## KAJIAN VARIASI SEKUNES INTRASPESIES DAN FILOGENETIK MONYET
HITAM SULAWESI ( Macaca nigra) DENGAN MENGGUNAKAN GEN COI
Fitri E. Hasibuan 1) , Feky R. Mantiri 1) , Rooije R.H. Rumende 1)
1) Program Studi Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Sam Ratulangi Jl. Kampus UNSRAT FMIPA, Manado 95115 e-mail: fitrielizabeth19@gmail.com : fmantiri@yahoo.com : rooije.rumende@yahoo.com

## ABSTRAK
Macaca nigra merupakan salah satu spesies yang endemik dan terancam punah di Sulawesi Utara. Eksploitasi  yang  berlebihan  serta  alih  fungsi  hutan  menjadi  ancaman  bagi  spesies  ini  di  alam. Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  variasi  sekuens  intraspesies M.  nigra yang  berada  di Pusat  Penyelamatan  Satwa  Tasikoki  Bitung.  Analisis  sekuens  menunjukkan  terdapat  perbedaan sepuluh pasang basa nukleotida pada urutan sekuens sampel dilokasi yang berbeda. Jarak genetik antara  kedua  sampel  yaitu  0.016.  Hasil  perhitungan  jarak  genetik  menunjukkan  variasi  genetik masih  berada  dalam  kisaran  variasi  intraspesies  dengan  ambang  batas  untuk  variasi  intraspesies yaitu 0.015-0.025. Selain itu, variasi juga ditunjukkan pada sampel dengan kerabat dekatnya yang terdata  di  GenBank  disebabkan  karena  adanya  mutasi  sinonim  dan  mutasi  nonsinonim.  Analisis filogenetik  berdasarkan  gen  COI  ( Cytochrome  Oxidase-I )  menunjukkan  bahwa  sampel M.  nigra yang digunakan dalam penelitian ini berada satu klaster dengan M. nigra yang ada di database dan termasuk ke dalam kelompok Silenus.
Kata kunci: Variasi sekuens intraspesies, Gen COI, Macaca nigra, analisis filogenetik.

## THE STUDY INTRASPECIFIC VARIATION SEQUENCES AND
PHYLOGENETIC CELEBES BLACK MACAQUE (Macaca nigra ) USING COI

## GENE

## ABSTRACT
Macaca  nigra is  listed  as  one  of  the  endemic  species  and  endangered  in  North  Sulawesi. Exploitation and forest conversion have become threats to this species in the wild. This study was conducted  to  determine  the  intraspecific  sequence  variation  of M.  nigra located  in  Tasikoki Wildlife Rescue Center, Bitung.  Sequence  analysis revealed ten nucleotides differences between these  two  specimens.  Genetic  distance  for  both  of  specimens  is  0.016.  The  result  of  genetic distance,  the  genetic  variation  between  the  specimens  of M.  nigra was  still  within  the  range  of intraspecific  variation.  Distance  analysis  was  also  conducted  by  comparing  with  the  close relatives  of M.  nigra based  on  BLAST  search,  which  showed  range  from  0.015-0.025.  These differences  resulted  in  both  synonymous  and  nonsynonymous  mutation.  Phylogenetic  analysis using  DNA  sequences  of  COI  ( Cytochrome  Oxidase-I )  gene  revealed  that  the  two  specimens  of M.  nigra claster  together  with M.  nigra sequences  that  have  been  deposited  in  GeneBank. Moreover M. nigra is claster in the silenus group which is in accordance with previous reports.
Keywords : Intraspecific Sequence Variation, COI Gene, Macaca nigra, Phylogenetic analysis.

## PENDAHULUAN
Macaca  merupakan  salah  satu  dari Genus Primata yang mempunyai penyebaran sangat  luas.  Ada  sekitar  20  jenis  yang tersebar  mulai  dari  gurun  pasir  di  Afrika, hutan  tropis  Asia,  hingga  pegunungan  salju di  Jepang  (Supriatna  dan  Wahyono,  2000). Macaca  nigra termasuk  diantara  monyet Sulawesi  yang  terbesar.  Hewan  ini  adalah
salah satu jenis satwa liar Ordo Primata yang tergolong  langka  dan  endemik  di  Sulawesi Utara (Whitten et al. , 1987). Kebanyakan M. nigra ditemukan  di  dalam  daerah  yang dilindungi  (kawasan  lindung).  Dalam  daftar yang dikeluarkan IUCN, M. nigra digolongkan  sebagai  satwa  hampir  punah ( Endangered) dan dicantumkan dalam Apendix II CITES (Supriatna dan Wahyono, 2000).
