Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
少した。この減少の程度はそれぞれの微生物間で差があり、指標細菌が最も減衰が大きく、次にF-phageであり、S-phage、腸管系ウイルスおよびPMMoVは指標細菌に比べて減衰が小さかった。この減衰は物理的な移流拡散によるものだけでなく、水温、塩分、日光などの様々な環境因子による微生物の不活化が原因と考えられる。移流拡散効果はすべての微生物について同じであることから、微生物間の減衰の差は環境因子に対する微生物間の感受性の差違によって生じたものと推察される。したがって、指標細菌は病原ウイルスより海域の環境因子に対して感受性が高いと考えられる。

また、放流口からかなり離れた海域においても微生物が観測される場合があり、それぞれの微生物の環境因子に対する耐性について今後検討する必要がある。

## 2 ) 難分解性医薬品を用いた海域における指標微生物の移流・拡散と不活化の評価

測定した難分解性医薬品のうちCrotamitonが海域における適切な移流・拡散指標として最も有効であるとの結論を得た。Crotamiton濃度の減衰と調査結果を基にした海域での各微生物の濃度減衰の比較を行い、不活化による減衰を評価した。Crotamiton濃度減衰（log $$ C/C_{0} $$ ）

図3 Crotamitonの濃度減衰に対する微生物の濃度減衰プロット(H27年10月)

Crotamitonの減衰は移流拡散効果のみによることから、図3に示した傾き1の直線で表される。また、指標細菌である大腸菌群、大腸菌および腸球菌とF-phageは傾きが1より大きく、明らかに移流拡散だけでなく他の環境因子による不活化が起こっていることを示している。一方で、病原ウイルスのアイチウイルス（AiV）、エンテロウイルス（EntV）そしてアデノウイルス（AdV）と、PMMoVは、ほぼ傾きがCrotamitonの傾き1に近く、不活化による減衰の程度は低いと考えられる。このことから、これらの微生物は海域の環境因子に対して抵抗力を有していると考えられる。ただし、細菌、ファージは生菌数、感染性を測定しているが、ウイルスは遺伝子を定量し感染価を測定してないことから、ウイルスの不活化を考える場合にはさらに今後の検討が必要である。

## 3 ) 擬似太陽光照射による微生物不活化の評価

擬似太陽光照射による微生物の減衰は、大腸菌、腸球菌、S-phage T4、F-phage Qβ、ポリオウイルス（PoV）、AiVを対象に実施した。細菌における擬似太陽光による減衰は、照射開始後1～3hr程度で始まり、減衰速度は大腸菌が速く、腸球菌が太陽光に対する耐性が高いことが確認された。ファージは、F-phage Qβ、S-phage T4共に照射後24時間で減衰が確認され、減衰速度はS-phage T4が速いことが確認された。海域におけるファージの検出は、S-phageの方が比較的濃度が高く、検出率も高い傾向が確認されている。一方で、太陽光に対しては、S-phageの方が感受性は高いことが示唆された。このことから、海域におけるF-phageの減少には太陽光以外の環境要因がS-phageよりも強く影響している可能性が示唆された。PoVとAiVでは、殆ど減衰せず（192hrで約1～1.5 log）、減少速度に差はなかった。太陽光に対する感受性は、細菌＞ファージ＞ウイルスであることが確認された。これらの結果から、太陽光による不活化を考慮する必要がある環境では、ウイルスの指標として細菌を使用することは難しいと考えられる。また、ファージが腸管系ウイルスの代替指標の候補として挙げられているが、ウイルスの減衰と差があることから環境中の他の不活化要因の影響についてさらに検証を進め検討する必要がある。
## 4 ）放流先海域において検出される大腸菌の塩分耐性の評価

処理場試料の塩素添加前・初沈後水、海域試料の沖2 km、沖10 kmで、塩分非添加および塩分添加のクロモカルトコリフォーム寒天培地、および塩添加培地を用いた大腸菌の検出を行った。初沈後水において塩分耐性大腸菌と判定された細菌が高濃度で存在することが確認された。海域試料においても、塩分耐性を有する大腸菌と判定された細菌が検出された。

塩分添加クロモカルトコリフォーム寒天培地で大腸菌と判定された単離菌株においてtnaA遺伝子の検出を行った結果、処理場試料単離菌株では28/57(66.7%)からtnaA遺伝子が検出され大腸菌と確認された。一方で、海域試料単離菌株ではtnaA遺伝子は検出されず、大腸菌ではないことが確認された。今回、塩分耐性大腸菌は海域からは検出されなかったが、下水処理場には豊富に存在することから、海域にも存在する可能性がある。また、塩分添加酵素基質特定培地において、大腸菌と疑判定される細菌が存在することが確認された。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

## 1 )琵琶湖南湖における大腸菌群と大腸菌濃度の相関

琵琶湖南湖での調査の結果、大腸菌群濃度が大腸菌濃度の100倍以上となった。この結果は琵琶湖南湖における採水で検出された大腸菌群はほとんどが糞便ではなく土壌等に由来することを示唆している。少なくとも琵琶湖南湖においては、大腸菌群は糞便汚染を測るための指標として有効でないことが示唆された。

## 2 )琵琶湖南湖での腸管系ウイルス及びウイルス指標の存在状況

本研究は、2年間にわたって湖沼における腸管系ウイルスおよびウイルス指標の存在状況を毎月継続的に調査した初めての調査事例であり、大変貴重なデータである。調査の結果、トウガラシ微斑ウイルス(PMMoV)、GI型大腸菌ファージ(GI-FPH)、GⅡ型ノロウイルス(GII-NoV)、ロタウイルス(RV)、アイチウイルス(AiV)がそれぞれ高頻度で検出された。陽性率はPMMoVが最も高かった。リスク因子と考えられるウイルスとしてはGII-NoVおよびRVが高頻度で検出されたが、GI型ノロウイルス(GI-NoV)、エンテロウイルス(EV)、サポウイルス(SaV)はほとんど検出されなかった。GII-NoVについては一般的な冬季流行性とは異なり、6～8月の夏季においても検出されることがわかった。

## 3 )腸管系ウイルス間の濃度相関、及び腸管ウイルス濃度と指標細菌濃度の相関

GII-NoVとAiV、PMMoV、GI-FPHの検出濃度の比較を行った。加えて指標微生物である大肠菌との比較も行った。その結果、大肠菌はGII-NoVに比べて検出濃度が低く、濃度の相関も見られない結果となり、琵琶湖南湖では、大肠菌をウイルス汚染の指標として用いるのは不適切であることが示唆された。

