涂片和压片是进行植物染色体观察研究常用的制片方法。其中涂片是将新鲜的材料或者是经过固定的材料于载片上,托涂成均匀一层,经染色后盖上盖玻片镜检。压片是将处理后的材料于载片上分散后加盖片,用拇指或镊子轻轻挤压盖片,使组织分散成一片,然后镜检。用此法进行染色体观察时注意,若进行染色体数目测定要求取样个体数在5个以上,细胞总数在30个以上;若进行染色体核型分析(组型分析)则要求取样应是来源于不同个体的5个细胞。
现将操作程序简述如下:
一、常规压片法
1.取材:与细胞分裂旺盛时期取样,一般植物在上午9-12时,下午2-5时,一般取根尖、茎尖。
2.预处理(前处理):目的是防止纺锤体的形成,使细胞分裂停止在中期阶段,从而获得较多的中期分裂相,同时预处理还可以使染色体收缩变短,便于观察统计。
常用的预处理药剂有:0.05%-0.2%的秋水仙碱溶液、8-羟基喹啉0.002-0.004M、对二氯苯饱和水溶液、富民隆0.01-0.001%。预处理的时间一般为2-12小时。
3. 固定:目的是把细胞迅速杀死,是蛋白质变性沉淀,尽量保持材料结构的原有状态,以备进一步处理。
常用的固定液为卡诺固定液,即3:1的纯酒精:冰醋酸溶液。固定时间一般为1-24小时。若不立即压片,可以用70%酒精保存,但不如立即压片效果好。
4.解离:根尖、茎尖等体细胞组织,需经过某些处理,除去细胞之间的果胶层并使细胞软化,这种细胞分离和软化后的组织才便于压片。最常用的是酸水解和酶处理两种。
(1)酸水解:一般可用以下处理方法:一是将固定后的材料用蒸馏水清洗后,转入1N盐酸溶液中于60℃恒温下处理5-20分钟或更长时间。二是用5N盐酸于室温下处理20-30分钟。
(2)酶处理:可单独用1-2%的果胶酶,也有与1-5%纤维素酶混合使用。一般讲,常规的染色体压片。一般无需用这种处理方法,此法在去壁低渗法和染色体显带技术中常用。
5.染色:常可用孚尔根染色法或醋酸洋红等核染色剂进行染色。
6.压片:将材料移至载玻片上,盖上盖玻片,用解剖针或用铅笔的橡皮头在盖玻片上轻轻敲击,使细胞分散,再用拇指轻挤压盖片(不要使盖片移动),使组织成为一薄层。
7.镜检:将压片置于显微镜下观察,选择染色体分散、清晰的细胞进行统计记数,并可照相灰土,以便进行核型分析