Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
今回の検討では、男児では、J-PSAIと臍帯血中の性ホルモン濃度の間に有意な関連を認めることができなかった（表(1)-8）。一方、女児においては、Tとの間に有意な関連を認めなかったが、composite scoreではPとの間に負の関連を、feminine scoreでは、E、Pとの間に正の関連を認め、臍帯血中のE、Pが性役割行動における女性化に関連していることが示唆された。（表(1)-9）

従来の報告では、胎生期の男性ホルモンへの曝露が、性役割行動における男性化に関与していることが報告されているが $ ^{[27,28]} $ 、本研究では女性ホルモンが性役割行動関連を示した。今回の性ホルモンの濃度は臍帯血中のものであり、出産時のホルモン環境を反映している。しかし、脳性分化に関わるのは妊娠のより初期の段階であると考えられており、そのため今回の結果は、臍帯血中の男性ホルモン濃度が必ずしも性分化に関わる時期のアンドロゲンへの曝露を反映していないためと考えられた。一方、今回の結果は女性化にE、P関与していることを示唆しており、新たな知見となりうると考えられた。更なる検討が必要である。

表(1)-8 J-PSAIと臍帯血中ホルモン濃度の関係（男児）：重回帰解析

Hormone levels	Composite	Masculine	Feminine
n	B (95%CI)	R²	n	B (95%CI)	R²	n	B (95%CI)	R²
T (pg/mL)	428	-0.047 a (-3.658, 1.255)	0.025	428	-0.021 a (-2.514, 1.625)	0.014	428	0.043 (-0.782, 2.077)	0.014
E (ng/mL)	428	-0.009 (-2.428, 2.013)	0.023	428	0.034 a (-1.198, 2.539)	0.015	428	0.063 (-0.431, 2.148)	0.016
P (ng/mL)	428	0.012 a (-3.533, 4.534)	0.023	428	0.070 a (-0.913, 5.863)	0.018	428	0.082 b (-0.319, 4.359)	0.019
T/E	428	-0.036 (-3.312, 1.500)	0.024	428	-0.057 a (-3.236, 0.809)	0.017	428	-0.027 (-1.788, 1.011)	0.013
LH (mIU/mL)	422	-0.030 (-2.040, 01.101)	0.024	422	-0.008 a (-1.443, 1.223)	0.014	422	0.037 (-0.577, 1.265)	0.012
FSH (mIU/mL)	422	-0.030 (-3.055, 1.549)	0.024	422	-0.010 a (-2.131, 1.730)	0.014	422	0.035 (-0.846, 1.813)	0.012
INSL3 (ng/mL)	427	0.007 a (-2.771, 3.227)	0.023	427	0.013 a (-2.193, 2.854)	0.014	427	0.007 (-1.622, 1.868)	0.012
Inhibin B (pg/mL)	426	-0.053 (-7.257, 2.111)	0.025	426	-0.081 a (-7.225, 0.653)	0.020	427	-0.034 (-3.665, 1.770)	0.012

調整因子:出生時体重、飲酒歷、喫煙歷、兄弟、姉妹

a: 兄弟が有意な影響、b: 姉妹が有意な影響
表(1)-9 J-PSAIと臍帯血中ホルモン濃度の関係（女児）：重回帰解析

Hormone levels	Composite	Masculine	Feminine
n	B (95%CI)	R²	n	B (95%CI)	R²	n	B (95%CI)	R²
T (pg/mL)	444	-0.037 (-3.821, 1.662)	0.011	444	-0.009 (-2.011, 1.648)	0.021	444	0.033 (-1.187, 2.513)	0.038
E (ng/mL)	444	-0.085 (-4.663, 0.222)	0.017	444	-0.006 (-1.732, 1.537)	0.021	444	0.108* (0.273, 3.569)	0.039
P (ng/mL)	444	-0.099* (-9.464, 0.245)	0.019	444	-0.030 (-4.077, 2.098)	0.022	444	0.103* (0.306, 6.540)	0.038
T/E	444	0.081 (-0.550, 6.948)	0.016	444	-0.004 (-2.620, 2.396)	0.021	444	-0.112* (-5.548, -0.492)	0.040

調整因子: 出生時体重、飲酒歷、喫煙歷、兄弟、姉妹

*: p<0.05

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

胎児の環境要因が生後身体と脳の性分化に与える影響について詳細に分析した研究は国際的にも非常に少ない。

本研究は、まず北海道スタディにおいて、世界的に見て最も精度の高い曝露評価により妊娠中のPCB・ダイオキシン類、PFOS/PFOAなどの有機フッ素系化合物、フタル酸エステル類など環境化学物質曝露の測定を行い、胎生期のホルモン環境を含めて、学童期における身体の変化(2D/4D)に与える影響、脳の性分化に与える影響について明らかにした。本研究の結果からは、Leydig細胞機能を反映する胎生期のホルモン環境が学童期の2D/4Dに影響を与えるものの、日常生活の中で曝露されるような低濃度の母への環境化学物質曝露では、2D/4Dには影響を及ぼさないことを明らかにできた。また、胎生期のアンドロゲン曝露を示唆する2D/4Dが、学童期の脳の性分化を評価するJ-PSAIの結果から、特に脳の男性化に関連していることを明らかにすることができた。

