# Korespondensi:  Program  Studi  Akuakultur  Fakultas  Pertanian dan  Peternakan,  Universitas  Muhammadiyah  Malang.  Kampus III,  Gedung  GKB  1  Lantai  5,  Jl.  Raya  Tlogomas  No.  246  Malang, Jawa  Timur  65144,  Indonesia. Tel.  +  62  341  464318 E-mail:  aniszubaidah@umm.ac.id
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra

## SCREENING  BAKTERI  SELULOLITIK  DAN AMILOLITIK  PADA  RUMEN  SAPI SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK PADA BUDIDAYA IKAN SECARA IN VITRO
Anis  Zubaidah # ,  Dony  Prasetyo,  Hany  Handajani,  Sulis  Puji  Rohmah,  dan  Diah  Ayu  Puspita
Program Studi Akuakultur Fakultas Pertanian dan Peternakan, Universitas Muhammadiyah Malang Kampus III, Gedung GKB 1 Lantai 5, Jl. Raya Tlogomas No. 246 Malang, Jawa Timur 65144
(Naskah diterima: 16 September 2019; Revisi final: 14 November 2019; Disetujui publikasi: 18 November 2019)

## ABSTRAK
Bakteri selulolitik  dan amilolitik mampu  mengubah selulosa dan  amilum menjadi glukosa  serta mampu menghasilkan enzim selulase dan amilase. Bakteri selulolitik dan amilolitik diisolasi dari rumen sapi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan bakteri selulolitik dan amilolitik dari rumen sapi yang memiliki nilai indeks selulolitik dan amilolitik yang tinggi, serta mampu memenuhi syarat untuk dijadikan sebagai probiotik. Screening bakteri pada rumen sapi menghasilkan enam isolat yaitu AR, BR, CR, DR, ER, dan FR. Uji aktivitas selulolitik dilakukan pada substrat carboxy methyl cellulose (CMC) dan amilolitik pada amilum, uji ketahanan terhadap kondisi asam (pH 3), pengamatan pertumbuhan bakteri selama 30 jam, uji antagonistik terhadap bakteri patogen Aeromonas hydrophila, uji penempelan bakteri dan uji patogenisitas bakteri pada ikan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas selulolitik terbesar pada isolat AR (2,67 ± 0,35 cm) dan aktivitas amilolitik terbesar pada isolat AR (4 ± 0,60 cm). Hanya empat isolat (AR, BR, ER, dan FR) yang dilakukan uji lanjut. Keempat isolat mampu bertahan dalam kondisi asam pH 3 selama delapan jam dengan nilai kepadatan (OD ) terbesar pada isolat ER (1.137). Uji antagonistik menunjukkan bahwa isolat AR, ER, dan FR mampu menghambat pertumbuhan bakteri Aeromonas hydrophila. Isolat FR memiliki nilai antagonistik terbesar  yang  ditandai  dengan  terbentuknya  zona  hambat  17  mm.  Uji  penempelan  bakteri  untuk membuktikan bahwa isolat mampu menempel pada usus ikan. Uji patogenesitas pada isolat yang didapatkan guna membuktikan bahwa isolat tidak bersifat patogen terhadap inang. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa isolat yang didapatkan dari rumen sapi termasuk bakteri selulolitik dan amilolitik yang telah memenuhi syarat sebagai kandidat probiotik pada ikan.
KATA KUNCI: amilase; selulase; zona hambat
ABSTRACT: In vitro screening of cellulolytic and amylolytic bacteria in cow rumen as probiotic candidates for fish culture. By: Anis Zubaidah, Dony Prasetyo, Hany Handajani, Sulis Puji Rohmah, and Diah Ayu Puspita
Cellulolytic and amylolytic bacteria can transform cellulose and starch into glucose and produce the cellulase and amylase enzymes. These types of bacteria can be found in and isolated from cow’s rumen. Thus, the purpose of this study was to obtain potential cellulolytic and amylolytic bacteria from cow’s rumen with a high cellulolytic and amylolytic index value and can be qualified as probiotics. The screening of bacteria in the cow’s rumen produces six isolates i.e. AR, BR, CR, DR, ER, and FR. The parameters observed were: the cellulolytic activity in carboxymethyl cellulose (CMC) substrate, amylolytic activity on starch substrates, resistance test to acidic conditions (pH 3), bacterial growth for 30 hours, antagonistic to pathogenicity test to bacteria Aeromonas hydrophila, bacterial attachment test, and bacterial pathogenicity test in fish. The results showed that the largest cellulolytic and amylolytic activities were observed in AR isolates with a value of 2.67 ± 0.35 cm) and 4 ± 0.60 cm, respectively. Only four isolates (AR, BR, ER, and FR) were used in further tests. The four isolates were able to survive in the acidic conditions of pH 3 for 8 hours with the largest optical density (OD) value was achieved by ER isolates (1,137). The growth of each isolate was different. The antagonistic test showed that the three isolates could inhibit the growth of A. hydrophila. FR isolates had the greatest antagonistic values characterized by the formation of an inhibition zone of 17 mm. Bacteria attachment test proved
that the isolates were able to stick in the fish gut. The pathogenicity tests also proved that the isolates were not pathogenic to the host.

## KEYWORDS: amylase; cellulose; inhibition zone
bidang pangan dan industri, juga dapat dimanfaatkan dalam bidang perikanan.
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk mendapatkan bakteri selulolitik  dan amilolitik yang berasal  dari  cairan  rumen  sapi  yang  memiliki  nilai indeks  selulolitik  dan  amilolitik  yang  tinggi,  tahan terhadap  suasana  asam,  memiliki  sifat  antagonistik terhadap  bakteri  patogen,  dapat  menempel  pada substrat,  serta  tidak  bersifat  patogen.  Hasil  dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terkait adanya bakteri selulolitik dan amilolitik pada rumen  sapi  yang  dapat  dijadikan  sebagai  kandidat probiotik  pada  ikan  guna  membantu  proses pencernaan makanan pada ikan.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-Juni 2019 di  Laboratorim  Bioteknologi  dan  Laboratorium Perikanan Universitas Muhammadiyah Malang. Bahan- bahan yang digunakan adalah rumen sapi, trypticase soy broth (TSB), carboxy methyl cellulose (CMC), amilum, natrium  agar  (NA),  congo  red,  iodin,  NaCl,  bakteri Aeromonas  hydrophila,  dan  ikan  nila.  Alat-alat  yang digunakan  meliputi  cawan  petri,  tabung  reaksi, mikropipet  (100-1.000  mikroliter),  laminar  air  flow (LAF),  spektrofotometer,  autoklaf,  hotplate,  vortex, timbangan analitik, erlenmeyer, jarum ose, dan L-rod. Alat untuk uji patogenesitas antara lain akuarium lima buah ukuran 60 cm x 30 cm x 30 cm, selang aerasi, batu aerasi, blower, selang, seser.
Data  yang  diperoleh  dianalisis  secara  deskriptif. Data ditampilkan dalam bentuk tabel, grafik, ringkasan, dan numerik data.

