Desember  2022, Vol. 9 No. 2: 136 – 146
pISSN : 2355-9942, eISSN:2656-792X
Terakreditasi Nasional, Dirjen Pendidikan Tinggi, Riset, dan Teknologi Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset dan Teknologi RI
S.K. No. 105/E/KPT/2022
Received: 13 Agustus 2022, Accepted: 11 Desember 2022
Published online: 18 Desember 2022
Doi: https://doi.org/10.35508/nukleus.v9i2.7949 https://ejurnal.undana.ac.id/index.php/nukleus/article/view/7949

## PENGARUH KOMBINASI  SUSU KACANG KEDELAI DAN PENGENCER SITRAT KUNING TELUR TERHADAP KUALITAS SEMEN SAPI BALI
(Effect of combination soy bean milk and citrate egg yolk liqid on the quality of bali cattle semen)
Maria E.E. Fernandez, Wilmientje M. Nalley, Franky M.S Telupere, Thomas M. Hine Program Studi Peternakan, Fakultas Peternakan, Kelautan, dan Perikanan, Universitas Nusa Cendana Jln. Adisucipto, Penfui, Kupang, Nusa Tenggara Timur, Indonesia 850001
* Correspondent author, email: nalleywm@yahoo.co.id

## ABSTRAK
Salah  satu  bahan  pengencer  yang  mengandung  lipoprotein  dan  lesitin  yang  berfungsi  untuk  mempertahankan dan melindungi integritas membran plasma spermatozoa dari kejutan dingin adalah susu kacang kedelai. Tujuan penelitian ini dilakukan adalah untuk mengetahui pengaruh kombinasi susu kacang kedelai dan pengencer sitrat kuning telur terhadap kualitas semen cair sapi bali. Materi yang digunakan dalam  penelitian ini adalah semen segar yang berasal dari satu ekor sapi bali jantan yang berumur 3 tahun. Semen diencerkan dengan pengencer sitrat  kuning  telur  dengan  kombinasi  susu  kacang  kedelai  yaitu  P0:  sitrat  kuning  telur  (SKT)  100%;  P1:  SKT 75%+susu  kacang  kedelai  (SKD)  25%;  P2:  SKT  50%+SKD  50%;  P3:  SKT  25%+SKD  75%;  dan  P4:  SKD 100%.  Semen  yang  telah  diencerkan  disimpan  pada  suhu  3-5oC.    Parameter  yang  diteliti  adalah  motilitas, viabilitas,  abnormalitas  dan  daya  tahan  hidup  spermatozoa.  Data    hasil  penelitian  dianalisis  menggunakan analysis  ragam  dan  dilanjutkan  dengan  uji  Duncan.  Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa  P1  berbeda  nyata (P<0,05)  dengan  perlakuan  lainnya,  dengan  motilitas  42,40±2,50%,  viabilitas  52,15±6,31%,  abnormalitas 6,44±0,84%,  dan  daya  tahan  hidup  6,00±0,00  hari.  Dari  hasil  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  kombinasi  susu kacang kedelai 25% dan 75% pengencer sitrat kuning telur merupakan perlakuan terbaik, dan spermatozoa dapat disimpan hingga hari ke enam.
Kata-kata kunci: sitrat, kuning telur, susu kacang kedelai, spermatozoa, sapi bali

## ABSTRACT
One of the diluent containing lipoproteins and lecithins that function in maintaining and protecting the integrity of  the  plasma  membrane  of  spermatozoa  from  cold  shock  is  soy  milk.  The  purpose  of  this  study  was  to determine  the  effect  of  the  combination  of  soy  bean  milk  and  egg  yolk  citrate  liqud  on  the  quality  of  liquid semen  of  bali  cattle.  The  material  used  in  this  study  was  fresh  semen  of    3  year  old  bali  cattle.  Semen  was diluted  with  egg  yolk  citrate  diluent  with  a  combination  of  soy  bean  milk,  namely  T0: 100%  citrate  egg  yolk (CEY); T1: CEY 75%+soy bean milk (SBM) 25%; T2: CEY 50%+SBM 50%; T3: CEY 25%+SBM 75%; and T4:  100%  SBM.  Liqud  semen  was  stored  at  a  temperature  of  3-5oC.  The  parameter  studied  were  motility, viability,  abnormality  and  liveability  of  spermatozoa.  The  research  data  ware  analyzed  using  an  analysis  of variance (ANOVA) and followed by the multiple range test. The results showed that T1 significantly difference (P<0.05) from other treatments, with motility of 42.40±2.50%, viability 52.15±6.31%, abnormality 6.44±0.84%, and liveability 6.00±0.00 days. From these result it could be concluded that the combination of 25% soy bean milk and 75% egg yolk citrate liqud was the best treatment, and spermatozoa can be stored until six days.
Keywords: citrate, egg yolk, soy bean milk, spermatozoa, bali cattle

