Desember 2022, Vol. 9 No. 2: 176 – 186
pISSN : 2355-9942, eISSN:2656-792X
Terakreditasi Nasional, Dirjen Pendidikan Tinggi, Riset, dan Teknologi Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset dan Teknologi RI
S.K. No. 105/E/KPT/2022
Received: 13 Agustus 2022, Accepted: 19 Desember 2022
Published online: 21 Desember 2022
Doi: https://doi.org/10.35508/nukleus.v9i2.7953 https://ejurnal.undana.ac.id/index.php/nukleus/article/view/7953

## KUALITAS SEMEN SAPI BALI DENGAN PENAMBAHAN VITAMIN C DAN MINERAL ZN (ZINK) DALAM PENGENCER SITRAT KUNING.TELUR
(Quality of bali bulls semen with the addition of vitamin c and mineral zn (zinc) in egg yolk citrate)
Ansgarius F. Armangun,  Kirenius Uly, Johny Nada Kihe, Henderiana L.L. Belli, Wilmientje

## M. Nalley
Program Studi Peternakan, Fakultas Peternakan, Kelautan, dan Perikanan, Universitas Nusa Cendana Jln. Adisucipto, Penfui, Kupang, Nusa Tenggara Timur, Indonesia 850001
* Correspondent author, email: ulykirenius@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  suplementasi  vitamin  C  dan  mineral  Zn  (Zink)    pada pengencer  sitrat  kuning  telur  (S-KT)  terhadap  motilitas,  viabilitas,  abnormalitas  dan  daya  tahan  hidup spermatozoa  sapi  bali  selama  penyimpanan.  Materi  yang  digunakan  adalah  semen  segar  sapi  bali  yang berkualitas baik, diencerkan dengan pengencer perlakuan yaitu : P0: S-KT – 100% , P1: S-KT + 0,05 g Zn, P2: S-KT + 0,05 g Vitamin C, P3: S-KT + 0,025 g Vitamin C + 0,025 g Zn, semen yang telah diencerkan disimpan pada  suhu  3-5oC.    Evaluasi  pasca  pengenceran  dilakukan  setiap  24  jam  penyimpanan  terhadap  motiltas, viabilitas  dan  abnormalitas.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  suplementasi  mineral  Zn  (Zink)  pada perlakuan  (P1)  mempunyai  kualitas  terbaik  (P<0,05)  dibandingkan  dengan  perlakuan  lainnya,  yaitu  dengan motilitas (43,50 ± 4,87%), viabilitas (52,20 ± 6,76 %,), dan abnormalitas (4,74 ±1,14%) dan daya tahan hidup (6,40±0,89%)  .Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  suplementasi  Zn  0,05  g  pada  pengencer  sitrat-  kuning telur memberikan efek yang cukup baik dalam menjaga kualitas spermatozoa sapi bali.
Kata-kata kunci: sitrat - kuning telur, vitamin C, zink, spermatozoa, sapi bali

## ABSTRACT
This research aims to find out the effect of vitamin C supplementation and Zn mineral (Zinc) in citrate egg yolk dilution (C-EY) on motility, viability, abnormality and endurance of bali bulls spermatozoa during storage. The material  used  is  fresh  sperm  of  good  quality  bali  bulls.  Sement  diluted  with  treatment  diluent  is:  T0:  C-EY  – 100%, T1: C-EY – 0.05 g Zn, T2: C-EY – 0.05 g Vitamin C, T3: C-EY – 0.025 g Vitamin C – 0.025 g Zn, After diluent  semen  is  stored  at  a  temperature  of  3-5oC.  Sperm  is  evaluated  post-dilution  and  every  24  hours  of storage against motility, viability and abnormalities. The results showed that Zn (Zinc) mineral supplementation in  treatment  (T1)  has  the  best  quality  (P<0.05)  compared  to  other  treatments,  namely  with  motility  (43.50  ± 4.87%), viability (52.20 ± 6.76%,), abnormalities (4.74 ±1.14 %.) and durability (6,40±0,89 days). The results of  this  study  showed  that  Zn  0,05  g  in  citrate-yolk  a  fairly  good  influence  in  maintaining  the  quality  of spermatozoa of bali bulls.
Keywords: citrate-egg yolk, vitamin C, zinc, spermatozoa, bali bulls

## PENDAHULUAN
Keberhasilan  inseminasi  buatan  (IB) ditentukan faktor kualitas semen, jenis pengencer, tahapan preservasi semen, pelaksana IB  (inseminator),  ketepatan  dan  kecermatan deteksi  estrus  (Toelihere,  2006).  Selanjutnya dinyatakan  bahwa  masalah  yang  sering  timbul dalam proses preservasi semen adalah spermatozoa  mengalami  kejutan  dingin  (cold shock)  sehingga  mengakibatkan  kerusakan
bahkan  terjadi  kematian  spermatozoa.  Menurut Garner  dan  Hafez  (2000)  pada  suhu  ruang spermatozoa mempunyai daya tahan hidup yang sangat  pendek  yakni  berkisar  2-3  jam.  Semen yang  akan  disimpan  dalam  suhu  ruang,  harus ditambahkan bahan pengencer yang sesuai untuk menekan  laju  penurunan  kualitas  semen  yakni motilitas  dan  daya  tahan  hidup  spermatozoa. Jenis  pengencer  yang  biasa  digunakan  dalam
proses  preservasi  baik  semen  cair  maupun semen beku adalah pengencer dasar sitrat kuning telur.    Pemanfaatan  sitrat-kuning  telur  dalam pengenceran  semen  yakni  sitrat  berfungsi sebagai  buffer  dan  kuning  telur  sebagai  sumber lesitin  dan  lipoprotein  berperan  mencegah kejutan  dingin  (cold  shock)  akibat  penurunan temperatur  yang  relatif  cepat  (Afiati et  al ., 2013).  Natrium  sitrat  merupakan  penyangga yang  mampu  mempertahankan  kestabilan  pH pengencer,  sedangkan  kuning  telur  bermanfaat sebagai  sumber  energi  dan  lipoprotein  yang dapat memberikan perlindungan terhadap spermatozoa selama proses preservasi (Pubiandara et al ., 2016).
Vitamin  C  dapat  menangkap.radikal bebas,  mencegah  terjadinya  reaksi  rantai sehingga  spermatozoa  terhindar  dari  kerusakan
perosidatif  yang  dapat  mempengaruhi  viabilitas serta fertilitas spermatozoa (Aslam et al ., 2014). Pemberian  mineral  Zn  (Zink)  merupakan mineral penting pada beberapa respon enzimatik yang  terkait  dengan  metabolisme  karbohidrat, sintesis  protein  serta  metabolisme  asam  nukleat (Abbasi et  al .,1980).  Selain  itu,  mineral  Zn (Zink) juga mempunyai fungsi sebagai antioksidan serta sebagai imunostimulan sehingga dapat dipakai dalam proses pengenceran  semen.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mengetahui  kualitas  semen  sapi  bali setelah  ditambahkan  vitamin  C  dan  mineral  Zn (Zink) serta mengetahui kualitas semen sapi bali dalam  pengencer  sitrat  kuning  telur  yang disuplementasi  dengan  vitamin  C  dan  mineral Zn.

