Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## 第2章 室内環境における家庭系有害化学物質・有機臭素系難燃剤の動態と毒性及びその制御

## 1 －1 室内ダストに含まれる臭素含有成分の検索同定

分担研究者 滝上英孝 （独） 国立環境研究所 資源循環・廃棄物研究センター

研究協力者 鈴木 剛 （独）国立環境研究所 資源循環・廃棄物研究センター

## A 研究目的

PBDEs は過去に製造された難燃製品中に今なお含有されているため、製品の使用等に伴ってその環境負荷やヒトへの曝露が継続している。近年、室内ダストから PBDEs が非常に高い濃度で検出され（Jones-Otazo et al, 2005; Suzuki et al, 2006）、その取り込みが人への曝露ルートになっていることが指摘されている（Jones-Otazo et al, 2005; Suzuki et al, 2006）。室内で使用される電子製品や繊維製品等の BFRs 含有製品との関連性が考えられるが、それらを起源とする BFRs がダスト成分のどの画分に存在するのかについて調査した研究は、これまで実施されていない。

本研究では、エネルギー分散型微小部蛍光 X 線分析法（μXRFS）と高分解能 GC-MS を用いて、室内ダストの臭素含有成分を指標として BFRs の存在画分の推定を試みた。臭素含有成分は、防炎機能が強化されている施設（ホテルなど）の室内ダストや PBDEs が非常に高い濃度で検出されているテレビ内部ダストを対象として、μXRFS を用いて検索・同定を行った。同定された臭素含有成分は、デジタルマイクロスコープを用いてその由来を推定するため拡大画像を観察し、PBDEs の定量分析を行いその存在の有無を検証した。

## B 研究方法

### 1. 試料収集

室内ダストは、2005年5月から2007年3月にかけて、一般家庭、大学・研究機関、ビジネスホテル、事業所、飲食店、家電量販店、クリーニング店、病院、保育園・幼稚園及び老人介護施設等から収集した45検体を分析試料とした。テレビ内部ダストは、使用済み廃テレビを入手し、バックカバーを外して、カバー、電子銃、ブラウン管及び基板上に付着しているダストを採取した。具体的には、ポンプ吸引を行い、ガラス容器で挟み込んだグラスファイバーフィルター上に捕集して採取した。各種室内ダストは、基本的に掃除機のクリナーバックの集塵物を試料とした。一般家庭および大学・研究機関のダストは、ふ
るいを通して 1.0mm 以下を分析試料とした。それ以外の室内ダストについては、小石、木片、ホッチキスの芯、クリップ、髪の毛などを出来るだけ取り除いて分析試料とした。

### 2. 前处理

ダストは、1mg 程度採取し、透明テープ上に薄く分散塗布したものを分析試料としてμXRFSに供した。ポジティブコントロールとして、テレビ筐体、防炎カーテン及びPC筐体といったBFRs含有製品も、ハサミ等で細片化したものを分析試料としてμXRFSに供した。テレビ筐体、防炎カーテン及びPC筐体は、約10%、1%及び0.1%の臭素を含有する。

### 3. 微小部萤光 X 線分析裝置 ( $ \mu $ XRFS)

μXRFS は、島津製作所製エネルギー分散型 μEDX-1200 を用いて実施した。50μm の微小領域が測定可能な本装置により臭素マッピング（バックグラウンド低減のため Ni フィルター使用）を 10×10 mm² のエリアを対象として実施した。測定条件は、チューブ電圧 50keV、電流 1000μA 及び照射口径 50μm とした。基本的に測定時間 0.5 秒で測定を行い、強度をマッピング図としてイメージ化した。後述するテレビ内部ダストと大学ダストはより低い濃度の臭素を検出するため 100 秒あるいは 1,000 秒の測定時間で再測定した。また、本装置の妥当性は、蛍光 X 線プラスチックスタンダード PE-5E6（ポリエチレン臭素添加試料：0、40、70、200、400 及び 800ppm）を使用して確認した。

### 4. 実体顕微鏡による臭素含有成分の拡大観察

臭素強度マッピングの結果から同定された臭素を高濃度（0.1%程度以上）に含む粒子や繊維などの臭素含有成分の由来を推定するために、それらの拡大画像をデジタルマイクロスコープで観察した。

### 5. PBDEs 分析

高濃度（0.1%程度以上）の臭素含有成分は、PBDEsを抽出するために2mlのテトラヒドロフラン（THF）中で15分間超音波処理した。超音波処理後、THF画分を回収した。この抽出行程を計3回実施した。THF画分は、クリーンアップスパイクとして13Cラベル体のPBDE mixを添加して濃縮した後、シリンジスパイクとして13Cラベル体のBDE138を添加して高分解能GC-MSによるPBDEsの定量分析を行った。
## C 結果と考察

### 1. ダストの臭素強度マッピング

臭素含有成分は、ダスト48試料のうち27試料で検出された。臭素含有成分が検出された事例として室内ダスト9試料の臭素強度マッピング画像を、テレビ筐体(臭素含有量10%)、防炎カーテン（臭素含有量1%）及びPC筐体（臭素含有量0.1%）といったBFRs含有製品の結果と共に図1に示す。結果として、室内ダストには、臭素濃度がおよそ1.0%程度までの成分が存在することが示されている。また、ビジネスホテル1（図1-g）やハウスダスト（図1-l）で検出されている臭素含有成分の蛍光強度は、PC筐体と比較すると低いものの、トレースレベルで検出されていることがわかる。この結果は、本分析条件において0.1%程度の臭素含有成分を識別することが可能であることを示している。本研究の結果はBFRs等の臭素化合物を高濃度に含む製品が微細化してダストに偏在する可能性を示した。実際、高濃度の臭素を含有する電子製品や繊維製品等は、家具として家庭(Takigami et al, 2009a)やビジネスホテル（Takigami et al, 2009b）で使用されており、PBDEs等の臭素化合物を含む製品が微細化してダストへ移行している可能性が示唆された。

