G B/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样用甲醇一水溶液超声波振荡提取,提取液经离心、浓缩,定容、过滤,用高效液相色谱仪测定,外标法定量。4试剂与材料除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水应符合G B/T6682中一级水的规定。4.1乙腈:色谱纯。4.2甲醇。4.3乙酸。4.490%甲醇溶液:取900 m L甲醇,加入100 m L水,混匀。4.560%甲醇溶液:取600 m L甲醇,加入400 m L水,混匀。10%甲醇溶液:取100 m L甲醇,加入900 m L水,混匀。0.1%乙酸溶液:取1 m L乙酸,置于1 000 m L容量瓶中,用水定容至刻度。0.1%乙酸乙腈溶液:取1 m L乙酸,置于1 000m L容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度。4.9大豆甙( dai dzi n) :纯度不低于98%。4.64.74.84.10染料木甙( geni sti n) :纯度不低于99%。4.11大豆黄素( dai dzei n) :纯度不低于98%。4.12染料木素( geni stei n) :纯度不低于98%。4.13黄豆黄素( gl yci ti n) :纯度不低于98%。4.14黄豆黄素甙元(gl yci tei n):纯度不低于98%。4.15标准储备溶液配制:4.15.1大豆异黄酮标准储备溶液:分别准确称取适量的大豆甙、染料木甙、大豆黄素、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄素甙元标准品,分别用60%甲醇( 4.5) 配成浓度为1 m g/m L的标准储备溶液。一18℃避】 CB/T 26625--2011光保存,有效期6个月。4.15.2大豆异黄酮混合标准中间溶液:分别移取上述各组分大豆异黄酮标准储备溶液( 4.15.1)0.5 m L于同一10 m L容量瓶中,用60%甲醇( 4.5) 定容至刻度,配制成各组分浓度为50 btg/m L的大豆异黄酮混合标准中间溶液,0℃~4℃冷藏避光保存,有效期3个月。4.15.3大豆异黄酮混合标准工作溶液:分别吸取50.0 pL、100.0 pL、200.0 pL、300.0 pL、1000.0pL上述大豆异黄酮混合标准中间溶液( 4.15.2) 于10 m L容量瓶中,用10%甲醇( 4.6) 溶液配成各组分浓度0.25/Lg/m L、0.50/19/m L、1.00/tg/m L、1.50 btg/m L、5.00 pg/m L系列的大豆异黄酮混合标准工作溶液,0℃~4℃冷藏避光保存,有效期一周。4.16滤膜:0.45 p-m 。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪:配紫外检测器。5.2分析天平:感量0.01 m g、感量0.01g。5.3旋转蒸发器。5.4超声波清洗器:50 W 。5.5离心机:10 000r/rai n。5.6粉碎机。5.7组织捣碎机。5.8浓缩瓶:250 m L。5.9样品筛:孔径2.0 m m 。6试样制备与保存6.1试样制备6.1.1大豆取有代表性样品约500 g,用粉碎机( 5.6) 粉碎使其全部通过孔径2.0 m m 样品筛( 5.9) ,混匀,装入洁净容器作为试样,密封备用。6.1.2豆豉取有代表性样品约500 g,用组织捣碎机( 5.7) 捣碎,混匀,装入洁净容器作为试样,密封备用。6.2试样保存粉碎试样于4℃以下保存。试样制备过程中,应防止样品污染或组分变化。7操作步骤7.1提取称取5 g( 精确到0.01 g) 试样于250 m L具塞三角瓶中,加90m L90%甲醇溶液( 4.4) ,置于超声波清洗器( 5.4) 中60℃提取30 rai n,在离心机( 5.5) 中10000r/rai n离心10 rai n,上清液转移至250m L浓缩瓶( 5.8) 中,残渣再加入60m L 90%甲醇溶液进行提取,上清液也转入250m L浓缩瓶,在旋转蒸发器( 5.3) 60℃浓缩至约40 m L。浓缩液转入50 m L容量瓶,用10%甲醇溶液( 4.6) 冲洗浓缩瓶并定容至刻度。取1 m L提取液通过0.45 btm 滤膜( 4.16) ,供高效液相色谱仪测定。7.2色谱参考条件色谱参考条件如下:a) 色谱柱:RPCI8柱( 250 m i nx4.6 m i Tt,5 pm ) 或性能相当的色谱柱;b) 流动相:0.1%乙酸溶液( 4.7) 和0.1%乙酸乙腈溶液( 4.8) ,按表1的规定进行梯度洗脱;c) 流速:1.0 m L/m i n;2 d) 柱温:40℃;e) 波长:260 nm ;进样量:20 pL。f)表1梯度洗脱表G B/T 26625--20”时间/m i n0.1%乙酸水溶液/m L0.1%乙酸乙腈溶液/m LO901012.5703017.5604018.5Ol O O21.0010022.5901026.090107.3测定参考上述色谱条件( 7.2) 调节高效液相色谱仪,使大豆异黄酮各组分的色谱峰完全分离。