http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## Desain Primer PCR Sebagai Biomarker COVID-19 Strain Terbaru Yang Di Identifikasi Di Januari 2021

## Muhammad Azhari Herli, Dewi Gulyla Hari, Ayu Rahmawati
Program Studi Farmasi, Fakultas MIPA dan Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Riau JL. Tuanku Tambusai, Kota Pekanbaru, Provinsi Riau- Indonesia
Correspondence e-mail : azhari.herli@umri.ac.id

## ABSTRAK
Penyakit  Coronavirus  2019  (COVID-19)  adalah  penyakit  menular  yang  disebabkan  oleh Severe Acute  Respiratory  Syndrome  Corona  Virus 2 (SARS  CoV-2).  Penyakit ini menyebar pertama kali di Wuhan,  Provinsi  hubei,  Cina  di  bulan  desember  2019.  SARS-CoV-2  sangat  menular  dan  telah berkembang pesat di seluruh dunia sejak ditemukan. sampai Januari 2021, total kasus infeksi SARS- CoV-2 101.406.059 kasus telah dikonfirmasi di seluruh  dunia dengan  jumlah kematian  2.191.898 jiwa dan masih terus bertambah. Diagnosa COVID-19 dilakukan dengan dua cara yang umum yaitu rapid test dan  PCR ( polymerase chain reaction ). Penelitian ini bertujuan untuk mendesain primer PCR  strain COVID-19 terbaru  yang di  isolasi  pada  januari 2021  dengan  metode  insilico  (simulasi menggunakan  komputer)  sehingga  didapat  primer  yang  digunakan  sebagai  biomarker  COVID-19 yang cepat, dan akurat. Hasil penelitian ini didapatkan 10  buah primer terbaik dari strain COVID- 19 dengan kode MW454767, MW454771, MW460582, MW454660 yang di identifikasi pada 11 Jan 2021.
Kata kunci : SARS CoV 2; Covid 19; Primer; Polymer Chain Reaction; biomarker

## ABSTRACT
Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a contagious disease caused by Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus 2 (SARS CoV-2). The disease first spread in Wuhan, Hubei Province, China in December 2019. SARS-CoV-2 is highly contagious and has grown rapidly around the world since its discovery. Until January 2021, a total of 101,406,059 confirmed cases of SARS-CoV-2 infection worldwide with a death toll of 2,191,898 and still growing. Diagnosis of COVID-19 is carried out in two common ways, namely  a rapid test and PCR (polymerase chain reaction). This study aims  to design  a  PCR  primer  for  the  latest  COVID-19  strain  isolated  in  January  2021  with  the  insilico method  (computer  simulation)  so  that  the  primer  used  as  a  COVID-19  biomarker  is  fast  and accurate. The results of this study obtained 10 of the best primers from the latest COVID-19 strains with  codes  MW454767,  MW454771,  MW460582,  MW454660  which  were  identified  on  11  Jan 2021.
Keywords: SARS CoV 2; Covid 19; Primer; Polymer Chain Reaction; biomarkers
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI :
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## 1. Introduction
Penyakit Coronavirus 2019 (COVID-19) adalah penyakit menular yang disebabkan oleh Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus 2 (SARS CoV-2).
Penyakit ini menyebar pertama kali di Wuhan, Provinsi hubei, Cina di bulan desember 2019. SARS-CoV-2 sangat menular dan telah berkembang pesat di seluruh dunia sejak ditemukan sampai januari 2021, total kasus infeksi SARS-CoV-2 101.406.059 kasus telah dikonfirmasi di seluruh dunia dengan jumlah kematian  2.191.898  jiwa  dan  masih  terus  bertambah  [1]  [2].  Diagnosa  COVID-19  dilakukan  dengan  dua  cara  yang  umum  yaitu  rapid  test  dan  PCR ( polymerase  chain  reaction )  yang  bertujuan  membantu  menahan  penyebaran  virus  corona  di  Asia  pada  umumnya  dan  Indonesia  pada  khususnya terutama pada negara menengah dan negara berkembang. Ada beberapa kendala dalam memutus rantai penyebaran Covid-19 ini yaitu ketidakpastian teknis dalam pengujian seperti biomarker yang terbatas dan sumber daya terbatas (dana dan personel). Berbagai kit diagnostik (biomarker) SARS-CoV-2 sudah tersedia dari banyak perusahaan dan lembaga kesehatan nasional. Namun, informasi yang tersedia secara publik tentang kit diagnostik ini masih kurang  [3]  [4]  [5].  Menanggapi  meningkatnya  kebutuhan  kit  diagnostik  COVID-19  yang  cepat  dan  akurat  serta  kurangnya  informasi,  kami  tertarik melakukan penelitian ini yang bertujuan untuk mendesain primer PCR untuk biomarker mudah diakses untuk deteksi dini virus COVID-19 secara cepat dan akurat. Penelitian ini adalah penelitian secara insilico (simulasi menggunakan komputer), bertujuan untuk mendisain dan mengevaluasi primer untuk mendeteksi Covid-19 strain terbaru dilakukan menggunakan software online yaitu primer BLAST. Ada dua Langkah proses dalam mendesain primer dan optimalisasi set primer spesifik meliputi (1) pemilihan set primer untuk gen target (RdRP , N , E , dan S ) dalam genome SARS-CoV-2 (COVID-19), (2) validasi in silico urutan primer dan amplikon [6].

