A comprehensive characterization of human Hsp70 and J-domain protein interactomes reveals their functions in maintaining proteostasis

Protein homeostasis, or proteostasis, maintains cells’ and organisms’ health, protecting them from diverse intrinsic and extrinsic stresses. Proteostasis dysregulation is associated with different human diseases, such as neurodegenerative disorders or cancer. Proteostasis is regulated by a wide variety of chaperones and other quality control factors. Key players in the proteostasis network include the Hsp70 heat-shock protein and their J-domain protein co-chaperones (JDPs). JDPs dictate specificity to the Hsp70s by recruiting them to specific client proteins or cellular compartments. The human genome encodes 13 different Hsp70s and, remarkably, 49 unique JDPs. However, the client specificity of most JDPs has remained elusive, limiting the understanding of how the Hsp70 machinery can regulate distinct aspects of proteostasis.For my PhD project, I have employed complementary proteomic approaches to characterize the interactome of all human Hsp70s and JDPs. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) was performed to reveal physical interactors and proximity biotinylation (BioID) was utilized to uncover transient interactors and/or insoluble proximal partners. My results revealed a striking client specificity, connecting JDPs to diverse biological pathways. For example, an essential nuclear JDP, DNAJC9, interacts specifically with histone H3 and H4, whereas a previously uncharacterized JDP DNAJC27 interacts with novel and conserved centriolar satellite proteins. Hsp70 inhibition or DNAJC27 knockdown strikingly impairs ciliogenesis, establishing a novel function for Hsp70 in this process. Surprisingly, only the DNAJC27 J domain and no other J domain could rescue the ciliogenesis defect due to DNAJC27 silencing. By contrast, overexpressing specific J domains from other JDPs abolishes ciliogenesis in a dominant-negative manner. This suggests that the functional specificity of JDPs is not only provided by their unique domains, but can also be encoded in the J domain itself. In summary, this doctoral research provides a comprehensive map of JDP and Hsp70 interactions, revealing previously unknown potential biological functions for many JDPs. This unbiased mapping explains how Hsp70s and J-domain proteins are integrated to the larger proteostasis network with other major chaperone and protein quality control factors, and provides functional links between individual JDPs and cellular processes including histone chaperoning and ciliogenesis. Afin d’accomplir sa principale fonction dans la cellule, chaque protéine doit adopter une structure tridimensionnelle stable, doit être transportée à la bonne organelle, et, ultimement, doit être dégradée. Ces trois étapes constituent la base de l’homéostasie des protéines, la protéostasie. Un débalancement de la protéostasie résulte notamment en diverses maladies neurodégénératives ou cancers.La protéostasie est maintenue grâce à différents mécanismes moléculaires. L’un d’eux assiste au repliement des protéines – les protéines clientes – dans leur forme tridimensionnelle active, prévenant la formation d’agrégats protéiques non fonctionnels et toxiques pour la cellule. Ce repliement est initié par les protéines chaperonnes Hsp70s et leurs co-chaperonnes, les protéines à domaine J (JDP, pour « J-domain proteins » ci-dessous). Ces dernières interagissent spécifiquement avec certaines protéines clientes, suivi du recrutement d’une chaperonne Hsp70. Les JDPs catalysent alors l’activité de la chaperonne Hsp70 grâce à leur domaine J, permettant le repliement de la protéine cliente. Le nombre d’Hsp70s est demeuré constant parmi les différents organismes eucaryotes. En revanche, la famille des JDPs a grandement évolué, passant de 22 JDPs chez l’organisme modèle S. cerevisiae à plus de 49 chez l’homme. Cette augmentation marquée suggère que les fonctions biologiques des chaperonnes Hsp70s se sont diversifiées via leurs différentes co-chaperonnes JDPs. Malheureusement, très peu de recherches ont, jusqu’à présent, établi les protéines clientes pour chacune de ces chaperonnes et co-chaperonnes. Il est donc primordial de connaître les différentes protéines clientes, et donc les processus biologiques, régulés par chacune de ces chaperonnes si l’on veut remédier à divers