Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
国会、裁判所、会计检查院、内阁、内阁府、复興厅、総務省、法務省、外務省、財務省、

32 文部科学省、厚生労働省、農林水産省、経済産業省、国土交通省、環境省及び防衛省所管 東日本大震災復興特別会計

所 管 · 組 織 · 項	事項	目の区分	予定額(千円)	積算内訳
26 經濟・産業及工木ル 千一安定供給確保等復 興事業費	県等株式会社日本政策金融公 庫中小企業者向け業務	1/2·1/3
60 中小企業事業環境の整備に必 要な経費	36,700,000
60062-865-16 中小企業組合等共 同施設等災害復旧 費補助金	29,000,000
60062-959-24 株式会社日本政策 金融公庫出資金	7,700,000

61 東日本大震災復興国立 研究開発法人産業技術 総合研究所運營費	国立研究開発法人産業技 術総合研究所	定額(末尾記載の年度計画予 算見積りを参照)
13 東日本大震災復興に係る国立 研究開発法人産業技術総合研 究所運營費交付金に必要な経 費	13062-305-16 国立研究開発法人 産業技術総合研究 所運營費交付金	1,080,000
28 東日本大震災復興独立 行政法人中小企業基盤 整備機構運營費	独立行政法人中小企業基 盤整備機構	定額(末尾記載の年度計画予 算見積りを参照)
60 東日本大震災復興に係る独立 行政法人中小企業基盤整備機 構運營費交付金に必要な経費	60062-305-16 独立行政法人中小 企業基盤整備機構 一般勘定運營費交 付金	832,428
29 住宅・地域公共交通等 復興政策費	5,533,777
95 住宅市場の環境整備の推進に 必要な経費	95016-405-16 住宅市場整備推進 等事業費補助金	150,000
95 観光振興に必要な経費	3,530,111
95016-129-06 諸 謝 金	285
95016-122-08 職員旅費	2,992
会議等出席謝金 内国旅費 会議等出席旅費 検査及び監督等旅費	1,313千円 1,679

95016-122-08 委員等旅費	534
95063-815-16 観光関連復興支援 事業費補助金	265,000
95063-815-16 東北観光復興対策 交付金	3,261,300
95 地域公共交通の維持・活性化 の推進に必要な経費	95063-405-16 地域公共交通確保 維持改善事業費補 助金	1,486,850
95 社会資本整備・管理等の効率的な推進に必要な経費	95016-815-16 官民連携社会資本 整備等推進費補助 金	120,000
地方公共団体等 定額
所 管 · 組 織 · 項	事 项	目 の 区 分	予 定 額 (千円)	積 算 内 訳
29 (住宅·地域公共交通等) 復興政策費	95 国 土 調 查 に 必 要 な 經 費	95059-815-16 地籍調查費負担金	246,816	地方 公共 团体 等 2/3·1/2
77 東日本大震災復興独立 行政法人國際観光振興 機構運營費	独立行政法人國際観光振興機構 定額(未尾記載の年度計画予算見積りを参照)
95 東日本大震災復興に係る独立 行政法人國際観光振興機構運 營費交付金に必要な経費	95062-305-16 独立行政法人國際観光振興機構一般 勘定運營費交付金	1,000,000
30 環境保全復興政策費	744,281,023
95 大気·水·土壤環境等の保全 に必要な経費	750,659
95016-129-06 諸 謝 金	566	会 議 出 席 等 謝 金
95016-122-08 職 員 旅 費	560	内 国 旅 費
現 地 調 查 等 旅 費
内 国 旅 費
95016-122-08 委 員 等 旅 費	626	会 議 出 席 等 旅 費
消 耗 品 費 17千円
95016-123-09 庁 費	382	印 刷 製 本 費 133
借 料 及 び 損 料 227
会 議 費 5
95016-123-09 環境保全調查費	623,305	雑 役 務 費
95016-725-16 經濟協力開発機構 等拠出金	125,220	北太平洋海洋科学機関事務局拠出金
95 廃棄物·リサイクル対策の推 進に必要な経費	24,766,276	内 国 旅 費
95016-122-08 職 員 旅 費	1,049	現 地 調 查 等 旅 費
雑 役 務 費
95088-123-09 災害等廃棄物処理 事業費	24,200,000	市町村、一部事務組合 90/100·80/100·50/100
95088-815-16 災害等廃棄物処理 事業費補助金	565,227
95 生物多樣性の保全等の推進に 必要な経費	191,854	内 国 旅 費
95016-122-08 職 員 旅 費	2,747	現 地 調 查 等 旅 費
雑 役 務 費
95016-123-09 環境保全調查費	189,107
所 管 · 組 織 · 項	事項	目の区分	予定額(千円)	積算内訳
63(環境保全復興事業費)	95(放射性物質による環境の污染)への対処に必要な経費	平成27年度支出額15,287,400千円26,611,200
貯蔵施設及び減容化施設等整備
放射性物質除去土壤等管理施設整備費	75,000,000	うち国庫債務負担行為の歳出化46,600,000千円(参考)
国庫債務負担行為限度額総計381,200,000
平成28年度支出予定額46,600,000
平成29年度以降支出予定額334,600,000

放射性物質除去土壤等管理施設不動産購入費	22,800,000
放射性物質除去土壤等管理施設立地補償金	22,800,000
65防衛復興政策費	11,461,552
35武器車両等の購入に必要な経費	2,192,674
35030-123-09武器購入費	541,188	武器購入費国庫債務負担行為の歳出化541,188千円(参考)
国庫債務負担行為限度額総計722,328181,140
[うち国庫債務負担行為を実行しなかった額平成28年度支出予定額541,188
航空需品費188,244千円1,111,270351,9721,612,879540,2161,072,663
35030-123-09諸器材購入費	1,651,486	修理保管用備品費1,111,270351,9721,612,879540,2161,072,663
1.平成25年度国庫債務負担行為2.平成26年度国庫債務負担行為(参考)
国庫債務負担行為限度額総計3,779,0141,166,024
[うち国庫債務負担行為を実行しなかった額
国会、裁判所、会计検査院、内閣、内閣府、復興庁、総務省、法務省、外務省、財務省、文部科学省、厚生労働省、農林水産省、経済産業省、国土交通省、環境省及び防衛省所管 東日本大震災復興特別会計 43

所 管 · 組 織 · 項	事 项	目 の 区 分	予 定 額 (千円)	積 算 内 訳
31 (東日本大震災復興事業) 費	46 水産基盤整備に必要な経費	14,122,000	地方 公共 団 体 水産流通基盤整備事業 水産物供給基盤機能保全 事業
46052-825-00 水産物供給基盤整備事業費補助	12,060,000

