实验报告 实验项目编号:实验二 实验名称:美拉德反应初始反应阶段的测定 实验学时:3 实验日期:暂时不写 实验地点:格致楼A415	实验目的 1. 了解美拉德反应的基本原理和测定方法。 二、实验原理 美拉德反应即蛋白质、氨基酸或胺与碳水化合物之间的相互作用。美拉德反应开始,以无紫外吸收的无色溶液为特征。随着反应不断进行,还原力逐渐增强,溶液变成黄色,在近紫外区吸收增大,同时还有少量糖脱水变成5-羟甲基糖醛(HMF),以及发生健断裂形成二羰基化合物和色素的初产物,最后生成类黑精色素。本实验利用模拟实验:即葡萄糖与甘氨酸在一定pH缓冲液中加热反应,一定时间后测定HMF的含量和在波长为285nm处的紫外吸光值。 HMF的测定方法是根据HMF与对一氨基甲苯和巴比妥酸在酸性条件下的呈色反应。此反应常温下生成最大吸收波长的550nm的紫红色。因不受糖的影响,所以可直接测定。这种呈色物对光、氧气不稳定,操作时要注意。 三、实验材料和试剂 (一) 仪器:分光光度计、水浴锅、试管、移液管等。 (二) 试剂 1.巴比妥酸溶液:称取巴比妥酸500 mg,加约70 mL水,在水浴加热使其溶解,冷却后转移入100 mL容量瓶中,定容。 2.对甲基苯氨溶液:称取对甲基苯氨l0.0 g,加50 mL异丙醇在水浴上慢慢加热使之溶解,冷却后移入100 mL容量瓶中,加冰醋酸l0 mL,然后用异丙醇定容。溶液置于暗处保存24小时后使用。保存4-5天后,如呈色度增加,应重新配制。 3. 1.0 mo1/L葡萄糖溶液。 4. 0.1 mol/L甘氨酸溶液。 5. 10%NaOH溶液。 6. 20%亚硫酸钠溶液。 四、实验步骤 (一) 取5支试管,分别加入5 mL 1.0 mo1/L葡萄糖溶液和0.1 mol/L甘氨酸溶液,编号为A1,A2,A3,A4,A5。A2,A4调pH到9.0,A5加亚硫酸钠溶液5 mL。5支试管置于90 ℃水浴锅内并记时,反应1 h,取A1,A2,A5管,冷却后测定它们的285 nm紫外吸收和HMF值。 (二) HMF的测定:A1,A2,A5各取2.0 mL于三支试管中,加对甲基苯氨溶液5 mL。然后分别加入巴比妥酸溶液l mL,另取一支试管加A1液2 mL和5 mL对甲基苯氨溶液,但不加巴比妥酸液而加l mL水,将试管充分振动。试剂的添加要连续进行,在1-2 min内加完,以加水的试管作参比,测定在550 nm处吸光度,通过吸光度比较A1,A2,A5中HMF的含量可看出美拉德反应与哪些因素有关。 (三) A3,A4两试管继续加热反应,直到看出有深颜色为止,记下出现颜色的时间。 五、注意事项 HMF显色后会很快褪色,比色时一定要快。 六、实验结果 (实验报告记录相关数据(见下表)及解释原因)。 A1 A2 A5 A285 nm A1 A1 A2 A5 反应液体积数 2 mL 对甲基苯氨溶液 5 mL 巴比妥酸溶液 0 1 mL 蒸馏水 1 mL 0 A550 nm A3 A4 反应总时间 七、思考题 1. 如何控制美拉德反应?