原因分析及准备改进:转染大容量的质粒(融合蛋白的质粒)的效率会相对较低,大分子量表达也会相对较低,加上大分子量蛋白的转移不完全,可能是我没有拿到大分子量条带结果的原因。另外背景稍微有一些脏(背景整体均匀一致),估计是二抗的浓度高了些,准备降至1:5000,另外抗体稀释液准备改用5%奶粉TTBS,封闭改为室温2小时。这个过程有没有问题?
解答:首先分析你的整个实验步骤。我发现了两个比较大的毛病:
1、一抗用TBST稀释。按照我的理解,一抗最好用5%的TBST脱脂牛奶稀释,和你的封闭液相一致,这样可以降低背景。
2、“biorad半干转PDVF膜,15v转30分钟”,你是这么做的吗?因为我大部分时间是做的恒流转移,用的是0.1mA/膜,100kd--200kd转2小时。到最后电压会升到20v左右。