艾叶(Folium Artermisiae Argyi),别名大艾叶、 杜艾叶、萎蒿。为菊科植物艾叶Artermisiae argyi Levl.et Vant 痛,温经止血。用于小腹冷痛、经寒不调、宫冷不孕、吐血、崩漏经多、妊娠下血、皮肤瘙痒[1]。艾叶挥发油具有平喘、镇咳、祛痰和消炎等作用[2]。 艾叶挥发油具有明显的平喘、镇咳、去痰、消炎、抗过敏之功效,已制成胶囊剂用于慢性支 气管炎、肺气肿、小儿咳嗽、哮喘等病症[3]。在:2003年非典流行期问,用艾叶制作的卷 烟曾受到消费者的青睐。20世纪80年代以来,有关艾叶挥发性成分已有一些报道[4],这些 研究多集中在不同产地、提取条件等方面的分析,而没有涉及艾叶中黄酮类化合物的提取。 1.2 艾叶的抗氧化性研究进展 艾叶中含有黄酮类化合物,这些化合物是一种天然的抗氧化剂,具有清除人体中氧自由基、 抗衰老、增强机体免疫力的生理活性,在预防与治疗疾病方面黄酮类物质具有广阔的应用前 景。对与艾叶中黄酮类化合物的提取,有很多种方法,曾虹燕等人通过超临界 CO2萃取和 微波辅助萃取艾叶挥发油的试验,考察了影响提取的主要工艺和最佳工艺条件。 饮食中的抗氧化剂长期以来倍受国内外学者的关注,这是因为:(1)食物中的抗氧化剂能够 保护食物自身,以免食物氧化损伤而变质;(2)在人体中可以清除自由基,起到预防衰老、 癌症和心血管疾病等作用。(3)可被机体吸收的抗氧化剂在机体内的组织器官中发挥作用;(4) 食物中的某些抗氧化剂可作为植物提取物或纯化物作为治疗药品。 但动物与植物体内存在许多抗氧化物质参与组成体内的抗氧化体系,包括已知的抗氧化物质 如维生素 C、维生素 E、β-胡萝卜素、尿酸、黄酮等,还有一些尚未认识的抗氧化物质。 由于抗氧化物众多,单个抗氧化剂对抗氧化状态并不能代表他们在体内相互协同作用,因此, 相应产生多种测定样品的总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)或总清除自由基抗氧 化能力(total radical-trapping antioxidant capacity,TRAC)。 本项目以艾叶为研究对象,对从中提取黄酮类化合物的工艺进行研究,在提取过程中,通过 单因素试验,分析主要影响因素对提取率的影响。在单因素的基础上,通过正交试验,得到 最佳提取工艺。 实验部分2.1 实验原料与仪器 2.1.1 实验原料 艾叶、芸香叶芦(芦丁)、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、甲醇、工业酒 精、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氰铁酸钾、赤血盐、硫氰酸铵、 三氯乙酸、三氯化铁、二氯化铁、Tris(三-羟基氨基甲烷)、NADH(辅酸-I,二钠盐)、NBT (氯化硝基四唑蓝)、PMS(N-甲基吩嗪甲基)、番红花红(藏红)、EDTA-Fe()、Vc、亚油 酸,吐温-20等。 2.1.2 实验仪器 752紫外可见分光光度仪,电子分析天平,电热恒温水浴锅,植物粉碎机,恒温鼓风干燥箱, 离心机,容量瓶,移液管等。 2.2 实验方法 2.2.1 提取溶剂的确定 黄酮类化合的提取通常采用水提取和极性溶剂提取两种方法[11]。极性溶剂易渗入至原料的 内部,提取效果要好于水提取发;极性溶剂中,乙醇的使用安全性高,价格较低,可回收再 利用。所以本研究采用乙醇作为艾叶中黄酮类化合物的提取溶剂。 2.2.2 提取工艺条件的确定 溶剂提取效果受溶剂浓度、提取温度及提取时间等因素影响。本试验采用单因素试验和正交 试验来确定艾叶中黄酮类化合物最佳工艺的条件。 