*  Penulis untuk korespondensi. e-mail: sudarsono_agh@apps.ipb.ac.id
ISSN 2085-2916 e-ISSN 2337-3652 Tersedia daring http://jai.ipb.ac.id J. Agron. Indonesia, Desember 2020, 48(3):348-354 DOI: https://dx.doi.org/10.24831/jai.v48i3.32205
Isolasi dan Karakterisasi Potongan DNA Gen Sterol Metiltransferase 1 (SMT1) Asal Kelapa Sawit Isolation and Characterization of Oil Palm Sterol Methyltransferase 1 (SMT1) Gene Fragment
Syamsi Rizal 1* , Dewi Sukma 2 , Roberdi Siberakuno 3* , Tony Liwang 3 , dan Sudarsono Sudarsono 2*
1 Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor 2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB University), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
3 PT SMART Tbk, Jl. Cijayanti, Kec. Babakan Madang, Bogor, Jawa Barat 16810, Indonesia Diterima 18 Agustus 2020/Disetujui 11 November 2020

## ABSTRACT
Slow height increment is a desirable character in oil palm breeding, and brassinosteroid is an important hormone associated with the character. Sterol methyltransferase 1 (SMT1) is a key gene associated with brassinosteroid biosynthesis. One of the molecular marker development approaches is identifying and characterization of genes associated with the target character. The study aims to isolate and characterize the nucleotide sequence diversity of the SMT1 gene. PCR amplification of the SMT1 gene from Elaeis oleifera (E.o.), E. guineensis (E.g.), and their hybrids (E.g. × E.o.) was done using SMT1 gene-specific primers. The SMT1 gene fragment representing partial intron 8, exons 9, intron 9, and partial exon 10 was successfully amplified and the fragment sequenced in this study. The total nucleotide sequences found in this study were between 501-505 bp, encoded a ranged from 104-105 amino acid residues. A conserved domain of the amino acid residues associated with brassinosteroid biosynthesis was identified in the translated polypeptide, confirming the amplicon’s identity as the SMT1 gene fragment. The identified SMT1 gene nucleotide sequence variabilities may be used to develop molecular markers useful for oil palm breeding programs, especially for the low height increment character.
Keywords: Brasinosteroid, dwarf stature, sterol

## ABSTRAK
Tanaman dengan pertambahan tinggi yang lambat merupakan karakter penting dalam program pemuliaan kelapa sawit dan brasinosteroid merupakan hormon penting yang berpengaruh untuk karakter tersebut. Gen sterol metiltransferase 1 (SMT1) merupakan salah satu gen kunci dalam biosintesis brasinosteroid. Pengembangan marker molekuler dapat dimulai dengan identifikasi dan karakterisasi gen yang terkait dengan karakter target. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi keragaman nukleotida gen SMT1. Amplifikasi PCR dilakukan menggunakan genom Elaeis oleifera (E.o.), E. guineensis (E.g.) dan hibrida dari keduanya (E.g. x E.o.) dengan sepasang primer spesifik gen SMT1. Dalam penelitian ini berhasil diamplifikasi satu potongan DNA gen SMT1 dan dari hasil DNA sequencing berhasil diidentifikasi sebanyak 501- 505 pb. Potongan DNA yang diidentifikasi terdiri atas partial intron 8, exon 9, intron 9, dan patial exon 10, yang menyandi antara 104-105 residu asam amino. Domain residu asam amino terkonservasi ditemukan dalam hasil translasi amplikon,  yang  berkorelasi  dengan  situs  aktif  dalam  biosintesis  brasinosteroid  dan  mengkonfirmasi  identitas  amplikon sebagai  bagian  dari  gen  SMT1.  Keragaman  nukleotida  potongan  DNA  gen  SMT1  yang  teridentifikasi  berpotensi  dapat digunakan untuk pengembangan marker molekuler yang bermanfaat untuk pemuliaan tanaman kelapa sawit, terutama untuk karakter pertambahan tinggi tanaman yang lambat.
Kata kunci: Brasinosteroid, sterol, tanaman kerdil

## PENDAHULUAN
Kelapa  sawit  ( Elaeis  guineensis Jacq.)  merupakan tanaman  penghasil  minyak  nabati  dengan  produktivitas tertinggi dibandingkan dengan tanaman penghasil minyak lainnya.  Kelapa  sawit  memenuhi  34%    total  konsumsi minyak nabati dunia dengan total produksi sebanyak 69.57 juta ton pada tahun 2017 (USDA, 2018). Sejauh ini kelapa sawit  merupakan  tanaman  penghasil  minyak  yang  paling produktif dan mampu memenuhi permintaan minyak nabati dunia yang diperkirakan mencapai 240 juta ton pada tahun 2050 (Corley, 2009).
