## HIDROLISIS ENZIMATIK MINYAK IKAN UNTUK PRODUKSI ASAM LEMAK OMEGA-3 MENGGUNAKAN LIPASE DARI Aspergillus niger
[Enzymatic Hydrolysis of Fish Oil for Production of Omega-3 Fatty Acids Using Lipase Derived from Aspergillus niger ]

## Sapta Raharja*, Prayoga Suryadarma, dan Teni Oktavia
Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor
Diterima 26 Agustus 2010 / Disetujui 26 Desember 2010

## ABSTRACT
Fish oil is the source of important fatty-acid, especially polyunsaturated fatty acid (PUFA) omega-3, such as eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA). Lipase catalysis activity of Aspergillus niger is low when it is used in fish oil hydrolysis. The activity of the lipase can be increased by adding organic solvent such as hexane into the media. This research aimed to determine temperature, pH and amount of water which produce the highest degree of hydrolysis of fish oil in the presence of hexane. Correlation between the highest degree of hydrolysis and the amount of omega-3 fatty acid was also investigated. The variables used in this research were temperatures (25-65) o C, pH (5-9), and water addition (1-5) %v/v. The highest degree of enzymatic hydrolysis of fish oil in the media without hexane was 28.07 % that was reached at 45 o C and pH 5. In the presence of hexane, the highest degree of hydrolysis was 75.12 % which was reached at 5% water addition, temperature 45 o C, and pH 5. GC- MS  analysis  showed  that  omega-3  fatty  acid  content  especially  EPA  and  DHA  increased  along  with  increase  in  the  degree  of  hydrolysis. Concentration of omega-3 fatty acid produced without hexane addition was 18.42 % with EPA amounted to 12,17% and DHA 0,86%. Meanwhile omega-3 fatty acid content in the presence of hexane reached 21.93 % with EPA amounted to 17.75 % and DHA 1.21 %.
Keywords: Fish Oil, Omega-3, Hydrolysis, Aspergillus niger lipase, Hexane

## 1 PENDAHULUAN
Minyak ikan merupakan  sumber asam lemak yang penting khususnya  asam  lemak  tidak  jenuh  dengan  banyak  ikatan rangkap  (PUFA)  n-3  atau  yang  lebih  dikenal  dengan  sebutan omega-3  yaitu  asam  eikosapentanoat  (EPA)  dan  asam dokosaheksanoat  (DHA)  yang  merupakan  asam  lemak  yang esensial  untuk  manusia  karena  asam  lemak  ini  tidak  bisa diproduksi oleh tubuh manusia itu sendiri.
Efek  kesehatan  yang  menguntungkan  dari  asam  lemak tidak  jenuh  dengan  banyak  ikatan  rangkap  (PUFA)  n-3  dan berantai  panjang,  khususnya  asam  eikosapentanoat  pada  cis- 5,8,11,14,17  dan  asam  dokosaheksanoat  pada  cis- 4,7,10,13,16,19  adalah  kemampuannya  untuk  menurunkan kadar  kolesterol  dalam  darah  serta  untuk  mencegah  dan mengatasi beberapa jenis penyakit diantaranya penyakit jantung koroner,  hipertensi,  kanker,  inflamasi,  efek hypotrigliceridemic dan  diabetes.  Selain  itu,  asam  lemak  omega-3  juga  sangat penting  untuk  membantu  fungsi  kerja  otak,  terutama  untuk proses pertumbuhan dan perkembangan otak (De Busk, 2007).
Bentuk asilgliserol dalam ilmu nutrisi dipertimbangkan lebih baik  daripada  etil  ester  karena  bentuk  alkil  ester  tidak  mudah diserap oleh usus, sedangkan asam lemak bebas (FFA) mudah teroksidasi  dan  tidak  dapat  dikonsumsi  manusia  secara langsung.  Berbagai  macam  cara  telah  dikembangkan  oleh industri  farmasi  untuk  memurnikan  asam  lemak  omega-3  dari minyak  ikan  melalui  metode  fisika  maupun  kimia  antara  lain dengan pemisahan kromatografi, distilasi fraksional, kristalisasi
* Korespondensi Penulis : Email : saptaraharja@ipb.ac.id
pada  suhu  rendah, urea  complexation , supercritical  fluid extraction ,  akan  tetapi  kebanyakan  dari  metode  tersebut menghasilkan asam lemak omega-3 dalam bentuk asam lemak bebas (FFA) dan alkil ester (Wanasundara dan Shahidi, 1998).
Hoshino et  al. (1990)  menyatakan  minyak  ikan  dihidrolisis secara  parsial  oleh  enzim  lipase,  banyaknya  asam  lemak omega-3  pada  minyak  yang  tersisa  dalam  bentuk  asilgliserol meningkat  secara  signifikan  dan  metode  tersebut  kemudian lebih  dikenal  sebagai  hidrolisis  secara  enzimatik.  Keuntungan penggunaan  lipase  sebagai  katalis  daripada  metode  fisik maupun  kimia  antara  lain  efisiensi  katalitik  lipase  yang  tinggi sehingga  jumlah  enzim  yang  dibutuhkan  cukup  sedikit, menghilangkan penggunaan katalis anorganik dan bahan kimia berbahaya lainnya, dan bekerja optimal pada kondisi lingkungan ringan,  sehingga  dapat  menghemat  energi.  Produk  yang dihasilkan  menggunakan  katalis  lipase  lebih  tinggi  tingkat kemurnian  dan  kualitasnya  baik  dalam  hal  rasa  maupun warnanya (Haraldson et al. , 1997). Menurut Carvalho et al . (2009), salah satu jenis lipase yang memberikan  hasil  hidrolisis  selektif  terbaik  dihasilkan  oleh Aspergillus  niger .  Hal  tersebut  dikarenakan  lipase  dari Aspergillus  niger mempunyai  spesifisitas  posisional  memutus ikatan triasilgliserol pada posisi stereochemical numbering (sn)1 dan  3,  sehingga  dapat  menjaga  asam  lemak  omega-3  dalam bentuk asilgliserol yang umumnya terletak pada sn 2.
