## Abnormalitas Morfologi Spermatozoa Ayam Nunukan Asal Ejakulat
Fikri Ardhani 1 , Julinda R. Manullang 2 , dan Bryta Mbincar Boangmanalu 3 1,2,3 Jurusan Peternakan Fakultas Pertanian, Universitas Mulawarman, Kampus Gunung Kelua Jl. Pasir Belengkong Po.Box. 1040
1 email : fikri_ardhani@faperta.unmul.ac.id

## ABSTRACT
Nunukan chickens, Indonesian germplasm, spread out the northern and eastern part of Kalimantan.  The  high  morphological  abnormality  percentage  of  spermatozoa  would decrease the value of fertility. The research aims to identify abnormalities in the shape and  to  develop  abnormality  identification  material  through  painting  by  using  eosin nigrosin. Ten nunukan roosters, above one year old with weight, 2-2,5 kg, were collect its semen with dorsal massage method. The make of swab preparat were stained by using  a  solution  of  eosin  nigrosin.  The  spermatozoa  abnormality  percentage  was counted and the shape abnormality was observed by using microscope. The percentage of abnormality spermatozoa of nunukan rooster on staining by eosin nigrosin was 13,01 ± 2,16%; the abnormality is generally  dominated at the tail part where by eosin nigrosin was 8,52 ± 1,89%. The abnormality shapes of the head were dominated by the head without tail, round head, and the swelled head. The abnormality shapes of the middle part  were  dominated  by  the  folding  of  middle,  section  roundling,  and  broken.  The abnormality  shapes  of  the  tail  part  were  dominated  by  the  round  tail,  bent  tail,  and broken  tail.  The  use  of  eosin  nigrosin  staining  is  effective  for  sperm  morphology evaluation  of  nunukan  chiken  Spermatozoa  because  from  than  eosin  microscopic observation; result the good one contrast between the cell and the background.
Keywords: nunukan rooster, abnormality spermatozoa, eosin nigrosine

## ABSTRAK
Ayam  nunukan  merupakan  plasma  nutfah  Indonesia  yang  berkembang  di  wilayah Kalimantan  terutama  bagian  Utara  dan  Timur.  Tingginya  persentase  abnormalitas morfologi spermatozoa akan menurunkan nilai fertilitas. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi  abnormalitas  bentuk  dan  akan  dikembangkan  bahan  identifikasi abnormalitas  melalui  pengecatan  menggunakan  kombinasi  eosin  nigrosin.  Sepuluh ekor ayam nunukan jantan diatas satu tahun dengan bobot 2-2,5 kg dikoleksi semennya dengan  metode massage atau  pengurutan  bagian  punggung  (dorsal)  ayam  jantan. Pembuatan  preparat  ulas  dilakukan  dengan  menggunakan  larutan  kombinasi  eosin nigrosin.  Persentase  abnormalitas  spermatozoa  dihitung  dan  identifikasi  bentuk abnormalitas  diamati  dengan  menggunakan  mikroskop.  Persentase  abnormalitas spermatozoa ayam nunukan sebesar 13,01±2,16%; abnormalitas umumnya didominasi pada  bagian  ekor  8,52±1,89%.  Bentuk  abnormalitas  bagian  kepala  didominasi  oleh kepala tanpa ekor, kepala melingkar, dan kepala membengkak. Bentuk abnormalitas bagian  tengah  didominasi  oleh  bagian  tengah  melipat,  melingkar  dan  patah.  Bentuk abnormalitas  bagian  ekor  didominasi  oleh  bagian  ekor melingkar, membengkok,  dan patah.  Penggunaan  pengecatan  eosin  nigrosin  efektif  untuk  pengamatan  evaluasi morfologi spermatozoa ayam nunukan karena berdasar pada pengamatan mikroskopis menghasilkan kontras antara sel dan background yang baik.
Kata kunci : ayam nunukan, abnormalitas spermatozoa, eosin nigrosin

