POTENSI FRAKSI n-HEKSAN EKSTRAK ETANOL RIMPANG LENGKUAS [ Alpinia galanga (L.) Swartz.] DALAM MENINGKATKAN KUALITAS SPERMA

## DAN SPERMATOGENESIS
Yance Anas 1) , Imam Faozi 2) dan Suharjono 3)
1) Bagian Farmakologi dan Farmasi Klinik Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang
2) Program S-1Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang
3) Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang
e-mail: yance.apt@gmail.com

## ABSTRACT
Flavonoids and steroid's compounds have been identifying in the galangal rhizome [ Alpinia galanga (L.) Swartz.]. This compound has hormonal and antioxidant effects and can improve the spermatogenesis and quality of spermatozoa. The purpose of this study is to find out the effects of the  n-hexane  fractions  from  galangal  rhizome  ethanol  extract  (HFGREE)  on  male  Swiss  mice spermatogenesis  and  quality  of  spermatozoa.  This  research  is  a  laboratory  experimental  with randomized matched post test only controls group design. Twenty-four male Swiss mice (8-weeks old) divided among four groups: control groups (mice treated with CMC 1.0% 10 mL.kg - 1.day -1 ), and  three groups  of  mice  treated  with  HFGREE (1.29; 2.58 and 5.16) mg.kg -1 .day -1 for 30 days. All mice sacrificed at day 31. Furthermore, testicular tissue sections are used to calculate the score of  spermatogenesis.  Spermatozoa  in  the  epididymis  were  used  to  assess  the  quality  of spermatozoa.  The  results  showed  the  HFRGEE  (2.58  and  5.16)  mg.kg -1 .day -1 for  30  days, significantly  elevate  spermatogenesis  score,  and  improve  the  spermatozoa  count,  spermatozoa motility, healthy and normal spermatozoa of male Swiss mice (p<0.05). Further studies can focus on  the  identification  of  active  compounds  in  HFGREE  that  play  a  role  in  improving spermatogenesis and quality of spermatozoa.
Key  words: n-hexane  fraction,  galangal  rhizome  ethanol  extract,  spermatogenesis,  quality  of spermatozoa

## PENDAHULUAN
Salah  satu  penyebab  kegagalan  pasangan  suami  istri  untuk  memperoleh  keturunan  adalah infertilitas  pada  pria  (Miyamoto  dkk ., 2012).  Di  Indonesia,  diperkirakan  sekitar  20%  pria mengalami  gangguan  infertilitas.  Menurut  Stuart  dan  Howard  (1995),  penyebab  pasti  infertilitas pada pria masih belum banyak diketahui. Oleh karena itu, rencana pengobatan yang rasional untuk memperbaiki  patologi  infertilitas  pada  pria  masih  sulit  untuk  dikembangkan.  WHO  pada  tahun 2010 mengatakan bahwa pada beberapa banyak kasus yang terjadi, penyebab infertilitas pada pria diakibatkan oleh keadaan azoospermia non-obstruktif. Keadaan ini merupakan sedikitnya volume sperma  yang  diproduksi  dan  terjadinya  penurunan  sekresi Folicle  Stimulating  Hormone (FSH) (Kobayashi dkk., 2012).
Indonesia merupakan negara kaya akan berbagai jenis tumbuhan, termasuk rempah-rempah. Salah  satunya  adalah  rimpang  lengkuas  [ Alpinia  galanga (L.)  Swartz.]  yang  sering  digunakan masyarakat  Indonesia  sebagai  bumbu  masakan.  Rimpang  lengkuas  telah  dimanfaatkan  secara tradisional  untuk  mengobati  infeksi  jamur  pada  kulit.  Tanaman    familia Zingiberaceae ini diketahui  memiliki  zat  aktif  yang  berfungsi mengobati gangguan pencernaan, meredakan kolik, sebagai  penawar  keracunan,  antikejang  (Sudarsono  dkk . ,  2006)  serta  memiliki  aktivitas  sebagai antiartrithis  (Chandur  dkk.,  2010).  Ekstrak  rimpang  lengkuas  juga  dilaporkan  memiliki  aktivitas sebagai antikanker (Verma dkk., 2011) dan antituberkulosis (Warit, 2009). Rimpang lengkuas juga dilaporkan  berpotensi  untuk  dikembangkan  sebagai  afrodisiak  (Singh  dkk.,  2010) . Rimpang lengkuas  memiliki  kandungan  senyawa  aktif  berupa  senyawa  saponin,  flavonoid,  glikosida, senyawa  fenolik,  minyak  atsiri  terpinen-4-ol  (monoterpen),  1'-asetoksikafikol  asetat  (ACA),  dan
Prosiding Seminar Nasional Peluang Herbal Sebagai Alternatif Medicine Tahun 2015 ISBN: 978-602-19556-2-8 Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim
steroid/triterpenoid  yang  pada  gilirannya  akan  dapat  dimanfaatkan  untuk  pengobatan  penyakit (Chandur dkk., 2010; Gholib dan Darmono, 2008; Verma dkk., 2011).
Penelitian yang dilakukan Darminto (2012) menyimpulkan bahwa pemberian ekstrak etanol rimpang  lengkuas  [ Alpinia  galanga (L.)  Swartz.]  (100,  200  dan  400)  mg/KgBB/hari  selama  21 hari  belum  memberikan  pengaruh  yang  signifikan  terhadap  spermatogenesis  dan  kualitas spermatozoa mencit jantan galur Swiss. Penelitian tersebut juga menyimpulkan bahwa pemberian ekstrak  etanol  rimpang  lengkuas  (100  dan  400)  mg/KgBB/hari  menunjukkan  motilitas  progresif spermatozoa lebih rendah dibanding mencit kelompok kontrol negatif. Akan tetapi, ekstrak etanol rimpang  lengkuas  200  mg/KgBB/hari  mampu  meningkatkan  jumlah  spermatozoa  mencit  jantan galur  Swiss  (p<0,05).  Efek  ekstrak  etanol  rimpang  lengkuas  terhadap  spermatogenesis  dan spermatozoa  sangat  berkaitan  dengan  kandungan  senyawa  aktif  yang  terdapat  di  dalamnya,  baik yang  bersifat  polar  maupun  non-polar.  Senyawa-senyawa  tersebut  kemungkinan  memiliki  efek saling  berlawanan  terhadap  sistem  reproduksi  mencit  jantan.  Oleh  sebab  itu,  perlu  dilakukan penelitian lebih lanjut mengunakan ektrak etanol rimpang lengkuas yang telah difraksinasi untuk melihat pengaruhnya terhadap sistem reproduksi mencit jantan.
Fraksinasi esktrak etanol rimpang lengkuas dapat dilakukan dengan menggunakaan larutan n-heksan.  Fraksi  n-heksan  ekstrak  etanol  rimpang  lengkuas  (FHEERL)  diharapkan  mengandung senyawa aktif non-polar yang diketahui mempu mempengaruhi sistem reproduksi mamalia jantan, seperti  senyawa  golongan  flavonoid  dan  steroid.  Penelitian  sebelumnya  melaporkan  bahwa pemberian  ekstrak  kulit  jeruk Citrus    sinesis yang  mengandung  flavonoid  mampu  meningkatkan Total Antioxidant Capacity (TCA), viabilitas, dan motilitas spermatozoa tikus jantan galur Wistar karena aktivitasnya sebagai antioksidan (Khaki dkk., 2011).

## METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  eksperimental  dengan  rancangan randomized  matched post  test  only  control  group, menggunakan  hewan  coba  sebagai  subjek  penelitian.  Tempat penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang

## Bahan Penelitian
Hewan  percobaan  yang  digunakan  adalah  mencit  jantan  galur  Swiss  yang  diperoleh  dari Laboratorium  Biologi  Jurusan  Biologi  FMIPA,  Universitas  Negeri  Semarang.  Kriteria  inklusi mencit yang digunakan dalam penelitian ini adalah galur Swiss, umur ± 2 bulan, berat badan 20-30 gram dan dalam kondisi sehat; dan kriteria eksklusi: terdapat abnormalitas fisik pada mencit dan mencit mati selama percobaan karena kesalahan perlakuan. Rimpang lengkuas berasal dari daerah Karangawen, Demak, Jawa Tengah. Tinggi batang tanaman lengkuas saat dipanen antara 2,0 - 2,5 meter. Bahan  lain  yang  digunakan  adalah  etanol  70%  dan  larutan  n-heksan  (PT.  Brataco Chemical) larutan CMC 1%, klorofrom 99,0 % (PT. Brataco Chemical), NaCL fisiologis (Otsuka), reagen  giemsa,  dan  larutan  etanol  70%,  formalin  10%,  etanol  bertingkat,  xilol,  parafin, albumin meyer dan haematoxylin-eosin (HE).

## Alat yang digunakan
Blender (philips) ,  timbangan  elektrik (cook  master) ,  jarum  oral,  seperangkat  alat  gelas, rotary  evaporator  (Heildolph),  waterbath,  seperangkat  alat  bedah,  pipet  mikro  serta yellow  tip , kamar hitung haemocytometer (Neubauer), objek glass , deck glass, hand counter, laptop, vial, alat potong mikrotom (Shandon finesse 325), dan  mikroskop trinokuler (N-400 M).

## Ekstraksi dan Fraksinasi Rimpang Lengkuas
Rimpang  lengkuas  dicuci  bersih  dengan  air  mengalir  kemudian  dipotong  tipis.  Rimpang lengkuas  dikeringkan  langsung  di  bawah  sinar  matahari  dengan  cara  ditutup  kain  hitam  selama tiga  hari.  Setelah  kering,  semua  rimpang  diserbuk  dengan  blender  dan  diayak  dengan  ayakan ukuran 25 Mesh. Serbuk simplisia rimpang lengkuas direndam dengan etanol 70% di dalam wadah kaca  selama  tiga  hari  dan  diaduk  sesering  mungkin  pada  hari  pertama  dan  sesekali  pada  hari berikutnya.  Pengambilan  maserat  dilakukan  dengan  cara  disaring  dengan  menggunakan  kertas
Potensi Fraksi n-Heksan Ekstrak Etanol Rimpang Lengkuas
saring  (Whatman  no.  3).  Maserat  diuapkan  menggunakan vaccum  rotary  evaporator pada  suhu 60°C hingga didapatkan ekstrak kental rimpang lengkuas. Selanjutnya, ekstrak kental difraksinasi menggunakan pelarut n-heksan.
Fraksinasi dilakukan dengan mencampurkan 30 g ekstrak etanol (kental) rimpang lengkuas dengan  30  mL  aquadestilata  dingin  dalam  mortir.  Campuran  dimasukkan  ke  dalam  corong  pisah dan ditambahkan 30 mL larutan n-heksan. Campuran tersebut digojok keras dan didiamkan hingga memisah  menjadi  dua  fraksi.  Masing-masing  fraksi  n-heksan  dan  fraksi  air    yang  terbentuk ditampung terpisah dalam gelas ukur. Fraksi air yang telah diukur volumenya dimasukkan kembali ke dalam corong pisah dan ditambah dengan larutan n-heksan sesuai volume fraksi air (1:1). Cara ini diulang-ulang hingga campuran menghasilkan fraksi n-heksan yang tidak berwarna.  Fraksi n- heksan dipekatkan dengan waterbath (suhu <50˚C).

## Perlakuan Hewan Uji
Sebanyak  24  ekor  mencit  jantan  galur  Swiss  dikelompokkan  secara  acak  ke  dalam  empat kelompok  perlakuan.  Sebelum  perlakuan,  mencit  diadaptasikan  terlebih  dahulu  dalam  suasana laboratorium  selama  satu  minggu.  Pemberian  pakan  dilakukan  tiga  kali  setiap  hari    (pagi,  siang dan  sore)  hari  menggunakan  pakan  standar  BR2  dan  minum ad.  libitum .  Tiga  peringkat  dosis FHEERL  (1,29;  2,58  dan  5,16)  mg/kgBB/hari;  dan  CMC  1,0%  10,0  mL/KgBB/hari  diberikan secara oral satu kali sehari selama 30 hari. Pemejanan sediaan uji dilakukan pada pagi hari sekitar pukul 09.00 WIB.