Sumber pertumbuhan kebun kelapa sawit di Indonesia sebesar 89% disebabkan oleh perluasan areal (ekstensifikasi) dan 11% disebabkan oleh peningkatan produktivitas ( yield ) (Saragih,  2016).  Secara  alami kelapa  sawit  memiliki pertambahan  tinggi  batang  yang  bervariasi  antara  aksesi. Pertambahan tinggi batang pada genotipe komersial Elaeis guineensis berkisar  45-75  cm  per  tahun,  sedangkan  pada E. oleifera setiap tahun bertambah tinggi sekitar 5-10 cm. Hibrida F 1 interspesifik antara E. guineensis dan E. oleifera memiliki  pertumbuhan  tinggi  rata-rata  dari  kedua  tetua dengan pertambahan tinggi antara 15-25 cm per tahun.
Karakter pertambahan tinggi batang lambat merupakan sifat penting dalam pemuliaan tanaman kelapa sawit. Batang pendek akan memudahkan dalam proses panen tandan buah segar (TBS) dan memperpanjang umur ekonomis tanaman kelapa  sawit  (Kovi et  al., 2011).  Kemajuan  teknologi molekuler memudahkan proses pemuliaan tanaman dalam mewujudkan  varietas  dengan  target  karakter  tertentu. Penggunaan penanda molekuler untuk seleksi tanaman dapat memperpendek siklus pemuliaan tanaman dan seleksi yang dilakukan lebih valid, sehingga hanya kelapa sawit terpilih yang  ditanam  di  lapangan.  Melalui  kemajuan  teknologi molekuler, identifikasi dan karakterisasi gen potensial dan variasi genom yang meregulasi pertambahan tinggi batang sebagai  langkah  awal  pemuliaan  tanaman  dapat  dicapai (Roberdi et al. , 2015; Devi et al., 2017). Gen  kekerdilan  ( dwarf )  sangat  berkaitan  dengan biosintesis  hormon  pertumbuhan  tanaman  seperti auxin,  brasinosteroid  dan  giberelin  (Azni et  al .,    2014). Brasinosteroid berperan  penting  dalam  berbagai  macam aspek  biologi  tanaman  termasuk  pemanjangan  sel, pembelahan  sel,  pertumbuhan  akar,  foto-morfogenesis, diferensiasi  stomata  dan  jaringan  pembuluh  (Tang et  al ., 2016). Salah satu gen kunci dalam biosintesis brasinosteroid adalah  gen  sterol  metiltransferase  1  ( SMT1 ).  Chen et  al . (2018)  melaporkan  bahwa  gen SMT1 mempunyai  fungsi yang  berhubungan  dengan  fenotipe  kerdil  pada  tanaman herba.  Lebih  lanjut,  isolasi  dan  karakterisasi  gen SMT1 telah  dilaporkan  pada  tanaman Tripterygium  wilfordii (Guan et  al., 2017).  Informasi  mengenai  keberadaan  gen SMT1 pada  kelapa  sawit  perlu  dikaji  lebih  lanjut  dengan tujuan pengembangan marker molekuler untuk mendukung pemuliaan kelapa sawit. Tersedianya informasi gen SMT1 asal  kelapa  sawit  gen SMT1 pada  kelapa  sawit  dapat digunakan sebagai bahan pengembangan marker molekuler terkait pertambahan tinggi batang tanaman kelapa sawit.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  melanjutkan  isolasi potongan  DNA  gen SMT1 asal  kelapa  sawit  dengan amplifikasi  PCR,  mengkarakterisasi  potongan  DNA  yang teramplifikasi dengan DNA sequencing dan mengembangkan primer untuk menghasilkan marker molekuler spesifik gen SMT1 yang dapat digunakan untuk mendukung pemuliaan kelapa sawit ke depan.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  dilakukan  pada  bulan April  2019  sampai dengan  Desember  2019  di  Laboratorium  Bioteknologi Divisi  Produksi  Tanaman  dan  Bioteknologi,  PT.  SMART Tbk.,  Kelurahan  Cijayanti,  Kecamatan  Babakan  Madang, Kabupaten  Bogor,  Jawa  Barat.  Materi  genetik  yang digunakan  pada  percobaan  ini  terdiri  atas  tiga  tanaman E.  guineensis ( E.g. )  sebagai  contoh  tanaman  dengan pertambahan  cepat  (normal),  tiga  tanaman E.  oleifera ( E.o. ) sebagai contoh tanaman dengan pertambahan tinggi lambat dan tiga tanaman hibrida E.g. x E.o. sebagai contoh tanaman dengan  pertambahan tinggi medium. Gen  terkait pertambahan tinggi yang dipelajari dalam penelitian adalah gen penyandi ensim sterol metiltransferase 1 ( SMT1 ).

