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平成26年行政事業レビューシート(復興庁)
事業名	生活・就労総合支援事業費	担当部局庁	復興庁	作成責任者
事業開始・終了(予定)年度	平成24年度～(未定)	担当課室	統括官付参事官(予算・会計担当)	参事官 大野 秀敏
会計区分	東日本大震災復興特別会計	政策・施策名	政策:復興施策の推進
施策:東日本大震災からの復興に係る施策の推進
根拠法令(具体的な条項も記載)	-	関係する計画、通知等	-
事業の目的(目指す姿を簡潔に。3行程度以内)	東日本大震災等の影響により、多数の者が住居・資産・職を喪失し、避難を余儀なくされ、生活・就労面の課題を抱える被災求職者の安定した就職実現を図ることが喫緊の課題であるため、ワンストップ型での相談・援助等が受けられる体制をつくり、就労支援により経済的自立を促すことを目的とする。
事業概要(5行程度以内。別添可)	ワンストップ型での相談・援助が受けられる体制をつくり、住居・生活支援に関する総合相談、関係機関への誘導等を行うほか、協定等に基づき、ハローワークと地方自治体が連携して就労支援を行う。
実施方法	■直接実施 □委託・請負 □補助 □負担 □交付 □貸付 □その他
予算額・執行額(単位:百万円)	予算の状況	23年度	24年度	25年度	26年度	27年度要求
当初予算	-	1,311	211	127
補正予算	221	-	-
前年度から線越し	-	-	-	-
翌年度へ線越し	-	-	-	-
予備費等	-	-	-
計	221	1,311	211	127
執行額	143	1,158	189
執行率(%)	64.7%	88.3%	89.6%
成果目標及び成果実績(アウトカム)	成果指標	単位	23年度	24年度	25年度	目標値(26年度)
利用者にアンケートを実施し、住居・生活支援アドバイザーの相談・誘導等が役に立ったとする割合が8割以上労働保険特別会計雇用勘定分を含む	成果実績	%	87.1%	88.2%	96.9%
目標値	%	70%以上	75%以上	80%以上(被災3局)	80%以上(被災3局)
達成度	%	124.4%	117.6%	121.10%
活動指標及び活動実績(アウトブット)	活動指標	単位	23年度	24年度	25年度	26年度活動見込
住居・生活支援相談等件数※労働保険特別会計雇用勘定分を含む	活動実績	件	10,721(年間)	197,546(年間)	1,034(月平均、被災3局)	-
当初見込み	件	-	12,000(月平均)	693(月平均、被災3局)	863(月平均、被災3局)
単位当たりコスト	算出根拠	単位	23年度	24年度	25年度	26年度見込
執行額/住居・生活支援相談等件数(年間)※労働保険特別会計雇用勘定分を含む	単位当たりコスト	(円/件)	13,293	11,251	30,080	24,594
計算式	/	142,519千円/10,721件	2,222,627千円/197,546件	373,229千円/12,408件	254,694千円/10,356件
平成26-27百年度予算内訳(単	費 目	26年度当初予算	27年度要求	主な増減理由
諸謝金	100
旅費	1
庁費	26

計	127
## 環境モニタリング調査

○東日本大震災により漏出された放射性物質の基礎的な情報等を的確に把握し、国民に正しい情報を提供する。

○正確な情報を迅速に提供することにより、被災地周辺の環境回復状況の把握及び国民の安心の確保に資する。

## 東日本大震災被災地における環境モニタリング調査

①公共用水域放射性物質モニタリング調査

②地下水放射性物質モニタリング調査

③被災影響海域における海洋環境関連モニタリング調査

Ⅰ.有害物質等海洋モニタリング調査

Ⅱ. 洋上漂流物に係る海洋表層環境調査

④アスベスト大気濃度モニタリング調査
# ①公共用水域放射性物質モニタリング調査 ②地下水放射性物質モニタリング調査

## 背景·目的

○東京電力株式会社福島第一原子力発電所の事故により環境中に放出された放射性物質による環境汚染が懸念。

○放射性物質による環境の汚染状況を把握し、一体的でわかりやすい情報提供を行うため、総合モニタリング計画(平成23年8月モニタリング調整会議決定、平成27年4月改定)に沿って、関係省庁等が連携し、モニタリングを実施。

## 事業スキーム

## 請負事業（請負先：民間事業者）

## 事業概要

総合モニタリング計画に基づき、河川、湖沼等の公共用水域、地下水のモニタリングを実施。

## 期待される効果

○被災地における環境モニタリング調査の実施により、被災地周辺の環境に関する基礎的な情報等を的確に把握し、情報を国民に提供することで、国民の不安解消と復旧・復興に資する。

## モニタリング調査地点図

## ○福島県及び近隣県においてモニタリングを実施

## (公共用水域(河川、湖沼等))

## 平成26年度事業の成果

## (公共用水域)

○福島県及び近隣1都7県の約600地点において調査を実施し、結果を公表。

## (地下水)

○福島県及び近隣6県の約370地点において調査を実施し、結果を公表。

## 環境省ホームページでの結果の公表

東日本大震災の被災地における放射性物質関連の環境モニタリング調査：公共用水域
# ③被災影響海域における海洋環境関連モニタリング調査（有害物質等海洋モニタリング調査）

## 背景·目的

平成23年3月11日に発生した東日本大震災に伴い、津波等の被害にあった地域における海洋の汚染状況を経時的に把握することにより、有害物質や放射性物質に対する住民の不安や風評被害を解消する。

## 事業概要

震災に起因する油等の流出及び福島第一原子力発電所から放出された放射性物質による海洋環境の汚染状況を把握する。

### 1. 調査測線

浸水面積が広大であった地点の海域や石油タンクの流出、有害物質の流出、放射性物質による恐れがある海域を網羅的に実施。

## (8測線程度)

### 2. 分析項目

## ● 化学物質調査(海水及び海底土)

環境基準項目(生活環境項目、健康項目及びダイオキシン類)、油、PCB、臭素系難燃剤、多環芳香族炭化水素(PAH)、有機フッ素化合物等。

## ● 放射性物質調查

·海水:Cs-134、Cs-137

·海底土：Cs-134、Cs-137、Sr-90

## 事業スキーム

## 期待される効果

調査の実施により、汚染状況を的確に把握し、調査結果を公表することにより、国民の不安解消に資する。

## 事業成果

・平成26年度は38測点において、化学物質調査及び放射性物質調査を実施した。

・調査結果については、随時公表している。

図は平成26年度実施測点
# ③被災影響海域における海洋環境関連モニタリング調査（洋上漂流物に係る海洋表層環境調査）

## 背景·目的

先の東日本大震災で洋上に流出した大量の木材等は、太平洋を横断して北米大陸西岸に到達した。これにより、現地米国及びカナダにおいては、木材等に付着した日本由来の海洋生物(外来生物)の脅威が大きな話題となり、現地の海洋生態系や水産業への重大な影響が懸念された。このため、現地での科学的事実に基づかない無用な混乱を防止する観点から、これら日本由来の海洋生物のリスク評価等を実施する。

