Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
# Development of Risk Management Program for Avoiding Pesticide Residue in Succeeding Crops

Principal Investigator: Nobuyasu SEIKE

Institution: National Institute for Agro-Environmental Sciences (NIAES)

3-1-3 Kannondai, Tsukuba, 305-8604, JAPAN

Tel: +81-29-838-8329 / Fax: +81-29-838-8199

E-mail: seike@affrc.go.jp

## [Abstract]

Key Words: Pesticide, Residue in succeeding crop, Risk evaluation, Availability, Plant back interval, Soil diagnosis

In Japan, some pesticides were recently detected in crops exceeding the maximum residue limits set by the Japanese Food Sanitation Law. One of the reasons for this could be that succeeding crops take up residual pesticides applied to previous crops from the soils. Under the Japanese registration system for newly developed pesticides, dates (or studies) for pesticide residue in succeeding crops are required only if the half-lives of pesticides in soils are longer than 100 days. Furthermore, the registration system is based on knowledge of the scientific studies performed in the last century, yet approximately 100 new pesticides have been developed every year since then.

In this study, we elucidated pesticide aging processes in soil and uptake mechanisms in crops in order to develop a risk management program for avoiding pesticide residues in succeeding crops. We focused particularly on techniques for evaluating the potential for pesticide residues in succeeding crops, to make them available for setting appropriate plant back intervals (PBIs). Further, we proposed alternative crops, methods of soil diagnosis and protocols for pesticide residue testing using suitable crops and soil.

In order to elucidate pesticide aging processes in soil, at first, extraction method from soil for evaluating phytoavailability was tested. The highest positive correlation with concentrations of water-extractable pesticide from soil and the plant indicated that water is the most suitable solution for evaluating the phytoavailability. The longer half-lives of water-extractable pesticide was found in soil with low carbon content, i.e. sandy soil, could be proposed as the suitable soil for pesticide residue testing. Additionally, we could predict the time-dependent increase of soil sorption coefficient (Kd) values and dissipation behavior from the results of temporal change in water extractable pesticides that could be detected by ELSA kit without purification. This indicated simple and faster soil diagnosis can be achieved.
Differential uptake of pesticides by 16 crops was indicated that leafy vegetable such as Komatsuna, was a suitable crop for pesticide residue testing. Uptake of pesticide in crops in early and late growth stage from soil was depend on pesticide’s octanol-water partition coefficient.

Taking into account for pesticide residue in soil and uptake mechanism in crops, we developed the techniques for evaluating the potential for pesticide residues in succeeding crops using half-lives in soil and octanol-water partition coefficient. Further, we also developed the frameworks of a simulation model for estimating pesticides concentration in soil and crops, and the suitable PBIs.
第Ⅱ部 イノベーションの促進とワーク・ライフ・バランスの実現に向けた課題

## ● TFP の上昇率を高めるにはイノベーションの促進が重要

続いて TFP の上昇には何が必要なのかをみていく。TFP は、具体的には、生産手法の革新、最先端の技術の導入などの資本の質的な変化、生産効率の改善、工場における分業体制の見直しなどの業務改善、組織改善、革新的な経営戦略などによるイノベーションの実現によって上昇するといわれている。そこで、第 2-(1)-4 図により TFP とイノベーションの関係について確認してみよう $ ^{8} $ 。

まず左図により TFP とイノベーションの関係を国際比較してみると、これらの関係には正の相関があることが分かる。我が国について確認すると、イノベーションの実現割合が低く、TFP 上昇率が低いという状況になっている一方で、主要国であるドイツやフランスは我が国に比べてイノベーションの実現割合が高く、TFP 上昇率も高い状況となっている。

さらに、右図により産業別にTFPとイノベーションの関係をみても同様の関係を確認でき、我が国では、製造業は「イノベーションの実現割合が高く、TFP上昇率も高い」、サービス業

## 第2-(1)-4図 TFP とイノベーションの関係

○ TFP 上昇率を高めるにはイノベーションが重要。

○ 産業別にみると、製造業はイノベーションの実現割合が高く、TFP 上昇率も高い。一方、サービス業はイノベーションの実現割合が低く、TFP 上昇率も低い。

資料出所 文部科学省科学技術・学術政策研究所「全国イノベーション調査」、OECD “Innovation statistics and indicators” をもとに厚生労働省労働政策担当参事官室にて作成

（注）1）イノベーションの実現とは、実際に、新たな製品・サービスの開発や生産・販売方法の導入、また経営管理方法の導入等を通じて新たな価値を生み出すことができていること。実現割合とは、実現企業数を全体の企業数で除した割合のことをいう。

2）左図について、国別の TFP 上昇率は、2013 年から 2014 年の上昇率。

3）右図について、産業ごとのTFP上昇率は、2010年から2014年の上昇率（日本についてのみ、2010年から2012年の上昇率）

8 イノベーション活動の関係のデータについては、データに制約もあるため、本章では「イノベーション活動」を国際比較する際には、イノベーション活動の指標として用いられることが多い「OECD Innovation statistics and indicators」及びOECDとも連携して調査を行っている科学技術・学術政策研究所（NISTEP）において、民間企業におけるイノベーションの実現やそれに向けた活動の状況及び動向調査を目的として実施している「全国イノベーション調査」を用い、企業におけるイノベーション活動の認識やその変化などを概観する。また、イノベーションについては、様々な定義があるが、ここではOECDのオスロ・マニュアルに従い、本章では、新たな製品・サービスの開発や生産・販売方法の導入、また経営管理方法の導入等を通じて新たな価値を生み出すことと定義する。
課題名 C-0906 受容体AhRの転写活性化を伴わないダイオキシン類の新たな毒性発現メカニズムの解明

課題代表者名 遠山 千春 （東京大学大学院医学系研究科疾患生命工学センター

$$ 健康環境医学部門 ) $$

研究实施期间 平成21～23年度

累計予算額 13,325 千円（うち 23 年度 3,825 千円）

予算額は、間接経費を含む。

## 研究体制

(1) cPLA₂ 遺伝子欠損マウスにおけるダイオキシン曝露による水腎症に関する研究、及びダイオキシン曝露マウス腎臓におけるサイトカインの解析に関する研究 (東京大学・大学院医学系研究科)

(2) ダイオキシン曝露マウス尿管の形態と機能の解析（東京大学・大学院医学系研究科、（独）国立環境研究所・環境リスク研究センター）

研究協力機関

University of California, Davis.

