Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
### B. 研究方法

### 1. BFRs の調製

3 種類の PBDEs 製剤(DE-71 [Pentabromodiphenyl oxide], DE-79 [Octabromodiphenyl oxide], DE-83R [Dcabromodiphenyl oxide]; Wellington Laboratories Inc., Ontario, Canada)と、HBCD 製剤 ([1,2,5,6,9,10-Hexabromocyclododecan]; Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO)、TBBPA 製剤 ([4,4'-(1-metylethylidene)bis2,6-(dibromophenol)]; Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan) の 5 物質を検討対象とした。これらの BFRs の化学構造式を、図 1 に示した。各 BFRs は、ジメチルスルフォキシド (DMSO) に溶解した後、DMSO の最終濃度が 0.1% となるように培地で希釈し、実験に使用した。曝露時の最高濃度は、難溶解性の DE-83R のみ 6 μg/ml とし、その他は 10 μg/ml とした。

### 2. 動物

動物は、アトピー素因を有する NC/NgaTndCrlj 雄性マウス（10-13 週齢）を使用した。SPF [specific pathogen free] のマウスを日本チャールスリバー（Yokohama, Japan）より購入し、実験まで通常の餌 CE-2（CE-2; CLEA Japan Inc., Tokyo, Japan）と滅菌水を与えて飼育した。全ての動物実験は、米国 NIH のガイドラインを遵守して行い、当該施設の担当委員会の承認の基に遂行した。また、動物数はできる限り最小限にとどめた。

### 3. 免疫担当細胞の調製と BFRs の曝露

免疫担当細胞は、リンパ球を主体として、複数の免疫担当細胞より構成される脾細胞と免疫・アレルギー反応の起点を担う抗原提示細胞の代表とも言える骨髓由来樹状細胞（bone marrow-derived dendritic cells: BMDC）を用いた。マウスは、ペントバルビタールナトリウム（Dainippon Pharmaceutical Co., Osaka, Japan）の腹腔内注射（100 mg/Kg 体重）により麻酔し、脱血した後、脾臓および大腿骨を摘出した。脾臓は、滅菌したステンレスメッシュ上でつぶし、細胞懸濁液を調製した。大腿骨は、70% エタノールに1分間浸した後、PBS [Dulbecco's calcium and magnesium-free phosphate-buffered saline]（Takara Bio Inc., Shiga, Japan）で洗浄した。この大腿骨の両端をカットし、培地を注入して骨髓を押し出し、懸濁液を滅菌したナイロンメッシュに通して骨の破片等を除去した。脾細胞と骨髓細胞は、溶血処理した後、遠心洗浄し、培地に懸濁した。培地は、GIBCO $ ^{®} $ RPMI-1640 培地（Invitrogen, Grand Island, NY）に10% 非働化ウシ胎児血清（FBS; MP Biomedicals Inc., Eschwege, Germany）、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン（Sigma）、50 μM 2-メルカプトエタノール（Invitrogen）を添加した R10 培地を使用した。生細胞数は、トリパンブルー（Invitrogen）色素排除法により求めた。BMDC は、骨髓細胞（4×10 $ ^{5} $ cells/ml）を、リコンビナントマウス顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor: GM-CSF; Sigma）を含む R10 培地中で6日または8日間培養することにより、分化誘導した。培養の間は、3日目に
等量の培地を加え、8日間培養の場合は6日目に半量の培地を新しい培地と交換した。培養後、浮遊細胞と弱い接着細胞を未熟・成熟BMDCとして回収した。生細胞数は、トリパンブル一色素排除法により求めた。

脾細胞および BMDC（ $ 1 \times 10^{6} $ cells/ml）を、BFRs（0.001-10 μg/ml）またはコントロール（0.1% DMSO）に曝露した。脾細胞は、当該物質に24時間曝露した後、細胞増殖・生存能力と細胞表面分子の発現、培養上清中のサイトカインを測定した。また、脾細胞を、ヤケヒヨウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus: Dp）抽出物（Cosmo Bio LSL, Tokyo, Japan）の存在下で当該物質に72時間曝露した後、細胞増殖を測定した。GM-CSF（20 ng/ml）存在下で8日間培養したBMDCは、GM-CSF（10 ng/ml）の存在下で当該物質に24時間曝露した後、細胞増殖・生存能力と細胞表面分子の発現、ケモカインの産生を測定した。BFRsがBMDCの分化誘導過程に及ぼす影響評価については、骨髓細胞にGM-CSF（10 ng/ml）を加え、BFRs（0.01-1 μg/ml）またはコントロール（0.1% DMSO）の存在下で6日間培養を行い、BMDCを誘導した後、細胞増殖・生存能力と細胞表面分子の発現、サイトカインの産生を測定した。なお、細胞増殖・生存能力はWST-1を用いた比色法により、細胞表面分子の発現はフローサイトメトリーにより、サイトカイン産生はELISA法により、ダニ抗原刺激による細胞増殖はBrdUの取り込み量をELISA法により解析した。

さらに、脾細胞および8日間、GM-CSF（20 ng/ml）刺激により分化誘導したBMDC（ $ 1\times10^{6} $ cells/ml）は、BFRsまたはコントロールに15、60分間曝露した後、シグナル伝達系の変化を解析した。

### 4. 気道上皮細胞と BFRs の曝露

正常ヒト気道上皮細胞株 BEAS-2B を使用し、LHC-9 培地を用いて培養した。BEAS-2B (7.5×10^{4}/ml) は、コラーゲン I コートプレートに播種し、semi-confluent な状態まで培養した後、培地を除去し、化学物質 (0.01-10 $ \mu $ g/ml) またはコントロール (0.1% DMSO) を添加して 24 時間曝露した。曝露後、細胞生存・増殖能は WST-1 を用いた比色法により、細胞表面分子の発現はフローサイトメトリーにより、炎症反応に関与するサイトカイン等の液性因子の産生は ELISA 法により解析した。

