PCR 扩增不出或扩增效率低的解决方法 1. 对 PCR 退火温度进行梯度设置(例:55℃±10℃) ,根据 TM 值来选择最适温度 2. 确认模板是否存在降解问题,适当调整模板、引物、聚合酶的量 3. 反应体系里补加甜菜碱 (终浓度为 1M) 、 DMSO(总体积的 1-5%, 注: 加过多会影响酶的活性) 4. 如果模板是菌液未扩增出的,可选用所提的质粒,再做 PCR 扩增 5. 更换其他 DNA 聚合酶做小试实验(Pfu、Fastpfu、KOD) 目前首选聚合酶为 Pfu,在扩增不出的情况下,可以选用 Fast pfu、KOD 等等聚合酶 6. 可尝试两步法 PCR 程序(如下: ) 94℃ 5’ 94℃ 68℃ 10℃ 5’ 30” 保存 by 25-30cycles 7. 用过 PCR 拼接获得目的基因全长的,每个小片段都必须凝胶纯化回收,回收后再进行下一 轮拼接实验。 8. 如上述方法都不能解决扩增不出的问题,请分析是否存在引物设计错误。