三种荧光定量PCR检测方法比较 定量pcr: 以参照物为标准, 对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测, 从而达 到评估样本中靶基因的拷贝数, 称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩 增的指数期进行的。 常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类: SYBRGreen 检测模式SYBR Green 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。其与双链 DNA 结合后, 荧光大大增强。因此, SYBR Green 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关, 能够根据 荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。SYBR Green 的最大吸收波长约为497nm, 发射波长最大约为 520nm。PCR 扩增程序一般为 94~55~72三步法, 40 个循环。SYBR Green 的缺点:由于 SYBR Green 没有特异性,不能识别特定的双链, PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光, 一般 本底较高, 因此在临床上使用可能会有假阳性发生。 SYBR Green 的优点:SYBR Green 的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双 DNA相结合, 因此对不同模板不需特别定制不同的特异性探针, 通用性较好, 而且价格相 对较低。这对科研是很有利的, 因此国内外在科研中使用比较普遍。 水解探针模式(taqman探针) TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针, 荧光基团连接在探针的 5’末端, 而淬灭剂则在 末端。当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与 进行延伸反应时,聚合酶的 5’外切酶活性将探针切断, 使得荧光基团与淬灭剂分离, 发射荧 光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加, 释放 出来的荧光基团不断积累。因此 Taqman 探针检测的是积累荧光。PCR 扩增程序一般是: 94~60 40个循环。常见的荧光基团是 FAM, TET, VIC, HEX。 杂交探针模式(Beacon、FRET) 分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针, 两端的核酸序列互补配对, 由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中, 环一般为 15-30 个核苷酸长, 并与目标序列互补;茎一般 5-7 个核苷酸长, 相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端,而淬灭剂则标记在另