AiVは測定した全ウイルス種の中で最もGII-NoVと類似した濃度分布であり、“病原ウイルスの存在を示す指標”として有効であると考えられた。一方、PMMoVは測定した全ウイルス中、最も高頻度で検出されたが、GII-NoV濃度との相関は見られなかった。また、全試料のうち88％からPMMoVが検出されている。これらの結果こから、病原ウイルスが存在しない環境水中にもPMMoVが普遍的に存在すると考えられる。PMMoVは必ずしも病原ウイルスの流行を表していないが、“ウイルスを管理値以下に抑えることで病原ウイルスの流行に備えて安全を確保する指標”としては有望であると言える。

ファージGI-FPHは検出頻度が二番目に高いウイルスでありPMMoVと同じく、“ウイルスを管理値以下に抑えることで病原ウイルスの流行に備えて安全を確保する指標”として利用できる可能性が考えられる。また、GI-FPHもPMMoVと同じく必ずしも病原ウイルスの流行を表していないと考えられた。

## 4 )琵琶湖南湖での水利用における安全性評価

琵琶湖南湖での遊泳及び釣りによる感染リスクを、測定濃度から推定した感染性GII-NoV濃度を用いて評価を行った。琵琶湖南湖におけるレクエーション利用にかかる感染リスクをQMRA手法により評価した初めての事例である。その結果、夏季に遊泳するとUSEPAが水道で想定している年間許容リスク $ 10^{-4} $ /年を超過する恐れがあるが、釣りに関しては通年で感染リスクは低いことが示された。

## 5 ) 降雨後の海域におけるウイルス汚染の空間的特性

降雨後の東京湾調査で検出したいずれのウイルスについても、中層、低層における濃度が表層に比べて大きくなる傾向が見られた。一方で、大腸菌濃度は表層における濃度が高い状態から、中層における濃度が高い状態、低層における濃度が高い状態への移行が見られた。ウイルス汚染の空間的な特性は降雨分布や汚濁流出源に影響されると考えられるため、今後は流出解析や3次元流動解析を用いて結果の解釈を行うのが望ましい。

## 6 ) ヒト糞便由来のウイルスを検出するためのツールとしてのカキの有用性

ヒト糞便由来のウイルスを長期的に蓄積していると考えられるカキに着目した調査においては、環境水中に存在するウイルス遺伝子型との異同を検討した。カキ試料には、水試料では見られない固有の配列が複数確認されたことから、水試料中に検出されていないウイルスを補足する試料として期待できる。
## 7 ) 水環境中における大腸菌の増殖について

大腸菌の分裂関連遺伝子に着目し、その発現を検出、定量する手法ついては、新たな系を確立することができた。今後、培養実験によって他の一般機能遺伝子と挙動の異なる点を探索することで、環境中における大腸菌の増殖活性を解析するツールとして活用することができると考えられる。

環境中における大腸菌の増殖について、大腸菌は、暗所かつ30度という限られた条件においては、滅菌された環境水中で増殖可能であることが確かめられた。大腸菌を指標細菌として利用する際には、大腸菌が環境水中で増殖しうるということに注意してリスク管理をする必要がある。

## 8 )下水放流先海域における微生物の不活化を評価する手法の開発

南蒲生浄化センター周辺の海域での調査により、人為由来の難分解性医薬品や微生物が海域の広い範囲に分布していることが示された。下水処理水放流先海域の水質に対する下水処理水の寄与を難分解性医薬品を指標として評価し、微生物（指標細菌、ファージ、ウイルス）濃度と比較することで、放流先海域における微生物の不活化を評価する手法を開発した。これにより、海域において微生物が受ける様々な環境ストレスの大きさや、それが微生物の消長に与える影響を評価できる。

## (2) 環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

本研究の成果は、環境省で現在、水質環境基準の生活環境基準項目の変更を検討している大腸菌の指標検討を行うための平成24年度生活環境項目新規基準等検討会の衛生指標WGおよび平成25年度大腸菌数環境基準検討会において、これまでの大腸菌群や腸球菌、ファージ、ウイルスなどの水域の存在実態や動態、下水処理過程や消毒過程での動態の相違を示し、リクレーション利用、水産用水、水道原水の視点からの水質環境基準の検討の基礎的知見を一部提供している。また環境省水環境課が平成24年、平成25年度に国立環境研究所と主催している、水質環境基準の生活環境項目のうち、水生生物基準の追加項目を検討するために「今後の水生生物保全に関する検討会」および水生生物保護を目的に新たにバイオアツセイを排水管理に導入するための「生物応答を利用した水環境管理手法の制度・運用分科会」で、本研究課題の一部の成果から塩素による水生生物への影響についての情報提供を行っている。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

大腸菌群は、琵琶湖南湖では糞便指標としては不適切であり、大腸菌を用いる方が糞便指標としては適切である。ただし、海域、湖沼とも、ウイルスの存在が大腸菌を指標としても十分存在を反映できていないことから、水浴場の微生物学的な水質基準は糞便性大腸菌群数や大腸菌だけではウイルス由来の感染リスク管理には不十分である。このため、ウイルスの存在を示す新たな指標も今後検討すべきであり、その候補として、PMMoV、AiVなどが考えられる。今後、本研究で開発された直接水域での病原微生物の動態を把握する方法などを用いてさらに情報を収集すべきである。また、新しい衛生指標として期待される大腸菌は、環境中で増殖するとすれば、汚染の過大評価に直結する環境政策上重要な問題である。本研究によって確立した分裂関連遺伝子の定量手法は、今後、培養実験によってその挙動に関するデータを蓄積することで、環境中における増殖活性を調査する手法として実用できる可能性がある。

塩素を用いた消毒では、付着性藻類の多様性に影響を与えていることが現地調査から示唆されていることから放流水の残留塩素の管理が今後重要な課題となると考えられる。

### 6. 研究成果の主な発表状況

(1) 主な誌上発表

く査読付き論文>

特に記載すべき事項はない。

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1）浅見達也、柴田智世、片山浩之、古米弘明：第51回環境工学研究フォーラム（2014）

「親水活動による感染リスク評価に向けた東京湾沿岸域の降雨後ウイルス汚染実態調査」

2）井原賢、堅川陽平、李善太、松田知成、山下尚之、田中宏明：第17回日本水環境学会シンポジウム(2014)

「次世代シーケンサーを用いた、水環境における薬剤耐性遺伝子の大規模検出」

3）朴耿洙、山下尚之、田中宏明、金丸国夫、岩崎達行：第17回日本水環境学会シンポジウム（2014）

「高濁度下水に対する紫外線消毒における紫外線照射量の検討」

4) Hiroaki Tanaka: Tsinghua University Water Safety Symposium held at Shenzhen, China (2014)
"Microbial pollution by discharge from municipal sewage treatment plants damaged by Tsunami"

