艾叶(Folium Artermisiae Argyi),别名大艾叶、杜艾叶、萎蒿。为菊科植物艾叶Artermisiae argyi Levl.et Vant 叶。性温,味苦、辛,散寒止痛,温经止血。用于小腹冷痛、经寒不调、宫冷不孕、吐血、崩漏经多、妊娠下血、皮肤瘙痒[1]。艾叶挥发油具有平喘、镇咳、祛痰和消炎等作用[2]。
艾叶挥发油具有明显的平喘、镇咳、去痰、消炎、抗过敏之功效,已制成胶囊剂用于慢性支气管炎、肺气肿、小儿咳嗽、哮喘等病症[3]。在:2003年非典流行期问,用艾叶制作的卷烟曾受到消费者的青睐。20世纪80年代以来,有关艾叶挥发性成分已有一些报道[4],这些研究多集中在不同产地、提取条件等方面的分析,而没有涉及艾叶中黄酮类化合物的提取。
1.2 艾叶的抗氧化性研究进展
艾叶中含有黄酮类化合物,这些化合物是一种天然的抗氧化剂,具有清除人体中氧自由基、抗衰老、增强机体免疫力的生理活性,在预防与治疗疾病方面黄酮类物质具有广阔的应用前景。对与艾叶中黄酮类化合物的提取,有很多种方法,曾虹燕等人通过超临界CO2萃取和微波辅助萃取艾叶挥发油的试验,考察了影响提取的主要工艺和最佳工艺条件。
饮食中的抗氧化剂长期以来倍受国内外学者的关注,这是因为:(1)食物中的抗氧化剂能够保护食物自身,以免食物氧化损伤而变质;(2)在人体中可以清除自由基,起到预防衰老、癌症和心血管疾病等作用。(3)可被机体吸收的抗氧化剂在机体内的组织器官中发挥作用;(4)食物中的某些抗氧化剂可作为植物提取物或纯化物作为治疗药品。
但动物与植物体内存在许多抗氧化物质参与组成体内的抗氧化体系,包括已知的抗氧化物质如维生素 C、维生素 E、β-胡萝卜素、尿酸、黄酮等,还有一些尚未认识的抗氧化物质。由于抗氧化物众多,单个抗氧化剂对抗氧化状态并不能代表他们在体内相互协同作用,因此,相应产生多种测定样品的总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)或总清除自由基抗氧化能力(total radical-trapping antioxidant capacity,TRAC)。
1.3 抗氧化剂概念及作用机理
1.3.1 抗氧化剂概念
在食品体系中,抗氧化剂[5]被定义为:能够阻止或延缓食品氧化,以提高食品稳定性和延长储藏期的食品添加剂。
在生物体系中,抗氧化剂是指:任何物质,能够在低剂量下明显组织和延缓易被氧化物质的氧化。后一个定义中涵盖所有易被氧化物质,包括脂,蛋白质,DNA和碳水化合物等。生物抗氧化剂定义范围如此广大,已失去其传统意义,而以前我们将一些抗氧化活性归功于一些植物提取物和黄酮类物质,实际上可能是其他一些物质在起作用。
1.3.2 抗氧化剂作用机理
金属离子鳌合剂是通过与过渡金属离子形成络合物,阻碍金属离子催化脂过氧化物分解。此外作用机理还有单线态氧胙灭,氧清除,氧化酶抑制等。
在食品和生物体系中抗氧化反应非常复杂,几种作用机理会同时参加其中。在测定时如果仅将作用机理限制为某一种,可能会忽略样品中其他重要抗氧化剂。另一方面,如果范围太大,包含太多类型反应,不仅费时费力,而且还会影响我们对作用机理的准确了解。要对抗氧化反应有一个合理的解释需做到以下几点[6]:
1、测定这种抗氧化剂是用哪种易被氧化底物。
2、准确测量氧化反应和氧化抑制程度,选择合适氧化反应阶段作为终点。
3、确定所选氧化底物和氧化反应是氧化受损真正来源
4、确定抗氧化剂任何可能促氧化反应
