Studi Aktivitas Antioksidan dan Inhibitor Α-Glukosidase Ekstrak Fenolik Daun Bungur ( Lagerstroemia speciosa ) dari Taman Nasional Meru Betiri
Antioxidant Activity Study And Α-glucosidase Inhibitor Phenolic Leaf Extract Bungur ( Lagerstroemia speciosa ) From Meru National Park Betiri
Jainur Rochman *) , Tri Agus Siswoyo, A.A. Istri Ratnadewi Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan IlmuPengetahuan Alam Universitas Jember
*) Email: jjelicious@gmail.com

## ABSTRACT
Study activities phenolic extract of bungur leaf as an antioxidant and inhibitor for the enzyme α- glucosidase was performed by spectrophotometric method. The extraction was carried out by three solvents with different polarity level in order to get three types of extracts namely hexane extract Bungur (HB), ethyl acetate extract Bungur (EAB), and the  methanol extract Bungur (MB). The units, used in the analysis, is the total phenolic that standardized in gallic acid. The antioxidant activity of phenolic extracts Bungur leaf can be seen from its ability to reduce free radicals through the  damping  test  DPPH  radical,  superoxide  anion,  and  hydroxyl.  Potential  extract  phenolic  leaf Bungur as an inhibitor of α-glucosidase were analyzed by inhibition of α-glucosidase, but in this study also tested the inhibition of the enzyme α-amylase because both of these enzymes worked on the digestive system and hydrolyze carbohydrates. The results generally showed that the methanol extract  of  leaves Bungur potential  as  antioxidants that compared with standard  vitamin  C.  In addition, it had as well as potential for inhibitors of α-glucosidase and α-amylase that compared akarbosa standard, which is expected to be a natural antidiabetic agent.
Keywords : phenolic, bungur, antioxidant, inhibitor, α-amilase, α-glukosidase

## PENDAHULUAN
Saat  ini  pola  penyakit  mulai  bergeser  dari penyakit  infeksi  ke  arah  sindrom  metabolik. Diabetes  Melitus  (DM)  adalah  sindrom metabolic yang secara global prevalensi cukup tinggi. Pada tahun 2003 prevalensi global DM usia  20  sampai  79  tahun  mencapai  149  juta jiwa  (5,1%)  dan  diperkirakan  mencapai  333 juta  (6,3%)  pada  tahun  2025  (International Diabetes Federation, 2003). Perkembangan diabetes  dan  komplikasi yang  terjadi  diketahui  dimediasi  oleh  stres oksidatif  (Dewanjee et  al .,  2009).  Stress oksidatif  ini  terjadi  karena  sistem  pertahanan antioksidan  dalam  tubuh  tidak  mampu mengatasi  peningkatan  produksi  spesies oksigen  reaktif  dalam  tubuh.  Peningkatan produksi spesies oksigen reaktif ini disebabkan tingginya  kadar  glukosa  dalam  darah (hiperglikemia), karena menurut Wolff (1993), glukosa  dapat  mengalami  reaksi  autooksidasi yang  dapat  menghasilkan  produk  berupa senyawa  oksigen  reaktif  seperti  hidrogen
peroksida (H2O2), radikal hidroksil (•OH), dan radikal  anion  superoksida  (•O2).  Peningkatan produksi  dan  ketidakefektifan  penangkapan spesies  oksigen  reaktif  ini  beresiko  pada kerusakan  organel  sel,  kenaikan  peroksidasi lipid, dan meningkatkan resistensi insulin. Hal ini  yang  menyebabkan  munculnya  berbagai komplikasi pada penderita diabetes (Maritim et al ., 2003).
Berdasarkan  data  dari  International Diabetes  Federation  (2003),  sebagian  besar penderita diabetes melitus (85-95%)
didominasi  oleh pasien  penderita  DM  tipe  2. Salah  satu  langkah  strategis  dalam  terapi  DM tipe  2  yaitu  dengan menghambat  kerja  enzim yang  menghidrolisis  karbohidrat  menjadi glukosa,  seperti  α-glukosidase  pada  organ pencernaan.  Dengan  menginhibisi  kerja  enzim ini,  maka  dapat  secara  efektif  mengurangi pencernaan karbohidrat kompleks dan absorbsi glukosa  oleh  epitelium  intestinal,  sehingga dapat  mencegah  peningkatan  kadar  glukosa postprandial pada  penderita  diabetes  tipe  2. Inihbisi  kerja  enzim  dapat  dilakukan  dengan
adanya  senyawa-senyawa  inhibitor  tertentu. (Shinde et al ., 2008). Penderita  diabetes  memerlukan  asupan antioksidan  dalam  jumlah  besar  karena peningkatan radikal bebas akibat hiperglikemia yang  dapat  memicu  terjadinya  berbagai komplikasi.  Namun  menurut  Nadeesha et  al . (2007)  antioksidan  sintetik  memiliki  efek toksikologi  dan  bersifat  karsinogenesis.  Oleh karena itu, banyak penelitian saat ini diarahkan untuk  terapi  menggunakan  bahan  alami  untuk menghindari  efek  samping  tersebut.  Dengan adanya  perpaduan  antara  inhibitor  enzim  α- glukosidase dan antioksidan,  diharapkan dapat memberikan efek farmakologis yang sinergis. Tanaman  merupakan  sumber  yang  baik untuk  obat.  Informasi  etnobotani  melaporkan ada  sekitar  800  sampai  1000  tanaman  yang diperkirakan  memiliki  potensi  antidiabetes (Rao et  al .,  2010).  Tanaman  dapat  menjadi sumber inhibitor α-glukosidase dan antioksidan alami.  Sebagai  kawasan  hutan  konservasi, Taman  Nasional  Meru  Betiri  memiliki kekayaan  keanekaragaman  hayati  yang  cukup banyak.  Saat  ini  telah  diketahui  sebanyak  496 jenis  tumbuhan,  dan  di  antara  berbagai tumbuhan tersebut, 239 jenis telah diidentifikasi  sebagai  tumbuhan  obat.  Sebagai salah  satu  institusi  pendidikan  terbesar  di Jember, Universitas Jember memiliki kepentingan untuk menggali dan mengembangkan  potensi  TNMB  yang  ada  di Jember  sebagai  bentuk  Tri  Dharma  Perguruan Tinggi. Bungur ( Lagerstroemia speciosa ) merupakan salah satu tanaman yang tumbuh di TNMB  yang  memiliki  potensi  sebagai  obat. Secara  tradisional,  tanaman  ini  digunakan sebagai  ramuan  obat  antidiabetes,  namun penggunaannya  belum  begitu  populer  karena belum  teruji  secara  ilmiah  khususnya di Indonesia.  Beberapa  penelitian  melaporkan adanya  potensi  ekstrak  daun  Bungur  sebagai antidiabetes. Menurut Dalimartha (2003), daun Bungur  memiliki  kandungan  senyawa  fenolik seperti  flavonoid  dan  tanin.  Senyawa-senyawa fenolik  menurut  Patel et  al .  (2012) memiliki aktivitas  antihiperglikemik.  Senyawa  fenolik seperti  flavonoid  juga  merupakan  salah  satu agen  antioksidan  alami  (Shan et  al .,  2005). Oleh  sebab  itu  pada  penelitian  ini  akan dilakukan  studi  mengenai  potensi  ekstrak fenolik daun Bungur sebagai agen antidiabetik yang  secara  khusus  ditinjau  dari  segi
aktivitasnya  sebagai  inhibitor  α-glukosidase sekaligus sebagai antioksidan.

