由于农家肥肥力强、肥 效长.可以改良土壤结构.增加肥力.防止土壤板 结.目前仍有许多农户采用农家肥对小麦进行施 肥.研究显示.在用动物排泄物施肥的土壤0~40cI n 土层.检测到了土霉素和金霉素的残留.其浓度分 别高达32.3 mg/kg和26.4 mg/kgE引.这些残留的土 霉素进入土壤环境后.是否会对小麦苗期生长及根 际微生物群落结构产生影响值得关注。 鉴于土壤环境的复杂性.对进人土壤的土霉素 有一定的吸附、降解和缓释作用,因此为降低其他 干扰因素的影响.本研究采取水培法.仅设置土霉 收稿日期:2014—06—30 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 20677014) ;三门峡职业技术学院课题项目( SZY一2014—017) 作者简介:张晶( 1985一) ,女,河南三门峡人,讲师,硕士,主要从事环境微生物研究,( 电话) 13419845630( 电子信箱) zhangj i n9826—826@163.col rl 。 万方数据 第8期 张 晶等:土霉素暴露对水培小麦生长及根际微生物的影响 1833 素一个单因素处理.测定其对小麦苗期生长和根际 微生物群落结构的影响.并结合分子生物学方 法——PCR—DGGE技术对根际微生物的敏感性进 行分析.比较不同剂量土霉素处理下微生物群落结 构在数量和优势种群类别上的差异,以期综合评价 土霉素对小麦苗期生长的潜在影响。 1 材料与方法 1.1 材料 盐酸土霉素均为分析纯.购自上海生物工程技 术服务有限公司。 供试样品为小麦.其品种为矮抗58.购自河南 省农业科学院。 1_2试验方法 1.2.1 水培试验方法 选取子粒饱满的小麦种子. 经次氯酸钠浸泡消毒后.用去离子水冲洗两遍.选 取30粒均匀摆放在培养皿中.加人终浓度为0mg/L (CK)、0.8 mg/L(A)、4.0 mg/L( B) 、20.0 mg/L( C) 、 60.0mg/L(D)、100.0 mg/L( E) 的土霉素培养液,各 浓度处理设置3次重复,25 cC培养15 d。 1.2.2参数测定选取4个时间点。分别为水培的 第4、6、10和15天,测定各浓度处理条件下小麦的 根长和芽长。采用SPSS软件对各浓度处理的小麦 根长和芽长进行统计分析。 1.2.3 微生物群落结构的分子生物学分析 于第 15天取水培溶液.采用PCR—DGGE方法分析培养 液中微生物数目及丰富度,具体方法参照文献[ 5] 。 2结果与分析 2.1 土霉素暴露对小麦发芽率的影响 当培养温度为25℃时.小麦种子培养1 d后开 始发芽.不同浓度土霉素处理对小麦种子发芽率的 影响如图1所示。由图1可知.CK处理培养1 d后 发芽率达63.3%.试验设置的各土霉素浓度由低到 高种子发芽率均较对照处理有不同程度的下降.发 芽率依次为50.0%、46.7%、43.4%、36.7%和23.3%, 表明土霉素暴露对小麦种子萌发率有明显的抑制 作用.且抑制程度与土霉素浓度呈正相关,土霉素 100 80 鐾60 糌 蕊40 20 O O 0.8 4 0 20 O 60 O 100 0 土街素浓J 复l l mg/1. 图1 土霉素暴露对小麦发芽率的影响 浓度越高抑制作用越明显.当土霉素浓度为100.0 mg/L时,发芽率较对照下降了40.O%。 2.2土霉素暴露对小麦生长的影响 2.2.1 土霉素对小麦根长的影响 培养周期内土 霉素对小麦根生长的影响状况如图2所示。由图2 可知.对照处理在4次测量时根长均为最长,为 3.988~7.910cm。A处理次之,根长为2.923~6.170 cm。 随着土霉素浓度的增大.小麦根长受抑制情况加 剧.C处理4次测量根长为1.178~1.688 cm,后期甚 至出现了负增长的现象。D和E处理条件下,根的 生长基本保持恒定.随着培养时间的延长,根的生 长状况越来越差.培养15 d时.E处理条件下根的生 长抑制率达到87%。