RT-PCR在基因表达检测中的应用 基因表达的检测有几种方法。经典的方法(仍然重要)是根据在细胞或生物体中 所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技 术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术 的运用,现在有可能检测.分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于 于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交.NORTHERN凝胶分析.打点或印迹打 点.S-1核酸酶分析和RNA酶保护研究。这里描述RT-PCR从RNA水平上检查基因表达的 应用。 RT-PCR检测基因表达的问题讨论 关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展, 在此主要讨论它在应用中的 问题。理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了(每个细胞有1个或几个拷 贝)。1μL差不多相当于50-100,000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数 量,靶分子的数量通常大于50,000,因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低 靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同;例如它能检测出单个RNA分子。当已知量的 转录RNA(用T7RNA聚合酶体外合成)经一系列稀释,实验结果表明通过PCR的方法可 检测出10个分子或低于10个分子,这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不 到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。 因此没必要分离polyA+RNA,RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需 要。 将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应,可简化实验步骤。我们发现整个 反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA,然后PCR缓 冲液进行PCR扩增循环。当然,值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合 成。我们对不同的缓冲液用于大片段DNA合成是否成功还没有进行过严格的研究。 反转录酶的选择似乎对实验方法成功与否并不十分重要。BRL和BOEHRINGERMANN HEIM的MULV反转录酶进行全面的研究,但没有理由认为来源可靠的反转录酶不能适用 于该方法。在研究中,我们仅使用了PERKINELMER/CETUS公司生产的TAQ聚合酶。 cDNA第一条链的合成可用不规则六聚体、寡聚(dT)或PCR下游引物来启动反应。 如果用寡聚(dT),一般每次反应加0.1μL就够了。如果用下游寡核苷酸作为第一条链 的起始引物,10-50pmol最为理想。反转录反应以后,加入适量的上游和下游引物进 行PCR反应与用不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一种最后得到的扩 增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似乎更容易得到前后一致的结果,且靶序列 的合成量通常最多(E.S.K.)加入不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一 种最后得到的扩增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似站更容易得到事一致的结 果,且靶序列的合成量通常最多(E.S.K.未发表)。第一条链合成完毕,不必加碱或 RNA酶以除去RNA模板。95℃热处理使反转录酶失活,同时也使RNA-DNA杂合子变性。 不必加碱或RNA酶以除去RNA模板。95℃热处理使反转录酶失活,同时也使RNA-DNA杂 合子变性。残留的RNA模板似乎对PCR反应无干扰。 寻找使PCR反应产生良好扩增结果的最低浓度的寡核苷酸引物是十分重要的。我 们发现过量的引物通常会产生许多妨碍随后分析的额外扩增产物。浓度为5pmol的引 物可得到非常清晰及有效的扩增产物。当然,最好是找到你要扩增的每个序列的最佳 引物量。没有必要用全部的cDNA反应产物进行PCR扩增。可取等分量cDNA样品用几组 不同的引物作PCR分析;例如:一份cDNA反应物可用于研究几种不同类型的RNA。cDNA反 应物通常用PCR缓冲液衡释5倍。将cDNA的浓度隆低至0.2mM,此浓度更适于Taq聚合 酶。dNTP浓度不应超过0.2mM,因为较高浓度的dDTP使Taq聚合酶的错误掺入或突变率 增高。对于扩增来说,即使dNTP的浓度低到0.05mM也不会出现问题。 镁离子浓度对反应十分重要,因此应注意将镁的摩尔浓度保持恒定。有时核酸溶 于含1mMEDTA的缓冲液中,EDTA可歼螯合大多数镁离子。通常,PCR反应中游离镁离子 浓度应保持在2mM。 将PCRA循环次数减少,不可避免地产生许多非特异性的扩增产物。很容易将长度 不同的DNA的扩增。即使基因组序列得到扩增,当引物与大小不同的外显子结合时, 很容易将长度不同的MRNA与基因组的产物区别一来。如果不了解基因组的结构,选用 与5'编码基因间隔300-400bp的引物,脊椎动物的外显子很少大于300-400bp,因此很 容易从不同的外显子中导出引物。如果所研究的基因无内含子、或者研究完整原病毒 RNA转录,为了获得有关PCR的结果有必要用DNA酶彻底处理RNA。只要有很少量的基因 组DNA污染,用此方法分析就会出现假阳性结果。 实际应用举例 基因表达检测 用该方法先后扩增,检测了许多不同类型的细胞、组织和器官的mRNA。当然,仅 仅检测mRNA并没有新颖之处,它的新颖在于能对10-1000个细胞的RNA进行分析。所需 起始物质比通常的低很多,这使得研究者能设计并进行以前看是不可能进行的实验。 例如研究血细胞生成的研究人员经常用群体分析确定生长因子或环境对特殊细胞系发 育的影响。经常部到的一个问题是:群体细胞产生的何种生长/分化因子会影响其本身 的发育。现在可以确信,利用RNA/PCR技术能够对数百个群体的mRNA对任何与生长或 分化有关的因子进行分析。而用常规的杂交或抗体检测方法来分析它们是极其因难、 甚至是不可能的。