【原理】 补体花环形成试验是红细胞 抗红细胞抗体 补体花环试验的简称 B淋巴细胞表面有特异性补体受体 绵羊红细胞与其抗体结合 称致敏羊红细胞 给予亚溶血量的活化补体便结合形成补体花环。 【操作方法】 从外周血中分离出淋巴细胞 取与活化补体结合的羊红细胞悬液与淋巴细胞悬液 置37 温箱内30分钟 离心5分钟 弃上清液 取沉淀轻轻摇散后涂片、干燥、固定、染色、镜检。外周血补体花环形成率正常参考值为10 15 八、红细胞免疫功能检查有关红细胞免疫功能的检查较多 本处仅介绍最基本的方法 红细胞C3b受体花环及免疫复合物花环试验。本试验作为酵母菌红细胞花环试验之一 用于检测红细胞的免疫粘附功能。 【原理】 红细胞C3b受体花环即红细胞膜上CR1 第一补体受体 可与C3b致敏酵母多糖粘附形成花环 花环率的高低与C3b的活性及数量有关 红细胞免疫复合物花环由红细胞膜粘附的免疫复合物中C3b分子与酵母多糖粘附所形成 花环形成率的高低与血清中局部免疫复合物含量有关。 【操作方法】 预备试验 待测RBC 肝素抗凝 指血、静脉血均可经生理盐水洗涤离心3次000转分钟 5分钟按细胞计数方法配成1 25 107 ml使用液备用 补体致敏酵母多糖冻干试剂按说明书要求溶解 用生理盐水洗涤离心2次 水平离心 按红细胞计数法计数配成1 108 ml使用液备用。 正式试验 取2支试管 每管加待测红细胞使用液0 075ml 第一管再加补体致敏酵母多糖使用液0 075ml 第二管再加酵母多糖使用液0 075ml 摇匀后加生理盐水0 15ml 混匀后再加0 75 戊二醛0 05ml 轻轻摇匀 3量水平涂片吹干 加甲醇固定 加少许瑞氏液缓冲液 pH6 用盐水或自来水少许冲洗加盐水后高倍显微镜计数。 【结果与临床意义】 结果高倍显微镜下计数花环形成率 以1个红细胞结合上2个或2个以上酵母菌为1朵花环 计数200个红细胞 算出百分率 第一管为RBC C3b受体花环率 第二管为RBC IC花环率。计数要准 173 临床意义作为红细胞免疫粘附功能的指标。2项都低下判断为原发性红细胞免疫功能低下 为红细胞膜C3b受体受到破坏和影响所致 如果RBC C3b花环率低而RBC IC花环率升高 为继发性红细胞免疫功能低下 是由于局部免疫复合物增加 红细胞粘附过多引起 如两项都升高 为红细胞免疫功能亢进与紊乱。该两项试验可作为临床上免疫性疾病的辅助诊断、疗效观察、预后判断等指标使用 亦广泛应用于器官移植、疾病发病机制、中医中药免疫学研究等领域。 研究表明SLE活动期患者RBC C3b受体花环率降低、RBC IC花环率升高 呈继发性红细胞免疫功能低下特征 银屑病患者RBC C3b受体花环率和RBC IC花环率均明显升高 表明银屑病患者红细胞免疫功能亢进和紊乱。 九、斑贴试验 【原理】 斑贴试验 patch test 是测定机体迟发型接触性变态反应的一种诊断方法 属IV型变态反应。受试物 接触物 本身具有抗原性 或为低分子半抗原与表皮细胞膜蛋白结合成的完全抗原 被表皮内的朗格汉斯细胞捕获或携带到局部淋巴结 传递给T细胞 在朗格汉斯细胞及角质形成细胞新产生的表皮胸腺细胞活化因子的共同作用下 Th产生IL 进一步激发了T细胞活化、增殖及产生T效应细胞使机体致敏 再次接触时 机体则在接触部位释放各种淋巴因子激发炎症反应而出现炎性细胞浸润、血管扩张、通透性增加 朗格汉斯氏细胞受损害后亦可释放溶酶体 使之与半抗原结合的表皮细胞受到破坏而发生红斑、丘疹、水疱、渗出、糜烂等急性皮炎。 【操作方法】 根据受试物性质选择与之相适应的赋形剂配制适当浓度浸液、溶液、软膏或直接用接触物作试剂 并将其置于4层1cm 1cm大小纱布上 将该纱布置于前臂屈侧或肩胛区脊柱两侧紧贴皮肤 其上用一稍大的透明玻璃纸覆盖 四周固定。每次可作数种受试物的检测 48小时后取下受试物并查看结果 如果在48小时出现瘙痒、红肿等 可随时取下试物并用清水清洗。也可采用铝制小室贴膜进行试验 图14 。目前国内尚有含多种变应原的诊断试剂盒出售较为简便。国外有变态反应诊断仪可检测上百种变应原。 图14 斑贴试验示铝制小室贴膜 【结果与临床意义】 结果判定受试部位无任何反应 受试部位皮肤出现轻微瘙痒发红 受试部位皮肤出现单纯红斑、瘙痒 174 受试部位皮肤出现显著红斑、丘疹及水疱。 