## Efek Spermisida Ekstrak Metanol Biji Buah Kalangkala (Litsea angulata) terhadap
Spermatozoa Mencit (Mus musculus)

## The Spermicide Effect from Methanol Extract of Kalangkala Seed (Litsea angulata) to Spermatozoa Mice (Mus musculus)
Rommy Akmal, Kuswanto, Syarifah Fahrunnisa, Ridha Aulia Rahmi, Nur Ema Putri Bayanil, Anni Nurliani Program Studi Biologi Fakultas MIPA Universitas Lambung Mangkurat Jl. A. Yani Km 35,8 Banjarbaru, Kalimantan Selatan 70614 e-mail korespondensi: nurliani_anni@yahoo.co.id

## Abstrak
Keikutsertaan  pria  dalam  program  KB  perlu  ditingkatkan  dengan  menyediakan  spermisida  alami  yang bersumber dari bahan alam yang lebih aman. Salah satunya adalah biji buah dari kalangkala yang merupakan tumbuhan  endemik  Kalimantan  Selatan.  Efek  spermisida  dari  ekstrak  metanol  biji  buah  kalangkala  terhadap spermatozoa  mencit  dikaji  dalam  penelitian  ini  secara  in  vitro.  Sebanyak  25  ekor  mencit  jantan  galur  Balb/c berumur 2-3 bulan dengan  berat badan 20-30 g digunakan dalam penelitian ini untuk diambil spermatozoanya dengan  mengeluarkan  sekret  cauda  epididimis.  Penelitian  ini  menggunakan  rancangan  acak  lengkap  (RAL) dengan 5 perlakuan yaitu kontrol dimana suspensi spermatozoa tanpa diberi apapun; Suspensi spermatozoa + NaCMC 0,5%; suspensi spermatozoa + ekstrak  biji buah kalangkala 0,1%; suspensi spermatozoa + ekstrak  biji buah kalangkala 0,3%; dan suspensi spermatozoa + ekstrak biji buah kalangkala 0.5% dengan 5 ulangan setiap perlakuan.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak  biji  buah  kalangkala  menyebabkan  penurunan motilitas dan kecepatan gerak spermatozoa mencit hingga mencapai nilai nol pada konsentrasi 0,5%.

## Kata kunci: biji kalangkala, mencit, spermatozoa, spermisida alami

## Abstract
Men involvement in family planning needs to be increased by providing natural spermicide from natural source which  is  safer.  One  of  them  is  kalangkala  seed  which  is  endemic  plant  in  South  Kalimantan.  The  spermicide effect from methanol extract of kalangkala seed to mice spermatozoa was studied in this research by  in vitro method.  Spermatozoa  suspension  was  taken  from  epididymis  cauda  of  twenty  five  male  Balb/c  mice.  This research  used  a  complete  randomized  design  with  five  treatments  i.e  control  which  without  any  addition; spermatozoa suspension + NaCMC 0.5%; spermatozoa suspension + methanol extract of kalangkala seed 0.1%; spermatozoa suspension + methanol extract of kalangkala seed 0.3%; and spermatozoa suspension + methanol extract of kalangkala seed 0.5% with five repetitions for each treatment. The result of this study showed that methanol  extract  of  kalangkala  seed  caused  decrease  of  motility  and  movement  velocity  mice  spermatozoa until achieve zero value in 0.5% concentration.
Key words: kalangkala seed, mice, spermatozoa, natural spermicide