## METODE PENELITIAN

## Materi Penelitian
Penelitian menggunakan semen segar sapi bali  yang  diperoleh  dari  seekor  sapi  bali  jantan umur  3  tahun,  kondisi  sehat,  memiliki  organ reproduksi  normal  serta  sudah  terlatih  untuk penampungan  semen.  Sapi  tersebut  dipelihara dalam kandang individu yang dilengkapi dengan tempat  pakan  dan  minum.  Pakan  hijauan diberikan  10%  dari  berat  badan  (basis  bahan segar)  konsentrat  0,5  kg/  hari  air  minum diberikan add libitum.

## Metode Penelitian
Penelitian dirancang menggunakan rancangan  acak  lengkap  (RAL)  dengan  4 perlakuan  dan  5  ulangan.  Perlakuan  yang  diuji adalah  :  P0  =    Sitrat  kuning  telur  100%,  P1  = Sitrat  kuning  telur  100%  +  Zn  0,05  gram,  P2 = Sitrat  kuning  telur  100%  +  Vitamin  C  0,05 gram,P3 =  Sitrat kuning telur 100% + Vitamin C 0,025 gram  + Zn 0,025 gram.

## Persiapan Pengencer Natrium Sitrat
Natrium  sitrat  (Na3C6H5O7)  sebanyak 2,9  gram  dimasukkan  ke  dalam  tabung erlenmeyer  dan  tambahkan  aquades  sampai dengan  100  ml.  Campuran  dilarutkan  hingga homogen  menggunakan  stirrer  dan  spin  bar. Pembuatan  pengencer  sitrat,  ambil  80  mL larutan sitrat dan tambahkan 20 mL kuning telur, di  campur  menggunakan  stirrer,  kemudian tambahkan antibiotik.
Penambahan  antibiotik  penicillin  dan streptomycin
Antibiotik  penicillin  0,5  ml    dan streptomycin 0,4 mg/mL ditambahkan ke dalam setiap  tabung  yang  berisi  pengencer  kemudian tabung  digoyangkan  agar  tercampur  hingga homogen dan  pengencer siap digunakan.

## Persiapan Kuning Telur
Telur ayam kampung yang baik, dibersihkan dengan kapas yang dibasahi dengan alcohol  70%.  Telur  dipecahkan  dibagian  sudut lancipnyatuangkan  seluruh  putih  telur  serta pisahkan dari kuning telur. Selanjutnya bersihkan  sisa  putih  telur  dengan  kuning  telur yang masih terbungkus oleh membrane viteline, dengan metode menempatkan pada kertas saring supaya  seluruh  putih  telur  terserap  habis. Pecahkan  selaput  vitelinnya,  setelah  itu  kuning telur dimasukkan ke dalam gelas ukur serta siap dimanfaatkan sesuai dengan kebutuhan.

## Persiapan vitamin C
Vitamin  C  dihaluskan  menggunakan ulekan obat hingga halus. Setelah halus vitamin C  diletakkan  diatas  alluminium  foil  untuk ditimbang  menggunakan  timbangan  analitik. Dosis vitamin C ditimbang sesuai perlakuan lalu dimasukkan  ke  dalam  masing-masing  tabung perlakuan.  Dosis  penambahan  vitamin  C perlakuan 2 (P2) 0,05 g/mL dan pada perlakuan 3 (P3) 0,025 g/mL.
Persiapan mineral Zn (Zink)
Mineral Zn
(Zink) dihaluskan menggunakan ulekan obat hingga halus. Setelah halus  mineral  Zn  (Zink)  diletakkan  dalam alluminium  foil  untuk  ditimbang  menggunakan timbangan  analitik.  Dosis  mineral  Zn  (Zink) ditimbang  sesuai  perlakuan  lalu  dimasukkan  ke dalam masing-masing tabung perlakuan. Penambahan  mineral  Zn  (Zink)  pada  perlakuan 1  (P1)  0,05  g/mL  dan  pada  perlakuan  3    (P3) 0,025 g/mL.

## Penampungan
Saat sebelum melaksanakan penampungan  menggunakan  vagina  buatan terlebih  dulu  mempersiapkan  air.panas  bersuhu 50  -  55oC,  setelah  itu  air  panas  dimasukan melalui  klep  vagina  buatan  hingga  ¾  bagian kemudian  klep  ditutup.  Setelah  itu  udara dimasukkan menggunakan metode meniup pada klep.  Beri  pelicin  pada  bagian  muka  vagina buatan.  Temperatur  pada  vagina  buatan  diatur pada suhu 42-44o C. Pasang tabung penampung pada  corong  vagina  buatan,  ikat  kuat-kuat dengan  karet.  Bungkus  tabung  penampung dengan memakai tisu supaya tidak terkena sinar matahari  langsung.  Setelah  vagina  buatan disiapkan,  berikutnya  penampungan  semen  bisa dilakukana.  Ternak  sapi  betina  ditempatkan dalam  kandang  jepit,  sapi  jantan  didekatkan dengan sapi betina. Saat sapi jantan menaiki sapi betina arahkan penisnya masuk ke dalam vagina buatan.  ejakulasi  terjadi  bila  terjadi  gerakan dorongan  yang  keras  dari  sapi  jantan,  lepaskan vagina  buatan  bertepatan  dengan  turunnya  sapi jantan  dari  sapi  betina.  Bila  semen  kelihatan pada  tabung  penampung,  lakukan  gerakan menyerupai angka 8 supaya seluruh semen turun serta  tertampung  di  tabung  penampung.  Semen yang diperoleh langsung dibawa ke laboratorium untuk dievaluasi.