## Pengambilan Testis dan Epididimis
Pada hari ke 31, mencit dikorbankan dengan cara disklokasi tulang belakang. Bagian bawah perut  mencit  dibasahi  dengan  kapas  alkohol  70%,  dan  selanjutnya  dipotong  melintang  hingga terlihat  epididimis  dan  testis.  Selanjutnya,  satu    buah  organ  testis  dimasukkan  ke    dalam  larutan formalin  10%  untuk  keperluan  pemeriksaan  spermatogenesis.  Epididimis  diurut/diplirit menggunakan  pinset  untuk  mengeluarkan  spermatozoa  sehingga  tersuspensi  ke  dalam  larutan NaCl  0,9%.  Pengamatan  mikroskopis  terhadap  kualitas  sperma  dilakukan    dalam  jangka  waktu yang  tidak  melebihi  dari  60  menit  (WHO,  2010).  Pemeriksaan  kualitas  sperma  yang  dilakukan meliputi jumlah, motilitas dan morfologi sperma

## Pemeriksaan  Jumlah Sperma
Sebanyak  10  µL    sampel  sperma,  diteteskan  di  sisi  kamar  hitung  Neubauer  yang  sudah ditutup dengan kaca penutup, dan dibiarkan selama 5 menit (agar sel-sel spermatozoa mengendap) untuk  memudahkan  perhitungan.  Jumlah  spermatozoa  dihitung  di  bawah  mikroskop  trinokuler dengan perbesaran 400 x.

## Pengamatan Motilitas Sperma
Satu tetes sampel sperma diteteskan di atas objek glass , kemudian ditutup dengan deg glass . Pengamatan  motilitas  dilakukan  di  bawah  mikroskop  trinokuler  dengan  perbesaran  200x. Pengamatan dilakukan sedikitnya pada lima lapang pandang. Setiap satu lapang pandang direkam selama  20  detik.  Motilitas  sperma  selanjutnya  dikelompokkan  berdasarkan motilitas  progesif (sperma bergerak cepat dan lurus), non-progesif (sperma bergerak ditempat) dan immotil (sperma tidak bergerak/mati).

## Pengamatan Morfologi Sperma
Satu  tetes  sampel  sperma  dan  giemsa  dibuat  dalam  bentuk  hapusan  pada  obyek  glass, kemudian  dikering  anginkan.  Selanjutnya,  sediaan  hapusan  ditetesi  dengan  etanol  70%  dan dibiarkan  selama  15  menit  hingga  kering.  Pengamatan  dilakukan  terhadap  100  sperma  di  bawah mikroskop  trinokuler  dengan  pembesaran  400x.  Selanjutnya,  dilakukan  perhitungan  persentase sperma  normal  dan  abnormal,  sesuai  dengan  protokol  penelitian  yang  dilakukan  oleh    Suparni (2009).

## Pengamatan Viabilitas Sperma
Pengamatan  viabilitas  merupakan  kelanjutan  dari  pemeriksaan  morfologi  spermatozoa. Pengamatan  dilakukan  terhadap  100  spermatozoa,  dihitung  persentase  antara  spermatozoa  yang hidup (kepala tidak berwarna) dan yang mati (kepala berwarna merah). Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop Trinokuler dengan perbesaran 200x.

## Pemeriksaan Spermatogenesis
Testis  difiksasi  dengan  larutan  formalin  10%  dan    direndam  selama  24  jam,  kemudian dicuci  dengan  air  dan  didehidrasi  menggunakan  pelarut  etanol  bertingkat.  Tahap  selanjutnya adalah  mengeluarkan  cairan  pembening  dari  testis  dan  diganti  dengan  parafin.  Pengecoran  testis dilakukan dengan membuat blok parafin agar mudah dipotong dengan mikorotrom. Hasil potongan tersebut kemudian dipindahkan ke dalam penangas air dengan suhu 60 o C dan diletakkan di atas objek glass yang telah diolesi albumin meyer. Preparat jaringan testis hasil irisan diwarnai dengan Heatoksilin-Eosin (HE) dan diamati di bawah mikroskop trinokuler. Hematoxylin akan mewarnai inti  sel  sedangkan  eosin  mewarnai  sitoplasma  (Zulham,  2009).  Penilaian  spermatogenesis dilakukan berdasarkan penilaian  skor spermatogenesis yang mengacu pada skor spermatogenesis Johnsen.

## Analisa Data
Hasil  perhitungan  jumlah  sperma  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  rumus  berdasarkan sesuai penelitian yang dilakukan oleh Suparni (2009), persamaan 1. Sementara itu, perhitungan % motilitas sperma progresif, non-progresif dan immotil di lakukan sesuai dengan persamaan   2-4.
Jumlah sperma  = 𝑁 5 ÷ 2 x10 5 sperma/mL……  (1)
% sperma progresif = a/n x 100%  ...…………  (2)
% sperma non-progresif = b/n x 100% ............  (3)
% sperma immotil = c/n x 100% ......................  (4)

## Keterangan :
N   :   Jumlah sperma yang dihitung pada 25 kotak a    :   Jumlah sperma dengan motilitas progresif b    :   Jumlah sperma dengan motilitas non-progresif c    :   Jumlah sperma dengan motilitas immotil n    :   Jumlah sperma pada lima lapang   pandang
Data skor spermatogenesis dinilai menggunakan Skor Johnsen (Skala 1-10). Semua data penelitian dianalisa  menggunakan  Anova  satu  jalan  yang  dilanjutkan  dengan  uji  LSD  ( least  difference significance )  atau  uji  Kruskal-Wallis  dan  dilanjutkan  dengan  uji  Mann-Whitney  pada  taraf kepercayaan  95%.  Adanya  perbedaan  yang  signifikan  ditandai  dengan  nilai  signifikansi  kurang dari 0,05 (p<0,05).

