Jurnal Perikanan Tropis
Volume 7, Nomor 2, 2020 http://jurnal.utu.ac.id/jptropis ISSN: 2355-5564, E-ISSN: 2355-5572
AKTIVITAS ENZIM KATEPSIN PADA IKAN LELE ( Clarias sp. ) PADA PERLAKUAN SUHU DAN SUBSTRAT YANG BERBEDA
ACTIVITIES OF CATFISH ( Clarias sp. ) CATHEPSIN ENZYME WITH DIFFERENT TEMPERATURE AND SUBSTRATES TREATMENT
Anhar Rozi 1 *, Ikhsanul Khairi 1 , Reni Tri Cahyani 2 , Stephani Bija 2 , Nurhikma 2 , Nuring Wulansari 3 , Deden Yusman Maulid 4 , Siluh Putu Sri Dia Utari 5 , Diah Anggraini Wulandari 6 , Tati Nurhayati 7
1 Program Studi Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Teuku Umar Meulaboh, Aceh
2 Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Borneo Tarakan, Kalimantan Utara
3 Pangkalan PSDKP Jakarta, Ditjen PSDKP
4 Politeknik Kelautan dan Perikanan Pangandaran
5 Politeknik Kelautan dan Perikanan Jembrana
6 Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI, Cibinong,Bogor
7 Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor
*Korespondensi : anharrozi@utu.ac.id

## Abstract
Cathepsin  was  proteolytic  enzyme  which  is  found  animal  tissues  included  fish. Cathepsin  found  in  fish  muscle  tissue,  cathepsin  and  other  hydrolyzing  enzymes were  place  in  subcellular  organelles  and  divided  into  two  places,    that  was  in muscle  fibers  and  extracellular  matrix.  The  aimed  of  this  study  was  to  the characterization  of  cathepsin  enzyme  especially  catfish.  So  that  in  enviromental condition  that  can  increased  the  activity  of  cathepsin  enzyme  an  approtiate handling process can be carried out. The method of analyze enzyme activity, while the  measurement  of  protein  concentration  refered  to  Bradford  (1976).  The treatments  in  this  study  was  determination  temperature  (30 o C,  40 o C,  50 o C,  dan 60 o C) and substrate (1.5% 2%, 2.5%). The result showed of enzyme activity with detrmination  temperature  very  influential  and  fluctuating,  the  optimum temperature  was  30 o C  where  the  activity  reaches  0.38  U/ml.  The  best  activity treatment  of  substrate  was  1.5%  where  the  activity  reaches  0.42  U/ml.  BSA Standard curve with regression equation y = 0.95x + 0.109.
Keywords: Cathepsin, enzyme, substrate, temperature

