Abstrak — Azotobacter adalah  kelompok  bakteri  rhizosfer  yang dapat  menambat  N  atmosferik. Azotobacter juga  mampu mensintesis  hormon  pertumbuhan  IAA  (auksin  alami)  yang terlibat  dalam  regulasi  pertumbuhan  dan  perkembangan tanaman.  Tujuan  penelitian  ialah    untuk  mendapatkan  isolat Azotobacter yang  berpotensi  menghasilkan  hormon  IAA ( Indole-3-Acetic  Acid ).  Purifikasi  isolat Azotobacter dilakukan menggunakan  media Nutrient  Agar .  Uji  potensi  sintesis  IAA dilakukan dengan metode Salkowski pada media Nutrient Agar - triptofan  yang  ditunjukkan  dengan  perubahan  warna  merah pada  isolat.  Isolat Azotobacter yang  mampu  menghasilkan hormon  IAA  adalah  isolat Azotobacter A1a,  A1b,  A3,  A6,  A9, dan  A10  dengan  isolat  Azotobacter  A9  dan  A10  diindikasi merupakan  isolat  yang  produktivitas  IAA  nya  lebih  besar dibandingkan isolat lainnya.
Kata Kunci — Azotobacter , Hormon, Indole-3-Acetic Acid

## I. PENDAHULUAN
NDOLE-3-ACETIC  ACID (IAA)  merupakan  anggota utama  dari  kelompok  auksin  yang  mengendalikan banyak  proses  fisiologis  penting  termasuk  pembesaran dan  pembelahan  sel,  deferensiasi  jaringan  dan  respon terhadap  cahaya  dan  gravitasi  [1].  IAA  memiliki  struktur kimia  yang  dapat  dilihat  pada  Gambar  1.  Fitohormon  IAA diketahui  dapat  menghasilkan  lebih  banyak  akar  lateral, rambut  akar  dan  cabang  rambut  akar  [2].  Keberadaan  lima jalur  biosintesis  IAA  yang  berbeda  telah  diteliti  dengan triptofan  (Trp)  sebagai  precursor.  Lima  jalur  tersebut  ialah indole-3-piruvat (IpyA), indole-3-asetamida (IAM), triptamin  (TAM),  indole-3-asetonitril  (IAN)  dan  jalur  Trp cincin  samping  oksidase  [3].  Eksudat  akar  merupakan sumber  alami  L-triptofan  untuk  mikrorganisme  rizhosfer yang  dapat  meningkatkan  produksi  IAA  di  daerah  rizosfer. Biosintesis  IAA  dalam  tanah  dapat  dipacu  dengan  adanya triptofan  yang  berasal  dari  eksudat  akar  atau  sel-sel  yang rusak atu membusuk [4].
Gambar 1. Struktur Kimia Indole-3-Acetic Acid (IAA) [5].
Azotobacter sp.  adalah  bakteri  gram  negatif,  bersifat aerobik,  polymorphic  dan  mempunyai  berbagai  ukuran  dan bentuk [6].  Sel Azotobacter berbentuk rod besar atau cocci.
Mempunyai  diameter  2-4  μm  atau  lebih.  Beberapa  spesies adalah motil dengan flagel peritrikus. Ketika mereka tumbuh di  N 2 sebagai  sumber  nitrogen,    perluasan  kapsul  atau lapisan  lendir  biasanya  diproduksi  oleh  spesies  dari  bakteri yang menfiksasi nitrogen bebas. Lapisan tersebut melindungi enzim  nitrogenase  di  dalam  sitoplasma  [7]. Azotobacter dapat membentuk struktur istirahat yang disebut cysts . Salah satu  spesies Azotobacter diketahui    memiliki  kemampuan untuk  menghasilkan  amonia,  vitamin  dan  zat  pertumbuhan yang  meningkatkan  perkecambahan  biji,  produksi  asam indole  asetat  dan  hormon  lain  yaitu  giberelin  dan  sitokinin [8]. Azotobacter spp. dari Eco Urban Farming ITS diketahui berpotensi  menghasilkan  enzim  merkuri  reduktase  yang dapat  digunakan  untuk  mendegradasi  logam  berat  merkuri HgCl 2 [9].  Berdasarkan  kemampuannya  tersebut  dilakukan penelitian  yang  menguji  potensi Azotobacter yang  diisolasi dari Eco Urban Farming ITS sebagai penghasil IAA.

