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補助事業名 環境研究総合推進費補助金循環型社会形成推進研究事業（平成25年度～平成27年度）

所管 環境省

研究課題名 生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法の確立と高度利用に関する研究

課題番号 3K133010

研究代表者名 鈴木 剛（国立研究開発法人国立環境研究所）

国庫補助金 34,166,000 円（うち平成 27 年度：11,111,000 円）

研究期間 平成25年5月15日～平成28年3月31日

本研究のキーワード 臭素化ダイオキシン類、DR-CALUX アッセイ、XDS-CALUX アッセイ、生物検定法、ダイオキシン、簡易測定法

研究分担者 中田俊芳（株）日吉）

半田洋士（株）日吉）

## 研究概要

### 1. はじめに（研究背景等）

本研究で評価対象とするPBDD/Fs（臭素化ダイオキシン類）は、国際的に規制されている塩素化ダイオキシン類と同様の毒性や性質を示すと考えられている。臭素化ダイオキシン類は、デカ BDE 等の臭素系難燃剤に含まれる不純物であり、臭素系難燃剤含有製品のライフサイクル（製造・使用・廃棄・リサイクル）を通じて生じる非意図的生成物である。難燃剤は、プラスチックや繊維等の燃えやすい材料を難燃化するために広く使用されている物質であり、火災の発生や延焼を防ぎ火災による死亡リスクを低下する有用性を持つ。難燃剤含有製品は一般生活に欠かせないものとなっており、身の回りの含有製品としては家電製品や防災カーテン、自動車の内装等が挙げられる。環境省の取りまとめによると、2013年の国内における有機系難燃剤の使用量は、臭素系難燃剤で42,830トン／年、塩素系難燃剤で4,600トン／年、リン系難燃剤で29,000トン／年となっており、臭素系難燃剤の使用量が最も高い状況である。従って、臭素化ダイオキシン類の環境排出は、臭素系含有製品のライフサイクルを通じて今後も継続すると考えられる。2012年3月、国連環境計画（UNEP）と世界保健機構（WHO）は、臭素化ダイオキシン類に毒性等価係数（WHO-TEF）を設定して、塩素化ダイオキシン類と同様に規制管理することを提言した。UNEPとWHOの見解を受けて、POPs条約やダイオキシン対策特別措置法（特措法）の中で、臭素化ダイオキシン類が国内外で規制される場合、塩素化ダイオキシン類と共にWHO-TEQ（毒性等量）ベースで管理することになる。その場合、ガスクロマトグラフ-高分解能質量分析計（GC-HRMS）法による分析では、これまで以上に分析費用や時間がかかると推察される。GC-HRMSによる塩素化ダイオキシン類分析は、1検体あたり15万円程度であり、GC-HRMSによる臭素化ダイオキシン類分析を単純に加えると、1検体あたり30万円程度になる見込みである。臭素系難燃剤含有製品の製造や使用状況を考慮すると、費用対効果の良い塩素化／臭素化ダイオキシン類調査態勢の確立は必須と思われる。

### 2. 研究開発目的

本研究では、環境省が特措法に追加した生物検定法を応用して、費用対効果の良い塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類の測定評価法の確立とその高度利用の可能性を検証することを目的として、次の3つの課題を実施した。

課題① 臭素化ダイオキシン類検出ツールとしての生物検定法の妥当性評価に関する研究

課題② 生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法の確立に関する研究
課題③ 生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法の高度利用に向けた研究

### 3. 研究方法

課題①: 本研究では、塩素化ダイオキシン類の簡易測定法として環境省が特措法に追加した生物検定法のうち、Ah レセプターバインディングアッセイ法に分類される DR-CALUX アッセイ法と XDS-CALUX アッセイ法を用いて、臭素化ダイオキシン類を含む臭素系ダイオキシン類の AhR を介したルシフェラーゼ活性能を評価して、DR-CALUX アッセイ法と XDS-CALUX アッセイ法の臭素化ダイオキシン類の検出ツールとしての妥当性を評価した。

課題②：本研究では、生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法を確立することを目的として、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類を分別して評価する簡易前処理法を開発し、生物検定法と簡易前処理法からなる塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法の妥当性を確認した。

課題③：本研究では、由来や履歴の異なる小型焼却炉の排出ガス、廃棄物焼却炉のばいじん及び燃え殻、排水、土壌、底質、建屋内空気及びハウスダストの計339試料を対象として、塩素化ダイオキシン類のWHO-TEQによる排出基準や環境基準を管理基準として、各種試料から調製した精製画分のCALUX-TEQによって塩素化／臭素化ダイオキシン類汚染試料をスクリーニングした。次いで管理基準超過試料から調製した臭素化ダイオキシン類画分と塩素化ダイオキシン類画分のCALUX-TEQ比によって汚染主体を推定した。終局的には、当該測定評価法の高度利用のための活用方針を考察した。

