曾有文献提到选用WizardPurificationKit,PRC-5 柱,SephacrylS-1000 或S-500,QiagenGenomictip500/G,或者CsCl 梯度离心纯化DNA。 楼主可根据自己的实验要求试一下以上方法,希望能对你有所帮助,祝成功。 大家帮忙看看我提的DNA能用于后面PCR 的模板吗? 我是用CTAB法提取白腐真菌的染色体DNA,提取之后用0.8%琼脂糖电泳图如下(1 和10 泳道为Marker,23000bp): 总体感觉长片段的条带不多,小片段的倒是很多,后面我设计了mnp 和lip 基因的引物 准备PCR,请教各位这次提取的DNA质量可以用作PCR 的模板吗? 还用一个问题: 电泳图片上加样孔附近的条带是片段很大的DNA吗?还是由于别的操作问题产生的条 带?谢谢! 建议从新抽题后再进行PCR,原因如下: 1.从你的图上来看,一是RNA含量太高,建议加 RNAase 处理,可以在加入CTAB后 加入RNAase,这样可以在65 度处理时同时去除RNA。 2.你的DNA条带其实是23000bp 左右的条带; 3.点样孔附近的条带,其实不是DNA条带,是蛋白污染造成的亮带,不是大片段的DNA。 不知我的回答,能解决你的问题否? 楼上的朋友说得对,而且楼主的DNA不仅是存在杂质,而且还发生了降解。 楼主可再次重新抽提DNA,在抽提时请注意以下几点: 1.研磨样品时要有液氮的保护,在整个过程中都不要让液氮挥发干净。避免材料回温和 反复冻融带来的降解。 2.将DNA加入异丙醇析出时用的枪头一定要剪过的。这点很重要。过尖的枪头会把DNA 链弄断。 3.加入异丙醇后出现的DNA絮状物尽量要挑出,如果不是产量太小梅办法跳出来,尽 量不要离心,因为离心后虽然产量会增大,但是不完整的DNA也增多了。 这里对于增加提取量想说明一点,在研磨样品时,研得细和研得很细,提出的DNA量 可以相差几倍!所以,在液氮保护的很好的情况下多研磨几次,要比在后面的过程中离心以 增加产量要划得来! 楼主可以先粗提后,经琼脂糖凝胶电泳检测确认DNA比较完整的情况下,再进一步纯 化,以除去其中混杂的RNA和蛋白质。 下面是一张 DNA 提取后的电泳检测照片,用的胶浓度为 1%,下面一排有些降解,少 数几个点样孔内有蛋白质,但上面一排的是可以作为后面实验模版的DNA。 初提DNA,感觉最难掌握就是液氮研磨,请教colchicine 液氮研磨的问题: 1)一般0.1g 和1g 的样品,要在液氮中研磨多久变成细粉才算迅速? 我今天提水稻的DNA,0.1g 的稻叶,磨了有5,6 分钟,才把它磨成粉,但是加到装有 提取缓冲液的离心管后发觉仍有很多碎片,这样是否即研磨未够充分?我是男生,不可能不 够力气的啊。可以讲多些液氮研磨的细节和要领吗? 2)研磨好的样品须在液氮刚挥发光时转移到装有提取缓冲液的离心管,请问这个过程 样品(粉末)干了会使DNA降解吗?还是要不断补充液氮,等刚挥发光一次就转移一次? 1)所谓的迅速,是指研磨的时候手的转动迅速,只要保证材料有液氮保护,可以研磨的 久一些,但一定要及时补充液氮。一般来讲,在粉末颜色比较钱的时候加液氮,不要等材料 颜色已经变深再加,那时DNA就已经可能降解了。一般来说,当液氮快要挥发完时,粉末 颜色呈现淡淡的绿色,说明已经比较细了,颜色越浅,则说明粉末越细。下面是另外一个关 于研磨的帖子,供你参考: http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=6586233&sty=1 2)装管的时候,材料一定要有液氮的保护才行!否则研磨时的液氮保护DNA不都前功 可以这样做:将几个离心管放入一个容器,向容器中加液氮,将其冷冻一下,使之处于低温状态,将液氮还未挥发干净的材料放入管内,不要急着盖盖子,因为液氮不挥发干净就 盖上会再次弹开。将离心管放入盛有液氮的容器,等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。 另外,如果是在离心管上编号,最好在冷冻前写好,否则离心管冷冻后材料会受影响不 说,也很难写上。 提取DNA时加液氮的目的主要是防止DNA 的降解,所以必须一直提醒自己,减少材 料回温的机会,液氮保护必须自始至终,材料采集时最好立即投入液氮中保存,以最大程度 上保证DNA的完整性。为了实验的准确性,还是多注意点比较好。 正准备提DNA,看了colchicine 前辈的回贴,受益匪浅,非常感谢! 现在我对液氮研磨质量的优劣和原则有了认识。您说的用容器装离心管,加液氮的方法 很好,不过不知道是否不适合CTAB法?因为CTAB法一开始不是要把提取缓冲液置于65 度水浴的吗?加了液氮那缓冲液不结冰了?据说 CTAB 在低温时会和核酸形成不溶性沉淀 CTAB法的下一步骤正是用氯仿-异戊醇抽提取上清,冰冻会否损失很多核酸?不知colchicine 前辈如何看这个问题? 