一些感染性疾病, 心血管疾病,肿瘤,肌营养不良症,阿尔茨海默症,HIV,朊病毒病等 可能与脂筏功能紊乱有着密切的关系 。 1992 年Brown 和Rose过周密详实的实验提出了脂筏(lipid raft s) 的假设, 旨在说明这类脂锚定蛋白和信号激酶可以进出的特殊微区, 而且脂筏已被证实是由大小为10~100 nm 的膜片(membrane patches) 组成, 且可以作为中介将与它相互作用的细胞蛋白和外周蛋白输送到 细胞表面. 近几年来新发展起来的实验手段,如扫描探针显微镜(SPM) 等已经可以观察到生物膜纳米尺度上的结构和动态特性, 从而使在分 子水平上阐述生物膜微结构和功能的物理化学机制成为可能. 1 生物体系中的相分离 脂类通常以长程有序的二维体系聚集在一起,然而在脂肪酰链区 通常有相当的无序微区存在. 简单的双组分和三组分膜模型体系展现 了脂类组织的几个基本特性. 对一种由两种脂类组成的生物膜, 如果 温度在两种脂类的相变温度之间, 体系的物理状态将是凝胶和流体相 [9 ] 共存, 即会发生相分离, 形成微区 . 当然, 对于同一种磷脂, 如果 [8] [2,3] [1] 姓名:陶旭光 学号:10589017 单位: 基础医学院遗传系 处于两相共存区, 也会发生相分离, 比如, 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC) [10 ,11 ] 处于液态凝聚相和液态扩张相共存区 . 为了深刻理解生物组成成 分之间的相容性、微区形状以及这些复合结构的分子排布情况, 对磷脂 [5 ] 与胆固醇、 糖脂类、 多肽以及蛋白质 的复合膜也有相当多的研究. 结 [12 ] 果表明, 生物膜中发生相分离的因素是很多的 , 但主要有以下几个: a1类脂的碳氢链. 不同的碳氢链在生理温度下, 具有不同的疏水性和 相态. 疏水性的不匹配(类脂分子之间的相溶性) 是决定膜的整体有序 度的一个关键因素, 比如由带特长和特短脂肪链的脂类按一定摩尔比 组成的脂双层, 便会由链长的不匹配产生一些局域无序态, 相态的不 互溶发生一定的相分离. b1头基. 类脂的头基是多种多样的, 头基的大 小和带电性, 以及特殊头基间相互作用形成的氢键也会影响膜的结构. c1 膜中胆固醇和膜蛋白的加入也会形成微区结构. 胆固醇分子对膜结 构特性有显著影响: 当它平行插入磷脂分子之间, 其刚性的四环核与 磷脂脂肪酰链的相互作用, 可改变脂肪链排布的紧密程度———增加 凝胶相的流动性(无序性) 和增强流体相的刚性(有序度) . 当胆固醇加 入凝胶/ 流体相共存的双组分脂类体系中, 情况则更为复杂,在特定的 体系中, 温度和摩尔比一定时, 会出现一种液态有序相. 该相中, 胆 固醇的含量比较高, 脂肪链区域比较有序. 而且, 胆固醇含量的降低, 可增加体系的相分离程度, 而胆固醇含量的提高, 可降低相分离程度 甚至使相分离消失. 液态有序相正是后一种情况[13 ] . 许多跨膜蛋白通 常通过配体聚集或者偶联在膜中形成特定区域, 例如Shiga 病毒通过 鞘糖脂受体存在于细胞表面, 只是受体在小(caveolae) 中聚集而有效 的地包于其中, 偶联的糖肌醇磷脂锚定蛋白、Src 家族激活酶等易嵌入 富含胆固醇2鞘磷脂的区域组成特殊的脂类2蛋白质复合体. d1 膜的曲 率. 