Параспеклы

Параспе́клы (), или паракрапинки, — класс ядерных телец, располагающихся в интерхроматиновом пространстве клеточного ядра в клетках млекопитающих. Они состоят из белков и РНК и формируются при взаимодействии длинной некодирующей РНК, известной как , и белков семейства DBHS (от ), а именно , PSPC1 и PSF/SFPQ. Параспеклы играют важную роль в регуляции экспрессии генов, обеспечивая удержание в ядре молекул РНК, содержащих двуцепочечные участки и подвергшихся редактированию аденозин → инозин (A → I). Регулируя экспрессию генов, параспеклы оказываются вовлечёнными в такие процессы, как дифференцировка клеток, ответ на стресс и протекание вирусных инфекций. Имеются данные о связи параспекл с раком и заболеваниями нервной системы.

История изучения 
Параспеклы были открыты в 2002 году Андерсеном и коллегами в ходе изучения протеома очищенных ядрышек клеток человека с помощью масс-спектрометрии. В ходе исследования был выделен 271 белок, из которых 30 % оказались ранее неизвестными. Более детальное изучение одного из этих новооткрытых белков показало, что он вовсе не накапливается в ядрышках, а располагается в нуклеоплазме диффузно, но сильно концентрируется в 5—20 ядерных фокусах. Оказалось, что эти фокусы не перекрываются ни с одним из ранее известных ядерных телец, и они получили название «параспеклы» из-за расположения вблизи других ядерных телец — спекл. Сам же белок получил название PSPC1 (от ).

Структура 
Параспеклы — это мелкие тельца неправильной формы. В зависимости от типа клеток обычно в ядре имеется от 5 до 20 параспекл. Изучение с помощью электронной и флуоресцентной микроскопии показало, что параспеклы человека имеют ширину около 360 нм (у мыши чуть меньше) и длину от 1 до 2 мкм. Достоверно существование параспекл показано только для клеток млекопитающих. У человека параспеклы отсутствуют в эмбриональных стволовых клетках и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках. Ортологи ключевых белков параспекл обнаруживаются у других позвоночных и беспозвоночных животных, однако длинная некодирующая РНК NEAT1, необходимая для формирования параспекл, есть только у млекопитающих, с чем, по-видимому, и связано отсутствие параспекл в ядрах других организмов. Количество и длина параспекл пропорциональны уровню экспрессии длинной изоформы NEAT1.

Последние исследования с использованием электронной микроскопии и  показали, что параспеклы представляют собой цепочки слитых сферических субкомпартментов, каждый из которых имеет коровую часть и оболочку. 5'- и 3'-концы длинной изоформы NEAT1 локализуются в оболочке, а остальная часть молекулы находится в коровой части. Разные белки параспекл тоже локализуются в разных частях параспекл.

Параспеклы располагаются в интерхроматиновом пространстве, зажатые между более крупными ядерными спеклами и хроматином. Показано, что внутри параспекл РНК-полимераза II неактивна, и транскрипция, опосредованная этим ферментом, происходит только у края параспекл.

Связь параспекл с ядрышком ещё не до конца понятна, однако один из ключевых белков параспекл, PSPC1, может перемещаться между параспеклами и ядрышком. Кроме того, при подавлении работы РНК-полимеразы II белки параспекл локализуются в особых околоядрышковых кэпах.

Компоненты 
В параспеклах в больших количествах накапливается свыше 40 различных белков и РНК. Большинство белков параспекл связаны с транскрипцией, опосредуемой РНК-полимеразой II, и процессингом РНК. Одна из двух РНК, накапливающихся в параспеклах, называется Ctn и участвует в регуляции экспрессии генов путём удержания РНК в ядре. Вторая РНК называется NEAT1 и играет архитектурную роль, являясь необходимой для формирования и поддержания структуры параспекл. Основные компоненты параспекл перечислены в таблице ниже.

Белки 
Важнейшими компонентами параспекл являются три белка семейства DBHS: PSF/SFPQ, NONO/P54NRB и PSPC1. Они локализуются в нуклеоплазме и в параспеклах. Чаще всего в качестве маркера для параспекл используется белок PSPC1, поскольку он в меньшей степени накапливается в нуклеоплазме. Два N-концевых РНК-связывающих мотива и С-концевой  () у этих белков на 50 % совпадают по последовательности. Эти белки играют важную структурную роль в параспеклах: так, нокдаун белков P54NRB и PSF в клетках HeLa приводит к утрате параспекл. По сравнению с P54NRB и PSF, PSPC1 экспрессируется не так обильно, и его нокдаун не приводит к утрате параспекл. Эти три белка взаимодействуют друг с другом и, вполне вероятно, внутри клеток они находятся в виде гомо- или гетеродимеров. Взаимодействие друг с другом осуществляется через биспиральный мотив. Для локализации этих белков в параспеклах необходимы как домены, содержащие С-концевые биспиральные мотивы, так и  домены. Члены семейства DBHS связывают одно- и двуцепочечные молекулы ДНК и РНК и участвуют во многих этапах синтеза и процессинга РНК. Кроме того, PSF и P54NRB связывают и удерживают внутри ядра транскрипты, подвергшиеся интенсивному редактированию аденозин → инозин. Они также функционируют в цитоплазме, например, PSF и P54NRB входят в состав переносящих РНК гранул в дендритах, однако только P54NRB может активно транспортироваться из ядра в цитоплазму. Интересно, что P54NRB участвует в регуляции циркадных ритмов у млекопитающих.

