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探水月

図(1)-9 琵琶湖南湖における各採水月のGII-NoV、AiV、PMMoV、GI-FPH検出結果（2014年7月～2016年2月）。

上記4種のウイルスの相互相関性を精査するため、図(1)-10に琵琶湖南湖の小容量濃縮試料から検出されたGII-NoVとAiV、PMMoV、GI-FPHの検出濃度の比較を示した。加えて指標微生物である大肠菌との比較も示した。大肠菌はGII-NoVに比べて検出濃度が低く、濃度の相関も見られない。さらに、GII-NoVが $ 10^{4} $ copies/L以上と高濃度で検出された試料で大肠菌が不検出となることもあり、琵琶湖南湖では、大肠菌をウイルス汚染の指標として用いるのは不適切であることが示唆された。AiVは測定した全ウイルス種の中で最もGII-NoVと類似した濃度分布であった。特にGII-NoVが $ 10^{4} $ copies/L以上の高濃度で検出された試料について、AiVも同様に高濃度で検出された。これらの結果から、AiVは“病原ウイルスの存在を示す指標”として有望であると考えられる。

一方、PMMoVは測定した全ウイルス中、最も高頻度で検出されたが、GII-NoV濃度との相関は見られなかった。また、全試料のうち88％からPMMoVが検出されている（図(1)-8）。これらの結果こから、病原ウイルスが存在しない環境水中にもPMMoVが普遍的に存在すると考えられる。PMMoVは必ずしも病原ウイルスの流行を表していないが、“ウイルスを管理値以下に抑えることで病原ウイルスの流行に備えて安全を確保する指標”としては有望であると言える。

GI-FPHは検出頻度が二番目に高いウイルスであり、PMMoVと同じく、「ウイルスを管理値以下に抑えることで病原ウイルスの流行に備えて安全を確保する指標」として利用できる可能性が考えられる。その一方、前述の通り、GII-NoVとは検出された時期が大きく異なり濃度相関は見られなかった。また、PMMoVとは対照的に、GII-NoVが検出された89試料のうち34試料（38%）でしかGI-FPH
が検出されなかった。GI-FPHもPMMoVと同じく必ずしも病原ウイルスの流行を表していないと考えられる。

GII-NoVとAiVの相関が見られた理由として、GII-NoVおよびAiVは宿主がヒトに限られ、両者共に直径20 nm程度の正二十面体構造であることが考えられる。これに対し、PMMoVはヒトから高濃度で排出されるものの、宿主は植物であるため、ヒト糞便以外の汚染ソースがある可能性がある。また、長径300 nm、短径20 nm程度の棹状構造であり、湖流等の環境での減衰機構がGII-NoVと異なると考えられるため、GII-NoVと異なる濃度変動パターンを示したと考えられる。また、GI-FPHについてはGII-NoV、AiVと同様に正二十面体構造をしているが、ヒト以外にも鳥類の糞便等の汚染ソースがあるため、GII-NoVとは異なる濃度分布を示したと考えられる。

(A) $ E.co/i\log_{10} $ 濃度 (CFU/L)

(B) AiV $ \log_{10} $ 濃度 (copies/L)

図(1)-10 小容量濃縮試料から検出したGII-NoVと大腸菌（A）、AiV（B）、PMMoV（C）、GI-FPH（D）の検出濃度比較。図中の斜線にプロットが位置する場合、GII-NoVとの濃度比が1:1となる。図中の"N.D."は不検出を示す。

## 4 ）琵琶湖南湖での水利用における安全性評価

琵琶湖南湖において6～8月の夏季からもGII-NoVが検出されたが、滋賀県感染症情報によると2014年、2015年ともに非流行期の5、6月にも滋賀県内にGII-NoV患者が存在していることが明らかになった（図(1)-11）。これらの患者の養便とともに排出されたGII-NoVが下水処理場へ流入し、処理しきれずに残ったGII-NoVが琵琶湖に放流されたと考えられる。これにより、琵琶湖南湖において非流行期である夏季からもGII-NoVが検出されたと考えられる。
図(1)-11 琵琶湖南湖試料からのGII-NoV検出結果（上図）と滋賀県内のGII-NoV患者報告数（下図）

滋賀県感染症情報月報2016年2月版を基に作成。

PCRによるウイルス検出ではウイルスの感染力は評価できないため、検出されたウイルスが不活化していることが考えられる。そこで、培養法（プラック法）により感染価を有したFファージの検出を試みることで、他の腸管系ウイルスが感染力を保持していた可能性を検証した。加えて、PCRによるFファージの定量も試み、以下の式でFファージlog不活化率を算出した。

$$ \mathbf{F} ファージ \mathbf{l o g} 不活化率 =-\mathbf{l o g}_{10}\frac{ 培養法による \mathbf{F} ファージ濃度 (\mathbf{P F U/L})}{\mathbf{P C R} による \mathbf{G}I\sim\mathbf{G}I V\text{-}F P H 濃度の総和 (\mathbf{c o p i e s/L})} $$

図(1)-12に琵琶湖南湖におけるFファージの検出結果及びFファージlog不活化率の季節変動を示した。培養法により測定したFファージ（FPH（Plaque））の陽性率が22%（全241試料中53試料で陽性）と低い結果となった。しかし、2014年12月から2015年2月までの冬季においては同陽性率が53%（45試料中26試料で陽性）と高い傾向を示した。これに対して、PCRにより測定したGI～GIV-FPH（FPH（PCR））の陽性率は全体で56%、冬季では58%と顕著な差は見られなかった。このため、Fファージlog不活化率は冬季に低くなる結果となった。

培養法によるGII-NoVの検出が確立されていないため、感染力を有するGII-NoV濃度を定量することはできない。そこで、GII-NoVの不活化率がFファージと同等であると仮定し、以下の式からPCRによるGII-NoV検出濃度から感染力を有するGII-NoV濃度を推定した。
感染性GII-NoV = PCRによるGII-NoV検出濃度 × $ \frac{FPH\ (Plaque)}{FPH\ (PCR)} $

