l. 5无菌获取脾脏, 用剪刀反复剪切至糊状, 然后用不锈钢网筛(l00 目 )滤过。 离心 l 000 r /min、l0 min 后弃上清,用低渗休克法溶解红细胞[2]。 最后用 RPMI-l640 培养液悬浮细胞。 台盼蓝染色,细胞活力> 95% 。l. 6腹腔巨噬细胞的分离过量乙醚处死大鼠, 腹腔内注入无菌预冷的 PBS 30 ~ 50ml, 按摩腹部 l min, 吸出腹腔液, 离心 l 000 r /min、 l0 min, 用RPMI-l640 培养液悬浮细胞, 于 37 C、 5% CO2培养箱中培养 2h, 洗去未贴壁细胞, 轻轻刮下贴壁的巨噬细胞 (MacrOphage,M#),调细胞浓度为 l X l06/ml 备用。 经瑞氏染色法鉴定 M# 细胞纯度> 90% ;台盼蓝染色,细胞存活率> 95% 。l. 7脾淋巴细胞增殖能力测定取无菌制备的大鼠脾淋巴细胞悬液, 并调细胞浓度为 l Xl06/ml。 于 96 孔无菌培养板内每孔加入: 细胞悬液 0. l ml, 含有或不含有 COnA 的 RPMI-l640 培养液 0. l ml(COnA 终浓度 5!g /ml), 一式三孔。 于 37 C、 5% CO2培养箱中培养 48 h, 加入3~-TcR 20 !l(0. 25 !Ci /ml) /孔,继续培养 l6 h。用多头细胞收获仪收集细胞,用液闪仪测其放射性(cpm)。IL-2 活性(细胞法)[3 ]和 IL-2 受体测定(ELISA法)测定[4]l. 824 孔培养板上每孔加入: 脾细胞悬液 l ml, COnA 50 !l(终浓度 l0 !g /ml),于 37 C,5% CO2培养中培养 24 h,离心。 收集的上清 - 70 C 保存, 为 IL-2 待测样本; 细胞用于 IL-2R 测定。IL-2 活性和 IL-2R 测定的详细步骤见参考文献[3,4]。腹腔巨噬细胞 M~C-$ 抗原表达的测定[5 ]l. 9取腹腔巨噬细胞悬液 l ml, 加入 OX6、 OXl7(荧光标记) 各l0 !l,4 C 避光放置 30 min,其间混悬细胞 l 次。 用 PBS 洗涤细胞 2 次,上流式细胞仪进行测定。l. l0TNF-" 的测定按试剂盒说明书操作。腹腔巨噬细胞吞噬能力测定[6]l. ll大鼠腹腔注入 l0% 鸡红细胞 l ml, 30 min 后处死大鼠。 分离腹腔巨噬细胞。吸 0. 5 ml 滴于载玻片上,37 C 孵育 30 min,用生理盐水洗掉未贴片的细胞,晾干。 用 lf l 丙酮 - 甲醇液固定,姬姆萨 - 瑞氏染色液染色, 在高倍镜下或油镜下观察计数 200个巨噬细胞,计算吞噬率。吞噬率 = 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞 /巨噬细胞数 X l00%l. l2统计学处理实验所得数据以 ! " # 表示, 分别用 $ 检验进行统计学处理。"实验结果2. lGS 对创伤失血性休克大鼠脾淋巴细胞增殖、IL-2 活性、 IL-2R 表达的影响和正常对照组大鼠相比, 创伤失血性休克 l c 大鼠脾淋巴细胞增殖、IL-2 活性、 IL-2R 降低。 GS 体内应用 (2. 5 mg /l00 g)对大鼠淋巴细胞免疫功能有明显的升高作用,见表 l。325第 4 期刘靖华,等 . 人参皂甙对创伤失血性休克免疫功能的调节作用 表 2GS 对创伤失血性休克 1 d 大鼠脾淋巴细胞免疫功能的体外调节作用 ( n = 6)Tab 2Effect of GS on splenocyte function 24 hours aftertrauma-hemorrhage in vitro ( n = 6)GroupGS (!B/"g ・ mI- 1) ProIiferation (min- 1)IL-2 (U/mI)IL-2R#( !495)ControI05724.5 1 438.267.83 1 0.750.3402 1 0.03T-HS02902 1 272.01! !2.13 1 0.45! !0.1737 1 0.07!T-HS+ GS13350.17 1 131.33#3.63 