核酸提取及常见问题分析 (一)——DNA 主讲人:张蕾 09年8月12日 内容 第一部分:前言 第二部分:DNA提取方法简介 第三部分:DNA提取常见问题、 原因分析及其对策 前言 核酸是遗传信息的载体,是最重要的生物 信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因 此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、 最基本的操作 。 第二部分:DNA提取方法简介 DNA提取的几种方法 ? ? ? ? 基因组DNA的提取 CTAB法SDS法 其它 ? ? 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 基因组DNA- CTAB法??CTAB法原理(植物DNA提取经典方法) CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基 溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合 物。 该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂 抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。 ? 注:CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热。 基因组DNA- CTAB法?CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 TrisEDTA HCl (pH8.0)NaCl (pH8.0) CTAB β-巯基乙 醇0.1% (V/V)使 用前加入 终浓度 100 mM 20 mM 2%(W/ 1.4M V) ? Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏; ? EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性; ? NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中; ? CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离; ? β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除 基因组DNA- CTAB法?CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl EDTA NaC (pH8.0) (pH8.0)l 100 mM 20 mM CTAB PVP40 β-巯基乙 醇2%(V/V) 使用前加 入 终浓 度1.4 M 3%(W/ V) 5%(W/ V) ? PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶 的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能 和多糖结合,有效去除多糖。 基因组DNA- CTAB法?CTAB法流程图 裂解液 酒精沉淀 植物材料 液氮研磨 抽提 离心洗涤 DNA溶液 细胞裂解 上层溶液 干燥溶解 基因组DNA-SDS法?SDS法原理 ? ? ? SDS 是一种阴离子去垢剂,在高温( 55 ~ 65℃)条件下能裂解细 胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸; 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖 杂质沉淀,离心后除去沉淀; 上清液中的 DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 ? SDS法DNA提取缓冲液 组份 Tris-HCl EDTA (pH8.0) (pH 8.0 )NaCl SDS 终浓 度10 mM 20 mM 0.4M 2% 基因组DNA-SDS法?SDS法流程图 (以动物组织为例) 动物组织 抽提 离心洗涤 组织匀浆 上层溶液 干燥溶解 细胞裂解 酒精沉淀 DNA溶液 基因组DNA-其它方法 ? ? 根据细胞裂解方式的不同有: 物理方式:玻璃珠法、超声波法、研磨法、 冻融法 化学方式:异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式:酶法 ? ? 基因组DNA-其它方法 ? ? 根据核酸分离纯化方式的不同有: 吸附材料结合法: 硅质材料 高盐低pH值结合核酸,低盐高pH值洗脱。 快捷高效。 ? ? ? 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸,高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。 磁珠 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物,从而达到分离目的。 基因组DNA-其它方法 ? 浓盐法: 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离 ? 有机溶剂抽提法: 有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用 ? 密度梯度离心法: 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 细胞器DNA-差速离心法 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器,自身可编码蛋 白,它们的比重和大小一定,因而在同一离心场内的沉降速度 也一定,根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各 种组分分级分离出来。 ? 差速离心法原理 ? 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 ? 将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中,以一定的转速进 行离心,比重大的物质优先沉降,比重小的却处于上层, 从而得以分离。 第三部分:DNA提取常见问题、 第二部分: 原因分析及其对策 DNA提取的基本步骤 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜-内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸,并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 材料准备 基因组DNA的提取 ? 最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复冻融 ? 提取血液基因组DNA时,要选择有核细胞(白细胞) ? 组培细胞培养时间不能过长,否则会造成DNA降解 ? 含病毒的液体材料DNA含量较少,提取前先富集 细胞裂解 基因组DNA的提取 ? 材料应适量,过多会影响裂解,导致DNA量少,纯度低 ? 针对不同材料,选择适当的裂解预处理方式: ? 植物材料--液氮研磨 ? 动物组织--匀浆或液氮研磨 ? 组培细胞--蛋白酶K ? 细菌--溶菌酶破壁 ? 酵母--破壁酶或玻璃珠 ? 高温温浴时,定时轻柔振荡 核酸分离、纯化 基因组DNA的提取 ? 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应提供相应的缓冲体 系?采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔 ? 离心分离两相时,应保证一定的转速和时间 ? 针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方 法 核酸分离、纯化 ? 蛋白质的去除: ? 酚/氯仿抽提 ? 使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等) ? 高盐洗涤 ? 蛋白酶处理 核酸分离、纯化 ? 多糖的去除: ? 高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl,高盐可溶解多糖。 ? 用多糖水解酶将多糖降解。 ? 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可 以与多糖的羟基作用,从而去除多糖 。 ? 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500μ L DNA液中加入 200μ l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ,冰浴20min。 核酸分离、纯化 ? 多酚的去除: ? 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β -巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 ? 加入易与酚类结合的试剂:如PVP、PEG(聚乙二醇),它 们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合 ? 盐离子的去除: ? 70%的乙醇洗涤 核酸沉淀、溶解 基因组DNA的提取 ? 当沉淀时间有限时,用预冷的乙醇或异丙醇沉淀,沉淀会更充 分?沉淀时加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),有利于充分沉淀 ? 沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等 ? 晾干DNA,让乙醇充分挥发(不要过分干燥) ? 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 ? ? TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase pH值为8.0,可防止DNA发生酸解 DNA提取常见问题 ?