## Pendahuluan
Pemerintah Republik Indonesia
dalam menanggulangi  angka  pertambahan  penduduk yang  cepat  ini  telah  melaksanakan  program Keluarga  Berencana  (KB)  sebagai  program nasional. Salah satu usaha yang telah dilaksanakan adalah  penyediaan  sarana  kontrasepsi.  Sarana  ini sudah  sering  diperkenalkan  pada  masyarakat, tetapi  masih  menjadikan  wanita  sebagai  sasaran utamanya.  Alangkah  baiknya  jika  sasaran  itu  juga mengutamakan pria, sebagai wujud aktif keikutsertaannya  dalam  mensukseskan  program KB (Purwaningsih & Susmiarsih, 1998).
Alat  atau  bahan  kontrasepsi  pria  yang  telah digunakan  saat  ini  terbatas  pada  vasektomi, penyuntikan hormon, dan kondom (Prawirohardjo, 1999). Alat atau bahan kontrasepsi tersebut masih belum sepenuhnya dapat diterima oleh masyarakat,  dengan  alasan  yaitu  sifat  irreversible dari  vasektomi  dan  adanya  efek  samping  yang ditimbulkan  baik  dari  penyuntikan  hormon maupun  penggunaan  spermisida  sintetis  pada kondom  (Moeloek,  1990).  Sejauh  ini  telah dilaporkan  bahwa  spermisida  sintesis  yang dikomersialkan  dalam  bentuk  krim  dengan kandungan  nonil-fenoksi  polietoksi  etanol  dapat menyebabkan  iritasi  (Sukrasno,  2003)  baik  pada penis  maupun  vagina  serta  dapat  menyebabkan gangguan  pada  sel  epitel  vagina  (WHO/CONRAD, 2002).
Berbeda  dengan  penggunaan  spermisida  sintetis yang  menggunakan  bahan-bahan  kimia  sehingga menimbulkan  efek  samping  yang  merugikan, spermisida alami lebih aman dan tidak menimbulkan efek  samping.  Salah satu tumbuhan endemik Kalimantan Selatan yang diduga berpotensi  memiliki  khasiat  sebagai  spermisida adalah  kalangkala  (Litsea  angulata).  Tumbuhan yang  berbuah  musiman  ini  terkenal  dengan  rasa buahnya  yang  manis.  Setelah  daging  buahnya dimakan  biasanya  bijinya  hanya  dibuang  saja. Padahal  menurut  penelitian  Mustikasari  &  Ariyani (2010)  biji  buah  kalangkala  mengandung  senyawa alkaloid  dan  tanin  dan  kedua  senyawa  tersebut dapat  berperan  sebagai  senyawa  antifertilitas, khususnya sebagai spermisida (Asif, 2013).
Efektifitas  suatu  spermisida  dapat  dilihat  dari kemampuannya  dalam  menurunkan  kualitas spermatozoa.  Salah  satu  parameter  kualitas spermatozoa  yang  penting  adalah  motilitas  dan kecepatan  gerak  spermatozoa.    Motilitas  dan kecepatan  gerak  spermatozoa  sangat  erat hubungannya  dengan  proses  fertilisasi.  Jika
spermatozoa  berenang  atau  bergerak  sangat lambat  maka  jumlah  total  spermatozoa  yang membuahi  ovum  terlalu  sedikit.  Untuk  mendekati ovum, spermatozoa harus berenang dengan cepat dan  bergerak  seperti  spiral  yaitu  yang  disebut sebagai  pola  kapasitas  motilitas  (capacitating motility pattern) (Anonim, 2003).
Oleh  karena  itu,  dalam  penelitian  ini  ingin diketahui  efek  spermisida  ekstrak  biji  buah kalangkala terhadap motilitas dan kecepatan gerak spermatozoa  mencit  secara  in  vitro  dalam  rangka menggali  potensi  biji  buah  kalangkala  sebagai spermisida  alami  utnuk  meningkatkan  nilai  guna biji  buah  kalangkala  yang  selama  ini  dianggap hanya  sebagai  limbah  dan  belum  dimanfaatkan sama sekali.

## Metode Penelitian

## Bahan
Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 25 ekor mencit jantan (Mus musculus) galur Balb/c berumur  2-3  bulan  dengan  berat  badan  20-30  g, biji buah kalangkala (Litsea angulata), metanol p.a dan Na-CMC 0,5%.

## Cara kerja
1. Pengolahan simplisia
biji buah kalangkala
Biji buah kalangkala disortasi basah untuk memisahkan dari kotoran yang menempel saat  pengambilan  sampel.  Sampel  dicuci, kemudian  dirajang-rajang.  Selanjutnya dijemur  di  bawah  sinar  matahari  secara tidak langsung.
2. Pembuatan  Ekstrak  Metanol  Biji  buah kalangkala
Metode  ekstraksi  yang  digunakan  adalah maserasi.  Serbuk  biji  buah  kalangkala ditimbang  sebanyak  200  gr  kering, kemudian dimasukkan ke dalam maserator.  Cairan  metanol  dituangkan secara  perlahan  ke  dalam  maserator. Sampel direndam dengan etanol hingga 1 cm  di  atas  permukaan  sampel.  Ekstraksi dilakukan  selama  24  jam,  Semua  filtrat hasil  penyarian  diuapkan  dengan  vacum rotary  evaporator  pada  suhu  pemanasan 40 0 C  sampai  pelarut  tidak  menguap  lagi. Filtrat diuapkan kembali di atas waterbath pada suhu 55 0 C dan ditimbang hingga beratnya konstan untuk memastikan  pelarut  sudah  habis.  Ekstrak
kental  yang  sudah  diperoleh  disebut ekstrak metanol biji buah kalangkala.

