1. 2. 5　细胞超微结构观察　用细胞刮子刮取体外培养的第 3 代膀胱移行上皮细胞, 3% 戊二醛预固定, 1%四氧化锇再固定, 丙酮逐级脱水, Epon812 包埋, 半薄切片光学定位, 超薄切片, 醋酸铀和枸橼酸铅双重染色, 透射电镜观察细胞超微结构特征。1. 2. 6　不同代次细胞的细胞周期和DNA 倍体水平检测　取体外培养同步化后的第 2、 4、 6 代膀胱移行上皮细 胞, 以 1× 106个孔接种于 12 孔板, 每代细胞3 孔(分为接种后第3、 5、 7 天3 个时间点); 检测时用01 25%胰蛋白酶和 01 1% EDTA 混合消化液消化收集细胞,通过流式细胞仪检测 3 种不同代次膀胱移行上皮细胞的细胞周期和DNA 倍体水平有无差异。2　结果2. 1　细胞形态观察机械法分离获取幼犬膀胱黏膜层大小 4~ 6 cm每次酶消化收集到的细胞总数为 (1~ 5) × 106个。 细胞接种至培养瓶, 初期悬浮于培养液中, 呈透亮圆形;12 h 后细胞贴壁, 24 h 大量细胞贴壁, 48 h 后贴壁细胞伸展为多角形, 呈集落状生长(图 1 a) , 72 h 后细胞数量逐渐增加, 连成小片向周围生长。 随着细胞增殖,5 d 后细胞数量进一步增加, 大部分细胞融合, 至7 d可见细胞铺满培养瓶底壁80%~ 90% (图1 b) , 此时可进行细胞传代, 每5~ 7 天可传代 1 次, 细胞纯度高, 无杂细胞污染, 排列呈典型铺路石样, 至第 4~ 6 代细胞仍保持良好形态(图1 c) , 但是随着传代次数的增加, 7 代以后细胞逐渐老化, 胞核不明显, 细胞体积增大, 折光性差, 胞浆内有较多空泡形成(图 1 d)。2. 2　细胞生长曲线第 3 代犬膀胱移行上皮细胞生长曲线见图 2, 培养2,・9321・中国修复重建外科杂志 2007 年11 月第 21 卷第 11 期 7 d 细胞生长达高峰。2. 3　免疫组织化学染色抗角蛋白A E1 A E3 单克隆抗体对培养的细胞进行免疫组织化学鉴定, 细胞呈阳性反应, 多数细胞胞浆呈棕黄色, 苏木素衬染的细胞核呈蓝色 (图 3 a)。 阳性对照组犬膀胱上皮全层染色呈阳性(图 3 b) , 空白对照组(图3 c) 和阴性对照组(图3 d) 染色呈阴性, 胞浆未见着色。2. 4　细胞超微结构特点透射电镜下见膀胱移行上皮细胞超微结构清晰,胞浆内除含有正常细胞器外还可见大量的网状张力微丝, 细胞之间有桥粒连接(图 4 a); 还发现有较为幼稚的膀胱移行上皮细胞, 该类细胞体积小, 表面可见大量微绒毛, 细胞核大而圆, 核仁明显, 常染色质丰富, 异染色质较少, 胞浆内有典型张力微丝和丰富的线粒体, 该细胞具有较强的分裂增殖能力 (图 4 b)。2. 5　细胞周期和DNA 倍体水平检测体外培养的第 2、 4、 6 代膀胱移行上皮细胞均为二倍体细胞。3　讨论组织工程尿路上皮组织的构建需要大量活性良好的种子细胞, 如何建立一个稳定的尿路移行上皮细胞体外培养扩增体系是构建工程化尿路上皮组织的基础和关键。 目前, 尿路上皮细胞的体外培养体系主要包括两种: 以 3T3 细胞、L 929 细胞或胶原为饲细胞层的有血清培养体系和无血清培养体系[7211 ]。 饲细胞层有血清培养体系具有促进尿路上皮细胞贴壁, 并抑制成纤维细胞生长的优点。 但是尿路上皮细胞体外培养的基础研究方法最终将应用于临床修复泌尿道缺损, 这就要求体外培养尿路上皮细胞的成分必须明确。 由于饲细胞层和血清存在诸多不明确成分, 此培养体系显然不能满足潜在的临床应用要求。 上皮细胞无血清培养体系去除了 饲细胞层和血清的影响, 其添加物成分明确, 能够促进尿路上皮细胞增长, 抑制细胞终末分化,保持细胞体外持续增殖活力。 因此, 我们的研究选择无血清培养基DKSFM 为基础培养基, 结果表明在无饲细胞层的条件下, 细胞贴壁率高, 活力良好, 增殖能力强, 能够多次传代 (4~ 6 代) , 传代后细胞生长特性稳定, 不同代次细胞均为二倍体细胞, 细胞周期无差异,表明 该方法是尿路上皮细 胞体外培养的一种较好方法。