Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
38）浜 知広、藤木健司、高梨啓和、中島常憲、大木 章、上田岳彦、松下 拓、近藤貴志、亀屋隆志：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「農薬変化体等の変異原性および変異原性物質生成能(MFP)の検討」

39）宮崎菜月、有島由紀子、濱美紗希、高梨啓和、中島常憲、大木章、上田岳彦、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「LC/MSによる農薬光照射サンプル中の未知変化体のスクリーニング」

40）浜知広、藤木健司、高梨啓和、中島常憲、大木章、上田岳彦、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「農薬変化体等の変異原性および変異原性物質生成能(MFP)の調査」

41）高梨啓和、宮崎菜月、有島由紀子、濱美紗希、中島常憲、大木章、上田岳彦、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「精密質量解析による農薬光照射サンプル中の未知変化体のスクリーニング」

42）田中華子、糸満桃子、高梨啓和、中島常憲、大木章、上田岳彦、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「殺虫剤fenitrothionの環境変化体3-methyl-4-nitrophenol塩素処理副生成物の構造推定」

43）濱美紗希、宮崎菜月、高梨啓和、中島常憲、大木章、上田岳彦、近藤貴志、亀屋隆志、松下拓：日本水環境学会九州支部研究発表会、霧島市（2014）

「精密質量解析および修飾反応解析によるフェニトロチオン変化体の探索」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

1) 農薬分解物の安全性、環境中濃度、浄水処理性～農薬分解物の環境安全管理を目指して～（2012年9月13日、横浜国立大学、観客20名程度）

2) 農薬変化体の環境安全管理を目指して（2013年9月4日、静岡県コンベンションアーツセンター、観客20名程度）

3) 国民と科学・技術対話、工学部における環境研究の実際（2011年7月19日、北九州市、観客12名）

4) 国民との科学・技術対話、10回実施、アンケート調査用紙159名分を回収・集計（集計結果を図(1)-14に示す。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。
図(1)-14 国民との科学・技術対話イベントの実施結果

## (6) その他

1) H. TAKANASHI: WET Excellent Presentation Award, Japan Society on Water Environment (2012)

“Production of chloro-5-hydroxy-2-nitrobenzoic acid through chlorination of 3-methyl-4-nitrophenol, a typical hydrolysate of fenitrothion Japan Society on Water Environment”

2) 阿比留和也：第47回日本水環境学会年会優秀発表賞（2013）

「農薬変化体等の変異原性および変異原性物質生成能(MFP)の調査」

3) H. TAKANASHI, T. HAMA, T. NAKAJIMA, A. OHKI, T. KONDO, T. KAMEYA and T. MATSUSHITA: WET Excellent Research Award, Japan Society on Water Environment (2013)

“A screening study of mutagen formation potential (MFP) of pesticide transformation products in water environments (PTPWs) to investigate the MFP changes from their parent pesticides through transformations”

4) 浜 知広、藤木健司、高梨啓和、中島常憲、大木 章、上田岳彦、松下 拓、近藤貴志、亀屋隆志：第48回日本水環境学会年会学生ポスター発表賞（2014）

「農薬変化体等の変異原性および変異原性物質生成能(MFP)の調査」

### 8 \. 引用文献

1) BOXALL, A.B.A. ed.: Handbook of environmental chemistry, Subseries 2, Springer-Verlag, Berlin, 249 pp. (2009)

“Transformation products of synthetic chemicals in the environment”

2) AIZAWA, H., ed.: Metabolic maps: Pesticides, environmentally relevant molecules and biologically active molecules, Academic Press, Tokyo, 330 pp (2009)

3) 労働省化学物質調査課編：新・微生物を用いる変異原性試験ガイドブック，187pp，中央労働災害防止協会，東京 (1986)

4) TAKANASHI, H., URANO, K., HIRATA, M., HANO T., and OHGAKI, S.: Water Research, 35, 7, 1627–1634 (2001)
“Method for measuring Mutagen Formation Potential (MFP) on chlorination as a new water quality index”

5) DEJONCKHEERE, W.P. and Kips, R.H.: Journal of Agricultural Food Chemistry, 22, 959–968 (1974) “Photodecomposition of Methidathion”

6) TSAO, R. and ETO, M.: Journal of Pesticide Science, 14, 47–51 (1989)

“Chemical and photochemical transformation of the insecticide cartap hydrochloride into nereistoxin”

7) DURAND, G., BARCELÓ, D., ALBAIGES, J. and MANSOUR, M: Toxicology and Environmental Chemistry, 31, 55–62 (1991)

“On the photolysis of selected pesticides in the aquatic environment”

8) McCall, P.J.: Pesticide Science, 19, 235–242 (1987)

“Hydrolysis of 1,3-dichloropropene in dilute aqueous solution”

9) MINGXIN, G., SHARON, K.P., WEI, Z. and SCOTT, R.Y.: Journal of environmental quality, 33, 612–618 (2004)

“Effects of environmental factors on 1,3-dichloropropene hydrolysis in water and soil”

10) LIEBERMAN, M.T. and ALEXANDER, M.: Journal of Agricultural Food Chemistry., 31, 265–267 (1983)

"Microbial and nonenzymatic steps in the decomposition of dichlorvos (2,2-dichlorovinyl O,O-dimethyl phosphate)"

11) ZHANG, Q. and PEHKONEN, S., O.: Journal of Agricultural Food Chemistry, 47, 1760–1766 (1999)

