2 方法2.1 大鼠MCAO模型的复制
采用线栓法制备急性大鼠脑缺血/再灌注模型,具体方法在参考文献[4]方法的基础上加以改进:术前大鼠禁食12 h,自由饮水,手术过程中用10%水合氯醛0.3 g·kg-1腹腔注射麻醉。待大鼠翻正反射消失后,取仰卧位固定,剪去颈部被毛,消毒,正中切口。于气管左侧找到颈总动脉(common carotid artery,CCA),结扎CCA近心端、远心端被线,再分离颈外动脉(external carotid artery,ECA)和颈内动脉(internal carotid artery,ICA),结扎ECA,在ICA远端放置动脉夹,CCA切口,近心端距分叉处4 mm切口插入直径为0.285 mm、头端打磨光滑的鱼线,直视下进入颈内动脉,插入长度约为20 mm,完全阻断其对大脑中动脉的供血,固定栓线。缺血2 h后再灌注时,轻柔回抽鱼线约10 mm。术中和术后保持室温25℃左右,同时白炽灯照动物使其肛温维持在(37±1)℃,直到动物恢复活动。假手术组动物除不插入鱼线外,其余操作同模型动物。
2.2 动物分组与给药
手术动物术后按照Longa等[4]的5分制评分标准进行分级评分:0分,无明显神经损伤症状;1分,不能完全伸展对侧前爪;2分,向对侧转圈;3分,向对侧倾倒;4分,不能自发行走,意识丧失。评分为1~3分者入选本次实验,其余评分动物剔除。本次实验造模成功率约50%,将复制成功的模型动物随机分为MCAO模型组,Nim组和AH 1.2、0.6、0.3、0.15 mg·kg-14个剂量组。再灌注时假手术组注射生理盐水,Nim组注射尼莫地平注射液1 mg·kg-1,AH各剂量组对应尾静脉注射AH 1.2、0.6、0.3、0.15 mg·kg-1,再灌注6 h同法进行第2次给药,共计给药2次。
2.3 PC12细胞的培养及氧糖剥夺再灌注(oxygen and glucose deprivation -reperfusion, OGD-R)模型的复制
PC12细胞用含10%小牛血清的DMEM高糖培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。当显微镜下观察到细胞覆盖瓶底约达70%~80%时,用0.25%胰蛋白酶消化离心,完全培养基重悬,调节细胞浓度为2×108·L-1接种于60 cm培养皿中,设空白对照组(cont