## DETECTION OF NITROGENASE PRODUCING BACTERIA FROM THE SOIL OF LIWA BOTANICAL GARDEN
Christina Nugroho Ekowati*, Mica Mirani, Kusuma Handayani, Rochmah Agustrina
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung Jl. Prof. Soemantri Brodjonegoro No. 1, Bandar Lampung, Indonesia *E-mail: ecoli.lacto@gmail.com

## ABSTRACT
Liwa Botanical Gardens is an ex-situ conservation area for various types of plants. Each plant produces organic matter that will provide nutrients for the growth of nitrogen-fixing bacteria. This  indicates  the  existence  of  an  environment  that  supports  the  growth  of  nitrogen-fixing bacteria.  Nitrogen  is  one  of  the  nutrients  needed  by  plants  for  their  growth.  However,  the abundance of nitrogen in the atmosphere cannot be utilized directly by plants but needs to transform into ammonium and nitrate first. This transformation can be done by nitrogen-fixing bacteria through an enzymatic process. This research aims to obtain bacterial isolates that can fix nitrogen. Nitrogen-fixing bacteria were isolated using Nutrient Agar (NA) medium and furthered  by  nitrogenase  activity  detection  test  with  semi-solid  Nitrogen  Free  Bromothymol Blue (NFB). Nitrogen-fixing bacteria are characterized by color changes in the medium. The results  obtained  22  isolates  with  3  isolates  detected  capable  of  producing  nitrogenase enzymes, namely TBP B3, TB1 B2, and TMA2 B2.
Keywords: KRL, NFB, Nitrogen, Nitrogenase.

## PENDAHULUAN
Kebun  Raya  Liwa  merupakan  kawasan konservasi ex-situ untuk berbagai spesies tanaman. Keberhasilan dalam mengkonservasi  berbagai  jenis  tanaman tidak terlepas dari ketersediaan unsur hara yang  cukup  di  dalam  tanah.  Salah  satu unsur hara yang dapat memacu pertumbuhan tanaman yaitu unsur nitrogen. Nitrogen berfungsi dalam sintesis klorofil, asam amino dan protein sehingga dapat meningkatkan pertumbuhan vegetatif  pada  tanaman  (Subowo et  al ., 2010).
Namun,  unsur  nitrogen  dapat  hilang  dari tanah  karena  tercuci  oleh  aliran  air, penguapan  dan  diserap  oleh  tanaman (Patti et  al .,  2013).  Keadaan  tersebut membuat  proses  fiksasi  nitrogen  dari atmosfer mutlak diperlukan untuk menjaga ketersediaan  nitrogen  di  dalam  tanah. Pemulihan atau peningkatan unsur nitrogen  di  dalam  tanah  dapat  dilakukan oleh bakteri penambat nitrogen.
Kemampuan  bakteri  dalam  menambat nitrogen  disebabkan  adanya  aktivitas nitrogenase. Nitrogenase merupakan enzim kompleks yang di kode oleh sekitar 20 gen nif H yang dapat mengubah bentuk nitrogen  bebas  di  udara  menjadi  amonia yang  selanjutnya  akan  diubah  menjadi amonium dan nitrat yang dapat dimanfaatkan  oleh  tanaman  (Lee et  al ., 2000).
Bakteri penambat nitrogen yaitu diantaranya bakteri Azospirillum ,
Azotobacter ,  dan Rhizobium merupakan bakteri  yang  dapat  ditemukan  di  daerah rhizosfer  tanaman  (Amalia et  al .,  2020). Bakteri penambat nitrogen dapat dijadikan sebagai  pupuk  nitrogen  hayati  untuk menunjang pertumbuhan tanaman. Namun,  sampai  saat  ini belum ditemukan adanya data ilmiah terkait bakteri penambat  nitrogen  pada  tanah  KRL sehingga  perlu  dilakukan  penelitian  untuk
mendapatkan  isolat  bakteri  penambat nitrogen.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  pada  penelitian ini  yaitu  sekop,  autoklaf,  inkubator,  oven, neraca analitik, hot plate , magnetic stirrer , mikroskop, ultrasonic  cleane r, vortex mixer ,  peralatan  gelas,  pipet  volume, mikropipet.
