Ekstrak Daun Sirsak ( Annona muricata ) Sebagai Penghambat Perkembangan Tumor  Payudara

## The Extract of Soursop Leaves (Annona muricata) as Inhibitors of Breast Tumor Development
Breast cancer remains the second most common cause of death after cervix cancer in women. Breast cancer still can not be treated satisfactorily.  Soursop leaves is has been used empirically in Indonesian society as anti- inflammatory and anticancer. Active ingredients acetogenin on soursop leaves is known to induce apoptosis by increasing the activity of caspase-3 and inhibits cancer cell proliferation in vitro. The study to observe the anticancer potential of soursop leaves extract  was conducted with post-test randomized control group design. Twenty four C3H mice that had been inoculated with homogenate of adenocarcinoma breast tumor and has been growing tumors. Mice were divided randomly into group 1 (control), 2 and 3 that get distilled water, sour- sop leaves extract at a dose of 10 mg/kg and 20 mg/kg respectively. Treatment was given orally for 30 days. During the treatment, the tumor volume was observed every 3 days to determine the inhibition of breast tu- mor progression. On day 31, the tumor tissue was taken and made preparations for Ki-67 immunohistochemistry staining  to  determine  the  level  of  proliferation,  and  Tunnel  staining  to  observe  the  number  of  cancer  cells undergoing apoptosis. The data was analysed with One Way Anova. The results indicated that the soursop leaves extract  had the potential to inhibit the growth of breast tumors but it has not been able to show the final tumor size reduction.  In detail, soursop leaves extract could inhibit cell proliferation by down regulate Ki -67 expression and increase apoptosis.
Keywords: soursop leaves, Annona muricata, breast tumor, Ki-67, apoptosis.
Atina Hussaana (a) * , Qathrunnada Djam’an (a) , Edijanti Goenarwo (a) , Chodidjah (a)
(a) Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung, Semarang, Indonesia
(b) Bagian Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung, Semarang, Indonesia
Kanker payudara merupakan penyebab kematian kedua setelah kanker leher rahim pada wanita. Pengobatan kanker sampai sekarang masih belum berhasil dengan baik. Daun sirsak merupakan obat tradisional yang secara empirik dipakai masyarakat Indonesia sebagai obat antiinflamasi dan antikanker. Kandungan aktif acetogenin pada  daun  sirsak  diketahui  dapat  menginduksi  apoptosis  dengan  meningkatkan  aktivitas  caspase-3  dan menghambat proliferasi pada kultur sel kanker. Dengan tujuan untuk mengetahui potensi antikanker ekstrak daun sirsak, penelitian ini  dilakukan dengan rancangan post test randomized control group design , menggunakan 24 ekor mencit C3H yang telah diinokulasi bubur tumor jenis adenokasrsinoma mamma dan telah tumbuh tumor.  Mencit  kemudian  dikelompokkan  secara  random  menjadi  kelompok  1  (kontrol),  2  dan  3,  berturut- turut mendapatkan aquades, ekstrak daun sirsak dosis 10 mg/kg dan 20 mg/kg. Perlakuan diberikan peroral selama 30 hari. Selama perlakuan, volume tumor diamati tiap 3 hari untuk mengetahui penghambatan per- kembangan tumor payudara. Pada hari ke-31, jaringan tumor diambil dan dibuat preparat histopatologi untuk pengecatan  imunohistokimia  terhadap  ekspresi  protein  Ki-67  dan  pengecatan  Tunnel,  berturut-turut  untuk mengetahui tingkat proliferasi serta jumlah sel kanker yang mengalami apoptosis. Data di uji dengan uji One Way Anova . Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak daun sirsak mampu memperlambat pertumbuhan tumor payudara tetapi tidak mengurangi besar tumor akhir. Disamping itu, ekstrak daun sirsak mampu meng- hambat proliferasi sel melalui hambatan ekspresi Ki-67 dan mampu meningkatkan apoptosis.
Kata kunci : daun sirsak, Annona muricata , tumor payudara, Ki-67, apoptosis.

