## PERBAIKAN METODE INTRODUKSI GEN PADA Kappaphycus alvarezii

## IMPROVEMENT METHOD OF GENE TRANSFER IN Kappaphycus alvarezii
St. Hidayah Triana 1,2,3 , Alimuddin 2* , Utut Widyastuti 3,4 , Suharsono 3,4 ,
Emma Suryati 5 , dan Andi Parenrengi 5
1 Jurusan Budidaya Perairan, FPIK, Universitas Muslim Indonesia, Makassar
2 Departemen Budidaya Perairan, FPIK, IPB. Kampus IPB Dramaga, Bogor
3 Pusat Studi Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi.  Kampus IPB Dramaga, Bogor
4 Departemen Biologi, FMIPA IPB.  Kampus IPB Dramaga, Bogor
5 Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau, Maros *E-mail: alimuddin@ipb.ac.id

## ABSTRACT
Method of foreign gene transfer in red seaweed Kappaphycus alvarezii has been reported, however, li- mited number of transgenic F0 (broodstock)  was obtained. This study was  conducted to improve the method of gene transfer mediated by Agrobacterium tumefaciens in order to obtain high percentage of K. alvarezii transgenic. Superoxide dismutase gene from Melastoma malabatrichum (MmCu/Zn-SOD) was used as model towards increasing adaptability of K. alvarezii to environmental stress. The treat- ments  were  the  culture  media  and  recovery  duration, and  each  treatment  consisted  of  three  replica- tions. The best method  was co-cultivation using liquid media, then recovery  was conducted in liquid media for 10 days. That treatment allowed higher transformation percentage (90%), regeneration effi- ciency  (90%),  putative  bud  efficiency  (100%),  number  of  buds  and  explants  sprouted  (100%)  and transgenic  explants  (100%).  The  transgenic  explants  showed  an  amplification  PCR  product  of  Mm- Cu/Zn-SOD  gene  fragment,  whereas  the  non-transgenic  explants  showed  no  amplification  product. All results revealed that suitable method of transgenesis for K. alvarezii has been developed.
Keywords : Agrobacterium  tumefaciens,  culture  media,  Kappaphycus  alvarezii,  recovery  duration, transformation

## ABSTRAK
Metode introduksi gen asing pada rumput laut Kappaphycus alvarezii telah dilaporkan, namun  jumlah transgenik  F0  (induk)  yang  diperoleh  sedikit.  Penelitian  ini  dilakukan  untuk  memperbaiki  metode transfer  gen  yang  dimediasi  oleh Agrobacterium  tumefaciens untuk  mendapatkan K.  alvarezii trans- genik yang banyak. Gen penyandi superoksida dismutase dari Melastoma malabatrichum ( MmCu/Zn- SOD )  digunakan  sebagai  model  untuk  meningkatkan  ketahanan K.  alvarezii terhadap  stres  ling- kungan.  Perlakuan terdiri atas jenis  media kultur dan  lama pemulihan, dan setiap perlakuan  diberi 3 ulangan. Metode terbaik adalah kombinasi perlakuan antara kokultivasi dilakukan pada media cair dan kemudian  dilakukan  pemulihan  juga  pada  media  cair  dengan  durasi  pemulihan  selama  10  hari.  Pada perlakuan  tersebut  diperoleh  hasil  tertinggi  pada  persentase  transformasi  (90%),  efisiensi  regenerasi (90%),  efisiensi  tunas  putatif  (100%),  dan  eksplan  transgenik  (100%).  Eksplan  transgenik  menun- jukkan  adanya  fragmen  gen MmCu/Zn-SOD produk  amplifikasi  PCR , sedangkan  eksplan  non- transgenik tidak menunjukkan produk amplifikasi. Dengan demikian metode transfer gen yang sesuai untuk K. alvarezii telah berhasil diperoleh.
Kata  kunci : Agrobacterium  tumefaciens, media  kultur, Kappaphycus  alvarezii, lama  pemulihan,  in- troduksi

