1.2 试剂的配制 所有试剂溶液配制后均采用相应容量瓶定容,并 置于4冰箱贮存备用. 1.2.16mol/LHPO4 溶液的配制 准确量取41mL85%H3P04 后以蒸馏水定容至 100mL. 1.2.2 混酸溶液的配制 6mol/LH3PO4 与冰乙酸(HAc)分别以 l:5,1:3 的体积比配制. 1.2.325mg/mL 茚三酮反应液的配制 准确称量1.250g 茚三酮,加入到装有50mL 酸的烧杯中于70水浴中使茚三酮完全溶解后定容,并转入棕色试剂瓶中. 1.2.4L 一鸟氨酸单盐酸盐标准液的配制 准确称取0.034gL 一鸟氨酸单盐酸盐,加入装有 70mL 蒸馏水的烧杯中,充分溶解后定容至100mL, 其浓度相当于2.0t~mol/mL. 1.2.5 其他氨基酸标准溶液 准确称量0.030gL 一天冬氨酸(Asp),0.026g 一亮氨酸(Leu),0.035gL一精氨酸(Arg),0.023g L.缬氨酸(Va1),0.041gL 一色氨酸(Trp),0.026g L.异亮氨酸(Ik),0.018gL 一丙氨酸(Ala),0.033g L.苯丙氨酸(Phe),0.024gL 一苏氨酸(Thr),0.030 gL 一蛋氨酸(Met),0.029gL 一谷氨酸(Glu),0.023g 脯氨酸(Pro),0.035gL一瓜氨酸(Cit),0.015gL 甘氨酸(Gly),0.022gL一半光氨酸(Cys),0.037gL 赖氨酸盐酸盐(Lys)和0.036gL.酪氨酸(Tyr),分别以蒸馏水定容至100mL,浓度各相当于2.0t~mol/ mL.使用时,准确吸取适量上述氨基酸标准溶液,分 别用适量蒸馏水稀释成0.20mol/mL 的氨基酸溶 1.3实验方法 1.3.1 基本操作程序 参照Chinard 建议的方法并进行改良.即准确 吸取2.0mLL 一鸟氨酸单盐酸盐标准液于10mL 具塞比色管中,加入混酸溶液,在恒温水浴锅中反应显色后取出,迅速冷却至室温,再加入适量冰乙酸使 得比色液体积达到10mL 后测定OD 值.空白对照 组则分别以蒸馏水和混酸溶液替代,进行同样的分析 比较. 1.3.2 吸收波长的选择 以0.20t~mol/mLL 一鸟氨酸单盐酸盐标准液为 分析样液,分别测定了400~640nm之间的OD 1.3.3显色温度的影响 一鸟氨酸标准样液同1.3.2,分别在60,70,80,90和100下反应,在1.3.2 所确定的 最适吸收波长处测定0D 1.3.4反应时问的影响 在确定的最适吸收波长和反应温度的基础上,分 别考察10min,20min,30min,40min,50min 和60 min 时的0D 1.3.5HPO4与冰乙酸体积配比对反应的影响 由于6mol/LH3PO4 与冰乙酸配比不同,可能会 引起不同的pH 值,从而影响反应体系的灵敏度.因此,选择6mol/LH3PO4 与冰乙酸体积比为1:5,1: 进行混合,配成酸性溶液,考察不同配比下,茚三酮反应液对0.20t~mol/mLL 一鸟氨酸 测定的灵敏度的影响. 1.3.6 线性范围的选择 分别吸取0.5mL,1.0mL,2.0mL,3.0mL,4.0 mL,5.0mL,6.0mL,7.0mL,8.0mL,9.0mL,10.0 mL,11.0mL,l2mL 的2.0t~mol/mLL 一鸟氨酸单盐 酸盐标准液,分别用适量蒸馏水稀释并定容至100 mL,即0.01t~mol/mL,0.02t~mol/mL,0.04t~mol/ mL,0.06t~mol/mL,0.08t~mol/mL,0.10t~mol/mL, 0.12t~mol/mL,0.14~mol/mL,0.16t~mol/mL,0.18 t~mol/mL,0.20t~mol/mL,0.22lumol/mL 和0.24 t~mol/mL 一鸟氨酸单盐酸盐标准梯度溶液,依据实验操作程序进行显色反应,在上述所确定的吸收波 长下分别测定其OD 一鸟氨酸单盐酸盐浓度为横坐标(X),OD 值为纵坐标(Y)绘制曲线,从图上 OD 值的变化趋势分析确定茚三酮反应液所能检测 1.3.7显色液的稳定性测试 由上述单因素所确定的最适反应条件,使用 0.20t~mol/mLL 一鸟氨酸作为待测样液,分别测定了 反应后显色物质OD 值的经时变化状况. 