## Profil Protein Spermatozoa Setelah Pembekuan
M. Dwi Susan 1) , Sri Rahayu 1)
1) Laboratorium Biomolekuler dan Seluler, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universits Brawijaya, Malang 65145, JawaTimur, Indonesia. E-mail: dwi.susan1990@gmail.com

## ABSTRAK
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  profil  protein  spermatozoa  sebelum  dan  setelah pembekuan.  Protein  spermatozoa  diisolasi  dari  10  sampel  sapi  Friesian  holstein  dengan  pemisahan fraksi atas dan bawah hasil sentrifugasi. Profil protein kemudian dianalisis menggunakan SDS PAGE dengan  konsentrasi  separating  gel  12,5%.  Data  yang  diperoleh  dianalisis  secara  deskriptif  dengan membandingkan  profil  protein  spermatozoa  sebelum  dan  setelah  pembekuan.  Hasil  analisis menunjukkan bahwa pada fraksi atas semen segar ditemukan 12 pita protein spermatozoa dengan berat molekul 144, 128, 99, 90, 83, 59, 31, 20, 14, 12, 10 dan 9 kDa, dan pada semen beku ditemukan 8 pita protein spermatozoa dengan berat molekul 144, 128, 99, 90, 83, 59, 31, 14 dan 12 kDa. Sementara itu pada fraksi bawah semen segar ditemukan 16 pita protein dengan berat molekul 128, 116, 103, 90, 75, 69, 48, 40, 31, 26, 20, 14, 10, 9, 7 dan 6 kDa, dan 11 pita protein dengan berat molekul 128, 116, 103, 90,  75,  69,  48,  40,  31,  20  dan  14  kDa  pada  semen  beku.  Dari  penelitian  yang  telah  dilakukan  dapat disimpulka  bahwa  terdapat  perbedaan  profil  protein  spermatozoa  sebelum  dan  setelah  pembekuan yang dilihat dari variasi berat molekul protein pada masing – masing perlakuan.
kata kunci : pembekuan, protein, SDS PAGE, spermatozoa.

## ABSTRACT
The  aims  of  this  research  was  to  determine  protein  profile  of  spermatozoa  before  and  after  freezing. Spermatozoa  proteins  was  isolated  from  10  sample  Friesian  holstein  using  separate  upper  and  lower fraction  of  sentrifugation  result.  Protein  profiles  was  analysed  by  SDS  PAGE  with  separating  gel 12,5%.  Data  was analyzed  descriptively  by  comparing of spermatozoa protein profiles  of before and after  freezing.  The  result  showed  in  upper  fraction  of  fresh  semen  found  12  protein  bands  with moleculer  weight  of  144,  128,  99,  90,  83,  59,  31,  20,  14,  12,  10,    9  kDa  and  frozen  semen  found  8 protein bands with moleculer weight of 144, 128, 99, 90, 83, 59, 31, 14, 12 kDa. In the lower fraction of fresh semen found 16 protein bands with molecular weight of 128, 116, 103, 90, 75, 69, 48, 40, 31, 26, 20, 14, 10, 9, 7, 6 kDa, and 11 protein bands with molecular weights of 128, 116, 103, 90, 75, 69, 48,  40,  31,  20  14  kDa  in  frozen  semen.  In  conclusion,  there  were  differences  protein  profiles  of spermatozoa  before and  after  freezing semen are seen from  variation  of  moleculer  weight  protein  on each treatments.
key words : protein, SDS PAGE, spermatozoa.

## PENDAHULUAN
Bioteknologi  yang bisa digunakan  untuk meningkatkan populasi sapi dalam  negeri adalah inseminasi  buatan  (IB).  IB  dilapangan  banyak menggunakan  semen  beku  hasil  pembekuan dengan  pertimbangan  masa  simpan  lebih  lama dan  pelaksanaannya  lebih  mudah  dibandingkan dengan  semen  segar.  Namun  pada  beberapa kasus, pembekuan dan thawing dapat menginduksi kerusakan spermatozoa yang berakibat  pada  penurunan  kualitas  (Zilli  et  al, 2005)  seperti  penurunan  motilitas  sebesar  40%
(Tanaka  et  al,  2000),  peningkatan  abnormalitas dan  penurunan  viabilitas  sebesar  20-30% (Dhanju  et  al,  2001),  penurunan  integritas membran  plasma  (Nishizono  et  al,  2000), peningkatan kesalahan kondensasi kromatin, dan peningkatan  fragmentasi  DNA  (Yildiz  et  al, 2007).  Adanya  penurunan  kualitas  spermatozoa akan  mengakibatkan  penurunan  kemampuan fertilisasi spermatozoa (Zilli, 2005).
