肌酸激酶同工酶—— 肌酸激酶同工酶——MB 评估 —— 上海仁济医院检验科 肌酸激酶 MB 同工酶(CK-MB)是由 M 和 B 亚基构成的杂化型二聚体,主要存在 于心肌细胞的外浆层,是心肌酶谱中最有特异性的酶,从 80 年代起公认为心肌酶学诊 断的“金标准” ,应用于急性心肌梗塞(AMI)的早期诊断[1 ,2] 1979 年 Gerhardt[3]等人首 次报道用免疫抑制原理测定 CK 同工酶,免疫抑制法以其快速、灵敏、定量且可进行自 动分析等优点适合常规检测, 随着方法与试剂不断改进与完善, 1986 年国外已有试剂盒 供应,但价格昂贵;最近国内研制成功免疫抑制法测 CK-MB 的试剂盒,本文旨在对该 试剂盒的特性作一评估。 材料和方法 一、标本来源 分正常组,AMI 组和非 AMI 组,非常人血清来自体检健康人员,计 30 例,AMI 组 53 例,系仁济医院心内科病房已确诊为 AMI 者,非 AMI 组系心内科及其它科门诊 病人,因胸痛、心率失常等初诊疑拟 AMI,后经系列观察和酶学检查证实不是 AMI 患 者,共 20 例。 血标本留取后及时分离血清检测或将检测血清置于-20 度冰箱保存至测定。 二、试剂 1. 免疫抑制法检测 CK-MB 试剂盒:上海北加生化试剂有限公司产品 (1) R1:含 CK-MB 抗体的咪唑缓冲液 (羊抗人 CK-M 多克隆抗体抑制剂>2000U/L,100mmol/L 的咪唑缓冲液成 pH6.7 内含葡萄糖 20mmol/L,醋酸镁 10mmol/L,EDTA 2mmol/L) (2) R2(A):酶干粉。 (AMP 5mmol/L,磷酸肌酸 30mmol/L,五磷酸二腺苷 10mmol/L,NADP 2mmol/L,V-乙腺半胱氨酸 20mmol/L,已糖激酶≥2500U/L,G6PDH≥ 500U/L,ADP 2mmol/L) 。 2. 宝灵曼 CK-MB 试剂盒:对照用。 三、仪器 HITACHI 7150 型自动生化分析仪 波长=340nm 四、方法 本试验在日立 7150 生化自动分析仪器上测定,参数表如下: TEST ASSAY CODE SAMPLE VOLUME R1 VOLUME R2 VOLUME WAVELENGTH CALIB METHOD STD. (1) CONC. –POSZ. STD. (2) CONC. –POSZ. STD. (3) CONC. –POSZ. STD. (4) CONC. –POSZ. STD. (5) CONC. –POSZ. STD. (6) CONC. –POSZ. SD LIMIT DUPLICATE LIMIT SENSITIVITY LIMIT SENSITIVITY LIMIT ABS. LIMIT (INC/DEC) PROZONE LIMIT EXPECTED VALUE TECH LIMIT INSTRUMENT FACTOR [ CK-MB ] [ RATE - A ]:[ 45 ]-[ 50 ] [ 5 ][ 3 ] [ 240 ][ 100 ][ NO ] [60 ][ 20 ][ NO ] [ ][ 340 ] [ LINEAR ][ 0 ][ 0 ] [ 0.0 ]-[ 1 ] [ 65 ]-[ 28 ] [ 0 ]-‘[ 0 ] [ 0 ]-‘[ 0 ] [ 0 ]-‘[ 0 ] [ 0 ]-‘[ 0 ] [ 0.1 ] [ 100 ] [ 100 ] [0] [ 9000 ][ INCREASE ] [ [ [ 0 ][ LOWER ] 0 ]-[ 100]-[ 25 ] 1000] [ 1.0 ] 结 一、线性范围 果 取一高活性 CK-MB 标本:152.0U/L 用生理盐水按 1/5、2/5、3/5、4/5、5/5 比例稀 释,测得其相应活性分别为 38.0、81.0、111.0、131.0、152.0,作图(见图 1) 。呈典型 的抛物线曲线,符合免疫比浊法反应原理。 