膜蛋白的分析由于它们的疏水性,复杂的翻译后修饰(PTM)以及它们以低丰度,一直以来都是蛋白研究的难点。
膜蛋白富集实验方法
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细胞膜蛋白
膜蛋白是一类与生物膜相互作用或从属于生物膜的蛋白质。膜蛋白可根据其位置和与膜的相互作用分为三个部分:integral(跨膜蛋白);peripheral(外周蛋白); 或lipid-anchored(脂质锚定蛋白)[1]。
外周膜蛋白以几种方式附着在膜的一侧,如平面内α-螺旋。跨膜蛋白跨越脂质双层并且是两亲性的。它们的亲水区域突出到细胞质或细胞外环境中以与可溶性蛋白质和分子相互作用,而疏水区域用于将蛋白质嵌入脂质双层中。而脂质锚定蛋白确实直接结合在磷脂双子层上
膜蛋白在各种细胞过程中起重要作用,例如细胞粘附,免疫应答,代谢和信号转导。它们可以作为转运蛋白,受体和结构蛋白。因此,膜蛋白是蛋白质组学研究的热门目标,也是药物开发的常用候选药物。然而,膜蛋白具有低丰度,溶解度低,以及酶切位点可及性低等特性,也就限制膜蛋白研究。
质谱蛋白质组学方法减轻了膜蛋白鉴定的难度。然而膜蛋白的研究困难并不是消失了,就目前而言,膜蛋白质组分析的主要困难还是主要集中在于膜蛋白的富集上。因此膜蛋白的研究手段一般第一步就是膜蛋白的富集。
膜蛋白的富集
由于整合膜蛋白质含量低,因此膜蛋白的富集对于蛋白质组学分析至关重要。有几种策略[2]:
亚细胞分级(使用甘油或山梨糖醇进行梯度密度离心梯度收集细胞膜表面活性剂破坏细胞膜膜,然后使用氯仿/甲醇溶液进行脱脂以提取和溶解膜来自脂双层的蛋白质,跑PAGE胶分离膜蛋白, 还有人用抗体和生物素亲和纯化, 也有用高盐和高pH去除非膜蛋白。蛋白酶消化(胰蛋白酶和蛋白酶K)质谱和比对计算分析
文献推荐是用蛋白酶K去切割,因为膜蛋白缺乏胰蛋白酶位点,所以部分膜蛋白可能切割不彻底,从而保留大分子结构,被质谱过滤掉。应该用广谱蛋白酶K,但是我也看其他文献就是直接用胰蛋白酶去切割蛋白获得肽段。具体那个参考文献忘了,文末可以找找。
膜蛋白鉴定为其生物过程的调节提供了有价值的见解。具有更高质量准确度的先进仪器将允许更高的蛋白质组覆盖,这将加速膜蛋白的分析。这里推荐DIA蛋白检测技术。
因为DIA是数据采集非依赖模式,不会想Labelfree每个窗口选择丰度