Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
クレイク、カナダ・カナナスキス、スウェーデン・ケブネケーゼ、ニーオルセン・スバールバル諸島）から、集団あたり24～46個体の葉を採取し、マイクロサテライトDNA $ ^{4)} $ の遺伝的多様性を解析した。遺伝的多様性の指標値として、多型的遺伝子座の割合(PLP)、アリルの有効数(Ne)、稀なアリルの豊富度(RA $ _{R} $ )、遺伝子多様度(He)、近交係数(F $ _{IS} $ )を算出した。集団間の遺伝的分化係数としてはF $ _{ST} $ を用いた。集団の遺伝構造はSTRUCTURE解析で推定し、集団間の系統関係を推定するために遺伝距離に基づいたNJ系統樹を作成した。

## （２）山岳植物の標高傾度に沿った遺伝的・生態的分化の維持過程

## 1 ）サラシナショウマにおける標高傾度に沿った3生態型間の遺伝的分化

サラシナショウマ(Cimicifuga simplex)には異なる送粉生態をもつ3つの送粉型(pollination morph)が存在する。Pellmyrは3送粉型の分布と生態について、栃木県における状況を以下のように記載した $ ^{5)} $ 。Type Iは高標高に分布し、明るい林内に生育するタイプで、9月に開花しマルハナバチ類に送粉される。Type IIは中標高以下に分布し、やはり9月に開花し甘い芳香を放つことでチョウ類を送粉者としている。そしてType IIIは中・低標高の林床に生育するタイプで、他のタイプの開花が終わる頃に遅れて咲き始め、マルハナバチ類を送粉者としている。本研究では以下の調査を行った。

a. 長野県の美ヶ原山系と北アルプス山系の2山系の標高860 mから2330 mの15地点において、各送粉型の分布標高、開花時期、花の香り、個体サイズ、および生育環境を調べた。

b. 3送粉型について草丈・花序長・小花柄長・花序数・小花数・めしべ数の6形質を計測した。

c. 3送粉型間の表現型の違いが倍数性の違いに起因する可能性を検証するため、根端分裂組織を用いて染色体数を調べた。

d. 3送粉型の遺伝的分化の程度を明らかにするため、TypeI-46個体、TypeII-34個体、TypeIII-12個体について、核遺伝子のITS領域の配列決定を行い、Yamaji et al. $ ^{6)} $ がすでに記載しているITS領域の7つのリボタイプ(特定サイトにおける塩基配列を基準としたタイプ)との一致性を確認した。さらに、外群としてイヌショウマの配列を加え、MEGA 5.0を用いて系統解析を行った。

e. 3送粉型が遺伝的に分化したグループであるかどうかを明らかにするため、TypeI-3個体、TypeII-5個体、TypeIII-6個体について、AFLP法を用いて解析を行った。バンドの有無に基づいて主座標分析を行った。

## 2 ）標高傾度に沿ったヤマホタルブクロの花サイズ変異と遺伝子流動

ヤマホタルブクロ（Campanula punctata var. hondoensis）は中部山岳域の幅広い標高帯に生育しており、主な送粉者であるマルハナバチ類は中部山岳域において、標高によってその種組成が変化することが知られている。このことから、マルハナバチ類によるヤマホタルブクロに対する選択圧が標高間で異なっていることにより、標高間で花形質に変異が生じている可能性が考えられた。

このことを検証するために、まず花形質の地理的変異について調査を行なった。2010年に乗鞍6地点、2011年に乗鞍6地点、美ヶ原3地点、およびハケ岳2地点において花冠口直径、花冠最大幅、花冠全長、花柱長、草丈、および花数を計測し、4つの花形態形質をもとに主成分分析を行なった。
各植物形質及び主成分分析の結果得られた主成分得点（PC1）について、山域ごとに標高間で違いがあるかをANOVAで、また花サイズと植物体サイズ（草丈、花数）の間に相関があるかをPearsonの積率相関分析で、それぞれ検定した。

花形質の変異が遺伝的なものかを検証するために共通圃場実験を行なった。2010年に乗鞍地域2地点（最低標高と最高標高）で48株ずつを採集し、各株をポットに植え替え、信州大学構内（標高630 m）で栽培した。花茎が成長した株について、花サイズを計測し、自然状態と栽培下での形質の平均値に違いがあるかをt検定によって検定した。