“Oxidation of diazinon by aqueous chlorine: kinetics, mechanisms, and product studies”

13) DEJONCKHEERE, W.P. and KIPS, R.H.: Journal of Agricultural Food Chemistry, 22, 959–968 (1974)

“Photodecomposition of Methidathion”

14) ZAMY, C., MAZELLIER, P. and LEGUBE, B.: Water Research, 38, 2305–2314 (2004) "Phototransformation of selected organophosphorus pesticides in dilute aqueous solutions"

15) BÖRJESSON, E., TORSTENSSON, L.: Journal of Chromatography A, 886, 207–216 (2000) "New methods for determination of glyphosate and (aminomethyl)phosphonic acid in water and soil"

16) DERBALAH, A.S.H., WAKATSUKI, H., YAMAZAKI, T. and SAKUGAWA, H.: Geochemical Journal., 38, 201–213 (2004)

“Photodegradation kinetics of fenitrothion in various aqueous media and its effect on steroid hormones biosynthesis”

17) MATSUSHITA, T., MATSUI, Y. and MATSUI, Y.: Chemosphere, 64, 144–151 (2006)
“Estimating mutagenic compounds generated during photolysis of fenitrothion—by HPLC fractionation followed by mutagenicity testing and high-resolution GC–MS analysis”

18) KORMALI, P., DIMOTICALI, D., TSIPI, D., HISKIA, A. and PAPACONSTANTINOU, E.: Applied Catalysis B: Environmental, 48, 175–183 (2004)

“Photolytic and photocatalytic decomposition of fenitrothion by $ PW_{12}O_{40}^{3-} $ and $ TiO_{2} $ : a comparative study”

19) BAROJA, O., UNCETA, N., SAMPEDRO, M.C., GOICOLEA, M.A. and BARRIO, R.J.: Journal of Chromatography A, 1059, 165–170 (2004)

"Optimization and validation of a method of analysis for fenitrothion and its main metabolites in forestry air samples using sorbent tubes with thermal desorption cold trap injection and gas chromatography–mass spectrometry"

20) BARCELÓ, D., DURAND, G., de BERTRAND, N. and ALBAIGÉS, J.: Science of the Total Environment, 132, 283–296 (1993)

“Determination of aquatic photodegradation products of selected pesticides by gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-mass spectrometry”

21) WEBER, J., KURKOVÁ, R., KLÁNOVÁ, J., KLÁN, P. and HALSALL, C.J.: Environmental Pollution, 157, 3308–3313 (2009)

“Photolytic degradation of methyl-parathion and fenitrothion in ice and water: Implications for cold environments”

22) LACORTE, S. and BARCELÓ, D.: Environmental Science & Technology, 28, 1159–1163 (1994) "Rapid degradation of fenitrothion in estuarine waters"

23) DURAND, G., MANSOUR, M. and BARCELÓ, D.: Analytica Chimica Acta, 262, 167–178 (1992)

“Identification and determination of fenitrothion photolysis products in water—methanol by gas chromatography—mass spectrometry”

24) SAKELLARIDES, T.M., SISKOS, M.G. and ALBANIS, T.A.: International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 83, 33–50 (2002)

“Photodegradation of selected organophosphorus insecticides under sunlight in different natural waters and soils”

25) CASTILLO, M., DOMINGUES, R., ALPENDURADA, M.F. and BARCELÓ, D.: Analytica Chimica Acta, 353, 133–142 (1997)

“Persistence of selected pesticides and their phenolic transformation products in natural waters using off-line liquid solid extraction followed by liquid chromatographic techniques”

26) OUBIÑA, A., FERRER, I., GASCÓN, J. and BARCELÓ, D.: Environmental Science & Technology, 30, 3551–3557 (1996)

“Disappearance of aerially applied fenitrothion in rice crop waters”

28) PEÑUELA, G., A. and BARCELÓ, D.: Journal of Chromatography A, 823, 81–90 (1998)
“Photodegradation and stability of chlorothalonil in water studied by solid-phase disk extraction, followed by gas chromatographic techniques”

30) LAGANÀ, A., BACALONI, A., LEVA, I.D., FABERI, A. and FAGO, G., MARINO, A.: Analytica Chimica Acta, 462, 187–198 (2002)

“Occurrence and determination of herbicides and their major transformation products in environmental waters”

31) CONNORS, T.F., STUART, J.D. and COPE, J.B.: The Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 44, 288–293 (1990)

“Chromatographic and mutagenic analysis of 1,2-dichloropropane and 1,3-dichloropropylene and their degradation products”

32) ZBIGNIEW, H.K., DOROTA, K.G., JÓZEF, D. and JERZY, L.: Journal of Chromatography A, 947, 129–141 (2002)

“Novel approach for the simultaneous analysis of glyphosate and its metabolites”

33) LUND-HØIE, K. and FRIESTAD, H.O.: The Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 36, 723–729 (1986)

“Photodegradation of the herbicide glyphosate in water”

34) KRALJ, M.B., TREBŠE, P. and ZUPANČIČ-KRALJ, L.: Chemosphere, 50, 595–601 (2003) "Investigations of the determination and transformations of diazinon and malathion under environmental conditions using gas chromatography coupled with a flame ionisation detector"

35) KRALJ, M.B., FRANKO, M. and TREBŠE, P.: Chemosphere, 67, 99–107 (2007)

“Photodegradation of organophosphorus insecticides – Investigations of products and their toxicity using gas chromatography–mass spectrometry and AChE-thermal lens spectrometric bioassay”

