实验一 DNA 的小量制备 小量法提取植物基因组DNA(CTAB法) 1 实验目的: 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用,人们经常需要提取高 分子量的植物DNA,用于构建基因文库、基因组 southern 分析、酶切及克隆等, 这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定 DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法,进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理 细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物(DNP)的形式存在于细胞核内。 提取DNA 时,一般先破碎细胞释放出DNP,再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质, 最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白(RNP)在不同浓度 的电解质溶液中溶解度差别很大,利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例: RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大,而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1%。 当NaCl 浓度逐渐增大时, RNP的溶解度变化不大, 而DNP 的溶解则随之不断增加。 当NaCl 浓度大于1mol/L 时,DNP的溶解度最大,为纯水中溶解度的2 倍,因此通 常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。 为了得到纯的DNA 制品, 可用适量的RNase 处理 提取液,以降解DNA 中搀杂的RNA。 关于植物总DNA 的提取主要有两种方法: 1. CTAB 法: CTAB (十六烷基三甲基溴化铵, hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称 CTAB) :是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶 液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl) 时从溶液中沉淀, 通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、 多糖类物质分开, 然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀, CTAB 能溶解于乙醇中。 2. SDS 法: 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠,Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS)使DNA 与蛋白质分离,在高温(55~65℃)条件下裂解细胞,使染色体离 析,蛋白变性,释放出核酸,然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多 糖杂质沉淀,离心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇 沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp,在基因克隆工作中, 通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上,否则会由于制 备过程中随机断裂的末端多为平末端,导致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比 例太低,严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则: (1)尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质(如多酚、类黄酮等) 、多糖等杂质, 并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。 (2 ) 尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切 破坏。 几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子,故实现( 1)尽量去除蛋白 质的要求,需加入一定浓度的螯合剂,如EDTA、柠檬酸,而且整个提取过程应在 较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴) 。为实现(2)需要在DNA 处于溶解状态 时,尽量减弱溶液的涡旋,而且动作要轻柔,在进行DNA 溶液转移时用大口(或 剪口)吸管。提取的DNA 是否为纯净、双链、高分子的化合物,一般要通过紫外 吸收、化学测定、“熔点”(melting temperature, Tm)测定、电镜观察及电泳分离等 方法鉴定。本实验采用CTAB 法提取DNA 并通过紫外吸收法鉴定。 3材料和试剂: 3.1长春花叶片 3.2 试剂 (1)CTAB 提取缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ,20 mmol/L EDTA-Na2, 1.4mol/LNaCl(如表1) ,2% CTAB,使用前加入0.1%(V/V)的β-巯基乙醇。 表1 CTAB提取缓冲液配制 用HCl 调pH 值。 (2)TE 缓冲液:10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA( pH8.0) 。 (3)氯仿/异戊醇:将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀,置棕色瓶中,4℃保存。 4 仪器设备 离心机、3离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等。 5 方法与步骤: 5.1 在提取过程中用到的吸头,提取缓冲液等先高压灭菌(121℃,20min) ,取 出后待用; 5.2 取大约指甲盖大小的植物叶片,放入1.5ml的EP管中, 加入液氮,用钢珠研 磨成粉末状,再加入600μL的CTAB提取缓冲液, ; 5.3 65℃水浴锅中水浴40min,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),轻轻混匀,颠 倒几次,乳化1min。4℃,11,000rpm离心10min; 5.4 吸上清到新离心管中(约400μ l) ,加入等体积预冷异丙醇,混匀,-20℃放置20min沉淀DNA; 5.5 5000 rpm常温离心15min,倒掉上清液; 5.6 用75%乙醇(900μ l)洗沉淀,11,000rpm离心2min,倒掉乙醇,再用乙醇 同样处理一次; 5.7 置于干燥仪干燥10min,将水分蒸干; 5.8 加入50μL去离子水,融解 DNA,同时加入RNA酶(按每50μL DNA加入1μL RNase),37℃30min; 5.9 利用分光光度计检测OD260,同时进行1%凝胶电泳检测; 5.10 琼脂糖电泳检测DNA:制作1%的琼脂糖凝胶,吸取提取的 DNA溶液5μL 电泳检测; 5.11 -20℃保存DNA备用; 5.12 提取的DNA的浓度检测:取少量待测DNA样品,用蒸馏水稀释1,000倍; 用蒸馏水做空白,分别在260nm、280nm测DNA样品的吸光值。 