绥和二年(公元前7年)三月,酒色侵骨的汉成帝在赵合德的宫中暴死(淫乐过度而亡),刘欣即位,是为汉哀帝。王政君成为太皇太后。面对“王氏子弟皆卿、大夫、侍中、诸曹,分据势官满朝廷”的局面,汉哀帝着手排挤王氏外戚势力,强化皇权,他即位后便拔高自己祖母和母亲家族傅氏、丁氏的势力,封祖母傅昭仪为恭皇太后,母亲丁姬为恭皇后,食邑与王政君相等。王政君看到后非常不安,便要大司马王莽“乞骸骨”回家,哀帝没有批准王莽的辞呈。丞相孔光、大司空何武、左将军师丹等对王政君说:“皇帝听说太后下令贬斥王莽,非常伤心。大司马如果不复职,皇帝就不敢听政了。”于是王政君又令王莽复行视事。对王莽“乞骸骨”的处理似乎表现出哀帝对王氏的客气态度,实际上汉哀帝却深忌王氏骄横,所以起初对王家人颇为优待,日子一久,便渐渐疏远。此后,汉哀帝与王氏之间的斗争日趋激烈。司隶校尉解光弹劾王根罪行,汉哀帝借机将王根逐出京师,并将王氏举荐的官吏悉数罢免。后有高昌侯董宏承风希旨,以《春秋》“母以子贵”之义请尊哀帝生母丁姬为帝太后。此议一出,便遭到大司马王莽、丞相孔光、左将军史丹等人的坚决反对。哀帝迫于压力,将董宏免为庶人。不久,未央宫举行宴会,内者令为傅昭仪设帷幄,坐于王政君旁。王莽呵斥道:“定陶太后不过是一个藩妾而已,怎能与至尊并坐!”遂撤去其座。但在汉哀帝的打击下,王氏仍难免衰落的命运,过了两年,汉哀帝还是尊傅昭仪为帝太太后,丁姬为帝太后,王莽则被贬逐新野,王氏势力跌落谷底。到元寿元年(公元前2年),汉哀帝念王政君年事已高,才将王莽与平阿侯王仁召还京师,侍奉王政君。