实验五 血液中谷丙转氨酶活力的测定
【目的和要求】
了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义,学习转氨酶活力测定的原理和方法。
【原理】
生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶,能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换,在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4,它的种类甚多,其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶)和谷氨酸-丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶)的活力最强。它们催化的反应如下。
正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎,心肌梗死等病患时,血清中转氨酶活力常显著增加,所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。
测定转氨酶活力的方法很多,本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后,生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2,4-二
硝基苯腙。
丙酮酸2,4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色,可用分光光度法测定。从丙酮酸2,4-二硝基苯腙的生成量,可计算酶的活力。
【操作方法】
1.标准曲线的给制:取6支试管,分别标上0,1,2,3,4,5六个号。按
2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸与2,4-二硝基苯肼反应,生成α-酮戊二酸苯腙。因此,在制作标准曲线时,须加入一定量的底物,(内含α-酮戊二酸)以抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响。
先将试管置于37℃恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。向各管内加入0.5ml2,4-二硝基苯肼溶液后再保温20min,最后,分别向各管内加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min,以0号管作空白,测定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标,光吸收值为纵坐标,画出标准曲线。
2.酶活力的测定:取2支试管并标号,用第1号试管做为未知管,第2号试管做为空白对照管。各加入谷丙转氨酶底物0.5ml,置于37℃水浴内10min,使管内外温度平衡。取血清0.1ml加到第1号试管内,继续保温60min。到60min时,向两支试管内各加入2,4-二硝基苯肼试剂0.5ml,于37℃保温20min,然后再向2支管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min后,测定未知管的520nm波长光吸收值(