7）白坂勇也、端昭彦、山下尚之、田中宏明:第37回京都大学環境衛生工学研究会シンポジウム(2015)「琵琶湖南湖におけるウイルス汚染の実態評価」

8）朴耿洙、山下尚之、田中宏明：日本オゾン協会第24回年次研究講演会(2015)「被災下水処理場での前凝集後の塩素とオゾン消毒でのMS2ファージの不活化効果の比

9) Masaru Ihara, Yoshifumi Masago, Manami Inaba, Seiya Hanamoto, Akihiko Hata, Shinobu Kazama, Suntae Lee, Yohei Katakawa, Naoyuki Yamashita, Tomonari Matsuda, Hiroyuki Katayama, Tatsuo Omura, Hiroaki Tanaka: 18th International symposium on health-related water microbiology (2015)

“HOW DO MICROBES ATTENUATE IN WATER ENVIRONMENT? : COMPARATIVE ANALYSIS OF MICROBES AND CHEMICALS RELEVANT TO HUMAN WASTES”

10) Akihiko Hata, Yuya Shirasaka, Naoyuki Yamashita, Hiroaki Tanaka: 18th International symposium on health-related water microbiology (2015)

“Quantitative genotyping of infectious FRNA–phages at wastewater treatment plants in Japan”

11) Hiroaki Tanaka: Sixth Chemical Sciences & Society Symposium (CS3) (2015), Leipzig, Germany "Water, Health, the Environment and Sanitation, A Japanese Perspective"

12）井原賢:水中の健康関連微生物研究委員会シンポジウム(2015)

「水環境における病原微生物、指標微生物の実態調査」

「貯留管からの遮集下水を受け入れる高速凝集沈殿処理施設の健康関連微生物に着目した雨天時モニタリング調査計画」

14）朴耿洙、山下尚之、田中宏明:水中の健康関連微生物研究委員会シンポジウム(2015)「被災下水処理場の暫定処理水での塩素消毒と代替消毒技術による指標微生物の不活化

15) T. Asami, K. Inoue, H. Katayama, T. Shibata and H. Furumai: The 6th IWA-ASPIRE Conference and Exhibition (2015)

"Field Investigation of Wet-weather Viral Pollution in Coastal Area of Tokyo Bay"

16) H. Katayama: 2nd International Forum on Asian Water Environment and Technology (2015) "Virus Detection and Monitoring in Coastal Seawater"

17) H. Katayama: Special seminar at Universitas Padjadjaran (2015) "Virus Detection and Monitoring in Environment"

18) Hiroaki Tanaka, Naoyuki Yamashita, Masaru Ihara, Akihiko Hata, Yuya Shirasaka, Takeshi Yamaguchi: China–Japan Joint Seminar on Wastewater Resource Reclamation and Reuse in the Course of Urbanization held at Tsinghua University, Graduate School at Shenzhen (2015)

“Are the waters currently improved in quality really swimmable?”

19) H. Katayama: International Forum on Sustainable Future in Asia 1st NIES International Forum (2016) "Health risk monitoring and management for sustainable urban environment"

### 7. 研究者略壓

## 課題代表者:田中 宏明

京都大学大学院工学研究科修了、独立行政法人土木研究所水質チーム上席研究員、博士(工学)、現在、京都大学大学院工学研究科教授

研究分担者

1）田中 宏明（同上）

2）片山 浩之

東京大学大学院工学系研究科修了、東京大学大学院新領域創成科学研究科講師工学博士、現在、東京大学大学院工学系研究科准教授
## 3 ）大村 達夫

东北大学工学部卒業、東北大学大学院工学研究科修了、

工学博士、現在、東北大学未来科学技術共同研究センター教授
## （１）琵琶湖南湖での下水放流による病原微生物と水生生物の影響

京都大学大学院工学研究科附属流域圏総合環境質研究センター 田中宏明

京都大学大学院工学研究科附属流域圏総合環境質研究センター 山下尚之

京都大学大学院工学研究科附属流域圏総合環境質研究センター 中田典秀

京都大学大学院工学研究科附属流域圏総合環境質研究センター 井原賢

京都大学大学院工学研究科附属流域圏総合環境質研究センター 端昭彦

京都大学大学院工学研究科附属流域圏総合環境質研究センター 李善太

平成26～27年度累計予算額：39,491千円（うち平成27年度：19,237千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

本研究では、現在検討が進められている大腸菌への衛生指標微生物の変更や、今後導入されると想定される定量的微生物リスク評価による環境基準値の見直しに対応するため、琵琶湖南湖および近隣の下水処理場において毎月の定期調査を2年間継続して行い、琵琶湖南湖に存在する様々なウイルス、細菌をリアルタイムPCR、培養法、次世代シーケンサーを組み合わせて把握し、衛生指標微生物との関係を検討した。さらにウイルスの検出濃度を元にレクリエーション利用に伴うリスク計算を行い、USEPA提唱の水道水での年間許容感染リスク( $ 10^{-4} $ )を超過するかどうか検討した。また、合流式下水道の雨天時越流水の発生を検知するための3次元蛍光分析の有用性を検討した。また、下水処理水の流入する都市河川における残留塩素と藻類への毒性影響を調査した。

その結果、腸管系ウイルスと指標微生物の関係については、大肠菌濃度は大肠菌群やGII-ノロウイルスの濃度と相関が見られず、大肠菌群は糞便汚染の指標として不適切であり、また大肠菌をウイルス汚染の指標として用いることは不適切であることが示唆された。下水処理場からの放流水は大肠菌、腸管系ウイルス、Fファージの南湖への主要な排出源であると考えられた。また、ノロウイルス感染のリスク計算をした結果、南湖において夏季に遊泳するとUSEPAの水道水での年間許容リスクを超過する恐れがあるが、釣りに関しては通年で感染リスクは低いと示された。3次元蛍光分析を下水に適用した結果、雨天時越流水の発生のマーカーとなりうる3次元蛍光スペクトルのピークを見出した。都市河川において下水処理場水の流入直後では残留塩素濃度は上昇し、それに伴って河床に出現する付着藻類の平均出現種数の減少と多様性指数の低下が見られた。また、海域の重要な海藻であるスサビノリを用いた生態毒性試験を行ったところ、残留塩素に対してスサビノリは敏感であることが示唆された。