## I. PENDAHULUAN
Rumput  laut Kappaphycus  alvarezii merupakan  salah  satu  komoditas  budidaya
laut  andalan  Indonesia.  Masalah  serius  yang masih sering dihadapi dalam budidaya K. al- varezii adalah  penurunan  hasil  panen  dise- babkan  oleh  penyakit ice-ice (bercak  putih).
Penyakit  ini diduga penyebab utamanya ada- lah perubahan lingkungan yang ekstrim yang berlangsung dalam waktu lama sehingga me- nyebabkan rumput laut mengalami stres (Ari- sandi et  al .,  2011).  Strain  rumput  laut  tahan stres  lingkungan  merupakan  salah  satu  alter- natif pemecahan masalah penyakit ice-ice . Superoksida  dismutase  (SOD)  meru- pakan  enzim  yang  mengkatalisis  dismutase radikal  anion  superoksida  (O 2 - )  menjadi  hi- drogen  peroksida  (H 2 O 2 )  dan  molekul  oksi- gen  (O 2 ).  Enzim  ini  memegang  peranan penting  dalam  sistem  pertahanan  tubuh, terutama    aktivitas  senyawa  oksigen  reaktif yang dapat  menyebabkan stres.  Transfer  gen superoksida  dismutase  yang  berasal  dari tanaman Melastoma malabathricum ( MmCu/ Zn-SOD )  meningkatkan  daya  tahan  tanaman Nicotiana  benthamiana dan Nicotiana  taba- cum terhadap  cekaman  aluminum  (Hannum, 2012).  Tanaman  transgenik MmCu/Zn-SOD lainnya  seperti  tanaman  jarak  dan  padi  baru sampai  pada  tahap  keberhasilan  introduksi gen  ke  dalam  genom  tanaman.  Peningkatan daya  tahan K.  alvarezii terhadap  stres lingkungan  diharapkan  dapat  diperoleh melalui transfer gen MmCu/Zn-SOD . Transfer  gen  asing  pada K.  alvarezii telah  dilakukan  menggunakan  metode  yang dimediasi  oleh Agrobacterium  tumefaciens dengan gen PaCS (Daud et al., 2013), gen li- sozim  (Handayani et  al., 2014),  dan  gen Mamt2 sebagai  model (Fajriah et  al., 2015). Kedua  peneliti  yang  pertama menggunakan media Prevasoli’s  enriched  seawater (PES) padat, sedangkan  Fajriah et al. (2015) meng- gunakan  PES  cair.  Efisiensi  regenerasi  dan transformasi  yang  diperoleh  Daud et  al. (2013)  dan  Handayani et  al. (2014)  yang menggunakan  PES  padat  sangat  rendah  di- bandingkan  dengan  menggunakan  PES  cair (Fajriah et al., 2015). Demikian juga efisiensi regenerasi  yang  diperoleh  pada  penelitian Triana  (2016)  tahap  pertama  relatif  rendah, yakni  6,67%  bila  menggunakan  OD 600 0,5 dengan  lama  inokulasi  60  menit  dan  kokul- tivasi 3 hari, dan 26,67% dengan mengguna- kan OD 600 0,4 dengan lama inokulasi 30 me-
nit dan kokultivasi 4 hari.  Hal ini yang men- dasari untuk  memperbaiki  metode introduksi gen pada K. alvarezii.
Keberhasilan  transfer  gen  pada  tana- man  tergantung  pada  keberhasilan  regenera- si tanaman  (Purnamaningsih,   2006).   Media kultur merupakan salah satu faktor yang ber- pengaruh  terhadap  keberhasilan  regenerasi pada  kultur in  vitro tanaman  (Wattimena, 1992;  Wetter  dan  Constable,  1991).  Media kultur dapat berbentuk cair  dan  padat. Pemi- lihan jenis media tergantung pada  jenis tana- man,  faktor  aerasi,  bentuk  pertumbuhan  dan diferensiasi  yang  dinginkan  (Pierik,  1987). Selanjutnya,  tahap  kokultivasi juga  mempe- ngaruhi  keberhasilan  introduksi  gen  pada  ta- naman  (Wu et  al. , 2006;  Islam et al., 2015). Tahap  kokultivasi  adalah  tahap  dimana bakteri Agrobacterium  tumefaciens dan  eks- plan  rumput  laut  hidup  bersama  dalam  satu media. Selain itu, lama waktu pemulihan ( du- ration  of  recovery )  diperhatikan  agar  diper- oleh kelangsungan  hidup tinggi  bagi  eksplan setelah kokultivasi di ruang gelap untuk ber- egenerasi  di  media  seleksi.  Berdasarkan  hal tersebut,  penelitian ini dilakukan untuk men- dapatkan  metode  yang  memberikan  keber- hasilan  tinggi  dalam  pembuatan K.  alvarezii transgenik,  dengan  membandingkan  efekti- vitas  penggunaan  media  kultur  cair,  padat dan  kombinasi  keduanya,  pada  tahap  kokul- tivasi dan pemulihan, dengan lama waktu pe- mulihan yang berbeda.

## II. METODE PENELITIAN

## 2.1.  Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan Mei 2014  sampai dengan  Juli 2015 di Labo- ratorium  Biotechnology  Research  Indonesia- The  Netherland  (BIORIN),  dan  Laborato- rium  Biologi  Molekuler  dan  Seluler  Tana- man,  Pusat  Penelitian  Sumberdaya  Hayati dan  Biologi (PPS HB) IPB, Bogor.

## 2.2.  Rancangan Percobaan
Penelitian  dilakukan  menggunakan rancangan acak lengkap dengan pola faktori-
al  yang  terdiri  atas  dua  faktor.  Faktor  per- tama  adalah  jenis  media  kultur,  yakni:    A1) media cair, baik pada tahap kokultivasi mau- pun  pada  tahap  pemulihan  (disingkat  KP: CC);    A2)  media  padat  pada  tahap  kokulti- vasi,  dan    media  cair  pada  tahap  pemulihan (KP:  PC);  dan  A3)  media  padat,  baik  pada tahap  kokultivasi  maupun  pada  tahap  pemu- lihan  (KP:  PP).  Faktor  kedua  adalah  perla- kuan  lama  pemulihan  (LP),  yaitu:  B1)  10 hari,  B2) 20 hari, dan  B3)  30 hari.  Dari ke- dua faktor diperoleh sembilan kombinasi per- lakuan dengan tiga kali ulangan.   Setiap unit perlakuan  menggunakan  10  eksplan  rumput laut.

## 2.3. Rumput Laut dan Preparasi Eksplan
Rumput  laut K.  alvarezii yang  digu- nakan  dalam  penelitian  merupakan  koleksi Balai  Penelitian  dan  Pengembangan  Budi- daya Air Payau (BPPBAP) Maros,  yang ber- asal dari  Kabupaten Takalar, Sulawesi Sela- tan.  Selanjutnya,  eksplan  disiapkan  dengan cara  memotong  talus  rumput  laut  sehingga berukuran  0,5-0,8  cm,  kemudian  disterilkan mengikuti  metode  Suryati  dan  Mulyaning- rum (2009).
2.4. Penyiapan  Bakteri Agrobacterium tumefaciens
Penyiapan  bakteri A.  tumefaciens di- lakukan  mengikuti  metode Hannum (2012). Isolat A.  Tumefaciens LB 4404  membawa plasmid  pGWB5  dan  mengandung  gen  pe- nyandi  enzim  superoksida  dismutase  dari
tanaman Melastoma malabathricum ( MmCu/ Zn-SOD )  yang  dikendalikan  oleh promoter 35S CaMV (Gambar 1). Subkultur bakteri di- lakukan  selama  18  jam.    Endapan A.  Tume- faciens diresuspensi  menggunakan  larutan media  PES  cair  sampai  OD  mencapai  0,4 (Triana, 2016).

