## Pengaruh Variasi Waktu Fiksasi Sediaan Apusan Darah Tepi pada Pewarnaan Giemsa terhadap Morfologi Sel Darah Merah
Puput Triyani
Politeknik Piksi Ganesha
Arfa Izzati
Politeknik Piksi Ganesha
Sediaan Apus Darah Tepi (SADT) merupakan slide yang salah satu permukaannya dilapisi lapisan darah tipis, difiksasi menggunakan methanol (methyl alkohol) dan diwarnai dengan pengecatan giemsa atau wright. Methanol yang baik digunakan untuk fiksasi memiliki kandungan air kurang dari 3% dengan konsentrasi larutan 96%. Methanol yang dibiarkan terlalu lama terbuka akan menguap dan mengalami penurunan konsentrasi. Penelitian ini bertujuan untuk melihat adanya pengaruh dari variasi waktu fiksasi SADT pada pewarnaan giemsa terhadap morfologi sel darah merah. Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimen. Penelitian eksperimen dengan jumlah sampel 24 dalam bentuk sediaaan apusan darah tepi dibagi 4 berdasarkan variasi waktu fiksasi yaitu 3 menit, 5 menit, 10 menit, dan 15 menit. Waktu fiksasi 3 menit menunjukan morfologi sel darah merah pada preparat dalam kondisi baik 100%, pada waktu 5 menit hasil krenasi sedang menjadi 16,7%, pada waktu 10 menit hasil krenasi sedang menjadi 50,0%, pada waktu 15 menit hasil krenasi sedang menjadi 83,3%. Hasil penelitian menunjukan waktu yang tepat untuk fiksasi pada waktu 3 menit. Hasil uji statistik Chi Square didapatkan nilai signifikan (P value) 0,015 (<0,05) sehingga dapat dinyatakan bahwa terdapat pengaruh yang jelas terhadap hasil mikroskopis bentuk sel darah merah dengan variasi waktu pada proses fiksasi sediaan apusan darah tepi.

## PENDAHULUAN
Pemeriksaan hamatologi merupakan salah satu pemeriksaan yang dapatdigunakan untuk penunjang diagnosis yang berhubungan dengan terapi danprognosis. Pemeriksaan hematologi terdiri dari hematologi rutin danhematologi khusus. Salah satu prosedur pemeriksaan hematologi rutinadalah sediaan apusan darah tepi (SADT).
Sediaan Apus Darat Tepi (SADT) menjadi salah satu pemeriksaanhematologi yang bertujuan untuk pemeriksaan mikroskopis untuk mengamatimorfologi sel darah, seperti gambaran darah tepi, jumlah eritrosit,indeks eritrosit, jumlah retikulosit dan trombosit. Pemeriksaan sediaanapus darah tepi meliputi 2 bagian pemeriksaan yaitu pemeriksaan hitungjumlah leukosit (termasuk pemeriksaan rutin) dan gambaran sel darahserta unsur-unsur lain seperti parasit, sel-sel ganas dan melihat sertamenilai morfologi sel darah bahkan komponen lain yang dapat memberikaninformasi tentang keadaan hematologi seseorang. Pada sediaan perludilakukan pewarnaan agar mempermudah proses pemeriksaan sel-sel darah.Sediaan apus yang dibuat dan dipulas dengan baik merupakan syarat mutlakuntuk mendapatkan hasil makroskopis maupun mikroskopis yang baik.