### 4. 結果及び考察

課題①：臭素化ダイオキシン類18種（PBDDs7異性体、PBDFs9異性体、Co-PBBs2異性体）と臭素化塩素化ダイオキシン類14種（PXDDs6異性体、PXDFs8異性体）を評価したところ、WHO-TEFによるリスク管理が推奨されている2,3,7,8-位に臭素が置換している臭素化ダイオキシン類について顕著な用量反応が示され、得られた用量反応曲線の形状が2,3,7,8-TCDDと良く似ていた。また、2,3,7,8-位に臭素や塩素が置換している臭素化塩素化ダイオキシン類も基本的に同様の傾向を示した。臭素化ダイオキシン類と臭素化塩素化ダイオキシン類の各種効果濃度（EC）及び2,3,7,8-TCDD比活性（REP）に基づくと、臭素化ダイオキシン類のPBDD/Fsについては、2,3,7,8-位に臭素が置換している異性体の反応性が強くなる傾向であり、4臭素化体から8臭素化体へと臭素の数が増えるに応じて反応性が弱くなった。臭素化塩素化ダイオキシン類についても、2,3,7,8-位に臭素や塩素が置換している異性体の反応性が強くなる傾向であり、2,3,7,8-位のいずれかに臭素や塩素が置換していない異性体の反応性が低かった。臭素化ダイオキシン類及び臭素化塩素化ダイオキシン類のREPについては、PBB-77を除くと、対応するWHO-TEFとの差が1オーダー以内であり、WHO-TEFを良く反映していると考えられた。また、臭素化ダイオキシン類と塩素化ダイオキシン類の混合物を用いて、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類の混合物への相加性評価の適用性を確認した。本研究の実施によって、DR-CALUXアツセイ法及びXDS-CALUXアツセイ法の臭素化ダイオキシン類検出ツールとしての妥当性が確認された。

課題②：本研究では、精製カラムとして55%硫酸シリカゲルカラムと分画カラムとして10%硝酸銀シリカゲルカラムを用いる簡易前処理法を開発して、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類の化学物質標準品の添加回収試験を実施して、WHO-TEQに主要に寄与する異性体の高い回収率と繰り返し再現性を確認した。次いで、小型焼却炉の排出ガス、ばいじん及び燃え殻、排水・環境水、土壌、底質、建屋内空気及びハウスダストについて塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類のWHO-TEQを把握して既知濃度試料を得た。既知濃度試料の粗抽出液を簡易前処理法に適用して生物検定法でCALUX-TEQを測定した結果、粗抽出液を55%硫酸シリカゲルカラム処理した精製画分のCALUX-TEQはWHO-TEQよりも高値を示すものの、両者に強い正の相関関係が示され、精製画分のCALUX-TEQによって臭素化ダイオキシン類と塩素化ダイオキシン類で汚染されている試料をスクリーニングできることが示唆された。また、精製画分を10%硝酸銀シリカゲルカラム分画して得られる塩素化ダイオキシン類画分と臭素化ダイオキシン類画分のCALUX-TEQ比は、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類のWHO-TEQ比と強い正の相関関係を示し、当該分画処理によって得られるCALUX-TEQ比によって汚染の主体の把握が可能であることを示した。本研究の実施によって、塩素化／臭素化ダイオキシン類スクリーニング法としての生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法の適用性が確認できた。本研究で開発し
た簡易前処理は、臭素化ダイオキシン類と塩素化ダイオキシン類の回収率が良いという点だけでなく、汎用有機溶剤であるヘキサンやアセトンで使用可能であり、さらに省溶剤な方法であることから、汎用性の高い方法といえる。また、55%硫酸シリカゲルカラムと10%硝酸銀シリカゲルカラム共に、1本あたり1500円以下になる見込みであり、価格の面からも汎用性が高いと考えられる。

課題③：得られた結果は、臭素系難燃剤含有製品のライフサイクル（製造・使用・廃棄・リサイクル）において、臭素化ダイオキシン類の高濃度排出事例が存在することを示唆した。具体的には、製造時の排出事例として電子機器製造業の小型焼却炉の排出ガスや難燃製品加工工場の排水、使用時の排出事例としてハウスダスト、廃棄処理時の排出事例として廃棄物焼却炉の排出ガス、ばいじん及び燃え殻、リサイクル時の排出事例として廃電子機器のリサイクル施設集積地区で採取した土壤や底質が、それぞれ挙げられる。環境省は、「臭素系ダイオキシンに係る総括ワークショップ（2012年2月）」において2001年から実施している臭素系ダイオキシン類の排出実態等調査の取得結果と今後の調査方針をまとめている。ワークショップでは、調査結果に基づいて難燃製品加工工場及び難燃剤含有製品のリサイクル処理施設が臭素化ダイオキシン類の主要な発生源であると結論付け、アジア途上国での廃電子機器製品処理施設の作業環境における曝露実態把握やハウスダストを通じた曝露実態の把握等に焦点を絞った今後の調査方針が提案された。本研究で得られた結果は、環境省の結論と矛盾せず、また調査方針を支持するものとなっている。更に本研究は、臭素系難燃剤を使用する製造業の小型焼却炉の排出ガスや都市部の下水処理場の流入水、廃棄物焼却炉由来の排水等、これまでに調査例が少なかった試料媒体においても臭素化ダイオキシン類汚染事例が存在することを示唆した。これらは、本研究で開発した生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法が、臭素化ダイオキシン類及び塩素化ダイオキシン類による汚染実態調査に有用であることを示している。臭素化ダイオキシン類を不純物として含み、その非意図的生成の発生源となるデカ BDE は、2016年にPOPs条約上の廃絶対象物質として管理される見込みである。従ってデカ BDE 含有製品の廃棄量は、今後増加することが見込まれ、その適正管理と処分が求められる。その際、臭素化ダイオキシン類の排出実態調査において、生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法の適用が見込める。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## （1） 科学的意義