## I. Pendahuluan
Lahan budidaya tambak memiliki potensi mencapai 500.000 ha serta dengan produktivitas udang sebesar 2 ton/ha/tahun, sedangkan produksi perikanan air tawar memiliki potensi lebih dari satu juta ton/tahun. Potensi produksi sebesar 356.000 ton/tahun dari perikanan tangkap, total potensi produksi perikanan Indonesia dapat mencapai 9,5 juta ton/tahun (KKP 2011).
Potensi  yang  dihaslkan  dari  segi  perikanan  memiliki  permasalahan  dimana kemunduran  mutu  hasil  perairan  sangat  cepat.  Kemuduran  mutu hasil  perairan berlangsung  dalam  waktu  yang  sangat  cepat,  sehingga  dibutuhkan  penanganan yang  baik  agar  dapat  menghambat  proses  pembusukan  secara  kimiawi  maupun enzimatis  (Rehbein  1979).  Metode  yang  paling  tepat  untuk  menghambat
Jurnal Perikanan Tropis
Volume 7, Nomor 2, 2020 http://jurnal.utu.ac.id/jptropis ISSN: 2355-5564, E-ISSN: 2355-5572
pembusukan ikan adalah dengan menggunakan suhu rendah baik menggunakan es maupun  pembekuan.  Penggunaan  suhu  rendah  pada  produk-produk  perikanan mampu  menghambat  aktivitas  enzim  dan  pertumbuhan  bakteri  sehingga kemunduran  mutu  ikan  berjalan  lebih  lambat  dan  ikan  akan  tetap  segar  dalam jangka  waktu  yang  lama  (Ilyas  1983).  Menurut  Stein et  al. (2005)  menyatakan bahwa  ikan  yang  diberi  perlakuan  penyimpanan  suhu  rendah  dapat  diperpanjang daya  awetnya  hingga  mencapai  1-4  minggu,  tergantung  jenis  ikan  dan  cara penanganannya.
Kemunduran mutu ikan yang paling banyak terjadi melalui proses enzimatis. Protease  merupakan  enzim  yang  penting  untuk  kelangsungan  makhluk  hidup karena berperan dalam sejumlah reaksi biokimia seluler. Enzim protease diperlukan untuk mendegradasi protein nutrient, enzim protease juga terlibat dalam sejumlah mekanisme  patogenitas,  proses  koagulasi  darah,  proses  sporulasi,  diferensiasi, sejumlah  proses  pasca  tranlasi  protein  dan  mekanisme  ekspresi  protein  ekstra seluler.  Protease  juga  mempuyai  peranan  yang  penting  dan  banyak  digunakan dalam  industri  pangan  dan  non  pangan.  Protease  dalam  industri  pangan dimanfaatkan sebagai penjernih bir, membuat kecap, membuat protein hidrolisat, pengempuk daging dan kegunaan lainnya.
Enzim  protease  yang  berperan  dalam  kemunduran  mutu  ikan  ialah  enzim katepsin.  Katepsin  merupakan  enzim  proteolitik  yang  ditemukan  pada    jaringan hewan  termasuk  ikan  dan  banyak  ditemukan  dalam  jaringan  otot  ikan.  Pada jaringan otot ikan, katepsin  dan enzim penghidrolisis lainnya ditempatkan dalam organel  subseluller  dan  dibagi  dalam  dua  tempat,  yaitu  pada  serabut  otot  dan matriks  ekstraselluler  (Shahidi  dan  Botta  1994).  Aktivitas  katepsin  memberikan pengaruh pada tekstur daging ikan karena katepsin dapat menurunkan fleksibilitas sehingga daging ikan menjadi tidak elastis dan jaringan daging ikan melunak (Jiang 2000). Enzim katepsin optimal pada pH asam walaupun beberapa diantaranya aktif pada pH yang netral (Haard 1994).
Berdasarkan latar belakang tersebut informasi mengenai kondisi optimal dari enzim  katepsin  sangat  diperlukan.  Oleh  karena  itu  dilakukan  penelitian  tentang karakterisasi  enzim  katepsin  khususnya  pada  ikan  lele.  Sehingga  pada  kondisi lingkungan  yang  dapat  meningkatkan  enzin  katepsin  dapat  dilakukan  proses penanganan yang tepat.
II. Metode Penelitian

## Bahan dan Alat
Bahan yang di gunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan baku ikan lele dalam keadaan post-rigor , bahan-bahan untuk ekstraksi kasar (buffer tris Hidrogen Klorida0,1 M, pH 7,4, aquades), presipitasi (ammonium sulfat teknis), uji aktifitas katepsin [hemoglobin (sigma), buffer tris 0,1 pH 7,4, tirosin (Applichem), akuades, TCA  5%,  folin  (merck),  HCl  1  N],  uji  kadar  protein  [pereaksi  Bradford, bovine serum albumin (applichem)].
Jurnal Perikanan Tropis
Volume 7, Nomor 2, 2020 http://jurnal.utu.ac.id/jptropis ISSN: 2355-5564, E-ISSN: 2355-5572
Alat yang di gunakan pada penelitian ini antara lain inkubator (Thermoline), sentrifuse  dingin,  Spektrofotometer  UV-Vis  2500  (LaboMed),  pH  meter,  kertas saring Whatman no.1, mikropipet, mikropipet tip, sudip dan erlenmeyer.

## Prosedur Penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu preparasi sampel berupa ikan  lele  pada  tahap post-rigor yang  di  ambil  dagingnya.  Tahap  selanjutnya  yakni pemurnian enzim katepsin semi murni yang meliputi ekstraksi kasar dan presipitasi. Data  dianalisa  secara  deskriptif  yang  disajikan  dalam  bentuk  tabel  dan  grafik, kemudian dibahas berdasarkan literatur dan standar yang ada. Tahapan penelitian yang disajikan pada Gambar 1.

