## BIOSPECIES
ISSN : 19790902 E-ISSN : 2503-0426 DOI  : 10.22437/biospecies.v16i1.21079

## AKTIVITAS  ENZIM  KITINASE ACTINOBACTERIA

## ASAL  PERKEBUNAN KELAPA  SAWIT  PTPN  VI  MUARO  JAMBI  DALAM  MENGHAMBAT GANODERMA BONINENSE
Activity  of  The  Chitinase  Enzyme  Actinobacteria  from  Palm  Oil Plantation PTPN VI Muaro Jambi in Inhibiting Ganoderma boninense
Rena Astika 1 , Mahya Ihsan 2 , Ashiv Irvan Yusuf 3
1 2 3 Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Jambi Jl. Jambi-Ma. Bulian KM15 Mendalo Darat Jambi 36361
* Email : astikarena9@gmail.com
Actinobacteria are gram-positive bacteria that can produce primary metabolites in the form of enzymes, one of which is the chitinase enzyme. Chitinase is an enzyme that has the ability to degrade chitin which is the main structure in the cell wall of plant pathogenic fungi. One of the Actinobacteria that have the ability to produce enzymes can be obtained from the soil of the PTPN VI Muaro Jambi oil palm plantation which can be used as a biocontrol agent for plant pathogenic fungi, namely Ganoderma boninense. The purpose of this study was to determine the  magnitude  of  the  activity  of  the  chitinase  enzyme  Actinobacteria  and  to  determine  the magnitude of the inhibitory activity of the enzyme chitinase Actinobacteria against Ganoderma boninense. This research was conducted with a quantitative descriptive method. The results showed that one isolate of Actinobacteria (SP1) had enzyme activity (Crude Extract Enzyme (EEK) and concentrated chitinase enzyme). The activity of the chitinase enzyme was higher at 0.0296 U/mL compared to the EEK activity of 0.0288 U/mL. The inhibitory power using the concentrated  chitinase  enzyme  also  had  a  higher  value,  namely  57.3%  compared  to  the inhibitory power using EEK, which was 56.6%
Keywords : Actinobacteria, PTPN VI Muaro Jambi Oil Plantation, Chitinase Enzyme, Ganoderma boninense .
Actinobacteria merupakan bakteri gram positif yang dapat menghasilkan  senyawa metabolit primer  berupa  enzim,  salah  satunya  yaitu  enzim  kitinase.  Kitinase  merupakan  enzim  yang memiliki kemampuan dalam mendegradasi kitin yag menjadi struktur utama pada dinding sel jamur  patogen  tanaman.  Actinobacteria  yang  memiliki  kemampuan  dalam  menghasilkan enzim  salah  satunya  dapat  diperoleh  dari  tanah  perkebunan  kelapa  sawit  PTPN  VI  Muaro Jambi  yang  dapat  dijadikan  sebagai  agen  biokontrol  jamur  patogen  tanaman,  yaitu Ganoderma  boninense.  Tujuan  penelitian  ini  untuk  mengetahui  besarnya  aktivitas  enzim kitinase  Actinobacteria  dan  mengetahui  besarnya  aktivitas  penghambatan  enzim  kitinase Actinobacteria  terhadap  Ganoderma  boninense.  Penelitian  ini  dilakukan  dengan  metode deskriptif kuantitatif. Hasil penelitian diperoleh satu isolat Actinobacteria (SP1) yang memiliki aktivitas enzim (Enzim Ekstrak Kasar (EEK) dan enzim kitinase hasil pemekatan). Aktivitas enzim kitinase hasil pemekatan lebih tinggi yaitu 0,0296 U/mL dibandingkan dengan aktivitas EEK  yaitu  0,0288  U/mL.  Daya  hambat  menggunakan  enzim  kitinase  hasil  pemekatan  juga memiliki nilai lebih tinggi yaitu 57,3% dibandingkan dengan daya hambat menggunakan EEK yaitu 56,6%.
Kata  kunci : Actinobacteria,  Perkebunan  Kelapa  Sawit  PTPN  VI  Muaro  Jambi, Enzim Kitinase, Ganoderma boninense
Abstract
Abstrak

