第三章 药物的鉴别 本章讲授鉴别药物常用的方法和药物一般鉴别试验,其中以化学鉴别法、紫外分光光 度法、红外光谱法、熔点测定法和薄层色谱法为重点。 第一节 常用鉴别方法 一、药物鉴别的目的和特点 1、鉴别目的 所谓鉴别就是依据药物的组成、结构与性质通过化学反应、仪器分析或测定物理常数, 来判断药物的真伪。鉴别项下规定的试验方法,仅适用于判别药品的真伪,对于原料药还应 结合性状项下的外观和物理常数进行确认。物理常数的测定结果,不仅对药品具有鉴别意义, 也反映药品的纯度,是检定药品质量的主要指标之一。性状观测是药品检验工作的第一步, 也是不可省略的极其重要的一步。只有性状符合规定的供试品,方可继续检查杂质限量和测 定含量,否则不必进行检查和含量测定。 2、特点 ①为已知物的确证试验。根据中国药典或局颁标准鉴别药物时,供试品都是已知物, 鉴别的目的是确证供试品的真伪,而不是鉴定未知物的组成和结构。 ②鉴别试验是个别分析,而不是系统分析。其试验项目比较少,一般在四、五个项目 以内,有的只做一、两项试验就可以做出明确结论。 ③通常选用药物的化学鉴别反应、红外特征吸收、紫外-可见特征吸收、测定熔点、色 谱行为、生物活性、旋光性、折光率或放射性等不同方法鉴别同一种供试品,综合分析实验 结果,做出判断。 ④鉴别制剂时,要注意消除辅料的干扰。鉴别复方制剂中的不同成分时,要注意消除 各成分间的干扰。 二、化学鉴别法 根据药物与化学试剂在一定条件下发生离子反应或官能团反应产生不同颜色,生成不 同沉淀,放出不同气体,呈现不同荧光,从而做出定性分析结论。如果供试品的反应现象和 质量标准中的鉴别项目和反应相同,则认定为同一种药物。 化学鉴别法是药物分析中最常用的鉴别方法。它有一定的专属性和灵敏度,且简便易 行。 如阴阳离子鉴别反应的专属性灵敏度都比较高。所以,简单无机药物只要用阴阳离子 分析就可确定其成分。而有机定性分析也有一定的专属性,把几种有机定性分析反应综合起 来进行分析归纳,就可以作出准确结论。 药典中应用较多的化学鉴别反应有各种无机阴阳离子的鉴别反应,芳香第一胺反应, 茚三酮反应,放出氨或胺的反应,亚硝基铁氰化钠反应,高锰酸钾褪色反应,丙二酰脲反应, 醋酸铅反应,有机氟化物反应,托烷生物碱类反应,碘化汞钾反应,水杨酸盐反应,苯甲酸 盐反应,枸橼酸盐反应,乳酸盐反应,酒石酸盐反应等。有关这些反应的原理、条件、专属 性等在下一节中讲授。 三、紫外-可见分光光度法 1、适用范围 含有芳环或共轭双键的药物在紫外光区有特征吸收,含有生色团和助色团的药物在可 见光区有特征吸收,它们都可用紫外-可见分光光度法进行鉴别。本法有一定的灵敏度和专 属性、应用范围广、使用频率高。同时,紫外-可见分光光度计的普及率高,操作也比较简 便,在药检工作中易于为大家所接受。其应用范围仅次于化学鉴别法。中国药典二部中只用 紫外-可见分光光度法鉴别的药物较少,本法大都与其他方法结合进行鉴别。例如,与化学 鉴别法或红外光谱法联合进行鉴别。 2、具体做法 用分光光度法鉴别药物的方法有四种,采用这些方法可以适当提高本法的专属性。 (1)对比吸收曲线的一致性 按药品质量标准将供试品和对照品用规定溶剂分别配成 一定浓度的溶液,在规定波长区域内绘制吸收曲线,供试品和对照品的图谱应一致。这里所 谓的一致是指吸收曲线的峰位、峰形和相对强度均一致。