不保密。 (请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名: 指导教师签名: 日期: 英汉缩略语对照表....................................................................................5研究背景....................................................................................................7 中文摘要..................................................................................................14 Abstract....................................................................................................17 第一部分 慢性EAE 中APC 的免疫应答机制研究...........................21 言............................................................................................21材料和方法......................................................................................22 论............................................................................................62第二部分 一种新型融合免疫球蛋白-mGE对慢性小鼠EAE治疗作用 的分析评估..............................................................................................63 言............................................................................................63材料和方法......................................................................................65 论............................................................................................81参考文献..................................................................................................82 综述...........................................................................................................88 英汉缩略语对照表英文缩写 英文全称 中文全称 APC Antigen-presenting Cell 抗原提呈细胞 APP Amyloid Precursor Protein 淀粉样前体蛋白 Complement补体 CFA Complete Freund's Adjuvant 完全弗式佐剂 CNS Central Nervous System 中枢神经系统 CR Complement 补体受体 CTL Cytotoxic lymphocyte细胞毒性T 淋巴细胞 CTLA-4 Cytotoxic LymphocyteAntigen-4 细胞毒性T 淋巴细胞抗原-4 DC Dendritic cell 树突状细胞 EAE Experimenial Allergie Encephalomyelitis 实验性变态反应性脑脊髓炎 EB Evans Blue 伊文思蓝 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay 酶联免疫吸附检测 FoxP3 Forkhead Box P3 叉状头转录因子 Iba-1 Ionized Calcium Binding-adaptor Molecule 小胶质细胞特异性钙结合蛋白1 IFN-γ Interferon –gamma 干扰素-γ IL Interleukin 白介素- ITAM Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif 免疫受体酪氨酸激活基序 ITIM Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif 免疫受体酪氨酸抑制基序 LFB Luxol Fast Blue 罗可沙尔坚牢蓝-焦油紫 MAGMyelin-associated Glycoprotein 髓鞘相关糖蛋白 MBP Myelin Basic Protein 髓鞘碱性蛋白 MHC Major Histoeompatibility Complex 主要组织相容性复合物 MOG Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 MS Multiple Sclerosis 多发性硬化 PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液 PLP Proteolipid Protein 蛋白脂蛋白 RT Reverse Transcription 逆转录 TGF-β Transforming Growth Factor-β 转化生长因子-β Th Cell Helper Cell辅助性T 细胞 Treg RegulatoryCell 调节性T 细胞 WB Western Blot 免疫蛋白印迹 研究背景多发性硬化(MS)是以中枢神经系统白质散在/多灶性髓鞘脱失为主要病理 变化,可伴有不同程度轴索损伤的炎性自身免疫性疾病。脱髓鞘病灶于脑白质小 静脉和侧脑室周围常见,伴随淋巴细胞和单核巨噬细胞浸润,免疫荧光检查可见 IgG 鞘内沉积,提示有免疫激活现象。