Penurunan  kualitas  spermatozoa  selama pembekuan dan thawing salah satunya disebabkan  oleh    peningkatan  kadar  reactive oxygen species (ROS). Hasil produk ROS seperti
70 kDa 25 kDa 260 kDa 70 kDa 40 kDa 10 kDa
Peroksida lipid akan merusak struktur dan fungsi membran dengan mengacaukan struktur fosfolipid dan fluiditas membran (Atiken, 1995). Peningkatan  Ca2+  ekstra  dan  intraseluler  dan adanya  peroksida  lipid  pada  membran  fosfolipid akhirnya akan mengubah struktur dan terdegradasinya membran (Awda, 2009). Terdegradasinya membrane menyebabkan kerusakan  komponen  sel  yang  penting  seperti DNA dan protein.
Kerusakan  DNA  oleh  peroksida  lipid seperti pembukaan  cincin,  fragmentasi  dan  cross linking protein-DNA dan pemecahan untai DNA akan  menyebabkan  sel  mengalami  mutasi  atau letal  (Awda,  2009).  Selain  itu,  hasil  peroksidasi lipid  seperti  malondialdehyde  (MDA)  dan  4- hydroxynonenol juga memicu terjadinya modifikasi  oksidasi  protein  yang  dapat  merusak enzim active sites, merusak konformasi struktural protein dan menyebabkan protein tidak folding atau kesalahan folding untuk membentuk struktur aslinya (Kumar et al, 2010). Adanya perubahan atau hilangnya susunan protein selama pembekua tentunya akan mengakibatkan  perubahan  aktifitas  fungsional protein  (Lessard  et  al,  2000).  Salah  satu  contoh fungsi  penting  protein  spermatozoa  adalah sebagai ligan untuk pengenalan dengan ZP3 yang merupakan  glikoprotein  pada  zona  pelusida (Morales,  1996).  Mempertimbangkan  hal  itu maka penelitain dengan tujuan untuk mengetahui profil  protein  spermatozoa  sebelum  dan  setelah pembekuan ini penting untuk dilakukan.

## METODE PENELITIAN

## Sampel penelitian
Sampel  yang  digunakan  pada  penelitian ini  adalah  5  semen  segar  dan  beku  sapi  Friesian Holstein  yang  dikoleksi  dari  Balai  Besar Insemniansi  Buatan  Singosari  Malang.  Semen segar  yang  digunakan  memiliki  motilitas  masa ++  dan  motilitas  individu  >70%.  Semen  beku yang  digunakan  adalah  semen  beku  yang  telah disimpan selama 1 bulan.

## Isolasi protein spermatoza
Metode isolasi protein spermatozoa yang digunakan  pada  penelitian  ini  berdasarkan Cheema  et  al  (2010).  Spematozoa  dan  seminal plasma dipisahkan menggunakan PBS hangat pH 7,4 dengan sentrifugasi pada kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Diambil fraksi atas dan bawah,
lalu  ditambahkan  PBS  hangat  pH  7,4  pada masing  –  masing  fraksi.  Suspensi  disentrifugasi pada  kecepatan  10.000  rpm  selama  10  menit. Diambil  pelet   dan  ditambahkan PBS  hangat pH 7,4,  lalu  disentrifugasi  kembali  pada  kecepatan 10.000  rpm  selama  10  menit.  Diambil  pelet  dan ditambahkan  buffer ekstrak  protein yang mengandung 1M Tris Cl-pH 6,8, 5M NaCl, 10% sodium  deoxycholate,  20%  SDS  dan  ddH 2 O. Hasil  akhir  adalah  isolat  crude  protein  yang disimpan  pada  suhu  -20°C  sampai  akan dilakukan elektroforesis. Untuk mengetahi konsentrasi  protein  total  setiap  isolat  dilakukan uji kuantitatif menggunakan spektofotometri.