## 事業スキーム

環境省

資金拠出

PICES

(北太平洋海洋科学機関)

調査を実施

## 事業概要

世界的に著名な国際海洋科学機関である「北太平洋海洋科学機関(PICES)」の下、日米加三力国の海洋分野の科学者が連携・協力して、日本由来の海洋生物の定着と繁殖・拡大の有無と、北米大陸西岸の海洋生態系に対するリスク評価等を3年間の予定で実施。

## 期待される効果

日米加三カ国の科学者が取りまとめた公平で透明性の高い調査結果を公表することで、米国及びカナダの住民にその結果をスムーズに受け入れてもらえる。これにより、科学的根拠に基づかない風評による無用な混乱・中傷を回避することが可能。また、本調査の結果、日本由来の海洋生物の定着等が事実であっても、日米加三カ国の科学者の連携の下、適切な拡大防止策等を速やかに提案することが可能。

震災起因洋上漂流物が 北米大陸西岸に到達

北米大陸西岸で日本由来の海洋生物の定着等を調査(日米加三力国の科学者が)

漂流した漁船

公平で透明性の高い情報を提供（要すれば必要な対策を提案）
# ④アスベスト大気濃度モニタリング調査

## 背景·目的

東日本大震災の被災地において、全壊・半壊した建築物等の解体及びがれき処理に伴い、アスベストの飛散が懸念されることを踏まえ、アスベスト濃度を的確に把握し、住民等に正しい情報を迅速に提供し、その結果の基づき適切な対応を行う。

## 事業スキーム

請負事業（請負先：民間事業者）

## 期待される効果

調査結果を迅速に提供し、その結果に基づき適切な対応を行うことにより、住民等の健康の保護、生活環境の保全が図られる。

## 事業概要

## 調查対象

被災避難所、倒壊建築物及びその解体現場、がれきの処理場等

☐ 調查地域、調查地点数

年度	平成24年度	平成25年度	平成26年度
調查地域	青森県、岩手県、宮城県、山形県、福島県、茨城県、栃木県、千葉県	福島県
調查地点数	719	489	95

## ○ 調査結果の活用方法

·年1回以上公表。

・比較的高い濃度のアスベストが検出された場合速やかに管轄する自治体に連絡し、事業者等に改善指導、HP公表。

結果のフィードバック

## 飛散防止対策

「災害時における石綿飛散防止対策に係る取扱いマニュアル」等の普及啓発

○廃石綿が混入した災害廃棄物の取扱いについて周知徹底

○ホームページ等によるアスベストに関するQ & A等の基礎知識の情報提供

○石綿等が吹き付けられた建築物等からの石綿等の飛散及びばく露防止対策の徹底

○合同パトロールの実施

## ばく露防止対策等

ホームページ等によるアスベストに関するQ&A等の基礎知識の情報提供【再掲】

○防じんマスク等の無償配布及び着用・使用方法の普及啓発

○被災した住民等へ、アスベストに関する基礎知識等を情報提供するように自治体に対して依頼

○被災地において活動するボランティア等の防じんマスク

の持参・着用の周知徹底等

対策の確認

## 大気濃度調査(モニタリング)

○地方公共団体、関係団体に対して、アスベスト大気濃度調査に関する協力を要請

○環境省と地方公共団体の間で、アスベスト大気濃度調査の計画・実施等に関する情報共有体制の確立

○アスベスト大気濃度に係る予備調査を実施し、結果を公表

○委員会で策定した実施方針に基づいて本格調査の実施

住民等の安全・安心の確保に向けてアスベストの飛散ばく露防止対策のより一層の推進
A-0806 気温とオブン濃度上昇が水稲の生産性におよぼす複合影響評価と適応方策に関する研究

（3）高温・オブン適応のための分子マーカーの探索とオブンストレス診断アレイの開発

1）高温・オブン適応のための分子マーカーの探索とオブンストレス診断アレイの開発

独立行政法人 国立環境研究所

生物圈環境研究領域 生理生態研究室 久保明弘

生態遺伝研究室 玉置雅紀

<研究協力者>

独立行政法人 国立環境研究所 生物圈環境研究領域

独立行政法人 農業生物資源研究所 基盤研究領域

秋田県立大学 生物資源科学部

昭和大学 医学部

財団法人 電力中央研究所 環境科学研究所 生物環境領域

Kyoungwon Cho

菊池尚志・佐藤浩二

田母神 繁

Randeep Rakwal

河野吉久・松村英幸

平成20～22年度累計予算額：31,159千円（うち、平成22年度予算額：8,654千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 地球温暖化の進行に伴い、温度上昇とともに地表オゾン濃度の上昇が指摘されているが、これらの植物への複合影響について、分子レベルではほとんど調べられていない。本サブサブテーマでは、高温・オゾンに対する植物生体内物質（分子マーカー）の変化を検出することにより、分子マーカーを利用した新しい影響評価手法と、オゾンストレス診断のためのDNAアレイを開発した。様々なイネ品種の幼苗に高温とオゾンの単独及び複合処理を行い、葉の分子マーカーを探索した。その結果、画像解析で数値化したオゾンによる可視障害と関連する147個の遺伝子発現マーカーが明らかになり、その機能分類から可視障害の進行に伴う細胞機能が示唆された。また、様々な代謝産物を分析した結果、オゾンによる収量影響を受けにくい品種では、マロンジアルデヒド（脂質分解物）とサクラネチン（ファイトアレキシンの一種）の含量がオゾン暴露により顕著に増加することが明らかになり、オゾン耐性を判定する指標として利用できると考えられた。また、マイクロアレイで網羅的に遺伝子発現を調べた結果、多数の遺伝子の発現誘導と発現抑制が検出され、これらとサブテーマ(1)の暴露試験の結果との関係を調べたところ、高温、オゾン、及びそれらの複合ストレスによる収量やバイオマス影響と発現誘導レベルが相関している遺伝子マーカーが多数明らかになり、この相関関係を利用して分子マーカーを調べることにより幼苗の段階で簡便にイネ品種の高温とオゾンに対する感受性を評価する方法を開発した。

シロイヌナズナとイネの高温・オゾンストレス診断用DNAアレイを開発し、その有用性を確認した。さらに、イネのオゾンによる収量低下に関与する遺伝子座を同定する目的でQTL（量的形質遺伝子座）解析を行った結果、オゾン感受性イネ品種“ハバタキ”におけるオゾンによる収量の減少は、AP01遺伝子の働きが抑制されることによる一次枝梗数の減少を介して総精釈数（総顕花数）が減少することにより生じていることが示唆された。

