1. 熔解曲线主峰前有杂峰可能原因:存在比目的片段短的非特异性片段,也有引物二聚体的可能;2. 熔解曲线主峰后有杂峰可能原因:存在比目的片段长的非特异性片段;熔解曲线的问题,小伙伴们还是主要注意,引物设计和浓度是否有问题,同时操作时注意污染和镁离子浓度是否过高。三、数据处理对于qPCR数据的分析主要是绝对定量和相对定量。1. 绝对定量主要使用标准曲线的方法;对于科研小伙伴们,主要通过相对定量来分析目的基因的表达差异。2. 相对定量,主要使用的方法为双标曲线法和2^-Ct首先要明白的就是Ct值的定义:PCR过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。因此分析定量时目的基因Ct值取15-35较好。内参基因的Ct值一般在13-15左右较好,需要注意的是:平行孔之间Ct值相差不要超过0.5,这也是为何建议设置3个平行孔的原因。2^-Ct为最常用的方法,表示实验组中目的基因较对照组中目的基因表达的差异倍数,计算公式首先:Ct=Ct(实验组)-Ct(对照组)Ct(实验组)= Ct(实验组目的基因)- Ct(实验组内参基因)Ct(对照组)= Ct(对照组目的基因)- Ct(对照组内参基因)最后表达水平的差异倍数Fold Change=2^-Ct当Ct>0时,目的基因呈现下调趋势,Ct