Optimasi Variasi Sumber Karbon dan Nitrogen Isolat Bakteri Endofitik dari Tanaman Bruguiera gymnorrhiza dalam Menghasilkan Crude Enzim Protease
Anthoni Agustien (1*), Yetti Marlida (2), Miftahul Zovia (1)
1 Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Andalas
2 Jurusan Nutrisi dan Makanan Ternak, Fakultas Peternakan, Universitas Andalas
anthoniagustien@sci.unand.ac.id (1*), yettimarlida@ansci.unand.ac.id (2), miftahulzoviaa20@gmail.com (3)

## ABSTRAK
Enzim  protease  merupakan  salah  satu  enzim  komersial  yang  memiliki  berbagai  manfaat  dan  aplikasi  pada bidang  industri.  Enzim  protease  dapat  dihasilkan  oleh  mikroorganisme  dan  dapat  dilakukan  optimasi  untuk menghasilkan  aktivitas  enzim  yang  optimum.  Tujuan  penelitian  adalah  untuk  mengetahui  jenis  sumber karbon  dan  sumber  nitrogen  terbaik  dalam  menghasilkan  enzim  protease.  Penelitian  ini  dilakukan  dengan metode eksperimen menggunakan beberapa variasi jenis sumber karbon dan nitrogen untuk melihat aktivitas enzim  protease  melalui  ekstrak  kasar  enzim  ( crude  enzyme  extract) yang  dihasilkan.  Hasil  didapatkan  dari penelitian  ini  adalah  sumber  karbon  yang  terbaik  berupa  maltosa,  sedangkan  sumber  nitrogen  terbaik merupakan kalium nitrat (KNO 3 ) konsentrasi 1% (v/v), dengan aktivitas protease sebesar 1,136 U/mL.
Kata Kunci : Bakteri, Endofitik, Karbon, Nitrogen, Protease

## ABSTRACT
The  protease  enzyme  is  a  commercial  enzyme  that  has  various  benefits  and  applications  in  the  industrial sector. Protease enzymes can be produced by microorganisms and optimization can be carried out to produce optimum enzyme activity. The aim of the research is to determine the best type of carbon source and nitrogen source  in  producing  protease  enzymes.  This  research  was  carried  out  using  experimental  methods  using several variations of carbon and nitrogen sources to see protease enzyme activity from crude enzyme extract that  produced. The  results  obtained  from  this  research  are that  the  best  carbon  source  is  maltose,  while  the best nitrogen source is potassium nitrate (KNO 3 ) concentration 1% (v/v), with the protease activity of 1,136 U/mL.
Keywords :  Bacteria, Endophytic, Carbon, Nitrogen, Protease
Agustien  A, Marlida Y, Zovia M  : Optimasi  Variasi Sumber Karbon Dan Nitrogen Isolat Bakteri  Endofitik  Dari  Tanaman Bruguiera  gymnorrhiza Dalam  Menghasilkan Crude Enzim Protease

## I. PENDAHULUAN

## 1. Latar Belakang
Enzim merupakan senyawa protein yang berfungsi sebagai katalis alami. Salah satu enzim yang  paling  berpengaruh  pada  bidang  industri  adalah  enzim  protease  (Sutay  Kocabaş  & Grumet,  2019).  Protease  merupakan  enzim  yang  berperan  penting  dalam  menghidrolisis protein  menjadi  senyawa  yang  lebih  sederhana  seperti  peptida  dan  asam  amino  sehingga menjadi  enzim  komersial  yang  memiliki  banyak  manfaat  di  bidang  industri.    Enzim protease menempati sekitar 60% dari total penjualan enzim di dunia (Razzaq et al., 2019). Protease memainkan peran penting dalam bidang kesehatan, karena mampu meningkatkan daya  cerna  dan  mempercepat  recovery  atau  penyembuhan  luka  pada  sistem  pencernaan yang  mengalami  defisiensi  enzim,  sehingga  protease  dapat  menjadi  komponen  utama penyusun obat oral pencernaan  (Agustien et al., 2024). Protease sebagian besar diperoleh dari  tanaman  dan  hewan,  namun  keterbatasan  sumberdaya,  dan  bioethics  menjadi  suatu hambatan.  