Sisi aktif enzim lipase ditutup oleh lid enzim yang tersusun dari  triptofan  yang  bersifat  fleksibel  dan  bersifat  non  polar (hidrofobik).  Oleh  karena  itu,  dibutuhkan  suatu  pelarut  organik yang  mempunyai  sifat  non  polar  (hidrofobik),  sehingga  dapat meningkatkan pembukaan lid , termostabilitas,
enantioselektivitas  dan  aktivitas  lipase  (Gupta,  2007).  Pelarut organik  yang  bersifat  hidrofobik  dengan  nilai  kepolaran  yang berada pada rentang penerimaan aktivitas dan stabilitas lipase yaitu  antara  2  sampai  4,  salah  satunya  adalah  heksana. Menurut  Baharum et  al. (2003),  heksana  memiliki  nilai  log  p sebesar 3,5 dan titik didih sebesar 69 o C, dan dengan titik didih yang  rendah  isolasi  produk  dari  pelarutnya  dapat  dilakukan dengan mudah.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan  kondisi  faktor reaksi yaitu suhu, pH dan penambahan air yang menghasilkan tingkat  hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan  tertinggi  pada  media tanpa dan dengan ditambahkan pelarut organik heksana. Selain itu,  tujuan  penelitian  ini  juga  untuk  menentukan  hubungan antara tingkat hidrolisis enzimatik minyak ikan tertinggi terhadap total asam lemak omega-3 yang dihasilkan.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bahan  baku  utama  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  minyak  ikan  dari  hasil  samping  industri  pengalengan ikan lemuru ( Sardinella sp. ) yang sudah diolah oleh perusahaan dan  diperoleh  dari  daerah  Muncar,  Banyuwangi.  Lipase  dari Aspergillus  niger diperoleh  dari Amano  Pharmaceutical Manufacturing Co . Lipase dari Aspergillus niger yang digunakan pada penelitian ini mempunyai aktivitas sebesar 7939,97 Unit/g. Bahan  kimia  yang  digunakan  untuk  analisis  sampel  adalah monosodium  difosfat  (NaH 2 PO 4 ),  disodium  fosfat  (Na 2 HPO 4 ), gas  nitrogen,  etanol  95%,  kalium  hidroksida  (KOH),  HCL  35- 37%, metanol, isopropil alkohol, dan toluene
Peralatan  utama  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah shaker waterbath yang dilengkapi dengan pemanas dan pengatur kecepatan, wadah gelas (diameter 4 cm dan tinggi 7 cm),  kondensor, spectrofotometry  (Pharmacia  Novaspec  II  ), magnetic  stirrer , shaker  tube, dan gas  chromatography  mass spectrometry (Agilent Technologies 7890A GC System dengan detector Agilent Technologies 5975C. MSD).

## Karakterisasi minyak ikan
Karakterisasi  minyak  ikan  yang  dilakukan  meliputi  analisis komposisi  asam  lemak  yang  terkandung  dalam  minyak  ikan sebelum  dihidrolisis,  menggunakan gas  chromatography  mass spectrometry  (GC-MS)  dan pengujian  sifat  kimia  minyak  ikan yaitu bilangan asam dan kadar  asam lemak bebas  (AOCS  Cd 3d-63,  1997) serta  bilangan  penyabunan  (AOCS  Cd  3-25, 1997).
Pengukuran  aktivitas  lipase  dengan  metode  Spektro- fotometri (Sigma Aldrich, 1994)
Pengukuran ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas lipase dari Aspergillus  niger dalam  satuan  Unit. Satu  Unit  aktivitas lipase  pada  metode  spektrofotometri  didefinisikan  sebagai kemampuan sejumlah enzim untuk membebaskan satu µmol p- nitrophenol dari pNP butyrate sebagai substrat dalam waktu 30 menit pada kondisi pH, komposisi buffer dan suhu 37 o C .
Sebanyak  0,45  ml  larutan  enzim  dimasukkan  ke  dalam tabung  reaksi  bertutup  ulir.  Larutan buffer fosfat 0,1  M  pH  7 ditambahkan  sebanyak  0,54  ml  ke  dalam  tabung  ulir,  dikocok
dengan shaker  tube hingga  larutan  bercampur  merata. Selanjutnya  dimasukkan  ke  0,01  ml  larutan ρ-nitrophenyl butyrate 0,2  M , dikocok  kembali  dengan shaker  tube hingga larutan bercampur rata. Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C  selama  30  menit.  Pengukuran  absorbansi  sampel dilakukan  dengan  spektrofotometer  pada  panjang  gelombang 410  nm.  Blanko  dibuat  sesuai  dengan  prosedur  untuk  sampel tanpa penambahan larutan enzim. Penghitungan aktivitas enzim dilakukan dengan menggunakan rumus :
Unit / ml enzim =
keterangan: A = nilai absorbansi sampel fp = Faktor pengencer B = nilai absorbansi blanko K = Nilai konversi standar ρ- nitrophenyl butyrate (0,0148 μmol) T  = lama inkubasi (menit) Vt = Volume total larutan sampel (ml) Ve = Volume larutan enzim (ml)
Hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan  (Modifikasi  Metode Wanasundara dan Shahidi, 1998)
Pada penelitian ini dilakukan hidrolisis terhadap minyak ikan dengan  katalis  lipase  dari Aspergillus  niger dalam  dua  tahap. Hidrolisis enzimatik yang pertama dilakukan pada media tanpa penambahan pelarut organik heksana untuk menentukan suhu dan pH yang memberikan hasil  tingkat hidrolisis tertinggi yang akan  digunakan  pada  hidrolisis  enzimatik  tahap  kedua. Hidrolisis  enzimatik  tahap  kedua  dilakukan  dengan penambahan pelarut organik heksana pada medianya.
Minyak  ikan  sebanyak  4  gram  ditambahkan  6  ml buffer fosfat 0,1 M (pH 5,6,7,8,9) yang didalamnya telah dilarutkan 800 unit  lipase  dari Aspergillus  niger (200  U/gram  minyak)  dan penambahan air yaitu (1, 2, 3, 4 dan 5%) v/v terhadap larutan. Pelarut  organik  yaitu  heksana  (ρ:0.65  g/cm 3 )  ditambahkan  ke dalam campuran larutan enzim lipase, air dan minyak, dengan perbandingan  antara  larutan  lipase  terhadap  pelarut  heksana adalah  3:1  (v:v).  Larutan  kemudian  ditempatkan  ke  dalam wadah  gelas  (diameter  4  cm  dan  tinggi  7  cm).  Wadah  berisi larutan  kemudian  dibilas  dengan  gas  nitrogen  dan  ditutup dengan sumbat karet serta plastik wrap.
Setelah  itu  wadah  gelas  ditempatkan  dalam shaker waterbath untuk  kemudian  dihidrolisis  selama  48  jam  dengan kecepatan  200  rpm  pada  berbagai  suhu  inkubasi  yang dicobakan yaitu 25, 35, 45, 55, 65 o C. Setelah proses hidrolisis enzimatik  minyak  ikan  selesai,  selanjutnya  ditambahkan  2  ml metanol  dan  dicampur  hingga  merata  untuk  menghentikan aktivitas  lipolitik  enzim  lipase,  kemudian  dilakukan  analisis produk  akhir.  Untuk  perlakuan  kontrol,  sama  dengan  prosedur diatas, akan tetapi kedalam campuran reaksi tidak ditambahkan larutan enzim lipase.

## Penentuan  tingkat  hidrolisis  (Wanasundara  dan  Shahidi, 1998)
Minyak  ikan  hasil  hidrolisis  enzimatik  setelah  48  jam kemudian  dianalisis  bilangan  asam  sesuai  dengan  metode AOCS  Cd  3a-63.  Nilai  bilangan  asam  yang  diperoleh  setelah hidrolisis digunakan untuk menentukan tingkat hidrolisisnya.
