Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
図 2-80-A AM1000 群、投与後 540 日目 肺、HE 染色 矢印は肉芽腫を示す。

図 2-81-A AM1000G 群、投与後 540 日目 肺、HE 染色

図2-80-B AM1000群、投与後540日目 肺、Masson's trichrome 染色 肉芽腫（矢印）とその周囲の線維化が認め られた。

図2-81-B AM1000G群、投与後540日目 肺、Masson's trichrome 染色 ごく一部に投与粒子の沈着が認められた。
図 2-82-A AM1200 群、投与後 540 日目 肺、HE 染色 矢印は肉芽腫を示す。

図 2-83-A AM1400 群、投与後 540 日目 肺、HE 染色

図2-82-B AM1200群、投与後540日目 肺、Masson's trichrome 染色 肉芽腫（矢印）の周囲で線維化が認められ た。

図 2-83-B AM1400 群、投与後 540 日目 肺、Masson's trichrome 染色
## ③18 ヶ月観察群の腫瘍発生率

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 18 ヶ月観察した肺腫瘍および中皮腫発生率を表 2-1 に示した。

AM 焼成物(AM1000、AM1200、AM1400)およびその粉砕物(AM1000G)では、肺腫瘍の発生は認められず、腫瘍発生リスクの明らかな増加は認められなかった。

表 2-1 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1400 の気管内投与後のラット肺腫瘍発生率（投与後 18 ヶ月まで）

試料	投与量	肺腺腫発生率(%)	肺癌発生率(%)	中皮腫発生率(%)	肺の線維化
AM	2mg	0/10 (0%)	0/10 (0%)	0/10 (0%)	+
AM1000	2mg	0/10 (0%)	0/10 (0%)	0/10 (0%)	+
AM1000G	2mg	0/10 (0%)	0/10 (0%)	0/10 (0%)	—
AM1200	2mg	0/10 (0%)	0/10 (0%)	0/10 (0%)	+
AM1400	2mg	0/10 (0%)	0/10 (0%)	0/10 (0%)	—
生理食塩水	—	0/10 (0%)	0/10 (0%)	0/10 (0%)	—
## 2 ）気管支肺胞洗浄液（BALF）の細胞分画

## ①BALF 中炎症細胞数の変化

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの BALF 中に存在する炎症細胞数の変化を図 2-84、85 に示した。

投与初期に炎症が見られた AM、AM1000 では、投与後、観察日数の経過に伴い炎症の回復傾向が見られ、投与後 540 日目では対照群の好中球数と有意差は認められなかった。また投与初期から AM や AM1000 に比べて好中球の出現が軽微であった焼成粉砕物である AM1000G は、全期間を通じて炎症反応は軽微なものであり、投与後 540 日目では対照群と有意差も示されなかった（図 2-85）。

一方、AM1200 と AM1400 は、投与初期には AM と AM1000 に比較して好中球数が少ない傾向を示したが、投与後 30 日目から急激に好中球数が増加し、投与後 540 日目でも好中球数の増加が持続していた（図 2-85）。

図 2-84 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの BALF 中炎症細胞数の経時的変化 (AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である)
図 2-85 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの BALF 中好中球数の変化

(AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である)

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\mathrm{^{\#}}$, $p<0.05$; $\mathrm{^{\#\#}}$, $p<0.01$; $\mathrm{^{\#\#\#}}$, $p<0.001$

AM vs. AM1000 : $ ^{} $ , p < 0.05; $ ^{} $ , p < 0.01; $ ^{} $ , p < 0.001
## ②BALF 细胞像

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目の BALF 中に回収される細胞像を図 2-86 に示した。

対照群の BALF 中には全観察期間を通して肺胞マクロファージが主に観察された。投与初期に炎症が観察された AM、AM1000 では観察日数の経過に伴い回復傾向を示し、投与後 540 日目では対照群同様に肺胞マクロファージが主に観察された。また AM1000G は全期間を通して好中球の増加は軽微なものであり投与後 540 日目では対照群と同様に主に肺胞マクロファージが観察された。

一方、投与初期は AM や AM1000 に比べて好中球の出現が少なった AM1200、AM1400 は投与後 30 日目で急激に好中球が増加し、その後観察日数の経過と共に回復傾向を示すものの 540 日目では対照群に比べて好中球の残存が認められ、炎症が長期間持続していたことが示唆された。

control

AM

AM1000

AM1000G

AM1200

AM1400

図 2-86 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目の BALF 中に回収される細胞像 矢印（→）は好中球を示す。
## 3 ）BALF 中たんぱく濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの BALF 中たんぱく濃度の経時的変化を図 2-87 に示した。

投与後3日目では、AM1000G以外、AMとAM焼成物については対照群に比較して有意にタンパク濃度の上昇が観察され、特に、AM、AM1000は顕著であった $ (p<0.01,0.001) $ 。その後、AMとAM焼成物のたんぱく濃度は時間の経過と共に減少する傾向が見られ、投与後180日目以降では対照群との間に有意差は示されなかった。

すなわち、BALF 中たんぱく濃度は、有害性のある AM と AM 焼成物に対して、投与初期の生体影響を評価できる指標であった。本研究において、AM1000G は BALF 中たんぱく濃度に変化がなく、有害性の低い物質であることを明らかにした。

図 2-87 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの BALF 中たんぱく濃度の変化 (AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である) 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001 AM群との比較：*,p<0.05;##,p<0.01;##,p<0.001
## 4 ）BALF 中 LDH 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの BALF 中 LDH 濃度の経時的変化を図 2-88 に示した。

