DotBl ot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原 抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 Dot blot DotBl ot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 Dot blot 是最快速简捷的方法之一,简述如下:在超净台内,使 用无菌多孔加样器将96 孔板内的细胞克隆培养液以5L上样量,成 排点于硝酸纤维素膜上并风干,记录好样品顺序(可在膜的正面边缘 处标记正面及名称,也可通过在膜的右下角剪去一角作为标记,识别 膜的正反面及方向)。取上面风干好的硝酸纤维素膜,用配制好的封 闭液(脱脂奶粉或白蛋白溶液)室温震荡孵育至少一小时。此步骤的 目的是封闭硝酸纤维素膜上的非特异性蛋白结合位点,以避免下一步 加入的抗体与膜发生非特异性结合。将封闭好的硝酸纤维素膜浸泡在 第一抗体中,室温震荡孵育1 小时,然后用TTBS 溶液淋洗膜2 将膜浸泡到TTBS溶液中,室温震荡洗涤3 次,每次5 分钟。将洗涤 后的硝酸纤维膜浸泡在含有酶标第二抗体溶液中,室温震荡孵育1 时,然后用TTBS溶液淋洗膜2 遍后,将膜浸泡到TBST 溶液中,室 温震荡洗涤3 次,每次5 分钟。最后,将膜浸于荧光显色剂(新鲜刚 刚混合的等量A和B 液)。1-2 分钟后将浸泡过的膜,抖去多余显色 剂,夹入保鲜膜(保鲜膜应薄而透明,以免阻挡曝光效果)中,同时 观察显色情况,确定大致曝光时间(一般情况下,如果样品亮度肉眼 可见且较强,那么初次曝光时间应较短,一般选3-5 秒;如果样品亮 度肉眼不可见,则初次曝光时间应略长一些,一般选择1 分钟),曝 光完毕,经显影,定影后,用清水冲洗X 光胶片,根据胶片上结果 情况,再将膜放入曝光暗盒中进行二次曝光及显影、定影反应。溶液 配制及整个操作过程请斑点杂交操作流程图。Dot blot 需要TTBS 解的倍比稀释后的标准品做对照方能进行半定量。同时样品倍比稀释也是半定量所必需。Dot Blot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 附1:Dot-Blot 操作流程图DotBlot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 DotBlot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 DotBlot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96 孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 一、试剂 1、抗待检样品抗体: 第一抗体为纯化鼠抗人 IgG Fc 单抗; 第二抗体为 HRP-兔抗小鼠 IgG ELISADotBlot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 1、双抗体夹心法:本法适用于样品含量低灵敏度要求高的定量分析, 简述如下。先用选定的第一抗体(单抗原结合点的单抗为首选)在碱 性条件下(一般PH=8.0~8.5 碳酸盐缓冲液)包裹96 夜或者室温1小时。然后用排枪或真空吸管吸出一抗,再用BSA 稀释的奶粉封闭45至60 分钟。封闭后用洗涤液洗板2 次。加入待测 抗原样品(条件培养液)和标准品(PBS 稀释)。用洗涤液洗板2 加入标记好的相应抗体室温1小时。用洗涤液洗板2 次。如果不是标 记的抗体,可再用标记的抗一抗抗体(二抗)重复以上步骤再加入底物 液显色和上机读数。Dot Blot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 2、间接法:适用于灵敏度要求低,样品含量高的分析方法,步骤如 下。将制备好的标准品及样品,加至96 温放置3小时。用洗涤液PBS-T 配制的1%BSA 溶液加至板内, 37 放置1 小时。将封闭好的酶标板用洗涤液洗板2 同时加入两孔空白对照(稀释液),37放置1 小时。用稀释液稀释 HRP 酶标记的第二抗体加至板内,37放置1 小时。用洗涤液洗板2 次。加入底物液显色和上机读数。 注:终止液可加可不加。Dot Blot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot bl 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄3、结合竞争法:放射免疫法是典型的竞争法。它利用同位素标记抗 原(I-125)与非标记抗原竞争结合抗体。非标记抗原或者样品中的 抗原越多标记的抗原(I-125)与抗体结合的越少。一定浓度的PEG 可以沉淀抗体结合的标记的抗原(即抗原-抗体复合物),但不可以 沉淀游离的抗体或抗原(即非结合的抗原或者抗体)。沉淀的抗原- 抗体复合物离心后吸出上清中的非结合的抗原或者抗体可以经过放 射性计数定量。标准品或样品中的待测抗原越少计数越高。根据这个 道理可以画出标准曲线和查出相应标准品中的抗原含量。此法灵敏度 高于其它方法,可达到10-100pg/ml 水平,适用于血浆和组织药物浓 度的动力学研究(药物PK study)。DotBl ot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96 孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 4、新方法的建立原则Dot Blot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 以上所有方法的建立主要取决于抗体质量的好坏,因此多试几个商品化的抗体有必要。