微阵列是新出现的分子生物学技术,是本世纪重要的科学进展,它能够高效率、大规模地获取相关生物信息, 是现代生物技术、微电子技术、机械制造技术、计算机技术的结合。其对科学的 深远影响将远胜过 DNA测序和 PCR ,使人们更大规模地获取生物信息,使人类基因组计划早日实现。 技术原理及操作规程1.1 微阵列制作类型 (1)大规模cDNA微阵列 Drmanac 等人将31104个cDNA克隆或基因组 DNA 固定在尼龙膜、玻片等固相载体上以研究基因的表达 。应用PCR 技术每 天可以进行数千克隆的扩增,同时利用高速机械手将 cDNA 自动而精确地点在尼 龙膜上或其它载体上 (2)芯片外寡核苷酸合成ershov 等人用传统方法合成 DNA 后,再用机器 人将其以 20,000-30,000/cm2 的密度点布于覆有凝胶的玻片上。凝胶可以增强寡核 苷酸与玻片的结合和促进杂交,但只有短核苷酸才能扩散到凝胶内 (3)原位合成寡核苷酸制造芯片是借鉴半导体照相平板印刷技术,在1cm 左右的玻片上原位合成寡核苷酸探针序列[8,9] 。合成时将传统的以亚磷酰胺为基 础的DNA合成技术改进为光不稳定的保护基团固定于载体上。第一步是透过掩模 的紫外光照射处去除保护基团,以生成自由羟基;第二步是 5’端保护的亚磷酰胺 加上活性位点。随着未反应羟基的加帽、氧化和冲洗,应用第二个掩模在必要的 位点合成下一个核苷酸,重复进行直至所需要的核苷酸全部合成为止。应用组合 掩模策略,可以通过尽量少的步骤来合成指数递增的探针,从而制作出更高容量、 更大密度的微阵列。对于含有 个合成步骤产生4n 个可能结构。 (4)应用喷墨打印机技术制造芯片 冷泉港的Castellino [10] 借鉴喷墨打印机 的技术原理,并加以改进后用以制作芯片,已经取得了巨大成功,并有较大的应 用潜力。 1.2 探针标记与杂交 靶DNA标记上同位素(32p,33p)或荧光染料后,再与芯片进行严格条件 下的杂交。探针通常是从mRNA反转录的cDNA片段的混合体 [11] 1.3信号检测与结果分析 同位素标记的探针可通过放射自显影来检测;荧光标记的探针片段结合 到相应的位置后,可通过氩离子激光共聚焦显微镜检测。由于荧光标记有实时、 分辨率好、无放射性污染等优点,现已基本取代了同位素标记。将结果输入计算 机,并通过相应的软件来分析。例如比较正常组织与肿瘤组织的表达差异等[12]。 应用2.1 基因表达分析 微阵列技术已经被许多研究小组应用于与基因表达有关的工作中,如对细菌、 动植物、酵母和人类的研究。在最初的研究中,为了检测微阵列方法的特异性, Schena 等人采用48 对不同种属来源的cDNA片段与标记荧光的探针杂交,其中包 括丽丝胺(lissamine)的阳性对照,鼠糖皮质激素受体、酵母TRP4 cDNA等来检 测拟南芥(Arabidopsis thalima)的不同基因表达。在鼠和酵母的对照中,未发现 有基因表达,说明微阵列的特异性是非常高的 [13] DeSaizieu 等人用 6400 个寡核苷酸微阵列来检测肺炎球菌的 100 个基因,其 敏感性要比 Northern 杂交好一些,同时重复的错误率低于 25%或更小。结果揭示 感受态基因cinA,recA,和cytA的诱导水平分别增加了30 ,18 和15 倍;同时测量 了肺炎球菌在指数生长期和静止期的基因表达差异。在静止期,4 个与多糖荚膜合 成、长链脂肪酸合成、细胞分裂相关的酶的基因表达水平极低,与预期结果相似。 因此应用单个微阵列而不需纯化 mRNA 就可检测具有协同作用的基因组合,克服 了细菌mRNA在总RNA中含量低,纯化困难的问题。 DeRisi 等人 [15] 应用微阵列来研究实验性肿瘤抑制机制。人类黑色素瘤的致瘤 性可以被导入的正常人的6 号染色体抑制,6 号染色体和细胞的衰老有关。他应用 含有1000 多个与之有关的cDNA克隆的微阵列系统去寻找基因表达的差异。发现 在被检测到的900 多种基因中,致瘤性下降时,有1.7%的基因表达下调,7%基因 表达上调。 