再加上你本身样品CT值就很大,通常来说CT值大于32可信度就已经降低了(因为样品稀释度很高时就不服从正态分布,而是服从贝努里分布)。
所以你的标准曲线数据重现性会很差,计算出来的效率也会忽高忽低。
建议先用PCR扩增目的基因,然后再用PCR后产物(最好是10倍等比稀释7个梯度,每个梯度做三个重复)来做标准曲线。
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举个简单例子说明这个问题:
1) 假设地上有1000个绿豆。现在你闭上眼睛从中间切下去,那么大致能对半分,也就是500:500(1:1)的关系。
2) 然后将其中的500再闭上眼睛从中间切下去,那么还是能大致对半分。
3) 如此反复进行。。。。
4) 当最后剩3个绿豆,现在再闭上眼睛从中间切下去,就有很大概率是一边3个,另一边0个(即全或无的关系)。
因此,如果绿豆数量多的时候,闭上眼睛从中间切下去,大致能对半分,这就是服从线性分布。
如最后绿豆数量减少到一定的时候,闭上眼睛从中间切下去,绝大部分情况是全或无的关系, 这时就服从贝努里分布。
回归qPCR:
“绿豆” = “DNA”
“闭上眼睛从中间切下去” = “二倍稀释” (强调“闭上眼睛”是因为我们稀释时也看不见DNA,保证随机性)。
当DNA稀释服从线性分布时,这时的qPCR就是传统意义上的qPCR. 这时候的标准曲线才时一条直线。
当DNA稀释服从贝努里分布时,这时的qPCR叫做"digital PCR(数字PCR)". 为什么起这个名字呢? 因为计算机存储是 0与1, 也就是 全或无。 以前大学生理学上提到过细胞动作电位的“全或无”现像也是这个道理,是数字信号,区号于模拟信号。
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