第二节脱毒方法 任务目标 1.掌握植物脱毒的方法。 2.掌握茎尖脱毒的方法及影响因素。 重点、难点 重点:植物热处理脱毒、微茎尖脱毒方法。 难点:熟练掌握微茎尖脱毒方法。 解决难点的方法:通过实验实训使学生掌握。 教学方法及手段 教法:多媒体教学法、现场演示教学法、任务驱动教学法、讨论、分析、总 结法等。 1、运用多媒体图片观察及现场演示的教学方法能够激发学生的学习兴趣。 2、安排学生操作任务,活跃课堂教学气氛,有利于任务目标的完成。 3、学生的学习过程由观察入手,到领取任务,然后进行操作,最后完成任 务。逐步深入,逐步掌握。 课时安排 课时任务内容及完成过程:、 一、热处理脱毒 (一)热处理法的发现及应用 热处理又称温热疗法(Theomtherapy)。原理是植物组织处于高于正常温度的 环境中,组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化,但寄主植物的组织很少或不 会受到伤害。 (二)热处理方法 1.温汤处理 将植物材料放置在50-55的热水中浸渍数分钟至数小时,或在35热水 中处理30-40h 而是病毒失活。可使病毒失活。此方法简便易行,但易使材料受 伤。适用于休眠器官、剪下的接穗或离体材料。处理时,要严格控制温度和处理 时间。 2.热处理 热处理对活跃生长的茎尖效果较 好,将生长旺盛的盆栽植株移入温热治 疗室处理一定时间。一般在 35~ 40 ,处理时间因植物而异,短则几 十分钟,长可达数月。香石竹置于38 下处理2 个月,其茎尖所含病毒即可被 清除。马铃薯在37下处理20d 即可 除去马铃薯卷叶病毒,马铃薯植株经过 热处理在切取茎尖进行离体培养,可除 去马铃薯S 病毒和马铃薯X 病毒。草 莓茎尖培养结合36处理6 周,可有 效消除轻型黄边病毒,同时还提高植 物的生长速率。 热处理温度和持续时间对脱毒效果有很大影响,并非温度越高,持续时间越 长,效果越好。每一种植物的热处理均有其临界温度范围,超出临界温度范围或 图5-1 马铃薯茎尖脱毒培养 在此范围之内处理时间过长,都会对植物造成损伤,对菊花的热处理时间有10d 增加到30d,可使脱毒植株由9%增加到90%,但会显著减少能形成植株的茎尖 的总数。 亦可采用变温方法,如马铃薯每天40处理4 小时,16-20处理20h,可 清除芽眼中马铃薯的叶片病毒,而且保持了芽眼的活力。 茎尖培养脱毒(一)通过茎尖培养脱毒的原理 1.病毒在植物体内的分布 感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀,病毒的数量随植株部位及年龄而 异,越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低,生长点(约0.1~1.0mm)区域 则几乎不含或含病毒很少。这是因为分生区域内无维管束,病毒只能通过胞间连 丝传递,赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。 2.茎尖大小与脱毒效果 在切取茎尖时越小越好,在切取茎尖时越小越好,但太小则不易成活,过大 则不能保证完全除去病毒。通常以1-3 个幼叶原基的茎尖(约0.2-0.5mm)做外 植体较好。茎尖培养脱毒,由于其脱毒效果好,所以是目前培育无病毒苗的最广 泛最重要的一个途径。 (二)培养基 一般以White、Morel 和MS 培养基作为基本培养基,尤其是提高钾盐和铵 盐含量有利于茎尖的生长。植物激素的种类与浓度对茎尖生长和发育具有重要的 作用。在双子叶植物激素大概是在最年幼的叶原基中合成,所以茎尖的圆锥组织 生长激素不能自给,必须提高适当浓度的生长素(0.1~0.5mg/L)与细胞分裂素, 在生长素中应避免使用易促进愈伤组织分化的 2,4-D,宜换用稳定性较好的 NAA 或IBA,细胞分裂素可用KT 或BA。GA3 对某些植物茎尖培养是有用的。 有时茎尖培养时也添加活性炭。 (三)茎尖培养方法 1.取样与消毒 进行脱毒培养时,由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作,除了需要进行植物 组织无菌培养的一般工具外,还需要一台带有适当光源的简单的解剖镜 40X)。用于脱毒的植株应是患病群体中病害相对较轻的植株。