8.00 9.00 10.00  11.00 12.00  13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00  19.00 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 500000 550000 600000 650000 700000 750000 Waktu Retensi Ab un da nc e TIC: MINYAK IKAN .D 7.44 9.01 9.06 9.45 9.69 10.74 10.85 11.42 11.99 12.01 12.65 12.92 13.03 13.66 13.92   14.59 16.13 16.75
17.06 19.45
Adapun  persamaan  perhitungan  untuk  menentukan  tingkat hidrolisis sebagai berikut :
Keterangan : A : Nilai bilangan asam sebelum hidrolisis (mg KOH/ g minyak) B : Nilai bilangan asam setelah hidrolisis (mg KOH/ g minyak) P : Nilai bilangan penyabunan (mg KOH/g minyak)
Analisis  komponen  minyak  hasil  hidrolisis  menggunakan GC-MS (Modifikasi Metode Wanasundara dan Shahidi, 1998) Terhadap  hasil  hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan  kemudian dilakukan  pemisahan  berdasarkan  sifat  kepolarannya  dengan menempatkan  hasil  hidrolisis  ke  dalam  labu  pemisah.  Air, gliserol  dan  lipase  yang  cenderung  polar  akan  menempati lapisan paling bawah untuk kemudian dipisahkan dan dibuang. Pelarut heksana yang mengandung tri-, di-dan monoasilgliserol yang bersifat non polar akan memisah dan berada pada lapisan paling atas.
Terhadap  produk  yang  terdapat  di  dalam  pelarut  heksana kemudian  dilakukan  pengukuran  total  asam  lemak  omega-3 dengan menggunakan GC-MS . Sebanyak 1 μL fraksi minyak di dalam  pelarut  heksana  kemudian  injeksikan  kedalam gas chromatography  mass  spectrometry  (GC-MS)  untuk  dilakukan analisis terhadap kandungan total omega-3 produk.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakterisasi minyak ikan
Karakterisasi  minyak  ikan  dilakukan  untuk  mengetahui kondisi  awal  bahan  baku.  Hasil  Karakterisasi  minyak  ikan disajikan pada Tabel 1.
Berdasarkan Tabel 1, minyak ikan yang digunakan sebagai bahan  baku  untuk  proses  hidrolisis  dengan  katalis  lipase  dari Aspergillus  niger mempunyai  nilai  bilangan  asam  dan  kadar asam  lemak  bebas  yang  sesuai  dengan  standar  mutu  untuk minyak ikan berkualitas baik. Nilai tersebut juga memenuhi sifat kimia minyak ikan sebagai bahan baku untuk hidrolisis menurut Celik (2002).
Selain  itu  minyak  yang  digunakan  oleh  Fu et  al. (1995) dalam  percobaan  hidrolisis  minyak  dengan  lipase  dari Aspergillus sp  mempunyai  kadar  asam  lemak  bebas  berkisar 0,8-2,6%,  sehingga  minyak  ikan  pada  percobaan  ini  masih sesuai dengan penelitian sebelumnya.
Tabel 1. Hasil karakterisasi sifat fisikokimia minyak ikan
Karakteristik Satuan Nilai terukur Celik (2002) Jedwar ds Int. Inc (2005) Bilangan asam mg KOH/g 3,26 10,15 1,5 Kadar asam lemak bebas % 1,49 4,6 0,69 Bilangan penyabunan mg KOH/g 204,81 187,4 180
Nilai bilangan penyabunan yang diperoleh mempunyai nilai yang  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  bilangan  penyabunan minyak  ikan  yang  digunakan  dalam  penelitian  Celik  (2002). Perbedaan  nilai  bilangan  penyabunan  ini  dikarenakan  minyak ikan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  berbeda  dengan penelitian  Celik  (2002),  karena  tingkat  pemurnian  oleh  industri kecil  di  Banyuwangi  yang  berbeda  dengan  minyak  ikan  dari industri  besar  yang  digunakan  pada  penelitian  Celik  (2002). Perbedaan  nilai  ini  diduga  karena  asam  lemak  pada  sampel cukup  tinggi  sehingga  nilai  bilangan  penyabunannya  lebih tinggi.
Hasil  analisis  komponen  minyak  dengan  GC-MS menunjukkan  bahwa  minyak  ikan  diketahui  mempunyai kandungan asam lemak jenuh 23,2%, asam lemak tidak jenuh 34,98%,  senyawa  alkana  11.19%,  squalen  4,75%,  aldehid 0,88%  dan  lanol  24,96%  dari  keseluruhan  total  komponen  di dalam  minyak  ikan.  Dari  data  hasil  analisis  juga  diketahui  ada dua  jenis  asam  lemak  yang  dominan  dari  keseluruhan komponen didalam minyak ikan yaitu asam lemak oleat 26,37% yang  merupakan  asam  lemak  tidak  jenuh  dengan  satu  ikatan rangkap  dan  asam  lemak  palmitat  16,81%  yang  merupakan asam lemak jenuh (Gambar 1).
Gambar 1.  Hasil analisis komponen minyak ikan dengan menggunakan  GC-MS
0 2 4 6 8 25 35 45 55 65 Ti ng ka t H id ro lis is (%) Suhu ( 0 C)
Tingkatl hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media tanpa penambahan heksana Tingkat hidrolisis kontrol tanpa katalis  lipase pada media tanpa penambahan heksana 0 5 10 15 20 25 30 5 6 7 8 9 Ti ng ka t H id ro lis is (%) pH Tingkat hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media tanpa penambahan heksana
Tingkat hidolisis kontrol tanpa katalis  lipase pada media tanpa penambahan heksana

## Hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan  pada  media  tanpa penambahan pelarut organik heksana
Hubungan antara suhu inkubasi dengan tingkat hidrolisis Gambar  2  menunjukkan  tingkat  hidrolisis  tertinggi diperoleh  pada  penggunaan  suhu  inkubasi  45 o C  yaitu  6,79%. Sedangkan  tingkat  hidrolisis  terendah  yaitu  2,77%,  diperoleh pada  penggunaan  suhu  inkubasi  25 o C.  Hal  ini  sesuai  dengan pernyataan  Murty et  al. (2002)  bahwa  lipase  dari Aspergillus niger akan aktif dan bekerja optimal pada suhu 45 o C.
Gambar 2.  Kurva  hubungan  antara  suhu  dengan  tingkat  hidrolisis enzimatik  minyak  ikan  pada  media  tanpa  penambahan pelarut organik heksana (pH 7)
Peningkatan  suhu  inkubasi  dari  suhu  25 o C  menjadi  35 o C menyebabkan tingkat hidrolisis yang diperoleh meningkat 1,37% sehingga  diperoleh  tingkat  hidrolisis  4,15%.  Sedangkan peningkatan penggunaan suhu inkubasi dari 35 o C menjadi 45 o C memberikan  kenaikan  tingkat  hidrolisis  tertinggi  yaitu  2,64%. Penggunaan  suhu  yang  tinggi  pada  reaksi  hidrolisis  enzimatik minyak  ikan  akan  meningkatkan  hasil  konversi.  Pada penggunaan suhu reaksi yang terlalu rendah menyebabkan laju reaksi  berjalan  lambat,  akibatnya  tumbukan  antar  pereaksi rendah dan minyak tidak terhidrolisis secara sempurna.
