柱层析的操作步骤和注意事项 柱层析技术 常说的过柱子应该叫柱层析分离, 也叫柱色谱。 我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相 的吸附柱。 由于柱分的经验成分太多, 所以下面我就几年来过柱的体会写些心得, 希望 能有所帮助。 柱子可以分为: 加压, 常压, 减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度, 减少产品收集的时间, 但是会减低柱子的塔板数。 所 以其他条件相同的时候, 常压柱是效率最高的, 但是时间也最长, 比如天然化合物的分 离, 一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量, 感觉能够节省一半甚至更多, 但是由于大量的空气通过 硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝聚) , 以及有些比较易分解的东西可能得 不到, 而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音, 而且时间长) 。 以前曾经大量的过 减压柱, 对它有比较深厚的感情, 但是自从尝试了 加压后, 就几乎再也没动过减压的念 头了。 加压柱是一种比较好的方法, 与常压柱类似, 只不过外加压力使淋洗剂走的快些。 压力 的提供可以是压缩空气, 双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行) 。 非凡是在轻易分解 的样品的分离中适用。 压力不可过大, 不然溶剂走的太快就会减低分离效果。 个人觉得 加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 关于柱子的尺寸, 应该是粗长的最好。 柱子长了 , 相应的塔板数就高。 柱子粗了 , 上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是 样品层比较薄) , 这样相对的减小了分离的难度。 试想假如柱子十厘米, 而样品就有二 厘米, 那么分离的难度可想而知, 恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。 而假如样品层只 有 0. 5 厘米, 那么各组分就比较轻易得到完全分离了。 当然采用粗大的柱子要牺牲比较多 的硅胶和溶剂了, 不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说, 不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费) 。 现在见到的柱子径高比一般在 1: 5~10, 书中写硅胶量是样品量的 30~40 倍, 具体的选择要具体分析。 假如所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分 rf 在 0. 2~0. 4, 杂质 相差 0. 1 以上) , 就可以少用硅胶, 用小柱子(例如 200 毫克的样品, 用 2cm× 20cm 的柱子 ) ; 假如相差不到 0. 1, 就要加大柱子, 我觉得可以增加柱子的直径, 比如用 3cm 的,也 可以减小淋洗剂的极性等等。 关于无水无氧柱, 适用于对氧, 水敏感, 易分解的产品。 可以湿柱, 也可以干柱。 不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次, 因为溶剂和硅 胶饱和时放出的热量有可能是产品分解, 究竟要分离的是敏感的东东, 小心不为过。 也 是因为分离的东西比较敏感, 所以接收瓶一定要用可密封的, 遵循 schlenk 操作。 至于是 加压、 常压、 减压, 随需而定。 因为是 schlenk 操作, 所以点板是个问题, 假如样品是显 色的, 恭喜了, 不用点板, 直接看柱子上的色带就行了 。 假如样品无色, 只好预备几十 个 schlenk 瓶, 一瓶一瓶的点, 不过几次之后就知道样品在哪, 也就可以省些了 。 像我以 前过一根无水无氧柱, 需要六个 schlenk, 现在只一个就能把所要的全收集到。 无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。 因为硅胶中有大量的羟基裸露在外, 很轻易是样品分解, 非凡是金属有机化合物和含磷化合物。 而氧化铝可以做成碱性、 中 性和酸性的, 选择余地比较大, 但是比硅胶要贵些。 听说有个方法, 就是用石英做柱子, 然后用 HF254 做固定相, 这样在柱子外面用紫外灯一 照就知道产品在哪里了, 没有验证过。 