实验八 麦拉德反应初始阶段的测定 一、 原理 美拉德反应通常可分为几个阶段。 初始阶段起始于羰基和氨基的缩合, 生成Amadori/Heyenes 化合物;高级阶段主要是 Amadori/Heyenes 化合物降解, 释放氨基化合物, 糖类物质通过烯醇化生成高反应活性的邻酮糖类、 糠醛类等物质;高反应活性的邻酮糖物质极易裂解生成酮类物质, 酮类物质可进行醇醛缩合, 或重新与氨基化合物反应, 生成复杂的具有特征性风味的小分子物质;终级阶段主要是高级阶段产生的小分子物质自身或相互间聚合生成大分子褐色物质, 使体系表现出显著的颜色特征。 美拉德反应的小分子产物具有强紫外光吸收和荧光。 294 nm 光吸收是由糖裂解产生的酮、 醛类等无色小分子物质产生的; 240 nm 吸收峰鲜有报道, 一般认为具有共轭双键的物质在此波长下有特征光吸收。 随着温度升高或加热时间延长, 两个特征峰强度增加, 表明美拉德反应产生的具有紫外吸收的呋喃酮类、 吡喃酮类、 吡咯类、 噻吩类、 吡啶类及吡嗪类等的小分子物质的积累, 这些小分子物质是对肉香味有贡献的成分; 但是在较高温度时, 两个峰强度出现最大稳定值,表明已生成的无色小分子物质之间或与肽等发生聚合反应, 进入到终级阶段, 生成褐色的大分子黑素类物质, 从而使小分子的积累表现出一定的消除速率。 麦拉德反应即蛋白质、 氨基酸或胺与碳水化合物之间的相互作用。 麦拉德反应开始, 以无紫外吸收的无色溶液为特征。 随着反应不断进行, 还原力逐渐增强,溶液变成黄色, 在近紫外区吸收增大, 同时还有少量糖脱水变成 5-羟甲基糖醛(HMF) , 以及发生键断裂形成二羰基化合物和色素的初产物, 最后生成类黑精色素。 本实验利用模拟实验: 即葡萄糖与甘氨酸在一定 pH 缓冲液中加热反应, 一定时间后测定 HMF 的含量和在波长为 285nm 处的紫外吸光值。 HMF 的测定方法是根据 HMF 与对-氨基甲苯和巴比妥酸在酸性条件下的呈色反应。 此反应常温下生成最大吸收波长的 550nm 的紫红色。 因不受糖的影响,所以可直接测定。 这种呈色物对光、 氧气不稳定, 操作时要注意。 二、 仪器与试剂 (一) 仪器 1. 紫外-可见分光光度计 2. 水浴锅 3. 试管 (二) 试剂 1. 巴比妥酸溶液: 称取巴比妥酸 500mg, 加约 70ml 水, 在水浴加热使其溶解, 冷却后转移入 100ml 容量瓶中, 定容; 2. 对-氨基甲苯溶液: 称取对—氨基甲苯 10.0g, 加 50ml 异丙醇在水浴上慢慢加热使之溶解, 冷却后移入 100ml 容量瓶中, 加冰醋酸 10ml, 然后用异丙醇定容。 溶液置于暗处保存 24h 后使用。 保存 4-5 天后, 如呈色度增加, 应重新配制; 3. 1mol/L 葡萄糖溶液; 4. 0.1mol/L 甘氨酸溶液。 5. 5%亚硫酸钠溶液 三、 操作步骤 1. 取 5 支试管, 分别加入 5ml 1.0mol/L 葡萄糖溶液和 5ml 0.1mol/L 赖氨酸溶液, 编号为 A1, A2, A3, A4, A5。 A2、 A4调 pH 到 9.0, A5加 5ml 亚硫酸钠溶液。 5 支试管置于 90℃水浴锅内并记时, 反应 1h, 取 A1, A2, A5管, 冷却后测定它们的 285nm 紫外吸收和 HMF 值。 2. HMF 的测定: A1, A2, A5各取 2.0ml 于三支试管中, 加对一氨基甲苯溶液 5ml。 然后分别加入巴比妥酸溶液 1ml, 另取一支试管加 A1液 2ml 和 5ml 对一氨基甲苯溶液, 但不加巴比妥酸液而加 1ml 水, 将试管充分振动。 试剂的添加要连续进行, 在 1-2min 内加完, 以加水的试管作参比, 测定在 550nm 处吸光度,通过吸光度比较 A1, A2, A5中 HMF 的含量可看出麦拉德反应与哪些因素有关 3. A3, A4两试管继续加热反应, 直到看出有深颜色为止, 记下出现颜色的时间。 四、 说明与注意事项 HMF 显色后会很快褪色, 1-2min 完成, 并尽快比色。