## PERKEMBANGAN SEL LIMFOSIT B DAN PENANDANYA UNTUK FLOWCYTOMETRY

## Yelvi Levani
Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Surabaya Korespondensi: blue_levani@yahoo.com

## ABSTRAK
Sel limfosit B merupakan bagian dari respon imunitas adaptif yang berperan penting untuk pertahanan tubuh melawan  patogen.  Perkembangan  sel  limfosit  B  dimulai  dari  sel  punca  hematopoietik  di  sumsum  tulang belakang  dan  organ  limfoid  sekunder  dengan  melalui  berbagai  tahapan  proses  maturasi  dan  seleksi.  Sel limfosit  B  matur  dapat  menghasilkan  berbagai  macam  antibodi  yang  spesifik  untuk  patogen.  Di  tiap perkembangannya,  sel  limfosit  B  memiliki  ekspresi  molekul  yang  berbeda  pada  permukaannya  dan  dapat diketahui  dengan  pemeriksaan flowcytometry .  Pemeriksaan  sel  limfosit  B  yang  sesuai  dengan  tahapan perkembangannya dapat digunakan untuk membantu diagnosis penyakit defisiensi imun kongenital, leukemia, limfoma dan penyakit autoimun.

## Kata kunci: Limfosit B, perkembangan, penanda, flowcytometry

## ABSTRACT
Lymphocyte B cell is part of adaptive immune system to defense from pathogen. Lymphocyte B cell develop from hematopoietic precursor cells to be mature lymphocyte B cells through differentiation and maturation process in bone marrow and secondary lymphoid organ. Mature lymphocyte B cell produces specific antibody for  different  pathogens.  In  each  step,  lymphocyte  B  cell  has  different  molecule  expression  and  can  be examined  by  using  flowcytometry.  Lymphocyte  B  cell  examination  in  each  step  can  be  used  to  diagnose congenital immunodeficiency, leukemia, lymphoma and autoimmune disease.
Keywords: lymphocyte B, development, marker, flowcytometry

## PENDAHULUAN
Secara umum sistem imun dibagi menjadi dua  lini:  imunitas  alamiah  dan  imunitas  adaptif. Imunitas  alamiah  ( innate )  adalah  pertahanan  lapis pertama,  berupa  mekanisme  non-spesifik  ( antigen- independent ) untuk melawan dan mengatasi patogen yang  menerobos  masuk  ke  dalam  tubuh  kita. Imunitas adaptif bersifat spesifik terhadap antigen ( antigen-dependent ),  dan  memiliki  memori  sehingga tubuh  kita  mampu  bereaksi  dengan  lebih  cepat serta lebih efisien pada saat terpapar ulang dengan antigen yang sama. Sel limfosit B termasuk dalam imunitas  adaptif.  Selain  memiliki  kemampuan mengenali  antigen  secara  spesifik,  sel  limfosit  B juga dapat mengsekresi antibodi atau immunoglobulin.  Sel  limfosit  B  dan  antibodi merupakan  elemen  uatma  dari  respon  imun humoral  sebagai  pertahanan  tubuh  terhadap berbagai patogen. Gangguan pada perkembangan, seleksi  dan  fungsi  sel  limfosit  B  akan menyebabkan  penyakit  autoimun,  keganasan, imunodefisiensi  dan  alergi. 1 Dalam  telaah  pustaka ini akan dibahas secara singkat mengenai asal dari sel  limfosit  B,  perkembangan  sel  limfosit  B  di sumsum tulang belakang ( bone marrow ), perkembangan  sel  limfosit  B  menjadi  sel  plasma dan sel memori serta marker yang bisa digunakan untuk  pemeriksaan  sel  limfosit  B  dengan flowcytometry