## PENDAHULUAN
Salah  satu  faktor  yang  memengaruhi tingkat  keberhasilan  program  inseminasi  buatan (IB)  adalah  kualitas  semen  (Tamoes et  al ., 2014).  Semen  yang  berkualitas  baik  memiliki peluang  yang  lebih  besar  untuk  terjadinya pembuahan  sel  telur  oleh  spermatozoa  dan
selanjutnya  sel  telur  akan  berkembang  menjadi embrio. Semen segar tidak bertahan lama dalam penyimpanan  in  vitro  yang  diakibatkan  oleh adanya  kematian  spermatozoa  dan  berlangsung secara  cepat.  Salah  satu  penyebab  kematian spermatozoa  adalah  adanya  serangan  radikal
bebas sebagai hasil dari proses transpor elektron di  mitokondria  terhadap  membrane  plasma spermatozoa (Hammerstedt, 1993).
Pengencer  yang  mengandung  nutrisi, antioksidan,  buffer,  dan  anti  kejutan  dingin merupakan pengencer yang mampu mempertahankan  kualitas  dan  daya  hidup spermatozoa selama penyimpanan. Sitrat kuning telur  merupakan  salah  satu  bahan  pengencer yang  umum  digunakan  dalam  penyimpanan semen. Natrium sitrat berperan sebagai penyangga yang dapat mempertahankan kestabilan  pH  pengencer,  dan  kuning  telur  juga merupakan  komponen  penting  dalam  pengencer semen,  karena  kandungan  nutrisi  yang  terdapat dalam kuning telur mampu melindungi akrosom spermatozoa  selama  penyimpanan  (Amirat et al .,  2004).  Kandungan  yang  terdapat  dalam kuning  telur  diantaranya  adalah  fosfolipid kolestrol  dan  low  density  lipoprotein  yang berperan penting dalam melindungi spermatozoa terhadap kejutan dingin selama proses pendinginan (Kulaksız et al ., 2010).
Selama  preservasi  spermatozoa  akan mengalami  proses  metabolisme,  menghasilkan zat peroksida lipid, dan apabila bereaksi dengan radikal bebas, dapat menyebabkan integritas dan
kehidupan sel terganggu sehingga mengakibatkan  kematian  spermatozoa.  Radikal bebas  juga  dapat  menyebabkan  penurunan fungsi spermatozoa yaitu mengoksidasi membrane sel yang terdiri dari lipid, hal ini akan mempercepat kematian spermatozoa.
Susu kacang kedelai mengandung lipoprotein dan lesitin sehingga dapat digunakan sebagai  salah  satu  bahan  pengencer  dan berfungsi dalam mempertahankan dan melindungi integritas membran plasma spermatozoa  (Aboagla  dan  Terada,  2004; Bergeron  dan  Manjunath,  2006).  Kandungan lesitin  dalam  susu  kacang  sebesar  1,488-3,08% lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  kacang  tanah yaitu  1,11%.  Penggunaan  susu  kacang  kedelai sebagai  pengencer  semen  telah  dilaporkan Tamoes et al . (2014) pada semen babi, Rezki et al .  (2016)  pada  semen  PO  dan  Immelda et  al . (2019) pada semen domba sapudi.
Penelitian ini, mencoba berbagai kombinasi  susu  kacang  kedelai  dan  pengencer sitrat  kuning  telur  dalam  mempertahankan kualitas  spermatozoa  sapi  bali  yang  disimpan pada suhu 3-5oC.

## METODE PENELITIAN

## Materi Penelitian
Semen  yang  ditampung  berasal  dari  satu ekor  sapi  bali  jantan  yang  berumur  3  tahun dalam kondisi sehat dan sudah dewasa kelamin. Ternak  sapi  tersebut  dipelihara  dalam  kandang individu  yang  dilengkapi  tempat  makan  dan minum. Pakan hijauan diberikan 10% dari berat badan  ternak  serta  pemberian  konsentrat sebanyak  0,5%/ekor/hari  dan  air  minum  secara add libitium.

## Metode penelitian
Penelitian  menggunakan  rancangan  acak lengkap  dengan  5  perlakuan  dan  5  ulangan sehingga  menghasilkan  25  unit  percobaan. Perlakuan yang dimaksud terdiri dari: P0: Sitrat- kuning telur (SKT) 100%; P1: SKT 75% + SKD 25% ; P2: SKT 50% + SKD 50%; P3: SKT 25% + 75%; P4: SKD 100%.

## Penyiapan Bahan Pengencer
Penyiapan  kuning  telur  :  Bersihkan cangkang  telur  menggunakan  kapas  yang  sudah dibasahi  alkohol 70% agar steril, pecahkan kulit telur,  pisahkan  putih  dari  kuning    telur.
Selanjutnya  letakkan  kuning  telur  di  atas permukaan  kertas  saring  buat  gerakan  berputar agar putih telur terserap habis oleh kertas saring. Kuning  telur  yang  telah  bersih  dari  putih  telur disayat  selaput  vitelinnya  dan  kuning  telur dimasukan ke dalam gelas ukur.
Penyiapan  larutan  sitrat:  Bahan  yang digunakan terdiri dari natrium sitrat (Na3C6H5O7)  sebanyak  2,9g  dan  dilarutkan dengan  100mL  aquabidest.  Pengencer  sitrat 80mL  dan  tambahkan  20mL  kuning  telur, dihomogenkan menggunakan stirer, dan tambahkan antibiotic  penicilin 1000 IU/mL dan streptomycin  1g/mL  yang  berfungsi  untuk menghambat pertumbuhan bakteri.
Penyiapan pengencer susu kacang kedelai: Timbang susu kacang kedelai sebanyak 8g  dilarutkan  dalam  100mL  aquabidest  lalu disentrifus.  Setelah  disentrifus  ambil  80mL  dan tambahkan  20mL  kuning  telur,  penicillin  1000 IU/mL, streptomycin 1g/mL lalu dihomogenkan menggunakan stirer.
Perlakuan  merupakan  kombinasi  dari pengencer  sitrat  kuning  telur  (SKT)  dan
pengencer  susu  kacang  kedelai-kuning  telur (SKD-KT) disajikan pada Tabel 1.

## Penampungan dan evaluasi semen
Semen  yang  digunakan  ditampung  pada pagi hari dengan periode dua kali penampungan per minggu. Penampungan semen sapi dilakukan menggunakan  metode  vagina  buatan.  Semen
yang  diperoleh  selanjutnya  dievaluasi  kualitas semen  secara  makroskopis  dan  mikroskopis. Secara  makroskopis  meliputi  pemeriksaan volume,  warna,  konsistensi,  dan  pH  sedangkan secara    mikroskopis  yang  meliputi  gerakan spermatozoa  (gerakan  massa  maupun  individu), konsentrasi, motilitas, viabilitas, dan abnormalitas spermatozoa. Tabel 1. Komposisi pengencer perlakuan Bahan Pengencer Perlakuan P0 P1 P2 P3 P4 SKT (mL) 100 75 50 25 0 SKD (mL) 0 25 50 75 100 Jumlah (mL) 100 100 100 100 100

## Pengenceran dan Penyimpanan Semen
Semen yang digunakan memiliki motilitas  >70%,  konsentrasi  >  1000×106  dan abnormalitas <15%, diencerkan dengan pengencer perlakuan, selanjutnya disimpan pada suhu  3-5oC  dan  dilakukan  evaluasi  setiap  24 jam, hingga motilitas 40%.

## Variabel Penelitian
1). Motilitas spermatozoa (%), ditentukan melalui  pengamatan  spermatozoa  di  bawah mikroskop  cahaya  dengan  pembesaran  40x10. Penilaian terhadap persentase spermatozoa motil adalah  spermatozoa  yang  bergerak  progresif ditentukan  secara  subjektif  pada  5  lapang
pandang yang berbeda. 2). Viabilitas spermatozoa  (%),  3)  Abnormalitas  spermatozoa (%),  dan  4).  Daya  tahan  hidup  spermatozoa (hari) dapat dilihat dari berapa lama kemampuan spermatozoa bertahan hidup selama penyimpanan.