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
Efek Fraksi n-Heksan Ekstrak Etanol Rimpang Lengkuas Terhadap Jumlah Sperma Mencit Jantan Galur Swiss
Jumlah  spermatozoa  merupakan  salah  satu  indikator  yang  penting  di  dalam  penilaian kualitas spermatozoa mamalia jantan (Dohle, dkk., 2004). Gambaran sebaran sperma dalam kamar hitung Neubeur dapat  dilihat  pada  gambar  1.  Hasil  penghitungan  rata-rata  jumlah  spermatozoa mencit  jantan  galur  Swiss  setelah  mendapatkan  perlakuan  dengan  CMC  1%  10,0  mL/KgBB/hari dan FHEERL (1,29; 2,58; dan 5,16) mg/KgBB/hari selama 30 hari tersaji pada Gambar 2.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  jumlah  spermatozoa  mencit  yang  mendapatkan perlakuan  FHEERL  lebih  tinggi  daripada  mencit  kelompok  kontrol  negatif  (p<0,05).  Rata-rata
Potensi Fraksi n-Heksan Ekstrak Etanol Rimpang Lengkuas
jumlah spermatozoa mencit galur Swiss paling tinggi diperlihatkan oleh kelompok FHEERL 5,16 mg/KgBB/hari  dengan  jumlah  spermatozoa  (33,50  ±  0,91)  x  10 5 /mL.  Hasil  uji  LSD  ini  juga memperlihatkan  perbedaan  yang  signifikan  pada  antar  kelompok  perlakuan  fraksi  uji  (p<0,05). Selain itu, hasil uji korelasi Pearson juga menunjukkan adanya korelasi positif antara dosis fraksi uji dengan jumlah spermatozoa (p<0,05) dengan nilai koefisien korelasi sebesar 0,996. Oleh sebab itu,  dapat  disimpulkan  bahwa  peningkatan  jumlah  spermatozoa  akibat  perlakuan  FHEERL mengikuti pola tergantung dosis.
Gambar 1.  Sebaran jumlah  pada kamar hitung Neubeur
Keterangan :  K1 (kelompok kontrol negatif, perlakuan CMC 1%  10,0 mL/KgBB/hari) K2 (Kelompok FHEERL 1,29mg/KgBB/hari) K3(Kelompok FHEERL 2,58 mg/KgBB/hari) K4 (Kelompok FHEERL 5,16 mg/KgBB/hari)
*  Hasil  uji  LSD  menunjukan  adanya  perbedaan  yang  bermakna  dengan  kelompok  kontrol negatif (p<0,05).
Gambar 2.   Perbandingan  jumlah  spermatozoa  mencit  jantan  galur  Swiss  setelah mendapatkan perlakuan dengan CMC 1% 10,0 mL/KgBB/hari, FHEERL (1,29; 2,58; dan 5,16) mg/KgBB/hari selama 30 hari. Data disajikan dalam bentuk (rata- rata ± SE) melalui 6 percobaan independen.

## Efek Fraksi n-Heksan Ekstrak Etanol Rimpang Lengkuas Terhadap Motilitas Sperma Mencit Jantan Galur Swiss
Motilitas spermatozoa diklasifikasikan menjadi tiga yaitu: motililas progresif, non-progresif serta immotil (WHO, 2010). Pergerakan spermatozoa secara progresif merupakan indikator paling penting  dalam  menilai  motilitas  spermatozoa  dibandingkan  motilitas  non-progresif  dan  immotil. Perbandingan  rata-rata  motilitas  progresif,  non-progresif  dan  immotil  mencit  jantan  galur  Swiss kelompok perlakukan CMC 1% 10,0 mL/KgBB/hari dengan kelompok perlakuan dosis FHEERL (1,29; 2,58; dan 5,16) mg/KgBB/hari selama 30 hari dapat dilihat pada tabel I.
Pergerakan spermatozoa secara progresif merupakan indikator paling penting dalam menilai motilitas  spermatozoa  dibandingkan  motilitas  non-progresif  dan  immotil.  Secara  umum, kemampuan  motilitas  spermatozoa  progresif  berkorelasi  positif  dengan kemampuan  spermatozoa

## Yance Anas
dalam  membuahi  sel  telur  (Firman,  2012).  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  persentase motilitas spermatozoa progresif pada kelompok mencit yang diberikan perlakuan dengan FHEERL (1,29; 2,58 dan 5,16)  mg/KgBB/hari selama 30 hari lebih tinggi  dibandingkan kelompok kontrol negatif (p<0,05). Selain itu, hasil uji korelasi Pearson menyimpulkan adanya korelasi positif antara dosis  fraksi  uji  dengan  spermatozoa  progresif  (p<0,05).  Nilai  koefisien  korelasi  yang  dihasilkan adalah  sebesar  0,917  sehingga  peningkatan  spermatozoa  progresif  akibat  perlakuan  FHEERL mengikuti pola tergantung dosis.
Tabel I.   Perbandingan rata-rata persentase motilitas sperma mencit setelah mendapatkan perlakuan dengan FHEERL (1,29; 2,58; dan 5,16) mg/KgBB/hari selama 30 hari. Motilitas  sperma  merupakan  nilai  rata-rata  (%)  (n=6). *Hasil  uji  LSD menunjukkan  perbedaan  yang  bermakna  dengan  kelompok  kontrol  negatif  (CMC) (P<0,05).

