## TOKSISITAS  SUBKRONIS TIMBAL (Pb) DALAM LIMBAH PADAT IPAL INDUSTRI KERTAS TERHADAP KARAKTERISTIK DARAH TIKUS Rattus norvegicus
Rina S. Soetopo * ;  Ahmad Ridwan**;  Suripto**
* Peneliti kelompok lingkungan Balai Besar Pulp dan Kertas; ** Dosen pengajar di Departemen biologi ITB

## SUBCHRONIC TOXICITY OF LEAD (Pb) IN PAPER INDUSTRY SOLID  WASTE  TO BLOOD CHARACTERISTICS  OF  RAT Rattus norvegicus

## Abstract
The  primary  environmental  problem  associated  with  open  dumping  solid  waste  disposal  is  the leachate potency to contaminates ground and surface waters.   Paper industry solid waste using mixture raw  material  with  deinked pulp  is contaminated by  heavy  metals.    One  of the heavy  metals is  lead  (Pb) which is dominant in waste. The effects of  subchronic toxicity of paper solid waste to blood characteristics of rat ( Rattus norvegicus ) have been done. Solid waste extract was administered to each individual rat by gavage through gastrointestinal tract at three different doses (350; 2500 and 5000 mg/kg body weight/day) and also positif control (0,5; 5,0; 50; 500; 5000 µg/kg body weight/day) and negatif control (water) daily during 90 days period.
Results  showed  that  subchronic  toxicity  effect  of  lead  in  5000  μg/kg  body  weight/day  of  paper industry  solid  waste  caused  reduction  to  blood δ -ALA-D    activities,  hemoglobin  concentration  and hematocrit value, but it was still in normal ranges.

## Key words : solid waste, blood ALA-D activities, blood characteristic, blood lead

## Intisari
Masalah  lingkungan  yang  utama  dari  pembuangan  limbah  padat  industri  kertas  secara  open dumping adalah berpotensi mencemari air permukaan dan air tanah. Beberapa jenis logam berat terdapat dalam limbah padat industri kertas yang menggunakan bahan baku campuran dengan deinked pulp. Salah satu dari logam berat tersebut adalah timbal yang keberadaannya dalam limbah cukup tinggi. Penelitian toksisitas  subkronis  limbah  padat  industri  kertas    terhadap  hewan  percobaan  tikus  (Rattus  norvegicus) telah dilakukan. Variasi perlakuan percobaan terdiri dari tiga perlakuan dosis ekstrak limbah yaitu 350; 2500 dan 5000 mg/kg berat badan/hari dan 5 dosis timbal nitrat sebagai kontrol positif  yaitu 0,5; 5,0; 50; 500; 5000 μg/kg berat badan/hari serta kontrol negatif yang hanya mengandung air pelarut.
Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  pengaruh  toksisitas  subkronis  ekstrak  limbah  sludge  IPAL industri  kertas  dosis  5000  mg/kg  bb/hari  menyebabkan  penurunan  aktivitas  δ-ALA-D  darah    dan konsentrasi  hemoglobin  serta  nilai  hematokrit,  tetapi    penurunan  tersebut  masih  dalam  batas  normal karakteristik darah tikus.
Kata kunci : limbah padat, aktivitas ALA-D darah, karakteristik darah, timbal  dalam darah

## PENDAHULUAN
Saat  ini  industri  kertas  di  Indonesia  di- hadapkan  pada  masalah  penanganan  dan  pe- ngelolaan  limbah  padat  yang  merupakan  hasil samping  dari  Instalasi  Pengolahan  Air  Limbah (IPAL).  Jumlah  limbah  padat  yang  dihasilkan cukup besar berkisar antara 3 - 4 % dari kapasitas produksinya 19) .    Penanganan  dan  pengelolaan limbah  padat  IPAL  industri  kertas  umumnya dibuang  secara open  dumping dilokasi  sekitar pabrik. Pembuangan limbah secara open dumping
tersebut  berpotensi  terjadi  pencemaran  air  per- mukaan dan  air  tanah 5) .
Limbah  padat  IPAL  industri  kertas  yang  dalam proses  produksinya  menggunakan  proses deinking , umumnya mengandung logam pada konsentrasi yang cukup  tinggi,  sehingga  berdasarkan  Peraturan Pemerintah No. 18 dan perubahannya No. 85 Tahun 1999 diklasifikasikan  sebagai  Bahan  Berbahaya dan Beracun  (B3)  dari  sumber  yang  spesifik.  Di  dalam peraturan tersebut dinyatakan bahwa penentuan sifat racun  untuk  identifikasi  limbah,  dilakukan  dengan uji TCLP ( Toxicity Characteristic Leaching
Procedure )  dan  uji  toksikologi.  Uji  TCLP dilakukan untuk menentukan besarnya aliran atau pergerakan  kontaminan  yang  terkandung  dalam limbah  cair,  padat  maupun  multifase 26) dan    uji toksikologi  dilakukan  untuk  mengetahui  efek toksik limbah terhadap mahluk hidup 24) .
Data analisis TCLP limbah padat IPAL dari 9 industri  kertas    yang  melakukan  proses deinking menunjukkan  bahwa  beberapa  pencemar  logam non  esensial  terdapat  di  dalamnya.  Konsentrasi logam  timbal  merupakan  yang  tertinggi  dengan nilai maksimum 0,900 ppm, sedangkan konsentrasi  maksimum  logam  non  esensial lainnya  adalah  kadmium  0,220  ppm,  kromium 0,170  ppm  dan  arsen  0,020  ppm 19) .  Logam  non esensial  yang  dimaksud  dalam  artikel  ini  adalah logam  logam  yang tidak diperlukan  dalam  tubuh organisme,  sehingga  keberadaannya  dalam  tubuh dapat menyebabkan dampak negatif.
Senyawa timbal dapat masuk ke dalam tubuh manusia  dan  hewan  mamalia  melalui  saluran pencernaan  dan  saluran  pernafasan 24) .  Timbal masuk  ke  dalam  saluran  pencernaan  bersama dengan  makanan  dan  minuman  yang  di- konsumsi 27) . Pada sistem peredaran darah, timbal dapat mengganggu biosintesis heme dalam sistem hematopoetik 24) .  Timbal  menghambat  beberapa aktivitas  enzim  yang  berperan  di  dalam biosintesis  heme.  Salah  satunya  adalah  enzim delta aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) yang  merupakan  enzim  yang  paling  sensitif terhadap  timbal 12) .  Selain  itu  gangguan  timbal menyebabkan  pula  rapuhnya  sel  eritrosit  yang berakibat  memperpendek  umur  sel  eritrosit  serta mempengaruhi pembentukan retikulosit.
Sampai  saat  ini,  pengaruh  timbal  yang terkandung  dalam  limbah  padat  IPAL  industri kertas  terhadap  hewan  mamalia  belum  banyak diteliti.  Atas  dasar  hal  tersebut  di  atas,  laporan penelitian  ini  menjelaskan  pengaruh  timbal  yang terkandung  dalam  limbah  padat  IPAL  industri kertas  terhadap  beberapa  aspek  fisiologis  tikus ( Rattus norvegicus ) yang meliputi laju pertambahan  berat  badan,  konsentrasi  timbal dalam  darah,  karakteristik  darah  yang  meliputi jumlah  sel  darah  merah,  nilai  hematokrit  dan konsentrasi  hemoglobin  serta  aktivitas  enzim  δ- ALA-D darah  dalam biosintesis heme.

## Tinjauan  pustaka

## Sumber logam berat dalam limbah padat
Industri  kertas  yang  dalam  proses  produksinya melibatkan  proses deinking dari  bahan  baku  kertas bekas  akan  menghasilkan  limbah  padat  yang mengandung logam berat non esensial seperti timbal, kadmium,  kromium  dan  arsen 5). .  Keberadaan  logam tersebut  di  dalam  limbah  padat  IPAL,  berasal  dari tinta  percetakan  yang  menempel  pada  kertas  bekas yang  digunakan  sebagai  bahan  baku  untuk  industri kertas. Logam-logam tersebut terikat dalam senyawa kompleks logam-DTPA, dimana DTPA ( Diethylene- triaminepentaacetic  Acid )  adalah  suatu bahan  kimia yang  ditambahkan  pada  proses deinking .  Selain berasal  dari  tinta  percetakan,  logam  tersebut  dapat juga  berasal  dari clay  filler dan coatin 22) .  Beberapa jenis logam yang terdapat dalam limbah padat IPAL industri  kertas  yang  menggunakan  proses deinking adalah  Fe,  Ni,  Cd,  Pb,  Cu,  Cr,  Al,  Ba,  Co,  Hg,  Zn dan Mn 22) .