## METODE
Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: daun  Bungur  ( Lagerstroemia  speciosa );  heksana (Merck);  etil  asetat  (Merck);  metanol  (Merck); akuades;  reagen  Folin-Ciocalteu  (Merck);  natrium karbonat (Merck);  asam  galat  (Sigma-Aldrich); natrium  nitrit  (Merck);  alumunium(III)  klorida (Merck);  natrium  hidroksida  (Merck);  kuersetin (nacalai tasque); asam format (Merck); 1,1-diphenyl-
2-picryl-hydrazil (DPPH)  (nacalai  tasque);  etanol (Merck); vitamin C (nacalai tasque); ethylenediaminetetraacetic  acid (EDTA)  (nacalai tasque);  Besi(III)  klorida (Merck);  hidrogen peroksida (Sigma-Aldrich); 2-deoksi-D-ribosa
(Sigma-Aldrich);  kalium  dihidrogenfosfat  (Merck); asam  trikloroasetat  (Merck);  asam  2-tiobarbiturat (Merck);  pirogalol  (Sigma-Aldrich);  Trizma-base (nacalai  tasque);  asam  klorida  (Merck);  sukrosa (Merck);  dimetilsulfoksida  (Merck);  natrium hidrogenfosfat (nacalai tasque); peroksidase (Sigma- Aldrich);  α-glukosidase  (Sigma-Aldrich);  glukosa oksidase (Sigma-Aldrich); 4-aminoantipirin (Sigma- Aldrich);  fenol  (Sigma-Aldrich);  natrium  klorida (Merck); Kalium  natrium  tartrat  (Merck); Soluble starch (Merck); asam 3,5-dinitrosalisilat (Merck); α- amilase  (Sigma-Aldrich);  kalium  hidrogenfosfat (Merck); triton x-100 (Sigma-Aldrich); dan akarbosa (Glucobay).

## Pembuatan Simplisia Daun Bungur
Daun  Bungur  yang  telah  divalidasi  oleh  Lembaga Taman Nasional Meru Betiri dikeringkan selama 10 hari.  Daun  yang telah  kering  dan  terpilih  dipotong kecil-kecil  kemudian  diblender  sehingga  dihasilkan serbuk simplisia.

