## Optimalisasi Kondisi PCR Untuk Amplifikasi Sekuen Gen HBB

## Magfirahtul Jannah
Program Studi Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Negeri Gorontalo, Kampus 4 UNG Jl. Prof. Ing. B.J. Habibie, Bone Bolango 96554, Indonesia
E-mail: magfirahtuljannah@ung.ac.id Article Info Abstract Article History Received: 2023-03-08 Revised: 2023-03-28
Published: 2023-04-02
Keywords: Amplification, HBB Gene, Hemoglobin, Optimization, PCR
The HBB gene is a gene that plays a role in the synthesis of hemoglobin, especially the β-globin protein. Various methods of molecular analysis to detect abnormalities or variants in the hemoglobin coding gene require high-quality DNA amplification products.  This  study  aims  to  determine  the  most  optimal  PCR  conditions  for amplifying HBB gene sequences from blood samples. We performed qualitative and quantitative tests on isolated DNA samples, then amplified the HBB gene sequences using  2  pairs  of  primers  with  6  variations  of  the  master  mix  composition  and annealing temperature. The results showed that the DNA samples were successfully isolated  with  a  purity  ratio  of  1.925  and  a  concentration  of  48.9  µg/ml.  The amplification  product  using  the  HBE01  primer  resulted  in  very  thin  and  non- specific  bands,  while  the  HBE02  primer  succeeded  to  amplify  the  HBB  gene sequences specifically and looked quite thick. HBB gene sequence amplification is better  using  HBE02  primer  with  master  mix  composition  and  annealing temperature according to Mix 6. Artikel Info Abstrak Sejarah Artikel Diterima: 2023-03-08 Direvisi: 2023-03-28
Dipublikasi: 2023-04-02
Kata kunci: Amplifikasi, Gen HBB, Hemoglobin, Optimalisasi, PCR
Gen  HBB  merupakan  salah  satu  gen  yang  berperan  dalam  sintesis  hemoglobin, khususnya protein β-globin. Berbagai metode analisis molekuler untuk mendeteksi kelainan  atau  varian  pada  gen  penyandi  hemoglobin  membutuhkan  produk amplifikasi  DNA  yang  berkualitas  tinggi.  Penelitian  ini  bertujuan  menentukan kondisi  PCR  paling  optimal  untuk  mengamplifikasi  sekuen  gen  HBB  dari  sampel darah.  Kami  melakukan  uji  kualitatif  dan  kuantitatif  pada  DNA  sampel  yang  telah diisolasi,  lalu  mengamplifikasi  sekuen  gen  HBB  menggunakan  2  pasang  primer dengan  6  variasi  komposisi  master  mix  dan  suhu  annealing.  Hasil  penelitian menunjukkan bahwa DNA sampel berhasil diisolasi dengan rasio kemurnian 1,925 dan  konsentrasi  48,9  µg/ml.  Produk  amplifikasi  menggunakan  primer  HBE01 menghasilkan  pita  yang  sangat  tipis  dan  tidak  spesifik,  sedangkan  primer  HBE02 berhasil mengamplifikasi sekuen gen HBB dengan spesifik dan tampak cukup tebal. Amplifikasi  sekuen  gen  HBB  lebih  baik  menggunakan  primer  HBE02  dengan komposisi master mix dan suhu annealing sesuai Mix 6.

## PENDAHULUAN
Gen  HBB  merupakan  salah  satu  gen dalam cluster gen  β-globin,  yaitu  gen-gen yang  terutama  berperan  pada  sintesis rantai  globin  penyusun  hemoglobin  pada fetus  hingga  dewasa  (Jannah,  2014;  Nawaz et  al.,  2021).  Sebagai  molekul  protein  yang berperan  penting  dalam  pengangkutan oksigen,  kekurangan  atau  bahkan  tidak disintesisnya  salah  satu  rantai  globin berdampak pada kegagalan fungsi
hemoglobin. Dalam 2 dekade terakhir telah banyak  dilaporkan  kasus  kelainan  genetik terkait  hemoglobin  di  seluruh  dunia termasuk Indonesia, diantaranya thalassemia  dan  hemoglobinopati  (varian hemoglobin)  (Luo  et  al.,  2022;  Modell  & Darlison,  2008;  Tangvarasittichai,  2011; Weatherall  &  Clegg,  2001;  Wulandari, 2016).
