蛋白沉淀的定义
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。蛋白质从溶液中析出的现象,称为蛋白质的沉淀。
蛋白沉淀前处理的优势与劣势
优势:蛋白沉淀的最主要的优势就是操作简便、成本低、易于实施。
劣势:①此方法仅去除了蛋白质,内源性杂质并没有去除掉,长时间检测可能会对色谱柱和仪器的寿命产生影响。所以,要对色谱柱和仪器做定期维护。
②处理后的样本浓度会被稀释,不适用于浓度低的目标物和质谱响应偏低的情况。
临床质谱领域蛋白沉淀方法汇总
1.有机溶剂沉淀法
此方法为临床质谱领域最常用方法,一般沉淀试剂以甲醇、乙醇、乙腈为主。个别项目会在有机溶剂中加入一定量的有机酸来提高沉淀效率。例如同型半胱氨酸的检测,一般会在有机溶剂中加入一定量的三氟乙酸或者三氯乙酸。
在做血浆或血清样品时,多用甲醇或乙腈沉淀蛋白,一般情况样本与沉淀剂的比例为乙腈最低1:2(一般1:3以上),甲醇最低1:3(一般1:5以上),有实验显示以血清:水:乙腈为1:2:4.5时去除效果最好。
适用目标物:生物小分子、糖类。
原理:有机溶剂的沉淀原理是降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出。
优点:①分辨能力比盐析法高,即蛋白质只在一个比较窄的有机浓度下沉淀;②沉淀后不用需考虑除盐,过滤较为容易。
2.盐析法
当目标物为非蛋白质时,纯盐析法在临床质谱领域应用较少,因为沉淀后会引入高浓度盐,长时间进样的话会对仪器灵敏度和柱压产生影响。所以,一般使用盐析法沉淀后,样本还需经过稀释、减少进样量或者透析除盐等步骤。盐析法可与其他沉淀方法结合使用。
适用目标物:盐析法沉淀出的蛋白并没有失活,所以主要用于蛋白质和酶的提取。
3.加热凝固法
原理:将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热,可使蛋白质发生凝固( coagulation)而沉淀。加热首先是加热使蛋白质变性,有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构,分子的不对称性增加,疏水基团暴露,进而凝聚成凝胶状的蛋白块如煮熟的鸡蛋,蛋黄和蛋清都凝固。此方法主要选择性去除不耐热的杂蛋白。
适用目标物:目标物需要有较强的热稳定性,例如葡萄糖。
其余的蛋白沉淀法还有等电点沉淀法、非离子多聚物沉淀法、生成盐复合物沉淀法等,这些方法临床质谱领域应用