Konstruksi Mutan Pseudomonas sp. untuk Meningkatkan Produksi Indole Acetic Acid (IAA) melalui Mutagenesis dengan Transposon

## Aris Tri Wahyudi, Mutiha Panjaitan, dan Nisa Rachmania
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor

## Abstract
Pseudomonas sp. is one of bacterial groups having ability to promote plant growth and health. Of a hundred successfully isolated Pseudomonas sp. from soybean rhyzosphere, 98 were found to produce indole acetic acid (IAA) ranging from 0.33 to 16.02 ppm. These isolates are bacilli, motile, Gram negative, and showing positive oxidase assay. One of them, i.e. Pseudomonas sp. CRB17, can promote plant growth by means of significant stimulation of primary root length and lateral root number. This isolate was then subject to mutagenesis   using   transposon   Mini-Tn5Km1   to   increase   IAA   production.   Mutagenesis   was   done   by conjugation between E coli S17-1 (  pir) carrying transposon mini-Tn5Km1 (donor) and Pseudomonas sp. (recipient),  resulting  in   conjugation  frequency   of  approximately  3.1  x  10 -5 cell  per   recipient. The  resulted CRB17 mutants were then tested for their ability to produce IAA, one of which showed an increment of IAA production up to 77.5%, while some others showed no significant change or even had a reduction to 55.3%. Sequence analyisis of 16S rRNA gene of Pseudomonas sp. CRB17 indicated that it has a high homology with that of Pseudomonas plecoglossicida (identical value of 99%). The results recommends that mutagenesis using transposon can be applied to increase IAA production, especially in Pseudomonas sp. CRB17.
Key words : Pseudomonas sp., transposon mutagenesis, IAA, plant growth stimulation

## Pendahuluan
Usaha   ekstensifikasi   dan   intensifikasi   pertanian   yang   kian   digalakkan   untuk mencapai   swasembada   pangan   berimplikasi   terhadap   penggunaan   pupuk   kimia   yang terus   meningkat.   Residu   pupuk   kimia   diketahui   dapat   mencemari   perairan   dan menimbulkan   eutrofikasi.   Teknologi   berwawasan   lingkungan   yang   dapat   meningkatkan efektivitas  penggunaan  pupuk kimia menjadi penting untuk  dikembangkan.   Salah  satu produk teknologi alternatif yang ramah lingkungan ialah dengan menggunakan mikroba sebagai pupuk hayati.
Bakteri tanah dapat hidup bebas di daerah rizosfer yang menguntungkan dan telah menunjukkan   kemampuan   untuk   memperbaiki   kesehatan   atau   meningkatkan   hasil tanaman. Kelompok bakteri ini disebut plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) (Dey et al. ,  2004). Mekanisme pemacuan pertumbuhan tanaman yang dilakukan oleh PGPR ialah   melalui   penambatan   nitrogen,   produksi   antibiotik,   produksi   siderofor,   pelarutan fosfat, dan produksi zat pengatur tumbuh tanaman (Kapulnik dan Okon, 2002). Beberapa PGPR mampu menghasilkan zat pengatur tumbuh seperti auksin, giberelin, dan sitokinin (Dey et al. , 2004).
Salah   satu   genus   PGPR   yang   banyak   diteliti   karena   kemampuannya   dalam menghasilkan  auksin  ialah Pseudomonas . Sebagai contoh, Pseudomonas  putida telah diketahui   mampu   menghasilkan   berbagai   zat   pemacu   tumbuh,   termasuk   auksin   dan giberelin, siderofor, asam organik dan antibiotik (Premono dan Widyastuti, 1996, Patten dan Glick, 2002).
