一、一个引物找周边序列1.进NCBI BLAST 模式 2.粘贴相关序列 blast 后(例如水稻内源基因引物GGAAAGCCGATGGCATCAG) 3.出现相关序列 4.找到下方alignment,也就是 5.选择合适的物种,点击graphics,得到下面图形 最下方的序列为我们输进去的序列,上面两条黑色的链条是与其匹配的DNA双链,点击并 按住鼠标可左右移动该双链,点击右键可以下载(FASTA格式为单纯序列格式),下载的序 列片段长度为网页所显示的长度,如果想扩大范围,可以点击移动双链序列上方的(-+)按二、一对引物找扩增序列(电子PCR)以水稻内源基因引物为例: 上游外引物F3-2: GGAAAGCCGATGGCATCAG 下游外引物B3-2: TCTCCATTGTCCTCCTCTGC (反向互补GCAGAGGAGGACAATGGAGA) 进NCBI BLAST 页面,找到下面的特殊blast 中的primer-blast 点开primer-blast 页面, A.输入自己的引物 B.选择数据库database(如Mrna,或genomes) C.输入物种(范围可大可小,如plant 植物) ,就可以出结果。E.点击合适物种链接如 ,得全基因图; 也可以继续点击graphics ,得下图(点击-+按键调 节显示序列,点击并按住可以拖动双链至合适位置(D 上显示1750-1928 为目的 序列): G.在双链上点击右键,选save,选fasta,然后保存到电脑,此.fa 文件可以用IE 打开,得到 下列目的序列 >gi|115468835|ref|NM_001064552.1|:1741-1966 Oryza sativa Japonica Group Os06g0604400 (Os06g0604400) mRNA, complete cds CATTTGCATGGAAAGCCGATGGCATCAGACCAGAAGACATTGAGGCGTTGCATCTGATTCCCAGAGAGA TTTCTCTGAAGATTGTGAACAAGATTGAAGCTGGTGAGCGTTTTGCAGTCTATGTTGTGCTGCCAATGT GGCCTGAAGGACCTCCTGCTAGTGGATCAGTGCAGGCAATACTGGATTGGCAGAGGAGGACAATGGAGA TGATGTACTATGATATTGC 3.水稻内源基因LAMP 扩增片段及引物 水稻内源基因引物2: 上游外引物F3-2: GGAAAGCCGATGGCATCAG 下游外引物B3-2: TCTCCATTGTCCTCCTCTGC TTGAAGCTGGTGAGCGTTTTGC)-GACATTGAGGCGTTGCATCT 下游内引物BIP-2:ATGTTGTGCTGCCAATGTGGC-CCAGTATTGCCTGCACTGAT(反向 互补ATCAGTGCAGGCAATACTGG) 内源基因内源基因扩增序列如下: Oryza sati va Japonica Group genomic DNA, chromosome PACclone:P0481H08 CATTTGCATGGAAAGCCGATGGCATCAGACCAGAAGACATTGAGGCGTTGCATCTGATTCCCAGAGAGA TTTCTCTGAAGATTGTGAACAAGATTGAAGCTGGTGAGCGTTTTGCAGTCTATGTTGTGCTGCCAATGT GGCCTGAAGGACCTCCTGCTAGTGGATCAGTGCAGGCAATACTGGATTGGCAGAGGAGGACAATGGAGA TGATGTACTATGATATTGC