46052-825-00 水産資源環境整備事業費補助	1,783,000	地方 公共 団 体 水産環境整備事業 水産生産基盤整備事業

46052-825-00 水産基盤整備事業後進地域特例法適用団体補助率差額	279,000	県 定 率
46 離島水産基盤整備に必要な経費	46052-825-00 水産基盤整備事業費補助	88,000	地方 公共 団 体 水産物供給基盤整備事業 漁港施設機能強化事業

47 社会資本総合整備事業に必要な経費	47052-825-00 社会資本整備総合交付金	103,888,000	地方 公共 団 体 定 額
47 離島社会資本総合整備事業に必要な経費	47052-825-00 社会資本整備総合交付金	1,548,000	地方 公共 団 体 定 額
72 東日本大震災復興附帶工事費
95 東日本大震災復興に係る附帶工事に必要な経費	95059-204-15 附 帯 工 事 費	436,000
73 東日本大震災復興治水事業工事諸費
41 東日本大震災復興に係る治水事業工事諸費に必要な経費	146,475	人員は以下の各工事諸費に係るものである 東日本大震災復興治水事業工事諸費 東日本大震災復興道路整備事業工事諸費 東日本大震災復興港湾整備事業工事諸費 東日本大震災復興国營追悼・祈念施設整備事業工事諸費

41051-201-02 職 員 基 本 給	66,834	一 般 職
02-01 職 員 俸 給	61,573	行政職俸給表(一) 82人〔内6箇月 1人〕
53人
02-02 扶 養 手 当	3,600
02-03 地 域 手 当	1,661	33人
国会、裁判所、会计检查院、内阁、内阁府、复興庁、総務省、法務省、外務省、財務省、

50 文部科学省、厚生労働省、農林水産省、経済産業省、国土交通省、環境省及び防衛省所管 東日本大震災復興特別会計

所 管 · 組 織 · 項	事 项	目 の 区 分	予 定 額 (千円)	積 算 内 訳
66 (東日本大震災復興農業施設災害復旧事業等工事諸費)	49 (東日本大震災復興に係る農業施設災害復旧事業等工事諸費)	49053-201-04 超 過 勤 務 手 当	14,922	時 間 外 手 当
49053-202-08 日 額 旅 費	1,574	内 国 旅 費
工 事 施 行 等 旅 費
49053-203-09 工 事 雑 費	35,817
67 東日本大震災復興山林施設災害復旧事業工事諸費
49 東日本大震災復興に係る山林施設災害復旧事業工事諸費に必要な経費	21,962	時 間 外 手 当
49053-201-04 超 過 勤 務 手 当	7,762	内 国 旅 費
49053-202-08 日 額 旅 費	1,319	工 事 施 行 等 旅 費

49053-203-09 工 事 雑 費	12,881
76 東日本大震災復興河川等災害復旧事業工事諸費
49 東日本大震災復興に係る河川等災害復旧事業工事諸費に必要な経費	328,568	時 間 外 手 当
49053-201-04 超 過 勤 務 手 当	116,125	内 国 旅 費
49053-202-08 日 額 旅 費	19,742	工 事 施 行 等 旅 費

49053-203-09 工 事 雑 費	192,701
総 務 省
総 務 本 省
03 地方交付税交付金
地方交付税交付金財源の交付税及び議与税配付金特別会計へ繰入れに必要な経費	31021-306-22 交付税及び議与税配付金特別会計へ繰入	347,774,901	震災復興特別交付税財源
財 務 省
財 務 本 省	493,474,642
日本司法支援センター総括表
平 成 28 年 度 計 画 予 算 見 積 り
収	支	出
区	区	分	見 达 額(千円)
運 営 費 交 付 金	業 務 經 費	18,078,118
受 託 収 入	東 日本 大 震 災 復 興 業 務 經 費	491,133
事 業 収 入	一 般 管 理 費	2,309,328
そ の 他 の 収 入	363,613	東 日本 大 震 災 復 興 一 般 管 理 費	69,209
人 件 費	5,310,711
東 日本 大 震 災 復 興 人 件 費	142,274
受 託 経 費	16,066,696
合	42,467,469	合	計	42,467,469
（注）下記表中の見込額は、主務大臣に年度計画の届出を行う前のものであることなどの理由により、相当に異動することがある。

## （3） 国立研究開発法人日本原子力研究開発機構

一般勘定

平 成 28 年 度 計 画 予 算 見 積 り
収 入	支 出
区 分	見 込 額(千円)	区 分	見 込 額(千円)
運 營 費 交 付 金	37,866,109	一 般 管 理 費	4,511,643
施 設 整 備 費 補 助 金	1,029,823	人 件 費 (管 理 系)	1,760,349
特定先端大型研究施設運営費等補助金	9,702,208	物 件 費	725,670
核セキュリティ強化等推進事業費補助金	518,879	公 租 公 課	2,025,624
核 変 換 技 術 研究 開 発 費 補 助 金	267,127	事 業 費	33,774,836
受 託 等 収 入	564,731	人 件 費 (事 業 系)	15,353,071
そ の 他 の 収 入	441,072	う ち、埋 設 処 分 事 業 費 繰 入	44,238
物 件 費	15,170,477
う ち、埋 設 処 分 事 業 費 繰 入	477,036
東 日本 大 震 災 復 興 業 務 經 費	3,251,288
施 設 整 備 費 補 助 金 經 費	1,029,823
特定先端大型研究施設運営費等補助金經費	9,702,208
核セキュリティ強化等推進事業費補助金經費	518,879
核 变 換 技 術 研究 開 発 費 補 助 金 經 費	267,127
受 託 等 经 費	564,731
廃 棄 物 処 理 事 業 經 費 繰 越	20,702
合 計	50,389,949	合 計	50,389,949
（注）下記表中の見込額は、主務大臣に年度計画の届出を行う前のものであることなどの理由により、相当に異動することがある。

## （7） 独立行政法人国際観光振興機構

一般勘定

平 成 28 年 度 計 画 予 算 見 積 り
収	支	出
区	見 达 額(千円)	区	見 达 額(千円)
運 営 費 交 付 金	8,037,380	業 務 經 費	5,925,243
寄 附 金 等 収 入	268,500	海 外 宣 伝 事 業 經 費	4,867,279
事 業 収 入	321,230	東日本大震災復興海外宣伝事業經費	1,000,000
事 業 外 収 入	9,002	受 入 対 策 事 業 經 費	48,257
調 查 研 究 事 業 經 費	9,707
受 託 經 費	457,169
人 件 費	1,908,306
一 般 管 理 費	369,104
合 計	8,636,112	合 計	8,659,822
課題名 4RFd-1201 希少種の人為的導入による、在来種への交雑を介した遺伝子浸透

