问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应。 原因1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前,有酒 精残留,酒精抑制 后续酶解反应 DNA中残留有金属离 子1. 2. 对策重新纯化DNA,去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质(具体方法见前) 重新沉淀DNA,让酒精 充分挥发 增加70%乙醇洗涤的 次数(2-3次) 2. 3. 3. DNA提取常见问题 ?问题二:DNA降解。 原因1. 2. 1. 2. 3. 4. 5. 材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 酶的活性 提取过程操作过于剧 烈,DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融 3. 对策4. 5. 6. 尽量取新鲜材料,低温保存材 料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后,应在 解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的 材料的DNA时,可增加裂解液 中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量 轻柔 所有试剂用无菌水配制,耗材 经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中, 避免反复冻融 DNA提取常见问题 ?问题三:DNA提取量少。 原因1. 2. 3. 4. 1. 2. 实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 对策3. 4. 5. 6. 尽量选用新鲜(幼嫩)的材 料 动植物要匀浆研磨充分;G+ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 高温裂解时,时间适当延长 (对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量) 低温沉淀,延长沉淀时间 加辅助物,促进沉淀 洗涤时,最好用枪头将洗涤 液吸出,勿倾倒 Thank you!