JMHT Vol. XIV, (2): 66-72, Agustus 2008                                                                                                                                                 Artikel Ilmiah ISSN: 0215-157X

## Metode Perlakuan Pendahuluan untuk Penyimpanan Benih Melur pada Suhu Sangat Rendah

## Pretreatment Method of Melur Seeds Storing at Extreme Low Temperature
Dida Syamsuwida 1* dan Aam Aminah 1
1 Balai Penelitian Teknologi Perbenihan Bogor

## Abstract
Cryopreservation is a method of long term storage in which an extremely low temperature of nitrogen liquid  (-196 o C)  being  used  to  preserve  seeds  of  recalcitrant  characteristics.  The  study  was  aimed  to determine  the  standard  protocol  of  vitrivication  in  melur  (Podocarpus  neriifolius)  seeds  storing  in various  cryoprotectans.  The  use  of  sucrose  PVS2  and  DMSO  as  a  cryoprotectan  were  employed  to protect the regularly-desiccated seeds during preserving in liquid nitrogen for 1 hour. Evaluation was made  on  the  viability  by  germinating  the  seeds  in  green  house.  Randomized  completely  design  of  3 factors  was  used  in  this  study.  The  results  revealed  that  seed  moisture  content  was  53%  after  being desiccated  using  vaccuum-desicator  for  24  hours  and  showed  more  than  85%  of  germination,  in average. Vitrivicated seeds in DMSO for 2 hours performed 66.67% germination. Meanwhile, seeds in sucrose and PVS2 for 1 hour reached of 53.33% and 25.33% of germination, respectively. Preservation in liquid  nitrogen  for  1  hour did  not  succeed  to keep  any  treated  seeds  as  there was no  germination found during viability testing.
Keywords: cryiopreservation, vitrivication, melur, desiccation, recalcitrant
*Penulis untuk korespondensi, e-mail: dida_syam@yahoo.co.id

## Pendahuluan
Kriopreservasi adalah  salah  satu  cara  yang  dapat dilakukan  untuk  mengonservasi  sumberdaya  genetik terutama  terhadap  tanaman  yang  mempunyai karakteristik benih rekalsitran  (Berjak  dkk.  1998). Melalui  metode  ini  material  tanaman  dapat  diawetkan tanpa  mengubah  morfologi  maupun  kandungan biokimianya,  sehingga  dapat  juga  digunakan  untuk pelestarian  jenis-jenis  tanaman  langka  dan  hampir punah. Metode ini sudah berkembang dengan baik dan menjadi  metode  rutin  untuk  beberapa  jenis  tanaman. Ketahanan  terhadap  kondisi  dingin  beku  ( freezing ) di dalam larutan nitrogen telah  banyak diteliti pada  lebih dari 100  jenis  tanaman  baik  yang  berasal  dari  daerah beriklim  sedang  maupun  tropik  pada  berbagai  kultur jaringan  tanaman  (Engelmann  1997  dalam  Chaudhury dan Malik 1998).  Namun demikian, belum ada metode dengan tujuan yang sama untuk struktur tanaman yang lebih  kompleks  seperti  apeks  dan  embrio,  sehingga masih  perlu  dilakukan  penelitian  mendalam  untuk mendapatkan  metode  yang  baku  dan  dapat diaplikasikan secara lebih luas.
Dalam  prosedur  vitrivikasi,  bahan  tanaman  harus cukup  terdehidrasi  secara  osmotik  pada  suhu  tidak dingin  dengan  memberi  konsentrasi  larutan  vitrivikasi yang  tinggi  untuk  menghindari  kristalisasi  saat dimasukan  ke dalam  larutan  nitrogen.  Ketidak- mampuan  benih  rekalsitran  untuk  menoleransi
pengeringan  hingga  kadar  air  optimum  yang  dapat disimpan  pada  suhu  di  bawah  -5 o C  memerlukan percobaan yang lebih intensif.  Dengan demikian perlu dilakukan  percobaan  pendahuluan  untuk  mengetahui kadar  air  optimum  yang  menghasilkan  daya berkecambah  paling  baik  serta  mengandung  kadar  air kritis  dimana  benih  atau  embrio  masih  mampu berkecambah.
