Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
BALF 中サイトカイン濃度 52
血清中サイトカイン濃度 58
血清中酸化ストレス度と抗酸化力 60
血清中 N-ERC/mesothelin 濃度 64
尿中 N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG)濃度 66
急性影響 (BALF 中 Monocyte chemotactic protein-1(MCP-1)濃度等)
の量反応関係 68

小括 72

(2) 慢性影響 73
実験方法 73
結果と考察 77
病理組織学的検索 77
BALF の細胞分画 85
BALF 中たんぱく濃度 88
BALF 中 LDH 濃度 89
BALF 中サイトカイン濃度 90
血清中サイトカイン濃度 93
血清中酸化ストレス度と抗酸化力 95
血清中 N-ERC/mesothelin 濃度 97
尿中 NAG 濃度 98
尿中 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG)濃度 99

小括 101

ラット腹腔内投与による発がん性試験 102
実験方法 102
結果と考察 104
死亡率および中皮腫発生率 104
病理組織学的検索 106
血清中酸化ストレス度と抗酸化力 112
血清中サイトカイン濃度 114
血清中 N-ERC/mesothelin 濃度 115
尿中 NAG 濃度 116

小括 117

II 研究業績 118
## I 研究報告概要

アモサイトの無害化処理生成物の安全性に関する研究（K2303）

代表研究者 山中博（北里大学）

共同研究者 高田礼子、網中雅仁（聖マリアンナ医科大学）

山下喜世次（(株)ノザワ技術研究所）

## 研究目的

アスベスト含有廃棄物の無害化処理において非飛散性アスベストにはクリソタイルのほかにアモサイトが含まれる可能性がある。ラットを用いた気管内投与試験において、クリソタイルと異なり、アモサイト焼成無害化処理物には毒性の軽減が認められない結果が得られている。さらに、アモサイトは焼成処理により、結晶質シリカであるクリストバライトとトリジマイト及び酸化鉄であるヘマタイトとマグネタイトなどに変換され、アスベストと異なる新たな有害性が懸念される。アスベスト含有廃棄物の無害化処理を推進する上で、とくに中皮腫などの発がん性に関する明確な結論、そして、急性と慢性ばく露からの呼吸器影響および全身臓器への影響も検討する必要がある。

本研究は、アモサイト焼成処理物の安全性を科学的に検証することを目的に in vitro と in vivo 試験を連携し、発がん性の有無、そして結晶質シリカと酸化鉄を加味して生体影響を総合的に評価した。

## 研究方法

### 1. 被験試料

UICC アモサイト(AM)を表-1 の条件で 1000℃、1200℃、1400℃で焼成して非石綿化した試料(AM1000、AM1200、AM1400)を作製した。さらに焼成物の形状と生体影響との関連を検討するために、見かけの繊維形状が残っている AM1000、AM1200 について、表-1 の条件で焼成後に粉砕した試料(AM1000G、AM1200G)を作製した。

AM 焼成物の結晶構造と生体影響との関連を検討するために、結晶質シリカ（クリストバライト、トリジマイト）については（社）日本作業環境測定協会標準試料を、酸化鉄（ヘマタイト、マグネタイト）については関東化学株式会社 一級試薬を粉砕して、粒度を AM 焼成後粉砕物(AM1000G、AM1200G)と同程度に調製した。

AM とその焼成物、焼成物に粉砕処理を加えたもの、そして、結晶質シリカと酸化鉄の調製試料に対して、X 線回折基底標準吸収補正法による生成物含有量の定量、Brunauer-Emmett-Teller (BET)法による比表面積、透過型電子顕微鏡(TEM)によるサイズ分布等の測定を行った。
AM と AM 焼成物、焼成後粉砕物における生成物（結晶質シリカと酸化鉄）の含有量を表-1、粒子サイズと比表面積の測定結果を表-2 に示した。また、結晶質シリカと酸化鉄の調製試料についての粒子サイズと比表面積の測定結果は表-3 に示した。

表-1 アモサイト焼成物の焼成条件および加熱後生成物

試料	加熱温度(℃)1)	加熱後粉砕有無2)	加熱後の生成物と含有量(%)3)
Amosite	Quartz	Cristobalite	Tridymite	Hematite	Magnetite
AM(原試料)	—	—	+	tr	—	—	—	—
AM1000	1000	なし	—	1.6	0	0	22	<10
AM1000G	1000	あり	—	2.3	0	0	19	<10
AM1200	1200	なし	—	0	21	0	0	38
AM1200G	1200	あり	—	0	18	0	0	35
AM1400	1400	なし	—	0	7	14	0	22

1) AM 焼成物の作製は、AM を白金ルツボに入れ、電気炉（51524 型、光洋リドバーグ）にて加熱し、加熱後は室温まで自然放冷を行った。

2) AM 焼成物の粉砕処理は、粉砕機（VIBRATING SAMPLE MILL TI-10, 平工製作所）にて 3 分間粉砕した。

3) 生成物の含有量は、X線回折基底標準吸収補正法により定量した。なお、HematiteとMagnetiteが混在するAM1000、AM1000GはMagnetiteの定量が困難なため、回折強度から推測した。

生成物：+；検出、tr；微量の検出、-；不検出。

表-2 アモサイト焼成物の粒子サイズおよび比表面積の測定結果

試料	長さ(μm)	幅(μm)	総粒子数 (106/mg)2)	緘維数(106/mg) (72°外比>=3)	比表面積 (m2/g)3)
幾何平均(標準偏差)	幾何平均(標準偏差)
AM	4.3(3.3)1	0.31(1.9)1	2031	1891	5.9
AM1000	1.6(2.7)	0.24(2.1)	316	267	3.8
AM1000G	0.33(2.4)	0.21(2.1)	3,111	242	7.7
AM1200	2.2(3.5)	0.60(2.2)	48.8	31.2	1.2
AM1200G	0.18(2.2)	0.13(2.1)	7,019	165	7.7
AM1400	0.49(2.5)	0.33(2.4)	231	11.1	0.5

1) Kohyama et al. Am J Ind Med. 1996; 30: 515-528 の測定結果を用いた。

2) 総粒子数は、AM1000, AM1000G, AM1200, AM1200G, AM1400 の比重を比重瓶で実測し、それぞれ、3.21, 3.30, 3.25, 3.34, 3.19 として算出した。

