## Karakterisasi Molekuler Ikan Gurami Soang ( Osphronemus gouramy
Lac.) yang Mati pada Rentang Waktu berbeda menggunakan PCR-RFLP Gen Major Histocompatibility Complex Kelas II B
Jaka Tri Spetiawan 1 , Agus Nuryanto 1 , Hendro Pramono 1 , Kusbiyanto 1 , Petrus H. Tjahja Soedibja 2
1 Fakultas Biologi, Universitas Jenderal , Jalan dr. Suparno 63 Purwokerto 53122
2 Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Jenderal Soedirman
* correspondence author: anuryanto2003@yahoo.com

## Abstract
Gurami ( Osphronemus gouramy Lac.) is a popular fish species among Indonesian people. Several Gurami strains have been cultivated by fish farmer, one of which is Gurami Soang. This strain is belived to have a faster growth rate compared to other strains. However, like other strains, the fingerling of Soang strain  have  also  a  low  survival  and  suceptible  to  disease,  especially  that  caused  by Aeromonas hydrophila infection. It has been proved that seeds from a single spawning event show varibale disease resistance. The difference in resistance among individuals is suggested related to the difference in their genetic  component.  One  of  the  genes  responsible  for  resistance  is  Major  Histocompatibility  Complex ( MHC ) class II B gene. Variability in resistance can be analyzed by using PCR - RFLP technique. PCR- RFLP  is  a  technique  that  can  produce  a  specific  DNA  fragments  by  PCR,  followed  by  cutting  the  PCR product  using  restriction  enzymes  to  describe  the  presence  or  absence  of  restriction  sites  in  DNA fragments.  This  research  aims  to  determine  genetic  marker  to  differiantiate  between  resitant  and irresistant individual of Gurami Soang infected by A. hydrophila which die at a different time priod based on  PCR-RFLP MHC class  IIB  gene.  The  study  used  survey  method  with  purposive  random  sampling. This study was done from November 2015 up to April 2016. The Data of PCR-RFLP band patterns were analyzed  descriptively.  The  result  indicated  that cutting  of  the MHC class  II  B  gene  using Hinf I  produce two  RFLP  bands  with  300  bp  and  100  bp  length  in  all  samples.  Meanwhile,  the  MHC  IIB  gene  was  not cuted  by Pst I, Hind III, Bam HI  and Eco RI  enzymes  forall  samples.  These  mean  that  MHC  II  gene  in  all individuals were monomorphic. Therefore,it can be concluded that there is no specific genetic marker  to differentiate gurami soang individulas which was dying in different time periods.
Keywords : Gourami Soang, PCR-RFLP, genetic diversity, MHC class II B gene

## Abstrak
Ikan  Gurami  ( Osphronemus  gouramy Lac.)  merupakan  jenis  ikan  yang  populer  di  masyarakat Indonesia. Gurami soang merupakan strain ikan gurami yang memiliki laju pertumbuhan yang lebih cepat dibanding dengan strain yang lain. Namun, strain soang juga memiliki kelangsungan hidup  yang rendah dan  rentan  terhadap  penyakit.  Penyakit  ikan  yang  sangat  berbahaya  adalah  yang  disebabkan  oleh bakteri Aeromonas  hydrophila .    Benih  yang  berasal  dari  satu  pemijahan  memiliki  ketahanan  terhadap penyakit  yang  bervariasi  sehingga  jika  diinfeksi  oleh  bakteri A.  hydrophila akan  memiliki  ketahanan berbeda-beda. Perbedaan  daya hidup  tersebut dapat  terjadi karena perbedaan komponen genetik  yang dimiliki  pada  setiap  individu  dalam  satu  pemijahan.  Salah  satu  gen  yang  bertanggungjawab  terhadap resistensi  adalah  gen Major  Histocompatibility  Complex ( MHC )  kelas  II  B.  Variasi  resistensi  dapat dianalisa secara molekuler menggunakan teknik PCR ( Polymerase Chain Reaction ) – RFLP ( Restriction Fragment  Length  Polymorphism ).  PCR-RFLP  merupakan  suatu  teknik  yang  dapat  memperbanyak fragmen DNA tertentu melalui PCR, diikuti dengan pemotongan situs restriksi untuk menggambarkan ada atau tidak adanya perubahan situs restriksi yang terdapat pada fragmen. Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan  marka  gen MHC kelas  2B  pada  ikan  gurami  soang  dari  satu  pemijahan  yang  diinfeksi A. hydrophila yang  mengalami  kematian  pada  rentang  waktu  berbeda  berdasarkan  karakter  PCR-RFLP. Penelitian  dilakukan  menggunakan  metode survey dengan  pengambilan  sampel  secara purposive random  sampling .  Penelitian  dilakukan  mulai  November  2015  sampai  dengan  April  2016.Data  pola  pita PCR-RFLP  dianalisis  secara  deskriptif.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pemotongan  gen  MHC  II menggunakan enzim Hinf I menghasilkan dua pita RFLP yang masing-masing berukuran lebih kurang 300 pb  dan  100  pb.  Kedua  fragmen  RFLP  tersebut  muncul  pada  semua  sampel  ikan  gurami  soang  yang diteliti.  Sementara  itu,  gen  MHC  II  tidak  terpotong  ketika  restriksi  dilakukan  menggunakan  enzim Pst I, Hind III, Bam HI,  dan Eco RI.  Hal  tersebut mengindikasikan  bahwa  gen  MHC  IIB  pada  individu  yang  mati dalam  waktu  berbeda  bersifat  monomorfik.  Oleh  karena  itu  dapat  disimpulkan  bahwa  tidak  ada  marka PCR  RFLP  gen  MHC  II  yang  dapat  digunakan  untuk  membedakan  benih  ikan  gurami  soang  yang  mati dengan waktu berbeda.
Kata kunci : Gurami soang, PCR-RFLP, keragaman genetik, gen MHC kelas IIB

## Pendahuluan
Ikan  gurami  ( Osphronemus  goramy Lac.) merupakan  jenis  ikan  konsumsi  yang  disukai karena  dagingnya  yang  tebal  dan  rasanya  yang enak.  Gurami  telah  dibudidayakan  secara  luas oleh  masyarakat  Indonesia  dan  menyebar  ke negara  lain  (Welcomme,  1988).  Ikan  gurami memiliki  beberapa strain di  antaranya  gurami Soang,  Jepang,  Paris,  Bastard,  dan  Porselen yang  banyak  dibudidayakan  (Nugroho,  2011). Sementara itu, menurut Setijaningsih et al . (2007), strain  ikan  gurami  yang  telah  dibudidayakan  di Indonesia  meliputi  gurami  soang,  gurami  jepang, gurami paris, gurami bastar, dan gurami porselen Masalah yang sering dihadapi dalam kegiatan  budidaya  ikan  adalah  adanya  penyakit pada  ikan  yang  bersifat  patogenik  baik  dari golongan parasit, jamur, bakteri, dan virus.  Yu, et al.  (2004)  menyatakan  bahwa  bakteri Aeromonas hydrophila merupakan bakteri yang dapat menyebabkan penyakit Motile Aeromonad Septicemia (MAS)  dan  sangat  membahayakan produksi perikanan. Sementara itu menurut Austin & Austin (2007), bakteri Aeromonas menjadi salah satu  penyebab  penyakit  pada  ikan  air  tawar  dan dapat  menyebabkan  penyakit furunculosis dan carp erytrodermatitis .  Bakteri  pada  ikan  dapat dijumpai  pada  permukaan  tubuh  dan  saluran pencernaan.  Bakteri  tersebut  menyerang  sistem pertahanan  ikan  yang  mengakibatkan  nafsu makan berkurang, tukak pada kulit dan penimbunan  cairan  dirongga  tubuh  sehingga menimbulkan kematian pada ikan gurami.
