模板中抑制物包括多糖类,有机溶剂,蛋白酶K等,可以参考之前给大家介绍的RNA品质检测内容。一般cDNA中存在抑制物可以在反转录前对RNA进行梯度稀释,分别进行反转录,可以减少或消除抑制物的影响(参见图三)。
图三
5扩增精密度差(图四):
a. 加样误差,建议引物和qPCR Mix先预混,分装后加模板;
b. 体系配置错误,仔细检查操作步骤;
c. 反应液没有混匀,充分涡旋混匀;
d. 低拷贝基因或模板浓度过高或过低,调整模板上样量,cDNA原液加入体积不超过体系总体积1/10;
e. 未引入校正系统,根据机器型号加入ROX。
6、溶解曲线不是单峰(图五):
a. 引物设计及用量问题,建议重新设计退火温度较高(58~62℃),无错配,Blast比对特异的引物、引物用量合适(0.2~0.4 μM);
b. 模板有基因组污染,建议优化RNA提取方法,选择合适的反转录试剂,跨内含子设计引物;
c. 基因表达量低,建议增加反转录效率,适当提高模板量,选用一步法qRT-PCR;
d. 扩增体系不佳,可以使用灵敏度高,特异性强,封闭技术先进的试剂。
7、标准曲线线性关系不佳(图六):
a. 加样误差,建议标准品加样体积大于2微升、引物预混后再分复孔,定期校正移液器,尽量选择硅化枪头,使用文库稀释液稀释标准品,降低耗材管壁对DNA吸附;
b. 标准品降解,应该避免反复冻融、电泳检测发现降解后重新制备稀释标准品;
c. 模板浓度高或有抑制物,可以改变稀释精度,增加稀释梯度;
d. 引物或探针不佳,重新设计引物和探针;
e. PCR酶灵敏度不高及活力下降,建议更换灵敏度更高,线性关系更好的试剂,校正-20℃冰箱,使用时将酶置于冰上。
8、NTC有扩增:
a. 水,试剂或引物污染,可以分装水和引物,试剂优先于引物和模板加入到体系中;
b. 引物二聚体,建议优化引物设计,提高退火温度(58~62℃),降低引物浓度(0.2~0.4 μM);
c. PCR核心酶特异性差,可以选用封闭技术先进(全封闭)的试剂。
9、扩增效率低:
a. 反应条件不够优化,建议降低退火温度,使用三步法,使用扩增更线性的试剂;
b. PCR抑制物,建议优化核酸纯化方法