【摘要】假肥大型进行性肌营养不良(DMD)是一类x连锁隐性退行性肌肉萎缩病。目前,关于DMD基因外显子缺失,内含子断裂点以及所编码dystrophin蛋白的结构已经明确.这对DMD的临床诊　断有很大价值;但对于基因治疗来说,明确DMD基因启动子的顺式元件以及反式因子的结构及相互作　用关系是十分重要的。这些元件的相互作用对于dystrophin蛋白的转录水平及表达起关键的调节作用;　研究表明,人工合成的DMD肌启动子活性比生物体内DMD基因启动子活性高.找出启动子关键元件构　建特异性高效启动子,将其应用于基因治疗,这是一条新的途径。　【关键词】DMD;启动子;基因治疗　Progress　OU　DMD　Gene　Promoter　GeaeTherapy肋ng-ctmo’,CAI　Wang—wei,SHENG　Wen　li.(’Department　ofMolecular　Biochemical,6uangdongMedicinal　College,Zhanjiang　110001,Ch/-　Correspondingauthor:CAI　Wang-wei.E-mail:scb801@126.com　【Abstract】Duchenne　muscular　dystrophy　X-linkedrecessive　disorders　which　result　adistinctivepattern　progressivemuscle　wasting.At　present,on　DMDgene　deletion　exoncontaining　break-point,　脑well　aB　dystrophinprotein　has　aclear　structure.which　greatvalue　clinicaldiag-　nosis　DMD.Furthermore,forgene　therapy,more　development　DMDgene　promoter　Cis　acting　elements　trans-factorstructure　relationshipbetween　components,whichplay　akey　role　regulationprotein　expression　transferrate;Study　showed　artificialmuscle　promoter　vivobio-　logical　activity　morethan　geneitself　promoter.The　relevant　sub-components　stanbuilding　ahish　specific　promoter.if　applied.it　anewway　genetherapy.　【Key　words】DMD;Promoter;Gene　therapy　假肥大型肌营养不良症(duchenne　muscular　dystrophy,DMD)是儿童神经肌肉系统最常见的X　连锁隐性单基因遗传病;本病的发病机制至今不明,　目前尚无有效的药物治疗,基因治疗是目前公认有　效的治疗本病的方法。由于DMD基因突变导致抗　肌萎缩蛋白(dystrophin)缺乏引致全身性的骨骼肌　(包括心肌)的变性和坏死,治疗的关键是使dystro—　phin蛋白有效表达。DMD患者随着年龄增加而死　亡,儿童和成人的dystrophin蛋白表达差异很大,这　说明在肌细胞不同分化时期调节表达效果不同,基　因治疗需要的有效靶向性,要能够驱动DMD基因　DOl:10.3760/cma.j.issn.1673-4386.2009.05.005　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271378)　作者单位:110001湛江.广东医学院分子生物化学教研室(李　江超);5l0070广州,中山大学附属第一医院(盛文利);517i01海121.海南医学院生化教研室(蔡望伟)　通信作者:蔡望伟(E—mail:sehS01@126.com)　综述在骨骼肌中高水平表达,使基因表达具有组织和细　胞特异性,同时防止其他正常组织和细胞受到损伤。　