Pertahanan  tubuh  yang  dimiliki  setiap individu  berbeda-beda  tergantung  komponen genetik yang diwarisi dari induknya (Kusbiyanto et al.,  2016).  Variasi  sifat  pertahanan  tubuh  dari individu dalam satu populasi merupakan keanekaragaman yang dimiliki oleh suatu spesies yang  terdapat  dalam  suatu populasi  (Campbell  et al.,  2009).  Variasi  intra  populasi  dapat  dilihat secara  genetik  melalui  karakter  polimorfisme. Karakter  tersebut  seringkali  dikontrol  oleh  satu gen yang diturunkan.  Penelitian  ini akan membantu  dalam  program  budidaya  melalui penyediaan metode seleksi benih secara molekuler. Metode selective breeding ini merupakan  program  pemuliaan  yang  bertujuan untuk  meningkatkan  mutu  genetik  dari  populasi. Apabila  hal  ini  dilakukan  pada  gurami  soang, maka  generasi  berikutnya  akan  memiliki  kualitas yang  lebih  baik,  misalnya  dapat  tumbuh  lebih cepat  sehingga  pemeliharaannya  menjadi  lebih efisien dan murah (Sembiring et al., 2013).
Major  Histocompatibility  Complex ( MHC ) merupakan  gen  terbesar  yang  dapat  ditemukan pada  vertebrata  yang  mengkode  molekul MHC yang  berperan  penting  dalam  sistem  kekebalan tubuh  (Zhao  et  al.,  2013).  Molekul MHC terlibat dalam  interaksi  antara  benda  asing  dengan sistem pertahanan tubuh ikan. Berdasarkan fungsi
dan  susunan  kimianya,  gen MHC dibagi  menjadi dua, yaitu MHC class I dan MHC class II (Pang et al., 2013). MHC I merupakan molekul yang terlibat dalam presentasi antigen peptida pada permukaan  sel  yang  dikenali  oleh  reseptor  T  sel sitotoksik  (TCR)  dari  limfosit  T  CD8 + .  Molekul MHC I  merupakan  rantai  besar  α  transmembran heterodimer  (45  kDa)  yang  berasosiasi  non- kovalen  dengan  rantai  pendek  (12  kDa)  β2- mikroglobulin. Masing-masing rantai besar disandikan oleh gen polimorfik yang berisi peptida leader , tiga domain ekstraseluler (α1, α2, α3) dan transmembran  serta  sitoplasma  (Cuesta  et  al., 2007). MHC I  berperan  penting  dalam  sistem utama kekebalan tubuh (Zhao et al., 2013). Major  Histocompatibility  Complex ( MHC ) adalah  suatu  kelompok  atau  kumpulan  gen  yang terletak  dalam  kromosom  6  dan  berperan  dalam pengenalan  dan  pemberian  sinyal  di  antara  sel- sel  sistem  pertahanan  tubuh  (sistem  imun). MHC class II  termasuk  sistem  imun  spesifik  yang bersifat  adaptif. MHC class II  terdiri  atas  sel-sel imunokompeten seperti sel B, monosit, makrofag, antigen  presenting  cells (APC),  dan  sel  T  aktif yang  terdapat  pada  epitel  kelenjar  Timus (Baratawidjaja,  1991).  Respons  imun  biasanya terkait  dengan  adanya  molekul MHC class I  dan MHC class II.  Sel-sel  fagositik  akan  diaktifkan oleh MHC class II  untuk  memproduksi  antibodi dan  mengaktivasi  karakter-karakter  imunologi yang  terlibat  dalam  mengeliminasi  parasit  dan bakteri,  dan  menetralkan  virus  (Sucipto,  2011). Sebagai salah satu gen yang berfungsi menetralkan virus maka
gen
Major Histocompatibility  Complex  class II  ( MHC -  II) telah banyak digunakan sebagai penciri molekuler sebagai penanda ikan tahan penyakit (Consuegra dan  Leaniz,  2008;  Rakus  et  al.,  2009;  Aryanto  et al., 2015; Aziz et al., 2015).
MHC merupakan  karakter  daya  tahan  tubuh terhadap penyakit yang dapat dideteksi keberadaannya secara genotip. Menurut Hayuningtyas  et  al.  (2013)  hubungan  antara pertumbuhan  dengan  gen MHC II  memiliki korelasi  yang  negatif.  Oleh  karena  itu,  populasi ikan  yang  pertumbuhannya  lambat  memiliki tingkat persentase positif MHC II lebih dibandingkan populasi ikan yang pertumbuhannya cepat.  Selain  karakter  daya  tahan  terdapat karakter  pertumbuhan  yang  dapat  dilihat  secara fenotip,  karakter  ini  juga  berperan  penting  dalam peningkatan  produksi  secara  kualitatif.  Oleh karena  itu,  perlu  adanya  jaminan  kualitas  ikan konsumsi  yang  baik,  salah  satunya  dengan penyediaan  induk  unggul  yang  dihasilkan  melalui perbaikan  genetic,  sehingga  dapat  diperoleh keturunan gurami yang tahan infeksi A. hydrophila.
Deteksi restriction fragment
length polymorphism (RFLP)  dilakukan  berdasarkan pada adanya kemungkinan untuk mem-
bandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan  pemotongan  dengan  enzim  restriksi terhadap  DNA  target/dari  individu  yang  berbeda. Enzim  restriksi  akan  memotong  situs  tertentu yang dikenalinya. Situs enzim restriksi dari genom suatu  kelompok  organisme  yang  berubah  karena mutasi atau berpindah karena genetic rearrangement dapat menyebabkan situs tersebut tidak lagi dikenali oleh enzim, atau enzim restriksi akan  memotong  daerah  lain  yang  berbeda. Proses  ini  menyebabkan  terbentuknya  fragmen- fragmen  DNA  yang  berbeda  ukurannya  antar individu.  Polimorfisme  ini  selanjutnya  digunakan untuk membuat pohon filogeni/dendogram kekerabatan kelompok (Purwantini et al., 2013).