## 2. The Methods
Penelitian ini adalah penelitian secara insilico (simulasi menggunakan komputer), dimana dalam mendisain dan mengevaluasi primer untuk mendeteksi Covid-19  dilakukan  menggunakan  software  primer  BLAST  online.  Penelitian  ini  sudah  berjalan  lebih  kurang  5-6  bulan  di  laboratorium  Farmasi, Universitas  Muhammadiyah  Riau.    Yang  pertama  dilakukan  pada  penelitian  ini  adalah  pemilihan  set  genome  strain  COVID-19  terbaru  dengan mendownload  dari https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sars-cov-2/download-nuccore-ids/ kemudian  data  yang  didapat  dipilih  yang  terbawah  dan  dicek
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License

## http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon
secara online https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore dan di BLAST untuk melihat waktu genome strain COVID-19 diidentifikasi, data terpilih dimasukkan ke dalam software FastPCR (dalam bentuk software java) dan primer BLAST untuk mendapatkan desain primer selanjut dilakukan validasi urutan primer dan amplikon hasil yang didapat dan dipilih yang terbaik dalam mendeteksi COVID-19.

## 3. Result And Discussion
Pemilihan Genome Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) yang ditampilkan pada tabel 1 berdasarkan waktu identifikasi terbaru sequen genome secara lengkap dengan menggunakan teknologi sequensing illumina. Penelitian ini dimulai dengan mendownload data dari set genome COVID-19  terbaru  dari https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sars-cov-2/download-nuccore-ids/ dalam  file  acc.txt  lalu  dipilih  dan  dicek  secara  online https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore dan di BLAST untuk melihat waktu genome strain COVID-19 diidentifikasi, berikut hasil pengecekan secara online didapatkan kode genome COVID-19 dan waktu diidentifikasinya seperti dibawah ini :