总之,解决基因治疗的理想途径是驱动DMD基因　高效表达,提高启动子在基因治疗中的表达效率。　筛选出特异性肌启动子,可以驱动目的基因在特定　的细胞和组织中高效持久表达,达到靶向,高水平表　达的目的,所以了解和研究DMD启动子区域十分　必要。我们对国内外文献报道的DMD启动子周围　区域序列的研究进行综述,以便深入了解DMD启　动子和其他序列元件在调控蛋白表达中的作崩。　lDMD启动子周围区域基因的结构特点　1.1　DMD基因组的特点:DMD基因是当今已知的　人类最大的基因,跨越2400　kb,其基因组长度约占　人基因组的0.1%。占x染色体的1.5%,由79个外　显子和78个内含子构成,整个基因内含子序列占　99%。DMD基因编码的RNA长达14　000　bp。在　万方数据　DMD所有突变中,约有1/3患者是新的突变引起7的,基因缺失占55%一65%,基因重复占5%一15%。点突变占30%左右J。缺失为主要突变类　型。所以外显子缺失具有不均一性的特点。DMD缺　7端的第4—2l外显子(占缺失的20%),以及第45—52外显子(占54%一60%)。　内含子44约160—180　kb,断裂频率最高;缺失导致　移码突变者,无论缺失或晕复,都有可能使突变区域　的两个残端形成连接片段,多数会引起DMD,未导　致移码者多为BMD。DMD/BMD基冈的5’启动子　区域、基冈缺失热区的内含子及基冈的3　7不翻译区　的还存在多个短串联重复序列(short　tandem　repeat。　STR)。Gualandi等拉1发现患者内含子断裂点在内　含子2、6、7和外显子3-7,3-6缺失以及外显子24　重复有着密切相关联系,5　7端内含子断裂点在突变　和转录以及蛋白表达中起了很大作用,内含子序列　长,不可避免地存在多种断裂点,内含子的重复序列　很多与内含子的不稳定相关联,这是因为单链发夹　结构导致的【3　J。DMD基因有至少4种不同亚型启　动子,分别可以启动较短形式的dystrophin蛋白转　录,它们不具有结合actin蛋白的末端,但保留了富　含半胱氨酸区域和羧基末端,这些启动子只是对下　游序列起作用,基冈内部的启动子分别以DMD基　因第30、45、56、和63号外显子作为第1个外显子　启动转录,其产物分别为Dp260、Dpl40、Dpl　16和Dp7l。Dp260在视网膜中表达,同时在脑和肌组织　中与全长型的dystrophin蛋白共同表达”1;Dpl40表　达于脑、视网膜和肾组织呤1;Dpl　16只在成熟的外周　神经组织(雪旺细胞)中表达一1;Dp71在包括脑、视　网膜、肾、肝、肺等多种组织器官中表达,而不在骨骼　肌中表达;这砦分型,我们推测是不同肌组织在　DMD患者身上不同表现的基础。临床上对DMD肌　启动子的突变子范围是很少!^!.的,但缺失是存在的　而且很常见,启动子是高度保守的,从另外一个角度　也说明启动子在DMD基冈表达中重要的调节作　1.2启动子区顺式元件和反式因子研究进展:　Karasseva等‘“发现高丰度A/T元件(betaA/T　rich,　一269/一258)和转录增强子1以及MEFE.2之间相　互作用,它们相互结合形成转录复合体能够调节　DMD转录的水平,TEF一1　DNA结合蛋白通过结合　A/T富含区域DNA序列和MEF-2一起涮节心肌、　平滑肌的dystrophin蛋白的转录和表达。肌细胞在　不同分化时期内自身的DMD启动子的调节作用是　不同的,成人肌细胞限制了dystrophin蛋白的高效　表达(推测3岁以下儿童则不出现该疾病,说明其　表达水平高),在转录过程中的转录水平很低,而文　献报道合成的人工启动子比正常人体启动子启动转　录水平更高。Dystrophin的表达和外显子l上游的　850　bp的序列对dystrophin蛋白的转录和表达有着　重要作用,因为存在着积极和消极顺式元件,所以　DNA和DNA结合蛋白之间存在着复杂的相互作　用,它们导致了特异性肌启动子的效率不同,成人　DMD的表达效率低,从而导致肌肉萎缩。用顺式元　件来控制基因的表达,如果它们缺失会导致dystro—　phio蛋白的表达下调。