TaqMan 探针法qPCR原理
TaqMan探针法qPCR是使用TaqMan荧光探针进行荧光检测的方法。那什么是TaqMan荧光探针呢?它是一段序列特异的、荧光标记的寡核苷酸,其5’端标记一个报告荧光基团(Reporter,R),一般为FAM、VIC、HEX、TET等荧光基团,3’端标记一个淬灭荧光基团(Quencher,Q),一般为TAMRA、MGB等。
图:TaqMan探针图示。R为报告荧光基团,Q为淬灭荧光基团,中间连接的表示核苷酸。
TaqMan探针法qPCR的原理是在PCR扩增时加入一对引物的同时另外加入一条特异性的TaqMan荧光探针,该探针与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。
当探针完整时,报告荧光基团和淬灭荧光基团的空间距离很近,报告荧光基团发射的荧光信号会被淬灭荧光基团吸收,使仪器检测不到荧光信号。
在PCR延伸阶段,Taq DNA 聚合酶沿着模板链从5’到3’的方向合成新链,当Taq DNA 聚合酶到达探针结合位点时,Taq DNA 聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性将探针5’端连接的报告荧光基团切割下来,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而发出荧光,切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比,因此,通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到检测PCR产物扩增量的目的。
图:TaqMan探针法qPCR原理图。
TaqMan 探针法qPCR优点与应用
1、特异性高、定量准确
从原理可以看出,荧光探针只与目的序列结合,理论上探针法的荧光信号只来源于目的序列,即不受非特异性产物的影响,因此,TaqMan探针法qPCR的特异性非常高,定量准确。
2、实验耗时短
因TaqMan探针法的高特异性,故无需再设置熔解曲线检测扩增产物的特异性如何,大大缩短了实验时间。
3、兼容多重反应
不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针,因此可以在同一个反应体系中利用不同荧光标记的探针同时检测多个靶标,达到节省实验成本的目的。
正是由于上述优点,TaqMan探针法qPCR已被广泛应用于生物医药食品等行业的基因检测,包括疾病的早期诊断、药物研究、病原微生物检测、转基因食品检测等。
图:TaqMan探针法qPCR的应用
TaqMan 探针法qPCR局限与注意
虽然TaqMan探针法有众多优点,但也有明显的局限性,如探针合成费用较贵,实验成本较高,探针设计难度大等。因此,在进行实验前应注意以下事项:
1、设计引物:引物的GC含量建议在40-60%,Tm值在55-60℃。
2、设计探针:
1)探针位置应尽可能的靠近上游引物。
2)探针长度通常在25-35bp,以保证结合的特异性。
3)探针的Tm值在65-70℃,通常比引物的Tm值高5–10℃,以确保探针与模板结合的稳定程度大于引物与模板结合的稳定程度,GC含量在40-60%。
4)探针5'端不应含G,因为5’G能够淬灭荧光信号,以避免报告基团的荧光在探针切割后发生淬灭。
5)报告荧光基团及淬灭荧光基团选择:
①选择报告荧光基团时首先要确认激发波长和发射波长与仪器是匹配的。对于多重荧光反应,标记不同探针的报告基团染料的最大发射波长应该至少有15nm的差异。
②对于淬灭荧光基团,必须要保证其吸收光谱与报告基团的发射光谱有重合。
常用的报告荧光基团及淬灭荧光基团组合见下表:

淬灭荧光基团
报告荧光基团
BHQ/MGB
FAM、VIC、HEX、TET、JOE、ROX、CY3、CY5等
TAMRA
FAM、VIC、HEX、TET、JOE等

表:TaqMan报告荧光基团及淬灭荧光基团常用组合
6)为确保引物探针的特异性,最好将设计好的序列在blast中核实一次,若发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针。
3、确认反应性能:建议用标准曲线确认反应的扩增效率(操作可参考),根据国际公认的MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)指南,扩增效率需要达到90%-110%,线性相关性R2> 0.98。由于探针是TaqMan实验最昂贵的成分,建议先订购引物,用SYBR Green I反应来确定引物的性能之后再订购TaqMan探针。
到这里,本期关于TaqManqPCR的内容就介绍完了,
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