【注意事项】 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活 性外, 第一步的操作应迅速, 以免组织解冻, 导致细胞裂解, 释放出DNA酶, 使DNA 降解。 6. 思考题 1.制备的DNA 在什么溶液中较稳定? 2.为了保证植物DNA 的完整性,在吸取样品、抽提过程中应注意什么? 7 实验结果: 结果计算 式中OD260nm 为260nm 处的光密度;L 为比色杯光径(cm) ;0.020 为1μg/mL DNA 钠盐的光 密度。 DNA 的紫外吸收高峰为260nm,吸收低峰为230nm,而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述 DNA 溶液适当稀释后,在751 分光光度计上测定其 OD260nm 、 OD230nm 和OD280nm 。如OD260nm/ OD230nm≥2OD260nm/ OD280nm≥1.8,表示RNA 已经除净,蛋白含量不超过0.3%。 8 实验分析: 传统 DNA 提取方法 CTAB 法、 SDS 法是在裂解细胞的基础上,多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变 性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的;加入 RNA 酶除去核酸中 的RNA; 然后加入异丙醇、乙醇等沉淀 DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除去分离过程中 残留的有机溶剂和盐离子 , 以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应 , 最后用 TE 溶解 DNA 备用。 CTAB 是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐( > 0. 7 mol/ L) 浓 度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0. 1~0. 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸复合物 就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。 通过有机溶剂 抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃 上清后,CTAB - 核酸复合物再用 70 %酒精浸泡可洗脱掉 CTAB 。 SDS 是一种阴离子去垢剂,在高温(55~65 ℃) 条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时 SDS 与 蛋白质和多糖 结合成 复合物 , 释放 出核酸 ; 提高盐 (KAc 或NH4Ac) 浓度并降低温度(冰浴) ,使SDS - 蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形 式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的 DNA 用酚/ 氯仿 抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 SDS 法操作简单,温和,也可提取到高 分子量的 DNA ,但所得到的产物含糖类杂质较多。 基因组 DNA 经典的提取方法由于无需昂贵仪器和药品,提取的 DNA 纯度能够满足 一般分子生物学的需要,一直作为 DNA 提取的常规方法。但这种方法操作步骤复杂, 耗时长,易交叉污染,残留在 DNA 溶液中有机物质对 DNA 聚合酶有抑制作用。另外, 酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康。 DNA 提取新方法 近年来出现了以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉 吸附等基础 DNA 提取新方法。这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人和动物 细胞、包埋组织样品、古生物标本及土壤环境样品 DNA 。 已有多篇利用纯化柱和玻璃粉纯化植物基因组 DNA 的报道。马小军等将 CTAB 液 提取和氯仿抽提两步的上清液直接通过 Wizard 纯化系统纯化得到的 DNA ,RAPD 扩 增效果良好,产率达 2 250μg/ g 。 张博等用硅珠 (SiO2) 颗粒吸附 DNA 纯化方法 , 从不同树木叶片中均得到了高质量 的DNA 样品 。 黄椰林等对常规 CTAB 法提取的 DNA 用玻璃粉悬浮液纯化,所获 DN 的APCR 产物 能直接测序,比较适用于富含黏多糖、单宁、多酚和萜类化合物等次生代谢物的植物 样品和长期保存的标本材料。 袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯净的总 DNA。 目前国内外开发了多种商品化的 DNA 提取纯化试剂盒,其分离原理有的利用核酸的 分子量差异,有的利用特异性膜与 DNA 结合达到分离、回收的目的,如离子交换柱、 磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法 , 操作简单、高效, DNA 质量较高,但价格昂贵,提取量少。 著名的国外的试剂盒生产厂家有 Sigma2Aldrich、Promega、Invitrogen、 TaKaRa 、 Whatman 等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、加 工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒。 国内的生物公司发展迅速,如上海生工、 北京天为、 北京博奥等也开发了系列试剂盒, 质量与国外厂家相当,价格较低。 除此之外,由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低,还有大量的生物公司提供试剂盒产 品,使用者一定要慎重选择。 DNA 试剂盒经过了几十年的发展,已经不再局限于单纯的提取纯化,有些厂家推出了 DNA 提取—扩增 PCR 试剂盒,将DNA 提取和 PCR 扩增结合起来,极大的提高了工 作效率,如Sigma2Aldrich 公司的 Sigma’s Extract2N2Amp Plant PCR kit 等。 另外,还有高通量的 DNA 提取产品,如高通量组织细胞研磨仪 MM301 ,在常温和冷冻 条件下对硬性、中硬性、韧性、脆性及纤维材料的研磨破碎,每次处理样品的个数可 以多达 48 个甚至 192 个。美国应用生物系统公司 6100 型核酸提取仪,可用于 RNA、 DNA 的提取纯化,可自编程序, 可选预设的程序,具有严格的防交叉污染体系,可从不 同来源的样品中同时提取 96 个样品。