## ISSN: 0215-7950
*Alamat penulis korespondensi: Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Jalan Kamper, Kampus IPB Dramaga, Bogor, Jawa Barat 16680. Tel: +62251-8629364, Surel: ryuntania@apps.ipb.ac.id

## Volume 19, Nomor 2, Maret 2023
Halaman 45–56 DOI: 10.14692/jfi.19.2.45–56
Keanekaragaman Karakter Galur-Galur Bakteri Penyebab Busuk Hitam ( Xanthomonas campestris pv. campestris ) pada Kubis terhadap Campuran Bahan Aktif Azoksistrobin dan Difenokonazol
Character Diversity of Black Rot Bacterial Strains ( Xanthomonas campestris pv. campestris ) on Cabbage against Mixture of Active Ingredients Azoxystrobin and Diphenoconazole
Af’idzatuttama, Abdjad Asih Nawangsih * , Giyanto Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680

## ABSTRAK
Xanthomonas campestris pv. campestris merupakan bakteri penyebab penyakit busuk hitam ( black rot ) pada kubis. Petani masih mengandalkan pestitida sintetis azoksistrobin dan difenokonazol untuk mengendalikan penyakit pada tanaman kubis yang dikhawatirkan akan berdampak pada keanekaragaman X. campestris pv. campestris . Tujuan penelitian ialah mendapatkan data keanekaragaman secara genetik dan fenotipik isolat bakteri X. campestris pv. campestris , serta mendapatkan data respons resistensi isolat bakteri tersebut terhadap campuran bahan aktif azoksistrobin dan difenokonazol. Penelitian terdiri atas lima tahapan, yaitu (1) pengambilan sampel pada lahan yang terdapat gejala busuk hitam; (2) isolasi bakteri menggunakan teknik penanaman jaringan; (3) seleksi isolat dengan uji sifat Gram, hipersensitif, hidrolisis pati, dan patogenesitas; (4) identifikasi menggunakan primer spesifik dan universal 16S rRNA; dan (5) analisis keanekaragaman genotipe dengan metode RFLP in silico dan keragaman fenotipe dengan mengukur  bobot  eksopolisakarida.  Hasil  karakterisasi  dan  identifikasi  secara  molekuler  diperoleh lima isolat bakteri X. campestris pv. campestris , yaitu CLT01, CDA08, SDA02, SDA22, dan SDA26. Hasil analisis keanekaragaman genotipe menunjukkan bahwa kelima isolat memiliki keanekaragaman berdasarkan pemotongan fragmen DNA gen 16S rRNA, sedangkan keragaman fenotipe ditunjukkan dengan nilai inhibition consentration (IC) yang berbeda-beda. Isolat SDA22 memiliki nilai IC 50 paling tinggi dan keanekaragaman secara genetik yang berbeda dibandingkan dengan  isolat X. campestris pv. campestris lainnya. Penggunaan pestitida sintetis azoksistrobin dan difenokonazol secara terus-menerus dalam jangka waktu lama dikhawatirkan berdampak pada patogen seperti X. campestris pv. campestris. Oleh karena itu, alternatif pengendalian yang lain diperlukan agar tidak terjadi resistensi pada X. campestris pv. campestris . Kata kunci: eksopolisakarida, enzim restriksi, in silico

## ABSTRACT
Xanthomonas campestris pv. campestris is a bacterium that causes black rot on cabbage. Farmers still rely on the synthetic pesticides azoxystrobin and difenoconazole to control diseases in cabbage which are feared to have an impact on the diversity of X. campestris pv. campestris . The objective of the research was to obtain genetic and phenotypic diversity data on X. campestris pv. campestris , as well as obtaining data on the resistance response of these bacterial isolates to a mixture of the active

## PENDAHULUAN
Kubis ( Brassica oleracea var. capitata ) merupakan salah satu komoditas sayuran yang memiliki nilai ekonomi tinggi dan banyak diminati oleh masyarakat. Tanaman kubis banyak dibudidayakan di daerah dengan ketinggian 800-1000 m dpl (BPTP 2019). Salah satu sentra penghasil kubis di daerah Jawa Barat ialah Kabupaten Cianjur dengan total produksi sebesar 13 748.5 ton per tahun dan menempati urutan ketiga setelah Kabupaten Garut (124 377.7 ton) dan Kabupaten Bandung (66 095.8 ton) (BPS Jawa Barat 2021). Petani sayuran di Kecamatan Cipanas, Kabupaten Cianjur, Jawa Barat, masih mengandalkan pengguanan pestisida sintetik untuk mengendalikan organisme pengganggu tanaman (OPT) (Darajat 2014). Gusfi (2002) melaporkan bahwa sebagian besar petani responden (95.5%) tanaman sayuran di daerah Cipanas, Jawa Barat, sangat bergantung pada pestisida kimia untuk mencegah dan mengendalikan serangan OPT. Petani meyakini bahwa penggunaan pestisida dapat menurunkan biaya operasional dan menaikkan produksi tanaman sayuran, terutama kubis. Biaya produksi usaha tani tanaman kubis per hektar per musim tanam di Indonesia paling tinggi digunakan untuk pembelian pupuk dan pestisida, serta upah tenaga kerja. Biaya untuk mengendalikan OPT pada kubis per
hektar sebesar 8.52% atau setara dengan nilai Rp 2 836 700.00 (BPS 2018).