## 2.5.  Inokulasi dan Kokultivasi
Inokulasi  dan  kokultivasi  dilakukan menggunakan  metode  yang  dilaporkan  oleh Triana (2016), yaitu inokulasi selama 30 me- nit  dengan  kokultivasi  selama  4  hari.  De- ngan lama inokulasi dan kokultivasi tersebut, diperoleh  efisiensi  regenerasi  dan  persentase transformasi yang tinggi.

## 2.6.  Pemulihan dan Seleksi Eksplan
Sebelum  eksplan  ditumbuhkan  pada media  pemulihan  [PES  cair  atau  padat  0,4% (berdasarkan  perlakuan  media  kultur),  air laut  28 g/L], terlebih dahulu direndam  sela- ma 15-20 menit di dalam media air laut yang mengandung    cefotaksim  (100  mg/mL)  dan dikultur di media pemulihan berdasarkan per- lakuan LP. Eksplan yang hidup di media pe- mulihan  selanjutnya  dikultur  pada  media seleksi (PES cair atau padat 0,4%, air laut 28 g/L  +  higromisin  10  mg/L)  selama  14  hari. Selanjutnya,  eksplan  dipindahkan  ke  media pemulihan  [PES  cair  atau  padat  0,4%  sesuai perlakuan  media  kultur,  air  laut  280  g/L] selama  10  hari,  kemudian  dipindahkan  ke media  PES  cair . Semua  kultur in  vitro diin- kubasi dalam ruangan dengan suhu 20-25 o C.
NosP NPT 35S
SOD GFP NosT
35S::HPT RB LB NosT
Hind III Att B1
Att B2 Sac I Xba I 456 bp
Gambar  1.  Konstruksi  plasmid  biner  pGWB- MmCu/Zn-SOD yang  membawa  gen  penyandi enzim superoksida dismutase  (SOD, berukuran 456 bp)  dari tanaman Melastoma malabathricum (Hannum,  2012).  RB: right  border ,  NosP:  promoter  Nos,  NPT: gen neomycin  phosphotransferase II  penyandi  resistensi  antibiotik  neomisin, NosT:  terminator  Nos,  HPT:  gen hygromycin  phosphotransferase penyandi resistensi antibiotik higromisin, 35S: promoter 35S CaMV, LB: left border .
2.7.   Identifikasi Transgenik Mengguna- kan PCR
2.7.1.  Ekstraksi  DNA Genom Rumput Laut
Ekstraksi  DNA  genom  rumput  laut dilakukan  mengikuti  metode  Wattier et  al. (2000).  Jumlah  tunas  yang  diperiksa  seba- nyak lima tunas setiap kombinasi perlakuan.

## 2.7.2.  Reaksi PCR dan Elektroforesis
Rumput  laut  transgenik  diidentifikasi menggunakan  PCR  dengan  primer  spesifik gen  penyandi MmCuZn-SOD ( MmSOD -F1: 5’-ATGGTGAAGGCTGTGGTTGT-3’  dan MmSOD -R2 : 5’CATCTCCAACGGTGACA TTG-3’)  untuk  deteksi  keberadaan  gen Mm- CuZn-SOD .  Selanjutnya,  konfirmasi  keutu- han konstruksi gen dalam genom rumput laut dilakukan dengan menggunakan primer 35S- F2  :  5’-AAACCTCCTCGGATTCCATT-3’ dan MmSOD -R2:  CATCTCCAACGGTGAC ATTG-3’. Ketiga set primer tersebut didesain oleh  Hannum  (2012).  Komposisi  dan  proses PCR  yang  digunakan    mengikuti  Triana (2016).
Elektroforesis  hasil  PCR  dilakukan pada gel agarosa 1% (b/v) pada tegangan 100 volt  selama  30  menit.  Gel  diwarnai  dalam larutan  etidium  bromida  (0,5  mg/L)  dan  vi- sualisasi  hasil  PCR  diamati  dengan  UV transiluminator.  Dokumentasi fotografi dila- kukan dengan perangkat gel doc.

## 2.8.  Parameter Uji dan Analisis Data
Kriteria keberhasilan transformasi da- pat ditinjau dari  persentase transformasi, efi- siensi  regenerasi,  dan  efisiensi  tunas  putatif. Persentase  transformasi  diperoleh  dari  jum- lah  eksplan  yang  tahan  antibiotik  higromisin dibandingkan  dengan  jumlah  eksplan  selu- ruhnya (Daud et  al. , 2013;  Handayani et  al., 2014).  Efisiensi  regenerasi  diperoleh  dari jumlah  eksplan  yang  menghasilkan  tunas  di- bandingkan  dengan  jumlah  eksplan  seluruh- nya. Efisiensi tunas putatif dihitung dari jum- lah  eksplan  yang  menghasilkan  tunas  diban- dingkan dengan jumlah tunas tahan antibiotik higromisin  (Handayani et  al., 2014).  Data
persentase  transformasi,  efisiensi  regenerasi dan  efisiensi  tunas  putatif  dianalisis  meng- gunakan  ANOVA  dengan  bantuan  program SPSS  versi  18,  dan  perbedaan  antar  perla- kuan dianalisis menggunakan uji lanjut Dun- can’s  pada  p=0,05.  Uji  korelasi  antar  faktor perlakuan  dilakukan  menggunakan  uji  reg- resi,  sedangkan  antar  parameter  menggu- nakan  uji  Pearson. Data hasil PCR dianalisis secara deskriptif.

