鱼堂竖坠塑!QU链尘旦笙!Q鲞笙兰翅!!!翌型丛生!!!塑堡鱼坠塑211坐!!垒P型垫!!!!!!:!Q!堕!:兰Ph阴性伴Y染色体缺失的不典型慢性粒细胞白血病一例并文献复习王梅芳杨林花李国霞杨波 高芳 高艳【摘要】 目的对一例Ph阴性、bcr—abl 融合基因阴性伴Y染色体缺失的不典划慢性粒细胞白血病( CML) 患者进行荧光原位杂交( Fl sH) 分析,以枪测其是否存在隐蔽的hmahl 基因重排,排除h卜ahl融合基刚假阴性可能,验证其Y染色体缺失的异常核型。方法采用位点特异性探针GLP},cr—abl ( 绿/红)额外信号( Es) 探针检测bcr_abl 幕凶重排;采用着丝粒探针CSPY染色体缺失。结果GI.Pbc:卜abl ES探针计数200个间期细胞,100%为两红、两绿信号,Ph染色体为阴性;着丝粒csP 18/csP x/csP Y探针计数200个问期细胞,67%细胞为两蓝一绿信号,红色信号丢失,存在Y染色体缺失。结合其病情特点,Y染色体缺失为后天获得性。该例Ph阴性、l性伴Y染色体缺失的不典型cML患者预后差。结论Ph阴性、kr-abl 融合基因阴性伴Y染色体缺失的不典型cML患者病情进展凶险,预后差;FIsH技术检测染色体异常特异、可靠,有助于对不典型cML患者确诊,关丁小典犁CMI。患者的分子生物学本质有待进一步病例积累及研究揭示。【关键词】IJ }l 阴性; 白血病,髓样,慢性;原位杂交,荧光Ph阴性(Ph一)不典型慢性粒细胞白『IIL病(chmnj c:myel ocyti cl e¨ kemi a,cML)依据其分子学本质可分为Ph一/bcr+及Ph一/},cr不典型( :ML。Ph一/bcr+cMI。伴有变异、复杂或隐匿Ph易位,其临床和血液学表现与Ph阳性cML没有差别;Ph一/bcr不典型CML罕见,Ie分了生物学本质有待临床进一步病例积累及新的检测手段研究揭示j ,研究显示,Ph一/hrr不典型CML临床特点呈异质性,有别于典型Ph+/hr+( :ML,多数患者治疗效果差,预后差,多以骨髓衰竭死亡,急变少见。临床应与骨髓增牛异常综合征( myel odyspl astj c syndmme,MDs J 及其他骨髓增殖性疾病进行鉴别。荧光原位杂交( nuorescence i nsi tuhy踊di zati on,FISH) 检测X寸其遗传学异常有确证价值。现将我院诊断的l 例Ph一/bcr伴Y染色体缺失不典型r:ML患者作一报道,对其染色体标本进行FIsH柃测,并进行文献复习。1资料与方法1.1病例资料患者,男,67岁。主因间断发热、头晕、面色苍白、疲乏兀力4个月于2( ) ( ) 9年11月20日于我院就诊。患者4个月前出现发热,呈低热,伴乏力、头晕、食欲不振,自以为感冒,于当地诊所问断静脉输注抗生素( 具体药物不详) ,效果欠佳。症状渐加重,出现活动后心悸,,后发现四肢皮肷散在出血点。既往史:平素体质欠佳,4年前当地医院化验血红蛋白( 11h) 90 g/L,未予诊断和治疗,间断白行服用含铁制剂;3年前,无诱因突然剧烈腹痛就诊于当地医院,诊断为脾破裂,行脾切除术;有输m史;患者育有.儿一女,家族中无类似病史记载二体格检杏:中度贫血貌,伞身皮肤可见散在⋯血点,睑结膜苍白,浅表淋巴结末触及,胸骨压痛可疑.心牢103次/mi n,各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音;肝脾肋下缘未触及。