## Journal of Scientech Research and Development
Volume 5, Issue 1, June 2023 P-ISSN: 2715-6974            E-ISSN: 2715-5846 Open Access at: http://idm.or.id/JSCR

## EFFECT OF PORANG GLUCOMANNAN AND Bacillus Subtilis ON INTESTINAL MORPHOLOGY AND PRODUCTIVITY OF BROILERS
PENGARUH GLUKOMANAN PORANG DAN Bacillus Subtilis TERHADAP

## MORFOLOGI USUS DAN PRODUKTIVITAS AYAM BROILER
Acep Perdinan 1 , Yenny Niken Larasati 2 Andang  Andiani Listyowati 3 1,2,3 Jurusan Peternakan,  Politeknik  Pembangunan Pertanian Yogyakarta  Magelang,  Magelang, Jawa Tengah, Indonesia
E-mail: acepperdinan@gmail.com
ARTICLE  INFO ABSTRACT Correspondent:
Acep Perdinan acepperdinan@gmail.com
Key words: BWG, mortality, synbiotic, villi height Website: https://idm.or.id/JSCR/in dex.php/JSCR
page: 136 - 142
The  study  aimed  to  determine  the  supplementation  effect  of  porang (Amorphophallus oncophyllus) glucomannan  and Bacillus subtilis on intestinal  morphology and productivity of broilers.  One  hundred and sixty  one-day-old  broiler  chickens  were  reared  for  35  days.  The experiment  was  arranged  in  a  completely  randomized  design with  4 treatments  and 4 replications. The treatments  given were T0 (control), T1  (prebiotic  porang  glucomannan),  T2  (probiotic  Bacillus  subtilis), and  T3  (synbiotic  porang  glucomannan  and  Bacillus  subtilis). Parameters  observed  were  intestinal  morphology  (villi  height)  and productivity (body weight gain and mortality). The results showed that villi height  and  body  weight  gain  (BWG)  of  T1,  T2,  and  T3  were greater (p≤0.05) than T0. Mortality of T0, T1, and T2 were higher than
T3.  It  was  concluded  that  supplementation  of  prebiotic  porang glucomannan,  probiotic  Bacillus  subtilis,  and  synbiotic  porang glucomannan  and  Bacillus  subtilis  had  better  villi height and  body weight gain than control  with the lowest  mortality on synbiotic.
INFO  ARTIKEL
ABSTRAK
Koresponden Acep Perdinan acepperdinan@gmail.com
Kata kunci:
broiler, mortalitas, pbb, sinbiotik, tinggi vili Website: https://idm.or.id/JSCR/in dex.php/JSCR
hal: 136 - 142
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh suplementasi  glukomanan  porang  ( Amorphophallus  oncophyllus ) dan Bacillus  subtilis terhadap  morfologi  usus  dan produktivitas ayam  broiler.  Seratus  enam  puluh  ekor  ayam  broiler  berumur satu  hari  dipelihara  selama  35  hari.  Percobaan  disusun  dalam rancangan  acak  lengkap  dengan  4  perlakuan  dan  4  ulangan. Perlakuan  yang  diberikan  adalah  T0  (kontrol),  T1  (prebiotik glukomanan  porang),  T2  (probiotik Bacillus  subtilis ),  dan  T3 (sinbiotik  glukomanan  porang  dan Bacillus  subtilis ).  Parameter yang  diamati  adalah  morfologi  usus  (tinggi  vili)  dan produktivitas  (pertambahan bobot  badan (PBB)  dan mortalitas). Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  tinggi  vili  dan pertambahan  bobot  badan  T1,  T2,  dan  T3  lebih  besar  (p≤0,05) dibandingkan  T0.  Mortalitas  T0,  T1,  dan  T2  lebih  tinggi dibandingkan  T3.  Disimpulkan  bahwa  suplementasi  prebiotik glukomanan  porang,  probiotik Bacillus  subtilis ,  serta  sinbiotik glukomanan porang dan Bacillus subtilis memiliki tinggi  vili dan pertambahan  bobot  badan  lebih  baik  daripada  kontrol  dengan mortalitas terendah pada sinbiotik.
Copyright © 2023 JSCR. All rights reserved.