## PENDAHULUAN
Actinobacteria atau  dikenal  juga  dengan Actinomycetes merupakan kelompok bakteri gram positif berbentuk benang yang memiliki kemampuan  dalam  menghasilkan  senyawa metabolit  primer  dan  sekunder  (Fathurahman, 2019). Senyawa metabolit primer yang dihasilkan oleh Actinobacteria berupa enzim, salah satunya yaitu enzim kitinase (Gomes dkk., 2018). Kitinase adalah kelompok enzim yang memiliki kemampuan  untuk  menghidrolisis  polimer  kitin menjadi  oligomer  kitin.  Kitin  merupakan  struktur penyusun  dinding  sel pada  jamur,  salah  satunya yaitu  jamur  patogen.  Struktur  kitin  pada  dinding sel  jamur  patogen  dapat  didegradasi  oleh mikroorganisme  kitinolitik  sehingga  mengurangi terjadinya  infeksi  penyakit  tanaman  (Yurnaliza dkk.,  2011).  Jamur  patogen  adalah  jamur  yang menyebabkan  penyakit  pada  inangnya  dan bersifat  merugikan.  Menurut  Shivas  (2005) menyatakan bahwa terdapat beberapa jenis jamur patogen yang menyerang tanaman yang mencakup jamur Fusarium sp., Sclerotium rolfsii , Peronospora  manshurica , Phytophthora sp., Collectotrichum gloeosporioides , dan Ganoderma boninense . Ganoderma  boninense merupakan  jamur patogen  yang  menyebabkan  busuk  pangkal batang  (BPB)  pada  tanaman  kelapa  sawit. Patogen ini tidak hanya menyerang tanaman tua, tetapi  juga  yang  masih  muda  (Priwiratama  dkk., 2014).  Menurut  Queendy  dan  Roza  (2019), penyakit busuk pangkal batang ini menyebabkan berkurangnya  hasil  panen  secara  drastis  pada perkebunan  kelapa  sawit  dan  menyebabkan kematian  80%  atau  lebih  dari  populasi  kelapa sawit. Banyak upaya untuk pengendalian penyakit BPB  dengan  fungisida  kimia,  tetapi  keamanan lingkungan  menjadi  pertimbangan  yang  harus diperhatikan. Alternatif yang dapat dilakukan ialah menggunakan agen pengendalian hayati.
Pengendalian  hayati  menggunakan  berbagai mikroorganisme seperti bakteri kitinolitik penghasil  kitinase  sudah  banyak  digunakan. Actinobacteria menghasilkan  aktivitas  enzim kitinase  yang  merupakan  salah  satu  alternatif pengendalian G . boninense (Queendy dan Roza, 2019). Penelitian Muzaimah dkk., (2015) menyatakan  isolat  aktinomicetes  yang  diisolasi dari  rhizosfer  tanaman  kelapa  sawit  dapat menghambat  pertumbuhan  jamur G . boninense yang  menyebabkan  penyakit  busuk  pangkal batang pada tanaman kelapa sawit. Berdasarkan uraian  diatas  maka  perlu  dilakukan  penelitian mengenai  aktivitas  enzim  kitinase Actinobacteria asal  perkebunan  kelapa  sawit  PTPN  VI  Muaro Jambi dalam menghambat Ganoderma boninense

## BAHAN DAN METODE

## Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan  April- Agustus 2022. Pengambilan sampel dilakukan di perkebunan  kelapa  sawit  PTPN  VI  Unit  Usaha Batang  Hari  di  Jalan  Ness  Kab.  Muaro  Jambi, kemudian  untuk  tahap  isolasi  tanah  sampai  uji antagonis dilakukan di Laboratorium Agroindustri Tanaman  Obat  dan  Bioteknologi  Fakultas  Sains dan Teknologi Universitas Jambi.

## Bahan dan Peralatan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  Alkohol  70%,  spirtus,  Aquades, Starch Nitrat Agar ( SNA ) (KNO 3 , K 2 HPO 4 , MgSO 4 .7H 2 O, NaCl, FeSO 4 . 7H 2 O, Solublestarch , agar), Potato Dextrose  Agar (PDA),  media  kitin  agar  (bubuk kitin, HCl, air dingin, NaOH, K 2 HPO 4 , MgSO 4 .7H 2 O, yeastexstract , pepton , bactotripton , NaCl,  (NH 4 ) 2 SO 4 ,  agar,  aquades),  Buffer  fosfat, Pereaksi  Schales  (K-Ferrisianida  +  Na 2 CO 3 ), ketoconazole ,  kertas  saring,  plastik  wrap  dan alumuniumfoil. Isolat Actinobacteria yang digunakan  dalam  penelitian  ini  merupakan  isolat hasil  isolasi  dari  tanah  perkebunan  kelapa  sawit PTPN VI Muaro Jambi. Isolat jamur patogen yang digunakan yaitu Ganoderma boninense .
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah erlenmeyer, beaker glass, cawan petri, hot plate dan  magnetic stirrer , sentifuge ,  kertas  pH, tabung  reaksi,  rak  tabung  reaksi, Laminar  Air Flow ,  jarum  ose,  bunsen,  vortex,  shaker, spektrofotometer, waterbath , tabung  effendorf , spatula,  batang  pengaduk,  pipet  tetes,  neraca analitik, inkubator, refrigerator , autoclave , objectglass , jangka sorong, mikroskop fluorescense .

## Metode Penelitian
Pengambilan sampel dilakukan di perkebunan  kelapa  sawit  PTPN  VI  Unit  Usaha Batang  Hari  di  Jalan  Ness  Kab.  Muaro  Jambi, kemudian  untuk  tahap  isolasi  tanah  sampai  uji antagonis dilakukan di Laboratorium Agroindustri Tanaman  Obat  dan  Bioteknologi  Fakultas  Sains dan Teknologi Universitas Jambi.

## Preparasi Koloidal Kitin
20  g  bubuk  kitin  ditambah  400  mL  HCl  1  N distirrer  2  jam  kemudian  ditutup  rapat  dan dibiarkan selama 24 jam pada suhu 4⁰C (semua tahapan perlakuan dalam suhu dingin). Selanjutnya disaring dengan menggunakan kertas saring dan filtrat yang diperoleh ditambahkan 200 mL  air  dingin  dan  pH  larutan  diatur  menjadi  7,0 dengan penambahan NaOH 10 N dan disentrifugasi  pada  8.000  rpm  pada  suhu  4⁰C selama  10  menit.  Filtrat  dibuang  dan  pellet (endapan) dicuci dengan aquades dingin
kemudian  disentrifugasi  lagi.  Endapan  berupa pelet  (koloidal  kitin)  disimpan  pada  suhu  dingin (Suryadi dkk., 2013).

## Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel tanah dilakukan secara acak  dibeberapa  titik  pada  kedalaman  10-20  cm untuk  memaksimalkan  potensi  tanah  yang terdapat  bakteri Actinobacteria. Sampel  tanah sebanyak  5  g  dilarutkan  kedalam  45  mL  larutan fisiologis.  Larutan  dihomogenkan  menggunakan vortex selama 90 menit pada suhu ruang (±27⁰C). Sebanyak  1  mL  suspensi  biakan  diencerkan hingga  10 -4 ,  kemudian  sebanyak  0,1  mL disebarkan  secara merata  pada media  agar kitin (Koloidal kitin 0,3%, yeastextract 0,1%,
K 2 HPO 4 ,1%, MgSO 4 7H 2 O 0, 01% dan NaCl 0,1% dan  agar  1,5%,  diinkubasi  pada  suhu  kamar selama 5 hari (Nurmalinda dkk., 2020).

