2003年中国土霉素产量达10000 t,占世界 土霉素生产总量的65%.作为四环素类抗生素的一 种.其化学结构稳定,在环境中残留时间较长[2],对 生态环境存在潜在危害。因此.土霉素的环境行为 和生态影响已成为研究热点。 河南省作为农业大省.2013年全省小麦种植面 积达537万hm2.产量约占河南农作物总产量的60%, 占全国小麦总产量的25%E引。由于农家肥肥力强、肥 效长.可以改良土壤结构.增加肥力.防止土壤板 结.目前仍有许多农户采用农家肥对小麦进行施 肥.研究显示.在用动物排泄物施肥的土壤0~40 cIn 土层.检测到了土霉素和金霉素的残留.其浓度分 别高达32.3 mg/kg和26.4 mg/kg E引.这些残留的土 霉素进入土壤环境后.是否会对小麦苗期生长及根 际微生物群落结构产生影响值得关注。 鉴于土壤环境的复杂性.对进人土壤的土霉素 有一定的吸附、降解和缓释作用,因此为降低其他 干扰因素的影响.本研究采取水培法.仅设置土霉 收稿日期:2014—06—30 基金项目:国家自然科学基金资助项目(20677014);三门峡职业技术学院课题项目(SZY一2014—017) 作者简介:张晶(1985一),女,河南三门峡人,讲师,硕士,主要从事环境微生物研究,(电话)13419845630(电子信箱)zhangjin9826—826@163.colrl。 万方数据 张晶等:土霉素暴露对水培小麦生长及根际微生物的影响1833 素一个单因素处理.测定其对小麦苗期生长和根际 微生物群落结构的影响.并结合分子生物学方 法——PCR—DGGE技术对根际微生物的敏感性进 行分析.比较不同剂量土霉素处理下微生物群落结 构在数量和优势种群类别上的差异,以期综合评价 土霉素对小麦苗期生长的潜在影响。 1材料与方法 1.1 材料 盐酸土霉素均为分析纯.购自上海生物工程技 术服务有限公司。 供试样品为小麦.其品种为矮抗58.购自河南 省农业科学院。 1_2试验方法 1.2.1 水培试验方法 选取子粒饱满的小麦种子. 经次氯酸钠浸泡消毒后.用去离子水冲洗两遍.选 取30粒均匀摆放在培养皿中.加人终浓度为0 mg/L (CK)、0.8 mg/L(A)、4.0 mg/L(B)、20.0 mg/L(C)、 60.0 mg/L(D)、100.0 mg/L(E)的土霉素培养液,各 浓度处理设置3次重复,25 cC培养15 1.2.2参数测定选取4个时间点。分别为水培的第4、6、10和15天,测定各浓度处理条件下小麦的 根长和芽长。采用SPSS软件对各浓度处理的小麦 根长和芽长进行统计分析。 1.2.3 微生物群落结构的分子生物学分析 15天取水培溶液.采用PCR—DGGE方法分析培养液中微生物数目及丰富度,具体方法参照文献[5]。 2结果与分析 2.1 土霉素暴露对小麦发芽率的影响 当培养温度为25时.小麦种子培养1 始发芽.不同浓度土霉素处理对小麦种子发芽率的影响如图1所示。由图1可知.CK处理培养1 发芽率达63.3%.试验设置的各土霉素浓度由低到高种子发芽率均较对照处理有不同程度的下降.发 芽率依次为50.0%、46.7%、43.4%、36.7%和23.3%, 表明土霉素暴露对小麦种子萌发率有明显的抑制 作用.且抑制程度与土霉素浓度呈正相关,土霉素 100 80 鐾60 糌蕊40 20 OO0.8 4020 O60 O100 土霉素暴露对小麦发芽率的影响浓度越高抑制作用越明显.当土霉素浓度为100.0 mg/L时,发芽率较对照下降了40.O%。 2.2土霉素暴露对小麦生长的影响 2.2.1 土霉素对小麦根长的影响 培养周期内土 霉素对小麦根生长的影响状况如图2所示。由图2 可知.对照处理在4次测量时根长均为最长,为 3.988~7.910 cm。A处理次之,根长为2.923~6.170 cm。 随着土霉素浓度的增大.小麦根长受抑制情况加 剧.C处理4次测量根长为1.178~1.688 cm,后期甚 至出现了负增长的现象。D和E处理条件下,根的 生长基本保持恒定.随着培养时间的延长,根的生 长状况越来越差.培养15 d时.E处理条件下根的生 长抑制率达到87%。由此可见,在高浓度土霉素暴 露条件下.毒害作用随培养时间增长而加剧,小麦 根系的生长几乎完全被抑制。 运用SPASS软件对统计数据进行分析,结果 (表1)表明,小麦水培第4、6和15天,各试验浓度 土霉素处理条件下.小麦根长较CK均具有显著差异 (P<0.05)。水培第10天时,A土霉素处理与对照相 比差异不显著(尸之0.05)。在4个时间点,A、B与C处 理之间根长均具有显著(P<0.05)差异。当土霉素浓 度高于20.0 mg/L时.