図(1)-12 琵琶湖南湖のFファージ検出結果及びFファージlog不活化率 Fファージlog不活化率は各採水月の平均値を棒グラフで表示した

そして、琵琶湖南湖でのレクリエーション利用による感染リスクを、推定した感染性GII-NoV濃度を用いて評価を試みた（図(1)-13）。曝露形態には遊泳時及び釣り時の誤飲を仮定し、表(1)-2に曝露頻度及び1回あたりの摂取量をまとめた（Asano et al., 1992）。GII-NoVの用量反応モデルにはベータ分布感染モデルを用いた（Teunis et al., 2008）。上記の曝露シナリオ及びベータ分布感染モデルから、年間許容感染リスク10^{-4}（USEPA Surface Water Treatment Rule）を超過しないGII-NoV許容濃度を逆算した。遊泳時のGII-NoV許容濃度は4.3×10^{2} copies/L、釣り時のGII-NoV許容濃度は2.6×10^{4} copies/Lであった。

遊泳シーズンである2014年8月の3地点で、感染性GII-NoV濃度が遊泳時の許容濃度を超過した。不活化率が低かった2014年12月においても遊泳時の許容濃度を超過した。しかし、2014年10月をはじめ、他の採水月については感染力の補正後に許容濃度を下回ることが示された。釣りに関しては、2014年8月、10月にPCRによるGII-NoV検出濃度が許容濃度を超過していたが、感染力補正後の感染性GII-NoV濃度はすべての試料で許容濃度を下回った。以上より、遊泳及び釣りにおける感染リスクを評価したところ、夏季に遊泳すると年間許容リスクを超過する恐れがあるが、釣りに関しては通年で感染リスクは低いことが示された。今後は、Fファージの培養法の検出感度を向上させることでFファージの不活化率をより詳細に算出することや、GII-NoVとFファージの不活化率が同等であるという仮定を検証することが必要である。
表(1)-2 琵琶湖南湖での曝露形態別曝露頻度及び摂取量

曝露形態	曝露頻度	1回あたりの摂取量
遊泳中の誤飲	8回/年	30 mL/回
魚釣り中の誤飲	20回/年	0.2 mL/回

図(1)-13 琵琶湖南湖におけるPCRによるGII-NoV検出濃度及び感染性GII-NoV濃度の推定値青線は遊泳時のGII-NoV許容濃度、緑線は釣り時のGII-NoV許容濃度を示す。

## 5 ）近隣下水処理場での腸管系ウイルスの調査結果

南湖において大腸菌、腸管系ウイルス、Fファージは下水処理場近傍で特に高頻度で検出される傾向にあったため、下水処理場からの放流水は南湖への主要な排出源であると考えられる。そこで、2014年11月より南湖に放流する3か所の下水処理場で流入水試料及び放流水試料からの腸管系ウイルスの検出を試みた。これらの結果を南湖での検出結果と併せて図(1)-14にまとめた。ここで、処理場A及びBは地点1近傍に位置し、処理場Cは地点9の北部に位置する（図(1)-1参照）。GII-NoVは流入水47試料すべてから検出され、非流行期である夏季においても一定数の感染者が存在し、感染者糞便を通じて下水処理場ヘGII-NoVが流入していることが示された。さらに、下水処理によって2 log程度除去できているものの、放流水中にも47試料中38試料で $ 10^{2}\sim10^{4} $ copies/L程度の濃度で存在することが示された。南湖へ放流されたのち、検出頻度は小さくなるものの、湖水中でも同程度の濃度でGII-NoVが検出された。また、AiVもすべての流入水試料から検出され、一年中感染者が存在すると示唆された。GII-NoVと同様に下水処理によって3 log程度濃度が減少するが、南湖への放流後、湖水試料でも同程度の濃度で検出された。PMMoVは流入水・放流水とも
にすべての試料で検出され、濃度もGII-NoV、AiVに比べ高く、放流水中でも $ 10^{4}\sim10^{6} $ copies/Lと高濃度であった。南湖で希釈・拡散されるものの、放流水中の濃度が比較的高いため、湖水試料でも高い陽性率を示したと考えられる。

以上の結果から、南湖での陽性率及び検出濃度は下水処理場からの放流水中濃度に少なからず影響を受けていると示唆される。また、南湖で夏季においてもGII-NoVが検出された理由のひとつとして放流水から年間通して検出されることが挙げられる。ただし、下水処理場での採水日と琵琶湖南湖での採水日に約2週間の時間差があるため、放流直後の影響を捉えるためには下水処理場と琵琶湖南湖での採水日を同日に行う等の工夫が必要である。

図(1)-14 下水処理場流入水、放流水及び琵琶湖南湖試料からのGII-NoV、AiV、PMMoV検出結果図中の数値は陽性率を示す（下水処理場試料：N=47、琵琶湖南湖試料：N=256）。

## （２）合流式下水道雨天時越流水の発生の推定

貯留管の遮集量(mm/h)・貯留量(mm)及び未処理放流量(mm/h)の計算例を図(1)-15に示す。この例は2014年6月30日17時～7月1日12時の独立の降雨イベントについて計算しており、計算の結果CSO(未処理放流)が発生したと推測される降雨ベントである。本例では、2014/7/12:00に貯留管の遮集能力の限界を超えて貯留管内への貯留が瞬間的に起こり、その量は0.3mmであった。同日の7:00に再び遮集能力の限界を超えて、貯留管内への貯留が開始した。さらに11:00に貯留能力の限界も超えてCSOが瞬間的に発生し、その量は6.7mm/hであった。その後は貯留量も減少し、CSOは発生しなかった。なお、遮集量は、6月30日17時の遮集の開始から7月1日16時の終了までの時間のうちに累積34.4mmであった。
図(1)-15 貯留管遮集量・貯留量および未処理放流量の計算例

2014年6月30日～7月1日の降雨イベントの計算例

図(1)-15に示した例と同様に、2014年4月1日～2016年2月29日の期間について降雨強度に基づくCSOの発生を推測（未処理放流量の計算）した。その結果を図(1)-16に示す。この結果に基づくと、CSO発生直後（1～2日以内）に行われた調査はなかったと推測される。よって、本研究における琵琶湖南湖調査では微生物汚染に対するCSOの影響の有無を論じることは出来ない結果となった。琵琶湖南湖の調査は滋賀県也国土交通省が実施している月1回の定期調査に参加させていただく形で実施しており、CSOのタイミングに合わせることが出来ない難しさがある。水系での微生物汚染に対するCSOの影響を評価するためには、採水の比較的容易な河川等で降雨イベント直後に調査することが必要である。