## Isolasi  Bakteri  dari  Rumen  Sapi
Sumber inokulan berasal dari rumen sapi di rumah potong hewan (RPH), Batu. Rumen sapi diinokulasikan dengan metode sebaran (spread plate) pada media padat selektif carboxy methyl cellulose (CMC) 1% dan amilum 2% sebanyak 0,1 mL. Proses inokulasi isolat dilakukan pada laminar air flow, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam.

## Pengamatan  Morfologi  Koloni  dan  Pemurnian Bakteri
Pengamatan  morfologi  dilakukan  dengan  cara mengamati secara langsung morfologi koloni bakteri yang terbentuk, pengamatan meliputi warna, bentuk, elevasi,  tepian,  dan  karakteristik  optik.  Pemurnian

## PENDAHULUAN
Bakteri selulolitik merupakan bakteri yang dapat menghasilkan enzim selulase sebagai respons terhadap adanya selulosa pada lingkungannya, serta memiliki kemampuan menghidrolisis selulosa menjadi glukosa (Baharuddin et al., 2010). Sedangkan bakteri amilolitik merupakan bakteri yang dapat menghasilkan enzim amilase yang mampu memecah pati menjadi glukosa (Murtius, 2016).  Proses tersebut  dapat berlangsung apabila  terjadi  kontak  langsung  antara  sel  bakteri dengan substrat. Nilai kecernaan selulosa yang rendah dapat  menyebabkan  energi  potensialnya  tidak dimanfaatkan dengan baik dalam metabolisme ikan, begitu pula dengan amilum. ikan memiliki perbedaan dengan  hewan  terestrial  herbivora  berdasarkan kemampuan untuk mendegradasi lignin selulosa dalam pencernaan makanannya (Mudasir et al., 2015).
Bakteri selulolitik dan amilolitik dapat diisolasi dari rumen  sapi.  Rumen  mengandung  berbagai  macam mikroorganisme hidup seperti bakteri yang berperan membantu  proses  pencernaan  makanan.  Rumen merupakan  salah  satu  bagian  pada  lambung  hewan ruminansia yang berfungsi sebagai tempat pencernaan makanan  dengan  proses  fermentasi  yang  dilakukan oleh berbagai macam mikroorganisme seperti bakteri. Bakteri selulolitik dan amilolitik merupakan salah satu jenis  bakteri  yang  hidup  dalam  rumen  sapi  karena mampu  menghasilkan  enzim  ekstraseluler  yang diperlukan untuk perombakan bahan organik. Menurut Lamid  et  al.  (2006),  rumen  sapi  merupakan  bahan buangan  sisa  pakan  yang  tidak  tercerna  dengan berbagai macam jenis mikroba. Beberapa genus bakteri yang  memiliki  kemampuan  selulolitik  di  antaranya Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Aeromonas (Anand  et  al.,  2009)  Bacillus,  Clostridium, Thermomonospora, Cellulomonas, Ruminococcus, Bacteroi- des,  Acetivibrio,  Misrobispora,  dan  Streptomyces  yang mampu memproduksi enzim selulase secara efektif. Mikroorganisme  tersebut  dapat  mendegradasi selulosa karena mampu menghasilkan enzim selulase yang  memiliki  spesifikasi  berbeda  dan  kerja  sama. Enzim tersebut menghidrolisis ikatan (1,4)-â-Dglukosa pada  selulosa  (Saratale  et  al.,  2012).  Sedangkan beberapa  genus  mikroorganisme  yang  memiliki kemampuan  amilolitik  di  antaranya  adalah  kapang, sedangkan  contoh  bakteri  jenis  amilolitik  adalah Clostridium  butyricium  dan  Basilus  subtilis  (Murtius, 2016). Pemanfaatan enzim selulase dan amilase yang diekstraksi  dari  bakteri  sangat  luas.  Selain  dalam
bakteri  dilakukan  dengan  mengambil  koloni  yang tumbuh  terpisah  yang  menunjukkan  karakteristik morfologi  yang  berbeda  dengan  menginokulasikan isolat pada media agar CMC 1% dan amilum 2% baru dengan metode  streak  kuadran untuk  mendapatkan koloni tunggal. Proses inokulasi isolat dilakukan pada laminar air flow. Diinkubasi pada suhu ruang selama 24  jam. Koloni  tunggal yang  terbentuk pada  cawan petri kemudian diinokulasikan pada media agar CMC dan amilum sebagai stok bakteri.