Sediaan Apus Darah Tepi (SADT) merupakan slide yang salah satupermukaannya dilapisi lapisan darah tipis dan diwarnai dengan pengecatangiemsa atau wright. Sebelum pengecatan, preparat terlebih dahuludifiksasi menggunakan methanol (methyl alkohol). Proses fiksasibertujuan untuk merekatkan apusan darah tepi supaya tidak terkelupasdari preparat dan menghentikan proses metabolisme tanpa mengubahstruktur sel. Larutan fiksasi yang tidak baik karena terjadi
penguapanatau penurnan konsentrasi akan mempengaruhi perbahan morfologi sel danperlekatan apusan darah.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Dian Rachmawati pada tahun2016 menunjukan bahwa penguapan yang dilakukan kepada lartan fiksasiterlebih dahulu dapat menurunkan konsentrasi larutan sehingga dapatberpengaruh terhadap hasil makroskopik maupun mikroskopik pada SADT.Adapun penelitian lain yang dilakukan oleh Fatima Sholekha pada tahun2018 menunjukan perbedaan bermakna bahwa konsentrasi larutan fiksasiyang berbeda dapat mempengaruhi terhadap hasil dari mikroskopikSADT.
Menurut Romanowsky terdapat 4 macam pengecatan yatu pengecatanLiesman, pengecatan Wright, pengecatan Grundwald, dan pengecatan Giemsa.Pewarnaan giemsa termasuk salah satu pewarna sintesis. Prinsip daripewarnaan giemsa adalah adanya presipitasi hitam yang terbentuk daripenambahan larutan metilen blue dan eosin yang dilarutkan didalammethanol. Pewarnaan giemsa adalah pulasan yang terdiri dari eosin,metilen azur dan metilen blue yang berguna untuk mewarnai darah melaluifiksasi dengan metil alkohol. Pewarnaan dilakukan setelah sediaandilakukan tahap fiksasi. Menurut Kiswari apusan darah difiksasi dandigenangi methanol selama 2-3 menit.(7) Menurut Barbara J setelahdikering udarakan, film darah difiksasi dengan Methanol absolute selama10-20 menit.
Proses fiksasi dengan methanol absolute selama lima menit berfungsiuntuk membuka dinding sel eritrosit agar cat giemsa dapat masuk sehinggadapat mewarnai sel eritrosit.Methanol yang baik digunakan untuk prosesfiksasi memiliki kadungan air kurang dari 3%, methanol yang memilikikandungan air lebih dari  3% dapat menyebabkan pengaruh terhadapmorfologi sel eritrosit. Methanol yang dibiarkan terlalu lama terbukaakan menguap dan mengalami penurunan konsentrasi sehingga meninggalkanair pada proses fiksasinya dan mempengaruhi morfologi eritrosit. Larutanfiksasi yang tidak baik dapat menyebabkan perubahan morfologi, warna danperlekatan sel yang tidak baik. Ini mungkin dapat terjadi apabilalarutan fiksasi yang digunakan tidak absolute, methanol mengandung air> 3%, karena telah menguap dan dapat mengubah konsentrasi darimethanol tersebut yang dapat menyebabkan fiksasi tidak sempurna.Seldarah merah yang dimasukan kedalam larutan hipertonis, maka tekananosmosis akan terjadi dari dalam sel keluar sel yang akan menyebabkaansel mengalami krenasi (pengerutan), sedangkan apabila eritrosit beradadalam lingkungan yang hipotonis, maka tekanan osmosis akan terjadi dariluar kedalam sel yang akan menyebabkan sel menggembung hingga selburr.Proses fiksasi bekepanjangan harus dihindari karena reagenmempengaruhi pengecatan selanjutnya dan menyebabkan beberapapenghambatan enzim intraseluler.
Pemeriksaan laboratorium dengan banyaknya sampel memungkinkanterjadinya keterlambatan atau membiarkan terlalu lama pada saat fiksasisehingga terjadi penguapan dan penurunan konsentrasi methanol absolute.Lamanya waktu fiksasi ini akan berdampak pada morfologi sel darah merahdan dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan SADT. Hal ini melatar belakangipenulis untuk melakukan penelitian tentang “Pengaruh Variasi WaktuFiksasi Sediaan Apusan Darah Tepi pada Pewarnaan Giemsa TerhadapMorfologi Sel Darah Merah”.