36) KRALJ, M.B., ČERNIGOJ, U., FRANKO, M. and TREBŠE, P.: Water Research, 41, 4504–4514 (2007)

“Comparison of photocatalysis and photolysis of malation, isomalation, malaoxon, and commercial malathion–Products and toxicity studies”

37) 巴山忠：福岡大学薬学集報、第8巻、84-99（2008）

「LC-MS/MS による環境負荷化学物質の分析に関する研究」

38) SANDAHL, M., MATHIASSON, L. and JÖNSSON, J., Å.: Journal of Chromatography A, 893, 123–131 (2000)

“Determination of thiophanate-methyl and its metabolites at trace level in spiked natural water using the supported liquid membrane extraction and the microporous membrane liquid–liquid extraction techniques combined on-line with high-performance liquid chromatography”
（２）農薬加水分解物の河川水中濃度モニタリング

横浜国立大学

大学院環境情報研究院環境リスクマネジメント専攻 環境管理学研究室 亀屋 隆志 <研究協力者>

横浜国立大学大学院環境情報研究院・産学連携研究員 近藤 貴志

平成23～25年度累計予算額：34,010千円

（うち、平成25年度予算額：11,696千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

農薬は、水田や畑、森林などに散布され、その除草、殺虫、殺菌、成長促進などの薬効を発揮した後には、自然的な作用によって速やかに分解されて環境中へ排出されないことが望ましいとされ、環境中での分解性が高く、すなわち残留性が低い農薬が開発されてきた。しかし、ここでいう分解性は、農薬分子の複雑な構造の一部が改変するだけの一次分解であり、無害な二酸化炭素や水にまで至る完全分解ではない場合が多く、その結果、農薬からの分解生成物が環境中に残存することになる。河川水等から検出される農薬の濃度は、最大でもppbオーダーと低いものだが、米国において河川水中の農薬および農薬分解物の濃度を測定した例では、分解物の方が138倍も高濃度で検出された報告もある。そこでサブテーマ2では、多数の農薬および農薬加水分解物の一斉分析方法を確立するとともに、それらの河川水中濃度の実態調査（モニタリング）を実施した。

その結果、親農薬37物質とその環境変化体（PTPWs）63物質について、河川水試料に対し共通の固相抽出と窒素バージ濃縮を施した後にGC/MSあるいはLC/MS/MSで一斉分析を行うための保持時間とイオン化モードおよび質量スペクトルに関する分析条件のデータベースを構築できた。この方法を用いて水道水源として利用される河川地点についての広域モニタリング調査、農耕期前後における農耕地近傍河川での集中モニタリング調査および都市河川の一般環境測定点での調査を計42地点311試料について実施した結果、環境変化体が親農薬の消失に伴って出現し、また時間とともに消失していくといった様子が観察され、また、農耕地および一般環境測定点や水道水源においても、親農薬に比べてPTPWsが高濃度で検出されるケースがかなりの割合で観測された。これらの結果より、環境中に排出された農薬にはそのPTPWsが河川水中に一定期間残存するものが多数あり、親農薬に比べてむしろPTPWsの方が高頻度・高濃度に検出される実態も明らかになったことから、新たな環境汚染物質としてのPTPWsの重要性を裏付けるデータが示された。

## [キーワード]

一斉分析、GC/MS、LC/MS/MS、環境モニタリング、河川水

### 1. はじめに

農薬は、水田や畑、森林などに散布され、その除草、殺虫、殺菌、成長促進などの薬効を発揮した後には、自然的な作用によって速やかに分解されて環境中へ排出されないことが望ましいと
され、環境中での分解性が高く、すなわち残留性が低い農薬が開発されてきた。しかし、ここでいう分解性は、農薬分子の複雑な構造の一部が改変するだけの一次分解であり、無害な二酸化炭素や水にまで至る完全分解ではない場合が多く、その結果、農薬の環境変化体（Pesticide Transformation Products in Water Environments: PTPWs）が水環境中に残存することになる。

河川水等から検出される農薬の濃度は、最大でもppbオーダーと低いものだが、米国において河川水中の農薬および農薬分解物の濃度を測定した例では、分解物の方が138倍も高濃度で検出された報告もある。わが国もおいても、有機塩素系殺虫剤のジクロロジフェニルトリクロロエタンやベンゼンヘキサクロリドが1971年の農薬取締法の改正施行に伴って農業用としての使用がすべて禁止になったが、使用禁止以降、これらの親農薬が水中や土壌中などの環境中で加水分解や光分解および微生物分解されて生成した環境変化体の残留が認められ、生態系への懸念されるようになった。例えば、ジクロロジフェニルトリクロロエタンの環境変化体の一つであるジクロロジフェニルジクロロエチレンは、環境中に長期間にわたって残留することが知られており、食物連鎖を通じた野生生物への影響が懸念されている $ ^{1} $ 。また、有機りん系農薬は、急性毒性であるアセチルコリンエステラーゼ活性障害や、慢性毒性である神経毒性が知られており、特に変化体であるオキソン体の方が親農薬（原体）に比べて数百〜一万倍程度にまで毒性が高まるとの報告もある。このため、有機りん系農薬のオキソン体には検査法が定められ、監視が行われている $ ^{2} $ 。