Keberadaan M. nigra semakin berkurang  dan  terancam  punah  disebabkan oleh berbagai alasan, diantaranya yaitu lewat perburuan, perdagangan, pemberantasan hama  pertanian,  pemeliharaan  di  kandang, dan  lain  sebagainya.  Populasi  kecil  lebih rentan  pada  sejumlah  efek  genetik  yang merugikan, sehingga hewan tersebut
mengalami penurunan kemampuan berevolusi atau adaptasinya pada lingkungan yang  berubah.    Konservasi  keragaman genetik  dalam  suatu  populasi  merupakan salah  satu cara untuk tetap mempertahankan keberadaan  suatu  populasi  di  alam.  Suatu populasi  dapat  beradaptasi  dengan  baik terhadap perubahan yang terjadi di lingkungan  sekitar  disebabkan  oleh  adanya keragaman genetik. Keragaman genetik turut menentukan keberhasilan konservasi populasi.  Oleh  karena  itu,  usaha-usaha konservasi perlu dilakukan
untuk pencegahan  kepunahan  yang  lebih  cepat pada M. nigra .
Filogenetik  adalah  studi  tentang hubungan  antara  organisme  berdasarkan kekerabatan  satu  sama  lain,  penelusuran hubungan  evolusi,  sejarah  kehidupan  suatu spesies  (Brown,  2002).  Analisis  dilakukan untuk menduga atau mengestimasi hubungan evolusioner.  Pendugaan  sejarah  evolusioner berdasarkan analisis filogenetik yang dilakukan  biasanya  digambarkan  dalam diagram yang menyerupai pohon bercabang. Salah  satu  gen  mitokondria  yang  dapat digunakan  untuk  membantu  konstruksi  dari pohon  filogeni  adalah  dengan  menggunakan gen  COI (Cytochrome  c  oxidase  I) yang bertindak  sebagai  gen  marker  (Li et  al .,
2011).  Penelitian  ini  dilakukan  dengan tujuan menganalisis variasi sekuens intraspesies  gen  COI  dan  mengkonstruksi pohon  filogenetik M.  nigra dengan  kerabat dekatnya di GenBank.

## METODE PENELITIAN

## Ekstraksi DNA
Proses  ekstraksi  DNA  dilakukan menggunakan  metode spin-column  based dengan  menggunakan Axyprep  Multisource Genomic  DNA  miniprep  kit (Axygen)  yang dimodifikasi  berdasarkan  Kolondam  (2012). DNA  mitokondria  diekstrak  dari  darah M. nigra yang diperoleh dari Pusat
Penyelamatan Satwa Tasikoki (PPST) Bitung. Penelitian dilaksanakan pada September hingga Desember 2016.

## Amplifikasi  Gen  COI  dengan  Metode PCR dan Sekuensing
Primer  Gen  COI  universal  yang digunakan  adalah  LCO1490  (5’-GGT  CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’) dan HCO2198  (5’-TAA  ACT  TCA  GGG  TGA CCA  AAA  AAT  CA-3’)  (Folmer et  al. , 1994).  Amplifikasi  gen  COI  dilakukan  di dalam  40  µL  reaksi  PCR  menggunakan  2x KapaTaq PCR MasterMix.  Komponen yang dicampur  yaitu  20  µL  2X KapaTaq, 1,5µL primer forward, 1,5µL primer reverse,  2  µL templat  DNA,  dan  15  µL    ddH 2 O  (air terdeionisasi) untuk satu kali reaksi. Pengaturan suhu untuk mesin PCR TPersonal (Bimetra) dimulai dengan denaturasi  awal    ( initial  denaturation )    pada suhu  95˚C  selama  3  menit  yang  kemudian dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri atas tahap denaturasi (95˚C, 30 detik), penempelan  primer  (50˚C,  40  detik),  dan ekstensi  DNA  (72˚C,  50  detik)  seperti  yang telah  dilakukan  oleh  Kolondam  (2015). Produk  PCR  dikirim  bersama  pasangan primernya  untuk  proses  sekuensing.  Semua proses  termasuk  PCR clean  up (ekstraksi DNA  dari  gel)  dilakukan  oleh  penyedia  jasa sekuensing 1 st BASE  Malaysia .  Sekuensing dilakukan  dua  kali  dari  arah  yang  berbeda, sesuai dengan primer yang tersedia.

