1.5 g/袋的铝箔袋装,推荐食用方法为每天1 次,每次1袋,温开水冲饮。 77 现代食品科技 Modern Food S cience and Technology 2013, Vol.29, No.1 1.2 实验方法 标准差形式。 2 结果与讨论 2.1 动物实验 1.2.1 增强免疫力实验方法[2] 1.2.1.1 实验动物 选用SPF级昆明种雌性小白鼠48只,6~8周龄(体 重18~22 g)。 1.2.1.2 剂量与分组 实验按人体每日推荐量(以儿童体重30 kg计,推 荐量为0.05 g/kg· BW) 的5倍 (0.25 g/kg· BW) 、 10倍 (0.5 g/kg· BW) 和30倍 (1.5 g/kg· BW) 分成对照组和低、 中、 高剂量组共四组,每组12只。 1.2.1.3 灌喂方法 实验时分别称取样品0.50、1.00、3.00 g,用纯净 水配制成20 mL的样液,分别供低、中、高三个剂量组 动物灌胃使用。动物在实验室条件下适应三天后,以 下每个实验均为随机将48只鼠分为四组,每组12只, 每日灌胃给予受试物,给样量根据每周体重增减调整, 连续灌胃四周。对照组灌服无菌纯净水。 1.2.2 小鼠迟发型变态反应试验(足跖厚度增加法) 实验结束前的第4天免疫动物,用2%(v/v)绵羊 红细胞腹腔注射0.2 mL致敏动物,5天后测定左后足跖 部厚度,接着于该处皮下注射20%(v/v)绵羊红细胞 (20 μ L/每鼠),注射后24小时测定左后足跖部厚度三 次,得平均值。 1.2.3 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT 法) 淋巴细胞增殖反应:将细胞悬液分两孔加入24孔 培养板中,每孔1 mL, 一孔75 μ L ConA 液 (相当于7.5 μg/mL) , 另一孔作为对照, 置5% CO2 , 37 ℃培养72 h。 培养结束前4小时, 每孔吸去上清液0.7 mL, 加入0.7 mL 无血清RPMI 1640培养液, 同时加入MTT (5 mg/mL) 50 μ L/孔,继续培养4 h。培养结束后,每孔加入1mL异丙 醇,吹打混匀,使紫色结晶溶解,分加于96孔培养板 中,作3个孔的平行样,以570 nm波长测定光密度值。 1.2.4 NK细胞活性测定(LDH法) NK细胞活性检测:取浓度为4?105 个/mL的YAC-1 靶细胞和效应细胞各100 μ L(效靶比50:1),加入U型 96孔培养板;靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 100 μ L,靶细胞最大释放孔加靶细胞和1% NP40各100 μ L;上述各项均设三个复孔,于37 ℃、5% CO2 培养箱 中培养4小时,然后将96孔培养板以1500 rpm离心5分 钟, 每孔吸取上清100 μ L置平底96孔培养板中, 同时加 入LDH基质液100 μ L,反应3分钟,每孔加入1 mol/L HCl 30 μ L,在酶联仪492 nm处测定光密度值。 1.3 实验数据统计 用SPSS 10.0软件包进行统计分析, 结果采取均值± 78 2.1.1 益生菌冲剂对小鼠体重的影响 益生菌冲剂对小鼠体重的影响:迟发型变态反应 组见表1,淋巴细胞转化、NK活性测定组见表2。 表1 益生菌冲剂对小鼠体重的影响(第I批动物,n=12) Table 1 Influence of complex probiotics on mice weight 组别 对照组 低剂量 中剂量 高剂量 F值 P值 剂量/ (g/kg· BW) 0.00 0.25 0.50 1.50 初始体 重/g 中期 体重/g 终期体 重/g 增重 /g 20.00±1.20 30.80±3.10 35.10±4.00 15.10±3.70 20.00±1.20 29.50±2.40 34.10±2.60 14.10±3.10 20.00±1.10 29.50±1.50 33.70±1.70 13.70±2.30 19.90±1.20 30.00±1.50 34.50±1.80 14.60±2.30 0.02 >0.05 0.91 >0.05 0.62 >0.05 0.54 >0.05 表2 益生菌冲剂对小鼠体重的影响(第II批动物,n=12) Table 2 Influence of complex probiotics on mice weight 组别 对照组 低剂量 中剂量 高剂量 F值 P值 剂量/ (g/kg· BW) 0.00 0.25 0.50 1.50 初始体 重/g 中期体 重/g 终期 体重/g 增重 /g 20.80±1.00 30.40±2.40 34.70±2.80 13.90±3.20 20.70±1.00 29.80±1.20 34.10±2.10 13.40±2.10 20.70±1.00 28.90±1.50 33.30±1.60 12.60±1.60 20.70±0.90 29.60±1.70 33.80±1.80 13.10±2.20 0.01 >0.05 1.43 >0.05 0.88 >0.05 0.68 >0.05 各剂量组各期体重与对照组相应时期体重比较, 差异均无显著性意义,表明益生菌冲剂对小鼠的体重 生长无明显影响。 2.1.2 益生菌冲剂对小鼠脾脏重量和胸腺重量的影响 表3 益生菌冲剂对小鼠胸腺、脾脏重量的影响(n=12,x+s) Table 3 Influence of complex probiotics on thymus & spleen weight of mice 组别 对照组 低剂量 中剂量 高剂量 F值 剂量/ 脾脏/体重 P值 脾脏/体重 比值/(mg/g) 3.96±0.64 >0.05 >0.05 >0.05 P值 (g/kg· BW) 比值/(mg/g) 0.00 0.25 0.50 1.50 4.46±0.74 4.28±0.58 >0.05 3.80±0.67 4.53±0.78 >0.05 3.84±0.72 4.17±0.61 >0.05 3.98±0.37 0.70(P>0.05) 0.27(P>0.05) 各剂量组脏器/体重比值与对照组比较,差异均无 显著性意义(见表3)。表明益生菌冲剂对小鼠的脾脏 重量和胸腺重量无明显影响。 2.1.3 益生菌冲剂对小鼠免疫力的影响 现代食品科技 Modern Food S cience and Technology 2013, Vol.29, No.1 2.1.3.1 益生菌冲剂对小鼠的迟发型变态反应的影响 绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应试验(足 跖增厚法),其高剂量组足跖增厚值与对照组比较, 差异有显著性意义(见表4)。 表4 益生菌冲剂对小鼠迟发型变态反应的影响(x+s) Table 4 Influence of complex probiotics on delayed hypersensitivity of mice 组别 对照组 低剂量 中剂量 高剂量 F值 剂量/ (g/kg· BW) 0.00 0.25 0.50 1.50 动物数 /只 12 12 12 12 足跖增 厚/mm 0.46±0.17 0.49±0.18 0.60±0.16 0.64±0.18 3.02(P<0.05) >0.05 >0.05 <0.05 P值 (与对照组比) NK细胞活性转换值:X=Sin-1(p)1/2 2.1.4 小结 依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版) 中增强免疫力功能评价标准判断,该益生菌冲剂具 有增强免疫力功能作用。 3 讨论 最常见的益生菌是乳杆菌和双歧杆菌,它们是人 类肠道重要的生理菌,对机体有多种其它正常生理菌 无法比拟的生理作用,包括增强免疫力等[3]。 嗜酸乳杆 [4] 菌 和乳双歧杆菌具有以下功能作用:在肠道定植,激 活机体巨噬活性,诱发免疫反应;同时通过自身及其 代谢产物与其他细菌间相互作用,维持和保证菌群最 佳优势组合,阻止致病菌定植入,拮抗致病菌和有害 微生物生长及其毒素吸附;通过激活巨噬细胞可提高 非特异性及特异性免疫反应、自然杀伤细胞活力,增 强细胞因子表达水平,促进免疫球蛋白特别是分泌型 IgA的表达,从而发挥产品增强免疫力的功效[1,5~9]。 