## Identifikasi Makroskopis dan Mikroskopis Actinobacteria
Identifikasi  makroskopis  dilakukan  untuk melihat  pertumbuhan Actinobateria pada  media kitin  agar  (Koloidal  Kitin  Agar).  Uji  makroskopis dilakukan dengan melihat bentuk, ukuran, warna, karakteristik optik, elevasi dan margin dari koloni Actinobacteria .  Untuk  uji  mikroskopis  dilakukan pewarnaan gram (Amanullah dkk., 2020). Uji Kualitatif Aktivitas Kitinolitik Actinobacteria
Uji kualitatif Actinobacteria dilakukan dengan menumbuhkan Actinobacteria pada  media  kitin agar.  sebanyak  2  ose  isolat Actinobacteria diencerkan  dalam  100  µL aquades dan diinokulasikan sebanyak 5 µL dengan metode titik (sumur) pada bagian tengah media kitin agar dan diinkubasi pada suhu 31⁰C selama 7 hari (Suryadi dkk., 2013). Setelah terbentuk zona bening diberi congored 0,1%  selama  15  menit  dan  dibilas menggunakan aquades .  Indeks  Kitinolitik  (IK) yang  diperoleh  menunjukkan  kemampuan  isolat Actinobacteria dalam mendegradasai kitin. Indeks Kitinolitik (IK) tinggi apabila isolat memiliki nilai IK ≥ 2, sedangkan IK dikatakan rendah apabila nilai IK  isolat  ˂  2  (Khikmah  dkk.,  2016).  Indeks Kitinolitik  (IK)  dihitung  dengan  rumus  sebagai berikut (Haedar dkk., 2017) :

## IK = Diameter Zona Bening yang terbentuk Diameter Koloni 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑛𝑜𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎

## Pengukuran Kurva Pertumbuhan Actinobacteria
Inokulasikan sebanyak 2 lup isolat Actinobacteria  yang  memiliki  zona  bening  paling tinggi  kedalam  100  mL  media  cair  kitin  didalam erlenmeyer lalu di inkubasi menggunakan shaker dengan  kecepatan  130  rpm  pada  suhu  37⁰C.
Adapun  perlakuan  waktu  inkubasi  dilakukan variasi setiap 12 jam sekali selama 5 hari. Setiap jam  tersebut  diambil  1,5  ml  dan  dimasukkan kedalam  tabung eppendorf lalu  disimpan  di refrigerator .  Setelah  itu,  dihitung  menggunakan spektrofotometer untuk mengetahui jumlah koloni Actinobacteria (Pribadhi dkk., 2021).

## Produksi Enzim Ekstrak Kasar
Sebanyak 1-2 lup bakteri diinokulasi ke dalam 100 mL media cair kitin (oloidal kitin 0,3%, yeast extract 0,1%,  K 2 HPO 4 1%,  MgSO 4 7H 2 O  0.01% dan NaCl 0,1%) diinkubasi sampai waktu optimum pertumbuhan Actinobacteria pada  suhu  ruang (±27⁰C).  Kultur  disentrifugasi  pada  8.000  rpm selama  15  menit.  Supernatan  yang  diperoleh merupakan  ekstrak  kasar  kitinase  dari  isolat terpilih.  Pengendapan  kitinase  dilakukan  dengan amonium  sulfat  dengan  kadar 20-70%.  Endapan yang  diperoleh  dilarutkan  dengan  1  mL  buffer fosfat  0,1  M  pH  7,0  kemudian  dilakukan pengukuran  aktivitas  enzim  kitinase  (Nurmalinda dkk., 2020).

## Pengukuran Aktivitas Enzim kitinase
150  µL  ekstrak  kasar  enzim  kitinase ditambahkan  ke  dalam  300  µL  koloidal  kitin  dan 150 µL bufer fosfat 0,1 M pada suhu 30⁰C, pH 7 dan di vortex. Campuran diinkubasi menggunakan waterbath pada  suhu  30⁰C  selama  30  menit. Kemudian inkubasi dihentikan pada 100⁰C selama 10  menit  dan  didinginkan  selama  10  menit. Selanjutnya  campuran  disentrifugasi  pada  6.000 rpm selama 5 menit. Kemudian filtrat diambil dan ditambahkan kedalam aquades 500 µL dan 1000 µL  reagens schales (K-Ferrisianida  dan  Na- Karbodat 0,5 M) dan reaksi dihentikan pada suhu 100⁰C  selama  10  menit.  Aktivitas  enzim ditentukan  dengan  mengukur  absorbansi  pada panjang  gelombang  420  nm.  Satu  unit  aktivitas enzim  didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  yang menghasilkan 1 µmol N-asetilglukosamin (sebagai  standar)  per  menit  (Nurmalinda  dkk., 2020).  Rumus  perhitungan  aktivitas  enzim sebagai berikut:
Aktivitas enzim (U/mL)   = K x 1000 t x BM Keterangan : K     = Konsentrasi (ppm) t       = waktu inkubasi
BM  = Berat Molekul (Glc-NaC = 221, 21 g/mol)