## 研究概要

### 1. はじめに(研究背景等)

ダイオキシン類の毒性は、生殖機能や記憶・学習機能への悪影響、および発癌性など多岐にわたる。さらに、発生や発達の特定の時期に影響を受け易いことが知られている。毒性の多様性は、想定される毒性現象に関して発生・発達の様々な時期のうち、もっとも低用量で生じる毒性のエンドポイントに焦点を当てて検証する必要がある。こうした方法は、これまで多くの研究者により採用されている毒性試験の主要な方法であるが、他方、これら毒性に共通する根本的なメカニズム解明を行うことによって、ダイオキシン毒性の多様性の解明を行うことも重要である。すなわち、ダイオキシン類の毒性発現メカニズムを解明することによって毒性発現の範囲と程度を推定することが可能となり、より適切なリスク評価を行うための基本情報が提供できる。このダイオキシン毒性発現の分子メカニズムのこれまでのパラダイムは、「まずダイオキシンが転写因子AhRと結合し、そして、ダイオキシン・AhR複合体が結合する標的遺伝子に異常な転写活性化が生じ、その結果として毒性が発現する」というものであった。しかしこれまでのパラダイムだけでは、ダイオキシン類が多様な毒性現象を引き起こすメカニズムを説明できなかった。ごく最近、細胞を用いた研究によって「ダイオキシン類が受容体AhRの転写活性化を伴わない反応を引き起こす」ことが示された。この新しく発見されたダイオキシン類が細胞質で引き起こす反応は、これまでのパラダイムでは説明されない反応であり、これまで明らかにされてこなかったダイオキシン類の毒性発現メカニズムを説明する反応である可能性がある。この可能性は、新しく発見された反応を仲介する因子であるcPLA₂やCOX-2が学習や炎症や細胞質内の応答などの幅広い生命現象を調節する因子であることから、高いものであると考えられる。

### 2. 研究開発目的

ダイオキシン類が引き起こす、ほぼすべての種類の毒性と同様に、ダイオキシン類による水腎症の発症にはAhRが必須であることから、AhRが転写因子として作用する標的遺伝子のダイオキシンによる異常な転写誘導が水腎症発症の契機となると考えられてきた。我々は、プロスタノイド合成の誘導性酵素であるシクロオキシゲナーゼ2(COX-2)が、AhRのシグナル伝達の川下において水腎症発症にとって極めて重要な役割を果たしていることを明らかにしていた。このCOX-2のダイオキシン曝露による誘導は、これまで前提とされてきたAhRの転写活性化を前提とするパラダイムとは異なる分子基盤であるAhRのノンジェノミック作用で引き起こされる可能性が、研究協力者であるカリフォルニア大学教授松村博士によって提唱されていた。そこで、AhRのノンジェノミック作用がダイオキシン毒性を引き起こすか検証する動物実験系の研究開発を目的とした。さらに、サイトカイン類がAhRのノンジェノミック作用と毒性発現を仲介する分子である可能性から、ダイオキシンを曝露した新生仔マウスの腎臓におけるサイトカイン類の変化を解明することを目的とした。さらに、ダイオキシンが多様な毒性現象を引き起こすこと、毒性影響の生じる時期について発達時期特異性が存在することなど、リスク評価に大きな影響を与える問題が、AhRのノンジェノミック作用に起因するのではないかと考えられた。そこで、ダイオキシンがマウス
に引き起こす腎奇形である水腎症をエンドポイントとして、毒性発現メカニズムを明らかにすることを目的とした。

具体的には、「AhRのノンジェノミック作用がどのように腎機能を攪乱して水腎症を引き起こすのか解明すること」を目標として、ダイオキシン曝露が引き起こす水腎症について、直接の原因となる腎・尿管の機能と構造の変化を明らかにすることを目的とした。

### 3. 研究開発の方法

## (1) cPLA_{2} 遺伝子欠損マウスにおけるダイオキシン曝露による水腎症に関する研究、及びダイオキシン曝

## 露マウス腎臓におけるサイトカインの解析に関する研究

AhRのノンジェノミック作用が動物個体におけるダイオキシン毒性に及ぼす影響を検証する方法を開発することを目標に、マウスを用いた曝露実験系を構築した。マウス系統は、ダイオキシンに対して高感受性であるC57BL/6Jを、ダイオキシンとしては毒性が最も強い2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)を用いた。AhRのノンジェノミック作用を評価するために、AhRのノンジェノミック経路で重要な位置にあるcPLA_{2}について欠損型と野生型を比較するという方法を採った。エンドポイントとしては、曝露によってマウス新生仔に生じる奇形である水腎症を用いた。水腎症はダイオキシン毒性の主要なものであり、症状の進行によって腎実質消失による腎機能不全という重篤で不可逆的な結果を引き起こす。ダイオキシン曝露によるマウス授乳期水腎症について、本研究の代表者らは、COX-2発現上昇が原因であることを明らかにしていた。また、COX-2はAhRのノンジェノミック経路によって発現上昇することが、細胞を用いた実験系では明らかにされていた。これらのことを総合して、水腎症をエンドポイントすることが適切であると判断した。

ダイオキシン曝露による授乳期水腎症においては、COX-2と共に炎症関連因子に含まれるサイトカイン類の発現上昇が起こることが明らかになっていた。サイトカインは細胞間のシグナル伝達を担う液性因子であり、広範な生命現象を仲介する調節因子である。サイトカイン類を網羅的に定量することで、ダイオキシン曝露が引き起こす毒性発現の原因となる分子の特定や多様な毒性現象が生じるメカニズムの解明につながる可能性があると考えられた。そこで、ダイオキシン曝露による腎臓中のサイトカイン量の変化の解析を本サブテーマの研究目的とした。