根的生长均受到较明显的抑 制.C、D和E处理问根长差异不显著。 培养时I'@lld 图2土霉素暴露对小麦根长的影响 土霉素暴露对小麦根长的统计分析(单位:cm) 小麦根长2.2.2 土霉素暴露对小麦芽生长的影响 不同浓 度土霉素处理对小麦芽伸长的影响如图3所示。由 图3可知。CK在培养前6 d芽伸长量最长,为 6.152 cm.其他各浓度处理土霉素对芽伸长均有明 显抑制作用.抑制程度随土霉素浓度增加表现出明 42O86420 万方数据 1834 湖北农业科学2015正 显的剂量效应.E处理在水培第6天抑制程度最强. 达到78.1%:水培第10天.B处理土霉素对芽的生 长出现促生现象.芽长较CK增加9.8%,该促生作 用一直延续至水培第15天.芽长较CK增长7.1%: B和C处理均保持抑制作用.且随着培养时间的延 长抑制作用加剧:D和E处理在整个培养周期内对 小麦芽生长的抑制作用更强,芽长始终较短.长度 与CK水培第4天时芽长接近.可见高浓度的土霉 素对小麦芽的生长出现抑制甚至毒害作用。 25 20 l15 壬桊10 5O培养时间//d 图3土霉素对小麦芽伸长的影响 运用SPASS软件对芽生长数据进行统计分 析(表2)。结果表明,水培前6 d,CK具有最大的芽 伸长量.A处理表现微弱的抑制现象,但与CK相 比差异不显著,C、D和E处理与CK相比具有显著 (P<0.05)差异。水培第10天,A处理芽长最长,为 14.811 cm.高于CK.表明低浓度土霉素暴露对小麦 芽生长表现出促进作用。B、C、D和E处理的芽长较 CK显著(P<0.05)下降,且B处理与C处理间,C处 理与D、E处理间芽长也表现出显著(P<0.05)差异。 水培第15天.A处理仍表现出微弱的促进作用,芽 长最长.为18.294 处理和CK间差异显著(P<0.05)。表2土霉素对小麦芽生长的影响 (单位:cm) 小麦根长CK 2.970_+0.979 a6.152-+2.002 a13.493_+4.125 a17.075_+4.144 aA2.729-+1.153 a5.34l1.632 a14.811-+2.892 ab 18.294_+4.224 aB2.3llO.797 ab 3.727_+1.166 b11.7412.287 b13.250_+4.877 bC1.823_+0.465 b2.022_+0.800 c7.568_+2.35 1c8.447-+2.227 cD1.235_+0.481 b1.286_+0.495 c3.044_+1.638 d4.1781.684 dE1.360_+0.416 b1.345_+0.575 c2.96l1.034 d3.807_+1.176 d结果表明.土霉素暴露对于芽生长的影响表现 出明显的剂量效应和时间效应,低浓度(0.8 mg/L) 处理条件下差异不显著,且随着时间延长表现出微 弱的促进作用,较高浓度(4.0 mg/L)处理条件下均 较CK出现明显下降,高浓度(20.0 mg/L)处理组, 土霉素暴露对芽的生长表现出明显的抑制作用甚 至是毒害作用。 秦俊梅等[6]研究表明.土霉素暴露对小麦影响 虽总体上表现为抑制作用.但低浓度土霉素暴露对 小麦株高、株鲜重起促进作用,其他测试指标均随 土霉素浓度增加呈下降趋势。安婧等[7]研究认为土 霉素暴露对小麦芽长及根长具有抑制作用.且芽长 及根长抑制率与土霉素浓度呈线性正相关。土霉素 暴露对小麦种子发芽的毒性大小依次为根长<芽 长<发芽率.与本研究结果一致。 2.3水培液微生物群落的PGR—DGGE分析 可培养微生物仅占所有微生物数目的1%左 右.传统的培养方法不能真实反映水培溶液中的微 生物类群。各类微生物(如细菌和古细菌)的16Sr. RNA基因序列中可变区的碱基顺序有很大的差异。 利用PCR—DGGE技术可以根据电泳条带的多寡、亮 度和条带的位置辨别样品中微生物的种类多少、优 势类群数量.分析样品中微生物的多样性.真实反 映培养体系中的微生物构成。 培养15 d后.不同土霉素浓度条件下.水培溶 液中微生物的DCGE及统计分析图谱如图4所 不同浓度土霉素水培溶液中微生物群落结构变化差异较为明显。从条带数目看,CK、A、B、C、D 和E处理的水培溶液中.可检测到的微生物条带数 目分别为28、26、37、30、33和31,条带数目越多表 明该环境下微生物的物种丰富度越高。B处理物种 数量最多.但肉眼可辨识度较低.提示各类微生物 单位数量较低,未形成特征性优势种类。 低浓度处理组(A和B处理)与CK有较为相似 的图谱.差别在于CK中出现了一条亮度较高的特 征条带(图4A条带5),而该条带在A和B处理条 件下亮度微弱.