日间Ct 1 dCt 2 dCt 3 dCt 4 dCt 5 dCt 6 dCt 7 dCt 8 dmean±SDCV
图5 批内精密度检测荧光强度曲线图.
3 讨论
SUZ12又称为KIAA0160, JJAZ1和ChET9, 是PcG基因家族中的EED-EZH2复合体中的一员, 后者参与HOX基因沉默、X染色体灭活和肿瘤转移等[1-10]. SUZ12是EED-SUZ12复合体发挥其内在的组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase, HMTase)活性所必需的成分之一[7,10]. 研究发现SUZ12基因是受双重启动子调控, 功能具有双向性; 其上游基因包括E2Fs, β-catenin等[9]. 在结肠癌、乳腺癌和肝癌的组织标本中SUZ12 mRNA的表达水平显著高于其对应的正常组织; 而在结肠癌细胞系中, 应用siRNA沉默SUZ12的表达, 发现一系列基因的表达发生改变[9], 提示SUZ12可能通过改变基因表达轮廓而调节肿瘤的表现型. 因此, SUZ12可能参与肿瘤的发生、发展, 而实时荧光定量PCR检测SUZ12方法的建立无疑为其在肿瘤中的进一步研究奠定基础.
目前最简单、经济、有效的实时荧光PCR方法就是通过嵌入双链DNA(dsDNAs)的荧光试剂如SYBR GreenⅠ等来检测PCR扩增产物[11-13]. 在游离状态下, SYBR GreenⅠ不发出荧光; 而在PCR的延伸阶段, SYBR GreenⅠ与dsDNAs相结合而发出荧光, 随着反应的进行, 荧光信号逐渐增强. 荧光信号的强度依赖于反应体系中现有的dsDNAs(包括特异性扩增产物和引物二聚体等)的量. 因此, 一旦PCR反应体系中出现非特异扩增, 就会影响到定量结果的可靠性与重复性. 在本研究中, 我们参考Ballet al[14]的建议, 在每一个PCR循环中延伸步骤后增加了一步, 即将温度提高后再检测反应体系中的荧光, 这个温度(78℃)大于引物二聚体的Tm 76.54±0.51℃而小于特异性扩增产物的Tm 81.37±0.16℃, 因而此时引物二聚体都变性成单链, 只检测到与特异性PCR产物结合的SYBR GreenⅠ所发出的荧光, 消除了引物二聚体的干扰, 降低了非特异性荧光, 有助于目标基因的准确定量. 另外, 为了进一步验证