Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## （２）難分解性医薬品を用いた海域における指標微生物の移流・拡散と不活化の評価

下水処理水放流先海域における指標微生物および病原微生物の減衰・不活化はさまざまな環境要因の複合影響により生じている。放流先海域における濃度の減衰は、海流・潮汐・攪拌などによる単純な移流・拡散によって生じる。一方で不活化は、日光やSS、塩分濃度などの環境要因によって影響を受ける。指標・病原微生物の不活化を正確に評価するためには、移流・拡散と分けた濃度の減衰を評価する必要がある。そこで、下水処理場放流水に含まれる人為由来の難分解性医薬品に着目し、放流先海域での移流・拡散を示す適正な医薬品の選定と有効性の評価を行った。また、選定したPPCPsと指標微生物の濃度を比較し、移流・拡散以外の微生物の不活化を評価した。

## （３）擬似太陽光照射による微生物不活化の評価

現在、衛生学的水質基準の見直しが進められ、大腸菌群より指標性が高いと考えられている大腸菌や腸球菌が提案されている。指標性の高い指標微生物を選定するためには、環境要因による不活化の影響を把握する必要がある。環境中における微生物の不活化に影響する要因として温度・塩分・太陽光などが知られている。そのうち、太陽光による微生物の不活化に関する知見は乏しい。そこで、現在指標として用いられている大腸菌群、新たな指標候補である大腸菌および腸球菌、ウイルスの代替指標である体表面吸着ファージ（S-phage）T4、F特異的RNAファージ（F-phage）Qβ、さらに、代表的な腸管系ウイルスでありウイルス指標として着目されているポリオウイルス、アイチウイルスに対して、LEDソーラーシミュレーターを用いた擬似太陽光照射による不活化を評価した。

## （４）放流先海域において検出される大腸菌の塩分耐性の評価

大腸菌は、さまざまな水環境において糞便汚染の指標細菌として国際的に使われている。しかし、H24～25年度の環境研究総合推進費の海域における調査で、大腸菌は、濃度の減衰は見られるものの一定の濃度で検出されることが確認された。このことから、海域においても大腸菌が広範囲に分布している可能性が考えられ、塩分耐性を有していることが示唆された。すなわち、大腸菌は海域では塩分耐性により長期間生存し、沿岸域に広く定常的に分布していることになる。既存の研究においてこのような知見はなく、検出される大腸菌の性状を解析する必要がある。海水と同程度の塩分を添加した特定酵素基質培地を用いたメンブレンフィルター法により検出される大腸菌の測定・単離を行い、その性状を比較・検討した。

## 3 ．研究開発方法

## （１）被災下水処理場および下水処理場放流先海域における病原微生物および指標微生物の消長に関する現地調査

2014年9月から2016年1月の期間に被災した仙台市南蒲生浄化センターおよび放流先海域において合計7回の試料採取を行った。試料採取地点を図(3)-1に示す。処理場内では、流入水、初沈後の塩素添加前、塩素添加後の放流水の3地点で採取を行った。放流先海域では、定点観測地点の定点①～④（下水放流口から0.9～2.2 km）、下水放流水の流軸方向に沿った流軸①～⑤（0.1～0.7 km）、沖合の2 km（8～10月・夏期）または5 km（11～2月・冬期）、および10 kmの11地点で表層水の採取を行った。
図(3)-1. 南蒲生浄化センターおよび放流先海域の調査地点

採取試料の測定項目を表(3)-1に示す。基礎水質項目として、水温、透明度、塩分、電気伝導度（EC）、pH、全塩素、遊離塩素、結合塩素、濁度、SS、有機汚濁水質項目としては、BOD、COD、TOC、DOCを測定した。また指標細菌として、大腸菌群、大腸菌、腸球菌を測定した。細菌は、メンブレンフィルター法（∅47 mm、口径0.45 μm）でフィルター上に捕捉後、特定酵素基質培地（大腸菌群・大腸菌：クロモカルト コリフォーム寒天培地 ES（Merck-Millipore）、腸球菌：M-エンテロコッカス培地（BD））の上で37 ℃24時間、または48時間（腸球菌）培養した。細菌ウイルスであるファージについては、体表面吸着ファージ（S-phage）、F特異的RNAファージ（F-phage）の濃度を培養法で測定した。S-phageの測定には、modified Scholten’s培地で培養したE. coli WG5を、F-phageはtryptone-yeast extract-glucose培地で培養したSalmonella typhimurium WG49を宿主として用いた。海域試料中のファージは低濃度であることが予想されたため、大容量試料の測定が可能であるGrabow and Coubrough(1986) $ ^{1)} $ の手法を用い、100～1000 mlの試料を測定に供した。病原ウイルスは、陰電荷膜吸着法 $ ^{2)} $ 、 $ ^{3)} $ によりウイルスを濃縮した試料からアイチウイルス（AiV）、エンテロウイルス（EntV）、ノロウイルスGI（GI NoV）、ノロウイルスGII（GII NoV）、アデノウイルス（AdV）の遺伝子数を定量PCR法で測定した（但し、AdVは沖合地点では測定していない）。また、近年病原ウイルスの指標ウイルスとして注目されているトウガラシ微斑ウイルス（PMMoV）の遺伝子数も定量PCR法で測定した。
表3(3)-1. 测定项目

分類	測定項目
基礎水質項目	水温、透明度、塩分、EC、pH、全塩素、遊離塩素、結合塩素、濁度、SS
有機污濁水質項目	BOD、COD、TOC、DOC
指標細菌（培養法）	大腸菌群、大腸菌、腸球菌
ファージ（培養法）	Somaticファージ（S-phage）、F-ファージ（F-phage）
ウイルス（定量PCR法）	アイチウイルス（AiV）、エンテロウイルス（EntV）、ノロウイルスGI（GI NoV）、ノロウイルスGII（GII NoV）、アデノウイルス（AdV）、トウガラシ微斑ウイルス（PMMoV）
難分解性医薬品	PPCPs、特に難分解性医薬品を多数含む70種

