AKTIVITAS AGEN TROMBOLITIK DAUN PEGAGAN ( Centella asiatica ) HASIL FERMENTASI OLEH Acetobacter aceti FNCC 0016 DENGAN METODE CLOT LYSIS SECARA IN-VITRO
Submitted : 6 Oktober 2021 Edited : 6 Desember 2021
Accepted : 13 Desember 2021
Adristy Ratna Kusumo, Achmad Toto Poernomo*, Riesta Primaharinastiti
Departemen Ilmu Kefarmasian, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Jawa Timur, Indonesia Email : achmad-t-p@ff.unair.ac.id Telepon Penulis Utama : 08165434137

## ABSTRACT
Thrombolytic agents are plasminogen activators which can dissolve blood clot that caused cardiovascular disease (CVD). Thrombolytic agents can be obtained from microorganism such as Acetobacter aceti FNCC 0016 and from plants such as Centella asiatica, these thrombolytic agents  are  combined  using  fermentation  method.  Fermentation  can  improves  the pharmacological  properties  of  plants through  modification of their  metabolites.  Fermentation mediated by microorganism has been shown to enhance the therapeutic efficacies of some plants. This  research  aimed  to  determine  the  increase  of  thrombolytic  activity  from  the  fermentation product of Centella asiatica by Acetobacter aceti FNCC 0016. Fermentation was carried out at various times (0 h, 24 h, 48 h, 72 h) at a temperature of 30±1°C. The thrombolytic activity was determined  using  in-vitro  clot  lysis  method.  The  results  showed  a  significant  increase  in thrombolytic activity after 72 hours of fermentation with thrombolytic index of 91,49 compared to Centella asiatica extract (42.93) and Acetobacter aceti FNCC 0016 (19.99). Conclusion: Thus, Centella asiatica that has undergone a fermentation process with Acetobacter aceti FNCC 0016 can increase the thrombolytic activity.
Keywords: Thrombolytic Agent, Acetobacter aceti, Centella asiatica

## PENDAHULUAN
Trombosis  atau  akumulasi  gumpalan fibrin  di  pembuluh  darah  merupakan  salah satu faktor risiko penyakit kardiovaskular (1) . Dalam keadaan normal, trombus atau bekuan darah akan dihidrolisis oleh plasmin sehingga trombosis  tidak  terjadi.  Namun,  dalam kondisi yang tidak seimbang atau abnormal, thrombus  tidak  terhidrolisis  sehingga terjadilah  trombosis (2) .  Untuk  mengurangi risiko  penyakit  akibat  penyumbatan  oleh trombus, dapat digunakan agen trombolitik (3) .
Agen trombolitik berdasarkan mekanisme  kerjanya  dapat  dibedakan menjadi dua
yaitu, mengaktifkan
plasminogen menjadi plasmin untuk mendegradasi  fibrin  atau  disebut  aktivator plasminogen, seperti tissue-type plasminogen activator (t-PA),  streptokinase  (SK),  dan urokinase  (UK)  atau  secara  langsung mendegradasi fibrin menjadi fibrin degradation product (FDP) (4). .Terapi fibrinolitik  dengan  t-PA  masih  populer sampai saat ini, tetapi memiliki keterbatasan diantaranya  spesifisitas  fibrin  yang  rendah dan timbul efek samping pendarahan (5) . Oleh karena  itu,  perlu  dilakukan  penelitian  yang bertujuan  untuk  meningkatkan  efikasi  dan spesifisitas dari terapi fibrinolitik (2) .
