Pengaruh Lactobacillus fermentum dan Lacto bacillus salivarius dalam Menghambat Pertumbuhan Bakteri Patogen pada Saluran Pencernaan Ayam Pedaging ( Gallus gallus domesticus )
Siska OktaFina Diarlin 1 , Tri Ardyati 1 , Osfar Sjofjan 2
1) Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Brawijaya
2) Jurusan Nutrisi dan Makanan Ternak, Fakultas Peternakan, Universitas Brawijaya
Jl. Veteran no. 169 Malang, Email : Anak_Tuhan40@yahoo.com

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh Lactobacillus    fermentum dan Lactobacillus salivarius sebagai penghambat pertumbuhan bakteri E. coli yang terdapat pada saluran pencernaan ayam pedaging ( Gallus gallus domesticus ). Penelitian ini menggunakan 12 sampel ayam pedaging strain Lohman yang terbagi menjadi 4 kandang dan setiap kandang terdiri dari 3 ekor ayam pedaging sebagai ulangan. Langkah  pertama  yang  dilakukan  adalah  pembuatan starter menggunakan  media  MRS Broth yang dilanjutkan  dengan  inokulasi  ke  dalam  media  bekatul  9  %  untuk  dibuat  kurva  pertumbuhan.  Setelah jumlah bakteri mencapai 10 7 sel/ml  dibuat masing-masing suspensi isolat dengan konsentrasi 0 %, 5 %, 10 %, dan 15 % pada pakan konsentrat. Penambahan suspensi pada pakan diberikan saat ayam pedaging berumur  14  hari.  Perhitungan  jumlah  bakteri  patogen  ( E.  coli )  dari feses ayam  pedaging  usia  14  hari (sebelum perlakuan) dan 35 hari (setelah perlakuan) menggunakan metode TPC ( Total Plate Count ) pada media  EMB  ( Eosin Metil Blue )  Agar.  Penimbangan  berat  badan  ayam  dilakukan  setiap  minggu.  Data dianalisis menggunakan ragam ANOVA yang dilanjutkan dengan Dunken. Kesimpulan dari penelitian ini menunjukkan  bahwa  konsentrasi  suspensi Lactobacillus    fermentum dan Lactobacillus  salivarius yang dapat  menurunkan  jumlah  populasi E.  coli sebesar  39,6  %  (3,1  x  10 7 sel/ml)  dari  populasi  awal  serta memberikan penambahan berat badan ayam pedaging terbaik (2,53 kg) adalah konsentrasi 5 %.
Kata Kunci : Ayam pedaging, Lactobacillus fermentum , Lactobacillus  salivarius , starter

## ABSTRACT
This study aimed to determine the effect of Lactobacillus fermentum and Lactobacillus salivarius in inhibiting the growth of bacteria E . coli were found in the digestive tract of broiler chickens (Gallus gallus domesticus).  This  study  uses  the  method  of  inoculation  of Lactobacillus  fermentum and Lactobacillus salivarius of  Man  ROGOSA  media  Sharpe  (MRS)  broth  into  a  concentrate  feed.  The  growth  curve  and using  media starter bran 9%. The next 10 7 CFU / ml suspension  made each isolate as much as 0%, 5%, 10%, and 15%. Detection of the number of pathogenic bacteria of faecal samples of broilers aged 14 days before treatment and 35 days after treatment with the method of TPC (Total Plate Count) on EMB media (Ethylene  Methyl  Blue).  Data were  analyzed  using  SPSS  16.0  software  to  look  for  a correlation  between the  number  of  bacterial  pathogens  with  weight  gain.  ANOVA  analysis  of  variance  followed  by  Dunken. The conclusion of this study showed that the  concentration of the  suspension of Lactobacillus fermentum and Lactobacillus salivarius can inhibit the growth of pathogenic bacteria to degrade 39,6 % (3,1 x 10 7 cell / ml) of the initial population and providing the best broiler weight gain gives an increase of 2.53 kg is 5%
Keywords: Broiler, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus salivarius , starter

## PENDAHULUAN
Ayam pedaging ( Broiler ) merupakan salah satu  hewan  ternak  yang  mudah  terserang penyakit.  Salah  satu  jenis  penyakit  yang  sering menyerang  peternakan  unggas  adalah  infeksi bakteri  [9].  Salah  satu  upayanya  yaitu  dengan memberikan  antibiotik  yang  dicampur  dalam ransum pakan atau air minum. Selain menggunakan  antibiotik,  pengendalian  penyakit
