9. SDS作用机理: SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。SDS能使蛋白质发生完全变性,由几条肽链组成的蛋白质复合体在 SDS 的作用下会解聚成单条肽链,因此测定的结果只是单条肽链的分子量。
10.哺乳动物的红细胞无细胞核,其组成中除水分外,约90%是血红蛋白,因此便于作为提取血红蛋白的材料。
11. 血红蛋白由四条肽链组成,包括两条 α-肽链和两条 β-肽链,其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团,此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。
12. 分离红细胞:对血样进行低速短时间离心(速度越高和时间越长,会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀,达不到分离的效果),如500r/min 离心 2min ,然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆,得到下层暗红色的红细胞液体。
13.洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白,以利于后续血红蛋白的分离纯化。
洗涤方法:加入五倍体积的生理盐水(质量分数为 0.9% 的氯化钠溶液),缓慢搅拌10min ,低速短时间离心,如此重复洗涤三次,直至上清液中不再呈现黄色,表明洗涤干净。
14.血红蛋白的释放:将洗涤好的红细胞倒入烧杯中,加蒸馏水到原血液体积,再加 40% 体积的甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌 10 分钟(加速细胞破裂),细胞破裂释放出血红蛋白。
15. 分离血红蛋白溶液:
①过程:将搅拌好的混合液转移到离心管中,以2000r/min 的速度离心 10min。
②试管中溶液分为 4 层:
第1层(最上层):有机溶剂甲苯层(无色透明);
第2层(中上层):脂溶性物质沉淀层(白色薄层);
第3层(中下层):血红蛋白的水溶液层(红色透明);
第4层(最下层):杂质沉淀层(暗红色)。
③分离:先用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层。于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。
16.透析袋一般是用玻璃纸(半透膜)制成,能使小分子自由进出,而将大分子保留在袋内。
17.透析目的:除去样品中分子量较小的杂质(血红蛋白的粗分离)。
18.凝胶色谱法目的:将相对分子质量较大的杂质蛋白除去,实现血红蛋白的纯化。
19. 可将加入洗脱