蛋白质纯化的方法、 局限性及展望 姓名: 杜改亮 学号: 201020945 专业: 细胞生物学 摘要: 相对与上游工作来说, 分子克隆的下游工作显得更难, 蛋白 纯化工作非常复杂, 除了 要保证纯度外, 蛋白产品还必须保持其生物学活性。 纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白, 重复性良好。 这就要求应用 适应性非常强的方法而不是用 能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。 在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用 中失败, 因为后者要求规模化, 且在每日 的应用 中要有很好的重复性。 本文综述了 蛋白 质纯化方法优点及局限性, 以期对蛋白 纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导, 并提出展望。 关键词: 蛋白 质的纯化方法; 局限性; 展望 引言 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异, 利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染, 而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。 每种蛋白间的大小、 形状、 电荷、 疏水性、 溶解度和生物学活性都会有差异, 利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。 蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。 粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如 DNA、 RNA 等分开, 由于此时样本体积大、 成分杂,要求所用的树脂高容量、 高流速, 颗粒大、 粒径分布宽. 并可以迅速将蛋白与污染物分开, 防止目 的蛋白被降解。 精细纯化阶段则需要更高的分辨率, 此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来, 要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱, 应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。 选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性, 柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力, 洗脱峰越窄, 柱效越好。 仅有好的选择性, 洗脱峰太宽, 蛋白照样不能有效分离。 1. 各种蛋白纯化方法及优缺点 1.1 硫酸铵沉淀蛋白 蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。 在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低, 蛋白则倾向于从溶液中析出。 硫酸铵是沉淀蛋白质最常用 的盐, 因为它在冷的缓冲液中溶解性好, 冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。 硫酸铵分馏常用做纯化的第一步, 它可以初步粗提蛋白质, 去除非蛋白成分。 蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定, 可以短期在这种状态下保存中间产物, 当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。 在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题, 硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。 其他的盐如硫酸钠不存在这种问题, 但其纯化效果不如硫酸铵。 除了盐析外蛋白还可以用多聚物如 PEG 和防冻剂沉淀出来, PEG 是一种惰性物质, 同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果, 在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的 PEG 浓度, 蛋白沉淀可通过离心或过滤获得, 蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。 蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法, 因为它只能达到几倍的纯化效果, 而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 1. 2 离子交换色谱 这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。 基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用, 通过选择不同的缓冲液, 同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂 (能结合带负电荷的分子) 结合, 也可以和阳离子交换树脂结合。 树脂所用的带电基团有四种: 二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂; 羧甲基用于弱的阳离子交换树脂; 季铵用于强阴离子交换树脂; 甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。 