompok
Dua  puluh  ekor  mencit  jantan  dengan  berat  25-30  gram  dibagi  menjadi  2  kelompok yaitu  kelompok  kontrol  dan  perlakuan.  Kelompok  kontrol  diinjeksi  subkutan  dengan akuabides  selama  12  hari,  dilanjutkan  dengan  pemberian  CMC  secara gavage .  Kelompok perlakuan  di  berikan  injeksi  2-ME  secara  subkutan,  yang  diberikan  dengan  dosis  setara dengan 100 mg/kg bb/hari selama 12 hari, lalu perlakuan dihentikan. Hari ke 13 dilanjutkan dengan  pemberian  CMC  secara gavage selama  51  hari.  Pada  hari  ke  64,  pada  kelompok kontrol dan perlakuan, semua mencit dikorbankan dan diambil testisnya untuk dibuat sediaan histologinya, yaitu dengan metode parafin dan pewarnaan Haematoxylin-Eosin .
Metode penghitungan dan pengambilan data diperoleh dengan cara menghitung jumlah sel spermatogenik meliputi spermatogonium, spermatosit I dan spermatid bundar dalam satu tubulus seminiferus. Pengumpulan data dilakukan dengan mengamati sediaan testis di bawah mikroskop  cahaya  dengan    perbesaran  400  x.  Dalam  satu  sediaan,  berisi  sepasang  irisan testis,  dengan  setiap  sediaan  diamati  sebanyak  lima  lapang  pandang  secara  acak.  Setiap lapang  pandang  diamati  satu  tubulus  seminiferus  bentuk  bundar  dengan  kriteria  jenis  sel spermatogenik mengacu pada tahap 7 dari siklus epitel (Franca et al., 1998).

## HASIL
Preparat  testis diamati dan dihitung jumlah sel  spermatogeniknya, meliputi jumlah sel spermatogonium,    spermatosit  I,  dan  spermatid  bundar.  Hasil  penghitungan  jumlah  sel spermatogenik dapat dilihat pada Tabel 1.
Hewan
coba
Kontrol
2-ME
Akuabides CMC 0,5 % CMC 0,5 % Pengambilan testis 12 hari 51 hari Perlakuan Pengambilan testis
25µm 25µm A B 1 1 2 2 3 3 Tabel  1.  Rerata  jumlah  sel  spermatogenik  pada  kelompok  kontrol  dan  kelompok Perlakuan
Kelompok perlakuan Rerata jumlah sel + SD Spermatogonium Spermatosit I Spermatid bundar Kontrol 41,71 + 3,14 a 34,51 + 4,15 b 81,50 + 11,34 ab Perlakuan 40,66 + 2,31 a 29,50 + 1,58 a 80,02 + 7,44 a
superscript berbeda menunjukkan beda signifikan
Jumlah spermatogonium pada kontrol lebih tinggi dibanding perlakuan, namun tidak ada beda  yang  signifikan.  Jumlah  spermatid  bundar  tidak  terdapat  perbedaan  signifikan  antara kelompok  kontrol  dan  perlakuan.  Jumlah  spermatosit  I  antara  kontrol  dan  perlakuan menunjukkan beda yang signifikan, yaitu terjadi penurunan jumlah spermatosit I yang cukup tajam pada kelompok perlakuan yang diberikan 2-ME.
Gambar 2. Penampang melintang tubulus seminiferus. A: kelompok kontrol; B: kelompok perlakuan. 1: spermatogonium; 2: spermatosit I; 3: spermatid bundar, 400x,

## Hematoxylin-Eosin
Pengaruh 2-ME pada jumlah sel spermatogenik dapat dilihat pada kelompok perlakuan. Gambar  2.  menunjukkan  bahwa  pada  kontrol,  sel  spermatogenik  tersusun  rapi  dengan kepadatan  sel  yang  tinggi.  Spermatogonium  tersusun  atas  1  lapis,  spermatosit  I  tersusun  1-2 lapis  dan  spermatid  tersusun  atas  2-3  lapis,  sebaliknya  pada  kelompok  perlakuan,  letak  sel spermatogenik  tampak  tidak  beraturan  dengan  kepadatan  sel  yang  rendah.  Pengaruh  2-ME tampak paling berpengaruh pada spermatosit I, dibuktikan melalui jumlah spermatosit I yang
menurun jika dibanding  dengan kelompok kontrol. Spermatosit I pada kelompok kontrol ini hanya tersusun atas 1 lapisan.

