第九章 免疫学活性测定 Dot blot 原理: 原理: 抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。 被吸附在 96 孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。 由于细胞培养需要不断监测, 工作量很大。 因此快速简洁的定量分析是检测细胞表达水平监测的重要手段。 主要监测方法包括 Dot blot 和 ELISA。 Dot blot Dot blot 是最快速简捷的方法之一, 简述如下: 在超净台内, 使用无菌多孔加样器将 96 孔板内的细胞克隆培养液以 5µL 上样量, 成排点于硝酸纤维素膜上并风干, 记录好样品顺序(可在膜的正面边缘处标记正面及名称, 也可通过在膜的右下角剪去一角作为标记, 识别膜的正反面及方向) 。 取上面风干好的硝酸纤维素膜, 用配制好的封闭液(脱脂奶粉或白蛋白溶液) 室温震荡孵育至少一小时。 此步骤的目的是封闭硝酸纤维素膜上的非特异性蛋白结合位点, 以避免下一步加入的抗体与膜发生非特异性结合。 将封闭好的硝酸纤维素膜浸泡在第一抗体中, 室温震荡孵育 1 小时, 然后用 TTBS 溶液淋洗膜 2 遍后,将膜浸泡到 TTBS 溶液中, 室温震荡洗涤 3 次, 每次 5 分钟。 将洗涤后的硝酸纤维膜浸泡在含有酶标第二抗体溶液中, 室温震荡孵育 1 小时, 然后用 TTBS 溶液淋洗膜 2 遍后, 将膜浸泡到 TBST 溶液中, 室温震荡洗涤 3 次, 每次 5 分钟。 最后, 将膜浸于荧光显色剂(新鲜刚 刚混合的等量 A 和 B 液) 。 1-2 分钟后将浸泡过的膜, 抖去多余显色剂, 夹入保鲜膜(保鲜膜应薄而透明, 以免阻挡曝光效果) 中, 同时观察显色情况, 确定大致曝光时间(一般情况下, 如果样品亮度肉眼可见且较强, 那么初次曝光时间应较短, 一般选 3-5 秒; 如果样品亮度肉眼不可见, 则初次曝光时间应略长一些, 一般选择 1 分钟) , 曝光完毕, 经显影, 定影后, 用清水冲洗 X 光胶片, 根据胶片上结果情况, 再将膜放入曝光暗盒中进行二次曝光及显影、 定影反应。 溶液配制及整个操作过程请斑点杂交操作流程图。 Dot blot 需要 TTBS 溶解的倍比稀释后的标准品做对照方能进行半定量。 同时样品倍比稀释也是半定量所必需。 附 1: Dot-Blot 操作流程图 以下均用微振摇床混和 一 、 试 剂 1、 抗 待 检 样 品 抗 体 : 第 一 抗 体 为 纯 化 鼠 抗 人 IgG Fc 单 抗 ; 第 二 抗 体 为 HRP-兔 抗 小 鼠 IgG 二 抗 。 2、 封 闭 液 ( 5%脱 脂 奶 粉 ) 3、 底 物 荧 光 显 色 剂 A、 B 4、 TTBS(10× ) 缓 冲 液 :取 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 (Tris) 60. 5g,NaCl 45g, 吐 温-80 5. 5ml,加 适 量 超 纯 水 溶 解 ,用 浓 盐 酸 (~ 32ml) 调 PH7. 5,补 加 超 纯 水至 500ml。 置 于 棕 色 瓶 中 ,4℃ 保 存 , 有 效 期 6 个 月 。 用 前 10 倍 稀 释 为 1× TTBS 缓 冲 液 。 二 、 操 作 1、 取 硝 酸 纤 维 素 膜 1 张 , 将 标 准 品 倍 比 稀 释 、 样 品 、 阴 性 对 照 、 阳 性 对 照 点在 膜 上 , 风 干 。 2、 将 膜 置 于 封 闭 液 ( 5%脱 脂 奶 粉 溶 于 超 纯 水 中 ) 室 温 封 闭 1 小 时 ( 也 可 4℃过 夜 封 闭 ) 。 3、 弃 去 封 闭 液 后 ,加 入 含 有 待 检 样 品 第 一 抗 体 的 TTBS 缓 冲 液 30mL( 抗 体 稀释 度 为 1:1000) , 且 其 中 含 有 1%的 脱 脂 奶 粉 ,室 温 震 荡 孵 育 1 小 时 。 4、 将 硝 酸 纤 维 素 膜 用 TTBS 缓 冲 液 充 分 淋 洗 两 次 , 每 次 洗 后 都 尽 量 弃 去 溶 液 。