例如,鉴别已烯雌酚注射液时,就 用等体积的乙醇和磷酸氢二钾溶液(2→100)混合,将供试品和对照品分别配成 0.01mg/ml 的溶液,在 250~450nm 区间绘制吸收曲线,供试品和对照品的图谱应一致。 (2)对比最大吸收波长和相应吸收度的一致性 按药品质量标准将供试品用规定溶剂 配成一定浓度的供试液,按分光光度法在规定波长区域内测定最大吸收波长和相应的吸收度, 与药品质量标准中规定的最大吸收波长和相应的吸收度对比,如果相同就是同一种药物。药 典中所讲的“吸收度约为 A”是指测定值应在 A±5%A 以内。USP 规定供试品一律与对照 品对比,其最大吸收波长应与对照品一致,相应的吸收度与对照品吸收度的误差一般不得超 过±2%。 (3)对比最大吸收和最小吸收波长的一致性 例如鉴别布洛芬片时,用 0.4%氢氧化钠 溶液配成含布洛芬 0.25mg/ml 的溶液,按分光光度法测定吸收度,在 265nm 和 273nm 波长 处有最大吸收,在 245nm 和 271nm 波长处有最小吸收,在 259nm 处有一肩峰。 (4)对比最大、最小吸收波长和相应吸收度比值的一致性 例如鉴别维生素 B12 注射 液时,用水配成含维生素 B1225μg/ml 的溶液,按分光光度法测定吸收度,在 361nm 和 550nm 波长处有最大吸收,361nm 和 550nm 波长处吸收度比值应为 3.15~3.45。又如鉴别维生素 K1 时,用三甲基戊烷制成 10μg/ml 溶液,按分光光度法测定,在 243nm、249nm、261nm 和 270nm 波长处有最大吸收,在 228nm、246nm、254nm 和 266nm 波长处有最小吸收,254nm 处和 249nm 处吸收度之比应为 0.70~0.75。 四、红外光谱法 有机药物在红外光区有特征吸收,药物分子的组成、结构、官能团不同时,其红外光 谱也不同。药物的红外光谱能反映药物分子的结构特点,具有专属性强、准确度高的特点, 是验证已知药物的有效方法。在药品化学结构比较复杂、相互之间差异较小,用颜色反应、 沉淀生成或紫外分光光度法不足以相互区分时,采用红外光谱法常可有效地解决。国内外药 典都广泛使用红外光谱法鉴别药物的真伪,鉴别品种不断增加,所起作用日益扩大。用本法 鉴别药物时,常用直接法:即将供试品的红外光谱与相应的标准红外光谱直接比较,核对是 否一致,如不一致,应按该药品谱图中备注的方法进行预处理以后再行录制、核对;也可采 用对照品法:即将供试品与相应的对照品在同样条件下绘制红外吸收光谱,直接对比是否一 致。前一方法简便,但无法消除不同仪器和不同操作条件造成的差异;后一方法没有以上缺 点,不足之处是对照品不易得到,因此中国药典一般均采用前一种方法。用红外光谱鉴别药 物时,也常将供试品的红外光谱和标准图谱或对照品图谱,按吸收峰的强度由强到弱的顺序, 逐个记录第一强峰(A)、第二强峰(B)和第三强峰(C)的波数,相互对比。这些强峰往 往反映了药物分子的主要官能团或主要结构特征,对鉴别药物的真伪有重要作用。 用本法鉴别药物时,中国药典要求按指定条件绘制供试品的红外光吸收图谱,与《药 品红外光谱集》中的相应标准图谱对比,如果峰位、峰形、相对强度都一致时,即为同一种 药物。而 USP 规定用供试品和对照品同时绘制红外光谱,供试品图谱中的最大吸收波数应 与对照品图谱一致(中国药典中只有头孢拉定和盐酸倍他司汀两种药物用对照品比较法进行 鉴别)。