BALF 中 LDH 濃度は、投与後 3 日目の AM と AM1000 は対照群に比較して顕著な上昇傾向を示し $ (p < 0.001) $ 、この上昇は一過的なもので投与後 7 日目からは対照群とほぼ同じレベルにまで回復した

一方、AM1200とAM1400では投与後30日目と90日目にLDH濃度が上昇し、その後回復傾向が示された。AM、AM1000の構成物質が酸化鉄であるのに対し、AM1200、AM1400の構成物質は酸化鉄に加え結晶質シリカも生成されていることから、この挙動の違いは構成物質の相違であることが示唆された。

すなわち、BALF 中 LDH 濃度は、有害性のある AM とその焼成物に対して、投与初期の生体影響を評価できる指標であった。本研究において、AM1000G は BALF 中 LDH 濃度に変化がなく、有害性の低い物質であることを明らかにした。

図 2-88 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの BALF 中 LDH 濃度の変化

(AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である)

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\begin{aligned}\#,p<0.05;\quad\#\#,p<0.01;\quad\#\#\#,p<0.001\end{aligned}$
## 5 ）BALF 中サイトカイン濃度

## ①BALF 中 MCP-1 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400をそれぞれ2mg/mlを一回気管内投与後540日目までのBALF中MCP-1濃度の経時的変化を図2-89に示した。

投与後3日目でAMとAM1000は対照群に比較して有意にMCP-1濃度の上昇が観察された $ (p<0.05,0.001) $ 。AMとAM1000のMCP-1濃度は投与後7日目以降で急速に減少する傾向が示された。

これに対して、AM1200とAM1400は投与後3日目と7日目の変化は僅かであったが、30日目以降の上昇傾向は特異的な傾向が示された。しかし、投与後540日目の値は共通して対照群の値に対して差異は認められなかった。

BALF 中 MCP-1 濃度の検査において、AM1000G は一貫して変化は明確に認められず、有害性の低さを示唆していた。

図 2-89 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの BALF 中 MCP-1 濃度の変化

(AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である)

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM 群との比較：$\mathrm{^{\#}}$, $p<0.05$; $\mathrm{^{\#\#}}$, $p<0.01$; $\mathrm{^{\#\#\#}}$, $p<0.001$

AM vs. AM1000 : $ ^{} $ , p < 0.05; $ ^{} $ , p < 0.01; $ ^{} $ , p < 0.001
## ②BALF 中 TNF- $ \alpha $ 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400をそれぞれ2mg/mlを一回気管内投与後540日目までのBALF中TNF- $ \alpha $ 濃度の経時的変化を図2-90に示した。

投与後 3 日目で AM と AM1000 は対照群に比較して有意に TNF- $ \alpha $ 濃度の上昇が観察された (AM, p < 0.05; AM1000, p < 0.01)。そして、AM と AM1000 の TNF- $ \alpha $ 濃度は投与後 7 日目以降で急速に減少する傾向が示された。

一方、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 における BALF 中 TNF- $ \alpha $ 濃度の経時的変化は顕著な動態はなく、AM1000G も同様であった。

この研究から、BALF 中の TNF- $ \alpha $ 濃度は、有害性物質ばく露において、初期の影響評価を可能とするものと判断された。

図 2-90 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの BALF 中 TNF- $ \alpha $ 濃度の変化

(AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である)

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\begin{aligned}\#,p<0.05;\quad\#\#,p<0.01;\quad\#\#\#,p<0.001\end{aligned}$
## ③BALF 中 IL-6 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの BALF 中 IL-6 濃度の経時的変化を図 2-91 に示した。

BALF 中 IL-6 濃度の測定では、同様のサイトカインである MCP-1 と比較して特徴的な経過を観察や評価することはなかった。

対照群および AM、AM 焼成物でほぼ同じ挙動を示し、なお、投与後 540 日目を経過すると AM、AM1000、AM1400 においては、対照群に比較してやや上昇している程度の結果であった。

図 2-91 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの BALF 中 IL-6 濃度の変化

(AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である)

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\mathrm{^{\#}}$, $p<0.05$; $\mathrm{^{\#\#}}$, $p<0.01$; $\mathrm{^{\#\#\#}}$, $p<0.001$
## 6 ）血清中サイトカイン濃度

## ①血清中 MCP-1 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの血清中 MCP-1 濃度の経時的変化を図 2-92 に示した。

AM と AM 焼成物において、投与後 180 日目までの経時的な血清中 MCP-1 濃度を観察した結果、被験試料においては対照群とほぼ同一な傾向を示した。なお、AM1400 では投与後 540 日目の濃度がやや上昇している結果であった。

BALF 中 MCP-1 濃度の測定は、被験試料間の差異を鋭敏に評価することが可能であったが、血清中 MCP-1 濃度は BALF 中 MCP-1 濃度に比較して有効性は低いものと考えられた。

図 2-92 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの血清中 MCP-1 濃度の変化

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\mathrm{^{\#}}$, $p<0.05$; $\mathrm{^{\#\#}}$, $p<0.01$; $\mathrm{^{\#\#\#}}$, $p<0.001$
## ②血清中 IL-6 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの血清中 IL-6 濃度の経時的変化を図 2-93 に示した。

血清中 IL-6 濃度は、対照群を含めて全ての被験試料群において、投与後 30 日目まで高値を示した。しかし、90 日目以降の値は急速に低下して、投与後 540 日目の値は共通して、この検査で最も低い値となり、その原因は不明であった。この検査法においては、被験試料群における生体影響の比較は困難と考えた。