蛋白质由氨基酸组成, 氨基酸在不同的 pH 环境中所带总电荷不同。 大多数蛋白在生理 pH(pH 6—8) 下带负电荷, 需用阴离子交换柱纯化, 极端的 pH 下蛋白会变性失活. 应尽量避免。 由于在某个特定的 pH 下不同的蛋白所带电荷数不同, 与树脂的结合力也不同, 随着缓冲液中盐浓度的增加或 pH 的变化, 蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。 在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变 pH 值,因为前者更容易控制。 在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱, 利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升, 当离子强度能够中和蛋白的电荷时, 蛋白就被从柱上洗脱下来。 但在工业生产中盐浓度很难精确控制,所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。 与排阻层析相比, 离子交换特异性更好, 有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果, 树脂也比较便宜。 值得一 提的是, 即便是用最精确控制的条件, 仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白, 还需要其他的纯化步骤。 1. 3 亲和层析 亲和层析基于目 的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留, 其他杂蛋白会流过柱子。 本方法存在的问题是: 单抗非常昂贵, 而且也需先纯化; 单抗与目 的蛋白结合力太强. 要用苛刻的条件来洗脱, 这会使目的蛋白失活并破坏单抗; 混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破坏抗体或与它们非特异结合; 某些单抗也会在纯化过程中从树脂上解离下来混入产物中, 也需要从终产物中去除。 亲和柱通常在纯化过程的后期应用, 此时标本体积已缩小, 大部分的杂质已经去除。 谷胱甘肽 S一转移酶(Glutathione S—transferase, GST) 是最常用的亲和层析纯化标签之一, 带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化, 但本方法有以下缺点: 首先, 蛋白上的 GST 必须能合适地折叠, 形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化; 其次, GST 标签多达 220 个氨基酸, 如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性, 使形成包涵体, 这会破坏蛋白的天然结构, 难于进行结构分析, 有时即便纯化后再酶切去除 GST 标签也不一定能解决问题。 另一种可应用的亲和纯化标签是 6 组氨酸标签, 组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、 锌和钴等金属离子, 在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合, 在低pH 下用咪唑竞争洗脱。 组氨酸标签与 GST 相比有许多优点, 首先, 由于只有 6个氨基酸, 分子量很小, 一般需要酶切去除: 其次, 可以在变性条件下纯化蛋白,在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力; 另外 6 组氨酸标签无免疫原性, 重组蛋白可直接用来注射动物, 也不影响免疫学分析。 虽然有这么多的优点, 但此标签仍有不足, 如目的蛋白易形成包涵体、 难以溶解、 稳定性差及错误折叠等。 镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏出混入蛋白溶液, 不但会通过氧化破坏目 的蛋白的氨基酸侧链, 而且柱子也会非特异吸附蛋白质, 影响纯化效果。 若目的蛋白可与某种碳水化合物特异结合, 或者需要某种特殊的辅因子, 可将该碳水化合物或辅因子固相化制成亲和柱, 结合后目的蛋白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱。 1. 4 疏水作用层析蛋白 是由疏水性和亲水性氨基酸组成’ 的。 疏水性氨基酸位于蛋白空间结构的中心部位, 远离表面的水分子。 亲水性氨基酸残基则位于蛋白表面。 由于亲水性氨基酸吸引了许多的水分子, 所以通常情况下整个蛋白分子被水分子包围着, 疏水性氨基酸不会暴露在外。 在高盐浓度的环境中蛋白的疏水性区域则会暴露并与疏水性介质表面的疏水性配基结合。 不同的蛋白疏水性不同, 与疏水作用力大小也不同,通过逐渐降低缓冲液中盐浓度冲洗柱子, 在盐浓度很低时, 蛋白恢复自然状态,疏水作用力减弱被洗脱出来。 疏水性树脂的选择性是由疏水性配基的结构决定的, 常用的直链配体为烷基配体(alkyl ligands) 和芳基配体(arylligands) ,链越长结合蛋白的能力也越强。 理想树脂种类的选择应根据目的蛋白的化学性质而定, 不能选择结合力太强的树脂, 结合力太强的树脂会很难洗脱, 所以开始时应选用中等结合力的苯基树脂探讨条件。 为了使选择合适的介质更容易Amersham Biosciences 推出了疏水作用树脂选择试剂盒, 里面包括 5 种不同的树脂供比较。 