Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
### 1. はじめに

腸管系ウイルスは感染したヒトの消化器系器官中で複製された後、高濃度で糞便と共に排泄されるため、下水中にはウイルスが高濃度で含まれている。東京都市圏から排出される下水は通常、沈殿、生物処理、消毒等の処理を経て排出されるものの、大雨時には合流式下水道雨天時越流水（combined sewer overflow，CSO）が生じてしまう。CSOは未処理の下水を環境水中に放出するため、CSO発生時には不定期に受水域のウイルス汚染が深刻化する。この傾向は東京湾沿岸域や東京23区域の都市河川において確認されている。このようなことから、CSO発生時においてはウイルスの感染リスクが増加すると考えられ、実際にデンマークのコペンハーゲンでCSO発生時に開催されたトライアスロン大会における下痢症のアウトブレイク事例が報告されている（Andersen et al. 2013）。

一方で、東京湾の汚染状況は年間を通じて一定ではなく、大きな変動が予想され、定期的に採水調査することだけでは、年間の汚染状況を把握することは困難である。また、主にRNAでゲノムが構成される腸管系ウイルスは進化速度が速く、粒子表面のタンパクが変化すると、過去にヒトが獲得した免疫は役に立たず、少しのウイルス粒子だけで感染が成立してしまう。この点について、2015-2016年にかけては従来の主流ノロウイルス（GII.4遺伝子型）が新型（GII.17遺伝子型）へと入れ替わる転換点となり、大きな話題となった。

以上のことから、リスク管理の観点について、降雨後環境中に排出されたウイルスの濃度、およびウイルスの遺伝子型に着目した汚染状況の把握が重要であると言える。

今後、2020年東京オリンピックではお台場においてトライアスロン競技、中央防波堤ではボート競技などが予定されている。過去にコペンハーゲンで生じたアウトブレイクのような事態が国際大会で繰り返されることはあってはならず、そのため、東京湾沿岸域のウイルス汚染状況把握は急務の問題であると言える。

また、我が国では微生物学的な水浴場水質判定基準は、糞便性大肠菌群により定められているが、しばしば指標細菌の存在状況と腸管系ウイルス等の病原性ウイルスの存在状況との間には必ずしも相関が見られないことや、指標細菌自体の増殖可能性について指摘されている。それ故、新しい衛生指標として期待される大肠菌の環境中での増殖に関わる挙動は、状況を把握すべき重要な事項である。加えて、アイチウイルスやトウガラシ微斑ウイルス（PMMoV）は、糞便由来でありかつ水環境中に高濃度で存在することから、ウイルス汚染の指標となる可能性がある。

## 2 ．研究開発目的

沿岸海域の汚染は、親水活動を介して人々に健康リスクをもたらす。中でも病原微生物の水系感染は曝露一回あたりのリスクが大きく、下痢症等による健康影響を直ちに引き起こす。そのため、感染リスクを適切に評価し、管理する必要がある。腸管系ウイルスによる沿岸海域の汚染が世界的に広く報告されており、またその感染力の強さゆえに、細菌や原虫のみならず腸管系ウイルスによる感染リスクも考慮する必要がある。また、親水活動を介した病原微生物リスクの主因はノロウイルスであるとする報告がなされており、実際にスウェーデンにおけるアウトブレイク事例が報告されている（Sartorius et al. 2007）。さらに、新しい遺伝子型をもつ腸管系ウイルスに対しては過去の流行によって得られた免疫が充分に機能しないため、感染リスクを適切に評価し、管理する必要がある。
以上のことから、本サブテーマでは下記の４点を目的に掲げた。

1）市民の親水活動の場である東京湾沿岸域における、ノロウイルスを中心としたウイルス汚染実態の把握

2）大量の海水を濾過するカキ等の二枚貝の中腸腺や、底泥に蓄積するウイルスに着目し、これらの遺伝子型を解析することで、東京湾に流れ込む海水に含まれるウイルスの蓄積データ取得

3）分子生物学的手法によって分裂関連遺伝子発現を検出・定量することで、環境中における大肠菌の増殖を評価する系の確立

4）環境水中において大腸菌が増殖しうることを確認し、環境水中において大腸菌が増殖基質としている溶存有機物の探索

## 3 ．研究開発方法

## 1 ）東京湾沿岸域における降雨後ウイルス汚染の実態調査

2014年6月5日から6月18日にかけて、総降雨量247 mm、時間最大降雨量16 mm/hrの降雨が東京23区域において観測された（気象庁、大手町観測所）（図(2)-1）。時間最大降雨量は6月7日に記録された。なお、同地点において同年5月28日以降6月4日までの期間に降雨は観測されていない。

6月5日の降雨観測後1、2、3、5、8、13日後（6月6、7、8、10、13、18日）に東京湾内の4地点（隅田川河口、目黒川河口、測線観測地点、お台場）で合計57試料をウイルス濃度測定のために採取した。隅田川河口および目黒川河口においては6月6、7、8、10日に、測線観測地点においては調査期間中の全日に、お台場においては6月13日を除く全日に採水を行った。各採水地点の位置関係を図(2)-2に示す。採水時は、船側に固定した鉄パイプを鉛直方向に下ろし、異なる水深にチューブの先端を固定してアスピレーターによる吸引を行うことにより、表層、中層、低層の水として、それぞれ水深0.5、3、5 mの試料を同時に採取した。機器の接続等、採水方法の概略を図(2)-3に示す。なお、測線観測地点では鉄パイプを下ろしたまま船を測線上に航行させ、その間アスピレーターで海水を吸引し続けることによって試料を得た。大腸菌、大腸菌群、および塩濃度を含む物理化学的水質項目測定に際しても、同時に、同地点で鉛直方向3層から試料採取を行った。測線観測地点では、ウイルス測定用試料と異なり、航行中に一定の時間間隔で試料を採取した。

採取試料は、1次濃縮として、試料採取時にアスピレーターと接続させたカートリッジ型陰電荷MF膜にウイルスを吸着させ（図(2)-3）、東京大学でウイルスを誘出した。さらに、1次濃縮を終えた試料は4℃以下で冷蔵保存し、UF膜を用いた遠心ろ過により2次濃縮を行った。得られた濃縮試料に対して核酸抽出、逆転写、real-time PCRを行い、ノロウイルスGIおよびGII（NoV GI、GII）、アイチウイルス（AiV）およびPMMoVの濃度を定量した。また、RNAウイルス測定時には、検出阻害を評価するために、プロセスコントロールとしてマウスノロウイルス（MNV）を濃縮試料およびMilli-Q水に添加し、試料におけるMNV濃度が対照であるMilli-Q水における濃度の10%未満であった場合、検出阻害ありと判定した。検出阻害を軽減するためRNA抽出液の10倍希釈を行い、RNA抽出液の10倍希釈を行った場合と行わなかった場合のウイルス定量濃度を比較し、より濃度が高かったものを真の濃度に近い測定値とみなし採用した。また、指標細菌や物理化学的水質項目についても同時に測定を行った。
図(2)-1. 試料採取期間中の降雨状況

