超滤及透析法主要用于水溶性大分子化合 物,如蛋白质、核酸、多糖类的脱盐精制及分离工作,对分离小分子化合物来说不太适 用。凝胶过滤法则不然,也适用于分离相对分子质量1000以下的化合物。 1.1.2.5根据物质解离程度不同进行分离 天然有机化合物中,具有酸性、碱性及两性基团的分子,在水中多呈解离状态,据 此可用离子交换法或电泳技术进行分离。 离子交换法,以离子交换树脂作为固定相,以水或含水溶剂作为流动相。当流动相 通过交换柱时,溶液中的中性分子及具有与离子交换树脂交换基团相反电荷的离子将通 过柱子从柱底流出,而具有相同电荷的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸 附到柱上,随后改变条件,并用适当溶剂从柱上洗脱下来,即可实现物质分离。 1.2中药成分现代仪器分析方法 中草药中天然化合物含量少,品种多,难以采用经典的化学方法进行研究分析,而 主要依靠波谱、色谱,得到各种图谱,加以综合并充分利用文献数据进行定性和定量。 1.2.1气相色谱一质谱联用(GC.MS)分析[6-81 气相色谱一质谱(GC—MS)联用分析是二十世纪六、七十年代发展起来的一种新 型仪器分析方法,具有灵敏度高、分析速度快、鉴别能力强、可同时完成分离和鉴定等 特点,特别适用于多组分混合物中未知组分的定性、定量分析,鉴定化合物的分子结构 和相对分子质量测定。随着分析检测技术和数据库的日趋完善,己成为植物的化学分类、 生物品种的鉴定、有效成分的研究、药用资源的扩大应用、建立中药的质量控制指标和 中药炮制机理研究等的重要手段。在中药化学成分研究方面主要包括挥发油类成分的分 析、脂肪酸类成分的分析和脂溶性成分的分析,有关这方面的研究报道很多。 1.2.2高效液相色谱分析【9’12】 高效液相色谱(HPLC)分析技术发展于二十世纪60年代,目前高效液相色谱已成为 化学、生化、医药、农业、工业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离、分析技 术,是分析化学家和生物化学家解决各种分析、分离问题的不可缺少的工具。它特别适 用于高沸点、大分子和热稳定性差的化合物的分离、分析。中草药成分复杂,常规的薄 层色谱等不能满足现代中药成分分离、分析的需要,高效液相色谱正是以其稳定、可靠、 高效的特点成为中草药研究的重要手段。高效液相色谱在中药有效成分分析中的应用主 要包括生物碱、皂苷、黄酮、蒽醌、酚酸类、氨基酸、蛋白质、肽类、糖类、香豆素等。 1.2.3原子光谱分析【13。14】 原子光谱分析是分析中草药中微量金属元素的有效方法,主要包括发射光谱分析和 原子吸收光谱分析,其中发射光谱分析可用于金属元素的定性、半定量和定量分析,特 化香树果序化学成分研究别是二十世纪60年代发展起来的电感偶合等离子体原子发射光谱(ICP.AES)分析方法, 具有可进行多元素同时分析、蒸发、原子化和激发能力强、干扰小、可对固、液、气态 样品直接进样分析、分析速度快、测量精度高等特点,在中草药微量元素分析方面得到 了广泛的应用。原子吸收光谱分析也是中草药中微量元素分析的有效方法。 1.2.4紫外吸收光谱法 分子中含有共扼双键、发色团及具有共扼体系的助色团分子在紫外及可见光区域产 生吸收,可用来判定含双键的物质。 1.2.5毛细管气相色谱 毛细管气相色谱法是目前常用的高效分离和定量方法。毛细管气相色谱分离非极性 物质一般选用非极性固定液,这时试样中各组分按沸点次序流出。分离极性物质时,选 用极性固定液,样品各组分按极性次序分离。检测使用火焰离子化检测器(FD)。