図 2-93 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの血清中 IL-6 濃度の変化

(AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である)

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM 群との比較： $ ^{\#} $ ，p < 0.05； $ ^{\#\#} $ ，p < 0.01； $ ^{\#\#\#} $ ，p < 0.001
対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

## 7 ）血清中酸化ストレス度と抗酸化力

①酸化ストレス度（d−ROMs）

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの血清中 d-ROMs 値の経時的変化を図 2-94 に示した。

対照群、AMおよびAM1000G以外の焼成物で投与後180日目から血清中d-ROMs値が上昇傾向を示した。血清中d-ROMs値は全身状態を反映する値であることが考えられ、投与後540日目を経過すると加齢など他の交絡因子の影響も関与していると思われた。そのため540日目の酸化ストレスの上昇傾向は、単純に被験試料だけの影響であると言及するには至らないと思われた。また投与後540日目の間、群間での差は見られず、焼成温度や粉砕処理がもたらす生体への効果を反映させるような結果は得られなかった。

図 2-94 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの血清中 d-ROMs 値の変化

(AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である)

AM群との比較：$\begin{aligned}\#,p<0.05;\quad\#\#,p<0.01;\quad\#\#\#,p<0.001\end{aligned}$
## ②抗酸化力 (BAP)

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの血清中 BAP 値の経時的変化を図 2-95 に示した。

対照群およびAMとAM焼成物では、投与後180日目まではほぼ一定の値を示していたが、540日目になると漸減する傾向があるように思われた。血清中d-ROMs値同様、BAP値も全身状態を反映する値であることが考えられ、投与後540日目を経過すると加齢など他の交絡因子の影響も関与していると思われた。そのため540日目でBAP値が減少したのは、d-ROMs値の上昇からの生体防御の一貫と推測した。

本試験結果においては、被験試料群間の比較、焼成温度や粉砕処理がもたらす生体影響を明確に評価する手法としては課題があると考えた。

図 2-95 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの血清中 BAP 値の変化

(AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である)

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\begin{aligned}\#,p<0.05;\quad\#\#,p<0.01;\quad\#\#\#,p<0.001\end{aligned}$

$$ p<0.001 $$
## 8 ）血清中 N-ERC/mesothelin 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの血清中 N-ERC/mesothelin 濃度の経時的変化を図 2-96 に示した。

投与後 3～540 日目の全期間を通して対照群と間に大きな差は見られず、焼成温度や粉砕処理がもたらす生体への効果を反映させるような結果は得られなかった。また投与後 540 日目で対照群、AM および AM 焼成物において N-ERC/mesothelin 濃度が増加する傾向を示した。N-ERC/mesothelin 濃度は全身状態を反映する値であることが考えられ、投与後 540 日目を経過すると加齢など他の影響も関与していると思われる。そのため 540 日目で N-ERC/mesothelin 濃度が増加したのは、被験試料より動物の加齢から生じた影響と推測する。

本検査法は、クリソタイルとその焼成物に対する生体影響、特に、中皮腫発生の初期影響を正確に評価されたことから、この分野の新たな研究課題と考えている。

図 2-96 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの血清中 N-ERC/mesothelin 濃度の変化 (AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である) 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;****,p<0.001
## 9 ）尿中 NAG 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの尿中 NAG 濃度の経時的変化を図 2-97 に示した。

尿中 NAG 濃度は対照群と AM、AM 焼成物に共通して、投与直後の 3 日目は上昇し、その後は急速に減少する傾向を示した。

他方、対照群と AM、AM 焼成物に共通して 180 と 540 日目の値は共通して上昇する結果が示され、なお、被験試料群における明確な差異は認められなかった。

図 2-97 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 540 日目までの尿中 NAG 濃度の変化

(AM1200G 群の投与後 540 日目は結果が欠損し、研究中である)

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\begin{aligned}\#,p<0.05;\quad\#\#,p<0.01;\quad\#\#\#,p<0.001\end{aligned}$
## 10 ）尿中 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine（8-OHdG）濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与後 180 日目までの尿中 8-OHdG 濃度の経時的変化を図 2-98、99 に示した。

## 焼成温度による比較

AM と AM1000 においては、投与後の尿中 8-OHdG 濃度が対照群に比較して顕著な上昇傾向を認め、この現象は AM1200 と AM1400 に比較しても有意な差異であった。

AM1000 の尿中 8-OHdG 濃度は、AMと同様に投与後3日目に対照群に比較して3倍近い上昇が認められた $ (p<0.001) $ 。投与後7日目には尿中8-OHdG濃度は低下したが、30日目以降に再び上昇した。投与後180日目においても、AM1000の尿中8-OHdG濃度は対照群の約3倍の濃度を示しており $ (p<0.01) $ 、AMに比較して酸化的DNA損傷の明らかな軽減が認められなかった。またAM1200、AM1400では、投与後3日目の尿中8-OHdG濃度が上昇傾向を示したが、AM、AM1000に比較して軽度であった。しかし、投与後30日目以降尿中8-OHdG濃度の経時的な上昇傾向が認められた。

図 2-98 AM、AM1000、AM1200、AM1400 一回気管内投与後の尿中 8-OHdG 濃度の変化 対照群との比較 : *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 AM 群との比較 : #, p < 0.05; ##, p < 0.01; ###, p < 0.001
## 粉砕の有無による比較

