鱿鱼墨黑色素

鱿鱼墨汁中所含有的生物大分子多聚体的代称，是已知唯一能够保护生物体免受辐射伤害的天然内源生物聚合体。含有多肽片断、酸性多糖、酪氨酸酶等多种生物活性成分。具有清除自由基和结合潜在毒性离子（如一些过渡金属） 的特性，应用潜力巨大。
简介
鱿鱼是头足类海洋动物中枪乌贼和柔鱼的俗称。据报道，全世界大洋中头足类的总资源量为4.2-6.5亿吨。随着世界远洋海洋生物资源的日益减少，鱿鱼因其味道鲜美、营养丰富而逐渐成为人类重要的蛋白质资源。鱿鱼加工的品种主要有北太平鱿鱼（Ommastrephes bartrami）、阿根廷鱿鱼（Illes argentinus）、新西兰鱿鱼（Nototodaras sloani）等，鱿鱼的可食部分接近80%，比一般鱼类高出20%左右。每100克鱿鱼鲜品中含蛋白质16-18%，脂肪1-2%，同时含有丰富的维生素及矿物质，是一种营养丰富的水产品。
黑色素的降解产物
黑色素(melanin)是一种不溶于水的生物大分子多聚体，它广泛存在于动植物体内。黑色素一词来源于希腊语melanos，表示黑暗的意思，由瑞士化学家Berzelius首先提出。黑色素在动植物体内具有防御、保护功能，在人体内的黑色素亦参加许多生理、病理活动。它还是已知唯一能够保护生物体免受辐射伤害的天然内源生物聚合体。黑色素还能够有效的清除活性氧自由基，这些是其保护生物大分子如DNA免受氧化损伤的重要原因。黑色素根据产生前体不同可分为三类：真黑色素以由酪氨酸氧化而成的两种吲哚结构的分子为前体的，即DHI(5，6-二羟基吲哚),DHICA（5，6－二羟基吲哚酸），其显深黑色；棕黑色素以Cys-Dopa（半胱氨酸多巴）为前体的，其分子中含有硫，一般显棕色或者红色；神经元黑色素以多巴胺（同时含有吲哚和苯丙噻嗪结构）为前体。
黑色素的降解途径
液相色谱法微观分析法是一个在分析黑色素上比较有用的工具。用高锰酸钾氧化真黑素可以产生PTCA，用氢碘酸还原水解棕黑素可以产生AHP异构体，这两种物质可以通过液相色谱测定，从而给这种方法奠定了基础。BorgesCR的研究表明，黑色素和黑色素的降解产品之间存在着定量关系；DHI通过H2O2的氧化作用可以成为PDCA（得率是0.037%），而真黑素中的DHICA通过一些强氧化剂比如（H2O2）的氧化可以生成PTCA（得率是4.8%）,棕黑素中的2-Cys-Dopa通过酸水解可以生成3-氨基酪氨酸（得率是16%），5-Cys-Dopa通过酸水解可以产生4-氨基-3羟基苯丙氨酸（得率是23%）。PDCA，PTCA，2-Cys-Dopa，5-Cys-Dopa可用HPLC测量，然后反推黑色素的含量及结构。
鱿鱼墨黑色素是从鱿鱼墨汁中提取出的生物活性成分，即多糖-蛋白复合体，其多糖部分主要由等摩尔比例的葡糖醛酸(Glc A)、N-乙酰半乳糖胺(Gal NAc)和岩藻糖(Fuc)构成，这种黑色素能和蛋白质的交联起到强化结构的功能；提供一些机械力并保护蛋白质不被降解；黑色素中含有的一些亲核性的基团（如-SH，-NH2），使其获得抗生素特性；它还与许多神经系统的疾病密切相关等。日本还研究出利用鱿鱼墨黑色素以及柠檬酸等原料，来清除体内残留重金属的食品。
理化性质
结构
鱿鱼墨黑色素单体在体内转换的四种形式
鱿鱼墨黑色素的形成是一个复杂的过程。它是酪氨酸在酪氨酸酶及TRP1，TRP2等一系列的酶作用下最后形成黑色素聚合物。具有以下特性：单体（DHI和DHICA）的高度聚合性、单体间通过横向和纵向相互连接、聚合度的不均一性、聚合方式随着外部条件改变而改变。如随着溶液pH变化，金属离子，糖，蛋白质等含量的变化，黑色素的聚合方式也发生变化。Christine M R，认为黑色素首先是由一些由5-6个单体聚合而成的平行低聚体通过π电子的堆叠和相邻低聚体之间的羟基相互作用形成分子量较大的聚合体，该聚合体通过一系列酶的作用继续聚合，形成了黑色素大分子聚合体。
