Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
COX-2 の発現レベルに重要な役割を果たすことが示され、本研究の目的であるノンジェノミック経路が機能しない動物実験モデルが構築できたものと考えられる。AhR のノンジェノミック作用が最近発見されたものであることからその全貌は未だ明らかでなく、今後のさらなる検証が必要であるが、この新しい AhR のノンジェノミック作用を検証するための有用な系の開発に成功したといえる。特筆すべきことは、cPLA_{2}\alpha の構成する経路の下流にダイオキシン曝露による水腎症発症が位置することである。すなわち、ダイオキシン毒性の少なくとも 1 つは、AhR のノンジェノミック作用によって引き起こされるものと結論付けることが妥当である。

## (2) ダイオキシン曝露マウス腎臓におけるサイトカインの解析に関する研究

ダイオキシン曝露マウスの腎臓において、水腎症発症に伴って変化するサイトカインを探索するために、Luminexシステムを利用してサイトカインの定量を行った。その結果、ケモカインであるIP-10, MCP-1, MIGと炎症性サイトカインであるIL-1β, TNF-α, IL-6の量が増加することを発見した(図1-7)。これらのサイトカイン類の量の変化と、AhRのノンジェノミック作用あるいは水腎症との関係を検証するために、cPLA_{2}α遺伝子欠損マウスの腎臓における発現量をIP-10とIL-1βについて測定した。その結果、これらのケモカインと炎症性サイトカインのmRNA量はTCDD曝露によって増加すること、その増加がcPLA_{2}αには依存しないことが明らかになった(図1-8)。このことから、IP-10やIL-1βはcPLA_{2}αの関与するAhRのノンジェノミック作用と水腎症を仲介する分子ではない可能性が高いと考えられる。本研究で発見したサイトカイン類の顕著な誘導は、ダイオキシン曝露によって引き起こされる、水腎症以外のその他の毒性に関与する可能性がある。この可能性については、非常に興味深いことではあるが、本研究のテーマからは外れるため、今後の課題とすることにした。
表 1. cPLA_{2}\alpha 欠損マウスにおける水腎症の発症率と重症度

PND	TCDD(μg/kg)	cPLA2αgenotype	Npup / dam	0	1	2	3	4	0
14	0	+/-	5 / 6	3	2	0
0	-/-	5 / 6	4	1	0
20	+/-	8 / 7	1	2	5	100
20	-/-	8 / 7	4	2	1	35.7
図 1-3. ダイオキシン曝露による cPLA₂α 遺伝子依存的な COX-2 発現誘導. cPLA2α mRNA 量はΔΔCT 法によって内在性コントロールである cyclophilin B mRNA 量で補正して算出した。
ROMK mRNA

AQP2 mRNA

図 1-4. ダイオキシン曝露による cPLA_{2}\alpha 遺伝子依存的な遺伝子発現変化. 各 mRNA 量は $ \Delta\Delta $ CT 法によって内在性コントロールである cyclophilin B mRNA 量で補正して算出した。
AhRR mRNA

IGFBP-1 mRNA

図 1-5. ダイオキシン曝露による cPLA_{2}\alpha 遺伝子非依存的な遺伝子発現変化. 各遺伝子の mRNA 量は $ \Delta\Delta $ CT 法によって内在性コントロールである cyclophilin B mRNA 量で補正して算出した。
図 1-6. ダイオキシン曝露による cPLA₂α ならびに cSrc kinase 遺伝子発現変化.
IL-1α	IL-1β	IL-2	IL-4	IL-5
IL-6	IL-10	IL-12	IL-13	IL-17
TNF-α	bFGF	VEGF	IFN-γ	GM-CSF
IP-10	MCP-1	KC	MIG	MIP-1α

図 1-7. ダイオキシン曝露が引き起こすサイトカイン類の変化. Luminex system を用いて、腎サンプルから抽出したサイトカインを定量し、非曝露群と比した増加率の大きさを評価した。
IL-1β mRNA

