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医学研究过程中,非常重要的一环就是实验数据的处理与分析。而图像,是最为常见的展现形式。
相信大家一开始看研究型文献,一定会懵逼于其中一幅幅缤纷多彩的图像。一篇医学文献中,少则有20+张图,多则可达70+张图。看不懂图,也就看不懂文献。
在多种类型的实验数据图中,最让小白们懵圈的,当属
流式细胞图。
于是今天小编就带大家了解一下,流式细胞术的原理以及如何看懂流式细胞图吧。
流式细胞术的基本原理
基本仪器:流式细胞仪
流式细胞仪(Flow cytometer )是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。目前广泛应用于外周血细胞的免疫表型分析、凋亡分析和细胞因子的检测.
如上图所示,细胞进入鞘液,鞘液使细胞悬液聚拢,依次通过激光束,检测器会检测前向和侧向散射光以及染色细胞发射的荧光。
两种光信号:前向散射光信号(FSC)& 侧向散射光信号(SSC)
借助流体系统,细胞悬液在通过流式细胞仪时,从小喷嘴中流出的细胞悬液得以在鞘液(通常为磷酸盐缓冲溶液(PBS))的流体力学作用下向中心聚拢,形成的细流可使细胞依次通过激光束,且一次仅一个细胞。借助光学系统,当细胞通过激光束时,检测器会检测到细胞或颗粒的散射光,放置在前面的检测器检测FSC,而放置在侧面的多个检测器检测SSC,荧光检测器则检测被染色的细胞或颗粒发射的荧光。而FSC与细胞的大小有关,SSC则与细胞颗粒度(即细胞中所含的细胞器、细胞核等的数量)成比例,故借助以FSC或SSC形式检测到的散射光,即根据细胞大小和颗粒度差异可区分各细胞群。
荧光信号:反映细胞中待检测蛋白质、核酸的存在情况
当激光光束与荧光正交时,会产生两种荧光信号。一种是细胞自发荧光信号,由于细胞内的核黄素、细胞色素、NADPH、芳香族氨基酸均可在激光照射后发出微弱的荧光;一种是经过特异的荧光素标记后,待检测的蛋白质/核酸等发出的较为强烈的荧光信号。后者为对我们有用的荧光信号。
通过上述三种光信号,我们就可以把一堆细胞分成不同的群,一个群里又可以根据待测物质的有无继续区分,这就达到了我们的目的——细胞分选。
流式细胞图
→单参数图(又称直方图):横坐标代表荧光信号或散射光信号的相对强度,可以是线性或对数坐标;一般是相对细胞数。直方图的展示方式与平日所接触的大部分数据表示方式大致相同,理解上较为直观,但当需要比较不同标记之间的表达量或是所检测的细胞在一个细胞群体中所占的比例特别少时,则遇到瓶颈,不得不转向散点图
如图即为单参数图,纵坐标为细胞数,横坐标为该参数的荧光信号/散射光信号的相对强度,向正方向增大。图中参数为IL-17+(白细胞介素17阳性)。
要注意,单参数图横坐标有时为线性表示(即按照比例),有时为对数表示,图中为对数表示,每小格相差10^n-10^(n-1)。
→散点图:散点图十分利于两参数图,而两个参数分别分布在x轴和y轴上,并且细胞计数以密度(点)图或轮廓图的形式显示,可显示其频率分布,同时也可以不同的颜色以标识给定位置的单元格密度。当用象限标记将散点图分为四个部分时,在直方图理解的基础上,可知右上象限表示荧光标记均为阳性或双阳性细胞,而左下象限则恰恰是显示两个标记均为负的细胞,左上象限和右下象限则分别代表只对y轴参数或x轴参数标记为正的细胞。
如图即为双参数图(散点图),两个参数分别为CD4+、CD3+,图中不同颜色为不同荧光染料染色的细胞。
在此引入一个概念——“门(gate)”/“设门”:说白了就是框定一个区域的细胞,让计算机帮你分析该区域。图中的十字称为“十字线”,用来分群,而非我们所说的“设门”。
上图为“设门”的例子,左下方的单参数图中圈定了一块区域,这块区域为淋巴细胞,则在右边的双参数图中就只显示淋巴细胞。(对比左列两图,对比右列两图)
→等高线图:与散点图相类似,等高线图也可以代表两个通道的信息,但其优势在于可以更直观地体现细胞的密度,与地理上的等高线图做类比,地理上,等高线表示海拔高度,越密集则代表海拔变化越快,类似的,流式细胞图里的等高线越密集则表示细胞数目密度的变化越快。如下图:
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