Abnormalitas  gen  penyandi  protein globin  dapat  dideteksi  secara  molekuler
dengan  teknik Polymerase  Chain  Reaction (PCR) (Al-Musawi et al., 2022; Munkongdee et  al.,  2020;  Nawaz  et  al.,  2021).  PCR merupakan  teknik  yang  ampuh  untuk memperbanyak  salinan  fragmen  DNA spesifik  dalam  jumlah  tak  terbatas  secara cepat, meskipun sumber DNA sangat sedikit dan  kualitasnya  relatif  buruk  (Amanda  et al.,  2019;  Rahman  et  al.,  2013;  Solanki, 2012).  Proses  penggandaan  DNA  dengan teknik  PCR  terjadi  melalui  puluhan  siklus berulang  yang  meliputi  3  tahapan,  yaitu denaturasi, annealing dan  ekstensi.  Proses ini  membutuhkan  beberapa  komponen yaitu  cetakan  DNA,  sepasang  primer oligonukleotida  spesifik,  enzim  DNA polimerase  yang  termostabil,  nukleotida (dNTP),  buffer  PCR  dan  ion  Mg 2+ (Solanki, 2012; Yuenleni, 2019).
Metode  PCR  sangat  sensitif  dan kualitas  hasilnya  sangat  bergantung  pada kuantitas  komponen  yang  digunakan  serta ketepatan  suhu  dan  durasi  waktu  pada setiap  tahapan  siklus  PCR.  Komposisi master  mix dan  kondisi  PCR  yang  optimal dapat  berbeda  pada  setiap  sampel  DNA yang  akan  diuji,  terutama  jika  spesiesnya berbeda  (Amanda  et  al.,  2019;  Deniariasih et  al.,  2013;  Kurniawan  et  al.,  2022; Obradovic et al., 2013).
Metode analisis DNA secara molekuler untuk  berbagai  keperluan,  seperti  deteksi dan  diagnosis  kelainan  atau  penyakit  (Al- Musawi et al., 2022; Deniariasih et al., 2013; Amanda  et  al.,  2019),  sekuensing  DNA (Sasmito  et al.,  2014),  identifikasi  sidik jari DNA,  uji  paternitas  (Rahman  et  al.,  2013), maupun  identifikasi  spesies  (Pertiwi  et  al., 2015) membutuhkan hasil amplifikasi DNA
yang  berkualitas,  sehingga  penting  bagi peneliti  untuk  melakukan  optimalisasi kondisi  PCR  sebelum  memulai  penelitian. Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk menentukan  kondisi  PCR  paling  optimal untuk  mengamplifikasi  sekuen  gen  HBB, khususnya  pada  sebagian  daerah  ekson  1 dan ekson 2, dari sampel darah.

## METODE
Penelitian ini merupakan jenis penelitian pre-eksperimental dengan memanipulasi  komposisi master  mix dan suhu annealing (T a )  untuk  memperoleh produk  amplifikasi  terbaik.  Penelitian dilaksanakan selama 3 bulan di Laboratorium  Fasilitas  Penelitian  Bersama (FALITMA)  Fakultas  Biologi  Universitas Gadjah  Mada.  Sumber  DNA  diperoleh  dari sampel  darah  beku  ( frozen  blood )  peserta kegiatan  skrining  Thalassemia  yang  telah menandatangani informed  consent untuk berpartisipasi dalam penelitian.

