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課題名 4−1302 再導入による希少鳥類の保全手法の確立に関する研究

課題代表者名 永田尚志 （新潟大学 研究推進機構 朱鷺・自然再生学研究センター 教授）

研究实施期间 平成25～27年度

累計予算額 78,347 千円（うち平成27年度：26,116 千円）

予算額は、間接経費を含む。

本研究のキーワード 絶滅危惧種、再導入、生存率、飼育下繁殖、個体群管理、繁殖成功、遺伝的多様性、トキ、コウノトリ、ヤンバルクイナ

研究体制

(1)トキの繁殖成功に影響を与える要因の解明と希少鳥類の再導入手法の確立に関する研究（新潟大学研究推進機構）

(2)コウノトリの再導入とメタ個体群形成に関する研究（兵庫県立大学自然環境科学研究所）

(3) ヤンバルクイナの飼育繁殖と再導入のための予備的研究（公益財団法人山階鳥類研究所）

(4) 希少鳥類の遺伝子プロファイルと再導入に関する研究 (新潟大学自然科学系 (農学))

研究協力機関

京都大学、NPO法人どうぶつたちの病院

## 研究概要

### 1. はじめに(研究背景等)

2010年、名古屋で開催された生物多様性条約締結国会議（COP10）で合意された愛知目標では、絶滅危惧種の絶滅や減少を防ぐことが5つの戦略目標のひとつとされている。野外でいったん絶滅した場所に個体を放して野生生物を復活させることを再導入とよんでいる。生物多様性を回復させるために、世界中で最近20年間に約500種の動物で再導入が実施されているが、再導入の成功率は飼育繁殖個体では15％と低く、試行錯誤に頼っているのが現状で、技術として確立されているとはいえない。日本国内でも、種の保存法で国内希少野生動植物種に指定された82種のうち15種の鳥類で保護増殖事業計画が策定されている。希少鳥類の飼育個体群を適切に管理し確実な再導入技術を確立することは、劣化した生物多様性を回復し保全する重要な手法のひとつと考えられ、愛知目標を達成する我が国の主要行動目標の一つとして、希少種の生息域外保全と野生復帰の推進が掲げられている（生物多様性国家戦略2012-2020）。

### 2. 研究開発目的

2005年に兵庫県豊岡市でコウノトリが、2008年には新潟県佐渡島においてトキの再導入が開始され、2010年にはヤンバルクイナの再導入のための飼育繁殖施設が建設された。コウノトリは野外での近親交配の問題が顕在化し、トキは野外での繁殖成功率が低く放鳥によって個体群がかろうじて維持されている状況にある。そこで、本研究では、再導入の途上にあるヤンバルクイナ、トキ、コウノトリを対象として、飼育下の個体の履歴、行動、遺伝子プロファイルが、放鳥後の個体の定着および繁殖成功にどのように影響を与えているかを明らかにすることで、対象種の再導入を成功に導く最善の手法を提案することを目的としている。

個体が持つ行動様式や性質が、生存や繁殖成功などの個体差は、飼育下繁殖における育ち方の違いや、個体が有する遺伝子型の差異によって個体差が生じ、再導入の成功に大きく影響を与える要因を明らかにすると考えられる。再導入が行われているトキ及びコウノトリにおいて、野外および飼育下の個体・繁殖情報をデータベース化するとともに、これらが再導入の適応度に与える影響を解明することで、再導入の成功に影響羽与える要因を特定する。また、希少鳥類の中立遺伝子と適応度遺伝子の遺伝子解析手法を確立し、対象個体群の遺伝的多様性を評価すると同時に、これらの遺伝子多型が再導入の成功に与える影響を評価する。また、コウノトリにおいては、再導入個体群がメタ個体群を形成する条件について解析し、飼育および野外の個体群管理方法を明らかにする。ヤンバルクイナでは、減少要因を特定し、再導入に注意すべき項目を整理する。また、飼育個体を用いて、捕獲・追跡技術を開発し再導入後のモニタリング手法を検討する。近縁クイナ（グアムクイナ、ニュー
ジーランドクイナ等)の再導入事例を詳細に調査し、ヤンバルクイナに適用可能な飼育、再導入技術を抽出する。トキ、コウノトリの成果と近縁クイナ類、希少鳥類の再導入事例の比較研究により、希少鳥類の再導入の成功率を高めるのに最適な飼育個体群の管理手法を提案することを目的としている。

