相比传统分子互作检测技术,Attana开创了直接在细胞层面进行实时原位分子结合动力学的检测方法,更准确地反映了体内环境的分子间互作,能够高质量、精确地研究其特异性、动力学和亲和力。
Attana Cell 200蛋白互作分析仪检测优势
1、可检测蛋白与细胞的相互作用
2、可检测蛋白与组织切片的相互作用
3、可检测细胞与细胞的相互作用
4、可使用粗制蛋白样品
Attana Cell 200蛋白互作分析仪实验操作流程举例(蛋白-细胞互作分析)
一、实验材料
1.PBS-Phosphate-buffered salt pH 7.4。
2.水——用于Attana Cell 200蛋白互作分析仪的所有水必须是高质量的水(18.2MΩ,0.2μm过滤)。
3.Attana Cell 200蛋白互作分析仪。
4.适当的阳性和阴性对照分析物。
5.适当的参考细胞系。
二、实验流程
2.1 贴壁细胞——铺细胞
2.2.1 细胞生长和观察
1.COP-1表面——细胞优化的聚苯乙烯表面。 Attana蛋白互作分析仪芯片。
2.培养基——用于特定细胞系的任何合适的细胞培养基。
3.胰蛋白酶-EDTA溶液。
4.贴壁细胞——可以在标准细胞培养物中生长的任何细胞系都可以在COP-1表面上生长。
2.2 悬浮细胞——捕获细胞
1.LNB-羧基表面——低非特异性结合羧基表面。 Attana蛋白互作分析仪芯片。
2.Amine coupling kit——EDC(1-乙基-3- [3-二甲基氨基丙基]——碳二亚胺盐酸盐),磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺),乙醇胺(1M,pH8.5)。
3.固定化缓冲液——例如0.1M乙酸钠pH4.5。
4.捕获分子(如ConA等)——参见注释6.
5.悬浮细胞——任何不粘附于标准细胞培养物的原代细胞或细胞系。 该方法也适用于贴壁细胞。
2.3 固定细胞
1.甲醛-新鲜制备的3.7%无甲醇甲醛。
2.4 观察细胞
1.DAPI-40,6-二脒基-2-苯基吲哚,3μM。
2.荧光显微镜。
3.其他染色——见注10。
2.5 相互作用实验
1.待测样本。
2.10mM甘氨酸pH 3。
3.10mM甘氨酸pH 2。
4.10mM甘氨酸pH 1.5。
5.20mM甘氨酸pH 1.5。
6.含有1M NaCl的10mM甘氨酸pH 3。
7.含有3M NaCl的10mM甘氨酸pH3。
8.1mM NaOH。
9.10mM NaOH。
10.100mM NaOH。
11.含有3M NaCl的1mM NaOH。
12.含有3M NaCl的10mM NaOH。
13.含有3M NaCl的100mM NaOH。
14.0.005%SDS。
15.0.01%SDS。
三、实验方法
1.所有溶液必须采用优质水(18.2MΩcm,0.2μm过滤)制备。
2.当通过溶解固体(例如粉末或粉末)制备溶液时,必须使用0.2μm过滤器进行过滤(参见注1)。
3.应轻轻完成所有移液操作,同时避免移液器吸头与传感器表面接触。
4.传感器表面绝对不能干燥。 更换缓冲液或进行清洗时,务必留下少量液体,足以覆盖表面。
5.尽可能覆盖表面,以防止灰尘沉积在表面上。
3.1 贴壁细胞——铺细胞
1.按照使用说明准备COP-1芯片表面。
2.按照标准细胞传代方法获取细胞(参见注释2)。
3.在培养基中将细胞稀释至适当的细胞密度(见注3)。
4.向COP-1培养室中加入700μL细胞悬液。
5.轻轻地上下吹打悬浮液一次,以确保细胞均匀分布。
6.将传感器芯片置于适当的条件下,使细胞生长至少1个细胞周期(见注4)。
3.2 悬浮细胞——捕获细胞
1.将捕获分子溶解或稀释在合适的固定缓冲液中(见注5)。
2.将捕获分子固定在LNB-羧基表面上(见注6)。
