在超净台内,使 用无菌多孔加样器将96 孔板内的细胞克隆培养液以5L上样量,成 排点于硝酸纤维素膜上并风干,记录好样品顺序(可在膜的正面边缘 处标记正面及名称,也可通过在膜的右下角剪去一角作为标记,识别 膜的正反面及方向)。取上面风干好的硝酸纤维素膜,用配制好的封 闭液(脱脂奶粉或白蛋白溶液)室温震荡孵育至少一小时。此步骤的 目的是封闭硝酸纤维素膜上的非特异性蛋白结合位点,以避免下一步 加入的抗体与膜发生非特异性结合。将封闭好的硝酸纤维素膜浸泡在 第一抗体中,室温震荡孵育1 小时,然后用TTBS 溶液淋洗膜2 将膜浸泡到TTBS溶液中,室温震荡洗涤3 次,每次5 分钟。将洗涤 后的硝酸纤维膜浸泡在含有酶标第二抗体溶液中,室温震荡孵育1 时,然后用TTBS溶液淋洗膜2 遍后,将膜浸泡到TBST 溶液中,室 温震荡洗涤3 次,每次5 分钟。最后,将膜浸于荧光显色剂(新鲜刚 刚混合的等量A和B 液)。1-2 分钟后将浸泡过的膜,抖去多余显色 剂,夹入保鲜膜(保鲜膜应薄而透明,以免阻挡曝光效果)中,同时 观察显色情况,确定大致曝光时间(一般情况下,如果样品亮度肉眼 可见且较强,那么初次曝光时间应较短,一般选3-5 秒;如果样品亮 度肉眼不可见,则初次曝光时间应略长一些,一般选择1 分钟),曝 光完毕,经显影,定影后,用清水冲洗X 光胶片,根据胶片上结果 情况,再将膜放入曝光暗盒中进行二次曝光及显影、定影反应。溶液 配制及整个操作过程请斑点杂交操作流程图。Dot blot 需要TTBS 解的倍比稀释后的标准品做对照方能进行半定量。同时样品倍比稀释也是半定量所必需。 附1:Dot-Blot 操作流程图 一、试剂1、抗待检样品抗体: 第一抗体为纯化鼠抗人 IgG Fc 单抗; 第二抗体为 HRP-兔抗小鼠 IgG 2、封闭液(5%脱脂奶粉)3、底物荧光显色剂 缓冲液:取三羟甲基氨基甲烷(Tris)60.5g,NaCl 45g -805.5ml ,加适量超纯水溶解,用浓盐酸(~32ml) 个月。用前10 倍稀释为 TTBS缓冲液。 二、操作 1、取硝酸纤维素膜 张,将标准品倍比稀释、样品、阴性对照、阳性对照点在膜上,风干。 2、将膜置于封闭液(5%脱脂奶粉溶于超纯水中)室温封闭 过夜封闭)。3、弃去封闭液后,加入含有待检样品第一抗体的 TTBS 缓冲液 30mL(抗体稀 1:1000),且其中含有1%的脱脂奶粉,室温震荡孵育 小时。4、将硝酸纤维素膜用 TTBS 缓冲液充分淋洗两次,每次洗后都尽量弃去溶液。 然后再用 TTBS 缓冲液震荡洗涤 分钟。5、弃去液体后,加入含有第二抗体的 TTBS 缓冲液 30mL(抗体稀释度为 小时。6、将硝酸纤维素膜用 TTBS 缓冲液充分淋洗两次,每次洗后都尽量弃去溶液。 然后再用 TTBS 缓冲液震荡洗涤 分钟。7、取出硝酸纤维素膜,略除去膜上多余溶液后,加入适量的荧光显色剂 (一般1/2 4mLA、B混合液,且液=1:1)。8、用保鲜膜将硝酸纤维素膜覆盖,尽量平整,避免产生气泡,并放在曝光夹 上,根据样品及标准品的亮度,初步确定曝光时间(一般情况下,如果样品亮度 肉眼可见且较强,那么初次曝光时间应较短,一般选3-5 秒;如果样品亮度肉眼不可见, 则初次曝光时间应略长一些,一般选择1 分钟),然后取适当大小的胶片覆盖在薄膜 上,关夹曝光。 