2.2.3 黄酮类化合物测定方法 采用NaNO2-A1(NO3)3-NaOH 显色法[12]。铝盐在碱性条件下与黄酮类化合物形成络合物, 在一定波长下有最大吸收峰,在此波长下可以进行比色分析。加入的亚硝酸起还原剂作用, 防止黄酮类化合物受氧化而损失。 2.2.4 标准曲线的制备 准确称取经105干燥至恒重的芦丁0.012g,用体积分数为60%的乙醇溶液微热溶解,冷却 后移入100mL 容量瓶中,摇匀,定容,此标准溶液的浓度为0.12g/L。分别吸取标准液0,1, 2,3,4,5mL 于25mL 容量瓶中,分别加入体积分数为30%乙醇至6mL,加入质量分数为 5%NaNO2 0.3mL,摇匀,放置5min,加入质量分数为10%Al(NO3)3,摇匀,放置6min,再 加入1mol/L 的NaOH 溶液2mL,加水至刻度,摇匀,静置10min,于波长510nm处测定吸光 度,以试剂空白作为参比液。以吸光度为横坐标、芦丁浓度为纵坐标画标准曲线。 2.2.5 提取液中黄酮类化合物含量的测定 准确吸取提取液1mL,用与提取时同浓度的乙醇溶液稀释至25mL。取1mL 稀释液置于试管 中,然后按与标准曲线相同的方法测定提取液的吸光度,计算提取率e。 e=YaV/W Y——黄酮类物质的质量浓度,mg/mLV——原提取液体积,mL W——提取用艾叶的质量,mg a——稀释倍数 根据所测定溶液的吸光度,用曲线方程计算出Y。 2.2.6 总抗氧化能力测试实验方法 分别取0、1.0ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml 不同浓度的艾叶提取溶液与不同浓度的Vc 溶液,加入2.5ml 0.2M,pH6.6的磷酸缓冲液和2.5ml 1%(W/V)的赤血盐溶液,于50水浴反 应20min,急速冷却,再加入2.5ml 10%(W/V)的三氯乙酸,将混合物于3000rpm离心10min, 取上清液2.5ml 于25ml 容量瓶中,0.5ml 0.1%(W/V)三氯化铁,用蒸馏水定容至刻度,混合 均匀,于700nm处测吸光值[13]。 2.2.7 超氧阴离子自由基测试实验方法 超氧阴离子自由基产生在 PMS-NBT[14]系统下通过 NADH 的氧化和 NBT 的还原对其进行 分析的。在此实验中,超氧阴离子自由基的生成是通过3ml 的Tris-HCl 16mM,pH8.0 其中包括78MNADH,50M NBT,10M PMS,和不同浓度的样品。PMS 作为反应的促成剂 最后加入反应体系中,反应混合物在室温静置5min 后,在560 nm处测定吸光度。 2.2.8 羟基自由基测试实验方法 羟基自由基•OH 是反应活性大、氧化能力很强的自由基,可以使糖类、氨基酸、蛋白质核酸 和脂类等发生氧化、遭受损伤与破坏。原理是化学发光试剂与活性氧自由基反应生成激发态 的产物,产物中的电子经非辐射性跃迁回到基态,放出光子。 采用 Fenton 反应产生的羟基自由基可使番红花红褪色的原理来检测。在25mL 容量瓶中加 pH=7.4 的磷酸盐缓冲液5.0mL, 50g/ml 的番红花红5.0mL,不同浓度的供试液0.5mL,3%的 过氧化氢5.0mL(新鲜配置),2mmol/L EDTA-Fe()2.5mL(新鲜配置),用二次蒸馏水标定 至刻度,混合均匀后于37水浴中反应30min 后,在520nm处测定吸光度。空白组以二次 蒸馏水代替供试液,对照组以二次蒸馏水代替EDTA-Fe()和供试液,并按下式计算清除率: 清除率=(A 样品—A 空白)/(A对照—A 空白)。 其中:A 样品是加入样品后的吸光度,A 空白是未加样品的吸光度,A 对照是未加样品和 EDTA-Fe()的吸光度。 