## 1 Pendahuluan
Ayam buras merupakan sumber genetik ternak yang perlu di lestarikan, masih alami dan  belum  banyak  mengalami  perbaikan  mutu  genetis.  Beberapa  daerah  ayam  buras dikembangkan  masyarakat  sehingga  memiliki  karakteristik  yang  relatif  homogen,  baik bentuk  tubuh  maupun  warna  bulu  (Johari  dkk,  2009).    Ayam  nunukan  merupakan  salah
ISSN 2549-7383 (online) ISSN 2354-7251 (print)
satu  plasma  nutfah  Indonesia  yang  belum  banyak  berkembang  di  wilayah  Kalimantan terutama bagian Utara (Sartika dkk, 2006).
Sebagai upaya meningkatkan produktifitas ternak di masa yang akan datang melalui teknologi  reproduksi  seperti  inseminasi  buatan  (IB)  dan  in  vitro  fertilisasi  (IVF)  perlu diketahui terlebih dahulu tentang karakteristik unsur perkawinan hewan tersebut, baik dari sisi  betina  maupun  pejantan.  Dalam  proses  fertilisasi  kontribusi  seekor  pejantan  hanya terbatas  pada  sel  sperma  (spermatozoa).  Tingkat  fertilsasi  ditinjau  dari  aspek  pejantan berupa  sperma  ditentukan  oleh  empat  faktor  yaitu  pergerakan  daya  gerak  (motilitas) kemampuan hidup (viabilitas) dan keutuhan DNA ( deoxyribose-nucleic acid ) serta morfologi dari  sperma  (Morell  dkk.,  2009).  Ardhani  (2014)  telah  mengkarakterisasi  kualitas  semen dan spermatozoa ayam nunukan dan menyatakan bahwa secara morfologi spermatozoa normal ayam nunukan berkisar 80,25%. Hal ini menunjukkan bahwa ada spermatozoa yang memiliki  abnormalitas  morfologi  yang  pada  akhirnya  akan  menurunkan  nilai  fertilitas. Penelitian ini dimaksudkan untuk mengetahui bentuk dan jenis abnormalitas spermatozoa untuk  mengidentifikasi  abnormalitas  bentuk  dan  akan  dikembangkan  bahan  identifikasi abnormalitas melalui pengecatan eosin nigrosin.

## 2 Metode Penelitian

## Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada Juni-Agustus 2015 di Laboratorium Produksi dan Teknologi  Peternakan  Jurusan  Peternakan  Fakultas  Pertanian  Universitas  Mulawarman, Samarinda.

## Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 10 ekor ayam nunukan jantan berumur diatas satu tahun dengan bobot badan 2-2,5 kg. Ayam tersebut  di kandangkan Teaching Farm Dinas Perikanan dan Peternakan Kota Samarinda. Ayam dipelihara pada kandang individu ukuran 1 x 2 m 2 dengan pencahayaan ± 12 jam per hari. Bahan lainya antara lain semen segar ayam Nunukan, eosin, eosin nigrosin dan NaCl 0,9%.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: mikroskop OptiLab, kamera, monitor, collection  tube ,  pipet  tetes,  kertas  pH,  objek  glass,  cover  glass,  tabung  reaksi, kamera digital.
Umur ayam dalam penelitian ini adalah umur diatas satu tahun dengan bobot badan 2-2,5 kg. Ayam dipelihara pada kandang individu ukuran 1 x 2  m 2 dengan pendahayaaan ± 12 jam per hari. Suhu dalam kandang penelitian adalah 24-28 0 C.
Tingkat  ransangan  ayam  dalam  penelitian  ini  adalah  tingkat  ransangannya  tinggi Teknik  pengurutan  atau massage adalah  dengan  mengusap  punggung  ayam  jantan sampai pangkal ekor dengan jemari tangan kanan kemudian diteruskan naik sampai keekor
telapak tangan kolektor membentuk sudut 30-40 0 dari punggung ayam jantan.
Frekuensi ejakulasi adalah dilakukan setiap dua hari sehari dan dilakukan dengan metode massage atau  pengurutan  bagian  punggung  (dorsal)  ayam  jantan.  Pemberian minum secara ad libitum dan pemberian pakan setiap dua kali dalam sehari sebanyak 100- 150  g/hari  menggunakan  pakan  komersial.  Kondisi  ternak  dalam  penelitian  ini  adalah ternaknya harus sehat dan tidak ada sakit supaya pada saat penampungan semen hasil ya bagus.