## PENDAHULUAN
Kanker payudara merupakan penyebab ke- matian  yang  cukup  tinggi  pada  wanita  didunia. Setiap  tahun  terdapat  lebih  dari  1,1  juta  wanita penderita  kanker  payudara  yang  baru  dengan 410.000  kematian.  Peningkatan  angka  kejadian kanker  payudara  lebih  dari  5%  setiap  tahun (Moningkey et al ., 2000). Pengobatan kanker payu- dara dengan radioterapi, kemoterapi maupun dengan imunoterapi  masih  belum  mendapatkan  hasil yang  baik  (Zablotska et  al .,  2005;  Weimberg et al ., 2007).
Daun sirsak secara empirik telah digunakan oleh masyarakat untuk pengobatan kanker. Pada penelitian terdahulu akar dari familia Annonaceae lain ( Annona reticulata ) dapat menghambat per- tumbuhan tumor dengan menginduksi apoptosis dan menghambat proliferasi sel tumor secara in vitro  (Suresh et  al .,  2011).  Zat  aktif  pada  daun sirsak di antaranya alkaloid dan acetogenin.  Pada biji familia annonaceae lain ( Annona squamosa ), alkaloid  dapat  menghentikan  pertumbuhan  sel kanker pada fase metafase dan menimbulkan ke- matian sel. Acetogenin dapat menginduksi apoptosis dengan meningkatkan aktifitas caspase-3, menu- runkan ekspresi Bcl-2 dan Bcl-xl yang merupakan protein proapotosis, dan menghambat proliferasi sel kanker (Pardhasaradi et al ., 2004).
Pertumbuhan tumor dipengaruhi oleh protein yang  terlibat  pada  proliferasi  sel,  dapat  dilihat dengan tolok ukur protein Ki-67. Ekspresi protein Ki-67  yang  meningkat  terdapat  pada  sel  kanker payudara  (Azambuja et  al .,  2007).  Daun  sirsak yang diberikan pada kultur sel kanker akan mem- pengaruhi proses apoptosis dengan peningkatan jumlah  sel  yang  mengalami  apoptosis  yaitu  ter- dapatnya kondensasi kromatin, badan apoptotik ( apoptotic body ),  dan  pengkerutan sel. Selain itu juga  terjadi  hambatan  pada  proliferasi  sel  yang ditandai dengan menurunnya ekspresi protein Ki-67.

## METODE PENELITIAN

## Alat
Sonde oral, timbangan digital, alat sokletasi, kompor listrik, rotary evaporator , spuit injeksi, skalpel.
Bahan
Ekstrak daun sirsak, CMC Na, mencit C3H betina, bufer formalin, H 2 O 2 , Trypsin, PBS, anti Ki-67.

## Tahapan Penelitian
Penelitian  dilakukan  dari  bulan  Maret  sampai Oktober  2013  di  laboratorium  Farmakologi  Fa- kultas  Kedokteran  Universitas  Islam  Sultan Agung  dan  di  bagian  Patologi  Anatomi  RS.  Dr. Sardjito Yogyakarta.

## Ekstrak Daun Sirsak
Ekstrak  daun  sirsak  dibuat  suspensi  dengan larutan CMC Na 0,05% untuk memperoleh dosis 10 mg/kgBB dan 20 mg/kgBB. Perlakuan dosis ekstrak  daun  sirsak  diberikan  per  oral  1  kali sehari selama 30 hari.

## Transplantasi Tumor
Transplantasi tumor pada penelitian ini dikerjakan seperti  pada  Varticovski  (2007).  Seekor  mencit C3H  bertumor  sebagai  donor  kanker  payudara dimatikan,  jaringan  tumor  diambil  dan  dicacah menjadi  bubur    dengan  ditambahkan  larutan garam fisiologis (perbandingan 1:1). Bubur tumor disuntikkan secara subkutis ke setiap mencit resipien. Setelah 7 hari sejumlah 18 mencit yang telah tumbuh tumor dikelompokkan secara random menjadi 3 kelompok. Kelompok 1 mendapat perlakuan per oral  dengan  aquades  0,2  ml,  kelompok  2  dan kelompok  3  berturut-turut  mendapat  perlakuan peroral  dengan  ekstrak  daun  sirsak  10  dan  20 mg/kgBB, sekali sehari selama 30 hari. Pada hari ke-31 jaringan tumor diambil untuk dibuat preparat histopatologi, dilanjutkan dengan pengecatan imuno- histokimia dan Tunnel untuk pemeriksaan protein Ki-67 dan pemeriksaan  jumlah sel yang mengalami apoptosis.