## [キーワード]

病原微生物、琵琶湖南湖、下水放流水、リスク評価、水生生物影響
### 1. はじめに

世界保健機構（WHO）は、水道水質基準、農業灌溉再生水基準に指標微生物による管理と並行させ、定量的微生物リスク評価（QMRA）で原虫やウイルスなどの個別病原微生物の管理方法を導入してきたが、新たに水域でのリクレーション基準への適用を検討している。また米国環境保護庁（USEPA）でも、リクレーション利用基準は、これまでの疫学調査と衛生指標の関係に加え、新たにQMRAによる方法を検討している。一方、わが国ではこれまでリクレーション利用に関する疫学データがなく、1世紀近く前の米国での疫学情報に基づいていたが、今回の環境基準の輩便性指標設定の検討に当たっても、科学的な安全性の議論ができていない。また、現在検討されている大腸菌の環境基準値の導入と、今後導入が想定されるウイルスなどの個別病原微生物による基準値の設定に対応するための基礎データも十分にそろっていない。また、塩素消毒プロセスを経た下水は、放流先水域の水生生物に対して影響を与える可能性がある、知見が不足しているのが現状である。

## 2 ．研究開発目的

上記の背景を鑑みて、本研究では、以下を研究開発目標とした。

## （1） 琵琶湖南湖における病原微生物、指標微生物の調査

琵琶湖南湖において毎月の定期調査を行い2年間継続して行い、琵琶湖南湖に存在する様々なウイルス、細菌をリアルタイムPCR、培養法を組み合わせて網羅的に把握し、衛生指標微生物との関係を検討した。ウイルスについては、定量結果を元に、レクリエーション利用に伴うリスク計算を行い、USEPA提唱の年間許容感染リスク（ $ 10^{-4} $ ）を超過するかどうか検討した。

## （２）合流式下水道雨天時越流水の発生の推定

合流式下水道の雨天時越流水の発生を推定し、（１）での調査との関わりを検討した。

## （３）次世代シーケンサーを用いたバクテリア群集構造の解析

次世代シーケンサーを用いた16S rRNA配列に基づくバクテリアの群集解析を確立し、琵琶湖南湖水試料および近隣の下水処理場放流水試料に適用し、琵琶湖南湖でのバクテリア群集構造を調べることで、琵琶湖南湖でのヒト糞便汚染を探る方法を検討した。

## （４）下水処理水の流入する都市河川における残留塩素と水生生物の影響

山科川へ放流する2つの下水処理場からの放流水に含まれる残留塩素の動態と放流先河川の付着藻類の分布に及ぼす影響を現地調査するとともに、放流先が海域である場合を想定したとき、海藻であるスサビノリを用いた残留塩素の生態毒性試験を行った。

（５）３次元蛍光分析による合流式下水道雨天時越流水の検出の基礎検討

（２）での下水処理場放流水の他に合流式下水道の雨天時越流水が、琵琶湖への流入する場合に、両者を区分してモニタリングするために、3次元蛍光測定装置の利用可能性を検討した。

## 3 ．研究開発方法

## （１）琵琶湖南湖における病原微生物、指標微生物の調査

琵琶湖南湖を対象とし、月1回の定期調査を実施し、指標微生物及び病原微生物のデータを収集した。なお、琵琶湖南湖は水道水源として利用されているほか、ボートや魚釣りなどのレクリエーション利用も活発である。主要な病原微生物汚染源としては周辺の下水処理場3か所からの下水
処理放流水が考えられるほか、激しい降雨時には合流式下水道からの越流水が十分な処理を経ずに流入する。そこで、上記の3下水処理場の流入水及び下水処理放流水（以下、放流水）も収集し、分析に供した。

## 1 ）試料の収集

2014年7月から2016年3月にかけ、月に1度の頻度で琵琶湖南湖の複数地点で湖水試料を収集した。2014年7月から2015年3月までは15地点、2015年4月から2016年3月までは11地点で試料を収集した。バケツを用いて表層水を収集し、1地点につき約6 Lを滅菌済み容器（マイティーパック、1.8 L、マルエム）にて捕集した。これら試料は指標微生物分析、ウイルス濃縮（小容量法）及び微生物群集構造解析に供した。これに加え、2014年7月から2015年3月までは15地点中6地点、2015年4月から2016年3月までは11地点中4地点で表層水20 Lを同様に収集し、ウイルス濃縮（大容量法）に供した。

2014年11月から2016年3月にかけ、月に1度の頻度で南湖沿岸に位置する3か所の下水処理場で流入水試料及び放流水試料を収集した。流入水試料は250 mLを滅菌済み遠沈管（250 mL、Corning）にて捕集した。また、放流水試料（約4 L）は塩素消費のためチオ硫酸ナトリウム（終濃度：15 mg/L）を添加した滅菌済み容器（マイティーパック、1.8 L、マルエム）にて捕集した。これら試料は指標微生物分析、ウイルス濃縮（小容量法）に供した。

収集した試料は保冷したまま研究室へ輸送し、採取から24時間以内に指標微生物検出及びウイルス濃縮操作に供した。

図(1)-1．調査対象地点。丸囲みの数字は湖水採水地点、図中星印（A-C）は下水処理場を示す。 赤色の地点は2015年4月以降の採水地点を示す。

## 2 ）指標微生物の分析

大腸菌、大腸菌群はXMG寒天培地（ニッスイ）を用いた平板培養法により検出・定量した。試料1 mLもしくは5 mLをシャーレに添加し、寒天培地と混釈し、培地を固化させた後37°Cで一晩培養した。培養操作の後に形成したコロニーを計数し、存在濃度を求めた。なお、流入水試料など濃
度が高いと考えられる試料についてはリン酸緩衝液（pH 7.0）により適宜希釈した後同様の操作に供した。また、特に低濃度と考えられる試料については50～1,000 mLを平板膜（Analysis monitor: Advantec、孔径0.45 μm、口径47 mmもしくはtype HA filter: Millipore、孔径0.45 μm、口径47 mm）に通水した後、膜上に寒天培地を撒き、培養操作に供した。

Fファージは宿主として Salmonella typhimulium WG49 を用いたプラック形成法（Mooijman et al.、2002）により検出・定量した。トリプトン1%、塩化ナトリウム 0.8%、グルコース 0.1%（それぞれ w/v）を含む寒天培地及び対数増殖期に達したWG49適量と試料 5 mL をシャーレ上で混釈し、培地を固化させた後 37°C で一晩培養した。培養操作の後に形成したプラックを計数し、存在濃度を求めた。なお、流入水試料など濃度が高いと考えられる試料についてはリン酸緩衝液（pH 7.0）により適宜希釈した後同様の操作に供した。また、特に濃度が低いと考えられる試料については、1 試料あたりに 10 枚のシャーレを用いることで、50 mL からの検出とした。