AM1000G の尿中 8-OHdG 濃度は、投与後 3 日目に軽度の上昇を認めるが一過性であり、対照群に比較して有意な上昇は認められなかった。とくに投与後 30 日目以降の AM1000G の尿中 8-OHdG 濃度は AM および AM1000 に比較して有意に低く、粉砕処理による酸化的 DNA 損傷の明らかな軽減が認められた。一方 AM1200G の尿中 8-OHdG 濃度は投与後 3 日目では AM1200 よりもやや低値であった。しかし、投与後 30 日目以降尿中 8-OHdG 濃度は対照群に比較して 2 倍以上の増加を示し、AM1200 と比較して粉砕処理による酸化的 DNA 損傷の明らかな軽減は認められなかった。

すなわち、焼成物の粉砕処理による酸化的ストレスの軽減が有意に認められたのはAM1000のみであった。

図 2-99 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G 一回気管内投与後の尿中 8-OHdG 濃度の変化

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\begin{aligned}\#,p<0.05;\quad\#\#,p<0.01;\quad\#\#\#,p<0.001\end{aligned}$

AM vs. AM1000 : $ ^{} $ , p < 0.05; $ ^{} $ , p < 0.01; $ ^{} $ , p < 0.001
## 小括

気管内一回投与後 540 日目まで観察した結果、AM1000、AM1200 では肺胞道～肺胞にかけて肉芽腫が長期間持続し、その周囲で線維化が認められたが、AM に比較して線維化の程度は軽度であった。一方、AM1400 では、肺の炎症が持続していたが、線維化は明らかではなかった。これに対して、AM1000G では慢性呼吸器影響はほぼ認められず、肺の線維化は認められなかった。以上の結果から、AM1000G による呼吸器毒性が最も軽減されていることが明らかとなった。また AM 焼成物の慢性呼吸器影響には、繊維形状（アスベスト由来の見かけの繊維形状の残存）および結晶構造が影響することが示唆された。

AM 焼成物(AM1000、AM1200、AM1400)およびその粉砕物(AM1000G)では、気管内投与後540日目までの観察の結果、肺腫瘍の発生は認められず、腫瘍発生リスクの明らかな増加は認められなかった。

気管支肺胞洗浄液（BALF）の細胞分画による炎症細胞数の変化および細胞像の観察から投与初期にはどの試料を投与した群でも炎症反応が観察され、これは投与に伴う初期炎症であると考えられた。そのうち AM および AM1000 は特に強い炎症反応を示した。AM および AM1000 は繊維長の長い粒子を含んでいることが影響していると考えられた。同じ温度で焼成し粉砕処理を施した AM1000G では AM1000 で認められたような顕著な炎症反応が観察されなかったことから、初期炎症反応には繊維状物質のサイズや形状が関与していることが示唆された。

一方、AM1200およびAM1400は投与後30日目に急激に炎症細胞が出現され、投与後540日目が経過しても炎症細胞の残存が観察された。AM1200およびAM1400は焼成により酸化鉄だけでなく結晶質シリカが生成してくることが確認されている。また全観察期間を通して炎症反応が軽微であるAM1000Gには酸化鉄のみしか生成しないことから、長期的な炎症反応（慢性影響）には結晶質シリカが関与している可能性が示唆された。

本研究から、繊維状物質の急性と慢性影響には物質のサイズや形状だけでなく結晶構成成分など複雑な要因が関与しており、生体影響を正しく検証する際には多角的な研究の必要性が求められるのではないかと考えた。
### 3. ラット腹腔内投与による発がん性試験

## 実験方法

## 1 ）実験動物

Wistar 系雄ラット（Crlj:WI、日本チャールスリバー）を使用した。動物はステンレス製金網ケージに5匹ずつ収容し、浄水器ろ過水道水、放射線滅菌飼料（CE-2、日本クレア）を自由摂取させた。なお、酸化ストレス関連のマーカーの測定を実施したラットは、採血および採尿日の3日前から放射線滅菌高タンパク飼料（Egg white diet; Dyets No.110952, Dyets Inc.）にて飼育した。

動物実験は北里大学医療衛生学部の動物飼育施設で実施した。飼育環境はセミバリア施設で12hr/12hr明暗、24±1℃、55±5%RHである。実験は北里大学の動物飼育管理委員会の規則及び承認のもとに実施された。

## 2 ）被験試料の懸濁液調整

被験試料 (AM、AM1000、AM1000G) は、投与前日に秤量した後、オートクレーブで 121℃、20 分間滅菌、37℃の乾燥器内で保存した。動物投与直前に試料を所定容量になるように生理食塩水に懸濁させ、超音波洗浄器で 10 分間分散処理を行った。

## 3 ）腹腔内投与

ラット（10 週齢）に AM、AM1000、AM1000G をそれぞれ 10mg/2ml 一回腹腔内投与した。AM、AM1000 以外の被験試料は非繊維形状の粒子が多いため、投与量はすべて繊維数ではなく、重量濃度で統一した。予備試験による急性毒性をもとに投与量を設定した。投与匹数は各群 25 匹である。対照群には生理食塩水を 2ml 注入した。

採血はラット尾静脈からツベルクリン用シリンジを用いて採血した。ラットを採血用保定器内で保定しラットの尾静脈から無麻酔下で0.5～0.7ml採血し採血チューブに入れ遮光ボックス内で室温、30分静置した後、卓上遠心分離器（フナコシ）で血清分離し-80℃で凍結保存した。

採尿は、前日にメタボリックケージ（Tecniplast）に個別に一晩収容し、遮光した採尿チューブで採尿し-80℃で凍結保存した。採血および採尿に用いたラット匹数は各群5匹である。