Berdasarkan penelitian sebelumnya dikemukakan  bahwa  analisis  polymerase  chain reaction  (PCR)-RFLP  telah  diterapkan  untuk membedakan  spesies  dan  mendeteksi  variasi antar  spesies  atau  intra  spesies  variasi  berbagai spesiesikan  (Mesquita et  al. ,  2001;  Takehana et al. ,  2004;  Cheng  and  Lu  2005;  Ma et  al .,  2010) dan  babi  (Fibriana et  al .,  2012)..  Oleh  karena  itu, teknik PCR-RFLP dapat digunakan untuk menganalisis keragaman dan keseragaman genetik  individu.  Hal  ini  merupakan  salah  satu alternatif yang dapat digunakan untuk menganalisis  keanekaragaman  genetik  pada  ikan gurami  soang  berbeda  ukuran  dalam  satu pemijahan,  sehingga  dapat  mempelajari  apakah ada  perbedaan  situs  restriksi  pada  fragmen  DNA ikan  gurami  soang  berbeda  ukuran  yang dihasilkan dari satu pemijahan.
Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan  marka  gen MHC kelas  2B  pada ikan  gurami  soang  dari  satu  pemijahan  yang diinfeksi A.  hydrophila yang  mengalami  kematian pada rentang waktu berbeda berdasarkan karakter PCR-RFLP dan juga untuk menggambarkan  fenomena  variasi  intra  populasi yang terjadi pada populasi tersebut.
Penelitian  karakterisasi  molekuler  dengan menggunakan  PCR-RFLP  gen MHC kelas  2B pada  ikan  gurami  soang  yang  diinfeksi A. hydrophila dan mengalami kematian pada rentang waktu  berbeda  ini  diharapkan  dapat  memberikan informasi  ilmiah  mengenai  karakter  PCR-RFLP gen MHC kelas  2B  pada  ikan  tersebut.  Informasi tersebut  dapat  digunakan  untuk  membedakan individu yang memiliki tingkat resistensi tinggi dan rendah.  Oleh  karena  itu  diharapkan  dapat bermanfaat  bagi  para  pembudidaya  ikan  gurami soang  untuk  menentukan  program  pemuliaan yang tepat dalam tahapan berikutnya.

## Metode
Penelitian  ini  dilaksanakan  selama  enam bulan  dari  November  2015  sampai  April  2016. Metode  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  metode survey dengan  menggunakan
teknik purposive random sampling , yaitu pengambilan  sampel  hanya  individu  yang  mati pada  rentang  waktu  berbeda  setelah  infeksi A. hydrophila . Ikan yang mati mengalami peradangan  sangat  parah  dan  tidak  ada  proses penyembuhan,  sedangkan  ikan  yang  tetap  hidup pasca  infeksi  mengalami  peradangan  namun kemudian  mengalami  penyembuhan.  Sirip  ekor dari  masing-masing  sampel  ikan  gurami  soang dipotong  dengan  ukuran  lebih  kurang  5  mm. Sampel  jaringan  sirip  ekor  selanjutnya  diawetkan dalam  alkohol  absolut  96%  dan  kemudian disimpan di lemari es dengan temperatur 4 o C. Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode Chelex. Pertama dibuat larutan mastermix yang terdiri atas chelex 5% 100 µl, DTT 0,1 mM 5 µl,  dan  proteinase-K  sebanyak  4  µl,  dimasukkan ke  dalam tube 1,5  ml.  Kemudian,  pipet  109  µl mastermix ke  dalam tube 1,5  ml  yang  telah disiapkan untuk masing-masing sampel. Potongan  sirip  ikan  dengan  ukuran  kurang  lebih 0,2  mm  dimasukkan  ke  dalam tube yang  telah diberi  larutan mastermix tersebut.  Setelah  itu, diinkubasi  pada  suhu  56 o C  dengan  kecepatan 1000  rpm  selama  4-6  jam  pada  thermomixer. Selanjutnya,  disentrifugasi  dengan  kecepatan 13.000  gr  selama  2-4  menit.  Supernatan ditransfer  ke  dalam tube baru,  kemudian diinkubasi  kembali  dengan  kecepatan  1000  rpm selama 10-20 menit pada temperatur 95 o C untuk menghindari  sisa  protein  yang  terdapat  pada templat  sehingga  tidak  menghancurkan Taq polymerase .
Penanda  genetik  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah gen MHC kelas II B. Fragmen gen tersebut diamplifikasi
menggunakan sepasang primer MHC Forward : 5’ ATGGAAGATGAAATCGCCGC dan MHC Reverse 5’ TGCCAGATCTTCTCCATGTCG
(Wegner  et  al.,  2006) . Reaksi  PCR  dilakukan dengan  volume  total  campuran  sebanyak  25  µl. Larutan  campuran  tersebut  terdiri  atas  air ultrapure (ddH 2 O)  sebanyak  18,4  µl,  buffer  PCR 10x sebanyak 2,5 µl, dNTP sebanyak 1 µl,  1 mM MgCl 2 1  µl,  primer  0,1  mM MHC Forward 1  µl, primer  0,1  mM MHC Reverse 1  µl dan,  1  U  DNA Taq  polymerase sebanyak  0,1  µl  dan  DNA  1  µl. Proses  PCR  dilakukan  di  dalam  mesin thermal cycle. Kondisi  optimal  PCR  yang  diperoleh selama  penelitian  adalah  predenaturasi  pada suhu  95 0 C  selama  3  menit.  PCR  dilakukan sebanyak  3  siklus  yang  terdiri  atas  denaturasi pada  suhu  95 0 C    selama  30  detik,  penempelan ( annealing )  pada  suhu  45 0 C  selama  2  menit  dan pemanjangan ( extention) pada suhu 72 0 C  selama 1  menit  15  detik.  Setelah  3  siklus,  kemudian dilanjutkan  sebanyak  35  siklus  yang  terdiri  atas denaturasi  pada  suhu  95 0 C    selama  30  detik, penempelan ( annealing ) pada suhu 48 0 C  selama 2  menit  dan  pemanjangan  ( extention) pada  suhu 72 0 C  selama 1 menit 15 detik. Setelah 35 siklus,
kemudian  dilanjutkan  dengan  pemanjangan  akhir ( final  extention) pada  suhu  72 0 C  selama  9  menit. Selanjutnya  produk  PCR  divisualisasikan  pada elektroforesis gel agarosa 1%.
