ISOLASI SENYAWA AKTIF ANTIJAMUR Fusarium oxysporum Schlecht

## DARI DAUN CENGKEH
Yenni Karlina 1 , Sukrasno 2 , I Nyoman Pugeg Aryantha 3
1 Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Jenderal Achmad Yani, Jl. Terusan Sudirman, Cimahi
2 Sekolah Farmasi, Institut Teknologi Bandung, Jl. Ganesha 10
3 Sekolah Ilmu Teknologi dan Hayati, Institut Teknologi Bandung, Jl. Ganesha 10 Corresponding author email: yheyhen_k@yahoo.co.id

## ABSTRAK
Pada  penelitian  ini  telah  dilakukan  isolasi  dan  identifikasi  senyawa  aktif  antijamur  dari  ekstrak    n- heksan,  etil  asetat  ,methanol  dan  minyak  atsiri  tanaman  obat  daun  cengkeh  ( Syzygium aromaticum (L.)  Merrill  and  Perry),  terhadap  pertumbuhan  jamur  Fusarium  oxysporum  Schlecht.  Uji  aktivitas antijamur  menggunakan  metode  difusi  agar  dengan  menghitung    prosentase  penghambatan pertumbuhan radial miselium jamur pada hari ke tujuh. Konsentrasi ekstrak  yang digunakan untuk uji aktivitas  antijamur,  yaitu  2,5%,  5%,  dan  10%.  Ekstrak  n-heksan  dan  minyak  atsiri  daun  cengkeh memiliki  aktivitas  antijamur  tinggi,  yaitu  76-100%.  Selanjutnya,  ekstrak  n-heksan  difraksinasi menggunakan  kromatografi  cair  vakum,  kromatografi  kolom  dan  kromatotron.  Identifikasi  senyawa dianalisis dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa (KG- SM).  Pada  ekstrak  n-heksan  yang  didapatkan  2  subfraksi.  Subfraksi  1  memiliki  aktivitas  antijamur 32,72%  pada  konsentrasi  5%  dan  subfraksi  2  dengan  aktivitasnya  90,90%  pada  konsentrasi  2,5%. Data KG-SM menunjukkan kandungan utama subfraksi 1 adanya senyawa karyofilen (BM 204) dan subfraksi 2 eugenol (BM 164).
Kata kunci : Antijamur, Fusarium oxysporium, tanaman obat

## ABSTRACT
This research has been performed, the isolation and identification the antifungal activity of extracts of n-hexane,  ethyl  acetate,  methanol  and  essential  oils  from  medicinal  plant  cloves  (Syzygium aromaticum (L.) Merrill and Perry), against the growth of the fungus Fusarium oxysporum Schlecht. Antifungal  activity  test,  using  the  jelly  diffusion  method  by  calculating  the  percentage  inhibition  of radial  growth  of  fungal  mycelium  on  the  seventh  day.  Concentration  of  extract  used  to  test  the antifungal activity was 2.5%, 5%  and 10%. N-hexane extracts and essential oils of clove leaf has a high antifungal activity, which is 76-100%. Further, n-hexane extract was fractionated using vacuum liquid chromatography, chromatography columns and chromatotron. Identification of the compound was  analyzed  by  Thin  Layer  Chromatography  (TLC)  and  Gas  Chromatography-Mass  Spectroscopy (GC-MS).    In  the  n-hexane  extract  obtained  2  subfractions.  Subfraction  1  has  antifungal  activity  of 32.72% at concentration of 5% and subfraction 2 has antifungal activity of 90.90% at concentration of 2,5%. GC-MS data shows that the  major component of subfraction 1 was caryophyllene (M = 204) and  subfraction  2 was eugenol (M =164).
Keywords : Antifungal, Fusarium oxysporium, medicinal plant cloves.

## PENDAHULUAN
Cengkeh sudah dikenal sejak zaman dahulu di India  dan  Cina  sebagai  tanaman  obat,  kemudian penyebarnnya  meluas  ke  seluruh  dunia.  Minyak cengkeh  dipakai  juga  sebagai  penambah  rasa masakan di India dan Cina. Cengkeh mengandung  kalsium,  asam  klorida,  zat  besi,
fosfor,  natrium,  kalium,  vitamin  A  dan  vitamin C.
