HPV难以建立动物模型,难　以通过传统疫苗的方法体外培养获得病毒颗粒。HPV疫苗开发面临的问题实质是:基因　重组表达、生物发酵、产物纯化的问题,以及如何放大化、低成本生产等等问题。　从技术节点上:基因序列的选择、表达系统的选择、纯化工艺等等都需要一步一　行业深度报告　P15　报告标题　步研究探索。HPV疫苗的稳定性与蛋白序列、表达系统、VLPs结构、纯化工艺等都有直　接的关系。　总结下来,大概分为两大关键步骤:　一、制备类病毒颗粒(VLPs)　;　二、如何实现产业化、规模化生产,以及降低成本?如何提高单位重组细胞表达　的抗原蛋白量以及如何提高细胞发酵密度,降低疫苗生产成本?　1.1、制备类病毒颗粒(VLPs)是HPV疫苗研发的基础　HPVL1蛋白能自我组装成病毒样颗粒,是宫颈癌预防疫苗理想的靶蛋白,但HPVL1　蛋白只有正确的折叠为类病毒样颗粒才具有生物学活性,因此必须选择一个合适的表　达系统生产。原核表达系统,　酿酒酵母和昆虫细胞都能够组装出病毒样颗粒。但每种　表达体系制备类病毒颗粒都有痛点需要解决,成功开发出HPV疫苗,需要逐一解决以上　痛点。　1)原核表达体系痛点:后期的体外复性过程复杂,这是原核表达体系技术的主要　瓶颈。　原核系统虽然表达量很高,但往往容易形成包涵体,不能自我组装成类病毒颗粒　(VLPs)　,需要经过复杂的变性和复性,才能恢复蛋白质的高级结构,不适合工业化生产。　后期的体外复性过程复杂,这也是发展原核表达体系技术的主要瓶颈。使用该表达体　系进行HPV疫苗研发的关键就是要有先进的蛋白表达和复性工艺。例如康乐士L1蛋白以　融合蛋白的方式表达,经过处理,用于解决他人未能解决的L1可溶性问题。　其次原核表达体系缺点是蛋白提取液中内毒素含量高,进而造成后期分离纯化比　较困难。但原核表达系统具有生产周期短、成本低廉、工艺简单等优势。　2)酿酒酵母:部分亚型颗粒形态与天然状态的病毒形态相比,在尺寸上偏小,需　要经过解聚和重聚成大颗粒。　HPV病毒的衣壳蛋白在该表达系统中都能形成VLPs。在一些HPV亚型主要衣壳蛋白　L1的表达中,酿酒酵母细胞均可以将这种蛋白装配成类似病毒颗粒的形态,但除HPV18　型外,这种颗粒形态与天然状态的病毒形态相比,在尺寸上偏小,在稳定性方面比经　过解聚和重聚的大颗粒差一些,所以需将将这种颗粒进行了体外还原性解聚和重聚。　3)毕赤