3.1大豆异黄酮soybean i sofl avone大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的总称,黄酮类物质。分子式如下:大豆苷;Cz,H。。O 。,大豆黄苷:C22H:20。。,染料木苷:c2。H:。O 。大豆素:C。。H。oO t,大豆黄素:c-eH,zO s,染料木素:c15H1005。4方法提要样品制备、提取、过滤后,经高效液相色谱仪分析(c,。柱分离),依据保留时间定性,用外标法定量。5试剂和材料本标准使用符合G B/T 6682规定的一级水。除另有规定仅使用分析纯试剂。5.1乙腈:色谱纯。5.2甲醇:优级纯。80%甲醇:用甲醇80 m L,加水20 m L,混匀。5.35.4磷酸。5.5磷酸水溶液:用磷酸调节pH 至3.0,经0.45 pm 滤膜过滤。5.6二甲基亚砜:色谱纯。50%二甲基亚砜溶液:取二甲基亚砜50 m L,加水50 m L,混匀。5.75.8大豆异黄酮标准贮备溶液:称取大豆苷( dai dzi n) 、大豆黄苷( gl yci ti n) 和染料木苷( geni sti n) 、大豆】 G B/T 23788--2009素( dai dzei n) 、大豆黄素( gl yci tei n) 和染料木素( geni stei n) ( 纯度均为98.0%以上) 各4 m g,分别置于10 m L容量瓶中,加入二甲基亚砜( 5.6) 至接近刻度,超声处理30 rai n,再用二甲基亚砜( 5.6) 定容。各标准贮备溶液浓度均为400 rag/L( 大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素) 。5.9大豆异黄酮混合标准使用溶液:8.0 m g/L混合标准溶液配制:吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液( 5.8) 各0.2 m L于10 n1L容量瓶中,加入等体积水,用50%二甲基亚砜溶液( 5.7) 定容。16.0m g/L混合标准溶液配制:吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液( 5.8) 各0.4 m L于10 m L容量瓶中,加入等体积水,用50%二甲基亚砜溶液( 5.7) 定容。24.0 m g/L混合标准溶液配制:吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液( 5.8) 各0.6 m L于10 m L容量瓶中,加入等体积水,用50%二甲基亚砜溶液( 5.7) 定容。32.0 m g/L混合标准溶液配制:吸取大豆苷、大豆黄昔、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液( 5.8) 各0.8m L于10m L容量瓶中,加入等体积水,用50%二甲基亚砜溶液( 5.7) 定容。40.0m g/L混合标准溶液配制:吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液( 5.8) 各1.0m L于10m L容量瓶中,加入等体积水,用50%二甲基亚砜溶液( 5.7) 定容。6仪器和设备6.1高效液相色谱仪:带紫外检测器( 或二极管阵列检测器) 。6.2超声波振荡器。6.3分析天平:感量0.01 m g。6.4酸度计:精度0.02 pH 。6.5离心机:转速不低于8000r/m i n。6.6滤膜:孔径为0.45 btm 。6.7容量瓶:10 m L。7分析步骤7.1样品处理7.1.1固体样品、半固体样品:固体样品粉碎、磨细( 过80目筛) 、混匀,半固体样品混匀,称取样品0.05g~o.5 g( 精确至0.1 m g) ,用80%甲醇溶液( 5.3) 溶解并转移至50 m L容量瓶中,加入80%甲醇溶液至接近刻度。7.1.2液体样品:吸取混匀的液体样品0.5m L~5.0m L于50m L容量瓶中。加入80%甲醇溶液至接近刻度。7.1.3将上述样品溶液( 7.1.1或7.1.2) 用超声波振荡器振荡20rai n,用80%甲醇定容,摇匀。取样品溶液置于离心管中,离心机离心15 m i n( 转速大于8000r/m i n) 。取上清液用滤膜( 6.6) 过滤,收集滤液备用。7.2色谱条件7.2.1色谱柱c,。,4.6 ram × 250 m FIl ,粒度5 pm 不锈钢色谱柱;也可使用分离效果相当的其他不锈钢柱。7.2.2流动相流动相A:乙腈( 5.I) 。流动相B:磷酸水溶液( pH =3.O ) ( 5.5) 。7.2.3梯度洗脱条件见表1。 表1GB/T 23788--2009时间/m i n010233050555660流动相A/"/.1218243030801212流动相B/%88827670702088887.2.4流速;1.0 m L/m i n。7.2.5波长:2607.2.6进样量:10 pL。7.2.7柱温:30℃。7.3测定7.3.1定性分别将大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素的标准贮备溶液( 5.8) 稀释10倍后,按色谱条件( 7.2) 进行测定,依据单一标准样品的保留时间,对样品溶液中的组分进行定性,定性色谱图参见附录A。7.3.2定量将大豆异黄酮混合标准使用溶液( 5.9) 在色谱条件( 7.2) 下进行测定,绘制以峰面积为纵坐标、混合标准使用溶液浓度为横坐标的标准曲线。将7.1.3制备的样品溶液注入高效液相色谱仪中,保证样品溶液中大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的响应值均在工作曲线的线性范围内,由标准曲线查得样品溶液中大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的浓度。1' 11"11。8结果计算8.1( x;) 和染料木素( x。) ] 的含量分别按式( 1) 计算:样品中大豆异黄酮各组分[大豆苷(x,)、大豆黄昔(%)、染料木苷(xa)、大豆素(xt)、大豆黄素墨一.× 羔× 揣⋯⋯⋯⋯⋯⋯( 1)式中:x。——样品中大豆异黄酮单一组分的含量,单位为毫克每千克(m g/kg)或毫克每升(rag/L);c.——根据标准曲线得出的大豆苷(或大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素)的浓度,单位为毫克每升( m g/L) ;y——样品稀释液总体积的数值,单位为毫升(m L);m ——固体、半固体样品质量的数值,单位为克(g);液体样品体积的数值,单位为毫升( m L) 。8.2样品中大豆异黄酮总含量,按式( 2) 计算:X=X。+X:+X。+X。+墨+Xs式中:x——样品中大豆异黄酮总含量,单位为毫克每千克(m g/kg)或毫克每升(m g/L);x,——样品中大豆苷的含量,单位为毫克每千克(m g/kg)或毫克每升(rag/L);x。——样品中大豆黄苷的含量,单位为毫克每千克(m g/kg)或毫克每升(m g/L)}墨——样品中染料木苷的含量,单位为毫克每千克(m g/kg)或毫克每升(m g/L);x。——样品中大豆素的含量,单位为毫克每千克(m g/kg)或毫克每升(m g/L);x;——样品中大豆黄素的含量,单位为毫克每千克(m g/kg)或毫克每升(rag/L);x。——样品中染料木素的含量,单位为毫克每千克(m g/kg)或毫克每升(m g/L)。计算结果应表示到小数点后一位。9精密度在重复性条件下,两次独立测定结果之差不得超过算术平均值的l O W 。 G B/T 23788--2009毫吸光单位350250200150- 50附录A( 资料性附录)标准样品色谱图