Dengan  demikian,  protease  yang  berasal  dari  mikroorganisme  menjadi perhatian  karena  dapat  mensintesis  enzim  skala  besar  dengan  tingkat  hasil  yang  tinggi. Hampir  dua  pertiga  dari  protease  komersial  di  pasar  dunia  saat  ini  berasal  dari mikroorganisme  (Gurumallesh  et  al.,  2019).  Bakteri  endofitik  adalah  bakteri  yang  dapat membentuk  koloni  dalam  jaringan  internal  tumbuhan.  Bakteri  endofitik  dapat menghasilkan enzim sebagai hasil metabolit primernya. Bakteri endofitik dianggap sebagai sumber penting enzim ekstraseluler, beberapa penelitian telah menghasilkan enzim seperti protease,  amilase,  selulase,  asparaginase,  dan  lain-lain  (Lestari  et  al.,  2019).  Bakteri endofitik  menghasilkan  enzim  hidrolitik  untuk  melawan  mikroba  patogen  tanaman  dan dapat  menjadi  alternatif  untuk  mengatasi  resistensi  obat  kimia,  selain  itu  pertumbuhan bakteri  endofitik  dapat  ditingkatkan  melalui  optimasi  dengan  merekayasa  lingkungan ekstrinsiknya  seperti  komposisi  medium,  seperti  sumber  karbon  dan  nitrogen  sehingga produksi  enzim  yang  dihasilkan  lebih  optimum  (Agustien  et  al.,  2018). Sumber  karbon diperlukan bakteri dalam metabolism sedangan nitrogen penting dalam menjaga kestabilan sel  dan  sintesis  protein.  Sumber  karbon  dan  nitrogen  dapat  mempengaruhi  kelangsungan hidup mikroorganisme sekaligus mempengaruhi produksi enzim sebagai produk metabolit primer  mikroorganisme.  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  penting  dilakukan  untuk mengetahui  jenis  sumber  karbon  dan  nitrogen  yang  baik  dan  optimum  bagi mikroorganisme  endofitik Bruguiera  gymnorrhiza dalam  memproduksi  ekstrak  kasar enzim protease.
2. Perumusan Masalah
Pada penelitian ini terdapat beberapa rumusan masalah, yaitu:
1. Apakah jenis sumber karbon yang dapat menginduksi bakteri endofitik dari Bruguiera gymnorrhiza dalam memproduksi enzim protease?
2. Apakah  jenis  sumber  nitrogen  yang  dapat  menginduksi  bakteri  endofitik  dari Bruguiera gymnorrhiza dalam memproduksi enzim protease?
3. Bagaimanakah hasil aktivitas enzim protease dari ekstrak kasar enzim yang dihasilkan oleh bakteri endofitik Bruguiera gymnorrhiza sebelum dan sesudah optimasi?.
3. Tujuan Penelitian
Tujuan yang ingin dicapai yaitu
1. Menganalisis  jenis  sumber  karbon  terbaik  terhadap  bakteri  endofitik  dari Bruguiera gymnorrhiza dalam memproduksi enzim protease.
2. Menganalisis jenis sumber nitrogen terbaik terhadap bakteri endofitik dari Bruguiera gymnorrhiza dalam memproduksi enzim protease.
3. Menganalisis hasil aktivitas enzim protease dari ekstrak kasar enzim  yang dihasilkan oleh bakteri endofitik Bruguiera gymnorrhiza sebelum dan sesudah optimasi.
Agustien  A, Marlida Y, Zovia M  : Optimasi  Variasi Sumber Karbon Dan Nitrogen Isolat Bakteri  Endofitik  Dari  Tanaman Bruguiera  gymnorrhiza Dalam  Menghasilkan Crude Enzim Protease

## 4. Manfaat Penelitian
Penelitian  ini  diharapkan  dapat  memberikan  informasi  ilmiah  mengenai  jenis  sumber karbon  dan  sumber  nitrogen  isolat  bakteri Bruguiera  gymnorrhiza dalam  memproduksi enzim protease.

