## Kualitas Spermatozoa Post Thawing dari Semen Beku Sapi Perah
Engki Zelpina 1 , Bayu Rosadi 1 dan Teguh Sumarsono 1
1 Fakultas Peternakan Universitas Jambi, Jl. Jambi-Ma. Bulian KM 15 Mendalo, Jambi email: engki_zelpina@yahoo.com

## Intisari
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  berbagai  suhu  thawing  terhadap kualitas spermatozoa dari semen beku sapi perah Fries Holland (FH).  Rancangan percobaan yang digunakan  yaitu  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan  5  perlakuan  dan  5  kali  ulangan. Perlakuan yang dilakukan meliputi: semen beku yang di thawing selama 30 detik pada air dengan suhu 33 0 C  (P1), suhu 35 0 C (P2), suhu 37 0 C (P3), suhu 39 0 C (P4), suhu 41 0 C (P5). Peubah yang di amati meliputi persentase motilitas spermatozoa,viabilitas dan recovery rate .  Data yang diperoleh dianalisis  menggunakan  sidik  ragam.    Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  suhu thawing yang berbeda  mempengaruhi  motilitas,  viabilitas, recovery rate spermatozoa  yang  dibekukan  (P<0,05). Motilitas, recovery rate P4 lebih tinggi dibandingkan  P2, P1 dan P5 (P<0,05), tetapi tidak berbeda dengan  P3  (P>0,05).  Viabilitas    P4  lebih  tinggi  dibandingkan  P1  dan  P5  (P>0,05)  tetapi  tidak berbeda  dengan  P2  dan  P3  (P>0,05).  Dapat  disimpulkan  bahwa  suhu  thawing  mempengaruhi motilitas, viabilitas, recovery rate spermatozoa yang dibekukan. Kualitas  yang terbaik pada semen beku sapi perah Fries Holland (FH) dengan menggunakan suhu thawing 39 0 C dan  37 0 C selama 30 detik.
Kata kunci : spermatozoa, semen beku,  sapi perah, thawing

## Abstract
The purpose of this study was to determine the effect of various thawing temperatures to the sperm quality of FH dairy cow frozen semen. The experimental design used was completely randomized design (CRD) with 5 treatments and 5 replications . The thawing treatments were  30 seconds at 33 0 C (P1), 35 0 C (P2), 37 0 C (P3), 39 0 C (P4), 41 0 C (P5) . Observed variables were sperm motility, viability and recovery rate . Data were analyzed using analysis of variance . The results showed that different thawing temperatures affect the motility , viability, recovery rate of frozen spermatozoa (P<0.05). Motility and  recovery rate of P4 was higher (P< 0.05)  than P2 , P1 and P5  , but did not differ (P>0.05) with P3 . Viability of P4  was higher (P>0.05)  than P1 and P5  but did not differ (P>0.05) with P2 and P3.  In conclusion , thawing at 39 0 c and 37 0 C for 30 seconds had best semen quality of FH frozen semen.
Keywords : spermatozoa , frozen semen , dairy cow, thawing