## Isolasi DNA Aksesi Kelapa Sawit
Isolasi  DNA  dilakukan  mengikuti  prosedur  standar Kit isolasi DNA tanaman II dari Bioline (Bioline, London, Inggris)  sebagaimana  disarankan  oleh  pabrikan  kit DNA.  Contoh  daun  yang  telah  digerus  sebanyak  100  mg dipindahkan  ke  dalam  tabung  ukuran  2  mL,  ditambahkan 200 µl bufer lisis, dan digerus agar homogen. Selanjutnya ke dalam gerusan daun ditambahkan 10 µL larutan RNAse dan dicampur agar homogen. Campuran selanjutnya diinkubasi pada  suhu  65 o C  selama  10  menit.  Setelah  pemanasan, supernatan dipindahkan ke dalam tabung berfilter, dengan ukuran  volume  2  mL  dan  disentrifugasi  selama  2  menit pada kecepatan 11,000 g. Selanjutnya ke dalam supernatan ditambahkan  450  µL bufer binding dan  dicampur  hingga homogen. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke tabung baru dengan ukuran volume 2 mL dan disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 11,000 g. Kemudian sebanyak 400 µL bufer pencuci pertama ditambahkan dan disentrifugasi kembali  selama  1  menit.  Selanjutnya,  ditambahkan  bufer pencuci  kedua  sebanyak  700  µL,  disentrifugasi  selama 1  menit  serta  dilanjutkan  dengan  menambahkan  bufer pencuci ketiga sebanyak 200 µL dan disentrifugasi selama 2 menit. Filter dipindahkan ke dalam tabung ukuran 1.5 mL dan ditambahkan 50 µL elution buffer , diinkubasi selama 5 menit pada suhu 65 o C. Selanjutnya disentrifugasi selama 1  menit  pada  kecepatan  11,000  g  dan  tahap  ini  diulangi dengan  menambahkan  50  µL elution  buffer yang  kedua. DNA  hasil  elusi  digunakan  sebagai  cetakan  pada  proses PCR atau disimpan pada suhu 4 o C. DNA hasil isolasi kemudian ditentukan kuantitasnya menggunakan Nanodrop spektrofotometer 2,000c (Thermo Fisher  Scientific,  Waltham,  MA,  USA)  dan  dilanjutkan uji  kualitas  dengan  elektroforesis  dalam  1%  gel  agarosa.
Konsentrasi  DNA  yang  digunakan  untuk  melakukan amplifikasi PCR yaitu 40 ng/µL.

## Desain Primer Spesifik Gen SMT1
Desain  primer  spesifik  dilakukan  menggunakan metode  homologi  dari  runutan  DNA  gen SMT1 tanaman kurma  (no.  Aksesi  XM_010925108)  yang  diperoleh  dari database DNA GenBank National Center for Biotechnology Information (NCBI). Runutan DNA gen SMT1 pada tanaman kurma  digunakan  untuk  memperoleh  runutan  nukleotida dan  lokasi  gen SMT1 pada  genom  tanaman  kelapa  sawit dengan  metode  BLAST-N  ( basic  local  alignment  search tool - nucleotide ) di database DNA lokal milik PT. SMART Tbk. Hal ini dilakukan untuk mengetahui panjang, posisi, jumlah exon dan intron gen SMT1 di dalam genom kelapa sawit.
Posisi dan jumlah exon yang diperoleh pada database lokal  digunakan  sebagai  bahan  untuk  mendisain  primer spesifik menggunakan perangkat lunak Primer3plus. Output dari perangkat lunak berupa sepasang primer forward dan reverse. Runutan DNA dari primer yang digunakan adalah primer forward 5’–GCACCAGATGTFFTAATCTGC–3’ dan  primer reverse 5’–CTTCTTTCTCTTTGCTCGTCA– 3’.