## METODE
Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimen, yaitu memberikanperlakuan variasi waktu fiksasi terhadap preparat sediaan apusan darahtepi sebagai subjek penelitian. Pada penelitian ini peneliti memberikanperlakuan waktu fiksasi berbeda untuk mengetahui pengaruhnya terhadapmorfologi sel darah merah. Populasi dari penelitian ini adalah mahasiswaDIII Analis Kesehatan Fakultas Kesehatan Politeknik Piksi GaneshaBandung. Penelitian ini bersifat homogen, dengan menggunakan teknikSimpel Random Sampling. Sampel yang digunakan dalam penelitian iniadalah sampel darah EDTA. Sampel yang digunakan dalam penelitian inisebanyak 6 sampel dengan 4 perlakuan (total 24 preparat) untukmasing-masing perlakuan sebanyak 6 sampel dengan variasi waktu fiksasisegera (waktu normal), 5 menit, 10 menit, dan 15 menit. Penelitiandilakukan di
Laboratorium Dinas Kesehatan Kota Bandung. Hasil penelitiandiuji dengan menggunakan uji SPSS Chi Square untuk melihat adanyapengaruh dari variasi waktu fiksasi terhadap morfologi sel darahmerah.
Darah diambil sebanyak 1-3 ml kemudian dimasukan kedalam tabungvacuntainer berisi EDTA dan diberi label. Sampel darah yang telahdiambil dibuat sediaan sebanyak 24 preparat  (masing-masing 6 sampeluntuk 4 perlakuan) kemudian dilakukan fiksasi dengan konsentrasi larutan96% dan variasi waktu fiksasi yang berbeda  yaitu 3 menit (waktunormal), 5 menit, 10 menit, dan 15 menit dihitung menggunakan stopwatch.Setelah sediaan mengering kemudian dilakukan pengecatan giemsa denganpengenceran giemsa 1:9 atau 1 ml giemsa diencerkan dengan 9 ml aquadest.Dengan perbandingan pengenceran giemsa 1:9 maka pengecatan dilakukanselama 25 menit, kemudian dibilas dengan air mengalir dan dikeringudarakan dalam posisi vertikal. Setelah sediaan mengering dilakukanpembacaan menggunakan mikroskop pembesaran 1000x dengan menambahkanminyak imersi. Pemeriksaan dilakukan dengan melihat adanya sel krenasi(pengerutan sel) dengan kriteria sebagai berikut : Baik (tidakmenunjukan sel krenasi), sedang (menunjukan sel krenasi < 3 perlapang pandang), buruk (menunjukan sel krenasi > 3 per lapangpandang).

## HASIL
Sampel diambil dari mahasiswa Analis Kesehatan Fakultas KesehatanPoliteknik Piksi Ganesha Bandung menggunakan teknik Simpel RandomSampling yang berjumlah enam orang. Darah diambil sebanyak 1-3 mlkemudian dimasukan kedalam tabung vacuntainer yang berisi EDTA dandiberi label. Sampel tersebut dibuat apusan darah kemudian dikeringkandengan cara di angin- anginkan. Setelah kering dilakukan fiksasi denganvariasi waktu berbeda yaitu 3 menit (waktu normal), 5 menit, 10 menitdan 15 menit lalu dilakukan pengecatan menggunakan pewarna giemsa selama25 menit lalu di amati dibawah mikroskop. Penilaian dengan melihatmikroskopis morfologi sel darah merah.
