直链淀粉与支链淀粉的分离方法 摘 要: 按照溶解度差异和分子特性差异两种分离原理, 直链淀粉与支链淀粉的分离方法 分别有温水抽提法、配合剂分离盐类分离法、 控制结晶法以及色谱法和纤维素吸附法等。 对这些方法进行了综述及分析比较。 关键词: 直链淀粉 支链淀粉 分离 淀粉既可供食用又可做工业原料。Mever K H 等人指出淀粉不是单一的物质,而是直链淀粉 和支链淀粉的混合物。直链淀粉是线性直链状分子的多糖,支链淀粉具高度分支的多糖。 分离直链淀粉和支链淀粉的方法有很多, 主要有 2 类。 一类方法是以溶解度的差异为依 据,它包括温水抽提法,配合剂分离法,盐类分离法,聚合物控制结晶法。另一类方法是以 直链和支链淀粉分子结构特性差异为依据,象色谱分离和纤维素吸附法。 1 根据不同的溶解度讲行分离 1.1 温水抽提法 Meyer 等人最早采用温水抽提法分离直链淀粉和支链淀粉,发现其结构差异。温水抽提 法是将脱脂的淀粉在略高于该淀粉糊化温度的热水中进行搅拌、抽提。在温度为 57-100℃ 的水中溶涨的淀粉团粒容易浸提。 流动的直钵淀粉分从溶胀团粒中渗透出来, 而团粒却保持 完整,此时大多数链淀粉仍以氢键结合,或处于结晶状态留在团粒中。存有存在时一部分抽 提物会氧化分解而成低分子直铸淀粉 Baum,Gilbel 将淀粉粒在氮气流下用 0.5 mol/L NaOH 溶 液浮 30 min,然后用 40000g 离心 2h,上部清液经过中和、浓缩脱水后得直链淀粉。 此方法中温度影响淀粉的抽提效率。 一般抽提温度稍高天淀粉的糊化温度。 若温度太高, 则直链淀粉的抽提效率高,但支链淀粉也会被抽提出来,纯度差;若温度太低,则抽提效率 低直链淀粉得率也低。 1.2 配合列分离法 配合剂 分离法中以 Schoch 的丁醇法最为有名。该法是往淀粉中加入正丁醇进行冷却, 使直链淀粉-正丁醇复合物沉淀出来。可以用来形成复合物的试剂有很多,把它们分类如下。 溶剂:脂肪属醇、二噁烷、氯酸戊酯,丁酮、吡啶。 硝基化合物:硝基乙烷、硝基丙烷、硝基苯、硝基链烷烃。 其他:百里酚、高级脂肪酸、溶血卵磷脂。 1984 年 Paul Colonna 和 Christiane Mercier 采用 Banks 和 Greenwood 在 1967 年提出的基 本方法分离从光皮和皱皮豌豆中提取的淀粉, 成功地将其中的直链淀粉和支链淀粉以及中间 组分分离开来。 1984 年 Yasuhito 阁等人分离百合、木薯、马铃薯中的直链淀粉所使用的方法是将热的 含水 10%的丁醇溶液在氮气的环境下冷却,这样重结晶 3-6 次进行纯化。Yasuhito Take-da 等采用配合剂的方法从大米淀粉中分离纯化出直链淀粉。具体步骤如下:将干重为 10 g 的 大米淀粉溶解在 300 ml 二甲亚矾中,在氮气的环境下搅拌并加热至 100℃左右,然后把 300 ml 的乙醇加人到溶液中。混合物在 0℃的条件下静置几个小时之后在室温条件下离心分离 (20 min,2 500g),得到的沉淀物再重新溶解在 300 ml 二甲亚矾中。把再次用乙醇沉淀的淀 粉分散在 70 一 80℃的 400 ml 水中,然后加人 100 ml 正丁醇,100ml3-甲基-1-丁醇和 13 阅 而水。混合物在氮气环境下搅拌加热 3h,然后冷却至 50℃,在室温的条件下放置在泡沫聚 苯乙烯盒中过夜,再在 8 rC 的条件下静置 48 h。离心分离(10000g,20 min,4℃)得到的沉 淀物再分散在 1L 的含水 10%的正丁醇中,加热 1h 之后冷却,在 89C 的条件下静置 24 h。 