図 1-8. ダイオキシン曝露による cPLA_{2}\alpha 遺伝子依存的な IP-10 と IL-1\beta の変化. 各遺伝子の mRNA 量は $ \Delta\Delta $ CT 法によって内在性コントロールである cyclophilin B mRNA 量で補正して算出した。
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

これまでのダイオキシン毒性の分子基盤についての理解は、受容体 AhR によって転写活性化される遺伝子が毒性発現を引き起こすというものであった。これに対して、in vitro 実験系によって最近新しくみつかった AhR のノンジェノミック作用は、培養細胞を用いた実験によって明らかとなったものであり、個体レベルでのダイオキシン毒性における役割が不明であり、そもそも、ダイオキシン毒性における役割を検証する有用な実験系が存在しなかったのである。本研究により、ダイオキシン毒性における AhR のノンジェノミック作用の役割を検証するモデル実験系の開発が成功したことになる。このことによって、AhR のノンジェノミック作用に関する研究が今後大きく進展するものと考えられる。さらに、本研究は開発したマウス曝露実験系を利用して、AhR のノンジェノミック作用がダイオキシン曝露による水腎症を引き起こす原因であることを示すことに成功した。この発見は、これまでのパラダイムによらない分子基盤がダイオキシン毒性の原因となることを意味しており、ダイオキシン毒性研究の新しい局面を拓く重要なものである。また、本研究では、ケモカインや炎症性サイトカインがダイオキシン曝露によって誘導されることを発見した。特に顕著な誘導率を示した IP-10 については、これまで知られていなかった新発見である。

## （２）環境政策への貢献

ダイオキシンが発達時期に特異的に多様な毒性現象を引き起こすことから、その影響の全貌を解明し適切なリスクを評価することが困難であった。リスク評価のためには、比較的単純な用量反応関係の研究も有効ではあるが、これだけではリスク評価の為の基礎的知見として充分とは言えない。毒性が発現する分子メカニズムを解明することによって、初めて様々な動物種に共通で生じる毒性の分子基盤情報が明らかになる。本研究は、これまで知られていなかった分子基盤がダイオキシン毒性の原因であると示したものであり、この作用が細胞内カルシウムや炎症関連因子といった汎用性の高い生体内分子に変化を及ぼすものであることから、このAhRのノンジェノミック作用が水腎症以外の様々な毒性の解明の鍵となる発見に結びつくことが期待できる。すなわち、信頼に足るリスク評価を下すための基盤となる知見を提供したことになる。

種々の化合物がダイオキシン様毒性を持つかを検証するために、AhRの転写活性化能を指標とするレポーターアッセイシステムが利用されている。本研究は、AhRの転写活性化能に基づかないダイオキシン毒性が存在することを明らかにした。このことは、上記レポーターアッセイシステムのみでダイオキシン毒性を評価することが不適切である可能性を示唆している。ダイオキシン毒性を持つ化学物質のリスク評価に影響し得る新たな科学的知見をもたらしたものと考えられる。
## 6 ．国際共同研究等の状況

本研究はカリフォルニア大学デービス校(University of California, Davis, Environmental Toxicology Faculty)の Matsumura Fumio(松村文夫)教授と連携して研究開発を推進した。松村教授はダイオキシン毒性学について90を超す原著論文を発表しているこの分野における代表的な研究者である。「ダイオキシン類が受容体 AhR の転写活性化を伴わない反応を引き起こす」ことをin vitro 実験系を用いて松村教授の研究グループが発見した $ ^{43-46, 48, 51, 52} $ ことがこの分野での最近の重要なトピックとなっており、非常に大きな注目を集めている。松村教授の研究グループによるこの発見が本研究開発の起点になっている。松村教授との共同研究により受容体 AhR の転写活性化を伴わないダイオキシンへの反応に関する MMDD1 細胞を用いた in vitro 研究の成果を2010年に共著で発表した $ ^{44)} $ 。in vivo 研究の成果については投稿準備中であり、ダイオキシン毒性の研究として大きな注目を集めると考えている。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) Dong B, Nishimura N, Vogel CF, Tohyama C, Matsumura F. TCDD-induced cyclooxygenase-2 expression is mediated by the nongenomic pathway in mouse MMDD1 macula densa cells and kidneys. Biochem Pharmacol. 79(3):487-97, 2010