## Amplifikasi PCR dengan Primer Spesifik SMT1
Amplifikasi  DNA  gen SMT1 menggunakan  materi genetik E. guineensis ( E.g. ), E. oleifera ( E.o. ) dan hibrida E.g. × E.o. yang merupakan representasi dari karakter cepat (normal),  lambat  dan  medium  menggunakan  Kit  Toyobo High  Fidelity  Taq  Polymerase (TOYOBO,  OSAKA, Jepang). Total volume untuk reaksi PCR adalah 25 µL untuk 1x reaksi yang terdiri dari: 12.5 µL 2x PCR buffer, 5 µL 1x dNTPs, 3 µL primer forward 1 µM dan 3 µL primer reverse 1 µM, 0.5 µL 1U/µl Taq DNA polymerase dan 4 µL DNA 40 ng/µl. Reaksi PCR dilakukan dengan 35 siklus, denaturasi pada suhu 98 o C selama 10 detik, penempelan pada suhu 65 o C selama 30 detik dan pemanjangan pada suhu 68 o C selama 30 detik. Hasil produk PCR divisualisasi dengan gel agarosa 1% selama 25 menit pada mesin elektroforesis dengan arus 100 V. Produk PCR dengan pita tunggal dilakukan purifikasi atau pemurnian menggunakan QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen,  Jerman).  Hasil  purifikasi  digunakan  sebagai bahan untuk perunutan nukleotida yang dikirim ke 1 st BASE (Singapura).

## Karakterisasi Gen SMT1
Amplikon  berupa  pita  tunggal  dari  masing-masing aksesi  kelapa  sawit  dikirim  untuk  proses  perunutan nukleotida  (DNA sequencing )  ke  1 st BASE,  Singapura. Proses  perunutan  nukleotida  menghasilkan  data  genomik berupa  urutan  basa  nukleotida  gen SMT1 dari  sembilan aksesi  contoh  kelapa  sawit  yang  digunakan.  Data  yang diperoleh berupa format ab1 dalam bentuk electroferogram. Data  dianalisis  menggunakan  perangkat  lunak  Geneious
(Biomatters,  Ltd.)  dengan  cara  disejajarkan  untuk penentuan  bagian  exon  dan  intron  serta  ditranslasikan menjadi residu asam amino. Runutan nukleotida amplikon dan runutan asam amino hasil translasi dilakukan analisis basic  local  alignment  sequence  tool (BLAST)  untuk menemukan  kesamaan  runutan  nukleotida  dengan  aksesi yang ada di database DNA Genbank NCBI. Hasil analisis BLAST digunakan untuk menduga identitas amplikon yang didapatkan.  Selanjutnya  sejumlah  aksesi  gen SMT1 dari tanaman dikotil dan monokotil yang teridentifikasi diunduh dari database NCBI dan dilakukan analisis filogenetik untuk mengevaluasi hubungan kekerabatannya dengan aksesi dari kelapa sawit yang dikarakterisasi dalam penelitian ini.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Amplifikasi PCR dengan Primer Spesifik SMT1
Struktur lengkap gen SMT1 berukuran panjang 9.787 pasang basa (pb) dengan unit transkripsi yang terdiri atas 12 exon dan 11 intron (Gambar 1.A) serta menyandi polipeptida yang terdiri atas 342 residu asam amino. Untuk gen SMT1 , exon 1 dan 2 (Potongan DNA 1) dan exon 3-5 (potongan DNA  2) asal  kelapa  sawit  (Gambar  1.A)  telah  berhasil diisolasi  dan  dikarakterisasi  oleh  Salsabila  (2019).  Pada penelitian  ini  dilakukan  amplifikasi  pada  sebagian  exon 8  sampai  dengan  sebagian  exon  11  (Gambar  1).  Namun demikian,  berdasarkan  hasil  perunutan  nukleotida  hanya berhasil diidentifikasi sebanyak 501-505 pb dari gen SMT1 . Potongan  DNA  yang  diidentifikasi  runutan  nukleotidanya terdiri atas sebagian intron 8, exon 9, intron 9 dan sebagian exon  10.  Potongan  DNA  yang  diidentifikasi  menyandi antara 104-105 residu asam amino. Sebagian dari runutan nukleotida dari potongan DNA hasil amplifikasi PCR tidak dapat  teridentifikasi  karena  berkualitas  rendah  sehingga harus dihilangkan dari hasil perunutan nukleotioda. Sesuai dengan  kesepakatan  dengan  PT  SMART  Tbk,  runutan nukleotida  yang  teridentifikasi  tidak  dapat  dipublikasikan dan hanya disajikan dalam bentuk residu asam amino hasil translasi dan hasil analisis filogenetik.

## Identitas Potongan DNA Gen SMT1
Runutan  nukleotida  potongan  DNA  gen SMT1 hasil penelitian ini dibandingkan dengan aksesi gen SMT1 yang terdapat  pada  database  DNA  GenBank  NCBI dengan menggunakan BLAST-N. Hasil analisis BLAST-N diperoleh tingkat  kesamaan  runutan  nukleotida  gen SMT1 tanaman kelapa  sawit  dengan  tanaman  lainnya.  Tingkat  kesamaan tertinggi  (94%)  diperoleh  pada  runutan  nukleotida  gen SMT1 dari tanaman kurma ( Phoenix dactylifera ). Kesamaan identitas  gen SMT1 asal  kelapa  sawit  dengan  runutan nukleotida  tanaman  pisang,  nanas  dan  anggur  memiliki kisaran nilai antara 80-85%  (Tabel 1). Meskipun berbeda- beda  tingkat  kesamaan  identitas  runutan  nukleotidanya, gen SMT1 yang  diisolasi  dari  aksesi  kelapa  sawit  diduga memiliki fungsi yang sama dengan gen SMT1 dari tanaman lain.

