艾叶总黄酮的提取及纯化工艺条件第50 卷第12 湖北农业科学HubeiAgriculturalSciences Vo1.50No.12 Jun.,2011 艾叶总黄酮的提取及纯化工艺条件 (湖南人文科技学院化学与材料科学系,湖南娄底417000)摘要:以总黄酮的吸附率,解吸率为指标,采用可见分光光度计测定总黄酮的含量, 考察AB 附树脂对艾叶总黄酮的最佳纯化条件.结果表明, 最佳吸附条件为样液浓度 0I311me,/mL.吸附速率1.0 mL/min,样液pH 值2,上样量每克大孔树脂5mg 粗黄酮溶液;最佳解吸条件是4 床体积,体积分数为70%的乙醇.以1.0mL/min 的速率洗脱.艾叶总黄酮的含量(质量分数)在未经纯化 之前为19I3%,在最佳 条件下纯化之后可达60.1%.约是原来含量的3.1 关键词:艾叶;总黄酮;大孔吸附树脂;提取;纯化中图分类号:Q949.783.5:R284.2 文献标识码:A 文章编号:0439—8114(2011)12— 2519—03 StudyontheExtractingandPurifyingConditionsofTotalFlavonoidsfromArgy WormwoodLeaves SHENXiang-zhong (DepartmentofChemistryandMaterialsScience,HunanInstituteofHumanitiesScienceand Technology,Loudi417000,Hunan,China) Abstract:ThepurificationconditionsoftotalflavonoidsfromargywormwoodleavesbyAB- 8macroporousadsorptionresin wereoptimizedusingadsorptionratioandelutionratiooftotalflavonoidsasevaluatingcriteri a.Andthecontentoftotal flavonoidswasdeterminedbyVisspectrophotometer.Theoptimaladsorptionconditionswe reconfirmedasfollows,soluble flavonoidcontent,0.311mg/mL;adsorptionrate,1.0mL/min;pH,2;5mgcrudeflavonoidspe r1gmacroporousresin.The bestelutionconditionwas4BV,70%()alcoholatarateof1.0mL/min.Afterpurification,theco ntentoftotalflavonoids couldreachedto60.1%,whichwas3.1timesofthatunpurified(19-3%). Keywords:rgywormwoodleaves;totalflavonoids;macroporousadsorptionresin;extractio n;purification 总黄酮广泛存在于自然界的某些植物和果浆 中.总数大约有4 千多种.其分子结构不尽相同,如 芸香苷,橘皮苷,栎素,绿茶多酚,花色糖苷,花色苷 酸等都属总黄酮总黄酮的功能是多方面的.它具 有消除氧自由基,抗氧化,调节血脂,抗肿瘤,抗病 毒等生理活性.同时总黄酮具有抗溃疡,抗过敏,抗菌,抗炎,抗衰老,降血脂,治疗心脑血管疾病等药 用保健功能.是一类具有广阔开发前景的天然抗氧 化剂[1-7].另外,在食品工业上可作色素用. 生物类黄酮(Bioflavonoids)亦称维生素P.常与 维生素c 伴存,在自然界分布广泛.属植物次级代 谢产物.