## （２）難分解性医薬品を用いた海域における指標微生物の移流・拡散と不活化の評価

PPCPsに着目した移流・拡散を正確に評価する指標を選定した。PPCPsに含まれる難分解性医薬品のうち海域において殆ど分解されないものを選定できれば、海域における移流・拡散指標となりうると考えられた。その難分解性医薬品と動態が類似する指標細菌や病原微生物は海域で増殖ないしは不活化が起こらないことが推察された。

図(3)-2. 移流拡散モデルにおける変数の定義

ここで、Q = 放流水量、r = 距離、 $ u_{r} $ = 流速とした。

図(3)-2に示したような半無限の海域（水深 $ H_{l} $ は一定）に下水浄化センターからの放流水（流量Q）が放出されたとする。この時、法線方向の流速 $ u_{r} $ は、

$$ u_{r}=\frac{Q}{\pi rH} $$

である。
一次元円筒座標系の移流拡散方程式は、物質の濃度をC、拡散係数をkとして、

$$ \frac{1}{r}\frac{d}{dr}\bigg(kr\frac{dc}{dr}\bigg)-\frac{Q}{\pi rH}\frac{dc}{dr}=0 $$

と表される。ここで、k=prとおくと、

$$ \frac{1}{r}\frac{d}{dr}\bigg(pr^{2}\frac{dc}{dr}\bigg)-\frac{Q}{\pi rH}\frac{dc}{dr}=0 $$

これを $ C=C_{0} $ のとき r=0 、および $ C=0 $ のとき $ r\to\infty $ の境界条件の下で解くと、

$$ C=C_{0}\Biggl[1-\exp\biggl(-\frac{Q}{\pi H p r}\biggr)\Biggr] $$

したがって、上式を変形すると、

$$ \ln\left(1-\frac{C}{C_{0}}\right)=-\frac{Q}{\pi H p}\frac{1}{r} $$

と表された。すなわち、上式において $\frac{Q}{\pi H p}$ は定数なので、$\ln\left(1-\frac{C}{C_{0}}\right)$ は $\frac{1}{r}$ に比例すると考えられた。

すなわち、移流および拡散の効果でのみ濃度が減少する物質は、図(3)-3の直線上に乗り、移流・拡散の指標として利用可能であると考えられた。

図(3)-3. 移流および拡散の効果でのみ濃度が減少する物質の举動を示す式

そこで、上記の式に $ C_{0}= $ 塩素処理後放流水、C= 海域試料の各PPCPs測定濃度を当てはめ適正な医薬品の選定と有効性の評価を行った。また、選定したPPCPsと指標微生物の濃度を比較し移流・拡散以外の微生物の不活化を評価した。
## （３）擬似太陽光照射による微生物不活化の評価

太陽光による指標微生物および腸管系ウイルスの不活化の評価は、細菌はE. coli（NBRC No. 102203）、腸球菌（Enterococcus faecalis（NBRC No. 100480））、細菌ファージは、F-phageにE. coli phage Qβ（F-phage Qβ）、S-phageにEnterobacteria phage T4（S-phage T4）、腸管系ウイルスはポリオウイルス（PoV）およびAiVを用いる。PBS（-）に懸濁した微生物をタンパク質低吸着性の24 wellプレート（Corning、Cat.No.3473）に水密状態で添加した。石英ガラスプレートで蓋をした状態で緩やかに攪拌しながらLEDソーラーシミュレーター（WSLED 100SC、ワコム電創）を用いて、350～1100 nmの波長域の可視光を太陽光強度と同等になるように照射した。照射時溶液温度が22.4～27.8℃の条件下で、照射開始後、細菌は0、10、20、30、45分、1.0、1.5、2.0、3.0、6.0、12、18、24、36、48時間、ファージとウイルスは0、6、12、24、48、72、96、192時間の試料を回収し、濃度測定を行った。陰性対象区として、同様に用意した試料をアルミ箔で包み25℃条件下で培養し回収・培養を行った。E. coliはクロモカルトコリフォーム寒天培地 ES（Merck-Millipore）、腸球菌はM-エンテロコッカス培地（BD）を用いた寒天培地法で、S-phage T4とF-phage Qβは、それぞれE. coli WG5とSalmonella typhimurium WG49を宿主に用いたプラーク法で、PoVとAiVは、それぞれの感受性細胞であるINT407細胞とBGM細胞を用いたメチルセルロース封入プラーク法で測定した。

## （４）放流先海域において検出される大腸菌の塩分耐性の評価

水環境における塩分耐性を有する大腸菌の存在を確認するために、塩素処理前の初沈後水と沖合2 km、10 kmの試料を対象に、海水と同程度の塩分（人工海水成分、3.5%）を添加したクロモカルトコリフォーム寒天培地 ES（Merck-Millipore）で培養し測定した。さらに、2015年8月、10月、12月、2016年1月に採取した試料において大腸菌と判定された青色コロニーを単離し、tnaA遺伝子の検出を行い、大腸菌か否かの判定を行った。これにより大腸菌の塩分耐性保有状況を調査した。

## 4 ．結果及び考察

（１）被災下水処理場および下水処理場放流先海域における病原微生物および指標微生物の消長に関する現地調査

## 1 ）基礎水質項目

基礎水質項目については、表(3)-2に調査期間全体を通じた項目ごとの最小値、平均値、そして最大値を示した。ただし、透明度は海域のみ、塩素に関わる項目は放流水の放流前後と海域の流軸方向の桜水点5カ所の測定値である。

## 2 ）有機汚濁水質項目

有機汚濁水質項目であるBOD、COD、TOCそしてDOCは同様に表(3)-2に纏められているが、BODについては浄化センター流入水と放流水消毒前後での測定値である。BODは海域では測定されていない。また、H27年2月は有効データが得られなかった。調査期間におけるそれぞれの項目の最大値は流入水の値であり、BODの場合98.00～160.00 mg/Lであった。CODについては流入水と放流水消毒前後では2 mg/Lより高い値を示したが、海域全体ではほぼ2 mg/L以下であり環境基準のA類型を
満していた。このことは浄化センターの復旧期間であっても、有機汚濁に関しては軽微な状況であることを示している。