農薬およびその環境変化体等の安全性は、農薬登録時に確認されることになっており、農薬登録にあたって申請者から提出された申請書や各種試験データに基づき審査が行われる。試験には毒性試験や生体内等代謝試験などが行われ、毒性・水産動植物に対する影響に加え、生成する変化体の種類や残留性も審査内容に含まれている $ ^{3} $ 。しかしながら、これらの確認は農薬登録前に行う事前確認の制度であるため、物質の毒性情報や物理化学的性状等のハザード情報に基づき行われているものであり、実際に様々な農薬が水田や畑等で農薬が使用された後に、環境中へどのように排出され、どのような変化を受けてどのような環境変化体が生じ、それらが実環境中でどの程度残留しているのかについては情報が少ない。このため、化学物質の環境リスク評価の観点からみれば、様々な農薬およびその環境変化体の環境中での存在状況について懸念が残る状況となっている。

一方、水環境中には極めて多種の化学物質が存在すると考えられるが、ppbオーダーで存在する物質はほとんどない。それにも拘わらず、それら微量化学物質の存在が懸念される理由は、数多くの物質の中に特異的に毒性が高い物質が存在するからである。そのため、微量化学物質を低濃度まで精度良く効率的に分析することが必要となるが、近年は、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC/MS）法や液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC/MS/MS）法などの精度の高い微量分析技術が格段に進歩してきており、pptオーダーまでの高精度分析が可能となる物質も増えてきている。

## 2 ．研究開発目的

サブテーマ2では、農薬およびその環境変化体（PTPWs）の河川水中でのモニタリングデータを蓄積し、これらにより、水道原水となる河川水中での農薬の濃度は低いが、PTPWsの濃度は比較的高い場合があることを示し、PTPWsの水環境中でのモニタリングが重要であることを示すこととした。このため、多数の農薬およびその環境変化体を効率的にモニタリングするための一斉
分析方法を確立するとともに、その確立した方法を農耕地近傍の河川水や一般環境の河川水および水道水源として利用されている河川水モニタリングに適用して、農薬およびその環境変化体の河川水中濃度の実態調査を実施した。サブテーマ2における研究アプローチの概要を図(2)-1に示した。

一斉分析方法の確立においては、より多数の親農薬およびその環境変化体を効率よく分析できるようにすることを念頭におき、サンプリングした河川水試料に共通の前処理を施し、GC/MSあるいはLC/MS/MSで同時分析するための条件の確立を行うこととした。また、実態調査においては、農薬使用の多様性を鑑みて、茨城県から千葉県、神奈川県、山梨県まで関東地方の広域に亘る河川の調査を行うとともに、この地域において水道水源として利用されている河川水の調査や、春から夏にかけての農耕期における農耕地近傍での集中調査を行って、検出される農薬およびその環境変化体の種類、それらの出現と消長の様子、濃度レベル、親子での濃度比などを調べることとした。

図(2)-1 サブテーマ2における研究アプローチの概要

### 3. 研究開発方法

## （１）３-メチル-４-ニトロフェノール(３M4NP)の河川水モニタリングの先行調査

代表的な殺虫剤であるフェニトロチオン(MEP)の加水分解物3-メチル-4-ニトロフェノール(3M4NP)を例に、河川水モニタリングの先行調査を行った。この先行調査は、初年度に当たり、親子関係が明らかであり、使用量も多いフェニトロチオンとそのPTPWである3M4NPを対象して、複数の県にまたがる広域調査と場所と地点を絞った集中調査により、農薬とその環境変化体の検出についての時空間的な調査事例を蓄積し、一斉分析法の開発ならびにモニタリング実態調査の方法論の確立のモデルにしようとしたものである。

フェニトロチオン(MEP)は、代表的な有機リン酸エステル系殺虫剤であり、リン酸基が加水分解して水酸基(-OH)に置換され、主要な変化体である3M4NPが生成する（図(2)-2）。神奈川県内の農耕地におけるMEPの使用量は平成17農薬年度で約3トンと推定され、その主な適用作物はみかん、
水稻、なし、すいかなどとなっている。他県においても水稻や果樹、その他ゴルフ場や森林、家庭園芸などでも広く使用されていることに留意し、サンプリング地点としては、関東近郊の神奈川県、千葉県、山梨県を選んだ。フェニトロチオンの分解の程度の違いによる影響も加味できるように、各県が設置している公共水域の環境測定点39地点と、農耕地の発生源近傍4地点を選んだ。また、環境測定点では季節サンプリングを、発生源となる農耕地近傍にいては、春から夏の農耕期に週2回程度の集中サンプリングを実施した。

MEP

3M4NP

図(2)-2 先行調査対象のフェニトロチオン(MEP)と3-メチル-4-ニトロフェノール(3M4NP)

## （２）農薬加水分解物等の一斉分析に必要な分析条件の検討とデータベースの整備

水道法、特定化学物質の環境への排出量の把握等及び管理の改善の促進に関する法律（化管法）等において規制対象となる農薬を対象に継続的な文献調査を行って新たな農薬およびそのPTPWsを探索・整理し、一斉分析対象物質のデータベース化を図った。

親子関係が明らかになった対象物質について、汎用性の高い四重極型ガスクロマトグラフ質量分析装置GC/MS（島津製作所、GCMS-QP2010 plus）およびトリプル四重極型高速液体クロマトグラフ質量分析装置LC/MS/MS（サーモサイエンティフィック、TSQ Quantum Access MAX）を用いた農薬およびPTPWsの一斉分析について検討を行った。それぞれ適用可能な分析機器において、クロマトグラム保持時間、イオン化モードや定性イオンと定量イオンの質量スペクトル、検量線データを実験により取得して、一斉質量分析データベースの整備を行った。そのうえで、対象とした親農薬およびその環境変化体（PTPWs）について、河川水中の共存物質によるマトリクス効果の実態把握と改善を図るとともに、固相抽出から機器分析に至るまでの回収率や分析感度、定量下限などの精査を行った。

