先加CuSO4的话,滴入每一滴NaOH都会和CuSO4反应生成Cu(OH)2沉淀,这样的话就没法配置菲林试剂.而如果先加NaOH,CuSO4在过量的NaOH环境中,新制的Cu(OH)₂ 与OH-可以生成[Cu(OH)₄]²-,[Cu(OH)₄]²-可以电离出少量的Cu²+.作为氧化剂,可以被含有-CHO的葡萄糖还原成红色的Cu₂O.
具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫色反应.蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色的化合物.颜色深浅与蛋白质浓度成正比.