胰岛素是由 A 链和 B 链两条肽链共 51 个氨基酸残基组成的生物大分子。其种族差异,只在 A 或B 链中的个别氨基酸残基有所不同。由图 1 可见, A 链含有 11 种 21 个氨基酸残基,N- 端为 Gly,C- 端为 Asn。A 链的 6 位和 11 位上的两个 Cys 通过二硫键相连成环 ; B 链含有 16 种30 个氨基酸残基,其 N- 端为 Phe,C- 端为 Ala。A链和B链又通过两对二硫键互相连接成胰岛素分子。50 多年前,我从北京大学化学系毕业后,有幸参加了我国合成结晶牛胰岛素 A 链的研究项目。本文通过自己的亲身经历和所见所闻分七节来阐述我国 20 世纪 60 年代成功合成结晶牛胰岛素的启示[2-3]。因为他 叶蕴华:我国成功合成结晶牛胰岛素的启示和收获第6期649小[6]。按照这一推论,合成胰岛素几乎是不可能的。关于胰岛素分子中三对二硫键如何能正确配对的问题在立项时就困扰着大家。 为了解决这个问题,1959 年初上海生化所邹承鲁课题组的杜雨苍、张友尚等开始探索天然胰岛素拆分与重组合的研究。他们的拆、合研究经历了多次失败后,于 1959 年 3月取得了好的苗头,发现重新氧化拆开后的胰岛素A、B 链的混合物能表现出天然胰岛素 0.7%~1% 的活力。经过进一步探索,拆分和重组合后的胰岛素生物活力可以达到天然胰岛素的 5%~10%。他们最终发现,在适当条件下氧化被还原的 A 链和 B 链,生物活力的恢复可达 50%。经过多次纯化,杜雨苍等最终获得了与天然胰岛素相同的正立方体结晶。在发表论文的结论中他们明确指出“从充分苄基化了的胰岛素衍生物能恢复活力这一事实,说明可以通过人工合成的 A 与 B 链最后合成胰岛素”[7-8]。根据他们的研究结果,我们决定先分别合成 A 链和B 链,然后用合成的 A 或 B 链分别与天然的 B 或A 链组合成半合成胰岛素,最后用合成的 A 链与合成的 B 链完成胰岛素的全合成。总的合成路线确定后,还有一系列问题需要解决。首先,带有保护基 A 链和 B 链的合成,因为侧链的官能团很多,而要按指定顺序连接时,必须对不让其反应的基团加以保护 ( 我们戏称之为穿靴戴帽 )。有的保护基需在不同阶段顺利脱除,而有的保护基则要到最后才脱除。所以对于胰岛素中氨基、羧基及侧链官能团的保护基的选择和设计是十分关键的步骤。其次,组成胰岛素的 51 个氨基酸残基中,除 4 个甘氨酸残基 (Gly) 外,其他 47 个氨基酸残基均为手性分子,在合成反应的每一步,包括肽键形成及脱保护基时,均要保证手性分子不发生消旋反应,否则将导致胰岛素生物活性失活。所图1 牛胰岛素的一级结构和收获 : 敢于向难题挑战,坚持严谨的科学作风,依靠团队间的合作,发扬奉献的精神,为我国生命科学培养了一批人才,提高了我国有关领域的科研水平以及带动了我国相关产品的研发。2　敢于向难题挑战1958 年在大跃进形势的鼓舞下,我国科学家大胆提出了合成胰岛素的课题。当时在国际上合成的最大多肽是促肾上腺皮质激素的十三肽片段。此前 du Vigneaud 于 1955 年曾合成了含有一个 -S-S-环的催产素,也只是一个九肽[4-5]。而胰岛素是一个蛋白质,不仅分子量大而且结构非常复杂,分子中含有三对 -S-S- 键。胰岛素合成涉及有机合成、化学与生物分析、 生物活性等方面。其工作量之大、难度之高是生物化学与有机化学领域中前所未有的。在我国当时的条件下,靠一个单位来完成这个项目显然是不可能的。1959 年 3 月中国科学院上海生化所派了曹天钦、钮经义、邹承鲁、鲁子贤、王芷涯等 5 人到北大来探讨与北大共同合成胰岛素的可能性,并做了有关胰岛素的学术报告。北大方面积极响应,同意承担合成 A 链的研究任务。Sanger 在测定胰岛素一级结构时,先把胰岛素拆分成 A 链和 B 链,经纯化后再分别测定它们的氨基酸序列。据此,我们在设计合成路线时,考虑到是否可以先分别合成 A 链和 B 链,再把 A、B 链连接成为胰岛素呢?由于当时还没有对巯基 (-SH)选择性的保护基,所以含有 6 个 -SH 基的 A 链与 B链连接方式将有非常非常多的可能性。Kauzmann曾计算过,并在理论上指出 A 与 B 链不仅可以以A1B1而且可以 AnBm各种可能的方式结合,此处 n与 m 可以是 0 或任何正数。因此 Kauzmann 认为,A 链与 B 链形成正确的胰岛素结构的可能性也就很 生命科学第27卷650以在设计合成路线时, 何处为避免消旋的最佳接头、合成方法的选择以及保护基的选择与脱除条件均为合成的难点。另外,当时大部分合成胰岛素的最基本的原料氨基酸,都要靠外汇进口。为解决这一问题,上海生化所抽调了陈远聪等创建了我国第一个生产氨基酸的东风生化试剂厂,解决合成胰岛素所需氨基酸的燃眉之急[9]。