Белками параспекл считают такие белки, которые колокализуются в определённых ядерных локусах вместе с белками семейства DBHS, однако общая картина локализации этих белков может значительно различаться. Например, белок CFIM68 можно наблюдать в параспеклах, но он также встречается и в ядерных спеклах; в то же время РНК-полимераза II, кроме параспекл, выявляется в хроматине и ядерных спеклах. Наконец, некоторые белки обнаруживаются в параспеклах только в условиях сверхэкспрессии, например, BCL11A, WTX, WT1(+KTS) и CoAA.

Белки параспекл, не входящие в семейство DBHS, обычно являются транскрипционными факторами или корегуляторами транскрипции. CoAA функционирует как транскрипционный коактиватор, регулирующий транскрипцию, опосредованную , и альтернативный сплайсинг. WTX — корегулятор транскрипции и супрессор опухолей, он коактивирует транскрипцию белка WT1, который также может локализоваться в параспеклах. SOX9 — это транскрипционный фактор, играющий важнейшую роль в формировании костей. Он непосредственно взаимодействует с P54NRB, а его сверхэкспрессия приводит к изменению локализации P54NRB и PSPC1. BCL11A является транскрипционным фактором, который вовлечён в развитие /лейкемий. Фактор разрезания CFIM68 необходим для первого этапа процессинга 3'-конца пре-мРНК.

Для формирования параспекл строго необходимы белки NONO и SFPQ. Кроме того, нокдаун таких белков, как HNRNPK, DAZAP1, FUS, RBM14 и HNRNPH3 приводит к отсутствию параспекл.

РНК 
До описания конкретных РНК, входящих в параспеклы, был известен ряд свидетельств того, что параспеклы действительно содержат РНК помимо белков. Во-первых, параспеклы разрушаются при обработке клеток РНКазой. Во-вторых, во всех важнейших белках параспеклах содержатся мотивы, связывающие РНК, кроме того, все эти белки так или иначе участвуют в процессинге РНК. В-третьих, для локализации PSPC1 в параспеклах необходим РНК-связывающий домен этого белка. Наконец, параспеклы исчезают при подавлении транскрипции, опосредованной РНК-полимеразой II, и снова появляются при возобновлении транскрипции. Известны две РНК, входящие в состав параспекл: Ctn и NEAT1/Men ε/β.

Ctn стала первой открытой РНК параспекл, она была описана в 2005 году. Это специфичный для мышей транскрипт с поли(А)-хвостом, который считывается с локуса mCAT2. В состав Ctn входят все экзоны белка-транспортера CAT2, однако, в отличие от мРНК этого белка, Ctn синтезируется с другого промотора и имеет более длинную 3'-нетранслируемую область (3'-НТО). Ctn локализуется не только в параспеклах, но и в нуклеоплазме. 3'-НТО этой РНК подвергается интенсивному редактированию А → I, причём редактируются инвертированные повторы, благодаря которым в структуре РНК образуются двуцепочечные участки. С инозином в РНК связывается белок параспекл P54NRB, который, кроме того, связывается с Ctn in vivo. Вероятно, благодаря связыванию с белками параспекл Ctn остаётся в параспеклах, а не экспортируется в цитоплазму. Под действием ряда стрессовых сигналов 3'-НТО Ctn разрезается, и количество этой РНК в ядре падает.

В 2009 году несколько групп исследователей независимо открыли вторую РНК параспекл — NEAT1. Эта длинная некодирующая РНК необходима для формирования и поддержания структурной целостности параспекл. Известно два варианта NEAT1, различающихся своей длиной; структурную роль в параспеклах играет длинная изоформа. Интересно, что длинная изоформа NEAT1 подвергается разрезанию очень близко к 3'-концу, из-за чего образуется очень короткая молекула РНК, похожая на тРНК. Нокдаун NEAT1 приводит к полной утрате параспекл, а сверхэкспрессия этой РНК приводит к увеличению количества параспекл в некоторых . Кроме того, параспеклы формируются вблизи генов NEAT1. По-видимому, как и в случае Ctn, локализация NEAT1 в параспеклах связана с взаимодействием с белками семейства DBHS, хотя NEAT1 не подвергается редактированию А → I. По изменению количества NEAT1 в клетке можно судить о функционировании параспекл. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, а также индуцированные плюрипотентные стволовые клетки не экспрессируют NEAT1 и не имеют параспекл, несмотря на экспрессию белков DBHS, однако при начале дифференцировки параспеклы появляются. Кроме того, с появлением параспекл усиливается накопление в ядре мРНК, подвергшихся редактированию А → I.