Salah satu penyakit penting pada kubis ialah busuk hitam ( black rot ) yang disebabkan oleh Xanthomonas campestris pv. campestris . Gejala khas penyakit busuk hitam pada kubis ialah lesio berwarna kuning yang berbentuk V. Gejala lesio dimulai dari tepi daun kemudian berubah menjadi klorosis pada tulang daun dan akhirnya membusuk dan menghitam (Vicenta dan Holub 2013). Penyakit busuk hitam dilaporkan dapat menyebabkan kerugian sebesar 61% di Desa Kopeng, Kabupaten Semarang (Nugroho 2012). Pengendalian penyakit di lapang pada tanaman kubis sering menggunakan fungisida. Salah satu fungisida yang diaplikasikan pada tanaman kubis memiliki campuran bahan aktif azoksistrobin dan difenokonazol. Peningkatan penggunaan dosis azoksistrobin dapat menghambat pertumbuhan bakteri organotrofik,  aktinomiset,  dan  cendawan. Penggunaan fungisida yang berbahan aktif azoksistrobin dan difenokonazol pada tanaman kubis secara terus-menerus dikhawatirkan berdampak terhadap bakteri, terutama bakteri patogen (Bacmaga et al . 2015). Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan mendapatkan keanekaragaman secara genetik dan fenotipik isolat bakteri X. campestris pv. campestris serta mendapatkan responsnya terhadap campuran bahan aktif azoksistrobin dan difenokonazol.
ingredients azoxystrobin and difenoconazole. The study consisted of five stages (1) sampling on land with black rot symptoms; (2) isolation of bacteria using tissue implant technique; (3) selection of isolates by testing properties of Gram, hypersensitivity, starch hydrolysis, and pathogenicity; (4) identification using specific and universal 16S rRNA primers; and (5) analysis of genotypic diversity by in silico RFLP method and phenotypic diversity by measuring EPS weight. The results of molecular characterization and  identification  obtained  five  isolates  of X. campestris pv. campestris (CLT01, CDA08, SDA02, SDA22, and SDA26). The results of the analysis of genotypic diversity showed that the five isolates had genetic diversity based on the cutting of the 16S rRNA gene DNA fragment, while phenotypically indicated  different  Inhibition  concentration  (IC)  values.  SDA22  isolate  had  the  highest  IC50  value and different genetic diversity compared to other X. campestris pv. campestris . The use of synthetic pesticides azoxystrobin and difenoconazole continuously for a long time is feared to have an impact on pathogenic microbes such as X. campestris pv. campestris . So that other control alternatives are needed so that there is no resistance to these pathogenic microbes.
Keywords: exopolysaccharide, in silico, restriction enzyme
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Af’idzatuttama et al.

## BAHAN DAN METODE
Pengambilan Sampel dan Isolasi Xanthomonas campestris pv. campestris Sampel daun diambil dari 4 lahan di Kabupaten Cianjur-Jawa Barat, yaitu pada lahan tanaman kubis yang terdapat gejala busuk hitam serta dilakukan pengendalian menggunakan bahan aktif campuran azoksistrobin dan difenokonazol. Sampel diambil dengan teknik purposive sampling dan wawancara dengan petani untuk didapatkan identitas sampel. Identitas sampel di antaranya ialah lokasi pengambilan, varietas tanaman, umur tanaman, dan pengendalian yang digunakan.
Isolasi X. campestris pv. campestris dilakukan dengan metode penanaman jaringan tanaman mengikuti Panjaitan et al. (2014). Isolasi dilakukan pada medium yeast dextrose carbonat agar (YDCA) dan nutrient agar (NA).
Seleksi Bakteri X. campestris pv. campestris Uji Gram. Uji Gram dilakukan menggunakan metode KOH 3%. Sebanyak 1 lup bakteri dicampurkan dan diaduk dengan larutan KOH 3% yang sudah diteteskan pada kaca preparat (Schaad et al. 2001).
Uji Hidrolisis Pati. Uji hidrolisis pati menggunakan medium starch hydrolisis yang terdiri atas pepton, beef extract , agar, dan starch ( soluble potato ) (Schaad et al. 2001).
Uji Hipersensitivitas. Sebanyak 1 lup isolat bakteri ditumbuhkan pada medium nutrient broth (NB) selama 24 jam. Suspensi bakteri diambil sebanyak 1 mL, kemudian diinfiltrasikan  pada  bagian  bawah  daun tembakau menggunakan jarum syringe . Isolat yang menghasilkan gejala nekrotik (hasil uji positif) digunakan untuk uju lanjut.
Uji Patogenisitas. Isolat bakteri ditumbuhkan pada medium NB selama 24 jam. Inokulasi bakteri dilakukan dengan cara clip- method, yakni menggunting atau memotong pinggir daun kubis sekitar 5 cm dengan gunting yang telah dicelupkan dalam suspensi bakteri X. campestris pv. campestris (Parida 2016).  Isolat yang menimbulkan gejala pada daun kubis setelah 7 hari inokulasi digunakan untuk pengujian selanjutnya.