## PENDAHULUAN
Penggunaan antibiotik  dengan dosis  subterapi  sebagai  pemacu pertumbuhan atau lebih dikenal dengan antibiotic growth promoters (AGP) untuk semua ternak termasuk unggas telah dilarang di  Indonesia sejak 1 Januari 2018, melalui peraturan Menteri Pertanian  tentang  larangan  penggunaan  antibiotik  sebagai  imbuhan  pakan (Kementerian Pertanian, 2017). Penggunaan antibiotik pada ayam broiler yang tidak terkontrol dapat menyebabkan timbulnya mikroba  patogen yang resisten terhadap antibiotik yang menurunkan ketersediaan nutrisi bagi inang sehingga produktivitas menjadi  lebih  rendah,  timbulnya  penyakit  unggas  tertentu,  muncul  risiko perkembangan resistensi antimikroba transfer gen resistensi antibiotik dari hewan ke mikroflora manusia yang mengakibatkan foodborne disease (Van Immerseel et al ., 2009; Gaggia et al ., 2010; Sugiharto, 2014). Pemberlakuan larangan penggunaan AGP pada pakan mendorong penelitian secara intensif mencari alternatif pengganti AGP untuk menunjang kesehatan, produktivitas, dan keamanan produk unggas.
Konsep sinbiotik  muncul  dari kombinasi  prebiotik  dan probiotik.  Sinbiotik  adalah suplemen bernutrisi terdiri dari prebiotik Alasan utama adalah bahwa probiotik, tanpa prebiotik  sebagai  sumber  makanan,  tidak  bertahan  dengan  baik  dalam  saluran pencernaan. Probiotik tanpa sumber makanan yang diperlukan memiliki lebih sedikit intoleransi  terhadap  oksigen,  pH  rendah,  dan  suhu  (Sekhon  dan  Jairath,  2010). Sinbiotik  mendorong  pertumbuhan  organisme  probiotik  dengan  menyediakan substrat spesifik bagi organisme probiotik untuk difermentasi (Farnworth, 2001). Hal
ini  dapat  mengarah  pada  keseimbangan  mikrobioma  sehingga  kesehatan  dan produktivitas  ternak  menjadi  lebih  baik  karena  dapat  memperbaiki  dan mengoptimalkan pencernaan dan penyerapan nutrien.
Prebiotik  yang  saat  ini  sedang  dikembangkan  diantaranya  adalah  glukomanan bersumber dari umbi porang ( Amorphophallus oncophyllus ). Glukomanan tersusun dari monomer D-glukosa dan D- manosa dengan ikatan β -1,4 (Katsuraya et al. , 2003; Tester and Al-Ghazzewi, 2013). Ayam tidak memiliki  en zim yang dapat mencerna ikatan β sehingga glukomanan berpotensi sebagai prebiotik. Glukomanan porang juga dapat menurunkan mortalitas ayam broiler (Perdinan et al ., 2019; Larasati et al. , 2021).
Bacillus subtilis adalah salah satu kandidat probiotik yang  digunakan pada unggas. Bacillus subtilis natto berpotensi sebagai probiotik  (Nhi dan Huong, 2016). Probiotik seperti Bacillus sangat  cocok  digunakan  pada  ayam  broiler  karena  aktif  setelah pemberian,  dapat  tumbuh  dalam  saluran  pencernaan,  dan  berfungsi  dalam mekanisme  metabolik  aktif  (misalnya  sekresi  senyawa  antimikroba  dan  atau kompetisi nutrisi) (Deniz et al ., 2011).
Beberapa penelitian menggunakan Bacillus subtilis dalam pakan dapat menurunkan populasi Salmonella dan Coliform serta  meningkatkan  produktivitas  ayam  broiler (Knap et al ., 2011; Deniz et al ., 2011; Harrington et al ., 2016; Koli et al ., 2017). Sheng-Qiu et  al .  (2013)  juga  menyatakan  bahwa Bacillus  subtilis natto dapat  memperbaiki morfologi usus dan menaikkan produktivitas bebek.  Samanya dan Yamauchi (2002) meneliti  tentang ayam  yang  diberi Bacillus  subtilis natto selama  28  hari  memiliki kecenderungan produktivitas dan histologi  usus  yang lebih  baik, seperti  tinggi  vili yang menonjol dan sel yang lebih luas daripada kontrol. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh glukomanan porang ( Amorphophallus oncophyllus ) dan Bacillus subtilis terhadap morfologi usus dan produktivitas ayam broiler.

