亚硝化螺菌属Nitrosopira 亚硝化弧菌属Nitrosovibrio 细胞形状 球形 小裂叶状 直杆状 螺旋形 细卷曲杆状 细胞大小(μm) 1.5~1.8×1.7~2.5 1.0~1.5×1.0~2.0 0.7~1.5×1.0~2.40.3~0.8×1.0~8.0 0.3~0.4×1.1~3.0 鞭毛 单根或一小丛群生 周生鞭毛 极性或亚极性 周生鞭毛 极性或亚极性膜结构 细胞中心形成一层扁平细胞质膜 土壤和海水 广泛分布于土分成小室 扁平状周生膜 内陷 内陷 生存环境 生长 温度 (℃) 生长pH 值 细胞 色素 模式种 壤 广泛分布于土壤 广泛分布于土壤 —— 2~30 15~30 5~30 15~30 15~30 6.0~8.0 6.0~8.2 5.8~8.5 6.5~8.5 6.5~8.5 淡黄至淡红 淡黄至淡红 淡黄至淡红 淡黄至淡红 淡黄至淡红 亚硝基亚硝化球菌 多形亚硝化叶菌 欧洲亚硝化单胞菌 白里亚硝化螺菌 —— 1.2.2 影响硝化作用的环境因素 由于硝化细菌化能自养的特殊性, 导致硝化细菌易受外界因素影响, 对环境的变化很敏感, 其影响因子主要有以下几点: 1.2.2.1 氨氮底物浓度 硝化细菌的起始作用底物为氨氮, 较低浓度的底物常常不能满足硝化菌的要求, 但过高浓度的氨氮又可能会对硝化细菌产生抑制作用, 所以氨氮底物浓度的高低对硝化作用有较大影响。 研究表明不同的硝化细菌菌种可能会适应不同浓度的氨氮底物[10]。 张伟对所研究的活性污泥的氨氮浓度实验表明在氨氮浓度在 500~550 mg/L 范围时, 硝化细菌对氨氮的降解速率最快。 pH 和氨氮浓度过高可能会导致非离子氨氮含量的增加从而抑制硝化作 第 1 章 绪论 - 5 -用的进行[11]。 崔袁园所研究的亚硝酸菌株 yn6 在氨氮负荷为 50 mg/L 时, 氨氮去除效率达到最高为 68%[12]。 1.2.2.2 C/N 碳源和氮源是维持微生物生长繁殖非常重要的营养物质。 碳源和氮源的合适配比至关重要。 在废水生物处理中, 好氧微生物群体(活性污泥)正常生长繁殖所需的碳、 氮、 磷比例为 BOD5: N: P=100: 5: 1, 厌氧硝化污泥中的厌氧微生物群体对碳、 氮、 磷比例要求为 BOD5: N: P=100: 6: 1。 生物脱 氮 过 程 中 碳 源 和 氮 源 的 配 比 同 样 重 要 。 硝 化 反 应 的 一 般 要 求 是BOD5/TKN>5, COD/TKN>8。 硝化细菌属于典型的自 养细菌, 有机物对于硝化细菌是否具有毒害作用是人们普遍争论的问题。 近来, 越来越多的研究表明, 有机物对硝化细菌的影响并非是具有毒害作用, 更为可能的是有机物的存在刺激异养细菌迅速生长, 从而与硝化细菌竞争溶解氧、 氨和微量营养物质,使得硝化细菌的生长受到限制, 而有机物本身并不直接影响硝化细菌的生长与硝化作用[13]。 Hanaki 也认为有机物导致硝化作用的降低不是直接毒害作用的结果, 他认为原因有二: 一是异养菌的同化作用导致氨的减少; 二是异养细菌细胞的凝聚体会对氨的氧化作用产生抑制作用, 二者共同作用导致了 硝化作用的降低[14]。 一般情况下, 为方便工艺研究和污水处理系统的运行管理, C/N 指标的选用往往与待处理水的水质情况有关。 当污水中的氮主要为有机氮, 污水的可生化性较好时可用 BOD5/TKN 或 COD/TKN 作为 C/N 指标。 在本研究中, 考虑到试验采用人工配水, 为方便水质检测, 拟采用指标 COD/TN 表示 C/N。 1.2.2.3 pH 值 环境中的 pH 值对微生物的生命活动影响很大, 主要作用在于其引起细胞膜电荷的变化, 从而影响了 微生物对营养物质的吸收, 影响代谢过程中酶的活性, 改变生长环境中营养物质的可给性, 以及有害物质的毒性。 