Identifikasi X. campestris pv. campestris secara Molekuler Identifikasi  bakteri  dilakukan  dengan teknik PCR yang diawali dengan ektrasi DNA. Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan metode Sambrook dan Russel (2001). Selanjutnya amplifikasi  fragmen  DNA  dilakukan menggunakan mesin PCR GeneAmp PCR system 9700 dengan sepasang primer spesifik bakteri X. campestris pv. campestris dan primer  universal  16S  rRNA.  Primer  spesifik yang digunakan yaitu (BE1 dan BE2) F (5’-CCGTAGCACTTAGTGCAATG-3’) dan R(5’-GCATTTCCATCGGTCACGATTG - 3’) (Berg et al . 2006), sedangkan primer universal yaitu 16S rRNA bakteri 27F (5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) dan 1492R (5’ACCTTGTTAGGACTT-3’). Proses PCR menggunakan primer spesifik berlangsung sebayak 30 siklus dengan target DNA berukuran ± 619 pb. Proses PCR terdiri atas  pre-denaturasi  pada  94  ℃  selama  5 menit, denaturasi pada 94 ℃ selama 15 detik, annealing pada  suhu  58  ℃  selama  1  menit, ekstensi  awal  pada  suhu  72  ℃  selama  15 detik, dan ekstensi akhir berlangsung selama 10 menit pada suhu 72 ℃. Total volume PCR yang digunakan sebanyak 50 μ L terdiri atas 4 μ L primer 16S (F dan R), 25 μ L master mix (MyMaq HS Red Mix 2x), 2 μ L DNA templat, dan 19 μ L ddH2O. Proses PCR menggunakan primer universal berlangsung sebanyak 35 sikus  yang  terdiri  atas  pre-denaturasi  95  ℃ selama 5 menit, denaturasi 95 ℃ selama 30 detik, annealing 55 ℃ selama 30 detik, ekstensi 72 ℃ selama 1 menit, dan ekstensi akhir 72 ℃ selama 10 menit (Frank et al. 2008).
Hasil  amplifikasi  DNA  dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% pada tegangan 50 volt selama 50 menit. Pita DNA yang tervisualisasi didokumentasikan.
Analisis Keanekaragaman Genotipe X. campestris pv. campestris Hasil  amplifikasi  pada  identifikasi molekuler digunakan untuk sekuensing nukleotida. Sekuensing perunutan basa nukleotida menggunakan gen 16S rRNA untuk analisis keragaman genotipe. Analisis
keragaman genotipe menggunakan dua metode, yaitu analisis filogenetika dan in silico. Analisis Filogenetik Sikuen Gen 16S rRNA. Hasil sekuensing perunutan basa nukleotida gen 16S rRNA kemudian dibuat pohon filogeni menggunakan aplikasi MEGA X dengan metode neighbour joining tree. Sebagai pembanding, diambil sikuen gen 16S rRNA X. campestris pv. campestris dari negara China, Serbia, Mexico, dan India. Sebagai outgrup, digunakan sikuen dari gen 16S rRNA Agrobacterium tumefaciens . Sikuen gen diambil dari data yang terdeposit dalam GenBank.
Analisis RFLP in Silico . Hasil perunutan nukleotida gen 16S rRNA digunakan untuk analisis keanekaragaman genetik secara in silico . Keanekaragaman genetik didasarkan pada situs pemotongan menggunakan enzim restriksi pada software pDraw 32. Enzim restriksi yang digunakan ialah AciI, AluI, DdeI, EcoRI, dan RsaI . Hasil pemotongan enzim restriksi digunakan untuk menentukan pengelompokan isolat X. campestris pv. campestris dengan metode nearest neighbour menggunakan program multivariate statistical package (MVSP).
Pengujian Toksisitas Campuran Azoksitrobin dan Difenokonazol terhadap Bakteri X. campestris pv. campestris Fungisida yang digunakan ialah AmistarTop (azoksitrobin 200 g L -1 + difenokonazol 125 g L -1 ) sesuai dosis anjuran, yaitu 1 mL L -1 (X). Pengujian dilakukan pada medium YDCA yang telah dicampur fungisida uji sesuai konsentrasi perlakuan (X, ¼X, ½X, ¾X, 3 / 2 X, 2X). Perlakuan kontrol ialah medium YDCA tanpa fungisida. X. campestris pv. campestris dibuat suspensi dalam medium NB hingga mencapai kerapatan 10 7 cfu mL -1 . Selanjutnya sebanyak 1 mL suspensi disebar pada medium YDCA sesuai perlakuan dan diinkubasi selama 72 jam. Koloni bakteri yang tumbuh kemudian dihitung populasi dan persen penghambatannya. Persen penghambatan (PP) dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
PP  (%) = PB perlakuan –PB kontrol
PB kontrol
× 100%, dengan PP, persen penghambatan dan PB, populasi bakteri. Hasil perhitungan persen penghambatan kemudian diolah menggunakan software POLO PC untuk menentukan nilai IC 50 , IC 90 , dan IC 95 .