Segmen  gen MHC kelas  II  B  yang teramplifikasi dilakukan skrinning untuk memperoleh  situs  polimorfisme  menggunakan  5 enzim  restriksi  ( Eco RI, Bam HI, Hind III, Pst I,  dan Hinf I).  Pemotongan  enzim  restriksi  dilakukan mengikuti  protokol  dari Thermo  scientific dengan volume  total  campuran  sebanyak  32  µl.  Larutan campuran tersebut terdiri atas 18 µl nuclease free water ,  10  µl  produk  PCR,  2  µl  10X  buffer  enzim, dan 0,5-2 µl enzim restriksi (1 U). Masing-masing larutan  campuran  dimasukkan  ke  dalam  tube  1,5 ml  dan  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  ±  16 jam.  Sampel  hasil  digesti  dimigrasikan  pada  gel agarosa  1  %  dalam  1X  TAE  buffer  dan  diwarnai dengan  menggunakan  EtBr  ( ethidium  bromide ). Fragmen  yang  terpotong  divisualisasikan  di bawah  UV  trans-illuminator.  Penggunaan  enzim restriksi  diharapkan  mampu  menghasilkan  pola restriksi  (pemotongan)  DNA  sehingga  dapat digunakan  untuk  mengetahui  adanya  perbedaan antara  individu  yang  digunakan  pada  penelitian ini.  Jika  terdapat  situs  pemotongan  maka  enzim restriksi  akan  memotong  DNA  pada  situs  yang dikenal  sehingga  sekuens  DNA  terpisah  menjadi fragmen-fragmen  DNA.  Ada  atau  tidaknya  situs restriksi  ditentukan  berdasarkan  kemunculan fragmen  RFLP.  Profil  marka  PCR-RFLP  untuk setiap  individu  dianalisis  kemunculan  pitanya menggunakan  teknik  elektroforesis  gel  agarosa 1%  dan  menggunakan  marka  100  bp ladder sebagai pembanding fragmen yang diperoleh.
Variabel  yang  diamati  pada  penelitian  ini yaitu  keragaman  genetik  intra  populasi  ikan gurami strain soang.  Sementara  itu,  parameter yang diamati keberadaan marka PCR-RFLP yang dapat  digunakan  untuk  membedakan  ikan  yang mati  pada  rentang  waktu  berbeda.  Profil  marka PCR-RFLP  untuk  setiap  benih  yang  mati  pada rentang waktu berbeda dianalisis secara deskriptif berdasarkan  kemunculan  pita  RFLP  pada  gel agarosa.

## Hasil dan Pembahasan
Profil  Genom  Total  Hasil  Isolasi  DNA  Ikan Gurami Soang
DNA  dari  12  individu  ikan  gurami  soang berhasil  diisolasi  meskipun  DNA  yang  diperoleh terlihat  tidak  utuh  ( smear )  (Gambar  1.).  Pita smear ini  menunjukkan  adanya  fragmen-fragmen DNA yang terbentuk akibat perlakuan fisik selama proses  ekstraksi  DNA,  seperti  penggunaan butiran-butiran chelex .  Butiran-butiran  tersebut diduga  yang menyebabkan genom terfragmentasi dan  ketika  divisualisasi  pada  gel  agarosa  terlihat
sebagai smear .    Menurut  Weeden  et  al.  (1992), munculnya  pita smear pada  elektroforesis  hasil isolasi  DNA  juga  dapat  terjadi  karena  adanya kontaminasi  bahan  organik  lainnya  seperti  RNA dan protein.

## Gambar  1.  Hasil  visualisasi  genom  total  ikan gurami soang
Keterangan :
1 & 7 = sampel ikan gurami soang yang mati pada hari kesatu,  2  &  8  =  sampel  ikan  gurami  soang  yang  mati pada  hari  kedua,  3  &  9  =  sampel  ikan  gurami  soang yang  mati  pada  hari  ketiga,  4  &  10  =  sampel  ikan gurami  soang  yang  mati  pada  hari  keempat,  5  &  11  = sampel ikan gurami soang yang mati pada hari kelima, 6 & 12 = sampel ikan gurami soang yang mati pada hari keenam, dan M = DNA marka 1kb
Menurut  Weeden  et  al.  (1992),  hasil  isolasi DNA  tersebut  masih  bisa  digunakan  sebagai template yang  cukup  baik  untuk  reaksi  PCR. Kondisi  tersebut  juga  pernah  dilaporkan  pada beberapa  penelitian  terdahulu  yang  memperoleh produk  PCR  dengan  kuantitas  dan  kualitas  yang baik  meskipun  menggunakan  templat  DNA berupa  DNA smear (Nuryanto  &  Kochzius,  2009; Nuryanto et al., 2012; Azizah et al., 2015).

## Amplifikasi Gen MHC Kelas II B
Hasil  amplifikasi gen MHC Kelas II B  berupa fragmen DNA berukuran lebih kurang 400 pasang basa  (pb).  Pita  amplikon  yang  dihasilkan merupakan  fragmen  yang  diharapkan,  karena menurut  Hayuningtyas  et  al.  (2013)  dan  Wegner et al. (2006), amplifikasi gen MHC Kelas II B dari genom  total  menggunakan  primer MHC II  akan menghasilkan produk dengan panjang sekitar 400 pb.  Produk  amplifikasi  ( amplicon )  dapat  dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Hasil  amplifikasi  Gen MHC Kelas II B ikan gurami soang
Keterangan :
1 & 7 = sampel ikan gurami soang yang mati pada hari kesatu,  2  &  8  =  sampel  ikan  gurami  soang  yang  mati pada  hari  kedua,  3  &  9  =  sampel  ikan  gurami  soang yang  mati  pada  hari  ketiga,  4  &  10  =  sampel  ikan gurami  soang  yang  mati  pada  hari  keempat,  5  &  11  = sampel ikan gurami soang yang mati pada hari kelima, 6 & 12 = sampel ikan gurami soang yang mati pada hari keenam, dan M = DNA marka 100 pb
Produk  PCR  400  pb  diperoleh  setelah melalui  proses  optimasi  suhu,  waktu,  dan kombinasi  reagen  yang  tepat.  Gen MHC Kelas  II B  diamplifikasi  dari  12  individu,  namun  produk amplifikasi  hanya  diproleh  dari  7  individu.  Produk amplifikasi  memiliki  variasi  intensitas  pita  yang dihasilkan seperti tebal dan jelas, tipis dan samar- samar.  Hasil  tersebut  diduga  disebabkan  oleh perbedaan  jumlah  salinan  amplifikasi  yang dipengaruhi oleh keberadaan pengulangan sekuens  tertentu  dalam  genom.  Menurut  Poerba & Martanti (2008), jumlah dan intensitas pita DNA yang dihasilkan sangat tergantung pada kemampuan  primer  mengenali  urutan  DNA komplementernya  pada  cetakan  DNA  yang digunakan.  Intensitas  pita  DNA  hasil  amplifikasi pada  setiap  primer  dipengaruhi  oleh  kemurnian dan konsentrasi DNA templat. DNA templat  yang mengandung senyawa-senyawa seperti polisakarida dan senyawa fenolik sering menghasilkan  pita  DNA  amplifikasi  yang  redup. Sementara  itu,  menurut  Gusmiaty  et  al.  (2012), perbedaan  DNA  hasil  amplifikasi  disebabkan adanya  persebaran  lokasi  basa  nukleotida  di dalam  genom  yang  menjadi  tempat  atau  situs penempelan  primer.  Jarak  antar  situs  amplifikasi ini  menghasilkan  fragmen  DNA  dengan  berbagai ukuran pasang basa.