1 0.56##0.2385 1 0.02#103846.33 1 101 .01##4.38 1 0.60##0.2833 1 0.03#1003772.5 1 225.80##4.08 1 0.71##0.2770 1 0.02#T-HS: Trauma-hemorrhagic Shock;!: " < 0.05,!!: " < 0.01#$ controI; # : " < 0.05, ## : " < 0.01 #$ T-HS表 3GS 对创伤失血性休克 1 d 大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响 ( ! = 10)Tab 3Effect of GS on pM!function 24 hours after trauma-hemorrhagic shock 24 hours "! #"#$ ( ! = 10)GroupPhagocytosis ( %)I-A ( %)I-E ( %)TNF!("B/pg ・ mI- 1)CoitroI32.4 1 1 .6670.0 1 1 .4568.4 1 3.52296.21 1 23.42T-HS27.2 1 3.54!37.5 1 5.64! !34.6 1 5.26! !133.42 1 12.11! !T-HS + GS37.5 1 4.24##49.2 1 2.04#48.5 1 3.86#208.25 1 16.38#T-HS: Trauma-hemarrhagic shock;!: ! < 0.05,! !: ! < 0.01"# coitroI; # : ! < 0.05, ## : ! < 0.01 "# T-HS表 4GS 对创伤失血性休克 1 d 大鼠腹腔巨噬细胞功能的体外调节作用 ( n = 6)Tab 4Effect of GS on pM!function 24 hours after trauma-hemorrhagic shock in vitro ( n = 6)Group GS (!B/"g ・mI- 1)Phagocytosis ( %)I -A ( %)I -E ( %)TNF-#(!B/pg ・ mI- 1)ControI033.4 1 1.7671.32 1 1.2268.77 1 1.58281.17 1 25.58TH-S028.4 1 3.18! !38.27 1 5.99! !35.68 1 5.97! !130.67 1 10.21! !T-HS+ GS131.7 1 1.1940.48 1 4.65#41.83 1 1.19#160.83 1 17.01##1033.23 1 1.59#44.30 1 2.03#45.48 1 1.87##170.33 1 22.28##10032.15 1 1.09#45.13 1 1.08#42.58 1 3.05#168.5 1 17.17##T-HS: Trauma-hemarrhagic shock controI;!!: ! < 0.01"# controI; # : ! < 0.05, ## : ! < 0.01 "# T-HS2. 2GS 对创伤失血性休克大鼠脾淋巴细胞免疫功能的体外调节作用一定浓度范围内的 GS(1 ~ 100 !g /ml) 在体外对创伤失血性休克大鼠 1 d 脾淋巴细胞增殖、 IL-2 产生、 IL-2R 表达均有不同程度的升高作用,见表 2。2. 3GS 对创伤失血性休克大鼠腹腔巨噬细胞 MHC-" 抗原表达、TNF-# 释放、巨噬细胞吞噬活性的影响和正常对照组大鼠相比, 创伤失血性休克后 1 d 大鼠腹腔巨噬细胞 MHC-"表达降低, TNF-# 分泌减少, 巨噬细胞吞噬活性降低。 GS 体内应用后对上述各指标均有明显的升高作用,见表 3。2. 4GS 对创伤失血性休克大鼠腹腔巨噬细胞 MHC-" 抗原表达、TNF-# 释放、吞噬功能的体外调节作用不同浓度范围内的 GS(1 ~ 100 !g /ml) 在体外对创伤失血性休克 1 d 大鼠 MHC-"抗原表达、 TNF-# 释放、 吞噬功能均有不同程度的改善作用,见表 4。