膜中分子的形状大概可分为三类: 圆柱、圆锥和倒圆锥. 头基和尾 巴横截面积大致相等的磷脂, 如饱和的和仅一个不饱和键的磷脂酰胆 碱易形成圆柱构型; 像溶血磷脂这样的头基截面大于尾巴的, 易形成 倒圆锥构型; 而诸如磷脂酸、磷脂酰丝氨酸这类头基截面小于尾巴截面 的易形成类似圆锥的构型. 单从几何形状考虑, 圆柱构型的分子易形 成平板双层膜, 圆锥和倒圆锥构型的分子易形成反曲率的分子膜. 值 得一提的是许多细胞转导(比如囊泡、微管的形成, 发生内吞作用囊泡 的变换和融合等) 都伴随着细胞膜曲率的巨大变化. 另外, 根据生物 膜中分子的构型, 可推测一些特殊复合体中的分子排布情况. 2 脂筏 生物膜膜脂主要分为磷脂,糖脂和固醇类,其中,磷脂根据醇成分 姓名:陶旭光 学号:10589017 单位: 基础医学院遗传系 的不同分为甘油磷脂和鞘磷脂,糖脂根据醇的成分分为甘油糖脂和鞘糖 脂,固醇类主要是指胆固醇。脂筏是膜脂双层内含有特殊脂质和蛋白质 的微区。富含鞘磷脂,鞘糖脂,胆固醇,GPI-锚固蛋白, Src-kinase等。 脂筏不仅存在于质膜上,而且还存在于高尔基体膜(Golgi membrane)上。 鞘磷脂和鞘糖脂(如神经节苷脂类)的饱和脂肪链紧密聚集,饱和脂肪 链之间的空隙填满了作为间隔分子的胆固醇,形成液态有序相 (liquid-ordered phase,即脂筏),直径大约在50nm左右。而不饱和脂肪 链围绕在筏区的周围,形成非筏区,非筏区的主要成分是卵磷脂,磷脂 酰乙醇胺,磷脂酰丝氨酸等,也含有胆固醇。因为鞘脂含有长链饱和脂 肪链,Tm较高,所以脂筏区与非筏区相比,流动性差,脂肪链伸展, 而且粘稠。所以出现分相。脂筏区比非筏区高大约0.4-1nm左右。质膜 内外两层均含有脂筏,脂膜内层的脂筏除了知道需要胆固醇来维持其整 体性和缺少鞘脂之外,脂筏的组成还是不清楚的。到目前为止脂筏中唯 一的一种脂膜外层和内层都已经明确的是“质膜微囊(caveolae)”。 2.1 脂筏的形成、相结构特点和组成成分之间的相互作用 鞘磷脂的两条疏水链大多较长且高度饱和, 这使得它们能够充分 伸直而紧密排布, 这也是脂筏组装体的一个重要特征. 鞘脂类和磷脂 不同的排布能力可能正是他们的混合膜发生相分离的关键因素.因此, 富含鞘磷脂的脂筏与大家熟悉的疏松无序排布的磷脂区是共存的. 处 于不同相态(大多是液态凝聚相和类固态的凝胶相) 的脂类之间发生的 相分离已得到了广泛的研究. 众所周知, 在纯的磷脂双层中加入胆固 醇, 可使正常的胶态和液态凝聚相之间明显的热转变相消失, 这表明 了高浓度胆固醇的环境下, 有序态和无序态不能共存. 进一步研究表 明, 在胆固醇和两种磷脂的混合体系中可发生一种不同的相分离行为: 类液晶相区和一种新的液态有序相区共存, 在这种新的液态有序相中, 脂类的脂肪酰链充分伸直并密集排布, 和胶态类似, 但有高度的侧向 流动性.脂筏可能存在于这种液态有序相或者具有与之类似的相态中. 因此我们可以说脂筏以液态有序相存在. 这些研究结果证实, 在含有 两种磷脂(或其中一种是鞘磷脂) 与胆固醇的三项混合体系(它们具有 不同的熔点) 中, 可以发生两个并列的液态有序相/ 液晶相和胶态相/ 液晶相的相分离: 磷脂/ 鞘脂类混合体系既可在没有胆固醇存在的情 况下, 发生胶态和液晶态之间的相分离, 也可以在胆固醇存在的情况 下发生液态有序相和液晶相之间的相分离.