血常规:白细胞( wBC)92.2× 109/L,}[ 细日包( RBC) 2.68× 10” /L,Hh 72.1 g/I.,血DOI:10.376帆ma.j .j s异n.1(x)9—9921.2011.04.019作者单位:030( ) ( ) 1太原,山西医科大学第一二医院血液科通信作者:杨林花.Emai l :)Tan—h196()@yal l 00.comⅧ·245·· 短篇论著·偏低,成熟红细胞大小不一,部分中空区偏大。2 cm× 2 cm髓膜上共计巨核细胞15个,颗粒型13个。裸核2个,血小板少见。外周血片:原始粒细胞占0.08,可见中幼粒细胞及晚幼红细胞,易见嗜碱性粒细胞;成熟红细胞大小不一,部分中空区偏大,易见畸彤( 靶型、棘状、碎片) ,Pn少见。诊断为“ cML慢性期可能性大,建议查染色体、融合慕凶确定” :骨髓活检:骨髓增殖较活跃,C/E增大;粒系以巾性晚幼粒及以卜.阶段细胞为卡,成簇分布,红系以中幼2l :细胞、晚幼红细胞为丰,散在或小簇分布;全片未见巨核细胞;银染色( +) ,铁染色( +) 。院外L:】服羟基脲,并水化、碱化尿液等支持对症治疗。患者wBc下降,P1f降低明显,于2010年2月就诊于当地医院,r输PIt等支持对症治疗,病情无改善。相继出现尿血、呕血,最终因消化道大出m于2( ) 10年3月4日死亡。1_2 FISH方法检测Ph及Y染色体1.2.1操作方法染色体标本来源于外周『f【L,肝素抗凝,采用24 h短期培养法,收集细胞悬液滴片。37℃下2× ss( :中老化30 mi n。在 自墅&瘟:鲞里堕!盟.!堡垒旦筮垫鲞箜曼塑』竺望型堕丛鲤鱼垦!型砭坠塑坠垒世!呈Q!!:!尘:垫:盟!::|170%、80%、100%的乙醇中室温下梯度脱水各2~3 mi n,室温下晾干。将玻片放入已在75℃中预热的70%甲酰胺/2× sSC混合液中变性3—5 nl i n,取出分别在70%、80%、100%的乙醇中脱水各2 l Il :i n,室温下晾干。暗环境中取探针1.0山+杂交液7.0山+2.O—H:O( 每例标本l Om反应液) 加入到离心管中离心混匀,置于75℃水浴箱中变性处理5 l l l i n。将10斗l 反应液加在玻片上已规定的杂交区域内,用22 mm× 22咖盖玻片盖好,封片胶封好四周,略干后放入保湿盒内杂交16—18 h(42℃k快速洗脱样本,玻片晾干后加D埘10 m,盖玻片封片,室温下复染15 mi n。采用位点特异性探针GLP bcr.abl( 绿/红) 额外信号( Ex妇si 印al ,Es) 探针检测Ph染色体,采用着丝粒探针csP 18/CsPX/csPY( 蓝/绿/红) 检测Y染色体。1.2.2结果判读GLP ber-aJ )l Es探针能区分BcR断裂点位置为主要断裂点( M.BCR) 还是次要断裂点( m.BeR) 。正常细胞为两红、两绿信号;M.BCR阳性细胞为一红、一绿、一黄、一小红信号;m.BCR阳性细胞为一红、一绿、两黄信号。着丝粒探针csP18/csPX/ICSPY( 蓝/绿/红) 检测Y染色体,正常细胞为两蓝、一绿、一红信号。日本0l yInp鹏Bx51荧光显微镜下通过三色滤光镜激发观察杂交信号,每例至少分析200个间期细胞,不计数重叠细胞,计算阳性细胞的百分比。结果判定:至少10%以上的细胞出现异常的杂交信号才能被判断为阳性结果。2结果计数该患者200个间期细胞,均为两红,两绿信号。