(一)溶液配制注意事项 1.药品要有较好的质量 试剂分为优级纯(保证试剂, Guaranteed reagent, R.、 G. )分析试剂 (Antalytical reagent, R. A. ) 化学纯(Chemical pure,C.P. )和实验试剂(Laboratory reagent, L.R. )等等。工业用的化学试剂,杂质较多,只在个别情况下应用, 如配洗液用的硫酸、配干燥剂的氯化钙等。 2.药品称量要精确。 3.配制试剂用水应用新鲜的去离子水或双蒸馏水,比电阻值在 50 万 欧姆以上,pH 在 5.5~7.0 之间才可应用,在组织培养等特殊用途时 应注意此项要求,配制一般化验用溶液只要求用双蒸馏水或去离子 水。 4.配好后的溶液,应立即除菌处理(如高压灭菌、抽滤或加抑菌物 质) ,以防杂菌生长。 (二)0.067(1/15)Mol/L 磷酸缓冲液 1. 1/15Mol/L 磷酸二氢钾溶液的配制: 称取磷酸二氢钾 (KH2PO4, R. A. ) 9.08g,用蒸馏水溶解后,倾入 1 000ml 容量瓶内,再稀释至刻度 (1 000ml) 。 2 . 1 /15Mol/L 磷 酸 二 氢 钠 溶 液 的 配 制 : 称 取 无 水 磷 酸 氢 二 钠 (Na2HPO4,A.R.)9.47g(或者 Na2HPO4·2H2O 11.87g)用蒸馏水 溶解后, 放入 1 000ml 容量瓶内, 再加蒸馏水稀释至刻度 (1 000ml) 。 3.按附表的比例,配制成不同 pH 值的缓冲溶液。 附表 1 磷酸盐缓冲液配制法(单位:毫升) pH 1/15Mol/L Na2HPO4 1/15Mol/L KH2PO4 pH 1/15Mol/L Na2HPO4 1/15Mol/L KH2PO4 5.8 8.0 92.0 7.1 66.6 23.4 5.9 9.9 90.1 7.2 72.0 28.0 6.0 12.2 87.8 7.3 76.8 23.2 6.1 15.3 84.7 7.3 80.8 19.2 6.2 18.6 81.4 7.5 84.1 15.9 6.3 22.4 77.6 7.6 87.0 13.0 6.4 26.7 73.3 7.7 89.4 10.6 6.5 31.8 68.2 7.8 91.5 8.5 6.6 37.5 62.5 7.9 93.2 6.8 6.7 43.5 56.5 8.8 94.7 5.3 6.8 49.6 50.4 8.1 95.8 4.2 6.9 55.4 44.6 8.2 97.0 3.0 7.0 61.1 38.9 8.4 98.0 2.0 (三)0.15Mol/L PB 液 附表 2 0.15Mol/LPB 液配制法 pH 0.15Mol/L Na2HPO4(ml) 0.15Mol/L NaH2PO4(ml) 6.4 26.5 73.5 6.6 37.5 62.5 6.8 49.0 51.0 7.0 61.0 39.0 7.2 72.0 28.0 7.4 81.0 19.0 7.6 87.0 13.0 Na2HPO4·2H2O 分子量=175.05 0.15Mol/L 溶液含 26.7g/L。 Na2HPO4·12H2O 分子量=358.22 0.15Mol/L 溶液含 53.7g/L。 NaH2PO4·H2O 分子量=138.00 NaH2PO4·2H2O 分子量=156.03 (四)0.2Mol/L PB 缓冲液 附表 3 0.2mol/L PB 缓冲液配制法 pH 0.2 Mol/L Na2HPO4(ml) 0.2Mol/L NaH2PO4(ml) 5.8 8.0 92.0 6.0 12.3 87.7 6.2 18.5 81.5 6.4 26.5 73.5 6.6 37.5 62.5 6.8 49.0 51.0 7.0 61.0 39.0 7.2 72.0 28.0 7.4 81.0 19.0 7.6 87.0 13.0 0.15Mol/L 溶液含 20.7g/L。 0.15Mol/L 溶液含 23.4g/L。 7.8 91.5 8.5 8.0 94.7 5.3 0.2Mol/L Na2HPO4·2 H2O 溶液 35.61g/L Na2HPO4·12 H2O 溶液含 71.64g/L 0.2Mol/LNaH2PO4·H2O 溶液含 27.60g/L NaH2PO4·2 H2O 溶液含 31.21g/L 欲配 0.1Mol/L PB 缓冲液则在 0.2Mol/L PB 缓冲液的基础上加 H2O 稀 释 1 倍即可。