莱道菲阴谋使得伊丽莎白不得不重新考虑如何处置玛丽。1572年,议会在女王的鼓励下,订立了一道禁止玛丽成为英格兰女王的法案(即“联合合约”),其目的在于预防任何可能在刺杀女王中得益的继位者。这道法案并不是法令,但数以千计的人在上面签字,包括玛丽自己。伊丽莎白再也不能容忍玛丽,因为她收到许多报告,有人阴谋谋害她本人而让玛丽取而代之(一些历史学家认为这些都是玛丽的敌人伪造的)。玛丽斯图亚特于1587年2月8日在北安普敦郡佛斯里亨城堡被处极刑,罪名是被怀疑卷入阴谋,贝比通阴谋,企图刺杀伊丽莎白。行刑那天,玛丽身着红色,表明她是一个天主教殉教者。行刑过程是很残酷的,一些人事后回忆说那天刽子手喝醉之后长喘三口大气才把玛丽的头砍下来,当第一斧头下去,据传她用喉咙喃喃作声说:“刽子手,做完你的事儿!”关于这场行刑有很多其他版本,但经久不衰延续至当代的版本是:当刽子手拿着玛丽面容冷峻的头颅向在场的人展示的时候,这才发现玛丽戴了一个假发头套(戴着假发,就像她平时那样)。她死后的面容难以辨认。玛丽最初被埋葬在彼得镇大教堂,但是她的遗体于1612年被她的儿子,英格兰国王詹姆士一世挖掘出来了,迁葬到威斯敏斯特教堂。仍在那儿,她的墓穴和她表姑伊丽莎白的只有30英尺(9米)之遥。遗物玛丽死后被封为圣徒,跻身耶稣会殉难者之列,现存还有很多玛丽的遗物,她的祈祷书长期以来在法国展示,她的辩护书也已出版。在英语刊物中,她所做的十四行诗已经出版,在这本书里据说有她的亲笔。一位著名的德国女演员,亨德尔·席勒茨被玛丽的人生态度所感染并开始钦佩玛丽的为人,她在弗里德里希·席勒一剧中饰演“玛利亚”在德国众多城镇中赢得好评。据称她所佩戴在脖子上的十字架挂件与不幸的玛丽女王所佩戴的极其相似。在众多遗物中很少有确凿证据证明是玛丽女王曾经使用过的。但是还是有一些遗物被证实确实是女王曾经所有的。比如在行刑后覆盖在女王脸上的面纱。不知道是由于刽子手手忙脚乱还是当时环境的混乱,误伤了这位不幸女王的肩膀。这块面纱原本是J.C 希匹斯雷爵士所有,他声称他母亲是斯图亚特王朝的后代,1818年,在罗马,马提奥戴奥塔夫雕刻了一尊以他形象为蓝本的木雕,并将这尊木雕的复制品赠送给他的朋友。