## Gambar 1 Diagram alir tahapan penelitian

## Ekstraksi katepsin kasar
Ekstraksi  dilakukan  dengan  preparasi  sampel  untuk  memperoleh  ekstrak  kasar katepsin dengan cara ikan dimatikan, kemudian daging ikan diambil dan dicuci untuk menghilangkan  darah.  Daging  yang  telah  diambil  disuspensikan  dalam  akuades dengan perbandingan daging ikan dan akuades 1:1 lalu di homogenisasi pada suhu 0- 4°C.
Ekstrak  daging  hasil  homogenisasi  disentrifugasi  pada  600xg,  suhu  4°C selama 10 menit dan supernatant yang diperoleh kemudian disentrifugasi lagi pada 10.000xg,  4°C  selama  10  menit.    Pelet  yang  di  hasilkan  dari  hasil  sentrifugasi kemudian di larutkan dalam buffer tris HCl 0,1 M pH 7,4 dengan jumlah yang sama seperti  jumlah  aquades  dan  disentrifugasi  pada  4000xg,  4°C  selama  10  menit.
Ikan lele
Preparasi (daging)
• Penentuan Suhu 30, 40, 50,  dan 60°C • Penentuan subtrat
1,5; 2; 2,5% Ekstraksi enzim katepsin
• Analisis aktivitas katepsin (Dinu et al. 2002)
• Pengukuran konsentrasi protein (Bradford 1976) Enzim katepsin kasar
Presipitasi
(50%, 60 70%, 80%)
• Analisis aktivitas katepsin (Dinu et al. 2002)
• Pengukuran konsentrasi protein (Bradford 1976)
Katepsin semi murni
Jurnal Perikanan Tropis
Volume 7, Nomor 2, 2020 http://jurnal.utu.ac.id/jptropis ISSN: 2355-5564, E-ISSN: 2355-5572
Supernatan  (ekstrak  kasar  katepsin)  yang  diperoleh  merupakan  protein  utama  dari mitokondria dan lisosom yang siap di teliti aktivitasnya lebih lanjut.

## Presipitasi dan dialisis
Katepsin  semi  murni  diperoleh  dengan  mengendapkan  ekstrak  kasar  katepsin menggunakan ammonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 40%, 50%, 60%, 70% dan 80% (b/v). Pengendapan dilakukan dengan menambahkan garam ammonium sulfat ke  dalam  supernatant  sedikit  demi  sedikit  dan  di  sentrifugasi  pada  12.000xg,  4°C selama 30 menit.
Pelet dilarutkan dalam buffer tris HCl 0,1 M pH 7,4. Langkah selanjutnya adalah dialisis.  Dialisis  dilakukan  dalam  bufer  tris  HCl  0,1  M  pH  7,4  menggunakan kantong selofan berukuran 12 kDa, dengan waktu dialisis 2, 4, 6 dan 8 jam. Tahap presipitasi dan analisis ini dilakukan pada suhu ≤4 °C. Hasil yang diperoleh dari masing-masing tahap pemurnian, diuji aktivitas enzim dan kadar protein.

## Karakterisaasi katepsin
Karakterisasi  dilakukan  terhadap  hasil  dialisis  dengan  aktifitas  spesifik  yang tertinggi. Karakterisasi meliputi penentuan suhu optimum dan penentuan konsentrasi subtrat optimum.

## Karakterisasi suhu
Karakterisasi suhu dilakukan dengan variasi suhu inkubasi pada saat pengujian aktivitas katepsin dengan suhu 40, 50, 60 dan 70 °C. Pengujian hemoglobin sebagai subtrat dibuat dengan konsentrasi 2% pH 2. Sebanyak 0,5 mL dari larutan subtrat, 0,1 mL larutan buffer Tris HCl 0,1 M pH 7,4 diinkubasi dengan 0,1 mL larutan enzim pada variasi suhu 40, 50, 60 dan 70 °C selama 10 menit.  Reaksi dihentikan dengan penambahan  2  ml  TCA  5%  (w/v).  Campuran  disaring  dan  1  mL  filtrat  hasil penyaringan di tambah 1 mL pereaksi folin, selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu 37 °C selama 10 menit. Campuran kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang  gelombang  750  nm.  Selain  itu,  dilakukan  pula  pengukuran  untuk  larutan blanko dan larutan standar dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel hanya untuk larutan blanko dan larutan standar enzimnya digantikan dengan aquades dan tirosin.