每种有机体都存在可以生长的 pH 值范围, 通常还有一个最适 pH 值, 绝大部分生物的最适 pH 值在 5~9 之间, 而自然环境的 pH 值普遍都属于此范围, 只有少数种类能在 pH 值小于 2 或 pH 值大于 10 的环境中生长。 pH 值对亚硝化反应的影响有两方面, 一方面是 AOB 生长要求有合适的pH 值, 另一方面是 pH 值对游离氨浓度有重大影响。 废水中氨随 pH 值不同分别以分子态(FA)和离子态(NH4+)形式存在。 一般认为, 适宜 NOB 和 AOB 生长介质的 pH 值分别为 6.0~7.5 和 7.0~8.5, AOB 最佳 pH 值范围为 7.8~8.0。 而NOB 的最佳 pH 范围为 7.3~7.5。 当 pH<7.0 时, AOB 生长缓慢, 若 pH<6.5时, 其生长将受到抑制。 当 pH<6.0 时, 系统中硝化作用就会停止[15]。 当硝化细菌处在最佳 pH 值条件下, 其比增长速率也达到相应的最大值。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 6 -1.2.2.4 DO 值 水体中 DO 值的高低影响到好氧、 厌氧微生物的比例, 大多数研究人员认为 DO 的质量浓度应当控制在 1.5~2.0 mg/L, 低于 0.5 mg/L 时硝化作用趋于停止。 DO 值偏大, 一方面加剧了 活性污泥的内源呼吸, 造成活性污泥的大量消耗, 另一方面 DO 值太高不仅不经济, 反而使反硝化速率降低, 能耗也增大, 降低了设备运行的经济性, 影响脱氮效果。 1.2.2.5 温度 任何微生物都是在一定的温度下生存的。 因为微生物的生长发育是个极其复杂的生物化学反应, 这种反应需要在一定的温度范围内进行, 因而温度是影响微生物生长与存活的重要因素之一。 关于不同温度下硝化细菌的最大比增长速率的比较, 不同的研究者得到的结果差别较大, 但总的趋势还是一致。 硝化细菌在 5~30 ℃的范围内, 随着温度升高, 最大比增长速率增大, 硝化反应的速率也会随之增大。 生物硝化反应在 4~45 ℃内均可进行, 适宜温度为 20~35 ℃。 当温度低于 15 ℃即发现硝化速率迅速下降, 低温对硝化细菌的抑制作用更为强烈[16]。 一般的硝化细菌是中温生长菌, 其适宜的温度范围为 20~30 ℃ 。 Fdz-Polanco 等人的试验结果表明, AOB 的活性在 28~29 ℃达到最大值, 温度超过30 ℃, 硝化反应的速率开始降低, 这是因为温度超过 30 ℃时, 蛋白质变性降低了微生物的活性[16]。 硝化细菌能承受最高温度的上限为 40 ℃[15, 17]。 Ford 认为, 温度低于 18 ℃和高于 35 ℃时, 硝化速率会快速下降[18]。 温度在 17 ℃时硝化速率下降到只有 30 ℃时的一半[19]。 当系统温度低于 4 ℃时, 硝化细菌的生命活动几乎完全停止[20]。 温度对硝化速率的影响可表示为公式 1-1: )20(0·θ−=Tμμ (1-1) 式中 μ ——硝化速率; 0μ ——初始硝化速率; θ ——温度系数; T ——温度(℃)。 1.2.3 污水生物脱氮中硝化作用的强化 在生物脱氮过程中, 硝化细菌常因生长代谢慢、 数量少及易受环境条件影响等, 硝化作用减弱, 使污水中的氨氮含量升高。 为了 增加污水中硝化细菌的数量, 强化其硝化作用, 从而降低污水中的氨氮含量, 向污水中投加硝化细菌 第 1 章 绪论 - 7 -的生物强化方式来提高系统的硝化性能, 已经在很多行业开始应用。 庞金钊等应用优势菌剂处理城市湖泊水的小试结果表明, 投加光合菌、 硝化菌和复合菌的混合液, 使水中的浊度、 叶绿素 a、 CODMn和氨氮的含量显著降低[21]。 