分类~j密级Y9 0 2 8 3 3t_ f叫训℃¨芊{ j食管鳞状细胞癌9 号染色体等位基因杂合性丢失的研究研究啦幽垒一指导教师:王仝红申请学位门类级别:医堂——专业职称:痼!!堂皇越理坐型生研究方向:月±型筮王瘟理所扯学院:基型i医堂鲨10 1142 0 0 4 0 12 食管鳞状细胞癌9 号染色体等位基因杂合性丢失的研究摘要目的: 抑癌基因的失活是细胞癌变的重要机制之一, 研究发现9 弓染色体上可能存在着与食管鳞癌发生发展密切相关的抑癌基因。 通过检测食管鳞癌和高级不典型增生组织中的L O H . 探讨食管鳞痛发生发展过程中基因的变化, 探讨L O H 和牛H 关临床病理参数及消化道JlI|】 瘤家族史之州的关系, 以期发现9 号染色体上与食镎鳞癌密纠相关的抑癌缝囚。方法: 选择4 5倒伴有jI常及高级不典型增生组织的食管鳞癌标本, 采用显微切割、 P C R 、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、 A g N 0 3染色等技术, 对照正常细织, 检测高级不舆型增生及癌组织在9 号染色体上7 个微卫星位点的L O H 的情况, 并就杂合性丢失率与病人的相关临床病理参数、 消化道肿瘤家族史分别进行分析。 所有统计学分析采用S P S S ll. 0统计学软件。结果:1. 在有信息的病例中, 高级不典型增生总L O H 率为16%, 食管鳞癌总L O H 率为26 %; 高级不典型增生组织中, 7 个微卫星位点的L O H 率依次为D 9 S 30 3( 31%)、 D 9 S 17 1( 29 %)、 D 9 S 7 53( 29 %)、 D 9 S 16 2( 15%)、 D 9 S 24 2( 1l%)、 D 9 S l 7 4 8 ( 7 %)、 D 9 S 4 3( 0 %):在食管鳞癌组织中, 7 个微卫星位点的L O H 率依次为D 9 S 7 53( 4 3%)、 D 9 S 30 3( 38 %)、D 9 S 17 l( 3 6 %)、 D 9 S 16 2 ( 3 6 %)、 D 9 S 2 4 2 ( 17 %)、 D 9 S 17 4 8 ( 17 %)D 9 S 4 3 ( O %)。2. 无沦在高级不典型增生还是在癌组织中, 有消化道肿瘤家族史病例的L O ll率明显高于无家族史的病例( x2= 4 . 8 6 , P < 0 . 0 5; x2= 5. 11, P < 0 . 0 5)。 在不同性别、 分化及淋巴结转移之问差异不显著( p > 0. 05)。结论: 1. 从正常鳞状上皮到不典型增生再到癌变的过程中存在基因的异常累积。2. p 15基因可能与食管鳞癌的发生发展相关。3. D 9 S 16 2位点或其附近可能存在与食管鳞癌发展相关的抑癌基因。4 . 9 q 末端可能存在与食管鳞癌的发生发展相关的抑瘸基因。5. 有消化道挣¨ 茁家族史病例的L O H 率明显高于无家族史的病例。关键词: 食管鳞状细胞痛, 高级不典型增生, 抑癌基因, 杂合性丢失 L o ss o fh e te r o z y g o sityO Rc h r o m o so m e 9ine so p h a g e a l sq u a m o u scell c a r c in o m aa n ditsp r e c u r so rle sio nA b str a c tO b jectiv e: T h ein a ctiv a tio n o f t u m o rsu p p r e sso r g e n e s( T S G )w a so n e o f th esig n if ica n tm e c h a n ism s o fceil c a n c e r a tio n . P o ssib le t u m o rsu p p r e sso rg e n e sr ela ted to th ed e v e lo p m e n ta n dp r o g r e ssio no fe so p h a g e a l sq u a m o u scellc“rcif lo m a ( E S C C )m a yex ist a t c h r o m o so m e 9 . T h ea imo f th isstu d yw a s toin v estig a teth eg e n ev a r ia tio n a n dtoe v a lu a tep o ssib let m n o rsu p p r e sso rg e n e so nc h r o f n o so n le9 inth ed e v e lo p m e n ta n dp r o g r e ssio no fE S C C , th r o u g hd e te ctin gth e lo sso