Introduksi Gen Sitrat Sintase Pseudomonas aeruginosa ke Nicotiana tabacum dan Jatropha curcas untuk Meningkatkan Toleransi terhadap Cekaman Aluminium
Introduction of Pseudomonas aeruginosa Citrate Synthase Gene to Nicotiana tabacum and Jatropha curcas to Enhance Tolerance to Aluminum Stress
Radite Tistama 1 , Utut Widyastuti 2 , Suharsono 2*
1 Balai Penelitian Sungei Putih, Pusat Penelitian Karet , PO Box 1415 Medan 20001 2 Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor Jl. Dramaga, Bogor 16680 *Email : sony.suharsono@yahoo.com
Diterima 20 Juli 2017 / Disetujui 27 Agustus 2017

## ABSTRAK
Cekaman aluminium merupakan faktor penghalang utama untuk pengembangan komoditas tanaman unggulan di  lahan-lahan  masam.  Sintesis  dan  sekresi  asam  organik  oleh  akar  merupakan  salah  satu  mekanisme mengurangi  cekaman  aluminium.  Penelitian  ini  bertujuan  mengintroduksikan  gen  sitrat  sintase  bakteri P. aeruginosa ( PaCS )  ke  dalam  tanaman  tembakau (N.  tabacum) dan Jatropha  curcas . PaCS berhasil diintroduksi dengan batuan Agrobacterium tumefaciens baik ke dalam jaringan tembakau maupun J. curcas .. Toleransi  tembakau  transgenik  ditandai  dengan  pertambahan  panjang  akar  yang  lebih  tinggi  dibanding  tipe liarnya  pada  cekaman  0,3  mM  AlCl3.  Toleransi  tembakau  transgenik  dapat  mengurangi  masuknya  Al  ke dalam jaringan akar. Sifat toleran gen PaCS diturunkan mengikuti Hukum Mendel. Persentase introduksi gen PaCS ke dalam J. curcas hanya 1% dari jumlah eksplan yang ditranformasi.
Kata kunci : introduksi gen, sitrat sintase, cekaman aluminium, N. tabacum, J. curcas

## ABSTRACT
Aluminum stress is the main obstacle for development of superior commodity in the acid area. Organic acid synthesis  and  secresion  of  it  by  root  is  one  mechanism  of  aluminum  tolerance.  This  research  obtain  to introduced  citrate  synthase  of P.  aeruginosa ( PaCS )  into  tabacco  ( N.  tabacum )  and J.  curcas . PaCS was introduced succesfully by Agrobacterium tumefaciens into tabacco and Jatropha. The tolerance of  transgenic tabacco  signed  with  the  lenght  increase  of  root  that  were  higher  than  its  wild  type  under  0,3  mM  AlCl3 treatment.  The transgenic tabacco capable to reduced the  aluminum  influx to root tissue. The character  of PaCS  gene  was  inherited  followed  Mendel’s  law.  The  precentange  of PaCS gene  introduction  into J  curcas was low only 1% from total explants.
Keywords : gene introduction, citrate synthase, aluminum strees , N. tabacum, J. curcas

## PENDAHULUAN
Keracunan  alumininum  (Al)  merupakan penyebab  utama  berkurangnya  pertumbuhan  dan produktivitas  tanaman  pertanian  di  tanah  masam. Pada pH di bawah 5, Al 3+ merupakan bentuk yang dominan  di  dalam  tanah  dan  beracun  bagi  banyak tanaman  (Kochian et  al .  2002),  dan  dalam konsentrasi  mikromolar  Al 3+ dapat  menghambat pertumbuhan  akar  hanya  dalam  beberapa  jam. Aluminium  mengganggu  fungsi  dinding  sel, plasma, dan jalur signal transduksi hanya beberapa
jam  setelah  akar  dicekam  Al  (Poschenrieder et  al . 2008).
Upaya  meningkatkan  daya  hasil  tanaman  di lahan masam dapat dilakukan dengan meningkatkan  toleransi  tanaman  terhadap  Al dengan  mengurangi  kontak  sel  dengan  Al.  Ma (2000) menyebutkan bahwa salah satu mekanisme toleransi  tanaman  terhadap  Al  adalah  dengan mencegah  Al  masuk    ke  jaringan  akar  atau mendetoksifikasi  Al  yang  sudah  masuk  di  dalam sel  dan  kemudian  mengeluarkannya.  Tanaman