## II. METODOLOGI

## A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  dilakukan  mulai  bulan  Februari  hingga  April 2015  di  Laboratorium  Mikrobiologi  dan  Bioteknologi Jurusan  Biologi  FMIPA,  Institut  Teknologi  Sepuluh Nopember Surabaya.
B. Purifikasi Isolat Azotobacter Sepuluh  isolat Azotobacter koleksi  Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Jurusan Biologi FMIPA ITS dilakukan  purfikasi  kembali  untuk  memastikan  isolat tersebut  murni  dan  beradaptasi  kembali  pada  media pertumbuhan  yang  baru.  Purifikasi  dilakukan  dengan menggoreskan 1 ose isolat bakteri dengan metode streak 16 pada agar datar Nutrient Agar . Kemudian diinkubasi hingga isolat  tumbuh  dan  diamati  pertumbuhan  koloni  isolat. Purifikasi  dilakukan  hingga  koloni  isolat  yang  teramati seragam.
C. Subkultur Azotobacter Isolat Azotobacte r  masing-masing  diinokulasikan  secara aseptis  pada Nutrient  Agar miring.  Kemudian  diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam.

## D. Pereaksi Salkowski
Pereaksi  Salkowski  dibuat  dengan  mencampurkan  2  ml larutan  FeCl 3 0,5M    dan  98  ml  HClO 4 35  %  (Mali  dan

## Potensi Azotobacter sebagai Penghasil Hormon IAA

## ( Indole-3-Acetic Acid )
Fahima Tahta Kholida dan Enny Zulaika Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia e-mail : enny@bio.its.ac.id
I
Bodhankar,  2009).  Larutan  dimasukkan  ke  dalam  botol gelap.  Pereaksi  Salkowski  akan  membentuk  warna kemerahan hingga merah saat bereaksi dengan IAA.