## Pengaruh timbal terhadap kehidupan
Di  alam,  timbal  tidak  dapat  terdegradasi,  se- hingga  akan  terakumulasi  dan  menjadi  bahan  pen- cemar  yang  dapat  membahayakan  kelangsungan hidup manusia dan mahluk hidup lainnya. Masuknya timbal  ke  dalam  tubuh  sangat  dipengaruhi  oleh banyak  faktor,  di  antaranya  adalah  jalur  masuknya timbal ke dalam tubuh dan sifat kimia timbal 1) . . Jalur masuk  timbal  ke  dalam  tubuh  manusia  dan  hewan mamalia  dapat  melalui  saluran  pernafasan  dan saluran pencernaan 24) .
Timbal  dapat  masuk  dalam  tubuh  melalui saluran  pencernaan  bersama  dengan  makanan  dan minuman  yang  dikonsumsi  yang  kemudian  akan diabsorbsi  di  dalam  usus  halus 15) .  Laju  absorbsi dipengaruhi  oleh  kondisi  fisiologi  individu  yang meliputi  umur,  status  nutrisi  dan kondisi  puasa  atau tidak.  Absorbsi  timbal  pada  anak-anak  lebih  tinggi dari pada orang dewasa. Pada anak  umur 2 minggu sampai  8  tahun  sekitar  40-50%  timbal  yang  masuk ke  dalam  tubuh  dapat  diabsorbsi  di  usus  halus 30) . Pada orang dewasa yang tidak dalam kondisi puasa, hanya  sekitar  10%  timbal  yang  masuk  ke  dalam tubuh  dapat  diabsorbsi  di  usus  halus 29) ,  tetapi  pada orang  dewasa  dalam  kondisi  puasa,  sekitar  60-80% timbal yang masuk ke dalam tubuh dapat diabsorbsi usus  halus 15) .
Berdasarkan  bentuk  senyawanya,  sifat  kimia timbal  dapat  dibedakan  dalam  dua  bentuk  yaitu senyawa  anorganik  dan  senyawa  organik. Beberapa senyawa timbal anorganik adalah timbal klorida, timbal asetat, timbal nitrat, timbal sulfida, timbal  fosfat  dan  timbal  oksida 1) .  Senyawa timbal  anorganik  bersifat  hidrofil,  sehingga  sulit menembus  membran  sel.  Di  dalam  lambung  dan usus  halus,  absorbsi  timbal  anorganik  tergantung pada senyawa kimia nutrisi yang ada di dalamnya 27) .  Lain  halnya  dengan  senyawa  timbal  organik yang  umumnya  bersifat  lipofil,  sehingga  lebih mudah menembus  membran  sel dan dapat masuk ke  dalam  sistem  peredaran  darah.  Terdapat beberapa  garam  timbal  yang  dibentuk  dengan asam organik, di antaranya adalah tetraetil-timbal (Et 4 Pb)  dan  tetrametil-timbal  (Me 4 Pb).  Timbal organik  mempunyai  daya  toksik  yang  jauh  lebih besar  dibanding dengan timbal anorganik 8) .
Timbal  yang masuk  ke  peredaran  darah  akan didistribusikan  ke  seluruh  tubuh  dan  akan berikatan  dengan  reseptor  sel  dari  organ  target. Akumulasi  timbal  dalam  tubuh  dapat  terjadi dalam darah, jaringan organ tubuh dan tulang 12) . Dari  timbal  yang  dapat  diabsorbsi  masuk  ke peredaran  darah,  sekitar  99%  terdapat  dalam  sel eritrosit 1) .  Akumulasi  timbal  pada  sel  eritrosit tersebut  dapat  menyebabkan  sel  menjadi  rapuh dan  umur  sel  menjadi  lebih  singkat  serta berpengaruh pada pembentukan retikulosit. Selain itu  juga  mengganggu  aktivitas  enzim  δ-ALA-D darah dalam sintesis heme 7) .

## Aktivitas δ-ALA-D darah
Heme  disintesis  dari  glisin  dan  suksinil koenzim  A,  dengan  piridoksal  fosfat  sebagai kofaktor (12) .  Timbal  yang  berada  dalam  darah dapat  mengganggu  biosintesis  heme.  Heme merupakan  komponen  utama  dari  hemoglobin yang  dibentuk  dalam  sistem  hematopoetik. Timbal  dalam  sistem  peredaran  darah  dapat mengganggu  beberapa  enzim  yang  berperan dalam  biosintesis  heme  dan salah  satunya  adalah enzim  δ-ALA-D 7;  12) .  Enzim  δ-ALA-D  me- rupakan  enzim  yang    paling  sensitif    terhadap timbal  dan  berperan  pada  tahap  awal  dari biosintesis  heme  yaitu  mengkatalis  dua  molekul Aminolevulinic  Acid (ALA)  menjadi  satu  mol porfobilinogen 24) . Keberadaan timbal dalam darah dapat  menurunkan  aktivitas  δ-ALA-D  yang  akan menyebabkan terhambatnya pembentukan porfobilinogen dari substrat ALA 7; 12) .
Mekanisme  terhambatnya  aktivitas  δ-ALA-D darah  oleh  timbal  dengan  cara  menempelnya
timbal  pada  gugus  –SH  sebagai  sisi  aktif  dari molekul  enzim  δ-ALA-D  darah  dan  membentuk ikatan  kovalen  dengan  atom  sulfur 10) .  Reaksi  ikatan enzim δ-ALA-D darah dengan timbal adalah sebagai berikut :
2 E-SH + Pb +2 E-S-Pb-S-E + 2 H +

## BAHAN DAN METODA

## Bahan
Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium  Fisiologi Hewan,  Departemen  Biologi  ITB  Bandung  pada bulan  Maret  2004  -  Januari  2005.  Bahan  yang digunakan dalam  penelitian ini  adalah  limbah  padat IPAL yang berasal dari industri kertas. Dalam proses produksinya,  industri  kertas  tersebut  menggunakan bahan  baku  kertas  bekas  dan  melakukan  proses penghilangan  tinta  ( deinking )  terhadap  bahan  baku tersebut.
Hewan  percobaan  yang  digunakan  adalah  tikus ( Rattus  norvegicus )  jantan  galur  Wistar  berumur  4 minggu dengan berat badan rata-rata 79,88 ± 8,36 g. Tikus diperoleh dari Laboratorium Hewan Departemen  Biologi  ITB  Bandung.  Jumlah  tikus yang digunakan dalam percobaan ini adalah 90 ekor. Sebelum  digunakan  sebagai  hewan  percobaan, semua  tikus  diadaptasikan  selama  7  hari  di  dalam ruang percobaan. Suhu ruang percobaan berkisar 22 - 28 o C  dan  kelembaban  relatif  67  -  84  %.  Hewan diberi  pakan  dan  air  minum  secara  berlebihan  ( ad libitum ). Pakan  yang  diberikan  berupa  pelet CP 551 yang  diproduksi  oleh  PT  Charoen  Pokphand Indonesia.

## Metoda
Penelitian  dilakukan  dengan  menggunakan Rancangan  Acak  Kelompok  (RAK)  dengan  9 perlakuan yang terdiri atas 3 perlakuan dosis ekstrak limbah  dan  5  perlakuan  kontrol  positif    yang mengandung timbal  dan  kontrol  negatif  yang  hanya mengandung    pelarut  (air).  Jumlah  tikus  pada masing-masing  perlakuan  adalah  10  ekor.  Masing- masing  variasi  perlakuan tersebut  dapat  dilihat  pada Tabel 1.
Penentuan  3  variasi  perlakuan  dosis  ekstrak limbah  dilakukan  berdasarkan  nilai  LD 50 yang diperoleh  dari  uji  toksisitas  akut  yaitu  11000  mg/kg b.b  dan  pendekatan  dengan  menggunakan  formula Forbes 6) . Sedangkan  penentuan variasi dosis timbal sebagai  kontrol  positif,  berdasarkan  pada  kisaran konsentrasi  timbal  yang  terkandung  dalam  limbah padat IPAL industri kertas yang menggunakan bahan baku kertas bekas.                                          .

