## ISOLASI PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS (PBMCS) DARI DARAH MANUSIA SEHAT DENGAN METODE SENTRIFUGASI GRADIEN FICOLL
Siti Warnasih 1 ,W.Yulia 2 , B.Yohan 3 , I.M. Artika 4 , R.T. Sasmono 5
1 Program Studi Kimia, FMIPA, Universitas Pakuan
2 Faculty of Medicine, Syiah Kuala University, Aceh, 23111, Indonesia 3,4,5 Eijkman Institute for Molecular Biology, Jakarta, 10430, Indonesia
Email : siti.warnasih11@gmail.com

## ABSTRACT
Peripheral  blood  sel  mononuclear  cell  (PBMC)  is  a  white  blood  cell  that  can  be isolated  using  the  gradient  centrifugation  method.  Ficoll  is  a  reactant  which  can  be  used  in this  method  because  it  produce  a  high  viability  i.e.  97.1%  ±  1.0%.  This  research  aims  to isolate PBMC from healthy human blood. PBMC’s result  is used for analysis of dengue virus immune response.Dengue viruses infect PBMC, so going on the secretion of cytokine which is one  marker  of  severity  of  dengue  disease.  Expression  of  cytokines  can  be  measured  using quantitative real-time reverse transcription – polymerase chain reaction (qRT-PCR).Venous blood  from  healthy  human  is  takenaseptically  using  anticoagulants  heparin,  then  PBMC  is isolated with ficoll gradient centrifugation method to produce buffy coat that contain PBMC. Viability of PBMC is calculated using hemositometer with the help of a microscope.Based on the  results  obtained  by  PBMC  isolation  per  mL  of  venous  blood  that  is  2,  08x106  up  to  2, 61x106  with  an  average  of  2,  i.e.  31x106  withviabilityof  95-99%.  These  results  indicate  that this method is quite effective in isolating PBMC from healthy human blood.
Keyword : blood, ficoll, centrifugasigradien, PBMCs

## PENDAHULUAN
Penyakit  dengue  ialah  penyakit yang  disebabkan  oleh  virus  dengue  yang ditularkan  melalui  gigitan  nyamuk Aedes aegypti dan Aedes  albopictus (Gubler, 1998).  Virus  dengue  dapat  bereplikasi dalam  darah  khususnya  sel  mononuklear/ PBMC  sehingga  akan  terjadi  suatu  respon imun (Kou et al. 2008; Sun et al. 2013).
PBMC  merupakan  sel  darah  putih yang    memiliki    inti  tunggal  berbentuk bulat, terdiri atas sel limfosit T, sel limfosit B,  sel natural  killer (NK),  dan  monosit (Delves et al. 2006). Sel-sel ini merupakan komponen  penting  dari  sistem  kekebalan tubuh  yang  terlibat  dalam  imunitas humoral  dan  seluler.  Sel  mononuklear banyak  digunakan  dalam  penelitian  dan aplikasi  klinis  seperti  dalam  bidang mikrobiologi, virologi, onkologi,
pengembangan  vaksin,  transplantasi  dan biologi regeneratif, dan toksikologi.
Salah  satu  cara  pemisahan  PBMC dari  komponen-komponen  lain  pada  darah adalah  menggunakan  metode  sentrifugasi gradien.  Prinsip  sentrifugasi  didasarkan atas  fenomena  bahwa  partikel  yang tersuspensi  di  dalam  suatu  wadah  (tabung atau  bentuk-bentuk  lain)  akan  mengendap ke  dasar  wadah  karena  pengaruh  gravitasi. Laju pengendapan tersebut dapat ditingkatkan  dengan  cara  meningkatkan pengaruh  gravitasional  terhadap  partikel. Hal ini dapat dilakukan dengan menempatkan tabung berisi suspensi partikel  ke  dalam  rotor  suatu  mesin sentrifugasi  kemudian  diputar  dengan kecepatan tinggi (Yuwono, 2010).
Percoll  dan  ficoll  merupakan    media yang  dapat  digunakan  pada  sentrifugasi gradien untuk isolaai PBMC. Percoll terdiri
dari  partikel-partikel  silika  yang  dilapisi PVP ( polyvinyl pyrollidine ) yang mempunyai  densitas  1,130 g/mL (Almeida et  al. 2000).  Ficoll  berupa  larutan  yang mengandung  polisukrosa  dan  natrium diatrizoatyang  mempunyai  densitas  1,077 g/mL. (Graham 2002; Bahunde et al . 2013; Healthcare 2014).
Fungsi natrium diatrizoat  adalah  untuk  mengoptimalkan densitas dan osmolaritas sehingga pemisahan  sel-sel  lebih  efisien.  Penelitian Chang et  al. tahun  2009  yang  mengisolasi hMSCs  ( human  Mesenchymal  Stem  Cells ) dari  sumsum  tulang  menyatakan  bahwa penggunaan ficoll menghasilkan yield yang lebih banyak dibandingkan jika mengguna- kan percoll.
