一、样品制备
对于Western Blotting实验而言,样品处理是关键步骤之一,获得的蛋白样品必须均质、可溶,并解离成单个多肽亚基,且尽量减少相互间的聚集,使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时,需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器(如核抽提物),或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。
1. 样品收集
1)培养的细胞
贴壁和悬浮细胞收集方式不同,细胞裂解液种类各异,推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解,煮沸即可。
2)动物组织
与细胞不同,组织块由于体积较大,须预先经破碎匀浆处理。
2. 样品定量
样品电泳前需测定蛋白浓度,以便保证上样量一致,有利于后续定量或半定量分析。常用的蛋白质浓度测定方法有好多种,其灵敏度和所需时间不同,且不同的方法会受不同干扰物质的影响,实验者可根据样品制备方法(裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等)自行选择。
几种蛋白质浓度测定方法比较

优点缺点
Bradford法迅速、灵敏对各种纯化蛋白质反应不同
BCA法简单、干扰少耗时
Lowry法不同蛋白差别小干扰多,较慢

注意事项:
a. 应尽量避免引入影响后续定量的杂蛋白(如细胞培养液、蛋白酶抑制剂等)及其他干扰物质;
b. 样品浓度应适中,1×SDS凝胶加样缓冲液建议用量:贴壁细胞按10cm2培养皿/0.1ml,悬浮细胞按5×106细胞/0.1ml比例加入;
c. SDS对蛋白质变性和电泳分离至关重要,浓度应控制在2-10%之间,并根据具体需要调整;
d. 制备好的样品可以在-20℃保存,但时间不宜过长,并避免反复冻融,否则蛋白会发生降解;
e. 内参对实验结果至关重要,应选择合适的内参。
二、电泳
电泳分为非变形凝胶电泳和变性凝胶电泳,Western Blotting中常用的是不连续缓冲系统下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),该法中由于变性的多肽与SDS结合而带负电荷,在凝胶电泳中迁移率仅与多肽的分子量相关。凝胶的筛分特性取决于它的孔径,而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围

丙烯酰胺浓度(%)线性分离范围(KD)