Agen  trombolitik  banyak  ditemukan pada mikroorganisme diantaranya Acetobacter aceti (6) , Bacillus natto , Bacillus amyloliquefaciens , dan subtilis QK02 (4) . Dari sumber mikroorganisme tersebut, Acetobacter  aceti hasil  isolasi  ekstrak  daun pinus telah dikarakterisasi aktivitas fibrinolitiknya  dan  memiliki  aktivitas  yang cukup  besar (6) .  Agen  trombolitik  juga  dapat ditemukan  pada  tanaman  seperti Centella asiatica berdasarkan  penelitian  Hossain (2018),  diketahui  daun Centella  asiatica memiliki aktivitas trombolitik dengan indeks trombolitik  sebesar  79,18 (7) .  Selain Centella asiatica ,  tanaman  lain  juga  diteliti  aktivitas trombolitiknya  seperti  kulit  batang  dan  biji asam  jawa  ( Tamarindus  indica ) (8) ,  daun Lophopetalum  javanicum (9) ,  dan  daun Coriandrum  sativum (10) . Centella  asiatica mengandung  metabolit  sekunder  yang  baik bagi  pertumbuhan  bakteri  dan  kandungan protein  dalam Centella  asiatica dapat memodulasi  enzim  melalui  ikatan  pada  sisi allosterik  enzim (11) .  Sehingga, Centella asiatica dapat  dipertimbangkan  sebagai media fermentasi.
Fermentasi  dapat  meningkatkan  sifat farmakologis  tanaman  melalui  modifikasi metabolitnya.  Fermentasi  yang  dimediasi oleh mikroorganisme telah terbukti meningkatkan  khasiat  terapeutik  dari beberapa  tanaman (12) .  Fermentasi  dapat memproduksi  produk  dengan  kualitas  yang lebih  baik.  Lebih  spesifiknya  proses fermentasi  menggunakan  mikroba  untuk memecah  substrat  yang  tidak  diinginkan menjadi  komponen  yang  sesuai,  sehingga menghasilkan  komponen  bioaktif  yang bermanfaat. Selain itu, fermentasi juga dapat meningkatkan nilai nutrisi dalam makanan (12) .  Banyaknya  manfaat  yang dihasilkan pada proses fermentasi maka pada penelitian  ini  dilakukan  proses  fermentasi daun Centella asiatica oleh Acetobacter aceti yang juga memiliki aktivitas fibrinolitik dan
merupakan salah satu mikroba yang banyak digunakan dalam proses fermentasi.
Fermentasi Centella  asiatica belum pernah  dilaporkan  menghasilkan  aktivitas trombolitik.  Untuk  mengetahui  aktivitas trombolitik,  digunakan  metode clot  lysis dengan  persen  lisis  bekuan  darah  sebagai parameter pengamatan, kemudian
aktivitasnya ditentukan menggunakan indeks trombolitik.  Diharapkan  terjadi  peningkatan aktivitas  trombolitik  dari  hasil  fermentasi daun Centella  asiatica dengan Acetobacter aceti FNCC 0016.

## METODE PENELITIAN Bahan
Acetobacter  aceti FNCC  0016  yang diperoleh  dari Food  and  Nutrition  Culture Collection Universitas  Gadjah  Mada,  daun Centella  asiatica koleksi  Balai  Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan  Obat  Tradisional  Tawangmangu,  darah vena  jugularis  sapi  dari  Rumah  Potong Hewan  Surabaya.  Bahan  untuk  media pertumbuhan bakteri yaitu glucose (PUDAK Scientific), yeast , pepton, agar. Bahan untuk peremajaan  bakteri  yaitu Glucose  Yeast Peptone  broth ,  bahan  untuk  uji  proteolitik adalah susu skim (PT. Nutrifood Indonesia), bahan  untuk  uji  fibrinolitik  fibrin  adalah fibrin bovine  blood (Simagchem®),  dan bahan  lain  yang  digunakan  adalah  aquades, agarose  (Pijar  Samudera),  NaCl  0,9%, metilen biru (MERCK), dapar fosfat K 2 HPO 4 dan  KH 2 PO 4 (SIGMA),  dan  fibrinase  (Dipa Pharmalab Intersains).

## Alat
Cawan petri, Beaker glass, gelas ukur, autoclave  HL-340  Series  Vertical  Type Steam  Sterilizer,  vortex  maxi  mixII  IKA®, centrifuge  Hettich  Zentrifugen  EBA  20, mikropipet  Eppendorf®  research  plus, inkubator  Memmert  IN110  genius  3, timbangan digital Sartorius Type BP 221S®.