Setelah didapatkan hasil penelitian kemudian dilakukan pengolahandata dengan menggunakan uji SPSS Chi Square. Berikut adalah tabel hasiluji statistik dan gambar mikroskopis morfologi sel darah merah :
Waktu Krenasi Total % Buruk % Sedang % Baik % 3 menit (normal) 5 menit 10 menit 15 menit 0
0
0 0 0,0
0,0
0,0 0,0 0 1 3 5 0,0
16,7
50,0 83,3 6 5 3 1 100
83,3
50,0 16,7 6 6 6 6 100 100 100 100 Jumlah 0 0,0 9 37,5 15 62,5 24 100
Table 1. Tabel Hasil Mikroskopis Morfologi Sel Darah Merah
Berdasarkan tabel hasil mikroskopis bentuk krenasi pada enam sampeldidapatkan hasil bahwa preparat sediaan apusan darah tepi dengam lamawaktu fiksasi 3 menit (waktu normal) ditemukan 6 preparat (100%)memiliki hasil mikroskopis dengan bentuk sel darah merah yang baik.Pengamatan pada preparat sediaan apusan darah tepi dengan variasi waktufiksasi 5 menit ditemukan 5 preparat (83,3%) memiliki hasil mikroskopis bentuk sel darah merah yang baik dan 1 (16,7%) preparat memiliki hasilmikroskopis sel darah yang sedang. Pengamatan pada preparat sediaanapusan darah tepi dengan variasi waktu fiksasi 10 menit ditemukan 3preparat (50,0%) memiliki hasil mikroskopis bentuk sel darah merah yangbaik dan 3 preparat (50,0%) memiliki hasil mikroskopis sel darah
merahyang sedang. Pengamatan pada preparat sediaan apusan darah tepi denganvariasi waktu fiksasi 15 menit ditemukan 1 preparat (16,7%) memilikihasil mikroskopis bentuk sel darah merah yang baik dan 5 preparat(83,3%) memiliki hasil mikroskopis sel darah merah yang sedang.
Hasil krenasi sediaan apusan darah tepi engan variasi waktu fiksasisegera (waktu normal), 5 menit, 10 menit, dan 15 menit dapat dilihatpada gambar berikut :
Figure 1. Gambar Mikroskopis Morfologi Sel Darah Merah Berdasarkan Variasi Waktu Fiksasi
Berdasarkan gambar hasil mikroskopis bentuk sel darah merah denganwaktu fiksasi segera (waktu normal) tidak menunjukan kelainan bentuk,sedangkan pada variasi waktu fiksasi 5 menit, 10 menit, dan 15 menitmenunjukan adanya perubahan bentuk sel darah merah (ditunjukan tandapanah merah) akibat pengaruh dari variasi waktu fiksasi yangmengakibatkan  penguapan pada larutan fiksasi (methanol absolute 96%).
Data yang didapat dari penelitian merupakan data yang memliki skalaordinal dan skala nominal sehingga pengujian yang digunakan menggunakananalisis Uji Chi Square untuk menguji ada tidaknya pengaruh dari 4kelompok perlakuan. Pengujian Chi Square dapat dilakukan pada hasilmikroskopis bentuk sel darah merah. Pengamatan dalam penelitianditemukan hasil krenasi
pada mikroskopis bentuk sel darah merah sebanyak15 preparat (62,5%) memiliki mikroskopis bentuk sel darah merah yangbaik dan 9 preparat (37,5%) memiliki mikroskopis bentuk sel darah merahyang sedang.
Hasil Uji Chi Square mikroskopis bentuk sel darah merah pada variasiwaktu fiksasi 3 menit (waktu normal), 5 menit, 10 menit, dan 15 menitdidapatkan nilai p sebesar 0,015 (<0,05) sehingga dapat dinyatakanbahwa terdapat pengaruh yang jelas terhadap hasil mikroskopis bentuksel darah merah dengan variasi waktu pada proses fiksasi sediaan apusandarah tepi.