1.3.8 其他氨基酸的干扰 分别考察了0.20t~mol/mLL 一天冬氨酸,L 一亮 氨酸,L 一精氨酸,L 一缬氨酸,L 一色氨酸,L 一丙氨酸,L一苯丙氨酸,L 一苏氨酸,L 一谷氨酸,L一脯氨酸,L 一瓜氨酸,L 一甘氨酸, 一半光氨酸,L一赖氨酸盐酸盐和L 一酪氨酸对 氨酸反应显色的灵敏性影响程度.1.3.9 标准曲线的绘制 根据所确定的线性范围,以0.01"mol/mL,0.02 t~mol/mL,0.04t~mol/mL,0.06t~mol/mL,0.08 t~mol/mL,0.10t~mol/mL,0.12t~mol/mL,0.14 t~mol/mL,0.16t~mol/mL,0.18t~mol/mL,0.20 t~mol/mL 的L.鸟氨酸单盐酸盐标准梯度溶液,分别 测定其OD 值,同时绘制标准曲线图,并且进行线性 回归分析,求出其线性回归方程. 结果与分析2.1 最适吸收波长的确定 0.20mol/mLL 一鸟氨酸单盐酸盐标准样液与 茚三酮反应液进行显色反应后,在波长400~640nm 之问扫描测定OD 值,以确定反应产物的最适吸收波 长,结果如图1 所示. 41M)43046(14【)Il521lSl581l61I1fI 波f.Jnm 图1L 一鸟氨酸反应产物在波长下的吸收值 可知,在400~640nm的波长范围内,反应形成的有色物质在510nm处有一个最高吸收峰, OD 值最大,这与Chinard【14]报道的515nm有所不 同,推测是由于本方法进行了适当改进之后所导致 的.在多次的重复验证试验中也都证明最大的吸收 峰稳定在510nm之处,所以,以下的实验中除非有 具体说明,OD 值均是在此波长下进行测定的. 2005 216期)199´..............................´.´————————´ 2.2反应温度的选择 反应温度对该反应体系有很大的影响,这可以从 氨酸反应所形成的红色物质的颜色深浅程度具有明显的差别. 0",70 踟901lm 可以看出,在60下基本上不发生显色反应,从70开始,随着显色温度的升高,OD 随之增大,到90为止几乎为直线上升,也基本上符合了温度每增加10,反应速度和反应产物增加1 倍的一级化学反应方程模式的增长规律.90之后, 反应明显缓慢,在100时,0D 值最大.虽然实验 采用过其他方法在 l10和120左右的温度下进行 反应,测试得出的OD 值均略有增加,但是,实际操作 繁琐,准确性,重复性差.所以,本方法确定的最适反 应温度为常压下100. 2.3 反应时间的选择 显色反应时间的长短,主要会影响茚三酮与L 鸟氨酸之间的反应是否充分,但另一方面,也可能会影响反应所形成产物的显色性能及其稳定性.图3 显示了从5~60min 的反应时间范围内,OD 化情况.01I1.2lll4Ol6´ 反应时间对OD510值的影响 可以看到,随着显色反应时间的延长,OD 随之增大,特别是在0~20min,OD值变化非常明 显,呈线性快速增长趋势;在20~60mitt,OD 长的势头逐步趋于平缓.虽然结果没有表示出来,超100J2—005Vo—l,31No—.12(To—tal216) 过60rain,OD 值几乎不再增加.因此,60min 应显色时间已经比较充分.而整个比色测定时间基本上可以控制在2h,甚至是1.5h 的短时间之内,达 到了快速定量分析的目的. 2.4H3P04 与冰乙酸不同体积配比对反应的影响 显示了6real/LHPO4与冰乙酸之间的不 同体积配比对OD 值的影响结果. ll70.6 I1.5 【1_4 l1.3 -Il;)f:,I1iI}.551 ll1lI【Iii1:1:32:33:33:23:lV(HPO1):V(HAc) 图46mol/LH3PO,与冰乙酸的体积 配比对OD510 值的影响 可以看出,随着6mol/LH3PO4与冰乙酸 配比的减小,OD 值却随之增大,可能是由于配比不 同,引起了反应显色体系pH 值的变化,使得茚三酮 一鸟氨酸反应形成的红色物质的颜色加深,从而引起OD 值的增大.