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1.如何保存引物?
我们提供的干粉DNA从有机溶剂中干燥出来,无菌,无核酸酶。可以室温或-20℃密闭长期保存。
溶解以后的DNA最好保存在-20℃,溶解引物的水的PH要求大于7,并且无菌。带有荧光标记的引物请注意避光保存。
2.如何测定引物的OD值?
用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。请注意紫外分光光度计的使用,测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。
举例:您拿到一管干粉的DNA,用1ml水溶解成母液,取该母液50微升稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的光密度为0.25,说明该50微升中含有0.25OD的DNA,也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
3.如何检测引物的纯度?
实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带。)
4.为什么说用EB染色合成DNA片段来定量是不正确的?
通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA),是因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA,由于碱基组成不同,形成二级结构的可能性不同,EB的染色程度也会不同,比如Oligo(dT)等不形成二级结构,EB根本无法染色。所以不要用EB染色的方法来定量,而用紫外分光光度计检测。同样道理,用EB染色来照片不适合所有引物。
5.如何计算引物的Tm值?
引物设计软件都可以给出Tm,引物长度,碱基组成,引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为: Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中,Size = 引物长度。上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。
6.Primer设计的基本原则是什么?
引物长度一般在18-35mer。G-C含量控制在40-60%左右。避免近3’端有酶切位点或发夹结构。如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。退火温度Tm控制在 58-60C左右。如果是设计点突变引物,突变点应尽可能在引物的中间。
7.TaqMan 探针设计的基本原则是什么?
TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物50-150bp),但不能与引物重叠。长度一般为18-40mer 。G-C含量控制在40-80%左右。避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。在引物的5’端避免使用G。