## Isolasi DNA
DNA  genomik  diisolasi  dari  sampel darah  sesuai  dengan  petunjuk  manufaktur menggunakan Genomic  DNA  Mini  Kit ( Blood/Cultured Cell ) frozen blood (Geneaid, Cat.  No.  GB100).  Kemurnian  DNA  hasil isolasi  dicek  dengan  elektroforesis  (Mini Run GE-100) menggunakan gel agarose 1% dalam  buffer  TBE  0,5X  yang  mengandung SYBR safe DNA gel stain (Invitrogen, Cat. No. S33102).  Elektroforesis  dijalankan pada 100 volt selama 45 menit, lalu divisualisasi pada transiluminator
UV dan didokumentasikan.  DNA  juga  diukur konsentrasinya
menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

## Amplifikasi gen HBB
DNA  diamplifikasi  menggunakan  2 pasang  primer  spesifik  pada  sekuen  gen HBB  (Tabel  1).  Primer  HBE01  mengacu pada  Moiz  et  al.  (2012),  sedangkan  primer HBE02  didesain  menggunakan tools pada situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer -blast/ berdasarkan  referensi  sekuen  gen HBB dari spesies Homo sapiens (NC_000011.10)  di  GenBank.  Primer  ini mengamplifikasi  sebagian  ekson  1  hingga ekson  2  gen  HBB,  menghasilkan  amplikon berukuran  335  bp  (Gambar  1).  Pemilihan region  ini  berdasarkan  keperluan  untuk mendeteksi  keberadaan  mutasi  HbE,  yang merupakan salah satu varian hemoglobin. Tabel  1.  Sekuen  Primer  untuk  Amplifikasi

## Sekuen Gen HBB
Pasangan Primer Sekuen Posisi primer HBE01  F 5ʹ CCTGAGGAGAAGTCTGCCGTT 3ʹ R 5ʹ CATCACTAAAGGCACGCACT 3ʹ 5227006 – 5226986 5226688 – 5226669 HBE02  F 5ʹ AGAAGTCTGCCGTTACTGCC 3ʹ R 5ʹ AGGCCATCACTAAAGGCACC 3ʹ 5226999 – 5226980 5226684 – 5226665
Gambar 1.   Representasi  skematik  gen  HBB yang  diamplifikasi  dengan  desain baru primer forward (panah merah) dan reverse (panah hijau)
Master  mix PCR  mengandung  2X KAPA2G Fast Ready Mix (KAPA Biosystems, Cat.  No.  KK5102),  10  µM  masing-masing primer,  ~250  ng  DNA  cetakan,  MgCl 2 dan ddH 2 O  hingga  25  µL  dengan  beberapa variasi  komposisi. Mastercycler personal (Eppendorf)  dijalankan  sebanyak  35  siklus dengan pengaturan sebagai berikut:
predenaturasi  95°C  selama  3  menit, denaturasi 95°C selama 15 detik, annealing pada  beberapa  variasi  suhu  sesuai  Tm primer  selama  15  detik,  ekstensi  72°C selama  30  detik,  dan  ekstensi  akhir  72°C selama  5  menit.  Ragam  komposisi master mix dan suhu annealing (T a ) disajikan pada Tabel 2. Setiap amplikon dan marker 100 bp DNA ladder dielektroforesis  menggunakan gel agarosa 1% yang mengandung SYBR safe DNA gel stain (Invitrogen, Cat. No. S33102) dalam  buffer  0,5X  TBE  pada  50V  selama  1 jam, kemudian divisualisasi pada transiluminator UV dan didokumentasikan Tabel 2.  Komposisi Master  Mix dan  Suhu Annealing untuk  Amplifikasi  Sekuen Gen HBB

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Berbagai  metode  analisis  molekuler membutuhkan  sejumlah  sampel  DNA dengan  kualitas  dan  kuantitas  yang  baik. DNA  diekstraksi  dari  sel  atau  jaringan sampel melalui beberapa tahapan prosedur isolasi  DNA.  Dalam  proses  isolasi,  DNA dipisahkan  dari  komponen  sel  lain,  seperti debris  sel,  lemak,  polisakarida,  protein  dan RNA.  Tidak  jarang  hasil  isolasi  DNA  masih mengandung  protein,    RNA,  ataupun kontaminan lain. Untuk itu perlu dilakukan uji  kualitatif  dan  kuantitatif  DNA  sebelum memulai suatu analisis molekuler (Turrahmi et al., 2021). Uji kualitatif kemurnian DNA dilakukan  menggunakan  elektroforesis  gel agarosa  (Adriany  et  al.,  2020;  Lucena-
Aguilar  et  al.,  2016).  Molekul  DNA  dan komponen  lain  yang  ada  di  dalamnya  akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Keberadaan protein atau RNA di dalam DNA sampel  akan  tampak  berupa  smear  di bagian  atas  atau  bawah  pita  DNA.  Hasil elektroforesis  DNA  genomik  dari  sampel darah disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2.  Visualisasi hasil elektroforesis DNA genomik  dari sampel  darah: M=marker; S=DNA sampel
Pada  Gambar  2  dapat  dilihat  bahwa pita  DNA  sampel  (S)  tampak  jelas,  tanpa adanya  smear  di  bagian  atas  atau  bawah fragmen  DNA.  Ini  mengindikasikan  bahwa DNA  hasil  isolasi  memiliki  kemurnian  yang baik  tanpa  kontaminan.  Hal  ini  didukung oleh  hasil  uji  kuantitatif  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (Tabel 3).