## Uji  Aktivitas  Selulolitik  dan  Amilolitik
Isolat bakteri berasal dari stok agar miring CMC dan amilum yang ditotolkan pada media agar CMC dan amilum dalam cawan petri yang telah dibagi menjadi empat  kuadran.  Pada  media  agar  CMC  dan  amilum dalam cawan petri yang telah dibagi menjadi empat kuadran ditumbuhkan isolat bakteri yang berasal dari stok agar miring CMC dan amilum. Proses inokulasi isolat dilakukan pada laminar air flow. Inkubasi pada suhu  ruang  selama  24  jam.  Pengujian  aktivitas selulolitik dilakukan dengan metode congo red 0,1%; sedangkan  pengujian  aktivitas  amilolitik  dilakukan dengan  penyiraman  iodine  0,1%  pada  media  agar amilum, yang kemudian dituang pada media yang telah ditumbuhi bakteri dan diinkubasi selama 15 menit dan dibilas  dengan  NaCl  0,1%.  Pencucian  ini  bertujuan untuk  membuang  congo  red  dan  iodin  yang  tidak berikatan  dengan  polisakarida.  Isolat  bakteri  yang mampu menguraikan  CMC dan  amilum ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni. Indeks aktivitas selulase dan amilase dapat ditentukan dengan  cara  mengukur  rasio  diameter  zona  bening dan diameter koloni. Indeks aktivitas selulolitik dan amilolitik dapat diukur dengan dengan menggunakan persamaan sebagai berikut (Kasana et al., 2008):

## di mana: D= diameter

## Uji  Ketahanan  Terhadap  Kondisi  Asam
Isolat  bakteri  dari  stok  agar  miring  CMC  dan amilum diinokulasikan pada media TSB 10 mL dengan pH  3  dalam  tabung  reaksi.  Proses  inokulasi  isolat dilakukan  pada  laminar  air  flow  dan  dilakukan pengukuran  nilai  OD  (optical  density)  dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm pada waktu inkubasi 2, 4, 6, dan 8 jam. Sebagai kontrol dan  blanko  digunakan  larutan  TSB  tanpa  inokulasi bakteri.

## Uji  Pertumbuhan  Bakteri
Isolat  bakteri  dari  stok  agar  miring  CMC  dan amilum  diinokulasikan  pada  media  TSB  25  mL
sebanyak 1 ose dan diinkubasi selama 24 pada suhu ruang. Dilakukan inokulasi hasil kultur cair pada me- dia  TSB  ke  media  TSB  baru  dalam  tabung  reaksi sebanyak  1  mL  isolat  pada  TSB  cair  9  mL.  Inkubasi pada suhu ruang dan dilakukan pengukuran nilai OD (optical density) dengan spektrofotometer pada panjang gelombang  620  nm  setiap  dua  jam  sekali  selama 30 jam.

## Uji  Antagonistik  Terhadap  Bakteri  Patogen
Kertas saring yang sudah dipotong bulat dengan diameter 0,5 cm direndam dalam isolat bakteri calon kandidat  probiotik  selama  satu  menit  dengan kepadatan  10 6 cfu/mL.  Bakteri  Aeromonas  hydrophila disebar  pada  media  agar  TSA  dalam  petri  sebanyak 0,1 mL dengan kepadatan 10 6 cfu/mL. Kertas saring yang  sudah  terdapat  masing-masing  isolat  bakteri diletakkan  di  atas  media  yang  sudah  ditumbuhi Aeromonas hydrophila pada cawan petri yang berbeda dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.

## Uji  Penempelan  Bakteri
Masing-masing isolat bakteri dari hasil kultur cair pada media TSB, diinokulasi pada media TSB baru pada tabung reaksi sebanyak 9 mL TSB dengan 1 mL isolat bakteri.  Lempeng  baja  ukuran  4  cm  x  0,5  cm dimasukkan  ke dalam  tabung  reaksi dan  diinkubasi menggunakan  incubator  shaker  selama  24  jam  pada suhu  ruang.  Baja  diambil  dan  diseka  dengan  kertas minyak guna mengambil isolat yang menempel pada baja  dan  diukur  nilai  OD  (optical  density)  dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm dengan pelarut NaCl 0,1%.

## Uji  Patogenesitas  Bakteri
Masing-masing isolat dengan kepadatan 10 10 cfu/ mL sebanyak 10 mL dituangkan pada media budidaya ikan nila ukuran 10 cm dalam akuarium ukuran 60 cm x 30 cm x 30 cm yang berisi air setinggi 20 cm. Isolat diberikan pada hari pertama dan keenam. Disediakan satu akuarium kontrol tanpa pemberian isolat bakteri. Budidaya  dilakukan  selama  12  hari  dan  dilakukan pengamatan  gejala  klinis  pada  masing-masing akuarium.

## HASIL DAN BAHASAN

## Isolasi  dan  Pemurnian  Bakteri
Isolat yang tumbuh menunjukkan bahwa bakteri tersebut  termasuk  jenis  bakteri  selulolitik  dan amilolitik.  Bakteri  selulolitik  merupakan  bakteri heterotrof yang memiliki kemampuan menghidrolisis selulosa menjadi glukosa sedangkan bakteri amilolitik merupakan  bakteri  yang  memiliki  kemampuan menghidrolisis amilum menjadi glukosa. Bakteri yang mampu hidup dalam media yang mengandung CMC
koloni koloni bening zona D D D I  
dan  amilum  menunjukkan  bahwa  bakteri  tersebut mampu  mengasilkan  enzim  selulase  dan  amilase. Berdasarkan hasil penelitian didapatkan enam isolat bakteri  selulolitik  dan  amilolitik  dengan  dua  kali pemurnian. Isolasi bakteri menggunakan media padat CMC 1%, dan amilum 2% sehingga bakteri yang dapat hidup  pada  media  tersebut  merupakan  bakteri selulolitik dan amilolitik. Isolat yang tumbuh diamati morfologinya, mulai dari bentuk koloni, warna, tepian, dan  elevasi.  Hasil  pengamatan  gambaran  morfologi enam isolat bakteri tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.  Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  pada  rumen  sapi terdapat bakteri selulolitik.
Menurut  Yogyaswari  et  al.  (2016),  karakteristik isolat morfologi bakteri pada cairan rumen sapi fries holland  dan  limousin  peranakan  ongle  yang  memiliki aktivitas selulolitik yang tinggi di antaranya memiliki bentuk rata-rata bulat, tepi koloni rata dan tidak rata, warna  koloni  putih  kekuningan  dan  putih  susu, sedangkan ketinggian (elevasi) raised dan convex.

## Uji  Aktivitas  Selulolitik
Hasil  uji  aktivitas  selulolitik  secara  kualitatif menunjukkan bahwa masing-masing isolat yang telah dimurnikan mampu menghasilkan enzim selulase yang ditandai dengan terbentuknya zona bening pada me- dia CMC plate setelah diuji menggunakan metode congo red (Gambar  1). Menurut  Anand et  al. (2009),  congo red akan berikatan secara spesifik dengan polisakarida yang  memiliki  ikatan  -1,4  glikosida  pada  media tumbuh bakteri.
Zona  bening  menunjukkan  adanya  aktivitas hidrolisis  oleh  enzim  ekstraseluler  selulase  yang diekskresikan  oleh  masing-masing  isolat  bakteri
sehingga membentuk zona bening. Besar kecilnya zona bening  tergantung  dari  kemampuan  masing-masing isolat  dalam  menghidrolisis  selulosa.  Menurut Afrilasari  et  al.  (2016),  enzim  ekstraseluler  yang diproduksi  oleh  kandidat  bakteri  probiotik  akan membantu  enzim  yang  terdapat  dalam  saluran pencernaan inang dalam menghidrolisis nutrien pada pakan dan sebagai akibatnya proses pencernaan dan penyerapan  dalam  saluran  pencernaan  ikan  akan berlangsung  lebih  mudah.  Masing-masing  isolat memiliki  kemampuan  berbeda-beda  untuk menghasilkan  enzim  selulase.  Hasil  nilai  indeks selulolitik  masing-masing  isolat  dapat  dilihat  pada Gambar 2.
Berdasarkan Gambar 2. diketahui bahwa nilai indeks selulolitik terbesar ialah pada isolat AR sebesar 2,67 ± 0,35 cm. Bakteri selulolitik merupakan bakteri yang mampu  menghasilkan  selulase  yang  berperan menghidrolisis  selulosa  menjadi  produk  yang  lebih sederhana  yaitu  berupa  glukosa  (Baharuddin  et  al., 2010).

## Uji  Aktivitas  Amilolitik
Keenam isolat yang sudah diremajakan dilakukan uji  aktivitas  amilolitik  untuk  mengetahui  aktivitas amilolitik masing-masing isolat. Pengujian dilakukan dengan  cara  menotolkan  setitik  bakteri  (dapat menggunakan  cotton  bud)  pada  media  agar  selektif amilum dan diinkubasi selama 24 jam. Zona bening bisa  diamati  setelah  dilakukan  penyiraman  dengan larutan  iodin  1%  dan  dibiarkan  selama  15  menit kemudian dicuci dengan larutan NaCl fisiologis.
Larutan iodin akan terserap oleh media selektif di sekitar  zona  bening  sehingga  akan  menghasilkan
Tabel 1. Morfologi koloni bakteri hasil isolasi dari rumen sapi Table 1. Morphology of bacterial colonies isolated from bovine rumen
Isolat Isolate Warna Color Bentuk Form Elevasi Elevation Tepian Edge Karakteristik optik Optical characteristics AR Putih (White ) Bundar (Circular ) Kawah Crateriform Bergelombang Undulate Tidak tembus cahaya Not translucent BR Putih (White ) Tidak beraturan Irregular Datar (Flat ) Rata (Entire ) Tembus cahaya Transparent CR Krem (Cream ) Filamen (Filament ) Datar (Flat ) Filamen (Filament ) Tembus cahaya Transparent DR Putih (White ) Bundar (Circular ) Menonjol Raised Rata (Entire ) Tidak tembus cahaya Not translucent ER Putih (White ) Tidak beraturan Irregular Kawah Crateriform Bergelombang Undulate Tidak tembus cahaya Not translucent FR Krem (Cream ) Filamen (Filament ) Datar (Flat ) Filamen (Filament ) Tembus cahaya Transparent
warna biru tua. Aktivitas amilolitik ditunjukkan dengan terbentuknya  zona  bening  pada  media  agar.  Zona bening  dapat  terlihat  jelas  dengan  menambahkan larutan iodin di sekitar koloni bakteri. Larutan iodin akan mewarnai pati yang terkandung di dalam media menjadi  biru  pekat,  sedangkan  bagian  zona  bening
yaitu bagian yang telah terjadi penguraian pati oleh enzim  amilase  akan  terlihat  bening  atau  tidak terwarnai. Zona bening yang terbentuk terkait dengan kelarutan dari enzim amilase. Semakin tinggi tingkat kelarutan suatu enzim maka akan semakin besar zona bening yang terbentuk.
Gambar 1. Aktivitas selulolitik pada isolat ER (tanda panah menunjukkan zona bening).
Figure 1. Cellulolytic activity on ER isolate (the arrow showed inhibition zone).
Gambar 2. Nilai indeks selulolitik pada isolat bakteri.
Figure 2. Value of cellulolytic index in bacterial isolates.
2.67 ± 0.35 1.20 ± 0.26
1.87 ± 1.10 1.83 ± 1.04 2.03 ± 0.64
1.90 ± 1.01 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 AR BR CR DR ER FR Ni la i In d ek s Se lu lo lit ik ( cm )
C el lu lo ly ti c in de x (c m ) Isolat (Isolate)
Gambar 3. Aktivitas  amilolitik  pada  isolat  ER  (tanda panah menunjukkan zona bening).
Figure 3. Amylolytic  activity  on  ER  isolate  (the  arrow showed inhibition zone).
Diameter zona bening umumnya berukuran lebih besar dibandingkan dengan diameter koloni, karena enzim amilase disekresikan ke lingkungan sekitarnya oleh  bakteri  pendegradasi  amilum  (Zverlova  et  al., 2003).