疏水层析很适合作为离子交换纯化的下一个步骤, 因为疏水作用层析在高盐浓度下上样, 从离子交换得到的产物不需更换缓冲液即可使用。 蛋白又在低盐缓冲液中洗脱, 又省去了下一步纯化前的更换缓冲液的步骤, 既节约了时间, 又减少了蛋白的丢失。 1. 5 排阻层析也叫凝胶过滤或分子筛 排阻层析柱的填充颗粒是多孔的介质, 柱中围绕着颗粒所能容纳的液体量叫流动相, 也称无效体积。 太大的蛋白不能进入颗粒的孔内, 只能存在于无效体积的溶液中, 将会最早从柱中洗脱出来, 对这部分蛋白无纯化效果。 由于各种蛋白的分子大小不同, 扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异。 大的蛋白分子会被先洗脱出来, 分子越小, 洗脱出来的越晚。 为得到最佳的纯化效果, 应将孔径大小选在目的蛋白能在无效体积和总柱床体积的中点附近洗脱。 排阻层析有其他方法所不具备的优点, 首先所能纯化的蛋白分子量范围宽, Tosoh Biosep 公司的聚合物树脂, 排阻极限可达 20o000kD; 其次, 树脂微孔的形状适合分离球形的蛋白质, 纯化过程中也不需要能引起蛋白变性的有机溶剂。 应该注意的是某些蛋白不适合用凝胶过滤纯化, 因为本技术所用树脂有轻度的亲水性, 电荷密度较高的蛋白容易吸附在上面。 排阻层析从不用于纯化过程的早期, 因为这种方法要求标 本高度浓缩, 上样量只能在柱体积的 1%--4%之间, 柱子要细而长才能得到好的分离效果, 树脂本身也比较昂贵, 规模化的工业生产中不太适用。 另外近几年还出现一些对蛋白质方法的改进的方法, 如: 内含肽介导的新型蛋白质纯化技术; 反胶束用于蛋白质纯化。 2. 一些实例应用 2. 1 2008年的内含肽介导的新型蛋白质纯化技术 内含肽的自切割功能在蛋白质工程领域有着广泛的应用, 尤其是在蛋白质纯化方面, 将内含肽与亲和纯化技术联合应用, 使得传统的亲和纯化方式有了 重大的突破。 近年来, 随着内含肽的研究不断深入, 一批内含肽介导的新型蛋白质纯化技术不断出现。 新技术依靠内含肽的自切割功能去除亲和标签, 避免了传统工艺中因外加蛋白酶而带来的诸多麻烦; 新的聚合材料的引入又成功地避开了 亲和树脂柱的使用, 不仅优化了工艺, 也大大降低了纯化的成本, 为在工业化大生产中的应用奠定了基础。 2. 2 2009年的2种棉花叶片总蛋白质纯化方法比较研究 以三氯乙酸—丙酮沉淀法粗提的棉花总蛋白为材料, 比较了丙酮沉淀法、 醋酸铵沉淀法纯化棉花总蛋白的效果. 结果显示: 与三氯乙酸— 丙酮沉淀法提取的棉花总蛋白干粉加入裂解液后直接电泳相比较, 经丙酮沉淀法和醋酸铵沉淀法处理后的总蛋白杂质干扰少、 电泳结果蛋白条带清晰, 蛋白含量较高, 相比醋酸铵沉淀法丙酮沉淀法效果较好, 适合于棉花蛋白质组学研究中纯化总蛋白质. 2. 3 2010 年的 Protein A /G 亲和层析在 HCV 抗体纯化中的应用效果 目的: 分析蛋白A /G亲和层析柱在纯化抗HCV 血清的影响因素, 以便选择最佳使用条件提高Prote in A /G亲和柱的利用效率。 方法: 分别将抗HCV 血清用不同处理方式、 不同上样方式、 不同使用次数的亲和柱进行纯化, 并收集纯化样品进 行检测、 分析。 结果: 用饱和硫酸铵粗纯后, 在蛋白A /G亲和层析柱的纯化效果更好; 样品在亲和柱内吸附30m in可提高亲和柱的对目的蛋白的吸附。 结论: 使用初纯的抗体并增加吸附时间能提高亲和层析柱的利用率, 并有效延长亲和柱的使用寿命。 3. 蛋白质纯化方法的进化与展望 近年来随着各学科的迅猛发展, 对蛋白纯化技术的需求不断增长, 已有的纯化方法被日益改进, 新型的纯化方法也相继涌现。 羟磷灰石是磷酸钙的结晶, 由于其理化性质不够稳定, 结合能力差, 很难用于层析。 进来Bio—Rad公司对其进行了改进, 提高了钙和磷的比例, 使形成球形、 多孔、 性质稳定的陶瓷羟磷灰石颗粒,其带正电的钙离子和负电性的磷酸根离子可分别与蛋白的羧基及氨基结合。 通过调整缓冲液的pH值, 酸性及碱性氨基酸可选择性地与此树脂结合, 改变缓冲液的盐浓度可将蛋白洗脱分离。 资料显示, 使用这种方法能使两种等电点、 分子量和疏水性相同的蛋白很好分离” q。 亲和纯化方面, SigrIla发展了利用FLAG标签的纯化方法, FIAG序列为N—AspTyrLysAspAspAspAsp—Lys—C, 分子量小且亲水性, 与其融合表达的蛋白不易形成包涵体, 活性也不受影响, 用该公司抗FLAG抗体亲和树脂即可纯化目的蛋白。 其他新型标签及相应纯化系统还有CBP (Calmodulin—binding peptide, CBP) 、 Promega公司的BCCP(Biotin carboxy—kaⅡ ier protein, BCCP) 标签和亲和素一生物素纯化系统、 麦芽糖结合蛋白(Maltose_binding protein, MBP) 标签、 Biolabs公司的IMPACT—CN系统、 Novagen公司的CBD一tag和T7一tag系统等。 相信随着时间的推移, 会有更多更好的方法出现, 合理充分地应用这些方法, 对科研、 生物制药、 疫苗、 诊断试剂研制等工作都会有很大帮助。 参考文献 [1] 汪小雄, 卢龙斗, 李明军等. 日本落叶松胚性愈伤组织蛋白组分双向电泳分析[J] . 河南师范大学学报( 自然科学版) , 2009, 37(1) : 116- 122. [2] Zhao Z et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 77(5) : 1175-1180. [3] Mee C et al. Chem Eng J, 2008, 135(1) : 56-62. [4] 金宇. 反胶束中酶催化反应研究进展[J] . 化学工程, 2008, 24(4) : 33- 35. [5] Lan J, Zhang Y, Huang ...