1.4 抗氧化能力的测定方法
目前常用的方法主要基于两类[7]:①通过测定样品抑制脂类物质氧化的能力来评定被测物的抗氧化能力(表1); ②用样品对人工生成的自由基的清除能力来反映待测物的抗氧化活性(表2)。
表1 测定样品对脂类物质氧化抑制的能力来评定被测物的抗氧化能力方法
被氧化底物的种类 环境及条件 测量,定量方法 样品
猪油 40 ℃±2℃ 过氧化物值POV 蜂胶
色拉油 60 ℃±1℃ 硫代巴比妥酸底物法 脂溶性茶多酚
过氧化物值 POV
Tween乳化的亚油酸 25 ℃ 含β- 胡萝卜素 维生素C
(含β- 胡萝卜素) 血红蛋白 的降解率 葡萄糖
SDS乳化的亚油酸 40℃,数分钟 共轭二烯(234nm) 香豆素,苯乙
AAPH 吸光度 烯酸,黄酮
甲基亚油酸 37 ℃ , HPLC法测产生的氢 荞麦中的活性
AMVN 12 过氧化物成分
人体血清低密 2小时以上,Cu 2+ 共轭二烯(234nm) 葡萄酒
度脂蛋白(HDL) 正铁血红蛋白 己烯醛降解时间
氧化抑制率 %
人体血清低密 37 ℃,2 小时 顺- 18碳四烯酸吸 酚类化合物
脂蛋白(含AWVN 光度的减少
顺- 18碳四烯酸
注:Tween:山梨糖醇酐单脂肪酸酯聚氧乙烯醚,SDS:十二烷基硫酸钠,AAPH:2 ,2′- 偶氮(2 - 眯基丙烷)二氯化氢,AWVN:2 ,2′- 偶氮(2 ,4 - 二甲基戊睛)。
表2 对人工生成的自由基的清除能力来反映待测物的抗氧化活性的方法
自由基反应物 环境条件,诱导剂 测量和定量方法 样品
DPPH 515nm下DPPH+ 的 葡萄酒
减少 EC50
DMPD FeCl3 515nm下DPPH+ 的 葡萄酒
减少Trolox当量
β- PE(ORC法) 37 ℃,AAPH β-PE荧光强度的变化 水果,蔬菜
CCl3O2• Trolox当量,CCl3O2 没食子酸
的反应速率常数
•OH(Fenton反应) Fe2 + H2O2 420nm下吸光度的变化 核桃,黄豆
花生,姜等
O2 • 次黄嘌呤- 黄嘌 氧化酶的抑制 酚类提取物
呤氧化酶
注:DPPH:2,2-二苯代苦味肼,DMPD:氮,氮-二甲基-对苯二胺,二氯化氢,Trolox:6 —羟基 2 ,4 ,7 ,8-四甲基-2-羧酸,EC 50:清除DDPH•50 %所需用量,β- PE:β- 藻红蛋白。
1.4.1 抗脂类物质过氧化法
抗脂类物质过氧化法有以下几种方法:
1、食用油脂或富含油脂的食物作为被氧化的底物:
在油脂的结构分子中有不饱和键,在氧气、水、金属离子、光照和受热等情况下,其中的不饱和键会变成酮、醛及醛酮酸。这个过程的反应历程之一是游离基链式反应。所以,油脂氧化抑制的作用机理之一就是放出特定的游离基,使链式反应中断。研究表明[8],在有氧的条件下抗氧化剂将氢原子提供给过氧化物自由基LOO•反应,缺氧时提供氢原子给烷烃自由基L•反应(2)
AH + LOO•→LOOH + A• (1)
AH + L•→LH + A• (2)
反应(1)是食品和生物体系中最常见的反应,也是实验中常用氧化指标。
2、亚油酸及甲基亚油酸作为被氧化基质:
在食用油脂体系中,脂类的自动氧化非常复杂,几种作用机理会同时参与其中。在测定时如果仅将作用机理限制为某一种,可能会忽略掉样品中其它重要的抗氧化剂。另一方面 ,如果范围太大包含太多类型的反应,不仅费时费力,而且还会影响我们对作用机理的准确了解[9]。而胶束体系相对简单而且体系均匀,且抗氧化剂能够在水相和油相间快速实现分配平衡。这就避免了在食用油脂体系中分配效应对抗氧化剂的活性的影响。许多实验选择乳化亚油酸、甲基亚油酸作氧化基质,一方面亚油酸作为多不饱和脂肪酸极易被氧化,另一方面乳化亚油酸、甲基亚油酸在水相中易形成胶束。