Uji Produksi Eksopolisakarida (EPS) Isolat bakteri X. campestris pv. campestris hasil karakterisasi dianalisis secara fenotipik kandungan EPSnya menggunakan metode Putrie  (2013)  dengan  modifikasi.    Sebanyak 1 lup bakteri dimasukkan ke dalam 10 mL medium PSB dan diinkubasi pada inkubator bergoyang selama 24 dan 48 jam. Suspensi bakteri sebanyak 1 mL dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 mL, kemudian disentrifugasi pada suhu 4 ℃ dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit. Dalam tabung mikro yang baru, sebanyak 950 µL supernatan dicampur etanol 96% dingin sebanyak 2× volume supernatan dan didiamkan selama 24 jam. Supernatan disentrifugasi kembali pada suhu 4  ℃  dengan  kecepatan  10  000  rpm  selama 15 menit. Pelet yang terbentuk dikeringkan dalam oven (55 ℃)  dan  ditimbang  bobot kering EPS-nya. Bobot senyawa EPS total yang mengendap di dasar tabung dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Bobot EPS = Bobot EPS dalam tabung – Bobot tabung

## HASIL
Gejala, Intensitas, dan Pengendalian Penyakit Busuk Hitam di Lapangan Gejala penyakit busuk hitam pada daun kubis ditandai dengan nekrosis yang dimulai dari pinggir daun dan menyebar ke tengah mengikuti arah vena daun (Gambar 1). Selain itu terdapat lesio kuning yang berbentuk seperti huruf  V pada daun sakit. Hasil pengamatan intensitas penyakit busuk hitam di beberapa lokasi di daerah Cianjur menunjukkan bahwa penyakit ini masih menjadi kendala utama bagi petani. Lahan kubis ditanam secara monokultur dan
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Af’idzatuttama et al. tumpangsari dengan bawang daun. Kondisi lahan di sekitar tanaman kubis banyak ditumbuhi gulma. Lahan yang ditumbuhi gulma lebih banyak mengalami gejala yang lebih berat. Hal ini dikarenakan kondisi lahan lebih lembab sehingga gejala cepat berkembang dan menyebar. Petani menggunakan fungisida yang memiliki bahan aktif campuran azoksistrobin dan difenokonazol untuk mengendalikan penyakit. Campuran bahan aktif azoksistrobin dan difenokonazol diaplikasikan petani pada semua lahan lokasi pengambilan sampel. Rata-rata petani mengaplikasikan bahan aktif ini dengan intensitas 2–3 kali dalam seminggu. Selain bahan aktif azoksistrobin
dan difenokonazol, bahan aktif lain yang diaplikasikan petani, yaitu asibenzolar s-metil dan mankozeb, piraklostrobin, propinep, dan mankozeb (Tabel 1).
Karakteristik Isolat Bakteri Xanthomonas campestris pv. campestris Hasil isolasi pada 3 lokasi pengambilan sampel didapatkan 62 isolat. Hasil isolasi tersebut terdiri atas 9 isolat CLT, 17 isolat CDA, 36 isolat SDA. Isolat yang tumbuh pada medium YDCA dan NA memiliki koloni berwarna kuning.
Sebanyak 62 isolat diseleksi dengan uji sifat Gram dan didapatkan 24 isolat bersifat Gram negatif. Bakteri Gram negatif dicirikan dengan terbentuknya lendir ketika diangkat menggunakan jarum ose. Berdasarkan uji hidrolisis sebanyak 15 isolat bakteri berhasil membentuk zona bening di sekitar koloni. Reaksi hipersensitif positif ditandai dengan terbentuknya gejala nekrosis pada daun tembakau setelah disuntik dengan isolat bakteri X. campestris pv. campestris (Gambar 2a). Hasil uji patogenesitas menunjukkan bahwa 15 isolat dapat menimbulkan gejala nekrosis daun kubis setelah 7 hari inokulasi (Gambar 2b).
Amplifikasi  DNA X. campestris pv. campestris menggunakan primer spesifik BE 1
Tabel 1  Identitas lokasi sampel daun kubis yang bergejala busuk hitam dan asal isolat Xanthomonas campestris pv. campestris Lokasi Varietas Umur tanaman (bulan) Pengendalian Kode isolat Desa Ciloto, Kec. Cipanas, Cianjur Gutji 2 - Azoksistrobin & Difenokonazol CLT01 Desa Cipendewa, Kec. Pacet, Cianjur Polaris 2.5 - Azoksistrobin & Difenokonazol - Asibenzolar s-metil & Mankozeb - Difenokonazol - Mankozeb CDA08 Desa Sindangjaya, Kec. Cipanas, Cianjur Polaris 3 - Azoksistrobin & Difenokonazol - Propinep - Mankozeb SDA02 Desa Sindangjaya, Kec. Cipanas, Cianjur Polaris 3 - Azoksistrobin & Difenokonazol - Propinep - Mankozeb SDA22 Desa Sindangjaya, Kec. Cipanas, Cianjur Polaris 3 - Azoksistrobin & Difenokonazol - Propinep - Mankozeb SDA26
Gambar 1  Gejala busuk hitam pada daun kubis di lokasi pengambilan sampel daerah Cianjur. Jawa Barat.
dan BE 2 menunjukkan bahwa terdapat lima  isolat  bakteri  yang  teramplifikasi,  yaitu CLT01, CDA08, SDA02, SDA22, dan SDA26 (Gambar 3). Sebanyak lima isolat bakteri X. campestris pv. campestris bersifat Gram negatif, patogen terhadap tanaman, dan hidrolisis positif pada medium yang mengandung pati (Tabel 2). Bakteri X. campestris pv. campestris pada medium YDCA memiliki koloni berwarna kuning, mengkilap, elevasi cembung, mucoid (berlendir), dan tepian licin (Gambar 4).
