l 6 I1 原发 性肝癌 9 号染色体 等位基 因 声 砚 究 k, Liew Choo ’ ng Tsek 吴秋 良 。 李晓 明 邵 建永 杂 7 觋 2 . ‘ 梁 小曼 。 候箭辉 【 摘要 】 目的 : 对广 地 区 37 倒 癌 染 色体 91 的 9 个f 点进 i r擞 【 J 域 口 能存 的 I 肝癌 有关 的肿 瘤抑制 肚啁 LOH 的 位点 : 结 果 : 30 侧 l 8O 80% )在 多 态一 rE分析 , f 确 这此 化点 染 色体等 方 法 : 刘1 取 少~ 个 点 发 卜IJ )H . j Ll}】 I OH 蛳 率最 位荩 进 r微 卫星 多忐 I +1 -~ 析 蚌确 定发 高的位 是 D9S54f60 60% 1, LOH 颧半 高于 50%的 位点有 忙于 9p2l 带 的 I}NA I)9S 1 747 和 D9S I 752, 6 例在 li )H ( 能够提 供信 息的值 点均 发生 1. 0 1I, 7 倒 所 有 9 个位点 均 束发 位 于 D9S54l9[)24) , 和 I)9S I 752, I)9S1 747,I} A(91 }2I 】 结 论 :小研究 首次 发现肝 癌在 染 也体 9l】 24 I‘ 发 L 高颧半 L O { 杂台性 丢失{ LO[Il 的情 况 , 定 位 陵 . 川 I'CI/ 法 LO[t .提 本 地 区 痈 染色体 9 缺失 的 域 i 蜃 固 美键词 中图号 : R735 7 些量: 量盒. 旺五 合随链 反应 ;肿瘤 抑制 基 因 S tu d y of L oss of H eter oz y g osity on C h r om osom e 9 in P r im a ry H ep a t0c ellu lar C ell C arc in om as Sha (} J iany mg Cancer Cente r. Sun Yd¨ eR University 2 Dept.。 厂 Anatom&al and Cellular Patholog} .Faculty o j Medicine , The Chinese Uni~ : ersity 。 ,Hongkong L iew Choong T se k : 1S ang X iaoman et al Medical Sciences. Guangzhou 510060 |. Dept E目P atho logy 【 A bst ract 1 P urp o~ :W analyzed t he mic rosatellite instability of 9 ll i 【 ln I-h¨¨1 l0s{ 9n i| 1 37 hepatc Je( llJJi|rl ( ar . n‘】 m f H C C ) From G u ang don g to d etect t he 1 ()s of h etero zygos ity l k O I I J l l th es e 】 0 【 _i.i1 1 ll l t ,f i d th-L iI l㈣tu 1 s u[1[Jre~sor gen e w hi ch a ss(K4 ~ted w lt}I H C C M eth o d : I O H O1 ] th e 9 l ll⋯i eiis u r~ - l b y P C R l ^ ed mi cJI, H d IIiI ins t , il il v a r~ a lys i s R es u lt :In 3 7 t as es of H C C ,at l eas t 3 0 【 -as s h ave L 0 TI O I~: {: UlT@ Il of DOn— inf i m na ti ve at (, n h,cuH.6 ()f th lI 30 I-uH s H CC of: e urlx~d I OH at a ll the nine loci ⋯一 hH㈣ 0me 9 p H ig h frequent 【 0 l I f> 5 0 % J ⋯ ec u 1j aI four l川 I ineIuding D 9S 54 l 6O 6 0% 1.D9 S l 75 2 f5 3 84 % J . IFN A ( 5 2 I7 % } and D9 S I74 7 ( 5() 04 )% 1 S ( ‘ ) 】 ()} _ l¨ I. ⋯l 0{ 1 1 o [/ 一 inl bm mtIv al all the n in e 1oe l 1’h e resu lts ind i ca led tha t h igh freq uent 1 O H (H-(-ur]~ l {It (一 hrom J f f l 9 i)24 r| J i【 ¨1 a¨ l at h⋯(, (, m 9 p 2 I reg im l C o n cl us tlo n : F r o m ou r i nvesti