## Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Cengkeh dengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB

## DNA Isolation Technique of Clove Plant Genomes Using Buffer CTAB Modification
Sundari
Prodi Pendidikan Biologi FKIP Universitas Khairun Ternate email: sundariunkhair08@gmail.com

## Abstrak
Metode  dan  teknik  sederhana,  efisien  untuk  isolasi  DNA  genom  tanaman  cengkeh  yang banyak  mengandung  residu  polisakarida  dan  phenol  telah  dihasilkan.  Pada  penelitian  ini,  digunakan protokol  isolasi  DNA  tumbuhan  dengan  metode  CTAB  yang  dimodifikasi  sebagai  protokol  yang efisien  untuk  membuang  polisakarida  dan  phenol  yang  terdapat  pada  tanaman  cengkeh.  Obyek penelitian  ini  terdiri  dari  sampel  tanaman  cengkeh  dan  protocol  CTAB  yang  dimodifikasi  pada konsentrasi  pvp,  washing  dan  presipitasi  serta  inkubasi  dingin  untuk  pemurnian  DNA  genom  dari polisakarida  dan  phenol.  Perbandingan  2  protokol  isolasi  DNA  genom  cengkeh  dengan  CTAB standard  dan  CTAB  modifikasi  menunjukkan  bahwa  metode  CTAB  modifikasi  menghasilkan whole genom durian cukup murni rata rata 1,90 dan berhasil diamplifikasi  dengan PCR-RAPD.
Kata kunci: isolasi, DNA, polisakarida, CTAB, modifikasi.

## Abstract
The  simple  and  efficient  method  for  genomic  DNA  isolation  protochol from  clove, its  woody crops containing high polysaccharide and phenol levels has been described here. In the present study, using  modified  CTAB  for  plant  DNA  isolation  method  were  studied  for  removing  the  highly concentrated polysaccharides from genomic DNA of woody crops.This method involves the modified CTAB      at  the  pvp  concentration,  time  incubate    and  precipitate  procedure  employing  DNA purification  step to remove polysaccharides and phenol residu.  Compared with the two studied DNA isolation  methode  of  clove  using  standart  CTAB  and  modified  CTAB  the  everage  yield  high  quality DNA whole genom is 1.90 purity and DNA was suitable for PCR and RAPD analyses.
Keyword: isolation, DNA, polysaccharides, phenol residu, CTAB
Sundari: Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Cengkeh…..