## Analisis Data
Data yang diperoleh dihitung rata-rata dan standar  deviasi  dan  analisis  dengan  analysis ragam  dari  rancangan  acak  lengkap  dan dilanjutkan  dengan  uji  Duncan.  Analisis menggunakan software SPSS 22 for windows.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik Semen Segar Sapi Bali
Hasil  evaluasi  terhadap  kualitas  semen segar  sapi  bali  menunjukan  kualitas  semen cukup  baik  dan  memenuhi  syarat  untuk digunakan.  Semen  yang  dievaluasi  diperoleh selama lima kali penampungan Tabel 2.
Nilai  rerata  volume  semen  segar  yang diperoleh  adalah  3,58±1,12mL  dengan  kisaran 2,5-5mL.  Hasil  ini  sesuai  dengan  penelitian Prastowo et  al .  (2018) yang  menyatakan  bahwa volume  semen  sapi  bali  berkisar  antara  0,40- 4,83 mL. Perbedaan jumlah semen per ejakulasi disebabkan  oleh  beberapa  faktor  yaitu  umur, suhu  lingkungan,  bangsa,  tingkatan  makanan, frekuensi penampungan, ukuran testis dan tubuh ternak.
Warna  semen  yang  diperoleh  adalah krem. Menurut Kune et al . (2021) warna semen sapi  yang  normal  yaitu  putih  susu  atau  krem, keputih-putihan  dan  keruh.  Warna  krem  atau putih  susu  pada  semen  membuktikan  bahwa konsentrasi  spermatozoa  sapi  tinggi  namun volume semen sapi relative rendah.
Konsistensi  semen  dari  hasil  penelitian  ini tergolong dalam kategori sedang. Hasil ini sama dengan  hasil  penelitian  Nabilla et  al .  (2018) yang  menyatakan  bahwa  pada  sapi  bali  umur produktif  dan  non  produktif  yaitu  konsistensi semen  sedang.  Roziqin  (2015)  menyatakan bahwa warna semen, konsistensi dan konsentrasi spermatozoa  merupakan  komponen  yang  saling berkaitan.  Semen  yang  memiliki  konsistensi kental  dan  warna  semen  krem  atau  putih  susu
maka kualitas semen tersebut memiliki konsentrasi  spermatozoa  yang  tinggi.  Derajat keasaman  (pH)  merupakan  salah  satu  faktor yang  memengaruhi  viabilitas  spermatozoa.  Dari
hasil  penelitian  derajat  keasaman  semen  sapi bali adalah 6,46±0,13. Hasil ini lebih tinggi dari laporan Prastowo et al . (2018) yang memperoleh pH semen sapi adalah 6,2.
Tabel 2. Karakteristik semen segar sapi bali
Karakteristik semen Hasil Pengamatan Makroskopis: Volume (mL) 3,58±1,12 Warna Krem Konsistensi Sedang pH 6,46±0,13 Mikroskopis: Gerakan Massa ++ Motilitas (%) 76,50±2,85 Konsentrasi ( x 10 6 sel/mL) 1076±94,49 Viabilitas (%) 86,32±2,35 Abnormalitas (%) 4,63±0,72
Hasil penelitian terhadap gerakan massa semen  segar  sapi  bali  yang  diperoleh  ++.  Hasil ini  sama  dengan  laporan  Anwar et  al .  (2014) dengan  nilai  gerakan  massa  ++,  Kurnia et  al . (2018)  menyatakan  bahwa  gerakan  massa  pada sapi lokal lainya  diperoleh rata-rata sebesar 2,7 setara  dengan  (++/+++)  yang  didukung  oleh kondisi ternak maupun lingkungan.
Kosentrasi  spermatozoa  yang  diperoleh adalah  1076±94,49/mL.  Ismaya  (2014)  yang menjelaskan  bahwa  konsistensi  sedang  sampai kental  atau  warna  krem  maka  konsentrasi spermatozoa berkisar 1.000-2.000 juta spermatozoa/mL.  Hasil  penelitian  motilitas spermatozoa  sapi  bali  yang  diperoleh  adalah 76,50±2,85.  Hasil  ini  lebih  tinggi  dari  laporan Anwar et al . (2014) dengan nilai motilitas hanya sebesar  62,50±5,00  namun  hasil  penelitian  ini masih  tergolong  rendah  jika  dibandingkan dengan  penelitian  Feka et  al .  (2016)  yang memperoleh  motilitas  spermatozoa  sapi  bali mencapai  89,00%.  Viabilitas  spermatozoa  yang diperoleh adalah 86,32±2,35, hasil penelitian ini lebih tinggi dari laporan Kune et al . (2021) yang melaporkan  bahwa  viabilitas  spermatozoa  sapi bali sebesar 84,69%.
Salah  satu  indikator  dalam  menentukan kualitas semen adalah abnormalitas spermatozoa.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  abnormalitas  spermatozoa  mencapai 4,63±0,72. Kusumawati et al . (2016)
melaporkan  bahwa  abnormalitas  spermatozoa tidak boleh melebihi 20%, sehingga semen yang digunakan  dalam  penelitian  ini  memiliki abnormalitas  spermatozoa  masih  tergolong normal.

## Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Motilitas Spermatozoa
Motilitas  adalah  pergerakan  spermatozoa secara  progresif  atau  pergerakan  aktif  maju. Kemampuan spermatozoa untuk bergerak progresif  memiliki  kolerasi  positif  pada  tingkat fertilitas    spermatozoa  (Dongkot et  al .,  2022). Rerata  motilitas  spermatozoa  sapi  bali  hasil penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 3.
Hasil  analisis  statistik  terhadap  motilitas pasca  pengenceran  menunjukkan  perbedaan yang  tidak  nyata  (P>0,05)  antar  perlakuan, namun  setelah  penyimpanan  hari  ke  1-6 menunjukkan  perbedaan  yang  nyata  (P<0,05) antar perlakuan. Selama enam hari penyimpanan,  motilitas  spermatozoa  tertinggi terdapat  pada  perlakuan  P1  yaitu  42,40±2,50% dan    terendah  terdapat  pada  P4  yaitu 9,00±2,23%.
Angka pada Tabel 2 membuktikan bahwa semakin  lama  waktu  penyimpanan  maka semakin  turun  motilitas  dari  masing-masing perlakuan. Hal ini disebabkan oleh berkurangnya  sumber  energy  yang  terdapat dalam  pengencer.  Penurunan  zat  nutrisi  yang
berfungsi  sebagai  makanan  bagi  spermatozoa dan  pengaruh  toksik  dari  hasil  metabolisme spermatozoa  merupakan  salah  satu  faktor  yang menyebabkan penurunan motilitas  spermatozoa. Suplai  energy  berupa  adenosine  triphosphate
(ATP) proses metabolisme spermatozoa memberi  dukungan  yang  besar  bagi  motilitas spermatozoa.  Kejutan  dingin  dan  peningkatan asam  laktat  juga  merupakan  faktor  yang mempengaruhi penurunan motilitas.
Tabel 3. Pengaruh perlakuan terhadap motilitas spermatozoa (%)
Hari Perlakuan Nilai P P0 P1 P2 P3 P4 0 78,00±2,73 a 78,00±2,73 a 78,00±2,73 a 78,00±2,73 a 78,00±2,73 a 1,000 1 73,00±2,73 cd 73,80±1,64 d 69,00±4,18 bc 67,00±2,73 ab 63,00±4,47 a 0,000 2 63,00±2,73 cd 67,40±2,50 d 61,00±2,23 bc 56,00±5,47 b 45,00±7,07 a 0,000 3 56,00±5,47 c 63,00±2,73 d 52,50±5,59 c 45,00±5,00 b 33,00±4,47 a 0,000 4 47,00±6,70 c 58,00±2,73 d 42, 00±4,47 c 35,00±5,00 b 23,00±4,47 a 0,000 5 36,00±5,47 c 50,00±3,53 d 36,00±5,47 c 24,00±6,51 b 16,00±4,18 a 0,000 6 28,00±2,73 c 42,40±2,50 d 25,50±4,47 c 18,00±4,47 b 9,00±2,23 a 0,000 7 18,50±6,02 c 36,60±2,30 d 16,00±5,47 bc 11,00±2,23 b 5,00±0,00 a 0,000
a,b,c,d superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Tamoes et  al .  (2014)  melaporkan  bahwa motilitas dan daya hidup spermatozoa, perubahan  permeabilitas  dan  komponen  lipid pada  membran  dapat  disebabkan  oleh  adanya kejutan  dingin  terhadap sel  spermatozoa selama penyimpanan.  Kerusakan  organel-organel  sel disebabkan  oleh  asam  laktat  yang  dapat menganggu  proses  metabolisme  dalam  upaya memperoleh energi. Apabila proses metabolisme berkurang  dapat  mengakibatkan  jumlah  energy yang  dihasilkan  berkurang  dan  akan  terjadinya penurunan motilitas spermatozoa
Secara  umum  terjadi  penurunan  motilitas spermatozoa selama penyimpanan, yakni terendah  terlihat  pada  perlakuan  P1:  5,93%  dan tertinggi  terlihat  pada  perlakuan  P4:  11,5% diikuti oleh P3: 10%; P2: 8,83%; dan P0: 8,33%. Perlakuan  P4  menunjukkan  adanya  penurunan persentase  motilitas  yang  sangat  tinggi.  Hal  ini disebabkan  karena  kemungkinan  level  SKD sebagai  suplementasi  dalam  pengencer  terlalu tinggi  sehingga  mempengaruhi  ruang  gerak spermatozoa,  sedangkan  perlakuan  P0  tidak mengandung SKD yang memungkinkan membran  spermatozoa  tidak  terlindungi  secara maksimal  dalam  mengurangi  cold  shock  ketika penyimpanan pada suhu 3-5oC.
Rahayu et  al .  (2014)  menyatakan  bahwa ketika  level  SKD  dinaikan  akan  memiliki  efek negatif  terhadap  kualitas  spermatozoa.  Ketika level  lesitin  pada  pengencer  lebih  tinggi  dan ketika level SKD dinaikkan dapat mengakibatkan    ruang  gerak  spermatozoa  pada medium  terbatas.
Salah  satu  parameter  yang  memberi pengaruh  bagi  kualitas  spermatozoa  adalah motilitas.  Kombinasi  sitrat  kuning  telur  (SKT) dan susu kacang kedelai (SKD) 25% memperlihatkan  bahwa  selama  enam  hari penyimpanan  terjadi  perbedaan  yang  nyata dengan  kombinasi  SKD  50%,  75%  dan  100% dalam  mempertahankan  motilitas  spermatozoa. Hal  ini  menunjukkan  perlakuan  kombinasi SKT+SKD  25%  memberikan  pengaruh  yang baik  terhadap  motilitas  spermatozoa  selama enam hari penyimpanan.
Semen  yang  berkualitas  baik  dan  layak digunakan  dalam  program  inseminasi  buatan yaitu  semen  yang  memiliki  standar  motilitas 40%  yang  terdapat  pada  setiap  perlakuan  yang diamati  pada  hari  yang  berbeda.  Berdasarkan Tabel  3  jika  dikaitkan  dengan  program inseminasi  buatan  (IB),  maka  semen  yang mendapat perlakuan P0 dan P2 layak digunakan untuk  IB  pada  pemyimpanan  hari  keempat, perlakuan  P3  pada  hari  ketiga,  perlakuan  P4 pada  hari  kedua  dan  perlakuan  P1  pada  hari keenam.

## Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Viabilitas Spermatozoa
Daya  hidup  atau  viabilitas  spermatozoa juga  merupakan  salah  satu  indikator  dalam menilai layak dan tidaknya kualitas spermatozoa (Sukmawati, 2014). Untuk mengetahui persentase viabilitas dilakukan dengan pewarnaan eosin-negrosin. Nilai viabilitas spermatozoa  dari  hasil  penelitian  ini  dapat dilihat pada Tabel 4.

