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技术宝典— qPCR
引物从文献中得到后,或者由公司提供得到后,比较稳妥的方式是在ncbi网站上对上游和下游引物分别进行Blast分析,以确定该对引物是否特异扩增靶基因,而且不会扩增非靶基因。
具体方法是:
进入ncbi的blast网站:
选择nucletide blast,点击进入:
也可直接点击:
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome
在框里复制上游引物,和下游引物;中间用分行符隔开;
如果你比对的是mRNA序列, 选择 reference RNA sequence(refseq-rna);
如果是其他序列,分别选择;如果不确定是什么,选择nucletide collection(这是最大的一个库);
点击下方的blast按钮;
会跳出如下界面:
判断原则:
一般来说,多少都会找到一些其他基因的同源序列,此时,可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析,只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。