CD4T淋巴细胞检测标准及要求 毛爱玲 山西省性病艾滋病监测中心 HIV在人体内的复制 ? 1.吸附及穿入:gp120+CCR5 →GP41和膜融合→核衣壳 穿入宿主细胞 ? 2.脱衣壳和逆转录:P24+亲环素→出壳→RNA依赖的 DNA聚合酶→逆转录→cDNA ? 3.环化:cDNA →双链环状DNA ? 4.整合:双股DNA整合入宿主细胞染色体DNA中→前病 毒 ? 5.转录:前病毒DNA → RNA → mRNA ? 6.翻译与装配:Gag蛋白与病毒的RNA结合装配成核壳 体。 ? 7.病毒成熟、出芽:芽生方式释放 AIDS发病机理 HIV侵入人体后主要攻击的是一种带CD4 抗原的淋巴细胞(T4淋巴细胞)。这种 细胞是免疫系统的基本组成部分,HIV通 过大量、不断地复制与释放,导致T4淋 巴细胞进行性下降,感染者免疫功能遭 到严重破坏,造成免疫缺陷。临床表现 为各种各样机会性感染与肿瘤。 AIDS发病机理 1. HIV进入人体后能选择性地侵犯有CD4受体 的淋巴细胞,当病毒颗粒释放出来后,继 续攻击其他CD4T淋巴细胞。大量的CD4+T淋 巴细胞被HIV攻击后,首先引起细胞功能的 障碍。 2. HIV病毒在细胞内大量繁殖,导致细胞的溶 解和破裂。 AIDS发病机理 3. HIV在细胞内复制后,以芽生方式释出时可 引起细胞膜的损伤。由于HIV可抑制细胞膜磷 脂的合成从而影响细胞膜的功能,导致细胞 病变。 4. HIV还可以感染骨髓干细胞导致CD4+T淋巴 细胞减少。 AIDS发病机理 5. 当受HIV感染的CD4+T淋巴细胞表面存在的gp120 发生表达后,它可以与未感染的CD4+T淋巴细胞 CD4分子结合,形成融合细胞,从而改变细胞膜 的通透性,引起细胞的溶解和破坏。 6. 游离的gp120也可以与未感染的CD4+T淋巴细胞 结合,作为抗体介导依赖性细胞毒作用的抗原, 使CD4+T淋巴细胞成为靶细胞,受K细胞攻击而 损伤。 AIDS发病机理 HIV感染后一般首先出现CD4T淋巴细胞轻度至 中度降低,该细胞总数可持续数年不变,反应 病毒为免疫应答所抑制。历经一段时间后, CD4+T细胞逐渐进行性下降,表明病毒逐渐逃 脱了免疫应答的控制。当CD4+T淋巴细胞一旦 下降至200细胞/μl或更低时,则就可出现机 会性感染。 HIV感染的三种结局 ? 典型进展者:8-10年内免疫功能逐渐下 降,最后发展成为艾滋病。 ? 快速进展者:CD4+细胞计数在2-5年内迅 速下降,抗HIV抗体水平很低,HIV感染 后有较高的病毒载量。 ? 长期存活者(长期不进展者):感染后 维持健康状态12年以上,且CD4+计数维 持正常。 艾滋病的病程就象一列迫近 悬崖的火车 病毒载量 = 火车的速度 CD4 计数 = 离悬崖的距离 HIV infection J. Coffin, XI International Conf. on AIDS, Vancouver, 1996 传染源 HIV感染者(更危险) AIDS病人 从 HIV感染发展到艾滋病 HIV一旦进入人体,这个人就成为HIV感染者。 经过急性感染期﹑潜伏期,以后逐渐发展成艾 滋病病人。处于潜伏期的感染者免疫功能没有 受到严重破坏,因而没有明显的临床症状。从 感染者到艾滋病病人这段潜伏期时间的长短与 感染途径﹑感染病毒的数量﹑感染者的年龄、 生活条件、心理、生理状况等多种因素有关, 短则几年,长则20年。发达国家较长,发展中 国家短些。资料表明,经输血传播的潜伏期较 短,经性接触传播的潜伏期较长。 检测CD4、CD8T淋巴细胞的意义 ? 淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一群 细胞,在正常机体内各淋巴细胞亚群相互作用, 维持机体正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群 的数量和功能发生异常时,可导致机体免疫功 能紊乱并发生一系列病理变化。因此,T淋巴 细胞亚群的免疫分型能够提供有关患者免疫状 态的重要信息。