3.将传感器表面(即金芯片)转移到COP-1支架上。
4.连接培养室。
5.准备最终密度为2×106细胞/ mL的细胞悬液(以PBS重悬)(见注7)。
6.移取50μL细胞悬浮液到捕获表面,确保其覆盖整个表面。
7.在室温下孵育细胞30分钟。
3.3 固定细胞(可选,见注释8)
1.从培养室中弃去细胞培养基或缓冲液。
2.用PBS轻轻吹打冲洗细胞两次。
3.在室温下用PBS洗涤细胞两次,每次5分钟。
4.在室温下用不含甲醇的甲醛3.7%固定细胞10分钟(见注9)。
5.用PBS轻轻吹打两次。
6.在室温下用PBS洗涤细胞两次,每次5分钟。
7.向培养室中加入700μL PBS。芯片可以在4℃下储存数天。
3.4 观察芯片表面的细胞
在此阶段,可以使用荧光显微镜评估表面覆盖率。
1.在室温下用3μM DAPI孵育细胞5分钟(见注10)。
2.弃去DAPI。
3.用PBS轻轻吹打冲洗细胞三次。
4.去除大部分液体,只留下足以覆盖表面的液体。
5.取下培养室。
6.在荧光显微镜下观察以评估细胞密度(见注11)(图2)。
7.安装测量盖。
8.使用移液器,通过将移液管尖端“插入”两个流动池孔中的一个,用流动缓冲液轻轻地填充流动池(见注12)。此时芯片表面已准备好用于上机,但可以在4℃下在湿度室中储存数天。
3.5 互做实验
双通道系统可用于评价和减去与传感器表面的非特异性结合。不表达特异性受体的细胞可用作对照。强烈建议使用对照来分析与芯片表面和除靶点之外的细胞膜组分的非特异性相互作用(见注释13)。 还建议在分析物注射循环之前和之后(即,在数据收集之前和数据收集之后,而不是在每个循环之间)使用阳性和阴性对照样品注射。
1.用Running Buffer运行仪器,使液体充满管路(参见注释14)。
2.将芯片插入Attana蛋白互作分析仪。
3.将流速设置为20μL/ min,启动。
4.将温度设置为所需的值。
5.使基线稳定(即基线漂移小于0.2 Hz / min,持续10分钟)。这通常需要至少4小时,最多可能需要24小时。
6.以下述方法确定待测样品的浓度:从0.1 KD(如果KD已知)或5μg/ mL(如果KD未知)开始注入分析物,并且每次进样浓度增大2倍,直到检测不到显著的信号增加。用此方法测定的分析物浓度范围,其通常接近0.1KD至10KD的范围。
7.准备再生溶液(见注15)。
8.按步骤6将样品注入最大浓度的一半。
9.如果之前做过实验,请从最可能的再生解决方案开始。否则,请从注释15中列表中的第一个解决方案开始。
10.以短脉冲式注入再生溶液(酸性溶液30秒,碱性溶液或洗涤剂10秒)。如果除去分析物不完全(即信号部分返回基线),则增加再生时间(见注释16)。如果分析物没有或只有极少量的被去除,请进入列表中的下一个再生溶液。
11.按步骤6将样品注入最大浓度的一半。
12.每次步骤10之后要再生表面。
13.重复步骤11和12共计五次。最后3个循环必须显示相同的结合水平(见注17)(图4)。
14.确定适当的因子稀释度,以跨越步骤6的分析物浓度范围,同时具有五种不同的浓度。
15.用稀释分析物,按步骤14准备分析物稀释行。包括相同数量的空白注射(见注18)。
16.用Running Buffer清洗蛋白互作分析仪环。
17.注入随机空白,结合时间为105秒,解离时间为300秒(对于强结合物,解离时间可能更长)。
18.按步骤16注入相应的样品。
19.每步骤6重新再生。
20.用Running Buffer清洗蛋白互作分析仪环路。
21.重复步骤17-20,直到分析完所有样品。
22.现在可以使用Attester Evaluation(Attana)和/或TraceDrawer(Ridgeview)分析数据(图5)。
4.注释