## III.   HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1.  Hasil
3.1.1.  Pengaruh Media Kultur
Persentase  transformasi  (PT) , efisi- ensi  regenerasi  (ER)  dan  efisiensi  tunas  pu- tatif  (ETP) K.  alvarezii menggunakan  media kokultivasi  (K)  dan  pemulihan  (P)  berbeda disajikan  pada  Gambar  2. PT  tertinggi  (P< 0,05) diperoleh pada perlakuan media K cair dan P cair (KP cair-cair: 88,89±5,5%), diikuti oleh  perlakuan  KP  padat-cair  (77,78±7,5%), dan  terendah  adalah  KP:  padat-padat  (60,00 ±45,1%).  Begitu  juga  nilai  PT  untuk  KP padat-cair  (77,78±7,5%)  lebih  tinggi  dari- pada yang menggunakan KP padat-padat (60, 00±45,1%).
Efisiensi  regenerasi  (ER)  perlakuan KP  cair-cair  (75,55±12,6%)  lebih  tinggi  (P< 0,05)  daripada  perlakuan  KP  padat-cair  (65, 56±11,3%)  dan  perlakuan  KP  padat-padat (26,67±21,2%).  ETP  perlakuan  KP  cair-cair (84,78±11,5%)  sama  dengan  KP  padat-cair (84,0±5,3%),  dan  KP  padat-padat  (29,56± 22,3%),  tetapi  keduanya  lebih  tinggi  (P<0, 05) daripada ETP perlakuan KP padat-padat.

## 3.1.2. Pengaruh Lama Waktu Recovery
(Pemulihan)
Setelah kokultivasi selama empat hari dibutuhkan  waktu  pemulihan  sebelum  eks- plan diseleksi menggunakan antibiotik higro- misin.  Masa  pemulihan  ini  berfungsi untuk mengembalikan  eksplan  ke  kondisi  normal secara  berangsur  setelah  diinokulasi  dan  di kokultivasi di ruang gelap.
Gambar  2.  Persentase  transformasi  (PT), efisiensi  regenerasi  (ER)  dan efisiensi tunas putatif (ETP) pa- da  media  kokultivasi  dan  pe- mulihan (KP) berbeda. Cair-cair (media  kokultivasi  cair  dan  pe- mulihan cair), padat-cair (media kokultivasi  padat  dan  pemuli- han  cair    dan  padat-padat  (me- dia kokultivasi padat dan pemu- lihan padat).
Persentase  transformasi  (PT) , efisi- ensi regenerasi (ER) dan efisiensi tunas puta- tif (ETP) K. alvarezii dengan lama waktu pe- mulihan (LP) berbeda disajikan pada Gambar 3. PT dan ER perlakuan 10 dan 20  hari ada- lah  sama  (P>0,05),  tetapi  lebih  tinggi  dari- pada  perlakuan  30  hari  (P<0,05).  PT  pada perlakuan  LP  10  hari,  20  hari  dan  30  hari masing-masing  adalah  85,56±8,1%,  88,89± 6,9%,  52,22±39,5%.  ER  pada  perlakuan  10, 20  dan  30  hari  berturut-turut  adalah  65,56 ±23,5%,  62,22±18,0%  dan  40,0±30,4%. Sementara  itu,  ETP  tertinggi  (P<0,05)  ter- dapat  pada  perlakuan  LP  10  hari,  diikuti  20 hari  dan  terendah  adalah  perlakuan  30  hari. Nilai  ETP  masing-masing  adalah  77,0±25, 3% (LP 10 hari), 70,22±19,9% (LP 20 ha-ri), dan 51,11±38,4% (LP 30 hari).

## 3.1.3. Pengaruh Interaksi Media Kultur dan Lama Waktu Pemulihan
Interaksi pengaruh faktor media kokultivasi-pemulihan  (KP)  dan  lama  pemu- lihan (LP) disajikan pada Gambar 4. Interaksi antara  jenis  media  (KP)  dan  (LP)  berpe- ngaruh  nyata  (P<0.05)  terhadap  parameter PT, ER, dan ETP. Koefisien korelasi KP dan
LP untuk parameter PT sebesar 0,88; ER se- besar  0,99  dan  ETP  0,97.  Selanjutnya  koefi- sien  korelasi  antara  PT  dengan  ER  nilai  se- besar  0,73;  PT  dengan  ETP  sebesar  0,72. Koefisien korelasi tertinggi adalah antara ER dan ETP sebesar 0,95.
Gambar  3.    Persentase  transformasi  (PT), efisiensi  regenerasi  (ER)  dan efisiensi  tunas  putatif  (ETP) pada  waktu  pemulihan  10,  20 dan 30 hari.
Gambar  4.  Interaksi  antara  pengaruh  jenis media  kokultivasi  dan  pemuli- han  (KP),  dan  lama  waktu  pe- mulihan  terhadap  persentase transformasi  (PT),  efisiensi  re- generasi  (ER)  dan  efisiensi  tu- nas  putatif  (ETP).  Dua  huruf pertama  pada  sumbu  X  adalah jenis  media  KP.  Jenis  media kokultivasi dan pemulihan (KP):  cair-cair  (CC),  padat-cair (PC),  padat-padat  (PP).  Angka setelah  2  huruf  pada  sumbu  X adalah  lama  waktu  pemulihan, yakni 10, 20 dan 30 hari.
PT tertinggi didapatkan dengan menggunakan  media  KP:  CC-20  (93,33± 5,8%), KP: CC-10 (90±0%), KP: PP-10 (90± 5,0%) dan KP:  PP-20 (90±5,0%), sedangkan perlakuan  terendah  adalah  KP:  PP-30  (0%). Nilai  efisiensi  regenerasi  tertinggi  diperoleh menggunakan  media  KP:  CC-10  (90±0%), disusul  KP:  CC-20  (73,33±7,6%)  dan  KP: PC-20  (73,33±5,7%),  sedangkan  yang  teren- dah  adalah  KP:  PP-30  (0%).  Efisiensi  tunas putatif tertinggi diperoleh  menggunakan  me- dia KP: CC-10 (100±0%), disusul KP: PC-20 (88,0±1,0%)  dan  KP:  PC-10  (86,67±2,5%), yang  terendah  adalah  KP:  PP-30  (0).  Ber- dasarkan  hasil  interaksi  yang  diperoleh  ter- sebut,  maka  yang  terbaik  adalah  media  ko- kultivasi  cair  dan  pemulihan  cair  dengan lama pemulihan 10 hari (KP: CC-10) dengan nilai PT 90%, ER 90% dan ETP 100%.