Penggunaan  embrio  zigotik  atau  embrio  aksis banyak  ditujukan  untuk  menyelamatkan  materi      hasil persilangan,  studi  transformasi  dan  konservasi sumberdaya  genetik.    Dalam  sepuluh  tahun  terakhir, struktur embrio banyak digunakan dalam penyimpanan kriogenik khususnya untuk jenis   benih rekalsitran dan subortodok (Engelmann 1992; Hong dan Ellis 1996).
Dalam penelitian ini penyimpanan benih  utuh dan embrio jenis melur ( Podocarpus neriifolius ) dilakukan pada  suhu  ekstrim  rendah  (-196 o C)  dengan  metoda vitrifikasi.    Melur  adalah  jenis  tanaman  hutan  yang memiliki  benih  bersifat  rekalsitran  (Tompsett  1992; Syamsuwida dkk. 2004).
Penelitian  ini  ditujukan  untuk  memperoleh prosedur  preservasi  optimum  dengan  metode vitrivikasi pada suhu rendah terhadap benih melur.

## Metodologi
Pengumpulan  buah  dilakukan  di  daerah  Gunung Kidul,  Jawa  Tengah.  Penelitian  dilakukan  di
JMHT Vol. XIV, (2): 66-72, Agustus 2008                                                                                                                                                 Artikel Ilmiah ISSN: 0215-157X
laboratorium  dan  rumah  kaca  Balai  Penelitian Teknologi  Perbenihan  (BPTP)  Bogor . Bahan  tanaman yang  digunakan  adalah  benih  melur  dalam  bentuk benih utuh dan embrio (tanpa kotiledon).
Bahan kimia yang digunakan adalah nitrogen cair, sukrosa,  dimethil  sulfoksid  (DMSO),  gliserol,  ethilen glikol, dan silica gel .  Peralatan yang digunakan adalah tabung  nitrogen  cair, vacuum  desicator ,  timbangan analitis, germinator chamber , gelas ukur,  cawan  petri, beaker glass , botol penyimpan bahan tanaman ( vials ).
Metode  yang  dilakukan  terdiri  dari  metode penurunan kadar air dan metode kriopreservasi dengan penjelasan sebagai berikut:
Metode  penurunan  kadar  air .    Untuk  mendapatkan kadar  air  benih  yang  diinginkan  digunakan  teknik penurunan  kadar  air  dengan  alat  desikator  (divakum dan  diisi silica  gel ) dan  inkubator  suhu  35 o C.  Teknik ini  dilakukan  agar  penurunan  kadar  air benih  tidak terlalu  drastis.  Sebelum  dilakukan  teknik  penurunan kadar  air  tersebut,  dilakukan  percobaan  pendahuluan. Benih  yang  digunakan  adalah  benih  berwarna  coklat dan  hijau.  Lama  pengeringan  adalah  24  jam  dengan interval  waktu  setiap  3  jam.  Kadar  air  awal  benih coklat  adalah  33,69%  dan  benih  hijau  adalah  56,07%. Adapun perlakuan penurunan kadar air pada percobaan pendahuluan terdiri dari:
a Alat pengeringan : A1 = inkubator (35 o C),
A2 = vacuum desicator b Warna benih : B1 = kulit benih coklat, B2 = kulit benih hijau c Lama pengeringan  : C1 = 3 jam, C2 = 6 jam,
C3 = 12 jam,
C4 = 18 jam,  dan
C5 = 24 jam
Rancangan  percobaan  yang  digunakan  adalah Rancangan  Acak  Lengkap  pola  faktorial  dengan  3 faktor dan ulangan 3 kali. Setiap unit percobaan terdiri dari 50  benih.  Model  persamaannya  adalah  sebagai berikut:
Y ijk ℓ =  µ +  A i +  B j +  ABij  +  C k +  AC ik +  BC jk + ABC ijk + Є ℓ(ijk) dimana:
Y ijk ℓ = peubah respon karena pengaruh bersama taraf ke- i faktor A, taraf ke- j faktor B dan taraf ke- k faktor C yang terdapat pada observasi ke- ℓ µ = efek  rata-rata  yang  sebenarnya  (berharga konstan)
A i = efek  sebenarnya dari taraf ke- i faktor A B j = efek  sebenarnya dari taraf ke- j faktor B AB ij = efek sebenarnya dari interaksi antara taraf ke- i faktor A dengan taraf ke- j faktor B C k = efek  sebenarnya dari taraf ke- k faktor C AC ik = efek sebenarnya dari interaksi antara taraf ke- i faktor A dengan taraf ke- k faktor C BC jk = efek  sebenarnya dari interaksi antara taraf ke- j faktor B dengan taraf ke- k faktor C
ABC ijk = efek  sebenarnya terhadap peubah respon yang disebabkan  oleh  interaksi  antara  taraf  ke- i faktor  A,  taraf  ke- j faktor  B  dan  taraf  ke- k faktor C Є ℓ(ijk) = efek  sebenarnya  dari  unit  eksperimen  ke- ℓ disebabkan oleh kombinasi perlakuan ( ijk )
Metode  kriopreservasi. Perlakuan  kriopreservasi untuk  benih  melur  disajkan  pada  Tabel  1.    Tahapan- tahapan dalam  pelaksanaan  protokol  preservasi kriogenik dapat diuraikan sebagai berikut:
a Vitrivikasi, yaitu  proses  perlindungan  terhadap  sel- sel  tanaman  dari  kerusakan selama  berada  dalam nitrogen  cair.  Krioprotektan  yang digunakan  terdiri dari  sukrosa  (Yap  dkk.  1999),  PVS2  (Sakai  dkk. 1990), dan DMSO (Sudarmonowati dkk. 1995).
b Pembekuan, yaitu proses pencelupan benih ke dalam tabung  berisi  nitrogen  cair  (-196 o C)  selama  1  jam untuk  mengetahui  tingkat  kemampuan  benih  yang disimpan pada suhu ekstra rendah.
c Thawing (pencairan),  yaitu  proses  pencairan  bahan tanaman  setelah  disimpan  dalam nitrogen  cair dengan cara perendaman pada larutan sukrosa 0,4 M pada  suhu  kamar  selama  1  jam  dan  pembilasan menggunakan akuades hingga bersih.
d Pengujian  daya  berkecambah,  yaitu  pengujian  pada embrio (tanpa kotiledon) melalui metode uji di Atas Kertas (UDK) dalam germinator chamber 25 o C dan pengujian pada benih utuh di rumah kaca (30 o -34 o C) menggunakan media pasir halus.
Pengamatan  yang  dilakukan  terhadap  setiap  unit percobaan  meliputi  daya  berkecambah  dan  kecepatan berkecambah. Selanjutnya, hasil pengamatan dianalisis secara statistik melalui pengujian perlakuan percobaan menggunakan uji Duncan.

## Hasil dan Pembahasan
Penurunan  kadar  air. Teknik  pengeringan  baik dengan menggunakan inkubator 35 o C maupun vacuum desicator menunjukkan nilai kadar air benih yang tidak jauh  berbeda  yaitu  berkisar  antara  32%-35%      untuk benih yang berwarna coklat dan antara 51%-53% untuk benih  yang  berwarna  hijau.  Hasil  pengamatan selengkapnya disajikan pada Tabel 2.
Penurunan  kadar  air  secara  bertahap  yang diharapkan  terjadi  selama  pengeringan  setiap  3  jam sekali  tampaknya  kurang  berhasil.  Namun  demikian, setelah  pengeringan  selama  24  jam  terjadi  penurunan kadar  air  menjadi  32,80%  untuk  benih  yang  berwarna coklat  dan  dikeringkan  dalam  inkubator.  Penurunan kadar  air  pada  benih  yang  berwarna  hijau,  baik  yang dikeringkan  dalam  inkubator  maupun  desikator, berkisar antara 51-52%.
