1 对象与方法1. 1 对象 样本采集对象为 2015 年 11 ~ 12 月辽宁省中医药研究院门诊及住院病例,怀疑有人乳头瘤病毒 HPV 感染的女性。1. 2 方法1. 2. 1 主要仪器与试剂:Lightcycler 480 实时荧光定量 PCR仪(上海罗氏制药有限公司),人乳头瘤病毒(23 个型)核酸分型检测试剂盒(潮州凯普生物化学有限公司)。1. 2. 2 HPV DNA 实时荧光定量 PCR 检测:采用潮州凯普生物化学有限公司提供的人乳头瘤病毒(23 个型)核酸分型检测试剂盒,进行宫颈拭子 HPV DNA 检测。试剂盒提供阴性和阳性对照品。本试剂盒基于多重荧光 PCR 技术,通过实时荧光定量 PCR 仪,进行同步核酸扩增与检测。分成 6 个反应管,通过仪器 4 种荧光检测通道,从而对 23 种人乳头瘤病毒基因型进行分型检测。及对细胞内对照 β-globin DNA 检测。细胞内对照 DNA 用于评估样本质量及 PCR 抑制因素。1. 3 样本处理(在样本处理区进行) 用拭子采集的样本加入 1mL 生理盐水,震荡洗脱细胞,液体转移至 1. 5mL 离心管。一次性使用宫颈脱落细胞采集器采集的样本取 0. 5 ~1mL(如果细胞数量少可以加大体积到 2mL)。13000r·min-1离心1min。弃上清,加入 0. 5mL 细胞保存液重悬细胞。13000r·min-1 离心 1min,尽量弃干净上清。每样本加入 5μL 细胞裂解液,充分振荡重悬细胞,煮沸 10min。13000r·min-1离心10min,保留上清备用 (上清中为释放的 DNA)。取上清2. 0μL 作为 PCR 扩增的模板,其余保存于 -20℃。· 7 7 ·Strait Pharmaceutical Journal Vol 28 No. 7 2016 1. 4 扩增试剂准备(在 PCR 前准备区进行) 从试剂盒中取出 PCR MIX,室温下避光解冻,上下颠倒混匀后,8000r·min-1 离心 10s。从试剂盒中取出 DNA 聚合酶,8000r·min -1离 10s。按照下表 1 配制扩增试剂。将配制好的扩增试剂充分混匀,8000r·min-1 离心 10s,向设定的 n 个 PCR 反应管中分别加入 18μL 配制好的扩增试剂,转移到样本处理区。表 1 扩增试剂的制备组份 PCR MIX DNA 聚合酶1 人份用量(μL) 17. 5 0. 510 人份用量(μL) 175 51. 5 加样(在样本处理区进行) 在对应的 PCR 反应管中分别加入 2μL 处理好的样本 DNA、空白对照、阳性对照,盖紧管盖,稍作离心。(反应总体积为 20μL/人份,每次反应需要设置一个阳性对照以及一个空白对照。)转移到检测区,放入相应的荧光 PCR 检测仪内,记录样本摆放顺序。1. 6 PCR 扩增(在检验区进行) 按表 2 设置 4 种荧光检测通道的报告荧光、猝灭荧光:positive Reference 选择 none。荧光 PCR 仪上按表 3 设定如下程序。表 2 荧光检测通道的设定Detector Name相应 PCR MIX 各通道检测项1 2 3 4 5 6Reporter Dye QuencherFAM 16 35 52 66 42 81 FAM NoneHEX 18 39 56 68 43 73 HEX/JOE NoneROX 31 45 58 6 44 82 ROX/Red 610 NoneCy5 33 51 59 11 53 globin Cy5 none表 3 扩增程序的设定程序 循环数 温度 恒温时间 采样模式1 1 95℃ 10min 无2 45 95℃ 15sec 无60℃ 60sec 单次采集荧光3 1 38℃ 5sec 无1. 7 质控对照 空白对照在各荧光检测通道 Ct 值均应显示为 Undet。阳性对照在对应荧光检测通道 Ct 值≤36。符合以上两个条件,此次实验视为有效。1. 8 结果判断 样本中 globin 在 Cy5 荧光检测通道 Ct 值≤40,其他荧光检测通道 Ct 值显示为 Undet,判断为阴性。样本在除 globin 之外其他荧光检测通道 40 < Ct 值 < 45,建议重做,重做结果 Ct 值 <40 者为阳性,否则为阴性。2 结果3 讨论自从 1974 年 Zur Hausen 提出人乳头状瘤病毒与宫颈癌发病有关的假设后,国内外学者就 HPV 感染与宫颈癌的关系进行了大量的研究〔7 ~11〕 ,宫颈癌与高危型 HPV 感染密切相关。1995 年国际癌症研究协会(IARC)专题讨论会认为:HPV感染是宫颈癌的主要病因。