débalancements de la protéostasie. Pour ce projet de doctorat, j’ai caractérisé l’interactome de chacune des chaperonnes Hsp70s et des co-chaperonnes JDPs en utilisant deux techniques complémentaires de protéomique fonctionnelle. J’ai utilisé la purification par affinité suivie de la spectrométrie de masse (AP-MS) pour identifier les protéines clientes capable de se lier avec les différentes Hsp70s ou JDPs. De plus, parallèlement, j’ai utilisé une technique de biotinylation par proximité nommée BioID pour identifier les protéines qui se trouvent en proximité des Hsp70 ou JDPs dans les cellules vivantes, suggérant un lien fonctionnel. L’utilisation de ces deux méthodes hautement complémentaires a révélé une grande spécificité entre les co-chaperonnes JDPs et ces dernières. Par exemple, deux JDPs, DNAJC8 et DNAJC17, interagissent respectivement avec les complexes U2 et U5/PRP19 impliqués à différentes étapes de l’épissage de l’ARN messager, alors que DNAJC15 semble réguler le complexe I de la chaîne de transport d’électrons de la mitochondrie via son interaction avec le complexe MCIA. Mes résultats de protéomique suggéraient que la co-chaperonne essentielle DNAJC9 interagit spécifiquement avec l’histone H4. J’ai alors pris l’opportunité de caractériser plus spécifiquement le rôle de DNAJC9 dans la régulation des histones. J’ai tout d’abord démontré la spécificité de DNAJC9 pour l’interaction avec les histones H3 et H4 in vitro. J’ai aussi démontré par microscopie à immunofluorescence qu’une forme inactive de DNAJC9 peut causer des mitoses multipolaires ou des cellules ayant des micronoyaux. Ces phénotypes corroborent avec ceux observés avec d’autres chaperonnes spécialisées pour les histones, révélant donc la fonction de DNAJC9 comme chaperonne pour histones. Cette fonction fut finalement approfondie en comparant les sites de la chromatine où DNAJC9 interagit avec ceux de d’autres chaperonnes spécialisées en histones, dévoilant un attachement de DNAJC9 aux sites actifs de la chromatine. Mes expériences de protéomique ont aussi révélé plusieurs protéines clientes potentielles n’ayant jamais été étudiées de façon fonctionnelle. J’ai donc procédé à la caractérisation protéomique d’une de ces protéines, FAM184A, une protéine cliente potentielle de la co-chaperonne DNAJC27, révélant son interaction et colocalisation avec des protéines en périphérie du centrosome. En regardant la conservation des gènes codants pour DNAJC27 et FAM184A, j’ai remarqué leur préservation chez les eucaryotes ayant des cils (ou flagelles). J’ai donc poursuivi la caractérisation de DNAJC27 et FAM184A pour leur fonction potentielle avec la ciliogénèse. J’ai tout d’abord démontré que DNAJC27 est important pour la localisation de FAM184A en périphérie du centrosome, révélant donc son rôle pour sa protéine cliente. Qui plus est, une réduction de l’expression génique de DNAJC27 ou FAM184A réduit considérablement la longueur de cils émergents, et ce phénotype est renversé par une réexpression de DNAJC27, validant l’hypothèse de leur fonction biologique pour la ciliogénèse. Étonnamment, la surexpression du domaine J de DNAJC27 parvient aussi à renverser cette réduction de ciliogénèse lors de la réduction de son expression. Au contraire, la surexpression de d’autres domaines J cause un phénotype complètement inverse, ils préviennent la ciliogénèse de façon dominante négative. Cette découverte suggère que les différents domaines J possèdent différentes spécificités et/ou affinités pour les Hsp70s, causant alors un phénotype dominant négatif sur ces chaperonnes. Pour confirmer cette hypothèse, j’ai testé différents composés chimiques inhibiteurs des Hsp70s, démontrant la nécessité de ces chaperonnes pour la ciliogénèse, révélant finalement un nouveau processus biologique régulé par ces chaperonnes. En conclusion, ce projet de doctorat fournit la première cartographie exhaustive des interactions entre les chaperonnes Hsp70s, les JPDs et leurs protéines clientes respectives, révélant une panoplie de processus biologiques moléculaires régulés par ces chaperonnes et co-chaperonnes. Cet atlas d’interactions explique les diverses raisons pour lesquelles les Hsp70s et les protéines à domaine J sont impliqués au maintien constant de la protéostasie.

Keywords: Hsp40
Hsp70
Interactome
J-domain protein
Network biology
Proteostasis
Advisor: Taipale, Mikko
Gingras, Anne-Claude