内皮舒张因子是一种不稳定的化合物,能被血红蛋白及超氧阴离子自由基灭活。长期研究亚硝基化合物的药理作用的伊格纳罗与佛契哥特合作,针对内皮舒张因子的药理作用以及化学本质进行了一系列实验,发现内皮舒张因子与一氧化氮及许多亚硝基化合物一样能够激活可溶性鸟苷酸环化酶(SolubleGuanylateCyclase,sGC),一氧化氮主要通过环磷鸟苷(cGMP)途径扩张血管。穆拉德博士的发现20世纪50年代,环磷鸟苷作为一种天然产物标志在尿中发现,相关酶类包括作用于环磷鸟苷的合成的鸟苷酸环化酶(GuanylateCyclase,GC)、水解环磷鸟苷的磷酸二酯酶和选择性地被环磷鸟苷激活的蛋白激酶。穆拉德博士于1970年结束了在美国国立卫生研究院(NIH)的训练后,决定将更多的研究精力从环化腺核苷一磷酸(cAMP)转移到环磷鸟苷,并着力解决两个问题:第一,激素类配基如何与它们的受体结合来调控鸟苷酸环化酶?第二,其分子偶合事件是什么?对受体鸟苷酸环化酶偶联的了解,有助于使用制剂或药物来增强或抑制激素在某些临床疾病中的影响。在得州大学医学院,多年来一直独立从事硝酸甘油扩张血管作用研究的药理学家穆拉德博士早在1977年就发现硝基酯类药物及外源性一氧化氮均可使环磷鸟苷的含量增高,他们甚至提出硝基酯类药物可能是通过形成一氧化氮或某种活性物质来增加细胞内环磷鸟苷的含量,进而使血管扩张和抑制血小板。至此,众多研究汇聚到一个焦点——硝基类活性物质。早在20世纪70年代,穆拉德博士与合作者就系统地研究了硝酸甘油及其他具有增强血管活性的作用的有机硝基化合物的药理作用,发现这些化合物都能使组织内环鸟苷酸、环化腺核苷一磷酸等第二信使的浓度升高。这类化合物有一个共同的性质,可以在体内代谢产生一氧化氮。1977年,穆拉德博士发现硝酸甘油等必须代谢为一氧化氮才能发挥扩张血管的作用,由此他认为一氧化氮可能是一种对血液流通具有调节作用的信使分子,但当时这一推断还缺少实验证据。穆拉德博士在前期工作中发现,在不同组织匀浆中(包括高速离心上清液和匀浆颗粒部分)都能检测到鸟苷酸环化酶的活性。但在这两种组织制备中,酶活性的动力学特征是不同的,最显著的特征就是匀浆颗粒部分对基质三磷酸鸟苷(GTP)就活性呈现协同催化动力学,而可溶性鸟苷酸环化酶的活性被证实为典型的米曼氏动力学,这个发现提示可溶性鸟苷酸环化酶的活性代表一个三磷酸鸟苷的催化位点。尽管推测鸟苷酸环化酶有不同的亚型,但由于粗制备物也含有竞争底物或产物的核苷酸酶、磷酸酶和磷酸二酯酶而无法剔除不可靠的虚假数据,穆拉德花费了整整12年的时间纯化、验证、克隆、表达和再验证这个酶,才彻底解决了这个问题。通过实验,穆拉德博士发现某些物质包括叠氮钠、亚硝酸盐和羟胺,能激活鸟苷酸环化酶。在不同组织包括气管平滑肌制备物中,叠氮钠、亚硝酸盐和羟胺也能提高环磷鸟苷的水平。这些环磷鸟苷水平的提高与平滑肌舒张有关,显示为直线的剂量应答关系。硝酸甘油,一种从18世纪70年代起应用于临床心绞痛的药物,也可活化可溶性鸟苷酸环化酶,在不同的组织包括气管平滑肌中提高环磷鸟苷的水平,引起平滑肌舒张。穆拉德博士称这些不断增长的可溶性鸟苷酸环化酶激活剂名单中气管、肠胃和血管平滑肌的弛缓剂为“硝基血管舒张剂”,确信它们能被转化为一氧化氮,因为用化学法产生的一氧化氮能激活所有测试中的可溶性鸟苷酸环化酶制备物。这些一氧化氮前药物质的作用机制因此确定。穆拉德博士提出了一氧化氮能起到调控激素和药物的细胞内信使的作用的假说,即一个自由基激活一个酶,且这个自由基是一个内源信使分子。由于被纯化的可溶性鸟苷酸环化酶的激活作用发生在纳摩尔浓度下,并且由于一氧化氮及其氧化产物亚硝酸盐和硝酸盐的测定法不敏感,在一氧化氮分析测定的新技术发展后的七八年,这个当年遭到学术界怀疑的假说才被决定性地证实和接受。穆拉德博士表示,人体内的一氧化氮有两个来源:一为非酶生,来自体表或者摄入的无机氮的化学降解与转化;一为酶生,由一氧化氮合酶催化L-精氨酸脱胍基所产生。非酶生性的一氧化氮,大部分来自硝基血管舒张剂家族,包括硝普盐、有机或无机亚硝酸盐和硝酸盐、亚硝胺、氮芥、联氨等。比如有名的硝酸甘油和硝普钠的扩张血管、治疗心脏病的功能都是通过非酶生性产生的一氧化氮起作用的。酶生性的一氧化氮,来自于一氧化氮的前体物质,例如精氨酸。摄入人体的富含精氨酸的食物,在体内通过酶生性产生一氧化氮并发挥其生理功能。酶生性一氧化氮产生机理(L-精氨酸在内皮型一氧化氮合酶的作用下生成L-瓜氨酸并释放一氧化氮)穆拉德博士的研究集中于由非酶生性产生的一氧化氮的化合物对于一氧化氮合酶的影响,这不仅阐明了一氧化氮在体内扩张血管的作用机制,而且也为新型的药物和化妆品研发开辟了道路。穆拉德博士所参与的生物科技公司所应用的技术是一种能够产生一氧化氮的组合,分别为氮剂和酸剂,其中氮剂为亚硝酸盐或富含亚硝酸盐的植物提取物,酸剂为维生素C、柠檬酸等足够强度的有机或者无机酸。使用时,先清洁皮肤,涂抹适量的氮剂化妆品,再涂抹酸剂化妆品,两者缓慢反应释放出一氧化氮,渗入皮肤,提高毛细血管血流量,促进胶原蛋白的合成,从而改善肤质。值得一提的是,早在19世纪末,德国学者格里斯(Griess)就研究和发表了亚硝酸盐的检测方法,但当时对其与一氧化氮的关系并不了解。由于亚硝酸盐是一氧化氮在水溶液中进行氧化代谢的终产物而相对稳定,改良后的格里斯法至今仍是实验室间接检测一氧化氮含量最简单、最常用的方法之一。