火焰 离子化检测器利用含碳有机物在火焰中燃烧产生离子流,根据离子流产生的电信号强 度,检测被色谱柱分离出的组分。它灵敏度高,检出限低,能检测大多数含碳有机化合 物,线性范围宽。气相色谱分析对象是在气化室温度下能成为气态的物质。大多数物质 在分析前都需要预处理,有些物质如有机酸,极性很强,热稳定性差,必须先进行化学 处理成酯,才能进行色谱分析。 1.2.6氨基酸分析仪分析【18-20l 中草药中的氨基酸可分为两类,一类为蛋白质的组分氨基酸,这些氨基酸由蛋白质 水解而来,大约有20种,都是a一氨基酸:另一类是非蛋白质组成氨基酸,它们以游离 状态存在于植物中。经典的氨基酸检测方法为阳离子交换分离、柱后衍生反应、分光或 荧光检测。氨基酸分析仪就是据此原理发展起来的,在中草药氨基酸分析中得到较广泛 的应用,具有分析速度快、灵敏度高等特点。 1.2.7红外光谱法 对于不同产地的中药提取物,红外光谱法可以无需分离、直接测定。通过对中药提 取物在特征频率区和指纹区基团吸收峰大小和位置的比较鉴别。 1.2.8液相色谱一质谱联用分析 液相色谱一质谱联用(,LC—MS)分析技术是二十世纪70年代发展起来的一种 以MS为检测手段的色谱技术,它集LC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的定性 特性于一身。HPLC-MS是目前公认的以活性物质为导向的分离提取、化学筛选以及对 有潜在活性的新型化合物进行检测分析的一种理想手段。液质联用技术可以在较短的时 间内对于不同相对分子质量大小的化学物质一次性的进行分离和鉴定,多级质谱联用还 可以对感兴趣的化合物进行靶分析。植物药作为天然产物,其化学成分复杂,相对分子 质量和极性分布广泛。采用ESI接口技术的液一质联用仪在一级质谱上将样品首先转化 陕西科技大学硕士学位论文为分子离子峰。然后在二级质谱上得到化合物的碎片峰,能够得到尽可能多的化合物信 息。肿LC—MS己成为现代分析手段中的必不可少的组成部分。目前,液相色谱一质谱 联用技术的主要应用领域包括定性分析和定量分析两方面。 1.2.9其它分析方法 除了上述方法之外,高效毛细管电泳(I-WCE)分析、荧光分光光度分析法、气相色谱 .傅立叶变换红外分光光度法、核磁共振波谱法、旋光光谱法、薄层色谱法、纸色谱法等 在中草药成分分析中均有应用。 l。3植物多酚 1.3.1植物多酚的结构【22】 种类繁多的植物多酚可根据其化学结构、来源和用途等进行分类。人们最初研究的 植物多酚主要为单宁。K.Frendenberg于1920年按照单宁的化学结构特征将其分为水解 单宁(hydrolysabletannin)和缩合单宁(condensedtannin)两大类,这种分类法得到公认并一 直沿用至今。Haslam相对应地将植物多酚分为聚倍酸酯类(含水解单宁及其相关化合物) 和聚黄烷醇类(含缩合单宁及其相关化合物)两大基本类型,并将其统称为植物多酚。这 种分类方法更着重以结构特征为依据,而不考虑分子量,更符合人们现在对这类混合物 开展研究工作的实际情况。由于单宁一词已为许多学科领域的学者所惯用,因此本文仍 采用这一术语。但其含义与Haslam的分类方法一致。 图1-1典型单宁的结构Figl-1Typical molecularstructureoftannis 水解单宁或聚桔酸酯类多酚,分子内具有酯键,通常是以一个多元醇为核心。通过 酯键与多个酚羧酸相连接而成,属C6.C1型酚类,在酸、碱、酶的作用下不稳定,易于 水解。缩合单宁或聚黄烷醇类多酚,是黄烷醇的聚合物,具有C6.Ca.C6的结构特征, 分子中芳香环以C.C键相连,不易水解,在强酸性条件下缩合成不溶于水的物质。