—愛媛県タナゴ類の事例

課題代表者名 畑 啓生 （愛媛大学 大学院理工学研究科 環境機能科学専攻 生態環境科学分野）

研究实施期间 平成24～26年度

累計予算額 5,896千円（うち26年度1,997千円）

予算額は、間接経費を含む。

本研究のキーワード 希少種、保全、国内外来種、交雑、遺伝子浸透

研究体制

（１）希少種の人為的導入による、在来種への交雑を介した遺伝子浸透－愛媛県タナゴ類の事例（愛媛大学）

## 研究概要

### 1. はじめに(研究背景等)

近年の河川環境の人為的な改変により、日本の淡水域では、水生生物にとっての生息場所が質、量ともに損なわれてきた。一方で、日本各地の淡水域には国内外から様々な外来生物が導入され、在来生物に、捕食や競争、また時に遺伝子浸透を介して、強い攪乱を与えている。その結果、多くの在来淡水魚類は希少種となり、その保護が急務である。特に国内の他地域からもたらされる国内外来種の問題は、導入先で定着しやすく、また検出しにくいという特徴があり、私たちが気付かぬ間に在来の生態系を蝕む恐れがある。実際日本の淡水魚においては少なくとも6目13科58種・亜種、日本の在来淡水魚の20%が国内外来種化しているとされ（日本魚類学会自然保護委員会，2013）、これらの国内外来魚がどこからもたらされ、導入先でどのように定着し、在来の生態系にどのような影響を及ぼしているのか、その実体を把握して、対策を講じる必要がある。

そこで、本申請研究では、愛媛県松山平野で在来希少種のヤリタナゴと、国内外来種の可能性が高いアブラボテ（図1）を対象に、形態学的観察と分子遺伝学的手法、さらに野外と実験室における生態

図1。Aヤリタナゴ雄、Bヤリタナゴ雌、Cアブラボテ雄、Dアブラボテ雌。
観察を同時に行って、両種の競争関係や、交雑、遺伝子浸透について明らかにする。ヤリタナゴとアブラボテは、松山平野では二つの小河川のわずか数kmにわたる流程と、それに繋がる4つの泉にしか生息しておらず、ともに絶滅危惧種Ⅰ類に指定されている(愛媛県，2003)。しかし、ミトコンドリア遺伝子の解析により、このアブラボテが福岡からの移入であることが示唆され、しかも在来のヤリタナゴと交雑を生じているらしい(Hashiguchi et al., 2006)。このまま放置すれば、在来のヤリタナゴの、長い時間をかけ、この地に適応して形成された遺伝的固有性が永遠に失われてしまいかねない。そのため、事例研究の一つとして、この松山平野のタナゴ類を対象に、国内の他地域からもたらされる国内外来種が、導入先でどのように定着し、在来の生態系にどのような影響を与えているか、それをどのように検出すれば良いかについて研究を行う。さらに本研究から得られる科学的知見を用いて実際にどのような対策を講じることが可能か検討し、行政や地元住民と協働し、自然再生地など半自然水域を適切に用いて在来の希少種ヤリタナゴの保全区を作成することを検討したい。

### 2. 研究開発目的

本研究は、愛媛県松山平野において、人為的に国内他地域からもたらされたと考えられるアブラボテの起源を明らかにすること、この国内外来魚アブラボテが導入先の松山平野でどのように定着しているのか、在来の生態系、特に近縁種の在来希少種ヤリタナゴにどのような影響を及ぼしているのかを明らかにすることを目的とする。さらに得られた科学的知見をもとに、行政と地域住民と協働して、自然再生事業により作られた半自然水域を用いて、ヤリタナゴの保全区を策定し、ヤリタナゴ保全のシステムの構築を目指す。この松山のタナゴ類を事例研究の一つとし、国内の他地域からもたらされる国内外来種が、導入先でどのように定着し、在来の生態系にどのような影響を与えているか、それをどのように検出すれば良いか、どのような対策を講じることができるか、これらについて私たちの理解を深めることを目的とする。

### 3. 研究開発の方法

## (1) 希少種の人為的導入による、在来種への交雑を介した遺伝子浸透

松山平野を流れる重信川水系、国近川水系、長尾谷川、大谷川水系の4水系59地点及び湧水池42地点にてアブラボテの採集を試みた。42地点の湧水池においては潜水調査も行い、アブラボテの在／不在を確認した。また、香川県、広島県、兵庫県、京都府、山口県、大分県、福岡県、佐賀県、鹿児島県及び熊本県においてアブラボテの採集を行った。

採集しエタノール固定した各試料より右腹鰭の一部を切り出し、DNAを抽出した。mtDNAのcytochrome b（cytb）領域についてPCRを行い増幅し、塩基配列を決定した。得られたcytb領域の塩基配列データに加えて、DDBJからアブラボテのcytb遺伝子塩基配列として登録されている全データを引用して使用した。これらの塩基配列データをもとに系統樹を作製した。

上記のミトコンドリア遺伝子は母系遺伝するため、この配列のみに基づいて交雑個体の判定をすることはできない。形態型とミトコンドリア遺伝子型の不一致により、明らかに交雑由来と分かる個体が判定できるに止まる。そのため、より高い精度で交雑由来の個体を検出するため、マイクロサテライトマーカーを用いることとした。マイクロサテライト解析は先行研究に従い計6つのマーカーを用いて行った。STRUCTUREを用いて各個体の帰属性について解析を行い、ヤリタナゴ、アブラボテ、交雑個体に分類した。

またこれらのタナゴ類について、識別形質として知られる側線有孔鱗数と臀鰭分岐軟条数を計数した。これらのデータを用いて、二種の形態的な差異と、交雑個体の形態的特徴を明らかにした。

国近川水系3河川、長尾谷川水系1河川に合計58地点の調査地点を設定し、タナゴ類の産卵床となる二枚貝の分布調査を行った。採集した生貝はマーキングを行い、実験室に持ち帰って殻長を計測し、育児囊内の卵及び幼生の有無を記録し、その後河川の採集した場所に再び放流した。

国近川、神寄川、長尾谷川の3河川において、二枚貝が高密度で生息する地点に調査地を一つずつ設定し、2013年4月から10月にかけて、毎週タナゴ卵が産みこまれた二枚貝を採集し、水槽内で稚魚を孵化させ、この稚魚について核DNAのマイクロサテライトマーカー分析を行った。STRUCTURE解析によって、各仔魚個体がアブラボテ純系か、ヤリタナゴ純系か、または交雑個体かどうかを判定した。

国近川、神寄川、長尾谷川において、2014年6月、10月にヤリタナゴとアブラボテ、交雑個体の採集を行った。同時に各地点において懸濁態有機物、ベントス（ミズムシ、ヌマエビ、マツカサガイ）、デトリタス、底生藻類、水草を採集した。これらにつき、安定同位体比質量分析計を用い炭素・窒素
安定同位体比を測定した。

