• 1 \ue008生理学说\ue009认为培养物形态发生潜力的下降可能是由于细胞或组织内激素平衡关系改变造成的。• 2\ue008遗传学说\ue009由于在培养细胞中常见的自发体细胞甲基化等。这种由遗传原因造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。• 3\ue008竞争学说\ue009生理学说和遗传学说的结合。突变\ue006包括染色体数目变异、染色体重排以及DNA的 细胞全能性脱分化再分化个体再生细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的\ue012在大多数情况下\ue012脱分化是细胞全能性表达的前提\ue012再分化是细胞全能性表达的最终体现。细胞分裂 • \ue004一\ue005培养基\ue009培养基的种类、各种添加物、培养基渗透压• \ue004二\ue005外植体\ue009外植体基因型、外植体类型、外植体发育状态和取材时期、外植体极性、外植体损伤反应• \ue004三\ue005植物激素对愈伤组织培养的调控作用\ue009生长素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯• \ue004四\ue005培养条件的影响\ue009光照、干燥处理、温度 两个重要的概念• 外植体• 植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。• 极性• 指在器官、组织甚至细胞中\ue006在不同的轴向上存在某种形态结构和生理生化上的梯度差异。 \ue001植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团\ue010愈伤组织\ue011分化形成不定根\ue010adventitious roots\ue011、不定芽\ue010adventitious shoots\ue011等器官的过程。\ue001通过器官发生形成再生植株有三种方式\ue013 • • • 1、在生物体内\ue004细胞没有表现出全能性\ue004而是分化为不同的组织、器官\ue004是因为\ue005A、细胞丧失了全能性B、基因的表达有选择性C、不同的细胞内基因不完全相同D、在个体发育的不同时期\ue006细胞内的基因发生了变化B 2、当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时\ue006下列有可能使其表现出全能性\ue006发育成完整的植株的是\ue004A、植物激素C、一定的营养物质3、在生物体的所有细胞中\ue006全能性最高的是A、卵细胞 B、植物花粉 C、体细胞 D、受精卵4、下列哪一种细胞的脱分化能力最强的是\ue004 \ue005A、薄壁细胞 B、形成层 C、厚壁细胞 D、退化细胞\ue005B、培养温度D、以上三者均是DDB 5、外植体经离休培养后出现以下特征\ue006请选择该细胞属于哪一时期\ue009a、细胞呈多边形\ue006核变大\ue006细胞质变浓、液泡极小\ue006形成一团团愈伤组织\ue004\ue005\ue00ab、有瘤状结构\ue006薄壁细胞占优势\ue006有导管形成\ue010\ue011 \ue00ac、液泡变小\ue006核变大\ue006核向中央移动\ue010\ue011 。AA、诱导期 B、分裂期 C、分化期 D、衰退期6、哪一种植物的外植体最容易诱导成愈伤组织A、裸子植物 B、蕨类植物C、苔藓植物 D、被子植物BCD 7、影响器官发生的因素有\ue009A、外源激素 B、光照和温度C、外植体的生理状态 D、培养物的年龄8、植物离体培养器官发生\ue006一般情况下\ue006\ue004\ue005能促进生根\ue00a\ue004\ue005能促进茎芽的分化\ue00a\ue004\ue005却可以抑制根茎芽的发生\ue009A B C DA、激动素KT B、吲哚乙酸IAA C、赤霉素GA3D、脱落酸ABABAC 上一节课的基本概念• 1、细胞全能性• 植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息\ue012在适宜条件下具有发育成完整植株的能力。• 2、外植体• 植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。• 3、愈伤组织• 通常是指植物受到机械、动物或微生物等伤害后\ue012创伤部位的细胞脱分化而不断增殖形成松散排列、无特定结构和功能的非器官化组织。 \ue001•–根芽器官直接分化形成植株•–产生具有胚芽、胚根的胚状体结构再形成植株 • 胚状体\ue013\ue010embryoid\ue011亦称体细胞胚。一些离体培养植物的体细胞\ue012也可经胚胎发生过程形成在形态上与合子胚相似的结构\ue012这种结构同样具有再生出完整植株的能力。• 在其发生的最早阶段就具有两极性\ue004即根端\ue002胚根\ue003和茎端\ue002胚芽\ue003\ue004并且与母体细胞或外植体的维管束无直接联系• 胚状体一开始就是一个完整植物的雏形\ue012可通过根端或类似胚柄结构从外植体或愈伤组织中取得营养。• 很容易从愈伤组织的表面脱离下来\ue004在适宜条件下长成一株植物。 \ue001• 胚状体具双极性\ue010double polarity\ue011• 生理隔离\ue010physiological isolation\ue011• 遗传性相对稳定由于大多数体细胞胚起源于单细胞\ue012因此对于单个植株来讲\ue012通过体细胞胚形成的再生植株\ue012其遗传特性相对稳定。