## Tabel 1. Genome Strain COVID-19 Terbaru
No Kode Genome COVID-19 Diidentifikasi Pada 1 MW454767 11 Januari 2021 2 MW454771 11 Januari 2021 3 MW460582 11 Januari 2021 4 MW454660 11 Januari 2021
Sumber data https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sars-cov-2/download-nuccore-ids/ [7].
Genome  Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)  dengan  kode  MW454767  disajikan  pada gambar 1,  merupakan genome RNA yang memiliki panjang 29903 bp diisolasi dari pasien di rumah sakit Massachusetts dan diidentifikasi sequen lengkapnya pada tanggal 11 januari 2021.
Untuk susunan lengkap genomenya dapat dilihat https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW454767 [8] .
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon
Gambar 1. Genome SARS-CoV-2 Kode MW454767
Genome Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) dengan kode MW454771 disajikan pada gambar 2, merupakan genome RNA yang  memiliki  panjang  29813  bp  diisolasi  pada  tanggal  20  desember  2020  dari  pasien  di  rumah  sakit  Massachusetts  dan  diidentifikasi  sequen lengkapnya pada tanggal 11 januari 2021. Untuk susunan lengkap genomenya dapat dilihat https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW454771 [9] .
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon
Gambar 2. Genome SARS-CoV-2 Kode MW454771
Genome Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) dengan kode MW460582 disajikan pada gambar 3, merupakan genome RNA yang memiliki panjang 29782 bp diisolasi pada tanggal 26 desember 2020 dari spesimen pasien dan diidentifikasi sequen lengkapnya pada tanggal 11 januari 2021. Untuk susunan lengkap genomenya dapat dilihat https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW460582 [10] .
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon
Gambar 3. Genome SARS-CoV-2 Kode MW460582
Genome Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) dengan kode MW454660 disajikan pada gambar 4, merupakan genome RNA yang memiliki panjang 29834 bp diisolasi pada tanggal 26 oktober 2020 dari spesimen pasien rumah sakit Massachusetts dan diidentifikasi sequen lengkapnya pada tanggal 11 januari 2021. Untuk susunan lengkap genomenya dapat dilihat https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW454660 [11] .
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon
Gambar 4. Genome SARS-CoV-2 Kode MW454660
Setelah penentuan strain Genome Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di tabel 1, selanjutnya dilakukan desain set primer untuk masing-masing genome dengan menggunakan primer BLAST online dengan data berasal dari NCBI [12] [13]. Primer BLAST dipilih karena cukup sensitif  untuk  mendeteksi  target  yang  memiliki  banyak  ketidakcocokan  dengan  primer.  Primer  BLAST  memungkinkan  pengguna  untuk  merancang primer spesifik-target baru dalam satu langkah serta untuk memeriksa spesitifitas primer yang sudah ada sebelumnya. Primer-BLAST juga mendukung penempatan primer berdasarkan lokasi ekson / intron dan tidak termasuk nukleotida tunggal polimorfisme (SNP)[14] [15].
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon
Berikut  hasil  desain  primer  dari  masing-masing  kode  genome  menggunakan  primer  BLAST  ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer- blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome )  :
1. Untuk genome kode MW454767 didapatkan 10 primer (disajikan di tabel 2)
Tabel 2. Hasil primer BLAST untuk genome kode MW454767

## Primer pair 1
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer CGGATGGCTTATTGTTGGCG Plus 20  25521 25540 59.97 55.00 2.00 2.00 Reverse primer TTGTGCTTACAAAGGCACGC  Minus 20  26226 26207 59.97 50.00 5.00 2.00 Product length 706

## Primer pair 2
Sequence (5'->3') Template strand  Length  Start  Stop  Tm  GC%  Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GCCGCTGTTGATGCACTATG Plus 20  17170 17189 59.97 55.00 4.00 2.00 Reverse primer CTCCAAGCAGGGTTACGTGT Minus 20  17756 17737 59.97 55.00 4.00 2.00 Product length 587

## Primer pair 3
Sequence (5'->3') Template strand Length Start Stop  Tm  GC%  Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TGTCGTTGACAGGACACGAG Plus 20 148  167  59.97 55.00 5.00 2.00 Reverse primer TTACCTTTCGGTCACACCCG Minus 20 264  245  59.97 55.00 3.00 2.00 Product length 117
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## Primer pair 4
Sequence (5'->3') Template strand  Length  Start  Stop  Tm  GC%  Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TGAGCCAGTGCTCAAAGGAG Plus 20  25345 25364 59.96 55.00 7.00 2.00 Reverse primer CGCCAACAATAAGCCATCCG Minus 20  25540 25521 59.97 55.00 2.00 2.00 Product length 196

## Primer pair 5
Sequence (5'->3') Template strand Length Start  Stop  Tm  GC%  Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TACGGCGCCGATCTAAAGTC Plus 20 671  690  59.97 55.00 8.00 2.00 Reverse primer GCGACCACCCTTACGAAGAA Minus 20  1471 1452 60.04 55.00 4.00 0.00 Product length 801

