Enzyme Engineering 酶工程 退出 第三章 固定化酶 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 的应用 概述 固定化酶的性质及其影响因素 固定化酶的制备 固定化细胞 固定化辅酶和原生质体 酶反应器和固定化酶(细胞) 酶反应器和固定化酶(细胞) 退出 第一节 概述 固定化酶的发展史 生物催化剂 细胞 非生长 悬浮 材料 固定化 膜固定 凝胶 吸附 化学连接物 分批 吸附 活塞模式 搅拌连续反应器 活塞模式 搅拌连续反应器 酶液 连续 生长 固定化 再循环系统 连续 间歇 可溶 吸附 包埋 间歇 交联 间歇 酶 固定化 化学连续 半连续 凝胶 连续 连续 图6-1 生物催化剂作用方式示意 退出 什么是固定化酶? 水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术 水不溶性酶 (固定化酶) 固定化酶) 退出 第一节 概述 二. 固定化酶的优缺点 多次使用 可以装塔连续反应 优点: 纯化简单 提高产物质量 应用范围广 缺点: 首次投入成本高 大分子底物较困难 退出 第一节结束 点击返回 退出 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 一. 影响固定化酶性质的因素 二. 固定化后酶性质的变化 三. 评价固定化酶的指标 退出 一. 影响固定化酶性质的因素 1. 酶本身的变化,主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生了变化。 退出 一. 影响固定化酶性质的因素 2. 载体的影响 (1) 分配效应 (2) 空间障碍效应 (3) 扩散限制效应 3. 退出 固定化方法的影响 二.固定化后酶性质的变化 1. 固定化对酶活性的影响:酶活性下降,反 应速度下降 原因:酶结构的变化 空间位阻 退出 二. 固定化酶的性质 2. 固定化对酶稳定性的影响 (1) 操作稳定性提高 (2) 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性,大多数升高,有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 (5) 对变性剂的耐受力升高 退出 2 .固定化后酶稳定性提高的原因: 固定化后酶稳定性提高的原因: a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解,提高了酶稳定性。 退出 3. pH的变化 . 的变化 PH对酶活性的影响: (1) 改变酶的空间构象 (2)影响酶的催化基团的解离 (3)影响酶的结合基团的解离 (4)改变底物的解离状态,酶与底物不能结合 或结合后不能生成产物。 退出 pH对固定化酶的影响 对固定化酶的影响 1) 载体带负电荷,pH向碱性方向移动。 退出 微环境是指在固定化酶附近的局部环境,而把主体溶液称为 宏观环境。 3. pH的变化 . 的变化 载体带正电荷,pH向酸性方向移动。 (2)产物性质对体系pH的影响 催化反应的产物为酸性时,固定化酶的pH值比游离酶的 pH值高;反之则低 退出 4. 最适温度变化 . 一般与游离酶差不多,但有些会有较明显的变化。 5. 底物特异性变化 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。 退出 6. 米氏常数 . 米氏常数Km的变化,Km值随载体 的变化, 的变化 值随载体 性质变化 (1) 载体与底物带相同电荷,Km’>Km固定化酶降低了 酶的亲和力。 (2) 载体与底物电荷相反,静电作用,Km'12 简单 大多数要光照 敏感 色素、药物、香 精、酶等 微生物细胞 1-10 0.3-6 简单 不要求 大多数不敏感 醇、有机酸、氨基 酸、抗生素、核 苷酸、酶 动物细胞 10-100 >15 复杂 不要求 敏感 疫苗、激素、 抗体、酶 主要产物 退出 固定化细胞的特点 类型:微生物细胞、植物细胞、动物细胞 生理状态:死细胞(完整细胞、细胞碎片、细胞器) 活细胞(增殖细胞、静止细胞、完整细胞) 形状:颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。 最多使用:颗粒状珠体 使用周期:理论上讲,固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性, 只要载体不解体,不污染就可以长期使用。 退出 概念: 概念: 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细 胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新 陈代谢,又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。 退出 细胞固定化方法 吸附法 包埋法 退出 酶和细胞固定化示意图 退出 吸附法 它主要通过载体与细胞间的静电引力,即细胞表面与载 体之间范德华作用力,离子键和氢键作用力,才使细胞 固定在载体上的。 退出 影响吸附法的主要因素 (1)Z-电位: Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大 小 (2)细胞的性质和细胞壁的组成:细胞壁的电荷性质 (3)载体的性质:特别是玻璃、陶瓷等无机材料 退出 包埋固定法 包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情 况下将其包埋在半透性聚合物颗粒(或膜)内的一种固 定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多 酶系统的活力,可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。 