## 3.1.4 Analisis PCR
Hasil  analisis  PCR  untuk konfirmasi rumput  laut  transgenik  disajikan  pada  Gam- bar 5. PCR menggunakan primer 35S-F2 dan MmSOD-R2 menghasilkan pita DNA dengan ukuran sebesar 633 pb (Gambar 5A kolom P, T29 , T30,  T31,  T32,  T33,  T34,  T35,  T36, T37,  T38  dan  T39),  sedangkan  dengan  pri- mer MmSOD-F1 dan MmSOD-R2 adalah se- besar  456  pb  (Gambar  5B  kolom  P,  T29, T30,  T31,  T32,  T33,  T34,  T35,  T36,  T37, T38  dan  T39).  Pada  kontrol  non-transgenik (Gambar  5A  dan  5B,  kolom  NT)  tidak  ada produk  PCR.  Dengan  menggunakan  primer aktin, diperoleh produk PCR berukuran seki- tar  600  pb  (Gambar  5  C  kolom  NT  dan  ko- lom  T29-T39),  tetapi  tidak  ada  produk  PCR pada kontrol positif plasmid pGWB5- MmCU /Zn-SOD (Gambar  5B  kolom  P,  T29 , T30, T31, T32, T33, T34, T35, T36, T37, T38 dan T39).  Dengan  demikian,  tunas  rumput  laut pada  kolom  T29 , T30,  T31,  T32,  T33,  T34, T35,  T36,  T37,  T38  dan  T39  adalah  trans- genik  yang  membawa  gen MmCu/Zn-SOD . MmCu/Zn-SOD sebanyak  75%  (30  dari  40 tunas  putatif    yang  diperiksa  PCR.  Jenis media  yang  menghasilkan  eksplan  positif PCR terbaik adalah KP-CC yang menghasil-
kan  86,67%  (13  dari  15  eksplan  yang dianalisis),  disusul  KP-PC  menghasilkan 60,0%  dan  KP-PP  menghasilkan  53,3%. Secara umum media KP: CC dan LP 10 hari adalah  terbanyak  menghasilkan  eksplan  ber- tunas  (27),  jumlah  tunas  (33)  dan  positif membawa gen MmCu/Zn-SOD 100%.
Gambar 5.  Elektroforegram  produk  PCR dengan DNA genom dari rumput laut Kappaphycus  alvarezii hasil introduksi  gen  penyandi MmCu/ Zn-SOD dan nontransgenik. PCR dilakukan  dengan  3  set  primer berbeda,  yaitu  A:  primer 35SF- MmSODR2 ; B: primer MmSODF -MmSODR2 , dan C: primer aktin kedelai,  M=  marker  1  kb  DNA; NT  adalah  kontrol  negatif  (non- transgenik rumput laut); P adalah produk  PCR  dengan  templat berupa  plasmid  pGWB5- MmCU/ Zn-SOD ; T29-T39 adalah rumput laut transgenik.