## Evaluasi Semen
Evaluasi  semen  secara  makroskopis adalah  warna  semen  dapat  dilihat langsung  dari gelas  ukur  saat  penampungan  spermatozoa dilakukan.  Umumnya  spermatozoa  berwarna putih  susu.  Bau  sperma  dapat  diketahui  dengan cara  mendekatkan  semen  ke  hidung  untuk mengetahui  aromanya.  Volume  sperma  dapat diukur  dengan  mengamati  angka  pada  tabung penampung berskala. Konsistensi dinilai dengan memiringkan  tabung  yang  berisi  semen  dan mengembalikan pada posisi semula. Konsistensi dapat  dinilai  berdasarkan  kecepatan  semen
kembali ke dasar tabung penampung, penilaiannya  dikategorikan  dalam  tiga  jenis yaitu:  encer,  sedang  dan  kental.  Derajat keasaman  (pH)  dapat  diketahui  dengan  cara meneteskan  semen  di  atas  kertas  indikator dengan skala 1-14. Perubahan warna pada kertas pH  tersebut  disesuaikan  dengan  standar  warna pada kertas indikator
Evaluasi secara mikroskopis adalah gerakan  masa  bergerak  cepat  (+++),  yaitu pergerakan  masa  spermatozoa  yang  terlihat menyerupai  awan  tebal,  bergerak  agak  lambat (++)  merupakan  pergerakan  masa  spermatzoa menyerupai  awan  tipis  serta  bergerak  lambat (+).  Konsentrasi  spermatozoa  menunjukkan jumlah  sel  spermatozoa  tiap  satuan  volume semen  diamati  di  bawah  mikroskop  dengan pembesaran 40×10.
Konsentrasi spermatozoa dihitung dengan menggunakan haemocytometer. Konsentrasi spermatozoa = 𝑋 × 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑠𝑝𝑒𝑟𝑚𝑎𝑡𝑜𝑧𝑜𝑎 ×106 sperma/ml  .  X  =  jumlah  spermatozoa  hasil perhitungan.
Presentase motilitas spermatozoa ditentukan  melalui  pengamatan  spermatozoa ditentukan  melalui  pengamatan  spermatozoa  di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 40 x 10. Penilaian diberikan mulai nol persen (tidak ada  spermatozoa  yang  bergerak  ke  depan) sampai  100%  (semua  spermatozoa  bergerak  ke depan).
Viabilitas    dihitung  dengan  melihat jumlah  spermatozoa  yang  hidup  dan  mati menggunakan
media
eosin-negrosin.
Spermatozoa hidup ditandai dengan spermatozoa  tidak  menyerap  warna  merah (bening  atau  putih),  sedangkan  spermatozoa mati  akan  menyerap  eosin-negrosin  dan  terlihat berwarna merah ungu.
Perhitungan  nilai  viabilitas  diperoleh sesuai rumus:  .
Abnormalitas dapat diketahui dengan cara semen diwarnai dengan melihat bentuk morfologi  spermatozoa  yang  tidak  normal  baik abnormalitas primer maupun sekunder.

## Variabel Penelitian
Variabel  yang  diukur  pada  penelitian  ini yaitu:
1.  Motilitas  spermatozoa  (%)  adalah presentase spermatozoa yang bergerak progresif pada  suatu  lapang  padang.  Penilaian  yaitu dengan  memberikan  angka  berkisar  antara  0- 100% dengan skala 5%.
2. Abnormalitas spermatozoa (%) perhitungan
dilakukan dengan cara menempatkan preparat hasil pewarnaan differensial  di  bawah  mikroskop  dan  diamati dengan  pembesaran  10  x  40,  sebanyak  kurang lebih 200 sel sperma. Abnormalitas dapat terjadi pada bagian kepala ataupun ekor spermatozoa.
3.  Viabilitas  spermatozoa  (%)  diketahui dengan  mengamati  preparat  hasil  pewarnaan differensial (eosin-negrosin) menggunakan mikroskop. Spermatozoa hidup memiliki kepala berwarna  putih  sedangkan  yang  mati  berwarna merah.
4.  Daya  tahan  hidup  ditandai  dengan adanya motilitas  dan  daya gerak  yang  dijadikan patokan  atau  cara  yang  mudah  dan  sederhana dalam  penilaian  semen  untuk  IB,  gerakan individu  yang  terbaik  adalah  gerakan  progresif maju  ke  depan.  Persentase  motilitas  semen  di bawah  40%  menunjukan  semen  yang  kurang baik dan sering dihubungkan dengan infertilitas.

## Analisis Data
Data  yang  diperoleh  dianalisis  dengan analisis ragam dan dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan  menggunakan  paket    software  IBM SSPS statistics 25 for windows.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik semen segar sapi bali
Karateristik  semen  segar  yang  diperoleh dari 5 kali penampungan memiliki rerata volume
3,64 ± 0,93 mL, konsistensi sedang dan motilitas 77,00 ± 2,09% (Tabel 1).
Tabel 1. Karakteristik semen segar sapi bali
Karakteristik . semen Rerata ± standar deviasi Makroskopis Volume (mL) 3,64 ± 0,93 Warna Bau Krem Khas Konsistensi Sedang pH 6,40 ± 0,00 Mikroskopis Gerakan Massa ++ - +++ Konsentrasi ( x 10 6 sel/mL) 1062,00 ± 95,23 Motilitas (%) 77,00 ± 2,09 Viabilitas (%) 86,55 ± 1,05 Abnormalitas (%) 5,79 ± 1,21
Hasil penilaian semen segar pada Tabel 1 bahwa hasil uji makroskopis dan uji mikroskopis  semen  segar  sapi  bali  yang ditampung  mempunyai  kualitas  yang  baik  dan memenuhi persyaratan untuk diencerkan.
Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa rataan  volume  sperma  segar  sapi  bali  adalah 3,64  ±  0,93  dengan  kisaran  3-5  ml.  Dapat dikatakan  bahwa  hasil  tersebut  berada  dalam kisaran  normal.  Hasil  ini  sesuai  dengan pernyataan  Garner  dan  Hafez  (2000)  yang menyatakan bahwa volume semen sapi bervariasi,  setiap  penampungan  antara  1-15 mililiter  atau  5-8  mililiter  setiap  ejakulasi. Volume  sperma  setiap  ejakulasi  berbeda-beda dapat disebabkan oleh berbagai faktor, misalnya umur,  suhu,  bangsa,  tingkatan  makanan,
frekuensi penampungan, ukuran testis dan tubuh ternak.  Frekuensi  ejakulasi  tinggi  atau  ejakulasi yang  terlampau  sering  dapat  menyebabkan penurunan volume.
Warna semen segar adalah krem. Hasil ini sesuai dengan pendapat dari Seuk (2018) bahwa semen  sapi  biasanya  berwarna  keputih-putihan atau  krem  dan  ada  beberapa  jenis  sapi  yang semennya berwarna agak kuning. Kira-kira 10% sapi  menghasilkan  semen  yang  normal  dengan warna  kekuning-kuningan,  yang  disebabkan oleh  riboflavin  yang  dibawa  oleh  satu  gen autosom  resesif  dan  tidak mempunyai  pengaruh terhadap fertilitas.
Bau  yang  diperoleh  selama  penelitian adalah  normal,  berbau  khas  sperma  ternak.  Hal ini  sesuai  dengan  pendapat  Nur  (2019)  yang
menyatakan  bahwa  semen  yang  normal  pada umumnya  memiliki  bau  khas  disertai  dengan bau    dari  ternak  itu  sendiri.  Bau  tesebut menunjukan  semen  tersebut  dalam  keadaan normal dan tidak terdapat kontaminasi (Inonie et al ., 2016).
Konsistensi  semen  segar  yang  diperoleh termasuk  dalam  kategori  sedang.  Konsistensi semen  sapi  dan  domba  kental  dan  berwarna krem  (Feradis,  2010).  Konsistensi  semen berkisar dari kental berwarna krem (1.000-2.000 sel  spermatozoa  per  mL),  encer  berwarna  susu (500-600 juta sel spermatozoa per mL), cair dan sedikit  keruh  (sekitar  100  juta  sel  spermatozoa per  mL)    dan  jernih  seperti  air  kurang  dari  50 juta sel spermatozoa per ml.
Derajat  keasaman  atau  pH  semen  segar yang  diperoleh  adalah  6,40  ±  0,00.  Hasil  ini sesuai  dengan  hasil  yang  diperoleh  Mila et  al . (2022) yakni pH semen sapi berkisar antara 6,2- 6,8.  Derajat  kesamaan  sangat  berpengaruh  pada daya  tahan  hidup  dari  spermatozoa.  pH  semen segar  Sapi  Bali  yang  digunakan  sebagai  bahan penelitian  dapat  dikatakan  normal.  Feradis (2010)  menyatakan  pH  semen  dapat  berbeda antar bangsa sapi.
Gerakan  massa  semen  segar  sapi  bali yang  diperoleh  (Tabel  1)  memiliki  nilai  ++  - +++.  Ducha et  al .  (2013)  menyatakan  bahwa persyaratan  gerakan  massa  semen  agar  dapat diproses  minimal  ++.  Hasil  pengamatan  yang diperoleh  menunjukkan  gerakan  massa  semen segar  sapi  angus  masih  dalam  kisaran  normal. Konsentrasi sperma pada semen segar dari hasil penelitian  ini  mencapai  1.062,00  ±  95,23 sel/mL. Hasil ini masih termasuk dalam kisaran normal  sesuai  dengan  hasil  laporan  penelitian Ismaya  (2014)  yang  menjelaskan  bahwa konsistensi  sedang  hingga  kental  atau  warna
krem  maka  konsentrasi  spermatozoa  berkisar 1.000-2.000 Juta spermatozoa/mL.
Motilitas merupakan daya gerak spermatozoa  untuk  sampai  ke  tempat  fertilisasi sekaligus  merupakan  patokan  dalam  penilaian kualitas  spermatozoa  untuk  inseminasi  buatan. Motilitas  sangat  penting  untuk  diketahui  demi keberhasilan  dari  suatu  perkawinan.  Motilitas spermatozoa  sapi  bali  yang  dipeoleh  pada penelitian ini adalah 77,00 ± 2,09% menunjukkan  motilitas  yang  cukup  tinggi  dan dalam kisaran normal. Menurut Toelihere (1993) motilitas individu semen segar yaitu 50-80%.
Viabilitas  spermatozoa  semen  segar  sapi yang  diperoleh  dalam  penelitian  adalah 86,55 ± 1,05%, hasil ini tidak berbeda jauh dengan hasil penelitian Rizal (2009) yang melaporkan bahwa viabilitas spermatozoa sapi bali sebesar 86,75%, Labetubun dan Siwa (2011) 86,75% dan Siahaan et  al .  (2012)  85%.  Menurut  pendapat  Toelihere (1993)  bahwa,  semen  yang  layak  digunakan untuk  inseminasi  buatan  (IB)  harus  memiliki presentase spermatozoa hidup  diatas 50%.
Abnormalitas  semen  sapi  bali  rata-rata 5,79  ±1,21%.  Dari  hasil  penelitian  persentase abnormalitas  menunjukkan  bahwa  semen  segar layak  untuk  diproses  lebih  lanjut  karena  sesuai dengan pernyataan Toelihere (1993) abnormalitas  spermatozoa  tidak  boleh  melebihi 20%. Dapat dikatakan kualitas semen segar yang digunakan adalah semen yang memiliki kualitas baik.