また、別の実験系として、BEAS-2B (1×10^{5}/ml) を、コラーゲンⅠコートプレートに播種し、semi-confluentな状態まで培養した後、培地を除去し、化学物質 (0.3-10 $ \mu $ g/ml) またはコントロールを添加した。BFRs の 24 時間曝露後、栄養因子を含まない LHC 基礎培地 (Invitrogen) に変換して 3 時間培養し、培養上清中の上皮成長因子 (EGF) 産生量を ELISA 法により測定した。一方、シグナル伝達系の変化については、BFRs またはコントロールに 15、60 分間曝露した後、フローサイトメトリーにより解析した。

### 5. 細胞増殖・生存能力の測定

脾細胞、BMDC、及び、BEAS-2B の細胞増殖・生存能力は、Premix WST-1 (Takara Bio,
Shiga, Japan）を添加して、30分間反応させ、吸光度を測定することにより評価した。

### 6. フローサイトメトリー

脾細胞については、T細胞マーカーとしてTCRとCD3、リンパ球の活性化マーカーとしてCD69、抗原提示細胞の活性化マーカーとしてMHC class IIと補助刺激分子のCD86の発現を、BMDCについては、BMDCの分化・成熟・活性化レベルの指標として、抗原提示に関わる細胞表面分子であるMHC class IIと補助刺激分子（CD80、CD86）、樹状細胞活性化マーカー（CD11c、DEC205）、リンパ節への遊走に関わるケモカイオンレセプター（CCR7、CXCR4）の発現を、以下の蛍光標識抗抗体を用いて解析した。TCRβ chain (H57-597, FITC標識, BD Pharmingen™, Franklin Lakes, NJ); CD3 complex (17A2, PE標識, BD Pharmingen™); CD69 (H1.2F3, PE標識, BD Pharmingen™); MHC class II: I-A/I-E (2G9, FITC標識, BD Pharmingen™); CD80 (16-10A1, PE標識, BD Pharmingen™); CD86 (GL1, PE標識, BD Pharmingen™); CD11c (HL3, PE標識, BD Pharmingen™); DEC205 (NLDC-145, PE標識, Miltenyi Biotech GmbH, Gladbach Germany); CCR7 (4B12, PE標識, BioLegend, San Diego, CA), CXCR4 (2B11/CXCR4, PE標識, BD Pharmingen™)。BEAS-2Bについては、0.25% Trypsin-EDTAの処理によりプレートから剥離して回収し、接着分子のintercellular adhesion molecule-1: ICAM-1 (CD54)をCD54 (HCD54, PE標識, BioLegend, San Diego, CA)抗体を用いて解析した。細胞は、FACS Buffer（0.3%ウシ血清アルブミンと0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS）に懸濁し、4°C、400×g、5分間遠心洗浄した。各サンプルの細胞（3-5×10⁵）は、100μlのFACS Bufferに懸濁させ、それぞれの蛍光標識抗体を加えて遮光し、氷上で30分間放置した。細胞は、遠心洗浄した後、FACS Bufferに再懸濁させ、蛍光をフローサイトメーターFACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, NJ)により解析した。各サンプルにおいて、1万個の細胞の蛍光データを取得し、陽性細胞率(%)と発現量を示す平均蛍光強度(mean fluorescent intensity、MFI)を指標に解析した。

また脾細胞および8日間の培養により分化誘導したBMDCにおけるシグナル伝達系因子の変化は、Phosflowの製品プロトコールに従い、細胞の固定、細胞膜透過処理、リン酸化特異的抗体の反応の後、フローサイトメーターにより解析した。BEAS-2Bにおけるシグナル伝達系因子の解析には、細胞を0.25% Trypsin-EDTAの処理によりプレートから剥離して回収した後、同様に解析した。使用した蛍光標識リン酸化特異的抗体(BD Pharmingen™)は以下の通りである。p38 MAPK (pT180/pY182) (36/p38 (pT180/pY182), Alexa Fluor® 488 標識); ERK1/2 (pT202/pY204) (20A, PerCP-Cy™5.5 標識); Stat1 (pY701) (4a, PE 標識); Stat3 (pY705) (4/P-STAT3, Alexa Fluor® 647 標識); Stat5 (pY694) (47, Alexa Fluor® 647 標識); NF-κB p65 (pS529) (K10-895.12.50, Alexa Fluor® 488 標識); Akt (pS473) (M89-61, PE 標識); EGF 受容体(EGFR (pY845)) (12A3, Alexa Fluor® 647 標識)。EGF Receptor (pY845) については、BEAS-2B の実験でのみ検討した。各サンプルにおいて、1万個の細胞の蛍光データを取得し、MFI を指標に解析した。
### 7. 液性因子の定量

脾細胞の培養上清中のインターフェロン(interferon: IFN)-γとインターロイキン(interleukin: IL)-4、IL-17、IL-18およびBMDCの培養上清中のthymus- and activation-regulated chemokine (TARC)とmacrophage-derived chemokine (MDC)、IL-12p40の含有量を、マウスIFN-γ ELISA kit (Endogen, Cambridge, MA)とIL-4 ELISA kit (Amersham, Buckinghamshire, UK)、IL-17 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)、IL-18 (MBL, Woburn, MA)、TARC ELISA kit (R&D Systems)、MDC ELISA kit (R&D Systems)、IL-12p40 ELISA kit (Endogen)を用いて、吸光度を測定することにより定量した。

BMDCの培養上清中のtTARCとMDC、IL-12p40の含有量を、Mouse TARC ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)、MDC ELISA kit (R&D Systems)、IL-12p40 ELISA kit (Endogen, Cambridge, MA)を用いて、吸光度を測定することにより定量した。