## Koleksi Semen
Pengoleksian semen segar dilakukan setiap dua hari sekali dan dilakukan dengan metode massage atau pengurutan bagian punggung (dorsal) ayam jantan. Bagian sekitar bibir  dan  kloaka  dibersihkan  terlebih  dahulu  dengan  tissue  yang  telah  dibasahi  NaCl, apabila  bulu  di  sekitas  kloaka  cukup  banyak  maka  bulu  tersebut  dipotong  dengan menggunakan  gunting.  Teknik  pengurutan  atau massage adalah  dengan  mengusap punggung  ayam  jantan  sampai  pangkal  ekor  dengan  jemari  tangan  kanan  kemudian diteruskan naik sampai ke ekornya, telapak tangan kolektor membentuk sudut 30-40 º dari punggung ayam jantan.
Perabaan  harus  halus  dan  tepat  agar  ayam  terangsang  ditunjukkan  dengan  ekor terangkat,  kaki  agak  meregang,  kloaka  membuka  dan  terlihat  sepasang  papilla  ( phallus nonprotudens )  menonjol.  Tangan  kanan  secara  cepat  memenggam  dan  sedikit mengangkat  pangkal  ekor,  jari  tengah  dan  ibu  jari  menekan  dasar  kloaka  dan  tetap menahan agar kedua papilla tetap menonjol. Metode tersebut dilakukan dengan tekanan tertentu  sampai  keluar  cairan  bening  (transudat  kloaka)  yang  diikuti  oleh  cairan  kental berwarna  putih  susu.  Transundat  kloaka  harus  dihindari  karena  jika  tercampur  dengan semen,  maka  akan  menyebabkan  semen  mengalami  penggumpalan  (aglutinasi) (Supriatna,  2000).  Cairan  kental  (semen)  segera  ditampung  dengan  tabung  penampung berukuran 1,5 mL yang ditutup dengan aluminium foil.

## Penilaian makroskopis
Penilaian  makroskopis  dilakukan  dengan  pengamatan  volume  dilihat  dari  skala yang  ditunjukkan  pada  spuit,  uji  pH  menggunakan  kertas  pH  skala  6.4-8.0  pengamatan warna dan bau semen.

## Pengecatan
Pengambilan  semen  dari  ayam  penelitian  setelah  itu  dilakukan  pengecatan  di laboratorium.  Pembuatan  preparat  ulas  dilakukan  dengan  menggunakan  3  kaca  objek untuk  tiap  sampelnya.  Semen  segar  dicampurkan  dengan  larutan  Eosin,  Eosin  Nigrosin dengan  perbandingan  1:50  pada  kaca  objek  campuran  semen  tersebut  diaduk  hingga homogen dengan ujung gelas objek lainnya kemudian dibuat preparat ulas setipis mungkin pada ketiga gelas objek yang berbeda kemudian dikeringkan.
ISSN 2549-7383 (online) ISSN 2354-7251 (print)

## Pengamatan Abnormalitas
Jumlah sperma yang diamati morfologinya dalam satu bidang pandang untuk tiap ulangan pengamatan abnormalitas menggunakan makroskopis dengan perbesaran objektif 40x persentasi abnormalitas dihitung berdasarkan dengan rumus:
Persentasi  = Jumlah spermatozoa abnormalitas Jumlah spermatozoa keseluruhan x 100% (1)
Karakteristik kerusakan morfologi yang diamati mengacu kepada Alkan dkk (2002).