## 4 ）病理組織学的檢索

瀕死動物および死亡動物を含め、すべての動物を解剖し、病理組織学的検索を実施した。腫瘍および胸腔、腹腔内の全臓器、横隔膜、腹膜を採取し、10％リン酸緩衝ホルマリン液で固定した。定法によりパラフィン包埋した後、3μm以下に薄切し、HE染色、必要に応じて特殊染色を行った。
## 5 ）血清中酸化ストレス度と抗酸化力の測定

気管内投与試験と同様に、発がん試験（腹腔内投与）においても、FRAS4（DIACRON）を使用し、血清を用いて生体内の活性酸素・フリーラジカルによるd-ROMs値と抗酸化力を示すBAP値を測定した。d-ROMsとBAPの測定法は、気管内投与実験と同様に実施した。

## 6 ）血清中 MCP-1 濃度の測定

血清中 MCP-1 濃度は、気管内投与試験と同様に BD OptEIA $ ^{TM} $ Set Rat MCP-1 （BD Biosciences）を用いて測定した。

## 7 ）血清中 N-ERC/mesothelin 濃度の測定

血清中 N-ERC/mesothelin 濃度は、気管内投与試験と同様に Rat N-ERC/mesothelin assay kit (Immuno-Biological Laboratories) を用いて測定した。

## 8 ）尿検査

尿の測定項目は、クレアチニンおよび近位尿細管障害のマーカーである N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ（N-acetyl-β-D-glucosaminidase : NAG）の2項目である。それぞれの測定方法は気管内投与試験と同様に行った。NAG濃度は尿中クレアチニン濃度で補正した。

## 9 ）統計処理

測定値の統計解析は、SPSS ver.18J を用い、各群間の差について、tukey の検定を行った。生存分析は腹腔内投与後 720 日目までの動物の生存データをもとに、死亡、中皮腫による死亡のそれぞれについて、Kaplan-Meier 法で生存曲線を作成した。
## 結果と考察

## 1 ）死亡率および中皮腫発生率

AM と AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後 720 日目までの中皮腫発生率の結果を表 3-1 に示した。また、各群のすべての死亡についての生存曲線を図 3-1 に、中皮腫による死亡についての生存曲線を図 3-2 に示した。

AM の中皮腫発生率は 56% であり、AM1000、AM1000G に比較して有意に高値であった $ (p < 0.001) $ 。中皮腫死亡の初発は投与後 358 日目であり、中皮腫の 50% 生存期間は 664 日であった。

一方、AM1000では、腹膜の線維化所見は認められたが、中皮腫発生率は4％とわずかであり、AMに比較して有意に低値であった $ (p<0.001) $ 。これに対して、AM1000Gでは腹膜の線維化も認められず、さらに、中皮腫の発生も認められなかった。

表 3-1 ラットへの AM と AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後の中皮腫発生率（投与後 2 年まで）

試料	投与量	WHO 繊維数×109※1	中皮腫発生率(%)※2	中皮腫50%生存期間
AM	10mg	0.75	14/25 (56%) ***	664 日 (95%CI:617-711)
AM1000	10mg	0.44	1/25 (4%)	—
AM1000G	10mg	0	0/25 (0%)	—

※1 WHO 繊維：繊維長≥5μm、繊維幅＜3μm、アスペクト比≥3、なお、AM1000については、見かけ上の繊維を指す。

$ ^{*} $ 2 AM vs. AM1000, AM1000G: $ ^{***} $ , p < 0.001
図 3-1 ラットへの AM と AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後の生存曲線（全死因）

Days after intraperitoneal injection

図 3-2 ラットへの AM と AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後の生存曲線（中皮腫死亡）
## 2 ）病理組織学的檢索

## ①肉眼的所見

対照群の腹腔内の肉眼的所見を図3-3に示した。またAM、AM1000、AM1000Gを腹腔内投与後の代表的な肉眼的所見をそれぞれ図3-4-A, B、図3-5、図3-6に示した。

## 对照群

腹膜の線維化、癒着等は認められず、中皮腫の発生も認められなかった（図3-3）。

## AM群

投与試料が肝臓、脾臓の被膜、腸管漿膜、横隔膜、大網、腸間膜、腹壁などの腹膜組織に沈着しており、腹膜組織の線維性肥厚が認められた。さらに腹膜中皮腫の発生例では、血性腹水の貯留が認められることが多く、中皮腫の結節性腫瘤が肝臓、横隔膜、大網、腸管漿膜、腸間膜、腹壁などの腹膜組織に多数存在し、腹腔内臓器の癒着が認められた（図3-4-A, B）。

## AM1000 群

投与試料が肝臓の被膜、腸管漿膜、橫隔膜、大網、腸間膜、腹壁などの腹膜組織に集積して沈着しており、肝臓の被膜等で腹膜組織の線維性肥厚や腹腔内臓器の癒着が局所的に認められた（図3-5）。しかし、AM群と比較して中皮腫の発生は1個体しか認められなかった。

## AM1000G 群

投与試料が大網や腸間膜等に集積して沈着しているのが観察された。しかし、AM1000群に比較して腹膜の線維化や腹腔内臓器の癒着はほとんど認められなかった(図3-6)。さらに、中皮腫の発生は認められなかった。
図3-3 対照群：腹膜の線維化や中皮腫の発生を認めない。