哪位做过可以提出来大家参详参详。 -- ※ 关于湿法、 干法上样。 湿法省事, 一般用淋洗剂溶解样品, 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等, 但溶剂越少越好 , 不然溶剂就成了 淋洗剂了。 很多样品在上柱前是粘乎乎的, 一般没关系。 可是有的上样后在硅胶上又会析出, 这一 般都是比较大量的样品才会出现, 是因为硅胶对样品的吸附饱和, 而样品本身又是比较 好的固体才会发生, 这就应该先重结晶, 得到大部分的产品后再柱分, 假如不能重结晶 那就不管它了, 直接过就是了 , 样品随着淋洗剂流动会溶解的。 有些样品溶解性差, 能溶解的溶剂又不能上柱(比如 DMF, DMSO 等, 会随着溶剂一起走, 显色是一个很长的脱尾) , 这时就必须用干法上柱了。 样品和硅胶的量有一种说法是1: 1, 我觉得是越少越好, 但是要保证在旋干后, 不能看到明显的固体颗粒(那说明有的样 品没有吸附在硅胶上) 。 溶剂的选择。 当然是最便宜, 最安全, 最环保的了。 所以大多选用石油醚, 乙酸乙酯。 文献中有写用 正己烷的, 太贵了 , 除非非凡需要不要用不然银子哗哗的, 流的比淋洗剂还快, 不过因 为极性很小, 有时还是非它不可。 乙醚也可以用, 但是就是轻易睡觉, 注重保持清醒别 让溶剂流干了, 那样柱子也就不爽了。 二氯甲烷也有用的, 但是要知道, 它和硅胶的吸 附是一个放热过程, 所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡, 天气冷的时候会好一些 。 甲醇, 据说能溶解部分的硅胶, 所以产品假如想过元素分析的话要留神, 应该经过后 继处理, 比如说重结晶等。 其他的溶剂用的相对较少, 要依个人的不同需要选择了。 由于某些原因, 用到的淋洗剂多是大包装的(便宜嘛) , 我们这里是用 10 升或 25 升的塑 料桶装的, 就要注重这些工业品的纯度是较低的。 经常能够从送来的大桶底部看见有色 的杂质, 其他的杂质就可想而知了 , 所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。 当然过 原料时就可以免去这一步了, 反正下面还有提纯的方法。 另外溶剂在过柱子后最好也回收使用, 一方面环保, 另一方面也能节省部分经费, 缺点 是要消耗一定的人工。 这里要注重的是, 一般在过柱同时进行的是减压旋蒸, 石油醚和 乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化, 一般会使得极性变大, 在梯度淋 洗时比较合适, 正好极性越来越大了。 在过完柱子后, 溶剂最后回收要采用常压, 因为 在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来, 常压时就会减少这种现象, 假如杂质和 你下面要过的样品有反应那就惨了。 关于操作问题。 1 装柱。 柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂, 会被淋洗剂带到产品中的, 可以采用四氟节门的。 干法和湿法装柱觉得没什么区别, 只要能把柱子装实就行。 装完的柱子应该要适度的紧 密(太密了淋洗剂走的太慢) , 一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来) 。 书中写 的都是不能见到气泡, 我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响, 一加压气泡就 全下来了 。 当然假如你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。 但是柱子更忌讳的是 开裂, 甭管竖的还是横的, 都会影响分离效果, 甚至作废! 2 加样。 用少量的溶剂溶样品加样, 加完后将下面的活塞打开, 待溶剂层下降至石英砂面时, 再 加少量的低极性溶剂, 然后俅蚩　钊　　绱肆饺　危　话闶　⑸熬突　臼前咨　牧恕? 加入淋洗剂, 一开始不要加压, 等溶样品的溶剂和样品层有一段距离(2~4cm 就够了 ) , 再加压, 这样避免了溶剂(如二氯甲烷等) 夹带样品快速下行。 3 淋洗剂的选择。 感觉上要使所需点在 rf0. 2~0. 3 左右的比较好。 不要认为在板上爬高了分的比较开,过 柱子就用那种极性, 假如 rf 在 0. 6, 即使相差 0. 2 也不轻易在柱子上分开, 因为柱子是一 个多次爬板的状态, 可以通过公式的比较: 0. 6/0. 8 一次的分离度, 肯定不如(0. 2/0. 3 ) 的三次方或四次方大。 