阳性反应表示患者对受试物过敏也可能是原发性刺激或其他因素所致。后者一旦试验物除去 反应可很快消失 阳性反应者则在除去试物后24 48小时 反应增加而不是减弱。阴性反应表示患者对试验物不敏感或因操作技术不当而出现假阴性反应。使用中应注意 禁用原发性刺激物作斑试 配制试验物与原试验物一致时 浓度必须由低到高 以免引起强烈反应而导致皮肤坏死 急性皮炎未消退前不宜作该项试验 服用激素及其他抗组胺类药物期间作该项试验可出现假阴性反应 多个试验物或不同浓度试验物斑试时 每两个试验物之间至少相隔4cm并有阴性对照 赋形剂 十、光斑贴试验【原理】 在皮肤斑贴试验的基础上 再给予一定剂量的紫外线照射 如斑试物中有光敏物质 经紫外线照射后在敏感机体的皮肤受试部位可出现迟发型变态反应。 【操作方法】 用可疑光敏物质于背部同时作三处闭合斑贴试验 配制斑试物 浓度 10 及具体操作步骤与斑贴试验相同。24小时后去掉两斑贴后进行照射 斑贴部位的四周用黑布遮盖 第一处用亚红斑量 UVC 照射 第二处用加有窗玻璃滤过的同一灯源 UVA 照射 剂量为10个最小红斑量 MED 第三处去掉斑试后 立即用敷料覆盖作对照。第一、二处光照时 另外分别照射无可疑物的一个区作为对照 亦可同时测定多种光敏物质 每一光敏物质作三处。无论作测定一种还是多种光敏物质 均于24小时、48小时及72小时分别观察结果。 【结果与临床意义】 若三处均为阴性 说明该可疑物质既无光敏作用 又无接触过敏作用 第一、二处与无可疑物质单纯光照处 对照 反应一致 证明该物质无光敏作用 若三处均为阳性反应 且表现相似 程度相同 说明被试物仅有接触过敏 无光敏作用 若三处均为阳性反应 但照光部位大于非照光部位 且大于单纯照光无可疑物部位 则该试物为光敏物质 若第一处出现红斑、灼痛等 并于72 96小时迅速消退者 为光毒反应 若第二处引起湿疹样反应改变并伴瘙痒 且持续1 则为光变态反应连续观察72小时无反应者 不能肯定该物质就一定不是光敏物质 因个别潜在光敏物质可能推迟到96小时后才出现反应。 十一、划破试验 【原理】 划破试验 scratch test 是用注射针头或其他锐器划破表皮 使变应原通过划破处进入真皮 与组织中的肥大细胞及血中嗜碱性粒细胞表面的相应的IgE结合 使靶细胞脱颗粒 释放组胺、慢反应物质、激肽、缓激肽、血小板活化因子等多种炎性介质 在30分钟内产生明显红晕或风团 该试验属 型变态反应 用于测定所试变应原。 【操作方法】 先将受试物按一定浓度溶于生理盐水中 用75 乙醇消毒前臂内侧 并用消毒注射针头在皮肤上划1cm长的划痕 以划破皮肤、不出血为度 然后滴1滴试液于划痕上 并用针柄轻压一 175 30分钟后观察结果并于对侧相应部位作对照试验。 【结果与临床意义】 结果判定与对照试验相同 即无反应 出现水肿性红斑、风团 直径 5cm出现风团有红晕 直径为0 5cm 出现风团并有红晕直径0 5cm 出现风团并有红晕及伪足直径 临床意义该试验用于检测速发型变态反应的过敏原 阳性反应表现患者对该试验物过敏 需注意假阴性反应。抗组胺类药物可减弱试验反应 需停药48小时后再进行测试。试验前应准备0 肾上腺素等药物以抢救可能出现的过敏性休克高度过敏者 如过敏性休克 禁止进行本试验检查。 十二、皮内试验 【原理】 皮内试验 intradermal test 同划破试验。 【操作方法】 先配备适当浓度皮试液 如青霉素皮试液为500U ml 然后用0 1ml稀释液于前臂内侧皮内注射 15 30分钟内观察结果。 【结果与临床意义】 结果判定无反应 红斑直径 1cm 伴有轻度风团 红斑直径2cm 伴风团或伪足 迟发反应阳性 临床意义同划破试验 需注意 高度敏感并有过严重反应者 不宜作这项试验 因其危险性比划破试验更大 试验后30分钟内严密观察 注意过敏性休克的发生 并于试验前做好各项抢救过敏性休克的措施 若结果阴性而仍有可疑者 可增加试物浓度后重复试验。 十三、被动转移试验 【原理】 被动转移试验又称P K试验 Pransnitz Kustner test 是一种被动转移的局部过敏反应 用以检测特应性人体的IgE或变应原。因患者血清中的IgE 也可能是IgG4 抗体可转移到正常人局部皮肤 借此可间接测定机体的致敏原。 