## ANALISIS DATA
Hasil sekuensing yang diperoleh dari perusahaan  penyedia  jasa  sekuensing 1 st BASE  Malaysia berupa  kromatogram  DNA disunting  menggunakan  Geneious  v5.6 (Drummond et al., 2012). DNA bagian awal dan  akhir  dihapus  sepanjang  kurang  lebih 30bp.  Proses reverse  and  complement dilakukan  untuk  hasil  sekuensing  yang menggunakan  primer  reserve,  kemudian dipadukan  dengan  hasil  sekuensing  primer forward  menggunakan  MUSCLE  ( Multiple Sequence  Comparison  by  Log-Expectation) yang terintegrasi dalam Geneious (Kolondam, 2015). Sekuens kemudian diubah  dalam  bentuk  format  FASTA  ( Fast Alignment )  untuk  dibandingkan  dengan sekuens  kerabat  terdekat  yang  diambil  dari GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov ) .
Penjajaran  sekuens  DNA  dan  semua  gap menggunakan multalin V.5.4.1 (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)
yang  dikembangkan  oleh  Corpet  (1998). Pembentukan  pohon  filogenetik  dibuat berdasarkan  BOLD System dan  untuk perhitungan jarak  genetik digunakan metode Kimura’s  2-parameter pada  MEGA7  yang dikembangkan  oleh  Tamura et  al.  ( 2013) (Kairupan, 2015).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pasangan  primer  LCO1490  dan HCO2198 yang digunakan berhasil mengamplifikasi ke-4 sampel M. nigra yang digunakan  dalam  penelitian  ini,  tetapi  dari ke-4  sampel  hanya  terdapat  2  sampel  yang menunjukkan  hasil  yang  baik  yaitu  DNA sampel  FE3  dan  FE4.    Sampel  DNA  yang berhasil  diamplifikasi  memperlihatkan  hasil pola pita yang terlihat jelas, sedangkan untuk sampel  DNA  FE1  dan  FE2  memperlihatkan hasil  pola  pita  yang  samar  dikarenakan konsentrasi  yang  tidak  memadai  sehingga tidak  bisa  dilakukan  analisis  selanjutnya. Profil  DNA  hasil  amplifikasi  gen  COI disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1. Visualisasi hasil amplifikasi fragmen gen COI dari sampel M. nigra .
DNA ladder 1kb  dibuat  sebagai pembanding sehingga dapat diketahui panjang fragmen DNA sampel yang teramplifikasi.  Panjang  gen  COI  dari  ketiga sampel M.  nigra yang  berhasil  diamplifikasi berada  pada  ukuran  mendekati  pita  750  bp daripada  500  bp.  Hal  ini  sesuai  dengan perkiraan panjang pita DNA yang
teramplifikasi  melalui  PCR  yaitu  sepanjang 709 bp.
Multiple  alignment dua  sekuens sampel M. nigra dikerjakan dengan menggunakan  Geneious  v5.6.4.  Proses penyuntingan  sekuens  fragmen  DNA  ini dimulai  dengan  penghapusan  urutan  DNA pada bagian ujung. Tujuan dari penghapusan urutan sekuens awal adalah untuk mendapatkan  bagian  inti  ( core  region) , keakuratan  yang  sesuai  dalam  pengolahan data, memudahkan penjajaran dan mengurangi  resiko  salah  pembacaan  ketika pembuatan  pohon  filogenetik.  Panjang  rata- rata  pita  yang  teramplifikasi  pada  kedua sampel  adalah  709  bp,  setelah  proses penghapusan, didapatkan daerah inti sekuens DNA  sampel  dengan  panjang  631  bp. Penjajaran sekuens dilakukan dengan Multalin v5.4.1.
