## PENGARUH PENAMBAHAN SITOKININ PADA SENYAWA
FLAVONOID KALUS ( Echinacea purpurea L)
Heru Sudrajad, Saryanto
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional Badan Penelitian dan Pengembang Kesehatan Kementerian Kesehatan RI

## ABSTRAK
Kultur  jaringan  dapat  dimanfaatkan  untuk  menghasilkan  metabolit  sekunder. Echinacea purpurea L merupakan salah satu tanaman obat yang berkhasiat merangsang sistem  kekebalan  tubuh  (imunostimulator).  Tujuan  penelitian  adalah  untuk  mengetahui pengaruh Benzyl aminopurin terhadap kalus dan senyawa flavonoid Echinacea purpurea L  pada  media  Murashige  dan  Skoog  (MS).  Pelaksanaan    penelitian    yaitu  eksplan  dari daun Echinacea  purpurea L  ditumbuhkan  pada  media  MS  yang  diperkaya  dengan  zat pengatur tumbuh Benzyl aminopurin (BAP) dengan konsentrasi 1, 2, 3 dan 4  mg/l. Hasil kalus  yang  diperoleh  kemudian  dilakukan  uji  reaksi  warna  dengan  kertas  kromatografi (kuantitatif),  kemudian  dilanjutkan  dengan  spektrofotometri  (kuantitatif).  Sebagai pembanding  daun  tanaman  asal Echinacea  purpurea L  juga  dilakukan  uji  yang  sama. Hasil yang diperoleh menunjukkan keberhasilan membentuk kalus 80% pada konsentrasi BAP 3 dan 4 mg/l dengan rata-rata waktu induksi kalus 4,7 - 5,6 hari. Hasil reaksi warna menunjukkan  noda  warna merah  yang  menunjukkan  adanya  flavonoid.  Kadar  flavonoid total  kalus Echinacea  purpurea L  pada  konsentrasi  4  mg/l  yaitu  0,28%.    Dari  hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa penambahan BAP dapat meningkatkan pertumbuhan kalus secara kultur jaringan dan mempunyai kadar flavonoid  0,28 % sama  dengan daun Echinacea purpurea L.
Kata kunci : Echinacea  purpurea L, Benzyl aminopurin , Murashige dan Skoog

## PENDAHULUAN
Tanaman obat mempunyai peranan yang sangat besar dalam bidang kesehatan dikarenakan dapat memproduksi zat-zat kimia yang memiliki kegunaan yang potensial dalam pengobatan.
Kultur jaringan dapat dimanfaatkan untuk menghasilkan  metabolit sekunder dari suatu tanaman. Kultur jaringan tanaman hanya mengambil jaringan yang cukup kecil dan pengembangannya di atas media yang sesuai dalam waktu yang relatif singkat (Suryowinoto, 1985). Metabolit sekunder merupakan hasil dari proses biokimia yang terjadi dalam tubuh tanaman. Proses-proses tersebut juga terjadi pada teknik kultur jaringan, oleh karena itu kultur jaringan dapat digunakan sebagai sarana penghasil metabolit sekunder (Dalimoenthe, 1987).
Sitokinin merupakan salah satu dari golongan zat pengatur tumbuh yang berpengaruh terhadap pertumbuhan dengan teknik jaringan. Benzil aminopurin merupakan zat pengatur tumbuh golongan sitokinin. Sitokinin adalah turunan adenin, yang berperan sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis (Gunawan, 1987)
Echinacea purpurea L merupakan salah satu tanaman obat yang berkhasiat merangsang sistem kekebalan tubuh (imunostimulator). Echinacea mengandung komponen kimia seperti polisakarida, flavonoid, turunan caffeic acid ( cicchoric acid,
chlorogenic acid, cinarin, echinoside ), poliasetilen, minyak-minyak esensial dan alkil amida (Anonim, 1987). Kandungan yang lain adalah alkamid pada umumnya isobutilamid, ester asam kafein terutama echinacoside dan cinarin, polisakarida, echinolon, betaine dan minyak atsiri khususnya humulun (Kadans Josep, 1978).
Flavonoid adalah senyawa polifenol yang mengandung 15 atom karbon dalam inti dasarnya yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6, yaitu dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tak dapat membentuk cincin ketiga. Flavonoid merupakan kandungan khas tumbuhan hijau dengan mengecualikan alga (Markham, 1988). Senyawa flavonoid dalam jaringan tumbuhan lazimnya ditemukan sebagai senyawa campuran dan jarang sekali ditemukan sebagai senyawa tunggal (Harborne, 1987). Flavonoid banyak terdapat antara lain dalam familia Poligonaceae, Rutaceae, Leguminosae, Umbeliferae dan Asteraceae (Markham, 1988).
Analisis kuantitatif adalah penentuan jumlah dan kadar suatu zat. Penentuan kadar flavonoid dalam tanaman dapat dilakukan secara spektrofotometri. Prinsip kerjanya adalah pembentukan komplek dengan AlCl 3, sehingga memberikan serapan pada panjang gelombang 425 nm. Dari hal-hal tersebut diatas maka dilakukan penelitian pengaruh penambahan sitokinin pada senyawa fvavonoid kalus Echinacea  purpurea L.