3) 比表面積は、BET 法により BELSORP-mini（日本ベル）を用いて測定した。

表-3 結晶質シリカ、酸化鉄の粒子サイズおよび比表面積の測定結果

試料	長さ(μm)	幅(μm)	総粒子数 (106/mg)3)	比表面積 (m2/g)4)
幾何平均(標準偏差)	幾何平均(標準偏差)
クリストハライト1)	0.18(2.3)	0.14(2.2)	23,357	8.0
トリジマイト1)	0.33(2.7)	0.26(2.5)	608	5.6
ヘマタイト2)	0.13(1.9)	0.11(1.8)	52,431	1.4
マグネタイト2)	0.27(1.9)	0.21(1.9)	10,683	0.5

1) クストバラ仆、トリジマ仆は、(社) 日本作業環境測定協会 標準試料を用いて調製した。

2) ヘッタイ、マグネイは、関東化学株式会社 一級試薬を用いて調製した。

3) 総粒子数は、クスパラ仆、トリジマ仆、マタ仆、マグ初仆の比重をそれぞれ、文献値より、2.33, 2.30, 5.27, 5.20 として算出した。

4) 比表面積は、BET 法により BELSORP-mini（日本ベル）を用いて測定した。
### 2. 細胞毒性試驗

マウス・マクロファージ細胞株(J774A.1 細胞)に AM と AM 焼成物およびその粉砕物、結晶質シリカ、酸化鉄をそれぞれ添加し、24 時間後の細胞生存率、5-(and 6) Carboxy-2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate (H₂DCFDA)染色による細胞内活性酸素種の測定、培養上清中の Tumor necrosis factor-α (TNF-α)濃度を ELISA 法にて測定した。

### 3. ラット気管内一回投与試験

AM と AM 焼成物およびその粉砕物、結晶質シリカ、酸化鉄を生理食塩水に懸濁して、2mg/ml の用量をラットに気管内一回投与した。投与後 30 日目まで病理組織検査、気管支肺胞洗浄液 (Bronchoalveolar lavage fluid: BALF) 中の炎症細胞数及びサイトカイン (Monocyte chemotactic protein-1; MCP-1 等)、その他の炎症関連生化学指標（蛋白、乳酸脱水素酵素；LDH 等）、血清の酸化ストレスマーカー等の測定を実施した。さらに AM と AM 焼成物およびその粉砕物の投与群については、慢性影響を評価するため、投与後 1.5 年まで観察した。

### 4. ラット腹腔内一回投与による発がん性試験

AM と AM 焼成物およびその粉砕物を 10mg/2ml の用量を一回投与量として、2 年間の経過観察中における中皮腫発生について病理組織検査を行った。さらに、血清中の中皮腫関連マーカー(N-ERC/mesothelin)等の経時的変化も評価した。

## 結果と考察

### 1. 細胞毒性試験

## (1) 细胞内活性酸素種

J774A.1 細胞に AM、AM1000 を 24 時間ばく露後、細胞内活性酸素種の生成が顕著に認められた。しかし AM1200、AM1400 をばく露した細胞内の活性酸素種の生成量に顕著な変化は認められなかった。さらに、粉砕処理した AM1000G、AM1200G においても 24 時間ばく露後の細胞内活性酸素種の生成は認められなかった。とくに AM1000G は AM1000 に比較して細胞内活性酸素種レベルの有意な低下が明確に認められた。一方、結晶質シリカ（クリストバライト、トリジマイト）、酸化鉄（ヘマタイト、マグネタイト）については、J7774A.1 細胞に 24 時間ばく露後の細胞内活性酸素種レベルの有意な増加は認められなかった。

## (2) TNF- $ \alpha $ 濃度

じん肺やがんにも関連し、炎症の初期反応で重要なサイトカインである TNF- $ \alpha $ を指標として細胞毒性を評価した。J774A.1 細胞に AM と AM1000 を 24 時間ばく露後、培養上清中の TNF- $ \alpha $ 濃度の顕著な上昇が認められた。一方、AM1200、AM1400 を 24 時間ばく露後の培養上清中の TNF- $ \alpha $ 濃度に変化は認められなかった。さらに、粉砕処理した AM1000G、AM1200G における培養上清中の TNF- $ \alpha $ 濃度に変化はなく、とくに AM1000G は AM1000 に比較して
TNF-α 濃度は有意に低値であった。一方、結晶質シリカ（クリストバライト、トリジマイト）、酸化鉄（ヘマタイト、マグネタイト）については、24 時間ばく露後の培養上清中の TNF-α 濃度に有意な変化は認められなかった。

以上の結果から、細胞への毒性は、試料の結晶構造よりも、アスベストに由来する見かけの繊維形状の残存が大きく影響する可能性が示唆された。

### 2. 気管内投与試験

## （1） 急性影響

## ①病理組織檢查

AM1000 では、投与後 30 日目まで肺胞道～肺胞にかけて肉芽腫が認められ、気道上皮細胞および炎症細胞において酸化的 DNA 損傷のバイオマーカーである。

8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG)の生成は AM 群と同様に持続していた。一方、AM1000G では粉砕処理による炎症反応の軽減が認められた。しかし、AM1200、AM1400 では、経時的に炎症が進展し、投与後 30 日目の時点でも炎症、8-OHdG の生成が持続していた。

結晶質シリカであるクリストバライト、トリジマイトでは、投与後 3 日目で肺胞領域の急性炎症反応が認められ、気道上皮およびマクロファージ等の炎症細胞で 8-OHdG の生成が認められた。クリストバライト、トリジマイトともに、投与後 30 日目の時点でも炎症反応は持続しており、気道上皮および炎症細胞で 8-OHdG の生成の持続も認められた。しかし、クリストバライト、トリジマイトの投与後 30 日目の時点での炎症反応は AM1000 や AM1200、AM1400 よりも軽度であった。また、クリストバライトの方がトリジマイトに比較して炎症反応がやや強い傾向にあり、一部に肉芽腫形成が認められたが、明らかな線維化は認められなかった。

酸化鉄であるヘマタイト、マグネタイトでは、投与後3日目で肺胞領域の急性炎症反応が認められ、気道上皮およびマクロファージ等の炎症細胞で8-OHdGの生成が認められた。これらの炎症反応はクリストバライト、トリジマイトよりもやや軽度であった。ヘマタイト、マグネタイトの炎症反応は結晶質シリカと異なり経時的に回復傾向を示した。投与後30日目の時点では、肺胞領域の炎症はごく軽度であり、肺組織における8-OHdGの生成も減少していた。

