Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## ④肺組織における iNOS の局在

結晶質シリカと酸化鉄について、気管内投与後の肺組織におけるニトロ化ストレスについて、iNOSの免疫組織染色により比較して評価した。

対照群：iNOS の発現は、細気管支上皮の細胞質に軽度みられた。一方、好中球では発現が認められたが、肺胞マクロファージでの発現はほとんどみられなかった（図 2-16-D）。

CB 群：投与後 3 日目以降、炎症反応に伴い動員されたマクロファージや好中球で iNOS の発現が認められた（図 2-19-A、B）。投与後 30 日目においてもマクロファージにおける iNOS の発現は持続しており、肉芽腫内の単球-マクロファージ系細胞においても iNOS の発現が認められた（図 2-19-C）。

TR 群 : CB 群と同様に、投与後 3 日目以降、マクロファージや好中球で iNOS の発現が認められた（図 2-22-A、B）。投与後 30 日目においてもマクロファージにおける iNOS の発現は持続していた（図 2-22-C）。

HM群:投与後3日目以降、マクロファージや好中球でiNOSの発現が認められた(図2-25-A、B)。しかし、炎症反応の回復に伴い、投与後30日目の時点ではiNOS陽性細胞は減少していた(図2-25-C)。

MT 群：HM 群と同様に、投与後 3 日目以降、マクロファージや好中球で iNOS の発現が認められた（図 2-28-A、B）。しかし、炎症反応の回復に伴い、投与後 30 日目の時点では iNOS 陽性細胞は減少していた（図 2-28-C）。
図 2-16-A 対照群、投与後 7 日目、 肺、HE 染色

(平成21年度報告書 図2-33-A再掲)

図 2-16-B 対照群、投与後 30 日目、 肺、Masson's trichrome 染色 (平成 21 年度報告書 図 2-33-B 再掲)

図 2-16-C 対照群、投与後 30 日目、 肺、8-OHdG 染色

(平成21年度報告書 図2-33-C再掲)

図 2-16-D 対照群、投与後 30 日目、 肺、iNOS 染色

(平成21年度報告書 図2-33-D再掲)
図 2-17-A CB 群、投与後 3 日目、 肺、HE 染色

肺胞領域に広がる炎症が認められた。

炎症反応が持続していた。

図 2-17-C CB 群、投与後 30 日目、 肺、HE 染色

肺胞領域の炎症が持続していた。

図2-17-D CB群、投与後30日目、 肺、HE染色

肉芽腫の形成が認められた。
図2-18-A CB群、投与後3日目、 肺、8-OHdG染色 細気管支上皮および炎症細胞で8-OHdGの 生成（細胞の核が褐色）が認められた。

図 2-18-B CB 群、投与後 7 日目、 肺、8-OHdG 染色 8-OHdG の生成が持続していた。

図 2-18-C CB 群、投与後 30 日目、 肺、8-OHdG 染色

肉芽腫内の細胞で8-OHdGの生成が認められた。
図 2-19-A CB 群、投与後 3 日目、 肺、iNOS 染色

図 2-19-B CB 群、投与後 7 日目、 肺、iNOS 染色

マクロファージなどの炎症細胞の細胞質に

iNOS の発現（褐色）が認められた。

図 2-19-C CB 群、投与後 30 日目、 肺、iNOS 染色

肉芽腫内の炎症細胞の細胞質に iNOS の発現が認められた。
図 2-20-A TR 群、投与後 3 日目、 肺、HE 染色

肺胞領域に広がる炎症反応が観察された。

図 2-20-B TR 群、投与後 7 日目、 肺、HE 染色

図 2-20-C TR 群、投与後 30 日目、 肺、HE 染色

肺胞領域の炎症反応が持続していた。
図2-21-A TR群、投与後3日目、 肺、8-OHdG染色 細気管支上皮および炎症細胞で8-OHdGの 生成（細胞の核が褐色）が認められた。