退出 包埋法分类 常用载体:琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、 聚丙烯酰胺 常用凝胶包埋法 退出 举例海藻酸钙包埋法 基本原理是:称取一定量的海藻酸钠配成水溶液,经杀 菌冷却后,与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀, 然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中 (常用CaCl2 溶液),形成球状固定化细胞 退出 通过改变载体溶液参数包埋细胞 改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和 溶剂等参数时,亦可使其转变为凝胶状态, 将细胞包埋其中。 退出 研究热点——光交联树脂包埋法 光交联树脂包埋法 研究热点 例:相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等, 加入1%左右的光敏剂,加水配成一定浓度,加热至50℃, 然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀,摊成一定厚度 的薄层,用紫外照射3min,就可制得 退出 固定化细胞的目的 微生物菌体:不需多次培养、扩大,从而缩 短了发酵生产周期 植物细胞 动物细胞 退出 第四节固定化细胞提要 特点 方法 目的 退出 第四节结束 点击返回 退出 第五节 固定化原生质体和辅酶 一 原生质体的制备 二 固定化 三 举例 四 辅酶固定化 退出 一 原生质体的制备 将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压 稳定剂的高渗缓冲液中——加入水解酶——分 离——得到原生质体 退出 二 原生质体固定化的方法 将原生质替制备好后,把离心收集到的原生质体 重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中,配成 一定浓度的原生质体悬浮液,然后采用包埋法制 成固定化原生质体。 退出 四 辅酶固定化 1 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团,参与酶的催化 反应 有机辅因子在使用过程中要流失,并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵 ——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生 退出 辅酶固定化的方法: 辅酶固定化的方法: 2 固定化方法与酶相似,一般采用溴化氰法,碳二亚胺法 以及重氮偶联法等共价偶联,或将其进行适当的化学修 饰后固定在超滤器中。 3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。 退出 辅酶的固定化 退出 辅酶的固定化 退出 辅酶固定化的形式: 辅酶固定化的形式: 退出 第五节 固定化原生质体和辅酶的固定化 原生质体 方法 固定化要点 原因 辅酶固定化 退出 方法 形式 第五节结束 点击返回 退出 酶反应器和固定化酶(细胞) 第六节 酶反应器和固定化酶(细胞)的应用 酶反应器介绍 反应器选择的依据 反应器和酶稳定性 固定化酶和细胞的应用(工农业、医药、分析化 学、酶电极、亲和色谱、环境保护、能源开发、 基础理论研究) 退出 生物催化反应器工程 通过反应器型式、 通过反应器型式 、 操作方式的改变能 否使生物催化反应效率最大化? 否使生物催化反应效率最大化? 将反应与传质紧密相关 退出 一.酶反应器。 酶反应器。 1. 分批搅拌反应器。 2. 连续流搅拌桶反应器。 3. 连续搅拌桶-超滤反应器 4. 填充床反应器 5. 循环反应器 6. 流化床反应器 退出 1. 分批搅拌反应器 . 反应器结构简单,不需要特殊装置,适与小 规模试验 退出 2. 连续流搅拌桶反应器 . 退出 连续搅拌釜式反应器 3. 连续搅拌桶 超滤反应器 . 连续搅拌桶-超滤反应器 酶循环 退出 4. 填充床反应器 . 旋转填充床 退出 5. 循环反应器 . 高效内循环生物反应器(HCR) 退出 6. 流化床反应器 . 与连续流搅拌桶式反应器类似,是让适量的颗粒 状酶悬浮于反应床中,不用搅拌器,而是底物向 上流过固定酶床,因此流速要适当控制。 退出 反应器选择 酶的形式: 底物的物理性质: 酶反应动力学 酶的稳定性 操作要求、应用和可塑性成本 退出 反应器和酶的稳定性 反应器中酶催化活性损失的原因: 酶本身失效 酶从载体上脱落 载体肢解 扩散限制效应 退出 生物催化反应- 生物催化反应-分离耦合反应器 退出 Diagram of the enzymatic synthesis of cefaclor with in situ product removal. (1) Complexation reactor, (2) enzymatic reaction reactor, (3) peristaltic pump, (4) sintered-glass (G2), (5) mechanical stirrer. 反应-分离耦合反应器成功实现产物在线分 反应- 离 Concentration (mmoldm-3) 60 7ACCA without ISPR 50 40 30 20 10 0 0 2 cefaclor without ISPR 7-ACCA with ISPR cefaclor with ISPR 4 6 8 Time (h) 10 12 青霉素酰化酶生物催化合成头孢克罗 退出 产物在线分离策略实现头孢克罗半连续制备 60 50 7-ACCA (mM) 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 Time (h) 退出 Journal of Molecular Catalysis, 17(2):81-87, 2003. Biotechnology Letters, 2003, 25 (14): 1195-1198. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic,2003,26 (1-2):99-104. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2004, 79:480-485. 减压式反应器用于生物催化反应中易挥发产 物的在线去除 退出 Wei Dongzhi*, Yu ying, Biocatalysis and Biotransformation, 2003,21(3)135-139. 