Hasil  pengamatan  kadar  air  benih  melur sehubungan  dengan  perlakuan  yang  diberikan  dapat dilihat  pada  Tabel  2.  Benih  melur  kontrol  yang berwarna hijau memiliki daya berkecambah yang lebih
JMHT Vol. XIV, (2): 66-72, Agustus 2008                                                                                                                                                 Artikel Ilmiah ISSN: 0215-157X
tinggi  daripada  yang  berwarna  coklat.    Setelah dilakukan  penurunan  kadar  air  dengan  pengeringan (baik  menggunakan  inkubator  maupun  desikator), benih  yang  berwarna  coklat  tidak  mampu  lagi berkecambah  hingga  akhir  pengamatan.  Sebaliknya, benih berwarna hijau menghasilkan daya berkecambah yang  tinggi  (>85%)  setelah  dilakukan  pengeringan hingga 24 jam.
Tidak  terdapat  perbedaan  yang  berarti  terhadap daya berkecambah pada kedua cara pengeringan benih (menggunakan  inkubator  maupun  desikator.  Namun demikian,  desikator  lebih  disarankan untuk  digunakan dalam  penurunan  kadar  air  benih  melur.  Warna  kulit benih  hijau  memiliki  viabilitas  yang tinggi  dan  sangat berbeda  dengan  benih  yang  berwarna  coklat.  Apabila
dilihat  dari  kadar  air  benih  yang  terkandung,  maka dapat  dilihat  bahwa  benih  berwarna  coklat  memiliki kadar  air  berkisar  antara  33-35%,  sedangkan  benih berwarna  hijau  berkisar  antara  52-56%.  Dari  nilai kisaran  kadar  air  benih  yang  ada,  maka  dapat  diduga bahwa  benih  melur  memiliki  kadar  air  kritis  >35%, karena  pada  kadar  air  benih  33,69%  (benih  kontrol) hanya mampu berkecambah sebesar 46,67%. Demikian halnya dengan respon terhadap kecepatan berkecambah yang  menunjukkan  kecenderungan  yang  sama  dengan daya  berkecambah.  Grafik  kadar  air  benih  dan  daya berkecambah  melur  masing-masing  dapat  dilihat  pada Gambar 1 dan Gambar 2.
Tabel 1. Perlakuan kriopreservasi untuk benih melur Kode perlakuan Perlakuan Krioprotektan Keterangan V0 (-V-N) Tanpa vitrivikasi, tanpa Nitrogen cair Sukrosa 1 jam V1 (-V+N) Tanpa vitrivikasi, celup Nitrogen cair Sukrosa 1 jam V2 (+V-N) Vitrivikasi, tanpa Nitrogen cair PVS2 1 jam V3 (+V+N) Vitrivikasi, celup Nitrogen cair PVS2 1 jam V4 (+V-N) Vitrivikasi, tanpa Nitrogen cair DMSO 2 jam V5 (+V+N) Vitrivikasi, celup Nitrogen cair DMSO 2 jam Tabel 2. Nilai rata-rata kadar air (%) benih melur pada berbagai perlakuan pengeringan Inkubator Vacuum Desicator Lama pengeringan Coklat Hijau Coklat Hijau % Kecambah 3 jam 33,15 51,31 34,20 51,71 6 jam 35,57 52,03 34,20 52,21 12 jam 35,82 52,74 34,98 53,26 18 jam 33,26 52,31 33,81 52,17 24 jam 32,80 51,71 33,60 52,43 Rataan 34,12 52,02 34,16 52,36 % Kadar Air 3 jam 0 96 0 92 6 jam 0 89,33 0 92 12 jam 0 92 0 82,67 18 jam 0 74,67 0 88 24 jam 0 72 0 85,33 Rataan 0 84,8 0 88
25 30 35 40 45 50 55 1 2 3 4 5 Lama pengeringan (jam) K ad ar a ir ( % ) coklat inkubator
coklat desikator hijau inkubator hijau desikator
Gambar 1. Kadar  air  benih  melur  pada  berbagai  metode  pengeringan (inkubator  dan  desikator),  warna  kulit  benih  (coklat  dan  hijau) serta lama pengeringan (jam)
0 25 50 75 100 1 2 3 4 5 Lama pengeringan (jam) D ay a b er k ec am b ah ( % ) coklat inkubator coklat inkubator
coklat desikator hijau inkubator
Gambar  2. Daya  berkecambah  benih  melur  pada berbagai  metode pengeringan (inkubator dan desikator), warna kulit benih (coklat dan hijau) serta lama pengeringan (jam)
Dengan  demikian,  benih  melur  berwarna  coklat merupakan  benih  yang  tidak  dapat  digunakan  untuk percobaan  penyimpanan  kriopreservasi  karena  diduga sudah  mengalami  penurunan  viabilitas.  Penurunan viabilitas  ini  diduga  terjadi  karena  benih  yang dikumpulkan  sudah  beberapa  waktu  jatuh  atau  berada di  bawah  pohon  dan  terbawa  atau  tercampur  saat pengumpulan.