3、低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(HLDL)作被氧化的底物:
许多学者用抗氧化剂抑制LDL 和HLDL 的过氧化的能力来评价样品的抗氧化活性。
1.4.2 测定抗氧化剂清除自由基能力的方法
自由基是指一类可以独立存在的含有未配对电子的物质,包括分子、原子、原子团或离子。主要包括超氧阴离子(O2-•)、过氧化氢、羟自由基(OH•)、单线态氧[10](O)等,这些不成对的电子使自由基具有不稳定性和高反应性。大量的自由基产生呈现对生物体的强大破坏作用。
1、羟自由基(OH•)清除法
在生命活动的代谢氧化代谢过程中不断产生各种自由基,其中羟自由基(OH•)是体内最活泼的活性氧,可导致许多病理变化。因此羟自由基的检测对自由基的生物作用研究具有重要意义。
2、超氧阴离子自由基(O2-•)清除法
虽然超氧阴离子自由基(O2-•)不能直接诱导生物和食品体系中的脂类氧化,但它会在金属离子的催化下发生 Fenton 反应产生具有高活性的羟自由基(OH-)。因此常用样品对超氧阴离子自由基(O2-)的清除能力来反映抗氧化活性。
3、DMPD自由基清除法
DMPD: 氮 ,氮-苯二甲基-对二胺,二氯化氢也是一种有机自由基前体物,在酸性条件下可被Fe3+ 、H2O2、Cu2+ 等氧化形成有色自由基(DMPD•),反应原理如下:
DMPD-+ 氧化剂 + H+ →DMPD -
DMPD- +•AOH →DMPD+ + AO•
然后在505nm下根据吸光度值的变化判定样品清除自由基的能力,能力大小用 Trolox 当量(TEAC)来表示。
4、DDPH自由基清除法
此法是依据 DPPH•在517nm处有一强吸收和其乙醇溶液呈紫色的特性,在有自由基清除剂时,由于与其单电子配对而使其吸收消失,其褪色程度与其接受的电子数成定量关系,因而可用分与测试体系密切相关。
5、ORAC法
即氧自由基清除能力法,采用藻红蛋白(phy-coerythrin, PE)作为指示蛋白,以2,2′- 偶氮(2- 脒基丙烷)二盐酸盐、Cu2+ - H2O2体系产生的 Fenton反应或者过度金属离子 Cu2+分别作为脂过氧化自由基(LOO•)、羟自由基(OH•)和过渡金属离子的发生源,Trolox作为标准参照物,PE在自由基的攻击下,一定波长下的荧光度不断衰减,而具有自由基清除能力的样品可以保护它免受攻击,根据PE荧光强度衰减曲线下的面积变化计算出被测样品的自由基清除能力。由于本方法采用不同自由基发生物,由此可以测试样品对不同自由基的清除能力 。
6、TRPA法
即总自由基清除法,用来测定血浆或血清的总抗氧化能力。此法是用2, 2′- 偶氮(2 - 脒基)丙烷盐酸(ABAP)产生过氧化物自由基与血浆中的抗氧化剂反应来测定样品的抗氧化能力。能力大小用Trolox当量 TEAC 来表示。
本项目以艾叶为研究对象,对从中提取黄酮类化合物的工艺进行研究,在提取过程中,通过单因素试验,分析主要影响因素对提取率的影响。在单因素的基础上,通过正交试验,得到最佳提取工艺。再利用“还原活性”“总抗氧化活性”、“超氧阴离子”等抗氧化模型,对从中提取得到的总黄酮的抗氧化活性进行考察。
2 实验部分
2.1 实验原料与仪器
2.1.1 实验原料
艾叶、芸香叶芦(芦丁)、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、甲醇、工业酒精、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氰铁酸钾、赤血盐、硫氰酸铵、三氯乙酸、三氯化铁、二氯化铁、Tris(三-羟基氨基甲烷)、NADH(辅酸-I,二钠盐)、NBT(氯化硝基四 氮唑蓝)、PMS(N-甲基吩嗪甲基)、番红花红(藏红)、EDTA-Fe(Ⅱ)、Vc、亚油酸,吐温-20等。
2.1.2 实验仪器
752紫外可见分光光度仪,电子分析天平,电热恒温水浴锅,植物粉碎机,恒温鼓风干燥箱,离心机,容量瓶,移液管等。
2.2 实验方法
2.2.1 提取溶剂的确定
黄酮类化合的提取通常采用水提取和极性溶剂提取两种方法[11]。极性溶剂易渗入至原料的内部,提取效果要好于水提取发;极性溶剂中,乙醇的使用安全性高,价格较低,可回收再利用。所以本研究采用乙醇作为艾叶中黄酮类化合物的提取溶剂。
2.2.2 提取工艺条件的确定
溶剂提取效果受溶剂浓度、提取温度及提取时间等因素影响。本试验采用单因素试验和正交试验来确定艾叶中黄酮类化合物最佳工艺的条件。
2.2.3 黄酮类化合物测定方法
采用NaNO2-A1(NO3)3-NaOH显色法[12]。铝盐在碱性条件下与黄酮类化合物形成络合物,在一定波长下有最大吸收峰,在此波长下可以进行比色分析。加入的亚硝酸起还原剂作用,防止黄酮类化合物受氧化而损失。
2.2.4 标准曲线的制备
准确称取经105℃干燥至恒重的芦丁0.012g,用体积分数为60%的乙醇溶液微热溶解,冷却后移入100mL容量瓶中,摇匀,定容,此标准溶液的浓度为0.12g/L。分别吸取标准液0,1,2,3,4,5mL于25mL容量瓶中,分别加入体积分数为30%乙醇至6mL,加入质量分数为5%NaNO2 0.3mL,摇匀,放置5min,加入质量分数为10%Al(NO3)3,摇匀,放置6min,再加入1mol/L的NaOH溶液2mL,加水至刻度,摇匀,静置10min,于波长510nm处测定吸光度,以试剂空白作为参比液。以吸光度为横坐标、芦丁浓度为纵坐标画标准曲线。
2.2.5 提取液中黄酮类化合物含量的测定
准确吸取提取液1mL,用与提取时同浓度的乙醇溶液稀释至25mL。取1mL稀释液置于试管中,然后按与标准曲线相同的方法测定提取液的吸光度,计算提取率e。
e=YaV/W
式中 Y——黄酮类物质的质量浓度,mg/mL
V——原提取液体积,mL
W——提取用艾叶的质量,mg
a——稀释倍数
根据所测定溶液的吸光度,用曲线方程计算出Y。
2.2.6 总抗氧化能力测试实验方法
分别取0、1.0ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml不同浓度的艾叶提取溶液与不同浓度的Vc溶液,加入2.5ml 0.2M,pH6.6的磷酸缓冲液和2.5ml 1%(W/V)的赤血盐溶液,于50℃水浴反应20min,急速冷却,再加入2.5ml 10%(W/V)的三氯乙酸,将混合物于3000rpm离心10min,取上清液2.5ml于25ml容量瓶中,0.5ml 0.1%(W/V)三氯化铁,用蒸馏水定容至刻度,混合均匀,于700nm处测吸光值[13]。
2.2.7 超氧阴离子自由基测试实验方法
