吴禄贞和秦力山指挥的自立军前军为庚子年长江流域大举中唯一发难者。自立军起义失败后,吴禄贞重返日本。
1901年冬,吴禄贞从士官学校毕业,回到武昌后,被张之洞扣押。在审讯时,张之洞反被吴禄贞说服,委他以重任,任武昌武普通学堂教习、会办,一时轰动武汉。吴禄贞利用职务之便并继续从事革命活动,广泛撒播革命火种,秘密翻印陈天华的《警世钟》、《猛回头》等革命书刊,散发到学堂、军队。创建了国内第一个秘密组织“花园山聚会”,倡导“秀才当兵”,使得一批具有新思想的知识分子从军,大大加强了军队本身的文化程度。
1903年,吴禄贞应黄兴邀请,同李书城、耿觐光等人前往长沙与黄兴、宋教仁、陈天华等在湖南发起组织华兴会,积极协助黄兴制订在长沙起义的计划,筹划湖南独立。恰逢此时,清廷在北京设立练兵处编练新军,急需用人,吴禄贞被在日本士官学校的好友良弼举荐获准。黄兴劝他“投身中央,伺隙而动”,吴遂北上就职。1904年5月奉调入京,任练兵处军学司训练科马队监督。在京期间,仍与湖北志士暗中联系。刘静庵被捕后,他曾竭力援救。
1906年赴新疆伊犁考察新军。因忤陕甘总督升允,被撤去监督差使,被扣留于兰州。
1907年7月,徐世昌任东三省总督,吴禄贞随行任军事参议。此时,日本制造舆论,妄图以吞并中国“间岛”地区。吴禄贞提出“筹边之道,贵在知边”,为徐世昌所接纳,被派往延吉调查边务,任延吉边务帮办。8月,吴禄贞得到日人已在间岛附近集结的消息,立即召开会议,与当地民团首领韩登举取得联系。经过妥善布置,吴禄贞向日人头目斋藤季治致信,要求交涉。交涉当日,韩登举率队伍远远布阵,斋藤以为中方早有准备,心中忐忑,不得不引手下撤出中国边境,叹曰:“中国尚有人在,如吴禄贞者,不可欺也。”之后,吴禄贞在徐世昌支持下主持编写了《延吉边务报告书》,并绘有《延吉边务图》。后来中方以此为谈判的重要依据,终于让日军彻底退出了间岛地区。
1908年11月,吴禄贞回京不久,日人又开始制造纠纷,清廷再次调吴禄贞前往延吉。1909年5月升延吉边务督办,并任陆军协都统。1909年9月4日,《图们江中韩界务条款》在京签订,坚持了中韩以图们江为界河的历史事实,吴禄贞因间岛功绩,被誉为“间岛英雄”!
光绪、慈禧相继亡故后,摄政王载沣企图削弱袁世凯军权,故于1910年调吴禄贞入京,孙中山、黄兴对此相当重视,李书城也建议