AIDS是由HIV引起的一组综合 症,HIV主要侵犯人CD4T淋巴细胞,导致其数 量上的减少和功能缺陷,使机体免疫平衡被打 破造成免疫功能低下,最终导致各种机会感染 和肿瘤 检测CD4、CD8T淋巴细胞的意义(续) ? CD4T淋巴细胞绝对值的检测在HIV感染和艾滋 病病人治疗以及病毒治疗疗效方面发挥了重要 的作用 ? 1.了解机体的免役状态以确定疾病分期 ? 2.监测疾病进程 ? 3.评估疾病预后 ? 4.制定抗病毒治疗及机会性感染预防性治疗方 案 ? 评估抗病毒药物疗效 检测CD4、CD8T淋巴细胞的意义(续) ? 因而,对HIV感染者和AIDS病人定期进行 CD4、CD8T淋巴细胞检测具有十分重要的 意义。 ? 美国疾病预防控制中心就是以此为基础 制订了HIV感染者/AIDS病人的诊断和分 类标准,目前国内外仍被采纳应用。 规范的AIDS治疗 目前我国HIV治疗范围逐渐扩大,国家示范区 大批的治疗已经开始。我省也于2004年启动了 对AIDS的治疗。但是由于检测费用昂贵,大批 治疗中50%以上病人不进行规范检测.一旦出现 耐药病人,后果将不堪设想。所以规范的实验 室检测是非常重要的一个环节。 实验室条件 1.人员 进行HIV感染者和病人CD4+和CD8+T淋巴 细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的 上岗资格,并接受过省级以上艾滋病实 验室安全及实验操作技术培训。 实 验 室 条 件(续) 设施和设备 样品处理区:生物安全柜、离心机、冰 箱、水浴箱、旋转震荡器、精确移液器 (5ul~50u1、20u1~200u1、 200u1~1000u1)。 流式细胞仪检测区:流式细胞仪 实 验 室 条 件(续) 功能分区 实验室应分为样品处理区和流式细胞仪 检测区,各区的功能是: 样品处理区应达到生物安全Ⅱ级实验室 要求,用于样品处理、流式检测样品制 备。流式细胞仪检测区用于制备好的样 品上机检测。 方 法 ? 目前用于CD4和CD8T淋巴细胞计数的检测 方法分为自动检测方法和手工操作法。 自动检测方法包括流式细胞仪(主要有 多平台三级程序法和单平台一步法)和 专门的细胞计数仪。手工操作法包括几 种手工操纵试验,需要显微镜或酶联免 疫试验设备。 方 法 ? 检测CD4T淋巴细胞数的标准方法为流式 细胞仪,可得出CD4,CD8等淋巴细胞及比 值。为确保检测的准确性,应建立内部 质量控制及参加国家室间评价。 流式细胞仪 (FACS Calibur, BD) 简易流式细胞仪器(FACSCount, BD) 免疫指标的检测 CD4/CD3 CD8/CD3 CD3 CD4/CD8 全省CD4流氏细胞仪分布 ? ? ? ? ? ? 山西省艾滋病确证中心实验室 运城市艾滋病确证实验室 临汾市艾滋病确证实验室 太原市艾滋病确证实验室 大同市艾滋病确证实验室 长治市艾滋病初筛中心实验室 CD4细胞样本采集﹑运送﹑检测要求 标本采集的要求 1.成功的临床治疗效果评定依赖于有保障 的标本采集、保存、检测,以及数据处理 等等。在研究前期就要有计划的设计研究 项目,确定所需要的标本类型。比如:所 有的血液标本是否需要抗凝处理、是否需 要无菌等 标本采集的要求(续) 2.采集的标本应该长期保存,至少要求保 存至此项目完成。血液标本可用于CD4T淋 巴细胞 、抗原、抗体检测,病毒分离, PCR检测. 3.血液标本应尽量在24小时内处理,尤其 是CD4T淋巴细胞检测、病毒分离,PCR检 测. 标 本 的 采 集(续) 选择合适的抗凝剂,分别用于血液学检测和流式细胞 仪的免疫表型检测。 用于血液学检测的抗凝剂 ⑴K3EDTA (1.5±0.15mg/ml血液)。 ⑵枸橼酸钠 (3)肝素 在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测,不超过 30h,不检测超出抗凝时间范围的样品。 用于流式细胞仪的抗凝剂主要是K3EDTA 标 本 的 采 集 标本的采集 采集用品 ?采血管 ? 真空、负压 ? 抗凝(EDTA或枸橼酸钠) ? 无菌 ?针头 ? 蝶形针头 标 本 的 采 集(续) 采集用品: ?采血套管 固定采血管位置,方便操作;保护操作者的安全 注意:切勿将采血针头的套管回套! 注意采血后器具的放置、消毒、处理 标本的采集(续) 采血后应立即握住试管两端,颠倒混匀多次, 将血液与抗凝剂混匀,以防止凝固。 