1 材料与方法1.1 药物制备左归丸由熟地、淮山药、枸杞子、山茱萸、菟丝子、川牛膝、鹿角胶、龟版胶依次按 8∶4∶4∶4∶4∶2∶4∶4 称量, 前 6 味浸泡 30 min后水煎, 分别煎煮 20 min、40 min、60 min 后将3次的药液混合, 后2味加温溶于其中, 制成浓度为1∶1 的水溶液 100 ml, 4℃保存。右归丸以熟地、山茱萸、山药、枸杞子、菟丝子、鹿角胶、杜仲、当归、肉桂、制附子按 8 ∶3 ∶4 ∶4 ∶4∶4∶4∶3∶2∶2 比例称取, 除鹿角胶烊化外其余均水煎, 制备及保存方法同左归丸。上述 -223-中药均购于成都中医药大学第二附属医院, 并自行熬制而成, 制备后的左、右归丸溶液其生药含量均为 500 g/L。1.2 实验动物分组将4~5周龄正常清洁级雄性ICR小鼠(购于成都中医药大学动物实验中心)置于室温 20℃~25℃、相对湿度 45%~55%、每日光照 14 h 环境下自由摄食, 饲养 1 周后随机分为实验组和对照组, 每组 10只。采用灌胃方式灌服, 实验组灌服给予制备好的左、右归丸, 每次各 0.5 ml, 分别含左、右归丸的生药 0.25 g, qd × 14 d; 对照组以等量生理盐水(1 ml)替代, 每次剂量为 1 ml。于末次灌胃后第 7日与雌鼠交配进行体内实验, 以获取受精卵。1.3 自然受精小鼠卵的卵裂率和囊胚形成率于末次灌胃后第 7 日(即灌服第 21 日)与腹腔注射 hCG(宁波第二激素厂)10 IU的超促排卵雌鼠按雌∶雄为 2∶1 进行合笼交配, 将确认有阴道栓形成的雌鼠, 在注射 hCG 18~24 h 后处死, 每组 10只, 取出1-细胞胚胎(受精卵), 移入透明质酸酶(美国Sigma公司)中消化颗粒细胞, 然后迅速将卵子移入Hepes-HTF(美国Sage公司)中冲洗数次, 最后移入 HTF Quinn’s 培养液(美国 Sage公司)中冲洗, 再移入预先已准备好的生长皿中, 于体积分数5%CO 2培养箱中培养 24 h, 将分裂至 2-细胞期的胚胎置于新的 HTF Quinn’s培养液中继续培养至第 4日~第 6 日, 记录到达囊胚期的胚胎数(卵裂率), 计算囊胚形成率, 囊胚形成率(%)= 囊胚数/2-细胞胚胎数× 100%。1.4 小鼠成熟卵体外受精率和囊胚形成率将上述确认与雌鼠交配成功的每组10只雄鼠3 d 后分别处死, 剪开附睾尾, 取部分附睾制备精子悬液, 以超促排卵获取雌鼠的成熟卵母细胞, 分别进行精子穿卵实验, 观察实验组和对照组的体外受精(IVF)率和囊胚形成率; 体外受精率(IVF率)=2-细胞胚胎数/ 获取的成熟卵细胞数× 100%。1.5 FITC-PSA 染色将上述剪开的附睾尾, 立即放置于盛有 HTFQuinn’s培养液的表面皿中(培养基使用之前在37℃、体积分数 5%CO 2 孵箱预平衡过夜), 在 37℃、体积分数5%CO 2 孵箱获能1.5 h后, 分别取密度为5×10 6 /ml精子悬液 20 µl 到 0.5 ml 离心管中。为诱导顶体反应, 将事先用工作缓冲液(PBS)配制好的 4 µg/ml 孕酮(美国 Sigma 公司)20 µl 分别加入每组精子悬液中, 并在 37℃黑暗中孵育 1 h。每组取 20 µl 被孕酮诱导的精子悬液到 0.5 ml 离心管中, 分别加入100% 甲醇 250 µl 后冰中孵育至少 1 h。1 500 × g离心 5 min, 弃上清液, 分别取沉淀 10 µl 涂片。空气干燥后滴加丙酮, 5 s后立即在暗光下用已配置好的 FITC-PSA 溶液(美国 Sigma 公司)染色至少10 min。用双蒸水洗涤 2 min × 2 次, 用体积分数2% 福尔马林固定 15 min, 最后双蒸水洗涤、干燥后甘油封片。在 1 000 倍荧光显微镜下, 每张涂片计数至少400个精子, 若精子头部区域出现均匀的荧光, 代表完整的顶体; 若在精子赤道板出现不均匀的荧光, 则代表不完整的顶体, 即在孕酮诱导下部分或完全发生了顶体反应; 计算具完整顶体(acrosome-intactspermatozoa, AIS)的精子百分率。1.6 顶体酶活性检测特异性顶体酶活性检测采用 Kennedy 等的方法[5] , 首先将从附睾尾获取的精子调整密度至>7.5×10 6 /ml, 取每份精子悬液样本约200~500 µl,加入到1.5 ml 离心管中, 每管中先加入0.5 ml Ficoll溶液(美国 Sigma 公司), 每例标本同时设 2 管, 分别为测定管(T)和对照管(C), 每管精子悬液用体积分数2% 福尔马林(美国 Sigma 公司)100 µl 固定, 15 min后每管均加入100 µl反应液(美国Sigma公司), 马上再加入 100 µl 终止液到对照管(C)。T、C 管再同时在24℃水中孵育至少1 h, 最后加入100 µl终止液到测定管(T), 1 500 × g 离心 10 min。分光光度计(410 nm 波长、0.5 cm 比色杯)用双蒸水调零后分别读出测定管(T)和对照管(C)的 OD 值。