図2-21-B TR群、投与後7日目、 肺、8-OHdG染色 8-OHdGの生成が持続していた。

図 2-21-C TR 群、投与後 30 日目、 肺、8-OHdG 染色

8-OHdG の生成が持続していた。
図 2-22-A TR 群、投与後 3 日目、 肺、iNOS 染色

炎症細胞でも iNOS の発現が認められた。

図 2-22-B TR 群、投与後 7 日目、 肺、iNOS 染色

図 2-22-C TR 群、投与後 30 日目、 肺、iNOS 染色

肺胞領域のマクロファージを中心とした

炎症細胞で iNOS の発現が認められた。
図 2-23-A HM 群、投与後 3 日目、 肺、HE 染色

肺胞領域に軽度の炎症反応が観察された。

図 2-23-B HM 群、投与後 7 日目、 肺、HE 染色

図 2-23-C HM 群、投与後 30 日目、 肺、HE 染色

肺胞領域の炎症は回復していた。
図 2-24-A HM 群、投与後 3 日目、 肺、8-OHdG 染色

図 2-24-B HM 群、投与後 7 日目、 肺、8-OHdG 染色

気道上皮および炎症細胞で8-OHdGの生成が認められた。

図 2-24-C HM 群、投与後 30 日目、 肺、8-OHdG 染色

8-OHdG の生成は軽減していた。
図 2-25-A HM 群、投与後 3 日目、 肺、iNOS 染色

図 2-25-B HM 群、投与後 7 日目、 肺、iNOS 染色

炎症細胞においても iNOS の発現を認めた。

図 2-25-C HM 群、投与後 30 日目、 肺、iNOS 染色

肺胞領域の iNOS 陽性細胞は減少していた。
図 2-26-A MT 群、投与後 3 日目、 肺、HE 染色

肺胞領域での炎症が観察された。

図 2-26-B MT 群、投与後 7 日目、 肺、HE 染色

図 2-26-C MT 群、投与後 30 日目、 肺、HE 染色

肺胞領域の炎症は回復していた。
図 2-27-A MT 群、投与後 3 日目、 肺、8-OHdG 染色

図 2-27-B MT 群、投与後 7 日目、 肺、8-OHdG 染色

炎症細胞で8-OHdGの生成が軽度認められた。

図 2-27-C MT 群、投与後 30 日目、 肺、8-OHdG 染色

8-OHdG の生成は軽減していた。
図 2-28-A MT 群、投与後 3 日目、 肺、iNOS 染色

炎症細胞でも iNOS の発現が認められた。

図 2-28-B MT 群、投与後 7 日目、 肺、iNOS 染色

図 2-28-C MT 群、投与後 30 日目、 肺、iNOS 染色

肺胞領域の iNOS 陽性細胞は減少していた。
## 病理組織学的検索から得られた結果について：

結晶質シリカ(CBとTR)では、投与後3日目で肺胞領域の急性炎症反応が認められ、気道上皮およびマクロファージ等の炎症細胞で8-OHdGの生成が認められた。CBとTRともに、投与後30日目の時点でも炎症反応は持続しており、気道上皮および炎症細胞で8-OHdGの生成の持続も認められた。しかし、CBとTRの投与後30日目の時点での炎症反応はAM1000、AM1200、AM1400よりも軽度であった。また、CBの方がTRに比較して炎症反応がやや強い傾向にあり、一部に肉芽腫形成が認められたが、明らかな線維化は認められなかった。

酸化鉄(HMとMT)では、投与後3日目で肺胞領域の急性炎症反応が認められ、気道上皮およびマクロファージ等の炎症細胞で8-OHdGの生成が認められた。これらの炎症反応はCBとTRよりもやや軽度であった。HMとMTの炎症反応は結晶質シリカと異なり経時的に回復傾向を示した。投与後30日目の時点では、肺胞領域の炎症はごく軽度であり、肺組織における8-OHdGの生成も減少していた。

平成 21 年および 22 年度報告書に示すとおり、AM 焼成物のうち最も呼吸器影響が軽減されていた AM1000G の結晶構造は酸化鉄(HM と MT)のみで結晶質シリカ(CB と TR)が生成されていないのに対し、経時的に炎症が進展した AM1400 では酸化鉄に加えて CB と TR も生成されていた。すなわち、AM 焼成物の結晶構成成分のうち、結晶質シリカの方が酸化鉄よりも呼吸器影響に関与している可能性が示唆された。
## 2 ）気管支肺胞洗浄液 Bronchoalveolar lavage fluid（BALF）の細胞分画

## ①BALF 中炎症細胞数の変化

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400および結晶質シリカ（CBとTR）と酸化鉄（HMとMT）について、それぞれを2mg一回気管内投与後3、7、30日目までのBALF中の細胞分画について図2-29～32に示した。

投与後3、7、30日目の急性期間、炎症細胞数の変化はAM及びAM焼成物に比較して結晶質シリカと酸化鉄の方が共通してやや軽減されている傾向が示された（図2-29）。このうち、好中球数の特異的に変化がAM焼成物の一部で観察された。

投与後3日目ではAMとAM1000、AM1400が対照群に比較して好中球数が約30－50倍に上昇し、特に、AM1000で顕著な変化を示した $ (p<0.001) $ 。これに対して、AM1000を軽度に粉砕したAM1000Gでは、炎症反応の指標である好中球数の増加は認められなかった（図2-30）。なお、結晶質シリカは酸化鉄に比較して好中球数がやや上昇する傾向が認められた（図2-30）。

好中球数は投与後の時間の経過に従い減少傾向を示したが、AM1400のみが顕著な上昇を示し、対投与後7日目で対照群に比較して約100倍の高値であった $ (p<0.001) $ 。しかし、この時期のAMとAM1000に顕著な変動は見られなかった（図2-31）。さらに、投与後30日目では、AM1400の好中球数はより顕著に上昇し、また、結晶質シリカ（CBとTR）も対照群に比較して約50、25倍の高値を示した $ (p<0.001,p<0.05) $ （図2-32）。しかし、酸化鉄（HMとMT）にこの傾向は認められなかった。投与後30日目において、AM1000の好中球数はやや上昇傾向にあったが、その粉砕物のAM1000Gに変化は認められなかった（図2-32）。

図 2-29 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中炎症細胞数の経時的変化
図 2-30 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中好中球数 （投与後 3 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001 AM 群との比較：#,p<0.05;##,p<0.01;###,p<0.001 AM vs. AM1000 :$,p<0.05;$$,p<0.01;$$$,p<0.001

図 2-31 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中好中球数 （投与後 7 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001 AM 群との比較：#,p<0.05;##,p<0.01;###,p<0.001
図 2-32 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中好中球数 （投与後 30 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\begin{aligned}\#,p<0.05;\quad\#\#,p<0.01;\quad\#\#\#,p<0.001\end{aligned}$
## ②BALF 细胞像

