测定原理双链DNA在热变性时吸光度的增高是温度的函数,以相对吸光度为纵坐标,温度为横坐标作图,查得吸光度增加专时的温度,即为了Tm。材料和试剂小牛胸腺DNA,溶于0.1XSSC缓冲液中。仪器UV—365型紫外—可见—近红外双光束分光光度计,带有SPR—8程序升温仪。测定步骤1.以260nm测定DNA的吸光度,按50ug/ml时A=1.00计算DNA的浓度。2.关于样品的配制,其总容积为3ml,加入DNA的量为60ug左右;吸光度在0.3—0.4之间,再加10XSSC溶液,使待测液的缓冲液最终浓度为1XSSC。3.以lXSSC为参比溶液,将参比杯和样品杯加盖密封,并在比色杯的两侧涂以硅油,样品杯放入前槽,参比杯放入后槽,将热电耦插入样品盖的金属管内,然后测定。4.在25℃测定A260、A280、A230、A260/A280应在1。75—1。85之间,A230/A260应在0.5—0.6之间。5.按下SPR—8程序升温仪的RUN键,分8步自动控制升温,在75℃后,每升高1℃记录一次吸光度值,一直到94℃吸光度不再变化为止。数据处理与计算将记录的温度和相应的吸光度整理成表,将各吸光度乘以相应温度的相对膨胀体积(VT/V25),以校正成相当于25℃水溶液体积的吸光度。用校正后的各吸光度除以25℃的吸光度,得出各个温度的相对吸光度。用各个温度和相对应的相对吸光度绘制DNA热变性曲线,热变性曲线的中点对应的温度为Tm值。最后将Tm值代入经验公式求出G-Cmol%:lXSSC G-C=(Tm一69.3)2.440.1XSSC G-C=(Tm一53.9)2.44经过氯化铯梯度离心而分离纯化的小牛胸腺DNA,其Tm为87℃,G-C含量为42%。