## Identifikasi dan Karakterisasi Isolat 23 Ducc Serta Kemampuannya dalam Memproduksi Enzim Inulinase
Wijanarka 1) ; Endang K 2) dan Hermin 3)
1) Lab. Mikrobiologi; 2) Lab. Biokimia dan 3) Lab. Genetika. dan staf pengajar FMIPA- Jurusan Biologi Universitas Diponegoro Semarang. Contact person Hp. 08179526187. E-mail: Wied_bio_undip@telkom.net

## Abstract
Inulinase has a capacity to convert inulin into fructose hence it could be used in high fructose syrup production.  Inulinase   is  not  readily  available   in  Indonesian  market.  This  enzyme  could  be  obtained   from thermotolerant yeast found in Dahlia variabilis . Therefore this study was conducted to identify inulinolytic yeast in D. variabilis. The results showed  that an inulinolytic yeast isolate 23 DUCC from D. variabilis tubers was found. The inulinolitic yeast produces inulinase  (E.C.3.2.1.7).  Based on the identification and determination, the isolate is known to be Kluyveromyces marxianus .   The best optimation condition for this yeast was as follows: concentration of carbon source (inulin) was 0.75%, pH was 5.5 and time of fermentation was 53 hours. In such condition K. marxianus produced inulinase up to 0.6481 IU.
Key words: K. marxiaus , inulinase, Dahlia variabilis

## Pendahuluan
Jumlah penduduk Indonesia dari tahun ke tahun cenderung meningkat sehingga konsumsi gula pun ikut meningkat. Di sisi lain, produksi gula secara nasional belum dapat memenuhi tingkat konsumsi gula di Indonesia. Hal ini terbukti dengan adanya impor gula oleh pemerintah berupa gula cair dan gula kristal, yang tiap tahun mencapai rata-rata sebesar 2 juta ton (Tjokroadikoesoemo, 1986; Mangunwijaya, l993). Keadaan inilah yang mendorong upaya untuk mencari aneka jenis bahan untuk digunakan sebagai pemanis sehingga kemudian banyak diproduksi pemanis sintetis. Pemanis sintetis ini meskipun memiliki tingkat kemanisan lebih tinggi daripada pemanis alami, ternyata membahayakan bagi kesehatan  karena bersifat  karsinogenik.
Dua jenis sumber pemanis alami yang telah ada sekarang ini adalah gula kristal dan gula   cair   (dari   pati).   Pemanis   alami   yang   dihasilkan   dari   bahan   dasar   amilum   dapat berupa gula cair fruktosa atau high fructose syrup ( HFS ) dan melalui beberapa tahapan proses enzimatis sehingga tidak efektif dan efisien. Pembuatan HFS secara konvensional adalah dengan menghidrolisis amilum menjadi glukosa kemudian dilakukan isomerisasi menjadi   fruktosa   menggunakan   enzim   glukosa   isomerase.   Sirup   fruktosa   juga   dapat dibuat dari bahan dasar inulin dengan cara dihidrolisis menggunakan asam atau enzim inulinase (Byun dan Nahjm, l978; Allais et al ., l986; Xiao et al ., l988). Inulinase  (E.C.3.2.1.7) yang juga dikenal sebagai 2,1  -D- fruktafruktanohidrolase banyak   dihasilkan   oleh   beberapa   khamir   seperti Candida   kefir,   C.   salmanticensis, Debaromyces cantarelii, D. phafii, Kluveromyces fragilis , (Guiraud et al ., l982). Enzim ini mempunyai   kemampuan   untuk   mengubah   inulin   menjadi   unit-unit   fruktosa.   Dengan adanya   penggunaan   enzim   ini,   maka   proses   pembuatan HFS menjadi   lebih menguntungkan   karena   prosesnya   cepat,   efisien,   ekonomis,   dan   berlangsung   dengan satu tahap saja .