Berdasarkan  Tabel  3  dapat  dilihat bahwa  DNA  yang  diperoleh  memiliki kemurnian  yang  baik  (rasio  A 260/280 = 1,925), tanpa kontaminan protein. Kemurnian  DNA  dikatakan  baik  jika  rasio absorbansinya  pada  panjang  gelombang 260  dan  280  nm  berkisar  antara  1,8-2,0 (Adriany  et  al.,  2020;  Mollah  et  al.,  2022; Siswanto  et  al.,  2016;  Utaminingsih  et  al., 2022).  Konsentrasi  DNA  yang  diperoleh (48,9  µg/ml)  terbilang  mencukupi  untuk proses analisis molekuler seperti PCR.
Tabel 3.  Hasil  Uji  Kuantitatif  DNA  dengan Spektrofotometer UV-Vis
Kode Sampel Absorb ansi Rasio A 260/280 Konsentrasi (µg/ml) Protein (µg/ml) S 0,000 1,925 48,9 0,0 Sebelum melakukan proses amplifikasi  DNA  dengan  teknik  PCR,  perlu dilakukan  optimalisasi  komposisi master mix dan  kondisi  siklus  termal  PCR.  Pada penelitian  ini,  komponen master  mix yang dioptimalisasi meliputi jenis dan
konsentrasi  primer,  DNA  cetakan,  dan MgCl 2 , sedangkan kondisi siklus termal PCR dikhususkan  pada  optimalisasi  suhu annealing (T a )  (Tabel  2).  Komponen- komponen  tersebut  sangat  mempengaruhi keberhasilan dan kualitas produk amplifikasi (Pertiwi  et  al.,  2015;  Uslan  & Pharmawati,  2015). Hasil  elektroforesis amplikon  dengan  variasi  komposisi master mix dan  suhu annealing (T a )  kedua  pasang primer disajikan pada Gambar 3.
Gambar 3.   Visualisasi  hasil  amplifikasi  sekuen gen  HBB  dengan  variasi  komposisi master  mix dan  suhu annealing : M=marker; 1-6= Mix 1-6
Berdasarkan  Gambar  3  dapat  dilihat bahwa  amplifikasi  sekuen  gen  HBB dengan primer  HBE01  pada  berbagai  variasi komposisi master  mix dan  suhu annealing ( Mix 1-5)  memberikan  hasil  beberapa  pita yang tidak spesifik dan sangat tipis. Padahal
menurut  Moiz  et  al.  (2012),  penggunaan primer  ini  akan  menghasilkan  amplifikasi sekuen gen HBB spesifik berukuran 334 bp. Sebaliknya,  produk  amplifikasi  dengan komposisi Mix 6 dan  suhu annealing 52°C menggunakan primer HBE02 yang didesain sendiri  menghasilkan  produk  yang  sangat spesifik dan jelas, berukuran 335 bp.
Desain  primer  yang  baik  sangat penting  untuk  keberhasilan  reaksi  PCR (Sasmito  et  al.,  2014).  Kegagalan  primer HBE01  dalam  mengamplifikasi  sekuen spesifik gen HBB diduga disebabkan karena beberapa  sekuen  nukleotida  pada  primer tidak  sesuai  dengan  referensi  sekuen  gen HBB dari spesies Homo sapiens (NC_000011.10) di GenBank.
