RNA提取及反转录标准操作流程 一、仪器试剂 Trizol 试剂 三氯甲烷( 4预冷) 异丙醇( 4预冷) 75%乙醇( DEPC 处理水配置)(4预冷) DEPC 处理水 /RNase free water(反转录试剂盒) 1.5mL 冷冻离心机Nano Drop 2000 反转录试剂盒( Takara RR036A EP管时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用。取完 EP 管后,袋子及时封好。 Trizol含剧毒,若溅到皮肤上,请立即用清水冲洗;若溅到眼内,立即大量清水冲洗,并 送医就诊。 三、样品处理 组织样品将组织在液 中磨成粉末后,再以 50-100mg 组织加入 1ml Trizol 溶液,混匀,室温放置 5min 使其充分裂解。 1:样品总体积不能超过所用Trizol 体积的 10%。 2:组织样品收取后应立即处理或液氮冷冻并-80 摄氏度保藏。胰腺组织样品因其各种酶 含量极其丰富,应尤为注意,研磨过程中注意保持样品低温状态。 贴壁细胞样品弃去细胞培养皿中培养基,根据下表加入适量 Trizol 溶液,吹打混匀,并吸至 1.5ml EP管中,室温静置 5min,使细胞充分裂解。 培养皿 Trizol 体积 3.5cm 1mL6cm 3mL10cm 10mL注:加入 Trizol 溶液后, 可将培养皿放入 -80冰箱, 20min 后取出化开, 通过冻融增加细胞 裂解效果。 悬浮细胞500g5min 离心收集细胞, 弃去培养基, 细胞加入1mLTrizol 溶液,吹打混匀, 室温静置 5min,使细胞充分裂解。 注:某些酵母或细菌细胞须超声裂解。 4.注意事项 1)样品裂解液可室温存放数小时, -80可至少存放一月。 2)若样品含大量脂肪、蛋白、多糖及包外物质,如脂肪、肌肉或块茎植物等样品,可增加 一步离心操作,具体步骤如下: 12000g、4离心10min,胞外基质、多糖、高分子量 DNA 将会形成颗粒沉淀于底部, RNA 包含于上清中,而高脂样品会在上清液上方形成一层脂肪层。 移除脂肪层,将澄清的上清液移至新的无酶EP RNA提取 1mLTrizol溶液加入 200μL 三氯甲烷,立即盖上盖子,剧烈振荡 15s,使水相和有机相 充分接触,室温静置 3-5min 2.4下,12000g 离心 15min,液体分为三层, RNA 位于上层水相,约占总体积的 50%,移20-200μL的枪吸取上清,吸上清时, EP 管倾斜大约 45 加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀 (颠倒 6-8 次,不应用振荡器混匀) ,室温静置 10min。 12,000g离心 10min ,可见羽毛状白色 RNA 沉淀,小心吸出上清。 1mL75% 乙醇洗涤两次( 7500g离心 5min,加入乙醇后只需轻轻颠倒 EP 管即可,不 可使用振荡器震荡或枪头吸打沉淀) 75%乙醇中4保存一周, -80保存一年。 室温干燥室温或真空干燥5-10min ,注意不要干燥过分,否则会降低 RNA 的溶解度。视 沉淀量加入适量 DEPC 水(至少 15μL)溶解沉淀,使用 Nano Drop 测定 RNA 浓度。 首次提取RNA 时须跑胶验证 RNA 质量,核酸胶配置为: 1%琼脂糖 /1TAE 缓冲液,取5μLRNA 溶液混上 0.5μL Loading Buffer ,上样跑胶,电泳大概 15min,凝胶成像仪上观察 RNA 条带质量,RNA 条带一般为三条, 理想的 RNA 条带为:明亮的 28S 条带与 18S 条带, 并且 28S 条带亮度大约为 18S 条带两倍,微弱或没有 5S 条带。 五、反转录 PrimeScript TM 反转录试剂盒( Takara RR036A)将总 RNA 反转录成 cDNA 200μL无酶PCR 管中按反应体系配置 RT 反应体系如下:试剂 使用量 终浓度 PrimeScriptRT Master Mix (Perfect Real Time) RNA500ng DEPC 处理水 补足至 10μL 轻柔混匀后进行反转录应,条件如下: 37 15min (反转录反应) 85 5sec (反转录酶失活反应) 得到的RT 反应液使用 Nano Drop 测定 cDNA 浓度, -20保存。 QPCR 标准操作流程 一、QPCR 原理 所谓实时荧光定量 PCR 技术,是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实 时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行绝对定量分析或通过内参对比进 行相对定量分析的方法。本实验室常采用相对定量进行分析。 SYBRGreen PCR反应体系中, 加入过量 SYBR 荧光染料, SYBR 荧光染料特异性结合 DNA 出荧光信号,而游离SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。 Ct值(Cycle threshold ,循环阈值)的含义为:每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所 经历的循环数。 1)荧光阈值( threshold)的设定 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号, 荧光阈值的缺省 (默认)设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 10SDcycle 3-15 2)Ct值与起始模板的关系 每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,公式如下: Ct=-1/lg(1+e) lgX0+lgN/lg(1+e) 为扩增反应的循环次数,X0 为初始模板量, 为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。 二、仪器试剂 SYBR Green PCR Master Mix 引物 ddH2O cDNA 模板 EP 迷你离心机7200RPM(TOMOS TMC15287 离心机(湘仪L530) QPCR 仪(伯乐 Q200) 三、QPCR 操作步骤 QPCR每孔体系如下: 根据样品数量计算所需体系 预混液体积(预混液中不包含 cDNA 模板),并按组分比例配置, 振荡器振荡或用枪吹打均匀, 迷你离心机快速离心去除气泡。 cDNA 模板根据使用量用 ddH 2O 稀释到合适的浓度。 根据实验设计,小心地将体系与cDNA 模板加入每孔之内。 例如:两组样品:对照组、处理组,每组样品三个样,检测目的基因表达量,绿色部分表示 检测内参基因表达量,蓝色部分表示检测目的基因表达量, 96 孔板设置如下: 1011 1)样品全都稀释至50 ng/ μL,模板量采用 100ng,即每孔须加样 1:内参基因18 个孔,我们配置 20 个孔体系,即200μLSYBR Green PCR Master Mix 20μL内参基因上游引物,20μL内参基因下游引物, ddH2O120μL。 2:目的基因18 个孔,我们配置 20 个孔体系,即200μL SYBR Green PCR Master Mix, 20μL目的基因上游引物, 20μL目的基因下游引物, ddH2O120μL。 注:配置预混液时须适当多配, EP 管及枪头易附着预混液引起损失,例如 18 个孔可配置 20-22 试剂使用量 cDNA 模板 10pg-100ng SYBR Green PCR Master Mix 10μL 上游引物 ddH2O补足至 20μL 3)根据 96 孔板设置,分别将预混液加入孔内,同一预混液不需换枪头,注意不要将枪打到 第二档,避免产生气泡。 4)根据 96 孔板设置,分别将样品加入孔内,每一孔都必须换枪头,避免交叉污染。 封上封口膜,用硬卡片左右上下来回刮几下,使封口膜与 96 孔板贴紧,避免交叉污染,离 心机 1500g2min 离心。 QPCR仪进行反应分析,反应程序如下 Step 9530sec Step secStep3 60 30sec 设置 Step2-3 39 个循环 Step4 添加溶解曲线 注:该反应程序仅是一般性建议,如有需要请根据具体情况优化。 数据导出,进行定量分析。相对定量分析举例如下:第一步计算 Ct=基因 Ct 值-内参 Ct 第二步计算Ct=处理组 Ct-对照组 Ct 第三步计算 Ct最后结果对照是 1,处理小于 1,说明该基因表达下调。 注:相对定量计算繁琐复杂, 初学者需在师兄师姐指导下进行处理数据, 熟练后方可独自处 理数据。 四、注意事项 Mix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后存放在 个平行孔。