## ISOLASI SENYAWA STEROID DARI TANAMAN GYNURA PSEUDOCHINA (LOUR) DC DAN UJI AKTIVITAS
ANALGETIKA TERHADAP MENCIT JANTAN ( MUS MUSCULUS )

## Roby Pahala Januario Gultom
Staf  Pengajar Prodi D-III Keperawatan  STIKes Imelda Medan, Jalan Bilal Nomor 52 Medan
E-mail: robi.gultom@gmail.com

## ABSTRAK
The  secondary  metabolites  have  been  isolated  from  nonpolar  fraction  of  methanol  extract  of  Gynura pseudochina (Lour) DC plants. The extraction was done by maseration. Separation and purification were done by column chromatography. The isolated compound was a white solids with melting point 123 o C- 125 o C.  The  structure  of  this  compound  was  determined  based  on  spectral  evidence  including  IR, 13 C- NMR, 1 H-NMR,  HSQC,  HMBC  and  COSY.  The  spectral  data  analysis  were  suggested  that  the  isolated compound is a mixture of two steroids which is stigmast-5-en-3-ol or β-sitosterol as a major compound. The analgesic activity of the isolated compound was tested in male mice by writhing test method with 1% acetic acid as the pain-inducer. The isolated compound showed that pain-inhibition activity were 56,2 % for 2 mg/20 g BB dose and 67 % for 4 mg/20 g BB dose. The analgesic activity of the isolated compound is lower than the  aspirin.
Key words : Gynura pseudochina (Lour) DC; Steroid; Stigmast-5-en-3-ol; analgesic activity.

## ABSTRAK
Telah  dilakukan  isolasi  senyawa  metabolit  sekunder  dari  fraksi  nonpolar  ekstrak  metanol  tanaman Gynura  pseudochina  (Lour)  DC.  Ekstraksi  dilakukan  dengan  metode  maserasi.  Pemisahan  dan pemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengan  kromatografi kolom. Senyawa isolasi berupa padatan bewarna  putih  dengan  titik  leleh  123 o C-125 o C.  Struktur  dari  senyawa  hasil  isolasi    ditentukan berdasarkan data spektroskopi meliputi IR, 13 C-NMR, 1 H-NMR, HSQC, HMBC dan COSY. Berdasarkan analisa  data  spektrum,  senyawa  hasil  isolasi  merupakan  campuran  dua  senyawa  steroid,  dimana senyawa  stigmast-5-en-3-ol  atau  dikenal  dengan  nama  lain  β-sitosterol  merupakan  senyawa  mayor. Senyawa hasil isolasi selanjutnya diuji aktivitas analgetikanya pada mencit jantan dengan metode geliat dengan asam asetat 1% sebagai pemberi rasa nyeri. Hasilnya, senyawa memiliki aktivitas menekan rasa nyeri  untuk  dosis  2  mg/20g  BB  sebesar  56,2  %  dan  dosis  4  mg/20  g  BB  sebesar    67  %.  Aktivitas analgetika dari kedua dosis ini di bawah aktivitas aspirin.
Kata kunci: Gynura Pseudochina (Lour) DC; Steroid; Stigmast-5-en-3-ol; Aktivitas Analgetika.

## PENDAHULUAN
Pada  saat  ini  pemanfaatan  tanaman untuk  mengobati  berbagai  penyakit  telah banyak  diterapkan  oleh  masyarakat  karena khasiat  yang  dihasilkannya  sama  baiknya dengan  mengkonsumsi  obat-obatan  yang diolah  secara  modern  yang  cenderung  lebih
mahal. Penggunaan obat-obatan untuk mengobati  penyakit  dapat  juga  memberikan efek  samping  yang  kurang  baik  bagi  tubuh apabila  mengkonsumsinya  dengan  jumlah dosis yang berlebih.
Secara  umum  penyakit  yang  ada  di dalam  tubuh  dapat  menimbulkan  rasa  nyeri yang  membuat  keadaan  penderita  merasa

## Penelitian
tidak nyaman. Adanya respon tubuh terhadap nyeri  dapat  diartikan  sebagai  tanda  adanya gangguan  jaringan  pada  tubuh  (Tjay  dan Rahardja, 2002).  Untuk meringankan bahkan menghilangkan  rasa  nyeri  yang  memberikan efek ketidaknyamanan pada penderita digunakan obat-obat analgetika.
Tanaman Gynura  pseudochina (Lour) DC  dapat  berkhasiat  sebagai  tanaman  obat dan  dapat  digunakan sebagai  analgetika (Badan  POM,  2001).  Kandungan  metabolit sekunder  yang  terdapat  di dalam  tanaman G. Pseudochina (Lour) DC antara lain flavonoid,  terpenoid,  steroid,  alkaloid,  tanin, saponin,  polifenol,  minyak  atsiri  serta  asam fenolat  (Harrizul,  2011;    Herwindriandita dkk,  2006;  Nirwan  dan  Aziz,  2006;  dan Zaini,  2006).  Uji  analgetika  terhadap  ekstrak Gynura procumbens (Lour) Merr dan Gynura segetum (Lour)  Merr  memberikan  hasil bahwa  pemberian  ekstrak  tanaman  tersebut dapat  efektif  menghambat  respon  rasa  nyeri (Suhendi dkk, (2003) dan Putri dkk, (2009)).
Berdasarkan literatur bahwa uji aktivitas analgetika  dari  tanaman Gynura tersebut masih  sebatas  pada  penggunaan  ekstrak tanamannya  saja.  Namun  senyawa-senyawa yang  berperan  aktif  sebagai  analgetika  yang terkandung di dalam ekstrak tanaman tersebut belum  diketahui  secara  pasti.  Berdasarkan tinjauan adanya kandungan metabolit sekunder  pada  tanaman G.  pseudochina (Lour)  DC  dan  pemanfaatannya  sebagai analgetika,  maka  dari  itu  perlu  dilakukan isolasi  senyawa  dari  ekstrak  tanaman G. pseudochina (Lour)  DC  dan  melakukan  uji aktivitas  analgetika  dari  senyawa  hasil isolasinya tersebut.