## Uji Antagonis Actinobacteria Terhadap Ganoderma boninense Secara In vitro
Uji  antagonis  secara  in  vitro  menggunakan metode dual culture pada media Potato Dextrose Agar (PDA). Enzim kitinase dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 20 µl yang diletakkan pada 3 cm dari tempat jamur patogen yang berukuran 0,5 cm
di media PDA dengan diameter cawan petri 9 cm. Inkubasi  dilakukan  selama  10  hari  pada  suhu ruang  (±25⁰C)  (Nurmalinda  dkk.,  2020;  Suryadi dkk., 2020).
Menurut  Zivkovic  dkk.,  (2010)  secara kuantitatif  aktivitas  kitinase Actinobacteria dalam menghambat  jamur  patogen  tanaman  dapat dilihat  dari  persentase  daya  hambat  dengan kategori  0-4  (0  =  tidak  ada  daya  hambat,  1  =  1- 25%  (rendah),  2  =  26-50%  (sedang/cukup),  3  = 51-75% (tinggi) dan 4 = 76-100% (sangat tinggi). Berdasarkan  Amaria  dkk.,  (2015)  perhitungan persentase hambatan enzim kitinase Actinobacteria terhadap G.  boninense dihitung dengan rumus :
P = R1 − R2 R1 X 100%
Keterangan :
P = persentase hambatan
R1   = jari-jari koloni patogen yang tumbuh kearah berlawanan dengan isolat antagonis (mm)
R2   = jari-jari koloni patogen yang tumbuh mendekati isolat antagonis (mm)

## Analisis Data
Aktivitas kitinase Actinobacteria secara kualitatif  dan  kuantitatif  serta  persentase  daya hambat  enzim  kitinase Actinobacteria terhadap jamur  patogen tanaman dianalisis secara deskriptif kuantitatif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Actinobacteria Tanah Perkebunan Kelapa Sawit
Hasil isolasi dari tiga titik pengamatan hanya didapatkan  satu  sampel  yang  menunjukkan pertumbuhan Actinobacteria yaitu  tanah  yang berdekatan  dengan  pohon  kelapa  sawit.  Jenis tanah tempat ditemukannya bakteri Actinobacteria tersebut berjenis Tanah Merah Kekuningan (PMK) dengan kode isolat SP1 (Gambar 1). Keberadaan Actinobacteria di  lokasi  ini  disebabkan  karena pada  Tanah  Merah  Kekuningan  mendapat penambahan nutrisi dari proses pemupukan yang dilakukan  secara  rutin.  Selain  itu,  tanah  tersebut juga  memiliki  faktor  fisik  kimia  lingkungan  yang baik untuk pertumbuhan Actinobacteria . Sunarko (2014), menyatakan tanah PMK (Podsolik Merah Kuning)  merupakan  salah  satu  ekosistem  yang memiliki  potensi  sebagai  habitat  pertumbuhan Actinobacteria karena memiliki kandungan mineral yang tinggi dengan pH 4-5,5. Pada tanah merah pertumbuhan Actinobacteria menunjukkan persentase  sebesar  36%.  Hasil  pengamatan faktor  lingkungan  tanah  tersebut  memiliki  suhu 30°C  dan  pH  6  dengan  kelembapan  tanah  80%. Sesuai  dengan  Dhanasekaran  dan  Jiang  (2016) Wink  dkk  (2017),  bahwa Actinobacteria mampu tumbuh pada suhu 28-37° dengan rentang pH 4,5- 6,5.  Namun,  pertumbuhan  Actinobacteria  akan lebih  optimum  pada  pH  6,5-8,0.  Selanjutnya dilakukan  identifikasi  secara  makroskopis  dan mikroskopis.
Gambar 1. Isolat Actinobacteria (SP 1 ) tanah Perkebunan Kelapa Sawit

## Identifikasi Makroskopis dan Mikroskopis

## Actinobacteria Asal Tanah Perkebunan Kelapa Sawit
Berdasarkan  pengamatan  ciri  makroskopis dan mikroskopis yang didapatkan, diduga bakteri isolat  SP1  merupakan Actinobacteria dari  genus Streptomyces (Tabel 1).
Tabel 1. Ciri Makroskopis Actinobacteria
Ciri Makroskopis Bentuk Warna permuka an Tepi Irregular Putih kekuninga n Raissed undula te
Kemiripan  ciri  yang  ditemukan  pada  isolat SP1 ini yaitu pada bentuk dan warna koloni yang dihasilkan.  Warna  koloni  ini  muncul  disebabkan oleh  produksi  pigmen  hifa  aerial  vegetatif  yang larut dan berdifusi kedalam media. Kawuri (2016), menyatakan bahwa Streptomyces memiliki bentuk koloni  bulat  tidak  teratur  dengan  miselium  yang
memanjang  dengan  pewarnaan  koloni  kelabu, merah, putih, kuning, coklat, dan hijau. Selain itu, Madigan  dkk.,  (2011),  juga  menyatakan  bahwa warna khas yang timbul pada koloni Streptomyces disebabkan  oleh  konidia  dan  sporofor  yang berpigmen.  Sehingga,  akan  terlihat  penampakan koloni  yang  berdebu  dengan  pewarnaan  koloni kelabu,  putih,  kekuningan  dan  hijau.  Hasil pengamatan  mikroskopis  bakteri  isolat  SP1 merupakan  bakteri  gram  positif  berwarna  ungu berbentuk  coccus,  hifa  tidak  bercabang  dan memiliki hifa aseptat (tidak bersekat) (Gambar 2). Hasil  pengamatan  sesuai  dengan  Prasetya  dan Abadi  (2022),  menyatakan  bahwa Streptomyces merupakan  bakteri  gram  positif  yang  bersifat aerobik  dan  tidak  tahan  asam  dengan  karakter membentuk  percabangan  hifa  yang  kompleks, hifa tidak memiliki sekat (aseptat) dan spora aerial yang  berkumpul  membentuk  rantai  spora  yang panjang yang tersusun bergelung.
Gambar 2. Karakteristik Mikroskopik (A) Bentuk sel bakteri coccus ; (B) Hifa aseptat