## 3 ）ウイルス濃縮操作

小容量試料（～4 L）中のウイルスはKatayama et al.（2002）の手法により濃縮した。試料に終濃度25 mMで2.5 M 塩化マグネシウム水溶液を添加し、ニトロセルロース膜（type HA、Millipore、孔径0.45 μm、口径90 mm）に通水した。通水過程で膜に目詰りが生じた場合は通水を取りやめ、次の操作に移行した。続いて0.5 mM 硫酸（pH 3.0）200 mLを膜に通水した。さらに、1.0 mM 水酸化ナトリウム水溶液10 mLを膜に通水し、ろ液を捕集した。ろ液は0.5 mM 硫酸50 μL及び100×TE-Buffer（和光純薬）100 μLと混合し、これを一次濃縮液とした。一次濃縮液全量を遠心式UF濃縮ユニット（centriprep YM-50、Millipore）による濃縮操作に供し、約650 μLの二次濃縮液を得た。濃縮水量は琵琶湖表層水について最大4 L、流入水及び放流水についてそれぞれ0.1 L、2 Lとした。

大容量試料（20 L）中のウイルスはHata et al.（2015）の手法により濃縮した。試料に終濃度25 mMで2.5 M 塩化マグネシウム水溶液を添加し、カートリッジ式ニトロセルロース膜（opticap XL-2、Millipore、孔径0.5 μm、膜面積0.1 m²）に通水した。続いて0.5 mM 硫酸（pH 3.0）2 L 及び超純水1 Lを膜に通水した。さらに、1.0 mM 水酸化ナトリウム水溶液200 mLを膜に通水し、ろ液を捕集した。ろ液は0.5 mM 硫酸 1 mL及び100× TE-Buffer 2 mLと混合し、これを一次濃縮液とした。一次濃縮液全量を遠心式UF濃縮コニット（centricon plus-70、Millipore）による濃縮操作に供し、約650 μLの二次濃縮液を得た。

## 4 ）定量RT-PCRによるウイルスRNAの検出

二次濃縮液を用い、定量 RT-PCR（以下RT-qPCR）によるRNA定量を試みた。まず、二次濃縮液140μLより、QIAamp viral RNA mini kit（Qiagen）によるRNA抽出操作に供し、RNA抽出液60μLを得た。RNA抽出液2.5μLをHigh performance reverse transcription kit（Life technologies）による逆転写反応（Reverse transcription:RT）に供し、cDNA 5μLを得た。得られたcDNA 5μLから、qPCRによる各種ウイルス遺伝子の検出を試みた。測定対象はGI型及びGII型ノロウイルス（NoV, Kageyama et al., 2003）、サポウイルス（SaV, Oka et al., 2006）、ロタウイルス（RV, Pang et al., 2004）、エンテロウイルス（EV, Katayama et al., 2002）、アイチウイルス（AiV, Kitajima et al., 2013）、トウガラシ微斑ウイルス（pepper mild mottle virus: PMMoV, Zhang et al., 2005）、
GI型～GIV型FRNA大腸菌ファージ（FPH、Wolf et al., 2008）、マウスノロウイルス（MNV, Kitajima et al., 2008）とし、プライマー、TaqManプローブは既往文献記載のものを使用した。

## （２）合流式下水道雨天時越流水の発生の推定

合流式下水道ではある程度以上の降雨時には雨水吐やポンプ場から汚水と雨水の混じった下水が未処理で放流される雨天時越流の問題がある。滋賀県大津処理区合流区域における雨天時越流水の量を降雨イベントから推測し、琵琶湖南湖での定期調査が雨天時越流イベントを捉えることができていたかどうかを検討した。

合流式下水道では少雨の際は雨天時越流が起こらないようにある程度の下水量を処理場まで流下させる。この量を遮集量という。本研究で対象とした滋賀県大津処理区合流区域では、降雨があると晴天時時間最大汚水量(Qとする)の1倍、すなわち1Q分の下水は遮集管によって遮集されA下水処理場まで流下し、下水処理の後に放流される。1Qを超える分の下水は貯留管に流れ込む。貯留管に流れ込んだ下水の一部はA下水処理場へ遮集され、高速凝集沈殿処理された後に放流される。遮集限界を超えた下水は貯留管で貯留されることになる。そして、貯留管での貯留限界をも超えた分の下水は、雨水吐から未処理のまま放流されることになる(未処理放流)。

気象庁ホームページより入手した大津アメダスの1時間降雨強度(mm/h)を入力値として、貯留管の遮集量(mm/h)・貯留量(mm)及び未処理放流量(mm/h)を1時間毎に計算した。計算条件は以下のように設定した(図(1)-2も参照)。2014年4月1日～2016年2月29日までの期間について計算を実施した。

① 降雨量の計算：降雨強度(mm/h)、降雨時間(h)、および大津処理区合流区域の土地面積(155ha=155×10^{4} m^{2})より計算。例えば1.0mm/hの雨が1時間降った場合、約1,550m^{3}に相当する

② 降雨の初期損失：考慮しない

③流出係数(地表面に到達した降雨に対し、浸透・蒸発等をせず地表に流出するものの割合)

：本試算では、大津処理区合流区域の全域に対して共通の流出係数を設定し適用した。その設定方法は、1：各吐室の受け持つ処理区域毎に、土地利用形態に応じた流出係数を設定し、2：処理区域毎の受け持つ土地面積の大津処理区合流区域全体の面積に対する比を算出（面積の広い処理区域は当然、大津処理区合流区域全体に対する流出係数の寄与は大きくなる）、3：1で設定した処理区域毎の流出係数と2で算出した処理区域毎の土地面積の比から、大津処理区合流区域の全域の共通の流出係数を算出した。その値は0.57となった。さらに地表に流出した雨水の全量を下水道が受け入れると仮定した。

④ 遮集管の遮集量(雨水吐室で越流せず水再生センターへ流下する量)

: 大津市では、晴天時間最大汚水量ベースで1Q(雨水0.5～0.8mm/h相当)としている

: 地表に流出した雨水の一部は遮集管によって遮集されるはずであるが、その量の正確な把握は不可能である。よって本研究では遮集管によって遮集される雨水はゼロと仮定し、全量が貯留管へ流れ込むと仮定した。つまり、遮集管による雨水の遮集量は無視した。

⑤ 貯留管の遮集能力：限界を2.0mm/hとし、超過した量が管内に貯留する

⑥ 貯留管の貯留能力：限界を9.0mmとし、超過した量がCSOとして環境中に放流される（未処理放流量）
図(1)-2 合流式下水道雨天時越流水発生予測、試算条件の説明