## Analisis profil protein
Profil  protein  spermatozoa  dianalisis menggunakan  SDS  PAGE  dengan  konsentrasi separating  gel  12,5%  dan  stacking  gel  5%. Running sampel dilakukan pada arus  konstan 30 mA  selama  kurang  lebih  60  menit.  Gel  hasil running  diwarnai  menggunakan  Commasie Brilliant Blue sampai pita protein terlihat jelas.

## Analisis data
Data  yang  diperoleh  dianalisis  secara deskriptif  dengan  membandingkan  profil  protein hasil SDS PAGE sebelum dan setelah pembekuan

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Analisis profil protein spermatozoa
Berdasarkan  hasil  elektroforesis  dapat diketahui  perbedaan  profil  protein  spermatozoa pada fraksi atas semen segar dan beku (gambar 1 dan tabel 1)
M   1     2    3   4    5    6    7   8    9   10
260 kDa 10  kDa 70 kDa 40 kDa
25 kDa
Gambar 1. hasil elektroforesis protein spermatozoa  fraksi  atas.  M  adalah    marker protein  dengan  berat  molekul  260-10  kDa.  Lane 1-5  adalah  isolat  crude  protein  dari  5  semen segar. Lane 6-10 adalah  isolat  crude protein  dari 5 semen beku.
Tabel 1. variasi berat molekul protein spermatozoa fraksi atas (kDa) Pita protein Fraksi atas Segar Beku 1  2  3  4  5  6  7  8  9 10 144kDa . . . . . . . . . . 128kDa . . . . . . . . . . 99kDa . . . . . . . . . . 90kDa . . . . . . . . . . 83 kDa . . . . . . . . . . 59 kDa . . . . . . . . . . 31 kDa . . . . . . . . . . 20 kDa . . . . . - - - - - 14 kDa . . . . . . . . . . 12 kDa . . . . . . . . . . 10 kDa . . . . . - - - - - 9  kDa . . . . . - - - - - Keterangan : . Ada pita protein
- Tidak ada pita protein
Hasil elektroforesis semen segar ditemukan  12  pita  protein  spermatozoa  dengan berat  molekul  144,  128,  99,  90,  83,  59,  31,  20, 14,  12,  10  dan  9  kDa.  Sedangkan  pada  semen beku  ditemukan  9  pita  protein  dengan  berat molekul 144, 128, 99,  90, 83, 59, 31, 14 dan  12 kDa.  Pada  hasil  analisis  semen  beku  tidak ditemukan  3  pita  protein  dengan  berat  molekul 20,  10  dan  9  kDa  yang  ditemukan  pada  semua semen segar.
Hasil elektroforesis fraksi bawah (gambar  2  dan  tabel  2)  juga  dapat  diketahui adanya  perbedaan  profil  protein  antara  semen segar dan beku
Gambar  2.  hasil  elektroforesis  SDS  PAGE protein  spermatozoa  fraksi  bawah.  M  adalah marker  protein  dengan  berat  molekul  260-10 kDa. Lane 1-5 adalah isolat  crude protein semen segar.  lane  6-10  adalah  isolat  crude  protein semen beku.
Tabel 2. variasi berat molekul protein spermatozoa fraksi bawah (kDa) Pita protein Fraksi bawah Segar Beku 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10 128kDa . . . . . . . . . . 116kDa . . . . . . . . . . 103kDa . . . . . . . . . . 90kDa . . . . . . . . . . 75 kDa . . . . . . . . . . 69 kDa . . . . . . . . . . 48 kDa . . . . . . . . . . 40 kDa . . . . . . . . . . 31 kDa . . . . . . . . . . 26 kDa . . . . . - - - - - 20 kDa . . . . . . . . . . 14 kDa . . . . . . . . . . 10 kDa . . . . . - - - - - 9  kDa . . . . . - - - - - 7  kDa . . . . . - - - - - 6  kDa . . . . . - - - - -
Keterangan : . Ada pita protein
- Tidak ada pita protein
Perbedaan  profil  protein  dapat  dilihat berdasarkan  keberadaan  pita  –  pita  protein  dan variasi berat molekul protein. Hasil elektroforesis semen  segar  ditemukan  16  pita  protein  dengan berat  molekul  128,  116,  103,  90,  75,  69,  48,  40, 31,  26,  20,  14,  10,  9,  7  dan  6  kDa.  Sedangkan pada  semen  beku  ditemukan  11  pita  protein dengan berat  molekul 128,  116, 103, 90, 75, 69, 48,  40,  31,  20  dan  14  kDa.  Ada  5  pita  protein dengan  berat  molekul  26,  10,  9,  7  dan  6  kDa yang  ditemukan  pada  semua  semen  segar  tidak ditemukan pada semua semen beku.
