流动相流动相流动相流动相 对流动性溶剂的要求1. 溶剂应有高纯度, 不与固定相互溶2. 溶剂应与所用检测器的性能匹配3. 溶剂对样品应有足够的溶解能力4. 溶剂应有低的溶解能力5. 溶剂应有低的黏度6. 溶剂的毒性要小 正相色谱中流动相的选择质子接受体: 乙醚或甲基叔丁基醚质子给予体: 氯仿氯仿氯仿氯仿偶极溶剂: 二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷1-氯丁烷, 异丙醚、 二氯甲烷呋喃呋喃呋喃呋喃、 、 、 、 氯仿氯仿氯仿氯仿、 乙酸乙酯、 乙醇、 甲醇、 乙腈乙腈乙腈乙腈二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷、 四氢四氢四氢四氢中等极性: 二氯甲烷异丙醚、 乙酸乙酯、 甲基叔丁基醚极性: 四氢呋喃四氢呋喃四氢呋喃四氢呋喃、 乙腈甲醇、 水二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷、 、 、 、 氯仿氯仿氯仿氯仿、 乙醚、乙腈乙腈乙腈、 异丙醇、改性剂己烷己烷己烷己烷、 庚烷正相键合相色谱己烷己烷己烷己烷、 庚烷正相液液分配色谱戊烷、 己烷庚烷己烷己烷己烷、硅胶、 氧化铝等吸附剂的液固色谱主体正相色谱类型 反相色谱中流动相的选择质子接受体: 甲醇质子给予体: 乙腈偶极溶剂: 四氢呋喃甲醇甲醇甲醇乙腈乙腈乙腈四氢呋喃四氢呋喃四氢呋喃二甲基亚砜、 乙二醇、 乙腈醇醇醇醇、 丙酮、 对二氧六环、 四氢呋喃喃喃喃、 异丙醇乙腈乙腈乙腈、 甲 甲 甲 甲四氢呋四氢呋四氢呋乙腈乙腈乙腈乙腈、 四氢呋喃四氢呋喃四氢呋喃四氢呋喃改性剂水水水水反相键合相色谱水水水水反相液液分配色谱水水水水、 甲醇、乙醇苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球、 石墨化炭黑等非极性吸附剂的液固色谱主体正相色谱类型在正相色谱中在正相色谱中在正相色谱中在正相色谱中, , , , 溶剂的强度随极性的增强而增加溶剂的强度随极性的增强而增加溶剂的强度随极性的增强而增加溶剂的强度随极性的增强而增加; ; ; ;流动相通常采用 烷烃加适量极性调整剂流动相通常采用 烷烃加适量极性调整剂流动相通常采用 烷烃加适量极性调整剂流动相通常采用 烷烃加适量极性调整剂。 。 。 。 反相色谱中常用的洗脱体系极性: 水>甲醇>乙腈>四氢呋喃(THF)强度: 水<甲醇<乙腈<四氢呋喃甲醇-水为反相色谱中最常用的流动相, 黏度下, 价格低, 水-乙腈在205nm处无紫外吸收 改变多元混合溶剂中强洗脱溶剂组成对分离选择性的影响改变多元混合溶剂中强洗脱溶剂组成对分离选择性的影响改变多元混合溶剂中强洗脱溶剂组成对分离选择性的影响改变多元混合溶剂中强洗脱溶剂组成对分离选择性的影响 加入改性剂来改善色谱分离的选择性加入改性剂来改善色谱分离的选择性加入改性剂来改善色谱分离的选择性加入改性剂来改善色谱分离的选择性离子抑制法离子抑制法离子抑制法离子抑制法: (控制pH, 抑制离子化)加入1%甲酸弱酸性样品弱酸性样品弱酸性样品弱酸性样品: : : : 加入H2SO4) ) ) )弱碱性样品: : : : 1%三乙胺加入加入甲酸甲酸甲酸( ( ( ( 或或或或乙酸乙酸乙酸乙酸、 、 、 、 三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸、 、 、 、 H3PO4、 、 、 、弱碱性样品弱碱性样品弱碱性样品三乙胺三乙胺三乙胺离子强度调节法离子强度调节法离子强度调节法离子强度调节法: : : :反相色谱中反相色谱中反相色谱中反相色谱中, , , , 分析易解离的碱性有机物时分析易解离的碱性有机物时分析易解离的碱性有机物时分析易解离的碱性有机物时, , , , 随流动相的增加的增加的增加的增加, , , , 键合相表面硅羟基与碱的阴离子的亲和力增键合相表面硅羟基与碱的阴离子的亲和力增键合相表面硅羟基与碱的阴离子的亲和力增键合相表面硅羟基与碱的阴离子的亲和力增强 强 强 强, , , , 会引 起峰形拖尾并干扰分离会引 起峰形拖尾并干扰分离会引 起峰形拖尾并干扰分离会引 起峰形拖尾并干扰分离, , , ,酸盐酸盐酸盐酸盐、 、 、 、 硫酸盐硫酸盐硫酸盐硫酸盐、 、 、 、 硼酸盐硼酸盐硼酸盐硼酸盐抑制色谱峰形拖尾抑制色谱峰形拖尾抑制色谱峰形拖尾抑制色谱峰形拖尾随流动相随流动相随流动相pH加入加入加入加入0.1%~1%的 的 的 的乙乙 乙乙 反相色谱流动相的经验性做法1、 、 、 、 一般用甲醇一般用甲醇一般用甲醇一般用甲醇/水或乙腈水或乙腈水或乙腈水或乙腈/水作流动相水作流动相水作流动相水作流动相峰分的不完全峰分的不完全峰分的不完全峰分的不完全: : : : 加大水的比例峰太靠后而分离效果又不错峰太靠后而分离效果又不错峰太靠后而分离效果又不错峰太靠后而分离效果又不错: 加大甲醇的比例。一些难分离的物质一些难分离的物质一些难分离的物质一些难分离的物质: 用乙腈/水2、 、 、 、 秘诀秘诀秘诀秘诀1:由强到弱由强到弱由强到弱由强到弱: : : :一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试 验,地得到分离结果, 然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比这样可以很快秘诀秘诀秘诀秘诀2:三倍规则三倍规则三倍规则三倍规则 :每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量, 保留因子约增加3倍, 此为三倍规则。 这是一个聪明而又省力的办法。 调整的过程中, 注意观察各个峰的分离情况。秘诀3:粗调转微调粗调转微调粗调转微调粗调转微调: : : :秘诀秘诀秘诀当分离达到一定程度, 应将有机溶剂10%的改变量调整为5%, 并据此规则逐渐降低调整率, 直至各组分的分离情况不再改变。 3、 含缓冲盐的流动相最好当天用完, 不要留置过夜, 用不完也要倒掉, 这是为了保护好机子起见, 流动相的保存期限与缓冲盐的浓度有关系, 越浓越不宜保留, 总之, 缓冲盐溶液都不宜保留超过24小时, HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。4、 缓冲盐析出的状况确实很麻烦, 一般都采用有机盐类替代无机盐, 磷酸氢二钾代替磷酸二氢钾, 不仅缓冲液配制方便, 而且泵头也比较容易清洗干净, 有利于保护泵头。