第五章 植物的原生质体培养 主要内容 原生质体的概念 原生质体培养的优越性 原生质体的分离 原生质体的培养 (protoplast): 原生质体(protoplast): 指除去细胞壁 除去细胞壁的细胞 除去细胞壁 或是说一个被质膜所包围 的裸露球形细胞。 一、植物原生质体的特点 植物原生质体的特点: 特点 1、吸收能力增强:易于摄取外来遗传物质、 、吸收能力增强: 细胞器、细菌、病毒等;易于吸收氧、养 分; 2、具有全能性:具有全套的遗传物质,具有 、具有全能性: 细胞壁再生并能进行人工培养分化发育成 完整植株的能力; 3、在一定条件下可诱导原生质体融合,形 、在一定条件下可诱导原生质体融合 成杂种细胞 。 4、分泌能力提高 、 去除了细胞壁的扩散障碍,使细胞膜的透 过性增强,利于胞内产物的分泌。 5、稳定性较差 、 失去了细胞壁的保护作用,稳定性较差, 易于受到渗透压等条件变化的影响。 原生质体用途 原生质体用途 信息传递、 信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理 诱发突变体 引入各种细胞器 导入外源基因 融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 二、 原生质体的制备 不同的植物细胞,由于细胞壁的组成、 不同的植物细胞,由于细胞壁的组成、 结构和性质有所不同, 结构和性质有所不同,原生质体的制备 方法也不一样。 方法也不一样。 1、用于分离原生质体的材料准备:选取生长 用于分离原生质体的材料准备: 旺盛的细胞。 旺盛的细胞。 无菌试管苗叶片 上胚轴和子叶 培养细胞(愈伤组织) 2、原生质体的分离 1)、机械法 )、机械法 2)、酶解法 )、酶解法 1)、机械法 )、机械法 1892年首先用于藻类分离原生质体 做法:先使细胞质壁分离,再用刀把细胞壁 切破,使原生质体流出或释放出来。 优点: 优点:该方法可避免酶制剂对原生质体的 破坏作用。 缺点: 缺点: 1) 手工操作难度大 操作难度大,原生质体得率低, 操作难度大 费时费力,难以大量制备。 2)能够用此法产生原生质体的植物种类 植物种类 受到限制。 2)、酶解法 )、酶解法 1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体; 常用酶:纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等; 优点:条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高,而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。 缺点:酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质,影响所获原生质体的 活力。 酶解制备原生质体过程 1)、取材消毒 、 2)、酶解制备 、 3)、原生质体收集 、 酶解考虑因素: 酶解考虑因素: A、酶溶剂及其渗透压 酶的种类、 酶溶剂:原生质体培养基或特殊配制、PH値。 渗透压调节剂:葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 B、酶解时间:酶浓度及温度 酶解时间: 3、原生质体的收集和纯化: 原生质体的收集和纯化: 1)沉淀法: 沉淀法: 筛网过滤除去未消化的细胞、细胞团和 碎片后在适当试剂内低速离心。 优缺点: 优缺点: 比较简单 但不易除尽一些完整的细胞,或引起 原生质的破碎 2)飘浮法: 飘浮法: 据原生质体比重小能在一定渗透压的 溶液(如25%的蔗糖)中漂浮得到收集。 优缺点: 优缺点: – 可以得到较为纯净、完整的原生质体, – 但完好的原生质体数量较少 3)沉淀法和飘浮法结合: 沉淀法和飘浮法结合: 先沉淀后漂浮,重复操作, 纯化后可用于培养或细胞融合。 4)界面法 采用两种比重 两种比重不同的溶液,使原生质体 两种比重 处于两液相的界面之中 优缺点: 优缺点: 可以收到数量较大的纯净原生质体,同 时避免收集过程中原生质体因相互挤压而 破碎 4、原生质体鉴定 、 目的: 目的:检验获得的原生质体是否真正的原 生质体 鉴定方法(针对有无细胞壁): 鉴定方法(针对有无细胞壁) 低渗爆破法: 低渗爆破法: 原生质体在低渗溶液中吸水胀破,观察有无细 胞壁碎片; 荧光染色法: 荧光染色法: 通过荧光增白剂染色后离心去除多余染料,在荧 光显微镜下观察(波长3600-4400),绿光显示有 纤维素,红光示真正的原生质体。 5、原生质体活力检测 、 染色法 FDA法:FDA(二乙酸荧光素)能穿越细胞质膜, FDA法 被活细胞内的酯酶裂解,在荧光显微镜下发荧光(荧 光素)。 伊凡蓝法: 伊凡蓝法:伊凡蓝不能穿过质膜,但质膜受到严重 损坏使细胞被染色。 