固定化酶的制备及应用 徐玉尚 08 生工(2) 20080804243 摘要: 酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内, 酶仍能进行其特有的催化反应、 并可回收及重复利用的一类技术。 本文主要从传统固定化酶技术以及新型固定化酶技术两大方面介绍了固定化酶的制备方法。 另外, 又对固定化酶在医药、 食品、 环保、生物传感器、 能源五大方面的应用作了综述。 本文旨在进一步研究固定化酶的制备方法以及探究固定化酶在多个领域的应用。 关键词: 固定化酶; 制备; 载体; 应用 酶是重要的生物催化剂, 具有专一性强、 催化效率高、 无污染、 反应条件温和等特点,在制药、 食品、 环保、 酿造、 能源等领域都得到了广泛的应用。 但在实际应用中, 酶也存在许多不足, 如大多数的酶在高温、 强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下, 都容易变性失活, 不够稳定; 与底物和产物混在一起, 反应结束后, 即使酶仍有很高的活力, 也难于回收利用, 这种一次性使用酶的方式, 不仅使生产成本提高, 而且难于连续化生产; 并且分离纯化困难, 也会导致生产成本的提高等。 固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。 酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内 ,仍能进行其特有的催化反应、 并可回收及重复利用的一类技术。 与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了 游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、 分离回收容易、 可多次重复使用、 操作连续可控、 工艺简便等一系列优点。 现今, 固定化酶的制备方法已由传统走向新型, 并在多个领域有重要应用[1]。 1固定化酶的传统制备方法 1.1吸附法 吸附法是利用物理吸附法, 将酶固定在纤维素、 琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、 离子交换树脂等载体上的固定方式。 显著特点是: 工艺简便及条件温和, 包括无机、 有机高分子材料,吸附过程可同时达到纯化和固定化; 酶失活后可重新活化, 载体也可再生。 但要求载体的比表面积要求较大, 有活泼的表面[2]。 1.2包埋法 包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中, 而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。 这个方法比较简便, 酶分子仅仅是被包埋起来, 生物活性被破坏的程度低, 但此法对大分子底物不适用。 (1)网格型 将酶或包埋在凝胶细微网格中, 制成一定形状的固定化酶, 称为网格型包埋法。 也称为凝胶包埋法。 (2)微囊型 把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内, 制成固定化酶。 由于形成的酶小球直径一般 只有几微米至几百微米, 所以也称为微囊化法。 1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法, 叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫共价键结合法。共价键结合法结合力牢固,使用过程中不易发生酶的脱落, 稳定性能好。 该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂, 反应条件也比较强烈, 所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。 1.4交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联, 使酶分子和多功能试剂之间形成共价键, 得到三向的交联网架结构, 除了酶分子之间发生交联外, 还存在着一定的分子内交联。多功能试剂制备固定化酶方法可分为: (1) 单独与酶作用; ( 2) 酶吸附在载体表面上再经受交联; ( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功能团的载体, 再连接酶。 交联剂的种类很多,最常用的是戊二醛, 其他的还有异氰酸衍生物、 双偶氮二联苯胺、 N, N-乙烯马来酰亚胺等。交联法的优点是酶与载体结合牢固, 稳定性较高; 缺点是有的方法固定化操作较复杂, 进行化学修饰时易造成酶失活[3]。 