微阵列是新出现的分子生物学技术,是本世纪重要的科学进展, 它能够高效率、大规模 地获取相关生物信息, 是现代生物技术、微电子技 术、机械制造技术、计算机技术的结合。其对科学 的深远影响将远胜过DNA 测序和PCR 们更大规模地获取生物信息,使人类基因组计划早 日实现。 技术原理及操作规程111 微阵列制作类型 大规模cDNA微阵列 Drmanac 等人将31104 个cDNA 克隆或基因组DNA 固定在尼龙膜、 玻片等固相载体上以研究基因的表达 。应用PCR 技术每天可以进行数千克隆的扩增, 同时利 用高速机械手将cDNA 自动而精确地点在尼龙膜上 或其它载体上 芯片外寡核苷酸合成 ershov等人用传统 方法合成 DNA 再用机器人将其以20 000230 000/cm2 的密度点布于覆有凝胶的玻片上。凝 胶可以增强寡核苷酸与玻片的结合和促进杂交, 原位合成寡核苷酸制造芯片 是借鉴半导体照相平板印刷技术, 左右的玻片上原位合成寡核苷酸探针序列 。合成时将传统的以亚磷酰胺为基础的DNA 合成技术改进为光不稳定的 保护基团固定于载体上。第一步是透过掩模的紫外 光照射处去除保护基团, 以生成自由羟基; 第二步 是5’端保护的亚磷酰胺加上活性位点。随着未反 应羟基的加帽、氧化和冲洗, 应用第二个掩模在必 要的位点合成下一个核苷酸, 重复进行直至所需要 的核苷酸全部合成为止。应用组合掩模策略, 可以 通过尽量少的步骤来合成指数递增的探针, 从而制 作出更高容量、更大密度的微阵列。对于含有n 核苷酸的寡核苷酸,可通过 个合成步骤产生4n 个可能结构。 应用喷墨打印机技术制造芯片 冷泉港的Castellino 借鉴喷墨打印机的技术原理,并加以 改进后用以制作芯片, 已经取得了巨大成功, 并有 较大的应用潜力。 112 探针标记与杂交 靶DNA 标记上同位素 (32p 33p)或荧光染 联系人。(收稿日期: 1999211217) 1970年生, 博士, 讲师; 研究方向: 肿瘤癌变机理、分子肿瘤。 863 计划资助项目 再与芯片进行严格条件下的杂交。探针通常是从mRNA 反转录的cDNA 片段的混合体 113 信号检测与结果分析 同位素标记的探针可通过放射自显影来检测; 荧光标记的探针片段结合到相应的位置后, 可通过 氩离子激光共聚焦显微镜检测。由于荧光标记有实 时、分辨率好、无放射性污染等优点, 现已基本取 代了同位素标记。将结果输入计算机, 并通过相应 的软件来分析。例如比较正常组织与肿瘤组织的表 达差异等[ 12 应用211 基因表达分析 微阵列技术已经被许多研究小组应用于与基因 表达有关的工作中, 如对细菌、动植物、酵母和人 类的研究。在最初的研究中, 为了检测微阵列方法 的特异性, Schena 等人采用 48 对不同种属来源的 cDNA 片段与标记荧光的探针杂交, 其中包括丽丝 (lissamine)的阳性对照, 鼠糖皮质激素受体、 酵母 TRP4 cDNA 等来检测拟南芥 halima)的不同基因表达。在鼠和酵母的对照中, 未发现有基因表达, 说明微阵列的特异性是非常高 DeSaizieu 等人用6400 个寡核苷酸微阵列来检 测肺炎球菌的100 个基因, 其敏感性要比Nort hern 杂交好一些, 同时重复的错误率低于25 %或更小。 结果揭示感受态基因 ci nA cytA的诱导 水平分别增加了30 同时测量了肺炎球菌在指数生长期和静止期的基因表达差异。在 静止期, 个与多糖荚膜合成、长链脂肪酸合成、细胞分裂相关的酶的基因表达水平极低, 与预期结 果相似。因此应用单个微阵列而不需纯化 mRNA 就可检测具有协同作用的基因组合, 克服了细菌 mRNA RNA中含量低, 纯化困难的问题。 DeRisi 等人 应用微阵列来研究实验性肿瘤抑制机制。人类黑色素瘤的致瘤性可以被导入的正 常人的6 号染色体抑制, 号染色体和细胞的衰老有关。他应用含有1000 多个与之有关的cDNA 隆的微阵列系统去寻找基因表达的差异。发现在被检测到的 900 多种基因中, 致瘤性下降时, 117%的基因表达下调, %基因表达上调。此项技术还被延伸应用于研究炎症性疾病如风 湿性关节炎 rheumatoidart hritis RA)和炎症性 (inflammatorybowel diseases IBD)的基因表 达特性上 RA组织或 IBD 粘膜制备的探针 被标记上荧光, 并和含有与疾病进展有关的目的 cDNA 克隆的微阵列膜杂交, 观察已知在炎症性疾 病中表达的基因, 如肿瘤坏死因子、白细胞介素、 集落细胞刺激因子的表达情况。一些以前并未发现 与炎症性疾病有关的基因, 如人类金属基质弹性蛋 HME)和黑色素瘤生长刺激因子等均有表 达。这些新发现的表达基因可能成为治疗的靶点。 又用外周血cDNA 文库的1146 个克隆的微阵列膜 进行杂交, 揭示了这两种疾病的基因表达差异。金 属蛋白酶的组织抑制因子、铁蛋白轻链、锰超氧化 物歧化酶在 RA 组织中显著增高, 表明cDNA 芯片 能够准确快速提供疾病基因表达情况的信息。 212 功能分析 检测到基因表达差异之后, 下一步是寻找这些 差异的生物学功能。目前研究未知基因编码蛋白的 生物学功能是利用含有 6000 个基因的啤酒酵母, 通过基因破坏造成酵母的突变链来实现的。突变的 合适程度是在一系列有选择的生长条件监测下完成 如暴露于紫外光下,这种做法不仅耗时较长而 且劳动强度大。 最近 Davis 等人 发明了一种新的方法。主要是应用插入一个独特序列或标记的突变酵母链。 分子标记在特殊的的生长条件下从生存链中扩增, 并与高密度微阵列进行杂交。这样不仅可以确定这 同时还可以精确比较每条缺失链的适应性。Brown 等人还研究了调控基因表达的蛋白质 转录因子。他们计划监测其在基因内部区域的结 合部位。通过将转录因子与DNA 交互连锁, 然后 免疫沉淀结合有转录因子的蛋白质复合物, DNA从蛋白质上分离下来, 并用作探针去检测基 因内部的变化 213 基因作图 微阵列技术的应用补充了基因表达研究的方 加强了对疾病易感性和疾病本质的研究。遗传学家在基因制图中常用的一种方法是将基因组的一 个区段或片段, 通过有共同祖先的后代 IBD)来鉴定。同一种疾病在不同个 体之中均表现为同样症状的区段, 可能隐藏着高度 易感基因, 进而可以此作为侯选位点进行定位克 隆。IBD 片段的大小依赖于共同祖先与个体之间代 数的多少, 同时也决定与遗传多样性。而且, 我们 刘连新等:微阵列(Microarray)技术原理及应用 应该考虑到这种多样性可能很大。Chueng 应用微阵列技术结合基因组错配扫描 genomicmis2 match scanning GMS)法对先天性高胰岛素血症 患者的基因进行定位。GMS 不需要同时进行基因 多态性的扫描, 也不需要应用大肠杆菌错配修复蛋 白来移出两个基因组的错配, 这样就使得 IBD 段更加丰富。Chueng对无亲缘关系的Ashkenazi 太人先天性高胰岛素血症11 号染色体上磺酰脲受 SURI)单基因突变进行定位。她将 GMS 物直接与含有从11号染色体分离的96 个片段的微 阵列膜进行杂交, 发现 SURI 基因区就是这些成对 个体的 IBD。这个实验结果证实了先前已知的先天 性高胰岛素血症单基因突变的位点。