大津市、下水道機構の資料を基に作成

## （３）次世代シーケンサーを用いたバクテリア群集構造の解析

次世代シーケンサーを用いた16S rRNA配列に基づくバクテリアの群集解析を、琵琶湖南湖水試料および近隣の下水処理場放流水試料に適用し、琵琶湖南湖でのバクテリア群集構造を調べた。解析の流れを図(1)-3に示す。水試料からのバクテリアの分離、バクテリアからのゲノムDNAの抽出、次世代シーケンサー解析のためのライブラリーの調整、シーケンサーのラン、得られたデータのデータ解析を行った。
図(1)-3 次世代シーケンサーによる解析の流れ

## a） 探水

2014年10月、2014年11月、2015年2月、2015年9月、および2016年1月に琵琶湖南湖水サンプルを採水した。採水地点は図(1)-1に示した通りである。また、2015年7月、2016年1月に琵琶湖南湖沿岸に位置する下水処理場3箇所（図(1)-1、A-C）で放流水試料を収集した。

## b) バクテリアDNAの回収

琵琶湖水試料については2～4Lを混合セルロース膜(Millipore社製、直径90 mm、孔径0.45 μm)を用いたろ過によりバクテリアを膜面上に捕捉したのち、滅菌したフットボール型攪拌子を用いてセルロース膜から剥がし、エッペンチューブに回収した。回収したバクテリアから、PowerSoil $ ^{®} $ DNA Isolation Kit (MO BIO製)を用いてDNAを回収した。PowerSoil $ ^{®} $ DNA Isolation Kitは底質等に存在するバクテリアからのDNA回収に定評のあるキットである。具体的な操作手順はキットに添付のマニュアルに従った。

## c）DNA濃度の測定

DNA濃度を正確に測定することは以降のPCR反応やライブラリーの出来を大きく左右するので、吸光度による測定では不十分である。よって、DNA濃度の測定はQubit $ ^{®} $ 2.0 Fluorometer（Life Technologies製）を用いておこなった。なお、測定時の試料の量は1 μLとした。Qubit $ ^{®} $ 2.0 FluorometerはDNAに特異的に吸着する蛍光試薬を用いて濃度を高精度、高感度に測定する事が可能である。Qubit $ ^{®} $ 2.0 Fluorometerによる定量結果に基づいて、DNA濃度を1 ng/μLに調整した。回収されたDNA量がこれに満たないサンプルについては0.5 ng/μLに調整し、PCRに供した。

## d）PCRによる16S rRNA V4領域の増幅

16S rRNA遺伝子V4領域をPCRにより増幅した。プライマーは515番目～806番目の塩基配列を挟むように設定した。プライマーにはバーコード配列が付加してあり、サンプル毎に異なるバーコード配列を使い分けることで最大96サンプルまで同時解析が可能である。PCR試薬はQuanti Fast SYBR Green PCR kit（QIAGEN社製）を用いた。

## e）次世代シーケンサー用のライブラリーの調整

PCR産物はQIA quick $ ^{®} $ PCR Purification Kit（QIAGEN製）を用いて精製した後、ライブラリー調
整へ供した。各サンプルの16S rRNA PCR産物を当量ずつ混合し、「16S rRNA PCRライブラリー」を作成した。リアルタイムPCRによる濃度確認を経て次世代シーケンサーへ供した。

## f） MiSeqでの遺伝子配列解析

4 nMに調整したライブラリーをさらに12 pMに希釈して、illumina社製の次世代シーケンサーMiSeqへ供した。MiSeqランの試薬はMiSeq Reagent Kit、300 Cycles（illumina社）を用いた。このキットは、PCR産物の両端から150bpずつ、合計300bpの配列の解読が可能である。

## g）データ解析

16S rRNAのアノテーション付は、フリーの解析サーバー Metagenomics RAST (MG-RAST) (http://metagenomics.anl.gov/)によって実施した。MG-RASTはBlast like Alignment Tool (BLAT) アルゴリズムを採用しており、ある閾値以上で類似性のある配列を検索してくれる。本研究では、閾値は塩基配列の相同性（Min. % Identity Cutoff）を95%、最小の長さ(Min. Alignment Length Cutoff)を50base、e-valueの最大値を1e-30にセットして解析を行った。バクテリアの分類結果はClass(網)レベルの分類で表示した。サンプルごとにどのバクテリア種がどのくらいの割合を占めているのかを算出し、サンプル間でバクテリアの群集構造を比較した。なお、ある種の藻類は葉緑体のような色素体を持つ。色素体DNAに含まれる16S rRNAの配列から藻類についても分類を行った。

## （４）下水処理水の流入する都市河川における残留塩素と水生生物の影響

## 1 ）下水処理水の流入する都市河川における藻類種の変化

本研究で調査対象とした都市河川の山科川は、京都市南部を流れる小河川である。山科川には2つの下水処理場からの放流水（STP1（石田処理場）、STP2（東宇治処理場））があるのに加えてSTP2のおよそ400m下流でため池からの流入がある。また、山科川はSTP2のおよそ1.5km下流で宇治川に合流している。下水処理場とサンプリング地点の関係を図(1)-4に示す。3地点（R1、R5、R6）において河川水を、2地点（STP1、STP2）において下水処理場放流水を採取した。また、5地点（R1、R2、R3、R4、R5）において付着藻類を採取した。R1はSTP1放流口の直上流、R2はSTP1放流口の直下流、R3はSTP2放流口の直上流、R4はSTP2放流口の直下流、R5はSTP2放流口のおよそ800m下流の地点である。

河川水および下水処理場放流水の採水はステンレス製のバケツで行い、ポリプロピレン製のボトルに入れ替えて持ち帰った。持ち帰ったサンプルは速やかにガラス繊維ろ紙（GF/B、孔径1μm、Whatman）で濾過し、ポリプロピレン製のボトルで4℃で保存した。

付着藻類は河床の石から採取した。石を拾う際は周辺の石の中で比較的多く藻類が付着していると思われるものを選び、採取にはコドラート法を用いた。本手法は5cm四方の枠（コドラート）とブラシを用いて、コドラートの内側の範囲にある石の表面の付着物すべてをこすり落とす方法である。種の同定・計数に使用するサンプルにはルゴール溶液を3%程度加えて保存した。下水放流水（STP1、STP2）と河川水（R3、R5）において全残留塩素濃度を測定した。
図(1)-4 都市河川におけるサンプリング地点

## 2 ）下水処理場での消毒による薬類に対する影響評価

下水処理場では、活性污泥処理の後に消毒が実施されて水域に放流されるが、消毒による水生生物への毒性影響が懸念される。そこで、下水処理水が海域へ放流された場合を想定して、海域における重要な藻類として海藻を用いた生態毒性試験を行い、下水の消毒に一般的に用いられている塩素の海藻への毒性影響を評価するとともに、実際の下水を用いて塩素消毒を適用した場合の水生生物への毒性影響についての検討を行った。

