## FRAKSIONASI DAN PENENTUAN PROFIL PROTEIN BUNGKIL KELAPA DENGAN SDS-PAGE
[Fractionation and Profiling of Copra Meal’s Protein by Using SDS-PAGE]
Agus Danang Wibowo 1) , Maggy T. Suhartono 1) *, dan Patuan L. P. Siagian 2)
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Pusat Penelitian Kimia-LIPI, PUSPITEK, Tangerang Selatan
Diterima 19 Juli 2010 / Disetujui 30 April 2012

## ABSTRACT
The aim of this research was to extract proteins from the copra meal, base on their solubility and analysis of the protein profiles by Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) This research was conducted in two stages, protein fractionation and molecular weight estimation using SDS PAGE. The fractionation was conducted by non-enzymatic treatment and enzymatic (mannanase) treatment. Kjeldahl analysis showed that the protein content of copra meal was 18.52% of dry basis. Protein fractionation could separate the copra meal’s proteins based  on  their  solubility.  Albumin  was  solubilized  by  water,  globulin  by  NaCl  5%,  glutelin  by  NaOH  0.02M,  and  prolamin  by  ethanol  70%. Fractionation using non-enzymatic treatment resulted in 64% of albumin, 39.25% of globulin, 15.27% of glutelin, and 38.84% of prolamin fractions. On the other hand, fractionation using enzymatic treatment resulted different protein profile, giving 28.17%, 39.44%, 10.91%, and 21.48% of the respective  proteins.  Characterization  using  SDS  PAGE  showed  that  the  protein  profile  from  the  non-enzymatic  was  different  from  that  of  the enzymatic treatment. In conclusion, we found that the proteins extracted from the copra meal with and without mannanase showed variation in the range of molecular weights: 45.1-66,0 kDa and 66.1-97.4 kDa, respectively.
Key words: copra meal, fractionation, mannanase, proteins, SDS-PAGE

## 1 PENDAHULUAN
Indonesia merupakan salah satu pusat penghasil kelapa di dunia. Berdasarkan data dari FAO (2009), nilai produksi kelapa Indonesia berada pada peringkat pertama.  Perkebunan  kelapa di  Indonesia  merupakan  yang  terluas  di  dunia  dengan  pangsa 31,2%  dari  total  luas  areal  kelapa  dunia.  Peringkat  kedua diduduki Filipina (pangsa 25,8%), disusul India (pangsa 16,0%), Sri Langka (pangsa 3,7%) dan Thailand (pangsa 3,1%). Jumlah produksi  kelapa  di  Indonesia  setiap  tahunnya  cenderung mengalami  peningkatan.  Pada  tahun  2007,  jumlah  produksi kelapa di Indonesia mencapai 19.625.000 ton (FAO , 2009 ) . Pada  umumnya  buah  kelapa  yang  dihasilkan  di  Indonesia sebagian  besar  diolah  menjadi  kopra,  dan  digunakan  sebagai bahan  baku  dalam  pembuatan  minyak  kelapa  (Siagian,  2009). Proses ekstraksi minyak  kelapa  dari  kopra akan menghasilkan residu  yang disebut  sebagai bungkil  kelapa  ( copra meal )  yang masih  mengandung  komponen  serat  seperti mannan, galactomannan,  xilan ,  dan arabinoxilan. Pemanfaatan  protein dari bungkil kelapa belum optimal. Bungkil kelapa dapat menjadi sumber ingredient potensial  pada  industri  pangan  atau  ternak apabila  diolah  lebih  lanjut.  Salah  satu  potensi  bungkil  kelapa adalah  kandungan  proteinnya  yang  relatif  tinggi  yaitu  berkisar 18% (Miskiyah et al., 2006).
Kelarutan  protein  merupakan  salah  satu  atribut  fungsional kritis  yang  dibutuhkan  agar  dapat  berfungsi  sebagai  bahan pangan. Sifat kelarutan memiliki pengaruh yang besar terhadap sifat-sifat  fungsionalnya,  seperti  pengikat  air  dan  minyak,
* Korespondensi Penulis :
Email : mthenawidjaja@yahoo.com
emulsifikasi,  gelasi,  viskositas  dan  pembentuk  busa  (Ragab et al ., 2004). Berdasarkan karakterisik kelarutannya, protein yang terdapat  pada  tanaman  seperti  beras,  gandum,  kacang- kacangan,  dan  biji-bijian  dapat  digolongkan  sebagai  kelompok albumin, globulin, prolamin, dan glutelin (Sikorski, 1992). Proses ekstraksi  protein  dari  bungkil  diperlukan  sebelum  mempelajari karakteristik  protein  tersebut.  Informasi  dasar  yang  diperoleh bermanfaat untuk memanfaatkan protein bungkil kelapa sebagai ingredient bagi  industri  pangan.  Tujuan  penelitian  ini  adalah melakukan  fraksinasi  protein  bungkil  kelapa  berdasarkan kelarutannya  dan  analisis  profil  protein  yang  diperoleh  dengan SDS PAGE. Informasi yang diperoleh dapat menjadi data dasar bagi pengembangan ekstraksi dan produksi protein spesifik dari bungkil kelapa.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bahan  kimia  untuk  ekstraksi  dan  analisis  protein  yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Sigma dan Merck melalui  perwakilan  di  Bogor.  Untuk  SDS  PAGE  dipergunakan elektroforesis untuk protein dari BIORAD (California, USA).

