与甲状腺相关的免疫分析技术 ——和医学检验同行共同探讨 与甲状腺相关的免疫分析技术 “simplex” ——Michael M. Kaplan 主 题 ? 免疫检测技术 甲状腺疾病与免疫测量指标 相关问题讨论 ? ? 免疫分析技术——换个角度看问题 ? 多方面认识影响技术发展的因素: ?检测技术本身的衍变 ? 临床循证医学的需要和对疾病的新认识 医疗产业链的发展 ? 标记免疫分析 ——可能是免疫学最显著的进展 ? 放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析 酶免疫分析 ? ? 化学发光免疫分析 时间分辨荧光免疫分析 电化学发光免疫分析 ? ? 放射免疫分析-RIA 独特的测量技术 可能也是人类历史上最戏剧性的测量技术 Ag + Ab ? AgAb Ag* Ag*Ab 免疫学可能是现代科学最难的学科之一 ? 表达多元化 ? ? ? 结构复杂化 方法多样化 个体多变化 免疫分析独特性 ? ? ? 利用异种免疫反应性测量含量!!! 可测物与被测物只是相似而不是一致(RIA)! 被测物的含量是通过计算推测得到的!!! Ag + Ab ? AgAb Ag* Ag*Ab 免疫检测是不是临床需要的技术? 其实我们期待检测到:生物活性量\生物效应量 免疫测量的现实 ? 多数被测物的抗原性不完全清楚 ?目前我们对多数大分子待测物的空间结构不清楚 ? 测量抗体只针对多数被测物的一部分抗原性 ?抗体的种类多 ?方法学之间有差异 PSA 复合物 微量物质的免疫性___我们知道不充分 ? 为什么形成抗原和抗体? 为什么不? ? 半抗原的T3(rT3)、T4(T2、T1)为什么有不同抗体? ? 体内究竟有没有自身自身抗体!!! ? 甲状腺激素小分子的免疫性与生产(药物)和定标的抗原抗体有没有差异? ? 抗原性与生物活性之间有多少相关性? ? 非生物活性和单纯定性诊断不是大问题 ? 激素、药物要对疾病分期、分级和疗效分析及预后判断是个关键问题。 微量物质的免疫测量___是比较和筛查的结果 ? 抗体的筛选仍然、也只能是综合因素的选择! ? 非统一化的抗体可比性差 ? 批间差异几乎不可避免 ? 免疫反应性与个体样品测量的差异(以及干扰因素)很 难解决。 ? 质控是必要的,而标准化只能是一个相对的概念! 免疫测不准法则 ? 多数情况下,免疫分析的结果与临床期望值一致! 免疫性与生物表达量不相一致!且免疫性尚没有确定! ? 激素、药物、定量分析等临床解释要慎重 ? ? 待测样品中的干扰因素仍过于复杂 ? 我们实验室不清楚(只能做好流程管理) ? 实验室研究——成本比较高,答案可能比较模糊! 免疫技术的临床实用价值 n 绝大多数情况下 ,测量结果与病人临床表现基 本符合; n 存在波动是正常的 n 实验室之间的差异也可能是很大的 n 疾病因素(包括个体差异)是比较复杂的 n 为临床疾病诊疗提供客观依据 标记免疫分析技术 相关问题探讨 2 ? 甲状腺免疫测量指标 甲状腺实验室诊断指标 功能指标 ? 蛋白和自身免疫指标 ? ? ? ? ? ? ? 总T4(TT4),游离T4(FT4) 总T3(TT3),游离T3(FT3) 反T3(rT3) 促甲状腺激素TSH 游离甲状腺素指数 TRH兴奋试验 甲状腺素结合球蛋白(TBG) 甲状腺球蛋白(TG) 甲状腺过氧化物酶抗体TPOAb 甲状腺球蛋白抗体(TGAb) TSH-受体抗体(TRAb) 游离甲状腺素指数 甲状腺激素自身抗体(THAAb) ? ? ? ? ? 