ヤマホタルブクロに訪花したマルハナバチ類の種組成、及び体サイズに地理的な変異があるかを検証するために、各標高における訪花マルハナバチの個体数調査及び形態測定を行なった。花サイズを測定した各地点において訪花マルハナバチ数をカウントし、また各マルハナバチ種について胸高、中舌、前脚基節～外葉先端、頭幅、体長、および全長を計測した。

各標高地点間における花サイズとハチサイズの変異の対応性を見た。地点ごとのハチサイズの指標として、まず、計測した6つのハチサイズを基に主成分分析を行い、種ごとの平均主成分得分点を算出した。そして、地点ごとのハチの訪花割合に応じて、各マルハナバチ種の平均PC1得点×訪花割合を算出し、その地点のハチサイズの指標平均PC1とした。地点ごとに平均化した花サイズPC1と、ハチサイズのPC1の相関があるかをPearsonの積率相関分析によって検定した。

集団間で遺伝的分化が見られるかどうか、及び遺伝子流動の障壁となりうる要因は何かを検証するために3つのマイクロサテライト遺伝子座を用いて解析を行った。4山域の標高上下2地点に低標高地点の1地点を加え、合計9地点で各20～24サンプルずつ採集した。マイクロサテライト解析では3つの遺伝子座の遺伝子型を決定し、地点間の遺伝的分化度（ $ F_{ST} $ ）を算出し、Mantel testによって、地点間の距離や標高差が遺伝的分化にどれほど寄与しているかの解析を行なった。地理的距離には各集団間の直線距離を用いた。

## 3 ）ウツボグサにおける花サイズの地理的モザイクと訪花マルハナバチ相の関係

中部山岳域の乗鞍岳（標高1150、1370、1450、1700、1800、1995、2050 m）、ハケ岳（標高1570、1580、1650、1730、1785 m）、および美ヶ原（標高1082、1977 m）において、ウツボグサ（Prunella vulgaris）とその送粉者であるマルハナバチ類Bombus spp.（マルハナバチ亜科）の調査を行った。

ウツボグサの送粉者種構成が標高ごとに変化しているかを調べるため、各標高でウツボグサ2～59個体を含む区画を設けた。各区画は1 m×1 mで、6:30～17:00の時間帯にウツボグサを訪花するすべてのマルハナバチ類を観察し、マルハナバチの種名と小花への訪花回数を記録した。

ウツボグサの花サイズが標高ごとに変化しているかどうかを調べるため、野外で花を採集し、70%エタノール中に保存し、研究室に持ち帰った。花の基部から花冠口までの筒状の部分の長さを花筒長とし、デジタルノギスを用いて測定を行った。

ウツボグサに訪花したマルハナバチ類の体サイズに地理的な変異があるかを検証するために、マルハナバチの形態測定を行なった。胸高、中舌、前脚基節～外葉先端、頭幅、体長、および全長を計測し、地点ごとのハチサイズの指標として、計測した6つのハチサイズを基に主成分分析を行い、種ごとの平均主成分得点を算出した。そして、地点ごとのハチの訪花割合に応じて、各マルハナバチ種の平均PC1得点×訪花割合を算出し、その地点のハチサイズの指標平均PC1とした。
## 4 ）種間雑種ナガバノアケボノスミレ形成集団における交雑現象の解析

スミレ科スミレ属のアケボノスミレ（Viola rossii）とナガバノスミレサインン（Viola bissetii）は日本国内において側所的な分布様態を示し、分布が接触する一部の地域において種間雑種ナガバノアケボノスミレを形成している。雑種形成地における両親種間の交雑の実態をAFLP解析により明らかにした。

調査は雑種形成地のひとつである山梨県大月市扇山（標高1138 m）で行なった。アケボノスミレ、ナガバノスミレサイシン、及びその種間雑種とされるナガバノアケボノスミレを計74個体採集した。1個体につき葉1枚、同一クローン個体である可能性が高いと思われる近接した個体同士は採集せず、最低でも1m離れた個体を採集するようにした。