2) Yoshioka W, Peterson RE, Tohyama C. Molecular targets that link dioxin exposure to toxicity phenotypes. J Steroid Biochem Mol Biol. 127:96-101, 2011

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) Yoshioka W, Aida-Yasuoka K, Kawaguchi T, Fujisawa N, Ohsako S, Hara S, Tohyama C. Involvement of $ PGE_{2} $ and urine volume increased in the onset of dioxin-induced hydronephrosis in mice. The Toxicologist, Suppl. Toxicol. Sci. 126:408-408, 2012

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 遠山千春. 環境毒性学から疾患研究への展開…水腎症発症の分子毒性メカニズムの解明. 学会長招聘講演, 第39回日本毒性学会学術年会, 仙台. 5月10日, 2010

2) Tohyama C. Cyclooxygenase-2 as a molecular target of dioxin-induced hydronephrosis in mice. Symposium of Koran Society of Toxicology, Seoul National University, 13-14 May, 2010

3) 遠山千春, Perspectives on Emerging Important Research Fields in Toxicology. 中国毒理学会/学术讨论会, 大连医科大学. 31 July, 2010

4) Yoshioka W, Aida-Yasuoka K, Kawaguchi T, Fujisawa N, Ohsako S, Hara S, Tohyama C.
Involvement of $ PGE_{2} $ and urine volume increase in the onset of dioxin-induced hydronephrosis in mice. SOT2102, The Annual Meeting of the Society of Toxicology, San Francisco, USA. 2012

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## (4) シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

日本衛生学会賞受賞(「環境化学物質の健康影響とその毒性発現メカニズムの解明に関する研究」遠山千春, 2010 年): 本研究を含む環境化学物質の健康影響とその毒性発現メカニズムの解明に関する研究が評価されて日本衛生学会の学会賞を受賞した。
### 8 \. 引用文献

1) Jan MR, Shah J, Khawaja MA, and Gul K. DDT residue in soil and water in and around abandoned DDT manufacturing factory. Environ Monit Assess. 155(1-4):31-8, 2009

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3) Hansen JC. The human health programme under AMAP. AMAP Human Health Group. Arctic Monitoring and Assessment Program. Int J Circumpolar Health. 57(4):280-91, 1998

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50) Uozumi N, et al. Role of cytosolic phospholipase A2 in allergic response and parturition. Nature. 390(6660):618-22, 1997

51) Sciullo EM, Dong B, Vogel CF, and Matsumura F. Characterization of the pattern of the nongenomic signaling pathway through which TCDD-induces early inflammatory responses in U937 human macrophages. Chemosphere. 74(11):1531-7, 2009

52) Li W and Matsumura F. Significance of the nongenomic, inflammatory pathway in mediating the toxic action of TCDD to induce rapid and long-term cellular responses in 3T3-L1 adipocytes. Biochemistry. 47(52):13997-4008, 2008
(2) ダイオキシン曝露マウス尿管の形態と機能の解析

東京大学・大学院医学系研究科

遠山千春

(独)国立環境研究所・環境リスク研究センター

西村典子（平成21年度のみ）

<研究協力者>

東京大学・大学院医学系研究科

吉岡 亘

平成21～23年度までの累計予算額：6,058千円

(うち平成23年度：2,414千円)