BEAS-2Bの培養上清中の interleukin (IL)-6、IL-8、可溶性ICAM-1 (sICAM-1)の含有量を、IL-6 ELISA kit、IL-8 ELISA kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) と sICAM-1 ELISA kit (BenderMedSystems, Vienna, Austria) を用いて、EGF含有量を、Human EGF ELISA kit (R&D Systems) を用いて、吸光度を測定することにより定量した。

### 8. ダニ抗原刺激による脾細胞増殖の測定

ダニ抗原刺激による脾細胞増殖は、Cell-proliferation ELISA, BrdU (calorimetric) kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) を用いて、培養終了20時間前にBrdUを添加し、その取り込み量を吸光度で測定することにより評価した。

### 9. 統計解析

実験データは、n=3 で行った 1 回の実験の平均値±SEM を代表例として示した。実験は 2 回または 3 回繰り返し行い、再現性を確認した。データは分散分析を行い、コントロールに対する各実験群間の差異は、Dunnett の多重比較検定を用いて解析し、p<0.05 を有意差とした。

### C. 研究結果と考察

### 1. BFRs 曝露が脾細胞の生存率と活性化マーカー分子に及ぼす影響

初年度に、まず、BFRsの脾細胞に対する毒性影響を明らかにするため、脾細胞の細胞増殖・生存能力について検討した。その結果、DE-71とTBBPAによる変化はほとんど認められず、DE-79とDE-83Rは、最高濃度で、コントロールに比べて脾細胞の細胞増殖・生存能力を抑制する傾向がみられた。一方、HBCDは、最高濃度で、脾細胞の細胞増殖・生存能力をコントロールの60%以下まで抑制した（図2A）。これより、脾細
胞に対して、高濃度の HBCD は毒性影響を及ぼすが、それ以外の 4 物質の毒性影響は弱いものと考えられた。

次に、BFRsが脾細胞の活性化を修飾するか否かを明らかにするため、脾細胞の細胞表面分子の発現とサイトカイン産生について検討した。その結果、いずれのBFRsも、脾細胞中の抗原提示細胞の活性化マーカーであるCD86陽性細胞の割合とMHC class IIのMFI値を増加することが明らかとなった（図3）。加えて、DE-71は、T細胞マーカーであるTCRおよびCD3陽性細胞の割合を増加し、HBCDとTBBPAは、TCR陽性細胞の割合を増加した。一方、いずれのBFRsもCD69の発現は増強しなかった。アレルギー反応に関わるTh2サイトカインであるIL-4の産生は、いずれのBFRs曝露においても顕著な増加が観察された（図4）。しかし、その増加とBFRsの曝露濃度の反応パターンは、物質によって異なる傾向がみられた。また、Th1サイトカインであるIFN-γは、検出限界以下であった。さらに、近年アレルギーへの寄与が示唆されているIL-17とIL-18についても検討したが、いずれも検出限界以下であった。

続いて、ダニ抗原である Dp の存在下で脾細胞増殖を検討した。その結果、DE-71とDE-79、HBCD は、高濃度で、ダニ抗原刺激に誘導される脾細胞増殖を抑制したが、DE-79とDE-83R は、わずかではあるが一部低濃度域で、細胞増殖を促進する作用が観察された。一方、TBBPA による変化は認められなかった。

これより、BFRs は物質によって反応性に違いはあるが、脾細胞の活性化を修飾する作用を持つことが示唆された。一般的に、PBDEs の中で、DE-83R は、DE-71 や DE-79 よりも毒性が低いとされているが、脾細胞に対する影響の明確な差異は認められなかった。また、高濃度の HBCD の毒性影響は有意であったが、その他の BFRs、特に TBBPA の毒性は弱い可能性が示唆された。

### 2. BFRs 曝露が BMDC の生存率と活性化マーカー分子に及ぼす影響

まず、BFRs の BMDC に対する毒性影響を明らかにするため、BMDC の細胞増殖・生存能力について検討した。その結果、いずれの BFRs も BMDC に対して毒性を示すず、高濃度の DE-71 と DE-79 については、むしろ BMDC の細胞数を増加する傾向がみられた（図 2B）。

次に、BFRsがBMDCの活性化を修飾するか否かを明らかにするため、BMDCの細胞表面分子の発現について検討した。その結果、DE-71とDE-79、DE-83R、HBCDは、BMDCの活性化マーカーであるDEC205の陽性細胞の割合の増加とMHC class IIあるいはDEC205、CD86のMFI値を増加した。TBBPAにおいては、MHC class IIのMFI値を増加する傾向がみられたが、BMDCに対する修飾作用は弱い可能性が示唆された。また、DE-83RとHBCDに曝露したBMDCは、Th2反応に関わるケモカインであるTARCとMDCの産生を増加または増加する傾向がみられた（図5）。DE-79曝露は、BMDCのTARCとMDCの産生を低下し、DE71とTBBPA曝露は、BMDCのケモカイン産生に影響を与えなかった。一方、Th1反応に関わるIL-12p40は、いずれのBMDCの培養
上清からも検出されなかった。

初年度に行った BFRs が免疫担当細胞に及ぼす影響を表 1,2 にまとめた。初年度の成果より、BMDC に比較し、脾細胞では、高濃度の BFRs、特に HBCD により生存率の低下が観察されたことや、脾細胞の活性化を示す細胞表面分子の発現の増加や Th2 サイトカイン産生の増加が観察されたことから、リンパ球を主体とする脾細胞と BMDC 等の抗原提示細胞単独の BFRs に対する応答性は異なる可能性が示唆された。

### 3. BFRs 存在下での分化誘導が BMDC の生存率と活性化マーカー分子に及ぼす影響

一方、BFRs が BMDC の分化誘導の過程を修飾する可能性も考えられることから、BFRs の存在下で骨髓細胞を 6 日間培養し、その影響を検討した。細胞生存・増殖能に及ぼす影響について検討した、どの BFRs も BMDC に対しては細胞毒性を示さず、むしろ 1 μg/ml の HBCD は、細胞増殖を促進する傾向がみられた。

