蛋白样品需浓缩、纯化吗?如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白?对小分子蛋白Western　blot时需特别注意哪些条件?　解答:按照你提供的浓度,如果做Western　Blot,是不用浓缩样品的.　对于20kd的小分子的蛋白,Western　Blot中要注意的是:　1、转移时的时间,　2、转移时的电流或电压.　3、transfer　buffer　中加20%的甲醇.　4、可以用13-15%的分离胶.　PPP.　蛋白分子量大小分别为21kd、28kd,用的是湿转,请问多大电流,多长时间比较合适?　解答:分子量比较小,最好是用干转,湿转效率太高,易转过了。干转的话,用2.5　A/cm　2　,　30min就应该够了。湿转,按照bio-rad的说明,用100mA,也得要半个多小时吧。　QQQ.　需要测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量,但相互间　干扰太大,怎么办?　解答:将膜放入stripping　buffer(SDS　2%,Tris·Cl　(PH=6.7)　62.5mM,beta-巯基乙醇　100mM)中,50℃孵育30分钟,TTBS西三次,再重新加入一抗,进行另一种抗原的检测。　RRR.　做Western　Blot实验时,发现转膜时的电流总是偏小,转膜的效率也偏低.　100V恒压转膜时的电流只有190mA左右,而以前都有250mA。体系和条件都和以前一样,只是环境温度比以前低了很多。　解答:有可能重复使用了转移缓冲液,随着离子的逐渐减少,电阻越来越大,当然恒压时电流越来越小了。建议更换转移缓冲液。反复使用不要超过三次。环境温度低是有利于转移的。　SSS.　我电泳用的是恒流,一块胶,20mA,100分钟左右。转膜也是恒流,38mA,100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了,当然彼此的目的蛋白不同。所以,我想问题应该出在抗原和一抗上,不知对不对。一抗我买的是单抗,推荐的稀释度是1:100——1:1000。我用的是1:100。难道非要用多抗吗?按道理单抗也应该出条带呀!细胞用三去污剂裂解的,没有做定量,加巯基乙醇变性后,每孔上样20微升。提出的蛋白我保存在4度了,这样行吗?　解答:1、建议您用恒压进行电泳,先用70V,等跑过积层胶与分离胶的界限时,换用90-100V,再跑3小时左右。2、转膜可用恒流,但要根据你的膜的面积及所要检测的蛋白的分子量的大小来确定电流的