元升生物科技内部资料 a-L-岩藻糖苷底物测定 AFU 酶活的评估 元升生物科技技术研发部 1 概述 a-L- 岩 藻 糖 苷 酶 (a-L-Fucosidase , AFU) 的 分 类 名 为 a-L- 岩 藻 糖 苷 酶 水 解 酶 (EC3.2.1.51),催化岩藻糖苷键水解,参与含岩藻糖的低聚糖、糖肽、糖蛋 白和糖脂的分解代谢。AFU 合成于细胞内,定位于溶酶体,是一种酸性水解酶, 它的本质是糖蛋白。广泛分布于人体肝、肾、胰、脑和胎盘等组织以及血清、尿 液、唾液和泪液中。AFU 在人体内呈多形性,在等电聚焦电泳中 AFU 可分出 5~ 9 条区带,血清中 AFU 除含有 PI 为 4.68 和 4.84 两种主要成分以外,还可见 到 5 个次要成分。AFU 具有 3 型同工酶,即 AFU1、AFU2 和 AFU3,是由 1 个 位于第一号染色体短臂(1p34)上基因位点的 2 个等位基因所表达,由于不同人 所表达的同工酶类型不同,所以正常人群 AFU 活性也有所不同,大约有 10%左 右的正常人血浆 AFU 呈低活性。测定 a-L-岩藻糖苷酶(a-L-Fucosidase,AFU)对诊 断原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)具有重要临床意义。它是 PHC 的特 异性标志物,可用于 PHC 的早期诊断. 2 原理 底物CNP-AFU在血清样本中a-L-岩藻糖苷酶酶作用下,生成产物CPNP,而产物 CPNP的生成量与样本中AFU的酶活性成正比,通过测定黄色产物在405nm波长 的生成速率,即可计算出样本中AFU的活性。 3 实验方法 3.1 样本 瑞安市人民医院临床新鲜血清样品。 3.2 仪器和试剂 CNP-AFU元升生物科技生物科技有限公司生产,批号 1213M05QH。进口底物购自美国sigma公司,批号1013C07QH;仪器为日立7080 全自动生化分析仪、抗坏血酸、胆红素、人胎盘a-L-岩藻糖苷酶均购自sigma公 司,血红蛋白标准品购自上海血液中心。 3.3 试剂配制方法 按常法配制,所用原料均为分析纯。 3.4 测定方法 HITACHI 7080自动分析仪参数 反应类型:Rate-A法;反应温 元升生物科技内部资料 度:37℃;波长:(主)340/(次)405nm;样本:25μl,试剂250μl,读点时间6-12点。 4 实验结果 4.1 精密度评价 按 NCCLS 评价方案,取低、中、高三个不同浓度的 AFU 样本, 浓度分别为 25U/L、68U/L、235U/L,上、下午双份测定,连续测定 20d,再每 天测 1 次,共测 20d,结果见表 1 表1 批内和批间精密度测定结果(U/L) 样本 标本 次数 批内 x SD CV% 次数 批间 x SD CV% 1 低值 20 2 中值 20 3 高值 20 25 0.55 68 0.78 235 2.26 2.20 20 1.15 20 0.96 20 25 0.60 2.40 68 1.02 1.5 235 2.82 1.2 4.2 线性范围评价 按NCCLS的评价方案,选用购自sigma公司人胎盘a-L-岩藻糖苷酶 为300U/L和20U/L的高低值酶样本2份,然后2份样本等量混合产生中间值160U/L,中 间值再与高低值等量混合,产生230U/L和90U/L的5个不同梯度值样本,在仪器上以 低值到高值和高值到低值分别测定,求得两次平均值,以X作为理论值,Y作为测定 值进行回归分析,其方程Y=0.9986X-0.3714,r=0.9994。表明AFU活性在300U/L范围内, 线性良好。 AFU理论值(U/L) AFU线性 350 300 y = 0.9986x - 0.3714 R2 = 0.9989 250 200 150 100 50 0 0 100 200 300 400 AFU实测值(U/L) 4.3 比对实验 取AFU浓度从10~200U/L的不同病人新鲜血清标本50份,分别用本公 司合成底物配制的试剂与进口底物配制的试剂同时测定AFU活性,所得数据均按 NCCLS文件统计,经t检验得P>0.05,y=0.9813X-0.3746;r=0.9991,表明本试剂与进口 元升生物科技内部资料 试剂高度相关。 4.4 回收实验 向250μl血清中加入50μl的生理盐水作为基础样本,测得AFU浓度为 20U/L,向同体积的血清标本中分别加入50μl浓度为25U/L和80U/L的AFU酶标准品, 使其终浓度分别为24.2U/L和33.3U/L的样本,每一浓度作平行管,测得其回收率为 98.5%~102.4%. 4.5 干扰试验 在高、低两个浓度的混合血清样本中分别加入不同浓度的胆红素、血 红蛋白、抗坏血酸(VitC),然合对AFU进行测定,结果表明三酰甘油≤5.0mmol/L、 Hb≤2.5g/L、 胆红素≤500μmol/L、VitC≤10g/L时经配对差异比较,均无显著干扰 (P<0.05)。而常用抗凝剂中EDTA.K2、草酸钠对检测无显著干扰,但肝素明显干扰AFU 的检测,使AFU结果出现假性偏高,其干扰机理尚不清楚。 5 结论 本公司合成的CNP-AFU底物法用于检测AFU活性较为理想,该底物在酸性条件 下,样本中的AFU将含呈色基团的底物CNP-AFU的1,4位糖苷键水解,使反应 在405nm处产生最大吸光度,通过测定吸光度的变化,即可计算出样本中AFU的 活性。我们对公司合成的该底物用于检测AFU酶活进行其主要指标的评价,其结 果显示批内CV <2.2% ,批间CV <2.4%。三酰甘油≤5.0mmol/L、Hb≤2.5g/L、 胆红素≤500μmol/L、VitC≤10g/L时对结果无显著性干扰(P<0.05);经与进口底 物配制的试剂比对其结果高度相关,完全能满