## METODOLOGI

## Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan berupa tanaman Echinacea purpurea L. bahan penyusun  media  MS  (Murashige  &  Skoog),  Benzil  amonopurin  (BAP),  HCl,  KOH, Dithane  M-45    (0,5%),  byclean  10%,  alkohol  70%,  aquadest  steril,  detergen,  spiritus, ethanol, kertas Whatman.

## Alat Penelitian
Alat yang digunakan meliputi Laminair Air Flow (LAF), autoklaf, ruang inkubasi yang  dilengkapi  lampu  TL,  timbangan  analitis,  shaker, hot  plate ,  oven,  botol  kultur, penyemprot, lampu UV, chamber dan Spektrofotometer.

## Jalannya Penelitian
Tanaman Echinacea  purpurea L  diambil  dari  kebun  koleksi  Balai  Besar Penelitian  dan  Pengembangan  Tanaman  Obat  dan  Obat  Tradisional  pada  umur  kurang lebih 5 bulan, tanaman dengan pertumbuhan yang baik, yaitu masih terdapat banyak daun muda,  regenerasi  daun  masih  berjalan  dengan  cepat  dan  tanaman  belum  berbunga. Sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  daun Echinacea  purpurea yang masih  muda,  terletak  pada  daun  yang  ke-2  dan  ke-3.  Tanaman  yang  akan  digunakan sebagai eksplan dikarantina dahulu dalam rumah kaca.
Tahap pertama eksplan dicuci air mengalir, direndam larutan detergen1% selama 3  menit,  dicuci,  direndam  larutan  Dithane  M-45  2-3%.  Kemudian  daun  dibilas  aquades steril  3  kali  dalam  LAF,  dan  dimasukkan  dalam  larutan  byclean  10%  selama  15  menit, dicuci aquadest steril 3-4 kali, selanjutnya eksplan dipindah dalam cawan petridish steril kemudian  dipotong  kecil  ukuran  1  x  1  cm  dengan  pisau  skalpel  dan  siap  ditanam. Tahapan  selanjutnya  penanaman  eksplan,  dilakukan  di  dalam  LAF  yang  sebelumnya sudah  disemprot  dengan  alkohol  dan  disinari  lampu  UV  selama  30  menit.  Eksplan ditanam  pada  media  MS  yang  diperkaya  dengan  zat  pengatur  tumbuh  BAP  dengan konsentrasi 1, 2, 3 dan 4 mg/L.
Tabel I. Komposisi media Murashige dan Skoog (MS) (mg/L)
Makronutrien Mikronutrien
Besi
Vitamin
KNO 3 …………………………………………
NH 4 NO 3 ………………………………………………
CaCl 2 .2H 2 O …………………………………………... MgSO 4 ………………………………………………... KH 2 PO 4 ……………………………………………….
MnSO 4 .4H 2 O ………………………………………… H 3 BO 3 ………………………………………………... ZnSO 4 .4H 2 O …………………………………………. Na 2 MoO 4 .2H 2 O ……………………………………… CuSO 4 .5H 2 O ………………………………………….
CoCl 2 .6H 2 O ………………………………………….. KI………………………………………………………
FeSO 4 .7H 2 O …………………………………………..
Na 2 EDTA.2H 2 O ………………………………………
Niacin ………………………………………………….
Glicine………………………………………………….
Pyridoxine HCl………………………………………… Thiamine HCl ………………………………………….
Myo-Inositol …………………………………………..
Sukrosa ………………………………………………... 1900 1650 440 370 170 22,3 6,2 8,6 0,25 0,025 0,025 0,83 27,8 37,3 0,5 2 0,5 0,1 100 30.000
(Gunawan, 1987)
Eksplan diinkubasi, pengamatan dan pendataan pertumbuhan eksplan dalam inkubator dilakukan secara teratur. Pengamatan dilakukan terhadap perubahan eksplan dan pembentukan kalus. Kalus dipanen utnuk pemerikasaan kandungan flavonoid baik secara kualitatif dan kuantitatif.

