96 Jurnal Agrotek Tropika 5(2): 96-101, 2017 J.  Agrotek    Tropika.    ISSN  2337-4993 Vol. 5,  No. 2: 96 – 101,  Mei 2017

## VIRULENSI BEBERAPA ISOLAT METARHIZIUM ANISOPLIAE TERHADAP ULAT GRAYAK ( Spodoptera litura F.) di LABORATORIUM

## Ketut Aryo, Purnomo, Lestari Wibowo & Titik Nur Aeny
Jurusan Agroteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Lampung Jl. Soemantri Bojonegoro No. 1 Bandar Lampung 35145 Email: ketutaryo@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pertumbuhan koloni, viabilitas spora serta kerapatan spora dari lima isolat Metarhizium anisopliae dan mempelajari pengaruh aplikasi Metarhizium anisopliae terhadap mortalitas Spodoptera litura F. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Hama Tumbuhan dan Laboratorium Penyakit Tumbuhan, Bidang Proteksi Tanaman Jurusan Agroteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Lampung  pada akhir tahun 2013 (Tahap I) dan dilanjutkan pada awal tahun 2016 (Tahap II). Hasil Penelitian menunjukkan bahwa : Tidak terdapat perbedaan viabilitas spora M . anisopliae yang nyata antar 5 isolat asal Tegineneng, Trimurjo, Gadingrejo, Bantul dan UGM; Kerapatan isolat asal UGM adalah 2,25 x 10 9 spora/ml, lebih tinggi dibandingkan dengan isolat asal Gadingrejo, Bantul, Tegineneng dan Trimurjo; Isolat M. anisopliae asal UGM mampu membunuh ulat grayak ( S. litura ) hingga 86,67%, isolat lain memiliki kemampuan lebih rendah dibandingkan isolat asal UGM.
Kata kunci: diameter koloni, kerapatan spora, viabilitas spora, virulensi, Metarhizium   anisopliae , ulat grayak ( Spodoptera litura F.).

## PENDAHULUAN
Ulat  grayak  ( Spodoptera  litura Fabr. )merupakan salah  satu hama  penting pada  tanaman kedelai. S.  litura dapat  hidup  pada  berbagai  jenis tanaman, seperti tembakau, kacang tanah, ubi jalar, cabai, bawang merah, kacang hijau, dan jagung. Ulat instar muda merusak daun sehingga bagian daun yang tersisa hanya tulang-tulang daun, dan ulat instar tua memakan seluruh bagian daun.  Selain merusak daun, larva juga menyerang polong muda (Prayogo et al ., 2005). Pengendalian ulat  grayak pada  saat ini masih mengandalkan penggunaan insektisida. Pengendalian menggunakan  insektisida  kimia  diketahui  memiliki dampak buruk untuk kedepannya, selain merusak dan meracuni  tanah  insektisida  kimia  dapat  mematikan serangga lain di sekitar area pertanaman yang bukan merupakan  suatu  hama.  Untuk  mendukung pengendalian hama yang berwawasan lingkungan maka perlu dilakukannya pengendalian yang ramah lingkungan, Purnomo  (2010)  berpendapat  salah  satu  tawaran alternatif teknik pengendalian yang ramah lingkungan yaitu  pengendalian  hayati,  yang  lebih  fokus  pada penggunaan musuh alami hama, atau agens pengendali hayati.  Pengendalian hayati menggunakan parasitoid, predator, patogen, atau kompetitor yang dapat menekan populasi hama, sehingga menurunkan tingkat kerusakan
bila dibandingkan jika musuh alami tidak ada. Salah satu jenis patogen serangga adalah jamur entomopatogenik.
Pemanfaatan jamur entomopatogen berpotensi untuk  dikembangkan.  Salah  satu  jenis  jamur entomopatogen yang cukup efektif adalah Metarhizium spp.  Salah  satu  cendawan Metarhizium spp.  yang seringdigunakan  dan  merupakan  bagian  dari  fokus penelitian ini adalah Metarhizium anisopliae. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui pertumbuhan koloni, viabilitas spora, serta kerapatan spora  dari  lima  isolat M.  anisopliae . Mengetahui hubungan antara pertumbuhan koloni, viabilitas spora, dan kerapatan spora M. anisopliae dengan mortalitas S.  litura . Mengetahui  virulensi Metarhizium anisopliae terhadap S.  litura .