Pemanis alami seperti HFS memiliki peluang pasar yang baik untuk dikembangkan pengadaannya.   Namun, produksi HFS di Indonesia saat ini belum dapat berkembang dengan baik karena (1) belum ada produsen enzim inulinase, (2) biaya untuk mengimpor enzim   ini   sangat   mahal,   (3)   enzim   yang   dihasilkan   sangat   sedikit,   (4)   hidrolisis   inulin menjadi fruktosa menggunakan asam pada suhu tinggi akan menghasilkan fraksi warna yang   gelap   serta   hasil   samping   yang   tidak   diinginkan   seperti   difruktofuranoanhidrida (Allais et al ., l986; Xiao et al ., l998). Upaya mengatasi masalah tersebut akhir-akhir ini dipusatkan terhadap sumber pemanis alami hasil biosintesis dari mikroorganisme dengan
alasan mudah dimanipulasi secara genetik dan murah operasionalnya. Sumber pemanis alami tersebut dapat  dihasilkan oleh khamir ( yeast ) termotoleran indigenous inulinolitik. Khamir   ini   secara   alami   ada   pada   umbi   dahlia   dan   mempunyai  enzim   inulinase   yang mampu mengubah inulin menjadi fruktosa sebagai bahan dasar pembuatan HFS .
Beberapa keuntungan pada pembuatan HFS menggunakan enzim inulinase adalah dapat memperpendek jalur biosintesis (dari tiga tahap menjadi satu tahap proses) dan hanya menggunakan satu enzim yaitu inulinase.
Khamir termotoleran indigenous inulinolitik diisolasi dari tropical bioresourses pada tanaman Dahlia   variabilis Willd   di   Pulau   Jawa.   Isolat   khamir   terpilih   akan   diuji kemampuannya dalam menghasilkan enzim inulinase.

## Materi dan Metode
Dalam penelitian ini digunakan isolat  23 koleksi Wijanarka dari umbi dahlia ( Dahlia variabilis Willd.);   inulin   murni;   medium   produksi   inulinase;   pepton   (Pronadisa); dinitrosalicylic   acid ,   dan   sodium   asetat.   Identifikasi   khamir   dilakukan   menggunakan medium medium menurut Kurtzman dan Fell (1998), yang terdiri atas yeast extract malt agar (YMA) , yeast extract malt broth (YMB), corn meal agar (CMA), yeast extract peptone (YEP), yeast extract peptone agar (YEPA), yeast nitrogen base (YNB), yeast carbon base (YCB), Christensen’s urea agar (CUA),  potato dextrose agar  (PDA).  Medium  produksi dibuat dari bahan-bahan sebagai berikut: 1 g/100 mL inulin; 0,5 g/100 mL (NH4)2HPO4; 0,05 g/100 mL MgSO 4 .7H 2 O; 0,015 g/100mL FeSO 4 .7H 2 O, dan pH 5,0 (Byun dand Nahm, 1978). Starter dibuat dengan menginokulasikan satu ose biakan isolat  23 berumur 3 hari ke dalam 50 mL medium produksi dan diagitasi 150 rpm selama 22 jam.
Produksi  enzim,   dilakukan   dengan   menginokulasikan   starter   10%   (v/v)   pada medium produksi enzim. Supernatan hasil sentrifugasi merupakan enzim kasar inulinase untuk penentuan aktivitas inulinase.
Penentuan aktivitas inulinase (Xiao et al. , 1998; Ertan et al ., 2003) didasarkan atas jumlah gula reduksi yang terbentuk dengan menghitung absorbansi enzim-substrat (ES) dikurangi substrat (S) dan enzim (E).  ES dibuat dari 0,5 mL substrat inulin 1%; 0,4 mL bufer, dan 0,1 mL enzim kasar. S dibuat dari 0,5 mL substrat inulin 1%; 0,4 mL bufer; 0,1 mL akuades. E dibuat dari 0,4 mL bufer; 0,1 mL enzim kasar dan 0,5 mL akuades. Tiap campuran  diinkubasi  30  menit   (50 o C).   Reaksi  dihentikan  dengan  memasukkan  tabung sampel  ke  dalam   air   mendidih selama 5 menit.  Setelah   dingin, ditambahkan 1 mL DNS,   lalu   dipanaskan   ke   dalam   air   mendidih   selama   10   menit,   dan   setelah   dingin ditambahkan 5 mL akuades. Pengukuran absorbansi  dilakukan pada  570 nm.