## METODE

## Alat
Alat  yang  digunakan  seperangkat  alat destilasi, rotary  eveporator R-114  Buchi dengan sistem vakum Buchi B-169, c hamber , timbangan, KCV (Kromatogafi Cair Vakum), lampu  UV  CAMAG  254  nm,  kromatogafi kolom  gavitasi,  alat  pengukur  titik  leleh Fisher John, peralatan gelas. Spekrofotometer NMR  Agilent  DD2  (500  MHz  untuk 1 H- NMR dan 125 MHz untuk 13 C-NMR),  NMR 2D,  FTIR  Perkin  ELMER Spectrum  One ,
spidol, spatula, sarung tangan plastik, syringe jarum  suntik  injeksi, timer ,  wadah  mencit (kandang), hot plate , kamera digital , dan oral sonde tikus, lumpang.

## Bahan
Bahan  yang  dibutuhkan  sampel  daun tanaman Gynura  pseudochina (Lour)  DC yang  sudah  kering,  mencit  jantan,  pelarut metanol,  n-heksana,  etil  asetat,  kloroform, aseton,  aquadest,  silika  gel  60  GF 254 ,  silika gel  60G.  Plat  KLT  Kiessel  gel  60  F 254 ,  0,25 mm,  20  x  20  cm,  asam  asetat  glasial  p.a, aspirin,  karboksimetil  selulosa  (CMC),  aqua pro-injeksi  Otsuka,  kapas,  alkohol  70%,  dan penampak noda (serium sulfat).

## Pengambilan dan Penyiapan  Tanaman
Sampel  tanaman Gynura  pseudochina (Lour)  DC  diperoleh  dan  dikumpulkan  dari Bandung.  Bagian  sampel  yang  digunakan dalam penelitian adalah daunnya, yang sudah dikeringkan  terlebih  dahulu.  Determinasi tanaman ditentukan oleh Herbarium Bogoriense,  Bidang  Botani  Pusat  Penelitian Biologi-LIPI Cibinong.

## Prosedur Kerja

## Ekstraksi Senyawa Metabolit

## Sekunder
Sebanyak 1 kilogam serbuk kering daun, dilakukan  ekstraksi  dengan  menggunakan pelarut  metanol  sebanyak  3  liter  selama  3 hari.  Masing-masing  ekstrak  metanol  yang diperoleh dipisahkan dari sampel dengan cara disaring dan dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator namun tidak sampai  pekat  dan  disimpan  di  dalam  wadah tertutup.  Kemudian  masing-masing  ekstrak metanol  tersebut  selanjutnya  digabungkan sehingga diperoleh ekstrak metanol total hasil maserasi, yang selanjutnya dipekatkan kembali dengan menggunakan rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak pekat metanol  total  kemudian  disimpan  di  dalam vial tertutup.
Uji Fitokimia Uji Alkaloid Sejumlah ekstrak pekat metanol dilarutkan  dengan  kloroform,  selanjutnya ditambahkan  larutan  amoniak  5%  dalam kloroform,  kemudian    diteteskan  asam  sulfat 2  N,  campuran  dikocok  selama  1  menit. Setelah itu akan terbentuk dua lapisan, untuk selanjutnya  dipisahkan  lapisan  atas  dan lapisan  bawahnya.  Terhadap  lapisan  atas untuk  selanjutnya  diteteskan  ke  dalam beberapa  tabung  reaksi  untuk  diuji  dengan pereaksi  Meyer,  pereaksi  Wagner  dan pereaksi Dragendroff. Positif adanya alkaloid dari  masing-masing  perekasi  ditunjukkan dengan adanya endapan.

## Uji Terpenoid/Steroid
Lapisan  bawah  dari  ekstrak  kloroform pada uji alkaloid selanjutnya diuji menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard dengan  cara  menambahkan  2  tetes  asam asetat  anhidrat  pada  lapisan  bawah  dari ekstrak kloroform tersebut, kemudian dibiarkan hingga kering. Selanjutnya ditambahkan  2  tetes  asam  sulfat  pekat, perubahan  warna  yang  terjadi  diamati. Adanya  triterpenoid  ditunjukkan  dengan terjadinya  warna  merah.  Sedangkan  adanya steroid  ditunjukkan  dengan  terbentuknya warna biru kehijauan.

## Pemisahan Senyawa Metabolit Sekunder
Sebanyak  20  g  ekstrak  pekat  metanol dilakukan pemisahan dengan cara kromatogafi cair vakum
(KCV).
Kromatografi  kolom  vakum  menggunakan fase  diam  silika  gel  60  GF 254 dan  dielusi pelarut dengan menggunakan kepolaran yang meningkat,  dimulai  dari  fraksi  nonpolar sampai  fraksi  polar  yaitu:  n-heksana  :  etil asetat  (10:0  sampai  0:10),  etila  asetat  : metanol (9:1 dan 8:2) dan metanol 100%.
Hasil  pemisahan  (eluat)  ditampung  dan dianalisis pola nodanya menggunakan kromatogafi  lapis  tipis  (KLT).  Eluat  yang mempunyai  pola  noda  yang  sama  digabung menjadi  satu  fraksi,  sehingga  didapatkan beberapa  jumlah  fraksi.  Semua  fraksi dianalisis pola nodanya kembali
menggunakan KLT. Visualisasi noda
dilakukan  dengan  menggunakan  lampu  UV dan  serium  sulfat.  Fraksi  yang  berpotensial dilakukan pemisahan dengan teknik kromatografi kolom untuk selanjutnya diperoleh senyawa murni hasil isolasi.