Selain  faktor  yang  telah  dijelaskan  di  atas, keberhasilan proses PCR juga sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor lain yaitu kondisi deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP), oligonukleotida  primer,  DNA template (cetakan), komposisi larutan buffer , jumlah siklus reaksi, dan faktor  teknis  dan  non-teknis  lainnya,  misalnya kontaminasi  (Yuwono,  2006).  Faktor  lain  yang diduga sebagai penyebab produk amplifikasi tidak baik  yaitu  efisiensi  reaksi  amplifikasi  dengan teknik  PCR  tidak  akan  meningkat  dengan meningkatnya  jumlah  siklus  amplifikasi,  karena tingginya  siklus  amplifikasi  dapat  menyebabkan
terjadinya  inaktivasi  enzim  DNA  polimerase, degradasi  dNTPs  ataupun  akumulasi  hasil  PCR yang  nonspesifik.  Pertimbangan  faktor  lain  yang berperan  penting  dalam  optimalisasi  PCR  adalah pengaturan  temperatur  pada  penempelan  primer dan waktu dari masing-masing reaksi. Sementara itu  menurut  Christianti  et  al.  (2003),  hasil  PCR yang  baik  dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor seperti  kemurnian  hasil  ekstraksi  DNA,  ketepatan pemilihan primer  yang digunakan serta ketepatan kondisi  PCR.  Apabila  konsentrasi  DNA  terlalu rendah  akan  menghasilkan  fragmen  sebagai  pita yang sangat tipis pada gel atau bahkan pita tidak terlihat  secara  visual.  Sebaliknya,  konsentrasi DNA  yang  terlalu  tinggi  akan  menyebabkan fragmen  terlihat  tebal  sehingga  sulit  dibedakan antara  satu  pita  dengan  pita  lainnya  (Haris  et  al., 2003).  Primer  merupakan  bagian  penting  dalam reaksi  PCR  karena  primer  merupakan  inisiator pada sintesis DNA target. Primer yang digunakan pada  penelitian  ini  telah  memenuhi  syarat  dalam seleksi  primer  seperti  terdiri  atas  20  basa  dan memiliki kandungan G/C sebesar 50%.

## Profil  Marka  PCR-RFLP  Benih  Ikan  Mati  Pada Rentang Waktu Berbeda
Pemotongan produk PCR menggunakan lima enzim  restriksi  diperoleh  satu  enzim  yang menghasilkan  pola  marka  RFLP  yaitu Hinf I. Setelah  dilakukan  pemotongan  produk  PCR menggunakan  enzim Hinf I,  dua  pita  RFLP  yang dihasilkan berukuran lebih kurang 300 pb dan 100 pb.  Kedua  fragmen  RFLP  tersebut  muncul  pada semua  sampel  ikan  gurami  soang  meskipun  mati pada  rentang  waktu  berbeda.  Pemotongan  yang menghasilkan  dua  pita  ini  menunjukkan  bahwa gen MHC Kelas  II  B  mempunyai  satu  sisi pemotongan untuk enzim Hinf I. Hasil pemotongan produk  PCR  menggunakan  enzim Hinf I  dapat dilihat pada Gambar 4.3.
Pola  marka Hinf 1  yang  dihasilkan  sama untuk  semua  individu,  maka  marka Hinf 1  PCR- RFLP  gen  MHC  kelas  II  B  tidak  dapat  digunakan sebagai  pembeda  antara  benih  ikan  yang  mati pada waktu berbeda. Hal ini diduga karena semua benih  ikan  yang  mati  pascainfeksi  bakteri A. hydrophila memiliki alel gen MHC kelas II B  yang sama  dan  waktu  kematian  tidak  terkait  dengan variasi  komponen  genetik.  Hal  tersebut  berbeda dengan  penelitian  Jakaria  &  Noor  (2011)  pada sapi  Bali  ( Bos  javanicus )  yang  menghasilkan  alel heterozigot menggunakan gen Pit-1 yang dipotong  emnggunakan  enzim Hinf 1.  Perbedaan tersebut terjadi karena spesies organisme bahkan classis organisme yang digunakan dalam penelitian  ini  berbeda  dengan  penelitian  Jakaria dan  Noor  (2011).  Pada  penelitian  ini  digunakan ikan  gurami  soang  sedangkan  pada  penelitian
Jakaria dan Noor (2011) digunakan sapi. Menurut Kusbiyanto  et  al.  (2016)  setiap  spesies  diduga memiliki  ukuran  gen  yang  berbeda  termasuk ukuran gen MHC. Hal ini didukung oleh penelitian Hayuningtyas et  al. (2013),  Aryanto et  al. (2015), dan  Supriyanto  &  Dharmawantho  (2015)  yang memperoleh  amplikon  gen  MHC  II  yang  berbeda dari spesies ikan berbeda.
Gambar 3. Hasil  pemotongan  produk  PCR menggunakan Enzim Hinf I
Keterangan
:
1  =  sampel  ikan  gurami  soang  yang  mati  pada  hari kesatu,  3  =  sampel ikan  gurami soang  yang mati  pada hari  ketiga,  4  &  10  =  sampel  ikan  gurami  soang  yang mati  pada  hari  keempat,  5  &  11  =  sampel  ikan  gurami soang  yang  mati  pada  hari  kelima,  8  =  sampel  ikan gurami soang yang mati pada hari kedua, dan M = DNA marka 100pb
Hasil  pemotongan  produk  PCR  mengg- unakan  enzim Pst 1  dapat  dilihat pada  Gambar  4. Penggunaan  enzim Pst I  tidak  menghasilkan marka spesifik sebagai pembeda strain ikan yang tahan  terhadap A.  hydrophila dan  hanya menghasilkan pita dengan ukuran 400 pb. Kondisi ini  terjadi  diduga  karena  tidak  situs  spesifik  yang dapat  dikenali  oleh  enzim Pst 1.  Menurut  Santoso et  al. (2008) enzim Pst 1 memiliki situs pemotongan  (restriksi)  pada  posisi  5’C-T-G-C- A↓G 3’ atau 3 G↓A-C-G-T-C 5’. Hasil penelitian ini sama dengan penelitian Azizah et al. (2015) pada ikan Osphronemus  gouramy berbeda  ukuran.
Pada  penelitian  tersebut  enzim  Pst1  juga  tidak dapat  memotong  gen  sitokrom  c  oksidase  1 (CO1).  Persamaan  hasil  tersebut  diduga  karena kedua  gen  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini dan  penelitian  Azizah  et  al.  (2015)  sama-sama tidak memiliki situs restriksi untuk enzim Pst1.
