引物设计原则
1、长度:15—30bp,其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38,否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度),从而降低产物的特异性。
2、G十C含量:应在40%一60%之间,PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时,其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。
3、碱基分布的随机性:应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C,否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。
4、引物自身:不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构。
5、引物之间:两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端的互补重叠。
6、上下游引物的互补性:一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。
7、3’末端:如果可能的话,每个引物的3‘末端碱基应为G或C。
8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。
扩展资料
引物合成
1、是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团DMT,获得游离的5′-羟基。
2、合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3′端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。
3、带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在后续环节根据实验需要来选择纯化方式分离掉。
4、在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
参考资料来源:搜狗百科—引物设计