塩素化ダイオキシン類を検出する生物検定法として、世界的にも知名度の高い DR-CALUX アッセイ法と XDS-CALUX アッセイ法における臭素化ダイオキシン類の検出特性を明らかにした。本研究は、購入可能な臭素化ダイオキシン類を全て入手しており、これまでになく網羅的に臭素化ダイオキシン類の活性を評価することができ、塩素化ダイオキシン類との差を明示した。更に、同じ化学物質標準品をラット肝がん細胞由来の DR-CALUX アッセイ法とマウス肝がん細胞由来の XDS-CALUX アッセイ法で評価することで、臭素化ダイオキシン類の毒性の種間差の一端を明らかにした。また、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類の混合液による相加性評価では、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類が相加的に作用することを明らかにした。これは、臭素化ダイオキシン類への WHO-TEF 設定にむけて、重要な知見となる。

精製カラムとして 55%硫酸シリカゲルカラムを、分画カラムとして 10%硝酸銀シリカゲルカラムを、和光純薬工業の協力のもと、世界で初めて開発した。特に、10%硝酸銀シリカゲルカラムと汎用溶媒であるヘキサンとアセトンで塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類を分別することができる知見は、世界で初めて明らかにした知見であり、大きな成果といえる。両カラムにおいて塩素化ダイオキシン類及び臭素化ダイオキシン類の回収率を網羅的に明らかにするだけでなく、様々な試料媒体の供試料量も明示した。これらは、両カラムや本研究で開発した測定評価法の汎用に繋がる重要なポイントである。また、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類の WHO-TEQ を明らかにした既知濃度試料を用いて、本研究で開発した測定評価法を評価することで科学的知見に基づいてその有用性と限界を提示した。結果に基づいて、当該測定評価法のスクリーニング法としての位置付け、GC-HRMS 法との併用は、科学的飛躍のない結論として、国際的に広く受け入れられるものである。

本研究で開発した測定評価法による多媒体多検体試料（n=339）の評価結果は、臭素系難燃剤含有製品のライフサイクルにおける曝露・排出実態を明らかにし、臭素化ダイオキシン類の排出実態等を把握するための国内
外の重要フィールドや管理すべきプロセスを明らかにした。当該測定法を活用することによって、臭素化ダイオキシン類の人への曝露や環境負荷の低減を導出できる。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特になし。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

本研究で開発した生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法は、ダイオキシン類特別措置法附則二条に基づき実施されている臭素系ダイオキシン類の排出実態等調査に適用可能であり、当該評価法とGC-HRMS法を併用することによって費用対効果と実態調査の充実度を高めることができる。臭素系難燃剤のうち、HBCDは2012年10月に残留性有機汚染物質（POPs）条約に追加され、建築用のビーズ法発泡ポリスチレン及び押出発泡ポリスチレンを除いて、その製造や使用が禁止されている。また、現在も臭素系難燃剤として使用されているデカBDEについても、2016年にはPOPs条約に追加される見込みであり、自動車及び航空機用の特定の交換部品を適用除外として、その製造や使用が禁止される予定である。今後、既に販売されたHBCD含有製品やデカBDE製品は、引き続き使用されることになり、製品寿命を迎えた含有製品から徐々に処理処分されることになる。POPsに指定されたHBCDやデカBDEについては、含有製品の使用や廃棄等を通じてそれ自体を適切に管理していく必要があるが、非意図的生成物或いは不純物として含有製品に付随する臭素化ダイオキシン類も適切に管理していく必要がある。従って、臭素化ダイオキシン類の排出実態調査は今後も必要と考えられ、本研究で開発した生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法の高度利用による貢献が見込める。また、アジアやアフリカの途上国で臭素系難燃剤を含む廃電子機器や廃自動車の処理や不適切なリサイクルが大きな社会問題になっており、塩素化／臭素化ダイオキシン類による汚染実態把握において日本発の当該測定評価法のニーズがある。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## （１）主な誌上発表

## <查読付論文>

1) G. Suzuki, N.M. Tue, S. Takahashi, S. Tanabe, H. Takigami: Current Organic Chemistry, Vol. 18, 2231–2239 (2014)

“Effect-based hazard identification of house dust by in vitro assays detecting dioxin-like compounds, thyroid and reproductive toxicants”

## 2 ）中村昌文：環境技術、44（7），18-21（2015）

「生物検定法の実際（2）ダイオキシン類簡易測定法 ケイラックス®アッセイの実際」

3) G. Suzuki, M. Someya, H. Matsukami, N. M. Tue, N. Uchida, L. H. Tuyen, P. H. Viet, S. Takahashi, S. Tanabe, A. Brouwer, H. Takigami: Emerging Contaminants, in press

“Comprehensive evaluation of dioxins and dioxin-like compounds in surface soils and river sediments from e-waste-processing sites in a village in northern Vietnam: Heading towards the environmentally sound management of e-waste”

## く査読付論文に準ずる成果発表>

特になし。

## （２）主な口頭発表（学会等）

1）鈴木 剛、染矢雅之、松神秀徳、宇智田奈津代、Tue Nguyen M、藤森 崇、Tuyen Le H、阿草哲郎、Viet Pham H、高橋 真、田辺信介、滝上英孝：第22回環境化学討論会（2013）