## Primer pair 6
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TCTTGGTTCACCGCTCTCAC Plus 20  28424 28443 59.97 55.00 4.00 0.00 Reverse primer TGCGGGTGCCAATGTAATCT  Minus 20  28721 28702 60.03 50.00 3.00 0.00 Product length 298
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## Primer pair 7
Sequence (5'->3') Template strand  Length Start Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer ATCTGTGTGGCTGTCACTCG Plus 20 82  101  60.04 55.00 5.00 3.00 Reverse primer ACTCGTGTCCTGTCAACGAC  Minus 20 168  149  59.97 55.00 4.00 3.00 Product length 87

## Primer pair 8
Sequence (5'->3') Template strand  Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer CACCTTCGGGAACGTGGTTA Plus 20  29247 29266 59.97 55.00 8.00 2.00 Reverse primer TAGCCCATCTGCCTTGTGTG Minus 20  29565 29546 60.04 55.00 2.00 0.00 Product length 319

## Primer pair 9
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer AGAATGGAGAACGCAGTGGG Plus 20  28356 28375 60.04 55.00 3.00 3.00 Reverse primer TGAGAGCGGTGAACCAAGAC Minus 20  28442 28423 59.97 55.00 4.00 1.00 Product length 87
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## Primer pair 10
Sequence (5'->3') Template strand  Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TGTTCCTCGGAACTTGTCGG Plus 20 17543  17562  59.97  55.00 8.00 1.00 Reverse primer CTGAGGTGTGTAGGTGCCTG Minus 20 18122  18103  60.04  60.00 4.00 2.00 Product length 580
2. Untuk genome kode MW454771 didapatkan 10 primer (yang disajikan di tabel 3)
Tabel 3. Hasil primer BLAST untuk genome kode MW454767

## Primer pair 1
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer CGGATGGCTTATTGTTGGCG Plus 20  25493 25512 59.97 55.00 2.00 2.00 Reverse primer TTGTGCTTACAAAGGCACGC Minus 20  26198 26179 59.97 50.00 5.00 2.00 Product length 706 Primer pair 2 Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GCCGCTGTTGATGCACTATG Plus 20  17142 17161 59.97 55.00 4.00 2.00 Reverse primer CTCCAAGCAGGGTTACGTGT Minus 20  17728 17709 59.97 55.00 4.00 2.00 Product length 587
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## Primer pair 3
Sequence (5'->3') Template strand Length Start Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TGTCGTTGACAGGACACGAG Plus 20 120  139  59.97 55.00 5.00 2.00 Reverse primer TTACCTTTCGGTCACACCCG Minus 20 236  217  59.97 55.00 3.00 2.00 Product length 117

## Primer pair 4
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TGAGCCAGTGCTCAAAGGAG Plus 20  25317  25336  59.96 55.00 7.00 2.00 Reverse primer CGCCAACAATAAGCCATCCG Minus 20  25512  25493  59.97 55.00 2.00 2.00 Product length 196 Primer pair 5 Sequence (5'->3') Template strand Length Start  Stop  Tm GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TACGGCGCCGATCTAAAGTC Plus 20 643  662  59.97 55.00 8.00 2.00 Reverse primer GCGACCACCCTTACGAAGAA Minus 20  1443 1424 60.04 55.00 4.00 0.00 Product length 801
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## Primer pair 6
Sequence (5'->3') Template strand  Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer ATCTGTGTGGCTGTCACTCG Plus 20 54 73  60.04  55.00 5.00 3.00 Reverse primer ACTCGTGTCCTGTCAACGAC Minus 20 140  121  59.97  55.00 4.00 3.00 Product length 87