因解 单宁和缩合单宁在构成单元骨架上完全不同,由此造成它们在化学性质、应用范围上的 化香树果序化学成分研究 显著差异,但是它们在分子结构上仍具有某些共性:(1)酚羟基数目众多,以邻位酚羟基 (连苯三酚、邻苯二酚)最为典型;(2)分子量较大,且分布较宽。正是这种化学结构,赋 予多酚独特的化学性质,使多酚不仅与源于植物的其它大分子如纤维素、木质素、腐植 酸区别开来,也使其与低分子的植物酚类(如黄酮类、蒽醌类化合物)显著不同。 1.3.2植物多酚的提取、分离和纯化[23-24】 植物多酚种类繁多,均以混合形式存在,它们在植物体内通常与蛋白质、多糖以 氢键和疏水键形式形成稳定的分子复合物,尤其对分子量大、羟基酸多的植物多酚尤为 突出。通常可根据不同植物的结构及分子量,采用溶剂法、络合沉淀等方法进行分离。 由于多酚物质在结构中都含有羟基,具有一定极性,所以水、低碳醇、乙酸乙酯、 丙酮都是可被选择的溶剂,通常可按以下原则分提:按主体酚类的含量,调节溶液 的pH值,根据酚类分子量。对以桔酸酯多酚为主体的酚类一般可采用丙酮一水体系, 因醇类溶剂易造成醇解反应,使多酚分子降解;而以缩合单宁为主体的样品可采用弱酸 性醇一水体系,使以共价键与植物组织分子相联的单宁降解溶出。一般而言,pH低时, 以分子状态存在的多酚较多;pH高时,则以负离子存在的多酚多,因此,我们可采用调 节水提物pH值控制有机溶剂萃取物的组分。又可根据多酚不同的分子量可采用不同的 溶剂分级方法进行提取。一般来说,从乙醚萃取物中可得到低分子量酚类物质,用乙酸 乙酯或丙酮一水溶液萃取,可得到中等分子量单宁化合物,从水溶液中得到的是1500左 右分子量物质,而在热碱浸提物中可得到大分子量多酚。所以通过不同溶剂的分提,可 将各组分得到初步分离。 粗提物中含有大量的糖、蛋白质、脂类等杂质,加上多酚本身是许多结构和理化性 质十分接近的混合物,需进一步分离纯化。通常采用有机溶剂分步萃取的方法进行初步 纯化,甲醇能使水解鞣质中的缩酚酸键发生醇解,乙酸乙酯能够溶解多种水解鞣质及低 聚的缩合鞣质,乙醚只溶解分子量小的多元酚。初步分离还可以采取皮粉法、醋酸铅沉 淀法、氯化钠盐析法、渗析法、超滤法和结晶法等。柱色谱是目前制备纯鞣质及有关化 合物的最主要方法,可选用的固定相有有硅胶、纤维素、聚酰胺、聚苯乙烯凝胶,聚乙 烯凝胶、葡聚糖凝胶等,其中又以葡聚糖凝胶SephadexLH-20最为常用。 1.3.3植物多酚的定量定性分析 植物多酚是一此复杂的聚合物,构成多酚的基本功能基团的多样性、酚羟基的位置 和数目不同、取代基团的结构和取代位置的多样性、C.C链的长度不一,使得多酚的结 构异常复杂,而且植物体内多酚含量和种类变化多端,不同植物、同种植物的不同生长 阶段和部位多酚含量和种类各不相同。因此难以用简单的一种或几种方法来定量,鉴定 多酚的结构也十分困难。 陕西科技大学硕士学位论文1.3.3.1含量分析方法[22251 1.)化学还原法总酚测定一般采用福林酚法和普鲁士蓝法(P-B法)。福林酚法又包 括Folin-Denis法(F.D)和Folin.Ciocalteus法伊.C),F.C法是F.D法的改进方法,在反应 体系加入“盐,克服了F.D法不稳定的缺点。 化学还原法是应用酚羟基的还原性、酚羟基数目与氧化试剂所形成的有色化学物质 的量在一定范围内成线性。这种方法并不能区分样品中多酚和其他易氧化物质,也不能 区分单宁和非单宁类多酚。比较福林酚法和P.B法,蛋白质和游离氨基酸的存在会明显 地干扰前者,因此在分析蛋白含量比较高的样品时,选择P-B法比较理想,但福林酚法 比P-B法稳定,P.B法对反应时间更为敏感,反应时间如果控制不恰当,结果误差较大。 