AFLP解析では2つのプライマーペアEcoRI-ACA/MseI-CCA、EcoRI-ACG/MseI-CATを用いて選択的増幅反応を行なった。シーケンサー泳動の後、フラグメントを選出し、その中から多型基準（0.05＜保有個体率＜0.95）に合った計153のフラグメントを解析に用いた。

得られたフラグメントデータから主座標分析を行なった。また、解析ソフトNewHybridsを用いてベイズ推定に基づいた雑種判別を行なった。MCMC計算の試行回数は5,000回の焼き捨ての後に、100,000回行ない、6つの交雑段階（各親種、F₁雑種、F₂雑種、各親種との戻し交雑）に当てはまる確率を算定させた。

## 4 ．結果及び考察

## （１）周北極分布する日本産高山植物の系統地理的な起源と遺伝的多様性

## 1 ）日本産クロマメノキの系統地理的な起源

日本産クロマメノキからは3つのハプロタイプ(J,V,U)が検出された。カムチャッカ半島のハプロタイプは、日本でも検出されたJタイプであった。極東アジア地域を除いてクロマメノキの分布全域を網羅した分子系統解析の結果³)よると、クロマメノキには周北極・アルプス系統と環大西洋系統およびベーリンジア系統の3大系統が存在する。今回の研究によって、日本およびカムチャッカ半島から検出された3つのハプロタイプは、全てベーリンジア系統に属していた。ベーリンジアは北米大陸北西部とアジア大陸北東部の間の現在のベーリング海峡をまたがる地域であり、最終氷河期には海水面の低下によって陸橋化して、寒地性植物のレフュージア（避難所）だったと考えられている⁷,⁸)。Eric Hulténが提唱したベーリンジア・レフュージア仮説⁷)は、クロマメノキのみならず日本列島に遺存分布する他の周北極植物種の大陸起源地を推定するための重要な視点を提供していると考えられる。さらにベーリンジア系統を詳しく検討すると、西ベーリンジア亜系統とアラスカ湾亜系統の2つの亜系統が判別され、日本産のものは西ベーリンジア亜系統に含まれることが分かった（図(4)-1）。日本産クロマメノキは、更新世の寒冷期にベーリンジアを起源として、カムチャッカ半島などを経由し日本列島にまで南下したと推察される。
図(4)-1. クロマメノキにおける葉緑体ハプロタイプ

(trnS-trnGおよびtrnS-trnG領域)の地理的分布.

## 2 ）日本列島に遺存分布するチョウノスケソウの遺伝的脆弱性

チョウノスケソウの遺伝的多様性について、日本の高山帯に遺存分布する集団と高緯度地域のものを比較すると、集団内の遺伝的多様性が大きく喪失していることが明らかになった（図(4)-2）。日本列島の中でも、本州中部地域、とくに南アルプスにおける遺伝変異の喪失が顕著であり、高緯度地域では多型性を示す遺伝子座の多くが固定し、アリル数が減少しており、遺伝子多様度が非常に低いレベルを示した。遺伝的多様性のレベルが低い集団では近交係数が高く、小集団化に付随する近親交配の増加が遺伝的多様性の消失を促進したと考えられる。本州中部地域と比べると、北海道・大雪山の遺伝的多様性は比較的に保持されていた。

国外の集団に目を移してみると、より高緯度地域の集団が高い遺伝的多様性を保持している傾向が認められ、最も高い遺伝的多様性を示したのはアラスカの2つの集団であった。日本産クロマメノキの系統地理的な起源について考察したように、ベーリンジアは寒地性植物のレフュージアだったと考えられており $ ^{7,8} $ 、アラスカ集団の高い遺伝的多様性はベーリンジア・レフュージア仮説を支持する。一方で、最も高緯度に位置するスバールバル諸島のニーオルセン集団では、アラスカの集団よりも遺伝的多様性レベルが低くなっていた。最終氷期のスバールバル諸島は氷河に完全に覆われていたため、現存の個体は最終氷期以降に移住したものの子孫であり、移住初期の低いレベル遺伝的多様性の影響（創始者効果）を現在にまで引きずっていると考えられる。集団間の遺伝的な違いの程度について遺伝分化係数（ $ F_{ST} $ ）で評価したところ、日本列島の分集団は平均で0.549となり、高緯度に位置する北欧の分集団分化レベル（0.264）と比較して、遺伝的な分断化が促進されていた（図(4)-3）。
図(4)-2．チョウノスケソウの分集団内の遺伝的多様性．①悪沢岳（南アルプス）、②ハケ岳、③木曽駒ケ岳（中央アルプス）、④杓子岳（北アルプス）、⑤鉢ヶ岳（北アルプス）、⑥雪倉岳（北アルプス）、⑦大雪山、⑧長白山（中国）、⑨カナナスキス（カナダ）、⑩ケブネケーゼ（スウェーデン）、⑪トゥーリック・レイク（アラスカ）、⑫デナリ（アラスカ）、⑬ニーオルセン（スバールバル諸島）.