10%中性ホルマリンで固定したタナゴ魚体サンプルの標準体長（SL）を測定後、腸管を取り出し、Intersecting Point（IP値）と腸管長（Intestine length，IL）を測定した。得られた結果につきヤリタナゴとアブラボテ間で比較を行い、これらの二種のニッチの重複について検討した。

またヤリタナゴとアブラボテの自然分布域で二種が共存している西日本各地の調査地、熊本県緑川、佐賀県嘉瀬川、佐賀県六角川、福岡県遠賀川、福岡県今川、大分川駅館川、山口県厚東川、広島県芦田川、兵庫県武庫川、京都府淀川の10の河川で、ヤリタナゴとアブラボテの採集を行い、標本からDNA抽出し、核遺伝子の6つのマイクロサテライトマーカーを用いた集団遺伝解析を行い、各調査地において採集された各個体につき、ヤリタナゴ純系、アブラボテ純系、交雑個体のいずれに当たるか判定を行った。松山平野では、国近川水系において2014年6月、8月、10月に河川上流から300 mおきに採集を行った。マイクロサテライト解析には上記と同様計6つのマーカーを用いて行った。

図2。ヤリタナゴとアブラボテのミトコンドリア遺伝子cytochrome b領域を用いた分子系統樹。最尤法により構築。枝上の値は最尤法/近隣結合法によるブートストラップ値。括弧内の数字は同一配列を持つ個体数。*は、その配列がDDBJからの引用であることを示す。
### 4. 結果及び考察

## (1) 希少種の人為的導入による、在来種への交雑を介した遺伝子浸透

湧水池における分布調査の結果、アブラボテは全湧水池42地点のうち、国近川水系、長尾谷川水系周辺の松前区域に位置する4地点と重信川中流の東温区域に位置する2地点の合計6地点に出現した。1979年に重信川中下流域で初確認された松山平野のアブラボテは、湧水池における過去との魚類相比較から分布域を拡大していることが明らかとなった。

合計216個体から得られたcytb領域1016塩基対を用いて系統解析を行ったところ、塩基置換によって区別される87種類のmtDNAハプロタイプが検出された。アブラボテは東瀬戸内グループ、西瀬戸内グループ、西九州グループの3グループに分けられた（図2）。松山平野のアブラボテの分布は、湧水池が集中する松山平野沿岸部の松前区域と重信川水系中流の東温区域の2区域に限られていた。この2区域で採集したアブラボテは全てmtDNAの系統において西九州グループに含まれた。松山平野では湧水池に加え、河川で採集した全てのアブラボテ個体が福岡県西部の矢部川水系に見られるアブラボテ個体群とハプロタイプを共有した（図3）。愛媛県と隣接する香川県、広島県芦田川以東では東瀬戸内グループの個体群が、山口県、広島県沼田川以西、大分県、福岡県東部の豊前地域（中島 et al.，2006）は西瀬戸内グループの個体群が生息していた。そのため、松山平野で採集されたアブラボテ個体群が、福岡県西部の矢部川のみでみられるハプロタイプを持つのは不自然であり、三郡山地・英彦山地の地理的隔離を越えて人為的にもたらされた個体群である可能性が極めて高い。

図3。アブラボテの九州グループのcytochrome b遺伝子領域のハプロタイプネットワーク図。円グラフの黒は松山平野で採集した個体、灰色は福岡県矢部川で採集した個体、白は矢部川以外の九州の河川で採集した個体を示す。円の大きさは個体数に対応する。トッドは検出されなかったハプロタイプを示し、各ハプロタイプを結ぶ線は一塩基の変異を示す。
の個体を判定したところ、調査した松山平野全体では22.5%（40/178個体）交雑個体が見られた。松山平野における交雑個体の分布は、国近川、神寄川、長尾谷川ともに上流ほどアブラボテの割合が高く、特に湧水池においては出作新泉、福徳泉ともにアブラボテの割合が高かった（図4）。つまり、流速が早く河川幅のある国近川河口付近にはヤリタナゴが分布し、湧水池から近く流速が遅い地点にはアブラボテが分布しており、2種は棲み分けていることが分かった。しかし、交雑個体は湧水池から河口付近まで幅広く分布し、松山平野で広く見られることが明らかになった。また、両種とも浸透交雑が進んでいることが明らかとなった。

図4。マイクロサテライト解析により判定したヤリタナゴ純系（赤）、アブラボテ純系（緑）、ヤリタナゴーアブラボテ交雑（灰）個体の松山平野における分布。

松山平野において二枚貝類の分布を調査したところ、松山平野にはマツカサガイが最も優占していたが、その分布は局所的であった（図5）。イシガイ類の生息密度を説明する環境要因を選択したところ、底質材料中の砂の割合が37.3%より大きい場所で密度が有意に高く、堰堤より下流に生息域があることが分かった。イシガイ類は自身の体を底質中に埋没させて生活しており、マツカサガイは一般に砂礫から砂質の底質を好むことが知られており、松山平野の湧水性河川でも、マツカサガイは砂質の底質を好むことが示唆された。また堰堤がイシガイ類のグロキディウム幼生の宿主となる魚類の遡上を妨げ、マツカサガイの分布が河川堰の下流側に制限されていることが示唆された。さらに、今回採集された生貝は、殻長組成のピークが一つしかなく、いずれも成貝であった（図6）。メスの貝は繁殖期に妊卵していることと、シマヨシノボリでマツカサガイのグロキディウム幼生の寄生がみられることが確認された。そのため、これらの成貝は全て再生産に参加できるにも関わらず、少なくとも過去数年間は新規加入した個体は存在しない、その理由としてはグロキディウム幼生の生残率、着底率、稚貝の生残率が低いことなどが考えられた。

採集した二枚貝を飼育し、得られたタナゴ稚魚について、6つのマイクロサテライトマーカーの解析を行なった。その結果、3河川ともに交雑由来の仔魚が確認でき、交雑仔魚の割合は、国近川で3.0%（4/135個体）、神寄川で11.2%（20/178個体）、長尾谷川で14.4%（34/235個体）であった。アブラボテ
図5。松山平野における淡水二枚貝の分布。円の大きさは個体数を表す。

図6。愛媛県松山平野におけるマツカサガイの殻長のサイズ分布。

とヤリタナゴの産卵期は、3河川で6月中旬から8月下旬にかけて重なっていた。アブラボテとヤリタナゴの交雑個体は3河川で確認でき、いずれも2種の孵出した時期が重なった期間に交雑個体が孵出した傾向にあるため、2種の産卵期が重なっている時期に交雑が起こっていることが示唆された。神寄川と長尾谷川では交雑個体の割合が高かった。これはこれらの河川でマツカサガイの密度が低く、マツカサガイ一個体に産卵されていたタナゴ類の卵が多いためと考えられる。