一方、エコチル調査では、出生時に身体測定を行い、1500人を超える新生児の陰茎長、精巣体積、肛門性器間距離、2D/4Dの測定を行うことができた。この結果は新生児の身体測定の結果の分布を作成することができた。今後このデータをもとにエコチル調査から得られる胎生期の環境要因の影響について解析することが可能である。また、本研究に参加した児の経過を観察することで、胎生期および出生後の環境的要因が、児の身体および脳の成長に与える影響についても明らかにできる可能性を秘めている。

このように、本研究では、環境要因が生後身体と脳の性分化に与える影響について、貴重なデータを得ることができた。
## （２）環境政策への貢献

＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

本研究では、Leydig細胞機能を反映する胎生期のホルモン環境が学童期の身体の性分化（2D/4D）に与える影響や胎生期のアンドロゲンへの曝露が脳の性分化（男性化）に影響を与えるものの、日常生活の中で曝露されるような低濃度の母への妊娠中における環境化学物質曝露では、これらの身体や脳の性分化影響を及ぼさないことを明らかにできたことから、本邦における環境化学物質への曝露に関する新たな知見であると考える。

また、エコチル調査で得られた出生時に身体測定では、1500人を超える新生児の陰茎長、精巣体積、肛門性器間距離、2D/4Dの測定を行うことができたことから、今後エコチル調査から得られる胎生期の環境要因の影響について解析することが可能であること、本研究に参加した児の経過を観察することで、胎生期および出生後の環境的要因が、児の身体および脳の成長に与える影響についても明らかにできる。この結果も、本邦から世界に発信できる新たなデータであると考える。

このように本研究は、環境省が主導しているエコチル調査の基本課題「胎児から小児期にかけての化学物質曝露が、子どもの健康に大きな影響を与えているのではないか？」という中心仮説の解決に大きく貢献するものと考える。さらには、本研究は日本の妊婦や児のデータに基づく科学的な成果を提供できるものと考える。

また、WHOから出された「State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals 2012」では、組織や臓器の発達を阻害する環境化学物質である内分泌かく乱化学物質(EDCs)についてグローバルな対策が必要とされている。さらに、2012年の第3回国際化学物質管理会議ではEDCsを国際的な化学物質管理のための戦略的アプローチの新規政策課題に挙げており、特にヒトの疫学データが少ない性分化や性成熟、次世代影響を研究、評価することは緊急の課題であり、その対策に直結する。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。
### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) A. Araki, T. Mitsui, C. Miyashita, T. Nakajima, H. Naito, S. Ito, S. Sasaki, K. Cho, T. Ikeno, K. Nonomura, R. Kishi: PLOS ONE, 9, 10 (vol, issue), e109039 (2014)

“Association between maternal exposure to di(2-ethylhexyl) phthalate and reproductive hormone levels in fetal blood”

2) T. Mitsui, A. Araki, A. Imai, S. Sato, C. Miyashita, S. Ito, S. Sasaki, T. Kitta, K. Moriya, K. Cho, K. Morioka, R. Kishi, K. Nonomura: PLOS One, 10, 3 (vol, issue), e0120636 (2015)

“Effects of prenatal Leydig cell function on the ratio of the second to fourth digit lengths in school-aged children.”

## <査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない。

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) 長 和俊 : Endocrine Disruptor News Lettr, 15, 1 （卷, 号） 5 （2012）

「胎児期の環境化学物質が性分化および性腺機能におよぼす影響の解析」

2) 三井貴彦、野々村 克也：Endocrine Disruptor News Lettr, 15, 1 （卷, 号）6（2012）

「胎児期環境化学物質曝露による性殖機能への影響」

## （2） 口頭発表（学会等）

1. 三井貴彦、荒木敦子、宮下ちひろ、今井紋子、佐藤早基子、橘田岳也、守屋仁彦、長和俊、森岡圭太、伊藤佐智子、岸玲子、野々村克也:第102回日本泌尿器科学会（2014.4）「母体への環境化学物質曝露と胎児期ホルモン環境が身体的变化に与える影響：第2指／第4指比との関連性について」

2. Takahiko Mitsui, Ayako Imai, Sakiko Sato, Atsuko Araki, Chihiro Miyashita, Takeya Kitta, Kimihiko Moriya, Kazutoshi Cho, Keita Morioka, Reiko Kishi, Katsuya Nonomura: 62th Annual meeting, Society of Pediatric Urology (2014.5) Effect of maternal exposure to endocrine-disrupting chemicals on sex hormone levels in cord blood and ratio of the second and fourth digit length in school-age children

3. 三井貴彦、橘田岳也、守屋仁彦、篠原信雄、野々村克也: 第23回日本小児泌尿器科学会(2014.7)「胎児期ホルモン環境が身体的変化に与える影響: 第2指: 第4指比との関連性について」