## Tabel  1 Variasi perlakuan dosis ekstrak limbah dan kontrol positif
Ket :  b.b: berat badan; A : dosis ( mg/kg b.b/hari ) ; B : kandungan timbal dalam ekstrak (μg )
Pemberian  perlakuan  dosis  limbah  dilakukan dalam bentuk ekstrak dan  perlakuan dosis timbal dalam  bentuk    larutan  senyawa  timbal  nitrat Pb(NO 3 ) 2 .  Pembuatan  ekstrak  limbah  dilakukan dengan metoda dingin dengan pelarut air. Seluruh dosis  perlakuan  diberikan  dengan  jarum gavage melalui lambung. Pemberian perlakuan dilakukan setiap  hari  selama  90  hari 18) dan  selama penelitian,  tikus  diberi  pakan  pelet  komersil  dan air minum  secara berlebihan.
Pengamatan dilakukan terhadap laju pertambahan  berat  badan  setiap 1  minggu  sekali; perubahan    fisiologis  tikus  yang  meliputi  analisis darah  setiap  2  minggu  sekali.  Parameter  darah yang  dianalisis  adalah  karakteristik  darah (konsentrasi  hemoglobin,  jumlah  sel  eritrosit  dan nilai  hematokrit)  dan  aktivitas  δ-ALA-D  darah serta  kandungan  timbal  dalam  darah.    Analisis timbal  dalam  darah  dan  aktivitas  -ALA-D dilakukan  dengan  metode  tanpa  HgCl 2 menurut Nakagawa 17) .  Penentuan  karakteristik  darah dilakukan  dengan  metode  teknologi  resistensi elektronik  dan volumetric  metering dengan instrumen hematology  analyzer  Cell  dyn 1700 yang  pelaksanaannya  dilakukan  di  Laboratorium klinik Prodia Bandung

## Teknik pengolahan data
Pengolahan  data  konsentrasi  timbal  dalam darah,  aktivitas  δ-ALA-D darah  dan karakteristik darah  dilakukan  dengan  menggunakan  analisis statistik.  Pengolahan  data  diawali  dengan  uji normalitas  dan  uji  homogenitas  dari  masing- masing  populasi  data.  Uji  normalitas  dilakukan dengan  metode  Kolmogorov-Smirnov  dan  uji homogenitas menurut  Mauchy 25) .
Data  yang  berdistribusi  normal  dan  homogen dianalisis  dengan  statistik  parametrik  ANOVA  dan terhadap  data  yang  tidak  berdistribusi  normal  dan atau  tidak  homogen  dianalisis  dengan  statistik  non parametrik  Kruskal  Wallis.  Terhadap  hasil  analisis yang  menunjukkan  adanya  perbedaan  yang  nyata ( p <0,05), dilanjutkan  dengan uji post hoc comparison dari  Tukey  pada  selang  kepercayaan 95% 25) .  Pengolahan  data  statistik  dari  seluruh  data dilakukan  dengan  menggunakan software statistik yaitu Statistical  Product  and  Service  Solutions (SPSS) series 10.0.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik  limbah dan ekstraknya
Limbah  dari  industri  kertas  yang  melakukan proses deinking , umumnya lebih banyak mengandung logam    timbal, kadmium,  tembaga dan kromium 5) .  Atas  dasar  hal  tersebut,  karakterisasi limbah  dibatasi  hanya  pada  empat  jenis  logam tersebut. Karakteristik  limbah dan ekstraknya dapat dilihat pada Tabel 2.
Logam-logam  yang  terkandung  dalam  ekstrak menunjukkan  konsentrasi  yang  sangat  rendah dibandingkan  dengan  yang  terkandung  dalam limbahnya.  Konsentrasi  timbal  dalam  limbah maupun  dalam  ekstraknya  menunjukkan  nilai tertinggi  dibandingkan  dengan  tiga  jenis  logam lainnya.  Timbal  yang  terkandung  dalam  limbah yang dapat larut dalam ekstraknya sangat kecil yaitu hanya 126 µg/kg atau sekitar 0,07% dari total yang terkandung dalam limbah total.  Rendahnya konsentrasi  timbal  dalam  ekstrak  dapat  disebabkan oleh  kuatnya  ikatan  timbal  dalam  suatu  senyawa yang  sulit  larut  dalam  air.  Hal  tersebut  dapat dijelaskan  dengan  sifat  kelarutan  logam  dalam  air alami.
Bahan Perlakuan  Ekstrak limbah Dosis Pb penelitian A B (µg/kg b.b/hari) Kontrol negatif * I - - - Ekstrak limbah II 350 0,04 - III 2500 0,32 - IV 5000 0,64 - Pb Nitrat (kontrol positif) V 0,5 VI 5 VII 50 VIII 500 IX 5000
Tabel    2  Hasil  analisis  logam  pada  limbah    dan ekstraknya
Keterangan : * Konsentrasi larutan ekstrak 2 g/ml
Di  alam,  logam  dapat  bereaksi  dengan  ligan pengkompleks anorganik yang ada dalam air, baik dari  sumber  alami  maupun  sumber  pencemar. Ligan  pengkompleks  anorganik  yang  dominan adalah  Cl - ,  SO 4 2- ,  HCO 3 - ,  F - ,  sulfida  dan  fosfat. Reaksi  logam-ligan  akan  membentuk  ion-ion kompleks  yang  kelarutannya  sangat  tergantung pada pH serta kepekatan dan jenis ligannya. Makin asam  pH  dan  makin  pekat  ligannya  makin  tinggi tingkat kelarutannya 4) .
Ikatan  senyawa  timbal  dalam  limbah  padat IPAL  industri  kertas  sangat  dipengaruhi  oleh bahan  kimia  yang  dipakai  dalam  proses  produksi dan proses pengolahan air limbahnya.