## E. Uji Potensi Produksi IAA
Isolat Azotobacter diinokulasikan  pada  media Nutrient Agar datar yang disuplementasi triptofan dengan konsentrasi 100  ppm  menggunakan  metode streak  plate .  Kemudian diinkubasi  pada  suhu  ruang  selama  48  jam.  Pereaksi Salkowski  diteteskan  pada  isolat Azotobacter yang  telah tumbuh  di  medium  Nutrient  Agar  datar  sampai  merata. Selanjutnya  isolat  yang  telah  ditetesi  pereaksi  Salkowski disimpan  dalam  ruang  gelap  selama  30  menit.  Hasil  positif ditunjukkan  dengan  perubahan  warna  koloni  isolat  menjadi merah.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pufikasi  isolat  Azotobacter  betujuan  untuk  memurnikan isolat bakteri dan beradaptasi pada media pertumbuhan baru setelah  dalam  kultur  awetan.  Purifikasi  dilakukan  dengan tiga  kali  pengulangan.  Pada  Gambar 2 ditampilkan hasil uji purifikasi isolat Azotobacter .
Gambar 2. Hasil purifikasi isolat Azotobacter A1a, A1b, A2, A3, A5, A6, A7, A8, A9, A10 yang telah murni.
Produksi  IAA  oleh  isolat Azotobacter diuji  secara kualitatif  menggunakan  metode  Salkowski  yang  dilakukan dengan  streak  plate  pada  agar  datar  yang  disuplementasi triptofan.  Suplementasi  menggunakan  triptofan  dibutuhkan karena  triptofan  merupakan  prekursor  primer  dalam biosintesis IAA [10].
Pada  uji  potensi  produksi  IAA  6  isolat  terindikasi mampu memproduksi hormon IAA yaitu isolat Azotobacter A1a, A1b, A3, A6, A9 dan A10 dan 4 isolat yang lain yaitu A2,  A5,  A7  dan  A8  tidak  mengalami  perubahan  warna. (Gambar  3).  Kemampuan  isolat  menghasilkan  IAA ditunjukkan  dengan  perubahan  warna  isolat  menjadi kemerahan.  Perubahan  warna  untuk  setiap  isolat  berbeda- beda (Tabel 1).
Gambar  3.  Isolat Azotobacter setelah  ditetesi  Salkowski  dan  diinkubasi selama 30 menit di ruang gelap.
Tabel 1. Potensi Isolat Azotobacter yang Berpotensi Menghasilkan Hormon
IAA. Isolat Azotobacter Reaksi warna Isolat Azotobacter Reaksi warna A1a + A6 + A1b + A7 - A2 - A8 - A3 + A9 ++ A5 - A10 ++
Keterangan:  +++  :  merah,  ++  :  merah  muda,  +  :  sedikit  merah  muda,  -  : tidak berwarna merah.
Isolat  yang  menunjukkan  warna  merah  yang  paling mencolok  adalah  isolat Azotobacter A9  dan  A10  dan dimungkinkan dapat menghasilkan IAA lebih besar daripada 4 isolat lain. Perubahan warna kemerahan pada isolat setelah ditetesi  pereaksi  Salkowski  terjadi  karena  adanya  reaksi antara  pereaksi  Salkowski  dengan  IAA  ataupun  dengan beberapa  senyawa  pembentuk  IAA. Indole-3-acetic  acid (IAA)  berikatan  dengan  FeCl 3 dan  HClO 4 yang  merupakan senyawa penyusun pereaksi Salkoswki membentuk kompleks  tris-(indole-3-aceto) iron  (III) yang  memberikan warna  kemerahan  hingga  merah.  Reaksi  terjadinya perubahan  warna  merah  pada  isolat Azotobacter setelah
ditetesi pereaksi Salkowski ini mengindikasikan kemampuan bakteri  tersebut  dalam  memetabolisme  L-triptofan  menjadi IAA [11].
Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan  Chaiharn  & Lumyong  (2011),  sebagian  besar  dari  isolat  bakteri  akan memproduksi  IAA  lebih  tinggi  ketika  ada  penambahan prekursor    L-triptofan  dan  sintesis  IAA  akan  melalui  jalur Trp-pathways . Pada kondisi alami, akar tanaman mensekresikan  bahan  organik  termasuk  L-triptofan  yang dapat dimanfaatkan bakteri untuk biosintesis IAA [12].