曝露実験は以下の手順で行った。ダイオキシンに対して高感受性であるC57BL/6系統を遺伝的背景とするcPLA_{2} $ \alpha $ 欠損マウスを用いて、ヘテロ欠損型の雌雄を交配した。出産後1日目の母マウスにTCDDを経口投与することで産仔に対して経母乳曝露した。経母乳曝露された新生仔について、PCR法によるcPLA_{2} $ \alpha $ 遺伝子型の判別を行い、ホモ遺伝子欠損型と野生型の産仔の腎臓について組織学的解析を行った。具体的には、HE染色した腎切片についてBryantらの方法に従って水腎症の有無とその程度を判定した。また、尿中PGE_{2}をELISA法で、腎臓中COX-2mRNA量をRT-qPCR法で、それぞれ定量した。

炎症性サイトカインの解析のためには、C57BL/6系統のAhR野生型マウスを用いて、出産後1日目の母マウスに体重1 kg あたり10 μg のTCDDを経口投与することで経母乳曝露した。授乳量が同程度となるようにするため、産仔数を日齢(PND)1で6匹に調整した。出生後のPND 1, 3, 5, 7, 9 に麻酔下で解剖を行った。サイトカインの定量は、微量サンプルを用いて多項目同時測定が可能なLuminexシステムを利用して行い、TCDD曝露に伴い変動するサイトカインのスクリーニングを行った。発現レベルの上昇がみとめられたサイトカインについてはRT-qPCRによる確認を行った。

## (2) ダイオキシン曝露マウス尿管の形態と機能の解析に関する研究

AhRのノンジェノミック作用が如何にしてダイオキシン毒性を引き起こすか解明することを目標に、マウスを用いた曝露実験を行うこととした。マウス系統はC57BL/6Jを、ダイオキシンとしてはTCDDを用いた。ダイオキシン曝露がマウス新生仔に水腎症を引き起こす直接の原因としては尿管の物理的閉塞ではないことが明らかになっており、泌尿器系の何らかの機能異常であることが予想されていた。この泌尿器系の異常として、尿管の層構造の消失による蠕動運動阻害が有力と考えられた。そこで、尿管横断面切片の組織学的解析と尿管蠕動運動の解析によって、それぞれ構造と機能の側面からダイオキシンによる影響を評価することとした。また、尿排出能を担う重要な構造体である腎乳頭の発達の度合いを検証した。加えて、ダイオキシンが腎臓の生理機能を攪乱する可能性についても検証した。腎機能としては、本研究の過程で尿産生量が増加しているという観察を解剖学的に得たことから、尿産生量の指標として膀胱中尿重量を、尿濃縮能の指標として尿浸透圧を測定した。曝露実験手順は次のとおりである。出産後1日目の母マウスに0, 10, 20, 80 μg/kg の何れかの用量のTCDDを経口投与することで産仔に対して経母乳曝露した。PND 3, 5, 7, 9, 11, 14 において解析を行った。

### 4. 結果及び考察

(1) cPLA_{2} 遺伝子欠損マウスにおけるダイオキシン曝露による水腎症に関する研究、及びダイオキシン曝露マ
## ウス腎臓におけるサイトカインの解析に関する研究

マウス産仔に経母乳曝露を行ったところ、TCDD曝露による水腎症の発症率は野生型では100%であったのに対し、cPLA_{2}\alpha 遺伝子欠損型の曝露群では35.7%と顕著に低かった。また、重症度についても、cPLA_{2}\alpha 遺伝子欠損型の曝露群では野生型に比して顕著に抑制された。この結果から、cPLA_{2}\alpha はダイオキシン曝露による授乳期水腎症の発症を引き起こす重要な分子であることが明らかになった。cPLA_{2}\alpha が如何にして水腎症発症に影響を与えるかを明らかにするために、TCDD曝露によるマウス授乳期水腎症の原因となるCOX-2について発現レベルの指標としてmRNA量を、活性レベルの指標としてPGE_{2}量を測定した結果、TCDD曝露によるCOX-2のmRNA量と活性の増加は、cPLA_{2}\alpha に依存することが明らかになった。また、水腎症発症に伴って発現量の減少する遺伝子であるNKCC2、ROMK AQP2についても、cPLA_{2}\alpha cPLA_{2}\alpha に依存することが明らかになった。これらの結果から、TCDD曝露によるマウス授乳期水腎症について、cPLA_{2}\alpha は原因となる分子の上流に位置して発症に影響を与える分子であることが明らかになった。

ダイオキシン曝露マウスの腎臓において、曝露と発症を仲介する分子の探索を行うために、Luminexシステムを利用してサイトカイン類の定量を行った。その結果、ケモカインであるIP-10, MCP-1, MIGと炎症性サイトカインであるIL-1β, TNF-α, IL-6の量が増加することを発見した。しかしながら、これらのサイトカイン類の変化が

cPLA_{2}\alpha 遺伝子の有無に依存するという結果は得られなかった。このことから、これらのケモカインと炎症性サイトカインはcPLA_{2}\alpha の関与するAhRのノンジェノミック作用と水腎症を仲介する分子ではない可能性が高いと考えられる。また、これまで想定されてきたパラダイムの分子基盤であるAhRのジェノミック経路と、本研究でダイオキシン毒性に影響を与えることが明らかになったcPLA_{2}\alpha を経由する経路の関係を検証するために、前者の経路によって発現レベルの上昇することの知られている遺伝子のmRNA量を測定した。その結果、AhRのジェノミック経路の活性化の指標となる遺伝子の発現にcPLA_{2}\alpha は影響を及ぼさないことが明らかになった。他方、AhRのノンジェノミック経路に位置するとされるcSrcに関連してcSrc kinaseのmRNA量がcPLA_{2}\alpha 依存的にTCDD曝露によって増加した。また、cPLA_{2}\alpha の発現レベルがTCDD曝露で上昇することも明らかになった。以上の結果から、

cPLA_{2}αはAhRのジェノミック経路には影響を与えないこと、cSrc kinaseやCOX-2の発現レベルに重要な役割を果たすことが示され、本研究の目的であるノンジェノミック経路が機能しない動物実験モデルが構築できたものと考えられる。特筆すべきことは、cPLA_{2}αの構成する経路の下流にダイオキシン曝露による水腎症発症が位置することである。すなわち、ダイオキシン毒性の少なくとも1つは、AhRのノンジェノミック作用によって引き起こされるものと考えられる。

