第十三章非蛋白含氮化合物及总胆汁酸测定 非蛋白含氮化合物包括除蛋白质以外的尿素、肌酐、肌酸、尿酸、氨基酸、核苷酸、嘌呤、谷胱甘肽等多种含氮有机物。临床上应用较多的有尿素、肌酐、尿酸和肌酸及它们的最 终代谢产物氨,含血红素蛋白的代谢产物胆红素,以及肝脏合成的胆汁酸。 尿素、肌酐、尿酸和肌酐清除率可作为肾小球滤过功能的指标,尿酸水平还能反映嘌呤 代谢紊乱的情况;尿肌酸测定能反映肌肉损害性疾病。血氨是肝功能衰竭的指标,胆红素和 胆汁酸可反映肝胆功能。 第一节 血清尿素测定 检测尿素的方法有二乙酰一肟法、半酶法和全酶法。二乙酰一肟法需煮沸反应,检测精 密度较差,目前临床实验室基本上已不使用。半酶法是直接或间接测定经脲酶作用后由尿素 转变成的氨,氨的测定方法有:离子选择性电极法;用波氏比色法;干化学法。脲酶 -波氏比色法在基层实验室较多用。全酶法用脲酶和谷氨酸脱氢酶偶联,使用连续监测法测 定,可自动化,目前在多数医院普遍使用。 实验79 二乙酰一肟法测定血清尿素 【原理】 二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的 4,5-二甲基-2-氧咪唑化合物,颜 色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定,故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。 【试剂】 1.酸性试剂 在三角烧瓶中加去离子水约100ml,然后加入浓硫酸44ml、85%磷酸66ml。 冷至室温,加入氨基硫脲 50mg 及硫酸镉(CdSO O)2g,溶解后用去离子水稀释至1L。 置棕色瓶中,4可保存半年。 2.179.9mmol/L 二乙酰一肟溶液 称二乙酰一肟20g 溶于去离子水中并定容至1L。置棕 色瓶中,4可保存半年。 3.尿素标准贮存液(100mmol/L) 精确称取于 60~65干燥恒重的尿素(Mw 60.06)0.6g,溶解于无氨去离子水,并定容至100ml,加0.1g叠氮钠防腐,4可保存6 个月。 4.尿素标准应用液(5mmol/L) 取5ml 上述贮存液用无氨去离子水稀释至100ml。 【操作步骤】 按表13-1 操作。 表13-1二乙酰一肟法操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 血清 0.02尿素标准应用液 去离子水0.02 二乙酰一肟溶液0.5 0.5 0.5 酸性试剂 5.0 5.0 5.0 混匀,置沸水浴加热12min,取出置冷水中冷却5min,以空白管调零,在540nm处读取 各管吸光度。 【计算】 标准测定 尿素 【参考范围】 血清尿素1.78~7.14mmol/L。 【临床意义】 1.血液尿素浓度增高 分生理性和病理性因素两方面。 生理因素:高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血清尿素浓度男性比女性平均高 0.3~0.5mmol/L,随年龄增加有增高倾向。成人日间生理变异平均为 0.63mmol/L。 肾前性:最重要的原因是失水,因血液浓缩使肾血流量减少,肾小球滤过率减低而致血液尿素浓度增加。 肾性:肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎等影响肾小球滤过的疾病,都可使血液尿素含量增高。 肾后性疾病:所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高,如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。 2.血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外,常见于肝功能衰竭患者。 【注意事项】 1.试剂中加入氨基硫脲和镉离子,可增进显色强度和色泽稳定性,但仍有轻度褪色现象, (每小时小于5%)。煮沸显色经冷却后,应及时比色。 2.尿液中尿素也可用此法测定,但因浓度高,需先用去离子水作50 倍以上稀释。 3.尿素浓度以前习惯用尿素氮 mg/dl 表示,因为一个尿素分子中有 个氮原子,所以1mmol 尿素相当于 28mg 尿素氮(1mmol/L 尿素相当于 2.8mg/dL 尿素氮);另外还有以尿素氮 mmol/L表示,则1mmol/L 尿素=2mmol/L 尿素氮。世界卫生组织推荐尿素用 mmol/L 表示, 我国卫生部临检中心也已规定一律使用此表示方法,不再用尿素氮一词。 【评价】 1.本法试剂单一,方法简便,但试剂具毒性和腐蚀性。在标本数量多时加热开始难以达 100,各管间受热温度也可能不一致,因而本法重复性不佳。若改善加热条件,如采用在水浴锅底部加置高约5mm的网垫,在网垫上加热显色,可使CV 由不加网垫时的6.46%降至2.99%。 2.线性上限仅达7.14mmol/L;回收率为96%~102.1%。 3.二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它化合物在结构中会 有尿素的残基,如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素,虽然也会产生一种带颜色的产物,但这些化 合物在血清中浓度很低,故很少引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高,但 这些色素的最大吸收峰不同,因此不产生明显干扰。胆红素达171μ mol/L、血红蛋白达10g/L 均无影响。 实验80 脲酶-波氏比色法测定血清尿素 【原理】 脲酶水解尿素产生 分子二氧化碳,氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸钠反应,生成蓝色的吲哚酚阴离子,此过程需用亚硝基铁氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚 的生成量与尿素含量成正比,在630nm波长处有吸收峰。 【试剂】 1.酚显色剂 苯酚10g,亚硝基铁氰化钠(含2 分子水)0.05g,溶于1L 无氨去离子水中, 存放4可保存2 个月。 2.碱性次氯酸钠溶液 氢氧化钠5g 溶于无氨去离子水中,加“安替福明”8ml(相当于次 氯酸钠0.42g),再加无氨去离子水至1L,置棕色瓶内,4可保存2 个月。 3.脲酶贮存液 脲酶(比活性3 000~4 000U/g)0.2g 置于20ml 50%(V/V)甘油中,4可保 个月。4.脲酶应用液 脲酶贮存液1ml,加10g/L EDTA-Na 溶液(pH6.5)至100ml,4保存可稳定1 个月。 5.尿素标准液(5.0mmol/L) 【操作步骤】按表13-2 操作。 表13-2脲酶-波氏比色法操作步骤 加入物(ml) 测定管 标准管 空白管 脲酶应用液 1.0 1.0 1.0 0.01混匀,37水浴15min 酚显色剂 5.0 5.0 5.0 碱性次氯酸钠 5.0 5.0 5.0 混匀,置37水浴20min。波长630nm,空白管调零,读取吸光度。 【计算】 标准测定 尿素 mmol