### 2. 室内ダストで検出された臭素含有成分の拡大観察

ピンセットで採取することができた直径 0.5～1.5mm 程度の 12 個の臭素含有成分の拡大画像を図 2 に示す。撮影した拡大画像から、臭素含有成分は形状によって 2 種類に分類できた。12 個のうち、9 個の臭素含有成分は、様々な表面形状と色彩を有する微粒子成分であることがわかった（図 2、BF (bromine-rich fragment)-1～9）。残りは、繊維状成分（繊維の断片とかたまり）であった（図 2、BF-10～12）。

### 3. 臭素含有成分中の PBDEs

臭素含有成分と PBDEs の関連性を評価するため、細い繊維状のため回収が困難であったBF-12 を除く臭素含有成分 11 試料について PBDEs 分析を行った。また、同条件で臭素が検出されなかったダストマトリクス成分についても PBDEs 分析を実施した。PBDEs は、BF-1、-2、-4、-5、-8、-9、-10 及び-11、臭素が検出されなかったダストマトリクス成分で検出された（図 3）。μXRFS で測定した臭素含有量と PBDEs 濃度の相関は低く、PBDEs 以外の臭素化合物が臭素含有成分に含まれている可能性が考えられた。既報研究では、室内ダスト中に TBBPA、HBCD や TBPh が高濃度に含まれることを明らかにしている（Suzuki et al, 2008; Takigami et al, 2008; 2009a; 2009b）。PBDE 異性体パターンは、
PBDEsが検出された全ての臭素含有成分でBDE209が主要であった。これは、日本の室内ダストの一般的なPBDEs異性体パターンと類似している(Suzuki et al, 2006)。DecaBDE（BDE209）製剤は、電子製品に使用されるハイインパクトポリスチレンのような熱可塑性樹脂に使用される傾向であるが、その一部は防炎繊維としても使用されている（Hardy, 2002）。これまでの既報研究と本研究の結果は、製品含有のPBDEsが微細化したプラスチックや繊維を通じて室内ダストに移行していることを示唆している。

### 4. ダストの高感度臭素強度マッピング

本研究では、滝上ら（2008）の研究において PBDEs を高濃度に含んでいることを既に把握しているテレビ内部ダスト（PBDEs 濃度：99 μg/g、BDE209 濃度：88 μg/g）も μXRFS に供した。0.5 秒の測定時間で臭素強度マッピングを行った結果、このテレビ内部ダストは臭素含有成分が検出されず（図4-b）、対象とした試験領域に0.1%以上の臭素含有成分が存在しないことが示された。0.5 秒の測定条件では、0.1%以下の臭素濃度を判別できないため、200 倍の測定時間（100 秒測定）による高感度分析を行った。その結果、臭素が試料塗布面で検出された（図4-c）。同時に鉛も測定したが、臭素と同様の傾向はみられなかった（図4-d および e）。同様の結果は、大学で採取した室内ダスト（Suzuki et al, 2006、オフィスダスト 8）でも得られた（図5）。大学ダストは、先のテレビ内部ダストと比較して2 オーダー程度低い濃度レベル（PBDEs 濃度：1.5 μg/g、BDE209 濃度：0.45 μg/g）であったので、200 倍の測定時間（100 秒測定）だけでなく、2,000 倍の測定時間（1,000 秒）による高感度分析も行った。その結果、臭素が大学ダストでも検出された（図5-c と d）。これらの結果は、BFRs 等の臭素化合物を含有するプラスチック等が微細物として移行する経路だけでなく、臭素化合物の蒸散や極小微粒子による移行経路の存在も示唆するものであった。
図１ 室内ダストと BFRs 含有製品の供試料画像（上段）と μXRFS による臭素強度マッピング画像（下段）。矢印で示されている BFs（臭素含有成分）については、デジタルマイクロスコープにて拡大画像が観察された（図２参照）。
図２ デジタルマイクロスコープで撮影した室内ダスト中の臭素含有成分の拡大画像（100倍～500倍）

図3 臭素含有成分中の BDE209 含有量(pg/臭素含有成分): non-BF = non-bromine-containing fragment, BF = bromine-rich fragment
a. Dust inside TV set

b. Bromine-mapping (0.5 sec mode)

c. Bromine-mapping (100 sec mode)

d. Lead-mapping (0.5 sec mode)

図４ テレビ内部ダストの臭素（aおよびb）および鉛（cおよびd）強度マッピングデータ

a. University office dust

b. Bromine-mapping (0.5 sec mode)

c. Bromine-mapping (100 sec mode)

d. Bromine-mapping (1 000 sec mode)

e. Lead-mapping (0.5 sec mode)

図 5 大学ダストの臭素（a および b）および鉛（c および d）強度マッピングデータ
# 1－2 In vitro バイオアッセイ／化学分画／化学分析統合手法による室内ダスト中ダイオキシン類縁化合物の毒性同定評価－臭素化ジベンゾフランの重要性－