## Ekatraksi Simplisia Daun Bungur
Ekstraksi  simplisia  daun  Bungur  dilakukan  dengan metode maserasi bertingkat menggunakan tiga jenis pelarut  yang  berbeda  tingkat  kepolarannya. Ekstraksi  dimulai  dari  pelarut  yang  nonpolar  yaitu heksana,  kemudian  dilanjutkan  dengan  pelarut  etil asetat,  dan  diakhiri  dengan  pelarut  metanol.  Waktu inkubasi untuk masing-masing pelarut adalah 72 jam dalam shaker . Perbandingan antara berat sampel dan volume  pelarut  adalah  1:5.  Tiga  macam  ekstrak dihasilkan dari tahap ini yaitu heksana Bungur (HB), etil  asetat  Bungur  (EAB),  dan  metanol  Bungur (MB).
Analisis Total Fenolik Ekstrak Daun Bungur Penentuan  kandungan  total  fenolik  menggunakan metode  yang  dikemukakan  oleh  Taga et  al .  (1984) dan  dihitung  menggunakan  standar  asam  galat. Sebanyak  50  μL  ekstrak  HB,  EAB,  dan  MB dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  yang  berbeda.
Sebanyak 1 mL Na 2 CO 3 2%, ( w / v ) ditambahkan ke dalam  masing-masing  tabung  reaksi  dan  diinkubasi selama  2  menit.  Selanjutnya  ditambahkan  50  μL reagen Folin-Ciocalteu 50% ( v / v ) dan diinkubasi lagi sela,a  30  menit.  Absorbansi  larutan  diukur  dengan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang 750  nm.  Total  fenolik  masing-masing ekstrak ditentukan  dalam  mg  asam  galat equivalent (AGE) per  gram  ekstrak  menggunakan  persamaan  dari kurva standar asam galat.

## Analisis Total Flavonoid Ekstrak Daun Bungur
Penentuan  kandungan  total  flavonoid  didasarkan pada  metode  yang  dikemukakan  oleh  Chang et  al . (2002).  Sebanyak  150  μL  masing-masing  ekstrak ditambahkan  dengan  400  μL  akuades.  Larutan  ini ditambahkan  dengan  30  μL  NaNO 2 5%  ( w / v )  dan diinkubasi  selama  5  menit.  Kemudian ditambahkan 30 μL AlCl 3 10% ( w / v ) dan diinkubasi lagi selama 6 menit. Setelah itu ditambahkan 200 μL NaOH 1 M dan 240 μL akuades. Absorbansi larutan diukur pada panjang  gelombang  415  nm.  Total  flavonoid masing-masing  ekstrak  ditentukan  dalam  mg kuersetin equivalent (KE)  per  gram  ekstrak menggunakan  persamaan  dari  kurva  standar kuersetin.
Analisis Peredaman Radikal DPPH Oleh Ekstrak Fenolik Daun Bungur
Analisis  peredaman  radikal  DPPH  mengacu  pada Soler-Rivas et  al. (2000).  Sebayak  200  μL  ekstrak dengan  5  konsentrasi  yang  berbeda  untuk  masing- masing ekstrak dimasukkan ke dalam 96- well plates . Setelah  itu,  ditambahkan  100  μL  reagen  DPPH  90 μM  (dalam  metanol)  dan  diinkubasi  selama  30 menit.  Absorbansi  masing-masing  larutan  diukur dengan Microplate reader pada panjang gelombang 515  nm  setelah  30  menit  inkubasi.  Persen peredaman  radikal  DPPH pada  masing-masing konsentrasi ekstrak dihitung dengan persamaan:
(1)
A 0 adalah  absorbansi  kontrol  dan  A 1 adalah absorbansi  ekstrak.  Hasil  perhitungan  persen peredaman  pada  tiap-tiap  konsentrasi  digunakan untuk  membuat  kurva  linier  dengan  mengeplotkan persen  peredaman  dan  log  konsentrasinya. Persamaan linier yang dihasilkan adalah y = mx + c dan  persamaan  tersebut  digunakan  untuk menghitung  nilai  IC 50 masing-masing  ekstrak dengan persamaan:
(2)

## Vitamin C digunakan sebagai standar positif.
Analisis  Peredaman  Radikal  Anion  Superoksida Oleh Ekstrak Fenolik Daun Bungur Analisis  peredaman  radikal  anion  superoksida ditentukan  berdasarkan  autooksidasi  pirogalol  yang
mengacu pada Tang et al. (2010). Sebanyak 150 μL larutan  ekstrak  dicampur  dengan  1,75  mL  buffer Tris-HCL  50  mM  (pH  8,2).  Campuran  diinkubasi pada  suhu  ruang  selama  10  menit,  kemudian ditambahkan  100  μL  pirogalol 10  mM  (dilarutkan dalam  HCl  10  mM). Slope reaksi  autooksidasi pirogalol  selama  4  menit  ditentukan  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang 320  nm.  Persen  peredaman  radikal  anion superoksida dihitung dengan persamaan:
(3)
S 0 adalah slope kontrol dan S1 adalah slope ekstrak. Vitamin C digunakan sebagai standar positif.

