Email:liqing@fmmu.edu.c11 60 n垃nH塔插本中,HER-2基因扩增的情况。结果发现,5例网孤.2蛋白(卅)病例中,2例(40%);33例碰弧.2蛋白(++)病例 中12例(36A%)基因扩增。16例蛋白(+)的病例中,5例(31.2%)为基因扩增阳性。54例病例中,19例(35.2%)基 因扩增。本研究结果显示,基因扩增在HER-2蛋白表达各强度组分布的比较,差异无统计学意义(P>O.05).因此我们 认为采用的IHC作为HER-2检测初筛,FISH对不确定病例(++)进行补充确认的检测方案是必须的。而且,HER-2 IHC (+)或(卅)在条件允许的情况下,也应进行FISH检测,以确定HER.2基因的扩增情况。 关键词:荧光原位杂交,乳腺癌,免疫组织化学 随着分子生物学在医学领域研究的进展,对于影响和控制癌症生长的癌基因和抑癌基因的认识也有了 长足的进步。其中原癌基因HER-2/neu已成为当前研究的熟点之一[1-3]。目前认为居女性癌症发病率之首的 乳腺癌,25%'30%的病例有HER.2基因的扩增和蛋白的表达。大规模研究证实,HER-2阳性的肿瘤预后 不良,其基因扩增与乳腺癌的复发、转移有关,放疗、化疗效果欠佳。目前通过抑制细胞活化信号的传递 而专用于治疗髓R.2基因扩增乳腺癌的单克隆抗体赫赛汀(Herceptin)已通过美国FDA认证,并已成功地 应用于临床,疗效非常明显【柚J。 目前用来治疗乳癌的单克隆抗体Herceptin,理论上只对细胞膜上有过多HER-2蛋白质表达的细胞才有 作用,所以Herceptm治疗需筛选髓R.2阳性的病例才会有效,因此用可靠的方法来检测肿瘤的HER-2水平 十分重要。目前在实验室检测HER.2基因扩增(amplification)或HER-2蛋白质过度表现的方法有许多种, 包括Southern blot、Western blot、Northern blot、免疫化学染色法(immunohistochemistry,IHC)、与荧光 原位杂交法(fluorescence situhybridization,HSH)。目前只有免疫化学染色法中的DAKO Hercep test以 及两种荧光原位杂交法(Vysis PathVysion HER.2 DNA Prol把鼬及Oncor INFORM HER.2/HeU)已通过美国 食品药物管理局的验证,似乎是比较可靠的方法。目前在我国,金菩佳公司也推出了相应的HER一2基因扩 增HSH检测试剂盒,而且在国内也开展了大规模的检测工作。 1材料与方法 1.1材料 54例乳腺癌标本选自解放军第四军医大学西京医院和唐都医院及外院2008.01"-2009.05间的手术切 除病例,其中浸润性导管癌46例、浸润性小叶癌8例。免疫组化HER.2表达水平,阴性(阴性或+1)16例、 弱阳性(+2)33例,强阳性(+3)5例。免疫组化以癌细胞胞膜呈棕褐色为阳性,以Dako公司提供的分级 进行结果判读。即全部癌细胞中10%癌细胞胞膜不完整弱染色为(+);>10% 癌细胞胞膜轻至中度完整染色为(++);>10%癌细胞胞膜完整强染色为(卅)。 1.2方法 PathVysion HER-2 DNA探针试剂购自美国Vvsis公司。标本固定于4%中性甲醛液24、48 hr后石蜡包 埋,常规病理学诊断。经4~5岫厚切片、二甲苯脱蜡、100%乙醇脱二甲苯后,空气干燥或45---50"(2烤片。 0.2 mM HCl 20 vain,纯水充分洗涤,2 xSSC洗3 rain;1 mM NaSCN(异硫酸氰钠)8030 rain(温度要求 准确),纯水及缓冲液洗片后,将组织片放入蛋白酶溶液3TCl0 rain(250 mg/500 ml O.01 mol/L HCl)。 纯水洗涤后经75%、95%、100%乙醇各1 rain,空气干燥。加10ILl探针混合液在组织片靶区域上,加18 mm x18呦盖玻片并用蜡胶封边。放入原位杂交仪(美[虱StatSpin￥500224)中:80变性10 mill后37过夜 (14"18 hr)。将切片置后洗液(2xSSC,0.3%NP40)中漂洗盖玻片,组织片入洗液后722 rain将其 放置在室温暗处干燥,在组织片靶区域滴j哪]109l DAPI显色液,盖玻片封片,荧光显微镜观察结果或储存 20。