## Pendahuluan
Inseminasi Buatan (IB) merupakan  proses  perkawinan  yang dilakukan  dengan  campur  tangan manusia,
yaitu mendeposisikan semen  ke  dalam  saluran  reproduksi betina  agar  terjadi  proses  fertilisasi. Aplikasi  IB  secara  meluas  telah dimulai  di  Indonesia  sejak  tahun
1970-an terutama pada sapi perah.
Prosedur pelaksanaan IB
mulai  dari  pengamatan  berahi, handling semen beku, thawing semen beku  sampai  dengan  pelaksanaan inseminasi  sangat  mempengaruhi keberhasilan  perkawinan.  Metode thawing  semen  beku  menjadi  salah satu  faktor  yang  sangat  menentukan
karena  penggunaan  metode  thawing yang  tidak  tepat  akan  menyebabkan kerusakan  spermatozoa  sehingga menurunkan  kualitas  semen  (Evans dan  Maxwell,    1976).  Thawing merupakan  pencairan  kembali  semen yang  telah  dibekukan  sebelum dilakukan  (IB).  Suhu  dan  lama thawing mempunyai  pengaruh  besar terhadap keadaan spermatozoa khususnya  keutuhan      spermatozoa dalam  semen.  Kombinasi  suhu thawing yang  baik  adalah  yang  dapat mencegah  kerusakan  spermatozoa, sehingga  tetap  memiliki  kemampuan membuahi ovum yang tinggi . Metode thawing yang dikembangkan  beragam.  Deka  dan Rao  (1987)    menyatakan  bahwa  suhu thawing di  atas  37 0 C  akan meningkatkan daya hidup spermatozoa,  tetapi  bila  melebihi batas  waktu  kritis  akan  bersifat  fatal pada  sel  spermatozoa.  Persentase motilitas  tertinggi  diperoleh  pada suhu  thawing  37 0 C  (Pace  dkk,  1981). suhu  yang  tinggi  dalam    media thawing akan  menyebabkan  proses metabolisme  spermatozoa  meninggi sehingga  memerlukan  energi  yang tinggi pula (Soepriondho, 1985).
Pada  penelitian  ini  dilakukan pengujian  kualitas  spermatozoa  post thawing  dari  semen  beku  sapi  perah Fries  Holland  (FH)  menggunakan suhu  thawing  yang  berbeda.  Hasil penelitian  ini  diharapkan  diperoleh metode  thawing  yang  menghasilkan kualitas  spermatozoa  sapi  FH  terbaik untuk IB.

## Materi  dan Metode

## Tempat dan Waktu
Penelitian  ini  dilaksanakan  di Laboratorium Reproduksi Ternak Fakultas Peternakan dan Laboratorium Pusat Pengembangan Agribisnis
Terpadu Universitas Jambi, 30 Oktober sampai dengan  5 November  2013.

## Semen Beku
Semen  beku    dari  pejantan  sapi perah  FH  yang  digunakan  sebanyak 35 straw dari BIB Lembang kode bull 307101  No  Registrasi  AH0.01.INAJ 0280 33081 .

## Thawing
Menyiapkan  penangas  air dan mengatur  suhu  air  di  dalamnya hingga  suhu  yang  telah  ditentukan. Mengambil straw dengan  penjepit (pinset) dari kontainer dan memasukkannya  ke  dalam  penangas air selama 30 detik.

## Rancangan Percobaan
Rancangan  penelitian  yang digunakan  adalah  rancangan  acak lengkap  (RAL)  dengan  5  perlakuan (P1,  P2,  P3,  P4,  P5)  dan  5  kali ulangan.    Perlakuan  adalah  suhu thawing sebagai berikut:
P1: Suhu  33 0 C, P2: Suhu  35 0 C P3: Suhu  37 0 C P4: Suhu  39 0 C P5: Suhu   41 0 C Lama  thawing  seraga  pada  semua perlakuan yaitu 30 detik.
Peubah  yang  diamati  pada penelitian  ini  adalah  Motilitas, Viabilitas,  Recovery  Rate.    Recovery Rate  adalah  kemampuan  pemulihan spermatozoa setelah pembekuan dengan  membandingkan  persentase sperma  motil  pada  semen  segar    dan ekuilibrasi  dengan  pasca  thawing (Garner dan Hafez, 2000).

## Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan  sidik  ragam.  Untuk melihat  perbedaan  antarperlakuan dilakukan uji lanjut Duncan.

