大豆异黄酮检测的研究进展 HPLC法测定异黄酮含量 大豆异黄酮是大豆生长过程中形成 的一类次生代谢产物。大豆异黄酮在通 常情况下为固体,熔点在100℃ 以上。 常温下性质稳定,呈黄白色粉末状,无 毒,有轻微苦涩味,在醇类、酯类和酮 类溶剂中有一定的溶解度,不溶于水, 难溶于石油醚、正已烷等。 大豆异黄酮在强酸、高温或酶存在下 可水解去掉葡萄糖基而转变成葡萄糖苷 配基形式(游离大豆异黄酮)。据报道游 离型大豆异黄酮(苷元)约占异黄酮总量 的2%~3 ,主要以大豆黄素(Daidzein)、 染料木素(Glycitein)和黄豆黄素 (Genistein)形式存在。 保健作用 ? ? ? ? ? ? 抗癌作用 抗氧化作用 具有对骨组织密度的阳性反应,有效防治骨质疏松症; 具有弱的雌激素活性,可用于改善妇女更年期症状; 具有抗酸化能力,能增强心肌收缩力,增加冠状动脉血流 量,对心脏病的危害有良好预防效果; 可降低体内胆固醇和脂肪量,并能影响脂肪代谢,防止高 血压、高血脂,预防心血管疾症发生。 除上述功能、作用外,异黄酮还具有抗真菌性从而抑制真菌活性的 功能。研究表明,大豆异黄酮具有雌激素调节作用,能够改善妇女皮 肤(美容)并对糖尿病及其他并发症、肾肝疾病、牙周炎等有预防和治疗 的功效。 毒性作用: 人体资料表明: ? ? ? ? 可刺激绝经前妇女乳腺增生和子宫内膜增生。 可能会降低男性血管内皮功能 孕妇摄入可致宫内胎儿造血细胞DNA损伤 增加子代生殖系统疾病发生的危险性 动物实验表明: ? ? ? 致癌作用 生殖内分泌毒性 其他毒性:可能具有免疫毒性;可能具有神经毒性;可 能具有细胞毒性;可能具有潜在的遗传毒性。 测定方法 ? ? ? 薄板层析法:操作简单,定量检测精度低多用于定 性分析,适用于生产过程的中间物料及无精度要求 的检测。 紫外分光光度法:分为单波长法和三波长法,两者 步骤相似,操作简便,重现性好,但特异性较差, 主要用于样品中总大豆异黄酮的测定。 高效液相色谱法:目前应用最广泛,为测定保健品 中大豆异黄酮的国家标准法,分离效率高,准确度 精密度高,测定样品范围广,主要用于单个大豆异 黄酮样品的检测,如质量检验及科学研究等。 测定方法 ? ? ? 色相色谱法:进样量少,敏感性、选择性及特异性 较高,但需制备衍生物,操作复杂,耗时长,仪器 昂贵。 毛细管电泳法:快速经济,选择性高,样品前处理 简单分离效率高。 免疫检验法:以酶联免疫法为基础,测定中根据标 记物和干扰物荧光寿命的差异,选择性的测定标记 物的荧光信号。 以下介绍检测保健食品中大豆异黄 酮的测定方法 GB 23788-2009-T 高效液 相色谱法 样品处理 固体样品、半固体样品:固体样品粉碎、磨细(过80 目筛)、混匀,半固体样品混匀,称取样品0.05g~0.5g (精确至0.1mg),用80%甲醇溶液溶解并转移至50mL 容量瓶中,加入80%甲醇溶液至接近刻度。 液体样品:吸取混匀的液体样品0.5~5.0mL于50mL 容量瓶中,加入甲醇溶液至接近刻度。 将上述样品溶液用超声波振荡器振荡20min,用80% 甲醇定容,摇匀。取样品溶液置于离心管中,离心机离心 15min(转速大于8000r/min)。取上清液用滤膜过滤,收 集滤液备用。 大豆异黄酮混合标准使用溶液 ? ? 将大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆 黄素和染料木素六种标准贮备溶液按1:1:1:1:1:1 的比例配成标准混合溶液,待用。 分别吸取0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL标准 混合溶液于10mL容量瓶中,加入等体积水,用 50%二甲基亚砜溶液定容,配成浓度分别为 0.0mg/L, 8.0mg/L ,16.0mg/L,24.0mg/L, 32.0mg/L,40.0mg/L的混合标准系列溶液。 色谱条件 ? ? ? ? ? 色谱柱:C18,4.6mm×250mm,粒度5μm 不 锈钢色谱柱,也可使用分离效果相当的其他不 锈钢柱。 流动相:A:乙腈 B:磷酸水溶液(pH=3.0) 波长:260nm。 进样量:10μL。 柱温:30℃ 测定 ? 定性 分别将大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆 素、大豆黄素、染料木素的标准贮备溶液稀释10 倍后,按色谱条件进行测定,依据单一标准样品 的保留时间,对样品溶液中的组分进行定性。 测定 ? 定量 将大豆异黄酮混合标准使用溶液在色谱条件下进 行测定,绘制以峰面积为纵坐标、混合标准使用溶液 浓度为横坐标的标准曲线。将样品溶液注入高效液相 色谱仪中,保证样品溶液中大豆苷、大豆黄苷、染料 木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的响应值均在工 作曲线的线性范围内,由标准曲线差得样品溶液中大 豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染 料木素的浓度。 结果计算 ? 样品中大豆异黄酮各组分[大豆苷(X1)、大豆黄苷(X2)、染料木 苷(X3)、大豆素(X4)、大豆黄素(X5)和染料木素(X6)]的含 量分别按下式计算: 式中: Xi——样品中大豆异黄酮单一组分的含量,单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克 每升(mg/L); Ci——根据标准曲线得出的大豆苷(或大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素 和染料木素)的浓度,单位为毫克每升(mg/L); V——样品稀释液总体积的数值,单位为毫升(mL); m——固体、半固体杨南平质量的数值,单位为克(g); 液体样品体积的数值,单位为毫升(mL)。 ? 样品中大豆异黄酮总含量,按下式计算: X= X1+X2+X3+X4+X5+X6 精密度 ? 在重复性条件下,两次独立测定结果之差不得 超过算数平均值的10%。