一、试剂准备 1. 预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机。 2. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS。 3. 加入预冷的RIPA Buffer(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶,0.5 ml/5×106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶)。 4. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15 min(EP管插冰上,置水平摇床上)。 5. 4℃,14000 g离心15 min,立即将上清转移到一个新的离心管中。 6. 准备Protein A agarose,用PBS 清洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。 7. 每1 ml总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10 min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景。 8. 4℃,14000 g离心1 5min,将上清转到一个新的离心管中,除去Protein A的珠子。
9. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)。 10. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度稍高(如10 μg/μl)。 11. 加入一定体积的兔抗到500 μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。 12. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。 13. 加入100 μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1 h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)。 14. 14000 rpm瞬时离心5 s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800 μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS。 15. 用60 μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)。 16. 将上样样品煮5 min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5 min变性。
二、免疫共沉淀反应 1. 转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30 min,细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清; 2. 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜; 3. 取10 μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3 000 rpm离心3 min; 4.. 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4 h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连; 5. 免疫沉淀反应之后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心的吸去,琼脂糖珠用1 ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15 μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟; 6. SDS-PAGE,Western blotting或质谱仪分析。
三、通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中; 2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 ; 3.收集上清(约30 ml)并加入30 μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h; 4.加0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min; 5.先用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,然后再重复洗5次。最后,用NETN洗一次;
6.吸取出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min; 7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜; 8.通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带; 9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1 ml 50%乙腈洗两次,每次3 min; 10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱; 11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
1. 使用对照抗体: 单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体:正常兔IgG 2.确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。 3.要先确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。