## Analisis Filogenetik Potongan DNA Gen SMT1
Analisis  filogenetik  residu  asam  amino  yang ditranslasikan  dari  potongan  gen SMT1 dari  tiga  aksesi kelapa sawit dan dari berbagai spesies lain disajikan dalam Gambar  2.  Hasil  analisis  filogenetik  menunjukkan  bahwa SMT1 dari  berbagai  tanaman  yang  dievaluasi  terbagi  ke dalam tiga grup utama (grup I, II dan III). Grup 1 terdiri atas tiga aksesi tanaman dikotil, grup II terdiri atas 6 enam tanaman  monokotil  dan  grup  3  terdiri  atas  tiga  tanaman monokotil  lainnya.  Residu  asam  amino  SMT1  dari  tiga aksesi kelapa sawit memiliki kedekatan dengan SMT1 dari Phoenix  dactylifera (keempatnya  masuk  ke  dalam  sub- grup II.B) serta berada dalam satu grup dengan SMT1 dari anggrek Dendrobium catenatum dan anggrek Phalaenopsis equestris yang berada dalam sub-grup II.A. Rekonstruksi  pohon  filogenetik  bertujuan  untuk melihat  pengelompokan  individu  berdasarkan  kemiripan runutan nukleotida atau residu asam aminonya (Chen et al., 2018). Dalam penelitian yang dilakukan, analisis filogenetik digunakan untuk mengetahui kedekatan genetik berdasarkan runutan nukleotida gen SMT1 kelapa sawit dan gen SMT1
tanaman  lain  berdasarkan  data  hasil  perunutan  nukleotida dan residu asam amino yang ditranslasikan dari data runutan nukleotida. Pengklasteran dengan metode Neighbor-Joining merupakan  metode  yang  menggunakan  prinsip  algoritma untuk jarak genetik antar runutan nukleotida pada bagian- bagian  yang  memiliki  kemiripan.  Rekonstruksi  pohon filogenetik  yang  ditampilkan  pada  Gambar  2  digunakan untuk mempelajari hubungan kekerabatan, nenek moyang dan  evolusi  suatu  organisme.  Menurut  Putri  (2010), informasi  parameter  genetik  sangat  diperlukan  untuk kegiatan  seleksi  agar  dapat  berjalan  efisien.  Selanjutnya Sayekti (2015) menjelaskan bahwa analisis pengelompokan baik berdasarkan metode Neighbor-Joining atau PCoA tidak selalu menunjukkan pengelompokan individu berdasarkan aksesi yang dikoleksi.

## Domain Terkonservasi pada SMT1 Kelapa Sawit
Domain  terkonservasi  merupakan  bagian  protein yang berasosiasi dengan fungsi tertentu dan terkonservasi selama  terjadi  evolusi  (Singh  dan  Singh  2015).  Domain terkonservasi  dianalisis  pada  potongan  SMT1  dari  tiga
Gambar 1. (A) Ilustrasi struktur gen sterol metiltransferase 1 ( SMT1 ) asal kelapa sawit Elaeis guineensis . (B) Foto hasil elektroforesis gel agarosa untuk amplikon potongan DNA hasil PCR dengan menggunakan sepasang primer spesifik SMT1 . Posisi masing- masing primer F = forward (F1, F2, dan F3); serta R = reverse (R1, R2, dan R3) pada struktur gen SMT1 ditunjukkan dengan tanda panah; pb = pasang basa. Kolom 1-3 (aksesi hibrida E.g. x E.o. ); 4-6 (aksesi E. guineensis ); 7-9 (aksesi E. oleifera ); M = marker DNA (1 kb ladder )
Deskripsi aksesi Nomer aksesi Nilai E Identity (%) Phoenix dactylifera cycloartenol-C-24-methyltransferase 1-like XM_008806132.3 2e-81 94% Ananas comosus cycloartenol-C-24-methyltransferase 1-like XM_020227168.1 4e-52 85% Musa acuminata subsp. malaccensis cycloartenol-C-24-methyltransferase 1  XM_009413003.2 5e-45 82% Vitis vinifera cycloartenol-C-24-methyltransferase XM_010661136.2 5e-39 80% Tabel 1. Hasil basic local alignment sequence tool (BLAST) dan identitas runutan nukleotida potongan DNA gen sterol metiltransferase 1 ( SMT1 ) hasil PCR asal Elaeis guineensis dengan aksesi tanaman lain pada data GeneBank
aksesi  kelapa  sawit  yang  masing-masing  mewakili  tiga kelompok  fenotipe  pertambahan  tinggi.  Analisis  domain terkonservasi  dilakukan  dengan  menggunakan  program conserved domain di NCBI website (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi).