CB、TR、HM、MT をそれぞれ 2mg 投与後 3、7、30 日目における、BALF 中に観察される細胞像を図 2-33～35 に示した。

対照群の BALF 中には全観察期間を通して肺胞マクロファージが主に観察された。

投与後3日目(図2-33)、7日目(図2-34)では、結晶質シリカおよび酸化鉄試料においても対照群と同様に肺胞マクロファージが主に観察された。

投与後30日目では結晶質シリカであるCBとTRにおいて、好中球が観察された(図2-35)。なお、TRに比較してCBがより多くの好中球の出現を観察した(図2-35)。一方、酸化鉄であるHMとMTにおいては対照群と同様に肺胞マクロファージが主に観察され、明確な好中球の出現は観察されなかった(図2-35)。すなわち、結晶質シリカは酸化鉄に比較して、炎症反応が起こりやすい傾向を明らかにした。

control

CB

TR

HM

MT

図 2-33 CB、TR、HM、MT をそれぞれ 2mg ラット気管内一回投与後 3 日目の BALF 中の細胞像

矢印（→）は好中球を示す。
control

CB

TR

HM

MT

図 2-34 CB、TR、HM、MT をそれぞれ 2mg ラット気管内一回投与後 7 日目の BALF 中の細胞像

control

CB

TR

HM

MT

図 2-35 CB、TR、HM、MT をそれぞれ 2mg ラット気管内一回投与後 30 日目の BALF 中の細胞像

矢印（→）は好中球を示す。
## 3 ）BALF 中たんぱく濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400およびCB、TR、HM、MTをそれぞれ2mg一回気管内投与後3、7、30日目までのBALF中たんぱく濃度について図2-36～38に示した。

投与後3日目では、AM及びAM焼成物のタンパク濃度はAM1000G、AM1200G以外、対照群に比較して2−3倍の有意な上昇が観察された $ (p<0.01,0.001) $ （図2-36）。また、結晶質シリカと酸化鉄試料においては、CBが対照群に比較して僅かな上昇のみで、たんぱく濃度に顕著な変化は観察されなかった(図2-36)。

その後、相対的に漸減傾向を示したが、投与後7日目の結果は、ほぼ3日目の濃度とパターンが類似していた。結晶質シリカ及び酸化鉄も同様であった（図2-37）。

他方、投与後30日目では投与後7日目の結果にほぼ類似していたが、これに対して、AM1400のみが対照群に比較して約2倍の値である傾向を示した $ (p<0.001) $ 。

図 2-36 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中たんぱく濃度（投与後 3 日目）

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\begin{aligned}\#,p<0.05;\quad\#\#,p<0.01;\quad\#\#\#,p<0.001\end{aligned}$

AM vs. AM1000 : $ ^{} $ , p < 0.05; $ ^{} $ , p < 0.01; $ ^{} $ , p < 0.001
図 2-37 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中たんぱく濃度（投与後 7 日目）

$$ *,p<0.05; $$

$$ p<0.01 $$

$$ p<0.001 $$

$$ p<0.05; $$

$$ p<0.01 $$

$$ p<0.001 $$

$$ vs.AM1000 $$

$$ p<0.05; $$

$$ p<0.01 $$

$$ p<0.001 $$

図 2-38 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中たんぱく濃度（投与後 30 日目）

$$ p<0.05; $$

$$ p<0.01 $$

$$ p<0.001 $$

AM 群との比較： $ ^{\#} $ ，p < 0.05； $ ^{\#\#} $ ，p < 0.01； $ ^{\#\#\#} $ ，p < 0.001
## 4 ）BALF 中 Lactate dehydrogenase（LDH）濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400およびCB、TR、HM、MTをそれぞれ2mg一回気管内投与後3、7、30日目までのBALF中LDH濃度について図2-39～41に示した。

BALF 中 LDH 濃度は、投与後 3 日目において AM と AM1000 が対照群に対して約 7 倍の上昇傾向を示した $ (p < 0.001) $ (図 2-39)。なお、他の AM 焼成物では僅かな上昇傾向を示した。

投与後 30 日目の結果は 7 日目に類似しており、さらに、AM1200 の LDH 濃度が有意に上昇していた $ (p < 0.05) $ (図 2-41)。

一方、結晶質シリカおよび酸化鉄群では、投与後のLDH濃度は対照群に比較して変化は示されなかった(図2-39～41)。

図 2-39 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 LDH 濃度（投与後 3 日目）

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM群との比較：$\begin{aligned}\#,p<0.05;\quad\#\#,p<0.01;\quad\#\#\#,p<0.001\end{aligned}$

AM vs. AM1000 : $ ^{} $ , p < 0.05; $ ^{} $ , p < 0.01; $ ^{} $ , p < 0.001
図 2-40 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 LDH 濃度（投与後 7 日目）

図 2-41 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 LDH 濃度（投与後 30 日目）

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM 群との比較： $ ^{\#} $ ，p<0.05； $ ^{\#\#} $ ，p<0.01； $ ^{\#\#\#} $ ，p<0.001
## 5 ）BALF 中サイトカイン濃度

## ①BALF 中 MCP-1 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400およびCB、TR、HM、MTをそれぞれ2mg一回気管内投与後3、7、30日目までのBALF中MCP-1濃度について図2-42～44に示した。

投与後3日目ではAMとAM1000、AM1400におけるMCP-1濃度は、対照群に比較してそれぞれ約120、200、70倍に上昇した傾向が示された $ (p<0.01,0.001) $ 。なお、AM1000のMCP-1濃度は顕著に上昇したが、AM1000Gに変化は認められなかった(図2-42)。

投与後 7 日目では 3 日目で増加していた AM と AM1000 の MCP-1 濃度は急速に、対照群とほぼ同レベルまで減少した（図 2-43）。なお、AM1400 の MCP-1 濃度は持続していた。

投与後 30 日目の AM は、ほぼ対照群の値であったが、これに対して、AM1000 と AM1200、AM1400 の MCP-1 濃度が顕著に再度上昇の傾向を示した (図 2-44)。特に AM1200 と AM1400 は対照群に比較して約 200 倍に上昇した (図 2-44)。