## METODE PENELITIAN
Seratus enam puluh day old chick (DOC) broiler strain New Lohmann dari PT. Japfa Comfeed  digunakan dalam penelitian  selama 35 hari. Glukomanan porang dibuat menurut metode Harmayani et al . (2014). Kandidat probiotik yang digunakan adalah Bacillus  subtilis FNCC 0059 dari  Pusat Studi  Pangan dan  Gizi,  Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia. Pakan basal terdiri dari jagung kuning, bekatul, bungkil kedelai, tepung tulang daging, tepung daging unggas, dikalsium fosfat, L-lisin, DL- metionin, kalsium karbonat, dan premiks yang memiliki kandungan nutrien 2965,7% energi metabolis, 21,3% kasar protein, ekstrak eter 4,7%, serat kasar 4,5%, metionin 0,6%, lisin 1,2%, kalsium 1%, dan fosfor 0,7%. Rancangan acak lengkap disusun dengan 4 perlakuan dan 4 ulangan (masing-masing 10 ekor). Perlakuan yang diberikan adalah T0 (kontrol), T1 (glukomanan porang 0,1%), T2 ( Bacillus subtilis 1 mLx10 8 cfu/mL), dan T3 (glukomanan porang 0,1% dan Bacillus subtilis 1 mLx10 8 cfu/mL). Pakan dan air minum diberikan secara ad libitum .
Metode pengambilan sampel yang digunakan adalah acak sederhana. Pertambahan bobot badan diukur dari selisih bobot badan umur 35 hari dengan bobot badan umur 1 hari. Mortalitas diperoleh dari jumlah ayam yang mati selama pemeliharaan dibagi dengan jumlah total ayam yang dipelihara pada setiap perlakuan. Ayam diambil 1 ekor  secara acak dari tiap unit percobaan (4 ekor  per perlakuan) untuk disembelih pada umur 35 hari dan diambil organ jejunum untuk analisis tinggi vili usus. Sampel jejunum segar dipotong sepanjang 2 cm kemudian difiksasi dalam 10% buferformalin,
dibiarkan terendam 24 sampai 48 jam, dan dibuat preparat histologi. Cara penyiapan preparat haematoxylin – eosin, setiap potongan sampel jaringan dihidrasi melalui satu seri alkohol yang konsentrasinya bertingkat semakin meninggi. Sampel ditransfer satu demi satu ke dalam setiap konsentrasi alkohol dan dibiarkan untuk terendam dalam setiap  konsentrasi  alkohol  tersebut  kira-kira  10  detik.  Untuk  selanjutnya sampel tersebut  dimasukkan  dalam  xytol  dan  akhirnya  dicelupkan  dalam  parafin. Menggunakan  microtome,  sampel  disayat  tipis  untuk  seterusnya  dilakukan pengecatan haematoxylin-eosin. Preparat histologi yang sudah siap dalam objek glas diamati dan diukur menggunakan mikroskop dengan bantuan komputer.
Langkah  untuk  pengukuran  tinggi  vili  terlebih  dahulu  obyek  ditentukan menggunakan mikroskop yang dilengkapi proyektor diatur dengan perbesaran 4 kali. Gambaran histologi muncul pada layar monitor. Setelah ditemukan morfologi  usus sesuai dengan yang diharapkan, dilakukan pemotretan seluruh preparat yang diukur. Pengukuran  minimum  tiga  kali  per slide yang  dibuat  untuk  setiap  parameter. Selanjutnya cara pengukuran tinggi  vili  dilakukan  menggunakan komputer  layar datar dengan program Microsoft Office Picture Manager pada perbesaran 40%. Standar ukuran µm  ditentukan lebih  dahulu dengan bantuan komputer  yaitu berapa nilai perbesaran yang  dipakai  atau  diinginkan  dikonversikan  kedalam  satuan  panjang (µm). Angka satuan µm yang diperoleh selanjutnya digunakan sebagai standar dalam mengukur tinggi vili yang terpampang pada layar monitor.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Morfologi usus disajikan dalam bentuk data tinggi vili (Tabel 1). Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa terdapat pengaruh perlakuan terhadap tinggi vili usus. Hasil uji lanjut menyatakan bahwa T0 memiliki vili yang lebih rendah dibandingkan perlakuan lainnya. Vili T1, T2, dan T3 lebih tinggi dari T0. Namun, T1, T2, dan T3 tidak berbeda nyata (P>0,05). Perlakuan prebiotik glukomanan porang, probiotik Bacillus subtilis , dan sinbiotik glukomanan porang plus Bacillus subtilis dapat meningkatkan tinggi vili usus ayam broiler dibandingkan dengan kontrol.