## 3 ）指標細菌、ファージ、病原ウイルス、トウガラシ微斑ウイルスの動態

図(3)-4から図(3)-10にH26年9月～H28年1月の7回の試料採取における微生物測定結果をそれぞれ示した。H26年9月、H27年8月、12月、H28年1月の採取試料において指標細菌である大肠菌群、大肠菌そして腸球菌においては消毒効果がはっきりと確認された。一方で、H26年11月、H27年2月、10月の採取試料では1 log以上の消毒効果が確認されなかった。しかし、消毒効果が確認されなかったいずれの採取試料においても、沿岸から最近点に位置する海域の採取地点（流軸①）において、2 log以上の減少が確認され、排水に至るまでに残留塩素の効果で減衰していることが示唆された。S-phageとF-phageでは、最大で3 log程度の減少が確認されたが（H26年9月、F-phage）、他の試料においては0.25～2 log程度の減少であり、指標細菌と比較して消毒効果は低かった。また、腸管系ウイルスでは、最大で2 log程度の減衰が確認されたが、殆どの試料において指標細菌とファージに比べて消毒効果はあまり見られない。また、ノロウイルス（NoV）の場合は検出限界以下の場合も多く見られ、消毒効果は明確ではないが、検出された場合には他の病原ウイルスと同様に消毒効果は殆ど無いと考えられる。植物ウイルスであるトウガラシ微斑ウイルス（PMMoV）は腸管系ウイルスに比べ高濃度で存在していた。また、消毒効果は病原ウイルスと同じく殆ど効果が無かった。

海域における指標細菌、ファージ、腸管系ウイルスおよびPMMoVの濃度は、放流口からの距離に比例して減少した。減少の程度はそれぞれの微生物間で差があり、指標細菌が最も減衰が大きく、次にF-phageであり、S-phage、腸管系ウイルスおよびPMMoVは指標細菌に比べて減衰が小さかった。距離に比例して減少する傾向が確認された一方で、沿岸から最遠方地点の沖10 kmにおいても、細菌、ファージ、ウイルスが存在することが確認された。放流先海域における減衰は物理的な移流拡散によるものだけでなく、水温、塩分、日光などの様々な環境要因による微生物の不活化が原因と考えられる。移流拡散効果はすべての微生物について同じであることから、微生物間の減衰の差は環境要因に対する微生物間の感受性の差違によって生じたものと推祭される。したがって、指標細菌は病原ウイルスより海域の環境要因に対して感受性が高いと考えられる。

また、沖10 kmにおいても微生物が観測されることから、それぞれの微生物の環境因子に対する耐性について今後検討する必要がある。
表(3)-2. 基礎水質項目および有機汚濁水質項目の測定結果

测定项目	水深
(m)	水温
(℃)	透明度
(m)	塩分	EC
(mS/m)	pH	全塩素
(mg/L)	游離塩素
(mg/L)	結合塩素
(mg/L)	濁度
(度)	SS
(mg/L)	BOD
(mg/L)	COD
(mg/L)	TOC
(mg/L)	DOC
(Mg/L)
H26年9月	最小值	5.40	19.70	1.50	0.30	55.50	6.80	<0.1	<0.1	<0.1	0.70	1.00	42.00	1.40	1.44	1.35
平均值	13.29	21.55	3.34	21.49	3318.14	7.80	0.36	0.22	0.14	12.59	14.85	73.67	3.92	6.98	5.72
最大值	18.50	23.90	5.90	29.60	4730.00	8.20	0.94	0.39	0.63	84.50	110.00	130.00	8.60	28.10	22.09
H26年11月	最小值	5.40	12.20	3.70	0.30	52.10	7.30	<0.1	<0.1	<0.1	0.60	1.00	30.00	0.80	2.78	2.20
平均值	16.05	13.90	4.78	23.01	3689.91	7.96	<0.1	<0.1	<0.1	9.84	14.23	54.00	2.20	6.42	5.02
最大值	28.40	18.20	7.50	32.20	5230.00	8.20	0.13	<0.1	<0.1	82.10	120.00	100.00	5.40	17.52	13.30
H27年2月	最小值	7.60	7.00	2.10	0.30	59.90	7.30	<0.1	<0.1	<0.1	2.10	3.00	-	0.50	0.88	0.73
平均值	12.22	9.38	2.63	22.71	3639.92	8.08	<0.1	<0.1	<0.1	13.31	16.25	-	17.38	8.05	6.53
最大值	19.00	15.60	3.70	31.80	5080.00	8.30	<0.1	<0.1	<0.1	76.70	100.00	-	100.00	29.15	22.23
H27年8月	最小值	3.70	24.50	2.50	0.30	54.40	7.00	<0.1	<0.1	<0.1	0.70	1.00	38.00	1.40	1.40	1.30
平均值	14.41	26.86	5.65	22.14	3560.19	7.88	0.52	<0.1	<0.1	15.12	14.00	62.67	2.60	7.34	4.27
最大值	27.80	28.10	16.00	29.40	4690.00	8.20	2.30	1.34	0.96	97.80	100.00	110.00	4.80	27.90	17.90
H27年10月	最小值	8.20	17.90	1.80	27.20	3850.00	8.10	<0.1	<0.1	<0.1	1.00	1.00	30.00	1.10	0.80	0.70
平均值	17.72	18.21	3.93	30.25	4732.73	8.14	<0.1	<0.1	<0.1	17.99	20.08	76.67	1.99	6.65	5.24
最大值	28.90	18.70	8.20	31.20	4960.00	8.20	0.10	<0.1	<0.1	157.00	170.00	160.00	3.20	36.40	31.50
H27年12月	最小值	4.80	10.40	2.30	0.30	57.00	7.30	<0.1	<0.1	<0.1	2.00	1.00	30.00	1.90	1.10	1.00
平均值	16.15	12.69	3.44	22.25	3545.69	7.97	0.39	0.15	0.24	9.10	9.71	64.00	2.83	6.26	4.69
最大值	28.70	18.20	4.90	31.70	5000.00	8.30	1.55	0.57	0.98	115.20	130.00	130.00	4.20	35.20	23.70
H28年1月	最小值	5.70	6.80	2.70	0.30	54.40	6.80	<0.1	<0.1	<0.1	2.00	1.00	14.00	1.10	0.90	0.80
平均值	16.21	9.55	3.64	22.33	3661.81	8.07	0.31	0.16	<0.1	7.58	9.53	39.00	1.82	4.99	3.74
最大值	28.50	17.00	4.50	31.80	5060.00	8.40	0.89	0.51	0.58	68.20	100.00	98.00	2.50	22.30	14.50
図(3)-4. 放流先海域における、指標細菌、ファージ、ウイルスの減衰（H26年9月）
図(3)-5．放流先海域における、指標細菌、ファージ、ウイルスの減衰（H26年11月）
図(3)-6. 放流先海域における、指標細菌、ファージ、ウイルスの減衰（H27年2月）
図(3)-7. 放流先海域における、指標細菌、ファージ、ウイルスの減衰（H27年8月）
図(3)-8．放流先海域における、指標細菌、ファージ、ウイルスの減衰（H27年10月）
図(3)-9．放流先海域における、指標細菌、ファージ、ウイルスの減衰（H27年12月）
採水地点と放流口からの距離 [Km]