「ベトナム北部における E-waste リサイクルに伴うダイオキシン類縁化合物の環境排出実態調査(第一報)」
2) G. Suzuki, M. Someya, H. Matsukami, N. Uchida-Noda, N.M. Tue, T. Fujimori, L.H. Tuyen, T. Agusa, P.H. Viet, S. Takahashi, S. Tanabe, H. Takigami: 33th International Symposium on Halogenated Environmental Organic Pollutants and POPs. Daegu, Korea, 2013

“Emissions of dioxin-like compounds from primitive E-waste recycling activities in the northern part of Vietnam –1st report–”

3）鈴木 剛、染矢雅之、松神秀徳、宇智田奈津代、Tue Nguyen M、藤森 崇、Tuyen Le H、阿草哲郎、Viet Pham H、高橋 真、田辺信介、滝上英孝：第23回環境化学討論会（2014）

「ベトナム北部のE-wasteリサイクル施設におけるダイオキシン類縁化合物の環境排出実態調査（第二報）」

4）中村 昌文、Tue Nguyen M、中田俊芳、半田洋士、鈴木 剛：第23回環境化学討論会（2014）「生物検定法による臭素系ダイオキシン類の検出特性評価」

5) G. Suzuki, M. Someya, H. Matsukami, N. Uchida-Noda, N. M. Tue, T. Fujimori, L. H. Tuyen, T. Agusa, P. H. Viet, S. Takahashi, S. Tanabe, H. Takigami: 1st Southeast Asian Workshop on the Integrated Exposure and Effects Analysis. Hanoi, Vietnam, 2014

“Effect and Exposure Analysis of Dioxin-like Compounds in Soil and River Sediment Collected from E-waste Recycling Village in the Northern Part of Vietnam”

6）鈴木　剛、中村昌文、中田俊芳、半田洋士、Nguyen Minh Tue、滝上英孝：第24回環境化学討論会（2015）「生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類の分別測定評価法の確立」

### 7. 研究者略历

研究代表者：鈴木剛

岩手大学大学院連合農学研究科修了、農学博士、現在、国立研究開発法人国立環境研究所 資源循環・廃棄物研究センター 主任研究員／環境リスク・健康研究センター エコチル調査コアセンター 主任研究員（兼務）

研究分担者：

1）中田俊芳

摂南大学藥学部卒業、現在、株式会社日吉 技術部 研究課 食品衛生係

2）半田 洋士

龍谷大学理工学部卒業、現在、株式会社日吉 技術部 研究課 ダイオキシン係
## 3 K133010 生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法の確立と高度利用に関する研究

## [要旨]

2011 年 3 月、国連環境計画 (United Nations Environmental Programme, UNEP) と世界保健機構 (World Health Organization, WHO) は、臭素化ダイオキシン類に毒性等価係数 (Toxic Equivalency Factor, TEF) を設定して、塩素化ダイオキシン類と同様に規制管理することを提言した。UNEP と WHO の見解を受けて、スットクホルム条約やダイオキシン対策特別措置法（特措法）の中で、臭素化ダイオキシン類が国内外で規制される場合、塩素化ダイオキシン類と共に毒性等量 (Toxic Equivalents, TEQ) ベースで管理することになる。その場合、ガスクロマトグラフ-高分解能質量分析計法による分析では、これまで以上に分析費用や時間がかかると推察される。本研究では、特措法に追加された塩素化ダイオキシン類を測定する生物検定法を応用して、費用対効果の良い塩素化／臭素化ダイオキシン類の測定評価法の確立とその高度利用の可能性を検証した。本研究では、生物検定法の臭素化ダイオキシン類検出ツールとしての妥当性を確認し、55%硫酸シリカゲルカラムと10%硝酸銀シリカゲルカラムを用いる塩素化／臭素化ダイオキシン類の分別評価法を開発して、生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法（測定評価法）を確立した。既知濃度試料について、測定評価法による55%硫酸シリカゲルカラムで処理した精製画分で塩素化／臭素化ダイオキシン類のスクリーニングが、10%硝酸銀シリカゲルカラムで処理した分離画分で塩素化／臭素化ダイオキシン類の寄与把握が、それぞれ可能であった。測定評価法の高度利用可能性を評価するため、廃棄物焼却炉の排出ガス、ばいじん及び燃え殻、排水、土壌、底質、建屋内空気及びハウスダストの計339試料を測定評価法に適用して、WHO-TEQによる環境基準・排出基準等の管理基準濃度を超過する試料をスクリーニングし、基準超過試料の塩素化／臭素化ダイオキシン類の寄与を把握した。測定評価の結果は、臭素系難燃剤関連試料で媒体問わず臭素化ダイオキシン類の存在割合が高くなることを示唆し、排出実態等を把握すべき国内外の重要フィールドを明らかにした。本研究の結果は、塩素化／臭素化ダイオキシン類の管理において測定評価法の高度利用が可能であることを示した。
### 1. はじめに

