实验中常用异硫氰基荧光黄(fluorescein　isothiocyanate,　FITC)作为标记物,在碱性溶液　中,FITC　上的化学基团异硫氰基(-N=C=S)与抗体蛋白自由氨基(主要是赖氨酸的ε-氨基)结合,形成荧光抗体,　以测定细胞相应抗原的存在。FITC　具有很高的量子产量(发射光与吸收光的比值,0　.85),而且形成的偶联物的稳　定性很好。FITC　是应用最广的荧光染料,流式细胞仪就按　FITC　的特性,设计了激光波长为　488　nm,很接近于　FITC　的最大激发波长　492nm)。　Tel:　(025)　5889-　4959　www.DetaiBio.com　Sales@DetaiBio.com　活性蛋白整体方案　Active　Protein　Solutions　作为标记的荧光素应符合以下要求:　\uf0b7　应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团,与蛋白质结合后不易解离,而未结合的色素及其降解产物　易于清除。　\uf0b7　荧光效率高,与蛋白质结合后,仍能保持较高的荧光效率。　\uf0b7　荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。　\uf0b7　与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质,与蛋白质的结合物稳定,易于保存。　\uf0b7　标记方法简单、安全无毒。　操作步骤:　\uf0b7　用碳酸氢钠缓冲液　pH9.8　稀释抗体为　1-5mg/ml,　或抗体对该缓冲液充分透析,　以足以使赖氨酸不解离　(去　其正电荷),但注意保持大部分蛋白质仍未变性;　\uf0b7　将透析袋放入　100ml　含0.1　mg/ml　的pH9.8　碳酸氢钠缓冲液(新配制)的烧杯中,用铝铂包烧杯以避　光,4℃搅拌过夜;　\uf0b7　上述抗体液对　PBS　在4℃透析以终止反应。其间至少更换　PBS　液三次,直致　480nm　的吸收为零;　\uf0b7　加入　0.5g/L　的叠氮钠。此后,结合物在　4℃避光保存,或分装后在-20℃冻存。　荧光偶联质量的检测　\uf0b7　用标准免疫荧光染色试验以测定偶联率。　\uf0b7　或用　F/P　值测定对其　FITC　标记质量进行鉴定。　\uf0b7　取结合物液　0.2ml,加PBS　2.8ml(或两者均改用半量),测定其　A490/A280,查FITC　标志曲线得其浓　度μg/ml　值,按IgG　的消光系数(mg/ml　约A280　1.2),可计算其　F/P　值,即每　mg　抗体所标记的　FITC　的比值,以此鉴定及比较各批标记物的质量。　实验要点及说