Preparasi  Media  dan  Pemeliharaan Bakteri
Melarutkan 2,0 g glukosa, 0,5 g yeast , 0,5  g  pepton  dan  1,5  g  agar  dalam  100  mL aquadest, kemudian dipanaskan. Selanjutnya dimasukkan  dalam  tabung  reaksi  masing- masing  sebanyak  10  mL  dan  disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121° C selama  15  menit,  setelah  itu  tabung  reaksi dimiringkan dan biarkan memadat.
Acetobacter  aceti FNCC  001  digesekkan secara  aseptis  ke  dalam  GYP  Agar  miring. diinkubasi  pada  suhu  37±1°C  selama  24 jam (13,14) .
Preparasi Inokulum Glucose Yeast Peptone Melarutkan 3,0 g glukosa, 0,75 g yeast , dan  0,75  g  pepton  dalam  125  ml  aquadest kemudian  disterilkan  pada  suhu  121°C selama  15  menit.  Media  GYP  agar  miring berisi Acetobacter  aceti FNCC  0016  yang telah diinkubasi selama 24 jam ditambahkan dengan  10  mL  media  cair  GYP.  Suspensi tersebut kemudian divortex selama ± 5 menit sampai  bakteri  terlepas  dari  media.
Kemudian diukur
menggunakan spektrofotometer  hingga  didapatkan  25% transmitan pada panjang gelombang 580 nm. 10 ml suspensi tersebut dimasukkan kedalam Erlenmeyer  250  ml  berisi  media  cair  GYP. Kemudian,  inkubasi  pada  shaker  inkubator dengan  kecepatan  penggojokan  100  rpm selama 24 jam pada suhu 30 ± 1°C.

## Pembuatan Infusa Daun
Centella  asiatica koleksi  Balai  Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional di Kota Tawangmangu, diperoleh  bulan  Februari  2021.  Simplisia daun  kering  dibuat  menjadi  serbuk  dengan cara dimasukkan ke dalam blender yang telah steril.  Serbuk  tersebut  disaring  dengan ayakan mesh 500 dan dapat disimpan dalam wadah  gelas  dan  terhindar  dari  matahari. Pada saat  penyiapan ekstrak, sebanyak 32,5 gram serbuk Centella asiatica ditambah 650
ml  aqua  demineralisata,  kemudian  disaring menggunakan kertas Whatman dan
disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (15) .

## Fermentasi Media Tanaman
Pada  media  fermentasi,  inokulum Acetobacter  aceti FNCC  0016  yang ditambahkan  yaitu  sebanyak  10  ml. Fermentasi  dilakukan  dalam  12  labu Erlenmeyer  250  ml  berisi  ekstrak Centella asiatica ,  Erlenmeyer  pertama  sampai  ketiga diberi label 0 jam (R1,R2,R3) , Erlenmeyer keempat sampai keenam diberi label 24 jam (R1,R2,R3),  Erlenmeyer  ketujuh  sampai kesembilan diberi label  48 jam (R1,R2,R3), dan  Erlenmeyer  kesepuluh  sampai  kedua belas  diberi  label  72  jam  (R1,R2,R3). Erlenmeyer  diinkubasi  pada  suhu  30°C selama  0,  24,  48,  dan  72  jam.  (modifikasi metode Rosada 2018) (16) .

## Uji  Aktivitas  Proteolitik  dengan  Susu Skim Agar
Dengan  melarutkan  1  gram  serbuk susu  ke  dalam  10  ml  aquadest  (10%  b/v). Selanjutnya, ditambahkan 1,5% larutan agar dan  dilarutkan  dalam  100  mL  aquadest. Menuang 20 mL ke dalam cawan petri serta diratakan dan biarkan hingga media memadat sempurna.  Dibuat  sumuran  untuk  tempat sampel.  Pada  media  susu  skim  agar, dibuatkan  sumur  dengan  diameter  7  mm menggunakan  logam  pelubang  steril  dan masing-masing lubang diberi 15 µL ekstrak Centella asiatica, larutan starter Acetobacter aceti FNCC  0016,  kontrol  positif  yaitu nattokinase  dan  kontrol  negatif  yaitu  dapar fosfat  pH  7.  Setelah  itu  media  uji  aktivitas enzim  proteolitik  diinkubasi  pada  suhu 37±1°C  selama  24  jam.  Jika  bakteri menimbulkan  zona  jernih  di  sekitar  koloni maka  bakteri  tersebut  menghasilkan  enzim proteolitik. Kemudian dilakukan pengukuran diameter  zona  jernih  dengan  menggunakan jangka  sorong  dan  ditentukan  indeks
proteolitiknya (IP) yaitu dengan membandingkan  antara  rata  –  rata  diameter zona jernih (mm) dan diameter lubang (mm).