然 后 再 用 TTBS 缓 冲 液 震 荡 洗 涤 3 次 , 每 次 5 分 钟 。 5、 弃 去 液 体 后 , 加 入 含 有 第 二 抗 体 的 TTBS 缓 冲 液 30mL( 抗 体 稀 释 度 为 1:2000) ,室 温 震 荡 孵 育 1 小 时 。 6、 将 硝 酸 纤 维 素 膜 用 TTBS 缓 冲 液 充 分 淋 洗 两 次 , 每 次 洗 后 都 尽 量 弃 去 溶 液 。然 后 再 用 TTBS 缓 冲 液 震 荡 洗 涤 3 次 , 每 次 5 分 钟 。 7、 取 出 硝 酸 纤 维 素 膜 , 略 除 去 膜 上 多 余 溶 液 后 , 加 入 适 量 的 荧 光 显 色 剂 A、 B( 一 般 1/2 张 96 孔 板 大 小 的 膜 加 4mLA、 B 混 合 液 , 且 A 液 :8、 用 保 鲜 膜 将 硝 酸 纤 维 素 膜 覆 盖 , 尽 量 平 整 , 避 免 产 生 气 泡 ,B 液 =1:1) 。并 放 在 曝 光 夹上 , 根 据 样 品 及 标 准 品 的 亮 度 , 初 步 确 定 曝 光 时 间 (一般情况下, 如果样品亮度肉眼可见且较强, 那么初次曝光时间应较短, 一般选 3-5 秒; 如果样品亮度肉眼不可见,则初次曝光时间应略长一些, 一般选择 1 分钟) , 然后取适 当 大 小 的 胶 片 覆 盖 在 薄 膜上 , 关 夹 曝 光 。 8、 曝光后, 取出胶片浸于显影液中, 在红光下观察, 直到胶片上的样品点不再变化为止 (~1.5分钟) , 取出胶片在水中涮洗一下(此步骤避免显影液与定影液混合, 降低定影液使用效率) , 再放入定影液中, 当胶片本底呈现蓝色透明后, 即可取出胶片进行流水冲洗,洗净后晾干即可。 此实验中的注意事项: (1) 在整个操作过程中, 手不能直接接触硝酸纤维素膜, 以免蛋白污染或造成蛋白降解; (2) 脱脂奶粉封避一定要充分, 否则容易造成膜与蛋白的非特异性结合, 导致结果片中出现杂点或假阳性, 干扰试验结果。 (3) 一抗浓度与二抗浓度不宜过高, 否则容易造成高背景或者杂点。 适宜浓度的选择, 可以通过不同浓度组合的预试验进行确定。 (4) 暗室一定要确保其不漏光, 否则容易造成 X 光片跑光, 整个光片全黑的情况。 (5) 曝光时, 时间的确定应该具体情况具体分析, 需要一定的实践经验积累。 ELISA 1、 双抗体夹心法: 本法适用于样品含量低灵敏度要求高的定量分析,简述如下。 先用选定的第一抗体(单抗原结合点的单抗为首选) 在碱性条件下(一般 PH=8.0~8.5 碳酸盐缓冲液) 包裹 96 孔板, 置 4℃过夜或者室温 1 小时。 然后用排枪或真空吸管吸出一抗, 再用 BSA 或稀释的奶粉封闭 45 至 60 分钟。 封闭后用洗涤液洗板 2 次。 加入待测抗原样品(条件培养液) 和标准品(PBS 稀释)。 用洗涤液洗板 2 次。加入标记好的相应抗体室温 1 小时。 用洗涤液洗板 2 次。 如果不是标记的抗体, 可再用标记的抗一抗抗体(二抗)重复以上步骤再加入底物液显色和上机读数。 2、 间接法: 适用于灵敏度要求低, 样品含量高的分析方法, 步骤如下。 将制备好的标准品及样品, 加至 96 孔酶标板, 置 4℃过夜,或室温放置 3 小时。 用洗涤液 PBS-T 配制的 1%BSA 溶液加至板内, 37℃放置 1 小时。 将封闭好的酶标板用洗涤液洗板 2 次。 将一抗加至板内,同时加入两孔空白对照(稀释液), 37℃放置 1 小时。 用稀释液稀释HRP 酶标记的第二抗体加至板内, 37℃放置 1 小时。 用洗涤液洗板 2次。 加入底物液显色和上机读数。 注: 终止液可加可不加。 3、 结合竞争法: 放射免疫法是典型的竞争法。 它利用同位素标记抗原(I-125) 与非标记抗原竞争结合抗体。 非标记抗原或者样品中的抗原越多标记的抗原(I-125) 与抗体结合的越少。 一定浓度的 PEG可以沉淀抗体结合的标记的抗原(即抗原-抗体复合物) , 但不可以沉淀游离的抗体或抗原(即非结合的抗原或者抗体) 。 