Gambar  4.  Hasil  pemotongan  produk  PCR menggunakan Enzim Pst I Keterangan :
1  =  sampel  ikan  gurami  soang  yang  mati  pada  hari kesatu,  3  =  sampel ikan  gurami soang  yang mati  pada hari  ketiga,  4  &  10  =  sampel  ikan  gurami  soang  yang mati  pada  hari  keempat,  5  &  11  =  sampel  ikan  gurami soang  yang  mati  pada  hari  kelima,  8  =  sampel  ikan gurami soang yang mati pada hari kedua, dan M = DNA marka 100 pb
Hasil  pemotongan  produk  PCR  menggu- nakan enzim Hind III dapat dilihat pada Gambar 5. Penggunaan  enzim Hind III  tidak  menghasilkan marka spesifik sebagai pembeda strain ikan yang tahan  terhadap A.  hydrophila dan  hanya menghasilkan  pita  dengan  ukuran  400  pb.  Enzim Hind III  memiliki  situs  pemotongan  (restriksi) 5’A↓A-G-C-T-T-3’  atau  3’T-T-C-G-A↓A  5’  (Brown, 1991). Tidak terpotongnya  gen  MHC IIB dari ikan gurami soang yang digunakan dalam penelitian ini diduga karena tidak ada situs spesifik yang dapat dikenali  oleh  gen Hind III.  Hasil  penelitian  ini berbeda  dengan  hasil  penelitian  Azizah  et  al. (2015)  pada  ikan Osphronemus  gouramy soang berbeda  ukuran.  Perbedaan  ini  terjadi  karena setiap  gen  urutan  basa  nukleotida  yang  berbeda sehingga  situs  restriksi  yang  dimiliki  setiap  gen berbeda  meskipun  diisolasi  dari  individu  atau spesies yang sama.
Keterangan : 1    =  sampel  ikan  gurami  soang  yang  mati  pada  hari kesatu,  3  =  sampel ikan  gurami soang  yang mati  pada hari  ketiga,  4  &  10  =  sampel  ikan  gurami  soang  yang mati  pada  hari  keempat,  5  &  11  =  sampel  ikan  gurami soang  yang  mati  pada  hari  kelima,  8  =  sampel  ikan gurami soang yang mati pada hari kedua, dan M = DNA marka 100 pb
Hasil  pemotongan  produk  PCR  menggu- nakan enzim BamHI dapat dilihat pada Gambar 6. Penggunaan  enzim Bam HI  tidak  menghasilkan marka spesifik sebagai pembeda strain ikan yang tahan  terhadap A.  hydrophila dan  hanya menghasilkan pita dengan ukuran 400 pb. Kondisi tersebut  terjadi  karena  gen  MHC  IIB  dari  gurami soang  tidakmemiliki  situs  restriksi  yang  dikenali oleh  enzim  BamH1.      Menurut  Ausubel  (2003) enzim Bam HI  akan  mengenali  situs  restriksi dengan  urutan  basa  nukleotida pada  posisi  5’ G↓G-A-T-C-C  3’  atau  3’C-C-T-A-G↓G  5’.  Hasil penelitian ini sama dengan hasil penelitian Azizah et  al.  (2015)  pada  ikan Osphronemus  gouramy soang  berbeda  ukuran.  Tidak  terpotongnya produk  PCR  pada  penelitian  ini  dan  penelitian Azizah  et  al.  (2015)  diduga  terjadi  karena  tidak terdapat  situs  pengenalan  enzim  restriksi BamH I pada semua sampel.
Hasil  pemotongan  produk  PCR  menggu- nakan enzim Eco RI dapat dilihat pada Gambar 7. Penggunaan  enzim Eco RI  tidak  menghasilkan marka spesifik sebagai pembeda strain ikan yang tahan  terhadap A.  hydrophila dan  hanya menghasilkan pita dengan ukuran 400 pb. Kondisi tersebut  diduga  karena  pada  gen  MHC  IIB  ikan gurami  soang  tidak  terdapat  situs  restriksi  yang dapat  dikenali  oleh  gen  EcoR1.  Enzim Eco RI memiliki  situs  pemotongan  (restriksi)  pada  posisi 5’  G↓A-A-T-T-C  3’  atau  3’  C-T-T-A-A↓G  5’ (Gholizadeh & Kohnehrouz, 2009). Hasil penelitian ini sama dengan hasil penelitian Azizah et  al.  (2015)  pada  ikan Osphronemus  gouramy soang  berbeda ukuran.  Persamaan hasil tersebut diduga  gen  MHC  IIB  dan  CO1  padaikan  gurami soang  tidak  memiliki  situs  restriksi  yang  dapat dikenali oleh enzim EcoR1.
Keragaman  genetik  atau  polimorfisme  me- miliki  pengertian  yaitu  keberadaan  dua  atau  lebih alel pada sebuah lokus dalam populasi. Keragaman genetik dapat diamati dengan pengamatan melalui karakter genetik dengan sifat yang  diamati  berupa  DNA,  yang  sulit  dipengaruhi lingkungan  (Langga  et  al.,  2012).  Polimorfisme memiliki  penilaian  variasi  genetik  di  alam  yang terbaik  dengan  cara  melihat  nilai  rata-rata heterozigositas yang teramati.
Gambar  6.  Hasil  pemotongan  produk  PCR menggunakan Enzim Bam HI
Keterangan : 1  = sampel ikan gurami soang yang mati pada  hari  kesatu,  3  =  sampel  ikan  gurami  soang  yang mati  pada  hari  ketiga,  4  &  10  =  sampel  ikan  gurami soang  yang  mati  pada  hari  keempat,  5  &  11  =  sampel ikan  gurami  soang  yang  mati  pada  hari  kelima,  8  = sampel  ikan  gurami  soang  yang  mati  pada  hari kedua, dan M = DNA marka 100 bp)
Lokus  dinyatakan  polimorfik  apabila  memiliki variasi  alel  dalam  suatu  populasi,  sedangkan apabila  tidak  memiliki  variasi  maka  dinyatakan bersifat  monomorfik.  Individu  yang  memiliki  alel sama  pada  suatu  lokus  dinyatakan  memiliki genotip yang homozigot, sedangkan yang memiliki  alel  berbeda  dinyatakan  heterozigot. Suatu lokus dianggap polimorfik apabila frekuensi alel  yang  paling  sering  muncul  yaitu  sama  atau kurang  dari  0,99  (Hughes  et  al.,  2008).  Hasil penelitian ini tidak menunjukkan adanya polimorfisme  gen MHC Kelas  II  B  pada  ikan gurami  soang  yang  mati  pada  waktu  berbeda. Pemotongan  produk  PCR  menggunakan  enzim Hinf I  menghasilkan  dua  pita  RFLP  yang  masing- masing  berukuran  lebih  kurang  300  pb  dan  100 pb.  Kedua  fragmen  RFLP  tersebut  muncul  pada semua  sampel  ikan  gurami  soang.  Pemotongan yang  menghasilkan  dua  pita  ini  menunjukkan bahwa  gen MHC Kelas  II  B  mempunyai  satu  sisi pemotongan  untuk  enzim Hinf I.  Sedangkan pemotongan  menggunakan  enzim  restriksi Pst I, Hind III, Bam HI,  dan Eco RI  tidak  menunjukkan variasi individu jika dipotong atau dengan kata lain dalam  keadaan  monomorfisme,  memiliki  alel serupa
(homozigot)
sehingga nilai heterozigositasnya  0  (nol).  Oleh  karena  nilai heterozigositas  yang  diperoleh  0  (nol),  sehingga tidak  perlu  dianalisis  lebih  lanjut  mengenai polimorfisme,  frekuensi  alel  dan  kekayaan  alel menggunakan software Arlequin .