### 3. 研究開発の方法

## (1) トキの繁殖成功に影響を与える要因の解明と希少鳥類の再導入手法の確立に関する研究

環境省佐渡自然保護官事務所を通して放鳥トキについての飼育情報を入手し、放鳥トキの個体情報、飼育履歴、飼育繁殖のデータベース、マイクロサテライト多型情報をもとに遺伝子データベースを構築し、野外の繁殖・生息状況をもとにした繁殖成績、生存状況データベースと結びつけることで、放鳥トキの生存に影響を与える要因、および、繁殖成功に影響をあたえる要因を解析した。また、第9回～13回放鳥個体の訓練中の行動を順化ケージに設置したセンサーカメラを使って解析した。さらに、放鳥から3ヶ月間、新規放鳥個体を追跡し、各個体の採餌行動、警戒行動を記録した。

希少鳥類の再導入が実施されているグアム島、ロタ島、ニュージーランド、モーリシャス島において、希少鳥類の再導入状況を調査した。希少鳥類ごとに、減少要因、最小個体群サイズ、放鳥ソース、再導入実施年、放鳥個体数、放鳥後のモニタリング法を担当者に聞き取り調査した。また、同時に放鳥場所の生態系管理手法についての情報も収集した。さらに、飼育個体群からの再導入が実施されている場合には、増殖方法、近交弱勢の程度、飼育時の問題点、飼育個体と野生個体の繁殖・行動等の差異についても聞き取り調査を実施した。これらに文献情報を加えて、トキやコウノトリとの相違点について比較した。

## (2) コウノトリの再導入とメタ個体群形成に関する研究

既存および新規加入した個体の飼育情報および遺伝情報等を整理し、コウノトリの郷公園等の飼育個体情報データベースを作成した。馴化訓練の成績と放鳥後の行動から飛行能力、採餌能力、同種対応能力（社会性）、および、異種対応能力（捕食回避、競争）を評価する手法を開発した。飼育下の18個体、および、放鳥された13個体の血液試料からDNAを抽出して、マイクロサテライトの12遺伝子座についてタイピングを行い、遺伝的多様性を評価した。複数のマイクロサテライト遺伝子座のタイピング結果から、多次元尺度法により解析対象個体間の遺伝的距離を視覚化、および、算出した。また、家系情報を用いて、個体数の増加にともなう野外集団の創設個体のゲノム相当量（FGE）の年次推移を計算すると同時に、現存ペアが子を1個体の増やしたときの飼育、野外それぞれの集団の遺伝的多様性への影響効果を算出し、JAZAのデータベースから放鳥候補個体を絞り込む手法を開発した。放鳥方法を評価するために、4種類の異なる方法で放鳥した個体の放鳥後の滞在位置、放鳥地点への飛来状況、繁殖期の個体間距離と行動範囲を解析した。放鳥個体と野生生まれ個体の年齢別生存率、野外の繁殖成功率をもとに豊岡個体群の個体群存続可能性分析を行った。徳島県鳴門市に定着したペアの生息状況からメタ個体群の成立条件を調べた。

## (3) ヤンバルクイナの飼育繁殖と再導入のための予備的研究

ヤンバルクイナの減少の主要な要因としては、移入された哺乳類であるマングース、ネコ、クマネズミの存在が考えられ、環境省や沖縄県の実施している移入種駆除事業の結果と、山階鳥類研究所と環境省が実施しているヤンバルクイナの調査結果をもちいて、それぞれの分布域とその経年変化との相関関係を検討し、ヤンバルクイナの減少要因を解析した。また、国頭村安田にある環境省ヤンバルクイナ飼育施設で飼育されている飼育個体を用いて、飼育個体での発信機の装着方法の検証、並びに、野外における誘引効果の実験を行い、捕獲、及び追跡技術を開発した。次に、飼育下で繁殖した個体に発信機を装着し、安田家畜改良センターにあるヤンバルクイナ保護シェルターにおいて、実際に野外放鳥実験を行い、追跡結果をその結果を野生個体と比較した。さらに、グアムクイナ、ロードハウクイナ、ニュージーランドクイナおよびカラヤンクイナの保全と再導入状況について現地で調査し、ヤンバルクイナに適用可能な技術を検討した。

