Це подружжя стало першою в ланцюжку помилок, які врешті-решт призвели до перемоги шотландських протестантів та Єлизавети. Дарнлі різко втратив популярність у Шотландії, а потім зганьбив себе вбивством італійського секретаря Марії Девіда Річчіо. У лютому 1567 року Дарнлі вбили змовники, яких, швидше за все, очолював Джеймс Гепберн, 4-ий граф Ботвелл. Незабаром, 15 травня 1567 року, Марія вийшла заміж за Ботвелла, збуджуючи підозри про те, що вона брала участь у змові проти свого чоловіка.