## Efek Fraksi n-Heksan Ekstrak Etanol Rimpang Lengkuas Terhadap Morfologi Sperma Mencit Jantan Galur Swiss
Morfologi  spermatozoa  dapat  dibedakan  menjadi  spermatozoa  normal  dan  abnormal. Morfologi spermatozoa abnormal dapat diketahui berdasarkan kecacatan bentuk pada kepala, leher dan  atau  ekor  spermatozoa,  seperti  kepala  terputus  dari  leher  spermatozoa,  leher  spermatozoa melipat,  ekor  spermatozoa  melipat,  serta  ekor  spermatozoa  pendek  (WHO,  2010).  Morfologi spermatozoa  normal  dan  abnormal  dapat  dilihat  pada  Gambar  3.  Persentase  rata-rata  morfologi spermatozoa  normal  dan  abnormal  pada  mencit  jantan  galur  Swiss  yang  mendapat  perlakukan CMC 1% 10,0 mL/KgBB/hari dan FHEERL (1,29; 2,58; dan 5,16) mg/KgBB/hari selama 30 hari dapat dilihat pada Gambar 4.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  persentase  morfologi  spermatozoa  normal  mencit yang mendapatkan  perlakuan FHEERL (1,29; 2,58 dan 5,16) mg/KgBB/hari selama 30 hari lebih tinggi daripada kelompok kontrol negatif (p<0,05). Semakin tinggi dosis FHEERL yang diberikan pada mencit  mengakibatkan persentase spermatozoa normal yang lebih tinggi (p<0,05). Hasil uji korelasi  Spearman  menunjukkan  bahwa  adanya  korelasi  positif  antara  dosis  fraksi  uji  dengan persentase  spermatozoa  normal  (p<0,05)  dengan  nilai  koefisien  korelasi  sebesar  0,888.  Oleh karena  itu,  penelitian  ini  menyimpulkan  bahwa  pemberian  FHEERL  pada  mencit  jantan  galur Swiss akan meningkatkan persentase spermatozoa normal dengan pola tergantung dosis.
Gambar 3.   Bentuk-bentuk spermatozoamencit jantan galur Swiss dengan perbesaran 200x. A  (spermatozoa  normal),  B  (leher  spermatozoa  melipat),  C  (ekor  spermatozoa melipat), D (kepala spermatozoa putus), E (ekor spermatozoa pendek).
Keterangan :  K1 (kelompok kontrol negatif, perlakuan CMC 1%  10,0 mL/KgBB/hari) K2 (Kelompok FHEERL 1,29 mg/KgBB/hari) K3(Kelompok FHEERL 2,58 mg/KgBB/hari) K4 (Kelompok FHEERL 5,16 mg/KgBB/hari)
*    Hasil  uji  Mann-Whitney    menunjukan  adanya  perbedaan  yang  bermakna  dengan  rata-rata morfologi spermatozoa normal kelompok perlakuan kontrol negatif (p<0,05).
Gambar 4. Perbandingan persentase morfologi spermatozoa normal dan abnormal mencit jantan  galur  Swiss  setelah  mendapatkan  perlakuan  dengan  CMC  1%  10,0 mL/KgBB/hari, FHEERL (1,29;  2,58;  dan  5,16)  mg/KgBB/hari  selama  30 hari. Data disajikan dalam bentuk (rata-rata ± SE) melalui 6 percobaan independen.

