1964 年作为北大科研组成员之一 到上海与中科院上海有机化学研究所及上海生物化学研究所合作,从事胰岛素合 成的研究,于1965 年在国际上首次完成了结晶牛胰岛素的全合成。主要从事生 物活性肽的合成及构效关系的研究;形成肽键的含磷缩合试剂的研究;环肽合成 方法及环化规律的研究;氨基酸,肽—甾体缀合物的合成与生物活性研究;在非 水介质中,蛋白水解酶催化酰胺键形成的研究;人参属植物水溶性化学成分的研 究等。取得了多项开创性的研究成果,受到国内外同行的关注。 1 引言 胰岛素(insulin) 是一种蛋白质类激素。它是人 体内唯一能降低血糖的激素,也是唯一同时促进糖 原、脂肪、蛋白质合成的激素。它的分子量较小而 结构比较复杂,所以在蛋白质的结构与功能研究中 占有特殊地位。 1921 年,加拿大外科医生Frederick Grant Banting 首次从狗的萎缩胰脏中提取了胰岛素,并将初步纯 化的动物胰岛素成功地应用于糖尿病患者。基于该 项研究成果,Banting 与Macleod 获得 1923 尔医学和生理学奖。胰岛素的发现被认为是糖尿病研究史上的里程碑,它激发了各个相关领域科学家 的兴趣 从胰腺中提取的胰岛素经纯化得到结晶后,英国科学家Sanger 从1945 经过10年的研究, 于1955 年报道了牛胰岛素的一级结构 [2-3] 。因为他 测定了生物体中第一个蛋白质的一级结构,而获得 了1958 年诺贝尔化学奖。此后他又测定了猪、羊 胰岛素的一级结构。 胰岛素是由A 链两条肽链共51个氨基 酸残基组成的生物大分子。其种族差异,只在A 可见,A链含有11 种21 个氨基酸残基, 端为Gly,C-端为Asn。A 的两个Cys通过二硫键相连成环;B 链含有16 30个氨基酸残基,其N- 端为Phe,C- 端为Ala。A 链和B链又通过两对二硫键互相连接成胰岛素分子。 50 多年前,我从北京大学化学系毕业后,有 幸参加了我国合成结晶牛胰岛素A 链的研究项目。 本文通过自己的亲身经历和所见所闻分七节来阐述 我国20 世纪60 年代成功合成结晶牛胰岛素的启示 叶蕴华:我国成功合成结晶牛胰岛素的启示和收获 。按照这一推论,合成胰岛素几乎是不可能的。关于胰岛素分子中三对二硫键如何能正确配对 的问题在立项时就困扰着大家。为了解决这个问题, 1959 年初上海生化所邹承鲁课题组的杜雨苍、张友 尚等开始探索天然胰岛素拆分与重组合的研究。他 们的拆、合研究经历了多次失败后,于1959 活力。经过进一步探索,拆分和重组合后的胰岛素生物活力可以达到天然胰岛素的5%~10%。他们最 终发现,在适当条件下氧化被还原的A 生物活力的恢复可达50%。经过多次纯化,杜雨苍等最终获得了与天然胰岛素相同的正立方体结晶。 在发表论文的结论中他们明确指出“从充分苄基化 了的胰岛素衍生物能恢复活力这一事实,说明可以 通过人工合成的A 链最后合成胰岛素”[7-8] 链完成胰岛素的全合成。总的合成路线确定后,还有一系列问题需要解 决。首先,带有保护基A 链的合成,因为侧链的官能团很多,而要按指定顺序连接时,必须 对不让其反应的基团加以保护( 我们戏称之为穿靴 戴帽)。有的保护基需在不同阶段顺利脱除,而有 的保护基则要到最后才脱除。所以对于胰岛素中氨 基、羧基及侧链官能团的保护基的选择和设计是十 分关键的步骤。其次,组成胰岛素的51 个氨基酸 残基中,除4 个甘氨酸残基(Gly) 外,其他47 基酸残基均为手性分子,在合成反应的每一步,包括肽键形成及脱保护基时,均要保证手性分子不发 生消旋反应,否则将导致胰岛素生物活性失活。所 牛胰岛素的一级结构和收获:敢于向难题挑战,坚持严谨的科学作风, 依靠团队间的合作,发扬奉献的精神,为我国生命 科学培养了一批人才,提高了我国有关领域的科研 水平以及带动了我国相关产品的研发。 2 敢于向难题挑战 1958 年在大跃进形势的鼓舞下,我国科学家 大胆提出了合成胰岛素的课题。当时在国际上合成 的最大多肽是促肾上腺皮质激素的十三肽片段。此前du Vigneaud 于1955 年曾合成了含有一个-S-S- 环的催产素,也只是一个九肽 [4-5] 。而胰岛素是一 个蛋白质,不仅分子量大而且结构非常复杂,分子 中含有三对-S-S- 键。