## 3.2. Pembahasan
Penelitian  transgenik  pada  rumput laut, khususnya K. alvarezii masih sangat ter- batas. Pada penelitian  ini  dilakukan  modifi- kasi metode transfer gen untuk meningkatkan keberhasilan  transgenesis  pada K.  alvarezii . Keberhasilan  transgenesis  pada  rumput  laut ditentukan  oleh  jumlah  eksplan  (persentase transformasi)  yang  hidup pada  media seleksi mengandung  antibiotik,  efisiensi  regenerasi, dan  jumlah  eksplan  transgenik  yang  diper- oleh.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bah-
Tabel 1. Jumlah eksplan bertunas, jumlah tunas, dan tunas positif PCR pada rumput laut
Kappaphycus alvarezii.
Perlakuan Jumlah Persentase eksplan membawa transgen Jenis Media (KP) Waktu Pemulihan (hari) Eksplan Bertunas Tunas CC 10 20 30 27 22 19
33 32 19 100 (5/5) 80 (4/5) 80 (4/5) Total 68 84 86,7 (13/15) PC 10 20 30 20 22 17
22 30 17 80 (4/5) 60 (3/5) 40 (2/5) Total 59 69 60,0 (9/15) PP 10 20 30 12 12 0
18 31 0 60 (3/5) 100  (5/5) 0 Total 24 49 53,3 (8/15)
CC:  media  kokultivasi  cair,  media  pemulihan  cair;  PC:  media  kokultivasi  padat,  media pemulihan  cair;  PP:  media  kokultivasi  padat,  media  pemulihan  padat.  Eksplan  yang membawa transgen ( MmCu/Zn-SOD ) dianalisis menggunakan metode PCR .
wa  persentase  transformasi  tertinggi  dida- patkan  pada  perlakuan  media  KP  CC-20 (93,3%).  Hasil  ini  sekitar  3  kali  lebih  tinggi daripada hasil riset sebelumnya (30,0%). Ca- paian tersebut juga lebih tinggi daripada yang dilaporkan  oleh  Fajriah et  al. (2015)  yang menggunakan  media  cair  (27,4%),  dan  Han- dayani et  al. (2014)  yang  menggunakan  me- dia  padat  (23,6%).  Persentase  transformasi menggunakan  media  padat  pada  riset  ini (60,0%) juga lebih tinggi daripada hasil Han- dayani et al. (2014).
Persentase  transformasi  rendah  pada perlakuan media KP padat-padat (60,0%) di- duga karena banyaknya jumlah eksplan yang mati  pada  tahap  pemulihan  di  media  padat sehingga  eksplan  yang  lolos  higromisin  ma- kin sedikit. Efisiensi regenerasi paling rendah juga terjadi pada perlakuan  media KP padat- padat (26,7%), sedangkan  yang tertinggi  ter- dapat pada media KP cair-cair (75,6%). Jum- lah eksplan sedikit yang hidup di media padat diduga  karena  kemampuan  eksplan  untuk bertahan hidup dan beregenerasi di media pa- dat  lebih  sulit  dibandingkan  di  media  cair,
bahkan  pada  perlakuan  media  KP  padat- padat dengan LP 30 hari semua eksplan mati. Hal  ini  diduga  karena  kadar  air  rendah  dan berlangsung dalam waktu yang lama, eksplan tidak  mampu  mempertahankan  struktur  sel- nya.
Efisiensi  regenerasi  tertinggi  terjadi pada  perlakuan  media  KP  cair-cair  (75,6%). Tingginya  efisiensi  regenerasi  di  media  KP: cair-cair  diduga  disebabkan  karena  rumput laut  merupakan  tanaman  yang  hidup  di  per- airan sehingga jumlah eksplan yang hidup di media cair  baik pada tahap kokultivasi  mau- pun  pemulihan  lebih  sesuai  dibandingkan perlakuan  di  media  padat.  Efisiensi  regene- rasi eksplan di  media KP cair-cair juga lebih tinggi  dibandingkan  dengan  hasil  Fajriah et al. (2015)  yang  menggunakan  media  cair (27,6%).  Hal  tersebut  diduga  karena  perbe- daan  dosis  higromisin  yang  digunakan;  pada riset  ini  digunakan  dosis  yang  lebih  rendah (10 mg/mL), sedangkan Fajriah et al. (2015) menggunakan  dosis  20  mg/mL.  Hal  tersebut sejalan dengan yang dilaporkan oleh Sumarni (2008)  bahwa  dosis  higromisin  berkorelasi
negatif  dengan  eksplan  yang  lolos  higromi- sin.  Pucuk Melastoma  malabathricum me- ngalami  kematian  89%  bila  menggunakan higromisin  10  mg/mL,  sedangkan  pada  kon- sentrasi  25  mg/mL  pucuk  mengalami  kema- tian 100% (Sumarni, 2008).
Efisiensi tunas putatif terendah terjadi pada  eksplan  di  media  KP:  padat-padat  (29, 6%).  Rendahnya  efisiensi  tunas  putatif  di- duga juga disebabkan banyaknya jumlah eks- plan yang mati pada tahap pemulihan di me- dia  padat  sehingga  eksplan  yang  bertunas juga makin sedikit. Untuk efisiensi tunas pu- tatif  tertinggi  didapatkan  pada  perlakuan media KP cair-cair  (84,8%), diikuti oleh KP padat-cair  (84,0%).  Efisiensi  tunas  putatif pada  perlakuan  media  cair  dan  media  padat pada  penelitian  ini  lebih  baik  dibandingkan dengan  Fajriah et  al. (2015)  yang  menggu- nakan  media  cair  (27,6%)  dan  Handayani et al. (2014)  yang  menggunakan  media  padat (11,3%).  Hal  ini  diduga  karena  konsentrasi cefotaksim yang digunakan lebih rendah (100 mg/mL)  sehingga  regenerasi  pada  penelitian ini  lebih  baik dibandingkan Handayani et  al. (2014) dan  Fajriah et  al. (2015)  yang  meng- gunakan  cefotaksim  200  mg/mL.  Hal  terse- but  didukung  oleh  pernyataan  Pipatpanukul et  al. (2004)  bahwa  konsentrasi  cefotaksim 250  mg/mL  dapat  menghambat  regenerasi kalus padi cv. RD6.