Hasil analisis
keragaman parameter perkecambahan  benih  melur  menunjukkan  adanya perbedaan yang nyata dari  warna kulit benih, lamanya pengeringan, interaksinya terhadap daya berkecambah, dan  kecepatan  berkecambah  benih  melur.    Hasil analisis juga menunjukkan bahwa faktor alat pengering tidak menunjukkan perbedaan yang nyata, seperti yang terlihat dalam Tabel 3.
JMHT Vol. XIV, (2): 66-72, Agustus 2008                                                                                                                                                 Artikel Ilmiah ISSN: 0215-157X
Tabel 3. Analisis keragaman parameter perkecambahan benih melur Perlakuan Daya berkecambah Kecepatan berkecambah A (Alat pengering) tn tn B (Warna buah) p < 0,01 p < 0,01 C (Lama pengeringan) p < 0,05 p < 0,05 AxB (interaksi) p < 0,05 tn AxC (interaksi) p < 0,05 p < 0,05 BxC (interaksi) p < 0,01 p < 0,01 AxBxC (interaksi) p < 0,01 p < 0,01
Kriopreservasi. Berdasarkan  hasil  percobaan penurunan  kadar  air  benih,  maka  untuk  percobaan kriopreservasi digunakan benih berwarna hijau dengan kadar  air  rata-rata  53%  (yaitu  kondisi  kadar  air  benih setelah  benih  segar  dikeringkan  dengan  menggunakan vaccum  desicator selama  24  jam).  Hasil  pengamatan disajikan pada Tabel 4.
Benih  melur  yang  divitrivikasi  dengan  DMSO selama  2  jam  (V4)  mampu  menghasilkan  daya berkecambah  sebesar  66,67%,  sedangkan  vitrivikasi yang  menggunakan  krioprotektan  sukrosa  (V0)  dan PVS2  (V2)  selama  1  jam  masing-masing  mempunyai daya berkecambah 53,33% dan 25,33%.  Dalam hal ini,
larutan  vitrivikasi  yang  digunakan  tidak  bersifat phytotoksin  karena  persentase  kecambah  yang dihasilkan  hampir  sama  atau  bahkan  lebih  tinggi daripada  kontrol  yaitu  38,67%.  Pembekuan  dalam nitrogen  cair  selama  1  jam  untuk  semua  benih  baik yang  divitrivikasi  maupun  tidak  divitrivikasi, menyebabkan benih tidak dapat mempertahankan daya berkecambah  pada  saat  pengujian  di  rumah  kaca. Dalam kasus ini ada dugaan bahwa krioprotektan yang digunakan  masih  belum  dapat  melindungi  benih  dari proses kristalisasi selama pembekuan di dalam  larutan nitrogen.