## PEMBAHASAN
Berdasarkan penelitian sediaan apusan darah tepi secara mikroskopisdidapatkan hasil terbaik tahap fiksasi pada waktu 3 menit. Hal iniberkaitan dengan teori menurut Kiswari yaitu apusan darah diiksasi dandigenangi methanol selama 2-3 menit. Pada waktu fiksasi 3 menit tidakditemukan sel krenasi pada hasil SADT, morfologi sel darah merah baikdengan bentuk bentuk cakram bikonkaf, tidak berinti, tidak bergerak,memiliki diameter sekitar 7,5 mikron dan tebal 2,0 mikron dan centralpallor 1/3 bagian sel darah merah. Sel krenasi ditemukan pada waktufiksasi 5 menit, 10 menit dan 15 menit. Pengamatan dalam penelitiandengan total sampel sebanyak 24 preparat ditemukan hasil krenasi padamikroskopis bentuk sel darah merah sebanyak 15 preparat (62,5%) memilikimikroskopis bentuk sel darah merah yang baik dan 9 preparat (37,5%)memiliki mikroskopis bentuk sel darah merah yang sedang. Fiksasi denganwaktu 3 menit semua hasil morfologi sel darah merah pada sediaan apusdarah tepi dalam kondisi baik 100%, pada variasi waktu fiksasi 5 menithasil krenasi sedang menjadi 16,7%, pada waktu fiksasi 10 menit hasilkrenasi sedang menjadi 50,0%, pada waktu fiksasi 15 menit hasil krenasimenjadi 83,3%.
Hasil uji Chi Square didapatkan nilai sig (p value) sebesar 0,015(<0,05) sehingga dapat dinyatakkan bahwa terdapat pengaruh antaralama waktu fiksasi terhadap hasil mikroskopis pada morfologi sel darahmerah pada sediaan apusan darah tepi. Hal ini terjadi karena larutanmethanol mengalami penguapan dan larutan  menjadi larutan hpertonis makatekanan osmosis akan terjadi dari dalam sel keluar sel yang akanmenyebabkan sel mengalami krenasi (pengerutan), sedangkan apabilaeritrosit berada dalam lingkungan yang hipotonis, maka osmosis yangterjadi dari luar ke dalam sel yang akan menyebabkan sel menggelembungsehingga menjadi sel burr.
Sel Krenasi adalah kelainan bentuk eritrosit (poikilositosis) yangberbentuk seperti artefak. Suhu yang panas bisa mengakibatkan membransel eritrosit pecah sebagai akibatnya sel mengalami pengerutan yangdisebut krenasi akibat cairan yang berada di dalam sel keluar melaluimembran.(5) Morfologi krenasi bisa disebabkan oleh beberapa faktor,seperti terjadinya kesalahan dalam prosedur pemeriksaan praanalitik.
Tahap fiksasi pada pembuatan preparat sediaan apusan darah tepibertujuan untuk pelekatan sel pada objek glass serta menghentikan prosesmetabolisme tanpa mengubah keadaan atau struktur sebenarnya sehinggamembuat struktur sel-sel  tetap normal dan mampu menyerap cat giemsadengan sempurna. Proses fiksasi yang tidak baik dapat menyebabkanperbahan morfologi pada sediaan. Hal ini mungkin terjadi apabila fiksasidilakukan menggunakan methanol yang tidak absolute karena telah menyerapuap air akibat penyimpanan yang tidak baik. Terlalu lama disimpan dalamkeadaan terbuka akan menyebabkan methanol menguap dan memiliki kandunganair > 3% didalamnya yang dapat menyebabkan larutan menjadi hipertonisdan morfologi sel darah merah mengalami krenasi.

## SIMPULAN
Dari penelitian yang dilakukan tentang Pengaruh Variasi Waktu FiksasiSediaan Apusan Darah Tepi Pada Pewarnaan Giemsa Terhadap Morfologi SelDarah Merah dapat disimpulkan :
1.   Dari 6 sampel dan 4 kelompok perlakuan (24 preparat) didapatkan sebanyak 15 preparat (62,5%) memiliki mikroskopis bentuk sel darah merah dalam kategori baik dan 9 preparat (37,5%) memiliki mikroskopis bentuk sel darah merah dalam kategori sedang.
