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abi仪器篇

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Real-time PCR数据导出——ABI仪器篇
1.Real-time PCR数据:Real-time PCR完成后,所有数据并非可以直接导出,由于每一次实验的情况都不相同,仪器的很多默认设定都会对最终数据结果造成重大偏差,所以在完成PCR过程后,需要人为对实验结果进行条件设置,才能提取到科学有效的实验结果,进而完成对实验结果的分析和判断。
2.数据导出调整步骤:a调整参比荧光选项;b调整基线;c调整阈值
3.概念:
a.参比荧光(dye as the passive reference):参比荧光的作用是用来消除光程差,调整扩增曲线线形和溶解曲线峰形,与PCR反应所加荧光染料mix相关,不同公司品牌的mix所含参比荧光的种类不一样,如:Takara选用ROX,ABI则没有参比荧光,数据提取时,需注意下参比荧光选项,如选错,扩增曲线或溶解曲线或将无法正确呈现。
b.基线(Baseline):是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大。接近一条直线,这样的直线即是基线。基线调整包括基线起点与基线重点,起点一般设在2-3个CT,终点设在扩增曲线开始上扬即进入指数增长期的CT值前2-3个CT,终点设置太靠前会降低CT值,太靠后则会增加CT值。如仪器默认基线期与上述基准不一致,很可能需要人为设定调整。
c.荧光域值(threshold):一般仪器会将PCR反应前15个循环(即基线期)的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值默认是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍,正确的荧光域值应设定在PCR扩增的指数期循环数。
4.StepOne参比荧光:在plate setup中选择和设置参比荧光。
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5.StepOne基线(Baseline):选中Analysis Setting按钮,出现如下对话框
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•选中Advanced Setting选项,将每个差别大Baseline End值调到正确数值。
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•最后点击Apply Analysis Setting按钮
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•上图调整前基线微上翘,下图调整后基线平整
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6.StepOne阈值(Threshold):选中孔板中所有的数值,如下界面选择log、Target对话框
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•将每个基因的TredsholdAuto勾选掉,阈值数值调整范围原则在指数增长期。
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阈值数值调整范围原则在指数增长期,该范围中,曲线斜率相同,ΔCT值不变
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•注意同一板结果所有内参目的基因阈值设定需一致,这样的ΔCT有可比性。
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