Asam indol asetat ( indole acetic acid , IAA) adalah auksin yang paling aktif pada berbagai tanaman dan berperan penting dalam pemacuan pertumbuhan, seperti inisiasi akar,   pembesaran   sel,   diferensiasi   pembuluh,   dan   pemacuan   pembungaan.   Tanaman kurang   mampu   menghasilkan   IAA   yang   cukup   untuk   pertumbuhan   yang   optimal. Sementara itu, sejumlah bakteri telah diidentifikasi mampu menyintesis IAA pada biakan murni dan di tanah (Husen dan Saraswati, 2003). Pseudomonas putida GR12-2 penghasil auksin   berupa   asam   indol   asetat   telah   diketahui   mampu   memacu   perpanjangan   akar primer dan pembentukan akar lateral (Patten dan Glick, 2002).
Berbagai   jalur   sintesis   IAA   digunakan   oleh   prokariot.   Suatu   galur   bakteri   dapat menggunakan lebih dari satu jalur dalam biosintesis IAA. Jalur-jalur ini dikelompokkan berdasarkan jenis intermediatnya, yaitu jalur indol asetamida (IAM), asam indol-3-piruvat (IPA), triptamin, dan indol-3-asetonitril (Manulis et al. , 1998). Jalur yang menguntungkan bagi bakteri adalah jalur IPA sebagai jalur utama untuk menyintesis IAA (Patten dan Glick, 2002).
Mutagenesis   dengan   transposon   merupakan   salah   satu   metode   untuk   membuat mutan dengan cara menyisipkan segmen DNA (transposon) ke dalam genom bakteri yang digunakan   (Wahyudi,   2001).   Secara   umum   metode   ini   digunakan   untuk   isolasi   dan lokalisasi   gen.  Transposon   merupakan   suatu   fragmen   DNA yang   dapat   meloncat   dan menyisip pada genom organisme (Wahyudi, 2000). Transposon ini akan menyisip pada DNA  secara   random.   Dengan   adanya   penyisipan   transposon   ini   dapat   menyebabkan perubahan genetik yang memiliki kontribusi penting dalam evolusi genom karena selain dapat menyisip ke dalam genom, penyisipan juga dapat terjadi pada sekuens DNA yang berperan untuk regulasi proses fisiologi tertentu sehingga dapat menyebabkan modifikasi ekspresi gen dan menyebabkan mutasi kromosom.
Transposon Tn 5 sering digunakan untuk kegiatan mutagenesis dengan transposon seperti pada penelitian yang dilakukan oleh Harayama et al. (1984) untuk menganalisis operon gen jalur pemotongan meta dari plasmid TOL Pseudomonas putida mt-2. Selain itu, Wahyudi (2005) juga melakukan mutagenesis dengan transposon dalam penelitiannya untuk melaporkan konstruksi pustaka genom Magnetospirillum magneticum AMB-1 dan penapisan pustaka yang membawa gen yang terlibat dalam biosintesis magnetosom.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengarakterisasi Pseudomonas sp. asal rizosfer tanaman kedelai yang berpotensi sebagai pemacu pertumbuhan tanaman, serta mengonstruksi mutan Pseudomonas sp. CRB17 untuk meningkatkan produksi IAA melalui mutagenesis dengan transposon.

## Materi dan Metode
Pseudomonas sp.   diisolasi   dari   tanah   rizosfer   kedelai   daerah   Cirebon.   Isolasi dilakukan dengan pengenceran serial menggunakan garam fisiologis 0.85 % hingga 10 -4 . Tiga   pengenceran   terakhir     disebar   pada   media   agar   King’s   B   (20   g   pepton,   15   mL gliserol, 1,5 g K 2 HPO 4, 1,5 g MgSO 4. 7H 2 O,  15 g agar, 1 L akuades) dan diinkubasi selama 24 jam. Koloni-koloni yang tumbuh kemudian diamati morfologinya dan diuji fisiologinya yang meliputi pewarnaan Gram, bentuk sel, motilitas, dan reaksi uji oksidase.
