1.4盒说明 书提 取细胞基因组 DNA。依次加入 10伊Buffer5滋l、 dNTP4滋l、 上下游引物各1滋l、 TaqDNA聚合酶0.25滋l、DNA 5滋l、 dH2O 32.75滋l, 构建 50滋l PCR 反应体 系。 PCR反应参数为:95益变性 5min, 95益 30s, 52益退火 45s,72益延伸 30s, 共 30 个循环, 最后 72益延伸 10min。PCR产物行凝胶电泳, 以 DNA 标 准样品作为阳性对照。 电泳结束后, 通过紫外透视仪观察、 拍照。 筛选出的病例继续扩增 BRAF 基因 15 外显子。PCR 产物送检 DNA 测序,将测序结果与 BRAF 基因组 DNA 序列进行比对,以确定 有 无 点突变。1.5以表 示, 多组样本比较采 用方 差分析, 两组间比较采用 t 检验, 计数资料组间比较采 用 字2检验。2结果图 21 799 位核苷酸 T→A 的转换;B:阴性对照)FNA 标 本 BRAFV600E突变测序结果(A:15 号外显子上第仪器和 试剂高分辨率彩色多普勒超声诊断仪购超声引导下甲状腺结节 FNA术前常规检查出、分子生物学检测取冻存的 FNA 标 本, 依据试剂统计学处理采 用 SPSS 13.0 统计软件 , 计量资料2.1显示, 从细胞样本提 取的 DNA 经 PCR 扩增得 到的产物与 DNA 标 准样品对照具 备可比性,图 1 中 1 号条带为阳性。经 测序证实 为 15 号外显子上第 1 799 位核苷酸甲状腺标 本 PCR 产物电泳及测序结果凝胶电泳T寅A 的转换, 即密 码子 600 位的错义 突变 (V600E) , 见图 2。2.2比较中 87.0%满足基因诊断。各组标 本中 因 DNA 量不 足而不 能完成基因诊断的依次为:Thy1 组 12.8% (6/47) ,Thy2 组13.8% (28/203) , Thy4 组 33.3% (2/6) 和 Thy5 组3.6% (1/28) 。BRAFV600E突变率为 4.8% (12/247) ,其 中Thy5 组 (22.2%, 6/27) , 与 Thy2 组 (3.4%, 7/203) 比较, 有统计学差异 (字2=14.786, P<0.01) 。Thy5 组 6 枚突变阳性结节均经 术后组织学确 诊为甲状腺乳头状癌 (papil原lary thyroid carcinoma, PTC) 。不 同病理 类型甲状腺结节与 HT 间均无 相关性(均 P>0.05) 。甲状腺功能比较,Thy5 组 TSH 水 平 较 Thy2 组高,具 有 统计学差异(t=-2.251, P<0.05) , 其 余组间比较, 均无 统计学差异 (均 P>0.05) , 见表 1。2.3组患 者 BRAFV600E突变与 HT 总体 无 相关性 (字2=2.959,P >0.05) 。进一 步分层比较提 示 Thy2 组和 Thy5 组BRAFV600E突变与 HT 均无 相关性 (字2=1.165、 0.044, 均 P>0.05) , 见表 2。Thy1 组及 Thy4 组样本量少 , 未 作统计学处理 。各组患 者 甲状腺结节 BRAF 突变率及甲状腺功能284 枚甲状腺结节 FNA 标 本完成基因测序, 其各组患 者 甲状腺结节 BRAF 突变与 HT 相关性各3讨论由于 50.0%以上恶性甲状腺结节无 症状, 当出现症状和 体 征时诊断常常为时已晚。如 果结节质地较硬, 与图 1FNA 标 本 PCR 产物电泳 (5、 6 之间为 DNA 阳性对照, N 为阴性对照, 1 为阳性)AB191 浙江医学 2014 年第 36 卷第 3 期表 2不 同病理 类型甲状腺结节 HT 与 BRAFV600E突变率比较[例 (%) ]表 1各组患 者 甲状腺标 本 BRAFV600E突变及甲状腺功能比较周围粘连、 生长迅速, 伴周围淋巴结肿大 , 声带麻痹, 或侵犯颈部组织等 表 现时恶性风险增加 7 倍。 指南推荐当出现上述 2 项或 2 项以上临 床 表 现, 包 括 具 有 甲状腺癌家族史, 常可临 床 诊断为甲状腺癌, 但 这 种情况较少见[1]。目 前临 床 上主要 依靠超声诊断, 超声结合 FNA 细胞学诊断是 术前最可靠的手段。FNA 诊断敏感性高, 但仍 然 可能存在假阴性, 而 且 部分结节因取材问题导致 细胞学无 法诊断。 检测 BRAF 突变有 助于鉴别这 些不 确 定标 本,提 高术前诊断准确 率。本研究甲状腺结节 FNA标 本 87.0% (247/284) 完成 BRAF 突变基因诊断, 基本满足临 床 诊断的要 求。值 得 注意的是 , 47 枚细胞学不能诊断或结节取材不 满意的 Thy1 组患 者 结节中 ,87.2%完成基因诊断, 提 示 FNA 标 本 DNA 检测可以提供补充 诊断。随着经 验积累, 标 本取材满意率提 高, 有望进一 步提 高诊断阳性率。BRAF 基因位于染色体 7q34, 全长约 190kb, 转录mRNA 长约 2.4kb,编码的 BRAF 蛋 白 是 一 个 95kD 左右的丝/苏氨酸激酶, 作为 RAS 下游效 应器, 在 MARK信号通路中 发挥重 要 作用。目 前已证实 至少 45 种BRAF 突变, 90%是 15 号外显子 1 799 位核苷酸 T寅A转位 (T1 799A) , 导致 600 位缬氨酸被谷氨酸替代, 称V600E于选择最佳手术方 式,也可为术后复发的临 床 监测提供可靠的参考, 在治疗方 面也很有 意义 。Fagin 等究中 应用 Raf 激酶抑制剂已起到抑制肿瘤细胞生长的作用。据目 前文献报道, BRAFV600E突变仅见于甲状腺恶[2]。检测术前穿刺标 本的 BRAF 突变状况, 有 助[3]的研性肿瘤, 主要 见于经 典的 PTC, 在高细胞变异的 PTC 及PTC 来源的低分化癌、 未 分化癌也有 报道, 但 在滤泡状变异的 PTC (FVPTC) 中 极少 , 在甲状腺滤泡癌则未 见报道[2]。弥漫硬化变异型 PTC[4]、 PTC 罕见变异型 (cribri原form-morular variant of PTC, CMVPTC) 也未 检测到BRAF 突变[5]。理 论上 BRAF 突变联合细胞学检查可以提 高诊断阳性率, 目 前有 关方 法学可行性验证主要 见于国外文献[6], 国内未 见报道。 不 同地区报道的 BRAF 突变率不 一 致 , 在 60.0%左右。本研究细胞学诊断为恶性的结节中 , BRAFV600E突变率为 22.2%,突变阳性者 均经 术后组织病理 证实 为 PTC。 另有 6 枚细胞学诊断良性的结节查见突变,很可惜其 中 3 例患 者 分别因妊娠、两次FNA 检查提 示细胞学形态良性以及准备生育而 拒绝手术, 另外 3 例因预留电话号码不 准确 而 失访, 其 临 床 结局有 待 随访手术后组织病理 学诊断进一 步明 确 。