Desain  primer  yang  baik  tetap  harus ditunjang  dengan  konsentrasi  primer  dan DNA  cetakan  yang  memadai,  serta  suhu annealing yang  tepat.  Konsentrasi  primer yang  tinggi  dapat  menghasilkan  pita  yang tebal,  namun  kadang  disertai  dengan  pita yang  tidak  spesifik  (Yuenleni,  2019). Konsentrasi  DNA  cetakan  yang  berlebih dapat  menyebabkan  terbentuknya  produk yang  tidak  spesifik,  karena  dapat  terjadi penempelan  antara  kedua  untai  DNA cetakan  ketika annealing .  Suhu annealing yang  baik  umumnya  5°C  di  bawah melting temperature (T m )  primer.  Suhu annealing yang  terlalu  tinggi  dapat  menyebabkan kegagalan  penempelan  primer  pada  DNA cetakan,  sedangkan  suhu annealing yang terlalu  rendah  menyebabkan  primer menempel  pada  lokasi  yang  tidak  spesifik pada  DNA  cetakan  (Amanda  et  al.,  2019; Kurniawan et al., 2022; Nafisa et al., 2022),
Berdasarkan tujuan dan hasil penelitian  dapat  disimpulkan  bahwa amplifikasi  sekuen  gen  HBB  menggunakan primer  HBE02  memberikan  hasil  paling optimal,  jelas  dan  spesifik,  dengan komposisi master  mix sesuai Mix 6:  12,5  µl KAPA 2G, masing-masing 1 µl primer 10 µM, 5  µl  DNA  sampel  (~250  ng)  dan  ddH 2 O hingga 25 µl, serta suhu annealing PCR pada 52°C.  Amplifikasi  sekuen  gen  HBB  dengan primer  HBE01  tidak  disarankan  karena produknya  yang  tidak  spesifik  dan  sangat tipis .

## DAFTAR PUSTAKA
Adriany, D. T., Bakri, A. A., & Bungalim, M. I. (2020).  Perbandingan  Metode  Isolasi DNA  Terhadap  Nilai  Kemurnian  DNA untuk  Pengujian  White  Spot  Syndrom Virus  (WSSV)  pada  Lobster  Bambu (Panulirus versicolor).
Prosiding Simposium  Nasional  VII  Kelautan  Dan Perikanan 2020 , 239–246.
https://www.researchgate.net/public ation/343151485.
Amanda,  K.,  Sari,  R.,  &  Apridamayanti,  P. (2019).  Optimasi  Suhu  Annealing Proses  PCR  Amplifikasi  Gen  shv Bakteri  Escherichia  coli  Pasien  Ulkus Diabetik. Jurnal  Farmasi  Kalbar , 4 (1),
39969.
https://jurnal.untan.ac.id/index.php/j mfarmasi/article/download/39969/7 5676585518
Deniariasih, N. W., Ratnayani, K., & Yowani, S. C. (2013). Optimasi PCR
(Polymerase Chain Reaction) Fragmen 724  pb  Gen  katG  Multi  Drug Resistance Tuberculosis untuk Meningkatkan  Produk  Amplifikasi. Jurnal  Farmasi  Udayana , 2 (3),  110– 115.
https://ojs.unud.ac.id/index.php/jfu/ article/view/7386/5640
Jannah,  M.  (2014). Profil  Hematologis  dan Deteksi  Molekular  Pembawa  Sifat Hemoglobin  E  di  Yogyakarta [ETD, Universitas Gadjah Mada]. https://repository.ugm.ac.id/134302/ Kurniawan,  A.,  Anjani,  T.  P.,  Lestari,  E., Merin,  Ichsan,  M.,  Apriyani,  R.,  Safitri, A.  M.,  Almagribi,  I.  P.,  Syarif,  A.  F.,  & Kurniawan,  A.  (2022).  Optimasi  Suhu Annealing  untuk  Amplifikasi  Gen  COI Ikan  Ekstrimofil  Menggunakan  Real- Time PCR. Journal of Aquatropica Asia ,
7 (2), 57–62.
