ApoB 综合实验 年级: 2001 级 专业: 医学检验 姓名: 陈佳燕 学号: 200132210002 ApoB  基础理论 ApoB 属于载脂蛋白的一类, 在正常人体血浆中以两种形式存在: ApoB100 和ApoB48。 在正常代谢过程中, 它们与脂类结合构成脂蛋白参与脂类的转运及利用。 ApoB100 主要由肝脏合成, 它 在血浆中的浓度为 60-120mg/dl,主要存在于VLDL,IDL,LDL 中, 并且是 LDL 颗粒中唯一的蛋白质成分。 ApoB 族位于 2 号染色体P23→Pter 区, 是由非翻译区, 编码区、 TAA 终止密码子和一个 3’ 端的非翻译区组成, ApoB100 基因全长 43Kb, 含 29 个外显子和 28 个内含子, 人群中至少有 14 种不同的 3’ 端高变异等位基因区, 75%的人群在此区是不均一的。 在氨基酸序列中,ApoB100 分子含有 4563 个氨基酸, 其中 27 个氨基酸为信号肽, 4536 个为成熟的蛋白质, 因此, ApoB100 是已知的最大的单体蛋白质, 具有很强的疏水性。 ApoB 分子中有 19 个潜在的 N—连接的糖基化位置, 还有 7 个不同区域可与肝素紧密结合, 这些结合区域除能促使富含三酰甘油的脂蛋白与毛细血管的内皮细胞结合之外, 它们还能促使脂蛋白脂肪酶水解脂蛋白核心中的甘油三酯, 使之形成 IDL 和 LDL。 总的来说, ApoB100 在脂类代谢过程中有以下四种主要功能: ① 合成、 装配和分泌三酰甘油丰富的脂蛋白 VLDL; ② 它可与脂质结合, 是 VLDL、 IDL、 LDL 的结构蛋白; ③ 与肝素及不同的糖蛋白结合, 参与 LDL 与动脉粥样硬化斑块的相互作用; ④ 与 LDL受体结合, 调节 LDL 从血浆中的清除。 ApoB48 主要在小肠中合成, 主要存在于 CM 中。 ApoB48 是 ApoB100 基因通过一种新的涉及 mRNA 的编码机制而产生的。 ApoB48 是 ApoB100 基因中的第 6666个核苷酸由 C→T 后产生的, 但这种变化只发生在小肠的 mRNA 上, 而不发生在小肠基因组 DNA 上, 因此这是转录以后的一种特殊形成的编辑小肠 mRNA 的结果。 在氨基酸序列上, ApoB48 的组氨酸含量低于 ApoB100, 而精氨酸含量高于 ApoB100, 最显著的是含硫氨基酸含量高于 ApoB100。 ApoB48 的作用主要体现在 ApoB48 对组装乳糜微粒有特殊的作用, 所以它的合成对吸收食物中的脂肪和脂溶性的维生素都是至关重要的。  临床应用价值 由于 apoB 在脂质代谢中起着重要的作用, 同时它又是一种蛋白质, 因此 apoB 在机体内的升高与降低对机体均有很大的影响。 1. apoB 降低 apoB100 在多种脂蛋白(VLDL、 IDL、 LDL)的转运及利用中均有重要作用。 尤其是 LDL,apoB100 使 LDL 中唯一的蛋白质, 是 LDL 受体的配基以调节肝脏和肝外组织的 LDL 受体摄取 LDL 颗粒。 因此, apoB100 的降低对 LDL 的运输及利用的影响较大, 它可导致 LDL在体内的堆积。 如果这种情况发生在血管, 将会导致动脉粥样硬化的发生。 apoB48 对组装乳糜微粒有特殊的作用。 它是吸收外源性脂肪的一个很重要的载体。 因此 apoB48 的降低将会使机体无法利用外源性脂肪和脂溶性维生素。 2. apoB 升高 机体中 apoB 通常与脂质结合在一起形成脂蛋白。 因此, apoB 的升高通常会造成机体有高脂蛋白血症, 继而导致动脉粥样硬化并有发生冠心病的危险。 