Berdasarkan  hal  tersebut,  maka penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi PBMC dari darah manusia sehat menggunakan  metode  sentrifugasi  gradien ficoll.  PBMC  hasil  isolasi  kemudian  akan digunakan  pada  penelitian  selanjutnya untuk analisis respon imun virus dengue.

## BAHAN DAN METODE Bahan
Sel  PBMC  berasal  dari  manusia sehat.  Pengambilan  darah  vena  dilakukan secara  aseptik.  Medium  yang  digunakan adalah  1X  RPMI  1640  mengandung  2m M L-glutamine dan  disupplementasi  2% (v/v) Fetal  Bovine  Serum /FBS,  100U/mL Penicillin dan 100µg/mL Streptomycin [Gibco-Invirogen]. Bahan lain adalah ficoll [Histopaque,  Sigma  Aldrich];  1X  0,25% Tripsin-EDTA  [Gibco],  1X Dulbecco s Phosphate  Buffer  Saline (D-PBS)  pH  7,4 tanpa  CaCl 2 dan  MgCl 2 [Gibco], trypan blue [Sigma];  70%  etanol  [Merck];  dan 10% bleach [Vesphene].
Metode Metode  isolasi  PBMC  berdasarkan pada  Bahunde et  al. 2013  yang  telah dimodifikasi.  Darah  vena  donor  sehat diambil  secara  aseptic  (daerah  yang  akan diambil  darah  dibersihkan  dengan  alkohol dan  pengambilan  darah  menggunakan
jarum suntik steril) dan dengan penambahan  antikoagulan  heparin  dalam tabung Vacuette. Darah diencerkan dengan 1X      D-PBS  pH  7,2  dengan  perbandingan 1:1  dalam  tabung  sentrifugasi  50mL  dan dihomogenisasi.  Lalu  dipindahkan  ke dalam  tabung  sentrifugasi  baru  dan ditambahkan  larutan  ficoll  sebanyak  1:1 menggunakan spuit sehingga terbentuk dua fase cairan. Kemudian disentrifugasi dengan  kecepatan  400  x g pada  suhu  20 o C selama  40  menit  pada  alat refrigerated centrifuge tipe  Universal  320R.  Bagian buffy  coat yang  berisi  PBMC  diambil dengan menggunakan pipet transfer kapasitas  3  mL.  PBMC  dipindahkan kedalam  tabung  sentrifugasi  baru  dan dilakukan  pencucian  menggunakan  1X D-PBS  pH  7,2  sebanyak  3  kali  volume buffy  coat yang  didapat  dan  disentrifugasi lagi dengan kecepatan 300 x g , 4 o C selama 10  menit.  Supernatan  kemudian  dibuang. Proses  tersebut  diulang  hingga  2  kali. Jumlah  sel  PBMC  dihitung  dengan menggunakan haemocytometer dan viabilitas sel PBMC ditentukan menggunakan  pewarnaan trypan  blue .  Sel PBMC dikultur didalam tabung sentrifugasi  15  mL  dalam  medium  1X RPMI  1640  dengan  suplementasi  10  % FBS,  2  mM  l-glutamin,  100  U/mL Penisilin,  dan  100  µg/mL  Streptomisin diinkubasi pada suhu 37°C, 5% CO 2 .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebelum  isolasi  PBMC  dilakukan, agar sampel darah tidak menggumpal maka perlu  ditambahkan  antikoagulan.  Heparin, EDTA, sitrat, acid citrate dextrose (ACD), dan citrate  phosphate  dextrose (CPD) dapat  digunakan  sebagai  antikoagulan untuk  sampel  darah  (Boyum,  1976).  Pada penelitian  ini  antikoagulan  yang  dipakai adalah heparin. Hal ini karena antikoagulan heparin  tidak  mempengaruhi  morfologi  sel yang  ada  dalam  darah,  yaitu  eritrosit, trombosit, maupun leukosit yang merupakan target isolasi.
Gambar1 . Proses isolasi PBMC dengan menggunakan metode sentrifugasi gradient ficoll. A. Sebelum dilakukan sentrifugasi,  B. Telah dilakukan sentrifugasi.
Isolasi  PBMC  dilakukan  mengguna- kan  metode  sentrifugasi  gradient  ficoll (Gambar1).  Metode  sentrifugasi  gradien ficoll merupakan metode pemisahan berdasarkan  pada  perbedaan  densitas. Proses  sentrifugasi  menghasilkan  bagian cincin  yang  putih  keruh  disebut  dengan buffy  coat yang  berisi  sel  PBMC. Buffy coat terletak  diantara  plasma  danficoll. Eritrosit  yang  mempunyai  densitas  yang besar  berada  di  lapisan  paling  bawah, sedangkan  plasma  yang  berdensitas  kecil berada di lapisan paling atas.
