## Artikel Penelitian

## CYTOTOXIC EFFECT OF  FREEZE DRIED BOVINE CARTILAGE POWDER AND PLATELET RICH PLASMA (PRP) TO MESENCHYMAL STEM CELL (MSCs)
Dwikora Novembri Utomo 1* , Anthoni Yusbida 2
1 Senior Consultant of Orthopaedic and Traumatology Department, Faculty of Medicine, Universitas Airlangga, Dr Soetomo General Hospital, Surabaya
2 Resident of Orthopaedic and Traumatology Department, Faculty of Medicine, Universitas Airlangga, Dr Soetomo General Hospital, Surabaya
*Correspondence: Dwikora Novembri Utomo, Senior Consultant of Orthopaedic and Traumatology Department, Faculty of Medicine, Universitas Airlangga, Jl. Mayjen Prof. Dr. Moestopo 6-8, Surabaya E-mail : dwikora_utomo@yahoo.com

## ABSTRAK
Perbaikan  tulang  rawan  adalah  masalah  klinis  yang  menantang  karena  kerusakan merupakan kondisi yang ireversibel. Banyak penelitian telah dilakukan dengan menggunakan beberapa  jenis scaffold alami  maupun  sintetis.  Upaya  untuk  memperbaiki  tulang  rawan artikular dengan menggunakan scaffold biasanya memiliki banyak masalah, kekurangan pada struktur fisik dan sifat mekanik yang diperlukan untuk memastikan keefektivan jangka panjang terhadap kerusakan tulang rawan. Selain itu, scaffold sering menyebabkan toksisitas terhadap inang. Oleh karena itu penelitian ini dilakukan secara in vitro untuk menguji efek toksisitas dari scaffold bubuk  tulang  rawan  dan platelet  rich  plasma (PRP).  Penelitian  ini  dilakukan dengan menggunakan rancangan penelitian eksperimental murni pada 4 kelompok stem cell hewan yang ditambahkan dengan scaffold tulang rawan kering yang diberi platelet rich plasma (PRP).  Penelitian  ini  menggunakan post  test  only  control  group  design .  Hasilnya  diproses dengan MTT assay dan spektrofotometer untuk menghitung stem cell yang masih hidup. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam jumlah makrofag antara kelompok kontrol dan scaffold tulang  rawan  kering  beku  yang  ditambahkan  PRP  (p=0,128).  Dengan  hasil  ini  pada  jumlah makrofag antara kelompok kontrol dan scaffold tulang rawan kering beku yang ditambahkan PRP, dapat disimpulkan bahwa biomaterial ini memiliki biokompatibilitas.
Kata kunci : tulang rawan sapi beku kering, scaffold , platelet rich plasma, makrofag

## ABSTRACT
Cartilage repair is a challenging clinical problem because the damage is an irreversible condition.  Many  studies  had  been  performed  using  several  kinds  of  natural  or  synthetic scaffold. Attempts to repair articular  cartilage  using  scaffold usually  found  many  problems, lacks the  physical structure and mechanical properties necessary to ensure long-term efficacy to  cartilage  defect. Furthermore,  scaffold  frequently  cause  toxicity  to  the  host.  Therefore, this  study  was  performed in  vitro  to test  the  toxicity effect  of  scaffold  freeze  dried  bovine cartilage  powder  and  platelets Rich Plasma (PRP). This research  was  conducted using pure experimental research design in 4 groups of animal stem cells which being added with scaffold freeze  dried  bovine  cartilage  scaffold  provided  with platelet  rich  plasma. This  study using posttest  only  control  group  design.  The  result  being  processed  with  MTT  assay  and spectrophotometer for counting the viable stem cells. There was  no significant  difference in the  amount  of  macrophage  between  control  and  the  freeze  dried  bovine  cartilage  scaffold provided  with  PRP  (p=0,128).  With  this  result  in  the  number  of  macrophages  between  the control with freeze dried bovine cartilage scaffold provided PRP, it can be concluded that these biomaterials have biocompatibility.
Keywords : freeze dried bovine cartilage, scaffold, platelet rich plasma, macrophage