8、曝光后,取出胶片浸于显影液中,在红光下观察,直到胶片上的样品点不再变化为止(~1.5 分钟),取出胶片在水中涮洗一下(此步骤避免显影液与定影液混合,降低定影液使用 效率),再放入定影液中,当胶片本底呈现蓝色透明后,即可取出胶片进行流水冲洗, 洗净后晾干即可。 此实验中的注意事项: (1)在整个操作过程中,手不能直接接触硝酸纤维素膜,以免蛋白污染或造成蛋白降解; (2)脱脂奶粉封避一定要充分,否则容易造成膜与蛋白的非特异性结合,导致结果片中出 现杂点或假阳性,干扰试验结果。 (3)一抗浓度与二抗浓度不宜过高,否则容易造成高背景或者杂点。适宜浓度的选择,可 以通过不同浓度组合的预试验进行确定。 (4)暗室一定要确保其不漏光,否则容易造成X 光片跑光,整个光片全黑的情况。 (5)曝光时,时间的确定应该具体情况具体分析,需要一定的实践经验积累。 ELISA 1、双抗体夹心法:本法适用于样品含量低灵敏度要求高的定量分析, 简述如下。先用选定的第一抗体(单抗原结合点的单抗为首选)在碱 性条件下(一般PH=8.0~8.5 碳酸盐缓冲液)包裹96 夜或者室温1小时。然后用排枪或真空吸管吸出一抗,再用BSA 稀释的奶粉封闭45至60 分钟。封闭后用洗涤液洗板2 次。加入待测 抗原样品(条件培养液)和标准品(PBS 稀释)。用洗涤液洗板2 加入标记好的相应抗体室温1小时。用洗涤液洗板2 次。如果不是标 记的抗体,可再用标记的抗一抗抗体(二抗)重复以上步骤再加入底物 液显色和上机读数。 2、间接法:适用于灵敏度要求低,样品含量高的分析方法,步骤如 下。将制备好的标准品及样品,加至96 温放置3小时。用洗涤液PBS-T 配制的1%BSA 溶液加至板内, 37 放置1 小时。将封闭好的酶标板用洗涤液洗板2 同时加入两孔空白对照(稀释液),37放置1 小时。用稀释液稀释 HRP 酶标记的第二抗体加至板内,37放置1 小时。用洗涤液洗板2 次。加入底物液显色和上机读数。 注:终止液可加可不加。 3、结合竞争法:放射免疫法是典型的竞争法。它利用同位素标记抗 原(I-125)与非标记抗原竞争结合抗体。非标记抗原或者样品中的 抗原越多标记的抗原(I-125)与抗体结合的越少。一定浓度的PEG 可以沉淀抗体结合的标记的抗原(即抗原-抗体复合物),但不可以 沉淀游离的抗体或抗原(即非结合的抗原或者抗体)。沉淀的抗原- 抗体复合物离心后吸出上清中的非结合的抗原或者抗体可以经过放 射性计数定量。标准品或样品中的待测抗原越少计数越高。根据这个 道理可以画出标准曲线和查出相应标准品中的抗原含量。此法灵敏度 高于其它方法,可达到10-100pg/ml 水平,适用于血浆和组织药物浓 度的动力学研究(药物PK study)。 4、新方法的建立原则 以上所有方法的建立主要取决于抗体质量的好坏,因此多试几个商品化的抗体有必要。 一般情况下,先决定所测样本中抗原量的最低和最高限度,即测定范围。原则上要求抗原和抗体的浓度等量,比如新方法要求检 测抗原浓度在 1~10mg/L 范围内,灵敏度要求是 1mg/ml,最高浓度 10 mg/ml,高于10 mg/ml 使用样品倍比稀释的方法来解决。此时, 检测抗原浓度在 1mg/L,假设需要 100%抗原抗体结合的有效抗体稀 1:8000,又假设需要100%抗原抗体结合的有效抗体稀释度 1:4000。