1 材料与方法1.1 材料1.1.1 研究材料
实验所用研究材料为华细辛。分别取华细辛营养生长期的根(Root A)、根茎(Rhizoma A)、叶(Leaf A)、叶柄(Petiole A),花期的根(Root B)、根茎(Rhizoma B)、叶(Leaf B)、叶柄(Petiole B),花(Flower),花后期的根(Root C)、根茎(Rhizoma C)、叶(Leaf C)、叶柄(Petiole C),将它们清洗干净并在液氮中研磨成粉,置于-80℃冰箱中保存备用。
1.1.2 主要试剂
总RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant Kit(Tiangen公司)、逆转录试剂盒FastQuant RT Kit(With gDNase)(Tiangen公司)、荧光定量PCR试剂盒SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(Tiangen公司)。其余试剂若未说明均为国产分析纯。引物由上海英骏公司合成。
1.2 方法1.2.1 总RNA的提取及逆转录
根据Tiangen RNA-prep Pure Plant Kit说明书进行总RNA的提取,用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,确保各样品28S与18S电泳条带亮度之比约为2:1,且无基因组DNA残留。根据Tiangen FastQuantRTKit(With gDNase)说明书进行逆转录反应,合成的cDNA作为荧光定量PCR反应的模板。
1.2.2 候选内参基因的选择及引物设计
本研究共选取6个候选内参基因,分别为SAND-1、ACT、18SrRNA、CYP-2、GAPDH和TUB,引物序列见表1。在qRT-PCR中,可通过熔解曲线判断引物的特异性。
表1 qRT-PCR中内参基因的引物序列
1.2.3 实时荧光定量PCR
本实验在Applied Biosy-stems StepOne PCR仪上进行。反应体系(20 µL)如下:2×SuperReal PreMix Plus 10 µL,50×ROX Reference Dye 2 µL,cDNA模板(100 ng)0.1 µL,上游引物(10 µmol/L)0.6 µL,下游引物(10 µmol/L)0.6 µL,RNase-free ddH2O 6.7 µL。
反