1.3结果判定 荧光原位杂交计算细胞核内绿色荧光信号为17号染色体倍体状况,根据信号的数目可分为单体、双 体和多体(即着丝粒绿色信号数>2)。细胞核内橘红色的基因荧光信号和17号染色体的绿色荧光信号的 数目比值>2,或细胞核内>4个橘红色的基因荧光信号者为阳性扩增。 61 2.1乳牖癌细胞中HER-2基因采用Vysis HSH技术可以清楚地分辨,肿瘤细胞中17号染色件的着丝点和HER一2基因的情况。荧光原 位杂交检测结果见图1~2。 HsH拄木检铡到}啦-2基目扩增2.2乳腺癌基因扩增慵况 具体结果见表1,本组5例HER-2蛋白(+++)病倒中,2倒40%)为基因扩增阳性;33例I砸R_2蛋白(++) 病例中12例(孤4%)基因扩增。16倒蛋白“)的病例中.5倒(31 2%)。54例病例中,1州(352%)基 因扩增。本研究结果显示,基因扩增在HER-2蛋白表选各强度组分布的比较,差异无统计学意史卵>005)。 HER-2基因扩增情况m.2#目 }扩增ll(68 35(乩8%)扩增 5(31弭) 12(拍』%) 2(40嘏) 19(35 2%) 3讨论 基因是否扩增不仅是预测乳腺癌预后的独立风险标记,同时还是曲妥珠(Herceptin)单抗治疗和辅助 化疗的重要参考指标.所以准确检测非常重要u”。免疫组化(1HC)因具有成本低、生物学关联性密切、 技术易掌握等特点,以{c检测结果评估HER-2蛋白表达状况是目前临床上首选的方法,但{c染色本 身所固有的特点:如抗体差异、抗原修复方法不同、组织固定和制片以及结果的主观判读等,使不同医院 之间的结果差异较大…。免疫组化染色法与HSH均可使用福尔马林固定后的组织蜡块来作.与一般病理标 本之处理相同.以前的组织蜡块也可以做,因此实验室目前一般均以这两种方法来检测HER-2.若拿IHC 与FISH来作比较,IHC的操作时间比较短,约4{小时即可完成,而FISH必须隔夜。在设备上FISH需使用 荧光显微镜,而IHC只需一般光学显微镜即可。在分子生物学上,FISH测的是肿瘤细胞的DNA,而免疫化 学染色法测的是细胞膜表面的蛋白质。检测基因扩增的FIs}Ij去具有较高的准确性、灵敏度和特异性,所以 其结果在不同实验室问致性很高“”。尽管IHC结果与FISH检测结果不同,但由于FISH目前是非常规分 子病理技术并且成本高.故绝太多数学者建议结果误差最大的IHC(++)病例要进行FISH检测,以明确 其基因是否扩增““。但是本研究显示.无论I]-IC(+)、(+-)、(+++)的患者的FISH诊断结果之间均未 发现明显的统计学差异,因此我们认为无论IHC结果如何均应做FISH检测,以进一步明确基因是否扩增: 而且如果条件允许,mC(卅)者也应做FISH确认。 使用FISH的优点在于,用传统的分子生物方学法抽取肿瘤组织的DNA或RNA作Northern Blot或Southern Blot的时候,很难避免受到邻近肿瘤组织的间质组织之干扰,会稀释肿瘤组织所特有的DNA表现,而FISH 可以避免这个问题。FISH在荧光显微镜下可以确认出肿瘤所在的位置,以PathVysion Test来说,它会把 HER-2基因部位呈现橘色荧光亮点,它也会将第17对染色体的中心粒(centromem)呈现绿色亮点,我们只 要比对橘色及绿色亮点的数目,若橘点,绿点大于2,就表示有HER2基因过度表现。然而也有人认为,真正 执行基因功能的物质是蛋白质而不是DNA,我们要看HER-2基因是否过度表现,当然以观察细胞膜表面是 否HER.2蛋白质的量有增加最为直接,也最为可信,实在没有道理去用HSH来检测DNA的量。因为有时即 使DNA有过度表现,其结果未必能在蛋白质层面表现出来。我们要知道,由DNA表现到蛋白质被制造出来, 必须经过很多程序,包括DNA_RNA_蛋白质,中间可能出现很多干扰因素,因此有时DNA有表现, 蛋白质却未必有表现,此外,作免疫化学染色法比较便宜,又省时,比较适合优先当作筛选的工具。因此, 我们认为HER.2 IHC(++)必须加作HSH来判断是否真的有加’R.2过度表现。而HER-2阴性或HER.2(+) 则表示没有HER-2过度表现,不必再作HSH(除个别认为判断误差外),也不适合使用Herceptin来治疗。 本研究验证了目前所采用的IHC作为HER-2检测初筛,FISH对不确定病侧(*)进行补充确认的检 测方案是必须的。