## (4) 希少鳥類の遺伝子プロファイルと再導入に関する研究

## 1 ) 野外サンプルを用いた遺伝子解析手法の確立

白色レグホーン系採卵鶏（ジュリア）のヒナから3本の胸部の羽髄をもつ幼羽を採取しDNA抽出を行った後、分光光度計にてDNA収量を測定した。次に、トキ保護センターで飼育されているトキの雛の胸部および、背部より羽髄をもつ幼羽を採取し、DNA抽出し、DNA収量の測定および品質確認を行った。

## 2 ) マイクロサイトの多型情報およびその遺伝的多様性の評価

19個のマイクロサテライトマーカーを用いて、2000年から2012年に孵化したトキ188個体のDNAマーカー型タイピングを行った。個体レベルでの遺伝的類縁関係を推定するために、MICROSATELLITE ANALYZER version 4.05により共有アリル率に基づく個体間の遺伝距離(Dps)を計算し、PHYLIP version 3.69のNEIGHBORプログラムにより樹形図を作成した。

## 3 ) MHC領域のゲノム構造の解明、多型情報の収集および遺伝的多様性の評価

ラムダファージベクターを使用してゲノムライブラリーを作製し、MHC-IIB遺伝子のエクソン2を増幅するプライマーを用いてPCR法によるスクリーニングを行い、トキMHCクラスII領域を解析した。得られた陽性クローンの両端
の配列を基に新たなプライマーを合成し、ゲノムウォーキングによりコンティグを作製し、その全塩基配列を決定し、ゲノム構造を明らかにした。PCR-RFLP法およびサザンブロット法により、トキ始祖5個体のMHCクラスII領域の多様性を解析した。トキと同様にして、コウノトリMHC-IIB遺伝子を含む領域をPCRで増幅したのち、特異的プライマーを使用して各MHC-IIB遺伝子座のエクソン2配列を決定することでハプロタイプを解析した。

## 4 )DRD4のゲノム構造の解明、多型情報の収集、遺伝的多様性の評価

トキ死亡個体の脳から抽出されたDNAおよびRNAを用いて、PCR、RT-PCR、RACEを行った後、ダイレクトシーケンスによりトキDRD4配列を決定した。次に、始祖5個体のDRD4の保存配列領域のシーケンスにより得られた波形データを用いて、多型検出を行い、これに基づき、日本産トキ集団が保有しているDRD4のハプロタイプを決定した。サブテーマ1から提供された生存率、採餌効率、移動分散距離データを用いてDRD4ハプロタイプとの関連を解析した。

### 4. 結果及び考察

(1)トキの繁殖成功に影響を与える要因の解明と希少鳥類の再導入手法の確立に関する研究

## 1 )トキの再導入成功に影響を与える要因解析

再導入の成功には、まず、放鳥個体が生存し、生存個体が番い形成をして繁殖成功して子孫を残し自立的な個体群を形成する必要がある。放鳥トキ215個体を対象として、どのような飼育履歴、個体特性をもつ個体が生き残れたかを解析した。まず、生存時間に影響を与える従属変数として、発信機の有無、放鳥年齢、性別のほか、飼育履歴から、育雛形態、孵化形態、一腹雛数、クラッチ順、クラッチ内孵化順、飼育時の捕獲回数、傷病治療歴の有無、エンゼルウィング発症歴、チアミン欠乏症の発症歴を検討した。放鳥後の生存に影響を与えていた共変量は、年齢、性別、発信機（PTT）、育雛形態、エンゼルウィング発症歴、チアミン欠乏症発症歴、一腹雛数であった。発信機装着個体、エンゼルウィング発症個体、チアミン欠乏症発症個体、および、放鳥時の年齢が高いほど放鳥後の生存率が低くなり、自然育雛個体、ぷ個体、兄妹の多い個体ほど生存率が高くなる傾向があった（図1）。