## （３）農薬およびPTPWsの河川水モニタリング

高性能の吸着樹脂および活性炭を用いた固相抽出カートリッジ（Sep-Pak PS-2およびSep-Pak AC-2、いずれも日本ウォーターズ）からアセトン溶出ならびに窒素パージ濃縮を行う共通の前処理法について、水試料からの回収率の確認を行った。この前処理法と上記の一斉分析法を用いて、アドバイザリーボード会合での指摘などに基づき、水道原水となる河川水域を主たる調査対象として、農薬使用の異なる地域の広がりや季節変化をみるための広域モニタリングと、農耕期における分解による親子比の変化をみるための集中モニタリングを実施した。河川水をサンプリングし、前処理と濃縮を行って分析測定を行い、検出頻度や検出レベル、親子比の把握を行った。農
薬およびその環境変化体の一斉分析の一連の流れを図(2)-3に示した。

## 1 ）試料水の調製

## a 試料水のサンプリングとろ過、保存

モニタリング地点においてサンプリングした河川水試料を10Lポリタンクに入れて研究室に搬送した。この際、川幅の大きい河川においては河川の流れの中央部から試料水を採水し、枝や葉など大きな固形物が出来るだけ入らないようにし、試料水でポリタンクを共洗いして用いた。ポリタンクの容量一杯に試料水を満たし、試料水が空気に触れないようにした。研究室へ持ち帰った試料水は直ちに、ガラス繊維ろ紙（GA-100、有効径1.0μm、ADVANTEC社製）で吸引ろ過して懸濁物質を取り除いた。ろ過した水は、基本的には速やかに濃縮操作を行うが、作業が翌日に持ち越す場合には、4℃の冷蔵庫で暗所保管した。

## b 固相抽出カートリッジのコンディションニングと通水

固相抽出カートリッジSep-Pak PS-2およびSep-Pak AC-2は、カートリッジ内に残存する可能性がある汚染物質を除去するためにコンディショングを行ってから使用した。コンディショング方法は、AC-2に最大5個を連結させ、ヘキサン10mL(10mL/min×1min)とアセトン10mL(10mL/min×1min)の順で、PS-2も最大5個連結させ、アセトン10mL(10mL/min×1min)を脱離方向に上向流で通液させた後、イオン交換樹脂と活性炭を通したイオン交換活性炭処理水（以下、IE/AC水）を100mL(20mL/min×5min)を吸着方向に上向流で通水した。

コンディショング済みのPS-2とAC-2をPS-2への通水が先となるように1つずつ連結させたものをコンセントレーターにセットして、1Lあたり塩化ナトリウム25gと0.5Mリン酸緩衝液4mLを添加したろ過試料水を流量15mL/minで1000mLを通水した。

## c 固相抽出カートリッジからの脱離と窒素パージ濃縮

試料水を通水した固相カートリッジを連結したまま、そこへ常温の窒素ガスを40 L (1L/min×40min)通気してカートリッジ内をある程度乾燥させた。乾燥後、PS-2とAC-2の連結を外し、通水した方向とは逆の方向にそれぞれアセトン9mL (1mL/min×9min)を通液して10mL遠沈管に受けた。直ちに濃縮を行わない場合は、遠沈管のねじ口の上からパラフィルムを巻いて-20℃のメディカルフリーザ内で保管した。

脱離後、35℃の湯浴下で遠沈管に入れた脱離液に窒素ガスを吹き付けて濃縮を行った。およそ5.5mLまで濃縮した後、遠沈管内の試料上部の内壁に付着・残存している可能性がある部分をアセトン0.5mLで洗い流した後、再び窒素ガスを吹き付けて、液量が3.0mLとなったところでPS-2脱離液の遠沈管内にAC-2脱離液の遠沈管内の濃縮液を移し入れて混合した。AC-2脱離液の遠沈管の内壁をアセトン2.0mLを数回に分けてよく洗い流し、この洗い流した液も混合した。混合した脱離液に再び窒素ガスを吹き付け、液量が3.5mLとなった時に0.5mLアセトンで管壁を洗い流した。その後、再び窒素ガスを吹き付けて1.0mLまで濃縮した。直ちに分析を行わない場合は、遠沈管のねじ口の上からパラフィルムを巻いて-20℃のディープフリーザーで保管した。
## d 機器分析

GC/MS分析およびLC/MS/MS分析の運転条件を表(2)-1に示した。GC/MS分析は、北九州市立大学の門上希和夫教授が開発した全自動同定・定量データベース（AIQS-DB）システムにおける運転条件に準じることにした。分離カラムも同システムに準じたJ&W DB-5ms（Agilent社製、30m×0.25mm×0.25μm）とした。この分離カラムは、疎水性がきわめて高い物質や極性が高い物質、揮発性物質などにはあまり適さないとされるが、同AIQS-DBシステムでは、農薬をはじめとする半揮発性物質を主な対象物質とされており、これに準じることで汎用性の高い検出が行えると考えた。電子イオン化(EI)法はGC/MS分析でもっともよく使用されるイオン化法であり、定性および定量の両方の分析で非常に有用とされている方法を採用した。