Analisis Sikuen dan Filogenetika X. campestris pv . campestris
Urutan basa nukleotida hasil sekuensing yang diperoleh kemudian disejajarkan pada data GeneBank menggunakan program BLAST pada situs NCBI. Hasil penyejajaran didapatkan 5 isolat yang teridenfikasi sebagai X. campestris pv. campestris . Isolat X. campestris pv. campestris memiliki kedekatan dengan isolat X. campestris pv. campestris dari negara India, China, Serbia, dan Mexico. Homologi lima isolat X. campestris pv. campestris tersebut memiliki kemiripan lebih dari 99% (Tabel 3).
Analisis  filogenetika  dengan neighbour joining tree menggambarkan kekerabatan isolat X. campestris pv. campestris yang didapatkan dengan isolat dari negara lain. Isolat CLT01, SDA02, dan SDA22 berkerabat
dekat dengan X. campestris pv. campestris dari China, sedangkan isolat SDA26 dan CDA08 berkerabat dekat dengan X. campestris pv. campestris dari Serbia (Gambar 5).
Analisis Keanekaragaman dengan RFLP in Silico Bakteri dikelompokkan menjadi 3 kelompok berdasarkan profil terhadap situs pemotongan 5 enzim menggunakan program MVSP dengan metode nearest neighbour . Berdasarkan situs pemotongan menggunakan enzim restriksi, sebanyak 5 isolat bakteri X. campestris pv. campestris dan 4 spesies pembanding yang diambil dari GenBank dikelompokkan menjadi 5 kelompok. Kelompok tersebut adalah kelompok 1 (CLT01), kelompok 2 (SDA22), kelompok 3 (CDA08, SDA26, SDA02), kelompok 4 ( X. campestris pv. campestris Serbia dan China), dan kelompok 5 ( X. campestris pv. campestris Mexico dan India) (Gambar 6). Hasil pengelompokan menggunakan MVSP tidak berbeda jauh jika dibandingkan dengan analisis neighbour joining tree berdasarkan sikuen gen 16S rRNA. Semua isolat saling memiliki kedekatan meskipun dengan pengelompokan yang berbeda, karena isolat masih dalam satu cabang. Hasil pemotongan enzim enzim AluI, AciI, DdeI, EcoRI, dan RsaI dari sikuen gen 16S rRNA ditampilkan pada (Gambar 7).
Gambar 2  Pengujian isolat bakteri Xanthomonas campestris pv. campestris. a, Nekrosis daun tembakau pada uji hipersensitivitas dan b, Nekrosis daun kubis pada uji patogenesitas.
a b
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Tabel 2  Sifat patogenesitas, hipersensitivitas (HR), hidrolisis pati, sifat Gram, dan hasil amplifikasi DNA isolat bakteri Xanthomonas campestris pv. campestris
Kode isolat Asal isolat Uji patogenesitas Uji HR Uji hidrolisis pati Uji Gram PCR CLT01 Ciloto + + + negatif + CDA08 Cipendewa + + + negatif + SDA02 Sindangjaya + + + negatif + SDA22 Sindangjaya + + + negatif + SDA26 Sindangjaya + + + negatif +
Gambar 4  Karakteristik koloni isolat Xanthomonas campestris pv. campestris asal tanaman kubis pada medium yeast dextrose carbonat agar . a, Gores kuadran dan b, Koloni tunggal isolat.
a b
Gambar 3  Visualisasi fragmen DNA Xanthomonas campestris pv. campestris penyebab busuk hitam pada kubis menggunakan primer spesifik BE 1 dan BE 2. M, Marker 100 pb; 1, Isolat CLT01;  2, Isolat CDA08; 3, Isolat SDA02; 4, Isolat CDA22; dan 5, Isolat CDA26.
M 1 2 3 4 5 619 pb 500 pb
Toksisitas Bahan Aktif Fungisida pada Isolat Bakteri X. campestris pv. campestris Nilai IC 50 senyawa kimia campuran aktif azoksistrobin dan difenokonazol terhadap isolat-isolat X. campestris pv. campestris beragam (Tabel 4).  Isolat SDA22 memiliki nilai IC 50 yang paling tinggi dan melebihi dari konsentrasi anjuran, sedangkan isolat CLT01, CDA08, SDA02, dan SDA26 memiliki nilai IC 50 kurang dari konsentrasi
anjuran. Isolat SDA22 memiliki nilai IC 50 sebesar 2.67, nilai 2.67 menandakan bahwa untuk membunuh sebesar 50% dari populasi bakteri X. campestris pv. campestris di lapang diperlukan sebanyak 2.67 mL L -1 bahan aktif. Nilai 2.67 mL L -1 termasuk tinggi karena konsentrasi tersebut sudah melebihi dari konsentrasi anjuran. Konsentrasi anjuran pada label produk sebesar 1 mL L -1 (Tabel 4). Nilai IC 50 yang tinggi ini diindikasikan bahwa
Gambar 5   Kontruksi pohon filogenetika Xanthomonas campestris pv. campestris asal Cianjur, Jawa Barat dan isolat negara lain dengan metode neighbour joining tree.
X. campestris pv. campestris Mexico
X. campestris pv. campestris India X. campestris pv. campestris Serbia X. campestris pv. campestris Cina Isolat SDA02 Isolat SDA26 Isolat CDA08 Isolat SDA22 Isolat CLT01 Agrobacterium tumefaciens 56 42 41 39 39 48 41
Gambar 6  Pengelompokan isolat Xanthomonas campestris pv. campestris asal Cianjur, Jawa Barat berdasarkan situs pemotongan enzim AluI. AciI. DdeI. EcoRI. RsaI dari sikuen gen 16S rRNA dengan metode nearest neighbour menggunakan MVSP.