## 3. Pembuatan Larutan NaCMC 0.5%
Sebanyak  0,5  g  Na-CMC  dilarutkan dengan  akuades  panas  70  mL  kemudian ditambahkan  akuades  dingin  sampai  100 mL.  Larutan  NaCMC  digunakan  sebagai emulsifier agar ekstrak  kental dapat larut dalam aquades.

## 4. Rancangan penelitian
Penelitian  ini  merupakan  penelitian eksperimental  dan  rancangan  penelitian yang  digunakan  adalah  Rancangan  Acak Lengkap  (RAL)  dengan  5  kelompok perlakuan pada 5 ulangan.
Pola pengelompokan perlakuan yaitu:
 KTP  :  kelompok  kontrol  yaitu suspensi  spermatozoa  yang  tidak ditambahkan apapun.
 P : placebo, yaitu suspensi
spermatozoa yang ditambahkan NaCMC 0.5%.
 PI  :  kelompok  perlakuan  dimana suspensi  spermatozoa  ditambahkan dengan  ekstrak    methanol  biji  buah kalangkala dengan konsentrasi 0.1%.
 PII  :  merupakan  kelompok  perlakuan dimana suspensi spermatozoa
ditambahkan dengan ekstrak
metanol  biji  buah  kalangkala  dengan konsentrasi 0.3%.
 PIII : merupakan kelompok perlakuan dimana suspensi spermatozoa
ditambahkan dengan ekstrak metanol  biji  buah  kalangkala  dengan konsentrasi 0.5%.

## 5. Pengambilan Sekresi Cauda Epididimis
Mencit dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah. Kemudian cauda  epididimis  diambil  dan  diletakkan ke  dalam  cawan  petri  yang  berisi  NaCl
Fisiologis 0,9%. Cauda epididimis dipisahkan  dari  testis  dengan  cara memotong bagian proximal corpus epididimis dan bagian distal vas deferens, selanjutnya  cauda  epididimis  dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi 1 mL NaCl fisiologis,  kemudian  bagian  proximal cauda  dipotong  sedikit  dengan  gunting lalu  cauda  ditekan  dengan  perlahan hingga  sekret/cairan  epididimis  keluar
dan  tersuspensi  dengan  NaCl  0,9%, selanjutnya  diaduk  hingga  homogen. Suspensi spermatozoa kemudian dicampurkan dengan ekstrak  metanol biji buah kalangkala dengan perbandingan 1 : 1.  Campuran  tersebut  diaduk  hingga homogen  kemudian  diambil  satu  tetes untuk  diteteskan  pada  kaca objek  bersih. Selanjutnya dilakukan pengamatan terhadap  kualitas  spermatozoa  yang meliputi  motilitas  dan    kecepatan  gerak spermatozoa.
6. Pengamatan kualitas spermatozoa  Analisis Motilitas Spermatozoa
Analisis  motilitas  spermatozoa  dilakukan dengan  cara  meneteskan  1  tetes  semen pada  gelas  benda.  Tetesan  diupayakan sama besarnya untuk setiap pemeriksaan. Kemudian ditutup dengan gelas penutup. Motilitas  spermatozoa  ditentukan  dari 100  spermatozoa  dalam  satu  lapang pandang.
Penilaian  motilitas  spermatozoa  (Suhadi dan Arsyad, 1983) adalah :
a. Spermatozoa dengan motilitas baik,  yaitu  gerak  cepat,  lurus  ke depan, lincah dan aktif (%).
b. Spermatozoa dengan motilitas kurang  baik,  yaitu  gerak  apapun selain spermatozoa dengan motilitas baik (%).
c. Spermatozoa tidak motil (%).
Nilai motilitas spermatozoa dalam persen dikonversikan  dalam  bentuk  desimal  (2 angka di belakang koma).
 Analisis
Kecepatan Gerak
Spermatozoa
Kecepatan  gerak  spermatozoa  diukur dengan  menghitung  waktu  (detik)  yang diperlukan  untuk  menempuh  1  kotak mikrohemositometer  oleh  spermatozoa yang  motil  dan  lurus.  Nilai  kecepatan gerak  dalam  satuan  um/detik  (Hartamto, 1985).