## Uji  Ketahanan  Terhadap  Kondisi  Asam
Pengujian  ketahanan  bakteri  kandidat  probiotik dalam kondisi asam sangat penting dilakukan untuk mengetahui  kemampuan  kandidat  probiotik  untuk bertahan atau tumbuh dalam kondisi asam pada saluran pencernaan ikan. Berikut hasil pengukuran nilai OD bakteri pada pH 3 dan pH 7 dengan panjang gelombang 620 nm (Tabel 2).
Dari  keenam  isolat  yang  diperoleh  selanjutnya dipilih empat isolat yang akan diuji selanjutnya. Isolat yang dipilih adalah isolat AR, BR, ER, dan FR. Pemilihan kandidat  probiotik  didasarkan  karakterisitik morfologinya  (Tabel  1.).  Pada  pengujian  ini  bakteri kandidat probiotik yang diperoleh mampu bertahan dalam suasana asam, hal ini dimungkinkan karena isolat diisolasi dari saluran pencernaan sapi sehingga sudah beradaptasi dengan kondisi pH rendah. Berdasarkan Tabel 4 menunjukkan bahwa keempat isolat (AR, BR, ER,  dan  FR)  memiliki  kemampuan  yang  baik  untuk bertahan dalam kondisi asam jika dilihat dari masing- masing nilai OD yang didapatkan. Berrada et al. (1991) menyatakan bahwa waktu yang diperlukan mulai saat bakteri masuk sampai keluar dari lambung sekitar 90 menit. Isolat yang diseleksi untuk digunakan sebagai probiotik harus mampu bertahan dalam keadaan asam lambung selama sedikitnya 90 menit. Harjuni (2016) juga menguji toleransi isolat bakteri dari kakap putih terhadap pH 3 selama 48 jam.

## Uji  Pertumbuhan  Bakteri
Tahap  selanjutnya  dilakukan  pengamatan pertumbuhan  bakteri  pada  keempat  isolat. Pengamatan dilakukan selama dua jam sekali selama
30  jam  dengan  melakukan  pengukuran  OD  untuk mengetahui fase pertumbuhan masing-masing isolat yang didapatkan. Berikut hasil pengukuran nilai OD selama 30 jam dapat dilihat pada Gambar 4.
Untuk  mengetahui  jumlah  bakteri  yang  tumbuh pada masing-masing isolat, data hasil nilai OD pada masing-masing isolat dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar. Kurva standar merupakan suatu kurva untuk  menghitung  jumlah  sel  bakteri  secara  tidak langsung, yakni dengan meregresikan nilai absorbansi dan  jumlah  koloni  (TPC)  ke  dalam  persamaan  garis kurva  standar.  Hasil  analisis  regresi  menunjukkan bahwa, hubungan antara nilai OD dan jumlah koloni mempunyai  pola  linier.  Hubungan  kedua  parameter tersebut mempunyai persamaan sebagai berikut: isolat AR:  y  =  8.809,2x-4.875,8;  isolat  BR:  y  =  1.047,5x- 724,38; isolat ER: y = 1.082,8x-310,34; dan isolat FR: y = 1.349,7x-5.677,5. Berdasarkan persamaan tersebut dapat digunakan untuk mengetahui banyaknya jumlah bakteri pada isolat secara lebih cepat setelah diketahui nilai OD-nya.
Berdasarkan kurva pertumbuhan pada Gambar 3, terlihat  bahwa  pada  isolat  AR  dan  BR  fase  lag  atau fase penyesuaian aktivitas mikroba dalam lingkungan barunya yang  terjadi sangat  singkat, pada  isolat AR fase stasioner terjadi pada jam ke-20 sampai 24. Pada isolat BR fase stasioner terjadi pada jam ke-24 sampai 30. Sedangkan pada isolat ER dan FR fase lag terjadi pada  satu  jam  pertama,  isolat  ER  mengalami  fase eksponensial  pada  jam  ke-2  sampai  jam  ke-10  dan selanjutnya  mengalami  fase  stasioner  yang  dapat dilihat  pada  kurva  di atas.  Sedangkan  pada  jam  ke- 26—34  nilai  OD  terus  mengalami  penurunan,  hal tersebut menunjukkan bahwa bakteri mulai mengalami fase  kematian.  Menurut  Rolf  et  al.  (2012)  fase eksponensial  merupakan fase  peningkatan  aktivitas pertumbuhan  bentuk  maupun  jumlah  dengan kecepatan maksimum yang harus diimbangi oleh faktor biologi dan nonbiologi. Faktor biologi meliputi bentuk

## Tabel 2. Hasil pengukuran kepadatan bakteri berdasarkan nilai optical density (OD) pada pH 3 dan pH 7
Table 2. The result of bacteria turbidity using optical density value on pH 3 and pH 7
2 jam 2 nd hours 4 jam 4 th hours 6 jam 6 th hours 8 jam 8 th hours 2 jam 2 nd hours 4 jam 4 th hours 6 jam 6 th hours 8 jam
8 th hours AR 0.4 0.49 0.59 0.61 1.19 1.6 1.77 1.8 BR 0.42 0.5 0.6 0.63 1.08 1.57 1.78 1.79 ER 0.19 0.22 0.26 0.3 0.34 0.64 0.85 1.137 FR 0.32 0.36 0.4 0.44 0.47 0.82 1.24 1.5
3 7 Isolat Isolate pH
dan  sifat  mikroorganisme  terhadap  lingkungannya. Sedangkan  faktor  nonbiologi  meliputi  kandungan nutrisi pada  media pertumbuhannya, pH,  dan suhu. Isolat FR mengalami fase eksponensial mulai pada jam ke-2  terus  meningkat  sampai  pada  jam  ke-24, selanjutnya isolat FR mengalami fase stasioner. Semua isolat  mengalami  fase  lag  yang  relatif  singkat dikarenakan dari awal isolat dikultur di media yang sama sehingga tidak butuh waktu lama dalam proses penyesuaian.  Masing-masing  isolat  mengalami  fase stasioner  pada  kurun  waktu  yang  berbeda-beda tergantung  dari  pertumbuhan  bakterinya.  Dari keempat  isolat, ER  memiliki fase  hidup yang  paling singkat. Sedangkan fase eksponensial dari empat isolat terjadi sangat cepat dan sangat signifikan. Menurut Rolf et al. (2012), kurva pertumbuhan menggambarkan adanya proses pembelahan sel maupun pertumbuhan bertahap suatu mikroorganisme yang dimulai dari awal pertumbuhan  sampai  dengan  berakhirnya  aktivitas, terdiri atas empat fase utama yaitu: lag, eksponensial, stasioner,  dan  kematian.  Fase  lag  merupakan  fase penyesuaian atau pengaturan suatu aktivitas mikroba dalam lingkungan barunya.