## Tabel 4. Pengaruh perlakuan terhadap viabilitas spermatozoa (%)
Hari ke Perlakuan Nilai P P0 P1 P2 P3 P4 0 86,22±5,53 a 85,44±3,86 a 84,26±3,08 a 84,57±3,45 a 85,38±4,6 a 0,951 1 81,49±3,99 b 81,37±2,91 b 75,53±2,44 a 74,33±3,02 a 71,51±5,83 a 0,001 2 71,95±4,80 cd 77,57±4,35 d 68,32±2,90 bc 62,34±5,33 b 52,04±8,22 a 0,000 3 66,58±6,73 cd 70,93±5,40 d 59,58±3,77 c 51,73±6,57 b 39,01±5,20 a 0,000 4 56,38±6,57 c 64,83±6,18 d 49,82±5,11 c 42,05±5,87 b 28,67±5,18 a 0,000 5 46,53±6,35 c 58,49±6,16 d 42,75±5,82 c 29,80±7,15 b 21,00±3,04 a 0,000 6 36,28±3,96 c 52,15±6,31 d 33,31±5,36 c 23,48±5,75 b 15,59±2,01 a 0,000 7 25,20±7,74 c 45,88±6,16 d 24,98±6,89 c 16,86±3,47 a 10,28±1,23 a 0,000
a,b,c,d Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (P<0,05).
Data  yang  diperoleh  dari  hasil  analisis terhadap viabilitas setelah pengenceran menunjukkan  perbedaan  yang  tidak  nyata (P>0,05) antar perlakuan, tetapi setelah penyimpanan  selama  1-7  hari  menunjukan perbedaan yang nyata antar perlakuan (P<0,05). Semakin  lama  umur  spermatozoa  disimpan dapat menyebabkan terjadinya penurunan jumlah spermatozoa hidup pada setiap perlakuan.  Penurunan  terjadi  diduga  akibat spermatozoa mati secara alami selama penyimpanan.  Stres  oksidasi  yang  terjadi  pada spermatozoa  selama  penyimpanan  pada  suhu dingin  dapat  memberi  dampak  negatif  terhadap viabilitas spermatozoa.
Tabel 4 memperlihatkan bawah persentase viabilitas spermatozoa dengan penambahan 25% SKD pada perlakuan P1 lebih baik  dibandingkan  dengan  penambahan  50%, 75% dan 100% SKD pada perlakuan P2, P3 dan P4  serta  pada  perlakuan  P0  tanpa  SKD.  Jumlah viabilitas  spermatozoa  pada  perlakuan  P1 mampu  bertahan  sampai  hari  ke  enam  dengan nilai  52,15±6,3%.  Hal  ini  terjadi  karena spermatozoa  dalam  pengencer  SKT  dan  SKD dapat  dilindungi  dari  kerusakan  akibat  radikal bebas  sehingga  spermatozoa  memiliki  daya hidup lama. Kandungan lipoprotein dan phospholipid yang terdapat dalam SKD terbukti mampu melindungi membran plasma spermatozoa  sehingga  kombinasi  antara  SKT dan  SKD mampu memberikan  persentase  hidup yang tinggi.
Viabilitas spermatozoa mempunyai keterkaitan dengan kemampuan fertilitas spermatozoa, sehingga dapat disimpulkan bawah ketika  viabilitas  spermatozoa  tinggi  maka kemampuan untuk membuahi sel telur atau daya fertilitas  juga  tinggi  (Blegur et  al .,  2020). Viabilitas  spermatozoa  sangat  dipengaruhi  oleh nutrisi  yang  dibutuhkan  oleh  spermatozoa
selama  penyimpanan.  Viabilitas  spermatozoa akan  menurun  ketika  ketersediaan  nutrisi sebagai  sumber energi dalam  pengencer berkurang (Hidayaturrahmah, 2018).
Terlihat  penurunan  viabilitas  terendah diamati pada perlakuan P1: 6,59% dan tertinggi pada perlakuan P4: 12,43% diikuti P3: 11,28%; P0:  10,23%  dan  P2:  9,88%.  Persentase  hidup spermatozoa  dengan  konsentrasi  susu  kacang kedelai  (SKD)  25%  memiliki  daya  hidup  lebih lama  dibandingkan  dengan  konsentasi  SKD 50%, 75% dan 100%. Hal ini terjadi karena daya hidup  spermatozoa  dipengaruhi  oleh  level  SKD yang  berikan.  Fenomena  ini  terjadi  ketika spermatozoa menyesuaikan diri dengan pengencer  dalam  suhu  penyimpanan  untuk metabolisme dengan baik, tetapi ketika semakin lama  waktu  penyimpanan  maka  ketersediaan nutrisi  sebagai  sumber  energi  bagi  spermatozoa akan  menurun.    Penurunan  viabilitas  tertinggi terdapat  pada  P4,  ini  membuktikan  bahwa kecilnya persentase hidup spermatozoa diakibatkan  oleh  tingginya  level  SKD  yang diberikan,  karena  konsentrasi  SKD  yang  tinggi dapat mempengaruhi ruang gerak spermatozoa.
Susilawati  (2013)  menyatakan  bahwa spermatozoa  yang  mati,  permeabilitas  membran selnya  meningkat,  terutama  pada  bagian  post nuclear  caps  sehingga  sel  spermatozoa  yang mati  akan  menyerap  warna  eosin-negrosin,  sel spermatozoa  yang  masih  hidup  mempunyai kondisi  membran  yang  baik  sehingga zat  warna tidak dapat menembus membran, yang menyebabkan  sel  spermatozoa  tetap  berwarna putih/bening  (tidak  menyerap  warna  eosin- negrosin).  Hal  ini  terjadi  karena  membran plasma  secara  fisik  dan  fungsional  masih  utuh. Eosin yang berikatan dengan natrium sitrat akan masuk  ke  dalam  sel,  tetapi  karena  membran plasma  sel  masih  berfungsi,    maka  senyawa natrium  sitrat  dan  eosin  ini  akan  segera
dikeluarkan  kembali  dari  dalam  sel  oleh mekanisme kerja pompa sodium. Pada spermatozoa yang mati, plasma termasuk pompa sodium  tidak  berfungi.  Hal  ini  yang  membuat senyawa  natrium  sitrat  dan  eosin  masuk  ke dalam  sel  dan  tidak  dapat  dipompa  keluar sehingga mengakibatkan spermatozoa yang mati memiliki kepala yang berwarna merah.
Pengaruh Perlakuan Terhadap Abnormalitas Spermatozoa
Abnormalitas merupakan kelainan  bentuk yang dialami oleh spermatozoa. Bentuk spermatozoa  yang  normal  terdiri  dari  kepala, leher bagian tengah dan ekor yang sesuai dengan bentuk  morfologinya  (Leyn et  al .,  2021). Abnormalitas  merupakan  salah  satu  indikator penting dalam menentukan kualitas spermatozoa karena  spermatozoa  yang  abnormal  tidak  dapat membuahi sel telur. Nilai viabilitas spermatozoa dari hasil penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Pengaruh perlakuan terhadap abnormalitas spermatozoa (%)
Hari Perlakuan Nilai P P0 P1 P2 P3 P4 0 4,53±1,16 a 4,48±1,22 a 4,79±0,99 a 4,73±0,98 a 4,85±0,93 a 0,975 1 4,83±1,22 a 4,57±1,33 a 4,88±1,14 a 5,00±1,38 a 5,22±1,15 a 0,947 2 5,27±1,11 a 4,88±1,40 a 5,15±1,13 a 5,36±1,03 a 5,67±0,99 a 0,858 3 5,57±1,01 a 5,01±1,51 a 5,21±1,3 0 a 5,45±1,26 a 5,97±1,16 a 0,796 4 5,78±1,17 a 5,33±1,29 a 5,66±1,24 a 6,04±0,85 a 6,13±1,29 a 0,831 5 5,78±1,59 a 5,90±1,04 a 6,18±1,23 a 5,93±1,35 a 6,85±1,04 a 0,692 6 6,16±1,73 a 6,44±0,84 a 6,12±1,67 a 6,44±1,46 a 6,80±1,28 a 0,948 7 6,41±1,95 a 6,31±1,14 a 6,47±1,64 a 6,91±1,34 a 7,08±1,48 a 0,912
a,b,c,d superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Dari hasil analisis ini deterhadap variabel abnormalitas  menunjukkan  perbedaan  yang tidak nyata (P>0,05) sejak hari ke-0 sampai hari ke-6  penyimpanan.  Perbedaan  ini  disebabkan oleh  kandungan  lesitin  yang  terdapat  dalam SKD  yang  berfungsi  sebagai  anti  kejut  dingin yang  dapat  mempertahankan  bentuk  normal spermatozoa.  Lesitin  berperan  sebagai  anti  cold shock  biasanya  terdapat  pada  kuning  telur  dan kacang  kedelai  yaitu  lesitin  hewani  dan  lesitin nabati.  Barek et  al .  (2020)  menyatakan  kejutan suhu  dingin  dapat  berkurang  jika  pengencer yang  digunakan  mengadung  lipoprotein  dan lesitin. Kuning telur merupakan salah satu bahan pengencer  yang  mengandung  lipoprotein  dan lesitin  yang  berperan  melindungi  spermatozoa dari  kejut  dingin  dan  kerusakan  pada  saat pengenceran dan pendinginan.
Dari hasil analisis  memperlihatkan bahwa dengan  adanya    kombinasi  susu  kacang  kedelai dan  pengencer  SKT  tidak  memberikan  dampak negatif  terhadap  abnormalitas  sapi  bali.  Angka abnormalitas  spermatozoa  hasil  penelitian  ini masih  tergolong  normal.  Standar  Nasional Indonesia  (2017)  menetapkan  kualitas  semen yang  layak  digunakan  dalam  inseminasi  buatan adalah kurang dari 20%. Persentase abnormalitas  spermatozoa  hasil  penelitian  ini antara  4,48-7,08% sedikit  lebih  tinggi dari hasil penelitian  yang  dilaporkan  oleh  Meo et  al .
(2022)  yaitu  7,06%.  Rezki et  al .  (2016) menyatakan  bahwa  membran  plasma  pada spermatozoa  adalah  sebagai  pelindung.  Ketika sel mengalami kerusakan maka hal tersebut akan menganggu  proses  metabolisme  (Bunga et  al ., 2014).  Derajat  keasaman    semen,  tekanan osmotik,  dan  stress  dingin  dapat  menyebabkan kenaikan  angka  abnormalitas  (Rokana et  al ., 2022).  Pada  penelitian  abnormalitas  yang dijumpai  adalah  abnormalitas  sekunder,  berupa kepala  dan  ekor  terpisah  dan  ekor  melingkar. Menurut  Suyadi  dan  Rachmawati  (2012) persentase  abnormalitas  spermatozoa  dapat terjadi  pada  saat  pembuatan  preparat    dan  juga disebabkan  peroksidasi  lipid.  Peroksidasi  lipid merupakan  suatu  proses  dimana  terjadi  radikal bebas  dan  adanya  hasil  reaksi  asam  lemak  tak jenuh.  Penyebab  terjadinya  kerusakan  membran plasma adalah proksidasi lipid. Nilai abnormalitas spermatozoa dapat disebabkan oleh lamanya  waktu  penyimpanan  karena  selama proses  metabolisme  berlangsung  terjadi  ketidak seimbangan tekanan osmotik dan pengaruh suhu dingin selama penyimpanan.