由此可见,在高浓度土霉素暴 露条件下.毒害作用随培养时间增长而加剧,小麦 根系的生长几乎完全被抑制。 运用SPASS软件对统计数据进行分析,结果 ( 表1) 表明,小麦水培第4、6和15天,各试验浓度 土霉素处理条件下.小麦根长较CK均具有显著差异 ( P<0.05) 。水培第10天时,A土霉素处理与对照相 比差异不显著( 尸之0.05) 。在4个时间点,A、B与C处 理之间根长均具有显著( P<0.05) 差异。当土霉素浓 度高于20.0mg/L时.根的生长均受到较明显的抑 制.C、D和E处理问根长差异不显著。 培养时I' @l l d 图2土霉素暴露对小麦根长的影响 表1 土霉素暴露对小麦根长的统计分析 (单位:cm) 处理—丽了芙—■ —甭ii——]F五芙——1瓣 小麦根长 2.2.2 土霉素暴露对小麦芽生长的影响 不同浓 度土霉素处理对小麦芽伸长的影响如图3所示。由 图3可知。CK在培养前6 d芽伸长量最长,为 6.152 cm.其他各浓度处理土霉素对芽伸长均有明 显抑制作用.抑制程度随土霉素浓度增加表现出明 4 2 O 8 6 4 2 0 万方数据 1834 湖 北 农 业 科 学 2015正 显的剂量效应.E处理在水培第6天抑制程度最强. 达到78.1%:水培第10天.B处理土霉素对芽的生 长出现促生现象.芽长较CK增加9.8%,该促生作 用一直延续至水培第15天.芽长较CK增长7.1%: B和C处理均保持抑制作用.且随着培养时间的延 长抑制作用加剧:D和E处理在整个培养周期内对 小麦芽生长的抑制作用更强,芽长始终较短.长度 与CK水培第4天时芽长接近.可见高浓度的土霉 素对小麦芽的生长出现抑制甚至毒害作用。 25 20 l 15 壬 桊10 5 O 培养时间//d 图3土霉素对小麦芽伸长的影响 运用SPASS软件对芽生长数据进行统计分 析( 表2) 。结果表明,水培前6 d,CK具有最大的芽 伸长量.A处理表现微弱的抑制现象,但与CK相 比差异不显著,C、D和E处理与CK相比具有显著 ( P<0.05) 差异。水培第10天,A处理芽长最长,为 14.811 cm.高于CK.表明低浓度土霉素暴露对小麦 芽生长表现出促进作用。B、C、D和E处理的芽长较 CK显著( P<0.05) 下降,且B处理与C处理间,C处 理与D、E处理间芽长也表现出显著( P<0.05) 差异。 水培第15天.A处理仍表现出微弱的促进作用,芽 长最长.为18.294 ern。B、C、D和E处理的芽长与A 处理和CK间差异显著( P<0.05) 。 表2土霉素对小麦芽生长的影响 ( 单位:cm) 处理—焉了芙———万万r——1玎正F——1丽 小麦根长 CK 2.970_+0.979 a 6.152-+2.002 a 13.493_+4.125 a 17.075_+4.144 a A 2.729-+1.153 a 5.34l ± 1.632 a 14.811-+2.892 ab 18.294_+4.224 a B 2.3l l ± O.797 ab 3.727_+1.166 b 11.741± 2.287 b 13.250_+4.877 b C 1.823_+0.465b 2.022_+0.800 c 7.568_+2.351 c 8.447-+2.227 c D 1.235_+0.481 b 1.286_+0.495 c 3.044_+1.638d 4.178± 1.684 d E 1.360_+0.416 b 1.345_+0.575 c 2.96l ± 1.034 d 3.807_+1.176 d 结果表明.土霉素暴露对于芽生长的影响表现 出明显的剂量效应和时间效应,低浓度( ≤0.8mg/L) 处理条件下差异不显著,且随着时间延长表现出微 弱的促进作用,较高浓度( 4.0mg/L) 处理条件下均 较CK出现明显下降,高浓度( ≥20.0 mg/L)处理组, 土霉素暴露对芽的生长表现出明显的抑制作用甚 至是毒害作用。 