分担研究者 滝上英孝 （独）国立環境研究所 循環型社会・廃棄物研究センター

研究協力者 鈴木 剛 （独） 国立環境研究所 循環型社会・廃棄物研究センター

## A 研究目的

室内ダストは、室内で使用される化学物質の溜まり場となっており、その取り込みが小児（乳幼児や幼児）への重要な曝露源になっていることが指摘されてきた（Butte et al, 2002）。国内外の最近の研究では、室内ダストからPBDEsなどのBFRsが高い濃度で検出されることを報告しており、ダストの取り込みがPBDEsの重要な曝露経路であると結論付けている（Jones-Otazo et al, 2005; Stapleton et al, 2005; Suzuki et al, 2006a）。我々は、ダイオキシン様活性を検出するDR-CALUXアッセイを用いて、室内ダスト中ダイオキシン類縁化合物を影響ベースで包括的に評価した（Suzuki et al, 2007）。室内ダスト中ダイオキシン類縁化合物は38～1400 pg CALUX-TEQ/g（中央値160 pg CALUX-TEQ/g）と算出され、これまで報告されている環境試料（港湾底質等）と比較しても非常に高いレベルであることがわかった。食品類と比較すると、室内ダストの濃度レベルは3～5桁程度大きいことが示された。濃度レベルの高さを考慮して、室内ダストの取り込みによるダイオキシン類縁化合物の曝露量を推定した結果、特に小児については、飲料水や土壌などを介したダイオキシン類（PCDD/Fs及びCo-PCBs）の曝露量よりも明らかに高いレベルであり、室内ダストの摂取量やダイオキシン類縁化合物の濃度によっては魚類や肉類を介したダイオキシン類曝露量よりも高くなることが推定された。WHO-IPCS（van den Berg et al, 2006）がダイオキシン類縁化合物の曝露実態について調査・検討していることを鑑みると、室内ダストのダイオキシン類縁化合物を明らかにするアプローチは曝露経路での有用な知見をWHO-IPCSに提供することに繋がり意義がある。そこで本研究では、室内ダストをDR-CALUXアッセイ／化学分画／化学分析統合手法に適用して、ダイオキシン類縁化合物の同定検索・定量評価を行なった。

## B 研究方法

### 1. DR-CALUX アッセイ／化学分画／化学分析統合手法に適用する室内ダスト抽出液の調製

室内ダストは、先行研究（Suzuki et al, 2006a）で採取したものを使用した。ダイオキシ
様活性レベルは、ハウスダストで38～900 pg CALUX-TEQ/g（中央値110 pg/g）、オフィスダストで67～1400 pg CALUX-TEQ/g（中央値220 pg/g）である（Suzuki et al., 2007）。この結果を参考にして、本研究では、比較的高いダイオキシン様活性を示すハウスダスト3及び4、オフィスダスト5を、DR-CALUXアッセイ／化学分画／化学分析統合手法に適用する試料として選定した。また、複数のハウスダスト（ハウスダスト3、4、6、9、17～19）からプール試料（ダスト・プール）も調製して本研究に適用した。室内ダストは、トルエンーソックスレー法により16時間抽出し、トルエンをヘキサンに転溶したものを粗抽出液とした。粗抽出液の一部（4～5 g相当量）を硫酸及び銅処理し、水洗・脱水後、22%硫酸シリカゲル／44%硫酸シリカゲルカラムで展開させ、n-ヘキサンで溶出した。溶出液は、DMSOに転溶して本研究に適用した。

### 2. DR-CALUX アッセイ／化学分画／化学分析によるダイオキシン類縁化合物の同定検索

室内ダストのダイオキシン様活性に関連する重要なダイオキシン類縁化合物を同定するために、1．で調製した抽出液を DR-CALUX アッセイ／化学分画／化学分析統合手法に適用した。

はじめに、NITRO（nitrophenylpropylsilica：Nucleosil 5u NO₂、4.6 × 250 mm、5 μm、Phenomenex、USA）カラムによる順相 HPLC（NITRO-HPLC）分画を行ない、室内ダスト中ダイオキシン類縁化合物を芳香環数別に分離することを試みた（Suzuki et al, 2006b）。分離時間は、既報（Suzuki et al, 2006b）をもとに一部改良して設定し、計7つの画分を調製した：第1画分、2.5～5.0分；第2画分、5.0～7.0分；第3画分、7.0～10.0分；第4画分、10.0～14.0分；第5画分、14.0～20.0分；第6画分、20.0～28.0分；第7画分、28.0～120.0分。各画分はDMSOに転溶して、DR-CALUXアッセイに供した。

次に、高活性を示す NITRO-HPLC 画分を、ODS（octadecylsilica : Wakosil-PAHs、4.6 × 250 mm、5 μm、Wako、Japan）カラムによる逆相 HPLC（ODS-HPLC）分画に供し、画分中ダイオキシン類縁化合物を疎水性に応じて分離した（Suzuki et al, 2004）。ODS-HPLC 画分では、計 90 の画分を調製した：0～25 分まで 30 秒間隔で分画して 50 画分調製、25～50 分まで 60 秒間隔で分画して 25 画分調製、50～80 分まで 120 秒間隔で分画して 15 画分調製。各画分は DMSO に転溶して、DR-CALUX アッセイに供した。

ODS-HPLC 画分については、PCDD/Fs、PCBs 及び PCNs の定性分析を実施して、これらダイオキシン類縁化合物の存在を確認すると共に分画における溶出画分を決定した。また、PBDD/Fs は、化学物質標準品を用いて ODS-HPLC 分画における溶出画分を決定し
た。定性分析は高分解能 GC-MS を用いて行ない、測定条件は既往研究に準じた：PCDD/Fs 及び Co-PCBs (Tanabe et al, 2004); PCNs 及び PBDD/Fs (Suzuki et al, 2006b)。

### 3. DR-CALUX アッセイによるダイオキシン様活性の測定

ダイオキシン様活性は、DR-CALUX アッセイを用いて測定した。DR-CALUX アッセイの培養、曝露及び測定については、既報に従って実施した（Suzuki et al, 2004）。

### 4. 高分解能 GC-MS 分析

室内ダスト 33 試料の粗抽出液の一部（1.5 g 相当量）を硫酸及び銅処理し、水洗・脱水後、22%硫酸シリカゲル／44%硫酸シリカゲルカラムで展開させ、n-ヘキサンで溶出した。溶出液は、定量分析用の n-ヘキサン画分として 4℃下で保存した。定量分析を実施する際に、クリーンアップスパイクとして $ {}^{13} $ C-labeled PCDD/Fs mix、PCBsmix、PCNs mix を n-ヘキサン画分に添加して、1～2ml 程度にまで濃縮した。濃縮液は、多層シリカゲルカラム／カーボンリバーシブルカラムに添加し、n-ヘキサンを流下した。次いで、多層シリカゲルカラムから取り外したカーボンリバーシブルカラムに 25%ジクロロメタン／n-ヘキサン（v／v）を流下後、カラムを上下反転させトルエンを流下して PCDDs、PCDFs、Co-PCBs 及び PCNs を含む溶出液を得た。濃縮後、シリンジスパイクとして $ {}^{13} $ C-labeled PCDD/Fs mix、PCBs mix 及び 1,2,3,5,6,7-HxCN を添加して、高分解能 GC-MS に供した。 $ {}^{13} $ C-labeled PCDD/Fs、PCBs 及び PCNs の回収率は 64～108%の範囲であった。

