实验五 血液中谷丙转氨酶活力的测定 【目的和要求】 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义, 学习转氨酶活力测定的原理和方法。 【原理】 生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶, 能催化α -氨基酸的α -氨基与α -酮基酸的α -酮基互换, 在氨基酸的合成和分解、 尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。 转氨酶的最适 pH 接近 7.4, 它的种类甚多, 其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶) 和谷氨酸-丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶) 的活力最强。 它们催化的反应如下。 正常人血清中只含有少量转氨酶。 当发生肝炎, 心肌梗死等病患时, 血清中转氨酶活力常显著增加, 所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 测定转氨酶活力的方法很多, 本实验采用分光光度法。 谷丙转氨酶作用于丙氨酸α -酮戊二酸后, 生成的丙酮酸与 2, 4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸 2, 4-二硝基苯腙。 丙酮酸 2, 4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色, 可用分光光度法测定。 从丙酮酸 2, 4-二硝基苯腙的生成量, 可计算酶的活力。 【操作方法】 1. 标准曲线的给制: 取 6 支试管, 分别标上 0, 1, 2, 3, 4, 5 六个号。 按下表所列的次序添加各试剂。 试 管 号 2 试剂(ml) 0 1 3 4 5 丙酮酸钠标准液 - 0. 05 0. 10 0. 15 0. 20 0. 25 谷丙转氨酶底物 0. 50 0. 45 0. 40 0. 35 0. 30 0. 25 磷酸缓冲液 (0. 1mol/L, pH7. 4) 0. 10 0. 10 0. 10 0. 10 0. 10 0. 10 2, 4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。 底物中的α -酮戊二酸与2, 4-二硝基苯肼反应, 生成α -酮戊二酸苯腙。 因此, 在制作标准曲线时, 须加入一定量的底物, (内含α -酮戊二酸) 以抵消由α -酮戊二酸产生的消光影响。 先将试管置于 37℃恒温水浴中保温 10min 以平衡内外温度。 向各管内加入0. 5ml2, 4-二硝基苯肼溶液后再保温 20min, 最后, 分别向各管内加入 0. 4mol/L氢氧化钠溶液 5ml。 在室温下静置 30min, 以 0 号管作空白, 测定 520nm 的光吸收值。 用丙酮酸的微摩尔数为横坐标, 光吸收