## Pengaruh  perlakuan  terhadap  motilitas spermatozoa
Motilitas  atau  daya  gerak    spermatozoa merupakan salah satu parameter yang digunakan pada  penilaian  kualitas  semen.  Rataan  motilitas spermatozoa  sapi  bali  berdasarkan  perlakuan dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Pengaruh perlakuan terhadap motilitas spermatozoa (%)
Hari ke Perlakuan P Value P0 P1 P2 P3 0 78,50 ± 2,23 a 77,00 ± 5,41 a 78,50 ± 2,23 a 79,00 ± 1,36 a 0,780 1 73,00 ± 2,09 a 74,00 ± 2,23 a 74,50 ± 1,11 a 73,00 ± 2,09 a 0,538 2 67,50 ± 2,50 b 69,00 ± 3,79 b 66,00 ± 2,85 ab 63,00 ± 2,73 a 0,036 3 60,50 ± 1,11 ab 63,00 ± 4,80 b 59,50 ± 1,11 ab 56,50 ± 6,02 a 0,112 4 52,50 ± 3,53 a 57,00 ± 4,47 a 51,50 ± 4,18 a 49,00 ± 9,45 a 0,228 5 45,00 ± 5,86 ab 50,00 ± 3,95 b 42,50 ± 5,59 ab 41,00 ± 8,21 a 0,142 6 35,50 ± 5,70 a 43,50 ± 4,87 b 33,50 ± 6,75 a 34,00 ± 5,75 a 0,051 7 25,50 ± 5,12 a 34,50 ± 6,22 a 24,00 ± 6,91 a 25,00 ± 9,35 a 0,164
a,b Superskrip dengan huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (p<0,05)
Hasil analisis statistik menunjukan bahwa motilitas  spermatozoa  berbeda  tidak  nyata (P>0,05) pasca pengenceran, setelah penyimpanan satu, empat, dan tujuh hari namun berbeda nyata ( P<0,05) pada penyimpanan dua, tiga,  lima,  dan  enam    hari.  Hal  ini  menandakan bahwa  adanya  interaksi  antara  pengencer  dan spermatozoa.  Penambahan  vitamin  C    dan mineral  Zn  (Zink)  pada  P1,  P2  dan  P3 memberikan pengaruh yang signifikan.
Perlakuan  P1  mampu  mempertahankan rerata  motilitas  spermatozoa  lebih  tinggi  yaitu hari  pertama  74,00  ±  2,23%,  kedua  69,00  ± 3,79%, ketiga 63,00 ± 4,80 %, keempat 57,00 ± 4,47 %, kelima 50,00 ± 3,95b%, keenam 43,50 ± 4,87%, dan ketujuh 34,50 ± 6,22  % dibandingkan  P0  yang  tanpa  ditambahkan mineral  Zn  (Zink).  Tingginya  persentase motilitas  P1  dibandingkan  P0  diduga  karena adanya  penambahan  mineral  Zn  (Zink)  yang berperan  sebagai  antioksidan  yang  mampu melindungi  sperma  dari  radikal  bebas  yang dapat  menyebabkan  kerusakan  membran  dan menghambat  fosfolifase  pada  peroksidase  lipid. Hal  ini  didukung  oleh  pernyataan  Iwasaki  dan Gagnon  (1992)  yang  menyatakan  bahwa pemberian mineral Zn (Zink) dapat meningkatkan  motilitas  sperma.  Mineral  Zn (Zink)  dapat  menyediakan  energi  gerak  bagi sperma sehingga sperma lebih aktif. Mineral Zn (Zink)  berfungsi  terhadap  kerja  enzim-enzim metabolisme  sel  sperma  untuk  menghasilkan energi  (ATP).  Mineral  Zn  (Zink)  juga  berperan sebagai  antioksidan  yang  mampu  melindungi sperma dari radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan membran dan menghambat  fosfolifase  pada  peroksidase  lipid. Mineral Zn (Zink) sebagai antioksidan bertanggung  jawab  untuk  perbaikan  motilitas sperma.  Melalui  suplementasi  mineral  Zn (Zink), kerusakan akibat oksidasi dapat dikurangi (Syarifuddin et al . 2017).
Persentase  sperma  motil  pada  perlakuan P0,  P2  dan  P3  dalam  penelitian  ini  dapat dipertahankan  di  atas  40%  dalam  sampai  pada penyimpanan  hari  ke  lima  yakni  berturut-turut sebesar  45,00  ±  5,86  %,    42,50  ±  5,59%,  dan 41,00  ±  8,21%  .  Sebaliknya  P1  dapat dipertahankan  sampai  penyimpanan  hari  ke enam, yakni 43,50 ± 4,87% (Tabel 2). Motilitas sperma  setelah  penyimpanan  lima  hari  pada sebesar  42,50  ±  5,59%  dan  pada  P3  sebesar 41,00 ± 8,21 lebih rendah dari P0 sebesar 45,00
±  5,86  %.      Perbedaan  ini  kemungkinan penambahan  vitamin  C  dalam  pengencer sebanyak  0,025-0,05  gram  tidak  ideal  untuk kehidupan spermatozoa. Penurunan motilitas ini diduga  berhubungan  dengan  vitamin  C  atau asam  askorbat  yang  terkandung  di  dalamnya bersifat  asam  dan  juga  kandungan  antioksidan dalam  jumlah  banyak  dapat  bersifat  prooksidan sehingga akan mengakibatkan penurunan motilitas.  Spermatozoa  sangat  peka  terhadap perubahan  pH  medium  dari  keadaan  netral, terutama  terhadap  pH  rendah.  Savitria et  al . (2014) juga berpendapat bahwa dosis antioksidan yang terlalu banyak dapat berpengaruh  terhadap  laju  oksidasi  yang menyebabkan  aktivitas  antioksidan  menghilang bahkan  antioksidan  yang  berlebihan  dapat menjadi peroksidan. Pada perlakuan P3 menunjukkan bahwa persentase motilitas spermatozoa  lebih  rendah  secara  tidak  nyata (P>0,05)  dari  P0  dan  P2  namun  lebih  rendah secara  nyata  (P<0,05)  dari  P1.  Persentase motilitas  P3  terlihat  bertahan  pada  hari  ke  lima dengan  persentase  motilitas  41,00  ±  8,21%. Memasuki  hari  ke  enam  motilitas  P3  berada  di bawah  40%  dengan  nilai  34,00  ±  5,75%.  Hasil ini  menunjukkan  bahwa  penambahan  vitamin  C 0,025  g  dan  mineral  Zn  (Zink)  0,025  g  dalam pengencer  S-KT  dapat  menurunkan  persentase motilitas.  Hal  ini  diduga  karena  penambahan vitamin  C  0,05  g  yang  bersifat  asam  dengan kandungan  antioksidan  dalam  jumlah  banyak dapat bersifat peroksidan sehingga akan mengakibatkan  penurunan  motilitas.  Menurut Gordon  (1990)  besar  konsentrasi  antioksidan yang  ditambahkan  dapat  berpengaruh  pada  laju oksidasi, selain itu menambahkan pada konsentrasi  tinggi,  aktivitas  antioksidan  sering lenyap  bahkan  antioksidan  tersebut  menjadi peroksidan.
Pengaruh  perlakuan  terhadap  viabilitas spermatozoa
Viabilitas merupakan daya hidup spermatozoa sebagai indikator kualitas spermatozoa  (Sukmawati et  al .,  2014).  Nilai Viabilitas  spermatozoa  dari  hasil  penelitian dapat  dilihat  pada  Tabel  3.  Dari  Tabel  3  dapat dilihat adanya penurunan nilai viabilitas. Namun penurunan  tidak  sama  pada  masing-masing perlakuan.

