大家好,我做QPCR基因扩增效率的时候,一个基因由于CT太大,所以只进行4个2倍的稀释度,二步法退火温度是61度扩增效率不高只有78%(图1)溶解曲线(图3),所以我做了三步法退火温度59度扩增效率反而更低了只有57%(图2)溶解曲线(图4),很奇怪,请教下大家看这是什么原因,该怎么改进呢?有看到资料说把引物浓度提高,不知道效果怎样。
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图2
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图3~~~~~~~~~~~~~~~
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图4~~~~~~~~~
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viviwang1987
2倍的稀释度很容易产生误差(枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例)。
再加上你本身样品CT值就很大,通常来说CT值大于32可信度就已经降低了(因为样品稀释度很高时就不服从正态分布,而是服从贝努里分布)。
所以你的标准曲线数据重现性会很差,计算出来的效率也会忽高忽低。
建议先用PCR扩增目的基因,然后再用PCR后产物(最好是10倍等比稀释7个梯度,每个梯度做三个重复)来做标准曲线。
viviwang1987
举个简单例子说明这个问题:
1) 假设地上有1000个绿豆。现在你闭上眼睛从中间切下去,那么大致能对半分,也就是500:500(1:1)的关系。
2) 然后将其中的500再闭上眼睛从中间切下去,那么还是能大致对半分。
3) 如此反复进行。。。。
4) 当最后剩3个绿豆,现在再闭上眼睛从中间切下去,就有很大概率是一边3个,另一边0个(即全或无的关系)。
因此,如果绿豆数量多的时候,闭上眼睛从中间切下去,大致能对半分,这就是服从线性分布。
如最后绿豆数量减少到一定的时候,闭上眼睛从中间切下去,绝大部分情况是全或无的关系, 这时就服从贝努里分布。
回归qPCR:
“绿豆” = “DNA”
“闭上眼睛从中间切下去” = “二倍稀释” (强调“闭上眼睛”是因为我们稀释时也看不见DNA,保证随机性)。
当DNA稀释服从线性分布时,这时的qPCR就是传统意义上的qPCR. 这时候的标准曲线才时一条直线。
当DNA稀释服从贝努里分布时,这时的qPCR叫做"digital PCR(数字PCR)". 为什么起这个名字呢? 因为计算机存储是 0与1, 也就是 全或无。 以前大学生理学上提到过细胞动作电位的“全或无”现像也是这个道理,是数字信号,区号于模拟信号。
9900
无所谓吧。pcr效率本来就很少95%的。多数都是90%就不错了。只要每次实验都做标准曲线就可以了。
owanaka
楼主是用那个公司的染料?最近我也在做实时荧光PCR,发现扩增效率也降低了,本来90%以上的,现在只有60%左右了,不知是不是染料原因?
wiwi
我的是Thermo下的FINNZYMES
wiwi
楼主是用那个公司的染料?最近我也在做实时荧光PCR,发现扩增效率也降低了,本来90%以上的,现在只有60%左右了,不知是不是染料原因?
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可以说是染料原因,也可以说不是染料原因。
因为SYBR这个染料是靠嵌入DNA发光来检测DNA量的。所以必然会影响DNA复制的效率。另外SYBR是溶解在DMSO中的。如果量太大DMSO也会抑制PCR反应。
因此很多正常的引物用在SYBR里面都会效率下降,有时候需要重新设计引物。
但是只要质量合格,跟哪个公司关系不大。
wiwi
好像理论上95%-105%是算比较有效的扩增。
jude
我用的Evagreen,在ABI7500里扩增,用自带软件分析每次扩增效率都大于100%,一般都超过105%了。
nut6694
2倍的稀释度很容易产生误差(枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例)。
再加上你本身样品CT值就很大,通常来说CT值大于32可信度就已经降低了(因为样品稀释度很高时就不服从正态分布,而是服从贝努里分布)。
所以你的标准曲线数据重现性会很差,计算出来的效率也会忽高忽低。
建议先用PCR扩增目的基因,然后再用PCR后产物(最好是10倍等比稀释7个梯度,每个梯度做三个重复)来做标准曲线。
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2倍的稀释度很容易产生误差(枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例)。
再加上你本身样品CT值就很大,通常来说CT值大于32可信度就已经降低了(因为样品稀释度很高时就不服从正态分布,而是服从贝努里分布)。
所以你的标 ...谢谢,很好的建议!以后尝试下。就是有个问题,以前我相同方法,试剂什么也一样的情况下,这个基因CT值有30的,现在补做扩增效率,怎么也达不到30了,只有33左右。这是什么原因,模板降解了吗?我都是放在-20度的,就这次用的时候解冻了下。
nut6694
谢谢,很好的建议!以后尝试下。就是有个问题,以前我相同方法,试剂什么也一样的情况下,这个基因CT值有30的,现在补做扩增效率,怎么也达不到30了,只有33左右。这是什么原因,模板降解了吗?我都是放在-20度的,就这次用的时候解冻了下 ...有几个潜在原因:
1)首先就是你所说的模板降解。
2)荧光染料随时间增加而敏感性降低。
3)qPCR软件在处理数据过程中设置的baseline和threshold前后有所差别也会导致单一CT value的变化。
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有几个潜在原因:
1)首先就是你所说的模板降解。
2)荧光染料随时间增加而敏感性降低。
3)qPCR软件在处理数据过程中设置的baseline和threshold前后有所差别也会导致单一CT value的变化。 ...是啊,我的染料4月份就过期了。可能是这个的原因。
另外我最近一直有个关于兼并引物的困惑,一直没有被解答,很着急,能麻烦您有空的时候帮我解答下吗?不甚感激
xyw5
因为样品稀释度很高时就不服从正态分布,而是服从贝努里分布)。
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能否详细解释下这句话什么意思?本人数学不是很好。。。谢谢
33号
能否详细解释下这句话什么意思?本人数学不是很好。。。谢谢
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举个简单例子说明这个问题:
1) 假设地上有1000个绿豆。现在你闭上眼睛从中间切下去,那么大致能对半分,也就是500:500(1:1)的关系。
2) 然后将其中的500再闭上眼睛从中间切下去,那么还是能大致对半分。
3) 如此反复进行。。。。
4) 当最后剩3个绿豆,现在再闭上眼睛从中间切下去,就有很大概率是一边3个,另一边0个(即全或无的关系)。
因此,如果绿豆数量多的时候,闭上眼睛从中间切下去,大致能对半分,这就是服从线性分布。
如最后绿豆数量减少到一定的时候,闭上眼睛从中间切下去,绝大部分情况是全或无的关系, 这时就服从贝努里分布。
回归qPCR:
“绿豆” = “DNA”
“闭上眼睛从中间切下去” = “二倍稀释” (强调“闭上眼睛”是因为我们稀释时也看不见DNA,保证随机性)。
当DNA稀释服从线性分布时,这时的qPCR就是传统意义上的qPCR. 这时候的标准曲线才时一条直线。
当DNA稀释服从贝努里分布时,这时的qPCR叫做"digital PCR(数字PCR)". 为什么起这个名字呢? 因为计算机存储是 0与1, 也就是 全或无。 以前大学生理学上提到过细胞动作电位的“全或无”现像也是这个道理,是数字信号,区号于模拟信号。
vvmmoy
最近在做QPCR之前用罗氏的SYBR做得很好,扩增效率均在95%,引物溶解曲线是单峰,特异性好。但是老板换了TOYOBO的SYBR同样的体系扩增效率下降了60%,扩增效率很低,荧光染料也会影响扩增效率么?
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