Tabel 1. Pengaruh Suplementasi Glukomanan  Porang, Bacillus  subtilis ,  dan Kombinasinya terhadap Tinggi  Vili  Usus Ayam Broiler Variabel Perlakuan T0 T1 T2 T3 Tinggi vili (µm) 1230.77 b 1362.15 a 1409.91 a 1451.30 a Keterangan: ab Superskrip  huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan  beda  nyata. T0 = pakan basal; T1 = pakan basal + glukomanan porang; T2 = pakan basal + Bacillus subtilis ; T3 = pakan basal + glukomanan porang + Bacillus subtilis.
Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa terdapat pengaruh perlakuan terhadap PBB dan mortalitas ayam broiler. Berdasarkan uji lanjut, perlakuan T1, T2, dan T3 berbeda nyata (P ≤ 0,05) dengan kontrol  pada bobot  badan PBB,  dan konversi  pakan ayam broiler (Tabel 2). perlakuan prebiotik, probiotik, atau sinbiotik dapat menaikkan bobot badan dan  PBB  serta  menurunkan konversi  pakan dibandingkan  dengan kontrol Tidak terdapat perbedaan yang nyata (P>0,05) terhadap konsumsi pakan ayam broiler pada penelitian ini. Mortalitas T0, T1, dan T2 adalah sebesar 2,5% dan tidak diperoleh kematian pada perlakuan sinbiotik T3.
Tabel 2. Pengaruh Suplementasi Glukomanan  Porang, Bacillus  Subtilis ,  dan Kombinasinya Terhadap PBB dan Mortalitas  Ayam Broiler Parameter Perlakuan T0 T1 T2 T3 PBB (g/ekor) 1635,3 b 1921,0 a 1967,9 a 1955,2 a Mortalitas (%) 2,5 a 2,5 a 2,5 a 0 b
Keterangan: ab Superskrip  huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan  beda  nyata. T0 = pakan basal; T1 = pakan basal + glukomanan porang; T2 = pakan basal + Bacillus subtilis ; T3 = pakan basal + glukomanan porang + Bacillus subtilis.
Taklimi et  al. (2012) dan  Perdinan et  al. (2019) menyatakan bahwa keseimbangan mikroflora akibat perlakuan prebiotik  glukomanan dapat meningkatkan daya tahan tubuh dan tinggi vili  ayam broiler. Sheng-Qiu et al . (2013) juga melaporkan tentang Bacillus subtilis natto 0,2% yang diberikan pada bebek  dapat memperbaiki morfologi usus. Samanya dan Yamauchi (2002) menyatakan bahwa ayam yang diberi Bacillus subtilis natto selama 28 hari memiliki kecenderungan produktivitas dan histologi usus yang lebih baik, seperti  tinggi  vili yang menonjol dan sel  yang lebih  luas daripada kontrol. Tayeri et al. (2018) dan Julendra et al. (2021) berpendapat bahwa ayam broiler yang diberi perlakuan sinbiotik  memiliki  vili usus yang lebih tinggi. Sejalan dengan penelitian ini bahwa perlakuan prebiotik, probiotik, dan sinbiotik  memiliki vili yang lebih  tinggi  dibandingkan dengan kontrol. Pertumbuhan vili  membuktikan bahwa prebiotik, probiotik, atau sinbiotik dapat meningkatkan produktivitas ayam menjadi lebih baik.