## Tabel 3. Pengaruh perlakuan terhadap viabiltas spermatozoa (%)
Hari ke . Perlakuan P-Value P0 P1 P2 P3 0 87,33 ± 2,66 87,81 ± 3,96 85,35 ± 1,12 86,76 ± 1,36 0,447 1 81,60 ± 4,07 82,86 ± 1,76 81,16 ± 2,15 81,75 ± 3,58 0,837 2 75,13 ± 4,15 77,88 ± 2,86 75,38 ± 4,26 72,92 ± 3,23 0,247 3 69.87 ± 3,96 71,83 ± 7,34 67,39 ± 5,43 67,19 ± 6,36 0,567 4 60,05 ± 3,68 64,42 ± 5,84 61,04 ± 9,16 58,18 ± 8,65 0,586 5 54,69 ± 6,69 57,40 ± 6,58 53,97 ± 9,71 51,75 ± 10,20 0,769 6 34,16 ± 8,84 52,20 ± 6,76 44,93 ± 11,27 43,30 ± 6,72 0,444 7 45,72 ± 10,31 44,71 ± 8,78 35,23 ± 9,86 31,30 ± 9,68 0,162
a,b Superskrip dengan huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (p<0,05)
Viabilitas adalah daya hidup spermatozoa sebagai indikator kualitas spermatozoa Sukmawati  (2014)  menyatakan  bahwa  semakin tinggi presentase viabilitas semen maka semakin baik  kualitas  semen  tersebut.  Hasil  analisis statistik  terhadap  viabilitas  spermatozoa  pada setiap  perlakuan  menunjukan  perbedaan  yang tidak  nyata  (P>0,05)  dari  hari  0  sampai  dengan hari ke 7. Rerata persentase viabilitas spermatozoa  sapi  bali  dalam  pengencer  S-KT pada  setiap  perlakuan  mengalami  penurunan seiring  lama  waktu  penyimpanan.  Pada  Tabel  3 terlihat  persentase  viabilitas  spermatozoa  sapi bali dalam pengencer S-KT dengan penambahan mineral  Zn  (Zink)  0,05  g  pada  perlakuan  P1 lebih  baik  dibandingkan  dengan  P2  (vitamin  C 0,05 g) dan P3 ( Zn 0,025 g dan vitamin C 0,025 g) serta P0 tanpa penambahan mineral Zn (Zink) dan  vitamin  C.  Persentase  viabilitas  pada  P1 mampu  bertahan  sampai  hari  ke  enam  dengan nilai  52,20  ±  6,76%  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  P0  (45,72  ±  10,31%),  P2  (  44,93  ± 11,27%)  dan  P3  (  43,30  ±  6,72%).  Hal  ini menunjukkan  peranan  dari  mineral  Zn  (Zink) terhadap  kerja  enzim-enzim  metabolisme  sel sperma  untuk  menghasilkan  energi  (ATP)  serta berperan  sebagai  antioksidan  yang  mampu melindungi  sperma  dari  radikal  bebas.  Nutrisi akan  digunakan  oleh  spermatozoa  untuk dijadikan  energi  sehingga  apabila  kebutuhan nutrisi  spermatozoa  berkurang  maka  akan mengakibatkan viabilitas spermatozoa menurun. Dalam penelitian ini digunakan pengencer S-KT yang  dapat  mengendalikan  larutan  penyanggah dalam  mempertahankan  pH  larutan.  Sitrat berperan  sebagai  buffer  yang  berfungsi  untuk mempertahan  pH  selama  proses  penyimpanan pada  suhu  dingin  untuk  preservasi  daya  tahan hidup  dan  fertilitas  spermatozoa  (Garner  dan Hafez,  2000).  Salisbury  (1984)  menyatakan
bahwa  Citrate  natricus  akan  mengikat  kalsium dengan logam-logam berat lainnya dan menyebabkan  butiran-butiran  lemak  di  dalam sel-sel  sperma  dapat  diobservasi  dibawah mikroskop.  Kuning  telur  berfungsi  sebagai pelindung spermatozoa terhadap kejutan dingin/cold  shock  dan  sebagai  sumber  energi bagi pergerakan spermatozoa. Komposisi utama kuning  telur  adalah  terdiri  dari  air,  lemak, karbohidrat,  mineral,  vitamin  dan  protein, termasuk  sempurna  karena  mengandung  semua jenis  asam  amino  esensial  dalam  jumlah  yang cukup besar, selain itu kuning telur mengandung lipoprotein dan lesitin yang dapat melindungi sel spermatozoa dari kejutan dingin ( Kommisrud et al ., 2002)
Pada Tabel 3 menunjukan bahwa ketersediaan  mineral  Zn  (Zink)  0,05  g  dalam pengencer SKT dapat mempertahankan persentase  viabilitas  spermatozoa.  Hal  ini disebabkan  karena  mineral  Zn  (Zink)  berperan sebagai antioksidan mampu melindungi spermatozoa  dari  radikal  bebas  yang  dapat menyebabkan kerusakan membran dan menghambat  fosfolipase  pada  peroksidase  lipid (Syarifuddin et al ., 2017). Pemberian mineral Zn meningkatkan  motilitas  sperma,  mengaktifkan kerja  enzim  metabolisme  untuk  menghasilkan energi  yang  bagi  aktifitas  gerak  spermatozoa. Spermatozoa  dengan  motilitas  tinggi  memiliki peluang yang tinggi untuk membuahi (fertilisasi).
Selama  pengamatan  terjadi  penurunan viabilitas  di  setiap  perlakuan.  Hal  ini  dapat terjadi  karena  berbagai  faktor  misalnya  secara almiah  sel  akan  mengalami  kematian,  sperma mengalami  stress  pada  waktu  pengenceran  dan sperma segar mengalami penurunan kualitas dan jumlah  sperma  mati  lebih  banyak  setelah penyimpanan  2  hari  (Yani et  al .,  2001).
Pemberian dosis mineral (Zn) 0,05 ini didukung oleh  penilitian  terdahulu  oleh  Payaran et  al . (2014) pada mencit dengan dosis 10 mg, 20 mg, 30  mg,    dengan  dosis  terbaik  30  mg  yang  jika dikonversikan  ke  gram  menjadi  0,03  g. Penelitian  pada  sapi  diberikan  dengan  dosis yang  lebih  besar  dibandingkan  pada  mencit karena  volume  dan  konsentrasi  spermatozoa pada  sapi  lebih  banyak  dibandingkan  pada mencit.