また、LC/MS/MS分析においても、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析で汎用性の高いオクタデシルシリル(ODS)系カラム(C18カラム)と電子スプレーイオン化(ESI)法によるイオン化を採用し、より幅広い物質に対応できるようにした。

図(2)-3 農薬およびその環境変化体の一斉分析の流れ

## 4 ．結果及び考察

## （１）３-メチル-４-ニトロフェノール(３M4NP)の河川水モニタリングの先行調査

フェニトロチオン(親)と3M4NP(子)のモニタリングの先行調査の地点を選定し図(2)-4に示した。神奈川県内では、水道水源として利用されている相模川と酒匂川のほか、下水放流水や農耕地排水が混入する境川、都市部を貫流しており汚染が全国的にも有名な鶴見川などに設置された一般環境測定点から上流／下流の流れを考慮して23地点を選んだ。このほか、農耕地近傍の河川として4地点を別に選んだ。千葉県内では、水道水源として利用されている養老川や小櫃川などに設置された一般環境測定点から上流／下流の流れを考慮して10地点を選んだ。山梨県内では、富士川へとつながる笛吹川およびその支流に設置された一般環境測定点から上流／下流の流れを考慮して6地点を選んだ。
表(2)-1 GC/MS分析およびLC/MS/MS分析の運転条件

GC/MS分析条件

GC/MS	島津 GCMS-QP2010 plus
カラム	J&W DB-5ms (30 m x 0.25 mm, 0.25 μm)
カラム昇温プログラム	40 °C (2 min) → 8 °C/min → 310 °C (5 min)
イオン源温度	200 °C
気化室温度	250 °C
インターフェイス温度	300 °C
注入モード	スプリットレス
キャリアガス	ヘリウム
キャリアガス流速	40 cm/sec
イオン化法	EI
測定モード	Fast Automated Scan/SIM Type (FASST)
試料注入量	1 μL

LC/MS/MS分析条件

LC/MS/MS	Thermo Scientific TSQ Quantum Access MAX
カラム	Hypersil GOLD (50 mm × 2.1 mm, 1.9 μm)
移動相	A: メタノール, B: 2mM ギ酸アンモニウム
A [vol%] 1% (0 min) → 1% (2 min) → 60% (4 min)
→ 75% (10 min) → 99% (15 min) → 1% (15.01 min)
→ 1% (18 min)
イオン化法	エレクトロンスプレー法
スプレー電圧	3000 V (ポジティブモード), 2500 V (ネガティブモード)
シースガス圧力	50 arb
補助ガス圧力	15 arb	キャピラリー温度 270 °C
脱溶媒ガス温度	450 °C	測定モード Timed SRM with EZ Method
衝突ガス圧力	1.5 mTorr	試料注入量 5 μL

上記の計39地点においてフェニトロチオン(親)と3M4NP(子)のモニタリングの先行調査を行った結果を図(2)-5に示した。その結果、親農薬のフェニトロチオンは、延べ107試料中51試料（48%）で検出され、その環境変化体である3M4NPは33試料（31%）で検出され、かなり高い検出率であった。このとき検出された濃度レベルは、フェニトロチオン(親)が1.1μg/L、3M4NP(子)が0.44μg/L（いずれも神奈川県）であり、米国食品医薬品局(U.S. Food and Drug Administration: USFDA)が飲料水中の微量汚染物質の閾値とする0.75μg/Lに近いレベルでも存在しうることが確認された。千葉県内の10地点および山梨県内の6地点においては、フェニトロチオン(親)と3M4NP(子)のいずれもおおむね0.1μg/L以下の濃度であり、顕著な汚染物質としての検出ではなかった。

また、いずれか一方が検出された地点において、フェニトロチオン(親)に比べて3M4NP(子)の方が濃度の高くなっている場合が107試料中15試料（25%）あることが明らかになった。これはフェニトロチオン(親)と3M4NP(子)それぞれの検出率からみても、環境変化体が親農薬とほぼ同等以上の濃度で検出されることを示したデータとして注目すべき結果であった。

また、サブグループ1での過去の研究において、3M4NP(子)はフェニトロチオン(親)に比べて約30倍の変異原性物質生成能（MFP）の比活性があることがわかっており、これを考慮すれば、実
図(2)-4 MEPおよび3M4NPの河川水モニタリング先行調査の対象地点

際の河川水中ではフェニトロチオン(親)よりむしろ3M4NP(子)の影響が強く懸念される場合がかなり多いものと思われる。しかし、フェニトロチオン(親)と3M4NP(子)の存在比は、地点ごと季節ごとに不規則に異なっており、予測が困難である。このことから、環境変化体を考慮した河川水モニタリングを実際に行うことの重要性はかなり高いことが明らかになったと言える。
また、神奈川県内4地点の農耕地近傍河川で行った先行調査の地点を図(2)-4に合わせて示した。週2回程度の集中調査としたために、4地点と地点数は少なくなっているが、4月中旬から6月下旬までの農耕期に約10週に亘って継続的に行った調査であるため、試料数はかなり多いものとなっている。