## Penyiapan sampel
Sampel bungkil kelapa yang digunakan diperoleh dari Pusat Penelitian  Kimia  LIPI  yang  didapatkan  dari  Jambi.  Sebelum protein  diektraksi,  bungkil  kelapa  dihilangkan  terlebih  dahulu kandungan  lemaknya  dengan  metoda soxhlet dengan  meng- gunakan heksana (25 L/5 kg, 5 sirkulasi). Bungkil kelapa yang telah  dihilangkan  lemaknya  ( defatted  copra  meal /DCM)  di-
blender  kering  untuk  memperkecil  ukuran  partikel  bungkil kelapa sehingga mempermudah proses ekstraksi protein.

## Analisisis proksimat
Analisis  proksimat  dilakukan  menggunakan  metode  AOAC (1995)  untuk  menentukan  kadar  air,  kadar  abu,  kadar  lemak kasar, kadar protein kasar, kadar serat kasar, dan kadar Bungkil Ekstrak Total Nitrogen (BETN).
Fraksinasi  protein  metode  non-enzimatis  (modifikasi Adebiyi et al ., 2009) Fraksionasi  protein  dilakukan  pada  suhu  ruang  dengan menggunakan shaker berkecepatan  250  rpm.  Bungkil  kelapa yang telah dihilangkan kadar lemaknya DCM diekstraksi dengan air  destilata  menggunakan shaker selama  1  jam.  Selanjutnya dilakukan  sentrifugasi  dengan  kecepatan  4000  g  selama  15 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang didapatkan merupakan fraksi kasar albumin (ALB). Tahap tersebut diulangi kembali.
Residu hasil fraksinasi albumin kemudian diekstraksi meng- gunakan  larutan  NaCl  encer  menggunakan shaker selama  1 jam,  kemudian  disentrifusgasi  dengan  kecepatan  4000  g selama 15 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang didapatkan merupakan fraksi kasar globulin (GLB). Tahap tersebut diulangi kembali.
Untuk mendapatkan fraksi kasar glutelin (GLT), residu hasil fraksinasi globulin diekstrak dengan menggunakan larutan basa encer NaOH. Fraksi prolamin (PRO) didapatkan dengan meng- ekstrak  residu  hasil  fraksinasi  kasar  glutelin  menggunakan larutan etanol 70%. Metode fraksinasi yang digunakan mengacu pada metode fraksinasi sebelumnya.
Setiap  ekstrak  kasar  protein  disentrifugasi  dengan  ke- cepatan  4000  g  selama  15  menit  pada  suhu  4°C.  Supernatan kemudian  disaring  menggunakan glass  wool .  Fraksi  albumin, globulin, dan glutelin kemudian diatur pH-nya hingga mencapai pH  isoelektriknya,  yaitu  4,1;  4,3;  dan  4,8.  Fraksi  selanjutnya diistirahatkan  kemudian  disentrifugasi  pada  kecepatan  4000  g selama 15 menit pada suhu 4°C. Residu yang diperoleh dicuci menggunakan  air  destilata  dan  disentrifugasi  kembali  dengan kecepatan yang sama. Pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Residu kemudian dilarutkan dalam buffer fosfat untuk dianalisis lebih lanjut. Berbeda dengan fraksi protein yang lainnya, fraksi protein  prolamin  diendapkan  dengan  menambahkan  sejumlah aseton secara bertahap, sebanyak 3 tahap.
Fraksinasi  protein  dengan  aplikasi  enzim  (modifikasi Adebiyi et al ., 2009) Sebelum  tahapan  fraksionasi  dilakukan,  terlebih  dahulu bungkil  kelapa  diberi  tambahan  enzim  mannanase.  Enzim mannanase  yang  digunakan  memiliki  konsentrasi  1%  dalam buffer  asetat  (0,5  M,  pH  5,3).  Waktu  inkubasi  yang  digunakan adalah  berdasarkan  hasil  analisis  waktu  inkubasi  yang  paling optimum pada (percobaan sebelumnya un published data). Bungkil  kelapa  yang  sudah  menjadi  DCM  ditambah  enzim mannanasedan  diinkubasi  pada  kondisi  optimumnya.  Sentri- fugasi  dilakukan  setelah  tahapan  inkubasi  selesai  dilakukan. Supernatan  dipisahkan  dan  ekstraksi  dilakukan  pada  pelet mengikuti metode sebelumnya.
