第5章 基因组序列注释 学习重点: 1) 基因注释的方法 2) 基因功能的研究方法 基因组序列所包含的全部遗传信息是什么? 基因组作为一个整体如何行使其功能? 用什么方法寻找基因? 用什么方法研究基因的功能? 计算机分析+实验 5.1 寻找基因 基因组序列 查找基因。有两种常见的方法: 1. 计算机分析寻找与基因有关的序列。 2. 通过对DNA序列进行实验分析,看其能否表 达基因产物。 5.1.1 根据基因结构特征搜寻基因 基因不是核苷酸的随机排列而是具有明显特征: 基因的编码区是可读框。 可能的六种ORF 1. 根据开放读码框预测基因 a. 起始密码子ATG: 第一个ATG的确定则依据Kozak规则: Kozak规则是基于已知数据的统计结果, 所谓Kozak规则,即第一个ATG侧翼序列的 碱基分布所满足的统计规律。 若将第一个ATG中的碱基A,T,G分别标为1, 2,3位,则Kozak规则可描述如下: (1) 第4位的偏好碱基为G; (2) ATG的5?端约15bp范围的侧翼序列内不含 碱基T; (3) 在-3,-6和-9位置,G是偏好碱基; (4) 除-3,-6和-9位,在整个侧翼序列区,C是 偏好碱基。 b. 终止密码子 终止密码子: TAA, TAG,TGA GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次; GC% > 50% 终止密码子每100-200 bp 出现 一次; 由于多数基因 ORF 均多于50个密码子,因此 最可能的选择应该是 ORF 不少于100 个密码子。 细菌基因组的ORF阅读相对比较简单,错误 的概率较少,但单纯的ORF扫描对高等真核 生物DNA效果不佳。 内含子使ORF扫描复杂化 内含子的出现给计算机判读基因带来不少问题, 对ORF扫描的基本程序的编写要考虑以下几个问 题: 1)密码子偏倚; 2)外显子—内含子边界; 3)上游调控序列。 1)密码子偏爱性 编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码, 其差别仅在密码子的第3位碱基不同。 不同种属间使用同义密码的频率有很大差异, 如人类基因中,丙氨酸(Ale)密码子多为 GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。 特定种属有特征性的密码子偏爱,这些序列在 编码区常常出现,非编码区只保持平均的碱基 分布水平。 2)外显子-内含子边界 外显子和内含子的边界有一些明显的特征如: 内含子的5?端或称供体位(donor site)常见的顺序为 5?-AG↓GTTAAGT-3?; 3?端又称受体位(acceptor site), 多为 5?PyPyPyPyPyPyCAG-3?(“Py”嘧啶核苷酸,T或C); 上游外显子-内含 子边界的共有序列 在真正基因中发现 的真实序列之间的 关系。 3)上游控制顺序 几乎所有基因(或操纵子)上游都有调控序 列,它们可与DNA结合蛋白作用,控制基因 表达。 另外个别生物的基因组特有组成也可作为判 别依据,如脊椎动物基因组许多基因的上游 都有CpG岛。 大多数CpG岛都位于管家基因和大部分组织 专一性表达基因的5?侧翼区以及基因的第一 个外显子区。 5.1.2 同源基因查询 通过已存入数据库中的基因序列与待查的 基因组序列进行比较,从中查找可与之匹 配的碱基序列及其比例,用于界定基因的 方法称为同源查询。 同源有如下几种情况: A. DNA序列某些片段完全相同; B. 开放读码框排列类似,如有等长外显子; C. 开放读码框翻译成的氨基酸序列的相同; D. 模拟多肽高级结构相似。 同源查询 当在氨基酸水平进行比较时,两个序列之间缺少同源性 就更明显。 同源性,一致性和相似性 1) 同源性(homology)基因系指起源于同一祖先但序列已经 发生变异的基因成员。 分布在不同物种间的同源基因又称直向同源基因。 同一物种的同源基因则称共生同源基因(水平基因), 水平基因由重复后趋异产生。 基因同源性只有“是”和“非”的区别, 无所谓百 分比. 2) 一致性(identity):指同源DNA顺序的同一碱 基位置的相同的碱基成员, 或者蛋白质的同一 氨基酸位置的相同的氨基酸成员, 可用百分比 表示. 3) 相似性(similarity):指同源蛋白质的氨基酸 序列中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的 比例。可取代氨基酸系指具有相同性质如极 性氨基酸或非极性氨基酸的成员, 它们之间的 代换不影响蛋白质(或酶)的生物学功能。 相似性与一致性 249 MFN-MAI PFGAGAYAQALNQQQAALMASVAQGG 232 I LTSL TLPFS AGAYAQALNQQQTTV I S - -T S GS 注: 红色为一致性氨基酸, 蓝色为可取代氨基酸, 白色为趋 异氨基酸. 一致性氨基酸百分比为红色氨基酸所占的 比例, 相似性氨基酸百分比为红色和蓝色氨基酸相加 所占的比例. 