Uji  Aktivitas  Enzim  Fibrinolitik  dengan Fibrin Plate
Fibrin plate dibuat dengan melarutkan 0,3%  b/v  fibrin  dalam  100  mL  dapar  fosfat 0,1 M pH 7 kemudian ditambah dengan 1,7% b/v  agarosa  lalu  disterilkan  dengan  cara pasteurisasi pada suhu 80°C selama 3 menit. Kemudian larutan tersebut ditambahkan 800 µL metilen biru pada plate agar zona jernih pada  uji  aktivitas  enzim  fibrinolitik  terlihat dengan jelas. Setelah itu dituang sebanyak 20 mL  ke  dalam  cawan  petri  yang  telah disterilkan (Modifikasi metode Ashipala and He,  2008  dan  Poernomo,  Isnaeni,  and Purwanto,  2013) (17)(18) .  Dibuat  sumuran dengan  logam  pelubang  steril  dengan diameter  7  mm  pada  masing-masing  fibrin plate.  Kemudian  masing-masing  lubang diberi  15  µL  ekstrak Centella  asiatica , larutan starter Acetobacter aceti FNCC 0016, hasil  fermentasi Centella  asiatica ,  kontrol positif yaitu nattokinase dan kontrol negatif yaitu  dapar  fosfat  pH  7  dan  dilakukan replikasi  sebanyak  tiga  kali.  Kemudian diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  24  jam. Jika bakteri menghasilkan enzim fibrinolitik akan  memberikan  zona  jernih  disekitar koloni. Kemudian diukur zona jernihnya dan ditentukan  aktivitas  fibrinolitiknya  yang dinyatakan  dalam  Indeks  Fibrinolitik  (IR) yaitu perbandingan antara rata – rata diameter zona jernih (mm) dan diameter lubang (mm). Zona jernih diartikan sebagai hasil degradasi fibrin  dan  diameternya  sebanding  dengan potensi aktivitas fibrinolitik.

## Uji Aktivitas Trombolitik dengan Metode Clot Lysis
Media  yang  digunakan  untuk  uji aktivitas agen trombolitik adalah darah vena jugularis  sapi  yang  diperoleh  dari  Rumah Potong  Hewan  Kota  Surabaya.  Darah
tersebut disimpan dalam wadah yang berisi es batu dengan suhu 2°C – 6°C agar tidak terjadi penggumpalan. Selanjutnya darah diletakkan pada  tabung  mikrosentrifus  dan  diinkubasi pada  suhu  37°C  selama  45  menit.  Setelah diinkubasi kemudian disentrifugasi selama 5 menit  dengan  kecepatan  3000  rpm.  Setelah proses  tersebut,  akan  terbentuk  gumpalan darah.  Untuk  memisahkan  serum  dari gumpalan tersebut adalah dengan mendekantasi dan tabung ditimbang kembali untuk  menentukan  berat  gumpalan  darah. Kemudian hasil fermentasi Centella asiatica , Centella  asiatica non-fermentasi  dan  starter Acetobacter  aceti FNCC  0016  dimasukkan pada  masing-  masing  tabung  mikrosentrifus dan  diberi  label  sebagai  penanda.  Kontrol yang digunakan pada uji aktivitas ini adalah streptokinase  sebagai  kontrol  positif  dan dapar  fosfat  sebagai  kontrol  negatif. Selanjutnya  semua  tabung  diinkubasi  pada suhu  37±1°C  selama  90  menit.  Setelah diinkubasi,  dilakukan  sentrifugasi  dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit sampai cairan dan gumpalan darah terpisah. Apabila cairan tidak terpisah, maka lakukan orientasi pada proses trombolitik selama 15 menit, 30 menit, 45 menit, dan 60 menit. Setelah proses orientasi, cairan yang berasal dari hasil lisis bekuan darah dibuang secara hati – hati dan kemudian tabung ditimbang kembali sebagai berat  tabung  setelah  lisis.  Pengukuran aktivitas  trombolitik  diukur  berdasarkan  % clot  lysis yang  dinyatakan  dalam  indeks trombolitik  yang  dibandingkan  dengan standar streptokinase (19) .