予算額は間接経費を含む

[要旨] ダイオキシンが発達の時期特異的に幅広い毒性現象を引き起こすとから、その影響の全貌を解明し適切なリスクを評価することが困難であった。ダイオキシン毒性発現の分子メカニズムのこれまでのパラダイムは、「まずダイオキシンが転写因子 AhR と結合し、そして、ダイオキシン・AhR 複合体が結合する標的遺伝子に異常な転写活性化が生じ、その結果として毒性が発現する」というものであった。細胞を用いた研究によって最近新しく発見された「ダイオキシン類が受容体 AhR の転写活性化を伴わない反応を引き起こす」というこれまでのパラダイムでは説明されない反応が、ダイオキシン類の多様な毒性発現を説明する反応である可能性があることから、この反応経路を構成する生体分子である COX-2 依存性の毒性現象である水腎症に着目した。C57BL/6 系統の新生仔にダイオキシンを経母乳曝露し、腎臓および尿管の形態の変化を定量的に解析する研究手法を開発した。解析の結果、曝露後 2 日というごく早期に引き起こされる腎臓と尿管の形態変化を発見した。この発見は、ダイオキシンが発達時期特異的に毒性現象を引き起こすメカニズムの解明につながるものであり、より適切なリスク評価を行うための基本情報が提供できるものと期待できる。

[キーワード] ダイオキシン、水腎症、毒性発現メカニズム、cPLA_{2}、リスク評価

### 1. はじめに

化学物質の中には、難分解性で環境中に残留するものが存在する。その多くは、過去に農薬や工業用材料として用いられたものである。これらの使用歴のある国では、現在でも汚染が問題となっている $ ^{1} $ 。また、製造や使用歴のない地域の住民からも、難分解性有機化学物質であるポリ
塩化ビフェニル (PCB) が検出された $ {}^{2-4)} $ 。さらに海洋生物からも、海域間での濃度差こそあれ、難分解性有機化学物質が検出されている $ {}^{5)} $ 。これらの報告から、難分解性有機化学物質の地球規模での広がりと汚染が危惧されている。

難分解性有機化学物質は、生態系での食物連鎖を経て生物体内に濃縮されることから、高等動物ほど高濃度で蓄積するという性質をもつ。実際に北極圈の高等動物から高濃度のPCBやジクロロジフェニルトリクロロエタン(DDT)が検出され $ ^{6} $ 、これが原因と考えられる生殖器異常や奇形の発生が報告されている $ ^{7} $ 。このような、残留性が高く生物に有害な影響を及ぼすおそれのある有機物は残留性有機汚染物質(POPs)と定義され、2001年には、削減や廃絶にむけた「残留性有機汚染物質に関するストックホルム条約」が採択された。

POPs の 1 つであるダイオキシン類は、塩素の置換された位置と数の違いにより区別される 210 種類の塩素化芳香族炭化水素の総称である。内訳は、ポリ塩素化ジベンゾパラダイオキシン (PCDDs ; polychlorinated dibenzo-p-dioxins) 同族体・異性体の計 75 種と、ポリ塩素化ジベンゾフラン (PCDF ; polychlorinated dibenzo-p-furans) 同族体・異性体の計 135 種である。さらに、ポリ塩素化ビフェニル (PCBs ; polychlorinated biphenyl) の同族体・異性体の計 209 種のうち平面構造を有する (コプラナーPCBs) 12 種も、ダイオキシン類と同様の毒性を示す化合物として知られる。ダイオキシン類は毒性の強さがそれぞれ異なり、最も毒性の強い化合物は 2,3,7,8-四塩素化ジベンゾ-p-ダイオキシン (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin ; TCDD) である。TCDD は常温では無色の固体であり、水には難溶である。800℃以上で完全に分解されるが、通常の環境下では難分解性で環境残留性が高い。ダイオキシン類とコプラナーPCBの中で 29 種類の化合物は、実際に TCDD と同様の生体毒性を持つことが明らかにされており、リスク管理の対象物質として分類されている 8-10)。様々な毒性強度を持つダイオキシン類の中で、個別の強度を評価する手段として毒性等量が用いられる。毒性等量は、最も毒性の強い TCDD を 1 として相対的な毒性を示した毒性等価係数に、実測濃度を掛けた数値の合計である。