DE-71、DE-79、DE-83R、HBCD の存在下で分化・誘導した BMDC は、抗原提示に関わる MHC class II や CD86、活性化マーカーである DEC205 の MFI 値が増加した。また、HBCD は、MHC class II、CD86、CD80、CD11c や DEC205 陽性細胞率を増加させた。一方、影響のパターンや有意差の有無は各化学物質によって異なってはいたが、総じて、5 種類の BFRs の曝露は、BMDC の所属リンパ節への遊走に重要な役割を果たすケモカインレセプターの CCR7 や CXCR4 の陽性率を上昇させた（図 6）。しかし、分化・成熟に関連にする Th2 ケモカインの TARC や MDC の産生に対しては、BFRs 曝露による明確な影響は観察されなかった。また、Th1 サイトカインの IL-12p40 は検出限界以下であった。

最終年度に行った BFRs 存在下での培養が BMDC の分化・成熟に及ぼす影響を表 3 にまとめた。BFRs は BMDC の分化誘導過程に影響を与える可能性が示唆された。

### 4. BFRs 曝露が気道上皮細胞の生存率と活性化マーカー分子に及ぼす影響

BFRs の曝露が気道上皮細胞（BEAS-2B）の細胞生存・増殖能に及ぼす影響について検討した（図7）。その結果、どの BFRs も 1 μg/ml までは細胞毒性を示さなかったが 10 μg/ml の HBCD と 3, 10 μg/ml の TBBPA は、BEAS-2B の生存率を低下させた。一方、0.01-1 μg/ml の TBBPA と 3, 10 μg/ml の DE-71 は、コントロールに比べて BEAS-2B の増殖を促進する傾向が観察された。これより、HBCD と TBBPA は気道上皮細胞に対して毒性を示す可能性があるが、PBDEs の毒性作用は乏しいものと考えられた。

次に、BFRs の曝露が BEAS-2B の ICAM-1 の発現に及ぼす影響について検討した。ICAM-1 は、細胞表面に発現し、炎症細胞との接着に関与する糖蛋白である。ICAM-1 は、BEAS-2B に恒常的に発現しており、いずれの BFRs もその陽性細胞の割合に影響を及ぼさなかったが、その発現強度は、DE-83R を除く 4 種類の BFRs の曝露で、コントロールに対して有意に増加した（図 8）。ただし、10 μg/ml の TBBPA については、コントロールに対して、ICAM-1 の発現強度を有意に低下した。また、BFRs の曝露が
BEAS-2B の sICAM-1 の産生に及ぼす影響について検討した。sICAM-1 は、膜結合型 ICAM-1 が細胞膜に極めて近い部分で切断されて形成される分子であり、これもまた炎症時に増加することが知られている。BEAS-2B の sICAM-1 産生は、1 μg/ml の HBCD と 0.1-10 μg/ml の TBBPA の曝露により有意に増加し、その他の PBDEs は、それを増加する傾向を示したものの、有意な変化は認められなかった（図 8）。

次に、BFRs の曝露が BEAS-2B の IL-6 と IL-8 の産生に及ぼす影響について検討した。IL-6 と IL-8 は、種々の刺激により産生が誘導され、免疫・炎症性疾患の発症メカニズムに関与していることが知られている炎症性サイトカインである。DE-71 と DE-79、HBCD は、コントロールに対して BEAS-2B の IL-6 および IL-8 産生を有意に増加すること、TBBPA は、コントロールに対して BEAS-2B の IL-6 産生を有意に増加し、IL-8 産生を有意に抑制することを明らかにした（図 9，10）。一方、DE-83R は BEAS-2B のこれらの炎症性サイトカインの産生に顕著な影響を及ぼさなかった。この他に、炎症・免疫疾患に関わる tumor necrosis factor-α や macrophage inflammatory protein-3α、thymic stromal lymphopoietin、IL-13、IL-18、IL-33 等の産生についても検討したが、いずれも顕著な変化は認められなかった。

二年度に行った BFRs が BEAS-2B に及ぼす影響を表 4 にまとめた。一般に、PBDEs の中で DE-83R は、DE-71 や DE-79 よりも毒性が低いとされているが、今回検討した BEAS-2B の細胞生存・増殖能および炎症に関わる分子の発現や液性因子の産生においても、DE-83R による影響は弱い傾向が観察された。また、我々は、免疫担当細胞の毒性や活性化に対して TBBPA の影響が弱いことを初年度に報告したが、BEAS-2B を用いた検討では、TBBPA による影響が観察されたことから、細胞の種類によって反応性が異なることも示唆された（表 1－表 4）。

2 年度の成果より、ある種の BFRs は、気道上皮細胞の毒性や炎症反応に関わる因子の発現を修飾することが明らかとなり、特に、気道上皮細胞の ICAM-1 の発現や IL-6、IL-8、sICAM-1 の産生は、影響評価におけるバイオマーカー候補として有力である可能性が示唆された。

### 5. BFRs 曝露が気道上皮細胞の成長因子の産生に及ぼす影響

BFRs の曝露が BEAS-2B の EGF 産生に及ぼす影響について検討した結果、コントロールに対して、増加または増加する傾向が観察された。しかし、明確な EGF 産生の増加を示したのは、DE-71 と HBCD、TBBPA であった（図 11）。

### 6. BFRs 曝露が免疫担当細胞のシグナル伝達系に及ぼす影響

BFRs が免疫担当細胞の細胞生存・増殖能やサイトカイン産生、活性化マーカーの発現等に及ぼす影響メカニズムの一環として、BFRs 曝露による脾細胞と BMDC の p38 MAPK (pT180/pY182), ERK1/2 (pT202/pY204), Stat1 (pY701), Stat3 (pY705), Stat5 (pY694), NF- $ \kappa $ B p65 (pS529), Akt (pS473) のリン酸化レベルについて検討した。その結果、DE-71
と DE-79 で 15 分間の刺激した BMDC で、ごくわずかなリン酸化 NF-κB の増加がみられたものの、総じて今回検討した 15 分間および 60 分間の BFRs 刺激では、顕著な変化は認められなかった。

