SYBR Green I是一种非常敏感的能结合双链DNA(dsDNA)和RNA的绿色荧光染料。虽然DAPI也被用于流式病毒定量,但这个染料的病毒颗粒染色比较暗淡,不易计数。相反,SYBR Green I的荧光非常亮且背景低,是一个优选选择。FCM被成功用于实验室生物样本的病毒计数 [78,79] 。最近,Gates等发展了一种新的FCM法用于检测MRC-5细胞水痘 - 带状疱疹病毒(VZV)的减毒疫苗株(vOka/Merck)的感染性,该法比空斑试验更高效 [80] 。另外还研制出了一些用于检测HIV-1病毒的FCM检测方法 [81,82] 。FCM法也被用于定量昆虫细胞中产生的杆状病毒颗粒 [83] 。Sivaraman D等建议FCM可用于多种病毒感染的实际诊断 [84] 。跟荧光显微镜法相比,FCM法可在单细胞水平获得统计学上可靠的数据,且花费的精力相对较少。FCM得到的荧光分布结果还可进一步用于病毒蛋白合成及病毒颗粒释放等数据的统计估算和数学建模 [85] 。最近发展了一种称为荧光共振能量转移(FRET)的方法,即在细胞中表达一对相互间可激发能量转移的荧光蛋白,用于快速检测病毒的感染力。FCM可以检测荧光蛋白间的重叠信号,因此可以用于检测FRET信号。FCM可以快速地检测每个病毒感染的细胞上的荧光信号数量 [86-88] 。一般来讲,FCM病毒颗粒检测法敏感度不高 [78,79] ,但某些商品化的FCM方法(如Virus Counter® 2100)可以简单快速地进行病毒定量且敏感度较高。在病毒计数时,每个样本先用两种不同的荧光染料染色:一个特异的染核酸,另一个染蛋白,孵育30min后,将染色样本置于病毒计数仪器上分析以计算病毒颗粒的浓度(vp/mL)。
材料和仪器电镜级别的戊二醛SYBR® green I染色工作液(母液为10,000×,溶于DMSO)无菌TE溶液,pH8.0超纯水(Milli-Q水)含0.5% BSA的PBS(PBSA)液氮离心管超声仪流式细胞仪,PASIII (Partec公司), CyFlow® Space (Partec公司), Cytomics FC 500, MPL (Beckman Coulter公司)实验方案制备系列病毒稀释液:标记6个无菌离心管,每管加入270 μl PBSA,加30μl病毒母液至第一管,混匀,然后取