## (2) ダイオキシン曝露マウス尿管の形態と機能の解析

TCDD曝露個体の腎臓で、PND3では腎乳頭の長さに曝露影響が認められなかったが、PND5,7では対照群と比較してTCDD曝露群の方が短い傾向にあった。腎臓の短軸長に対する腎乳頭の長さの比率は、PND5ではTCDD曝露群の方が小さい傾向にあり、PND7ではTCDD曝露群の方が有意に小さかったが、尿管の層構造に関しては、大きな形態変化が認められなかった。蠕動運動に関しては、曝露影響が認められなかった。以上の結果から、ダイオキシン曝露が、尿排出に重要な腎と尿管の構造に変化を引き起こすことは明らかになったが、当初想定した尿管層構造の消失のような蠕動運動阻害に直ちに結びつくような変化は見出すことができなかった。このことに対応して、蠕動運動にも水腎症発症に至るような変化が観察されなかった。

一方、水腎症発症に結びつきうる腎機能変化として尿濃縮阻害を新たに想定し、尿濃縮能の指標として尿浸透圧と尿量の指標として尿重量を測定した。その結果、TCDD曝露群では尿浸透圧が有意に減少し、また、尿重量が顕著に増加した。以上の結果から、TCDD曝露に授乳期のマウス新生仔の尿量を増やす作用があることが明らかになった。TCDD曝露による尿量の増加と、水腎症発症との関連が示唆されたことから、TCDD曝露による尿量増加を抗利尿ホルモン作用のある1-Desamino-8-D-arginine vasopressin (dDAVP)を用いて抑制する実験を行った。その結果、TCDD単独曝露群に比べてdDAVPを同時に曝露した群では、ダイオキシン曝露による尿量増加の程度が顕著に抑制され、ダイオキシン非投与群レベルとなった。また、腎臓について組織学的解析を行ったところ、dDAVPを同時に曝露した群の水腎症発症率、重症度ともに、TCDD単独曝露群に比べて顕著に低下した。以上の結果から、TCDD曝露による水腎症は、TCDDによる尿産生量増加に起因することが明らかになった。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

これまでのダイオキシン毒性の分子基盤についての理解は、受容体AhRによって転写活性化される遺伝子が毒性発現を引き起こすというものであった。最近新たに発見されたAhRのノンジェノミック作用は、in vitro実験系における現象であり、毒性発現に果たす役割は不明であった。本研究では、ダイオキシン毒性におけるAhRのノンジェノミック作用の役割を検証するモデル実験系を開発することに成功した。このことによって、AhRのノンジェ
ノミック作用に関する研究が今後大きく進展するものと考えられる。さらに、本研究は開発したマウス曝

露実験系を利用して、AhRのノンジェノミック作用がダイオキシン曝露による水腎症を引き起こす原因であることを示すことに成功した。この発見は、これまでのパラダイムによらない分子基盤がダイオキシン毒性の原因となることを意味しており、ダイオキシン毒性研究の新しい局面を拓く重要なものである。

ダイオキシン毒性は、種差や系統による差が大きいこと、感受性の高い時期が存在することから、その毒性現象の全貌を把握することが困難である。この困難を克服するために、ダイオキシン類の毒性発現メカニズムを解明することによって毒性発現の条件・範囲・程度を推定することが可能ではないかと考えられてきた。一般に環境化学物質の毒性発現に関わる標的分子の解明はほとんどなされていない。ダイオキシン毒性の研究分野では、最近になってエンドポイントについて原因となる遺伝子について報告がなされてきた。このような状況にあって、本研究では、曝露から発症に至るまでの経路を分子・生理学レベルで明らかにすることができた。ダイオキシンの毒性発現メカニズム研究の最先端を切り開く研究ができたと言える。

## (2) 環境政策への貢献

ダイオキシンが発達の時期特異的に幅広い毒性現象を引き起こすとから、その影響の全貌を解明し適切なリスクを評価することが困難であった。リスク評価のためには、比較的単純な用量反応関係の研究も有効ではあるが、これだけではリスク評価の為の基礎的知見として充分とは言えない。毒性が発現する分子メカニズムを解明することによって、初めて様々な動物種に共通で生じる毒性の分子基盤情報が明らかになる。本研究は、これまで知られていなかった分子基盤がダイオキシン毒性の原因であることを示した。この作用が細胞内カルシウムや炎症関連因子といった汎用性の高い生体内分子に変化を及ぼすものであることから、このAhRのノンジェノミック作用が水腎症以外の様々な毒性の解明の鍵となる発見に結びつくことが期待できる。すなわち、信頼に足るリスク評価を下すための基盤となる知見を提供したことになる。

種々の化合物がダイオキシン様毒性を持つかを検証するために、AhRの転写活性化能を指標とするレポーターアッセイシステムが利用されている。本研究は、AhRの転写活性化能に基づかないダイオキシン毒性が存在することを明らかにした。このことは、上記レポーターアッセイシステムのみでダイオキシン毒性を評価することが不適切である可能性を示唆している。ダイオキシン毒性を持つ化学物質のリスク評価に影響し得る新たな科学的知見をもたらしたものと考えられる。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

## く査読付き論文>

1) B. DONG, N. NISHIMURA, C. F. VOGEL, C. TOHYAMA, and F. MATSUMURA: Biochem Pharmacol, 79, 3, 487-497 (2010)

“TCDD-induced cyclooxygenase-2 expression is mediated by the nongenomic pathway in mouse MMDD1 macula densa cells and kidneys.”

2) W. YOSHIOKA, R. E. PETERSON, C. TOHYAMA: J Steroid Biochem Mol Biol, 127, 96-101 (2011). "Molecular targets that link dioxin exposure to toxicity phenotypes."