胆固醇可以促使相分离行为 的发生. 因此, 胆固醇存在下形成液态有序相所需要的鞘脂类含量,比 没有胆固醇情况下形成胶态需要的鞘脂类量少,在鞘脂类含量相对较少 姓名:陶旭光 学号:10589017 单位: 基础医学院遗传系 的细胞膜中形成脂筏, 胆固醇的耗尽导致脂筏的破裂而影响脂筏的功 能, 再者, 这也可以解释相变温度处于37~41 ℃的神经鞘磷脂, 可以 和具有较高熔点的鞘甘脂一样有效地促使脂筏的形成, 但其稳定性没 有胆固醇形成的脂筏好. 究其根本原因, 可能是饱和脂类与胆固醇之 间的相互作用. 另外, SpM 有更多的官能团参与在极性头基区形成氢键, 然而氢键对胆固醇和/ SpM 相互作用到底有多大的贡献, 现在仍不清楚. 由于类脂的头基也是调节类脂排布结构的一个重要因素, 因此它们对 脂筏的形成起着重要的作用. 比如, 磷脂酰乙醇胺, 头基很小, 和对 应的磷脂酰胆碱相比, 具有较高的熔点温度, 这种作用可能在鞘脂类 含量较少而磷脂酰乙醇胺较多的脂双层 内叶中更为重要。 2.2脂筏( lipid raft) 的大小、种类、结构 脂筏这类特殊的微区, 其尺寸大多数在纳米量级上(数十个到上百 个纳米) , 由于太小而无法用光学显微镜观测到, 故而长期徘徊在我们 的视野之外. 脂质双层中含有的脂筏是不同的: 外层的微区主要含有 鞘脂、胆固醇及GPI 锚固蛋白, 这种流动性差, 而且黏稠的区域与邻近 多含不饱和脂肪酸的磷脂区发生分相; 膜内侧也有相似的微区, 但与 外侧的脂质不完全相同, 其具体的化学成分至今仍不完全清楚, 除了 知道在此区有许多酰化的蛋白质(比如信号转导蛋白) 和胆固醇, 不含 鞘磷脂. 虽然两层分别有脂筏, 但它们是偶联的[14 ] ,而且发现在一定 [15] 条件下内外层的成分可以发生上下翻转 . 以前人们研究用非离子性 去垢剂提取出来的脂筏, 其许多生物物理特性其实已经遭到了损坏. 因而, 人们为了对细胞膜造成较小的损伤, 转向了原位的测试研究脂 筏. 这种早期的实验结果表明, 脂筏在质膜里以微米尺寸大小团簇在 一起. 然而, 人们对富含脂筏微区的动力学特征, 特别是在细胞激活 [16 ] 过程中, 还不清楚. 为此, Jordan 等 用时间分辨共聚焦荧光显微镜, 研究了一系列活体细胞表达靶向脂筏GFP 融合蛋白的过程, 包括富含 脂筏的微区在细胞膜外叶片、附有抗体的乳珠/T 细胞受体界面以及T 细胞/ B 细胞(含抗原) 界面(免疫抗原表达过程) 的运动. 研究结果证 实了含脂筏的微区是运动的. 脂筏可能有三类: 小窝、富含糖鞘脂膜区、富含多磷酸肌醇膜区. 不同的脂筏有其各自的特异蛋白, 并有不同的功能. 小窝是脂筏中最 主要的一种, 由胆固醇、鞘脂(糖基神经鞘脂、神经鞘磷脂) 及蛋白质 组成, 大约有数十个纳米, 形态有多种多样, 有瓶型、囊泡型及管型, 多数是瓶型. 在细胞表面有开放型, 如形成胞吐囊泡, 也有封闭型, 姓名:陶旭光 学号:10589017 单位: 基础医学院遗传系 如形成胞吞囊泡. 小窝表面由曲纹覆盖, 曲纹主要由小窝蛋白结合胆 固醇而成. 胆固醇与小窝蛋白的比例大约在415∶1 , 小窝蛋白是小窝 的标记蛋白. 脂筏内的蛋白质, 有的是经跨膜直接插入膜,但更多的蛋 白质需酰化, 由酰化后的脂肪酸插入膜, 而且不同的酰化蛋白插入不 同的脂筏. 