多克隆抗体本质上是抗体的混合物,具有各自的动力学特征,并且很可能还具有抗原表位特异性的差异。由于这种异质性,导出的速率常数和计算的亲和力应被视为不同亚群的平均值。
实验目的
确定两种不同的多克隆抗体与其各自的多肽和蛋白抗原之间相互作用的动力学。
实验方法
1、多克隆抗体和生物素化肽抗原之间相互作用的动力学测定
生物素化肽(1纳克/毫升)以25微升/分钟的流速,用PBST(含0.005%吐温20的10mM磷酸盐缓冲液)作为流动缓冲液,固定在链霉亲和素包被的Attana生物素芯片上。将识别生物素化肽抗原的纯化多克隆抗体稀释至10、5、2.5、1.25 微克/毫升。随后注射到芯片表面上。在每次抗体注射之间,通过一次注射甘氨酸-盐酸(pH 2.5)使表面再生,接触时间为30秒。
2、多克隆抗体和15kDa蛋白质抗原之间相互作用的动力学测定
在Attana蛋白互作分析仪中平衡Attana羧基传感器芯片,通过EDC/sulfo-NHS介导的胺偶联,使用10mM HEPES作为23℃和25微升/分钟的运行缓冲液,将50微升蛋白质抗原(0.1μg/ml,溶于HAc pH 5.0中)固定在表面上。用PBST做流动相,以5、2.5、1.25、0.625和0.3125μg/ml注射多克隆抗体进行相互作用实验。表面顺序用100mM H3PO4再生45秒、200mM氢氧化钠再生30秒。