1. 什么是原生质体?
原生质体(protoplast),指除去细胞壁后,由质膜所包围的具有生活力的裸露植物细胞。离体的原生质体在适当的条件下可以生存数天,并具有一定的繁殖能力。原生质体具有较好的一致性,是比较均一的去除细胞壁的单细胞群体。
叶片表皮细胞及酶解后得到的原生质体2. 原生质体能用来干啥?
原生质体是一种非常好的瞬时表达系统。原生质体易于制备,单细胞群本身还可以摄取外源细胞器、病毒、质粒以及DNA等各种大分子物质。
近年来,原生质体瞬时表达技术被广泛应用于基因功能研究、植物生理生化过程研究和分子机制的研究(包括研究细胞信号转导过程、离子转运、细胞壁合成、蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程),以及生产有用的代谢产物、构建植物融合细胞、创制多倍体等。
现在已有的基于原生质体的实验技术包括蛋白亚细胞定位分析、基因瞬时表达分析、启动子活性分析、离子吸收实验以及蛋白质互作验证(如Bi-FC、FRET和蛋白质免疫共沉淀)等。
使用原生质体研究蛋白亚细胞定位及蛋白间互作的实例,左图证明转录因子ART1定位在细胞核,右图证明转录因子FIT与激酶CIPK11可以发生互作。3. 怎么制备原生质体?
一般采用酶解法制备原生质体。现在的研究表明,用适当的酶处理,几乎能从任何种植物或任何类型的植物组织中有效地游离出原生质体。
酶是分离原生质体的关键成份, 已应用的酶主要有:纤维素酶R-10、半纤维素酶 、果胶酶Y-23、离析酶R-10 及崩溃酶等 , 其中纤维素酶R-10和果胶酶Y-23最为常用。
纤维素酶(右,蓝色)和离析酶(左,粉色)是好朋友。
比如制备拟南芥原生质体,可以使用叶片。
可以使用14天龄幼苗,将叶片剪下,放入配好的缓冲液(维持一定渗透压和pH)中,用小刀切碎,加入酶液(上图的纤维素酶及离析酶),放在摇床上15转/分钟的速度酶解5-6h(也可酶解过夜),之后过滤除去植物残渣,原生质体就在酶液中了。用一些溶液如W5冲洗干净,离心收集,就可以获得原生质体了。可以显微镜下镜检,看看完整程度及浓度,然后用来做后续实验。
也可以使用水培或土培的开花前大苗,剪少数几个完全展开的叶片,用胶带撕去下表皮,放入酶液酶解1h即可,之后过滤除渣,用W5冲洗干净,离心收集即可。
三明治法,两侧贴胶带,撕去拟南芥下表皮。
比如水稻原生质体,可以使用幼茎(叶绿体少 , 细胞大)。
将种子去壳播在1/2MS培养基,或者直接水培条件下养大,全程遮光使之黄化(水稻较糙,黄化苗更嫩易酶解),养到10cm左右(约12天)取黄化苗,剪去叶片和根,用刀片切碎茎段成薄片(像切葱那样,越细碎越好)。加入酶液(也是纤维素酶及离析酶,浓度高一些),放在摇床上60-80转/分钟的速度酶解4-5h,之后过滤除去植物残渣,W5冲洗干净,离心收集,镜检后就可以使用啦。
镜检观察制备好的原生质体,主要看浓度、完整性、形态,以确定制备出原生质体的质量。
游离原生质体的植物材料(物种、组织)不同,应用的酶剂、浓度、处理时间也不一样。在以叶片、下胚轴等器官为材料时,应选用活性较弱的酶,且酶的浓度要低,处理时间要短;在以愈伤组织、细胞悬浮培养系为材料时,应 选用活性较强的酶或高浓度的酶,这样才能分离出活性较高、去壁彻底的原生质体。
参考文献孙鹤, 郎志宏, 朱莉, 等. 玉米、小麦、水稻原生质体制备条件优化. 生物工程学报, 2013, 29(2): 224−234.Zhang Y, Su J, Duan S, et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplastrelated processes. Plant Methods, 2011, 7:30–43.Wu F H, Shen S C, Lee L Y, et al. Tape-Arabidopsis Sandwich — a simpler Arabidopsis protoplast isolation method[J]. Plant Methods, 2009, 5(1):16.