BP 则主要采用与标准红外光谱对比法,也用对照品对比法。JP 两种方法都有采用。 中国药典(2005)配套出版了相应的《药品红外光谱集》。 红外光谱法的专属性强,但绘制光谱时受外界条件影响较大,图谱容易发生变异。为 了确保鉴别结果准确无误,中国药典不单独用本法进行鉴别,常与其他理化方法联合进行鉴 别。由此看出在鉴别药物真伪方面中国药典所持的严谨态度。 五、熔点测定法 熔点系指一种物质照药典方法测定时,由固体熔化成液体的温度,熔融同时分解的温 度,或在熔化时自初熔至全熔的一段温度。某些药品具有一定的熔点,测定熔点可以区别或 检查药品的纯杂程度。国内外药典均用熔点测定法鉴别有机药物的真伪。可以测定供试品本 身的熔点,也可以将供试品按药典规定制成衍生物后,测定衍生物的溶点。随着红外光谱法 和色谱法的逐步推广,熔点测定法有减少的趋势。 六、薄层色谱法 同一种药物在同样条件下的薄层色谱行为是相同的,依此可以鉴别药物及其制剂的真 伪。将供试品和对照品按药典规定,用同种溶剂配成同样浓度的溶液,在同一薄层板上点样、 展开、显色,供试品所显主斑点的颜色、位置应与对照品的主斑点相同。薄层色谱法是一种 简便易行的方法,其应用范围日益扩大。 此外,2005 年版中国药典还用其它方法对药物进行鉴别,包括放射性药物用测定半衰 期和能谱的方法进行鉴别,有些药物(青霉素钠、钾及其针剂、玻璃酸酶及其针剂、胰岛素 等)用生物活性法进行鉴别,有些药物(氯霉素及其制剂、硫酸奎尼丁和罗通定片等)用旋 光法进行鉴别,有些药物用纸上色谱法进行鉴别,还有用折光率进行鉴别,用显微镜及偏光 显微镜进行鉴别的。2005 年版中国药典中还大量使用了高效液相色谱法鉴别药物。 一般来说,根据药典中鉴别项下的试验方法即可确证供试品的真伪,不必再作其他检 验。偶尔出现问题时,可参照性状项下的内容作出结论。中国药典和 JP(14)中均有药物 的性状叙述,但 USP(24)删去了这项内容。BP(2000)在鉴别项下列出可供选择的多种 鉴别方法,供不同地区、不同实验室根据自己的条件选择使用。例如硫酸阿托品可用 A、红 外光谱;B、水溶液无旋光性;C、衍生物熔点;D、显色反应;E、生物碱鉴别反应;F、 硫酸根鉴别反应等六种方法鉴别。做了 A、B、F 项可不做 C、D、E,做了 C、D、E、F 项 可不做 A、B、项。 第二节 一般鉴别试验 鉴别药品时经常使用的化学鉴别法,中国药典和美国药典均称为一般鉴别试验,英国 药典和日本药典称为定性反应。 一、芳香第一胺类鉴别反应 芳香第一胺类药物或水解后、还原后能生成芳香第一胺类的药物均可与亚硝酸钠发生 重氮化反应,重氮盐与碱性β-萘酚形成偶氮染料。 R R NH2 + HNO2 + H+ + N N + 2 H2O R + N N+ OH + NaOH NN OH R + H2O + Na+ 二、茚三酮反应 橙色~猩红色 α-氨基酸、伯胺和某些羟基胺类药物可与茚三酮在加热时反应生成紫色、蓝色或红紫 色产物。