X. campestris Mexico
X. campestris India
X. campestris Serbia
X. campestris Cina SDA02
SDA26 CDA08 SDA22 CLT01 Nearest neighbour Simple matching coefficient 0.76 0.80 0.84 0.88
0.92 0.96 1.00
Tabel 3   Hasil analisis homologi urutan nukleotida gen 16S rRNA isolat bakteri dengan database nukleotida di GenBank
Kode isolat No aksesi Asal negara Query cover (%) Spesies Homologi (%) CLT01 MG597200.1 India 100 X. campestris galur MSSRF 98.93 CDA08 KP182149.1 China 100 X. campestris pv. campestris galur SHC-1 99.82 SDA02 MN565572.1 Serbia 100 X. campestris pv. campestris galur KS-42 100.00 SDA22 MT645261.1 Mexico 100 X. campestris pv. campestris galur Xcf2-APJR 99.84 SDA26 MN565571.1 Serbia 100 X. campestris pv. campestris galur KLj-1 99.67
Jurnal Fitopatologi Indonesia
isolat SDA22 sudah mulai tahan atau resisten terhadap bahan aktif tersebut. Berdasarkan informasi dari lahan pengambilan sampel, intensitas penyemprotan bahan aktif di lahan tersebut dilakukan sebanyak 2–3 kali selama seminggu. Jika petani merasa tidak memberikan dampak terhadap gejala penyakit yang ada, konsentrasi penyemprotan bahan aktif sering dinaikkan dari konsentrasi anjuran. Dampak dari perlakuan petani di lapang seperti ini dapat memengaruhi habitat bakteri X. campestris pv. campestris.
Produksi Senyawa Eksopolisakarida Rata-rata bobot EPS yang dihasilkan bakteri X. campestris pv. campestris selama 24 dan 48 jam inkubasi mengalami kenaikan, kecuali isolat SDA26 (Gambar 8). Rata-rata bobot EPS yang berbeda-beda antarisolat ini diperkirakan dipengaruhi oleh tingkat virulensi masing-masing isolat. Senyawa EPS paling banyak dihasilkan oleh isolat CDA08 sedangkan paling sedikit isolat SDA22.

## PEMBAHASAN
Busuk hitam pada daun kubis di daerah Cianjur, Jawa Barat yang disebabkan oleh bakteri X. campestris pv. campestris merupakan masalah endemik dan menjadi kendala utama pada budi daya kubis. Petani kubis di di Kabupaten Cianjur biasa mengendalikan penyakit menggunakan fungisida berbahan aktif campuran azoksistrobin dan difenokonazol. Bahan aktif azoksistrobin dan difenokonazol merupakan fungisida sistemik yang bersifat proteksi, kuratif, dan preventif serta sebagai zat pengatur tumbuh untuk tanaman kubis. Patogen lain yang dapat dikendalikan dengan bahan aktif ini ialah Plasmodiophora brassicae , penyebab akar gada (Ditjen PSP 2016). Bartlet et al . (2001) melaporkan bahwa azoksistrobin termasuk  fungisida sistemik yang memiliki spektrum luas untuk mengendalikan penyakit yang disebabkan oleh cendawan Ascomycota , Deuteromycota ,
Gambar 7  Visualisasi elektroforesis pemotongan fragmen DNA X. campestris pv. campestris asal Cianjur, Jawa Barat menggunakan 5 enzim restriksi.
SDA02 SDA26 CDA08 SDA22 CLT01 M AciI AluI DdeI EcoR1 RsaI Keterangan:
Tabel 4  Nilai IC 50 , IC 90, dan IC 95 campuran bahan aktif azoksistrobin dan difenokonazol terhadap Xanthomonas campestris pv. campestris
Kode isolat a ± GB a b ± GB b Inhibition concentration (ml L -1 ) IC 50
IC 90 IC 95 CLT01 0.195 ±0.058 2.188 ± 0.198 0.814 3.138 4.600 CDA08 1.474 ± 0.112 0.934 ± 0.334 0.027 5.929 37.353 SDA02 0.179 ± 0.090 2.288 ± 0.305 0.836 7.630 16.186 SDA22 -0.654 ± 0.059 1.571 ± 0.221 2.607 17.060 29.059 SDA26 2.483 ± 0.173 2.133 ± 0.449 0.069 0.734 1.644
Keterangan: a, intersep regresi probit; b, kemiringan garis regresi probit;  dan GB, galat baku.
Basidiomycota , dan Oomycota . Sedangkan difenokonazol merupakan senyawa yang sering digunakan sebagai fungisida untuk mengendalikan penyakit pada tanaman sayur- sayuran seperti busuk akar, embun tepung, dan kudis (EPA 2021).  Hasil penelitian menunjukkan bahwa campuran senyawa kimia azoksistrobin dan difenokonazol tidak hanya dapat mengendalikan patogen dari kelompok cendawan, tetapi juga berpengaruh terhadap bakteri X. campestris pv. campestris di Kabupaten Cianjur.