各类固定化方法的特点比较: 比较项目 吸附法 结合法 交联法 包埋法 物理化学方法分类 物理吸附 化学共价键结合 物理离子键结合 化学键连接 物理包埋 制备难易 易 难 易 较难 较难 固定化程度 弱 强 中等 强 强 活力回收率 较高 低 高 中等 高 载体再生 可能 不可能 可能 不可能 不可能 费用 低 高 低 中等 低 底物专不可变 不变 可不 一性 变 变 变 适用性 酶源多 较广 广泛 较广 小分子底物、 药用酶 2固定化酶的新型制备方法 2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离活性位点的特定稀有基团(如巯基)进行反应, 使该基团与载体上另一基团共价交联来同定酶蛋白, 使其活性中心朝向溶液方向, 以达到控制其空间取向的目的。 Collioud等化学合成一个异双功能试剂(N-[m一[3一(trifluoromethyl)diazirin-3-yl]phenyl]一4一maleimidobutyr amide), 他们利用这种双功能试剂成功地实现了氨基酸、 合成肽和抗体Fab片段的定向固定。 Stein等通过衍生全氟叠氮基苯疏水交联共价固定一种脂链细胞蛋白, 取得了一致的空间取向。 固定后的蛋白质分子结合牢固、 稳定性佳, 不能被离子或非离子去污剂清除。 2.2氨基酸置换法 利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸分子, 通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。 Huang等通过定点突变在枯草蛋白酶(subtil2isin)分子表面远离活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)残基。 经蛋白质空间折叠后暴露出Cys, 然后利用Cys残基上的巯基固定枯草蛋白酶分子, 取得了较好的固定效果, 固定效率和固定后催化活性均有很大提高。 2.3抗体耦联法 大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分子中很多可供偶联用的官能团可以通过赖氨酸的ε-氨基或末端氨基、 天冬氨酸的β-氨基、 谷氨酸的γ-氨基或末端羧基进行一般性的偶联。 Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠来定向固定抗体酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段, 抗体酶Fab片段保持了很好的催化活性。 抗体分子Fc区的糖链部分氧化可产生醛基, 醛基与载体上的氨基通过缩合反应可实现定向固定。 醛基若与载体上的酰肼通过腙键结合实现抗体分子的定向固定, 与随机固定相比, 固定后抗体稳定性提高的同时免疫吸附活性也提高了3倍。 2.4生物素--亲和素亲合法 生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微(<0. 0001%)的中性小分子辅酶。 亲和素是一个含有四个相同亚基的四聚体, 每个亚基均含一个生物素结合位点(解离常数10~5mol/ L) 。生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素有高专一性的、 极强的亲和力。 这种特性使其成为免疫分析、 受体研究、 免疫组织化学、 基因工程和蛋白质分离等领域中独特有力的工具。 Min等将生物素羧化载体蛋白、 片段分别融合在荧光素酶和氧化还原酶的N末端, 然后将这两个融合蛋白定向固定在亲和素包被的琼脂颗粒上。 荧光活性提高了8倍, 固定化酶的稳定性和固定效率均大大提高。 2.5疏水定向固定法 细胞粘着分子(cell adhesion molecules, CAMs)是介导细胞-细胞、 细胞-底物粘着、 细胞发育和细胞信号发生的分子。细胞粘着分子和其它细胞表面分子通常通过疏水作用固定在脂质膜上, 磷脂锚定是常选择的方式。 接触位点A糖蛋白是调节发育的细胞粘着分子, 产生于多细胞发生早期, 通过形成高亲和、 EDTA稳定的接触位点介导细胞粘着。 接触位点A糖蛋白可通过神经酰胺疏水同定在细胞表面。 疏水定向固定可保持蛋白质分子结构、 生理活性及天然构象。 这种通过疏水作用的固定, 固定的效率高, 固定为非共价, 而且固定过程可逆,用去污剂可终止或消除同定应。 Stein等用庚基胺修饰羧甲基葡聚糖载体表面的羧基来疏水固定接触位点A糖蛋白分子, 成功地控制了固定位点的空间取向。 用mAb7l特异结合来检测csA的活性状态, mAb71结合良好, 而mAb353则不能结合[4]。 2.6微波/超声辅助固定化 微波是一种电磁波, 波长为0.1~100 cm。 微波加热的主要原理是介质材料的极性分子在微波高频电场的作用下反复快速取向转动而摩擦生热, 是从物质内部开始, 瞬时达到需要的温度。 