单克隆抗体制备过程中经过两次筛选单克隆抗体制备过程中,总共有两次筛选,第一次筛选出杂交瘤细胞,第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细 胞,两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法:细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT 选择 性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)。其依据是细胞 中的DNA合成有两条途径:一条途径是生物合成途径(“D 途径”),即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸, 为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT 培养液中氨基喋呤是 一种叶酸的拮抗物,可以阻断 DNA 合成的“D 途径”。另一条途径是应急途径或补救途径(“S 途径”),它是利用次 黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核 苷酸,两种酶缺一不可。因此,在HAT 培养液中,未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D 途径”被氨基喋 呤阻断,虽“S 途径”正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d 左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融 合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT)细胞,因此自身没 途径”,且“D途径”又被氨基喋呤阻断,所以在 HAT 培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应 细胞的“S途径”,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的 特性,因此能在HAT 培养液中选择性存活下来,并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法:在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且一种抗原决定簇刺激机体 形成相对应的一种效应 淋巴细胞的特异性是不同的,经HAT 培养 液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异,所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异 性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,使每一 孔含一个或几个杂交瘤细胞(理论上30%的孔中细胞数为0 时,才能保证有些孔中是单个细胞),再由这些单细胞克 隆生长,最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此,单克隆抗体制备过程中,两次筛选的原理 和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理: 淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和 量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的 骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具 有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效 价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程 1)免疫脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c 小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方 法同一般血清的制备,也可采用脾内直接免疫法。 2)骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前,骨髓瘤细胞应经过含8-AG 的培养基筛选,防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性(恢复HGPRT 的活性的细胞不能在含8-AG 的培养基中存活)。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞 培养瓶中培养,融合前24h 换液一次,使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3)细胞融合的关键: 融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。4)阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10 天作第一次检测,过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、 而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质,以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便,RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次,均阳性时才确定为 阳性克隆进行扩增。 5)克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细 胞是不稳定的,有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。