Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
### 3. 研究開発方法

## （１）農薬加水分解物の変異原性物質生成能（MFP）の測定

## 1 ）農薬の環境変化体の文献研究

PTPWsの変異原性物質生成能（Mutagen Formation Potential: MFP）を測定するにあたり、PTPWsのまとまった情報を検索したが得ることができなかった。そこで、サブテーマ2におけるモニタリング地域である神奈川県において出荷量が上位30位までの農薬を対象としてPTPWsの文献研究を行った。また、著者らが農薬のMFPを測定した結果、MFPが500 net rev./mg以上であった2種類の農薬も対象とした。文献検索は、独立行政法人科学技術振興機構（JST）が運営する文献情報データベースであるJ-Dream II、Elsevier社が運営するScienceDirect、Thomson Reuters社が運営するWeb of Scienceを用いて文献検索を行った。本研究では、水中での分解反応を加水分解反応および光分解反応に限定し、PTPWsを質量分析計またはNMRで同定した文献を検索した。以上の文献の検索は、サブテーマ2およびサブテーマ3と共同で実施した。また、代表的な書籍としてTransformation Products of Synthetic Chemicals in the Environment $ ^{1} $ およびMetabolic Maps $ ^{2} $ を検索した。

以上の文献検索および書籍検索の結果ヒットした文献および書籍にPTPWsの同定結果が記載されている場合には、根拠Aに基づくPTPWsとしてまとめた。PTPWsの同定結果が記載されていないが、PTPWsの化学物質名や構造情報などが記載されている場合が多く認められたため、文献の玄孫引きまで実施して同定結果を確認した。また、玄孫引きまで実施してもPTPWsの同定根拠を確認できなかったが、水環境中のモニタリングなどが実施されている場合には、根拠Bに基づくPTPWsとしてまとめた。

## 2 ）変異原性および変異原性物質生成能の測定

作成したPTPWsのリストに基づき、変異原性およびMFPを測定した。変異原性は、成書 $ ^{3)} $ に従い、Ames試験により測定した。Ames試験は、サルモネラ菌TA100株を用いて代謝活性化剤を添加せずに行った。MFPは、文献 $ ^{4)} $ にしたがって測定した。すべての実験は2名の実験者で3回以上繰り返して実験を実施し、再現性を確認した。

3-methyl-4-nitrophenolおよび3-methylphenolは東京化成工業（株）の試薬1級を、3,4-dichloroaniline（純度98%）、4-chlorobenzyl alcohol（純度99%）、4-chlorobenzoic acid（純度99%）、2-hydroxybenzyl alcohol（純度99%）、3-hydroxybenzyl alcohol（純度99%）、3-tert-butylphenol（純度98%）、2-aminothiophenol（純度95%）、monuron（純度95%）、2(3H)-benzothiazolone（純度98%）、2-methylbenzoic acid（純度98%）、3-phenoxybenzoic acid（純度98%）および2-(4-ethoxyphenyl)-2-methyl-1-propanol（純度98%）は東京化成工業（株）より市販されている試薬を、isoxathion、furathiocarb、bensulfuron methyl、isoxathion oxon、EPN oxon、bromobutide-debromo、dinotefuran、butamifos、carbosulfan、bromobutide、cafenstrole、methyl dymron、dimuron、tolclofos-methyl oxon、fenthion-oxon-sulfone、benfuracarb、ethylenethiourea、cafenstrole-descarbamoyl、3-hydroxycarbofuran、DMTP oxon、thiophanate methyl、pyriproxyfen、pencycron、methamidophos、fenthion-sulfoxide、fenthion-sulfone、fenthion-oxon-sulfoxide、fenthion-oxon、fentirooxon、disulfotonoxon、malaoxon、diazoxon、carbendazimおよび2-aminobenzimidazoleは和光純薬工業（株）の残留農薬試験用試薬を、EPN、carbofuran、tolclofos-methyl、pendimethalin、etofenprox、pyributicarbおよびisoprothiolaneは和光純薬工業（株）のTraceSureを、sulfanilamideおよびN-methylbenzenamineは和光純薬工業（株）の試薬特級を、p-cresol
は和光純薬工業（株）の水質試験用を、o-methylacetophenone（純度97.0%）、4-chlorobenzaldehyde（純度98%）、4-phenoxyphenol（純度99%）、4-nitrophenol（純度99%）、3-methyl-4-(methylthio)phenol（純度97%）、2-hydroxybenzonitrile（純度98%）、phenylurea（純度98%）、trimethyl phosphate、diethyl fumarate、diethyl maleateおよびD-diethyl tartrateは和光純薬工業（株）より市販されている試薬を、polycarbamateおよびTPNは関東化学（株）の残留農薬試験用試薬を、benzyl alcohol（純度99%）およびbenzaldehyde（純度98%）はナカライテスクより市販されている試薬を、desethylatrazine（純度99.5%）、desisopropylatrazine（純度97.5%）、isophthalonitrile（純度98%）、2-isopropyl-6-methyl-pyrimidine-4-ol（純度99%）、1-(3,4-dichlorophenyl)-3-methylurea、1-(3,4-dichlorophenyl)-3-formyl-3-methylurea、3-(3-chlorophenyl)-1,1-dimethylurea、3-methyl-4-nitroanisolおよびL-diethyl tartrateはシグマアルドリッチジャパン（株）より市販されている試薬を、glyphosate（純度97%）はDr.Ehrenstorfer GmbHより市販されている試薬を、AMPA((aminomethyl)phosphonic acid)はMP Biomedicals, Inc.より市販されている試薬を、disulfoton-sulfoxide（純度99%）はコスモ・バイオ（株）より市販されている試薬を、phosphoric acid diethyl ester（純度75%）およびdimethyl phosphate（純度98%）はACROS ORGANICSのブランド名でThermo Fisher Scientific Inc.より市販されている試薬をそれぞれ用いた。