## Analisis Statistik
Data  rata-rata  3  pengulangan  dan  3 paralel untuk setiap pengulangan. Nilai rata- rata dan standar deviasi dihitung menggunakan  perangkat  lunak  Microsoft Excel  (Office  2013,  Microsoft).  Nilai  rata- rata  dibandingkan  dengan  menggunakan software  statistik  SPSS  (SPSS  versi  22.0, SPSS  Inc.,  Chicago,  IL,  USA).  Selanjutnya
dilakukan  uji  lanjut  Duncan  pada  taraf kebermaknaan 0,05 untuk melihat perbedaan yang  bermakna  pada  aktivitas  trombolitik dan variasi waktu fermentasi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji  Proteolitik  pada  Media  Susu  Skim Agar
Starter Acetobacter aceti FNCC 0016,
ekstrak Centella  asiatica ,  dan  hasil fermentasi Centella asiatica dengan
Acetobacter  aceti  FNCC  0016  pada  variasi waktu  0  jam,  24  jam,  48  jam,  dan  72  jam terlebih dahulu dilakukan uji aktivitas enzim proteolitiknya.  Sampel  diinokulasikan  ke dalam  media  susu  skim  agar  yang  telah dilubangi  masing-masing  sebesar  7  mm, kemudian diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37±1°C selama 24 jam dan diamati zona jernih  di  sekitar  sumuran.  Adanya  aktivitas proteolitik ditunjukkan dengan terbentuknya zona  jernih  di  sekitar  sumuran  (Gambar  1) yang  menunjukkan  kemampuan  bakteri dalam  menghidrolisis  substrat  menjadi peptida dan asam amino.
Gambar 1. Contoh  hasil  pengamatan  zona jernih aktivitas enzim proteolitik  pada Acetobacter aceti FNCC 0016
(Keterangan: Aa: Acetobacter aceti ; + = kontrol positif; - = kontrol negatif).
Dari  hasil  pengukuran  diameter  zona jernih  (Tabel  1),  diketahui  bahwa  seluruh sampel  memiliki  aktivitas  proteolitik, aktivitas  terbesar  dimiliki  oleh  Starter Acetobacter aceti FNCC 0016 dengan indeks proteolitik  sebesar  3,99,  sedangkan  indeks trombolitik terbesar diantara hasil fermentasi Centella  asiatica dengan Acetobacter  aceti FNCC  0016  pada  berbagai  variasi  waktu diperoleh pada waktu 0 jam sebesar 3,71.
Tabel 1 . Hasil uji aktivitas enzim proteolitik Sampel Rata-rata diameter zona jernih (mm) ± SD Indeks Proteolitik Starter Acetobacter aceti FNCC 0016 27,95 ± 2,63 3,99 Nattokinase 26,00 3,71 Ekstrak Centella asiatica 14,91 ± 0,57 2,13 Fermentasi 0 jam 25,93 ± 1,24 3,71 Nattokinase 26,30 3,76 Fermentasi 24 jam 20,65 ± 1,26 2,95 Nattokinase 22,30 3,18 Fermentasi 48 jam 11,00 ± 0 1,57 Nattokinase 24,175 3,45 Fermentasi 72 jam 17,58 ± 2,07 2,51 Nattokinase 22,30 3,18 Zona Jernih Proteolitik
Uji Fibrinolitik pada Media Fibrin Plate

## Agar
Uji  fibrinolitik  dilakukan  dengan menggunakan  fibrin  plate  agar  dalam dapar fosfat pH 7 dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37±1°C untuk mengetahui aktivitas  enzim  fibrinolitik  dari  starter Acetobacter  aceti  FNCC  0016,  ekstrak Centella  asiatica,  dan  hasil  fermentasi Centella asiatica dengan Acetobacter aceti FNCC  0016.  Aktivitas  enzim  fibrinolitik dapat  ditentukan  oleh  kemampuannya dalam menghidrolisis substrat fibrin yang ditunjukkan dengan adanya zona jernih di sekitar lubang (Gambar 2).