図1.放鳥個体の生存に影響を与える要因（左）発信機（PTT）、（右）育雛形態

佐渡は、2015年繁殖期までにのべ169巣で産卵が記録されている。雌雄の孵化形態、育雛形態、年齢、野外での成功履歴、初卵日などが繁殖成功にどのような影響を与えているかを一般化線形モデルで解析した結果、繁殖成功にもとも大きな影響を与えているのは初卵日と過去の繁殖履歴であり、繁殖開始の早い繁殖成功履歴がある番いほど繁殖成功率が高かった。繁殖履歴がない場合、繁殖成功度は初卵日と雌親が自然育雛で初卵日が早い番いが人工育雛の番いより繁殖成功が高まった。

順化訓練中に餌のない池を最初に訪問する個体は新規探索性の強い個体であると仮定し、給餌しないG池の訪問順と個体の性質の関連を解析した。G池を早く訪問する個体は、年齢の若い個体、あるいは、自然育雛個体であった（図2，図3）。

図2. 育雛形態とG池訪問順位

図3.年齢とG池訪問順位
群れに合流した個体は観察されやすくなるため、群れへの合流の指標として放鳥後100日間の各個体の観察日数を解析した。放鳥後100日間の観察日数と年齢の間には負の相関が認められ、若い個体ほど観察日数が多く、早く群れに合流していると考えられた（図4、GLMM:p<0.001、ランダム効果：放鳥回）。

図4.年齢と放鳥後100日間の観察日数

図5.年齢群と生存時間

親鳥に育てられた自然育雛個体は、順化ケージや放鳥後の野外で新規探索性が強いので新しい環境に早く順応できるため、結果として、生存率も高かったと考えられた（図5）。また、若い個体ほど新規開拓性が強く放鳥直後にすぐに群れに合流するため、環境の順応性が高く、生存率も向上すると考えられた。トキの再導入の成功を高めるには、放鳥個体の生存率を上げることが重要である。エンゼルウィングやチアミン欠乏症発症個体、老齢個体は放鳥後の生存率を低いため、病歴のない1～2歳の若い自然育雛個体を優先して放鳥したほうが望ましい。

## 2 ) 希少鳥類の再導入手法の比較研究

海洋島での希少種の再導入による基本的な保全戦略は、まず、保護区として島嶼を確保し、次に、侵入捕食者や外来植物を駆除して生息可能な環境を準備し、最後に希少種を他所から移植して島嶼保護区に再導入個体群を確立するという手法である。同様にして（島嶼）保護区を増やしていくことで、複数の再導入個体群が設立され、環境変動やカタストロフが生じても一度に絶滅する危険性を分散できる。飼育下繁殖が困難な中小型鳥類にとって2～20km²程度の島嶼に自然個体群を確保することは、大規模な飼育施設を複数基建設して、島嶼保護区と同規模の個体群を維持するよりも経済的である。モーリシャスやニュージーランドの希少鳥類で行われていた再導入手法は、既存個体群からの「移植」、野外で採卵し孵化させて人工育雛個体を放鳥する「採卵育雛」、トキやコウノトリのような「飼育下繁殖」個体の放鳥の3つに分類される。飼育期間が短いほど再導入の成功率は高くなるので、一般的に、再導入の成功率は、移植＞採卵育雛＞飼育下繁殖の順に低くなり、逆に、事業コストは、飼育下繁殖＞採卵育雛＞移植の順で高くなると考えられる。