此项技术还被延伸应用于研究炎症性疾病如风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)和炎症性肠病(inflammatory bowel diseases, IBD)的基因表达特性上 [16] RA组织或 IBD 粘膜制备的探针被标记上荧光,并和含有与疾病进展有关的目 cDNA克隆的微阵列膜杂交,观察已知在炎症性疾病中表达的基因,如肿瘤坏 死因子、白细胞介素、集落细胞刺激因子的表达情况。一些以前并未发现与炎症 性疾病有关的基因,如人类金属基质弹性蛋白酶(HME)和黑色素瘤生长刺激因 子等均有表达。这些新发现的表达基因可能成为治疗的靶点。又用外周血 cDNA 文库的1146 个克隆的微阵列膜进行杂交,揭示了这两种疾病的基因表达差异。金 属蛋白酶的组织抑制因子、铁蛋白轻链、锰超氧化物歧化酶在RA组织中显著增高, 表明cDNA芯片能够准确快速提供疾病基因表达情况的信息。 2.2 功能分析 检测到基因表达差异之后,下一步是寻找这些差异的生物学功能。目前研究 未知基因编码蛋白的生物学功能是利用含有6000 个基因的啤酒酵母,通过基因破 坏造成酵母的突变链来实现的。突变的合适程度是在一系列有选择的生长条件监 测下完成的,如暴露于紫外光下,这种做法不仅耗时较长而且劳动强度大。 最近Davis 等人 [17] 发明了一种新的方法。主要是应用插入一个独特序列或标 记的突变酵母链。分子标记在特殊的的生长条件下从生存链中扩增,并与高密度 微阵列进行杂交。这样不仅可以确定这条链的相对丰度,而且可以在不同时间点 反复进行,同时还可以精确比较每条缺失链的适应性。 Brown 等人还研究了调控基因表达的蛋白质转录因子。他们计划监测其在 基因内部区域的结合部位。通过将转录因子与DNA交互连锁,然后免疫沉淀结合 有转录因子的蛋白质复合物,将DNA从蛋白质上分离下来,并用作探针去检测基 因内部的变化 [18] 2.3基因作图 微阵列技术的应用补充了基因表达研究的方法,加强了对疾病易感性和疾病 本质的研究。遗传学家在基因制图中常用的一种方法是将基因组的一个区段或片 段,通过有共同祖先的后代(Identical descent,IBD)来鉴定。同一种疾病在不 同个体之中均表现为同样症状的区段,可能隐藏着高度易感基因,进而可以此作 为侯选位点进行定位克隆。IBD片段的大小依赖于共同祖先与个体之间代数的多少, 同时也决定与遗传多样性。而且,我们应该考虑到这种多样性可能很大。 Chueng [19] 应用微阵列技术结合基因组错配扫描(genomic mismatch scanning, GMS)法对 先天性高胰岛素血症患者的基因进行定位。GMS 不需要同时进行基因多态性的扫 描,也不需要应用大肠杆菌错配修复蛋白来移出两个基因组的错配,这样就使得 IBD片段更加丰富。Chueng 对无亲缘关系的Ashkenazi 犹太人先天性高胰岛素血症 11 号染色体上磺酰脲受体( SURI)单基因突变进行定位。她将 GMS 产物直接与含 有从11 号染色体分离的96 个片段的微阵列膜进行杂交,发现SURI 基因区就是这 些成对个体的 IBD。这个实验结果证实了先前已知的先天性高胰岛素血症单基因 突变的位点。这种方法无论是在速度上还是在准确性上都远胜于传统方法,它将 会改变基因制图的方法。 2.4 基因分型(genotyping) 对于等位基因在不同个体之间存在的突变的深入研究将使环境与疾病易感性 之间的关系更为明朗。这一点已经被许多专家们认识到,他们正试图通过微阵列 技术来观察遗传多态性,并最终建立起一个针对不同环境危险因子的范围。Brown 等人应用被未知污染物污染的外周血 细胞表达图象进行比较,可以鉴定出检测物曾受过汞的污染 [18] 。这样将会使对机体有害 环境因素的影响更为清楚,使两者的关系更为明确。 微阵列技术用于基因分型在 临床研究中的潜能已经被许多研究所证实,尤其在血液系统疾病中 [20] 。Hacia Collins[12] 应用微阵列技术检测了乳腺癌易感基因 BRCA1 的突变。他们用含有 96,000 个寡核苷酸探针的微阵列来检测 BRCA1 11外显子的 3.45kb 内所有可能 的杂合性突变,包括碱基替换,及小的缺失、插入等。在15 个患者中14 例精确诊 断了已知突变;在20 个对照样本中无假阳性,并且检测出了 SingleNucleotide Polymorphisms ,SNPs )。