1资料与方法1. 1一般资料11 例检测对象均为男性, 其中最小发病年龄为 2. 5 岁。 首发症状肢体无力,走路呈现鸭步态, 腓肠肌肥大。5 例肌电图检测呈肌源性损害,7 例血清酶学检测肌酸激酶 CK明显升高,高达 1 760 U/L。 经我院神经科临床诊断为 DMD。 2例有家族患病史,其余为散发。1. 2实验方法1. 2. 1人基因组 DNA 提取抽取 EDTA 抗凝静脉血 1 ml, 取0. 2 ml 加入等体积裂解液和蛋白酶 K 混匀,37℃ 孵育 10 min,加入 0. 2 ml DNA 结合液和 0. 2 ml 乙醇充分混匀,过柱离心,再加入 洗 液 离 心 清 洗 2 次, 加 30 μl TE 缓 冲 液 于 柱 上,10 000 r/min离心 1 min 收集 DNA. Nanodrop 测定 DNA 的量和纯度,0. 8% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 DNA 是否有降解。1. 2. 2多重 PCR 检测 DMD/BMD 基因突变选择 DMD 5’ 端缺失热点区和中央缺失热点区, 设计 9 对引物。 分成 5 对引 物和 4 对引物 2 组,25 μl 反应体系中加入: 模板 100 ng,10 × buff-er 2. 5μl, dNTP( 25 mmol/L, each) 2 μl,5 对/4 对引 物混合物2 μl( 引物终浓度为 0. 1 nmol) ,最后加水至 25 μl, 混匀后离心数秒,至 95℃ 预变性 10 min, 离心 15 s, 迅速置冰上, 加入 Tag酶 2. 5 U,混匀后放入 PCR 仪中按照:94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃60 s,30 个循环,最后 72℃ 延伸 5 min。1. 2. 3结果判定取 10 μl 扩增产物加入溴酚蓝载样缓冲液2 μl,2. 5% 琼脂糖凝胶电泳,100V 电压 0. 5 h,经溴化乙锭染色后,在凝胶成像检测仪上观察 DNA 条带并照相记录。 以正常男性模板扩增产物为对照,4 条或 5 条扩增带都存在为正常, 缺失任何一条带,经单一引 物再扩增确认结果相同后, 诊断为基因缺失型 DMD/BMD。2结果11 例临床诊断 DMD 患者外周血 DMD 外显子基因分别经多重 PCR 扩增和单一引物重复增确认发现共 5 例有缺失,分别是外显子 45、48、51 各 1 例,外显子 4 两例。 检出缺失的外显子片段最长者为 45 号( 547 bp) ,最短者为 4 号外显子 191 bp。 缺失的外显子分布情况为累及中央缺失热区( 44 ~ 53 号外显子区) 者检出率 60% ( 3 /5) ;5”端缺失热区( 3 ~ 19 号外显子区)为 40% ( 2 /5) ,且 2 例均为外显子 4 缺失。 见表 1、图 1。表 15 例 DMD 患者外显子缺失分布病例序号#1临床诊断DMD发病年龄5外显子4长度( bp)191#2DMD1151388#3DMD945546#4DMD448506#5DMD84191图 15 例 DMD 患者外显子缺失单一引物确认电泳图3讨论1987 年由 Kunkel 克隆出 DMD/BMD 的致病基因— — —抗肌萎缩蛋白基因( dystrophin gene) 。 Dystrophin 基因由 79 个外显子和 78 个内含子组成长约 213 Mb,cDNA 约 2 300 kb[3]。 迄今为止,分子遗传学研究发现抗肌营养不良蛋白基因是人类分离到的最大的基因。 正是由于此基因如此巨大, 才使其具有高度的突变率,在多种突变中,大多数为基因缺失,约占 2 /3,缺失的基因主要分布在两个区域,即中央缺失热区( 约占 70% ) 和 5'端缺失热区( 约占 20% )[4 ]。 我们研究分析临床诊断为 DMD/BMD 患者 11 例,发现 5 例具有外显子基因缺失,总基因突变检出率 45. 5% ,其中 60% 在中央缺失区( 外显子 45、48、51) ,40%在 5'端缺失热区( 外显子 4) ,缺失分布基本符合上述病变特点。5 例外显子缺失患者临床诊断均为 DMD, 但临床表现不尽相同,2 例 4 号外显子缺失临床症状较重: 走路呈现鸭步态, 病人会出现上楼困难、蹲下再起来困难,腓肠肌肥大; 肌电图检测呈肌源性损害;血清酶学检测肌酸激酶 CK 明显升高。 目前,本病3773河北医药 2013 年 12 月 第 35 卷 第 24 期Hebei Medical Journal,2013,Vol 35 Dec No. 24 尚无根治办法,新的治疗方法处于试验阶段, 如腺相关病毒为载体介导的小基因( 含肌萎缩蛋白编码中央重复区和羧端区约基因全长的 1 /3) 转染治疗, 在 mdx 小鼠实验中取得良好治疗效果,并已进入Ⅰ 期临床试验[5];还有针对上调与 dystrophin 蛋白高度同源的 utrophinA 基因表达的研究,以替代 dystrophin 的部分功能[6 ]。 所以,孕前遗传谘询、携带者的家谱分析, 通过检出致病基因携带者和鉴别妊娠携带者的胎儿性别及其基因型,进行产前诊断是预防本病发生的重要措施。