## Primer pair 7
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TGTTCCTCGGAACTTGTCGG Plus 20  17515 17534 59.97 55.00 8.00 1.00 Reverse primer CTGAGGTGTGTAGGTGCCTG Minus 20  18094 18075 60.04 60.00 4.00 2.00 Product length 580 Primer pair 8 Sequence (5'->3') Template strand Lengt h Start  Stop  Tm  GC% Self complementarit y Self 3' complementarity Forward primer GACTAATTCTCCTCGGCGGG Plus 20  23565 23584  59.97  60.00 4.00 3.00 Reverse primer TGTACCCGCTAACAGTGCAG Minus 20  24177 24158  60.04  55.00 4.00 2.00 Product length 613 Primer pair 9 Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TCTTGGTTCACCGCTCTCAC Plus 20  28396 28415 59.97 55.00 4.00 0.00 Reverse primer TTGTTAGCAGGATTGCGGGT Minus 20  28706 28687 59.96 50.00 4.00 1.00
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon
Product length 311

## Primer pair 10
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GACGGTTCATCCGGAGTTGT Plus 20  26112  26131 60.04  55.00 6.00 0.00 Reverse primer GGAGTGGCACGTTGAGAAGA Minus 20  26867  26848 59.97  55.00 5.00 0.00 Product length 756
3. Untuk genome kode MW460582 didapatkan 10 primer (yang disajikan di tabel 4)
Tabel 4. Hasil primer BLAST untuk genome kode MW460582

## Primer pair 1
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer CGGATGGCTTATTGTTGGCG Plus 20  25467 25486 59.97 55.00 2.00 2.00 Reverse primer TTGTGCTTACAAAGGCACGC Minus 20  26172 26153 59.97 50.00 5.00 2.00 Product length 706 Primer pair 2 Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GCCGCTGTTGATGCACTATG Plus 20  17116 17135 59.97 55.00 4.00 2.00 Reverse primer CTCCAAGCAGGGTTACGTGT  Minus 20  17702 17683 59.97 55.00 4.00 2.00 Product length 587
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## Primer pair 3
Sequence (5'->3') Template strand Length Start Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TGTCGTTGACAGGACACGAG Plus 20 94  113  59.97 55.00 5.00 2.00 Reverse primer TTACCTTTCGGTCACACCCG Minus 20 210  191  59.97 55.00 3.00 2.00 Product length 117 Primer pair 4 Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TGAGCCAGTGCTCAAAGGAG Plus 20  25291 25310 59.96 55.00 7.00 2.00 Reverse primer CGCCAACAATAAGCCATCCG Minus 20  25486 25467 59.97 55.00 2.00 2.00 Product length 196

## Primer pair 5
Sequence (5'->3') Template strand Length Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TACGGCGCCGATCTAAAGTC Plus 20 617  636  59.97 55.00 8.00 2.00 Reverse primer GCGACCACCCTTACGAAGAA  Minus 20  1417 1398 60.04 55.00 4.00 0.00 Product length 801 Primer pair 6 Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer ATCTGTGTGGCTGTCACTCG Plus 20 28  47  60.04  55.00 5.00 3.00 Reverse primer ACTCGTGTCCTGTCAACGAC Minus 20 114  95  59.97  55.00 4.00 3.00 Product length 87
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## Primer pair 7
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer AGAATGGAGAACGCAGTGGG Plus 20  28302  28321  60.04  55.00 3.00 3.00 Reverse primer TGAGAGCGGTGAACCAAGAC Minus 20  28388  28369  59.97  55.00 4.00 1.00 Product length 87 Primer pair 8 Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TGTTCCTCGGAACTTGTCGG Plus 20  17489 17508 59.97 55.00 8.00 1.00 Reverse primer CTGAGGTGTGTAGGTGCCTG Minus 20  18068 18049 60.04 60.00 4.00 2.00 Product length 580 Primer pair 9 Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GACTAATTCTCCTCGGCGGG Plus 20  23539 23558 59.97 60.00 4.00 3.00 Reverse primer TGTACCCGCTAACAGTGCAG  Minus 20  24151 24132 60.04 55.00 4.00 2.00 Product length 613 Primer pair 10 Sequence (5'->3') Template strand Length Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer CCTATTGGGTTCCACGTGCT Plus 20  1473  1492 60.04 55.00 6.00 2.00 Reverse primer GGTTTCAAGAGTGCGGGAGA  Minus 20  1873  1854 59.97 55.00 3.00 0.00 Product length 401
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon
4. Untuk genome kode MW454660 didapatkan 10 primer (yang disajikan di tabel 5)
Tabel 5. Hasil primer BLAST untuk genome kode MW454660