Untuk waktu pemulihan diperoleh da- ta  persentase  transformasi  terendah  terjadi pada eksplan  yang dikultur dengan  masa pe- mulihan  30  hari  (52,22%),  dan  yang  terbaik adalah  yang  20  hari  (88,89%)  dan  10  hari (85,56%). Hal ini disebabkan jumlah eksplan yang  lolos  higromisin  sangat  tinggi  karena kemampuan daya hidupnya yang cukup besar terutama  yang  dikultur  pada  media  cair,  se- dangkan  yang  dikultur  di  media  padat  per- sentase  transformasinya  berkorelasi  negatif dengan lama waktu pemulihan.
ER  regenerasi  perlakuan  lama  pemu- lihan  10  hari  (65,56%)  sama  dengan    perla- kuan  lama  pemulihan  20  hari  (62,22%).  Hal ini  menandakan  bahwa  kemampuan  eksplan beregenerasi setelah transformasi mengguna-
kan  waktu  pemulihan  10  hari  sama  saja  de- ngan 20 hari. Akan tetapi, kedua nilai ER ter- sebut lebih tinggi daripada  ER dengan lama pemulihan  30  hari  (40,0%).  Hal  ini  disebab- kan  eksplan  tidak  mampu  beregenerasi  de- ngan baik pada LP 30 hari terutama pada me- dia  KP:  padat-padat  bahkan  eksplan  tidak mampu  bertahan  hidup  (keseluruhannya  ma- ti).  ETP  perlakuan  lama  pemulihan  10  hari lebih tinggi daripada lama pemulihan 20 hari dan  30  hari,  begitu  juga  perlakuan  lama  pe- mulihan  20  hari  lebih  tinggi  daripada  ETP perlakuan  lama  pemulihan  30  hari.  Hal  ini didukung oleh Hiei et  al. (1997)  bahwa  fak- tor  yang  dapat  meningkatkan  persentase transformasi,  salah  satu  diantaranya  adalah kondisi  kultur in  vitro dan  kondisi  kokulti- vasi. Pada penelitian ini efek tersebut terlihat jelas  karena  perbedaan  jenis  media  media kokultivasi, media pemulihan, media seleksi, waktu kokultivasi dan pemulihan.
Ditinjau dari interaksi antar jenis me- dia dan waktu pemulihan, maka eksplan yang memiliki  nilai  efisiensi  regenerasi  dan  efisi- ensi  tunas  putatif  terbaik  adalah  KP:  CC-10 dengan  nilai  masing-masing 90% dan 100%, sedangkan untuk persentase transformasi ter- baik  adalah  KP:  CC-20  (93,33%)  dan  yang terendah  secara  keseluruhan  adalah  KP:  PP- 30  (0%).    Nilai  korelasi  antara  faktor  media KP  dan  LP  di  atas  87%,  menandakan  hubu- ngan  di  antara  keduanya  sangat  erat  khusus- nya pada ER (99%) dan ETP (97%). Dengan kata  lain  bahwa  faktor  KP  dan  LP  sangat kuat dalam mempengaruhi ER dan ETP. Ko- relasi  antara  parameter  efisiensi  regenerasi (ER)  dengan  ETP  lebih  erat  yaitu  95%  di- bandingkan  dengan  persentase  transformasi (PT)  73%.  Hal  ini  diduga  disebabkan  faktor utama  yang  berpengaruh  pada  ER  dan  ETP adalah  jumlah eksplan yang bertunas.  Kore- lasi antara PT dengan ETP sebesar 72%.
Keberadaan  gen Mmcu/Zn-SOD pada eksplan rumput laut hasil transformasi dikon- firmasi  dengan  PCR.  Hasilnya  memperli- hatkan  bahwa  rumput  laut  hasil  transformasi terbukti  sebagai  rumput  laut  transgenik,  se- dangkan  rumput  laut  non-transgenik  tidak
menunjukkan  amplifikasi  fragmen  tersebut. Analisis  PCR  ini  juga  mendukung  hasil  se- leksi  tanaman  transgenik  di  media  selektif mengandung  agen  seleksi  higromisin.  Kom- binasi  primer  ini  juga  digunakan  untuk  ana- lisis  integrasi  gen  pada Nicotiana  bentha- miana dan Nicotiana  tabaccum (Hannum, 2012),  tanaman  jarak  ( J.  curcas )  (Theresia, 2012)  dan  padi Oryza  sativa L.  sub  spesies Japonica (Davis, 2012).
Berdasarkan  jumlah  tunas  putatif yang dihasilkan, maka perlakuan terbaik ada- lah  KP:  CC-10,  KP:  CC-20,  KP:  PC-20  dan KP: PP-20 masing sebesar 33, 32, 30 dan 31. Akan  tetapi,  berdasarkan  jumlah  sampel  tu- nas  transgenik,  maka  perlakuan  terbaik  ada- lah  media  KP:  cair-cair  dan  LP  10  dan  20 hari  (persentase  transgenik  100%).  Hal  ter- sebut  sejalan  dengan  Cortina  dan  Macia (2004)  bahwa  makin  tinggi  persentase  tunas positif PCR, maka makin tinggi keberhasilan transfenesis  pada  tanaman.  Selanjutnya,  per- sentase transgenik pada perlakuan KP: PP-20 juga 100%, namun tetapi efisiensi regenerasi (40,0%)  dan  efisiensi  tunas  putatifnya  (44, 3%)  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  KP CC-10  (ER  90%;  ETP  100%).  Dengan  de- mikian, berdasarkan jumlah tunas putatif dan tunas  transgenik  serta  pertimbangan  waktu, maka  perlakuan  terbaik  pada  riset  ini  adalah KP CC-10.