## Analisis Data
Data  kuantitatif  yang  diperoleh  dalam  penelitian ini  kemudian  diolah  secara  statistik.  Pertama dilakukan  uji  normalitas  Kolmogorov–Smirnov yang  disesuaikan  oleh  Liliefors  (Dude  &  Satya, 1995),  jika  populasi  berdistribusi  normal,  maka
dilakukan uji homogenitas varians menurut Lavene (Lavene  test).  Jika  data  menunjukkan  homogen maka  dilakukan  pengujian  dengan  uji  sidik  ragam atau  ANAVA  α  =  0,05  untuk  mengetahui  adanya perbedaan  nyata.  Jika  uji  ANAVA  menunjukkan beda  nyata  kemudian  dilakukan  uji  BNT  (Beda Nyata  Terkecil)  untuk  mengetahui  beda  nyata terkecil  antar  hasil  pada  data  perlakuan  (Sokal  & Rohlf, 1996).
Jika populasi data tidak terdistribusi normal, maka dilakukan  transformasi,  jika  setelah  dilakukan transformasi tetap tidak mempelihatkan distribusi normal  atau  tidak  homogen,  maka  digunakan  uji statistik  nonparametrik  (Conover,  1980).  Adapun taraf kemaknaan yang dipakai dalam penelitian ini adalah taraf kemaknaan 5%.

## Hasil
Pengamatan  terhadap  parameter  motilitas  dan kecepatan  gerak  spermatozoa  menunjukkan terjadinya  penurunan  yang  signifikan  pada  semua perlakuan  ekstrak  dibandingkan  dengan  kontrol maupun  dengan  placebo.  Penurunan  ini  terjadi mulai  dari  perlakuan  dengan  konsentrasi  ekstrak biji  buah  kalangkala  terendah  yaitu  ekstrak  0.1%. Hasil tersebut dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel  1.    Nilai  rata-rata  motilitas  dan  kecepatan  gerak spermatozoa yang diukur dari setiap kelompok setelah  diberi  ekstrak  biji  buah  kalangkala secara in vitro
Keterangan:
Angka  yang  dikuti  oleh  huruf  yang  sama  tidak  berbeda nyata,  sebaliknya  jika  angka  diikuti  oleh  huruf  yang berbeda  maka  terdapat  perbedaan  nyata  pada  antar perlakuan (sig > 0,05)
KTP = Suspensi spermatozoa P = Suspensi spermatozoa + NaCMC 0,5% PI = Suspensi spermatozoa + Ekstrak Biji buah kalangkala 0,1%
PII  =  Suspensi  spermatozoa  +  Ekstrak  Biji  buah kalangkala 0,3%
PIII  =  Suspensi  spermatozoa  +  Ekstrak  Biji  buah kalangkala 0,5%
Hasil  uji  normalitas  Kolmogorov  -  Smirnov  dan  uji homogenitas  Levene  menunjukkan  bahwa  data terdistribusi  normal  tapi  tidak  homogen,  sehingga data tidak memenuhi syarat untuk diuji parametrik dengan  Anova,  maka  sebagai  alternatif  digunakan uji  non  parametrik  Kruskal–Walis.  Uji  Kruskal- Wallis  menunjukkan  bahwa  terdapat  pengaruh yang  nyata  dari  perlakuan  terhadap  motilitas  dan kecepatan  gerak  spermatozoa.    Dengan  uji  Mann Whitney  terlihat  bahwa  perbedaan  yang  nyata hanya terjadi di antara perlakuan ekstrak biji buah kalangkala  0.1%,  0.3%  dan  0.5%  baik  dengan kontrol maupun placebo, sedangkan antar kontrol dan placebo tidak terdapat perbedaan nyata.
Hal  ini  menunjukkan  bahwa  zat  aktif  biji  buah kalangkala  menimbulkan  pengaruh  yang  berarti dalam menurunkan kualitas spermatozoa, terutama untuk parameter motilitas dan kecepatan gerak spermatozoa. Penurunan kualitas spermatozoa ini sudah terlihat nyata pada ekstrak kulit  kayu  durian  0.1%  dan  meningkat  hingga ekstrak  0.5%  dengan  penurunan  persentase motilitas dan kecepatan gerak mencapai nilai 0.