Untuk  memperoleh  protein  dengan  konsentrasi  tinggi  ter- lebih dulu di buat percobaan berikut. Sampel dicampur dengan larutan enzim mannanase dalam buffer asetat (0,5 M, pH 5,3), selanjutnya  campuran  diinkubasi  pada  suhu  30°C.  Lama inkubasi diragamkan menjadi 0; 0,5; 1; 1,5; dan 2 jam dengan kecepatan  agitasi  sebesar  125  rpm.  Campuran  kemudian disentrifugasi  pada  kecepatan  4000  g  selama  10  menit  pada suhu  4°C.  Pelet  kemudian  dicampur  dengan  buffer  fosfat  dan divorteks  dengan  kuat  untuk  mendapatkan  protein  total. Sentrifugasi  kembali  dilakukan,  lalu  supernatan  yang  didapat- kan  diukur  konsentrasi  proteinnya  dengan  menggunakan metode Bradford. Hidrolisis yaang paling optimum akan meng- hasilkan konsentrasi protein paling tinggi.

## Analisis kadar protein (Bollag dan Edelstein, 1991)
Sebanyak 10 µL sampel larutan protein diencerkan dengan menggunakan buffer fosfat (0,2 M, pH 7,0) hingga volume 100 µL  kemudian  ditambah  dengan  reagen  Bradford.  Larutan dihomogenkan dan diistirahatkan  selama 5 menit. Pengukuran dilakukan dengan spektrofotometer pada λ=595 nm.
Kurva standar dibuat dengan memipet sebanyak 5, 10, 15, 20,  dan  25  µL  larutan  BSA  (b ovine serum  albumine).  Blanko yang digunakan adalah air destilata.
Penentuan  profil  protein  dengan  menggunakan  SDS- PAGE (Bollag dan Edelstein, 1991)
Gel  yang  digunakan  untuk  elektroforesis  terdiri  atas  gel penahan ( stacking gel ) dengan konsentrasi 4% dan gel pemisah ( separating  gel )  dengan  konsentrasi  12,5%.  Sebelum  elektro- foresis,  sampel  protein  didenaturasi  menggunakan  SDS  dan merkaptoetano  disertai  dengan  pemanasan.  Pembebanan sampel  dilakukan  pada  konsentrasi  protein  yang  sama  untuk setiap  fraksi  protein.  Jumlah  volume  maksimumsampel  protein untuk pembebanan adalah 25 µL. Elektroforesis dilakukan pada tegangan  100  Volt  dan  arus  listrik  80  mA  selama  2,5  jam. Setelah selesai, gel diwarnai dengan menggunakan pewarnaan perak (AgNO 3 ).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Komposisi kimia organik kelapa
Bungkil  kelapa  yang  digunakan  telah  mengalami  ekstraksi lemak  menggunakan  heksana  untuk  menghilangkan  sisa-sisa kandungan  minyak  yang  masih  terdapat  dalam  bungkil. Meskipun merupakan hasil samping dari industri minyak kelapa, bungkil  kelapa  memiliki  kandungan  protein  yang  cukup  tinggi, sekitar 18% (Miskiyah et al ., 2006). Analisis ini bertujuan untuk mendapatkan  data  dasar  komposisi  kimia  dari  sampel  bungkil yang digunakan.
Komposisi kimia dari bungkil kelapa yang digunakan dalam penelitian ini, dibandingkan dengan Standar Nasional Indonesia (1992), dapat dilihat pada Tabel 1. Ditunjukan bahwa dalam 100 g  bungkil  kelapa  diperoleh  protein  sebesar  18,52  g.  Jumlah tersebut  tidak  jauh  berbeda  dengan  kandungan  protein  yang dipersyaratkan oleh SNI (1992) ataupun  yang telah disebutkan oleh  Miskiyah et  al. (2006).  Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa sampel bungkil  kelapa  yang digunakan masih memiliki potensi
0 250 500 750 1000 Total protein Albumin Globulin Glutelin Prolamin Bo bo t P ro te in (u g) / g sa m pe l Fraksi Protein
yang  baik  untuk  dianalisis  dan  dikarakterisasi  lebih  lanjut sehingga  nantinya  dapat  digunakan  untuk  membantu  di- versifikasi  sumber  protein  asal  tanaman,  baik  untuk  pakan maupun bahan pangan.
