在运行光谱校正之前,请先进行背景校正和ROI校正。10.96孔板怎样封膜?
当使用96孔板做实验的时候,推荐使用光学膜代替盖子来密封反应孔。正确的封膜方法是:先沿着96孔板的纵向压膜,然后横向,最后沿着板的边缘按压使之密封。
11.使用单管或8连管做实验时,在样品加热块上应该怎样安排放置?
使用单管或8连管做实验,并且样本数量不多的时候,建议在样品加热块(TRAY)上对称地安放样品,最好是纵向放置,并且优先放在第6列或第7列,然后逐渐向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜,各个反应管的受力和受热都比较均匀,提高孔与孔之间的数据精密性.
12. 绝对定量与相对定量有什么区别?
绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。
举例来说,如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本,通常可以将未经处理的样本指定为基准,规定其目的基因浓度为100%,将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果,就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。
绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品,必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线。
相对定量实验有两种方法:标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法,可以使用绝对标准品,也可以使用相对标准品,而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品,典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。
CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系,来计算不同样本之间的相对百分比,其计算公式是。
绝对定量的数据易于理解,但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购,可以解决这种困难。
相对定量的标准品容易在实验室里自己制备,但是数据处理比较麻烦,对实验数据的解释有一定难度。
13. 定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理?
总的来说,有三个层次的校正是必须要做的。
首先,参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX,这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、