通常来讲,real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样,要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间,所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法,最好在PCR扩增程序结束后,加一个溶解程序,来形成溶解曲线,判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序,仪器都有默认设置,或稍有不同,但都是一个在产物进行溶解时候,进行荧光信号的收集。
3. 仪器设置
所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置(plate setup)和程序设置(program setup)。我们以 ABI StepOne为例,详细看一下反应设置:
A. 首先是实验目的选择:定量还是其他。我们命名为“BioTeke”,进行“定量”实验。
B. 实验方法的选择:我们选用的比较Ct的SYBR Green方法, Fast程序,以cDNA为模板进行。
C. 目的基因的设置:有几个目的基因和目的基因的名称。
D. 样品的设置:包括哪个是实验组,哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。
E. 对照组和内参基因的设置:这个是为后面的定量做准备
F. 反应程序的设置:PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10 分钟)。循环反应是95℃15秒,60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。
G. 反应体系的设置:
A-G这五个步骤简单设置好,可以保存,修改反应程序或者立刻进行反应。
需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料,默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面;也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料,所以选择“none”。
设置好之后,就可以把配置好的PCR管放进仪器,点击RUN!
Real-time qPCR数据分析
1. Real-time qPCR常见参数
基线(baseline)
通常是3-15个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
阈值(threshold)
自动设置