ダイオキシン類は、主に廃棄物処理場の燃焼過程において非意図的産物として環境中に放出される環境汚染物質であり、脂溶性であることから、体内から排出されにくく生体内に濃縮されやすい。ヒトや野生生物は、主に食物連鎖を介してダイオキシン類を生体内に取り込み、その大部分は脂肪組織や肝臓に蓄積する $ ^{11,12} $ 。ヒトでは特に脂肪組織への分布が高い傾向にある $ ^{13} $ 。TCDDの体内からの消失半減期は生物種によって大きく異なり、本研究で使用したマウスC57BL/6系統は11日と比較的短いが $ ^{14} $ 、WHOによるとヒトは7.5年と設定されており、非常に長い $ ^{15} $ 。

ダイオキシン類によるヒトへの健康被害が報告されている。1968年に、西日本を中心に発生したカネミ油症では、原因となった米ぬか油および患者の血液や脂肪組織からPCBやPCDFが検出された。油症では、クロルアクネ(塩素挫創)などの皮膚症状、視力低下、痺れなどの神経症状が観察された $ ^{16,17} $ 。同様の曝露事故は台湾でも発生した $ ^{16} $ 。1976年イタリアのセベソで起きた化学工場の爆発事故では、ダイオキシン類に曝露された工場周辺の地域住民が、曝露濃度に比例して塩素挫創を発症した $ ^{18} $ 。またこの地域での出産調査では、出産児の性比が女子側に偏
っていた $ ^{19)} $ 。さらに他の例として、ベトナム戦争でオレンジ剤の撒布に従事し、ダイオキシン類に曝露された米国退役軍人を対象とした調査では、糖尿病などの糖代謝障害とTCDD曝露との関連性が示唆された $ ^{20)} $ 。国際ガン研究機関(IARC)では、ダイオキシン類のうちTCDDをグループ1（ヒトに対して発ガン性がある）として分類されている。

実験動物を用いた研究では、TCDD の成熟個体への高用量・単回投与により、消耗性症候群と称される急激な体重減少 $ ^{21,22} $ 、肝臓肥大 $ ^{23,24} $ 、胸腺萎縮 $ ^{25)} $ が引き起こされることが明らかになっている。また発ガンプロモーション作用を有すること $ ^{26)} $ が報告されている。このような TCDD の様々な毒性発現は、転写因子である aryl hydrocarbon receptor (AhR) を介して行われることが、AhR 欠損マウスを用いた研究により証明されている $ ^{27-29)} $ 。しかし、AhR より下流の詳細なメカニズムについてはほとんど明らかにされていない。

上記の毒性現象に加えて、幼若動物においては、成熟個体で毒性のない用量でも次世代（胎仔や新生仔）に悪影響が及ぶことが報告されている。TCDDの長期曝露による流産、妊娠率の低下が示唆され $ ^{30,31} $ 、3世代目の出生仔においても低体重および性周期の異常が明らかになった $ ^{32} $ 。また、胎仔や新生仔への母体経由の曝露では、奇形の発生、生殖機能の異常、甲状腺機能異常などが報告されている $ ^{33-35} $ 。このように、曝露が引き起こす毒性影響について感受性の高い時期が存在するということがダイオキシン毒性の特徴であり、毒性影響の全貌を解明することを難しいものにしている。この困難を乗り越えてダイオキシン類の毒性影響を評価するために、想定される毒性現象に関して発生・発達の様々な時期のうち、もっとも低用量で生じる毒性のエンドポイントに焦点を当てて検証されてきた。こうした方法は、これまで多くの研究者により採用されている毒性試験の主要な方法である。他方、これら毒性に共通する根本的なメカニズム解明を行うことによって、ダイオキシン毒性の多様性の解明を行うことも重要である。すなわち、ダイオキシン類の毒性発現メカニズムを解明することによって毒性発現の範囲と程度を推定することが可能となり、より適切なリスク評価を行うための基本情報が提供できる。