消化管形態は、ヤリタナゴでアブラボテより腸管長が長く複雑であった。窒素安定同位体比分析からも、ヤリタナゴは藻類食が強く、アブラボテは動物食が強いことが示唆された。しかし、繁殖期には二種の栄養段階は重複し、餌資源に重複が生じることがわかった。

松山平野と西日本各地で採集したヤリタナゴ、アブラボテのマイクロサテライト遺伝子解析の結果、西日本のヤリタナゴ、アブラボテの共存域11地点のうち8地点で交雑個体が確認された（図7）。交雑個体からはヤリタナゴ、アブラボテ双方のmtDNA型が見つかり、交雑は双方向に生じることがわかった。多くの地点で交雑個体が確認されたことから、交雑は自然下でも生じていることが示唆された。
図7。西日本各地のヤリタナゴ、アブラボテ共存域における、ヤリタナゴ純系、アブラボテ純系、交雑個体の割合。核のマイクロサテライトマーカー6遺伝子座に基づいて判定した。

松山平野において、ヤリタナゴとアブラボテの間で流程分布に差が見られ、季節を通してヤリタナゴは河川の下流側、アブラボテは河川上流から下流側にかけて分布が集中していた。また、交雑個体は河川上流から下流にかけて分布していた。ヤリタナゴに関しては愛媛県松山平野において近年急速に数を減らしている。アブラボテとの交雑により生じた交雑個体が季節を通して河川全体に出現していることから、遺伝子浸透の進行や餌資源・繁殖資源をめぐる競争により、更にヤリタナゴの絶滅に拍車をかけているものと考えられる。

これらの結果より、愛媛県の絶滅危惧種ヤリタナゴを保全するためには、まずヤリタナゴ純系の保全区を策定する必要があること、その保全区はヤリタナゴの生息適地であるだけでなく、タナゴの産卵床となるマツカサガイの生育に適した砂地をもち、さらにマツカサガイのグロキディウム幼生の宿主となるヨシノボリ類が生育していることが必要であることがわかった。私たちの調査によって、自然再生事業で松山平野に作られている自然再生地がこの条件に適していることがわかり、この自然再生地を用いて、官民学がヤリタナゴ保全区を策定し、維持していく必要性を提言した。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

本研究では、ミトコンドリア遺伝子を用いて系統地理解析を行うことで、愛媛県松山平野に分布するアブラボテは、福岡県矢部川水系からの移入集団である可能性が高いことを明らかにした。また核のマイクロサテライト遺伝子マーカーを用いることで、在来のヤリタナゴと交雑が生じており、特に産卵床となるマツカサガイの密度が低い場所で交雑個体が多く生じることが分かった。松山平野ではヤリタナゴのみが生育する場所はすでになく、松山平野で広くアブラボテとの交雑個体が生育しており、両種の遺伝子浸透も双方向に進んでいるという危機的実態が明らかになった。また松山平野に共存する在来のヤリタナゴと国内移入種のアブラボテとで、消化管の形態を比較し、ヤリタナゴが藻食に適応し、アブラボテは雑食性であることを明らかにし、さらに炭素、窒素安定同位体比をマーカーとして用いることで、やはりアブラボテの方がより高い栄養段階を占めるが、繁殖期には両種が同様な餌資源を利用して競合関係にある可能性を示した。松山においては、マツカサガイの分布は極めて局所的で、その密度も低かった。さらに、マツカサガイの稚貝や幼貝が見られないことから、数年に亘って再生産していないものと考えられる。そのため、愛媛県の絶滅危惧種ヤリタナゴを保全するため
めに、ヤリタナゴのみならず、その産卵床となるマツカサガイ、さらにマツカサガイのグロキディウム幼生の寄主となるヨシノボリ類、これらを含んだ保全区を策定する必要があることを示した。

さらにヤリタナゴとアブラボテが共存する西日本各地の調査地において、核のマイクロサテライトマーカーを用いた集団解析により、松山平野以外にも高い交雑率を示す河川があることを明らかにした。松山のみならず、複数の地点で何らかの理由によって二種の間の生殖隔離機構が損なわれている可能性があるため、その原因を突き止め、準絶滅危惧種である両種の保全にあたる必要があることを示唆した。

## (2) 環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

本研究の成果に基づき愛媛県レッドデータブックの執筆を行い、ヤリタナゴを絶滅危惧IA（CR）に格上げ、アブラボテを情報不足（DD）に格下げを行った。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

本研究の成果について、行政（国土交通省四国地方整備局、愛媛県、松山市、伊予市、松前町、砥部町、東温市）と10のNP0、地域の大学（愛媛大学）、高校（伊予農業高校）が集まった重信川の自然を育む会第16会総会（2015年2月2日開催）において「自然再生地を用いたヤリタナゴ保全の提案」という議題で話題提供し、この会の合意を得て、官民学が協働してヤリタナゴ保全区を策定し、ヤリタナゴの保全にあたる計画が進行している。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

## く査読付き論文>

1）松葉成生、吉見翔太郎、井上幹生、畑啓生：分子系統地理が示す愛媛県松山平野におけるアブラボテの人為移入起源、魚類学雑誌、61, 89-96 (2014).

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1）松葉成生、畑啓生：日本生態学会（2013）

「愛媛県における在来種ヤリタナゴと国内移入種ア ブラボテの交雑」

2）松葉成生、久保田菜々、黒川真帆、畑啓生：四国魚類研究会（2013）

「松山平野における在来種ヤリタナゴと国内移入種アブラボテの交雑実態及びそれらの分布把握」

3) 松葉成生、大内魁人、吉見翔太郎、畑 啓生：日本魚類学会（2013）

「松山平野における在来ヤリタナゴと移入アブラボテの交雑と遺伝子浸透」

4）吉見翔太郎、畑啓生：四国魚類研究会（2014）

「DNAで探るアブラボテ属タナゴ2種の系統地理」

5）桑原明大、畑啓生：四国魚類研究会（2014）

「愛媛県松山平野の湧水性河川における希少イシガイ類の生息環境」

6）大内魁人、畑啓生：四国魚類研究会（2014）

「産卵床の二枚貝を共有する在来種ヤリタナゴと国内移入種アブラボテの交雑」

7）大内魁人、畑啓生：第42回四国魚類研究会（2015）

「松山平野における在来種やリタナゴと国内移入種アブラボテの交雑」

8）桑原明大、畑啓生：第42回四国魚類研究会（2015）

「愛媛県松山平野の湧水性河川におけるマツカサガイの分布と再生産」

9）畑 啓生、松葉成生、大内塊人、桑原明大、吉見翔太郎、石井麻友、井上幹生：日本生態学会（2014）「国内外来種が引き起こす在来種との交雑と遺伝子浸透：松山平野の在来ヤリタナゴと移入アブラボテの事例」