因此决定此法有效抗体稀释度在 1:8000 1:4000之间。我们的结论是一般情况下抗原的浓度降低则抗体的相对浓度也 降低。如果想提高方法的抗原探测灵敏度,一般使用相对低浓度的抗 体。如果想降低方法的抗原探测灵敏度,一般使用相对高浓度的抗体。 分析方法的变异范围(代表可靠程度) 一般用 CV (Coefficient variant)来计算。CV=SD(标准差)/X(平均值)100%。 一般批内(intra-assay)的CV要小于批间(inter-assay)的CV。例如N 至少要大于6)同一代测标本在一次方法分析中相差会很小,即CV 很小(CV=5-10%可以接受)。又如N 个同一代测标本在多次 方法分析中相差会很大,即CV很大(CV=10-30%可以接受)。批内 和批间变异是最常用的定量分析控制方法。一般低温(-30或以上) 长期贮存的质量控制用标准品在每次方法分析中都要使用,这就是常 用的定量分析方法的质量控制。 附:单克隆抗体制备原理 单克隆抗体的制备过程包括经典的细胞克隆化步骤。理解单克隆 抗体的制备不但有助于理解细胞克隆化的方法,还有助于理解分析方 法中抗体的选用。 简单地说,将一定浓度的抗原免疫小鼠,取小鼠脾脏,无菌磨碎, 取悬浮的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在体外在一定浓度PEG 的作用下 (PEG 可将2 个或多个细胞融合在一起)融合形成杂交瘤细胞。经过 HAT 培养液在96 孔细胞培养板中筛选,死亡者为未融合的小鼠骨髓 瘤细胞(HAT 培养液可杀死小鼠骨髓瘤细胞)和不能传代生长的小 鼠脾脏细胞(高度分化细胞不能传代生长)。幸存者(即可在HAT 培养液中生长的细胞)为融合的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞具有小鼠脾 脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞共同的特性,因此可以在HAT 培养液中传 代生长。 使用简单的抗体抗原结合的方法可以测定96 瘤细胞的抗体分泌量。选出分泌量最高的杂交瘤进行细胞扩增,再克隆,鉴定抗体的类型和亲和力,IgG 为首选。以上就是单克隆抗体制 备的简单过程。 附:多克隆抗体制备原理 将一定浓度的抗原免疫大鼠或兔羊马的起初产生的免疫球蛋白 为IgA IgM,后期大量产生IgG,IgG 可分为IgG 型。定期取血清检测抗体滴度,大约2-6 个月左右抗体滴度达到理想标准。全 部采血或分批采血取血清收获,即可获得多克隆抗体,直接纯化后使 稀释度来计算的。阳性100%结合的最低稀释度为抗体有效滴度,也是我们通常使用的抗体有效稀释度。抗体有效稀释度与所测定的抗原 量相关,抗原量高的抗体的有效稀释就相应降低,原则上抗原和抗体 的分子数为1:1。 七夕,古今诗人惯咏星月与悲情。吾生虽晚,世态炎凉却已看透矣。情也成空, 且作“挥手袖底风”罢。是夜,窗外风雨如晦,吾独坐陋室,听一曲《尘缘》,合 成诗韵一首,觉放诸古今,亦独有风韵也。乃书于纸上。毕而卧。凄然入梦。乙 酉年七月初七。 第一站:病史采集:男,21岁,腹痛伴恶心呕吐 小时急诊就诊。病历分析是十二指肠溃疡。第二站:体格检查是血压测量,颈部部淋巴结检查,肺底移动度,脾触诊,Brudzinski 征。基本操作,腹穿。