塩素消毒実験では300mL三角フラスコに下水試料を100mL入れ、次亜塩素酸ナトリウム（和光純薬）を適当に希釈して調整した溶液を所定量注入し、注入後15分後の試料を生態毒性試験に供した。供試生物として、Pyropia yezoensis（スサビノリ）を用いた。Pyropia yezoensisはウシケノリ目ウシケノリ科アマノリ属に属するノリである。また、スサビノリは、日本で養殖されている代表的な海苔である。本研究では、兵庫県立農林水産技術総合センターから分譲された株を用いた。海藻の培地にはNPM培地を用いて行った。培地に用いたNaNO_{3}およびグリセロリン酸Naは和光純薬工業製のものを、クレワット32はナガセケムテックス社製のものを用いた。また、スサビノリの生長の測定は定規を用いての目視および画像から解析ソフト(imageJ

(http://imagej.nih.gov/ij/) を用いて行った。目視では、ノリをフラスコから取り出し、測定ができるようにピンセットを用いて広げたのち、葉長（ノリを広げてノリの育つ際に伸びる方向における最も長い部位の長さ）（ノリを広げて葉長と垂直方向に最も幅の広い部位の長さ）を測定した。

試験では、一つの試料に対して3連で実験を行った。300mL三角フラスコに試料を200mL入れた後、葉長が1cm程度になるように切ったスサビノリを入れ、シリコ栓をした。このフラスコを培養庫（東京理化器械株式会社、照明付インキュベーターFLI-2000T）の中で20℃±2℃、照度
1000luxの明暗条件(10時間明期/14時間暗期)で培養を行った。また、塩素消毒を行った下水試料を用いた実験では、下水への塩素注入率は5mg/Lとし、塩素添加した下水試料を培地に1、2、5、10、20%添加して試験を行った。また、試料の入った試験培地は3～4日に一回の割合で、0日目と同様の試料を入れた試験培地を用いて試験培地の入れ替えを行った。

## （５）３次元蛍光分析による合流式下水道雨天時越流水の検出の基礎検討

## 1 ）水試料の採水及び過操作

琵琶湖南湖での採水地点、近隣下水処理場の位置は図1-(1)に示したとおり。2015年11月から2016年3月にかけて、月に1度の頻度で琵琶湖南湖の11地点で湖水試料を収集した。調査期間を通じて各地点で1試料、計55試料を収集した。バケツを用いて表層水を収集し、1地点につき約50 mLを無菌容器（遠沈管、50 mL、ビオラモ）にて捕集した。

2015年10月から2016年2月にかけて、月に1度の頻度で南湖沿岸に位置する2か所の下水処理場で放流水試料を収集した。調査期間を通じて各処理場（A、C）で1試料、計10試料を収集した。試料（約50 mL）は無菌容器（遠沈管、50 mL、ビオラモ）にて捕集した。これに加え、2015年11月から2016年2月にかけて、月に1度の頻度で南湖沿岸に位置する1か所の下水処理場（B）で放流水試料を収集した。調査期間を通じて1試料、計5試料を収集した。試料（約50 mL）は無菌容器（遠沈管、50 mL、ビオラモ）にて捕集した。

これら試料は保冷したまま研究室へ輸送し、遮光状態で冷蔵保存した。保存後48時間以内にニトロセルロース膜（type HA、Millipore、孔径0.45 μm、口径47 mm）によるろ過操作に供し、得られたろ液を3次元蛍光測定に用いた。

## 2 ）3次元萤光测定

ろ液（約10 mL）を用い、3次元蛍光測定による多波長励起-蛍光マトリックス（Excitation-Emission Matrix、以下EEM）を得た。EEMとは、試料水中の蛍光をもつ溶存有機物を調べるために、ある波長で励起した時に試料水から発せられる蛍光の波長とその蛍光強度を測定し、3次元のスペクトルとして表した図である。本研究では縦軸を励起波長、横軸を蛍光波長とし、段彩法により蛍光強度を表すものとする。測定機器はAqualog（Horiba社製）を用いた。測定条件を表1-(1)に示す。

表1-(1). 3次元蛍光測定の条件

積分時間	波長設定
励起光	蛍光 (E_{M}) の受光
·Integration:0.1s	·High:800nm·Low:240nm·Increment:3nm	·High:244.13nm·Low:826.63nm·Increment:4.66nm (8 pixel)
## 4 ．結果及び考察

## (1) 琵琶湖南湖における指標微生物、病原微生物の調査

## 1 ）琵琶湖南湖における大腸菌および大腸菌群の存在状況

下水試料など糞便に強く汚染された水中では、大肠菌と大肠菌群の濃度比は1:10程度となることが知られている（Costán-Longares et al., 2008、Water Res.）。しかしながら、本調査では、ほとんどの試料について、大肠菌群濃度が大肠菌濃度の100倍以上となった（図(1)-5）。この結果は琵琶湖南湖における採水で検出された大肠菌群はほとんどが糞便ではなく土壌等に由来することを示唆している。少なくとも琵琶湖南湖においては、大肠菌群は糞便汚染を測るための指標として有効でないことが示唆された。

図(1)-5 琵琶湖南湖での大腸菌と大腸菌群の検出濃度比較。図中の斜線上にプロットが位置する場合、大腸菌と大腸菌群濃度比が1:10となる。軸上の"N.D."は不検出データ（検出下限値： $ 10^{-1} $ CFU/100 mL）。

琵琶湖南湖全15地点での大肠菌検出結果（2014年7月～2016年2月、2015年4月以降は地点6、9、10、11を除く11地点でのみ採水）を図(1)-6に示した。大肠菌はおおむね $ 10^{-1}\sim10^{1} $ CFU/100 mL程度の濃度で検出された。特に下水処理場近傍である地点1および地点9ではそれぞれ中央値3.2 CFU/100 mL、4.0 CFU/100 mLで検出されており、他の地点よりも高濃度となる傾向にあった。さらに地点1では20回の採水日すべてで検出された。この結果から、少なくとも濃度ベースでは、琵琶湖南湖における大肠菌の主な汚染源の一つは下水処理水であることが示唆されるため、今後は負荷量ベースでの解析・検討を試みる必要がある。

地点1および地点9近傍の下水処理場における放流水中の大腸菌濃度は $ 10^{2}\sim10^{4} $ CFU/100 mL程度であったことから、地点1に達するまでに $ 1/10\sim1/1,000 $ 程度までに濃度が低下していると考えられた。遠方ではさらに濃度が低下しているが、これらの要因として、湖水による希釈、拡散、環境中での不活化が考えられる。

