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一个融合蛋白,将目的基因连接到PEGFP-N1载体上,目的基因大小900个碱基,测序结果正确,转染细胞24小时后可以检测到荧光表达,粗略计算了一下转染率,大约10-20%左右,将转染后的细胞提取RNA和蛋白分别作PCR和Western检测,未见有融合蛋白的mRNA和蛋白表达,现在不知道怎么办,请帮忙分析一下

7个回答

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提取过程中要避免RNA和蛋白的降解。
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转染细胞24小时后可以检测到荧光表达,粗略计算了一下转染率,大约10-20%左右;太低了吧 你自己想下 你提的mRNA和蛋白中 阳性的占多大比例?我怀疑你根本没提出阳性的
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真的有可能是表达量过低,检测不出。
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如果有10-20%的转染效率,应该是可以检测出来的,PCR和western的灵敏度还是很高的。不过在实验中有没有加入相应的阳性对照呢(比如单独转染PEGFP载体的)?建议重复一下看看结果吧。
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你用GFP的抗体做一下western,有的时候可能表达的是GFP单体蛋白,而不是融合蛋白。另外,你无需提取mRNA进行检测,因为你的基因是否有poly A都是未知之数,所以反转录可能不一定能得到你的目的cDNA
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前面说“将转染后的细胞提取RNA和蛋白分别作PCR和Western检测,未见有融合蛋白的mRNA和蛋白表达,”——认为你这里用的是目的蛋白的引物和抗体;
后面说“做了一下EGFP的western,发现在融合蛋白和EGFP单体的位置均出现条带”,那么至少说明一个问题,EGFP正确表达了(对应了你说的观测到荧光),并且EGFP和你的蛋白一起表达了。至于出现单体,很正常,只是蛋白裂解而已。
综合两个实验结果来看,有两个可能:
第一,是第一次实验的结果是可信的,即PCR和Western确实没有检测到你的目的蛋白,那么说明你连接进质粒的这段基因有问题。但是你说过你的引物是测过序列的是正确的。因此基本可以排除这个情况了。
第二,或者是你的第一次实验结果不可信,你的目的蛋白表达了,但提取mRNA失败了?反转录失败了?PCR引物拿错了?蛋白抗体坏了(这个也是比较可能的情况)?——所以PCR和Western没有结果。
建议换个公司买你的目标蛋白的抗体试试western。
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转染效率太低了,貌似这个载体是个满病毒载体,考虑包装病毒颗粒。或者再293t细胞检测你的重组载体的表达效率,确定没问题后,再转到你实验细胞中继续