図(4)-3. 集団間の遺伝距離と地理的距離の関係.

図4-4. 集団の遺伝構造と系統関係.
一方、広範な分布域の全体から見ると、日本列島の分集団は同じ系統グループにまとめられる（図(4)-4）。国外の集団の中で日本列島と最も系統的に近いのは中国・長白山であり、日本の大雪山集団と最も遺伝距離が短かった。したがって、更新世のいずれかの氷河期にチョウノスケソウが高緯度地域から南下して日本列島の本州中部まで至ったルートは、朝鮮半島経由ではなく、サハリンまたは千島列島から経由したと考えられる。今回の研究によって、代表的な寒地性生物種であるチョウノスケソウは、本州中部山岳の遺存集団において遺伝的に脆弱な状態になっており、特に分布の最南限に位置する南アルプスの悪沢岳では高緯度集団と比較すると最大で約90%の遺伝的多様性が消失していることが明らかになった。今後、日本、特に南方山域の高山植物の遺伝的多様度については、地球温暖化の影響を検知するための「炭鉱のカナリヤ」として、その推移に注目していく必要がある。

## （２）山岳植物の標高傾度に沿った遺伝的・生態的分化の維持過程

## 1 ）サラシナショウマにおける標高傾度に沿った3生態型間の遺伝的分化

先行研究 $ ^{5)} $ と異なり、3タイプの標高分布は連続的であり、美ヶ原山系では複数の送粉型が同所的に分布する地点があることが明らかになった（図(4)-5）。また6形態形質のうち、全ての形質において少なくとも2つの送粉型間で有意な差が検出された。一方、3送粉型の染色体数はいずれも2n=16であった（図(4)-6）。

図(4)-5. 長野県におけるサラシナショウマ3送粉型の分布標高.

図(4)-6. サラシナショウマの染色体．左からTypeI，TypeII，TypeIIIの順に示した．どの送粉型も2n=16であった．
核DNAのITS領域の配列決定の結果、送粉型とYamaji et al.⁶のリボタイプとの対応関係が明らかになった。送粉型TypeIはリボタイプ3に、送粉型TypeIIはリボタイプ2に、送粉型TypeIIIはリボタイプ1+3に対応した。さらに、ITS領域の解析全配列に基づく系統樹から、TypeIIの単系統性が明らかになった（図(4)-7）。また、387の遺伝子座についてのAFLP解析に基づき、主座標分析を行った結果においても、サラシナショウマの3送粉型は遺伝分化していることが明らかになった（図(4)-8）。

以上の結果から、サラシナショウマの3つの送粉型は遺伝的に分化を遂げており、それぞれの間で生殖的に隔離されていることが示された。これまで1種として扱われてきたサラシナショウマは、生態的にも遺伝的にも異なった複数の生態型に分けられることになる。温暖化による山岳植物への影響を評価する際、サラシナショウマのような生態型分化を遂げている種に関しては、きめ細かい保全単位の検討が必要と考えられる。

図(4)-7. 最尤法で作成した核リボソームDNAのITS領域の変異に基づく系統樹.
図(4)-8. サラシナショウマのAFLP解析結果の主座標分析.