Uji produksi IAA dilakukan sesuai dengan metode Patten dan Glick (2002). Isolat- isolat Pseudomonas sp.   diinokulasikan   ke   dalam   5   ml   media   cair   King’s   B   dengan penambahan   triptofan   0,5   mM.   Selanjutnya,   dilakukan   inkubasi   selama   48   jam   dan pengocokan dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang. Triptofan digunakan sebagai prekursor   terbentuknya   IAA   (Vande   Broek et   al. , 2005).   Sebanyak   1,5   mL   kultur disentrifugasi   selama   15   menit   pada   10000   rpm.   Selanjutnya,   1   mL supernatan   yang diperoleh dicampur dengan reagen Salkowski (150 ml H 2 SO 4 pekat, 250 mL H 2 O destilata, 7,5   mL   0,5   M   FeCl 3 ·6H 2 O)   dan   diinkubasi   pada   suhu   ruang   selama   20   menit   untuk kemudian diukur absorbansinya pada 520 nm (Spectronic 20, Bausch & Lomb, US). Konsentrasi   IAA   ditentukan   dengan   membandingkannya   terhadap   kurva   standar   IAA dengan kisaran konsentrasi 0–30 ppm.
Esai pemacuan pertumbuhan dilakukan menurut metode Dey et al. (2004). Isolat Pseudomonas sp. CRB 17 yang memproduksi IAA tinggi digoreskan secara penuh pada media agar King’s B, diinkubasi selama 24 jam, dan selanjutnya disuspensikan dengan kaldu nutrien steril. Sebanyak 100 µL kultur dengan konsentrasi 10 10 sel per mL dipipet dan diinokulasikan pada tiap kecambah kedelai varietas Slamet berumur 24 jam pada media   agar   semisolid   dalam   cawan   petri.   Kecambah   diinkubasi   selama   7  hari.   Uji   ini dilakukan dengan tiga ulangan.  Sebanyak 9 kecambah digunakan untuk tiap ulangan.
Parameter yang diamati meliputi panjang akar primer dan jumlah akar lateral. Analisis data   dilakukan   menggunakan   uji   Anova   SPSS   ( Statistical   Package   for   the   Social Sciences) 12.0 for Windows .
Genom   DNA Pseudomonas sp.   CRB17   diekstrak   menggunakan   metode   CTAB (Sambrook et al ., 2001). Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan 1387f (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) (Marchesi et al ., 1998). PCR dilakukan sebanyak 30 siklus yang meliputi pradenaturasi pada 94 o C selama 2 menit, denaturasi selama 30 detik pada suhu 92 o C, penempelan primer selama 30 detik pada suhu 55 o C, pemanjangan   DNA   selama   60   detik   pada   suhu   75 o C.   Pemanjangan   DNA   terakhir dilakukan  selama  7  menit   pada  suhu  75 o C.     Fragmen  DNA produk  PCR  selanjutnya dimurnikan   dan   disekuens   serta   dianalisis   bioinformatikanya   menggunakan   Program BLAST yang ada di pangkalan data (NCBI).
Uji resistensi antibiotik dilakukan terhadap Escherichia coli S-17  pir (donor) dan isolat Pseudomonas sp.  CRB 17. Jenis antibiotik yang digunakan dalam pengujian ini adalah kanamisin, kloramfenikol,  rifampisin, dan  ampisilin pada konsentrasi 50 µg/mL. Masing-masing   jenis   antibiotik   ditambahkan   pada   media   agar   Luria   (10   g   tripton,   5  g ekstrak khamir, 10 g NaCl, 15 g agar, dan akuades 1 L). Baik E. coli S17-1  pir maupun CRB17 ditumbuhkan pada media tersebut dengan cara digores dan diinkubasi selama 24 jam pada  suhu ruang untuk CRB17 dan pada suhu 37 o C untuk E. coli .