是一组存在于蔬菜,水果,花和谷物中的天 然色素,因多呈黄色而称生物类黄酮大孔吸附树 脂物理化学稳定性高,吸附选择性独特,不受有机 物存在的影响,再生简便,解吸条件温和,使用周期 长,宜于构成闭路循环,节省费用等,广泛用于生化 和天然物质的分离提纯l8l93 郑亚杰等[10-153 的研究表 明.AB 型大孔吸附树脂对总黄酮有较好的吸附效果试验主要研究用AB 型大孔吸附树脂纯化艾叶总黄酮的最佳工艺条件.其中考虑的主要因素 是样液浓度,吸附速率,样液pH 率的影响,洗脱剂体积分数,洗脱速率,洗脱剂用量对解吸率的影响 材料与方法1.1 材料 1.1,1 仪器FA2004 型电子天平:101—2AB 热鼓风干燥箱;RE一52D 旋转蒸发器:WFJ7200 收稿日期:2010—10—14作者简介:申湘忠(1965 一),男,湖南邵东人,副教授, 箱)Ldsxz7656@163-cUm.2520 湖jE 农业科学2011 3C数字酸度计:SHZ—D 循环水式真空泵. 1.1.2 药品艾叶(购于娄底药店):AB 吸附树脂(天津市光复精细化工研究所):芦丁(上海化学试剂公司);氢氧化钠;亚硝酸钠;硝酸铝;盐酸;无水乙醇;体积分数为95%的乙醇;石油醚;乙 醚以上试剂均为分析纯 1.2 方法 1.2.1 粗黄酮的提取取一定量的艾叶.将其洗 净,把水晾干,然后放人干燥箱中.在50下烘干. 再用粉碎机将其磨成碎末称取一定量的艾叶碎末 按以下方法脱色和脱脂.以无水乙醚为脱脂剂.在45水浴下脱脂约20h.充分除去样品中脂类和脂 溶性色素.当用玻璃棒蘸一滴刚要发生虹吸时的浸 提液于滤纸上.而滤纸上没有油斑.可认为脱脂完 全.再放入干燥箱中50 烘干.将脱过脂的样品放 入圆底烧瓶中.加人体积分数为70%的乙醇溶液. 回流浸提8 次.每次2h 左右.且前4 次样品的质量 (g)与乙醇的体积(mL)比为1:8,后4 次为1:6,最后 次浸提液几乎无色,说明浸提基本完成合并8次浸提液.放入分液漏斗中.用石油醚进行二次脱 脂.收集二次脱脂过的粗黄酮提取液.用旋转蒸发 仪减压浓缩至一定体积.再放人真空干燥箱中干燥 得到粗黄酮粉末 1.2.2 标准曲线的建立精密称取芦丁对照品 50.3mg 置于100mL 容量瓶中.加体积分数为60% 的乙醇溶解.定容至刻度.精密吸取该溶液50mL 于100mL 容量瓶中.定容至刻度.得浓度为0.252 mg/mL 的芦丁对照品溶液分别精密吸取该芦丁对 照品溶液0.0,2.0,5.0,8.0,12.0,16.0mL 于50mL 容量瓶中.各加体积分数为30%的乙醇4mL.6WL 亚硝酸钠2mL,放置6min 后加10L 硝酸铝溶液 2mL,同样放置6rain 后加入1Og/L 氢氧化钠溶液 2OmL.补加30%乙醇至50mL,放置15min.用分光 光度计于508nm波长处测定吸光度.由此可作出标 准曲线,并计算出线性回归方程 由标准曲线可以计算得回归方程为A-9.9788C+ 0.90.8 O.1 0.O 0.0o0.01O.020.03O.040.05O.060.07O.080.09 芦丁溶液浓度C//mg/mL 标准曲线0.0118.其中C 为芦丁对照品溶液的浓度(mg/mL). 相关系数r=0.9989 1.2-3AB 型大孔吸附树脂的预处理称取约16g 的AB 吸附树脂按照以下步骤对其进行处理.先用95%的乙醇充分浸泡24h 后用95%的乙醇洗至加适量水无白色浑浊.再用去离子水洗至无醇味后加入大约4 倍床体积的体积 分数为5%的HE1 浸泡34h.用去离子水洗至中 性,再加人大约4 倍床体积的为5g/L 的NaOH 液浸泡3~4h,最后用去离子水洗至中性即可使用1.2.4 粗黄酮中总黄酮含量的测定称取32.7mg 的粗黄酮.在90用去离子水溶解.然后用离心机 3500r/rain 离心.取上层清液配成50mL 溶液.