## II. METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium  UPT  Biota  Sumatera,  Universitas  Andalas. Adapun penelitian ini dilakukan dari bulan maret-mei 2024

## Rancangan Penelitian atau Model
Penelitian  ini  menggunakan  metode  eksperimen.  Tahapan  penelitian  dilakukan  dengan menentukan  kondisi  optimum  isolat  bakteri Bruguiera  gymnorrhiza penghasil  protease koleksi dari Laboratorium UPT Biota Sumatera untuk mengetahui pengaruh jenis sumber karbon  dan  sumber  nitrogen  yang  optimum  dalam  menghasilkan  ekstrak  kasar  enzim protease. Data disajikan dalam bentuk histogram.

## Bahan dan Peralatan
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah centrifuge, tabung  reaksi, shaker, incubator, eppendorf ¸ mikropipet, timbangan, gelas ukur dan spektrofotometer. Sedangkan bahan  pada  penelitian  ini  adalah  isolate  bakteri  endofitik  dari  tanaman Bruguiera gymnorrhiza koleksi  Laboratorium  UPT  Biota  Sumatera, nutrient  agar (NA),  maltose, glukosa,  sukrosa,  laktosa,  KH 2 PO 4 ,  K 2 HPO 4 ,  MgSO 4 ,  NaCl,  Tris-HCl,  TCA,  Na 2 CO 3 , NaNO 3 , NH 4 Cl, (NH 4 ) 2 SO 4 , KNO 3 , akuades, alkohol, dan spritus. Tahapan Penelitian
1. Peremajaan bakteri Isolat  bakteri  koleksi  laboratorium  diremajakan  dengan  menggores  biakan  murni pada  media  NA  (Nutrient  Agar)  yang  baru.  Selanjutnya  inkubasi  dalam  inkubator dengan suhu 30ºC selama 24 jam.
2. Penentuan sumber karbon optimum untuk produksi protease Medium  produksi  ditambahkan  dengan  variasi    sumber  karbon  yaitu  glukosa, laktosa,  sukrosa  dan  maltosa  dengan  konsentrasi  masing-masing  1%.  Medium produksi  diinkubasi  pada  kondisi  optimum  yang  didapatkan  dari  penelitian sebelumnya dan dicuplik pada waktu idiofase.
3. Penentuan sumber nitrogen optimum untuk produksi protease Medium  produksi  ditambahkan  dengan  variasi    sumber  nitrogen  yaitu  KNO3, NaNO3,  NH4Cl,  dan  (NH4)2SO4  dengan  konsentrasi  masing-masing  1%.  Medium produksi  diinkubasi  pada  kondisi  optimum  yang  didapatkan  dari  penelitian sebelumnya dan dicuplik pada waktu idiofase.
4. Pengukuran aktivitas enzim protease dari ekstrak kasar enzim Pengukuran  ekstrak  kasar  enzim  protease  mengikuti  metode  Takami  et  al.,  (1989). Substrat  kasein  dipipetkan  sebanyak  0,5  mL,  selanjutnya  ditambahkan  0,5  mL larutan  enzim,  0,25  Tris-HCL  buffer  50    pH  8,0  dan  diinkubasi  pada  suhu  30°C selama 15 menit. Kemudian dipipetkan 0,5 mL TCA dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 20 menit. Selanjunya, sentrifugasi pada 6000 rpm selama 20 menit, 0,375 mL supernatan  diambil  dan  ditambahkan  1,25  mL  Na 2 CO 3 dan  0,25  mL  1N Folin Ciocelteu .  Pengukuran Optical  Density pada  λ  578  nm  spektrofotometer.  Nilai blanko  ditentukan  dengan  mengganti  0,5  mL  enzim  menjadi  0,5  mL  akuades,  dan optical  density diukur  dengan  cara  yang  sama.  Penentuan  nilai  standar  juga dilakukan dengan cara 0,5 mL sampel protease diganti dengan 0,5 mL tirosin.