akibat  infeksi  mikroorganisme  juga  dilakukan dengan penambahan probiotik. Probiotik memiliki  peran  yang  baik  dalam  membantu memperbaiki  keseimbangan  mikroflora  dalam saluran  pencernaan  dan  dapat  membantu meningkatkan sistem kekebalan tubuh (imunitas), sehingga banyak dimanfaatkan dalam meningkatkan  produksi  ternak  serta  mencegah terjadinya  kontaminasi  produk-produk  pangan oleh bakteri, khususnya bakteri patogen [10]
Bakteri probiotik merupakan
mikroorganisme  hidup  yang  diberikan  sebagai suplemen makanan atau minuman yang memberikan  efek  kesehatan  bagi  manusia maupun  hewan.  Bakteri  probiotik  mampu menghasilkan  asam  laktat.  Asam  laktat  yang terbentuk  mengakibatkan  kondisi  menjadi  asam yang  menyebabkan  menurunnya  pH.  Penurunan pH  ini  terjadi  akibat  aktifitas  bakteri  probiotik dalam  mengubah  senyawa  protein  dan  gula menjadi  asam  laktat,  kondisi  asam  yang terbentuk  inilah  yang  mampu  menghambat pertumbuhan  bakteri  lain,  terutama  bakteri patogen yang tumbuh dalam pH normal [6]
Menurut  Laily  [5]  bakteri  asam  laktat dikelompokkan  ke  dalam  beberapa  genus  antara lain
Streptococcus ,
Leuconostoc , Pediococcus, dan Lactobacillus.  Lactobacillus sp . merupakan  salah  satu  bakteri  probiotik  yang menguntungkan karena terdapat di dalam saluran pencernaan manusia maupun hewan.
Lactobacillus sp. dapat membantu memperbaiki  sistem  pertahanan  usus  baik dengan  membentuk  koloni  pada  mukosa  usus dan  membantu  penyerapan  nutrisi.  Peningkatan jumlah koloni bakteri asam laktat (BAL) mampu memproduksi asam-asam organik yang mencegah kolonisasi bakteri patogen dalam usus halus  sehingga  kemampuan  kolonisasi  bakteri patogen  pada  usus  juga  berkurang,  sehingga bakteri  patogen  hanya  berada  dalam  lumen  dan akan dikeluarkan bersama feses [5].
Adapun kriteria probiotik yang harus dimiliki adalah kemampuan untuk membentuk kolonisasi pada  dinding  usus,  terutama  pada  bagian  usus halus dan lambung dengan efek barier yang lebih kuat  melawan  bakteri  patogen  atau  menjaga kekebalan  dan  mempercepat  penyerapan  nutrisi secara  optimal.  Penyerapan  nutrisi  pakan  secara optimal  dapat  meningkatkan  penambahan  berat badan ayam pedaging [6].

## METODE PENELITIAN
Persiapan Inokulum Lactobacillus fermentum dan Lactobacilus salivarius pada  Media MRS Broth Bakteri Lactobacillus fermentum dan Lactobacillus  salivarius yang  digunakan  dalam penelitian  ini  merupakan  hasil  isolasi  peneliti sebelumnya yang berasal dari saluran pencernaan burung  puyuh  jantan  berusia  2  bulan.  Hasil penelitian  sebelumnya  menunjukkan  bahwa kedua bakteri tersebut berpotensi sebagai bakteri probiotik.
Persiapan inokulum
Lactobacillus fermentum dan Lactobacillus salivarius bertujuan untuk memperkaya bakteri pada media pertumbuhannya,  yakni  MRS Broth. Isolat Lactobacillus  fermentum dan Lactobacillus salivarius yang  berasal  dari deep freezer -70 0 C dicairkan hingga suhu 4 0 C. Kemudian bakteri di adaptasikan  dengan  menginokulasikan  1  ml suspensi  biakan    dalam  9  ml  media  MRS broth kemudian  diinkubasi  pada shaker suhu  37 0 C kecepatan  100  rpm  selama  24  jam.    Hasil adaptasi  pada  media  MRS Broth ditumbuhkan dalam  media  MRS  Agar  untuk  memperoleh isolat  tunggal  menggunakan  metode pour  plate . Isolat  tunggal  yang  tumbuh  dimurnikan  pada media  MRS  Agar.  Masing-masing  bakteri dilakukan  pengulangan  sebagai  stok.  Dilakukan Uji konfirmasi dengan pewarnaan Gram dan Uji Katalase.