## Konsentrasi timbal dalam darah
Hubungan  antara  lamanya  pemberian  ekstrak dengan  konsentrasi  timbal  rata-rata  dalam  darah tikus  dapat dilihat  pada  Gambar  1.  Secara  umum, data  menunjukkan  bahwa  kisaran  konsentrasi timbal  rata-rata dalam  darah  pada kelompok  tikus yang  diberi  perlakuan  ekstrak  jauh  lebih  rendah dibandingkan dengan  kelompok  tikus  yang  diberi perlakuan  kontrol  positif  (timbal  nitrat).  Kisaran konsentrasi  timbal  rata-rata  dalam  darah  tikus yang  diberi  perlakuan  ekstrak  dosis  350  -  5000 mg/kg  b.b/hari  adalah  0  -  4,58  µg/dl  jauh  lebih rendah dibandingkan dengan yang diberi perlakuan    kontrol  positif  yang  mengandung timbal 50; 500 dan 5000 µg/kg b.b/hari.
Konsentrasi  timbal  rata-rata  dalam  darah tikus  yang  diberi  perlakuan  kontrol  positif tersebut  berkisar  antara  1,49  -  19,80  µg/dl, sedangkan  dalam  darah  tikus  pada  kontrol negatif  tidak  terdeteksi  adanya  timbal. Walaupun  konsentrasi  timbal  rata-rata  dalam darah tikus yang diberi perlakuan ekstrak jauh lebih
rendah  dibandingkan  dengan  yang  diberi perlakuan  kontrol  positif,  tetapi  pada  kedua kelompok perlakuan tersebut sama-sama menunjukkan  konsentrasi  timbal  rata-rata  dalam darah  yang  jauh  lebih  rendah    dibandingkan dengan  konsentrasi  timbal  yang  diberikan  setiap hari  selama  90  hari.  Hal  tersebut  diketahui  dari persentase timbal yang masuk ke dalam darah kelompok  tikus  yang  diberi  ekstrak  dosis  5000 mg/kg  b.b/hari  hanya  7,95%  -  9,51%  dari  jumlah kumulatif timbal  yang diberikan  selama  56  hari dan 90 hari
Dalam  penelitian  ini  terdapat  2  faktor  utama yang  menyebabkan  rendahnya  konsentrasi  timbal dalam  darah  pada  kelompok  tikus  yang  diberi ekstrak  dosis  5000  mg/kg  b.b/hari  yaitu  jalur masuknya  timbal  ke  dalam  tubuh  dan  sifat  kimia timbal  dalam  ekstrak  limbah.  Perlakuan  pemberian timbal  yang  dilakukan  pada  penelitian  ini  adalah melalui saluran pencernaan. Absorbsi timbal melalui saluran  pencernaan,  terutama  terjadi  di  dalam  usus halus  dengan  laju  absorbsi  sangat  dipengaruhi  oleh tingkat  kelarutannya  dalam  lemak 15) .  Makin  tinggi tingkat  kelarutan  senyawa  timbal  dalam  lemak, makin  cepat  laju  absorbsinya  melalui  membran bilayer fosfolipid  pada  saluran  pencernaan.  Timbal yang  masuk  ke  dalam  tubuh  melalui  jalur  saluran pencernaan  hanya  10 %  yang  dapat  diabsorbsi  usus dan sisanya akan terbuang bersama dengan feses 24) . Sifat  kimia  timbal  yang  terikat  dalam  senyawa anorganik, umumnya bersifat hidrofil dan lebih polar dibandingkan  dengan  timbal  yang  terikat  dalam senyawa organik, sehingga senyawa anorganik lebih sulit  larut  dalam  lemak 12) .  Timbal  yang  terkandung dalam  limbah,  umumnya  berasal  dari  tinta  yang menempel  pada  bahan  baku  kertas  bekas,  sehingga diperkirakan  timbal  tersebut  terikat  dalam  senyawa anorganik  yang  bersifat  hidrofil  yang  sulit menembus  membran  sel 26) .  Di  dalam  usus  halus, tingkat absorbsi timbal anorganik sangat rendah dan untuk  dapat  terabsorbsi,  tergantung  pada  senyawa kimia  nutrisi  yang  ada  di  dalamnya.  Beberapa komponen    nutrisi  yang mengandung natrium  sitrat, asam  askorbat,  asam  amino,  vitamin  D,  protein, lemak dan laktosa dapat berikatan dengan timbal dan dapat  meningkatkan  absorbsi  timbal  masuk  ke peredaran  darah (26) .  Kandungan  protein  dan  lemak dalam  pakan  yang  diberikan  pada  tikus  dalam penelitian  ini  adalah  protein  20%,  lemak  4,5%. Pakan tersebut berupa pelet CP 551 yang diproduksi oleh PT Charoen Pokphand Indonesia.
Nilai rata-rata Parame ter Limbah total Ekstrak limbah mg/kg µg/l ekstrak* µg/kg limbah Pb 175,2 252 126 Cd 26,2 42 21 Cu 6,9 10 5 Cr 56.3 144 72
Gambar 1. Hubungan lamanya pemberian perlakuan ekstrak dan kontrol positif terhadap konsentrasi timbal dalam darah tikus
Konsentrasi  timbal  rata-rata  dalam  darah tikus  yang  diberi  perlakuan  ekstrak  dosis  5000 mg/kg b.b/hari  menunjukkan  adanya  peningkatan sampai  3,41  ±  0,62  µg/dl  pada  hari  ke-56, kemudian  menurun  sampai  tidak  terdeteksi  pada hari ke-70 dan meningkat kembali sampai 4,58 ± 0,39  µg/dl  pada  hari  ke-90.  Dari  data  tersebut menunjukkan  bahwa  konsentrasi  timbal  dalam darah  tikus  yang  diberi  perlakuan  ekstrak  dosis 5000 mg/kg b.b/hari secara terus menerus  selama 90 hari sangat rendah dan  keberadaannya cende- rung berfluktuasi. Kecenderungan tersebut tampak  juga  pada  pemberian  perlakuan  kontrol positif  yang  mengandung  timbal  50;  500  dan 5000  µg/kg  b.b/hari.  Kisaran  konsentrasi  timbal rata-rata  dalam  darah  pada  perlakuan  kontrol positif tersebut adalah 1,49 -19,80 µg/dl.
Adanya kecenderungan berfluktuasinya konsentrasi  timbal  rata-rata  dalam  darah  tikus yang  diberi  perlakuan  ekstrak  dosis  5000  mg/kg b.b/hari  sangat  dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor yaitu  waktu  paruh  timbal  dalam  darah,  selang waktu  pemberian  perlakuan  dan  besarnya  dosis yang diberikan. Waktu paruh timbal darah 28 – 36 hari 24) .
Pada  penelitian  ini,  selang  pemberian perlakuan  adalah  satu  hari  dan kandungan  timbal dalam  perlakuan  ekstrak  dosis  5000  mg/kg
b.b/hari adalah 0,64 µg (Tabel 1). Oleh karena selang waktu pemberian perlakuan ekstrak dilakukan setiap hari    dan  lebih  kecil  dibandingkan  dengan  waktu paruh  timbal  dalam  darah,  maka  pada  akhir  tiap selang  pemberian  perlakuan  ekstrak  dosis  5000 mg/kg  b.b/hari kemungkinan  masih  terdapat sejumlah  timbal  dalam  tubuh,  sehingga  terjadi peningkatan konsentrasi timbal dalam darah.
Walaupun peningkatannya sangat kecil, konsentrasi  timbal  dalam  darah  tikus  yang  diberi perlakuan  ekstrak  dosis  5000  mg/kg  b.b/hari  mulai terdeteksi pada hari ke-56 sebesar 3,41 ± 0,62 µg/dl. Karena timbal dalam darah mempunyai waktu paruh, maka  bersamaan  dengan  meningkatnya  konsentrasi timbal  dalam  darah,  timbal  juga  akan    tereliminasi. Kecepatan  peningkatan  konsentrasi  timbal  dalam darah  dipengaruhi  oleh  sifat  kimia  timbal.  Daya absorbsi timbal anorganik dalam tubuh sangat lambat dan  kemungkinan  jumlah  yang  dapat  terabsorbsi  di usus  halus persatuan waktu  tidak konstan, sehingga keberadaan  timbal  dalam  darah  akan  menurun kembali.  Terjadinya  penurunan  konsentrasi  timbal dalam  darah  tikus  yang  diberi  perlakuan  ekstrak dosis 5000 mg/kg b.b/hari  tampak pada hari ke-70.
Mutschler  menyatakan  bahwa  apabila  waktu paruh  lebih  besar  dari  selang  waktu  pemberian perlakuan  suatu  senyawa,  maka  pada  akhir  tiap selang  pemberian  dosis  masih  terdapat  sejumlah
Perlakuan timbal 0 25 50 75 100 125 150 175 200 0 14 28 42 56 70 84 98 Lama pemberian perlakuan, hari Kontrol negatif Pb 0.5 ug/kg bb/hr Pb 5 ug/kg bb/hr Pb 50 ug/kg bb/hr
Pb 500 ug/kg bb/hr Pb 5000 ug/kg bb/hr Perlakuan eks trak limbah IPK 0 25 50 75 100 125 150 175 200 0 14 28 42 56 70 84 98 Lama pemberian perlakuan, hari A LA-D (n m o l P BG/ m l eri tr o si t/ ja m ) Kontrol negatif eks trak limbah,350 mg/kg bb/hr eks trak limbah,2500 mg/kg bb/hr eks trak limbah,5000 mg/kg bb/hr
senyawa tersebut dalam tubuh 16) . Pada pemberian dosis  selanjutnya  akan  menyebabkan  konsentrasi senyawa  tersebut  dalam  darah  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  saat  pemberian  dosis sebelumnya.  Pada  waktu  yang  bersamaan  jumlah senyawa  yang  dieliminasi  persatuan  waktu  juga meningkat  Hal tersebut  akan terjadi  terus  sampai kondisi  setimbang  atau  konsentrasi steady  state . Pada data yang diperoleh pada penelitian ini, efek perlakuan  ekstrak  terhadap  konsentrasi  timbal dalam darah belum dapat diketahui kecenderungannya  secara  jelas,  karena  frekuensi terjadinya  fluktuasi  konsentrasi  timbal  dalam darah belum terlalu tampak dan masih sedikit.