Tabel   4.  Nilai rata-rata daya berkecambah (%) benih melur pada  berbagai perlakuan vitrivikasi (V) dan pembekuan dalam Nitrogen (N) Perlakuan Ulangan Daya berkecambah (%) Rata-rata (%) Kontrol 1 12 38,67 2 56 3 48 V0 (-V-N) 1 56 53,33 2 56 3 48 V1 (-V+ N) 1 0 0 2 0 3 0 V2 (+V-N) 1 12 25,33 2 44 3 20 V3 (+V+N) 1 0 0 2 0 3 0 V4 (+V-N) 1 80 66,67 2 68 3 52 V5 (+V+N) 1 0 0 2 0 3 0 Menurut Chaudhury dan Malik (1999), penggunaan  krioprotektan  yang  lembut  kemudian secara perlahan dimasukkan ke dalam suhu rendah atau larutan  krioprotektan  keras  dan  dimasukkan  dengan cepat  kedalam  suhu rendah  telah  banyak  diadopsi dalam  teknik  preservasi  kriogenik.  Penggunaan
vitrivikasi  PVS2  untuk  penyimpanan  embrio zygotic karet  dalam  cairan  nitrogen  berhasil  mempertahankan viabilitasnya  hingga  8  minggu  (Sam  dan  Hor  1999). Hal yang sama terjadi juga pada benih Podocarpus spp, dimana  benih  masih  dapat  bertahan  hingga  6  minggu setelah  divitrivikasi  dengan  PVS2  dan  disimpan  di
JMHT Vol. XIV, (2): 66-72, Agustus 2008                                                                                                                                                 Artikel Ilmiah ISSN: 0215-157X
ruang  berpengatur  udara  (Dharmawati  dkk.  2005). Penggunaan DMSO dalam vitrivikasi benih rekalsitran matoa ( Pommetia pinnata ) dengan metode pembekuan secara lambat dan bertahap setiap 0,5 o C/menit sehingga mencapai -10 o C dan -20 o C, memperlihatkan kemampuan benih dalam mempertahankan viabilitasnya (Sudarmonowati dkk. 1995).
Penggunaan  material  tanaman  dalam  bentuk embrio  pada  penelitian  ini  tidak  dilakukan  karena ukuran  embrio  yang  sangat  kecil  cukup  sulit  untuk dikeluarkan  dari  benih.    Selain  itu,  jumlah  persediaan benih  kurang  memadai,  sehingga  penelitian  dengan menggunakan  embrio  untuk    jenis  melur  perlu  dikaji lebih  lanjut  efektifitasnya.  Namun  demikian,  pada percobaan pendahuluan embrio melur yang dikulturkan di  atas  kertas    saring  pada  suhu  25 o C  dapat  bertahan hidup  dan  memperlihatkan  pertumbuhan  atau perpanjangan embrio.

## Kesimpulan
Pengembangan  metode  vitrivikasi  dalam  prosedur preservasi  kriogenik  benih  melur  masih  perlu dievaluasi lebih  lanjut  karena ketidakkonsistenan hasil yang  diperoleh  setelah  dilakukan  pembekuan  pada suhu ekstra rendah (196 o C) dalam larutan nitrogen.

## Saran
Saat  ini  penggunaan  metode  kriopreservasi  pada sektor  kehutanan  masih  pada  taraf  penelitian.  Namun demikian, pada masa yang akan datang teknik ini akan sangat  aplikatif  dan  bermanfaat  khususnya  dalam upaya  penyelamatan  plasma  nutfah  dari  jenis-jenis langka  dan  hampir  punah  serta  antisipasi  terhadap pengawetan materi hasil pemuliaan.

## Daftar Pustaka
Aitken-Christie, J. dan Singh, A.P. 1987. Cold Storage of Tissue Cultures. Di dalam J.M Bonga dan D.J Durzan  (eds).  Cell  and  Tissue  Culture  in Forestry.  Matinus  Nijhoff,  Dordrecht.  Hlm.285- 304.
Berjak,  P.,  Kioko,  J.I.,  Walker,  M.,  Mycock,  D.J., Wesley-Smith,  J.,  Watt,  P.,  dan  Pammenter, N.W.  1999.  Cryopreservation-An  Elusive  Goal. Prosiding  IUFRO  Seed  Symposium  1998. Hlm.96-109.
Chaudhury,
R. dan Malik, S.K. 1999. Cryopreservation  and  In  Vitro  Technology  for Conservation  of  Recalsitrant  Seeds  of    Some Tree Species. Prosiding IUFRO Seed Symposium 1998.  Hlm.119-131.
Dumet,  D.,  Engelmann,  F.,  Chabrillange,  N.,  dan Duval, Y.  1993.  Cryopreservation of Oil Palm ( Elaeis  guineensis Jacq.)  Somatic  Embryos
Involving a Desiccation Step. Plant Cell Reports, 12:352-355.
Dharmawati,  F.D.,  Syamsuwida,  D.,  Muharam,  A., Suartana,  M.,  dan  Kartiana,  E.R.  2005.  Metode Kriopreservasi  untuk  Penyimpanan  Benih Rekalsitran.  Laporan  Hasil  Penelitian.  Balai Litbang Teknologi Perbenihan, Bogor.