## 2 ）標高傾度に沿ったヤマホタルブクロの花サイズ変異と遺伝子流動

ヤマホタルブクロの花サイズは、各山域の標高間で変異しており（ANOVA：P<0.05）、標高が上がると共に小さくなる傾向にあった（図(4)-9左）。4つの花形質を基にした主成分分析では、因子分析表よりPC1（寄与率：62.1%）は花冠全体のサイズ変異に影響されていた。各花サイズ及びPC1、PC2は各山域の標高間で有意な違いがあった（ANOVA：それぞれP<0.05）。植物体サイズ（草丈と花数）も各山域で標高地点によって変異していた（ANOVA：それぞれP<0.05）。しかし、草丈や花数の変異は、はっきりとした標高に沿ったパタンは見られなかった。

栽培個体のうち、花茎が成長したのは乗鞍低標高：8/48株、乗鞍高標高：14/48株のみであった。乗鞍低標高と乗鞍高標高の各平均花サイズを、各地点の自然状態での平均花サイズと比較したところ、有意な差は認められなかった（それぞれt-test：P>0.05）。一方、植物体サイズは両標高とも有意に異なっていた（それぞれt-test：P<0.05）。

各標高、各地点でのマルハナバチ種組成に関して、1000 m以下の低標高の地点では、主に大型種のトラマルハナバチ及びコマルハナバチが優占していた。1500 m前後の中標高地点では大型種のトラマルハナバチと小型種のヒメマルハナバチが優占していた。ただし、美ヶ原中標高地点に限り、最大種のナガマルハナバチが優占していた。2000 m前後の高標高域では、いずれの山域、地点においても小型種のヒメマルハナバチが優占していた。

6つのハチ形質を基にした主成分分析では、因子分析表よりPC1（寄与率：92.3%）は全体的なハチサイズの変異に影響されていた。観察された主なハチ種の平均PC1は大きい順にナガマルハナバチ、トラマルハナバチ、コマルハナバチ、ヒメマルハナバチであった。各地点のハチサイズの指標平均PC1は一部地点を除き、標高があるにつれて低い値を示す傾向があった（図(4)-9右）。これは、高標高ほど小型種が優占していた為である。

地点ごとに平均した花サイズPC1と、ハチサイズPC1の変異の間には有意な相関が見られた $ (P< $
0.05、r=0.60：図(4)-10）。一方で、標高と花サイズPC1との間には有意な相関は見られなかった$(P=0.07,\ r=0.48:\ \text{図}(4)-9$ 左）。

標高(m)

図(4)-9. 花サイズ（左：各地点の花における平均PC1±標準誤差）とハチサイズ（右：各マルハナバチ種の平均PC1×各地点における訪花割合）の標高間変異．共に一部地点を除いて、各山域で標高があると共に小さくなる傾向が見られた．

図(4)-10. 花サイズとハチサイズの対応性．横軸は各地点における平均ハチサイズ（各マルハナバチ種の平均PC1×各地点における訪花割合）、縦軸は各地点における平均花サイズ（平均PC1±標準誤差）を示す．有意な相関が見られた（P<0.05, r=0.60）．

ヤマホタルブクロの花サイズと主な送粉者であるマルハナバチの体サイズの対応が、一訪花当たりの花粉持ち出し率（雄性適応度）を高めることが示されている（阿部 未発表）。これは、送粉者のサイズが花サイズに対して選択圧となるということである。また、マルハナバチ種組成が標高間で異なっており、標高間で訪花するマルハナバチの体サイズが異なることから、ヤマホタルブクロの花サイズに対して標高間で異なった選択圧が働いていると考えられた。これらのことから、標高間でヤマホタルブクロの花サイズに適応的な変異が生じている可能性が考えられる。実際に、種組成の変異に基づく送粉者サイズの標高間変異と花サイズの標高間変異の間には対応性が見られた。

集団間の遺伝子流動の評価を行なうために、各集団間における遺伝的分化度 $ (F_{\mathrm{ST}}) $ を算定した。
$ F_{ST} $ の値は0.062～0.127と低く、同標高の地点間における値と比較しても同程度の値を示した（図(4)-11）。また、集団間の距離や標高の違いが遺伝的分化にどれほど寄与しているかを確かめるために、Mantel testによりこれらの間の相関性の検定を行なった。地点間の地理的な距離（r=0.20、P=0.14:図(4)-12左）と遺伝的分化度との間に有意な相関は見られなかった。標高の違い（r=0.09、P=0.21:図(4)-12右）と遺伝的分化度との間にも有意な相関は見られなかった。

図(4)-11. 各地点間の遺伝的分化度 $ (F_{\mathrm{ST}}) $

図(4)-12. 遺伝的分化度 $ (F_{\mathrm{ST}}) $ と地点間の標高差（左）及び地理的距離（右）の関係．共に有意な相関は見られなかった（左： $ r=0.09,\ P=0.21 $ ，右： $ r=0.20,\ P=0.14 $ ）.

