引物序列验证引物设计完成之后,需要用软件进行分析,找到最佳的引物对,采用Blast 分析验证引 物,可以知道序列的正确性,也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及PCR 产物 的大小。 先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA 序列,可以通过全文(如最 先发现该基因的文章),全文中有时可以找到大鼠 c-jun mRNA 序列的 ACCESSION NUMBER,在PubMed 中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER 就能找到序列。 可以利用这个ACCESSION NUMBER 在PubMed 中的“Nucleotide”中搜索到序列后,点 击右边的“Links”,再点击里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠 c-jun mRNA 序列及其他物种的一些c-jun mRNA 序列。 文献中的引物最好先验证其序列正确,并用软件分析引物比较好后再采用。通过BLAST 验证,既可知道序列是否正确,也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR 产物的大 如果仅仅是为了验证引物序列是否正确(仅适合于基于完全匹配原则设计的引物),也可以用 Blast 的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search short,nearly exact matches”搜索,具体方法为: 打开Blast,点击“Nucleotide-nucleotideBLAST (blastn)”或“Search short,nearly exact matches” 等新页面完全显示后,将引物序列直接copy 到“Search”框(没有必要将下游引 物序列转换成其互补链),下面3种方法都可以(我觉得这3种方法的搜索结果没有什么区别, 没仔细比较过哦!) (1)直接拷贝上游引物序列,然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面 (2)直接拷贝上游引物序列,在上游引物序列后加一空格,然后直接将下游引物序列拷 贝在空格后面 (3)直接拷贝上游引物序列,换行,然后直接拷贝下游引物序列 注意:记住上、下游引物的长度,如上游引物为19bp、下游引物为18bp,这在查看Blast 结果时有用。 结果完全出来后,查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因,其他的就不用考虑了。当然,如果下游引物序列所对应的基因片段的3´端正好和上游引物序列的3´端的1或2 个碱基互补,那就可能是19-37或18-37。 如果有,那你的引物序列就是正确的。从文献上查的引物,除了要用Blast 验证其序列 是否正确外,还是应该用软件分析分析到底引物好不好。 实例 1、进入网页:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 2、点击Search short,nearly exact matches 在search栏中输入引物系列: 注:文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’; 5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’ (1)输入方法可先输入上游引物,进行blast 程序,同样方法在进行下游引物的blast 这种方法叫繁琐,而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列,还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。 (2)简便的做法是同时输入上下游引物:有以下两种方法。输入上下游引物系列都从 A、输入上游引物空格 输入下游引物 B、输入上游引物 回车 输入下游引物 advancedblasting selectfrom 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】 Expect 后面的数字改为10 5、在format selectfrom 栏通过菜单选择Homo sapiens【ORGN】 Expect 后面的数字填上0 10 BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast 的结果。 (1)图形格式: 图中代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40~50分 图中代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40~50分,而与下游引物不互补 图中代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分,而与上游引物不匹配 通过点击相应的bar 可以得到匹配情况的详细信息。 (2)结果信息概要: 从左到右分别为: A、数据库系列的身份证:点击之后可以获得该序列的信息 B、系列的简单描述 C、高比值片段对(high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大 到小排列。得分的计算公式=匹配的碱基2+0.1。举例:如果有20个碱基匹配,则其得分 为40.1。 valuedecreases exponentially matchbetween two sequences increases】。E 值最低的最有意义,也就是说序列的相似性最大。设定的E 值是我们限定的 上限,E 值太高的就不显示了 E、最后一栏有的有UEG 的字样,其中: U代表:Unigene 数据库 代表:GEOprofiles 数据库 代表:Gene数据库 (3)结果详细信息: 圈出来的部分代表序列的信息 第一个大括号代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况: 共有21个碱基匹配,得分42.1分【212+0.1=42.1】,E 值为0.020 上游引物与序列的2143~2163位点匹配 第二个大括号代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况: 共有20个碱基匹配,得分40.1分【202+0.1=40.1】,E 值为0.077。 下游引物与该序列的29360~29379位点互补 注意点: 上游引物为20个碱基,为什么会变成21个碱基呢?这是因为下游引物的第一个碱基为 T,刚好与系列的2163位点的T 匹配,因此下游引物的开头的第一个碱基被当成了上游引物 了。同理,上游引物的最后一个碱基为G,被当成了下游引物了。通过寻找有没有与1~20 位点、20~40位点完全匹配的序列,就可以避免这个因素的干扰了。 为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种? 为同一个基因来源的不同的mRNA片段 为该基因的DNA系列 为同一个基因来源的不同的cDNA克隆片段。 结果判断: 验证文献报道的引物是否正确:如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因,一 般说明你的引物正确性没问题。如果你blast 后没有发现你的目的基因,或者分值很低,该 引物就可能不适合用 检测该引物是否存有同源序列相匹配,造成PCR 反应的非特异扩增。