## Analisis  Peredaman  Radikal  Oleh  Ekstrak
Fenolik Daun Bungur Analisis peredaman radikan hidroksil mengacu pada metode  yang  dikemukaan  Halliwel  dan  Gutteridge (1999). Larutan yang terdiri atas 50 μL 2-deoksi-D- ribosa 28 mM (dalam buffer fosfat 20 mM; pH 7,4), 150 μL  ekstrak, 100 μL EDTA 1 mM, 100 μL FeCl 3 10  mM,  50  μL  H 2 O 2 1  mM,  dan  50  μL  asam askorbat  1  mM  dimasukkan  dalam microtube yang berbeda untuk masing-masing ekstrak lalu divortex. Campuran diinkubasi pada suhu 37˚C selama 1 jam. Setelah itu, ditambahkan 500 μL asam tiobarbiturat 1%  dan  500  μL  asam  trikloroasetat  2,8%.  Larutan divortex dan  diinkubasi  lagi  selama  20  menit  pada suhu  100 ˚C  untuk  menghasilkan  warna  merah muda.  Absorbansi  larutan  diukur  pada  panjang gelombang  532  nm  setelah  larutan  dingin.  Persen peredaman  radikal  hidroksil  dihitung  dengan persamaan 1. Vitamin C digunakan sebagai standar positif.

## Analisis  Penghambatan  α-Amilase    OlehEkstrak Fenolik Daun Bungur
Analisis  penghambatan  α-amilase  dilakukan berdasarkan  metode  hashim et  al . (2013)  yang dimodifikasi. Sebanyak 100 μL ekstrak dimasukkan ke dalam dua microtube yang diberi label S + dan S - . Sebagai kontrol, 100 μL DMSO juga dimasukkan ke dalam  dua microtube yang  dberi  label  C + dan  C - . Microtube yang berlabel S + dan C + ditambahkan 150 μL α-amilase (0,1 u/mL) sedangkan yang berlabel S - dan  C - ditambahkan  150  μL  buffer  fosfat  pH  6,9. Larutan  di  prainkubasi  selama  15  menit  pada  37˚C setelah  divortex.  Setelah  itu,  ditambahkan  250  μL soluble starch 1% ( w/v ) ke dalam semua microtube . Larutan  diinkubasi  selama  15  menit  pada  37˚C setelah divortex. Reaksi hidrolisis dihentikan dengan mendidihkan selama 1 menit. Setelah dingin, larutan dikosmosil lalu diambil 160 μL dari masing-masing microtube kemudia  dimasukkan  ke microtube lain dengan  label  yang  sama.  Sebanyak  80  μL  reagen DNS  ditambahkan  ke  dalam  tiap-tiap microtube . Larutan  dididihkan  selama  15  menit  untuk menentukan  total  gula  reduksinya.  Setelah  itu diencerkan dengan 720 μL akuades dan dipipet 200
μL  ke  dalam  96- well  plates untuk  diukur absorbansinya menggunakan microplate reader pada panjang  gelombang  540  nm.  Akarbosa  yang merupakan  agen  antihiperglikemik  yang  banyak beredar  di  pasaran  digunakan  sebagai  standarnya. Persen  penghambatan  α-amilase  pada  masing- masing ekstrak dihitung dengan persamaan berikut:
(4)
C + adalah  kontrol  sampel  dengan  enzim  dan  C - adalah  kontrol  sampel  tanpa  enzim,  sedangkan  S + adalah  sampel  dengan  enzim  dan  S - adalah  sampel tanpa enzim.
Analisis  Penghambatan  α-Glukosidase  Oleh Ekstrak Fenolik Daun Bungur Analisis  penghambatan  α-glukosidase  dilakukan dengan  mengacu  pada  metode  yang  dikemukaan Miyazawa et al . (2005) yang dimodifikasi. Sebanyak 100  μL  maltosa  0,125  M  dimasukkan  ke  dalam microtube yang berlabel C + , C - , S + , dan S - . Sebanyak 100 μL ekstrak dimasukkan ke dalam microtube S + dan  S - ,  sedangkan  C + dan  C - ditambahkan  dengan 100 μL DMSO. Setelah itu, 190 μL buffer fosfat pH 7  ditambahkan  ke  dalam  setiap microtube . Campuran  divortex  lalu  ditambahkan  10  μL  α- glukosidase (1 u/mL) ke dalam microtube C + dan S + sedangkan  C - dan  S - ditambahkan  akuabides. Campuran diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama 1 jam setelah  divortex.  Reaksi  dihentikan  dengan mendidihkannya  selama  3  menit.  Setelah  dingin, Campuran  dikosmosil lalu  diambil  235  μL  dari masing-masing microtube untuk  dimasukkan  ke microtube lain  dengan  label  yang  sama.  Sebanyak 750  μL  buffer  fenol  pH  7  ditambahkan  ke  dalam setiap microtube, dilanjutkan dengan penambahan 5 μL  peroksidase  (0,5  unit/  μL),  5  μL  aminoantipirin (4  mg/mL),  dan  5  μL  glukosa  oksidase  (0,8  unit/ μL). Larutan divortex dan diinkubasi lagi selama 10 menit  pada  suhu  37 ˚C.  Hasil  inkubasi  dipipet  200 μL  dan  dimasukkan  ke  dalam  96- well  plates untuk diukur  absorbansinya  pada  500  nm  dengan microplate  reader .  Persen  penghambatan  α- glukosidase dihitung dengan persamaan 4. Akarbosa digunakan sebagai standar positifnya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Rendemen Maserasi Simplisia Daun Bungur
Rendemen  hasil  maserasi  simplisia  daun Bungur  dihitung  berdasarkan  perbandingan antara  berat  ekstrak  yang  diperoleh  dan  berat simplisia  yang  dimaserasi  dalam  bentuk  nilai persentase. Hasil perhitungan persen rendemen maserasi ditampilkan pada Tabel 1 berikut:
Tabel 1. Rendemen  maserasi  simplisia daun Bungur Ekstrak Rendemen (%) HB 3,06 EAB 3,37 MB 17,9 Total 24,33
Kenaikan  tingkat  kepolaran  pelarut  diiringi kenaikan  rendemen  maserasi.  Hal  ini disebabkan pelarut polar seperti metanol selain mampu  melarutkan  senyawa  polar  juga  dapat melarutkan senyawa yang kurang polar hingga nonpolar.  Oleh  karena  itu  pelarut  metanol menghasilkan rendemen tertinggi.