Hasil identifikasi secara molekur terhadap isolat-isolat bakteri patogen dari pertanaman kubis yang menunjukkan bercak hawar daun khas X. campestris pv. campestris di 3 lokasi pertanaman sayuran di Kabupaten Cianjur telah mengonfirmasi  keberadaannya  di  lapangan. Hal ini menunjukkan bahwa X. campestris pv. campestris telah endemik. Bakteri ini memiliki pertumbuhan yang optimal pada suhu 25–27 ℃ pada medium NA dan YDCA dengan koloni berwarna kuning dan mengkilap, serta bersifat Gram negatif (Naqvi et al. 2013). Bakteri Gram negatif memiliki dinding sel yang tipis sehingga ketika dilarutkan dengan larutan KOH 3% akan lisis terbentuk lendir (Wanger et al . 2017). Gejala nekrosis pada daun tembakau merupakan usaha tanaman untuk menghambat pertumbuhan mikrob yang bersifat patogen (Zhue et al . 2000).
Hasil analisis secara molekuler menggunakan  primer  spesifik  didapatkan sebanyak lima isolat yang mampu teramplifikasi  pada  ukuran  619  pb.  Hal  ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Berg et al .  (2006)  yang  melakukan  uji  konfirmasi terhadap gen hrpF dari X. campestris pv. campestris. Bakteri  hasil  identifikasi  secara molekuler kemudian diamati karakter morfologinya berwarna kuning terang, mengkilap, elevasi cembung, dan tepian licin. Sedangkan hasil analisis menggunakan primer universal terkonfirmasi 5 isolat sebagai bakteri X. campestris pv. campestris . Berdasarkan FRAC (2018), azoksistrobin bekerja dengan cara menghambat respirasi di mitokondria yang mengganggu sitrokrom pada kompleks bc1. Hasil penelitian ini melaporkan azoksistrobin dapat menghambat proses respirasi bakteri yang ditunjukkan dengan nilai IC 50 isolat SDA22 yang tinggi dibandingkan dengan isolat lainnya. Wang et al . (2018) melaporkan bahwa azoksistrobin yang diaplikasikan di tanah dapat menghambat populasi bakteri, aktinomiset, aktivitas dehidrogenase, dan proses respirasi mikroba pada tanah. Peningkatan penggunaan dosis azoksistrobin dapat menghambat pertumbuhan bakteri  organotrofik,  aktinomiset,  dan cendawan (Bacmaga et al . 2015).
Gambar  8  Bobot eksopolisakaraida (EPS) beberapa isolat Xanthomonas campestris pv. campestris asal tanaman kubis di Cianjur, Jawa Barat pada medium PSB selama 24 ( ) dan 48 ( ) jam inkubasi. Rata-rata bobot EPS (mg mL -1 ) Jenis isolat
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Af’idzatuttama et al.
Ozturk dan Aslin (2010) menyatakan bahwa EPS diproduksi oleh bakteri untuk melindungi sel bakteri dari cekaman biotik dan abiotik. Bobot EPS paling tinggi dihasilkan oleh bakteri X. campestris pv. campestris isolat CDA08 dan paling rendah isolat SDA22. Berdasarkan identitas pengambilan sampel, isolat CDA08 dan SDA22 berada pada lokasi yang berbeda. Isolat CDA08 dilakukan penyemprotan bahan aktif campuran azoksistrobin dan difenokonazol sebanyak 2.5 kali setiap bulan, sedangkan isolat SDA22 sebanyak 3 kali. Intensitas penyemprotan bahan aktif dapat memengaruhi produksi EPS dari bakteri X. campestris pv. campestris. Bobot EPS berbanding terbalik dengan nilai IC . Isolat SDA22 memiliki nilai IC 50 tinggi, tetapi menghasilkan senyawa EPS yang rendah. Hal ini diduga  karena X. campestris pv. campestris sudah lama beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang mengandung bahan aktif lebih tinggi sehingga X. campestris pv. campestris tidak memerlukan perlindungan berupa eksopolisakarida untuk mengatasi kondisi lingkungan yang mencekam.
Hasil pengujian dengan campuran azooksistrobin dan difenokonazol terhadap lima isolat X. campestris pv. campestris memiliki pola keanekaragaman fenotipik yang ditunjukkan dengan nilai IC 50 yang berbeda-beda. Hal ini ditunjukkan juga pada teknik RFLP in silico berdasarkan gen 16S rRNA . Lima isolat X. campestris pv. campestris tersebut memiliki tingkat resistensi terhadap campuran dua bahan aktif tersebut, yang ditunjukkan pada nilai IC 50 . Isolat yang memiliki nilai  IC 50 tinggi ialah isolat SDA22, sedangkan nilai  IC 50 rendah ialah isolat CDA08. Penggunaan campuran bahan aktif azoksistrobin dan difenokonazol dalam budi daya tanaman kubis berpegaruh terhadap keragaman fenotipe dan genotipe X. campestris pv. campestris . Oleh karena itu, pembatasan penggunaan pestisida kimia dan alternatif metode pengendalian yang lain perlu dibatasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Bacmaga M, Kucharski J, Wyszkowska J. 2015. Microbial and enzymatic aztivity of soil contaminatedwith azoxystrobin. Enviromental Monitoring and Assesment. 187:615–630. DOI: https://doi. org/10.1007/s10661-015-4827-5.
Bartlet DW, Clough JM, Godfrey CRA, Godwin JR, Hall AA, Heaney SP, Maund SJ.2001. Understanding the strobilurin fungicides. Pesticide Outlook . 12(4):143– 148. DOI: https://doi.org/10.1039/ b106300f.