近几年研究表明【8j,5’端的　一96　bp左右的区域对于dystrophin蛋白表达十分　关键,它的作用远远大于一140　bp左右区域;　CCArGG　box是位于一91　bp左右,它对于转录有很　强的激活影响,但它对非肌原性细胞不起作用,它的　存在和缺失对于DMD转录和表达的I亩低是一致　的,特别是在心肌。Galvagni等一1发现在一96　bp到一73　bp序列区域和血清反应因子结合促进DMD　的表达,也说明了这段序列属于核心启动子范同之　一,DMD核心启动子包含一致序列CC(A/T)。GG。　和其他真核生物一致,序列AATA和GC　box以及在　一9l　bp附近的CArG　box是调节DMD转录水平的　关键元件,研究者还发现MSE与NF.1形成转录复　合体,促进DMD肌特异性启动子转录。通过上述　文献我们可以保守推测关键的启动子保守范同大约　在一1200　bp到100　bp之间。为研究下一步启动子　序列关键元件提供有力的数据分析。　2人工启动子对基因治疗研究进展　对于启动子表达效率和表达水平研究,町通过　生物信息学寻找关键元件然后对其随机组合来构建　关键启动子元件序列,或构建启动子库,挑选jlj转录　和表达效率较高的核心肩动子;当然也可以启动子　不变,构建H{有效的调控反式冈子。如果在DMD　基囚5’端上游存在缺失,nr在基|大I缺失下游重新开　始蛋白的合成启动,而产,{i没自.正常的5’氨基端、　但也是一个完整的蛋F{质0|,根据此思路同外研究　人员进行外显子跳跃法基I天I治疗。部分启动子相关　结构对于转录有上调作用,部分元件有下调作用,当　然免疫监视,药物反馈作用也是其中影响因素。　Mattei等。j在2007年报道了起上调作用的DMD相关utrophin基因,它所表达的蛋向来弥补DMD缺失　后的功能,之后他们首次合成了基于转录因子本身　万方数据　339的3个锌指结构域蛋白,并且命名他们为Jazz结构　域,使它能够高效驱动utrophin基因启动子进行转　录。类似的还有Kondoh等纠报道的患DMD双胞　胎两兄弟其中一个的DMD启动子上游序列的缺　失,导致了他们的蛋白表达差异很大,此发现对肩动　子上游149　bp左右是核心启动子有力支持,启发我　们从核心启动子人手寻找有效的基因治疗手段。成　人肌细胞自然存在的DMD启动子较低的表达效率　限制了DMD的基因治疗,通过随机组合TATA　box、　MEF-2、TEF.1、SRE的DNA结合位点随机组合引,　研究人员找到了表达效率较高的人工启动子,它们　的表达效率无论在细胞内或者在DMD模型小鼠体　内都超过体内自然存在的启动子,说明体内启动子　并不是转录效率最高的启动子,这一结果对构建人　工微小启动子提供了理论支持。基因治疗的关键是　重塑dystrophin蛋白,研究人员在内含子1中找到1　个增强子,构建含有增强子的启动子来驱动蛋白进　行表达,并对模型鼠进行注射,结果表明存在高水平　蛋白表达4|。还有RP反式作用因子YYl和DNFB　两种DNA结合蛋白特异性竞争肌特异性肩动子关　键部位,抑制启动子的高效率表达:15]。Dunant　等纠的研究表明,在肌特异性启动子(MCK　1.35　kb)控制之下,表达的微小dystrophin蛋白,在DMD　模型小鼠体内得到比较理想的效果。Yoshimura　等u构建了重组AAV2.MCKDehaCSl载体,在肌相　关特异性MCK启动子控制下表达dystrophon蛋白,　其效果显著。这些说明启动子的合理构建对于基冈　治疗十分必要。　3构建人工DMD启动子应用于基因治疗的问题　与展望　在基冈治疗中,最近同外研究人员将目标锁定　肌萎缩蛋白相关基因utrophin扎憎J,它是常染色体　同源的抗肌萎缩基}I习,因为它的大量表达可以弥补　抗肌萎缩蛋Fj的缺失。研究人员将utrophin.A启动　子的调控水平上调,以这种方式补充缺乏抗肌萎缩　蛋白的功能』。Foster等口采取腺相关病毒载体　的构建实现高效的基闪转移系统,对DMD小鼠治　疗,其生理评估表明,启动子序列优化后的Delta—　AB/R3.R18/DehaCT可以改善表达。这哆结果表　明,将启动子优化后在microdystrophin的控制之下,　对基}马治疗是一个必然的方向。