标题:【求助】做荧光定量PCR扩增效率很低是为什么?

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扩增曲线总是上不去,在一个较低的水平就到平台了,而且融解曲线的峰也很低,很少能上0.10以上.连内参GAPDH也是,怎么回事啊?
25 ul 体系用了2ul的摸板和2l的引物,是不是太高了?
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太高了吧,我一般只加1ul模板和0.5ul的引物
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模版有问题,建议你纯化一下模版。而且模版加的太多了。
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可能是模版提取过程中残留的抑制PCR反应的物质在起作用,建议你把模版稀释几倍试试。引物量要适当,一般在0.1~0.2微摩。
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可能一:模板浓度太高了.模板总量一般不超过100ng
可能二:引物太多了,终浓度0.2uM就可以了,也就是10pmol/ul的引物只需0.5ul就可以了.
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模板可能含有不纯杂质,会影响扩增效率。另外,你加的模板浓度也高了点,少加点。
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各位大侠:我在做PCR时也遇到扩增效率不高的问题,我的模板是从肠道内容物中用酚-氯仿提取法提取细菌的DNA,请问这种模板应该如何纯化处理呢?谢谢!
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QUOTE:
各位大侠:我在做PCR时也遇到扩增效率不高的问题,我的模板是从肠道内容物中用酚-氯仿提取法提取细菌的DNA,请问这种模板应该如何纯化处理呢?谢谢! ...
建议用氯仿再抽提,不要加酚。
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引物和探针100µM,各0.1µL就OK了Shy
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