## Introduksi Gen Sitrat Sintase Pseudomonas aeruginosa ke  Nicotiana tabacum dan Jatropha curcas untuk Meningkatkan Toleransi terhadap Cekaman Aluminium
dapat mendektosifikasi Al dengan mensintesis dan mensekresikan  asam  organik.  Usaha  untuk mendapatkan  tanaman  yang  toleran  Al  telah dilakukan dengan mengekspresikan secara berlebih  gen  yang  mengatur  sintesis  asam  sitrat yaitu  gen  sitrat  sintase  (de  la  Fuente et  al .  1997; Koyama et al . 2000; Anoop et al 2003).
Pseudomonas merupakan salah satu mikroba  utama  di  dalam  rhizosfer  yang  banyak digunakan  berbagai  proses  seperti  mengatasi cekaman oksidatif (Hassett et al. 1993), antimikroba  (Chin-A-Woeng et  al .  2003),  dan pengkelat  logam  (Lemire et  al. 2010).  Beberapa spesies  dalam  genus  ini  juga  sitrat  (Buch et  al . 2008)  yang  dikaitkan  dengan  toleransi  bakteri  ini terhadap  cekaman  Al  (Mailloux et  al. 2008; Lemire et  al. 2010).    Hal  ini  menjadi  alasan  para peneliti  mengisolasi  dan  mengekspresikan  gen sitrat sintase Pseudomonas ke dalam tanaman atau khamir  (de  la  Fuente et  al .  1997;  Baron et  al. 2008).
Tanaman  yang  banyak  digunakan  untuk model  rekayasa  genetik  adalah Arabidopsis thaliana , Nicotiana bentamiana (Deng et al . 2009; Anggraito  2012)  dan Nicotiana  tabacum (de  la Fuente et  al. 1997;  Hanum  2012).  Hanum  (2012) melaporkan  bahwa  efisiensi  transformasi  melalui perantara Agrobacterium pada N.  tabacum mencapai  92% dan  pada N.  bentamiana mencapai 82%,  sedangkan  Anggraito  (2012)  mendapatkan efisiensi transformasi hanya 34,6% dalam mengintroduksikan gen MaMt 2.
Salah  satu  tanaman  target  untuk  direkayasa genetiknya  adalah Jatropha  curcas . J.  curcas merupakan  salah  satu  pilihan  sumber  utama biodiesel,  karena  tidak  berkompetisi  manfaatnya
sebagai  pangan  (Makkar  &  Becker,  2009)  dan memiliki  manfaat  ekologis  (Fairless,  2007). Namun  demikian, J.  curcas dinilai  kurang kompetitif  dikembangkan  di  lahan  yang  subur, sehingga pengembangan tanaman ini diarahkan ke lahan-lahan marginal dengan kandungan aluminium  tinggi.    Dari  penelitian  pertama diketahui  bahwa  pertumbuhan J.  curcas menurun akibat cekaman aluminium (Tistama et al . 2012). Upaya untuk meningkatkan toleransi tanaman  terhadap  aluminium  dapat  dilakukan dengan mengintroduksi gen CS (de la Fuente et al. 1997).  Penelitian ini  bertujuan  mengintroduksikan gen PaCS ke  dalam  tanaman  tembakau  dan beberapa  aksesi J.  curcas untuk  meningkatkan sintesis  dan  sekresi  sitrat  sebagai  agen  pengkelat aluminium.

## METODE PENELITIAN
Bahan  untuk  penelitian  ini  meliputi  gen PaCS yang  dikonstruksi  ke  dalam    plasmid pMSH1  sebagai  vector  ekspresi  (Gambar  1)  dan Agrobacterium  tumefaciens LB  4404 sebagai perantara  transformasi. Tanaman  model  yang digunakan  untuk  menguji  ekspresi  gen  adalah Nicotiana  tabacum, dan Jatropha  curcas sebagai tanaman  target  untuk  ditingkatkan  toleransinya terhadap cekaman aluminium. Primer 35 S forward (5’AAACCTCCTC-GATTCCATT3’)  dan  PaCS reverse  (5’TCAGCCGCGATCCTTGAGGGC3’) digunakan  untuk  menganalisis  integrasi  transgen PaCS di dalam  tanaman transgenik.
Gambar 1. Kontruksi gen PaCS di vektor ekspresi pMSH1 di sisi pemotongan Spe I dan Not I . LB
NPT II HPT T T T nos P 35SP 35SP PaCS RB Spe I Not I 1630 pb Hind III Hind III
BamH I

## Introduksi gen PaCS ke N. Tabacum
Introduksi gen mengikuti metode Anggaraito  (2012).  Daun N.  tabacum dipotong kurang lebih 1cm 2 sebanyak 50 eksplan. Potongan daun  direndam  di  dalam  medium  cair  Murashige dan Skoog (MS) (Murashige & Skoog 1962) yang mengandung A. tumefaciens (OD 600 = 0,4-0,6) dan 20  µM  asetosiringon,  selama  10  menit.  Daun ditanam  pada  media  kokultivasi  yaitu  medium padat MS yang diperkaya dengan 1 ppm BAP dan 20  µM  asetosiringon,    dan  diseleksi  dengan higromisin dan kanamisin. Tanaman yang mengandung  sisipan  promotor  dan  gen PaCS disebut  sebagai  tanaman  transgenik  T1.  Tanaman transgenik  T1  diaklimatisasi  dan  ditanam  di  pot hingga menghasilkan biji.