尽管BRCA1 有22 个外显子可发生改变, 但其仅有 5592 个碱基,因此有可能制作出一种微阵列来检测其可能的所有突变。 许多开发这种技术的公司如 Affymetrix 公司迅速向市场推出两种芯片。一个是研 究HIV蛋白酶和反转录酶的芯片;另一个是研究p53 反密码子的芯片。p53 芯片包 400多个与肿瘤有关的突变,并已用于检测个体罹患肿瘤的风险,这将带来伦 理学上的困惑,将会明显影响被检测出有问题的个体,因为目前尚没有有效的早 期治疗干预措施 [21] 许多制药公司投巨资研究微阵列技术。DNA微阵列技术可以用来同时检测成千上万个基因的表达类型。发现基因功能的线索将有助于选择 治疗药物的干预靶点。它们也可用于监测药物治疗所致的基因改变。同时可以通 过应用微阵列技术来改进药物,发现新药物 [22] 问题与不足微阵列技术包括三个主要方面:能够得到大量的 cDNA和EST 序列;能够制 作出高密度的微阵列系统;荧光标记技术的改进和计算机系统的优化 。目前极度缺乏公开可得的、序列经过证实的 cDNA 克隆和 EST。这些限制了微阵列技术 的发展与进步,因为这项技术的威力依赖于点布在载体上的 cDNA 数量。在人类 细胞中已知表达的10,000~50,000 个基因中,只有15,000 个cDNA克隆可以得到, 其每一个均代表一个人类基因,关于鼠的 cDNA 克隆比人类更少。另一个限制是 许多 cDNA 文库中的全长必须在对所表达的基因进行分析之后才能获取。例如, 要获得乳蛋白的基因必须在乳腺的cDNA文库中才能够得到。 这项技术在目前的花费是很昂贵的,仅有少数大实验室或医药公司才能够承 受得起。一个最简单的配置应包括微阵列制作系统(arrayer),信号收集系统 (scanner),计算机和软件(操作系统和生物信息学相关软件),此项大约需要 125,000 美金。另外,一个实验室可能要用很多芯片,尽管芯片可以重复使用,但 理论上每次杂交后总是要使敏感性下降。 此外,还存在诸如:由于光本身的物理特征,如反射、衍射和散射引起的寡 核苷酸合成错误;由于碱基组成不同而形成的二级或三级结构;在尼龙膜或玻片 上点布的 cDNA 量的一致性问题;荧光标记技术的不完善;信号捕获系统的敏感 性等许多原因均可造成假阴性结果。如何确定同一的标准;如何判断结果和分析, 解释结果都是需要我们不断探索的工作。 前景与展望微阵列技术的迅速发展已经引起了各方面的广泛关注。许多实 验室、专业公 司和制药公司都在大力开发与此相关的技术。在制作设备、分析设备、支持软件 和探针的构建等方面均投入巨资,尤其是一些新兴的从事微阵列相关产业的公司 如Affymetrix,Incyte,Synteni,Clontech 等公司 [21,23-27] 均已研制生产出相关的产 品。有供诊断用的芯片如HIV,p53 和细胞色素p450 的芯片;有可供研究用的人、 大鼠、小鼠不同基因类别的芯片;有与不同疾病如肿瘤、心血管疾病、神经系统 疾病相关的芯片也已投入使用。而且很多公司可根据需要定制各种微阵列系统, 为研究人员提供方便。国内也开展了此项工作,清华大学、上海细胞生物所、军 事医学科学院放射医学研究所及广州等地正在进行此项研究。 微阵列技术的发展 为探索生命科学提供了强有力的工具。使一些原本复杂的工作变得简捷。正如NIH 的主任Harold Varmus 在旧金山美国细胞生物学年会上指出的:“应用微阵列技术, 我们将最终揭示单个细胞的全部基因表达,甚至整个机体的基因概况”。同时,他 还预言:“微阵列技术将改变我们对生命本质的认识” [26] 刘连新(中国医学科学院中国协和医科大学 肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实 北京100021) 王秀琴(中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实 北京100021) 吴旻(中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验 北京100021) 参考文献: DavisRW, et al. 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