## （２）生成する変異原の探索

モデル農薬として土壌燻蒸剤D-Dの主要成分である $ (E) $ -1,3-dichloropropene (CASRN: 10061-02-6、DCP)を用いた。DCP（純度96%以上）、1,1-dichroacetone（1,1-DCA、純度95%以上）、1,3-dichroacetone（1,3-DCA、純度97%以上）、3-chloropropinyl chloride（3-CPC、純度98%以上）は東京化成工業(株)より市販されているものを試験に用いた。3-chlorallyl alcohol（3CAA）は、DCPを純水に溶解させ、25℃、遮光下で29日間攪拌することで取得した。この際のDCPの分解率は、SPME法を用いてGC/QMSで測定された。

これらの物質のMFPの測定は、pH7.00の0.1 Mリン酸緩衝液中で塩素処理することによって行った。また、塩素処理されたサンプルは、LC/MSおよびGC/MSによる分析用に濃縮が行われた。この際、予備実験によりMFPが最も高くなる塩素添加量を求めておき、その塩素添加量にて分析用サンプルの作成が行われた。DCP塩素処理サンプルなどの定性分析は、Thermo Fisher Scientific Co. Ltd.より市販されているAPI-linear ion trap-Kingdon trap質量分析計と島津製作所（株）より市販されているUPLCを組み合わせたLC/MSを用いて行った。測定に先立ち、2,4-dinitrophenilhydrazine (DNPH)を用いてアナライトを誘導体化した。誘導体化物の合成確認および純度検定は、 $ ^{1} $ H-NMRを用いて行った。イオン化は、ESIおよびAPCIを用いてネガティブイオンモード、ポジティブイオンモードにて行った。LCによる分離は、ODSカラムを用いた逆相分離モードとシリカゲルカラムを用いた順相分離モードの両方を検討した。構造解析は、衝突誘起解離（Collision Induced Dissociation: CID）により行った。

1,3-DCAが実河川水中においても生成することを確認した。2013年12月3日に鹿児島県を流れる甲突川から採取した実河川を、採取後直ちにNo.5Cのろ紙でろ過した。その際、ろ紙は純水を用いて予め十分に洗浄した。ろ過した実河川水を用いてpH7.00の0.5 Mリン酸緩衝液を調整し、DCPを添加して塩素処理を行った。
## 4 ．結果及び考察

## （１）農薬加水分解物の変異原性物質生成能（MFP）の測定

## 1 ）農薬の環境変化体の文献研究

根拠Aに基づくPTPWsを表(1)-1に示す。農薬によっては、インドキサカルブのようにラセミ体や複数の物質の混合物をまとめた評価書が公開されている場合がある。そのような場合には、食品安全委員会から所轄大臣に答申される際の農薬の名称を英訳して表(1)-1に示した。農薬抄録・農薬評価書は2011年6月23日時点で179種類の農薬が公開されていた。無機物、ヨウ化工チル、臭化メチル、マシン油およびピネンを除いた全国出荷量上位10種類の中で農薬評価書が公開されていたのはブタミホスおよびエスプロカルブの2種類であった。農薬評価書が公開されている農薬の使用量順位の分布に偏りがあるか否かを検討するために、平成17農薬年度における458農薬の全国使用量の順位について、農薬評価書公開の有無と順位についてMann-Whitney検定をおこなった結果、P=0.00138となった。そこで、使用量の順位1～100位、101～200位、201～300位、301～400位、401～458位における農薬評価書が公開されていた農薬数を計数したところ、それぞれ27、27、19、18および4種類となった。すなわち、本研究において解析した農薬に関しては、比較的使用量が多い農薬の農薬評価書が公開されていると判断できる。

農薬評価書が公開されている農薬のうち、水中運命試験の結果が記載されていない農薬が5種類、水中運命試験は実施されているが分解物が表記されていない農薬が17種類、分解物が生じないとされている農薬が7種類あり、PTPWsの情報が報告されていたのは150種類の農薬であった。これらのうち、分解生成物がCO $ _{2} $ のみのような農薬5種類を除き、145種類の農薬について610種類のPTPWsを表(1)-1に示した。

根拠BおよびCに関する文献検索の結果、12,269報の論文がヒットした。ヒットしたすべての論文タイトルを調査し、水環境中で起こることが演繰的に推定できない人工的あるいは生物的な触媒を必要とする反応、系外から酸化剤などの反応試薬・反応基質を添加している反応を議論していると判断された論文を除き、5,791報の論文アブストラクトを取得した。除外された論文の多くは、光触媒分解やマウスなどの生物による代謝を議論している論文であった。

得られた5,791報の論文アブストラクトおよび下記の105報の論文を調査した結果、PTPWsを同定している論文22報を発見し、入手・調査した。この22報の論文に基づき、根拠BのPTPWsを取りまとめた。また、2冊の書籍より根拠Bの論文2報、根拠Cの論文2報を発見し、PTPWsを取りまとめた。なお、質量分析計を用いてPTPWsを同定している文献として採用したのは、分離カラムにおけるリテンションタイムが標準物質と一致し、かつEIやCIDによるフラグメンテーションパターンが標準物質と一致していることを確認している文献に限定した。以上のように調査した根拠Bに基づくPTPWsを取りまとめ、表(1)-2に示す。