Namun  setelah  mencapai  suhu  yang  optimum  yaitu  suhu 45°C,  peningkatan  suhu  inkubasi  10°C  akan  menurunkan  laju reaksi  pembentukan  asam  lemak  bebas.  Akibatnya  tingkat hidrolisis pada suhu 55 dan 65°C menurun 2,21 dan 3,66% dari tingkat  hidrolisis  tertinggi,  sehingga  diperoleh  tingkat  hidrolisis 4,67  dan  3,13%.  Suhu  yang  tinggi  selain  dapat  meningkatkan laju  reaksi  juga  dapat  menyebabkan  enzim  mengalami denaturasi  dikarenakan  deformasi  atau  perubahan  bentuk struktur tersier atau struktur tiga dimensi lipase dari Aspergillus niger yang  menyebabkan  kerusakan  pada  sisi  aktifnya  dan menginaktifkan enzim tersebut. Perubahan ini semakin berlanjut dengan semakin tingginya suhu reaksi hidrolisis. Oleh sebab itu, aktivitas  katalitiknya  semakin  rendah  pada  setiap  peningkatan suhu 10°C dari suhu inkubasi optimumnya. Hasil hidrolisis dari kontrol tanpa lipase memberikan tingkat hidrolisis yang rendah yaitu kurang dari 1%.
Hubungan  antara  derajat  keasaman  (pH)  dengan  tingkat hidrolisis
Menurut Ozturk (2001), setiap enzim mempunyai pH optimal yang  membantu  menjaga  konformasi  alaminya  dalam lingkungan dimana enzim bekerja.
Hasil analisis pada Gambar 3, menunjukkan bahwa pening- katan  pH  menyebabkan  penurunan  tingkat  hidrolisis.  Tingkat
hidrolisis  yang  memberikan  nilai  tertinggi  diperoleh  pada hidrolisis dengan menggunakan media pada pH 5 yaitu 28,07%. Hal ini sesuai dengan pernyataan Petersen et al . (2001) bahwa lipase dari Aspergillus niger akan aktif pada kondisi lingkungan yang  asam  dengan  aktivitas  optimumnya  pada  pH  4,5-6,5. Penggunaan nilai pH dibawah rentang pH optimum menyebab- kan  enzim  mengalami  penggumpalan  karena  titik  isoelektrik lipase dari Aspergillus niger berada pada pH 4,1.
Gambar 3.  Kurva  hubungan  antara  pH  dengan  tingkat  hidrolisis enzimatik  minyak  ikan  pada  media  tanpa  penambahan pelarut organik heksana (suhu 45 0 C)
Pada  penggunaan  media  pH  6,  tingkat  hidrolisis  yang diperoleh  lipase  dari Aspergillus  niger mengalami  penurunan sebesar 19,73% dari tingkat hidrolisis tertingginya, hal tersebut dikarenakan  enzim  mengalami  denaturasi  sisi  aktif  enzim karena ion H + berikatan dengan NH 3+ pada struktur asam amino protein  membentuk  NH 4- .  Proses  pengikatan  tersebut menyebabkan  ikatan  antara  atom  nitrogen  dengan  atom hidrogen  lainnya  terputus,  sehingga  enzim  terdenaturasi. Penurunan  tingkat  hidrolisis  terbesar  diperoleh  pada penggunaan pH media yang bersifat netral cenderung ke arah basa  yaitu  pada  pH  7,  8  dan  9  dengan  penurunan  tingkat hidrolisis  lebih  dari  20%.  Penurunan  tingkat  hidrolisis  tersebut dikarenakan  rusaknya  struktur  tiga  dimensi  enzim  dikarenakan pada kondisi tersebut gugus OH - dari lingkungan akan berikatan dengan  ion  H + dari  gugus  COO - sisi  aktif  enzim  membentuk H 2 O. Hal tersebut mengakibatkan rusaknya ikatan antara atom hidrogen  dengan  nitrogen  atau  oksigen,  akibatnya  enzim kehilangan  aktivitas  katalitiknya.  Pada  kontrol  tanpa menggunakan  lipase  sebagai  katalis  menunjukkan  tingkat hidrolisis kurang dari 5%.

## Hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan  pada  media  dengan penambahan pelarut organik heksana

## Hubungan antara penambahan air dengan tingkat hidrolisis
Pada  proses  hidrolisis  enzimatik  walaupun  menggunakan pelarut  organik  heksana  sebagai  media,  sejumlah  air  secara mutlak dibutuhkan untuk mengaktifkan sisi katalitik dari enzim.
Berdasarkan  Gambar  4,  diketahui  bahwa  dengan  penam- bahan  pelarut  organik  heksana  dan  sejumlah  air  ke  dalam media reaksi dapat meningkatkan tingkat hidrolisis minyak ikan yang  dapat  dicapai  lipase  jika  dibandingkan  dengan  kontrol tanpa penambahan enzim lipase. Pada kontrol, tingkat hidrolisis yang berkisar 5% diduga merupakan hasil hidrolisis dikarenakan
0 10 20 30 40 50 60 70 80 25 35 45 55 65 Ti ngk at H idr ol is is (%) Suhu ( o C)
Tingkat hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media yang ditambahkan heksana Tingkat hidrolisis kontrol tanpa katalis lipase pada media yang ditambahkan heksana Tingkatl hidrolisis  enzimatik minyak ikan pada  media tanpa penambahan heksana 0 20 40 60 80 1 2 3 4 5 Ti ngk at H idr ol is is (%) Penambahan Air v/v  (%) Tingkat hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media yang ditambahkan heksana Tingkat hidolisis kontrol tanpa katalis lipase pada media yang ditambahkan heksana
adanya  sejumlah  air  dan  panas  pada  media  reaksi  bukan dikarenakan adanya penambahan heksana dalam media reaksi.
Gambar  4.   Kurva hubungan antara penambahan air dengan tingkat hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan  pada  media  yang ditambahkan pelarut organik heksana (suhu 45 o C dan pH 5)
Dari Gambar 4 dapat diketahui bahwa penambahan air 5% v/v  larutan  merupakan  jumlah  minimum  air  yang  dibutuhkan oleh lipase dari Aspergillus niger pada media yang ditambahkan pelarut organik heksana untuk membentuk selapis (monolayer) molekul  air  yang  mampu  menutup  permukaan  enzim.  Oleh sebab  itu,  lipase  tetap  dapat  mengaktifkan  sisi-sisi  katalitiknya dan  memelihara  konformasi  alaminya  (struktur  tiga  dimensi) supaya  terjadi  migrasi  asilester  kearah  pembentukan  produk dengan  parameter  asam  lemak  bebas  yang  meningkat, sehingga diperoleh tingkat hidrolisis tertinggi yaitu 75,12% pada rentang penambahan air yang dicobakan.
Penambahan  air  4%  menyebabkan  penurunan  tingkat hidrolisis  sebesar  11,12%  dari  tingkat  hidrolisis  tertingginya. Sedangkan  penurunan  tingkat  hidrolisis  lebih  dari  13%  dari tingkat hidrolisis tertinggi terjadi pada penambahan air 3, 2 dan 1%,  dengan  tingkat  hidrolisis  terendah  yaitu  58,98%  pada penambahan air 1%. Hal tersebut dikarenakan jumlah air yang terlalu sedikit akan mengurangi kemungkinan kontak fisik antara lipase dari Aspergillus niger dengan air sebagai pereaksi yang berguna untuk mengaktifkan sisi katalitik enzim lipase, sehingga proses  hidrolisis  enzimatik  tidak  berjalan  optimal.  Selain  itu, jumlah air yang terlalu sedikit menyebabkan sisi aktif asil ester sering tidak dapat bereaksi dengan molekul air untuk memotong asil enzim dan membentuk produk.