## Total Fenolik Ekstrak Daun Bungur
Analisis  total  fenolik  ekstrak  daun  Bungur didasarkan  pada  kemampuannya  mereduksi reagen  Folin-Ciocalteu  (FC).  Senyawa  fenolik yang  terkandung  pada  daun  Bungur  akan mereduksi  reagen  FC  yang  berwarna  kuning menghasilkan  kompleks  yang  berwarna  biru. Warna biru yang dihasilkan dari reaksi tersebut diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang maksimumnya yaitu 750 nm. Asam galat  digunakan  sebagai  standar  sehingga satuan  perhitungan  total  fenolik  adalah  asam galat equivalent (AGE) per gram ekstrak. Hasil perhitungan  total  fenolik  ekstrak  daun  Bungur ditampilkan oleh Gambar 1.
Gambar 1. Total fenolik ekstrak daun Bungur Kandungan  total  fenolik  ekstrak  daun Bungur meningkat seiring dengan peningkatan kepolaran pelarutnya. Ekstrak metanol Bungur
memiliki  kandungan  fenolik  tertinggi  karena metanol mampu melarutkan senyawa dari polar hingga  nonpolar.  Hal  ini  mungkin  disebabkan karena  kemampuan  metanol  yang  bisa membentuk  ikatan  hidrogen,  interaksi  dipol- dipol, dan van der Waals.

## Total Flavonoid Ekstrak Daun Bungur
Analisis  total  flavonoid  ekstrak  daun  Bungur didasarkan  pada  kemampuan  gugus  katekol flavonoid  untuk  mengompleks  dengan  logam alumunium.  Kompleks  yang  terbentuk berwarna  kuning  dengan  panjang  gelombang maksimum  415  nm  untuk standar  kuersetin. Semakin  tinggi  konsentrasi  flavonoid  dengan gugus  katekol  maka  absorbansinya  juga semakin  meningkat.  Hasil  perhitungan  total flavonoid  ekstrak  daun  Bungur  ditampilkan oleh Gambar 2.
Gambar  2.  Total  flavonoid  ekstrak  daun Bungur
Sama halnya seperti pola pada total fenolik, kandungan  total  flavonoid  juga  meningkat seiring  dengan  dengan  peningkatan  kepolaran pelarutnya.  Artinya  pelarut  paling  polar  yaitu metanol menghasilkan total flavonoid tertinggi.
Peredaman  Radikal  DPPH  Oleh  Ekstrak Fenolik Daun Bungur Kemampuan  ekstrak  fenolik  daun  Bungur dalam meredam radikal DPPH dilihat dari nilai IC 50 masing-masing  ekstraknya.  Nilai  IC 50 yang  lebih  kecil  menunjukkan  bahwa kemampuannya  dalam  mereduksi  radikal DPPH  lebih  kuat.  Hasil  perhitungan  nilai  IC 50 ekstrak daun Bungur ditunjukkan oleh Gambar 3.
Gambar  3.  Nilai  IC 50 ekstrak  fenolik  daun
Bungur
Kemampuan  ekstrak  fenolik  daun  Bungur dalam  meredam  radikal  DPPH  meningkat seiring dengan peningkatan kepolaran senyawa fenoliknya.  Ekstrak  MB  memiliki  nilai  IC 50 terkecil  yang  artinya  kemampuannya  dalam meredam  radikal  DPPH  paling  baik  sehingga dapat  dikatakan  paling  potensial  dibandingkan dua ekstrak lainnya. Namun jika dibandingkan dengan  standar  Vitamin  C,  aktivitasnya  masih lebih  rendah.  Ekstrak  MB  mengandung senyawa fenolik yang paling polar dibandingkan  dengan  ekstrak  EAB  dan  HB. Senyawa  fenolik  yang  lebih  polar  memiliki jumlah substituen hidroksil yang lebih banyak, akibatnya  senyawa  fenolik  dalam  ekstrak  MB mampu  menyumbangkan  lebih  banyak  atom hidrogen  untuk  mereduksi  radikal  DPPH dibandingkan  dengan  senyawa  fenolik  dalam EAB dan HB. Hal ini juga didukung oleh data total flavonoid dimana kenaikan total flavonoid juga  diikuti  dengan  kenaikan  aktivitasnya sebagai peredam radikal DPPH.

