考马斯亮蓝染色 一 产品简介: 本考马斯亮蓝染色试剂盒(Commassie Blue Staining Kit)采用了最经典的考马斯亮蓝染色 和脱色方法,以考马斯亮蓝 R250 为染料,可用于 SDS-PAGE 或非变性 PAGE 等蛋白电泳凝 胶的常规染色和脱色,或 Western 转膜后 PAGE 胶上残余蛋白的检测。 使用本试剂盒,采用常规染色脱色方法累计时间达到 2-3 小时后可以观察到蛋白条带; 采用快速染色脱色方法 20 分钟左右即可观察到蛋白条带。观察到最清晰的蛋白条带则需染 色脱色更长时间。 本试剂盒中的染色液和脱色液经过改良,不含有毒的甲醇,但含有刺激性气味的乙酸。 二 保存条件:室温保存,至少一年有效。 注意事项: 可以使用枪头盒或适当大小的培养皿作为染色和脱色的容器。 本染色液呈酸性,有轻微腐蚀性,使用时请作必要防护。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 三 使用说明: 1. 常规染色脱色方法: a. 电泳结束后,取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中,确保染色液可以充分覆盖凝胶。 b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动,室温染色 1 小时或更长时间。 注:具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚,温度较低,则染色时间 宜适当延长。凝胶较薄,温度较高,则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染 色液的颜色非常接近,在染色液中几乎看不清凝胶时,可以认为已染色充分。染色 2-4 个小 时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少 2-3 次。 d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液,确保脱色液可以充分覆盖凝胶。 e. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动,室温脱色 4-24 小时。期间更换脱色液 2-4 次,直 至蓝色背景基本上全部被脱去,并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色 1-2 小时后即可出现。 注: 脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸, 可以使部分染料吸附在吸水纸上, 加快脱色。 脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。 f. 完成脱色后,可以把凝胶保存在水中,用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶 涨。如需避免溶涨,可以把胶保 存在含 20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。 2. 快速染色脱色方法: a. 电泳结束后,取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中,微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾, 立即停止加热。通常对于胶浓度大于 10%的胶比较坚韧,在发生煮沸时不易破损;对于胶 浓度小于 10%的胶,宜尽量避免煮沸,以免出现胶碎裂的情况。 b. 随后在染色液温度较高的情况下,在室温摇床上摇动 5-10 分钟。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少 2-3 次。 d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液,确保染色液可以充分覆盖凝胶。 e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾,立即停止加热。 f. 随后在脱色液温度较高的情况下,在摇床上摇动 5-10 分钟。此时通常可以观察到比较清 楚的蛋白条带。 g. 更换新鲜的脱色液,重复步骤 e 和步骤 f,直至蓝色背景基本上全部被脱去,蛋白条带染 色效果达到预期。 h. 完成脱色后,可以把凝胶保存在水中,用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶 涨。如需避免溶涨,可以把胶保 存在含 20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。 四 常见问题: 1. 常规染色脱色方法和快速染色脱色方法的优缺点? 常规染色脱色方法耗时较长,但检测灵敏度更高,染色效果更加稳定。快速染色脱色方法通 常检测灵敏度略低, 并且在微波炉加热的过程中有时会出现暴沸导致凝胶碎裂的情况, 需特 别注意。 另外微波炉加热导致的高温会引起染色液和脱色液中的乙酸的挥发, 最好能在通风 橱中进行。 附: 考马斯亮蓝 R250(Coomassie brilliant blue R250) :别名考马斯灿烂蓝、弱酸性艳蓝 6B、 考马斯亮兰 R250、酸性蓝 83、考马斯亮蓝 R,室温保存。分子式:C45H44O7H3S2Na, MW=825.99。 化学性质:不溶于冷水,微溶于热水呈艳红色蓝光,微溶于乙醇呈艳蓝色。遇浓硫酸呈 橙红色。其水溶液加氢氧化钠呈紫色。 R250 中的 R 代表 Red,偏红,R250 属于慢染,染色浓度为 65%,但脱色脱的完全,故 主要用于电泳条带染色。 λmax=560―590nm,染色灵敏度比氨基黑高 5 倍。尤其适用于 SDS 电泳微量蛋白质染色, 但蛋白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白的染色不符合 Beer 定律, 用作定量分析时要注意。 考马斯亮蓝 G250,又名 Xylene brilliant cyaninG。比考马斯亮蓝 R250 多二个甲基, MW=854,λmax=590―610nm。G250 具有红色和蓝色两种色调,在酸性溶液中,其以游离 态存在呈棕红色;当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。染色灵敏度不如 R250,但 比氨基黑高 3 倍。 优点:反应速度快,约在 2 分钟左右达到平衡,在室温一小时内稳定;在三氯乙酸中不 溶而成胶体, 能选择性地染色蛋白质而几乎无本底色。 所以常用于需要重复性好和稳定的染 色,适于作定量分析,在 0.01~1.0mg 蛋白质范围内,蛋白质浓度与 A595nm 值成正比。