## ASAL DARI LIMFOSIT B
Berdasarkan  asal  perkembangannya  di sumsum  tulang  belakang  ( bone  marrow ),  sel  imun dibagi  menjadi  dua  kelompok  yaitu  lini  myeloid
dan  limfoid.  Sel  imun  alamiah  sebagian  besar termasuk  lini  myeloid  diantaranya;  neutrofil, eosinofil, basofil, sel mast, sel monosit/makrofag, dan sel dendritik. Hanya sel NK ( natural killer cell ) sel  imun  alami  yang  termasuk  lini  limfoid. Sedangkan semua sel imun adaptif berasal dari lini limfoid  diantaranya  sel  limfosit  Th  (T helper ),  sel limfosit Tc (T cytotoxic ) dan sel limfosit B. 2
Sel  limfosit  B  (bursal  atau bone  marrow ) merupakan kumpulan populasi sel yang mengekspresikan berbagai reseptor immunoglobulin  (Ig)  di  permukaan  sel  nya  untuk mengenali  berbagai  macam  epitop  spesifik  dari antigen. Sel limfosit B diproduksi di hati janin ( fetal liver )  saat  di  dalam  kandungan  dan  di  sumsum tulang  belakang.  Perkembangan  sel  limfosit  B kemudian  berlanjut  di  organ  limfoid  sekunder seperti  kelenjar  getah  bening  ( lymph  node ),  limpa ( spleen ),  jaringan  limfoid  sekunder  pada  mukosa ( mucosal associated lymphoid tissue / MALT), jaringan limfoid  sekunder  pada  usus  ( gut  associated  lymphoid tissue /  GALT)  dan  tonsil  untuk  menjadi  sel plasma  ataupun  sel  limfosit  B  memori. 3 Sel limfosit B memiliki lima kelas antibodi yaitu Ig-A, Ig-D, Ig-E, Ig-M dan Ig-G.