## Peredaman Radikal  Anion  Superoksida
Oleh Ekstrak Fenolik Daun Bungur Radikal  anion  superoksida  secara in-vitro dihasilkan  dari  reaksi  autooksidasi  pirogalol dalam  kondisi  basa.  Terbentuknya  radikal anion superoksida akan mengoksidasi ortoquinon  yang  merupakan  produk pertama reaksi oksidasi pirogalol menjadi purpurogalin. Aktivitas  radikal  anion  superoksida  dapat diamati  secara  tidak  langsung  dari  aktivitas produksi  purpurogalin.  Senyawa  purpurogalin memiliki  panjang  gelombang  maksimum  320 nm.  Semakin  tinggi  konsentrasi  radikal  anion superoksida maka semakin tinggi pula produksi purpurogalin sehingga absorbansinya pada 320 nm  juga  meningkat.  Aktivitas  produksi purpurogalin  setiap  saat  diamati  dengan spektrofotometer  UV-Vis  selama  4  menit reaksi  sehingga  didapat  nilai slope reaksi. Senyawa fenolik dapat bereaksi dengan radikal anion  superoksida  sehingga  keberadaannya dapat menurunkan slope reaksi karena produksi purpurogalin  juga  menurun.  Penurunan  nilai slope digunakan  untuk  menghitung  persen peredaman  radikal  anion  superoksida  oleh masing-masing  ekstrak  fenolik  daun  Bungur.
Hasil perhitungan ditunjukkan oleh Gambar 4.
Gambar  4.  Persen  peredaman  radikal  anion superoksida  oleh  ekstrak  fenolik daun Bungur
Kemampuan  ekstrak  fenolik  daun  Bungur dalam  meredam  radikal  anion  superoksida meningkat  seiring  dengan  peningkatan kepolaran senyawa fenoliknya. MB merupakan ekstrak  yang  paling  kuat  meredam  radikal anion superoksida. Namun EAB juga memiliki potensi  yang  bagus  karena  kedua  ekstrak  ini memiliki  aktivitas  peredaman  terhadap  radikal anion superoksida yang lebih baik dari vitamin C. Pola ini secara umum juga didukung dengan data total flavonoidnya.

## Peredaman Radikal Hidroksil Oleh Ekstrak
Fenolik Daun Bungur Radikal  hidroksil  secara in-vitro dihasilkan melalui  reaksi  Fenton.  Radikal  hidroksil  yang terbentuk  akan  menyerang  2-deoksi-D-ribosa dan  menghasilkan  produk  malondialdehid (MDA). Keberadaan senyawa
fenolik menyebabkan  terjadinya  kompetisi  dengan  2- deoksi-D-ribosa untuk bereaksi dengan radikal hidroksil.  Terjadinya  reaksi  antara  senyawa fenolik  dengan  radikal  hidroksil  menyebabkan tidak terbentuknya MDA sehingga menurunkan absorbansi  larutan  pada  532  nm  yang merupakan panjang gelombang maksimum dari MDA-ATB (produk  reaksi  antara  MDA  dan asam  2-tiobarbiturat).  Artinya,  kekuatan senyawa  fenolik  dalam  meredam  radikal hidroksil  meningkat  seiring  penurunan absorbansinya.  Persen  peredaman  masing- masing  ekstrak  dengan  konsentrasi  yang  sama dibandingkan  untuk  menentukan  ekstrak  yang paling  potensial.  Hasil  perhitungan  persen peredaman ditunjukkan oleh Gambar 5.
Gambar 5. Persen peredaman radikal hidroksil oleh ekstrak fenolik daun Bungur
Kemampuan  ekstrak  fenolik  daun  Bungur dalam  meredam  radikal  hidroksil  meningkat seiring dengan peningkatan kepolaran senyawa fenoliknya. MB merupakan ekstrak yang paling kuat  meredam  radikal  hidroksil.  Namun  jika dibandingkan dengan standar Vitamin C, ketiga ekstrak  tersebut  aktivitasnya  masih  lebih rendah.  Meskipun  belum  bisa  dikatakan potensial  namun  ekstrak  fenolik  daun  Bungur khususnya  fraksi  metanol  memiliki  aktivitas peredaman  terhadap  radikal  hiroksil.  Pola peredaman  radikal  hidroksil  oleh  ekstrak fenolik  daun  Bungur  ini  secara  umum didukung oleh data total flavonoidnya.