本研究で評価対象とする臭素化ダイオキシン類 (Polybrominated dibenzo-p-dioxins/dibenzofurans, PBDD/Fs) は、国際的に規制されている塩素化ダイオキシン類と同様の毒性や性質を示すと考えられている。臭素化ダイオキシン類は、デカ BDE 等の臭素系難燃剤に含まれる不純物であり $ ^{1} $ 、臭素系難燃剤含有製品のライフサイクル（製造・使用・廃棄・リサイクル）を通じて生じる非意図的生成物である $ ^{2-4} $ 。難燃剤は、プラスチックや繊維等の燃えやすい材料を難燃化するために広く使用されている物質であり、火災の発生や延焼を防ぎ火災による死亡リスクを低下する有用性を持つ。難燃剤含有製品は一般生活に欠かせないものとなっており、身の回りの含有製品としては家電製品や防災カーテン、自動車の内装等が挙げられる。環境省の取りまとめによると $ ^{5} $ 、2013 年の国内における有機系難燃剤の使用量は、臭素系難燃剤で 42,830 トン／年、塩素系難燃剤で 4,600 トン／年、リン系難燃剤で 29,000 トン／年となっており、臭素系難燃剤の使用量が最も高い状況である。従って、臭素化ダイオキシン類の環境排出は、臭素系含有製品のライフサイクルを通じて今後も継続すると考えられる。

臭素化ダイオキシン類に係る問題は、国内のみならず海外においても臭素系難燃剤含有製品の使用・廃棄・リサイクル時に顕在化しており、廃電子機器の不適切なリサイクルに伴う環境排出や人曝露 $ ^{6-10} $ 、臭素系難燃剤含有製品からハウスダストへの移行と人曝露等 $ ^{9,12,13} $ が問題となっている。このような状況の下、2012年3月、UNEPとWHOは、塩素化ダイオキシン類のWHO-TEFを臭素化ダイオキシン類に適用して、塩素化ダイオキシン類だけでなく臭素化ダイオキシン類によるリスクを毒性等量（WHO-TEQ：個別異性体の実測濃度にWHO-TEFを乗じて算出）で管理することを提言した $ ^{13} $ 。国内では、ダイオキシン類対策特別措置法附則二条に基づいて環境省によって臭素系ダイオキシン類の排出実態等が調査されており、臭素系難燃剤を使用する難燃製品加工工場や含有製品のリサイクル処理施設が重要な臭素化ダイオキシン類の発生源であることが明らかにされている。このような状況を踏まえると、ダイオキシン類等の残留性有機汚染物質（Persistent Organic Pollutants, POPs）を国際的に規制管理しているストックホルム条約やダイオキシン類特措法において、臭素化ダイオキシン類も規制対象となる可能性がある。臭素化ダイオキシン類が規制管理される場合、UNEP/WHOの提言に基づくと塩素化ダイオキシン類と共にWHO-TEQベースで管理する可能性が高い。その場合、塩素化ダイオキシン類及び臭素化ダイオキシン類を測定するために、ガスクロマトグラフ-高分解能質量分析計（Gas Chromatography-High-Resolution Mass Spectrometry, GC-HRMS）を用いることになり、これまで以上に分析費用がかかると推察される。GC-HRMSによる塩素化ダイオキシン類分析は、1検体あたり15万円程度であり、GC-HRMSによる臭素化ダイオキシン類分析を単純に加えると、1検体あたり30万円程度になる見込みである。臭素系難燃剤含有製品の製造や使用状況を考慮すると、費用対効果の良い塩素化／臭素化ダイオキシン類調査態勢の確立は必須と思われる。

環境省は、GC-HRMSによる塩素化ダイオキシン類分析のこのような難点を補うために、2004年12月にダイオキシン類対策特別措置法（特措法）施行規則の一部を改正して、廃棄物焼却炉からの排出ガス（焼却能力2,000 kg/h未満の小型焼却炉に限定）やばいじん及び燃え殻に含まれる塩素化ダイオキシン類の測定の一部に簡易測定法を追加するとともに、2005年9月にダイオキシン類対策特別措置法施行規則第二条第一項第四号の規定に基づき環境大臣が定める方法（平成17年環境省告示第92号）を定め、4種類の生物検定法を指定した。2010年3月に当該告示の一部を改正して、現在は10種類の生物検定法が塩素化ダイオキシン類の簡易測定法として指定されている。塩素化ダイオキシン類の毒性作用は、細胞質内に存在するアリルハイドロカーボン（Aryl hydrocarbon, Ah）レセプターを介した遺伝子発現に起因すると考えられている $ ^{14} $ 。環境省が特措法に追加した生物検定法（Ahレセプターバインディングアッセイ法6種類、イムノアッセイ法4種類）のうち、塩素化ダイオキシン類のAhレセプターへの結合に応じた遺伝子発現を評価する「Ahレセプターバインディングアッセイ法」は、測定原理を考慮すると臭素化ダイオキシン類の測定評価への応用が期待できる。しかしながら、現行の生物検定法では、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類を包括して評価しており、環境基準や排出基準等の管理基準を超過した試料について構成内訳（塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類の寄与割合等）を把握できない難点がある。また、臭素化ダイオキシン類に係る問題を考慮すると、小型焼却炉の排出ガス、ばいじん及び燃え殻への適用に限定されている生物検定法を、その他の環境試料で高度利用することが望ましい。
## 2 ．本研究の目的

本研究では、特措法に追加された生物検定法を応用して、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類の測定評価法の確立とその高度利用の可能性を検証することを目的として、次の3つの課題を実施した。