4. 三井貴彦、荒木敦子、伊藤佐智子、宮下ちひろ、橘田岳也、守屋仁彦、長和俊、森岡圭太、篠原信雄、岸玲子、野々村克也:日本泌尿器科学会北海道地方会（2015.1）「胎児期における男性ホルモンへの曝露が小児期の脳の性分化に与える影響について」
5. Takahiko Mitsui, Atsuko Araki, Sachiko Ito, Chihiro Miyashita, Takeya Kitta, Kimihiko Moriya, Kazutoshi Cho, Keita Morioka, Nobuo Shinohara, Reiko Kishi, Katsuya Nonomura: $ 30^{th} $ Annual meeting, European Urological Association (2015.3) [Effect of prenatal androgen exposure on behavioral sexual dimorphism in school-aged children]

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1) 市民公開講座「胎児期における環境ホルモンを考える」（平成27年2月7日、札幌市男女共同参画センター、観客34名

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）朝日新聞（平成27年2月4日、北海道版、朝刊26頁）

市民公開講座開催について

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1. Kallen B, Bertollini R, Castilla E, Czeizel A, Knudsen LB, Martinez-Frias ML et al. A joint international study on the epidemiology of hypospadias. Acta Paediatr Scand Suppl. 1986, 324:1-52.

2. Czeizel A. Increasing trends in congenital malformations of male external genitalia.

Lancet. 1985, 1;8426:462-463.

3. Acerini CL, Miles HL, Dunger DB, Ong KK, Hughes IA. The descriptive epidemiology of congenital and acquired cryptorchidism in a UK infant cohort. Arch Dis Child. 2009, 94;11:868-872.

4. Carbone P, Giordano F, Nori F, Mantovani A, Taruscio D, Lauria L et al. Cryptorchidism and hypospadias in the Sicilian district of Ragusa and the use of pesticides. Reprod Toxicol. 2006, 22;1:8-12.

5. Christensen JS, Asklund C, Skakkebaek NE, Jorgensen N, Andersen HR, Jorgensen TM et al. Association between organic dietary choice during pregnancy and hypospadias in offspring: a study of mothers of 306 boys operated on for hypospadias. The Journal of urology. 2013, 189;3:1077-1082.

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of hypospadias. PLoS One. 2012, 7;9:e44767.

7. Damgaard IN, Skakkebaek NE, Toppari J, Virtanen HE, Shen H, Schramm KW et al. Persistent pesticides in human breast milk and cryptorchidism. Environ Health Perspect. 2006, 114;7:1133-1138.

8. Jorgensen KT, Jensen MS, Toft GV, Larsen AD, Bonde JP, Hougaard KS. Risk of cryptorchidism among sons of horticultural workers and farmers in Denmark. Scand J Work Environ Health. 2014, 40;3:323-330.

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10. Carran M, Shaw IC. New Zealand Malayan war veterans’ exposure to dibutylphthalate is associated with an increased incidence of cryptorchidism, hypospadias and breast cancer in their children. N Z Med J. 2012, 125;1358:52-63.

11. Giordano F, Abballe A, De Felip E, di Domenico A, Ferro F, Grammatico P et al. Maternal exposures to endocrine disrupting chemicals and hypospadias in offspring. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2010, 88;4:241-250.

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13. Bergman Å, Heindel JJ, Jobling S, Kidd KA, Zoeller RT. Endocrine Disrupting Chemicals – 2012. World Health Organization. 2012.

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26. van de Beek C, Thijssen JH, Cohen-Kettenis PT, van Goozen SH, Buitelaar JK. Relationships between sex hormones assessed in amniotic fluid, and maternal and umbilical cord serum: what is the best source of information to investigate the effects of fetal hormonal exposure? Horm Behav. 2004, 46;5:663-669.

27. Lombardo MV, Ashwin E, Auyeung B, Chakrabarti B, Taylor K, Hackett G et al. Fetal testosterone influences sexually dimorphic gray matter in the human brain. J Neurosci. 2012, 32;2:674-680.

28. Yang CF, Shah NM. Representing sex in the brain, one module at a time. Neuron. 2014, 82;2:261-278.
5C-1252-28

# （２）環境化学物質が胎内ホルモン環境および性向行動に及ぼす影響

北海道大学 環境健康科学研究教育センター 岸 玲子、

荒木敦子、伊藤佐智子、宮下ちひろ

平成24～26年度累計予算額：49,359千円（うち、平成26年度予算額：16,732千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