前述の5,791報のアブストラクトに基づき、環境水中濃度モニタリングなど、PTPWsの定量分析を行っていると推測された73報の論文を入手した。その73報の論文を調査し、記載されていたPTPWsがPTPWsであることの根拠論文を玄孫引きまで調査し、105報の論文を入手した。その105報の論文を調査した結果、PTPWsの同定結果を確認できなかった論文が73報中12報あった。この12報の論文に基づいて根拠Cに基づくPTPWsを取りまとめ、表(1)-3に示す。

根拠Bに基づくPTPWsについては、調査した32種類の農薬のうち10種類の農薬について51種類のPTPWsが同定されていた。根拠Cに基づくPTPWについては、根拠BのPTPWsとの重複を除いて、
表(1)-1 根拠Aに基づく農薬環境変化体の調査結果（つづき）

Pesticide	CAS RN	PTPW (CASRN)
lufenuron	103055-07-8	2,5-dichloro-4-(1,1,2,3,3-3-hexafluoropropoxy)phenylurea (705279-76-1)
mandipropumid	374726-62-2	2,6-difluorobenzamide (18063-03-1)
mefenacet	73250-68-7	2,4-dichlorophenyl)-5-ethoxy-N-(1,2-(3-methoxy-4-propa-2-nyloxyphenyl)ethyl)acetamide (282720-26-7)
metenopron	13590-91-9	1-2-dichlorophenyl)-5-ethoxycarbonyl)-4-carboxylic acid (1254310-00-3)
mesotrone	55814-41-0	1-hydroxy-3-oxo-2-(3-isopropoxyphenyl)isointolone (76964-37-9)
metatofluzone	104206-82-8	2-methanesulfonyl-4-nitrobenzoic acid (11094-79-9)
metafluzone	139968-49-3	5-hydroxy-2-4-methansulfonyl-2-nitrobenzoyl)cyclhexane-1,3-dione (393085-46-7)
metahidopto	125116-23-6	p-[n-(trifluoromethyl)phenacyl)lufenonarrile (146653-56-7)
methiocarb	2032-65-7	4-cyanobenzaldehyde (105-07-7)
methoxifenozide	57837-19-1	D-2-(2,6-dimethylphenyl)-2-(methoxycarbyl)amino)propanoic acid (87764-37-2)
metadoxyl and mefenoxam	10265-92-6	3,2-triazole (288-88-0)
methadopto	125116-23-6	dimethyldisulfide (624-92-0)
methoxycenozide	161050-58-4	3-N-tert-butyl-N-(3-methoxy-2-methoxy)benzoyl)hydraznocarbonyl-5-methylbenzoic acid (-)
metolachlor	51218-45-2	N-(2-ethyl-6-methylphenyl)-2-hydroxy-N-(2-methoxy-1-methylethyl)acetamide (131068-72-9)
metonitrostron	133408-50-1	N-(2-ethyl-6-methylphenyl)-2-hydroxy-N-(2-methoxy)phenacyl)tacetamide (-)
milhement	51596-10-2	N-methylpoxoamoylo-2-phenoxyamine (-)
oryastrobin	5196-10-2	N-methylpoxo-2-phenoxyphenyl)acetamide (133409-58-2)
oxadiazone	27314-13-2	3,7,19-dioxetarectacyclo[15,6,1,1°(p32°)]pentacosa-2(10,14,12,22-pentamethyl-3,7,19-d
表(1)-1 根拠Aに基づく農薬環境変化体の調査結果（つづき）

Pesticide	CAS RN	PTPW (CASRN)	<nl>
表(1)-3 根拠Cに基づく農薬環境変化体の調査結果

Pesticide	CASRN	PTPW	Ref.	PTPW	Ref.	PTPW	Ref.
bentazone-sodium, bentazone	25057-89.0	8-hydroxybentazone (60374-43-8)	28, 29
BPPS	2312-35-8	NIA
captan	133-06-2	NIA
carbam	144-54-7	NIA
carban-sodium	144-54-7	NIA
carbap	15263-52-2	NIA
chalkoprecin	76-06-2	NIA
dazomet	533-74-4	NIA
DCMU	330-54-1	NIA
D-D	542-75-6	cis-3-chloropropenolic acid (1609-93-4)	30	trans-3-chloropropenolic acid (2345-61-1)	30	3-hydroxyacrylic acid (-)	30
DDVP	62-73-7	NIA
DEP	52-68-6	NIA
dazmon	333-41-5	NIA
DMTP	950-37-8	NIA
ethylthiomethion	298-04-4	NIA
fosthiazate	98886-44-3	NIA
glyphosate, ammonium salt	1071-83-6	methylaminomethylphosphonic acid (MAMPA) (35404-71-8)	31	methylphosphonic (MPA) acids (999-13-5)	31	glycine (56-40-6)	32
glyphosate, isopropylamine salt	1071-83-6	NIA
isothycyanate methyl	556-61-6	NIA
isoxathion	18854-01-8	NIA
malathion	121-75-5	malaxon (1634-78-2)	33, 34	diethyl maleate (141-05-9)	33, 34	diethyl fumarate (623-91-6)	33, 34
diethylmethylsulfonyl succinate (-)	33, 34	phosphorothioic O,O,S-trimethyl ester (152-20-5)	34	2-hydroxy-3-thionyl-2-butene-diethylster (-)	34
tartaric acid diethyl (57968-71-5)	34	diethyl malate (7554-12-3)	34, 35	O,O,S-trimethylthiophosphonic acid (2953-29-9)	34
maneb	12427-38-2	NIA
manzeb	8018-01-7	NIA
MEP	122-14-5	NIA
polycarbamate	64440-88-6	ethylmethaourea (96-45-7)	36
propene	12071-83-9	NIA
pyridaphenthion	119-12-0	NIA
thophanate methyl	23564-05-8	2-aminobenzimidazole (934-32-7)	37	carbendazim (10605-21-7)	37
thiram	137-26-8	NIA
tolcofos methyl	57018-04-9	NIA
TPN	1897-45-6	NIA
zineb	12122-67-7	NIA
NIA: no information available