Dari  potongan  SMT1  asal  kelapa  sawit,  berhasil diidentifikasi  keberadaan  satu  domain  yang  merupakan domain terkonservasi dari sterol metiltransferase di bagian C-terminus , sebagai domain terkonservasi dengan kode Cdd: pfam08498  (Gambar  3).  Dengan  demikian  memperkuat hasil sebelumnya yang menunjukkan bahwa potongan DNA yang berhasil diamplifikasi adalah potongan DNA dari gen SMT1 asal kelapa sawit. Pada  domain  terkonservasi  gen SMT1 asal  kelapa sawit  terdapat  satu  mutasi  substitusi  yang  menyebabkan terjadinya  terjadinya  non-sinonimous  single  nucleotide polimorphism  (SNP).  Non-sinonimous  SNP  tersebut
menyebabkan terjadinya perbedaan residu asam amino yang disandi (Gambar 3), yaitu N pada SMT_Ref dan SMT1 dari aksesi kelapa sawit SPEAR (SMT_SPEAR), D pada aksesi kelapa  sawit  BTC  (SMT_BTC) , serta  G  pada  aksesi Eo (SMT_ Eo ). Dari non-sinonimous SNP yang teridentifikasi tersebut  selanjutnya  dapat  dikembangkan  menjadi  marker single  nucleotide  amplified  polymorphism (SNAP)  dan keterkaitan  marker  SNAPnya  dapat  dievaluasi  dengan pertambahan tinggi tanaman kelapa sawit.
Senyawa  sterol  pada  tanaman  berperan  sebagai penyusun  membran  lipid  dan  sebagai  prekursor pembentukan  hormon  brasinosteroid,  yang  fungsinya menyerupai hormon steroid pada mamalia atau ecdysteroid pada serangga (Parish dan Nes, 1997). Fito-sterol memiliki satu sampai dua karbon tambahan karena peristiwa alkilasi yang  dikalisis  oleh S-adenosyl-methionine-dependent C-24 sterol  methyltransferases (SMTs).  Enzim  SMT1
1
1        10        20        30        40        50        60 |        |         |         |         |         |         | SMT_Ref.     LGCYKEIYRVMKPGQCFAAYEWCMTNHFDPTNESHQKTKAEIELGNGLPDIRTTSQCLEA SMT_SPEAR    LGCYKEIYRVMKPGQCFAAYEWCMTDHFDPTNESHQKTKAEIELGNGLPDIRTTSQCLEA SMT_Eo       LGCYKEIYRVMKPGQCFAAYEWCMTGHFDPTNESHQKTKAEIELGNGLPDIRTTSQCLEA SMT_BTC      LGCYKEIYRVMKPGQCFAAYEWCMTNHFDPTNESHQKTKAEIELGNGLPDIRTTSQCLEA
SMT_Ref.     LRLAGFEVEWEKDLALDSPVPWYLPLDTRHFSITSFRLTAFGRLITRTM SMT_SPEAR    LRLAGFEVEWEKDLALDSPVPWYLPLDTRHFSITSFRLT---------- SMT_Eo       LRLAGFEVEWEKDLALDSPVPWYLPLDTRHFSITSFRLT---------- SMT_BTC      LRLAGFEVEWEKDLALDSPVPWYLPLDTRHFSITSFRLT----------
Gambar 3. Pensejajaran asam amino hasil translasi potongan DNA gen sterol metiltransferase 1 ( SMT1 ) dari tiga aksesi kelapa sawit, Elaeis guineensis ( E.g. –SMT_BTC), E. oleifera ( E.o. –SMT_Eo), dan hibrida interspesifik E.g. × E.o. (SMT_SPEAR) serta referensi gen SMT1 (SMT_Ref.). Asam amino yang diberi latar belakang abu-abu merupakan domain polipeptida yang terkonservasi dari SMT1 dan tanda panah menunjukkan posisi mutasi substitusi yang menyebabkan terjadinya perubahan asam amino
Gambar  2.  Pohon  filogenetik  yang  dikonstruksi  menggunakan  runutan  nukleotida  gen  sterol  metiltransferase  1  ( SMT1 )  dari Elaeis guineensis ( E.g. ), E. oleifera ( E.o. ) dan hibrida interspesifik E.g. × E.o. serta gen SMT1 dari sejumlah tanaman monokotil dan dikotil yang terdeposit di database DNA GeneBank NCBI. Angka pada pohon filogenetik menunjukkan jarak genetik dan garis di bawah pohon filogenetik menunjukkan referensi jarak genetik sebesar 0.03. Aksesi dengan huruf tebal adalah representasi aksesi yang dihasilkan dalam penelitian ini, sedangkan yang lain adalah aksesi yang diunduh dari database DNA GeneBank NCBI