在脂筏中有许多蛋白质聚集, 便于相互作用. 脂筏的环境 有利于蛋白质的变构, 形成有效的构象. 从而使它具有许多功能: 参 [17] 与信号转导 、参与细胞蛋白质运转(包括参与跨细胞运转、细胞胞内 吞作用和细胞分选)胆固醇、鞘磷脂的体内循环过程. 脂筏生理功能具 有多向性, 如果它的正常生理过程发生改变, 则会引发多种疾病. 2 .3 脂筏的功能 脂筏的组分和结构特点有利于蛋白质之间相互作用和构象转化, 可以参与信号转导和蛋白质(包括细菌和毒素)转运。 2.3.1 信号转导 除了鞘脂和胆固醇之外,一些专一性的蛋白能够短暂的偶联到脂 筏上,或者作为脂筏的组成部分,如质膜微囊中的质膜微囊素。含有蛋 白质的脂筏能够参与信号转导过程并在其中扮演十分重要的角色。这些 蛋白质包括(1):通过GPI锚结合在质膜外层上的外层蛋白(如朊病毒 蛋白PrP);(2):转膜蛋白(如IgE受体); (3)结合在质膜内层的 Src 家族的酰化蛋白质酪氨酸激酶。由于脂筏分散在质膜上,而且能够 侧向漂移,因此脂筏能够将活化的受体和信号转换分子聚到一起,从而 引起信号传导。 一些信号转导单元能够在脂筏中预组装, 在CD4+ T细胞 中,T细胞受体信号启动器(例如T细胞受体-CD3复合物, ck ZAP-70激 酶和CD4共受体)的主要组成成分存在于脂筏中 。 2.3.2 蛋白质转运 越来越多的试验证明脂筏是蛋白质、特别是病原体进入细胞的入口。 质膜微囊内包含许多的受体蛋白,质膜微囊利用不同的途径运送这些受 体蛋白进入细胞。病原体如病毒,细菌及其毒素等将利用脂筏进入宿主 细胞作为其感染策略。利用细胞表面的GPI-锚固蛋白和筏脂作为主要 的或补充的受体。 例如霍乱毒素结合GM1, 志贺毒素结合中性糖脂Gb3, 分支杆菌结合胆固醇,这些病原体通过与脂筏中筏脂结合,并发生构象 转换,增加其与受体蛋白的亲和性。提出了病原体进入细胞的双受体模 型 ,脂筏在病原体进入细胞中的作用有:(1) 脂筏提供大量的低亲 和性的受体来稳定在细胞表面的入侵者――病原体。(2) 然后脂筏通 过漂移传递这些病原体至亲和性足够高的的受体上。(3) 脂筏中某些 专一性的脂可能作为分子伴侣而诱导接近高亲和性受体的病原体构象 [19] [18] 姓名:陶旭光 学号:10589017 单位: 基础医学院遗传系 转换。这个模型符合许多病原体入侵细胞的过程,如HIV-1,破伤风毒 素,肉毒杆菌毒素等等。 3 脂筏与疾病 病原体如病毒,细菌及其毒素等利用脂筏进入宿主细胞,利用细胞 表面的GPI-锚固蛋白和筏脂作为主要的或补充的受体。因此有必要研 究脂筏在疾病中的作用,以便了解疾病的机理。 3.1 脂筏与阿尔茨海默症 阿尔茨海默症是一种大脑神经退行性疾病,其病理学特征有细胞 外的淀粉样斑,细胞内的非正常tau蛋白螺旋丝形成的神经纤维缠结,神 经元的缺失和多种神经递质系统的改变。其中最显著的特征是细胞外大 量的弥散性老年斑,淀粉样斑由多种蛋白质组成,其主要成分是Aβ, 研究发现可溶性的,非毒性的Aβ转换为聚集的毒性的富含β-片层结构 是阿尔茨海默症发生的关键步骤。 Aβ是由前体蛋白APP剪切而来的分子 质量为4KD的多肽, 一般由39-42个氨基酸组成, 具有两亲性, N端亲水, C端疏水。