Aktivitas inulinase dianalisis dengan metode DNS (Chaplin dan Kennedy, 1994) dan ditentukan berdasarkan sejumlah 1  mol gula  reduksi yang dibebaskan per menit pada kondisi tertentu.

## Hasil dan Pembahasan
Identifikasi  isolat   23   DUCC,   yang   meliputi   uji   fisiologi-biokimia   dan   karakteristik morfologi, menghasilkan data seperti pada Tabel 1 dan 2.
Tabel 1. Hasil pengamatan morfologi isolat 23 DUCC Table 1. Observation on the morphology of isolate 23 DUCC
Pengamatan Isolat 23 DUCC Bentuk sel (MEB) bulat   sampai   silindris,   sel   terdapat   dalam  bentuk tunggal   atau   berpasangan   atau   dalam   rantai pendek. Ukuran sel (MEB) P (2-5) x L (3-6) μm Pertunasan (MEB) multipolar
Miselium palsu dan miselium sejati membentuk pseudomycelium yang   bercabang
(CMA) sangat   baik,   tidak   menghasilkan   hifa   sejati   ( true mycelium ). Penampakan koloni (YMA) putih   agak   krem   dan   menjadi   kecoklatan   pada biakan tua, tekstur kusam seperti mentega, profil koloni berkerut, tepi koloni bergerigi. Penampakan koloni (YMB) membentuk sedimen, tetapi tidak ada pelikel. Spora seksual askospora   berbentuk   bulat   sampai   semibulat, askus tidak mudah pecah dan terlihat pada hari ke- 15  pada YMB  dan  PDA.  Jumlah  askospora satu sampai 12 dalam setiap askus.
Tabel 2. Uji fisiologi/biokimia isolat 23 DUCC Table 2. Physiological/biochemical assay on isolate 23 DUCC
Uji Isolat 23 DUCC Fermentasi (YEP) positif: glukosa (s), sukrosa (s), rafinosa (s), negatif: galaktosa, maltosa, laktosa, melibiosa, trehalosa
Asimilasi C (YNB) positif: eritritol,   ribitol   (adonitol),   dulsitol   (galakstitol),   D- manitol, D-glusitol (D-sorbitol),  -metil-D-glukosida, salisin, glukono-  -laktona,   2-asam   ketoglukonat,   5-asam ketoglukonat.
negatif: glukosa,   galaktosa,   L-sorbosa,   sukrosa,   maltosa, selobiosa,   trehalosa,   laktosa,   melibiosa,   rafinosa, melezitosa, inulin, soluble starch , D-xilosa, L-arabinosa, D- arabinosa,   D-ribosa,   L-ramnosa,   metanol,   etanol,   gliserol,
D-L-asam laktat, asam suksinat, asam sitrat, inositol, asam D-glukuronat, asam D-galakturonat, arbutin, minyak parafin, D-glukosamin, N-asetil-D-glukosamin, heksadekana. Asimilasi N (YCB) positif :   kalium   nitrat,   natrium   nitrit,   L-lisin,   kadaverina, kreatin,   kreatinin,   D-glukosamin,   imidazol,   tirosin,   kasein, hipoxantin, N-asetil-D-glukosamin. negatif : amonium sulfat, etilamin-HCl. Pembentukan enzim urease (CUA) negatif
Pertumbuhan pada suhu 27 o C (YMA) positif Pertumbuhan pada suhu
37 o C (YMA) positif Pertumbuhan pada medium 60% sukrosa
(YEPA)
positif
Berdasarkan   karakter   morfologi   dan   hasil   uji   fisiologi/biokimia   yang   diamati disimpulkan bahwa khamir isolat 23 DUCC adalah K. marxianus (E.C. Hansen) van der Walt (Gambar 1).