胰岛素合成涉及有机合成、 化学与生物分析、生物活性等方面。其工作量之大、 难度之高是生物化学与有机化学领域中前所未有的。 在我国当时的条件下,靠一个单位来完成这个 项目显然是不可能的。1959 月中国科学院上海生化所派了曹天钦、钮经义、邹承鲁、鲁子贤、王 人到北大来探讨与北大共同合成胰岛素的可能性,并做了有关胰岛素的学术报告。北大方面 积极响应,同意承担合成A 链的研究任务。 Sanger 在测定胰岛素一级结构时,先把胰岛素 拆分成A 链,经纯化后再分别测定它们的氨基酸序列。据此,我们在设计合成路线时,考虑 到是否可以先分别合成A 连接成为胰岛素呢?由于当时还没有对巯基(-SH)选择性的保护基,所以含有6 个-SH 链连接方式将有非常非常多的可能性。Kauzmann曾计算过,并在理论上指出A 可以是0或任何正数。因此Kauzmann 认为, 链形成正确的胰岛素结构的可能性也就很生命科学 第27卷650 以在设计合成路线时,何处为避免消旋的最佳接头、 合成方法的选择以及保护基的选择与脱除条件均为 合成的难点。另外,当时大部分合成胰岛素的最基 本的原料氨基酸,都要靠外汇进口。为解决这一问 题,上海生化所抽调了陈远聪等创建了我国第一个 生产氨基酸的东风生化试剂厂,解决合成胰岛素所 需氨基酸的燃眉之急 3 坚持严谨的科学作风胰岛素合成是一个复杂的系统工程。它是由 51 个氨基酸通过200 多步化学反应而合成的具有生 物活力的蛋白质。合成中每一个步骤都会影响最后 的成败,因此对每一步反应都必须严格把关。所有 的中间产物均经过严格鉴定合格后才能用于下一步 反应。 在合成过程中,制备的大多数肽段均使用两种 或两种以上不同的路线或方法去得到同一性质的产 物,从而保证目标肽产物结构的正确性。例如在胰 的合成,由于九肽中有一个-S-S- 键小环,结构特殊,在合 两条不同的路线以及不同的接肽方法,得到了分析数据相同的九肽后,才 认定了我们的N- 端九肽的合成正确无误 [10-11] 于当年没有质谱、核磁共振等现代光谱分析手段,所有小肽均要通过元素分析、氨基酸的定量分析、 不同溶剂系统的纸层析( 因为那时没有TLC 薄层析 板),以及熔点、电泳、比旋光度、酶解图谱等的 测定。只要其中一项分析不过关,就不能进行下一 步反应,必须重新合成或经反复纯化后再做分析鉴 定。元素分析数据的理论值虽然事先都经过仔细的 计算,但是结果出来后,汪猷先生还要亲自再用计 算尺( 当时尚无计算器) 复审我们的计算是否有误。 中国科学院上海生物化学研究所、上海有机化 学研究所和北京大学化学系三个单位经过通力合 作,严格、严谨地实干,于1965 月终于得到了全合成的牛胰岛素结晶。全合成实验重复了四次 均得到了牛胰岛素结晶 [12-14] 1966年11 月在中科院副院长吴有训的主持下, 在上海召开了专家鉴定会。会议肯定了这一成果的 创新性和重大学术意义。同时也提出,为了慎重, 在向世界宣布这一重大成果之前,还需要补充酶解 图谱等数据。在这次鉴定会上,专家们踊跃发言, 各抒己见,对取得的结果进行了实事求是的讨论。 当时热烈讨论的情景至今记忆犹新。根据鉴定委员 的建议和意见,我们进一步补充了数据。 1966 月由国家科委组织全国有关专家,在北京再次举行成果鉴定的扩大会议。上海生化所 和上海有机所参加胰岛素合成工作的全体同事都到 北京来,听取鉴定委员们的意见。这次鉴定委员共 有40 多名,其中有北大的张龙翔、陈同度、沈同、 会议通过了鉴定,一致认为我们通过人工合成得到了与天然牛胰岛素完全相同的结晶牛胰岛素。会后 中国科学院郭沫若院长接见了全体鉴定委员和参加 胰岛素合成的全体工作人员 [15] 。该项成果于1982 年获国家自然科学奖一等奖。 4 依靠团队的合作 如前所述,胰岛素合成是一个复杂的系统工程, 涉及有机合成、化学与生物分析、生物活性等方面, 工作量大、难度高。在我国当时的条件下靠一个单 位来完成这个科研项目是不可能的。 1960 年北京大学、复旦大学与中科院上海几 个研究所共几百人先后开展了科研群众运动( 大兵团作战)。北大化学系为了合成胰岛素,停止了正常的教学工作。参加研究的主力是没有经过严 格科学研究训练的四、五年级大学生( 那时北大理 科由五年制改为六年制) 和一些年轻老师。