## Uji Kualitatif Aktivitas Kitinolitik
Actinobacteria Asal Tanah Perkebunan

## Kelapa Sawit
Hasil pengujian aktivitas kitinolitik isolat SP1 menunjukkan bahwa isolat SP1 memiliki kemampuan  aktivitas  kitinolitik.  Adanya  aktivitas kitinolitik  ditandai  dengan  terbentuknya  zona bening  disekitar  koloni bakteri  (Gambar  3).  Zona bening  akan  semakin  terlihat  jelas  setelah penambahan larutan congo red . Congo red (C 32 H 22 N 6 O 6 S 2 Na 2 )  berfungsi mengikat  polisakarida  kompleks  dalam  hal  ini yaitu kitin yang terkandung dalam media. Menurut Suryadi  dkk.,  (2013), congo  red akan  berikatan
dengan  substrat  polimer  kitin  i katan β-1,4 dalam media  agar  sehingga  berwarna  merah.  Bagian media  kitin  agar  yang  terhodrolisis  oleh  kitinase yang menghasilkan monomer GlcNAc yang tidak memiliki ikatan β-1,4 tidak dapat diikat kuat oleh congo  red .  Kemudian          dilakukan  pembilasan menggunakan  aquades  yang  akan  melunturkan congo red , terutama di daerah sekitar koloni yang mengandung gula reduksi sehingga terlihat zona bening. Terbentuknya zona bening membuktikan bahwa isolat tersebut mampu memproduksi enzim kitinase.  Berdasarkan  zona  bening  terbentuk dapat  diketahui  indeks  kitinolitik Actinobacteria . Hasil  indeks  kitinolitik  isolat  SP1  ditunjukkan dalam tabel 2.
Gambar 3. Aktivitas Kitinolitik Isolat SP1 asal Tanah Perkebunan Kelapa Sawit. ( ↔) Menunjukkan Diameter Zona Bening dan ( ↕) Menunjukkan Diameter Koloni
Tabel 2. Perhitungan Indeks Kitinolitik Isolat SP1 Actinobacteria Tanah Perkebunan Kelapa Sawit.
Kode isolat Indeks Kitinolitik Keterangan SP1 2, 05 Tinggi
Keterangan : Indeks Kitinolitik (˂ 2 : Rendah; ≥ 2 : Tinggi)
Berdasarkan  uji  kualitatif  zona  bening  yang terbentuk  (Tabel  2),  isolat Actinobacteria SP1 memiliki indeks kitinolitik yang tinggi dengan nilai 2,05. Indeks kitinolitik dikategorikan tinggi apabila memiliki nilai ≥ 2 dan dikategorikan rendah apabila memiliki  nilai  ˂  2  (Khikmah  dkk.,  2016).  Indeks kitinolitik  yang  tinggi  menunjukkan  bahwa  isolat memiliki  kemampuan  dalam  mendegradasi  kitin. Sesuai  dengan  penelitian  Suryadi  dkk.,  (2013) bahwa  besarnya  zona  bening  yang  dihasilkan tergantung pada jumlah monomer N- asetilglukosamin  yang  dihasilkan  dari  proses hidrolisis  kitin  dengan memutuskan  ikatan  β-1,4. Semakin besar jumlah monomer yang dihasilkan maka akan semakin besar pula zona bening yang terbentuk disekitar koloni. Jika zona bening yang terbentuk  besar  maka  indeks  kitinolitiknya  juga akan tinggi.

## Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Penentuan Waktu Inkubasi Optimum Produksi Kitinase dari Actinobacteria
Tujuan  dari  pengukuran  kurva  pertumbuhan ini  yaitu  untuk  mengkondisikan  pertumbuhan bakteri  mencapai  fase log (eksponensial),  yaitu fase  dimana  bakteri  mengalami  pertumbuhan yang  pesat  dan  merupakan  fase  yang  optimal dalam  pertumbuhan  sel.  Fase log isolat  SP1 didapatkan melalui pengukuran kurva pertumbuhan  pada  substrat  media  cair  kitin
(Gambar 4).
Berdasarkan  kurva  pertumbuhan,  bakteri Actinobacteria Isolat  SP1  diinkubasi  selama  96 jam. Kurva pertumbuhan menunjukkan isolat SP1 mengalami  fase lag yang  singkat  dan  tidak memerlukan waktu yang lama untuk beradaptasi dengan  media.  Hal  ini  dikarenakan  isolat  SP1 sudah  terbiasa  tumbuh  pada  media  kitin. Kemudian,  isolat  SP1  mengalami  fase  log  pada jam  ke-0-36.    Pada  fase  ini  bakteri  mengalami pertumbuhan  yang  sangat  pesat  dan  melakukan pembelahan  sel  yang  cepat.  Pada  jam  ke-48-72 mulai terjadinya fase stasioner karena jumlah sel tidak mengalami kenaikan dan pada jam ke-84-96 sudah dapat dikatakan fase death karena jumlah sel berkurang sangat drastis. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri sudah tidak mampu mengkonsumsi media  karena  nutrisi  pada  media  sudah  mulai habis.
Gambar 4. Kurva Pertumbuhan Actinobacteria