図 $ (2) $ -2. 試料採取地点
図 $ （2）-3 $ . 試料採取方法の概略図

2）二枚貝への腸管系ウイルス蓄積状況に基づいたヒト糞便由来の汚染履歴評価

2015年5、8、11月の大潮干潮時に合わせて、多摩川河口、葛西臨海公園沖、中央防波堤中潮橋付近、鮫洲ポンプ場の4箇所より、水試料およびカキ試料を採取した。各採取地点の位置関係を図(2)-2に示す。表層水の採水にはバケツを用い、バンドン採水器を用いて得た水深2-3mの試料を低層水とした。水試料は陰電荷膜を用いた酸洗浄・アルカリ誘出法によってウイルス濃縮した。一方、カキ試料は解剖して中腸腺を摘出し、MilliQ水に懸濁した後、上清をウイルス濃縮試料とした。

得られた濃縮試料に対して核酸抽出、逆転写の後、PMMoV coat protein特異的プライマーでPCRを行った。PMMoV coat protein遺伝子のプライマーは、Letschert et al. 2002, Fraile et al. 2011を参考として、PMMoV特異的となるよう本研究で再設計したものを用いた。PMMoVゲノム上のプライマーの設計位置を図(2)-4、特異性について図(2)-5、6に示す。

ここで得られたPCR産物に対し、DynaExpress TA PCR Cloning Kit (BioDynamics Laboratory Inc., Tokyo, Japan) を用いて、pTAC-1 vectorに挿入した。作成したプラスミドでJet Competent Cell (BioDynamics Laboratory Inc., Tokyo, Japan) を形質転換し、クローンライブラリを作成した。クローンライブラリで得られた塩基配列について、解析ソフトウェアMEGA 6.06 (Tamura et al. 2013) を用いて多重置換配列を求めた後、Neighbor-Joining (NJ) 法によって、系統樹を作成し、サンプル間の系統関係を比較解析した。

また、指標細菌についてはクロモカルトコリフォーム寒天ES（Merck Millipore, Darmstadt, Germany）を使用して測定した。
赤線：プライマー設計部位

図(2)-4. PMMoVゲノム上における新規プライマー設計部位

Species/Abbrv	Group Name

図(2)-5. PMMoV特異的プライマー（フォワード側）の特異性

図(2)-6. PMMoV特異的プライマー（リバース側）の特異性
## 3 ）環境中における大腸菌の増殖を評価する系の確立

National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で公開されているゲノム情報から腸内細菌科EnterobacterialesのftsZ配列を取得し、大腸菌E. coliと比較することで、大腸菌特異的領域を探索した。定量PCRの使用に適したサイズとして、100塩基前後のプロダクトサイズでプライマーとプローブを設計し、実験に用いた。プライマーおよびプローブの設計について、図(2)-7に示す。

Over night培養したE. coli K12株を $ 10^{3} $ 希釈した後、静止期まで30分毎にサンプリングしDNAおよびRNA試料を採取した。対数期に達した時点で核酸合成停止を意図してナリジクス酸添加系を用意し、以降16日後まで培養を継続した。

また、比較の為に非分裂関連遺伝子であるトリプトファン代謝遺伝子（tnaA）を同時に定量した。
図(2)-7. 大腸菌特異的ftsZプライマーおよびプローブの設計部位

Tm值：Forward primer 61.2℃、Reverse Primer 61.4℃、Probe 59.5℃、Product Size: 104 bp

## 4 ）環境水中溶存有機物による大腸菌の増殖可能性の評価と増殖基質の探索

本課題に用いる試料は、多摩川および矢上川から2015年12月15日採水した。採水地点を選定す
る際には、大腸菌が増殖しやすいと考えられる、下水処理水の影響を受けている河川水を中心に選んだ。多摩川における採水地点は、丸子橋の直上流地点であり、神奈川県川崎市の等々力水処理センターからの放流口付近である。そのため、下水処理水の影響を強く受けた河川水となっている。矢上川での採水は2地点において行った。1地点目は、神奈川県川崎市の加瀬水処理センターからの放流口付近であり、上記の多摩川からの試料同様に下水処理水の影響を強く受けている河川水である。2地点目は、鶴見川との合流点の直上流付近であり、1地点目から200 mほど下流の地点である。この地点で採水した試料も上記2試料ほどではないが、下水処理水の影響を受けている河川水である。

試料は採水後すぐに実験室に持ち帰り、濾過滅菌処理及び低温滅菌処理を行った。濾過滅菌処理には、孔径0.2μmのメンブレンフィルター(Nuclepore, Whatman)を用いた。また、低温滅菌では、75℃で1時間湯浴させた。

上記の通り滅菌した試料を以後、それぞれ河川水T、Y1、Y2と呼ぶこととする。河川水T、Y1、Y2の一般水質測定結果を表(2)-1に示す。

表(2)-1. 河川水T、Y1、Y2の一般水質

項目	T	Y1	Y2
採水時水温	(℃)	21.6	18.9	15.8
溶存酸素濃度	(mgO/L)	4.3	4.1	4.4
全塩素	(mg/L)	0.25	0.21	0.09
遊離塩素	(mg/L)	0.08	0.04	0.02
大腸菌数	(CFU/mL)	0	67	45
大腸菌群数	(CFU/mL)	0	366	181
全菌数	(cells/mL)	7.6×106	3.7×106	3.0×106
DOC	(mgC/L)	7.6	5.3	4.0
TN	(mgN/L)	18.0	9.0	6.5
NH4+-N	(mgN/L)	11	0.76	0.37
NO2--N	(mgN/L)	0.92	ND	ND
NO3--N	(mgN/L)	3.7	7.7	4.9
PO43--P	(mgP/L)	0.80	0.88	NA
SO42--	(mg/L)	37	38	NA

大腸菌が環境水中において増殖したことを確かめるための対照試料として、大腸菌の最小培地であるM9培地から唯一の有機炭素源であるグルコースのみを除いた溶液を作成した。この試料を以後、M9-Gluと呼ぶ。M9-Gluは、大腸菌が増殖するために必要な成分のうち、有機物成分以外をすべて含む溶液ということになる。

