当进行限制性酶切反应时,为确保最佳的反应条件,务必要遵守限制性内切酶供应商提供的建议。在此过程中需要考虑的重要参数包括:底物 (DNA) 和酶的量、反应体积以及孵育时间。
根据传统的定义,在最佳反应条件下,一个单位的限制性内切酶可以在1小时内,在50 μL体系中 完全酶切 1 μL 定义底物(例如,质粒 pUC19)。尽管单位定义提供了一种测定方式,但还需注意,根据 DNA 底物之中的识别序列出现的频率及所用底物类型,针对不同DNA底物使用等量的限制性内切酶可能需要不同的最佳反应条件。实际上,酶供应商往往根据 DNA 样本的潜在质量、数量和性质波动,推荐比完全酶切所需量多 5 至20 倍的酶(或1μL 酶/反应体积)。
为确保限制性内切酶的有效活性,应按照制造商的建议妥善存储并在过期前使用。通常情况下,应将酶分成小等份,存储在 –20⁰C 条件下的无霜冰箱之中,从而在维持活性的同时最大限度避免反复冻融。DNA 样本应避免接触可能抑制酶并造成其它负面效应的污染物,如核酸酶、盐、有机溶剂(例如,苯酚、氯仿或乙醇)以及洗涤剂。
为避免在 –20°C 条件下结冰,限制性内切酶往往采用 50% 的甘油溶液形式提供。但甘油自身的粘度可能导致反应配制阶段移液和少量酶加样较为困难。最好是最后添加酶至终体积,添加之后就充分混匀。“用手指轻弹反应管”轻柔混匀,然后短暂离心反应管,可帮助酶在反应混合物中充分扩散,并在反应管底部收集到反应溶液。
在孵育过程中,反应须达到所需的温度,并在整个孵育期间保持恒定。如果使用 5-15分钟完全酶切的快速限制性内切酶代替1小时酶切的传统限制性内切酶时,这一点尤为重要。