微波加热具有许多传统加热不具备的优点, 包括: 加热迅速、 均匀, 不需要热传导过程, 内外同时加热, 加热时间短; 加热质量高, 营养破坏少; 节能高效; 易于控制功能等 超声波是指振动频率大于20 kHz以上的一种纵波, 在介质中传播时, 使介质发生物理的和化学的变化, 从而产生一系列超声效应, 包括热效应、 机械效应、 空化效应和化学效应。研究认为, 超声波对液体化学反应速度和产率的影响主要是超声波在液体介质中的空化作用, 超声可使液体介质中形成微泡, 其破裂伴随能量的释放, 可以提高许多化学反应的速度。到目前为止, 超声波技术对物质提取, 高分子降解, 酶解反应等都有很好的促进作用。 其中超声波酶解反应具有高效、 廉价、 无污染, 可提高酶促反应速度和有效成分的产率[5]。 3固定化酶的应用 3.1 医药领域 固定化脲酶: 脲酶是专一性催化尿素水解的酶, 应用于尿素生产控制、 产品检验, 也广泛用于临床医学、 医学检验等, 脲酶的固定化在血液透析中有着极佳的应用前景。 固定化磷酸酯酶: 磷酸酯酶的作用是催化水解低密度脂蛋白上的磷脂的酶, 加速体内低密度脂蛋白的代谢。 人体中的低密度脂蛋白是主要的血浆胆固醇载体, 由于其在体内代谢缓慢, 易形成高血浆胆固醇, 以至引起心血管疾病, 因此磷酸酯酶的固定化可以应用于心血管疾病的治疗。 固定化葡聚糖酶: 葡聚糖酶常用于水解在血液替代品的制备过程中产生的右旋糖酐。 3.2 食品行业 固定化酶应用于食品检测: 固定化酶技术的发展使生物传感器也得到相当大的发展, 它不仅使食品成分的高选择性、 快速、 低成本分析测定成为可能, 而且生物传感器技术的持续发展将很快实现食品生产的在线质量控制, 降低食品生产成本, 并可以保证安全可靠及高质量的食品。 3.3 环境保护 在环境监测方面, 固定化酶也可以用于测定有毒物质含量以进行环境监测。 杨雪梅等选用硅胶、 活性炭、 大孔树脂, 在一定条件下用物理吸附法固定蛋白酶, 3 种载体固定的蛋白酶对含高浓度蛋白质的淀粉黄浆废水进行水解实验, 发现大孔树脂对蛋白酶的效果良好, 并对含高浓度蛋白质的废水处理效果最好。 在废水处理中, 固定化酶也受到了越来越多科学家的关注。 生活污水和工业废水中有害成分主要是氯酚, 将辣根过氧化物酶大量吸附在磁石上, 可以保证其 100%的活力, 且净化效果是粗酶的 20 多倍。 3.4 生物传感器方面的应用 在医学领域, 生物传感器因快速、 灵敏、 专一、 响应快等优点发挥着越来越重要的作用。目前, 在检测多种细菌、 病毒及其毒素等多个方面生物传感器已有较广泛应用。 比如高精度血糖分析仪是采用固定化酶的生物传感分析仪, 其分析精度可以达到 0. 5%~ 2%, 比家用保健类生物传感器几乎高一个数量级, 比目前医用生化分析仪的精度也高 2%~ 3%。 这在血糖分析领域是非常重要的[6]。 酶电极现已用于测定各种糖类、 抗生素、 氨基酸、 有机酸、 脂肪、 醇类、 胺类以及尿素、尿酸等。 3.5 能源利用 近年来不少学者为了解决能源紧缺问题致力于利用固定化的脂肪酶催化合成生物柴油。高阳等研究了利用多孔渗水物质为载体固定脂肪酶, 使其可在低水环境中合成生物柴油。 氢气作为一种清洁能源已引起人们的关注。有学者利用聚丙烯酰胺凝胶包埋丁酸梭状芽孢杆菌 IFO3847 菌株, 可以利用葡萄糖生产氢气, 并且稳定性好, 无需隔氧 4 结语 本文主要综述了固定化酶的制备方法极其在多个领域的应用。 目前, 固定化酶技术已成为酶工程研究的重点和热点之一。 研究探索新的酶固定化技术、 提高固定化酶活性收率、 延长半衰期、 降低成本将成为固定化酶研究领域的主要研究内容。 随着固定化酶研究的深入,必将在微生物发酵、 酶丁程、 精细化工、 环境保护、 制药、 生物传感器等领域, 尤其是在大规模生物转化、 手性化合物的合成以及其他传统酶和蛋白质等方面得到更广泛的应用。[7] 参考文献: [1]李彦锋,李军荣,伏莲娣. 固定化酶的制备及应用[J]. 高分子通报,2007 :13 – 23. [2]马秀玲,陈盛,黄丽梅,等.磁性固定化酶处理含酚废水的研究[J].广州化学,2009,28(1):17. [3]拜永孝,李彦锋, 马应霞, 等. 固定化酶技术及其应用[J]. 化学通报, 2009, (68): 1-6. [4] 胡和兵,王牧野,吴勇民,等.酶的固定化技术及应用[J].中国酿造,2007(7):4-7. [5]工家东, 姜子明, 曹彬, 毕韬韬, 侯红萍. 固定化糖化酶的研究[J]. 中国调味品,2008, (3): 14. 16. [6]李彦锋, 马应霞. 化学通报, 2010, 68: w027. [7]TangZX, Qian JQ, ShiLE. Characterizations of immobilized neutral proteinase on chitosan nanopartcles[J]. Process Biochemistry, 2009, 41: 1193-1197.