gatio~J we tl r: -,tly 1 Il I Ihat hi gh f l -⋯Iu ¨t v ·jf L O H 【 ¨ ⋯u r d at 9 ~)24 b an d. and h igh e r fre qu ente y e l ID H Wet@ e l sl ~ t~ ct: urred at 9 p2 1 re gion.I'h I- resu ltH i nd i~-ah th I Ⅲ )r tha n I JI】 I'SG re lated “ ’ H C C ma y bar red at eh ]x)l N c* sO1 ]l ~ · 9 p 24 r Olq and 9 p2 l r eg ion K ey w o r ~: H epat(x : ell ula r cel l cat'i : J illlnqo; 】 )s of h ete roz~g< 3 s l y: I)oly merase clm in ㈨-tiIlI】 : ru ITIOr SUp lHV s l l gen e 原发 性肝 癌 ( Primal ' hepaloeellular carcinoma. PHC ) 存我 圉的发病率在恶性肿瘤 中居第 一位 , 约 占 世 界年发病例数 的 42 5% I I。流行病学研究表 明 , HBV 感 染 、含 黄曲霉毒素 B. 的食 物摄 人等与 PHC 发病有关 , f}I这些 危险 因素是 参与 PHC 的基 因变 作者 亘住 : I广 州 tP 山 医科 太 学肿 瘤 医院病理 科 【 广 州 510060 ) 2香港 中文 太学 匡学 院病 理解 剖及 细胞 病理 学 系 化 尚 星多态性 标记 .通过等位 基 凶杂☆ 性丢失 heterozygosity.LOH ) 分 析 ,町以检测染 色件 上较 小 区域基 冈异常丢 失 .进而准确定位 并发 理这些 可能 隐含 的肿 瘤抑 制基 因 I ru『 【 】 .J1 SG) . .肝搐在 I P、 4f 、 4q、 81 ) 、 8【 { l16p、 I6{1发生 I,OH 在肺 小细胞癌 、 食管煽和鼻咽痛等肿瘤 中常 见 9 号染色体 9f)21— 22 医发牛 I,OH 域 可 能存 在 与肝 癌 l卡 H炎的 TSG 清楚 = 检测肿瘤基 组 中特定染色体的微 lJ — of 域 ne. suppressor , 提示在这 个区 肝 癌 9 号 染 色体 维普资讯 http://www.cqvip.com 《 谊 ~1 999 年第 1 8 卷第 1身】 l 7 LOH 的研 究国内 尚未见报道。 本研 究选取染色 『 率9p 的 9 个位点 , 进 行 PCR 微卫 星多态性标记分 析广 东 地 t 肝癌 中的 IX) H . 发现在 9p21和 9p24 两 个f五域 发 明显的等位基因杂合性丢失 1 材料 与 亩 . q . J 1. j 标 本 来 源 37 例 PHC 组织 取 自本科存 档的蜡块 组织 ,选 取肿瘤和瘤旁肝组织蜡块 ,部分病例蜡块肿瘤和正 常jl1 : 组织 混杂 ,组 织片经修饰剔除正常肝组织 . .病 人 { 龄 4o ~79 岁,平均 63 岁 。其 中男 34 例 ,女 3 例 所有病 人在住 院期 间均 怍 f HBV 血清 五项和 IICV 血清抗 体检测 1 2 DNA 抽 提 选 取瘤 细胞 保 存较 好 的瘤 组织 蜡块 和 癌旁 肝 ’ _~f f ff f 蜡块 , 视组织块 大小切取 5 ~l0 片 10 切 I 放人 1 5 mI E ppendof|管 中, 加 1 ml 二 甲苯脱 蜡 1 0 分钟 . 离心后倾去二 甲苯 。重 复 酒 精洗 甲苯 1 0 分钟 ,离心 后倾去酒精 ,重 复一 一 次将 Eppendof l 管置于 65 : 的温箱 中烘干 1小 时, 使 两精 完 全 挥 发 , 用 High Pure PCR temp]ate F'rellaralion Kil ( )ehringer Mannlleim) 抽提 DNA , 最 终 浓度稀释 至 100 ng/ lJ. 1 J 微 卫星 多态 性分析 9 号染 色 体 9 个微 卫 星标 记 物 引 物 购 自 Re- s㈨ - h Genelic 公司或 由 Oligios IⅢ-公 司合成 。每 对 引物 正链在 T4 多取核 苷酸合成酶 (PNK ) 催化下标 l 厚的 次] 加 95% 睡 . . . 一 记 ¨ -32一 P. A3’P 【 A rnlersham Corporation UK J PC R 反 应总体积 5 it] ,含模板 DNA 150 ng,10 XPCR 缓 冲 液 1. 5 l , I 5 r e t o ol/ L M 0. 1U Taq DNA 酶 和 0. 5 Pmol/ lJ 正负引物 。根据 不 同。 