## Pengaruh  Perlakuan  Terhadap  Daya  Tahan Hidup (DTH) Spermatozoa
Daya  tahan hidup spermatooza yang di maksud  adalah  kemampuan  gerak  spermatozoa untuk  tetap  hidup  dalam  kurun  waktu  tertentu
setelah  disimpan  dalam  suhu  tertentu  (Hine et al .,  2014).  Daya  tahan  hidup  spermatozoa  sapi bali yang dipreservasi dalam pengencer kombinasi  SKT+SKD  pada  perlakuan  P1
dengan nilai motilitas berada pada 42,40±2,50% mampu  mempertahankan  DTH  selama  enam hari penyimpanan Tabel6.
Tabel 6. Pengaruh perlakuan terhadap daya tahan hidup spermatozoa
Perlakuan Daya tahan hidup (Hari) P0 4,60±0,54 c P1 6,00±0,00 d P2 4,20±0,44 c P3 3,40±0,54 b P4 2,20±0,44 a Nilai P 0,000
a,b,c,d superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Kombinasi  antara  susu  kacang  kedelai dan  sitrat  kuning  telur  terbukti  mampu melindungi  spermatozoa  dari  cold  shock.  Hasil ini  sependapat  dengan  Salisbury et  al .  (1985) yang menyatakan bahwa untuk mempertahankan daya  hidup  spermatozoa  perlu  ditambahkan bahan pengencer kedalam semen sebagai nutrisi agar  spermatozoa  mampu  mempertahankan DTH dalam jangka waktu yang lebih lama.
Wiyanti et al . (2013) dalam penelitiannya menyatakan bahwa kualitas semen yang  baik  untuk  digunakan  dalam  program  IB yaitu  kualitas  semen  yang  memiliki  40%  DTH dengan lama penyimpanan enam hari.
Kehabisan energi yan terjadi selama penyimpanan  akan  memengaruhi  glikolisis untuk menghasilkan energi. Dalam kondisi tanpa oksigen,  suplai  energi  bagi  spermatozoa terutama disumbangakan melalui jalur glikolisis (Migliaccio et  al .,  2018).  Tabel  6  di  atas menunjukkan  bahwa  perlakuan  berpengaruh nyata  terhadap  DTH  spermatozoa.  Menurut Rhoyan et al . (2014) tingginya DTH spermatozoa disebabkan oleh rendahnya tekanan osmotik  dalam  pengencer  dan  penyediaan suplemen  nutrisi  yang  cukup  dalam  pengencer sehingga spermatozoa dapat bertahan hidup.