性機能に関連する異常（停留精巣や尿道下裂など）の発生数は欧米で増加傾向にあり、これらの原因として内分泌かく乱作用がある環境化学物質曝露による胎児期のホルモン環境への影響が懸念されている。環境化学物質曝露による性ホルモンや性腺機能への影響については、動物を用いた実験データは報告されているが、ヒトのデータは不十分である。そこで本研究では、胎児期の環境化学物質曝露と出生時の外性器、精巣の異常と胎生期ホルモン環境の異常との関連について明らかにすることを目的とした。特にサブテーマ（2）では、2001年に開始した出生コホート「北海道スタディ」を用いて、胎児期の環境化学物質への胎児期曝露が、児の性腺機能および性役割行動（性向行動）に与える影響を明らかにすることを目的とした。北海道スタディにおいて、児の性腺機能に関連すると考えられる性ステロイドホルモン（テストステロン（T）、エストラジオール（E2）、プロゲステロン（P4）、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）、アンドロステネジオン（A-dione））、SHBG（Steroid Hormone Binding Globulin）、プロラクチン（PRL）、卵胞刺激ホルモン（Follicle Stimulating Hormone; FSH）黄体形成ホルモン（Luteinizing Hormone; LH）、Inhibin B、Insulin-like Factor 3（ILSN3）の臍帯血中濃度を分析し、環境化学物質として既に測定済みの母体血中Polychlorinated Biphenyls；PCB、ダイオキシン類、有機フッ素化合物（Perfluorinated Compounds；PFC、フタル酸エステルDEHP（di(2-ethylhexyl)phthalate））濃度との関連を検討した。さらに、脳の性分化として7-8歳時点の性向行動調査（性役割行動）への影響を検討した。

胎児期の環境化学物質曝露による胎内の性腺機能に関しては、本研究の母体血中PCB・ダイオキシン類曝露濃度（PCDD/F：9.3 pg/g TEQ）は先行研究と比較して低いが、PCB・ダイオキシン類濃度の増加と共に臍帯血中T/E2比、SHBG、PRL濃度が低下し、DHEA濃度が増加した。従ってPCB・ダイオキシン類の胎児期曝露は抗アンドロゲン作用により児のLeydig細胞の機能低下、およびテストステロンへの合成に関連するアロマターゼの活性に影響する可能性が考えられた。またPFCについては、PFOS/PFOAを四分位にすると男児では、PFOS濃度が高いほどT/E2比が小さく、Inhibin Bが低かった。女児では、P4、PRL値が低かった。一方PFOA濃度が高いほど、男児でInhibin Bが有意に高く、p-for trendも有意だった。胎児期のPFOS曝露は、特に男児においてエストロゲン作用を有する可能性が示唆された。また、本研究からPFOSへの曝露がInhibin Bの産生を低下させる可能性が示唆されたことから、動物同様Inhibin Bを分泌するSertoli細胞変成等の影響があるのではないか。女児では明確なエストロゲン作用は認められなかった。一方、PFOAはInhibin Bを増加した。PFOA曝露によるSertoli細胞やInhibin Bへの影響に関する報告は動物実験や細胞実験でも調べた限りはなく、その機序については今後明らかにする必要がある。フタル酸エステルは、男
児でDEHP代謝物であるMEHP（mono(2-ethylhexyl) phthalate）の母体血中濃度が高いとP4、Inhibin B、およびINSL3濃度が有意に低かったが、女児では、MEHP濃度といずれの性ホルモンとの関連も見られなかった。Inhibin BおよびINSL3は、それぞれ精巣のSertoli細胞、Leydig細胞から分泌されるホルモンである。従って、動物実験で報告されてきた胎児期のDEHP曝露による男児の精巣発達への負の影響が、ヒトへの低濃度曝露でも生じる可能性が示唆された。

胎児期の環境化学物質曝露による脳の性分化に関しては、男児のみで母体血中ダイオキシン類濃度が高いほどJ-PSAI Scaleが低下する、つまり女児傾向を示す影響が認められた。男児傾向と女児傾向の得点別の解析では、母体血中ダイオキシン類濃度が高いほど男児傾向得点が低下する傾向が認められたが、女児傾向得点への影響は少なく有意ではなかった。胎児期のダイオキシン類曝露は、7歳の遊び傾向を女性化させる可能が示された。曝露がLeydig細胞で産生されるテストステロン・エストラジオールに影響し、抗アンドロゲン作用つまり女性化傾向に作用したことが示唆された。PCBs、PFCsおよびフタル酸エステル曝露は、本研究ではJ-PSAIと有意な関連が認められなかった。

胎児期のPCBs・ダイオキシン類、有機フッ素化合物、フタル酸エステル曝露は、胎内の性腺機能および7歳児の脳の性分化に、特に男児に影響する可能性が示唆された。コホートにおいて児の追跡を行うことで、胎児期曝露によるその後の影響についての研究が必要である。

## [キーワード]

環境化学物質、胎児期曝露、出生コホート、性ホルモン、性役割行動

### 1. はじめに

性機能に関連する異常（停留精巣や尿道下裂など）の発生数は欧米で増加傾向にあり、これらの原因として環境化学物質曝露による胎児期のホルモン環境の影響が懸念されている。エストロゲン作用がある環境化学物質への曝露が増加したために精巣形成不全症候群に至り、また女児の遊び方や思春期発来の早期化等への影響が懸念されている。このことから、World Health Organization（WHO）も2012年に内分泌かく乱物質による潜在的なヒトおよび野生動物への影響についての報告書を作成している $ ^{[1]} $ 。環境化学物質曝露による性ホルモンや性腺機能への影響については、動物を用いた実験データは報告されているが、ヒトのデータは不十分である。