### 7. 研究者略壓

課題代表者：畑 啓生

京都大学大学院人間・環境学研究科博士後期課程修了、博士（人間・環境学）、現在、愛媛大学院理工学研究科環境機能科学専攻生態環境科学分野助教
# 4RFd-1201 希少種の人為的導入による、在来種への交雑を介した遺伝子浸透－愛媛県タナゴ類の事例

爱媛大学 大学院理工学研究科

環境機能科学専攻 生態環境科学分野

烟 啓生

平成24～26年度累計予算額：5,896千円

（うち、平成26年度予算額：1,997千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

日本の淡水域には国内外から様々な外来生物が導入され、在来生物に、捕食や競争、また時に遺伝子浸透を介して、強い攪乱を与えている。特に国内の他地域からもたらされる国内外来種の問題は、導入先で定着しやすく、また検出しにくいという特徴があり、私たちが気付かぬ間に在来の生態系を蝕む恐れがある。実際日本の淡水魚においては少なくとも20%が国内外来種化しているとされ、これらの国内外来魚がどこからもたらされ、導入先でどのように定着し、在来の生態系にどのような影響を及ぼしているのか、その実体を把握して、対策を講じる必要がある。本研究では、松山で国内外来種と疑われるヤリタナゴについて、松山平野における網羅的採集と、西日本各地における採集を行い、それら標本について遺伝子マーカーを用いた系統地理解析を行うことで、松山平野のアブラボテが福岡県からの人為移入起源を持つことを明らかにした。さらに、松山平野では近年この国内外来種アブラボテが急速に分布を広げる一方、在来近縁種のヤリタナゴがその分布を急速に縮小していることが分かった。さらに両種が同じマツカサガイを産卵床として初夏から夏にかけてほぼ同じ時期に利用し、この二枚貝の分布が松山平野では極めて局所的で密度も低いため、二種が産卵床を巡って競争関係にあることが示唆された。さらに核遺伝子のマイクロサテライトマーカーを用いた集団遺伝解析により、松山平野ではヤリタナゴとアブラボテとの交雑が生じていること、交雑は雑種第二世代以降も進行し、両種への浸透交雑が生じていることが明らかとなった。これらの結果に基づき、ヤリタナゴは愛媛県レッドデータブックで絶滅危惧IA(CR)に指定された。さらに松山平野ではヤリタナゴのみが生育する生息地は見つかっておらず、広くアブラボテとの交雑が見られるため、早急にヤリタナゴの保全区を策定する必要があり、自然再生地を用いた官民学協働の保全を提言した。

[キーワード] 希少種、保全、国内外来種、交雑、遺伝子浸透

### 1. はじめに

近年の河川環境の人為的な改変により、日本の淡水域では、水生生物にとっての生息場所が質、
量ともに損なわれてきた。一方で、日本各地の淡水域には国内外から様々な外来生物が導入され、在来生物に、捕食や競争、また時に遺伝子浸透を介して、強い攪乱を与えている。その結果、多くの在来淡水魚類は希少種となり、その保護が急務である。特に国内の他地域からもたらされる国内外来種の問題は、導入先で定着しやすく、また検出しにくいという特徴があり、私たちが気付かぬ間に在来の生態系を蝕む恐れがある。実際日本の淡水魚においては少なくとも6目13科58種・亜種、日本の在来淡水魚の20%が国内外来種化しているとされ(日本魚類学会自然保護委員会，2013)、これらの国内外来魚がどこからもたらされ、導入先でどのように定着し、在来の生態系にどのような影響を及ぼしているのか、その実体を把握して、対策を講じる必要がある。

図1。Aヤリタナゴ雄、Bヤリタナゴ雌、Cアブラボテ雄、Dアブラボテ雌。

そこで、本申請研究では、愛媛県松山平野で在来希少種のヤリタナゴと、国内外来種の可能性が高いアブラボテ（図1）を対象に、形態学的観察と分子遺伝学的手法、さらに野外と実験室における生態観察を同時に行って、両種の競争関係や、交雑、遺伝子浸透について明らかにする。ヤリタナゴとアブラボテは、松山平野では二つの小河川のわずか数kmにわたる流程と、それに繋がる4つの泉にしか生息しておらず、ともに絶滅危惧種Ⅰ類に指定されている(愛媛県，2003)。しかし、ミトコンドリア遺伝子の解析により、このアブラボテが福岡からの移入であることが示唆され、しかも在来のヤリタナゴと交雑を生じているらしい(Hashiguchi et al.，2006)。このまま放置すれば、在来のヤリタナゴの、長い時間をかけ、この地に適応して形成された遺伝的固有性が
永遠に失われてしまいかねない。そのため、事例研究の一つとして、この松山平野のタナゴ類を対象に、国内の他地域からもたらされる国内外来種が、導入先でどのように定着し、在来の生態系にどのような影響を与えているか、それをどのように検出すれば良いかについて研究を行う。さらに本研究から得られる科学的知見を用いて実際にどのような対策を講じることが可能か検討し、行政や地元住民と協働し、自然再生地など半自然水域を適切に用いて在来の希少種ヤリタナゴの保全区を作成することを検討したい。

### 2. 研究開発目的

本研究は、愛媛県松山平野において、人為的に国内他地域からもたらされたと考えられるアブラボテの起源を明らかにすること、この国内外来魚アブラボテが導入先の松山平野でどのように定着しているのか、在来の生態系、特に近縁種の在来希少種ヤリタナゴにどのような影響を及ぼしているのかを明らかにすることを目的とする。さらに得られた科学的知見をもとに、行政と地域住民と協働して、自然再生事業により作られた半自然水域を用いて、ヤリタナゴの保全区を策定し、ヤリタナゴ保全のシステムの構築を目指す。この松山のタナゴ類を事例研究の一つとし、国内の他地域からもたらされる国内外来種が、導入先でどのように定着し、在来の生態系にどのような影響を与えているか、それをどのように検出すれば良いか、どのような対策を講じることができるか、これらについて私たちの理解を深めることを目的とする。