## Primer pair 1
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer CGGATGGCTTATTGTTGGCG Plus 20  25493 25512 59.97 55.00 2.00 2.00 Reverse primer TTGTGCTTACAAAGGCACGC Minus 20  26198 26179 59.97 50.00 5.00 2.00 Product length 706 Primer pair 2 Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GCCGCTGTTGATGCACTATG Plus 20  17142 17161 59.97 55.00 4.00 2.00 Reverse primer CTCCAAGCAGGGTTACGTGT Minus 20  17728 17709 59.97 55.00 4.00 2.00 Product length 587 Primer pair 3 Sequence (5'->3') Template strand Length Start Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TGTCGTTGACAGGACACGAG Plus 20 120  139  59.97 55.00 5.00 2.00 Reverse primer TTACCTTTCGGTCACACCCG Minus 20 236  217  59.97 55.00 3.00 2.00 Product length 117
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## Primer pair 4
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TGAGCCAGTGCTCAAAGGAG Plus 20  25317 25336 59.96 55.00 7.00 2.00 Reverse primer CGCCAACAATAAGCCATCCG Minus 20  25512 25493 59.97 55.00 2.00 2.00 Product length 196

## Primer pair 5
Sequence (5'->3') Template strand  Length Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TACGGCGCCGATCTAAAGTC Plus 20 643  662  59.97 55.00 8.00 2.00 Reverse primer GCGACCACCCTTACGAAGAA Minus 20  1443 1424 60.04 55.00 4.00 0.00 Product length 801 Primer pair 6 Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer ATCTGTGTGGCTGTCACTCG Plus 20 54  73  60.04  55.00 5.00 3.00 Reverse primer ACTCGTGTCCTGTCAACGAC Minus 20 140  121  59.97  55.00 4.00 3.00 Product length 87

## Primer pair 7
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer AGAATGGAGAACGCAGTGGG Plus 20  28328 28347 60.04 55.00 3.00 3.00 Reverse primer TGAGAGCGGTGAACCAAGAC Minus 20  28414 28395 59.97 55.00 4.00 1.00 Product length 87
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## Primer pair 8
Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GACTAATTCTCCTCGGCGGG Plus 20  23565 23584 59.97 60.00 4.00 3.00 Reverse primer TGTACCCGCTAACAGTGCAG  Minus 20  24177 24158 60.04 55.00 4.00 2.00 Product length 613 Primer pair 9 Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer TCTTGGTTCACCGCTCTCAC Plus 20  28396 28415 59.97 55.00 4.00 0.00 Reverse primer TTGTTAGCAGGATTGCGGGT Minus 20  28706 28687 59.96 50.00 4.00 1.00 Product length 311 Primer pair 10 Sequence (5'->3') Template strand Length  Start  Stop  Tm  GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer GACGGTTCATCCGGAGTTGT Plus 20  26112 26131 60.04 55.00 6.00 0.00 Reverse primer GGAGTGGCACGTTGAGAAGA Minus 20  26867 26848 59.97 55.00 5.00 0.00 Product length 756
Primer PCR yang baik harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu optimal panjang primer 16-28 basa walaupun dalam teori 18-22 basa dan tidak boleh lebih dari 30 basa [16] [17],  suhu minimal 57 o C-63 o C dan optimal 60 o C [18]. Sehingga dalam penelitian ini didapatkan masing-masing genome didapatkan primer sepuluh buah yang memenuhi persyaratan.

## 4. KESIMPULAN
Penelitian  ini  kami  mendapatkan  primer  masing-masing  10    buah  primer  terbaik  dari  strain  COVID-19  dengan  kode  MW454767,  MW454771, MW460582, MW454660 yang di identifikasi pada 11 Jan 2021.
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kepada Majelis Diktilitbang PP Muhammadiyah yang mendanai penelitian ini pada program Hibah RisetMu Batch 4 Majelis Diktilitbang PP Muhammadiyah,  serta  kepada  program  studi  farmasi,  Universitas  Muhammadiyah  Riau  yang  memberikan  izin  untuk  melakukan  penelitian  ini  di laboratorium farmasi.