欲配制 PBS 液时,则在溶液中加 0.85%的 NaCl 溶液即 可。 (五)无钙镁离子磷酸缓冲盐水(PBS) (0.15Mol/L PH 7.2) NaCl KCl Na2HPO4 8.0g 0.2g 1.15g (如为 Na2HPO4·12H2O,则为 2.89g) KH2PO4 0.2g 将上述试剂依次溶于 1 000ml 去离子水中,完全溶解后,115℃高压 灭菌 10min~15min,存在 4℃冰箱中备用。此液可用于配制和稀释细 胞分散剂以及洗涤细胞培养物。 (六)硼酸盐缓冲液(Borate saline buffer) 文章来自: 医药 园 (http://www.biodrug.cn) 1.硼酸(H3BO3) 整理:zfg 0.2Mol/L 硼酸:硼酸 12.37g 加水至 1 000ml。 2.硼砂(Na2B4O7) 0.05Mol/L 硼砂:硼砂 19.07g 加水至 1 000ml。 附表 4 不同 pH 的 0.2Mol/L 硼酸缓冲液配制法 pH 0.05Mol/L 硼砂(ml) 0.2Mol/L 硼酸(ml) pH 0.05Mol/L 硼砂 (ml) 0.2Mol/L 硼酸(ml) 7.4 1.0 9.0 8.2 3.5 6.5 7.6 1.5 8.5 8.4 4.5 5.5 7.8 2.0 8.0 8.7 6.0 4.0 8.0 3.0 7.0 9.0 8.0 2.0 (七)巴比妥缓冲液 1.pH8.2 离子强度 0.05Mol/L 巴比妥缓冲液 巴比妥钠 蒸馏水 1.17N HCl 47.6g 3 000ml 55.0ml (1.17 N HCl=193ml 浓 HCl 加 1 807ml 蒸馏水) ⑴ 将 4.76g 巴比妥钠溶于 3 000ml 蒸馏水。 ⑵ 加 1.17 N HCl 55ml。 ⑶ 用 HCl 调节 pH 到 8.2,并加蒸馏水至 4 265ml。 2.pH8.4 0.06Mol/L 巴比妥缓冲液 巴比妥 巴比妥钠 加蒸馏水至 1.84g 10.30g 1 000.00ml 3.pH8.6 0.06Mol/L 巴比妥缓冲液 巴比妥 巴比妥钠 加蒸馏水 (八)0.2Mol/L 醋酸盐缓冲液 1.66g 12.76g 1 000.00ml 见表附表 5 附表 5 0.2Mol/L 醋酸盐缓冲液配制法 pH 0.2Mol/L Tris(ml) 0.1Mol/L HCl(ml) pH 0.2Mol/L Tris(ml) 0.1Mol/L HCl(ml) 23℃ 37℃ 23℃ 37℃ 9.10 8.95 25 5 8.06 7.90 25 27.5 8.92 8.76 25 7.5 7.96 7.82 25 30.0 8.75 8.60 25 10.5 7.87 7.73 25 32.5 8.62 8.48 25 12.5 7.77 7.63 25 35.0 8.50 8.37 25 15.5 7.66 7.52 25 37.5 8.40 8.27 25 17.5 7.54 7.40 25 40.0 8.32 8.18 25 20.0 7.36 7.22 25 42.5 (九)三羟甲基甲烷—盐酸缓冲液(Tris—HCl 缓冲液) 不同 pH,0.05Mol/L 25ml0.2Mol/L 三羟甲基氨基甲烷加 х ml0.1NHCl,加水稀释至 100ml (见下表) 附表 6 Tris—HCl 缓冲液配制法 pH 0.2Mol/L Tris(ml) 0.1NHCl (ml) pH 0.2Mol/L Tris(ml) 0.1NHCl (ml) 23℃ 37℃ 23℃ 37℃ 9.10 8.96 25 5 8.05 7.90 25 27.5 8.92 8.78 25 7.5 7.96 7.82 25 30.0 8.74 8.60 25 10.0 7.87 7.73 25 32.5 8.62 8.48 25 12.5 7.77 7.63 25 35.0 8.50 8.37 25 15.0 7.66 7.52 25 37.5 8.40 8.27 25 17.5 7.54 7.40 25 40.0 8.32 8.18 25 20.0 7.36 7.22 25 42.5 8.23 8.10 25 22.5 7.20 7.05 25 45.0 8.14 8.00 25 25.0 25 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 分子量=121.14 0.2Mol/L 三羟甲基氨基甲烷:Tris24.23g,加水至 1 000ml。 