## BAHAN  DAN  METODE
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Hama Tumbuhan  dan  Laboratorium  Penyakit Tumbuhan, Bidang  Proteksi  Tanaman  Jurusan Agroteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Lampung  pada akhir tahun 2013 (Tahap I) dan dilanjutkan pada awal tahun 2016 (Tahap II).
Bahan-bahan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah serangga ulat grayak (S. litura) , tanaman padi, media SDA ( sabouraud dextrose agar ), tissu, alkohol
70%, kapas, aqua destilata steril, isolat M. anisopliae dari Tegineneng,  Gading  Rejo,  Bantul,  UGM,  dan Trimurjo. Sedangkan alat-alat yang dibutuhkan yaitu toples plastik, plastik tahan panas, kain kasa, tabung pemelihara  serangga,  nampan  plastik,  cawan  petri, haemocytometer , erlenmeyer, rotamixer , jarum ose, bor gabus,  mikropippet, laminar  air  flow ,  mikroskop, preparat, kaca penutup, autoclave , dan tabung reaksi. Penelitian ini berupa percobaan dalam rancangan acak kelompok (RAK)  yang dibagi  dalam 2 bagian. Pertama pengukuran pertumbuhan koloni  cendawan, pengamatan  kerapatan  spora,  dan  viabilitas  spora. Pengukuran pertumbuhan koloni cendawan terdiri dari 5 perlakuan dan 4 kelompok,  pengamatan kerapatan spora dan viabilitas spora terdiri dari 5 perlakuan dan 3 kelompok, dan kedua uji virulensi terdiri dari 6 perlakuan dan 3  kelompok.   Pengamatan  pertumbuhan  koloni cendawan  sebagai  perlakuan  adalah  5  isolat M. anisopliae (Tegineneng, Gading Rejo, UGM, Bantul, dan  Trimurjo),  kelompok  bedasarkan  berapa  kali dilakukan pengukuran.  Pengamatan kerapatan spora dan viabilitas spora sebagai perlakuan adalah 5 isolat M. anisopliae (Tegineneng, Gading Rejo, UGM, Bantul, dan  Trimurjo),  kelompok  berdasarkan  waktu pengamatan.  Pengujian virulensi sebagai  perlakuan adalah 5 isolat M. anisopliae (Tegineneng, Gading Rejo, UGM, Bantul, dan Trimurjo) dan 1 kontrol, kelompok berdasarkan waktu aplikasi yang berbeda.
Penyiapan  Serangga Spodoptera  litura F. Pembiakan  serangga  ulat  grayak  dilakukan  di laboratorium. Serangga diperoleh dari penangkapan di lapang pada area pertanaman sayuran dan jagung manis. 10  ekor serangga  kisaran instar  4-5 dimasukkan  ke dalam toples plastik berukuran diameter 15 cm x tinggi 7 cm yang berisi daun talas muda yang telah dipotong sebagai sumber makanan.
Pengukuran  Diameter  Koloni  Cendawan Metarhizium  anisopliae. Isolat  cendawan  diambil menggunakan bor gabus dan ditumbuhkan pada bagian tengah media SDA.  Setelah itu cendawan diinkubasi untuk melihat pertumbuhannya dengan diukur diameter koloninya.  Pengukuran dilakukan pada 4 cawan isolat di  hari  ke-3,  ke-5,  dan  ke-7  setelah  inokulasi. Pengamatan  dilakukan  terhadap  diameter  koloni cendawan yang tumbuh dari tiap-tiap jenis cendawan Metarhizium sp.    Data  diameter  yang  didapat merupakan nilai rata-rata 4 kali pengukuran diameter koloni cendawan yang tumbuh pada setiap sisinya.