Penelitian  yang  dilakukan  Ollero  et  al (1998)  menggunakan  sampel  sapi  menunjukkan bahwa ada perbedaan  profil  protein spermatozoa antara  semen  segar  dan  beku  hasil  pembekuan. Ada  4  pita  protein  dengan  berat  molekul  245, 100,  68,  dan  35  kDa  yang  tidak  terdeteksi  pada semen  beku.  Tidak  terdeteksinya  pita  protein dikarenakan telah hilang selama proses pembekuan.  Adanya  perbedaan  berat  molekul yang  ditemukan  pada  penelitian  ini  dengan M   1     2    3   4    5    6    7   8    9   10
penelitian  yang  dilakukan  Ollero  dimungkinkan karena  pemilihan  bangsa  sapi  dan  parameter waktu pembekuan yang digunakan pada penelitian ini berbeda dengan penelitian Ollero et al.
Hilangnya  protein  spermatozoa  selama pembekuan disebabkan oleh banyak faktor. Salah satunya  adalah  adanya  peningkatan  kadar  ROS selama  pembekuan  (Awda,  2009).  Terjadinya peningkatan  ROS  pada  pembekuan  disebabkan karena  habisnya  atau  kurangnya  antioksidan yang  tersedia  pada  spermatozoa  tidak  mampu mengubah  oksigen  reaktif  (O)  menjadi  senyawa yang  netral  (O 2 )  karena  adanya  stres  oksidasi pada  proses  oksidasi  fosforilasi.  Rendahnya produksi  O 2 menginduksi  terjadinya  peroksida lipid  (Lamirande  et  al,  1997).  Peroksida  lipid akan  merusak  struktur  dan  fungsi  membran dengan  mengacaukan  struktur  fosfolipid  dan fluiditas  membran  (Atiken,  1995).  Peningkatan ekstra  dan  intraseluler  Ca2+  dan  peroksida  lipid pada membran fosfolipid akhirnya akan mengubah  struktur  dan  degradasi  membran (Awda,  2009).  Degradasi  membrane  akan menyebabkan  terdegradasinya  komponen  sel yang  penting  seperti  protein  dan  DNA.  Protein yang  telah  terdegradasi  oleh  produk  ROS  akan dengan mudah berpindah ke medium ekstraselluler  karena  membrane  sel  yang  telah rusak (Zilli et al, 2005).
Pembekuan  semen  yang  mengakibatkan terdegradasinya beberapa molekul protein spermatozoa akan berkorelasiterhadap penurunan kualitas spermatozoa, seperti penurunan motilitas sebesar  40%  (Tanaka  et  al  ,  2000),  peningkatan abnormalitas,  penurunan  viabilitas  sebesar  20- 30%  (Dhanju  et  al,  2001)  dan  penurunan kemampuan  kapasitasi  saat  fertilisasi  (Nandre, 2013).  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Zilli  et  al (2005)  menghasilkan  bahwa  terjadi  penurunan tingkat  penetasan  ikan  yang  dibuahi  dengan spermatozoa hasil pembekuan.
Dari  gambar 1  dan 2  hasil  elektroforesis diketahui  terdapat  perbedaan  tebal  dan  tipisnya pita  protein.  Secara  keseluruhan  pita  protein semen  segar  terlihat  lebih  tebal  dibandingkan dengan  pita  protein  semen  beku.  Adanya perbedaan tebal tipisnya pita protein dipengaruhi oleh  konsentrasi  total  protein  pada  masing  – masing  sampel.  Semakin  tinggi  konsentrasi  total protein  maka  pita  yang  tercetak  dalam  gel  akan semakin  tebal,  begitu  juga  semakin  rendah konsentrasi total protein  maka pita  yang  tercetak dalam gel akansemakin tipis.