## Mengukur Ekspresi Protein Ki-67
Ekspresi protein Ki-67 pada penelitian ini dilakukan secara imunohistokimia dengan metode Labelled Avidin Biotin Peroxidase Complex (ABPC) dengan antibodi anti Ki-67. Hasil pulasan imunohistokimia Ki-67 dinyatakan positif bila terdapat sel-sel dengan inti berwarna coklat.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada  penelitian  ini,  perkembangan  tumor pada mencit yang diberi perlakuan ekstrak daun sirsak  diamati  secara  makroskopik  dan  mik- roskopik.  Hasil  pengamatan  secara  makroskopik seperti  dapat  dilihat  pada Tabel  1 dan  perkem- bangan  tumor seperti diilustrasikan dalam Gam- bar  1 me-nunjukkan  bahwa  ekstrak  daun  sirsak dosis  0,2  mg  tidak  berpengaruh  memperlambat pembesaran  tumor,  sedangkan  dosis  0,4  mg cenderung  memperlambat  pembesaran  tumor walaupun besar tumor akhir tidak berbeda den- gan kontrol.
Kurang  berpengaruhnya  ekstrak  daun  sir- sak terhadap perlambatan dan pengurangan besar tumor tersebut kemungkinan disebabkan karena perlakuan yang kurang lama. Untuk memastikan pengaruh  pada  tingkat  molekuler,  jaringan  tu- mor diambil untuk melihat faktor yang mempe- ngaruhi proliferasi dan apoptosis melalui penge- catan imunohistokimia (IHC).
Pengecatan  IHC  dilakukan  untuk  melihat ekspresi  protein  Ki-67  sebagai  parameter  faktor proliferasi, sedangkan pengecatan Tunnel untuk melihat jumlah sel yang mengalami apoptosis. Ha- sil  pengamatan  terhadap  ekspresi  Ki-67  ditam- pilkan pada Gambar 2 . Dari Gambar 2 dapat dilihat bahwa ekspresi Ki-67 pada jaringan tumor payudara  pada  tikus  yang  tidak  mendapatkan perlakuan  ekstrak  daun  sirsak  (kontrol),  secara kualitatif  terlihat  lebih  banyak  dibandingakan tikus yang mendapatkan perlakuan ekstrak daun sirsak.  Adapun  ekspresi  Ki-67  pada  tikus  yang mendapat ekstrak daun  sirsak dosis 0,2 mg dan dosis 0,4 mg  tidak terlihat berbeda.
TABEL 1. Perjalanan Besar Tumor pada Mencit yang Dino- kulasi dengan Bubur Tumor Payudara
GAMBAR  1. Perjalanan besar tumor pada mencit yang dinoku- lasi dengan bubur tumor payudara.
GAMBAR  2. Ekspresi  Ki-67  pada  jaringan  tumor  payudara ditunjukkan dengan warna coklat. (a) tikus yang tidak mendapatkan perlakuan ekstrak daun sirsak (kontrol); (b) tikus yang menda- patkan perlakuan ekstrak daun sirsak dosis 0,2 mg dan (c) tikus yang mendapatkan perlakuan ekstrak daun sirsak dosis 0,4 mg.
