密码子敏感性指的是在细胞内氨基酸缺乏的条件下,tRNA与氨基酸结合能力的强弱。结合能力随氨基酸浓度降低呈缓慢降低的tRNA的敏感性较低,其相应的密码子被称为低敏感性密码子;结合能力随氨基酸浓度降低呈快速降低的tRNA的敏感性较高,其相应的密码子被称为高敏感性密码子。随后的实验直接证实了该理论预测,在细胞缺乏相对应氨基酸时,丝氨酸、亮氨酸、苏氨酸和精氨酸家族中同功受体tRNA选择性氨酰化[30,45,47]。并根据tRNA可用性估算了密码子翻译速率,展示了tRNA在整个大肠杆菌基因组翻译过程中敏感性的动态变化[48],为微生物酶的工业化增加了新元素。
理论上,蛋白的合成速度与细胞内tRNA和氨基酸的浓度相关[49-50],但是,大肠杆菌tRNA的浓度在所有代谢条件下基本恒定[51],因此,在底物缺乏的条件下,即当核糖体翻译机制对某种氨基酸的需求大于其生物合成速率时,氨基酸的供应成为了蛋白合成的限制性因素。由于密码子的频率与敏感性并不呈对应的关系[10],频率较高的密码子,其敏感性并不一定低。在饥饿条件下表达异源蛋白时,如果宿主中频率较高的密码子正好敏感性也较高,那么,采用密码子偏好性来进行密码子优化不仅不会使蛋白的表达量提高,反而会使蛋白的表达量降低。在这种情况下,如果采用的是低敏性的密码子,即使氨基酸的浓度降低,该低敏性密码子对应的tRNA相较其他的同功受体tRNA也有较高的氨酰化水平,也能维持蛋白的持续表达(图1D)。反之,高敏性的密码子所对应的tRNA的氨酰化水平会随着氨基酸的浓度降低呈现较快的下降趋势,即使细胞内其他同功受体tRNA仍维持高水平的氨酰化状态也不能被细胞加以利用,会造成蛋白表达的暂缓甚至停止。
密码子敏感性的优化策略可广泛地应用于极端条件下或对于培养基有严格要求的蛋白表达,也可将其用于对蛋白质量要求较高的结构生物学、抗体或生物药物的研究中。目前,利用密码子敏感性的优化策略还未得到推广,只有文献报道了关于大肠杆菌的密码子敏感性数值[10],其他物种尚未见报道(表1)。
1.4 调整基因序列
在异源蛋白表达中,研究者关注更多的是转录和翻译过程,但基因序列本身对蛋白的表达也有一定影响。常见的对基因序列优化方法有调整GC含量[52-54]、避免碱基重复[55-56]、消除限制酶识别位点[57]、Chi-site延伸重组热点[57-