甲状腺血清功能指标 ——TSH:理论上最重要 关于TSH “代” 和“超敏” 提高灵敏度, 提高临床应用. Third generation Second generation First generation 20% 0.01 to 0.02 0.1 to 0.2 1 to 2 TSH concentration (? IU/mL) 超敏TSH的传统临床意义 ? ? ? 正常人群=0.3~5.0 uIU/ml 甲状腺亢进人群≤0.1uIU/ml Grave氏甲状腺毒症≤ 0.02uIU/ml ? 甲状腺减低人群≥10uIU/ml 超敏TSH的新临床要求 ? ? ? ? ? 正常人群=0.4~4.0 uIU/ml 甲状腺亢进人群≤0.1uIU/ml(变化中) Grave氏甲状腺毒症≤ 0.02uIU/ml (变化中) 甲状腺减低人群≥5~10uIU/ml 接受治疗的甲状腺病人: ? 分化型甲状腺癌 ≤0.1uIU/ml(变化中) ? 孕妇补充… TSH应用的实际情况 ? ? ? ? 正常人群的波动。 TSH属于慢反应激素,上升和下降的速度都很慢 TSH属于大分子多肽,血液内生物降解的速度比较慢。 HCG(LH、FSH等)与TSH有共同?亚单位,测量有误差。 ? ?亚单位很相类似 ? 口服甲状腺素替代治疗后,TSH参考范围需要改变。 ? TSH自身抗体? 六种TSH检测比较研究的初步结果 ? ? RIA方法比较差(对几乎甲亢组无意义)。 IMRA方法一般(对甲亢组有价值,但与自动化检测有显著 差异) ? 四种自动化检测有差异,对临床判断影响不一: ? 总体差异不太大(5~15%) ? 高灵敏度:ROCHE and ABBOTT ? 回收率:谨慎使用 ?? 未来TSH分析的临床要求 ? 测量范围和灵敏度同样重要 最好采用多元测量 ? 同时要保证特异性 ? ? TSH变化与T3、T4相一致 甲状腺血清功能指标——在实际应用中要谨慎 ? ? TSH(以及其他指标)多数是正确的,有时仅供参考! 影响因素包括: ? 受到药物的干扰 ? 受到垂体慢反应的影响 ? 受到垂体其他激素的干扰 ? 受到孕期的影响 ? 受到自身抗体的干扰和动物皮毛的影响 ? 受到测量试剂和设备稳定性的影响 ? 人为误差 甲状腺激素分子特点和代谢 ? ? 均为小分子激素 大多数与蛋白结合 T4是有生物活性T3的前体 ? T4通过外环脱碘产生T3, T3起主导的生物效应。 ? T4内环脱碘只能生成无活性T3 ? ? 甲状腺激素进一步代谢 ? T3通过内环脱碘形成3,3’二碘甲状腺氨酸 ? rT3通过外环脱碘也可产生3,3’二碘甲状腺氨酸。 ? 通过磺基转移酶的催化作用,苯环上的羟基被硫酸酯化。 ? 降解的主要部位在肝脏 ? 胆道和尿路排泄 甲状腺激素的临床免疫学意义 ? 小分子激素的抗原性比较单一 抗体的交叉反应性仍然不同程度存在? ? ? 测量方法有多重性,没有统一的标准 免疫测量受多种因素影响 抗甲状腺素抗体? ? ? 甲状腺功能指标——理论上较为简明 FT4二种检测结果对比(1) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 六院(11.5~22.7pmol/L) 1 49.77 55.24 38.09 30.37 48.78 50.96 30.74 24.03 26.27 33.21 34.98 22.80 25.22 瑞金(9.0~19.0pmol/L) 32.72 34.46 25.96 22.94 35.58 35.87 23.40 18.55 19.34 27.10 23.86 13.40 16.59 FT4二种检测结果对比(2) 六院(11.5~22.7pmol/L) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 瑞金(9.0~19.0 pmol/L) 44.06 16.48 18.48 23.67 23.90 23.66 18.84 13.79 12.88 17.16 24.44 1 83.44 25.08 27.95 24.57 29.36 25.68 25.10 23.27 23.05 25.13 31.72 FT4二种检测结果对比 可能对临床的影响 如果单指标性诊断:32% 甲亢~非甲亢 如进行病期或疗效判断:>50%差异 为什么? ? ? 