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1) W. YOSHIOKA, K. AIDA-YASUOKA, T. KAWAGUCHI, N. FUJISAWA, S. OHSAKO, S. HARA, C. TOHYAMA: SOT2012, The Annual Meeting of the Society of Toxicology, San Francisco, USA, (2012)

“Involvement of $ PGE_{2} $ and urine volume increase in the onset of dioxin-induced hydronephrosis in mice.”

2) 遠山千春：第39回日本毒性学会学術年会（2012）学会長招聘講演。「環境毒性学から疾患研究への展開…水腎症発症の分子毒性メカニズムの解明」

### 7. 研究者略壓

課題代表者:遠山 千春

東京大学医学部卒業、医学博士、Ph.D.、東京大学大学院医学系研究科教授

## 研究参画者

(1): 遠山 千春 (同上)

(2): 西村 典子

京都女子大学家政部卒業、医学博士、(独)国立環境研究所環境リスク研究センター主任研究員、2010年退職。
C-0906-1

# C-0906 受容体 AhR の転写活性化を伴わないダイオキシン類の新たな毒性発現 メカニズムの解明

# (1) cPLA_{2} 遺伝子欠損マウスにおけるダイオキシン曝露による水腎症に関する研究、及びダイオキシン曝露マウス腎臓におけるサイトカインの解析に関する研究

東京大学・大学院医学系研究科 遠山千春

<研究協力者>

University of California, Davis, Environmental Toxicology Faculty 松村文夫

東京大学・大学院医学系研究科 吉岡 亘

平成21～23年度までの累計予算額：7,267千円

(うち平成23年度:1,411千円)

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] ダイオキシンが発達の時期特異的に多様な毒性現象を引き起こすことから、その毒性現象の全貌を解明し適切なリスクを評価することが困難であった。ダイオキシン毒性発現の分子メカニズムのこれまでのパラダイムは、「まずダイオキシンが転写因子 AhR と結合し、そして、ダイオキシン・AhR 複合体が結合する標的遺伝子に異常な転写活性化が生じ、その結果として毒性が発現する」というものであった。細胞を用いた研究によって最近新しく発見された「ダイオキシン類が受容体 AhR の転写活性化を伴わない反応を引き起こす」というこれまでのパラダイムでは説明されない反応が、ダイオキシン類の多様な毒性発現を説明する反応である可能性が高いと考え、この新たな反応である AhR のノンジェノミックパスウェイがダイオキシン毒性に関与するか検証するための実験系の研究開発を行った。発達時期特異的毒性である水腎症をエンドポイントとして、上記の反応経路の主要な分子である cPLA₂ を欠損したマウスに対し、ダイオキシンとして 2,3,7,8-四塩素化ジベンゾ-p-ジオキシン(TCDD)を用いた曝露実験を行った。その結果、水腎症の発症とその原因となる COX-2 の発現上昇が cPLA₂ の欠損により抑制されることが明らかになった。一方、従来のパラダイムで説明される AhR の転写活性化の標的遺伝子は cPLA₂ 遺伝子型に影響を受けなかった。毒性の仲介因子であると想定したサイトカインも同様であった。本研究では、ダイオキシン毒性における AhR のノンジェノミック作用の役割を検証するモデル実験系の開発し、AhR のノンジェノミック作用がダイオキシン曝露による水腎症を引き起こす原因であると示すことに成功した。この発見は、これまでのパラダイムによらない分子基盤がダイオキシンの効果を持つための応募図に関する研究が行われている。
イオキシン毒性の原因となることを意味しており、ダイオキシン毒性研究の新しい局面を拓き、また、リスク評価の精緻化に寄与するものと考えられる。

[キーワード] ダイオキシン、水腎症、毒性発現メカニズム、cPLA_{2}、リスク評価

### 1. はじめに

化学物質の中には、難分解性で環境中に残留するものが存在する。その多くは、過去に農薬や工業用材料として用いられたものである。これらの使用歴のある国では、現在でも汚染が問題となっている $ ^{1} $ 。また、製造や使用歴のない地域の住民からも、難分解性有機化学物質であるポリ塩化ビフェニル（PCB）が検出された $ ^{2-4} $ 。さらに海洋生物からも、海域間での濃度差こそあれ、難分解性有機化学物質が検出されている $ ^{5} $ 。これらの報告から、難分解性有機化学物質の地球規模での広がりと汚染が危惧されている。

難分解性有機化学物質は、生体系での食物連鎖を経て生物体内に濃縮されることから、高等動物ほど高濃度で蓄積するという性質をもつ。実際に北極圈の高等動物から高濃度のPCBやジクロロジフェニルトリクロロエタン(DDT)が検出され $ ^{6} $ 、これが原因と考えられる生殖器異常や奇形の発生が報告されている $ ^{7} $ 。このような、残留性が高く生物に有害な影響を及ぼすおそれのある有機物は残留性有機汚染物質(POPs)と定義され、2001年には、削減や廃絶にむけた「残留性有機汚染物質に関するストックホルム条約」が採択された。

POPs の 1 つであるダイオキシン類は、塩素の置換された位置と数の違いにより区別される 210 種類の塩素化芳香族炭化水素の総称である。内訳は、ポリ塩素化ジベンゾパラダイオキシン (PCDDs ; polychlorinated dibenzo-p-dioxins) 同族体・異性体の計 75 種と、ポリ塩素化ジベンゾフラン (PCDF ; polychlorinated dibenzo-p-furans) 同族体・異性体の計 135 種である。さらに、ポリ塩素化ビフェニル (PCBs ; polychlorinated biphenyl) の同族体・異性体の計 209 種のうち平面構造を有する (コプラナーPCBs) 12 種も、ダイオキシン類と同様の毒性を示す化合物として知られる。ダイオキシン類は毒性の強さがそれぞれ異なり、最も毒性の強い化合物は 2,3,7,8-四塩素化ジベンゾ-p-ダイオキシン (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin ; TCDD) である。TCDD は常温では無色の固体であり、水には難溶である。800℃以上で完全に分解されるが、通常の環境下では難分解性で環境残留性が高い。ダイオキシン類とコプラナーPCBの中で 29 種類の化合物は、実際に TCDD と同様の生体毒性を持つことが明らかにされており、リスク管理の対象物質として分類されている 8-10)。様々な毒性強度を持つダイオキシン類の中で、個別の強度を評価する手段として毒性等量が用いられる。毒性等量は、最も毒性の強い TCDD を 1 として相対的な毒性を示した毒性等価係数に、実測濃度を掛けた数値の合計である。

