1、首先排除抗体孵育条件。一般来说,着色效果的好坏与抗体的孵育条件是密不可分的,由于用SP法已经做出来过一次且效果不错,因此对于同样组织的同一抗原进行分析,这种因素可以先排除。2、其次,DAB孵育时间是否太长?做出来那一次我是孵育8min,后来也是8-10min,我单独做了一次实验来排除该因素。结果孵育2、5min时先出现背景,而特异性染色较浅,故这不符合常理,一般先出现特异性染色,然后随着时间的延长,会出现非特异性背景着色。3、最后,血清封闭的问题?以前我一般孵育15-30min,所以我单独做了一次实验用血清封闭室温1h,其它条件同做出来的那一次,结果也一样背景着色很深。4、此外,我在改进的同时,也对PBS清洗不断地延长时间和增加次数,甚至完全参照试剂盒说明书来进行操作(我以前一般一抗4℃过夜且室温复温45min、二抗37℃30min、SP反应37℃ 30min),以及过氧化氢灭活加强等等均未起到效果。我冷静地分析了一下整个实验流程,与第一次做出来相比,只有两个地方做了改动:因血清不够而更换了不同厂家试剂盒、因抗体稀释液用完而重新买了抗体稀释液。5、我用PBS替代一抗稀释液(我以前还回收抗体,自我觉得抗体稀释液中含防腐剂和蛋白稳定剂),其它步骤和组织切片完全与第一次做出来的一致(包括血清也是老试剂盒内剩余的一点),奇迹出现了:结果很好。因为抗原抗体反应除温度、抗原/抗体浓度外,然后就是pH值,于是我测了新抗体稀释液、老抗体稀释液和PBS的pH值,结果是前者偏酸性(<6、0),而后两者均在7、5左右。6、看来主要祸根是抗体稀释液的pH值出问题了,于是我又用PBS替代抗体稀释液和新试剂盒内的试剂对组织切片做了免疫组化,结果还是没有做出来:背景很深。这真把我搞惨了。难道还有什么原因吗?通过仔细分析:一抗一定是结合上去了(老SP试剂盒结果很好),问题是二抗没有结合上去也不对(因为最后背景很深,这说明二抗可能也结合上去了),DAB孵育时间现在只用1、5min也是背景深而特异性染色浅,那我又怀疑封闭血清了。7、我做了两张切片:一张用老试剂盒内还剩下一点的血清而另一张用新试剂盒内的封闭血清,其余试剂(二抗、SP)均用新试剂盒提供的,结果是前一张效果很好,而后一张能够看到特异性染色,但背景太深,拍照效果不佳。看来封闭血清也是罪会祸首之一。结果分析显示:抗体稀释液的PH值偏低和封闭