## Hasil dan Pembahasan
Motilitas Spermatozoa Data hasil penelitian menunjukkan  bahwa  semen  beku yang  digunakan    memenuhi  syarat untuk disimpan dan diinseminasikan, dengan  nilai  motilitas  spermatozoa berkisar antara 42,4 - 51,0 % (Tabel 1).
Motilitas spermatozoa setelah thawing  minimal  40  %  jika  kurang dari  40  %  maka  semen  beku  tersebut tidak layak diinseminasikan.
Arifiantini  dkk  (2004)  melaporkan motilitas  spermatozoa pada  sapi  FH dengan  menggunakan  pengencer kacang kedelai (KK), tris sukrosa (TS) dan  tris  masing-masing  50,20  ±  7,07; 46,04 ± 3,54 dan 43,02 ± 7,68%.
Tabel 1. Rataan Persentase Motilitas Spermatozoa
Perlakuan Rataan P1 42, 8 ±  2, 58 b P2 45, 4 ±  1, 51 b P3 49,2  ± 1, 09 a P4 51, 0 ± 2, 64 a P5 42, 4 ±  2, 50 b
Ket:   Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata (P<0.05).
Perlakuan metode thawing pada semen beku sapi perah FH berpengaruh terhadap motilitas spermatozoa (P<0,05). Evaluasi motilitas  spermatozoa  post  thawing adalah  salah  satu  parameter  yang banyak digunakan untuk menentukan kualitas  semen  sapi  yang  akan digunakan  untuk  inseminasi  buatan.
Syarat  minimal  motilitas  individu semen post thawing agar semen dapat dipergunakan dalam inseminasi buatan  adalah  40  %  (Garner  dan
Hafez, 1993).
Thawing  yang  dilakukan  pada perlakauan P4 dan P3 dengan suhu 39 0 C  dan  37 0 C  selama  30  detik memperlihatkan  persentase  motilitas yang lebih tinggi (P<0,05) dibandingkan  pada  perlakuan  P1,  P2
dan P5 dengan  suhu 33 0 C, 35 0 C dan 41 0 C  selama  30  detik,  sedangkan antara  perlakuan  P4  dan  P3  yaitu suhu  39 0 C  dan  37 0 C  tidak    berbeda (P>0,05).  Diduga  pada  kisaran  suhu tersebut  metabolisme  spermatozoa
berjalan  sempurna  karena  sesuai dengan  suhu  fisiologis  yang  normal pada sapi perah.  Pada suhu fisiologis, aktivitas  reaksi  enzimatik  yang berlangsung  selama  metabolisme  sel berlangsung
optimal. Proses pembentukan dan pemanfaatan sumber  energi  kimiawi  spermatozoa diantaranya  digunakan  untuk  energi gerak  berlangsung  dengan  baik.  Hal ini  termanifestasi  pada  motilitas speratozoa.  Menurut Einarsson (1992) proses thawing dapat  mempengaruhi stabilitas  dan  fungsi ‐ fungsi  hidup membran sel spermatozoa.
Hafs  dan  Elliot  (1954)  dalam Toelihere  (1993)  menyatakan  bahwa thawing pada  air  bersuhu  38 0 C sampai  40 0 C  menghasilkan  daya tahan  hidup  sperma  yang  lebih  baik bila dibandingkan dengan pada suhu rendah.  Menurut   Sayoko  dkk  (2007), lama  thawing 30  detik  memberikan hasil  yang  lebih  baik  terhadap persentase  spermatozoa  hidup  dari pada thawing selama 15 detik.
Perlakuan  P1  dan  P2  rataan motilitas  spermatozoa  mengalami penurunan, hal ini disebabkan karena perlakuan suhu thawing pada P1 dan P2 yang digunakan suhu 33 0 C dan 35 0 C selama 30 detik. Pada suhu rendah pengeluaran  krioprotektan  sempurna tetapi  metabolisme  berjalan  tidak optimal sehingga motilitas spermatozoa yang dihasilkan mengalami  penurunan.  Sedangkan pada  perlakuan  P5  rataan  motilitas spermatozoa juga mengalami penurunan  hal  ini  disebabkan  suhu tinggi dibandingkan perlakuan lainnya  yaitu  41 0 C  selama  30  detik. Suhu thawing yang tinggi berpengaruh terhadap motilitas spermatozoa  karena  pada  proses thawing metabolisme berjalan dengan optimal  tetapi  proses  pengeluaran krioprotektan tidak terlangsung sempurna dapat mengakibatkan keracunan  bagi  spermatozoa  dan kerusakan  spermatozoa  sehingga menyebabkan  penurunan  motilitas spermatozoa.
Menurut  Soepriondho  (1985), suhu  yang  tinggi  dalam    media thawing  akan  menyebabkan  proses metabolisme  spermatozoa  meninggi
sehingga  memerlukan  energi  yang tinggi  pula.  Kondisi    demikian menyebabkan spermatozoa akan cepat  kehilangan  energi  sehingga berakibat kematian pada spermatozoa.  Suhu yang rendah akan mempenggaruhi metabolisme spermatozoa. Watson (1996)
menjelaskan  suhu  rendah  juga  akan mengakibatkan  struktur  fosfolipid membran  plasma  akan  berubah  dari fase cair menjadi fase gel.