以上のことから、花サイズなどの形質に変異があった集団間においても、遺伝子流動は少なからず存在しているということが示された。一般に距離が離れるほど遺伝子流動は少なくなる（距離による隔離：isolation by distance）とされ、地理的距離は遺伝的分化に影響しているものと考えられる。しかし、Mantel testではその相関に有意性は見られなかった。これは、狭い地理的スケールの中で解析を行なったため、山などの地理的障壁の影響が強く反映されたためと考えられる。例えば、高山帯にヤマホタルブクロは生育していないため、北アルプスの尾根は遺伝子流動の障壁となると考えられる。実際に、北アルプスを境にした西側の乗鞍岐阜県側2集団との比較点を除いて解析を行ったところ、有意性こそ認められなかったものの、相関係数が高い値をとり、より強い相関が見られた（r=0.47、P=0.06：図(4)-13）。このことから、地理的距離に関しては、有意性は認められなかったが、ある程度、遺伝子流動の障壁となっていると考えられる。
図(4)-13. 岐阜県側の比較地点を除いた際の遺伝的分化度 $ (F_{\mathrm{ST}}) $ と地理的距離の関係．有意ではないが，比較的高い相関性が見られた $ (r=0.47, P=0.06) $ ．

以上のように、マイクロサテライト3遺伝子座によるAMOVA解析の結果、集団間の遺伝的差異は少なく、 $ F_{ST} $ と地理的距離の比較から標高は遺伝子流動の障壁となっていないことが明らかとなった。このことから、花形質の変異に関して二つの仮説が挙げられる。ひとつは、遺伝子流動は存在するものの遺伝形質である花形質に強い選択圧がかかっていることで形質の分化が生じているというものである。今回、集団遺伝解析に用いたマイクロサテライト遺伝子座は、遺伝的に中立なマーカーであり、自然選択の影響を受けない。実際には、中立遺伝子で集団間に分化が見られなかったとしても、花サイズに関わる機能遺伝子には分化が見られるかもしれない。

もうひとつの仮説は、花形質が環境によって可塑的に変化する場合である。一般的に遺伝子流動は地域適応を阻害するとされているが、一方で、集団間の高い遺伝子流動は可塑性の進化をもたらすとされている。この場合、高い可塑性を持ち、環境ごとに最適な形質（例えば、送粉効率のいい形質など）をとることができるような（可塑性）遺伝子が選択されていくと考えられる。この場合でも、花形質が可塑的に変化する中で、異なる送粉者によって選択圧を受けることによって標高間で（可塑性）遺伝子の変異が生じていることが考えられる。いずれの仮説にしても、送粉者のサイズ変異が花サイズへの選択圧になりうるため（阿部 未発表）、標高間の花形質変異が送粉者による選択圧によって、維持されている可能性は高いと考えられる。

## 3 ）ウツボグサにおける花サイズの地理的モザイクと訪花マルハナバチ相の関係

乗鞍岳におけるウツボグサの送粉者種構成は標高ごとに異なっていた（図(4)-14）。標高1150～1700 mではウスリーマルハナバチ（Bombus ussurensis）が多く見られたが、1800～2050 mの高標高ではヒメマルハナバチ（B.beaticola）またはナガマルハナバチ（B.consobrinus）が主な訪花者であった。これらのハチは形態サイズが異なっており、ナガマルハナバチが最も大きく、ヒメマルハナバチが最も小さい。各地点のハチサイズの指標平均PC1は、その場所の訪花者種構成を反映しており、値が大きいほど訪花者の形態サイズが大きいことを表している。各標高のハチサイズ指標平均PC1は、1150m：0.2352、1370m：-0.2828、1450m：0.3813、1700m：-1.6182、1800m：-2.0458、