Dapat dilihat pula pada Tabel 1 bahwa hasil analisis kadar serat  kasar bungkil  kelapa memiliki nilai  yang  jauh lebih besar dibandingkan  nilai  yang  dipersyaratkan  oleh  SNI  (1992). Adanya  peningkatan  kadar  serat  kasar  kemungkinan  disebab- kan  adanya  perlakuan  fisik/kimia  (pengeringan  dan  ekstraksi lemak) yang dilakukan selama preparasi sampel bungkil kelapa. Adanya  perlakuan  fisik/kimia  dapat  menyebabkan  perubahan struktur  atau  jaringan  kopra  sehingga  bungkil  kelapa  me- ngandung  kadar  serat  kasar  relatif  lebih  tinggi.  Lemak  yang terlarut  menyisakan  ruang  atau  pori  pada  bungkil  yang  me- mungkinkan interaksi jalinan senyawa disekitarnya membentuk jaringan  tidak  larut  yang  terukur  sebagai  serat  kasar.  Hasil analisis  menunjukkan  bahwa  sampel  bungkil  kelapa  yang digunakan  memerlukan  tahapan  proses  prepasi  bahan  baku agar  dapat  dikategorikan  sebagai  bungkil  kelapa  kelas  I maupun  kelas  II,  misalnya  pengayakan  untuk  memisahkan batok dan pengotor lainnya.
Tabel 1.  Komposisi kimia sampel bungkil kelapa dibandingkan dengan
SNI Komponen SNI Hasil Analisis Kualitas I Kualitas II Air  (%) Maks. 12 Maks. 12 10,32 Abu (%) Maks. 7 Maks. 9 8,21 Protein (%) Min. 18 Min. 16 18,52 Lemak (%) Maks. 12 Maks. 15 2,25 Serat kasar (%) Maks. 14 Maks. 16 23,96 BETN (%) 37 32 36,74
Pada  penelitian  ini,  enzim  yang  digunakan  adalah  ekstrak kasar  enzim  mannanase.  Enzim  ini  didapatkan  dari  Fakultas Peternakan,  Institut  Pertanian  Bogor,  yang  dihasilkan  melalui proses  fermentasi  bungkil  kelapa  menggunakan  kapang Aspergillus  niger  dan  Trichoderma  sp. .  Berhubung  merupakan ekstrak  kasar,  selain  enzim  mannanaseyang  terkandung  di- dalamnya,  ekstrak  kasar  ini  juga  mengandung  enzim  xilanase dan selulase.
Endo-β-1,4-mannanase(EC3,2,1,78)  merupakan  enzim yang  penting  dalam  depolimerisasi  mannanase  (yang  tidak memiliki  cabang),  galaktomannan,  dan  galakto-glukomannan. Enzim  ini  mengkatalis  hidrolisis  ikatan  β-1,4-mannosidik  pada rantai  utama  polimer  mannan  secara  acak.  Dilaporkan  bahwa enzim  ini  memiliki  pH  optimum  antara  asam  sampai  netral, berberat molekul antara 33–80 kD, dan memiliki suhu optimum antara mesofilik sampai termofilik moderat (Mudau, 2006). Ber- dasarkan  hasil  percobaan  penapisan  awal  enzim  mannanase diperoleh waktu optimum inkubasi campuran substrat dan enzim untuk menghasilkan protein total tertinggi adalah 1,5 jam.

## Fraksi-fraksi protein
Fraksionasi  protein  merupakan  tahapan  yang  dilakukan untuk  memisahkan  jenis-jenis  protein  berdasarkan  beberapa karakteristik  kimianya,  yaitu  kelarutan,  pH,  struktur  molekul,
maupun berat molekulnya (Winarno, 1992). Dalam penelitian ini, dilakukan fraksionasi protein berdasarkan kelarutannya.
Dari  hasil  fraksionasi  tersebut  diperoleh  empat  kelompok protein,  yakni  albumin,  globulin,  glutelin  dan  prolamin.  Hasil percobaan  menunjukkan  bahwa  metode  fraksionasi  enzimatis menghasilkan kadar total protein yang lebih tinggi dibandingkan dengan  metode  fraksionasi  non-enzimatis.  Total  protein merupakan  hasil  penjumlahan  bobot  setiap  fraksi.  Secara keseluruhan,  fraksionasi  metode  enzimatis  mampu  mening- katkan kadar fraksi-fraksi protein dibandingkan dengan metoda non enzimatis. Peningkatan tersebut diakibatkan oleh hidrolisis struktur  glukomanno  protein.  Struktur  ini  awalnya  mengikat protein  sehingga  menjadi  tidak  terlarut  dan  tidak  dapat dimanfaatkan secara biologis. Namun, setelah ditambah enzim, struktur  tersebut  menjadi  terdegradasi.  Ikatan  antara  mannan dan protein terlepas sehingga protein menjadi lebih terlarut dan dapat dimanfaatkan secara optimal.