基因注释软件 1)目前基因注释程序的编写主要依据两种信息内涵: 1.signal terms ( 信号指令 ), 如起始密码 , 终止密码 , 终止信号 , 剪接受体位与供体位序列 , 多聚嘧啶顺序 , 分支点等保守的顺序组成; 2.content terms (内容指令), 如密码子使用偏好. 对结构紧凑的小基因组上述注释软件效果不错,但对大基 因组特别是超长基因的注释有很大困难.在一个长度数十 或数百kb的内含子中, 存在许多可能误判的信号指令. 2) 常 用 的 注 释 软 如 GenScan 主 要 偏 重 于 内 容 指 令 , 而 FgeneSH则着重于信号指令. 由于每种生物都有种属专一 性的密码子偏好,也存在某些非保守的信号指令, 因此在 超长基因注释中常出现正向错误(false-positive, 多注 释)或负向错误(false-negetive, 少注释). 引自: Nature reviews genetics, 4:741-749,2003. 不同注释软件之间的效率 Performance of three popular gene prediction programs on 42 semiartificial genomic sequences containing 178 known human gene sequences (900 exons). Sensitivity is percentage of exons that are predicted correctly. Selectivity is percentage of predicted exons that are correct. Reproduced with changes from Yada et al., 2002 Cold Spring Harbor Genome Sequencing and Biology Meeting, May 7-11, 2002. FGENESH is by far the most accurate of three programs. 效率与准确率比较 -----------------------------------------------------------------------------------------program sensitivity specificity missed exon (%) wrong exon (%) -----------------------------------------------------------------------------------------FGENESH 77.1 65.7 9.6 23.2 GenScan 66.5 44.9 12.0 40.9 HMMGene 69.5 36.6 15.5 55.5 -----------------------------------------------------------------------------------------引自: http://www.softberry.com/berry.phtml 人类基因注释标准 Known gene: 与人类已知cDNA和蛋白质顺序同源的基因. Novel gene: 与脊椎动物cDNA或其它物种蛋白质同源的 基因. Novel transcripts: 与novel 基因相似,但确少明确的ORF. Putative gene: 有同源EST支持, 但缺少cDNA或ORF. Predicted gene: 数据库中至少有一个外显子支持, 但缺 少cDNA或明确的ORF. Pseudogene(假基因): 与已知蛋白质有50%的同源性,但 cDNA残缺,在其它位点存在正常的同源基因的顺序. 引自: Nature 414:865-871, 2001(人类22号染色体注释) 人类基因总数可能是永远解不开的迷? 1. 人类基因总数的预测有三种方法: cDNA和ESTs顺序, 机算机注释, 比较基因组学(保守的ORF). 2. 已报道的人类基因总数的版本: 1) Celara: 27 894 HGR: 29 304 (Esemble)(2000) Celara与HGR的注释基因有7000个不同, 相同的为20000 左右, 加上不同的注释约34 000个. 2) Esemble注释: 24 847 (2003年) Ensembl is a joint project between EMBL-EBI and the Sanger Institute to develop a software system which produces and maintains automatic annotation on eukaryotic genomes. 3) EBI: 27 462 (2003, nature 423:576) 4) Genscan: 65 452 许多人倾向于不可能知道人类基因组精确的基因数. 几种模式生物注释的基因总数 大肠杆菌(E.coli): 4 800 酵母(yeast): 6 200 线虫(nematode): 19 000 果蝇(fly): 13 600 拟南芥(Arabidopsis): 25 000 水稻(rice): 60 000 玉米(maize): 59 000 老鼠(mouse): 30 000 功能域注释 1) 任何基因编码的蛋白质都由一些在高级结构 水平具有特征性的功能域组成, 如引导肽, 受体区, 激酶区, DNA或RNA结合域等。 