Kondisi lingkungan untuk produksi inulinase oleh khamir Kluyveromyces marxianus ini adalah pH medium 5,5 dan umur pemanenan 53 jam. Berdasarkan analisis ragam atau ANOVA   diketahui   bahwa   produksi   inulinase   sangat   dipengaruhi   oleh   konsentrasi karbon/inulin   (C)   tetapi   untuk   konsentrasi   nitrogen   (N)   dan   interaksinya   (CN)   tidak memberikan pengaruh (Tabel 3).
Gambar 1. Isolat  23 DUCC
Figure 1. Isolate of 23 DUCC
Setelah   dilakukan   uji   lanjut   (uji   t),   konsentrasi   inulin   0,75%   (C3)   memberikan pengaruh   yang   lebih   nyata   dengan   aktivitas   enzim   inulinase   sebesar   0,6481   IU   bila dibandingkan   dengan   konsentrasi   0,50%   (C2)   dan   0,25%   (C1)   (Tabel   4).  Aktivitas   ini meningkat sebesar 1,3 kali bila dibandingkan dengan sebelum kondisi optimasi (0,497 IU).   Hal ini membuktikan bahwa inulin sangat mempengaruhi produksi inulinase, dan enzim ini hanya dapat dihasilkan apabila ada rangsangan/induser yang berasal dari luar. Hal ini di dukung oleh pernyataan Park dan Yun (2001) bahwa inulinase diproduksi secara ekstraseluler dan besifat indusibel.
Tabel 3. ANOVA isolat K. marxianus Table 3. Anova of K. marxianus isolate SK DB JK KT Fhit Ftab (0,05) Perlakuan 8 0,2220 0,0278 2,3138 2,51 Konsentrasi Inulin 2 0,1427 0,0714 5,9508** 3,55 Konsentrasi Nitrogen 2 0,0282 0,0141 1,1763 3,55 Interaksi 4 0,0511 0,0128 1,0641 2,93 Galat 18 0,2159 0,0120 Total 26
** F Hitung (P) > F Tabel (0,05) maka berbeda nyata
Tabel 4. Analisis lanjut pengaruh Konsentrasi inulin pada isolat K. marxianus Table 4. Analysis of the effect of Inulin concentration on K. marxianus isolate
Konsentrasi Inulin Rata-rata beda dengan 0,25% 0,50% 0,75% 0,25% 0,4795 - 0,50% 0,6133 0,1338* - 0,75% 0,6481 0,1686** 0,0348 - BNT (18; 0,05) 0,10849 BNT (18; 0,01) 0,14862

## Kesimpulan
Berdasarkan   hasil   uji   identifikasi,   determinasi,   dan   karakterisasi   diketahui   bahwa isolat 23 DUCC adalah K. marxianus .  Pada kondisi optimasi sumber karbon inulin 0,75%, pH 5,5 (C3), dan umur 53 jam K. marxianus menghasilkan aktivitas inulinase sebesar 0,6481 IU.
Ucapan Terima Kasih
Penulis/peneliti mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Program Insentif Riset Terapan-Menristek Tahun Anggaran 2007 yang telah memberikan bantuan dana bagi terlaksananya penelitian ini.

## Daftar Pustaka
Allains,   J.J.,   Kammou   S.,   Blanc   P.,     Girard   C.,   and   Baratti,   J.   1986.   Isolation   and characteristic of bacterial strains with inulinase activity. Appl. Environ. Microbiol. 52 (50): 1086-1090.
Allains,   J.J.,   Hoyos-Lopez   G.,     Kammoun   S.,   and   Baratti   J.   1987.   Isolation   and characterization   of   thermophilic   bacterial   strains   with   inulinase   activity.   Appl. Environ. Microbiol. 53 (5) : 942 –945.
Baltz.   R.H.   l996.   Strain   Improvement. dalam Manual   of   Industrial   Microbiology   and Biotechnology.   Demain,   A,I.,   and   Solomon,   N.A.   (Ed).   American   Society   for Microbiology, Washington.