## Efek Fraksi n-Heksan Ekstrak Etanol Rimpang Lengkuas Terhadap Viabilitas Sperma Mencit Jantan Galur Swiss
Viabilitas  yang  tinggi  menunjukkan  kualitas  spermatozoa  yang  baik.  Viabilitas spermatozoa  dapat  diklasifikasikan  menjadi  spermatozoa  hidup  dan  spermatozoa  mati. Spermatozoa  hidup  memiliki  kepala  yang  tidak  terwarnai  oleh  pewarna  eosin.  Sebaliknya, spermatozoa mati  memiliki  kepala berwarna  merah karena  terwarnai oleh  pewarna eosin (WHO, 2010).  Perbedaan  warna  kepala  spermatozoa  hidup  dan  spermatozoa  mati  dapat  dilihat  pada Gambar  5.  Hasil  persentase  rata-rata  viabilitas  spermatozoa  hidup  dan  mati  mencit  jantan  galur Swiss  akibat  perlakukan  CMC  1%  10,0  mL/KgBB/hari  FHEERL  (1,29;  2,58;  dan  5,16) mg/KgBB/hari selama 30 hari dapat dilihat pada gambar 6.
Gambar 5.   Perbedaan spermatozoa mencit jantan galur Swiss yang hidup dan mati dengan perbesaran  200x. A  (Spermatozoa  hidup  memiliki  kepala  berwarna  transparan).  B (Spermatozoa mati memiliki kepala berwarna merah).
Keterangan :  K1 (kelompok kontrol negatif, perlakuan CMC 1%  10,0 mL/KgBB/hari) K2 (Kelompok FHEERL 1,29 mg/KgBB/hari) K3(Kelompok FHEERL 2,58 mg/KgBB/hari) K4 (Kelompok FHEERL 5,16 mg/KgBB/hari)
*   Hasil  uji  Mann-Whitney  menunjukan  adanya  perbedaan  yang  bermakna  dengan  rata-rata viabilitas spermatozoa hidup kelompok perlakuan kontrol negatif (p<0,05)
Gambar 6. Perbandingan persentase viabilitas spermatozoa hidup dan mati mencit jantan galur  Swiss  setelah  mendapatkan  perlakuan  dengan  CMC  1%  10,0 mL/KgBB/hari, FHEERL (1,29; 2,58; dan 5,16) mg/KgBB/hari selama 30 hari. Data disajikan dalam bentuk (rata-rata ± SE) dari 6 percobaan independen.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  mencit  yang  mendapat  perlakuan  dengan  FHERL (1,29; 2,58 dan 5,16) mg/KgBB/hari memiliki persentase spermatozoa hidup yang lebih tinggi dari pada  kelompok  kontrol  negatif  (p<0,05).  Selain  itu,  terdapat  pula  perbedaan  yang  bermakna persentase  spermatozoa  hidup  pada  antar  kelompok  perlakuan  fraksi  uji  (p<0,05),  sehingga pengaruh  perlakuan  fraksi  FHERL  terhadap  persentase  spermatozoa  hidup  mengikuti  pola tergantung  dosis.  Kesimpulan  ini  juga  diperkuat  oleh  hasil  uji  korelasi  Spearman  yang menunjukkan  adanya  korelasi  positif  antara  dosis  fraksi  uji  dengan  spermatozoa  hidup  (p<0,05) dengan nilai koefisisen korelasi sebesar 0,835.
Hasil  pengamatan  viabilitas  spermatozoa  menunjukkan  banyaknya  jumlah  spermatozoa yang mati pada tiap kelompok perlakuan. Hasil ini menunjukkan pola yang sama dengan jumlah spermatozoa  immotil  pada  pengamatan  motilitas  spermatozoa.  Spermatozoa  yang  mati  tersebut diduga  bukan  diakibatkan  karena  pengaruh  senyawa  uji,  baik  CMC  1%  maupun  fraksi  n-heksan ekstrak  etanol  rimpang  lengkuas,  akan  tetapi  disebabkan  karena  kelemahan  metode  penilaian spermatozoa  secara  in  vitro.  Spermatozoa  yang  diamati  dan  diukur  tidak  berasal  dari  air  mani, akan tetapi berasal dari epididimis yang disuspensikan dengan larutan NaCl 0,9%. Media tersebut tidak  terdapat  nutrisi  yang  berasal  dari  cairan  semen  yang  dibutuhkan  oleh  spermatozoa  untuk bertahan hidup di luar tubuh sehingga spermatozoa cepat mati dan memiliki pergerakan immotil.
A B
Efek  Fraksi  n-Heksan  Ekstrak  Etanol  Rimpang  Lengkuas  Terhadap  Spermatogenesis Mencit Jantan Galur Swiss
Pengamatan spermatogenesis dilakukan terhadap preparat jaringan testis mencit jantan galur Swiss. Spermatogenesis mencit dinilai berdasarkan skor spermatogenesis yang mengacu pada Skor Johnsen (skala 1-10) terhadap jumlah spermatogonium, spermatosit, spermatid, serta spermatozoa matang  pada  tubulus  semifenarus  preparat  testis  mencit  jantan  galur  Swiss.  Skor  1 menggambarkan  tidak  adanya  sel-sel  yang  divisualisasikan  di  dalam  tubulus  semifenarus  yang berarti terjadi kerusakan yang sangat parah. Sebaliknya, skor 10 menggambarkan spermatogenesis berjalan  secara  lengkap  dengan  dipenuhi  sel-sel  spermatogonia,  spermatosit,  spermatid  dan spermatozoa  matang  di  dalam  tubulus  semifenarus  (Filho,  dkk.,  2010).  Gambaran  mikroskopik tubulus semifenarus preparat jaringan testis yang dinilai dengan skor spermatogenesis dapat dilihat pada  Gambar  7.  Perbandinganskor  spermatogenesis  preparat  jaringan  testis  mencit  jantan  galur Swiss  (berdasarkan  Skor  Johnsen)  kelompok  CMC  1%  10,0  mL/KgBB/hari,  kelompok  fraksi  n- heksan (1,29; 2,58; dan 5,16) mg/KgBB/hari selama 30 hari dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 7. Gambaran mikroskopik tubulus semifenarus preparat jaringan testis mencit jantan  galur  Swiss  dengan  perbesaran  200x  menggunakan  mikroskop trinokuler. A  (skor  spermatogenesis  10,  pada  testis  mencit  yang  mendapat perlakuan  FHEERL  5,16  mg/KgBB/hari),  B  (skor  spermatogenesis  9,  pada  testis mencit  yang  mendapat  perlakuan  FHEERL  2,58  mg/KgBB/hari),  C  (skor spermatogenesis  8,  pada  testis  mencit  yang  mendapat  perlakuan  FHEERL 1,29mg/KgBB/hari),  dan  D  (skor  spermatogenesis  7,  pada  testis  mencit  yang mendapat perlakuan CMC 1%  10,0 mL/KgBB/hari).
A B C D Yance Anas
Keterangan :  K1 (kelompok kontrol negatif, perlakuan CMC 1%  10,0 mL/KgBB/hari) K2 (Kelompok FHEERL 1,29 mg/KgBB/hari) K3 (Kelompok FHEERL 2,58 mg/KgBB/hari) K4 (Kelompok FHEERL 5,16 mg/KgBB/hari)
* Hasil  uji  Mann-Whitney  menunjukan  adanya  perbedaan  yang  bermakna  dengan  kelompok kontrol negatif (p<0,05).
Gambar 8.  Perbandingan  skor  spermatogenesis  preparat  jaringan  testis  mencit  jantan galur  Swiss  setelah  mendapatkan  perlakuan  dengan  CMC  1%  10,0 mL/KgBB/hari,  FHEERL  (1,29;  2,58;  dan  5,16)  mg/KgBB/hari  selama  30 hari. Data  disajikan  dalam  bentuk  (rata-rata  ±  SE)  melalui  6  percobaan independen .