邓波等针对油田出水的特点, 进行高温高盐条件下实现硝化反应的试验, 筛选、 驯化出的耐高温高盐硝化菌对氨氮具有显著的降解效果[22]。 潘涌璋等应用土著微生物培养液和 BBL1 菌剂, 采用投菌法对富营养化人工景观湖水进行了净化试验, 其中氨氮的去除率大于 90%[23]。 周康群等利用投加硝化菌、 亚硝化菌、 芽孢 杆 菌 和 假 单 胞 菌 接 种 于 广 州 市 西 村 水 厂 水 源 水 中 ,40~94.5%[24]。 李咏梅等用美国 LRc 技术有限公司提供的液体状商业硝化菌种处理经厌氧——酸化好氧生物膜法处理的焦化废水, 结果表明, 试验菌种可以同时进行硝化和反硝化反应, 当氨氮与菌种比为 0.51 时, 氨氮去除率可达90%以上[25]。 可 降 解 氨 氮因此培养出价格便宜、 应用广泛的硝化细菌菌剂, 使之能有效降低含氮废水及污染水体中的氨氮, 为后续的反硝化脱氮工艺提供良好的条件。 这将是硝化细菌在水处理上应用的重要课题。 1.3 分子生物学技术在硝化细菌研究中的应用 1.3.1 分子生物学技术对水环境中硝化细菌的研究 生物的多样性及其丰富的现存量是生态系统的基础, 它起到维持环境平衡及物质循环的作用, 许多受污染地区的生物治理和处理废水的生物反应器等都依赖于微生物群落。 因此, 了 解微生物的多样性及其群落的动态非常重要。 首先, 群落结构决定了 生态功能的特性和强弱。 其次, 群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。 再次, 群落结构变化是标记环境变化的重要方面。 因此, 通过对目标环境群落的种群结构和多样性进行解析并研究其动态变化, 可以为优化群落结构、 调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。 Miura 等通过 PCR-DGGE 和 FISH (Fluorescence in Situ Hybridization)技术研究了 CMBR(传统 MBR)和 HMBR(复合型 MBR)中的微生物种群结构, 并与活性污泥工艺中的微生物种群结构进行了 比较, 结果显示活性污泥工艺中的微生物结构更接近于 CMBR, 表明进水组分对微生物种群结构有很大的影响[26]。 Park 等采用包括基于 16S rDNA 的 DGGE 技术和基于 amoA 基因的 FISH 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 8 -技术的分子技术, 控制 D1、 D2、 D3 和 D4 反应器不同的 DO 浓度(1 mg/L, 3 mg/L, 5 mg/L 和 7 mg/L)。 最佳的 DO 浓度保持稳定的硝化效率在 5.0 mg/L 以上。 DGGE 和克隆结果表明, AOB 群落组成和亚硝化单胞菌属所占比率只有轻微的改变。 FISH 结果显示了高 DO 浓度能导致 AOB 和 NOB 数量的上升和异氧菌数量的下降[27]。 Marsh 等也利用 DGGE 分析并获得了活性污泥中真核微生物的 种 群变化 情况[28]。 Nicolaisen 和 Ramsing 依 靠 DGGE 技术发现Nitrosomonas-like 细菌是上流式好氧流化床颗粒污泥中的主要氨氧化菌[29]。Tietz 等考察了一个全规模处理市政污水的垂直流人工湿地 AOB 菌群的结构,通过 DGGE 技术考察了其功能基因 amoA (仅在 AOB 中能出现的氨单加养酶基因)的多样性[30]。 Xia 等通过基于 16S rDNA 和 amoA 基因扩增的 DGGE 技术分析了 C/N 与微生物种群结构的关系, 同时通过 FISH 技术反应了 AOB 和 NOB种群数量的变化规律[31]。 