0.1NHCl:取 HCl8.6ml,加水至 1 000ml。 (十)0.5Mol/L pH9.5 碳酸盐缓冲液 NaHCO3 Na2CO3 3.70g 0.60g 溶于 600.00ml 蒸馏水中即得。 不用时塞紧瓶塞,以免吸收空气中二氧化碳使 PH 下降。最好小量配 制。 (十一)甘油磷酸缓冲液 1.配制 pH8.0 磷酸缓冲液 0.1Mol/L Na2HPO4 0.1N NaH2PO4 混合即可 2.9 份甘油与 1 份 pH8.0 磷酸缓冲液混合,即为甘油磷酸缓冲液。 用途:用于免疫荧光试验。 (十二)Hank’s 液 1.贮存液 NaCl KCl 80.00g 4.00g 94.50ml 5.50ml Na2HPO4·12 H2O KH2PO4 葡萄糖 0.4%酚红液 双馏水加至 1.52g 0.60g 4.00g 50.00ml 100.00ml 115℃高压灭菌 15min,冰冻保存。 2.工作液 贮存液 双馏水 1份 9份 115℃高压灭菌 15min。临用时用灭菌的 5.6%NaHCO3 液调 pH 值至 7.2 左右(溶液呈橙红色) 。 (十三)萘(钠)氏试剂(Nessler’s reagent) 配方 1:氯化汞 碘化钾 20%NaOH 加蒸馏水至 配方 2:碘化汞 碘化钾 蒸馏水 6.0g 12.4g 30ml 100ml 11.5g 8g 50ml (完全溶解后)过滤,加 20%NaOH 50ml。 用途:检测溶液中氨离子。 (十四)阿氏(Alsever’s)液 葡萄糖 柠檬酸钠 氯化钠 蒸馏水 2.05g 0.80g 0.42g 100ml 溶解后,以 10%柠檬酸调节 pH 至 6.1,过滤,分装,10 磅 10min 灭菌,4℃保存。 (十五)青、链霉素混合液(简称 S.P.液或双抗液) 青霉素(40 万 U) 5支 链霉素(200 万 μ g) 1 支 分别溶于 100ml 灭菌无离子水中或共同溶于 200ml 灭菌无离子水 中,混合后分装小瓶,置 -10℃~-20℃冰箱保存备用(1 万单位 μ g/ml) 。 临用时,按 1%的量加入营养液或其他溶液中,最后浓度是青霉素 100U/ml,链霉素 100ug/ml。 (十六)洗液(清洁液) 配方 1:重铬酸钾 蒸馏水 浓硫酸 150g 300ml 3 000ml 将重铬酸钾加入蒸馏水中,使之自然溶解或水浴溶解,亦可在大坩埚 中加热溶解, 然后慢慢加入浓硫酸, 边加边搅拌, 见发热过剧则稍停, 冷却后再继续加。此为强洗液。 盛清洁液的容器要坚固,上加厚玻璃盖,操作时要穿橡皮围裙、长统 胶靴、戴上眼镜和厚胶皮手套,以保安全。 洗液一旦变绿,表示铬酸已经还原,失去了氧化能力,不宜再用。如 将这样洗液加热,再加适量重铬酸钾,又可重新使用。 配方 2:浓硫酸 蒸馏水 重铬酸钾 此为中等强度洗液。 配方 3:重铬酸钾 蒸馏水 100g 1 000ml 50% 50% 5% 加热溶解,冷却后缓慢加入 工业硫酸 100ml 此液为弱洗液,为棕红色。使用此液时,必须预先用热肥皂水将玻璃 器皿洗净,经自来水冲洗,沥干然后才能浸入,否则该洗液很快失效 缓冲溶液(英文:buffer solution)是一种能在加入少量酸或 碱和水时大大减低 pH 变动的溶液。 缓冲系统对维持生物的正常 pH pH 值和正常生理环境起到重要作用。多数细胞仅能在很窄的 pH 范围内 进行活动, 而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的 pH 变化。 在生物体中有三种主要的 pH 缓冲体系,它们是蛋白质缓冲系统、重 碳酸盐缓冲系统以及磷酸盐缓冲系统。 每种缓冲体系所占的分量在各 类细胞和器官中是不同的。 在生化研究工作中, 常常需要使用缓冲溶液来维持实验体系的酸 碱度。研究工作的溶液体系 pH 值的变化往往直接影响到研究工作的 成效。如果“提取酶”实验体系的 pH 值变动或大幅度变动,酶活性 就会下降甚至完全丧失。 