### 3. 研究開発方法

松山平野を流れる重信川水系、国近川水系、長尾谷川、大谷川水系の4水系59地点及び湧水池42地点（愛媛県立博物館，1994，1995）にて2011年5月から2013年10月に手網、電気漁具もしくはモンドリ畏を用いてアブラボテの採集を試みた。そのうち、3水系11地点及び湧水池3地点の計14地点において計45個体のアブラボテが採集された。また比較サンプルとして香川県、広島県、兵庫県、京都府、山口県、大分県、福岡県、佐賀県、鹿児島県及び熊本県においてもアブラボテの採集を行った（表1）。なお、これらの地域のアブラボテの多くは各県のレッドデータブックに掲載されているため、採集個体数を10個体以下とした。採集した個体は直ちに99.9%エタノールで固定した。種同定は中坊（2013）に従った。また、42地点の湧水池においては潜水調査も行い、アブラボテの在／不在を確認した。この調査は、2012年12月から2013年7月の期間に、各池につき1回、Uchida and Inoue（2010）に準拠してベルトトランセクトを設けて行った。そして、湧水池の魚類相が記載されている文献(Uchida and Inoue，2010；愛媛県立博物館，1994，1995)からタナゴ類の分布記録を抽出し、本調査の結果と比較した。なお、湧水池の概況や潜水調査の方法についてはUchida and Inoue（2010）及び藤原 et al.（2014）に記述されている。
表1。アブラボテの採集地、採集日、採集個体数。灰色の網掛けは交雑と推定された個体を示す。

水系 略称	産地	n	採集日	アクセッション番号
愛媛県
国近川	KN	松前	29	2011年5、9月	AB907119 - 31
国近川	KN	松前	2	2011年5月	AB920290 - 91
国近川	KN	松前	1	2011年5月	AB920289
国近川	KN	3	*AB108980 - 82
長尾谷川	NDe	松前	6	2011年9月	AB907133 - 35
重信川	SGf	東温	7	2012年6月	AB907145 - 48
香川県
土器川	DK	丸亀	5	2011年10月	AB907110 - 11
京都府
淀川	YD	亀岡	9	2013年5月	AB907114 - 15
兵庫県
武庫川	MK	尼崎	5	2013年12月	AB907104 - 07
岡山県
旭川	AH	4	*AB108968 - 71
広島県
芦田川	AD	福山	8	2012年8月	AB907102 - 03
2	2013年6月	AB907102 - 03
沼田川	NT	三原	2	2013年6月	AB907108 - 09
島根県
江ノ川	GN	8	*AB108972 - 79
山口県
椹野川	FS	山口	5	2013年10月	AB907160 - 61
厚東川	KT	宇部	3	2013年10月	AB907162 - 63
木屋川	KY	下関	8	2013年9月	AB907164 - 66
10	*AB108958 - 67
大分県
山国川	YM	中津	10	2013年2月	AB907139 - 42
駅館川	YK	宇佐	4	2013年2月	AB907136 - 38
5	*AB108953 - 57
八坂川	YS	杵築	10	2013年10月	AB907143 - 44
福岡県
遠賀川	OG	3	*AB108935 - 37
今川	IM	5	*AB108938 - 42
長狭川	NG	3	*AB108943 - 45
筑後川	CGhm	5	*AB108921 - 25
CGks	9	*AB108926 - 34
表1。続き

River system	Abbreviation	Locality	n	Date	Accession number
福岡県
矢部川	YB	8	*AB108913 - 20
八女	10	2013年2月	AB907153 - 59
佐賀県
松浦川	MT	7	*AB108946 - 52
嘉瀬川	KS	佐賀	6	2013年2月	AB907149 - 52
熊本県
緑川	MD	熊本	4	2013年10月	AB907116 - 18
鹿児島県
小次郎川	KJ	出水	5	2013年10月	AB907112 - 13
高松川	TM	阿久根	5	2013年10月	AB907132

$ ^{*} $ はDDBJからの引用を示す。

## mtDNA分析

エタノール固定した各試料より右腹鰭の一部を切り出し、Wizard $ ^{®} $ Genomic DNA Purification Kit（Promega）を用いてDNAを抽出した。mtDNAのcytochrome b（cytb）領域についてプライマーセットForward: NEW-FOR, 5’-AGCCTACGAAAAACACACCC-3’（Gilles et al., 2001）、Reverse: cytb-Rev, 5’-GATCTTCGGATTACAAGACC-3’（Hashiguchi et al., 2006）を用いてPCRを行い増幅した。目的領域が増幅されたPCR産物についてはABI 3130（Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。得られた配列はDNA Data Bank of Japan（DDBJ）に登録した。

得られたcytb領域の塩基配列データに加えて、DDBJのウェブサイトからアブラボテのcytb遺伝子塩基配列として登録されている全データを引用して使用した。外群には国近川（AB108912、AB108906）、矢部川水系（YB、AB108852）、遠賀川（OG、AB108874）、旭川（AH、AB108894）、島根県斐伊川（AB108903）のヤリタナゴを用い、Clustal W（Thompson et al., 1994）により多重整列をおこなった。これらの塩基配列データをもとに、MEGA5（Tamura et al., 2011）によりモデル選択を行い、ベイズ情報量基準により選択されたTamura-Nei+G modelを用い、最尤法による系統樹を作製した。また各枝について近隣結合法、最尤法、それぞれで1,000回のランダム・サンプリングによるブートストラップ確率を求めた。松山平野で確認されたハプロタイプを含むクレードについて、統計学的最節約法に基づくハプロタイプネットワークをTCS1.21（Clement et al., 2000）により作製した。

## マイクロサテライトマーカーを用いた交雑個体の特定

上記のミトコンドリア遺伝子は母系遺伝するため、この配列のみに基づいて交雑個体の判定をすることはできない。形態型とミトコンドリア遺伝子型の不一致により、明らかに交雑由来と分かる個体が判定できるに止まる(Hashiguchi et al., 2006；松葉 et al., 2014)。そのため、より高い精度で交雑由来の個体を検出するため、マイクロサテライトマーカーを用いることとした。
DNAは魚体から切り取ったヒレの一部を用いてGenomic DNA Purification Kit (Promega)により抽出した。マイクロサテライト解析にはShirai et al. (2009)でRhodeus ocellatusに用いられたRC363、RC317AとDawson et al. (2003)でRhodeus sericeusに用いられたRser02、Rser03、Rser07、Rser10の計6つのマーカーを用いて行った。各マーカーにつき、得られたアリルサイズを用いてMicroChecker v. 2.2.3によりヌルアリルの有無を確かめた。結果、全てのマーカーにおいてヌルアリルの存在が確認されなかったため全てのマーカーを解析に用いた。この結果に基づき、STRUCTURE version 2.3.4を用いて各個体の帰属性について解析を行った。Structure Harvester v. 0.6.93を用いて最適なKを推定した結果、K=2で最も高い△Kを示した。これに従い、各個体の帰属性をヤリタナゴ、アブラボテ、交雑個体に分類した。交雑個体は、ヤリタナゴとアブラボテのそれぞれの遺伝的要素を2:8から8:2まで併せ持つ個体と定義した(Vähä and Primmer, 2006)。