## Pembahasan
Penurunan  parameter  motilitas  dan  kecepatan gerak  spermatozoa  akibat  pemberian  ekstrak  biji buah  kalangkala  diduga  disebabkan  oleh  adanya zat  aktif  dalam  biji  buah  kalangkala  yang  bersifat sitotoksis  atau  mempunyai  efek  spermisida terhadap  spermatozoa.  Sebagaimana  disebutkan dalam penelitian sebelumnya oleh Mustikasari dan Aryiani  (2010),  bahwa  dalam  ekstrak  biji  buah kalangkala banyak mengandung tannin yang dapat bersifat sitotoksis.  Dalam hal ini diduga zat tannin menyebabkan  penurunan  kualitas  spermatozoa melalui efek sitotoksis ini.
Selain  itu  diketahui  pula,  tannin  dapat  bersifat astringent  sehingga  dapat  berpengaruh  terhadap permeabilitas membran, karena dapat menyebabkan  pengerutan  membran  sel  (Merck Indeks,  1983).  Dengan  adanya  sifat  astringen  ini, maka  tannin  yang  ada  dalam  kulit  kayu  durian tersebut  dapat  menyebabkan  transportasi  zat makanan/nutrisi  melalui  membran  terganggu. Berkaitan  dengan  hal  ini,  Robertis  dan  Robertis (1979) melaporkan, bahwa permeabilitas membran  erat  kaitannya  dengan  transport  nutrisi yang  diperlukan  pada  metabolisme  sel  dalam menghasilkan  energi.    Sehubungan  dengan  hal tersebut Jeyendran dan Zaneveld (1986) menyatakan,  bahwa  permeabilitas  spermatozoa erat  kaitannya  dengan  motilitas  spermatozoa.
Perlakuan Motilitas (%) Kecepatan Gerak (µm/detik) KTP 96 a 141,79 a P 62 ab 65,14 ab P I 26 c 21.90 c P II 4 d 3.79 d P III 0 e 0 e
Selain    itu,  apabila  transport  nutrisi  terganggu, spermatozoa akan kekurangan energi.  Energi yang berkurang  ini  tidak  hanya  menurunkan  motilitas spermatozoa,  tetapi  juga  akan  menurunkan kecepatan gerak, dan mungkin beberapa parameter kualitas spermatozoa lainnya.
Kemungkinan  lain  terjadinya  penurunan  motilitas dan  kecepatan  gerak  spermatozoa  tersebut  yaitu disebabkan  zat  alkaloid  yang  ada  pada  kulit  kayu durian dapat mengganggu  aktifitas enzim ATP-ase yang  berada  dalam  membaran  sel  spermatozoa. Enzim  ATP-ase  ini  ada  di  bagian  tengah  ekor (“midle  piece”)  spermatozoa  dan  berfungsi mempertahankan  homeostatis  internal  untuk  ion natrium dan kalium. Di samping itu diketahui pula, bahwa  motilitas  spermatozoa  sangat  tergantung pada  komposisi  kalium  dan  natrium  (Grady  dan Nelson, 1972).  Jika pernyataan Grady dan Nelson tersebut  benar,  maka  dapat  diduga  bahwa  zat alkaloid dalam kulit kayu durian dapat menyebabkan  potensial  membran  spermatozoa berubah  dan  akhirnya  menurunkan  motilitas. Namun  demikian  hal  ini  masih  diperlukan penelitian lebih lanjut.
Kemungkinan  lain  terjadi  penurunan  kualitas spermatozoa  tersebut  adalah  bahwa  ekstrak  kulit kayu  durian  dapat  mengganggu  aktifitas  protein dinein  yang  merupakan  salah  satu  protein  yang terdapat  pada  ekor  spermatozoa.  Beberapa  ahli mengatakan, bahwa bagian tengah ekor spermatozoa  disusun  oleh  mikrotubulus  yang mengandung  substansi  fiber  yang  disusun  oleh protein  dinein.  Protein  ini  penting,  karena mempunyai  aktifitas  ATP-ase  (Zaneveld,  1978). Dengan  terganggunya  aktifitas  protein  dinein tersebut,  maka  aktifitas  ATP-ase  akan  terganggu sehingga  akan  menyebabkan  penurunan  kualitas spermatozoa,  terutama  motilitas  dan  kecepatan geraknya.
Nilai  penurunan  kualitas  spermatozoa  dalam penelitian  ini  yaitu  parameter  motilitas  dan kecepatan  gerak  spermatozoa  sudah  mencapai nilai  nol  seperti  yang  diharapkan  pada  cara kontrasepsi  pria  khusus  dalam  bentuk  spermisida di  dalam  kondom.  Dengan  demikian  diharapkan biji  buah  kalangkala  dapat  menjadi  salah  satu alternatif  bahan  baku  kontrasepsi  pria,  terutama dalam  bentuk  spermisida  di  dalam  kondom. Namun, hal ini masih memerlukan penelitian lebih lanjut.