可直接从选定的植株 上去顶芽进行消毒接种。选取茎尖前,可把供试植株种在无菌的盆土中,放在温 室中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在叶片上。另外,最好还要给 植株定期喷施内吸杀菌剂,可用多菌灵(0.1%)和抗生素(如0.1%链霉素)。室内 培养1-2 个月后,采顶芽与侧芽消毒接种。 消毒方法是:剪取顶芽梢段(也可用侧芽)3-5cm,剥去大叶片,用自来水 冲洗干净,在75%酒精中浸泡30s 左右,用1%-3%的次氯酸钠或5%-7%的漂白 粉溶液消毒10-20min(或用0.1%升汞消毒数分钟),无菌水冲洗材料4-5 2.剥去茎尖与接种把茎芽置于解剖镜下,一手用细镊子将其按住,另一手用解剖针将叶片和叶 原基剥掉,解剖针要常常蘸入90%酒精,并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解 剖针的冷却,可蘸入无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴 露出来之后,用解剖刀片将分生组织切下,为了提高成活率,可带1~2 然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触,只用解剖针接种即可。剥离茎尖时,应尽快接种,茎尖暴露的时间应当越短越好,以防茎尖变干。 3.培养 将接处好的茎尖置于22左右的温度。每天10-16 小时,2000~ 3000Lx 光照条件下培养。由于在低温和短日照下,有可能进入休眠;所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。一般维持在252。 培养2 个月左右,大的茎尖再生出绿芽,小的茎尖(0.1-0.2mm)则需要3 个月以上,有的甚至需要更长时间。 (四)影响微茎尖培养的因素 1.外植体大小 在最适培养条件下,外植体的大小决定茎尖的存活率,外植体越大,产生再 生植株的机会也就越多,而外植体越小脱毒效果越好。除了外植体的大小之外, 叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力,一般认为,叶原基能向分生 组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。在含有必要的生长调节物质 的培养基中,离体顶端分生组织能在组织重建过程中迅速形成双极性两端。 2.培养条件 在茎尖培养中,照光培养的效果通常比暗培养好,如马铃薯茎尖培养时,当 茎已长到1 厘米高时光照强度增加到4000Lx。 3.外植体的生理状态 茎尖最好要由活跃生长的芽上切取,在香石竹和菊花中,培养顶芽茎尖比培 养腋芽茎尖效果好。但在草莓中,二者没什么差别。取芽的时间也很重要,一般 选作萌动期较好。否则采用某种适当的处理、打破休眠才能进行。 三、热处理结合茎尖培养脱毒 分生组织一般不带病毒,但也要一些茎尖带有病毒。在香石竹0.1mm 尖培养中,33%的材料带有香石竹斑叶病毒(CaMV)。在菊花茎尖培养中,由0.3-0.6mm 长的茎尖愈伤组织形成的植株全部带有病毒。已知能侵染茎尖分生组 织区域的其他病毒还有马铃薯花叶病毒(TMV)、马铃薯X 病毒(PVX)以及黄 瓜花叶病毒(CMV)。在这种情况下,把茎尖培养和热处理结合起来,能明显提 图5-2 茎尖脱毒培育无毒苗 苗示意图 高脱毒率。 热处理结合茎尖培养法是在单独使用热处理或精简培养都不凑效时使用。如 侵染菊花的病毒有10 余种,对菊花矮缩病毒(CSV)和菊花番茄不孕病毒(TAV), 将植物在35-38条件下处理2 个月,可使病毒失活。要去除或尽量削弱褪绿 斑驳病毒、轻斑驳病毒、B 病毒等,单用热处理难以奏效,必须通过茎尖培养结 合热处理。又如在38下处理140d,未能取出香石竹蚀环病毒(CaERV),结合 茎尖培养可以除去。热处理可以在茎尖离体之前的母株上进行,也可以在茎尖培 养期间进行。,母株热处理可以使母株快速生长,茎尖生长速度远远高于病毒复 制和传播的速度。离体茎尖外植体热处理取的茎尖不不经热处理的大,这样既可 以保证高的脱毒率,又可以提高离体茎尖的存活率和再生植株百分数。