## Pendahuluan
Cengkeh ( Syzygium aromaticum L. Mer &  Perry)  merupakan  tanaman  rempah  rempah yang  bernilai  ekonomi.  Tanaman  ini  termasuk salah  satu  spesies  dari family  Myrtaceae . Cengkeh dalam sejarah disebut sebagai tanaman  asli  Indonesia  yang  berasal  dari Kepulauan  Maluku,  yaitu  dari  Pulau  Ternate, Tidore,  Motir,  Makian,  dan  Bacan  (Purseglove et  al .,  1981).  Cengkeh  varietas  Afo  terdapat  di pulau Ternate. Cengkeh ini merupakan cengkeh tetua  dari  cengkeh  zanzibar  yang  merupakan varietas  cengkeh  unggulan  di  Indonesia. Sebagai  daerah  hotspot  dan  pusat  persebaran cengkeh  dunia,  maka  perlu  dilakukan  program pemuliaan  dan  strategi  konservasi  spesies cengkeh asli Maluku Utara. Pada saat ini upaya pemuliaan dan konservasi cengkeh asal Maluku Utara telah dilakukan berbasis data sebaran dan karakter  fenotip.  Program  pemuliaan  akan sangat  efektif  jika  didukung  dengan  data genetic  dalam  hal  ini  keanekaragaman  genetic tanaman  cengkeh.  Diharapkan  melalui  kajian ini  dapat  diketahui  jarak  genetik  untuk digunakan  sebagai  acuan  dalam  persilangan antar  kerabat  sehingga  diperoleh  sifat  yang unggul.
Pada  saat  ini  teknologi  DNA  untuk kajian  analisa  molekuler  telah  berkembang pesat. Tahap isolation DNA dengan merupakan tahap  yang  sangat  penting  dan  menentukan keberhasilan.  Kualitas  DNA  genom  yang diisolasi  tinggi  merupakan  hal  yang  dijadikan tolak  ukur  keberhasilan  pekerjaan  ditahap amlifikasi  dan  analisis  sekuen  DNA  penenda molekuler.  Kontaminasi  Polysaccharida  dan derivatnya  merupakan  salah  satu  problem dalam  kegiatan  isolasi  DNA  pada  tanaman berkayu.  Pada  umumnya  sampel  DNA  dari tanaman  berkayu  sering  terkontaminasi  oleh polisakarida, fenol, dan derivatnya. Kontaminan tersebut  sangat  mengganggu  kualitas  DNA genom  yang  dihasilkan  (Fang et  al .  1992; Porebski et  al .  1997;  Schlink  and  Reski  2002), Kualitas  DNA  genom  yang  dihasilakan  selama isolasi  juga  akan  mempengaruhi  daya  simpan DNA  dan  peluang  adanya  enzim  dan  inhitor pada  saat  tahap  amplifikasi  DNA  dan sekuensing  (Lodi et  al .  1994;  Sharma et  al . 2002).
Bufer Cetyl  Trimethyl  Ammonium Bromide (CTAB) lebih dikenal sebagai  metode yang  umum  digunakan  dalam  ekstraksi  DNA genom  tanaman  yang  banyak  mengandung
polisakarida dan senyawa polifenol (Lumaret et al. 1998;  Jose  dan  Usha  2000).    Terdapat  tiga langkah  utama  dalam  ekstraksi  DNA,  yaitu perusakan  dinding  sel  (lisis),  pemisahan  DNA dari  bahan  padat  seperti  selulosa  dan  protein, serta  pemurnian  DNA  (Nicholl  1993;  Surzycki 2000).  Teknik  dan  metode  isolasi  DNA  saat sudah  banyak  dikembangkan  namun  teknik tersebut  masih  bersifat  universal  bagi  tanaman atau  hewan  dan  mikroorganisme.  Teknologi terbaru telah dikembangkan teknik isolasi DNA dalam paket miniprep kit DNA extraction untuk tanaman  sudah  dilengkapi  dengan  bahan  dan kolom  pembersih  polisakarida  (Porebski et  al . 1997; Schlink and Reski 2002) .
Tanaman  cegkeh  merupakan  jenis tanaman  berkayu  dan  aktif  menghasilkan senyawa metabolit sekunder minyak atsiri. Pada umumnya  teknik  isolasi  DNA  genom  tanaman berkayu  masih  sangat  sulit  dalam  memisahkan kontaminan polisakarida dan derivatnya selama proses isolasi DNA sehinnga proses amplifikasi DNA  dengan  PCR  –  RAPD,  RFLP  maupun SSR,  dan  sekuen  DNA  barcode  menghasilan pita DNA yang sangat sedikit bahkan ada yang gagal  dalam  amplifikasi  DNA  (Luro et  al . 1995; Porebski et al . 1997). Tujuan penelitaian ini  adalah  untuk  megembangkan  teknik  isolasi DNA  genom  dari  tanaman  cengkeh  yang merupakan  tanaman  berkayu  dan  produktif menghasilkan  senyawa  metabolit  sekunder, teknik  isolasi  DNA  genom  dimodifikasi  dari protocol  CTAB  standar,  modifikasi  difokuskan pada  menghilangkan  kontaminan  residu  fenol dan polisakarida dari DNA melalui peningkatan konsentrasi PVP, presipitasi PCI dan penamjangan waktu inkubasi dingin.