## Isolat SP1

## Produksi dan Pemekatan EnzimEkstrak Kasar
(EEK) Kitinase Actinobacteria Isolat SP1
Optimasi waktu produksi Enzim Ekstrak Kasar (EEK)  dilakukan  untuk  mengetahui  waktu  panen
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2 8 4 9 6 A b so rb an si Waktu Inkubasi (Jam)
yang  tepat  selama  proses  produksi  enzim kitinase.  Berdasarkan  kurva  pertumbuhan  yang telah dibuat, isolat SP1 memiliki nilai tertinggi yaitu 1,904  berada  pada  jam  ke-36.  Dapat  diketahui bahwa  pada  jam  tersebut  bakteri  isolat  SP1 mengalami fase log/eksponensial. Menurut Oktavia,  dkk.,  (2018)  pada  fase  inilah  enzim kitinase  dapat  di  produksi,  karena  bakteri mengalami  pertumbuhan  yang  sangat  cepat dengan  laju  konstan  dan  aktivitas  metabolisme berada  pada  kondisi  optimum  dan  metabolisme paling  aktif.  Sehingga  pada  fase  ini  diharapkan lebih banyak enzim kitinase yang dihasilkan.
Dari  proses  ini,  didapatkan  Enzim  Estrak Kasar  (EEK)  sebanyak  150  mL.  Enzim  Ekstrak Kasar  (EEK)    yang  dihasilkan  dibagi  menjadi  2 yaitu 100 mL untuk pemekatan enzim dan 50 mL tanpa pemekatan enzim. Kedua enzim inilah yang nantinya  akan  digunakan  sebagai  uji  antagonis pada jamur Ganoderma boninense.

## Pengukuran Aktivitas EEK dan Enzim kitinase
Actinobacteria Asal   Perkebunan Kelapa Sawit
Aktivitas kitinase ditentukan secara kolorimetri  dengan  alat  spektrofotometer.  Hasil pemecahan kitin yang berupa N-asetilglukosamin (GlcNAc) digunakan sebagai standar (Gambar 5).
Gambar 5. Kurva Standar Glc-NAc
Aktivitas  kitinase  ditentukan  berdasarkan kurva  N-asetilglukosamin  yang  dibuat  dengan mengukur  absorbansi  dari  campuran  antara larutan  N-asetilglukosamin  dengan  aquades  dan reagen schales .  Satu  unit  aktivitas  enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan  1  µmol  N-asetil-D-glukosamin  per menit.  Hasil  aktivitas enzim  kitinase dapat  dilihat
pada Tabel 3.
Tabel 3. Perhitungan Aktivitas Enzim kitinase Jenis Konsentrasi (ppm) Aktivitas Enzim (U/mL) EEK SP1 0,19125 0,0288 Enzim SP1 0,19662 0,0296
Berdasarkan  nilai  aktivitas  pada  Tabel  3 diketahui  bahwa  aktivitas  enzim  kitinase  hasil pemekatan  lebih  tinggi  yaitu  0,0296  U/mL dibandingkan  dengan  EEK Actinobacteria yaitu 0,0288  U/mL.  Hal  ini  disebabkan  oleh  tingkat kemurnian  enzim  kitinase  yang  telah  dipekatkan dengan amonium sulfat 70%. Menurut Putri dkk., (2013),  penambahan  amonium  sulfat  mampu memisahkan  enzim  dari  campuran  senyawa- senyawa lainnya seperti karbohidrat, vitamin, dan lemak  sehingga  enzim  yang  dihasilkan  lebih murni.  Semakin  tinggi  nilai  aktivitas  enzim  maka semakin murni pula enzim tersebut.
Selain  kemurnian  enzim,  tingginya  aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh pH dan suhu. Pada penelitian ini pengukuran aktivitas enzim kitinase Actinobacteria menggunakan  pH  7  dengan  suhu 30°C.  Enzim  dengan  pH  yang  optimum  akan menyebabkan aktivitas enzim yang optimum juga. Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  Orinda  dkk., (2015),  yang  menunjukkan  bahwa  aktivitas kitinase bakteri asal limbah kulit udang meningkat dengan  pH  mencapai  6,5  dan  suhu  25-45°C dengan  aktivitas  kitinase  sebesar  0,09  U/mg. Penelitian  Hardi  dkk.,  (2016),  juga  menyatakan aktivitas enzim kitinase isolat B1211 dengan suhu 30°C  memiliki  aktivitas  tertinggi  sebesar  0,  75 U/mL.