根据少突胶质细胞保留的程度、丢失的髓 鞘蛋白、炎症细胞浸润类型、免疫球蛋白或补体沉积情况可将髓鞘脱失或少突胶 质细胞损伤模式分成四种类型:(1)T 细胞/巨噬细胞介导的髓鞘脱失;(2)抗体/补体介导的髓鞘脱失;(3)少突胶质细胞营养不良并伴有少突胶质细胞凋亡; (4)原发性少突胶质细胞变性,特征与病毒感染或中毒所致的少突胶质细胞损 害类似 。由此可见,MS/EAE的免疫病理过程包括两个方面,一是周围免疫系 统的激活,二是免疫反应在中枢神经系统的持续存在并被放大。传统观点认为, 中枢神经系统以髓鞘脱失为主的损伤主要是由强致炎细胞因子IFN-γ 介导,IFN-γ 通过诱导Th1 型细胞分化引发针对髓鞘的免疫应答;然而在进行IFN-γ 或其受体 基因敲除动物研究时,却发现 EAE 仍能发生,甚至实验动物更易患病 ,说明MS/EAE 可能是多种机制共同作用引起的自身免疫性疾病;其中可能涉及固有免 疫、特异性免疫应答和免疫应答调节机制等诸多方面。有大量研究结果认为, EAE 模型发病机制中,Th1/Th2 型细胞反应失衡,Treg 细胞分化受阻或功能减弱 是最重要的两个因素 EAE发病中起致炎作用,疾病进展过程中 Th17 细胞的迁移至中枢神经系统是病变部位具有高度选择性的基础 [5-8] 。比较认 可的MS 免疫应答反应过程可能包括:特异性自身反应性T 淋巴细胞、B 淋巴细 胞在外周首先被激活,在多种炎症介质的趋化作用下,经异常开放的血-脑屏障 迁移、定位于中枢神经系统存在髓鞘的部位并引起免疫应答。自身反应性 巴细胞经中枢自身髓鞘抗原成分反复不断地刺激,通过特异性细胞毒性作用或趋化诱导单核巨噬细胞和小胶质细胞等其他免疫细胞激活并释放多种炎性细胞因 子,共同对中枢神经系统髓鞘进行直接攻击损害。其中自身反应性 CD4 细胞来源的抗髓鞘成分抗体经由补体激活途径,趋化各种炎性细胞,并刺激针对髓鞘的调理作用而产生 免疫损伤 鞘反复出现损伤和再生修复,临床症状随之出现特征性的缓解-复发进程。髓鞘是由少突胶质细胞和施万细胞突起形成的包裹神经纤维的反复折叠层 状脂质蛋白结构,中枢神经系统髓鞘和外周神经系统髓鞘在化学组成上有所有不 同,组成中枢神经系统髓鞘的成分主要是蛋白脂蛋白(PLP),约占总量的 50% 髓鞘碱性蛋白(MBP)约占总量的30-40% ;髓鞘相关糖蛋白(MAG)约占总 1%;少突胶质细胞糖蛋白(MOG)在中枢神经系统微量表达,而周围神 经系统不表达。在周围神经系统,组成髓鞘的主要成分是 P0 蛋白和 P2 蛋白, 这两种蛋白在中枢神经系统均不表达,P1 蛋白与中枢神经系统的MBP 为同一组 分,在周围神经系统约占 5-15% 。MAG 在周围神经系统仅微量表达。由此可 见,MOG 是中枢神经系统髓鞘所特有,P0 蛋白、P2 蛋白和PMP-22 则只存在于 周围神经系统髓鞘中;MBP 在中枢和周围神经系统均存在。 实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE),是发生于各种敏感实验动物中枢神经系 统的炎性变态反应性疾病。诱导 EAE 模型抗原一般为组成髓鞘的成分蛋白,可 通过注射特定的全髓鞘成分蛋白或其表达强抗原性表位的某一肽段加完全弗氏 佐剂主动免疫;也可以通过经髓鞘蛋白或其肽段致敏的 CD4 细胞过继免疫实验动物诱导。其中髓鞘成分蛋白或其肽段作为抗原,CFA 中的所含的结核杆菌, 是模型诱导的一个重要因素,可直接影响模型的发病率,甚至发病形式 。CFA还可以诱导Th0 细胞向Th1 细胞分化而辅助免疫诱导,没有CFA 的辅助作用, 一般不能被诱导出EAE 模型。另外,百日咳毒素可以提高正常血-脑屏障的通透 性,有利于活化的自身反应性淋巴细胞向中枢神经系统迁移、浸润,引起炎症反 应扩散 [10] 。诱导发病过程中,树突状细胞为主的APC 被活化并将髓鞘蛋白抗原 提呈给初始 淋巴细胞因此在外周被激活,穿过通透性增加的血脑屏障迁移至CNS。进入CNS 淋巴细胞通过释放炎性介质和细胞因子等途径招募炎性细胞至CNS,由于CNS 中存在同源髓鞘蛋白 抗原而被本地APC 再活化,增殖并释放炎性介质,并浸润递呈 MHC II-抗原肽 复合物的 APC,导致炎症发生,进而出现脱髓鞘及轴突受损 [11] 。EAE 模型动物 大多数表现为加重-自然缓解单相病程, MBP68-86 肽段在诱导Lewis 大鼠EAE 模型时一般发病率很高,而且疾病严重程度较均一,变异很小;但是该模型主要 表现为急性炎性反应反应,中枢神经系统血管周围的炎细胞以中性粒细胞和单核细胞为主,少有淋巴细胞浸润;缺乏缓解-复发的临床特征,也没有髓鞘脱失和 再生修复的病理学变化。PLP139-151 肽段可诱导 SJL 小鼠复发-缓解型 EAE, MOG35-55 肽段可在 C57BL/6 小鼠诱导出慢性非缓解型 EAE,所见病理改变与 与人类MS 极为相似。一般而言,血清各种抗髓鞘成分或非成分抗体不能诱导出 EAE 模型,但利用致敏T 淋巴细胞被动传递则能成功,提示EAE/MS 病变发生 的本质可能属于细胞免疫机制。现在认为其他各种抗髓鞘成分自身抗体在 EAE 中不具有致病性,只有抗 MOG 抗体可能与疾病的发生有关。MOG 是一种 26-28KDa 跨膜糖蛋白,表达在髓鞘膜和少突胶质细胞外表面,其胞外区有三个 可供识别的抗原表位,MOG35-55 MOG胞外区致脑炎抗原表位之一,由于MOG 选择性表达于成熟少突胶质细胞髓鞘外表面,因此更易受到免疫细胞直 接攻击。近年来 MOG 作为EAE 模型的诱导抗原已被广泛应用于动物实验研究 中,文献报道 MOG 诱导C57BL/6 小鼠的EAE 模型表现为两种形式,慢性进展 型和慢性非缓解型,在病理和临床表现上最接近于人类MS [12-14] 。还有研究结果 证明 MOG 是髓鞘组成蛋白中唯一的既能引起 细胞反应又能引起髓鞘抗体产生的自身抗原 [15] ;这也间接显示出 MOG 在诱导 EAE 模型建立及病理特点 中的优势 [16] 。C57BL/6 小鼠是一种常用实验小鼠,国内较易获得和饲养,且遗传 背景清楚。 MOG35-55 肽段诱导C57BL/6 小鼠的慢性EAE 模型比急性EAE 型在临床、生化、免疫及病理等诸多方面与MS 具有更相似的特征,尽管 MOG35-55 肽段诱导的 EAE 模型还不能完全真实地表现出人类 MS 全部病理特 点,但仍是当前公认的研究 MS 的发病机制和治疗策略的理想动物模型之一 [17, 18] 中枢神经系统曾被认为是机体的免疫豁免器官之一,由于血-脑屏障的作用,其中某些抗原成分和外周免疫系统相对隔离。