表-1 に示す通り、AM 焼成物のうち最も呼吸器影響が軽減されていた AM1000G では、酸化鉄のみで、クリストバライト、トリジマイトが生成されていないのに対し、経時的に炎症が進展した AM1400 では酸化鉄に加えて結晶質シリカも生成されていた。すなわち、AM 焼成物の結晶構成成分のうち、結晶質シリカの方が酸化鉄よりも呼吸器影響に関与している可能性が示唆された。

## ②氨管支肺胞洗净液(BALF)分析

気管内投与後の BALF の好中球数および炎症関連バイオマーカー（蛋白、LDH、MCP-1）の分析結果より、AM1000 は AM に比較して毒性の軽減が認められなかった。これに対して、
AM1000G では粉砕処理による毒性の軽減が認められた。AM1200、AM1400 では投与後 30 日目の時点で BALF 中の好中球数および炎症関連バイオマーカーの上昇が認められ、細胞毒性試験だけでは予測できない生体影響が動物実験で示唆された。

結晶質シリカであるクリストバライト、トリジマイトでは、BALF 中の好中球数および炎症関連バイオマーカー（蛋白、LDH、MCP-1）が投与後30日目にかけて増加する傾向が認められ、とくにクリストバライトで顕著であった。しかし、酸化鉄であるヘマタイト、マグネタイトではBALF 中の好中球数および炎症関連バイオマーカーの増加傾向は認められなかった。

以上の結果から、AM焼成物の急性影響には細胞毒性試験の結果と同様に、焼成物の繊維形状（アスベスト由来の見かけの繊維形状の残存）が影響することが示唆された。さらに、投与後30日目の結果から慢性影響には結晶質シリカの結晶構造が影響することが示唆された。

## (2) 慢性影響

気管内投与後1.5年まで観察した結果、AM1000、AM1200では肺胞道～肺胞にかけて肉芽腫が長期間持続し、その周囲で線維化が認められたが、AMに比較して線維化の程度は軽度であった。一方、AM1400では、肺の炎症が持続していたが、線維化は明らかではなかった。これに対して、AM1000Gでは慢性呼吸器影響はほぼ認められず、肺の線維化は認められなかった。以上の結果から、AM1000Gによる呼吸器毒性が最も軽減されていることが明らかとなった。またAM焼成物の慢性呼吸器影響には、繊維形状（アスベスト由来の見かけの繊維形状の残存）および結晶構造が影響することが示唆された。

AM 焼成物(AM1000、AM1200、AM1400)およびその粉砕物(AM1000G)では、気管内投与後1.5年までの観察の結果、肺腫瘍の発生は認められず、腫瘍発生リスクの明らかな増加は認められなかった。

### 3. 腹腔内投与による発がん性試験

AM の中皮腫発生率は 56% であったのに対し、AM1000 では腹膜の線維化は認められたが、中皮腫発生率は 4% とわずかであり、AM に比較して中皮腫発生率は有意に低かった。これに対して、AM1000G では腹膜の線維化も認められず、中皮腫発生も認められなかった。

腹腔内投与後の血清中の N-ERC/mesothelin 濃度の経時的変化は、中皮腫発生リスクを反映していた。中皮腫が高率に発生した AM では血清中 N-ERC/mesothelin 濃度が観察期間を通じて高値を示し、中皮腫発生の 1～3 ヶ月前から上昇傾向を認めた。一方、中皮腫発生が認められなかった AM1000G では血清中 N-ERC/mesothelin 濃度は投与後初期に一過性に軽度の上昇を認めたが、AM に比較して低値が持続した。しかし、投与後 540 日目以降、AM1000 および AM1000G において腎障害を発生した個体で血清中 N-ERC 濃度の上昇が認められ、血清中 N-ERC/mesothelin の評価には腎障害による影響を考慮する必要があることが示された。
## 結論

アモサイト(AM)の焼成物の慢性影響および発がん性を評価するため、ラットへの気管内投与と腹腔内投与試験を実施した。AM焼成物の生体影響は、形状に加えて結晶構造（結晶質シリカ、酸化鉄）を考慮したin vitro試験も加味して評価を行った。

気管内投与試験の結果、AMの1000℃、1200℃焼成物(AM1000、AM1200)では肺の肉芽腫と線維化が認められ、1400℃焼成物(AM1400)では肺の炎症が持続していた。一方、AM1000の粉砕物(AM1000G)では慢性呼吸器影響はほぼ認められなかった。AM焼成物の慢性呼吸器影響は、繊維形状および結晶構造が影響する結果を得た。

腹腔内投与による発がん試験の結果、AMでは高率に中皮腫が発生した。AM1000では腹膜の線維化は認められたが、中皮腫の発生率はAMに比較して低率であった。一方、AM1000Gでは中皮腫発生は認められなかった。

本研究から、AM1000Gに発がん性は認められなかった。慢性影響はAMに比べてAM1000Gが最も軽減されていた。アモサイトの無害化は、1000℃焼成後に粉砕処理により達成されることを明らかにした。

## 英語概要

· 研究課題名 = 「Evaluation of biological effects of thermal transformed amosite」

· 研究代表者名及び所属＝Hiroshi Yamauchi (Kitasato University)

· 共同研究者＝ Ayako Takata, Masahito Aminaka (St. Marianna University School of Medicine), Kiyotsugu Yamashita (Nozawa Corporation)

• 要旨 = In order to examine the chronic effects and carcinogenicity of thermally transformed amosite (AM), we conducted intratracheal and intraperitoneal administration tests in rats. Biological effects of thermally transformed AM were examined based on the forms and crystal structure (crystalline silica and iron oxides).

In the intratracheal administration tests, pulmonary granuloma and fibrosis developed in thermally transformed AM at $ 1,000^{\circ} $ C and $ 1,200^{\circ} $ C (AM1000, AM1200), and persistent pulmonary inflammation developed with AM1400. On the other hand, there was little, if any, chronic respiratory effect induced by ground AM1000 (AM1000G). These results indicate that the fiber morphology and crystal structure influence the chronic respiratory effects produced by thermally transformed AM.

In tests of carcinogenicity by intraperitoneal administration, mesothelioma occurred at high rates in AM. Peritoneal fibrosis developed in AM1000, while mesothelioma occurred at lower rates compared with AM. There was no incidence of mesothelioma with administration of AM1000G.