Формирование 
Согласно существующей модели, формирование параспекл начинается с образования транскриптов NEAT1 в ядрах дочерних клеток вскоре после клеточного деления. Вскоре после синтеза молекулы NEAT1 формируют комплексы с белками DBHS, причём транскрипты NEAT1 не успевают удалиться от своего локуса. Сформированные параспеклы, вероятнее всего, состоят из множества комплексов NEAT1 с белками DBHS и довольно динамичны: отдельные молекулы белков DBHS могут уходить в нуклеоплазму и обратно. Вероятно, в формировании параспекл задействована способность белков DBHS к олигомеризации, а также взаимодействия непосредственно между самими молекулами РНК NEAT1. В отсутствие NEAT1 параспеклы неспособны поддерживать свою структурную целостность и не формируются заново. Согласно последним данным, в формировании параспекл задействовано разделение фаз на границе жидкость—жидкость (). Капельки с разделенными фазами образуются благодаря поликомб белку ASXL1, который кроме того, усиливает экспрессию NEAT1 и увеличивает взаимодействия NONO-NEAT1

Функции 
Основной функцией параспекл является удержание в ядре мРНК, содержащих двуцепочечные участки, сформированные при помощи , и подвергшихся редактированию аденозин → инозин. Удержание РНК в ядре связано с клеточным ответом на стресс, вирусные инфекции, а также поддержанием циркадных ритмов. Судя по всему, параспеклы участвуют в перепрограммировании клетки, которое происходит при дифференцировке; возможно, путём удержания РНК в ядре параспеклы изменяют экспрессию ключевых белков. Отсутствие NEAT1 и параспекл потенциально может служить маркером плюрипотентности. Белок параспекл CFIM68 может регулировать высвобождение РНК из ядра, внося в РНК разрезы.

Параспеклы могут избирательно накапливать внутри себя определённые белки, приводя к понижению концентрации этих белков в других местах. Это, в свою очередь, может влиять на экспрессию ряда генов.

Согласно последним данным, параспеклы могут локализоваться непосредственно на сайтах начала транскрипции активно транскрибируемых генов. Белки параспекл SFPQ и NONO участвуют в процессинге микроРНК, причём накопление этих белков в параспеклах способствует эффективному процессингу микроРНК.

Физиологическое и клиническое значение 
Параспеклы и NEAT1 не являются строго необходимыми для развития млекопитающих в нормальных условиях, так как мыши, лишённые NEAT1, жизнеспособны. Тем не менее, у некоторых самок таких мышей наблюдались отклонения в формировании и функционировании яичниковых секреторных желёз и жёлтого тела, что снижает фертильность. Возможно, параспеклы выполняют какую-то эволюционно консервативную функцию в клетках секреторных структур женской репродуктивной системы млекопитающих: так, у опоссума в клетках маточных желёз имеются хорошо оформленные параспеклы. Любопытно, что подобные эффекты наблюдались не у всех нокаутных самок, а лишь у некоторых, что можно связать с необходимостью функционирования параспекл при стрессовых условиях окружающей среды.

Уровень экспрессии длинной изоформы NEAT1 повышается при заражении клетки некоторыми РНК-содержащими вирусами, такими как вирус японского энцефалита, бешенства, ВИЧ, вирус гриппа и вирус Хантаан, а также ДНК-содержащим вирусом простого герпеса. В большинстве случаев это повышение есть защитный механизм. Повышение количества параспекл приводит к накоплению в них большого количества белков, которые вирус не сможет использовать для своего размножения, а также изменению экспрессии ряда генов.

В случае рака экспрессия NEAT1 может понижаться, повышаться по сравнению с нормальной тканью или оставаться неизменной. Мутации в гене NEAT1 связывают с развитием рака печени и рака молочной железы. Имеются данные, что NEAT1 может даже стимулировать образование метастазов. Повышение экспрессии NEAT1 и увеличение количества параспекл может быть связано со стрессовыми условиями, в которых находятся раковые клетки, однако параспеклы могут иметь и онкогенную роль. В случае рака предстательной железы повышение количества параспекл и экспрессии NEAT1 соответствует более агрессивным формам заболевания. Есть, однако, и свидетельства того, что параспеклы могут подавлять развитие опухолей.

Параспеклы могут играть особые роли в функционировании нервной системы. Показано, что после эпилептического припадка в некоторых участках мозга мышей повышалась экспрессия длинной изоформы NEAT1. Параспеклы могут быть задействованы в развитии бокового амиотрофического склероза.

Имеются свидетельства, что NEAT1 может регулировать воспалительный процесс, запуская образование параспекл в макрофагах.

Примечания

Литература 
 
 

Субъядерные структуры