低年级 同学则负责处理溶剂、试剂制备、氨基酸提取、分 离和后勤等工作。参加研究的同学们凭着一股革命 热情不分昼夜地加班加点。但是他们不了解必须经 过多种分析手段才能确定合成产物的结构与纯度。 用未经严格分析鉴定的中间体进行下一步反应,所得 到的结果是无法肯定是否为预期的目标产物。事实证 明,各单位的大兵团作战都没有得到预期的结果。 到1960 年下半年,由于国家经济处于极端困 难时期,基于中央“调整、巩固、充实、提高”的 八字方针,各单位合成胰岛素的群众运动,在付出 巨大代价后纷纷收场 [15] 。北大化学系只留下李崇熙、 陆德培、张明哲、伍少兰等少数几位老师整理群众 运动留下的样品,继续胰岛素A 链片段的合成,后 来发表了论文 [16-17] 1963年,国家经济形势好转后,在国家科委 聂荣臻主任及上海市和北京市各级领导支持下,决 定集中“精锐部队”在上海重新合作,继续开展胰 岛素合成的研究。为了便于及时交流和讨论遇到的 问题,1964 月北大抽调了5位年轻教师在有机 教研室主任邢其毅教授和副系主任文重老师率领 叶蕴华:我国成功合成结晶牛胰岛素的启示和收获 651下,到上海有机所参加胰岛素A 链的合成。在北大 成员中有师姐季爱雪、师兄陆德培、李崇熙、施溥 涛和我。后来邢先生的研究生汤卡罗也加入了我们 的团队 [15] 。我们与上海有机所的徐杰诚、张伟君、 陈玲玲、钱瑞卿、李鸿绪和实验辅助人员王思清、 刘永福与姚月珍等密切合作重新进行牛胰岛素A 的合成。我们和有机所的同事在同一间实验室工作,并 定期到负责合成B 链拆合研究的上海生化所汇报工作进展及讨论遇到的问题,及时调整工 作计划和人力安排。通过三个单位的协作,大大提 高了工作效率。 胰岛素中的A 链虽然比B 链短,但是A 链与天然胰岛素B链组合后,所得产物的生 物活力只达天然胰岛素的1%~4%。经过大家反复 讨论,认为很可能是A 10-21 后十二肽酯在皂化脱保 护基时的副反应所致。为了避免后十二肽酯的皂化, 重新设计保护基策略,将17 位谷氨酸的γ- 羧基由 末端的天冬酰胺的α-羧基 则不加保护。同时决定分别用3 两条不同的路线合成。由于保护基策略的改变,整个后 十二肽(A 10-21 链已合成出一定量,在等待着A链的合成。为了 加速新设计的后十二肽的合成,北大的李崇熙老师 被调到后十二肽组,与有机所同事共同完成了新 十二肽的合成 [18] 。用这个新设计的后十二肽(A 10-21 氨法除去所有保护基得到A 经进一步纯化后,与天然胰岛素B 链组合后,所得半合成产物的生物活力 提高到天然胰岛素的5%~10%。最后,经过反复探 索半合成粗产物的纯化方法后,终于获得了形状与 天然胰岛素相同的结晶。在纸层析与纸电泳谱上与 天然胰岛素处于同一位置。小白鼠惊厥法测定表明, 所得半合成产物具有与天然牛胰岛素同等的生物活 力。这表明了半合成的成功 [20-21] 人工合成胰岛素虽然是50年前的事,但是许 多情景至今还历历在目。印象最深的是合成A链时, 北大派陆德培为代表,有机所派徐杰诚为代表进行 实验操作。汪猷先生亲临现场,其他人在陆、徐二 人周围观看。玻璃滴管头拉得很细,以便精细调节 溶液的pH 值。再根据精细pH 试纸的颜色,现场 讨论是否要再多加一滴碱或一滴酸。可惜当时没有 相机,没能拍下这一难忘的认真、紧张和激动人心 的合作场面。最后胰岛素的半合成与全合成是在生 化所进行的。施溥涛代表北大,张伟君代表有机所 与生化所杜雨苍等少数人进行实验,其他人只能在 实验室外面等待结果。 事实证明依靠精锐团队间的合作是一条成功之道。 5 发扬奉献的精神 当时德国的H.Zahn 和美国的P.G.Katsoyannis 都已经开始了胰岛素的合成研究, 并发表了关于胰 岛素片段合成的简报。到1963 年年底,Katsoyannis 和Zahn 还分别宣称他们合成了胰岛素。不过他们 始终未能获得合成胰岛素的结晶。他们所合成的胰 岛素也只具有微弱的生物活力。尽管如此,他们取 得的成果给了我们巨大的压力。 当年参加该项研究任务的大多数是年轻人,热 情非常高,决心要赶在德国人和美国人之前完成胰 岛素的合成。大家深知责任重大,必须全身心地投 入工作。