2.   Hasil penelitian menunjukan waktu yang tepat untuk tahap fiksasi pada waktu 3 menit. Hasil krenasi pada preparat sediaan apusan darah tepi ditemukan pada variasi waktu fiksasi 5 menit dalam kategori sedang menjadi 16,7%, pada waktu 10 menit dalam kategori sedang menjadi 50,0%, dan pada waktu 15 menit  dalam kategori sedang sebanyak 83,3%.
3.   Hasil uji SPSS Chi Square menunjukan terdapat pengaruh dari variasi waktu fiksasi terhadap hasil krenasi mikroskopis morfologi sel darah merah pada sediaan apusan darah tepi.

## SARAN
1.   Bagi petugas kesehatan yang bertugas di lanoratorium lebih memperhatikan penyimpanan reagen lartan fiksasi dan ketetlitian waktu pada saaat melakukan proses fiksasi agar tidak terjadi kesalahan dalam pemeriksaan dan pengeluaran hasil.
2.   Bagi peneliti selanjutnya diharapkan dapat melanjutkan penelitian dengan memperhatikan variasi konsentrasi larutan fiksasi dan karakteristik pada sampel yang akan digunakan.

## DAFTAR PUSTAKA
Bain Bj. Blood Cells : A Practical Guide. Australia: BlackwellPublishing Asia Pty Ltd; 2014
Budiwiyono I, et al., 2002. Pemantapan Mutu Laboratorium, PemeriksaanHematologik dan Imunologi, Semarang.
Dekayana A, 2019. Hitung Laju Endap Darah (Led). Ponorogo : UwaisInspirasi Indonesia.
Herper Ta. 1974. The Peripheral Blood Film. London; Butterworths& Co. Ltd.
Houwen B., 2002 Blood Film Preparation And Staining Procedures. LabHematol.
Kiswari R., 2014 HEMATOLOGI & TRANSFUSI. Carolina S, AstikawatiR, editors. Jakarta:Erlangga.
Nugraha, Gilang., 2015 Panduan Pemeriksaan Laboratorium HematologiDasar. Cetakan 1. Jakarta : CV. Media Trans Info.
Masters. 2002.Farmakologi Dasar Dan Klinik Katzing: Alkohol. Jakarta:Salemba Medika
Mescher dan Anthony, L. 2012. Histologi Dasar JUNQUIERA. Jakarta:Penerbit Bukiu Kedokteran EGC.
Mukh Syaifudin, Indah Irma, Dwi Ramadhani., 2018. OptimalisasiPewarnaan Giemsa Pada Apusan Darah Tipis Terinfeksi Plasmodium bergheiUntuk Mendukung Pengembangan Vaksin Malaria Iradiasi.
Nugraha, Gilang., 2015 Panduan Pemeriksaan Laboratorium HematologiDasar. Cetakan 1. Jakarta : CV. Media Trans Info.
Pamungkas Kp., 2014 Gambaran Morfologi Eritrosit Dengan PerbandinganLama Fiksasi. J Food Syst Res. UNIMUS, Semarang. 14(2):70-5.
Pasini, EM, Kirkeguard, M, Motensen, P, Hens U, Lutz, Thomas, AW danMann, M. 2006. Blood. The American Society of Hematology. WashingtonDC.
Rachmawati D., 2016 Pengaruh Lama Penguapan Larutan Fiksasi TerhadapHasil Makroskopis dan Mikroskopis Sediaan Apusan Darah Tepi. UniversitasMuhammadiyah Semarang.
Sholekha Fe., 201mukh8 Pengaruh Konsentrasi Larutan Fiksasi TerhadapHasil Mikroskopis dan Makroskopis Sediaan Apus Darah Tepi. UniversitasMuhammadiyah Semarang.
Wirawan R. 2011. Pemeriksaan Laboratorium Hematologi. Jakarta: Dept.Patologi Klinik- FKUI