引物的设计
引物的科学含义可以自行百度,一个简单的比喻就是唱歌的时候起的一个头。引物必然是特异性的,所以它们的设计不理想会导致后续实验失败。设计引物有以下几种方法:
1、抄袭大法:如果课题组/所在实验室有好的引物序列,直接抄;第二种抄袭就是从文献里拉出来,再去primer blast里验证。(此方法有风险,嗯,除了已经用过的确保可靠无误的引物,其他的方法都有风险= =)
2、请公司设计:生工可以免费设计,其他公司必然也有免费/付费设计,具体不详。
3、NCBI挑选:
NCBI-把数据库改成Gene-输入基因名词-Search
选择基因的种属-human/ house mouse/horse…
选择完基因后点击进入-下拉下拉再下拉-mRNA and protein(s)-NM_nnnnnnn点击进入-pick primers
修改参数-max改成150.200也可以-exonjunction span改为primer must span an exon-exon junction(一个分子生物学的知识:基因有外显子和内含子,如果没有任何限定的话,cDNA和genomic DNA都会被扩增。跨内含子设计的情况下只有cDNA得以扩增,就去除了genomic DNA的干扰。)-最后在最下面get primers
最后经过至少1分钟的等待,会显示出几条备选引物。根据法则挑选出合适的引物。
挑选引物的法则如下:
1、引物长度18-27bp,不大于38bp
2、3'端碱基一般不用A,最好用T。
3、3'端避开密码子第三位
4、GC比例40%-60% ,Forward和Reverseprimers 退火温度(Tm) 55-75℃,72℃为宜,且相差不超过4℃。
5、Self complementarity0-3为理想状态;self 3' complementarity 严格