先去除骨头里的非胶原物质,然后往沉淀中10%的胃蛋白酶,在4℃的条件下消化24h,以14000r/min离心40min。弃沉淀往上清液中加NaCL,使它终浓度达到0.9moL/L,静止过夜,再离心,最后的沉淀就是I型胶原蛋白。指使胶原分子内部和分子间通过共价健结合提高胶原纤维的张力和稳定性的方法。该法又分为物理方法、化学方法和低温等离子体法,生物学方法;其中物理方法、化学方法是最常用的交联改性方法,生物学方法改性胶原蛋白主要在研究有关动物老化的生命现象中涉及,在研制胶原基生物医学材料中少见报道。通过物理手段对胶原蛋白改性有紫外线照射、重度脱水、λ射线照射和热交联等方法。胶原溶液如被紫外线等照射,将在分子间产生交联,粘度增加,生成凝胶。常用的紫外线交联胶原膜的方法是将胶原膜放在铝箔上,距离254 nm紫外灯20 cm高度,照射1~5 h。对紫外线照射的胶原膜进行力学性能和胶原酶试验表明:交联胶原膜的萎缩温度Ts和抗胶原酶解的能力均显著高于未交联胶原膜。重度脱水也是胶原蛋白物理改性中常使用的方法,该法是通过脱水导致胶原分子间交联,从而增加变性温度,改善胶原的性能。改性后胶原膜生物相容性提高,降低了水溶性,影响了膜与成骨细胞的生物相容性。物理方法改性原蛋白的优点是可避免外源性有毒化学物质进入胶原内,缺点是胶原膜交联度低,且难以获得均匀一致的交联。化学方法比物理方法改性交联度高,且能获得均匀一致的交联,对调节、控制胶原的各性质均有效。已广泛应用于各种化学试剂交联胶原,以提高其交联度、力学性能及生物相容性。化学改性法具体又可分为使用化学试剂交联、侧链的修饰、生理活性物的固定化三种方法。化学试剂交联法中常用的化学交联剂有戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基磷等,其中戊二醛是应用最广泛的试剂,大量实验证明:戊二醛能提供有效交联,但有细胞毒性,且其用量难以控制。另外,随着交联度的增加,吸水能力和膨胀度却会降低。酰基叠氮化物、聚环氧化物或京尼平交联等,不会引入明显的毒性,且可获得理想的交联效果。所见报道中,多使用单一交联剂对胶原蛋白交联改性,但也有使用混合交联剂的,如为了解决人工心脏瓣膜晚期钙化问题,筛选出环氧丙烷化学改性戊二醛处理生物瓣的方法,可明显减低瓣膜组织胶原蛋白末端游离羧基含量。动物实验表明,经改性后的瓣膜组织能保持较好的组织稳定性和机械抗张强度、免疫原性测试为阴性,符合临床应用。侧链修饰就是对胶原分子侧链的氨基和羧基进行化学修饰,改善电荷分布,使胶原获得新的特性,例如将胶原氨基丁二酰化,可变成负电荷丰富的胶原。与未修饰胶原蛋白相比血小板粘附能,血纤维蛋白形成能都弱,有抗栓性;然而如将胶原羧基甲基化获得的正电荷丰富的胶原,生理条件下血小板粘附能、活化能都高。与交联改性相比,在生物材料领域,利用侧链修饰对胶原改性所做的工作还较少。化学方法虽然可获得均匀一致的交联,但存在着引入外源有毒试剂,残留试剂难清除等缺点。一些报道表明,低温等离子体技术改性胶原或胶原复合膜可使材料表面引入不同基团,改变材料表面化学组分和结构,从而改变材料的特性,如使之更具有细胞识别位,提高表面能,改善表面极性等。胶原单独使用,物理机械性能差(这几乎是天然材料共有的弱点),性能单一,且因有亲水性强,在体内易被胶原酶降解等不可避免的弱点限制了它的应用。但如将胶原与其它物理、化学性质不同的合成或天然高分子共混,组成一种多相固体材料,在性能上胶原与其它高分子互相补充,胶原基“复合材料”的概念由此产生。已见报道的与胶原共混的合成高分子有不可生物降解的聚甲基烯酸酯及丁烯酸酯、聚氨酯、聚酰胺和可生物降解的聚乙烯醇、聚乳酸、聚谷氨酸、聚乙醇酸等,20世纪80~90年代初最有代表性的是聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)和聚乙烯醇与胶原共混,其报道集中于复合方法、复合机理、理化及生物学性能、材料表面和整体结构、表面修饰的方法和机理以及水凝胶的溶胀扩散等,尤其是水凝胶制备、作软组织替代、药物缓释等。后来利用可生物降解的聚乳酸、聚乙醇酸、聚酸酐、聚谷氨酸、聚亚乙基四乙酸等与胶原共混改性制备可吸收外科缝线、组织工程支架材料(如组织引导再生材料)的相关研究相对增多。不过合成高分子与胶原蛋白共混复合一些问题,如尼龙等不降解高分子材料不能进行生理代谢,与胶原蛋白复合后只能用做皮肤的外层敷料不能永久代替皮肤,而聚谷氨酸等可生物降解材料,如果相对分子质量小则强度不够,相对分子质量大难溶于水,溶解时还出现降解,影响材料的机械强度。天然高分子材料中最具代表性的是天然蛋白质和天然多糖,多糖主要有软骨素、HA(透明质酸)、壳聚糖、肝素等,多糖复合材料比较集中于可吸收性外科缝线、药物释放的载体、皮肤替代物、透析膜、止血剂、医用引导组织再生材料、骨替代材料、组织培养系统的支架。胶原作为医用生物材料,最重要的特点在于其低免疫原性,与其它具有免疫原性的蛋白质相比,胶原蛋白的免疫原性非常低。人们甚至曾认为胶原不具有抗原性,研究表明:胶原具有低免疫原性,不含端肽时免疫原性尤其低。胶原有三种类型的抗原分子,第一类是胶原肽链非螺旋的端肽,在天然和变性胶原中均存在。由于2个不同种类的哺乳动物中间的胶原蛋白,其整个氨基酸序列变化不是很大,而且胶原蛋白的三螺旋区域有高度的进化稳定性,但在非螺旋的末端区域中有很大的变化性,在这区域中几乎50%以上的氨基酸残基表现出种属性变化,大量的研究和生产都集中在如何完全去除端肽,只要去除端肽就认为是安全的。