## IV. KESIMPULAN
Isolat Azotobacter koleksi  Laboratorium  Mikrobiologi dan  Bioteknologi  Jurusan  Biologi  FMIPA  ITS yang berpotensi  menghasilkan  hormon  auksin  (IAA)  ialah Azotobacter A1a,  A1b,  A3,  A6,  A9  dan  A10. Azotobacter A9  dan  A10  berpotensi  menghasilkan  IAA  lebih  besar dibanding isolat lainnya.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  Fahima  Tahta  mengucapkan  terima  kasih sebesar-besarnya  kepada  Dr.  Enny  Zulaika,  MP.  atas dukungan    melalui  pendanaan    PNPB  ITS  sesuai  dengan nomor kontrak 003246.256/IT2.11/PN.08/2015.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Shokri, D. and Emtiazi, G. “Indole-3-acetic acid (IAA) Production in Symbiotic  and  Non-Symbiotic  Nitrogen-Fixing  Bacteria  and  its Optimization  by  Taguchi  Design”. Curr  Microbiol .  Vol.  61  (2010) 217-225.
[2] Lestari,  P.L.,  Susilowati,  D.N.,  dan  Riyanti,  E.I.  “Pengaruh  Hormon Asam  Indol  Asetat  yang  Dihasilkan Azospirillum sp.  terhadap Perkembangan  Akar  Padi”. Jurnal  AgroBiogen .  Vol.  3,  No.2 (2007) 66-72.
[3] Szkop,  M.,  and  Bielawski,  W.  “A  simple  method  for  simultaneous RP-HPLC  determination  of  indolic  compounds  related  to  bacterial biosynthesis  of  Indole-3-acetic  acid”. Antonie  Van  Leeuwenhoek . Vol. 103 (2013) 683 – 691.
[4] Chaiharn,  M.,  dan  Lumyong,  S.  “Screening  and  Optimization  of Indole-3-Acetic  Acid  Production  and  Phosphate  Solubilization  from Rhizobacteria  Aimed  at  Improving  Plant  Growth” .  Curr  Microbiol . Vol. 62 (2011) 173-181.
[5] Dobrev,  P.I.,  Havlicek,  L.,  Vagner,  M.,    Malbeck,  J.,  dan  Kaminek, M.  “Purifcation  And  Determination  Of  Plant  Hormones  Auxin  And Abscisic  Acid  Using  Solid  Phase  Extraction  And  Two  Dimensional High Performance Liquid Chromatography”. Journal of Chromatography A . Vol. 1075 (2005)  159-166.
[6] Saribay, G. “Growth and Nitrogen Fixation Dynamics of Azotobacter chroococcum in Nitrogen-Free and OMW Containg Medium” thesis,
The Middle East Technical University (2003).
[7] Madigan,  M.  T.,  Martinko,  J.,  Stahl,  D.A.,  dan  Clark,  D.P. Brock Biology  of  Microorganisms  13 th edition .  San  Fransisco:  Benjamin Cummings (2012).
[8] Mali,  G.V  dan  Bodhankar,  M.G.  “Antifungal  and  Phytohormone Production  Potential  of Azotobacter  chrococcum Isolates  from Groundnut  ( Arachis  hypogea L.)  Rhizosphere”. Asian  J.  Exp.  Sci Vol. 23, No.1 (2009)  293-297.
[9] Sakinah,  A.L.,  dan  Zulaika,  E.  “Resistensi Azotobacter terhadap HgCl 2 yang  Berpotensi  Menghasilkan  Enzim  Merkuri  Reduktase”. Jurnal Sains dan Seni Pomits . Vol. 3, No.2 (2014) E84-E86.
[10] Tanaka,  E.,  Tanaka,  C.,  Ishihara,  A.,  Kuwahara,  Y.,  dan  Tsuda,  M. “Indole-3-acetic  acid  biosynthesis  in Aciculosporium take,  a  causal agent  of  witches’  broom  of  bamboo”.  J  Gen  Plant  Pathol.  Vol.  69 (2003) 1–6.
[11] Rahman,  A.,  Sitepu,  I.R.,  Tang,  S.Y.,  dan  Hashidoko,  Y. “Salkowski’s  Reagent  Test  As  A  Primary  Screening  Index  for
Functionalities  of  Rhizobacteria  Isolated  from  Wild  Dipterocarp Saplings  Growing  Naturally  on  Medium-Strongly  Acidic  Tropical Peat  Soil”. Biosci.  Biotechnol.  Biochem .  Vol.  74,  No.  11  (2010) 1003600-1-7.
[12] Ahmad,  F.,  Ahmad,  I.,  dan  Khan,  M.S.  “Indole  Acetic  Acid Production by the Indigenous Isolates of Azotobacter and Fluorescent Pseudomonas in  the  Presence  and  Absence  of  Tryptophan”. Turk  J Biol (2005) 29-34.