図(1)-16 2014年4月1日～2016年2月29日までのCSO発生予測結果
## （３）次世代シーケンサーを用いたバクテリア群集構造の解析

琵琶湖南湖におけるバクテリア群集構造の解析結果を、2014年10月の琵琶湖南湖水サンプルを例に示す。図(1)-17は各地点で回収されたDNA濃度と、バクテリア由来、藻類由来のDNAの割合を示している。DNA濃度が最も高かった地点は地点③三保ヶ崎沖(0.145ng-DNA/mL)であった①粟津沖中央、④柳ヶ崎沖、⑧唐崎沖、⑭堅田沖の、湖西沿岸部でDNA濃度が高い傾向であった。一方、DNA濃度が最も低かった地点は地点②浜大津沖(0.0.38ng-DNA/mL)であった。バクテリアと藻類の割合でみると、沿岸部(地点③、④、⑥山田港沖、⑦伊佐々側沖)および瀬田川河口に近い地点①、②浜大津沖中央においてバクテリア由来のDNAが50%以上の割合を占めていた。沖合から離れるほど(地点⑤柳ヶ崎沖中央、⑩大宮川沖中央)、また北湖に近い程(⑬雄琴沖、⑫雄琴沖中央、⑭堅田沖、⑮木ノ浜沖)、藻類由来のDNAが高い傾向が見られた。また、16S rRNA配列に基づいて放流先水域におけるバクテリアをclass(網)レベルで分類した結果を図(1)-18に示す。各棒グラフは水域での各バクテリア網の割合を色分けして示している。いずれの地点においてもバクテリアの種類に大きな違いがないことが分かる。具体的には、いずれの地点においてもCyanobacteria、Cytophagia、Flavobacteria、Betaproteobacteria、Aphaproteobacteria、Actinobacteriaが優占種であった。2014年11月、2015年2月、2015年9月、および2016年1月の琵琶湖南湖サンプルについても同様に、回収されたDNAの濃度測定と、バクテリアの群集構造を解析した。

図(1)-17 琵琶湖南湖でのDNA濃度、バクテリアDNAと藻類DNAの割合

緑色：藻類由来DNA濃度の割合。
図(1)-18 琵琶湖南湖におけるバクテリア種

図1－（17）に示したバクテリア由来のDNA濃度(ng-DMA/mL)と図1－（18）に示したclass（網）レベルでの各バクテリア種の存在割合(%)から、各バクテリア種由来のDNA濃度(ng-DMA/mL)を計算した。腸内細菌の優占種であるBacteroidia、Clostridiaの各採水地点におけるDNA濃度の計算結果をそれぞれ図1－（19）、図1－（20）に示す。2014年10月、2014年11月、2015年2月、2015年9月、および2016年1月の結果を比較して示している。また、2015年7月、2016年1月の近隣下水処理場の放流水の解析結果も比較のため併せて示す。この結果から言えることは、採水月毎のBacteroidia、Clostridia由来DNA濃度の変動が大きいことである。2014年10月、2014年11月、2015年9月は10^{-4} ng-DNA/mL以下の濃度に集中しているのに対して、2015年2月、2016年1月じゃ10^{-3} ng-DNA/mL付近に分布している。この採水月毎の変動に比べて、同じ採水月でのサンプルの採水地点間の変動は小さいことがわかる。ウイルスのqPCRによる測定結果からも、「検出濃度の時間変動に比べ、同採水月の検出濃度の地点間差は小さかった」という結果がえられているが（『3）琵琶湖南湖での腸管系ウイルス及びウイルス指標濃度の時間変動』の項参照）、バクテリア群集解析の結果もこの結果と同じであった。つまり、琵琶湖南湖においてはウイルスもバクテリアも、時間変動に比べて地点間差が小さい（時間変動の方が地点間差よりも大きい）ことがわかる。

琵琶湖水と下水処理場放流水のBacteroidia、Clostridia由来DNA濃度の比較では、2015年7月および9月の調査では放流水中の濃度と琵琶湖水の濃度の間におおむね2log以上の差が見られた(図1-(19)、1-(20)、黒三角)。ウイルスのqPCR測定では、PMMoVが最も高頻度に下水放流水からも琵琶湖水からも検出されていたが、その濃度測定結果でも、放流水中の濃度と琵琶湖水の濃度の間におおむね2log以上の差が見られていた（図1-(14)）。バクテリア、ウイルスともに、放流水から高濃度で排出され、琵琶湖で希釈・拡散されることが示唆される。一方、興味深いことに、2015年2月の調査では、琵琶湖水と下水処理場放流水のBacteroidia、Clostridia由来DNA濃度は同レベルであった(図1-(19)、1-(20)、緑丸)。この結果は、琵琶湖南湖においては、時期（季節）
Effluent：放流水、ND：検出されなかったことを示す。検出下限値は地点毎に若干の差があるが、おおむね10^{-7}ng-DNA/mL。

によっては下水処理場放流水にともなって排出された腸内細菌が琵琶湖南湖で蓄積している可能性を示唆している。もしくは、時期（季節）によっては下水処理場放流水以外の汚染源の寄与も大きいことを示唆している。ただし、バクテリアについては、下水処理場での採水日と琵琶湖南湖での採水日に約2週間の時間差があるため、このような結果になった可能性も考えられ、今後は下水処理場と琵琶湖南湖での採水を同日に行った上で、下水処理場以外の汚染源について検討していくことが必要である。

図(1)-19 琵琶湖南湖における Bacteroidia 由来 DNA 濃度の地点間、採水日間比較
図(1)-20 琵琶湖南湖におけるClostridia由来DNA濃度の地点間、採水日間比較