Dari  gambar  1  dan  2  juga  dapat diketahui  bahwa  terdapat  perbedaan  jumlah  dan variasi berat molekul pita protein pada fraksi atas dan  bawah.  Pada  fraksi  atas  ditemukan  lebih sedikit  pita  protein  daripada  fraksi  bawah,  dan berat  molekul  protein  pada  kedua  fraksi  tidak sama meskipun ada bebrapa protein dengan berat molekul  sama  yang  muncul.  Adanya  perbedaan jumlah pita protein antara fraksi atas  dan bawah, dimungkinkan  karena  ada  beberapa  pita  protein seminal plasma  yang ikut terdeteksi dalam fraksi bawah.
Pencucian  spermatozoa  dari  seminal plasma bisa dilakukan menggunakan sentrifugasi.  Hasil    swim  up  akan  terbentuk beberapa  medium. Spermatozoa  yang  hidup  atau yang  masih  aktif  bergerak  akan  menuju  keatas media  sedangkan  spermatozoa  yang  mati, berbagai  macam  mikroorganisme,  dan  debris  sel akan  bergerak  dan  mengendap  kebawah  media (Jamel, 2008).
Semua  sampel  fraksi  atas  dan  bawah baik  pada  semen  segar  dan  beku  ditemukan  4 pita  protein  dengan  berat  molekul  yang  sama, yaitu  128,  90,  31  dan  14  kDa.  Pita  protein dengan  berat  molekul  90  kDa  didentifikasi sebagai  heat  shock  protein  90  (HSP-90)  yang memiliki  peran  penting  terhadap  toleransi  stress serta  mengaktifkan  nitric  oxide  synthase  (NOS) yang  bermanfaat  untuk  membantu  motilitas spermatozoa.  Semakin  tinggi  ekspresi  HSP-90 maka  semakin  tinggi  pula  motilitas  dan ketahanan  spermatozoa  terhadap  stress  akibat pembekuan  dan  thawing  (Cao  et  al,  2003). Protein dengan berat molekul 31 kDa didentifikasi sebagai Heparin Binding Protein 30 (HBP-30)  dengan  nama  Fertility  Associated Antigen  (FAA).  Fungsi  protein  tersebut  untuk meningkatkan  angka  kebuntingan  sapi  sebesar 16-19% (Lenz et al, 2000).

## KESIMPULAN
Dari  penelitian  yang  telah  dilakukan dapat  disimpulkan  bahwa  terdapat  perbedaan profil  protein  spermatozoa  sebelum  dan  setelah pembekuan  yang  dilihat  dari  variasi  berat molekulnya.  Setelah  pembekuan  semen,  pada fraksi  atas  tidak  ditemukan  protein  dengan  berat molekul 20, 10 dan 9 kDa dan pada fraksi bawah tidak  ditemukan  protein  dengan  berat  molekul 26, 10, 9, 7 dan 6 kDa.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  pihak  Balai  Besar Inseminasi  Buatan  yang  telah  memberikan  izin melakukan  koleksi  semen,  dan  seluruh  staff Laboratorium  Biologi  Molekuler  dan  Seluler Jurusan  Biologi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan  Alam  Universitas  Brawijaya  atas bantuannya selama penelitian ini berlangsung.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Aitken  RJ.  1995.  Free  Radicals,  Lipid
Peroxidation and Sperm Function. ReprodFertil Dev.7:659–668.
[2]  Awda,  Basim  J,  Meghan  Mackenzie-Bell, and Marry M. Buhr. 2009. Reactive Oxygen Species  and  Boar  Sper  Function.  Journal Biolreprod. 81:553 – 561.
[3]  Cao,  Wen-Lei,  Yi-Xing  Wang,  Zu-Qiong
Xiang, and Zheng Li. 2003.
