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silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 鼓励新虫发帖交流2012-04-24 10:21:02
没叙述清楚,不知道引物F有没有PmeI酶切位点,如果没有,建议还是用高保真酶,免得在其末端引入其他碱基,没得到平末端;载体去磷酸化是必须的。
方案设计不合理,如果下面的改动不影响,试试改一下:
方案1,插入片段不要加PmeI等酶切位点,直接引物磷酸化后高保真酶PCR,连接到PmeI酶切去磷酸化载体,这种情况下,加PmeI才会只切开载体而不是重组质粒,插入片段既然是平末端连接,用的酶又不是常见酶,不如直接高保真PCR得到平末端;
方案2,载体经过PmeI酶切后用聚合酶在末端加T,插入片段用非高保真酶PCR,进行TA克隆。