有色物质不是单一化合物,而是几种缩合产物的混合物,可用下列总反应式表示其 原理: O O R C C C (OH2) + H2N CH 或 COOH H2NCH2 R O 茚 三酮 C C C 或O O C C C N CH2 R + 2 H2O + CO2 NCH2R + 2 H2O O O C C C 互变 NCH2 R O 酮式 O C C N CHR H2O C OH O C C C OH O C NH2 + (HO2)C C O O C C N CHR C OH O C C C OH NH2 + O CHR 缩合 O O C C CNC C C OH O 兰色 + 2 H2O 三、加碱加热后放出氨或胺的反应 酰胺、内酰胺、磺酰胺和胺类等能与酸生成盐的药物在过量碱作用下水解,受热时放 出氨或胺,有氨或胺臭,并可使湿润的红色石蕊试纸变蓝。 O O R C NH2 + NaOH R C ONa + NH3 或 RNH2·HX + NaOH → RNH2 ↑+ NaX + H2O 四、与亚硝基铁氰化钠反应 含有巯基(—SH)的硫醇或能被还原生成巯基的硫醚、硫酮类药物,在微碱性条件下 均可与亚硝基铁氰化钠试液反应,生成酒红色产物,关于有色络合物的准确组成目前尚不清 楚。 五、高锰酸钾褪色反应 含有不饱和双键的药物,或含有侧链芳烃的药物,在酸性溶液中与高锰酸钾试液作用, 可将高锰酸钾还原,使紫色消褪。盐酸丙卡巴肼分子中有肼基,在碳酸钠存在下可使高锰酸 钾褪色。 六、丙二酰脲类鉴别反应 司可巴比妥钠、异戊巴比妥、异戊巴比妥钠、苯巴比妥和苯巴比妥钠等原料药及其制 剂的分子结构均以丙二酰脲为母体,都能在弱碱性溶液中与硝酸银作用生成二银盐的白色沉 淀;也能与铜吡啶试液作用而显紫色。有关反应原理、反应条件和反应产物详见第五章第二 节。 七、与醋酸铅反应 含巯基的药物可与醋酸铅试液作用生成有色沉淀。有些含硫有机药物在适当条件下与 某些试剂作用放出硫化氢气体,可使醋酸铅试纸变成黑色。 八、有机氟化物鉴别反应 地塞米松磷酸钠及其注射液、苄氟噻嗪及其片剂、醋酸曲安奈德及其注射液、哈西奈 德、诺氟沙星、氟烷、醋酸地塞米松及其片剂、醋酸氟轻松和醋酸氟轻可的松等 13 种有机 氟化物中均含有氟。为把有机氟转化为无机氟离子,用氧瓶燃烧法进行破坏,用水和氢氧化 钠溶液为吸收液,然后鉴别氟离子。鉴别氟离子的反应原理如下:在 pH4.3 时,茜素氟蓝与 硝酸亚铈试液中的 Ce3+以 1:1 结合成红色络合物,当有 F-存在时,三者以 1:1:1 结合成蓝紫 色的络合物,检出限量为 0.2×10-6。 O OH F+ O OH Ce3+ CH2N CH2COOH CH2COOH O OH O O CH2N CH2COO CH2COO Ce F OH 蓝紫色 九、托烷生物碱类鉴别反应 氢溴酸山莨菪碱及其片剂、注射液,氢溴酸东莨菪碱及其片剂、注射液,丁溴东莨菪 碱及其注射液、胶囊,消旋山莨菪碱及其片剂、盐酸消旋山莨菪碱注射液,硫酸阿托品及其 片剂、注射液等 15 种药物的分子结构,都是由莨菪烷衍生物(又称托烷衍生物)与莨菪酸 生成的酯,称为托烷生物碱类。它们分子中都含有莨菪酸的结构,与发烟硝酸共热,即得黄 色的三硝基(或二硝基)衍生物,冷却后加醇制氢氧化钾少许,即显深紫色。 COOH COOH CHCH2OH + 3 HNO3 O2N CHCH2OH NO2 + 3 H2O NO2 莨菪酸 COOH O2N CHCH2OH NO2 + KOH O2N CHCH2OH NO2 + H2O + CO2 N NO2 O OK 深紫色 若供试品量少,形成紫色不明显时,可投入氢氧化钾颗粒少许,即可在氢氧化钾表面 形成深紫色。