CO-IP 实验详解 一、实验材料 详见 Western Blot 实验详解 二、实验原理 免疫共沉淀(CO-IP)是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一 种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话,那么当用一种蛋 白的抗体进行免疫沉淀时,另一个蛋白也会被同时沉淀下来。是一种基于体外非细胞的环境 中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法 其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的 相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互 作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用; (2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须 在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不 到结果,方法本身具有冒险性。 三、操作程序 (一)蛋白样制备 1. 无双抗 DMEM(10%血清)接皿,代细胞长至 80%时,细胞转染,6h 后换含双抗 DMEM (10%血清),再过 18h 后,换液,加入含 MG132 (25mM),双抗的 DMEM(10%血清) 处理细胞,培养 4h。 2. 吸出培养液,用 PBS 洗 1-2 次。每个皿(100mm)加入 1ml CO-IP 细胞裂解液(含 20ul cocktail 蛋白酶抑制剂),摇均匀,刮细胞。将收集液于 4 度摇转仪摇动 20min。4 度 12000rpm 10min,取上清蛋白定量(试剂盒)。取 500ug 蛋白,用 CO-IP 细胞裂解液将 体积补到 500ul。(注意:剩余的含蛋白的细胞裂解液可用于 Western Blot) 3. 用 Agarose A+G 预处理样品,每管加入 30ul Agarose A+G,以及同种属的其他抗体 0.5ug (消除非特异性),于 4 度摇转仪反应 2h。 4. 将预处理后的样品 4 度 3000rpm 5min,取上清。 5. 加抗体发生反应,与目标蛋白反应过夜(12h)。(Flag 按说明书 1:200 加入约为 2.5ul/ 管。 6. 抗体偶联 12h 后,加入 Agarose A+G (30ul/管),4 度摇转仪反应 3-6h。 7. 反应 6h 后,3000rpm 5min,弃上清,留沉淀于 1.5ml EP 管中。 8. 用预冷的裂解液洗涤上述沉淀:加入 1ml 裂解缓冲液,于 4 度摇转仪反应 10min。(再 重复 7、8 两次,共 3 次) 9. 收集沉淀,加入 30ul 2×Sample Buffer,沸水 5min,立即置于冰上,待冷却至室温后, 12000rpm 10min,取 30ul 上样。(注意:该蛋白样品用于 CO-IP) (二)SDS-PAGE/Western Bolt 方法详见 Western Blot 实验详解 四、注意事项 (1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用, 多采用非离子变性剂(NP40 或 Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验 确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。 (2)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗 体的使用有助于避免污染的发生; (3)要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀; (4)确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进 行蛋白质的定位来确定。