[キーワード] オゾン、高温、分子マーカー、DNAアレイ、ストレス診断
### 1. はじめに

一般に、大気汚染物質の植物影響を評価するためには対象とするガスの濃度制御や環境調節等の機能を備えた大型の暴露試験設備が必要であり、成長や収量などに対する影響を評価するため長期間にわたる暴露試験を行う必要があり、多額の経費と時間、空間スペースを用意する必要がある。このため、欧米に比較するとわが国においてはこの分野の研究を実施している研究機関は限定される。ましてや開発途上にあるアジア諸国では経済的にもこの種の研究は非常に少なく、成果も限定される。このため、大型の研究設備に依存しない実験室レベルで影響評価が可能な新しい評価手法の開発が必要である。近年、分子生物学領域の研究が急速に展開され、様々な環境ストレスに対する分子・遺伝子レベルでの応答が解明されるようになってきた。そこで、高温やオゾンにさらされた植物体内の生体内物質（RNA、タンパク質、代謝産物など）の変化を分子マーカーとして利用した新しい影響評価手法が開発できれば、簡便・迅速な評価手法として有用なだけでなく、高温・オゾンの複合影響メカニズムの解明や適応策のための栽培品種の選択・育種にも活用できる知見が得られると考えられる。しかし、塩類や重金属、水ストレスなどに係る分野と比較するとガス暴露試験設備を必要とする大気汚染物質の影響に係る分野の研究はまだ少ない。特に、温暖化条件下でのオゾンの複合影響について、分子レベルではほとんど調べられていない。

分子マーカーを利用して、以下の3つの展開が考えられる。すなわち、(1)分子マーカーを利用したイネの品種ごとの高温・オゾン感受性の簡便・迅速な評価手法の開発、(2)イネ品種間のオゾン感受性の差の原因遺伝子の量的形質遺伝子座（QTL）解析による解明、及び(3)分子マーカーを利用した野外の植物が受けている高温・オゾン影響の診断手法の開発である。本サブサブテーマでは、(1)においては、マイクロアレイで網羅的に調べることができ、かつ高温・オゾンで発現レベルが変化する遺伝子転写産物（RNA）を中心に様々な分子マーカーを分析し、各品種の収量やバイオマスに対する高温・オゾン影響と相関関係を示す分子マーカーを同定し、イネ品種の高温・オゾン感受性を分子マーカーで評価する手法を開発する。既に、イネのモデル品種である“日本晴”を用いた研究 $ ^{1-3)} $ により、オゾンに応答する多数の分子マーカー候補を得ている。(2)においては、オゾンによる収量影響に関して“ササニシキ”と“ハバタキ”の染色体断片置換系統群（CSSL系統）を用いたQTL解析を行う。(3)においては、シロイヌナズナのストレス診断用DNAアレイ $ ^{4,5)} $ のオープントップチャンバー（OTC）を用いた試験を実施するとともに、これを踏まえて、イネの高温・オゾンストレス診断用DNAアレイを開発する。

## 2 ．研究目的

高温やオゾンにさらされた植物体内で発現が誘導される物質や抑制される物質を分子マーカーとして検出することにより、分子マーカーを利用したイネ品種の高温・オゾン感受性評価手法と、高温下でオゾンストレスを特異的に検出できるシロイヌナズナ及びイネのオゾンストレス診断用DNAアレイを開発するとともに、高温・オゾンの影響メカニズムの解明や高温・オゾンに対する耐性品種の選択・育種に活用できる知見を得ることを目的とする。

## 3 ．研究方法

## 1 ）イネ幼苗の栽培

（１）イネ葉における高温・オゾン影響評価のための分子マーカーの探索
4種類の日本型品種（日本晴、コシヒカリ、きらら397、にこまる）と2種類のインド型品種（タカナリ及びKasalath（カサラス））を用いた。種子を滅菌してから25℃で暗所に3日間置いて発芽させた。発芽した芽生えをポットに植え、25℃または30℃、相対湿度は70%に設定したグロースキャビネット（蛍光灯による12時間日長、光強度は約400μmol m⁻²s⁻¹）内で約2週間まで育成した。生育中の草丈、最長葉の長さと2週間後の地上部乾重量を測定した。いずれの品種においても25℃で10日間育てた植物体と30℃で8日間育てた植物体の生育段階がほぼ同じ（第3葉が成熟し、第4葉が現れている）であったので、この時点の植物体を6品種の比較実験に用いた。可視障害測定用の“日本晴”においては、25℃で2週間育成した。

## 2 ）イネ幼苗への高温、オゾン及び複合処理

30℃で8日間育成したイネ幼苗をオゾン暴露が可能なグロースキャビネットに入れ、150ppbのオゾンに6時間さらすことにより、高温とオゾンの複合処理とした。その際、オゾンの代わりに清浄空気中に置いたものを高温単独処理とした。25℃で10日間育成した植物体を用いて同様にオゾン暴露したものをオゾン単独処理とし、オゾンの代わりに清浄空気を与えたものを対照とした。相対湿度は70%に制御し、約400μmolm⁻²s⁻¹の光をメタルハライドランプで照射した。オゾン暴露後、栽培に用いたグロースキャビネットに植物体を戻し、清浄空気中に24時間置いたものも分析し、オゾンの代わりに清浄空気で同様に処理したものを対照とした。可視障害測定用の“日本晴”においては、25℃で200ppbのオゾンに72時間までさらし、オゾンの代わりに清浄空気を与えたものを対照とした。

## 3 ）全RNAの抽出

イネ第3葉を、30個体まとめて、液体窒素で凍結しながら乳鉢と乳棒で粉末にし、QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit（米国、キアゲン社）を用いて全RNAを抽出した。全RNAの収量および純度は分光光度計（米国、ナノドロップ社）で測定すると同時に、ホルムアルデヒド-アガロースゲル電気泳動を用いて目視で確認した。

## 4 ）RT-PCR法による遺伝子発現解析

全RNAをDNase（米国、ストラタジーン社）で処理してから、StrataScript RT-PCR Kit（ストラタジーン社）で逆転写反応を行った。TaKaRa Ex Taq Hot Start Version（宝酒造社）を用いて、TaKaRa PCR Thermal Cycle Dice、Model TP600でポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、電気泳動後、DNAのバンドの濃さを数値化した。

## 5 ）DNAマイクロアレイ解析

全RNAをLow RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit（米国、アジレント・テクノロジーズ社）を用いてCy3またはCy5で蛍光標識した。可視障害測定用の“日本晴”ではアジレント・テクノロジーズ社のrice 22K custom oligo DNA microarray、それ以外はアジレント社のrice 44K custom oligo DNA microarray（特注品）にハイブリダイズさせ、Agilent Microarray Scanner G2565BAで蛍光画像を取得した。アジレント社のFeature抽出ソフトウェアを用いて、各遺伝子の発現レベルを調べた。このデータをGeneSpring GX 10ソフトウェア（アジレント・テクノロジーズ社）を用いて解析した。フリップ・ラベリング（Cy3及びCy5色素による色素交換または逆ラベリング）を実施し、2種類のCy色素が処理区（T）または対照区（C）のcRNAに不均等に入ることによる色素の偏りを無効にした。

