实验八 微生物生理生化试验 一 实验器材 1 菌种 大肠杆菌,普通变形杆菌,金黄色葡萄球菌,产气肠杆菌 2 培养基 尿素琼脂试管,蛋白胨水培养基,葡萄糖蛋白胨水培养基,葡萄糖发 酵管和乳糖发酵管各3支。 3 溶液和试剂 甲基红指示剂,5%?萘酚,乙醚和吲哚试剂 4 仪器和其他用品 接种针 二 目的要求 1 大分子物质水解试验 (1)证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同,从而说明 不同微生物有着不同的酶系统; (2)掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。 2 IMViC试验 了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 3 糖发酵试验 (1)了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中的重要作用。 (2)掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 三 基本原理 1 大分子物质水解试验 微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用,必须依靠产生的 胞外酶将大分子物质分解后,才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶,通 过加水裂解大分子物质为较小化合物,使其能被运输至细胞内。水解过程可通过 底物的变化来证明,如细菌对大分子的淀粉不能直接利用,产生胞外酶(淀粉酶) 将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖),再被细菌吸收利用, 这一过程可以用碘测定不再产生蓝色来证明;水解明胶可观察到明胶被液化;脂 肪水解后产生脂肪酸改变培养基的pH,其中的中性红指示剂使培养基从淡红色变 为深红色。 明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质,在25℃以下可维持凝胶状态,以固体 形式存在,而在25℃以上明胶会液化。有些微生物能产生明胶酶,水解明胶蛋白, 而使明胶液化,甚至在4 ℃仍能保持液化状态。 有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素,石蕊牛奶培养基由脱脂牛 奶和石蕊配制而成,是昏浊的蓝色,酪素水解成氨基酸和肽后,培养基 会变成透明。石蕊牛奶也用于检测乳糖发酵,在酸存在下,石蕊会转变 成粉红色,过量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成),氨基酸的分解会 引起碱性反应,石蕊变为紫色。某些细菌能还原石蕊,使试管底部变为 白色。 尿素酶能分解尿素释放氨。尿素琼脂含有尿素、葡萄糖和酚红,酚 红在pH6.8时为黄色,在培养过程中,产尿素酶的细菌将分解尿素产生 氨,培养基的pH升高,在pH8.4时,指示剂转变为深粉红色。尽管许多 微生物都可以产生尿素酶,但是利用尿素的速度比变形杆菌属的细菌要 慢,因此尿素酶实验被用于从其它非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分 这个属的成员。 2 IMViC(吲哚、甲基红、伏-普和柠檬酸盐)试验 这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌,多用于水的 细菌检查。 吲哚试验是用来检测吲哚的产生,有些细菌产生色氨酸酶,分解蛋 白胨中的色氨酸,产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合, 形成红色的玫瑰吲哚(红色化合物)。但并非所有的微生物都具有分解 色氨酸产生吲哚的能力,因此吲哚试验可作为一个生物化学检测的指标。 大肠杆菌吲哚反应阳性,产气肠杆菌为阴性。 甲基红试验是用来检测有葡萄糖产生的有机酸,如甲酸、乙酸、乳 酸等。当细菌代谢糖产酸时,培养基就会变酸,使加入培养基中的甲基 红由橙黄色(pH6.3)转变为红色(pH4.2),即甲基红反应。利用该 试验可区分大肠杆菌和产气肠杆菌。这两个细菌在培养早期均产生有机 酸,但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4,而产气肠杆菌则转化有 机酸为非酸性末端产物,如乙醇、丙酮酸等,使pH大约升至6。因此, 此时加入甲基红指示剂,呈现黄色。 大肠杆菌为阳性(红色),产气肠杆菌为阴性(黄色)。 伏-普试验用于测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产 物的能力,如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇,此化 合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中 的精氨酸的呱基作用,生成红色化合物,即伏-普试验阳性,不产生红 色化合物为反应阴性。 产气肠杆菌为阳性,大肠杆菌为阴性。 硫化氢试验也是检查肠道细菌的生化试验。硫化氢试验是检测硫化 氢的产生,也是用于肠道细菌检查的常用生化试验。