目前细胞培养中常用含血清培养基, 但由于血清成分复杂, 许多精细的实验研究要求培养基中不含有血清, 使含血清培养体系的应用受到一定限制。 现迫切需要建立一个相对简便的无血清培养体系, 不仅培养的成功率高, 而且适用于诸如TGF-β1抑制细胞增殖等有关细胞因子调控细胞生长的精细实验。 我们进行了以下研究。材料与方法　　一、 标本来源 　　经病理证实为肾癌、 前列腺增生、 先天性输尿管肾盂连接部梗阻患者的肾盂、 输尿管或膀胱组织。 患者平均年龄46岁。 男性31例, 女性17例。 新鲜标本放于4℃细胞无血清培养基, 可放置长达12小时而不致明显影响细胞活性。 同时取部分组织作为石蜡切片, 病理学检测证实无增生及恶变。 　　二、 主要试剂 　　无血清细胞生长培养基: 17.7g MCDB153, 牛垂体提取物50mg,CaCl2*H2O 0.13mg,氢化可的松0.074mg, 胰岛素0.005mg, T3 0.067mg溶于1L双蒸水, 调节pH值至7.2; 人重组TGF-β1; 大豆胰蛋白酶抑制剂, 以上试剂购于Sigma或Gibco公司。 　　三、 尿路上皮细胞的原代和传代培养 　　采用冷消化法将标本的上皮层与间质分开[5], 加入大豆胰蛋白酶抑制剂(1mg/ml)终止消化。 调整细胞数量1~2× 105个/ml无血清生长培养基。 在40ml玻璃培养瓶中加3~4ml细胞悬液, 于37℃、 5% CO2细胞培养箱中培养。 原代培养的细胞接近满瓶时, 按1∶ 3转入新的培养瓶中。 　　四、 绘制生长曲线 　　在24孔板每孔加入2ml无血清生长培养基含0.3× 105个2~4代正常移行上皮细胞。 在0、 1、 2、 3、 4、 5天各取3孔, 用血细胞计数仪计数, 绘制生长曲线。 每个标本重复试验3次。 　　五、 电镜观察 　　标本经2.5%戊二醛固定2小时, 缓冲液冲洗后再经1%锇酸固定2小时, 常规脱水埋于环氧树脂812#中, 超薄切片, 染色后在H 600电子显微镜下观察。 　　六、 TGF-β1抑制细胞增殖试验 　　采用10个标本, 其中膀胱2例、 输尿管4例、 肾盂4例。 每个标本的传代细胞以2.5× 104/ml密度重悬于无血清生长培养基或1% FCS培养基, 在24孔板每孔接种2ml细胞悬液。 12小时后加入TGF-β1至终浓度为50pg/ml, 以不加TGF-β1孔为对照组。 对照和加入TGF-β1组在第3天计数, 每个标本重复试验3次。 　　七、 数据分析 　　采用配对t检验进行统计分析。结　　果file:///E|/qk/zhmnwk/zhmn99/zhmn9906/990615.htm(第 2/5 页) 2010-3-23 19:55:20万方数据 中华泌尿外科杂志CHINESE JOURNAL OF UROLOGY1999年　第20卷　第6期 Vol　　一、 上皮细胞的原代和传代培养 　　本试验中成功培养标准为: 原代上皮细胞能够贴壁生长, 进入对数生长期, 长满瓶后能进行传代。 成功进行传代培养在各个器官的比例如下: 输尿管23/25、 肾盂10/13、 膀胱2/10, 总成功率为73%。 培养失败13例, 其中细菌污染9例, 不明原因2例,消化过度2例。 细菌污染是造成原代培养失败的首要原因, 膀胱标本中有7例为细菌污染造成失败, 在倒置显微镜下观察, 细菌具有杆菌特征, 可能是前列腺增生病人膀胱腔内残留细菌所致。 用酶消化每cm2组织大约可得1.9× 106细胞, 经台盼蓝染色活细胞占总细胞数86%。 将消化下来的细胞接种至普通培养瓶中即可成活扩增。 传代的正常上皮细胞24小时后进入对数生长期, 5天达到生长平台期, 一般可传9~11代。 　　二、 细胞形态 　　原代培养的肾盂、 输尿管、 膀胱移行上皮细胞以及原代与传代细胞之间形态无明显差别, 倒置显微镜下均表现为上皮样、 多形性和重叠生长的特点(图1)。 电镜下细胞呈梭型, 核仁明显, 胞浆中有张力原纤维, 细胞表面有短小微绒毛(图2), 具有典型的移行上皮特征。图1　正常尿路上皮细胞显微镜下表现为上皮样、 多形性和重叠生长的特点。 × 60file:///E|/qk/zhmnwk/zhmn99/zhmn9906/990615.htm(第 3/5 页) 2010-3-23 19:55:20万方数据 中华泌尿外科杂志CHINESE JOURNAL OF UROLOGY1999年　第20卷　第6期 Vol图2　电镜下细胞呈梭形、 核仁明显、 胞浆中有张力原纤维, 细胞表面有短小微绒毛。× 4200　　三、 TGF-β1抑制细胞增殖试验 　　TGF-β1在无血清生长培养基中对人正常尿路移行上皮细胞有明显的抑制作用,TGF-β1 50pg/ml组与对照相比差异有显著性(t=4.21,P<0.05)。 而在含有1% FCS的生长培养基中细胞则对TGF-β1不起反应, 与对照相比差异无显著性(t=0.10,P>0.05), 表明仅在无血清培养基中正常上皮细胞才能对TGF-β1作出敏感反应。