マイクロアレイ分析での生データを解析するために、2つの異なる段階の標準化を行った。まず、
順方向実験での各スポットのT^{Cy5}シグナルとC^{Cy3}シグナルとの比率値と、逆方向実験でのC^{Cy5}シグナルとT^{Cy3}シグナルとの比率値を、LOWESS（局所重み付き直線回帰）補正を用いて標準化した。次に、各スポットについてのlog比の値を、 $ \log_{2}F_{1st} = \log_{2}\left[T^{Cy5}/C^{Cy3}\right] $ 及び $ \log_{2}F_{2nd} = \log_{2}\left[C^{Cy5}/T^{Cy3}\right] $ のように計算した。最後に、残った遺伝子特異的な色素の偏りを修正するために、サンプル1個あたり色素を交換して2個のアレイを用いて、各遺伝子の平均倍率値（M）をM = 1/2 $ \left[\log_{2}F_{1st} - \log_{2}F_{2nd}\right] $ のように計算した。

## 6 ）ファイトアレキシンの抽出と定量

イネのファイトアレキシンであるサクラネチンとモミラクトンAを、凍結した葉の粉末を80％メタノールに懸濁・煮沸後、酢酸エチルで抽出し、Sep-Pak Light Silica Cartridge（米国、ウォーターズ社）とHPLCにセットしたXbridge C18 column（ウォーターズ社）を通した後、PE Scix API-2000（米国、パーキンエルマー社）を用いて液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（LC-MS/MS）で分析した。

## 7 ）葉のRGB画像解析

“日本晴”の第3葉の画像について、デジタルカメラで撮影し、Photoshop Elements 7（アドビ社）を用いて、赤（R）・緑（G）・青（B）の各色の平均の濃さ及び輝度（L）を計測した。これらの値に基づいて、パラメータ一G/R、G/L、 $ (R-G)/(R+G) $ 、 $ R/(R+G+B) $ 、 $ G/(R+G+B) $ の値を求めた。8）マロンジアルデヒド含量の測定

LPO Assay Kit、BIOXYTECH LPO-586（米国、オキシス・インターナショナル社）と島津分光光度計UV-2500PCを用いて、第3葉のマロンジアルデヒド（MDA）の含量を比色法で測定した。

## 9 ）代謝物質変動解析

6品種の比較のためにイネ幼苗へ高温、オゾンまたは複合処理したサンプルの内、12時間処理した“日本晴”の第3葉からイオン性の低分子を抽出し、Agilent CE-TOFMSシステム（アジレント・テクノロジーズ社）を用いて、陽イオン性及び陰イオン性の代謝物質を検出した。

## （２）シロイヌナズナ診断アレイの半野外実験下で栽培した植物への適用

## 1 ）オゾンストレス診断に最適な遺伝子の選択

プロトタイプのオゾンストレス診断アレイに含まれる4種類の遺伝子のうち、どの遺伝子がオゾン診断の指標として適切かを判断するために様々な環境ストレス（オゾン、酸性雨、 $ SO_{2} $ 、紫外線、乾燥、低温、塩ストレス）に植物を6時間暴露してサンプルを得た。これを用いてプロトタイプのオゾンストレス診断アレイにおけるハイブリダイゼーションパターンを解析し、オゾンストレス診断に最適な遺伝子の絞り込みを行った。

## 2 ）オープントップチャンバーにおけるシロイヌナズナの生育

本研究に用いたシロイヌナズナは遺伝学・分子生物学の分野でモデル植物として使用されており、その栽培は環境が安定した室内の条件において行われている。したがって、半野外環境に曝されるサブテーマ(1)で使用している電力中央研究所赤城試験センター（群馬県前橋市苗ヶ島町）のOTCにおいてこの植物が正常に生育し、且つストレス診断に耐える質のサンプリングができるかどうかは分からない。そこで赤城試験センターOTCにおける植物の栽培条件が適切であったかどうかを判定するために、OTCにおいてシロイヌナズナを2週間生育させ、この植物を用いて強光・低温などのストレスで蓄積されるアントシアニン類の含量測定を行った。またアントシアニン類
の合成に関与する遺伝子の発現量を定量的RT-PCRにより解析した。

## 3 ）オープントップチャンバーにおけるオゾンストレス診断

オゾンストレス診断の検証に必要なシロイヌナズナは、2)の検証により赤城試験センターのOTCにおいて正常に生育させることができた植物体を用いた。オゾンストレス診断解析用のサンプルは播種後2週間目のシロイヌナズナに対して、9時間（急性影響）と1週間（慢性影響）のオゾン暴露処理を行うことにより得た。オゾン処理はOTCをCF（オゾン濃度ほぼゼロ）、×1（最大オゾン濃度60 ppb）、×2（最大オゾン濃度120 ppb）に設定し行った。同濃度のオゾン処理を加温区（栽培期間中の平均として1.8℃を付加）においても行った。したがってサンプリングは、オゾン処理区3点×温度処理区2点、の6処理区で行った。赤城試験センターにおける植物の栽培は、2008年6月6日～23日、7月2日～15日、11月11日～25日の3回行い、サンプルを得た。得られた植物体から全RNAを単離し、シロイヌナズナのオゾンストレス診断アレイを用いてハイブリダイゼーションパターンを取得した。さらに得られたハイブリダイゼーションシグナルを画像解析により数値化し、定量的なデータを得た。

## （３）イネの高温・オゾンストレス診断用DNAアレイの開発

## 1 ）イネ・ストレス診断アレイに用いる遺伝子の探索

加温ストレス（30℃で8日間育成）、オゾンストレス（150 ppbのオゾンに6時間暴露）及び複合ストレス（30℃で8日間育成したイネを150 ppbのオゾンに6時間暴露）にさらした6品種のイネ幼苗のDNAマイクロアレイ解析の結果から、イネ・ストレス診断アレイに用いることのできる遺伝子の探索を行った。それぞれのストレス処理で2倍以上発現量が増加及び1/2以下に発現量が低下した遺伝子を選抜した。

## 2 ）イネ・ストレス診断アレイの作製

選抜した遺伝子182個のcDNAを独立行政法人農業生物資源研究所ジーンバンクより取り寄せた。それらの塩基配列を確認した後で、PCRによりcDNA断片を得た。こうして得られたPCR断片をMulti-pin Blotter 96（アトー社）を用いてナイロン膜上に載せることによりマクロアレイを作製した。

## 3 ）イネのサンプリング

オゾンストレス診断の検証に必要なイネは、赤城試験センターのOTCにおいて生育させた“日本晴”を用いた。イネの育苗・栽培条件はサブテーマ(1)に準じて行った。“日本晴”はサブテーマ(1)と同じ条件下においてCF区、×2.0区及び加温区にて栽培を行った。ポットに定植後、約1ヶ月経過したサンプル（2010年7月1日）より葉身のサンプリングを行った。

## 4 ）イネからの全RNAの抽出

サンプリングしたイネからの全RNAの抽出は、RNeasy Plant Mini kit（米国、キアゲン社）を用いて0.2 gの組織（菓身、生殖成長期頂端分裂組織、根など）から行った。抽出した全RNAは、-80℃のフリーザーにて保管した。