図(3)-10. 放流先海域における、指標細菌、ファージ、ウイルスの減衰（H28年1月）（F-phageは有効データが取れなかった。）
## （２）難分解性医薬品を用いた海域における指標微生物の移流・拡散と不活化の評価

## 1 ）適正な移流・拡散指標の選定

測定した70種の難分解性医薬品のうち、7回のサンプリングで有効データが得られたPPCPsを抽出した。その結果、Acetaminophen (Ace)、Bezafibrate (Bez)、Caffeine (Caf)、Clarithromycin (Cla)、Crotamiton (Cro)、Diltiazem (Dil)、Disopyramide (Dis)、Indometacin (Ind)、Roxithromycin (Rox)、Sulfamethoxazole (Sulf)、Sulpiride (Sulp)、Theophylline (The)の13種が移流・拡散指標の候補として抽出された。これら13種において、距離に対する放流源濃度（放流水または流軸①の濃度）からの各地点の濃度減少を比較した結果、13試料における相関係数（R）の幾何平均値およびp値の荷重算術平均値がより小さく（直線性が高い）、医薬品の中で流入下水中により多く含まれるCrotamitonが移流・拡散の評価に有効な指標であることが示唆された（表）3-3）。

表(3)-3. 拡散指標の候補として測定した難分解性医薬品の放流口からの距離（r）および濃度（C）をモデル式に当てはめた際の相関係数（R）およびp値

Dil	Dis	Ind	Rox	Sulf	Sulp	The
p	0.016	0.054	0.016	0.022	0.033	0.017	0.088
R	-0.83	-0.77	-0.85	-0.81	-0.81	-0.82	-0.68

Bez	Caf	Cla	Cro	DEET	Dil	Rox	Sulp
p	0.067	0.099	0.065	0.121	0.096	0.158	0.169	0.057
R	-0.67	-0.62	-0.69	-0.62	-0.60	-0.56	-0.53	-0.70

## 2 ）Crotamitonから推定した各微生物の海域での動態評価

本項では、Crotamitonを指標として用い、Crotamitonの混入率（log（C/C₀））と微生物存在率（log（C/C₀））の比較を行い、移流・拡散以外の微生物の不活化を評価した。以下に移流・拡散指標との比較から評価される微生物の不活化に関する概念について述べる。

図(3)-11にH27年10月の調査結果を基にした海域での各微生物の濃度減衰とCrotamitonの濃度減衰を示した。この図より、Crotamitonの減衰は移流拡散効果のみによることから傾き1の直線で表される。また、この図において傾きが1より大きい指標細菌である大肠菌群、大肠菌および腸球菌とF-phageは明らかに移流拡散だけでなく他の環境要因による不活化が起こっていることを示している。また、S-phageも不活化が起こっていると考えられるが、その程度は指標細菌とF-phageに比べて小さい。一方で、傾きが1、または1より小さい場合は、移流・拡散のみによる減衰を示している。
図(3)-11. Crotamitonの濃度減衰に対する微生物の濃度減衰プロット（H27年10月）

病原ウイルスのAiV、EntVそしてAdVと、PMMoVはほぼ傾きがCrotamitonの傾き1に近く、不活化による減衰の程度は低いと考えられる。このことから、これらの微生物は海域の環境要因に対して抵抗力を有していると考えられる。

図(3)-12にCrotamitonと比較した海域での各微生物の減衰直線の傾きを示した。傾きの図より、明らかに指標細菌とファージは海域で不活化が起こっており、不活化の効果は指標細菌の方が大きい。それに比べて病原ウイルスとPMMoVは傾きが1近くに散在しており、海域においてCrotamitonと類似した動態を示している。傾きにはかなりのばらつきもあるが、病原ウイルスは海域などの環境中での増殖は考えられないことから、不活化による減衰は小さいと考えて良いと判断できる。ただし、細菌、ファージは生菌数、感染性を測定しているが、ウイルスは遺伝子を定量し感染価を測定してないことから、ウイルスの不活化を考える場合には今後の検討が必要である。

以上のことから、放流先海域での移流・拡散を示す適正な指標としてCrotamitonが有効性であることが確認された。また、移流・拡散指標と微生物濃度の比較により細菌・ファージの移流・拡散以外の不活化による減衰が生じていることが示唆された。
## （３）擬似太陽光照射による微生物不活化の評価