冷冻离心管是为了保证DNA在装管的过程中不降解,这一步只是在研磨步骤中出现的。 装管后可以放入超低温冰箱保存,或者立即提取DNA。 如果随后就要提DNA,当然要加入CTAB提取液65 度水浴了,这时就不存在什么冷冻 的问题了,只要注意动作不要太猛烈就好了。CTAB 提取液水浴后的离心温度不低于 15 的话,DNA不会沉淀出去的。另外,在加入 CTAB 提取液之前,最好不要让材料的温度升得太高,如果是从丑低温 冰箱中拿出来,最好立即置于冰上放置。 用液氮研磨植物干燥的叶子时,叶子碎片随着液体在研钵中旋转,结果导致叶子不能成 为细粉状,而是小片状,请教一下怎么研磨才能成为细粉状,谢谢! 在液氮还比较多的时候,轻轻把变脆的叶片杵碎成小片状,待液氮快干时,迅速研磨, 研磨一阵后(别让液氮挥发得太干净,即叶片颜色有点发白时就加液氮,切莫等到颜色已经 变深!)再加液氮,这时就不会有小片状的东西了。 另外,在研磨之前,先向研钵加一次液氮将其冷冻一下,挥发干净后再放入样品和液氮, 不但研磨得比较快,提出的核酸也比较完整。研磨之前可以把叶子先用剪刀剪碎,然后再研 磨.有时候叶柄部分在液氮中容易变为结块很难研磨,可以把那部分剪掉.。 野外采集以后最大的问题是保鲜。短时间内可以把叶片放在底部装有少量水的袋子中保 持水分。回到实验室后,放-20 度可以保持两周左右,先用液氮冻 10min 后放-80 度可以保 存三个月左右。我们实验室一般都用后一种方法,效果不错。 提取植物DNA时遇到多糖成分的干扰,DNA质量一直不高,如何消除多糖的影响? 参考见解:一般来说,SDS 法提取的DNA会还有较多的多糖,使DNA成胶冻状。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比较高,可用以下方法试一试: DNA未溶出之前,先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液: 100mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、5mmol/LEDTA 和0.35mol/LSorbitol 洗几次。 2、使DNA提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入0.35 倍体积的无水乙醇,迅速混 匀,多糖会先沉淀。 3、沉淀 DNA 时,使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5mol/LNaCl NH4Ac使终浓度为 10mmol/L 0.5mLDNA液中加 0.125mL4mol/LNaCl 和0.625mL13%PEG8000(冰浴1h)。 4、多糖和DNA的共沉淀物进行再分离。如用TE 缓冲液反复清洗共沉淀物,将清洗液 合并再用醇沉淀 DNA,或将沉淀物溶解后,经琼脂糖电泳,切下 DNA 部分再将胶回收, 或者用多糖水解酶将多糖降解。还有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2 体积),氯苯可以 与多糖的羟基作用而去除多糖。 上述方法还可组合使用,以达到最佳效果。然而这些方法均会在一定程度上减低 DNA 的提取量;如果材料较少或要求较高,则可考虑用柱层析方法,使用对DNA具有特异性吸 附的树脂来纯化DNA。曾有文献提到选用WizardPurificationKit,PRC-5 柱,SephacrylS-1000 或S-500,QiagenGenomictip500/G,或者CsCl 梯度离心纯化DNA。 血样4 度保存了2 月,现在按照酚常规提取方法不能提取出DNA,有什么解决办法? 参考见解:按照常规的酚/氯仿法不可能提不出来,下面是参考方法: 1、首先洗出白细胞,最好有1 毫升以上血液。 2、加入5mlDNA提取缓冲液,(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。 3、加入25ul 蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀,50水浴过夜。 4、用等体积的(酚,氯仿,异戊醇,25:24:1)混合物抽提一次,5000r/min,10min 离心收集水相。 5、取水层,加入 倍体积-20预冷无水乙醇5000r/min,10min,75%乙醇 5000r/min 洗DNA,充分干燥将DNA溶于适量水中。 CTAB法提取水稻基因组DNA,TE 溶解后琼脂糖胶电泳检测,点样孔附近有一条明显 MBI公司产的限制性内切酶酶切过夜,鉴定时发现 DNA 已经被完全切烂,只 在溴酚蓝前存在微弱 smear 状产物。换用 NEB 公司产的酶,更换 EP 管,灭菌水之后重复 几次,结果还是如此。拿其他人的DNA做对照,酶切结果正常。