## Karakterisasi konsentrasi subtrat
Karakterisasi  konsentrasi  substrat  dilakukan  dengan  mengubah  konsentrasi substrat  hemoglobin  dengan variasi  (0,5%, 1%, 1,5%, dan  2%, 2,5%, 3%, 3,5%, dan 4% b/v). Pada saat  pengujian hemoglobin sebagai substratnya dibuat dengan konsentrasi (0,5%, 1%, 1,5%, dan 2%, 2,5%, 3%, 3,5% , dan 4%) pH 2. Sebanyak 0,5 mL dari larutan substrat 0,1 mL larutan bufer Tris HCl 0,1 M pH 7,4 diinkubasi dengan 0,1 mL larutan enzim pada suhu 37 o C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 mL TCA 5% (w/v). Campuran disaring dan 1 mL filtrat hasil penyaringan  ditambah  1  mL  pereaksi  folin,  selanjutnya  diinkubasi  kembali  pada suhu 37°C selama 20 menit. Campuran kemudian diukur dengan spektrofotometer pada  panjang  gelombang  750  nm.  Selain  itu,  dilakukan  pula  pengukuran  untuk larutan  blanko  dan  larutan  standar  dengan  prosedur  yang  sama  seperti  larutan
Jurnal Perikanan Tropis
Volume 7, Nomor 2, 2020 http://jurnal.utu.ac.id/jptropis ISSN: 2355-5564, E-ISSN: 2355-5572
sampel hanya untuk larutan blanko dan larutan standar enzimnya digantikan dengan akuades dan tirosin.

## Analisis
Aktivitas katepsin (Dinu et al. 2002)
Aktivitas  proteolitik  dari  katepin  diuji  menggunakan  hemoglobin  sebagai subtratnya dengan konsentrasi 2% pH 2. Sebanyak 0,5 mL dari larutan subtrat 0,1 mL larutan buffer Tris HCl 0,1 M pH 7,4 di inkubasi dengan 0,1 mL larutan enzim pada suhu 37 °C selama 10 menit.  Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 mL TCA 5% (w/v). Campuran disaring dan 1 ml filtrat hasil penyaringan di tambah 1 mL pereksi folin. Campuran kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 750  nm.    Selain  itu,  dilakukan  pula  pengukuran  untuk  larutan  blanko  dan  larutan standar dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel hanya untuk larutan blanko dan larutan standar enzimnya digantikan dengan aquades dan tirosin. Unit aktivitas di definisikan sebagai banyaknya enzim yang dapat mengubah subtrat menjadi 1 µmol tirosin dalam 1 menit.
Aktivitas enzim katepsin dapat dihitung dengan rumus berikut :
Keterangan   : UA : jumlah tirosin yang dihasilkan per ml enzim permenit P : faktor pengenceran T : waktu inkubasi