超氧阴离子自由基产生在PMS-NBT[14]系统下通过NADH的氧化和NBT的还原对其进行分析的。在此实验中,超氧阴离子自由基的生成是通过3ml的Tris-HCl ( 16mM, pH8.0 ) ,其中包括78M NADH,50M NBT,10M PMS,和不同浓度的样品。PMS作为反应的促成剂最后加入反应体系中,反应混合物在室温静置5min后,在560 nm处测定吸光度。
2.2.8 羟基自由基测试实验方法
羟基自由基•OH是反应活性大、氧化能力很强的自由基,可以使糖类、氨基酸、蛋白质核酸和脂类等发生氧化、遭受损伤与破坏。原理是化学发光试剂与活性氧自由基反应生成激发态的产物,产物中的电子经非辐射性跃迁回到基态,放出光子。
采用Fenton反应产生的羟基自由基可使番红花红褪色的原理来检测。在25mL容量瓶中加pH=7.4的磷酸盐缓冲液5.0mL, 50g/ml的番红花红5.0mL,不同浓度的供试液0.5mL,3%的过氧化氢5.0mL(新鲜配置),2mmol/L EDTA-Fe(Ⅱ)2.5mL(新鲜配置),用二次蒸馏水标定至刻度,混合均匀后于37℃水浴中反应30min后,在520nm处测定吸光度。空白组以二次蒸馏水代替供试液,对照组以二次蒸馏水代替EDTA-Fe(Ⅱ)和供试液,并按下式计算清除率:
清除率=(A样品—A空白)/(A对照—A空白)。
其中:A样品是加入样品后的吸光度,A空白是未加样品的吸光度,A对照是未加样品和EDTA-Fe(Ⅱ)的吸光度。
3 结果与讨论
3.1 艾叶中黄酮类物质的提取
3.1.1 芦丁标准曲线的绘制
图1 芦丁标准曲线
芦丁标准曲线如图1所示,R为相关系数。
3.1.2 单因素分析实验
(1)不同乙醇浓度对提取率的影响
精确称取6份(0.25g)艾叶粉(用植物粉碎机粉碎后过0.4mm的筛子)[12]于具塞试管中,分别加入体积分数为0,20%,40%,60%,80%,100%的乙醇各7.5mL,在60℃恒温水浴锅中提取4h,趁热过滤,冷却后分别取1mL提取液,置于25mL容量瓶中,用同浓度的提取液定容至25mL,然后按照2.2.5条的方法,分别加入体积分数为30%乙醇至6mL,加入质量分数为5%NaNO20.3mL,摇匀,放置5min,加入质量分数为10%Al(NO3)3,摇匀,放置6min,再加入1mol/L的NaOH溶液2mL,加水至刻度,摇匀,静置10min,于波长510nm处测定吸光度,以试剂空白作为参比液。图2表明,随着乙醇体积分数C的提高,黄酮的提取率呈上升到下降的趋势,体积分数达到40%,提取率最大,浓度大于40%后随着体积分数的进一步升高,黄酮提取率反而有所下降.这可能是因为艾叶中黄酮为多种化合物的混合物,包括各种黄酮苷和苷元,这些物质由于极性和化学结构不同,在不同极性的提取溶剂中的溶解度也不相同。本实验表明,体积分数为40%的乙醇溶液相对于其他浓度能更好地提取出艾叶中的黄酮类化合物。
图2 不同乙醇浓度对提取的影响
(2)料液比对提取率的影响
精确称取4份(0.50g)艾叶粉于具塞试管中,分别加入乙醇浓度为40%的乙醇5,10,15,20mL,料液比分别为1:10,1:20,1:30,l:40。在60℃恒温水浴锅中提取4h,趁热过滤,冷却后分别取1mL提取液,置于25mL容量瓶中,用同浓度的提取液定容至25mL,然后按照2. 2. 5条的方法进行黄酮类化合物的测定。图3表明,随着料液比W: V的升高,提取率也随之增大,但当料液比达到1: 30后,黄酮类化合物的提取率增加缓慢.黄酮类化合物的提取在考虑提取率的同时,还应该考虑提取剂用量和提取液蒸发浓缩时的能源消耗[15],因此需要对料液比进行进一步的研究。