## Penghambatan  α-Amilase  Oleh  Ekstrak Fenolik Daun Bungur
Potensi  ekstrak  fenolik  daun  Bungur  sebagai inhibitor  α-amilase  dapat  dilihat  dari  nilai persen  penghambatannya  pada  konsentrasi ekstrak yang sama. Semakin besar nilai persen penghambatannya,  maka  potensinya  sebagai inhibitor  α-amilase  semakin  baik  pula.  Persen penghambatan  α-amilase  dihitung  berdasarkan penurunan  gula  reduksi  hasil  reaksi  hidrolisis pati  terlarut  oleh  α-amilase.  Jumlah  gula reduksi  yang  dihasilkan  dari  reaksi  hidrolisis ditentukan menggunakan reagen 3,5- dinitrosalisilat  (DNS).  DNS  yang  berwarna kuning  akan  direduksi  oleh  gula  reduksi  dan menghasilkan  larutan  yang  berwarna  cokelat dengan  panjang  gelombang  maksimum  540 nm. Adanya inhibitor α-amilase dalam ekstrak akan  menurunkan  konsentrasi  gula  reduksi sehingga  menyebabkan  penurunan  nilai absorbansi.  Persen  penghambatan  α-amilase oleh  ekstrak  fenolik  daun  Bungur  ditampilkan oleh Gambar 6.
Gambar  6.  Persen  penghambatan  α-amilase oleh  ekstrak  fenolik  daun Bungur Kemampuan  ekstrak  fenolik  daun  Bungur dalam  menghambat  aktivitas  α-amilase meningkat  seiring  dengan  peningkatan kepolaran  senyawa  fenoliknya.  Hal  ini mungkin  disebabkan  karena  senyawa  yang paling aktif sebagai inhibitor α-amilase berasal dari  senyawa  fenolik  yang  bersifat  polar, sehingga  ekstrak  MB  dengan  kepolaran teringgi mampu menghambat α-amilase paling baik.  Namun  kepolaran  tidak  selamanya mendukung  potensinya  sebagai  inhibitor  α- amilase  karena  enzim  bersifat  lebih  spesifik daripada  radikal  sehingga  struktur  senyawa fenolik dalam  ekstrak  sangat  mempengaruhi aktivitasnya  sebagai  inhibitor.  Meskipun  MB paling  potensial  dibandingkan  dua  ekstrak lainnya,  namun  aktivitasnya  sebagai  inhibitor α-amilase masih lebih rendah daripada standar akarbosa.

## Penghambatan α-Glukosidase Oleh Ekstrak Fenolik Daun Bungur
Potensi  ekstrak  fenolik  daun  Bungur  sebagai inhibitor  α-glukosidase  dapat  dilihat  dari  nilai persen  penghambatannya  pada  konsentrasi ekstrak yang sama. Semakin besar nilai persen penghambatannya,  maka  potensinya  sebagai inhibitor α-glukosidase  semakin  baik  pula. Persen  penghambatan  α-glukosidase  dihitung berdasarkan  penurunan  konsentrasi  glukosa hasil  reaksi  hidrolisis  maltosa  oleh  α- glukosidase.  Konsentrasi  glukosa  ditentukan menggunakan  reaksi coupling enzim.  Pertama glukosa  dioksidasi  oleh  glukosa  oksidase menghasilkan  asam  glukonat  dan  hidrogen peroksida.  Hidrogen  peroksida  yang  terbentuk direaksikan  dengan  fenol  dan  aminoantipirin yang  dikatalis  oleh  peroksidase  menghasilkan larutan berwarna  merah  muda dengan panjang gelombang maksimum  500  nm.  Adanya inhibitor  α-glukosidase  dalam  ekstrak  akan menurunkan  konsentrasi  glukosa  sehingga
menyebabkan  penurunan  nilai  absorbansi. Persen  penghambatan  α-glukosidase  oleh ekstrak  fenolik  daun  Bungur  ditampilkan  oleh Gambar 7.
Gambar 7. Persen penghambatan α-glukosidase oleh ekstrak fenolik daun Bungur
Kepolaran  tidak  selamanya  mendukung potensi  ekstrak  fenolik  daun  Bungur  sebagai inhibitor α-glukosidase. Meskipun ekstrak MB yang  memiliki  kepolaran  tertinggi  mampu menghambat  aktivitas α-glukosidase  paling baik, hal ini tidak berlaku untuk ekstrak EAB. Ekstrak  HB  yang  bersifat  nonpolar  justru memiliki  persen  penghambatan  α-glukosidase lebih tinggi dari pada EAB yang bersifat lebih polar.  Sekali  lagi  enzim  bersifat  lebih  spesifik dari  radikal  sehingga  struktur  dari  senyawa fenolik dalam ekstrak akan sangat mempengaruhi aktivitasnya sebagai inhibitor. Ekstrak  MB  memiliki  potensi  yang  baik sebagai inhibitor α-glukosidase karena mampu menghambat
α-glukosidase  lebih  baik dibandingkan  standar  akarbosa.  Selain  itu ekstrak  MB  juga  dipilih  sebagai  ekstrak  yang paling  potensial  sebagai  agen  antidiabetik karena  mampu  menghambat  aktivitas  α- glukosidase  dan  α-amilase  paling  baik dibandingkan dua ekstrak lainnya.

