在PCR的后期,扩增曲线不再呈现指数扩增,进入线性期和平台期。
3.Ct值的重现性
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期,此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。
Ct值的范围?
1.扩增效率En
PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。由1个DNA分子转变生成2个DNA分子时的扩增效率为100%。扩增效率常用En表示。为了方便后续文章的分析,简要介绍下影响扩增效率的因素。
影响因素
解释
如何判定?
A.PCR抑制剂
1.模板RNA中可能含有抑制PCR反应的物质,如蛋白质或去污剂等。
2.反转录后的cDNA中含有高浓度的模板RNA和反转录试剂成分,也可能对后续PCR存在抑制。
1.可通过测定A260/A280和A260/A230比值或RNA电泳,判断是否存在污染。
2.反转录后cDNA是否按照一定比例进行稀释。
B.引物设计不合理
引物不能有效退火
检查引物是否存在二聚体或发夹结构、存在错配;有时需注意跨内含子设计。
C.反应程序不合适
1.引物不能有效退火。
2.DNA聚合酶活性未充分释放,
3.长期高温,DNA聚合酶活性下降。
1.退火温度高于引物Tm值。
2.预变性时间太短。
3.反应程序各阶段时间过长。
D.试剂未充分混匀或移液误差
反应体系中,PCR反应成分的局部浓度过高或不均匀,导致PCR扩增不呈指数扩增。
E.扩增子长度
扩增子长度太长,超过300bp,扩增效率低。
检查扩增子长度是否在80bp-300bp之间。
F.qPCR试剂的影响
试剂中DNA聚合酶浓度较低或Buffer中离子浓度非最优化,导致Taq酶活力未达最强。
标准曲线测定引物扩增效率。
2.Ct值的范围
Ct值的范围为15-35。