生物化学实验报告 题目:柱层析分离色素 姓名:余振洋 学号:200900140156 同组者:张刚刚 系年级:09 级生科 3 班 时间:2011/5/5 一、【实验目的】 1.了解柱层析的分类,掌握各种柱层析的原理。 2. 熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。 二、【试验原理】 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质,主要由叶绿素 a, 叶绿素 b,胡萝卜素和叶黄素组成。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,可用 丙酮、甲醇、乙醇等提取。 分离色素的方法有很多,可以用纸层析、薄膜层析、柱层析等。层析分为固 定相和流动相两部分, 当流动相从固定相上流过时,由于混合物中各成分在两相 间具有不同的分配系数,它们的移动速度不同,使样品中的混合物得到分离。 分离提纯是研究化学物质的前提,而层析是一种很好的分离提纯方法。层析 的原理是混合物在层析系统中的分配系数不同而达到分离提纯的目的。 本实验采 用的是比较简单的柱层析, 柱层析法分离的色素顺序应该为色素下移顺序:黄色 (胡萝卜素)——蓝绿(叶绿素 a)——黄绿色(叶黄素)——绿色(叶绿素 b) 。 三、 【试验器材】 层析拄(1×30cm) ,研钵,蒸馏装置,脱脂棉,天平,漏斗,三角瓶,分液漏 斗,烧杯等。 四、 【实验试剂】 1. 无水乙醇 2. 石英砂 3. 丙酮 4. 石油醚(60-90℃) 5.碱性 Al2O3 6.饱和氯化钠溶液 7.无水硫酸钠 8.洗脱掖:丙酮:石油醚=1:9 五、 【实验操作】 1.层析拄的制备: 取 12g 碱性三氧化二铝加入 30ml 石油醚搅拌,浸泡 10min.。在层析拄内加 入一团棉花在底部,再加入石英砂 0.5cm 以上,然后用石油醚半充满柱子,再将 浸泡好的三氧化二铝倒入柱内,倒时应该缓慢,重复使用下面的石油醚,直到装 完。用石油醚洗柱内壁,顶部加一小团棉花,然后再填入石英砂 0.5 厘米高。 2.色素的提取: 取 20g 菠菜,加少许石英砂,再加 30ml 无水乙醇研磨成浆,用脱脂棉过滤, 保存滤液,滤渣再用无水乙醇提取一次,合并滤液,滤渣再加入 30 毫升石油醚 提取一次,过滤,合并滤液,转移至分液漏斗中,再加入 40ml 饱和氯化钠溶液 振荡,弃去下层溶液,再分别加入 20 毫升水震荡洗涤几次,直至下层无色,保 留上层溶液,转移至三角瓶中,加入无水硫酸钠干燥 5 分钟,备用。 3.样品的浓缩: 将提取液放入蒸馏烧瓶中,蒸除多余的石油醚,至剩余液体 5-8ml 左右,以 备加样使用。 4.样品的分离层析:吸附层析分离色素 打开层析柱下部开关,向柱内加入 2ml 浓缩液,至液体没入砂内,再加入石 油醚冲洗柱壁,液体浸入砂内,加洗脱液开始层析,可以看到不同色带被分离出 来,直至洗脱完毕,在柱下面用试管分别接收不同色带的洗脱液,其颜色分别为 深黄—暗绿—黄绿—绿 六、 【注意事项】 1.在进行层析柱的制备时, 整个操作过程中溶剂都要保持高于三氧化二铝表面, 同手,整个装置要保持水品,以免样品倾斜,最终导致分离色素时各处的起点不 一致。 2.在分离色素时,要控制流速,以每分钟 60-80 滴为宜。流速过快,则吸附时 间过短,色素分离不开,一般只能分离出 3 种色带(深黄—黄绿—深绿) ;流速 过慢,则作用时间过长,色素洗脱很慢,浪费时间。 3.加样量不要过大,过大,分离条带过宽,如果层析拄不够长,各组分不易分 开,易同时洗脱下来;加样量过少,色带不是很清楚,不易观察,效果不好。 4.在研磨菠菜叶时,不要研磨得太细,否则会透过脱脂棉,造成堵塞。 5.色素提取过程中,分液漏斗震荡不能太激烈,防止生成小油滴。 6.蒸馏时,在溶液剩下 10 多毫升时,就应该停止加热,而利用余热将溶液蒸至 所需的量。 7.往层析柱内加样时,要沿着柱壁转圈加,使得四周的浸润速度和高度尽可能 保持一致,这样可使样品下降与胶面相切。 七、 【实验结果】 图一 黄色(胡萝卜素)带开始分离 图二 提取出的黄色胡萝卜素 八、 【结果分析及讨论】 分析: 从实验结果可以看出,黄色(胡萝卜素)带并不是一条平稳的带,而是呈现 波浪线的状态。造成这种现象的原因可能是:1、操作过程中,整个装置未保持 水平;2、往柱内加样时,四周浸润的程度和高度不同,造成样品起点不同,最 终他的下降与胶面不相切,造成不再同一水平线上;3、在石英砂里存在气泡, 造成四周下降速度不一致;4、分离色素时流速过快,使得黄色色素环的变形更 为严重。 讨论: 为什么实验只需接受胡萝卜素? 答:首先从原理上看, 柱层析是因为叶绿体色素中各色素在两相之间具有不 同的分配系数, 造成其被吸附剂吸附的程度不同,同时它们被溶剂溶解的能力也 不同,所以在层析柱中向下移动的距离和速度不同,最后得到分离。 而在叶绿体内的所有色素中,胡萝卜素分子最小,极性最小,且是单纯的碳 氢化合物,溶解度最大,所以扩散速度最快。而其他色素中除了叶黄素扩散速度 仅次于胡萝卜素外,剩余的色素扩散都很慢。考虑到实验时间及实验目的,即重 点为掌握原理和操作方法而非结果等因素,故只需分理出胡萝卜素。