## C 結果と考察

### 1. NITORO-HPLC 分画

室内ダスト中のダイオキシン類縁化合物を推定するために、ハウスダスト3（550 pg CALUX-TEQ/g）、ハウスダスト4（900 pg CALUX-TEQ/g）、オフィスダスト5（1,400 pg CALUX-TEQ/g）及びプール・ダスト（90 pg CALUX-TEQ/g）の抽出液をNITRO-HPLC分画に供して、分取した7画分のダイオキシン様活性を測定した。全てのダストについてNITRO-HPLC第1画分が相対的に最も高い40～90%程度のルシフェラーゼ活性（%2,3,7,8-tetraCDD 300 pM）を示した：10～100 pM 2,3,7,8-tetraCDDに相当するルシフェラーゼ活性。NITRO-HPLC第2画分では、3 pM 2,3,7,8-tetraCDDに相当する20%前後のルシフェラーゼ活性が誘導された。NITRO-HPLC第1画分には、化学物質標準品を用いてPBDD/Fs、Co-PCBs及びPCNsが溶出することを既に確認しており(Suzuki et al, 2006)、2～3環のハロゲン化芳香族化合物の活性寄与が大きいと考えられた。
### 2. ODS-HPLC 分画

高活性を示した NITRO-HPLC 第 1 画分を ODS-HPLC 分画に供し、溶離時間に応じて分取した 90 画分のダイオキシン様活性を測定した。全ての試料について、ODS-HPLC 第 35 画分～第 60 画分の範囲で顕著なダイオキシン様活性が示され、第 52 画分で共通して高い活性が示された（図 1-a）。ODS-HPLC 画分が示す活性プロファイルは試料間で類似しており、上位にある高活性画分が試料間で共通する傾向にあった。室内ダスト中のダイオキシン類縁化合物は試料間で共通している可能性があり、ある種のダイオキシン類縁化合物が室内環境に遍在していることが示唆された。

### 3. ODS-HPLC 画分中ダイオキシン類縁化合物の同定検索

室内ダスト中の主要なダイオキシン類縁化合物を推定するため、プール・ダストから調製した ODS-HPLC 画分中の PCDDs、PCDFs、Co-PCBs 及び PCNs の同定検索を高分解能 GC-MS を用いて実施した。PCDDs、PCDFs、Co-PCBs 及び PCNs が想定された ODS-HPLC 画分を図 1-b に示す。また、PBDDs と PBDFs については、化学物質標準品が溶出した ODS-HPLC 画分を図 1-b に示す。溶出画分と DR-CALUX アッセイにおける反応性を考慮して、高活性を示す ODS-HPLC 画分中のダイオキシン類縁化合物は下記の通り決定された：ODS-HPLC 第 35 画分、tetraCBs、pentaCBs 及び hexaCBs；第 39 画分、tetraCNs 及び pentaCNs；第 40 画分、tetraCNs 及び pentaCNs；第 43 画分、hexaCDFs、tetraCNs、pentaCNs、hexaCNs 及び tetraBDFs；第 45 画分、pentaCNs 及び hexaCNs；第 46 画分、pentaCDDs 及び hexaCNs；第 51 画分、pentaBDDs 及び hexaBDDs；第 52 画分、hexaCDDs、heptaCDDs、hexaCDFs、heptaCNs 及び tetraBDDs；第 56 画分、heptaCDFs 及び hexaBDFs；第 59 画分、heptaCDFs；第 60 画分、octaCDD 及び heptaCDFs。これらの結果から、NITRO-HPLC 画分のダイオキシン様活性には、多種類のダイオキシン類縁化合物が関連していることが明らかとなった。

### 4. ダイオキシン類縁化合物の活性同定評価

測定対象としたダイオキシン類縁化合物（PCDD/Fs、Co-PCBs 及び PCNs）は、国内で採取した全ての室内ダスト（n=33）で検出され、一般家庭や事務室等の室内環境に遍在していることが示された。PCDDs、PCDFs、non-ortho Co-PCBs、mono-ortho Co-PCBs 及び PCNs の濃度範囲は、440～15000 pg/g（中央値 1700 pg/g）、92～4400 pg/g（中央値 450 pg/g）、60～18000 pg/g（中央値 130 pg/g）、560～580000 pg/g（中央値 1400 pg/g）及び 1600～49000 pg/g（中央値 4400 pg/g）であった。なお、既報の PBDDs 及び PBDFs
の濃度範囲は、<2.5～2300 pg/g（中央値 54 pg/g）及び1100～29000 pg/g（中央値 4000 pg/g）である（Suzuki et al, 2006a）。中央値ベースでみると、PCNsとPBDFsが比較的高濃度で検出された。

これらダイオキシン類縁化合物のうちダイオキシン様活性ベースで重要な物質群を推定するため、各化合物の実測濃度に DR-CALUX における 2,3,7,8-tetraCDD に対する比活性を乗じて化学分析値由来のダイオキシン様活性（Chemically derived CALUX-TEQ）を算出し、DR-CALUX アッセイで測定したダイオキシン様活性（Experimental CALUX-TEQ）（Suzuki et al, 2007）との比較考察を行なった（図2）。Chemically derived CALUX-TEQ は、PCDDs:4.8～180 pg/g（中央値 22 pg/g）、PCDFs:2.6～220 pg/g（中央値 14 pg/g）、non-ortho Co-PCBs:0.53～67 pg/g（中央値 1.6 pg/g）、mono-ortho Co-PCBs:0.013～9.8 pg/g（中央値 0.030 pg/g）、PCNs:0.054～2.9 pg/g（中央値 0.16 pg/g）、PBDFs:1.8～87 pg/g（中央値 28 pg/g）であった（2,3,7,8 置換体 PBDDs は検出されていない：Suzuki et al, 2006a）。中央値ベースの濃度順位は PBDFs＞PCDDs＞PCDFs＞non-ortho Co-PCBs＞PCNs＞mono-ortho Co-PCBs の順であり、寄与割合は PBDFs:17%、PCDDs:14%、PCDFs:8.8%、non-ortho Co-PCBs:0.98%、PCNs:0.10%及び mono-ortho Co-PCBs:0.019%であり、PBDFs の寄与が最も高かった。