得到的沉淀物(粗直链淀粉)分散在 450ml80~90℃的水中之后立即离心分离(100000g,日立 65P),转子(RP -42)预热到 50℃。得到的上清液中加人 550 ml 70℃的水及 100 n1 正丁醇, 将其加热 10 nun 之后用玻璃纤维(G-5)过滤,再加热几分钟之后冷却(第 1 次重结晶)。而离 心分离得到的沉淀物分散在 1L 的含水 10%的正丁醇中,再次加热。以上步骤重复 2 次(第 2 和第 3 次重结晶)。直链淀粉和正丁醇的复合物通过离心收集,再用乙醇洗出直链淀粉之后 用玻璃纤维(G-2)过滤收集,用乙醇和乙醚洗涤,然后在室温的条件下置于 CaC12 上真空 干燥。粗直链淀粉溶解在热水中呈不完全透明的溶液,不溶解的物质通过离心分离除去 (100000g,1h,~50℃) ,通过主种方法提到的大米直链淀粉的特性见表 1。 表 1 大米直链淀粉的特性 特性 碘结合力/ % 蓝值 最大吸收波长/ n m 特性粘数/ m l · g I 1 平均聚合度 平均链长 平均每个分子上的链的个数 淀粉酶解极限/ % 经普鲁兰酶作用后, 淀粉酶解极限/ % IndicaIR42 20.0 1.4 653 192 980 230 4.3 76 101 1.3 盐类分离法 同系高聚物的溶解度随分子量的增加而降低。 将非溶剂加人高聚物溶液中将会引起分子 离析和沉淀,开始析出和沉淀的是分子量较高的级分。在两种聚合物的混合物中,当其中一 种结晶趋势较小时, 加人非溶剂将会沉淀或盐析出具有较多的全同立构结构, 形成有较高结 晶倾向的另一聚合物。 盐类分离法就是利用直链和支链淀粉在盐的浓度相同的条件下盐析的 温度不同而将其分离。常用的无机盐有硫酸镁、硫酸钱和硫酸钠等。 Bus 等提出了盐类分离法。此方法的原理是在质量分数 10%~13%硫酸镁存在下,从质 量分数 10%马铃薯淀粉的水溶液中使直链淀粉分级结晶而进行分离。先将淀粉溶液在加压 下加热至 160℃使之溶解,然后冷却至 80℃,借离心作伟使沉淀的直链淀粉分离。继续冷却 至 20℃,使支链淀粉沉淀。 此方法也能够用来按分子量的不同将直链淀粉进行分级。 1.4 控制结晶分离法 淀粉溶液或淀粉糊在低温静置条件下, 直链淀粉分子就缓慢渗出, 如果适当地降低温度, 则此类分子将产生定向并从溶液中结晶出来。 这种迅速结晶的现象是结构有规律的全同立构 a-D(1-4)键键合的线性直链淀粉分子的特征。如果浓度太高或温度太低,直链分子的渗出 减慢而结晶受阻,结果取而代之的是一种三维凝胶网络,即淀粉的凝沉现象。如果支链淀粉 的线性外支链也参与凝胶的形成,那么直链和支链淀粉分离困难或成为不可能。 Etherige 等通过控制结晶过程分离出了纯度相当高的直链淀粉。 Hoffman’ Starkfarbriken s 应用以凝胶作用为基础的流体力学法分离出马铃薯直链淀粉和支链淀粉。 2 根据不同的分子结构特性进行分离 2.1 色谱法 由于直链淀粉和支链淀粉的分子结构和分子量的不同, 使得采用凝胶过滤层析分离成为 可能。 当淀粉溶液通过层析柱时, 分子直径比凝胶孔大的支链淀粉分子只经过凝胶颗粒之间 的空隙,随洗脱液一起移动,先流出柱外;而分子直径比凝胶孔小的直链淀粉分子,能够进 人凝胶相内,不能和洗脱液一样向前移动,移动的速度必然要落后于支链淀粉分子。 但由于此方法所的上样量较少, 所以多用于对已分离的直链淀粉和支链淀粉进行纯度检 验。Jane 3 和 Chen 3 就是采用 Schoch 丁醇法先对马铃薯淀粉、普通玉米和高直链玉米淀粉 珊的组分进行分离,然后用凝胶过滤层析对其纯度进行检验。