## 3 Hasil dan Pembahasan
Volume  semen  ayam  nunukan  yang  diperoleh  sebesar  0,40±0,13  mL.  Volume semen ayam nunukan hasil penelitian ini lebih tinggi dari laporan Ardhani (2014) sebesar 0,21±0,15  mL.  Volume  semen  ayam  umumnya  berkisar  antara  0,3-1,5  mL  (Tholihere, 1993).  Beberapa  faktor  yang  dapat  mempengaruhi  volume  semen  saat  koleksi  semen adalah umur, tingkat rangsangan, frekuensi ejakulasi, kualitas pakan yang diberikan, serta kondisi ternak itu sendiri (Jonhson dkk., 2000; Toelihere, 1993).
Tabel 1. Kualitas semen segar ayam nunukan Karakteristik Rata-rata Volume ejakulat(mL) 0,40±0,13 Warna Putih susu Bau Spermin pH 7,34±0,15
Bangsa  ayam  baru  mencapai  dewasa  kelamin  pada  umur  24-26  minggu  dan individu muda dalam satu spesies menghasilkan volume semen yang rendah (Toelihere, 1993). Umur jantan yang baik untuk di koleksi semennya adalah pada umur 1-1,5 tahun (48-72 minggu)  dan  umur jantan  ayam  lokal  40-80  minggu merupakan  penghasil  semen terbaik (Sastrodihardjo dan Resnawati, 2003). Umur ayam jantan yang digunakan dalam penelitian ini berkisar antara 48-96 minggu, sehingga tingkat produksi spermatozoa cukup optimum.
Hasil yang sudah diamati secara visual warna semen ayam nunukan yang didapat berwarna putih susu. Warna semen ayam dapat tercemar akibat tercampur dengan feses, atau darah.
Nilai  pH  semen  yang  didapat  adalah  7,34±0,15.  Nilai  ini  lebih  tinggi  dari  pada penelitian sebelumnya (Ardhani, 2014) dengan pH 7,20±0,10, namun masih berada pada kisaran pH normal ayam yaitu 7,0-7,6 (Toelihere, 1993). Variasi dalam derajat keasaman disebabkan oleh suhu lingkungan sekitar kandang pemeliharaan (Mulyadi, 2007). Nilai pH semen juga dapat dipengaruhi oleh kontaminasi kuman dan banyaknya spermatozoa mati
dalam semen akibat terlalu lama sehingga memicu terbentuknya ammonia (Ardhani, 2014).
Secara umum, variasi abnormalitas spermatozoa dapat disebabkan oleh beberapa faktor, seperti: genetik, tingkat stres yang berbeda, respon terhadap suhu lingkungan dan penyakit masing-masing individu (Barth dan Oko, 1989).
Abnormalitas  bagian  kepala  memiliki  potensi  lebih  rendah  terkait  keberhasilan fertilisasi (Barth dan Oko, 1989) karena kepala spermatozoa mengandung materi genetik yang  akan  diturunkan  pada  anak  ayam  sehingga  abnormalitas  bagian  kepala  sangat dihindari.  Oleh  karena  itu,  salah  satu  tindakan  seleksi  pada  jantan  ayam  nunukan  yang memiliki  banyak  abnormalitas  pada  bagian  kepala  adalah culling (afkir)  atau  dapat melakukan tindakan prevatif seperti perbaikan manajemen pakan dan mengurangi potensi stres selama masa pertumbuhan ayam nunukan.