https://doi.org/10.33019/joaa.v7i2.3
401
Lucena-Aguilar,  G.,  Sánchez-López,  A.  M., Barberán-Aceituno, C., Carrillo-Ávila, J. A.,  López-Guerrero,  J.  A.,  &  Aguilar-
Quesada,  R.  (2016).  DNA  Source Selection for
Downstream
Applications  Based  on  DNA  Quality Indicators  Analysis. Biopreservation and  Biobanking , 14 (4),  264–270. https://doi.org/10.1089/bio.2015.00 64
Luo,  H.,  Huang,  T.,  Lu,  Q.,  Zhang,  L.,  Xu,  Y., Yang,  Y.,  Guo,  Z.,  Yuan,  H.,  Shen,  Y., Huang,  S.,  Yang,  B.,  Zou,  Y.,  &  Liu,  Y. (2022). Molecular prevalence of HBB- associated  hemoglobinopathy  among reproductive-age  adults  and  the prenatal diagnosis in Jiangxi Province, southern  central  China. Frontiers  in Genetics ,
13 , 992073. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.9
92073
Modell,  B.,  &  Darlison,  M.  (2008).  Global epidemiology of haemoglobin disorders and derived service indicators. Bulletin of the World Health Organization , 2008 (6), 480–487. https://doi.org/10.2471/BLT.06.0366 73
Moiz, B., Hashmi, M. R., Nasir, A., Rashid, A.,
&  Moatter,  T.  (2012).  Hemoglobin  E syndromes  in  Pakistani  population. BMC  Blood  Disorders , 12 ,  3–9.
https://doi.org/10.1186/1471-2326- 12-3 Mollah, A., Ashan, Muh. A., & Khatimah, A. H. (2022).  Uji  Kualitas  dan  Kuantitas DNA Porang (Amorphophallus
Muelleri  Blume)  pada  Beberapa Kawasan  di  Sulawesi  Selatan. Jurnal Agritechno , 15 (01), 1–7. https://doi.org/10.20956/at.v15i1.68 8
Munkongdee,  T.,  Chen,  P.,  Winichagoon,  P., Fucharoen,  S.,  &  Paiboonsukwong,  K.
(2020). Update in Laboratory Diagnosis  of  Thalassemia. Frontiers  in Molecular
Biosciences , 7 , 74. https://doi.org/10.3389/fmolb.2020. 00074 Nafisa,  A.  R.,  Sebastian,  A.,  Wijayanti,  P., Patigu, R. F., & Purwestri, Y. A. (2022). Optimasi  Primer  yang  Menargetkan Gen  OsAP2,  OsERF3  dan  OsEREBP2 Menggunakan  qPCR. Bioeksperimen ,
8 (1), 8–19.
https://doi.org/https://doi.org/10.23 917/bioeksperimen.v8i1.15800
Nawaz, F., Yousafzai, A., Luqman, M., Ahmed, N.,  Arbab,  M.,  Tabassum,  J.,  Ahmad,  J., &  Daud,  S.  (2021).  Mutational  Studies of Gene HBB in β-Thalassemia Patients from  Balochistan,  Pakistan. Current Trends  in  OMICS , 1 (2),  80–94. https://doi.org/https://doi.org/10.32 350/cto.12.05
Obradovic,  J.,  Jurisic,  V.,  Tosic,  N., Mrdjanovic, J., Perin, B., Pavlovic, S., & Djordjevic,  N.  (2013).  Optimization  of PCR  Conditions  for  Amplification  of GC-rich  EGFR  Promoter  Sequence. Journal of Clinical Laboratory Analysis ,
27 (6), 487–493.