图1 试剂盒测定 CK-MB 线性 同样操作方法,将 CK-MB 为 79.0U/L 的病人血清标本用生理盐水按 1/5、2/5、3/5、 4/5、5/5 比例稀释,测得相应活性为 18.7、32.5、48.9、65.5、79.0 以稀释倍数为 X 轴, 酶活性 Y 为轴,其线性见图 2,可见 CK-MB 活性在 80U/L 以下线性良好。 图 2 试剂盒测定 CK-MB 线性 二、精密度试验 分别取低、中、高活性的血清标本(简称低值、中值、高值) 。按本法操作,批内 重复 200 次,批间是每天测定一次共 10 天,表 1 为本试剂盒对五份血清标本所做的重 复性试验,批内: n=60,CV=1.66~13.66%,平均 6.78%。批间:n=20,CV=6.59~11.73%, 平均 9.16%,基本符合质控要求,显示该试剂盒有效较高的精密度。 表 1 精密度试验 标本 批 低值 中值 内 高值 批低值 批高值 n 20 20 20 10 10 man 13.0 61.4 168.0 15.0 108.8 min 8.0 51.7 158.0 10.4 90.1 X 10.15 55.99 163.1 12.45 98.73 SD 1.39 2.81 2.7 1.46 6.51 CV(%) 13.66 5.02 1.66 11.73 6.59 三、干扰试验 1. 甘油三酯(TG)干扰试验:采用高脂标本经测定分析物浓度后加入试验样品中。 选取两标本,一为高甘油三酯标本(TG:14.8mmol/L,CK-MB:30U/L) ,另一为 甘油三酯正常标本(TG:1.09mmol/L,CK-MB:32U/L) 。将高甘油三酯作为干扰物, 按不同比例 1/5、2/5、3/5、4/5、5/5 加入甘油三酯正常的标本中,随后测 CK-MB 活性 分别为 30、 33、 30。 31、 31、 干扰物加入前后的反应曲线图见图 3、 由于两标本 CK-MB 4。 接近,仅考虑 TG 带来的影响,根据图及测得值显示 TG 在 14.8mmol/L 以下对 CK-MB 活性无明显影响。 图 3 TG 加入前反应曲线图 图 4 TG 加入后反应曲线图 2. 胆红素(BIL)干扰试验: 选取高胆红素标本(BIL:394.72?mol/L,CK-MB:4.1U/L)作为干扰物,按不同 比例 1/4、1/3、1/2 加入胆红素正常(BIL:4.02?mol/L,CK-MB:11.0U/L)的标本中, 然后分别测胆红素,CK-MB 值(见表 2) ,干扰物加入前后的反应曲线见图 5、6。由于 两标本中 CK-MB 略有差异,随着干扰物高胆红素加入的同时,低活性的 CK-MB 亦被 带入,须计算理论值,根据测定值与理论值比较及图显示 BIL,在 209.33?mol/L 以下对 CK-MB 活性无明显影响。 表 2 胆红素对 CK-MB 的影响 干扰物加入比例 BIL CK-MB(测定值) CK-MB(理论值) 1/4 104.20 9.7 9.28 1/3 136.76 8.4 8.7 1/2 209.33 7.4 7.55 图5 BIL 加入前反应曲线图 图 6 BIL 加入后反应曲线图 3. 溶血干扰试验 将 8 例 CK-MB 活性增高的标本,先测定 CK-MB 活性,然后进行人为溶血,得到 溶血样品,再进行测定 CK-MB 活性及血红蛋白浓度,结果见表 3。进一步试验,将标 本 1、 溶血前重复测 5 次, 136.58±2.51、 4 得 27.74±2.21; 溶血后重复测 2 次, 均在 X±2SD 范围内,说明当轻度溶血(Hb<200mg/dl)时本试剂盒对 CK-MB 测定无明显影响;反 之严重溶血可致 CK-MB 活性升高。 表 3 试剂测定 CK-MB 活性溶血前后结果比较 1 溶血前 溶血后 135.1 135.8 2 201.5 202.6 100 3 27.3 27.4 100 4 27.3 26.1 200 5 65.2 64.6 200 6 69.5 70.4 200 7 181.9 189.5 300 8 201.5 214.9 500 Hb(mg/dl) 100 四、与德国宝灵曼同类试剂盒的相关性 60 份临床病人血清标本用本试剂和宝灵曼试剂进行 CK-MB 平行测定, 以宝灵曼试 剂测得结果为 X 轴,本试剂测得结果为 Y 轴,求得线性方程为 Y=0.565X-0.5999,线性 相关系数为 r=0.983(图 7) 。