## Metode Penelitian

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  adalah  sampel daun  muda  tanaman  cengkeh  asal  Ternate. Bahan  lain  yang  digunakan  adalah    Nitrogen cair,  Bufer CTAB CTAB (CTAB: 4,1 g NaCl, 10  g  CTAB,  0,5  M  EDTA  pH  8,0,  18,61  g disodium  etilendiamin  tetra  asetat  2H2O,  1M Tris-HCl pH 8,0, 12,11 g Trisma Base , 1,40 M NaCl,  29,22  g  sodium  khlorida,  2%  PVP  dan 0,20% ß-mercaptoetanol), pvp, ß- mercaptoetanol, buffer TE, buffer EDTA, befer TBE,  primer  RAPD  1-5  yang  mempunyai untaian  nukleotida  RAPD1,  RAPD2,  RAPD3, RAPD4,  RAPD5,  RAPD6,  3000  kb  DNA ladder .
Sundari: Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Cengkeh…..
Prosedur isolasi DNA Genom
Isolasi  DNA  genom  dari    sampel    daun cengkeh  Ternate  menggunakan  metode  CTAB (Doyle & Doyle, 1990 dan metode CTAB yang dimodifikasi  peneliti.  Modifikasi  CTAB  yang dilakukan  peneliti  adalah  modifikasi  :1) Konsentrasi  Bufer  CTAB  menjadi  3%;  2) konsentrasi  pvp  4%,  3)  proses  pencucian dengan  PCI  menjadi  3-4  kali  cuci,  dan  5) inkubasi suhu -20 0 C menjadi 18  jam. Selanjutnya,  sebanyak  0,05  gram  daun  segar digerus  dengan  mortal  pistil  steril  dengan nitrogen  cair  dan  ditambahkan  buffer  ekstrak {CTAB 2%, 1 M Tris-HCl (pH 8), 0,5M EDTA (pH  8),5  M  NaCl,  7,5  M Amonium  sulfat,  dan 0,1  mg/µL  RNAse  }  kemudian  ditambahkan PVP,    2%  β  mercaptoetanol,  dan  selanjutnya inkubasi suhu 60 0 C selama 30 menit, kemudian di sentrifuse pada suhu 4 0 C, 13.000 rpm selama 10  menit,  Supernatan  ditambahkan  PCI (phenol:  Chloroform:  Isoamilalkohol)  25:24:1 dan  disentrifuse    pada  suhu  4 0 C,  13.000  rpm selama  10,  selanjutnya  supernatan  ditambah dengan CI (chloroform:Isoamilalkohol) 24:1dan disentrifuse pada suhu 4 0 C, 13.000 rpm selama 5  menit,  supernatan  dipindahkan  ke  tabung ependof  baru  dan  ditambahkan  amonium  sulfat 7,5M sebanyak 0,1 volume supernatan mixgentle  dan  ditambahkan  alkohol  absolut sebanyak  2,5  volume  supernatan  dan  dikocok, selanjutnya diinkubasi pada suhu -20 0 C selama 2    jam,  selanjutnya  sentrifuge  selama  15  menit pada suhu 4 0 C 13.000 rpm.kemudian supernatan dibuang dan pelet ditambah alkohol 70%  sebanyak  500µL  dan  disentrifuse  selama 15  menit,  buang  supernatan  dan  pelet dikeringanginkan  selama  1  jam  selanjutnya ditambahkan buffer TE (pH 8) sebanyak 50 µL dan  DNA  cengkeh  siap  disimpan  pada  suhu  - 20 0 C untuk jangka waktu lama.
Kuantifikasi DNA Menggunakan Elektroforesis
DNA dikuantifikasi menggunakan elektroforesis pada agarose gel 1,5%.
Prosesnya, 1μl stok DNA dicampur dengan 9 μl air  suling  dan  2μl loading  dye .  Campuran contoh  lalu  dimasukkan  ke  dalam  sumuran  gel dalam  kamar  elektroforesis  yang  telah  diisi bufer TBE 1x ( Trisma Base , boric acid , dan 0,5 M  EDTA  pH  8,0).  Sebagai  pembanding digunakan marker DNA ladder yang diletakkan
pada  sumur  pertama  kemudian  elektroforesis dijalankan pada tegangan 70 volts sampai DNA bermigrasi/bergerak  lebih  kurang  1  cm  di  atas batas  bawah.  Selanjutnya  visualisasi  dengan GelDoc  Uv  transluminator,  sedangkan  uji kuantitatif dilakukan dengan mengukur konsentrasi dengan spektronanodrop.

## Amplifikasi RAPD PCR
Reaksi amplifikasi DNA dengan menggunakan  PCR  merk  Takara.  Jumlah koktail  PCR    yang  digunakan  adalah  10  µL dengan  komposisi  5  µL  PCR  mix  merk INTRON;  3  µL  DdH 2 O;  1  µL  primer  OPA  (1, dan  19)  dan  1  µL  DAN  template.  Pengaturan program PCR yang digunakan adalah sebanyak 45  siklus  yang  terdiri  dari  fase  Pradenaturasi suhu  94 0 C  selama    5  menit;  Denaturasi  suhu 94 0 C  selama    30  detik;    Anealing  suhu  37 0 C selama    30  detik;    Ekstensi  suhu  72 0 C  selama 90  detik;  dan  Post  Ekstensi  suhu    72 0 C  selama 7 menit. Selanjutnya dilakukan tahap elektroforesis untuk visualisasi hasil amplifikasi DNA  durian  menggunakan  penanda  molekuler RAPD  dengan  menggunakan  2  primer  (Tabel 1).  Untuk  membandingkan  ukuran  pasang  basa antar  pita  DNA  hasil  amplifikasi  digunakan marker DNA 1000bp plus merk INTRON.
Tabel 1. Sekuen primer OPA Primer Seq 5 to 3 OPA-1 CAG GCC CTT C OPA-2 TGC CGA GCT G Selanjutnya hasil dari PCR di elektroforesis dengan dimasukkan dalam sumuran  gel  1,5%  dalam  kamar  elektroforesis yang  sudah  diisi  bufer  TBE  1x,  diisikan  satu sumuran pertama dengan 3000 bp DNA ladder . Setelah  itu  elektroforesis  dijalankan  dengan daya  70  volt  sampai  penanda loading  dye berada  sekitar  1  cm  di  atas  batas  gel  bagian bawah.

