考马斯亮蓝染色法,也称Bradford检测法,是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法。其最早是在1976年由Bradford根据蛋白质与染料相结合的原理建立。1.Bradford法原理
在酸性分析试剂溶液中,染料考马斯亮蓝 G-250与蛋白质结合的主要是阴离子形式的蓝色,其最大吸收峰 (λmax)位置在590nm,形成的复合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。因此,通过测定染料的蓝色离子态可以定量测定蛋白质,通常测定595nm下的吸光度
研究认为染料最容易与蛋白质中的精氨酰和赖氨酰残基结合,由于各种蛋白质中的含量不同,与染料的相互作用有强有弱,导致测定不同蛋白质时偏差较大。进行了一些改良后,可以克服波动问题,但通常会导致检测更容易受其他化合物的干扰。
2.Bradford法优缺点分析
优点缺点
①.方便简单快速;
②.灵敏度高。
③.受生物制品中的非蛋白质组分和常用试剂的干扰更少。①.易受强碱性缓冲液、TritonX-100、SDS等去污剂的影响。
②.标准曲线有轻微的非线性。
③.不同蛋白质测定时有较大的偏差。
3.Bradford法实验流程