细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期,若用对数生长期的菌种进行保藏,其存活率反而降低。一般,细菌要求24—48小时的培养物;酵母需培养3天;形成孢子的微生物则宜保存孢子;放线菌与丝状真菌则培养7-10天。　(3)制备菌悬液与分装以细菌斜面为例,用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中,制成浓菌液,每支安瓿管分装0.2ml。　(4)冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售,价值昂贵,此处介绍的是简易方法与装置,可达到同样的目的。　将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻,无低温冰箱可用冷冻剂如干冰(固体CO2)酒精液或干冰丙酮液,温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂,只需冷冻4-5分钟,即可使悬液结冰。　(5)真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态,需准备冷冻槽,槽内放碎冰块与食盐,混合均匀,可冷至-15℃。装置仪器,安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。　抽气一般若在30分钟内能达到93.3Pa(0.7mmHg)真空度时,则干燥物不致熔化,以后再继续抽气,几小时内,肉眼可观察到被干燥物已趋干燥,一般抽到真空度26.7Pa(0.2mmHg),保持压力6-8小时即可。　(6)封口抽真空干燥后,取出安瓿管,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管继续抽气,约10分钟即可达到26.7Pa(0.2mmHg)。于真空状态下,以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后,保存于冰箱或室温暗处。　此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一,对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用,即使对一些很难保存的致病菌,如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存,一般可保存数年至十余年,但设备和操作都比较复杂。　滤纸保藏法　(1)将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条,装入0.6×8cm的安瓿管中,每管1-2张,塞以棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃灭菌30分钟。　(2)将需要保存的菌种,在适宜的斜面培养基上培养,使充分生长。　(3)取灭菌脱脂牛乳1-2ml滴加在灭菌培养皿或试管内,取数环菌苔在牛乳内混匀,制成浓悬液。　(4)用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内,使其吸饱,再放回至安瓿管中,塞上棉塞。　(5)将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中,用真空泵抽气至干。　(6)将棉花塞入管内,用火焰熔封,保存于低温下。　(7)需要使用菌种,复活培养时,可将安瓿管口在火焰上烧热,滴一滴冷水在烧热的部位,使玻