GAMBAR  3. Hasil pemeriksaan apoptosis dengan pengecatan Tunnel pada jaringan tumor payudara. Apoptosis ditunjukkan dengan warna coklat pada inti sel. (a) tikus yang tidak menda- patkan  perlakuan  ekstrak  daun  sirsak  (kontrol);  (b)  tikus  yang mendapatkan perlakuan ekstrak daun sirsak dosis 0,2 mg dan (c) tikus  yang  mendapatkan  perlakuan  ekstrak  daun  sirsak  dosis 0,4 mg dengan perbesaran 100x.
Adapun  untuk  melihat  pengaruh  ekstrak daun sirsak pada apoptosis digunakan pengecatan Tunnel.
Berdasarkan pengecatan Tunnel seperti di- ilustrasikan  pada Gambar  3 ,  dapat  dilihat bahwa  apoptosis  pada  jaringan  tumor  payudara pada tikus yang tidak mendapatkan perlakuan ek- strak daun sirsak (kontrol), secara kualitatif terli- hat lebih sedikit dibandingkan tikus yang menda- patkan  perlakuan  ekstrak  daun  sirsak.  Adapun apop-tosis pada tikus yang mendapat ekstrak daun sirsak  dosis 0,2 mg dan dosis 0,4 mg  tidak terlihat berbeda.
Dari berbagai hasil yang ditampilkan di atas dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak  daun  sirsak mempunyai  kecenderungan  menghambat  proli- ferasi  melalui  penghambatan  ekspresi  Ki-67.  Di samping itu, ekstrak daun sirsak mempunyai ke- cenderungan untuk meningkatkan apoptosis. Hal ini  kemungkinan  karena  kandungan  acetogenin yang mempunyai efek anti tumor yang poten baik secara invitro maupun secara invivo.
Golongan acetogenin (squamocin) diketahui mempunyai  efek  dapat  menghambat  proliferasi kultur sel HL-60 dengan IC50 pada 0,17 µg/mL dan  menginduksi  apoptosis  pada  sel  HL-60. Mekanisme squamocin terhadap apoptosis men- yebabkan  kondensasi  nucleus,  fragmentasi  DNA dan  pemecahan  PARP  ( Poly  ADP  Ribose  Poly- merase )  dan  menginduksi  aktifitas  caspase  3. Ekspresi  Bcl2,  Bax,  tidak  ada  perubahan  pada kultur  sel  HL-60  yang  diberi  Squamocin  walau- pun SAPK ( Stress Activated Protein Kinase ) aktif setelah treatment Squamocin  (Zhu et al. , 2002). Acetogenin juga merupakan inhibitor NADH quini- non  oxidase  (complex  1).  NADH  dehydrogenase merupakan  enzim  yang  berada  pada  membran mitokondria  bagian  dalam  mengkatalisis  trans- fer elektron dari NADH ke Co enzyme Q. NADH complex  1  meningkatkan  apoptosis.  Squamosin (gol. Acetogenin) memodulasi posporilasi Histon (Lee et al. , 2011). Histon merupakan merupakan protein  pada  struktur  kromatin  sel eukaryotic , terlibat pada regulasi gen, mitosis dan DNA repair . Pada  jalur  MAPK  (jalur  proliferasi) squamosin  menurunkan  phosporilasi  ERK  dan meng-aktifkan  caspase  3,  8,  dan  9  pada  proses apoptosis  (Lee et  al. ,  2011).  Acetogenin  aliphatic menghambat  proliferasi  sel  melalui  jalur  RAS/ RAF/Monstituen  MEK/ERK  (Ambrosio et  al. , 2011).