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
Berdasar hasil penelitian pengaruh pemberian zat pengatur tumbuh terhadap waktu induksi kalus dan prosentase keberhasilan penanaman eksplan dengan menghitung jumlah eksplan yang berhasil tumbuh membentuk kalus, dibagi jumlah keseluruhan eksplan yang ditanam dikalikan 100%. disajikan pada Tabel II.
Tabel II.  Pengaruh pemberian Benzil aminopurin terhadap waktu induksi kalus dan prosentase keberhasilan membentuk kalus Echinacea purpurea L Perlakuan Waktu induksi kalus rata-rata (hari) Prosentase keberhasilan membentuk kalus (%) Benzil aminopurin 1 mg/l 6,7 70
Benzil aminopurin 2 mg/l 6,0 70 Benzil aminopurin 3 mg/l 5,6 80 Benzil aminopurin 4 mg/l 4,7 80
Pertumbuhan kalus pada media MS yang diperkaya dengan hormon BAP 3 dan 4 mg/l induksi kalus terjadi pada hari ke 5-7 dengan pembentukan kalus yang optimal, ditandai terbentuknya kalus pada seluruh eksplan. Hormon BAP berpengaruh besar terhadap pembentukan kalus dari daun Echinacea purpurea L. Menurut Gunawan (1987), Benzil aminopurin merupakan zat pengatur tumbuh golongan sitokinin, yaitu adalah turunan adenin, yang sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis.
0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 Induksi kalus (hari) Gambar 1. Diagram pengaruh BAP terhadap waktu induksi kalus Echinacea purpurea L
65 70 75 80 1 2 3 4 Keberhasilan membentuk kalus  (%) Gambar 2.  Diagram  pengaruh  BAP  terhadap  prosentase  keberhasilan  membentuk  kalus
Echinacea purpurea L BAP (mg/L) BAP (mg/L)
Gambar 3. Kalus Echinacea purpurea L diperkaya BAP 4 mg/L
Kandungan flavonoid dalam kalus dan daun tanaman asal diperiksa dengan reaksi warna dilanjutkan dengan kromatografi kertas. Hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel III dan IV.
Tabel III. Hasil reaksi warna kalus dan daun Echinacea purpurea L
Sampel Pereaksi Interpretasi Amonia H 2 SO 4 pekat NaOH 10% Tes Willstater BAP 1 mg/l Kuning Merah kekuningan Kuning Hijau Flavonoid BAP 2 mg/l Kuning Merah kekuningan Kuning Hijau Flavonoid BAP 3 mg/l Kuning Merah kekuningan Kuning Hijau Flavonoid BAP 4 mg/l Kuning Merah kekuningan Kuning Hijau Flavonoid Tanaman asal Kuning Merah kekuningan Kuning Hijau Flavonoid
Uji pendahuluan golongan flavonoid dapat dideteksi dengan larutan NH 3 dan memberikan warna spesifik utnuk masing-masing golongan. Setelah ekstrak ditambah dengan larutan amonia terjadi warna kuning baik pada kalus maupun tanaman asal. Hal ini disebabkan karena flavon dan flavonol memberikan warna kuning sampai kuning kemerahan bila direaksikan dengan NH 3 . Antosian akan berwarna merah biru sedangkan flavonol akan memberikan warna orange atau coklat. Warna merah dan lembayung yang terjadi secara tiba-tiba dalam suasana asam disebabkan adanya auron dan khalkon. Pemerikasaan flavonoid pada ekstrak tanaman dengan penambahan HCl kemudian direduksi dengan serbuk Mg memberikan warna dari merah orange, merah atau magenta, terkadang hijau atau biru (Guevara dan Recio, 1985).
Tabel IV. Data kromatografi kertas pada kalus dan daun Echinacea purpurea L
