动物细胞电转化 1 电转细胞的准备 1.1 贴壁细胞 (1) 电转前 1-2 天, 将细胞转移至 75cm2 细胞培养瓶培养, 至转化前使细胞汇合度约 50-70%。 6 5 此时细胞数约为 2-10x10 ,而每次电转需约 1-10x10 个细胞。 (2)12ml PBS 缓慢冲洗细胞。 (3)吸出 PBS,用 0.4ml 胰蛋白酶消化细胞。 (4)加入 10ml 含血清的培养基,中和胰酶。 (5)400x 离心 5-7min 收集细胞。 (6)用 PBS、Hepes、无血清培养基等重悬细胞,使之密度为 1-5x106cell/ml。 1.2 悬浮细胞 基本等同 1.1。 2 电转化 (1)设置电转程序,或选择预设程序。 (2)将线性化的重组质粒加入电转杯,所需质粒量根据细胞不同而定,一般起始浓度为 10-50ug/ml (3) 向电击杯中加入细胞, 颠转电击杯使之混匀。 细胞浓度和体积的使用建议请参照表一。 (4)将电击杯放入电击槽中,脉冲电击一次。 (5)脉冲后,将细胞转移至已含 0.5ml 培养基的孔中 (6)轻轻晃动孔板,使细胞均匀分布,培养箱培养。 (7)电转 24-48 小时后,基因瞬时表达。 表一 电击杯 (cm) 0.2 0.2 0.4 细胞浓度 (cells/ml) 1x106 5x10 6 6 细胞体积 (?l) 100 400 200 电击后生长条件 48 孔板 0.5 ml 生长培养基 6 孔板 2 ml 生长培养基 6 孔板 2 ml 生长培养基 2.5x10 3 电转化的试机和方案 (1)含 10%胎牛血清的培养基 (2)Opti-MEM 培养基(英潍公司) (3)胰酶-EDTA:0..5%胰酶;0.53 mM EDTA (4)PBS:137 mM NaCl;2.7 mM KCl;9.5 mM 磷酸盐;Ph7.3 (5)HEPES 缓冲液:10 mM Hepes;pH 7.3;40 mM NaCl (6)磷酸盐缓冲蔗糖:272 mM Sucrose;10 mM sodium phosphate,;pH (7)HEPES 缓冲缓冲蔗糖:272 mM Sucrose;10 mM Hepes;pH 7.3 电转化效率: