广州健仑生物科技有限公司人乳头瘤病毒核酸扩增荧光检测试剂盒(HPV-PCR) 使用说明书 【药品名称】 人乳头瘤病毒核酸扩增荧光检测试剂盒 【英文名】 PCR Fluorescence Detection Kit HumanPapillomavirus 【汉语拼音】 Ren Rutouliu Bingdu(HPV) Hesuankuozeng(PCR) Yingguang Jiance Shijihe 【正文】 【用途】本试剂盒适用于HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68) 感染的辅助诊断。 【试验原理】本试剂盒采用多重核酸扩增(PCR)荧光检测法,根据高危型人乳头瘤病毒(HPV) 的L1 基因靶序列设计高度特异的引物和探针,能在同一PCR 反应中检测宫颈口脱落细胞中 的13 种高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)的脱氧核 糖核酸(DNA)。 【主要组成成份】 核酸扩增试剂HPV PCR 反应液 1.5ml/管1 910μ 样本处理试剂DNA 提取液 ml/管2广州健仑生物科技有限公司 对照品 阴性对照 15μ 临界阳性对照15μ 强阳性对照15μ 体系适用于ABI7000、7500、7700,PE5700,MJ Research Opticon2,BIORAD iCycler 等荧光PCR 扩增检测仪。 **注:25μ 体系适用于ROCHELightCycler 荧光PCR 扩增检测仪。 【适用仪器】 适用于ABI 7000、7500、7700,PE5700,MJ Research Opticon2,BIORAD iCycler 及ROCHE LightCycler 荧光PCR 扩增检测仪。 【样本要求】 标本类型 妇女宫颈口脱落细胞。 采样方法 采样前,用生理盐水浸湿的棉拭子轻轻拭净宫颈口过多的分泌物,更换棉拭子(用生理盐水 浸湿),在宫颈管内鳞柱上皮交界处采样,采样时注意稍用力转动两周,取得宫颈脱落细胞。 迅速将采样拭子浸入盛有1ml 无菌生理盐水的样本管中,充分漂洗。将棉拭子贴壁挤干后丢 弃,标本立即送检。 标本保存 采集的标本应尽快送检,建议4保存不超过24 小时,-20保存不超过6 个月,需要长期 保存的标本应置于-70保存,避免多次冻融标本。 【试验方法】 样本处理1.1 标本预处理 进行DNA 提取之前,将所有标本置13,000rpm 离心5 分钟,保留沉淀物。(注意:解冻-20 保存的标本需在室温条件下进行!) 1.2DNA 提取 广州健仑生物科技有限公司 1.2.1 准备三个离心管,分别加入阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照各5μ 1.2.2分别向标本沉淀物及上述对照品管中加入50μ DNA提取液,振荡混匀;沸水浴(或 干浴)10 分钟。 1.2.313,000rpm 离心10 分钟,样本上清液可直接用于PCR 检测。 1.3DNA 样品保存 建议DNA 样品立即用于PCR 检测,否则4保存;当天不检测的样品,-20保存。 反应液配制对ROCHE LightCycler,按25μ 体系配制PCR反应混合液,每个反应管分别取HPV PCR 应液22.75μl、Taq 酶0.2μ l、UNG 0.05μ 配制反应混合液;对其它类型仪器,每个反应管按40μ 体系配制PCR反应混合液,分别取HPV PCR 反应液37.5μ l、Taq 酶0.4μ l、UNG 0.1μ 配制反应混合液;反应管总数为标本数与对照品数之和。将反应混合液充分混匀并短暂离心后,再分装至各PCR 反应管中;最后转移反应管至检测区。 待测DNA样品。盖紧管盖、混匀、离心后置于PCR 检测仪 上扩增检测。 (注意:-20保存的DNA 样品,应在加样前取出,置室温自然解冻,然后13,000rpm 离心1 分钟,取上清用于检测!) 4PCR 扩增检测 按以下条件设置扩增和检测参数,不同仪器的设置方法参照各仪器使用说明。 4.1 荧光检测参数设置 设置能收集FAM 荧光信号的荧光检测通道。 4.2PCR 扩增参数设置 不同仪器的扩增参数设置适用仪器类型 ABI7000、7500、7700,PE5700, BIORAD iCycler, MJ Research Opticon2 ROCHELightCycler 扩增参数设置 502min,1 cycle; 502min, 9510min,1 cycle; 9410min, 9515 sec, 9310 sec, 广州健仑生物科技有限公司 52 30 sec, 62 min,40 cycles52 30 sec, 62 40 sec, 40 cycles *注:对BIORAD iCycler 设为42。 【对试验结果的解释】 参数设定基线(baseline)设定方法:一般情况下取按如下方式设置基线,比如:对ABI 7000、7500、 7700 等仪器,基线范围为6-15 循环,PE5700 为3-15 个循环,MJ Research Opticon2 线范围为6-12个循环,对ROCHE LightCycler,基线调整方式设置为“Arithmetic”。特 殊情况下也可对基线作适当调整。 阈值(threshold)设定原则:使刚好超过阴性扩增曲线的最高值。 质量控制质控品检测结果必须符合下述条件: a*阴性对照无扩增。 临界阳性对照的CT值在30