芳香族炭化水素受容体（AhR）アゴニストであるPCBs（Polychlorinated Biphenyls）、TCDD（Tetrachlorodibenzodioxin）、PCDFs（polychlorinated dibenzofuran）は、性ステロイドホルモン受容体へ作用することにより視床下部-下垂体-性腺系(HPG)、および視床下部-脳下垂体-甲状腺(HPT)などのホルモン恒常性を阻害し、内分泌かく乱作用を引き起こすことが示唆されている。また、AhRは発生段階の神経系に存在するため、TCDDの胎児期曝露が正常な脳神経発達を阻害し[2,3]、出生後の性役割行動に関与する可能性が示唆されているが、詳細なメカニズムは不明である。また、これらは主に動物実験や事故などで高濃度曝露されたヒトの研究からの報告である。ヒトを対象にした思春期および成人の生殖能力（月経周期、睾丸体積、精液質）を評価した研究はいくつか報告されている。Phillips et al.（2008）のまとめによると[4]、不妊患者では精液内のPCB-153、PCB-180が対照群よりも高く、またPCB濃度が高いと精子の運動能が低い、遊離テストステロン値の低下が報告されている一方で、有意な関連はないという報告もある。ドイツ
の工業地域に居住する母児104組を対象にした研究で、母体血中PCDD/Fs濃度が2倍になると臍帯血清中のテストステロンの低下 $ (MR=0.86,\ 95\%CI=0.72-1.03) $ ，およびエストラジオールの低下 $ (MR=0.73,\ 95\%CI=0.61-0.87) $ が認められた[5]。女性でテストステロンの減少が、男性でエストラジオールの減少がより認められた。胎児期曝露の影響は、PCB（この研究では6種類）と比較してダイオキシン類の方が、より影響が大きい可能性が示された。しかし、この研究では男女別のサブグループ人数は40から58名となり、サンプルサイズが不十分である。また、測定したPCBは6種類のみであり、PCBsの曝露を詳細に評価できたとは考え難い。母親が油症患者である次世代を対象にした研究で、中毒事故である油症のような高レベルの曝露を胎児期に受けると、男女ともに思春期以降の性ホルモンに影響が認められたが、曝露濃度は測定されていない[5]。

有機フッ素化合物（Perfluorinated compounds；PFCs）については、長期的なPFCs曝露による雄ラットの精巣内におけるステロイド合成能力を阻害 $ ^{[6]} $ 、あるいはラット細胞のin vitroでPFOA（Perfluorooctanoate）がLeydig細胞のテストステロン放出阻害が報告されている $ ^{[7]} $ 。疫学研究はいずれも横断研究で、成人男性では、血清中PFOS（Perfluorooctane sulfonate）、PFOA濃度とLuteinizing Hormone（LH）との正の相関がある一方、精子の質とは関連がみられなかった報告 $ ^{[8]} $ 、成人女性ではPFOS濃度とエストラジオールとの負の相関、およびPFOS、PFOA濃度が高い群で閉経が多いことが報告されている $ ^{[9]} $ 。しかし、胎児期曝露による児の性腺機能に関する報告はない。

フタル酸エステル類については、動物実験では、DEHP（di(2-ethylhexyl) phthalate）曝露が胎児のLeydig細胞、Sertoli細胞の減少あるいは増殖抑制を引き起こし、テストステロン濃度低下などのホルモンバランスを乱すことが報告されている $ ^{[10, 11]} $ 。ヒトでは、成人の横断研究、その多くが不妊外来での患者を対象とした調査で、曝露と精子濃度、テストステロン濃度との負の相関、Follicle Stimulating Hormone (FSH)との正の相関、および精子のDNA障害が多いことが報告されている $ ^{[12-17]} $ 。思春期の女児においてはケースコントロール研究で、フタル酸エステル曝露による思春期早発、乳房や陰毛の早期成熟などが示唆されている $ ^{[18-20]} $ 。一方、胎児期または乳幼児期の曝露については、曝露濃度が高いと児のテストステロン、SHBG（Steroid Hormone Binding Globulin）と負の相関、肛門性器間距離が短いことが報告されているが $ ^{[21-23]} $ 、このうち胎児期曝露による児の性ホルモンへの影響は1報のみである。また、フタル酸エステル類濃度が高いと遊びの男児スコアが低くなることから、脳の性分化への影響も示唆されている $ ^{[24]} $ 。しかし、ヒトでの科学的エビデンスは十分であるとはいえない。

ところで、性向行動とは、個人が持って生まれた性質（性質や性別）によって、傾向がある行動のことである。特に性別による行動を観察するものとしては青年期における性役割タイプを測定するBSRI（the Bem Sex Role Inventory）[25]、性役割尺度を両方の性にとって望ましい男性・女性に典型的な尺度、およびどちらかの性にとって望ましく典型的な両極で構成された尺度からなるPAQ（Personal Attributes Questionnaire）[26]があり、主に成人に使用される。子どもを対象にしたものだと、幼児期における典型的性役割行動(Sexual role behavior)の指標として使用されるPSAI（Pre-School Activities Inventory）がある[27]。男児、女児で出生後、または妊娠時母のテストステロン濃度が高いとPSAI得点が増加したことが報告されている[28, 29]。胎児期のPCB・ダイオキシン類、フタル酸エステル類とPSAIについては、5歳から7歳半までの児で、ドイツの報告ではPCB・ダイオキシン類濃度が高いと男児ではPSAI女児得点が高く、女児では低い
[30]、オランダの報告では男児で臍帯血中PCBが高いとPSAI男児得点が低く、男女ともダイオキシン類濃度が高いと女児得点が高い[31]ことが報告されている。また、フタル酸エステル類濃度が高いとPSAIの中の男性得点が低いことが報告されている[24]。しかし、環境化学物質曝露による脳の性分化への影響に関する研究はわずかである。