Sebagai  pembanding,  Dairo  dan  Fasuyi  (2008)  menyebut- kan  bahwa  proses  fermentasi  bungkil  kelapa  menggunakan kapang  penghasil  mannanase  mampu  meningkatkan  total protein  kasar  (dari  19,63%  menjadi  23,11%).  Hasil  fraksinasi protein bungkil kelapa dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1.    Bobot beberapa fraksi protein hasil fraksinasi dengan tautan penambahan enzim
Globulin  merupakan  fraksi  protein  yang  paling  banyak diperoleh dari hasil fraksionasi, baik pada metode non-enzimatis maupun  metode  enzimatis  (39%)  dan  (30%).  Menurut  Siu-Mei dan  Ching-Yung  (2006),  pada  tanaman  kacang-kacangan, globulin  merupakan  protein  simpanan  ( storage  protein )  dan ditemukan  dalam  jumlah  yang  paling  besar.  Hal  ini  meng- indikasikan  bahwa  kandungan  protein  bungkil  kelapa  ke- mungkinan besar mirip dengan tanaman kacang-kacangan.
Albumin merupakan protein larut air yang umumnya banyak ditemui pada hewan, seperti albumin telur, serum albumin, dan laktalbumin  (Sikorski,  1992).  Pada  bungkil  kelapa,  mannanase mengikat protein, seperti albumin, sehingga menjadi tidak larut dalam  air.  Setelah  perlakuan  enzimatis,  albumin  yang  terikat pada  mannan  menjadi  terlepas  sehingga  larut  kembali  dalam dan jumlahnya meningkat 4 kali lipat.
Glutelin  banyak  ditemukan  pada  gandum  dalam  bentuk gluten. Bungkil kelapa memiliki kandungan glutelin yang paling rendah  dibandingkan  fraksi  protein  yang  lain,  setelah  me- ngalami  tahapan  enzimatis.  Hal  tersebut  ditunjukkan  dengan bobot fraksi glutelin hasil percobaan, yakni sebanyak 85,19 µg (15%)  menggunakan  metode  non-enzimatis  dan  sebanyaknya
yaitu  114,81  µg  (10%)  menggunakan  metode  enzimatis.  Di- bandingkan  dengan  bobot  protein  total  dari  masing-masing metode  fraksionasi,  perlakuan  enzimatis  justru  menurunkan persentase kandungan glutelin.
Hal  yang  serupa  juga  ditemukan  pada  fraksi  protein prolamin.  Bobot  prolamin  secara  berturut-turut  dengan  meng- gunakan  metode  non-enzimatis  dan  enzimatis  adalah  216,67 µg  (38%)  dan  225,93  µg  (21%).  Prolamin  banyak  ditemukan sebagai  protein  simpanan  ( storage  protein )  pada  tanaman serealia  (Lie-Fen et  al. ,  1994).  Namun,  berdasarkan  hasil  per- cobaan,  prolamin  bukan  merupakan  protein  yang  banyak ditemui pada bungkil kelapa.
Berdasarkan  uji  statistik,  yakni  uji T-test ,  diketahui  bahwa penambahan  enzim  berpengaruh  signifikan  pada  perubahan bobot  fraksi  protein  albumin,  globulin,  dan  glutelin  dari  hasil fraksionasi  dari  bungkil  kelapa  secara  keseluruhan.  Namun, metode enzimatis tidak memiliki pengaruh yang nyata terhadap perubahan fraksi protein prolamin dari hasil fraksionasi bungkil kelapa.  Jika  dibandingkan  dengan  kadar  protein  kasar  hasil analisis  Kjeldahl,  kandungan  protein  terlarut  yang  terdapat dalam  bungkil  kelapa  sangatlah  kecil.  Dari  1  g  bungkil  kelapa hanya  didapatkan  jumlah  total  protein  sebesar  (0,001  g)  dari 3,70 g protein kasar hasil analisis Kjeldahl. Hasil ini menunjuk- kan  bahwa  masih  banyak  protein  yang  masih  terikat  dengan komponen  serat  pada  bungkil  kelapa.  Dinding  sel  tanaman umumnya  tersusun  atas  selulase,  lignin,  dan  hemiselulosa. Hemiselulosa  tersusun  atas  mannan  dan  xilan  (Mudau,  2006). Komponen-komponen  ini  juga  terdapat  pada  bungkil  kelapa. Oleh  karena  itu,  proses  penghilangan  komponen-komponen tersebut  secara  total  perlu  ditingkatkan  sehingga  mampu  me- mudahkan proses ekstraksi protein.

## Profil protein dengan menggunakan SDS-PAGE
Metode  analisis  elektroforesis  protein  merupakan  metode analisis  yang  memisahkan  molekul  protein  berdasarkan  bobot molekulnya (Bollag dan Edelstein, 1991). Metode terbaik dalam pemurnian protein dengan  teknik elektroforesis adalah dengan bahan  gel  poliakrilamida.  Analisis  profil  fraksi-fraksi  protein bungkil  kelapa,  baik  menggunakan  metode  non-enzimatis maupun  metode  enzimatis,  dilakukan  dengan  menggunakan SDS-PAGE.