显出高相关性,上述结果表明二种试剂盒对 AMI 的临床意 义均满意。 图7 本试剂(Y)与宝灵曼试剂(X)的相关性 五、正常值 本试剂盒测定体检健康人员 30 名,结果 CK-MB 为 4.96±2.95U/L(X±SD),取 95% 的范围,单测 u= 1.645 得 4.96±3.37(X±1.645SD),正常上限定在<10U/L。 讨 论 肌酸激酶(CK,EC2,7,3,2,,又称肌酸磷酸激酶(CK) ) ,是 Kuby 等于 1953 年首 先从兔骨骼肌中提取的。CK 是不稳定的酶,对光、热及高 pH 敏感,故测定时必须十 分注意测定条件,[4]标本最好用血清,除肝素外采血管中不应加其它抗凝剂,因为它们 对 CK 活性有抑制作用。 由于标本在保存中活性缓缓下降 (4 度, 小时活性丢失 10%; 24 25 度,1 小时丢失 10.) ,最好采用血后能迅速进行测定。如标本需储存,由于 CK 在室 温不稳定,所有标本都因尽快与细胞分离保存在 4 度,保存时间不应超过 24 小时;若 24 小时内不测定需放在-20 度冰箱中。 本试剂应用美国进口的羊抗人 CK-M 多克隆抗体,建立并产生了免疫抑制测定 CK-MB 方法的试剂盒,采用 N-乙酰半胱氨酸(NAC)代替谷胱苷肽作为激活物质,其 稳定性和溶解性好,而且测定时不会引起蛋白沉淀;并增加 DETA 作为酶激活剂,避免 了使用还原胱甘肽作酶激活剂使 CK-MB 结果偏低的情况。其原因为还原谷胱甘肽 (GSH)中除常混有氧化谷胱甘肽(GSSG)外,本身在保存过程中会部分地被氧化, 而血清中存在的谷胱甘肽还原酶(GR)则会催化氧化谷胱甘肽生成还原谷胱甘肽,并 同 时 竞 争 性 地 消 耗 在 催 化 CK-MB 过 程 中 产 生 的 NADPH , 反 应 如 下 : GSSG+NADPH+H+ 2GSH+NADP+,致使 CK-MB 结果偏低,可造成假阴性结果, 另外,单磷酸腺苷(AMP)和二腺苷-5-磷酸(Ap5A)亦是试剂盒不可缺少的成分,血 清中腺苷酸激酶(AK)主要来自 RBC、PLT、肝和肌肉组织,可催化 ADP 产生 ATP, 参与反应,导致 CK 值假性升高,因此分离血清时要保证离去 PLT、RBC 等等。虽然 RBC 中不存在 CK,溶血不直接影响 CK 活性;但是 RBC 中含有丰富的 AK,是测定的 主要干扰物质,这种干扰可以通过向底物反应混合液中入 AK 的抑制剂而减少,最有效 的便是将 AMP 和二腺苷-5-磷酸结合起来使用。因而本试剂对轻度溶血标本(如 Hb<200mg/dl) ,CK-MB 活性无明显改变。 本试剂盒测定 CK-MB 活性显示精确性和线性良好,对轻度溶血,黄疸及脂血不受 干扰。对 AMI 血清标本和进口宝灵曼试剂盒和相关性良好(r=0.983) ,表明该试剂符合 测定要求。关于正常值,通过测定 30 名健康人平均 CK-MB 为 4.96±2.05U/L,将其正常 值为<10U/L,比宝灵曼试剂正常值(<25U/L)低。在标准品方面,由于生产物标准品 提取纯化较困难且代价高昂,目前还没有 CK-MB 的国际二级标准品以提高可比性。日 常工作中如使用的标准品标化不准或日久失活,将影响工作质量,故标准品问题有待进 一步研究。值得一提的是,日常工作中应注意试剂盒的保存期及保存条件,因生物制品 性质不十分稳定,要低温保存和运输,若过了保质期有时虽仍一定活性,但相对定量关 系发生了改变,对测定结果有影响,给质量控制带来一定困难。 采用免疫抑制原理测 CK-MB 活性,其操作简单、快速、灵敏度高而具有一定精确 性的方法,适合心肌梗塞患者的急诊检查,也能用于自动分析作批量测定。[5]