实时荧光定量 PCR (qPCR) 的要素
什么是实时荧光定量PCR (RT-PCR,qPCR)?
实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测的能力(即实时)。因此,数据可在PCR扩增过程中,而非PCR结束之后,进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中,反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征,而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高,则会越快观察到荧光的显著增加。相反,终点法检测(也称 “读板检测”)测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。
关于序列检测试剂
我们开发了两种通过使用序列检测系统(SDS)仪器进行PCR产物检测的试剂:
TaqMan方法
TaqMan方法通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。
使用TaqMan方法的检测类型
TaqMan方法可用于以下检测类型:
定量,包括:
用于RNA定量的一步法RT-PCR用于RNA定量的两步法RT-PCRDNA/cDNA定量等位基因检测通过IPC进行的正负检测
SYBR Green I染料试剂
SYBR Green I染料法采用了Applied Biosystems SYBR Green I染料,一种可以在PCR循环过程中随着PCR产物的累计而对其进行检测的高度特异性双链DNA结合染料。TaqMan和SYBR Green I染料法最为重要的区别在于SYBR Green I染料试剂可以检测所有双链DNA,包括非特异性的反应产物。因此这样经过特别优化的反应体系,对于获取准确的结果而言是非常必要的。
使用SYBR Green I染料法的检测类型
SYBR Green I染料法可用于以下检测类型:
用于RNA定量的一步法RT-PCR用于RNA定量的两步法RT-PCRDNA/cDNA定量
TaqMan试剂
最初,使用嵌入式染料进行实时荧光PCR (qPCR) 产物定量。但这些染料存在重大缺点,即会同时检测特异性以及非特异性PCR产物的扩增量。
TaqMan方法的开发
通过引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的荧光标记探针,实时定量PCR系统