青藏高原是世界上海拔最高、面积最大的高原,其独特的高原气候和地域特征构成了特有的生态环境,这使得青藏高原土壤微生物具有独特的环境适应特性,而当前对青藏高原特色微生物的开发利用还相对有限[11-14]。本研究旨在通过对青藏高原土壤微生物产蛋白酶菌株的筛选优化及相关特性研究,以期寻找新的蛋白酶资源,为今后的工业应用和进一步开展分子生物学方面的研究奠定理论基础,并为高原菌种资源利用提供科学依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品来源
采样地点位于青海省海北州门源县,37°N,101°E,海拔3 175 m,属高原大陆性气候,具有典型的日照时间长、太阳辐射强、昼夜温差大等高原寒温湿润性气候特征,年平均气温为0.8 ℃,年平均降水量为520 mm。青藏高原高寒草甸土壤属于寒冻雏形土,具有土壤发育年青、土层浅薄、有机质含量丰富等特征,土壤pH值在7.3左右[15]。用梅花形采样法,取高寒草甸0−10 cm土壤,过2 mm土壤筛,装入采样袋,−20 ℃保存备用。
1.1.2 主要培养基
筛选培养基(g/L):脱脂奶粉50.0,琼脂粉20.0,1×105Pa灭菌20 min,倒平板备用。
纯化培养基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉膏3.0,琼脂粉20.0,pH 7.0−7.5,1×105Pa灭菌20 min。
发酵培养基(g/L):蛋白胨10.0,蔗糖10.0,NaCl 5.0,pH 7.0−7.5,1×105Pa灭菌20 min。
1.1.3 主要试剂和仪器
福林酚、脱脂奶粉,北京索莱宝科技有限公司;蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉,北京奥博星生物技术有限责任公司;干酪素,国药集团化学试剂有限公司;Triton X-100基因组提取试剂盒,天根生化科技有限公司;碳酸钠、三氯乙酸等均为国产分析纯。