实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的: 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义; 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理: 淀粉酶存在于几乎所有植物中,特别是萌发后的禾谷类种子,淀粉酶活力最强,其中主要是α -淀粉酶和β 淀粉酶。根据α -淀粉酶和β -淀粉酶特性不同,α -淀粉酶不耐酸,在pH3.6 以下迅速钝化;β -淀粉酶不耐热, 70℃ 15min 则被钝化。测定时,使其中一种酶失活,即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖,利用麦芽糖的还原性与 3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的 3-氨基-5-硝基水杨酸,测定其吸光度,从而确定酶液中淀粉酶活力(单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量)。 三、实验用具: 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管,分光光度计,酸度计,电热恒温水浴锅,离心机,电磁炉。 2、实验材料与试剂 (1) 0.1mol/l pH5.6 的柠檬酸缓冲液: A 液: 称取柠檬酸 20.01g, 定容至 1000ml; B 液: 称取柠檬酸钠 29.41g, 定容至 1000ml;取A液55ml 与B液145ml 混匀。 (2)1%可溶性淀粉溶液:1g 淀粉溶于 100ml 0.1mol/l pH5.6 的柠檬酸缓冲液; (3)1%3,5-二硝基水杨酸试剂:称取 3,5-二硝基水杨酸 1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠 30g,定容至 100ml 水中,紧盖瓶塞,勿使 CO2 进入; (4)麦芽糖标准溶液:取麦芽糖 0.1g 溶于 100ml 水中; (5)pH 6.8 的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾 6.8g,加水 500ml 使溶解,用0.1mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 6.8,加水稀释至 1000ml 即得。 (6)0.4mol/L 的NaOH 溶液; (7)1%NaCl 溶液。 (8)实验材料:萌发的谷物种子(芽长约 1cm) 四、操作步骤 1、酶液提取:取6.0g 浸泡好的原料,去皮后加入 10.0mL 1%的NaCl 溶液,磨碎后以 2000r/min 离心 10min, 转出上清液备用。取上清液 1.0ml,用pH 为6.8 的缓冲溶液稀释 5 倍,所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管 4 支,标明 2 支为对照管,2 支