図 3-4-A AM 群に発生した腹膜中皮腫の肉眼の所見

中皮腫の微小腫瘤が肝臓、大網、腸管漿膜、壁側腹膜に多数認められ、血性腹水が150ml貯留していた。右写真には左写真の四角部分の拡大写真を示す。
図 3-4-B AM 群に発生した腹膜中皮腫の肉眼の所見

大網、腸間膜に中皮腫の結節性腫瘤が多数認められ、腹腔内臓器の癒着が認められた。約100mlの血性腹水の貯留も認められた。

図 3-5 AM1000 群の解剖時の肉眼の所見

肝臓の被膜や腸間膜に褐色の試料の沈着が認められた。肝臓の被膜などの腹膜組織は線維性に肥厚し、横隔膜や腸管との癒着が認められた。しかし中皮腫の発生は認められず、血性腹水の貯留も認められなかった。右写真には左写真の四角部分の拡大写真を示す。
図 3-6 AM1000G 群の解剖時の肉眼の所見

大網に褐色の投与試料の沈着が認められた。しかし、AM1000群に比較して腹膜の線維化や腹腔内臓器の癒着はほとんど認められず、中皮腫の発生は認められなかった。
## ②病理組織学的所見

対照群の腹腔内の肉眼的所見を図3-7に示した。またAM、AM1000、AM1000Gを一回腹腔内投与後の動物の解剖時の腹膜組織の病理組織像を図3-8～10に示した。

## 对照群

腹膜組織の中皮細胞の過形成、線維化の所見は認められなかった（図3-7）。

## AM 群

横隔膜、肝臓被膜、大網、腸間膜、腸管漿膜などの腹膜組織に投与粒子の沈着と肉芽腫性病变が形成されており、肉芽腫性病变を中心として腹膜組織の線維化が認められた(図3-8-A)。さらに中皮の過形成性病变や中皮腫が認められた。腹膜中皮腫は腹腔内に結節性に増殖していた（図3-8-B）。中皮腫の組織型は、上皮型と肉腫型がほぼ同程度認められた。上皮型中皮腫では漿膜面で腫瘍細胞が乳頭状に増殖する像も観察された。

## AM1000 群

肝臓の被膜、腸管漿膜、横隔膜、大網、腸間膜、腹壁などの腹膜組織に投与試料の沈着と肉芽腫性病变の形成が認められた（図3-9）。さらに、肉芽腫性病变を中心として腹膜組織の線維化が認められた。しかし、多くの症例で中皮の過形成性変化は認められなかった。

## AM1000G 群

大網、腸間膜などの腹膜組織に投与粒子の沈着が観察された。投与粒子の沈着部位では肉芽腫性病变が認められたが、AM1000に比較して線維化は弱かった（図3-10）。また中皮腫の過形成性変化は認められなかった。

図 3-7 対照群、横隔膜、HE 染色
図 3-8-A AM 群、腹膜組織、HE 染色肉芽腫及び線維化が認められた。

図 3-9 AM1000 群、横隔膜、HE 染色肉芽腫性病变と線維化が認められた。矢印は投与粒子を示す。

図 3-8-B AM 群、横隔膜、HE 染色 腹腔内に結節性、一部乳頭状に増殖する 中皮腫が認められた。

図 3-10 AM1000G 群、肝臓、HE 染色被膜のごく一部に肉芽腫性病变が認められた。矢印は投与粒子を示す。
## 3 ）血清中酸化ストレス度と抗酸化力

## ① 酸化ストレス度（d-ROMs）

ラットへの AM、AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後 600 日目までの血清中 d-ROMs 値の経時的変化を図 3-11 に示した。AM、AM1000、AM1000G 共に腹腔内投与直後は、一過性の上昇傾向を示したが、その後は減少し、10 日目以後はやや上昇する傾向を示した。3 物質の酸化ストレス度は、AM＞AM1000＞AM1000G の順であり、360 日目頃までは各群共に経時的に上昇しており、ほとんどの時点において AM1000G は AM よりも有意に減弱したことから、粉砕処理による酸化ストレスの低減が示唆された。

一方、360 日目以降は他の群と比べて AM1000 が低い傾向を示したが、全体的に同一群の経時的な変化が大きく、また、各群の標準偏差（SD）も大きく変化した。この現象は、投与物質から発生する酸化的ストレスに、加齢による影響が加味されたものと推測された。

図 3-11 AM、AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後の血清中 d-ROMs 値の変化 AM vs. AM1000, AM1000G : *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 AM1000 vs. AM1000G : #, p < 0.05; ##, p < 0.01; ###, p < 0.001
## ②抗酸化力（BAP）

ラットへの AM、AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後 600 日目までの血清中 BAP 値の経時的変化を図 3-12 に示した。AM、AM1000、AM1000G 共に腹腔内投与直後は、一過性の低下の傾向を見たが、5 日目以後に顕著な変化は観察されていない。各群を比較しても特異性はないが、360 日目以降から各群共に緩やかに減少傾向を示していた。

一方、540 日目以降の AM1000 では AM1000G に比較して、抗酸化力の低下傾向が認められ、生体影響への負荷が増加していくことが示唆された。さらに、AM よりも AM1000 がより生体影響への負荷が増加していくことも示唆された。

図 3-12 AM、AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後の血清中 BAP 値の変化 AM vs. AM1000, AM1000G : *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 AM1000 vs. AM1000G : #, p < 0.05; ##, p < 0.01; ###, p < 0.001
## 4 ）血清中サイトカイン濃度（MCP-1濃度）