SDS-PAGE memisahkan molekul-molekul protein berdasar- kan  ukurandan  bentuk  partikelnya  (Pomeranz  dan  Meloan, 1994). Gel ini dapat dibuat dengan ukuran pori  yang beragam yang  ditentukan  berdasarkan  jumlah  total  senyawa  akrilamida yang  ditambahkan  (konsentrasi  gel).  Ukuran  pori  gel  akan semakin  kecil  seiring  dengan  meningkatnya  konsentrasi  gel sehingga  hanya  dapat  dilewati  oleh  molekul  protein  yang memiliki bobot molekul kecil.
Protein  penanda  digunakan  untuk  mengidentifikasi  bobot molekul  setiap  pita  dari  fraksi  protein.  Penanda  protein  yang digunakan  adalah  alpha-lactalbumine  (14,4  kD), trypsinogen from  bovine  pancreas (24,0  kD), carbonic  anhydrase  from bovine erythrocytes (29,0 kD), albumin from chicken egg white (45,0  kD),  BSA  (66,0  kD),  dan myosin  from  porcine  muscle (205,0  kD).  Kurva  standar  yang  dihasilkan  dari  protein penandaini  memiliki  persamaan  linear Y  =  2.278  –  1.158  X (R 2 =98.60%) , dengan Y adalah log bobot molekul (BM) dan  X
adalah  Rf (nisbah  antara  panjang  pita  dari  titik  awal elektroforesis  dengan  jarak  titik  awal  dan  titik  akhir elektroforesis). Ukuran bobot molekul suatu protein ini berguna dalam melakukan pemetaan protein ( profiling protein ).
Pewarnaan gel yang digunakan dalam penelitian ini adalah pewarnaan  menggunakan  metode  pewarnaan  perak.  Semakin tinggi  konsentrasi  protein  suatu  sampel  yang  dielektroforesis, pita  yang  dihasilkan  akan  tampak  jelas  dan  tebal.  Namun, apabila  konsentrasi  protein  suatu  protein  rendah,  pita  yang dihasilkan  akan  tampak  tipis.  Oleh  karena  itu,  pembebanan sampel  fraksi  protein  bungkil  kelapa  dilakukan  dalam  konsen- trasi  yang  sama,  tetapi  dalam  volume  yang  berbeda.  Hal tersebut  dilakukan  agar  dalam  waktu  yang  sama,  pita  yang diwarnai akan memiliki intensitas warna yang sama.
Hasil SDS-PAGE fraksi protein bungkil kelapa dapat dilihat pada Gambar 2.Dari hasil SDS-PAGE, tampak bahwa fraksinasi non-enzimatis protein memunculkan pita-pita protein yang lebih jelas  pada  semua  fraksi  protein  dibandingkan  dengan  pita-pita protein  hasil  fraksionasi  enzimatis.  Kemungkinan  yang  terjadi adalah  di  dalam  ekstrak  kasar  enzim  mannanase  terkandung enzim  protease  internal  yang  dihasilkan  oleh  mikroba  yang memfermentasi  bungkil  kelapa  selama  proses  produksi  enzim, sehingga  sebagian  protein  yang  terbebaskan  menjadi  ter- hidrolisis menjadi peptida-peptida  yang berukuran  kecil. Selain itu, mungkin terdapat senyawa lain sebagai hasil fermentasi.
Keterangan: 1–4: albumin, globulin, glutelin, dan prolamin (non-enzimatis); 5–8: albumin, globulin, glutelin, dan prolamin (enzimatis)
Gambar 2. Hasil SDS-PAGE fraksi-fraksi  protein bungkil kelapa
Tabel 2 menunjukkan perbandingan  kisaran bobot molekul fraksi-fraksi protein, sebelum menggunakan enzim dan sesudah menggunakan  enzim,  hasil  karakterisasi  dengan  SDS-PAGE. Karakterisasi  menggunakan  kisaran  bobot  molekul  dilakukan karena pita-pita yang dihasilkan dari hasil SDS-PAGE beragam dan saling berdekatan. Pita-pita protein yang saling berdekatan ( doublet )  mengindikasikan  bahwa  protein  tersebut  memiliki kesamaan  jumlah  asam-asam  amino,  namun  salah  satu  di- antaranya  memiliki  ekstra  residu  asam  amino  sehingga menyebabkan posisi pitanya sedikit berbeda (Laemmli, 1970).