## Hasil dan Pembahasan
Data  hasil  penelitian  ini  berupa  profil DNA  genom  tanaman  cengkeh  hasil  isolasi dengan  menggunakan  protocol  isolasi  DNA CTAB  (Doyle  &  Doyle,  1990)  dan  CTAB modifikasi ditunjukkan pada Gambar 1.
Sundari: Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Cengkeh…..
(A)
(B)
Gambar 1. A) DNA Cengkeh (metode CTAB) B) DNA Cengkeh (CTAB modifikasi)
Profil  DNA  genom  tanaman  cengkeh dengan protocol CTAB (Doyle & Doyle, 1990) (Gambar 1A) terlihat bahwa DNA genom yang dihasilkan  pada  3  sampel  tanaman  cengkeh DNA  genom  yang  dihasilkan  cukup  tebal namun  mengalami smear .  Gambar  1B  terlihat bahwa  DNA  genom  yang  dihasilkan  dengan protocol  CTAB  modifikasi  DNA  genom  yang dihasilkan  lebih  tipis  namun  tidak smear . Selanjutnya  data  konsentrasi  dan  kemurnian DNA seperti pada table 2 berikut:
Tabel 2. Data  Kemurnian  DNA  Genom  pada  tanaman durian Nomor Sampel Komurnian (metode CTAB) Kemurnian (CTAB modifikasi) 1 A1 2,03 1,78 2 A2 2,05 1,86 3 A3 2,09 1,79
Hasil  isolasi  DNA  genom  tanaman cengkeh  dengan  metode  isolasi  dengan  CTAB menghasilkan  DNA  dengan  kemurnian  yang rendah  artinya  masih  terdapat  kontaminasi polisakaridasi  dan  phenol.  Kemurnian  DNA genom  hasil  isolasi  dengan  protocol  CTAB modifikasi  menunjukkan  nilai  yang  mendekati DNA  murni  yaitu  1,80.  Komposisi  DNA  yang mengandung  basa  purin  dan  pirimidin  dapat menyerap  cahaya  UV.  Pita  ganda  DNA  dapat menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya pada panjang gelombang  280  nm.  Dengan  adanya  perbedaan penyerapan  cahaya  UV  ini,  kemurnian  DNA dapat diuji secara kuantitatif dengan
menghitung  nilai  absorbansi  260  nm  dibagi dengan  nilai  absorbansi  280  nm  (Aras, et  al ., 2003).  Kemurnian  DNA  ditentukan  dengan estimasi  rasio  absorbansi  pada  260  nm  sampai 280  nm  (Å  260/  Å  280),  dan  nilai  kemurnian DNA  berkisar  antara  1,8-2,0.  (Sambrook, 2001).
Pada  tahap  awal  isolasi  DNA  dengan menggunakan  nitrogen  cair  untuk  melisis dinding  sel  dan  mengeluarkan  semua  isi  sel, selanjutnya ditampung dalam larutan penyangga  yang  berisi  Tris  HCl  dan  EDTA. Namun  dinding  sel  juga  dapat  dipecahkan dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi  diikuti  dengan  penghangatan  pada suhu  65°C.  Bahan  detergen  seperti  sodium dodecil sulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB dapat digunakan  untuk  proses  lisis  (Subandiyah ,2006).  Penggunaan  bufer  CTAB  sebagai pengganti  nitrogen  cair  untuk  ekstraksi  dapat menghasilkan    produk  DNA  yang  berkualitas yang  ditunjukkan  oleh  pita  DNA  genom (Gambar  1).  Produk  isolasi  DNA  yang berkualitas  baik  ditunjukkan  dengan  pita  DNA yang  terlihat  tebal  dan  bersih  bila  divisualisasi menggunakan  gelDoc  elektroforesis.  Setelah proses elektroforesis DNA genom dan dihasilkan pita DNA yang berkualitas dilanjutkan  proses  PCR,  yaitu  metode in  vitro yang  secara  cepat  dapat  mengcopi  sekuen- sekuen  DNA  target  yang  ada  di  dalam    whole genom DNA. Selanjutnya dilakukan amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR-RAPD dengan  2  primer  OPA  1  dan  OPA  2.  Hasil amplifikasi DNA ditunjukkan pada Gambar 2.