Gambar 2. Contoh hasil pengamatan zona jernih aktivitas enzim fibrinolitik  pada  Acetobacter aceti FNCC 0016
(Keterangan:  Aa:  Acetobacter  aceti;  +  = kontrol positif; - = kontrol negatif).
Semakin besar aktivitas
fibrinolitik,  semakin  besar  zona  jernih yang  terbentuk (14) .  Zona  jernih  dapat terlihat  karena  penambahan  zat  warna metilen biru, tanpa penambahan zat warna zona  jernih  hampir  tidak  terlihat  pada media  fibrin.  Hasil  uji  aktivitas  enzim fibrinolitik  dinyatakan  dalam  indeks fibrinolitik (Tabel 2).

## Uji Clot Lysis
Setelah  diketahui  memiliki  enzim fibrinolitik, dilakukan uji clot lysis untuk mengetahui  aktivitas  agen  trombolitik
sampel.  Aktivitas  agen  trombolitik dinyatakan  dalam  indeks  trombolitik. Indeks  trombolitik  adalah  kekuatan  agen trombolitik  yang  diukur  berdasarkan perbandingan  antara  %  clot  lysis  sampel dengan clot lysis standar yaitu nattokinase. Gambar  3  menunjukkan  hasil  fermentasi, terjadi lisis pada gumpalan darah sehingga menunjukkan
adanya aktivitas trombolitik. Gambar 3. Contoh  hasil  uji  aktivitas trombolitik  pada Centella asiatica hasil fermentasi oleh Acetobacter aceti FNCC 0016 selama 72 jam dengan metode clot lysis
(Keterangan  K-  =  kontrol  negatif;  K+  = kontrol  positif;  1  =  replikasi  1;  2  = replikasi 2 dan 3 = replikasi 3).
Berdasarkan uji clot lysis, didapatkan  indeks  trombolitik  hasil fermentasi Centella asiatica oleh Acetobacter aceti FNCC 0016 pada variasi waktu 0 jam sebesar 43,89. Nilai tersebut menunjukkan adanya peningkatan dibanding  indeks  trombolitik  ekstrak Centella  asiatica  yang  hanya  42,93. Namun, pada fermentasi variasi waktu 24 jam, didapatkan penurunan indeks trombolitik  menjadi  40,68,  kemungkinan karena terjadi perubahan kondisi lingkungan yang menyebabkan stress pada bakteri,  sehingga  jumlah  sel  yang  aktif mengalami  penurunan.  Fermentasi  pada variasi waktu 48 jam kembali menunjukkan  peningkatan  menjadi  42,13 Zona Jernih Fibrinolitik
walaupun  masih  lebih  kecil  daripada fermentasi pada waktu 0 jam. Peningkatan pada  waktu  48  jam  menunjukkan  bakteri sudah menyesuaikan diri dengan lingkungan dan berupaya mengembalikan pola  metabolisme.  Indeks  trombolitik tertinggi  didapatkan  setelah  fermentasi dilakukan  selama  72  jam  yaitu  sebesar
91,49.  Pada  waktu  fermentasi  72  jam bakteri berada di akhir fase logaritmik dan mulai  memasuki  fase  stasioner,  sehingga kemungkinan  yang  berperan  tidak  hanya enzim  namun  juga  metabolit  sekunder menyebabkan nilai indeks trombolitik naik secara signifikan.