## 5 ）マクロアレイメンブレンのハイブリダイゼーション

マクロアレイメンブレンのハイブリダイゼーションはTamaokiら（2004）に従って行った $ ^{5)} $ 。以下に概略を示す。全RNAより一本鎖cDNAを合成する過程で、 $ \left[\alpha^{-33}P\right]dCTP $ にて標識し、これを作成したマクロアレイメンブレンと58℃にて一晩ハイブリダイゼーションを行った。メンブレンを洗浄
後、バイオイメージングプレート（東京、富士フイルム）と一晩接触させた。その後、得られたイメージを高解像度スキャナーTyphoon9400（米国、GEヘルスケア）で読み取った。

## （４）イネの収量に及ぼす遺伝子座のQTL解析による同定

## 1 ）イネの栽培

QTL解析に用いる“ササニシキ/ハバタキ”染色体断片置換系統群（CSSL系統）39系統、“ササニシキ”及び“ハバタキ”の種子は農業生物資源研究所イネゲノムリソースセンターより提供を受けた。これらのCSSL系統及び親系統である“ササニシキ”、“ハバタキ”、また“ハバタキ”の兄弟系統である“タカナリ”をサブテーマ(1)と同様な方法で育苗した。これらの栽培、オゾンの暴露試験は、2009年度および2010年度に2年間かけて2回繰り返した。育苗した苗は、2009年度は5月21日に、2010年度は6月8日に赤城試験センター内の標高540 m地点に設置されている2棟のガラス温室内にブロック配置したポットに定植を行うとともに、オゾンの暴露処理を開始した。実験に用いた用土は、構内で採取した黒ボク土を用い、ポットは白色の1/2000aのワグネルポット（土壌容量12 L）を用い、ポットあたり4個体を定植した。栽培管理、施肥量などはサブテーマ(1)に準じた。

イネの栽培を行った2棟のガラス温室の一方は外気を導入しているため、オゾン濃度は外気に準じる（以下NF区とする）。もう一方のガラス温室ではオゾンの影響を調べるため、人工的にオゾンを添加した。その際のオゾン濃度はNF区の2倍になるように調整を行った（以下×2区とする）。栽培期間中のオゾン濃度は2009年の12時間平均（午前6時～午後6時）では、NF区、×2区でそれぞれ32、76.5ppb、24時間平均ではそれぞれ27.7、77.4ppbであった。また2010年の12時間平均では、NF区、×2区でそれぞれ43.7、85.7ppb、24時間平均ではそれぞれ39.6、81.6ppbであった。イネの栽培は収穫を行うまで（2009年度は9月24、25日、2010年度は9月27、28日）上述した条件に設定したガラス温室内で行った。その間、2009年度7月20日～8月20日（2009年度）、2010年7月20日～8月10日（2010年度）にかけて出穂日、可視障害及び純光合成速度の測定等を行った。また、2009年8月27、28日には最大薬身長の測定を行った。なお、2010年度の最大薬身長の測定は刈り取り後に行った。

## 2 ）葉の可視障害調査方法

薬の可視障害はイネの第2葉、3葉、4葉（展開途中）上の褐色斑およびクロロシスの徴候に数値（Leaf bronzing score、LBS）を当てはめることによって定量化した。LBSは0：障害なし、1：黄白色斑の発生程度の軽いもの、2：褐色斑の発生程度の軽いもの、3：葉の面積の10-20％に黄白色斑および褐色斑が発生、4：葉の20-40％に黄白色斑および褐色斑が発生、5：葉の40％以上に黄白色斑および褐色斑が発生、6：葉の40％以上に褐色斑にネクロシス症状が伴うもの、7：部分的に枯死した葉、とした。

## 3 ）純光合成速度・気孔コンダクタンス等の測定

純光合成速度・気孔コンダクタンス等の測定は“ササニシキ”、“ハバタキ”及び“タカナリ”に対してのみ行った。測定は2009年7月29日及び8月4日に各温室からそれぞれの品種ごとに3ポットを選び、1ポットあたり2個体を対象に行った。測定は測定時における最上位完全展開葉（“ササニシキ”と“ハバタキ”は止葉、“タカナリ”は上位第2葉）を対象葉とした。ポットを温室から蛍光灯を備えた屋内（光合成有効光量子束密度：約 $ 10\mu mol/m^{2}/sec $ ）に移動させ、光合成蒸散測
定装置（LI-CORバイオサイエンス社、開放型光合成蒸散測定システムLI-6400P型）を用いて、薬身中央部を、LED冷光光源（同社、6400-02B型）を装着した3×2 cm（6 cm²）リーフチャンバーに挟んで測定した。測定後、リーフチャンバーに挟んだ薬身部等脚台形（高さ2 cm）と仮定し、上底と下底にあたる薬身幅を測定して、挟んだ薬身部の面積を算出した。測定時において、リーフチャンバー内の気温は25.2±0.2℃、チャンバーに導入した入口空気のCO₂濃度および水蒸気濃度は380±0.5 μmol/molおよび22±0.5 mmol/mol（相対湿度63±4%）にそれぞれ制御した。また、チャンバー内の光合成有効光量子束密度（PPFD）は2,000±1 μmol/m²/secに制御した。測定の記録は、薬をチャンバーに挟み込んでから入口の空気中CO₂濃度や薬温等が安定した10～30分後に行った。純光合成速度等の値は、測定装置に内蔵されたソフトウェアを用いて算出した。

## 4 ）植物体の測定

粉がほぼ黄色になった段階で、個体別に根本から地上部を刈り取り、地上部重量、桿長、桿数、を測定した。この測定の際に個体ごとに穂を切り取り約2～4週間自然乾燥させた後、一次枝梗数の計測後、粉の回収を行った。全粉は自動種子精選機（藤原製作所製FV-459A）を用いて個体別にシイナと稔実粉に選別し、それぞれをマルチオートカウンター（藤原製作所製KC-10M3）で計数した。計数後、稔実粉のみを個体ごとに集め、測定した重さを精粉重とした。

以上の測定結果を用いて、さらにイネの収量構成要素として、総精頻数・穂あたり釈数・登熟歩合・1000粒重を求めた。総釈数は総シイナ数と稔実釈数を合算する事で、穂あたり釈数は総精頻数を穂数で除算する事で、登熟歩合は総釈数に対する稔実釈数の百分率を求めることで、1000粒重は精釈重を稔実釈数で除算し、1000を乗じることにより求めた。なおここで得られた稔実釈数を本報告では精釈数として取り扱うこととする。

## 5 ）QTL解析

4) の結果より得られたデータを用いて QTL解析を行った。その際に全てのパラメータに対して QTL解析を行うことはせずに、CSSL系統群の親系統である “ササニシキ” と “ハバタキ” においてオゾン暴露の有無による差が有意に見られたデータに対してのみ解析を行った。解析はQTL解析ソフトの一つである J-qtl（http://pga.jax.org/qtl/index.html）を用いた。計算はEMアルゴリズム（最尤法）を用いて行い、計算回数は500回に設定した。各CSSL系統の遺伝子型はイネゲノムリソースセンターのデータベース（http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/jp/ineSHCSSL39.html）より入手した。QTL解析により得られた波形のうちLODスコア（対数オッズスコア）が3以上のものを有意なQTLとして遺伝子座の抽出を行った。また有意な波形が得られなかった場合には同様な計算をQGene（http://www.qgene.org/）でも行い、各マーカーの寄与率が一番高い部分を有意なQTLとして抽出した。

