一 原理: IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特 异性地结合到免疫球蛋白的 FC 片段的现象活用开发出来的方法。目前多 用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上,使之与含有抗 原的溶液及抗体反应后, beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目 的。 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免 染能结合未必能用在 IP 反应。 建议仔细检查抗体的说明书。 特别是多抗的 特异性是问题。 其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白, 特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活 性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用 弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其 它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使 IP 成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。 再次, 为防止蛋白的分解, 修饰, 溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂, 低温下进行实验。 每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原, 过多则就不能沉降在 beads 上, 残存在上清。 缓冲剂太少则不能溶解抗原, 过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。 IP 实验步骤 蛋白酶抑制剂的用量:0.5% 磷酸酶抑制剂的用量:1% Lysis buffer 的用量:一般是细胞离心体积的 5-10 倍。6 孔板加 200-300ul 左右。 基本实验步骤 (1)弃培养液,PBS 清洗细胞一遍。收获细胞,加入适量细胞 IP 裂 解缓冲液(含蛋白酶抑制剂) ,冰上或者 4℃裂解 30min,超声破碎 3-5S, 4℃离心,12,000g, 30 min 后取上清 20ul; (置于冰上操作) 给取的上清液中加入 20-30ul 2×loading buffer. (2) 取少量裂解液(25-30ul)以备 Western blot。 (3)平衡 beads:取 0.5mlEP 管,加入 10ul Beads,将提前放置在冰上 的 Lysis buffer 500ul 加入 EP 管中, 混合后再将小管放入 1.5 的 EP 管 中离心,200rcf,1min(枪头剪一点吸 Beads,Beads 用量不宜过多) (4)弃去上面的 Lysis buffer,用小针头平面朝向管壁轻轻吸去 Lysis buffer.用 Lysis buffer 将 Beads 洗三遍(200rcf ,1min, 3 次) 。 (5)加 40ul 2×loading buffer 到 Beads 上,管底打孔,放到 1.5ml 的 EP 管中离心,10000g,1min. 剩余裂解液将 1?g 相应的抗体和 10-50 ?l protein A/G-beads 加入到细 胞裂解液,4°C 缓慢摇晃孵育过夜; (3)免疫沉淀反应后,在 4°C 以 3,000 g 速度离心 5 min,将 protein A/G-beads 离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads 用 1ml 裂解缓冲液洗 3-4 次;最后加入 15?l 的 2×SDS 加样缓冲液,沸水 煮 10 分钟; (4)SDS-PAGE, Western blotting 实验方法:免疫沉淀法 实验所需主要器材:4℃离心机、透析袋、离心管、微量加样器、 实验所需主要试剂:透析液、蛋白 A 微球平衡液 、蛋白 A 微球、正常兔 血清、兔多克隆抗体、PBS、甘氨酸洗脱液(pH 3.5 ) 实验步骤: (一)透析去除小分子物质 4℃条件下, 将收集各管蛋白并入透析袋内, 放入透析外液 (含 Na2HPO4、 NaCl, pH 8.0)约 300 毫升,每 3~4 小时换浓度降低透析外液。最后将蛋 白溶液装入离心管中,约 6~8 ml. .(二)蛋白溶液的预处理 1、每 1 ml 蛋白溶液加 50 ul 正常兔血清或 IgG(浓度?) 2、冰上孵育 2hr 3、 平衡蛋白 A 微球: 将蛋白 A 微球悬浮于洗脱缓冲液中, 搅拌后 10000g 离心,弃洗液,置于冰上 4、将蛋白溶液与蛋白 A 微球混合 5、冰上 30 分钟,4000 g×3min,4 ℃离心。小心将上清移至另一试管中 (增加蛋白 A 的浓度,彻底去处用于预处理的非特异性抗体) (三)免疫复合物的沉淀 1、预处理的蛋白溶液置于适当数量的 1.5ml 的管中(0.5ml/管) ,加入抗 血清 1ul 作为起始用量(滴定抗体量:范围 0.5ul~5ul) 2、冰上孵育 2hr 3、加入 100ul 蛋白 A 微球(10%的悬液) ,4℃摇动 1hr 4、10000g×15sec,4℃ 离心,收集微球, 5、将 0.5 倍体积的的 PBS pH7.4 ,与沉淀混匀 15min, 离心后弃上清。重 复3次 (四)目的蛋白的洗脱 1、 将 0.5 倍体积的 pH3.5 的甘氨酸-盐酸洗脱液与沉淀复合物颠倒混匀 15min ,离心收集上清 2、 重复 2~3 次, 3、 取各管 SDS-PAGE,鉴定组份。 Protocol 1 调制 protein A sapharose protein A sapharose 5ml 溶于 20ml 含 0.02%NaN3 的 PBS 离心 2000 转 2 分,去上清,在沉淀加 0.02%NaN3 的 PBS,离心后去上 清,重复 2 次,最后沉淀加 20ml 含 0.02%NaN3 的 PBS,冷藏保存 用单抗做一抗时,把 protein A sapharose 先用抗鼠 Ig 兔血清处理(每 50ulprotein A sapharose 用 1-5ul 血清)。旋转 1-2h,混匀后,再离心 1-2s 去上清后,加 PBS,vortex 混合,离心去上清,重复二次 加含 0.02%NaN3 的 PBS 到原来体积,冷存。避免长期保存。 2.抗原的检出 以下操作全在冰面或 4 度进行 去除细胞培养液,用冷 PBS 洗一次。加 RIPA,溶解后,转移到 eppentube 中用 vortex 混匀。RIPA 的量:6cm 的培养皿加 1 ml(蛋白质的量为 500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。 30m,15000rpm 离心,上清转移到新 tube 。不用移液枪,直接从 tube 倒进另一个 tube 往上清加抗体,1ml 加 2-5ul 抗体,冷室内旋转混匀 1h 加 protein A sapharose50ul,再混匀 1h 5000rpm 离心 1s,使 sapharose 沉淀, 去上清。 sapharose 加 RIPA, 往 vortex 混匀,离心,去上清。重复 4 次洗净。 加电泳用 sample 缓冲液 40ul,2m 煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。 3.注意点 A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论 怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。 B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含 300mM,1omMNaCl 的 RIPA 洗净各一次。(完)