结论为患者外周血中期染色体标本中细胞全部为两红、两绿信号,无黄色融合信号,Ph染色体为阴性,不存在Pl l 染色体或隐蔽的b删基因重排,与bcMbl融合基因阴性凌捌结果—致(图1)。着丝粒探针csP 18/csPx/csPY检测结果:计数患者外周血中期染色体标本200个间期细胞,67%细胞中为两蓝一绿信号,红色信号丢失,结论为存在Y染色体缺失( 图2) 。图1:箭头所指为正常细胞:两红、两绿信号;图2:箭头所指为Y染色体缺失细胞:两蓝一绿信号,红色信号丢失圈1 nsH法位点特异性探针GLPbcr.abl 检测慢性粒细胞白血病患者示Ph染色体阴性× 1000图2 nsH法着丝粒探针CSPl 8/csPx/csPY检测慢性粒细胞白血病患示Y染色体缺失× 10003讨论cML是起源于多能造血干细胞的恶性血液病。t( 9;22)( q34;q11) 即Ph染色体是CML特征性的染色体异常,并在分子水平上导致bcr.abl 融合基因形成。95%的cML患者能检测到Ph染色体,其中5%一10%的患者为变异Ph易位形式『l l 。变异Ph易位有3种类型:简单变异易位、复杂变异易位、遮蔽或隐匿的Ph易位。由于白血病细胞分裂指数低,染色体形态短小,常显带不清,Ph染色体变异易位又可导致染色体形态变异,一些结构复杂或细小的改变常规染色体分析常难以准确识别,容易漏诊cML,因此分子分析显得尤其重要。bcr—abl 融合基因检测具有快速、灵敏的优点,但可因标本质量、交叉污染、引物设计等原因,造成假阳性及假阴性的可能性大,容易误诊或漏诊。nSH技术可以揭示bcr重排及某些不能识别的基因缺失和断裂点改变,具有灵敏度高,操作简单,取材方便,不受细胞周期限制;与反转录.聚合酶链反应相比,可减少由于交叉污染或引物设计而引起的假阳性、假阴性结果,因而所得结果更为准确。在CML诊断、疗效判断及微小残留病监测中是一个可靠的检测手段∞。本病例在常规染色体及分子生物学特征检测均为阴性,但临床特征疑似CML的基础上,采取Dc—Es一啜H探针检测,以排除隐匿或变异Ph存在,迸一步确证其染色体核型异常。研究表明,P矿cML依据其分子学本质可分为Ph一/b一及Ph~/bcr CML。Ph一/bcr+CML,为伴有变异和复杂或隐匿Ph易位,其临床和血液学表现与PIl tcML没有差别;Ph一/hcr不典型cML罕见,其分子遗传学变化有待于进一步研究嘲。P小/bcr不典型cML临床表现和血液学改变有别于Ph+典型cML,如年龄更大,男性多发,贫血和Pl t减少更常见,治疗效果差,疾病进展多以骨髓衰竭为主,急变相对少见。生存期偏短等嗍。关于其诊断,一般认为:( 1) 至少分析25个骨髓及外周血细胞有丝分裂相未发现Ph染色体;( 2) 骨髓中粒细胞异常增殖,存在核左移,骨髓中原始细胞<30%;( 3) 持续不明原因外周血白细胞增高>10× l 舻/L,原始细胞≤5%:( 4) 外周血发现早中晚幼粒细胞;( ” 分子生物检测无bcr基因重排;( 6) 诊断应与MDs中慢性粒单核细胞白血病( CMML) 、acML及其他骨髓增殖性疾病进行鉴别。既往报道Ph一/bcr CML单核细胞比例增高,但最终确诊为MDS中cMML。与cMML相比,Ph_/bcrCML在年龄、性别、脾大、生存期、Hb、Pl t数量、骨髓中G:E、细胞遗传学异常发生率及类型及Ras原癌基因突变发生率等方面与CMML十分相似。单核细胞比例及成熟程度是两者之间鉴别的一个主要要点闻。本例患者外周血单核细胞比例正常,绝对计数较高,骨髓中单核细胞比例也较高,占5.6%,但均为成熟单核细胞,有别于CMML。