### 7. BFRs 曝露が気道上皮細胞のシグナル伝達系に及ぼす影響

BFRs が BEAS-2B の細胞生存・増殖能やサイトカイン産生、活性化マーカーの発現等に及ぼす影響メカニズムの一環として、BFRs 曝露による BEAS-2B の p38 MAPK (pT180/pY182), ERK1/2 (pT202/pY204), Stat1 (pY701), Stat3 (pY705), Stat5 (pY694), NF- $ \kappa $ B p65 (pS529), Akt (pS473), EGF Receptor (pY845) のリン酸化レベルについて検討した。その結果、今回検討した 15 分間および 60 分間の BFRs 刺激では、顕著な変化は認められなかった。

最終年度の成果より、BFRsがBMDCの分化・成熟過程に及ぼす影響に関しては、サイトカイン産生などには変化がみられず、作用強度としてはさほど強いものではないと考えられるが、部分的に分化・成熟を促進することが明らかとなった。前年度までに、分化誘導後のBMDCに対するBFRsの影響を検討した際にも、微弱ながらも活性化マーカー分子の発現増加を認めている。これまでの成果を総合すると、BFRsが、種々の免疫担当細胞の種々の分化・成熟段階で、影響を及ぼしうることが示された。一方、BFRsは、気道上皮細胞の毒性や炎症反応に関わる因子（IL-6、IL-8、可溶性ICAM-1の産生等）以外に、EGF産生を増加することによっても気道上皮細胞に影響を及ぼす可能性を見出した。EGFRの活性化とその後のシグナル伝達がIL-8やIL-6産生に寄与することや(12)、化学物質（トルエンジイソシアネート）刺激は、p38MAPKやERK経路を介して、気道上皮細胞の炎症性サイトカイン・ケモカインの産生を誘導することが報告されている(13)。われわれは、いくつかのBFRsが、気道上皮細胞のIL-8やIL-6産生を促進することを見出していることから、これらにもEGFRの活性化とシグナル伝達が寄与している可能性がある。

BFRs の免疫担当細胞や気道上皮細胞に及ぼす影響発現メカニズムとして、シグナル伝達系やEGFR (pY845)のリン酸化レベル等が関与している可能性が考えられたため、これらについて検討を加えたが、今回用いた実験条件では、BFRs によるそれらの変動は認められなかった。また BFRs の酸化ストレス作用を 2,7-Dichloro-dihydrofluorescin diacetate を用いた酸化反応により検討したが、いずれの BFRs にも酸化ストレス作用は認められなかった。

### D. 結論

BFRs は、顕著なレベルとはいえないものの、免疫・アレルギー反応にかかわる脾細胞中の抗原提示細胞やリンパ球の活性化や Th2 反応を修飾する作用を持つことが、in vitro で明らかになった。また、脾細胞における CD86 の発現割合や MHC class II の発現
強度、IL-4 の産生等が影響スクリーニング指標として有用となる可能性が示された。また、BFRs は、作用強度としては強いものではないものの、成熟した抗原提示細胞の活性化に加え、骨髓由来抗原提示細胞の分化・成熟過程をも修飾する可能性が示された。また、BFRs がそれらと呼吸器との最初の物理化学的接点である気道上皮細胞に及ぼす影響のパターンは、化学物質により異なる結果であったが、DE-71 と DE-79、HBCD、TBBPA は、細胞毒性や炎症反応に関わる分子（IL-6、IL-8、可溶性 ICAM-1 等）を修飾することが明らかとなった。これより、これらの BFRs の曝露は、気道上皮細胞から産生される炎症性因子を介し、呼吸器、免疫系に影響を及ぼす可能性が示唆された。また、BFRs は、EGF の産生を増加することによっても呼吸器系に影響を及ぼしうることが示された。

### E. 参考文献

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5 Takano, H., Yanagisawa, R., Inoue, K., Khinose, T., Sadakane, K., and Yoshikawa, T. 2006. Di-(2-ethylhexyl) phthalate enhances atopic dermatitis-like skin lesions in mice. Environmental Health Perspectives 114:1266-1269.

6 Koike, E., Yanagisawa, R., Sadakane, K., Inoue, K., Ichinose, T., and Takano, H. 2010. Effects of Diisononyl Phthalate on Atopic Dermatitis in Vivo and Immunologic Responses in Vitro. Environmental Health Perspectives 118:472-478.

7 Yanagisawa, R., Takano, H., Inoue, K., Koike, E., Sadakane, K., and Ichinose, T. 2008. Effects of maternal exposure to di-(2-ethylhexyl) phthalate during fetal and/or neonatal periods on atopic dermatitis in male offspring. Environmental Health Perspectives 116:1136-1141.

8 Koike, E., Inoue, K., Yanagisawa, R., and Takano, H. 2009. Di-(2-ethylhexyl) phthalate affects immune cells from atopic prone mice in vitro. Toxicology 259:54-60.
Birnbaum, L. S. and Staskal, D. F. 2004. Brominated flame retardants: Cause for concern? Environmental Health Perspectives 112:9-17.

Costa, L. G., Giordano, G., Tagliaferri, S., Caglieri, A., and Mutti, A. 2008. Polybrominated diphenyl ether (PBDE) flame retardants: environmental contamination, human body burden and potential adverse health effects. Acta Biomed 79:172-83.

11 Talsness, C. E., Andrade, A. J. M., Kuriyama, S. N., Taylor, J. A., and vom Saal, F. S. 2009. Components of plastic: experimental studies in animals and relevance for human health. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences 364:2079-2096.

12 Dodmane, P. R., Schulte, N. A., Heires, A. J., Band, H., Romberger, D. J., and Toews, M. L. 2011. Airway Epithelial Epidermal Growth Factor Receptor Mediates Hogbarn Dust-Induced Cytokine Release but Not Ca $ ^{2+} $ Response. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 45:882-888.

