细胞培养过程中,无论是配制试剂还是水浴锅中用于细胞复苏的水,都需要使用超纯水;并且,即使冻存管是使用封口膜封存的,也要在超纯水中复苏才可以。
与此同时,人员流动也是细胞间无法控制的污染原因之一。人员流动本身就会携带很多灰尘,而细菌就会附集在灰尘之中,细胞间的无菌服除了需要定期清洗更换外,在穿着上也有要求。如下图所示,正规穿法是将白大衣的袖口掖到手套里,皮肤、头发或者女生佩戴的饰品都不可以暴露在超净台下。所以如果你不爱洗澡,也请你离细胞间远一点。
那么遇到细菌污染的情况下,我们该怎么处理?
如果污染较小,可以把庆大霉素、万古霉素或氨卡青霉素加入培养液中,具体的使用量按照说明书配制就可以了,24小时后换液。如果上述这些药物不方便购买,也可以去药店购买这种左氧氟沙星的注射液。刚发现细胞污染的时候,可以在6cm培养皿中加入500ul左氧氟沙星的注射液,每隔24小时换一次液,之后依次是300ul、100ul,基本上3-4天后就可以改善污染情况。但是上述的做法多多少少都会损伤细胞,所以如果细胞存量还有很多,建议发现污染就直接扔掉。
下面这张图拍摄的是20倍镜下肺微血管内皮细胞的状态。图中大致可看到内皮细胞开始出现老化的状态,而我用红色圈出的地方,镜下可见细胞质中有多个空泡(拍摄的效果不是很清晰)。有人说,内皮细胞是一种“很脏”的细胞,因为在培养过程中细胞之间的挤压和叠加,视觉下会看到很多圆形结构。这种情况不一样,细胞质和细胞核中出现很多空泡,这是很明显的异常显现,但即便如此培养基的颜色并没有发生变化,细胞仍在继续分裂生长,只是形态发生老化而已。
这种情况基本上可以判定是支原体污染了。细胞受到支原体污染后比真菌污染更难发现。最开始的阶段,细胞不会发生任何变化,培养基的颜色和细胞状态都不会有任何差别。当你传代几次之后,你会发现细胞生长速度缓慢,形态开始老化。如果不仔细观察细胞内部的变化,我们很容易将其归结于由于个人处理不当导致的细胞老化。这也提醒我们一点,日常观察细胞状态如何,不只是看有没有细胞死亡这么简单。
支原体污染后的细胞,高倍镜下可见细胞核或胞浆内会出现大小不等的空泡,细胞经常表现出一种突然暴毙的状况,而我们也很难找到具体是在哪一阶段感染了支原体。所以即使在这期间冻存细胞,再次复苏后,仍会有支原体污染的情况存在。
支原体污染影响的不仅是细胞形态和生长速度,也会改变细胞的自身的特性,诱导染色体发生改变,所以即使细胞没有死,也一样会对实验结果产生影响。
目前很多试剂公司都有针对支原体污染的抑制剂,但是价格都不便宜。支原体污染和细菌或真菌污染还有所不同,一旦发现支原体污染,很可能是一个孵箱或一个实验室的整体问题,而不是个人情况。所以为了预防支原体污染和扩散,最好的办法就是一经发现马上扔掉以及定期清理消毒细胞间。
我还没有经历过真菌污染的情况,所以不能为大家分享这方面的处理方法。但是除了上述说的两种问题,还有一种是细胞间的不可抗力—有些人某一时间段养什么细胞都会死,排查了所有可疑点,都找不到污染原因。遇到这样的情况,我们只能让他冷静冷静,远离细胞间一段时间,然后就好了。
So,你和你的细胞经历过水逆吗?