Pengujian  Kerapatan  konidia M.  anisopliae . Biakan cendawan Metarhizium sp. pada masing-masing media  diambil sebanyak  1 potongan  bor gabus  lalu ditambahkan ke dalam air steril dalam tabung reaksi steril
berukuran 10 ml dan dikocok dengan shaker hingga tercampur merata (± 10 menit).  Selanjutnya dilakukan pengenceran hingga  10 -3 .  Kerapatan spora  dihitung dengan  menggunakan alat  hemasitometer di  bawah mikroskop  binokuler  dengan  perbesaran  400  kali. Kerapatan spora dihitung dengan menggunakan rumus Gabriel & Riyatno (1989) sebagai berikut:
Keterangan: C = kerapatan spora per ml larutan t  = jumlah total spora dalam kotak yang diamati d = tingkat pengenceran n = jumlah kotak(5 kotak besar x 16 kotak kecil)
Pengujian viabilitas Metarhizium  anisopliae. Viabilitas spora cendawan Metarhizium spp. ditentukan setelah suspensi spora diinkubasikan selama 24 jam. Satu tetes suspensi tersebut diteteskan pada kaca preparat dan  ditutup dengan  gelas penutup dan diletakkan  di bawah  mikroskop  dengan  perbesaran  400  kali. Selanjutnya dihitung jumlah spora yang berkecambah dan tidak berkecambah pada luasan bidang pandang yang telah ditentukan. Penghitungan viabilitas spora dilakukan setiap 2 jam sekali mulai sejak 12 jam sampai dengan 24 jam setelah inkubasi. Viabilitas spora dihitung dengan menggunakan rumus Gabriel & Riyatno (1989) sebagai berikut :
Keterangan: V = persentase konidia yang berkecambah g  = rata-rata konidia yang berkecambah u  = rata-rata konidia yang tidak   berkecambah
Pengujian Virulensi Entomopatogen. Spora yang diambil dari media diencerkan dengan air steril sampai 10 -3 /ml, kemudian disemprotkan pada 10 ekor ulat S. litura instar 5. Serangga hama kemudian dipindahkan ke tempat pemeliharaan yang dibuat dari toples plastikl dan  diberi  makan  berupa  daun  talas.  Pengamatan serangga yang mati dilakukan pada 3, 7, dan 10 hari setelah aplikasi (HSA). Menurut Rustama et al. (2008) bahwa mortalitas serangga dapat dihitung menggunakan rumus seperti berikut :
6 10 0,25 n d t C     % 100 u) (g g V    % 100 N n M    

## Jurnal Agrotek Tropika 5(2): 96-101, 2017
Keterangan: M = mortalitas serangga (%) n  = serangga yang mati (ekor) N = jumlah serangga yang diuji (ekor)

## HASIL  DAN  PEMBAHASAN
Hasil Pengujian Pertumbuhan Koloni Cendawan . Hasil  analisis ragam  menunjukkan  bahwa  diameter koloni  cendawan  menunjukkan  perbedaan  ukuran diameter pada setiap pengamatan.  Pertumbuhan M . anisopliae dari UGM pada 3 hari setelah inkubasi (hsi) menunjukkan pertumbuhan koloni yang paling tinggi dibandingkan  dengan isolat  lainnya dengan  rata-rata diameter mencapai 2,80 cm.  Kemudian pada 5 hari setelah inkubasi (hsi) isolat Gadingrejo menunjukkan tingkat pertumbuhan tertinggi yaitu mencapai 7,80 cm dan pada 7 hari setelah inkubasi (hsi) dengan hasil rata- rata diameter mencapai 8,63 cm .  Isolat Gadingrejo menunjukkan  hasil  yang  paling  tinggi  tingkat pertumbuhannya (Tabel 1).
Hasil Pengujian Tingkat Kerapatan Spora. Hasil penelitian  terhadap  pengujian  kerapatan  spora M . anisopliae menunjukkan  hasil  yang  berbeda  nyata antara masing-masing perlakuan (Tabel 2). Dari Tabel 2 terlihat bahwa kerapatan spora yang memiliki tingkat kerapatan tertinggi adalah isolat yang berasal dari UGM dengan hasil rata-rata 2,25 x 10 9 spora/ml lebih tinggi dibandingkan dengan isolat asal Trimurjo dengan hasil rata-rata 2,09 x 10 9 spora/ml Hasil Pengujian Viabilitas Spora. Hasil penelitian terhadap  pengujian  viabilitas  spora M . anisopliae menunjukkan hasil  yang tidak berbeda nyata  antara masing-masing perlakuan (Tabel 3). Viabilitas spora yang memiliki tingkat perkecambahan tertinggi berdasarkan rata – rata adalah isolat yang berasal dari UGM dengan hasil 76,88 % kemudian diikuti dari isolat yang berasal dari Gadingrejo 55,19 %, Tegineneng dengan hasil 45,27 %, diikuti Bantul 41,86 % , dan Trimurjo 32,50 %.