試料中に大腸菌の種菌を培養しているLB培地由来の有機物成分が混入しないようにするために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて大腸菌と有機物成分の分離を行った。さらに、栄養豊富な培地中に存在していた大腸菌を、本実験で用いる河川水中のような低栄養条件下に馴致させるために、PBS中で3時間放置した。その後、各培養系及び対照系に大腸菌数の初期濃度が $ 10^{3}\sim10^{4} $ cells/mL程度となるように植種を行った。

大腸菌の培養実験は、河川水T、Y1、Y2と、対照試料M9-Gluの4種類の試料に対して行った。上記の通り大腸菌を植種したのち、暗所、30℃の条件下で培養を行い、定期的に大腸菌数及び全菌数の測定を行った。さらに、河川水T、Y1、Y2については、大腸菌を植種せずに、暗所30℃で培養
を行うブランクを用意した。このブランクについても大腸菌数と全菌数の測定を定期的に行い、細菌が増殖していないことを確認した。培養実験が終わったのちに、大腸菌を植種し増殖した試料と、ブランク試料の溶存有機物組成の比較を行った。溶存有機物組成の分析には、低級カルボン酸の測定とOrbitrap型質量分析計による分析を用いた。

大腸菌数の測定は、クロモカルトコリフォーム寒天ESを用いて行った。全菌数の測定にはフローサイトメトリによる計数法を用いた。試料490 μLを無菌的にマイクロチューブに採取し、ジメチルスルホキシド(DMSO, WAKO, USA)で100倍希釈した染色液SYBR $ ^{\circledR} $ Green I(Invitrogen, USA)及び、50 mM EDTAをそれぞれ5 μLずつ加えた。この試料を遮光し37℃で10分間インキュベートすることにより反応させ染色した。染色後、BD AccuriTM C6 フローサイトメーター(BD、USA)を用いて全菌数を測定した。なお、測定試料量は50 μL、流速はmediumに設定した。また、試料を孔径0.2 μmのPTFEメンブレンフィルター(DISMIC, Advantec, Japan)でろ過し、同様に染色することでブランク試料とした。試料中の菌数が多い場合は、リン酸緩衝生理食塩水を用いて適宜希釈を行った。測定後はソフトウェアCFlow Plus(Accuri, USA)を用いてデータの解析を行った。

低級カルボン酸の測定はイオンクロマトグラフィーにより行った。低級カルボン酸は、酢酸、ギ酸、シュウ酸の3種類を測定対象とした。装置は881 Compact IC pro(Metrohm, Switzerland)を、カラムはMetrosep A Supp 5-250/4.0(shodex, Japan)を用いて測定を行った。溶離液には3 mM炭酸ナトリウムと1 mM炭酸水素ナトリウムの混合液を用い、流速は0.6 mL/minに設定した。標準液には、酢酸、ギ酸、シュウ酸の3種混合溶液を用い、0 μgC/mL、1 μgC/mL、5 μgC/mL、10 μgC/mL、50 μgC/mL、100 μgC/mLの6段階の標準列を作成した。測定により得られた結果は、ソフトウェアMag IC Net 3.1を用いて分析を行った。

Orbitrap型質量分析計による分析は、試料の前処理、試料の固相抽出、質量分析の3つの段階で下記の通り行った。

## ①試料の前処理

Orbitrap型質量分析計で環境水を分析するためには、溶存有機物を濃縮させるために固相抽出を行う必要がある。そのために、試料を前処理する必要がある。まず、用いる試料を孔径0.3μmのガラス繊維ろ紙であるGF-75(Advantec, Japan)でろ過した。次に、5N塩酸を用いてpHを2.00に調整した。pHの微調整には、0.1N塩酸や0.1N水酸化ナトリウム水溶液を用いた。なお、本実験で使用するガラス器具は全てMilli-Qで十分にリンスし、アルミホイルに包みオーブン(550℃、6h)で熱処理を行った。また、ガラス繊維ろ紙もアルミホイルに包み同様に熱処理した。

## ②試料の固相抽出

試料中の溶存有機物を濃縮するために、上記の通り前処理を行ったサンプル1 Lを10 mLに100倍濃縮した。固相抽出には、Bond Elut PPL カラム(Agilent Technologies, USA)を用いた。

試料をPPLカラムに通水させる前に、メタノール及び0.01 N塩酸を各カラムに20 mLずつ順に流してコンディショングした。その後、1カラム当たり1 Lの試料を、真空ポンプを用いて通水した。通水時の圧力は約5 mmHgに調節した。試料の通水が終了した後、0.01 N塩酸を6 mLずつ各カラムに2回流すことにより洗浄し、真空ポンプで5分間乾燥した。乾燥後、各カラムにメタノール10 mLを正確に通じて有機物を溶出させ、100倍に濃縮した試料を得た。メタノールでの溶出の際も、通水時と同様に真空ポンプを用い、圧力は5 mmHgに調整した。固相抽出によって得られた試料は、-20℃で保管した。
## ③質量分析

上記の固相抽出によって得られた試料について、Orbitrap型質量分析計Exactive (ThermoFisher Scinetific, Japan)によりフローインジェクション分析を行った。測定はネガティブイオンモードで行い、イオン化方法はエレクトロスプレーイオン化法を選択した。測定範囲はm/z = 100 - 1000 (質量分解能100,000)を対象とした。モバイルフェイズには、純粋メタノールを用いた。また、分析保持時間、1回の測定につき2分とした。

質量分析によって得られたデータについては、ソフトウェアSeive2.2(ThermoFisher Scientific, Japan)を用いて解析を行った。

## 4 ．結果及び考察

## 1 ）東京湾沿岸域における降雨後ウイルス汚染の実態調査

隅田川河口、目黒川河口、測線観測地点、お台場の各地点から得られた合計57試料において、陽性率はPMMoV、ノロウイルスGII、アイチウイルス、ノロウイルスGIの順に高く、それぞれ79%、54%、46%、44%、となった。PMMoVの高い陽性率は、同ウイルスの優占性を示した先行研究を支持するものであったが、一方でアイチウイルスの陽性率はノロウイルスGIIよりも低く、必ずしも水環境中に優占して存在しているわけではない可能性が示された。しかしながら、下記に示すとおり、本調査において採取された試料中の阻害物質濃度が非常に高かったことから、検出阻害が完全に除去されず測定結果が不検出になった試料が多く存在し、各ウイルスの陽性率が過小評価されている可能性もある。