本研究の結果は、国際的に規制されている PCDD/Fs 及び Co-PCBs のようなダイオキシン類ではなく（van den Berg et al, 2006）、規制対象となっていない PBDFs が、室内ダスト中で最も重要なダイオキシン類縁化合物であることを示した。WHO-IPCS は、ダイオキシン類以外のダイオキシン類縁化合物の曝露実態について知見を収集しており、室内ダストが小児にとって重要な曝露媒体となることを考慮して (Butte et al, 2002)、本研究の結果をその関連知見としてここに提示したい。

### 5. 室内ダスト中の未同定ダイオキシン類縁化合物について

本研究の結果から、室内ダストには未同定のダイオキシン類縁化合物が存在すると考えられ、中央値ベースでその寄与割合を推定すると57%に達し、活性の半分強を未だ説明できていない。主要な未同定のダイキシン類縁化合物は、本研究のDR-CALUXアッセイ／化学分画／化学分析統合手法から、2環のハロゲン化芳香族化合物である可能性が高い。候補となるダイオキシン類縁化合物としては、既にダイオキシン様活性を示すことが報告されているミックスハロゲン化ダイオキシン類（PXDD/Fs、X=Cl、Br）、ポリ臭素化ビフェニル（PBBs）、2,3,7,8非置換体PBDD/Fs等が挙げられる（Behnisch et al, 2003；Olsman et al., 2003）。
al, 2007)。また、本研究でも対象とした PCDD/Fs、PCBs、PCNs 及び PBDD/Fs の中の in vitro 試験評価が実施されていない化学物質や、化学物質標準品が存在しない化学物質が活性に関連している可能性もある。
(a)

(b)

図１ ハウスダスト3、ハウスダスト4、オフィスダスト5及びプール・ダストのNITRO-HPLC画分第1画分から調製したODS-HPLC画分のダイオキシン様活性プロファイル（a）及びPCDDs、PCDFs、Co-PCBs、PCNs、PBDDs及びPBDFsの溶出画分（b）各結果は、1回の試験値を示している。
図２ 室内ダスト（n=33）の化学分析値（PCDD、PCDF、Co-PCB、PCN及びPBDF）由来のダイオキシン様活性値（Chemically derived CALUX-TEQ）及びDR-CALUXアッセイで測定したダイオキシン様活性値（Experimental CALUX-TEQ）
## 1 －3 ヒト皮膚モデルを用いたハウスダストの毒性評価

分担研究者 滝上英孝 （独） 国立環境研究所 資源循環・廃棄物研究センター

## A 研究目的

動物を用いる皮膚刺激性試験の代替法として3次元培養系の皮膚モデルが用いられるようになっており、特に化粧品原料の評価に必要性が見出されている。3次元培養系の皮膚モデルは腐食・皮膚刺激性の評価スキームとして1998年にOECDから発表されており(OECD, 1998)、2009年までに動物実験を用いた化粧品を販売できない、また、原料の試験を実施できないというEU7次改正に従うために欧州化粧品工業会で検討が進められた結果、欧米で積極的に開発が進められたものである。皮膚モデルは、角化細胞と比較して、角質層の厚さや角化細胞数など、生体細胞に比べると構造的に差異も大きいが、各社で開発されているモデルに大差はないとされている(小島, 2007)。よって、正常皮膚と比較して経皮吸収も早く、毒性が鋭敏に検出できるようである(小島, 2007)。我々はこの皮膚モデルを家庭系有害化学物質のシンクとしての媒体であるハウスダスト試料に適用し、細胞に対する毒性ポテンシャル（細胞毒性）、炎症性メディエーター等の放出量について調べた。

## B 研究方法

### 1.3 次元培養系皮膚モデルを用いた細胞毒性の測定

3 次元培養系の皮膚モデルとしては EPI-200 キット（正常ヒト表皮角化細胞，販売元クラボウ）を用いた（図1）。このモデルはヒト皮膚表皮構造に類似し、表皮基本構造の基底層から顆粒層、有棘層、角層に多層化し分化した3次元構造を有する。新生児包皮由来の正常ヒト表皮角化細胞（単ードナー細胞）から無血清培地にて培養・構築したものである（皮膚直径8mm）。

EPI-200 は納品後 48 時間以内に使用した。MTT 法は、生細胞において

3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）が紫色のホルマザンへ還元される反応を用いた細胞毒性の測定方法であり、生細胞にMTTを添加し、得られた着色溶液の波長（通常500-600 nmの間）の吸光度を分光光度計で測定することで定量化を行った。

### 2. 炎症性メディエーター（マーカー）の測定

細胞に試料を曝露した後に毒性を評価する指標としては、上述のMTT法による細胞毒性の他に炎症性メディエーターの遊離が使われている。そこで末梢皮膚組織において生成される炎症性メディエーターとしてインターロイキンやプロスタグランジンに着目し、4種類のマーカー物質（炎症性サイトカイン（IL-1α、IL-8、TNF-α）とアラキドン酸カスケードの代謝物である$\mathrm{PGE}_{2}$）について各々、市販のELISAキットを用いて、ヒト皮膚モデル
の曝露時にアッセイ培地に浸出したマーカー物質を測定した。