## Uji  Antagonistik  Terhadap  Bakteri  Patogen
Bakteri patogen yang digunakan untuk uji ini ialah bakteri Aeromonas hydrophila. Bakteri ini dipilih karena sering  menyerang  pada  ikan  budidaya  dan  dapat menyebabkan  kematian  massal.  Bakteri  ini  akan menyerang  ikan  yang  luka  dan  stres  akibat  adanya perubahan  pada  kondisi  lingkungan  budidaya.  Uji aktivitas  antagonistik  terhadap  bakteri  patogen  ini
bertujuan untuk mengetahui kemampuan isolat untuk menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen. Kemampuan isolat bakteri kandidat probiotik dalam melawan bakteri patogen ditunjukkan dengan adanya zona bening. Zona bening yang terbentuk dapat dilihat pada  Gambar  4,  sedangkan  diameter  zona  bening masing-masing isolat disajikan pada Tabel 6.
Berdasarkan Tabel 6, diketahui bahwa ketiga isolat tersebut  (AR,  ER,  dan  FR)  mampu  menghambat pertumbuhan  bakteri  Aeromonas  hydrophila  sebagai bakteri patogen pada ikan, hal ini ditunjukkan dengan adanya  zona  bening.  Isolat  BR  tidak  menunjukkan adanya  aktivitas  penghambatan  terhadap  bakteri Aeromonas hydrophila yang ditunjukkan dengan tidak terbentuknya zona bening di sekitar koloni. Aktivitas penghambatan  tersebut  dapat  terjadi  karena  isolat bakteri memproduksi senyawa tertentu yang mampu menghambat  pertumbuhan  Aeromonas  hydrophila. Menurut Mulyasari  et al.  (2016); Zhou  et al.  (2018), aktivitas  antagonistik  yang  dilakukan  oleh  bakteri selulolitik  terhadap  bakteri  patogen  Aeromonas hydrophila,  disebabkan  bakteri  tersebut  mampu memproduksi senyawa-senyawa anti bakteri. Senyawa tersebut seperti bakteriosin (contohnya subtilin dan koagulin), antibiotik (contohnya surfactin dan bayclin) dan  asam-asam  organik.  Mekanisme  kerja  dari bakteriosin dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen  yakni  dengan  memblokir  formasi  pori-pori pada  dinding  sel  dan  membran  sel  bakteri  target sehingga  dapat  menyebabkan  ketidak  seimbangan permeabilitas  sel,  serta  menghambat  aktivitas substansi genetik (DRA dan RNA).
Gambar 4. Grafik  pertumbuhan  isolat  bakteri  kandidat  probiotik  yang diisolasi dari rumen sapirumen sapi.
Figure 4. Growth chart of bacterial isolates from cow rumen.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 K epa da ta n b ak te ri T ur bi di ty o f ba ct er ia (OD 6 2 0 n m ) Jam ke- (Hour) AR BR ER FR
Ketiga  isolat  memiliki  kemampuan  antibakteri yang berbeda-beda yang ditunjukkan dengan besarnya zona  hambat  yang  dihasilkan  masing-masing  isolat bakteri. Zona hambat tetinggi dihasilkan oleh isolat FR dengan nilai zona bening sebesar 17 mm. Davis & Stout (1971) menyatakan bahwa apabila zona hambat yang dihasilkan memiliki daerah hambatan ³ 20 mm berarti memiliki kekuatan antibakteri sangat kuat, bila daerah hambatan berkisar 10-20 mm berarti kuat, bila daerah hambatannya 5-10 mm berarti sedang, dan bila daerah  hambatannya  5  mm  atau  kurang  dari  5  mm maka  aktivitas  antibakteri  tergolong  lemah.  Agen antibakteri seperti asam laktat dan bakteriosin yang memiliki  bakteri  probiotik  dapat  menghambat pertumbuhan  bakteri  patogen.  Hal  tersebut disebabkan  karena  agen  antibakteri  mampu menurunkan  pH  menjadi  rendah  sehingga  bakteri patogen sulit bertahan hidup (Tambekar & Bhutada, 2010).

## Uji  Penempelan  Bakteri
Uji  penempelan  bertujuan  untuk  mengetahui apakah bakteri dapat menempel pada usus ikan atau malah  terbuang  dengan  sisa-sisa  makanannya.  Uji penempelan  menggunakan  lempeng  baja  sebagai penempelan  bakterinya  Dewanti  &  Wong  (1995). Lempeng  baja  yang  akan  digunakan  disterilkan
Gambar 5. Zona bening uji daya hambat isolat AR, ER, dan FR. Figure 5. Clear zone inhibition resistance test of bacterial isolate AR, ER, and FR.
Tabel 3. Nilai diameter zona hambat uji antagonistic
Table 3. Antagonistic test inhibition zone diameter value
AR
ER
FR Kode isolat
Isolate code Diameter zona hambat Diameter of inhibitory zone  (mm) AR 11 BR - ER 15 FR 17
terlebih dahulu dengan cara direndam dalam larutan desinfektan selama 24 jam dan kemudian disterilkan kembali  pada  suhu  121°C  selama  dua  jam.  Hal  ini dilakukan  bertujuan  untuk  mencegah  terjadinya kontaminasi  pada  baja  yang  akan  digunakan  saat pengujian. Lempeng baja yang sudah steril kemudian dimasukkan dalam TSB cair steril sebanyak 10 mL yang telah berisi masing-masing isolat dengan kepadatan 10 6 cfu/mL pada tabung reaksi. Lama waktu inkubasi selama  24  jam  pada  suhu  ruang,  serta  dikocok. Kemudian diseka dengan kertas minyak lalu dilakukan uji  spektrofotometer  untuk  mengetahui  nilai  OD. Besar kecilnya nilai OD menunjukkan banyak sedikitnya bakteri yang mampu menempel pada tembaga yang diibaratkan sebagai usus dalam ikan. Hasil pengukuran nilai OD 620 nm disajikan pada Tabel 4.
Salah satu syarat untuk menjadi bakteri kandidat probiotik ialah memiliki kemampuan menempel pada substrat. Berdasarkan hasil uji, semua isolat memiliki kemampuan untuk menempel pada substrat, meskipun kemampuan  penempelannya  berbeda-beda. Kemampuan bakteri untuk menempel pada substrat dapat diketahui setelah lempeng baja yang berperan sebagai substrat dibersihkan dengan NaCl 0,1% untuk mengetahui banyaknya bakteri yang menempel dengan dilakukan pengukuran nilai OD. Berdasarkan Tabel 4, diketahui  bahwa  isolat  ER  memiliki  kemampuan
menempel pada substrat lebih baik dari yang lainnya yakni nilai OD sebesar 0,05 dengan kepadatan bakteri 24  x  10 2 cfu/mL.  Menurut  Verschuere  et  al.  (2000), penempelan bakteri pada permukaan inang atau lapisan mukosa dan kemampuannya untuk membentuk koloni dalam saluran pencernaan inang merupakan kriteria penting  untuk  seleksi  awal  kandidat  probiotik. Kemampuan masing-masing bakteri untuk menempel dan berkembang pada lapisan mukosa usus berfungsi untuk memastikan keberadaan bakteri dalam saluran pencernaan sehingga mampu memberikan efek positif pada inang  (Luis-Villaseñor et  al., 2011).  Rohy et  al. (2014) mendapatkan hasil jumlah total bakteri tertinggi pada  usus  halus  ikan  gurami  dengan  pemberian beberapa  pakan  komersil  sebesar  95  x  10 8 cfu/mL sedangkan pada usus besar 116 x 10 7 cfu/mL.