## Pembuatan Kurva Pertumbuhan  pada Media
Bekatul 9 %
Isolat  bakteri  dari  media  MRS Broth sebanyak  5  ml  diinolukasikan  ke  dalam  50  ml media  MRS Broth ,  kemudian  dihomogenkan. Stok inokulum bakteri kemudian diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 37 0 C  selama  24  jam.  Selanjutnya  20  ml  stok inokulum  di  tambahkan  pada  100  ml  media bekatul 9% dalam MRS cair untuk dibuat media produksi  sebanyak  200  ml.  Media  produksi kemudian  dihomogenasi  dan  diinkubasi  pada shaker dengan  kecepatan  100  pada  suhu  37 0 C. Kerapatan  sel  ( Optical  Density )  diukur  setiap  1 jam,  2  jam  dan  4  jam  sekali  hingga  mencapai fase stationer dari pertumbuhan bakteri probiotik. Kerapatan  sel  ( Optical  density )  diukur  dengan menggunakan  spektofotometer  pada  panjang gelombang 600 nm.
Pembuatan  Starter Lactobacillus  fermentum dan Lactobacillus  salivarius pada  media
Bekatul 9 %
Masing-masing isolat bakteri yaitu Lactobacillus  fermentum dan Lactobacillus salivarius dibiakkan  secara  terpisah  hingga mencapai  10 7 sel/ml  dalam  100  ml  MRS Broth . Perbandingan  jumlah  inokulum  yang  digunakan dalam  pembuatan  starter  adalah  1:1.  Kemudian disiapkan  100  MRS  cair  dalam beakerglass 500 ml  ditambahkan  9  gram  bekatul  steril  dan dihomogenasikan. Suspensi masing-masing isolat  sebanyak  5  ml  (10 7 sel/ml).  Setelah diinkubasi selama 12 jam, diambil sebanyak 0 % (kontrol), 5 % (2 ml), 10 % (4 ml), dan 15 % (6
ml)  dari  jumlah  pakan  yang  diberikan  pada  hari ke-14 (40 gram/ekor).
Penambahan Lactobacillus  fermentum dan Lactobacillus salivarius pada Pakan Unggas Penelitian  ini  akan  menggunakan  12  ekor ayam  pedaging  betina  umur  dua  hari  (DOC) strain  Lohman  202  dengan  berat  badan  sekitar 40-60  gram  yang  diperoleh  dari  tempat peternakan  ayam  potong  di  jalan  Randu  Agung 502  Singosari.  Sebelum  diberikan  perlakuan, hewan  percobaan  diaklimatisasi  selama  14  hari, yang  meliputi; kandang, umur, dan bobot tubuh. Pada  tahap  aklimatisasi  ini,  ayam  pedaging diberikan  makanan  standar  berupa  konsentrat starter (umur 1 - 14 hari) , campuran konsentrat grower (umur 15 – 40 hari).
Pakan  konsentrat  adalah  jenis  pakan unggas yang siap dikonsumsi dalam bentuk bulir. Komposisi  dari  pakan  konsentrat  terdiri  dari tepung  jagung  giling,  bekatul,  dan  tepung  ikan dengan  perbandingan  60:20:10.  Kandungan protein sebesar 38,58 % dan energi metabolisme sebesar  2538  %.  Bentuk  konsentrat  berupa pecahan  halus  dan  kasar.  Pecahan  halus  yang sering  disebut  crumble  untuk  ayam  pedaging berusia  1-14  hari,  sedangkan  untuk  pecahan kasar  atau  pellet  diberikan  pada  unggas  berusia 14- 35 hari.