表(2)-2に検出阻害が見られた試料の割合を示す。RNA抽出液の10倍希釈を行わなかった場合のウイルス検出阻害が見られた試料の割合は、隅田川河口で25%（3/12）、目黒川河口で83%（10/12）、測線観測地点で83%（15/18）、お台場で93%（14/15）であった。また、検出阻害軽減化処理としてRNA抽出液の10倍希釈を行った結果、阻害が見られた試料の割合は、隅田川河口で17%（2/12）、目黒川河口で33%（4/12）、測線観測地点で39%（7/18）、お台場60%（9/15）となった。この結果は、RNA抽出液の10倍希釈により全体としてみれば検出阻害が軽減されたことを示しているが、一方で、軽減の程度には採水地点による差が見られることも示している。特に、お台場においてはRNA抽出液の10倍希釈を行った後にも60%の試料で検出阻害が見られた。水理学的な条件により、お台場の採水地点周辺海域に阻害物質が輸送され、蓄積されている可能性がある。さらに、阻害が見られた試料の割合を鉛直方向別に見ると、低層において中層より、中層において表層より検出阻害が強く見られることが分かる（表(2)-3）。この結果は、再び、水理学的な条件により、深さ方向に阻害物質濃度の勾配があることを示唆している。

表(2)-2. 阻害が見られた試料の割合（%）

隅田川	目黒川	測線	お台場	全体
希釈前	25	83	83	93	74
希釈後	17	33	39	60	39
表(2)-3. 鉛直方向別に見た、RNA抽出液希釈後に阻害が見られた試料の割合（%）

隅田川	目黒川	測線	お台場	全体
表層	0	0	17	60	21
中層	25	25	33	60	37
低層	25	75	67	60	58

表(2)-4に検出阻害軽減化処理を行わなかった場合の各ウイルスの陽性率を、表(2)-5にRNA抽出液の10倍希釈を行った後のウイルス陽性率を示す。表(2)-4および表(2)-5に示した結果の比較により、RNA抽出液の10倍希釈を行った場合に、いずれのウイルスに関しても陽性率が増加したことが分かる。

表(2)-4. 検出阻害軽減化処理を行わなかった場合のウイルス陽性率（%）

ウイルス	隅田川	目黒川	測線	お台場	全体
PMMoV	75	42	50	20	46
AiV	67	0	22	7	23
NoV GI	75	0	14	7	23
NoV GII	75	8	22	0	25

表(2)-5. RNA抽出液の10倍希釈を行った後のウイルス陽性率（%）

ウイルス	隅田川	目黒川	測線	お台場	全体
PMMoV	83	92	72	73	79
AiV	83	33	50	20	46
NoV GI	75	25	56	20	44
NoV GII	75	42	50	53	54

以下に、各採水地点におけるウイルスおよび大腸菌の挙動について述べる。

## a）隅田川河口における挙動（図2-8）

6月6日において、ノロウイルスの濃度はGI、GII共に不検出となった。一方で同日試料の表層に関しては検出阻害が見られないため、ノロウイルスに関する結果は偽陰性ではないと考えられる。また、PMMoVやアイチウイルスが検出阻害の見られなかった表層で検出されており、大肠菌も全層から検出されたことから、同日中には採水地点においてCSOの影響があったと考えられる。併せて、ノロウイルスが6月7日以降の試料中で検出されたことから、到達時間にウイルス間の差が存在し、ノロウイルスは到達時間が遅い可能性がある。また、PMMoVの濃度が安定して高かったのに対し、他のウイルス濃度は8日に最高値を示したことから、PMMoV汚染はCSO発生前に既に存在した別の汚染源によるものであり、他のウイルスがCSOにより8日に排出された可能性もある。アイチウイルスの濃度が6月10日に向けて減少傾向を示したのに対し、PMMoVの濃度が減少傾向を見せなかったことから、先行研究による報告と同様に、PMMoVの水環境中における安定性の高さが示唆された。大腸菌の举動はPMMoVの举動との類似性を示した。
## b）目黒川河口における挙動（図2-9）

表層における挙動について、各ウイルス間で類似した傾向が見られた一方で、大腸菌の挙動はウイルスと異なる傾向を示した。また、6月6日の低層試料に関して、検出阻害が見られるのにも関わらず、ノロウイルスGIIの濃度が特異的に高い値で定量された。当採水地点における水深が5mと浅く、低層試料が河床近傍から採取されたことから、特異的に高い値で検出されたノロウイルスGIIが底泥由来である可能性が考えられる。一方、他の試料におけるウイルス濃度が6月6日から7日にかけて増加したことから、CSOによる汚染の影響が7日に到達したと考えられる。底泥由来と考えられるノロウイルスGIIは、7日の試料においては降雨やCSOの影響で流速の増加した河川水の剪断作用により巻き上がり、低層試料中で減少したと考えられる。

## c）測線観測地点における举動（図2-10）

ウイルスと大腸菌の挙動が異なっており、概してウイルス濃度の減少は大腸菌濃度の減少に比べて遅く、ウイルスの方が環境中において安定的に存在していた可能性、もしくはCSOによる汚染の影響が到達時間の差により遅れて生じた可能性がある。ただし、ウイルス濃度はreal-time PCRにより測定されており、ウイルスに関しては不活化を判定できないため、大腸菌の不活化による検出濃度の減少が、両者の濃度減少傾向の原因となっている可能性も考えられる。またウイルス間の比較においては、PMMoVとアイチウイルス、ノロウイルスGIとノロウイルスGIIがそれぞれ類似した挙動を示した。両者の挙動の差は、検出阻害の見られなかった6月8日の表層および中層試料においてノロウイルスGI、GIIが不検出となった点において顕著に見られる。ウイルス測定用に採取された試料に関しては、およそ2 kmの航行中に連続的に採取されたものであるため、濃度の定量結果は当該海域におけるウイルスの平均濃度をあらわしていると考えられ、ウイルス間に見られた挙動の差は試料の代表性により生じたものではないと考えられる。

## d）お台場における挙動（図2-11）

前述したように、当採水地点においては、検出阻害の見られた試料の割合が他の採水地点と比べて高く、ウイルスの継時的な挙動を比較、評価することが困難であった。しかし、降雨終了時から約1週間が経過した6月18日になってもノロウイルスが検出されており、親水活動を介した感染リスクが持続していることを示唆している。また、測線観測地点におけるPMMoVおよびアイチウイルスの濃度が6月10日から6月18日にかけて一定または減少する傾向を示したのに対し、お台場においてはいずれも増加する傾向を示した。この傾向の差は、CSOによる汚染の影響が到達するのに要する時間に関して、両採水地点における差があることを示唆している。大腸菌の挙動が両採水地点において類似した傾向を示したことに鑑みれば、ウイルス汚染の到達時間が細菌による汚染の到達時間に比べて長い可能性が示唆された。6月6日の低層試料におけるノロウイルスGIIの高い濃度は、当採水地点の水深が約5 mと浅かったことから、目黒川河口におけるものと同様に、底泥由来である可能性がある。また検出阻害の見られなかった6月10日の試料に関して、ノロウイルスが検出されている一方でアイチウイルスが不検出となったことから、アイチウイルスの測定によってノロウイルスの存在を予測できない場合があることが示された。