## Uji  Tantang  Tanaman  Transgenik  terhadap Higromisin dan Cekaman Aluminium
Benih  tembakau  tipe  liar  (TL)  dan transgenik  T1  disterilisasi  dengan  70%  alkohol selama  1  menit,  kemudian  benih  dikecambahkan selama 1 minggu pada kondisi gelap di media MS0 dengan dan tanpa ditambahkan 50 ppm higromisin. Setelah benih berkecambah, kultur dipindahkan ke kondisi terang. Setelah 1 minggu di kondisi terang, jumlah  tanaman  yang  berkecambah  normal  dan biji  yang  tidak  berkecambah  atau  berkecambah tetapi  tidak  normal  pertumbuhannya  dihitung. Respon  biji  T1  terhadap  higromisin  diuji  dengan Chi kwadrat untuk menentukan pola  segregasinya.
Kecambah  yang  lolos  seleksi  higromisin diaklimatisasi dan dikultur hidroponik menggunakan media ½ konsentrasi MS, pH 6 dan ditumbuhkan  selama  1  minggu  dengan  aerasi. Tanaman  tipe  liar  diperlakukan  sama  dengan tanaman transgenik. Setelah diadaptasi di medium pH  4  selama  3  hari,  tanaman  diperlakuan  dengan 300  µM  Al  dalam  media  ¼  MS0  pH  4  selama  6 hari  dan  diberi  aerasi.  Konsentrasi  aluminium tersebut  telah  digunakan  untuk  menyeleksi tembakau  transgenik MmSOD (Hanum  2012).
Media  diganti  setiap  dua  hari  dan  panjang  akar diukur pada hari ke 0, 2, 4 dan ke 6.
Introduksi  Gen  PaCS  ke    Jatropha  curcas dengan di Mediasi oleh A. tumefaciens
Introduksi  gen PaCS ke  tanaman J.  curcas mengikuti metode Li et al. (2007), dengan sumber eksplan  dari  kotiledon.  Eksplan  yang  berkalus dipindahkan  ke  dalam  medium  MIK  ditempatkan pada  kondisi  cahaya  2000  lux  dan  ditambah dengan  200  mg/l  cefotaksim  dan  20  mg/l kanamisin.  Jumlah  tunas  yang  muncul  dihitung pada  1  bulan  pertama  dan  kedua  setelah  2  bulan perlakuan.    Tunas  yang  hidup  pada  media  seleksi ini  kemudian  dipindahkan  ke  dalam  media      ½ MS,  yang  diperkaya  dengan  20  ppm  IBA,    100 µl/L  0,1  M  AgNO 3 :  Na  Thiofosfat  (1:4),  dan disubkultur setiap 10 hari.