Agustien  A, Marlida Y, Zovia M  : Optimasi  Variasi Sumber Karbon Dan Nitrogen Isolat Bakteri  Endofitik  Dari  Tanaman Bruguiera  gymnorrhiza Dalam  Menghasilkan Crude Enzim Protease
5. Rumus perhitungan:
Aktivitas enzim protease =
Keterangan: UA  : Unit Aktivitas Protease (unit/mL) Asp : Absorbansi sampel Abl : Absorbansi blanko Ast  : Absorbansi standar T : Waktu inkubasi (menit).

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Aktivitas enzim protease terhadap variasi sumber karbon
Gambar  1 .  Histogram  Aktivitas  Enzim  Protease  dari  Isolat  Bakteri  Endofitik  terhadap Variasi Sumber Karbon
Gambar  1.    menunjukkan  isolat  bakteri  endofitik Bruguiera  gymnorrhiza dapat menggunakan  empat  jenis  sumber  karbon  untuk  menghasilkan  enzim  protease.  Dari keempat  jenis  sumber  karbon  yang  digunakan  (glukosa,  fruktosa,  laktosa  dan  maltosa), karbon  berupa  maltose  (C 12 H 22 O 11 )  memiliki  aktivitas  enzim  protease  yang  lebih  tinggi dibandingkan  sumber  karbon  lainnya,  dengan  aktivitas  spesifik  protease  sebesar  1,136 U/mL.  Pati  dan  maltosa  menjadi  sumber  karbon  yang  paling  efektif  dalam  produksi protease  (Silva  et  al.,  2007).  Bakteri  yang  dapat  menggunakan  maltosa  dari  lingkungan sekitarnya merupakan bakteri yang memiliki transporter yang khusus untuk menggunakan maltosa  dari lingkungan  eksternal  dan memasukkannya  ke  dalam  sel  bakteri. Transporter ini memungkinkan maltosa masuk ke dalam sel dan berinteraksi dengan komponen seluler yang  terlibat  dalam  regulasi  aktivitas  protease.  Salah  satu  transporter  yang  khusus  untuk mengambil maltosa dari lingkungan eksternal pada bakteri adalah transporter maltosa yang disebut sebagai Maltose Transport System (MTS) atau Maltose Permease. MTS umumnya terdiri dari beberapa komponen yang bekerja sama untuk mengambil maltosa ke dalam sel bakteri (Saier Jr et al., 2016). Maltose selanjutnya akan dihidrolisis dan menghasilkan dua satuan  glukosa  dengan  menggunakan  katalis  enzim  maltase  atau  katalis  asam.  Banyak peneliti telah melaporkan bahwa maltosa lain dapat meningkatkan hasil produksi protease. Contohnya,  dalam  penelitian  Malathi  &  Chakraborty,  (1991),  maltosa  terbukti  sebagai sumber karbon yang efektif untuk meningkatkan produksi enzim protease. (Tsuchiya et al., 1991)  juga  melaporkan  penggunaan  maltosa  untuk  produksi  enzim  protease  yang  tinggi. Maltosa digunakan sebagai sumber karbon dalam produksi protease karena efektivitasnya dalam meningkatkan hasil protease. Penelitian oleh  Bezawada et al., (2010) menunjukkan
0.916 0.596 1.136 0.82 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Laktosa Sukrosa Maltosa Glukosa A kt iv it as S pe si fi k P ro te as e (U/m L ) Variasi Sumber Karbon
Agustien  A, Marlida Y, Zovia M  : Optimasi  Variasi Sumber Karbon Dan Nitrogen Isolat Bakteri  Endofitik  Dari  Tanaman Bruguiera  gymnorrhiza Dalam  Menghasilkan Crude Enzim Protease
bahwa suplementasi maltosa menghasilkan peningkatan produksi protease yang tinggi oleh B. licheniformis ATCC 21424 dibandingkan dengan sumber karbon uji lain.