## Pengukuran konsentrasi protein (Bradford 1976)
Konsentrasi  protein  ditentukan  menggunakan  metode  Bradford  dengan bovine serum albumin sebagai standar.  Persiapan pereaksi Bradford dilakukan dengan cara melarutkan 5 mg coomasie brilliant blue G-250 dalam 2,5 mL etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan dengan 5 mL asam fosfat 85% (v/v).  Jika telah larut lalu ditambahkan akuades  hingga  250  mL  dan  disaring  dengan  kertas  saring  whatman  no.  1  dan diencerkan 5 kali sesaat sebelum digunakan.
Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford dengan cara 0,1 mL enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan sebanyak 5 mL pereaksi Bradford, diinkubasi selama 5 menit dan diukur dengan spektrofotometer pada  panjang  gelombang  595  nm.    Larutan  standar  dilakukan  sama  seperti  larutan sampel dengan konsentrasi antara 0,1-1,0 mg/mL. Tahap berikutnya adalah membuat kurva standar dengan absorbansi sebagai ordinat (sumbu y) dan konsentrasi protein sebagai  absis  (sumbu  x). Berdasarkan  kurva  tersebut  dapat di tentukan  konsentrasi protein sampel.  Tabel komposisi volume larutan dengan pembuatan larutan standar dengan  konsentrasi 0,01-0,3mg/mL  dari  larutan  stok  BSA  konsentrasi  2 mg/mL  di sajikan pada Tabel 1.
Jurnal Perikanan Tropis
Volume 7, Nomor 2, 2020 http://jurnal.utu.ac.id/jptropis ISSN: 2355-5564, E-ISSN: 2355-5572
Tabel 1 Pembuatan larutan standar BSA konsentrasi 0.01-0,3 mg/mL Konsentrasi BSA (mg/mL) Volume BSA (mL) Volume akuades (mL) 0,01 0,01 1,99 0,02 0,02 1,98 0,03 0,03 1,97 0,04 0,04 1,96 0,05 0,05 1,95 0,06 0,06 1,94 0,07 0,07 1,93 0,08 0,08 1,92 0,09 0,09 1,91 0,10 0,10 1,90

## Penentuan berat molekul dengan SDS-PAGE
Konsentrasi gel akrilamid dalam analisis SDS-PAGE adalah 4% stacking gel dan 10% separating gel.  Metode ini menggunakan matriks  dari gel  yang disusun oleh  akrilamida  dan  N,N’-metilen-bis-akrilamida  yang  berpolimerisasi  melalui mekanisme  radikal  bebas  dengan  bantuan  katalisator  N,N,N’N,-tetramethylene- diamine  (TEMED)  dan  inisiator  ammonium  persulfat  (APS)  (Rosenberg  1996). Komposisi  pembuatan  gel  penahan  dan  pemisah  SDS-PAGE  dapat  dilihat  pada Tabel 2.
Tabel 2 Komposisi gel penahan dan pemisah SDS-PAGE Komponen Gel pemisah (8%) Gel penahan (4%) Larutan stok akrilamida Buffer gel pemisah Buffer gel pengumpul Akuades Ammonium persulfat
TEMED 2,66 ml
2,50 ml - 3,18 ml 50.00 µl
5.00 µl 0,67 ml - 1,25 ml 3,00 ml 50.00 µl 5.00 µl
Konsentrasi akrilamida yang digunakan dalam analisis ini adalah 10% (w/v). Pewarnaan  yang  digunakan  adalah  pewarnaan  perak.  Pendeteksian  SDS-PAGE dilakukan dengan melepaskan gel hasil elektroforesis dari cetakan dan diukur jarak migrasi brompenol blue. Gel tersebut dicelup dan direndam dalam larutan fiksasi (25%  metanol  +  12%  asam  asetat)  selama  1  jam  digoyang  konstan.  Kemudian direndam dalam 50% (v/v) etanol selama 2x20 menit. Larutannya diganti dengan larutan pengembang kemudian dicuci dengan akuabidestilata. Hasil cucian tersebut ditambahkan  larutan  perak  nitrat  selama  30  menit  kemudian  dicuci  lagi  dengan akuabidestilata 2x20 detik dan ditambahkan larutan campuran Na 2 CO 3 dan formal dehida dan terakhir dengan larutan fiksasi.
Jurnal Perikanan Tropis
Volume 7, Nomor 2, 2020 http://jurnal.utu.ac.id/jptropis ISSN: 2355-5564, E-ISSN: 2355-5572

## III. Hasil dan Pembahasan

## Karakterisasi Enzim Katepsin
Enzim merupakan biokatalisator yang bersifat spesifik. Aktivitas enzim sangat dipengaruhi  oleh  kondisi  lingkungan.  Tujuan  karakterisasi  enzim  katepsin  ini adalah untuk mengetahui kondisi optimum dari kerja enzim tersebut.

