一、实验操作qPCR的实验操作可谓说是比较简单,有一套详细的说明书各位小伙伴们都不在话下,但是还有一些小tip!1. 试剂耗材准备:qPCR的操作简单但是要严谨!建议小伙伴们提前备好耗材和试剂!耗材保证:无酶无菌,个人建议尽量选择进口枪头,减少液体挂壁,更为准确。(使用过很多厂家的八连管,进口的不管是做工还是结果上,本人都觉得更好,也欢迎小伙伴们好货推荐!)镊子提前高压,加样所用金属托架提前放置冰箱降温。2. RNA提取和反转录:低温操作!Trizol提取时注意蛋白质层的分离!Mix配置后切忌不可反复冻融!注意空气中小片段核酸污染!RNA提取后不可久放尽快反转录!3. 体系配制:注意避光!首先口罩戴起,头发扎好;每个样品设置3个平行孔,保证数据真实可用;反转录时可能同一样本核酸有多个小EP管分装,建议配体系时尽量转移一个管中混匀后加样,保证平行孔间数据稳定;没有排枪的小伙伴们加样只要手法稳定也是能保证结果的。(建议新手们提前在实验记录本上规划好加样安排,操作时不易出错,整理数据时也清晰明了。)4. 上机操作:上机前首先离心,如果管内有“顽固”气泡可以用手指轻轻弹就能完美解决!加完的样本不能久置,须立刻上机。
(金属托架:图片来自网络)二、曲线分析qPCR结果的分析主要就是对曲线的分析,这次我们主要了解扩增曲线(Amplification curve)和熔解曲线(Dissociation curve)。扩增曲线(Amplification curve):随着PCR反应的进行,荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强,通过荧光强度检测扩增产物量的变化。
理想的扩增曲线是S型,有明显的四个时期,我们主要分析形状奇怪的扩增曲线。1. 没有对数增长期的扩增曲线,无Ct值可能原因:引物或探针降解;模板量不足或模板降解。建议试剂不要反复冻融;2. Ct值出现过晚的扩增曲线可能原因:扩增效率低,建议各位小伙伴可以使用核酸电泳优化反应条件,比如降低退火温度;(当ct值较大>38,本人试过在反转录时即采用特异性引物进行反转录,并加大核酸浓度,效果有所改善)3. 扩增曲线出现向下或向上的尖峰可能原因:反应过程中电压不稳定,也可能为卤素灯老化。熔解曲线(Dissociation curve):随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。
熔解曲线上有特征峰(Tm,DNA双链解链50%的温度),一般通过熔解曲线判断扩增产物是否单一。