## Viabilitas (Persentase Hidup)
Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa suhu thawing nyata mempengaruhi  persentase  viabilitas spermatozoa  semen  beku  sapi  perah FH (P<0,05). Thawing yang dilakukan pada  perlakauan  P4,  P3  dan  P2 memperlihatkan  persentase  viabilitas yang lebih tinggi (P<0,05) dibandingkan pada perlakuan P1 dan P5    sedangkan  antara  perlakuan  P4, P3  dan  P2  tidak  nyata  berbeda (P>0,05). Angka persentase pengamatan  viabilitas  terbaik  pada perlakuan P4, P3 dan P2, menghasilkan nilai pengamatan viabilitas  yang  tinggi  yaitu  59,20  ±
4,20  ,  55,60  ±  3,57  dan  53,20  ±  4,38.

## Tabel 2. Rataan Persentase Viabilitas Spermatozoa
Perlakuan Rataan P1 51, 0 ± 4, 12 b P2 53, 2 ± 4, 38 ab P3 55, 6 ± 3, 57 a P4 59, 2 ± 4, 20 a P5 50, 8 ± 3, 52 b
Ket:  Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata (P<0.05).
Spermatozoa  yang  memiliki persentase hidup yang tinggi menandakan bahwa membran plasma masih  utuh  secara  fisik,  sehingga organel sel spermatozoa akan terlindungi,  kebutuhan  zat-  zat
makanan  dan  ion-  ion  untuk  proses metabolisme  tersedia.  Metabolisme sel  akan  berlangsung  baik  jika membran  plasma  sel  berada  dalam keadaan yang utuh, sehingga mampu dengan  baik  mengatur  lalu  lintas
substrat  dan  elektrolit  masuk  dan keluar dari sel.
Darnel dkk (1990) menyatakan bahwa  terjadi  perubahan  suhu  yang tidak  sesuai  secara  ekstraseluler, maka permiabilitas fosfolipid hidrofilik rusak menyebabkan fluiditas membran terganggu sehingga terjadi kematian spermatozoa.  Menurut  Chandler  dkk (1984) meningkatnya kecepatan perubahan pada saat thawing umunya menghasilkan lebih banyak spermatozoa  yang  hidup.  Hal  ini dapat  dicapai  apabila  melakukan
thawing dengan  temperatur  air th awing yang  cukup  tinggi.  Kecepatan perubahan  selama thawing akan mengurangi tekanan terhadap spermatozoa  karena  spermatozoa melewati  massa  kritis  (fasa  transisi) dengan cepat pula sehingga spermatozoa  yang  hidup  dan  normal menjadi  lebih  banyak  dan  akibatnya angka  konsepsi  menjadi  lebih  baik. Kerusakan  spermatozoa  biasanya terjadi  pada  fase  transisi.  Hasil
penelitian Hidayatin (2002)
menyatakan  bahwa  dibutuhkan  50% spermatozoa  yang  hidup  dan  motil untuk  dipakai  dalam  IB.  maka viabilitas  pada  perlakuan  suhu thawing menunjukkan bahwa persentase  viabilitas  dalam  kisaran normal.  Spermatozoa  yang  memiliki persentase hidup yang tinggi menandakan bahwa membran plasma masih  utuh  secara  fisik,  sehingga organel sel spermatozoa akan terlindungi,  kebutuhan  zat-  zat makanan  dan  ion-  ion  untuk  proses metabolisme tersedia.

