HPV6,11,2011　年8月,第三版/1　1　人乳头瘤病毒(6,11　型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)说明书　【产品名称】　通用名称:人乳头瘤病毒(6,11型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)　英文名称:Diagnostic　Kit　for　Human　Papillomavirus　(Type　6　and　11)　DNA　(PCR-Fluorescence　)　【包装规格】单管单人份,20人份/盒。　【预期用途】　适用于定性检测生殖泌尿道分泌物、生殖道刮片、组织活检标本等样本受感染细胞中人乳头瘤病毒(HPV)6,11　型DNA,可用于人乳头瘤病毒(HPV)6,11　型　感染的辅助诊断。检测结果仅供临床参考,不能单独作为确诊或排除病例的依据。　【检验原理】　本品选用人乳头瘤病毒(HPV)6　型(GenBank　序列号为:AF092932)基因组中编码主要外壳蛋白L1　基因的编码区为扩增靶区域,设计特异性引物及荧光探针,扩　增片段长度为　221bp,利用实时荧光定量　PCR　技术,定量检测人乳头瘤病毒(HPV)6,11　型DNA。　【主要组成成份】　试剂名称　规格　各组份的组成成分　数量　DNA提取液　500µl/管　去污剂和Tris盐酸缓冲液　2　管HPV6,11PCR反应管(未贴标签管)　HPV6,11PCR特异引物探针、酶系和Tris盐酸缓冲液　20　管HPV6,11阳性定量质控品　(1×10　6　copies/μl)　50µl/管HPV6,11PCR阳性标本处理液　1　管　阴性质控品　500µl/管HPV6,11PCR阴性标本处理液　1　管　【储存条件及有效期】保存于-20℃;有效期6个月。　【适用仪器】主要包括PE　GeneAmp5700、ABI　Prism　7700、DA-7600、Line　Gene、iCycler。　【样本要求】　1.　适用标本类型:生殖泌尿道分泌物棉拭子、生殖道刮片、组织活检标本。　2.　标本采集:　2.1　生殖泌尿道分泌物　男性—用细小棉拭子伸入尿道约2~4　厘米,捻动拭子采集分泌物,将棉拭子置无菌管,密闭送检(采集分泌物前　2　小时禁小便)。　女性生殖道—用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物,再用无菌棉拭子插入宫颈内,停5秒钟后旋动棉拭子采集宫颈分泌物,将棉拭子置入无菌玻璃管,密闭送检。　女性尿道—用无菌生理盐水棉球洗净尿道口,再用无菌棉拭子插入尿道约2　厘米,捻动拭子采集分泌物,将棉拭子置入无菌玻璃管,密闭送检。　2.2　生殖道刮片:用生殖道刮片刮取宫颈口组织细胞置入无菌管,密闭送检。　2.3　组织活检标本:取可疑组织约　50　毫克置无菌管,密闭送检。　3.　标本保存和运送:标本可立即用于测试,也可保存于-20℃待测,保存期为　6　个月。标本运送时应采用　0℃冰壶。　【检验方法】　一、DNA提取　1.　阴性质控品处理　a.　取50μl　阴性质控品加入等量　DNA　提取液充分混匀,100℃保温　10　分钟,误差不超过　1　分钟。　b.　12,000　rpm　离心　5　分钟,备用。　2.　标本处理　2.1　生殖泌尿道分泌物棉拭子:　a.　向玻璃管中加入　1　ml　灭菌生理盐水,充分震荡摇匀,挤干棉拭子。　b.　吸取全部液体转至　1.5ml　离心管中,12,000rpm　离心　5　分钟。　c.　去上清,沉淀加灭菌生理盐水　1ml,充分震荡混匀,12,000rpm　离心　5　分钟。　d.　去上清,沉淀加入　50μl　DNA　提取液充分混匀,100℃保温　10　分钟,误差不超过　1　分钟。　e.　12,000　rpm　离心　5　分钟,备用。　2.2　生殖道刮片:　a.　向玻璃管中加入　1　ml　灭菌生理盐水,充分震荡摇匀。12,000rpm　离心　5　分钟。　b.　以下操作同　2.1c.d.e　2.3　组织活检标本:　a.　用适量灭菌生理盐水洗净送检组织沾带的血液;　b.　取约　50　毫克组织,加1ml　灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆,转移至　1.5ml　离心管中,12,000rpm　离心　5　分钟;　c.　以下操作同　2.1c.d.e。　3.　HPV　6,11　阳性定量质控品(1×10　6　copies/μl)处理　a.　将阳性定量质控品　6,000rpm　离心数秒,标示为　1×10　6　。　b.　取5支灭菌　0.5ml　离心管,分别加入　45μl　阴性质控品,依次标示为　1×10　5　~1×10　2　。　c.　取1×10　6　阳性定量质控品　5μl　至1×10　5　管,用加样器反复混匀后换吸头取5μl　至1×10　4　管,依此方法依次稀释至　1×10　2　管。　d.　每个梯度各取　40μl,各加　40μl　DNA　提取液充分混匀,100℃保温　10　分钟,误差不超过　1　分钟。　e.　12,000rpm　离心　5　分钟,备用。　二、PCR扩增　PE　GeneAmp　5700操作　1.　加样:取PCR　反应管若干,加入处理后的样品(标本或阴性或阳性定量质控品)上清液　2μl,6,000rpm　离心数秒,放入仪器样品槽。　Cat.#DA-D056　HPV6,11,2011　年8月,第三版/1　2　2.　编辑　2.1　按对应顺序设置阴性质控品、阳性定量质控品以及未知标本,并在　Name　栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔,点击工具栏中　P　键,选择　PR1　Primer1　后关闭窗　口。选择工具栏中　Q　键,输入对应阳性定量质控品浓度。　2.2　打开　insturment　窗口设置循环条件:93℃→2　分钟预变性,93℃　45　秒→55℃　60　秒,10　个循环,再93℃　30　秒→55℃　45　秒,30　个循环。