Konstruksi   mutan   dilakukan   dengan   menyisipkan   gen   kanamisin   resisten   (Km1) yang dibawa oleh transposon mini-Tn5Km1 pada plasmid pUTmini-Tn 5 Km1 di dalam E. coli S17-1  pir  (donor) ke  dalam genom Pseudomonas sp.  CRB17  (resipien)  secara konjugasi diparental mating (Wahyudi et al . 2001) . Biakan resipien CRB17 ditumbuhkan pada   50   mL King’s  B   cair   +   kloramfenikol   (Kl)   50  g/mL dalam   erlenmeyer   250   mL. Selanjutnya, kultur diinkubasi pada mesin bergoyang dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang selama 24 jam. Sementara itu, biakan donor E. coli S17-1 (  pir) ditumbuhkan pada media 50 mL Luria Broth (LB) + kanamisin (Km) 50  g/mL dalam erlenmeyer 250 mL dan dinkubasi pada inkubator bergoyang (120 rpm) pada suhu 37 0 C selama 20 jam. Perbandingan  jumlah   sel   donor   dan   resipien   yang   digunakan   ialah   1:1   (kisaran konsentrasi   10 8 :10 8 sel).   Kultur   sel   donor   dan   resipien   disentrifugasi,   dan   pelet   yang terbentuk dicuci sebanyak 3 kali dengan garam fisiologis steril. Pelet sel resipien yang telah dipanen ditambah LB sebanyak 40 µL. Suspensi sel resipien kemudian dipindahkan ke dalam tabung mikro yang berisi pelet sel donor. Suspensi campuran sel donor dan resipien   diresuspensi dan dipindahkan  dan diletakkan di atas membran filter milipore steril dan diletakan di atas media Luria Agar (LA). Begitu pula, pelet sel donor dan pelet sel resipien sebagai kontrol negatif. Inkubasi dilakukan selama 24 jam. Masing-masing membran milipore selanjutnya diangkat dan dimasukkan ke dalam tabung mikro berisi 1 mL   garam   fisiologis.   Setelah   divorteks   hingga   sel   terlepas   dari   membran milipore , sebanyak 100 µL suspensi sel disebarkan  pada agar cawan King’s B + Km 50 µg/mL + Kl 50 µg/mL dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.  Koloni yang muncul pada media   tersebut   menunjukkan Pseudomonas sp.   CRB17   mutan   yang   telah   tersisipi genomnya oleh gen Km1 dari transposon Mini-Tn5Km1 sehingga selain resisten terhadap kloramfenikol juga resisten terhadap kanamisin.
Seleksi dilakukan terhadap 49 mutan Pseudomonas sp. CRB17 yang ditentukan secara acak. Tiap mutan ditumbuhkan dalam 5 mL media King’s B cair + 50 µg/mL Kl dan diinkubasi   pada   inkubator   bergoyang   (120   rpm,   suhu   ruang)   selama   24   jam   sebagai prakultur. Sebanyak  100 µL biakan  prakultur  kemudian  diinokulasikan  ke  dalam  5  mL media King’s B cair + Kl 50 µg/mL yang disuplementasi dengan 0,5 mM L-triptofan dan dinkubasi pada suhu ruang serta digoyang pada 100 rpm selama 48 jam. Sebanyak 1,5 mL kultur  disentrifugasi  selama 15  menit  pada  10000  rpm,  kemudian  sebanyak  1  mL supernatan dicampur rata dengan 4 ml reagen Salkowski dan dibiarkan pada suhu ruang
selama 20 menit dalam keadaan gelap, dan selanjutnya diukur absorbansinya pada 520 nm   (Spectronic   20,   Bausch  dan  Lomb,   US).   Konsentrasi   IAA   ditentukan   dengan membandingkannya terhadap kurva standar IAA dengan kisaran konsentrasi 0–30 ppm. Konsentrasi   IAA  yang   dihasilkan   oleh   mutan Pseudomonas sp.   CRB17   dibandingkan dengan konsentrasi IAA yang dihasilkan oleh Pseudomonas sp. CRB17 tipe liarnya.

## Hasil dan Pembahasan
Seratus isolat yang dikategorikan sebagai Pseudomonas sp. telah berhasil diisolasi dari   tanah   rizosfer   kedelai   daerah   Cirebon,   Jawa   Barat   setelah   melalui   uji biokimia/fisiologi secara parsial. Isolat-isolat tersebut memiliki  karakter mampu tumbuh pada media agar King’s B, berbentuk batang, motil, Gram negatif, dan uji oksidasenya positif (Gambar 1).

