· 论著 ·白细胞介素! " #对肾小球系膜细胞$ % &! !表达的影响!广东医学院附属医院肾脏病研究所 (湛江’ ( ) * * ") 王碧飞"陈孝文(江黎明梁东唐德目的: 研究白细胞介素!" # (+ ,!" #) 对肾小球系膜细胞 (- .) 表达$ % &!!的调节作用。方法: 采用/ , + 0 1法测定- .培养上清中$ % & ! !。用逆转录聚合酶链式反应 (2 $!3 . 2) 检测- .$ % &!!4 2 % 1表达, 并用凝胶成像分析系统作半定量比较。结果: 未经任何刺激的- .不分泌$ % &!!, 亦无$ % &!! 4 2 % 1表达。经脂多糖 (, 3 0)(" * 4 5/,) 刺激,- .高表达$ % &! !4 2 % 1及其蛋白。+ ,!" #浓度" 4 5/,、 " * 4 5/,、" * * 4 5/,时均显著抑制, 3 0诱导- .$ % &!! 4 2 % 1表达及其蛋白分泌。+ ,!" # (" * * 4 5/,) 几乎完全抑制- .表达$ % & ! !4 2 % 1及其蛋白分泌, + ,!" # (* 6 " 4 5/,) 则无抑制作用。结论: + ,!" #可能通过抑制- .分泌炎症细胞因子而延缓, 肾内炎症过程。关键词白细胞介素! " # 肿瘤坏死因子肾小球分类号2 # 7 ( 6 " (! " # $ % & ’ ( ) "" * * " + ’ ,- *( . ’ " ! % " $ / ( .! " #- .’ 0 "" 1 2 ! " , , ( - .- *’ . * !!( .3 " , & . # ( & %+ " % %! " # $% & ’ ( &, ) * ( #+ & " , - ( #, . & " # $/ & 0 & # $, ( 1 " 23+ 8 9 : ; : < : = > ?% = @ A B > @ C : A D, $ A =1 ? ? ; E ; F C : = GH > @ 9 @ ; : C E, I < C 8 5 G > 8 5- = G ; F C E . > E E = 5 =, J A C 8 5 K ; C 8 5’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肾小球系膜细胞 (- .) 是肾小球内具有活跃功能的固有细胞。在脂多糖 (, 3 0) 刺激等病理状态下,- .可表达$ % &!!、 + ,!" P、 + . 1-!"等多种炎症介质。而这些细胞因子又可以自分泌的方式作用- .本身, 使肾小球内炎症效应得逐级放大。+ ,!基金项目: 广东省自然科学基金资助课题 (% > 6 * * " ’ # ))" 现为中山医科大学( * * "级博士生( 通讯作者万方数据! " #是一种多效性细胞因子, 能抑制, 3 0诱导的单核 / 巨噬细胞产生多种炎症介质["]。- .具有部分巨噬细胞特性, 但+ ,! " #对- .表达$ % + ! !的作用如何目前尚缺乏深入研究。已有实验证实白细胞介素" * (" ,! " *) 能抑制- .产生$ % & ! !! " #和+ ,! " *同属于$ A (细胞分泌的抗炎性细胞因子, 它们具有多种相似的生物学功能[#]。因此,我们观察了+ ,!" #对体外培养的大鼠- .表达[(], 而+ ,·7)·第" #卷第" S期( * * #年7月中国现代医学杂志. A ; 8 C T > < B 8 C E > ?- > G = B 8- = G ; F ; 8 =U > E 6 " # % > 6 " S0 = @"" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "6 ( * * # ! " # $ !的影响。% 材料和方法% & % 实验材料’ ( )、 * ( + , % - . /为0 1 2 3 4公司产品, 重组大鼠, ’ $ % 5为美国6 1 7 0 7 8 9 : ;公司产品。! 9 1 < 7 =* " >提取试剂盒, * !$( ? *试剂盒为@ 1 A : 76 9 =公司产品。( ? *试剂盒为德国宝灵曼公司产品。! " #$!B ’ , ) >试剂盒为美国B C D 7 2 ; C公司产品。实验动物: 雄性) E大鼠, 体重% F / " . G / 2, 月龄F " 5月, 由本校实验动物中心提供。% & F 大鼠+ ?体外培养及鉴定按照文献方法[.], 无菌条件下取肾, 去包膜及髓质。肾皮质分别过H /目和% / /目筛, 再F / /目钢筛收集肾小球。经胶原酶消化后置F / I# ? )* ( + ,$ % - . /培养液中, 在5 J K、 G I? LF培养箱中培养,% / D后加入嘌呤霉素核苷选择。原代培养F /"5 / D后常规胰酶传代。传代细胞于% G I# ? ) * ( + ,$% - . /培养液中培养。经形态学, 抗胸腺细胞抗体及抗角蛋白抗体免疫组化鉴定为+ ?后, 取5 " H代细胞供实验用。% & 5 B ’ , ) >法测定+ ?! " # $ !蛋白的分泌将细胞重悬于含% G I# ? )的* ( + , % - . /中, 按每孔% 3 =(G M % /F . N后换无血清培养液培养F . N, 使细胞处于静止期。再换G I# ? ) * ( + ,% - . /培养液培养。空白对照组: 加入等体积双蒸水。’ ( )刺激组: 加入’ ( )% / 3 2/’ (终浓度, 下同) 。实验组: 加’ ( ) % / 3 2/’及不 同 浓 度, ’$% 5(/ & %# 2/’、%# 2/’、% /# 2/’、% / /# 2/’) 。每孔设5个复孔, 实验重复-次。培养F . N后取培养上清液, 并用B ’ , ) >法测定其! " #$!的浓度。本实验直接用吸光度>值比较。但每次测定仍用标准品作出标准曲线以实现质控。% & . 系膜细胞! " # $ !3 * " >表达检测% & . & % 细胞总* " >提取中, 待细胞近长满瓶底 (约FM% /血清培养液培养F . N。换G I# ? ) * ( + , % - . /培养,分别加入不同浓度, ’$ % 5及’ ( ) (% / 3 2/’) 继续培养- N。倾去培养液, 按% 3 = /% / : 3F细胞的比例加入! 9 1 < 7 =试剂提取细胞总* " >。提取方法严格按照@ 1 A : 76 9 = ! 9 1 < 7 =提取试剂盒说明书。总* " >用! B溶解, 调整浓度为% 3 2/3 =供实验用。% & . & F : E " >第一链合成万方数据.个细胞) 接种于F .孔培养板, 培养+ ?接种F G : 3F培养瓶-个细胞) 时, 换无反应体积为F / 3 =, 应用@ 1 A : 76 9 =公司0 8 O ; 9 0 : 9 1 O P!+ O 9 ; 4 3 O = 1 Q 1 : 4 P 1 7 C0 R 0 P ; 3进行! " #$!: E " >及A$4 : P 1 C第一链合成, 操作严格按试剂说明书。% & . & 5 ( ? *反应及! " # $ !3 * " >半定量分析! " #$!: E " >特异引物序列为G’$> @ >> ? !? ? >@ @ ?@ @ !@ ! ?! @ !@$5’ , 5’$! @ !@ @ ?> @ !? @ @? ! >> > ?@ @ !@$G’ 扩增片段长度为. % G A O。内参照A $ 4 : P 1 C特异引物序列为G’$? > @! > >? > @! ? ?@ ? ?! > @> >$ G’ , 5’$> ! ?? ! ?@ @ !? ! ? @ ! ?> ! ! > @$G’ 扩增片段长度为% J G A O。引物由大连宝生物工程公司设计合成。