先に説明したように、琵琶湖南湖では大腸菌群数は糞便汚染の指標として適切ではないと考えられる。そこで、本研究で測定された大腸菌数と現行の環境基準との比較を試みる。現行の環境基準では、水浴や通常の水道浄水操作（沈殿ろ過等）を想定している用途の湖沼A類型では大腸菌群数1,000 MPN/100mLと基準が定められている。現在、大腸菌の基準値が見直し中ではあり検討さ
れている数値が公開されていないので、仮に下水試料など糞便に強く汚染された水中での大肠菌と大肠菌群の濃度比の1:10程度(Costán-Longares et al., 2008、Water Res.)を当てはめて考えると、A類型大肠菌群数に相当する大肠菌数は“100 /100mL”となる。図(1)-6に示したとおり、琵琶湖南湖の全採水地点で大肠菌数は100 /100mL未満となっており、琵琶湖南湖の大肠菌数は現在検討されている大肠菌の環境基準A類型程度を満たしていると考えられ、水浴や現状の水道利用の基準は満足されると想定できる。

図(1)-6 琵琶湖南湖での大腸菌検出結果（2014年7月～2016年2月）。

縦軸上の"N.D."は不検出データ（検出下限値： $ 10^{-1} $ CFU/100mL）を示す。

## 2 ）琵琶湖南湖での腸管系ウイルス及びウイルス指標の存在状況

RT-qPCRによるウイルス遺伝子検出に際しては、20 Lの大容量濃縮および最大4 Lの小容量濃縮と、濃縮水量の異なる2種のウイルス濃縮手法を適用した。2014年7月から2015年3月までは、大容量濃縮を6地点（地点1、6、8、10、12、15）で、小容量濃縮を15地点で実施した。2015年4月から2016年2月までは、大容量濃縮を4地点（地点1、8、13、15）で、小容量濃縮を11地点（地点6、9、10、11を除く）で実施した。

図(1)-7 に大容量濃縮試料からのウイルス検出結果（2014年7月～2016年2月採水の計98試料）、図(1)-8 に小容量濃縮試料からのウイルス検出結果（2014年7月～2016年2月採水の計256試料）を示した。大容量濃縮試料からは対象とした9種のウイルス種のうち、8種が検出された。特にトウガラシ微斑ウイルス（PMMoV）、GI型大肠菌ファージ（GI-FPH）、GⅡ型ノロウイルス（GII-NoV）、ロタウイルス（RV）、アイチウイルス（AiV）がそれぞれ89試料、37試料、35試料、31試料、30試料で陽性となり、高頻度で検出された。また、小容量濃縮試料からは対象としたウイルス8種のうち、7種が検出され、PMMoV、GI-FPH、GII-NoV、AiVがそれぞれ224試料、139試料、89試料、82試料で陽性となり、特に高頻度で検出された。これは大容量濃縮と同様の検出傾向であった。リスク因子と考えられるウイルスとしてはGII-NoVおよびRVが高頻度で検出されたが、GI型ノロウイルス（GI-NoV）、エンテロウイルス（EV）、サポウイルス（SaV）はほとんど検出されなかった。なお、AiVはヒトに感染するウイルスであり、病原性については不明確だが、ヒトに由来する粪便汚染を受けた水環境中で比較的高濃度となることが知られており（Hata et al., 2014）、GII-NoVお
よびRVは特に冬季にウイルス性胃腸炎の大流行を引き起こすウイルスである（Ahmed et al., 2014）。

大容量濃縮手法は小容量濃縮手法に比べて検出濃度が1 log程度低い傾向にあるが、より大量の水試料を濃縮したことにより、濃縮液中の有機物濃度が高まり、核酸抽出やRT-qPCR効率の低下が生じたためと考えられる。核酸抽出及びRT-qPCR効率阻害の影響を評価するため、試料中にマウスノロウイルス（MNV）高濃度原液を添加し、添加濃度（期待値）に対する検出濃度（実測値）の比を計算した。この比をMNV回収率と呼ぶこととする。ここでは、MNV回収率が10%を下回った場合、検出阻害が生じたと判断し、1%を下回った場合、特に深刻な検出阻害が生じたと判断する（da Silva et al., 2007）。小容量濃縮試料でMNV回収率が10%を下回ったのは全256試料中7試料のみであったのに対し、大容量濃縮試料については全98試料中66試料でMNV回収率が10%を下回った。さらにそのうち16試料でMNV回収率が1%を下回った。このことから大容量濃縮操作により湖水試料中の有機物濃度も濃縮されることで、核酸抽出及びRT-qPCR効率阻害が生じたことが示唆された。このため、以下のデータは主に小容量濃縮試料を用いて評価する。

図(1)-7 琵琶湖南湖6地点における大容量試料（20 L）からの腸管系ウイルス検出結果（2014年7月～2016年2月、N = 98）。図中の数値は陽性率を示す。縦軸上の"N.D."は不検出を示す。
図(1)-8 琵琶湖南湖15地点における小容量試料（2～4 L）からの腸管系ウイルス検出結果（2015年4月～2016年2月、N = 256）。図中の数値は陽性率を示す。縦軸上の"N.D."は不検出を示す。

## 3 ）琵琶湖南湖での腸管系ウイルス及びウイルス指標濃度の時間変動

図(1)-9に小容量濃縮手法適用時のGII-NoV、AiV、PMMoV、GI-FPHの陽性数を採水月ごとに示した。対象とした全256試料からの陽性率はPMMoVが最も高かった（224試料で陽性）。GII-NoVは2014年に90試料中72試料で陽性となり、高頻度かつ高濃度で検出されていたが、2015年以降は166試料中17試料で陽性と検出頻度が著しく低下した。検出濃度も $ 10^{1}\sim10^{2} $ copies/L程度と定量下限値付近の低濃度であった。検出濃度の時間変動に比べ、同採水月の検出濃度の地点間差は小さかった。また、一般的な冬季流行性とは異なり、6～8月の夏季においても検出された。AiVもGII-NoV同様、2014年に陽性率が高く、2015年以降は陽性率が低下する傾向にあった。調査期間を通して $ 10^{2}\sim10^{3} $ copies/Lの濃度で検出され、いずれの調査月も検出濃度の地点間差が小さかった。これに対して、PMMoV、GI-FPHは各調査月の検出濃度の地点間差が100～1,000倍と大きい傾向が見られた。さらに、PMMoVは調査期間を通して高頻度で検出される傾向にあり、GI-FPHは2014年と比べて2015年以降に陽性率が高くなる傾向が見られた。これらの結果から、琵琶湖南湖においてPMMoV、GI-FPHの濃度変動傾向はAiV、GII-NoVとは異なることが示唆された。