因此, 在我国, 高脂血症并伴有动脉粥样硬化患者的治疗目标使将 LDL-C(apoB)降低道 2.6 以下, 以防发生心脑血管疾病。 1. 疾病诊断 血清 ApoA-1,ApoB 不仅对心血管系统疾病的早期诊断和预防有着显著的意义, 而且在与脂类代谢相关的疾病中有着广泛的临床应用价值。 (1) 冠心病。 ApoB 是一类在分子量、 免疫性和代谢上具有多态性的蛋白质之一, 主要分布于血浆 VLDLIDL 和 LDL 中, 是介导 LDL 与相应受体结合必不可少的配体。 因此, ApoA-1、 ApoB 和 ApoBS 可直接反映 HDL 和 LDL 的含量, 冠心病、 肾病综合症和糖尿病等都有 ApoA-1 下降和 ApoB 升高, 故临床上常将 ApoA-1 和 ApoB 的比值作为冠心病的危险指标。 (2) 肝脏疾病 肝脏是人体代谢的重要器官, 既担负着蛋白质、 糖的代谢, 又担负着脂类的代谢,因此, 当肝脏发生疾病时, 不仅在蛋白质代谢中表现出明显的异常, 同样在脂类的代谢中也可表现出异常。 所以, 测定肝脏疾病患者血清中 ApoA-1、 ApoB 含量同样能准确地反映出肝脏病变情况。 当肝脏发生明显疾病时, 血清中 ApoA-1、 ApoB 明显下降趋势, 在急性肝脏损伤时下降幅度不十分明显, 当随着病情的逐渐发展, 在慢性肝脏疾病时, 下降就显得十分明显, 并且造成 ApoA-1 与 ApoB 比值也发生了明显的降低, 这很可能与肝脏发生了严重的损伤后, 导致体内脂类代谢严重紊乱的结果。 据此, 临床上测定血清中 ApoA-1、 ApoB 的含量可作为监测肝细胞的损害程度或肝功能状况, 特别判断慢性肝脏疾病患者的病情程度有很重要的临床应用价值。 2. 疾病预后及治疗效果 蛋白质分离纯化原理  利用溶解度差异的方法 在一定温度范围内(0-40 之间), 大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加, 40-50 度以上, 大部分蛋白质变得不稳定而变性, 在中性 pH 介质中失去溶解能力。大部分蛋白质在低温下比较稳定, 因此蛋白质的分离纯化一般都在 0 度左右进行 盐析法 是最经典的方法。 其原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐液浓度升高而增1. 加, 此时称为盐溶。 当盐浓度继续升高时, 蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出, 称为蛋白质的盐析。 这一现象是由于蛋白质分子内及分子间带电的极性基团有着静电引力, 当水中加入少量盐类时, 盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团产生影响, 使蛋白质在水中溶解度增大。 但盐浓度增加到一定程度时, 水的活性被降低, 蛋白质表面的电荷大量被中和, 水化膜被破坏, 于是蛋白质分子相互聚集而沉淀析出。 盐析法就是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低的程度不同而达到彼此分离的方法, 但这种方法只能对蛋白质进行粗性分离。 有机溶剂沉淀法 有机溶剂能降低溶液的介电常数, 从而增加蛋白质分子之间不同电荷的引力, 导致2. 溶解度的降低。 另外, 有机溶剂与水的作用, 能破坏蛋白质的水化膜, 使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法, 称为有机溶剂分段沉淀法。 此方法沉淀蛋白质的分边路率比盐析法好, 溶 剂易于除去, 但高浓度高温度易引起蛋白质的变性失活。 