## DISKUSI
Metabolit  2-ME  yaitu  MAA  dapat  membahayakan  sel  spermatogenik,  terutama spermatosit  pakiten  (Hayati et  al .,  2005),  sama  seperti  yang  dilaporkan  oleh  Barone et  al., (2005) bahwa MAA menginduksi  apoptosis  pada sel  spermatogenik terutama spermatosit  I. Spermatogenesis  merupakan  proses  perubahan  dari  spermatogonia  menjadi  spermatozoa matur  yang  terspesialisasi  di  dalam  testis  (Wistuba et  al., 2007).  Proses  ini  dikendalikan secara langsung  oleh hormon testosteron,  yang  secara tidak langsung dikendalikan oleh  LH dan FSH.
Pengaruh  2-ME  terhadap  spermatogenesis  dapat  dilihat  pada  kelompok  kontrol  dan perlakuan.  Jumlah  sel  spermatogenik  pada  perlakuan  selalu  lebih  rendah  jika  dibandingkan dengan  kontrol.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  2-ME  mampu  menghambat  spermatogenesis yang ditunjukkan dengan penurunan jumlah sel spermatogenik.
Pengaruh 2-methoxyethanol pada  jumlah  sel  spermatogenik  yang  nampak  terutama pada  spermatosit  I.  Pengaruh  yang  terjadi  ditandai  dengan  penurunan  jumlah  spermatosit  I pada  perlakuan.  Terjadi  penurunan  jumlah  spermatosit  yang  signifikan  pada  kelompok perlakuan  dibanding  dengan  kontrol  yang  hanya  diberi  pelarut  akuabides,  sedangkan  jumlah spermatogonium dan spermatid bundar tidak menunjukkan penurunan yang berbeda nyata.
Spermatosit  merupakan  sel  pertama  yang  dipengaruhi  oleh  pemaparan  2-ME  dan penurunan jumlah spermatosit karena kematian sel melibatkan apoptosis (Jindo et al ., 2001). Spermatosit I adalah sel yang paling peka terhadap 2-ME (Hayati et al ., 2005). Dua belas jam setelah  pemaparan  2-ME  hampir  50  %  spermatosit  I  mengalami  apoptosis  pada  tahap-tahap spesifik, hal ini menunjukkan bahwa spermatosit adalah target utama untuk 2-ME (Tirado et al ., 2003).
Pengaruh  2-ME  terhadap  penampang  melintang  tubulus  seminiferus  (Gambar  2.B), terjadi penurunan kepadatan spermatosit I. Pemaparan 2-ME pada hewan jantan menyebabkan atropi  pada  testis,  degenerasi  pada  epitel  germinal,  menyebabkan  infertilitas,  dan  morfologi spermatozoa yang abnormal (Yoon et al ., 2001).

## KESIMPULAN
Pemberian  2-ME  pada  mencit  BALB-C  berpengaruh  terhadap  spermatogenesis,  yaitu terjadi  penurunan  jumlah  sel  spermatogenik,  terutama  pada  sel  spermatosit  I.  Penurunan jumlah  sel  spermatosit  I  diduga  melibatkan  apoptosis  sel. Dua  methoxyethanol juga memperngaruhi anatomi dari tubulus seminiferus testis, yang ditandai dengan degradasi epitel dan menyebabkan atropi pada testis.

## DAFTAR PUSTAKA
Barone,  F.,  S.  Aguanno,  and  D.  Agostino.  Modulation  of  MAA-induced  apoptosis  in  male germ cells : Role of sertoli cells P/Q-type calcium channels, Reproductive Biology and Endocrinology . 2005. 3: 13
Franca,  L.  R.,  T.  Ogawa,  M.  R.  Avarbock,  R.  L.  Brinster,  and  L.  D.  Russell.  Germ  Cell Genotype  Controls  Cell  Cycle  During  Spermatogenesis  in  The  Rat, Biology  of Reproduction . 1998. 59: 1371 – 1377.
Hayati,  A.,  D.  Any,  and  I.  B  Rai  Pidada.  Spermatozoa  motility  and  morphological  recovery process  in  mice  after  the  induction  of  2-methoxyethanol, Folia  Medica  Indonesia . 2005. 41 (2) : 90-95.
Irnidayanti, Y. Expression of Vimetin Protein and Neurofilamen on Forelimb Buds of Black-6 mice  on  Gestation  Day  12  Induced  by  2-Methoxyethanol  by  RT-PCR, Bioscience . 2010. 2(3) : 116-120
Jindo, T., R.N. Wine, Ling-Hong Li, and R.E. Chapin. Protein Kinase Is Central to Rat Germ Cell Apoptosis Induced by Meth oxyacetiv Acid, Toxicologic Patholoy .  2001. 29 : 607 – 616.
Starek,  A.,  K.  Miranowicz-  Dzierżawska,  B.  Starek-Świechowicz1.  Interactive  effect  of combined exposure to ethylene glycol ethers and ethanol on hematological parameters in rats, Health. 2010. 2(9) : 1054-1064.
Tirado,  O.M.,  E.D.  Martinez,  O.C.  Rodriguez,  M.  Danielsen,  D.M.  Selva,  J.  Reventos,  F. Munell and C.A. Suarez-Quian. Methoxyacetic acid disregulation of androgen receptor and  androgen-binding  protein  expression  in  adult  rat  testis, Biology  of  Reproduction . 2003. 68 : 1437-1446.
Wistuba,  J.,  J.  B.  Stukenborg,  C.  M.  Luetjens.  Mammalian  Spermatogenesis, Functional Development and Embyology. 2007. 1(2) : 99-117.
Yoon,  C.  Y.,  C.  M.  Hong,  J.  Y.  Song,  Y.  Y.  Cho,  K.  S.  Choi,  B.  M.  Lee,  and  C.  K.  Kim. Effect  of  Ethylene  Glycol  Monoethyl  Ether  on  the  Spermatogenesis  in  Pubertal  and Adult Rats, Veteranary Science. 2001. 2 (1) : 47-51.
Reviewer Dr. Dorta Simamora, M.Si