## Deteksi Tanaman Transgenik
Gen PaCS yang tersisip ke jaringan tanaman dianalisis  menggunakan  primer  35S forward dan PaCS reverse .  Kondisi  PCR    diatur  sebagai berikut: pre PCR 95 O C selama 4 menit, denaturasi 94 O C selama 30 detik, annealing pada suhu 55 O C selama  45  detik,  pemanjangan  pada  suhu  72 O C selama  2  menit,  siklus  ini  diulang    40  kali,  dan pasca PCR 72 O C selama 5 menit dan suhu 20 O C selama  5  menit.  Deteksi hpt menggunakan  primer forward 5’GATGGTTGGCGACCTCGTATT3’ dan reverse 5’GATGTAGGA-GGGCGTGG- ATA3’.  Kondisi  PCR  sebagai  berikut  Pre  PCR 95 O C selama 4 menit, denaturasi 94 O C selama 30 detik,  anneling  pada  suhu  60 O C  selama  45  detik, pemanjangan  pada  suhu  72 O C  selama  1  menit, siklus ini diulang  40 kali, dan pasca PCR pada 72 O C selama 5 menit dan suhu 20 O C selama 5 menit.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Introduksi PaCS ke  tanaman  model Nicotiana tabacum
Tiga  plantlet N.  tabacum lolos  seleksi terhadap medium MS yang mengandung diperkaya 30 µg/ml higromisin. Ketiga galur tersebut diduga telah tersisip gen hpt yang merupakan bagian dari konstruksi  gen PaCS. Hasil  PCR  dengan kombinasi primer gen PaCS dengan promoter 35S menunjukkan  bahwa  hanya  satu  galur  yang
Introduksi Gen Sitrat Sintase Pseudomonas aeruginosa ke  Nicotiana tabacum dan Jatropha curcas untuk Meningkatkan Toleransi terhadap Cekaman Aluminium
1630 pb
1000 pb
2000 pb pMSH1-PaCS TL NT-1 Nt-3 Nt-2 Marker 1 cm 1 cm
mempunyai pita DNA berukuran 1630 pb. Sisipan tersebut  dapat    dipastikan  merupakan  konstruksi yang diintroduksikan ke dalam tanaman tembakau dengan  ukuran  1630  pb,  karena  sam  ukurannya dengan  ukuran  gen  PaCS  dalam  pMSH1(Gambar
2). Tembakau tipe liar dan dua galur lainnya tidak mengandung  sisipan  gen PaCS .  Tembakau transgenik PaCS ditanam di pot hingga menghasilkan biji.
Gambar  2.  Hasil  PCR  dari  tiga  galur  tembakau  yang  diduga  transgenik  yaitu  Nt-1,  Nt-2  dan  Nt-3  dengan kontrol negatif  tembakau tipe liar (TL) dan  pMSH1- PaCS sebagai kontrol positif.
Biji transgenik pertama (T1) diseleksi untuk membedakan  biji  transgenik  dan  non-transgenik dengan menumbuhkan pada media yang mengandung 50 μg/ml higromisin (Hannum 2012; Anggraito  2012).  Kecambah  biji  tembakau transgenik sebagian besar tumbuh normal pada 50
μg/ml higromisin dan hanya sebagian kecil tumbuh kerdil. Tanaman yang tumbuh normal mengandung  gen hpt yang  mengatur  toleransi terhadap  higromisin , sedangkan  biji  yang  tidak mengandung gen tersebut mengalami penghambatan pertumbuhan (Gambar 3).
a
b
Gambar 3.   Seleksi tanaman tembakau menggunakan  medium MS  yang ditambahkan  50 µg/ml higromisin. Semua biji tembakau tipe liar (TL) terhambat perkecambahannya (a), dan  T1 (b) sebagian besar tumbuh  normal.  Tanda  kuning  menunjukan  tanaman  yang  toleran  terhadap  higromisin (transgenik),  dan  panah  merah    menunjuk  ke  tanaman  yang  peka  terhadap  higromisin  (non transgenik).
Pengujian  toleransi  150  biji  T1  terhadap higromisin diperoleh 126 benih dapat berkecambah  media  tersebut.  Jumlah  biji  yang berkecambah  dapat  tumbuh  normal  sebanyak  96 biji, sementara pertumbuhan 30 kecambah lainnya mengalami  penghambatan  dan  kerdil.  Hasil analisis Chi kuadrat menunjukkan bahwa segregasi NT1  adalah  3:1  (toleran  :  peka)  terhadap
higromisin.  Segregasi  tanaman  3:1  menunjukkan bahwa  gen hpt telah  terintegrasi  di  dalam  genom tanaman  tembakau,  dan  diwariskan  ke  generasi berikutnya  mengikuti  Hukum  Mendel.    Tanaman transgenik  T0  adalah  heterozigot  untuk hpt. Tanaman  yang  toleran  terhadap    higromisin diaklimatisasi  dan  di  kultur  hidroponik  dengan menggunakan  ½  konsentrasi  media  MS  pada  pH
5,8 selama 1  minggu. Hasil aklimatisasi  diperoleh 57  tanaman  yang  mempunyai  pertumbuhan  yang baik.  Kelima  puluh  tujuh  tanaman  ini  selanjutnya diuji  tantang  dengan  larutan  media  yang mengandung aluminium.

## Uji Tantang Tanaman T1 terhadap Cekaman Al
Pemanjangan  akar  tembakau  tipe  liar  (TL) dan sebagian besar tanaman transgenik mengalami penghambatan  setelah  dicekam  dengan  300  µM Al.  Pertambahan  panjang  akar  tembakau  TL  pada hari ke-2, 4, dan 6 berturut adalah rata-rata 0,2 cm dan  0,12  cm,  dan  0,04  cm.  Lima  tanaman  dari  57 tanaman  transgenik  yang  diuji  masih  tumbuh
dengan  normal  setelah  7  hari  mendapat  cekaman Al.  Kelima  tanaman  tersebut  adalah  tanaman transgenik  yang  toleran  terhadap  cekaman  Al. Rata-rata  pertambahan  panjang  akar  kelima tanaman yang toleran Al  (NT1) tersebut pada hari ke  2,  4,  dan  6  adalah  berturut-turut  0,48  cm,  0,40 dan 0,29 cm  (Gambar 4). Laporan Delhaize et al . (1993)  menyebutkan  bahwa  tanaman Triticum sativum yang peka  hampir tidak ada pemanjangan akar lagi setelah 1 hari dicekam oleh Al, demikian juga  dengan Pisum  sativum (Yamamoto et  al . 2001). Dengan demikian, pertambahan akar kelima tanaman  transgenik  menunjukkan  bahwa  gen PaCS meningkatkan toleransi tanaman tembakau.
Gambar 4.  Pemanjangan akar N. tabacum tipe liar (TL) dan tanaman transgenik T1 yang mendapat cekaman 300  µM  Al  dalam  ¼  konsentrasi  medium  MS.  Bar  menunjukkan  SE  dengan  n=5.  Fenotipe  akar tanaman tembakau setelah mendapat cekaman Al selama 7 hari.
Pemanjangan  akar  ditentukan  oleh  aktivitas pembelahan sel-sel di daerah meristem dan diikuti pemanjangan  sel-sel  di  zona  pemanjangan  (Ryan et al . 1993). Penghambatan aktivitas pemanjangan akar  oleh  Al  pada  varietas  sensitif  lebih  tinggi dibandingkan dengan varietas toleran. Hal ini telah dilaporkan  seperti  pada  tanaman  jagung  (Boscolo et al . 2003), dan gandum (Ma et al. 2004). Tamas et  al .  (2006)  melaporkan  bahwa  cekaman  Al selama    dua  hari  menyebabkan  penetrasi  Al
mencapai bagian luar korteks dan pada hari ketiga penetrasi telah mencapai sebagian besar endodermis.  Penghambatan  akar  terjadi  karena  Al memicu  terbentuknya reactive  oxygen  species (ROS),  menghambat  respirasi  dan  menipiskan ketersediaan  ATP  dalam  sel  (Yamamoto et  al . 2002)  dan  ROS  yang  terbentuk  menyebabkan degradasi  lipid penyusun membran  sel(Yamamoto et al. 2001).
Introduksi Gen Sitrat Sintase Pseudomonas aeruginosa ke  Nicotiana tabacum dan Jatropha curcas untuk Meningkatkan Toleransi terhadap Cekaman Aluminium

