一、实验目的 1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用 2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力 3.学习治疗检测SGPT的方法及原理 4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。 二、仪器与试剂 1实验材料 动物肝脏 2实验试剂 10.9NaCl溶液 2海砂 31谷氨酸溶液1KOH溶液中和 41丙酮酸钠溶液用1KOH溶液中和
50.1KHCO3溶液 60.025一溴乙酸溶液用1KOH中和 72乙酸溶液 8酚的饱和水溶液将2份酚和2份水按重量计算混合放入分液漏斗中振荡。静止24h以后分层将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。 90.1水合茚三酮的正丁醇溶液 100.1标准谷氨酸溶液 110.1标准丙氨酸溶液 121KOH溶液 谷丙转氨酶活性的鉴定纸层析法 一、实验原理 观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反
应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。 二、实验操作 1.谷丙转氨酶提取液制备2g肝脏0.9NaCL 6mL海砂 200mg在低温下研磨成浆用稀薄的脱脂棉过滤得提取液滤液不清。 2.转氨作用 取试管2支按下表加入试剂加入试剂的单位为mL 试剂对照管 测试管 1谷氨酸 0.50 0.50 1丙酮酸钠 0.50 0.50
0.1KHCO3 0.50 0.50 0.025一溴乙酸可不加 0.25 0.25 煮沸
的酶液 0.50 — 酶液 — 0.50 加脱脂棉塞45℃水浴1.5h时时振荡内容物 2乙酸 6滴 6滴 沸水浴2min使蛋白质完全沉下过滤作层析 3.纸层析操作方法 取圆形层析滤纸1张在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆滤纸不可以折通过中心将滤纸绘成四等分扇形。用毛细管点样2-4次直径不超过2mm在滤纸的圆心上剪一小孔直径约1-2mm取一小滤纸条将下端剪成刷状在卷成灯芯插入圆形小孔不能使灯芯突出纸面将圆形滤纸平放在盛有层析液水饱和酚培养皿上使灯芯向下与溶剂接触用大小相同的培养皿盖在滤纸上溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止展层时间为1h80-100℃烘箱干燥喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液80-100℃显色。 三、实验结果 实验 血清谷丙转氨酶活力单位测定 一、实验原理 本