## Pengaruh  perlakuan.terhadap  abnormalitas spermatozoa
Salah  satu  indikator  penting  diketahui dalam  menentukan  kualitas  spermatozoa  adalah persentase  abnormalitas  spermatozoa,  karena struktur  sel  yang  abnormal  akan  menyebabkan terjadinya  gangguan  ketika  fertilisasi  (Afiati et al .,  2015).  Nilai  anormalitas  spermatozoa  sapi bali selama penilitian disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4. Pengaruh perlakuan terhadap abnormalitas spermatozoa (%)
Hari ke . Perlakuan P-Value P0 P1 P2 P3 0 3,98 ± 0,76 3,54 ± 0,83 3,99 ± 0,74 4,35 ± 1,40 0,631 1 4,09 ± 0,80 3,86 ± 0,71 4,11 ± 0,55 3,93 ± 0,75 0,928 2 3,87 ± 1,25 4,01 ±0,75 4,74 ±1,50 4,23 ±0,82 0,639 3 4,31 ± 1,29 4,35 ± 0,89 4,85 ± 1,09 4,80 ± 1,00 0,791 4 4,49 ± 1,25 4,29 ± 0,98 4,79 ± 0,96 4,98 ± 1,14 0,764 5 4,39 ± 1,54 4,60 ± 0,89 4,64 ± 1,36 4,93 ± 1,25 0,927 6 4,65 ± 1,72 4,74 ±1,14 4,98 ± 1,39 5,06 ± 1,08 0,958 7 5,14 ± 1,45 5,15 ± 0,92 5,53 ± 1,37 5,35 ± 1,01 0,950
a,b Superskrip dengan huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (p<0,05)
Hasil analisis statistik terhadap abnormalitas pada semua perlakuan menunjukan perbedaan yang tidak nyata (P>0,05) dari hari 0 sampai  dengan  hari  ke  7.  Rerata  persentase abnormalitas  spermatozoa  dalam  semua  dan setiap perlakuan pengencer mengalami kenaikan selama waktu penyimpanan.
Tabel  4  menunjukkan  bahwa    kenaikan persentase abnormalitas tidak terlalu drastis dan tergolong rendah dimana terlihat pada pengamatan  hari  ke  0  sampai  pengamatan  hari ke  7  setelah  penyimpanan  pada  suhu  3-5oC menunjukkan  rentang  persentase  abnormalitas berada  dalam  kisaran  normal  yaitu kurang    dari 20%  dengan  kisaran  persentase  abnormalitas 3,54  ±  0,83  -  5,53  ±  1,37%.  Menurut  BSN (2017) penggunaan semen segar maupun semen beku  dalam  program  inseminasi  abnormalitas spermatozoa  sebaiknya  kurang  dari  20%. Rendahnya  persentase  kenaikan  abnormalitas sapi  bali  pada  suhu  5oC    dalam  penelitian  ini diduga  dipengaruhi  oleh  lipoprotein  yang terdapat  dalam  kuning  telur  yang  memiliki fungsi pelindung terhadap spermatozoa melawan cold  shock/kejutan  dingin.  Hasil  ini  sesuai dengan  pendapat  dari  Afiati et  al .  (2015),  yang menyatakan terjadinya peningkatan nilai abnormalitas  spermatozoa  disebabkan  oleh  efek cekaman  dingin  (cold  shock)  dan  ketidak seimbangan nutrisi.
Hasil  penelitian  ini  memperlihatkan bahwa  persentase  kenaikan  abnormalitas  pada P0  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  P1,  P2 dan  P3.  Tingginya  persentase  abnormalitas spermatozoa  pada  P1,  P2,  dan  P3  diduga penambahan mineral Zn (Zink) tidak memperngaruhi  abnormalitas  serta  vitamin  C yang  bersifat  asam.  Rendahnya  persentase  daya tahan  hidup  dapat  disebabkan  oleh  adanya aktivitas metabolisme spermatozoa yang membentuk asam laktat dalam media pengencer (Rhoyan et  al .,  2014).  Kynaston et  al .  (1988) menyatakan  bahwa  suplementasi  mineral  Zn (Zink) tidak mempengaruhi abnomalitas spermatozoa.Jenis  abnormalitas  yang  di  dapat selama  penilitian  adalah  abnormalitas  sekunder, berupa  ekor  dan  kepala  terpisah.  Menurut Firdausi et  al .,  (2014)  kerusakan  pada spermatozoa  dapat  diakibatkan  saat  pembuatan ulasan  di  object  glass  sehingga  abnormalitas yang terbentuk adalah spermatozoa dengan ekor yang patah atau kepala tanpa ekor.