Minyak  cengkeh  memiliki    manfaat  sebagai antimikroba, antijamur, antiseptik, antivirus, dan afrodisiak. Minyak esensial ini  digunakan untuk menghilangkan  rasa  sakit  gigi,  sariawan,  dan gusi  (Memmou  dkk.  2012).  Pada  gangguan pencernaan, minyak cengkeh berguna mengobati masalah  pada  lambung,  seperti  mabuk  ,mual,
muntah  dan  perut  kembung.  Selain  itu,  minyak cengkeh  biasa  ditambahkan  ke  dalam  krim kosmetik  dan  lotion  yang  lebih  dikenal  sebagai minyak pijat. Pemanfaatan cengkeh dan tanaman obat  juga  dapat  digunakan  sebagai  peptisida organik untuk mengendalikan hama, diantaranya sebagai  antijamur  (Carrasco  dkk.,  2012,  Manik dkk.  2009,  Cheng  dkk.,  2008,  Park  dkk.,  2007, Verma dkk., 2007). Pestisida yang menggunakan bahan organik lebih ramah lingkungan dan aman bagi  kesehatan  manusia,  serta  memberikan  nilai tambah  ekonomi  pada  produk  yang  dihasilkan (Sastrahidayat 1992, Semangun 1994).
Syzigium
aromaticum (cengkeh) merupakan Divisi: Magnoliophyta, Kelas: Magnoliopsida  (Dicots),  Anak  Kelas:  Rosidae, Bangsa:  Myrtales,  Suku:  Myrtaceae,  Jenis: Syzigium  aromaticum  (L.)  Merr  &  Perry (Cronquist,  1981).  Cengkeh  dikenal  sebagai nama daerah di Jawa dan  Sunda. Wunga lawang merupakan  nama  daerah  dari  cengkeh  yang banyak  dikenal  di  Bali.  Cengkeh  juga  ada  yang menyebut  cangkih  (Lampung),  sake  (Nias), beungeu  lawang  (Gayo),  cengke  (Bugis),  sinke (Flores), sanke (Makasar), dan gamode (Tidore). Ciri-cirinya,  antara  lain  berupa  pohon,  tinggi 18m,  daun  bulat  telur  lonjong,  tebal,  mengkilat, bunga coklat tua, kelopak 4 dan harum (DepKes RI,  1978).  Cengkeh  mengandung  minyak  atsiri terdiri  dari  eugenol,  asetil  eugenol,  dan kariofilen. Syzigium aromaticum diketahui memiliki  aktivitas  anti  jamur  terhadap  Jamur Fusarium oxysporum (Amin dkk. 2013, Suprapta, 2012).
Pada  penelitian  ini  dilakukan  isolasi  dan identifikasi  senyawa  aktif  antijamur  dari    daun cengkeh ( Syzygium aromaticum (L.) Merrill and Perry),  terhadap  pertumbuhan  jamur Fusarium oxysporum Schlecht.

## METODE
Bahan. Simplisia  yang  digunakan  adalah daun cengkeh ( Syzygium aromaticum L.), Bahan lain  yang  digunakan,  yaitu  metanol,  n-heksana, etil  asetat,  toluen,  aseton,  asam  klorida  pekat, asam  asetat  pekat, asam  sulfat  pekat, aluminium klorida,  Anisaldehida,  tween  80,  etanol  70%, aluminum foil, cling wrap, plat pralapis silica gel GF254  (MERCK ® ),  serbuk  silika  60  (0,063- 0,200mm)  (MERCK ® ),  serbuk  silika  60H (MERCK),  air suling, pereaksi untuk penapisan fitokimia,  media Potato  Dextrose  Agar (PDA) (OXOID ® ),  eugenol  (Aldrich),  dan  kultur  murni Fusarium  oxysporum dari  Balai  Penelitian
Tanaman Sayuran (BALITSA), Lembang, Bandung.
