2019年5月16日,来自英国剑桥大学医学研究委员会分子生物学实验室的Jason W. Chin团队在Nature发表题为Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome的文章,介绍了该团队人工合成并替换了全部的4Mb大肠杆菌基因组,并将其中丝氨酸的密码子TCG和TCA替换为同义密码子AGC、AGT,琥珀密码子TAG替换为TAA,成功构建一株只有61个密码子的大肠杆菌。
作者首先设计了开放阅读框(open reading frame, ORF)内基因序列TCG,TCA,TAG替换为AGC,AGT和TAA的基因组序列。但部分密码子出现在两个ORF的重叠区域。当重叠区域所属的ORF方向相反时,作者将重叠区复制成两份,分别连接到两个ORF的3’端;当所属ORF的方向相同时,将重叠区域复制并在之间插入重叠区域上游20bp的序列(图1)。最终,作者设计了3,978,937 bp的大肠杆菌基因组序列。
图1:同义密码子压缩的基因组设计。
为把大肠杆菌基因组替换为设计的基因组序列,作者将设计的基因组分成8个sections,每个section约0.5 Mb;再将每个section划分为4-5个fragments,得到37个fragments。划分的位置尽量避开必需基因。每个fragment在进一步分成9-14个stretch,每个stretch长度在10 kb左右。在酵母中利用同源重组的方法将stretch连接成fragment,并组装成细菌人工染色体。片段两侧连接正负筛选的标记和同源臂,利用之前已建立的REXER4技术将fragment重组替换大肠杆菌基因组对应的部分(图2A)。迭代使用REXER4技术,将4-5个fragment替换到基因组中,形成完整的section(图2B)。最终得到不同Section替代的7株大肠杆菌(section A和B在同一株大肠杆菌中)。
图2:REXER(A)及迭代REXER(B)示意图【9】。正负筛选标记+1:KanR;-1:rpsL;+2:CmR;-2:sacB。
接着,作者对构建的section进行测序,验证同义密码子是否完全被替换。结果发现仍有一些丝氨酸密码子未被替换,包括必需基因map(methionine amino peptidase)