https://doi.org/10.1002/jcla.21632
Pertiwi,  N.  P.  D.,  Mahardika,  I.  G.  N.  K.,  &
Watiniasih,  N.  L.  (2015).  Optimasi Amplifikasi DNA Menggunakan
Metode  PCR  (Polymerase  Chain Reaction)  pada  Ikan  Karang  Anggota Famili  Pseudochromidae  (Dottyback)
untuk  Identifikasi  Spesies  Secara Molekular. Jurnal  Biologi , 19 (2),  1–5. https://doi.org/http://dx.doi.org/10. 13140/RG.2.2.27883.34083
Rahman,  M.  T.,  Uddin,  M.  S.,  Sultana,  R., Moue,  A.,  &  Setu,  M.  (2013). Polymerase  Chain  Reaction  (PCR):  A Short  Review. AKMMC  J , 4 (1),  30–36. https://doi.org/https://doi.org/10.33 29/akmmcj.v4i1.13682 Sasmito,  D.  E.  K.,  Kurniawan,  R.,  & Muhimmah,  I.  (2014).  Karakteristik Primer  pada  Polymerase  Chain Reaction  (PCR)  untuk  Sekuensing DNA:  Mini  Review. Prosiding  Seminar Nasional  Informatika  Medis  (SNIMed) V , 93–102. https://journal.uii.ac.id/snimed/articl e/view/6329
Siswanto,  J.  E.,  Berlian,  T.,  Putricahya,  E., Panggalo,  L.  v,  &  Yuniani,  L.  (2016). Isolasi  DNA  pada  Sampel  Darah  Tepi dan  Swab  Buccal  pada Bayi  Penderita ROP: Perbandingan
Hasil Uji Konsentrasi  dan  Indeks  Kemurnian. Sari Pediatri , 18 (4), 270–277. https://doi.org/http://dx.doi.org/10.
14238/sp18.4.2016.270-7 Solanki,  G.  (2012).  Polymerase  Chain Reaction. International  Journal  of Pharmacological Research (IJPR) , 2 (3),
98–102. www.ssjournals.com Tangvarasittichai,  S.  (2011).  Thalassemia Syndrome.  In  K.  Ikehara  (Ed.), Advances  in  the  Study  of  Genetic Disorders (pp.  101–148).  InTech. http://www.intechopen.com/books/a dvances-in-the-study-of-genetic- disorders/thalassemia-syndrome Turrahmi, M., Nurhidayani,
N.,
Hasyimuddin,  H.,  &  Pabendon,  M.  B.
(2021).  Uji  kualitas  dan  kuantitas tanaman  jewawut  (Setaria  italic)  di Balai  Penelitian  Tanaman  Serealia Kabupaten  Maros. Filogeni:  Jurnal Mahasiswa  Biologi , 1 (2),  57–62.
https://doi.org/10.24252/filogeni.v1i 2.23803 Uslan,  U.,  &  Pharmawati,  M.  (2015). Optimasi Konsentrasi DNA dan MgCl2 pada  Reaksi  Polymerase  Chain Reaction-Random Amplified Polymorphic  DNA  untuk  Analisis Keragaman  Genetik  Tanaman  Faloak (Sterculia  quadrifida  R.Br). JURNAL BIOS
LOGOS , 5 (1), 26–34. https://doi.org/10.35799/jbl.5.1.201 5.9316
Utaminingsih, S., Utami, S. D., & Sophian, A.
(2022).  Isolasi  DNA  pada  Produk Otak-Otak Ikan Bandeng.
Muhammadiyah  Journal  of  Nutrition and Food Science (MJNF) , 3 (1), 36–41. https://doi.org/10.24853/mjnf.3.1.36 -41
Weatherall,  D.  J.,  &  Clegg,  J.  B.  (2001). Inherited  haemoglobin  disorders:  an increasing  global  health  problem. Bulletin of the World Health
Organization , 79 (8), 704–712.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/a rticles/PMC2566499/pdf/11545326. pdf Wulandari,  R.  D.  (2016).  Kelainan  pada Sintesis Hemoglobin: Thalassemia dan Epidemiologi  Thalassemia. Jurnal Ilmiah  Kedokteran  Wijaya  Kusuma ,
5 (2), 33–43. https://journal.uwks.ac.id/index.php/ jikw/article/view/340/310
Yuenleni,  Y.  (2019).  Langkah-Langkah Optimasi  PCR. Indonesian  Journal  of Laboratory ,
1 (3), 51–56. https://doi.org/http://dx.doi.org/10.
22146/ijl.v1i3.48723.