## a                                              b
Gambar 1.  a.  Penampilan sel Pseudomonas sp. CRB 17 hasil pewarnaan Gram b.  Penampilan   koloni Pseudomonas sp.   CRB   17   berfloresens  pada agar King’s B berumur 48 jam
Figure 1.    a.  Performance of Pseudomonas sp. CRB 17 cells after Gram staining b. Performance of fluorescence Pseudomonas sp. CRB    17colonies on agar King’s B of 48 hours
Pseudomonas sp. yang berpotensi dalam penghasilan IAA yang mampu memacu pertumbuhan   banyak   terdapat   di   rizosfer   suatu   tanaman   (Dey et   al. , 2004).   Oleh karenanya, dalam penelitian ini untuk mendapatkan isolat Pseudomonas sp. penghasil IAA dilakukan isolasi Pseudomonas sp. dari rizosfer tanaman kedelai.   Sebanyak 100 isolat dikategorikan sebagai Pseudomonas sp.  Karakter-karakter umum yang dimiliki oleh Pseudomonas sp.   tersebut   adalah   berbentuk   batang,   motil,   Gram   negatif,   memiliki oksidase positif dan mampu tumbuh pada media semiselektif King’s B (Holt et al. , 1994). Berdasarkan hasil uji produksi IAA oleh Pseudomonas sp. diperoleh 98 isolat yang menghasilkan  IAA   dengan   konsentrasi   yang   berbeda-beda.   Salah   satu   isolat,   yaitu Pseudomonas sp. CRB17, diketahui sebagai isolat penghasil IAA tertinggi, yakni sebesar 16,02 ppm. Isolat tersebut diketahui memiliki koloni yang mampu menghasilkan pigmen floresens pada media agar King’s B sehingga dapat dikatakan bahwa Pseudomonas sp. CRB17   termasuk   dalam   kelompok Pseudomonas yang   berfloresens.  Isolat   CRB17   ini selanjutnya digunakan untuk telaah pemacuan pertumbuhan dan  mutagenesis dengan transposon.
Hasil uji pemacuan pertumbuhan terhadap kecambah kedelai menunjukkan bahwa isolat Pseudomonas sp. CRB17 ternyata mampu memacu pertumbuhan secara signifikan dengan cara memperpanjang akar primer dan memperbanyak jumlah akar lateral. Hal ini dibuktikan dari nilai parameter bioasai pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai yang diinokulasi dengan CRB 17, yang secara signifikan berbeda nyata dengan kontrol pada taraf 5% (Tabel 1).
Tabel   1.   Hasil   uji   pemacuan   pertumbuhan   kecambah   kedelai   oleh Pseudomonas sp CRB17 Table 1.  Analysis of Pseudomonas sp CRB17 growth stimulation on soybean sprout
*  berbeda   nyata   secara   stastistik   pada   taraf   5%;   percobaan   dilakukan   dengan   tiga ulangan, masing-masing ulangan terdiri atas 9 kecambah kedelai.
Pada Tabel 1 dapat dilihat bahwa panjang akar primer kecambah yang diinokulasi dengan CRB17 memiliki rataan sebesar 21,4 cm dan jumlah akarnya sebanyak 75 buah. Sementara   itu,   panjang   akar   primer   kontrol   sebesar   11,4   cm   dan   jumlah   akarnya sebanyak 32 buah. Dari hasil ini dapat dikatakan bahwa isolat Pseudomonas sp. CRB17 dengan konsentrasi IAA yang dihasilkannya dapat berperan sebagai rizobakteria pemacu pertumbuhan tanaman, khususnya kedelai.
