正相色谱的流动相一般为极性较小的有机溶剂 高效液相色谱法及其在药物分析中的应用更新时间:2010-10-22 11:56:10 摘要:以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。用常压输送流动相的方法为经典液相色谱法,这种色谱法的柱效能低、分离周期长。高效液相色谱法(high perf ormance liquid chromatography,简称HPLC)是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。与经典的液相色谱法相比,高效液相色谱法具有下列主要优点:应用了颗粒极细(一般为10µm以下)、规则均匀的固定相,传质阻抗小,柱效高,分离效率高;采用高压输液泵输送流动相,流速快,一般试样的分析需数分钟,复杂试样分析在数十分钟内即可完成;广泛使用了高灵敏检测器,大大提高了灵敏度。目前,已经发展了多种不同的固定相,有多种不同的分离模式,使高效液相色谱法的应用范围不断扩大。下面介绍高效液相色谱法的有关知识,新的方法和技术以及在药物分析中的应用。 一、分类 高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类: (一)吸附色谱法(adsorption chromatography)以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶,流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。在吸附色谱中,不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。组分的极性越大、固定相的吸附力越强,则保留时间越长。流动相的极性越大,洗脱力越强,则组分的保留时间越短。 (二)液-液分配色谱法(liquid- liquid chromatography)液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂,分离时,组分溶入两相,不同的组分因分配系数(K)的不同而被分离。目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的,使用化学键合固定相的色谱方法(简称键合相色谱法)可以用分配色谱的原理加以解释。键合相色谱法在H PLC 中占有极其重要的地位,是应用最广的色谱法。按照固定相和流动相极性的不同,分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。 1.正相色谱法(n ormal phase chromatography)固定相极性大于流动相极性的分配色谱法称为正相分配色谱法,简称为正相色谱法。氰基键合硅胶、氨基键合硅胶等极性的化学键合固定相是正相色谱常用的固定相,正相色谱的流动相一般为极性较小的有机溶剂。在正相色谱中,极性小的组分由于K 值较小先流出,极性较大的组分后流出。正相色谱法用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质的分离。 2.反相色谱法(r eversed phas 值较小先流出色谱柱,极性较小的组分后流出。流动相中有机溶剂的比例增加,流动相极性减小,洗脱力增强。反相色谱法是目前应用最广的高效液相色谱法。(三)离子交换色谱法(i exchangechromatography)离子对交换色谱法是以离子交换剂为固定相的色谱方法,组分因和离子交换剂亲和力的不同而被分离。柱填料含有极性可离子化的基团,如羧酸、磺酸或季铵离子,在合适的PH 值下,这些基团将解离,吸引相反电荷的物质。由于离子型物质能与柱填料反应,所以可被分离。 样品中不同的组分因离子交换平衡常数的不同而分离。离子交换色谱的流动相一般为一定PH 值的缓冲溶液,有时也加入少量的有机溶剂,如乙醇、四氢呋喃、乙腈等,以增大组分在流动相中的溶解度。流动相的 PH 值影响离子交换剂的交换容量。对弱酸或弱碱性的被分离组分,流动相的 PH 值还会影响其电离状况,流动相的 PH 值必须使待分离组分处于离 解状态,才能被分离。离子交换色谱法用于分离在测定条件下呈离解状态的组分,如具有酸性或碱性的化合物,反相离子对色谱法在药物分析中的应用非常广泛,例如生物碱、磺胺类药物、某些抗生素及维生素等的分析均可采用此方法。 (四)空间排斥色谱法(steric exclusion chromatography)空间排斥色谱也称为凝胶色谱。其固定相是具有一定孔径范围的多孔性物质,即凝胶。被分离组分因分子空间尺寸大小的不同而被分离。当组分被流动相携带进入色谱柱时,体积大的分子不能进入固定相表面的孔穴中,而随流动相直接通过色谱柱,保留时间最短。体积较小的分子可 以进入孔穴内,在色谱柱中所走的途径较长,保留时间也较长。分子的尺寸越小,可进入的孔穴越多,所走的路径越长,保留时间也越长。因此,凝胶色谱中,在一定范围内,体积不同的分子保留时间不同,从而达到分离的目的。凝胶色谱法主 要用来分离高分子化合物,如蛋白质、多糖等。由于分子量和分子体积有关,凝胶色谱还可以用来测定组分的分子量。 (五)亲和色谱法(l igh performanc affinity chromatography)亲和色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用,从生物样品中分离和分析一些特殊物质的色谱方法。生物分子之间的专一作用包括抗原与抗体,酶与抑制剂,激素和药物与细胞受体,维生素与结合蛋白,基因与核酸之间的特异亲和作用等。亲和色谱的固定相是将配基连接于适宜的载体上而制成的,利用样品中各种物质与配基亲和力的不同而达到分离。当样品溶液通过色谱柱时,待分离物质X 与配基 形成X-L复合物,而被结合在固定相上,其他物质由于与配基无亲和力而直接流出色谱柱,用适宜的流动相将结合的待分离物质洗脱,如采用一定浓度的醋酸或氨溶液为流动相,减小待分离物质与配基的亲和力,使复合物离解,从而将被纯化的物质洗脱下来。 HPAC 可用于生物活性物质的分离、纯化和测定,还可以用来研究生物体内分子间的相互作用及其机理等。 (六)手性色谱法(chir al chromatography)不少有机药物的结构中有不对称碳原子,又称手性碳原子,有手性碳原子的药物具有旋; 光性。