## Uji  Patogenesitas  Bakteri
Uji ini bertujuan untuk mengetahui isolat bakteri calon  kandidat  probiotik  yang  diberikan  ke  inang bersifat  patogen  atau  tidak.  Berikut  hasil  uji patogenesitas calon kandidat probiotik dapat dilihat pada Tabel 5.
Ikan di budidaya selama 12 hari dengan pemberian makan  setiap  pagi  dan  sore  hari  sekenyang- kenyangnya.  Saat  pemberian  pakan  juga  dilakukan pengamatan  gejala  klinis  pada  masing-masing akuarium. Hari ke-1 sampai dengan hari ke-9 semua ikan dengan pemberian isolat masing-masing dalam kondisi sehat. Pergerakan lincah, serta nafsu makannya lahap. Tidak ada luka pada tubuhnya ataupun ikan yang menggosok-gosokkan  badannya  pada  dinding akuarium. Akan tetapi pada hari ke-5 ikan yang sebagai kontrol  mengalami  kematian  sebanyak  dua  ekor dengan ciri-ciri ikan terserang jamur. Hari ke-7 semua ikan  yang  terdapat  dikontrol  mengalami  kematian, dengan gejala klinis tubuh berjamur serta selama dua hari terakhir ikan tidak nafsu makan. Sedangkan pada hari  ke-10,  dua  ikan  pada  akuarium  yang  diberikan bakteri isolat AR menunjukkan aktivitas yang berbeda, cenderung  berdiam  di  dasar,  pada  punggungnya terdapat sedikit jamur, serta nafsu makannya menurun. Hari ke-11 pada akuarium yang telah diberikan isolat AR terdapat bintik putih pada mata ikan, cenderung menyendiri  dan  nafsu  makan  turun.  Hari  terakhir pengamatan terjadinya kematian pada akuarium kode
Tabel 4. Uji penempelan dari isolat bakteri rumen sapi
Table 4. Attachment test OD bacterial isolate of bovine rumen
Kode isolat Isolate code Nilai OD 620 nm Value of OD 620 nm Kemampuan penempelan Attachment ability  (cfu/mL) AR 0.02 4.8 x 10 2 BR 0.01 9.6 x 10 2 ER 0.05 24 x 10 2 FR 0.01 7.8 x 10 2
Tabel 5. Uji patogenesitas bakteri calon kandidat probiotik Table 5. Bacterial pathogenicity test of the prospective probiotic candidates
Keterangan (Note):
- tidak ada (none)
+ sedikit/cukup (fairly) ++ baik (good) +++ sangat baik (very good)
Isolat Isolate
Parameter Parameters + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - - + - - -
Luka di badan (Body wounds )
Serangan penyakit (Disease attack )
FR AR
BR
ER Pergerakan (Movement ) Nafsu makan (Apetite )
AR sebanyak dua ekor. Punggung ikan ditumbuhi jamur dan  terdapat  bintik  putih  pada  matanya.  Pada  uji antagonistik  isolat  AR  menunjukkan  kemampuan dapat melawan bakteri patogen Aeromonas hydrophila yang ditunjukkan dengan mengeluarkan zona bening yang  dapat  dilihat  pada  Tabel  3.  Hal  tersebut menunjukkan bahwa isolat AR hanya mampu melawan bakteri patogen tetapi tidak mampu melawan jamur yang terpapar dari lingkungan. Sedangkan akuarium dengan pemberian isolat BR, ER, dan FR ikannya dalam kondisi sehat seperti pada saat awal budidaya. Menurut Verschuere et al. (2000), bahwa sangat penting untuk mengetahui bahwa bakteri kandidat probiotik tidak bersifat patogen ketika dipaparkan ke inang. Hasil uji patogenesitas menunjukkan bahwa bakteri kandidat probiotik yang diperoleh tidak bersifat patogen dan aman diberikan ke ikan.

## KESIMPULAN
Isolasi  bakteri  dari  rumen  sapi  yang  dapat menghasilkan enzim selulase dan amilase diperoleh enam isolat yakni isolat AR, BR, CR, DR, ER, dan FR. Berdasarkan  hasil  dari  berbagai  uji  yang  telah dilakukan,  diperoleh  empat  isolat  (AR,  BR,  CR,  dan DR)  yang  memenuhi  syarat  untuk  sebagai  kandidat probiotik pada ikan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  diucapkan  kepada  Direktorat Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Univer- sitas  Muhammadiyah  Malang  yang  telah  mendanai penelitian ini melalui skim Penelitian Pengembangan IPTEKS  (P2I).