IAA yang  disekresikan   oleh   suatu  bakteri  diduga   dapat   memacu  pertumbuhan, baik secara langsung dengan merangsang pemanjangan atau pembelahan sel maupun secara   tidak   langsung   dengan   mempengaruhi   aktivitas   asam   1-aminosiklopropana-1- karboksilat (ACC)   deaminase.   Enzim   ini   menghidrolisis   ACC   tanaman,   prekursor fitohormon   etilen,   sehingga   mencegah   produksi   etilen   yang   berlebihan   dengan konsentrasi   yang   menghambat   pertumbuhan.   IAA   eksogenus   dapat   meningkatkan transkripsi   dan   aktivitas   sintesis  ACC   pada   tanaman.  ACC   ini   memacu   aktivitas  ACC deaminase bakteri (Patten dan Glick, 2002).
Isolat   CRB17   ini   selanjutnya   dipilih   untuk   dikonstruksi   sebagai   mutan   yang menghasilkan IAA lebih tinggi. Karakter lain yang dimiliki oleh CRB17 ialah menghasilkan pigmen floresens pada media King’s B. Banyak spesies Pseudomonas sp. yang mampu menghasilkan   pigmen   yang   berfloresens,   terutama   pada   kondisi   pertumbuhan   miskin besi, misalnya jika ditumbuhkan pada media King’s B yang tidak ditambah dengan zat besi. Beberapa pigmen ini dan turunannya berperan sebagai siderofor (zat pengkhelat besi) yang berpotensi menghambat pertumbuhan patogen (Garibaldi, 1967).
Amplifikasi gen 16S rRNA dengan PCR menghasilkan pita DNA berukuran sekitar 1.300   pasang   basa   (pb).   Analisis   sekuens   DNA/gen   16S   rRNA   tersebut   dilakukan menggunakan   Program   BLASTN.   Ternyata   gen   16S   rRNA   CRB17   memiliki   homologi sangat tinggi dengan gen 16S rRNA Pseudomonas plecoglossicida strain NyZ12 dengan nilai kesamaan hingga 99%. Hal ini menunjukkan bahwa isolat CRB17 memang benar- benar termasuk dalam kelompok Pseudomonas yang mempunyai sifat berfloresens. Berdasarkan hasil uji resistensi diketahui bahwa E. coli S17-1  pir (donor)  sensitif terhadap kloramfenikol 50 µg/ml tetapi resisten terhadap kanamisin 50 µg/ml. Sementara itu, Pseudomonas sp.   CRB17  diketahui   sensitif   terhadap   kanamisin   50   µg/ml   tetapi resisten   terhadap   kloramfenikol   50   µg/ml.   Dengan   demikian,   antibiotik   kanamisin   dan kloramfenikol   dapat   digunakan   sebagai   marker   seleksi   transkonjugan/  mutan Pseudomonas sp. CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon.
Hasil mutagenesis dengan transposon menunjukkan bahwa gen kanamisin resisten (Km1) telah berhasil diintegrasikan ke dalam genom Pseudomonas sp. CRB17 melalui konjugasi diparental mating . Hal ini diketahui melalui kemampuan mutan Pseudomonas
Perlakuan Rata-rata Panjang akar primer (cm) Rata-rata Jumlah akar Lateral Kecambah diinokulasi dengan Pseudomonas sp. CRB 17 21,4* 75* Kontrol (tanpa inokulasi dengan Pseudomonas sp CRB17) 11,4 32
sp CRB17 untuk tumbuh pada media King’S B yang ditambah dengan kloramfenikol dan kanamisin. Frekuensi transkonjugasi hasil transposon mutagenesis tersebut yang didapat dengan waktu inkubasi konjugasi selama 24 jam adalah sekitar 3,1 x 10 -5 sel per resipien. Frekuensi ini lebih tinggi bila dibandingkan dengan hasil penelitian Rukayadi (1998), yang mendapatkan frekuensi transkonjugasi pada Xanthomonas campestris sebesar 8,3 x 10 -6 menggunakan galur E. coli yang sama. Seleksi mutan Pseudomonas sp. CRB17 terhadap produksi IAA dilakukan terhadap 49   mutan   hasil   mutagenesis   dengan   transposon.   Dari   hasil   seleksi   diperoleh   21 transkonjugan yang menghasilkan IAA lebih tinggi daripada tipe liarnya, yaitu mengalami kenaikan produksi IAA hingga 77,52 % (Tabel 2). Hal ini diduga karena adanya penyisipan transposon di daerah represor dan mengakibatkan terjadinya perubahan pada gen-gen yang terlibat dalam regulasi biosintesis IAA sehingga produksi IAA menjadi meningkat (Pratiwi et al. , 2001). Transkonjugan I 3 diketahui merupakan mutan yang menghasilkan IAA paling tinggi dengan kenaikan produksi IAA hingga 77,52 % bila dibandingkan dengan tipe liarnya. Sementara itu, sebanyak 28 mutan menghasilkan IAA yang lebih rendah bila dibandingkan dengan tipe liarnya, yaitu dengan persentase penurunan hingga 55,31%. Salah satu transkonjugan, yaitu II 73 mengalami penurunan ( downregulated) sebanyak 55,31%   (Tabel   3).   Penurunan   produksi   IAA   ini   mungkin   disebabkan   oleh   adanya penghambatan salah satu gen dalam produksi IAA.