## Tabel 2 . Hasil Uji Fibrinolitik
Sampel Rata-rata diameter zona jernih (mm) ± SD Indeks Fibrinolitik Starter Acetobacter aceti FNCC 0016 24,32 ± 1,15 3,47 Nattokinase 22,10 3,16 Ekstrak Centella asiatica 12,92 ± 1,48 1,84 Fermentasi 0 jam 23,48 ± 1,99 3,35 Nattokinase 22,00 3,14 Fermentasi 24 jam 17,29 ± 1,15 2,47 Nattokinase 19,10 2,73 Fermentasi 48 jam 11,75 ± 1,09 1,68 Nattokinase 21,08 3,01 Fermentasi 72 jam 17,95 ± 7,28 2,56 Nattokinase 28,05 4,00 Tabel 3. Hasil Uji Clot Lysis
Sampel Rata-rata % Clot Lysis ± SD Rata-Rata Indeks Trombolitik Acetobacter aceti FNCC 0016 9,43 ± 1,74 19,99 Ekstrak Centella asiatica 20,24 ± 0,78 42,93 Hasil Fermentasi Centella asiatica 0 jam 20.69 ± 1,93 43.89 Hasil Fermentasi Centella asiatica 24 jam 19,18 ± 1,44 40,68 Hasil Fermentasi Centella asiatica 48 jam 19,87 ± 6,00 42,13 Hasil Fermentasi Centella asiatica 72 jam 43,14 ± 1,79 91,49 Nattokinase 47,15 ± 3,54 100,00
Data statistik One  way  anova  test dilakukan  untuk mengetahui  terdapat perbedaan yang bermakna  antar  kelompok  data.  Dari  uji tersebut didapatkan bahwa data terdistribusi normal. Hasil menunjukkan adanya perbedaan bermakna rerata persen clot lysis Acetobacter  aceti  FNCC  0016,  ekstrak Centella  asiatica,  dan  hasil  fermentasi Centella  asiatica  oleh  Acetobacter  aceti FNCC  0016  pada  berbagai  variasi  waktu. Dari  hasil  tersebut  diketahui  bahwa  hasil fermentasi  pada  waktu  72  jam  memiliki perbedaan  yang  paling  signifikan  dibanding hasil fermentasi pada variasi waktu lainnya.

## SIMPULAN
Terdapat  perbedaan  bermakna  rerata persen  clot  lysis  Acetobacter  aceti  FNCC 0016,  Ekstrak  Centella  asiatica,  dan  hasil fermentasi Centella asiatica oleh Acetobacter aceti  FNCC  0016  pada  berbagai  variasi waktu.  Dapat  disimpulkan  bahwa  hasil fermentasi  pada  waktu  72  jam  memiliki perbedaan  yang  paling  signifikan  dibanding hasil fermentasi pada variasi waktu lainnya.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Artikel  ini  telah  dipaparkan  pada Pertemuan Ilmiah Tahunan Ikatan Apoteker Indonesia tahun 2021.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Chandrasekaran,  S.D.,  Vaithilingam,
M., Shanker, R., Kumar, S., Thiyur, S.,
Babu, V., Selvakumar, J.N., Prakash, S., 2015, Exploring the in vitro thrombolytic  activity  of  nattokinase from  a  new  strain  Pseudomonas aeruginosa  CMSS. Jundishapur  J
Microbiol. , Volume 8, pp. 1-7 .
2. Kotb,  E.,  2013,  Activity  assessment  of microbial  fibrinolytic  enzymes. Appl Microbiol  Biotechnol. , Volume  97,  pp.
6647-6665
3. Ali,  R.,  Hossain,  M.S.,  Islam,  A., Arman,  S.I.,  Golam,  S.R.,  Prianka,  D.,
Noshin,  T.F.,  2014,  Aspect  of thrombolytic  therapy:  A  review. ScientificWorldJournal.,  Volume  2014, pp. 1-6.
4. Peng, Y., Yang, X. and Zhang, Y., 2005, Microbial  fibrinolytic  enzymes:  An overview of source, production, properties,  and thrombolytic  activity  in vivo. Appl  Microbiol  Biotechnol., Volume 69, pp. 126-132 .
5. Narasimhan, M. K., Chandrasekaran, M. and  Rajesh,  M..  2015,  Fibrinolytic enzyme  production  by  newly  isolated bacillus cereus SRM-001 with enhanced
in-vitro  blood  clot  lysis  potential. Adv Appl  Microbiol.,  volume  61,  pp.  157- 164 .
6. Park,  J.,  Yoon,  S.,  Kim,  S.,  Lee,  B., Cheong, H., 2012, Characterization and fibrinolytic  activity  of  acetobacter  sp. FP1 isolated from fermented pine needle extract. J Microbiol Biotechnol., Volume 22, pp. 215-219 .