Abnormalitas  spermatozoa  bagian  ekor  tergolong  abnormalitas  sekunder  yang banyak  terjadi  setelah  proses  spermatogenesis  dan  faktor  eksternal  seperti  syok  akibat adaptasi perubahan lingkungan dan preparasi semen yang kurang hati-hati setelah koleksi seperti kemungkinan bercampurnya cairan eksudat atau ekreta. Bagian ekor spermatozoa berperan dalam pergerakan spermatozoa dalam proses pembuahan, sehingga secara tidak langsung  mempengaruhi  keberhasilan  fertilisasi  sel  telur.  Abnormalitas  ini  dapat diminimalisir dengan manajemen preparasi semen yang lebih baik seperti menghindarkan kotak langsung dengan matahari, prevarasi yang cepat dan tepat serta melakukan teknik koleksi secara rutin untuk melatih jantan ayam nunukan mengejakulasikan semen dengan teknik massage (Mulyadi, 2007).
Tabel  2. Abnormalitas  spermatozoa  ayam  nunukan  dengan  pewarnaan  eosin    nigrosin  (dalam persen)
Abnormalitas Rata-rata Spermatozoa abnormal 13,01±2,10 Abnormal kepala 2,63±0,92 Abnormal tengah 1,87±0,61 Abnormal ekor 8,52±1,89
Berdasarkan  variasi  bentuk  abnormalitas  yang  dihasilkan  untuk  seleksi  ayam nunukan, jantan 4 dan 5 layak untuk dipertahankan karena total jumlah abnormalitas paling rendah, selain itu abnormalitas bagian kepala juga lebih rendah dibandingkan jantan lain, sebagai  pembawa  materi  genetik  yang  diturunkan  pada  keturunanya  sehingga  penting untuk mempertahankan jantan dengan kepala spermatozoa normal yang baik. Berdasarkan penelitian  Bakst  (1987)  fertilisasi  unggas  jantan  dapat  optimum  apabila  abnormalitas spermatozoanya  kurang  dari  10%,  namun  perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  tentang pengaruh masing-masing bentuk abnormalitas terhadap fertilitas unggas jantan.
Persentase  abnormalitas  spermatozoa  pada  pewarnaan  eosin  nigrosin  rata-rata ayam  nunukan  dalam  penelitian  ini  adalah  13,01±2,10%.  Pada  hasil  pewarnaan  dengan
ISSN 2549-7383 (online) ISSN 2354-7251 (print)
eosin  nigrosin,  sel  spermatozoa  dapat  terlihat  dengan  jelas  sehingga  dapat  banyak mengidentifikasikan  bentuk  kelainanya.  Eosin  merupakan  zat  warna  yang  mampu berpendar  karena  mengandung  brom  sehingga  dapat  mewarnai  sitoplasma  (Gunarso, 1989).  Eosin  nigrosin  tidak  mengandung chloramin yang  dapat  mengikis  membrane  sel. Menurut  Arifiantini  dkk . (2006)  pengeringan  preparat  pewarnaan  eosin  nigrosin menggunakan meja pemanas menyebabkan pergeseran ukuran kepala sehingga terlihat lebih besar.