1物选 择最 佳退 火温度和 时间 , PCR 反应循 环 40 次最后 于 72~ C 变性 7 分钟 , 4 电泳载样液 等量 稀释 ,95℃ 水浴 变性 10 分 钟 ,取 1 5 LLl 点样 于 6% ~7. 5% 聚 丙酰胺 凝 胶 ,I70 V , 30 ~ 40 w 电泳 3 ~4 小 时后 真空 干胶 ,于暗盒 中对 x 光底片放射 自显影 1 .62. 5 g. mol/ L dNTPs. 保存 . PCR 产物与 2 结果 2. 1 肝癌 组织发生 L OH 的结果 判断 癌 旁肝组织 DNA 为多态 杂合 子时 , 出现两 个等 位 堆因片段 , 与癌组织对 比 , 癌组 织 DNA 扩增带一 条 消 失 活一 条带 信号 明显 减 弱 时定 为 LOH ( 如 附 图 D 9 8 1748 N T ● D 9 S l 749 N D 9S l 7S2 N T T 1 C a se 5 D 9 S126 C I嵋e S I F N A . C ase l 7一 。 C atle 2扩 C atie 17 . 1 ‘ 附图肝癌 9 号 染 色体微 j i 里多 念性 丹析 LOH 问位素 放射 自显 影结 粜 方 框下 为病 例序 号, 力 框 j 力为微 卫星位 点 名称 ;方框 顶部示 肝癌 肿瘤 组织(T 【和 癌旁 正常肝 组织 ( ) 泳带 信 号癌旁 肝组 织 明显 碱弱 箭 头 《 1示 肿瘤组 织 发 : LOH, 其 中 一 条等位 基因 电 2. 2 结 果 本组肝癌 组织 中染 色体 9D 发生 ID H 的频 率 微卫 星多态性标记选取 的 9 个位点 均在 9 号 染 色体短臂上 (9p) , 其中位于 9P21带 的 7 个位点依 次 为 D9S I26. D9S 1752, D9S 1748. D9S 1747. D9S1749, D9S 1751和 IF NA , 另外两个位点是 D9SI62(9p22) , D9S54 (9p24) 。37 例肝癌 中 , 7 例在所有 9 个位点均 未发l牛 L OH , 3O例在至少一个位点发生 LOH , 其中 6 例在所有能够提供信息的位点均发生 LOH。在所 检测 的 9 个位点 中 ,有 4 个位点发生高频率的 LOH 大 于 50% ) .分 别 是 D9S54 (60 60% ) .D9S1752 (53. 84% ) , IFNA (52. I7% ) ,D9S I747 (5O. 00% ) 。 D9S 162 位点 LOH 频率 最低 f I5. 38%) , 另外 4 个位 点 的 LOH 发生频率均大于 30%。本 组 37 例 肝癌组 织 中染色体 9p 发生 LOH 的频率 见表 I, 提示 本地 区 肝癌染色体 9p 缺失 的区域 主要位 于 D9S54 (9p24) , 和 D9S I752 , D9S I747 , IF NA ( 9p21) 。 2 3 本组患者 HBV 血清五项 和 HCV 血清抗 体检 测 结 果 37 例肝癌 中 ,血清 HBV 五项 中至少一项 阳性 5(1 zl 一 lii 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 邵建 承 , 等原 发 哇开癌 9 号染色 体等 位基因 杂 台性 丢 失 究 表 1 37 例肝 癌组织 染色体 9P 发生 L OH 频 率 者 35 例 (94. 59% ) , 血 清抗 HCV 抗 体 阳性者 l 7 例 (45 95% ) ,其 中 HBV 和 HCV 复合感染者 l6 例 (43. 24% ) 。HBV 和/ 或 HCV 与本 组 肝 癌 各 位点 LOH 的关 系见 表 2 表 2 ItBV 和 / 或 H CV 与肝 癌染 色体 9P L OH 的关 系 3 讨论 染 色体 9p 区域 的缺失是 许多肿瘤 的细胞 遗传 学改变, 尤其是 9p21带, 在许多肿瘤中发生高频率 LOH。小 细胞肺癌 、 鼻咽癌 、 食管鳞癌 和膀胱癌等肿 瘤均发生高频率 9p21带 LOHt 。I, 并 提示 在染色体 9P 上存在 至少两个 肿瘤抑制基 因 (TSG) 。Tarmin 0 等 报 告 食 管 鳞 癌 在 染 色 体 9p21 带 的 D9S171 和 D9S 165 两个 位点发生高频率 LOH , Kim ‘ 等报告小 细咆肺癌 在 9p21带 的 IFNA 和 D9S171 位点 附近发 生 高频率 LOH , Huangf 等报告鼻咽癌在 9p21 带的 D9S 126.D9S 171 和 IFNA 等位 点 发生 高频率 LOH 和等位基 因纯合性 丢失 。 本研究 对广东地 区 37 例肝癌染色体 9p 的 9 个 位 点进行微卫 星多 态性 分析 ,结果 81. 08% 的病例 在 至少一个位点发生高频率 LOH, 其中LOH 频率最 高的位点是 D9S54( 60. 60% ) ,LOH 频率高于 50% 的 位 点 有 位 于 9p2- 1 带 的 IFNA , D9S1747 和 D9S 1752。