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian  ini  yaitu Nutrient  Agar (NA), Nitrogen  Free  Bromothymol  Blue (NFB) dengan komposisi media yaitu asam malat 1 g, KOH 0,8 g, K 2 HPO 4 0,1 g, FeSO 4 0,01 g,  MnSO 4 0,002  g,  MgSO 4 0,004  g,  NaCl 0,004 g, CaCl 2 0,004 g, Na 2 MoO 4 0,002 g, BTB ( Bromothymol Blue ) 2 ml, bacto agar 0,36 g untuk media semi padat dan 3,6 g untuk media padat,  200 mL akuades. semi solid,  akuades,  alkohol,  spiritus,  H 2 O 2 , glukosa,  sukrosa,  laktosa,  galaktosa, fruktosa, Nutrient  Broth (NB),  cat  Gram (larutan crystal  violet ,  larutan lugol  iodin , alkohol asam, dan safranin ) dan cat spora (larutan safranin dan malachite green ).

## Pengambilan Sampel
Pengambilan  sampel  tanah  dilakukan  di Kawasan  Kebun  Raya  Liwa,  Lampung Barat. Sampel tanah diambil pada kedalaman  5-20  cm  (Gagelidze et  al ., 2018)dari  5  lokasi  tanah  yang  berbeda, yaitu  tanah  laterit,  tanah  Araceae,  tanah serasah,  tanah  miring,  tanah  miring Araceae,  dan  tanah  biopori.  Pengambilan sampel  dilakukan  sebanyak  2  titik  pada setiap  lokasi  tanah.  Kemudian  dilakukan pengukuran pH pada setiap sampel tanah dengan menggunakan kertas indikator pH.

## Isolasi  Bakteri  dari  Tanah  Kebun  Raya Liwa
Sebanyak 1 gram sampel tanah dimasukkan  pada  9  ml  garam  fisiologis 0,85%
kemudian dihomogenkan. Selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat  hingga  10 -5 .  Sebanyak  1  mL diambil dari pengenceran 10 -3 , 10 -4 , dan 10 -
5 untuk  diinokulasikan  pada  20  mL  media Nutrient Agar (NA). Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30 o C (Santoso et al ., 2019). Karakterisasi Mikroskopis dan Makroskopis Karakterisasi secara makroskopis dilakukan  dengan  mengamati  koloni  yang meliputi  warna,  tepi,  bentuk,  dan  elevasi.
Karakterisasi secara mikroskopis dilakukan  pewarnaan  Gram  dan  spora (Kaburuan et al ., 2014).

## Uji Deteksi Aktivitas Nitrogenase
Isolat  yang  telah  didapatkanselanjutnya dilakukan uji kemampuan dalam menambat nitrogen. Uji ini dilakukan pada media NFB semi solid (Raffi et al ., 2012). Uji  positif  penambatan  nitrogen  dicirikan dengan terjadinya perubahan warna media kuning menjadi biru.
Uji Fisiologis Bakteri Penambat

## Nitrogen
Uji  fisiologis  yang  dilakukan  yaitu  uji katalase dan uji fermentasi karbohidrat. Uji katalase menggunakan H 2 O 2 3% sebanyak 2-3  tetes  yang  ditambahkan  pada  1  ose isolat  bakteri  penambat  nitrogen.  Hasil positif  ditunjukkan  dengan  terbentuknya gelembung  udara  (Restuati et  al .,  2012). Uji fermentasi karbohidrat dilakukan dengan  menginokulasikan  1  ose  isolat bakteri  penambat  nitrogen  pada  9  mL media Phenol  Red  Carbohydrate  Broth dengan penambahan 1% substrat karbohidrat  (glukosa,  sukrosa,  laktosa, fruktosa, dan galaktosa) kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Hasil positif ditunjukkan dengan terjadinya perubahan  warna  media  dari  merah menjadi kuning karena terjadinya perubahan pH media menjadi asam (Lay et al ., 1994).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan  hasil  pengukuran  pH  pada setiap  sampel  tanah  Kebun  Raya  Liwa memiliki  pH  dengan  kisaran  6-7.  Bakteri penambat  nitrogen  dapat  tumbuh  pada rentang  pH  4,5-8,5  (Holt et  al .,  1994).
