为手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原体之一 [1-2] ,CVA16和肠道病毒71型(human enterovirus 71, EV71)共同或交替流行导致世界范围的HFMD的暴发 [3] 。CVA16感染虽多为轻症病例,但部分患者可发展成为无菌性脑膜炎、脑干脑炎和心肌炎等重症HFMD [4-5] 。 作者简介: 毛群颖(1972-),女,研究员,主要从事疫苗质量评价及免疫机制研究; 高帆(1985-),男,助理研究员,主要从事疫苗质量评价及免疫机制研究。 通信作者: 梁争论,研究员, E-mail: lzhenglun@126.com ∆:共享第一作者 网络出版时间:2017-11-08 11:00:09网络出版地址:http://kns.cnki.net/kcms/detail/62.1120.R.20171108.1100.006.html 2 2016年,中国率先研发的EV71全病毒灭活疫苗开始在全国范围接种,其可有效预防EV71引起的严重HFMD流行,但同时CVA16引起HFMD的危害将更为凸显。为更好地防控HFMD暴发流行,近期多家机构开展了CVA16疫苗及EV71/CVA16联合疫苗的研制,包括Vero细胞和二倍体细胞为基质的全病毒灭活疫苗、应用重组表达系统(如昆虫细胞-杆状病毒表达系统与酵母表达系统)制备的病毒样颗粒(virus-likeparticle, VLP)疫苗等,在ICR小鼠等模型中均呈现良好的保护作用 [6-8] ;但有研究表明,CVA16疫苗难以在猕猴中获得良好的保护效果 [9] 。如何确证CVA16中和抗体的保护效果已成为研发该疫苗的瓶颈。为此,在2012年1月—2014年1月两年期间,对江苏省邳州市开展的EV71疫苗III期临床试验中的所有6~<36月龄婴幼儿进行了随访观察,根据疾病监测和病例报告结果,结合系列血样CVA16中和抗体检测结果,前瞻性分析CVA16中和抗体与CAV16疾病发生的相关性。 1 材料与方法 1.1 观察对象及内容 在 2012 年 1 月—2014 年 1 月两年期间,采用前瞻性队列研究方法,对江苏省邳州市开展的EV71 疫苗III期临床试验(clinical trial No. NCT01508247) [10] 中所有 6~ <36 月龄婴幼儿,进行CVA16 病原学及CVA16 中和抗体的主动监测。 1.2 标本采集 1.2.1 肛拭子和咽拭子的采集 在主动监测期间,对出现疑似HFMD临床症状的病例,连续 2~3 d采集肛拭子和咽拭子,标本采集及保存按照中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布的《手足口病预防控制指南》执行 [3] 。 1.2.2 血清 分别于疫苗接种 0 d(2012 年 1 月)、2 个月(2012 年 3 月)、8 个月(2012 年 9 月)和 24个月(2014 年 1 月)采集静脉血,分离血清,−20℃保存备用。 1.3 病毒株和细胞 中和试验毒株为 CVA16/G10 原型株 (Genebank accession number: U05876),由中国医学科学院医学生物学研究所惠赠;横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma, RD 细胞)由中国食品药品检定研究院重点实验室保存。 1.4 主要试剂和仪器 病毒 RNA 试剂盒购自德国 QIAGEN 公司;EV71、CVA16 及通用型肠道病毒核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法),均购自于江苏默乐生物科技有限公司;MEM 培养基购自日水制药株式会社;胎牛血清和胰蛋白酶均购自 GIBCO 公司。荧光定量 PCR 仪购自美国 ABI 公司。 1.5 方法 1.5.1 CVA16 病原学检测 将标本用病毒 RNA 试剂盒提取病毒 RNA,再用 EV71、CVA16 及肠道病毒通用型核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)对 RNA 进行 RT-PCR 检测。以出现 CVA16 核酸检测阳性≥2 次确诊为 CVA16-HFMD。 1.5.2 CVA16 中和抗体的检测 采用微量细胞病变法 [4] ,将待检血清 56 ℃灭活 30 min,从 1∶8 开始倍比系列稀释,取 96 孔板双孔平行加样 50 μL/孔,将中和毒株CVA16/G10 稀释至 100 CCID 50 /50 μL,分别加入系列倍比稀释的血清中,50 μL/孔,37 ℃中和 2 h后,再加入浓度为(1~2)×10 5 个/mL的 RD细胞悬液,100 μL/孔,置CO 2 培养箱 35 ℃培养 7 d,观察细胞病变(cytopathic effect, CPE),设立病毒对照、血清对照和细胞对照。结果判定:以抑制 50%细胞病变的血清最高稀释度的倒数为中和抗体效价。以中和抗体效价≥8 判定为中和抗体阳性,以中和抗体滴度≥4 倍升高作为抗体阳转,计算阳转率,并计算CVA16 中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer, GMT)。 1.5.3 CVA16 中和抗体与 CAV16 疾病的相关性 为探讨疾病流行前后 CVA16 中和抗体与 CVA16 疾病发生的相关性,结合病例确诊结果,将观察对象根据疾病流行前的 CVA16 血清中和抗体进行分组,分别统计流行前抗体阴性和阳性人群的 CVA16 发病率及流行后 CVA16 中和抗体阳转率和抗体几何平均增长倍 3 数(geometric mean fold increase, GMFI)的情况。 