Kindaichi 等用实时定量 PCR 和 FISH 检测自养硝化生物膜上的 AOB 和类螺菌 NOB 的群落动态变化。 虽然两种定量技术都给了 相似的结果, 但是在定量形成硝化生物膜的硝化细菌密微菌落里实时定量 PCR 的分析比 FISH 技术更简便更快捷[32]。 Hallin 等通过 FISH 技术和 DGGE 技术分析了 AOB 种群结构, 并且通过 FISH 技术对鉴别出的菌种进行了 定量分析, 结果表明本实验中的硝化细菌占总菌的比例达到 10%[33]。 Qin 等采用分子生物学方法对一个污水厂的淹没式曝气生物膜反应器进行了 为期一年的氨氧化菌的种群动态分析。 细胞膜上的总细菌数由基于 16S rRNA 的定量 PCR 技术确定, 结果显示, 一年中细菌数量变化很大, 从 4.71×107个/mL (2005 年 12 月)到 3.65×1011个/mL (2005年 6 月), AOB 总菌数由 6.63×105个/mL 到 2.67×109个/mL, 占总菌数比例由0.23%(2005 年 7 月)到 1.8%(2005 年 5 月)[34]。 Liu 等采用 FISH 技术, 调查了两种工艺中 AOB 群落的数量, 结果揭示 A2/O 工艺中 AOB 数量占总菌数量的3.6±0.2%, 而 AO 工艺中 AOB 数量占总菌的 1.9±0.2%。 因此 A2/O 工艺中厌氧环境的存在显著增加了 生物多样性[35]。 Limpiyakorn 调查了 在三个不同的季节里, 12 个污水处理系统的活性污泥中总菌数和总氨氧化菌数量的关系, 使用实时定量 PCR 揭示总菌数和总氨氧化菌数量范围分别为 1.6×1012~2.4×1013个/细胞和 1.0×109~9.2×1010个/细胞[36]。 Konuma 运用 FISH 法测定了氨氧化菌的数量, 结果表明, FISH 法对氨氮含量高的活性污泥混合液检测结果较好, 但对氨氮含量低的污水厂出水和河水的检测效果不佳[37]。 Zhang 应用 DGGE 结合FISH 技术研究了 两阶段限氧自养硝化——反硝化生物脱氮系统中的限氧亚硝酸化过程中, 氨氧化菌的种群变化和数量情况, 结果表明, 在稳定的亚硝酸盐 第 1 章 绪论 - 9 -积累阶段, Nitrosomonas 占到了所有氨氧化菌总数的 72.5%[38]。 Coskuner 鉴定了 活性污泥中硝化细菌群落的数量和空间分布[39]。 Silyn-Roberts 等探明了 废水处理湿地生物膜中影响氨氧化的主要功能菌群[40]。 1.3.2 硝化细菌的功能基因片段 在 AOB 基因组的不同基因片段上, 都有 AOB 的特异性保守序列, 对这些序列进行对比研究, 可以使对 AOB 分类鉴定的结果更加准确。 目前研究最多的有以下三种片段。 1.3.2.1 16S rDNA 部分片段 16S rDNA 是分子生物学中分析最多的序列, 是遗传第一标记。 第一个通过 16S rDNA 序列比对发现新β 亚纲的 AOB 的是McCaig 等[41]。 在这项研究中, 他们设计的引物对β AMO161f 和β AMO1301r扩增出的是 16S rRNA 基因上一段长为 1.1kb 的片段。 为了 增加引物的通用性, 他们降低了 这对引物的特异性, 使它不仅能扩增氨氧化菌, 还能扩增出其它亲缘关系较近的菌株, 这样一些新的 AOB 也不会被漏掉。 当将其应用到农耕土壤和海洋沉积物样品中时, 均发现了 Nitrosomonas 和 Nitrosospira 属内的新菌种[42]。 1.3.2.2 CTO 片段 CTO 片段也是 16S rDNA 上的一段氨氧化菌特异性片段,长度约为 465 bp。 自 Kowalchuk 等[43]