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan  persentase  transformasi, efisiensi  regenerasi,  dan  persentase  eksplan yang  membawa  gen Mmcu/Zn-SOD ,  maka keberhasilan  tertinggi  dalam  transfer  gen pada Kappaphyucs  alvarezii diperoleh  pada kombinasi  perlakuan  kokultivasi  dilakukan menggunakan  media  cair,  kemudian  pemuli- han  dilakukan  menggunakan  media  cair  de- ngan lama waktu pemulihan 10 hari.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  kepada  Pusat Penelitian  dan  Pengembangan  Budidaya  Air
Payau  Maros,  Sulawesi  Selatan  yang  telah mendanai  dan  memfasilitasi  penelitian  ini melalui  kerjasama  dengan  Pusat  Penelitian dan  Sumberdaya  Hayati  dan  Biologi  (PPS- HB)  IPB Bogor  a.n. Dr. Ir. Utut Widyastuti, MS.  Terima  kasih  juga  kepada  Laborato- rium  Biotechnology  Research  Indonesia  The Netherland (BIORIN) dan Laboratorium Bio- logi  Molekuler  dan  Seluler  Tanaman  (BM ST) yang telah  menyediakan  fasilitas  selama penelitian.  Tidak  lupa  kami  mengucapkan terima  kasih  kepada  mitra  bestari  yang  telah banyak  memberikan  masukan  dan  komentar untuk memperbaiki kualitas paper ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Arisandi,  A.,  H.  Marsoedi,  A. Nursyam,  dan Sartimbul.  2011.  Kecepatan  dan  pro- sentase  infeksi  penyakit ice-ice pada Kappaphycus  alvarezii di  Perairan Bluto  Sumenep. J.  Ilmu  Perikanan dan Kelautan , 3(1):47-51.
Cortina, C., and F.A.C. Macia. 2004. Tomato transformation  and  transgenic  plant production. Plant  Cell,  Tissue  and Organ Culture , 76:269-275.
Daud, R.F., U. Widyastuti, Suharsono, E. Su- ryati,  dan  A.  Parenrengi. 2013. Intro- duksi gen sitrat sintase ke dalam rum- put  laut Kappaphyus  alvarezii meng- gunakan Agrobacterium  tumefaciens.
J. Riset Akuakultur , 8(2):201-208. Davis,  L.M.M.  2012.  Transformasi  genetik padi  ( Oryza  sativa L)  sub  spesies  Ja- ponica  dengan  gen  penyandi  super- oksida  dismutase  dari Melastoma malabathricum menggunakan  peran- tara Agrobacterium tumefaciens. Tesis.  Sekolah  Pascasarjana.  Institut Pertanian Bogor.  Bogor. 46hlm.
Fajriah, U., E. Suryati,  A. Parenrengi, Suhar- sono, dan U.  Widyastuti. 2015. Intro- duksi  gen  metallothionein  tipe  II  ke dalam  rumput  laut Kappaphyus  al- varezii menggunakan Agrobacterium tumefaciens. J.  Riset  Akuakultur ,
9(3):377-385.
Handayani  T.,  Alimuddin,  U.  Widyastuti,  E. Suryati  and  A.  Parenrengi.  2014.  Bi- nary  vector  construction  and Agro- bacterium  tumefaciens -  mediated transformation  of Lysozyme gene in seaweed Kappaphycus alvarezii. Bio- tropia , 21(2):80-90.
Hannum,  S.  2012.  Isolasi,  pengklonan,  dan analisis  ekspresi  gen  penyandi Cop- per/Zinc Superoxide Dismutase ( CuZn-SOD ) dari Melastoma malaba- thricum L.  Disertasi.   Sekolah Pasca- sarjana.  Institut  Pertanian  Bogor.
Bogor. 106hlm.
Hiei,  Y.,    T.  Komari,  and  T.  Kubo.  1997. Transformation  of  rice  mediated  by Agrobacterium  tumefaciens.  Plant Moleculer Biology , 35:205-218.
Islam, M.M., Z.Y. Roly, M.Z. Naim, and M. Khalekuzzaman.  2015.  Agrobacteri- um  mediated    gene  transformation and  regeneration  in  elite  rice  ( Oryza sativa L.)  cultivar  BRRI  dhan56. Af- rican  J.  of  Biotechnology, 14(31): 2415-2423.
Pierik, R.L.M. 1987. In vitro culture of high- er  plants.  Martinus  Nijhoff.  Dord- recht. 344p.
Pipatpanukul,  T.,  S.  Bunnag,  P.  Theerakul- pisut,  and  M.  Kossitrakul.  2004. Transformation  of  indica  rice  ( Oryza sativa L.)  cultivar  RD6  mediated  by Agrobacterium tumefaciens.  Songkla- nakarin  J.  Science  Technology , 26 (1):1-13.
Purnamaningsih,  R.  2006.  Introduksi  gen
DefH9-iaaM dan DefH9-RI-iaaM melalui  vektor Agrobacterium  tume- faciens untuk  meningkatkan  potensi produksi  tanaman  tomat.  Disertasi. Sekolah  Pascasarjana.  Institut  Perta- nian Bogor. Bogor. 148hlm.
Sumarni,  N.  2008.  Pertumbuhan  dan  tole- ransi Melastoma terhadap  antibiotik kanamisin  dan  higromisin  secara in vitro. Tesis.  Sekolah  Pascasarjana.
Institut Pertanian Bogor. 34hlm.
Suryati,  E.,  dan  R.H.  Mulyaningrum.  2009. Regenerasi  rumput  laut Kappaphycus alvarezii (Doty) melalui induksi kalus dan  embrio  dengan  penambahan  hor- mon  perangsang  tumbuh  secara in vitro . J. Riset Akuakultur , 4(1):39-45. Theresia,  A.  2012.  Transformasi  genetik  ja- rak  pagar  ( Jatropha  curcas L.)  de- ngan  gen MmCuZn-SOD penyandi superoksida dismutase melalui peran- tara Agrobacterium  tumefaciens .  Te- sis.  Sekolah  Pascasarjana.  Institut Pertanian Bogor. Bogor. 30hlm.
Triana, S.H. 2016. Introduksi gen dengan pe- rantara Agrobacterium  tumefaciens dan  performa  rumput  laut Kappaphy- cus  alvarezii Transgenik MmCu/Zn- SOD. Disertasi.  Sekolah  Pascasarja- na.  Institut  Pertanian  Bogor.  Bogor. 67hlm.
Wattier,  R.A.,  P.A.  Prodohl,  and  C.A.  Mag- gs.  2000.  DNA  isolation  protocol  for red seaweed (Rhodophyta). Plant Mo- lecular Biology Reporter ,18:275-281. Wattimena,  G.A.  1992.  Bioteknologi  tana- man. Departemen Pendidikan dan Ke- budayaan.  Direktorat  Jenderal  Pendi- dikan Tinggi. Pusat Antar Universitas IPB. Bogor. 145hlm.
Wetter, L.R. and  F.  Constabe. 1991. Metode kultur  jaringan  tanaman.  Edisi  ke- dua. ITB. Bandung. 19hlm.
Wu,  Y.F.,  Y.  Chen,  X.M.  Liang,  and  X.Z. Wang. 2006. An experimental assess- ment  of  the  factors  influencing  agro- bacterium - mediated transformation in tomato. Russian  J.  Plant  Physiology ,
53(2):252-256. Diterima : 24 Januari 2016 Direview : 12 Juni 2016 Disetujui : 27 Juni 2016