掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原理与方法。熟练分光光度计的使用和操作方法。 考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质 结合,使染料的最大吸收峰的位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕红色变为蓝色。经 研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 (特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值,与蛋白质浓度成正 器材。可见分光光度计、试管、试管架、刻度移液管、移液枪 试剂。 考马斯亮蓝试剂称取考马斯亮蓝G250 100,加95%乙醇100ml,溶解 后加85%H3PO4, 100 ml,加水稀释至1000ml,存 于棕色瓶。 蛋白质标准溶液 准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白,配置 1mg/ml标准溶液。 标准曲线的制作 取试管6只,按下表进行编号并加入试剂,充分摇匀。 2040 60 80 100 10080 60 40 20 2040 60 80 100 试管编号 试剂 每支试管加入5ml考马斯亮蓝试剂 振荡混合后放置5分钟 于595nm测定吸光度 A595为纵坐标、标准蛋白含量横坐标 绘制标准曲线 样品提取液中蛋白质含量的测定 取3支试管,各吸未知浓度 蛋白液0.1ml,分别加考 马斯亮蓝试剂5ml 振荡混合放置5分钟 以制作标准曲线的1号试管 做空白对照,595nm测吸光度 据所测A595值,于标准曲线 上查出相当标准蛋白的量,取 三重复样品蛋白含量均值 结果计算 样品蛋白质含量 ug/ml 五、注意事项 待测液中蛋白质浓度不可过高或过低,应控制在 100~800g/ml为宜。 比色测定时,考马斯亮蓝易吸附在比色皿表面,对 后续测定造成影响,因此测定结束后用无水乙醇清 洗比色皿。