Gambar 7. Hasil  pemotongan  produk  PCR menggunakan Enzim Eco RI
Keterangan :
1    =  sampel  ikan  gurami  soang  yang  mati  pada  hari kesatu,  3  =  sampel ikan  gurami soang  yang mati  pada hari  ketiga,  4  &  10  =  sampel  ikan  gurami  soang  yang mati  pada  hari  keempat,  5  &  11  =  sampel  ikan  gurami soang  yang  mati  pada  hari  kelima,  8  =  sampel  ikan gurami soang yang mati pada hari kedua, dan M = DNA marka 100 bp)
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan,  karakterisasi  genetik  ikan  gurami soang  dengan  waktu  kematian  berbeda  dalam satu  pemijahan  menggunakan  PCR-RFLP  gen MHC Kelas II B tidak menunjukkan adanya variasi pada  level  molekuler.  Oleh  karena  itu,  gen MHC Kelas  II  B  dalam  penelitian  ini  dapat  dikatakan tidak  dapat  digunakan  sebagai  penanda  genetik untuk  membedakan  ikan  gurami  soang  dengan waktu  kematian  berbeda.  Variasi  waktu  kematian tersebut  dimungkinkan  terjadi  bukan  disebabkan oleh faktor genetik gen MHC Kelas II B, meskipun memiliki  peran  yang  vital  dalam  pertahanan. Diduga  masih  terdapat  beberapa  faktor  lain  yang mengatur  laju  ekspresi  gen  tersebut.  Hal  ini dijelaskan lebih lanjut oleh Christianti et al. (2003) yang  menyatakan  bahwa  variasi  dapat  terjadi karena  adanya  variasi  genetik  atau  variasi lingkungan  atau  karena  keduanya,  yaitu  variasi genetik dan lingkungan. Populasi dengan keragaman  genetik  yang  tinggi  memiliki  peluang hidup  yang  lebih  baik  karena  setiap  gen  memiliki respon  yang  berbeda-beda  terhadap  kondisi lingkungan,  sehingga  keragaman  genetik  yang tinggi di dalam populasi ikan dapat terlindung dari gangguan lingkungan (Hartl & Jones, 1998).

## Kesimpulan dan Saran
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  diperoleh yaitu  penggunaan  enzim  Hinf1,  Pst1,  HindIII  dan EcoR1  tidak  dapat  menghasilkan  marka  genetik PCR-RFLP Gen MHC Kelas II B dapat digunakan sebagai  marka  molekuler  pada  populasi  ikan
gurami  soang  yang  mati  pada  waktu  berbeda pasca infeksi bakteri Aeromonas hydrophila.
Perlu  membandingkan  antara  sampel  ikan yang  masih  hidup  dan  mati  pasca  infeksi  bakteri A.  hydrophila  untuk  mengetahui  ada  tidaknya perbedaan  genetik  antara  ikan  yang  resisten  dan tidak  resisten  terhadap  serangan  bakteri  tersebut serta menggunakan enzim restriksi yang berbeda.

## Ucapan Terimakasih
Peneliti  mengucapkan  terimakasih  kepada Direktorat  Rised  dan  Pengabdian  Masyarakat Kemetrian  Riset,  Teknologi,  dan  Pendidikan Tinggi yang telah mendanai penelitian ini. Peneliti juga  menyampaikan  terimakasih  kepada  Ketua LPPM  Unsoed  dan  Dekan  Fakultas  Biologi Unsoed yang telah memfasilitasi selama penelitian  berlangsung.  Ucapan  terimakasih  juga disampaikan  kepada  Anggi  Pratama,  S.Si.  dan Untung  yang  telah  banyak  membantu  selama pelaksanaan penelitian.

## Daftar  Referensi
Aryanto  D,  Hayuningtyas  EP,  Syahputra  K.  2015. Hubungan  antara  keberadaan  gen  Major histocompatibility  complex  class  II  (MHC-II) ketahanan terhadap penyakit, dan pertumbuhan  pada  populasi  ikan  mas  Ras Rajadanu. Jurnal  Riset  Akuakultur ,  10  (4):
461 – 469.
Austin,  B.  &  Austin,  D.  2007. Bacterial  Fish Pathogens  Diseases  of  Farmed  and  Wild Fish. Fourth Edition. Springer Ausubel,  F.M.,  2003. Current  Protocols  in Molecular  Biology  Tabs .  19th  ed.  Canada: John Willey & Sons.
Azizah,  S.  N.,  A.  Nuryanto,  &  H.  Pramono.  2015. Karakterisasi Molekuler Ikan Gurami Soang (Osphronemus goramy Lac.) berbeda ukuran menggunakan Pcr-Rflp Gen
Sitokrom C Oksidase 1. Biosfera 32 (3), pp. 185-193.
Baratawidjaja, K. G. 1991. Imunologi Dasar, Edisi 2 .  Balai  Penerbit  Fakultas  Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta.
Brown,  T.A.,  1991.  Pengantar  Kloning  Gen. Translated  by  A.M.  Sumiati  &  Praseno. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica.
Campbell,  R.,  Urry,  Cain,  Wasserman,  Minorsky, &  Jackson.  2009. Biology  8 th Edition . Benjamin Cummings. San Fransisco.
Christianti,  T.,  Sutarno  &  Etikawati,  N.  2003. Identifikasi  Polimorfisme  pada  Fragmen  D- Loop  DNA  Mitokondria  Sapi  Benggala. BioSMART , 5(2), pp.73-77.
Cuesta,  A.  J.,  Meseguer,  &  Esteban,  M.A.    2007. Cloning  and  regulation  of  the  major histocompatibility  class  I  alpha  gene  in  the
teleost fish gilthead seabream. Fish Shellfish Immunol , 22, pp.718-726.
Gholizadeh,  A.  &  Kohnehrouz,  B.B.,  2009. Carborundum-Dependent Entrance of EcoRI  Restriction  Enzyme  into  Plant  Cell and  Specific  of  Genomic  DNA. Indian Journal  of  Experimental  Biology ,  47, pp.684-689
Gusmiaty, Restu, M. & Pongtuluran. 2012. Seleksi
Primer  untuk  Analisis  Keragaman  Genetik Jenis Bitti ( Vitex coffassus ). Jurnal Perennial, 8(1), pp.25-29.
Haris,  N.,  Aswidinoor,  H.,  Nurita,  T.  M.  & Purwantara, A. 2003. Jurnal Menara Perkebunan, 71(1), pp.1 –15.
Hartl,  D.L.  &  Jones,  E.W.  1998. Genetics: principles  and  analysis .  4th  ed.  United Stated  of  America:  Jones  and  Bartlett Publishers. Inc.