ダイオキシン類は、主に廃棄物処理場の燃焼過程において非意図的産物として環境中に放出される環境汚染物質であり、脂溶性であることから、体内から排出されにくく生体内に濃縮されや
すい。ヒトや野生生物は、主に食物連鎖を介してダイオキシン類を生体内に取り込み、その大部分は脂肪組織や肝臓に蓄積する $ ^{11,12} $ 。ヒトでは特に脂肪組織への分布が高い傾向にある $ ^{13} $ 。TCDDの体内からの消失半減期は生物種によって大きく異なり、本研究で使用したマウスC57BL/6系統は11日と比較的短いが $ ^{14} $ 、WHOによるとヒトは7.5年と設定されており、非常に長い $ ^{15} $ 。

ダイオキシン類によるヒトへの健康被害が報告されている。1968年に、西日本を中心に発生したカネミ油症では、原因となった米ぬか油および患者の血液や脂肪組織からPCBやPCDFが検出された。油症では、クロルアクネ(塩素挫創)などの皮膚症状、視力低下、痺れなどの神経症状が観察された $ ^{16,17} $ 。同様の曝露事故は台湾でも発生した $ ^{16} $ 。1976年イタリアのセベソで起きた化学工場の爆発事故では、TCDDに曝露された工場周辺の地域住民が、曝露濃度に比例して塩素挫創を発症した $ ^{18} $ 。またこの地域での出産調査では、出産児の性比が女子側に偏っていた $ ^{19} $ 。さらに他の例として、ベトナム戦争でオレンジ剤の撒布に従事し、ダイオキシン類に曝露された米国退役軍人を対象とした調査では、糖尿病などの糖代謝障害とTCDD曝露との関連性が示唆された $ ^{20} $ 。国際ガン研究機関(IARC)では、ダイオキシン類のうちTCDDをグループ1（ヒトに対して発ガン性がある）として分類されている。

実験動物を用いた研究では、TCDD の成熟個体への高用量・単回投与により、急激な体重減少 $ ^{21,22} $ 、肝臓肥大 $ ^{23,24} $ 、胸腺萎縮 $ ^{25} $ を消耗性症候群と称される伴う病態が引き起こされることが明らかになっている。また発ガンプロモーション作用を有すること $ ^{26} $ が報告されている。このような TCDD の様々な毒性発現は、転写因子である aryl hydrocarbon receptor (AhR) を介して行われることが、AhR 欠損マウスを用いた研究により証明されている $ ^{27-29} $ 。しかし、AhR シグナル伝達経路において AhR よりも下流の詳細なメカニズムについてはほとんど明らかにされていない。

上記の毒性現象に加えて、幼若動物においては、成熟個体で顕著な毒性が観察されない用量でも次世代（胎仔や新生仔）に悪影響が及ぶことが報告されている。例えば、TCDDの長期曝露による流産、妊娠率の低下が示唆され $ ^{30,31} $ 、3世代目の出生仔においても低体重および性周期の異常が明らかになった $ ^{32} $ 。また、胎仔や新生仔への母体経由の曝露では、奇形の発生、生殖機能の異常、甲状腺機能異常などが報告されている $ ^{33-35} $ 。このように、曝露が引き起こす毒性影響について感受性の高い時期が存在するということがダイオキシン毒性の特徴であり、毒性影響の全貌を解明することを難しいものにしている。この困難を乗り越えてダイオキシン類の毒性影響を評価するために、発生・発達の様々な時期のうち、もっとも低用量で生じる毒性のエンドポイントに焦点を当てて検証されてきた。こうした方法は、これまで多くの研究者により採用されている毒性試験の主要な方法である。他方、これら毒性に共通する根本的なメカニズム解明を行うことによって、ダイオキシン毒性の多様性の解明を行うことも重要である。すなわち、ダイオキシン類の毒性発現メカニズムを解明することによって毒性発現の範囲と程度を推定することが可能となり、より適切なリスク評価を行うための基本情報を共有できるようになる。

ダイオキシン類の毒性発現メカニズムとしてこれまで想定されてきたパラダイムは、「まずダ
イオキシンが転写因子 AhR と結合し、そして、ダイオキシン・AhR 複合体が結合する標的遺伝子に異常な転写活性化が生じ、その結果として毒性が発現する」というものであった。ダイオキシン曝露が AhR 依存的に多くの遺伝子の発現量を増やすこと $ ^{36,37} $ 、ダイオキシン類が引き起こすほぼすべての毒性現象の発現に AhR が必須であること $ ^{38-40} $ がこのパラダイムの根拠とされている。このパラダイムに則って網羅的な遺伝子発現解析が数多くなされてきた。しかしながら、AhR による転写活性化の標的遺伝子が毒性発現の原因となることが明らかになっている例は、ダイオキシン曝露による血压上昇 $ ^{41} $ を例外として、他の主要な毒性現象については長年の研究にも関わらずみつかっていない $ ^{42} $ 。このように、これまでのパラダイムだけでは、ダイオキシン類が多様な毒性現象を引き起こすメカニズムを説明できない状況であった。