ダイオキシン類の毒性発現メカニズムとしてこれまで想定されてきたパラダイムは、「まずダイオキシンが転写因子 AhR と結合し、そして、ダイオキシン・AhR 複合体が結合する標的遺伝子に異常な転写活性化が生じ、その結果として毒性が発現する」というものであった。ダイオキシン曝露が AhR 依存的に多くの遺伝子の発現量を増やすこと $ ^{36,37} $ 、ダイオキシン類が引き起こすほぼすべての毒性現象の発現に AhR が必須であること $ ^{38-40} $ がこのパラダイムの根拠とされている。このパラダイムに則って網羅的な遺伝子発現解析が数多くなされてきた。しかしながら、AhR による転写活性化の標的遺伝子が毒性発現の原因となることが明らかになっている例は、ダイオキシン曝露による血压上昇 $ ^{41} $ を例外として、他の主要な毒性現象については長年の研究にも関わらずみつかっていない $ ^{42} $ 。このように、これまでのパラダイムだけでは、ダイオキシン類が多様な毒性現象を引き起こすメカニズムを説明できない状況であった。

本研究では、以下に述べる AhR のノンジェノミックな作用についての新たなアイディアを取り入れることによってこれまで解明されて来なかったダイオキシン毒性の発現メカニズムが明らかになるのではないかと考えた。この AhR のノンジェノミックな作用は、細胞を用いた最近
の研究で明らかになった。すなわち、「ダイオキシン類によって受容体 AhR が核内で引き起こす転写活性化とは別に、AhR は細胞質内のシグナル伝達経路を活性化する」という細胞質内で起こる現象 $ ^{43)} $ である。AhR のノンジェノミック作用と呼ぶことが提唱されたこの新しく発見された AhR の作用は、カルシウムシグナルを介して生理活性物質群プロスタノイドの合成酵素や細胞内シグナル伝達を担う分子を活性化する $ ^{44,45)} $ ものであり、その下流で幅広い影響を引き起こすと考えられた。したがって、ダイオキシン類が引き起こす多様な毒性現象の原因となる可能性があると考えられた。多様なダイオキシン毒性の中で本研究においてはダイオキシン曝露が引き起こす奇形である水腎症に焦点を当てた。その理由は、(1) ダイオキシン曝露が授乳期マウスに引き起こす水腎症はシクロオキシゲナーゼ 2 (COX-2) の誘導が原因であること $ ^{29)} $ 、(2) AhR のノンジェノミック作用が下流で COX-2 を誘導することで $ ^{44,45)} $ ある(図 2-1)。このような背景から、新たに発見されたダイオキシン毒性の分子基盤と考えられる AhR のノンジェノミック作用について、その下流で如何にして毒性現象が発現するか明らかにすることを本サブテーマの課題とした。

水腎症はダイオキシン曝露によるだけでなく、ヒトにおいて先天性のものと後天性に発症することが知られている。後天的に発症する水腎症の原因は腎尿管結石や腎盂癌などによるものが多い。先天性水腎症の主な原因は腎盂尿管の移行部の通過障害(ureteropelvic junction obstruction: UPJO)で、59.4%にも上る $ ^{46} $ 。腎盂尿管の移行部の通過障害は、ねじれや異常血管の圧迫による閉塞や筋層の形態異常により引き起こされる。筋層の形態異常は、尿が腎臓から膀胱へ輸送される際に不可欠な蠕動運動を阻害すると考えられている。哺乳類の胎仔は、体内の老廃物除去の多くを母体依存しているが、出生を契機に自身で処理するようになり、出生後には出生前のおよそ50倍もの尿生成を成し遂げる $ ^{47} $ 。このことは、多量の尿の生成に伴い腎臓の内圧上昇を防ぐため、腎臓から効率よく尿を排出しなければならないことを意味する。そのためには、尿の輸送に必要な蠕動運動の起点となる腎盂の発達が重要である $ ^{48} $ 。また、尿の濃縮能は出生時点では未成熟であり、濃縮をつかさどる腎髄質の発達にはラットでは2ないし3週間を要する $ ^{49} $ 。出生後の腎盂と尿管の発達には、renin-angiotensin系が重要な役割を果たすことが知られている $ ^{50} $ 。なかでも、angiotensin type 1 receptor (Agtr1)のKOマウスは、腎盂の萎縮と尿管の平滑筋層の形成不全、蠕動運動の障害によって水腎症を発症すると報告されている $ ^{48} $ 。また、胎仔期の尿管の発達にはsonic hedgehog (shh)とその受容体であるpatched 1のシグナルが必要不可欠であり、出生後の腎臓と尿管における役割に対する知見はないものの出生後1日でも共に発現が認められる $ ^{51} $ ことから、出生後における発達においても重要な役割を果たしている可能性がある。