## Hubungan antara suhu inkubasi dengan tingkat hidrolisis
Penambahan pelarut organik heksana selain meningkatkan aktivitas  enzim  juga  dapat  menggeser  kesetimbangan termodinamika  dan  termostabilitas  enzim  untuk  meningkatkan laju reaksi hidrolisis (Rahman et al ., 2006). Namun, berdasarkan hasil  pengujian  penambahan  pelarut  organik  heksana  pada media  reaksi  hanya  meningkatkan  aktivitas  katalitik  dan termostabilitas  lipase  dari Aspergillus  niger dalam  reaksi hidrolisis  enzimatik  dan  tidak  menyebabkan  pergeseran  suhu optimum dari enzim lipase
Bila  dilihat  dari  Gambar  5,  rentang  suhu  25-55 o C merupakan  rentang  suhu  yang  memberikan  tingkat  hidrolisis yang  cukup  tinggi.  Tingkat  hidrolisis  tertinggi  yaitu  74,83% diperoleh  pada  penggunaan  suhu  inkubasi  45 o C.  Tingginya tingkat  hidrolisis  yang  diperoleh  dikarenakan  pada  kondisi lingkungan hidrofobik mikroakueus dimana jumlah air terbatas, peningkatan suhu inkubasi hingga mencapai suhu optimumnya akan  meningkatkan  kelarutan  substrat  yaitu  minyak  ikan  ke
dalam pelarut organik heksana, sehingga substrat akan dibawa oleh pelarut heksana melalui kantung hidrofobik enzim menuju sisi  katalitiknya  untuk  dihidrolisis.  Sesuai  dengan  penelitian yang dilakukan oleh Probondari et al. (2008) yang menyatakan bahwa  suhu  optimum  proses  interesterifikasi  antara  minyak ikan,  asam  laurat  dan  lipase Candida  rugosa selama  24  jam pada suhu 45 o C.
Gambar 5.  Kurva  hubungan  antara  suhu  dengan  tingkat  hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media
Peningkatan  suhu  inkubasi  10 o C  dari  suhu  25  ke  35 o C memberikan  kenaikan  tingkat  hidrolisis  sebesar  1,50%, sehingga  diperoleh  tingkat  hidrolisis  51,00%  dari  sebelumnya yang 49,50%. Penggunaan suhu inkubasi yang lebih tinggi 10 o C dari  suhu  optimumnya  yaitu  suhu  55 o C,  menyebabkan  enzim mulai  mengalami  deaktivasi  akibat  terdenaturasinya  protein enzim  pada  suhu  tinggi,  sehingga  tingkat  hidrolisisnya  meng- alami penurunan sebesar 23,02% dari tingkat hidrolisis tertinggi. Rendahnya  tingkat  hidrolisis  yang  diperoleh  pada  suhu  65 o C hingga  berada  pada  nilai  8,33%  atau  turun  66,5%  dari  tingkat hidrolisis  tertingginya,  mengindikasikan  enzim  mengalami denaturasi  protein  secara  besar-besaran,  sebab  suhu  65 o C nilainya  mendekati  titik  didih  heksana  pada  69 o C  yang menyebabkan struktur tiga dimensi dari enzim mulai mengalami kerusakan  karena  pelarut  organik  heksana  tidak  dapat mempertahankan konformasi alami lipase dari Aspergillus niger , sehingga aktivitas katalitiknya rendah.
Dari  kurva  hasil  hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan,  pada media  tanpa  dan  yang  ditambahkan  pelarut  organik  heksana (Gambar  5),  diketahui  bahwa  penambahan  pelarut  heksana pada  penggunaan  suhu  inkubasi  25  dan  35 o C  pada  media reaksi menyebabkan tingkat hidrolisisnya meningkat 46,73 dan 46,85%  dari  nilai  hidrolisis  enzimatik  pada  media  tanpa penambahan  pelarut  heksana  pada  suhu  yang  sama. Peningkatan  aktivitas  katalitik  lipase  terbesar  diperoleh  pada hidrolisis  minyak  ikan  dalam  media  yang  ditambahkan  pelarut organik  heksana  dengan  suhu  inkubasi  45 o C,  dimana  tingkat hidrolisisnya  meningkat  68,2%  dari  tingkat  hidrolisis  enzimatik minyak  ikan  pada  media  tanpa  penambahan  pelarut  heksana pada  suhu  45 o C.  Meningkatnya  hasil  hidrolisis  disebabkan pelarut  organik  hidrofobik  heksana  mempunyai  konstanta dielektrika yang rendah, sehingga dapat memperkuat dan men- stabilkan struktur enzim secara keseluruhan jika disbandingkan dengan  hasil  hidrolisis  enzimatik  tanpa  penambahan  pelarut heksana,  dimana  banyaknya  kandungan  air  didalamnya
0 20 40 60 80 5 6 7 8 9 Ti ng ka t H id ro lis is (%) pH
Tingkat hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media yang ditambahkan heksana
Tingkat hidrolisis kontrol tanpa katalis  lipase pada  media yang ditambahkan heksana
Tingkat hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media tanpa penambahan heksana
menyebabkan struktur enzimnya bersifat labil dan mempercepat terjadinya denaturasi enzim oleh faktor panas.
Peningkatan hasil hidrolisis pada media yang ditambahkan pelarut  organik  heksana  juga  terjadi  pada  penggunaan  suhu yang lebih tinggi dari suhu optimumnya yaitu pada suhu 55 dan 65 o C, dimana tingkat hidrolisis yang diperoleh jika dibandingkan dengan  tingkat  hidrolisis  enzimatik  pada  media  tanpa penambahan pelarut organik heksana nilainya meningkat 47,14 dan 4,90%. Hal tersebut dikarenakan kenaikan rigiditas molekul lipase  karena  penambahan  pelarut  organik  heksana  membuat enzim  lebih  tahan  terhadap  panas  (termostabilitas  meningkat) dan  tidak  mudah  terdenaturasi  pada  suhu  tinggi.  Kontrol  hasil hidrolisis  digunakan  untuk  membuktikan  adanya  aktivitas katalitik  lipase  dari Aspergillus  niger pada  media  yang ditambahkan pelarut organik heksana.
Sesuai dengan penelitian yang dilakukan Martati et al. (20. ) bahwa hidrolisis minyak hati ikan cod dengan lipase dari Mucor miehei akan  memberikan  tingkat  hidrolisis  terbesar  pada  suhu 60 o C yaitu 77,7% dengan penambahan heksana dibandingkan dengan suhu 40 o C dengan nilai 64,6%.
Hubungan  antara  derajat  keasaman  (pH)  dengan  tingkat hidrolisis
Pada  pengujian  pengaruh  penambahan  pelarut  heksana pada berbagai pH, penambahan pelarut heksana pada hidrolisis enzimatik minyak ikan tidak menyebabkan pergeseran stabilitas pH optimum, akan tetapi hanya meningkatkan aktivitas katalitik lipase dari Aspergillus niger pada pH optimum.