本研究では、以下に述べる AhR のノンジェノミックな作用についての新たなアイディアを取り入れることによってこれまで解明されて来なかったダイオキシン毒性の発現メカニズムが明らかになるのではないかと考えた。この AhR のノンジェノミックな作用は、細胞を用いた最近の研究で明らかになった。すなわち、「ダイオキシン類によって受容体 AhR が核内で引き起こす転写活性化とは別に、AhR は細胞質内のシグナル伝達経路を活性化する」という細胞質内で起こる現象 $ ^{43)} $ である。AhR のノンジェノミック作用と呼ぶことが提唱されたこの新しく発見された AhR の作用は、カルシウムシグナルを介して生理活性物質群プロスタノイドの合成酵素や細胞内シグナル伝達を担う分子を活性化する $ ^{44,45)} $ ものであり、その下流で幅広い影響を引き起こすと考えられた。したがって、ダイオキシン類が引き起こす多様な毒性現象の原因となる可能性があると考えられた。しかしながら、AhR のノンジェノミック作用がダイオキシン曝露された動物個体で機能するか、さらには、ダイオキシン毒性に関与するかということは不明であった。そこで、本研究では、ダイオキシン受容体 AhR のノンジェノミック作用がダイオキシンによる発達時期特異的な毒性現象に及ぼす影響を解明することを目標とし、そのために必要な方法を開発することとした。図 1-1 の核内に示した経路が従来のパラダイムによる毒性発現であり、細胞質内に示した経路が新しいパラダイムによる毒性発現である。本研究は、後者を研究対象とした。前者と後者の経路は、AhR までが共通で、その下流で分岐すると考えられている。分岐後の後者の経路を構成する分子の 1 つである cPLA $ _{2} $ は細胞質型フォスフォリパーゼ A $ _{2} $ であり、細胞膜に存在するリン脂質をアラキドン酸に変換する酵素である。アラキドン酸はシクロオキシゲナーゼ(COX)を始めとする各種酵素群によって生理活性物質群であるプロスタノイドやロイコトリエン等に変換される。cSrc は非受容体型チロシンキナーゼであり、標的蛋白質のリン酸化を介して細胞内シグナル伝達を調節する分子である。
図 1-1. 受容体 AhR の転写活性化を伴わないノンジェノミック作用とダイオキシン毒性の概念図
### 2. 研究開発目的

本サブテーマでは、ダイオキシン曝露が引き起こす毒性現象に関して、これまで想定されてきたパラダイムに基づかない新しい分子基盤が存在するということを明らかにしようとした。これまで想定されてきたパラダイムとは「ダイオキシンが転写因子 AhR と結合し、ダイオキシン・AhR 複合体が結合する標的遺伝子に異常な転写活性化が生じ、その結果として毒性が発現する」というものである。このパラダイムの中で AhR が発揮する作用は、核内のゲノム(genome)中に存在する標的遺伝子の転写を引き起こす作用であることから、AhR のジェノミック(genomic)作用と呼ぶべきものである。一方、新しい分子基盤とは「ダイオキシンによって活性化した AhR が細胞質内でカルシウムシグナルを介して cPLA₂ とその下流で cSrc や COX-2 を活性化する」という AhR のノンジェノミック作用である。AhR のノンジェノミック作用は様々な培養細胞を用いてダイオキシンによって活性化することが最近明らかにされてきたが、動物個体におけるダイオキシンによる毒性現象に関与するかということについては不明であった。

AhR のノンジェノミック作用がダイオキシン毒性に及ぼす影響を個体レベルで検証する実験系はこれまで存在しなかった。そこで、AhR のノンジェノミック作用の影響を検証できる動物実験系を開発することを目的とした。このために、AhR のノンジェノミック作用が細胞質内で引き起こす一連のシグナル経路(AhR のノンジェノミック経路)で重要な位置をしめる cPLA_{2} に着目した。その理由は、AhR 自身はジェノミック経路とノンジェノミック経路の両方に必要な分子であり、AhR のノンジェノミック経路にあって上流に位置する cPLA_{2} が本研究で対象とするのに適切だと考えられたことである。実際に細胞を用いた研究では、cPLA_{2} の活性を阻害することで AhR のノンジェノミック経路を介したシグナルが下流に伝わらなくなることが示されている $ ^{44-46} $ 。これらのことから、cPLA_{2} 欠損マウスを用いて、AhR のノンジェノミック経路が機能しない場合にダイオキシン毒性が発現するか否かを検証する動物実験系を構築することを具体的な目的とした。

## 3 ．研究開発方法

本研究では、AhR のノンジェノミック作用が動物個体におけるダイオキシン毒性に及ぼす影響を検証する方法を開発することを目標として、マウスを用いた曝露実験系を構築した。対象としたマウス系統は、ダイオキシンに対して高感受性である C57BL/6J である。またダイオキシン同族体のうち、毒性が最も強い 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) を用いた。AhR のノンジェノミック作用を評価するために、AhR のノンジェノミック経路で重要な位置にある cPLA₂ について欠損型と野生型を比較するという方法を採った。TCDD 曝露により cPLA₂ 野生型で生じる毒性現象が欠損型のマウスで生じない場合に、その毒性現象は AhR のノンジェノミック作用によって起こると判断することとした。ダイオキシン曝露が cPLA₂ のサブタイプである
cPLA_{2} $ \alpha $ の発現誘導を行うことが幾つかの培養細胞では知られていた $ ^{47,48)} $ 。そこで、本研究ではcPLA_{2}としてサブタイプ $ \alpha $ を用いて以下の研究を行った。エンドポイントとしては、曝露によってマウス新生仔に生じる奇形である水腎症を用いた。水腎症はダイオキシン毒性の主要なものであり、症状の進行によって腎実質消失による腎機能不全という重篤で不可逆的な結果を引き起こす。ダイオキシン曝露によるマウス授乳期水腎症について、本研究の代表者らは、COX-2発現上昇が原因であることを既に明らかにしていた $ ^{29)} $ 。また、COX-2はAhRのノンジェノミック経路によって発現上昇することが、細胞を用いた実験系で、研究協力者のMatsumuraらによって明らかにされていた $ ^{44)} $ 。これらのことを総合して、水腎症をエンドポイントすることが適切であると判断した。

ダイオキシン曝露による授乳期水腎症においては、COX-2と共に炎症関連因子に含まれるサイトカイン類の発現上昇が起こることが明らかになっていた $ ^{29)} $ 。サイトカインは細胞間のシグナル伝達を担う液性因子であり、広範な生命現象を仲介する調節因子である。サイトカイン類を網羅的に定量することで、ダイオキシン曝露が引き起こす毒性発現の原因となる分子の特定や多様な毒性現象が生じるメカニズムの解明につながる可能性があると考えられた。そこで、ダイオキシン曝露による腎臓中のサイトカイン量の変化の解析を本サブテーマの研究目的とした。