甲状腺功能指标 药物的影响 甲状腺功能指标 药物的影响 甲状腺功能指标的影响因素 ——值得进行临床分类研究 ? 检验技术人员 ?做好室间质量控制,减少人为误差 ? 临床医生: ?熟悉常用药物对甲状腺功能指标测量的影响 ?熟悉常见病对甲状腺功能指标测量的影响 ?分析一过性异常指标的临床观察 ?动态检测比单次检测更重要 甲状腺疾病的实验室诊断 ? 临床更多的问题: ? 现在有些病人甚至表面健康人的抗体指标很高,与 病人临床表现不符合。 ? 为什么其他甲状腺指标检测很快,TRAb要等几天? 甲状腺疾病的免疫学指标 ?甲状腺疾病究竟有哪些抗体指标? ? 有些病人的抗体指标很高,与病人临床表现不符合; 与AITD密切相关的抗体 ? 甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb) 甲状腺球蛋白抗体 ATg(TGAb) ? ? 促甲状腺素受体抗体 (TRAb) ? 协助诊断甲状腺疾病的(病因或分类)诊断 用于甲状腺疾病的治疗监测和评价 ? 甲状腺疾病中:自身免疫性甲状腺疾病最多 ? 自身免疫性甲状腺疾病 AITD ? Grave’s (GD) ? Hashimoto’s甲状腺炎 (HT) 二者均为免疫失控 T和B淋巴细胞侵入甲状腺 ? ? ? 部分淋巴结和骨髓细胞 甲状腺过氧化物酶(TPO) ? TPO ? 细胞膜蛋白,分子量约为107KDa ? 93氨基酸残基糖蛋白 ? 空间结构仍不完全明确,临床不能常规检测 ? TPO在甲状腺激素的生物合成中的反应: ? 甲状腺素残基的碘化。 ? 甲状腺球蛋白上两个碘化甲状腺残基的氧化偶联。 甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb) ? TPOAb ? 基本由B淋巴细胞产生 ? 一般属于IgG1,或IgG4,(呈亚型或个体差异) ? 已经发现有近200种(H和L链的不同以及组合不同) ? 一定程度上代表甲状腺自身免疫障碍。 甲状腺球蛋白Tg ? TG ? 分子量约660 kDa、二聚体糖蛋白复合物 ? 甲状腺激素合成的基质,受到转译后碘化作用的影响 ? 在甲状腺滤泡中以胶体形式贮存 ? 生理条件下,血循环中可测出少量的TG。 ? 目前还不清楚血浆中的TG的特殊功能。 ? TSH 是TG生理性释放的主要刺激因子。 甲状腺球蛋白抗体TgAb (ATg) ? TgAb ? 基本也由B淋巴细胞产生 ? 与TPOAb可能存在共同的亚链 ? 已经发现有数十种TgAb亚型(H和L链的不同及组合不同) ? 与Tg共同存在于血液内。 TgAb和TPOAb在测量方面 技术关键因素 ? 寻找和确定特异性的抗体链 ?提高特异性 ?保持高的灵敏度 ? 减少和避免自身抗原的干扰 ?不同的技术方法、测量时间可能影响不同 TPOAb 和TgAb检测 的临床应用 TPOAb 和TgAb检测的临床应用 (一) ? 甲状腺高危人群的筛查 ? 富含碘食品的高龄妇女 ? 有精神、情绪波动的女性 ? 产后妇女(尤其有不舒适的表现) ? 患有甲状腺结节的无症状患者 ? 进行过甲状腺手术和其他手术 ? 