In this study, carcinogenicity of AM1000G was not observed and AM1000G showed the least chronic effects compared to AM, indicating that detoxification of AM was achieved by grinding after thermal transformation at $ 1,000^{\circ} $ C.

・キーワード = amosite, carcinogenicity, lung injury, crystalline silica, iron oxide mineral
Ⅱ アモサイト、アモサイト焼成物、結晶質シリカ、酸化鉄の細胞毒性試験

## (1) アモサイトとアモサイト焼成物

## 実験方法

## 1 ）细胞

マウス・マクロファージ細胞株（J774A.1）は ECACC (Cat. No. EC91051511) より購入し、10%牛胎児血清 (Lot.No. 68313101, MOREGATE, Australia & New Zealand) を含む Dulbecco's modified Eagle's 培地 (Sigma-aldrich) を用いて継代培養した。

## 2 ）AM 焼成物および粉砕物の調整

精密天秤にて秤量した試料はオートクレーブ滅菌後、乾燥機で十分に乾燥させた。次に、添加直前に超音波洗浄器にて10分間十分に分散させ、通常の継代培養に用いている培地に懸濁させながら添加した。

## 3 ）細胞内活性酸素種の測定

J774A.1 細胞はラブテックチェンバースライドに $ 5 \times 10^{4} $ cells/well で播種し、37℃、5%CO $ _{2} $ 存在下で 24 時間培養した。その後、細胞に AM, AM1000, AM1000G, AM1200, AM1200G, AM1400 を各々 100μg/mL となるように添加し、24 時間培養した。さらにばく露終了後、細胞は PBS で 2 回洗浄し、H $ _{2} $ DCFDA とハキスト 33342 を含むを含む DMEM（血清含まず）に置換し、37℃、5%CO $ _{2} $ 存在下で 1 時間インキュベートした。PBS で 2 回洗浄後、位相差および蛍光顕微鏡下で観察し、ランダムに数箇所を写真撮影した。位相差顕微鏡写真から一視野内の細胞数を求めた。WinRooF を用いて H $ _{2} $ DCFDA の蛍光量（輝度）を求め、活性酸素発生量とした。活性酸素発生量は各写真の細胞数および輝度を合計し、輝度を細胞数で除すことにより一細胞あたりの平均輝度を活性酸素発生量とした。

## 4 ）培養上清中 TNF- $ \alpha $ 濃度の測定

J774A.1 細胞を $ 9 \times 10^{3} $ cells/well となるように播種した。24 時間培養後、50μg/mL となるように AM, AM1000, AM1000G, AM1200, AM1200G, AM1400 を添加した。さらに 24 時間培養し、フィルター濾過したものを $ -80^{\circ} $ C で保存した。培養上清中の TNF- $ \alpha $ 濃度は ELISA kit Mouse TNF- $ \alpha $ (invitrogen) を用いて測定した。測定は 450nm の吸光度をプレートリーダーにて行い、解析ソフト WorkOut2.5 で検量線を求め、その検量線から培地上清中の TNF- $ \alpha $ 濾度を求めた。

## 5 ）統計処理

測定値の統計解析は、SPSS ver.18J を用い、各群間の差について一元配置分散分析およびTukeyの検定を行った。
## 結果と考察

## 1 ） 细胞内活性酸素種

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400をそれぞれ24時間ばく露したときに生成される細胞内活性酸素種量について、蛍光試薬(H₂DCFDA)による染色を行い測定した結果を図1-1に示した。

AM および AM1000 における細胞内活性酸素種の生成量は対照群に比較して約 10 倍の高値であった $ (p < 0.001) $ 。なお、細胞内活性酸素種の生成量が共に上昇した AM と AM1000 において、両者間に統計学的な有意差は認められなかった。これに対して、AM1200 および AM1400 ばく露後の細胞内活性酸素種の生成量は対照群に比較して有意差は認められず、さらに、AM に比較して有意に低値であった $ (p < 0.001) $ 。他方、粉砕物の AM1000G や AM1200G では、ばく露後の細胞内活性酸素種の生成量も対照群に比較して変化がなく、また、AM に比較しても有意な低下が示された $ (p < 0.001) $ 。

図 1-1 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 100μg/ml 添加 24 時間後の H₂DCFDA 染色による細胞内活性酸素種の比較

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM 群との比較： $ ^{\#} $ ，p<0.05； $ ^{\#\#} $ ，p<0.01； $ ^{\#\#\#} $ ，p<0.001

AM vs. AM1000 : $ ^{} $ , p < 0.05; $ ^{} $ , p < 0.01; $ ^{} $ , p < 0.001
## 2 ) 培養上清中 Tumor necrosis factor $ \alpha $ (TNF- $ \alpha $ ) 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 50μg/ml を 24 時間ばく露したときの培養上清中の TNF-α 濃度を図 1-2 に示した。

AM と AM1000 の TNF- $ \alpha $ 濃度は対照群に比較して、それぞれ約 2 倍と約 3.5 倍の高値に上昇した (AM, p < 0.01; AM1000, p < 0.001)。これに対して、AM1200 と AM1400 の TNF- $ \alpha $ 濃度は、対照群に比較して変化は認められなかった。次に、焼成物の粉砕処理の効果について、AM1000G と AM1200G では、対照群に比較して TNF- $ \alpha $ 濃度に変化は認められなかった。関連して、AM1000G の TNF- $ \alpha $ 濃度は AM1000 に比較して有意に低値であった (p < 0.001)。

図 1-2 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 50 μg/ml 添加 24 時間後における培養上清中の TNF-α 濃度の比較

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\begin{aligned}\#,p<0.05;\quad\#\#,p<0.01;\quad\#\#\#,p<0.001\end{aligned}$

AM vs. AM1000 : $ ^{} $ , p < 0.05; $ ^{} $ , p < 0.01; $ ^{} $ , p < 0.001
## (2) 結晶質シリカと酸化鉄

## 実験方法

## 1 ）细胞

マウス・マクロファージ細胞株（J774A.1）は ECACC (Cat. No. EC91051511) を用い、10% 牛胎児血清 (Lot.No. 68313101, MOREGATE, Australia & New Zealand) を含む Dulbecco's modified Eagle's 培地 (Sigma-aldrich) にて継代培養した。