我々のこれまでの研究から、ダイオキシン曝露が引き起こす授乳期水腎症は尿管閉塞を伴わないことが明らかになっていた $ ^{29} $ 。加えて、尿管横断面切片の組織学的解析から、尿管層構造の曝露による変化の可能性が示唆されていた。これらのことから、ダイオキシン曝露による水腎症は尿管の物理的閉塞によるものでなく、泌尿器系の機能をダイオキシンが攪乱することで起こると考えられた。ダイオキシンが攪乱する泌尿器系の機能として、上述の背景に基づいて尿管の層構造の変化による蠕動運動の阻害を想定して研究を開始した。
図2-1. 受容体 AhR の転写活性化を伴わないノンジェノミック作用とダイオキシン毒性
### 2. 研究開発目的

本サブテーマでは、ダイオキシン曝露が引き起こす毒性現象に関して、これまで想定されてきたパラダイムに基づかない新しい分子基盤である AhR のノンジェノミック作用が如何にしてダイオキシン毒性を引き起こすかを明らかにしようとした。これまで想定されてきたパラダイムとは「ダイオキシンが転写因子 AhR と結合し、ダイオキシン・AhR 複合体が結合する標的遺伝子に異常な転写活性化が生じ、その結果として毒性が発現する」というものである。このパラダイムの中で AhR が発揮する作用は、核内のゲノム(genome)中に存在する標的遺伝子の転写を引き起こす作用であることから、AhR のジェノミック(genomic)作用と呼ぶべきものである。一方、新しい分子基盤とは「ダイオキシンによって活性化した AhR が細胞質内でカルシウムシグナルを介して cPLA₂ とその下流で cSrc や COX-2 を活性化する」というものである。この新しいパラダイムの分子基盤である AhR のノンジェノミック作用は様々な培養細胞を用いてダイオキシンによって活性化することが最近明らかにされてきたが、動物個体におけるダイオキシンによる毒性現象に関与するかということについては不明であった。そこで、本研究は、AhR のノンジェノミック経路で誘導される COX-2 が毒性発現の原因となる水腎症について、どのようなメカニズムで発症するか解明することを目的とした。

### 3. 研究開発方法

本研究では、AhR のノンジェノミック作用が如何にしてダイオキシン毒性を引き起こすか解明することを目標に、マウスを用いた曝露実験を行うこととした。マウス系統は、ダイオキシンに対して高感受性である C57BL/6J を、ダイオキシンとしては毒性が最も強い 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) を用いた。ダイオキシン曝露がマウス新生仔に水腎症を引き起こす直接の原因としては、水腎症発症原因と指定一般的な尿管の物理的閉塞ではなく、泌尿器系の何らかの機能以上であることが明らかになっていた。水腎症を引き起こし得る泌尿器系の異常としては、尿管の層構造の消失による蠕動運動阻害が有力だと考えられた。そこで、尿管横断面切片の組織学的解析と尿管蠕動運動の解析によって、それぞれ構造と機能の側面からダイオキシンによる影響を評価することとした。また、尿排出能を担う重要な構造体である腎ペルビスの発達の度合いを検証した。加えて、ダイオキシンが腎臓の生理機能を攪乱する可能性についても検証した。腎機能としては、本研究の過程で尿産生量が増加しているという観察を解剖学的に得たことから、尿産生量の指標として膀胱中尿重量を、尿濃縮能の指標として尿浸透圧を測定した。曝露実験手順は次のとおりである。出産後1日目の母マウスに0,10,20,80 μg/kgの何れかの用量のTCDDを経口投与することで産仔に対して経母乳曝露した。出生後日齢(PND)3,5,7,9,11,14において各種解析を行った。
### 4. 結果及び考察