## 2. Aktivitas enzim protease terhadap variasi sumber nitrogen
Gambar  2 .  Histogram  Aktivitas  Enzim  Protease  dari  Isolat  Bakteri  Endofitik  terhadap Variasi Sumber Nitrogen
Gambar 2. menunjukkan bahwa aktivitas enzim isolat bakteri mengalami peningkatan yang signifikan  pada  penambahan  sumber  nitrogen  berupa  kalium  nitrat  (KNO 3 )  sebesar  0,907 U/mL.  Beberapa  penelitian  telah  membuktikan  bahwa  Kalium  nitrat  dapat  berpengaruh positif  terhadap  produksi  enzim  oleh  bakteri  tertentu.  Sebagai  contoh,  sebuah  penelitian yang  dilakukan  oleh  Agwa  &  Abu,  (2016)    menunjukkan  bahwa  penambahan  KNO 3 ke dalam  medium  kultur  Bacillus  sp.  S5  dapat  meningkatkan  aktivitas  enzim  selulase. Penelitian  lain  oleh  Qu  et  al.,  (2016)  menunjukkan  bahwa  penambahan  KNO 3 ke  dalam medium  kultur  Bacillus  amyloliquefaciens  dapat  meningkatkan  produksi  enzim  protease dan  amilase.  Penambahan  KNO 3 dapat  meningkatkan  aktivitas  protease  karena  dapat menyediakan nitrat (NO 3 ) sebagai sumber nitrogen. Nitrat adalah bentuk oksidasi nitrogen yang  dapat  digunakan  oleh  bakteri  sebagai  sumber  nitrogen  untuk  pertumbuhan  dan sintesis  protein.  Beberapa  bakteri  memiliki  jalur  metabolisme  nitrat  yang  memungkinkan mereka  mengambil  nitrat  dari  lingkungan  dan  menggunakannya  sebagai  sumber  nitrogen (Nelson  et  al.,  2017).  Kalium  nitrat  (KNO 3 )  memainkan  peran  penting  dalam  produksi protease.  Penambahan  KNO 3 dalam  media  fermentasi  telah  terbukti  meningkatkan  hasil enzim  protease,  karena  berkontribusi  pada  peningkatan  tingkat  produksi.  Sebuah  studi tentang Streptomyces  fradiae menunjukkan  bahwa  penambahan  KNO 3 dalam  media sintetis menyebabkan peningkatan substansif dalam hasil enzim protease, mencapai hingga 930  P.U/mL,  peningkatan  tiga  kali  lipat  dibandingkan  dengan  hasil  awal  (Santosa  et  al., 2013). Selanjutnya, dalam konteks mutasi UV Bacillus subtilis, KNO 3 digunakan  sebagai sumber  nitrogen  anorganik  dalam  media  fermentasi,  dengan  tujuan  menginduksi  strain yang  bermutasi  untuk  menghasilkan  unit  protease  yang  tinggi,  hasil  penelitian menunjukkan  aktivitas  protease  yang  dihasilkan mencapai  maksimum  hingga  455,25  unit (Sher  et  al.,  2012).  Oleh  karena  itu,  KNO 3 berfungsi  sebagai  komponen  penting  dalam mempromosikan dan mengoptimalkan produksi protease di berbagai strain mikroba.
3. Kondisi Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Protease Sebelum dan Sesudah Optimasi Tabel  1.  Aktivitas  protease  isolate  bakteri  endofitik Bruguiera  gymnorrhiza sebelum  dan sesudah optimasi
0.907 0.791 0.759 0.838 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 KNO3 NH4Cl NaNO3 (NH4)2SO4 A x is A kt iv it as S pe si fi k P ro te as e (U/m L ) Variasi Sumber Nitrogen
Agustien  A, Marlida Y, Zovia M  : Optimasi  Variasi Sumber Karbon Dan Nitrogen Isolat Bakteri  Endofitik  Dari  Tanaman Bruguiera  gymnorrhiza Dalam  Menghasilkan Crude Enzim Protease
Aktivitas Spesifik Protease (U/mL) Peningkatan Aktifitas Protease (kali) Sebelum Sesudah 0,861 1,136 1,31
Table 1. menunjukkan optimasi sumber karbon dan sumber nitrogen pada bakteri endofitik Bruguiera  gymnorrhiza penghasil  protease  memberikan  peningkatan  produksi  protease. Produksi  protease  sebelum  optimasi  dilakukan  tanpa  penambahan  sumber  karbon  dan sumber  nitrogen  terbaik.  Hasil  optimasi  menunjukkan  peningkatan  aktivitas  protease sebesar  1,31  kali,  hal  ini  membuktikan  bahwa  faktor  abiotik  memberikan  pengaruh terhadap bakteri dalam produksi enzim. Peningkatan produksi enzim oleh mikroorganisme dapat  dilakukan  dengan  melakukan  rekayasa  komposisi  medium,  berupa  sumber  karbon dan nitrogen. Penelitian  Aznia et al., (2014), menunjukkan peningkatan aktivitas protease setelah dilakukan optimasi ekstrinsik pada isolat bakteri M5-24 yaitu mencapai 1,75 kali.