mengkatalisis tahapan awal dalam biosintesis sterol dengan penambahan metil tunggal pada posisi C-24 (penambahan C1).  Sedangkan  enzim  SMT2 dan  SMT3 masing-masing dapat  menambahkan  kelompok  metil  kedua  (penambahan C2),  sehingga  melengkapi  penambahan  rantai  etil  pada posisi C-24 (Nes et al ., 1999). Mutan  sterol  metiltransferase  1 (SMT1)  dari Arabidopsis memiliki  sifat  fenotipik  yang  disebut fackel dan  telah  dibuktikan  terkait  dengan  kekurangan  pada langkah awal dalam jalur biosintesis sterol (Diener et al., 2000). Gen SMT1 menyandi enzim yang mampu melakukan alkilasi C-24 dari rantai samping sterol dengan adanya S- adenosilmetionin.  Seperti  brasinosteroid,  senyawa  sterol juga  berperan  penting  dalam  proses  pertumbuhan  dan perkembangan  tanaman.  Senyawa  sterol  berperan  sebagai prekursor untuk memproduksi brasinosteroid dan memiliki banyak peran yang serupa dengan brasinosteroid. Pada mutan Arabidopsis , abnormalitas biosintesis fito-sterol umumnya menampilkan fenotipe mirip defisiensi brasinosteroid yaitu pemendekan batang dan berkurangnya kesuburan (Vriet et al., 2012). Chen et al. (2018) melaporkan bahwa gen CdSMT1 - 1 berfungsi  dalam  mengatur  karakter  pertumbuhan  tinggi yang  lambat  sehingga  tanaman  menjadi  kerdil.  Fenotipe kerdil  diamati  pada  tanaman  padi  transgenik  sebagai akibat  berkurangnya  ekspresi  gen SMT1 .  Peran  dari terhambatnya ekspresi gen SMT1 menyebabkan terjadinya akumulasi kolesterol dan menginduksi ekspresi gen untuk meningkatkan  sintesis  poliamin.  Menurut  Neelakandan et al .,  (2010),  SMT1  bertindak  sebagai  katalis  yang  terlibat dalam  langkah  metilasi  awal  dalam  jalur  biosintesis  fito- sterol,  dimana  terjadi  konversi  cycloartenol  (intermediate fito-sterol)  menjadi  sterol  24-alkil.  Ekspresi  gen SMT1 mengakibatkan perubahan kandungan sterol dalam tanaman sehingga  terjadi  akumulasi  kolesterol  dan  sterol  yang teralkilasi. Menurut  Diener et al ., (2000) ekspresi gen SMT1 paling kuat terjadi di daerah tanaman yang sedang tumbuh dan berkembang terutama pada pucuk apikal.

## KESIMPULAN
Isolasi  dan  karakterisasi gen SMT1 pada  13  aksesi kelapa sawit berhasil dilakukan dan menghasilkan amplikon sepanjang  504  pb  yang  menyandikan  167  asam  amino. Tingkat kesamaan identitas gen SMT1 diperoleh mencapai 80%  sampai  94%  dengan  sejumlah  aksesi  gen SMT1 di pangkalan  data GeneBank NCBI.  Domain  terkonservasi teridentifikasi  pada  satu  target  yang  terlibat  biosintesis brasinosteroid  yang  berasal  dari  tiga  aksesi  kelapa  sawit. Karakterisasi  sekuens  gen SMT1 berupa  informasi  yang dapat digunakan untuk pengembangan penanda molekuler yang sangat bermanfaat untuk pemuliaan dan pengembangan varietas unggul tanaman kelapa sawit.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  kami  sampaikan  kepada  PT. SMART  Tbk  atas  fasilitas  yang  telah  diberikan  selama pelaksanaan penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Azni,  I.N.A.M.,  P.  Namasivayam,  H.C.  Ling,  S.S.R.S. Alwee, M.A.A. Manaf. 2014. Differentially expressed transcripts related to height in oil palm. J. Oil. Palm. Res. 26:308-316.