生物催化合成油酸乙基葡萄糖苷酯 退出 常规反应器用 减压式反应器用 二.固定化酶(细胞)的应用 固定化酶(细胞) 1. 固定化酶(细胞)在工农业生产上的应用 2. 固定化酶在医药治疗上的应用 3. 固定化酶在分析化学中应用 4. 固定化酶和亲和色谱 5. 固定化酶与环境保护 6. 新能源开发中的应用 7. 固定化酶在基础理论研究中应用 退出 1. 固定化酶(细胞)在工农业生产上的应用 . 固定化酶(细胞) 葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。 利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶 固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类 热点:固定化原生质体的应用 退出 2. 固定化酶在医药治疗上的应用 . 例1 固定化青霉素酰化酶,只要改变pH值等条件,就 可以生成不同的产物。 退出 青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素 H2N R1 O R2 NH2 O N O S Penicillin G acylase H2O R1 + OH NH2 H N S O N O O OH 1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2) 2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe) 3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2) 4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2 = OMe Ampicillin (RI = H) Amoxicillin (R1 = OH) 7-ACA as nucleus 退出 青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素 NH2 R2 R1 O H 2N S N O Penicillin G acylase + O R3 OH H2O R1 H NH2 N S O N R3 O O OH 7-ACCA (R3 = Cl) 7-ADCA (R3 = Me) Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl) Cephalexin (R1 = H, R3 = Me) Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me) 7-ACCA or 7-ADCA as nucleus 退出 酶促合成头孢类抗生素 CHCOOCH3 + NH2 H2N N O S CH3 COOH Synthetase CHCONH NH2 O N S CH3 COOH Hydrolase Esterase CHCOOH NH2 S N O CH3 COOH + H2N 退出 -- Reversible reaction -- Hydrolysis of substrate or product by biocatalyst -- Difficulty of separation of product from reactants 固定化酶在医药治疗上的应用 例2:制造人工肾 利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装 置,大大提高了疗效。 退出 3.固定化酶在分析化学中应用 . 酶柱和酶管,可与分光光度计、荧光计或电量计结合, 形成酶电极,进行某些物质的自动分析。 退出 酶电极 特点:快速、方便、灵敏、精确 范围:糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、 脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等 要求:酶必须有较强的专一性,并且要有一定的纯度。 退出 研究新方向-微生物传感器 研究新方向 微生物传感器 呼吸活性测定型: 电极活性测定型的微生物传感器 退出 酶电极 退出 β ? D ? 葡萄糖 + O2 → D ? 葡萄糖 ? 1,5 ?内酯 + H 2O 4. 固定化酶和亲和色谱 . 亲和技术的基础:是生物活性化合物生物特异信息的综 合。 利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、高专一 性,可逆结合而设计的纯化方法 是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的分离方 法 退出 5. 固定化酶与环境保护 . 一:环境监测 二:污染物处理。 退出 6. 新能源开发中的应用 . H2是重要的能源物质,虽然有许多微生物可以产生H2, 但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢, 稳定性比天然细胞好。 将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶原膜 包被,可用于水的光介产生氢气和氧气 退出 7. 固定化酶在基础理论研究中应用 . 阐明酶反应机理 揭示酶原激活机理 退出 酶亚基性质的研究 退出 研究蛋白质-核酸分子结构 研究蛋白质 核酸分子结构 连续的固定化酶柱进行DNA序列分析 原理:是测定DNA聚合时,以掺入dNTP同时释放的焦磷 酸判断是否发生了聚合反应,进而确定掺入的是哪种核 苷酸从而推导出序列 ——该系统由连续的6个固定化酶柱组成 焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、ATP磷 酸化酶,荧光酶柱 退出 第六节结束 酶反应器 分批搅拌反应器。 连续流搅拌桶反应器。 连续搅拌桶-超滤反应器 填充床反应器 循环反应器 流化床反应器 应用 工农业生产上的应用 医药治疗上的应用 分析化学中应用 亲和色谱 环境保护 新能源开发中 基础理论研究 青霉素酰化酶 制造人工肾 酶电极 退出 第六节结束 点击返回 退出