摘要 在单克隆抗体制备中两次提到筛选问题,对于两次筛选的方法和目的始终是一些人的困惑,那么两次筛选的目的和方法到底是什么。
关键词选择性培养基多孔培养板
单克隆抗体制备过程中两次提到了筛选,对于两次筛选中的目的和方法许多人也存在疑惑,那么到底是如何筛选的呢?现总结如下:
第一次筛选:首先在(效应)B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行杂交时可能出现的情况应该先弄清楚,
(一)可能的情况有:
1 (效应)B淋巴细胞和(效应)B淋巴细胞的融合
2 (效应)B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合(即杂交瘤细胞)
3 骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合(即瘤瘤细胞)
4 单个骨髓瘤细胞
5 单个(效应)B淋巴细胞
(二)筛选的目的————获得杂交瘤细胞
(三)筛选的方法
用选择性培养基来完成,即HAT培养基。含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶,其中氨基喋呤可阻断DNA合成的主要途径。主要途径阻断后,依靠应急途径即在HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)和TK(胸苷激酶)作用下,利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成DNA,缺少其中一种,DNA合成不能发生。用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞,细胞内均无TK或HGPRT,所以单个或融合骨髓瘤细胞在HAT培养液中将死亡。B细胞虽然有HGPRT和TK,但在体外通常培养条件下,尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。因此只有杂交瘤细胞才能在HAT培养液中生长繁殖。
所以通过以上方法可以选择出杂交瘤细胞,但虽然都是杂交瘤细胞,但可能是同一抗原的不同抗原决定基刺激产生的。所以产生抗体是不纯的。如果不进一步提纯,这样得到的是多克隆抗体。所以就有了第二次筛选。
第二次筛选 要想获得单克隆抗体,所以必须得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群, 由这样的细胞群产生的抗体才是真正意义的单克隆抗体。
(一)筛选的目的
筛选只针对某一种特定的抗原决定簇产生抗体的杂交瘤细胞,即得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群并且能产生所需抗体
(二)筛选的方法
1、分离单个细胞置入多孔培养板的每个孔中培养
2、检测每孔细胞是否产生所注射抗原的抗体(即教材插图中提到的选出能产生特定抗体的细胞群)所以筛选的条件是两层意思:单个细胞单孔培养保证每个孔中的细胞在产生抗体时是针对同一抗原的同一抗原决定簇产生的的,但每个孔中细胞却不一定都能产生抗体,把那些不产生抗体的细胞淘汰,对能分泌针对抗原某一决定簇抗体的阳性细胞选择下来继续克隆,从而保证大量的生产所需抗体。
3、对选择下来的细胞进行克隆方法有两种:一种可以在体外培养;一种可以一直到小鼠腹腔中增殖,即可从中提取所需要的单克隆抗体。