Alat. Cawan    penguap,  Erlenmeyer,  gelas kimia,   krus porselen, pipet ukur, labu destilasi, tabung  reaksi,  pipet  tetes,  pinset,  mikropipet, penguap  vakum  putar,  timbangan  analitik, pembakar Bunsen, cawan Petri, pencadang ( cork borer ), lemari inkubator (Wisecube®), plat tetes, autoclave ,  spatel  logam,  bejana  kromatografi lapis  tipis,  vial,  pipa  kapiler,  alat  kromatografi cair  vakum,  kromatotron,  dan    KG-SM (Shimadzu QP 2010 ULTRA).
Pembuatan Ekstrak. Sampel yang digunakan  dalam  penelitian  adalah  tumbuhan kering.  Sampel  tersebut  diekstraksi  dengan menggunakan  maserasi.  Tumbuhan  segar  20  gr dimaserasi dengan pelarut  metanol selama 3x 24 jam.
Hasil  maserasi  disaring  dan  dipekatkan menjadi  ekstrak  kental  dan    dibuat  larutan ekstrak  dengan  konsentrasi  2,5%,  5%  dan  10% untuk  masing-masing  ekstrak.  Larutan  ini kemudian digunakan sebagai bahan uji.
Penentuan  aktivitas  antijamur. Pemilihan metode uji aktivitas  antijamur  dilakukan dengan metode  difusi  agar,  caranya  cawan  Petri  yang telah berisi 15 ml media PDA dibiarkan memadat .  Setelah  padat  dibuat  sumur  difusi    masing  – masing sebanyak 4 buah pada setiap petri dengan menggunakan cork  borer .  Setiap  sumur  difusi diisi  dengan  50  µl  ekstrak  uji.  Jamur  dipotong dengan pencadang ( cork borer ) yang berdiameter 5 mm diletakkan ditengah medium agar tersebut. Daya  hambat  ekstrak  uji  diamati  terhadap pertumbuhan miselium dari jamur.
Ekstraksi Simplisia Daun Cengkeh. Ekstrak yang  aktif  selanjutnya  diekstraksi  dengan  Soklet secara bertingkat menggunakan pelarut n-heksan, etil  asetat  dan  metanol.  Masing-masing  ekstrak selanjutnya  dipekatkan  dan  diuji  aktivitas antijamur  dengan  konsentrasi  2,5%,  5%  dan 10%.  Terhadap  ekstrak  yang  paling  kuat aktivitasnya  dilanjutkan  dengan  isolasi  untuk mendapatkan senyawa aktif antijamur.
KG-MS  (Kromatografi  Gas-  Spektroskopi Massa). Kromatografi  gas  adalah  salah  satu teknik kromatografi dengan menggunakan prinsip pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen- komponen penyusunnya. Kromatografi ini digunakan  untuk  mendeteksi  senyawa-senyawa yang mudah menguap pada kondisi vakum tinggi dan  tekanan  rendah  serta  dapat  dipanaskan. Instrumen  kromatografi  gas  bisa  digunakan bersama  dengan  instumen  spektroskopi  massa.
Pada  KG-MS  akan  memisahkan  komponen- komponenyang menghasilkan kromatogram sedang spektrometri massa masing-masing senyawa disebut spektrum (Fowlis, 1998).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  Pengujian  Aktivitas  Ekstrak  dan Minyak  Atsiri  Daun  Cengkeh. Pengujian antijamur  secara in  vitro menunjukkan  aktivitas daun  cengkeh  dapat  menghambat  pertumbuhan radial  jamur Fusarium  oxysporum cukup  tinggi. Oleh  karena  itu,  dilakukan  ekstraksi  daun cengkeh dengan cara Soklet bertingkat menggunakan  pelarut  n-heksan,  etil  asetat  dan metanol. Masing-masing ekstrak tersebut dilakukan uji aktivitas antijamur.