2)离子沉降法利用多酚取代基能与一此金属离子络合成有色螯合物的性质,可以 用离子沉降的方法定量多酚。这种方法克服了植物样品中蛋白质和还原性物质的干扰, 但其线性范围难以控制。不同样品中的多酚线性范围有很大不同。 3)特定功能基团分析法该方法用来对一些特殊分子结构定性和定量,如缩合单宁 (大部分等同于原花色素,proanthocyanidins)的定量通用的是正丁醇盐酸法和香草醛盐酸 法。正丁醇盐酸法的原理是利用原花色素在热酸的作用下能水解产生红色物质花色素, 生成的有色物质比较稳定,在暗处保存几天都不会变色。香草醛盐酸的原理在于元花色 素(5,7.OHA环型)与香草醛.盐酸产生红色物质,必须注意,当用丙酮和水混合液提 取时,丙酮可以跟香草醛反应生成色素,对香草醛盐酸法有干扰,因此用甲醇提取更为 合适。两类方法均采用分光光度法测定,可以在水解多酚和其他酚类共存的情况下选择 性测定缩合单宁。正丁醇盐酸法比香草醛盐酸法简单可靠,专一性更强,可重复性也更 高。但受多酚分子结构影响太大。因此,在缩合单宁含量低的样品测定中最好用香草醛 盐酸法。香草醛盐酸法(仅终端单元跟缩合单宁反应生成有色物质)和正丁醇盐酸法(仅扩 展单元跟缩合单宁反应生成有色物质)两者的产率结合起来分析可以确定缩合单宁的聚 合度。该方法适合于化学结构相似的单宁之间的比较,因此已经用于研究植物在不同生 目价段缩合单宁量的变化。 铆蛋白质沉降法蛋白质沉降法既能测定多酚含量也能测定单宁的生物学活性,但 在解释结果时必须注意,因为不同的多酚种类对同种蛋白质的沉降能力不同。 1.3.3.2结构分析圈 1)检识反应多酚一般可用三氯化铁反应、溴水反应、乙酸铅反应、香草醛一浓硫酸 反应、甲醛浓盐酸等反应检识。如果三氯化铁反应无色提示无鞣质或有单取代酚羟基的 缩合鞣质;三氯化铁反应显蓝色一般为具邻三酚羟基化合物,可分为水解鞣质和没食子 儿茶酸缩合鞣质:三氯化铁反应显深绿色,一般具邻二酚羟基化合物,可分为邻二酚羟 基的黄酮和儿茶素类缩合鞣质。如果溴水反应有黄或橙红色沉淀为缩合鞣质。如果乙酸 lO 化香树果序化学成分研究 铅反应有沉淀且沉淀溶于乙酸的为缩合单宁。如果香草醛浓硫酸反应与对二甲氨基苯甲 醛反应呈红色,说明存在儿茶素类缩合单宁。如果甲醛浓盐酸有樱红色沉淀为缩合单宁。 2)物理方法物理参数的测定熔点、旋光度。进一步的分析一般用薄层层析法、纸 层析法等。薄层层析法应用较多,检测多酚的分解产物没食子酸的重现性好,灵敏度高, 斑点集中较清晰。纸层析法分离效果差,斑点重叠不集中,拖尾现象严重。近来也可用 高效液相色谱区分各种多酚类型,可识别植物提取物中的多酚,需用的样品量和紫外法 差不多,在研究植物中多酚和其有关的多酚化合物分布情况特别有效。在多酚的结构测 定中,1H-NMR、13C.NMR是两种重要的工具,相辅相成,提供有关分子中氢及碳原子 的类型,数目,相互连接方式,周围化学环境等。在确定有机化合物分子的平面及立体 结构中发挥着巨大的威力。 1.3.4植物多酚的构效关系【22】 多酚的生理括性往往是其化学括性的综合体现。这些生理活性除了多酚与蛋白质 (酶)、生物碱、生物大分子以及多糖的复合反应等原因相联以外,还与多酚具有较强的 清除自由基和抗氧化性能密切相关。 1.3.4.1植物多酚与蛋白质、生物碱、多糖的反应 植物多酚与蛋自质的结合反应是其最重要的化学特征,这方面的研究工作开展得也 最多最深入。现在普遍接受的是20世纪80年代Haslam等(1989)提出的“手套.手”反