这种方法无论 是在速度上还是在准确性上都远胜于传统方法, 将会改变基因制图的方法。214 基因分型 (genot yping) 对于等位基因在不同个体之间存在的突变的深 入研究将使环境与疾病易感性之间的关系更为明 朗。这一点已经被许多专家们认识到, 他们正试图 通过微阵列技术来观察遗传多态性, 并最终建立起 一个针对不同环境危险因子的范围。Brown 等人应 用被未知污染物污染的外周血 细胞与数千个接受不同污染物的 细胞表达图象进行比较,可以 鉴定出检测物曾受过汞的污染 。这样将会使对机体有害环境因素的影响更为清楚, 使两者的关系 更为明确。微阵列技术用于基因分型在临床研究中 的潜能已经被许多研究所证实, 尤其在血液系统疾 病中 应用微阵列技术检测了乳腺癌易感基因 RCA1的突变。他们用含有 96 000个寡核苷酸探针的微阵列来检测 RCA1第11 外显子的3145kb 内所有可能的杂合性突变, 包括碱基替换, 及小的缺失、插入等。在15 者中14例精确诊断了已知突变; 在20 个对照样本 中无假阳性, 并且检测出了 SingleNucleotide Polymorphisms 22个外显子可发生改变, 但其仅有 5592 个碱基, 因此有可能制作出一种微阵列来检 测其可能的所有突变。许多开发这种技术的公司如 Affymet rix 公司迅速向市场推出两种芯片。一个是 研究 HIV 蛋白酶和反转录酶的芯片; 另一个是研 究p53 反密码子的芯片。p53 芯片包括400 多个与 肿瘤有关的突变, 并已用于检测个体罹患肿瘤的风 这将带来伦理学上的困惑,将会明显影响被检 测出有问题的个体, 因为目前尚没有有效的早期治 疗干预措施 。许多制药公司投巨资研究微阵列技术。DNA 微阵列技术可以用来同时检测成千上 万个基因的表达类型。发现基因功能的线索将有助 于选择治疗药物的干预靶点。它们也可用于监测药 物治疗所致的基因改变。同时可以通过应用微阵列 技术来改进药物, 发现新药物 问题与不足微阵列技术包括三个主要方面: 能够得到大量 的cDNA EST序列; 能够制作出高密度的微阵 列系统; 荧光标记技术的改进和计算机系统的优 。目前极度缺乏公开可得的、序列经过证实的cDNA 克隆和 EST。这些限制了微阵列技术的 发展与进步, 因为这项技术的威力依赖于点布在载 体上的cDNA 数量。在人类细胞中已知表达的10 000个基因中, 只有 15 cDNA克隆可以得到, 其每一个均代表一个人类基因, 于鼠的cDNA克隆比人类更少。另一个限制是许多 cDNA文库中的全长必须在对所表达的基因进行分 析之后才能获取。例如, 要获得乳蛋白的基因必须 在乳腺的cDNA 文库中才能够得到。 这项技术在目前的花费是很昂贵的, 仅有少数 大实验室或医药公司才能够承受得起。一个最简单 的配置应包括微阵列制作系统 (arrayer) 信号收集系统 (scanner) 计算机和软件(操作系统和生 物信息学相关软件) 此项大约需要125 金。另外,一个实验室可能要用很多芯片, 尽管芯 片可以重复使用, 但理论上每次杂交后总是要使敏 感性下降。 此外, 还存在诸如: 由于光本身的物理特征, 如反射、衍射和散射引起的寡核苷酸合成错误; 于碱基组成不同而形成的二级或三级结构;在尼龙 膜或玻片上点布的cDNA 量的一致性问题; 荧光标 记技术的不完善; 信号捕获系统的敏感性等许多原 因均可造成假阴性结果。如何确定同一的标准; 何判断结果和分析,解释结果都是需要我们不断探 索的工作。 前景与展望微阵列技术的迅速发展已经引起了各方面的广 泛关注。许多实 验室、专业公司和制药公司都在 大力开发与此相关的技术。