1.关于凝胶的一些问题
胶的凝结不好,例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下,在分离胶的下部有波浪样的花纹,凝胶不均匀。解决方法:加大TEMED和过硫酸胺的量,使其凝结速度加快。同时洗干净玻璃板,防止有残留的胶干结在玻璃板上。
胶不凝,解决方法:温度较低时加大TEMED和过硫酸胺的量,过硫酸胺必须新鲜配制。如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。
胶易碎,例如浓度较高的胶在染色和脱色过程以及扫描过程中破裂。解决方法:首先在上述过程中一定要动作轻缓,其次在室温较高的情况下可以适当减少TEMED和过硫酸胺的量。
电泳完后胶上有很多长条纹的杂带,解决方法:建议电泳缓冲液不要回收利用。配制胶的溶液一定要纯。
2.凝胶时间不对
通常胶在30分钟到1小时内凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,AP剂量不够。 如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。
3.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳的影响
前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的,一般对电泳结果不会有太大的影响。
4.样品的处理
根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,形成SDS与蛋白相结合的分子。
带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止纹理现象的产生。100uL样品缓冲液中加入10uL20%的碘乙酸胺,并在25℃下保藏30min。
非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。
5.如何提高SDS-PAGE电泳分辨率
使聚丙烯酰胺的充分聚合,可以提高凝胶的分辨率。
建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。
6.条带两边向下中间鼓起的原因
一般原因是两板之间的底部间隙气泡未排除干净,或聚合不完全。
处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。
7.条带偏斜
原因:电极不平衡或者加样位置偏斜。
8.条带两边扩散
原因:加样量过多。
浓缩胶长度不够
9.电泳的条带过粗
电泳中条带很粗是常见的事,主要是浓缩胶的原因。
处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确;适当降低电压。
10.目的蛋白质条带模糊
电泳凝胶浓度选择不当。
低于10Kd的小分子蛋白质要用Tricine胶。
靠近前沿的电泳带分辨率不佳。根据分子量与凝胶孔径的关系,选择适当浓度的凝胶。
蛋白质样品水解。注意除去蛋白质样品的内源性的水解酶,不要反复冻融。
电泳时间过长或过短。溴酚蓝达到分离胶的底部即应该关闭电泳电源。
缓冲溶液、SDS都要新鲜配制。
避免加样过多,提高分辨率。小体积样品可给出窄带,加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15uL(即2-10ug蛋白质)。
加热变性后的蛋白质样品要放置到室温即电泳,不要久放,因为蛋白质的二硫键在高温下可能是会断开,但是暴露于空气中温度降低会重新形成二硫键,而且可能在过久放置过程中蛋白质可能会再折叠,更不要扔到冰箱里保存。
11.电泳时间比正常要长
可能是因为凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。
12.拖尾现象
主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。
13.纹理现象
主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。
14.溴酚蓝不能起到指示作用
我们在实验中有时会出现溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。
主要原因:缓冲液和分离胶的浓度过高。
处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。
15.甘氨酸在电极缓冲液中的作用
SDS-PAGE中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸,电泳开始后,HCL解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成以稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。
16.电泳电压很高但电流很低
现象:电压50v以上,可电流却在5mA以下。
主要原因:电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:内外槽装反;外槽液过少等。
处理办法:正确装配电泳槽即可。
17.条带两边翘起中间凹下的原因
在较厚的凝胶中,由于凝胶不均匀冷却,中间部分凝固不好。
原因:电泳系统温度偏高。
处理办法:待其充分凝固再作后续实验。
18.“鬼带”的出现及处理
“鬼带”就是在跑构象复杂的蛋白质大分子时,在泳道顶端出现一些未知条带或在加样孔底部生成沉淀,这主要是因为还原剂在加热的过程中被氧化失活,使解离的蛋白质分子重新折叠和亚基重新缔合,由于其分子量通常要比目标条带大,所以会生成未知条带或沉淀。
处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
19.配胶缓冲液系统在电泳中的影响
缓冲液在电泳过程中的主要作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应,正极发生的是氧化反应,负极发生的是还原反应,长时间的电泳将使正极变酸,负极变碱。缓冲液可以维持溶液两极的pH保持基本不变。在浓缩胶中,pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动并聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。