## Pengaruh  Perlakuan  Terhadap  Daya  Tahan Hidup Spermatozoa
Daya  tahan  hidup  spermatozoa  yang dimaksud  adalah  kemampuan  spermatozoa untuk  tetap  hidup  dalam  kurun  waktu  tertentu setelah penyimpanan in vitro  Hine et al , (2014).

## Tabel 5. Pengaruh perlakuan terhadap daya tahan hidup spermatozoa (%)
Perlakuan Daya Tahan Hidup (Hari) . P0 5,40±0,54 ab . P1 6,40±0,89 b . P2 5,00±0,70 a . P3 4,60±1,14 a P-Value 0,024
a,b Superskrip dengan huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa  perlakuan  berpengaruh  nyata  (P<0,05) terhadap  daya  tahan  hidup.  Perlakuan  P1 menunjukan bahwa daya tahan hidup spermatozoa  lebih  lama  yaitu  dengan  lama penyimpanan  6,40  hari  diikuti  perlakuan  P0: 5,40  hari,  P2:  5,00  hari,  dan  P3:  4,60  hari. Perbedaan  ini  kemungkinan  disebabkan  oleh ketiadaan  dan  perbedaan  dosis  unsur  pelindung di  dalam  pengencer  sperma  sehingga  saat spermatozoa  disimpan  pada  suhu  yang  rendah maka  daya  tahan  hidup    setiap  perlakuan berbeda.
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa perlakuan  P1  dapat  menjaga  daya  tahan  hidup sampai  6,40  hari  dibandingkan  P0  yaitu  5,40 hari.  Hal  ini  diduga  karena  P0  tidak  memiliki unsur pelindung spermatozoa seperti antioksidan sehingga tidak mampu mencegah atau mengurangi  kerusakan  akibat  radikal  bebas. Penambahan  mineral  Zn  (Zink)  0,05  g  dalam
pengencer  S-KT  pada  P1  mampu  mencegah kerusakan akibat radikal bebas. Hal ini didukung oleh  pernyataan  Payaran et  al .  (2014)  yang menyatakan bahwa mineral Zn (Zink) menghasilkan  sistem  enzim  yang  membantu menetralkan radikal bebas.
Pada  Tabel  5  daya  tahan  hidup spermatozoa  terendah    terlihat  pada  perlakuan P3  dengan  lama  penyimpanan  4,60  hari.  Daya tahan  hidup  spermatozoa  pada  P3  dan  P2  dari perlakuan yang lain yaitu P0 dan P1 sdisebabkan oleh  aktivitas  asam  yang  berlebihan  terutama pada  vitamin  C  yakni  asam  askrobat  yang menyebabkan perubahan pH. Rendahnya persentase  daya  tahan  hidup  dapat  disebabkan oleh  adanya  aktivitas  metabolisme  spermatozoa yang  membentuk  asam  laktat  dalam  media pengencer  (Rhoyan et  al .,  2014).  Akumulasi asam laktat yang berlebihan akan bersifat toksik bagi spermatozoa (Varasofiari et al ., 2013).

## SIMPULAN
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa penambahan  mineral  Zn  (Zink)  0,05g  dalam pengencer  S-KT  memberikan  efek  yang  cukup
baik  dalam  menjaga  kualitas  spermatozoa  sapi bali sampai penyimpanan hari ke enam.

## SARAN
Saran  untuk  penelitian  ini  perlu dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  untuk menguji  keberhasilan  dalam  pelaksanaan
inseminasi  buatan  menggunakan  pengencer S-KT  yang ditambahkan 0,05 g mineral Zn (Zink).