3. 等电点法 蛋白质在两性电解质带电基团性质与带电荷数量因 pH 不同而变化, 当蛋白质处于等电点 pH 时, 蛋白质的净电荷为零, 由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于凝集和沉淀, 它的溶解度达到最低。 利用蛋白质在等电点的溶解度最低而各种蛋白质具有不同等电点的特性进行分离的方法, 称为等电点沉淀法。 但在等电点时, 各种蛋白质仍有一定的溶解度而使沉淀不完全, 同时许多蛋白质的等电点十分接近, 故单独使用此法效果不理想, 分辨率也差, 多数用于去除蛋白质。  根据分子量不同的分离方法 1. 透析和超滤 透析和超滤是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质, 使蛋白质和其它小分子物质如无机盐, 单糖, 水等分开。 透析是将待提纯的溶液装入半透膜的透析袋中, 透析袋置于蒸馏水中, 更换透析外液, 直到透析袋内的无机盐等小分子降低到最低为止。 超滤是利用压力或离心力迫使水和其它小分子溶质分子通过半透膜而蛋白质保留下来, 可以选择不同载留分子量的超滤膜将分子量不同的蛋白质分离。 2. 平衡离心法 根据蛋白质分子大小, 形状不同进行分离的技术称为平衡离心法。 包括差速离心法和速度区带离心法。 1) 差速离心法: 逐渐增加离心速度, 可以使样品中沉淀速率不同的颗粒逐步分离开来,该方法主要适用于分子量或沉降系数相差较大的颗粒, 一般用作粗分离, 如从组织匀浆中分离细胞器及分离病毒 2) 速度区带离心法: 又称为沉降速度离心法。 混合样品中不同蛋白质颗粒的大小和沉降速率不同, 在一定的离心力作用下, 沉降的颗粒各自以一定的速度沉降而逐渐分开,在密度梯度介质的不同位置上分别形成界面清楚的不连续区带的方法, 称为速度区带离心法。 此法的沉降速度主要取决于颗粒的形状和大小。 一般用蔗糖, 聚蔗糖等作为密度梯度介质, 离心时间的选择非常重要, 时间太长, 颗粒全部沉入管底, 时间太短,颗粒之间未完全分开。 3. 凝胶过滤层析法 凝胶过滤又称为分子筛层析, 这是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。 在凝胶过滤中, 柱中的填充物是高度水化的惰性多聚物, 最常用的是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。 凝胶颗粒是具有不同交联度的网状结构物, 网眼大小可以通过交联剂与凝胶的比例来控制, 不同型号的凝胶用来分离纯化不同分子大小的物质。 在层析过程中不同分子大小的蛋白质借助重力通过层析柱内的凝胶颗粒, 比“网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格内, 被阻排在凝胶颗粒之间, 随着洗脱液的流动首先流出; 比“网眼” 小的分子则进入凝胶颗粒内部。 这样由于不同大小的分子所经路径距离不同而得到分离, 大分子物质首先被洗脱出来, 而小分子物质则后被洗脱出来。  根据电荷不同利用电泳法分离 在外界电场的作用下, 带电粒子(包括蛋白质) 在电场中向与其自身所带电荷相反方向移动的现象称为电泳。 移动的速度取决于蛋白质分子所带的净电荷性质及多少, 也与分子的大小与形状有关。 在同一电场作用下, 不同大小和净电荷量不等的带电颗粒在同一介质上(内) 移动时, 其移动速率不等, 经过一定时间后, 其移动距离不等, 从而得到分离。根据介质不同可分为醋酸纤维素薄膜电泳, 琼脂糖凝胶电泳, 聚丙烯酰胺凝胶电泳等。  