13 Ogawa, H., Inoue, S., Ogushi, F., Ogura, H., and Nakamura, Y. 2006. Toluene diisocyanate (tdi) induces production of inflammatory cytokines and chemokines by bronchial epithelial cells via the epidermal growth factor receptor and p38 mitogen-activated protein kinase pathways. Experimental Lung Research 32:245-262.
表 1. BFRs の 24 時間曝露が脾細胞に及ぼす影響の結果一覧

評価項目	DE-71	DE-79	DE-83R	HBCD	TBBPA
細胞生存·增殖能	→	↘(10 μg/ml)	↘(10 μg/ml)	↓(10 μg/ml)	→
細胞表面分子(%)
MHC class II	→	↓	↓	→	→
CD86	↑	↑	↑	↑	↑
TCR	↑	→	↓	↑	↑
CD3	↑	→	↓	→	↓
CD69	↓	↓	↓	→	→
サイトカイン産生
IL-4	↑	↑	↑	↑	↑
IFN-γ, IL-13, IL-17, IL-18	ND	ND	ND	ND	ND
ダニ抗原刺激細胞増殖	↓(3,10 μg/ml)	↓(10 μg/ml)	→	↓(10 μg/ml)	→

表 2. BFRs の 24 時間曝露が BMDC に及ぼす影響の結果一覧

評価項目	DE-71	DE-79	DE-83R	HBCD	TBBPA
細胞生存·增殖能	↗	↗	→	→	→
細胞表面分子(%)
MHC class II	→	→	→	→	→
CD80, CD86, CD11c	→	→	→	→	→
DEC205	↗	↗	↗	↑	→
ケモカイン産生
TARC	→	→	↑	→	→
MDC	→	→	↑	↗	→
IL-12p40	ND	ND	ND	ND	ND

ND: 検出限界以下
表 3. BFRs 存在下での 6 日間培養が BMDC の分化・成熟に及ぼす影響の結果一覧

評価項目	DE-71	DE-79	DE-83R	HBCD	TBBPA
細胞生存·增殖能	↗	↗	→	↗	→
細胞表面分子(%)
MHC class II	→(MFI↑)	→(MFI↑)	→(MFI↑)	↑	→
CD80, CD86, CD11c	→(MFI↑)	→(MFI↑)	→(MFI↑)	↑	→
DEC205	→(MFI↗)	→(MFI↗)	→(MFI↑)	↑	→
CCR7	↑	↗	↑	↗	↑
CXCR4	↗	↑	↑	↗	↗
ケモカイン産生
TARC, MDC	→	→	→	→	→
IL-12p40	ND	ND	ND	ND	ND

表 4. BFRs の 24 時間曝露が BEAS-2B 細胞に及ぼす影響の結果一覧

評価項目	DE-71	DE-79	DE-83R	HBCD	TBBPA
細胞生存·增殖能	$ \uparrow $ (3, 10 $ \mu $ g/ml)	→	→	↓ (10 $ \mu $ g/ml)	↓ (3, 10 $ \mu $ g/ml)
細胞表面分子
ICAM-1 (MFI)	↑	↑	→	↑	↑
サイトカイン等液性因子
IL-6	↑	↑	→	↑	↑
IL-8	↑	↑	→	↑	↓
MIP-3 $ \alpha $	ND	ND	ND	↑	ND
TNF- $ \alpha $ , TSLP, IL-13, IL-18, IL-33	ND	ND	ND	ND	ND
可溶性ICAM-1	$ \uparrow $	$ \uparrow $	$ \uparrow $	↑	↑

TNF- $ \alpha $ ; tumor necrosis factor- $ \alpha $

MIP-3 $ \alpha $ ; macrophage inflammatory protein-3 $ \alpha $

ND: 検出限界以下

TSLP; thymic stromal lymphopoietin
図 1. BFRs の化学構造式

(A). 脾细胞

(B). BMDC

図2. BFRsの24時間曝露による免疫担当細胞の細胞増殖・生存能の変化
図3. BFRs の 24 時間曝露が脾細胞中の抗原提示細胞表面分子の発現に及ぼす影響 $ *p<0.05, $ $ **p<0.01 $ BFRs 曝露対コントロール
図4. BFRs の 24 時間曝露が脾細胞の IL-4 産生に及ぼす影響 $ *p<0.05, $ $ **p<0.01 $ BFRs 曝露対コントロール
(A). TARC

(A). MDC

図 5. BFRs の 24 時間曝露が BMDC の TARC と MDC の産生に及ぼす影響 $ *p<0.05, $ $ **p<0.01 $ BFRs 曝露対コントロール
陽性細胞率 (%)

□ control

□ DE-83R 0.01 $ \mu $ g/ml

□ DE-83R 0.1 $ \mu $ g/ml

■ DE-83R 1 $ \mu $ g/ml

図6. BFRs存在下での6日間の分化誘導がBMDCのケモカインレセプターの陽性細胞率に及ぼす影響

$ ^{*} $ p<0.05, $ ^{**} $ p<0.01 BFRs 曝露対コントロール

図 7. BFRs の 24 時間曝露による BEAS-2B の細胞生存・増殖能の変化
図 8. BFRs の 24 時間曝露が BEAS-2B の ICAM-1 の発現強度と sICAM-1 の産生に及ぼす影響

$ ^{*} $ p<0.05, $ ^{**} $ p<0.01 BFRs 曝露対コントロール
IL-6 (pg/ml)

図9. BFRs の 24 時間曝露が BEAS-2B の IL-6 産生に及ぼす影響 **p<0.01 BFRs 曝露対コントロール
IL-8 (pg/ml)

図 10. BFRs の 24 時間曝露が BEAS-2B の IL-8 産生に及ぼす影響 **p<0.01 BFRs 曝露対コントロール
EGF (pg/ml)