Sundari: Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Cengkeh…..
,,, A=OPA1 B=OPA2 C=OPA1 D=OPA2
Gambar 2. Profil  PCR-RAPD  dari  3  sampel  cengkeh  dengan  Metode  CTAB  (Gambar  A  dan  B)  dan metode CTAB modifikasi (Gambar C dan D)
Hasil  amplifikasi  DNA  dengan  PCR- RAPD  menunjukkan  bahwa  metode  isolasi DNA dengan CTAB standar pada penelitian ini kurang  efektif  untuk  proses  amplifikasi  DNA cengkeh,  hal  ini  dapat  dilihat  pada  gambar  2 pita  DNA  yang  terbentuk  pada  primer  OPA  1 sedikit  pita  yang  muncul,  sedangkan  pada penggunaan  OPA  2  hanya  terdapat  1  sampel DNA  yang  dapat  teramplifikasi  dan  sisanya kosong.  Pada  produk  PCR-RAPD  dengan menggunakan  protocol  CTAB  modifikasi diketahui  pada  primer  OPA  1  dan  primer  OPA 2  terdapat  3  sampel  DNA  yang  teramplifikasi. Produk PCR akan menjadi DNA target.  Sekitar 105  kopi  dari  sekuen  DNA  target  dengan mudah  dapat  divisualisasikan  sebagai  pita diskret dengan ukuran spesifik ketika diseparasi pada  elektroforesis  gel  agarose  (Tridjatmiko, 2006).
Proses  amplifikasi  dengan Random
Amplified
Polymorphic DNA
(RAPD) merupakan  teknik  pengujian  polimorfisme DNA  berdasarkan  pada  amplifikasi  dari segmen-segmen DNA acak yang  menggunakan primer  tunggal  yang  sekuen  nukleotidanya ditentukan  secara  acak.  Primer  tunggal  ini biasanya  berukuran  10  basa.  PCR  dilakukan pada  suhu  anealing  yang  rendah  yang memungkinkan primer menempel pada beberapa  lokus  pada  DNA.  Aturan  sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60% (Subandiyah, 2006).
Profil  pita  DNA  genom  pada  tanaman termasuk  cengkeh  yang  dihasilkan  dari  isolasi DNA menggunakan CTAB standar (Gambar 3), dan  hasil  isolasi  DNA  pada  tanaman  cengkeh menggunakan  teknik  isolasi  DNA  modifikasi CTAB  {3%  CTAB,  1  M  NaCl,  3%  β - mercaptoetanol,  dan  4%  PVP  10}.  Bila  kedua
hasil  tersebut  dibandingkan  maka  pola  pita DNA  yang  dihasilkan  memiliki  ketebalan  yang tidak  sama.  Dengan  demikian,  bufer  CTAB modifikasi  cukup  memenuhi  syarat  untuk digunakan  dalam  isolasi  DNA  dari  tanaman yang  mengandung  karbohidrat  dan  fenol  tinggi karena  tidak  merusak  DNA.  Bufer  CTAB dengan  kandungan  garam  yang  tinggi  dapat memisahkan  polisakarida  dari  dinding  sel (Porebski et  al .  1997;  Surzycki  2000), sedangkan  PVP  dapat  mengurangi  broning akibat  kandungan  fenol  pada  daun  muda (Porebski et al . 1997).