## PERKEMBANGAN  SEL  LIMFOSIT  B  DI SUMSUM TULANG BELAKANG
Perkembangan sel limfosit B
membutuhkan beberapa tahapan yang dimulai dari progenitor sel  limfoid  ( common  lymphoid  progenitor / CLP)  untuk  menjadi  sel  limfosit  B  yang  matur  di sumsum tulang belakang. CLP sendiri berasal dari hematopoietic  stem  cells (HSC)  yang  sudah  tidak
memiliki  potensi  lini  myeloid.  CLP  dapat berkembang  menjadi  sel  limfosit  T,  sel  limfosit B dan  sel  dendritik  (DC).  Reseptor  sel  limfosit  B memiliki  dua  jenis  rantai  yaitu  rantai  H  ( heavy chain/ rantai berat) dan rantai L ( light chain / rantai ringan)  yang  memiliki  berbagai  lokus  gen. Imunoglobulin yang lengkap (Ig) memiliki 2 rantai H  dan  2  rantai  L.  Pada  tahapan  awal perkembangan  sel  limfosit  B  membutuhkan rekombinasi  dari  lokus  gen  V,  D,  J  di  rantai  H (VDJ H )  dan  lokus  gen  V,  J  di  rantai  ringan  (VJ L ). Rekombinasi  segmen  gen  tersebut  membuat kumpulan  sel  limfosit  B  memproduksi  antibodi yang  dapat  mengenali  lebih  dari  5  x  10 13 jenis antigen berbeda. Terdapat tiga tahapan perkembangan  sel  limfosit  B  berdasarkan  tahap rekombinasi  dan  penyusunan  gen  pembentuk rantai  L  dan  rantai  H,  yaitu  sel  pro  B merekombinasi  segmen  gen  D  dan  J  pada  rantai H,  diikuti  dengan rekombinasi  kedua  pada bagian segmen  V untuk  menggabungkan  dengan segmen DJ. 4
Perkembangan  sel  limfosit  B  diregulasi oleh  SLC  ( surrogate  L  chain )  yang  terdiri  dari  dua protein  yaitu  λ5  dan  VpreB.  Kedua  protein  ini berikatan  dengan  protein  µ  pada  rantai  H  dan membentuk pre BCR. Prerkursor sel B atau pre sel B  dibentuk  dari  Pro  sel  limfosit  B  yang mengekspresikan  pre  BCR  di  permukaan  selnya. Untuk  perkembangan  sel  limfosit  B  berikutnya dibutuhkan  gen Bruton’s  tyrosine  kinase (Btk)  dan sitokin  IL-7. 5 Mutasi  pada  gen  Btk  dapat menyebabkan
penyakit X-linked agammaglobulinemia . 6 Jalur  sinyal  BCR  dalam
perkembangan  sel  limfosit  B  ini  mendapatkan banyak  perhatian  dari  klinisi.  Tidak  hanya  dapat digunakan untuk membedakan agammaglobulinemia dengan jenis
hipoglobulinemia  yang  lain,  tetapi  inhibisi  jalur BCR ini dapat digunakan sebagai terapi baru yang menjanjikan untuk menangani limfoma sel limfosit B 7 dan penyakit autoimun. 8
Bila reseptor pre BCR tidak dapat muncul pada permukaan sel karena kesalahan rekombinasi gen  VHDJH  pada  rantai  H  maka  perkembangan sel  limfosit  B  akan  berhenti  dan  sel  akan melakukan  apoptosis.  Bila  sinyal  pre  BCR berfungsi baik, maka akan dihasilkan RAG1/2 dan terjadi  rekombinasi  gen  di  rantai  L.  Bila rekombinasi  rantai  L  berhasil,  maka  akan terbentuk  reseptor  IgM  pada  permukaan  sel limfosit  B  yang  imatur.  Kegagalan  saat rekombinasi  gen  di  rantai  L  akan  menyebabkan terjadinya proses apoptosis. 3 Sel limfosit B imatur dapat  meninggalkan  sumsum  tulang  belakang  dan bermigrasi  ke  limpa,  dimana  sel  limfosit  B  imatur tersebut  berdiferensiasi  menjadi  sel  limfosit  B naïve, folikuler atau marginal zone (MZ). 1
Tantangan pertama sel imun adalah untuk menemukan  keseimbangan  antara  spesifisitas antibodi  dalam  melawan  berbagai  patogen  tetapi dapat  menghindari  autoreaktivitas. Reseptor sel  B ( B cell receptor /BCR) pada sel limfosit B imatur diuji tubuh  apakah  dapat  berikatan  dengan  antigen tubuh  atau  tidak.  BCR  yang  dapat  berikatan dengan tubuh atau memiliki sifat autoreaktif dapat mengalami  apoptosis  atau  mengalami  proses  edit ulang pada reseptor rantai L nya oleh RAG1. 3 Sel
http://jurnal.unimus.ac.id
limfosit  B  imatur  memiliki  IgM  yang  fungsional, tetapi  belum  memiliki  Ig  yang  lain.  Sel  limfosit  B yang  imatur  terbagi  menjadi  dua  jenis  tipe  yang dibedakan  dengan  ekspresi  molekul  pada permukaan  selnya.  Sel  tersebut  dinamakan  sel transisi  T1  dan  T2. 9 Sel  transisi  T1  memiliki ekspresi  IgM  yang  tinggi  dan  IgD  yang  rendah, sedangkan  sel  transisi  T2  mengekspreksikan  IgD yang  lebih  tinggi.  Sebagian  besar  sel  transisi  T1 berubah menjadi sel transisi T2 kemudian menjadi sel  limfosit B  yang  matur. Tetapi  25% sel  transisi
T2  dapat  keluar  dari  sumsum  tulang  belakang, beredar  di  sirkulasi  darah  dan  masuk  ke  kelenjar getah  bening  serta  limpa.  Sel  limfosit  B  yang imatur  sudah  dapat  berinteraksi  dengan  antigen seperti lipopolisakarida dan menghasilkan antibodi secara  cepat  tanpa  bantuan  dari  antigen  MHC kelas 2. 10 Sel limfosit B yang matur memiliki IgM dan  IgD  di  permukaan  selnya,  kemudian  keluar dari  sumsum  tulang  belakang  dan  menuju  organ limfoid sekunder untuk perkembangan lebih jauh.
Gambar1. Tahapan perkembangan sel limfosit B 3