図 11. BFRs の曝露が BEAS-2B の EGF 産生に及ぼす影響 *p<0.05, **p<0.01 BFRs 曝露対コントロール
## 第4章 アジア諸国を発生源とする局所的・広域的な微量元素汚染の実態解明

研究分担者：田辺信介（愛媛大学沿岸環境科学研究センター）

研究協力者：板井啓明・宝来佐和子・高橋真（愛媛大学沿岸環境科学研究センター）

### A. 研究目的

アジア諸国では、近年急増する工業製品の需要にともない、廃棄物処理やリサイクルシステムの確立が重要課題となっている。しかしながら、リサイクルシステム構築の過程においては、かつて日本が経験したような、有害物質による環境汚染が発生する可能性がある。また、莫大な人口を抱えるアジア地域から放出される有害物質は、地球規模での汚染にも影響を及ぼすがある。本研究では、とくに重金属類による汚染に着目し、研究を展開してきた。重金属類は、一般に長距離移動性が低いため、発生源近辺にホットスポットが形成され、周辺環境住民が著しい高濃度暴露を受けるケースがある。そのような状況が懸念される環境として、電気電子機器(e-waste)リサイクル処理場が挙げられる。近年、先進国で不要となったe-wasteの多くは、アジアやアフリカの途上国へリサイクル目的で流出している。e-wasteは様々な重金属を含有するが、現地のリサイクル施設では、周辺環境やヒトの健康を無視した不適切な処理や廃棄物投棄が問題視されている。こうした過程で、重金属が環境中に放出されるだけでなく、リサイクル従事者も直接あるいは間接的に有害物質に暴露していると考えられる。本研究では、経済成長の著しいインド・ベトナムのe-waste処理場における土壌および大気粉塵中重金属濃度を網羅的に分析し、発生源の汚染実態について考察した。

一方で、広域的な汚染が懸念される重金属もある。Hgはその代表であり、産業革命以降大気中のHg濃度は約3倍上昇したと報告されている(Pacyna et al. 2006)。大気中Hg濃度の経年的上昇は、海洋中Hg濃度の上昇をもたらすと予察されるが、分析化学的な制約から、外洋における経年的変化に関する地球化学的データは乏しいのが現状である。本研究では、外洋性鯨類体内のHgは、(1)濃度が高く信頼度の高いデータが得られること、(2)生息域の積分値を反映することから、経年変動の検証に有効であると考え、1970年代以降に採取され冷凍保存されてきた沿岸性ならびに外洋性鯨類の試料を用いて日本沿岸から外洋域に至るまでのHg濃度の経年変動について解析した。

本報告書では二章を設け、前半ではアジア各地の電気電子機器(e-waste)処理場における重金属類汚染調査について、後半では鯨類を用いた海洋の重金属類汚染のモニタリング調査について、その成果を報告する。

## 第4章第1節 アジア各地の電気電子機器(e-waste)処理場における調査

### B. 研究方法
## B-1 調査地域の選定

インド・バンガロール市周辺と、ベトナム・ハノイ市周辺の各種 e-waste リサイクル地域および対照地域を選定し、調査を実施した（Fig. 1）。詳細は以下の通りである。

インド・バンガロール市：インド・バンガロール市は、カルナタカ洲の州都であり、インドで第三位の人口を擁する。市内には、重工業関連工場、ソフトウェア関連企業、宇宙開発、通信業、防衛関連施設が密集し、インドのシリコンバレーと呼ばれている。バンガロール地域における e-waste リサイクル工場の現状については報告例があり、バンガロールはインド国内にハか所存在する主要 e-waste 処理地域の一つとされている(Keller, 2010)。バンガロールでは CRT、プラスチック、PWB、ワイヤー・ケーブル類、金属製品などのリサイクルが進められているが、とくに金の抽出・回収が主体と考えられている。

ベトナム・ハノイ市：ベトナムの首都であるハノイ市はベトナム北部に位置し、人口620万人を越えるの大都市である。産業活動が急速に発達したため、周辺地域にはe-waste処理を含む様々な廃棄物処理場が分布している。以下に今回の調査地域の詳細を記す。

・Minh Khai （以下 MK）は人口約 9000 人で、700 世帯を擁する村落である。住民の 2/3 は家内工業規模のプラスチックリサイクルに従事している。プラスチック解体業は 16 年前に開始され、一日当たり数 100 トンのプラスチックが村内に搬入されていると推定されている。

• Dong Mai (以下 DM) では、40 年前から鉛バッテリーのリサイクル業が営まれている (Tue et al. 2010)。村の人口は約 2300 人で 600 世帯を擁し、鉛バッテリー工場での作業従事者は約 500 名と推定されている。Dong Mai 村では一日当たり約 14 トンの使用済みバッテリーが処理され、約 10 トンの廃棄物が発生していると推定されている。

・Bui Dau（以下 BD）は、約 80 世帯を有する小さな村落である。この村では e-waste のリサイクルが実施されているが、開始されたのは 6～8 年前である。

• Trang Minh（以下 TM）は、人口約 9000 人で、1980 年以降プラスチックのリサイクル業が営まれている。

上記の村落では、ほとんどのリサイクル業は家庭規模で実施されており、汚染対策が不十分な裏庭で作業がなされている。多くの場合、作業場での身体保護は、グローブ・タオル・フェイスマスクのみである（Tue et al. 2010）。主な廃棄物処理工程は、手動解体による金属部品の回収や、使用済みプラスチックの粉砕・ペレット化である。e-waste リサイクル地域における主要な廃棄物は、テレビ、ビデオプレイヤー、液晶モニター、コンピューター関連部品であった。
## B-2 試料採取

