1253年,忽必烈派蒙古军队征服大理国,1276年正式建立云南行省。色目人赛典赤·赡思丁任平章政事,省会中庆路(昆明),自此昆明取代大理成为云南的政治中心。在云南开发重要的铜矿和银矿,产量占全国一半以上。直到清朝,云南是中国白银的主要产区。大批色目人及少量蒙古人移居云南,形成今天的云南回族和蒙古族。明洪武十四年(1381年),朱元璋派大将傅友德、沐英率军队攻占云南,在明代,陆续有大批汉族军民向云南移民,改变了云南的人口结构。 随着大批汉族人口移民云南,使云南的经济和文化都取得了进步。
清世祖顺治十六年(1659年),派平西王吴三桂追捕永历。1662年,吴三桂从缅甸抓回永历皇帝,在昆明绞死。吴三桂驻守云南。1673年(康熙十二年),康熙决定削藩,吴三桂在昆明出兵反清。1681年(康熙二十年),清军攻破昆明,吴三桂之孙吴世璠自杀,三藩之乱失败。
1909年(己酉年),清朝实行新政,云南编立新军,成立云南陆军讲武堂。
1919年“五四运动”前后,马克思主义就开始在云南传播,1926年11月7日,经过李鑫等共产党员的艰苦工作,中共云南特别支部在昆明成立。由于国民党的残酷镇压,李鑫、王德三、刘平楷等相继牺牲,党组织遭到严重破坏。1929年,蒋介石任命龙云为云南省政府主席、国民革命军第十三路军总指挥等,以龙云为首的云南地方实力派统治在云南确立。
1938年,付出极大代价的滇缅公路修通,成为中国与境
外联系唯一的交通线。1942年有10多万中国远征军从云南进入缅甸配合英军与日军作战,日军击败英军,沿滇缅公路进至惠通桥,隔怒江与中国军队对峙2年。1938~1946年,清华大学、北京大学、南开大学在昆明联合办学,称为国立西南联合大学,其中的师范学院也就是今云南师范大学的前身。