加5mL热的蒸馏水至消化好的样品或空白对照液中,通过小玻杯加到反应室中,再用热蒸馏水洗涤小玻杯3次,每次用水量约3mL,洗涤液一并倒入反应室内。其余操作按标准硫酸铵的蒸馏进行。
由于消化液内硫酸钾浓度高而呈粘稠状,不易从凯氏烧瓶内倒出,必须加入热蒸馏水5 mL稀释之,如果有结晶析出,必须微热溶解,趁热加入玻杯,使其流入反应室。此外,还应当注意趁仪器洗涤尚未完全冷却时立即加入样品或空白对照液,否则消 化液通过冷却的管道容易析出结晶,造成堵塞。
(三)滴定
样品和空白蒸馏完毕后,一起进行滴定。
打开接受瓶盖,用酸式微量滴定管以 0.0100mol/L的标准盐酸溶液进行滴定。待滴至瓶内溶液呈暗灰色时,用蒸馏水将锥形瓶内壁四周淋洗一次。若振摇后复现绿色,应再小心滴入标准盐酸 溶液半滴,振摇观察瓶内溶液颜色变化,暗灰色在一二分钟内不变,当视为到达滴定终点。若呈粉红色,表明已超越滴定终点,可在已滴定耗用的标准盐酸溶液用量 中减去0.02mL,每组样品的定氮终点颜色必须完全一致。空白对照液接受瓶内的溶液颜色不变或略有变化尚未出现绿色,可以不滴定。记录每次滴定耗用标准 盐酸溶液毫升数,供计算用。
三、结果与计算
运算下列公式计算出每次无机氮标准样品和未知样品的总含氮量。
式中
WN——每毫升样品的含氮毫克数;
A——滴定样品消耗的盐酸量(mL);
B——滴定空白消耗的盐酸量(mL);
C——测定样品所取用量(mL);
0.0100——标准盐酸物质的量浓度(mol/L);
14.008——每摩尔氮原子质量(g/mol)。
三次样品测定的含氮量相对误差应小于±2%。
样品粗蛋白含量=总氮量× 6.25
6.25为含氮量换算为蛋白质含量的系数。.这个系数来自蛋白质平均含氮量为16%,实际上各种蛋白质因氨基酸组成不同,含氮量不完全相同。
四、应用
凯氏定氮法的普遍适用性、精确性和可重复性已经得到了国际的广泛认可。它已经被确定为检测食品中蛋白质含量的标准方法。