Kridtayopas et  al. (2019)  menyatakan  bahwa  fungsi  prebiotik  atau  sinbiotik menguntungkan  keseimbangan  ekologi  mikroba  dalam  saluran  pencernaan, mencegah stres, meningkatkan pemanfaatan nutrisi melalui kesehatan usus dengan memaksimalkan  fungsi  pencernaan dan  penyerapan nutrisi,  sehingga  menaikkan produktivitas ayam. Sejalan dengan Larasati dan Perdinan (2022) yang menyatakan bahwa  penggunaan  sinbiotik  glukomanan  porang  dan Bacillus  subtilis mampu meningkatkan bobot badan dan menurunkan konversi pakan. Pemberian glukomanan porang dan Bacillus  subtilis dapat meningkatkan PBB  dan  menurunkan mortalitas ayam  broiler.  Tidak  ada  kematian  yang  ditemukan  pada  kelompok  sinbiotik. Sebaliknya, ayam broiler  perlakuan kontrol, prebiotik,  dan probiotik  menunjukkan mortalitas  2,5%.  Kridtayopas et  al .  (2019) melaporkan  bahwa  sinbiotik  memiliki mortalitas  yang  lebih  rendah  daripada  prebiotik  dan  kontrol.  Sinbiotik  lebih memberikan  manfaat  untuk  mencegah  efek  stres  yang  tidak  diinginkan  karena kombinasi  prebiotik  dan  probiotik  sebagai  sinbiotik  memiliki  efek  sinergis  yang mampu  mengatasi  gangguan  pertumbuhan  seperti  bakteri  patogen  dan  stres lingkungan  sehingga  kematian  ayam  broiler  menurun  (Kridtayopas et  al .,  2019; Brugaletta et al ., 2020).

## SIMPULAN
Suplementasi glukomanan porang ( Amorphophallus oncophyllus ) dan Bacillus subtilis dapat memperbaiki morfologi usus dalam meningkatkan tinggi vili serta menaikkan produktivitas dengan  meningkatkan PBB  dan  menurunkan mortalitas  pada ayam broiler.

## DAFTAR PUSTAKA
Brugaletta, G., A. De Cesare, M. Zampiga, L. Laghi, C. Oliveri, C. Zhu, G. Manfreda, B.  Syed,  L. Valenzuela &  F.  Sirri. (2020). Effects of  Alternative Administration Programs of A Synbiotic Supplement on Broiler Performance, Foot Pad Dermatitis, Caecal Microbiota, and Blood Metabolites . Animals , 10, 1-18.
Deniz, G., A. Orman, F.  Cetinkaya, H. Gencoglu, Y. Meral, & I.I. Turkmen. (2011). Effects of Probiotic (Bacillus subtilis DSM 17299 ) Supplementation on The Caecal Microflora and Performance in Broiler Chickens . Revue Med. Vet., 162(11), 538-545. Farnworth, E.R. (2001). Probiotics and Prebiotics. In: Wildman, R.E.C. (Ed.), REC Handbook of Nutraceuticals and Functional Foods , USA: CRC Press.
Gaggia, F., P. Mattarelli, & B. Biavati. (2010). Probiotics and Prebiotics in Animal Feeding for Safe Food Production . Int. J Food Microbiol. Suppl., 141(1), S15-28.
Harmayani, E., V. Aprilia, & Y. Marsono. (2014). Characterization of Glucomannan from Amorphophallus oncophyllus and Its Prebiotic Activity in Vivo . Carbohydr. Polym., 112 (2014), 475 – 479.
Harrington. D., M. Sims, & A.B. Kehlet. (2016). Effect of Bacillus subtilis Supplementation in Low Energy Diets on Broiler Performance . J. Appl. Poult. Res . , 25, 29-39.
Julendra, H., A. Sofyan, L. Istiqomah, M.F. Karimy, Abinawanto, & Yasman. (2021). Intestinal  Morphology, Energy Availability, and Growth Performance of  Broilers Treated with The Combination of Probiotic and Inulin . Trop. Anim. Sci. J., 44(1), 39- 47.
Katsuraya, K., K. Okuyama, K. Hatanaka, R. Oshima, T. Sato, & K. Matsuzaki. (2003). Constitution of Konjac Glucomannan: Chemical Analysis and 13c Nmr Spectroscopy . Carbohydr. Polym., 53, 183-189. Kementerian Pertanian.  (2017).  Peraturan  Menteri Pertanian  nomor
14/permentan/pk.350/5/2017 tentang Klasifikasi Obat Hewan.
