HPV病毒检测的目的 及最佳检测方法 主要内容 1、HPV检测的目的是什么? 2、HPV检查的最佳方法? 3、德同产品介绍 2 HPV检测的目的是什么? ■ 只是为了查有没有HPV病毒感染? ■ 是为了查HPV感染型别,检测型别越多越好? ■ 是为了发现已经存在的CIN2+病变和预CIN2+ 的 风险人群? 3 专家对HPV检测是否要临床验证如何看待? HPV检测的目的是什么? 1个HIV/HBV = AIDS/HBV 1个HPV ≠ CIN或宫颈癌 (80-90%的女性HPV感染是一过性的,可在6-24个月通过自体免疫清除) 高危型HPV持续感会导致宫颈癌 从HPV感染到宫颈癌,一般需要10-20年 一过性的感染会自身清除 高分析敏感度 检测与临床无关的病毒 水平(假阳性) 恢复阶段:免疫响应 早期感染会自身清除 Snijders et al. Journal of Pathology 2003; 201:1-6 HPV检测的目的是什么? HPV病毒含量与临床病变的关系 CIN病变 进展为高级病变 无CIN病变 HPV检测的目的是什么? WHO指南对于HPVCutoff有明确推荐检测阳性判断值 ? 阳性判断值(Cutoff)的设定,在2013年的WHO宫颈癌筛查和管理 指南中是有具体建议的,其推荐高危型HPV 检测cut-off 值≥1.0 pg/ml HPV检测的目的是什么? WHO guidelines for screening and treatment of precancerous lesions for cervical cancer prevention. ? World Health Organization 2013 6 HPV检测的目的是什么? 2015年CFDA针对HPV检测试剂阳性判断值的规定:临床灵敏度特异度的Cutoff值 ? 不再是单纯的病毒检测,而是强调“临床”,不再是制造商说了算,而是临 床说了算 ? 阳性判断标准是要获得理想临床敏感度和特异度的临界值,制造商不能仅凭 简单的病毒检测数据来制定,建议使用ROC曲线的方式进行评估,这需要大 量临床检测数据才能最终找到理想的临界值 HPV检测的目的是什么? 2015年欧洲IPV大会:宫颈癌筛查HPV检测目的 ? HPV检测不是为了检测病毒,不是一过性感染,而是检测感染病毒后的进展风险 ? HPV检测需要关注临床敏感度,最大化的保护低风险人群,最大化的辨别高风险人群 2015 IPV Conference,Mark. Stoler HPV检测的目的是什么? 2016年CSCCP会议 ? HPV检测不是仅仅为了检出HPV感染,而是为了发现已经存在的CIN2+病变和预测 CIN2+的风险; ? 对于HPV检测来说,最重要的是临床灵敏度和阴性预测值 WHO / IRAC 明确检测13种HPV ? 从流行病学和致癌机制证据方面,WHO/IRAC 明确检测13种HPV型别: HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 最强的致癌型别,几 个致癌位点已经明确 充足流行病学证据证 实会导致宫颈癌 缺乏宫颈癌流行病学 证据,但从致癌机制 上有强的证据支持 2009 WHO IARC Special Report Policy A review of human carcinogens Part B HPV检测的目的是什么? 2015年中国CFDA明确HPV检测型范围 宫颈癌相关检测必须包 含13种高危HPV型别 ? 高危型13种:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、 52、56、58、59、68 ? 若可检测的HPV基因型别不能涵盖上述13种高危型,则 可能造成阴性预期值无法达到临床要求,因此不能用于 宫颈癌筛查。-------不能少!!! 另外最多可包含5种不确 定风险的HPV型别 ? 可包含不确定其风险的“中等风险型”5种:HPV26、 53、66、73、82 ? HPV检测型别太少的产品如只检测5种型别、2种型别(如HPV16/18)等,将 不能再注册 HPV检测的目的是什么? 中国CFDA明确限制低危型HPV检测 ? 不能盲目的追求过多的HPV检测型别 ? 不建议将低危型HPV检测用于宫颈癌筛查 限制申报其他型HPV ? 如申报的宫颈癌相关HPV核酸检测产品涉及上述18种以 外的其他HPV基因型,则需提出明确理由和依据 ? 且应得到国际有关权威机构的文献支持。 限制申报低危型HPV ? 不建议将低危型HPV检测用于宫颈癌筛查 ? 若申请人提出低危型HPV检测相关产品注册,则应详细解 释其临床意义和适应症,并提供充分的证据 。 2015最新CFDA指导原则以服务临床为最终目的 2015年CFDA新的指导原则,从临床目的出发,精确注册标准要求 阳性判 断值 设定与临床 风险相关的 阳性判断标 准Cutoff 临床敏 感度、 特异度 以CIN2+为 临床终点的 敏感度和特 异度 临床适 应症 ? 初筛 ? 联合筛查 ? ASCUS分 流 一项检测技术,要想满足以上要求,必须基于长时间大量的临床验证才能实现 HPV检测的目的是什么? 答案: ■只是为了查有没有HPV病毒感染?NO ■是为了查HPV感染型别,检测型别越多越好?NO ■是为了发现已经存在的CIN2+病变和预CIN2+ 的风险 人群?yes 14 主要内容 1、HPV检测的目的是什么? 2、HPV检查的最佳方法? 3、德同产品介绍 15 HPV检查的最佳方法 HPV DNA检测技术分类 直接核酸检测(无需PCR实验室) ? 杂交捕获技术 (HC2、DH1、DH2、DH3) ? 酶切信号放大法 (Cervista) 核酸扩增后检测——PCR类技术(需PCR实验室) ? 膜杂交法 ? 基因芯片法 ? 反向点杂交法 ? 流式荧光杂交法 ? 荧光探针法 HPV检查的最佳方法 HPV检查的最佳方法 杂交捕获技术 (HPV检测的金标准) 产品 德国凯杰的:HC2 杭州德同的:DH2、DH3 17 HPV检查的最佳方法 杂交捕获技术 的三大优势: 1、独特的探针技术:14 种全长 8000RNA 探针,避免因 区域片段(如 L1 区)丢失造成的假阴性 2、无需DNA提取,无需核酸扩增,有效避免因环境因素造 成的假阳性 3、统一的临 床 判 定 标 准≥1.0pg/ml,避 免 因方法 学灵敏度过高产生的假阳性,结果重复性好,准确可靠。 18 杂交捕获法独特的探针技术 HPV病毒基因组为环状双链DNA,含有~8000个碱基对 德同DH系德列同DHHP系V 检列测HPV 检测 “全长鸡“尾全酒长”鸡探尾针酒技”术探针技术 HPV16 HPV18 12种HR 通用探针 ? 8000bp,基于全长,涵盖HPV DNA 所有区域 ? 2+12种不同型别探针混合 ? 准确,不漏诊 Cobas HPV& Abbott HPV(12+2 Real-time PCR) Cobas HPV& Abbott HPV(12+2 Real-time PCR) ““寡寡核核苷苷酸酸探探针”针技”术技术 HPV18 HPV16 12种HR 通用探针 ? 约200bp,仅基于L1片断, 非全长 ? 仅3种探针混合 ? 病毒基因缺失、突变会造 成漏诊 其他其国他产国PC产RP方C法R“方寡法核苷“酸寡探核针苷”酸技探术 针”技术 13种HR 通用探针 ? 约100-150bp,仅基于L1 片断, 非全长 ? 仅1种通用探针 ? 病毒基因缺失、突变会造 成漏诊 Title, Location, Date PCR和HC2的临床敏感性比较: 综合1999-2005年间的主要研究 基于CIN2/3/癌症的病例数〉1,500 100% 90 80 70 60 50 40 ScBDhKMeieCufBlSapfluiiCommsnugzsthsyrialaaoacaaddlnknsnart000000000455334433 Studies sorted by year CKausSFStlcaBaeehHsellrGmnliCrlunAsKiePealagnegdajceirhgsardaavcctuooeeemXirmeieannsoryril 000000000000223131123303 SchRWiafftrmnigaahmnt 00 00 00 Cuzick 00 99 PCR median 82% HC2 median 94% HPV 病毒基因L1片段缺失 “L1片段的缺失并不普遍,但是任何变异或缺失都会造成PCR的检测结果为阴性…” Unger et al JHC 1998, 46(4): 535-540 “L1片段是病毒衣壳蛋白,在HPV病毒引发的肿瘤进展过程中是不必要的,因此很可 能在HPV整合过程会导致L1片段的缺失” Capone et al, Clin Cancer Research 2000, 6:4171-4175 “~5%的癌症和CIN3会因为HPV L1片段的缺失而无法被检测出来” Lorincz (Methods for HPV Detection) ; Emerging Issues on HPV Infections: From Science to Practice, Monsonego 2006 PCR中β-球蛋白的竞争 “β-球蛋白和HPV以共同引 物L1片段进行扩增,这样会 降低HPV检测的敏感度” Coutlee et al. JCM 2002; 40(3): 902-907 β-globin HPV HPV HPV β-globin β-globin HPV HPV β-globin β-globin HPV HPV β-globin β-globin HPV HPV β-globin β-globin 反应过程中的竞争会导致假阴性结果 PCR导致假阴性的原因 ? 不同HPV型别扩增效率不同 ? 如果L1片段缺失,检测失败 (整合型HPV) ? 通用引物会和低危型HPV结合,抑制了目 标高危型别的扩增 ? 内指控(Beta-globin)会抑制HPV扩增 ? 样本抑制 (有5%的样品丢失因出现抑制而 无法扩増) PCR检测可能导致假阳性结果 ? 检测与临床不相关的感染 ? 样本间的污染 HPV检查的最佳方法 统一的判定标准 杂交捕获 经临床验证的同一判定标准1.0pg/ml 仪器判读、结果客观可靠 PCR 缺乏统一的判定标准 结果受主观因素影响 HPV检查的最佳方法 为何要明确“临床灵敏度和临床特异度的Cutoff值”? ? 参考2015年世界IPV大会: ? 理想的临床灵敏度和特异度的临界值(Cutoff),即及能够保证对≥CIN2的病人具有非常高的检出率的同时,又可以避 免因分析敏感度过高而造成的假阳性 ? 临床敏感度与疾病进展风险挂钩 ? 分析敏感度与是否存在病毒感染挂钩:PCR过于敏感的分析敏感度,会将病毒含量的人判断为阳性 2015 IPV Conference,Mark. Stoler 分HPV检查的最佳方法 析敏感度与临床敏感度 ? 杂交捕获 HPV DNA检测为阴性时并 不代表体内没有HPV,表明样品中 HPV含量不足5000拷贝. ? 杂交捕获 HPV DNA检测为阳性时( 高于以上标准)可以预测未来8-10 内患CIN2/3或者进展为更高级别病 变的风险 ? 短暂及一过性的感染会通过自身免疫力 清除 ? PCR 方法检测HPV的分析敏感度可能 <10 拷贝 Adapted from Snijders et al. Journal of Pathology 2003; 201:1-6 区别:分析敏感度与临床敏感度 分析敏感度 临床敏感度 ? 样本中能检测出的病毒最低水平 ? 也被称作检测极限 (LOD) ? 统计学意义:检测结果与零的区分 ? 以临床病变为终点指征,检测出高度病变的敏 感度 (CIN3+ / SCC) ? 初筛时,能够检测出CIN2+或宫颈癌的比例 ? 分析阈值必须得到严格的验证 PCR 方法的分析敏感度达到 10个拷贝/ml 阳性结果:可能没有临床相关性 杂交捕获的分析阈值经临床验证为 5,000 个拷贝/ml 经临床证实:高度的阴性预测值 HPV检查的最佳方法 HPV检查的最佳方法 杂交捕获技术 (HPV检测的金标准) 产品 德国凯杰的:HC2 杭州德同的:DH2、DH3 29 主要内容 1、HPV检测的目的是什么? 2、HPV检查的最佳方法? 3、德同产品介绍 30 杭州德同DH系列产品 德同产品原理-新一代杂交捕获技术 利用基因杂交、 化学发光、信号 放大的原理在分 子水平检测WHO 认可的14种高危 型-HPV 病毒 DNA 最新“2+12型” 检测设计 (HPV16/ 18 与 其他12种型别检 测) 杭州德同DH系列产品 具有48T、96T两种规格 DH产品系列 DH2 DH3 可检测的高危型HPV型别 HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 HPV-16, 18 HPV-31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 杭州德同DH系列产品检测仪器 半自动检测仪器 全自动检测仪器 DH产品与HC2的临床比对 临床比对 阳性 DH2 阴性 合计 阳性符合率 (95%CI) 阴性符合率 (95%CI) 总符合率 (95%CI) HC2 阳性 阴性 合计 Kappa系数 (95%CI) 980 4 984 4 415 419 0.9864 (97.70%-99.58%) 984 419 1403 99.59%(98.96%-99.89%) 99.05%(97.57%-99.74%) 99.43%(98.88%-99.75%) 临床比对 阳性 DH3 阴性 合计 阳性符合率 (95%CI) 阴性符合率 (95%CI) 总符合率 (95%CI) HC2 阳性 阴性 合计 Kappa系数 (95%CI) 971 7 978 13 413 426 0.9662 (95.14%-98.09%) 984 420 1404 98.68%(97.75%-99.29%) 98.33%(96.60%-99.33%) 98.58%(97.81%-99.13%) 河南新密“两癌”筛查项目 DH2对CIN2+的检出率显著高于巴氏涂片和VIA/VILI 孙小伟等,《中华肿瘤防治杂志》 2016年2月 第23卷 第3期 137-140 浙江龙游10669名健康妇女 接受Cobas和DH3筛查结果比对 CIN2+ Sensitivity Specificity PPV NPV CIN3+ Sensitivity Specificity PPV NPV Cobas HPV DH3 HPV 123/135(91.1%,85.0-95.3) 9667/10534(91.8%,91.2-92.3) 123/990(12.4%,10.4-14.6) 9667/9679(99.9%,99.8-99.9) 126/135(93.3%,87.7-96.9) 9604/10534(91.2%,90.6-91.7) 126/1056(11.9%,10.0-14.0) 9604/9613(99.9%,99.8-100) 77/83(92.8%,84.9-97.3) 9673/10586(91.4%,90.8-91.9) 77/990(7.8%,6.2-9.6) 9673/9679(99.9%,99.9-100.0) 81/83(97.6%,91.6-99.7) 9611/10586(90.8%,90.2-91.3) 81/1056(7.7%,6.1-9.4) 9611/9613(99.9%,99.9-100) P value 0.650 0.120 0.736 0.663 0.277 0.135 0.934 0.175 临床试验显示:DH3具有与Cobas相同预测高级别病变的效能 浙江龙游10669名健康妇女 HPV16/18分型检测用于宫颈癌初筛Cobas/DH3效能的比 较 Cobas HPV DH3 HPV P value CIN2+ Sensitivity 108/135(80.0%,72.3-86.4) 114/135(84.4%,77.2-90.1) 0.426 Specificity 10143/10485(96.7%,96.4-97.1) 10111/10485(96.4%,96.1-96.8) 0.238 PPV 108/450(24.0%,20.1-28.2) 114/488(23.4%,19.7-27.4) 0.818 NPV 10143/10170(99.7%,99.6-99.8) 10111/10132(99.8%,99.7-99.9) 0.470 CIN3+ Sensitivity 73/83(88.0%,79.0-94.0) 78/83(94.0%,86.5-98.0) 0.279 Specificity 10160/10537(96.4%,96.1-96.8) 10127/10537(96.1%,95.7-96.5) 0.245 PPV 73/450(16.2%,12.9-20.0) 78/488(16.0%,12.8-19.5) 0.929 NPV 10160/10170(99.9%,99.8-100.0) 10127/10132(100.0%,99.9-100) 0.302 临床试验显示:DH3