在中国共产党积极准备南昌起义的同时,国民党武汉政府也加紧了在军队中的“清共”活动。此时,国民党武汉政府的第五方面军(总指挥朱培德)第3军主力位于樟树、吉安、万安地区,第9军主力位于进贤、临川地区,第6军主力正经萍乡向南昌开进;第二方面军的其余部队位于九江地区;南昌市及近郊只有第五方面军警备团和第3军、第6军、第9军各一部共3000余人驻守。中共前委决定赶在国民党武汉政府的援兵到来之前举行起义。起义的时间定于1927年8月1日凌晨4点,后来由于军中出现了叛徒,起义提前2个小时,在凌晨2点举行。周恩来以前委的名义任命贺龙为起义部队的总指挥。
8月1日2时,在周恩来、贺龙、叶挺、朱德、刘伯承的领导和指挥下,南昌起义开始。起义部队2万余人,向敌人驻地发起了猛烈的进攻,战斗进行了4个多小时,起义军完全控制了南昌城。歼灭南昌守敌3000多人,缴获机枪800多挺,步枪4000多支,子弹70多万发,大炮数门。
起义成功后,中共前委按照中共中央关于这次起义仍用国民党左派名义号召革命的指示精神,发表了国民党左派《中央委员宣言》,揭露蒋介石、汪精卫背叛革命的种种罪行,表达了拥护孙中山“三大政策”和继续反对帝国主义、封建军阀的斗争决心。当天上午,召开了有国民党中央委员、各省区特别市和海外党部代表参加的联席会议,成立了由宋庆龄、周恩来、贺龙、叶挺、朱德等25人组成的中国国民党革命委员会,通过了《八一起义宣言》等文件,提出了“打倒帝国主义”、“打倒新旧军阀”、“实行耕者有其田”等革命口号和政纲。
当日下午,驻马回岭的第25师第73团全部、第75团3个营和第74团机枪连,在聂荣臻、周士第率领下起义,8月2日到达南昌集中。