## Abnormalitas spermatozoa ayam nunukan dengan pewarnaan eosin nigrosin
Abnormalitas  bagian  kepala  pada  penelitian  ini  secara  keseluruhan  paling  tinggi ditemukan  pada  bentuk  kepala  spermatozoa  tanpa  ekor  sejalan  dengan  hasil  penelitian Mulyadi  (2007)  bahwa  abnormalitas  kepala  tanpa  ekor  banyak  ditemukan  pada  semen ayam arab, kedu dan pelung. Putusnya kepala dari ekor disebabkan oleh bagian tengah spermatozoa unggas yang sensitif terhadap pengaruh eksternal seperti rangsangan panas (Alkan  dkk.,  2002).  Selain  itu  juga  diduga  disebabkan  karena  spermatozoa  terlalu  lama berada di epididimis sehingga menyebabkan banyak spermatozoa mati dan terjadi absorbsi bagian-bagian  spermatozoa  karena  sebelumnya  sampel  jantan  belum  pernah  dikoleksi semennya. Oleh karena itu perlu adanya manajemen koleksi semen secara rutin.
Gambar 1. Bentuk kepala tanpa ekor
Kepala  melingkar  pada  bagian  tengah  maupun  ujungnya  sedangkan  bentuk smaller/larger  head atau  ukuran  kepala  yang  bervariasi.  Menurut  Barth  dan  Oko,  (1989) pada mamalia umumnya abnormalitas pada bentuk ini di sebabkan oleh faktor genetik yang terjadi  akibat  defisiensi  kromatin  inti  yang  mengarah  pada  kehilangan  atau  kelebihan pembentukan kromosom. Kegagalan pemisahan kromosom pada proses pembelahan sel (spermatogenesis) yang dapat menyebabkan kelebihan kromosom inti dapat disebebkan oleh perubahan lingkungan seperti suhu lingkungan yang fluktuatif pada musim kemarau.
Gambar 2. Bentuk kepala melingkar atau ukuran kepala bervariasi
Gambar 3 . Bentuk kepala membengkak
Kepala membengkak adalah bentuk kepala abnormal yang paling sedikit berbeda dengan dengan Alkan dkk . (2002) yang menemukan swelled head / kepala membengkak dengan  persentase  paling  banyak  pada  semen  kalkun.  Alkan dkk. (2002)  menjelaskan bahwa kepala spermatozoa membengkak sesaat semen diejakulasikan yang diakibatkan peredaan tekanan osmosis dan suhu sehingga sulit untuk menentukan swelled head yang abnormal.
Kerusakan  pada  bagian  kepala  dan  tengah  sehigga  pada  bagian  tengah  terlihat melipat  dan  patah.  Bentuk  ini  disebabkan  karena  sifat  sensitive  pada  bagian  tengah spermatozoa  dan  gerakan  ekor.  Dalam  penelitian  ini  cukup  banyak  ditemukan  dengan kondisi kepala melengkung membentuk siku.
Gambar 4. Bentuk beragam kerusakan  pada bagian tengah (melipat dan patah)
Bentuk abnormal pada bagian tengah hanya ditemukan pada bentuk melipat dan patah jenis abnormal ini sering terjadi karena proses yang abnormal selama ejakulasi yang dapat  terjadi  akibat  teknik  koleksi  yang  belum  terbiasa  dilakukan  pada  jantan  syok  dan stress pada kondisi tersebut mengingat bagian tengah sperematozoa adalah bagian yang sensitive oleh faktor eksternal (Alkan dkk. 2002).
Sejalan  dengan  hasil  penelitian  Mulyadi  (2007)  yang  banyak  menemukan abnormalitas dengan bentuk ekor melingkar (bending or knotting), ekor patah dan kepala tanpa ekor ( head detachment ) spermatozoa ayam arab. Tail detachment atau ekor tanpa kepala, bentuk ini juga disebabkan oleh faktor sekunder. Abnormalitas ini juga dapat terjadi secara  primer  akibat  adanya  gangguan  selama spermatogenesis  dimulai  dengan  bagian posterior  kepala  yang  tidak  terbentuk  dengan  sempurna  sehingga  menghasilkan ketidakstabilan pada daerah implantasi ekor. Kepala dan ekor hanya dihubungkan dengan membran  sel,  sehingga  kemungkinan  terpisahnya  kepala  dan  ekor  karena  awal  dari pergerakan sel dan perpindahan sisa sitoplasma (Barth dan Oko, 1989).
ISSN 2549-7383 (online) ISSN 2354-7251 (print)
Gambar 5. Bentuk abnormalitas ekor tanpa kepala
Bentuk ekor patah seperti pada yang terlihat patah yang paling banyak ditemukan dibandingkan bentuk ekor abnormal lainya, sedangkan bentuk ekor melingkar ditemukan paling banyak kedua. Beberapa peneliti menyatakan bahwa kerusakan ekor spermatozoa unggas dalam semen terjadi akibat faktor eksternal dan mekanis sehingga abnormal pada ekor tergolong dalam jenis abnormalitas sekunder. Meskipun tidak memiliki resiko sebesar abnormalitas  bagian  kepala,  abnormalitas  bagian  ekor  juga  perlu  diminimalisir  dengan perbaikan manajemen koleksi dan preservasi semen pasca ejakulasi.
Dalam penelitian ini adalah pewarnaan dengan eosin nigrosin lebih baik dan efektif dibandingkan  dengan  pewarnaan  eosin.  Pewarnaan  eosin  nigrosin  lebih  mudah  untuk mendeteksi  bentuk-bentuk  abnormalitas  sperma  karna  memberikan  background sedangkan eosin tidak ada memberikan background. Hasil tersebut juga didukung dengan pengujian statistik pada taraf 5% menolak sehingga dapat dinyatakan bahwa pernyataan eosin nigrosin lebih baik dari pada pewarnaan eosin.