## Artikel Penelitian

## PENDAHULUAN
Dari banyaknya cedera pada tulang dan  sendi  pada  kecelakaan,  kerusakan tulang  rawan  sendi  masih  merupakan masalah utama karena sering menimbulkan keluhan yang berkepanjangan dari penderita.
Hal  tersebut  sangat  merugikan, karena  berpengaruh  signifikan  terhadap menurunnya  tingkat  produktifitas  akibat tingkat  kesakitan  penderita.  Kerusakan tulang rawan sendi memerlukan pembiayaan  yang tinggi  baik  untuk pembelian  obat-obatan  dan  operasi. 1 Salah satu perkembangan  yang terbaru di  bidang pengobatan  tulang  rawan  sendi  adalah pengobatan  dengan  teknik cartilage  tissue engineering .  Metode  ini  merupakan  terapi kerusakan  tulang  rawan  sendi  dengan teknik yang berbasis sel, growth factor dan scaffold .  Sel  yang  digunakan  adalah kondrosit  atau mesenchymal  stem  cells.
Pada perkembangan terakhir sel yang sering digunakan adalah bone marrow mesenchymal stem cells . 2
Mesenchymal  stem  cells  (MSCs) adalah sel multipoten yang dapat berdeferensiasi  ke  dalam  beberapa  sel selama proses penyembuhan cedera jaringan. MSCs dapat  berdeferensiasi menjadi cartilage pembentuk cartilage sendi, collagen ,  osteoblas.  Sel  itu  secara bersama-sama  mempunyai  kemampuan
untuk  meregenerasi  kerusakan  jaringan yang  disebabkan  oleh  trauma,  perubahan degenerasi termasuk osteoarthritis. Regenerasi cartilage sendi  dengan  metode mesenchymal  stem  cells  (MSCs) paling banyak digunakan saat ini karena potensinya yang dapat memperbaiki kerusakan  jaringan  secara  signifikan. 3
Sejumlah  material scaffold baik  alami maupun sintesis telah ditest secara in vitro dan in vivo dalam penelitian. Scaffold yang ideal  mempunyai  sifat  biokompatibilitas untuk  dapat  mencegah  reaksi  radang  dari sel-sel host, bentuk yang tiga dimensi untuk proliferasi  dan  diferensiasi  sel,  dan porositas yang cukup untuk migrasi sel dan difusi molekul, nutrisi dan oksigen. Matriks dari  material  tersebut  juga  harus  dapat memfasilitasi  implantasi  sel  tersebut  pada lesi dan bertahan di dalam implan. 4
Berbagai jenis scaffold telah dikembangkan  untuk  terapi  kerusakan tulang  rawan  sendi,  tetapi  masing-masing memiliki kelebihan dan kekurangan. Untuk mengisi  defek  atau  rongga  pada  tulang rawan, scaffold yang  konvesional  kurang cocok dipakai karena relatif tidak larut dan menyatu  dengan  tulang  rawan. Scaffold yang  biasa  digunakan  sampai  sekarang berbentuk  tiga  dimensi  sehingga  biasanya implantasinya  kurang  baik  pada  tulang rawan. 4