fh etero zy g o sity ( L O I{ )inE S C Ca n ditsh ig h - g r a d e sq u a m o u sd y sp la sia .M e th o d : 4 5 c a se s o fE S C Cw ithh ig h - g r a d esq u a m o u sd y sp la siaa n dn o r m a l tissu ew e r eselected .L O H w a s d e te c te din n o r m a le so p h a g e a l m u c o sa , h ig h —g r a d e sq u a m o u s d y sp la sia a n de so p h a g e a lsq u a m o u scellc a r c in o n m u sin g m ic r o d isse c lio n , p o ly m e r a se c h a inrea ctio n ,d e n a tu r in gp o ly a c r y la m id e g el e le ctr o p h o r e sisa n d silv er n itr a testa in in g te c n o lo g y . T h ec h a n g e so f L O H a ts e v e n m icr o sa tellite m a r k e r s a n d th er ela tio n sh ipb e tw e e n L O H r a tea n dc lin ic o p a th o lo g icp a r a m e te r s, e n te r o n f a m ily h isto r yw e r ea n a ly z e d . A ll a n a ly sisw e r e ca r r ied o u tu sin gS P S S11. 0 so f tw a re.R e su lts: 1In th e in f o r m a tiv eca ses, to ta l f r e q u e n c yo fL O Hinh ig h —g r a d e sq u a m o u s d y sp la siaw a s16 %a n d it w a s 26 %ine so p h a g e a l sq u a m o u scell c a r c in o m a . inh ig h g r a d e sq u a m o u sd y sp la sia , L O Hw a s d e te c te d a t m a r k e rD 9 S 30 3( 31%), D 9 S 17 1( 29 %), D 9 S 7 53( 29 %),D 9 S 162( 15%), D 9 S 24 2( 1l%), D 9 S 17 4 8 ( 7 %)a n dD 9 S 4 3( O %). In sq u a m o u scell ca r cin o m a ,L O H w a s d e te c te da s f o llo w s: D 9 S 7 53( 4 3%), D 9 S 30 3( 38 %), D 9 S 17 1( 36 %), D 9 S 16 2( 36%), D 9 S 24 2( 17 %), D 9S17 4 8 ( 17 %)a n dD 9 S 4 3( O %), 2. T h e f r e q u e n c yo fL O Hin th e s e v e nm icr o sa tellite m a r k e r s w a s Ib u n dn o a sso cia te d w ith th esex , d if f er en tia tio n , a n do c c u r r e n c e o fly m p hn o d em eta sta sis( P > O . 0 5), b u tw a ssh o w e dsig n if ica n td if f e r e n ce w ith th e e n te r o nf a m ilyh isto r yfx2= 4 . 8 6 , P < 0 . 0 5; x 2= 5. 1 1, P < 0. 