低聚木糖通过增殖双歧杆菌、调节肠道菌群,并 因此抑制肠内有害物质形成、减少有害物质的吸收、 刺激肠道免疫应答反应、增强肠道粘膜抗感染能力, 改善和维护肠粘膜的屏障功能。 熊衍文等认为,嗜酸乳杆菌对上皮细胞有粘附作 用,能够抑制肠侵袭性大肠杆菌对上皮细胞的粘附作 用,具有非特异性的免疫刺激作用。实验使用口服链 霉素处理的 BALB/c 小鼠模型,在大肠杆菌 O157 : H788-2364感染前或后,在不同时间经口给以嗜酸乳杆 菌,观察试验小鼠的临床症状、肠道和肾脏的病理改 变、 排菌时间以及粪便中志贺毒素对V ero细胞的毒性作 用等。结果发现口服嗜酸乳杆菌可以明显降低感染了 大肠杆菌O157:H7小鼠的死亡率,降低通过粪便排泄 病原菌的时间, 以及降低粪便标本对V ero细胞的毒性作 用。结论嗜酸乳杆菌可以保护试验动物免受大肠杆菌 O157:H7的感染,能够明显预防疾病的发生[10]。 王雪明等实验也显示嗜酸乳杆菌增强机体免疫力 方面有明显效果[11]。Wagner等研究显示嗜酸乳杆菌的 摄入激发免疫系统缺乏的小鼠抗体和细胞对白假丝酵 母的应激反应,降低白色念珠菌感染程度,其血清中 免疫球蛋白IgM、 IgA和IgG比胸腺免疫缺乏小鼠对照组 [12] 更多 。 乳双歧杆菌作为双歧杆菌的一种,与其他双歧杆 菌属的菌种一样具有明显的增强免疫力功能。双歧杆 菌是人肠道正常菌群中占优势的益生菌,被机体摄入 后可激活宿主的免疫系统,对机体有明显的免疫促进 作用,可以促进新生儿免疫系统的成熟,也可以促进 79 2.1.3.2 益生菌冲剂对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转 化反应的影响 对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应,其高剂 量组光密度差值高于对照组,差异有显著性意义(见 表5)。表明益生菌冲剂的脾淋巴细胞转化试验结果为 阳性,受试样品具有增强细胞免疫功能作用。 表5 益生菌冲剂对小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响(x+s) Table 5 Influence of complex probiotics on conversion reaction of mice splenic lymphocyte 组别 对照组 低剂量 中剂量 高剂量 F值 剂量/ (g/kg· BW) 0.00 0.25 0.50 1.50 动物数 /只 12 12 12 12 光密度 差值 0.46±0.06 0.48±0.04 0.50±0.06 0.526±0.03 2.84(P<0.05) >0.05 >0.05 <0.05 P值 (与对照组比) 2.1.3.3 益生菌冲剂对受试动物NK细胞活性的影响: 表6 益生菌冲剂对小鼠NK细胞活性的影响(n=11,x+s) Table 6 Influence of complex probiotics on NK cells activity of mice 组别 对照组 低剂量 中剂量 高剂量 F值 剂量 (g/kg· BW) 0.00 0.25 0.50 1.50 NK 细胞 活性/% 8.11±1.73 8.16±2.08 12.04±2.78 11.17±2.13 NK 细胞活 性转换值 0.29±0.03 0.29±0.04 0.35±0.04 0.34±0.03 9.14(P<0.01) >0.05 <0.01 <0.01 P值 (与对照组比) 中、高剂量组的NK细胞活性高于对照组,差异均 有显著性意义(见表6)。表明益生菌冲剂对受试动物 NK细胞活性试验结果为阳性,受试样品具有增强NK 细胞活性作用。 现代食品科技 Modern Food S cience and Technology 2013, Vol.29, No.1 肠粘膜局部和系统的免疫功能,对特异性和非特异性 的免疫应答均有调节作用。通过免疫调节作用加强肠 道的各条防线,发挥抗感染和抗肿瘤作用,维持机体 健康状态时免疫功能的正常水平,促进免疫功能在疾 病状态时的增强。 给健康儿童食用含双歧杆菌的食品21 d后,其粪 便中的IgA水平显著增加,提高了胃肠道粘膜的免疫和 抗感染能力[13]。