DNA序列特征是影响核小体形成最重要的因素之一(Liuetal.,2016)。研究发现DNA序列中TA二核苷酸以10.5bp周期出现有利于核小体定位,而poly(A)则不易形成核小体,也有许多研究工作发现核小体DNA中存在一些序列模体(TrifonovandNibhani,2015)。除了DNA序列,组蛋白是核小体的另一个主要构成成分。在不同的细胞周期及细胞处于不同的环境状态下,组蛋白的表达会呈现一定的表达差异。从反应平衡角度考虑,不同含量的组蛋白和DNA序列组装核小体的速率可能是不同的,同时可能会进一步影响复制以及转录等生物学过程(Dyeretal.,2004)。体内核小体的装配在染色质装配因子、组蛋白伴侣以及依赖性ATP的重塑因子等调控下完成,受到许多因素的干扰,过程相对复杂不可控。盐透析法是体外组装核小体较为高效的实验方法之一,该方法的实验体系中仅有组蛋白和DNA序列,依赖盐离子浓度的变化驱动核小体装配,没有其它因子的参与,是研究组蛋白和DNA装配核小体速率及动力学特性较为有效的手段(赵宏宇等,2014)。实验表达了H2A、H2B、H3、H44种组蛋白,并按照等分子比组装为八聚体,利用盐透析法在“Windom601”序列上装配了核小体。通过改变体系中加入的组蛋白样品量,检测计算了核小体的生成效率,以此数据为基础构建了核小体装配过程组蛋白浓度依赖性的动力学模型。该动力学模型可用于检验DNA序列组装核小体的能力、组蛋白与其突变体以及组蛋白变体之间形成核小体结构能力的差异,同时为理解核小体装配、核小体定位、染色质结构等相关问题提供理论指导。1结果与分析1.1DNA序列收集及组蛋白的表达纯化实验室前期构建了重组质粒pUCCS1(赵宏宇等,该质粒含有“Win2016)和pUC601(Zhaoetal.,2015),dom601”核心DNA序列,长度为147bp。“Windom601”DNA序列是一段具有强核小体定位能力的DNA序列(LowaryandWidom,1998),是国际上体外构建核小体及染色质结构较为常用的模板DNA。CS1序列是本实验室设计的一条用于组装核小体的DNA序列,长度为163bp。以pUC601和pUCCS1为模板,利用PCR的方法大量扩增了601和CS1DNA序列。为了增强检测效率及后续定量化计算核小体组装效率,对PCR上游引物的5'端标记了荧光分子Cy3。PCR扩增产物回收后Native-PAGE电泳检测。激发Cy3荧光分子后检测的发射光信号后,显示Cy3标记的601和CS1DNA序列信号较强,条带整齐,纯度较高,无任何杂质污染(图1A);利用EB染色成像后,可以看出电泳条带位于100bp和200bp的DNA分子Marker之间(图1B)。培养含有H2A、H2B、H3、H4重组质粒的大肠杆菌,经IPTG诱导后,超声破碎收集蛋白,SDS-PAGE电泳检测蛋白(图2A)。理论上重组蛋白H2A、H2B、H3和H4的分子量分别15kD、电15kD、17kD和14kD,泳中条带位置与理论上组蛋白的分子量大小基本符合。尽管泳道中有少量的杂蛋白存在,但是经过复性后纯化可以有效去除。以小牛血清BSA为标准蛋白,利用考马斯亮蓝法测定了蛋白浓度标准曲线,线性回归曲线拟合度较高,回归相关系数达到0.996(图2C)。以该曲线为依据,分别测定计算了4种组蛋白的浓度。按照等摩尔比的关系将4种组蛋白混合后,在复性缓冲液中透析,4种组蛋白在复性的过程中会同时装配成组蛋2998基因组学与应用生物学图1Native-PAGE检测DNA序列注:A:Native-PAGE检测Cy3标记的DNA序列;B:Native-PAGE检测EB染色的DNA序列;M:DL1000DNAMarkerFigure1DNAsequencesdetectedbyNative-PAGE图24种组蛋白和八聚体的SDS-PAGE检测和测定蛋白浓度Note:A:Native-PAGEofDNAsequencesdetectedbyCy3-la-标准曲线belingmethod;B:Native-PAGEofDNAsequencesdetectedby注:A:4种组蛋白的SDS-PAGE;M:PrestainedproteinLadder;EB-stainingmethod;M:DL1000DNAMarkerB:蛋白浓度的标准曲线;C:组蛋白八聚体的SDS-PAGEFigure2SDS-PAGEresultsoffourhistonesandoctamerand白八聚体。经过蛋白纯化系统(AKTA)凝胶层析柱分standardcurvefordetectionofproteinconcentration离筛选,选取纯化的组蛋白八聚体样品进行Note:A:SDS-PAGEresultsoffourhistones;M:Prestainedpro-泳道SDS-PAGE电泳分析(图2B)。从图中可以看出,中存在3条条带,分别是H4、H2A/H2B和H3,且泳teinLadder;B:Standardcurvefordetectionofproteinconcentration;C:SDS-PAGEresultsofhistoneoctamer道中没有检测到其他杂蛋白,纯度较高。1.2不同组蛋白浓度对体外组装核小体的影响考察组蛋白浓度对体外组装核小体的影响,保证体系中DNA质量的恒定,改变组蛋白浓度的含量图3Native-PAGE检测601序列组装核小体样品进行核小体的装配实验。经Native-PAGE电泳后,分Figure3Native-PAGEofreconstituted-nucleosomesampleon析样品条带Cy3荧光信号值(图3)。在每个核小体组601DNAtemplate装样品的泳道中,均出现两条清晰的条带,分别是游离DNA和核小体DNA。组蛋白浓度为5μg/mL时,对应的核小体信号值较弱,仅有少量的核小体形成;随着样品中组蛋白八聚体浓度的增加,样品中核小体条带相对比例明显增大;当组蛋白浓度达到60μg/mL时,样品中DNA的条带荧光信号变得非常弱,而核小体DNA条带变得非常明亮,说明绝大多数DNA片段组装形成了核小体结构(图3)。1.3构建核小体组装过程浓度依赖性的动力学模型为构建核小体组装过程浓度依赖性的动力学模型,可将电泳中条带的荧光信号值分别进行定量化处理,确定核