Hasil  penjajaran  kedua  sampel M. nigra dengan  menggunakan  Multalin  v5.4.1 (Corpet, 1988), menunjukkan  adanya variasi intraspesies  pada  kedua  sampel M.  nigra (Gambar 2). Variasi basa nukleotida terdapat 10  titik  pada  gen  COI  yang  berada  pada urutan  basa  nomor  7,  58, 73,  148,  316,  358, 401, 406,  472 dan 583.
Variasi  basa  nukleotida  yang  terjadi pada  situs-situs  tersebut  disebabkan  karena adanya substitusi basa nukleotida. Perubahan basa  yang  terjadi  berupa  substitusi  transisi dan  transversi.  Transisi  adalah  perubahan antar  basa  A  (Adenin)  dan  G  (Guanin)  atau purin,  atau  antar  basa  C  (Sitosin)  dan  T (Timin)  atau pirimidin, sedangkan transversi adalah  perubahan  antara  suatu  basa  purin dengan  suatu  basa  pirimidin.  Di  antara substitusi  ini,  substitusi  transisi  paling banyak ditemukan daripada substitusi transversi. Hal ini disebabkan karena transisi bertukar  basa  nukleotida  dari  bentuk  yang sama,  sedangkan  transversi  pertukaran  dari bentuk  yang  berbeda.  Secara  khusus,  A (Adenin)  dan  G  (Guanin)  memiliki  dua cincin,  sementara  C  (Sitosin)  dan  T  (Timin) memiliki  satu  cincin.  Substitusi  transisi ditemukan  sebanyak  sepuluh  titik  pada  basa nukleotida  sedangkan  substitusi  transversi hanya  terdapat  satu.  Cracraft  dan  Helm- Bychowski (1991) menyatakan bahwa kecepatan  transisi  pada  mtDNA  vertebrata lebih  tinggi  daripada  transversi,  dan  adanya perubahan  komposisi  basa  atau  substitusi
pada kodon posisi ketiga lebih umum terjadi dibandingkan posisi pertama dan kedua. Pembacaan  urutan  nukleotida frame  2 menunjukkan  tidak  ada  perbedaan  asam amino  yang  dikode.  Peristiwa  ini  disebut mutasi  sinonim  yaitu  mutasi  pada  basa nukleotida tetapi tidak menyebabkan terjadinya perubahan asam amino. Mutasi ini menghasilkan  asam  amino  yang  sama meskipun  terdapat  variasi  basa  nukleotida
pada  urutan  sekuens  (Widodo et  al .,  2003).
Kandungan
GC digunakan untuk menentukan  bahwa  sekuens  COI  dalam penelitian  merupakan  DNA  mitokondria (mtDNA) bukan pseudogen. Geneious v5.6.4 menampilkan  hasil  dari  kandungan  GC untuk  sampel  FE  yaitu  46,1%,  sementara untuk sampel FE4 yaitu 45,0%.

## Gambar 2. Hasil penjajaran sekuens menggunakan Multalin v5.4.1.
Kandungan  GC  pada  vertebrata  40- 45%  (Sueoka,  1962).  Kandungan  GC  untuk mamalia  berkisar  diantara  35%-60%  untuk genom,  akan  tetapi  Vanyushin  dan Kirnos (1977)  mengungkapkan  bahwa  konsentrasi kandungan GC yang ada di DNA mitokondria  (mtDNA)  dengan  DNA  inti (nDNA)  tidak  berbeda  nyata.  Oleh  karena itu,  nilai  kisaran  kandungan  GC  untuk genom  mamalia  dapat  digunakan  sebagai acuan. Dengan demikian menandakan bahwa sekuens COI dalam penelitian ini merupakan mtDNA, bukan pseudogen.
Gambar 3. Hasil Penjajaran sekuens M.  nigra dengan keraat dekatnya menggunakan program Multalin v5.4.1
Gambar 4a. Pohon filogeni sampel M. nigra FE4 yang dikonstruksi dengan BOLD TaxonID Tree. Keterangan: Unknown specimen = Sampel FE4.