一方、結晶質シリカおよび酸化鉄試料において、対照群に比較して MCP-1 濃度に有意な変化は認められなかった(図 2-42～44)。

図 2-42 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 MCP-1 濃度（投与後 3 日目）

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM 群との比較： $ ^{\#} $ ，p<0.05； $ ^{\#\#} $ ，p<0.01； $ ^{\#\#\#} $ ，p<0.001
図 2-43 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 MCP-1 濃度（投与後 7 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001 AM 群との比較：#,p<0.05;##,p<0.01;##,p<0.001

図 2-44 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 MCP-1 濃度（投与後 30 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001 AM群との比較：$\mathrm{^{\#}}$ ,$p<0.05;^{\#\#}$ ,$p<0.01;^{\#\#\#}$ ,$p<0.001$
## ②BALF 中 TNF- $ \alpha $ 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400およびCB、TR、HM、MTをそれぞれ2mg一回気管内投与後3、7、30日目までのBALF中TNF-α濃度について図2-45～47に示した。

投与後3日目ではAMとAM1000のTNF- $ \alpha $ 濃度は対照群に比較して約7−8倍に上昇する傾向が示された $ (p<0.01,0.001) $ （図2-45）。なお、他のAM焼成物ではTNF- $ \alpha $ 濃度に変化は示されなかった。

投与後7日目と30日目ではAM及びAM焼成物においては焼成温度や粉砕処理の有無に関わらず、TNF- $ \alpha $ 濃度は対照群との差異は認められなかった(図2-46、47)。

一方、結晶質シリカおよび酸化鉄試料において、対照群に比較して TNF-α 濃度に有意な変化は認められなかった(図 2-45～47)。

すなわち、BALF 中の TNF- $ \alpha $ 濃度は投与後初期における生体影響を評価するため用いることが可能であるように思われた。

図 2-45 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 TNF- $ \alpha $ 濃度（投与後 3 日目）

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

AM 群との比較： $ ^{\#} $ ，p<0.05； $ ^{\#\#} $ ，p<0.01； $ ^{\#\#\#} $ ，p<0.001

AM vs. AM1000 : $\$,p<0.05;\$\$,p<0.01;\$\$,p<0.001$
図 2-46 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 TNF- $ \alpha $ 濃度（投与後 7 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

図 2-47 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 TNF- $ \alpha $ 濃度（投与後 30 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001
## ③BALF 中 IL-6 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400およびCB、TR、HM、MTをそれぞれ2mg一回気管内投与後3、7、30日目までのBALF中IL-6濃度について図2-48～50に示した。

投与後 3 日目から 30 日目を通して IL-6 濃度を測定したが、全ての値は対照群に比較して有意な変化が認められなかった。

図 2-48 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 IL-6 濃度（投与後 3 日目）
図 2-49 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 IL-6 濃度（投与後 7 日目）

図 2-50 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の BALF 中 IL-6 濃度（投与後 30 日目）
## 6 ）血清中サイトカイン濃度

## ①血清中 MCP-1 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400およびCB、TR、HM、MTをそれぞれ2mg一回気管内投与後3、7、30日目までの血清中MCP-1濃度について図2-51～53に示した。

投与後 3～30 日目の全期間を通して対照群に比較して大きな差は見られず、焼成温度や粉砕処理がもたらす生体への効果を反映させるような結果は得られなかった。結晶質シリカ及び酸化鉄試料でも全期間を通して対照群と比較して特異的な変化は認められず、構成物質が生体にもたらす影響を評価するに至らなかった。

BALF 中 MCP-1 濃度は被験試料間において差が明らかに見られる鋭敏なバイオマーカーであるのに対して、血清中 MCP-1 濃度はバイオマーカーとして有効性は低いことが考えられた。

なお、血清中 IL-6 は BALF 中 IL-6 濃度と同様に投与後 3 日目から 30 日目を通して測定を行ったが、全試料、全期間で対照群に比較して有意な増加や減少は観察されなかった。

図 2-51 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 MCP-1 濃度（投与後 3 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001
図 2-52 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 MCP-1 濃度（投与後 7 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

図 2-53 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 MCP-1 濃度（投与後 30 日目）
## 7 ）血清中酸化ストレス度と抗酸化力

①酸化ストレス度（d−ROMs）

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400およびCB、TR、HM、MTをそれぞれ2mg一回気管内投与後3、7、30日目までの血清中d-ROMs値について図2-54～56に示した。

投与後 3～30 日目の間で AM と AM 焼成物、結晶質シリカおよび酸化鉄試料で対照群との差異は認められなかった。血清中 d-ROMs 値は焼成温度や粉砕処理がもたらす生体への効果や構成物質が生体にもたらす影響を評価する指標としては有効なものではないことが考えられた。

図 2-54 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 d-ROMs 値（投与後 3 日目） 対照群との比較:* , p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001
図 2-55 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 d-ROMs 値（投与後 7 日目）

図 2-56 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 d-ROMs 値（投与後 30 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001
## ②抗酸化力（BAP）

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400およびCB、TR、HM、MTをそれぞれ2mg一回気管内投与後3、7、30日目までの血清中BAP値について図2-57～59に示した。

投与後3日目ではAM1000Gで対照群に対して有意にBAP値の上昇が観察された(図2-57)。また結晶質シリカ及び酸化鉄試料ではMTで対照群に比べてBAP値の有意な上昇が観察されたが、他の試料では観察されなかった(図2-57)。

投与後 7 日目では AM と AM 焼成物、結晶質シリカ及び酸化鉄試料において対照群に比べて BAP 値の有意な上昇は観察されなかった(図 2-58)。

投与後 30 日目では AM1000G の BAP 値が増加した（図 2-59）。AM および他の AM 焼成物では対照群に対して BAP 値に差異がみられなかった（図 2-59）。また結晶質シリカおよび酸化鉄試料においても対照群に対して BAP 値の有意な上昇は観察されなかった（図 2-59）。