## Pengaruh suhu terhadap enzim katepsin
Suhu sangat mempengaruhi aktvitas enzim, karena enzim tersusun dari protein. Pengaruh  suhu  terhadap  enzim  katepsin  mengakibatkan  aktivitasnya  mengalami fluktuasi.  Peningkatan  suhu  akan  meningkatkan  aktivitas  enzim  katepsin  sampai dengan  suhu  optimum,  peningkatan  suhu  lebih  tinggi  mengakibatkan  aktivitas enzim katepsin menurun. Aktivitas optimum enzim katepsin pda suhu 37 o C dengan nilai sebesar 0,439 U/ml. Pada perlakuan suhu menghasillkan nilai optimum pada suhu  30 o C,  dimana  aktivitasnya  mencapai  0,386  U/ml.  Pengaruh  suhu  terhadap aktivitas enzim katepsin ikan lele disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2 Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim katepsin
Aktivitas optimum pada setiap enzim termasuk katepsin dicapai pada kisaran suhu tertentu. Hal ini terjadi karena suhu menyediakan pasokan energi termal untuk memecah beberapa atraksi intramolekul grup polar (ikatan hidrogen, atraksi dipol- dipol, interaksi inonik) serta kekuatan hidropobik diantara grup non polar di dalam struktur enzim. Aktivitas enzim ketepsin berkurang pada suhu rendah dan optimum pada pH yang sesuai (Hultman dan Rustad 2007).
Suhu  yang  lebih    tinggi  akan  membuat  molekul  lebih  sering  bertabrakan. Konsep ini berlaku juga untuk tumbukan antar molekul substrat dengan enzim. Hal ini  disebabkan  suhu  yang  tinggi  akan  mengkatalisis  reaksi  enzimatis.  Kenaikan suhu melebihi titik tertentu akan menyebabkan gangguan terhadap struktur tersier enzim.  Perubahan  struktur  tersier  pada  sisi  aktif  akan  menghambat  aktivitas katalitik enzim (Stoker 2010).
0,386 0,439 0.313 0,416 0.147 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0 20 40 60 80 Suhu Aktiv itas enz im
Jurnal Perikanan Tropis
Volume 7, Nomor 2, 2020 http://jurnal.utu.ac.id/jptropis ISSN: 2355-5564, E-ISSN: 2355-5572

## Pengaruh konsentrasi substrat terhadap enzim katepsin
Substrat merupakan faktor yang sangat berpengaruh terhadap hasil atau jumlah produk  akhir  yang  dihasilkan  oleh  enzim.  Enzim  membutuhkan  substrat    yang memberikan  sisi  aktif  enzim  sehingga  membentuk  produk.  Penambahan konsentrasi  substrat  pada  reaksi  yang  dikatalis  oleh  enzim  awalnya  akan meningkatkan  laju  reaksi.  Konsentrasi  substrat  dinaikkan  untuk  lebih  lanjut sehingga  laju  reaksi  akan  mencapai  titik  jenuh  dan  tidak  bertambah  lagi. Konsentrasi  substrat  dan  enzim  sudah  seimbang,  laju  reaksi  akan  relatif  lebih konstan.  Gambar  3  menunjukan  pengaruh  substrat  terhadap  aktivitas  enzim katepsin ikan bawal. Aktivitas optimum enzim katepsin pada substrat 2% dengan nilai  0,439 U/ml. Pada perlakuan substrat  1,5% dan 2,5%,  aktivitas yang  terbaik terdapat pada pemberian substrat 1,5% dimana aktivitasnya mencapai 0,426 U/ml.
Hemoglobin  adalah  kompleks  protein-pigmen  yang  mengandung  zat  besi. Kompleks  tersebut  berwarna  merah  dan  terdapat  didalam  eritrosit.  Molekul hemoglobin memiliki empat gugus haeme yang mengandung besi fero dan empat rantai globin (Brooker 2001). Reaksi dengan kosentrasi enzim yang lebih sedikit dibandingkan  substrat,  kemudian  ditambahkan  enzim  akan  meningkatkan  laju reaksi. Laju peningkatan reaksi akan linier, jika kosentrasi substrat dan enzim sudah seimbang,  laju  reaksi  yang  terjadi  akan  relatif  stabil.  Penambahan  kosentrasi substrat pada suatu reaksi katalis oleh enzim pada awalnya akan meningkatkan laju reaksi.  Kosentrasi  substrat  dinaikkan lebih lanjut, laju reaksi  akan mencapai  titik jenuh dan tidak ditambahkan lagi (Dynnar 2011).