Hayuningtyas,    Didik,  A.,  &  Khairul,  S.  2013. Hubungan  Antara  Pertumbuhan  Dengan Keberadaan  Gen  Tahan  Penyakit Major Histocompatibility  Complex ( MHC )  pada Ikan Mas ( Cyprinus carpio ). Balai Penelitian Pemuliaan  Ikan. J.  Ris.  Akuakultur, 8(3), pp.383-391.
Hernawati  &  Gede,  S.  2007. Penggunaan  Sistem Resirkulasi  Dalam  Pendederan  Benih  Ikan Gurami  ( Osphronemus  gouramy, Lac). DiSainTek, 1(1), pp.1-14.
Hughes,  A.  R.,  Inouye,  B.  D.,  Johnson,  M.  T.  J., Underwood,  N.  &  Vellend,  M.,  2008. Ecological Consequences of Genetic Diversity. Ecology  Letters, 11(6),  pp.609 – 623.
Jakaria  &  R.  R.  Noor.  2011.  Identification  of  a Single  Nucleotide  Polymorphism  at Hinf-1 Enzyme  Restriction  Site  of Pit-1 Gene  on Indonesian  Bali  Cattle  Population. Media Peternakan , 38(2), pp.104-109.
Kusbiyanto,  A.  Nuryanto,  &  P.H.T.  Soedibja.
2016. Deteksi gen major histocompatibility  complex  class  II pada yuwana    gurami  soang, Osphronemus goramy Lacepede,  1801  asal  satu pemijahan.  Jurnal  Iktiologi  Indonesia, 16 (3) in pres.
Langga,  I.  F.,  Restu,  M.  &  Kuswinanti,  T.  2012. Optimalisasi  Suhu  dan  Lama  Inkubasi Dalam  Ekstraksi  DNA  Tanaman  Bitti  ( Vitex cofassus  Reinw )  serta  Analisis  Keragaman Genetik  dengan  Teknik  RAPD-PCR. Jurnal Sains & Teknologi , 12(3), pp.265 –276.
Nugroho, E. 2011. Evaluasi variasi genetik ras-ras ikan  gurami  dengan  menggunakan  marker DNA. Jurnal Perikanan , 8(2), pp.86-90.
Nuryanto,  A.  &  Kochzius,  M.,  2009.  Highly
Restricted Gene Flow
and Deep
Evolutionary  Lineages  in  the  Giant  Clam Tridacna  maxima . Coral  Reef ,  28,  pp.607- 619.
Nuryanto, A., Wijayanti, G. E., Susilo, U., Darsono &  Suharno.,  2012. Peningkatan  Produksi Gurami  Banyumas  Melalui  Pendekatan Genetik, Reproduksi, Manajemen Pemeliharaan dan Evaluasi Aspek Sosioekonomi . Laporan Penelitian. Purwokerto: Universitas Jenderal Soedirman Fakultas Biologi.
Pang,  J.  C.,  Feng-ying,  G.,  Mai-xin,  L.,  Xing,  Y., Hua-ping,  Z.,  &  Xiao-li,  K.  2013.  Major histocompatibility complex class IIA and IIB genes of Nile tilapia (Oreocrhomis niloticus):  Genomic  structure,  molecular polymorphism  and  expression  patterns. Fish  and  Shelfish  Immunology, 34,  pp.486- 496
Poerba,  Y.  S.  &  Martanti,  D.  2008.  Keragaman
Genetik Berdasarkan Marka Random Amplified Polymorphic DNA pada
Amorphopallus  muelleri Blume  di  Jawa. Jurnal Biodiversitas, 9(4), pp.245 –249.
Purwantini,  D.,  Yuwanta,  T.,  Hartatik,  T.,  & Ismoyowati.  2013.  Morphology  and  genetik diversity  of  mitochodrial  dna  d-loop  region using  PCR-RFLP  analysis  in  magelang duck  and  other  native  duck. J.Indonesian Trop.Anim.Agric , 38(1), pp.1-9.
Santoso, T.J., Hidayat, S., Herman, M.,
Aswidinnoor,  H.,  &  Sudarsono.,  2008. Identitas dan Keragaman Genetik Begomovirus  yang  Berasosiasi  dengan Penyakit  Keriting  pada  Tomat  Berdasarkan Teknik  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)- Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Jurnal AgroBiogen , 4(1), pp.9-17.
Sembiring,  S.B.M.,  Tridjoko  &  Haryanti.  2013. Keragaman  genetik  ikan  kerapu  bebek ( Cromileptes  altivelis )  generasi  f1  dan  f3. Jurnal  Ilmu  dan  Teknologi  Kelautan  Tropis , 5(1), pp.103-111.
Setijaningsih  L,  Arifin  OZ,  Gustiano  R.  2007. Karakterisasi tiga ras ikan gurame ( Osphronemus  gouramy Lac.)  berdasarkan metode  truss  morfometriks. Jurnal  lktiologi Indonesia , 7(1): 23-30
Subowo.  1993. Imunologi Klinik .  Angkasa. Bandung.
Sucipto,  C.D.  2011. Vektor  Penyakit  Tropis . Gosyen Publishing. Yogyakarta.
Supriyanto,  Dharmawantho  L.  2015.  Deteksi  gen major  histocompatibility  complex  (MHC) pada  beberapa  Ras  ikan  mas  (Cyprinus carpio  L.)  dengan  menggunakan  metode polymerase  chain  reaction  (PCR). Buletin Teknik Litkayasa Akuakultur, 13 (1): 33-37.
Weeden,  N.F.,  Timmerman,  G.M.,  Hemmat,  M.,
Kneen, B.E. & Lodhi, M.A. 1992. Inheritance and reliability of RAPD markers In applications of RAPD technology to plant breeding,  Symposium  Proceedings.  1992.
Crop Science Society of America, Madison, WI.
Wegner,  K.  M.,  Kalbe,  M.,  Rauch,  G.,  Kurtz,  J., Schaschl,  H.,  &  Reusch,  B.H.  2006. Genetic variation in MHC class II expression  and  interactions  with MHC sequence  polymorphism  in  three-spined sticklebacks. Molecular Ecology , 15, pp.1153 –1164.
Welcomme, R. L. 1988. International introductions of  indland  aquatic  species. FAO  Fisheries Technical Paper, 294, pp.212-214
Yu  HB,  Rao  PSS,  Lee  HC,  Vilches  S,  Merino  S, Tomas  JM,  Leung  KY.  2004.  A  type  III secretion system is required for Aeromonas hydrophila AH-1  patogenesis.  Infection  and Immunity 72 (3): 1248-1256
Yuwono,  T.  2006. Teori  dan  Aplikasi  Polymerase
Chain Reaction: Panduan Eksperimen PCR untuk Memecahkan Masalah Biologi
Terkini. Yogyakarta: Penerbit ANDI.
Zhao,  Y.,  Gentekaki,  E.,  Yi,  Z.  &  Lin,  X.  2013.
Genetic  differentiation  of  the  mitochondrial cytochrome  oxidase  c  subunit  gene  in genus  Paramecium  (Protista,  Ciliophora).
Plos One , 8(10), pp.1-8.