Gambar 4b. Pohon filogeni sampel M. nigra FE3 yang dikonstruksi dengan BOLD
TaxonID Tree Keterangan: Unknown specimen = Sampel FE3
Sekuens  fragmen  DNA  yang  telah disunting  diubah  ke  dalam  bentuk  FASTA untuk  dibandingkan  dengan  sekuens  kerabat
terdekatnya  dari  GenBank  menggunakan metode  BLAST.  Dua  belas  sampel  kerabat dekatnya yang diambil di GenBank
kemudian  dibuat  penjajaran  sekuensnya menggunakan Multalin v5.4.1 (Gambar 3).
Hasil  penjajaran  sampel  dengan kerabat  dekatnya  memperlihatkan  banyak variasi  pada  basa  nukleotida.  Pembacaan urutan  nukleotida  dengan  menggunakan frame  2 menunjukkan  terdapat  banyak variasi  asam  amino  yang  dikode,  ditemukan 21  situs  yang  disebabkan  oleh  mutasi nonsinonim  dan  yang  lainnya  mutasi sinonim.  Mutasi  nonsinonim  adalah  mutasi yang  menyebabkan  terjadinya  perubahan asam  amino.  Variasi  yang  terjadi  pada  basa nukleotida  disebabkan  oleh  adanya  mutasi. Mutasi  menjadi  penyebab  utama  perbedaan variasi  basa  nukleotida  pada  gen  COI. Variasi  yang  kecil  dapat  mempengaruhi keidentikan  suatu  spesies  dan  bahkan  dapat mempengaruhi  susunan  asam  amino  yang mengkodekan protein (Mattern et al, 2009). Pohon filogeni dikonstruksi menggunakan  BOLD  TaxonID Tree dan jarak genetik menggunakan metode Kimura- 2-parameter yang  terintegrasi  di  dalam piranti  lunak  MEGA7.  Pohon  filogeni sebelumnya dikonstruksi menggunakan MEGA7 yang dikembangkan oleh Tamura et al. (2013), tetapi hasil yang didapatkan tidak sesuai  dengan  yang  diharapkan  karena sekuens M. nigra yang ada di database tidak berada dalam  satu  klaster dengan sampel M. nigra dalam  penelitian  ini.  Pohon  filogeni yang  dikonstruksi  dengan  BOLD  TaxonID Tree ini  menunjukkan  hasil  sekuens  sampel M.  nigra berada  dalam  satu  klaster  dengan sekuens M.  nigra yang  ada  di database . Pohon filogeni disajikan pada Gambar 4. Kladogram menunjukkan bahwa
sampel M. nigra FE3 dan FE4 masih berada
dalam satu klaster dengan M. nigra yang ada di database . Unknown  specimen pada kladogram  (Gambar  4a  dan  Gambar  4b) merupakan sampel M. nigra yang digunakan dalam penelitian. Sampel M. nigra termasuk ke  dalam  kelompok  Silenus.  Anggota  dari klaster ini sebagian besar merupakan Macaca Sulawesi.  Hasil  penelitian  Li et  al. (2009), mengungkapkan bahwa genus Macaca terbagi  atas  empat  kelompok  monofiletik yaitu  kelompok  Sinica,  Sylvanus,  Silenus dan  Fascicularis.  Macaca  Asia  termasuk kedalam kelompok Silenus, dimana kelompok  Silenus  ini  memiliki  anggota M. nigra,  M.  silenus dan M.  nemestrina .  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa M.  nigra paling berkerabat dekat dengan M. nemestrina. Evans et al. (1999), mengungkapkan  bahwa  beberapa  halotipe dari M.  nemestrina memiliki  hubungan kekerabatan  dengan  Macaca  yang  berasal dari  Sulawesi  bagian  utara  hingga  Sulawesi bagian  tengah  dan  sebagian  lagi  memiliki hubungan  kekerabatan  dengan  Macaca  yang berada  di  Sulawesi  bagian  selatan,  sehingga memungkinkan  jika M.  nigra dan M. nemestrina masih  berada  dalam  satu  klaster monofiletik di pohon filogeni.