【操作方法】 在无菌条件下取患者外周血1ml 2ml离心以分离血清 并经细菌培养证实无菌后注射该血清0 1ml于正常人 非变应者 上臀或前臂外侧皮内 注入部位用龙胆紫或墨水标记。待致敏 176 24 48小时后将可疑一定浓度的变应原注入局部已致敏的皮内 并在附近正常区域注射同样剂量抗原作对照以及盐水对照各一处。亦可口服一定量的可疑变应原后观察局部反应。 【结果与临床意义】 阳性者于皮内注射或口服30分钟或数小时后在局部已致敏区域出现红斑及风团 阴性者皮内注射或口服后在已致敏局部无反应。阳性反应提示患者对所试变应原过敏 但阴性反应不能排除。试验期间忌食蛋、鱼、坚果、香蕉、玉米、芥荚等可疑变应原性食物 传染性肝炎、可疑HIV携带者等传染病患者禁作此试验。 第三节 性病检查 一、梅毒螺旋体的检查方法 暗野显微镜检查法【原理】 一期梅毒硬下疳和二期梅毒扁平湿疣等皮损以及梅毒性淋巴结炎的组织中 均有一定数量的梅毒螺旋体。用皮损渗出液及淋巴结穿刺液涂片 于暗视野显镜下可找到梅毒螺旋体。 【操作方法】 检查者戴手套 用无菌生理盐水棉试纸拭去皮损表面污物 有痂者可用消毒钝刀轻轻除去痂皮 并轻刮皮损表面 轻施压力至出现渗液而无出血为度。用盖玻片蘸取少量渗出液 覆盖于备有一滴生理盐水的载玻片上 并盖上盖玻片 置于暗视野显微镜检查。若为淋巴结取材 先向穿刺淋巴结注入0 3ml无菌生理盐水后抽取少量淋巴液制片。 【结果与临床意义】 暗视野显微镜下 螺旋体呈纤细螺旋状 12个螺旋。见到运动活泼的螺旋体即为阳性图14 。阳性结果可以确诊梅毒特别对有皮肤粘膜损害和淋巴结病变的一期、二期梅毒的诊断具有重要价值 而且简便、快速、可靠 阴性结果不能完全除外梅毒。因为用药、取材不当等较多因素可影响检查结果 有一定局限性。 图14 螺旋体镀银染色法【原理】 螺旋体具有亲银性 硝酸银可使之染呈棕黑色。 【操作方法】 取材、涂片、空气自然干燥 忌火焰固定 罗吉固定液固定1 2分钟 无水酒精洗涤 滴媒染液2 酒精灯微加热至产生热蒸汽为止染30秒后水洗 最后滴加银染液并加热产生蒸汽 染30秒后水洗 自然干燥后置油镜下镜检。 【结果与临床意义】 螺旋体被染成棕黑色 背景为淡棕色。阳性结果结合典型的皮肤粘膜损害可确诊梅毒 但阴性结果不能完全除外梅毒。注意有时某些腐生螺旋体亦呈假阳性反应。 免疫荧光染色法【原理】 含梅毒螺旋体抗体血清 加非致病性螺旋体培养物进行吸收 再与FITC相结合 梅毒 177 螺旋体在荧光显微镜下呈绿色荧光。 【操作方法】 分直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。 直接法将受检标本均匀涂布于载玻片上 直径小于1 0cm 待自然干燥后用丙酮固定10分钟 用培养的非致病性螺旋体培养物吸收后的抗 梅毒螺旋体血清与FITC结合并用适当稀释的此血清涂于备有标本的载玻片上 37 孵育30分钟 最后彻底清洗 缓冲甘油封固 荧光显微镜检查。 间接法标本制定及固定同直接法。加经吸收的抗血清 37 孵育30分钟 彻底冲洗 缓冲甘油封固后镜检。 【结果与临床意义】 梅毒螺旋体呈绿色荧光。阳性结果可确诊为梅毒 特别是对口腔、肛周等部位的损害 此法可区分梅毒螺旋体与非致病性螺旋体 阴性结果不能完全除外梅毒 因为标本、FITC、抗血清质量以及操作技术等方面影响均可能导致假阴性结果。 二、梅毒血清学检查 性病研究实验室试验【原理】 性病研究实验室试验 venersal disease research laboratory test VDRL 的原理是人体感染梅毒螺旋体后 经过一定时间 血清中产生一定数量的抗类脂质抗原的非特异性抗体 可用免疫学方法检测 作为梅毒的诊断筛选试验。 【操作方法】 定性试验待查血清置56 水浴30分钟灭活 吸取0 5ml 加在玻片圆圈中 让血清扩散在整个圆圈 再用上述针头注射器滴加抗原 用手或机械转动器摇动玻片4分钟 转速180次 分钟。 定量试验用等量盐水在小试管内作6个稀释度 即原倍盐水、1 16、132 每个稀释度取0 05ml血清加入玻片圆圈中 按定性法测定。 【结果】 定性与定量结果判定一致。 仅见微颗粒 液体混浊 肉眼可见小块状物 液体混浊 需用显微镜放大100倍观察其形状 肉眼观察到大或中等聚合在一起的块状物。