## Laju pertambahan berat badan
Hubungan lamanya pemberian ekstrak dengan laju pertambahan berat badan rata-rata dapat dilihat pada  Gambar  2.  Secara  umum,  laju  pertambahan berat  badan  rata-rata  dari  minggu  ke  minggu berikutnya menunjukkan kenaikan, baik pada tikus yang  diberi  perlakuan  ekstrak,  perlakuan  kontrol positif  maupun  kontrol  negatif.  Laju  pertambahan berat  badan  rata-rata  cenderung  sama  pada  semua perlakuan  yang  makin  menurun  sejalan  dengan bertambahnya umur tikus. Laju pertambahan berat badan  rata-rata  tikus  pada  kontrol  negatif menunjukkan  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan perlakuan ekstrak maupun kontrol positif
Hasil  analisis  ANOVA repeated  measures menunjukkan  bahwa  efek  variasi  lama  pemberian perlakuan ekstrak terhadap laju pertambahan berat badan  rata-rata  berbeda  nyata  ( p <0,05).  Hasil  uji
banding  berganda  Tukey,  menunjukkan  bahwa  laju pertambahan  berat  badan  rata-rata  tikus  yang  diberi perlakuan  ekstrak  dosis  5000  mg/kg  b.b/hari  lebih kecil  dan  berbeda  nyata  dengan  kontrol  negatif maupun  kontrol  positifnya.  Sampai  hari  ke  42,  laju pertambahan  berat  badan  rata-rata  tikus  yang  diberi perlakuan  ekstrak  dosis  5000  mg/kg  b.b/hari  lebih kecil  dan  berbeda  nyata  dengan  perlakuan  kontrol negatif.  Terjadinya  penurunan  laju  berat  badan  rata- rata  tikus  yang  diberi  perlakuan  ekstrak  dosis  5000 mg/kg  b.b/hari  merupakan  salah  satu  indikasi terjadinya stress terhadap  tikus  tersebut.  Menurut Campbell  (2000),  terjadinya  penurunan  berat  badan merupakan indikasi ringan terhadap stress 3) .Di dalam interval  waktu  saat  mengalami stress ,  metabolisme tubuh cenderung meningkat, yang akan diikuti dengan kebutuhan  energi  yang  meningkat  pula,  sehingga berat badan menurun.
Secara  fisiologis,  reaksi  awal  tubuh  terhadap stress adalah  aktifnya  hormon  epinefrin  yang  akan merangsang  sel  hati  melepaskan  glukosa  sebagai energi  untuk  aktivitas  selulernya 13) .    Selain  itu  Lu (1995)  juga  menyatakan  bahwa  menurunnya  laju pertambahan  berat  badan  rata-rata  yang  sifatnya sementara  lebih  disebabkan  oleh  efek  biologis  yang bersifat adaptasi daripada bersifat toksik 12) . Atas dasar hal tersebut di atas, penurunan laju pertambahan berat badan  rata-rata  tikus  yang  diberi  perlakuan  ekstrak dosis 5000 mg/kg b.b/hari  yang hanya terjadi selama 42  hari,  dapat  diklasifikasikan  sebagai  efek  biologis yang  bersifat  adaptasi  terhadap  ekstrak  yang  masuk dalam tubuhnya.
Gambar 2. Hubungan lamanya pemberian perlakuan ekstrak dan kontrol  positif terhadap laju pertambahan berat badan rata-rata
Perlakuan ekstrak limbah 0 50 100 150 200 250 300 350 0 14 28 42 56 70 84 98 Lama pemberian perlakuan(hari) L aju p ert amba han br t b adan (%) Kontrol  negatif 350mg/kg bb/h r 2500mg/kg bb/hr 5000mg/kg bb/hr Perlakuan timbal 0 50 100 150 200 250 300 350 0 14 28 42 56 70 84 98 Lama pemberian p erlakuan (hari) Kontrol negatif
Pb 0.5 ug/kg bb/hr Pb 5 ug/kg bb/hr Pb 50 ug/kg bb/hr Pb 500 ug/kg bb/hr Pb5000 ug/kg bb/hr