## Uji Kemurnian Senyawa Hasil Isolasi
Senyawa  hasil  isolasi  dilakukan  uji kemurnian  menggunakan  kromatogafi  lapis tipis  (KLT)  dengan  berbagai  sistem  eluen. Kemurnian senyawa ditandai dengan menunjukkan  satu  noda  pada  KLT.  Uji kemurnian  selanjutnya  dilakukan  dengan mengukur  titik  leleh  senyawa  hasil  isolasi dengan  menunjukkan  nilai range di  bawah 2 o C.
Penentuan Struktur Senyawa Hasil Isolasi Senyawa hasil isolasi selanjutnya ditentukan  struktur  senyawanya  dengan menggunakan  spektroskopi  UV,  FT-IR, 1 H- NMR, 13 C-NMR dan NMR 2D.

## Uji Aktivitas Analgetika
Uji Aktivitas analgesik dilakukan dengan  metode  rangsangan  kimia.  Sebagai penginduksi  nyeri  digunakan  larutan  asam asetat 1%.

## Persiapan Hewan Uji
Mencit  jantan  ( Mus  musculus )  dengan berat  badan  kurang  lebih  20-30  g  diperoleh dari STIH ITB, Bandung. Sebelum digunakan mencit  diadaptasikan  dilaboratorium  selama 2  minggu.  Pada  penelitian  ini  kelompok perlakuan  dibagi  ke  dalam  tiga  kelompok, yang  terdiri  dari  kelompok  uji,  kelompok pembanding  (kontrol  positif)  dan  kelompok kontrol  negatif.  Sebelum  percobaan,  mencit terlebih  dahulu  dipuasakan  selama  kurang lebih  10  jam,  namun  pemberian  air  minum tetap dilakukan.
Terhadap  mencit  dalam  kelompok  uji masing-masing  diberikan  senyawa  isolasi dengan  dosis  1  mg/20  g  BB,  2  mg/20  g  BB dan  dosis  4  mg/20  g  BB.  Terhadap  mencit kelompok  pembanding  diberikan  aspirin dengan  dosis  1,3  mg/20g  BB  yang  berasal dari  konversi  dosis  aspirin  untuk  usia  orang dewasa  terhadap  mencit  20  g  dengan pemberian dosis 0,5 ml untuk setiap 20 g BB. Mencit  dalam  kelompok  kontrol  negatif,
hanya  diberikan  larutan  suspensi  CMC  0,5% dengan volume pemberian setiap mencit yaitu 0,5 ml.

## Pembuatan Larutan Asam Asetat 1% dan Suspensi CMC 0,5%
Diambil  1  ml  asam  asetat  glasial dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur  100  ml  lalu diencerkan dengan aqua pro-injeksi.
Pembuatan suspensi CMC 0,5% di dalam 100 ml  dilakukan  dengan  menimbang  500  mg CMC,  ditaburkan  di  atas  aquadest  (30  ml) yang sudah dipanaskan dan dibiarkan sampai mengental  sekitar  5-10  menit,  kemudian diaduk sampai homogen, ditambahkan dengan  aquadest  sedikit  dan  diaduk  kembali dengan  cepat  sampai  terbentuk  gel  suspensi, kemudian  diencerkan  dengan  aquadest  ke dalam labu ukur 100 ml (Asteya, 2010).

## Pembuatan  Sediaan  Senyawa  Uji  dan Aspirin
Untuk  sediaan  pembanding  (aspirin), sebanyak  0,25  g  CMC  ditaburkan  di  atas aquadest (20 ml) yang sudah dipanaskan dan dibiarkan  sampai  mengental  sekitar  5-10 menit.  Kemudian  diaduk  sampai  homogen, ditambah  sedikit    aquadest  dan  diaduk kembali  dengan  cepat  sampai  terbentuk  gel suspensi kemudian ditambahkan gel suspensi tersebut  sedikit  demi  sedikit  ke  dalam  0,5  g aspirin  yang  telah  dihaluskan,  kemudian ditambahkan sedikit aquadest, diaduk dengan cepat  sehingga  terbentuk  suspensi  dan dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur  100  ml  lalu diencerkan dengan aquadest.
Untuk  pembuatan  sediaan  uji,  sebanyak 0,05  g  CMC  ditaburkan  di  atas  aquadest  (5 ml)  yang  sudah  dipanaskan  dan  dibiarkan sampai  mengental  sekitar  5-10  menit, kemudian diaduk sampai homogen, ditambah sedikit  aquadest dan diaduk kembali dengan cepat sampai terbentuk gel suspensi
kemudian  ditambahkan  gel  suspensi  tersebut sedikit  demi  sedikit  ke  dalam  0,1  g  sampel senyawa  isolasi,  kemudian  ditambahkan sedikit  aquadest,  diaduk  dengan  cepat sehingga  terbentuk  suspensi  dan  dimasukkan ke  dalam  labu  ukur  10  ml  kemudian diencerkan dengan aquadest.

## Pelaksanaan Uji Aktivitas Analgetika
Masing-masing  kelompok  ditimbang tiga ekor mencit, dicatat bobotnya dan diberi tanda. Terhadap kelompok uji diberikan dosis senyawa  isolasi,  kemudian  untuk  kelompok kontrol  positif  diberikan  dosis  aspirin,  dan kelompok  kontrol  negatif  diberikan  dosis CMC  0,5%,  semua  kelompok  pemberian dosisnya  secara  peroral  (p.o).  Setelah  15-20 menit  pemberian,  setiap  mencit  dalam masing-masing  kelompok  disuntik  dengan larutan asam asetat 1% secara intraperitoneal (i.p).
Respon geliat pada mencit diamati setiap 5  menit  pertama,  5  menit kedua  dan  5  menit ketiga,  selanjutnya  dicatat  frekuensi  geliat untuk  semua  kelompok  perlakuan.  Aktivitas hambatan  nyeri  ditentukan  dengan  cara mengamati  penurunan  frekuensi  geliatnya dan data frekuensi geliat pada tiap kelompok tersebut  dirata-ratakan.