胞质环流法: 胞质环流判断原生 质体活力; 胞质环流法:是否存在胞质环流 胞质环流 渗透压变化法: 渗透压变化法:活原生质体会随着外界渗透压的变化 体积变化 氧电极法:活原生质体在光照下光合放氧,无光呼吸 氧电极法: 耗氧 例子: 植物(烟草) 例子 植物(烟草)叶肉细胞原生质体的 分离 1). 材料的准备与消毒: 材料的准备与消毒: 2). 酶解: 酶解: 3). 纯化: 纯化: 4). 原生质体的活力测定 1). 材料的准备与消毒 a) 选取在温室中生长两个月左右的烟草植株 b) 从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片 c) 经自来水冲洗干净后 d) 放入 放入70%乙醇中进行表面消毒 乙醇中进行表面消毒 e) 然后再放入 次氯酸钠溶液中处理10分钟 然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理 分钟 次氯酸钠溶液中处理 f) 接着用无菌水洗涤 接着用无菌水洗涤3~4次,以充分除去消毒剂 次 2). 酶解 用一把尖镊子,小心撕去叶片的下表皮, 用一把尖镊子,小心撕去叶片的下表皮, 将叶片切成2cm长的小片,然后放入含 长的小片, 将叶片切成 长的小片 酶溶液中处理。 酶溶液中处理。 注意:使撕去表皮的一面朝下, (注意:使撕去表皮的一面朝下,温度 25~28℃ 下经 小时的酶解反应,其 小时的酶解反应, ℃ 下经3-4小时的酶解反应 间轻轻摇动培养皿若干次) 间轻轻摇动培养皿若干次) 3). 纯化 将酶解悬浮液通过300-400目网, 将酶解悬浮液通过300-400目网,以除去大 300 目网 的未消化的碎片 然后将含有原生质体的酶液收集在离心管 低速离心,使原生质体沉于管底, 中,低速离心,使原生质体沉于管底,倾 去上清液 在离心管中加入适量洗涤液,再离心; 在离心管中加入适量洗涤液,再离心;重 复此步骤3 使酶解液充分除去; 复此步骤3次,使酶解液充分除去; 最后用原生质体培养液离心一次 6、影响原生质体活力的因素: 影响原生质体活力的因素: 分离材料的生理状态; 分离材料的生理状态; 酶解条件:酶质量、浓度、酶解温度、 酶解条件:酶质量、浓度、酶解温度、 酶解时间、酶溶液的渗透压; 酶解时间、酶溶液的渗透压; 分离条件:离心次数、离心速度、纯 分离条件:离心次数、离心速度、 化方法、分离持续时间; 化方法、分离持续时间; 环境条件:操作环境的温度、 环境条件:操作环境的温度、分离用 具的影响。 具的影响。 二、原生质体的培养 一)、培养基 )、培养基 1.渗透压 . 常用的渗透压调节剂:甘露醇、山梨醇、 常用的渗透压调节剂:甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡 萄糖等。 萄糖等。 原生质体的渗透压原则: 原生质体的渗透压原则:培养基渗透压与细胞渗透 压等渗。 压等渗。 2.无机盐 3.有机成分 . 维生素、氨基酸、糖及糖醇等,酵母提取物、 维生素、氨基酸、糖及糖醇等,酵母提取物、水解 酪蛋白。 酪蛋白。 4.激素 . 常用的激素:NAA、IAA、BA与2,4-D 常用的激素: 、 、 与 5.pH值 . 值 二)原生质体培养方法 液体浅层培养 固体培养 液体- 液体-固体双层培养 琼脂糖珠培养 三)影响原生质体培养的主要因素 基因型:如番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性 基因型 状分离的遗传分析,证明其愈伤组织的再生 能力是2个显性基因所决定; 原生质体的来源:供体材料体类型、供体细 原生质体的来源 胞的分化程度、供体细胞的生长同步性; 起始培养密度与培养基:基本起始密度、培 起始培养密度与培养基 养基激素水平、密度与培养基营养成分完全 性。 三、原生质体的发育和植株再生 植物组织 去壁 原生质体 植物细胞 ? ? 愈伤组织 植株再生 完整细胞 ? 胚状体 一般包括如下几个步骤: 1)细胞壁再生: )细胞壁再生: 体积膨大,叶绿体重新排列,新的细胞 壁开始合成,细胞由球形变成椭圆形。 2)分裂: )分裂: 一般在培养2-3天后细胞质 增加,细胞器增殖,DNA、 蛋白质等合成增加,细胞分 裂,形成小的细胞团,发育 成愈伤组织或胚状体。 3)植株再生 ) 植物原生质体培养的应用 1、利用原生质体融合获得融合细胞 、利用原生质体融合获得融合细胞 原生质体融合 2、利用原生质体进行外源基因的转化 、利用原生质体进行外源基因的转化 3、利用原生质体再生植株 、利用原生质体再生植株 4、利用固定化原生质体培养生产次级代谢产物 、利用固定化原生质体培养生产次级代谢产物 较多的分泌产物 5、利用原生质体进行生物转化 、利用原生质体进行生物转化 通过原生质体中存在的酶或酶系的催化作 将酶作用的底物转化为所需的产物, 用,将酶作用的底物转化为所需的产物,提高 转化效率 四、原生质体研究的趋势 1、低密度和单个原生质体培养; 低密度和单个原生质体培养; 2、单倍配子体如花粉原生质体培养; 单倍配子体如花粉原生质体培养; 3、计算机控制系统、流式细胞光度计 计算机控制系统、 等技术的应用。 等技术的应用。