Sampel Nilai Pereaksi Interpretasi hRf UV 366 nm Uap Amonia Pereaksi Sitroborat BAP 1 mg/l 91 Merah jingga Kuning Hijau kekuningan Flavonoid BAP 2 mg/l 91 Merah jingga Kuning Hijau kekuningan Flavonoid BAP 3 mg/l 89 Merah jingga Kuning Hijau kekuningan Flavonoid BAP 4 mg/l 89 Merah jingga Kuning Hijau kekuningan Flavonoid Tanaman asal 89 Merah jingga Kuning Hijau kekuningan Flavonoid
Hasil kromatografi kertas dengan fase gerak n-butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5) adalah bercak berwarna merah jingga pada UV 266 nm. Hal ini menunjukkan bahwa deteksi terhadap bercak tersebut senyawa golongan flavonoid (Robinson, 1995).
Data penetapan kadar flavonoid total pada kalus dengan pertumbuhan mencapai 80% dan daun Echinacea purpurea L dengan metode Christ dan Muller pada Tabel V.
Tabel V. Kadar flavonoid total kalus dan daun Echinacea purpurea L. Sampel Kadar flavonoid total (%) Kalus hasil penambahan BAP 3 mg/l 0,29 Kalus hasil penambahan BAP 4 mg/l 0,28 Daun tanaman asal 0,28
Penetapan kadar flavonoid total dari kalus dan tanaman Echinacea purpurea L hasil perlakuan dengan BAP 3 mg/l diperoleh 0,29%, pada BAP 4 mg/l diperoleh 0,28% dan pada tanaman asal juga 0,28%. Kadar flavonoid tersebut menunjukkan hasil yang hampir sama antara hasil induksi kalus dengan tanaman asal, bahkan pada BAP 3 mg/l terjadi peningkatan. Hal ini menunjukkan bahwa kalus daun yang diperoleh secara kultur jaringan dapat digunakan sebagai alternatif untuk menghasilkan metabolit sekunder.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
1. Pemberian zat pengarur tumbuh BAP berpengaruh nyata terhadap induksi kalus  daun Echinacea purpurea L. dengan waktu induksi kalus rata-rata 5-7 hari
2. Penambahan  BAP  pada  konsentrasi  4  mg/l  diperoleh  waktu    induksi  kalus    rata-rata 4,7 hari dan prosentase keberhasilan membentuk kalus 80 % dengan kadar flavonoid total kalus Echinacea purpurea L yaitu 0,28%.

## Saran
Disarankan untuk dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap asal eksplan dan untuk mengetahui senyawa lain dalam kalus daun Echinacea purpurea L.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1987. Analisis Obat tradisional . Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta
Dalimoenthe, S.L., 1987. Kultur Jaringan Sebagai Sarana untuk Menghasilkan Metabolit Sekunder . Risalah Seminar nasional Metabolit Seknder. PAU Bioteknologi UGM. Yogyakarta
Gunawan L.W. 1987. Teknik Kultur Jaringan . Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman. PAU Bioteknologi. IPB Bogor.
Harborne, J.B,. 1987 . Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan , diterjemahkan oleh Kosasih Padmaewinata dan Iwang Soediro, Edisi II, Penerbit ITB. Bandung
Markham, K.H., 1988. Cara mengidentifikasi Flavonoid , diterjemahkan oleh Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, diterjemahkan oleh Kosasih Padmaewinata dan Iwang Soediro, Edisi II, Penerbit ITB. Bandung
Suryowinoto, 1991. Budidaya Jaringan Tanaman Terobosan Bermanfaat dalam Bioteknologi . Fakultas Biologi. UGM. Yogyakarta.