秦俊梅等[ 6] 研究表明.土霉素暴露对小麦影响 虽总体上表现为抑制作用.但低浓度土霉素暴露对 小麦株高、株鲜重起促进作用,其他测试指标均随 土霉素浓度增加呈下降趋势。安婧等[ 7] 研究认为土 霉素暴露对小麦芽长及根长具有抑制作用.且芽长 及根长抑制率与土霉素浓度呈线性正相关。土霉素 暴露对小麦种子发芽的毒性大小依次为根长<芽 长<发芽率.与本研究结果一致。 2.3水培液微生物群落的PGR—DGGE分析 可培养微生物仅占所有微生物数目的1%左 右.传统的培养方法不能真实反映水培溶液中的微 生物类群。各类微生物( 如细菌和古细菌) 的16Sr. RNA基因序列中可变区的碱基顺序有很大的差异。 利用PCR—DGGE技术可以根据电泳条带的多寡、亮 度和条带的位置辨别样品中微生物的种类多少、优 势类群数量.分析样品中微生物的多样性.真实反 映培养体系中的微生物构成。 培养15 d后.不同土霉素浓度条件下.水培溶 液中微生物的DCGE及统计分析图谱如图4所 不。 不同浓度土霉素水培溶液中微生物群落结构 变化差异较为明显。从条带数目看,CK、A、B、C、D 和E处理的水培溶液中.可检测到的微生物条带数 目分别为28、26、37、30、33和31,条带数目越多表 明该环境下微生物的物种丰富度越高。B处理物种 数量最多.但肉眼可辨识度较低.提示各类微生物 单位数量较低,未形成特征性优势种类。 低浓度处理组( A和B处理) 与CK有较为相似 的图谱.差别在于CK中出现了一条亮度较高的特 征条带( 图4A条带5) ,而该条带在A和B处理条 件下亮度微弱.表明该优势微生物类群对土霉素较 为敏感.低浓度处理下即出现抑制现象:高浓度处 理组( C、D和E处理) DGGE图谱较为一致,均出现 了多条高亮度特征性条带( 图4A 1—4条带) ,这些 条带在CK及低浓度处理组中可视度较低.与CK 图谱差异显著.推测是一些耐受土霉素的抗性微生 物类群.在高浓度处理下随着土霉素剂量和时间双 重作用驯化产生.目前对于这些高亮度特征条带 ( 图4A 1-5条带) 的研究正在进一步进行中。 结合各浓度处理间相似性聚类结果( 图5) ,CK 与各浓度间均表现出明显差异.相似性较低,与A 和B处理间相似性介于12.50%~40.00%,与C、D和 E处理间相似性极低.介于0%~11.10%。而A与B 处理间图谱相似性达42.86%。C、D和E处理内相 似性达33.33%~73.68%.D与E处理问相似性最 高,达73.68%。 万方数据 第8期 张 I帛等:土霉素暴露列水培小麦生长及根际微生物的影响 1835 A B A.DGGE原始电泳图谱:B.物种丰富度统计分析图谱 图4水培液中细菌群落结构的DGGE图谱 Rows\Col s 1 2 3 4 5 6 l 0000000 2 04000000 000000 0 3 0 125 0000 0428 57l 4 0000000 4 0 000000 0 0100 000 0 0 300 0000 l 0000000 5 0 J 11111l 1666667 0 277 777 8 0 333 333 3 0000000 6 0 0000000 0l l l l 】1l 0 222222 2 0 437 5000 0736842 1 000 0000 图5 土霉素DGGE图谱相似性分析结果 PCR—DGGE试验分析结果与土霉素对小麦生 长的毒理学试验结果相吻合.当土霉素处理浓度高 于20.0 mg/L的.对小麦生长和微生物群落结构均 造成了显著影响.可以初步判定20.0mg/L为土霉 素环境暴露的风险浓度。Xi ong等[ 8] 认为植物的根可 分泌促进细菌生长的物质.而土霉素的抑制会削弱 这一促生作用,影响微生物类群的多样性。该结论 也与本研究结果相吻合.低浓度土霉素处理xCd, 麦 发芽率、根长和芽长影响较小,微生物群落结构也 与CK差异较小:高浓度土霉素处理对小麦生理指...