## Pengaruh lama pemberian ekstrak limbah

## 1. Terhadap aktivitas δ-ALA-D darah
Hubungan  lamanya  pemberian  perlakuan ekstrak  terhadap  aktivitas  rata-rata  enzim  δ-ALA- D  darah  tikus  dapat  dilihat  pada  Gambar  3. Aktivitas  rata-rata  δ-ALA-D  darah  pada  semua perlakuan,  baik  yang  diberi  perlakuan  ekstrak maupun  perlakuan  kontrol  positif  menunjukkan fluktuasi  pada  kisaran  antara 90,05  - 140,40  nmol PBG/ml  sel  eritrosit/jam.  Kisaran  aktivitas  rata- rata δ-ALA-D darah  per 2 minggu selama 90 hari pada tikus yang diberi perlakuan ekstrak dosis 350 sampai  5000  mg/kg  b.b/hari  adalah  102,29  - 125,12  nmol  PBG/ml  sel  eritrosit/jam,  pada  dosis kontrol positif yang mengandung timbal antara 0,5 sampai 5000 µg/kg b.b/hari adalah 90,05 - 133,11 nmol  PBG/ml  sel  eritrosit/jam  dan  pada  kontrol negatif    adalah  113,29  –140,40  nmol  PBG/ml  sel eritrosit/jam.
Hasil  analisis  ANOVA repeated  measures menunjukkan  bahwa  aktivitas  rata-rata  δ-ALA-D
darah  pada  tikus  yang  diberi  ekstrak  tidak  berbeda nyata  dengan  tikus  yang  diberi  perlakuan  kontrol negatif dan kontrol positif. Walaupun secara statistik tidak  berbeda  nyata,  aktivitas  rata-rata  δ-ALA-D darah    pada  tikus  yang  diberi  ekstrak  mengalami penurunan.  Makin  tinggi  dosis  ekstrak  yang diberikan  menunjukkan  adanya  kecenderungan makin  menurunnya  aktivitas  rata-rata  δ-ALA-D darah.
Terjadinya penurunan aktivitas rata-rata δ-ALA- D darah  yang dialami oleh tikus yang diberi ekstrak, kemungkinan merupakan indikasi adanya kontaminan timbal dalam darah. Kisaran konsentrasi timbal  rata-rata  dalam  darah  tikus  yang  diberi ekstrak  dosis  350  -  5000  mg/kg  b.b/hari  selama  90 hari berkisar antara 0-4,578 µg/dl.  Schetinger et al . (1999),  Goulart et  al. (2001)  dan  Klaassen  (2001) menyatakan bahwa mekanisme terhambatnya aktivitas  enzim  δ-ALA-D  oleh  timbal  dengan  cara menempelnya  timbal  pada  gugus  –SH  sebagai  sisi aktif  dari  molekul  enzim  δ-ALA-D  darah  dan membentuk ikatan kovalen dengan atom sulfur. N
Gambar 3.   Hubungan lamanya pemberian perlakuan ekstrak dan kontrol positif terhadap aktivitas rata-rata δ-ALA-D darah
Perlakuan timbal 0 25 50 75 100 125 150 175 200 0 14 28 42 56 70 84 98
Lama pemberian perlakuan, hari
Kontrol negatif Pb 0.5 ug/kg bb/hr
Pb 5 ug/kg bb/hr Pb 50 ug/kg bb/hr Pb 500 ug/kg bb/hr Pb 5000 ug/kg bb/hr Perlakuan eks trak limbah IPK 0 25 50 75 100 125 150 175 200 0 14 28 42 56 70 84 98 Lama pemberian perlakuan, hari A LA -D (n mo l PB G /m l er it ro si t/ jam) Kontrol negatif ekstrak limbah,350 mg/kg bb/hr ekstrak limbah,2500 mg/kg bb/hr ekstrak limbah,5000 mg/kg bb/hr
Gambar 4.  Hubungan lamanya pemberian perlakuan ekstrak dan kontrol positif terhadap konsentrasi hemoglobin rata-rata.
Dengan  adanya  hambatan  timbal  terhadap aktivitas  δ-ALA-D    darah  akan  menyebabkan porfobilinogen  tidak  dapat  diproduksi  dari substrat ALA, akibatnya adalah konsentrasi ALA dalam urin dan plasma meningkat. Pada manusia, penghambatan  aktivitas  enzim  δ-ALA-D  terjadi pada konsentrasi  darah  5-50  µg  /dl (24) .    Menurut Lu (1995),  penurunan aktivitas rata-rata δ-ALA- D  darah  mulai  tampak  pada  konsentrasi  timbal darah 10 µg/dl dan menurut Toro dan Ackermann (1975) pada konsentrasi 10 - 50 µg/dl 12 & 28) .
2. Karakteristik darah
a.  Konsentrasi hemoglobin
Menurut  Goyer et  al .  (1975)  dan  Lu  (1995), keberadaan  timbal  dalam  sistem  peredaran  darah dapat  mengganggu  aktivitas  δ-ALA-D  yang berperan dalam biosintesis hemoglobin. Hubungan  lamanya  pemberian  perlakuan  ekstrak terhadap  konsentrasi  hemoglobin  rata-rata  dapat dilihat  pada  Gambar  4.  Pada  penelitian  ini, konsentrasi  hemoglobin  rata-rata  pada  kelompok tikus  yang  diberi  perlakuan  ekstrak  dosis  350  - 5000 mg/kg b.b/hari selama 90  hari  berkisar  antara  14,67  -  17,27  g/dl,  pada tikus  yang  diberi  perlakuan  kontrol  positif berkisar  antara  14,73  -  16,87  g/dl.  dan  kisaran pada kontrol negatif 15,60 - 17,20 g/dl.
Hasil  analisis  ANOVA repeated  measures menunjukkan  bahwa  konsentrasi    rata-rata hemo-globin  pada  tikus    yang  diberi  perlakuan ekstrak  tidak  berbeda  nyata  dengan  yang  diberi kontrol  negatif.  Walaupun  secara  statistik  tidak berbeda  nyata, konsentrasi  hemoglobin  rata-rata pada  tikus  yang  diberi  ekstrak,  cenderung menurun, terutama pada pemberian ekstrak dosis 5000 mg/kg b.b/hari pada  hari ke 90. Terjadinya penurunan  konsentrasi  hemoglobin  rata-rata, kemungkinan merupakan indikasi adanya kontaminan  timbal  dalam  darah  yang  dapat mengganggu  biosintesis  heme  yang  merupakan komponen utama dari hemoglobin 14) .
b. Jumlah sel  eritrosit dan nilai hematokrit
Hubungan lamanya pemberian perlakuan ekstrak dan kontrol  positif  terhadap  jumlah  sel  eritrosit  rata- rata  dan  nilai  hematokrit  rata-rata  dapat  dilihat  pada Gambar 5. Pada gambar tersebut tampak bahwa grafik jumlah  sel  eritrosit  rata-rata  cenderung  sama  dengan grafik nilai hematokrit rata-rata. Kecenderungan yang sama  dari  2  parameter  tersebut  disebabkan  karena hematokrit  merupakan  perbandingan  jumlah  sel eritrosit  rata-rata  terhadap  volume  darah  total, sehingga  ke-2  parameter  tersebut  dapat  saling mempengaruhi. Pada penelitian ini, kisaran jumlah sel eritrosit  rata-rata  pada  tikus  yang  diberi  perlakuan ekstrak dosis 350 - 5000 mg/kg b.b/hari adalah 6,58 - 8,32  M/µl,  perlakuan  dosis  kontrol  positif    yang
Perlakuan timbal 10 12 14 16 18 20 0 14 28 42 56 70 84 98 Lama pemberian perlakuan,h ari
Kont rol negat if Pb 0.5 ug/kg bb/hr
Pb 5 ug/kg bb/hr Pb 50 ug/kg bb/hr Pb 500 ug/kg bb/hr Pb 5000 ug/kg bb/hr P erlakuan ekst rak limbah IP K 10 12 14 16 18 20 0 14 28 42 56 70 84 98 Lama pemberian perlakuan, hari Hem o g lo b in ( g /d l) Kontrol negatif ekst rak limbah,350 mg/kg bb/hr ekst rak limbah,2500 mg/kg bb/hr ekst rak limbah,5000 mg/kg bb/hr
mengandung  timbal  0,5  -  5000  µg/kg  b.b/hari adalah 6,23 - 7,78 M/µl dan kontrol negatif 6,86 - 8,03 M/µl.
Hasil  analisis multivariete ANOVA repeated measures menunjukkan  jumlah  sel  eritrosit  rata- rata  pada  tikus  yang  diberi  ekstrak  berbeda  nyata dengan tikus yang diberi perlakuan kontrol negatif dan  kontrol  positif  ( p <0,05).  Jumlah  sel  eritrosit rata-rata pada tikus yang diberi ekstrak mengalami penurunan.  Makin  tinggi  dosis  ekstrak  yang diberikan  menunjukkan  jumlah  sel  eritrosit  rata- rata yang cenderung menurun.
Sejalan  dengan  menurunnya  jumlah  sel eritrosit  rata-rata,  nilai  hematokrit  rata-rata  per satuan  waktu  juga  menunjukkan  penurunan.  Hasil analisis multivariete ANOVA repeated  measures menunjukkan  bahwa  nilai  hematokrit  rata-rata darah  tikus  yang  diberi  ekstrak  berbeda  nyata dengan  kelompok  tikus  yang  diberi  perlakuan
kontrol  negatif  dan kontrol  positif  ( p <0,05).  Kisaran nilai  hematokrit  rata-rata  pada  tikus  yang  diberi perlakuan  ekstrak  dosis  350  -  5000  mg/kg  b.b/hari adalah 41,00 - 48,73 %, pada perlakuan kontrol positif yang  mengandung  timbal  antara  0,5  -  5000  µg/kg b.b/hari  adalah 38,60  –  46,80  %  dan kontrol  negatif 43,93  -  48,00%  .  Terjadinya  penurunan  jumlah  sel eritrosit rata-rata dan nilai hematokrit rata-rata dalam darah  yang  dialami  oleh  tikus  yang  diberi  ekstrak, kemungkinan merupakan indikasi adanya kontaminan timbal  dalam  darah.  Mugahi  dan  Heidari  (2003) menyatakan  bahwa  99%  timbal dalam  darah  terdapat dalam  sel  eritrosit  dan  sisanya  1%  berada  dalam plasma.  Tingginya konsentrasi  timbal  rata-rata dalam darah,  dapat  menyebabkan  sel  eritrosit  rapuh  dan mudah  pecah  dan juga  dapat menyebabkan terganggunya  proses  eritropoiesis  dalam  sumsum tulang (Marcus & Schwartz, 1987).
Gambar 5. Hubungan lamanya pemberian perlakuan ekstrak dan kontrol positif terhadap jumlah sel eritrosit rata-rata dan nilai hematokrit rata-rata
Perlakuan timbal 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 0 14 28 42 56 70 8 4 9 8 20 25 30 35 40 45 50 55 0 14 28 42 56 70 84 98 Lama p emberian p erlakuan, hari H ema to krit ,% Kontrol negatif ekstrak limbah,350 mg/kg bb/hr
ekst rak limbah,2500 mg/kg bb/hr ekstrak limbah,5000 mg/kg bb/hr 20 25 30 35 40 45 50 55 0 14 28 42 56 70 84 98 Lama pemberian perlakuan,hari
Kont rol negatif P b 0.5 ug/kg bb/hr Pb 5 ug/kg bb/hr P b 50 ug/kg bb/hr Pb 500 ug/kg bb/hr P b 5000 ug/kg bb/hr P erlakuan ekst rak limbah IPK 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 0 14 28 42 56 70 84 98 Ju m lah sel e ritr o si t,M /u l
Menurut  Rober  (2000),  konsentrasi  timbal rata-rata  dalam  darah  50 – 80 μg/dl  menyebabkan jumlah  sel  eritrosit  rata-rata  berkurang  dan mempengaruhi pembentukan retikulosit dan menurut  Ruslijanto  (1984)  kadar  timbal  darah lebih besar dari 40 μg/dl dapat menyebabkan nilai hemoglobin  lebih  kecil  dari  13  g/dl.  Pada penelitian  ini,  konsentrasi  timbal  rata-rata  dalam darah masih jauh di bawah 40 μg/dl.
Pengaruh  toksisitas  subkronis  ekstrak    ter- hadap karakteristik darah dan aktivitas ALA-D
Pengaruh  toksisitas  subkronis  perlakuan ekstrak  dan  kontrol  positif terhadap aktivitas  rata- rata  δ-ALA-D  darah  dan  karakteristik  darah  tikus dapat dilihat pada Tabel 3. Hasil analisis ANOVA menunjukkan  bahwa  aktivitas  rata-rata  δ-ALA-D pada  tikus  yang  diberi  perlakuan  ekstrak  dosis 2500  dan  5000  mg/kg  b.b/hari  lebih  rendah  dan berbeda  nyata  terhadap  perlakuan  kontrol  negatif (p<0,05).  Konsentrasi  timbal  dalam  darah  tikus yang diberi perlakuan ekstrak dosis 2500 dan 5000 mg/kg  b.b/hari  masing-masing  adalah  3,78  dan 4,24  μg/dl.  Kisaran  konsentrasi  timbal  tersebut tidak  berbeda  nyata  dengan  konsentrasi  timbal dalam  darah  pada  tikus  yang  diberi  perlakuan kontrol positif yang mengandung timbal 0,5 dan 5 μg,  tetapi  efek  yang  terjadi  terhadap  aktivitas  δ- ALA-D  darah  adalah  berbeda.  Perlakuan  ekstrak dosis  2500  dan  5000  mg/kg  b.b/hari  serta perlakuan kontrol positif yang mengandung timbal 500 μg  dan 5000  μg  memberikan  efek  yang tidak berbeda  nyata  terhadap  penurunan  aktivitas  δ- ALA-D.
Adanya  perbedaan  efek  perlakuan  ekstrak dosis  2500  dan  5000  mg/kg  b.b/hari  dengan perlakuan kontrol positif yang mengandung timbal 0,5  dan  5  μg  terhadap  aktivitas  δ-ALA-D, kemungkinan disebabkan oleh timbal dan komponen  pencemar  lainnya  yang  terkandung dalam  limbah  yang  juga  memberi  kontribusi  sifat toksik.  Menurunya  aktivitas  ALAD  darah  pada kelompok  tikus  yang  diberi  perlakuan  ekstrak dosis 2500 dan 5000 mg/kg b.b/hari mempengaruhi  biosintesis  heme  yang  akan mengakibatkan  terhambatnya  proses  pembentukan hemoglobin.  Namun  pengaruh  yang  tampak terhadap  pembentukan  hemoglobin,  hanya  pada kelompok tikus yang diberi perlakuan ekstrak 5000 mg/kg b.b/hari.
Hasil  analisis  ANOVA  menunjukkan  bahwa konsentrasi  hemoglobin  rata-rata  pada  tikus  yang diberi perlakuan ekstrak dosis 5000 mg/kg b.b/hari
lebih  rendah  dan  berbeda  nyata  terhadap  perlakuan kontrol  negatif  (p<0,05). Pada  Tabel  3  menunjukkan bahwa  makin  tinggi  konsentrasi  timbal  dalam  darah makin rendah konsentrasi hemoglobin rata-rata, tetapi kecenderungan tersebut hanya terjadi pada tikus yang diberi  perlakuan  ekstrak.  Lain  halnya  dengan  tikus yang  diberi  perlakuan  kontrol  positif,  kecenderungan tersebut tidak terjadi.  Adanya perbedaan efek timbal dalam  darah  terhadap  konsentrasi  hemoglobin  pada kelompok tikus yang diberi perlakuan ekstrak dengan yang  diberi  perlakuan  kontrol  positif,  memperkuat pernyataan yang telah disebutkan di atas yaitu  bahwa efek yang terjadi pada tikus yang diberi ekstrak bukan hanya  disebabkan  oleh  kandungan  timbal  yang terkandung  di  dalamnya,  tetapi  juga  oleh  komponen pencemar lain yang terkandung dalam limbah.
Sejalan  dengan  menurunnya  konsentrasi  hemo- globin pada kelompok tikus yang diberi ekstrak 5000 mg/kg  b.b/hari,  terjadi  pula  penurunan  nilai hematokrit.  Hasil  analisis  ANOVA  menunjukkan bahwa  nilai  hematokrit  rata-rata  pada  tikus  yang diberi  perlakuan  ekstrak  dosis  5000  mg/kg  b.b/hari lebih  rendah  dan  berbeda  nyata  terhadap  perlakuan kontrol negatif ( p <0,05). Telah diketahui bahwa nilai hematokrit  menunjukkan  perbandingan  antara jumlah sel  eritrosit  rata-rata  terhadap  volume  darah  total ( 16) . Namun dalam penelitian ini, jumlah sel eritrosit rata- rata  pada  tikus  yang  diberi  perlakuan  ekstrak  limbah 5000  mg/kg  b.b/hari  tidak  menunjukkan  perbedaan yang nyata.
Adanya  perbedaan  pengaruh  perlakuan  ekstrak dosis  5000  mg/kg  b.b/hari  terhadap  masing-masing parameter  karakteristik  darah  (konsentrasi  hemo- globin  dan  nilai  hematokrit  menurun  dan  berbeda nyata, tetapi jumlah sel eritrosit tidak berbeda nyata), hal  tersebut  kemungkinan  hanya  disebabkan  oleh sensitivitas  yang  berbeda,  karena  kisaran  nilai  dari masing-masing  parameter  tersebut  masih  dalam kisaran  nilai  normal  darah  tikus  (Tabel  .3).  Kisaran normal  konsentrasi  hemoglobin,  nilai  hematokrit  dan jumlah sel eritrosit dalam darah tikus adalah berturut- turut 14 - 20 g/dl; 36 - 48 % dan 7,2 - 9,6 M/μl (31) .
Berdasarkan  uraian  diatas  dapat  disimpulkan bahwa  pemberian  perlakuan  ekstrak  dosis  2500  dan 5000  mg/kg  b.b/hari  menyebabkan  penurunan aktivitas  δ-ALA-D,  sedangkan  pengaruhnya  terhadap karakte-ristik darah menyebabkan penurunan konsentrasi  hemoglobin  dan  nilai  hematokrit  darah yang masih dalam kisaran normal. Hal tersebut dapat dijelaskan  bahwa  perlakuan  ekstrak  dosis  2500  dan 5000  mg/kg  b.b/hari  menyebabkan  terjadinya penurunan aktivitas δ-ALA-D darah yang berpengaruh terhadap biosintesa hemoglobin, sehingga menyebabkan penurunan konsentrasi
Tabel  3.  Pengaruh toksisitas subkronis perlakuan ekstrak dan kontrol positifnya terhadap aktivitas δ-ALA-D darah dan karakteristik darah tikus
Keterangan :  -  nilai rata-rata ± S.D (n=10), -  nilai yang diikuti tanda * menunjukkan berbeda nyata terhadap kontrol ( p<0,05 )
(1) :  satuan  nmol PBG/ml darah /jam
hemoglobin  dalam  darah.  Penurunan  konsentrasi hemoglobin  dalam  darah  tersebut  masih  dalam kisaran  normal,  yang  artinya  tidak  mengganggu konsentrasi  oksigen  yang  didistribusikan  ke seluruh  tubuh,  sehingga  proses  metabolisme aerobik dalam mitokondria sel tidak terganggu.
Dengan tidak terganggunya suplai konsentrasi oksigen ke dalam tubuh, maka proses pembentukan  sel  eritrositpun  akan  terjadi  sesuai dengan  jumlah  sel  eritrosit  yang  hancur  karena masa aktifnya yang terbatas yaitu sekitar 120 hari. Telah  diketahui  bahwa  produksi  sel  eritrosit dikontrol  oleh  mekanisme  umpan  balik  negatif yang  sensitif  terhadap  jumlah  oksigen  dalam jaringan melalui darah (2) . Nilai hematokrit masih dalam  kisaran  normal,  artinya    jumlah  retikulosit yang  berada  dalam  peredaran  darah  tidak berpengaruh  nyata  terhadap  jumlah  sel  eritrosit yang  ada  pada  sistem  peredaran  darah,  sehingga tidak  berpengaruh  dalam  suplai  oksigen  dan metabolisme aerobik sel (16) .
Dalam  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa konsentrasi  timbal  dalam  darah  tikus  yang diberi perlakuan  ekstrak  dosis  2500  dan  5000  mg/kg b.b/hari  masing-masing  adalah  3,78  dan  4,24 μg/dl.  Nilai  tersebut  masih  jauh  dibawah    40 μg/dl.  Menurut  Ruslijanto  (1984)  kadar  timbal dalam  darah  lebih  besar  dari  40  μg/dl  dapat menyebabkan nilai hemoglobin lebih kecil dari 13 g/dl  dan  menurut  Rober  (2000),  konsentrasi timbal  dalam  darah  50  -  80  μg/dl  menyebabkan jumlah sel eritrosit berkurang dan mempengaruhi pembentukan retikulosit.