有些细菌能分解含 硫的有机物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢,硫化氢与培 养基中的铅盐或铁盐等形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物,为硫化氢 试验阳性,可用于鉴别细菌。 产气肠杆菌为阳性,大肠杆菌为阴性。 3 糖发酵试验 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上 尤为重要,不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶,因此不同细菌在分解 糖类物质的能力上有很大的差异,有些细菌能分解某种糖产生有机酸 (如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢气、甲烷、二氧化碳等),有 些细菌只产酸不产气。比如,大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸产气, 普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气,不能分解乳糖。糖发酵管含有蛋 白胨、指示剂(溴甲酚紫)和不同的糖类。当发酵产酸时,溴甲酚紫指 示剂可由紫色(pH6.8)转变为黄色(pH5.2)。气体的产生可由发酵管 中有无气泡来证明。 四、操作步骤 (一)大分子物质水解试验 1 明胶水解试验 (1)取3支明胶培养基试管,用记号笔表面各管欲接种的菌名。 (2)用接种针分别穿刺接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。 (3)将接种后的试管置20 ℃培养2-5 d。 (4)观察明胶液化情况。 2 石蕊牛奶试验 (1)取2支石蕊牛奶培养基试管,用记号笔表面各管欲接种的菌名。 (2)用接种针分别穿刺接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。 (3)将接种后的试管置35 ℃培养24-48h。 (4)观察培养基颜色变化。 石蕊在酸性条件下为粉红色,碱性条件下为紫色,而被还原时为白色。 3 尿素试验 (1)取2支尿素培养基试管,用记号笔表面各管欲接种的菌名。 (2)分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌(两种细菌对尿素的分 解速度不同),需要观察2次。 (3)将接种后的试管置35 ℃培养24-48h。 (4)观察培养基颜色变化。 尿素酶存在时为红色,无尿素酶时为黄色。 (二)IMViC试验 1 接种与培养 (1)用接种针将大肠杆菌和产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基 中(硫化氢试验),置37℃培养48 h。 (2)将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基(甲 基红和伏-普试验),置37℃培养48 h。 2 结果观察 (1)硫化氢试验:培养48 h后,观察黑色硫化铅的产生。 (2)甲基红试验:培养48 h后,葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红 试剂2滴,培养基变为红色为阳性,变为黄色为阴性。 (3)伏-普试验:葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲液,然后加入等量 的乙液,用力振荡,置37℃15-30 min,加快反应速度,培养物呈红色 者,为伏-普试验阳性。 (三)糖发酵试验 1 在发酵管上标明所接种的细菌名称。 2 取葡萄糖发酵管3支,分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌,第三支不 接种,作为对照,另取乳糖发酵管3支,同样操作。 3 将接种和对照的发酵管置37 ℃培养24-48h。 4 观察发酵管的颜色和有无气泡。 各试验需接种的菌种: (1)明胶水解试验:枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 20 ℃ 2-5 d (2)石蕊牛奶试验:普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌 35℃ 24-48 h (3)尿素试验:普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌 35℃ 24-48 h (4)糖发酵试验:葡萄糖发酵管和乳糖发酵管: 大肠杆菌、普通变形杆菌 37℃ 24-48 h (5)硫化氢、甲基红(葡萄糖蛋白胨水)和伏-普试验(葡萄糖蛋白胨 水) :大肠杆菌、产气肠杆菌 37℃ 48 h 各试验结果判定: (1)明胶水解试验:明胶液化 (+), 明胶不液化(-) (2)石蕊牛奶试验: 酸性条件下粉红色,碱性条件下紫色,被还原时白色。 (3)尿素试验: 红色为尿素酶阳性,黄色为尿素酶阴性 葡萄球菌分解较慢,普通变形杆菌分解较快 (4)糖发酵试验:产酸为黄色,(+) 普通变形杆菌,分解葡糖产酸产气,不分解乳糖;大肠杆菌分解乳糖和葡糖产 酸产气 (5)硫化氢: 培养基黑色为H2S阳性 大肠杆菌阴性,产气肠杆菌阳性 (6)甲基红:加入甲基红试剂,红色为阳性,黄色为阴性 大肠杆菌阳性,产气肠杆菌阴性 (7)伏-普试验:先加甲液,再加等量乙液,用力振荡, 37℃温箱中保 温15-30 min。