表(1)-4に、MFPを表(1)-5にまとめて示す。本研究でPTPWsのみを検討して親農薬を検討していない場合がある。そのような場合には、親農薬の試験結果について、表(1)-4と表(1)-5に著者らの以前の結果をあわせて示した。変異原性に関しては、etofenproxのPTPWである2-(4-ethoxyphenyl)-2-methyl-1-propanol、iprobenfosのPTPWsである2-hydroxybenzyl alcoholが陽性であった。MFPに関しては、4種類の農薬、35種類のPTPWsが陽性であった。これらのことから、農薬もPTPWsも、塩素処理を受けることにより変異原性物質を生成する場合があることが示された。とくにPTPWsについては、試験した63物質中35物質（56%）が塩素処理により変異原性が陰性から陽性に転じ、塩素処理前に陽性であった2物質は塩素処理後も陽性であった。

親農薬のMFPの分布を図(1)-2に、PTPWsのMFPの分布を図(1)-3に示す。図(1)-2および図(1)-3の横軸は、各被検物質のMFPから同物質の変異原性（Mutagenic Activity: MA）を差し引いた値を示す。
表(1)-4 農薬およびPTPWsの変異原性測定結果（つづき）

Compound	Mutagenicity
Determined value (net rev./μmol)a	Averagea (net rev./μmol)	MR value (−)a	Resultb	Detection limit (net rev./μmol)	Dose (mg/plate)
glyphosate	-	-	-	N (2)	-	-
AMPA((aminomethyl)phosphonic acid)	(7.6)	(7.6)	(1.0-1.1)	N (3)	15	0.125-0.5
iprobenfos	(9.8)	(9.8)	(0.97)	N (1)	20	0.25-1
benzyl alcohol	-	-	-	N (3)	-	-
benzaldehyde	-	-	-	N (4)	-	-
2-hydroxybenzyl alcohol	9.3-12	11	1.6-1.8	P (3)	6.0-6.6	0.25-1
3-hydroxybenzyl alcohol	(3.0-3.3)	(3.1)	(0.84-1.3)	N (3)	6.0-6.6	0.25-1
isoprothiolane	(95-110)	(100)	(1.0-1.1)	N (3)	190-220	0.125-0.5
isoxathion	(67)	(67)	(1.3)	N (1)	130	0.0375-0.15
isoxathion oxon	(18-19)	(19)	(1.2-1.4)	N (3)	36-39	0.125-0.5
malathon	(7.6)	(7.6)	(1.1)	N (1)	15	0.25-1
malaoxon	-	-	-	N (3)	-	-
diethyl maleate	(6.5)	(6.5)	(0.88-1.0)	N (3)	13	0.25-1
diethyl fumarate	(6.4)	(6.4)	(0.94)	N (2)	13	0.25-1
D-tartaric acid diethyl	(7.6-8.2)	(8.0)	(1.0-1.2)	N (3)	15-16	0.25-1
L-tartaric acid diethyl	(7.8-8.2)	(8.1)	(0.98-1.2)	N (3)	16	0.25-1
mefenacet	-	-	-	-	-	-
2(3H)-benzothiazolone	(3.7-4.0)	(3.8)	(0.87-1.1)	N (3)	7.3-8.0	0.25-1
2-aminothiophenol	-	-	-	N (4)	-	-
N-methylbenzenamine	-	-	-	N (2)	-	-
mepronil	(9.2)	(9.2)	(0.94)	N (1)	21	0.25-1
2-methylbenzoic acid	(2.4-3.6)	(2.8)	(0.94-1.1)	N (3)	4.8-7.2	0.25-1
methyl dymron	(22-25)	(23)	(1.1-1.2)	N (3)	44-51	0.125-0.5
pencycron	(820-1200)	(940)	(1.1-1.4)	N (3)	1600-2400	0.0025-0.01
phenylurea	(2.4-3.6)	(2.8)	(1.1-1.3)	N (3)	4.8-7.2	0.025-1
pendimethalin	(230-370)	(320)	(1.0-1.2)	N (3)	460-730	0.009375-0.0375
polycarbamate	(140-150)	(150)	(0.91-1.0)	N (3)	280-310	0.025-0.1
ethylenethiourea	(4.1)	(4.1)	(1.0)	N (1)	8.3	0.25-1
pyributicarb	(1600-2400)	(2100)	(1.1-1.4)	N (3)	3300-4800	0.00125-0.005
3-tert-butylphenol	(53-66)	(62)	(1.0-1.3)	N (3)	110-130	0.0125-0.05
pyriproxyfen	(800-1200)	(920)	(1.0-1.4)	N (3)	1600-2300	0.0025-0.01
4-phenoxyphenol	(66-82)	(77)	(1.2-1.3)	N (3)	130-160	0.0125-0.05
thiobencarb	(4.9)	(4.9)	(0.84)	N (1)	9.8	0.25-1
4-chlorobenzyl alcohol	-	-	-	N (1)	-	-
4-chlorobenzaldehyde	-	-	-	N (2)	-	-
4-chlorobenzoic acid	-	-	-	N (6)	-	-
thiophanate methyl	-	-	-	P (1), N (2)	-	-
carbendazim	-	-	-	N (9)	-	-
2-aminobenzimidazole	(4.8)	(4.8)	(0.93-1.0)	N (3)	10	0.25-1
tolclofos-methyl	(410-470)	(430)	(1.1)	N (3)	820-950	0.0075-0.03
tolclofos-methyl oxon	(23-27)	(25)	(1.1-1.2)	N (3)	47-54	0.125-0.5
p-cresol	-	-	-	N (1)	-	-
TPN	(320-350)	(330)	(0.96-1.3)	N (3)	650-700	0.005-0.02
isophthalonitrile	-	-	-	N (3)	-	-