Selain  itu,  dilakukan  juga  penyulingan minyak  atsiri  untuk  membandingkan  aktivitas antijamur.  Hasil  uji  aktivitas  antijamur  dapat dilihat  pada  Tabel  1.  untuk  pengujian  ekstrak  n- heksan  terhadap  jamur Fusarium  oxysporum menggunakan media PDA.
Tabel 1. Hasil  Uji  Aktivitas  Ekstrak  dan  Minyak Atsiri Daun Cengkeh
Keterangan :
- : tidak ada aktivitas + : aktivitas 1-25% ++ : aktivitas 26-50% +++ : aktivitas 51-75% ++++
: aktivitas 76-100%
Isolasi  Kandungan  Ekstrak  N-heksan. Ekstrak  n-heksan  (20  gr)  dilakukan  fraksinasi dengan  menggunakan  Kromatografi  Cair  vakum dengan  eluen  bergradien  berdasarkan  kenaikan kepolaran  (n-heksan,  etil  asetat  dan  metanol). Hasil  kromatografi  diperoleh  sebanyak  17  fraksi (A-Q)  dan  dipantau  dengan  Kromatografi  Lapis Tipis (Gambar 1).
Gambar 1. Kromatogram  hasil  pemisahan  dengan KCV ekstrak n-heksan (fasa gerak toluen- aseton 9:1) dibawah sinar UV 254 nm.
Fraksi  C,  E  dan  K  dilakukan  uji  aktivitas antijamur dengan konsentrasi 2,5%,5% dan 10%. Hasil  Uji  aktivitas  antijamur  dari  fraksi  dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil Uji Aktivitas Fraksi C,  E, dan K
Keterangan : - : tidak ada aktivitas, + : aktivitas 1-25% ++ : aktivitas 26-50% +++ : aktivitas 51-75% ++++ : aktivitas 76-100%
Fraksi  C  (41,3  mg)  dilakukan  pemurnian dengan  kromatografi  radial  menghasilkan  30 subfraksi  dengan  teknik  elusi  gradient  sehingga didapat  subfraksi  1.  Pada  fraksi  E  (2  gr) dilakukan  pemisahan  dengan  menggunakan kromatografi  kolom  dan  kromatografi  radial dengan  teknik  isokratik  sehingga  didapat subfraksi  2.  Masing-masing  subfraksi  1  dan subfraksi  2  dilakukan  uji  aktivitas  antijamur. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel 3.
No. Ekstrak Konsentrasi Aktivitas
2,5% - 5% ++ 10% ++++ 2,5% - 5% ++ 10% ++ 2,5% - 5% + 10% ++ 2,5% +++ 5% ++++ 10% ++++ 1 2 3 4 n-heksan Etil Asetat Metanol Minyak atsiri
Tabel 3. Hasil  Uji  Aktivitas  Pada  Subfraksi  1  dan
Subfraksi 2 Keterangan : - : tidak ada aktivitas + : aktivitas 1-25% ++ : aktivitas 26-50% +++ : aktivitas 51-75% ++++
: aktivitas 76-100%
Subfraksi 2 memberikan prosentase penghambatan  lebih  besar  dibandingkan  dengan subfraksi  1.  Hal  ini  diduga  karena  adanya perbedaan  kandungan  senyawa  pada  kedua subfraksi  tersebut.  Senyawa  yang  ada  pada subfraksi  2  ini  diduga  memberikan  kontribusi terhadap antijamur pada daun cengkeh.
Identifikasi Senyawa Subfraksi 1. Subfraksi 1 diperoleh berupa minyak berwarna bening dan berbau  aromatik.  Subfraksi  1  diduga  merupakan komponen minyak atsiri daun cengkeh. Subfraksi 1  dianalisis  menggunakan  pembanding  minyak atsiri  daun  cengkeh.  Hasil  kromatogram  dapat dilihat pada Gambar 2.
Data  kromatogram  subfraksi  1  menunjukkan bahwa  senyawa  yang  ada  merupakan  senyawa minor  yang  terkandung dari minyak atsiri. Hasil pemantauan  KLT  subfraksi  1  memiliki  Rf  0,85. Selanjutnya,  pada  subfraksi  1  dilakukan  analisis lebih  lanjut  menggunakan  KG-SM.  Hasil Kromatogram  dan  pola  fragmentasi  senyawa
subfraksi 1 dapat dilihat pada Gambar 3, Gambar 4, dan Gambar 5.