## 1 mm 1 mm

## Analisis Histologi Akar Tanaman Transgenik
Akumulasi Al di ujung akar T1 relatif lebih rendah  daripada  tipe  liarnya.  Hal  ini  ditunjukan oleh  adanya  intensitas  pewarnaan  hematoksilin yang  lebih  kuat  pada  akar  TL  dibandingkan  akar tanaman  transgenik.  Pewarnaan  hematoxilin  dapat mengikat  Al  sehingga  berwarna  keunguan. Akumulasi  Al  yang  tinggi  di  tanaman  TL menyebabkan  kerusakan  sel-sel  pada  jaringan ujung  akar  yang  ditunjukkan  dengan  pewarnaan
Evans  blue (Gambar  5). Evans  blue digunakan sebagai  pengukur  integritas  membran  plasma. Warna  biru  pada  sitoplasma  dikaitkan  dengan kerusakan  dan  kematian  sel  (Delisle et  al .  2001). Akumulasi  Al  dan  kerusakan  akar  pada  galur toleran  relatif  lebih  rendah  dibandingkan  TL. Sekresi sitrat akar tanaman transgenik diduga lebih tinggi  dibandingkan  TL.  Sekresi  sitrat  akan mengkelat  Al  dan  membentuk  komplek  Al-sitrat untuk mencegah masuk ke dalam sel (Anoop et al. 2003).  Xue et  al. (2006)  membuktikan  bahwa eksudasi  sitrat  mengurangi  penghambatan  akar oleh cekaman Al.

## TL                NT1   -Al               -Al         TL        NT1
Gambar 5.  Pewarnaan akar  tanaman tembakau tipe liar dan tanaman transgenik T1 mendapat cekaman 300 µM  selama  7  hari  dengan  hematoksilin  (kiri)  ,  dan  pewarnaan Evans  blue (kanan).  TL:  tanaman tipe liar, Nt1: tanaman transgenik T1, -Al : tanpa perlakuan Al.

