1. 2L o H 研究的方法及判断标准1. 2. 1方法: 早期的L O lI研究常采用限制性片段长度多态性( r estrJ c tio nf r a g m e n t le n g thp o ly m o r p h ism , R F L P )技术, 通过观察基因组D N A 经限制性内切酶水解后肿瘤组织与正常组织相对等位基因的改变来分析等位置因丢失的情况, 采集配对标本后, 分别提取人基因组D N A , 特定的限制内切酶酶切、 电泳、 转印, 与标记探针进行S o u th e r n 杂交, 分析等位基因的变化。 这种技术的缺点是所需D N A 量较多, 对一些体积小的癌组织进行L O Il研究不便, 且抽提D N A 千H 对繁琐。 P eR 方法问世后, 出现了P C R —R F L I, 法, 这种方法更快速、 简便、灵敏度高, D N A 样本用量也相对更低。 首先设计P cK 引物, 使其扩增片段包含多态性限制酶酶切位点序列, P C R 扩增后用相应的内切酶酶切P C R 产物, 直接电泳以观察酶切片段的长度多态性变化。近年来, 随着微卫星的发现和研究的深入, 微卫星分析逐渐取代R F L P 成为检测等位基因丢失的主要办法, 微卫星是广泛分稚于不同染色体上的一些简单重复序列, 通常}= { 二|2—4个核诣: 酸反复重复排列组成。 每个个体同一等位基因上这种序列重复的次数不同, 故序列 的长度不liⅥ, 呈多忿性。 迄今已发现60 0 0 余个微_ - 17 ,71. j= i- : y !j。 微卫星作为多念性标址, 因其在染包休土仃f W 砷的定何, 可以J一泛用于克隆新的遗传痫牛日关基因和肿瘤的抑癌基因、预测发病趋势、 评价治疗效柴羽I估计预后, 为器蚓在染色体的准确定位提供了一个新: ]: : 具。通过P C R 扩增分析D N A 微卫星序列的L O H , 灵敏、 简便. 1il. 快捷111。 其基本方法为莳先用P C R 技术扩增选定f cf cJ微卫!Ij序列, 然后用凝胶I乜泳分析D N A 序列( 等位基因)的变化,f 乜泳后可以直接川银染法染匕观察结果, 或者根拆: 引物标已物的不同( 同位素标记或荧光索标记), 分别采H 1放射…浩影或荧光自动化分析系统观察分析结果。 目前, 以荧光索标记的方法有墩代i}7 P ,c7 者f 内趋势。 这利r技术的主: 嘤特点足所需D N A 标本量少且灵敏皮高,不足之处是要求标本坌|: Il胞均一, 且受P C R 循环数的影响, 有研究表明川t瘤细胞中一常细胞的混杂污染将二1二扰L O H 的分析, 只有当JI'tq 南g tl/C g 的纯度大于7 0%一80%时, 才能较可靠的检测到L O H I引。 采用显微切割技术可以提供均…的目的细J也, 大大地提高了检测的精确性。1. 2. 2判断标准: 参照1'011/【【n so n 01等的判断标准, 当正常体细胞D N A 扩增产物凝iF ,乜泳出现两条分丌的主要条带叫, 。 髓明此位点为杂合性, 判断为有信息个体。 肿瘤条带中的一条信号强度与其正常对j{ Ic组织相应产物比较, 如减弱50%以一L 或消失, 则判断为杂合性丢失: 与iF 常对照相比出现异常条带, 如显示两个密度相似的条带, 为保留或未丢失; 如出现两个与难常组织位臀不同的条带或出现第三个条带, 则判断为微卫星刁; 稳定; 当正常对照组织的扩增产物仅为一条时, 说明此位点为纯合子, 不能用来判断L O H , 称为非信息个体; 假如一个肿瘤D N A 位点L O H 缺失率大于20 0 ,6 , 提示有抑癌基因的存在, 可认为此位点与肿瘤有相关性‘“。