其中,在本反应体系下,所设定 的混酸体积比为1:5 和1:3,之间的差别缩小,从而 使得各自的OD 值分别提高为0.792 和0.788,这与 2:03(OD=0.775)【14]比较时,OD 值分别增大了 0.015 和0.013,说明该反应体系的灵敏度有所提高, 有利于被检L 鸟氨酸浓度的进一步降低.因此.采用6mol/LH3P04 与冰乙酸体积比为1:03 进行混 合,用于配制茚三酮酸性显色液. 2.5 线性范围的确定 实验进一步探讨了25mg/mL 茚三酮酸性溶液 对于L 鸟氨酸的可检出浓度水平,并分析其相互间 的线性范围,结果如图5 所示. 图5L 鸟氨酸浓度与OD5l0n 值的关系 8765432l0 8765432l0 可知,当L一鸟氨酸单盐酸盐浓度低于 0.20~mol/mL,均可以采用该反应体系以茚三酮进 行显色检测出来,而且具有较好的一一线性对应趋 一鸟氨酸单盐酸盐浓度大于0.20mol/mL时,其OD 值则没有明显的对应变化.从而可知,线 性范围在0~0.20mol/mL,这说明该分析检测方法 的灵敏性很高,对L 鸟氨酸的可检出度可以达到 0.01t~mol/mL 的微量程度. 2.6 显色液颜色稳定性的确定 如图6 所示,反应显色后的反应产物的OD 反应后30rain之内是相当稳定的.超过30rain,随 着显色液(反应产物)放置时间的延长,显色液的OD 值有所减小,这可能是由于在放置过程中,有色物质 产生分解或者转化为其他产物.因此,显色液适合的 0lO20304O5tll- Il t/min 显色液放置过程中OD510值的变化 2.7 其他氨基酸的干扰 显示了酸性茚三酮与L.鸟氨酸以及其他多种氨基酸分别进行检测分析试验的显色比较结果. 各种氨基酸的显色比较可以看出,在该反应测试体系下,酸性茚三酮除 了能与脯氨酸(0.421),赖氨酸(0.081),瓜氨酸 (0.058)和色氨酸(0.011)反应,形成一定程度的色泽 外,与其他所列示的氨基酸均不会生成有色物质,这 点与Chinard[J的实验结果相似.但是,这一反应 显色方法经过改进之后,脯氨酸的影响已经被大幅度 降低,而其他3 种氨基酸的影响也变得非常微小.所以,其干扰因素主要为脯氨酸,但对于L 一鸟氨酸发 酵液来说,脯氨酸的含量一般来说比较低,因此,可以 忽略脯氨酸的干扰.L 一鸟氨酸发酵液中有可能会少 量存在的谷氨酸,精氨酸以及瓜氨酸所产生的对于鸟 氨酸定量分析的影响作用,也可以通过该检测体系得 到排除. 2.8 标准曲线的绘制 显示了L一鸟氨酸单盐酸盐浓度与OD510 值之间具有线性关系. 采用过原点进行回归分析,得到以下一元线性回 归方程: Y=3.7659X(1) 其中,Y—OD50 值;X—L.鸟氨酸单盐酸盐浓度 (t~mol/mL). 其线性相关系数为R=0.9973,并经过方差统 计分析后,结果表明L 一鸟氨酸单盐酸盐在 0.20tlmol/mL 的范围内,与OD5l0 值之间具有极显 着的线性相关性(r>r).由该方程还可以推算 出计算发酵液中L 一鸟氨酸浓度的公式为: X=2.01AN(2) 其中,X 一发酵液等样品中的L 一鸟氨酸浓度(g/L); A—OD5l0 一样品溶液的稀释倍数.I10.f150.1l02 ￡一鸟氨酸含量/,umo1.mL. 图7L 一鸟氨酸定量测定的标准曲线 小结文中就L 一鸟氨酸定量分析检测方法进行了探 讨,确定了一种既简单,有效,又具有较高灵敏度的分 析方法,为定量测定L.鸟氨酸发酵液等溶液介质中 L.鸟氨酸的实际含量提供了一种便利的评估方法. 至QQ 876543210砌ANl】FERMENTAT10NIND【JS,rRIES 今后,该方法仍需在蛋白质,多肽以及以及合成寡肽 等物质是否会产生干扰等方面,通过相关试验做进一 步分析,以补充整个体系的完整性和系统性. 参考文献