用RNA/PCR方法来分析复合抗药性(MDR)10基因和 胸腺核苷酸合成酶(TS)基因,发现了这mRAN水平的增高.突变的RAS原癌基因的mRNA分 析(见参考文献25综术述)在癌症的诊断或预测方面具有诊断价值。mRNA分析比常规的 DNA基因组分析有优越之处。由于没有内含子序列干扰mRNA的扩增,因此可以仅用一 组引物就能够扩增H-,K-,和N-RAS三个mRNA序列(E.S.K,未发表)。这样便可以比较 容易地检测出第12、13和61密码的突变,这些突变被认为是发生癌的原因。 癌症诱因的检测 在下面将列举数个RNA/PCR扩增方法的主要应用。首先是对鼠鸟氨酸氨甲栈基转 移酶mRNA进行亚克隆来确定缺失点突变的位置。同样,该方法可用于检测哺乳动物细 胞mRNA转录后的剪接,研究与HLA疾病相关性因素,分析人HPRT突变,研究自身免疫 与T细胞受体序列之间的关系,分析人碱性磷酸脂酶的突变,研究土拨鼠肝炎病毒引 发的c-myc活性,确定刺桐丁蛋白4.1mRNA的剪接变异,等等。 根据已发表的序列合成扩增mRNA的引物,我们发现用RNA/PCR是获取cDNA的最简 便的方法。用在5'末端带有限制性内切酶位点的引物来扩增mRNA的一部分或全部编码 区域。扩增后,PCR产物经合适的酶切并与适于表达的载体连接或制备成探针。按此 方法可在一星期内完成从RNA样品到用于高效表达的修饰cDNA克隆.这比常规的合成/ 筛选cDNA库,亚克隆靶cDNA,为达到表达目的而对克隆进行诱变等过程要简单得多。 区别主要在于用于扩增和分离cDNA克隆的引物为简并引物。引物序列是根据氨基酸的 序列而定的,因此当只知道很少的蛋白质序列时,就有可能扩增特异的RNA分子。当 只知一个内部序列时,只用一个基因特异性寡核苷酸引物,也可用PCR从稀有mRNA中 分离出cDNA。扩增cDNA的分析因使用本书其它章切有关PCR产物的直接序列分析步骤 而变得简单。将噬菌体(T7)启动了作为PCR引物的一部分同样可用于序列分析,因为 PCR终产物中有大量的群体特异的产物。 >