## Recovery Rate
Hasil  pengamatan  recovery rate terhadap semen segar  dan  hasil ekuilibrasi  spermatozoa  semen  beku sapi  perah  FH  yang  dithawing dengan  suhu  yang  berbeda  pada Tabel 3. Metode thawing pada semen beku  sapi  perah  FH  berpengaruh nyata terhadap recovery rate spermatozoa (P<0,05).
Tabel 3. Rataan Persentase Recovery Rate  Segar dan Ekuilibrasi
Perlakuan Rataan Segar Ekuilibrasi P1 61, 14 ± 3, 69 b 71, 33 ± 4, 31 b P2 64, 85 ± 2, 16 b 75, 66 ± 2, 52 b P3 70, 28 ± 1, 56 a 82, 00 ± 1, 82 a P4 72, 85 ± 3,77 a 85, 00 ± 4, 40 a P5 60, 57 ± 3,58 b 70, 66 ± 4, 18 b
Ket: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata (P<0,05).
Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  suhu  thawing  nyata  (P<0,05) mempengaruhi  persentase  motilitas spermatozoa  semen  beku  sapi  perah FH.  Thawing  yang  dilakukan  pada perlakuuan  P4  dan  P3  k  nyata memperlihatkan  persentase  motilitas yang lebih tinggi (P<0,05)
dibandingkan  pada  perlakuan  P1,  P2 dan  P5,  sedangkan  antara  perlakuan P4  dan  P3  tidak  nyata  berbeda (P>0,05).
Keberhasilan pembekuan semen  tidak  hanya  dinilai  dari persentase  motilitas  setelah  thawing, persentase  spermatozoa  yang  dapat
pulih  kembali  setelah  pembekuan yang memberikan gambaran keberhasilan  dari  proses  pembekuan itu sendiri. Aktifitas  metabolisme dan pergerakan  sel  spermatozoa  sesudah thawing  pada  suhu  ini  berjalan normal mengakibatkan laju pemulihan  spermatozoa  dari  pasca ekuilibrasi  dan  thawing  tinggi. Perbedaan  laju  pemulihan  kembali disebabkan oleh suhu yang digunakan  pada  saat  thawing.    Mole dkk  (2003)  menyatakan  bahwa spermatozoa sangat cepat terpengaruh  oleh  perbedaan  suhu baik  selama  proses  pendinginan, pembekuan  ataupun  thawing.  Pada saat  ekuilibrasi  spermatozoa  akan beradaptasi  dengan  pengencernya, sehingga dapat menurunkan persentase  motilitas  spermatozoa pada  saat  pembekuan.  Menurut Kacker  dan  Panwar  (1996)  ekuilibrasi
bertujuan  melindungi  spermatozoa dari  kematian  yang  disebabkan  oleh penurunan  tekanan  osmotik  yang menggangu keutuhan membran spermatozoa akibat pembekuan. Pada sapi  ekuilibrasi  biasanya  dilakukan selama  4  jam  dengan  suhu    5 0 C (Arifiantini dkk, 2004).
Menurut  Kwon  dkk    (2002) kerusakan  sel  akibat  pembekuan dapat  terjadi  karena  dehidrasi, peningkatan  konsentrasi  elektrolit, serta terbentuknya kristal es intraseluler yang dapat mempengaruhi permeabilitas dinding sel  dan  pada  akhirnya  spermatozoa kehilangan daya motilitasnya. Hilangnya daya motilitas spermatozoa selama proses pembekuan akan berpengaruh terhadap  laju  pemulihan  (recovery rate)  sperma  setelah  mengalami pencairan kembali.