Effluent：放流水、ND：検出されなかったことを示す。検出下限値は地点毎に若干の差があるが、おおむね $ 10^{-7} $ ng-DNA/mL。

## （４）下水処理水の流入する都市河川における残留塩素と水生生物の影響

## 1 ）下水処理水の流入する都市河川における藻類種の変化

京都市内を流れる都市河川の山科川において実施した6回の調査において、下水処理場放流水（STP1、STP2）と河川水（R3、R5）の全残留塩素濃度を測定した。その平均値と最大値、最小値を図(1)-21に示す。STP2の全残留塩素濃度の平均値が0.65mgCl_{2}/Lと最も高く、全ての測定においてでSTP1よりも高かった。

図(1)-21 下水放流水及び河川水の全残留塩素濃度
山科川における下水処理水の流入と残留塩素の水生生物への影響を調べるために、河床の付着藻類の採取を行った。採取した試料からは、藍藻類2種、珪藻類22種、ミドリムシ藻類1種、緑藻類12種が同定された。各サンプリング地点における分類綱ごとの平均出現種数を図(1)-22に示す。STP1放流水の流入後（R2）ではR1と比較して平均出現種数が大きく減少していることがわかる。また、放流口直下よりも河川流下後のほうが出現種数は増加する傾向が見られた。STP1放流水の流入後では珪藻類の出現種数が顕著に減少していた。また、河川下流にいくにつれ藍藻類の出現頻度が減少した。ミドリムシ藻類はR1とR2において1回ずつしか出現しなかった。緑藻類の平均出現種数は地点による変動があまりなかった。

図(1)-22 各地点における綱ごとの平均出現種数

各地点・各調査日の付着藻類の多様性指数を計算した。図(1)-23に、各地点の多様性指数の平均値、最大値、最小値を示す。多様性指数（H'）は下式のShannonの式で計算した。

$$ \begin{aligned}H^{^{\prime}}&=-\sum\frac{n_{i}}{N}log_{2}\frac{n_{i}}{N}\\&N：全藻類細胞数 \\&n_{i}：種 i の細胞数 \end{aligned} $$

多様性指数H'の平均値はR1で最も高い値となったが、下水処理水の流入後のR2で最も低い値となった。また、H'の平均値は河川流下後のR2～R5にかけて徐々に上昇する傾向が見られた。この結果から、下水処理水の流入によって、河川河床に生息する付着藻類については、藻類の出現種類だけではなく多様性も大きく低下していることがわかった。
図(1)-23 各地点における多様性指数

山科川の各地点における付着藻類の付着藻類の優占種となっていた付着藻類は、藍藻類：Homoeothrix janthina、Oscillatoria tenuis、珪藻類：Gomphonema parvulum、Nitzschia palea、緑藻類：Chlorolobion braunii、Stigeoclonium tenue、Scenedesmus quadricaudaの7種であった。Homoeothrix janthinaは比較的清浄な河川に生息している。本研究では、この種は下水放流水の影響を受けていない河川上流である地点R1において高い細胞占有率で見られた。Nitzschia paleaは汚濁した河川で典型的な種であると言われている。本研究では、この種はR1、R5において優占種として見られた。本種はR4でも多く見られたため、塩素に対してある程度耐性を持っていると考えられる。Gomphonema parvulumはR2、R4、R5において優占種として見られた。本種も塩素耐性を持っていると考えられる。Nitzschia paleaとGomphonema parvulumはすべてのサンプルから同定された。Stigeocolonium sp.はα、β中腐水性水域の代表種として知られている。本研究では、この種は稀にしか見られなかったが、R4のサンプルにおいて優占種として見られた。

Chlorolobion sp. は残留塩素濃度の高い地点の優占種として見られることが知られている。本研究では、本種はR1では全く見られなかったが、R2～R5においては極めて高い細胞占有率で見られた。このような分布は非常に特徴的である。また、細胞占有率が90%を超えるサンプルもあった。地点R4において測定された全残留塩素濃度は0.49～0.82mgCl₂/Lの範囲であり、R4においてChlorolobion brauniiが優占していた原因としては残留塩素の影響が非常に大きいためではないかと考えられ、残留塩素による他の藻類への生長阻害がChlorolobionが優占種となるための重要な要因になっていると考えられる。緑藻類の平均出現種数はR1～R5まで概ね一定だが、R2～R5においてはほぼ毎回の調査でChlorolobion brauniiが見られている。そのため、やはり緑藻類も、Chlorolobion braunii以外の種は放流水の影響を受けて出現頻度が減少している。Chlorolobion brauniiは高い残留塩素耐性と、STP1流入後の緑藻類に有利な栄養条件によって、他の付着藻類より急速に成長し基質である礫の表面を独占しているのではないかと推察される。

## 2 ）下水処理場での消毒による藻類に対する影響評価

下水処理水が海域へ放流された場合を想定して、海域における重要な藻類として海藻を用いた
生態毒性試験を行い、下水の消毒に用いられている塩素の海藻への毒性影響の評価を行った。供試生物としては、Pyropia yezoensis（スサビノリ）を用いた。

Pyropia yezoensisに対する塩素による影響を次の図(1)-24、図(1)-25に示す。図(1)-25において成長率とは、n日目における葉長を0日目におけるそれらで割った値である。また、凡例中の単位はmg/Lである。

図(1)-24において、対照区の場合、葉長は21日間の培養で31mm程度（10mmから41mmへ生長）の生長が見られた。試料中の塩素濃度が0.06、0.12mg/Lのとき、葉長の生長は16mm程度（10mmから26mmへ生長）であり、対照区と比べ半分程度の生長しかみられなかった。遊離塩素濃度が0.26mg/L以上では5～7mm程度の生長しかみられなかった。また、このとき、Pyropia yezoensisが実験途中より白く変色するものもあり、その試料においては、ほとんど生長がみられなかった。図(1)-25においては、それぞれ時間ごとの各塩素濃度における成長率について対照区の葉長の生長率を1としたときの成長率を示している。生長率が負の値を示しているものは、0日目の長さより短くなったことを示している。図(1)-24において述べたように、遊離塩素濃度0.06、0.12mg/Lでは0.5程度の値が示され、0.26mg/Lを超えると生長率は非常に小さいことが示された。

図(1)-24 塩素濃度(mg/L)とPyropia yezoensis葉長の変化
図(1)-25 塩素濃度(mg/L)とPyropia yezoensis葉長の相対生長率の変化