## PERKEMBANGAN  SEL  LIMFOSIT  B MENJADI SEL PLASMA DAN SEL LIMFOSIT B MEMORI
Sebagian  besar  sel  limfosit  B  yang  matur berada  di  dalam  folikel  limfoid  kelenjar  getah
http://jurnal.unimus.ac.id
bening dan limpa. Di dalam folikel tersebut, sel B dapat berinteraksi dengan antigen yang tergantung
pada  sel  T  ( T  cell  dependent /  TD)  dan  berikatan dengan sel dendritik folikuler untuk berproliferasi, kemudian  berdiferensiasi  menjadi  sel  plasma  atau menetap  di germinal  center (GC).  Sebagian  sel limfosit  B  yang  teraktivasi  dan  berubah  menjadi sel  plasma  keluar  dari  folikel  dan  berpindah  ke corda  medulla kelenjar  getah  bening  atau  sumsum tulang belakang. Sel plasma ini dapat menghasilkan IgM selama 4 hari. 11
Sel  limfosit  B  yang  teraktivasi  dan menetap di germinal center mengalami proses somatic hypermutation (SHM)  dan  seleksi  klonal  untuk membentuk kompartemen dari imunitas humoral. 12 Proses  SHM  ini  berperan  dalam pembentukan kelas antibodi atau immunoglobulin dan  dimediasi  oleh  enzim activation-induced  cytidin deaminase (AID). 13 Pembentukan  kelas  ini dinamakan class  switching .  Selain  dipengaruhi  oleh antigen  yang  tergantung  pada  sel  T, class  switching juga  tergantung  pada  sitokin  diantaranya  sitokin IL-4  untuk  membentuk  IgG1  dan  IgE,  sitokin TGF-b untuk membentuk IgA dan IgG2b, sitokin IL-5  untuk  membentuk  IgA  dan  IFN- ɣ untuk membentuk IgG3 dan IgG2a. Sel limfosit B yang memiliki  daya  afinitas  yang  rendah  serta autoreaktif  akan  mengalami  proses  apoptosis. Sedangkan  sel  yang  memiliki  daya  afinitas  yang tinggi  dan  tidak  autoreaktif  akan  menjadi  sel  B memori.  Bila  terpapar  dengan  antigen  yang  sama untuk  kedua  kalinya  maka  sel  B  memori  tersebut
dapat  menghasilkan  antibodi  yang  memiliki  daya afinitas yang tinggi. 3
Sel  limfosit  B  sendiri  memiliki  beberapa subset atau  tipe  diantaranya  sel  limfosit  B  B1,  sel limfosit  B  B2  (folikuler/konvensional)  dan  sel limfosit B marginal zone (MZ) yang dibedakan oleh fenotip,  lokasi  anatomi  dan  produksi  antibodi natural. 3 Sel  limfosit  B1-1  ditemukan  di peritoneum  dan  dibedakan  lagi  menjadi  sel limfosit  B  B1-a  dan  sel  limfosit  B  B1-b. 14 Sel limfosit  B  B1-a  memproduksi  antibodi  alami untuk  melawan  bakteri  sebagai  bagian  dari kekebalan  alami,  sedangkan  sel  limfosit  B  B1-b dapat berintaraksi dengan polisakarida dan antigen lain  yang  tidak  bergantung  dengan  sel  limfosit  T ( T  cell  independent ).  Sel  limfosit  B  MZ  berasal  dari sel  transisi  T2  dan  berada  di  luar  folikel.  Sel limfosit  B  MZ  mengekspresikan  IgM  yang  tinggi dan IgD yang rendah. 15