## Gambar 6 . Bentuk sermatozoa dengan pewarnaan eosin dan eosin nigrosin
Pengamatan  yang  dilakukan  dengan  menggunakan  pewarnaan  eosin  umumnya hanya dapat menemukan kondisi abnormalitas pada bagian ekor sedangkan pada bagian kepala  dan  tengah  pewarnaan  tidak  terlihat  dan  beberapa  sampel  menunjukkan  kondisi kepala lisis sehingga sulit mengidentifikasi bentuk abnormalitasnya.

## 4 Kesimpulan
Persentase abnormal spermatozoa ayam nunukan rata-rata sebesar 13,01±2,16%. Bentuk abnormalitas bagian kepala pada pewarnaan eosin didominasi oleh kepala tanpa ekor,  kepala  melingkar,  dan  kepala  membengkak  rata-rata  sebesar  3,19±0,89%.  Bentuk abnormalitas bagian kepala pada pewarnaan eosin nigrosin didominasi oleh kepala tanpa ekor,  kepala  melingkar,  dan  kepala  membengkak  rata-rata  sebesar  2,63±0,92%.  Bentuk
abnormalitas bagian tengah pada pewarnaan eosin nigrosin didominasi oleh bagian tengah melipat, melingkar dan patah rata-rata sebesar 1,87±0,61%. Bentuk abnormalitas bagian ekor pada pewarnaan eosin nigrosin didominasi oleh bagian ekor melingkar, membengkok, dan patah rata-rata sebesar 8,52±1,89%.
Berdasarkan pengamatan secara visual, pengecatan sperma menggunakan bahan eosin nigrosin memberikan performans yang baik karena kombinasi bahan kedua bahan pengecatan  ini  memberikan  efek  kontras  melalui  perbedaan  background  dan  objek  sel sperma.

## Daftar Pustaka
Alkan, S., A. Baran, O.B. ozdas, & M. Evecen. (2002). Morfologi defects in turkey semen. J Vet Anim Sci . 26: 1087-1092.
Ardhani,  F.(2014). Karakteristik  Semen  dan  Spermatozoa  ayam  Nunukan .  Penelitan Mandiri Faperta Universitas Mulawarman.
Arifiantini, R.I., T. Wresdiyati, & E.F. Retnani. (2006). Pengujian morfologi spermatozoa sapi bali ( Bos Sondaicus ) menggunakan pewarnaan “Williams”. J Indon Trop Anim Agric . 31(2):105-110.
Barth, A.D., & R.J. Oko. (1989). Abnormal Morphology of Bovine spermatozoa . Lowa (US): lowa state University Pr.
Gunarso, W. (1989). Mikroteknik . Bogor (ID): Pusat antar Universitas Ilmu Hayati Institut Pertanian Bogor.
Johari,  S.,  Sutopo  &  A.  Santi,    (2009)  frekuensi  fenotipik  sifat-sifat  kualitatif  ayam  kedu dewasa  (Fenotype  Frequency  of  The  Qualitative  Traits  at  Adult  Kedu  Chicken) . Prosiding Seminar Nasional Kebangkitan Peternakan Fakultas Peternakan . pp. 1- 12.
Johson, L.A., K. F. Weitze., Fiser & W. M. C. Maxwell. (2000). Storage of Boar Semen. J. Anim. Sci . 62:143-172.
Morell,  J.M.,  A.  Johannisson,  H.  Strutz.,  A-M.  Dalin  &  H.  Rodriguez-Martinez.  (2009) Colloidal  centrifugation  of  stallion  semen:  changes  in  sperm  motility,  velocity  and chromatin integrity during storage. Journal Equine Veterinary Science 29:24-32.
Mulyadi,  P.M.  (2007).  Karakteristik  Semen  ayam  Arab,  Pelung  dan  Wareng  Tangerang.
Skripsi Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor.
Sartika, T., Sulandari, S., Zein, M. S. A., & Paryanti, S. (2006). Karakter fenotipe/genetic ekstemal  ayam  lokal  Indonesia. Bahan  Laporan  Akhir  Penelitian  Kompetitif  Riset Karakterisasi molekuler-LIPI
Sastrodiharjo, S.,  & H. Resnawati. (2003). Inseminasi Buatan ayam buras . Jakarta (ID): Penebar Swadaya.
Supriatna, I. (2000) . Inseminasi Buatan pada ayam . FKH-IPB. Bogor.
Toelihere, M. R. (1993). Inseminasi Buatan pada Ternak . Angkasa, Bandung.