## DAFTAR  ACUAN
Afrilasari,  W.,  Widanarni,  &  Meryandini  A.  (2016).
Effect of probiotic Bacillus megaterium PTB 1.4 on the population of intestinal microflora, digestive enzyme activity and the growth of catfish (Clarias sp.). Hayati Journal of Biosciences, 23, 168-172.
Anand, Vennison, Sankar, Prabhu, Vasan, Raghuraman, Geoffrey, & Vendan. (2009). Isolation and charac- terization of bacteria from the gut of bombyx mori that  degrade  cellulose,  xylan,  pectin  and  starch and  their  impact  on  digestion.  Journal  of  Insect Science, 10(107), 1-20.
Baharuddin, A.S., Razak, M.N.A., Hock, L.S., Ahmad, M.N., Aziz, S.A., Rahman, N.A.A., & Shah, U.K.M. (2010). Isolation and characterization of thermo- philic cellulase producing bacteria from empty fruit bunches-palm oil mill effluent compost. American Journal of Applied Sciences, 7(1), 56-62.
Berrada,  N.,  Lemeland,  J.F.,  Laroch,  G.,  Thouvenot, P.,  &  Piala,  M.  (1991).  Bifidobacterium  from  fer- mented  milks:  Survival  during  gastric  transit.  J. Dairy Sci., 74, 409-413.
Davis, W.W., & Stout, T.R. (1971). Disc plate method of mocrobiological antibiotic assay. I. Factors in- fluencing variability and error. Appl Microbiol., 22, 659-665.
Dewanti, R. & Wong, A.C.L. (1995). Influence of cul- ture  condition  on  biofilm  formation  by  Escheri- chia coli. Journal Food Microbial., 26, 147.
Harjuni,  F.  &  Mulyadi,  A.B.  (2016).  Tolerance  of probiotic bacterial candidate from kakap putih on pH  and bile  salt.  Jurnal  Online  Mahasiswa  Bidang Perikanan dan Ilmu Kelautan, 3(2), 1-10.
Kasana, R.C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., & Gulati, A. (2008). A rapid dan easy method for the detec- tion of microbial cellulases on agar plates using gram’s iodine. Curr. Microbiol., 57(5), 503-7.
Lamid,  M.,  Chuzaemi,  S.,  Puspaningsih,  N.,  & Kusmantono. (2006). Inokulasi bakteri xilanolitik asal rumen sebagai upaya peningkatan nilai nutrisi jerami padi. Jurnal Protein, 14(2), 122-128.
Luis-Villaseñor, I.E., Macías-Rodríguez, M.E., Gómez- Gil,  B.,  Ascencio-Valle,  F.,  Campa-Córdova,  Á.I. (2011).  Beneficial  effects  of  four  Bacillus  strains on the larva cultivation of Litopenaeus vannamei. Aquaculture, 321(1-2), 136-144.
Mudasir, A.D., Pawar, K.D., Jadhav, J.P., & Pandit, R.S. (2015). Isolation of cellulolytic bacteria from the gastrointestinal  tract  of  Achatina  fulica  (Gas- tropoda:  Pulmonata)  and  their  evaluation  for cellulose biodegradation. International Biodeterioration & Biodegradation, 98, 73-80.
Mulyasari,  Widanarni, Suprayudi,  M.A., Zairin,  M.Jr.,
& Sunarno, M.T.D. (2016). Screening of probiotics from the digestive tract of gouramy (Osphronemus goramy) and their potency to enhance the growth of tilapia (Oreochromis niloticus). AACL Bioflux, 9(5), 1121-1132.
Murtius, W.S. (2016). Aktivitas amilolitik pada parutan ubi kayu (Manihot uttilissima) yang diperam dengan waktu yang berbeda. Jurusan Teknologi Pertanian Andalas, 20(1), 1410-1920.
Rohy, G.S., Rahardja, B.S., & Agustono. (2014). Jumlah total bakteri dalam saluran pencernaan ikan gurami (Osphronemus  gouramy)  dengan  pemberian beberapa  pakan  komersil  yang  berbeda.  Jurnal ilmiah perikanan dan kelautan, 6(1), 23.
Rolf,  M.D.,  Rice,  C.J.,  Lucchini,  S.,  Pin,  C.,  Thomp- son, A., Cameron, A.D., Alston, M., Stringer, M.F.,
Betts,  R.P.,  Baranyi,  J.,  &  Peck,  M.W.  (2012).  Lag phase  is  a  distinct  growth  phase  that  prepares bacteria for exponential growth and involves tran- sient metal accumulation. Journal of Bacteriology, 194(3), 686-701.
Saratale, G.D., Saratale, R.G., & Oh, S.E. (2012). Pro- duction and characterization of multiple cellulolytic enzymes by isolatd Streptomyces sp. MDS. Biomass and Bioenergy, 47, 302 -315.
Tambekar, D.H. & Bhutada S.A. (2010). An evaluation of probiotic potential of Lactobacillus sp. from milk of  domestic  animals  and  commercial  available probiotic  preparations  in  prevention  of  enteric bacterial infections. Recent Research Science and Tech- nology, 2(10), 82-88.
Verschuere,  L.,  Rombaut,  G.,  Sorgeloos,  P.,  & Verstraete,  W.  (2000).  Probiotic  bacteria  as  bio-
logical control agents in aquaculture. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(4), 655-671.
Yogyaswari,  A.S.,  Rukmi,  I.,  &  Raharjo,  B.  (2016).
Eksplorasi bakteri selulolitik dari cairan rumen sapi peranakan  fries  holland  (PFH)  dan  limousine peranakan ongle (LIMPO). Jurnal Biologi, 5(4), 88.
Zhou, S., Xia, Y., Zhu, C., & Chu, W. (2018). Isolation of  marine  Bacillus  sp.  with  antagonistic  and  or- ganic- substances-degrading activities and its po- tential  application  as  a  fish  probiotic.  Marine Drugs, 16(196), 7.
Zverlova, V.V., Holl, W., & Schwarz, H. (2003). Enzymes for digestion of cellulose  and other polysaccha- rides in the gut of longhorn beetle larvae, Rhagium inquisitor  L.  (Col.,  Cerambycidae).  International Biodeterioration and Biodegradation, 51(2), 175-179.