血清中 BAP 值も血清中 d-ROMs 値と同様に、焼成温度や粉砕処理、構成物質が生体にもたらす影響を評価する指標としては有効性が低いと考えられた。

図 2-57 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 BAP 値（投与後 3 日目）

対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001
図 2-58 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 BAP 値（投与後 7 日目）

図 2-59 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 BAP 値（投与後 30 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001
## 8 ）血清中 N-ERC/mesothelin 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400およびCB、TR、HM、MTをそれぞれ2mg一回気管内投与後3、7、30日目までの血清中N-ERC/mesothelin濃度について図2-60～62に示した。

投与後 3～30 日目の全期間を通して対照群との間に大きな差は見られず、焼成温度や粉砕処理がもたらす生体への効果を反映させるような結果は得られなかった。結晶質シリカ及び酸化鉄試料では全期間を通して対照群に比べてやや高い濃度を示したものの、構成物質が生体にもたらす影響を評価するに至るほどの大きな変動は観察されなかった。

図 2-60 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 N-ERC/mesothelin 濃度（投与後 3 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001
図 2-61 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 N-ERC/mesothelin 濃度（投与後 7 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

図 2-62 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の血清中 N-ERC/mesothelin 濃度（投与後 30 日目） 対照群との比較：*,p < 0.05; **,p < 0.01; ***,p < 0.001
## 9 ）尿中 N-acetyl-β-D-glucosaminidase（NAG）濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400およびCB、TR、HM、MTをそれぞれ2mg一回気管内投与後3、7、30日目までの尿中NAG濃度について図2-63～65に示した。

投与後 3 日目で AM1400 が対照群に比べて高い値を示した（図 2-63）が、その後は対照群との間に有意差は見られなかった(図 2-64～65)。AM と他の焼成物においても全期間を通して対照群との間に差異は認められなかった。結晶質シリカおよび酸化鉄試料においても投与後 3 日目で CB が高い値を示したが、その後は対照群との間に差異が見られなかった。

図 2-63 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の尿中 NAG 濃度（投与後 3 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001
図 2-64 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の尿中 NAG 濃度（投与後 7 日目） 対照群との比較：*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001

図 2-65 AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 および CB、TR、HM、MT をそれぞれ一回気管内投与後の尿中 NAG 濃度（投与後 30 日目）
## 10 ）急性影響（BALF 中 Monocyte chemotactic protein-1（MCP-1）濃度等）の量反応関係 ①BALF 中 MCP-1 濃度

AM、AM1000、AM1000G、AM1400 をそれぞれ 0.1mg, 0.5mg, 2mg、一回気管内投与後の BALF 中 MCP-1 濃度の変化を図 2-66～68 に示した。

BALF 中 MCP-1 濃度は、0.1mg と 0.5mg 投与群において 3、7、30 日目の観察期間で対照群に比較して変化が生じないことを確認した。

これに対して、AM および AM1000 の 2mg 投与群では、投与後 3 日目の BALF 中 MCP-1 濃度は対照群に比較して 100 倍以上に増加した (AM, p < 0.01; AM1000, p < 0.001) （図 2-66）。これら 2 つの試料群の BALF 中 MCP-1 濃度は投与後 3 日目をピークに減少する傾向を示した。しかし、AM1000 の 2mg 投与群では、投与後 30 日目の BALF 中 MCP-1 濃度は高値を示した (p < 0.001)。一方、粉砕処理した AM1000G では、2mg 投与群でのみ投与後 7 日目まで BALF 中 MCP-1 濃度が上昇したが (p < 0.01)、AM と AM1000 に比較して軽度の変化であった（図 2-67）。AM1400 では、2mg 投与群でのみ BALF 中 MCP-1 濃度が高値を示した。投与後 30 日目に最高値を示し、この値は AM と AM1000 に比較しても高値であり特徴的であった (p < 0.001)（図 2-68）。

図 2-66 AM、AM1000、AM1000G、AM1400 をそれぞれ一回気管内投与後 3 日目における BALF 中 MCP-1 濃度

$$ *,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001 $$
図 2-67 AM、AM1000、AM1000G、AM1400 をそれぞれ一回気管内投与後 7 日目における BALF 中 MCP-1 濃度

*,p<0.05; **,p<0.01; ***,p<0.001

図 2-68 AM、AM1000、AM1000G、AM1400 をそれぞれ一回気管内投与後 30 日目における BALF 中 MCP-1 濃度

*,p<0.05; **,p<0.01; ***,p<0.001
## ②肺組織中 MCP-1 mRNA 発現量

AM、AM1000、AM1000G、AM1400 をそれぞれ 0.1mg, 0.5mg, 2mg、一回気管内投与後の BALF 中 MCP-1 mRNA 発現量の変化を図 2-69～71 に示した。

肺組織における MCP-1 の mRNA の発現レベルの経時的変化は、BALF 中の MCP-1 濃度の変化と同様なパターンを示した。

MCP-1 mRNA 発現量は、0.1 mg と 0.5 mg 投与群において 3、7、30 日目の観察期間で対照群に比較して統計学的な有意差がある変化が生じないことを確認した。なお、AM1000 の 0.5 mg 投与群では、投与後 3 日目と 30 日目の値においてやや上昇する傾向を示した。

これに対して、AMおよびAM1000の2mg投与群では投与後3日目にMCP-1のmRNA発現量が対照群の15倍以上と顕著な増加を認めた $ (p<0.001) $ 。これら2つの試料群のMCP-1のmRNA発現量は投与後7日目には減少し、対照群に比べて発現量の増加は認められなかったが、AM、AM1000の2mg投与群では、投与後30日目のMCP-1のmRNA発現量が高値を示し、AM1000の2mg投与群では対照群の10倍以上に増加していた $ (p<0.001) $ 。しかし、AM1000Gでは、顕著な変化は認められなかった。AM1400では、MCP-1のmRNA発現量は経時的に増加傾向を示し、投与後30日目では、対照群に比較して約18倍に増加し、AMに比較して高値を示した。