## KESIMPULAN
Ekstrak daun sirsak mampu memperlambat per- tumbuhan  tumor  payudara  tetapi  tidak  mampu mengurangi  besar  tumor  akhir.  Ekstrak  daun sirsak mampu menghambat proliferasi sel melalui hambatan  ekspresi  Ki-67  dan  mampu  mening-
Rerata Besar Tumor (mm²) Hari Kontrol Dosis 0,2 mg Dosis 0,4 mg 1 28,39±4,25 14,53±2,30 16,75±1,82 7 53,19±7,42 38,65±3,61 51,60±5,41 16 297,52±12,53 209,37±8,06 205,88±8,67 27 291,65±6,17 319,93±8,32 331,90±6,68

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas AK, Lichman AH, dan Pober JS, 2010, Cellular and Molecular Immunology , Philadelphia, WB Saunders Coy.
Andreef M, Goodrich DW, dan Pardee AB, 2000, Cell pro- liferation,  Diiferentiation,  and  Apoptosis ,  Cancer Medicine-NCBI Bookshelf, BC Decker Inc., Atlanta.
Azambuja  E,  Candoso  F,  Castro  J,  Colloza  M,  Mano  MS, Sotirion C, Larsimont D, Gebhart MJP, dan Paesmans, 2007, Ki67  as  prognostic  marker  in  early  breast  cancer:  a  meta- analysis  of  published  studies  involving  12155  patient, Br  J Cancer , 96, 1504-1513.
Azhar TN, Wijaya, dan Zulfa A, 2000, Dasar Biologi Mole- kuler , Badan Penerbit UNDIP,  Semarang .
Baskar R, Rajeswari V, dan Kumar TS, 2007, In vitro antioxidant studies in leaves of Annona species , Indian J Exp Biol , 45(5), 480-5.
Fan TJ, Han LH, Cong RS, dan Liang J, 2005, Caspase Family Proteases and Apoptosis, Acta Biochim Biophys Sin , 37(11), 719-27.
Frank  LM  dan  Teich  NM,  1997,  Cellular and  Molecular Biology of Cancer , 3 rd ed., Oxford University Press, New York.
Jager R, 2007, Targeting the death machinery in mammary epithelial cells: Implications for breast cancer from transgenic and  tissue  cultur  experiments, Crit  Rev  Oncol  Hematol , 63(3), 231-40.
Lai CS, Mas RH, Nair NK, Majid MI, Mansor SM, dan Nava- rasman  V,  2008,  Typhonium  Flagelliforme  inhibits  cancer cell  gowth  in  vitro  and  induces  apoptosis:  An  evaluation by the  bioactivity  guide  approach, J  Ethnopathomol ,  118(1), 14-20.
Matsushige  A,  Kotake  Y,  Matsunami  K,  Otsuka  H,  Ohta  S, dan Takeda Y, 2012, Annonamine, a new aporphine alkaloid from  the  leaves  of Annona  muricata , Chem  Pharm  Bull , 60(2), 257-9.
Moningkey dan Ivone S, 2000, Epidemiologi Kanker Pa- yudara , Medika, Jakarta.
Pardhasaradhi BV, Reddy M, Ali AM, Kumari AL, dan Khar A, 2004, Antitumor activity of Annona squamosa seed extract is  through  the  generation  of  free  radicals  and  induction apoptosis, Indian J Biochem Biophys , 41(4), 167-72.
Mohan S,  Bustamam  A,  Ibrahim  S,  Al-Zubairi  AS,  Aspollah M, Abdullah R, Taha MM, Beng NK, dan Isa NM, 2010, Ty- phonium  flagelliforme  inhibits  the  proliferation  of  murine leukemia  WEHI-3  cells  in  vitro  and  induces  apoptosis  in vivo , Leuk Res , 34(11), 1483-92.
Rachmani  EPN,  Suhesti  TS,  dan  Aditiyono  RW,  2012,  The Breast of Anti Cancer From Leaf Extract of Annona muricata Agains Cell Line in  T47D, Int J Appl Sci Tech , 2(1), 157-164.
Suresh  HM, Shivakumar  B,  Hemalatha  K,  Heroor  S,  Hugar DS, dan  Rao S, 2011,  In vitro antiproliferative activity of Annona reticulata roots  on  human  cancer  cell  lines, Pharma- cognosy Res , 3(1), 9 – 12.
Varticovski L, Hollingshead MG, Robles AI, Wu X, Cherry J, Munroe DJ, Lukes L, Anver MR, Carter JP, Borgel SD, Stot- ler  H,  Bonomi  CA,  Nunez  NP,  Hursting  SD,  Qiao  W,  Deng CX,  Green  JE, Hunter  KW,  Merlino  G,  Steeg  PS,  Wakefield LM,  dan  Barrett  JC,  2007,  Accelerated  Preclinical  Testing Using  Trannsplanted  Tumors  from  Genetically  Engineered Mouse Breast Cancer Models, Clin  Cancer  Res , 13(7), 2168- 77.
Zablotska  LB,  Chak  A,  Das  A,  dan  Neugut  AI,  2005, Increased  Risk  of  Squamous  Cell  Esophageal  Cancer  after Adjuvant Radiation, Am J Epidemiology , 161(4), 330-7.