## 2 ）結晶質シリカおよび酸化鉄の調整

精密天秤にて秤量したクリストバライト（CB）、トリジマイト（TR）、ヘマタイト（HM）、マグネタイト（MT）試料はオートクレーブ滅菌後、乾燥機で十分に乾燥させた。次に、試料は、添加直前に超音波洗浄器にて10分間十分に分散させ、通常の継代培養に用いている培地に懸濁させながら添加した。

## 3 ）細胞内活性酸素種の測定

J774A.1 細胞はラブテックチェンバースライドに $ 5 \times 10^{4} $ cells/well で播種し、37℃、5%CO $ _{2} $ 存在下で 24 時間培養した。その後、細胞に CB、TR、HM、MT 試料を各々 100μg/mL となるように添加し、24 時間培養した。さらにばく露終了後、細胞は PBS で 2 回洗浄し、H $ _{2} $ DCFDA とハキスト 33342 を含むを含む DMEM（血清含まず）に置換し、37℃、5%CO $ _{2} $ 存在下で 1 時間インキュベートした。PBS で 2 回洗浄後、位相差および蛍光顕微鏡下で観察し、ランダムに数箇所を写真撮影した。位相差顕微鏡写真から一視野内の細胞数を求めた。WinRooF を用いて H $ _{2} $ DCFDA の蛍光量（輝度）を求め活性酸素発生量とした。活性酸素発生量は各写真の細胞数および輝度を合計し、輝度を細胞数で除すことにより一細胞あたりの平均輝度を活性酸素発生量とした。

## 4 ）培養上清中 TNF- $ \alpha $ 濃度の測定

J774A.1 細胞を $ 9 \times 10^{3} $ cells/well となるように播種した。24 時間培養後、50μg/mL となるように CB、TR、HM、MT 試料を添加した。さらに 24 時間培養し、フィルター濾過したものを一80℃で保存した。培養上清中の TNF-α は ELISA kit Mouse TNF-α (invitrogen) を用いて測定した。測定は 450nm の吸光度をプレートリーダーにて行い、解析ソフト WorkOut2.5 で検量線を求め、その検量線から培地上清中の TNF-α 濾度を求めた。

## 5 ）統計処理

測定値の統計解析は、SPSS ver.18J を用い、各群間の差について一元配置分散分析およびTukeyの検定を行った。
## 結果と考察

## 1 ） 细胞内活性酸素種

J774A.1 細胞に CB、TR、HM、MT をそれぞれ 24 時間ばく露したときに生成される細胞内活性酸素種について、蛍光試薬(H₂DCFDA)による染色の結果を図 1-3 に示した。さらに、細胞内活性酸素種量の測定結果を図 1-4 に示した。

図 1-3 CB、TR、HM、MT をそれぞれ 100μg/ml 添加 24 時間後の H₂DCFDA 染色による細胞内活性酸素種の誘導について

$$ Bar\left(\text{—}\right)=100\mu m $$
図 1-4 CB、TR、HM、MT をそれぞれ 100μg/ml 添加 24 時間後の H₂DCFDA 染色による細胞内活性酸素種の比較

結晶質シリカ（CB、TR）と酸化鉄（HM、MT）をそれぞれ J774A.1 細胞に添加し 24 時間培養後における細胞内活性酸素種の誘導について観察した結果、明確な増加は認められなかった。一方、前述の通り、AM と AM1000 を 24 時間ばく露後、細胞内活性酸素種の生成量の明確な上昇が認められた。しかし AM1200 と AM1400 をばく露した細胞内の活性酸素種の生成量に明確な変化は認められず、すなわち、結晶質シリカと酸化鉄の結果は、AM1200 や AM1400 に類似することが明らかになった。

なお、結晶質シリカと酸化鉄では共通して細胞内活性酸素種の顕著な誘導は観察されなかったが、この分野の評価は重要であることから、今後、観察時間や投与量を加味した検証が必要であると考えられる。
## 2 ）培養上清中 TNF- $ \alpha $ 濃度

じん肺やがんにも関連し、炎症の初期反応で重要なサイトカインである TNF- $ \alpha $ を指標として細胞毒性を評価した。

J774A.1 細胞に CB、TR、HM、MT 試料をそれぞれ 50μg/ml を添加し、24 時間ばく露後における培養上清中の TNF-α 濃度を図 1-5 に示した。

結晶質シリカ（CB、TR）および酸化鉄（HM、MT）のいずれにおいても、対照群に比較して TNF- $ \alpha $ 濃度に有意な変化は認められなかった。

図 1-5 CB、TR、HM、MT をそれぞれ 50μg/ml 添加 24 時間後の培養上清中の TNF-α 濃度
## 小括

J774A.1 細胞に AM と AM1000 を 24 時間ばく露後、細胞内活性酸素種の生成が顕著に上昇を認められたが、AM1200 や AM1400 は細胞内の活性酸素種の生成量に顕著な変化は認められなかった。さらに、粉砕処理した AM1000G と AM1200G においても 24 時間ばく露後の細胞内活性酸素種の生成に変化を認めなかった。とくに、粉砕処理の効果において重要な AM1000G は、AM1000 に比較して細胞内活性酸素種の生成において有意な低下を明確に確認できた。

この研究において、結晶質シリカ（CB、TR）、酸化鉄（HM、MT）については、J774A.1細胞に24時間ばく露後における細胞内活性酸素種の生成量の有意な上昇を認めなかった。すなわち、この結果は、AM1200やAM1400等の組成に関連することから、細胞内の活性酸素種の生成に関する傾向が類似することを明らかにした。

じん肺や発がん性にも関連するため、炎症の初期反応で重要なサイトカインである TNF- $ \alpha $ を指標として細胞毒性を評価した。J774A.1 細胞に AM と AM1000 を 24 時間ばく露後、培養上清中の TNF- $ \alpha $ 濃度の顕著な上昇が認められた。一方、AM1200、AM1400 を 24 時間ばく露後の培養上清中の TNF- $ \alpha $ 濃度に変化は認められなかった。さらに、粉砕処理した AM1000G、AM1200G における培養上清中の TNF- $ \alpha $ 濃度に変化はなく、とくに AM1000G は AM1000 に比較して TNF- $ \alpha $ 濃度は有意に低値であった。一方、結晶質シリカ（CB、TR）、酸化鉄（HM、MT）については、24 時間ばく露後の培養上清中の TNF- $ \alpha $ 濃度に有意な変化は認められなかった。