Sel  PBMC  yang  didapat  dari  hasil isolasi  kemudian  dihitung  jumlah  dan viabilitasnya  menggunakan hemositometer dan  pewarnaan trypan  blue .  Di  dalam hemositometer  terdapat  10  kamar  hitung dan  seluruh  sel  yang  terdapat  di  dalam kamar  hitung  tersebut  dijumlahkan.S  el yang  berwarna  putih  merupakan  sel  yang hidup atau viabel, sedangkan yang berwarna birua dalah sel yang mati. Untuk mengetahui persentasi viabilitas sel, dilakukan  perhitungan  dengan  memban- dingkan  jumlah  sel  yang  berwarna  putih dibandingkan  dengan  total  sel  yang  ada. Isolasi darah menggunakan metode sentrifugasi  gradient  ficoll  memungkinkan untuk  mendapatkan  sel  PBMC  yang  dapat digunakan  untuk  analisis  mengenai  system imun. Sel PBMC yang dihasilkan diinfeksi
oleh  virus  dengue,  yang  mengakibatkan terjadinya  respon,  yaitu  adanya  sekresi sitokin  (Noisakran et  al. 2010;Kou et  al. 2008).  Sitokin  merupakan  protein  sistem imun yang mengatur interaksi antar sel dan memacu  reaktivitas  imun,  baik  pada imunitas  bawaan  maupun  adaptif.  Sitokin merupakan protein pembawa pesan kimiawi  atau  perantara  dalam  komunikasi antar  sel  yang  sangat  poten.  Jadi  sitokin berperan  dalam  aktivasi  sel.  B,  monosit, makrofag,  inflamasi  dan  induksi  sito toksisitas  (Abbas et  al. 2012).  Produksi sitokin  yang  terjadi  akibat  infeksi  virus dengue  pada  sel  imun  memiliki  kontribusi pada terjadinya manifesta siklinis penyakit.
Hasil  perhitungan  jumlah  PBMC yang  didapat  dari  enam  kali  isolasi  darah vena  manusia  didapatkan  hasil  isolasi berkisar  antara  2,08x10 6 hingga  2,61x10 6 dengan  rata-rata  yaitu  2,31x10 6 PBMC/mL darah  vena  dengan  viabilitas  95-99%.  Hal ini  menunjukan  bahwa  metode  yang digunakan  untuk  mengisolasi  PBMC  dari darah  manusia  sehat  sangat  efektif,  sesuai dengan penelitian Nilsson et al. 2008 yang menyatakan  jumlah  PBMC  darah  vena manusia  sekitar  1,27  ±  0,4  juta  sel/mL darah yang diisolasi menggunakan sentrifugasi gradien ficoll dengan viabilitas 97,1 %  ± 1,0 %.
A
Tabel 1. Hasil perhitungan jumlah PBMC
Percobaan Volume darah vena (mL) Sel PBMC per mL darah (PBMC/mL) Viabilitas (%) 1 25 2,17 x 10 6 95 2 50 2,08 x 10 6 97 3 60 2,61 x 10 6 96 4 70 2,37 x 10 6 98 5 100 2,42 x 10 6 97 6 150 2,20 x 10 6 99 Rata-rata 2,31 x 10 6 97 Hal  iniseperti  yang  sudah  pernahd ilaporkan oleh beberapa peneliti sebelumnya    bahwa  prosedur  isolasi  ini memiliki angka viabilitas sel yang konsisten dan cukup reproduktif (Nilsson et al. 2008;  Bahunde  et  al.  2013).  Percobaan untuk  mendapatkan  jumlah  PBMC  yang optimal  dilakukan  beberapa  kali    dengan hasil yang terlihat pada Tabel 1.
Morfologi PBMC hasil isolasi menggunakan mikroskop cahaya ditampilkan  pada  Gambar  2.  Berdasarkan hasil  tersebut  didapatkan  PBMC  yang berbentuk  bulat  seperti  bola  dan  bersel tunggal.  Hasil  ini  sesuai  dengan  yang dikemukan Delves et al. 2006.
PBMC  manusia  terdiri  atas  70  % sellimfosit  T,  15  %  limfosit  B,  10  % sel natural  killer (NK),  5  %  monositdan  1
%  sel  dendritik  (Delves et  al. 2006).
Secara in  vitro ,  makro  fag  bias  diperoleh dengan  mengisolasi  monosit  dari  PBMC yang  jumlahnya  sekitar  5  %  dari  sel tersebut.  Makrofag  yang  di  diferensiasi secara in  vitro biasad  isebut  dengan monocyte  derived  macrophages (MDM). Sel PBMC dan MDM adalah sel imun yang merupakan target awal infeksi virus dengue (Warke et  al. 2003;  Kou et  al. 2008; Becerra et al. 2009).
