大家好,我最近在做克隆,是把我以前做过的一个基因的点突变后的质粒(pFastbac1-GENE)设计引物(F和R,在R引物上带有PmlI的酶切位点,F和R内侧附近分别有PmlI和KpnI位点,均为单酶切位点),PCR完了后溶液回收Kit回收,浓度大概130ng/ul,70ul elute,之后我用PmlI和KpnI切(此处犯了一个错误,应该只用PmlI切,这样就不用后面切平了),然后跑胶,切胶回收,用的是Qiagen的胶回收试剂盒,浓度大概为30ng/ul,50ul eltue,而且260/230的值不到0.1,很低。然后用Klenow酶(large fragment)切平KpnI的位点,然后溶液回收。我把pEF-GENE用PmlI酶切(在我要替换的片段上下游有两个PmlI酶切位点),跑胶回收vector,浓度是60ng/ul。用CIP酶处理后消除5‘磷酸,防止自连。然后溶液回收。
最后用T4liase把insert和vector连接起来,转化涂板,我试过DH5a和T1,都没有长出来,这个质粒要的很急,最近我也快做完毕业设计回去答辩了,由于最后这个实验不顺利,我都不知道老板会不会要我,虽然我很想留在她的实验室。最近给自己的压力好大啊!
P.S.求技术指导,关心酱油之类的回帖不回勿怪哈!我后面有用pEF-GENE为模板做点突变PCR,但是由于片段是9KB左右,很难P出来。还在平行做PCR后用PmlI单酶切,这样就不用连接了,还在想要不要再设计一下引物,就在紧挨片段上下游,再做PCR,这样酶切后就不用胶回收,直接溶液回收了。