## Tabel 4. Rataan Penurunan dari  Semen  Segar dan ekuilibrasi Ke Pasca  Thawing
Pengamatan Perlakuan P1 P2 P3 P4 P5 Segar  Motilitas Segar(%) 70 70 70 70 70 Pasca Thawing(%) 42,80 45,40 49,20 51,00 42.40 Penurunan (%) 38,85 b 35,14 b 29,70 a 27,14 a 39,42 b Ekuili brasi Pasca Ekuilibrasi(%)  60 60 60 60 60 Pasca Thawing(%) 42,80 45,40 49,20 51,00 42.40 Penurunan(%) 28,60 b 24,33 b 18,00a 15,00 a 29,33 b
Ket:  Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan perbedaan nyata (P<0.05).
Berdasarkan  Tabel  4.    laju pemulihan kembali motilitas spermatozoa setiap perlakuan mengalami  penurunan,  P1  (38,85%), P2  (35,14%),  P3  (29,70%)  P4  (27,14%  ) dan  P5  (39,42%)  dan  P1  (28,60%),  P2 (24,33%), P3 (18,00%) P4 (15,00% ) dan P5  (29,33%).    Tingkat  laju  penurunan motilitas  pada  perlakuan  P4  lebih rendah dibandingkan pada perlakuan yang lain, sedangkan tingkat
penurunan  tertinggi  diperoleh  pada perlakuan  P5.  Thawing    semen merupakan  suatu  prosedur  yang sangat  kritis,  dan  bila  thawing dilakukan  pada  suhu    yang  tidak tepat  akan  menimbulkan  kerusakan pada  spermatozoa.  Pada  semen  beku suhu  thawing  yang  tepat  sangat diperlukan,  karena  suhu  thawing yang  tepat    dapat  mengurangi    efek
dari  semen  beku  untuk  mencapai suhu yang kritis pada saat thawing.
Menurut Devireddy dkk (2002) menyatakan bahwa penurunan kualitas semen setelah ekuilibrasi dan setelah thawing dalam proses pembekuan  semen  dimulai  saat penambahan krioprotektan, perubahan  volume  sel  pada  saat pembekuan  diikuti  peregangan  dan pengkerutan membran plasma sebagai  respon  terhadap  larutan hiperosmotik. Pembekuan  pada  dasarnya adalah suatu proses pengeringan fisik di  bawah  titik  beku.  Bila  mana  suatu larutan dibekukan, maka zat pelarutnya berupa air akan membeku dan  membentuk  kristal-kristal  es, sedangkan  bahan  terlarutnya  tidak dapat  bersatu  dengan  Kristal-kristal es  tersebut,  melainkan  berakumulasi semakin pekat. Kristal-kristal es yang terdapat  di  dalam  sel  sperma  ini dapat  merusak  secara  mekanik, sedangkan konsentrasi elektrolit yang berlebihan akan melarutkan selubung lipoprotein pada dinding sel spermatozoa,  sehingga  pada  saat pencairan kembali ( thawing ), permeabilitas  membran  selnya  akan berubah dan mengakibatkan kematian  sel  (Salisbury    dan Vandemark, 1985). Sifat  semen  beku  yang  sangat labil mengakibatkan kondisi membran  itu  sendiri  yang  memiliki tingkat kerentanan yang cukup tinggi.
Selain  itu  diduga  karena  pengaruh cold shock ketika  proses  pembekuan.
Proses  pembekuan  semen  akan mengakibatkan kematian spermatozoa  mencapai  30%  dari jumlah  spermatozoa  segar  atau setelah  diencerkan  dan  kerusakan akibat pengaruh pendinginan
(Goldman dkk, 1991).
Kesimpulan Dari hasil penelitian dapat
disimpulkan bahwa:
1. Suhu thawing mempengaruhi motilitas,  viabilitas  dan recovery rate spermatozoa yang dibekukan.
2. Motilitas,  viabilitas, recovery  rate yang  terbaik  pada  semen  beku sapi  Fries  Holland  (FH)  dengan menggunakan    suhu  thawing  39 0 C dan 37 0 C selama 30 detik.