擬似太陽光照射によるPBS(-)中における各微生物生残率を図(3)-13～(3)-18に示す。大腸菌は照射開始45分後において約1 logの減少が確認され、以降、減少し続け12時間後に添加した大腸菌が検出限界以下となった（約6.5 logの減少）。腸球菌は照射開始3hrで約1 logの減少が確認され、6時間で約2 log、12時間後には添加した腸球菌が検出限界以下となった（約7.7 logの減少）。大腸菌、腸球菌は12時間後以降において全てで検出限界以下となったのは同じ傾向であったが、減少速度は大腸菌が速いことが確認され、腸球菌は大腸菌よりも太陽光に対する耐性が高いことが確認された。ファージは、F-phage Qβ、S-phage T4共に照射後24時間で約1 logと1.5 logの減少が確認され、照射開始後96時間で添加したファージが検出限界となった（共に約5 logの減衰）。添加したファージが検出限界以下となるまでの速さは同じであったが、照射開始12～72時間における減少速度はS-phage T4が速いことが確認された。海域におけるファージの検出は、S-phageの方が比較的濃度が高く、検出率も高い傾向が確認されている（図(3)-4～図(3)-10）。一方で、太陽光に対しては、S-phageの方が感受性が高いことが示唆されたことから、海域におけるF-phageの減少には太陽光以外の環境要因がS-phageよりも強く影響している可能性が示唆された。細菌とファージの太陽光による減少を比較すると、細菌が太陽光に対して感受性が高いことが確認された。代表的な腸管系ウイルスであるPoVとAiVでは、照射開始後192時間でそれぞれ約1.5 logと約2.0 logの減少が確認され、減少に僅かな差があったものの、減少速度に差はなかった。また、ウイルスは細菌、ファージに比べ太陽光に対する耐性が著しく高いことが確認された。太陽光に対する感受性は、細菌＞ファージ＞ウイルスであることが確認された。前項の海域における移流・拡散指標による微生物の減衰を評価した結果においても細菌がファージ、ウイルスよりもより減衰傾向が高いことが確認され、本項の太陽光による減衰結果と一致している。環境中にはさまざまな不活化要因が存在しているが、太陽光というひとつの不活化要因による影響の結果からも、太陽光による不活化を考慮する必要がある環境では、ウイルスの指標として細菌を使用することは困難であると考えられる。また、ファージが腸管系ウイルスの代替指標の候補として挙げられているが、環境中の他の不活化要因の影響についてさらに検証を進め検討していく必要がある。
図(3)-13. E. coliにおける擬似太陽光照射後の生産率

図(3)-14. Enterococcus faecalisにおける擬似太陽光照射後の生残率
図(3)-15. F-phage Qβにおける擬似太陽光照射後の生残率

図(3)-16. S-phage T4における擬似太陽光照射後の生残率
図(3)-17. PoVにおける擬似太陽光照射後の生残率

図(3)-18. AiVにおける擬似太陽光照射後の生残率
## （４）放流先海域において検出される大腸菌の塩分耐性の評価

処理場試料の塩素添加前・初沈後水、海域試料の沖2 km、沖10 kmにおける、塩分非添加培地、および塩分添加クロモカルトコリフォーム寒天培地を用いた大腸菌の検出結果を図(3)-19に示す。H27年2月の試料は、沖2 km、沖10 kmの試料採取を行っていないため実施していない。初沈後水において、H26年9月～H27年10月の試料において塩分耐性を有する大腸菌が大腸菌と同等の濃度で検出された。このことから、下水処理場の流入水には塩分耐性を有する大腸菌が高濃度に存在することが確認された。しかし、H27年10月および12月の試料からは検出されなかった。南蒲生浄化センターにおいてH27年11月に生物処理が再開されたことが塩分耐性を有する大腸菌が検出されなくなったことに影響している可能性がある。沖2 km、沖10 kmの試料において、H26年9月、H27年8月の試料から塩分耐性を有する大腸菌が検出された。そのうち、H26年9月の沖2 km、沖10 km、H27年8月沖10 kmでは塩分耐性を有する大腸菌がより高濃度で検出された。

初沈後水ではH27年8月、10月、沖2 km、沖10 kmではH27年8月の試料から検出された塩分耐性を有する大腸菌と判定された青色コロニーを単離し、大腸菌か否か正確に確認するためにtnaA遺伝子の検出を行った。初沈後水では各試料30コロニー、沖2 km、沖10 kmでは検出されたコロニー全てを釣菌し単離した株に対して実施した。単離株におけるtnaA遺伝子検出結果を表(3)-4に示す。初沈後水から単離した大腸菌と判定された塩分耐性を有する細菌株のうちH27年8月、10月の試料においてそれぞれ19菌株（63.3％と70.4%）からtnaA遺伝子が検出され大腸菌と確認された。一方で、沖2 km、沖10 kmの試料から単離した大腸菌と判定された塩分耐性を有する細菌株からはtnaA遺伝子は検出されず、大腸菌ではないことが確認された。このことから下水処理場には塩分耐性を有する大腸菌が大量に存在しているものの、海域からは検出されないことが確認された。しかし、下水処理場試料には塩分耐性を有する大腸菌が豊富に存在することから下水処理水中にも存在している可能性はあり、低濃度ではあるが海域にも塩分耐性を有する大腸菌が存在する可能性がある。一方で、塩を添加した酵素基質特定培地において大腸菌とされたもののうち大腸菌ではない細菌が含まれていることが確認されたことから、塩を添加した酵素気質特定培地による大腸菌検出は正確性に欠ける可能性がある。
図(3)-19. 塩非添加培地および塩添加区培地から検出された大肠菌濃度
表(3)-4. 单離細菌株からの tnaA 遺伝子検出結果