## 6 ）イネにおけるAP01遺伝子の発現解析

QTL解析により特定されたAP01（Aberrant Panicle Organization 1）遺伝子の“ササニシキ”及び“ハバタキ”の各器官における発現解析を行った。また、幼穂を用いてAP01遺伝子のオゾンによる発現変化について解析を行った。各器官のサンプリングは2010年8月4日に行った。また、幼穂のサンプリングは2010年7月22日（出穂前23日）及び2010年8月4日（出穂前10日）に行った。サンプルからの全RNAの抽出は（3）4)の方法に従った。AP01遺伝子の発現はリアルタイムPCR装置Lightcycler480（米国、ロシュ・ダイアグノスティック）を用いて行った。遺伝子発現の定量は相対定量法にて行い、AP01遺伝子の発現量はOsTub遺伝子の発現量の相対値として算出した。本
解析に使用したプライマ一配列は、5'-CAGGTAAGGGCTCCGTTGA-3'と5'-TGCGTAGCATGTTTTGCAGT-3'（APO1遺伝子）、5'-CATCGACATCAAGTTCGA-3'と5'-CCGAGTTCGACGATGGTGA-3'（OsTub遺伝子）である。

## 4 ．結果·考察

（１）イネ葉における高温・オゾン影響評価のための分子マーカーの探索

1）オゾンによる可視障害発現と関係する分子マーカー

オゾンによる葉の可視障害の評価と網羅的遺伝子発現プロファイリングを組み合わせた方法で、2週間育成した“日本晴”の幼苗を200ppbのオゾンに72時間までさらしたときの葉の可視障害発現に伴って発現する遺伝子を同定した。第3葉の可視障害の程度を目視で評価するとともに、RGB画像解析により数値化した結果、 $ \left(\mathrm{R}-\mathrm{G}\right)/\left(\mathrm{R}+\mathrm{G}\right) $ が可視障害を定量的に評価するのに最も適したRGBパラメーターであることがわかった。相対 $ \left(\mathrm{R}-\mathrm{G}\right)/\left(\mathrm{R}+\mathrm{G}\right) $ 値の経時変化を調べた結果、指数関数的に減少した（図-3-1-1）。この結果をマイクロアレイによる大規模な葉の転写産物解析（オゾン暴露1、12、24、48、72時間および浄化空気処理1、12、24時間）の結果と照合して、相関係数の絶対値が0.8以上で、可視障害に伴って誘導または抑制される遺伝子を探索したところ、146個の誘導される遺伝子と1個の抑制される遺伝子が見つかった。抑制される遺伝子の機能は不明であったが、誘導される遺伝子は機能分類で「代謝」、「トランスポーター」、「防御」、「翻訳後修飾・分解」等に分けられた。特に多かった「代謝」に分類される遺伝子の中には、光呼吸、二次代謝産物生成、解毒に関連するものが含まれており、これらの細胞機能が可視障害発現に関係していることが示唆された。

図-3-1-1 オゾン暴露によるイネ幼苗の可視障害の進行

2週間育成した “日本晴” に25℃で200 ppbのオゾン暴露を72時間まで行い、第3葉の色をRGB画像解析で数値化した。

## 2 ）オゾンにさらしたイネ幼苗における代謝産物プロファイリング

イネ幼苗における代謝物質マーカーについて調べるため、高温、オゾンまたは複合処理を12時間行った“日本晴”の第3葉を用いて、イオン性低分子物質をCE-TOFMSシステムで網羅的に分析し
たところ、105個の陽イオン性代謝物質と96個の陰イオン性代謝物質が検出された。これらの中には、対照区と各ストレス処理区で相対量が顕著に異なるものが多数含まれており、代謝物質マーカーとして利用できる可能性がある。

## 3 ）オゾン暴露によるイネ幼苗のマロンジアルデヒド含量の変動

サブテーマ(1)の結果から、“日本晴”、“コシヒカリ”、“にこまる”はオゾンによる収量減少が小さく、“きらら397”、“タカナリ”、“Kasalath”はオゾンによる収量減少が大きい品種である。これらの品種に、150 ppbのオゾン暴露を行い、その後、浄化空気中に置いたところ、オゾンによる収量減少が大きい品種ではオゾン暴露後のMDA含量の変動が少ないが、オゾンによる収量減少が小さい品種ではオゾン暴露後にMDA含量が増加することも明らかになった（図-3-1-2）。このことを利用して、オゾンによる収量影響が大きい品種かどうかを判定できる可能性がある。

オゾンによる収量減少が小さい品種

オゾンによる収量減少が大きい品種

図-3-1-2 オゾン暴露後のMDA含量の変化

25℃で10日間育成した6品種のイネ幼苗に25℃で150ppbのオゾン暴露を6時間行い、その後、浄化空気中に移した。第3葉のMDA含量を経時的に定量した。横軸の上側に出ている暗い線は暗期を示す。

## 4 ）オゾンによるファイトアレキシン含量の増加と分子マーカーとしての利用

オゾンにさらされた植物では病原体への防御反応と共通する反応が引き起こされることから³)、イネの主要なファイトアレキシン（抗菌性物質）であるサクラネチンとモミラクトンAを定量した。その結果、サクラネチンのオゾンによる誘導がオゾンにより減収になりやすい品種（Kasalath、タカナリ、きらら397）ではほとんど起こらないことが明らかになり（表-3-1-1）、サクラネチンがオゾンの防御に関与している可能性が考えられた。表-3-1-1より、30℃でのサクラネチンのオゾンによる蓄積と、収量影響に基づくイネ品種のオゾン耐性との間に対応関係があることから、この関係を利用したイネのオゾン影響評価方法を特許出願した。

## 5 ）RT-PCR法による遺伝子発現データとオゾンによる収量影響との関係

RT-PCR法でオゾン暴露時のイネ幼苗の遺伝子発現変化を、病原体への抵抗性に関与するOsPR10a遺伝子、光合成酵素のRubisCO LSU、SSU遺伝子及びシグナル伝達に関与するOsSIPK遺伝子につい
て調べた。その結果、赤城試験センターで行われたオゾンによる収量影響調査の結果に基づき、OsPR10a遺伝子の発現誘導の倍率が、オゾンによる減収の程度と正の相関を示すことが明らかになった。