## SIMPULAN
Kesimpulan  hasil  penelitian  ini  adalah kombinasi  susu  kacang  kedelai  25%  dan  75% pengencer  Sitrat-KT  merupakan  perlakuan
terbaik,  dan  dapat  mempertahankan  kualitas semen hingga enam hari penyimpanan.

## SARAN
Dari  hasil  penelitian  disarankan  perlu dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  untuk  menguji keberhasilan dalam pelaksanaan
IB
menggunakan  kombinasi  25%  SKD  dan  75% SKT.

## DAFTAR PUSTAKA
Aboagla  EME,  Terada  T.  2004.  Effects  of  egg yolk  during  the  freezing  step  of cryopreservation  on  the  viability  of  goat spermatozoa. Theriogenology , 62(6), 1160-1172.
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2
004.01.013
Amirat  L,  Tainturier  D,  Jeanneau,  L,  Thorin  C,
Gérard  O,  Courtens  JL,  dan  Anton  M. 2004.  Bull  semen  in  vitro  fertility  after cryopreservation  using  egg  yolk  LDL:  a comparison with Optidyl®, a commercial egg yolk extender. Theriogenology , 61(5),
895-907.  https://doi.org/10.1016/S0093-
691X(03)00259-0
Anwar  P,  Ondho  Y,  Samsudewa  D.  2014.
Pengaruh  Pengencer  ekstrak  air  tebu dengan penambahan kuning telur terhadap kualitas  spermatozoa  Sapi  Bali. Jurnal Peternakan , 11(2), 48-58. http://dx.doi.org/10.24014/jupet.v11i2.27 19
Barek  ME,  Hine  TM,  Nalley  WM,  Belli  HLL.
2020.  Pengaruh  penambahan  sari  wortel dalam  pengencer  sitrat  kuning  telur terhadap  kualitas  spermatozoa  kambing bligon. Jurnal  Nukleus  Peternakan ,  7(2), 109-117. https://doi.org/10.35508/nukleus.v7i2.315
2
Bergeron  A,  Manjunath  P.  2006.  New  insights
towards understanding the mechanisms of sperm  protection  by  egg  yolk  and  milk. Molecular Reproduction and Development , 73(10), 1338-1344.
https://doi.org/10.1002/mrd.20565
Blegur J, Nalley WM, Hine TM. 2020. Pengaruh penambahan  virgin  coconut  oil  dalam pengencer  Tris  kuning  telur  terhadap kualitas  spermatozoa  sapi  bali  selama preservasi Jurnal  Nukleus  Peternakan ,
7(2), 130-138. https://doi.org/10.35508/nukleus.v7i2.299 7 Bunga VD, Susilawati T, Wahjuningsih S. 2014.
Kualitas  semen  Sapi  Limousin  pada pengencer yang berbeda selama pendinginan. TERNAK TROPIKA Journal of Tropical Animal Production , 15(1), 13- 20.
Dongkot S, Marawali A, Hine TM, Nalley WM.
2022.  Kualitas  semen  beku  babi  duroc dalam  pengencer  tris  modifikasi  dengan waktu  ekuilibrasi  yang  berbeda Jurnal
Nukleus Peternakan , 9(1), 72-84.
https://doi.org/10.35508/nukleus.v9i1.549
1
Feka  WV,  Dethan  AA,  Beyleto  VY.  2016. Pengaruh  lama  penyimpanan  terhadap viabilitas  dan  pH  semen  babi  landrace yang  diencerkan  menggunakan  bahan pengencer  sitrat  kuning  telur. JAS ,  1(3), 34-35. https://doi.org/10.32938/ja.v1i03.253
Hammerstedt  RH.  1993.  Maintenance  of bioenergetic  balance  in  sperm  and prevention of lipid peroxidation: a review of  the  effect  on  design  of  storage preservation systems. Reproduction, Fertility and Development , 5(6), 675-690.
https://doi.org/10.1071/RD9930675
Hidayaturrahmah  H.  2018.  Waktu  motilitas  dan viabilitas spermatozoa ikan mas ( Cyprinus  carpio  L )  Pada  Beberapa Konsentrasi Larutan Fruktosa. BIOSCIENTIAE , 4(1).
https://doi.org/10.20527/b.v4i1.158
Immelda  KH,  Susilowati  S,  Yudaniayanti  IS. 2019.  Pengaruh  bahan  pengencer  sari kacang  kedelai  ( Glycine  max )  terhadap viabilitas dan nekrosis spermatozoa domba Sapudi. Ovozoa Journal of Animal Reproduction , 8(1), 36-42. https://doi.org/10.20473/ovz.v8i1.2019.36
-42
Kulaksız  R,  Çebi  Ç,    Akçay  E,  dan  Daşkın  A.
2010.  The  protective  effect  of  egg  yolk from  different  avian  species  during  the cryopreservation of Karayaka ram semen. Small  Ruminant  Research ,  88(1),  12-15.
https://doi.org/10.1016/j.smallrumres.200 9.11.014
Kune  P,  Uly  K,    Nalley  WM.  2021.  Pengaruh penambahan  filtrat  kelopak  bunga  rosella ( hibiscus sabdariffa linn ) dalam pengencer  tris-kuning  telur  terhadap kualitas  spermatozoa  sapi  bali. Jurnal Peternakan  Lahan  Kering ,  3(1),  1309-
1323.
Kurnia  A,  Soeparna  RIA,  Hidayat  R.  2018.
Fertilitas  semen  beku  dalam  Tris  kuning telur  dan  skim  yang  diberi  omega-3  pada sapi simmental dengan ransum berimbuhan  seng  dan  selenium  minimal.
Jurnal  Veteriner 19(2),  251-262.  DOI: 10.19087/jveteriner.2018.19.2.262 Kusumawati ED, Krisnaningsih ATN, Romadlon RR. 2016. Kualitas
spermatozoa  semen  beku  sapi  Simental dengan  suhu  dan  lama  thawing  yang berbeda. Indonesian  Journal  of  Animal Science , 26(3), 38-41.