課題① 臭素化ダイオキシン類検出ツールとしての生物検定法の妥当性評価に関する研究

課題② 生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法の確立に関する研究

課題③ 生物検定法による塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法の高度利用に向けた研究

課題①では、生物検定法の DR-CALUX アッセイ法と XDS-CALUX アッセイ法における臭素化ダイオキシン類の検出特性を評価してその検出ツールとしての妥当性を評価した。課題②では、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類を分別して評価する簡易前処理法の開発と、濃度既知試料を用いて生物検定法と簡易前処理法からなる塩素化／臭素化ダイオキシン類測定評価法 (測定評価法) の妥当性を評価した。課題③では、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類を測定していない小型焼却炉の排出ガス、廃棄物焼却炉のばいじん及び燃え殻、排水、土壌、底質、建屋内空気及びハウスダストの多媒体多検体試料 (n=339) を測定評価法に適用し、塩素化／臭素化ダイオキシン類汚染試料のスクリーニングを行い、臭素化ダイオキシン類及び塩素化ダイオキシン類の寄与を把握して、測定評価法の高度利用のための活用方針を考察した。
## 3 ．臭素化ダイオキシン類検出ツールとしての生物検定法の妥当性評価に関する研究

## （1） 研究目的

本研究では、塩素化ダイオキシン類の簡易測定法として環境省が特措法に追加した生物検定法のうち、Ahレセプターバインディングアッセイ法に分類されるDR-CALUXアッセイ法とXDS-CALUXアッセイ法の臭素化ダイオキシン類の検出ツールとしての妥当性を評価した。具体的には、DR-CALUXアッセイ法とXDS-CALUXアッセイ法を用いて臭素化ダイオキシン類のAhレセプターを介したルシフェラーゼ活性能を評価して、用量反応曲線の形状や用量反応曲線から算出する各種評価指標を評価して検出特性を把握した。次いで、WHO-TEFとの比較考察やWHO-TEQによるリスク管理の基礎となっている用量相加性の評価を実施して、臭素化ダイオキシン類測定評価におけるDR-CALUXアッセイ法とXDS-CALUXアッセイ法の適用性について考察した。

## （2） 研究方法

## 1 ）化学物質標準品

本研究で使用した化学物質標準品を表1に示す。

### a. 個別評価

個別評価では、臭素化ダイオキシン類と臭素化塩素化ダイオキシン類を評価対象とした。臭素化ダイオキシン類については、WHO-TEFの設定が提案されている化学物質について、標準品として購入可能なものを全て入手した。臭素化塩素化ダイオキシン類については、2013年8月時点で標準品として購入可能なものを全て入手した。購入した化学物質標準品は、粉末ではなく有機溶剂に溶解している状態のため、有機溶剂からDMSOに転溶して生物検定法による評価を実施した。生物検定法評価の基準物質として使用した2,3,7,8-TCDDについては、DMSOに溶解しているものを購入して使用した。

### b. 混合物評価

塩素化ダイオキシン類のリスクは WHO-TEF を各異性体の量（濃度）に乗じた値の総和を求めて毒性等量（WHO-TEQ）を算出して評価（相加性評価）している。塩素化ダイオキシン類に加えて、臭素化ダイオキシン類のリスクも WHO-TEQ で管理していくことになると、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類が用量相加的に作用することが前提となる。しかし、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類の混合物への相加性評価の適用性はこれまでに評価されていない。混合物評価では、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類の混合物を用いて、塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類の混合物への相加性評価の適用性を評価した。塩素化ダイオキシン類と臭素化ダイオキシン類の混合物は文献調査に基づいて調製しており、詳細は“結果と考察”に記述する。

## 2 ）生物檢定法

本研究では、環境省が特措法に追加した生物検定法のうち、「Ah レセプターバインディングアッセイ法」に分類される、ダイオキシン類応答性組換え細胞 H1L6.1c2（マウス肝がん細胞 Hepa1c1c7 由来）を用いるレポーター遺伝子アッセイ法の XDS-CALUX アッセイ法と、ダイオキシン応答性組換え細胞 H4IIE-luc（ラット肝がん細胞 H4IIE 由来）を用いるレポーター遺伝子アッセイ法の DR-CALUX アッセイ法を使用した。これらの細胞は、ダイオキシン類等の Ah レセプターリガンドを曝露すると、細胞内に取り込まれたリガンドが Ah レセプターと結合して Arnt と複合体を形成し、エンハンサー領域に存在するダイオキシン類応答配列 DRE に結合して、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子を含む下流遺伝子転写の結果、ルシフェラーゼを産出する。これにルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、酸素存在下でルシフェリンが酸化され、オキシルシフェリンと二酸化炭素になる際に生物発光を生じる。DR-CALUX アッセイ法及び XDS-CALUX アッセイ法は、一連の曝露試験を通じて生じる生物発光をルシフェラーゼ活性として測定して、ダイオキシン類等の Ah レセプターリガンドの定量を行う測定法である。DR-CALUX アッセイ法及び XDS-CALUX アッセイ法における曝露試験の概要を以下に示す。