再取10mL 该溶液于50mL 容量瓶中.按步骤1.2.2 的方法测得总黄酮含量为19.3% 结果与分析2.1 样液浓度对吸附率的影响 称取657.1mg 粗黄酮在90水浴中用去离子 水溶解.3500r/min 离心后取上层清液配成250mL 溶液,均分成5 份,再分别稀释至浓度为0.066, 0.217,0.311,0.413,0.507mg/mL 的溶液.然后将它 们均以1.0mL/min 的速率过柱.分别用3 倍床体积 的水洗柱.收集吸附及洗柱流出液.按步骤1.2.2 方法测量其中的总黄酮含量.据此计算出不同样液浓度下的吸附率(图2).由图2 可以看出,当样液浓 度小于0.311mg./mL 时.随着样液浓度的增大.吸附 率也增大:当样液浓度为0.31lmg/mL 时.吸附率达 到最大值.随后随着样液浓度的增大.吸附率减小 所以.上样时应使样液浓度为0.311mg/mL 样液浓度对吸附率的影响2.2 吸附速率对吸附率的影响 配制浓度为0.311mg/mL 的粗黄酮溶液500mL, 均分成5 份.分别以0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mL/min 速率过柱.并用3倍床体积的水洗柱,收集吸附及 洗柱流出液.测量其中的总黄酮含量,据此计算出 不同吸附速率下的吸附率如图3.由图3 可以看出, 第12 期申湘忠:艾叶总黄酮的提取及纯化工艺条件2521 随着吸附速率的增大.吸附率逐渐降低.但当吸附 速率太小时花费的时间就会很多.并且当吸附速率 由0.5mL/min 增大到1.0mL/min 时.吸附率只是 略微降低.却节省了1/2 的时间:而当吸附速率大 于1.0mL/min 时.虽然花费的时间减少了.但吸附 率却急剧下降综合考虑以上因素.选择吸附速率 为1.0mL/min 比较合适 9O 85 80 75 菠7O 65 60 吸附速率//mL/min 吸附速率对吸附率的影响2.3 样液pH 值对吸附率的影响 配制浓度为0_311mg/mL 的粗黄酮溶液500 mL.均分成5 份.用5%的HC1 将它们的pH 值分别 调至1,2,3,4,5,然后均以1.0mL/min 的速率过 柱.再用3 倍床体积的水洗柱.收集吸附及洗柱流 出液.按照步骤1.2.2 的方法测量其中的总黄酮含 量,据此计算出不同pH 值下的吸附率如图4 可看出,当pH值小于2 时,随着样液oH 大,吸附率相应地增大;当pH值大于2 后,随着pH 值的增大,吸附率明显地降低;当pH 时吸附率可达最大值因此过柱前要调好溶液的酸碱度. 使其pH 值为2.以便增大大孔树脂对总黄酮的吸附 能力 100 98 96 94 84 82 80 样液pH 样液pH值对吸附率的影响 2.4 上样量对吸附率的影响 配制浓度为O.3l1mg/mL 的粗黄酮溶液1500 mL,分别从中取出总黄酮量为40,60,80,100,120 mg 的溶液,均以1.0mL/min 的速率过柱.并用3 床体积的水洗柱,收集吸附及洗柱流出液.按步骤1.2.2 的方法测量其中的总黄酮含量.据此计算出不 同上样量下的吸附率如图5.由图5 可知.当上样量 小于60mg 时.随着上样量的增加.吸附率略有减 小:上样量在6O~80mg 之间时,随着上样量的增加, 吸附率略有增大;上样量大于80mg 后,随着上样量 的增加.吸附率明显减小.总体上看,上样量为40~ 80mg 时.吸附率变化不大:虽然上样量小有利于吸 附.但上样量太小,大孔树脂的利用率太低.因此, 当上样量为80mg 时.既能保持较大的吸附率,又使 得大孔树脂的利用率较高.根据所用大孔树脂的量 为16g 来计算.可算出平均每克大孔树脂的上样量 为5mg 时,吸附率和大孔树脂的利用率都比较高. 所以.试验前要根据所用大孔树脂的量来确定上样 量,使平均每克大孔树脂的上样量为5mg. 