すなわち、この検査法は極めて鋭敏であるが、AM1000Gでの影響の生じないことを確認した。

図 2-69 AM、AM1000、AM1000G、AM1400 をそれぞれ一回気管内投与後 3 日目における肺組織中 MCP-1 mRNA 発現量
図 2-70 AM、AM1000、AM1000G、AM1400 をそれぞれ一回気管内投与後 7 日目における 肺組織中 MCP-1 mRNA 発現量 *,p < 0.05; **,p < 0.01; ***,p < 0.001

図 2-71 AM、AM1000、AM1000G、AM1400 をそれぞれ一回気管内投与後 30 日目における肺組織中 MCP-1 mRNA 発現量 *,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001
## 小括

AM と AM 焼成物、その構成物質である結晶質シリカや酸化鉄試料を気管内投与したラットから、気管支肺胞洗浄液（BALF）と血清、尿を採取し生体影響を評価した。

BALF を用いた細胞分画から、AM と AM1000 は投与後 3 日目、対照群と比較して顕著な炎症細胞が確認され、その後、時間の経過にしたがい回復傾向を示した。一方、AM1200 と AM1400 にのみ、投与後 30 日目において顕著な好中球の増加が観察された。

関連研究として、AM、AM1000 の構成物質が酸化鉄であるのに対して、AM1200 および AM1400 の構成物質は結晶質シリカや酸化鉄も生成されていることから、結晶質シリカ（CB と TR）と酸化鉄（HM と MT）の影響について検討を試みた。酸化鉄である HM や MT では、観察期間中において炎症細胞の出現は認められなかったが、これに対して、CB や TR では AM や AM1000 などに比較すると軽微であったが投与後 30 日目において炎症細胞の出現が観察された。この結果において AM1200 と AM1400 に炎症細胞が出現された原因の一つは、結晶質シリカであることを示唆するものと考えられた。

BALF を用いてたんぱく濃度や LDH 濃度、サイトカイン等について測定した結果、BALF 中のたんぱく濃度と LDH 濃度、MCP-1 濃度はそれぞれ細胞分画の結果を非常に良く反映しており、バイオマーカーとして有効であると思われた。肺組織中 MCP-1 mRNA 発現量を指標として、AM、AM1000、AM1000G、AM1400 を被験試料について、量—反応関係 (0.1mg, 0.5mg, 2mg) を検討した結果、この鋭敏な検査法を用いたことにより、0.1mg と 0.5mg は無影響であるが、2mg 投与群では被験試料の違いによる差異が認められ、AM1000G のみが影響の生じないことを確認できた。なお、TNF-α に関しては投与初期にはバイオマーカーとして有効性が示唆された。一方、IL-6 は対照群と差異が認められず、鋭敏なバイオマーカーではないと思われた。

本研究では、BALF、血清、尿等の生体試料を用いて、細胞分画、サイトカイン、酸化ストレス、抗酸化力、N-ERC/mesothelin、8-OHdG等を比較した結果、評価対象の指標としてはBALFの優位性が示唆された。

すなわち、ラットの BALF を用いて、AM と AM 焼成物、結晶質シリカ、酸化鉄について生体影響を評価した結果、AM1000G のみが種々の検査において無影響であることを明らかとした。
## (2) 慢性影響

## 実験方法

## 1 ）実験動物

Wistar 系雄ラット（Crlj:WI、日本チャールスリバー）を使用した。動物はステンレス製金網ケージに5匹ずつ収容し、浄水器ろ過水道水、放射線滅菌飼料（CE-2、日本クレア）を自由摂取させた。なお、酸化ストレス関連のマーカーの測定を実施したラットは、採血および採尿日の3日前から放射線滅菌高タンパク飼料（Egg white diet; Dyets No.110952, Dyets Inc.）にて飼育した。

動物実験は北里大学医療衛生学部の動物飼育施設で実施した。飼育環境はセミバリア施設で12hr/12hr 明暗、24±1℃、55±5%RH である。実験は北里大学の動物飼育管理委員会の規則及び承認のもとに実施された。

## 2 ）被験試料の懸濁液調整

被験試料(AM、AM1000、AM1000G、AM1200、1200G、AM1400)は、投与前日に秤量した後、オートクレーブで121℃、20分間滅菌、37℃の乾燥器内で保存した。動物投与直前に試料を所定容量になるように生理食塩水に懸濁させ、超音波洗浄器で10分間分散処理を行った。

## 3 ）氢管内投与

ラット（10 週齢）に AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1200G、AM1400 をそれぞれ 2mg/ml を一回気管内投与した。対照群には、同様に生理食塩水 1ml を一回気管内投与した。

気管内投与は、ハロセン麻酔下（ハロセン濃度3.5%、空気容量4L/min）で、実体顕微鏡を用い呟喉頭部を観察しつつ気管ゾンデを気管支分岐部直上まで挿入し、一回の吸気時に被験試料の懸濁液を気管内に注入した。

AM1200G を除く各群とも投与後 540 日目まで経過観察を行った。またすべての群において投与後 90 日目および 180 日目に病理組織学的検索および気管支肺胞洗浄液（BALF）の採取を行った。動物をソムノペンチルの腹腔内投与による深麻酔下で解剖を行った。腹大静脈から採血後、肺および主要臓器を摘出した。酸化ストレス等の生化学検査を行う組織検体は、液体窒素で凍結後、−80℃で保存した。また病理組織学的検索を行う組織検体は、4％パラホルムアルデヒド液で固定した。