6）DNAマイクロアレイによる遺伝子発現データを用いたイネの高温・オゾン影響評価法の開発

イネにおいて、オゾンの単独暴露により発現が変化する遺伝子を網羅的に明らかにしたが $ ^{3)} $ 、高温とオゾンの複合により、遺伝子発現がどのように

表-3-1-1 オゾンによるサクラネチン生成と収量影響との関係

品種	サクラネチン含量(μg/g生重量)
25℃	30℃
対照区	オゾン区	対照区	オゾン区
日本晴	0.00	7.23	0.00	2.17
コシヒカリ	0.00	6.97	0.00	3.65
にこまる	0.00	6.76	0.00	2.19
きらら397*	0.00	2.30	0.00	0.00
タカナリ*	0.00	0.00	0.00	0.00
カサラス*	0.00	0.00	0.00	0.00

イネ実生にオゾン暴露（150 ppb, 6 h）後、清浄空気中に24 h置き、第3葉からサクラネチンを抽出・定量した。対照区は清浄空気中に置いたもの。発芽直後から実験終了まで同じ温度（25℃または30℃）に置いた。*, オゾンにより減収になりやすい品種（サプテーマ（1）より）

変化するかは全くわかっていなかった。そこで、25℃と30℃で育てた6品種のイネ幼苗に人工光型オゾン暴露チャンバーで150ppbのオゾン（または清浄空気）暴露を6時間行い、RNAを抽出し、アジレント・テクノロジーズ社のイネ・マイクロアレイを用いて、遺伝子発現の変化を網羅的に調べた。また、6時間のオゾン暴露後、清浄空気中に24時間置いたものも調べた。イネ品種としては、収量影響に基づくオゾン感受性品種“きらら397”（北海道産）、“タカナリ”（インド型品種）とオゾン耐性品種“日本晴”（基準品種）、“コシヒカリ”（日本代表）、高温耐性品種“にこまる”、研究によく使われているインド型品種“Kasalath（カサラス）”の合計6品種を用いた。2008年度に実施したサブテーマ(1)の試験より、これらの品種のオゾンや高温による収量影響のデータが提供され、“にこまる”がオゾン耐性で“Kasalath”がオゾン感受性であることが新たに明らかにされた。また、サブテーマ(1)の試験により、“にこまる”は加温処理で収量が顕著に増加し、“きらら397”はオゾン暴露下で加温により収量が顕著に減少することも明らかにされた。

イネ幼苗の初期生長は、いずれの品種においても25℃より30℃で早かった。いずれの品種においても25℃で10日間育てた植物体と30℃で8日間育てた植物体の生育段階がほぼ同じであったので、この時点の植物体を実験に用いた。この時点で成熟している第3葉を分子マーカー分析用にサンプリングした。

マイクロアレイ解析の結果、オゾン暴露で多数の遺伝子の発現誘導と発現抑制が検出された（図-3-1-3）。オゾン暴露終了後24時間の時点では発現誘導や抑制される遺伝子数の減少が見られたが、特に抑制される遺伝子の減少が顕著であった。30℃と25℃での遺伝子発現の比較では、オゾン暴露の場合に比べて発現誘導や抑制される遺伝子数がかなり少なかった。30℃でオゾン暴露した複合影響の場合は、オゾン暴露単独の場合と変化する遺伝子数は似ているが、誘導される遺伝子数が概ね相加的なのに対し、抑制される遺伝子数はオゾン暴露単独の場合より少し減少した。以上の遺伝子発現の変化はどの品種にもほぼ当てはまるが、“Kasalath”では全体的に変化する遺伝子が他の品種に比べて少なかった。“Kasalath”で変化する遺伝子数が少なかった原因としては、“Kasalath”がマイクロアレイ作製に用いられている“日本晴”と系統的に遠く離れているために、検出できた遺伝子が少なかった可能性と、“Kasalath”の遺伝子発現変化が実際に少なかった可能性の両方が考えられた。そこで、通常の生育時の各品種の発現遺伝子を、“日本晴”
を対照としてマイクロアレイで比較したデータを解析した。その結果、“Kasalath”では高温やオゾンで発現が変化する遺伝子が、他の品種に比べて少ないと結論した。

以上のようにイネ6品種の幼苗への6時間の高温、オゾンまたは複合処理により第3葉で発現量が変化する遺伝子をマイクロアレイで調べたところ、多数の誘導または抑制される遺伝子が明らかになったが、これらの遺伝子発現誘導量と収量影響との関連を調べるために、まず、収量影響を数値化した。サブテーマ(1)より提供された電力中央研究所赤城試験センターの大型OTCで行われた実験の収量データを用い、各品種のオゾンによる収量（玄米重量）への影響をオゾン濃度（ppb）と相対収量との関係の散布図にプロットし、近似直線の傾きをオゾン影響の大きさとした。加温処理区でのオゾン影響につい

図-3-1-3 発現が誘導（A図）または抑制（B図）された遺伝子の個数各イネ品種の幼苗を25℃で清浄空気中に置いた対照に対して、高温（30℃）に置いたもの、高温でオゾン（150ppb，6h）暴露したもの、25℃でオゾン暴露したもの、及び25℃でオゾン暴露してから清浄空気中に24h置いたものについて、第3葉からRNAを抽出し、発現量が2倍以上（A図）または1/2以下（B図）になった遺伝子をマイクロアレイで調べた。

ても同様に数値化した。また、各品種の加温区と対照区での収量の比を各品種への高温影響とした。バイオマス（地上部乾重量）への影響についても、収量の場合と同様に数値化した。

高温、オゾン、またはこれらの複合ストレスによる収量変化等の影響と緊密に関わる可能性がある候補遺伝子を見つけるために、3つの基準を満たす遺伝子を選択した。まず、発現レベルがイネ6品種における収量変化等の影響の違いと正または負の関連を持つ遺伝子のみを選択するために、各遺伝子に対して、相関テストを行った。この相関テストでは、エクセルプログラムを用いて、各遺伝子の転写誘導レベル（M値）と影響パラメータとの間の相関係数（R）を計算し、相関係数の高い（≥0.8または≤-0.8）遺伝子を選択した（第1基準）。次に、各品種間での収量変
化等の影響の有意差に対応して、M値においても有意差（p < 0.05）のある遺伝子を選択した（第2基準）。第3基準では、M値の差を-1未満または+1超に設定した。

このようにして、高温、オゾン、または複合ストレスによる収量変化等の影響と緊密に関わる可能性があるイネ幼苗の候補遺伝子を選択したところ、高温、オゾン、及び複合ストレスによる収量影響と相関のある遺伝子として、それぞれ390、179、219個の遺伝子が選択され、その中で、それぞれ383、156、195個の遺伝子が各ストレスに特異的であった（図-3-1-4の左図）。また、高温、オゾン、及び複合ストレスによるバイオマスに対する影響と相関のある遺伝子として、それぞれ221、418、557個の遺伝子が選択され、その中で、それぞれ211、386、521個の遺伝子が各ストレスに特異的であった（図-3-1-4の右図）。