Knap, I., A.B. Kehlet, M. Bennedsen, G.F. Mathis, C.L. Hofacre, B.S. Lumpkins, M.M. Jensen, M.M. Jensen, M. Raun, & A. Lay. (2011). Bacillus subtilis (DSM 17299) Significantly Reduces Salmonella in Broilers . Poult. Sci., 90, 1690-1694.
Koli, D., M. Kadam, M. Gole,  A. Patil, S. Hajare, A. Yeskal, S. Kolte, & N. Kurkure. (2017). Efficacy of Bacillus  Subtilis (Gallipro) Supplementation in  Clostridium perfringens Challenged Necrotic Enteritis of Broiler Chicken . Indian. J. Anim. Res., DOI:10.188805/ijar.B-3253.
Kridtayopas, C., C. Rakangtong, C. Bunchasak, & W. Loongyai. (2019). Effect of Prebiotic and Symbiotic Supplementation in  Diet  on  Growth Performance, Small  Intestinal Morphology, Stress, and Bacterial Population Under High Stocking Density Condition of Broiler Chickens . Poult. Sci . , 0, 1-11.
Larasati, Y.N., E.  Harmayani, J.  Widada, Nurliyani, &  A.  Perdinan. (2021). Caecal bacterial composition of broiler chickens affected by porang glucomannan . J. Indones. Trop. Anim. Agric . , 46(3): 187-198. Larasati, Y.N. & A. Perdinan. (2022). Performance of Broilers Supplemented with Porang Glucomannan  and  Bacillus  subtilis .  J.  Pengembangan Penyuluhan Pertanian,
19(36): 113-118.
Nhi,  N.T.H. &  N.T. Huong.  (2016). Examining Some  Probiotics Activities  of  Bacillus Subtilis Natto . IJMER, 6(5), 33-37.
Perdinan,  A.,  H.I.  Wahyuni,  &  N.  Suthama.  (2019). Body  Resistance  and  Growth Performance  of  Broiler  Fed  Glucomannan  Extracted  from  Amorphophallus Oncophyllus Tuber . Trop. Anim. Sci. J., 42(1), 33-38.
Samanya, M. & K. Yamauchi. (2002). Histological Alterations of Intestinal Villi in Chickens Fed Dried Bacillus subtilis var. natto. Comp. Biochem. Physiol. Physiol . , 133, 95-104.
Sekhon, B.S. &  S. Jairath. (2010). Prebiotics, Probiotics and Synbiotics : An  Overview . J. Pharm. Educ. Res. 1, 13-36.
Sheng-Qiu, T., D. Xiao-Ying, J. Chun-Mei, P. Jing-Jing, L. Shan-Shan, & C. Jin-Ding. (2013). Effect of Bacillus subtilis natto on Growth Performance in Muscovy Ducks. Braz. J. Poult. Sci., 15(3), 191-197. Sugiharto, S.  (2014). Role  of  Nutraceuticals in  Gut  Health and  Growth Performance of Poultry . J. Saudi Soc. Agric. Sci., 113.
Taklimi,  S.,  Mozafar  S.M.,  Hassan  Ghahri,  &  Mohammad  Asadi  Isakan.  (2012). Influence of Different Levels of Humic Acid and Esterified Glucomannan on Growth Performance and Intestinal Morphology of Broiler Chickens . Agric. Sci., 3(5), 663- 668.
Tayeri, V., A. Seidavi, L. Asadpour., & C.J.C. Phillips. (2018). A Comparison of The Effect of Antibiotics, Probiotics, Synbiotics and Prebiotics on The Performance and Carcas Characteristics of Broilers . Vet. Res. Commun . , 42, 195-207.
Tester, R.F. & F.H. Al-Ghazzewi. (2013). Mannans and Health, with A Special Focus on Glucomannans. Food Res. Int., 50(2013), 384-391.
Van Immerseel, F., L. De Zutter, K. Houf, F. Pasmans, F. Haesebrouck, & R. Ducatelle. (2009). Strategies to Control Salmonella in  The Broiler Production C hain. World’s Poult. Sci. J., 65, 367-392.