曝露実験は以下の手順で行った。ダイオキシンに対して高感受性である C57BL/6 系統を遺伝的背景とする cPLA_{2}\alpha 欠損マウスを用いて、ヘテロ欠損型の雌雄を交配した。出産後1日目の母マウスに TCDD を経口投与することで産仔に対して経母乳曝露した。経母乳曝露された新生仔について、PCR 法による cPLA_{2}\alpha 遺伝子型の判別を行い、ホモ遺伝子欠損型と野生型の産仔の腎臓について組織学的解析を行った。具体的には、HE 染色した腎切片について Bryant らの方法 $ ^{49)} $ に従って水腎症の有無とその重症度を判定した。また、尿中 PGE_{2} を ELISA 法で、腎臓中 COX-2 mRNA 量を RT-qPCR 法でそれぞれ定量した。

炎症性サイトカインの解析のためには、C57BL/6系統のAhR野生型マウスを用いて、出産後1日目の母マウスに体重1kgあたり10μgのTCDDを経口投与することで経母乳曝露した。授乳量が同程度となるようにするため、産仔数をPND1で6匹に調整した。出生後の日齢(PND)1,3,5,7,9に麻酔下で解剖を行った。サイトカインの定量は、微量サンプルを用いて多項目同時測定が可能なLuminexシステムを東京大学医学部附属病院神経内科のご厚意により利用させていただき、TCDD曝露に伴い変動するサイトカインのスクリーニングを行った。発現レベルの上昇が認められたサイトカインについてはRT-qPCRによる確認を行った。

### 4. 結果及び考察

## (1) cPLA_{2} 遺伝子欠損マウスにおけるダイオキシン曝露による水腎症に関する研究

本研究のために導入した cPLA_{2}\alpha 遺伝子欠損マウス $ {}^{50)} $ について、まず、AhR の遺伝子の配列解析を行った(図 1-2)。AhR はダイオキシン毒性の決定因子であり、AhR の遺伝子型の違いによる
てダイオキシン毒性に対する感受性が大きく異なることがその理由である。この解析の結果から、AhR 遺伝子の配列は高感受性型の AhR $ ^{b-1} $ であることが判明した。このことから、このマウス系統が本研究の目的に適うと判断して曝露実験を行ったところ、本系統の cPLA_{2} $ \alpha $ 野生型マウス系統はダイオキシン受容体 AhR が高感受性型であるにも関わらず、曝露影響に関しては予想に反して低感受性であることが判明した。そこで、2009-2010 年にかけて cPLA_{2} $ \alpha $ 遺伝子欠損マウスを C57BL/6J 系統に対して戻し交配を行った。3 世代の戻し交配の後に再び曝露実験を行い、HE 染色により水腎症の有無・重症度を判定したところ、20 $ \mu $ g/kg の用量が全てのマウスで発症する用量であること、曝露により尿中 PGE_{2} 量ならびに腎臓中 COX-2 mRNA 量が増加することを見出し、我々の研究目的に適う動物であることが確認できた。

そこで、20 μg/kg の TCDD を母マウスに投与することで cPLA_{2} 野生型および欠損型の産仔に母乳を介した TCDD 曝露を行った。生後 14 日 (PND 14) における産仔の TCDD 曝露による水腎症の発症率は野生型では 100% であった。一方、cPLA_{2}α 遺伝子欠損型の曝露群では、野生型と比べて頭著に低かった（表 1）。また、重症度についても、cPLA_{2}α 遺伝子欠損型の曝露群では野生型に比して頭著に抑制された。この結果から、cPLA_{2}α はダイオキシン曝露による授乳期水腎症の発症を引き起こす重要な分子であることが明らかになった。

cPLA_{2} $ \alpha $ が如何にして水腎症発症に影響を与えるかを明らかにするために、TCDD曝露によるマウス授乳期水腎症の原因となるCOX-2に関して、発現レベルの指標としてmRNA量を、活性レベルの指標としてPGE_{2}量を測定した(図1-3)。その結果、TCDD曝露によるCOX-2のmRNA量と活性の増加は、cPLA_{2} $ \alpha $ に依存することが明らかになった。また、水腎症発症に伴って発現量の減少する遺伝子であるNKCC2,ROMK,AQP2についても、cPLA_{2} $ \alpha $ に依存することが明らかになった(図1-4)。これらの結果から、TCDD曝露によるマウス授乳期水腎症について、cPLA_{2} $ \alpha $ は原因となる分子の上流に位置して発症に影響を与える分子であることが明らかになった。

これまで想定されてきたパラダイムの分子基盤である AhR のジェノミック経路と、本研究でダイオキシン毒性に影響を与えることが明らかになった cPLA_{2}\alpha を経由する経路の関係を検証するために、前者の経路によって発現レベルの上昇することの知られている遺伝子の mRNA 量を測定した(図 1-5)。その結果、AhR のジェノミック経路の活性化の指標となる遺伝子である CYP1A1, AhRR, IGFBP-1 の発現に cPLA_{2}\alpha は影響を及ぼさないことが明らかになった。他方、AhR のノンジェノミック経路に位置するとされる cSrc に関連して cSrc kinase の mRNA 量が、cPLA_{2}\alpha 依存的に TCDD 曝露によって増加した(図 1-6)。ダイオキシン曝露による授乳期水腎症の原因遺伝子である COX-2 についても、曝露による発現上昇は cSrc kinase と同じく cPLA_{2}\alpha 依存的であった。これらの結果は、ダイオキシン曝露による COX-2 の発現増加が、CYP1A1 に代表されるような AhR のジェノミック作用ではなく、cPLA_{2}\alpha や cSrc が構成する AhR のノンジェノミックパスウェイによって引き起こされることを示唆している。また、cPLA_{2}\alpha の発現レベルが TCDD 曝露で上昇することも明らかになった。

以上の結果から、 $ cPLA_{2}\alpha $ はAhRのジェノミック経路には影響を与えないこと、cSrc kinaseや