収量影響と相関のある第3葉の遺伝子数

バイオマス影響と相関のある第3葉の遺伝子数

図-3-1-4 高温、オゾン、複合ストレスによる収量影響と相関のある第3葉の遺伝子数（左図）及びバイオマス影響と相関のある第3葉の遺伝子数（右図）

高温、オゾン、またはそれらの複合により影響を受けるイネの収量、バイオマスと相関のある遺伝子発現マーカーが多数得られたが、その中でも特に良い相関を示し、また、発現誘導の品種間差が大きいものを選択した（図-3-1-5、6）。これらの相関関係を利用することにより、遺伝子の発現誘導を分子マーカーとして利用し、幼苗の段階の簡便な実験により、イネの収量やバイオマスへの高温、オゾン、または複合ストレスの影響評価を行うことが可能になった。

図-3-1-5および図-3-1-6に示した遺伝子発現マーカーの一覧を表-3-1-2に示した。これらの遺伝子は、耐性品種の育種に利用できる可能性がある。
図-3-1-5 第3葉の遺伝子発現マーカーとオゾン（左上図）、高温（左下図）、高温+オゾン（右上図）の収量影響との相関

図-3-1-6 第3葉の遺伝子発現マーカーとオゾン（左上図）、高温（左下図）、高温+オゾン（右上図）のバイオマス（地上部乾重量）への影響との相関
表-3-1-2 影響評価に利用できる遺伝子発現マーカー

プローブ名	発現部位	ストレス	影響	注釈
R5_c03_11844_R	葉	高温	収量	Similar to Beta-glucosidase
R5_c08_29474_R	葉	オゾン	収量	Similar to Resistance protein candidate
R5_c04_15502_F	葉	高温+オゾン	収量	Conserved hypothetical protein
R5_c01_04552_F	葉	高温	バイオマス	RPP17-1
R5_c11_37989_F	葉	オゾン	バイオマス	Conserved hypothetical protein
R5_c08_29474_R	葉	高温+オゾン	バイオマス	Similar to Resistance protein candidate

## （２）シロイヌナズナ診断アレイの半野外実験下で栽培した植物への適用

## 1 ）オゾンストレス診断に最適な遺伝子の選択

プロトタイプのオゾンストレス診断アレイには4種類の遺伝子（At1g34750、At1g70140、At2g17120、At3g21230）が載せられており、これらの遺伝子は酸性雨、SO₂、紫外線、オゾンストレスを与えた場合には、オゾン暴露にしか発現応答しないことが明らかになっている。

本研究では、これらのストレスに加えて乾燥、低温、塩ストレスに暴露した植物を用いてオブンストレス診断アレイに供し、これらの遺伝子のオブン暴露特異性について検証を行った。その結果、At1g34750、At1g70140はオブンと乾燥ストレスに対して、またAt3g21230はオブンと低温に対して発現応答することが明らかになった。一方、At2g17120はこれらのストレスには応答せず、オブンに対してのみ特異的に発現誘導されることが明らかになった。

さらに、At2g17120 遺伝子はシロイヌナズナのマイクロアレイ解析データベース(Genevestigator; https://3.met.genevestigator.com/at/)で検索を行ったところ、環境スト

## レスではオゾンのみで発現誘導される

ことが明らかになった。

以上のことからオゾンストレス診断にはAt2g17120遺伝子を用いることが最適であると考えられた。

2) オープントップチャンバーにおけるシロイヌナズナの生育

赤城試験センターにおける植物の栽培は、2008年6月6日～23日（1回目）、2008年7月2日～15日（2回目）、2008年11月11日～25日（3回目）の3回行った。このうち1回目及び3回目の栽培では植物の葉が赤みを帯びている、生育が悪い、等の症状が現れた。1回目及び3回目の栽培期間におけるOTCの条件を検証すると、1回目は平均光量（午前6時～午後6時）が495 μ mol m⁻² s⁻¹となっており、シロイヌナズナの栽培条件である100 μ mol m⁻² s⁻¹と比べて明らかに強光条件となっ

図-3-1-7 OTCにおけるシロイヌナズナの生育状態

（上図）OTCにおいて2週間栽培した時のシロイヌナズナ。（下図）各栽培期間直後のシロイヌナズナにおけるアントシアニン含量。
ていた。また、3回目は平均光量（午前6時～午後6時）が40.6μmol m^{-2} s^{-1}と問題はないが、一日の平均気温が10.6℃とシロイヌナズナの栽培条件である24℃に比べて低くなっていた。つまり、1回目の栽培では植物に強光ストレスが、3回目の栽培では低温ストレスが与えられ、正常に生育していないことが考えられた。一方、2回目のサンプリング時には平均光量（午前6時～午後6時）が63.8μmol m^{-2} s^{-1}、一日の平均気温が23.9℃と栽培に適正な条件であった。以上のことから2回目に栽培したサンプルを実験に用いることが適正であると示唆された。この事を検証するために強光・低温ストレスにより蓄積するアントシアニン類の定量を行った。その結果、2回目のサンプルに対し、1回目のサンプルでは25倍の、3回目のサンプルでは14倍のアントシアニン類が含まれていた（図-3-1-7）。また、アントシアニン類の合成に関与する遺伝子LDOX及びUF3GTの発現量も2回目のサンプルに対し、1回目のサンプルではそれぞれ21倍、2倍に、3回目のサンプルでは16倍、3倍になっていた。以上の結果から本研究におけるオゾンストレス診断には2回目に行ったサンプリングで得られた植物を用いることが適正であると考えられた。また、1回目のサンプルは強光ストレスによりアントシアニン類の蓄積が見られたものの、植物の生育は比較的良好であったため、強光ストレス下におけるオゾンストレス診断ができるかどうか検証するためのサンプルとして用いた。

## 3 ）オープントップチャンバーにおけるオゾンストレス診断

プロトタイプのオゾンストレス診断アレイが野外で観測されるオゾン濃度の変化に対して使用できるかについての検証を行った。2008年7月2日～15日（2回目）にOTCで栽培し、7月16日の午前6時～午後3時の9時間オゾン暴露した植物をオゾンの急性影響評価に、7月16日～23日の1週間オゾン暴露したものをオゾンの慢性影響評価に使用した。急性影響評価に用いた植物は、オゾン濃度×2（最大オゾン濃度120 ppb）+加温区において9時間後に一部の植物で若干の葉の萎れが観察されたが、他の処理区では見た目は無処理区と変化はなかった。このような植物から単離したRNAを用いてオゾンストレス診断アレイに供した。その結果、オゾン暴露開始時（initial）及びオゾン無処理（CF）区に比べオゾン濃度×1+加温、×2、及び×2＋加温処理区でAt2g17210遺伝子の発現が強く観察された（図3-1-8A）。さらに、この遺伝子の発現を定量的に見るために、オゾンにより発現変化がないことが確認されているシロイヌナズナのElongation factor 1α（EF1α）の遺伝子発現を1000とした時のAt2g17210

図-3-1-8 At2g17210遺伝子による急性オゾンストレス影響評価

(A) 各オゾンストレス・加温区におけるマクロアレイ解析により得られたAt2g17210遺伝子（上）及びEF1α遺伝子（下）の発現様式。(B) 各オゾンストレス・加温区におけるAt2g17210遺伝子の発現量。値はEF1α遺伝子の発現量を1000としたときの相対値で示す。