05).C o n c lu sio n s: 1. T h ep r o g r e ssio nf r o m n o r m a lsq u a m o u s e p ith e liu mtoh ig h —g r a d e sq u a m o u sd y sp la siaa n dsu b se q u e n tlytosq u a m o u scell c a r c in o m a o fth ee so p h a g u sw a s a sso c ia te d w itha c c u m u la tio n o fg e n e ticer r o r s. 2. T h ep 15g e n ein a ctiv a tio n h a dap o ssib le r ela tio n sh ipw ith th ed e v e lo p m e n ta n dp r o g r e ssio no fe so p h a g e a l sq u a m o u scellc a r c in o m a , 3. P o ssib le tu m o rsu p p r e sso r g e n e sa t o rn e a r D 9 S16 2m a yb e r ela ted to th ep r o g r e ssio no fe so p b a g e a l sq u a m o u sccll c a r c in o m a . 4 . P o ssib le tu m o rsu p p r e sso r g e n e sr ela ted to th ed e v e lo p m e n to fe so p h a g e a lsq u a m o u scell c a r c in o m am a yex ist n e a r c h r o m o so m e9 p . 5. T h ef r e q u e n c yo fL O Hin c a s e sw ithe n te r o nf a m ilyh isto r yw a ssig n if ica n tly h ig h e rth a nin c a s e s w ithn oe n te r o nf a m ily h isto ry .K e yw o r d s: E S C C , e so p h a g e a l h ig h - g r a d esq u a m o u sd y sp la sia , 7 f S G L O H 食管鳞状细胞癌9 号染色体等位基因杂合性丢失的研究刖舌食管癌( eso p h a g ea l c a r c in o m a , E C )是世界上最常见的10 种恶性肿瘤之一, 每年新增患者超过30 0 0 0 0 人, 并¨ 大多发生在发展叫J困家…。 我I竭食管癌占恶性J】 lI|瘤发病的筇四位, 并且以E S C C 为主。 近10 年来对食管癌分子遗传基础研究进展很快, 已经汪明在E C 中存在一些有规徘的染也体改变口l, 但其发生发展的分子机制仍不十分清楚。 在J】 【IJ瘤研究中, L O I- I是一种常川的等位赫凶缺失检测方法, 广泛用于候选T S G 的筛选和已知‘I'S G失活机制的阐明等方丽, 而且等位基因异常在多种肿瘤中被证明是肿瘌发生的早期分子事件, 因此L O H 检测可塑成为J|lIl癖筛查和早期诊断的重要: [ 具。 一股认为, 如果发现某一肿瘤某一染色体位点有较高的L O H 和M S l( m icr o sa te llite in sta bility ), 往往标志这一位点可能存在该肿瘤的T S G Ⅲ, 但目前尚未发现与食管癌发生发展相关特异的T S G 。 需要¨ - . 11“cb的是, 肿瘤的发生可能是众多失活T S G 帅同作用的结果。 9 号染色体上存在许多已知的T S G , 如属于IN K 4 1家族的位于9 p 21的p 16 和p 15基因、 9 q 22的P T C H 基因、 9 q 32的D E C l基因、 9 q 32. 33的D B C C R I基因等等, 我们通过显微切割、 P C R 、 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、 A g N 0 3染色等技术, 检测食管高级不典型增生和鳞癌组织中9 号染色体上7个微卫星位点的L O H 情况, 并就L O H 率与患者的临床病理参数、 消化道肿瘤家族史进行相关分析, 探讨E S C C 发生发展过程中的基因变化, 为E S C C 的早期诊断及遗传学研究探索新的途径。材料与方法1. 研究材料: 4 5例E S C C 标本( 均伴有高级别不典型增生及jE 常组织)均来自山西省刖, 癌医院, 按照世界卫生组织20 0 3年新标准进行病理分级、 分期E 47 。 所有标本切除后立即无菌取材, 7 0 %酒精固定, 常规石虫凿包埋, 同时收集病人有关的临床病理及流行病学资料( 附表1)。2。 主要试剂及仪器:引物: R esea rchG e n e tic s公司( 美国)( 附表2)蛋白酶K : S IG M A 。 