3　坚持严谨的科学作风胰岛素合成是一个复杂的系统工程。它是由51 个氨基酸通过 200 多步化学反应而合成的具有生物活力的蛋白质。合成中每一个步骤都会影响最后的成败,因此对每一步反应都必须严格把关。所有的中间产物均经过严格鉴定合格后才能用于下一步反应。在合成过程中,制备的大多数肽段均使用两种或两种以上不同的路线或方法去得到同一性质的产物,从而保证目标肽产物结构的正确性。例如在胰岛素 A 链合成中, 北大负责 N- 端九肽 (A1-9) 的合成,由于九肽中有一个 -S-S- 键小环,结构特殊,在合成时就设计了 4 + 5 和 5 + 4 两条不同的路线以及不同的接肽方法,得到了分析数据相同的九肽后,才认定了我们的 N- 端九肽的合成正确无误于当年没有质谱、核磁共振等现代光谱分析手段,[10-11]。由所有小肽均要通过元素分析、氨基酸的定量分析、不同溶剂系统的纸层析 ( 因为那时没有 TLC 薄层析板 ),以及熔点、电泳、比旋光度、酶解图谱等的测定。只要其中一项分析不过关,就不能进行下一步反应,必须重新合成或经反复纯化后再做分析鉴定。元素分析数据的理论值虽然事先都经过仔细的计算,但是结果出来后,汪猷先生还要亲自再用计算尺 ( 当时尚无计算器 ) 复审我们的计算是否有误。中国科学院上海生物化学研究所、上海有机化学研究所和北京大学化学系三个单位经过通力合作,严格、严谨地实干,于 1965 年 9 月终于得到了全合成的牛胰岛素结晶。全合成实验重复了四次均得到了牛胰岛素结晶1966 年 11 月在中科院副院长吴有训的主持下,在上海召开了专家鉴定会。会议肯定了这一成果的[12-14]。创新性和重大学术意义。同时也提出,为了慎重,在向世界宣布这一重大成果之前,还需要补充酶解图谱等数据。在这次鉴定会上,专家们踊跃发言,各抒己见,对取得的结果进行了实事求是的讨论。当时热烈讨论的情景至今记忆犹新。根据鉴定委员的建议和意见,我们进一步补充了数据。1966 年 4 月由国家科委组织全国有关专家,在北京再次举行成果鉴定的扩大会议。上海生化所和上海有机所参加胰岛素合成工作的全体同事都到北京来,听取鉴定委员们的意见。这次鉴定委员共有 40 多名,其中有北大的张龙翔、陈同度、沈同、唐有祺、张滂、杜锦珠、黄爱珠、陈廉生等老师。会议通过了鉴定,一致认为我们通过人工合成得到了与天然牛胰岛素完全相同的结晶牛胰岛素。会后中国科学院郭沫若院长接见了全体鉴定委员和参加胰岛素合成的全体工作人员[15]。该项成果于 1982年获国家自然科学奖一等奖。4　依靠团队的合作如前所述, 胰岛素合成是一个复杂的系统工程,涉及有机合成、化学与生物分析、生物活性等方面,工作量大、难度高。在我国当时的条件下靠一个单位来完成这个科研项目是不可能的。1960 年北京大学、复旦大学与中科院上海几个研究所共几百人先后开展了科研群众运动 ( 或称大兵团作战 )。北大化学系为了合成胰岛素,停止了正常的教学工作。参加研究的主力是没有经过严格科学研究训练的四、五年级大学生 ( 那时北大理科由五年制改为六年制 ) 和一些年轻老师。低年级同学则负责处理溶剂、试剂制备、氨基酸提取、分离和后勤等工作。参加研究的同学们凭着一股革命热情不分昼夜地加班加点。但是他们不了解必须经过多种分析手段才能确定合成产物的结构与纯度。用未经严格分析鉴定的中间体进行下一步反应,所得到的结果是无法肯定是否为预期的目标产物。事实证明,各单位的大兵团作战都没有得到预期的结果。到 1960 年下半年,由于国家经济处于极端困难时期,基于中央“调整、巩固、充实、提高”的八字方针,各单位合成胰岛素的群众运动,在付出巨大代价后纷纷收场[15]。 北大化学系只留下李崇熙、陆德培、张明哲、伍少兰等少数几位老师整理群众运动留下的样品,继续胰岛素 A 链片段的合成,后来发表了论文 [16-17]。1963 年,国家经济形势好转后,在国家科委聂荣臻主任及上海市和北京市各级领导支持下,决定集中“精锐部队”在上海重新合作,继续开展胰岛素合成的研究。为了便于及时交流和讨论遇到的问题,1964 年 3 月北大抽调了 5 位年轻教师在有机教研室主任邢其毅教授和副系主任文重老师率领 叶蕴华:我国成功合成结晶牛胰岛素的启示和收获第6期651下,到上海有机所参加胰岛素 A 链的合成。在北大成员中有师姐季爱雪、师兄陆德培、李崇熙、施溥涛和我。后来邢先生的研究生汤卡罗也加入了我们的团队[15]。我们与上海有机所的徐杰诚、张伟君、陈玲玲、钱瑞卿、李鸿绪和实验辅助人员王思清、刘永福与姚月珍等密切合作重新进行牛胰岛素 A 链的合成。我们和有机所的同事在同一间实验室工作,并定期到负责合成 B 链和 A、B 链拆合研究的上海生化所汇报工作进展及讨论遇到的问题,及时调整工作计划和人力安排。通过三个单位的协作,大大提高了工作效率。