### a. 細胞培養と播種

DR-CALUX アッセイ法及び XDS-CALUX アッセイ法で使用するダイオキシン類応答性組換え細胞は、培養用培地を用いて、37℃及び5% CO₂の条件で培養した。曝露試験を実施する際には、培養フラスコ中の細胞を、96well マイクロプレートに 70,000～100,000 cells/well の割合で播種して培養した。細胞は、約24時間培養することで、well 底面に対して95%程度まで増殖する。この条件下で、化学物質標準品への曝露を
実施した。

### b. 化学物質標準品への曝露

2,3,7,8-TCDD、臭素化ダイオキシン類及び臭素化塩素化ダイオキシン類の化学物質標準品の細胞への曝露は、DMSOに溶解した化学物質標準品を培養用培地に添加して調製した曝露用培地を、well内で増殖した細胞に添加して実施した。曝露試験時の培地中DMSOの最終濃度は、0.8%になるように調製した。

### c. ルシフェラーゼ活性の測定

曝露試験 20～24 時間後、96well マイクロプレートから培地を取り除き、界面活性剤を含む緩衝液で well 内の細胞を溶解した。化学物質標準品によって誘導されたルシフェラーゼを含む細胞溶解液に、ルシフェリンを添加して、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼによる発光を測定した。

## 3 ）データ解析

### a. 用量反応曲線に基づく各種効果濃度

本研究では、2,3,7,8-TCDDと臭素化ダイオキシン類及び臭素化塩素化ダイオキシン類の化学物質標準品の曝露試験で得られたルシフェラーゼ活性を対象として、下式①を組み込んだ曲線フィッティング（Sigma Plot version 13.0, Systat Software）によって用量反応曲線を描き、20%効果濃度（20% effective concentration, $ EC_{20} $ ）及び50%効果濃度（Median effective concentration, $ EC_{50} $ ）を算出した。当該曲線フィッティングを用いることによって、試験最高濃度においてもプラトー（濃度に応じたルシフェラーゼ活性の増加が示されなくなること）に達した最大ルシフェラーゼ活性値が得られない化学物質標準品について用量反応曲線が得られる場合がある。このような化学物質標準品についても用量反応曲線から $ EC_{20} $ 及び $ EC_{50} $ の算出を試みた。また、本研究では、曲線フィッティングによって用量反応曲線が得られない化学物質標準品が存在するため、活性評価の基準物質として使用している2,3,7,8-TCDDの5%効果濃度（ $ EC_{5} $ ）に相当するルシフェラーゼ活性を示す濃度についても $ EC_{5TCDD} $ として算出した。

$$ y=min+\frac{\left(\max-\min\right)}{\left(1+10^{\left(\log a1-x\right)}\times a_{2}\right)} $$

y = 試験物質のルシフェラーゼ活性の測定値

x = 試験物質の曝露試験濃度

$$ min=DMSO\ のルシフ \_{工 ラーゼ活性 \_{の}測定值 $$

$$ max= 試験物質の曝露試験最高濃度におけるルシフェラーゼ活性の測定値 $$

$$ a_{1}= 試験物質 \emptyset\mathrm{EC}_{50} $$

$$ a_{2}=Hillslope\ \left( 中点における曲線の傾き \right) $$

### b. 2,3,7,8-TCDD に対する比活性

本研究では、2,3,7,8-TCDDと臭素化ダイオキシン類及び臭素化塩素化ダイオキシン類の化学物質標準品で算出したEC_{5TCDD}、EC_{20}及びEC_{50}の比較から（図1）、下式②によって2,3,7,8-TCDDに対する化学物質標準品の各比活性（Relative potency, REP）をREP-EC_{5TCDD}、REP-EC_{20}及びREP-EC_{50}として算出した。また、REPは、毒性学的視点のモルベースだけでなく、TEQを算出する際に使用する重量ベースでも求めた。

$$ \mathrm{REP}-\mathrm{EC}_{\mathrm{x}}=\frac{\mathrm{EC}_{\mathrm{x}}\mathrm{for}\mathrm{tested}\mathrm{compound}}{\mathrm{EC}_{\mathrm{x}}\mathrm{for}2,3,7,8-\mathrm{TCDD}} $$

$$ x=EC_{5TCDD}、EC20 及び EC50 $$
## （3） 結果と考察

## 1 ）用量反応曲線

本研究では、臭素化ダイオキシン類18種（PBDDs7異性体、PBDFs9異性体、Co-PBBs2異性体）と臭素化塩素化ダイオキシン類14種（PXDDs6異性体、PXDFs8異性体）のルシフェラーゼ活性誘導能を評価した。顕著な用量反応を示す臭素化ダイオキシン類及び臭素化塩素化ダイオキシン類について、曲線フィッテイングによって用量反応曲線を描いた（図2及び図3）。