Gambar 6.   Kurva  hubungan  antara  pH  dengan  tingkat  hidrolisis enzimatik  minyak  ikan  pada  media  yang  ditambahkan pelarut organik heksana (penambahan air 5%v/v dan suhu 45 o C)
Gambar  6  memperlihatkan  pada  media  yang  ditambahkan heksana  diperoleh  tingkat  hidrolisis  enzimatik  pada  pH pengujian  yang  lebih  tinggi  daripada  tingkat  hidrolisis  yang diperoleh  pada  kontrol.  Hal  tersebut  membuktikan  adanya aktivitas  katalitik  oleh  lipase  dari Aspergillus  niger pada  media yang ditambahkan pelarut organik heksana.
Dari  kurva  hubungan  antara  pH  dengan  tingkat  hidrolisis enzimatik  minyak  ikan  pada  media  yang  ditambahkan  pelarut organik  heksana  (Gambar  6)  diketahui  pH  5  merupakan  pH optimum lipase dari Aspergillus niger dalam melakukan aktivitas katalitiknya.  Hal  tersebut  dapat  dilihat  pada  tingginya  tingkat hidrolisis  yang  mencapai  74,51%.  Peningkatan  penggunaan
nilai  pH  yang  lebih  tinggi  dari  pH  optimumnya  menyebabkan penurunan tingkat hidrolisis yang diperoleh. Pada penggunaan media dengan pH 6 tingkat hidrolisis yang diperoleh lipase dari Aspergillus  niger mengalami  penurunan  sebesar  62,42%  dari tingkat  hidrolisis  tertingginya.  Hal  tersebut  diduga  pada  pH  6 enzim  mengalami  denaturasi  sisi  aktif  enzim  karena  ion  H + berikatan  dengan  NH 3+ pada  struktur  asam  amino  protein membentuk  NH 4- .  Sedangkan  pada  PH  7,  8  dan  9,  tingkat hidrolisis  yang  dihasilkan  oleh  lipase  dari Aspergillus  niger menurun  hingga  70%  dari  tingkat  hidrolisis  pada  pH  5. Penurunan  tingkat  hidrolisis  terbesar  pada  media  yang ditambahkan pelarut organik heksana terjadi pada penggunaan pH 8 dan 9, dimana tingkat hidrolisis yang diperoleh yaitu 2,95% nilainya tidak berbeda secara signifikan dengan tingkat hidrolisis pada kontrol. Hal itu mengindikasikan bahwa pada pH 8 dan 9, penurunan  tingkat  hidrolisis  dikarenakan  enzim  mengalami denaturasi akibat struktur enzim berubah.
Berdasarkan  kurva  hasil  hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan pada  media  tanpa  dan  yang  ditambahkan  pelarut  organik heksana  dapat  diketahui  bahwa  penambahan  pelarut  organik heksana  kedalam  media  yang  bersifat  asam  yaitu  pH  5  dan  6 akan  meningkatkan  aktivitas  katalitik  lipase  dari Aspergillus niger .  Peningkatan  aktivitas  katalitik  lipase  terbesar  diperoleh pada penambahan pelarut heksana pada media dengan pH 5, dimana  tingkat  hidrolisisnya  meningkat  46,44%  dari  tingkat hidrolisis  tanpa  penambahan  pelarut  heksana  pada  pH  yang sama.
Sedangkan pada pH 6, penambahan pelarut heksana hanya memberikan  kenaikan  3,75%.  Tingginya  tingkat  hidrolisis  yang diperoleh pada pH 5 dikarenakan pelarut organik heksana pada kondisi  pH  yang  optimum  untuk  lipase  bekerja,  dapat meningkatkan stabilitas gugus ionik pada enzim, dimana gugus ionik  ini  berperan  dalam  menjaga  konformasi  alami  sisi  aktif enzim  dalam  mengikat  substrat.  Lipase  dalam  pelarut  organik hidrofobik  menjadi  tidak  stabil  pada  kondisi  basa  (pH>7)  dan kondisi yang cenderung asam (pH<5) (Akova dan Ustun, 2000). Hal tersebut sesuai dengn hasil pengujian dimana pada media dengan pH yang bersifat netral yaitu pH 7, penambahan pelarut organik  heksana  menyebabkan  terjadinya  deaktivasi  enzim lipase,  sehingga  menyebabkan  penurunan  tingkat  hidrolisis sebesar 0,31% dari tingkat hidrolisis tanpa penambahan pelarut heksana pada pH yang sama.
Sedangkan  penambahan  pelarut  organik  heksana  pada media yang bersifat basa yaitu pada pH 8 dan 9, menyebabkan lipase mengalami inaktivasi dengan penurunan tingkat hidrolisis sebesar 1,44 dan 1,56% dari nilai hidrolisis tanpa penambahan pelarut heksana pada pH yang sama.  Sesuai dengan penelitian yang  dilakukan  oleh  Saxea et  al. (2009)  dimana  optimasi produksi  enzim  lipase  secara  ekstraseluler  oleh  kapang Aspergillus  niger pada  substrat  minyak  sawit  adalah  pada kondisi  pH  5.6  dan  suhu  25 o C.  Wanasundara  dan  Shahidi (1998)  juga  menyatakan  bahwa  enzim  lipase Aspergillus  niger melakukan katalitik optimum pada pH optimum 5-7.

## Hubungan  antara  tingkat  hidolisis  tertinggi  dengan  total Omega-3 yang dihasilkan
Asam  lemak  omega-3  adalah  asam  lemak  tidak  jenuh dengan banyak ikatan rangkap, ikatan rangkap pertama terletak pada  atom  karbon  ketiga  dari  gugus  metil  omega.  Komponen
16.08 18.42 21.93 6.79 28.07 75.12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 H1 A H1 B H2 Pe rs en ta se (% ) Total OMEGA-3 Tingkat Hidrolisis a 6.79 28.07 75.12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 H1 A H1 B H2 P er se nt as e ( % ) Total EPA Tingkat Hidrolisis b 9,49 12,17 17,75 0.56 0.86 1.21 6.79 28.07 75.12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 H1 A H1 B H2 Pe rs en ta se (% ) Total DHA Tingkat Hidrolisis c
paling  tinggi  yang  terkandung  dalam  asam  lemak  omega-3 adalah  asam  eikosapentanoat  (C20:5 -3,  umumnya  dikenal sebagai EPA) dan asam dokosaheksanoat (C22:6 3, umumnya dikenal sebagai DHA) (Aidos,2002).
Berdasarkan  hasil  pengujian  komponen  minyak  ikan  pada fase non polar menggunakan GC-MS , diketahui bahwa hidrolisis minyak  ikan  dengan  menggunakan  katalis  lipase  dari Aspergillus  niger dapat  meningkatkan  kandungan  asam  lemak omega-3  pada  kondisi  optimum  faktor  reaksi.  Gambar  7  (a) menunjukkan  kandungan  asam  lemak  omega-3  tertinggi  yaitu 21,93% dari seluruh total komponen minyak ikan yang terdapat pada  sampel  tersebut  dengan  tingkat  hidrolisis  75,12%  (H2). Tingginya  kandungan  asam  lemak  omega-3,  diduga  berkaitan dengan  hidrolisis  minyak  ikan  pada  media  yang  ditambahkan heksana yang selain dapat meningkatkan aktivitas dan stabilitas lipase dari Aspergillus niger , juga dapat mengikat dan menjaga asilgliserol  yang  banyak  mengandung  asam  lemak  omega-3 yang terbentuk selama proses hidrolisis parsial ke dalam pelarut heksana,  sehingga  tidak  mudah  rusak  atau  tereduksi  menjadi komponen  lain  seperti  oleh  perubahan  kondisi  lingkungan selama proses.