## Analisis Data
Penentuan Frekuensi Respon Nyeri
(Geliatan)
Respon  nyeri  (geliatan)  mencit  masing- masing  kelompok  5  menit  pertama  sampai  5 menit  ketiga  dijumlahkan  kemudian  dirata- ratakan. Dari data hasil penelitian selanjutnya dianalisis  dengan  menggunakan  metoda ANOVA  serta  untuk  melihat  pengaruh  beda nyata  terkecil  respon  geliatan  dari  setiap kelompok perlakuan menggunakan uji BNT.

## Penentuan  Hambatan Nyeri
Dari  data  frekuensi  geliat  pada  mencit dalam  masing-masing  kelompok  kecuali kelompok kontrol negatif, dihitung persentase (%)  hambatan  nyeri  untuk  mengetahui  daya analgetikanya

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Ekstraksi  Senyawa  Steroid  dari  Tanaman
Gynura pseudochina (Lour) DC Sebanyak  1  kg  serbuk  kering  daun  dari tanaman G.  Pseudochina (L)  DC  dilakukan ekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut  metanol.  Hasil  maserasi  diperoleh ekstrak  pekat  metanol  sebanyak  35,71  g.  Uji terpenoid/steroid dengan menggunakan
pereaksi  Liebermann-Burchard  menunjukkan positif  terpenoid  dengan  munculnya  warna merah  dan  menunjukkan  positif  steroid dengan munculnya warna hijau kebiruan. Uji alkaloid  dengan  menggunakan  pereaksi Mayer,  pereaksi  Wagner  dan  pereaksi Dragendroff  masing-masing  menunjukkan positif alkaloid dengan adanya endapan pada masing-masing pereaksi.
Pemisahan dan Pemurnian Senyawa Steroid  dari  Ekstrak  Metanol Gynura pseudochina (Lour) DC Sebanyak  20  g  ekstrak  pekat  metanol dipisahkan  menggunakan  kromatogafi  cair vakum  (KCV).  Hasil  kromatografi  cair vakum  diperoleh  42  vial  dan  dikelompokkan menjadi  sejumlah  fraksi  sesuai  dengan  pola noda yang sama dari hasil kromatografi lapis tipis.  Hasil  pengelompokan  diperoleh  10 fraksi utama yaitu fraksi A (vial 1-6) (2,14 g),
fraksi B (vial B) (0,39 g), fraksi C (vial 8-9)
(0,08), fraksi D (vial 10-11) (0,46 g), fraksi E (vial  12-16)  (0,62  g),  fraksi  F  (vial  17-20) (0,53 g), fraksi G (vial 21-26) (0,78 g), fraksi
H  (vial  27-310  (1,04  g),  fraksi  I  (vial  32-39)
(1,79 g) dan vial J (vial 40-42) (5,05 g).
Fraksi  B  menghasilkan  padatan  yang masih  berwarna  hijau,  selanjutnya  dilakukan pencucian  menggunakan  n-heksana  sehingga dihasilkan  fraksi  B  (260  mg).  Pemurnian terhadap fraksi B dilakukan dengan
kromatografi  kolom  gravitasi  menggunakan eluen  n-heksana  100%  dan  n-heksana  :  etil asetat (98:2 ; 95:5 ; 9:1 ; dan 85:15). Masing- masing  eluat  hasil  pemisahan  selanjutnya dianalis  menggunakan  plat  KLT  dengan eluen:    n-heksana  :  etil  asetat  (9:1)  (Gambar 1 ).
Gambar 1 . Hasil KLT pemisahan fraksi B
Eluat  yang  mempunyai  pola  noda  yang sama  digabungkan  menjadi  satu  fraksi sehingga diperoleh 5 fraksi B yaitu fraksi B1 (vial 11) (0,017 g), fraksi B2 (vial 12) (0,030 g), fraksi B3 (vial 13-16) (0,165 g), fraksi B4 (vial 17-22) (0,013 g) dan fraksi B5 (vial 23-
28) (0,015 g). Fraksi B3 memperlihatkan satu noda  pada  plat  KLT  dan  diperolah  berupa padatan putih sebanyak 165 mg.
Selanjutnya  uji  kemurnian  terhadap fraksi  B3  dengan  KLT  menggunakan berbagai  sistem  eluen  yaitu  n-heksana  : kloroform  (6:4)  ( 1 ),  n-heksana  :  etil  asetat (9:1) ( 2 ), kloroform : etil asetat (4:1) ( 3 ) dan kloroform  :  aseton  (3:2)  ( 4 )  menghasilkan satu  noda  dengan  Rf  masing-masingnya adalah  0,17;  0,37;  0,7  dan  0,9  (Gambar 2 ). Hasil  KLT  tersebut  menunjukkan  bahwa senyawa hasil isolasi (fraksi B3) sudah cukup murni.  Hasil  pengukuran  titik  leleh  juga menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi ini cukup murni dengan titik leleh 123 – 125 o C.
( 1 )      ( 2 )     ( 3 )     ( 4 )
Gambar 2 .  Hasil  KLT  uji  kemurnian senyawa hasil isolasi dengan berbagai eluen

## Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

## Identifikasi dengan spektrum IR
Spektrum  IR  (Gambar 3 )  menunjukkan bahwa  senyawa  hasil  isolasi  merupakan senyawa  alifatik  yang  ditunjukkan  tidak adanya  serapan  C-H  aromatik  pada  bilangan gelombang  3000  cm -1 .  Hal  ini  diperkuat dengan  tidak  adanya  beberapa  puncak  khas serapan  untuk  gugus  C=C  terkonjugasi  pada bilangan  gelombang  1400-1600  cm -1 untuk senyawa aromatik, akan tetapi pada spektrum IR  memperlihatkan  adanya  serapan  yang lemah  pada  bilangan  gelombang  1642  cm -1 yang berasal dari serapan C=C terisolasi yang lazimnya berasal dari senyawa alifatik.
Dugaan  selanjutnya  bahwa  senyawa hasil isolasi adalah senyawa alifatik, didukung  dengan  adanya  serapan  kuat  pada bilangan gelombang 2933 cm -1 yang
merupakan vibrasi ulur asimetri dari C-H dan 2869  cm -1 yang  merupakan  vibrasi  ulur simetri dari C-H. Keberadaan serapan C-H ini didukung  dengan  munculnya  vibrasi  tekuk dari C-H pada bilangan gelombang 1463 dan 1384 cm -1 .
Spektrum  IR  juga  memperlihatkan adanya serapan yang tajam yang berasal dari vibrasi  ulur  gugus  OH  pada  bilangan gelombang 3430 cm -1 . Keberadaan gugus OH pada  senyawa  hasil  isolasi  diperkuat  dengan adanya  serapan  yang  tajam  dari  vibrasi  ulur gugus  C-O  pada  bilangan  gelombang  1053 cm -1 .
Gambar  3 .  Spektrum  IR  senyawa  hasil isolasi
Identifikasi  Spektrum Nuclear  Magnetic Resonance (NMR) Data  spektrum 1 H-NMR  dan 13 C-NMR mengindikasikan bahwa senyawa hasil isolasi merupakan  campuran  dua  senyawa  dengan perbandingan 2:1. Indikasi tersebut ditunjukkan  dari  spektrum 13 C-NMR  dengan tingginya  intensitas  sinyal  karbon  kuarterner pada  C 140,9 ppm jika dibandingkan dengan intensitas sinyal karbon metin vinilik pada  C 138,4 dan 129,4 ppm.
Lazimnya  intensitas  karbon  kuarterner
(tidak  mengikat  proton)  lebih  rendah  dari intensitas  karbon  yang  mengikat  proton
(Gambar  4).  Indikasi  bahwa  senyawa  hasil isolasi merupakan campuran 2 : 1 ditunjukkan pada spektrum 13 C-NMR dengan melihat  melihat  perbandingan  intensitas sinyal  dari  karbon  metin  vinilik  pada  C
121,8 ppm (sinyal dari campuran) dengan  C 138,4  atau  129,4  ppm  (sinyal  dari  senyawa minor).
Gambar 4 . Spektrum 13 C-NMR karbon sp 2
Spektrum 1 H-NMR, 13 C-NMR  dan dengan  bantuan  data  spektrum  HSQC ( Heteronuclear  Single  Quantum  Coherence ) mendukung  secara  tegas  bahwa  senyawa hasil  isolasi  adalah  campuran.  Hal  ini ditunjukkan  pada  spektrum  HSQC  dengan munculnya 12 metil (CH 3 ), 4 diantara proton metil  (CH 3 )  tersebut  memiliki  multiplisitas singlet yaitu pada  H 1,00 ppm (6H, s ) untuk  C 19,5  ppm    (2  x  CH 3 )  dan  H 0,67  ppm (3H, s )  untuk  C 12,00  ppm  serta  H 0,69 ppm (3H, s ) untuk  C 12,19 ppm  (Gambar 5 ). Lazimnya, senyawa golongan steroid mempunyai  6  gugus  metil  (CH 3 )  dengan  2 metil  diantaranya  memiliki  multiplisitas singlet .    Sedangkan  pada  senyawa  hasil isolasi ini diperoleh 12 metil (CH 3 ), dimana 4 metil diantaranya muncul dengan multiplisitas singlet .  Jadi hal ini memperkuat dugaan  bahwa  senyawa  hasil  isolasi  adalah campuran  dua  senyawa  yang  berasal  dari golongan steroid.
Gambar 5 .  Penggalan  spektrum  HSQC senyawa hasil isolasi
Spektrum 1 H-NMR memperlihatkan adanya sinyal pada  H 5,34 ppm (1H, br d , J = 4,8 Hz) yang merupakan sinyal dari proton
vinilik  (proton  yang  terikat  pada  karbon  sp 2 (Gambar 6 ).  Keberadaan  proton  yang  terikat dengan  karbon  sp 2 tersebut  didukung  oleh spektrum 13 C-NMR dengan munculnya sinyal pada  C 121,8  ppm  yang  khas  untuk  karbon sp 2 ,  selain  itu  pada  spektrum 1 H-NMR terdapat  sinyal  pada  H 3,52  ppm  (1H, m ) yang  khas  untuk  proton  yang  terikat  pada karbon yang mengikat O (oksimetin)
(Gambar  7).  Spektrum 13 C-NMR  juga mendukung  keberadaan  karbon  oksimetin yang  muncul  pada  C 71,9  ppm  (Gambar 7 ). Adanya  oksimetin  ini  mendukung  data spektrum  IR  menunjukkan  adanya  serapan gugus OH dari senyawa hasil isolasi.
Gambar 6 . Spektrum 1 H-NMR proton vinilik pada  H 5,34 ppm
Gambar  7 .  Spektrum 13 C-NMR  karbon oksimetin  C 71,9 ppm
Spektrum 1 H-NMR memperlihatkan
adanya  sinyal  dari  6  buah  gugus  metil. Terdiri  dari  2  gugus  metil  yang  tidak terkopling  yang  muncul  pada  H 0,67  ppm (3H, s )  dan  1,00  ppm  (3H, s ).  Tiga  gugus metil  dengan  multiplisitas  doublet  pada  H 0,91 ppm (3H , d, J = 6,4 Hz); 0,83 ppm (3H,
d , J =  6,7  Hz)  dan  0,80  ppm  (3H, d , J =  8,0 Hz) dan satu gugus metil dengan multiplisitas triplet  H 0,84  ppm  (3H, t , J =  8,8 Hz) (Gambar 8 ).
Gambar  8 .  Spektrum 1 H-NMR  proton  metil (CH 3 )  pada  H 1,00;  0,91;  0,84;  0,83;  0,80 dan 0,69 ppm