鱿鱼墨黑色素SEM
国际上对于黑色素的研究越来越重视，但是和蛋白质相比，对其结构的研究仍不是非常清楚：在基本构成单元上，蛋白质主要由20种标准氨基酸组成，而真黑色素的基本组成为DHI,DHICA；蛋白质的一级结构主要通过肽键，二硫键，而黑色素的以及结构的研究还不清楚，可能包括一些横向和纵向的连接；蛋白质的三维结构包括α-螺旋,β-折叠,和其他一级基础上的特殊多级结构，而对于黑色素，其初步合成的一些酶类虽然已经确定，但是和黑色素聚合相关的酶类尚未确定。
鱿鱼墨黑色素紫外光谱
从鱿鱼墨黑色素的紫外光谱分析可以看出，高速离心法提取的鱿鱼墨黑色素在310nm和410nm附件有两个明显的吸收峰，文献将这两个吸收峰分别[12]归属于DHI的特征吸收和亚氨基与金属离子螯合的特征吸收。而酸解后，鱿鱼墨黑色素的这两个吸收峰都明显减弱，这说明鱿鱼墨黑色素在酸水解过程中发生了降解。同样，碱水解虽然能够相对较好的保护 310nm 处的 DHI 单元，但是 410nm处的特征吸收峰的降低说明碱水解过程中也发生了脱氨基反应。
鱿鱼墨黑色素红外光谱
鱿鱼墨黑色素的红外光谱大体上可以作以下归属：3200-87500px-1为吲哚和吡咯结构单元中的N-H(~80000px-1)和O-H(~85000px-1)的伸缩。42750px-1为COOH中的C=O伸缩振动；1610-42250px-1为芳香环中C=C和C=N的弯曲以及C=O伸缩(非羧酸集团)；39500px-1为离子化了的COO-的C=O；而31250px-1为酚羟基和羧羟基。另外，73750px-1为烷基中的羧基的伸缩。
光吸收性质
鱿鱼墨黑色素颗粒的直径分布
黑色素多聚物最显著的特性是由于其高度的共轭效应而产生的广谱光吸收特性。他能吸收多数可见光的结果,甚至还包括一些低能量的辐射，并能将吸收的光能量转化为热量。最低的能量转移发生在不成键轨道到反键轨道的跃迁中,这一情况主要发生在C=O键中,而黑色素中有很多这样的结构。黑色素还吸收紫外区域的光谱,能量从成键轨道到反键轨道的转移,这主要发生在不饱和的碳键中,由于共轭中的电子离域效应,使得这种由成键轨道到反键轨道的跃迁更加容易。Rosei等研究了合成黑色素的光谱和光电性质，作为一种合成的多巴黑色素生物聚合体，它与光电导性效应以及电荷传导性都有关系。
黑色素具有保护体内细胞免受辐射损伤的功能，即光保护作用。Sarna等研究了光照射鱿鱼墨黑色素产生活性氧族的情况，尽管黑色素在可见光和紫外光区都有吸收，但是在400nm左右处吸收光产生活性氧族较多。而且，随着聚合度的增加，产生活性氧族的含量减少。黑色素的聚合程度可能就是细胞色素作为光保护剂和光毒素的之间转换的一个原因。Nofsinger等进行光谱研究发现，聚集度越高，吸收光谱的能级低，越稳定，能吸收光，具有光保护性质，而且黑色素能够在被光激发后，又很快恢复到基态电子状态，并且把光转化为热量。表明黑色素的吸收光性质和聚合度有重要的关系。Menter等通过体外实验发现鱿鱼墨黑色素对脯乳动物的酸溶性胶原蛋白有一定的光保护作用。黑色素能够有效的提高果蝇在辐射条件下的存活率。同时鱿鱼墨黑色素已经被成功的用于保护苏云金芽胞杆菌生物杀虫剂，使得其免受阳光紫外线的损害，延长其杀虫时效。
氧化还原性
黑色素有显著的氧化还原性,这主要是由于在正醌和多聚物儿茶酚部分之间的电子离域,使其产生很多半醌自由基。黑色素可以参与一些单价或双价的氧化还原反应,并且光吸收的结果使这种色素产生光氧化,使其所含羰基数增加,从而改变黑色素的吸收特性,即所谓即刻色素变黑反应(IPD)。这种光氧化过程产生超氧自由基。
金属离子的影响
鱿鱼墨黑色素结合铜离子后的结构