## Introduksi gen PaCS ke  dalam Jatropha curcas
Kalus  kotiledon J.  curcas mulai  terbentuk pada  hari  ke-15  hingga  20  setelah  tanam  dan pertumbuhannya mencapai maksimal pada 45 hari setelah  tanam.    Persentase  kalus  yang  terbentuk pada  eksplan  IP  3A,  IP  3M  dan  IP  2P  yang  tidak diperlakukan dengan Agrobacterium berturut-turut 59,25 %, 76,79%, dan 66,67% dari jumlah eksplan yang ditanam. Sedangkan eksplan yang dikokultivasi dengan Agrobacterium menghasilkan persentase  kalus      64%,  69,  51%,  dan  58,19% berturut-turut  untuk  eksplan  IP  3A,  IP  3M,  IP  2P (Tabel 2). Mitchel et al . (2008) melaporkan bahwa tiap genotipe dan jenis eksplan mempunyai respon
yang  berbeda  dalam  menghasilkan  kalus  pada media dasar yang sama.
Penurunan  jumlah  eksplan  yang  berkalus pada  eksplan  yang  dikokultivasi  dengan A. tumefaciens berkisar  36,7%.  Tidak  semua  kalus dapat  menghasilkan  tunas  pada  medium  seleksi yang  mengandung  20  μg/ml  kanamisin  (Tabel  2). Persentase  tunas  yang  terbentuk  yang  toleran kanamisin  dari  aksesi  IP  3A,  IP  3M  dan  IP  2P adalah  12,88%,  10,26%  dan  12,5%  dari  rata-rata tunas  pada  media  tanpa  antibiotik.  Jumlah  tunas toleran  ini  masih  lebih  rendah  daripada  penelitian sebelumnya. Li et al. (2007)) mampu mendapatkan tunas yang toleran sebanyak 15-20%.
Kemungkinan  hal  ini  disebabkan  perbedaan
genotipe  yang  digunakan    dalam  penelitian  ini. Jumlah  kalus  lolos  seleksi  toleran  terhadap kanamisis  pada  IP  3A  dan  IP  2P  berturut-turut sebanyak 96 dan 103 kalus.
Tunas-tunas in  vitro dipindahkan  ke medium  pengakaran  selama  20  hari.  Beberapa tunas  yang  masih  bertahan  hidup  dipindahkan  ke media  ½  MS  tanpa  zat  pengatur  tumbuh.  Jumlah tunas yang bertahan pada media ½ MS sebanyak10 tunas dari aksesi IP 3A, 10 dari aksesi IP3M dan 9 dari aksesi IP 2P. Dari 10 tunas tersebut hanya ada
4  tunas  yang  dapat  berakar  atau  40%  tunas  dapat berakar.  Media  perakaran  diperkaya  dengan  20 ppm  BAP  dan  AgNO3  cukup    efektif  untuk menginduksi  perakaran  tanaman  jarak.    Penelitian Pan et al . (2010) hanya mendapat satu planlet dari 120  tunas in  vitro .  Kajikawa et  al .  (2012)  telah memperbaiki  sistem  transformasi  genetik  pada J. curcas dengan  efesiensi  mencapai  4,3%  yang menggunakan bispyribac sebagai bahan penyeleksinya.
Tabel 2. Jumlah tunas dari masing-masing aksesi J.curcas tanpa perlakuan Agrobacterium dan tunas terduga transgenik.
Jumlah Eksplan Jumlah Kalus Jumlah Tunas Rata-rata tunas/eksplan Kontrol IP 3A 54 32 62 1.94 Kontrol IP 3M 56 43 67 1,56 Kontrol IP 2P 54 36 49 1,36 Transgenik IP 3A 150 96 24 0,25 Transgenik IP 3M 164 114 18 0,16 Transgenik IP 2P 177 103 17 0,17
a                                      b                                       c                                       d
Gambar  6.    Proses  introduksi  gen PaCS ke J.  curcas dengan  perantara Agrobacterium tumefaciens.  Infeksi eksplan kotiledon dengan A. tumefaciens (a). Kokultivasi eksplan dengan A. tumeaciens selama 3 hari (b). Induksi kalus menggunakan media MIK yang mengandung 200 ppm cefotaksim (c), di kondisi gelap. Induksi tunas menggunakan media MIK dengan agen seleksi 20 μg/ml kanamisin (d).  Pemanjangan  tunas  di  media  yang  mengandung  0,5  ppm  GA 3 (e).  Induksi  pengakaran menggunakan media yang mengandung 20 ppm IBA (f).
Analisis Integrasi Gen hpt dan Promoter-PaCS di dalam Genom Tanaman Trasngenik
Konfirmasi  tanaman  yang  lolos  seleksi dari  kanamisin  dilakukan  dengan  menggunakan primer  gen PaCS ,  primer  spesifik  ketahanan higromisin  dan  primer  kombinasi  35S    CaMV
Introduksi Gen Sitrat Sintase Pseudomonas aeruginosa ke  Nicotiana tabacum dan Jatropha curcas untuk Meningkatkan Toleransi terhadap Cekaman Aluminium
forward  dengan PaCS reverse.  Planlet  yang  diuji sebanyaki  27  planlet  transgenik  yaitu  12  tunas  IP 3A,  15  tunas  dari  IP  3M,  dan  11  tunas  IP  2P. Primer  spesifik  gen PaCS menunjukkan  bahwa semua tunas menghasilkan pita berukuran 1300 pb termasuk tipe liarnya. Diduga J. curcas mempunyai  gen  famili  sitrat  sintase  yang sekuennya mirip dengan PaCS (Gambar 7 a). PCR menggunakan primer spesifik gen hpt menunjukkan 4 planlet IP 3A, 4 planlet IP 3M dan 3  planlet  IP  2P  mengandung  gen hpt yang berukuran  600  pb,  sedangkan  tipe  liar  (TL)  tidak
mempunyai  gen  tersebut  (Gambar  7  b).  Karena posisi  gen hpt di  sisi  kiri  ( up  stream )  dari npt di dalam  T-DNA  maka  dipastikan  bahwa  eksplan- eksplan  tersebut  mengandung  gen  ketahanan terhadap kanamisin. Analis PCR  terhadap eksplan yang  mengandung PaCS menggunakan  kombinasi primer  35S  CaMV  F  dengan  primer PaCS R menunjukkan  bahwa  hanya  ada  dua  eksplan  yang mengandung  gen PaCS yaitu A1 dan P7 (Gambar 7  c).  Jumlah  tanaman  transgenik PaCS yang diperoleh  jika  dibandingkan  dengan  jumlah  kalus yang lolos seleksi kanamisin hanya berkisar 1%.
a
b