以上の結果から、細胞への毒性は、試料の結晶構造よりも、アスベストに由来する見かけの繊維形状の残存が大きく影響する可能性が示唆された。
### 2. ラット気管内一回投与によるアモサイト、アモサイト焼成物、結晶質シリカ、酸化鉄の急性と慢性影響

## （1） 急性影響

## 実験方法

## 1 ）実験動物

Wistar 系雄ラット（Crlj:WI、日本チャールスリバー）を使用した。動物はステンレス製金網ケージに5匹ずつ収容し、浄水器ろ過水道水、放射線滅菌飼料（CE-2、日本クレア）を自由摂取させた。なお、酸化ストレス関連のマーカーの測定を実施したラットは、採血および採尿日の3日前から放射線滅菌高タンパク飼料（Egg white diet; Dyets No.110952, Dyets Inc.）にて飼育した。

動物実験は北里大学医療衛生学部の動物飼育施設で実施した。飼育環境はセミバリア施設で12hr/12hr 明暗、24±1℃、55±5%RH である。実験は北里大学の動物飼育管理委員会の規則及び承認のもとに実施された。

## 2 ）被験試料の懸濁液調整

被験試料(AM、AM1000、AM1200、AM1400、AM1000G、AM1200G、CB、TR、HM、MTは、投与前日に秤量した後、オートクレーブで121℃、20分間滅菌、37℃の乾燥器内で保存した。動物投与直前に試料を所定容量になるように生理食塩水に懸濁させ、超音波洗浄器で10分間分散処理を行った。

## 3 ）氢管内投与

ラット（10 週齢）に AM、AM1000、AM1200、AM1400、AM1000G、AM1200G をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与した。また AM 焼成物の結晶構造と生体影響との関連を検討するために、CB、TR、HM、MT をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与した。対照群には、同様に生理食塩水 1ml を一回気管内投与した。さらに、生体影響の量反応関係を検討するため、AM、AM1000、AM1000G、AM1400 を被験試料として、ラット 1 匹あたり 0.1 と 0.5mg/ml をそれぞれ一回気管内投与し、0.1、0.5、2mg/ml による評価を行った。

気管内投与は、ハロセン麻酔下（ハロセン濃度3.5%、空気容量4L/min）で、実体頭微鏡を用い呟喉頭部を観察しつつ気管ゾンデを気管支分岐部直上まで挿入し、一回の吸気時に被験試料の懸濁液を気管内に注入した。

動物の観察期間と屠殺日は、AM、AM1000、AM1200、AM1400、AM1000G、AM1200Gの2mg投与群は3、7、30日目、CB、TR、HM、MTの2mg投与群は3、7、30日目、さらに、AM、AM1000、AM1000G、AM1400の0.1と0.5mg投与群は3、7、30日目とした。

動物は一回気管内投与後3、7、30日目にソムノペンチルの腹腔内投与による深麻醉下で解
剖を行った。腹大静脈から採血後、肺および主要臓器を摘出した。酸化ストレス等の生化学検査を行う組織検体は、液体窒素で凍結後、-80℃で保存した。また病理組織学的検索を行う組織検体は、4％パラホルムアルデヒド液で固定した。

解剖時に採取した血液（約4ml）は、チューブに入れ遮光し、室温で30分静置し、その後遠心分離を行った。血清は下記の分析に供するまで、-80℃で凍結保存した。なお、採尿は、検査日前日にメタボリックケージ（Tecniplast）に個別に一晩収容し、遮光した採尿チューブで採尿し、-80℃で凍結保存した。

## 4 ）気管支肺胞洗浄液(BALF)の採取

動物は一回気管内投与後3、7、30日目にソムノペンチルの腹腔内投与による深麻酔下で腹大静脈から採血後、腹大静脈を切断放血死させ、左肺気管支分岐部を結禁した。その後、気管にカテーテルを挿入し、右肺のみ生理食塩水5ml～8mlで2回洗浄してBALFを回収し液量を計測した。BALFの一部を下記の細胞分画検査に用い、残りは遠心後の上清を下記の分析に供するまで-80℃にて凍結保存した。

## 5 ）病理組織学的檢索

肺および主要臓器を4％パラホルムアルデヒド液に4℃で一晩浸漬固定し、翌日から室温に戻して再固定した。病理標本は定法に従ってパラフィン包埋後、厚さ3μm以下に薄切しヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を行った。さらに、肺の線維化を判定するためのMasson's trichrome等の特殊染色を行った。

## 6 ）8-OHdG および iNOS の免疫組織染色

肺の酸化ストレスおよび窒化ストレスを評価するために、上記のパラフィン切片について、抗8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(8-OHdG)モノクローナル抗体または抗inducible nitric oxide synthase (iNOS)ポリクローナル抗体を用い、Linked streptavidin-biotin (LSAB) 法を用いて免疫組織染色を行った。

パラフィン切片は脱パラフィン後、オートクレーブを用いて120℃で10分間の抗原賦活化を行った。内因性ペルオキシターゼを不活化し、phosphate-buffered saline（以下、PBS）にて洗浄した。その後、スキムミルクで非特異反応プロックを行い、再度PBSにて洗浄した。

一次抗体として、以下の抗体を使用した。8-OHdG に関しては、抗 8-OHdG モノクローナル抗体 MOG-020P（日本老化制御研究所）を希釈倍率 1:100 でスライドに添加後、4℃で一晩のインキュベーションをした。iNOS に関しては、抗 iNOS ポリクローナル抗体 ab15323 (abcam) を希釈倍率 1:100 でスライドに添加後、4℃で 1 時間のインキュベーションを行った。

PBS にて洗浄後、Biotin 標識二次抗体（DAKO Japan）を添加し、室温でインキュベーションした。PBS にて洗浄後、StreptAB complex/HRP（DAKO Japan）にて処理した。さらに、PBS にて洗浄後、diaminobenzidine（DAB: DAKO Japan）で発色させた。核染色は Meyer’s hematoxylin で行った。
## 7 ）BALF 中の細胞数、たんぱく濃度、LDH 濃度、サイトカイン濃度の測定

## 7 –1）BALF 中の細胞分画

BALF の浮遊細胞数は自動血球計数装置（Sysmex F-800、東亜医用電子）により計測した。細胞分画は、サイトスピン（Cytospin3、Shandon）を用いて標本を作製後、May-Grünwald-Giemsa 染色を行い、顕微鏡下で細胞を分別計数し、細胞分画（%）を求めた。サイトスピン標本上で肺胞マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球に分別計数して求めた細胞分画（%）に、自動血球計数装置で得られた総細胞数を乗じて各種炎症細胞数（cells/μl）を計算した。

