大会特别感谢东道主上海第二医科大学,瑞金医院,瑞金临床医 DMD基因及其产物检测的临床价值一 摘要:目的针对DMD基因的突变特点以及由此而产生的编码产物的异常,探讨DMD基因及其编码产物——航肌营养 良蛋白的检测对于诊断疾病的意义.方法用多重PCR技术和免疫印迹技术对DMD或BMD患者的DMD 基因和抗肌营养 不良蛋白进行丁检测结果33.3%的DMD患者虽然未被检测出基因的片段性缺失,但他们的抗肌营养不良蛋白却完全丧失.结 论多重PCR 技术是检测 DMD 基因片段性缺失的有效方法.但却无法检测出点突变等微小 突变.免疫印迹技术能反映由于各 ficlemtechniquefordetectingDMDgenedeletions,butitisunabletodetectmiero-mutatiormsuchaspointmutations. cieneyofthegenecodingproductresu]tlngfromanygenemutationscartbedetectedhyWestrnblotting.therefore,Western Duehenne肌营养不良症(DMD)和Becker 肌营养 不良症(BMD)是人类最常见的x连锁隐性遗传病,发 病率分别为活产男婴的1/3500和1/30o0.DMD 因定位于Xp21.1—3,长度为2.4Mb,含79个外显子. DMD基因的编码产物为抗肌营养不良蛋白(dys— tmphin),是一种分子量为427000的棒状糖蛋白,位于 内,外钙离子的正常浓度至关重要.DMD基因的突变主 为点突变等微小突变.DMD基因的各种突变导致抗营 丧失时,患者多为DMD表型;当抗肌营养不良蛋白合 成量下降或分子量改变时,多为BMD表型[句. 目前国际对DMD或BMD 的实验室诊断主要依赖 DMD基因的检测及基因编码产物的检测.前者主要 等技术.我们采用多重PCR和蛋白质印迹技术对DMD 和BMD患者同时进行DMD 基因检测以及抗肌营养不 良蛋白检测,并就这两种检测对于诊断DMD和BMD l_1患者来源 r_『:例实验谚断学1999年12 消毒后切开,取一块大小约0.3cm3的肌肉组织并将其 1.2实验材料 1.2.1试剂TaqDNA 聚合酶为上海生工生物工程有 限公司产品;dNTP为Pharmacla 公司产品;鼠抗人dys— trophin抗体为Castrava 公司产品(由巴黎第五大学 Kaplan教授惠赠);辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 抗体为华美公司产品{ECL检测系统为Amersham公司 产品.所用引物按ChamberlainI1和BeggsE21 设计的序列 由上海生T生物工程公司合成.Chambedain 引物系列 中加入扩增第46号外显子引物一对,本文称其为反应 体系I,Beggs引物系列被称为反应体系. 1.2.2仪器BioRed 垂直电泳与转移槽:AmplitronII Thennaline扩增仪. 1.3实验方法 1.3.1多重PCR 取患者外周血按常规方法抽取DNA 制各模板后进行PCR反应.反应体系I 内含l0 对引物 (分别扩增第45,48,19,17,51,8,12,44,4和46 号外 7mmoI/LMgCI2,6.7mo1/LEDTA.DNA模板为 200ng,反应体积为50I.PCR反应程序为:96预变 性7min后,加入4UTaqDNA 聚合酶,并按96oc30s, 56oc90s,722min的条件进行30 次循环反应,最后 于70oc延长lOmin.反应体系II 增Pm,第3,43,5O,13,6,47,60和52 号外显子外,其 余条件均与反应体系I相同. PCR反应产物经3%琼脂糖(低熔点琼脂糖:普通 1.3.2蛋白质印迹技术具体操作目,简述如下:15 右的冷冻肌肉组织放入300I标本处理液内粉碎后于 沸水中加热3rain离心后取2OI 上清液在浓度为4% 20mA电泳1.5h.将电泳后的凝胶置转移液中作用 皎上,装入垂直转移装置,于40V电压下转移1.5h.转 移结束后将鼠抗人dystrophin单克隆抗体经适度稀释 次漂洗后再与经辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体 在室温下反应45rain.反应完成后将膜漂洗3次并进行 的面积加入适量等体积的ECL反应液,作用lmin 薄膜于暗室内压片曝光,l~5min后显影. 临床诊断为DMD或BMD 的患者用 多重PCR技术检测其DMD 基因以及用免疫印迹技术 检测其抗肌营养不良蛋白,发现3种情况:7 例患者 呈DMD基因片段性缺失,他们的抗肌营养不良蛋白亦 完全丧失;1例患者(CZ)的多重PCRI 显示其缺 失第45,48和46 外显子(图1),在PCRII 中显示其缺 失第47外显子(图2),提示该患者至少缺失第45 第48外显子,但是其抗肌营养不良蛋白却并未完全丧 例DMD患者虽未被检测出DMD 基因缺失(图l,图 多重PCRI显示第1 泳道为正常对照:第6 泳道I 患者 和第1O条带,相应于第45,48 和46 外显子: 多重PCRlI显示第l 泳道为正常对照:第6 泳道(患者 CZ)映失第7条带相应于第47 外显子:其余泳道显示患者均 DMD和BMD 是由于DMD 基因发生突变,引起相 及各种微小突变.用Chamberlain和Beggs 所设计的引 物以多重PCR技术可以检测出98%的片段性异常[71,但 免疫f-f3~技术显示第1泳道为正常对照}第3 泳道(患者 用多重PcR技术对l2 例临床诊断为DMD BMD的患者进行DMD 基因检测,8 例患者(66.7%)表 营养不良蛋白完全丧失,可确诊为DMD,l例抗肌营养 不良蛋白部分丧失,可确诊为BMD.其余4例患者(33. 蛋白均完全丧失.我们推测这可能是由于DMD基因的 某些无法用多重PCR技术检测出的微小突变导致了抗 显的DMD基因片段性缺失,但由于他们的抗肌营养不 良蛋白完全丧失,DMD的诊断仍然能够确立.因此我们 认为,检测DMD基因的表达产物能够更全面地反映该 基因的状况,有利于DMD和BMD 的确实诊断. DMD基因微小突变的研究(包括分布热点和检测 技术)是国内外近几年的热门课题.由于DMD基因庞 采用DGGE,SSCP和异源二聚体分析(hetemduplex analysis,HDA)q等技术,但由于该基因的突变特点, DMD基因无义突变的虽有效方法l1]】.m试验基于无 膝这一原理.但是P1Tr只能检测无义突变,对不产生截 DMD基因的各种微小突变,在未检测出确切的基因异 者诊断为DMD或BMD 不太妥当这是因为有些常染 激酶,肌电图等方面均与DMD相似而曾被称为 Duchenne样肌营养不良症(Duchermelikemuscular 临床疑为DMD或BMD 而未被检测出基因异常时,应 床病理性后果的DMD基因的改变都可以根据抗肌营 基因的表达产物在某些情况下更有利于DMD和BMD 作者简介:樊琦诗,女,46岁.检验科副主任.副研完员,法国理 2B喈AlI,KoeingBo~,eeFD.eta1.Detectiond98%ofDMD/BMD 5Coral-VazquezfLArn聃D.Cisner~sB,eta1.Patternofdeletlot~of 6ArabataJ【.HotD且nEPardy? dy鲁砷ph 血gene:APplicationtopointmutationandCfiXTtU~”detection.