全体として、検出阻害が多く見られたことから、ウイルスの挙動を定量的に議論することが困
難であった。そのため、降雨後の沿岸海域におけるウイルス汚染の実態を適切に把握するためには、RNA抽出液の10倍希釈に加え、さらなる検出阻害の軽減化処理を施す必要があると考えられる。また、大肠菌に関しては、全体的に中層および低層における濃度のピークが表層におけるピークに遅れて現れる傾向が見られたが、ウイルスに関してはこのような傾向が見られなかった。ウイルスおよび大肠菌の鉛直方向における濃度分布は、沈降により表層から中層、低層へと推移していくことが予想されたが、この結果は、ウイルス粒子が調査期間中にあまり沈降していなかったことをあらわしている。ウイルス粒子は数十nmから数百nmの大きさを有しているため、環境中で他のコロイド粒子との凝集があまり起きていなかった、浮遊物質への吸着があまり起きていなかった等の理由により、輸送のメカニズムとして移流が沈降に対して卓越していたと考えられる。

図(2)-8. 隅田川河口におけるウイルスおよび大腸菌の定量結果

白抜きのプロットは定量不可能値、下向きの矢印は不検出、アスタリスク (*) は検出阻害を表す。定量不可能値のプロットには検出下限値を代替的に用いた。
図(2)-9. 目黒川河口におけるウイルスおよび大腸菌の定量結果

白抜きのプロットは定量不可能値、下向きの矢印は不検出、アスタリスク (*) は検出阻害を表す。定量不可能値のプロットには検出下限値を代替的に用いた。
a) 低層のみ阻害

b) 表層、低層のみ不検出

図(2)-10. 測線観測地点におけるウイルスおよび大腸菌の定量結果

白抜きのプロットは定量不可能値、下向きの矢印は不検出、アスタリスク $ ^{*} $ は検出阻害を表す。定量不可能値のプロットには検出下限値を代替的に用いた。また、大肠菌濃度に関しては測線上を航行中に一定の時間間隔で採取された10試料に関する幾何平均値を示し、その標準偏差をエラーバーで示した。
図(2)-11. お台場におけるウイルスおよび大腸菌の定量結果

白抜きのプロットは定量不可能値、下向きの矢印は不検出、アスタリスク（*）は検出阻害を表す。定量不可能値のプロットには検出下限値を代替的に用いた。
## 2 ）二枚貝への腸管系ウイルス蓄積状況に基づいたヒト糞便由来の汚染履歴評価

東京湾内の4地点から水試料およびカキ試料を得た時点における環境パラメータを表(2)-6、7、8に、大腸菌および大腸菌群の濃度を表(2)-9、10に示す。空欄の試料については採取を行っていない。

表(2)-6. 東京湾サンプリング時の水温(℃)

5月	8月	11月	2月
多摩川	表層	24.4	23.2	14.5	9.2
低層	23.0	24.0	14.0
葛西臨海公園	表層	26.7	22.0	14.0	9.0
低層	25.0	22.0
中央防波堤	表層	22.6	15.5	9.9
低層	16.0
鮫洲	表層	27.3	23.2	14.0	9.6
低層	22.9	25.3	16.0

表(2)-7. 東京湾サンプリング時のpH

5月	8月	11月	2月
多摩川	表層	7.61	7.75	7.60	7.73
低層	8.07	7.70	7.63
葛西臨海公園	表層	8.63	7.74	7.77	7.77
低層	7.85	7.96
中央防波堤	表層	7.50	7.68	8.21
低層	7.71
鮫洲	表層	7.53	7.47	7.89	7.52
低層	7.30	7.57	8.15

表(2)-8. 東京湾サンプリング時の塩分(%)

5月	8月	11月	2月
多摩川	表層	1	1.2	1.5	1.4
低層	1.3	2.1	2.1
葛西臨海公園	表層	0.1	0.2	1.1	1.5
低層	0.5	0.2
中央防波堤	表層	2.2	3	3.4
低層	3.2
鮫洲	表層	1.9	1.3	1.6	1.7
低層	2.6	2.7	2.9
表(2)-9. 東京湾サンプリング時の大腸菌群濃度（CFU/100mL）

5月	8月	11月	2月
多摩川	表層	1.5×10²	2.0×10²	3.4×10³	3.3×10²
低層	5.5×10²	6.6×10¹	3.0×10²
葛西臨海公園	表層	7.5×10²	3.0×10²	5.3×10³	4.3×10²
低層	1.5×10³	9.3×10²
中央防波堤	表層	-	2.9×10³	1.0×10²
低層	2.1×10³
鮫洲	表層	6.0×10²	2.6×10²	1.5×10⁴	1.1×10³
低層	2.5×10²	3.3×10¹	3.3×10³

表(2)-10. 東京湾サンプリング時の大腸菌濃度（CFU/100mL）

5月	8月	11月	2月
多摩川	表層	-	$ 3.3 \times 10^{1} $	$ 2.5 \times 10^{2} $	-
低層	$ 1.5 \times 10^{2} $	-	$ 1.0 \times 10^{2} $
葛西臨海公園	表層	$ 5.0 \times 10^{1} $	$ 1.3 \times 10^{2} $	$ 2.0 \times 10^{2} $	$ 1.3 \times 10^{2} $
低層	$ 5.5 \times 10^{2} $	$ 3.3 \times 10^{2} $
中央防波堤	表層	-	$ 1.1 \times 10^{3} $	$ 1.0 \times 10^{2} $
低層	$ 3.3 \times 10^{2} $
鮫洲	表層	$ 4.5 \times 10^{2} $	$ 6.6 \times 10^{1} $	$ 3.3 \times 10^{3} $	$ 3.3 \times 10^{2} $
低層	$ 3.0 \times 10^{2} $	-	$ 2.1 \times 10^{3} $

## 横線は検出限界以下

2015年11月のサンプリングにおいて、大肠菌および大肠菌群の濃度が比較的高い値を示していたが、これは前日の降雨によってCSOが発生していた為であると考えられる。

水試料およびカキ試料について、PMMoV coat protein遺伝子のクローンライブラリをそれぞれ8から20配列得た。図(2)-12は全試料、図(2)-13は5月の多摩川河口試料について、水中とカキに含まれるPMMoV coat protein遺伝子の系統関係を示している。

