我的实际解决方案:1、首先,排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少。免疫组化中两个最重要的因素是抗原和抗体。⑴抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度,一般切片室温保存超过3-6个月,可能切片内的抗原丢失很严重(有文献支持),此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证(蜡块需要低温保存)。⑵石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭,这需要通过抗原修复来充分暴露,从而增加抗原抗体结合反应,提高阳性率,我一般用6min*4次中火微波抗原修复,用枸橼酸钠缓冲液。⑶组织切片中本身抗原含量的多少?这方面我有教训的,我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定,用1:200一抗效果很好;但我用1:200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测,几乎呈阴性,后来证实是因为两者抗原含量相差甚远,则一抗也要适当提高浓度。2、其次,检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。⑴一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果,因为灵敏度低但特异性好;一抗的species reactivity中无检测组织的种属,这是比较常见的错误;一抗选择rat,而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。⑵抗体孵育时间过短,容易导致阴性结果。一般一抗我建议4℃孵育过夜和37℃复温45min;二抗我一般37℃30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。⑶抗体浓度过低。这是阴性结果的最可能原因。必须提高稀释度,我一般初次做一种新抗体,喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次,然后决定是向高还是低方向摸索。一般先决定二抗的浓度(工作液就好办了,直接滴加),重点摸索一抗的最适浓度。注意:免疫反应中存在前带和后带效应,这提示不是浓度越高,阳性率就越高,反之亦然。⑷重要原因排除之后,也不要忽视抗体的质量:原装抗体一般比较稳定,效果较好;而进口分装次之;工作液可能要注意质量问题。3、同时,DAB的孵育时间可能要适当延长,在镜下观察,有时可延长至30min。但一般3-10min最好,此时背景也较浅。否则,说明抗体浓度不合适。4、最后,血清封闭时间也可相应缩短。一般10-30min,但这个时间可以调整,封闭主要是降低切片的总体背景着色。5、此外,细胞通透也不可忽视。许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透,因为切片时可能已经把细胞切开了,但对于胞核蛋白,建议还是通透一下,促进抗体等试剂充分进入参与反应。6、以上原因,都是针对实际中常见原因来进行分析的