1.如果不能用0.2μm过滤器过滤溶液。在这种情况下,使用0.45μm过滤器进行过滤也行,但是有可能增加堵塞仪器管道的风险。
2.使用贴壁细胞之前,建议至少将细胞传代两次。使用标准方法(例如,胰蛋白酶-EDTA处理)消化收集细胞。
3.标准细胞密度为60,000-120,000个细胞/ mL。通常,建议使用较高的细胞密度,只要细胞均匀分布在溶液中即可。调节细胞密度的目的是确保细胞覆盖率为80%以实现高灵敏度,同时防止细胞多层叠在一起。
4.细胞必须贴壁牢固。芯片上加入细胞后可以在培养箱培养过夜,细胞融合度不应超过80%。
5.合适的固定缓冲液应该具有较强的缓冲力并且pH值比待固定分子的pI低1。此外,它不应该破坏或导致待固定分子的不可逆构象变化。
6.使用胺偶联试剂盒时,仔细按照说明书操作,在LNB-羧基表面上实现捕获分子的高密度或饱和覆盖。可以多次注射捕获分子,直至达到饱和。好的捕获分子应该能与细胞表面分子强结合。其他标准是捕获分子在测定期间应该是稳定的并且不与分析物相互作用。常见的选择包括抗体和凝集素。
7.可以使用多种缓冲液进行细胞稀释,只要它不含有抑制捕获分子与其靶标之间相互作用的成分即可。
8.细胞固定有利有弊。优点是固定的细胞更稳定,能进行更长时间的实验并有更好的信噪比。缺点包括改变活性位点的风险。为了尽量减少这种缺点,必须注意尽可能温和的固定细胞,如注释[10]所述。
9.在室温下用3.7%甲醛固定10分钟是一个很好的开始。如果需要更温和的固定剂,降低甲醛浓度或使用冷甲醛在冰上或4℃下进行固定。也可以使用其他交联剂,例如戊二醛。
10.可以使用任何核酸染色剂。也可以使用表面染色,但建议在测定前除去染色剂或确认染色剂不会影响细胞表面和目标分子之间的相互作用。
11.80%的细胞融合度是一个很好的目标。融合度降低会降低灵敏度。
12.填充细胞小室时,确保没有气泡,这会减少基线稳定需要的时间。用Running Buffer轻轻地冲洗流动池,可以去除气泡。如果没有清除气泡,可能需要拆下并重新安装检测盖。
13.选择与实验组尽可能接近的对照。对照的优先顺序是(1)具有变体无活性靶标的相同细胞系(例如,突变体),(2)不存在靶分子的相同细胞系(例如,敲低),(3)其他完全不同的不表达靶分子的细胞系或没有任何细胞的芯片。
14.Attana蛋白互作分析仪可以使用各种Running Buffer。它可以是简单的缓冲液,如PBST或HBST,或更多含有蛋白质含量的粗缓冲液,如血清或培养基。运行缓冲区还可以包含阻断剂,如BSA或酪蛋白。
15.在随后的分析周期开始之前,执行表面再生以去除剩余的分析物。再生过程必须结合细胞及其表位的有效性和保存。找到满足这些标准的再生解决方案必须根据经验对每种类型的交互对进行。然而,通常可以在使用相似分子种类的实验中找到指导。要优化再生条件,请从温和的再生溶液开始。如果没有去除分析物,则需要尝试更严格的解决方案。以下再生条件可用作细胞传感器表面的指导:10 mM甘氨酸pH 3-20 mM甘氨酸pH 1.5,10 mM甘氨酸pH 3-20 mM甘氨酸pH 1.5含1-3 M NaCl,1 mM至100 mM NaOH,1mM至100mM NaOH,3M NaCl,0.005%至0.01%SDS。
16.通过以20 s增量(最多50 s)和/或重复进样增加脉冲长度,可以增加接触时间。不要将接触时间增加到100秒以上。
17.在样品再生注射的前几个循环期间,灵敏度初始降低是很常见的。最后三次注射的结合水平必须相似。如果连续进样的响应差异减小,但尚未达到0,则重复小标题3.5,步骤11和步骤12,直到进样足够稳定或副标题3.5,步骤11和步骤12重复总共十次。
18.用Running Buffer做空白对照(样品也用Running Buffer稀释)。