## DAFTAR PUSTAKA
Abbasi AA, Prasad AS, Rabbani P, DuMouchelle E. 1980.  Experimental zinc deficiency  in  man:  effect  on  testicular function. The  Journal  of  Laboratory  and Clinical Medicine, 96(3) : 544–550.
Afiati  F,  Herdis,  Said  S. 2013. Pembibitan Ternak dengan Inseminasi Buatan .
Penebar Swadaya.
Afiati  F,  Yulnawati  MR,  Arifiantini  RI.  2015.
Abnormalitas spermatozoa domba dengan frekuensi  penampungan  berbeda. In:
Prosiding  Seminar  Nasional  Masyarakat Biodiversitas  Indonesia , 1 (4)  :  930–934.
10.13057/psnmbi/m010449
Aslam HA, Dasrul,  Rosmaidar. 2014. Pengaruh penambahan  vitamin  C  dalam  pengencer
andromed  terhadap  persentase  motilitas dan  membran  plasmaa  utuh  spermatozoa sapi  Aceh  setelah  pembekuan. Jurnal Medika Veterinaria , 8 (1) : 20–26. 10.21157/j.med.vet..v8i1.3326
Ducha N, Susilawati T, Aulanni’am,
Wahjuningsih  S.  2013.  Motilitas  dan viabilitas  spermatozoa  sapi  limousin selama  penyimpanan  pada  refrigerator dalam pengencer
CEP-2 dengan suplementasi kuning telur. Jurnal
Kedokteran Hewan, 7 (1) : 5-8. https://doi.org/10.21157/j.ked.hewan.v7i1 .555
Feradis.  2010. Bioteknologi  Reproduksi  pada Ternak .  Cetakan  ke  satu.  Alfabeta, Bandung
Firdausi  PA,  Susilawati  T,  Wahyuningsih  S.
2014.  Kualitas  semen  sapi  limousin selama pendinginan menggunakan pengencer  cep-2  dengan  penambahan berbagai  konsentrasi  santan. Ternak Tropika 15 (1) : 21–30.
Garner DL, Hafez ESE. 2000. Spermatozoa and seminal plasma. In : Hafez B, Hafes ESE , Reproduction  in  Farm  Animals.  Pp:  96- 109 .
https://doi.org/10.1002/9781119265306.c
h7
Gordon  MH.  1990. The  Mechanism  of Antioxidants  Action  in  Vitro . Elsevier Applied  Food  Science  Series,  London.
10.1007/978-94-009-0753-9_1
Hine  TM,    Burhanuddin,  Marawali  A.  2014. Efektivitas air buah lontar dalam mempertahankan  motilitas,  viabilitas  dan daya  tahan  hidup  spermatozoa  sapi  bali. Jurnal Veteriner , 15 (2) : 263–273
Inonie  RI,  Baa  LO,    Saili  T.  2016.  Kualitas spermatozoa kambing boerawa dan kambing  kacang  pada  penggunaan  tris- kuning  telur  yang  berbeda. JITRO , 3 (1)  :
52–64. https://doi.org/10.33772/jitro.v3i1.1070 . Ismaya.  2014. Bioteknologi  Inseminasi  Buatan pada  Sapi  dan  Kerbau .  Gadjah  Mada University Press.
Iwasaki AMD, Gagnon C. 1992.
Formation  of  reactive  oxygen  species  in spermatozoa of infertile patients. Fertility and Sterility 57(2) : 409-416.
https://doi.org/10.1016/S0015- 0282(16)54855-9
Kommisrud  E,  Paulenz  H,  Sehested  E,  Grevle IS.  2002.  Influence  of  boar  and  semen parameters  on  motility  and  acrosome integrity  in  liquid  boar  semen  stored  for five days. Acta Veterinaria Scandinavica , 43(1) :49-55. https://doi.org/10.1186/1751-0147-43-49 Kynaston  HG,  Lewis‐Jones  DI,  Lynch RV, dan Desmond AD. 1988. Changes in seminal  quality  following  oral  zinc therapy. Andrologia , 20 (1) : 21–22. 10.1111/j.1439-0272.1988.tb02355.x. Labetubun J, Siwa IP. 2011. Kualitas spermatozoa  kauda  epididimis  sapi  Bali dengan  penambahan  laktosa  atau  maltosa yang dipreservasi pada suhu 3-5 0 C. Jurnal Veteriner , 12 (3) : 200–207. https://ojs.unud.ac.id/index.php/jvet/articl
e/view/3511
Mila FNH, Ina YT, Kaka A. 2022. Karakteristik dan  kualitas  semen  sapi  sumba  ongole dalam pengencer tris yang disuplementasi dengan susu skim pada suhu 3- 5ºC. Jurnal Sains dan Teknologi
Peternakan 3(1) : 12-18. https://doi.org/10.31605/jstp.v3i1.1201 Nur  NE.  2019.  Pengaruh  pengencer  tris  kuning telur  itik  dan  konsentrasi  spermatozoa berbeda terhadap kualitas semen sapi bali. Skripsi . Fakulytasa Peternakan
Universitas Hasanuddin.
Payaran  KO,  Wantouw  B,  Tendean  L.  2014. Pengaruh pemberian zink terhadap kualitas  spermatozoa  pada  mencit  jantan (Mus musculus). Jurnal e-Biomedik 2 (2)
: 496-500.
https://doi.org/10.35790/ebm.2.2.2014.50
44
Pubiandara  S,  Suharyati  S,  Hartono  M.  2016. Pengaruh  penambahan  dosis  rafinosa dalam  pengencer  sitrat  kuning  telur terhadap  motilitas,  persentase  hidup  dan abnormalitas  spermatozoa  sapi  ongole. Jurnal Ilmiah Peternakan Terpadu , 4 (4) :
292-299.
https://doi.org/10.23960/jipt.v4i4.1396
Rhoyan YH, Lestari TD, dan Setiawan R. 2014.
Kualitas  semen  cair  dingin  domba  garut pada  tiga  jenis  larutan  pengencer. Jurnal Ilmu Ternak , 14 (1) : 63–67.
Rizal  M.  2009.  Daya  hidup  spermatozoa epididimis  sapi  bali  yang  dipreservasi pada  suhu  3–5oC  dalam  pengencer  tris dengan  konsentrasi  laktosa  yang  berbeda. Jurnal Ilmu Ternak dan  Veteriner 14(2) : 142–149. https://doi.org/10.14334/jitv.v14i2.355 Salisbury, G. W. 1984. Fisiologi Reproduksi dan Inseminasi Buatan Pada Sapi . Gadjah Mada University Press.
Savitria  FK,  Suharyati  S,  Siswanto.  2014.
Kualitas  semen  beku  sapi  bali  dengan penambahan  berbagai  dosis  vitamin  C pada  bahan  pengencer  skim  kuning  telur.
Jurnal Ilmiah Peternakan Terpadu . 2 (3) : 30-36. http://dx.doi.org/10.23960/jipt.v2i3.p%25p Seuk, MO. 2018. Pengaruh frekuensi penampungan terhadap kualitas spermatozoa  sapi  bali. Journal  of  Animal
Sains , 3 (4) : 51–53. https://doi.org/10.32938/ja.v3i4.540 Siahaan  EA,  Laksmi,  DNDI,  Bebas  W.  2012.
Efektivitas penambahan berbagai konsentrasi  β-karoten  terhadap  motilitas dan daya hidup spermatozoa sapi bali post thawing. Indonesia  Medicus  Veterinus 1 (2) : 239–251..
Sukmawati  E,  Arifiantini  RI,  Purwantara  B. Daya  tahan  spermatozoa  terhadap  proses pembekuan  pada  berbagai  jenis  sapi pejantan  unggul. Jurnal  Ilmu  Ternak  dan Veteriner 19(3) : 168-175.
https://doi.org/10.14334/jitv.v19i3.1079
Syarifuddin  NA,  Toleng  AL,  Rahardja  DP, Ismartoyo,  Yusuf  M.  2017.  Daun  kelor sumber mineral seng (Zn) untuk meningkatkan  libido  dan  kualitas  semen pejantan sapi bali. In : Prosiding Seminar Nasional  Lahan  Basah. Banjarmasin,  5 November 2016. pp: 180–186. http://eprints.ulm.ac.id/id/eprint/2785
Toelihere  MR.  1993.  Inseminasi  Buatan  pada Ternak. Angkasa, Bandung.
https://lib.ui.ac.id/detail.jsp?id=141995 Toelihere  MR.  2006.  Pokok-pokok  pikiran tentang perkembangan bioteknologi reproduksi  di  masa  lalu,  masa  kini  dan masa yang akan datang dalam menunjang pembangunan peternakan di Indonesia. In : Seminar Nasional Peranan Bioteknologi
Reproduksi dalam Pembangunan Peternakan di Indonesia . Fakultas Kedokteran  Hewan-IPB  Bogor,  April
2006.
Varasofiari  LN,  Setiatin  ET,  Sutopo  D.  2013. Evaluasi  kualitas  semen  segar  sapi  jawa brebes berdasarkan lama waktu penyimpanan. Animal Agriculture Journal , 2 (1) : 201–208. http://ejournal- s1.undip.ac.id/index.php/aaj .
Yani  A,  Nuryadi,  Pratiwi  T.  2001.  Pengaruh tingkat  substitusi  santan  kelapa  pada pengencer  tris  dan  waktu  penyimpanan terhadap kualitas semen kambing peranakan  ettawah  (PE). Jurnal  Biosain 1(1):23-29.