## c
Gambar 7.  Hasil  PCR terhadap tunas transgenik yang terdiri 4 galur IP 3A, 4 galur IP 3M dan 3 galur dari IP 3P.  PCR  menggunakan  primer  spesifik  gen PaCS, semua  galur  menghasilkan  pita  1300  pb (a), menggunakan  primer hpt menghasilkan  semua  galur    transgenik  mengandung  gen  resistensi antibiotik  higromisin  (b),  dan  menggunakan  primer  promoter  35S  CaMV    forward  dan PaCS reverse menghasilkan  pita berukuran 1650 pb hanya pada 2 galur yang transgenik yaitu A1 dan P7 (c).

## KESIMPULAN
Gen PaCS berhasil  diintroduksikan  ke dalam  genom    tanaman Nicotiana  tabacum dan J. curcas dengan  bantuan A.  tumefaciens. Tanaman tembakau  transgenik PaCS di  bawah  kendali promoter 35S CaMV dapat mengurangi penyerapan  aluminium  ke  dalam  akar  sehingga meningkatkan  toleransinya  terhadap  cekaman  Al. Gen  tersebut  diturunkan  ke  generasi  berikutnya mengikuti hukum Mendel. Introduksi gen PaCS ke J. curcas masih rendah yaitu 1% dari total eksplan
yang  ditranformasi.    Introduksi  gen  pelapor hpt tidak selalu diikuti introduksi gen target PaCS.