採取地点	採取日	釣菌口口二一数	单離菌株数	tnaA遺伝子檢出菌株数（%）
初沈後水	H27年8月	30	30	19 (63.3)
H27年10月	30	27	19 (70.4)
沖2 km	H27年8月	15	0	0 (0.0)
沖10km	H27年8月	27	0	0 (0.0)

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

これまで海域環境中での病原微生物を含む環境微生物の挙動に関する研究は少なからず行われて来たが、主に大肠菌群を代表とする指標細菌に限られていた。その要因として、海域環境に存在する病原微生物起因の感染症は主に病原細菌によるものと考えられて来たからと判断される。しかしながら、近年ノロウイルスやA型肝炎ウイルスなどの病原ウイルスによる感染症が注目されて来ており、これまでの指標細菌による衛生的水質の評価のみでは対応できなくなって来ている。

そこで、本研究においてはこれまで研究が行われて来ている指標細菌の大肠菌群、大肠菌、腸球菌だけでなく、細菌ウイルスであるS-phageとF-phage、植物ウイルスのトウガラシ微斑ウイルス、そして病原ウイルスであるアイチウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス、アデノウイルスを仙台市南蒲生浄化センターの放流水地先海域で調査を行い、これらの環境微生物の挙動の比較を行った。このことにより、指標細菌の挙動はファージ、植物ウイルス、病原ウイルスの挙動とは異なることが、難分解性医薬品の挙動と比較することにより明らかになった。このことから、海域における病原ウイルス汚染の指標として、大肠菌群などの従来の指標細菌の有効性が疑われる結果が明らかとなった。

一方、病原ウイルスの挙動はF-ファージとトウガラシ微斑ウイルスの挙動と近くこれらの微生物が海域での病原微生物の指標微生物として有効である可能性を示すことが出来た。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

これまで海水浴などのレクリーションの安全性評価においては、海域での衛生学的水質基準である大肠菌群数で評価されている。しかしながら、海域だけでなく、河川や湖沼の環境基準においても大肠菌群の有効性が検討されているところであり、本研究で得られた成果は大肠菌群数による水の衛生的安全性評価の検討に大いに貢献すると考えられ、河川、湖沼、海域の大肠菌群数による環境基準の見直しにとって多くの知見を提供できた。
## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない。

## くその他誌上発表（査読なし）>

1）片山浩之、安井宣仁、猪又明子、田中宏明、岸田直裕、原本英司、渡部徹、真砂佳史、浅田安廣、端昭彦、佐野大輔、井原賢、稲葉愛美：水環境学会誌、37、12、424-433（2014）「水中の健康関連微生物に関する研究動向」

2）井原賢、稲葉愛美、佐野大輔、臨床と微生物、42、685-689（2015）

「衛生環境工学分野におけるマイクロバイオーム研究」

## （2） 口頭発表（学会等）

1）稲葉愛美、山下尚之、井原賢、田中宏明、三浦尚之、真砂佳史、風間しのぶ、端昭彦、片山浩之、井上健太郎、大村達夫：第50回日本水環境学会年会（2016）

「難分解性医薬品を用いた海域における指標微生物の希釈・拡散と不活化の評価」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

京都大学G報告書に記載

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) W. O. K. Grabow and P. Coubrough: Applied and Environmental Microbiology, 52(3), 430–433 (1986) “Practical Direct Plaque Assay for Coliphages in 100-ml Samples of Drinking Water.”

2) H. Katayama, A. Shimasaki and S. Ohgaki: Applied and Environmental Microbiology, 68(3), 1033–1039 (2002) “Development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and Norwalk virus from coastal seawater.”
3) A. Hata, K. Matsumori, M. Kitajima and H. Katayama: Food and environmental Virology, “Concentration of Enteric Viruses in Large Volumes of Water Using a Cartridge-Type Mixed Cellulose Ester Membrane.”
# Study on occurrence of waterborne pathogens in water environment and applicability of indicator microorganisms against pathogens

Principal Investigator: Hiroaki TANAKA

Institution: Kyoto University

1-2 Yumihama, Otsu, Shiga, 520-0811, JAPAN

Tel: +81-77-527-6222 / Fax: +81-77-524-9869

E-mail: htanaka@biwa.eqc.kyoto-u.ac.jp

Cooperated by: The University of Tokyo, Tohoku University

## [Abstract]

Key Words: Pathogenic virus, Fecal indicator bacteria, Water environment, Lake Biwa, Sendai coastal area, Tokyo bay, Wastewater treatment plant effluent

World Health Organization (WHO) has been implementing the water quality management for pathogen control based on the fecal indicator bacteria (FIB) as well as the risk-based framework, Quantitative Microbial Risk Assessment (QMRA). QMRA was developed to control the risk from protozoa and viruses in waters, and has been applied to water quality standards for such as drinking water, reclaimed water for agricultural usage, and recreational or bathing waters. United States Environmental Protection Agency (USEPA) is also promoting water quality management based on QMRA framework.

On the other hand, in Japan, Total coliform (TC) has been still used as a fecal indicator in environmental water quality standards, and viewpoint for pathogenic virus control is still missing. Ministry of the Environment is now rethinking the environmental water quality standard to apply $ E.\ coli $ as FIB instead of TC. However, viewpoint for pathogenic virus control is still missing.

From these backgrounds, we aimed to investigate 1) the occurrence of FIBs and viruses include human enteric viruses in various environmental waters; and 2) the validity of FIBs as indicators for human enteric viruses in waters. We measured concentrations of these microbes in lake and coastal waters by using qPCR, culture methods, and next generation sequencing through two years monitoring, and analyze the correlation between them. We also compared the decrease of FIBs and human enteric viruses in coastal waters, and investigated the environmental factor that affect the attenuation of these bacteria and viruses in water environment.