Ayam pedaging ditempatkan pada kandang  yang  terbuat  dari  bambu  dengan Litter (100  x100  cm)  sebanyak  4  unit  dengan  alas sekam  padi  dan  alas  triplek,  dilengkapi  dengan lampu  neon,    tempat  ransum  dan  air  minum. Setiap  unit  kandang  terdiri  dari  3  ekor  ayam pedaging, setiap ekor diberi  tanda menggunakan spidol permanen sebagi ulangan.
Biakan  masing  –  masing  bakteri  yang  telah tumbuh  pada  media  MRS  cair  dengan  masa inkubasi  8  jam  sehingga  diperoleh  konsentrasi suspensi kurang lebih 10 8 CFU/ml pada suhu 37 0
C  di vortex untuk  mendapatkan  biakan  yang homogen, kemudian diambil sebanyak 0 %, 5 %, 10  %,  dan  15  %  dari  jumlah  pakan  (g/ekor). Perlakuan ini dilakukan selama 5 minggu dengan frekuensi  sekali  pemberian  dalam  sehari  (pada jam  16.00  WIB).  Setiap  hari  ransum  pakan  di timbang  untuk  per  ekor  ayam  pedaging  dan setiap  minggu  selama  perlakuan  pertambahan berat  badan  ayam  pedaging  selalu  di  timbang juga  [8].
Deteksi  Jumlah  Bakteri  Patogen  dengan Metode TPC
Ketika ayam pedaging berumur 14 hari (2 minggu)  sebelum  diberikan  perlakuan  dan sesudah  perlakuan  yaitu  berumur  35  hari  (5 minggu)  dilakukan  pengambilan  sampel feses dari  masing-masing  sampel  dengan  3  kali pengulangan. Sebanyak 5 gram feses dimasukkan ke  dalam  45  ml  NaCl  0,85%  untuk  memperoleh dilusi  10 -1 bagian.  Kemudian  hasil  dari pengenceran  10 -1 bagian  diambil  1  ml  dengan menggunakan  pipet  volum  dan  dimasukkan  ke dalam  tabung  reaksi  10 -2 dan  0,1  ml  ke  dalam cawan petri (media EMB Agar) dilakukan hingga pengenceran  10 -6 dengan  metode pour  plate . Diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 48 jam, dan selanjutnya dilakukan pengamatan dan perhitungan  jumlah  koloni  bakteri  patogen menggunakan colony counter .

## Analisis Data
Hasil  dari  jumlah  koloni  bateri  patogen yang  didapat,  di  analisis  statistika  menggunakan ragam  ANOVA  software  SPSS  16.0    untuk mengetahui korelasi dan kebenaran dari hipotesis penelitian.  Dilanjutkan  dengan  uji    lanjutan Duncan dan  Correlations.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  uji  konfirmasi  pada  kedua  bakteri tersebut  dengan  pewarnaan  Gram  menunjukkan bahwa  keduanya  Gram  positif  dan  pada  uji katalase menunjukkan hasil negatif (tabel 1).
Tabel 1. Hasil Uji konfirmasi Lactobacillus fermentun dan Lactobacillus salivarius
Dari  hasil  pembuatan  kurva  pertumbuhan pada  media  MRS  cair  diperoleh  fase  log  pada jam  ke-4  hingga  jam  ke-20,  untuk  itu  perlu diketahui  pula  lama  fase  log  saat  media  MRS cair  ditambahkan  dengan  bekatul  9%,  karena bekatul  salah  satu  bahan  dasar  konsentrat  pakan ayam  pedaging.  Berdasarkan  penelitian  yang
Karakter
Morfologi
Lactobacillus fermentum Lactobacillus salivarius
Bentuk koloni
 Conveks  Entire
 Berwarna putih keruh (putih kekuningan)
 Opaque  Bentuk Basil • Conveks • Entire
• Berwarna putih
• Opaque
• Bentuk basil Pewarnaan Gram • Gram positif • Gram Positif Uji Katalase Negatif Negatif
dilakukan  Kalsum  [4]  dengan  penambahan bekatul sebanyak 9% memiliki kandungan nutrisi seperti  asam  amino,  vitamin  B  kompleks, vitamin  D,  dan  mineral  yang  tercukupi  dengan baik  untuk  pertumbuhan  bakteri Lactobacillus salivarius . Hasil kurva pertumbuhan pada media MRS Broth dengan  penambahan  bakatul sebanyak  9%  dan  penurunan  pH  ditunjukkan pada gambar 2.