表明该优势微生物类群对土霉素较 为敏感.低浓度处理下即出现抑制现象:高浓度处 理组(C、D和E处理)DGGE图谱较为一致,均出现 了多条高亮度特征性条带(图4A 1—4条带),这些 条带在CK及低浓度处理组中可视度较低.与CK 图谱差异显著.推测是一些耐受土霉素的抗性微生 物类群.在高浓度处理下随着土霉素剂量和时间双 重作用驯化产生.目前对于这些高亮度特征条带 (图4A 1-5条带)的研究正在进一步进行中。 结合各浓度处理间相似性聚类结果(图5),CK 与各浓度间均表现出明显差异.相似性较低,与A 和B处理间相似性介于12.50%~40.00%,与C、D和 E处理间相似性极低.介于0%~11.10%。而A与B 处理间图谱相似性达42.86%。C、D和E处理内相 似性达33.33%~73.68%.D与E处理问相似性最 高,达73.68%。 万方数据 张I帛等:土霉素暴露列水培小麦生长及根际微生物的影响1835 ABA.DGGE原始电泳图谱:B.物种丰富度统计分析图谱 图4水培液中细菌群落结构的DGGE图谱 Rows\Cols 123456l0000000 204000000 000000 030125 000 00428 57l 40000000 40000 000 00100 000 00300 000 0l0000000 50J11111l 166 666 70277 777 80333 333 30000000 600000000 0llll】1l 0222 222 20437 500 00736 842 1000 000 土霉素DGGE图谱相似性分析结果PCR—DGGE试验分析结果与土霉素对小麦生 长的毒理学试验结果相吻合.当土霉素处理浓度高 于20.0 mg/L的.对小麦生长和微生物群落结构均 造成了显著影响.可以初步判定20.0 mg/L为土霉 素环境暴露的风险浓度。Xiong等[8]认为植物的根可 分泌促进细菌生长的物质.而土霉素的抑制会削弱 这一促生作用,影响微生物类群的多样性。该结论 也与本研究结果相吻合.低浓度土霉素处理xCd麦 发芽率、根长和芽长影响较小,微生物群落结构也 与CK差异较小:高浓度土霉素处理对小麦生理指 标影响较大.甚至出现了完全抑制和毒害作用.微 生物群落结构数量和种类均出现显著差异.说明小 麦植株生长与微生物之间紧密相关.相互制约.土 霉素暴露对小麦生长和微生物群落的环境风险随 浓度水平提高而加大。 3小结与讨论 水培条件下.土霉素对小麦发芽率、芽长及根 长具有抑制作用.且芽长及根长抑制率与土霉素浓 度呈线性正相关.处理浓度20.0 mg/L时抑制作用 尤为显著。土霉素对小麦种子发芽的毒性大小为根 长<芽长<发芽率。 水培液PCR—DGGE分析结果表明,土霉素暴露 对根际微生物群落结构影响较大.A和B处理水培 液中微生物群落图谱与CK相似性较高。但仍有部 分条带亮度减弱.表明该类群对低浓度土霉素即表 现出敏感性;而高浓度(C、D和E)处理DGGE图谱 结果较一致.均与CK具有较大差异.出现多条高亮 度条带.推测存在一些耐受土霉素的抗性微生物类 群。为高浓度处理条件下随着土霉素剂量和时间双 重作用驯化产生。 参考文献: [1]崔馨,乔显亮,韩成伟,等.生菜对土霉素的吸收及其植物毒 性[J].农业环境科学学报,2008,27(3):1038—1042. 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(责任编辑韩 —+一“+”+一+一+-—--P-+一+一+“+-—+一。+一十一+一—-’一一—+一-+一+”+“—+一”—+一一+”+一—+一一—+一一—+一”+一—--P—+-一--+一一—+一 (上接第1807页) [8]彭锁堂,薛光文,董淑英沁州黄徉子优质机理分析研究[J]flI两 农业大学学报,2000,20(1):13一15 『9]刘成,张佩丽,沈群,等.河北产区9个谷子品种淀粉性质的 研究[J].食品工业科技,2010,31(1):81—84. f101马金丰,李延东,李辉,等.春谷直链淀粉含量与淀粉粘滞性 相关性的分析[J]东北农业大学学报,2009,40(12):5-8. [II]金玉红,张开利,张兴春,等.双波长法测定小麦及小麦芽中直 链、支链淀粉含量[J].中国粮油学报,2009,24(1):137—140. 2]LETCHWORTHMB,LAMBERT RJ.Pollen pm'ents effects OIl fat,protein starchconcentration maizekernel[J].Crop Sei,1998,38:363—367. (责任编辑韩