## PENANDA  YANG  BISA  DIGUNAKAN UNTUK PEMERIKSAAN SEL LIMFOSIT B DENGAN FLOWCYTOMETRY
Sel  limfosit  B  memiliki  berbagai  macam molekul di permukaan selnya. Untuk memudahkan mengenali berbagai molekul permukaan  tersebut,  WHO  membuat  sistem Cluster  Differentiation yang  disingkat  dengan  CD dengan  menggunakan  teknik monoclonal  anti  body (mAb). CD19 merupakan molekul yang diekspresikan  oleh  permukaan  sel  limfosit  B selama masa perkembangannya. CD20 merupakan molekul  yang  terdapat  pada  sel  limfosit  B  matur yang  berfungsi  sebagai  pelekat channel Ca 2+ di
http://jurnal.unimus.ac.id
membran  sel.  Saat  ini  terdapat  obat  mAb  CD20 yaitu  Rituximab  yang  telah  diuji  coba  dan digunakan  secara  luas  untuk  menangani  kanker darah.  CD21  merupakan  reseptor  yang  dapat berikatan dengan CD19 untuk memberikan sinyal dan  menginformasikan  ada  proses  inflamasi  pada sel  limfosit  B.  CD22  berfungsi  untuk  mengatur proses seleksi positif dan negatif pada sel limfosit B  folikel.  CD23  merupakan  reseptor  yang berikatan  lemah  untuk  IgE  pada  sel  limfosit  B yang  teraktivasi  untuk  memproduksi  IgE.  CD24 merupakan  molekul  yang  dapat  ditemukan  di semua  sel  limfoist  B,  sel  granulosit  dan  sel  epitel. CD40  berperan  sebagai  faktor survival yang penting  untuk  sel  B  di germinal  center (GC)  dan untuk  berinteraksi  dengan  sel  limfosit  T  dengan menggunakan  ligand  CD154.    CD72  berfungsi sebagai negative  regulator dari  sinyal  transduksi  dan CD79a.b  diekspresikan  di  permukaan  sel  limfosit B. 3
Di  tiap  tahapan  perkembangan  sel limfosit B terdapat ekspresi molekul CD yang unik di permukaan selnya. Pre-Pro sel B mengekspresikan CD45R yang merupakan penanda  spesifik  untuk  lini  sel  B.  Pro  sel  B mengekspresikan  CD19  yang  terlibat  dalam pengenalan  antigen  dan  mengekspresikan  CD34. Pre  sel  B  mengekspresikan  CD79a  dan  CD79b yang  juga  merupakan  komponen  Ig  pada  limfosit B  matur.  Sel  limfosit  B  imatur  sudah  memiliki antibodi  IgM  yang  fungsional  tetapi  belum memiliki  jenis  Ig  yang  lain.  Sel  limfosit  B  imatur mengekspresikan  B220,  CD25,  IL-7R  dan  CD19. Sel limfosit B memiliki 2 jenis sel transisi yaitu T1
dan T2. Sel transisi T2 memiliki ekspresi IgD yang lebih  tinggi,  CD21+  dan  BAFF-R.  Sedangkan  sel transisi T1 memiliki ekspresi IgM yang tinggi, IgD yang  rendah,  CD21-,  CD23-,  CD24+  dan  CD 93+.  Sebagian  besar  sel  transisi  T1  berubah menjadi  sel  transisi  T2  dan  berkembang  menjadi sel  limfosit  B  matur.  Sel  limfosit  B  yang  matur mengekspresikan  HLA-DR,  CD19,  CD20  dan CD40 di permukaan selnya dan memiliki IgM dan IgD.  Sel  plasma  sudah  tidak  mengekspresikan CD19  dan  CD20  lagi,  tetapi  mengekspresikan XBP-1,  BLIMP-1,  CD38  dan  Ig  sitoplasma.  Sel limfosit B memiliki beberapa jenis diantaranya Sel B  folikuler  (B2)  yang  merupakan  sel  limfosit  B yang  konvensional,  sel  B  B-1  dan  sel  B marginal zone (MZ)  yang  memiliki  perbedaan  ekspresi molekul  di  permukaan  selnya.  Sel  B  B-1 mengekspresikan  CD43,  CD5  dan  IgM  tinggi. Sedangkan sel B MZ mengekspresikan CD21 dan IgM tinggi. 3
Untuk  pemeriksaan  sel  limfosit  B,  baik untuk  kepentingan  diagnostik  ataupun  penelitian biasanya  digunakan  alat flowcytometry . Flowcytometry merupakan suatu alat untuk menganalisis populasi suatu sel dengan menggunakan teknik immunofluoresens  yang  menggunakan  antibodil monoclonal  (mAb)  sehingga  dapat  berikatan dengan  CD  yang  sesuai  dengan  mAb  tersebut. Flowcytometry dapat  mengukur  karakteristik  fisik tiap  sel  yang  akurat  termasuk  ukuran  dan granularitas  sel  secara  simultan. 16 Pemeriksaan  sel limfosit B yang sesuai dengan tahapan perkembangannya dapat digunakan untuk membantu  diagnosis  penyakit  defisiensi  imun

## Yelvi Levani
kongenital,  leukemia,  limfoma  dan  penyakit autoimun.

## KESIMPULAN
Sel  limfosit  B  merupakan  bagian  dari imunitas  adaptif  yang  dapat  menghasilkan antibodi. Sel limfosit B dibentuk di sumsum tulang belakang  dan  mengalami  aktivasi  dan  maturasi  di organ  limfoid  sekunder.  Setelah  berinteraksi
dengan  antigen  yang  tergantung  pada  sel  T  dan berikatan dengan sel dendiritik, sel limfosit B yang matur  dapat  berubah  menjadi  sel  plasma  atau  sel limfosit  B  memori.  Di  tiap  perkembangannya,  sel limfosit B memiliki ekspresi molekul yang berbeda pada  permukaannya  dan  dapat  diketahui  dengan pemeriksaan flowcytometry .
Tabel 1. Daftar molekul CD yang diekspresikan di permukaan sel limfosit B[3]