Aβ包括Aβ40和Aβ42,其中Aβ42是APP在内质网上被蛋白酶 切产生的,在反式高尔基体网络中产生Aβ40,也有人认为都是在质膜 [20] 表面蛋白酶切产生的 。 APP经过两个连续的蛋白酶切过程产生Aβ的, 涉及二个酶:β-分泌酶和γ-分泌酶,β-分泌酶将APP剪切为可溶的 sAPPβ和C端片断CTFβ,然后CTFβ被 γ-分泌酶酶切掉形成Aβ。因为 APP,β-分泌酶和γ-分泌酶都是存在于脂筏中。因此Aβ的产生和聚集 主要发生在脂筏中。Cordy, J. M. 等为了研究脂筏在APP酶切过程中的 作用,将只存在于脂筏中的GPI锚取代β-分泌酶的C端和跨膜区,结果 发现,与野生型的β-分泌酶表达的SH-SY5Y细胞系相比,GPI-β-分泌 酶表达的细胞系上调了sAPPβ和Aβ的分泌量。当脂筏被胆固醇水平损 耗而引起脂筏紊乱后,这种影响得已逆转。结果也表明APP酶切为Aβ的 过程主要发生在脂筏中,而且β-分泌酶是该过程的限速酶。 脂筏特别是质膜外层的脂筏容易与Aβ多肽发生相互作用,并是细 [21] 胞功能紊乱和神经退化发生的原因之一 。两种筏脂(胆固醇和GM1) 与Aβ的结合可能促进纤维化的形成。Kakio, A.等提出了Aβ与膜相互 作用的模型,认为首先是Aβ专一性的识别神经节苷脂簇,胆固醇的存 在有利于神经节苷脂簇的形成,然后Aβ在神经节苷脂簇的帮助下,蛋 白质密度增加到一定高的程度后,Aβ构象发生转换,从α-螺旋构象转 换为β-片层构象,β-片层构象的Aβ作为淀粉样纤维形成的种子在与 膜结合之后立刻寡聚化,同时与之竞争发生的是与膜结合的β-片层构 象的Aβ作为一种膜活化的物质,转位至与可溶性Aβ没有亲和性的膜区 姓名:陶旭光 学号:10589017 单位: 基础医学院遗传系 即非脂筏区。包含神经节苷脂簇的脂筏可能作为一个构象催化剂或者分 子伴侣来辅助产生具有成熟能力的Aβ膜活化形式。 3.2 脂筏与朊病毒病 朊病毒病是一种由朊病毒引起的神经退行性疾病。包括人克雅氏综 合症,羊瘙痒症和牛海绵样脑病,猫海绵状脑病等。朊病毒本质上是具 有感染性的蛋白质。朊病毒病主要的特点是脑内朊蛋白(PrP )的异常 形式(PrP )的聚集。PrP 是由正常的PrP 构象转换而成,两者有同样 的氨基酸序列,只是构象不同而已。PrP 发生构象转换PrP 是由α螺旋 转换为β片层结构。两者相比,PrP 溶解度低,且抗蛋白酶K酶切。 PrP 是结合在细胞膜外层, 带有GPI锚结构的糖蛋白, 主要存在于脂 筏中 ,胆固醇损耗降低了PrP 的产生量,而鞘脂损耗增加了PrP 的产 [23] 生量。发现感染性的朊病毒里存在有两种鞘脂,GalCer和鞘磷脂 。所 Fantini, 有这些证据都表明脂筏可能在PrP 构象转换中起着关键的作用。 J. 等提出了一种基于脂筏的PrP 繁殖的可能机制:(1)感染的朊病毒 (或者是单个的PrP 分子,或者是富含PrP 的小单层脂质体)从感染细 (2)内源的PrP 和感染的 胞上脱落下来,PrP 插入未感染细胞的质膜。 PrP 蛋白都可能存在于一个脂筏中,脂筏彼此靠近,使得PrP 和PrP 紧 密连接。(3)在脂筏中发生PrP 向PrP 的构象转换。(4)产生的PrP 继 续去感染其他的PrP ,从而引起PrP 大量的产生。 参考文献: 1. 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