Chen,  M.,  J.  Chen,  N.  Luo,  R.  Qu,  Z.  Guo,  S.  Lu.  2018. Cholesterol  accumulation  by  suppression  of  SMT1 leads  to  dwarfism  and  improved  drought  tolerance in  herbaceous  plants.  Plant  Cell  Environ.  41:1417- 1426.
Corley,  R.H.V.  2009.  How  much  palm  oil  do  we  need? Environ.  Sci.  Policy 12:134-139.  Doi:10.1016/ j.envsci.2008.10.011.
Devi, E.L., C.H. Devi, S. Kumar, S.K. Sharma, A. Beemrote, S.K. Chongtham, C.H. Singh, C. Tania, T.B. Singh, A. Ningombam. 2017. Marker assisted selection (MAS) towards generating stress tolerant crop plants. Plant Gene 11:205-218.
Diener, A.C., H. Li, W.X. Zhou, W.J. Whoriskey, W.D. Nes, G.R. Fink. 2000. Sterol methyltransferase 1 controls the level of cholesterol in plants. Plant Cell 12:853- 870.
Guan,  H.,  Y.  Zhao,  P.  Su,  Y.  Tong,  Y.  Liu,  T.  Hu,  L. Huang.  2017.  Molecular  cloning  and  functional identification  of  sterol  C24-methyltransferase  gene from Tripterygium  wilfordii . Acta  Pharm  Sin  B.  7: 603-609.
Kovi,  M.R., Y.  Zhang,  S. Yu,  G. Yang, W. Yan, Y.  Xing. 2011.  Candidacy  of  a  chitin-inducible  gibberellin- responsive gene for major locus affecting plant height in rice that is closely linked to Green Revolution gene sd1 . Theor. Appl. Genet. 123:705-714.
Neelakandan, A.K., H.T.M. Nguyen, R. Kumar, L.S.P. Tran, S.K.  Guttikonda,  T.N.  Quach,  D.L.  Aldrich,  W.D. Nes, H.T. Nguyen. 2010. Molecular characterization and functional analysis of Glycine max sterol methyl transferase 2  genes  involved  in  plant  membrane sterol biosynthesis. Plant Mol. Biol. 74:503-518.
Nes, W.D., B.S. McCourt, J.A. Marshall, J. Ma, A.L. Dennis,
M.  Lopez,  L.  He.  1999.  Site-directed  mutagenesis of  the  sterol  methyl  transferase  active  site  from Saccharomyces  cerevisiae results  in  formation  of novel 24-ethyl sterols. J. Org. Chem. 64:1535-1542.
Parish, E.J., W.D.Nes. 1997. Biochemistry and function of sterols. CRC press, Boca Raton, NY.
Putri, L.A.P., H. Aswidinnoor, D. Asmono. 2010. Keragaan genetik dan pendugaan heritabilitas pada komponen hasil dan kandungan β-karoten progeni kelapa sawit. J. Agron. Indonesia 37:145-151.
Roberdi,  Sobir,  S. Yahya,  N. Toruan-Mathius, T.  Liwang.
2015.  Identification  of  gene  related  to  hard  bunch phenotype  in  oil  palm  ( Elaeis  guineensis Jacq.).  J. Agron. Indonesia 43:147-152.
Salsabila,  A.S.  2019.  Identifikasi Single  Nucleotide Polymorphism (SNP) pada Gen Terkait Pertambahan Tinggi  Batang  Kelapa  Sawit.  Tesis.  Sekolah
Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Saragih, B. 2016. Produktivitas sumber pertumbuhan minyak sawit  yang  berkelanjutan.  Palm  Oil  Agribusiness
Strategic  Policy  Institute.  https://www.iopri.org  [15 Agustus 2020].
Sayekti,  U.,  U.  Widyastuti,  N.  Toruan-Mathius.  2015. Keragaman genetik kelapa sawit ( Elaeis guineensis Jacq.)  asal  Angola  menggunakan  marker  SSR.  J. Agron. Indonesia 43:140-146.
Schaller,  H.  2004.  New  aspects  of  sterol  biosynthesis  in growth  and  development  of  higher  plants.  Plant Physiol. Biochem . 42:465-476.
Singh,  B.D.,  A.K.  Singh.  2015.  Marker-Assisted  Plant Breeding:  Principles  and  Practice. India,  Springer, IN.
Tang, J., Z. Han, J. Chai. 2016. Q&A: What are brasinosteroid and  how  do  they  act  in  plants?.  BMC  Biology. 14:113.
[USDA]  United  State  Department  of  Agriculture.  2018. Indonesia  Oilseed  and  Products  Update  2017. Jakarta.
Vriet, C., E. Russinova, C. Reuzeau. 2012. Boosting crop yields with plant steroids. Plant Cell 24:842-857.