Gambar  1. Kurva  pertumbuhan Lactobacillus fermentum dan Lactobacillus salivarius pada media bekatul 9 %
Fase  logaritma  yang  terjadi  pada  kurva pertumbuhan  menggunakan  media  bekatul  9  % lebih  panjang  dari  kurva  pertumbuhan    yang hanya  menggunakan  media  MRS Broth .  Lama waktu  yang  dibutuhkan  pada  fase  logaritma adalah 16 jam.    Waktu pada fase ini yang akan digunakan  dalam  penambahan  probiotik  pada konsentrat  pakan  dengan  konsentrasi  suspensi  0 %, 5 %, 10 %, dan 15 %.  Penambahan suspensi Lactobacillus  fermentum dan Lactobacillus salivarius pada  jam  ke-8  dengan  jumlah  10 7 sel/ml sehingga saat pakan probiotik dikonsumsi oleh  unggas,  bakteri Lactobacillus  fermentum dan Lactobacillus  salivarius dapat  tumbuh  dan memperbanyak sel dalam saluran pencernaan.
Gambar  2. Jumlah  bakteri  patogen  ( E.  coli ) sebelum dan sesudah perlakuan
Jumlah  koloni  bakteri  patogen  ( E.  coli ) pada ayam pedaging yang diberikan
Lactobacillus  fermentum dan Lactobacillus salivarius lebih  rendah  jika  dibandingkan dengan  ayam  pedaging  yang  tidak  diberikan suspensi Lactobacillus fermentum dan Lactobacillus salivarius (gambar 2). Konsentrasi terbaik dalam menurunkan jumlah bakteri E. coli sebesar  68,1  %  adalah  konsentrasi  suspensi bakteri  15  %.  Semakin  banyak  suspensi  yang diberikan  maka  jumlah  bakteri E.  coli semakin menurun [7].
Sehubungan dengan hal ini Vernazza et al . [11]  menyatakan  bahwa,  keberadaan  BAL sebagai  probiotik  di  dalam  saluran  pencernaan dapat menstimulasi populasi BAL lainnya dalam saluran  pencernaan.  Hal  ini  disebabkan  karena bakteri probiotik dapat memodifikasi lingkungan mikroekosistem usus dengan memproduksi asam laktat, sehingga dapat menurunkan pH. Penurunan pH akan mengakibatkan pertumbuhan BAL  dalam  saluran  pencernaan  mengalami peningkatan (gambar 3).
Gambar 3. Jumlah BAL sebelum dan sesudah perlakuan
Seperti  yang  dijelaskan  oleh  husmaini dalam  penelitiannya  [3]  bahwa  keseimbangan mikroflora  usus  akan  tercapai  apabila  mikroba yang  menguntungkan  dapat  menekan  mikroba yang  merugikan  dengan  cara  mendesak  keluar mikroba  patogen  tersebut.  Keseimbangan  ini dapat  tercapai  apabila  perbandingan  antara mikroba yang  menguntungkan terhadap mikroba yang merugikan adalah sebesar 85 : 15 atau 80 : 20.
Jumlah  probiotik  harus  lebih  banyak  dari jumlah bakteri patogen. Probiotik dapat meningkatkan  kesehatan  dengan  mekanisme sebagai berikut :
(1)  Produksi senyawa anti mikroba seperti asam laktat,  asam  asetat,  karbondioksida,  H 2 O 2 , bakteriosin, reuterin, dan senyawa penghambat  lainnya  yang  dapat  menekan pertumbuhan mikroorganisme patogen.
(2)    Kompetisi  dalam  penyerapan  nutrient,  dan sisi  penempelan  pada  sel  epitel  usus, produksi mukus.
(3)  menstimulasi  sistem  imunitas  dan  mampu mengubah  aktivitas  metabolisme  mikroba dalam saluran pencernaan [2].