保存文件,运行。　3.　结果分析　3.1　反应结束后保存检测数据文件。　3.2　分析条件设置:在Analysis　菜单下调节　Baseline　的start　值、stop　值以及　Threshold　下manual　的value　值,　使Std　curve　窗口下的标准曲线图达到最佳,即correlation　数值介于-0.97~-1.0。在Analysis　菜单下选择　Analyze　自动分析结果。最后到　Tray　窗口下读取的未知样品数值(Qty)　。　4.　质量控制　阴性质控品:全部阴性　阳性定量质控品:全部阳性　0.97≤|r|≤1　(r　值等同于　correlation　数值)　以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,全部实验应重新进行。　【检验结果的解释】　1.PE　GeneAmp　5700　1.1.　阴性结果判定:如果增长曲线不呈　S　型曲线或　Ct　值=30,则样品的　HPV　6,11　DNA　含量判为小于　2.5×10　3　copies。　1.2.　阳性结果判定:如果增长曲线呈　S　型曲线且　Ct　值<27,则实验结果判为阳性;样品的拷贝数计算为:　若实验结果显示,1×10　2　≤样品的　Qty≤×10　6　,则该样品的　HPV　6,11　DNA　含量=　25×(Qty)copies;　若实验结果显示样品的　Qty>1×10　6　,则该样品的　HPV　6,11　DNA　含量为>2.5×10　7　copies。如果需要精确定量,可将提取后的样品稀释　1000　倍再检测。　1.3.　实验灰度区:如果　30>Ct　值≥27,则为实验灰度区,需重复实验一次,若重复实验结果显示为增长曲线呈S　型曲线且　Ct　值<30,则判为阳性,　该样品的　HPV　6,11　DNA　含量=　25×(Qty)　copies;否则判为样品的　HPV　6,11　DNA　含量小于　2.5×10　3　copies。　1.4　以上定量结果仅供参考,不作为定量依据。　2.　ABI　Prism　7700、DA-7600、Line　Gene、iCycler　以上仪器　PCR　操作、循环条件、阴阳性结果判定、实验灰度区、质量控制同　PE　GeneAmp　5700。　3.　对于检测结果阳性的报告,表明该样本有　HPV　6,11　型病毒的遗传物质　DNA　存在,并不显示一定存在活病毒。　4.　虽然本试剂盒的检测特异性、灵敏度均较高,但检测结果阴性并不能排除样本含有病毒,只能说明样本含有的病毒浓度低于本试剂盒的检测下限。　5.　检测系统的交叉反应性已经临床考核而确定,阳性结果仅能说明　HPV　6　型或　HPV　11　型病毒　DNA　存在,并不能证明其它　HPV　亚型的存在与否。　【检验方法的局限性】　由于样本来自组织或分泌物,不同部位的组织或分泌物含　HPV　核酸的量可能不同,因此检测结果仅反映样本中的核酸含量,且该定量结果仅供　参考,不作为定量依据。　【产品性能指标】　1.　灵敏度:本试剂盒对标本的灵敏度为2.5×10　3　copies。　2.　线性检测范围:本试剂盒线性检测范围　10　6　copies/μl~10　2　copies/μl。　3.　精密度:以阳性定量质控标准品　L3　为精密度参考品,连续　10　次重复检测,CT　值的变异系数小于　10%。　4.　尖锐湿疣的临床:主要由人乳头瘤病毒(HPV)6,11　型感染引起,尚有部分由人乳头瘤病毒(HPV)其它亚型感染引起,所以阴性结果并不能排除人乳头瘤病毒(HPV)6,11　型以外其它亚型的感染。　5.　交叉反应:试剂盒与　CT(沙眼衣原体)　、NG(淋病奈瑟菌)　、UU(解脲脲原体)　、HPV　其它亚型临床无交叉反应。　【注意事项】　1.　实验前请仔细阅读本说明书;　2.实验人员必须进行专业培训,实验过程严格分区进行(试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区)　,所用消耗品应灭菌后一次性使用,PCR　操作每个阶段使用专用　的仪器和设备,各区各阶段用品不能交叉使用;　3.为试剂和标本准备阶段提供负压超净工作台,实验过程中请穿工作服,带一次性手套,使用自卸管移液器;　4.对每次实验进行质量控制;　5.自备灭菌生理盐水;　6.标本处理时“去上清”步骤,注意吸头不要碰触沉淀;　7.试剂使用前要完全解冻,但应避免反复冻融;　8.试剂盒　DNA　提取液内含不溶于水的物质,取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象,可先用洁净无污染的剪刀将　吸头嘴部剪去一截　;　9.加样时要加于反应管管壁上,然后务必离心,使样品与反应液充分混匀;　10.为保证病毒颗粒充分裂解可转至4℃静置　6~8　小时;　11.标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器,并与废弃物一起灭菌后方可丢弃;　12.实验完毕用　10%次氯酸或　70%酒精或紫外线灯处理工作台和移液器。　13.本试剂盒内的阳性定量质控品应视为具有传染性物质,操作和处理均需符合相关法规要求:卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》　。　【生产企业】　中山大学达安基因股份有限公司　生产地址:广州市高新技术产业开发区香山路19　号　传真:020-32068820　电话:020-32290789,8008304008　邮政编码:510665　网址:http://www.daangene.com　【医疗器械生产企业许可证编号】粤食药监械生产许20040999号　【医疗器械注册证书编号】国食药监械(准)字2011　第3400391　号　【产品标准编号】YZB/国0260-2011　【说明书批准及修改日期】2011年3　月30　日