## 7 –2）BALF 中のたんぱく濃度の測定

Pierce BCA Protein Assay Kit（Thermo scientific）を用いて、BCA 法により肺胞洗浄液中のたんぱく濃度を測定した。標準物質として添付の Bovine serum albumin (BSA) を用いた。

## 7 –3）BALF 中の LDH 濃度の測定

肺上皮の細胞傷害の程度を測定するため、Lactate dehydrogenase (LDH) cytotoxicity detection Kit（Takara Bio）を用いて、肺胞洗浄液中のLDH濃度を測定した。標準物質として、ブタ心臓由来LDH（オリエンタル酵母）を用いた。

## 7 –4）BALF 中のサイトカイン濃度の測定

BD OptEIA $ ^{™} $ Set Rat IL-6、MCP-1（BD Biosciences）およびRat TNF-α ELISA Kit（Thermo Scientific）を用いてBALFのサイトカイン濃度を測定した。BALFは、IL-6、TNF-α測定時には希釈せず、MCP-1測定時にその濃度に応じてAssay Diluent（BD Biosciences）により1～200倍に希釈した。

## 8 ）血清中の生化学分析

## 8 −1）血清中サイトカイン濃度の測定

BD OptEIA $ ^{TM} $ Set Rat IL-6 および BD OptEIA $ ^{TM} $ Set Rat MCP-1 （BD Biosciences）を用いて血清中のサイトカイン濃度を測定した。測定に使用した血清は Assay Diluent (BD Biosciences) により希釈し、その倍率は、IL-6 測定時には 10 倍、MCP-1 測定時には 100 倍とした。

## 8 –2）血清中酸化ストレス度と抗酸化力の測定

気管内投与実験において、FRAS4（DIACRON）を用いて、生体内の活性酸素・フリーラジカルによる酸化ストレス度（derivative of reactive oxygen metabolites; d-ROMs）と抗酸化力（biological antioxidant potential; BAP）を測定した。測定には、血清を用いた。

d-ROMs は、活性酸素やフリーラジカルにより生じる血中ヒドロぺルオキシド濃度をクロモゲン試薬のラジカル陽イオンへの変化として測定した。10μl の血清を酢酸緩衝液と混合し
た後クロモゲン試薬入りのキュベットへ移し 505nm の吸光度で測定した。

BAP は、血中の抗酸化物質が三価鉄イオン塩とチオシアン酸塩の化合物を還元し、脱色する反応を測定した。着色した反応液に 10μl の血清を混合し、505nm の吸光度の経時的な変化を測定した。

## 8 –3）血清中 N-ERC/mesothelin 濃度の測定

血清中 N-ERC/mesothelin 濃度は、6 μl の血清を EIA buffer (1% BSA, 0.05% Tween20 in PBS) で 40 倍に希釈した後に、Rat N-ERC/mesothelin assay kit (Immuno-Biological Laboratories) を用いて測定した。

## 9 ）尿中 NAG 濃度の測定

尿の測定項目は、クレアチニンおよび近位尿細管障害のマーカーである N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ（N-acetyl-β-D-Glucosaminidase ; NAG）の2項目である。尿中クレアチニン濃度はラボアッセイクレアチニン（和光純薬）を用いて Jaffe 法で行った。NAG 濃度は NAG テスト（シオノギ製薬）を用いて、一定時間に分解される合成基質（sodio-m-Cresolsulfonphthaleinyl N-Acetyl-β-D-Glucosaminide）の生成物をマイクロプレートリーダー ARVO X4（Perkin Elmer）にて測定した。NAG 濃度は尿中クレアチニン濃度で補正した。

## 10 ）尿中8-OHdG濃度の測定

尿は遠心分離(10,000rpm×10min)し、上清を超純水で4倍希釈したのち、クロマトディスク（孔径0.45μm）でろ過した。尿中8-OHdG濃度は、高速液体クロマトグラフィー・電気化学検出器(HPLC-ECD)装置を用いて測定した。本分析法では、2台のHPLCを連結した。第一HPLCは以下の通りである：pump (LC-10ADSP；島津製作所)，guard colomun (Inertsil ODS-3,5μm,4×10mm,GLサイエンス)，main column (TSK precolumn SW,4.6×35mm,東ソ一)。UV Detector (UV 620;GLサイエンス)。分析条件は、流量0.3ml/min、カラム温度35℃とした。第二HPLCは以下の通りである：pump (PU 610;GLサイエンス)，guard colomun (MGカートリッジ,3μm,4×20mm,資生堂)，main column (CAPCELL PAK C18 MG S5,資生堂)、ECD Detector (ED703 Pulse;GLサイエンス)。移動相にリン酸-8%メタノール緩衝液を使用した。8-OHdGはECDにより検出した。尿中8-OHdG濃度は尿中クレアチニン濃度により補正した。

## 11 ）肺組織中の MCP-1 mRNA 発現量の測定

肺約0.1gからRiboPure $ ^{TM} $ Kit (Life Technologies)を用いて抽出したRNAを基にHigh Capacity RNA-to-cDNA Master Mix (Life Technologies)を使ってcDNAを合成した。Real-time PCRはTaqMan Gene Expression Assays(Life Technologies)を用いてStepOnePlus (Life Technologies)にて行った。各反応液は20μlとし、18S rRNAを内在性コントロールとして比較C $ _{T} $ 法によりMCP-1のmRNA発現量を測定した。
## 12 ）統計処理

測定値の統計解析は、SPSS ver.18J を用い、各群間の差について一元配置分散分析およびTukeyの検定もしくはDunnettの検定などによって行った。
## 結果と考察

## 1 ）病理組織学的檢索

## ①肺の肉眼の所見

対照群の気管内投与後3、7、30日目の肺の肉眼的写真を図2-1～図2-3に示した。

結晶質シリカについて、CB群の投与後3、7、30日目の肺の肉眼的写真を図2-4～2-6、TR群の投与後3、7、30日目の肺の肉眼的写真を図2-7～2-9に示した。また酸化鉄について、HM群の3、7、30日目の肺の肉眼的写真を図2-10～2-12、MT群の3、7、30日目の肺の肉眼的写真を図2-13～2-15に示した。