We found that there was no correlation between the concentrations of FIBs (TC and E. coli) and human enteric viruses in lake water. In addition, decreasing pattern of concentrations of human enteric viruses in coastal water were different from those of FIBs. Concentrations of human enteric viruses decreased depending on the dilution of
wastewater discharge from the wastewater treatment plant in receiving water body, however, concentration of FIBs decreased by the dilution of wastewater discharge as well as inactivation of them. These results indicate that FIBs are not appropriate indicators for human enteric viruses in environmental waters. On the other hand, Aichi virus and Pepper mild mottle virus were detected with higher frequency and strong abundant compared to GI and GII NoV, and Enterovirus, and seemed to be useful indicators for human enteric viruses.

We also found that $ E.\ coli $ is able to proliferate in environmental water, which means that $ E.\ coli $ is not appropriate indicator for fecal contamination in environmental water. Further study is needed to investigate validity of $ E.\ coli $ as FIBs.
## 第 5 章 諸外国の関係機関との協力

### 1. 概説

米エンロン及び米ワールドコム等における会計不祥事に端を発して、会計監査の品質の確保及び向上の必要性が認識され、平成14年以降、世界各国で会計プロフェッションから独立した監査監督機関が設立された。

こうした中、各国における監査監督機関の情報交換等を行うことを目的として、金融安定化フォーラム（FSF : Financial Stability Forum）（注）主催により、平成16年9月に第1回監査人監督者会議がワシントンD.C.において非公式に開催され、我が国を含む9か国（日、米、英、独、仏、伊、加、豪、シンガポール）が参加した。その後も非公式会合として開催回数を重ねたが、常設の国際会合設立の機運が高まり、平成18年9月にパリで開催された第5回監査人監督機関会議において監査監督機関国際フォーラム（International Forum of Independent Audit Regulators：以下、「IFIAR」）の設立が正式に承認された。その最初の会合が、審査会により、平成19年3月に東京で開催され、22か国の監査監督当局が参加した。その後、平成27年3月までに14回の会合が開催されており、IFIAR加盟国数は、平成27年3月時点で51か国・地域となっている。

審査会は、IFIARにおける活動への積極的な参画を通じた各国の監査監督当局との連携を図るとともに、各国の監査監督機関等と個別の意見交換等を行うことにより、監査の品質の確保・向上に向けた国際的な協力関係の構築・充実に努めている。

（注）FSF は、平成 21 年 4 月に開催された第 2 回金融・世界経済に関する首脳会合（ロンドン・サミット）の宣言を踏まえ、より強固な組織基盤と拡大した能力を持つ組織として、金融安定理事会（FSB : Financial Stability Board）に再構成されている。

## 2 ．監査監督機関国際フォーラム（IFIAR）

## （1） 組織等

ア 目的

IFIARは、憲章（Charter）において、以下を活動目的としている。

① 監査事務所の検査に焦点を当て、監査市場の環境に関する知識や監査監督活動の実務的な経験を共有すること。

② 監督活動における協力及び整合性を促進すること。

③ 監査の品質に関心を有する他の政策立案者や組織との対話を主導すること。

④ 個々のメンバーの法令で定められた任務及び使命を考慮の上、メンバーにとって重要事項に関する共通かつ一貫した見解又は立場を
形成すること。

## 亻 組織

IFIARは、メンバー資格を有する各国の監査監督当局により構成され、その意思決定は、原則として、全メンバー当局が参加する会合（plenary meeting）において行われる。IFIARの活動を円滑に進めるため、個人資格としての議長及び副議長を置き、議長及び副議長への支援及び助言を行う機関として諮問委員会（Advisory Council）が設置されている。平成27年3月末現在、諮問委員会はアブダビ、オーストラリア、カナダ、フランス、シンガポール、スリランカ、イギリスの7か国で構成されている。

また、IFIARには、平成27年3月末現在、6つのワーキング・グループが設けられており、それぞれの目的等は以下のとおりである。

## （ア）6大監査ネットワーク・ワーキング・グループ

6 大監査ネットワーク（注）とグローバルな監査の品質管理のあり方について意見交換を行うことを目的としている。「グローバル監査ネットワークの品質管理体制」等のテーマについて、各ネットワークと継続的に対話し、品質管理における改善状況や各ネットワークの組織展開状況を当局間で共有している。

（注）6 大監査ネットワークは、Deloitte Touche Tohmatsu、Ernst & Young、KPMG、PricewaterhouseCoopers、BDO 及び Grant Thornton で構成されている。

## （イ）基準調整ワーキング・グループ

国際監査・保証基準審議会（IAASB：International Auditing and Assurance Standards Board）における国際監査基準の設定や、監査業務に係る基準設定主体との連携等について、意見交換を行うことを目的としている。

## （ウ）検査ワークショップ・ワーキング・グループ

検査官の技能研鑽と検査手法・経験の共有を目的としており、毎年、IFIAR 検査ワークショップを開催している。また、検査ワークショップの企画・調整及び事後的な評価等も行っている。

## （エ）投資家・利害関係者ワーキング・グループ

監査報告書のユーザーである投資家及びその他利害関係者と、監査品質、監査報告書のあり方等について対話することを目的としており、IFIAR 会合における投資家代表との意見交換等の企画・調整等も行っている。
## （２）IFIAR の主要な取組みと日本の貢献

## ア 本会合

第 14 回会合（ワシントン D. C. 会合）

平成26年4月7日から4月9日の日程で、米公開会社計監督委員会（PCAOB: Public Company Accounting Oversight Board）の主催で開催された。

当該会合では IFIAR 恒久的事務局の設立が議論されたほか、監査法人の経済・ビジネスモデルや監査品質を評価する上での課題等について議論が行われた。また、我が国から、株式会社東芝監査委員会議長の村岡富美雄氏を投資家代表として推薦し、同氏に会合へ参加頂いた（P148 資料 4－1、P149 資料 4－2 参照）。