Jarak genetik dihitung menggunakan metode Kimura-2-parameter yang terintegrasi  di  dalam  piranti  lunak  MEGA7. Analisis  jarak  genetik  merupakan  analisis berdasarkan  penghitungan  matriks  dari “jarak”  antar  pasangan  basa  antara  sekuens yang  mendekati  jarak  evolusioner  (Dowell, 2005).  Jarak  genetik  dari  masing-masing sampel  pada  pohon  filogenetik  disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Jarak genetik sampel M. nigra dengan kerabat dekatnya menggunakan analisis Kimura-2-parameter dalam MEGA7 FE3
FE4 0.016 JF444310.1_Macaca_sylvanus 0.095  0.091 KJ567057.1_Macaca_silenus 0.059  0.059  0.124 KJ567058.1_Macaca_tonkeana 0.077  0.069  0.122  0.101 KJ690297.1_Macaca_arctoides 0.038  0.045  0.086  0.086  0.105 KJ690321.1_Macaca_nemestrina 0.016  0.026  0.084  0.062  0.084  0.028 KP330231.1_Macaca_leonina 0.069  0.066  0.122  0.023  0.111  0.094  0.069
Jarak genetik antara sampel FE3 dan FE4 yaitu 0.016, nilai jarak ini menunjukkan adanya  variasi  intraspesies.  Kisaran  nilai jarak genetik untuk
membedakan intraspesies  pada  mamalia  menurut  Tobe et al. (2010)  yaitu  antara  0,015-0,025.  Nilai jarak  genetik  FE3  dan  FE4  masih  tergolong dalam  kisaran  variasi  intraspesies.  Semakin besar nilai jarak genetik (p-distance) diantara suatu  populasi  atau  individu,  semakin terisolasi  antara  satu  dengan  lainnya.  Jarak genetik  menunjukkan  kemungkinan  adanya pengaruh  isolasi  geografis  terhadap  suatu populasi  (Schmitt  dan  Haubrich,  2008). Analisis berdasarkan jarak genetik menunjukkan  bahwa  sampel  FE3  dan  FE4 yang  menjadi  sampel  dalam  penelitian  ini termasuk  spesies  yang  sama  yaitu M.  nigra memiliki  perbedaan  jarak  genetik  dengan nilai  1,6%    artinya  terdapat  variasi intraspesies  pada  sampel  yang  disebabkan karena adanya mutasi.
Nilai  jarak  genetik  untuk  sampel FE3  dan  FE4  sama  dengan  jarak  genetik untuk  sampel  FE3  dan M.  nemestrina .  Nilai jarak  genetik  antara  FE3-FE4  dan  FE3- M. nemestrina yaitu 0,016 artinya rata-rata jarak genetik  secara  keseluruhan  sebesar  1,6% menunjukkan  bahwa  dari  panjang  sekuens 631  bp  hanya  ada  10  nukleotida  yang berbeda.  Posisi  perbedaan  basa  nukleotida itu  berbeda  dalam  sekuens  meskipun  jarak genetik  antara FE3-FE4  dan  FE3- M.
nemestrina memiliki nilai yang sama.

## KESIMPULAN
1. Sekuens  gen  COI  sampel Macaca  nigra
FE3  dan  FE4  menunjukkan  adanya variasi  intraspesies.  Variasi  ditunjukkan dengan adanya perbedaan 10 pasang basa nukleotida  pada  urutan  sekuens  sampel dilokasi yang berbeda.
2. Macaca  nigra sampel  penelitian  berada satu  klaster  dengan Macaca  nigra yang terdapat  di  database  dan  termasuk kedalam kelompok Silenus.

## DAFTAR PUSTAKA
Brown,  T.A.  2002.  Genomes  2 nd .  Magdalen Road,  Oxford,  UK:  BIOS  Scientifict Publisher Ltd.
Corpet, F. 1998. Multiple Sequence Alignment with Hierarchical Clustering. NUCL.  Acids  res. 16(22): 10881-10890.
Cracraft,  J.  and  K.  Helm-Bychowski.  1991. Parsimony and Phylogenetic Inference Using DNA Sequences: Some Methodological Strategies . In Phylogenetic Analysis of DNA
Sequences.  M.  Miyanmoto  and  J. Cracraft  (Eds.).  Oxford  Univ.  Press, New York.
Dowell,  K.  2005. Molecular  Phylogenetics an  Introduction  to  Computational Methods  and  Tools  for  Analyzing Evolutionary Relationships . Math 500: 1-19.
