7 项呼吸道病毒试剂盒操作流程 1、取样: (此步骤大多由临床医生完成。 ) 用特制的鼻咽拭子从病人的鼻咽部取样或者使用鼻腔灌洗液, 将鼻咽拭子放入储 存管中(含有缓冲液) 。使用鼻咽拭子取样时,拭子进入鼻部后,应水平向鼻腔 伸入。伸入的深度约为耳垂到鼻尖的二分之一处,取样前可事先大致测量一下。 二岁一下的儿童,伸入深度约为拭子绒毛长度的二倍。拭子伸入至指定深度后, 缓缓贴壁旋转 2-3 周,约停留 10 秒钟,取出拭子。取样后一小时内向取样管中 加入生理盐水,样本最好在 24 小时内进行操作。 2、样本准备步骤:(此步骤除离心以外,建议都在二级生物安全柜内操作 ① 将样本充分震荡混匀约 10-15 秒。 ② 在 3000rpm 转速下离心 10 分钟。 ③ 弃上清。 ) ④ 在沉淀中加 5 mL PBS 缓冲液( 请使用普通 PBS ,不要使用试剂盒内配套的浓缩 洗液 ) ,充分震荡混匀约 10-15 秒。 ⑤ 在 3000rpm 转速下离心 10 分钟。 ⑥ 吸走上清和黏液层,小心不要吸到沉淀。 ⑦ 重复步骤 4 到 6 ,直至黏液层被完全去除。 注意:一定要将黏液去除干净, 否则会造成非特异荧光从而影响实验结果。 不见粘液为准。一般重复两到三次即可,若肉眼不可粘液,洗一次即可。 ⑧ 在沉淀中加 0.5 到 1 mL 的 PBS缓冲液。视沉淀的量而定,若无可见沉淀则加入 0.2mL. ⑨ 用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀,形成一个略混浊的悬液。这个悬浊液可用 于直接样本测试。 以看 3、直接样本测试步骤: 在操作前请将试剂盒内 40×的高浓缩洗液稀释 40 倍后使用。 ① 在 8 孔板上的每孔内滴加 25 μ L 的细胞悬浊液。 (若在之前步骤清洗沉淀中可明 显见大块沉淀,则滴加 15μ L 细胞悬浊液即可。 ② 样本完全风干。风干时若操作实验室温度较低,建议置于 风干更短时间内完成。 25 o C 烘箱,可以使 ③ 在 20o C 到 25o C, 用预冷的 100%丙酮固定细胞约 10 分钟。注意:丙酮是易挥发、 可燃性物质,使用时请远离明火。丙酮可重复使用,可用 ④ 从丙酮中取出载玻片并风干。 ⑤ 在固定并风干的细胞上滴加对应的七种 DFA染色试剂,使其完全覆盖细胞。 DFA染色试剂。抗原对照板包 ⑥ 在呼吸道病毒抗原对照板的每孔内也要滴加七种 含了被病毒感染的细胞和未感染的细胞,只能一次性使用。 ⑦ 在阴性对照孔内滴加正常鼠丙种球蛋白试剂, 使其完全覆盖细胞。(此步骤仅限 筛查试剂) 备注:以上步骤① ~⑦ 建议在二级生物安全柜中完成。 ⑧ 将载玻片放于 35o C 到 37o C 的恒温箱内孵育 15 分钟,为保持其湿润最好 放置 于 带盖的盒子内。(可置于培养皿内,或用盖子将玻片盖住均可) ⑨ 用事先稀释好 1 倍的洗液(试剂盒内 40 ×洗液稀释)漂洗染色细胞。为了更有 效地洗涤,请将玻片在洗液中反复浸蘸 般洗 10 块板左右) ⑩ 使用新的 1 倍洗液再洗一次。请用少量的洗液冲洗玻片。 ?用去离子水再洗一遍。 4 次左右。 (洗液颜色变深即可更换,一 4、观察实验结果与判断 滴加 1 到 2 滴固定液,以盖盖玻片时不产生气泡为益。 并加盖盖玻片 ( 20X50 mm) ,要注意避免产生气泡。在 试剂盒中染色液包含 200 倍放大荧光显微镜下观察结果。 FITC 荧光物标记的特异性抗体,阳性的样本会结合特 荧光需要蓝光激发,荧光激发 异性抗体,结果观察需要在荧光显微镜下观察。 波长约 480nm 左右。FITC在蓝光激发下发绿色荧光, 反射光波长为 520nm 左右。 因此,阳性感染细胞应发绿色荧光。 阳性结果判断:在样本孔中低倍视野下若有 光,即为该孔所对应的病毒阳性。 实验后, 已使用的鼻咽拭子、 储存管、 玻片等按照国家有关医疗废弃物处理规定进行处 理,无需特别处理措施。 可重复使用的试剂( 丙酮、试剂盒自带的漂洗液等 )在达到使用次 数限制以后按照规定进行处理。 2 个或以上由细胞发出果绿色荧