Hasil  Pengujian  Virulensi M . Anisopliae. Pengujian virulensi isolat M . anisopliae memiliki hasil mortalitas yang beragam, dan menghasilkan hasil yang nyata antar perlakuan setelah dilakukan analisis statistik.
Tabel 1. Rata-rata diameter pertumbuhan koloni cendawan M . anisopliae
Asal Isolat Diameter Koloni Cendawan M . anisopliae (cm) 3 hsi 5 hsi 7 hsi Trimurjo 1,71 bc 5,03 bc 8,11 ab Gadingrejo 1,90 bc 7,98 a 8,63 a Bantul 2,30 ab 5,10 bc 6,49 bc Tegineneng 1,14 c 3,66 c 5,34 c UGM 2,80 a 6,97 ab 7,47 ab Nilai BNT 0,77 2,42 1,73 Keterangan: hsi = hari setelah inokulasi, Nilai tengah yang diikuti huruf yang beda berbeda nyata menurut uji BNT pada taraf (5%). Asal Isolat Rerata Kerapatan Spora (Spora/ml) UGM 2,25 x 10 9 a Trimurjo 2,09 x 10 9 b Bantul 2,01 x 10 9 bc Tegineneng 1,75 x 10 9 c Gadingrejo 1,68 x 10 9 c Nilai BNT: 0,13 Tabel 2. Rerata Kerapatan spora Metarhizium anisopliae
Keterangan: Pengujian tingkat kerapatan spora M . anisopliae yang diikut  huruf yang sama berbeda nyata menurut uji BNT pada taraf (5%).
Gambar 1 . Grafik regresi antara diameter koloni dan mortalitas serangga S. litura
Berdasarkan rata-rata persentase mortalitas serangga, isolat yang memiliki tingkat virulensi yang relatif lebih tinggi dari yang lainnya adalah isolat dari UGM dengan hasil mencapai 8,67 % serangga mati (Tabel 4) yang terinfeksi cendawan M . anisopliae. Pada  pengujian  virulensi  beberapa  isolat M . anisopliae setelah 10 hari penginfeksian menghasilkan mortalitas S. litura tertinggi dengan nilai mencapai 86,67 % serangga mati, yaitu terdapat pada isolat asal UGM, kemudian diikuti isolat dari Bantul dengan nilai 83,33 % dan isolat asal Gadingrejo dan Trimurjo dengan nilai 76,67 %  serangga  mati  dan  nilai  terendah  isolat  asal Tegineneng  dengan nilai  73,33 %.   Dalam  aplikasi terhadap S. litura pada  penelitian  ini,  suspensi M . anisopliae menggunakan pengenceran yang sama yaitu 10 -3 /ml setiap perlakuan dan aplikasi dilakukan hanya satu kali.  Pada pengujian virulensi isolat M . anisopliae memiliki  hasil  mortalitas  yang  beragam,  dan menghasilkan hasil yang nyata antar perlakuan setelah dilakukan analisis statistik pada uji BNT dengan taraf nyata 5%.