上样量对吸附率的影响2.5 洗脱剂体积分数对解吸率的影响 配制浓度为O.311mg/mL 的粗黄酮溶液500 mL.均分成5 份.均以1.0mL/min 的速率过柱,分 别用3 倍床体积的水洗柱.并收集吸附及洗柱流出 液,再用4 倍床体积的体积分数分别为3O%,50%, 7O%,80%,90%的乙醇溶液以1.0mL/min 的速率洗 脱.收集洗脱液按步骤1.2.2 的方法测量其中的总 黄酮含量.据此计算出不同体积分数的洗脱剂下的 解吸率如图6 可以看出.当洗脱剂体积分数小于70%时.随着洗脱剂体积分数的增大,解吸率也增大:当 洗脱剂体积分数为70%时,解吸率达最大值:当洗 脱剂体积分数大于70%后.随着洗脱剂体积分数的 增大.解吸率逐渐减小.所以,洗脱时用体积分数为 70%的乙醇.洗脱效果最好. 洗脱剂体积分数对解吸率的影响2522 湖北农业科学2011 2.6洗脱速率对解吸率的影响 配制浓度为0.311mg/mL 的粗黄酮溶液500 mL,均分成5 份,均以1.0mL/min 的速率过柱.分 别用3 倍床体积的水洗柱.并收集吸附及洗柱流出 液,再用4 倍床体积的体积分数为70%的乙醇溶液 洗脱,洗脱速率分别为0.5,1.0,2.0,3.0,4.0mL/min, 收集洗脱液.按步骤1.2.2 的方法测量其中的总黄 酮含量.据此计算出不同洗脱速率下的解吸率如图 可看出,随着洗脱速率的增大.解吸率减小.因此.按说洗脱速率小有利于解吸率的增加;但 洗脱速率太小就需要花费很多时间同时由图7 以看出.洗脱速率在0.5~1.0mL/min之间解吸率 大.且随着洗脱速率的增加.解吸率降低很小,却节 省了1/2 的时间:而当洗脱速率大于1.0mL/min 时,虽然所用时间减少,但解吸率急速减小.考虑以 上因素,将洗脱速率定为1.0mlMmin 比较合适. 洗脱速率对解吸率的影响2.7 洗脱剂用量对解吸率的影响 配制浓度为0.3l1mg./mL 的粗黄酮溶液500 mL.均分成5 份,均以1.0mlMmin 的速率过柱,分 别用3 倍床体积的水洗柱.并收集吸附及洗柱流出 液,分别用2,3,4,5,6 倍床体积的体积分数为70% 的乙醇溶液洗脱.收集洗脱液.按步骤1.2.2 的方法 测量其中的总黄酮含量.据此计算出不同用量洗脱 剂下的解吸率如图8.由图8 可看出.洗脱剂用量从 倍床体积增加到4倍床体积时.解吸率显着增大: 洗脱剂用量大于4 倍床体积时,随着洗脱剂用量的 增加.解吸率几乎不再变化.因此,洗脱剂用量为4 倍床体积时.洗脱效果最好 洗脱剂用量对解吸率的影响2.8 最佳条件下的纯化效果 配制浓度为0.31lmg/mL 的粗黄酮溶液250 mL,pH 值调为2,以1.0mlMmin 倍床体积的水洗柱.再用4倍床体积的体积分数为 7O%的乙醇溶液以1.0mlMmin 的速率洗脱.将洗脱 液用旋转蒸发仪浓缩到一定体积.再减压干燥成粉 末.然后按步骤1.2.2 的方法测得其总黄酮的含量 为60.1%.约是过柱前含量的3.1 结论用AB 型大孔吸附树脂为吸附剂对粗黄酮进行纯化,受到各种因素的影响,包括样液浓度,吸附 速率,样液pH 值,上样量对吸附率的影响及洗脱剂 体积分数,洗脱速率,洗脱剂用量对解吸率的影响, 这些因素对纯化效果有很大的影响.研究发现.当 样液浓度为0.311mg/mL,pH 值为2,吸附速率为 1.0mlMmin.上样量为每克大孔树脂5mg 粗黄酮溶 液.吸附率可达最大值:再用4 倍床体积的体积分 数为7O%的乙醇溶液以1.0mlMmin 的速率洗脱可 使解吸率达到最大值当吸附率和解吸率都达到最 大值时,即为试验所需的最佳条件.在最佳条件下. 通过AB 吸附树脂的纯化.使得粗黄酮中的总黄酮含量由原来的19-3%增大到60.1%.是原 含量的3.1 参考文献:[1]