## (2) コウノトリの再導入とメタ個体群形成に関する研究

## 1 ) 飼育個体情報データベースの作成と順化訓練の評価手法の確立

兵庫県立コウノトリの郷公園で飼育履歴のある計237羽について、個体情報、飼育情報および遺伝情報を整理しデータベースを構築した。このシステムの運用により、個々の個体の飼育履歴や遺伝情報を一元的に管理できるようになり、必要に応じて取り出すことができるため、個体の飼育方法、すなわち配偶計画や繁殖計画、同居個体の選定、飼育ケージの選定などの立案が容易になった。放鳥後の経験と学習で採餌能力、同種対応能力、異種対応能力はすぐに向上するため、コウノトリの野生馴化訓練では、飛行訓練が最も重要であった。

## 2 )飼育・野生集団の遺伝的多様性の解析

コウノトリのマイクロサテライト遺伝子座当たりの平均アリル数は5.08であり(最小-最大:2(Cbo133)～13

(Cc04)、中国の野生個体群の平均アリル数と違いはなかった。異なる母系（ハプロタイプ）個体同士でペア形成するという方針で飼育個体群の繁殖計画が立てられ、放鳥個体ペアでもハプロタイプの組合わせに注意してきた。その結果、マイクロサテライト遺伝子座のタイピングに基づく遺伝的距離からみても、遺伝的距離が離れた個体間でペア形成をしていた。父性解析の結果、これまでは3歳以上で性成熟すると考えられていたが、2歳雄の繁殖参加事例が判明し、婚外交尾も確認された。家系情報に基づく遺伝的評価の結果、再導入以降、個体数はほぼ一貫して増加傾向にあるのに対して、集団の遺伝的多様性総量の指標となる創設個体のゲノム相当量の値は、緩やかに低下する傾向が認められ、野外の巣立ち個体が増加するに伴って野外の平均近交係数が上昇していることが明らかになった。家系情報解析によりJAZAで飼育されているペアの中にコウノトリの郷公園で飼育されているペアよりも繁殖の優先度が高いペアが存在することが明らかになり（図6）、集団の遺伝的多様性を高める繁殖計画を策定することが可能となった。
図6.個体の放鳥が飼育集団および野外集団の遺伝的多様性に及ぼす効果.

## 3 ) メタ個体群管理方法の研究

放鳥個体の産卵数は平均4.0±0.6(SD)卵、孵化数は平均2.1±0.9(SD)羽、巣立ち雛数は平均1.5±0.7(SD)羽であった。放鳥個体の年生存率は、雄が平均0.91±0.07(SD)、雌が平均0.93±0.09(SD)で性差はなかった。また、野外で巣立った個体の年生存率は、雄が平均0.90±0.13(SD)、メスが平均0.90±0.10(SD)で性差はなかった。この個体群パラメータを用いて個体群存続可能性分析(PVA)を行った。PVAにより、現状の個体群パラメータが維持される限り、但馬地方個体群は絶滅する可能性は低いことが推定された。野外では個体数が増えるにしたがって移動個体数の割合が有意に高くなっていた(図7.r=0.91、P<0.01)。この結果、再導入が実施された但馬地方では既に密度効果が生じており、現在の環境収容力は約50羽と推定された。

但馬地方から南に約130km離れた徳島県鳴門市に、2015年、新しいペアが定着し、電柱で造巣した。この地域に定着できた要因として、周年、餌動物が生息できるレンコン田と増水時にレンコン田に水生動物を供給する浅い水路が存在していたためと考えられた。コウノトリの再導入の最終目標は、ロシアと中国北部の繁殖個体群をソースとする極東地域のメタ個体群構造の復活である。そのためには、配偶ペアによるソフトリリース、放鳥拠点の飼育個体による誘引、周年採餌可能な環境の整備をして定着を促進するとともに、放浪個体数の増加により定着地での配偶を促進し、近親婚の回避、大陸からの渡来個体の定着促進により高い遺伝的多様性を維持することが有効であると考えられた。