してしている。両者に差が無いと考えられることから、両者のパーセンタイルプロットを行ったところ、図(1)-4に示すように、両者のプロットがほぼ一致した。一般的に、農薬は水環境中で変化体に変化すると毒性が低下すると考えられるが、エンドポイントをMFPにして郡全体同士で比較すると、毒性は変化しないことが明らかになった。

そこで、次に、親農薬からPTPWsへの変化に伴うMFPの変化を物質毎に検討した。これまでの研究とあわせて、PTPWsのMFPとその親農薬のMFPの両方を測定したのは48組であった。PTPWsのMFPをaとし、その親農薬のMFPをbとして、aをbで除した値をモル基準で比較すると、図(1)-5に示すように0.010～38倍の範囲で分布していた。その中で、比率が最も高かったのは
図(1)-2 農薬の MFP の分布

図(1)-3 PTPWsのMFPの分布

図(1)-4 農薬と PTPWs の MFP 分布の比較

図(1)-5 PTPWsへの変化による MFP の変化

薬であるDCPの水溶液を塩素処理した際に生成する変異原性物質を探索した。DCP塩素処理物をESIおよびAPCIでイオン化したところ、ポジティブイオンモードおよびネガティブイオンモードのいずれのイオン化モードにおいても塩素処理生成物のピークと考えられるピークが得られなかった。このため、イオン化されにくいケトンやアルデヒドなどのカルボニル化合物の生成を予測し、
図(1)-6 DCP塩素処理-DNPH誘導体化サンプルのLC/MS測定結果

図(1)-7 DCP塩素処理-DNPH誘導体化サンプル中に含まれるイオンの分子式決定例

DNPHで誘導体化したDCP塩素処理サンプル（以下、①サンプル）中に含まれる物質をLC/MSにより分析した。その結果、図(1)-6に示すように明確なピークが得られたため、この全イオン電流クロマトグラムを解析した。解析する際、DCPが有機塩素化合物であること、DCPを塩素処理していることから、有機塩素化合物のみを対象とした。その結果、LCカラム保持時間が異なる8物質が塩素化合物のイオンとして発見された。8物質のうち、2物質は精密質量が同一であったため、異性体の可能性がある。発見されたイオンの分子式は、DCPおよびDNPHの化学構造に基づき、構成元素をC、H、O、NおよびClと仮定して推定した。さらに、同位体パターン分析を行い、図(1)-7に例を示すように、分解能154,000～181,000、質量誤差0.063～0.805 ppmの精度において6つの分子式を決定した。また、MS²およびMS³分析による各物質の構造を解析したところ、すべての物質がDNPH誘導体であることが示唆された。決定された分子式から、DCPとDNPHの化学構造に基づいてそれらのイオンの化学構造を推定したところ、互変異性体を含めて18種類の構造が推定された。推定された18物質の中で試薬の購入が可能だったのは、質量電荷比m/z 304.9850を有するイオンから推定された1,3-DCAのみであった。1,3-DCAの変異原性は、TA100株を用いた代謝活性剤非存在下の条件において陽性であることが報告されている。本研究において1,3-DCAの比活性を評価したところ
図(1)-8 1,3-DCAとDCP塩素処理物の変異原性（○：1,3-DCA、△：DCP塩素処理物）

図(1)-9 1,3-DCA-DNPH誘導体化物の $ ^{1} $ H-NMR測定結果

ろ、図(1)-8に示すように160,000 net rev./μmolであった。この値は、Ames試験の陽性対照物質として用いられる4-nitroquinoline 1-oxideの10分の1程度と高い値であった。そこで、1,3-DCAが①サンプル中に含まれているか否かを検討した。

検討に先立ち、購入した1,3-DCAの試薬をDNPHで誘導体化し、誘導体化物の合成と精製を $ ^{1} $ H-NMRにて確認した。その結果、図(1)-9に示すように、誘導体化物の合成と精製が確認された。そこで、合成した誘導体化物を標準物質して用いて、①サンプル中に1,3-DCAが含まれているか否かを検討した。その結果、図(1)-10に示すように、LCの保持時間が合成した標準物と①サンプル中のm/z 304.9850を有するイオンで一致し、さらにMSスペクトルが一致した。また、linear ion trapに
図(1)-10 1,3-DCA-DNPH誘導体化物とDCP塩素処理-DNPH誘導体化サンプル中のm/z 304.9850のLCカラム保持時間とMSスペクトル（上：1,3-DCA-DNPH誘導体化物、下：DCP塩素処理-DNPH誘導体化サンプル）
図(1)-11 1,3-DCA-DNPH誘導体化物とDCP塩素処理-DNPH誘導体化サンプル中のm/z 304.9850のMS²プロダクトイオンスペクトル