Barnett,   J.A.,   Oayne,   R.W.,   and   Yarrow,   D.   L990.   Yeasts:   Characteristics   and Identification. 2 nd Edition. Cambridge Univ. Press. Cambridge
Bajpai, P. and Margaritis, A. 1987. Characterization of molecular sieve-bound inulinase. J. Ferment Technol. 65 (2): 239 – 247.
Bucke, C. l988. Enzymes in Fructose Manufacture dalam Enzymes and food Processeing. Applied. Science. Pub. Ltd.
Byun, S.M. and Nahm, B.H. 1987. Production of fructose from Jerusalem artichoke by enzymatic hydrolysis. J. Food Sci. 43: 1871 – 1873.
Chaplin, M.F. and Kennedy, J.F. 1994. Carbohydrate Analysis: a Practical Approach. 2 nd Edition. Oxford University Press. Oxford.
Cruegur, W and Crueger, A. 1984.  Biotechnology: a Texbook of Industral  Microbiology.
Thomas (Ed) Sinauer Associated, Inc. Sunderland, M.A 01375.
De   Lenheer,   L.   and   H.   Hoebregs.  1994.   Inulin.   Megazyme   International   Ireland   Ltd. Ireland.
Deutscher,  M.   l990.   Guide  To  Protein   Purification.   Methods   in   Enzymology     Vol.   182. Academic Press. Inc.  Boston. Toronto. Tokyo.
Doty, T. and Vaninen. 1979 The Properties, Manufacture and Uses as an Industrial Raw Material. Dalam : C.G. Birch dan K.J. Parker (ed) Sugar : Science and Technology Appl. Sci Publ. London
Dixon, M. and Webb, E. 1979. Enzymes. Logman Group Ltd., London
Hartiko, H. l994. Biologi Organisme Termofilik. PAU-Bioteknologi UGM. Jogyakarta.
Holz, G. and Saunders, G. l985. Genetic Modification of Industrial Microorganisms dalam Comprehensive   Biotechnology.   The   Principles,   Application   and   Regulation   of Biotechnology   in   Industry,   Agryculture   and   Medicine.   Moo-Young,   M   (Ed) Pergamon Press.
Javadekar,   V.S.,   Siva   H.,   Raman,   and     Gokhale   D..   1995.   Industrial   yeast   strain improvement:   construction of a highly flocculent yeast with a killer character by protoplast fusion. Jour. Indst. Microbiology 15: 94-102.
Kockova-Kratochilova, A. 1990. Yeast and Yeast Like Organism. VCH. Publishers. France. Pp. 6 – 7, 42 – 51.
Kreger-van Rij, N.J.W. 1984. The Yeast, a Taxonomic Study. Third revised and Enlarged Ed., Elsevier sci. publ. B.v., Amsterdam.
Kurtzman,   C.P.  and   Fell,   J.W.  1998.  The  Yeasts:   a Taxonomic   Study.  4 th ed.   Elsevier Science Publisher B.V., Amsterdam.
Lutony, T.L. 1993. Tanaman Sumber Pemanis. Penebar Swadaya, Jakarta.
Matsushima,   R   and   Baltz,   R.H.   l986.   Protoplast   Fusion dalam Manual   of   Industrial Microbiology   and   Biotechnology.   Demain,   A.L.   and   Solomon,   N.A.   American Society for Microbiology . Washington DC.
Mayes, P.A., Daryl, K.G., Victor, W.R. and David, W.M. l987. Biokimia Harper (Terjemahan Iyan Darmawan). Penerbit  Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Moat, A.G. and Foster, J.W. l988. Microbial Physiology. John Wiley and Sons Inc., New York.
Nagy, I., Palagyi Z., Vagvolgyi C.   and   Fernczy L., 1994. Genomic comparison among wild-type and  mutant strains of P. rhodozyma . FEMS Microbiology. Lett. 123: 315- 318.
Panji, C. l985. Penuntun Praktikum  Bioindustri. PAU IPB. Bogor.
Park,   J.P.  and  Yun   J.W.,   2001.   Utilization   of   chicory   roots   for   microbial   endoinulinase production. Letters in Applied Microbiology (33): 183 – 187.