農耕期におけるフェニトロチオン(親)と3M4NP(子)の集中モニタリングを行った結果を図(2)-6に示した。特に、Site-1の中野（永池川）でのモニタリング結果においては、フェニトロチオン(親)の消長に連動して3M4NP(子)が出現してくる様子がよく見て取れたものと思われた。また、サンプリング地点がフェニトロチオン(親)の発生源となる農耕地近傍であるにもかかわらず、3M4NP(子)の濃度がフェニトロチオン(親)に比べて高く検出される時期もかなり確認された。しかし、3M4NP(子)濃度がピークとして検出される期間は約1週間程度で収まり、その後は検出限界（0.01μg/L）未満になった。下流域にあたる環境測定点においても3M4NP(子)の濃度レベルは低いことから、3M4NP(子)はその生成速度および消失速度がかなり速い物質であると考えられた。このような農薬については、その使用時期や使用場所によって特異的に検出されるため、対象農薬とその分解物の一斉分析ツールを用いた継続的な河川水モニタリングの重要性が示されたと言える。

図(2)-5 環境測定点におけるフェニトロチオン(親)と3M4NP(子)の先行モニタリング結果（神奈川、千葉、山梨、2011年度）
探水日(2011)

図(2)-6 農耕地近傍河川でのフェニトロチオン(親)と3M4NP(子)の先行モニタリング結果（2011年4月～6月の農耕期）

## （２）農薬加水分解物等の一斉分析に必要な分析条件の検討とデータベースの整備

## 1 ）一斉分析データベースの整備

## a データベース化の方針

農薬および農薬加水分解物の一斉分析のためのデータベースの整備を行った。前提条件として、一斉分析方法の確立において多数の親農薬およびその環境変化体を効率よく分析できるようにすることを念頭におき、サンプリングした河川水試料に共通の前処理を施した上で、四重極型ガスクロマトグラフ質量分析(GC/MS)法あるいはトリプル四重極型高速液体クロマトグラフ質量分析装置(LC/MS/MS)で同時分析するための条件の確立を行うこととした。ここで、共通の前処理を行う目的は、第一には、河川水試料中のppbオーダー以下の微量の農薬およびその環境変化体を高感度に検出するための濃縮・精製を行うことにある。また第二には、微量汚染物質の分析においては前処理法の選択が対象物質の範囲や回収率に大きく影響するが、その一連の分析操作において前処理工程には多大な労力を要するので、様々な物質の検出の有無を主眼とする本研究の場合には、様々な物性を有するできるだけ多くの物質に適用できる汎用の前処理法が適当を考えられるためである。このため本研究では、疎水性の有機物の回収を得意とする吸着樹脂Sep-Pak PS-2 $ ^{4} $ と極性を有する有機物の回収を得意とする高性能活性炭Sep-Pak AC-2（ともに日本ウォーターズ社製）を用いた固相抽出法を採用することとし、揮発性の高い物質や極端に水溶解性の高い物質、アルデヒド類などをはじめとする不安定ために反応捕集が必要な物質などは、前処理不適のため検討対象外とした。

GC/MS一斉分析方法としては、汎用性の高い四重極型ガスクロマトグラフ質量分析装置（島津
製作所製、GC/MS-QP2010 plus）を用い、対象物質について高感度の選択イオン検出(Selected Ion Monitoring: SIM)での分析方法の確立を行った。LC/MS/MS一斉分析方法としては、環境分析の分野でも近年に急速に普及してきているトリプル四重極型高速液体クロマトグラフ質量分析装置LC/MS/MS（サーモサイエンティフィック、TSQ Quantum Access MAX）を用い、高精度の多重反応検出(Multiple Reaction Monitoring: MRM）モードにおける分析条件の検討を行った。

## b 一斉分析対象物質リストの作成

まず最初に、本研究における河川水モニタリングの対象として予定地点の多い神奈川県で使用される農薬に着目し、神奈川県内での親農薬の使用量や神奈川県内の農耕地近傍でのモニタリング調査における検出頻度を参考に、親農薬およびその環境変化体の一斉分析法の確立に着手した。その後、分析対象物質の拡充を図るため、水道法等において規制対象とされる農薬に対してそれらの環境変化体の調査を実施し、一斉分析データベースへの登録を検討した。水道法対象農薬の旧第1群の102物質に同対象農薬カルボフランの親農薬にあたるフラチオカルブ、カルボスルファンを加えた計104物質を対象とし、キーワードとして「加水分解」「光分解」「土壌中分解」「水圈中分解」と指定して、国際連合食糧農業機関(FAO)、アメリカ合衆国環境保護庁(USEPA)等のデータベースや、その他文献検索により環境変化体についての情報を確認した。その結果、水道法関係の親農薬104物質のうち、83物質に対して約530物質の環境変化体の情報が確認された一方、残る21物質については環境変化体の情報は得られなかった。親子関係が確認されている83物質について標準物質の市販の有無を確認したところ、親農薬71物質の環境変化体203物質について標準物質が入手可能であることが確認された。そこで、環境変化体の標準物質を順次入手して、GC/MSおよびLC/MS/MSを用いた一斉分析法の検討を行った。また、集中モニタリング地域（鹿児島県、茨城県）において農薬散布情報が明らかとなった法規制対象農薬2物質（フェリムゾン、クロメプロップ）と分解物3物質等についても検討した。その結果、親農薬37物質（除草剤11物質、殺虫剤20物質、殺菌剤6物質）とその環境変化体63物質（除草剤の環境変化体15物質、殺虫剤の環境変化体37物質、殺菌剤の環境変化体11物質）の計100物質を分析可能とする一斉分析データベースを確立することができた。