残留性有機汚染物質（Persistent Organic Pollutants；POPs）については、国際的に協調して廃絶、削減等を促すための取組として「残留性有機汚染物質に関するストックホルム条約（POPs 条約）」が締結されている。PCBは条約発効時から、有機フッ素化学物質のうちPFOSはストックホルム条約の第4回締約国会議（2009年5月）で制限物質として新たに追加されている。わが国では、PCBやダイオキシン類に対してはダイオキシン類対策特別措置法（平成11年7月12日成立）などにより対策がとられている。しかし、既に欧米ではPFOAについて使用禁止に踏み切った国も多いがわが国では具体的な禁止措置はとられていない。さらに他の有機フッ素化合物についても使用が増えているがリスク評価も十分でないものも多い。フタル酸エステル類は食品の包装容器や乳幼児のおもちゃへの使用については厚生労働省告示による規制があるが、その他の製品への使用規制はない。これら動物実験から内分泌かく乱作用が疑われている物質について日本ではこれまで人の疫学データはほとんどなかったので、日本において性分化や次世代影響を研究、評価する必要がある。

## 2 ．研究開発目的

本研究では、北海道スタディ、エコチル調査において、環境化学物質濃度と出生時の外性器、精巣の異常と胎生期ホルモン環境の異常との関連について明らかにすることを目的とする。サブテーマ（2）では、2001年に開始した出生コホート「北海道スタディ」を用いて、PCBs、ダイオキシン類、有機フッ素化合物、フタル酸エステルDEHP（di(2-ethylhexyl)phthalate）への胎児期曝露が、児の性腺機能および性役割行動（性向行動）に与える影響を明らかにすることを目的とする。具体的には、臍帯血中の、児の性腺機能に関連すると考えられる性ステロイドホルモン（テストステロン（T）、エストラジオール(E2)、プロゲステロン（P4）、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、アンドロステネジオン(A-dione))、SHBG(Steroid Hormone Binding Globulin)、プロラクチン（PRL）、卵胞刺激ホルモン（FSH: Follicle Stimulating Hormone）黄体形成ホルモン（Luteinizing Hormone; LH）、Inhibin B、Insulin-like Factor 3(ILSN3)、7-8歳時点の性向行動（J-PSAI）への影響を解析し、胎児期の環境化学物質曝露が胎内ホルモン環境および脳の性分化に与える影響について解明する。

### 3. 研究開発方法

## （1） 環境と子どもの健康に関する北海道スタディ（北海道スタディ）

## 1 ）小規模コホート

小規模コホートは、北海道札幌市の一産科病院を受診した妊婦とその児を対象に出生前向きコホート研究である。コホートのながれを図(2)-1に示す。札幌市およびその周辺に住む日本人で，2002年7月から2005年9月に産科を受診した妊婦1,796名に研究への参加を依頼した。依頼した妊婦のうち，日本臍帯血バンク登録者（22%）と里帰り分娩（3%）（他施設で分娩）予定者は研究対象から除外した。最終的に妊娠23週から35週の妊婦514名（28.6%）が研究参加に同意した。妊娠中
期から後期に妊婦と配偶者から、自記式調査票により両親の既往歴、教育歴，世帯収入，妊娠中喫煙状況，妊娠中飲酒状況などの基本的情報を得た。医療診療録から母児の分娩・出生時所見を得た。妊娠中期から後期に妊婦から母体血40 ml、および分娩時に膚帯血40 mlを採取し、分析まで-80℃で凍結保存した。

図(2)-1 小規模コホートのながれ

## 2 ）大規模コホート

大規模コホートは、北海道内全域の産科30施設で2003年に開始し、2013年3月までに妊婦20,823人が登録している。コホートのながれを図(2)-2に示す。妊娠初期のベースライン調査票から、妊娠時の年齢、妊娠前の体格、既往歴、教育歴、妊娠前後の喫煙および飲酒、世帯収入などの情報を得た。出産時の医療機関カルテから在胎週数、児の性別、出生時体重などの情報を得た。出生後の調査で母乳栄養の有無などの情報を得た。妊娠初期と後期の母体血、および分娩時の臍帯血を採取し、-80℃で保存した。8歳児に性向調査（J-PSAI）を実施している。加えて、サブ（1）で7歳から8歳の児を対象に両手のコピーを依頼し、第2指第4指比（2D/4D）を測定した。