つぎに、下水処理水が海域に放流されたことを想定して、塩素消毒した下水（塩素注入率 5mg/L）の添加による Pyropia yezoensis に対する影響について実験的に検討を行った。その結果を図（1）-26、図（1）-27 に示す。図（1）-26 では、それぞれ時間ごとの各下水添加率における葉長の変化を、図（1）-26 では、それぞれ時間ごとの各下水添加率における対象区の葉長生長率を1 としたときの生長率比を示している。図（1）-26 において、下水添加率1、2、5、10% のときは、葉長はそれぞれ20、14、9、4mm 程度生長し、塩素消毒した下水の添加率が高くなるにつれて葉長の生長は低くなった。また、下水添加率20% のときには、葉長の生長は0～1mm となり、ほとんど生長が見られなくなった。また、下水添加率が10% を超えると、白く変色し生長しない試料がみられるようになった。また、図（1）-27 の生長率比に関して、下水添加率1% のとき生長率はほとんど対照区と変わらず、添加率か上がるにつれて生長率は低下が見られた。このとき、下水添加率5% を超えたあたりから0.5 を下回るようになり、顕著な葉長の生長阻害がみられるようになった。

図(1)-26 塩素消毒した下水の添加率とPyropia yezoensis葉長の変化
図(1)-27 塩素消毒した下水の添加率と Pyropia yezoensis 葉長の相対生長率の変化

塩素消毒した下水を添加した実験においては、葉長の生長について下水添加率が20%を超えると、ほとんど生長しなくなり白く変色するのが見られた。ただし、下水添加によって試料中の塩分濃度が変化するため、塩分濃度による生長阻害であるのか、下水由来の生長阻害であるのか、今後検討していく必要がある。

## （５）３次元蛍光分析による合流式下水道雨天時越流水の検出の基礎検討

2015年11月から2016年3月にかけて毎月、琵琶湖南湖および近隣の3下水処理場において定期採水を行い、励起波長、蛍光波長、および蛍光強度の3次元スペクトルを調べた。下水処理場流入水および放流水の3次元スペクトルの測定結果の例をそれぞれ図(1)-28、図(1)-29に示す。流入下水においては、励起波長275nm、蛍光波長300～350nm付近の位置に強い蛍光波長のエリアが検出された。このエリアの中には励起波長275nm/蛍光波長300nmのピークと励起波長275nm/蛍光波長340nmのピークの二つがあるように見受けられた(それぞれ図(1)-28aまたはc)。また、励起波長480nm/蛍光波長520nm付近の位置にもピークが検出された(図(1)-28b)。一方、放流水からは流入下水と類似したパターンの3次元蛍光スペクトルが得られたが、蛍光の強度は流入下水に比べて弱くなっていることが確認された(図(1)-29)。特に、ピークa(励起波長275nm/蛍光波長300nm)については、流入下水での蛍光強度が放流水に比べて強く、合流式下水道の雨天時越流水の特異的マーカーとして使える可能性が考えられた。
図(1)-28 下水処理場流入下水の3次元蛍光スペクトル 2016年1月 A下水処理場

図(1)-29 下水処理場放流水の3次元蛍光スペクトル

下水処理に伴うピークa、b、cの蛍光強度の変遷を図(1)-30に示す。この図からも、ピークa、cの蛍光強度が生物処理によって大きく減少することが分かる。ピークa、cが、合流式下水道の雨天時越流水の特異的マーカーとして使える可能性が考えられた。
図(1)-30 下水処理に伴う蛍光強度の変化

A下水処理場の例。流入：流入下水、沈後：初沈越流水、処理：二次処理水、放流：放流水。

$ n = 5 $

琵琶湖南湖水の3次元蛍光スペクトルを2016年1月の地点1を例に図(1)-31に示す。流入下水のピークaと同じ位置にピークが見られた。他の採水地点、採水月についても同様に3次元蛍光スペクトルを得た。琵琶湖南湖の各採水地点における、ピークa、b、およびcの蛍光強度を図(1)-32に示す。ピークa、cは比較的強い強度で、全ての採水地点で採水期間を通じて検出されていることが分かる。これに対してピークbは蛍光強度が弱くほとんど検出されていない。今後は、採水が比較的容易な河川等での降雨イベント直後の採水を通じて、CS0を確実に捉えた状況下でのこれらのピークの蛍光強度の動態を把握し、CS0のマーカーとしての適性を検討することが課題である。なお、図(1)-32では地点1、13、14、および15に代表されるように、採水月での蛍光強度の変動が大きいことが分かる。『(2)合流式下水道雨天時越流水の発生の推定』の項で説明したように、降雨強度に基づくCS0の発生推測の結果(図(1)-16)からはCS0発生直後(1～2日以内)に行われた調査はなかったと推測されており、図(1)-32で見られる変動がCS0の影響を受けたものであるかは不明である。
図(1)-31 琵琶湖南湖水の3次元蛍光スペクトル 2016年1月 採水地点1

図(1)-32 琵琶湖南湖の各採水地点における、ピークa、b、およびcの蛍光強度 $n = 5$
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

## 1 ）琵琶湖南湖における大腸菌群と大腸菌濃度の相関

琵琶湖南湖での調査の結果、大腸菌群濃度が大腸菌濃度の100倍以上となった。この結果は琵琶湖南湖における採水で検出された大腸菌群はほとんどが糞便ではなく土壌等に由来することを示唆している。少なくとも琵琶湖南湖においては、大腸菌群は糞便汚染を測るための指標として有効でないことが示唆された。

## 2 ）琵琶湖南湖での腸管系ウイルス及びウイルス指標の存在状況

本研究は、2年間にわたって湖沼における腸管系ウイルスおよびウイルス指標の存在状況を毎月継続的に調査した初めての調査事例であり、大変貴重なデータである。調査の結果、トウガラシ微斑ウイルス（PMMoV）、GI型大腸菌ファージ（GI-FPH）、GⅡ型ノロウイルス（GII-NoV）、ロタウイルス（RV）、アイチウイルス（AiV）がそれぞれ高頻度で検出された。陽性率はPMMoVが最も高かった。リスク因子と考えられるウイルスとしてはGII-NoVおよびRVが高頻度で検出されたが、GI型ノロウイルス（GI-NoV）、エンテロウイルス（EV）、サポウイルス（SaV）はほとんど検出された。GII-NoVについては一般的な冬季流行性とは異なり、6～8月の夏季においても検出されることがわかった。