ラットへの AM、AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後 600 日目までの血清中 MCP-1 濃度の経時的変化を図 3-13 に示した。AM と AM1000 の血清中 MCP-1 濃度から、投与後初期の炎症反応を鋭敏に捉えている結果を得た。その後、投与後 30 日目から 360 日目にかけては経時的な変化は見られなかった。AM1000G は AM と AM1000 に比較して僅かな変化であった。血清中 MCP-1 濃度の測定の意義の一つとして、有害因子ばく露後における初期の影響評価に有益と考えられた。

一方、360 日目以降では、AM と AM1000 の血清中 MCP-1 濃度が徐々に上昇する傾向が示された。なお、AM1000G もその傾向が示されたが、AM と AM1000 の値より常に低い結果であった。

図 3-13 AM、AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後の血清中 MCP-1 濃度の変化 AM vs. AM1000, AM1000G : *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 AM1000 vs. AM1000G : #, p < 0.05; ##, p < 0.01; ###, p < 0.001
## 5 ）血清中 N-ERC/mesothelin 濃度

ラットへの AM、AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後 600 日目までの血清中 N-ERC/mesothelin 濃度の経時的変化を図 3-14 に示した。投与後 450 日目までの観察期間において各群共に投与後の一過性の上昇以外は低い値を示したが、AM1000 と AM1000G は、AMと比較して有意に減少していた。また、AM1000G は AM1000 と比較しても有意に減少していた。その後、660 日目まで経時的に上昇し、各群の差は広がる傾向にあった。

血清中 N-ERC/mesothelin 濃度の結果から、AM、AM1000 と AM1000G では、生体影響の作用が大きく相違する結果が明確に示された。このような背景から、時間の経過からの各物質における中皮腫発生への予測と判断に重要な知見と考られた。

中皮腫発生率と血清中 N-ERC/mesothelin 濃度の関係を解析すると、中皮腫発生と強く関係することが明らかとなった。

図 3-14 AM、AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後の血清中 N-ERC/mesothelin 濃度の変化

$$ \begin{aligned}&AM vs.AM1000,AM1000G:*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001\\&AM1000 vs.AM1000G:^{\#},p<0.05;^{\#\#},p<0.01;^{\#\#\#},p<0.001\\ \end{aligned} $$
## 6 ）尿中 NAG 濃度

ラットへの AM、AM1000、AM1000G をそれぞれ 630 日目までの尿中 NAG 濃度の経時的変化を図 3-15 に示した。各群共に経時的に値が上昇していた。3 物質投与後の尿中 NAG 濃度は、360 日目までは AM＞AM1000＞AM1000G の順であり、特に、AM と AM1000 がそれぞれ AM1000G に比較して、高値の傾向であった。なお、360 日目以降は AM と AM1000 が逆転し、AM1000 の上昇傾向がみられた。しかし、AM1000 の粉砕物である AM1000G は、投与後 540 日までは統計学的な有意差を示す低値の傾向であった。観察期間の末期は、動物個体の生理的な影響も加味された尿中 NAG 濃度の変動が観察された。

これまで、腎臓がアスベストの標的臓器となることは知られていない。しかし、AM焼成物の構成成分であるシリカに関しては腎炎を引き起こすことが報告されており、この分野の研究の補充が重要であると推察した。

図 3-15 AM、AM1000、AM1000G をそれぞれ一回腹腔内投与後の尿中 NAG 濃度の変化 AM1000 vs. AM1000G : #, p < 0.05; ##, p < 0.01; ##, p < 0.001
## 小括

AM の中皮腫発生率は 56% であったのに対し、AM1000 では腹膜の線維化は認められたが、中皮腫発生率は 4% とわずかであり、AM に比較して中皮腫発生率は有意に低かった。これに対して、AM1000G では腹膜の線維化も認められず、中皮腫発生も認められなかった。

腹腔内投与後の血清中の N-ERC/mesothelin 濃度の経時的変化は、中皮腫発生リスクを反映していた。中皮腫が高率に発生した AM では血清中 N-ERC/mesothelin 濃度が観察期間を通じて高値を示し、中皮腫発生の 1～3 ヶ月前から上昇傾向を認めた。一方、中皮腫発生が認められなかった AM1000G では血清中 N-ERC/mesothelin 濃度は投与後初期に一過性に軽度の上昇を認めたが、AM に比較して低値が持続した。しかし、投与後 540 日目以降、AM1000 および AM1000G において腎障害を発生した個体で血清中 N-ERC/mesothelin 濃度の上昇が認められ、血清中 N-ERC/mesothelin の評価には腎障害による影響を考慮する必要があることが示唆された。

一方、血清中 MCP-1 濃度の測定の意義の一つとして、有害因子ばく露後における初期の影響評価に有益であることも明らかとなった。なお、従来、アスベスト関連物質からの呼吸器への急性と慢性影響そして中皮腫等について強い生体影響が懸念されてきたが、他の臓器への影響は少ないと考えられた。尿中 NAG 濃度の変動の結果から、この研究分野において標的臓器の評価を拡大する必要性を感じた。
## Ⅲ 研究業績

## 論文

1) 戸田枝里子，高田礼子，網中雅仁，戸谷忠雄，山下喜世次，神山宣彦，山内博. ラット気管内一回投与によるクリソタイルとアモサイトとその焼成品の酸化ストレスに関する研究、臨床環境医学、20, 131-140, 2011.