根据蛋白质的 Ag 性质分离 大多数蛋白质都具有 Ag 性, 可与特定的 Ab 结合,因此可利用 Ag—Ab 反应分离纯化蛋白质。 1. 免疫亲和层析 亲和层析是利用生物高分子能与相应的专一配基分子可逆结合的原理, 将配基通过共价键牢固地结合于固相载体上, 制得亲和层析系统, 带有杂质的高分子分离目的物在一定条件下能以某种次级键与已固相化的配基结合, 而杂质则不吸附, 除去杂质后变换条件, 又可以使待分离的高分子物质重新解离, 获得纯化。 大多数蛋白质都具有 Ag 性, 可与特定的 Ab 结合, 因此将能与所需的蛋白质特异性结合的 Ab 固定于固相载体上, 当分离物通过时, 所需蛋白质可与 Ab 结合而留于载体上, 当改变外界条件(如温度, pH 值等) 时, Ag 与 Ab 能重新解离, 洗出载体上的蛋白质(Ag) ,即可得到分离纯化的蛋白质。 2. 免疫沉淀法 此法同样也是利用蛋白质具有 Ag 特性并且能与相应的 Ab 特异性结合的原理, 将特异性 Ab 加入含有所需蛋白质的分离物中, 此 Ab 能与所需的蛋白质结合, 形成 Ag—Ab 复合物并将其沉淀下来(PEG 沉淀法), 弃去上清液, 将沉淀物洗涤, 并改变条件, 使 Ag—Ab复合物解离, 用胰蛋白酶消化沉淀物中的 Ab 蛋白, 游离出 Ag 部分,即为所需的蛋白质。 总之, 蛋白质的分离方法多种多样, 不同蛋白质的种类, 性质, 所处体系以及分离纯化的目的不同, 需要不用的分离方法, 因此不可能有一个固定的程序适用与各类蛋白质的分离工作, 但这并不意味着蛋白质的分离纯化没有一定的规律, 实际上多数分离纯化工作中都有相类似的步骤和手段。 — ↑ ↓ 前处理 离心技术 ↓ 生物体组织细胞 ↓ — ↑ ↓ 粗分离 亲和层析 凝胶电泳 离子交换技术 盐析法 等电点沉淀 ↓ — ↓ ↑ 细分离 — 纯化蛋白 蛋白质分离纯化一般程序 抗体  机体产生抗体的机制 机体产生抗体是机体发挥体液免疫功能的首要条件, 其机制为: Ag 进入人体后,B 细胞通过其表面的 BCR 与 Ag 结合, B 细胞结合 Ag 后, 受到两个信号的刺激: ① : Ag 与 BCR 结合后, 引起 BCR 聚集, 与 BCR 组成 BCR 复合物的 Iga 和 Igb 的胞浆中有 ITAM 基序, 可以引发信号级联, 从而激活 PTK, 产生第一个活化信号。 B细胞上的 CD19,CD21,CD81 对第一活化信号的转导有辅助作用, 称为辐助受体, 起到放大信号的作用。 ②: B 细胞将加工处理的 TD--Ag 以肽—MHCII 类分子复合物形式呈递给 Th 细胞,与 Th 细胞相互刺激, 使 Th 细胞活化增殖, 表达 CD40L, 与 B 细胞表面的 CD40 结合,产生第二活化信号。 B 细胞受到 2 个信号的刺激后, 胞内发生一系列生化事件, 活化, 增殖并分化为浆细胞, 从而产生效应分子—Ab.  机体产生抗体的生物学意义 首先先谈谈抗体的主要功能, 机体中的抗体主要为 IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE,总的来说, 抗体有以下几方面功能: ① 中和作用。 这种方式是针对病毒和胞内细菌的感染。 病毒和胞内细菌必须感染细胞才能复制及生长繁殖, 并在细胞间传播, 这类病原体是藉与靶细胞表面的特异分子(受体) 结合而感染细胞的。 能与病原体结合的抗体,可防止病原体与靶细胞的结合而阻断病原体对机体的侵噬, 抗体的这个作用称为中和作用。 大多数抗体都具有这个作用, 抗体的中和作用在中和细菌毒素的作用中也起重要作用。 ② 调理作用。 这种方式是针对胞外复制的细菌的, 主要为 IgG。...