## 3 ）腸管系ウイルス間の濃度相関、及び腸管ウイルス濃度と指標細菌濃度の相関

GII-NoVとAiV、PMMoV、GI-FPHの検出濃度の比較を行った。加えて指標微生物である大肠菌との比較も行った。その結果、大肠菌はGII-NoVに比べて検出濃度が低く、濃度の相関も見られない結果となり、琵琶湖南湖では、大肠菌をウイルス汚染の指標として用いるのは不適切であることが示唆された。

AiVは測定した全ウイルス種の中で最もGII-NoVと類似した濃度分布であり、“病原ウイルスの存在を示す指標”として有効であると考えられた。一方、PMMoVは測定した全ウイルス中、最も高頻度で検出されたが、GII-NoV濃度との相関は見られなかった。また、全試料のうち88％からPMMoVが検出されている。これらの結果こから、病原ウイルスが存在しない環境水中にもPMMoVが普遍的に存在すると考えられる。PMMoVは必ずしも病原ウイルスの流行を表していないが、“ウイルスを管理値以下に抑えることで病原ウイルスの流行に備えて安全を確保する指標”としては有望であると言える。

ファージGI-FPHは検出頻度が二番目に高いウイルスでありPMMoVと同じく、“ウイルスを管理値以下に抑えることで病原ウイルスの流行に備えて安全を確保する指標”として利用できる可能性が考えられる。また、GI-FPHもPMMoVと同じく必ずしも病原ウイルスの流行を表していないと考えられた。

## 4 ）琵琶湖南湖での水利用における安全性評価

現在環境基準として検討されている大腸菌の視点からは、琵琶湖南湖は水浴が可能なA類型レベルを満足できる考えられたが、琵琶湖南湖での遊泳及び釣りによる感染リスクを、GII-NoVの測定濃度からをファージの不活化率を考慮して、推定した。この結果、夏季に琵琶湖南湖で遊泳するとUSEPAの水道水で想定している年間許容リスクを超過する恐れがあるが、釣りに関しては通年で感染リスクは低いことが示された。
## 5 ）次世代シーケンサーを用いたバクテリア群集構造の解析

本研究は、琵琶湖南湖におけるバクテリア群集構造を、近隣下水処理場の放流水も含めて解析した初めての調査事例である。ヒト腸内細菌の優占種であるBacteroidia、Clostridialについて解析した結果、、採水月毎のBacteroidia、Clostridia由来DNA濃度の変動が大きいこと、採水月毎の変動に比べて、同じ採水月でのサンプルの採水地点間の変動は小さいことが分かった。ウイルスのqPCRによる測定結果からも、検出濃度の時間変動に比べ、同採水月の検出濃度の地点間差は小さかった結果がえられており、バクテリア群集解析の結果もこの結果と同じをであった。つまり、琵琶湖南湖においてはウイルスもバクテリアも、時間変動に比べて地点間差が小さい（時間変動の方が地点間差よりも大きい）ことがわかる。

琵琶湖水と下水処理場放流水のBacteroidia、Clostridia由来DNA濃度の比較結果から、バクテリア、ウイルスともに、放流水から高濃度で排出され、琵琶湖で希釈・拡散されることが示唆された。一方、興味深いことに、採水月によっては琵琶湖水と下水処理場放流水のBacteroidia、Clostridia由来DNA濃度は同レベルであった月もあり、この結果は、琵琶湖南湖においては、時期（季節）によっては下水処理場放流水にともなって排出された腸内細菌が琵琶湖南湖で蓄積している可能性が示唆された。もしくは、時期（季節）によっては下水処理場放流水以外の汚染源の寄与が大きいことが示唆された。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

本研究の成果は、環境省で現在、水質環境基準の生活環境基準項目の変更を検討している大腸菌の指標検討を行うための平成24年度生活環境項目新規基準等検討会の衛生指標WGおよび平成25年度大腸菌数環境基準検討会において、これまでの大腸菌群や腸球菌、ファージ、ウイルスなどの水域の存在実態や動態、下水処理過程や消毒過程での動態の相違を示し、リクレーション利用、水産用水、水道原水の視点からの水質環境基準の検討の基礎的知見を一部提供している。また環境省水環境課が平成24年、平成25年度に国立環境研究所と主催している、水質環境基準の生活環境項目のうち、水生生物基準の追加項目を検討するために「今後の水生生物保全に関する検討会」および水生生物保護を目的に新たにバイオアッセイを排水管理に導入するための「生物応答を利用した水環境管理手法の制度・運用分科会」で、本研究課題の一部の成果から塩素による水生生物への影響についての情報提供を行っている。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

琵琶湖南湖での調査の結果、大肠菌群濃度は大肠菌と無相関であり、大肠菌濃度の2オーダーを超える結果となった。この結果は琵琶湖南湖において検出された大肠菌群はほとんどが輿便ではないことを示唆しているため、少なくとも琵琶湖南湖においては、薬便汚染を測るための指標としては、大肠菌群は有効でなく、大肠菌への基準変更が必要である。

大腸菌は病原ウイルス濃度との相関がみられなかった。また琵琶湖南湖では、大腸菌が十分低い場合（現在検討されている大腸菌のA類型の基準案を下回る程度）でもウイルスが検出されることがあった。推定された水浴の感染リスクは、USEPAの想定する許容リスクよりも高い場合があることから、琵琶湖南湖の場合、水浴の適否を改定が予定されている大腸菌だけでの判定で行うこと
とは不十分である可能性がある。よって、ウイルス汚染の指標が新たに必要であることが示唆される。今後検討すべきウイルス指標の候補としてはアイチウイルス（Aichi virus: AiV）やトウガラシ微斑ウイルス（pepper mild mottle virus: PMMoV）が考えられる。

塩素を用いた消毒では、付着性藻類の多様性に影響を与えていることが現地調査から示唆されていることから放流水の残留塩素の管理が今後重要な課題となると考えられる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) A. HATA, K. MATSUMIRI, M. KITAJIMA, and H. KATAYAMA: Food Environ. Virol., 7(1), 7–13 (2015)