## KESIMPULAN
Secara  umum,  ekstrak  fenolik  daun  Bungur memiliki potensi sebagai antioksidan dibandingkan  dengan  standar vitamin  C.
Ekstrak  MB  merupakan  ekstrak  yang  paling potensial sebagai antioksidan sekaligus sebagai inhibitor  karena  mampu  meredam  radikal DPPH, anion superoksida, dan hidroksil paling baik,  dan  mampu  menghambat  aktivitas  α- amilase  dan  α-glukosidase  paling baik dibandingkan  dengan  ekstrak  HB  dan  EAB, sehingga dapat dikatakan memiliki potensi jika digunakan sebagai agen antidiabetik dibandingkan dengan standar akarbosa.
Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih disampaikan pada Center for  Development  of  Advanced  Science  and Technology (CDAST) Universitas Jember yang telah mendanai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Chang, W. C., Kim, S. C., Hwang, S. S., Choi., B. K., Ahn, H. J., Lee, M. Y., Park, S. H.,
&  Kim,  S.  K. (2002). Antioxidant  Activity and  Free  Radical Scavenging  Capacity Between  Korean  Medicinal  Plants  and Flavonoids,
Assay-guided  Comparison.
Plant Sci . Vol.163, pp.1161-1168. Dalimartha,  S. (2003). Atlas  Tumbuhan  Obat Indonesia ,  Jilid  II.  Jakarta:  Trubus Agriwidya.
Dewanjee,  S.,  Das,  A.K.,  Sahu,  R.,
Gangopadhyay,  M. (2009). Anti-diabetic
Activity  of  Diospyros  peregrine  Fruit: Effect  on  Hyperglycemia,  Hyperlipidemia and  Augmented  Oxidative  Stress  in Experimental Type 2 Diabetes. Food Chem Toxicol, Vol. 4, pp. 2679-2685. Halliwel  B,  Gutteridge  JMC. (1999). Free radical in biology and medicine. 3rd ed . New York: Oxford University Press. pp.639-45.
Hashim,  A.,  Khan,  M.  S.,  Khan,  M.  S.,  Baig, M.  H.,  &  Ahmad,  S. (2013). Antioxidant and  Alpha  Amylase  Inhibitory  Property  of Phyllanthus  Virgatus  L:  An  In-Vitro  and
Moleculer  Interaction  Study. BioMed
Research International, 2013.
International  Diabetes  Federation. (2003). Diabetes  Atlas . Second  Edition .  Belgium: Imprimerie L Vanmelle SA, Gent/Mariakerke. Patel,  D.  K.,  Kumar,  R.,  &  Hemalatha,  D.  L. (2012). Natural  medicines  from  plant source  used  for  therapy  of  diabetes mellitus: An overview of its pharmacological  aspects.
Asian  Pacific
Journal of Tropical Disease , pp. 239-250. Maritim,  A.  C.,  Sanders,  R.  A.,  Miyaza,  M., yagi,  N.,  &  Taguchi,  K. (2005). Inhibitory
Compounds of α-Glukosidase Activity , from Arctium  lappa  I.  J.  Oleo  Sci , Vol.54  (11),
pp. 589-594.
Nadheesha,  M.  K.  F.,  Bamunuarachichi,  A.,
Edirisinghe,  E.  M.  R.  K.  B.  M.,  &
Weerasinghe W. M. S. K. (2007). Study on Antioxidant  Activity  of  Indian  Gooseberry
Fruit and Seed . J. Sci. Vol.3, pp. 83-92. Rao,  M.U.,  Sreenivasulu,  M.,  Chengaiah,  B., Reddy,  K.J.,  Chetty,  C.M. (2010). Herbal Medicines for Diabetes Mellitus: A Review . PharmTech  Research,  Vol.2, pp. 1883- 1892. Shan,  Bin.,  Z,  Cai,  Yizhong  Z.,  Sun,  Mei., Corke,  Harold. (2005). Antioxidant Capacity  of  26  Spice  Extracts  and Characterization  of  Their  Phenolic Constituents. J  Agric  Food  Chem. Vol.53, pp. 7749-7759.
Shinde,  J.,  Taldone,  T.,  Barletta,  M., Kunaparaju,  N.,  Bo,  H.,  Kumar,  S., et  al. (2008). Alpha-glucosidase Inhibitory Activity  of  Syzygium  cumini  (Linn.)  Skeels Seed Kernel In Vitro and in Goto-Kakizaki (GK)  Rats .  Carbohydrate  Research, Vol.343, pp. 1278-1281. Soler-Rivas,  C.,  Espin,  J.C.,  &  Wichers,  H.J. (2000). An  easy  and  fast  test  to  compare total  free  radical  scavenger  capacity  of food  stuffs. Phytochem.  Anal , Vol.11,  pp.
330-338. Taga, M. S., Miller, E. E., & Prat, D. E. (1984).
Chia  Seeds  as  a  Source  of  Nature  Lipid Antioxidant  s. J.  Am.  Oil.  Chem.  Soc. Vol.61, pp. 928-931. Tang,  X.,  He,  Z.,  Day,  Y.,  Xiong,  Y.L.,  Xie, M.,  &  Chen,  J. (2010). Peptide fractionation  and  free  radical  scavenging activity of zein hydrolysate. J. Agric. Food
Chem. Vol.58, pp.587-593.
Wolff, S. P. (1993). Diabetes Mellitus and free radicals:  Free  radicals,  transition  metals and  oxidative  stress  in  the  aetiology  of diabetes mellitus and complication. British Medical Bulletin, Vol.49 (3), pp. 642-432.