またこれらのタナゴ類について、識別形質として知られる側線有孔鱗数と臀鰭分岐軟条数を計数し、また魚体輪郭にランドマークを設定し、幾何学的形態測定法にて形態計測を行った。これらのデータを用いて、二種の形態的な差異と、交雑個体の形態的特徴を明らかにした。

## イシガイ類の分布調査

国近川水系3河川、長尾谷川水系1河川に合計58地点の調査地点を設定し、2013年6月から11月にかけて調査を行った。国近川と長尾谷川は河口から300 m毎に調査地点を設定した。また、神寄川は国近川に、大井手川は神寄川にそれぞれ接続しているため、その接続地点から上流に向け300 m毎に調査地点を設定した。

各調査地点では水路幅×流路に沿った特定の長さ（水路幅が10 m未満であれば5 m、10 m以上15 m未満であれば3 m、15 m以上であれば1 m）の長方形の調査区を設置し、その中でイシガイ類を網羅的に徒手採集した。採集したイシガイ類は生貝、合弁死貝ともに調査区内の左岸側、流央側、右岸側のいずれで採集できたかを記録した。その後、生貝はマーキングを行い、実験室に持ち帰って殻長の計測し、育児囊内の卵及び幼生の有無を記録し、その後河川の採集した場所に再び放流した。種同定は、(近藤，2008)にしたがって形態で分類を行った。なお、ドブガイにはヌマガイとタガイの2種が含まれるが(田部 et al.，1994)、中間的な形態が現れるため、殻形態からの2種の同定は困難である。本研究の調査地では生息密度が非常に低く、本研究ではドブガイAnodonta sp.として扱った。

## イシガイ類への産卵数調査

国近川、神寄川、長尾谷川の3河川において、二枚貝が高密度で生息する地点に調査地を一つずつ設定し、2013年4月から10月にかけて、毎週タナゴ卵が産みこまれた二枚貝を採集し、水槽内で稚魚を孵化させ、この稚魚について核DNAのマイクロサテライトマーカー分析を行った。DNAは魚体または卵を用いてGenomic DNA Purification Kit (Promega)により抽出した。マイクロサテライト解析には上記と同様、計6つのマーカーを用いて行った。各マーカーにつき、得られたアリルサイズを用いてMicroChecker v.2.2.3によりヌルアリルの有無を確かめた。結果、全てのマーカーにおいてヌルアリルの存在が確認されなかったため全てのマーカーを用い、STRUCTURE version 2.3.4によって各個体の帰属性について解析を行った。それにより、産卵されていた卵数を計数し、各仔魚個体がアブラボテ純系か、ヤリタナゴ純系か、または交雑個体かどうかを判定した。
炭素、窒素安定同位体比を用いたヤリタナゴとアブラボテの餌資源解析

国近川、神寄川、長尾谷川において、2014年6月、10月にヤリタナゴとアブラボテ、交雑個体の採集を行った。同時に各地点において水20 L、ベントス（ミズムシ、ヌマエビ、マツカサガイ）、デトリタス、底生藻類、水草を採集した。ベントスはタモ網を用いて採集し、ミズムシとヌマエビは5個体以上、マツカサガイは1個体採集した。デトリタスは流下物を網で採取した。底生藻類は石に付着している藻類をブラシでこすり落として採集した。得られた標本から筋肉片を取り出し、窒素、炭素安定同位体比を用いて食物網解析を行った。安定同位体解析に用いためにベントスは採集後24時間を無給餌で放置し、消化管内容物を排出させた。ミズムシを除くベントスとタナゴ類は、骨や殻を除いた筋肉組織のみを切り出した。デトリタス、底生藻類は不純物を除いた。水草は超純水で洗浄した。ソーティングしたサンプルは、電気オーブンにて60℃で24時間以上乾燥した後、それぞれメノウ鉢で粉末状に粉砕した。550℃で3時間焼き、有機物を除去したGF/Fガラスフィルターを用いて、水20 Lを濾過し、懸濁態有機物（POM）を採集した。濾過したフィルターは、電気オーブンにて60℃で24時間乾燥させた。フィルターは乾燥後、フィルター上の濾過捕集物の付着した部分を全てピンセットで剥離し、メノウ鉢で粉末状に粉砕した。また、炭素安定同位体比を測定するフィルターは、無機炭酸塩を除去するために、乾燥後12N塩酸溶液10 mlをシャーレに入れ、底部にセットしたデシケーター内へ、フィルターを時計皿にのせて入れ24時間処理し、再び乾燥させた。その後同様に剥離し、粉砕した。粉砕したサンプルをスズカップに量りとり円柱状に包み込んだ。スズカップに包み込んだサンプルを安定同位体比質量分析計

(ANCA-SL, SerCon, PDZ Europe, Ltd) にセットし、炭素・窒素安定同位体比を測定した。スタンダードとしてヒスチジンを使用した。炭素・窒素安定同位体比は標準試料（Cは矢石の化石中の炭酸カルシウム、Nは大気中の窒素）の炭素・窒素安定同位体比に対する千分率として以下の式によって表される。

$ \delta X = \left[\left(R \text{ sample}/R \text{ standard}\right) - 1\right] \times 1,000 (\%) $

Xは $ ^{13} $ Cまたは $ ^{15} $ N、R sampleはサンプルの $ ^{13} $ C/ $ ^{12} $ C比または $ ^{15} $ N/ $ ^{14} $ N比を、R standardは標準試料の $ ^{13} $ C/ $ ^{12} $ C比または $ ^{15} $ N/ $ ^{14} $ N比をそれぞれ表す。

解析するサンプルを選定するための予備解析として、タナゴ類とマツカサガイ、ヌマエビ、ミズムシ、底生藻類、デトリタスを解析し、その結果からタナゴ類と濾過食者であるマツカサガイ、餌資源と考えられる一次生産者（POM、底生藻類、水草）、デトリタス、ミズムシを解析に用いた。ヌマエビはタナゴ類とδ¹⁵N値とδ¹³C値において同様の値を示したため、予備解析以降の解析を行わなかった。

10%中性ホルマリンで固定したタナゴ魚体サンプルの標準体長（SL）をノギスで測定後、解剖バサミとピンセットを用いて腸管を取り出し、Intersecting Point（IP値，(Yamaoka, 1985)）と腸管長（Intestine length，IL）を測定した。IP値は腸管の巻き方の複雑さの指標である。取り出した腸管をほどきながら巻き方をスケッチし、腸管の巻きと交点が最も多くなり、前後軸と垂直な直線を引き、交点数を数えることで算出した。腸管長はデジタルカメラで腸管を撮影し、Image Jを用いて測定した。また、腸長比（Intestine length rate，ILR）を腸管長と標準体長から以下のように算出した。

ILR = IL (mm)/SL (mm)