Pada  sampel  H1(A)  dan  H1(B)  hasil  hidrolisis  enzimatik minyak ikan tanpa penambahan heksana, diketahui banyaknya asam  lemak  omega-3  yang  terkandung  didalamnya  yaitu sebesar 16,08 dan 18,42% dari seluruh total komponen dalam minyak ikan. Pada sampel H1(A) dengan tingkat hidrolisis yang lebih  rendah  yaitu  6,79%  jika  dibandingkan  dengan  sampel H1(B)  yaitu  28,07%,  mempunyai  kandungan  asam  lemak omega-3  yang  lebih  tinggi  dibandingkan  tingkat  hidrolisisnya. Hal  tersebut  diduga  pada  sampel  H1(B)  penggunaan  media hidrolisis  dengan  pH  5  yang  merupakan  pH  optimum  bagi aktivitas lipase dari Aspergillus niger, menyebabkan kerusakan parsial pada asam lemak tidak jenuh dengan banyaknya ikatan rangkap  (PUFA)  omega-3  yang  terbentuk.  Untuk  asam  lemak, pH  5  merupakan  pH  ekstrim  jika  dibandingkan  pH  7  yang digunakan  pada  sampel  H1(A),  sehingga  menyebabkan terjadinya  proses  oksidasi,  isomerisasi  cis-trans  atau  migrasi ikatan  ganda  asam  lemak  omega-3  pada  suhu  relatif  tinggi (45 o C). Banyaknya kandungan asam lemak omega-3 pada sampel yang  telah  mengalami  hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan dikarenakan  lipase  dari Aspergillus  niger dengan  spesifisitas posisional stereochemical  numbering (sn)  1,3  mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis ikatan ester minyak ikan yang berupa  triasilgliserol  pada  posisi  primer  (sn-1  dan  atau  sn-3), sehingga  dihasilkan  banyak  asam  lemak  tidak  jenuh  dengan banyak  ikatan  rangkap  (PUFA)  omega-3  yang  terletak  pada posisi sekunder (sn-2) (lihat Gambar 8). Menurut Carvalho et al . (2009),  pengkayaan  asam  lemak  tidak  jenuh  dengan  banyak ikatan rangkap (PUFA) omega-3 dapat dilakukan melalui proses reduksi  asam  lemak  jenuh  (SFA  C16–C18)  dan  asam  lemak tidak jenuh tunggal (MUFA).
Dari  Gambar  7  (b)  dan  (c),  dapat  dilihat  bahwa  hidrolisis enzimatik  minyak  ikan  dengan  katalis  lipase  dari Aspergillus niger juga  dapat  meningkatkan  kandungan  asam  lemak  EPA dan DHA pada kondisi optimum faktor reaksi. Pada sampel hasil hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan  tanpa  penambahan  pelarut heksana yaitu sampel H1(A) dan H1(B) dengan tingkat hidrolisis
6,79 dan 28,07%, diketahui kandungan EPA di dalamnya yaitu sebesar 9,49 dan 12,17%, dengan kandungan DHA didalamnya sebesar  0,56  dan  0,86%  dari  total  seluruh  komponen  dalam minyak  ikan.  Peningkatan  kandungan  EPA  dan  DHA  tertinggi terdapat pada sampel H2 hasil hidrolisis enzimatik minyak ikan dengan penambahan pelarut heksana yang mempunyai tingkat hidrolisis  75,12%,  dengan  jumlah  EPA  yang  terkandung didalamnya 17,75% dari seluruh total komponen atau meningkat 5,58%  dari  sampel  H1(B),  sedangkan  kandungan  DHA  di dalamnya  1,21%  dari  seluruh  total  komponen  dalam  minyak ikan  atau  meningkat  0,35%  jika  dibandingkan  dengan  sampel H1(B).
Gambar 7.   Diagram  hubungan  antara  tingkat  hidrolisis  dengan  total omega-3  (a),  total  EPA  (b)  total  DHA  (c)  hasil  hidrolisis enzimatik minyak ikan pada kondisi optimum reaksi. H1(A) : Hasil hidrolisis enzimatik minyak ikan pada media tanpa penambahan pelarut organik heksana pada kondisi reaksi suhu  45 o C  dan  pH  7;  H1(B)  :  Hasil  hidrolisis  enzimatik minyak  ikan  pada  media  tanpa  penambahan  pelarut organik  heksana  pada  reaksi  suhu  45 o C  dan  pH  5;  H2  : Hasil  hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan  pada  media  yang ditambahkan pelarut organik heksana pada kondisi reaksi suhu 45 o C, pH 5 dan penambahan air 5% v/v
Nilai  ini  berbeda  dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh Wanasundara  dan  Shahidi  (1998)  dimana  reaksi  hidrolisis minyak  ikan menhaden dengan  lipase  dari Aspergillus  niger memiliki  tingkat  hidrolisis  sebesar  9%  selama  72  jam  dengan kandungan  EPA  14%  dan  DHA  10%.  Sedangkan  pada  reaksi hidrolisis  minyak  ikan seal  bubber ,  tingkat  hidrolisis  yang diperoleh  selama  72  jam  sebesar  25%  dengan  konversi  EPA 7%  dan  DHA  10%.  Perbedaan  ini  disebabkan  perbedaan
metode  tanpa  menggunakan  penambahan  air  dan  suhu inkubasi  35 o C  sehingga  proses  hidrolisis  menjadi  tidak sempurna.
Gambar 8.  Mekanisme  reaksi  hidrolisis  triasilgliserol  dengan  katalis lipase spesifik 1,3 dari Aspergillus niger ( Carvalho et al .,
2009)
Tingginya  kandungan  EPA  pada  sampel  hasil  hidrolisis enzimatik  jika  dibandingkan  dengan  kandungan  DHA dikarenakan jenis minyak ikan yang digunakan dalam penelitian ini  berasal  dari  ikan  lemuru  ( Sardinella sp.)  yang  mempunyai kandungan EPA lebih banyak daripada DHAnya (Halldorsson et al 2003).  Banyaknya  kandungan  EPA  dan  DHA  pada  minyak ikan  yang  telah  mengalami  hidrolisis  enzimatik  dikarenakan banyaknya  ikatan  ganda  cis-cis  EPA  dan  DHA  membuat molekulnya  bersifat  kuat  dan  dapat  meningkatkan  efek steric hidrance sehingga  ikatan  ester  asam  lemak  EPA  dan  DHA dalam bentuk asilgliserol lebih sulit untuk diputuskan oleh lipase jika  dibandingkan  asam  lemak  jenuh  (SFA)  dan  asam  lemak tidak jenuh dengan satu ikatan rangkap (MUFA) yang umumnya terletak  pada  posisi  primer.  Oleh  karena  itu,  kandungan  EPA dan  DHA  pada  fase  non  polar  jumlahnya  meningkat  setelah dilakukan  hidrolisis  minyak  ikan  dengan  katalis  lipase  dari Aspergillus niger . Hoshino et al . (1990) menunjukkan bahwa hidrolisis minyak ikan  oleh  lipase  ditentukan  dari  berbagai  faktor  yang  saling terkait, diantaranya perbedaan substrat yang spesifik, termasuk asam  lemak  dan  posisional  spesifik  lipase,  perbedaan  dalam tingkat reaksi yang terjadi selama proses hidrolisis, perbedaan komposisi  asam  lemak  dari  minyak  yang  digunakan  dan reaktivitas  dari  setiap  lipase  dalam  mengkonversi  minyak menjadi acylglycerols parsial (mono dan diacylglycerols).