## 对照群

全観察期間を通じて、肺の表面はほぼ平滑で、赤色斑、白色斑等は認められず、ほぼ正常な外観を示していた。気管支リンパ節の腫大は認められなかった。

## CB 群

投与後 3 日目に肺の一部に点状出血斑や赤色斑が観察された。これらの変化は投与後 7 日目以降に回復傾向を示したが、投与後 30 日目まで赤色斑の残存が認められた。なお、投与後 30 日目まで気管支リンパ節の腫大は認められなかった。

## TR 群

投与後 3 日目に肺の一部に点状出血斑や赤色斑が観察された。これらの変化は投与後 7 日目以降に回復傾向を示したが、投与後 30 日目まで赤色斑の残存が認められた。なお、投与後 30 日目まで気管支リンパ節の腫大は認められなかった。

## HM 群

投与後３日目に肺の一部に赤色斑が観察された。これらの変化は投与後７日目以降回復傾向を示した。なお、投与後３０日目まで気管支リンパ節の腫大は認められなかった。

## MT 群

黒色の投与粒子の肺内への沈着により肺全体の色調が黒ずんで観察された。投与後3日目に肺の一部に赤色斑が観察された。これらの変化は投与後7日目以降回復傾向を示した。なお、投与後30日目まで気管支リンパ節の腫大は認められなかった。
図 2-1 対照群、投与後 3 日目

(平成21年度報告書図2-21再掲)

図2-2 対照群、投与後7日目

図 2-3 対照群、投与後 30 日目
図2-4 CB群、投与後3日目点状出血斑（矢印）を認めた。

図2-5 CB群、投与後7日目淡赤色斑（矢印）を認めた。

図2-6 CB群、投与後30日目 赤色斑（矢印）が認められた。
図2-7 TR群、投与後3日目 点状出血斑（矢印）や赤色斑が認められた。

図2-9 TR群、投与後30日目 赤色斑（矢印）が認められた。

図2-8 TR群、投与後7日目
図 2-10 HM 群、投与後 3 日目

図 2-11 HM 群、投与後 7 日目

図 2-12 HM 群、投与後 30 日目
図 2-13 MT 群、投与後 3 日目

図 2-14 MT 群、投与後 7 日目

図 2-15 MT 群、投与後 30 日目
## ②病理組織学的所見

対照群の生理食塩水気管内投与後7、30日目の肺病理組織像を図2-16-A, Bに示した。結晶質シリカであるCBおよびTR群の気管内投与後3、7、30日目の肺病理組織像については、それぞれ、図2-17-A～Cおよび図2-20-A～Cに示した。酸化鉄シリカであるHMおよびMT群の気管内投与後3、7、30日目の肺病理組織像については、それぞれ、図2-23-A～C、図2-26-A～Cに示した。

対照群：投与後180日目まで著変は認められなかった（図2-16-A, B）。

CB群：投与後3日目で細気管支、肺胞道から末梢の肺胞領域まで急性炎症反応が認められた（図2-17-A）。炎症反応は投与後30日目まで持続して観察された（図2-17-B、C）。また肺胞道および肺胞領域の一部で肉芽腫が認められた（図2-17-D）。なお、投与後30日目の時点では明らかな線維化は認められなかった。

TR 群 : CB 群と同様に、投与後 3 日目で細気管支、肺胞道から末梢の肺胞領域まで急性炎症反応が認められた（図 2-20-A）。投与後 7 日目以降も炎症反応は観察されたが、CB 群に比較して軽度であった（図 2-20-B、C）。なお、投与後 30 日目の時点では明らかな線維化は認められなかった。

HM 群：投与後 3 日目で肺胞領域の急性炎症反応が認められたが、結晶質シリカである CB および TR 群よりも炎症反応の程度は軽度であった（図 2-23-A）。投与後 7 日目においても炎症反応は観察されたが（図 2-23-B）、その後、回復傾向を示し、投与後 30 日目では炎症反応はごく軽度しか認められなかった（図 2-23-C）。なお、投与後 30 日目の時点では明らかな線維化は認められなかった。

MT 群：HM 群と同様に、投与後 3 日目で肺胞領域の急性炎症反応が認められたが、結晶質シリカである CB および TR 群よりも炎症反応の程度は軽度であった（図 2-26-A）。投与後 7 日目以降、炎症反応は回復傾向を示し、投与後 30 日目では炎症反応はごく軽度しか認められなかった（図 2-26-B、C）。なお、投与後 30 日目の時点では明らかな線維化は認められなかった。
## ③肺組織における8-OHdGの局在

結晶質シリカと酸化鉄について、気管内投与後の肺組織における酸化的 DNA 損傷の経時的変化を酸化的 DNA 損傷のバイオマーカーである 8-OHdG の免疫組織染色により比較して評価した。

対照群：気道上皮（気管支上皮と肺胞上皮）および炎症細胞において8-OHdGは陽性ではなかった（図2-16-C）。

CB 群：投与後 3 日目以降、炎症反応に伴って気道上皮細胞およびマクロファージ、好中球等の炎症細胞で 8-OHdG の生成が顕著に認められた（図 2-18-A、B）。投与後 30 日目においても気道上皮および炎症細胞における 8-OHdG の生成が持続しており、肉芽腫内の細胞においても 8-OHdG の生成が認められた（図 2-18-C）。

TR 群 : CB 群と同様に、投与後 3 日目以降、炎症反応に伴って気道上皮およびマクロファージ、好中球等の炎症細胞で 8-OHdG の生成が顕著に認められた（図 2-21-A）。投与後 30 日目まで気道上皮および炎症細胞における 8-OHdG の生成が持続していた（図 2-21-B、C）。

HM群：投与後3日目および7日目で、炎症反応に伴って気道上皮およびマクロファージ、好中球等の炎症細胞で8-OHdGの生成が認められた（図2-24-A、B）。しかし、結晶質シリカ（CBとTR）と異なり、投与後30日目では炎症反応の回復に伴い、8-OHdG陽性細胞が減少していた（図2-24-C）。

MT 群：投与後 3 日目で炎症反応に伴って気道上皮およびマクロファージ、好中球等の炎症細胞で 8-OHdG の生成が認められた（図 2-27-A）。しかし、結晶質シリカ（CB と TR）と異なり、投与後 7 日目以降、炎症反応の回復に伴い、8-OHdG の生成も回復傾向を示した（図 2-27-B、C）。