2) 功能域具有很强的保守性, 关键的氨基酸组 成及其排列位置是相当衡定的,是鉴定功能域 的主要标识。 3) 功能域是目前确定基因功能的主要依据之一. 4) 已由许多专门的功能域注释软件,可用于基因 组序列的注释。 什么是功能域 (domain)? 定义: 1) Region of a protein with a distinct tertiary structure (e.g, globular or rodlike) and characterristic activity; homolgous domains may occur in different protein. (引自“Molecular Cell Biology”) 2) A continuous part of the amino acid sequence of a protein that can be equated with a particular fuction. (引自“Gene VII”) 3) Portion of a protein that has a tertiary structure of its own. In larger proteins each domain is connected to other domain by short flexible regions of polypeptide. (引自“Molecular Biology of The Cell”) 同源功能域注释 5.1.3 实验确认基因 1. Northern 杂交确定DNA片段是表达序列: Northern 杂交 注意事项: a. 当某一基因的转录产物进行可变剪接时,由于 连接的外显子不同,会产生好几条长度不一的 杂交带,如果该基因是某一基因家族的成员也 会出现多个信息; b. 考虑组织专一性和发育阶段的问题; c. 基因表达产物丰度的问题 如果丰度较低,用拟Northern 杂交和动物杂交 (Zoo-blotting)分析。 拟Northern 杂交—— 根据已知的DNA序列设计引物,从mRNA群体 中扩增基因产物,再以DNA为探针与之杂交。 动物园杂交—— 根据亲缘关系相似的物种,其基因的编码区相 似性较高,而非编码区的同源性很低的原理。 如果某一物种的DNA 序列与来自另一亲缘物种 的DNA片段杂交产生阳性信号,该区段可能含 有1个或多个基因,这种方法又称为动物园杂交。 动物园杂交(Zoo blotting) 2. 由EST或cDNA指认基因 目前在数据库中已经测序的物种的EST和cDNA 序列的数量正在呈指数增长。 EST和cDNA是基因转录加工后的产物,可以确 切无疑的代表相应基因成员的存在。 寻找目的序列的EST证据 cDNA: CDS: ORF: EST : 3. 获取基因全长cDNA序列 A. 构建cDNA文库,用目的基因DNA片段筛选 文库。 B. 根据已知片段设计引物,RACE 技术得到基 因的全长cDNA序列。 4.确定DNA顺序中基因的位置 A. 通过对全长cDNA序列的测序、对比,以及 与基因组DNA的比较,确定基因所在的区域; B. 通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因 的位置; 5.1.4 基因的命名与分类 自学 5.2 基因功能预测 确认DNA序列中的基因序列后,下一个问题 就是探索它的功能,这是基因组研究的重点 所在,也是一个难点。 信息分析+实验生物学 基因功能的含义 影响途径? 基因类型? 底物? 影响器官? 细胞内分布? 空间结构? 基因水平 转录水平 蛋白水平 基因功能研究方法:生物信息学方法 5.2.1 计算机预测基因功能 原理:主要依据同源性比较,同源性反应出进化 关系。 方法:既存数据库的比较分析。 分析的基础是:如果一个新测序的基因与另 一个原来已测序的基因相似,那么就揭示 他们可能有进化上的关系,并且新基因的 功能很可能与已知基因的功能相同,或至 少是相似。 5.2.2 蛋白质结构域在功能预测中的意义 同一物种或不同物种中具有相同结构域的 蛋白质可将其划归在同一蛋白质家族。 蛋白质结构与功能分析 果蝇 甲虫 蜜蜂 基因功能研究方法:实验方法 5.3 基因功能的检测 5.1.3 基因失活是基因功能分析的主要手段 使特定基因失活的最简单方法是用一段无关DNA 片段将其破坏。两个DNA分子具有相似序列,重 组能引起分子片段进行互换。 剔 除 老 鼠 (1) 剔 除 老 鼠 (2) 美英三科学家因干细胞研究的贡献 获诺贝尔医学奖 马利欧· 卡佩奇 奥利弗· 史密斯 埃文斯 5.2.3 基因 过表 达用 于功 能检 测 水稻FCA RRM domain转化 5.4 高通量基因功能的研究方法 同源重组并不是唯一的打断基因的方法。另 一种方法是用转座子标记技术,通过向基因 中插入转座元件或转座子使其失活。 人工诱导转座 5.4.1突变库构建 1) 利用天然的DNA转座子构建表达载体,转化 受体细胞, 当转座子活化时可被动转座并随 机插入受体细胞基因组引起基因突变. 