インド南部・バンガロール地域およびベトナム北部・ハノイ周辺地域において e-waste リサイクル地域と対照地域を選定し、各地域で採取した土壌試料・粉塵試料を分析に供試した。1 m² あたり 5 点の表層土壌（0-5 cm）をステンレス製スコップで採取した後、各土壌等量ずつ混合して 1 つの試料とした。大気粉塵は、ハイボリュームエアーサンプラー (HV-500F, Shibata Kagaku, Tokyo, Japan) を用いて、石英フィルター(QR-100, ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan) 上に捕集した。流量は 500 L/min、採取時間は 5 時間とし、採取した粉塵の粒径は 7 μm 以下である。土壌および大気粉塵はポリエチレン製の袋に採集した後、速やかに冷凍し、日本に持ち帰った。全ての試料は愛媛大学沿岸環境科学研究センターの生物環境試料バンク（es-BANK）に保存した。試料採取地域と採取試料数は以下の通りである。

・インド・バンガロール市周辺：

BEF: : e-waste リサイクル工場（土壌 : n = 3 、粉塵 : n = 1）、

BES：スラムの小規模リサイクル施設（以下 BES、土壌：n=7）、

BC : 对照地域（土壤 : n = 10 、粉塵 : n = 1）。

スラムの小規模リサイクル施設では、喚気設備の整わない環境で、水銀を用いて金や銀を抽出している作業が認められた。対照地域は e-waste リサイクルが実施されていない都市域や農地を選定した。

・ベトナム・ハノイ市周辺：

DM: 鉛バッテリーリサイクル村（土壌：n=7、粉塵：n=1）

MK: プラスチックおよび金属回収施設（土壌：n=7）

TM: e-waste 解体施設（土壤：n=6、粉塵：n=1）

BD: e-waste 解体施設（土壤 : n = 13 、粉塵 : n = 3）

TH: 对照地域（土壤：n=4、粉塵：n=1）。

各リサイクル施設では、手動での e-waste 製品の解体や酸処理、野焼きの形跡などが認められた。対照地域は e-waste リサイクルが実施されていない農地を選定した。

## B-3 化学分析

土壤試料は、風乾後、0.5 mm メッシュの篩で粗粒の粒子を除去した後、磁性乳鉢で均質化した。均質化した試料を秤量し、硝酸とフッ化水素酸を用いてマイクロ波加熱分解装置（Ethos D, Milestone S. r. l., Sorisole, BG, Italy）で酸分解した。粉塵試料は、石英フィルターにトラップされた試料を40℃で24時間乾燥した後、重量を秤量し、硝酸とフッ化水素酸を用いてマイクロ波加熱分解装置で酸分解した。土壤・粉塵試料の分解液中の15元素（V、
Fig. 1 インドおよびベトナムにおける調査地域の地理的分布

Table 1. ハザード比の計算パラメーター覧

Parameter	Unit	Adults	Children
C	$ \mu $ g/g	测定值
$ RfD_{0} $	(mg/kg-day) $ ^{-1} $	US-EPA
IRS	mg/day	100	200
EF	days/year	350
ED	years	30	6
BW	kg	60	15
AT	days	ED $ \times $ 360
Cr、Mn、Co、Cu、Zn、Mo、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Tl、Pb、Bi）はICP質量分析計（Agilent 7500cx, Agilent）で、Hgは水銀分析装置(HG-3000, Sanso)で定量した。分析の確度は、PACS2（海洋堆積物標準試料、National Research Council of Canada）、BCR-142R（砂質土壤標準試料、Institute for Reference Materials and Measurements, Belguim）、NIES No.8（排ガス粒子標準試料、国立環境研究所）を分析して確認した。各々の標準試料中微量元素濃度の回収率は、それぞれ86-119%、86-115%、85-118%であった。

## B-4 XAFS 分析

インド南部・バンガロール地域の e-waste 処理場 $ (n=4) $ ，およびベトナム北部の Dong Mai 地域の鉛バッテリー処理場周辺 $ (n=3) $ で採取した土壌試料を XAFS 分析に供試した。XAFS 分析では，形態変化を防止するため，凍結した土壌試料を酸素不透過性のフィルムに入れ，直接 X 線を照射して分析した。各測定は，高エネルギー加速器研究機構・Photon Factory で実施した。Cu, Zn の K 吸収端 XANES は BL-9A で，Sn, Sb の K 吸収端 XANES は NW-10A で測定した。

## B-5 統計解析

全ての統計解析には、解析ソフトウェア StatView (version 5.0, SAS Institute, Cary, NC, USA) と SPSS (version 12, SPSS, Chicago, IL, USA) を用いた。微量元素濃度が検出下限以下の検体については、各元素の検出限界の半分の値を採用し、統計解析に組み込んだ。全てのデータは、Kolmogorov-Smirnov 検定により正規性を確認した。データに正規性が認められない場合は、パラメトリック検定を適用するためにデータを対数変換した。各地域間での土壤中微量元素濃度の有意差は、一元配置分散分析（1 way ANOVA）で検定し、有意水準は p < 0.05 とした。

## B-6 リスク評価

ATSDR の複合毒性リスク評価スキームに従い、各種 HI を算出した。計算には、Bangalore (BES)、Dong Mai の土壌中重金属濃度の幾何平均値および最大値を用い、成人と子供の両方について計算を試行した(ATSDR, 2004)。HQ の算出に用いた各種パラメータは Table 1 の通りである (US-EPA, 2001)。

HI の算出にあたっては、土壌中微量元素濃度に基づき、(1)単純加算法 $ (\mathrm{HI}_{\mathrm{add}}) $ 、(2)標的器官毒性当量を用いた手法 $ (\mathrm{HI}_{\mathrm{TTD}}) $ 、(3)複合影響を考慮した手法 $ (\mathrm{HI}_{\mathrm{int}}) $ 、の三種類の手法でHIを算出した。なお、今回の計算は毒性発現閾値の与えられている非発癒性リスクのみについて実施した

### C. 結果と考察

## C-1 汚染レベル

C-1-1 インド・バンガロール市周辺