Drummond, A.J., B. Ashton., S. Buxton., M. Cheung.,  A.  Cooper.,  C.  Duran.,  M. Field.,  J.  Heled.,  M.  Kearse.,  S. Markiwitz.,  R.  Moir.,  S.  Stones- Havas.,  S.  Sturrock.,  T.  Thierer.,  dan A.  Wilson.  2012. Geneious  v5.6 .
Biomatters. New Zealand.
Evans,  B.J.,  J.C,  Morales.,  J.  Supriatna  dan D.J,  Melnick.  1999.  Origin  of  the Sulawesi  macaques  (Cercopithecidae: Macaca) as suggested by mitochondrial DNA phylogeny.
Biological  Journal  of  the  Linnean Society 66: 539–560.
Folmer,  O.,  M.  Black.,  W.  Hoeh.,  R.  Lutz dan  R.  Vrijenhoek.  1994.  DNA primers for  amplification  of  mitochondrial cytochrome  c  oxidase  subunit  I  from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and
Biotechnology 3(5): 294-299. Kairupan,  C.F.  2015.  Variasi  Genetik Troides Helena (Lepidoptera:
Papilionidae)  Berdasarkan  Gen  COI (Cytochrome  C  Oxidase)  [Skripsi]. Jurusan Biologi UNSRAT Manado.
Kolondam,  B.J.  2012.  Barcode  DNA  rbcl dan matK  Aglaonema ( Aglaonema sp.), Anthurium  Gelombang  Cinta ( Anthurium  plowmanii )  dan  Anggrek Payus Limondok ( Phaius tancarvilleae ) [tesis]. Program Pascasarjana UNSRAT Manado.
Kolondam,  B.J.  2015.  Applying  matK  gene for  identification  of  liliopsida  plant species  from  North  Sulawesi  through Bold System. International Journal of Applied  Biology  and  Pharmaceutical Technology. 6 (2): 242-245. Li,  J.,  K.  Han.,  J.  Xing.,  K.  Heui-Soo.,  J.
Rogers.,  O.A  Ryder.,  T.  Disotell.,  B.
Yue dan M.A, Batzer. 2009. Phylogeny of the Macaques (Cercopithecidae: Macaca )  Based  on Alu Elements. Gene 15:448(2): 242-
249.
Li,  C.,  M.  Wang,  F.  Cheng,  dan  S.  Sun.
2011.  DNA  Barcoding  and Its Application  to  Marine  Zooplankton Ecology. Biodiv. Sci . 19(06): 805-814.
Mattern,  A.,  Desender,  K.,  Drees,  C., Gaublomme,  E.,  Paill,  W.,  dan Assmann,  T.  2009. Genetic  Diversity and  Population  Structure  of  thr Endangered  Insect  Species Carabus variolosus in  its  Western  Distribution Range : Implications for Concervation.
Concerv Genet.
Schmidt,  H.  2003. Phylogenetic  Trees  from Large Datasets. Inaugural- Dissertation , Dusseldorf University.
Sueoka,  N.  1962.  On  the  Genetic  Basis  of Variation  and  Heterogeneity  of  DNA
Base  Composition. Genetics 48: 589-
592.
Supriatna,  J.,  dan  E.H  Wahyono.  2000. Panduan  Lapangan Primata  Indonesia. Yayasan Obor Indonesia. Jakarta.
Tamura,  K.,  Stecher,  G.,  Peterson,  D.,
Filipski, A., Kumar, S. 2013. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis  Version  7.0. Molecular
Biologi  and  Evolution 30(12): 2725-
2729.
Tobe,  S.S.,  A.C,  Kitchener  dan  A.M.T,
Linacre. 2010. Reconstruction Mammalian  Phylogenies:  A  Detailed Comparison of the Cythochrome b and
Cythochrome Oxidase  Subunit I
Mitochondrial  Genes. PLOS  One Journals.
Vanyushin,  B.F  dan  Kirnos.  1977.  The Structure  of  Animal  Mitochondrial DNA  (Base  Composition,  Pyrimidine Clusters,  Character  of  Methylation). Mol Cell Biochem 14(1-3): 31-36.
Whitten,  A.J.,  M.  Mustafa  dan  J.B. Henderson.  1987.  Ekologi  Sulawesi.
Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
Widodo, A., L, Mohammad dan Umie. 2003. Evolusi. Malang: UM Press.