Cryopreservation-induced  decrease  in  heat- shock protein 90 in human spermatozoa and its mechanism.  Asian Journal  Androl. 5:43- 46
[4]   Cheema,  Ranjna  S,  Amrit  K.  Bansal,  G.S. Bilaspuri,  and  V.  K.  Gandotra.  2010. Correlation between the proteins and protein profile(s)  of  different regions  of  epididymis and  their  contents  in  goat  buck.  Animal Science Papers and Reports. 29:75-84
[5]  Dhanju,  C.K,  R.S  Cheema  and  S.P  Kaur. 2001.  Effects  of  Freezing  On  Protein  and Profiles  Of  Sperm  Membrane  Extracts  and Seminal Plasma of Buffalo Bulls. Journal of Department of Animal Breeding, College of Veterinary  Sciences,  Punjab  Agricultural University, Ludhiana, India.
[6]  Jameel,  Tahir.  2008.  Sperm  Swim-Up:  A Simple  And Effective Technique Of Semen Processing  For  Intrauterine  Insemination. Journal Pak Med Assoc. 58:71-74
[7]  Kumar,  Vinay,  Abul  K  Abbas,  Nelson Fausto, Jon C. Aster, and James A. Perkins. 2010.  Robbins  and  Cotran  Pathology  Basic of  Disease,  Professional  Edition,  8th. Saunders Elsevier. Philadelphoa.
[8] Zhang, J. N. Oyarzo, M. E. Bellin, and R. L. Ax.  2000.  Bovine  Fertility-Associated Antigen (FAA) and a Recombinant Segment of FAA Improve Sperm Function
[9]  Lamirande,  Eve  de Lamirande, Hong Jiang, Armand  Zini,  Hideya  Kodama  and  Claude
Gagnon. 1997. Reactive oxygen species and
sperm physiology. Journal Review Reproduction. 2:48–54
[10] Lessard  C,  S  Parent,  P  Leclerc,  JL  Bailey, and  R  Sullivan.  2000.  Cryopreservation Alters the  Levels of the Bull Sperm Surface Protein P25b. Journal Androl. 21:700-707
[11]  Ollero,  M,  O.  Bescos,  J.A  Cebrian-Perez and T. Muino-Blanco. 1998. Loss of Plasma Membran  Protein  of  Bull  Spermatozoa Through  The  Freezing-Thawing  Process. Journal  Theriogenology  Elsevier.  49:547- 555
[12] Nandre,  R.M,  Fatima,  Sh,  Bhupal  G, Derashri  H.J  and  Joshi,  C.G.  2013. Assessment  of  variations  in  Indian  Bubalus bubalis  seminal  plasma  proteins  during winter and summer seasons. Iranian Journal of Veterinary Research. 14:1-8
[13] Nishizono H, Shioda M, Takeo T, Irie T and Nakagata  N.  2004.  Decrease  of  Fertilizing Ability  of  Mouse  Spermatozoa  After Freezing  And  Thawing  Is  Related  To Cellular  Injury.  Biology  of  Reproduction 71:973–978.
[14] Sudarmadji,  S.  1996.  Teknik  Analisa
Biokimiawi. Edisi Pertama. Liberty. Yogyakarta.
[15]Tanaka  H,  Herliantien,  Herwiyanti  E,  Lubis OP,  Buwono,  danPujianto  J.  2002The Aftercare  Technical  Cooperation  for  The Strengthening  of  Artificial  Insemination
Center Project. Japan International Cooperation Agency. p. 2 [16] Yildiz,  Cengiz,  Palma  Ottaviani,  Napoleon Law,  Renise  Ayearst,  Ling  Liu  and  Colin McKerlie. 2007. Effects of Cryopreservation On Sperm Quality, Nuclear DNA Integrity, In Vitro Fertilization, And In Vitro Embryo Development  In  The  Mouse.  Biology  of
Reproduction. 133:585-595 [17]  Zilli,  Loredana,  Roberto  Sciavone,  Vicenzo Zonno,  Rocco  Rossanao,  Carlo  Storelli  and Sebastiano Viella. 2005. Effect of Cryopreservation  on  Sea  Bass  Sperm
Protein.  Journal  Biolog  of  Reproduction.
72:1262-1267.