## DAFTAR PUSTAKA
Anggraito  YU.  2012.  Transformasi  genetik Nicotiana  bentamiana L.  dan  kedelai dengan gen MaMt 2 penyandi metalothionein tipe  II  dari Melastoma  malabathricum L. [Disertasi].  Sekolah  Pascasarjana,  Institut Pertanian Bogor. Bogor.
plasmid A1 A2 A8 A11 M22 M24 M13 M6 P1 P7 P13 marker TL 2000 pb 1000 pb plasmid A1 A2 A8 A11 M22 M24
M13 M6 P1 P7 P13 marker TL
600 pb
Plasmid A1 A2 A8 A11 M22 M24 M13
M6 P1 P7 P13 marker
TL 2000 bp
Anoop VM, Basu U, McCammon MT, McAlister- Henn  L,  Taylor  GJ.  2003.  Modulation  of citrate metabolism alters aluminium
tolerance  in  yeast  and  transgenic  canola overexpressing  a  mitochondrial  citrate synthase. Plant Physiol 132: 2205-2217.
Barone  P,  Rosellini  D,  LaFayette  P,  Bouton  J, Veronesi  F,  Parrott  W.  2008.  Bacterial citrate synthase expression and soil aluminum  tolerance  in  transgenic  alfafa. Plant Cell Rep 27: 893-901.
Boscolo  PRS,  Menossi  M,  Jorge  RA.  2003. Aluminum-induced  oxidative  stress  in maize. Phytochem 62: 181-189.
Buch  AB,  Archana  G,  Naresh-Kumar  G.  (2008). Metabolic  channeling  of  glucose  towards gluconate in
phosphate-solubilizing
Pseudomonas aeruginosa P4 under phosphorus  deficiency. Res  Microbiol 159:
635–642.
Chin-A-Woeng  TFC,  Bloemberg  GV,  Lugtenberg BJJ.  2003.  Phenazine  and  their  role  in bicontrol  by Pseudomonas bacteria. New Phytol 157: 503-523.
de  la  Fuente  JM,  Ramire-Rondriguez  V,  Cabrera-
Ponce JL, Harrere-Estrell L. 1997.
Aluminum  tolerance  in  transgenic  plant  by alteration  of  citrate  synthesis. Science 276:
1566-1568.
Delhaize  E,  Craig  S,  Beaton  CD,  Bennet  RJ, Jagadish  VC,  Randall  PJ.  1993.  Aluminum tolerance in wheat ( Triticum aestivum L). I.
Uptake  and  distribution  of  Aluminum  in root apices. Plant Physiol 103: 685-693.
Delisle  G,  Champoux  M,  Houde  M.  2001. Characterization of oxalate oxidase and cell death  in  Al-sensitive  and  tolerant  wheat roots. Plant Cell Physiol 42(3): 324-333.
Deng  W,  Luo  K,  Li  Z,  Yang  Y,  Hu  N,  Wu  H. 2009.  Overexpression  of Citrus  junos mitochondrial  citrate  synthase  gene  in Nicotiana  benthamiana confers  aluminum tolerance. Planta 230(2): 355-365.
Hannum  S.  2012.  Ispolasi,  pengklonan,  dan analisis  ekspresi  gen  penyandi  copper-zinc superoxide  dismutase  (CuZn-SOD)  dari
Melastoma  malabathricum L.  [Disertasi]. Sekolah  Pascasarjana  Institut  Pertanian Bogor. Bogor.
Hassett  DJ,  Woodruff  WA,  Wozniak  DJ,  Vasil ML, Cohen MS, Ohman DE. 1993. Cloning and  characterization  of  the Pseudomonas aeruginosa sod A  and sod B  genes  encoding manganese-  and  iron-  cofactored  superxide dismutase: Increased manganese superoxide dismutase  activity  in  alginate-producing bacteria. J of Bacteriol : 7668-7665.
Kajikawa  M,  Morikawa  K,  Inoue  M,  Widyastuti U, Suharsono S, Yokota A, Akashi K. 2012. Establishment of biopyribac selection protocols  for Agrobacterium  tumefaciens dan Agrobacterium  rhizogenes -mediated transformation of the oil seed plant Jatropha curcas. Plant Biothecnol 29: 145-153
Kochian  LV,  Pence  NS,  Letham  DLD,  Pineros MA,  Magahaes  JV,  Hoekenga  OA,  Garvin DF.  2002.  Mechanisms  of  metal  resistance in    plants:  aluminum  and  heavy  metals.
Plant and Soil 247: 109-119.
Koyama  H,  Kawamura  A,  Kihara  T,  Hara  T, Takita  E,  Shibata  D.  2000.  Overexpression of mitochondrial citrate synthase in Arabidopsis  thaliana improved  growth  on phosphorous  limited  soil. Plant  Cell Physiol 41: 1030-1037.
Lemire  J.  Mailloux  R,  Auger  C,  Whalen  D,
Appana VD. 2010.
Pseudomonas
fluorescens orchestrates  a  fine  metabolic- balancing  act  to  counter  aluminum  toxicity.
Envir Microb 12(6): 1384-1390.
Li  M,  Li  H,  Jiang  H,  Pan  X,  Wu  X.  2007. Establishment of an Agrobacterium - mediated  cotyledone  disc  transformation method for Jatropha curcas . Plant Cell Tiss Org Cult :173-181.
Ma  J  F,  Nagao  S,  Sato  K,  Ito  H,  Furukawa  J, Takeda  K.  (2004).  Molecular  mapping  of  a gene  responsible  for  Al-activated  secretion of  citrate  in  barley. J  Exp  Bot 55:  1335– 1341.
Mailloux RJ, Lemire J, Kalyuzhnyi S, Appanna V.
2008.  A  novel  metabolic  network  leads  to enhanced citrate biogenesis in Pseudomonas
Introduksi Gen Sitrat Sintase Pseudomonas aeruginosa ke  Nicotiana tabacum dan Jatropha curcas untuk Meningkatkan Toleransi terhadap Cekaman Aluminium
flourescens exposed  to  aluminum  toxicity.
Extremophiles 12: 451-459.
Makkar  HPS,  Becker  K.  2009.  Jatropha  curcas,  a promising  crop  for  the  generation  of biodiesel  and  value-added  cproducts. Eur  J Lipid Sci technol 111: 773-787 .
Murashige  T,  Skoog  F.  1962.  A  revised  medium for  rapid  growth  and  bioassay  with  tobacco tissue culture. Plant Physol 15: 473-497.
Pan  J,  Fu  Q,  Xu  ZF.  2010.  Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of biofuel plant Jatropha curcas using kanamicin  selection. Afric  J  Biotec 2(39):
6477-6481.
Poschenrieder C, Gunse B, Corrales I, Barchelo J. 2008.  A  glance  into  aluminum  toxicity  and resistance  in  plants. Sci  of  the  Tot  Envir:
356-368.
Ryan  PR,  Ditamaso  JM,  Kochian  LV.  1993. Aluminum  toxicity  in  root:  an  investigation of  spatial  sensitivity  and  of  the  root  cap. J Exp Bot 44: 437-446.
Tamas  L,  Budikova  S,  Simonovicova  M,  Huttova J,  Siroka  B,  Mistrik  I.  2006.  Rapid  and simple  method  for  Al-toxicity  analysis  in emerging  barley  roots  during  germination. Biol Plant 50(1): 87-93.
Xue  YJ,  Xie  FL,  Yang  ZM.  2006.  Negative regulation  of  aluminum-responsive  citrate efflux from roots of Cassia tora by an anion channel antagonist. Bot Stud 47: 137-144.
Yamamoto  Y,  Kobayashi  Y,  Devi  SR,  Rikiishi  S, Matsumoto  H.  2002.  Aluminum  toxicity  is associated  with  mitochondrial  dysfunction and  production  reactive  oxygen  species  in plant cells. Plant Physiol 128:63-72.
Yamamoto  Y,  Kobayashi Y,  Matsumoto  H.  2001. Lipid  peroxidation  is  an  early  symptom triggered  by  aluminum,  but  not the  primary cause  of  elongation  inhibition  in  pea  roots. Plant Physiol 125:199-208.