1.污染的原因
污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌,导致培养失败的现象。污染的原因从病源菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类;从污染的途径而言,主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。
细菌污染的特点是菌斑呈黏液状物,而且在接种后1~2d即可发现。除材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染外,操作人员的不慎也是造成细菌污染的重要原因。因此接种人员的手应经常用70%酒精擦净,镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。
真菌污染的特点是污染部分长有不同颜色的霉菌,在接种后3~10d才能发现,造成真菌污染的原因多为周围环境的不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养用器皿的口径过大等。
为了减少损失,提高工作效率,必须在每个操作环节注意防止污染的发生。
2.污染的预防措施
发现污染的材料应及时处理,否则将导致培养室环境污染。对一些特别宝贵的材料,可以取出再次进行更为严格的灭菌,然后接人新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前,先集中进行高压灭菌,再清除污染物,然后洗净备用。现就根据污染途径,阐述一下污染的几个预防措施。
(1)防止材料带菌的措施
①用茎尖作外植体时,可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中,使其抽枝,然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体,便可大大减少材料的污染。或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养,待抽出徒长的黄化枝条时采枝,经灭雨后接种也可明显减少污染。
③避免阴雨天在田间采取外植体。在晴天采材料时,下午采取的外植体要比早晨采的污染少,因材料经过口晒后可杀死部分细菌或真菌。
③目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时,不仅去掉芽的鳞片,甚至要除去韧皮组织,只接种内部的分生组织,可以收到一定的效果。
(2)外植体的灭菌
①多次灭菌法如咖啡成熟叶片的灭菌即用这种方法。首先除去主脉(因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在),同时去掉叶的顶端、基部和边缘部分,这样可大大减少污染;其次,将切好的外植体放入1.3%的次氯酸盐溶液中(商品漂白粉25%的溶液),灭菌30min;然后,在无菌蒸馏水中漂洗3次;随后将材料封闭在无菌的培养皿中过夜,保持一定温度;次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min;最后用蒸馏水洗3次。对层积过的种子也可用多次灭菌法,在种子吸胀前后都要灭菌,在层积贮藏的第1周还应增加1次灭菌处理。
②多种药液交替浸泡法对一些容易污染而难灭菌的材料,用下列程序灭菌较为理想。
首先取茎尖、芽或器官外植体,用自来水及肥皂充分洗净,表面不可附着污垢、灰尘,用剪刀修剪掉外植体上无用的部分,剥去芽上鳞片;然后将材料放入70%~75%的酒精中灭菌数秒钟;随后在1:500 RoccalB(一种商品灭菌剂名)稀释液中浸5min;再放入5%~10‰次氯酸钠溶液中并滴入吐温80数滴,灭菌15~30min,或浸入0.1%~0.2%升汞溶液中并加入吐温80数滴,灭菌5~10min)最后用无菌水冲洗5次。也可以在从次氯酸钠溶液中取出后,再放入无菌的0.1mol/L盐酸(HCl)中浸片刻,再用无菌水冲洗数次。
(3)器皿与金属器械的灭菌
玻璃器皿的灭菌:玻璃器皿可采用湿热灭菌法,即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌,灭菌时间可延长达25~30min;也可以用干热灭菌法,即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌;还可以把玻璃器皿放入水中煮沸灭菌。
金属器械的灭菌:金属器械一般用火焰灭菌法,即把金属器械放在95%的酒精中浸一下,然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。金属器械也可以用干热灭菌法灭菌,即将拭净或烘干的金属器械用纸包好,盛在金属盒内,放在烘箱中灭菌。
(4)布质制品的灭菌工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法,即将洗净晾干的布质品,放入高压锅中,用1.1kg/cm2(即15磅/英寸2),温度121℃,灭菌20~30min。
(5)无菌操作室的灭菌无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新浩尔灭或70%的酒精擦洗,然后用紫外灯照射约20min。使用前用70g的酒精喷雾,使空间灰尘落下。一年中要定期1、2次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。
(6)操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行这是植物组织培养操作中最基本的要求,必须严格遵守。