患有其他免疫性疾病 TPOAb 和TgAb检测的临床应用 (一) ? 甲状腺高危人群的筛查 ?家族性甲状腺疾病 ?使用过减肥药物 ?甲状腺癌患者 ?其他内分泌代谢异常 TPOAb和TSH的筛查 TPOAb 和TgAb检测的临床应用 (二) ? 颈部不适患者的诊断和鉴别诊断 ?临床考虑有甲状腺炎(HT)、甲亢(GD) ?(HT)、甲亢(GD)的鉴别诊断 ? 结合其他指标 TPOAb 和TgAb检测的临床应用(三)病程监测 ? TPOAb和TgAb持续阳性 ?AITD仍处于活动期,与症状无必然关系 ? TPOAb和TgAb恢复正常 ?AITD仍处于免疫抑制或正常状态 ?或可能预示有甲状腺机能减退出现 TPOAb 和TgAb持续阳性 ? 异常B淋巴细胞活动持续存在 ?临床意义需要继续研究 ?预后作用的报道有差异 GD和HD的TPOAb 和Tg阴性问题? 真阴性?假阴性? ? 测量抗体和表达抗体的区别 ?测量方法的差异 ? 血液中的干扰因素 ?TG TSH receptor autoantibodies (TRAb) Elecsys? Anti-TSHR 53 TSH Receptor Rapoport B et al, Tue thyrotropin (TSH) receptor: Interaction with TSH and Autoantibodies. 54 TSH受体抗体——TRAb ? 三个类别: ?TSH结合抑制免疫球蛋白——TSH受体抗体 ?甲状腺刺激抗体——TSAb ? GRAVE’s致病性抗体 ?甲状腺刺激阻断抗体——TSBAb ? 可能是部分甲状腺炎发生甲减的致病性抗体 TSAb与Grave‘s病 TSAb TRH T4 TSH T3 fT3, fT4 TRH TSH T4 T3 fT3 fT4 TSAb Thyreotropin Releasing Hormone Thyroidea Stimulating Hormone Thyroxine, Tetraiodothyronine Triiodothyronine free T3 free T4 56 Thyroid Stimulating Antibodies TRAb ? TRAb与甲状腺细胞上的促甲状腺激素受体 结合后引起以下作用: ? 兴奋腺苷酸环化酶活性。 ? 激活第二信使CAMP的分泌。 ? 甲状腺激素的产生和分泌的增加。 ? 直接抗受体的抗体的性质属于异原性的,同时有兴奋 和阻断性质,但整体的效果是对受体有刺激作用。 TRAb的适应征 ? ? ? ? ? 甲亢的鉴别诊断。 内分泌性眼病的评估。 有Grave’s病的孕妇随访。 Grave’s病治疗随访。 是否有抗体存在时甲减的评估。 Elecsys? Anti-TSHR Elecsys? Anti-TSHR的特点 初步临床验证研究结果 ? 参考范围:<1.60 IU/L >60%的表面健康人群<0.3 IU/L 批内和批间CV<10% ? Grave’s甲亢的检测阳性率96.1% ? 85.2%非Grave’s甲亢阴性; ? 与TGAb和TPOAb共同阳性比例明显下降! ? 减少了70%甲亢病人的类型判断。 ? 检测的干扰因素比较少(在分析总结中) 60 Elecsys? Anti-TSHR的特点 临床验证研究结果 ? 检测速度快,而且方便; 甲亢的检测阳性率最高,检测稳定性最好; 检测的量程比较宽,可稀释。 ?最适合进行治疗监测; ?将成为临床应用的趋势 61 ? ? 甲状腺免疫指标——在实际应用中要谨慎 ? 其他影响因素包括: ? 受到药物或者食物因素的干扰 ? 受到自身抗体的干扰和动物皮毛的影响 ? 受到测量试剂和设备稳定性的影响 ? 人为误差 ? 其他因素