## Artikel Penelitian
Di  Bank  Jaringan  RS  Dr.  Soetomo dikembangkan scaffold berbentuk powder yang  dibuat  dari  tulang  rawan  sapi  dan diproses dengan freeze dried (beku kering).
Untuk  memudahkan  implantasinya  maka dikombinasi  dengan platelet  rich  plasma (PRP  Gel) .  Bubuk  tulang  rawan  sapi  ini larut  pada  PRP  dan  akan  membentuk larutan  yang  berbentuk  gel  sehingga  siap untuk  diimplantasikan. PRP  gel ini merupakan bahan yang
banyak mengandung growth  factor yang  penting untuk  regenerasi  tulang  rawan,  proliferasi dan  diferensiasi mesenchymal  stem  cells (MSCs).
Untuk  penelitian  lebih  lanjut  guna memanfaatkan bubuk tulang rawan sapi dan platelet  rich  plasma tersebut  maka diperlukan suatu penelitian untuk
mengetahui efeknya terhadap mesenchymal stem  cells. Pada  penelitian  sebelumnya terbukti  bahwa  bubuk  tulang  rawan  sapi tersebut dan platelet rich plasma biokompatibel terhadap jaringan.
Diharapkan nantinya scaffold bubuk tulang rawan sapi ini dapat digunakan secara luas untuk  pengobatan  kerusakan  tulang  rawan sendi yang dikombinasi dengan mesenchymal stem cells.

## METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini adalah suatu penelitian  experimental  murni  dengan
rancangan post-test  only  control  group design . Sampel penelitian  dibagi  menjadi empat kelompok, tiga kelompok mendapat perlakuan  dan  satu  kelompok  menjadi kontrol.  Satu  kelompok  tidak  dirikan perlakuan,  satu  kelompok  mendapat platelet rich plasma (PRP) satu kelompok mendapat Freeze  Dried Bovine  Cartilage (FDBCP)  dan  satu  lagi  mendapatkan FDBCP dan PRP.
Gambar 1. Skema metodologi penelitian

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian  eksperimental  dimulai dengan pembuatan platelet rich plasma dan pengaktifan mesenchymal stem cell . Platelet rich plasma dan freeze dried bovine cartilage powder kemudian diuji toksisitasnya  terhadap mesenchymal  stem cell dengan  MTT assay pada  panjang gelombang 630 nm. Data tentang  pengaruh sitotoksik scaffold bubuk tulang rawan sapi dan platelet  rich  plasma secara kuantitatif dinilai  dengan  menggunakan  uji  viabilitas MTT assay terlihat pada tabel 1.

## Artikel Penelitian
- Hasil perhitungan jumlah mesenchymal stem cell Perhitungan  jumlah  stem  cell  yang didapatkan dengan ELISA reader ditampilkan pada tabel 1 berikut.
Tabel  1 . Hasil Penelitian
Hasil Pemeriksaan Statistic MSCs Mean 95% Confidence Interval for Mean                 Lower Bound Upper Bound 5% Trimmed Mean Median Std. Deviation ,71050 ,60496 ,81604 ,70006 ,68850 ,166102 MSCs + PRP Mean 95% Confidence Interval for Mean                 Lower Bound Upper Bound 5% Trimmed Mean Median Std. Deviation 1,17542 1,03788 1,31296 1,16357 1,15750 ,216474 MSCs + FDBCP Mean 95% Confidence Interval for Mean                 Lower Bound Upper Bound 5% Trimmed Mean Median Std. Deviation ,67467 ,59900 ,75033 ,67707 ,68750 ,119088 MSCs + PRP + FDBCP Mean 95% Confidence Interval for Mean                Lower Bound Upper Bound 5% Trimmed Mean Median Std. Deviation 1,58317 1,43867 1,72766 1,59641 1,66650 ,227418 Dari data deskriptif diatas
didapatkan  bahwa  kadar  rata-rata  MTT meningkat pada kelompok yang diberi PRP dan kelompok yang mendapat PRP+FDBCP.  Sedangkan  pada  kelompok yang  mendapat  FDBCP  terjadi  penurunan kadar  rata-rata  MTT  untuk  mengetahui apakah  peningkatan  atau  penurunan  kadar rata-rata  MTT  ini  signifikan,  maka dilakukan uji statistik yaitu Uji ANOVA.
- Uji Statistik ANOVA
Karena  diberikan  empat  perlakuan yang berbeda maka digunakan uji ANOVA. Untuk  memakai  uji    ini  maka  data  harus homogen dan varian data harus homogen.
1. Uji homogenitas data
Tabel 2. Homogenitas data penelitian
Perlakuan Shapiro-Wilk Statistic Df Sig. M MSCS ,887 12 ,107
T T MSCS + PRP ,930 12 ,379 MSCS + FDBCP ,972 12 ,928 MSCS + PRP + FDBCP ,880 12 ,088
Dari  data  berikut  didapatkan  keempat kelompok  data  terdistribusi  normal.  Ini karena semua kelompok data memiliki nilai p>0,05.
2. Uji homogenitas variance
Tabel 3. Homogenitas variance Levene Statistic df1 df2 Sig. 1,475 3 44 ,234
Dari  data  diatas  didapatkan  bahwa variance data homogen. Ini dilihat dari nilai p>0,05.  Karena  homogenitas  data  normal dan  homogenitas variance normal  maka dapat dilakukan uji ANOVA.