鱿鱼墨黑色素具有很强的阳离子螯合特性,它主要通过如羧基和去质子化羟基等阴离子起作用。黑色素与金属离子的结合能够起着保护细胞的功能。然而，在高浓度的金属离子下，色素的完整性将会受到影响，这将导致它会释放出一些可以引起对细胞急性伤害的重金属离子。比如帕金森患者病人的大脑神经元黑色素中三价铁离子的含量就比正常人的高，导致Fe(III)代谢不正常。
通过对鱿鱼墨黑色素溶液研究发现，其溶液中主要存在对苯二酚和苯醌两种基团。其中：对苯二酚的等电点在9-13之间，苯醌（QI）是6.3。在不同的pH条件下，两种基团在吸收金属离子过程中分别起着主导作用。Barbara Bilin′ska等人采用IR分析了Cu2+在不同的pH条件与人头发黑色素的络合波谱图，发现Cu2+是通过羧基和羟基与不同的黑色素大分子络合。Bruno Szpoganicz等人分析了Cu2+和Zn2+与胶状黑色素的络合位点，并通过电位滴定法分析了这种络合位点的数量。Jonas Stainsack等人用EPR和FTIR研究了VO2+, Cu2+与合成黑色素的结合，并认为这两种金属分别与黑色素上的酚羟基，羧基和亚胺基结合。在鱿鱼墨中加入一些金属离子后用SEM（扫描电镜）和AFM来研究它的结构形态。在和Na(I), Ca(II)，Mg(II)或则Fe(III)等结合，并在云母上干燥后，这些含大量DHICA的黑色素显示了明显的二维聚合结构。
Liu Y等还对对乌贼墨与金属离子的结合进行了一系列的研究，结果发现Fe3+和 Mg2+/Ca2+结合在不同的位点；同时采对金属离子含量对黑色素颗粒的形态的影响进行了研究，发现含不同浓度Fe3+的黑色素形态差异并不大。因此可以认为有机基团和金属离子间的离子力对已经聚合的天然黑色素分子的表面形态并没有影响。而对超声波降解后的乌贼墨黑色素（分子量<10kDa）与金属离子（Na+, Ca2+，Mg2+和Fe3+）螯合后，用SEM（扫描电镜）和AFM来研究它的结构形态，发现黑色素显示了明显的二维聚合结构，与未与金属离子螯合的黑色素结构形态差异明显，这表明金属离子中帮助建立黑色素三维结构的过程中起了重要的作用。
纯化和制备
黑色素颗粒形成原子力显微镜图
不同的分离纯化方法对保持黑色素的生物活性性质有着较大的影响。黑色素的分离纯化主要有四种方法，有水洗法，酶解法，酸水解法以及碱水解法。水洗法指用双蒸法重复洗涤以去除蛋白质以及多糖等水溶性杂质，只适合少数含杂质较少的黑色素样品制备，主要是用于鱿鱼墨等乌贼属墨囊黑色素的分离。能够较好的保持黑色素原有的性质，而不影响其相关的一些活性。酸解法、碱解法（化学法）是指采用强酸强碱去除用品中的蛋白等杂质来提取黑色素。但是进来的研究表明强酸处理能够导致真黑色素脱去羧基，而且容易使蛋白质转变成色素类似物，而其碱处理则会使黑色素和一些相关蛋白的化学成分发生变化。Liu Y等人对人的头发进行了酶解，酸解和碱解，发现碱解和酸解后的黑色素蛋白含量高，而且除去了大部分的金属离子，并提出酸解，碱解后的样品并不是原先的黑色素体，它对研究黑色素的光物性和化学性质来说不是一个可行的提取方法。
鱿鱼墨黑色素及硫酸酯化基团高效液相色谱
酶解法主要通过酶的作用水解作用去除蛋白质，脂质等杂质，这种方法条件相对温和，能够保持完整的黑素颗粒形态，是一种比较理想的提取纯化黑色素的方法。早期的酶解由于难以找到合适的酶类，主要是酶解和酸碱处理相结合的方法。1956年，eck et等人采用尿素、木瓜蛋白酶、偏亚硫酸氢钠从人的头发中提取黑色素。Bratosin采用了两步碱水解后，再用酶解的方法从老鼠的黑头发里分离了黑色素。1981年Arnaud和Bore用蛋白酶PSF2019处理后，再用三步酸水解从头发中分离了黑色素。2000年，Prota和他的同伴用先后用蛋白酶K,木瓜蛋白酶和蛋白酶XIV以及Triton-X-100分别处理24h,从人的头发和眼球中分离了蛋白质.这是酶法水解提取黑色素的一大突破，被认为是酶法提取黑色素的一个比较成功的应用方法。JohnD.Simon等用胶原蛋白酶处理16h,胰液素处理2h，从牛的眼睛里提取了黑色素，优化了Prota等人的方法。其他影响黑色素的制备的因素还有金属离子以及干燥方法等。
