主要途径阻断后,依靠应急途径即在HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)和TK(胸苷激酶)作用下,利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成DNA,缺少其中一种,DNA合成不能发生。用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞,细胞内均无TK或HGPRT,所以单个或融合骨髓瘤细胞在HAT培养液中将死亡。B细胞虽然有HGPRT和TK,但在体外通常培养条件下,尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。因此只有杂交瘤细胞才能在HAT培养液中生长繁殖。所以通过以上方法可以选择出杂交瘤细胞,但虽然都是杂交瘤细胞,但可能是同一抗原的不同抗原决定基刺激产生的。所以产生抗体是不纯的。如果不进一步提纯,这样得到的是多克隆抗体。所以就有了第二次筛选。