六、操作步骤 1、细胞或组织加Trizol后,室温放置5min,使其充分裂解。注:此时 可放入—70长期保持。 2、12,000rpm 离心5min,弃沉淀。 3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置15min。注: 禁用漩涡振荡器,以免基因组DNA断裂. (氯仿为有机溶剂,有效的使有机相和无机相迅速分离.有机相中主要是酚 和蛋白结合,从而使得蛋白和RNA脱离,RNA进入水相) 12,000g离心15min.5、吸取上层水相,至另一离心管中。注:千万不要吸取中间界面;若同 时提取DNA和蛋白质,则保留下层酚相存于4冰箱,若只提RNA,则弃 下层酚相. 6、按0。5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇(沉淀RNA)混匀,室温 放置5-10min。 12,000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底。8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇(沉淀RNA),温和振荡离心管, 悬浮沉淀。 8,000g离心5min,尽量弃上清.Trizol 法提取RNA实验步骤及原理新手详细注释版 10、室温晾干或真空干燥5-10min。 注:RNA样品不要过于干燥,否则很 难溶解. 11、可用50ul O,TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA样品,55-60, 5-10min。注:H O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。(TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成,主要用于溶解核酸,能稳定 储存DNA和RNA。用于酶切反应不能使用SDS) 12、测O.D 值定量RNA 浓度。注:此方法提取 RNA 1.6—1.8之间;产率估计:组织标本:(ug RNA/mg 组织)1-10ug,培 养细胞(ug RNA/10 Cell):5—15ug.注:组织或细胞量过少,可酌情减少 Trizol 用量;组织或细胞用量过多,会 引起DNA对RNA的污染; 高蛋白、脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆或液 氮研磨后须4 12,000g 离心10min 去掉不溶物,再进行下面操作, 若顶层有脂肪物,则也须去掉; 热天提RNA,带手套是必须的,手是RNase的主要来源; 组织块用液氮研磨,效果最好,若没有液氮或电动匀浆器,可用手动匀 浆器代替,此时组织块不宜过大,且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎, 然后再充分研磨。 6.1.2。1 肝脏、肠道、肌肉总RNA提取方法 使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部解剖开,从中取出完 整的肝脏、肠、肌肉等组织,置于离心管后立即放入液氮中; Trizol 法提取RNA实验步骤及原理新手详细注释版 组织在液氮下研磨成粉,取少量至加有1mLTrizol的1。5ml 离心 管中,充分混合后于4,12,000rpm离心15min; 取上清移至新1。5ml 离心管中,加入200ul 氯仿,剧烈震荡直至呈乳 白色,于4,12,000rpm离心15min; 取上清移至新1.5ml 离心管中,加入500ul异丙醇,轻轻颠倒10 次,冰上放置20mins,于4,12,000rpm离心15min; 弃上清,加入1ml75%乙醇(用DEPC水现配现用),于4,120 00rpm离心5min,重复此步骤一次; 弃上清后,室温干燥5-7mins; 加入适量(20-30ul)的DEPC水溶解沉淀65溶解,-20(最好 -80)保存,检测RNA浓度,并电泳检测。 RNA浓度测定和电泳检测取2ul 提取好的RNA溶液,于Nanodrop 2000 Spectroph ptpmeter 测定 RNA浓度及 A260/A280 的相对吸光度,纯净RNA 的A260/A280 应在1。8-2。2 之间。 电泳检测:1%琼脂糖,1ATE缓冲液,90V电泳30min,凝胶成 像系统观察,分析结果。 6.1。2。3 肝脏、肌肉、肠道样品cDNA的合成 反应按照TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit gDNAEraser(Perfect Real Time) 反转录试剂盒说明书 进行,合成cDNA模板。 (残存的)基因组DNA的除去反应,在PCR 管中配置如下缓冲液。 试剂 用量 Trizol 法提取RNA实验步骤及原理新手详细注释版 5gDNA Eraser Buffer 2.0 gDNAEraser 1.0 TotalRNA ulRNase Free dH (gDNA、genomicDNA、基因组DNA:是指有机体在单倍体状态下 的DNA全部含量,是染色体DNA,与质粒等染色体外DNA区别.) X*:根据检测到的RNA浓度来配置; 混合均匀后,室温放置20—30min 反转录反应,在PCR 管中配置如下缓冲液(20ul system),反 应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应 时,先按反应数+1 的量配制Master Mix ,然后再分装到每个反应管 试剂使用量 5PrimeScript Buffer RealTime) ulPrimeScript RT Enzyme Mix RTPrimer Mix 的反应液10.0 ul RNase Free dH 混合均匀后,在PCR仪上进行逆转录反应,反应条件为:37 15 min 85 secTrizol 法提取RNA实验步骤及原理新手详细注释版 然后将得到的cDNA存放于-20冰箱保存待用。