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa jenis sumber karbon dan nitrogen yang optimum dalam menginduksi bakteri endofitik Bruguiera gymnorrhyza dalam memproduksi protease adalah maltose dan KNO 3 1% (v/v) dengan aktivitas ekstrak kasar enzim protease tertinggi sebesar 1,136 U/mL dan peningkatan sebelum dan sesudah optimasi mencapai 1,31 kali.

## DAFTAR PUSTAKA
Agustien,  A.,  Melhanza,  Z.  N.,  Annisa,  A.,  Husnah,  Q.,  Nasir,  N.,  &  Rilda,  Y.  (2018).
Isolation  and  Screening  Protease  Acid,  Neutral  and  Alkaline  Producing  Bacteria from  Dadih  (Traditional  Indonesian  Food).  Available  Online  Www.Jocpr.Com Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 10(1), 50–54. www.jocpr.com Agustien,  A.,  Muqarramah,  M.,  &  Alamsjah,  F.  (2024).  Optimization  and  Molecular Identification of Protease-Producing Thermophilic Bacterial Isolate TUA-26. OnLine Journal of Biological Sciences, 24(3), 321–329.
Agwa, O. K., & Abu, G. O. (2016). Influence of various nitrogen sources on biomass and lipid production by Chlorella vulgaris. British Biotechnology Journal, 15(2), 1–13.
Aznia,  A.,  Agustien,  A.,  Nasril,  D.,  Laboratorium,  N.,  Mikrobiologi,  R.,  &  Biologi,  J. (2014).  Optimasi  Parsial  Isolat  Termofilik  M5-24  dalam  Produksi  Protease  Partial Optimization of Thermophilic Isolate M5-24 on Protease Production. Jurnal Biologi Universitas Andalas (J. Bio. UA.), 3(3), 238–243.
Bezawada,  J.,  Yan,  S.,  John,  R.  P.,  Tyagi,  R.  D.,  &  Surampalli,  R.  Y.  (2010). Augmentation of protease production by supplementing carbon and nitrogen sources into  wastewater  sludge  medium.  JOURNAL  OF  RESIDUALS  SCIENCE  & TECHNOLOGY, 7(3), 161–172.
Gurumallesh,  P.,  Alagu,  K.,  Ramakrishnan,  B.,  &  Muthusamy,  S.  (2019).  A  systematic reconsideration on proteases. In International Journal of Biological Macromolecules (Vol. 128, pp. 254–267). Elsevier B.V.
Lestari,  K.,  Agustien,  A.,  &  Djamaan,  A.  (2019).  Potensi Jamur  Endofit  pada  Tumbuhan Mangrove  Avicennia  marina  di  Kuala  Enok  Indragiri  Hilir  sebagai  Penghasil Antibiotika  The  Potential  of  Endophytic  Fungi  Isolated  from  Leaves,  Stems, Mangrove  Roots  Avicennia  marina  as  a  Producer  of  Antibiotics.  JURNAL METAMORFOSA, 6(1), 83–89.
