请教各位大侠,在pMX载体上连接目的基因,用lipo2000转染293T细胞,什么时候能够在细胞内表达该蛋白啊??我做的GFP阳性不到一天就有比较强的荧光了。问了师兄师姐,他们说这个跟蛋白大小有关,我的蛋白大小50KD左右,不知道1天的时间会不会有表达啊??
要外转了去做IF的,要是没有表达,我就悲剧了哦!!N, G: h2 @3 U/ X
谢谢各位啊!!
LZ我先说句题外话啊,为什么要用pMX做过表达呢?你把pMX转293还不如pcDNA之类的载体表达量来的高。还有,我不知道是不是我理解错误了,你想说的是用pMX包的retrovirus然后感染目的细胞,GFP 1天就亮了。那你对应的蛋白也应该表达了,我做的时候检测postinfection 48h 目的蛋白就已经overexpression了
回复webber43的帖子- K, a$ }' A9 P7 U& [; Q( O
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很正常,转细胞的话,6小时就可表达蛋白
一般说来,24-48h后,蛋白表达就比较强了。24h后做免疫细胞荧光,应该没问题的!
回复Yedan的帖子
呵呵,因为实验室有现成的连有那个基因的载体,我就嫌麻烦,没有换其他载体直接转了。好像转染以后,蛋白小的表达快些,大的蛋白表达慢些吧,我也不知道为什么,希望有牛人指导啊!!
回复zxcv12345的帖子+ x% K7 l9 V- l1 w
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恩,非常感谢!那这样我就放心了,呵呵
回复gandanxiaoyang的帖子" H! T$ s; \) h* ?+ U
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也是,protocol上说的是转染48小时以后收细胞,估计48小时以后蛋白的增加就不显著了吧?
这个1天就可以了,时间长了,蛋白量会积累,看你的目的了。
如果是做IF我认为1天就足够了,如果要做WB可能要的蛋白量比较多,不过这样的话,2天也是足够足够。我以前的蛋白300K,2天就表的非常好了~~~
回复eley的帖子. F' u. O b' [1 z/ w
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恩,非常感谢,期待阳性结果的出现呵呵