## DAFTAR PUSTAKA
1. Pieper  K,  Grimbacher  B,  Eibel  H.  B  cell biology  and  development.  J  Allergy  Clin Immunol 2013;131(4):959-71.
2. Todd I,Spickett G, Fairclough L. The nature of  immune  system.  In:  Todd  I,Spickett  G, Fairclough L. Immunology Lectures Note. 7 th edition.  West  Sussex,  Wiley  Blackwell.  2015. p: 3-12.
3. LeBien  TW,  Tedder  TF.  B  lymphocytes: How  they  develop  and  function.  Blood. 2008;112: 1570-1580
4. van  Zelm  MC,  Szczepanski  T,  van  der  Burg M,  van  Dongen  JJ.  Replication  history  of  B
lymphocytes reveals homeostatic
proliferation  and  extensive antigeninduced B cell expansion. J Exp Med 2007;204:645-55.
5. Matthias  P,  Rolink  AG.  Transcriptional networks  in  developing  and  mature  B  cells. Nat Rev Immunol 2005;5:497-508
6. Conley  ME,  Mathias  D,  Treadaway  J,
Minegishi  Y,  Rohrer  J.  Mutations  in  btk  in patients with presumed X-linked agammaglobulinemia.  Am  J  Hum  Genet 1998; 62:1034-43.
7. Ponader  S,  Chen  SS,  Buggy  JJ,  Balakrishnan K, Gandhi V, Wierda WG, et al. The Bruton tyrosine  kinase  inhibitor  PCI-32765  thwarts chronic  lymphocytic  leukemia  cell  survival and tissue homing in vitro and in vivo. Blood 2012;119:1182-9
8. Hutcheson  J,  Vanarsa  K,  Bashmakov  A, Grewal  S,  Sajitharan  D,  Chang  BY,  et  al. Modulating  proximal  cell  signaling  by
targeting Btk ameliorates humoral autoimmunity  and  end-organ  disease  in murine  lupus.  Arthritis  Res  Ther  2012; 14:R243.
9. Chung  JB,  Silverman  M,  Monroe  JG. Transitional  B  cells:  step  by  step  towards immune  competence.  Trends  Immunol. 2003;24:343-349
10. Marshall-Clarke  S,  Tasker  L,  Parkhouse RME.  Immature  B  lymphocytes  from  adult bone  marrow  exhibit  a  selective  defect  in induce hyperexpression of major histocompatibility complex class II and fail to show B2.7 induction. Immunol. 2000;100(2):141-151.
11. Balazs  M,  Martin  F,  Zhou  T,  Kearney  J. Blood  dendritic  cells  interact  with  splenic marginal  zone  B  cells  to  initiate  T- independent  immune  responses.  Immunity 2002;17:341-52.
12. Muramatsu  M,  Kinoshita  K,  Fagarasan S,Yamada  S,  Shinkai  Y,  Honjo  T.  Class
switch  recombination  and  hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 2000;102:553-563
13. Revy  P,  Muto  T,  Levy  Y,  Geissmann  F, Plebani A, Sanal O, et al. Activation-induced cytidine  deaminase  (AID)  deficiency  causes the  autosomal  recessive  form  of  the  Hyper- IgM syndrome (HIGM2). Cell 2000;102:565- 75.
14. Allman D, Pillai S. Peripheral B subset. Curr Opin Immunol. 2008;20(2):149-157.
15. Haas  KM,  Poe  JC,  Steeber  DA,  Tedder  TF. B-1a  and  B-1b  cells  exhibit  distinct developmental requirements and have unique functional  roles  in  innate  and  adaptive immunity  to  S.  pneumoniae.  Immunity. 2005;23:7-18.
16. Adan  A,  Alizada  G,  Kiraz  Y,  Baran  Y, Nalbant  A.  Flow  cytometry:  basic  principles and  applications.  Crit  Rev  Biotechnol. 2017;37(2):163-176.