Gambar 2. Kromatogram  KLT,  (1)  Subfraksi  1  (2) minyak  atsiri  daun  cengkeh,  fase  diam silika  gel  GF254  dan  fase  gerak  toluen- aseton  (9:1),  (A)dibawah  lampu  UV 254nm, (B) setelah disemprot Anisaldehid-as.sulfat, dipanaskan.
Data spektrum kromatografi gas menunjukkan    puncak  I  yang  tertinggi  adalah pelarut n-heksan. Puncak  II merupakan senyawa yang  kandungannya  tertinggi  dibandingkan dengan senyawa lainnya, yaitu 25,23%.
Senyawa ini memiliki waktu retensi14 menit. Pemeriksaan spektrum  masa puncak II memiliki berat molekul 204 dengan rumus molekul C 15 H 24 . Spektrum  massa  ini  memperlihatkan  adanya fragmen molekul pada m/z 204 (10%), m/z  189 (20%),  m/z  133  (90%)  dan    m/z  98  (100%) menunjukkan  bagian  spektrum  yang  sama dengan  spektrum  standar  kariofilen.  Hasil  KG- MS ini sesuai dengan hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Memmou dan Mahboun (2012).
Gambar 3. Kromatogram KG-SM subfraksi 1
Gambar 4. Spektrum massa senyawa II
Gambar 5. Spektrum massa karyofilen
Identifikasi Senyawa Subfraksi 2.
Identifikasi senyawa subfraksi ini berupa minyak atsiri,  berbau  khas,  dan  berwarna  kuning kecoklatan.  Hasil  identifikasi  senyawa  subfraksi tersebut  sama  seperti  penelitian  yang  telah dipublikasikan  oleh  Rahimi  dkk  (2012).  Data kromatogram dari subfraksi 2 dengan pembanding  eugenol  memiliki  pola  KLT  yang mirip. Hal ini dapat dilihat pada gambar 6.
Data  kromatogram  dari  KG-SM  subfraksi  2 terdapat  puncak  utama  X  dengan  kadar  99.88% yang  menunjukkan  puncak  mayor.  Senyawa subfraksi  ini  memiliki  waktu  retensi  15  menit. Kromatogram  KG-SM  subfraksi  2  ini  dapat diamati seperti yang terlihat pada gambar 7.
Gambar 6. Kromatogram  KLT  (1)  subfraksi  2 dengan  (2)  pembanding  eugenol,  fase diam  silika  gel  F 254  nm dan  fase  gerak toluene-aseton  (9:1),  A)  dibawah  lampu UV  254nm,  (B)  setelah  disemprot Anisaldehid-as.sulfat, dipanaskan.
Gambar 7. Kromatogram KG-SM subfraksi 2
(a) (b)
Gambar 8. Spektrum massa senyawa X (a) dan spektrum massa eugenol (b)
Pemeriksaan  spektrum  massa  menunjukkan berat  molekul  senyawa  X  adalah  164  dengan rumus  molekul  C 10 H 12 O 2 .  Spektrum  massa  ini memperlihatkan  adanya  fragmen  molekul  pada m/z 164 (100%), m/z 149 (32%), m/z 131 (22%), m/z  121  (15%),  m/z  103  (20%)  dan  m/z  91 (18%). Pola pemecahan fragmen dari spektrometer  massa  juga  sesuai  dengan  pustaka dan  hasil  analisis  menunjukkan  bahwa  senyawa ini adalah eugenol. Spektrum massa dari masing- masing puncak X dan eugenol dapat dilihat pada Gambar 8 (a) dan 8(b).