Profil  albumin  dengan  metode  non-enzimatis  berbeda dengan profil albumin dengan metode enzimatis. Pada metode non-enzimatis, albumin memiliki 4 ragam kisaran bobot molekul,
M Bobot Molekul 205,5 kD 66,0 kD 45,0 kD
29,0 kD 24,0 kD
14,4 kD 1 2 3 4 5 6 7 8
yakni 24,1-29,0 kD; 29,1-45,0 kD; 45,1-66,0 kD; dan 66,1-97,4 kD.  Pada  metode  enzimatis,  albumin  juga  memiliki  4  ragam kisaran  bobot  molekul,  namun  kisaran  29,1-45,0  kD  tidak muncul,  sebaliknya  muncul  kisaran  baru,  yakni  97,5-205,0  kD. Pedroche et  al. (2005)  menyebutkan  bahwa chickpea memiliki protein albumin  yang berukuran  44,0 dan 46,4  kD.  Sementara itu  Singh et  al. (2001)  menyebutkan  bahwa  albumin  pada gandum  memiliki  memiliki  bobot  molekul  54,0-60,0;  62,0;  dan 64,0 kD. Hasil tersebut menunjukkan adanya kesamaan dengan kisaran  bobot  molekul  albumin  hasil  percobaan.  Kemungkinan penambahan  enzim  menyebabkan  sebagian  protein  yang  ada berikatan  silang  menjadi  enzim  dengan  bobot  molekul  lebih besar.
Hal yang serupa terjadi pada fraksi protein globulin. Dengan metode non-enzimatis, globulin memiliki 6 ragam kisaran bobot molekul, yakni 14,4-24,0 kD; 24,1-29,0 kD; 29,1-45,0 kD; 45,1- 66,0  kD; 66,1-97,4  kD; dan 97,5-205,0  kD. Pada metode non- enzimatis,  kisaran  bobot  molekul  97,5-205,0  kD  merupakan kisaran bobot molekul yang hanya dimiliki oleh protein globulin yang membedakan dengan jenis-jenis protein lainnya.  Dengan metode  enzimatis,  globulin  kehilangan  satu  ragam  kisaran bobot molekul, yakni 14,4-24,0 kD. Kemungkinan ekstrak kasar enzim  yang  digunakan  memiliki  protease  yang  menghidrolisis fraksi  14,4-24,0  kD  pada  fraksi  globulin.  Denavi et  al. (2009) menyebutkan  bahwa  ukuran  protein  globulin  kedelai  adalah 20,0; 35,0; 52,0; 72,0; dan 94,0 kD.
Tabel 2. Pemetaan fraksi-fraksi protein bungkil kelapa ( protein profiling) BM (kD) Metode Non-enzimatis Metode Enzimatis AL B G LB G LT PR O AL B G LB G LT
PR O 14,4 – 24,0 - v - v - - - v 24,1 – 29,0 v v v - v v v - 29,1 – 45,0 v v v - - v v - 45,1 – 66,0 v v v v v v v v
66,1 – 97,4 v
v v v v v v v 97,5 – 205,0 - v - - v v - -
Keterangan:  albumin  (ALB),  globulin  (GLB),  glutelin  (GLT),  dan prolamin (PRO)
Glutelin memiliki jumlah variasi kisaran bobot molekul yang sama,  baik  dengan  metode  non-enzimatis  maupun  metode enzimatis,  yakni 4 macam  ragam kisaran bobot molekul: 24,1- 29,0 kD; 29,1-45,0 kD; 45,1-66,0 kD; dan 66,1-97,4 kD. ragam kisaran ini mirip dengan ragam kisaran albumin dengan metode non-enzimatis.  Menurut  Agboola et  al. (2005),  protein  glutelin pada  beras  memiliki  bobot  molekul  5,9;  12,7;  21,4;  29,5;  dan 39,8 kD.
Sedangkan  Prolamin  memiliki  3  macam  ragam  kisaran bobot  molekul,  baik  menggunakan  metode  non-enzimatis maupun enzimatis, yakni 14,4-24,0 kD; 45,1-66,0 kD; dan 66,1- 97,4  kD.  Pada  metode  enzimatis,  kisaran  bobot  molekul  14,4- 24,0  kD  merupakan  kekhasan  khas  yang  hanya  dimiliki  oleh prolamin  sehingga  membedakannya  dari  jenis-jenis  protein lainnya.  Menurut  Agboola et  al. (2005),  protein  prolamin  pada beras  memiliki  ukuran  bobot  molekul  12,8;  37,7;  43,7;  45,3; 49,0; dan 105,2 kD.
Keseluruhan  fraksi  protein  memiliki  kisaran  bobot  molekul yang  beragam,  namun  ditemukan  ada  kisaran  bobot  molekul yang sama yakni pada kisaran 45,1–66,0 kD dan 66,1–97,4 kD. Meskipun  memiliki  kisaran  bobot  molekul  yang  sama,  setiap protein  tersebut  memiliki  kelarutan  yang  berbeda.  Dengan demikian  dapat  dikatakan  bahwa  pada  bungkil  kelapa  di- temukan  protein  albumin,  globulin,  glutelin,  dan  prolamin dengan kisaran bobot molekul yang sama.