Tabel 2.  Persentasi kenaikan IAA yang dihasilkan oleh mutan Pseudomonas sp CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon Table 2. Percentage of IAA increase produced by transposon mutagenic Pseudomonas sp CRB17
Melalui   mutagenesis   dengan   transposon   ini   tidak   didapatkan   mutan   yang   tidak menghasilkan IAA.  Hal ini diduga karena banyaknya jalur sintesis yang digunakan dalam produksi IAA yang mungkin dimiliki oleh genus Pseudomonas. Jika salah satu jalur saja terhambat   karena   salah   satu   gen   yang   berperan   dalam   jalur   tersebut   tidak   dapat diekspresikan   akibat   penyisipan   transposon,   maka   bakteri   penghasil   IAA   dapat mengambil jalur sintesis alternatif. Hal serupa juga ditemui dalam penelitian Pratiwi et al . (2001),   yang mendapatkan mutan-mutan Azospirillum braziliense dengan produksi IAA lebih tinggi dan lebih rendah melalui mutagenesis dengan transposon.
Kode Mutan Kenaikan produksi IAA (%) Kode Mutan Kenaikan produksi IAA (%) III 73 1,80 I 22 22,99 II 20 2,93 II 99 30,41 I 25 5,12 V 20 32,67 I 33 8,13 I 23 37,94 III 41 8,33 I 8 48,43 III 14 9,53 II 11 49,58 II 30 9,83 I 2 51,48 V 11 10,29 I 1 65,59 II 7 10,62 I 11 70,54 I 31 14,76 I 3 77,52 I 32 17,81
Tabel 3.  Persentasi penurunan IAA yang dihasilkan oleh mutan Pseudomonas sp CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon Table 3. Percentage of IAA decrease produced by transposon mutagenic Pseudomonas sp CRB17

## Kesimpulan
Berdasarkan   hasil   penelitian   dan   pembahasan   tersebut   di   atas   dapat   ditarik kesimpulan   bahwa   melalui   mutagenesis   dengan   transposon   dapat   dikonstruksi   mutan Pseudomonas sp. CRB 17 penghasil IAA yang lebih tinggi daripada tipe liarnya.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian   ini   didanai   oleh   Program   Insentif   Penelitian   Dasar   dari   Kementrian Negara Riset dan Teknologi (KNRT) Indonesia. Oleh karena itu, peneliti mengucapkan terima kasih atas dukungan dana dan kepercayaan yang diberikan untuk melaksanakan penelitian ini.

## Daftar Pustaka
Dey R., Pal, K.K., Bhatt, D.M., and Chauhan, S.M. 2004. Growth promotion and yield enhancement   of   peanut   ( Arachis   hypogaea L.)   by   application   of   plant   growth- promoting rhizobacteria. Microbiol. Res. , 159, 371-394.
Garibaldi,  A.   1967.   Media   for   the   enhancement   of   fluorescent   pigment   production   by Pseudomonas species. J. Bacteriol. , 94, 1296-1299.
