【本研究切入点】腹水病是近年来广西斑点叉尾鮰养殖过程中常见可导致大量死亡的疾病,给养殖户造成重大经济损失。除了钟妮娜等(2002)、曹良和李英伦(2009)曾对斑点叉尾鮰腹水症的病原进行分离及体外中药药敏试验外,至今国内未见其他有关斑点叉尾鮰腹水 症的研究报道。【拟解决的关键问题】通过对广西龙州某养殖场患腹水病的斑点叉尾鮰进行病原菌分离鉴定及药敏试验,旨在找出斑点叉尾鮰腹水病的发病原因,为生产中有效防控该病提供参考。 1 1 材料与方法 1.1 试验材料 患病斑点叉尾鮰为广西龙州某养殖基地濒临死亡、症状典型的个体,平均体重13.67 g。健康斑点叉尾鮰购自南宁市苗种市场,实验室暂养15 d确认健康无病后用于回归感染试验。普通营养琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司,兔血琼脂培养基是在普通营养琼脂培养基中加入无菌兔血制成,所有培养基均经无菌检验合格后4℃保存备用。TaqDNA聚合酶、10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自北京天根生化科技(北京)有限公司;琼脂糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司;API 20NE细菌鉴定系统购自法国梅里埃公司;药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。 1.2 病料剖检 将病鱼编号后分别以肉眼观察和镜检方式,检查其体表、鳃、肝脏、肾脏、脾脏、肠道、胆囊等组织器官的病理变化和寄生虫感染情况。 1.3 病原菌分离纯化 取具有典型发病症状的濒死斑点叉尾鮰,用常规方法从其心脏、肝脏和腹水中取样划线接种普通营养琼脂培养基,37℃培养24 h后,挑取形态特征一致的优势菌落进行纯化培养,并转接到斜面普通营养琼脂培养基保存备用。取纯化的分离菌株接种兔血琼脂培养基,37℃培养24 h后观察菌株有无溶血性。分离菌株经革兰氏染色后,显微镜下观察其形态特征。 1.4 人工感染试验 1.4.1 无菌滤液人工感染试验 在分离病原菌的同时,将病鱼的心脏、肝脏、脾脏和肾脏等组织剪碎、匀浆,10000 r/min离心20 min后取上清,经0.22 μm微孔细菌滤器过滤除菌即获得无菌滤液。以无菌滤液进行培养基平板涂布,37℃培养24 h,检验滤液是否无菌。取健康斑点叉尾鮰腹腔注射无菌滤液(0.2 mL/尾),对照组注射等量无菌PBS,试验组和对照组各注射10尾,然后分别在不同水簇箱内饲养观察15 d(黄钧等,2012b)。 1.