## KESIMPULAN
Hasil  karakterisasi masing-masing fraksi protein menunjuk- kan  adanya  keberagaman  kisaran  ukuran  bobot  molekulnya. Namun,  di  balik  keberagaman  tersebut  ditemukan  adanya kesamaan  kisaran  ukuran  bobot  molekul  pada  kesemua  jenis fraksi  protein,  yaknipada  kisaran  45,1–66,0  kD  dan  66,1–97,4 kD.  Meskipun  memiliki  kisaran  bobot  molekul  yang  sama, protein-protein  tersebut  memiliki  sifat-sifat  kelarutan  yang berbeda.  Hasil  analisis  SDS  PAGE  kemungkinan  masih ditemukan  protein  lain  diluar  albumin,  globulin,  glutelin,  dan prolamin. Oleh karena itu, diperlukan tahapan pemurnian untuk menghilangkan protein lain di luar fraksi-fraksi yang diinginkan.

## DAFTAR PUSTAKA
Adebiyi AP, Adebiyi AO, Hasegawa Y, Ogawa T, Muramoto K.
2009. Isolation and characterization of protein fractions from de-oiled rice bran. Eur Food Res Technol 228: 391-401.
Agboola S, Ng D, Mills D. 2005. Characterisation and functional properties  of  Australian  rice  protein  isolates.  J  Cereal  Sci 41: 283-290.
AOAC  [Assosiation  of  Analytical  Chemistry].  1995.  Official Methods  of  Analysis.  16 th edition.  Assosiation  of  Analytical Chemistry. Washington D.C.
Bollag  DM,  Edelstein  SJ.  1991.  Protein  Methods.  Wiley-Liss,
Inc. USA.
Dairo  FAS,  Fasuyi  AO.  2008.  Evaluation  of  fermented  palm kernel  meal  and  fermented  copra  meal  proteins  as substitute  for  soybean  meal  protein  in  laying  hens  diets.  J Cent Eur Agric 9: 35-44.
Denavi G, Tapia-Blacido DR, Anon MC, Sobral PJA, Mauri AN, Menegalli  FC.  2009.  Effects  of  drying  conditions  on  some physical properties of soy protein films. J Food Eng 90: 341- 349.
FAO  [Food  Agricultural  Organization].  2009.  Production  of Coconut in Indonesia. http://faostat.fao.org/site/567/Desktop Default.aspx?PageID=567#ancor. [27 Agustus 2009].
Laemmli UK. 1970. SDS PAGE. Nature. 227:680-685.
Lie-Fen  S,  Tuan-Nan  W,  Ching-San  C.  1994.  Purification  and Characterization of rice prolamins. Bot Bull Acad Sin 35: 65- 71.
Miskiyah,  Mulyawati  I,  Haliza  W.  2006.  Pemanfaatan  ampas kelapa  limbah  pengolahan  minyak  kelapa  murni  menjadi
pakan.  Seminar  Nasional  Teknologi  Peternakan  dan Veteriner.
Mudau  MM.  2006.  The  Production,  Purification  and Characterization  of  Endo-1,4-β-Mannanase  from  Newly Isolated  Strains  of Scopulariopsis  candida .  Disssertation.
Department  of  Microbial,  Biochemical,  and  Food Biotechnology. University of Free State. South Africa.
Pedroche J, Yust MM, Lqari H, Megi’as C, Giro’n-Calle J, Alaiz
M,  Milla’n  F,Vioque  J.  2005.  Chickpea  pa2  albumin  binds hemin. J Plant Sci 168: 1109-1114.
Pomeranz  Y,  Meloan  CL.  1994.  Food  Analysis:  Theory  and Practice.  3rd  ed.  Chapman  and  Hall  an  International Thomson Publ. Co. New York.
Ragab  DM,  Babiker  EE,  Eltinay  AH.  2004.  Fractionation, solubility,  and  functional  properties  of  cowpea  ( Vigna unguiculata )  proteins  as  affected  by  pH  and/or  salt concentration. Food Chem 84: 207-212.
Siagian  PLP.  2009.  Production  of  protein  isolate,  protein concentrate,  and  dietary  fibre.  Research  Center  for Chemistry. Indonesia Institute of Sciences. Jakarta.
Sikorski ZE. 1992. Chemical and Functional Properties of Food Proteins. Technomic Publishing Co., Inc. Lancaster-Basel.
Singh J, Malcolm B, Tanner G, Skerritt JH. 2001. Albumin and globulin  proteins  of  wheat  flour:  Immunological  and  n- terminal  sequence  characterization.  J  Cereal  Sci  34:  85- 103.
Siu-Mei  C,  Ching-Yung  M.  2006.  Extraction,  purification  and characterization  of  globulin  from  common  buckwheat ( Fagopyrum esculentum Moench) seeds. Food Res Intl 39: 974-981.
Standar  Nasional  Indonesia  01-2904-1996/Rev.  1992.  Bungkil Kelapa/Bahan Baku Pakan. Dewan Standardisasi Nasional. Jakarta.
Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta. Gramedia Pustaka Utama.