解剖時に採取した血液（約4ml）は、チューブに入れ遮光し、室温で30分静置し、その後遠心分離を行った。血清は下記の分析に供するまで、-80℃で凍結保存した。なお、採尿は、検査日前日にメタボリックケージ（Tecniplast）に個別に一晩収容し、遮光した採尿チューブで採尿し、-80℃で凍結保存した。
## 4 ）気管支肺胞洗浄液(BALF)の採取

投与後 90、180、540 日目に動物をソムノペンチルの腹腔内投与による深麻酔下で、腹大静脈から採血後、腹大静脈を切断放血死させ、左肺気管支分岐部を結禁した。その後、気管にカテーテルを挿入し、右肺のみ生理食塩水 5ml～8ml で 2 回洗浄して BALF を回収し液量を計測した。BALF の一部を下記の細胞分画検査に用い、残りは遠心後の上清を下記の分析に供するまで－80℃にて凍結保存した。

## 5 ）病理組織学的檢索

投与後 540 日目までの経過観察期間中に死亡した動物も含めて、すべての動物に病理組織学的検索を実施した。肺および主要臓器を 4% パラホルムアルデヒド液に 4℃ で一晩浸漬固定し、翌日から室温に戻して再固定した。病理標本は定法に従ってパラフィン包埋後、厚さ 3μm 以下に薄切しヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を行った。さらに、肺の線維化を判定するための Masson's trichrome 等の特殊染色を行った。

## 6 ）BALF 中の細胞数、たんぱく濃度、LDH 濃度、サイトカイン濃度の測定

## 6 –1）BALF 中の細胞分画

BALF の浮遊細胞数は自動血球計数装置（Sysmex F-800，東亜医用電子）により計測した。細胞分画は、サイトスピン（Cytospin3、Shandon）を用いて標本を作製後、May-Grünwald-Giemsa 染色を行い、顕微鏡下で細胞を分別計数し、細胞分画（%）を求めた。サイトスピン標本上で肺胞マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球に分別計数して求めた細胞分画（%）に、自動血球計数装置で得られた総細胞数を乗じて各種炎症細胞数（cells/μl）を計算した。

## 6 –2）BALF 中のたんぱく濃度の測定

Pierce BCA Protein Assay Kit（Thermo scientific）を用いて、BCA 法により肺胞洗浄液中のたんぱく濃度を測定した。標準物質として添付の BSA を用いた。

## 6 –3）BALF 中の LDH 濃度の測定

肺上皮の細胞傷害の程度を測定するため、LDH Cytotoxicity Detection Kit（Takara Bio）を用いて、肺胞洗浄液中のLDH濃度を測定した。標準物質として、ブタ心臓由来LDH（オリエンタル酵母）を用いた。

## 6 –4）BALF 中のサイトカイン濃度の測定

BD OptEIA $ ^{™} $ Set Rat IL-6、MCP-1（BD Biosciences）およびRat TNF-α ELISA Kit（Thermo Scientific）を用いてBALFのサイトカイン濃度を測定した。BALFは、IL-6、TNF-α測定時には希釈せず、MCP-1測定時には、その濃度に応じてAssay Diluent（BD Biosciences）により1～200倍に希釈した。
## 7 ）血清中の生化学分析

## 7 −1）血清中サイトカイン濃度の測定

BD OptEIA $ ^{TM} $ Set Rat IL-6 および BD OptEIA $ ^{TM} $ Set Rat MCP-1 （BD Biosciences）を用いて血清のサイトカイン濃度を測定した。測定に使用した血清は Assay Diluent（BD Biosciences）により希釈し、その倍率は、IL-6 測定時には 10 倍、MCP-1 測定時には 100 倍とした。

## 7 –2）血清中酸化ストレス度と抗酸化力の測定

気管内投与実験において、FRAS4（DIACRON）を用いて、生体内の活性酸素・フリーラジカルによる酸化ストレス度 d-ROMs と抗酸化力 BAP を測定した。測定には、血清を用いた。

d-ROMs は、活性酸素やフリーラジカルにより生じる血中ヒドロペルオキシド濃度をクロモゲン試薬のラジカル陽イオンへの変化として測定する。10μl の血清を酢酸緩衝液と混合した後クロモゲン試薬入りのキュベットへ移し 505nm の吸光度で測定した。

BAP は、血中の抗酸化物質が三価鉄イオン塩とチオシアン酸塩の化合物を還元し、脱色する反応を測定する。着色した反応液に 10μl の血清を混合し、505nm の吸光度の経時的な変化を測定した。

## 7 –3）血清中 N-ERC/mesothelin 濃度の測定

血清中 N-ERC/mesothelin 濃度は、6 μl の血清を EIA buffer (1% BSA, 0.05% Tween20 in PBS) で 40 倍に希釈した後に、Rat N-ERC/mesothelin assay kit (Immuno-Biological Laboratories) を用いて測定した。

## 8 ）尿検査

尿の測定項目は、クレアチニンおよび近位尿細管障害マーカーの NAG である。尿中クレアチニン濃度はラボアッセイクレアチニン（和光純薬）を用いて Jaffe 法で行った。NAG 濃度は NAG テスト（シオノギ製薬）を用いて、一定時間に分解される合成基質（sodio-m-cresolsulfonphthaleinyl N-acetyl-β-D-glucosaminide）の生成物をマイクロプレートリーダー ARVO X4 (Perkin Elmer) にて測定した。NAG 濃度は尿中クレアチニン濃度で補正した。