## 3. Uji ANOVA
Tabel 4. Uji ANOVA
df Mean square F Sig. Between Groups Within Groups Total 3 44 47 2,221 ,035 63,308 ,000
Pada  uji  ANOVA  didapatkan p<0,05. Ini artinya bahwa terdapat beberapa kelompok  data  yang  berbeda  secara signifikan.  Untuk  melihat  kelompok  yang berbeda  itu  maka  dilakukan multiple comparison.
Tabel 5. Multiple comparisons
P erlakuan Perlakuan Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound MSCS MSCS+PRP ,000  -,61904 -,31080 MSCS+FDBC P ,642  -,11829 ,18995 MSCS+PRP + FDBCP ,000  -1,02679 -,71855
* The mean difference is significant at the 0.05 level
Dari uji multiple comparison didapatkan  bahwa  terdapat  perbedaan signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok  MSCS+PRP  dan  kelompok MSCS+FDBCP+PRP.  Ini  artinya  bahwa kenaikan kadar MTT setelah ditambah PRP meningkat secara signifikan. Demikian juga setelah  ditambah  PRP+FDBCP  terjadi kenaikan signifikan. Sedangkan kadar MTT setelah  ditambah  FDBCP  menurun  tetapi tidak signifikan.

## PEMBAHASAN
Persentase  viabilitas mesenchymal stem  cells setelah  dilakukan  pemberian scaffold bubuk  tulang  rawan  sapi  dan platelet  rich  plasma  dihitung  dengan menggunakan  MTT  assay  yaitu  dengan menilai densitas optik. Sebagai pembanding juga dilakukan uji viabilitas dengan metoda yang  sama  terhadap  bubuk  tulang  rawan sapi  saja  dan  juga  terhadap  platelet  rich plasma  saja.  Kadar  MTT  menunjukkan keaktifan  sel.  Makin  tinggi  MTT  berarti