## 学会発表

1）戸田枝里子、江尻直美、高野（宮本）清子、高田礼子、網中雅仁、山下喜世次、神山宣彦、山内博．アモサイト焼成無害化材料のラット腹腔内投与による酸化ストレス評価．第84回日本産業衛生学会、2011年5月、東京

2）高田礼子，戸谷忠雄，山内博，戸田枝里子，網中雅仁，山下喜世次，神山宣彦．クリソタイル焼成無害化処理材料のラット腹腔内投与による中皮腫発がん性評価．第52回大気環境学会年会、2011年9月、長崎

3) 戸田枝里子，高田礼子，網中雅仁，戸谷忠雄，山下喜世次，神山宣彦，山内博．クリソタイルとアモサイトの焼成無害化材料のラット気管内投与による酸化ストレスの比較. 第52回大気環境学会年会、2011年9月、長崎

4) 山内博，中野（青木）瑞穂，網中雅仁，高田礼子，山下喜世次，神山宣彦．アモサイトの焼成無害化処理材料に対する細胞毒性．第52回大気環境学会年会、2011年9月、長崎

5）高田礼子、高野（宮本）清子、網中雅仁、山下喜世次、神山宣彦、山内博．アモサイト焼成無害化処理材料のラット気管内投与による呼吸器影響評価．第59回日本職業・災害医学会学術総会．2011年11月、東京

6) 江尻直美、戸田枝里子、高田礼子、高野清子、網中雅仁、山下喜世次、神山宣彦、山内博. アモサイト焼成無害化処理材料のラット気管内投与による酸化的 DNA 損傷評価. 第 82 回日本衛生学会学術総会. 2012 年 3 月、京都

知的所有権の取得状況

なし
課題名 S-9-4 陸水生態系における生物多様性損失の定量的評価に関する研究

課題代表者名 高村 典子 (国立研究開発法人国立環境研究所 生物・生態系環境研究センター フェロー)

研究实施期间 平成23～27年度

累計予算額 316,122千円（うち平成27年度：57,869千円）

予算額は、間接経費を含む。

本研究のキーワード 陸水、河川、湖沼、湿地、ため池、生物多様性評価、優先保護区、ギャップ分析、駆動因、メコン川

研究体制

(1) リモートセンシングを活用した湖沼の流域特性ならびに湖内生態系情報の推定手法の開発（筑波大学）

(2) 湖沼における生物多様性損失・生態系劣化の評価 (東邦大学)

(3)ため池の生物多様性損失の評価とプロジェクト総括(国立研究開発法人国立環境研究所)

(4) 湿地における生物多様性損失・生態系劣化の評価 (北海道大学)

(5)河川における生物多様性損失・生態系劣化の評価(北海道大学)

(6)空間的異質性と長期変動からみた大規模湖沼・琵琶湖の生物多様性評価(京都大学)

(7) アジアの淡水域における環境劣化と生物多様性損失の評価 (九州大学)

## 研究概要

### 1. はじめに(研究背景等)

陸水域は地球の表面積の1％に満たないが、この小面積に多種多様な生物が生育・生息しており、その種多様性は極めて高い。例えば、既存の動物種数の9.5%、全脊椎動物種数の35%が陸水域を生活の場としており固有種も多い。陸水域の生物種の分布は、湖沼や水域などの地質学的な成因、地理的要因、上流から下流といった河川のヒエラルキー構造などと深く関係しており、多くの生物種は移動分散能力が低い。淡水生物種のこうした特徴は、それらが気候変動や人為的なインパクトに極めて脆弱であることを意味している。

一方で、陸水域は多様な生態系機能を通して、単位面積当たりに換算すると人々への恩恵が最も高いとされる生態系である。安定した良質の水の供給は、人々の安全面や災害防止という観点から社会経済の成長期には特に重要視されたが、水は偏在するという特質を持つため、陸水域はすでに大きな人為的な改変を受け、地球規模で生態系への負の影響が極めて大きい。さらに、気候変動による今後の利用や攪乱の増加等も想定されるため、陸水域の持続的な利用とバランスのとれた保全・保護の効果的な実施は喫緊で重要な課題である。愛知目標においても、戦略目標B「生物多様性への直接的な圧力を減少させ、持続可能な利用を促進する」や戦略目標C「生態系、種及び遺伝子の多様性を保護することにより、生物多様性の状況を改善する」の元に、目標6「2020年までに水生生物資源の持続可能な管理が実現される。」や目標11「2020年までに少なくとも内陸水域の17%が適切に保全・管理される。」というように、特に淡水域に言及した条文が設けられている。

テーマ4では、こうした愛知目標の達成に貢献し、陸水域の生物多様性の減少を緩和する施策に科学的知見を提供するため、日本とアジアにおける河川、湖沼、湿地、ため池等の小規模水域を対象として、陸水域の生物多様性評価や保護を優先すべき場所の選定、ならびに生物多様性を減少させる駆動因の解析を実施した。

### 2. 研究開発目的

日本とアジアにおける陸水域の生物多様性の減少をくいとめるための施策に科学的知見を提供することを目的とし、日本とアジアにおける陸水域の生物多様性の現状評価、保護を優先すべき場所の選定、生物多様性を減少させる駆動因の解明を行う。そして愛知目標に謳われている「生物多様性への直接的な圧力の低下、持続的な利用の促進、生物多様性の保護と状況の改善」に科学の面から貢献する。

具体的には、日本では河川、湖沼、琵琶湖、湿地、ため池などを対象とし、おのおのの水域の特性に適した情報量の多い生物種を指標として選び、生物多様性の広域評価を実施する。次に、そうした広域評価に基づき、優先的に保全すべき場所を選定し、現在の保護区とのギャップ分析を実施する。そして、現在の生物多様性の