Gambar  4. Pertambahan  berat  badan  ayam pedaging selama 5 minggu
Penambahan  berat  badan  ayam  pedaging dari  minggu  pertama  hingga  minggu  kelima menunjukkan  peningkatan  yang  sama.  Dengan kata lain, masing-masing konsentrasi memberikan hasil peningkatan (gambar 4). Hasil akhir  pada  minggu  kelima  menunjukkan  berat paling  tinggi  oleh  konsentrasi  5  %  yaitu mencapai  2,53  kg.  Korelasi  antara  berat  badan pada  minggu  terakhir  dengan  jumlah  bakteri patogen  sesudah  perlakuan  menyatakan  adanya korelasi  sebesar  0,338  (gambar  5).  Pemberian probiotik  meningkatkan  berat  badan  dari  ayam pedaging, juga dikemukakan oleh Arun [1].

## Gambar 5. Uji korelasi

## KESIMPULAN
Kesimpulan dari penelitian ini menunjukkan bahwa konsentrasi suspensi Lactobacillus    fermentum dan Lactobacillus salivarius yang  dapat  menurunkan  jumlah bakteri  patogen  ( E.  coli) sebesar  68,13  %  dari populasi  awal  adalah  konsentrasi  15  %. Sedangkan konsentrasi terbaik untuk penambahan  berat  badan  ayam  pedaging  adalah
5  %  memberikan  peningkatan  sebesar  terbaik 2,53 kg.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  penulis  ucapkan  kepada rekan-rekan peneliti Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan  Biologi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan  Alam,  Universitas  Brawijaya, Malang  yang  telah  sangat  membantu  dalam proses pengerjaan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]   Arun,K., dkk..2006. Dietary Suplementation of Lactobacillus Sporogenes  on  Performance  an  Serum Biochemico-Lipid Profile of Broiler Chicken. The Journal of Poultry Science,43:235:240
[2]   Hoover,  D.  G.  2000.  Microorganism  and Their  Products  in  the  Preservation  of Foods. In : B.M. Lund, T.C.Baird- Parker, G.W.  Gould  (Eds).  The  Microbiological Safety  and  Quality  of  Food.  Aspen Publisher, Maryland
[3]   Husmaini. 2009.
Isolation and
identification  of  latic  acid  bacteria  from waste  processing  virgin  coconut  oil  with the  Biolog  Microstation.  International Seminar  and  Workshop  Biodiversity, Biotechnology  and  Crop  Production.
Padang, 17-18 [4]   Kalsum  Umi,  Osfar    Sjofjan    dan  Tri Ardyati. 2008. The Growth of Lactobacillus  Salivarius Isolated  From
Quail Intestine In Rice Bran Medium.
[5]   Laily.  2008.  Roles  of  Probiotics  and Prebiotics  in  Colon  Cancer  Prevention: Postulated Mechanisms and In-vivo Evidence. Int. J. Mol. Sci. 9(5) : 854-863.
[6]   Langhout,  P.  2000.  New  Additives  for broiler chicken. Feed Mix. The International  Journal  on  feed,  Nutrition and Technology 9(6):24- 27.
[7] Ray,  B.  and  Sandine,  W.  E.  2000 Acetic,  propionic,  and  lactic  acids  of starter culture
bacteria as
biopreservatives,  in  Ray,  B.  and Daeschel, M. (eds). Food bio preservatives of biological origin. CRC
press,  Inc.  Boca  Raton,  Florida:  103- 136.
[8]   Sujaya,  I  N.,  Y.  Ramona,  N.P.  Widarini, N.P.  Suariani,  N.M.U.  Dwipayanti,  K.A. Nocianitri dan N.W. Nursini (2010). 2009. Isolasi  dan  Karakteristik  Bakteri  Asam Laktat dari Susu Kuda Sumbawa. J. Vet. 9
(2) : 52 – 59.
[9]   Tabbu,  C.  R.  2000.  Penyakit  Ayam  dan Penanggulangannya-vol 1. Penerbit
Kasinus. Yogyakarta.
[10]   Utomo.1999.  Teknologi  pakan  hijauan. Jurusan  Nutrisi    Dan    Makanan  Ternak.
Hand out. Fakultas Peternakan Universitas Gadjah Mada.  Yogyakarta.
[11]   Vernazza,  C.L.,  B.A.  Rabiu,  and  G.R.
Gibson. 2006. Human Colonic Microbiology  and  the  Role  of  Dietary
Intervention:  Introduction  to  Prebiotics.
Prebiotics:  Development  and  Application. John Wiley & Sons, Ltd