## Kemampuan Daya Hambat EEK dan Enzim Kitinase bakteri Actinobacteria terhadap Ganoderma boninense
Hasil  uji  daya  hambat  menunjukkan  bahwa EEK  dan  enzim  kitinase Actinobacteria hasil pemekatan isolat  SP1  memiliki  kemampuan dalam  menghambat  pertumbuhan Ganoderma boninense .  Pertumbuhan G.  boninense akan terganggu akibat adanya EEK dan enzim kitinase Actinobacteria hasil pemekatan yang ditumbuhkan bersama pada media jika dibandingkan dengan kontrol positif antibiotik dan kontrol negatif aquades, dan diinkubasi selama 10 hari (Gambar 6).
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 O 0 , 0 3 0 , 0 6 0 , 0 9 0 , 1 2 0 , 1 5 0 , 1 8 0 , 2 1 A b so rb an si Konsentrasi (ppm )
Gambar 6. Kemampuan Daya Hambat Actinobacteria Terhadap G. boninense (A). EEK Actinobacteria dan G. boninense ; (B) Enzim kitinase hasil pemekatan dan G.boninense ; (C). Antibiotik dan G. boninense ; (D) Kontrol aquades.
Berdasarkan data yang didapatkan, diketahui bahwa  EEK  dan  enzim  kitinase Actinobacteria hasil  pemekatan  memiliki  kemampuan  daya hambat  yang  tinggi  terhadap G.  boninense . Persentase  daya  hambat  menggunakan  enzim kitinase hasil pemekatan memiliki nilai lebih tinggi yaitu  57,3%  dibandingkan  dengan  daya  hambat menggunakan EEK yaitu 56,6%.
Persentase daya hambat yang dihasilkan oleh EEK  dan  enzim  kitinase Actinobacteria hasil pemekatan  terhadap G.  boninense berbanding lurus  dengan  pengukuran  aktivitas  enzimnya. Aktivitas  enzim  kitinase Actinobacteria hasil pemekatan memiliki nilai lebih tinggi yaitu 0,0296 U/mL  dibandingkan  dengan  aktivitas  EEK Actinobacteria yaitu 0,0288 U/mL. Semakin tinggi nilai aktivitas enzim maka semakin tinggi pula nilai kemurniannya  serta  memiliki  kemampuan  yang baik  dalam  menghambat  jamur  patogen.  Hal  ini sesuai  dengan  Yuniati  dkk.,  (2015),  Guo  dkk., (2019),  yang  menyatakan  bahwa  semakin  tinggi aktivitas  enzim  maka  semakin tinggi  pula  tingkat kemurnian enzim tersebut serta aktivitas antifungal  yang  disebabkan  oleh Actinobacteria kitinolitik  akan  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan aktivitas antifungal Actinobacteria non-kitinolitik. Mekanisme  penghambatan  oleh  EEK  dan enzim  kitinase Actinobacteria hasil  pemekatan dapat diketahui  melalui  pengamatan  secara
makroskopis dan mikroskopis. Mekanisme antibiosis secara makroskopis ditunjukkan dengan  terbentuknya  zona  hambatan  disekitar EEK  dan  enzim  kitinase Actinobacteria hasil pemekatan (Gambar 6).
Mekanisme  antibiosis  oleh  EEK  dan  enzim kitinase Actinobacteria hasil  pemekatan  dapat menyebabkan  perubahan  bentuk  hifa  jamur patogen G.  boninense .  Untuk  memperjelas  hal tersebut dapat dilakukan pengamatan hifa secara mikroskopis.  Kerusakan  hifa  yang  disebabkan mekanisme  antibiosis  oleh  EEK  dan  enzim kitinase Actinobacteria isolat  SP1  yaitu  hifa bercabang,  hifa  melengkung,  hifa  melilit,  hifa membesar,  hifa  berkelok,  dan  hifa  keriting (Gambar  10).  Kerusakan  hifa  inilah  yang menyebabkan pertumbuhan G. boninense terhambat.  Hal  ini  sesuai  dengan  Hanif  dkk., (2012),  yang  menyebutkan  bahwa  mekanisme penghambatan jamur patogen oleh mikroorganisme dapat menyebakan abnormalitas hifa seperti pembengkokan ujung hifa, hifa pecah, hifa  melilit,  hifa  melengkung,  hifa  terbelah,  hifa bercabang, hifa lisis dan hifa kerdil.
Berdasarkan  kerusakan  hifa G.  boninense pada gambar 7, menunjukkan bahwa penghambatan  menggunakan  enzim  kitinase Actinobacteria hasil  pemekatan  lebih  baik dibandingkan dengan
penghambatan
A B
C
D
menggunakan  EEK Actinobacteria .  Hal  ini  dapat dilihat dari penampakan kerusakan hifa G.boninense oleh enzim kitinase hasil pemekatan yang  lebih  rusak  dan  tidak  beraturan.  Hasil pengamatan membuktikan semakin tinggi kemurnian  enzim  maka  semakin  tinggi  aktivitas enzim yang berakibat banyaknya kerusakan pada hifa G.  boninense yang  mempengaruhi  daya pertumbuhan G.  boninense itu  sendiri.  Menurut Sriyanti  dkk.,  (2015)  Pangemanan  dkk.,  (2020),
enzim kitinase menyebabkan terjadinya abnormalitas  hifa  jamur  patogen  tanaman  dan efektif  menghambat  pertumbuhan  jamur.  Enzim kitinase merupakan enzim hidrolitik yang menghidrolisis  ikatan  β-1,4  antar  subunit  N- asetilglukosamin  (GlcNAc)  pada  polimer  kitin rusaknya polimer kitin yang merupakan salah satu komponen  dinding  sel  jamur  patogen  tanaman dapat  menghambat  pertumbuhan  jamur  patogen tanaman.
Gambar 7. Pengamatan Mikroskopis Hifa Abnormal G. boninense . Daya Hambat EEK Actinobacteria terhadap G.boninense (a)  hifa  normal;  (b)  hifa  bercabang;  (c)  hifa  melilit;  (d)  hifa  membesar.  Daya Hambat Enzim kitinase Actinobacteria Hasil Pemekatan Terhadap G. boninense (e) hifa bercabang; (f) hifa membesar/membengkak; (g) hifa berkelok; (h) hifa keriting.

## KESIMPULAN
Enzim  Ekstrak  Kasar  (EEK)  dan  enzim kitinase Actinobacteria hasil  pemekatan  memiliki aktivitas  enzim  yang  tinggi.  Akan  tetapi,  aktivitas enzim  kitinase  hasil  pemekatan  lebih  tinggi  yaitu 0,0296 U/mL dibandingkan dengan EEK Actinobacteria yaitu 0,0288 U/mL. Enzim kitinase Actinobacteria memiliki kemampuan dalam menghambat  pertumbuhan  jamur  patogen G. boninense . Persentase daya hambat menggunakan  enzim  kitinase  hasil  pemekatan memiliki nilai lebih tinggi yaitu 57,3% dibandingkan dengan daya hambat menggunakan EEK yaitu 56,6%.

