ELISA实验技术方法与技巧大全 生物谷讲座1:ELISA 技术的-操作要点 优质的试剂,良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 操作因固相载体的形成不同而有所差异,国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点,珠式、管式及磁性球 ELSIA,国外试剂均与特殊仪器配合应用,两者均有详细的使用说 明,严格遵照规定操作,必能得出准确的结果。 4.1 标本的采取和保存 可用作ELISA 测定的标本十分广泛,体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可 作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液),有些则需经预处理 (如粪便和某些分泌物)。大部分ELISA 检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外, 其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即 可取得。除特殊情况外,在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA 中血浆和血清可同等应用。血清 标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP 标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假 阳性反应。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA 中可使本底加深。 一般说来,在5 天内测定的血清标本可放置于4,超过一周测定的需低温冰存。冻结血清 融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,避免气泡,可上下颠倒混和, 不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反 复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少量分装冰 存。保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂(见3.2.4)。 4.2 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为 新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH 计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后 使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 4.3 在ELISA中一般有3 次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。加样时应将所加