## 9 ）尿中8-OHdG濃度の測定

尿は遠心分離(10,000rpm×10min)し、上清を超純水で4倍希釈したのち、クロマトディスク（孔径0.45μm）でろ過した。尿中8-OHdG濃度は、高速液体クロマトグラフィー・電気化学検出器(HPLC-ECD)装置を用いて測定した。本分析法では、2台のHPLCを連結した。第一HPLCは以下の通りである：pump (LC-10ADSP；島津製作所)，guard colomun (Inertsil ODS-3,5μm,4×10mm,GLサイエンス)，main column (TSK precolumn SW,4.6×35mm,東ソ一)。UV detector (UV 620;GLサイエンス)。分析条件は、流量0.3ml/min、カラム温度35℃とした。第二HPLCは以下の通りである：pump (PU 610;GLサイエンス)，guard colomun (MGカートリッジ,3μm,4×20mm，資生堂)，main column (CAPCELL PAK C18 MG S5，資生堂)、ECD detector
(ED703 Pulse; GL サイエンス)。移動相にリン酸-8%メタノール緩衝液を使用した。8-OHdGはECDにより検出した。尿中8-OHdG濃度は尿中クレアチニン濃度により補正した。

## 10 ）統計処理

測定値の統計解析は、SPSS ver.18J を用い、各群間の差について一元配置分散分析およびTukeyの検定を行った。
## 結果と考察

## 1 ）病理組織学的檢索

## ①肺の肉眼の所見

対照群の気管内投与後 540 日目の肺の肉眼的写真を図 2-72 に示した。

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1400 群の投与後 540 日目の肺の肉眼的写真を図2-73～2-77 に示した。

## 对照群

肺の表面はほぼ平滑で、赤色斑、白色斑等は認められず、ほぼ正常な外観を示していた。気管支リンパ節の腫大は認められなかった。

## AM群

投与後 180 日目の時点で肺の一部に観察された白色斑は、投与後 540 日目においても残存していた。さらに、肺の一部に赤色斑が散在して認められた（図 2-73）。また気管支リンパ節の腫大は認められなかった。

## AM1000 群

投与後 180 日目の時点で肺の一部に暗赤色斑が観察されていた。投与後 540 日目においても赤色斑が散在して認められた（図 2-74）。また気管支リンパ節の腫大は認められなかった。

## AM1000G 群

投与後 180 日目の時点では投与後初期に認められた点状出血斑は回復していた。投与後 540 日目まで観察した結果、肺に赤色斑や白色斑は認められなかった（図 2-75）。また気管支リンパ節の腫大は認められなかった。

## AM1200群

投与後 180 日目の時点で肺の一部に観察された白色斑は、投与後 540 日目においても残存していた。さらに、肺の一部に赤色斑が散在して認められた（図 2-76）。また気管支リンパ節の腫大が一部で認められた。

## AM1400群

投与後 180 日目の時点で肺の一部に観察された白色斑は、投与後 540 日目においても残存していた。さらに、肺の一部に赤色斑が散在して認められた（図 2-77）。また気管支リンパ節の腫大が一部で認められた。
図 2-72 対照群、投与後 540 日目

図2-74 AM1000群、投与後540日目 点状の赤色斑（矢印）が散在して認められた。

図2-73 AM群、投与後540日目 赤色斑と白色斑（矢印）が散在して認められた。

図 2-75 AM1000G 群、投与後 540 日目
図2-76 AM1200群、投与後540日目 赤色斑（矢印）や白色斑が観察された。

図2-77 AM1400群、投与後540日目赤色斑や白色斑（矢印）が観察された。
## ②病理組織学的所見

対照群の生理食塩水気管内投与後540日目の肺病理組織像を図2-78に示した。

AM、AM1000、AM1000G、AM1200、AM1400 群の投与後 540 日目の肺病理組織像を図 2-79～2-83 に示した。

## 对照群

投与後 540 日目の時点で肺の線維化等の変化は認められなかった（図 2-78-A、B）。

## AM 群

投与後 540 日目においても投与後 180 日目と同様に肺胞道、肺胞領域で局所的に慢性炎症が持続し（図 2-79-A）、肺胞道および肺胞壁の線維化の進展が認められた（図 2-79-B）。

## AM1000群

投与後 540 日目においても、投与後 180 日目と同様に肺胞道～肺胞領域にかけて局所的に慢性炎症が持続しており、肉芽腫も観察された（図 2-80-A）。さらに、肺胞道～肺胞領域において肉芽腫の周囲で線維化が観察されたが、AM 群よりは線維化の程度は軽度であった（図 2-80-B）。

## AM1000G 群

投与後 180 日目の時点で炎症反応は回復していた。投与後 540 日目においても肺のごく一部で投与粒子を貪食したマクロファージを主体とする小肉芽腫の残存が認められただけであった。AM1000G 群では、AM1000 群と異なり、肺の線維化は明らかではなかった（図 2-81-A、B）。

## AM1200 群

投与後 540 日目においても投与後 180 日目と同様に肺胞道～肺胞領域にかけて局所的に慢性炎症が持続しており、肉芽腫も観察された（図 2-82-A）。さらに、肺胞道～肺胞領域において肉芽腫の周囲で線維化が観察されたが、AM 群よりは線維化の程度は軽度であった（図 2-82-B）。

## AM1400群

投与後 540 日目においても投与後 180 日目と同様に肺胞での炎症が持続していた（図2-83-A）。しかし、AM1000 群や AM1200 群のような肉芽腫やその周囲の線維化所見は観察されなかった（図2-83-B）。
図 2-78-A 対照群、投与後 540 日目、 肺、HE 染色

図 2-78-B 対照群、投与後 540 日目、 肺、Masson's trichrome 染色

図 2-79-A AM 群、投与後 540 日目、 肺、HE 染色

図2-79-B AM群、投与後540日目、 肺、Masson's trichrome 染色 線維化が認められた。