図(2)-12、13を見ると、PMMoV coat protein遺伝子は保存性が強く、水試料とカキ試料それぞれに含まれるウイルスに大きな系統的違いは認められない一方で、カキ試料には、水試料では見られない固有の配列が複数確認された。カキは、水中に含まれるウイルスと長期間に渡って接触しているため、一時の水試料では捉えられない、蓄積したウイルスの配列を含んでいたものと考えられる。
図(2)-12. 水試料およびカキ試料に含まれるPMMoVのcoat protein遺伝子系統関係（NJ法）
図(2)-13. 5月多摩川河口試料の水およびカキに含まれるPMMoVのcoat protein遺伝子系統関係（NJ法）

## 3 ）環境中における大腸菌の増殖を評価する系の確立

大腸菌培養開始後6時間までの増殖曲線を図(2)-14に示す。mRNAの発現は、ftsZおよびtnaA共に対数増殖期に入ってから検出され、どちらもゲノムDNAに対して $ 10^{4} $ 程度低い検出量であった。ftsZ遺伝子については、対数増殖期後期にmRNAの発現量が横ばいとなっている点が、一般機能遺伝子のtnaAと異なる傾向として確認された。

図(2)-14. 大腸菌培養開始後6時間までの増殖曲線（左：ftsZ、右：tnaA）

対数増殖期後、16日後までの生残曲線を図(2)-15に示す。ftsZおよびtnaA共に、増殖が停止した後もmRNAが検出され、その濃度はゲノムDNAの $ 10^{4}-10^{5} $ 低い値を示した。本研究における培養実験条件においては、分裂関連遺伝子と一般機能遺伝子の生残には大きく異なる举動は認められなかった。
図(2)-15. 大腸菌培養開始後16日までの生残曲線（左：ftsZ、右：tnaA）

## 4 ）環境水中溶存有機物による大腸菌の増殖可能性の評価と増殖基質の探索

各河川水及び対照試料に大腸菌を植種して培養を行い、大腸菌数の経時変化を測定した結果を図(2)-16に示す。図中のプロットは各河川水及び対照試料で行った3連の培養実験の平均値を、エラーバーは3連の標準誤差を表している。図(2)-16を見て分かる通り河川水T、Y1、Y2のいずれの河川水においても、対照試料であるM9-Gluよりも大腸菌数が増加していることが分かる。各サンプルにおける大腸菌数の増加量を見てみると、河川水Tにおいては3連の平均でおよそ4.3×10^{5} CFU/mL、河川水Y1及びY2においてはおよそ1.8×10^{5} CFU/mL増加している。この増加量は、対照試料における大腸菌数の増加量3.4×10^{4} CFU/mLと比較して有意に大きいことが確認できる。本実験の対照試料であるM9-Glu中には、大腸菌が増殖するために必要な成分が有機物以外すべて含まれている。この対照試料と比較して有意に大腸菌数が増加していることから、大腸菌が河川水中の溶存有機物を利用して増殖をしていることが分かる。なお、有機物を含んでいないM9-Glu中で大腸菌が少量ではあるが増殖している理由は定かではないが、大腸菌が体内に蓄積していた有機物を利用して増殖していたなどの理由が考えられる。

図2-16. 大腸菌数の経時変化
表(2)-11に、河川水Tの低級カルボン酸濃度の測定結果を示す。表中の値はそれぞれ、（3連の平均値 ± 標準誤差）を表している。河川水Tでは、酢酸及びぎ酸は大腸菌の増殖により濃度に有意な変化は見られなかったが、シュウ酸は大腸菌の増殖に伴い減少している。大腸菌はシュウ酸をギ酸と二酸化炭素に分解し、さらにギ酸を二酸化炭素と水素に分解する酵素をもっている。また、これらの酵素は好気条件下で活動することができるため、本培養実験中においてもこの分解反応が進行する可能性がある。したがって、本培養実験において、河川水T中においては大腸菌がシュウ酸を増殖基質として用いている可能性が示唆される。

シュウ酸以外のカルボン酸についてはほとんど変化が見られず、また、河川水Y1及びY2においては酢酸、ぎ酸、シュウ酸のいずれも変化が見られなかった。これらのことから、シュウ酸は大腸菌の増殖に必須の有機物ではないこと、低級カルボン酸のほかに増殖基質として用いられている有機物が存在することが示された。

表(2)-11. 河川水Tにおける低級カルボン酸濃度( $ \mu $ gC/L)

酢酸	ギ酸	シュウ酸
培養前	(n=1)	224	12.0	9.2
大肠菌 增殖なし	(n=3)	224 ± 4	12.1 ± 0.5	7.9 ± 4.3
大肠菌 增殖御	(n=3)	229 ± 1	12.6 ± 0.1	1.1 ± 1.1

河川水T、Y1、Y2について、Orbitrap型質量分析計によりフローインジェクション分析を行い、分析により得られたマススペクトルを、Sieve2.2を用いて比較し、各河川水中の溶存有機物のピークを検出した。

まず、得られたピークからバックグラウンドノイズを除くために、ピークの積分強度が一定以下のものを解析対象から除外した。さらに、モバイルフェイズであるメタノール中で積分強度の大きいピークを、試料由来の有機物ではないと判断し、除外した。

大腸菌が増殖した河川水と、大腸菌を植種していない河川水とで比較したときに、前者の方が小さくなっているピークを抽出した。抽出の際には、3連の培養実験での結果の平均値をt検定することにより有意な差があるかどうかを確かめた。さらに、大腸菌培養実験前の試料と比較して積分強度が小さくなっているものを抽出した。

上記の抽出作業により、大腸菌の増殖に伴い減少した有機物について、精密質量数から分子式を推定した。分子式の推定の際には、C、H、O、N、P、S、Cl のみを使用した、実在しうる分子式のみを対象とした。これらの作業により、各河川水について250～300種類程度の有機物が、大腸菌の増殖に伴い減少したことが示された。

3種類の河川水すべてにおいて減少したピークは33種類しか抽出されず、また、減少率も平均で0.9程度であり、大肠菌は特定の有機物を絶対の増殖基質として利用しているのではなく、異なる環境水中においては異なる有機物を利用している可能性が示された。

また、各河川水において特に減少率が大きかったピークを表(2)-12に示す。これらの有機物の
多くは他の河川水中においては検出されず、各河川水特有のものであると考えられる。大腸菌は、それぞれの環境水中において、増殖基質として利用しやすい有機物を選択的に利用している可能性が示された。