DR-CALUX アッセイ法では、2-MBDF、2,8-DiBDF、2,4,8-TriBDF 及び 8-B-2,3-DiCDF を除く 28 異性体で顕著な用量反応が示された。XDS-CALUX アッセイ法では、2-MBDF 及び 2,8-DiBDF を除く 30 異性体で顕著な用量反応が示された。DR-CALUX アッセイ法及び XDS-CALUX アッセイ法共に、WHO-TEF によるリスク管理が推奨されている 2,3,7,8-位に臭素が置換している臭素化ダイオキシン類について顕著な容量反応が示された。また、XDS-CALUX アッセイ法では、非 2,3,7,8-位臭素置換体の 2,4,8-TriBDF についても用量反応が示された。臭素化塩素化ダイオキシン類については、2,3,7,8-位にハロゲン（臭素或いは塩素）が置換しているものに加えて、多くの非 2,3,7,8-位ハロゲン置換体（DR-CALUX アッセイ法：7-B-2,3-DiCDD、1,2-B-7,8-DiCDF、8-B-2,3,4-TriCDF；XDS-CALUX アッセイ法：7-B-2,3-DiCDD、1,2-B-7,8-DiCDF、8-B-2,3,4-TriCDF、8-B-2,3-DiCDF）についても顕著な用量反応が示されている。XDS-CALUX アッセイ法は、DR-CALUX アッセイ法と比較して、非 2,3,7,8-位ハロゲン置換体を検出する傾向であった。

毒性の類似性の評価指標 $ ^{15} $ といわれている用量反応曲線の形状について、物質間及びアッセイ間で比較評価した。用量反応曲線の形状をみると、DR-CALUXアッセイ法では、試験最高濃度でプラトーに達している用量反応曲線の傾きや飽和ルシフェラーゼ活性が、2,3,7,8-TCDD、臭素化ダイオキシン類及び臭素化塩素化ダイオキシン類で概ね類似する傾向であった。一方で、XDS-CALUXアッセイ法では、試験最高濃度でプラトーに達している用量反応曲線の傾きが、2,3,7,8-TCDD、臭素化ダイオキシン類及び臭素化塩素化ダイオキシン類で概ね類似する傾向であるが、飽和ルシフェラーゼ活性が2,3,7,8-TCDDと比較してPBDFsやPXDDsの一部異性体で高くなる傾向であった。DR-CALUXアッセイ法及びXDS-CALUXアッセイ法共に、PBB-77の用量反応曲線は、2,3,7,8-TCDDと傾きが異なっていた。

これらの結果は、マウス由来細胞を用いる XDS-CALUX アッセイとラット由来細胞を用いる DR-CALUX 法で、臭素化ダイオキシン類及び臭素化塩素化ダイオキシン類への反応性が若干異なり、マウスとラットの種間差を示している可能性がある。また、PBB-77 でみられる差は、物質構造に起因すると考えられ、ダイオキシン類と同じく扁平構造を有する Co-PBB であるが、ジベンゾ-パラ-ダイオキシン骨格やジベンゾフラン骨格の 2,3,7,8-位ハロゲン置換体とルシフェラーゼ誘導能が異なることに関連すると考えられた。

## 2 ）効果濃度（EC）と2,3,7,8-TCDDに対する比活性（REP）

DR-CALUX アッセイ法と XDS-CALUX アッセイ法で得られた用量反応曲線から算出した 2,3,7,8-TCDD、臭素化ダイオキシン類及び臭素化塩素化ダイオキシン類の各種 ECs（EC_{5TCDD}、EC_{20} 及び EC_{50}）と 2,3,7,8-TCDD に対する REPs（REP-EC_{5TCDD}、REP-EC_{20} 及び REP-EC_{50}）を表 2 及び表 3 に示す。

臭素化ダイオキシン類と臭素化塩素化ダイオキシン類のEC及びREPに基づくと、DR-CALUXアッセイ法とXDS-CALUXアッセイ法共に、臭素化ダイオキシン類のPBDD/Fsについては、2,3,7,8-位に臭素が置換している異性体の反応性が強くなる傾向であり、4臭素化体から8臭素化体へと臭素の数が増えるに応じて反応性が弱くなった。これは、WHO-TEFが設定されている塩素化ダイオキシン類と同様である。臭素化塩素化ダイオキシン類についても、2,3,7,8-位に臭素や塩素が置換している異性体の反応性が強くなる傾向であり、7-B-2,3-DiCDD、1,2-B-7,8-DiCDF及び8-B-2,3,4-TriCDFのように2,3,7,8-位のいずれかに臭素や塩素が置換していない異性体の反応性が低かった。また、ハロゲンの置換位置と数が同じ臭素化ダイオキシン類と臭素化塩素化ダイオキシン類を比較すると、臭素化塩素化ダイオキシン類で反応性が強くなる傾向であった。これらの結果は、Ahレセプターへの結合性に起因すると考えられ、2,3,7,8-位ハロゲン置換体で原子サイズの大きい臭素置換数が多くなることで分子サイズが大きくなりAhレセプターへの結合性が低下する傾向であることを示している。一方で、臭素化塩素化ダイオキシン類は、ハロゲン置換数が同じで臭素置換数の多い異性体が臭素置換数の少ない異性体よりもREPが高くなる場合があり（2,3-B-7,8-DiCDD＞2-B-3,7,8-TriCDD、2,3-B-7,8-DiCDF＞3-B-2,7,8-TriCDF）、分子サイズだけでなく臭素と塩素の置換位置や組み合わせによってAhレセプターへの結合性が変化することも考えられた。

XDS-CALUX アッセイ法における 2,3,7,8-TCDD の EC は DR-CALUX アッセイ法の 4 倍程度であり、2,3,7,8-TCDD に対する反応性（感度）は XDS-CALUX アッセイ法よりも DR-CALUX アッセイ法で 4 倍程度高いといえる。臭素化ダイオキシン類及び臭素化塩素化ダイオキシン類の反応性についても、