“Concentration of Enteric Viruses in Large Volumes of Water Using a Cartridge-Type Mixed Cellulose Ester Membrane”

2) A. HATA, H. KATAYAMA, H. FURUMAI: Appl. Environ. Microbiol, 81(5), 1585-1593 (2015) "Organic Substances Interfere with Reverse Transcription-Quantitative PCR-Based Virus Detection in Water Samples"

## くその他誌上発表（査読なし）>

1）片山浩之、安井宣仁、猪又明子、田中宏明、岸田直裕、原本英司、渡部徹、真砂佳史、浅田安廣、端昭彦、佐野大輔、井原賢、稲葉愛美、水環境学会誌、37、12、424-433（2014）

「水中の健康関連微生物に関する研究動向」

2）井原賢、稲葉愛美、佐野大輔、臨床と微生物、42、685-689（2015）

「衛生環境工学分野におけるマイクロバイオーム研究」

## （2） 口頭発表（学会等）

1）井原賢、堅川陽平、李善太、松田知成、山下尚之、田中宏明：第17回日本水環境学会シンポジウム（2014）

「次世代シーケンサーを用いた、水環境における薬剤耐性遺伝子の大規模検出」

2) 朴耿洙、山下尚之、田中宏明、金丸国夫、岩崎達行: 第17回日本水環境学会シンポジウム(2014)「高濁度下水に対する紫外線消毒における紫外線照射量の検討」

3）端昭彦、花本征也、山下尚之、田中宏明：第49回日本水環境学会年会（2015）

「感染価を保持したFRNA ファージの定量的タイピングを目的とした濃縮手法の開発」

4）白坂勇也、端昭彦、山下尚之、田中宏明：第49回日本水環境学会年会（2015）

「琵琶湖南湖における腸管系ウイルス汚染の実態評価」

5）白坂勇也、端昭彦、山下尚之、田中宏明：第37回京都大学環境衛生工学研究会シンポジウム
(2015)

「琵琶湖南湖におけるウイルス汚染の実態評価」

6）朴耿洙、山下尚之、田中宏明：日本オゾン協会第24回年次研究講演会(2015)

「被災下水処理場での前凝集後の塩素とオゾン消毒でのMS2ファージの不活化効果の比較」

7) Masaru IHARA, Yoshifumi MASAGO, Manami INABA, Seiya HANAMOTO, Akihiko HATA, Shinobu KAZAMA, Suntae LEE, Yohei KATAYAMA, Naoyuki YAMASHITA, Tomonari MATSUDA, Hiroyuki KATAYAMA, Tatsuo OMURA, Hiroaki TANAKA, 18th International symposium on health-related water microbiology (2015)

“HOW DO MICROBES ATTENUATE IN WATER ENVIRONMENT? : COMPARATIVE ANALYSIS OF MICROBES AND CHEMICALS RELEVANT TO HUMAN WASTES”

8) Akihiko HATA, Yuya SHIRASAKA, Naoyuki YAMASHITA, Hiroaki TANAKA, 18th International symposium on health-related water microbiology (2015)

“Quantitative genotyping of infectious FRNA-phages at wastewater treatment plants in japan”

9）田中宏明：第52回環境工学研究フォーラム 企画セッション（2015）

「今後の水環境保全に貢献する下水道システムの技術的課題と管理手法」

10）井原賢：水中の健康関連微生物研究委員会シンポジウム(2015)

「水環境における病原微生物、指標微生物の実態調査」」

11）白坂勇也、端昭彦、山下尚之、田中宏明：第50回日本水環境学会年会（2016）「琵琶湖南湖での通年調査をもとにした腸管系ウイルス濃度分布の把握」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1) 「水系感染微生物による水環境汚染の把握と指標微生物管理の限界に関する研究」平成26年度アドバイザリーボード会合（平成27年1月14日、東京都、航空会館、出席者17名）

2）環境研究総合推進費『水系感染微生物による水環境汚染の把握と指標微生物管理の限界に関する研究』報告会(2015年6月16日、仙台市 宮城県保健環境センター 大会議室、観客50名）

3）「水系感染微生物による水環境汚染の把握と指標微生物管理の限界に関する研究」平成27年度アドバイザリーボード会合（平成27年8月25日、仙台市、東北大学、出席者16名）

4）南蒲生浄化センター復旧状況視察（平成27年8月26日、仙台市、南蒲生浄化センター、参加者9名）

5) 日本水環境学会水中健康微生物研究委員会シンポジウム、水中の病原微生物によるリスク制御への総合対策に向けて (2015年12月15日、東京 発明会館、観客100名)
## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

## 受賞

1）白坂勇也、端昭彦、山下尚之、田中宏明、年会学生ポスター発表賞（ライオン賞）：第49回日本水環境学会年会（2015）

「琵琶湖南湖における腸管系ウイルス汚染の実態評価」

2）白坂勇也、端昭彦、山下尚之、田中宏明、優秀ポスター賞、第37回京都大学環境衛生工学研究会シンポジウム(2015)

「琵琶湖南湖におけるウイルス汚染の実態評価」

3）白坂勇也、端昭彦、山下尚之、田中宏明、第45回日本水環境学会年会 年会優秀発表特別賞（クリタ特別賞）、第50回日本水環境学会年会（2016）

「琵琶湖南湖での通年調査をもとにした腸管系ウイルス濃度分布の把握」

## 招待講演

1) Hiroaki TANAKA, Tsinghua University Water Safety Symposium, 2014/4/7, Shenzhen, China "Microbial pollution by discharge from municipal sewage treatment plants damaged by Tsunami"

2）田中宏明、京都技術士会平成27年2月例会特別講演、2015/2/7、京都「水環境と水循環の問題を解決するための都市の水利用のあり方」

3）田中宏明、平成27年度産総研エネルギー・環境シンポジウム「水資源の現状と循環利用のための技術展望～アジアに向けた技術貢献を目指して～」、2015/9/1、機械振興会館、東京「持続可能な水環境を形成するための下水道の課題と期待」

4）田中宏明、2015年度日立技術士会 関西RG講演会、2015/9/5、(株)日立製作所 関西支社 会 議室、大阪中之島フェスティバルタワー 31階

「身近な“水”についての課題と展望」

5) Hiroaki TANAKA, Sixth Chemical Sciences & Society Symposium (CS3), 2015/9/14-18, Leipzig, Germany

“Water, Health, the Environment and Sanitation, A Japanese Perspective”

6) H. TANAKA, N. YAMASHITA, M. IHARA, A. HATA, Y. SHIRASAKA, T. YAMAGUCHI, China-Japan Joint Seminar on Wastewater Resource Reclamation and Reuse in the Course of Urbanization, 2015/12/6, Tsinghua University, Graduate School at Shenzhen

“Are the waters currently improved in quality really swimmable?”