给小鼠腹腔注射双歧杆菌,发现动物 脾脏LAK、NK细胞活性,以及腹腔局部巨噬细胞来源 的IL-1、IL-6和TNF等细胞因子活性增强,从而提高了 宿主机体的特异性和非特异性免疫功能。 杨美芬等通过双歧杆菌对儿童机体免疫反应的作 用及其机制的研究,认为双歧杆菌作为人体肠道的正 常菌群中占有优势的益生菌,被宿主摄入后可激活宿 主的免疫系统,对特异性和非特异性的免疫应答均有 调节作用,尤其在儿童其免疫调节作用更显示出它的 重要性,双歧杆菌对儿童的免疫调节作用及其机制主 要是通过①对IgA影响②对IgE影响③对巨噬细胞影响 ④对淋巴细胞影响⑤转位作用等产生增强免疫力作用 [14] 相关的淋巴组织(GALT )将消化道变为人体内最大的 免疫器官。 每米小肠内存在1010个可产生免疫球蛋白的 细胞, 约占人体所有产生免疫球蛋白细胞的80%。 因而 消化道不同部位的免疫细胞可激发多种免疫反应,部 分乳杆菌和双歧杆菌属细菌在不同程度上被认为是免 疫刺激剂或“生物反应调节剂”[16]。 4.2 嗜酸乳杆菌、 乳双歧杆菌在儿童身体中普遍存在, 嗜酸乳杆菌有较好的耐酸性,使其能较好地通过人体 的胃部到达肠部而保持活性,双歧杆菌是人体内重要 的益生菌优势菌群,它和人体的健康息息相关。但儿 童因为处于成长期,体内各器官脏腑未发育成熟,抵 抗环境变化能力较弱,易受外界感染而致肠道菌群失 调及腹泻,从而导致儿童发病率和死亡率居高不下, 所以一旦出现肠道菌群失调,就应及时加以调理和改 善,例如可以通过服用具有增强免疫力功能的益生菌 制剂来恢复并维护肠道健康。 参考文献 [1] [2] [3] [4] 牛生洋,赵瑞香,孙俊良.嗜酸乳杆菌在乳品中的应用[J].安徽 农业科学,2005,33(12):2397-2399 中华人民共和国卫生部 .保健食品检验与评价技术规范 (2003版):22-34 杜 鹏 , 霍 贵成 . 国 内外益 生菌制品 发展现状 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Immun., 1997, 65: 4165-4172 。 本品所进行的系列功能试验结果也进一步证实了 配方原料组合具有增强少年儿童免疫力的作用。本研 究所采用的益生菌冲剂主要是由复合乳酸菌粉(嗜酸 乳杆菌+乳双歧杆菌)及低聚木糖组成,主要功效成分 是复合乳酸菌粉 (嗜酸乳杆菌+乳双歧杆菌) 。 据测定, 11 产品中 每 100 克含嗜酸乳杆菌 >3.0?10 cfu, 双歧 杆 菌>3.3?10 cfu。本人在另一篇针对本品调节肠道菌群 作用的研究中[15],在14 d动物实验和15 d人体实验中, 10 双歧杆菌和乳杆菌数量均有极显著增加,证明摄入该 复合乳酸菌产品也具有很好的调节肠道菌群的保健作 用。 4 结论 4.1 有研究表明, 儿童调节性的T细胞功能不完善, 细 胞因子的分泌与成年人之间有明显的差别, sIgA的分泌 量到6岁以后,才能达到成年人的水平。且粘膜屏障的 功能差,不能有效地阻抑抗原性物质的大量入侵[16]。 相对于正常儿童,免疫能力低下的儿童容易发生疾病, 其中厌食、腹泻、肺炎是儿童的多发问题。虽然有儿 童免疫能力通过经历疾病后获得提高的说法,但不可 否认,过度的非健康状态对儿童肯定是不利的。适当 的食品类营养素、益生菌等补充供给,对于免疫力低 下的儿童是有利而无害的。同时益生菌的增强免疫力 作用已被广泛认同。正常人的消化道粘膜的表面积可 达300 m ,这相当于近3/4个篮球场的面积,与消化道 80 2 现代食品科技 Modern Food S cience and Technology 2013, Vol.29, No.1 [13] 张延伸,马燕.双歧杆菌的生物特性及其保健功能[J].解放军 预防医学杂志,2005,23(5):386-389 [14] 杨美芬,黄永坤,李海林.双歧杆菌对儿童的免疫调节作用及 其机制[J].国外医学-儿科学分册,2005,32(5):299-301 [15] 朱韶娟.复合乳酸菌粉调节肠道菌群作用的研究[J].现代食 品科技,2011,27(12):1451-1453,1483 [17] [16] 张扬,袁杰利.肠道益生菌对机体免疫系统的影响[J].中国微 生态学杂志,2003,15(4):246-248 81