根据需 要可设置产物的大小,Tm 特异性(Specificity)在specificity check 区,选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较 重要的。这里提供了4种数据库:RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), standardnon-redundant database)。前两个数 据库是经过专家注释的数据,这样可以给出更准确的结果。特别是,当你用NCBI 的参考序 列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时,Primer-BLAST 可以设计出只扩增某 一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种: human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, rice。Nr数据库覆盖NCBI 所有的物种。 2.验证引物自身的特性 建议oligo6和primer5结合使用 在primer5.0里面,把你的基因序列粘上,在弹出窗口上选primer,点左上s 是选正义,点edit primer,把你的正义引物序列粘上,点primer,就能找到你的引物在整个序列上的位置, 如上再点a 找反义的位置,找好后弹出窗口中rating 代表评分,下面的几栏,分别是发夹 结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体,found 如为红色就是有这些东西,你看一下 严不严重,尤其不能出现在3´端,G 的绝对值越小越好。