热处理结 合茎尖培养的脱毒方法已成功地用来对马铃薯、菊花、石竹、草莓等植物进行脱 四、其他途径脱毒(一)愈伤组织培养脱毒 通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织。然后从愈伤组织再 分化产生芽,长成小植株,可以得到无病毒苗的方法,称为愈伤组织脱毒法。其 理论依据是愈伤组织细胞代病原菌不均一,部分细胞不带病毒,由这些细胞再生 出的植株是不带病毒的。多次继代的愈伤组织中病毒的浓度下降,甚至检测不到 病毒。例如,感染烟草花叶病毒的愈伤组织经机械分离后,仅有40%的单个细胞 含有病毒,其原因可能是:1.病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度;2.有些 细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。对病毒侵袭具有抗性的细胞可能与敏感的细 胞共同存在于母体组织之中。在一个受到TMV 侵染的烟草叶片中,暗绿色的组 织或者不带病毒,或者病毒浓度很低。从这些组织中切取1mm 外植体进行培养, 再生植株中有50%是脱毒苗。但是,愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定, 可能会产生变异植株。并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株。所以生产 上较少使用该方法生产脱毒苗。 茎尖微体嫁接技术,指在人工培养基上培养实生砧木,嫁接无病毒茎尖,以培养脱毒苗的技术。 木本植物茎尖培养难以生根成植株,将实生苗砧木种植培育,再从成年无病 树枝上切取0.1~1.0mm,带3-4 个叶原基的茎尖在砧木上进行试管微体嫁接, 以获得无病毒幼苗。这在桃、柑橘、苹果等果树上已获得成功,并且有的已在生 产上应用。 茎尖脱毒方法: 1.砧木培养 用新鲜种子去种皮后接种于含MS 无机盐的无激素琼脂培养基上,在25 2暗培养2 周,再转光照培养。 2.茎尖培养 供体株多用热处理或温室培养植株,对采集的嫩梢按“茎尖培养脱毒”中方 法消毒和剥离茎尖。 3.嫁接 从试管中取出砧木,切去过长的根,保留4-6cm 根长,切顶留1.5cm 左右茎。 在砧木近顶处留一个“U”形切口,深达形成层,用刀尖挑去切口部皮层。将茎 尖移植砧木切口部,茎尖切面紧贴横切面。 4.嫁接苗培养 微尖嫁接苗一般采用液体滤纸桥方式培养。事先在开一小孔,将砧木的根通 过小孔植入液体培养基,按常规光照培养管理。开始可用较低光照800 lx -1000lx, 长出新叶后可提高光照。 5.移栽 嫁接苗培养3-6 周,具有2-3 片叶时按一般试管苗移植方式移入蛭石、河沙 等基质中培养。 (三)化学疗法脱毒 1.病毒抗血清预处理 用龙舌兰环斑病毒(ORV)的血清处理兰属离体分生组织,提高了再生植株 中无OVR 的植株频率。 2.化学药品处理 许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和 原生质体具有脱毒效果。常用的药品有: 8-氮鸟嘌呤、 2-硫脲嘧啶、杀稻瘟抗 菌素、放线菌素D、庆硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素 、硫脲嘧啶、大霉 素等。例如,将100ug2-硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY 病毒 (马铃薯Y 病毒)。 (四)珠心胚培养脱毒 普通作物受精产生的种子绝大多数只形成一个合子胚,而柑橘类多胚品种中 除一个合子胚之外,还有多个由珠心细胞形成的无性胚即珠心胚。因为珠心细胞 与维管束系统无联系,由其产生的植株均为脱毒植株。但珠心胚一般不能发育成 熟,必须从胚珠中取出进行离体培养才能发育成正常的幼苗。这一技术可以脱去 柑橘的主要病毒与类病毒,包括用热处理不能去除的病毒。 (五)花药或花粉培养脱毒 花药和花粉培养一般程序是脱分化诱导愈伤组织形成,再分化出根、芽器官或胚 状体形成小植株。由于通过愈伤组织生长阶段,加之形成雄性配子体的小孢子母 细胞在植物体内属于高度活跃、不断分化生长的细胞,因此,从理论上来讲花药 含病毒质粒很少或几乎没有。 作业 1、说明植物脱毒的技术方法有哪些? 2、说明热处理脱毒的方法步骤。 3、说明微茎尖脱毒的方法步骤。