Engelmann, F. 1992. Cryopreservation of Embryos. Di dalam Reproductive Biology and Plant Breeding (Y.  Dattee,  C.  Dumas,  dan  A.  Gallais,  eds.). Springer Verlag Berlin.  Hlm.281-290.
______________.  1999.  Alternative  Methods  for  The Storage  of  Recalcitrant  Seeds-  An  Update. Di dalam Prosiding IUFRO Seed Symposium 1998, Kuala Lumpur. Malaysia. Hlm.159-170.
Hong,  T.  dan  Ellis,  R.H.    1996.  A  Protocol  to Determine  Seed  Storage  Behaviour. Di  dalam Engels, J.M.M & Toll, J (Eds). IPGRI Technical Bulletin No.1. IPGRI, Rome, Italy.
Krishnapillay, B., Tsan, F.Y., Marzalina, M.,; Jayanthi, N.,  dan  Nashatul  Zaimah,  N.A.  1999.  Slow Growth  as  a  Method  to  Ensure  Continuous Supply  of  Planting  Materials  for  Recalcitrant Seed  Species. Di  dalam Prosiding  IUFRO  Seed Symposium  1998,  Kuala  Lumpur.  Malaysia. Hlm.280-285.
Kamaluddin,  M.  1999.  Manipulation  of  Growth  Light Environment for Storage of Seedlings of Shade- Tolerant  Forest  Tree  Species  in  Nursery. Di dalam Prosiding IUFRO Seed Symposium 1998, Kuala Lumpur. Malaysia. Hlm.286-295.
Sudarmonowati,  E.S,  Fitriyatmi,  I.,  dan  Sadjad,  S. 1995. Viabilitas Benih Matoa ( Pometia pinnata ) dan  Kerabatnya  setelah  Penyimpanan  Suhu Rendah  hingga  -196 o C.  Pusat  penelitian Bioteknologi,  Lembaga  Ilmu  Pengetahuan Indonesia (LIPI).  Cibinong-Bogor.
Sakai,  A.,  Kobayashi,  S.,  dan  Oiyama,  I.  1990. Cryopreservation  of  Nucellar  Cells  of  Navel Orange  ( Citrus  sinensis  Osb.var  brasiliensis Tanaka)  by  Vitrivication.  Plant  Cell  Reports, 9:30-33.
Syamsuwida,  D.,  Aminah,  A.,  Hidayat,  A.R.,  dan Sanusi,  A.  2004.  Teknik  Penyimpanan  Benih Rekalsitran dalam Bentuk Semai. Laporan Hasil Penelitian.  Balai  Litbang Teknologi Perbenihan. Bogor.
Tompsett,  P.B.  1992.  A  Review  of  The  Literature  on Storage of Dipterocarp Seeds. Seed Science and Technology, 20:251-267.
Tsan,  F.Y.,  Jamaluddin,  B.,  Kamis,  A.,  Krishnapillay, B.,  dan  Ang,  K.C.  1999.  The  Growth Performance  of  Hopea  odorata  Seedlings
JMHT Vol. XIV, (2): 66-72, Agustus 2008                                                                                                                                                 Artikel Ilmiah ISSN: 0215-157X
Subjected  to  Application  of  Paclobutrazol  at Two  Ages. Di  dalam Prosiding  IUFRO  Seed Symposium  1998,  Kuala  Lumpur.  Malaysia. Hlm.297-303.
Thammasiri,  K.  1999.  Cryopreservation of  Embryonic
Axes  of  Jackfruit  by  Vitrivication. Di  dalam Prosiding IUFRO Seed Symposium 1998, Kuala
Lumpur. Malaysia. Hlm.153-158.
Yap , L.V., Hor, Y.L., dan Normah, M.N. 1999. Effects of Sucrose Preculture and Subsequent
Desiccation  on  Cryopreservation  of  Alginate- Encapsulated Hevea  Brasiliensis Embryo. Di dalam Prosiding IUFRO Seed Symposium 1998,
Kuala Lumpur. Malaysia. Hlm.140-145.