## Gambar 3 Pengaruh substrat terhadap aktivitas enzim katepsin

## Uji Konsentrasi Protein
Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total dengan secara  kolorimetri  dalam  suatu  larutan.  Pengujian  Bradford  melibatkan  pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan
0.426 0,439 0.408 0.405 0.41 0.415 0.42 0.425 0.43 0.435 0.44 0.445 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Aktiv ita s e n zim Substrat
Jurnal Perikanan Tropis
Volume 7, Nomor 2, 2020 http://jurnal.utu.ac.id/jptropis ISSN: 2355-5564, E-ISSN: 2355-5572
yang bersifat asam sehingga memberikan warna (kebiruan). Warna yang dihasilkan dari  penambahan  larutan  tersebut  sehingga  secara  kolorimetri  dapat  diukur absorbansinya  dengan  menggunakan  spektrofotometri  (Lambert‐Beer)  pada panjang gelombang 465‐595 nm (cahaya tampak).
Dari  hasil  pembacaan  spektrofotometri  larutan  standar  BSA  maka  diperoleh kurva standar yang ditunjukan pada gambar 4.

## Gambar 4 Pembacaan spektrofotometri larutan standar BSA
Dari nilai absorbansi standar BSA, maka diperoleh kurva standar BSA dengan persamaan regresi y = 0,959x + 0,109. Kosentrasi protein yang digunakan dari 0,01, 0,03, 0,05, 0,07, 0,09 dan 0,1 dengan nilai absorbansi sampel secara berturut-turut 0,122, 0,138, 0,153, 0,176, 0,197, 0,207 dari ekstrak enzim yang diperoleh dari ikan lele,  lalu  dimasukkan  ke  dalam  persamaan  regresi,  maka  kadar  protein  akan diketahui.

## Presipitasi
Ekstrak kasar yang diperoleh selanjutnya dipresipitasi menggunakan amonium sulfat.  Metode  yang  digunakan  untuk  presipitasi  protein  berdasarkan  hipotesis pengendapan yang disebabkan oleh interaksi diantara protein dan agen presipitasi. Presipitasi dilakukan menggunakan garam amonium sulfat dengan kejenuhan 50- 80%.  Grafik  kadar  protein  enzim  hasil  presipitasi  dengan  amonium  sulfat  dapat dilihat pada Gambar 5. Presipitasi protein memiliki karakteristik pada konsentrasi reagen yang berbeda pada amonium sulfat dan persen presipitasi berselang antara 20%-100% (Bissawanger 2004).
y = 0.9592x + 0.1095 R² = 0.9942 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Kosentrasi peotein (BSA) Ab so rb an si
Jurnal Perikanan Tropis
Volume 7, Nomor 2, 2020 http://jurnal.utu.ac.id/jptropis ISSN: 2355-5564, E-ISSN: 2355-5572
Gambar 5. Grafik presitipasi enzim katepsin Peningkatan aktivitas pada beberapa tingkat konsentrasi ammonium sulfat dan mencapai  aktivitas  optimum  pada  dengan  konsentrasi  ammonium  sulfat  70% dengan  aktivitas  0,65  U/ml.  Kosentrasi  80%  aktivitas  menurun  yang  di  duga pengendapan protein selain dipengaruhi oleh ion garam dari atau konsentrasi dari garam juga dipengaruhi oleh pH dan suhu tertentu, pH yang digunakan serta suhu yang  digunakan  nantinya  akan  sejalan  dengan  peningkatan  konsentrasi  garam ( salting in ).
Presipitasi protein dapat dilakukan dengan penambahan garam. Ekstrak kasar enzim katepsin ditambahkan garam untuk memperoleh enzim semi murni. Garam- garam  pengotor  yang  masih  tersisa  pada  hasil  presipitasi  dihilangkan  dengan melakukan dialisis.
IV. Kesimpulan

## Kesimpulan
Dari  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan  bahwa  kondisi  optimum  enzim katepsin dari ikan bawal adalah pada suhu 30 0 C dan subtrat 1,5%. Nilai absorbansi standar BSA diperoleh kurva standar BSA dengan persamaan regresi y = 0,959x + 0,109. Aktivitas pada beberapa tingkat konsentrasi ammonium sulfat dan mencapai aktivitas optimum pada dengan konsentrasi ammonium sulfat 70%.