## KESIMPULAN
1. Timbal yang terkandung dalam limbah sludge yang  dapat  larut  air dalam  ekstraknya  sangat kecil yaitu hanya 126 µg/kg dari 175,2 mg/kg atau sekitar 0,07% dari total yang terkandung dalam limbah sludge total.
2. Hasil penelitian pengaruh pemberian perlakuan  ekstrak  limbah  sampai  dosis  5000 mg/kg  b.b/hari  secara  terus  menerus  selama 90 hari adalah sebagai berikut :
- Konsentrasi  timbal  dalam  darah  tikus sangat  rendah  dan    keberadaannya  cen- derung  berfluktuasi  pada    kisaran  kon- sentrasi yang jauh lebih rendah daripada kontrol positifnya.
- Terjadi  penurunan  laju  pertambahan berat badan sampai hari ke 42 yang lebih disebabkan  oleh  efek  biologis  yang bersifat adaptasi.
- Konsentrasi  timbal  dalam  ekstrak limbah sludge menyebabkan penurunan aktivitas δ-ALA-D darah dan konsentrasi  hemoglobin  serta  nilai hematokrit  darah,  tetapi    penurunan tersebut  masih  dalam  batas  normal karakteristik darah tikus.
Konsentrasi Aktivitas Karakteristik darah Perlakuan Dosis Pb-darah µg/dl δ-ALA-D (1) Hemoglobin g/dl erithrosit M/µl Hematokrit % Kontrol 0 0 144,3 ± 48 17,28 ± 1,11 7,87 ± 0,26  46,45 ± 1,61 Ekstrak 350 2,73 ± 0,16 118,1 ± 27 16,46 ± 0,99 7,39 ± 0,45  45,06 ± 2,04 (mg/kg b.b/hari)  2500  3,78 ± 0,16 100,5 ± 24 * 16,16 ± 0,96 7,63 ± 0,63  45,61 ± 4,11 5000  4,24 ± 0,25 98,09 ± 51 * 15,55 ± 1,01 * 7,40 ± 0,65  42,15 ± 3,64 * Timbal 0,5 0,94 ± 0,4 141,3 ± 48 16,30 ± 0,10 7,36 ± 0,61  42,67 ± 0,09 (µg/kg b.b/hari) 5,0 4,46 ± 0,22 124,9 ± 29 16,92 ± 1,02 7,59 ± 0,37  43,42 ± 1,62 50 8,15 ± 0,23 * 127,2 ± 41 16,00 ± 1,26 7,16 ± 0,47  43,60 ± 4,49 500 10,2 ± 0,21 * 90,11 ± 40 * 16,68 ±  0,8 7,64 ± 0,38  44,72 ± 2,2 5000  13,2 ± 0,26 * 99,46 ± 30 * 16,38 ± 1,0 7,47 ± 0,46  41,11 ± 2,51 *

