主要有用于标记多肽氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最常用,当然,也可以直接使用生物素也可以标记,因为其结构上有个游离的羧基,采用HBTU/HOBt/DIEA方法缩合,由于生物素的溶解度低,使用DMSO/DMF的混合溶剂增加溶解度。
2.4.磷酸肽合成
磷酸肽在生命过程中发挥重要作用,磷酸化的位置在多肽上的Ser,Thr,Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸,目前使用的都是单苄基磷酸化氨基酸,Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的连接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法,但是目前采用该方法合成磷酸化也有缺点,特别是在合成多磷酸化多肽或长肽的时候,连接效率低,最后产品纯度很低,对于这种磷酸化多肽,我们考虑采用后磷酸化方法,其合成过程就是在多肽合成结束后,选择性脱去要标记的氨基酸的侧链保护基,对于Tyr,Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应,而Ser可以采用Fmoc-Ser(trt),在1% TFA/DCM条件下可以定量的脱除。后磷酸化,采用双苄基亚磷酰胺,四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体,连接到羟基上,随后在过氧酸下氧化生成磷酰基,完成反应。
蛋白结构与功能模拟多肽
多肽在与蛋白受体结合发挥功能的时候,总是先折叠出某些特殊的结构,多肽类似物合成主要是为了模拟这些结构,保持或提高生物活性,同时也为了改变多肽的稳定性,提高其抗酶解能力。
3.1.α-螺旋多肽
α-螺旋是蛋白结构中最为普通的一种,但是一般多肽在溶液中大多是无规卷曲的,目前使用最多的方法是多肽保持α-螺旋结构就是在多肽表面通过共价键将处在α-螺旋结构的两个氨基酸连接起来,选择的位点(i,i+4或i,i+7),选择的化学键包括:二硫键,硫醚键,酰胺键,烯烃键(RCM)等方法。
3.1.1.二硫键
二硫键广泛存在与蛋白结构中,对稳定蛋白结构具有非常重要的意义,二硫键一般是通过序列中的2个Cys的巯基,经氧化形成。形成二硫键的方法很多:空气氧化法,DMSO氧化法,过氧化氢氧化法等。二硫键的合成过程,可以通过Ellman检测以及HPLC检测方法对其反应进程进行监测。
3.1.2.硫醚键
硫醚键的形成可以通过序列中的Lys,将溴乙酸连接到Lys的侧链氨基上,利用其和巯基的特异