## Kesimpulan
Dari  hasil  penelitian  ini  dapat  diambil  kesimpulan bahwa ekstrak biji buah kalangkala yang diberikan secara  in  vitro  memiliki  efek  spermisida  terhadap spermatozoa mencit melalui penurunan parameter motilitas dan kecepatan gerak spermatozoa hingga mencapai nilai 0.

## Ucapan Terimakasih
Peneliti  mengucapkan  terimakasih  atas terselenggaranya  penelitian ini atas bantuan dana dari  DIKTI  melalui  kegiatan  PKM  Penelitian  tahun 2016.

## Daftar Pustaka
Asif,  M.  2013.  A  Review  On  Spermicidal  Activities Of Azadirachta Indica. Journal of
Pharmacognosy and Phytochemistry. 1 (5) : 61-79.
Anonim,  2003.  Ikan  Hias  Air  Tawar  dan Prospeknya.  Departemen  Kelautan  dan Perikanan  Direktorat  Jenderal  Perikanan Budidaya.
Conover,  W.J.  1980.  Practical  Non  Parametric Statistic 2ed. John Wiley & Sons, New York.
Dude, E.J. & Satya N.M.1995. Statistika Matematika Modern. Penerbit ITB,
Bandung.
Grady, A.V  & Nelson L 1972. Cationic influences on sperm biopotensial. Experimental Cell
Research. 73 : 192-195.
Hartamto,  H.,  N.  Moeloek  &  A,  Tjokronegoro. 1985.  Analisis  Semen  :  Proses  Reproduksi Kesuburan dan Seks Pria dalam Perkawinan.  Fakultas  Kedokteran  UI.
Jakarta.
Jeyendran R.S, & Zaneveld L.J.D. 1986.  Instruction for Hypoosmatic Swelling (HOS) Test. Short Course  :  Reproduction/Andrology  and  non hormonal contraception. Chicago.
Merck  Index  1985.  An  Encyciopedia  of  Chemical and Drugs.9 th Ed. New Yersey.
Moeloek, N. 1990. Kontrasepsi Pria : Masa Kini dan Masa  Yang  Akan  Datang.  Medika.  2  (6)  : 151 – 159.
Mustikasari,  K.  & Ariyani.  2010.  Skrining Fitokimia Ekstrak  Metanol  Biji,  Kalangkala  (Litsea
angulata). Sains dan Terapan Kimia. .4 (2) : 131-136.
Prawirohardjo,  S.  1991.    Ilmu  Kebidanan.  Edisi ketiga.  Yayasan  Bina  Pustaka  Sarwono Prawirohardjo. Jakarta
Purwaningsih,  E  &  T.  Susmiarsih.    1998.  Efek Spermatisida  Ekstrak  Biji  Oyong  (Luffa Acutungula,  Roxb)  Terhadap  Motilitas Dan  Viabilitas  Spermatozoa  In  Vitro. Jurnal Kedokteran YARSI. 6 : 17 – 27.
Robertis  ED,  &  Robertis  EM  1979.  Cell  and moleculer  Biology.  Philadelphia:  Sauders Colleg: 151-159.
Sokal,  R.R.  &  F.J.  Rohlf.  1996.  Pengantar Biostatistika, Edisi ke-2, terjemahan Nasrullah.  Gadjah  Mada  University  Press, Yogyakarta.
Suhadi,  K.  &  K.  M.  Arsyad,  1983.  Analisis  Sperma. Airlangga Universty Press, Surabaya.
Sukrasno.  2003.  Mengenal  lebih  dekat  Mimba, Tanaman  Obat  Multifungsi.  Agromedia Pustaka. Jakarta. Hal. 17-18.
WHO/CONRAD.  2002.  Technical  Consultation  on Nonoxynol-9. http://www.condomdepot.com/non9/. Diakses tanggal 20 April 2015.
Zaneveld,  L.J.D.  1978.  The  Biology  of  Human Spermatozoa. Dalam : Wynn Ed. Obstetrics and Gynecology Annual. Chicago: Appleton Century Croft: 15-40.