Pada  spektrum  HMBC  terdapat  korelasi antara  proton  metin  vinilik  pada  pergeseran kimia  H 5,34  ppm  (1H, br  d , J =  4,8  Hz) dengan  karbon  pada  pergeseran  C 42,4  ppm (CH 2 ),  C 36,6 ppm (Cq),  C 32,0 ppm (CH 2 ), dan  C 32,0 ppm (CH). Namun tidak terdapat korelasi  dari  proton  metin  vinilik  tersebut dengan  karbon  oksimetin  pada  C 71,9  ppm. Hal ini mengindikasikan bahwa proton metin vinilik  tersebut  berada  pada  posisi  C-6 (Gambar 9).
HO 5,34 32,0 36,6 42,4 32,0 A B 10 4 6 7 8
Gambar  9 .  Spektrum  HMBC  proton  metin vinilik pada  H 5,34 ppm
Penempatan  proton  metin  vinilik  pada posisi  C-6  didukung  oleh  spektrum  COSY
yang  memperlihatkan  adanya  korelasi  antara proton  metin  vinilik  pada  H 5,34  ppm dengan  proton  metilen  (CH 2 )  pada  H 1,51 dan  1,97  ppm  (C-7).  Korelasi  tersebut membuktikan  bahwa  proton  metin  vinilik bertetangga  dengan  proton  metilen  (CH 2 ) pada  posisi  posisi  C-7  yang  mengakibatkan multiplisitas  proton  vinilik  menjadi broad doublet pada  spektrum 1 H-NMR  (Gambar 10).
Spektrum COSY memperlihatkan terdapatnya  korelasi  antara  proton  oksimetin pada  H 3,52 ppm dengan proton metilen pada  H 2,25  ppm  (untuk  C-4)  dan  dengan  proton metilen  pada  H 1,83    dan  1,49  ppm  (untuk C-2)  Selanjutnya  spektrum  COSY  juga menunjukkan  adanya  korelasi  antara  proton metilen  pada      C-2  dengan  proton  metilen pada  C-1.  Hal  ini  diperlihatkan  dengan adanya  korelasi  antara  proton  pada  H 1,83 ppm dengan  H 1,07 ppm dan korelasi antara proton pada  H 1,49 ppm dengan  H 1,84 ppm (Gambar 10) .
HO A B 3,52 2,25 1,83 1,49 1,84 1,07 4 3 2 1 5,34 1,97 1,51 6
7
Gambar  10 .  Spektrum  COSY  proton  metin vinilik  pada  H 5,34    ppm;  proton  oksimetin pada  H 3,52  ppm  dan  proton  metilen  (CH 2 ) pada  H 1,83 dan 1,49  ppm
Korelasi  antara  proton-proton  metilen (CH 2 )  dan  metil  (CH 3 )  pada  rantai  samping steroid  ditunjukkan  berdasarkan  spektrum
COSY.  Spektrum  COSY  memperlihatkan adanya  korelasi  antara  sinyal  proton  pada  H 1,32  ppm    (H-22)  dan  H 1,01  ppm  (H-22) dengan  proton  pada  H 1,16  ppm  (H-23) (Gambar 11).
Spektrum
1 H-NMR menunjukkan terdapat  satu  gugus  metil  yang  memiliki multiplisitas  triplet  berada  pada  daerah  H 0,84 ppm (3H, t , J =8,8 Hz) ditempatkan pada posisi  C-29  pada  rantai  samping  steroid. Berdasarkan  dukungan  spektrum  COSY menunjukkan  adanya  korelasi  antara  proton  H 0,84  ppm  dengan  proton  metilen  (CH) tetangganya  pada  H 1,25  ppm  yang mengarahkan  posisi  karbon  metilen  itu  pada posisi C-28 (Gambar 11).
Sinyal  proton  metil  (CH 3 )  lainnya  pada rantai  samping  steroid  terdapat  pada  daerah  H 0,91 ppm (3H, d , J = 6,4 Hz) ditempatkan pada  posisi  C-21  dan  dengan  bantuan spektrum  COSY  dapat  diketahui  sinyal proton  metin  (CH)  tetangganya  yaitu  C-20 pada  H 1,35  ppm  dengan  adanya  korelasi antara  sinyal  proton  pada  H 0,91  ppm dengan  H 1,35 ppm (Gambar 11).
22 23 1,32 1,01 1,16 0,91 1,35 1,25 0,84 20 21 29 28 Gambar  11 Spektrum  COSY  proton  metil (CH 3 )  pada  H 0,84ppm;  proton  metil  (CH 3 ) pada  H 0,91  ppm  dan  proton  metilen  (CH 2 ) pada  H 1,16 ppm
Penempatan posisi kedua karbon metilen (CH 2 )  untuk  C-22  dan  C-23  pada  rantai samping  didukung  oleh  spektrum  HMBC yang  memperlihatkan  adanya  korelasi  antara
proton  pada  H 1,32  ppm  (H-22)  dengan karbon  metil  pada  C 18,9  ppm  (C-21)  dan dengan karbon metin (CH) pada  C 56,2 ppm (C-17).  Selanjutnya  juga  terdapat  korelasi HMBC antara   proton pada  H 1,16  ppm (H- 23)  dengan  karbon  metin  pada  C 46,0  ppm
(C-24)  dan  dengan  karbon  metilen  pada  C 23,2 ppm (C-28). (Gambar 12).
Korelasi  COSY  dan  beberapa  korelasi HMBC  penting  dari  senyawa  hasil  isolasi ditunjukkan pada Gambar 13 sedangkan data
NMR dari senyawa hasil isolasi selengkapnya dapat  dilihat  pada  Gambar  14. Berdasarkan data-data spektroskopi di atas maka disimpulkan  bahwa  senyawa  mayor  hasil isolasi  adalah  stigmast-5-en-3-ol  atau  yang lebih  dikenal  dengan  nama  β-sitosterol dengan rumus molekul C 29 H 50 O. 22 23 17 21 24 28 1,3 2 1,1 6 18 ,9 56 ,2 46 ,0
23 ,2 Gambar 12 .  Spektrum  HMBC  proton metilen (CH 2 )  H 1,32 dan  H 1,16 ppm
HO
HMBC COSY
Gambar  13 .  Korelasi  spektrum  COSY  dan beberapa  HMBC  penting    senyawa  hasil isolasi
HO 1,84 1,07 1,83 1,49 3,52 2,25 5,34 1,97 1,51 1,43 0,92 1,50 1,43 2,00 1,16 1,00 0,67 1,12 0,99 1,84 1,26 1,56 1,05 0,91 1,32 1,01 1,16 1,35 0,84 0,83 0,80 1,66 0,92 37,4 31,8 71,9 42,4 140,9 36,6 32,0 50,3 32,0 21,4 39,9 42,5 56,2 24,4 28,4 56,9 18,9 36,3 34,1 26,2 46,0 12,1 20,0 19,2 23,2 1,25 121,8 29,3 12,0 19,5 Gambar 14 .  Posisi  proton  dan  karbon berdasarkan spektrum HSQC