结果与讨论3.1 艾叶中黄酮类物质的提取 3.1.1 芦丁标准曲线的绘制 芦丁标准曲线芦丁标准曲线如图1 所示,R 为相关系数。 3.1.2 单因素分析实验 (1)不同乙醇浓度对提取率的影响 精确称取6 份(0.25g)艾叶粉(用植物粉碎机粉碎后过0.4mm的筛子)[12]于具塞试管中,分别 加入体积分数为0,20%,40%,60%,80%,100%的乙醇各7.5mL,在60恒温水浴锅中 提取4h,趁热过滤,冷却后分别取1mL 提取液,置于25mL 容量瓶中,用同浓度的提取液 定容至25mL,然后按照2.2.5 条的方法,分别加入体积分数为30%乙醇至6mL,加入质量 分数为 5%NaNO20.3mL,摇匀,放置 5min,加入质量分数为 10%Al(NO3)3,摇匀,放置 6min,再加入1mol/L 的NaOH 溶液2mL,加水至刻度,摇匀,静置10min,于波长510nm 处测定吸光度,以试剂空白作为参比液。图 的提高,黄酮的提取率呈上升到下降的趋势,体积分数达到 40%,提取率最大,浓度大于 40%后随着体积 分数的进一步升高,黄酮提取率反而有所下降.这可能是因为艾叶中黄酮为多种化合物的混 合物,包括各种黄酮苷和苷元,这些物质由于极性和化学结构不同,在不同极性的提取溶剂 中的溶解度也不相同。本实验表明,体积分数为 40%的乙醇溶液相对于其他浓度能更好地 提取出艾叶中的黄酮类化合物。 不同乙醇浓度对提取的影响(2)料液比对提取率的影响 精确称取4 份(0.50g)艾叶粉于具塞试管中,分别加入乙醇浓度为40%的乙醇5,10,15,20mL, 料液比分别为1:10,1:20,1:30,l:40。在60恒温水浴锅中提取4h,趁热过滤,冷 却后分别取1mL 提取液,置于25mL 容量瓶中,用同浓度的提取液定容至25mL,然后按照 条的方法进行黄酮类化合物的测定。图3表明,随着料液比W: 的升高,提取率也随之增大,但当料液比达到1: 30 后,黄酮类化合物的提取率增加缓慢.黄酮类化合物的提 取在考虑提取率的同时,还应该考虑提取剂用量和提取液蒸发浓缩时的能源消耗[15],因此 需要对料液比进行进一步的研究。 料液比对提取率的影响(3)提取时间对提取率的影响 精确称取 份(0.25g)艾叶于具塞试管中,加入乙醇浓度为40%的乙醇各 7.5mL,在60的 恒温水浴中分别提取1,2,3,4h,趁热过滤,冷却后分别取1 mL 取液,置于25mL 容量 瓶中。用同浓度的提取液定容至25mL,然后按照2. 表明,提取时间为1h时,提取率较低;随着时间的延长,艾叶黄酮类物质的提取率不 断上升,但是升高的幅度逐渐变小。 提取时间对提取率的影响(4)提取温度对提取率的影响 精确称取5 份(0.25g)艾叶于具塞试管中,分别加入乙醇浓度为40%的乙醇各7.5mL,分别在 40,50,60,70的恒温水浴中提取4 h,趁热过滤,冷却后分别取1mL 提取液,置于25mL 容量瓶中,用同浓度的提取液定容至 25mL,然后按照 2.2.5 条的方法进行黄酮类化合物的 测定。图5 表明,随着提取温度的升高,提取率呈增加的趋势。但综合考虑提取温度过高会 对提取液中的黄酮类化合物的活性造成破坏,杂质溶出较多,同时高温提取能耗也较大,因 此提取温度以不超过70为好。 提取温度对提取率的影响3.1.3 正交实验 单因素实验对上述不同提取工艺参数进行了初步的筛选,为了分析参数影响主次因素,得到 最佳的提取工艺,进行正交实验。参照单因素实验结果,以影响黄酮类化合物提取率的乙醇 浓度、料液比、提取时间和提取温度为4 个影响因素,取各自的不同水平进行正交实验,实 验设计及结果分析如表1 所示。由表1 可知。RD RC>RB RA,提取温度之间存在显著差异,最佳提取工艺为 A2B2C2D3 在最优化验证试验中。