公司T a q D N A 聚合酶: P r o m e g a 公司基因扩增仪: T C 一4 8 /H ( t)M JR E S E A R C H , IN C ( 美国)高压电泳仪: E C 30 0 0 —9 0E . CA p p a r a tu sC o r p o r a tio n ( 美国)3. 方法:3. 1制片: 选定具有鳞状细胞痛、 高级别不典型增生及jli常组织的蜡块, 切取5um . 7li m厚的切片lO 张, 取其中l张做H . E 染色, 供判断病变部位和显微切割参照用。 其余切片采_ }j{ |改良H E 染色: 常规脱蜡, 去离子水冲沈一次; 快速伊红染色, 去离子水冲洗两次, 浸泡在10 %的甘油T E 缓冲液中待用。3. 2配制1%蛋白酶K 组织消化液: 配制蛋白酶K 的缓冲液: 取O . 5%’ [ 'w een 1m L , 0 . 5M |||{ 】 E D T A0 . 4 m 1. ( P H = 8 . 0 ), 1M 的tris. H C L 10 m l, ( P I—I= 8 . 5), 加去离予水至20 0 m l; 墩冻存的1%蛋白酶K 2 0 uL , 加入4 8 0 l- tLJ_ j勺蛋门黼K 缓冲液, Ⅱ ¨ 得- 2. U ±I!I织消化液500uL ,分装至50uL 。3. 3显微切割并制备目的D N A : 将改良H E 染包的组织叨片%7 1二盟微镜: I二作台一I二, 根据H E染色切片所示区域, 在低倍显微镜下找到曰f J',J自ll胞区, 用…次性的无菌皮试针头在被切割组织周围刻划, 将目的细J他与周围组织分离, 然后用针尖粘工0 ( 纯目的细胞组织pJ( 鳞状细胞癌、 高级别不_ b 型增生及正常组织, 附图l一6 ), 分别放入已标记好的_ { { il有1%蛋白酶K消化液的e p p e n d o f f 小试管中。 37 ℃恒温消化24 . 4 8 小时, 9 5℃灭活蛋白酶K10 分钟, 离心后取上清制成样本D N A 液, 准备P C R 。3. 4P C R 扩增: 反应体系: lOuL ( 包括d d H 20 57uL 、 10 x b u [ 1'er 液1 0u L 、 d N T P2. 5m m o L /t。O . 8 u L 、 引物20 pm o L /L 0 . 2 pL 、 T a q 酶5U /uL 0 . 1 uL 、 待扩增样本D N A 液2. 0 ln , ); 反应条件: 9 5℃变性10 分钟、 9 5℃变性1分钟, 54 —58 ℃退火1分钟, 7 2* ( 2延伸l 9'01', 35个循环、 7 2。 C 延仲10 分钟: 取出P C R 反应管后立刻放入冰盒中, 进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。3. 5 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳: 取4 0 %聚丙烯酰胺母液15m l, 加入尿素4 8 克, 5× T B E20 m L , 加水至10 0 m L ; 用前Ic己上述液8 0 m L , 加入50 0uL 的A P S 和3 5uL 的T E M E D 混匀制成6%变性聚丙烯酰股凝胶。 取P C R 扩增产物5uL 加上样缓冲液1 uL ’ 在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中进行高压h 乜泳( 6 0W '18 0 0 V ), 根据P C R 扩增片段的大小, 电泳1. 5. 2. 5小时。3. 6A g N q 染色: 10%乙酸1000毫升, 30分钟, 去离予水冲洗1次; 1. 5%硝酸1000毫升10分钟, 去离子水冲洗1次; o . 2%硝酸银10 0 0 毫升30 分钟, 去离子水冲洗1次: 3%的无水碳酸钠加O . 0 7 5%的甲醛10 0 0 毫升, 时问依显色情况而定; 10 %乙酸10 0 0 毫升终』 I二显色5分钟; 去离予水冲洗1次, 室温凉干。3. 7 照相、 统计4 . 结果判断: 参照T o m lin so n el d 产1的判断标准: 当扩增产物为2条分开的主要条带时,说明此位点为杂台性, 判为有意义的信息个体。 J|l|l瘸条带“t, 的~条信号强度与其正常对照组织相应产物比较, 如减弱50 %以上或消失, 判断为杂合性丢失; 与正常对照相比, 如显示两个密度相似的条带, 判为未丢失; 当样本的iE 常对照组织的扩增产物仅为1条时, 醮明此位点为纯合子, 为非信息个体。5. 统讣分析: 采用S P S S l 1. 0 软件对L O H 率和各I临床病理参数及家族史进行处理( x2检验), 耿P < 0 . 0 5有意义。结果1. 临床病理资料: 4 5例伴有高级不典型增生的E S C C 患者, 男29 例, 女16 例, 年龄4 1. 