4 样品的收集。 用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。 所以假如样品与硅胶的吸附比 较强的话, 就不轻易流出。 这样就会发生, 后面的点先出, 而前面的点后出。 这时可以 采用氧化铝作固定相。 另外, 收集的试管大小要以样品量而定, 非凡是小量样品, 假如用大试管, 可能一根就 收到了三个样品, wuwu。 假如都用小试管那工作量又太大。 5 最后的处理。 柱分后的产品, 由于使用了大量的溶剂, 其中的杂质也会累积到产品中, 所以假如想送 分析, 最好用少量的溶剂洗涤一下, 因为大部分的杂质是溶在溶剂里的, 一洗基本就没了 , 必要时进行重结晶。 另外, 再过柱的时候, 有时会出现气泡, 一是 和使用的溶剂有关, 假如是易挥发的溶剂, 如乙醚、 二氯甲烷等, 在 室温稍高的情况下, 很轻易出现这种现象, 因此, 在室温高的时候, 可以选择沸点较高, 挥发相对小的溶剂。 还有, 使用混合溶剂时, 使用 的两种溶剂的沸点应该相差不大, 如: 乙酸乙酯和石油醚(60~90) , 而 乙醚却要选择 30-60 的石油醚。 二是: 不论是用带砂板的还是塞棉花的, 在装柱之前, 都要将空气用加压的方法将空气排干, 这样就可避免柱中有 空气! 过柱子需要耐心, 不要着急. dOePfQgRhSiTjUkVl WmXnXoYpZq#r!s$t%u&v*w(x ) y-y+z0A1B2C 3D4E5F6G7H8I9J9KaLbMcNdO ePfQg RhSiTjU kUlVmWnXoYpZq#r!s$t%u&v* v(w) x -y+z0A1 B2C3D4E5F6G6H7I8J9KaLbMc NdOePfQgRhRi SjTkUlVmWnXoYpZq#r! s$s%t &u*v(w ) x-y+z 0A1B2C3D3E4F5G6H7I8J9KaL bMcNd OeOfPgQ hRiSjTkUlVmWnXoYpZp#q!r$ s%t&u *v(w) x- y+z0A0B1C2D3E4F5G6H7I8J9 KaLbL cMdNeOf PgQhRiSjTkUlVmWmXnYoZp#q !r$s% t&u*v(w ) x) y-z+A0B1C2D3E4F5G6H7I 8I9JaK bLcMdN eOfPgQhRiSjTjUkVlWmXnYoZ p#q! r$s%t&u& v*w(x) y-z+A 0 B1C2D3E4F5F6 G7H8I9JaKbLc MdNeOfPgQgRhSiTjUkVlWmXn YoZp# q!r!s$t %u&v*w (x) y-z+A0B1C2C3D4 E5F6G7H8I9Ja KbLcMdNdOePfQgRhSiTjUkVl WmXnYo YpZq#r !s$t%u&v*w(x) y-z+z0A1B2C 3D4E5F6G7H8I 9JaKaLbMcNdO ePfQgRhSiTjU kVlVmWnXoYpZ q#r!s$t%u&v* w (w) x-y+z0A1 B2C3D4E5F6G7 H7I8J9KaLbMcNdOePfQgRhSi SjTkUlVmWnXo YpZq#r! s$t%t & u*v(w) x-y+z 0A1B2C3D4E4F 5G6H7I8J9KaL bMcNdOePfPgQ hRiSjTkUlVmW nXoYpZq#r!r$ s%t&u*v(w) x- y+z0A1B 2C2D3 E4F5G6H7I8J9 K aLbMcNdNeOf PgQhRiSjTkUl VmWnXoYoZp#q !r$s%t&u*v(w ) x-y+z+A0B1C 2D3E4F5G6H7I8J9KaKbLcMdN eOfPgQ hRiSjT kUlVlWmXnYoZp#q!r$s%t&u* v(w(x1B2C3D4 E4F5G6H7I8J9KaLbMcNdOePf PgQhRiSjTkUlVmWnXoYpZq# q !r$s%t&u*v( w) x-y+z0A1B1 C2D3E4F5G6H7 I8J9KaLbMcMd NeOfPgQ hRiSj TkUlVmWnXnYo Z p#q!r$s%t&u *v(w) x- y-z+A 0B1C2D3E4F5G 6H7I8J9JaKbL cMdNeOfP gQhR iSjTkUkVlWmX n YoZp#q! r$s% t&u*v*w( x) y- z+A0B1C2D3E4 F 5G6G7H8I9Ja KbLcMdNeOfPg QhRhSiTjUkVl W mXnYoZp#q!r $s$t%u& v*w(x ) y-z+A0B1C2D 3D4E5F6G7H8I 9JaKbLcMdNeO ePfQgRhSiTjU k VlWmXnYoZpZ q#r!s$t%u&v* w(x) y-z+A0A1 B2C3D4E5F6G7 H8I9JaKbLbMc NdOePfQgRhSi TjUkVlWmWnXo YpZq#r!s$t%u &v*w(x) x-y+z 0A1B2C3D4E5F 6G7H8I8J9KaL bMcNdOePfQgR hSiTjTkUlVmW nXoYpZq #r! s$ t%u&u*v(w) x- y +z0A1 B2C3D4E5F5G6H 7I8J 9KaLbMcNdOeP fQ gQhRiSjTkU lVmWnXoY pZq# r!r$s%t&u*v( w)x-y+z0A1B2 C2D3E4F5G 6H7 I8J9KaLbMcNd NeO fPgQhRiSj TkUlVmWnX oYo Zp#q!r$s%t&u *v( w) x-y+z+A 0B1C2D3E 4F5G 6H7I8J9KaKbL cM dNeOfPgQhR iSjTkUlV lWmX nYoZp#q! r$s% t& u*v(w(x) y-z+A0B1C2D3E4F5G6H 7H8I9JaKbLcM dNeOfPgQhRiS iTjUkVlWmXnY oZp#q!r$s%t% u&v*w(x) y-z+ D3E4F5G6H7I8 J9KaLbMcMdNeOfPgQhRiSjTk UlVmWn XnYoZp #q!r$s%t&u*v(w) x-y-z+A0B 1C2D3E4F5G6H 7I8J9JaKbLcM dNeOfPgQhRiS jTkUk VlWmXnY oZp#q!r$s%t& u*v*w(x) y-z+ A0B1C2D3E4F5 G6H7H8I9JaKbLcMdNeOfPgQh RiSiTjUkVlWm XnYoZp#q! r$s%t%u&v*w(x) y -z+A0B 1C2D3E 4E5F6G7H8I9JaKbLcMdNeOfP fQgRhSiTjUkV lWmXnYoZp#q#r!s$t%u&v*w( x) y-z+A0B1B2 C3D4E5F6G7H 8 I9JaKbLcMcNd OePfQ gRhSiTj UkVlWmXnXoY p Zq#r! s$t%u&v *w(x)y-y+z0A 1B2C3D4E5F6G7H8I9J9KaLbM cNdOePfQgRhS iTjUkU lVmWnXoYpZq#r!s$t %u&v*v( w) x-y +z0A1B2C3D4E5F6G6H7I8J9K aLbMcN dOePfQ gRhRiSjTkUlVmWnXoYpZq#r! s$s%t& u*v(w0 A1B2C3D4E5F6G7H8I9JaKbLb McNdOePfQgRh SiTjUkVlWmWnXoYpZq#r!s$t %u&v*w(x) x-y +z0A1B2C3D4E5F6G7H8I8J9K aLbMgQ gRhSiT jUkVlWmXnYoZp#q!r! s$t%u& v*w(x)y-z+A0 B1C2C3D4E5F6G7H8I9JaKbLc MdNdOePfQgRh SiTjUkVlWmXnYoYpZq#r!s$t %u&v*w( x) y-z +z0A1B2C3D4E8I9JaKbLcMdN eOfPgQ hRiSiT jUkVlWmXnYoZp#q!r$s%t%u& v*w(x)y-z+A0 B1C2D3E4E5F6G7H8I9JaKbLc MdNeOfP fWnXo YpZq#r!s$t%u&v*v(w) x-y+z 0A1B2C3D4E5F 6G6H7I8J9KaL bMcNdOePfQgR hRiSjTkUlVmWnXoYpZq#r!s $s%t&u*v(w) x -y+z0A1B 2C3D 3E4F5G6KbLbM cN dOePfQgRhS iTjUkVlW mWnX oYpZq#r!s$t% u&v*w(x) x-y+ z0A1B2C3D4E5 F6G7H8I8J9Ka LbMcNdOePpZq #r! s$t%u &v*w (w) x-y+z0A1B 2C 3D4E5F6G7H 7I8J9KaL bMcN dOePfQgRhSiS jT kUlVmWnXoY pZq#r!s$t%t& u*v(w) x-y+z0 A 1B2C3D4E4F5 JaKbLcMcNdOe PfQgRhSiTjUk V lWmXnXoYpZq #r! s$t%u &v*w (x) y-y+z0A1B 2C 3D4E5F6G7H 8I9J9Ka LbSjT kUlVmWnXoYpZ p #q! r$s%t&u* v(w) x-y +z0A0 B1C2D3E4F5G6 H aLbMcNdOePf QgRhSiT jTkUl VmWnXoYpZq#r !s$t%u&u*v(w ) x-y+z0A 1B2C 3D4E5F5G6...