关于内参基因的选择很多初级的实验人员很少会去思考这个问题,因为摆在面前的只有两种选择,β-actin和GAPDH,甚至在很多人长期的观念中对于内参的认知也仅仅停留在是一个表达量相对较高较稳定的看家基因,对于分子层面相对表达量的一个重要参照而已,至于为什么要选这两种,还有没有其他的内参,人们的回答往往是“Sorry,I don’t care.”或者“我的前辈就是这样用的,别的文献是这样写的,有问题吗?”。
有问题吗?BioTNT要在这里大声的疾呼“有,而且是很大的问题。”
当人们检测某个基因的表达降低或者提高得出结果以后,你并不知道是它本身的表达量发生变化,还是因为样本量大小或者操作导致RNA的损失等其他原因导致的表达量变化,所以这个时候需要同时检测另外的基因作为参照。这另外的基因就是内参基因。
于是,从我们本身科学的要求来看,理想的内参就会有这样几个条件,1、表达量较大;2、稳定表达于不同类型的细胞和组织;3、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关;4、不受任何内源性或外源性因素的影响;5、不存在假基因,以避免基因组 DNA的污染扩增。请注意这是理想的内参,让我们来一个一个看看我们常见的经典内参是不是真的够理想呢?
第一,是β-actin,即β肌动蛋白。我们先要来看看actin是什么,所谓的actin肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白,大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,包括α-skeletal(骨骼)、cardiac(心)、smooth(平滑)muscle actin和γ-smooth muscle actin,其余两种广泛分布于各种组织中,包括β- actin和γ-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的,在肌肉组织中的beta-actin分布就很少,心肌主要是α-cardiac muscle actin。显而易见,如果我的研究模型是心或者是骨骼,β-actin作为内参显然就不合适。有研究表明,当细胞向恶性转化时,β-actin的mRNA的表达水平增加,很明显这与肿瘤细胞易增殖,会迁移的特性从理论上也对的起来,BioTNT在平时接触以肿瘤组织为样本的实验中,虽然已经控制了组织湿重,但是正常组和肿瘤组间的β-actin的表达差异还是相当大的,这又进一步限制了β-actin的适用范围,另外β-actin也