分别吸取20 pL适当浓度的大豆异黄酮混合标准工作液( 4.15.3) 和样液( 7.1) 进行液相色谱测定,分别得到大豆异黄酮各组分的标准工作液峰面积( A,。) 和样液大豆异黄酮各组分峰面积( A) 。如果样液中大豆异黄酮某一组分峰面积与标准工作溶液中的该组分峰面积相差较大时,稀释样液或调整标准工作液浓度后再行测定。在上述色谱条件下,大豆异黄酮各组分的保留时间约为:大豆甙8.2 rai n、黄豆黄素8.8 m i n、染料木甙11.0 m i n、大豆黄素15.3 rai n、黄豆黄素甙元16.3 m i n、染料木素19.4 rai n。标准品的色谱图参见附录A。7.4空白试验除不加试样外,按7.1~7.3操作步骤进行测定。8结果计算与表示8.1大豆异黄酮各组分含量按式( 1) 计算试样中大豆异黄酮各组分含量( m g/kg) 。.。山一—瓦了万『-A。X e。XV式中:x,——试样中某一大豆异黄酮组分含量,单位为毫克每千克(m g/kg);A。——试样提取液中某一大豆异黄酮组分的峰面积;A。——大豆异黄酮混合标准工作液中某一组分的峰面积;e。——大豆异黄酮混合标准液中某一组分的浓度,单位为微克每毫升(pg/m L);y——试样提取液最终定容体积,单位为毫升( m L) ;m ——试样质量,单位为克(g)。洼:计算结果应扣除空白值。8.2大豆异黄酮总含量试样大豆异黄酮总含量为各组分之和,按式(2)计算:X一∑X。⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ @ B/T 26625--201 1式中:x——试样中总大豆异黄酮含量,单位为毫克每千克(m g/kg)。注:本标准6种异黄酮已包括大豆中异黄酮的绝大部分组分,可认为是大豆异黄酮总含量。8.3结果表示取两次测定结果绝对差值小于重复性限r的平均值为测定结果,单位为毫克每千克( m g/kg) ,保留三位有效数字。如果两个独立测试结果的绝对差值超过重复性限r,应弃去该测试结果。再重新完成两个独立测试。9精密度9.1重复性在重复性条件下,获得的两个独立测试结果的绝对差值不得超过重复性限r。各组分大豆异黄酮含量2.5 m g/kg~30 m g/kg范围内,其重复性限r计算方程参见附录B。9.2再现性在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过再现性限R。各组分大豆异黄酮含量2.5 m g/kg~30 m g/kg范围内,其再现性限R计算方程参见附录B。 AU0.500.400.300.20010附录A( 资料性附录)大豆异黄酮标准品液相色谱图6G B/T 26625--201125ll九一1——大豆甙;2——黄豆黄素;3——染料木甙;4——大豆黄素;5——黄豆黄素甙元6——染料木素。图A.1大豆异黄酮标准色谱图25 O O5 G B/T 26625--2011附录B( 资料性附录)精密度计算本标准的精密度是按照G B/T 6379.1和G B/T 6379.2规定的要求确定的,其重复性限r和再现性限R以95%的可信度来计算。表B.1重复性限,和再现性限皿计算方程组分名称含量范围/( m g/kg)样品重复性限r再现性限R大豆r=0.135 7m +0.400 0R=0.223 9m 一0.276 2大豆甙2.5~30豆豉r#0.127 5m +0.486 4R一0.168 5m +0.360 0大豆r=0.097 3m +0.704 7R一0.235 l m +0.308 9黄豆黄索2.5~30豆豉r=0.097 6m +0.806 6R一0.184l m +0.657 8大豆r=0.186 0m +0.256 8R一0.183 6m +0.4832染料木甙2.5~30豆豉r=0.114 7m +0.439 1R=0.136 9m +0.0391大豆r=0.124 l m +0.481 0R=0.159 8m +0.510 5大豆黄素2.5~30豆豉r=0.074 l m +0.738 9R一0.164 0m 一0.136 8大豆r=0.122 3m +0.544 8R一0.161 3m +0.676 2黄豆黄素甙元2.5~30豆豉r=0 129 0m +0.185 3R一0.071 8m +1.204 1大豆r=0.098 2m +0.664 3R=0.137 0m +0.750 2染料木素2.5~30豆豉r=0.114 7m +0.579 5R=0.088 5m +0.8544注:m 为该组分的含量,即该组分两个独立测j E结果的算术平均值。6 G B/T 26625--20 11参考文献[ 1] G B/T 6379.1测量方法与结果的准确度( 正确度与精密度) 第1部分:总则与定义[ 2] G B/T 6379.2测量方法与结果的准确度( 正确度与精密度) 第2部分:确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法