1.6 统计学分析 应用Excel 2007 软件录入、整理数据,用SPSS 16.0 软件进行统计学分析,率的比较采用χ 2 检验,以P<0.05 为差异具有统计学意义。 2 结 果 2.1 观察对象的基本情况 筛选 4 个时间点均采集到连续血清的 6~ <36 月龄婴幼儿为观察对象,共 180例;其中男性 117 例,女性 63 例,男女性别比为 1.90∶1;各年龄组研究对象的分布见表 1。 表 表 1 观察对象的基本情况 Tab.1 The Basic information of participants 年龄(月龄) 组别 观察对象(例) 男女比例 合计(例) 男 女 6~ <12 疫苗组 12 6 2.00∶1.00 18 安慰剂组 13 10 1.30∶1.00 23 12 ~<36 疫苗组 42 24 1.80∶1.00 66 安慰剂组 50 23 2.20∶1.00 73 合 计 117 63 1.90∶1.00 180 注:疫苗组为 EV71 疫苗。 2.2 病原学检测结果 180 名观察对象在两年的主动监测中,共监测到疑似HFMD临床症状病例 71 例。经病原学检测,其中有 10 例出现 2 次或 2 次以上CVA16 核酸检测阳性,即确诊为CVA16-HFMD。其中 6~<12月龄组 2 例,疫苗组和安慰剂组各 1 例,发病率分别为 5.56%和 4.35%;12~<36 月龄组 8 例,疫苗组和安慰剂组各4例,发病率分别为6.06%和5.48%,各年龄段疫苗组和安慰剂组间发病率均无统计学意义(χ 2 =0.30,P>0.05;χ 2 =0.05,P>0.05)。且 10 例CVA16-HFMD发病时间在随访日后 93.9~141 d(即 2012 年 4—5 月),均值为 117.9 d。见表 2。 表 表 2 病原学检测结果 Tab.2 The tested results of pathogeny 年龄(月龄) 组别 观察对象(例) CVA16 阳性(例) 发病率(%) 发病时间(d)* 6~<12 疫苗组 18 1 5.56 102.9 安慰剂组 23 1 4.35 132.9 12~<36 疫苗组 66 4 6.06 93.9 96.0 102.0 114.0 安慰剂组 73 4 5.48 141.0 101.1 123.0 138.9 合计 180 10 5.56 117.9 注:疫苗组为 EV71 疫苗。*:发病时间以疫苗接种日为 0 d 进行计算。 2.2 中和抗体 2.2.1 所有观察对象的 CAV16 中和抗体阳性率及 GMT 由表 3 所列可见,6~<12 月龄组 CVA16 中和抗体阳性率均低于 12~<36 月龄组,差异均有统计学意义(F=5.82,P<0.05;F=6.57,P<0.05)。在 0 d 和 2 个月时,不同年龄段各组的中和抗体效价均处于最低水平,至 8 个月监测时,不同年龄段各组中和抗体阳性率均明显升高,6~<12 月龄组由 2 个月的 0%和 4.3%分别升高至 33.3%和 26.1%,12~<36 月龄组由 2 个月的 21.2%和 16.4%分别升高至 53.0%和 47.9%,24 个月时不同年龄段各组抗体阳性率和 GMTs 均未出现明显下降。 由表 4 所列可见, 10 例 CVA16-HFMD 在 0 d 及 2 个月时,CVA16 中和抗体效价均<8;8 个月时 CVA16中和抗体均阳转,GMFI 为 51.71 倍。各年龄段的疫苗组与安慰剂组的 CVA16 中和抗体阳性率和 GMT 差异均无统计学意义(P>0.05)。 4 表 表 3 CVA16 中和抗体结果 Tab.3 The tested results for CVA16 neutrilization antibody 年龄 (月龄) 组别 观 察 对 象 (例) CAV16 中和抗体 0 d 2 个月 8 个月 24 个月 阳 性 数(例) 阳 性 率 (%) GMT 阳 性 数(例) 阳 性 率 (%) GMT 阳 性 数 (例) 阳 性 率 (%) GMT 阳 性 数(例) 阳 性 率 (%) GMT 6~<12 疫苗组 18 0 0.00 - 0 0.00 - 6 33.33 188.3 6 33.33 237.2 安慰剂组 23 1 4.35 12.0 1 4.35 12.0 6 26.09 79.9 5 21.74 228.2 12~<36 疫苗组 66 15 22.72 138.3 14 21.21 180.3 35 53.03 145.7 33 50.00 156.9 安慰剂组 73 9 12.33 55.3 12 16.44 74.0 35 47.95 143.6 33 45.21 127.9 合计 180 25 13.89 / 27 15.00 / 82 45.56 / 77 42.78 / 注:疫苗组为 EV71 疫苗。“-”为中和抗体阴性,“/”为未计算。 表 表 4 10 例 CVA16-HFMDCVA16 中和抗体 Tab.4 The tested results of CVA16 neutrilization antibody for 10 CVA16 cases 年龄 (月龄) 组别 CVA16 中和抗体效价 GMFI # 0 d 2 个月 8 个月 24 个月 8 个月 24 个月 6~<12 疫苗组 <8 <8 768 384 192 96 安慰剂组 <8 <8 64 384 16 96 12~<36 疫苗组 <8 <8 384 192 96 48 <8 <8 128 256 32 64 <8 <8 192 192 48 48 <8 <8 512 384 128 96 安慰剂组 <8 <8 96 128 24 32 <8 <8 128 64 32 16 <8 <8 96 96 24 24 <8 <8 512 768 128 192 均值 ...