2) 观测突变再生植株的表型变化, 分离与克隆 插入突变基因的结构与功能. 植 物 D N A 转 座 子 突 变 库 表 达 载 体 突变库表达载体元件的功能 1) Ac- 载体: 转座酶表达载体, 由于缺少两侧反 向重复边界顺序, 不能主动转座. 2) DsE-载体: 捕获增强子表达载体. 。两侧含 转座子Ac-Ds的边界顺序, 在转座酶作用下可 被动转座, 插入到启动子下游. 转座子标记技术很难瞄准单个基因,因为转 座是一种随机事件,它更实用于整体研究基 因组的功能,通过检查感兴趣表型变化的后 代来鉴定出具有相似功能的各类基因。 5.4.2 RNAi与基因功能检测 RNAi是一种完全不同的基因失活方法,它 并不打断基因本身,而是破坏其mRNA。 如何发现RNAi RNA干扰现象最初发现于1995年, Cornell大学的研究人员Guo 和Kemphues研究阻断秀丽新小杆线虫中的par-1基因时,利用 反义RNA(Antisense RNA)技术特异性地阻断par-1基因的表达, 同时在对照实验注射正义RNA(Sense RNA)以期观察到基因表 达的增强。但结果是二者都同样地切断了par-1 基因的表达途 径,这与传统上对反义RNA技术的解释相矛盾,但他们没能给出 合理解释。 直到1998年2月,Andrew Fire和Craig Mello首次揭开谜底,并 把这种现象首次命名。他们证实,Guo等遇到的正义RNA抑制基 因表达的现象,以及过去有关反义RNA对基因表达的阻断都是由 于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA (Double RNA, dsRNA) 而引起。他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫,发现 基因抑制效应十分微弱,而经过纯化的双链RNA却正好相反,能 够高效特异性阻断相应基因的表达。 线虫RNAi实验 有两种RNAi现象: 目前已发现两种RNAi抑制靶基因表达的现象: 1) siRNA: 小分子干扰RNA, 主要产生于双链 RNA分子, 在细胞内它们被切成短链RNA,然 后与靶mRNA序列结合,导致mRNA的进一步 降解。 2) miRNA: 微小干扰RNA, 主要来自mRNA链内 配对产生的双链RNA,在细胞内它们被切成 短链RNA,然后与靶mRNA序列结合,使 mRNA的翻译受阻或使mRNA降解。 microRNA干扰通路 RNA干扰通路 双链RNA是RNAi形成的必要前提 注意事项 注射时期 注射部位 表型观察 5.4.3 蛋白质互作 噬菌体外显 酵母双杂交 GAL4/UAS转基因系统 酵母转录激活子GAL4; GAL4反应元件UAS-靶基因 转基因技术将使人类能够更好的利用大自然几十亿年进化 的成就 Ras1CA overexpression in the posterior silk gland improves silk yield 转基因方法让蚕吃得少吐得多 科学家曾通过传统杂交手段获得高产、抗病的新家蚕品种, 使养蚕业获益匪浅。但好景不长,这种方法很快遭遇蚕丝产 量停滞的瓶颈。科学家又突发奇想,能否将转基因的方法运 用于提高蚕丝产量上,让蚕“吃得少、吐得多”呢?3月15日, 中科院上海生命科学研究院的李胜研究员和西南大学的夏庆 友教授及其研究团队发表在由中国科学家主办的国际生物学 学术期刊《Cell Research 》上的论文研究结果显示,这个 “贪婪”的想法可以付诸实现。 该研究团队在一种叫做GAL4/UAS的转基因家蚕品系中进行 实验,通过Ras1CA基因在家蚕后丝腺中特异地超表达,使蚕 丝蛋白生产和丝的产量提高60%,而食物消耗量却只增加 20%,桑叶蚕丝转化效率提高了30%,蚕丝质量没有受到明 显影响,在蚕业生产上呈现出良好的应用前景。 5.5 转录组和蛋白质组 基因组是一个生物信 息库,但是仅仅靠其 自身还不能将这些信 息传递给细胞。 基因组表达的最初产 物是转录组:即那些 含有细胞在特定时间 所需生物信息、编码 蛋白质的基因衍生而 来的RNA分子的集合。 基因组表达的第二个产物是蛋白质组:即细胞中那些 决定细胞能够进行生化反应的所有蛋白质组分。 5.5.2 转录物组 基因芯片技术:是指通过微阵列(Microarray)技术将 高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式 以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相 表面,以荧光标记的DNA探针,借助碱基互补杂交原 理,进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革 命性技术。 它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的 科学技术革命。 ?Types of DNA Chips DNA Chips Expression Chips Genomic Chips Sequencing Chips ?