## Artikel Penelitian
jumlah  sel  meningkat.  Demikian  juga sebaliknya, makin rendah berarti jumlah sel menurun.
Penelitian  ini  merupakan penelitian eksprimental laboratoris menggunakan  rancangan  penelitian Post Test-Only  Control  Group  Design pada kultur mesenchymal stem  cells .  Sampel mesenchymal stem cells formula 1 (kontrol), sampel mesenchymal stem cells formula 2 (dengan  PRP),  sampel mesenchymal  stem cells formula  3  (dengan  FDBCP)  dan sampel mesenchymal  stem  cells formula  4 (dengan  FDBCP  dan  PRP  )  ditanamkan pada  kultur  dan  kemudian  diinkubasikan selama  24  jam.  Pengukuran  persentase jumlah  sel  yang  viabel  didalam  kultur menggunakan metode MTT assay .
Data  hasil  penelitian  eksperimental mengenai  uji  sitotoksiksitas  secara in  vitro pada  sampel mesenchymal  stem  cells didapatkan  secara  kuantitatif  yaitu  dengan melihat  persentase  jumlah  sel  yang  yang viabel dalam kultur. Pemeriksaan kuantitatif MTT  assay berdasar  pada
kemampuan  sel  hidup  untuk  mereduksi garam  MTT  yang  berwarna  kuning  dan larut menjadi formazan  garam  tetrazolium yang  berwarna  biru-ungu  dan  tidak  larut. Produksi  formazan  dapat  dihitung  dengan melarutkan  dan  mengukur  densitas  optik larutan yang dihasilkan. Reaksi warna biru keunguan digunakan sebagai ukuran jumlah
sel  hidup.  Semakin  pekat  warna  biru ungunya  semakin  tinggi  nilai  absorpsinya hal  ini  menunjukkan  semakin  banyak jumlah  sel  yang  hidup.  Sedangkan  jumlah sel dapat diukur sebagai hasil produk MTT dengan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang  630  nm  sehingga  semakin tinggi persentase densitas optik menunjukkan  sel  memiliki  metabolisme aktif  yang  dapat  mereduksi  MTT  yang semakin baik.
Data  tentang  densitas  optik  yang menggambarkan  viabilitas mesenchymal stem  cells dengan  menggunakan  metode MTT Assay dapat  dilihat  pada  grafik  di bawah ini.
Gambar  2. Hasil  pengukuran  densitas optik  yang  menggambarkan  viabilitas mesenchymal stem cells
Dari data deskriptif diatas didapatkan  bahwa  kadar  rata-rata  MTT meningkat pada kelompok yang diberi PRP yaitu 1,17542 dan kelompok yang mendapat  PRP+FDBCP  sebesar  1,58317.

## Artikel Penelitian
Sedangkan pada kelompok yang mendapat FDBCP  terjadi  penurunan  kadar  rata-rata MTTdengan rerata 0,67467. Dari data-data tersebut  kita  dapat  menghitung  viabilitas dari stem  cell, yang  hasilnya  dapat  dilihat pada grafik di bawah ini.
Gambar  3. Grafik  persentase  viabilitas

## mesenchymal stem cells
Dari  grafik  di  atas  dapat  kita  lihat bahwa  viabilitas  dari mesenchymal  stem cells  cells formula  1  (kontrol)  yang  kita anggap mempunyai viabilitas 100%, sampel mesenchymal  stem  cells formula 2 (dengan  PRP)  meningkat  sampai  164%, sampel mesenchymal  stem  cells formula  3 (dengan  FDBCP)  didapatkan  penurunan persentase  yang  tidak  signifikan  yaitu sebesar  6%,  sehingga  menjadi  94%,  dan sampel mesenchymal  stem  cells formula  4 (dengan FDBCP dan PRP ) meningkat lebih dari dua kali lipat sebesar 223%.
Didapatkan  bahwa  formula  1  dan formula  3  menunjukkan  nilai  yang  lebih
besar  daripada  kelompok  kontrol  (100%). Formula  3  menunjukkan  hasil  yang paling signifikan.  Hal  ini  menunjukkan  terjadi percepatan pertumbuhan mesenchymal stem cells pada  media  kultur  setelah  diberikan kedua jenis komponen tersebut,  yaitu PRP dan FDBCP.
Hal  ini  membuktikan  bahwa  PRP dan  gel  larutan  PRP  tidak  bersifat  toksik, justru  bersifat  merangsang  pertumbuhan sel, dan berdasarkan uji statistik didapatkan hasil  yang  signifikan  (p<0.05).  Hasil  ini sesuai dengan studi yang dilakukan oleh K. Hyunchul  seperti  yang  membuktikan bahwa PRP meningkatkan kapasitas proliferasi  dan  diferensiasi  pada  sel tendon. 6 Penelitian  serupa  dilakukan  oleh K.  Akeda  yang  melakukan  percobaan dengan  nemberikan  PRP  pada  cartilage babi,  dan  membuktikan  bahwa growth factor yang  ada  di  PRP  merangsang proliferasi kondrosit dan biosintesa matriks. 7

