药物多晶型现象是影响药品 质量与临床疗效的重要因素之一,因此对存在多晶型的药物进行研发以及 审评时,应对其晶型分析予以特别的关注。目前鉴别晶型主要是针对不同 的晶型具有不同的理化特性及光谱学特征来进行的,现将几种常用且特征 性强、区分度高的方法介绍如下,以供参考。 1 X-射线衍射法(X-ray diffraction) X-射线衍射是研究药物晶型的主要手段,该方法可用于区别晶态和非 晶态,鉴别晶体的品种,区别混合物和化合物,测定药物晶型结构,测定 晶胞参数(如原子间的距离、环平面的距离、双面夹角等),还可用于不 同晶型的比较。X-射线衍射法又分为粉末衍射和单晶衍射两种,前者主要 用于结晶物质的鉴别及纯度检查,后者主要用于分子量和晶体结构的测定。 1.1 粉末衍射 粉末衍射是研究药物多晶型的最常用的方法。粉末法研 究的对象不是单晶体,而是众多取向随机的小晶体的总和。每一种晶体的 粉末 X-射线衍射图谱就如同人的指纹,利用该方法所测得的每一种晶体的 衍射线强度和分布都有着特殊的规律,以此利用所测得的图谱,可获得出 晶型变化、结晶度、晶构状态、是否有混晶等信息。该方法不必制备单晶, 使得实验过程更为简便,但在应用该方法时,应注意粉末的细度,而且在 制备样品时需特别注意研磨过筛时不可发生晶型的转变。 1.2 单晶衍射 单晶衍射是国际上公认的确证多晶型的最可靠方法,利 用该方法可获得对晶体的各晶胞参数,进而确定结晶构型和分子排列,达 到对晶型的深度认知。而且该方法还可用于结晶水/溶剂的测定,以及对成 盐药物碱基、酸根间成键关系的确认。然而,由于较难得到足够大小和纯 度的单晶,因此该方法在实际操作中存在一定困难。 2 红外吸收光谱法 不同晶型药物分子中的某些化学键键长、键角会有所不同,致使其振 动-转动跃迁能级不同,与其相应的红外光谱的某些主要特征如吸收带频 率、峰形、峰位、峰强度等也会出现差异,因此红外光谱可用于药物多晶 型研究。目前已知的由于晶型不同引起红外光谱不同的药物有甲苯咪唑等 20 多个品种。 红外光谱法常用的样品制备方法有 KBr 压片法、石蜡糊法、漫反射法 以及衰减全反射法(attenuated total reflection, ATR)等。考虑到研 磨可能会导致药物晶型的改变,所以在用红外光谱法进行药物晶型测定时 多采用石蜡油糊法,或采用扩散反射红外傅里叶变化光谱法(DRIFT)。近 些年来,随着计算机及分析软件的发展,近红外傅里叶变换拉曼光谱法 (NIR-FTRS)也应用在药物多晶型的定性、定量研究中,它融合了 NIR 速 度快、不破坏样品,不需试剂、可透过玻璃或石英在线测定的优势[6]和拉 曼光谱不需专门制备样品以及对固体药物晶型变化灵敏的特点,可视为传 统红外光谱法研究药物多晶型的一种延伸。 红外光谱法较为简便、快速,然而对于部分晶型不同而红外图谱相同 或差别不大的药物,红外光谱就难以区分了,如苯乙阿托品的晶型 I 和晶 型 II 的红外光谱一致;而且有时图谱的差异也可能是由于样品纯度不够, 晶体的大小,研磨过程的转晶等导致的分析结果偏差。这时就需要同时采 取其他方法共同确定样品的晶型。 3 熔点法和热台显微镜法 如上所述,药物晶型不同,熔点可能会有差异,除常见的毛细管法和 熔点测定仪方法外,热台显微镜也是通过熔点研究药物多晶型存在的常见 方法之一,该方法能直接观察晶体的相变、熔化、分解、重结晶等热力学 动态过程,因此利用该工具照药典规定进行熔点测定可初步判定药物是否 存在多晶现象。 部分药物多晶型之间熔点相差幅度较小,甚至无差别,故以熔点差异 确定多晶型,只是初步检测方法之一。一般来说,晶型稳定性越高熔点也 越高;两种晶型的熔点差距大小,可以相对地估计出它之间的稳定性关系。 如果两种晶型熔点相差不到 1℃时, 则这两种晶型在结晶过程中就可以同时 析出,且两者的相对稳定性较难判别。两者熔点越接近,不稳定的晶型越 不易得到。 4 热分析法 不同晶型,升温或冷却过程中的吸、放热也会有差异。热分析法就是 在程序控温下,测量物质的物理化学性质与温度的关系,并通过测得的热 分析曲线来判断药物晶型的异同。热分析法主要包括差示扫描量热法、差 热分析法和热重分析法。 4.1 差示扫描量热法 (differential scanning calorimeter, DSC) DSC 是在程序控制下,通过不断加热或降温,测量样品与惰性参比物(常用 α-Al2O3)之间的能量差随温度变化的一种技术。