(1)加热灭菌法
利用高温来杀死微生物(超过最高生长温度)的方法。加热灭菌的原理:当高温作用于微生物时,首先引起细胞内生理生化反应速率加快,机体内对温度敏感的物质如蛋白质、核酸等,随着温度的增高而遭受不可逆的破坏,尽而导致细胞内原生质体的变化、酶结构的破坏,从而使细胞失去了生活机能上的协调,停止了生长发育。随着高温的继续作用,细胞内原生质便发生凝固,酶结构完全破坏,活动消失,生化反应停止,渗透交换等新陈代谢活动消失,细胞死亡。加热灭菌可分干热灭菌和湿热灭菌两大类。
1)干热灭菌 利用灼烧或干热空气灭菌而没有饱和水蒸气参加的灭菌法称为干热灭菌法。由于干热灭菌使用方便,方法简单,故在生产上广泛应用。如火焰灭菌法:直接利用火焰把微生物烧死,故又称焚烧灭菌法。采用此法灭菌既彻底又迅速,但只适用于金属制的接种工具、试管口及污染物品等的处理。热空气灭菌法:即在电热恒温干燥箱中利用干热空气来灭菌。
2)湿热灭菌 即利用蒸汽进行灭菌的方法。湿热灭菌又分为高压、常压、间歇灭菌和巴氏灭菌4种。
①高压蒸汽灭菌 由于高压蒸汽具有较强的穿透力和较常压高的温度,能大大缩短灭菌时间,提高工作效率,加之蛋白质在湿热条件下容易变性,在热蒸汽条件下,细菌的芽孢在120℃,经20~30分钟可全部被杀死。如灭菌材料体积较大,不易被穿透时,可将压力增加到0.152兆帕,延长至1~2小时。在高压蒸汽灭菌中,灭菌温度随蒸汽压力的增加而升高(图2-6)。
图2-6 高压蒸汽灭菌锅
在使用高压灭菌锅时,要完全排出锅内的空气而以饱和蒸汽代之。如果空气不排除干净,则锅内温度将低于同样压力下由纯饱和蒸汽产生的温度,影响灭菌效果。
此法适用于各种耐热物品的灭菌,如一般培养基、生理盐水等各种溶液、玻璃器皿、工作服等。所采用的蒸汽压力与时间,应根据待灭菌物品的性质、体积与容器类型等决定。
②常压蒸汽灭菌 这是采用自然压力、100℃蒸汽进行灭菌的方法。它设备简单、成本低,当前使用最广泛。只要砌一个炉灶,买1~2只大锅,上面用砖和水泥砌成,也可用大铁桶、木桶等,体积大小可自行决定,但不宜过大,以装800~1500瓶为好。设计常压灶时应注意的问题:大小根据生产规模来定,灶顶部最好制成拱圆形,这样冷凝水可沿灶的内壁下流而不会打湿棉塞;灶仓内要有层架结构,以便分层装入灭菌物;灶上应安装温度计,可随时观察灶内温度的变化;因灭菌时间长,锅内水不够蒸发,故容量大的灶要安装加水装置;灶仓的密闭程度要尽可能高,这样既提高灭菌效果,又节省燃料。菇农在生产中还常用一种小型蒸汽发生装置,引出蒸汽后直接通到下边用木条堑起、四周用多层塑料布密封的菌袋堆中进行常压灭菌。这种方法不用建灶,简便省工(图2-7)。常压灭菌一般水烧开后保持8~10小时,闷一夜即可。
图2-7 简易常压灭菌法
③常压间歇蒸汽灭菌法 这是利用常压蒸汽反复几次灭菌的方法。具体做法是将待灭菌物品放在锅内,100℃处理1小时左右,杀死微生物的营养细胞,让其冷却至30℃左右,此时芽胞会萌发,再以同样方法加热处理,反复3次,可达到灭菌目的。该方法可用于不耐高温的药品、营养物、特殊培养基的灭菌。
④低温巴氏灭菌法 即在60~70℃下,经一定时间,杀死有害微生物的方法。适应于不耐高温的物品消毒。有些培养基,在高温下遭到破坏,用此法既可杀死致病微生物的营养体,又能使培养基的成分不致受到严重破坏。食用菌生产中培养料堆积发酵工艺,就是利用这个原理杀死其中的病虫、杂菌。
(2)过滤除菌法
又分液体过滤和空气过滤两种,就是采用机械的方法,设计一种滤孔比细菌还小的筛子,做成各种过滤器,通过机械过滤,只让液体培养基或空气从筛孔流出,各种微生物菌体则留在筛子上,从而达到除菌的目的。这种方法适用于对热不稳定的体积小的液体培养基(如动物血清、蛋白质、酶、维生素等)及气体的灭菌。超净工作台的工作原理就是将带菌空气通过过滤灭菌形成无菌空气,从风洞中吹出,来造成工作台范围的无菌状态。过滤灭菌的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。常用的过滤器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的,也有用火棉胶、硝化纤维素滤膜制成的。
(3)辐射灭菌法
利用辐射产生的能量进行杀菌的方法称辐射灭菌。辐射可分电离辐射和非电离辐射两种,α-射线、β-射线、γ-射线、X-射线、中子和质子、微波等属电离辐射,紫外线、臭氧、日光为非电离辐射。
1)紫外线灭菌 紫外线杀菌的原理是利用紫外线的辐射作用。用灯管直接照射细菌使其发生光化学反应,将细菌细胞质诱导形成胸腺嘧啶双聚体,从而抑制DNA的复制而发生变性、致死。另一方面,空气在紫外线照射下产生的臭氧(O3),也具有一定的杀菌作用。紫外线的有效作用距离为1.2~2.0米。紫外灯一般悬吊在接种室或培养室的上方,个数依房间大小而定,容1~2个人操作的接种室,安装一个30瓦的紫外灯就可以了。在每次接种前,应将所需的器具一起放入接种室(箱)内,然后打开紫外灯照射。如果接种室体积较大,开灯照射2小时才能达到灭菌效果;如果较小,只需开灯半小时左右既可达到灭菌效果。由于紫外线穿透力弱,即使是普通玻璃也不能滤过,因此,只适于空气或物体表面的灭菌。紫外线对人体皮肤,尤其是眼睛有杀伤作用,应避免直视,工作时应将紫外灯关闭。紫外线消毒时工作场所如果处在稍暗无光的情况下,能提高杀菌效果。细菌接受致死量紫外线照射后,随即给予可见光照射,部分细菌有复活的可能。干细胞比湿细胞对紫外线的抗性强,孢子比其营养细胞对紫外线更具抗性。
2)微波灭菌 由于微生物的细胞中都含有70%~90%的水分,水分子在微波电场中被极化,并随着电场方向的改变而转动,在转动过程中分子之间高速度摩擦产生热能,这种热能不同于外部加热,可在短时间里使细胞爆破而物体本身的温度却只有极微增加,从而达到灭菌效果。用YM7601型微波炉只需60秒钟就能杀死食品中192万个大肠杆菌。
3)臭氧发生器消毒 臭氧(O3)具有强烈的氧化作用,能破坏微生物的细胞膜与核酸。O3也是一种暂态物质,常温下能自然分解,还原成氧。其灭菌原理实际上和紫外线消毒极相似。