《監査監督機関国際フォーラム（IFIAR）本会合開催実績》

期間	場所	參加当局
第1回	平成19年3月22・23日	東京	22 か国・地域
第2回	平成19年9月24・25日	トロント	21 か国・地域
第3回	平成20年4月9～11日	オスロ	22 か国・地域
第4回	平成20年9月22～24日	ケープタウン	21 か国・地域
第5回	平成21年4月27～29日	バーゼル	30 か国・地域
第6回	平成21年9月14～16日	シンガポール	29 か国・地域
第7回	平成22年3月22～24日	アブダビ	30 か国・地域
第8回	平成22年9月27～29日	マドリッド	37 か国・地域
第9回	平成23年4月11～13日	ベルリン	34 か国・地域
第10回	平成23年9月26～28日	バンコク	29 か国・地域
第11回	平成24年4月16～18日	釜山	32 か国・地域
第12回	平成24年10月1～3日	ロンドン	39 か国・地域
第13回	平成25年4月15～17日	ノールドワイク	42 か国・地域
第14回	平成26年4月7～9日	ワシントンD.C.	44 か国・地域

## イ 中間会合

平成25年以降、本会合は年1回の開催とし、別途オフィサー、諮問委員会メンバー及びワーキング・グループ議長等に参加者を絞った中間会合を開催して、IFIAR業務の管理等に関するハイレベルな議論を行っている（平成26年はトロントで開催）。
## ウ 6 大監査ネットワーク・ワーキング・グループ

監査法人の収益構造の変化、人材戦略、国際的監査事務所のネットワークのガバナンス等を含む、監査法人のビジネスモデルについて活発に議論が行われた。また、グローバルに展開している多国籍企業の本社や海外子会社等のグループ監査の有効性を評価するため、大手ネットワーク傘下の監査法人（メンバーファーム）に対する各国監査監督当局による初の国際的な協同検査を、日本が主導して実施した。

## エ 検査ワークショップ

第1回 IFIAR 東京会合において、各国当局の検査手法や検査における課題等を共有し、検査官の技能研鑽を図ることを目的として、IFIAR メンバーの検査官を主体として検査ワークショップを開催することが承認された。以降、検査ワークショップ・ワーキンググループの企画・調整により、毎年開催されている。

今年度は、平成27年3月2日から3月4日の日程で、英国財務報告評議会（FRC：Financial Reporting Council）の主催により開催され、日本を含め37か国・地域から140名以上の検査官等が参加した。

《IFIAR 検査ワークショップ開催実績》

期間	場所	参加当局
第1回	平成19年5月30・31日	アムステルダム	22 か国・地域
第2回	平成20年1月29・30日	ベルリン	20 か国・地域
第3回	平成21年2月11～13日	ストックホルム	25 か国・地域
第4回	平成22年2月9～12日	パリ	31 か国・地域
第5回	平成23年2月23～25日	ワシントン	30 か国・地域
第6回	平成24年3月5～7日	アブダビ	32 か国・地域
第7回	平成25年3月4～6日	チューリッヒ	38 か国・地域
第8回	平成26年3月10～12日	クアラルンプール	36 か国・地域
第9回	平成27年3月2～4日	ロンドン	37 か国・地域

## （３）恒久的事務局誘致への対応状況

IFIAR は、近年、当局間の意見交換フォーラムから国際機関としての実質的な活動を伴う組織へと急速に成長するとともに、金融安定理事会(FSB)、証券監督者国際機構（IOSCO）、バーゼル銀行監督委員会（BCBS）等、他の国際機関との関係強化の必要性も高まっている。このような背景から、平
成 26 年 4 月、ワシントン本会合において恒久的事務局設立が議論され、その後、IFIAR メンバー当局に対し事務局の立地国に係る募集が行われた。

審査会は、IFIAR に対する中長期的な貢献、日本のプレゼンス向上の観点から、東京への恒久的事務局の誘致を目指して立候補を行い、平成 27 年 1 月、審査会ウェブサイトにおいて立候補の旨を公表した（P150 資料 4－3 参照）。これを受け、平成 27 年 4 月までに、国内外の民間団体より、恒久的事務局の東京誘致を支持する旨のプレスリリースが公表された（P151 資料 4－4 参照）。

（注）恒久的事務局の東京誘致を支持するプレスリリースを公表した民間団体

日本取引所グループ、日本公認会計士協会、全国銀行協会、日本経済団体連合会、経済同友会、日本監査研究学会、国際銀行協会（IBA）、在日米国商工会議所（ACCJ）、欧州ビジネス協会（EBC）、米日経済協議会（USJBC）、日米経済協議会（JUSBC）

審査会及び金融庁は、IFIARの政策的議論への貢献強化、IFIARメンバー当局への働きかけ、IFIAR関連会合の東京開催（平成27年10月予定）等を通じ、恒久的事務局の誘致活動を展開している。

### 3. 二国間での協力

## 各国当局等との意見交換

企業活動のグローバル化を踏まえ、連結財務諸表監査における海外監査法人の監査結果の利用等、国境を越えた監査手続きの品質確保がこれまで以上に重要になっており、グローバルに効率的で効果的な監査監督体制の構築を図る上で各国当局等との連携強化が不可欠となっている。審査会は、IFIAR 会合及び各ワーキング・グループへの参加を通じて、各国当局との知見の共有及び連携強化を積極的に図っている。その他、IFIAR における活動以外にも、監査や検査に係る課題や国際的に活動する監査事務所に係る情報共有等を目的として、二国間ベースで各国の監査監督当局等との意見交換を随時行い、各当局との協力関係の構築・充実に努めている。

また、審査会及び金融庁は、平成26年5月23日に英国財務報告評議会（FRC）との間で、監査監督上の協力に関する書簡を交換した。当該書簡の交換により、監査監督上の情報交換を円滑に行うことが可能となった（P159資料4－5参照）。

さらに、平成26年6月11日、審査会及び金融庁は、平成21年9月14日に公表した「外国監査法人等に対する検査監督の考え方」(注)に基づき、オランダ金融市場庁（AFM）との間で相互依拠を確認し、外国監査法人等に関する監査監督について、原則として、相互に依拠する旨を公表した（P166資料4－6参照）。