提出qRT-PCR 在植物研究中需注意的11 个黄金法 则。因此,优化试验的各个环节是成功实施定量 PCR 分析问题的前提。 样品准备和核酸的质量样品准备和核酸 马月萍等:荧光定量PCR技术在植物研究中的应用 提取是整个试验的第一步,以相同体积或相同重量 的样品组织提取核酸,使样品量保持一致,这是减少 试验误差的第一步 [27] 。在实时 RT-PCR 研究中, RNA 必须具有相当高的质量,因此反转录前要必须 对RNA 进行精确定量和完整性检测,从而保证 RNA 的量一致 [26] DNA为模板时,要对基因组 DNA 进行定量分析,以相同方法提取不同组织基因 组DNA 时提取效率往往不同 [28] 反转录实施 qRT-PCR 时,使用不同的引 物往往产生不同的结果。使用随机引物进行反转录 可能得到多个反转录产物,但在目标 mRNA 拷贝数 较低的情况下,可能无法被反转录。但在使用rRNA 做内参时,该反转录方法比较适用。使用 oligo-dT 作为引物进行反转时,使用特异性引物,不反转 rRNA,同时不反转所有不具有 polyA RNA,这样组蛋白和病毒 mRNA rRNA无法进行反转录。 使用特异性引物反转可以得到最敏感的结果,但是 要求对不同的目标序列设计不同的探针,增加了试 验的复杂性和成本。因此,在实际研究时结合自身 的试验选择合适的方法。 内参基因的选择qRT-PCR 是一项定量植 物转录本的极其高效和灵敏的技术 [26] 。试验通常 采用内参基因进行数据校正和标准化,以消除不同 样品在RNA 产量,质量及反转录效率上可能存在的 差异。由于管家基因在各种组织中是恒定表达的, 所以可以用管家基因的量作为某种标准,以比较来 源不同的样本目的基因表达量的差异。试验结果的 准确性很大程度上依赖于使用稳定表达的内参基因 精确标准化转录本 [29] 。通常选用的管家基因有 GAPDH、β-actin rRNA等。但近年来的研究发 现,目前常用内参基因均存在缺陷,在不同类型的组 织和器官发育的不同阶段、各种试验条件等不同情 况下,它们的表达量通常变异较大 [30 38]。Gutierrez [39]认为错误内参的选择将导致研究结果的完全 改变。Dombrowski [40]对逆境下毒麦的9 个管家 基因的表达进行了分析,发现EFF-1α 和UBQ5 对于 实时定量RT-PCR 分析是最稳定的内参因子。阙友 [41]