表(2)-12に示したピークの推定分子式は、構成元素や不飽和度などが様々な有機物が存在する。したがって、大腸菌はこのような多種多様な有機物を増殖基質として利用可能であることがうかがえる。

表(2)-12. 特に減少率の大きかった有機物

河川水	m/z测定值	推定分子式	减少率
Y2	194.0431	C5H5N7O2	0.65
Y2	204.0355	C9H13Cl2N	0.64
Y2	210.9997	C7H4N2O6	0.65
Y1	229.0257	C11H6N2O4	0.28
Y1	246.0154	C10H5N3O5	0.59
Y1	252.0587	C16H12ClN	0.50
T	258.0359	C11H14ClNO2S	0.61
T	259.0338	C16H8N2S	0.59
Y1	261.0421	C8H12N3O5S	0.60
Y1	263.1143	C12H24O2S2	0.32
Y1	265.1479	C12H26O4S	0.32
Y2	274.1390	C17H23OS	0.69
T	319.0863	C14H24O2S3	0.68
Y1	321.0624	C16H18O3S2	0.53
Y1	331.0657	C18H12N4OS	0.66
Y1	344.1227	C21H19N3S	0.65
Y1	345.0995	C19H14N4O3	0.54

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

降雨後の東京湾調査で検出したいずれのウイルスについても、中層、低層における濃度が表層に比べて大きくなる傾向が見られた。一方で、大腸菌濃度は表層における濃度が高い状態から、中層における濃度が高い状態、低層における濃度が高い状態への移行が見られた。ウイルス汚染の空間的な特性は降雨分布や汚濁流出源に影響されると考えられるため、今後は流出解析や3次元流動解析を用いて結果の解釈を行うのが望ましい。また、水環境中におけるノロウイルスGIIの濃度をさまざまな糞便汚染指標を用いた回帰モデルにより予測することを試みた最近の研究により、予測の精度は大腸菌や腸球菌といった従来の指標細菌に加え、ポリオーマウイルス等の新たに提案されている指標を加えることにより向上すると報告されている。本研究で扱ったアイチウイルスやPMMoVはノロウイルスと同様に一本鎖RNAを有するノンエンベロープウイルスであることから、その指標性について、さらなる検討がなされるべきであると考えられる。
ヒト糞便由来のウイルスを長期的に蓄積していると考えられるカキに着目した調査においては、環境水中に存在するウイルス遺伝子型との異同を検討した。カキ試料には、水試料では見られない固有の配列が複数確認されたことから、水試料中に検出されていないウイルスを補足する試料として期待できる。本研究では病原性の無いPMMoVを対象に検討を行ったが、今後、季節変動のあるノロウイルス等に応用し、年間汚染状況を把握する手法として利用することができると考えられる。

大腸菌の分裂関連遺伝子に着目し、その発現を検出、定量する手法ついては、新たな系を確立することができた。今後、培養実験によって他の一般機能遺伝子と挙動の異なる点を探索することで、環境中における大腸菌の増殖活性を解析するツールとして活用することができると考えられる。

環境中における大腸菌の増殖について、大腸菌は、暗所かつ30度という限られた条件においては、滅菌された環境水中で増殖可能であることが確かめられた。大腸菌を指標細菌として利用する際には、大腸菌が環境水中で増殖しうるということに注意してリスク管理をする必要がある。また、環境水中での大腸菌の増殖に伴い減少する有機物を検出することができた。大腸菌は異なる環境水中では異なる溶存有機物を増殖基質として利用できる可能性が示された。また、大腸菌は多種多様な有機物を増殖基質として利用可能であることが示唆された。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

PMMoV濃度と大腸菌濃度の経時的な傾向を比較すると、PMMoVの残留期間が大腸菌よりも長い。これは、降雨後のウイルス汚染が細菌汚染よりも長く持続することを示唆している。我が国においては、水浴場の微生物学的な水質基準は糞便性大腸菌群数により規制されているが、本研究の結果はこうした基準だけではウイルス由来の感染リスク管理には不十分であることを示していると考えられる。PMMoVやアイチウイルスは環境水中における濃度が他のウイルスに比べて高く、検出が比較的容易であるため、ウイルス指標となることが期待されている。本研究ではPMMoVの陽性率および濃度が他のウイルスよりも高く、アイチウイルスの陽性率はNoV GI、GIIと同程度であった。さらに、PMMoV濃度には下降傾向が見られなかったことから、水環境中で安定的であり、安全側の指標として機能すると考えられる。

ゲノムがRNAで構成される腸管系ウイルスは進化速度が速いため、粒子表面のタンパクが変化すると、過去にヒトが獲得した免疫は役に立たず、大きな流行に発展しやすい。それ故、リスク管理の観点からは、環境水中に存在する濃度情報の他に、遺伝子型の一覧を保有することが望ましい。本研究で検討した、カキ中腸腺に蓄積したウイルスの解析手法は、環境中に排出されたウイルスの遺伝子型を広く把握する手法として、応用できる可能性を持つものである。

また、新しい衛生指標として期待される大腸菌は、環境中で増殖するとすれば、汚染の過大評価に直結する環境政策上重要な問題である。本研究によって確立した分裂関連遺伝子の定量手法は、今後、培養実験によってその挙動に関するデータを蓄積することで、環境中における増殖活性を調査する手法として実用できる可能性がある。
“Field Investigation of Wet-weather Viral Pollution in Coastal Area of Tokyo Bay”

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない

## <査読付論文に準ずる成果発表>

1) T. AASAMI, K. INOUE, H. KATAYAMA, T. SHIBATA and H. FURUMAI: Full paper for The 6th IWA-ASPIRE Conference and Exhibition, submitted (2015)

## くその他誌上発表（査読なし）>

1）片山浩之、安井宣仁、猪又明子、田中宏明、岸田直裕、原本英司、渡部徹、真砂佳史、浅田安廣、端昭彦、佐野大輔、井原賢、稲葉愛美：水環境学会誌、37、12、424-433（2014）

「水中の健康関連微生物に関する研究動向」

## （2） 口頭発表（学会等）

1）浅見達也・柴田智世・片山浩之・古米弘明：第51回環境工学研究フォーラム（2014）

「親水活動による感染リスク評価に向けた東京湾沿岸域の降雨後ウイルス汚染実態調査」

2) T. ASAMI, K. INOUE, H. KATAYAMA, T. SHIBATA and H. FURUMAI: The 6th IWA-ASPIRE Conference and Exhibition (2015)

3) H. KATAYAMA: 2nd International Forum on Asian Water Environment and Technology (2015) "Virus Detection and Monitoring in Coastal Seawater"

5) H. KATAYAMA: International Forum on Sustainable Future in Asia 1st NIES International Forum (2016)