## Daftar Pustaka
Arifiantini,  M.I.  2004. Proses  Produksi Semen  Beku  Kerbau  dengan
Sistem Minitub . Institut Pertanian Bogor. Bogor. Datta, U., Sekar, M. C., Hembram, M. L., Dasgupta, R., 2009. Development  of  a  New Method to Preserve Caprine Cauda Epididymal Spermatozoa  in  situ  at  10 0 C. Procedings.  Departement  of Veterinary  Gynaecology  & Obstetrics Faculty of Veterinary and Animal Sciences West Bengal University  of  Animal  and Fishery Sciences. Kolkuta West Bengal. India.
Deka, B.C. and A. R. Rao. 1987. Effect of  extenders  and  thawing methods  on  post  thawing preservation  of  goat  semen. Indian Vet.J . 64:591-594. Devireddy,  R.V.,  D.J.  Swanlund,  T.
Olin,  W.  Vincente,  M.H.T. Troedson, J.C. Bischof and K.P. Roberts. 2002. Cryo-
preservation  of  equine  sperm:
Optimal  cooling  rates  in  the presence  and  absence  of cryoprotective agents determined  using  differential
scanning calorimetry. Biologi of Reproduction 66: 222-231.
Djanuar,R.1985. Fisiologi  Reproduksi dan Inseminasi Buatan pada Sapi . Gadjah Mada University Press Yogyakarta. Einarsson S. 1992. Concluding Remarks.  In:  Influence  of thawing  method  on  motility, plasma  membrane  integrity and morphology of frozenstallion spermatozoa. Bor  K,  B  Colenbrander,  A Fazelli,  J  Pallevliet  and  L Malmgren (eds.) Theriogenology VI. 48th. 1997. Pp.531 ‐ 536.
Evans G and MaxwelI WMC, 1987. Salamon’s Artificial Insemination of Sheep and Goats. Butterworths. Sydney. Garner, D.L., E. and S. E. Hafez. 2000.
Spermatozoa  and  seminal plasma.  In:  Reproduction  in
Farm  Animals.  7 th Ed  B
Hafez/ESE  Hafez.  Lippincott Williams  &  Wilkins.USA.96- 109. Goldman, E. E., J.E. Ellington, F.B. Farrel, And R.H.Foote. 1991. Use Of Fresh  And Frozen Thawed Bull Sperm Invitro. Theriogenology 35: 204.
Hafez,  E.S.E.  2000.  B.  Semen Evaluation dalam E.S.E. Hafez (ed).  Reproduction  In  Fram Animal.  Lea  and  Febiger.
Philadelphia. 144 – 164. Kacker, R.N., and B.S. Panwar, 1996. Textbook of Equine Husbandry . 1 st ed.,
Vikas Publishing Hause, London.
Kwon, A.Y, H.J. K.0 and C.S, Park. 2002. Effect of diluent component,   freezing  rate, thawing  time and thawing temperature  on  AC  acrosoma morphology  and  motility of frozen  thawed boar semen.
Asian-Aust. J.   Anim. Sci. 15:
247-249.
Mackie, A.R.P., P. S. James, S. Ladha and R. Jones. 2001. Diffusion Barriers in Ram and Boar Sperm Plasma Membranes : Directionality of Lipid Diffusion Across The Posterior Ring. Biology Reproduction. Society for The Study of Reproduction, Inc.
Partodiharjo,  S.  1992. Ilmu  Reproduksi Hewan. Fakultas  Kedokteran Veteriner  jurusan  Produksi. Institut Pertanian Bogor. Mutiara, Jakarta 499-557. Pace, M.M, J.J. Sullivan, F.I. Elliot, E.F. Graham,  and  G.H  Coulter. 1981.Effect of thawing temperature, number of spermatozoa and spermatozoal quality on fertility of bovine spermatozoa fackaged  in  0,5ml  french straws. J . Anim. Sci . 53 (3) : 693- 701.
Soepriondho,  Y.  1985  .  Pengaruh Waktu  dan  Suhu    Thawiing Semen  Beku  terhadap  Angka Konsepsi pada Ternak Kerbau.
Tesis.  Fakultas  Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Salisbury GW and Van Demark.  1985. Fisiologi    Reproduksi  dan Inseminasi  Buatan  pada  sapi. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
Sayoko  Y,  M  Hartono,  dan  PE Silitonga. 2007. Faktor ‐ faktor yang   Mempengaruhi       Per- sentase  Spermatozoa  Hidup Semen Beku Sapi pada Berbagai  Inseminator di
Lampung Tengah. Kumpulan Abstrak Skripsi  Jurusan Produksi  Ternak. Fakultas  Per- tanian. Universitas   Lam- pung.
Situmorang,  P.  2002. The  Effects  of Inclusion of Exogenous Phospolipid  In  Tris-  Diluent Containing  A  Different  Level  of Egg Yolk on the Viability of Bull Spermatozoa .  Pusat  Penelitian dan Pengembangan Peternakan dan Badan Penelitian  dan  Pengembangan Pertanian,  Bogor  7  (3)  :  131- 187. Sorenson  Jr.,  A.M.  1979.  Laboratory Manual for Animal Reproduction. 4th Ed. American Press. Boston. USA. Srianto,  P.  S.  P.,  Madyawati,  dan  T. Sardjito.  2009.  Kadar  hormon dan  mineral  serum  darah  sapi pejantan  di  Balai  Inseminasi Buatan Daerah. Laporan Penelitian. Fakultas Ke- dokteran  Hewan,  Universitas Airlangga. Surabaya. Steel , R.G .D . and J.H . Torrie. 1993. Prinsip dan Prosedur Statistika. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Toelihere, 1993. Inseminasi Buatan Pada Ternak. Penerbit Angkasa. Bandung. Watson,  P.  F.  1996.  Cooling  of Spermatozoa  and  Freezing
Capacity. Reprod.  Dom.  Anim. 31 : 135 – 140.