来源:　互联网　引物设计完成之后,需要用软件　进行分析,找到最佳的引物对,采用Blast分析验证引物,可以知道序列的正确性,也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及PCR产物的大小。　先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列,可以通过全文(如最先发现该基因的文章),全文中有时可以找到大鼠c-jun　mRNA序列的ACCESSION　NUMBER,在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION　NUMBER就能找到序列。　可以利用这个ACCESSION　NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后,点击右边的“Links”,再点击里面的“Related　Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun　mRNA序列及其他物种　的一些c-jun　mRNA序列。　文献中的引物最好先验证其序列正确,并用软件　分析引物比较好后再采用。通过BLAST验证,既可知道序列是否正确,也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。　如果仅仅是为了验证引物序列是否正确(仅适合于基于完全匹配原则设计的引物),也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide　BLAST　(blastn　)”或“Search　for　short,　nearly　exact　matches”搜索,具体方法为:　1.　打开Blast,点击“Nucleotide-nucleotide　BLAST　(blastn)”或“Search　for　short,　nearly　exact　matches”　2.　等新页面完全显示后,将引物序列直接copy到“Search”框(没有必要将下游引物序列转换成其互补链),下面3种方法都可以(我觉得3种方法的搜索结果没什么区别,没仔细比较过哦!)　(1)直接拷贝上游引物序列,然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面　(2)直接拷贝上游引物序列,在上游引物序列后加一空格,然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面　(3)直接拷贝上游引物序列,换行,然后直接拷贝下游引物序列　注意:记住上、下游引物的长度,如上游引物为19bp、下游引物为18bp,这在查看Blast结果时有用。　3.　点击“BLAST!”,新页面完全出来以后,点击“Format!”。　4.　结果完全出来后,查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因,其他的就不用考虑了。当然,如果下游引物序列所对应的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2个碱基互补,那就可能是19-37或18-37。　如果有,那你的引物序列就是正确的。从文献上查的引物,除了要用Blast验证其序列是否正确外,还是应该用软件　分析分析到底引物好不好。　实例　1、进入网页:　http://www.NCBI　.nlm.nih.gov/BLAST/　2、点击　Search　for　short,　nearly　exact　matches　3、　在search栏中输入引物系列:　注:文献报道ABCG2的引物为　5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;　5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’　(1)　输入方法可先输入上游引物,进行blast程序,同样方法在进行下游引物的blast程序。　这种方法较繁琐,而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列,还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。　(2)　简便的做法是同时输入上下游引物:有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。　A、输入上游引物　空格　输入下游引物　B、输入上游引物　回车　输入下游引物　4、　在options　for　advanced　blasting中:select　from　栏选择　Homo　sapiens【ORGN】,Expect后面的数字改为10　5、在format中:select　from　栏选择Homo　sapiens【ORGN】,Expect后面的数字填上0　10。　6、　点击网页中最下面的“BLAST!”　7、　出现新的网页,点击Format!　8、　等待若干秒之后,出现results　of　BLAST的网页。