Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)
使用细胞裂解液,对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶(分离胶及浓缩胶)可以参考一些文献资料进行配制
(2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制, 100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳 (1)冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准。
(2)电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置 或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右。
(3)为了电泳方便起见,也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设置在 100V,然后设定定时时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适 当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
(1)我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。