DotBl ot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 一般情况下,先决定所测样本中抗原量的最低和最高限度,即测定范围。原则上要求抗原和抗体的浓度等量,比如新方法要求检 测抗原浓度在 1~10mg/L 范围内,灵敏度要求是 1mg/ml,最高浓度 10 mg/ml,高于10 mg/ml 使用样品倍比稀释的方法来解决。此时, 检测抗原浓度在 1mg/L,假设需要 100%抗原抗体结合的有效抗体稀 1:8000,又假设需要100%抗原抗体结合的有效抗体稀释度 1:4000。因此决定此法有效抗体稀释度在 1:8000 1:4000之间。我们的结论是一般情况下抗原的浓度降低则抗体的相对浓度也 降低。如果想提高方法的抗原探测灵敏度,一般使用相对低浓度的抗 体。如果想降低方法的抗原探测灵敏度,一般使用相对高浓度的抗体。 DotBlot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96 孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 分析方法的变异范围(代表可靠程度) 一般用 CV (Coefficient variant)来计算。CV=SD(标准差)/X(平均值)100%。 一般批内(intra-assay)的CV要小于批间(inter-assay)的CV。例如N 至少要大于6)同一代测标本在一次方法分析中相差会很小,即CV 很小(CV=5-10%可以接受)。又如N 个同一代测标本在多次 方法分析中相差会很大,即CV很大(CV=10-30%可以接受)。批内 和批间变异是最常用的定量分析控制方法。一般低温(-30或以上) 长期贮存的质量控制用标准品在每次方法分析中都要使用,这就是常 用的定量分析方法的质量控制。Dot Blot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot bl ot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 附:单克隆抗体制备原理Dot Blot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 单克隆抗体的制备过程包括经典的细胞克隆化步骤。理解单克隆 抗体的制备不但有助于理解细胞克隆化的方法,还有助于理解分析方 法中抗体的选用。Dot Blot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot bl ot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 简单地说,将一定浓度的抗原免疫小鼠,取小鼠脾脏,无菌磨碎, 取悬浮的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在体外在一定浓度PEG 的作用下 (PEG 可将2 个或多个细胞融合在一起)融合形成杂交瘤细胞。经过 HAT 培养液在96 孔细胞培养板中筛选,死亡者为未融合的小鼠骨髓 瘤细胞(HAT 培养液可杀死小鼠骨髓瘤细胞)和不能传代生长的小 鼠脾脏细胞(高度分化细胞不能传代生长)。幸存者(即可在HAT 培养液中生长的细胞)为融合的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞具有小鼠脾 脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞共同的特性,因此可以在HAT 培养液中传 代生长。DotBl ot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 使用简单的抗体抗原结合的方法可以测定96 瘤细胞的抗体分泌量。选出分泌量最高的杂交瘤进行细胞扩增,再克隆,鉴定抗体的类型和亲和力,IgG 为首选。以上就是单克隆抗体制 备的简单过程。DotBl ot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96 孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 附:多克隆抗体制备原理Dot Blot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 将一定浓度的抗原免疫大鼠或兔羊马的起初产生的免疫球蛋白 为IgA IgM,后期大量产生IgG,IgG 可分为IgG 型。定期取血清检测抗体滴度,大约2-6 个月左右抗体滴度达到理想标准。全 部采血或分批采血取血清收获,即可获得多克隆抗体,直接纯化后使 用Dot Blot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot bl ot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 抗体滴度测定是通过将抗体倍比稀释,按0,2,4,8,16 稀释度来计算的。阳性100%结合的最低稀释度为抗体有效滴度,也是我们通常使用的抗体有效稀释度。抗体有效稀释度与所测定的抗原 量相关,抗原量高的抗体的有效稀释就相应降低,原则上抗原和抗体 的分子数为1:1。Dot Blot检测流程第九章 免疫学活性测定Dot blot 原理:原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测,工作量很大。因此殃恫眺摘仰梗氮看迸猿显峨杠扣酿懊吁摩禾糊烈俞尸逊材冷酱督饶蜘木驱则刀强肿跌喂饰穿席片粱贬痛馏帽颅挣响鬃涉里桥刘僧后幻翁欺阉媚莹锄 原理:抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在