同时,HER-2 IHC(+)或(+++)在条件允许的情况下,也应进行FISH检测,以确定 HER-2基因的扩增情况。 参考文献 1.BofioncUolI,V。ct aL。Trastazumab administration call effectively target chemotherapy-resistant cytokeratin一19 messenger RNA-positive tumor cells peripheralblood bonemorrow ofpatients breastcancFr.Olin Canogr Re,2004.10 (24):P.8185-94. 2.Bozzctli,C.。el aL,HER-2/neu amplification detected缈fluorescence situhybridization inJ{ne needle aspiratesfromprimary breast cance,:Ann OncoL 2002.13(9):P.1398-403. 3.Press,M.E,el a1.,Diagnostic evaluation amoleculartarget:all assessment laboratorytesting largeprospectiverandomizeddinical触ain Cancer Res.2005.11(18):P.6598—607. 4.Vogel,C山.,J.C.Reddyand L.M.ReynoEffcacy oftrastuzumab.Cancer Res,2005.65(5):P.2044. 5.SlamonD.J.,E.H.Romond’and E.A.Pc-fez,Advances adjuvanttherapyfor bmast cancer.Clin Adv Hematol Oneol2006.4 Suppl7):P.suppI 1.4-9;discussion suppl 10;quiz 2Pfollowing suppl 10。 NabhoRz,J.M.andD.SlamonNew adjuvant strategiesfor bmast cancer."meeting challengeofintegrating chemotherapy trastuzumab(Herceptin).SeminOncoL 2001.28(1 Suppl 3):P.1-12. 7.Schn五dtM.,et a1.,l ong-term prognostic sisnificance untreatednode-negative breast cancer depends methodoftesting.Breast Cancer Res。2005.7(2):P.R25每66. 8.Chorn,N.,Accurate identification ofHER2-positive patients essentialfo,superioroutcomes trastazumabtherapy.Oncol Nut's Forum2006.35(2):P.265-72. 9.Jaeobs,T.W,el a1.,HER-2/neu protein expresswn breastcancer evaluated细immunohistachemistry.A stuay interlaboratoryagreement.Am,ain Path01.2000.113(2):P.251—8, 10.Hammoc】【.L.。ct a1,,Strong HER 2/neu protein Dw他甲形站洳毋immunohistochemistry often does predictoncogene amplification byfluorescence sf彬hybridization.HumPathol。2003.34(10):P.1043-7. 11.Yaziji,H,,el a1.,HER一2 testing breastcancer usingparallel t缸sue based methods.Jama2004,291(16):P,1972-7.