7. Hossain,  S.,  Islam,  R.,  Sultana,  S., Rahman,  H.,  Bhowmick,  A.,  2018, Investigation  of  Thrombolytic  and Antioxidant  Potentials  of  Centella Asiatica. Galore  International  Journal of  Health  Sciences  and  Research, Volume 3, pp. 52-58 .
8. Biswas,  K.,  Azad,  A.  K.,  Sultana,  T., Khan,  F.,  Hossain,  S.,  Alam,  S., Chowdhary,  R.,  Khatun,  Y.,  2017, Assessment  of  in-vitro  cholinesterase inhibitory and thrombolytic potential of bark  and  seed  extracts  of  Tamarindus indica  (L.)  relevant  to  the  treatment  of Alzheimer’s  disease  and  clotting disorders. J Intercult Ethnopharmacol., Volume 6, pp. 115-19 .
9. Ferdous,  R.U.,  Azam,  G.,  Hossain,  D.,
2014,  Phytochemical  Screening  ,  in- Vitro  Membrane  Stabilizing  and Thrombo- Lytic Activities of
Lophopetalum  Javanicum. Int  J  Pharm Sci Res., Volume 5, pp. 350-353 .
10. Shahriar,  M.,  Islam,  Md.S.,  Islam, SM.A.,  Parvin.,  S.,  Afrin,  N.,  2013,
Thrombolytic  activity  of  Coriandrum sativum. Journal of Bangladesh Academy  of  Sciences.  Volume  36,  pp. 245-247 . 11. Lopina, O. D., 2016, Enzyme Inhibitors and  Activators  Provisional  chapter Enzyme  Inhibitors  and  Activators. InTech . Chapter 11.
12. Hussain,  A.,  Bose,  S.,  Wang,  J.H., Kumar,  M.,  Mahajan,  G.B.,  Kim,  H., 2016, Fermentation , a feasible strategy for  enhancing  bioactivity  of  herbal medicines. Food  Res  Int.,  Volume  81, pp. 1-16.
13. Salamah,  A.,  Srihardyastutie,  A.,
Prasetyawan,  S.,  Safitri,  A.,  2019,
Influence  of  mixed  cultures  of saccharomyces cerevisiae and acetobacter  aceti  for  hydrolysis  of tannins  in  the  cabbage  fermentation (brassica  oleracea  l.var.capitata).  IOP
Conference  Series:  Materials. Science and Engineering, Volume 546, pp. 1-6.
14. Zahoor, T., Siddique, F. and Farooq, U., 2006, Isolation and characterization of vinegar culture (Acetobacter aceti) from indigenous sources. British Food Journal, Volume 108, pp. 429-439 .
15. Madhusudhan, N. CH., Neeraja, P. and
Devi, P., 2014, Comparative analysis of
active constituents in centella asiatica varieties (Majjaposhak and Subhodak). International Journal of Pharmaceutical and Phytopharmacological Research, Volume 4, pp. 105-108.
16. Rosada,  K.  K.,  2018,  Enhanced  acetic acid  production  from  manalagi  apple (Malus  sylvestris  mill)  by  mixed cultures  of  Saccharomyces  cerevisiae and  Acetobacter  aceti  in  submerged fermentation. J Phys Conf Ser., Volume
1013, pp. 1-7 .
17. Ashipala,  O.K.,  He,  Qian.,  2008, Optimization  of  fibrinolytic  enzyme production by Bacillus subtilis DC-2 in aqueous  two-phase  system  (poly- ethylene  glycol  4000  and  sodium sulfate). Bioresour Technol., Volume 99, pp. 4112-19 . 18. Poernomo, T. A., Isnaeni and Purwanto.,
2013.  Kajian  potensi  enzim  fibrinolitik tempe  hasil  fermentasi  Rhizopus oligosporus  sebagai  agen  trombolitik dan antitrombotik. pp. 1-61.
19. Ratnasooriya, W. D., Fernando, T. S. P. and  Madubashini,  P.  P.,  2008.  In  vitro thrombolytic  activity  of  Sri  Lankan black  tea,  Camellia  sinensis  (L.)  O. Kuntze. Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka, Volume 36, pp. 179-181 .