微阵列最终 将在一次反应中分析整个人类基因组,酵母基因表 达实验在朝这个目标的道路上已跨出了重要的一 一次性分析多样本是微阵列技术的一个重要特点,在一个阵列上进行多样本比较,由于排除了 一系列复杂因素导致的各项比较实验的内在差异, 使一次性多样本比较性分析的精确性大为提高。 小型化是生物医学研究的一般倾向,微阵列分 析大大减少了试剂用量,使反应容积变小,样本浓 度增加,反应动力学加快。 与计算机相连的图象分析系统使研究结果更 客观、准确。通过对表达谱、突变和许多其它类型 基因组信息的大规模平行分析产生的如洪水样滚 滚而来的数据将由功能强大的生物信息工具来处 理,大大增加了研究内容的广度和深度。 微阵列(基因芯片) 的应用 411 基因表达 细胞的基因表达谱(profile) 决定了细胞的结构 和生物学行为。肿瘤的发生发展是以细胞内基因 的结构或活性改变为基础的,表现为基因表达谱的 改变,产生肿瘤不同的表型特征。通过基因表达谱 可以探索肿瘤发生发展的分子机理,因此微阵列技 术被大量用于肿瘤基因表达的研究。 Derisi 等应用cDNA 微阵列检测了肿瘤抑制相 关基因的表达。他们把正常人6 号染色体转导入 人黑色素瘤细胞株,该瘤的致病性被抑制。用cD2 NA 微阵列检测两株细胞的基因表达,几个表达有 显著差异的基因被认为决定了黑色素瘤细胞致瘤 的表型特征 Wang等用5766 个cDNA 的微阵列研究卵巢正 常和肿瘤组织的基因差异表达,发现了几个和卵巢 癌进展相关的基因,其结果为卵巢癌的诊断和治疗 提供了新的指导 cDNA微阵列和组织微阵列结 合,迅速确定并进一步评价了在肿瘤生物学中起作 用的基因。他们先用有5184 cDNA克隆的微阵 列筛选了肾细胞癌和正常肾组织之间89 个差异表 达的基因,然后制作了532 个肾细胞癌样本的组织 微阵列,用免疫组化法确定差异表达基因在肾细胞 癌中的表达状况 cDNA微阵列与代表性差异分析 (RDA) 结合检测原发瘤差异表达基因。先用 RDA 比较两个原发性 Ewing’s 肉瘤,一个进展迅速并有 转移,一个为局部生长并对治疗反应良好。将RDA 产物用鸟枪法克隆入载体,以载体特异引物扩增消 减文库中单个克隆的插入片段,高密度阵列到玻片 上,将两种肿瘤组织的起始扩增子( starting ampli2 cons) 标记不同的荧光素和微阵列杂交,荧光信号的 强度与起始mRNA(starting mRNA) 和RDA 扩增子中 片段的丰度相关。RDA 提供了一个差异表达基因 的富化库(enriched library) ,用微阵列分析该库能快 速地同时扫描数千个DNA 分子,从而建立一个大 的差异表达基因库 微阵列技术能高度敏感地检测出有害化合物对人体的影响。有毒物质几乎都会直接或间接地 改变基因表达,产生与某毒物相关的特异基因表达 谱。用微阵列技术建立起各种毒物导致的特异基 因表达谱数据库,样本细胞的基因表达与数据库比 较,即可确定该样本曾遭何种毒物影响 [10] 微阵列技术还可用于监测药物治疗引起的基因表达变化。分析基因表达类型(pattern) ,了解基 因功能,有助于确定治疗的靶效应,有助于发现新 的药品 [11] 应用微阵列进行基因表达分析可以用来进行疾病的诊断、预后、病理分析,药靶、效应、毒理等各 种研究。 412 基因功能分析 目前对不知其特性的基因是通过酵母菌的基 因突变株在选择性生长条件下的适应性来分析其 功能的。Shoemaker PCR靶策略产生大量的缺失 株,每个缺失株插入一个20 base 的单一标签序列, 这一序列可以和DNA 阵列杂交而被检出,从而起 着分子条形码的作用,这样可以同时分析大量的在 特殊生长条件下存活的缺失变异的酵母菌株,以此 确定大量新鉴定的基因的生物学功能 [12] 通过基因表达和特殊生理变化相关的分析,可以对一系列生物学过程的机理有更深入的了解。 Iyer 等用人 9804 cDNA组成的微阵列检测 了成纤维细胞在对血清反应中基因的程序性表达。 将人成纤维细胞在无血清培养基中培养48 ,加入血清在15 min 到24 中取12个时间点检测其8613 个基因的 mRNA 水平。基因表达的时相程序和伤 口修复的生理学相关,揭示了成纤维细胞在伤口修 国外医学分子生物学分册2001年第23 复过程中基因表达的状况,不仅发现了一些已知基因的新的作用,还发现了200 多个未知基因在成纤 维细胞对血清反应中的作用。