不同的干燥方法会影响到黑色素的多孔性和单位质量表面积，从而可以影响到黑色素的聚集方式，制备黑色素的干燥方式主要有真空冷冻干燥，减压干燥，喷雾干燥，CO2超临界干燥同的方法，而用的比较多的方法主要是真空冷冻干燥。
一种鱿鱼墨黑色素的制备方法，其特征在于取鱿鱼墨汁，加入蒸馏水搅拌、洗涤，用粗滤布除去杂物后，用碱液调pH至5．0－10．0；在搅拌下，加酶水解12－24h，酶解温度为35－70℃，90－100℃加热终止反应；用酸液调pH至1．0－5．0，3000－5000×g室温下离心收集沉淀；所得沉淀物经蒸馏水反复洗涤、离心，至洗涤水为中性，真空冷冻干燥。制得的产品纯度为30%－99%，提取率为6%－19．9%。
生理功能
抗病毒活性
台湾科学家对乌贼属的黑色素的抗菌和抗氧化能力进行了研究，发现这些黑色素都有一定的抗菌能力，而且，还有一定的抗氧化和光保护能力。黑色素在HIV的预防上面还有重要的作用，可溶性的黑色素可以防止微生物穿过皮肤及粘膜层，并且能够抑制此种病毒，从而可以减少感染的范围。Rajaganapathi等人在2000年发现从鱿鱼幼体的墨的水溶液能够抑制鼠科白血病病毒的逆转录。Fonsecaea pedrosoi（一类真菌病原体）产生的黑色素能够导致人体产生抗真菌抗体并且能够增强巨噬细胞的抗菌能力，其他真菌黑色素也能起着抗原的作用。
自由基清除剂
鱿鱼墨黑色素对羟基自由基的清除效果
衰老的自由基理论认为，衰老和衰老相关联的退化性疾病基本上可以归因于自由基对细胞成分和连接组织的有害进攻，其中起作用的主要是质子化超氧阴离子和羟基自由基。超氧阴离子是氧毒性的主要因素，是生物体内第一个生成的氧自由基，其他氧自由基都是从超氧阴离子衍生出来的。虽然它氧化作用不是最强，但它存在寿命长，扩散的距离长。而羟基自由基的是氧化性最强的氧化剂，可以与所有生物大分子反应。
鱿鱼黑色素对超氧自由基清除效果
鱿鱼墨黑色素是一种良好的自由基清除剂，是所知的唯一保护生物体免受辐射伤害的天然内源生物聚合体。它能够有效清除羟基自由基，氧自由基等自由基。人大脑神经元中的黑色素是一个三价铁离子储存库。帕金森患者病人的大脑中，伴随着三价铁离子水平的升高以及神经元黑色素的缺失，往往会造成神经细胞的死亡。在正常的人脑细胞中，神经元黑色素与铁离子的螯合量少于最大螯合量的一半，剩余未与铁离子螯合的神经黑色素起到人脑细胞抵抗铁离子的毒害的作用。然而，不正常的铁离子的新陈代谢可以导致神经元黑色素吸收过多的铁离子。在黑人黑质神经细胞中，神经元黑质中饱和的铁将导致产生一种游离铁，它能够催化非酶氧化反应，特别是一种高效的氧化反应，如H2O2氧化成羟基自由基（·OH）。鱿鱼墨黑色素与铁螯合以后，其抗氧化活性明显下降，这可能是黑色素与三价铁螯合时发生了氧化还原反应，发生对二苯酚/苯醌结构转换而失去电子，从而降低了其清除自由基的活性。
除此之外，Rita de Cássia从黑曲霉中提取黑色素并研究了其抗氧化活性。发现它能有效的清除 HOCl 和 H2O2氧化产生的自由基。RM.I.Blinovaa 等研究了黑酵母黑色素对人角化细胞和纤维原细胞的生长的影响，发现黑色素能够抑制角化细胞的生长。我国科学家也对黑色素的自由基清除活性进行了研究，李晓燕等的研究发现，工程菌产生黑色素在低剂量时的抗氧化能力强于其它几种常用的抗氧化剂。黑色素还能够与一些抗生素类药物，减少此类药物对人体的损伤作用。Rainer Knorle等研究了黑色素与药物的结合的亲和动力学，并且发现黑色素能够有效减缓此类药物带来的对小鼠的损伤。