一、实验目的:
1.1理解SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的基本原理。
1.2掌握分子电泳的基本步骤,掌握计算蛋白质相对分子质量的方法。
二、实验内容和原理:
2.1电泳(electrophoresis):是指带电颗粒在电场中向着与它电性相反的电极移动的现象。许多重要的生物分子都含有可电离基团(如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等),在非等电点条件下可解离成带有电荷分子,在电场力的作用下,它们向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异,在电场中的迁移速度不同,从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。可用于样品的制备、 纯度鉴定、分子量测定等。
2.2影响带电粒子在电场中泳动的因素:①生物分子的性质:待分离生物大分子所带电荷的多少、性质、分子大小和形状都会对电泳产生明显影响。②缓冲液:缓冲液pH值直接影响生物分子的解离程度和带电性质。溶液pH值距离等电点愈远,生物分子所带净电荷就越多,电泳时速度就越快。当缓冲液pH大于等电点时,生物分子带负电荷,电泳时向正极移动;当缓冲液pH小于等电点时,生物分子带正电荷,电泳时向负极移动。③电场强度:电场强度指每单位介质长度的电位梯度(又称电位差或电位降)。一般而言,电场强度越大,电泳速度越快。但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大,从而造成电泳过程产生的热量增多,最终导致介质温度升高。降低电流强度,可以减少产热,但会延长电泳时间,引起生物分子扩散增加,同样影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度。④电渗:液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。由于支持介质表面存在一些带电基团,如滤纸表面含有羧基,琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支持介质表面带电,吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动,形成介质表面溶液的流动。当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度;当电渗方向与电泳方向相反时,则降低电泳速度。⑤支持介质的筛孔:支持介质的筛孔大小对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快,反之则泳动速度慢。
2.3电泳技术的分类:①根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳:自由电泳不使用支持介质,电泳在溶液中进行;区带电泳需使用支持介质,根据支持介质不同可分为醋酸纤维薄膜电泳、