http://dx.doi.org/10.21776/ub.jiip.2016.02 6.03.06
Leyn  MFT,  Belli  HLL,  Nalley  WM,  Kune  P,
Hine  TM.  2021.  Kualitas  spermatozoa kambing  bligon  dalam  pengencer  tris- kuning telur dengan penambahan berbagai level  ekstrak  kulit  buah  naga Jurnal
Nukleus Peternakan , 8(1), 23-32. https://doi.org/10.35508/nukleus.v8i1.423
0
Hine  TM,  Burhanuddin,  Marawali  A.  2014.
Efektivitas air buah lontar dalam mempertahankan  motilitas,  viabilitas  dan daya  tahan  hidup  spermatozoa  sapi  bali.
Jurnal Veteriner , 15 (2), 263–273.
Meo MY, Telnoni SP, Dilak HI. 2022. Kualitas spermatozoa  sapi  angus  ( Bos  Taurus ) dalam pengencer tris kuning telur dengan substitusi  ekstrak  sari  buah  tomat. Flobamora  Biological  Journal ,  1(1),  10- 16. https://ejurnal.unisap.ac.id/index.php/biol ogicalJournal/article/view/167
Migliaccio M, Ricci G, Suglia A, Manfrevola F,
Mackie  K,  Fasano  S,  Pierantoni  R, Chioccarelli    T,  Cobellis  G.  2018.
Analysis of endocannabinoid system in rat testis  during  the  first  spermatogenetic wave. Frontiers in Endocrinology, 9, 269. https://doi.org/10.3389/fendo.2018.00269 Nabilla  A,  Arifiantini  RI,  Purwantara  B.  2018.
Kualitas  semen  segar  sapi  bali  umur produktif dan non-produktif serta penentuan konsentrasi krioprotektan
dalam  pengencer  tris  kuning  telur. Jurnal Veteriner , 19(2), 242-250. DOI: 10.19087/jveteriner.2018.19.2.242
Standar Nasional Indonesia. 2017. Semen Beku- Bagian  1 :  Sapi.  Badan  Standarisasi Nasional , Jakarta, ID .
Prastowo S, Dharmawan P, Nugroho T, Bachtiar A,  Pramono  A.  2018.  Kualitas  semen segar  sapi  Bali  ( Bos  javanicus )  pada kelompok  umur  yang  berbeda. Jurnal Ilmu  Ternak  Universitas  Padjadjaran ,
18(1),
1-7. https://doi.org/10.24198/jit.v18i1.17684 Rahayu  W, Agung  Pramana WM,  Ciptadi  G.
2014. Kualitas semen segar kambing boer pada temperatur penyimpanan 4 o C dengan menggunakan pengencer sitrat dan suplementasi susu kedelai bubuk.
Biotropika:  Journal  of  Tropical  Biology ,
2 (1), 55-60.
Rezki  ZM,  Sansudewa  D,  Ondo  YS.  2016.
Pengaruh pengencer kombinasi sari kedelai dan tris terhadap kualitas mikroskopis  spermatozoa  pejantan  sapi
PO  Kebumen. Jurnal  Sain  Peternakan Indonesia , 11(2), 67-74. https://doi.org/10.31186/jspi.id.11.2.67-74
Rhoyan  YH,  Lestari  TD,  Setiawan  R.  2014.
Kualitas  semen  cair  dingin  domba  garut pada  tiga  jenis  larutan  pengencer. Jurnal Ilmu Ternak , 14(1), 63-67. https://doi.org/10.24198/jit.v14i1.5150
Rokana  E,  Srigati  S,  Lisnanti  EF,  Samudi  S.
2022.  Pengaruh  pemberian  tepung  daun kelor  ( Moringa  oleifera  Lamm )  dan  lama penyimpanan  pada  suhu  dingin  4-5°C terhadap  kualitas  semen  cair  ( Liquid Semen ) kambing kacang. Jurnal
Peternakan  Indonesia 24 (1), 43-54. https://doi.org/10.25077/jpi.24.1.43-
54.2022
Roziqin  K.  2015.  Kualitas  semen  kambing peranakan etawah dalam pengencer andromed®  dengan  penambahan  ekstrak bawang  merah (Allium  cepa  L) setelah pembekuan . Skripsi Universitas Brawijaya. http://repository.ub.ac.id/id/eprint/137638
Salisbury  BG,  Falcone  DJ,  Minick  CR.  1985.
Insoluble low-density lipoprotein- proteoglycan complexes enhance cholesteryl ester accumulation in macrophages. The  American  Journal  of
Pathology , 120(1), 6-11
Sukmawati    E,  Arifiantini  RI,  Purwantara  B.
2014.  Daya  tahan  spermatozoa  terhadap proses  pembekuan  pada  berbagai  jenis sapi  pejantan unggul. Jurnal  Ilmu  Ternak dan Veteriner. 19 (3): 168-175
Susilawati T. 2013. Pedoman inseminasi Buatan pada  Ternak .  Universitas  Brawijaya
Press.
Suyadi  A,  Rachmawati  IN.  2012.  Pengaruh  α- tocopherol yang berbeda dalam pengencer dasar  tris  aminomethane  kuning  telur terhadap  kualitas  semen  kambing  boer yang  disimpan  pada  suhu  5oC. Jurnal Ilmiah Ilmu-Ilmu Peternakan , 22(3), 1-8.
Tamoes  JA,  Nalley  WM,  dan  Hine  TM.  2014. Fertilitas  spermatozoa  babi  landrace dalam  pengencer  modifikasi  zorlesco dengan  susu  kacang  kedelai. Sains Peternakan: Jurnal Penelitian Ilmu Peternakan , 12(1), 20-30. https://doi.org/10.20961/sainspet.v12i1.47 72
Wiyanti  DC,  Isnaini  N,  Trisunuwati  P.  2013.
Pengaruh  lama  simpan  semen  dalam pengencer  NaCl  fisiologis  pada  suhu kamar  terhadap  kualitas  spermatozoa ayam  kampung  ( Gallus  domesticus ). Jurnal  Kedokteran  Hewan-Indonesian Journal  of  Veterinary  Sciences ,  7(1):  53- 55. https://doi.org/10.21157/j.ked.hewan.v7i1
.566