図１ 用いた３次元皮膚モデル（EPI-200 キット）

### 3. 使用したハウスダスト試料

2009年6月～9月にかけて関東地方の一般家庭5軒の協力を得て、各家庭で通常使用されている掃除機に蓄積されていたゴミ全量を試料として採取した（HD-01，-02，-03，-04，-05）。採取試料は、まず、各試料から毛髪や小石、木片、紙屑等の夾雑物をピンセットで可能な限り除去した。異物除去後のハウスダスト試料は総重量を測定した後、電磁式ふるい振とう機（PRO型、FRITSCH社製）に搭載した2mm、1mm、500μm、250μm、106μm、53μmの開き目のステンレス製試験ふるい（JIS Z-8801）を通して、全量を「>2000μm」、「1000～2000μm」、「500～1000μm」、「250～500μm」、「106～250μm」、「53～106μm」、「<53μm」の7粒径に分画した（試験には細かい方から5粒径の分画試料を使用した）。

## C 研究結果と考察

### 1. ヒト皮膚モデル試験のバリデーション

まず、ヒト皮膚モデルの陰性及び陽性対象試料（それぞれ純水及びSLS）に対するロット内（購入したキットのロット内、n=3）における再現性を細胞毒性や炎症性メディエターに関して調べた。その結果、全ての測定項目で概扱良好な再現性（CVが10-20%の範囲内、最大で30%程度）が得られていることが確認できた。このことを踏まえて、ハウスダスト分級有姿試料の曝露試験の実施を行うこととした。

### 2. ハウスダスト分級有姿試料の毒性評価

ハウスダスト分級有姿試料の試験結果について、図2に細胞毒性、図3～6に炎症性メディエーター放出量のデータを示す。同時に実施した陽性対照（SLS 1%）のデータも併記している。

MTT 法による細胞毒性はほとんどのハウスダスト分級試料で観察された（図 2）。特に＜53 μm の最も細かい分級試料（n=5）では 54－75%（陰性対照比）の細胞生存率であり、
粒径別試料の中では強めの毒性を示した。

炎症性メディエーター放出量は、IL-1αが陰性対照比で有意に高く（桁違いに高い場合があり）、<53 μmの分級試料で高くなる傾向を示した（図4）。この傾向は陽性対照であるSLSと類似していた。一方で有意なIL-1αの放出が認められるSLSと比較してですら、より高い濃度が検出される試料があった。

TNF-αについても、IL-1αと同様に一部のハウスダスト分級試料で値が桁違いに高くなり、同一のハウスダスト試料でも分級粒径によって測定値が異なった（図6）。

IL-8 と $ PGE_{2} $ に関して、多くのダスト分級試料で、陰性対照よりやや高濃度（高々倍量程度）の放出が確認された（図3、5）。言い換えれば、これらのマーカーについては、ハウスダスト分級試料と陰性対照間で大きな差が認められなかった。陽性対照である SLS の曝露により、IL-8 と $ PGE_{2} $ の放出量が著しく抑制されることを踏まえれば、SLS とダスト分級試料の間では影響メカニズムが異なっているといえる。

上記のことをまとめれば、炎症性メディエーターのうち、IL-1αとTNF-αについては、一部のハウスダスト分級試料で放出が大きく促進され、同一（採取家庭が同一）のハウスダスト試料でも分級粒径によって測定値が著しく異なった。測定値が高くなる分級試料は2つのメディエーター間で共通性があり、原因物質がダスト中に偏在していることが推測された。IL-8とPGE_{2}に関しては、ハウスダスト試料の曝露による著しい放出抑制は観察されず、若干の放出促進の観察される試料が多くみられた。

## D 結論

本研究では、3次元培養系の皮膚モデルを用いてハウスダスト試料の有姿試料を直接、細胞表面に曝露し細胞毒性や炎症性メディエーターの放出量についての基礎知見を得た。ハウスダストによる感作作用（アレルギー免疫毒性）は、皮膚の末梢組織のみならず、他の臓器も関与した慢性的な曝露の結果、発現するものと考えられる。3次元培養系の皮膚モデルで得られた知見の一般性（他の皮膚モデルや動物皮膚細胞）を考察しつつ、今後in vitroの皮膚接触毒性試験の最適化を図る必要がある。
Cell viability (%)

図２ハウスダスト分級試料による試験結果（細胞毒性）

IL-8 release (pg/ml medium)

図 3 ハウスダスト分級試料による試験結果（IL-8 放出量）
IL-1α release (pg/ml medium)

図４ハウスダスト分級試料による試験結果（IL-1α放出量）

$ PGE_{2} $ release (pg/ml medium)

図 5 ハウスダスト分級試料による試験結果（ $ PGE_{2} $ 放出量）
TNF- $ \alpha $ release (pg/ml medium)

図6 ハウスダスト分級試料による試験結果（TNF- $ \alpha $ 放出量）

## 参考文献

Behnisch, P.A.; Hosoe, K.; Sakai, S. Brominated dioxin-like compounds: in vitro assessment in comparison to classical dioxin-like compounds and other polyaromatic compounds. Environ. Int. 2003, 29, 861-877.

Butte, W.; Heinzow, B. Pollutants in house dust as indicators of indoor contamination. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 2002, 175, 1-46.

Jones-Otazo, H. A.; Clarke, J. P.; Diamond, M. L.; Archbold, J. A.; Ferguson, G.; Harner, T.; Richardson, G. M.; Ryan, J. J.; Wilford, B. Is house dust the missing exposure pathway for PBDEs? An analysis of the urban fate and human exposure to PBDEs. Environ. Sci. Technol. 2005, 39, 5121-5130.
Mandalakis, M.; Atsarou, V.; Stephanou, E. G. Airborne PBDEs in specialized occupational settings, houses and outdoor urban areas in Greece. Environ. Pollut. 2008, 155, 375-382.

