1. 2　实验方法1. 2. 1　膀胱移行上皮细胞的原代培养　取幼犬断颈法 处死, 碘伏浸泡消 毒。 无菌条件切取膀胱, 用 含100 Λg m l庆大霉素的无菌Dulbecco’s2PBS 漂洗3 次,剖开膀胱平铺于无菌培养皿中, 机械法将黏膜层与肌层仔细分离。 取黏膜层并剪碎, 加入01 125% 胰蛋白酶于 37℃恒温水浴箱内振荡消化, 显微镜下观察消化液中有大量游离上皮细胞时(需 10~ 15 m in) 终止消化,并反复轻轻吹打。 200 目不锈钢网过滤残渣, 滤液移入离心管, 242×g 离心10 m in。 弃上清, 沉淀用DKSFM重悬, 计数并调整密度以 1× 105cm料培养瓶中, 置 37℃、 5%CO 2 及饱和湿度细胞培养箱内培养。 48 h 后首次换液, 以后每3~ 4 天换液1 次, 并2+和M g2+)、 胎牛血清、 胰蛋2接种于25 cm2塑于倒置相差显微镜下动态观察细胞形态变化和增殖情况。1. 2. 2　膀胱移行上皮细胞的传代与纯化　当原代培养的膀胱移行上皮细胞铺满培养瓶底80%~ 90% 时进行细胞传代。 先弃旧培养液, 用无菌Dulbecco’s2PBS漂洗 1~ 2 次, 加 0. 05% 胰蛋白酶和 0. 02% EDTA 混合液5 m l, 于37℃培养箱内消化, 倒置相差显微镜下观察细 胞回 缩呈圆 形 (约 需 10 m in) 时终止消 化, 加DKSFM 轻轻吹打培养瓶底壁, 细胞悬液242×g 离心10 m in, 弃上清, 加 10 m l DKSFM 重悬后, 以 1∶ 2 的比例接种于新培养瓶中继续培养。 待传代细胞长满培养瓶约80% 时, 重复上述步骤继续传代培养。 培养过程中如发现有成纤维细胞等细胞污染时予以纯化。 具体方 法: 弃旧 培养液后加入 5 m l 01 05% 胰蛋白 酶和01 02% EDTA 于 37℃消化, 显微镜下密切观察, 当混杂细胞突起回缩、 细胞变圆而膀胱上皮尚未变圆时, 轻轻吹打瓶底后将脱落的混杂细胞与消化液丢弃, 无菌Dulbecco’s2PBS 漂洗后加DKSFM 继续培养。