Kondisi pH tanah tersebut memungkinkan adanya  bakteri  penambat  nitrogen  pada tanah  Kebun  Raya  Liwa.  Hasil  isolasi bakteri diperoleh 22 isolat dengan karakteristik morfologi koloni yang berbeda.
Setiap  isolat  yang  didapatkan  kemudian dilakukan uji dengan menggunakan media NFB semi solid untuk melihat kemampuan bakteri  dalam  menambat  N 2 .  Pada  media NFB  semi  solid  tidak  terdapat  senyawa nitrogen,  sehingga  bakteri  yang  tumbuh dapat  memanfaatkan  nitrogen  bebas  (N 2 ) dengan  bantuan  enzim  nitrogenase  untuk
memenuhi kebutuhan unsur nitrogen pada proses  pertumbuhan  bakteri  tersebut. Berdasarkan  hasil  pengujian  ini  hanya  3 isolat  yang  menunjukkan  adanya aktivitas nitrogenase  dalam  menambat  nitrogen yaitu  TBP  B3,  TB1  B2,  dan  TMA2  B2 (Gambar 1) yang ditandai dengan perubahan warna pada media menjadi biru akibat  adanya  aktivitas  nitrogenase  yang menghasilkan  senyawa  amonia  yang bersifat  basa.  Media  NFB  menggunakan senyawa indikator Bromothymol Blue yang mampu  merubah  warna  media  menjadi biru ketika kondisi lingkungan basa (Hasan dan Ansori, 1992).
(a)                             (b)                       (c)
Gambar 1. Hasil pengamatan uji deteksi aktivitas nitrogenase: Isolat TBP B3 (a),TB1 B2 (b), TMA2 B2 (c).
Keterangan: I : Kontrol negatif uji deteksi aktivitas nitrogenase II: Hasil positif uji deteksi aktivitas nitrogenase
Proses  penambatan  nitrogen  aktivitas enzim  nitrogenase  dimulai  ketika  nitrogen bebas  di  atmosfer  berikatan  dengan kompleks  enzim  nitrogenase.  Pertama, protein  Fe  pada  kompleks  nitrogenase akan direduksi oleh elektron dari ferredoxin atau flavodoxin. Selanjutnya  protein  Fe yang  tereduksi  menghasilkan  elektron yang  akan  mereduksi  protein  Fe-Mo. Kemudian  protein  Fe-Mo  yang  tereduksi akan  memberikan  sepasang  elektron kepada substrat N 2 sehingga ikatan rangkap tiga akan terputus dan membentuk HN=NH karena adanya penambahan  ion  H + .  Selanjutnya,  ikatan rangkap  HN=NH  akan  terputus  dan membentuk  H2N-NH2.  Pada  akhir proses aktivitas nitrogenase akan tereduksi menjadi 2NH 3 (Simanungkalit et al ., 2006).
Karakteristik makroskopis dan mikroskopis ketiga  isolat  tertera  pada  Tabel  1.  Pada ketiga  isolat  memiliki  bentuk, elevasi,  dan warna  koloni  yang  berbeda,  sedangkan bentuk  tepian  pada  isolat  TBP  B3  dan TMA2 B2 memiliki bentuk yang sama yaitu entire dan  isolat  TB1  B2  memiliki  tepi dengan bentuk undulate . Hasil pengamatan  mikoskopis  isolat  TBP  B3 merupakan  bakteri  Gram  negatif  dengan bentuk sel coccobacillus, TB1 B2 memiliki bentuk  sel coccobacillus dan  termasuk kedalam Gram negatif, TMA2 B2 termasuk kedalam  Gram  yang  bersifat  negatif  dan memiliki  bentuk  sel bacilli .  Ketiga  isolat setelah dilakukan pengamatan mikroskopis  termasuk  kedalam  bakteri yang  tidak  memiliki  kemampuan  dalam membentuk  spora.  Hasil  pengamatan mikroskopis dapat dilihat pada Gambar 2.