氢溴酸后马托品虽然也属于托烷生物碱类,但由于分子中没有莨菪酸的结构, 故与发烟硝酸共热,冷却后加氢氧化钾不呈紫色,可供区别。 十、与碘化汞钾试剂反应 乙胺嘧啶片、别嘌醇及其片剂,硫酸比屈肼及其片剂,硫酸美芬丁胺及其注射液等 7 种含氮有机药物均可与碘化汞钾 K2[HgI4]试剂反应,生成白色或黄色沉淀。 十一、枸橼酸盐鉴别反应 中国药典二部中有枸橼酸、枸橼酸乙胺嗪及其片剂、枸橼酸芬太尼及其注射液、枸橼 酸哌嗪及其片剂、枸橼酸钠及其输血用注射液、枸橼酸钾、枸橼酸铁铵、枸橼酸铋钾及其片 剂、枸橼酸喷托维林及其片剂、滴丸、枸橼酸氯米芬及其片剂和胶囊等 19 种药物用枸橼酸 盐鉴别试验鉴别,方法有下述两种。 第一种方法 取供试品溶液 2ml(约相当于枸橼酸 10mg),加稀硫酸数滴,加热至沸, 加高锰酸钾试液数滴,振摇,紫色即消失;溶液分成两份,一份中加硫酸汞试液 1 滴,另一 份中逐滴加入溴试液,均生成白色沉淀。其反应原理为:构橼酸被高锰酸钾氧化为丙酮二羧 酸(也可称为β-酮戊二酸),与硫酸汞形成复盐沉淀;与溴试液产生五溴丙酮,均为白色沉 淀。 CH2COOH 2 C(OH)COOH + O2 CH2COOH CH2COOH 2C O + 2 CO2 + 2 H2O CH2COOH 2 HgSO4 + 2 H2O Hg2(OH)2SO4 + 2 CO2 + H2SO4 O O S OHgOH OHgOH + HOOCCH2 HOOCCH2 C O O O OHgO C S CH2 C O + 2 H2O O OHgO C CH2 O 白色 CH2COOH C O + 5 Br2 CH2COOH CHBr2 2 CO2 + 5 HBr + C O CBr3 白色 高锰酸钾的用量应加以控制,若加入高锰酸钾过多,丙酮二羧酸可进一步氧化为二氧 化碳和水,再加硫酸汞或溴水时均不生成白色沉淀。应注意逐滴加入溴水,边加边振摇,以 免过量溴水被五溴丙酮吸附而使沉淀呈黄色。 第二种方法 中国药典规定取供试品约 5mg,加吡啶-醋酐(3:1)约 5ml,振摇,即生 成黄色到红色或紫红色的溶液,本反应机理不明。枸橼酸铋钾及其片剂用本法鉴别。 十二、酒石酸盐鉴别反应 中国药典中酒石酸美托洛尔及其胶囊 2 种药物用酒石酸盐鉴别反应进行鉴别。取供试 吕的中性溶液,置洁净的试管中,加氨制硝酸银试液数滴,置水浴中加热,银即游离并附在 管的内壁形成银镜。 十三、乳酸盐鉴别反应 乳酸钙及其片剂、乳酸钠及其注射液、乳酸钠林格注射液等 6 种药物用乳酸盐鉴别试 验进行鉴别。其反应原理为:乳酸盐在酸性溶液中被溴试液氧化为乙醛,遇亚硝基铁氰化钠 生成暗绿色的缩合产物。加硫酸铵是为了增加下层溶液的相对密度。 2CH3—CH(OH)—COOH + O2 → 2CH3CHO + 2CO2↑+ 2H2O CH3CHO + [Fe(CN)5NO]2- + 2OH- → [Fe(CN)5ON = CHCHO]4- + 2H2O (暗绿色) 除上述 13 种有机鉴别试验外,尚有水杨酸、阿司匹林及其片剂、肠溶片和栓剂、双水 杨酯及其片剂,水杨酸镁及其片剂等 9 种药物用水杨酸盐鉴别试验鉴别,苯甲酸与苯甲酸钠 用苯甲酸鉴别试验鉴别,有关原理分别参见第六章第二节。