讨　　论　　肾盂、 输尿管和膀胱移行上皮细胞具有相同的生物学特性[2], 因此可采用相同的培养条件。 Petzold等[4]报道原代培养的尿路上皮细胞必须在饲养细胞层或胶原胶上生长。 但饲养细胞或胶原准备比较复杂, 并且饲养细胞不利于对上皮细胞进行计数。胶原层薄厚不均一时, 则严重影响倒置显微镜对细胞进行观察。 另外, 如果分离上皮细胞使用方法不当, 在原代培养时会出现大量的间质(成纤维)细胞, 导致正常移行上皮细胞生长受到抑制甚至失败。 本培养体系可以使正常尿路上皮细胞在玻璃支持物上形成单层并能传代, 在体外快速增殖形成对数生长期, 简化了正常上皮培养的操作, 而且冷消化法(4℃)由于只分离上皮层, 极大减少间质细胞污染的机会。 采用本法经倒置显微镜观察, 在原代及传代培养中未发现间质细胞生长。 　　TGF-β1是上皮细胞生长的强抑制剂[6], 对包括尿路移行上皮细胞在内的上皮具有抑制作用。 在含血清培养基中这种作用并未得到体现, 血清的复杂成分干扰了TGF-β1与细胞相应受体结合, 而在无血清培养基中细胞能敏感反应出TGF-β1的抑制作用。 虽然只以TGF-β1为例, 但可适用于分析其它生长因子与细胞生长关系的实验。 file:///E|/qk/zhmnwk/zhmn99/zhmn9906/990615.htm(第 4/5 页) 2010-3-23 19:55:20万方数据 中华泌尿外科杂志CHINESE JOURNAL OF UROLOGY1999年　第20卷　第6期 Vol　　正常尿路上皮细胞在无血清生长培养基中生长一般在9~11代以后开始出现衰退现象。 如果按原代培养106细胞, 每次可分为3份, 共培养6代, 最后的细胞数为106× 36个细胞, 其收获的细胞量和传代次数足以满足大多数生物学试验, 例如从基因转染开始到筛选出阳性细胞克隆为止, 细胞传代不超过3次, Southern杂交需要5× 107细胞[7]。 　　本培养体系具有简单、 短期内可扩增出大量纯净的上皮细胞、 应用范围广和成功率高的特点。 在无血清培养基中正常上皮生长从几代到十几代不等, 细胞逐渐衰退、老化或死亡, 如何增加传代次数, 延长培养时间, 需要在以后的研究中对培养条件如培养基组成加以改进。作者单位: 300211 天津医科大学第二医院泌尿外科(汤洋); 天津市泌尿外科研究所(畅继武、 隋志芳、 马腾骧)参考文献　1　Yoo JJ,Atala A.Novel gene delivery system using urothelial tissue engineered neo-organs.J Urol,1997,158∶ 1066-1070. 　2　Hutton KAR,Trejdosiewicz JP,Thomas DFM,et al.Urothelial tissue culture for bladder reconstruction:an experimental study.J Urol,1993,150∶ 721-725. 　3　Owens RB,Smith HS,Neson Ress WA,et al.Brief communication:epithelial cell culture from normal and cancerous human tissues. J Natl Cancer Inst,1976,56∶ 843-849. 　4　Petzold JL,Leigh IM,Duffy PG,et al.Culture and characterization of human urothelium in vivo and in vitro.Urol Res,1994,22∶ 67-74. 　5　Rahman Z,Reedy EA,Heatfield BM.Isolation and primary culture of urothelial cells from normal human bladder.Urol Res,1987,15∶ 315-320. 　6　Barnard HA,Ktibs RN,Noses HL.The cell biology of transforming growth factor β .Biochim Biophys Acta,1990,1032∶ 79-87. 　7　Davis LG,Kuehl WM,Battey JF.Basic methods in molecular biology.2th ed.Norwalk :Appleton&Lange,1994,611-612. (收稿: 1998-09-11　修回: 1999-02-09)file:///E|/qk/zhmnwk/zhmn99/zhmn9906/990615.htm(第 5/5 页) 2010-3-23 19:55:20万方数据