## c 一斉分析対象の親農薬およびその環境変化体の概要

一斉分析対象とした親農薬およびその環境変化体の概要を表(2)-2～表(2)-4に示した。対象物質の中には、親農薬としては水道法や化管法（PRTR法）あるいは農薬取締法の登録保留基準で監視の対象とされている物質も多いが、その環境変化体については、それら法規制の対象外であるものがほとんどであった。すなわち、既存の法規制においては、人間が使用し環境へ排出される化学物質までは管理の対象となっているが、ひとたび環境中へ排出された後に、光分解や加水分解、生分解などを受けて親化合物とは別の構造と別の物性・毒性を有する物質に変化した物質については、監視はなく、ほとんど調べられることもない状態であることが確認された。

除草剤は、主に水稲用であるが、中には、とうもろこしや果樹、野菜、ゴルフ場農薬として利用されているものも含まれる。アトラジンやジウロンメフェナセットのように複数の環境変化体が対象となった親農薬もある。変異原性(Mutagenic Activity: MA)が陽性を示す親農薬は今回は見つからなかったが、塩素処理時の変異原性すなわち変異原性物質生成能（Mutagen Formation）
表(2)-2 一斉分析対象とした親農薬およびその環境変化体の概要（除草剤）

農薬	PTPW	種類	主な適用作物	MA	MFP	水道法	PRTR	保留基準	神奈川	鹿児島	北海道	山梨	H23	H24	H25
アトラジン	1	除草剤	とうもろこし	ND	35	○	○	○	83	94	35	166	○
アトラジン脱エチル体	(KU)	(KU)	○
アトラジン脱イソプロピル体	○
カフェンストロール	1	除草剤	水稻	ND	ND	○	○	○	171	123	129	87	○	○
カフェンストロール脱カルバモイル体	ND	ND	○	○	○
ジウロン(DCMU)	3	除草剤	みかん、茶、果樹	ND	2,300	○	○	○	30	44	180	161	○
1-(3,4-ジウロフェニル)-3-メチルウレ(DCPMU)	ND	(KU)	○
3,4-ジウロロアニリン(DCA)	(KU)	(KU)	○	○
3-3-クロロフミニル-1,1-ジメルウレ(MCPDMU)	ND	(KU)	○
チオベンカルブ	1	除草剤	水稻、ねぎ	ND	81	○	○	○	19	116	139	40	○	○
4-クロロベンジルアルコール	ND	ND	○	○
ピリブチカルブ	1	除草剤	水稻	(KU)	(KU)	○	○	○	223	181	134	80	○
3-ターシャリーブチルフェノール	ND	490	○
ブタミホス	1	除草剤	キャベツ、野菜、すいか	(KU)	(KU)	○	○	○	89	73	96	184	○
ブタミホスオキソン	○	○
ブロモブチド	1	除草剤	水稻	ND	ND	○	○	75	142	78	66	○
ブロモブチドデブロモ	ND	ND	○	○
メコプロップ(MCPP)	1	除草剤	(ゴルフ場)	ND	450	○	○	○	NIA	NIA	NIA	NIA	○
○-クレゾール;2-メチルフェノール	○	○
メフェナセット	2	除草剤	水稻	○	○	○	58	17	172	58	○	○
2(3H)-ベンゾチアブロン	ND	14	○	○
N-メチルアニリン	ND	○	○
モリネート	1	除草剤	水稻	ND	84	○	○	○	141	333	115	51	○
モリネート-2-ケト	○
ジクロベニル(DBN)	1	除草剤	りんご、なし、もも	ND	11	○	○	○	88	146	85	89	○
2,6-ジクロロベンズアミド	○	○

注1）MAは変異原性、MFPは塩素処理時の変異原性。

注2）水道法、PRTR、保留基準は各法規制への対応の有無。

注3）神奈川、鹿児島、北海道、山梨は親農薬の農耕地での使用量順位（平成17農薬年度）。

注4）H23, H24, H25は本研究におけるモニタリング検討対象。

Potential: MFP) が陽性を示す親農薬はアトラジン、ジウロン、チオベンカルブ、メコプロップ、モリネート、ジクロベニルと11物質中6物質もあり、さらに環境変化体がMFP陽性を示すケースとして、ピリブチカルブ(親)の環境変化体である3-tert-ブチルフェノール、メフェナセット(親)の環境変化体である2(3H)-ベンブチアゾロンがあった。

殺虫剤は、野菜、果樹、水稲用と適用作物が幅広い。複数の環境変化体が対象となった親農薬が20物質中7物質あった一方、α-エンドスルファン(親)とβ-エンドスルファン(親)はいずれもエンドスルファンスルフェートの共通の親農薬として、また、ベンチオカルブ(親)とフラチオカルブ(親)およびカルボスルファン(親)はいずれもカルボフラン(子)、カルボフラン-3-ヒドロキシ(子)、カルボフラン-3-ケト(子)、カルボフラン-7-フェノール(子)の共通の親農薬として一斉分析対象とした。MA陽性が現時点で判明している親農薬および環境変化体はなかったが、MFP陽性が判明している親農薬が20物質中8物質、環境変化体が37物質中12物質あった。

殺菌剤は、主に水稲用であるが、中には、野菜や果実に用いられるもの含まれる。複数の環境変化体が対象となった親農薬が6物質中5物質あった。また、MFP陽性が判明している親農薬が6物質中3物質、環境変化体が11物質中5物質あった。

以上のように、本研究で対象とした親農薬および環境変化体の中には、親農薬や環境変化体自身では変異原性を示さないものの、塩素処理を施すと変異原性を発現するようになる親農薬やその環境変化体が多数存在することがわかった。この結果により、親農薬だけを監視するのではなく、その環境変化体や塩素処理における変化についても監視する必要性が見出せたと言える。な