よる衝突誘起解離を用いた$\mathrm{LC/MS^{2}}$分析を行った結果、図(1)-11に示すように、$m/z\ 170.9963,\ 240.0174,\ 269.0076$のイオンが一致した。それらのイオンを帰属した結果、すべてのイオンは1,3-DCA-DNPH誘導体化物として帰属することができた。これらの結果から、①サンプル中の$m/z\ 304.9850$を有するイオンは1,3-DCA-DNPH誘導体化物と結論づけられた。そこで、DCAから1,3-DCAの生成反応経路を考察した結果、1,3-DCAが生成し得ることを確認した。

次に、①サンプル中の1,3-DCAを定量したところ、DCP塩素処理時の収率が3.8%であった。1,3-DCAの濃度が明らかになったため、①サンプルの変異原性強度に対する1,3-DCAの変異原性の寄与率を求めた結果、110%となった。このことから、DCP塩素処理サンプル中の主要な変異原は1,3-DCAと結論づけることができる。なお、寄与率が100%を超えたのは、主に変異原性試験の誤差に起因すると考えられる。

発見された1,3-DCAが実河川水中においても生成することを確認するために、実河川水中で塩素処理したDCPサンプル中に含まれる物質をLC/MSを用いて探索した。測定前にサンプル中の被検物質をDNPHで誘導体化した。1,3-DCAのDNPH誘導体のexact massを算出し、算出結果に基づいて抽出イオンクロマトグラムを描いた。その結果、図(1)-12に示すように、純水中でDCPを塩素処理した際に生成した1,3-DCAの他に、カラム保持時間の異なる異性体AおよびC（カラム保持時間の早い順にA、BおよびC）が生成していることが確認された。また、異性体Aおよび1,3-DCA（異性体B）の生成量が減少し、異性体Cの生成量が増加していることが明らかになった。

そこで、最もピークが大きかった異性体Cを同定するために、購入可能であった異性体である
図(1)-12 (E)-1,3-dichloropropene塩素処理物DNPH誘導体化物中の $ C_{9}H_{7}N_{4}O_{4}Cl_{2} $ （上：純水中での塩素処理、下：河川水中での塩素処理）

図(1)-13 C₉H₇N₄O₄Cl₂の構造異性体のMSクロマトグラム（上：純水中での塩素処理、中：1,1-dichroloacetone誘導体、下：3-chloropropinyl chloride誘導体）
1,1-DCAと3-CPCをDNPHで誘導体化して同様に測定した。その結果、3-CPCは検出されなかった。また、図(1)-13に示すように、異性体Cのカラム保持時間は1,1-DCAのカラム保持時間とは異なり、異なる物質であることが明らかとなった。次に、異性体Cを単離してNMRで構造を推定することを試みた。しかし、アセトンと異性体Cの分離が困難であり、NMRを測定することができなかった。純水中で塩素処理した場合と実河川水中で塩素処理した場合で、各生成物の選択率が大きく異なる結果が得られた理由の詳細は不明であるが、実河川水中の微細な懸濁物質の表面における反応の寄与が考えられる。

なお、本研究における塩素処理は、浄水場における塩素処理条件を考慮せずに行った。今後、本研究により発見された物質の浄水中における存在確認や浄水処理性を検討する必要がある。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

農薬をはじめとする化学物質の環境リスク評価を行う際に、その環境変化体までを含めたリスクを対象にすることは、環境リスク評価の研究分野において最もホットな話題のひとつであり、基本的な評価の考え方やツールの開発が検討課題に挙がっている。そのような科学的・社会的ニーズに基づき、本研究では、農薬からどのような環境変化体が生成し得るのかを検討した。同時に、未同定の環境変化体が多く存在する可能性を指摘した。また、農薬やその環境変化体が浄水処理場で塩素処理を受けた際に、毒性の一種である変異原性を発現し得ることを示し、そのような物質が水道水中に存在するか否かを調査すること、その物質の発がん性を評価することの必要性を示した。同時に、親農薬より環境変化体の方が変異原性物質生成能(Mutagen Formation Potential: MFP)の比活性が高い物質が存在することを示した。一般的に、農薬は環境水中で速やかに分解して毒性が低減すると考えられているが、エンドポイントをMFPにした場合、毒性が上昇する物質が存在することが示された。さらに、モデル農薬として検討した2011農薬年度における使用量が最大であった土壌燻蒸剤D-D ((E)-1,3-dichloropropene)の塩素処理サンプルから強変異原性物質である1,3-dichloroacetoneが生成すること見いだした。この際、近年のLC/MSの技術的進歩を利用した、unknown exploringとも呼ぶべき新たな技術を構築し、環境サンプルのような複雑なマトリックス中に含まれる未知・微量な有害汚染物質の探索・同定技術に道を開いた。unknown exploringは、今後益々多様化していくと考えられる環境汚染物質について、とくに非意図的に生成する未知汚染物質や曝露された既知汚染物質の体内における未知代謝物の探索・同定に寄与すると考えられる。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載する事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

農薬取締法第3条第1項において、農薬の使用による水質汚濁が原因となり、人畜に被害が生ずるおそれがあるときは、環境大臣は当該農薬の登録を保留することとなっている。同法では、
環境経由の農薬の悪影響を律しているため、本研究の成果が検討されることが期待される。

また、化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律（化審法）の優先評価化学物質や、特定化学物質の環境中への排出量の把握等および管理の改善の促進に関する法律（化管法）の特定化学物質については、法の定めあるいは自主的取組による環境リスク評価の実施が求められている。この中で、環境中での分解を含めたリスク評価が求められており、本研究の成果が検討されることが期待される。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) H. TAKANASHI, K. ABIRU, H. TANAKA, M. KISHIDA, T. NAKAJIMA, A. OHKI, T. KONDO, T. KAMEYA and T. MATSUSHITA: Journal of Water and Environment Technology, 10(4), 437-447 (2012)