## References
[1].   Li D, Zhang J, Li J. Primer design for quantitative real-time PCR for the emerging Coronavirus SARS-CoV-2. Theranostics. 2020;10(16):7150 – 62.
https://doi.org/10.7150/thno.47649 [2].   WHO. Coronavirus Disease (COVID-19) Situation Reports [Internet]. 2020 [cited 2020 Jul 20]. Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports
[3].   Park M, Won J, Choi BY, Lee CJ. Optimization of primer sets and detection protocols for SARS-CoV-2 of coronavirus disease 2019 (COVID-19) using PCR and real-time PCR. Exp Mol Med. 2020;52(6):963 – 77.
[4].   Chan JF-W, Yip CC-Y, To KK-W, Tang TH-C, Wong SC-Y, Leung K-H, et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and  specific  COVID-19-RdRp/Hel  real-time  reverse  transcription-PCR  assay  validated  in  vitro  and  with  clinical  specimens.  J  Clin  Microbiol. 2020;58(5).
[5].   Chen L, Liu W, Zhang Q, Xu K, Ye G, Wu W, et al. RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak. Emerg Microbes Infect. 2020;9(1):313 – 9.
[6].   Yip CC-Y, Ho C-C, Chan JF-W, To KK-W, Chan HS-Y, Wong SC-Y, et al. Development of a novel, genome subtraction-derived, SARS-CoV-2-specific COVID-19-nsp2 real-time RT-PCR assay and its evaluation using clinical specimens. Int J Mol Sci. 2020;21(7):2574.
[7].   NCBI. NCBI SARS-CoV-2 Resources [Internet]. 2020 [cited 2020 Nov 27]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sars-cov-2/
[8].   Nucleotide  Database  N.  Severe  acute  respiratory  syndrome  coronavirus  2  isolate  SARS-CoV-2/human/USA/MA-MGH-03564/2020,  complete genome. 2021; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW454767.1
Received:  April 2021, Accepted : Mai 2021 - Jurnal Photon Vol.11 No.2 DOI : https://doi.org/10.37859/jp.v11i2.3645
PHOTON is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
http://ejurnalumri.ac.id/index.php/photon
[9].   Nucleotide  Database  N.  Severe  acute  respiratory  syndrome  coronavirus  2  isolate  SARS-CoV-2/human/USA/MA-MGH-03583/2020,  complete genome. 2021; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW454771.1
[10].   Nucleotide  Database  N.  Severe  acute  respiratory  syndrome  coronavirus  2  isolate  SARS-CoV-2/human/USA/CA-QDX-2772/2020,  complete genome. 2021; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW460582.1
[11].   Nucleotide  Database  N.  Severe  acute  respiratory  syndrome  coronavirus  2  isolate  SARS-CoV-2/human/USA/MA-MGH-03274/2020,  complete genome. 2021; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW454660.1
[12].   Rangwala SH, Kuznetsov A, Ananiev V, Asztalos A, Borodin E, Evgeniev V, et al. Accessing NCBI data using the NCBI Sequence Viewer and Genome Data Viewer (GDV). Genome Res. 2021;31(1):159 – 69.
[13].   NCBI SARS-CoV-2 Resources [Internet]. [cited 2020 Nov 27]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sars-cov-2/
[14].   Madden T. The BLAST sequence analysis tool. In: The NCBI Handbook [Internet] 2nd edition. National Center for Biotechnology Information (US); 2013.
[15].   Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S, Madden TL. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 2012;13(1):1 – 11.
[16].   Burpo FJ. A critical review of PCR primer design algorithms and crosshybridization case study. Biochemistry. 2001;218(11).
[17].   Yuwono T. Teori dan aplikasi polymerase chain reaction. Penerbit Andi Yogyak. 2006;1 – 3.
[18].   Dieffenbach CW, Dveksler GS. PCR primer: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2003.