## KESIMPULAN
Pada  hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan  dalam  media  tanpa penambahan pelarut organik heksana, tingkat hidrolisis tertinggi yaitu  28,07%  diperoleh  dari  aktivitas  katalitik  lipase  dari Aspergillus  niger pada  suhu  45 o C  dan  pH  5,  sedangkan  pada hidrolisis enzimatik minyak ikan dalam media yang ditambahkan pelarut  organik  heksana,  tingkat  hidrolisis  tertinggi  sebesar 75,12%  diperoleh  dari  aktivitas  katalitik  lipase  dari Aspergillus niger pada penambahan air 5%, suhu 45 o C dan pH 5.
Berdasarkan  hasil  analisis  dengan  GC-MS,  banyaknya kandungan  asam  lemak  omega-3  khususnya  EPA  dan  DHA meningkat  dengan  semakin  meningkatnya  tingkat  hidrolisis. Pada  hasil  hidrolisis  enzimatik  minyak  ikan  tertinggi  dalam media  tanpa  penambahan  heksana  (tingkat  hidrolisis  28,07%)
diketahui kandungan asam lemak omega-3nya 18,42% dengan jumlah  EPA  12,17%  dan  DHA  0,86%.  Sedangkan  pada  hasil hidrolisis  enzimatik  tertinggi  dalam  media  yang  ditambahkan heksana  (tingkat  hidrolisis  75,12%),  kandungan  asam  lemak omega-3nya  yaitu  21,93%  dengan  jumlah  EPA  17,75%  dan DHA 1,21%.

## DAFTAR PUSTAKA
Aidos  I.  2002.  Production  of  high-quality  fish  oil  from  herring byproducts. Dissertation. Universitas Wageningen, Belanda. http://library.wur.nl/wda/dissertations/dis3270.pdf. [18 September 2008].
Akova A, Üstün G. 2000. Activity and adsorption of lipase from Nigella  sativa seeds  on  celite  at  different  pH  values. Biotechnology Letters 22 : 355-359.
AOCS.  1997.  AOCS  Official  Methods . Association  of  Oil Chemist’ Society. Washington D.C.
Baharum SN, Salleh AB, Razak CNA, Rahman MBA, Rahman RNZRA.  2003.  Organic  solvent  tolerant  by Pseudomonas sp .  strain  S5:  stability  of  enzyme  in  organic  Solvent  and physical  factors  affecting  Its  production.  J  Annals  of Microbiology 53: 75-83.
Carvalho  PO,  Paula  RBC,  Maximiliano  DN,  Patrícia  BLF,
Leonardo VF. 2009.  Enzymatic  hydrolysis of salmon oil by native enzim lipases: Optimization of process parameters. J Braz Chem Soc 20(1): 117-124.
Celik  H.  2002.  Commercial  fish  oil.  ISSN  1302  647X.  B  serisi Cilt 3, no.1:1-6.
De  Busk  R.  2007.  Omega-3  fatty  acids.  http://www. umm.edu/omega-3-000316.htm. [16 September 2008].
Fu X, Zhu X, Gao K, Duan J. 1995. Oil and Fat Hydrolysis with Lipase from Aspergillus sp. JAOCS, 72:527-531.
Gupta  K.  2007.  Ecological  sceening  for  lipolitic  molds  and process  optimization  for  lipase  production  from Rhizopus oryzae KG-5. J App Sci Env Sanitation 2(2):35-42.
Haraldson  GG,  Kristinsson  B,  Sigurdardottir  R,  Gudmundsson GG,  Breivik  H.  1997.  The  preparation  of  concentrates  of eicosapentaenoi  acid  and  docosahexaenoic  acid  by  enzim lipase-catalized transesterification of fish oil with ethanol. J Am Oil Chem 74: 1419-1424.
Hoshino T, Yamane T, Shimizu S. 1990. Selective hydrolysis of fish  oil  by  lipase  to  concentrate  n-3  polyunsaturated  fatty acids. J Agr Biol Chem 54(6): 1459-1467.
Jedwards  International,  Inc.  2005. Fish  Oil  (18/12) . http://www.bulknaturaloils.com/fishoil/epadha/fishoil1812.ht ml. [9 Februari 2010].
Martati  E,  T  Utami,  P  Hastuti.  1999.  Profil  Gliserida  dan Kandungan  EPA  (Eicosapentanaenoat)  dan  DHA (Docosaheksanaenoat)  Hasil  Hidrolisis  Minyak  Hati  Ikan Cod  Oleh  Lipase  teramobil  dari Mucor  Miehei .  Agritech.19
1:5-10.
Murty RV, J Bhat, PKA Muniswaran. 2002. Hydrolysis of Oils by Using  Immobilized  Lipase  Enzyme:  A  Review.  Biotechnol. Bioprocess Eng 7: 57-66
Ozturk  B.  2001.  Immobilization  of  lipase  from Candida  rugosa on hydrophobic and hydrophilic supports. Dissertation. İzmir Institute of Technology. Izmir.
Petersen MTN, Fojan P and Petersen SB. 2001. How do lipases and esterases work: the electrostatic contribution. J Biotech 85(2): 115-147.
Probondari, C Hidayat, Supriyadi. 2008. Enzymatic Synthesis of Structured  Lipid  from  Fish  Oil  and  Lauric  Acid  using Immobilized Candida  rugosa Lipase  on  New  Developed Zirconia-Agarose.  Prosiding  Teknologi  Proses.  Gadjah mada University, Yogyakarta.
Rahman RNZRA, Baharum SN,  Salleh AB and Basri M. 2006.
S5:  An  organic  solvent  tolerant  enzyme.  J  Microb  44(6): 583-590.
Saxena RK, PK Ghosh, R Gupta, WS Davidson, S Bradoo and R Gulati. 2009. Microbial Lipases: potential Biocatalysts for The  Future  Industry.  Departement  of  Microbiology. University of delhi, India
Shamsudin S, Salimon J. 2006. Physicochemical characteristics of aji-aji fish seriola nigrofasciata lipids. Malaysia J Anal Sci 10(1): 55-58.
Sigma  Aldrich  co.  1994.  Enzymatic  assay  of  lipoprotein  lipase (EC  3.1.1.34).  http://www.sigmaaldrich.com//life-science/ enzymaticassayoflipoproteinenzimlipase.htm. [4 April 2009].
Wanasundara  UN,  Shahidi  F.  1998.  Lipase  assisted concentration  of  n-3  polyunsaturated  fatty  acids  in acylglycerol from Marine oil. J Am. Oil Chem 75: 945-951.