図 $ (2) $ -2 大規模コホートのながれ

## 3 ）胎児期の環境化学質曝露

小規模コホートで、妊娠後期の母体血から426名のPCB・ダイオキシン類を高分解能ガスクロマトグラフィー・高分解能マススベクロトメーター（HRGC/HRMS）法（福岡県保健環境研究所）、447名のPFOS・PFOAを液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（LC/MS/MS）法（星薬科大学）、
および487名のDEHP代謝物Mono(2-ethylhexyl) phthalate（MEHP）をガスクロマトグラフ質量分析（GC/MS）法（名古屋大学）で測定済みのデータを用いた。

## 4 ）臍帯血中ホルモン濃度の測定

## a．小規模コホート

小規模コホートでは、514人のうち、保存してあった全臍帯血295検体を用いて、臍帯血中の性ホルモン濃度の測定をサブ（1）と協力して行った。

性ステロイドホルモンであるテストステロン（T）、エストラジオール（E2）、プロゲステロン（P4）、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）、アンドロステネジオン（A-dione）をLC-MS/MS法で、黄体形成ホルモン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、性ホルモン結合グロブリン（SHBG）、およびプロラクチン（PRL）を免疫放射定量測定（IRMA）法で、InhibinBをELISA法で、insulin-like factor 3（INSL3）をEIA法で測定した。性ホルモンの測定は、あすか製薬メディカルにて実施した。

## b．大規模コホート

北海道スタディ大規模コホート全参加者20,823人の中で2013年までに8歳になった（2003年～2005年生まれ）7,632人を対象とした。このうち臍帯血検体を保有するのは5607人、かつ妊娠中のベースライン調査票および出産時の新生児個票がそう単胎は5,086人（男児は2,570人および女児は2,516人）だった。このうち男児608人および女児583人が2D/4Dのデータが得られていた。ところで、北海道スタディ大規模コホートでは、あらかじめ無作為に24%をサブコホートとして抽出して

図(2)-3 大規模コホートの性ホルモン測定対象者
いる。そこで、上記の集団で、サブコホートである男児114人および女児93人の全員を性ホルモン測定対象者とし、加えて無作為抽出した男児336人および女児357人、最終的に男児女児それぞれ450人を性ホルモン測定対象者とした（図(2)-3）。保存してあった臍帯血を用いて900名のE2、T、P4をサブ（1）と協力して測定した。加えて、男児のみ高感度LH、高感度FSH、Inhibin B、およびINSL3を測定した。測定は全てあすか製薬メディカル(株)で実施した。

## 5 ）典型的性役割行動（性向行動）調查

幼少性役割行動尺度（Japanese version of Pre-School Activities Inventory (J-PSAI)）は、佐々木ら(2006)が標準化した日本語版PSAIである $ ^{[32]} $ 。全24項目のうち、男児項目12、女児項目12に分かれており、それぞれの項目について頻度を1－5の5件法で回答し、得点を算出する。

小規模コホートでは、実施済みの小学校入学時J-PSAI質問票得点を用いた(図(2)-1)。佐々木ら(2006)が既に標準化した質問票は男児傾向12項目、女児傾向12項目を含むが、女児傾向の1項目の回答が得られなかったため、女児傾向12項目の平均値(男児2.2、女児3.4)を補完した。J-PSAI scaleは47.11+1.1×（男児傾向12項目合計-女児傾向12項目）で算出した $ ^{[32]} $ 。

大規模コホートでは、実施済みの8歳時J-PSAI質問票得点を用いた(図(2)-2)。

## 6 ）統計解析

## a．環境化学物質曝露による性ホルモンへの影響

環境化学物質、ホルモンとも測定値が検出下限値（detection limit；DL）未満の検体には検出下限値の半値を代入して解析した。ダイオキシン類の毒性等価量（toxicity equivalence quantity；TEQ）は，2005年にWHOが発表した毒性等価係数（toxic equivalence factor；TEF）を用いて算出した $ ^{[33]} $ 。環境化学物質および性ホルモン濃度は非正規分布を示したため、常用対数変換してから解析に用いた。性ホルモンの指標としてT/E2、T/SHBG、およびLH/Tを使用した。性ホルモン濃度と母児の特徴との関連をT検定、カイ2乗検定、Mann-Whitney U検定で検討した。児の男女別の性ホルモンの濃度差をMann-Whitney U検定で解析した。環境化学物質と性ホルモンの両方が得られた対象者について化学物質とホルモンの相関をSpearman's rank correlation testで解析した。環境化学物質を連続数として重回帰分析を実施した後、曝露と性ホルモン濃度が有意であった場合は曝露を四分位にして量-影響関係を確認した。調整因子は各環境化学物質ごとに別途示す。

統計学的有意水準はp<0.05 とし、統計解析はThe Statistical Package for Social Science (SPSS) for Windows version 19.0J（日本語版SPSS, Inc., Chicago, USA）、JMP pro 10またはJMP clinical 5（SAS Institute Inc., NC, USA）を用いた。

### b. 環境化学物質曝露によるJ-PSAIへの影響

環境化学物質，J-PSAI scale、男児傾向および女児傾向得点は正規分布でなかったため対数変換した。環境化学物質と男女別のPSAI scale、男児傾向および女児傾向得点の関連を交絡要因で調整した重回帰分析で検討した。調整因子は母親の年齢、妊娠中の喫煙と飲酒、世帯収入、妊娠週数、小学校入学時の児の体重、年長の兄弟有無、採血時期（妊娠週数＜28wks，28-＜36wks，≥36wks，出産後）、児の性別（男女別の解析は除く）を用いた。
統計学的有意水準はp<0.05 とし、統計解析はThe Statistical Package for Social Science (SPSS) for Windows version 19.0J（日本語版SPSS, Inc., Chicago, USA）を用いた。