• 重演受精卵形态发生的特性。 \ue001与合子胚相比\ue005• 合子胚在发育初期具有明显胚柄\ue012体细胞胚没有真正的胚柄• 合子胚的子叶是相当规范的\ue012要以作为分类的依据\ue012而体细胞胚的子叶常不规范\ue012有时具有两片以上的子叶• 与相同植物相比\ue012体细胞胚体积明显小于合子胚• 体细胞胚没有休眠\ue012而合子胚胚胎发育完全进入子叶期以后\ue012经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠。 胚胎细胞发生发育早期2次均等分裂胚结构形成 \ue001胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或间接地发生\ue012大致分为五种\ue013• 直接从外植体上发生(以叶片为例\ue011• 愈伤组织发生• 悬浮培养中胚性细胞复合体发生• 悬浮培养中游离的单细胞发生• 单倍体细胞发生 诱导阶段胚胎发育阶段(兰草,Chen等,1999)兰草 诱导愈伤组织形成愈伤组织胚性化球形胚形成子叶胚期蝴蝶兰,Lin等,2000 蝴蝶兰 • 发生过程\ue013胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后\ue012其外围的许多细胞开始不均等分裂\ue012靠近细胞团方向的一个细胞较大\ue012以后发育成类似胚柄的结构。另一个细胞则继续分裂形成类似原胚的结构\ue012以后经过类似于体内的发育过程\ue012经球形期、心形期等发育阶段形成完整的体细胞胚。悬浮液中有两类细胞\ue009不具备胚胎发生潜力\ue004自由分散、大、高度液泡化\ue005具备成胚能力的胚性细胞团\ue004成簇成团、小、胞质致密\ue005 愈伤组织胚性愈伤组织悬浮培养的胚性细胞团球形胚形成成熟子叶胚 1.生长调节物质(1)生长素类:(例\ue011在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程,每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养\ue012通常所用的生长素是2,4-D,浓度范围0.5\ue0091mg/L。在这样一种培养上,愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团,称作“胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代,胚性细胞团的数量不断增加,但并不出现成熟的胚。然而,如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养上,它们就能发育为成熟的胚。 既促进也可抑制体细胞胚的发生,这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而言,细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用,特别有利于子叶的发育。另外有研究表明,不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性,如在胡萝卜的研究中发现,虽然激动素对胚胎发生过程表现抑制作用,但浓度为0.1μM的玉米素却能促进这个过程,而6-BA对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖,但不形成胚性愈伤组织。 (3)赤霉素类:赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生,但对于许多植物而言,赤霉素对于体细胞胚的成熟与萌发有促进作用。(4)脱落酸:抑制剂特别是ABA,在体细胞胚发生过程中的作用正逐渐被提示出来,ABA是一种天然产生的生长调节剂,当把无抑制作用剂量(通常是0.1\ue0091μM)的ABA用于荷兰芹属培养物时,可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制不定胚的启动。• 小麦、石刁柏、颠茄则要在适当浓度的生长素和较高浓度的激动素时才能分化出胚状体 2.氮源\ue000 氮源有还原态氮(NH4+)和氧化态氮(NO3-)两种\ue000 在以KNO3为唯一氮源(如White培养基)的培养上建立起来的愈伤组织,去掉生长素以后不能形成胚。德国Reinert等在栽培胡萝卜愈伤组织培养中( 培养基均为White培养基)得到以下结果:[NH4+] 1000(mM)[NO3-] 405595(mM)体胚发生数(个/2ml)1131±21919±0.311.3±4.1 • 一个离体培养的烟草花药\ue006可以产生200个体细胞胚。花药培养中胚状体诱导率比较诱导率\ue004\ue003\ue005>300.43%~1.66%1.1%~1.68%烟草柑桔白菜 品种发生频率\ue004\ue003\ue005元帅1.9%~2.5%0.0%~1.2%0.2%~3.4%0.3%~1.5%国光金冠赤阳 • 如毛果杨花药诱导在不同年份效果截然不同• 以叶片为诱导材料的:黑杨x辽杨以组培苗的针刺叶片为材料\ue006才能诱导出胚性愈伤组织• N C - 5339取组培苗未展开的叶片。• 缘毛杨需先进行BA长时期暗培养。• 因此\ue006对外植体材料进行适当的选择或前处理\ue006有利于体细胞胚的诱导。\ue007\ue007:于志水\ue006男\ue0061977年10月生\ue006北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点开放实验室\ue006硕士研究生。