具体步骤如下:选用充满 Sephamse CL-2B 的层析柱(2.6~80 cm)。采用上行洗脱模式。取淀粉溶液 5 ml(淀粉 15 mg, 0 . 75 mg 的葡萄糖作为标记)进样,洗脱液是质量分数 0.02 % NaCl 水溶液,洗脱速率 30 m1/h。每个组分收集 4.8 m1 用双管自动分析仪进行测定。对支链淀粉的链长进行分析,选 用充满 Bio-Gel P-6 的 Econo-层析柱(1.5mm x 80 cm)。该柱采用下行洗脱模式。洗脱液是重 蒸水,洗脱速率 21 ml/h,每个组分收集 2.3 ml,用同样的方法讲行测定。所得直链淀粉的 纯度见表 2。 表 2 用电位滴定法和凝胶过滤层析( S e p h a r o s e 一 2 B ) 测得的直链淀粉的纯度 直链淀粉 碘结合力/% 马铃薯 普通玉米 高直链玉米Ⅶ 19.3 18.6 19.0 电位滴定法 纯度/% 96.5 93.0 95.0 凝胶过滤层析 纯度/% 90.2 96.2 96.2 在我国张林维运用交联明胶亲和色谱法对番薯淀粉组分进行分离, 得到直链淀粉和支链淀 粉两个级分。其中洗脱液 A 为含 2.0 mol/L 尿素,0.8 x 10-3 mol/L 碘和 1.2、10-2 mol/L 碘化钾的醋酸缓冲液(pH4.8, 0.1 mol/L),洗脱液 B 为含有 8 mol/L 尿素、0.8x 10-3 mol/L 碘、1.2x10-2 mol/L 碘化钾及 1.0x10-3 mol/L 十二烷基硫酸钠的醋酸缓冲液(pH4 .8,0.1 mol /L)。玻璃柱(2.5mmx10cm)用交联明胶微粒填装,黑布遮光,用洗脱液平衡 48 h,样品上 柱后分部收集。所得结果见表 3。 表 3 番薯淀粉级分的鉴定 多糖 标准直链淀粉 标准支链淀粉 蓝值 1.42 0.20 0.24 1.38 0.95 b 淀粉酶解极限/% 98 48 50 99 98 支链淀粉① 链淀粉 ① 直链淀粉 ② 直链淀粉 注: ①为用洗脱液 A 制备的支链或直链淀粉; ②为用洗脱液 B 制备的直链淀粉。 最近应用较多的还有高效色谱柱,比如 2003 年 patindolJ 和 Wang y J 应有高效分子排 阻色谱对分离出的大米淀粉各个组分(直链淀粉、支链淀粉和中间组分)检验并应用高效阴 离子交换色谱配合脉冲安培检测计绘出了支锭淀粉经异淀粉酶脱枝且得到的链长分布图。 2002 年 Grant L A ,Ostenson A Mt Rayas Duarte P 应用高效分子排阻色谱检验各种不同的谷物 淀粉的分离组分, 确定直链淀粉和支链淀粉的含量。 直淀粉粉和支链淀粉的分离用一根柱子 在 90min 内就完成了。由引得出结论,这个方法 比笔者所比较的其他方法更快,更准确而 重现性也更好。 2.2 纤维素吸附法 利用直链淀粉能被纤维吸附而支链淀粉不能被吸附的性质可将它们分离。 将冷淀粉溶液 通过脱脂棉花柱,直链淀粉被吸附在棉花上,支链淀粉流过,直链淀粉再用热水洗涤出来。 用此方法可制得高纯度的支链淀粉。 3 结语 淀粉并不完全由直链淀粉和支链淀粉这两种极端的结构完全不同的多糖类构成, 其中还 有性质处于两者之间的多糖类存在, 这给完全分离直链淀粉和支链淀粉以及分析淀粉的性质 带来了困难。另外,热的淀粉有被空气中的氧氧化分解的可能,为了避免这种情况,需要用 氮气等惰性气体将空气完全置换掉。即使这样,淀粉在分散作用、分级分离和离心分离期间 仍能发生降解,对此的控制还有待解决。