## SARAN
Penentuan  toksisitas  subkronis  limbah  IPAL industri kertas, sangat kompleks dan memerlukan waktu  yang  sangat  lama  serta  memerlukan biaya yang  tidak  sedikit.  Untuk  mengetahui  sifat subkronis suatu limbah, sebaiknya diawali dengan penelurusan  sumber  kontaminan  logam  di  dalam limbah,  kemudian  terhadap  sumbernya  tersebut dilakukan  penentuan  sifat kelarutannya  dalam  air (hidrofil)  dan  dalam  lemak  (lipofil).  Bila kecenderungannya  lebih  bersifat  hidrofil,  tidak perlu  dilakukan    uji  toksisitas  subkronis.  Tetapi bila  lebih  bersifat  lipofil,  maka  dilakukan  uji subkronis  dengan  pengamatan    lebih  difokuskan pada  kandungan  logam  dalam  darah,  yang kemudian  dihubungkan  dengan  waktu  paruhnya dalam  darah  untuk  mengetahui  ada  tidaknya akumulasi logam.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Agency  for  Toxic  and  Disease  Registry (ATSDR).  1999. Toxicology  Profile  for  Lead. Public  Health  Service,  U.S.  Department  of health and Human Service. Atlanta.
2. Campbell, N.A., Reece, J.B. & Mitchell, L.G. 1999. Biology. Fifth  edition.  Benjamin Ocummings. San Francisco.
3. Campbell, N.A., Mitchell, L.G. & Reece, J.B. 2000. Biology  Concepts  and  Connections .
Addison Wesley Longman, Inc. San Francisco.
4. Connell, D.W. & Miller, G.J. 1995. Chemistry and  Ecotoxicology  of  Pollutan .  Willey Interscience Publication. 342-386.
5. Ferguson,  K.  1991 .    Environmental  Solution for  the  Pulp  and  Paper  Industry .  Miller Freeman. San Fransisco. 171-176.
6. Forbes, V.E. & Forbes, T.L. 1994.
Ecotoxicology  in  Theory  and  Practice . Chapman & hall. London. 110-112.
7. Goyer,  R.A.,  Kuhn,  C.  &  Davis,  G.L.  1975. Environmental  Pathology. Academic  Press. New York. 23-29.
8. Grandjean,  P.  1984. Biological  Effects  of Organolead Compounds .  Florida CRC Press. 98-100.
9. Hodson,  P.V.,  Blunt,  B.R.,  Spry,  D.J.  & Austen, K.1977. Evaluation of Erythrocyte δ - Aminolevulinic  Dehydratase  Activity  as  a Short-Term  Indicator  in  Fish  of  a  Harmful Exposure to Lead. J.Fish.Res. Board Can . 34: 501-508.
10. Kelada,  S.,  Shelton,  E.,  Kaufmann,  R.B.  & Khoury,  J.K.  2001.    δ-Aminolevulinic  Acid Dehydratase genotype  and lead  toxicity. American  Journal of  Epidemiology .   154  (1): 1- 13.
11. Klassen,  C.D.  2001. Toxicology  The  Basic Science  of  Poisons .  6 th ed.  The  McGraw-Hill Companies. USA. 827-833.
12. Lu, F.C. 1995. Basic Toxicology, Fundamentals, target  organs  and  Risk  assesment .  Hemisphere publishing corporation. 346-370.
13. Martini,  F.H.  1998 .  Fundamentals of  Anatomy and  Physiology .  Fouth  Edition.  Prentice  Hall, Inc. New Jersey. 647-650.
14. Mugahi,  M.N.  &  Heidari,  Z.  2003.  Effects  of Chronic  Lead  Acetate  Intoxication  on  Blood Indices of Male Adult Rat. DARU. 11(4): 147-
50.
15. Mushak,  P.  1991.  Gastro-intestinal  Absorption of  Lead  in  Children  and  Adults.  Overview  of Biological  and  Biophysico-chemical  Aspects. Chemical  Speciation  and  Bioavailability 3:  87-
104.
16. Mutschler, E. 1999. Dinamika obat. Farmakologi  dan  Toksikologi (terjemahan). Edisi ke 5. Penerbit ITB. Bandung. 700-740. 17. Nakagawa,  H.,  Sato,  T  &  Kubo,  H.  1995. Method  Not  Requiring  Mercuric  Chloride  for Determination  of  Activity  of    δ-Aminolevulinic Acid  Dehydratase  in  Blood  of  Carp Cyprinus carpio . Fish.Sci . 61(1): 97-99. 18. Organization  for Economic Cooperation and Development  (OECD)  TG-408.  1998. Sub Chronic  Oral  Toxicity  Test-Repeated  Dose 90-day Toxicity Study in Rodents .
19. Purwati,  S.  Rina.  S.  Soetopo.  2001.  Kajian Karakteristik  Lumpur  IPAL-IPK  berkaitan Dengan  Peraturan  Pengelolaan  Limbah  B-3. Prosiding  Seminar  Teknologi  Selulosa .  Balai Besar  Penelitian  dan  Pengembangan  Industri Selulosa.  Bandung. 85-95.
20. Rober,  D.R.  2000. Toxicology of  Heavy  Metals. Departemen  of  Chemical  Pathology.  The Chinese university of Hongkong.
21. Robinowitz,  M.B.  &  Wettherill,  G.W.,  & Kopple,  J.D. 1976. Kinetic  Analysis  of  Lead Metabolisme  in  Healthy  Human . J.Lab.Clin
Inves . 58.  265-270
22. Richardson  et  al.,  1992,  The  environmental impact of deinking : a pilot study, APPITA, Vol. 45 No. 5, 314 - 318.
23. Ruslijanto,  H.  1984.  Keracunan  timah  hitam, sumber-sumber, bahayanya dan penang- gulangannya. Majalah  Ilmiah  Kedokteran  Gigi . Universitas Trisakti. Jakarta      . Sakai, T. 2000.
24. Biomakers  of  lead  Exposure .  Industrial Health . 38 : 127-142 . 25. Santoso,  S.  2004. SPSS  Statistik  Parametrik.
Edisi  ke  4.  PT  Elex  media  komputindo. Gramedia. Jakarta 26. Schiefer, B., Donald, G.I & Buzik S. C. 1987. You  and  Toxicology. Toxicology  Research Center  University  of  Saskatchewan.  Apex Graphics Saskatoon. 5 - 12.
27. Sipos, P., Szentmihalyi, K., Feher, E., Abaza, M., Szilagyi, M. 2003. Some Effects of Lead Contamination on Liver and Gallbladder Bile.
Acta  Biologica  Szegediensis. 47  (1-4):  139- 142.
28. Toro,  G  &  Ackermann,  P.G.  1975. Practical Clinical Chemistry . Little, Brown and Company. Boston. 539-541.
29. U.S.  Environmental  Protection  Agency  (US- EPA),  1996. Technology  Transfer  Handbook Management of water Treatment Plant Residuals. American  Water  Works  Association. Denver. Colorado. 125-136.
30. Ziegler, E.E., Edwards, B.B., Jensen, R.L. 1978. Absorption  of  Retention  of  Lead  by  Infants. Pediatr. Res 12: 29-34.
31. Zutphen,  L.F.M.,  Baumans,  V.  &  Beynen,  A.C. 1993. Principles  of  Laboratory  Animal Science. Elsevier. Amsterdam. 17-20.