(Clausen, T. M., et al. Real-time and label free determination of ligand binding-kinetics to primary cancer tissue specimens; a novel tool for the assessment of biomarker targeting. Sens Biosensing Res. 2016; 9: 23-30.)
图1.Attana Cell 200蛋白互作分析仪与COP-1检测芯片。
图2.免疫组化鉴定为阳性的甲醛固定石蜡包埋组织样品被切成5μm厚的薄片,并固定在COP-1芯片中心。
图3.(b)Attana测定出rVAR2蛋白与胎盘组织的KD值为4.27nM,具有高亲和力。(c)当添加了能抑制rVAR2粘附于胎盘组织的CSA溶液后,rVAR2蛋白与胎盘组织的结合曲线不再有明显的结合点和解离点。
图4.(a)免疫组化结果显示,与作为正常组织对照的扁桃体组织切片相比,rVAR2蛋白与乳腺癌、前列腺肿瘤组织切片有强相互作用,进一步用Attana测定其KD值分别为8.9nM和6.65nM,而与扁桃体组织的结合曲线无明显的结合点和解离点,无法测出其KD值。(b和c)用V5-FITC的抗体对rVAR2蛋白进行定位,进一步验证了Attana得到的结果,即rVAR2蛋白与前列腺肿瘤组织切片强结合,而不与扁桃体组织结合。证明Attana能准确对组织切片上抗原-抗体的亲和力进行定性和定量。
图5.检测发现纯化的胎盘样硫酸软骨素(pl-CS)受体与rVAR2蛋白的KD值为3.6nM,具有强结合,证明Attana可准确检测纯化蛋白间的相互作用。
图6.将乳腺癌细胞(SKBR3)、前列腺癌细胞(LNCap)与中国仓鼠卵巢细胞(CHO)相比,免疫组化和Attana的结果一致,乳腺癌细胞与前列腺癌细胞均检测到细胞与rVAR2蛋白有着很强的亲和力。
图7.高表达AR的Lncap细胞与AR抗体有强的亲和力,而雄激素非依赖的PC3与AR抗体的亲和力相对较弱。这一结果进一步在细胞水平上证明了Attana具有广泛的兼容性。
图8.采用Attana对AR抗体与FFPE组织切片的亲和力检测结果,与免疫组化结果一致,即免疫组化阳性的FFPE前列腺癌组织,对AR抗体有强的亲和力,免疫组化阴性的FFPE胎盘组织,对AR抗体无相互作用。这一结果在组织切片水平上也证明了Attana能有效监测抗体与切片的结合。
实验操作总结:
①组织切片如何固定在COP-1芯片上?
Attana的COP-1芯片在室温用聚L-赖氨酸溶液包被5分钟。包被后,用PBST冲洗芯片,并在室温干燥2小时。将甲醛固定石蜡包埋(FFPE)组织样品切成5μm厚的薄片,并贴在芯片上,60℃烘烤1h。
②脱蜡和抗原修复
将COP-1芯片上的组织样品浸没在EZprep溶液中,65℃水浴30min进行脱蜡。之后PBS洗3次。再在95℃下,用pH6.0的10mM柠檬酸钠、0.05%吐温溶液浸泡30min进行抗原修复。
实例2、研究抗体药曲妥珠单抗与SKOV3细胞的亲和力
在抗体药物研发中,检测抗体与细胞的结合非常重要。使用石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance,简称QCM),研究单克隆抗体曲妥珠单抗与表达人表皮生长因子受体2(HER2)的卵巢腺癌上皮细胞(SKOV3)的亲和,是一项非常新颖的技术。
Elmlund等人的实验结果揭示出曲妥珠单抗与SKOV3细胞结合的平均解离常数KD值为7±1nM。实验过程中对细胞固定程序和接种密度等进行优化非常重要,为抗体药的亲和力研究提供了一种新方法。与纯化的抗原抗体的结合相比,抗体与靶细胞的结合更为自然。
这些结果证明了在药物开发中使用基于全细胞的QCM分析,用于筛选靶向HER2的候选药物的潜力。