以上の研究は、すべて北海道大学環境健康科学研究教育センター倫理委員会の承認を得て実施した。インフォームドコンセントは、全対象者から疫学研究に関する倫理指針およびヘルシンキ宣言に基づき実施した。

## 4 ．結果及び考察

性ホルモンを測定した母児の基本的属性を表(2)-1に示す。母親の出産時年齢は30.1±5.0（平均値±SD）、男児の性別の割合は45.9%、女児は54.1%、児の在胎週数は39.3±1.0（平均値±SD）、および出生体重は3126.8±331.6（平均値±SD）であった。

表(2)-1 母児の基本的属性

N (%)	Mean±SD
Maternal characteristics
Age at delivery (years)	295	30.1±5.0
Pre-pregnancy BMI (m²/kg)	294	20.9±2.9
Parity	0	149 (50.7)
≥1	145 (49.3)
Annual household income (million yen)	<5	206 (70.5)
≥5	86 (29.5)
Educational level	≤12 years	133 (45.2)
≥13 years	161 (54.8)
Smoking during pregnancy	Nonsmoker	238 (81.0)
Smoker	56 (19.0)
Alcohol drinking during pregnancy	Nondrinker	193 (65.6)
Drinker	101 (34.4)
Infant characteristics
Gender	Boy	135 (45.9)
Girl	159 (54.1)
Birth weight (g)	294	3126.8±331.6
Gestational age (wks)	294	39.3±1.0

環境化学物質であるMEHP、PCB、ダイオキシン類、PFOS、およびPFOAの母体血中濃度分布を表(2)-2に示す。全ての環境化学物質の濃度は非正規分布を示し、児の性別によって環境化学物質濃度の有意な差は認められなかった。
INSL3は女児は20名のみ測定

表(2)-2 母体血中の環境化学物質濃度

Percentile
N	Min	25th	50th	75th	Max
MEHP (nmol/ml)	487	0.007	0.021	0.036	0.059	0.365
PCBs (ng/g lipid)	426	17.8	73.0	107	148	41460
Dioxins (TEQ pg/g lipid)	426	3.17	9.95	13.9	18.2	43.4
PFOS (ng/ml)	447	1.30	3.40	5.20	7.00	16.2
PFOA (ng/ml)	447	0.25	0.80	1.30	1.80	5.30

全体の性ホルモンの検出下限値、検出率、濃度の分布を表(2)-3に示す。検体の量不足により、LHは7件、FSHは8件、PRLは6件、Inhibin Bは5件、性ホルモンの測定が不可能であった。INSLは男児全員と女児20件のみを測定した。測定できた検体のうち、各性ホルモンの検出率はステロイドホルモン5種類はすべて100%、LHが16.3%、FSHが20.9%、SHBG並びにPRLが99.7%、Inhibin Bが60%、INSL3が100%であった。

表(2)-3 臍帯血中性ホルモンの濃度

Percentile
N	DL	Detection rate (%)	Minimum	25th	50th	75th	Maximum
E2 (ng/mL)	295	0.005	100	0.01	3.29	4.70	7.10	33.5
T (pg/mL)	295	0.005	100	5.45	59.8	83.9	114	1798
P4 (ng/mL)	295	0.010	100	0.43	175	219	279	514
DHEA (ng/mL)	295	0.010	100	0.67	1.77	2.19	2.99	114.16
A-dione (ng/mL)	295	0.010	100	0.10	0.36	0.46	0.58	7.46
LH (mIU/mL)	288	0.5	16.3	<DL	<DL	<DL	<DL	3.37
FSH (mIU/mL)	287	0.5	20.9	<DL	<DL	<DL	<DL	1.89
SHBG (nmol/L)	295	1.1	99.7	<DL	13.3	15.8	19.0	322
PRL (ng/mL)	289	1.0	99.7	<DL	63.1	85.8	116	223
Inhibin B	290	11	60.0	<DL	<DL	23.3	44.7	104
INSL3	153	100	0.07	0.23	0.27	0.32	0.75

N: 検体量不足で測定不可の検体を除く

DL: Detection Limit

児の性別の性ホルモン濃度を表(2)-4に示す。男児のホルモン濃度は女児よりもT、LH、FSH、Inhibin B、INSL3、T/E2、およびT/SHBGが有意に高かった。一方、DHEAは女児の方が有意に濃度が高かった。本研究において、男児で女児よりも男性ホルモンであるテストステロン濃度、T/E2、およびT/SHBGが高く、男児の特徴として従来の報告と同様であった $ ^{[34]} $ 。性腺刺激ホルモンであるLHおよびFSHに関して男児で濃度が高いのも従来の報告と同様であったが $ ^{[35]} $ 、その検出率は25%未満と低かった。