“Health risk monitoring and management for sustainable urban environment”

## 6 ）片山浩之：東京湾再生推進会議陸域対策分科会（2016）

「東京湾の微生物学的安全性」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

京都大学G報告書に記載
## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## （6） その他

く学会等におけるポスター発表>

1）井上健太郎、浅見達也、柴田智世、片山浩之、古米弘明：水中の健康関連微生物研究委員会シンポジウム（2015）

「東京湾奥部における降雨後ウイルス汚染の実態調査」

2）井上健太郎、片山浩之、古米弘明：第50回日本水環境学会年会（2016）

「二枚貝および底泥の腸管系ウイルス蓄積状況に基づいたヒト糞便由来の汚染履歴評価」

### 8 \. 引用文献

1) Andersen et al. 2013 J Water Health 11: 636–646

2) Sartorius et al. 2007 Scand J Infect Dis 39: 323-331

3) Letschert et al. 2002 J Virological Methods 106: 1-10

4) Fraile et al. 2011 Mol Biol Evol 28: 1425-1437

5) Tamura et al. 2013 Mol Biol Evol 30: 2725–2729
# （３）病原微生物の動態に与える環境因子の影響の評価

東北大学未来科学技術共同研究センター 大村達夫

東北大学未来科学技術共同研究センター 真砂佳史

東北大学未来科学技術共同研究センター 稲葉愛美

東北大学未来科学技術共同研究センター 風間しのぶ

東北大学未来科学技術共同研究センター 今田義光

東北大学未来科学技術共同研究センター 三浦尚之

東北大学大學院工学研究科 久保田健吾

くその他の研究協力機関等>

北海道大学大学院工学研究院 佐野大輔

平成26～27年度累計予算額：35,998千円（うち平成27年度：17,538千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

東日本大震災で被災した仙台市南蒲生浄化センターおよび処理水の放流先海域において、H26年9月～H28年1月の期間に7回、指標微生物および病原微生物の分布調査を行った結果、指標細菌、ファージ、ウイルスが沖10 kmにおいても検出されることがあり、海洋において幅広く分布していることが明らかになった。また、同じ試料において難分解性医薬品に着目し、海域における移流・拡散を評価する指標として選定を行った。一次元円筒座標移流拡散方程式に基づいた解析結果から適正な移流・拡散指標としてCrotamitonが選定された。さらに難分解性医薬品の濃度減衰と微生物の濃度減衰を比較することで、移流・拡散以外による微生物の不活化を評価した。その結果、放流先海域での移流・拡散を示す適正な指標としてCrotamitonの有効性が確認された。また、Crotamitonと微生物濃度の比較により細菌・ファージの移流・拡散以外の不活化による減衰が生じていることが示唆された。一方で、ウイルス濃度の減衰は移流・拡散のみにより生じていることが示唆されたが、ウイルスは遺伝子を定量し感染価を測定してないことから、ウイルスの不活化を考える場合には今後の検討が必要であった。そこで、水環境における微生物の不活化に影響する環境因子のひとつである太陽光による不活化をLEDソーラーシミュレーター（擬似太陽光）の照射により測定した。擬似太陽光照射による不活化は、細菌

## [キーワード]

指標細菌、病原ウイルス、難分解性医薬品、太陽光、塩分耐性
### 1. はじめに

近年、水質基準の改定が進められており、目的とした水利用に合わせた基準値や適正な指標の選定が重要な課題となっている。適正な指標や基準値を定めるためには、水環境における指標微生物や病原微生物の濃度変化や消長を現地調査により測定し、かつ、室内実験により、微生物の活性に影響を与えるさまざまな環境因子について評価する必要がある。現地調査および実内実験により得られたデータを蓄積し統合することで、病原微生物の環境水中の挙動解明を目指すとともに、指標微生物や指標化学物質による衛生学的水質管理に必要な知見を得る必要がある。

そこで、本サブテーマでは、実環境における調査として東日本大震災で被災し復旧段階にある仙台市南蒲生浄化センターおよび処理水放流先海域を対象に、指標微生物、病原微生物、各水質項目の現地調査を行った。

また、放流先海域における微生物濃度の減少には、太陽光、生物活性などの環境要因による不活化によるものと、海流、潮汐などによる移流・拡散による減少がある。指標微生物の有効性や病原微生物の感染リスクや汚染レベルは、指標微生物と病原微生物の室内実験による不活化効果の影響や下水到達率などと比較し評価する事が重要である。したがって、微生物の不活化と移流・拡散による減少を分けて濃度減衰を評価する必要があると考える。そこでパーソナルケア製品のうち、特に難分解性医薬品に着目し、適正な移流・拡散指標の選定と評価を行い、さらに、選定した医薬品と微生物の濃度減衰を比較し、微生物の不活化による減衰の評価を行った。

また、環境要因が微生物の活性に与える影響の評価として以下の室内実験を行った。水環境における微生物の不活化に影響する環境要因のひとつに太陽光が挙げられている。これまでに、UV照射による細菌やファージなどの不活化・消毒効果などが検討されてきたが、太陽光による不活化を測定した研究は少なく、ウイルスについては皆無である。そこで、LEDソーラーシミュレーター（擬似太陽光）を用い、細菌2種、ファージ2種、腸管系ウイルス2種に対する不活化を評価した。さらに、H24～H25年度の環境研究総合研究費で得られたデータによれば、海域においても大腸菌が幅広く分布していることが明らかになったことから、大腸菌は塩分に対する耐性を有している可能性がある。そこで、塩分耐性を有する大腸菌の存在・分布を明らかにした。

## 2 ．研究開発目的

（１）被災下水処理場および下水処理場放流先海域における病原微生物および指標微生物の消長に関する現地調査

東日本大震災に伴う津波により被災し復旧段階にある仙台市南蒲生浄化センターの処理場内および放流先海域において定期的に水試料を採取し、各種水質項目の分析を行った。復旧段階にある浄化センターおよび放流先海域の試料から得られた測定結果より、処理段階および放流先海域における指標微生物および病原微生物の濃度変化から、微生物の消長について実測に基づいた調査を行った。現在衛生学的水質基準の見直しが進められていることを鑑み、現行の水質指標である大腸菌群をはじめ、糞便汚染指標として提案されている水質指標（細菌、ファージ）および病原ウイルスを含むヒトウイルスを測定した。また、目的（2）の医薬品およびパーソナルケア製品（Pharmaceutical and Personal Care Products；PPCPs）の特に難分解性医薬品に着目した放流先水域における適正な移流・拡散指標の選定のために採取試料中のPPCPsの測定も行った。