OECD. Revised proposal for the harmonization of hazard classification based on skin irritation/corrosion, ENV/MC/CHEM/HCL (98) 4, 1998, pp. 12, Paris: OECD

Olsman, H.; Engwall, M.; Kammann, U.; Klempt, M.; Otte, J.; Bavel, B.; Hollert, H. Relative differences in aryl hydrocarbon receptor-mediated response for 18 polybrominated and mixed halogenated dibenzo-p-dioxins and -furans in cell lines from four different species. Environ. Toxicol. Chem. 2007, 26, 2448-2454.

Stapleton, H. M.; Dodder, N. G.; Offenberg, J. H.; Schantz, M. M.; Wise, S. A. Polybrominated diphenyl ethers in house dust and clothes dryer lint. Environ Sci. Technol. 2005, 39, 925-931.

Suzuki, G.; Nose, K.; Takigami, H.; Takahashi, S.; Sakai, S.-I. PBDEs and PBDD/Fs in house and office dust from Japan. Organohalogen Compd. 2006a, 68, 1843-1846.

Suzuki, G.; Takigami, H.; Kushi, Y.; Sakai, S. Evaluation of mixture effects in a crude extract of compost using the CALUX bioassay and HPLC fractionation. Environ. Int. 2004, 30, 1055-1066.

Suzuki, G.; Takigami, H.; Kushi, Y.; Sakai, S. Time-course changes of mixture effects on AhR binding-dependent luciferase activity in a crude extract from a compost sample. Toxicol. Lett. 2006b, 161, 174-187.

Suzuki, G.; Takigami, H.; Nose, K.; Takahashi, S.; Asari, M.; Sakai, S.-I. Dioxin-like and transthyretin-binding compounds in indoor dusts collected from Japan: average daily dose and possible implications for children. Environ. Sci. Technol. 2007, 41, 1487-1493.

Suzuki, G.; Takigami, H.; Watanabe, M.; Takahashi, S.; Nose, K.; Asari, M.; Sakai, S.-I. Identification of brominated and chlorinated phenols as potential thyroid-disrupting compounds in indoor dusts. Environ. Sci. Technol. 2008, 42, 1794-1800.

Takigami, H.; Suzuki, G.; Hirai, Y.; Ishikawa, Y.; Sunami, M.; Sakai, S.-I. Flame retardants in indoor dust and air of a hotel in Japan. Environ. Int. 2009b, 35, 688-693.

Takigami, H.; Suzuki, G.; Hirai, Y.; Sakai, S.-I. Comparison of brominated flame
retardants and other polyhalogenated compounds in indoor air and dust from two houses in Japan. Chemosphere 2009a, 76, 270-277.

Takigami, H.; Suzuki, G.; Hirai, Y.; Sakai, S.-I.. Transfer of brominated flame retardants from components into dust inside television cabinets. Chemosphere 2008, 73, 161-169.

Tanabe, S.; Watanabe, M.; Minh, T.B.; Kunisue, T.; Nakanishi, S.; Ono, H.; Tanaka, H. PCDDs, PCDFs, and coplanar PCBs in albatross from the North Pacific and Southern Oceans: Levels, patterns, and toxicological implications. Environ. Sci. Technol. 2004, 38, 403-413.

van den Berg, M.; Birnbaum, L.S.; Denison, M.; De Vito, M.; Farland, W.; Feeley, M.; Fiedler, H.; Hakansson, H.; Hanberg, A.; Haws, L.; Rose, M.; Safe, S.; Schrenk, D.; Tohyama, C.; Tritscher, A.; Tuomisto, J.; Tysklind, M.; Walker, N.; Peterson, R.E.. The 2005 World Health Organization reevaluation of human and Mammalian toxic equivalency factors for dioxins and dioxin-like compounds. Toxicol. Sci. 2006, 93, 223-241.

Wenning, R. J. Uncertainties and data needs in risk assessment of three commercial polybrominated diphenyl ethers: probabilistic exposure analysis and comparison with European Commission results. Chemosphere 2002, 46, 779-796.

小島肇夫、皮膚腐食性試験について，最新動物実験代替法～日米欧関連法規への対応／各種試験の手順～，技術情報協会，pp.297，2007
# 第3章 室内環境の残留性化学物質に関する影響スクリーニング

分担研究者 高野裕久（京都大学大学院工学研究科都市環境工学専攻）、

小池英子（独立行政法人国立環境研究所環境健康研究センター）

### A. 研究の背景と目的

### 1. 研究の背景

廃棄物リサイクルが、近年、世界的に進み、廃棄物関連の化学物質等を管理するシステムの検討や確立が望まれている。家電や自動車など、一般的な製品に対する個別のリサイクル制度や焼却・埋め立てといった廃棄物管理については、特に、フロー管理や施設整備等が進展している。その一方、対処すべき重要課題として、家庭系有害廃棄物(Household Hazardous Waste, HHW)管理の問題が残されたままとなっている。

HHW の代表例としては、①揮発性有機物質や残留性有機汚染物質を含む殺虫剤やスプレー缶、等、②重金属類やレアメタルに関連する電池や基板を含む小型電気電子機器や蛍光管、等、③難燃剤成分を含む電気機器や繊維製品等々があげられる。HHW 関連の化学物質は莫大であり、室内ダストとして、また、循環廃棄関連ダストとしても存在しうることから、経気道的、あるいは、経皮的に人間に曝露される可能性が充分にある。しかし、これらのダストやそれに由来する化学物質の環境動態や物理的、化学的、生物学的キャラクタリゼーションとともに、曝露評価、影響評価に関する取組みはほとんど進展していない。

