气浴恒温振荡器,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;恒温水浴锅,上海科銮仪器有限公司;分光光度计,上海精密科学仪器有限公司。
1.2 方法1.2.1 产蛋白酶菌株的筛选
初筛:无菌水稀释土壤样品,取10−3土壤稀释液200 μL均匀涂布于筛选培养基,28 ℃培养48 h,挑取单菌落纯化培养。挑取纯化后的单菌落点接种于筛选培养基,28 ℃培养48 h,观察菌落透明圈,挑选有较大透明圈的菌株为初筛菌株。
复筛:初筛菌株接种于发酵培养基中,28 ℃、200 r/min振荡培养24 h,取发酵上清液12 000 r/min离心10 min制备粗酶液,测定蛋白酶活力,选取酶活力最高的菌株为目标菌株。
1.2.2 蛋白酶活力的测定
采用Folin-酚法测定蛋白酶活力。200 μL粗酶液与200 μL底物(2%酪蛋白溶液)混匀,40 ℃反应10 min后立即加入600 μL的0.4 mol/L三氯乙酸终止反应,静置10 min后12 000 r/min离心10 min。取100 μL离心后的上清液,依次加入500 μL的0.4 mol/L碳酸钠溶液、100 μL福林酚试剂,混匀,40 ℃保温显色20 min后,于波长650 nm处测定吸光度值。以先加入三氯乙酸终止反应的一组为对照组。
酶活定义:在pH 7.0、40 ℃条件下,每分钟水解2%酪蛋白溶液产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位(U/mL)。
1.2.3 菌株鉴定
菌株形态鉴定:菌株于纯化培养基28 ℃恒温培养48 h,观察菌落形态。挑取单菌落涂片,革兰氏染色镜检观察形态。参照《常见细菌系统鉴定手册》[16]进行菌株形态观察和菌体特征描述。
分子生物学鉴定:用Triton X-100基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA。参照文献[17]的方法,选择通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCMTG GCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTA CGACTT-3′)扩增菌株的16S rRNA基因序列,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后,送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。