沉淀的抗原-抗体复合物离心后吸出上清中的非结合的抗原或者抗体可以经过放射性计数定量。 标准品或样品中的待测抗原越少计数越高。 根据这个道理可以画出标准曲线和查出相应标准品中的抗原含量。 此法灵敏度高于其它方法, 可达到 10-100pg/ml 水平, 适用于血浆和组织药物浓度的动力学研究(药物 PK study) 。 4、 新方法的建立原则 1) 以上所有方法的建立主要取决于抗体质量的好坏, 因此多试几个商品化的抗体有必要。 2) 一般情况下, 先决定所测样本中抗原量的最低和最高限度, 即测定范围。 原则上要求抗原和抗体的浓度等量, 比如新方法要求检测抗原浓度在 1~10mg/L 范围内, 灵敏度要求是 1mg/ml, 最高浓度10 mg/ml, 高于 10 mg/ml 使用样品倍比稀释的方法来解决。 此时,检测抗原浓度在 1mg/L, 假设需要 100%抗原抗体结合的有效抗体稀释度为 1: 8000, 又假设需要 100%抗原抗体结合的有效抗体稀释度为 1: 4000。 因此决定此法有效抗体稀释度在 1: 8000 到 1: 4000之间。 我们的结论是一般情况下抗原的浓度降低则抗体的相对浓度也降低。 如果想提高方法的抗原探测灵敏度, 一般使用相对低浓度的抗体。 如果想降低方法的抗原探测灵敏度, 一般使用相对高浓度的抗体。 3) 分 析 方 法 的 变 异 范 围 ( 代 表 可 靠 程 度 ) 一 般 用 CV(Coefficient variant)来计算。 CV=SD (标准差)/X (平均值)×100%。一般批内(intra-assay) 的 CV 要小于批间(inter-assay)的 CV。 例如 N个(N 至少要大于 6) 同一代测标本在一次方法分析中相差会很小,即 CV 很小(CV=5-10%可以接受) 。 又如 N 个同一代测标本在多次方法分析中相差会很大, 即 CV 很大(CV=10-30%可以接受) 。 批内和批间变异是最常用的定量分析控制方法。 一般低温(-30℃或以上)长期贮存的质量控制用标准品在每次方法分析中都要使用, 这就是常用的定量分析方法的质量控制。 附: 单克隆抗体制备原理 单克隆抗体的制备过程包括经典的细胞克隆化步骤。 理解单克隆抗体的制备不但有助于理解细胞克隆化的方法, 还有助于理解分析方法中抗体的选用。 简单地说, 将一定浓度的抗原免疫小鼠, 取小鼠脾脏, 无菌磨碎,取悬浮的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在体外在一定浓度 PEG 的作用下(PEG 可将 2 个或多个细胞融合在一起)融合形成杂交瘤细胞。 经过HAT 培养液在 96 孔细胞培养板中筛选, 死亡者为未融合的小鼠骨髓瘤细胞(HAT 培养液可杀死小鼠骨髓瘤细胞) 和不能传代生长的小鼠脾脏细胞(高度分化细胞不能传代生长) 。 幸存者(即可在 HAT培养液中生长的细胞) 为融合的杂交瘤细胞。 杂交瘤细胞具有小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞共同的特性, 因此可以在 HAT 培养液中传代生长。 使用简单的抗体抗原结合的方法可以测定 96 孔板中每孔中杂交瘤细胞的抗体分泌量。 选出分泌量最高的杂交瘤进行细胞扩增, 再克隆, 鉴定抗体的类型和亲和力, IgG 为首选。 以上就是单克隆抗体制备的简单过程。 附: 多克隆抗体制备原理 将一定浓度的抗原免疫大鼠或兔羊马的起初产生的免疫球蛋白为 IgA IgM,后期大量产生 IgG, IgG 可分为 IgG1、 IgG2、 IgG4型。 定期取血清检测抗体滴度, 大约 2-6 个月左右抗体滴度达到理想标准。 全部采血或分批采血取血清收获, 即可获得多克隆抗体, 直接纯化后使用 抗体滴度测定是通过将抗体倍比稀释, 按 0, 2, 4, 8, 16 等倍比稀释度来计算的。 阳性 100%结合的最低稀释度为抗体有效滴度, 也是我们通常使用的抗体有效稀释度。 抗体有效稀释度与所测定的抗原量相关, 抗原量高的抗体的有效稀释就相应降低, 原则上抗原和抗体的分子数为 1: 1。