一方、環境汚染物質や環境化学物質は、HHW以外にも多々存在し、それらの健康影響が危惧されてきた。われわれは、例えば、粒子状の大気汚染物質であるディーゼル排気微粒子（DEP）がアレルギー性気管支喘息を増悪することを明らかにした(1,2)。その後、DEPに含まれる脂溶性化学物質成分やプラスチックの可塑剤として汎用されているフタル酸エステル等の環境化学物質が、アレルギー性気管支喘息やアトピ一性皮膚炎を増悪することも報告した(3-6)。また、フタル酸ジェチルヘキシルは、肝毒性を指標に決定されたNo Adverse Effect Levelの千分の一に近い少量や、若齢期の曝露のみならず乳児期の経母体曝露によってもアレルギー増悪影響を発揮することさえ報告した(5,7)。このように、アレルギー疾患の増悪という影響指標は、環境汚染（化学）物質に対し、高い感受性を有すると考えられ、影響評価として重要であることが明らかとなっている。その後、われわれは、マウスの免疫担当細胞（免疫・アレルギー反応において重要な役割を演じている細胞群）、特に、リンパ球や抗原提示細胞など複数の免疫担当細胞が存在する脾細胞や主要な抗原提示細胞である樹状示細胞を用いて、環境化学物質のアレルギー増悪影響をin vitroで評価し、フタル酸エステルのin vitro曝露がこれらの免疫担当細胞を活性化することを見出した(6,8)。このin vitro影響評価系はin vivoに比べて、簡
易・迅速であり、多くの物質への適用が容易である。われわれは、複数の環境化学物質を対象に研究を進め、このin vitro影響評価系が、in vivoにおけるアレルギー疾患の増悪をよく反映することも明らかにした。

近年、HHW 関連の代表的環境化学物質である臭素系難燃剤 (BFRs) が、内分泌系を攪乱する可能性が指摘されている(9-11)。しかし、これらの物質が免疫応答に及ぼす影響についての報告は少ない。そこで、本研究課題では、HHW の影響評価の取りかかりとして、HHW に由来する環境化学物質が高感受性を示すと考えられる免疫・アレルギー関連疾患に及ぼす影響を評価することを目的とし、代表的な BFRs であるポリプロモジフェニルエーテル (PBDEs) 製剤 3 種類とヘキサブロモシクロドデカン (HBCD) 製剤、テトラブロモビスフェノール A (TBBPA) 製剤の 5 物質を評価対象として研究を進めることとした。

BFRs は、家電機器や繊維製品をはじめとする多くの生活用品に広範に使用されているため(9)、一般環境においても、経皮的、経気道的に曝露される可能性が高いことが容易に想像される。また、生活用品が日常的に使用される生活環境では、ハウスダスト中のダニをはじめとするアレルゲンが広く存在するため、BFRs とアレルゲンの複合的曝露は、日常生活の中でも、容易におこりうる現象とも考えやすい。特に、ダニやハウスダストは、気管支喘息やアトピ一性皮膚炎、アレルギー性鼻炎等、ありふれたアレルギー疾患において、もっとも一般的な原因となるアレルゲン (major allergen) である。

今回対象とした BFRs について、簡略に、その特徴を述べる。PBDEs は、ポリブロモビフェニルよりも毒性が低く、家電製品や建材、繊維などに使用されている。製剤として、ペンタ BDE、オクタ BDE、デカ BDE が知られているが、世界的に最も使用されているのはデカ BDE 製剤である。PBDEs は、添加型の難燃剤であり、製品から環境中に放出される可能性がある。また、PCB やダイオキシンと類似した構造を持ち、脂溶性が高く蓄積性があるため、生物濃縮を引き起こす可能性が高いことなどから、その健康影響が懸念されている。PBDEs は、急性毒性は低いと考えられているが、慢性曝露では、腎臓と甲状腺に影響を与えることが報告されている。発生、神経毒性や内分泌攪乱作用を持つ可能性も指摘されている。PBDEs は、類似した毒性を示すが、一般的に、デカ BDE は他の低臭素物質に比べて毒性は低いことも報告されている。

HBCD は、TBBPA、PBDEs に次いで、適用の広い難燃剤であり、主にポリスチレン発泡断熱材や繊維、電子機器に使用されており、使用は近年増加している。HBCD は、PBDEs と同様に、添加型の難燃剤であり、製品から環境中に放出される可能性がある。脂溶性が高く、蓄積性があることからも、健康影響が懸念されている。その発達毒性や内分泌攪乱作用を示唆する報告もあるが、HBCD の健康影響に関する研究は未だ不充分であり、結論は得られていない。

TBBPA は、現在、世界で最も多く生産、使用されている難燃剤であり、ABS、エポキシ、ポリカーボネート、耐衝撃性ポリスチレン、フェノール樹脂、接着剤等に使用されている。TBBPA は、反応性の難燃剤として化学的に結合させて使用する場合と、添
加型の難燃剤として使用する場合がある。前者の場合は、製品から環境中への移行はほとんどないが、後者の場合は、PBDEsおよびHBCDと同様に環境中に放出される可能性がある。TBBPAは、脂溶性が高いが、生体内では代謝されて多くが排泄されることから、蓄積性の可能性はほとんど無いものと考えられている。これまでの報告では、TBBPAは、非刺激性で、急性毒性は低く、長期的な摂取をしても影響は認められていない。しかし、in vitroの報告では、細胞毒性、免疫毒性、甲状腺ホルモン作動性、内分泌攪乱作用の存在も示唆されている。

### 2. 研究の目的

BFRs は、物質によって、化学的な特性や健康影響が異なる可能性があることが示されている。しかし、総じて、免疫・アレルギーに関連する疾患、あるいは、経気道曝露の影響を最初に受けやすいと考えられる呼吸器系に与える影響については、ほとんど検討が行われていない。そこで、本研究課題では、アトピー素因を有するマウスの免疫担当細胞およびBFRsと呼吸器との最初の物理化学的接点である気道上皮細胞に及ぼす影響について、細胞毒性や活性化マーカー分子を指標として、検討を行った。初年度は、BFRsが免疫担当細胞（脾細胞と骨髓由来樹状細胞）に及ぼす影響について検討することを目的とした。2年度は、BFRs曝露が気道上皮細胞に及ぼす影響を、その毒性や活性化に関わる分子の変動を含めて検討することを目的とした。そして、最終年度は、BFRsが樹状細胞の分化・成熟過程に与える影響や、免疫担当細胞および気道上皮細胞に対する影響の内在メカニズムについて検討を進めることを目的とした。