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  skor  spermatogenesis  mencit  jantan  yang  diberi perlakuan  dengan  FHEERL  lebih  tinggi  daripada  kelompok  kontrol.  Hasil  uji  Mann-Whitney menunjukkan  adanya  perbedaan  yang  bermakna  antara  nilai  Skor  Spermatogenesis  preparat jaringan testis mencit kelompok FHEERL 2,58 dan 5,16 mg/KgBB/hari dengan kelompok kontrol negatif  (p<0,05).  Selain  itu,  juga  terdapat  perbedaan  yang  bermakna  skor  spermatogenesis  antar kelompok  perlakuan  fraksi  uji  (p<0,05).  Uji  korelasi  Spearman  juga  memperlihatkan  adanya korelasi  positif  antar  kelompok  fraksi  uji  dengan  skor  spermatogenesis  (p<0,05),  dengan  nilai koefisien korelasi sebesar 0,897. Oleh karena itu, penelitian ini menyimpulkan bahwa peningkatan Skor Spermatogenesis akibat perlakuan FHEERL mengikuti pola tergantung dosis. Rata-rata nilai Skor  Spermatogenesis  preparat  jaringan  testis  paling  tinggi  diperlihatkan  oleh  kelompok  mencit yang mendapatkan perlakuan dengan FHEERL 5,16 mg/KgBB/hari (skor sebesar 9,67 ±0,47).
Hasil  penelitian  ini  secara  nyata  menunjukkan  adanya  hubungan  antara  penilaian spermatogenesis dengan kualitas spermatozoa. Spermatozoa yang memenuhi tubulus semifenarus pada  gambaran  preparat  jaringan  testis  akan  berdampak  langsung  terhadap  penilaian  jumlah spermatozoa di dalam epididimis. Semakin tinggi nilai skor spermatogenesis, maka semakin tinggi pula  jumlah  spermatozoa.  Hal  tersebut  dikarenakan  spermatozoa  yang  telah  matang  di  dalam tubulus semifenarus akan segera dikeluarkan melalui saluran epididimis sehingga spermatogenesis yang  berlangsung  dengan  baik  akan  menghasilkan  banyak  spermatozoa.  Tiga  parameter  kualitas spermatozoa  yang  lain  juga  berhubungan  erat  dengan  jumlah  spermatozoa.  Jumlah  spermatozoa, motilitas progresif, morfologi normal dan viabilitas spermatozoa hidup memiliki peranan masing- masing yang sangat berpengaruh terhadap kemampuannya dalam membuahi sel telur wanita.
Hasil  penelitian  ini  secara  keseluruhan  meyimpulkan  bahwa  pemberian  FHEERL  (1,29; 2,58 dan 5,16) mg/KgBB/hariselama 30 hari mampu meningkatkan spermatogenesis dan kualitas spermatozoa  mencit  jantan  galur  Swiss.  Pengaruh  perlakuan  FHEERL  terhadap  spermatogenesis dan kualitas spermatozoa memiliki pola tergantung dosis, dimana semakin tinggi dosis FHEERL yang  diberikan,  maka  semakin  tinggi  pula  pengaruhnya  terhadap  spermatogenensis  dan  kualitas spermatozoa. Pengaruh tersebut diduga karena terdapat berbagai senyawa aktif di dalam FHEERL.
Senyawa  aktif  yang  diduga  bertanggung  jawab  dalam  FHEERL  terhadap  peningkaan spermatogenesis  dan  kualitas  spermatozoa  mencit  jantan  galur  Swiss  adalah  1’-asetoksikhavikol (ACA)  dan  senyawa  golongan  flavonoid.  Hasil  penelitian  Hernani,  dkk.  (2007)  menunjukkan bahwa  FHEERL  mengandung  senyawa  ACA.  Senyawa  ACA  dan  senyawa  golongan  flavonoid mampu  mempengaruhi  spermatogenesis  dan  kualitas  spermatozoa  karena  aktivitasnya  sebagai
Potensi Fraksi n-Heksan Ekstrak Etanol Rimpang Lengkuas
antioksidan. Secara umum,  antioksidan  mampu  mencegah  aktivitas berlebih dari reactive oxygen species (ROS) yang dihasilkan melalui stres oksidasi. Aktivitas oksidasi ROS yang dihambat oleh antioksidan  memberikan  kesempatan  sel-sel  germinal  utuh  dapat  berkembang  menjadi  sel-sel spermatosit,  spermatid  dan  pada  akhirnya  menjadi  spermatozoa  matang  yang  memenuhi  tubulus semifenarus (Maneesh dan Jayalekshmi, 2006). Tubulus semifenarus  yang dipenuhi  spermatozoa mencerminkan  pengaruh  yang  sangat  baik  terhadap  spermatogenesis  (Filho,  dkk.,  2010).  Selain itu,  jika  membran  spermatozoa  dan  DNA  mitokondria  terhindar  dari  oksidasi  ROS,  maka dampaknya  akan  mengakibatkan  peningkatan  motilitas  progresif,  viabilitas  spermatozoa  hidup, dan  morofologi  spermatozoa  normal  (Maneesh  dan  Jayalekshmi,  2006).  Dampak  tersebut dikarenakan  mitokondria  merupakan  tempat  pembentukan Adeno  Tri  Phosphat (ATP)  sebagai sumber  energi  penggerak  ekor  spermatozoa,  baik  secara  anaerob  maupun  melalui  Siklus  Krebs. Jika radikal bebas yang terbentuk karena stres oksidasi dapat mengoksidasi membran sel dan DNA mitokondria,  maka  hal  ini  akan  mengakibatkan  kerusakan  spermatozoa  (mati  dan  abnormal) (Gagnon, dkk., 2006).
Selain  memiliki  aktivitas  antioksidan,  senyawa  aktif  golongan  flavonoid  juga  memiliki aktivitas  hormonal  terhadap  sistem  reproduksi  mamalia  jantan.  Flavonoid  merupakan  salah  satu fitokimia  penghambat  aktivitas  enzim  aromatase  yang  berperan  merubah  adrogen  (testosteron) menjadi  estrogen  sehingga  terjadi  peningkatan  hormon  testosteron.  Aktivitas  senyawa  golongan flavonoid  yang  mampu  menghambat  aktivitas  enzim  aromatase  dinilai  berdasarkan  IC 50 ,  yaitu konsentrasi senyawa flavonoid yang mampu menghambat 50% aktivitas enzim aromatase. Contoh senyawa golongan flavonoid yang telah diketahui mampu menghambat aktivitas enzim aromatase diantarnya, seperti: rotenone memiliki nilai IC 50 sebesar 0,3 mM, naringenin (IC 50 sebesar 85mM), quercetin  (IC 50 sebesar  10  mM)  dan  isoflavon genistein  (IC 50 sebesar  10  mM)  (Sanderson,  dkk., 2004).
Peningkatan  hormon  testosteron  akan  berdampak  terhadap  peningkatan  produksi spermatozoa atau yang disebut dengan spermatogenesis (Hong dan Chen, 2006). Oleh karena itu, perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  tentang  pengaruh  pemberian  FHEERL  terhadap peningkatan  kadar  testosteron  mencit  jantan  galur  Swiss.  Selain  itu,  perlu  juga  dilakukan penelusuran lebih jauh terhadap kandungan senyawa aktif di dalam FHEERL.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
FHEERL [ Alpinia galanga (L.) Swartz.] dosis 2,58 dan 5,16 mg/KgBB/hari selama 30 hari mampu  meningkatkan  spermatogenesis  mencit  jantan  galur  Swiss  (p<0,05).  Selain  itu,  FHEERL (1,29;  2,58;  dan  5,16)  mg/KgBB/hari  selama  30  hari  juga  memiliki  kemampuan  meningkatkan kualitas  spermatozoa.  Nilai  dari  jumlah  spermatozoa,  motilitas  spermatozoa  progresif,  morfologi tersebut lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol negatif (p<0,05).