DSC 多用于分析样品的熔 融分解情况以及是否有转晶或混晶现象。 4.2 差热分析法(differential thermal analysis, DTA) DTA 和 DSC 较为相似,所不同的是,DTA 是通过同步测量样品与惰性参比物的温度差来 判定物质的内在变化。各种物质都有自己的差热曲线,因此 DTA 是物质物 理特性分析的一种重要手段。 4.3 热重分析法(thermogravimetric analysis, TGA) TGA 是在程序 控制下,测定物质的质量随温度变化的一种技术,适用于检查晶体中溶剂 的丧失或样品升华、分解的过程,可推测晶体中含结晶水或结晶溶剂的情 况,从而可快速区分无水晶型与假多晶型。 热分析法所需样品量少,方法简便,灵敏度高,重现性好,在药物多 晶型分析中较为常用。 5 偏光显微镜法 偏光显微镜除了含有一般光学显微镜的结构外,最主要的特点是装有 两个偏光零件,即装在载物台下方的起偏镜(又称下偏光镜)和装在镜筒中 的分析镜(又称上偏光镜)。两镜均由人工合成偏光片组成,通过角度的调 整,可将射入光源转换成正交偏光。正因为如此,该方法主要适用于透明 固体药物。 透明固体药物的观测一般是在正交偏光下进行。由于晶体结构不同和 偏光射入时的双折射作用,在偏光显微镜上、下偏光镜的正交作用下,晶 体样品置于载物台上旋转 360º时,则晶体显现短暂的隐失和闪亮,晶 体隐失时晶体与偏振器振动力向所成的交角称为消光角,通过不同的消光 角,即可决定晶体所属的晶型]。 偏光显微镜法还可研究晶型间的相变,可以准确测定晶体熔点;对于 具有各项向异性的动植物材料(如纤维蛋白、淀粉粒)的结构,具有特殊的 鉴定作用。 6 核磁共振法 不同晶型结构中分子中的原子所处化学环境存在细微差异,类似核对 施加的外磁场即产生不同的响应,致使类似核在不同化学位移处发生共振, 因此其 13C—NMR 谱图不同,通过对不同晶型图谱的对比,即可判断药物是 否存在多晶现象,通过与已知晶型的 13C—NMR 比较,也可获得测试样品的 具体晶型。尤其是近年来出现的固态 13C—NMR、高效质子去耦合、交叉极 化(CP)、幻角自旋(CAS)等新技术的应用,使得我们能获得高分辨率的 13C—NMR 谱,这种谱图能给出有关动力学和局部化学环境的详细原子水平 的信息,因此利这种高分辨率的 13C—NMR 谱图可进行多晶型的混晶分析以 及某种特征晶型的测定。 扫描隧道显微镜法 扫描隧道显微镜可使人类能够直接观察到晶体表面上的单个原子及其 排列状态,并能够研究其相应的物理和化学特性;可以直接观测晶体的晶 格和原子结构、晶面分子原子排列、晶面缺陷等。因此 STM 用于药物多晶 型研究非常有利,具有广阔的应用前景。 8 溶解度方法 如前所叙,药物的不同晶型的自由能不同,导致了其溶解度不同,一 般说来,自由能越大,晶型越不稳定,溶解度越大;反之则小。在实践中 常测定各晶型再不同温度下的溶解度,并绘制出溶解度(Cs)-温度(T) 曲线。通过测定 Cs-T 曲线,可以区分出不同的晶型,如有相交的曲线,还 可得到其热力学转变温度(Tp) 9 药物多晶型计算机辅助预测 近年来,随着计算机技术的发展,计算机辅助预测药物晶型也有了较 大进展。例如,在固体药物结构已知的前提下,运用商业程序 Polymorph Predictor, 通过计算点阵能量最小化方法寻找能量上可能的晶体结构和 分子排列规律,并将它们按能量大小排列,计算出不同洁净条件下的最可 能生成的晶型。但该方法在药物中的成功率目前还较低。 10 其 他 除上述常见的的几种方法外,还可根据不同晶型药物因分子或原子在 晶格空间排列不同所导致在密度、折射率、吉布斯自由能等方面的差异, 通过测定药物的密度、折光率或采用磁性异向仪和膨胀计等仪器进行不同 晶型的确定;对于存在色多晶型药物,还可通过观察药物的颜色,推测药 物动物晶型。另外随着科学技术的进步,随着对化学物质细微结构认识的 加深,相信还会有新的技术手段可用于药物晶型的研究。 11 结 语 上述所提及的药物晶型确定方法多数仅能反映药物不同晶型某一方面 的物理性质,因此,不同测试手段的综合运用,可达到对药物晶型的全面 认识。近年来出现的红外与热显微镜法,以及差示扫描量热法与热台显微 镜法联用方法即是该思路的一种体现。