所以配制缓冲溶液是一个不可或缺的关键步 骤。 [编辑本段] 常用作缓冲溶液 常用作缓冲溶液的酸类由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液具有 缓冲作用。生化实验室常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋 酸、巴比妥酸、Tris(三羟甲基氨基甲烷)等系统,生化实验或研究 工作中要慎重地选择缓冲体系, 因为有时影响实验结果的因素并不是 缓冲液的 pH 值,而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、 磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的化学反应。 硼酸盐:硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。 柠檬酸盐:柠檬酸盐离子容易与钙结合,所以存在有钙离子的情 况下不能使用。 磷酸盐:在有些实验,它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物,重 金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。 而且它在 pH7.5 以上时缓 冲能力很小。 三羟甲基氨基甲烷:它可以和重金属一起作用,但在有些系统中 也起抑制作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视,在室温 pH 是 7.8 的 Tris 缓冲液,4℃时是 8.4,37℃时是 7.4,因此,4℃ 配制的缓冲液在 37℃进行测量时,其氢离子浓度就增加了 10 倍。在 pH7.5 以下,其缓冲能力极为不理想。 [编辑本段] 缓冲溶液组成 缓冲体系由 1、弱酸和它的盐(如 HAc---NaAc) 2、弱碱和它的盐(NH3.H2O---NH4Cl) 3、 多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐 (如 NaH2PO4---Na2HPO4) 的水溶液组成。 [编辑本段] 决定缓冲液 pH 值的因素 设缓冲系统的弱酸的电离常数为 K(平衡常数) ,平衡时弱酸的 浓度为[酸], 弱酸盐的浓度为[盐], 则由弱酸的电离平衡式可得下式: [H+] = Ka {[弱酸]/[共轭碱]} pH = pKa + log {[共轭碱]/[弱酸]} 这就是 Henderson-Hasselbach 等式。 如果[弱酸] = [共轭碱], pH = pKa 根据此式可得出下列几点结论: 1 缓冲液的 pH 值与该酸的电离平衡常数 K 及盐和酸的浓度有关。 弱酸的 pH 值衡定,但酸和盐的比例不同时,就会得到不同的 pH 值。 酸和盐浓度相等时,溶液的 pH 值与 PK 值相同。 2 酸和盐浓度等比例增减时,溶液的 pH 值不便。 3 酸和盐浓度相等时, 缓冲液的缓冲效率为最高, 比例相差越大, 缓冲效率越低,缓冲液的一般有效缓冲范围为 PK±1pH。 [编辑本段] 缓冲溶液的配制 只要知道缓冲对的 PK 值,和要配制的缓冲液的 pH 值(及要求的 缓冲液总浓度) ,就能按公式计算[盐]和[酸]的量。这个算法涉及对 数换算,较麻烦,前人为减少后人的计算麻烦,已为我们总结出 pH 值与缓冲液对离子用量的关系列出了表格。 只要我们知道要配制的缓 冲液的 pH,经查表便可计算处所用缓冲剂的比例和用量。例如配制 500nmpH5.8 浓度为 0.1M 磷酸缓冲液。 经 查 表 知 pH5.8 浓 度 为 0.2M Na2HPO48.0 毫 升 , 而 0.2M Na2HPO492.0 毫升。依此可推论出配制 100ml0.1M 的磷酸缓冲液需要 0.1M Na2HPO48.0 毫升,而 0.1M Na2HPO4 需要 92.0 毫升。 计算好后,按计算结果准确称好固态化学成分,放于烧杯中,加 少量蒸馏水溶解,转移入 50ml 容量瓶,加蒸馏水至刻度,摇匀,就 能得到所需的缓冲液。 各种缓冲溶液的配制,均按表格按比例混合,某些试剂,必须标 定配成准确浓度才能进行,如醋酸、氢氧化钠等。另外,所有缓冲溶 剂的配制计量都能从以上的算式准确获得。