(Elmlund, L., et al. Study of the interaction of trastuzumab and skov3 epithelial cancer cells using a quartz crystal microbalance sensor. Sensors, 2015; 15(3): 5884–5894)
图1.赫赛汀抗体与SKOV3细胞表面HER2受体(蓝色)结合的示意图。将SKOV3细胞培养并固定在Attana Cell 200蛋白互作分析仪的COP-1检测芯片上,然后在其上注射赫赛汀,观察振动频率的变化,实时测定赫赛汀与细胞膜上的HER2亲和力。
图2.用不同浓度的甲醛(FA)和戊二醛(GA)对COP-1芯片上SKOV3细胞进行固定后,采取DAPI染色。荧光显微镜观察发现,随甲醛(FA)浓度的升高,固定在芯片上的细胞也越多;而随戊二醛(GA)浓度的升高,固定在芯片上的细胞的数量不变或者稍有减少。后续实验选择3.7% FA和0.5% GA对芯片上的细胞进行固定。
图3.采用3.7%甲醛(FA)固定芯片上SKOV3细胞,注射20μg/mL赫赛汀后,Attana蛋白互作分析仪绘制出了一条结合点和解离点均很明显的结合曲线。
图4.采用0.5% GA戊二醛(GA)的固定方法时,虽然频率改变很大(达到17Hz左右),但是在解离阶段,曲线迅速下降、很快回复到基线类似水平,这一结果代表此时的结合很弱或发生了非特异性结合。因此,0.5% GA戊二醛(GA)固定对本次实验不合适。
图5.对比不同浓度的FA固定,2%浓度固定时,最大反应频率随抗体浓度增加并没有增加,因此有可能是芯片的非特异性结合。而5%浓度固定时,最大反应频率虽然与抗体浓度基本成比例增加,但是波动较大。在结合5%浓度固定时,染色较亮,这时很可能也发生了非特异性结合。因此后续实验选择3.7%FA固定。
图6.优化细胞接种密度(接种2万、4万、8万细胞),再DAPI染色,荧光显微镜观察发现在8×104的细胞接种密度下,不仅能制出一条结合点和解离点均很明显的结合曲线、20μg/mL的赫赛汀不会使其饱和,并且解离常数的平均值为KD=7±1nM,此结果与其他基于全细胞水平的分析得出的结果(KD=5nM)相一致。
在药物开发的早期研究和对生物分子间识别的基础性研究中,通常采用的是以纯化受体或细胞裂解物为基础的体外分析方法。这类方法不仅费时、成本高、抗体需要标记而且灵敏度也较低。生物大分子在标记后会影响分子之间的相互作用特性,并且增加非特异结合。而传统的生物传感器需要将纯化后的靶标分子固定在传感器表面,这些脱离了生理条件的靶标分子可能会发生构象上的改变,使得实验结果不能真实反映生理条件下分子间的相互作用。
Attana Cell 200蛋白互作分析仪采用石英晶体微量天平(QCM)技术,能快速、无需标记、直接在细胞表面准确地定性和定量测量分子间的相互作用,是基于全细胞的互作分析的研究利器。
实例3、用于多克隆抗体的动力学和亲和力的检测和计算
抗体生产的主要目标是获得用于实验、测试的高滴度、高亲和力抗血清。检测和监测这些多克隆抗体的纯化耗时且麻烦。本实验实例表明,Attana蛋白互作分析仪,可快速鉴定分别针对多肽、蛋白质抗原产生的多克隆抗体。