I     II
I     II
I    II
Tabel 1. Karakteristik makroskopis dan mikroskopis isolat penambat nitrogen.
Karakteristik Kode Isolat TBP B3 TB1 B2 TMA2 B2 Makroskopis Bentuk Circular Iirregular Round Elevasi Convex Raised Convex Tepi Entire Undulate Entire Warna Putih tulang Putih susu Putih transparan Mikroskopis Gram Negatif Negatif Negatif Spora - - - Bentuk sel coccobacillus Coccobacillus Bacilli
(a)                                          (b)                                        (c)
Gambar 2. Karakteristik mikroskopis isolat : (a) TBP B3; (b) TB1 B2; (c) TMA2 B2
Tabel 2. Hasil uji karakter fisiologis isolat bakteri penambat nitrogen
Isolat Karakter Fisiologis Katalase Fermentasi Karbohidrat Glukosa Sukrosa Laktosa Fruktosa Galaktosa TBP B3 + + + - + + TB1 B2 - + + - + + TMA2 B2 + + + - + +
(a)                                        (b)                                        (c)
Gambar 3. Hasil pengamatan uji katalase : Isolat TBP B3 terbentuk gelembung udara  yang  menunjukkan  uji  positif  (a),  TB1  B2  tidak  membentuk  gelembung udara  yang  menunjukkan  uji  negatif  (b),  TMA2  B2  terbentuk  gelembung  udara yang menunjukkan uji positif (c).
Karakter  fisiologis  isolat  bakteri  TBP  B3 dan  TMA2  B2  pada  uji  katalase  memiliki respon positif dengan terbentuknya gelembung, sedangkan isolat TB1 B2 tidak memiliki  enzim  katalase  karena  tidak terbentuk gelembung (Gambar 3). Senyawa hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) bersifat toksik bagi sel bakteri maupun sel tanaman.  Bakteri  yang  memiliki  enzim katalase  mampu mengubah H 2 O 2 menjadi air  dan  oksigen  sehingga  aman  untuk  sel Pada  mikroorganisme  enzim  katalase digunakan  untuk  menguraikan  senyawa hidrogen  peroksida  menjadi  H 2 O  dan  O 2 (Palealu et al . 2018).
Pembentukan  energi  oleh  bakteri  dapat dilakukan  dengan  cara  proses  fisiologis yaitu  yaitu  fermentasi.  Uji  fermentasi karbohidrat  dilakukan  untuk  mengetahui kemampuan isolat dalam memecah berbagai  jenis  karbohidrat  yang  mampu menghasilkan  berbagai  asam  organik, asam  laktat,  propionate,  ester,  dan  keton (Pelczar, 2008). Berdasarkan pengamatan hasil uji fermentasi karbohidrat isolat TBP B3, TB1 B2, TMA2 B2 memiliki
kemampuan dalam memfermentasi sumber karbohidrat berupa glukosa, sukrosa,  fruktosa  dan  galaktosa.  Akan tetapi ketiga isolat tidak memiliki kemampuan dalam memfermentasi laktosa.  Penggunaan  jenis  gula  sebagai sumber  karbon  dipengaruhi  oleh  sifat enzimatis di dalam sel bakteri. Oleh karena itu,  tidak  semua  mikroorganisme  mampu memanfaatkan  semua  jenis  gula  karena adanya  keterbatasan  aktivitas  enzimatik. Keterbatasan suatu mikroorganisme dalam memanfaatkan  jenis  gula  tertentu  dapat dijadikan  sebagai  kunci dalam  melakukan identifikasi mikroorganisme (Trivendi et al ., 2010).

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian didapatkan 22 isolat dan 3 diantaranya terdeteksi mampu melakukan  penambatan  nitrogen  yaitu pada tanah biopori, tanah datar, dan tanah datar  Araceae  dengan  kode  isolat  TBP B3,TD1 B2, dan TDA2 B2.

## DAFTAR PUSTAKA
Amalia, D. A. L., Oedjijono, O., & Purwanto,
P. (2020). Eksplorasi Bakteri Diazotrof  dari  Rizosfer  Tanaman Bawah Merah  ( Allium  ascalonicum L.)  di  Brebes,  Jawa  Tengah. BioEksakta:  Jurnal  Ilmiah  Biologi Unsoed , 2(3): 464-478.