## KESIMPULAN
Ekstrak  n-heksan  didapatkan  dua  subfraksi. Subfraksi 1 memiliki aktivitas antijamur 32,72% pada  konsentrasi  5%.  Subfraksi  2  dengan aktivitasnya antijamur  90,90%  pada konsentrasi 2,5%.  Data  KG-SM  menunjukkan  kandungan utama  subfraksi  1  adanya  senyawa  karyofilen (BM  204)  dan  subfraksi  2  eugenol  (BM  164). Komponen  utama  daun  cengkeh  yang  aktif sebagai antijamur adalah eugenol.

## DAFTAR PUSTAKA
Amin,  M.,  Jassal,  M.  M.  S.,  and  Tygi,  S.  V. (2013): Phytochemical Screening and
Isolation of Eugenol From Syzigium aromaticum by Gas Chromatography.
Internasional  Journal  of    Reseach  in Phytochemistry and Pharmacology, 3(1) : 74- 77
Carrasco, H., Raimondi, M., Stevaz, L., Liberto, M.  D.,  Rodriguez,  M.  V.,  Espinoza,  L., Madrid,  A.,    and  Zacchino,  S.  (2012): Antifungal  Activity  of  Eugenol  Analogues. Influence  of  Different  Substituents  and Studies  on Mechanism  of  Action.  Molecules. 17: 1002-1024
Cheng,  S.  S.,  Lin,  J.  Y.,  Chang,  E.  H.,  and Chang,  S.  T.  (2008):  Antifungal  activity  of cinnamaldehyde  and  eugenol  congeners against  wood-rot  fungi.  Jounal  Bioresource Technology. 99 : 5145-5149
Cronquist,  A.(1981)  :  An  Integrated  System  of Classification  of  Flowering  Plants.  Columbia University Press. New York
Departemen  Kesehatan  RI.  (1978):  Materia Medika  Indonesia.  Jilid  I-VI.  Jakarta: Departemen Kesehatan RI Fowlis,  Ian  A.,1998.  Gas  Chromatography
Analytical Chemistry by Open Learning. John Wiley  &  Sons  Ltd:  Chichester.  Khalimi,  K and    Suprapta,  D.  N.  (2012):  Anti-Fungal Activities  of  Selected  Tropical  Plants  from Bali  Island.  Phytopharmacology,  2(2):  265- 270
Manik, R. (2009): Uji Efektifitas Daun Cengkeh (Syzygium  aromaticum  L.)  dan  Daun  Serai (Andropogon  nardus  L.)  terhadap  penyakit Antraknosa  (Colletotrichum  capsici  (Syd)
Buttler  and  Bisby)  pada  tanaman  cabai (Capsicum annuum L.) dilapangan.
Universitas Sumatera Utara. Medan Memmou,  F.  and  Mahboub.,  R.  (2012):
Composition  of  Essential  Oil  from  Fresh Flower  of  Clove.  Journal  of  Scientific Research in Pharmacy, 1(2): 33-35
Park, M.J., Gwak, K.S., Yang, I., Choi, W.S., Jo, H. J., Chang, J. W., Jeung, E. B., and Choi, I. G.  (2007):  Antifungal  Activities  of  the Essensial  Oils  in  Syzigium  aromaticum  (L.) Merr.  Et  Perry  and  Leptospermum  petersonii Bailey  and  their  Constituen  against  Various Dermatophytes. The Journal of Microbiologi, 45 (5): 460-465
Rahimi,  A.  A.,  Ashnagar,  A  and  Hamideh,  N.
(2012)  :  Isolation  and  characterization  of  4- allyl-2-methoxyphenol  (eugenol)  from  Clove Buds  Marketed  In  Tehran  City  of  Iran. International Journal  of  ChemTech  Research, 4(1): 105-10 Sastrahidayat, I.R., 1992. Ilmu Penyakit Tumbuhan Usaha nasional Surabaya
Indonsia. Hal 365
Semangun  H.  1994.  Penyakit-penyakit  Tanaman Hortikultura  di  Indonesia.  Gadjah  Mada University Press, Yogyakarta. Hal 556-561
Verma,  R.  K.,  Chaurasia,  L.,  and  Katiyar,  S.
(2007):  Potential  Antifungal  Plants  For Controlling  Building  Fungi.  Natural  Product Radiance, 7(4): 374-387