## Hasil Uji Aktivitas Analgetika
Pengaruh  Pemberian  Suspensi CMC
0,5%,  Aspirin,  dan  Dosis  Sampel  Uji Terhadap Jumlah Geliatan Mencit pada 5 Menit Pertama, Kedua dan ketiga Berdasarkan hasil analisa anova menunjukkan  bahwa  pemberian  dosis  untuk kelompok  aspirin  dan  sampel  uji  secara peroral  (p.o)  pada  5  menit  pertama,  kedua dan  ketiga  semuanya  memberikan  perbedaan yang  nyata  jika  dibandingkan  dengan pemberian dosis untuk kontrol negatif (CMC 0,5%).  Hal  ini  terbukti  bahwa  F hitung >  F tabel dari  setiap  5  menit  perlakuan  yang  berarti, pemberian  dosis  kelompok  aspirin  dan sampel uji menunjukkan pengaruh analgetika yang menyebabkan penurunan jumlah geliatan dibandingkan dengan kontrol negatif. Untuk  dapat  melihat  beda  nyata  dari masing-masing kelompok perlakuan dilakukan  uji  beda  nyata  terkecil  (BNT) sehingga pengaruh analgetika terhadap jumlah  geliatan  yang  dihasilkan  masing- masing kelompok perlakuan dalam penelitian ini  dapat  diketahui.  Pada  5  menit  pertama berdasarkan jumlah geliatannya dari kelompok aspirin, kelompok II dan III sangat berbeda  nyata  yang  berarti  memberikan pengaruh  analgetika  dengan  menujukkan jumlah geliatan yang kecil jika dibandingkan dengan  kelompok  I.  Kelompok  I  tidak berbeda  nyata  dengan  kontrol  negatif  karena jumlah  geliatan  yang  sama  besarnya  dengan kelompok kontrol negatif sehingga
disimpulkan  bahwa  pengaruh  analgetika kelompok I tidak ada.
Kelompok  II  dan  III  sangat  berbeda nyata terhadap kelompok kontrol negatif akan tetapi kelompok aspirin sangat berbeda nyata terhadap  semua  kelompok  perlakuan.  Maka dari  itu  disimpulkan  bahwa  untuk  kelompok aspirin pada 5 menit kedua tetap memberikan pengaruh  analgetika  yang  lebih  baik  dari pada semua kelompok perlakuan hal ini dapat dilihat  sedikitnya  jumlah  geliatan  yang dihasilkan.
Pada  5  menit  ketiga  berdasarkan  uji BNT menunjukkan kembali kelompok aspirin sangat berbeda nyata dengan semua kelompok  perlakuan.  Maka  dari  itu  dapat disimpulkan  bahwa  pemberian  aspirin  pada penelitian  ini  tetap  memberikan  pengaruh analgetika terbaik dari setiap waktu perlakuan yang ada jika dibandingkan dengan kelompok II dan III yang memiliki pengaruh analgetika lebih rendah dari aspirin.
Jumlah  geliat  rata-rata  mencit  selama  5 menit  pertama,  kedua  dan  ketiga  dibuat kedalam  grafik    untuk  membandingkan jumlah  geliat  masing-masing  kelompok perlakuan. Pemberian dosis sampel uji secara bertingkat terhadap waktu pengamatan mampu  menurunkan jumlah  geliatan.  Hal ini berarti  semakin  besar  jumlah  dosis  yang diberikan  maka  semakin  kecil  jumlah geliatannya (Gambar 15).
Gambar 15 . Perbandingan rerataan geliatan mencit kelompok perlakuan pada 5 menit pertama, kedua dan ketiga
Gambar 15 menunjukkan bahwa kelompok  I,  II  dan  III  sudah  mengalami respon  geliatan  pada  5  menit  pertama  akibat
dari pemberian asam asetat 1% mulai bekerja, hal  ini  berbeda  dengan  kelompok  aspirin pada 5 menit pertama mencit tidak mengalami  geliatan  yang menunjukkan pengaruh  analgetika  sudah  bekerja  pada  5 menit pertama. Jumlah geliatan dari kelompok  I,  II  dan  III  berbeda-beda  pada  5 menit  pertama,  keadaan  ini  menunjukkan adanya  perbedaan  pengaruh  analgetika  dari setiap dosis yang diberikan.
Kelompok I menunjukkan jumlah geliatan  yang  besar  pada  5  menit  pertama, keadaan  ini  menyatakan  bahwa  kelompok  I tidak berpotensi memberikan pengaruh analgetika.  Kelompok  II  dan  III  pada  pada Gambar  15 mulai  menunjukkan  pengaruh analgetika  pada  5  menit  kedua  dengan ditandainya penurunan jumlah geliatan sampai  pada  5  menit  ketiga,  keadaan  ini menyatakan  bahwa  kelompok  II  dan  III berpotensi  sebagai  analgetika  namun  efek analgetika  kelompok  II  dan  III    berada  di bawah  aspirin.  Berdasarkan  Gambar  15 menyatakan bahwa kelompok aspirin sebagai kontrol positif memberikan pengaruh analgetika terbaik dari kelompok I, II dan III. Selain dilihat dari hasil jumlah geliatan yang kecil,  efek  obat  aspirin  sudah  mulai  bekerja pada 5 menit pertama.
Suatu  obat  dapat  dikatakan  mempunyai aktivitas  sebagai  analgetika  apabila  mampu menurunkan  jumlah  geliatan  mencit  ≥  50%
(Sirait dkk, 1993). Gambar 16
memperlihatkan bahwa kelompok  I  memiliki persentase  hambatan  nyeri  kurang  dari  50% sehingga  dapat  dikatakan  belum  mempunyai aktivitas analgetika. Pada kelompok II dan III memiliki  persentase  hambatan  nyeri  lebih dari 50% sehingga dapat dikatakan kelompok II dan III mempunyai aktivitas analgetika.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1 2 3 Re ra ta G eli at an Men cit Waktu Perlakuan (5 menit) Kontrol (-) Kontrol (+) (I) 1 mg
(II) 2 mg (III) 4 mg
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Aspirin I II III 25,7% 56,2% 67% 99,8 % % H a m ba ta n N y e ri Kelompok Perlakuan
Gambar 16 .  Grafik  %  hambatan  nyeri  rata- rata mencit setiap kelompok perlakuan
Persentase  hambatan  nyeri  selanjutnya dapat  dijadikan  dasar  untuk  menghitung persentase  efektivitas  analgetika  dengan  cara membandingkan  persentase  hambatan  nyeri kelompok  uji  terhadap  kelompok  aspirin. Persentase  efektivitas  analgetika  berguna untuk  mengetahui  keefektifan  analgetika kelompok  uji  dalam  berbagai  dosis  yang diberikan  terhadap  aspirin  karena  aspirin sudah  terbukti  sebagai  obat  analgetika  yang paling efektif dalam menggurangi rasa nyeri. Persentase efektivitas analgetika pada kelompok II sebesar 56,3 % dan kelompok III sebesar  67,1%  terhadap  aspirin.  Jadi,  dari persentase  hambatan  nyeri  dan  efektivitas analgetika  dapat  diketahui  bahwa  aktivitas analgetika  kelompok  II  dan  III  berada  di bawah aspirin