“Production of Chloro-5-Hydroxy-2-Nitrobenzoic Acid through Chlorination of 3-Methyl-4-Nitrophenol, a Typical Hydrolysate of Fenitrothion”

2) H. TAKANASHI, M. KISHIDA, K. ABIRU, T. KONDO, T. KAMEYA, T. MATSUSHITA, T. NAKAJIMA and A. OHKI: Journal of Water Supply: Research and Technology - Aqua, 62(1), 14-22 (2013)

“A screening Study on the Mutagen Formation Potential of 44 Pesticides”

3) 高梨啓和、浜崎賢太、加藤雄介、中島常憲、大木章、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：水環境学会誌、36(2), 29-38 (2013)

「水環境中で生成する農薬変化体の文献研究」

4) H. TAKANASHI, T. HAMA, T. NAKAJIMA, A. OHKI, T. KONDO, T. KAMEYA and T. MATSUSHITA: Journal of Water and Environment Technology, 12(1) (2014)

"A screening study of mutagen formation potential (MFP) of pesticide transformation products in water environments (PTPWs) to investigate the MFP changes from their parent pesticides through transformations"

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) 高梨啓和、亀屋隆志:環境科学会誌、25(6)、445-447(2012)

「農薬分解物の安全性,環境中濃度,浄水処理性～農薬分解物の環境安全管理を目指して～」

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 高梨啓和、加藤雄介、浜崎賢太、中島常憲、大木章、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：平成23年度日本水環境学会九州支部研究発表会(2011)
「農薬分解物の変異原性および変異原性物質生成能の調査」

2) 田中華子、阿比留和也、高梨啓和、中島常憲、大木章、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：平成23年度日本水環境学会九州支部研究発表会(2011)

「農薬分解物塩素処理サンプル中の変異原性物質の探索」

3) 阿比留和也、田中華子、高梨啓和、中島常憲、大木章、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：第46回日本水環境学会年会(2011)

「精密質量分析による農薬塩素処理物中の変異原性物質の探索」

4) 加藤雄介、浜崎賢太、高梨啓和、中島常憲、大木章、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：第46回日本水環境学会年会(2011)

「農薬分解物の変異原性物質生成能の調査」

5) H. TAKANASHI, K. ABIRU, H. TANAKA, M. KISHIDA, T. NAKAJIMA, A. OHKI, T. KONDO, T. KAMEYA and T. MATSUSHITA: Proceedings of 10 $ ^{th} $ China-Japan Water Environment Symposium-Water Reclamation, Remediation and Restoration towards a Greener Asia-, Shenzhen (2012)

“Accurate Mass Analysis of Chlorination By-Products of Fenitrothion”

6) H. TAKANASHI, K. ABIRU, H. TANAKA, M. KISHIDA, T. NAKAJIMA, A. OHKI, T. KONDO, T. KAMEYA and T. MATSUSHITA: Proceedings of the Water and Environment Technology Conference 2012, Tokyo (2012)

“Production of Chloro-5-Hydroxy-2-Nitrobenzoic Acid through Chlorination of 3-Methyl-4-Nitrophenol, a Typical Hydrolysate of Fenitrothion”

7) 高梨啓和、阿比留和也、田中華子、中島常憲、大木章、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：環境科学シンポジウム2012、横浜市（2012）

「フェニトロチオン等を塩素処理した際の副生物の探索」

8) H. TAKANASHI, K. ABIRU, M. KISHIDA, T. NAKAJIMA, A. OHKI, T. MATSUSHITA and T. KAMEYA: Proceedings of the IWA World Water Congress & Exhibition, Busan Korea (2012) "Qualitative analysis of chlorination byproducts of organophosphorus pesticide fenitrothion"

9) H. TAKANASHI, K. ABIRU, H. TANAKA, M. KISHIDA, T. NAKAJIMA, A. OHKI, T. KONDO, T. KAMEYA and T. MATSUSHITA: Proceedings of SETAC Asia/Pacific 2012 Annual Meeting, Kumamoto (2012)

“Production of Chlorophenols through Chlorination of 3-Methyl-4-Nitrophenol, a Typical Hydrolysate of Fenitrothion”

10）高梨啓和、阿比留和也、田中華子、中島常憲、大木章、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：第15回日本水環境学会シンポジウム、大阪市（2012）

「精密質量分析による農薬変化体の探索」

11）高梨啓和：日本分析化学会・機器分析ワークショップ、北九州（2012）

「精密質量分析に基づいた農薬変化体の探索～フェニトロチオン等を塩素処理した際の副生成物について～」

12）高梨啓和：日本分析化学会・機器分析ワークショップ、鹿児島 (2012)

「精密質量分析に基づいた農薬変化体の探索～フェニトロチオン等を塩素処理した際の副生
成物について～」

13）高梨啓和、濱美紗希、西山舞、阿比留和也、中島常憲、大木章、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：平成24年度日本水環境学会九州支部研究発表会、北九州市（2013）

「精密質量分析と天然同位体パターン分析によるフェニトロチオン光分解物質の探索」

14）阿比留和也、田中華子、高梨啓和、中島常憲、大木章、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：平成24年度日本水環境学会九州支部研究発表会、北九州市（2013）