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
1) Secara in  vitro, Platelet  Rich  Plasma (PRP) terbukti  tidak  toksik  terhadap pertumbuhan  kultur Mesenchymal Stem Cells (MSCs).
2) Secara in  vitro,  Freeze  Dried  Bovine Cartilage Powder (FDBCPP) terbukti tidak  toksik  terhadap  pertumbuhan

## Artikel Penelitian
kultur Mesenchymal stem cells
(MSCs).
3) Scaffold dari  bahan  Platelet  Rich Plasma (PRP) dan Freeze Dried Bovine
Cartilage Powder  (FDBCPP)  tidak bersifat  toksik  terhadap Mesenchymal stem cells (MSCs).
4) Scaffold  Scaffold dari  bahan  Platelet Rich  Plasma (PRP)  dan  Freeze  Dried Bovine Cartilage Powder  (FDBCPP) merangsang  proliferasi Mesenchymal stem cells (MSCs)
Saran
1) Untuk  mendapatkan  hasil  yang  lebih reliable perlu  dilakukan  penelitian in vivo (pada hewan coba).
2) Perlu kiranya untuk melakukan penelitian mengenai efek
genotoksisitas dan karsinogenisitas.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Gobbi  A.  and  Bathan  L.  2009. Biological  Approach  for  Cartilage Repair. Journal Knee Surgery, 22:36- 44.
2. Caplan  AI.  2000.  Hyaluronan-based polymers in the treatment of osteochondral  defects. J  Orthop  Res,
18:773.
3. Getgood  et  al.  2009.  Articular Cartilage Tissue Engineering: Today’s research,  tomorrow  practice? J  Bone and Joint Surgery, 91(5) p: 565-576.
4. Simon Ziv, Philip A, Watson Biomimetic  dental  implants—new ways  to  enhance  osseointegration. J Can Dent Assoc .  2002;68(5):286–288.
5. Chen G, Sato T, Ushida T, Hirochika R, Shirasaki Y, Ochiai N, Tateishi T.
The use of a novel PLGA fiber/collagen  composite  web  as  a scaffold  for  engineering  of  articular cartilage tissue with adjustable thickness. J Biomed Mater Res A. 2003;67:1170–1180.
6. Jo  CH,  Shin  JS,  Lee  YG,  Shin  WH, Kim H, Lee SY, Yoon KS, and Shin S. 2013.  Platelet  rich  plasma  for arthroscopic repair of large to massive rotator  cuff  tears:  a  randomized, single-blind, parallel-group trial.
American Journal of Sports Medicine . Vol 41(10):2240-8.
7. Akeda  K,  An  HS,  Pichika  R,  Attawia M,  Thonar  EJ,  Lenz  ME,  Uchida  A, and  Masuda  K.  2006.  Platelet-rich plasma (PRP) stimulates the extracellular  matrix  metabolism  of porcine  nucleus  pulposus  and  anulus fibrosus  cells  cultured  in  alginate beads. Spine Volume 31 (9):959-66.
8. Williams RJ. 2006. Articular cartilage repair: Clinical approach and decision making  in:  operative  techniques  in orthopaedics. New York. Elsevier Inc, p: 218-226.
9. Gregory  CA  and  Prockop  DJ.  2007. Fundamental of culture and
characterization of Mesenchymal Stem/Progenitor  Cells  (MSCs)  from bone  marrow  stroma,  in  culture  of specialized cells culture of human stem cells  (edited  by  Freshney  RI,  Stacey GN,  Auerbach  JM).  Jhon  Wiley  & Sons. New jersey: 207-232.
10. Muschler  GE,  Nakamoto  C,  and Griffith LG. 2004. Engineering Principles  of  Clinical  Cell-Based Tissue  Engineering. J.  Bone  Joint
Surg; Vol.86-A(7): 1542-1558.