## KESIMPULAN
1. Senyawa  golongan  steroid dengan  nama stigmast-5-en-3-ol sebagai    β-sitosterol telah diisolasi dari ekstrak metanol daun Gynura pseudochina (Lour) DC.
2. Pemberian dosis 2 mg/20 g BB dan dosis 4  mg/20  g  BB  menunjukkan  aktivitas sebagai  analgetika  dengan  waktu  kerja obat pada 5 menit kedua.
3. Perbandingan persentase efektivitas dosis 2 mg/20 g BB sebesar 56,3 % dan dosis  4  mg/20  g  BB  sebesar  67,1% terhadap aspirin

## DAFTAR PUSTAKA
Asteya,  D.M.  (2010). Sintesis  Asam  2- ( 2’Klorobenzoiloksi ) Benzoat  dan  Uji
Aktivitas  Analgesik  pada  Mencit ( Mus muscullus ).  Skripsi  Departemen  Kimia Farmasi,  Fakultas  Famasi,  Universitas Airlangga, Surabaya.
Badan  Pengawasan  Obat  dan  Makanan. (2001). Kebijakan  Obat  Alam/Herbal Medicine  Indonesia .  Jakarta  :  Badan POM Harrizul,  R.  (2011). Karakteristik  Ekstrak Daun  Dewa  (Gynura  Pseudochina  (L) DC)  dengan  Kromatografi  Cair  Kinerja Tinggi. Jurnal Farmasi Indonesia . Vol 5 (3), hal (134-141).
Herwindriandita.,  Siti,  K  dan  As’ari,  N.
(2006). Telaah  Fitokimia  Daun  Dewa (Gynura  Pseudochina  (Lour)  DC) .
Skripsi  Departemen  Farmasi,  ITB, Bandung.
Nirwan  dan  Aziz,  S.A.  (2006). Multiplikasi dan  Pigmentasi  Antosianin  Daun  Dewa (Gynura  Pseudochina  (L)  DC) In  Vitro . Buletin  Agronomi , Vol 34 (2), Hal (112-
118).
Putri,  C.A.R.,  Setjari,  W  dan  Hendrik.
(2009). Daun Dewa dapat Menghambat  Respon  Rasa  Nyeri . Oral Biology  Dental  Journal ,  Vol  (1),  hal (28-31).
Sirait,  M.D.,  Hargono.,  Wattimena.,  Husin.,
Sumadilaga dan Santoso. (1993). Pedoman Pengujian dan Pengembangan Fitofarmaka,  Penapisan  Farmakologi, Pengujian  Fitokimia  dan  Pengujian Klinik Pengembangan dan Pemanfaatan Obat  Bahan  Alam .  Jakarta:  Yayasan
Pengembangan Obat Bahan Alam Phytomedica.
Suhendi,  A.,  Kuswandi  dan  Nugroho,  A.E. (2003). Efek  Analgetik  Infusa  Daun Dewa  (Gynura  Procumbens  (Lour) Merr)  Pada  Mencit  Putih  Jantan  Galur DDI . International  Scientific  Journal Database ,  Vol (4), hal  (77-83).
Tjay,  T.H.,  dan  Rahardja  K.  (2002). Obat- Obat Penting Khasiat, Penggunaan, dan Efek-Efek  Sampingnya.  Edisi  Keenam . Jakarta: Elex Media Komputindo. Zaini,  R.  (2006). Isolasi  Komponen  Bioaktif Flavonoid  dari  Tanaman  Daun  Dewa (Gynura Pseudochina (Lour) DC). Tesis Sekolah Pascasarjana IPB, Bogor: IPB.