図7. 但馬地方における野外個体数と移動個体数の割合の関係

## (3) ヤンバルクイナの飼育繁殖と再導入のための予備的研究

## 1 ) ヤンバルクイナの減少要因

マングース、ネコ、ネズミの存在確率を独立変数、ヤンバルクイナの存在確率を従属変数としたロジスティック回帰モデルの解析結果、2000年から2008年まですべての年で、マングースの存在のみがヤンバルクイナの生息に負の影響を及ぼしていることが明確となった（ $ \chi^{2}=5.02\sim24.95,\ p<0.001 $ ）。一方、ネコとクマネズミの影響は検出できなかった。ただし、2004年のみ、ネコもヤンバルクイナの生息に負の効果を示した（p=0.013）。この結果から、再導入時にもとも注目すべき条件として、マングースの排除が重要であることが判明した。
## 2 ) ヤンバルクイナの誘引捕獲・追跡技術の開発

天敵であるハブの剥製を使った誘引捕獲技術を導入した。これは鳥類の天敵に対するモビング行動を利用したもので、長時間の誘因効果があることが判明した。クイナの警戒音声とハブの剥製による誘因で、ヤンバルクイナを効率良く捕獲することが可能となった。金網のかご罠の扉が両面のものは片面のものに比べて捕獲効率が優れていた。ボウネットは開けた場所での捕獲に適していることが分かった。ヤンバルクイナは直接観察して個体識別することが困難であり、個体の生存確認や行動圏の把握には、小型発信機による追跡が不可欠である。ハーネス型の発信機装着は、一部個体に脱羽がみられるものの軽度であり、2年ほど経過しても良好な状態を保っている個体もいる。一方、首輪型発信機は、装着後間もなく下嘴を首輪部分に挟み込み、自力では外せない状態となった。このことから、ヤンバルクイナへの発信機の装着方法としては適さないと考えられる。

## 3 )飼育下繁殖個体の放鳥実験

飼育下で繁殖した個体に発信機を装着し、野外（シェルター）に放鳥する実験を行った。その結果を同時期に周辺地域で実施した安田野生個体の追跡結果および、過去に西銘岳で実施した調査結果と比較した。野外への放鳥実験の結果、捕食による初期死亡率が高いことが判明し、改善には、放鳥個体の選択（若齢、自然ふ化、自然育雛など）、放鳥前の順化訓練、訓練とソフトリリースのための広い施設の必要性などが明確になった。

## (4) 希少鳥類の遺伝子プロファイルと再導入に関する研究

## 1 ) 野外サンプルを用いた遺伝子解析手法の確立

ニワトリ雄雑から、幼羽1本あたり、15日齢で20.3±1.2μg、20日齢で19.9±1.9μg、25日齢で9.9±1.8μg、30日齢で13.8±5.4μgというDNA収量が得られた。雌についても、15日齢で15.1±4.2μg、20日齢で23.3±6.4μg、25日齢で16.3±4.6μg、30日齢で10.0±3.5μgという収量が得られた。PCR増幅をした結果、いずれのサンプルにおいて期待長の明瞭なバンドが検出された。ニワトリヒナから3本の幼羽を取った場合、1000回以上のPCR反応に利用できる高収量の高品質DNAが得られることが示された。次に、トキヒナの胸部の幼羽を採取した場合、幼羽1本あたり雄では9.6±2.2μgのDNAが、背部の幼羽については、10.2±2.5μg（雄では9.735±3.300μg、雌では10.79±1.245μg）のDNAが抽出された。また、胸部あるいは背部のどちらでもPCR増幅により高品質のDNAが抽出されることが示された。

## 2 ) マイクロサイトの多型情報の収集および遺伝的多様性の評価

後代188個体からなる全集団について解析を行ったところ、始祖5個体にも関わらずA（アリル数）の最大値は3であった。A、ne、HE、HoおよびPICはボトルネックを受けた動物と同様の低いレベルの値を示し、遺伝的多様性は低いと考えられ、佐渡島トキ集団もボトルネックを受けていることが示唆された。後代188個体からなる全集団を飼育下集団、放鳥下集団に分け、同様の解析を行ったところ飼育下集団と全集団の遺伝的多様度は似たような値を示したが、放鳥下集団では始祖個体のアリルがすべて後代に伝わっていなかった。中国集団との比較では、遺伝的多様性の尺度である、A、ne、HE、HoおよびPICのいずれも、佐渡島トキ集団は中国集団より低くかった。一方、始祖5個体と後代188個体からなる全集団において、AIは同じ値を示し、始祖個体で検出されたすべてのアリルが後代に伝達していることが判明した。PHYLIPによる樹形図解析では、始祖個体のいずれにも偏ることなく放射状に分布していた（図8.）。これは、始祖ゲノムが様々な混合パターンで後代個体に伝達していることを示していて、佐渡島トキ集団におけるこれまでの計画交配は遺伝的多様性の維持に対して有効に機能していると考えられた。

