随着ome为词尾的各种组学的出现,转录组学已经成为了人们了解生物信息的一个重要组成部分。人们使用了许多办法来掌握转录组的情况,主要分为两类,一类是基于杂交,一类是基于下一代测序技术(Next Generation Sequencing, NGS)。
基于杂交的办法,主要是依靠印刷有荧光标记探针的基因芯片来实现。比如说基因组芯片,它高密度的集成了分辨率高达几bp~100bp的探针,通过与样品杂交荧光显色的办法来勾画转录组的情况。虽然基因芯片高度集成,并且易于应用,成本低,但是,这一手段高度地依赖已知信息,这不利于发现新知,同时,它还存在着高背噪,非特异杂交所带来的无法分辨弱信号和过饱和信号的问题。当然,在不同样品的比较当中,甚至在同一芯片内部,都存在杂交不均匀带来的各种问题,需要诸如标准化等统计学手段来分析结果。
随着下一代测序技术的成熟,它很快就被应用到转录组学的研究上来,并被寄以厚望。相比于杂交来说,测序技术直接针对的是cDNA进行测序,所以基分辩率在理论上可以达到单碱基的水平。然而这在高通量的要求之下变得比较困难。人们使用deep-sequencing技术来解决这一问题。深度测序,顾名思意,其是基于已有的基因组水平上的测序,也就是说它需要完整的参考序列。从这个意义上来说,它也是依赖已知信息的,但是它不象基因芯片那来,还需要依赖开放阅读框ORF,或者外显子exon等信息。当然,你没有模板序列也一样能完成测序这一步,只不过比较麻烦的事情就变成了如何来拼接这些序列了。第二,对于Alternative splicing events以及SNP的研究也较基因芯片来说方便的多。第三,背噪小,不存在饱和问题。因为是基因于测序的,所以它可以很准确地比对到固定的基因组序列上去。当然,也不担心饱合问题,因为它是数个数的。这一点也直接导致了它的精确度比基因芯片要高,并且可重复性好。第四,它不需要克隆步骤,所以它对样品量的要求更低。
但是深度测序也是有其不足的。首先是样品准备方面的。除了人为的操作差异外,还有其过程中必然带来的误差。Deep-sequencing只适用于小片段,对于small RNAs(microRNAs(miRNAs), Piwi-interacting RNAs(piRNAs),..)来说,挺方便,但对于转录的RNA来说,就需要一个打碎成小片段的过程了。一般来说,分两种手段,生化的(水解RNA或者酶切cDNA),物理的(雾化RNA或者超声波cDNA)。每种手段都有它的难度和倾向性。拿生化方法来说,对于RNA水解来说,3’及5’端都不容易保留,反而中间的部分容易保留下来。而DNaseI酶切cDNA就会出现3’端信号较强的现象。还有,如果构建cDNA库的话,又会引入逆转录或者PCR,不构建的话,RNA又极易降解。这些都会影响到实验的可重复性。还有一个问题就是,因为片段很小,如果基因组上出现overlapping的话,就不好注释,如果正好是方向相反的话重叠,就更会影响到注释结果了。