## (1) ダイオキシン曝露が泌尿器の形態と尿管蠕動運動に与える影響の研究

TCDD 曝露個体の腎臓で、腎髓質の先端部に位置する腎乳頭の発達不全が観察された。個体間の発達程度を補正し、腎乳頭の長さを評価する為に、腎臓の短軸長と腎乳頭の長さを図2-2のように測定し、短軸長に占める腎乳頭の長さを指標とした。PND3で、腎乳頭の長さには両群間で差は認められなかったが、PND5,7では対照群と比較してTCDD曝露群の方が短い傾向にあった(PND3:対照群824±151μm、TCDD曝露群710±65μm、PND5:対照群1110±201μm、TCDD曝露群842±117μm、PND7:対照群1474±110μm、TCDD曝露群1168±91μm.Mean±S.E.)。腎臓の短軸長に対する腎乳頭の長さの比率は、PND5ではTCDD曝露群の方が小さい傾向にあり、PND7ではTCDD曝露群の方が有意に小さかった(図2-3)。

尿管の層構造に関しては、TCDD 曝露個体で三層構造が保たれており (図 2-4)、大きな形態変化は認められなかった。各層に焦点をあてると、TCDD 曝露群では PND 3 で間質層の尿管に占める割合が有意に小さかった (図 2-5、A:PND3、B:PND5、C:PND7)。上皮層の占める割合は、PND5 と PND7 で、TCDD 曝露群の方が対照群と比較して有意に高かった。

蠕動運動の頻度を測定するため、腎臓-尿管-膀胱を採取し、速やかに培地に入れた後、腎盂が5回収縮する時間を指標として蠕動運動の頻度を測定した。表2-1に示すようにPND3,5,7の各時点において両群間に差は認められなかった。

以上の結果から、ダイオキシン曝露は、尿排出に重要な腎と尿管の構造に変化を引き起こすことは明らかになったが、当初想定した尿管層構造の消失のような蠕動運動阻害に直ちに結びつくような変化は見出すことができなかった。このことに対応して、蠕動運動にも水腎症発症に至るような変化が観察されなかった。

## (2) ダイオキシン曝露が尿生成メカニズムに与える影響の研究

当初想定したような尿排出メカニズムの TCDD 曝露による阻害が見出せなかったこと、ならびに、研究の過程で尿量が増加しているという観察をしたことから、TCDD 曝露による尿量増加が水腎症の原因となる可能性について検証した。TCDD 曝露による尿産生量変化の有無を調べるためには、産仔の尿量を測定する必要がある。尿量変化の有無を検証する方法としては、24 時間尿の容積測定が標準的な方法となっている。この方法では、代謝ケージにマウスを単独で飼育することで 24 時間で排尿した量を測定する。しかしこの方法は、授乳期のマウスには適用できない。マウス新生仔における尿量を解析した報告がないのはおそらくこのことに起因していると考えられる。本研究では当初、マウス新生仔の尿量を測るために、(1) 仔マウスのみを代謝ケージに入れる、(2) 仔マウス母マウス両方を代謝ケージに入れる、という二つの方法を試みたが、いずれも早い段階で仔マウスが死亡し、尿量測定を行うことが実現できなかった。そこで、代謝