Gagelidze,  N.  A.,  Amiranashvili,  L.  L., Sadunishvili,  T.  A.,  Kvesitadze,  G. I.,  Urushadze,  T.  F.,  &  Kvrivishvili, T. O. (2018). Bacterial composition of different types of soils of Georgia. Annals of  Agrarian  Science ,  16(1):
17-21. Hasan, S., & Ansori, N. (1992). Bioteknologi Pertanian Bogor Pusat Antar Universitas Bioteknologi,
Bogor:  Institut  Pertanian  Bogor
Press. Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A.,
Staley,  J.  T.,  &  William,  S.  T.,
(1994). Bergey’s Manual of
Determinative  Bacteriology .  2nd Edition. New York: Lippicolt William and Wilkins. Kaburuan, R., Hapsoh, H., & Gusmawartati,  G.  (2014).  Isolasi dan karakterisasi bakteri penambat nitrogen non-simbiotik tanah gambut  Cagar  Biosfer  Giam  Siak Kecil-Bukit Batu. Jurnal Agroteknologi , 5(1): 35-39.
Lay,  B.  W.  (1994). Analisis  Mikroba  di Laboratorium .  Jakarta:  PT.  Raja
Grafindo Persada.
Lee, S., Reth,  A., Meletzus, D., Sevilla, M.,
&
Kennedy,
C. (2000).
Characterization  of  a  major  cluster of nif, fix, and associated genes in a sugarcane endophyte, Acetobacter diazotrophicus. Journal of Bacteriology , 182(24): 7088. Patti, P. S., Kaya, E., & Silahooy, C. (2013). Analisis  status  nitrogen  tanah dalam  kaitannya  dengan  serapan
N oleh tanaman padi sawah di Desa Waimital, Kecamatan Kairatu,
Kabupaten  Seram  Bagian  Barat. Agrologia , 2(1): 51-58.
Pelczar,  M.  J.  (2008). Dasar-dasar Mikrobiologi . Malang: Djambatan.
Pelealu, J. B., Butarbutar, R. R., & Tallei, T. E.  (2018).  Isolasi  dan  identifikasi bakteri rizosfir Arachis pintoi setelah inokulasi Mikoriza Arbuskular dan penambahan pupuk organik. Jurnal  Bios  Logos ,  7(2):
35-40.
Raffi, M. M., & Charyulu, P. B. B. N. (2012).
Nitrogen  fixation  by  the  native Azospirillum spp.  Isolated  from rhizosphere and non-rhizosphere of foxtail  millet.  Asian Journal  of Biological  and  Life  Sciences ,  1(3): 213-218.
Restuati,  M.,  &  Gultom,  E.  S.  (2012). Potensi  Bakteri  Yang  Berasosiasi Dengan  Spons  Asal  Pulau  Ngge (Sibolga) Sebagai Sumber Antibakteri. Jurnal Penelitian Saintika ,12(2): 98-104. Santoso,  K.,  &  Rahmawati,  R.  (2019). Eksplorasi bakteri
penambat
nitrogen dari tanah Hutan Mangrove Sungai Peniti, Kabupaten Mempawah. Protobiont , 8(1): 52-58.
Simanungkalit,  R.  D.  M.,  Saraswati,  R., Hastuti, R. D., & Husein, E. (2006). Bakteri Penambat Nitrogen . Bogor.: Balai  Besar  Litbang  Sumberdaya Lahan  Pertanian  Badan  Penelitian dan Pengembangan Pertanian.
Subowo Y. B.,  Sugiharto, W.,  Suliasih, & Widawati,  S.    (2010).  Pengujian pupuk hayati Kalbar untuk meningkatkan produktivitas tanaman kedelai ( Glycine max ) var. Baluran. Cakra  Tani ,  25(1):  112- 118.
Trivedi, P. C., Pandey, S., & Bhadauria, S. (2010). Text  Book of  Microbiology. Jaipur: Aavishkar Publishers.