实验原理】
考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465 nm,后者在595 nm。在一定蛋白质浓度范围内(1~1000 mg),蛋白质与色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。
【仪器、材料与试剂】
(一)仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
(二)材料
1. 叶片或根系
2. 磷酸氢二钠
3. 磷酸二氢钠
4. 考马斯亮蓝G-250
5. 95%乙醇
6. 85%磷酸
(三)试剂
1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):
A母液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O(分子量358.14)71.7g;
B母液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量156.01)31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS(pH7.8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,B母液(NaH2PO4) 21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。
2. 考马斯亮蓝溶液:称取100 mg 考马斯亮蓝,溶于50 ml 95%乙醇中,加入100 ml 85%(W/V)的磷酸,再用蒸馏水定容到1L。在黑暗中静置2小时后用漏斗过滤并贮于棕色瓶中,常温下可在暗中保存一个月。
【实验步骤】
1. 酶液提取
称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三次加入1.6ml (0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml)50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、12000g下离心20min,上清液即为蛋白粗提液。
2. 酶活性测定
取100ml酶液,加入2.9ml考马斯亮蓝溶液,反应2min后测OD595。
3. 计算结果
蛋白质含量(mg/g)=(查得的蛋白质含量/ug×提取液总体积/ml)/(样品鲜重/g×测定时所用提取液体积/ml)