Park, S., Jeong H.Y., Kim H.S., and Yang. M.S. 2001. Enhanced production of Aspergillus ficuum endoinulinase in Saccharomyces cerevisiae by using the SUC 2 deletion mutation.  Enzyme and Microbial Technology 29 (2-3): 107-110
Pessoa,   A.   and   Vitolo   M..   1999.    Inulinase   from Kluyveromyces   marxianus: culture medium composition and Enzyme Extraction.   Braz. J. Chem. Eng.   16 (3): doi: 10.1590/S0104-66321999000300003
Perkins, S. l984. Biotechnology: a New Industrial Revolision. Orbis Publishing, London.
Rouwenhorst, R.J., Visser L.E., van Derbaan A.A., Scheffer W.A.,   and van Dijken J.P.. 1988.  Production,   distribution   and   kinetic   properties   of   inulinase   in   continous culture of Kluyveromyces marxianus CBS 6556.  Appl. Environ. Microbiol. 54(5): 1131 -  1137.
Rouwenhorst,   R.J.,   Ritmeester   W.S.,   Scheffer   W.A.,   and   van   Dijken   J.P.   1990a. Localization   of   innulinase   and   invertase   in Kluyveromyces sp.  Appl.   Environ. Microbiol. 56 (11): 3329 – 3336.
Rouwenhorst, R.J., Hensing M.,   Verbakel J., Scheffer W.A. and van Dijken J.P. 1990b. Structure and properties of the extracellular inulinase of Kluyveromyces marxianus CBS 6556. Appl. Environ. Microbiol. 56 (11): 3337 – 3345.
Rukmana, R. 2000. Dahlia: Prospek Agribisnis dan Teknik Budi Daya. Penerbit Kanisius, Jogyakarta.
Santiago,   C.M.   l982.   Protoplast   fusion:   a   new   tecnique   for   genetic   manipulation   and breeding of industrial microorganism. I.C. Biotech. 5: 435-440.
Tjokroadikoesoemo,   P.S.   1986.   HFS   dan   Industri   Ubi   Kayu   Lainnya.   Penerbit   PT Gramedia, Jakarta.
Wijanarka,  Arina, T.L, dan Emi, Y. 2001. Seleksi Khamir dan Optimasi Produksi Enzim Inulinase dari Tanah Sekitar Umbi Ketela Rambat ( Ipomoea batatas ) di Daerah Bandungan Ambarawa. Penelitian BBI Dosen Muda.
Wijanarka dan Sri, P. 2002. Isolasi Bakteri Termofilik dalam Menghasilkan Enzim Inulinase Termostabil   dari Tanah Sekitar Umbi Dahlia ( Dahlia sp) di Daerah Bandungan Ambarawa. Penelitian Dosen Muda.
Hermin,   P.S.,   Wijanarka,   Endang,   K.,   dan   Hermin,   P.  2003.   Peningkatan   Biosintesis Karotenoid   pada Phaffia   rhodozyma melalui   Fusi   Protoplas   dalam   Upaya Diversifikasi Pakan Buatan pada Sektor  Akuakultur. Penelitian Dasar.
Wijanarka , Kusdiyantini,   E.,   dan   Hermin,   P.S.   2004.   Fusi   Protoplas   Interspecifik Kluveromyces   marxianus dan Torulospora   pretoriensis Authotonuos   untuk Produksi Enzim Inulinase Termostabil.  Penelitian Dasar.
Wijanarka , Arina,   T.L.,   dan   Hermin,   P.S.   2004.   Fusi   Protoplas   Khamir   Inulinolitik Kluveromyces   marxianus dan Torulospora   pretoriensis Isolat   Lokal   serta Aplikasinya pada HFS.  Penelitian Terapan.
Xiao,   R.,   Tanida   M.   and   Takao   S..   1998.  Inulinase   from Crysosporium   pannorum J. Ferment. Technol. 66 (5): 244 – 248.
Xiao, R., Tanida M. and Takao S.. 1989. Purification and some properties of endoinulinase from Crysosporium pannorum J. Ferment. Bioeng 67 (4): 244.