Gambar 2. Morfologi PBMC dengan mikroskop cahaya pembesaran lensa objektif 20x dan 40x

## SIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat disimpulkan  bahwa  metode  sentrifugasi gradien  ficoll  sangat  efektif  digunakan untuk  mengisolasi  PBMC  dari  darah manusia  sehat.  Jumlah  PBMC  yang dihasilkan  pun  cukup  banyak,  sehingga dapat  digunakan  untuk  keperluan  analisis respon imun virus dengue.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  Laboratorium Dengue,    Lembaga  Biologi  Molekuler ijkman.

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas  AK,  Lichtman  AH,  Pillai  S.  2012. Cellularand Molecular Immu nology.    7 th ed.  United  States  of
America: Elsevier.
Almeida,  M.C.,  Silva,  A.C.,  Barral,  A., Netto,  M.B.  2000.  A  simple Method for human peripheral blood monocyte  isolation.  Mem  Inst Oswaldo Cruz. 95(2):221-223.
Bahunde,  F.,  Awoyode,  R.,  Fields,  B., McLean,  P.,  Tambwe,  C.,  Johnson, N.  2013.  Creating  Evidence-based Procedures Out of Establised
Processes:  Validation  of  Ficoll- Plaque TM Centrifugation for  Isolation of  Peripheral  Blood  Mononuclear Cells.  In  Precision  Bioservices,  Inc.
Frederick.  MD  Viability  and  Purity of Cell.
Beccera,  A.,  Warke,  R.V.,  Martin,  K., Xhaja,  K.,  de  Bosch,  N.,  Rothman, A.L., Bosch, I. 2009. Gene expression  profiling of  dengue infected human primary cells identifies secreted mediators in vivo. J Med Virol. 81(8):1403-1411.
Boyum,  A.,  Scand.1976.  Isolation  of lymphocytes, granulocytes and macrophages.  J  ImmunolSuppl . 5: 9–15.
Chang,  Y.,  Hsieh,  P-H.,  Chao,  C.C-K. 2009. The efficiency of  percoll and ficoll  density  gradient  media  inthe isolation  of  marrow  derived  human mesenchymal stemcells with osteogenic  potential.  Med  J.  32(3): 264-274.
Delves,  P.J.,  Martin,  S.J.,  Burton,  D.R., Roitt,  I.M.  2006. Roitt’s  Essential Immunology .  11 th ed.  Blackwell Publishing.
Graham  JM.  2002.  Isolation  of  peripheral blood  mononuclear  cells  from macaques  on  a  density  barrier.  The Scientific  World  Journal 2:1654– 1656. Gubler,  D.J.  1998.  Dengue  and  dengue hemorrhagic fever. Clinical
Microbiology  Reviews . 11(3):480- 498.
Healthcare GE. 2014. Isolation of mononuclear cells; Methodology and applications. GE Healthcare.
Kou,  Z.,  Quinn,  M.,  Chen,  H.,  Rodrigo, W.W., Rose, R.C., Schlesinger, J.J., Jin, X . 2008. Monocytes, but not T or  B  cells,  are  the  principal  target cells  for  dengue  virus  (DV) infection  among  human  peripheral blood  mono  nuclear  cells.  J  Med. Virol . 80: 134-146.
Nilsson,  C.,Aboud,  S.,  Karle´n,  K.,
Hejdeman, B., Urassa, W., Biberfeld,  G.  2008.  Optimal  Blood Mononuclear Cell Isolation Procedures  for  Gamma  Interferon Enzyme-Linked Immuno spot
Testing  of  Healthy  Swedish  and Tanzanian  Subjects.  Clinical  and Vaccine  Immunology.  15(4):585- 589.
Noisakran,  S.,  Onlamoon,  N.,  Song prakhon,  P.,  Hsiao,  H-M.,  Choke phaibulkit,  K.,  Perng,  G.C.  2010. Cells  in  dengue  virus  infection in vivo . Adv Virol . Article ID 164878,
15 pages.
Sun,  P.,  Kochel,  T.J.  2013.  The  Battle between Infection and Host Immune  Responses  of  Dengue Virus and Its Implication in Dengue Disease Pathogenesis. Sci World J.
Warke,  R.V.,  Xhaja,  K.,  Martin,  K.J.,
Fournier, M.F., Shaw, S.K., Brizuela,  N., et  al. 2003.  Dengue virus  induces  novel  change  in  gene expression of human umbilical vein endothelial  cells . J  Virol.  7(21):
11822-11832.
Yuwono, T. 2010.  Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga