1、电泳法各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质。2、离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素),当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。(四)根据蛋白质溶解度不同的分离方法1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。2、等电点沉淀法蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。3、低温有机溶剂沉淀法用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。