「塩素処理による土壌燻蒸剤1,3-ジクロロプロペンからの1,3-ジクロロアセトンの生成」

15）田中華子、阿比留和也、高梨啓和、中島常憲、大木章、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：平成24年度日本水環境学会九州支部研究発表会、北九州市（2013）

「精密質量分析による3-メチル-4-ニトロフェノール塩素処理物中の変異原探索」

16）高梨啓和、迫田健志、浜知広、中島常憲、大木章、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：第47回日本水環境学会年会、大阪市（2013）

「農薬分解物の変異原性物質生成」

17）濱美紗希、西山舞、阿比留和也、高梨啓和、中島常憲、大木章、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：第47回日本水環境学会年会、大阪市（2013）

「精密質量分析によるフェニトロチオン光分解物質の探索」

18）田中華子、阿比留和也、高梨啓和、中島常憲、大木章、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：第47回日本水環境学会年会、大阪市（2013）

「精密質量分析による3-メチル-4-ニトロフェノール塩素処理物中の変異原性物質の探索」

19）阿比留和也、田中華子、高梨啓和、中島常憲、大木章、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：第47回日本水環境学会年会、大阪市（2013）

「精密質量分析に基づく1,3-ジクロロプロペン塩素処理副生成物の探索」

20）高梨啓和：日本分析化学会・機器分析ワークショップ、大分市（2013）

「水道水源保全を指向した農薬取締法改定のための根拠データの取得～質量分析計の基礎から未知物質の構造推定まで～」

21）高梨啓和：日本分析化学会・機器分析ワークショップ、北九州市（2013）

「水道水源保全を指向した農薬取締法改定のための根拠データの取得～質量分析計の基礎から未知物質の構造推定まで～」

22) H. TAKANASHI, T. HAMA, T. NAKAJIMA, A. OHKI, T. KONDO, T. KAMEYA and T. MATSUSHITA: Proceedings of the Water and Environment Technology Conference 2013 (2013) "A screening study of mutagen formation potential (MFP) of pesticide transformation products in water environments (PTPWs) to investigate the MFP changes from their parent pesticides through transformations"

23) H. TAKANASHI, M. Hama, M. Nishiyama, K. Abiru, M. Kishida, T. Nakajima, A. Ohki, T. Ueda, T. Kondo, T. Kameya and T. Matsushita: Proceedings of the 5th IWA-ASPIRE Conference & Exhibition, Daejeon, Korea (2013)

“Exploring Photodegradation Products of Organophosphorus Pesticide Fenitrothion by LC/MS”

24）高梨啓和、有島由紀子、濱美紗希、中島常憲、大木章、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：環境科学会2013年会（2013）
「LC/MSを用いた農薬変化体の探索」

25）高梨啓和、中島常憲、大木章、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：環境科学会2013年会（2013）「LC-MSを用いたunknown screeningによる土壌燻蒸剤D-D塩素処理物中の変異原の探索」

26）高梨啓和、濱美紗希、有島由紀子、宮崎菜月、中島常憲、大木章、上田岳彦、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：第16回日本水環境学会シンポジウム（2013）

「LC/MSを用いた農薬変化体（PTPWs）のunknown screening）」

27）高梨啓和、田中華子、糸満桃子、松崎直樹、中島常憲、大木章、上田岳彦、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：第16回日本水環境学会シンポジウム（2013）

「LC/MSを用いた農薬変化体（PTPWs）塩素処理物中の変異原の探索」

28）高梨啓和：日本分析化学会機器分析ワークショップ、久留米市（2013）

「農薬塩素処理サンプルからの変異原性物質の探索・同定～質量分析計の基礎から未知物質の構造推定まで～」

29）高梨啓和：日本分析化学会機器分析ワークショップ、熊本市（2013）

「農薬塩素処理サンプルからの変異原性物質の探索・同定～質量分析計の基礎から未知物質の構造推定まで～」

30）高梨啓和：一般財団法人化学物質評価研究機構講演会、久留米市（2013）

「LC-Linear Ion trap-Kingdon trapハイブリッドMSを用いたunknown screeningによる農薬塩素処理サンプルからの変異原性物質の探索・同定」

31) H. TAKANASHI: The Japan Science and Technology Agency (JST)/The Chinese Academy of Sciences (CAS) Joint Symposium on Sustainable Social System, Xiamen China, (2014) "Analysis of chlorination by-products using high-resolution LC/MS"

32）田中華子、糸満桃子、高梨啓和、中島常憲、大木章、上田岳彥、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「殺虫剤fenitrothionの環境変化体3-methyl-4-nitrophenol塩素処理副生成物の構造解析」

33）有島由紀子、濱美紗希、高梨啓和、中島常憲、大木章、上田岳彦、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「精密質量分析によるDiuron光分解物質の探索」

34）濱美紗希、宮崎菜月、高梨啓和、中島常憲、大木章、上田岳彦、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「精密質量解析および修飾反応解析にもとづくフェニトロチオン変化体の探索」

35）糸満桃子、松崎直樹、田中華子、高梨啓和、中島常憲、大木章、上田岳彦、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「LC-MSを用いた3-メチル-4-ニトロフェノール塩素処理試料中の変異原性物質の探索」

36）藤木健司、浜知広、高梨啓和、中島常憲、大木章、上田岳彦、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「農薬および農薬変化体の構造と変異原性物質生成能(MFP)との関係の検討」

37）松崎直樹、糸満桃子、田中華子、高梨啓和、中島常憲、大木章、上田岳彦、松下拓、近藤貴志、亀屋隆志：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「3-ヒドロキシベンジルアルコール塩素処理物中の変異原の探索」