这一实验方法可以 用作模型来研究细胞从 到增殖的控制调节[13] 了解转录因子的靶位点能更精确地操纵基因表达。斯坦福大学的学者将转录因子和 DNA 合,用免疫沉淀法分离出结合物,再把DNA与转录 因子分离,将此DNA 用作探针和基因内元件(intra2 genic elements) 微阵列杂交,找出基因内和转录因子 结合的区域。 413 基因制图 Kruglyak 等将微阵列技术用于双等位基因标记 遗传图的连锁研究,能快速并高度自动化地鉴定基 因型,还能确切地检测样本的纯合性和杂合性 [14] Cheung等把基因组错配扫描(genomic mismatch screening GMS)与微阵列技术结合,不需以标记物 为根据的基因组分型而直接进行基因制图。他们 对成对无亲缘关系的先天性高胰岛素血症患者进 GMS产物与11 号染色体的微阵列杂交, 从而将先天性高胰岛素血症基因定位于 11p15. Mb范围内 [15] 414 基因测序及突变和多态性检测 将经设计的不同序列的寡核苷酸组成微阵列, 与靶序列杂交,从相应的寡核苷酸序列确定其互补 的靶核苷酸序列,通过计算机分析处理,可迅速将 正确的靶序列拼接起来。Chee 等以单杂交实验进 行人类完整线粒体基因组测序, 苷酸的阵列检测了线粒体基因组约16. [16]。Hacia 96000个寡核苷酸的阵列检测 BRCA1 基因11 外显子3. 45 kb 长度内的杂合性突 变,在14/ 15 个患者样本中精确诊断了已知突变, 同时还检测出38 个单核苷酸多态(SNP) [17] 。Hacia 等还设计了高密度寡核苷酸阵列对与人进化相近 的猩猩、大猩猩和黑猩猩的同源基因BRCA1 11外显子序列比较分析,证明在3. kb中83. %核苷酸相同[18] 。Favis PCR和链接酶检 测反应(ligase detection reaction LDR)结合,在一个 反应管里同时检测上百个突变,再结合寡核苷酸微 阵列,就能同时迅速分析大量样本。他们应用该方 法成功地描绘出结肠癌的 K2ras 和p53 突变。并测 出了BRCA1 和BRCA2 中的低频突变。 [19] Wen 等用寡核苷酸微阵列和常规DNA 序列分 析法检测 108 例卵巢癌 TP53 的突变, 比较了两者 的效率、敏感性、特异性。57 例突变同时被两种方 法检出,一致率为81 %;14 例被寡核苷酸微阵列检 出而未被常规 DNA 序列分析法检出; 例被常规DNA 序列分析法检出而未被寡核苷酸微阵列检出。 寡核苷酸微阵列检测突变的准确率、敏感性、特异 性分别为94 %、92 %、100 %,而常规DNA 序列分析 法则为87 %、82 %、100 微阵列技术一出现,就显示出了强大的生命 力。令人鼓舞的应用前景引起生物界、医学界学者 的热情关注。近年来, 微阵列技术及应用发展迅 速。待人类基因组计划完成,在微阵列上对全基因 组的变化进行检测将成为可能,用疾病相关微阵列 进行疾病诊断将成为常规而真正实现把实验室搬 到芯片上(lab2on2chip) etal NatureMed etal CancerRes FodorSPA et al etal etal etal NatureGenetics LashkariDA et al ProcNatl Acad Sci USA etal Gene,1999 WelfordSM et al NucleicAcids Res 305910 Medlin EnvironHealth Perspec A25611 Debouck etal NatureGenetics 21(1suppl) 4812 Shoemaker DD et al NatureGenetics 45013 Iyer VR et al 8314 Kruglyak NatureGenetics 2115 Cheung VG et al NatureGenetics 22516 Chee etal 61017 Hacia etal NatureGenetics 44118 Hacia etal NatureGenetics 15519 Favis etal AcadSci 906:39 20 Wen WH et al CancerRes ,2000 ;60 :2716 (2000203203 收稿) 国外医学分子生物学分册2001年第23