转染操作的提示和技巧:

1)从健康细胞开始

a.转染实验前,细胞解冻后传代3–4次。 这使得细胞从解冻过程中恢复过来,并恢复正常的生长速度。
b.仅使用活性 >90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。
c.定期传代细胞,切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。 如果让细胞长到汇合状态,可能会改变细胞的生长速度以及形态。
i.请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。 我们建议您使用TrypLE™试剂使细胞脱壁。 TrypLE™试剂可于室温下存储在通风橱中。可通过添加过量的TrypLE™来跳过PBS洗涤的步骤,然后吸弃全部液体,仅留可覆盖瓶子表面的液体。
ii.传代条件取决于所用的细胞系。 部分经验法则:
对于快速生长的细胞,倍增时间为16小时(如HEK-293细胞),按1:10的比例分瓶。对于生长缓慢的细胞,倍增时间为36小时(如原代细胞),按1:5的比例分瓶。
d.保留冻存的细胞系,并定期解冻新细胞。 传代次数高(>30–40)时,细胞的生长速度和形态会改变。

2) 进行实验之前,请先规划您的实验。

务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量,并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。
a.开始前,设计好铺板路线图,标注好每次处理或实验条件。
b.计算所需脂质体和DNA的储备量,并确认有足够的下列材料: Opti-MEM 培养基,Lipofectamine 2000 或Lipofectamine LTX试剂,以及DNA (0.5–1 µg/µL)。

3) 转染时,请使用优质DNA。

a.使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。
b.通过测量OD 260/280值来确定DNA纯度,测得的OD值应介于1.7–1.9]之间。数值过高或过低均说明有杂质,不宜用于转染实验。
c.在无DNA/RNA酶的水或TE中稀释DNA。
d.制备的工作浓度为0.5–1 µg/µL。 可用SpeedVac浓缩仪或透析过滤装置(例如,Amicon超滤管)来浓缩DNA。

4) 转染当天,将细胞铺板。

a.如果在转染前一天或更早时间铺板,转染效率可能下降。
b.转染时,细胞密度保持在汇合率为70–90%。
c.转染时,细胞密度影响转染效率。 为了简化转染优化过程或节省时间,我们建议细胞铺成2种不同的密度,以确保较高的转染效率。
d.细胞的铺板和转染可同时进行,或者通过反向转染操作进行。 反向转染操作中,使用的细胞是正常/正向转染的2.5倍以上。
e.转染复合物可以加到含抗生素和血清的培养基中,且不会影响转染效率。

5) 准备脂质体-DNA复合物。

a.为了获得最理想的试验结果,我们建议在Opti-MEM培养基中混合脂质体和DNA。 另一种方法是使用无血清培养基。
b.在Opti-MEM培养基中稀释脂质体。 在第二管Opti-MEM培养基中稀释DNA,然后和等体积脂质体溶液混合。 该2步稀释法可获得更优质的数据,比脂质体直接加入稀释的DNA中的方法获得的结果更有重复性。