## Daftar Pustaka
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities  of  protein  utilizing  the  principle  of  protein  dye  binding. Anal Biochem 72: 234-254.
Dinu  D,  Dumitru  IF,  Nechifor  MT.  2002.  Isolation  and  characterization  of  two cathepsin from muscle of Carratius auratus gibellio. Roum. Biotechnol. Lett. Vol 7. (3): 753-758.
0.15 0,50 0.65 0,20 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0% 20% 40% 60% 80% 100% Aktiv itas
Konsentrasi Presipitas (%)
Jurnal Perikanan Tropis
Volume 7, Nomor 2, 2020 http://jurnal.utu.ac.id/jptropis ISSN: 2355-5564, E-ISSN: 2355-5572
Dynnar N. 2011. Pemurnian Dan Karakterisasi Enzim Katepsindari Ikan Bandeng
( Chanos Chanos Forskall). [Skripsi] Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan. IPB
Harrd NF. 1994. Protein Hydrolysis in a Seafood . Glasgow: Blackie Academic and Professional.
Hafiludin. 2009. Pemurnian dan karakterisasi enzim protease katepsin dari ikan mas ( Cyprinus  carpio ).  Jurusan  Ilmu  Kelautan  Fakultas  Pertanian  Universitas Trunojoyo Madura. Kamal Bangkalan.
Hultman L, Rustad T. 2004. Iced stroge of atlantic salmon ( Salmo salar )- effects on  endogenous  enzymes  and  their  impact  on  muscle  proteins  and  texture. Food Chemistry . 87: 31-41.
Ilyas S. 1983. Teknologi Refrigrasi Hasil Perikanan Jilid  1 . Teknik Pendinginan Ikan. :CV. Paripurna.
Jiang ST, Lee JJ, Chen HC. 1994. Purification and characterizationof cathepsins B from  ordinary  muscle  of  mackerel  ( Scomber  australasicus ). Journal  of Agricultural and Food Chemistry . 42. 1073–1079.
Kirschke H. 1998. Cathepsin L. In :Barrt, A.J. Rawlings, N.D. Woessner, FF. (Eds), Handbook of Proteolytic Enzymes. Acedemic Press, California, ppp. 617-621.
[KKP]  Kementerian  Kelautan  dan  Perikanan.  2011.  Statistik  perikanan  tangkap Indonesia 2010. Jakarta: Direktorat Jenderal Perikanan Tangkap.
Li S, Shou X, Zhang N, Liu H, Ma C. 2008. Purification and characterizzation of chatepsin  L2  from  dorsal  muscle  of  silver  carp  ( Hypophthalmichthys molitrix ). Journal Food Chemestry.
Nurhayati T, Salamah E, Ifran M, Nugraha R. 2010. Aktivitas enim katepsin dan kolagenase pada kulit ikan bandeng ( Chanos chanos, Forskal) selama priode kemunduran mutu. Jurnal Sumberdaya Perairan. ISSN 1978-1652.
Shahidi  F,  Botta  JR.  1994.  Seafood  :  Chemistry,  Processing  Technology  and Quality. Glasgow: Blackie Academic and Professional.
Stein  LH,  Hirmas  E,  Mevik  MB,  Karlsen  R,  Nortved  R,  Bencze  AM,  Sunde  J, Kiessling A. 2005. The effects of stress and storage temperature on the colour and texture of pre-rigor filleted farmed cod ( Gadus morhua L.). Aquaculture Research 36:1197-1206.
Stoker  HS.  2010. General,  Organic,  and  Biological  Chemistry .  USA:  Cengage Learning.
Rehbein H. 1979. Development of an enzymatic method to differentiate fresh and sea-frozen and thawed fish fillets. Z Lebensm Unters Forsch 169:263-265.
Visessanguan  X,  Benjakul  S,  An  H.  2003.  Purification  and  characterizzation  of chatepsin  L  in  arrowtooth  flounder  ( Atherethes  stomias )  muscle. Comparative Biochemistry and Physiology Part B. 134: 477-487.