Agustien  A, Marlida Y, Zovia M  : Optimasi  Variasi Sumber Karbon Dan Nitrogen Isolat Bakteri  Endofitik  Dari  Tanaman Bruguiera  gymnorrhiza Dalam  Menghasilkan Crude Enzim Protease
Malathi,  S.,  &  Chakraborty,  R.  (1991).  Production  of  alkaline  protease  by  a  new Aspergillus  flavus  isolate  under  solid-substrate  fermentation conditions  for  use  as a depilation agent. Applied and Environmental Microbiology, 57(3), 712–716.
Nelson, J. W., Atilho, R. M., Sherlock, M. E., Stockbridge, R. B., & Breaker, R. R. (2017). Metabolism  of  free  guanidine  in  bacteria  is  regulated  by  a  widespread  riboswitch class. Molecular Cell, 65(2), 220–230.
Qu,  X.  M.,  Wu,  Z.  F.,  Pang,  B.  X.,  Jin,  L.  Y.,  Qin,  L.  Z.,  &  Wang,  S.  L.  (2016).  From Nitrate  to  Nitric  Oxide:  The  Role  of  Salivary  Glands  and  Oral  Bacteria.  Journal  of Dental Research, 95(13), 1452–1456. https://doi.org/10.1177/0022034516673019
Razzaq,  A.,  Shamsi,  S.,  Ali,  A.,  Ali,  Q.,  Sajjad,  M.,  Malik,  A.,  &  Ashraf,  M.  (2019). Microbial  proteases  applications.  In  Frontiers  in  Bioengineering  and  Biotechnology (Vol. 7, Issue JUN). Frontiers Media S.A. https://doi.org/10.3389/fbioe.2019.00110
Saier Jr, M. H., Reddy, V. S., Tsu, B. V, Ahmed, M. S.,  Li, C., & Moreno-Hagelsieb, G. (2016).  The  transporter  classification  database  (TCDB):  recent  advances.  Nucleic Acids Research, 44(D1), D372–D379.
Santosa,  E.,  Halimah,  S.,  Susila,  A.  D.,  Lonto,  A.  P.,  Mine,  Y.,  &  Sugiyama,  N.  (2013). KNO  3  Application  Affect  Growth  and  Production  of  Amorphophallus  muelleri Blume. Indonesian Journal of Agronomy, 41(3).
Sher, M. G., Nadeem, M., Syed, Q., Irfan, M., & Baig, S. (2012). Protease production from UV  mutated  Bacillus  subtilis.  Bangladesh  Journal  of  Scientific  and  Industrial Research, 47(1), 69–76.
Silva,  C.  R.  da,  Delatorre,  A.  B.,  &  Martins,  M.  L.  L.  (2007).  Effect  of  the  culture conditions on the production of an extracellular protease by thermophilic Bacillus sp and some properties of the enzymatic activity. Brazilian Journal of Microbiology, 38, 253–258.
Springer-Verlag, ©, Takami, H., Akiba, T., & Horikoshi, K. (1989). Applied Microbiology Biotechnology Production of extremely thermostable alkaline protease from Bacillus sp. no. AH-101. In Appl Microbiol Biotechnol (Vol. 30).
Sun, Y., Qian, Y., Zhang, J., Wang, Y., Li, X., Zhang, W., Wang, L., Liu, H., & Zhong, Y. (2021). Extracellular protease production regulated by nitrogen and carbon sources in Trichoderma reesei. Journal of Basic Microbiology, 61(2), 122–132.
Sutay  Kocabaş,  D.,  &  Grumet,  R.  (2019).  Evolving  regulatory  policies  regarding  food enzymes  produced  by  recombinant  microorganisms.  In  GM  Crops  and  Food  (Vol. 10, Issue 4, pp. 191–207). Taylor and Francis Ltd.
Tsuchiya,  K.,  Sakashita,  H.,  Nakamura,  Y.,  &  Kimura,  T.  (1991).  Production  of thermostable  alkaline  protease  by  alkalophilic  Thermoactinomyces  sp.  HS682. Agricultural and Biological Chemistry, 55(12), 3125–3127.
Accepted Date Revised Date Decided Date Accepted to Publish 08 Juni 2024 18 Juni 2024 23 Juli 2024 Ya