Berg T, Tesoriero L, Hailstones DL. 2006. A multiple realtime PCR assay for detection of Xanthomonas campestris from brassicas. Letters in Applied Microbiology . 42(6):624–630. DOI: https://doi. org/10.1111/j.1472-765X.2006.01887.x.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2018. Struktur Ongkos Usaha Tanaman Kubis Per Hektar Per Musim Tanam di Indonesia. https:// www.bps.go.id [diakses 03 Nov 2022].
[BPS Jawa Barat] Badan Pusat Statistik Provinsi Jawa Barat. 2021. Provinsi Jawa Barat dalam angka 2021. https://jabar.bps. go.id [diakses 03 Nov 2022].
[BPTP] Balai Pengkajian Teknologi Pertanian. 2019. Teknologi Budidaya Kubis ( Brassica oleracea L.) Dataran Rendah. http://repository.pertanian.go.id [diakses 28 September 2022].
[DITJEN PSP] Direktorat Jenderal Prasarana dan Sarana Pertanian. 2016. Pestisida Pertanian dan Kehutanan .  https://psp. pertanian.go.id [diakses 20 September 2022].
Darajat YM. 2014. Perbandingan pola penggunaan pestisida pada petani sayuran dan petani tanaman hias di Kecamatan Cipanas, Kabupaten Cianjur [skripsi]. Bogor (ID): IPB University.
[EPA] Environmental Protection Agency.
2021. Center for Food Safety . Washington
DC: Office of Pesticide Programs. [FRAC] Fungicide Resistance Action Committe. 2018. FRAC Code List©*2018: Fungicides sorted by mode of action (including FRAC Codenum bering. http: //www.frac.info/docs/default-source/ publications/fr [diakses 15 Sept 2022]. Frank JA, Reich CI, Sharma S, Weisbaun JS, Wilson BA, Olsen GJ. 2008. Critical evaluation of two primers commonly used  for  amplification  ofbacterial  16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology Journal. 74(8):2461–2470. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.02272- 07.
Gusfi  V.  2002.  Persepsi  petani  sayuran  di Cipanas terhadap insektisida sintetis dan botani [skripsi]. Bogor (ID): IPB University.
Naqvi SF, Ul-Haq MI, Khan MA, Tahir MI, Ali Z, Rehman HM. 2013. Morphological and biochemical characterization of Xanthomonas campestris (pammel)
Dawson pv. sesami and it’s management by bacterial antagonists. Pakistan Journal of Agricultural Research. 50(2):229–235. Nugroho A. 2012. Eksplorasi bakteriofage virulen terhadap Xanthomonas campestris pv. campestris asal Kopeng untuk mengendalikan busuk hitam kubis [skripsi]. Surakarta (ID): Universitas Sebelas Maret.
Ozturk  S,  Aslim  B.  2010.  Modification  of exopolysaccharide composition and production by three cyanobacterial isolates under salt stress. Environmental Science and Pollution Research . 17:595–602. DOI: https://doi.org/10.1007/s11356-009-0233-2. Panjaitan D, Suada I, Sritamin M. 2014. Uji keefektifan ekstrak beberapa biji tanaman untuk menghambat pertumbuhan bakteri bercak daun ( Xanthomonas campestris) pada tanaman tomat . Agroekoteknologi Tropika. 3(2):89–96.
Parida I, Damayanti TA, Giyanto. 2016.
Isolasi,  seleksi,  dan  identifikasi  bakteri
endofit  sebagai  agens  penginduksi ketahanan tanaman padi terhadap penyakit hawar daun bakteri. Jurnal Fitopatologi Indonesia. 12(6):199–208. DOI: https:// doi.org/10.14692/jfi.12.6.199.
Putrie RFA, Wahyudi AT, Nawangsih AA, Husen E. 2013. Screening of rhizobacteria for plant growth promotion and their tolerance to drought stress. Microbiology Indonesia. 25;7(3):94–104. DOI: https:// doi.org/10.5454/mi.7.3.2.
Schaad NW, Jones JB, Chun W. 2001. Laboratory  Guide  for  Identification  of Plant Pathogenic Bacteria . Ed ke-3. St. Paul (MN): American Phytopatological Society.
Sambrook J, Russell D. 2001. Moleculer Cloning: A Laboratory Manual . New York (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. Vicenta JG, Holub EB. 2013. Xanthomonas campestris pv. campestris (cause of black rot of crucifers) in the genomic era is still a worldwide threat to brassica crops. Moleculer Plant Pathology. 14(1):2–18. DOI:  https://doi.org/10.1111/j.1364- 3703.2012.00833.x.
Wang F, Li X, Zhu L, Du Z, Zhang C, Wang J, Lv D. 2018. Responses of soil microorganisms and enzymatic activities to azoxystrobin in Cambisol. Journal Environmental Study. 27(6):2775–2783. DOI: https://doi. org/10.15244/pjoes/81086.
Wanger A, Chavez V, Huang RSP, Wahed A, Actor JK, Dasgupta A. 2017. Microbiology and Molecular Diagnosis in Pathology . Texas (US): Elsevier.
Zhue Y, Damicone JP, Demezas DH, Bender CL. 2000. Bacterial leaf spot diseases of leafy crucifers in Oklahoma caused by pathovars of Xanthomonas campestris . Plant Disease . 84:1008–1014. DOI: https:// doi.org/10.1094/PDIS.2000.84.9.1008.