7 0岁, 平均年龄为65. 2岁; 商分化5例, 中分化34 例, 低分化6例: 15例伴有淋巴结转移;20 例一一级亲属有消化道恶性肿瘤史( 附表1)。 2. 等位基因的L O H : 4 5例E S C C 标本中7 个微卫星点的检测绱粜见表1、 附表1利I4,1吲7 一13。 有信息的病例中, 高级不媳型增生总L O H 率为16 %, 食管鳞煽总L O H 率为26 %;高级不典型增生组织中, 7 个微卫星位点的L O H 依次为D 9 S 30 3( 31%)、 D 9 S 17 1( 29 %)、D 9 S 7 53( 29 %)、 D 9 S 16 2( 15%)、 D 9 S 24 2( 1l%)、 D 9 S 17 4 8 ( 7 %)、 D 9 S 4 3( O %); 在食管鳞癌组织中, 7 个微卫星位点的L O H 率依次为D 9 S 7 53( 4 3%)、 D 9 S 30 3( 38 %)、 D 9 S 17 1( 36 %)、 D 9 S 16 2 ( 36 %)、 D 9 S 2 4 2 ( 17 %)、 D 9 S 17 4 8 ( 17 %)D 9 S 4 3( O %)。 C la u d ia …认为假如~个基因位点缺失率> 20 %, 可认为有相关性, 提示有T S G 的存在。 本实验结果提示在D 9 S 7 53、 D 9 S 30 3、 D 9 S 17 1、 D 9 S 16 2 4 个位点出现有意义的L O I—I, 提示这4 个位点或其附近可能存在与E S C C 发生发展相关的T S G 。表1: 4 5例伴有高级不典型增生的E S C C 患者的L O II检测结果3. L O H 检测结果与各临床病理参数: 应用S P S S l1. 0 软件对7 个微卫星位点L O H 检测结果与患者的性别、 病理组织学分化、 消化道肿瘤家族史及淋巴结转移情况进行x2检验( 见表2)。 无论在高级不典型增生还是在癌组织中, 有消化道刖r瘤家族史病例的L O H 率明显高于无家族史的病例fx2= 4 . 8 6 , P < 0 . 0 5; x2= 5. 11, P < 0 , 0 5)o 在不同性别、 分化及淋巴结转移之间差异不显著( P > O . 05)。表2: L O H 检测结果和各临床病理参数的关系分化家族史L 转移女16高分化5中分化34低分化6有2 0无有2 51 50 . 7 7 0 8O . 0900 2 7 50 . 6122l80 . 9 331155O2 3IlO . 26l5118215101l42 280 0 2 3 70 . 7 24b94悖●7”6博H7●”5B89他 讨论食管瘸的发生是环境吲素和宿主因素相互作用的结果, 涉及多因素的作用、 多, . E 因的变化利多阶段的发展过程, 其中一项重要的遗传变化就是多种T S G 的失活和癌基因的激活[ 8 1, 研究发现7 I、 S G 的失活常伴有邻近D N A 多态标记的丢失, 若观察到癌组织的某…染包体区域频发的L O F I, 此现象提示目标区域可能存在与所研究肿瘤相关的‘F S G I…。叭j0食管癌组织中的一些染包体L O H 频发部位已被发现I…引。 最近, 以L O H 为基础的微: lj星分析以及快速的D N A 微『虾列( D N Aa r r a y )分析已经成为克隆与鉴定新的食管癌牛H 关摧因的有效手段, 然而目前尚未发现直接与食管癌相关的基因, 因此探索食管瘸相关基因刈食管癌的基础研究和早期治疗有着重要的意义。 我们的研究间隔选取了位于9 号染色体|二的7个微卫星位点并列其发生的L O H 情况进行了检测和分析。1. 9 p 和相关T S G 的分析P 16和P 15属于IN K 4 I( cy clin —d ep en d en tk in a se 4in h ibito rs)家族, 都定位于9 p 21, 在细胞周期G ¨ 调训控细胞增生。 P 16蛋白为C D K 4 特异性抑制剂, 通过与cy clinD —C D K 4 复合物紧密结合或与C D K 4 结合竞争性地阻断c y c linD . C D K 4 复合物的形成, 维持R B 蛋白非磷酸化状态, 不能释放转录因子E 2F , 从而阻止细胞从G 1期进入S 期, 抑制细胞增殖。H a n n o ne ta lIl圳还发现P 16蛋白用同样的方式与同C D K 4 结构功能相似的另一个激酶C D K 6的作用。 P 15从P 16 分离而来, 与P 16 有9 5%的序列相同, P 16 的改变往往伴有P 15的改变【l” ” J, 目前已被认为是另一个具有研究意义的新的抑癌基因。 P 16耵】 P 15通过不同的机制失活【2“” I, P 16 失活占优势作用的是启动子区C P G 岛异常甲基化, 突变和纯合性缺失相对较低, 而P 15常发生纯合性缺失。