## DAFTAR PUSTAKA
Amaria,  W.,  R.  Harni  dan  Samsudin.  2015.
Evaluasi Jamur Antagonis dalam
Menghambat  Pertumbuhan Rigidoporus microsporus Penyebab  Penyakit  Jamur Akar  Putih  pada  Tanaman  Karet. J.  TIDP .
Vol. 2 (1) : 51-60. Amanullah R., M. Bahar, H. Muktamiroh dan O. Sandra. 2020. Aktivitas Isolat Actinomycetes Dari  Tanah  Kebun  Raya Bogor Sebagai Antifungi Terhadap
Pertumbuhan Candida  albicans Secara  In Vitro. Bioeduscience . Vol. 4 (1) : 90-96.
Dhanasekaran dan Y. Jiang. 2016. Actinobacteria : Basics and Biotechnological  Applications .  Croatia  : InTech.
Fathurahman,  A.  T.  2019. Actinobacteria :
Sumber  Biokatalis  Baru  yang  Potensial. BioTrends . Vol. 10 (1) : 28-35.
Guo,  X.,  N.  Liu.,  X.  Li.,  Y.  Ding.,  F.  Shang.,  Y. Gao.,  J.  Ruang  dan  Y.  Huang.  2015.  Red
Soils Harbor Diverse Culturable Actinomycetes Thatare Promising Sources of  Novel  Secondary  Metabolites. Applied and Enviromental Microbiology . Vol. 81 (9)
: 3086-3103.
Haedar, N., H. Natsir., Fahruddin dan W. Aryanti. 2017.  Produksi  dan  Karakterisasi  Enzim kitinase  dari  Bakteri  Kitinolitik  Asal  Kerang Andara  granosa. Jurnal  Ilmu  Alam  dan
Lingkungan . Vol. 8 (15) : 14-21.
Hanif, A., D. Suryanto dan I. Nurwahyuni. 2012.
Pemanfaatan  Bakteri  Kitinolitik  dalam Menghambat  Pertumbuhan Curvularia sp. Penyebab  Penyakit  Bercak  Daun  pada Tanaman Mentimun. Jurnal USU . Vol. 1 (1) : 1- 7.
Hardi, J., Jusman., A. R. Razak dan Silva. 2016. Produksi  dan  Uji  Aktivitas  Enzim  kitinase dari Isolat Bakteri Termofilik B1211 Asal Air Panas Bora. KOVALEN . Vol. 2 (3) : 67-72. Khikmah, N., S. Margino dan R. S. Kasiamdari. 2016.  Isolasi,  Seleksi  dan  Identifikasi Kapang Kitinolitik yang diisolasi dari Tanah Pembuangan Limbah Udang dan Rhizosfer Solanaceae. Biota . Vol. 1 (1) : 1-8. Madigan, M. T., J. M. Martinko., D. A. Stahl dan D.  P.  Clark.  2011. Brock  Biology  Of Microorganisms . San Fransisco : Benjamin Cummings, Pearson.
Nafiah,  H.,  S.  Pujiyanto  dan  B.  Raharjo.  2017. Isolasi  Uji  Aktivitas  Kitinase  Isolat  Bakteri Dari Kawasan Geoternal Dieng. Bioma . Vol. 19 (1) : 22-29.
Nurmalinda, A., N. R. Mubarik dan L. Sudirman. 2020.  Seleksi  dan  Karakterisasi  Bakteri
Penghasil Kitinase Penghambat Pertumbuhan Cendawan Patogen Tanaman. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia . Vol. 25 (1) : 35-42.
Oktavia, Y., S. D. Lestari., S. Lestari., Herpandi dan  M.  Jannah.  2018.  Optimasi  Waktu Inkubasi  Produksi  Protease  dan  Amilase
Isolat  Bakteri  Asal  Ikan  Teri Stolephorus
sp .. Jurnal  Ilmu  dan  Teknologi  Kelautan Tropis . Vol. 10 (3) : 719-725.
Orinda,  E.,  I.  D.  Puspita.,  M.  P.  Putra.,  Ustadi dan  I.  Y.  B.  Lelana.  2015.  Aktivitas  Enzim Pendegradasi  Kitin  Dari  Isolat  SDI23  Asal Petis  Serta  Karakterisasi  ph  dan  Suhu Aktivitas  Enzim  Hasil  Purifikasi  Parsial. Jurnal Perikanan . Vol. 17 (2) : 96-102.
Pangemanan, F. E., I. B. G. Darmayasa dan J. Wiryanto.  2020.  Potensi  Enzim  kitinase Yang  Dihasilkan  Bakteri  Kitinolitik  Yang  Di Isolasi  Dari  Limbah  Kulit  Udang  Sebagai Kandidat Biokontrol Dalam Mengendalikan Hama Penyakit Tanaman. SIMBIOSIS . Vol.
8 (1) : 1-8.
Parwati, P. A., R. Kawuri dan N. L. Watiningsih. 2018. Isolasi dan Identifikasi Streptomyces spp. Penghasil Enzim kitinase Dari Lumpur Selokan. JURNAL METAMORFOSA. Vol. 5 (2) : 99-104.
Yuniati, R., T. T. Nugroho dan F. Puspita. 2015. Uji  Aktivitas  Enzim  Protease  Dari  Isolat Bacillus sp. Galur Lokal Riau. JOM FMIPA. Vol. 1 (2) : 116-122.
Zivkovic,  S.,  S.  Stojanovic.,  Z.  Ivanovic.,  V. Gavrilovic.,  T.  Popovicand  J.  Balaz.  2010. Screening  of  Antagonistic  Activity  of Microorganisms  against  Collectotrichum acutatum and Collectotrichum gloeosporioides. Arch. Biol. Sci. Vol. 62 (3) : 611-623