准备适当数量的样品管 ? 当同一样品的血球检测和流式细胞仪免疫表型 检测在同一实验室内进行时,用一个装有 K3EDTA的试管即可。 ? 对所有样品编号,并写明日期和时间。 标 本 的 运 输 ?在标本运输过程中,应确保标本能够及时、 准确运输到指定地点。要求提前与对方联系, 确定时间,对方应提前做好相关实验的准备 工作,尽快进行标本处理 ? 运输的所有标本都应有送检单给接受样品 的实验室。每张送检单都应详细填写所要求 的内容. 样 品 的 运 输 运 送(续) ? 尽可能快地将样品送至免疫表型检测实验室。 ? 如需运送样品到其它地点时,应将装样品的试 管放于一个防漏的容器中,并将此容器放于一 个装有吸水性物质的指罐中,以防止震动并可 吸收所有试管破裂漏出的血液。盖紧指罐,用 橡皮带系紧。 ? 应选择特定的方案,并且安排合适的时间和运 输样品。 样 品 的 接 收 样品到达以后立即检查试管及其所装的 血样。 ? 不可检测溶血或结冰样品。 ? 不可检测凝血和乳糜的样品。 ? 如果样品的采集时间已超过48H,不于接 收. 标 本 的 处 理 一般采集HIV-1感染者全血10 - 20ml 1. 抗 血浆(含有血小板) 2. 无 3. 室 凝 菌 温 淋巴细胞层 红细胞层 4 . 24h 内处理 实现 CD4, CD8 , CD3 绝对计数 FACSCount 结果可信度: ?绝对计数 ?质控 ?内置错误自动报警 FACSCount 内置微处理 器实现数据 自动分析 自动打印质控与 病人的检测结果 简单易用的系 统控制面板 配套的样本 制备工作台 样本制备方法简捷 ,避免细胞损失 FACSCount – 完善的系统 FACSCount 试剂与对照 FACSCount 工作台 3步测定CD4, CD8 ,CD3 绝对计数 1 每管加入 50ml 全血加入, 混匀,室温避光孵育1h 无需溶血 2 每管加入 50ml 固定液, 混匀,室温避光孵育 30min 无需离心洗涤 3 FACSCount上机检测. 无需血球计数仪,直 接得到绝对值结果 FACSCount – 完善的系统 预配试剂 FACSCount – 完善的系统 检测试剂盒组成(50人份/盒) ? 荧光试剂 ? 2个组合/人份 ? CD4PE/CD3PE-CY5 ? CD8PE/CD3PE-CY5 ? 固定液 ? 效期 2—8 0C储存6个月 FACSCount – 完善的系统 ? 质控试剂盒(50人份/盒) ? 零,低,中,高 4种靶值微球 ? 效期 2—8 0C储存1个月 FACSCount 3步测定CD4, CD8 ,CD3 绝对计数 FACSCount 1 每管加入 50ml 全血加入, 混匀,室温避光孵育1h 无需溶血 FACSCount 2 每管加入 50ml 固定液, 混匀,室温避光孵育 30min 无需离心洗涤 FACSCount 3 FACSCount上机检测. 无需血球计数仪,直 接得到绝对值结果 FACSCount – 分析 打印结果 ? 对照 ? 病人标本 实验资料的记录 ? 实验应及时、准确地记录结果。 ? 实验记录中应包括以下内容:日期、操 作者、所有样品、实验内容、过程(步 骤)、结果及有无事故等。 ? 整个实验室的实验资料要统一有专人负 责,按固定格式记录在案。 ? 计算机生成的实验结果,存档备案:定 期拷贝计算机结果文档,备案保存。 HIV/AIDS CD4检测时间 ? 一经抗-HIV确证的HIV/AIDS,应立即进 行CD4细胞检测。(基线) ? CD4细胞数>200个/UL,每半年进行CD4细 胞计数检测。 ? CD4细胞数<200个/UL ,立即进入治疗。 ? 进入治疗的AIDS,严格按照3月、6月、12 月、18月、24月时间来进行采血检测。 CD4细胞检测报告时间 ? 经CD4流式细胞仪细胞检测后,一周内将 结果反馈送检单位 CD4细胞检测注意事项 ? 3.运送样本要求,春、秋季室温(18°C -23°C),夏季冷藏,冬季保温。 ? 4.样本量应按负压管的要求采集。 ? 5.溶血、乳糜和凝血的样本不于接收。 ? 6.送检表和样本不得放在同一容器内。 谢谢各位