犬是组织工程泌尿道修复重建常用的动物模型之一[12]; 尿路上皮细胞衬覆于肾盂、 输尿管、 膀胱和后尿道的泌尿道腔内面, 任何一个部位分离培养的尿路上皮细胞生物学特性无明显差异[13, 14]。 因此, 我们以犬为研究对象, 通过膀胱移行上皮细胞的体外培养来探讨尿路上皮细胞体外培养的技术方法。 目前, 文献报道尿路上皮细胞原代培养的方法主要包括组织块法、 酶消化法、 刮取法和尿脱落细胞法四种[15217 ], 具体培养条件不尽相同, 各有优缺点。 其中, 组织块法不需酶的消化, 细胞活力保持较好, 但培养周期长, 细胞萌出率低,获取的细胞数量少, 且易有成纤维细胞混杂; 酶消化法虽能获得大量的单细胞悬液, 但须采用低浓度蛋白水解酶消化并严格控制消化时间, 否则容易造成细胞损伤, 影响细胞活力; 刮取法具有简便且能避免酶消化的优点, 但获得的细胞数量有限; 尿脱落细胞法获取的尿路上皮细胞不仅数量和活力有限, 而且可能有其他细胞混杂。 我们经过多次实验表明, 采用先机械分离获取黏膜层, 再用低浓度胰酶消化, 能够从 4~ 6 cm黏膜组织中获取 (1~ 5) × 106个细胞, 在消化的过程2膀胱中严密观察, 严格控制消化时间, 获取的细胞活力良好, 体外增殖迅速, 原代培养约 1 周即可传代, 传代后每5~ 7 天又可再传1 代, 经过3~ 4 周可体外扩增得到约 9× 107个细胞, 完全能够满足构建组织工程尿路上皮组织的需要。 另外, 在膀胱移行上皮细胞培养过程中应重视成纤维细胞的污染问题, 否则上皮细胞容易被成纤维细胞的优势生长所代替。 如发现有成纤维细胞混杂, 则利用膀胱移行上皮细胞与培养瓶底壁粘附紧密、 不易消化的特点, 将混杂的成纤维细胞与膀胱移行上皮细胞分开, 使上皮细胞纯化[18 ]。 我们的研究采用该方法纯化体外连续培养的膀胱移行上皮细胞, 细胞纯度较高, 无成纤维细胞混杂污染。我们通过细胞形态学、 超微结构观察和免疫组织化学染色对所培养的膀胱移行上皮细胞进行鉴定。 在倒置相差显微镜下体外连续培养的膀胱移行上皮细胞为多角形, 大小均一, 呈铺路石样紧密排列, 细胞核大,核仁明显。 透射电镜下可见上皮细胞特征性张力微丝和细胞间桥粒连接。 角蛋白是上皮细胞的特异结构蛋白和分化标志产物[19 ], 采用免疫组织化学方法检测培养细胞角蛋白抗体阳性, 证实所培养细胞为上皮细胞。　　本研究建立了一种较好的犬膀胱移行上皮细胞体外连续培养扩增的方法, 采用该方法能从较少的膀胱组织中分离获取较大量的膀胱移行上皮细胞, 细胞在无血清培养基中生长增殖能力强, 经过传代扩增和纯化, 能够达到构建工程化尿路上皮组织所需要的数量和纯度。 本研究的成功为构建组织工程尿路上皮组织以及进一步泌尿道修复重建奠定了理论基础。