精确称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖500mg于50mL容量瓶中,加去离子水至刻度,超声溶解得10mg/mL的标准葡萄糖母液。基于母液配制0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL的系列葡萄糖标准溶液。用移液枪分别吸取上述浓度的葡萄糖标液2.0mL于25mL具塞比色管中,然后加入DNS试剂4mL,摇匀,置沸水浴加热7min,流水冷却至室温,以去离子水定容。取2.0mL去离子水进行同样的操作作为空白对照,于540nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
分别用移液管取2mL供试品溶液A和供试品溶液B于25mL具塞比色管中,定容,摇匀。加入DNS试剂4mL,摇匀,置沸水浴加热7min,流水冷却至室温,以去离子水定容。取2.0mL去离子水进行同样的操作作为空白对照,于540nm处测定吸光度,根据标准曲线,分别计算供试品溶液A和供试品溶液B的葡萄糖含量为CA和CB。麦蓝菜多糖或麦蓝菜多糖水解物中的多糖含量=CA-CB。
1.4分子量范围测定
用分子排阻高效液相色谱法(HPGPC)测定麦蓝菜多糖和麦蓝菜多糖水解物的分子量。
2、实验结果
含量测定结果和分子量范围测定结果如下表。
实施例5:麦蓝菜多糖水解物的制备
1、实验方法
1.1多糖提取
采用热水浸提法提取麦蓝菜多糖,提取条件为:提取温度100℃,提取时间0.5h,水料比15mL/g,提取1次,250目滤布过滤,合并提取液,浓缩至浸膏密度为1.05-1.15g/mL,加无水乙醇至浓度约75%,醇沉12h,倾出上清液,再向沉淀中加80%乙醇适量,醇沉8h,5000r/min离心。加入蒸馏水使沉淀充分复溶,加入三氯乙酸至8%浓度,搅拌后静置3h,溶液加热浓缩至原体积的1/3,搅拌下向浓缩提取液中加入4倍乙醇,静置8h后,5000r/min离心,收集沉淀,沉淀经60℃减压干燥后研磨,得麦蓝菜多糖。
1.2多糖水解
将上述麦蓝菜多糖溶解于适量pH值为3的盐酸溶液中,于45℃搅拌水解60min后加入氢氧化钠溶液中和至中性,离心取上清液。上清液减压浓缩后经纳滤机过滤除盐后减压浓缩至干,得浅灰色固体粉末;或上清液浓缩至干,加入甲醇溶解,离心,沉淀复以甲醇溶解,离心,沉淀减压烘干,得浅灰色固体粉末。采用上述水解方法即得麦蓝菜多糖水解物。
1.3多糖含量测定
精确称取麦蓝菜多糖或麦蓝菜多糖水解物100mg于安瓿瓶中,加15mL 2mol/L TFA,充氮气封口后120℃水解4h。取出冷却后,水解液旋转蒸发至干,加约2mL甲醇,再蒸干,如此重复多次,以除去TFA。加少量去离子水,超声溶解,转移至10mL容量瓶中,多次清洗转移,定容,摇匀,经0.45μm微孔滤膜过滤,得酸水解待测液。用移液管量取1mL酸水解待测液于25mL容量瓶中,去离子水定容,摇匀,即为供试品溶液A。
精确称取麦蓝菜多糖或麦蓝菜多糖水解物100mg,加入去离子水超声溶解,转移至10mL容量瓶中,清洗转移,定容,摇匀,经0.45μm微孔滤膜过滤得样品水溶液。用移液管量取1mL样品水溶液于25mL容量瓶中,去离子水定容,摇匀,即为供试品溶液B。
参照中国药典2015版和文献报道的DNS法并稍作改进,以葡萄糖为标准品制备标准曲线。