## Simpulan
Isolasi  DNA  genom  tanaman  cengkeh memerlukan  prosedur  dan  teknik  isolasi  yang spesifik yang dapat dikembangkan dari modifikasi CTAB. Teknik isolasi tersebut dapat dikembanagkan  dari  prosedur  standar  yaitu CTAB.  Pemisahan  DNA  dari  kontaminan seperti  protein,  lemak,  dan  karbohidrat  dapat dilakukan  saat  isolasi  dengan  modifikasi konsentrasi  bahan,  waktu  inkubasi  dan  teknik presipitasi.  Penggunaan  bufer  CTAB  ditambah 3% β-mercaptoetanol  dan  PVP  mampu mengurangi broning.

## Ucapan Terimakasih
Penulis  mengucapkan  terimakasih  tak terhingga  kepada  Dr.  Yayuk  Muliati,  M.Si  dan Abdu  Mas’ud  M.Pd  yang  telah  membantu pelaksanaan  isolasi  DNA,  pemotretan  gelDoc dan analisis data molekuler PCR-RAPD selama penelitian.
Sundari: Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Cengkeh…..

## Daftar Pustaka
Aras,  S.,  A.  Duran  &  G.  Yenilmez.  2003. Isolation  of  DNA  for  RAPD  Nalysis From Dry leaf Material of some Hesperis L.  specimens. Plant  Molecular  Biology Reporter . 21: 461a- 461f Doyle,  J.J.  and  J.L.  Doyle.  1990.  Isolation  of plant  DNA  from  fresh  tissue. Focus 12:13-15.  Fang,  G,  S.  Hammar  and  R. Grumet.  1992.  A  quick  and  inexpensive method  for  removing  polysaccharides from plant genomic DNA. BioTechniques 13:52-57.
Fang G, Bammar S, Grumnet R. 1992. A quick and  inexpensive  method  for  removing polysaccharides  from  plant  genomic DNA. Biofeedback 13: 52-54.
Jose,  J.  and  R.  Usha.  2000.  Extraction  of geminiviral DNA from a highly mucilaginous plant ( Abelmoschus esculentus ). Plant  Mol.  Biol.  Rep .  18: 349-355.
Lodhi  MA,  Ye  GN,  Weeden  NF,  Reisch  BI. 1994.  Simple  and  efficientmethod  for DNA  extractions  from  grape  vine cultivars  and  Vitis  species.  Plant  Mol Biol Rep 12: 6-13.
Luro  FM,  Lorieux JM,  Laigret  Bove,  Ollitrault P.  1995.  Genetic  mapping  of  an integenric Citus hybrid  using  molecular markers. Fruits . 49: 404-408.
Lumaret,  R.,  H.  Michaud,  J.P.  Ripoll,  and  L. Toumi. 1998. Chloroplast DNA
extraction  procedure  for  species  high  in phenolics  and  polysaccharides .  p.  15-17. In A. Karp, P.G.
Nicholl,  D.S.T.  1993. An  Introduction  to Genetic  Engineering .  Department  of Biological Science, University of Praisly.
Porebski, S., L.G. Baily, and B.R. Baum. 1997.
Modification of a CTAB DNA extraction
protocol  for  plants  containing  high polysaccharide and polyphenol
components. Plant Mol. Biol. Rep . 15: 8- 15.
Porebski  S,  Bailey  LG,  Baum  BR.  1997. Modification of a CTAB DNA extraction protocol  for  plants  containing  high polysaccharide and ployphenol components. Plant  Mol  Biol  Rep .  15:  8- 15.
Purseglove, J.W., E.G. Brown, C.L. Green, and S.J.  Robbins.  1981. Spices  Vol  I . Longman. London and New York. p. 229 Isaac,  and  D.S.  Ingram  (Eds.).  Molecular  Tool for Screening Biodiversity. Chapman and Hall,  London  Schlink  K,  Reski  R.  2002. Preparing  high-quality  DNA  from  Moss ( Physcomitrella  patens ). Plant  Mol  Biol Rep . 20: 423a-423f.
Sambrook  J,  Fritsch  EF,  Maniatis  T.  1989.
Molecular Cloning a Laboratory Manual.Edisi  ke-2.  Cold  Spring  Harbor Laboratory.  New  York  Sharma  AD,  Gill PK,  Singh  P.  2002.  DNA  isolation  from dry and fresh samples of polysaccharide- rich plants. Plant Mol Biol Rep . 20: 415a- 415f.
Subandiyah,  S.  2006.  Polymerase  Chain Reaction  untuk  Deteksi  atau  Identifikasi Patogen  Tumbuhan.  Beberapa  Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan Workshop Identifikasi  DNA  dengan  Aplikasi  PCR . Malang. hlm. 43-50.
Surzycki,  S.  2000. Basic  techniques  in
Molecular Biology . Springer-Verlag,
Berlin, Heidelberg, New York.
Tridjatmiko,  K.R.  2006.  Penggunaan  Metode
PCR  untuk  Deteksi  Cepat  Keragaman DNA. Pelatihan dan Workshop Identifikasi  DNA  dengan  Aplikasi  PCR . Malang. hlm. 22-25.