图3 料液比对提取率的影响
(3)提取时间对提取率的影响
精确称取4份(0.25g)艾叶于具塞试管中,加入乙醇浓度为40%的乙醇各7.5mL,在60℃的恒温水浴中分别提取1,2,3,4h,趁热过滤,冷却后分别取1 mL 提取液,置于25mL容量瓶中。用同浓度的提取液定容至25mL,然后按照2. 2. 5条方法进行黄酮类化合物的测定。图4表明,提取时间为1h时,提取率较低;随着时间的延长,艾叶黄酮类物质的提取率不断上升,但是升高的幅度逐渐变小。
图4 提取时间对提取率的影响
(4)提取温度对提取率的影响
精确称取5份(0.25g)艾叶于具塞试管中,分别加入乙醇浓度为40%的乙醇各7.5mL,分别在40,50,60,70℃的恒温水浴中提取4 h,趁热过滤,冷却后分别取1mL提取液,置于25mL容量瓶中,用同浓度的提取液定容至25mL,然后按照2.2.5条的方法进行黄酮类化合物的测定。图5表明,随着提取温度的升高,提取率呈增加的趋势。但综合考虑提取温度过高会对提取液中的黄酮类化合物的活性造成破坏,杂质溶出较多,同时高温提取能耗也较大,因此提取温度以不超过70℃为好。
图5 提取温度对提取率的影响
3.1.3 正交实验
单因素实验对上述不同提取工艺参数进行了初步的筛选,为了分析参数影响主次因素,得到最佳的提取工艺,进行正交实验。参照单因素实验结果,以影响黄酮类化合物提取率的乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度为4个影响因素,取各自的不同水平进行正交实验,实验设计及结果分析如表1所示。由表1可知。RD > RC >RB > RA,提取温度之间存在显著差异,最佳提取工艺为A2B2C2D3在最优化验证试验中。提取率为4.90%,此结果比正交试验中所有的提取率都高,证明此结果是合理的,所以取以乙醇为提取剂的最佳工艺条件为乙醇浓度40%,料液比1:30,提取时间3h,提取温度70℃。
表3 正交实验方案及实验结果
A B C D
试验号 乙醇浓度 料液比 提取时间 提取温度 吸光度 质量浓度 提取率/%
1 30 1:20 2 50 0.445 0.037 2.806
2 30 1:30 3 60 0.402 0.034 2.537
3 30 1:40 4 70 0.516 0.043 3.250
4 40 1:20 3 70 0.527 0.044 3.319
5 40 1:30 4 50 0.513 0.043 3.231
6 40 1:40 2 60 0.378 0.032 2.387
7 50 1:20 4 60 0.364 0.031 2.299
8 50 1:30 2 70 0.478 0.040 3.012
9 50 1:40 3 50 0.498 0.042 3.137
K1 8.593 8.424 8.205 9.175
K2 8.937 8.781 8.993 7.223
K3 8.449 8.774 8.780 9.581
k1 2.864 2.808 2.735 3.058
k2 2.979 2.927 2.998 2.408
k3 2.816 2.925 2.927 3.194
R 0.115 0.119 0.192 0.786