Penelitian Prayogo dan Tengkano (2004) yang menyatakan  bahwa  mortalitas S.  litura sangat ditentukan  oleh  frekuensi  aplikasi M.  anisopliae . Aplikasi M.  anisopliae satu  kali  sebenarnya  sudah mampu mematikan S. litura hingga 40%.  Begitupun hasil  penelitian  Suhairiyah  (2013)  yang  menguji mortalitas S.  litura pada  agensia  hayati  cendawan Lecanicillium lecanii yang menunjukan kematian S. litura sebesar 83 %. Hal ini mungkin dipengaruhi oleh kerapatan konidia yang tinggi, maka semakin banyak juga miselium dan konidia yang tumbuh.  Hal tersebut meningkatkan terjadinya kontak konidia dengan tubuh larva, sehingga memberi peluang yang lebih baik bagi
konidia untuk menempel, berkecambah dan melakukan penetrasi ke dalam tubuh larva (Destiyanti, 2007) Tingkat virulensi cendawan M . anisopliae tidak dipengaruhi oleh tingkat pertumbuhan diameter koloni cendawan,  viabilitas spora  cendawan dan kerapatan spora  cendawan.    Dari  grafik  regresi  (Gambar  1) pengukuran diameter koloni cendawan M. anisopliae dari Gadingrejo memiliki tingkat pertumbuhan tertinggi yaitu 8,07 cm namun memiliki persentase mortalitas S. litura hanya  76,67%.  Di sisi lain isolat asal Tegineneng memiliki nilai pertumbuhan koloni terkecil yaitu sebesar 5,42 cm juga memiliki mortalitas S. litura dengan angka persentase terkecil yaitu 73,33%.
Pada  grafik  regresi  viabilitas  spora  dengan mortalitas  (Gambar  3) didapatkan  hasil  yang  tidak berbeda nyata antara viabilitas dengan mortalitas.  Hal ini terjadi karena mungkin penambahan bahan pembawa yaitu media SDA menyebabkan viabilitas konidia M. anisopliae dapat bertahan. Pada  grafik  regresi  kerapatan  spora  dengan mortalitas (Gambar 2) menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata.  Hal ini dikarenakan pada pengamatan kerapatan spora tidak menggunakan bahan pembawa. Menurut  Effendy (2010) bioinsektisida tanpa bahan pembawa kerapatan  konidianya 8,3x10 6 konidia/ ml berbeda nyata dengan bioinsektisida yang menggunakan bahan  pembawa.    Hal  ini  dapat  disebabkan  bahan pembawa  bioinsektisida  waktu  pengenceran  yang diambil 5 g bersama bahan pembawa, sedangkan konidia tanpa bahan pembawa diambil 5 g hanya konidia saja. Hal ini  akan  mengakibatkan  jumlah  konidia  dalam suspensi memang sudah berbeda, tentunya konidia tanpa bahan pembawa akan lebih banyak. Hal ini mungkin yang menyebabkan pada isolat UGM walau memiliki
nilai kerapan yang tinggi yaitu sebesar 2,25 x 10 9 spora/ ml dan nilai mortalitas yang tinggi sebesar 86,67 %  hal ini membuktikan ternyata nilai kerapatan yang tinggi bukan satu-satunya faktor yang menyebabkan terjadinya mortalitas.  Hal ini didukung dengan pendapat Prayogo (2005) yang menyatakan selain toksin, faktor lingkungan juga berpengaruh terhadap mortalitas ulat grayak, yaitu seperti kelembaban dan suhu. Pada tahap penginfeksian cendawan terhadap serangga sasaran, kelembaban yang tinggi  diperlukan  untuk  perkecambahn  propagul cendawan.
Dalam pengujian pertumbuhan koloni cendawan dan viabilitas spora, menggunakan media yang berbeda dengan  pengujian  virulensi,  yaitu  media  SDA ( Sabouraud Dextrose Agar ).  Media SDA merupakan salah satu media yang digunakan untuk pertumbuhan cendawan yang sengaja dibuat untuk memiliki kandungan nutrisi untuk mensuplai makanan terhadap cendawan. Komposisi dari media SDA yang digunakan adalah 40 g Dextrose, 5 g Pepton, 5 g kasein, 15 g agar dan 1 liter air  destilata.  Glukosa  merupakan  salah  satu  jenis monosakarida yang menjadi sumber energi dan media pertumbuhan cendawan dalam  sistem  metabolisme. Monosakarida merupakan  gula sederhana  penyusun karbohidrat yang tidak dapat diuraikan secara hidrolisis. Bentuk alami (D-glukosa) dapat disebut juga dengan dekstrosa. Glukosa berperan  sebagai sumber  karbon bagi  cendawan Candida  albicans (Lestari,  2012 dalam Wayan et al. ,  2014).    Sedangkan  pengujian virulensi menggunakan media serangga S. litura yang berarti akan berbeda nutrisi yang akan diserap bahkan bisa jadi nutrisi yang tekandung dalam serangga uji terbatas sehingga menyebabkan hasil yang tidak sesuai.