7）田中宏明、大阪府下水道協会幹部職員研修会、2016/2/12、シティプラザ大阪

「水環境改善に貢献してきた下水道が今後の持続可能な都市水循環系構築に果たすべき課題」

### 8 \. 引用文献

Ahmed, Sharia M., et al. "Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a
systematic review and meta-analysis." The Lancet infectious diseases 14.8 (2014): 725-730.

Asano, T., et al. "Evaluation of the California wastewater reclamation criteria using enteric virus monitoring data." Water Science and Technology 26.7–8 (1992): 1513–1524.

Costán-Longares, Ana, et al. "Microbial indicators and pathogens: removal, relationships and predictive capabilities in water reclamation facilities." Water research 42.17 (2008): 4439-4448.

da Silva, Allegra Kyria, et al. "Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II." Applied and Environmental Microbiology 73.24 (2007): 7891-7897.

Hata, Akihiko, et al. "Effects of rainfall events on the occurrence and detection efficiency of viruses in river water impacted by combined sewer overflows." Science of the Total Environment 468 (2014): 757–763.

Hata, Akihiko, et al. "Concentration of Enteric Viruses in Large Volumes of Water Using a Cartridge-Type Mixed Cellulose Ester Membrane." Food and environmental virology 7.1 (2015): 7-13.

Kageyama, Tsutomu, et al. "Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR." Journal of clinical microbiology 41.4 (2003): 1548-1557.

Katayama, Hiroyuki, Akihiro Shimasaki, and Shinichiro Ohgaki. "Development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and Norwalk virus from coastal seawater." Applied and Environmental Microbiology 68.3 (2002): 1033-1039.

Kitajima, M., et al. "Use of murine norovirus as a novel surrogate to evaluate resistance of human norovirus to free chlorine disinfection in drinking water supply systems." Environ. Eng. Res 45 (2008): 361-370.

Kitajima, Masaaki, et al. "Development of a reverse transcription-quantitative PCR system for detection and genotyping of Aichi viruses in clinical and environmental samples." Applied and environmental microbiology 79.13 (2013): 3952-3958.

Mooijman, Kirsten A., et al. "Optimisation of ISO 10705-1 on enumeration of F-specific bacteriophages." Journal of virological methods 103.2 (2002): 129-136.

Oka, Tomoichiro, et al. "Detection of human sapovirus by real-time reverse transcription polymerase chain reaction." Journal of medical virology 78.10 (2006): 1347-1353.

Pang, Xiaoli L., et al. "Increased detection of rotavirus using a real time reverse transcription - polymerase chain reaction (RT - PCR) assay in stool specimens from children with diarrhea." Journal of medical virology 72.3 (2004): 496-501.

Teunis, Peter FM, et al. "Norwalk virus: how infectious is it?" Journal of medical virology 80.8 (2008): 1468-1476.

Wolf, Sandro, et al. "Detection and characterization of F⁺ RNA bacteriophages in water and shellfish: application of a multiplex real-time reverse transcription PCR." Journal of
Zhang, Tao, et al. "RNA viral community in human feces: prevalence of plant pathogenic viruses." PLoS Biol 4.1 (2005): e3.

virological methods 149.1 (2008): 123–128.
# （２）水環境中のウイルスと指標微生物の動態の把握

東京大学大学院工学系研究科

片山浩之

小熊久美子

井上健太郎

平成26～27年度累計予算額：35,999千円（うち平成27年度：17,539千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨]

腸管系ウイルスは感染したヒトの消化器系器官中で複製された後、高濃度で糞便と共に排泄されるため、下水中にはウイルスが高濃度で含まれている。通常は、沈殿、生物処理、消毒等の処理を経て排出されるものの、大雨時には合流式下水道雨天時越流水(combined sewer overflow, CSO)が生じ、CSOは未処理の下水を環境水中に放出するため、発生時には不定期に受水域の微生物汚染が深刻化する。また一方で、受水域の汚染状況は年間を通じて一定ではなく、大きな変動が予想され、定期的に採水調査することだけでは、年間の汚染状況を把握することは困難である。それ故、リスク管理の観点について、降雨後環境中に排出されたウイルスの濃度、およびウイルスの遺伝子型に着目した汚染状況の把握が重要であると言える。また、我が国では微生物学的な水浴場水質判定基準は、糞便性大腸菌群により定められているが、しばしば指標細菌の存在状況と腸管系ウイルス等の病原性ウイルスの存在状況との間には必ずしも相関が見られないことや、指標細菌自体の増殖可能性について指摘されている。それ故、新しい衛生指標として期待される大腸菌の環境中での増殖に関わる挙動は、状況を把握すべき重要な事項である。

本サブテーマでは、下記4点の課題を扱うことで、水環境中のウイルスと指標微生物の動態把握を試みた。①東京湾沿岸域における降雨後ウイルス汚染の実態調査、②二枚貝への腸管系ウイルス蓄積状況に基づいたヒト糞便由来の汚染履歴評価、③環境中における大腸菌の増殖を評価する系の確立、④環境水中溶存有機物による大腸菌の増殖可能性の評価と増殖基質の探索。

得られた成果としては、トウガラシ微班ウイルスおよびアイチウイルスのウイルス指標としての適性に関する知見、カキ中腸腺に蓄積したウイルスによって環境中に排出されたウイルスの遺伝子型を広く把握する解析手法の確立、大腸菌の分裂関連遺伝子定量によって環境中における増殖活性を調査する手法の確立が挙げられる。

## [キーワード]

腸管系ウイルス、ノロウイルス、トウガラシ微班ウイルス、大腸菌、合流式下水道雨天時越流水