Harayama, S., Lehrbach, P.R., and Timmis K.N. 1984. Transposon mutagenesis analysis of meta-cleavage pathway operon genes of the TOL plasmid of Pseudomonas putida mt-2. J. Bacteriol , 160, 251-255.
Holt   J.G.   1994. Bergey’s   Manual   of   Determinative   Bacteriology. 9 th Ed.   Philadelphia: Lippincott William and Wilkins.
Kode Mutan Penurunan produksi IAA (%) Kode Mutan Penurunan Produksi IAA (%) I 18 2,66 III 52 22,79 II 41 4,39 III 2 30,12 II 4 7,68 I 26 31,47 III 20 8,64 III 11 32,94 I 16 10,39 II 83 33,71 II 23 11,37 V14 34,56 II 52 11,49 II 92 39,68 II 33 14,37 V 7 39,96 I 30 14,63 III 23 40,61 I 27 14,76 III 83 47,31 III 4 17,90 V 23 47,68 I 29 19,58 I 28 54,61 III 63 20,04 III 30 54,73 II 63 21,62 II 73 55,31
Holtwick, R., Meinhard, F., and Keweloh, H. 1997. Cis-trans isomerization of unsatturated fatty acids: cloning and sequencing of the cti gene from Pseudomonas putida P8. Appl. Environ. Microbiol . , 63, 4292-4297.
Husen, E., dan Saraswati, R. 2003. Effect of IAA-producing bacteria on the growth of hot pepper. J.  Mikrobiol.  Indones. , 8, 22-26.
Kapulnik, Y., Okon, Y. 2002. Plant growth promotion by rhizosphere bacteria. In Warsel Y, Eshel A, Kafkafi U (editor). Plant Roots: The Hidden Half .  3 rd Ed. New York: Marcel Dekker. hlm. 869-885.
Manulis,   S.,   Haviv-Chesner,   A.,   Brandl,   M.T.,   Lindow,   S.E.,   and   Barash,   I.   1998. Differential involvement of Indole-3-Acetic Acid biosynthetic pathways in pathogenicity and   epiphytic   fitness   of   Erwinia   herbicola   pv.   gypsophilae. Mol.   Plant.   Microbe. Interact. , 11, 634–642.
Patten,   C.L.   and   Glick,   B.R.   2002.   Role   of Pseudomonas  putida indoleacetic   acid   in development of the host plant root system. Appl. Environ. Microbiol , 68, 3795-3801.
Pratiwi,   E.,   Suwanto,   A.,   Gunarto,   L.,   and   Adijuwana,   H.   2001.   Karakterisasi   mutan biosintesis asam indol asetat pada Azospirillum lipoferum J21.4 yang dihasilkan dari mutagnesis transposon. Hayati , 8, 18-22.
Premono, M.E. dan Widyastuti R. 1996. Status hara tanaman jagung yang diinokulasi dengan Pseudomonas putida L27A4A1. Hayati , 3, 55-60.
Rukayadi, Y., Suwanto, A. dan Tjahjono B. 1998. Konstruksi plasmid yang mengandung situs Pac I dan Pme I untuk transposon mutagenesis pada Xanthomonas campestris . Hayati , 5, 79-85.
Vande  Broek, A., P. Gysegom, O. Ona, N. Hendrickx, E. Prinsen, J. Van Impe and J. Vanderleyden. 2005. Transcriptional analysis of the Azospirillum brasilense Indole-3- Pyruvate decarboxylase gene and identification of a cis-Acting sequence involved in auxin responsive expression. Mol. Plant. Mirobe. Interac , 18, 311–323.
Wahyudi, A.T. 2000. Inverse polymerase chain reaction. Hayati , 7, 121-123.
Wahyudi, A.T. 2001. Perpustakaan gen: bagaimana mengkonstruksinya. Hayati , 8, 27-30. Wahyudi, A.T. 2005. Konstruksi pustaka genom Magnetospirillum magneticum AMB-1 dan penapisan gen yang terlibat dalam sintesis magnetosom. Hayati , 10, 91-95.