Berdasarkan  rata-rata  persentase  mortalitas serangga, isolat yang memiliki tingkat virulensi yang relatif lebih tinggi dari yang lainnya adalah isolat dari UGM dengan hasil mencapai 86,67% serangga mati (Tabel 4).  Isolat M . anisopliae asal UGM relatif lebih baik berdasarkan perhitungan rata-rata untuk digunakan sebagai agens pengendali hayati hama S. litura. Pada umumnya virulensi yang tinggi disebabkan oleh toksin yang  terkandung  dalam  cendawan.    Isolat M . anisopliae asal UGM memiliki toksisitas yang tinggi untuk  mematikan  serangga S.  litura sehingga mortalitasnya  besar.   Artinya  dalam  penelitian  ini toksisitas dari masing-masing asal isolat M . anisopliae berbeda. KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat diambil pada penelitian ini  yaitu tidak  terdapat perbedaan  yang nyata  pada viabilitas spora 5 isolat M. anisopliae (Tegineneng, Trimurjo,  Gadingrejo,  Bantul dan  UGM ). Tingkat kerapatan spora tertinggi terdapat pada isolat asal UGM (2,25 x 10 9 spora/ml). Virulensi M. anisopliae terhadap ulat  grayak  ( S.  litura )  tidak  dipengaruhi  oleh pertumbuhan koloni,viabilitas spora, dan kerapatan spora M.  anisopliae. Isi  isolat  M .  anisopliae asal  UGM terhadap ulat grayak ( S. litura ) mencapai 86,67%, paling tinggi dibandingkam dengan isolat-isolat lainnya.

## DAFTAR  PUSTAKA
Desyanti.  2007.  Kajian  Pengendalian  Rayap Tanah Coptotermes spp.  (Isoptera:  Rhinotermitidae) dengan Menggunakan Cendawan Entomopatogen Isolat Lokal . Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor. 97 hlm.
Effendy,  Siti H.,  Chandra I.,  Salim A. dan Erni. 2010 . Seleksi Substrat Jamur Metarhizium Sp. Untuk Mengendalikan Wereng  Coklat Nilaparvata lugens (Stal.) (Homoptera:  Delphacidae)  Di Tanaman  Padi. Majalah  ilmiah  Sriwijaya . 16(8).
Gabriel, BP dan Riyatno. 1989. Metarhizium anisopliae (Metch)  Sor:  Taksonomi,Patologi,  Produksi dan  Aplikasinya. Jakarta:  Direktorat Perlindungan Tanaman Perkebunan, Departemen  Pertanian.
Aryo et al.: Virulensi Beberapa Isolat Metharizium Anisopliae 101
Prayogo, Y., Tengkano W., dan Marwoto. 2005. Prospek Cendawan  Entomopatogen Metarhizium anisopliae Untuk Mengendalikan Ulat Grayak Spodoptera litura Pada  Kedelai. J.  Litbang Pertanian. 24(1): 19-26.
Purnomo, H. 2010. Pengantar Pengendalian Hayati. C.V Andi Offset. Yogyakarta.
Rustama,  M.  M.,  Melanie.,  dan  Irawan  B.  2008. Patogenisitas Jamur Entomopatogen Metarhizium anisopliae Terhadap Crocidolomia  pavonana Fab. Dalam Kegiatan Studi Pengendalian Hama Terpadu Tanaman Kubis Dengan Menggunakan
Agensia Hayati. Laporan Penelitian. Universitas Padjadjaran. Jawa Barat. Diakses tanggal 14 Juli 2013.
Suhairiyah.  2013.  Pengaruh  Pemberian  Cendawan Lecanicillium lecanii Terhadap Mortalitas Ulat Grayak  ( Spodoptera  litura )  Secara  In  Vitro. lentera bio 2 (3): 253-257.
Wayan,  I.  G.,  Ida  B.  R. W.,  dan  Luh A. W.  2014. Pengaruh  Penambahan  Glukosa  Dan  Waktu Inkubasi Pada Media SDA ( Sabaroud Dextrose Agar) Terhadap  Pertumbuhan Jamur Candida albicans . Media Bina Ilmiah 8 (1): 51-56.