## Saran
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  mengenai  pengaruh  pemberian  FHEERL  [ Alpinia galanga (L.)  Swartz.]  terhadap  kadar  testosteron  darah  mencit  jantan  galur  Swiss.  Penelitian selanjutnya  juga  dapat  diarahkan  pada  penelusuran  kandungan  senyawa  aktif  dalam  FHEERL yang diduga berperan dalam peningkatan spermatogenesis dan kualitas spermatozoa mencit jantan galur Swiss.

## DAFTAR PUSTAKA
Chandur  U.,  Shashidhar  S.,  Chandrasekar  S.B.  and  Rao,  M.N.,  2010,  Phytochemical  Evaluation and Screening of Anti-arthritic Activity of Alpinia galangal (Linn.), INT.  J.  PH.  SCI ., 2 (2), 593-597
Darminto,  2012,  Pengaruh  Pemberian  Ekstrak  Etanol  Rimpang  Lengkuas  [ Alpinia  galanga (L.) Swartz.]  terhadap  Spermatogenesis  dan  Kualitas  Spermatozoa  Mencit  Jantan  Galur Swiss, Skripsi , Universitas Wahid Hasyim Semarang
Dohle  G.R.,  Weidner  W.,  Jungwirth  A.,    Colpi  G.,  Papp  G.,    Pomerol  J.  and  Hargreave  T.B.,
2004,  Guedlines on Male Infertility , European Association of Urology , 7
Filho  A.B.O,  Souza  R.S.,  Oliveira  M.T.V.A.,  Peruquetti  R.L.,  and  Cedenho  A.P.,  2010, Microdissection  Testicular  Sperm  Extraction  Causes  Spermatogenic  Alterations  in  the Contralateral Testis, Journal Genetics and Molecular Research, 9 (3), 1405-1413
Firman S., 2012, Infertilitas Pria Akibat Kerja, C.D.K -195, 39 (7), 508-511
Gholib  D.  dan  Darmono,  2008,  Pengaruh  Ektsrak  Lengkuas  Putih  ( Alpinia  galanga (L.)  Willd) terhadap Infeksi Trychophyton mentagrophytes pada Kelinci, Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia , 6 (2), 57-62 Gagnon C. and de Lamirande E., 2006 , Controls of Sperm Motility , Cambridge University Press, New York, 109-110
Hernani, Marwati T. dan Winarti C., 2007, Pemilihan Pelarut pada Pemurnian Ekstrak Lengkuas (Alpinia galanga) secara Ekstraksi, J.Pascapanen , 4 (1), 1-8
Hong  Y.  and  Chen  S.  2006,  Aromatase  Inhibitors  Structural  Features  and  Biochemical Characterization , Ann. N.Y. Acad. Sci., 1089, 237–251
Khaki A., Fathiazad F., Nouri M., Khaki A.A., Ghanbari Z., Ghanbari M., Ouladsahebmadarek E., Javadi  L.,  and  Farzadi  L.,  2011,  Anti-oxidative  Effects  of  Citro  Flavonoids  on Spermatogenesis in Rat, Afr. J. Pharm. Pharmacol. , 5 (6), 721-725
Kobayashi  H.,  Koichi  Nagao  K.  and  Nakajima  K.,  2012,  Focus  Issue  on  Male  Infertility ,  Adv. Urol, 01 , 2012
Maneesh  M.,  and  Jayalekshmi  H.,  2006,  Role  of  Reactive  Oxygen  Species  and  Antioxidants  on Pathophysiology of Male Reproduction, Indian. J. Clin. Biochem., 21 (2), 80-89
Miyamoto  T.,  Tsujimura  A.,  Miyaqawa  Y.,  Koh  E.,  Namiki  M.  and  Senqoku  K.,  2012,  Male Infertility and  Its  Causes in Human, Adv. Urol , 2012, 2012
Sanderson J.T., Hordijk J., Denison M.S., Mark F. Springsteel M.F., Nantz M.H. and van den Berg M.,  2004,  Induction  and  Inhibition  of  Aromatase  (CYP19)  Activity  by  Naturaland Synthetic  Flavonoid  Compounds  in  H295R  Human  Adrenocortical  Carcinoma  Cells, Toxi. Sci ., 82 (1), 70–79
Singh B., Gupta V., Bansal P., Singh R. and Kumar D., 2010, Pharmacological Potential of Plant Used as Aphrodisiacs, Int. J. Pharm. Sci.Rev.Res ., 5 (1), 104-113
Stuart S. and Howard, M.D., 1995, Treatment of Male Infertility, N. Eng. J.Med . 332 , 312-317
Sudarsono, Pudjoarnto A., Gunawan D., Wahyuono S., Donatus I.A., Drajad M., Wibowo S. dan Ngatidjan,  2006, Tumbuhan  Obat  I ,  Edisi  I  Cetakan  II,  Pusat  Penelitian  Obat Tradisional (PPOT) Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, 19-23
Suparni,  2009,  Pengaruh  Pemberian  Vitamin  C  terhadap  Jumlah  Sperma  dan  Morfologi  Sperma Mencit  Jantan  Dewasa  ( Mus  musculus L.)  yang  Dipaparkan  Monosodium  Glutamat (MSG), Tesis , Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara.
Verma R.K., Mishra G., Singh P., Jha K.K. and Khosa R.L., 2011, Alpinia galangal , An Important Medicinal Plant: A review, Der Pharmacia Sinica , 2 (1), 142-154
Warit, S., 2009, A Wish List of New Anti-Tuberculous Candidate Agents, Siriraj. Med. J. , 61: 34- 36
WHO, 2010, Laboratory Manual For The Examination And Processing of Human Semen , World Healt Organization, 5 th Edition,21-22, 26-27, 56-57, 69-70
Zulham, 2009, Penuntun Praktikum Histoteknik , Departemen Histologi FKUSU, Medan, 5
Yance Anas