図9. PHYLIPによる全集団の個体関係をプロットした樹形図(始祖5個体および全体集団)
## 3 ) MHC領域のゲノム構造の解明、多型情報の収集および遺伝的多様性の評価

トキMHCクラスII領域の解析では、MHC IIA/IIB遺伝子ペア数が異なる3つのMHCクラスIIハプロタイプのゲノム構造(COL11A2-1～3コピーのMHC IIA/IIBペア-BRD2)を決定した。始祖5個体を対象として、PCR-RFLP法とサザンブロット法によりMHCクラスII領域の多様性を解析した結果、3種類のハプロタイプのみが検出され、日本トキ集団のMHCクラスII領域の多様性が極めて低いことが示された。

コウノトリMHC領域については、クラスII領域とクラスI領域を含む約160kbのコンティグが作製された。各クローンの一部の塩基配列を決定し、ホモロジー検索によるアノテーションを実施して、コウノトリMHC領域のおおよそのゲノム構造(COL11A2-2コピーのMHC IIA/IIBペア-BRD2-DMA-DMB1-DMB2-MHC I-TAP1-TAP2-2コピーのMHC I-TNXB)を明らかにした。MHCクラスII領域の多様性の解析では、始祖6個体から9種類のMHCクラスIIハプロタイプが検出され、トキ集団に比べコウノトリ集団の遺伝的多様性が高いことが示された。

## 4 )DRD4のゲノム構造の解明、多型情報の収集、遺伝的多様性の評価

トキDRD4の5'フランキング領域の1228bp、エクソン1の1652bp、イントロン1の12118bp、エクソン2の113bp、イントロン2の365bp、エクソン3の548bp、イントロン3の734bpおよびエクソン4の278bpの配列を決定した。この配列は385アミノ酸をコードする1155bpの翻訳領域を含んでいた。相同性解析の結果、プロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域の全ての領域においてニワトリ・トキ・シジュウカラの3種間で保存されている配列が存在した。佐渡島トキ集団の始祖5個体におけるDRD4保存配列領域の多型検出を行ったところ、7か所の一塩基多型と2か所の縦列反復配列数多型が検出された。さらに、検出された多型に基づいて、始祖5個体におけるDRD4のハプロタイプの決定を行ったところ、4種類のハプロタイプ（I～Ⅳ）が決定された。決定したDRD4のハプロタイプと生活史形質である生存率、行動特性である移動分散行動、採餌行動との関連性について解析したところ、DRD4遺伝子のハプロタイプⅣが短距離分散行動、低採餌行動および低生存率と関連する傾向がみられた。これらの結果から、DRD4遺伝子は、移動分散行動、採餌行動を介して、生存率に影響すると考えられた。本研究の成果は、野生下再導入による日本産トキの保全に貢献すると考えられる。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

いったん絶滅した希少種の再導入を行うためには、飼育下繁殖による放鳥個体の確保が必要であるが、飼育下での行動の発達や遺伝子プロファイルが再導入後の個体の適応度にどのような影響を与えているかを解明することで、遺伝と学習が鳥類の繁殖行動にそれぞれ、どのような効果をもつかを明らかにできる。このようなアプローチは、動物（特に、鳥類）の適応度コンポーネントに環境・遺伝の要因がどのように寄与するかを明らかにし、野生動物の行動遺伝学の発展に大きく寄与すると考えられる。エンゼルウィングやチアミン欠乏症の発症履歴や育雛形態などのトキの飼育履歴が、放鳥後の生存率に大きく影響することを証明し、飼育下の環境要因が適応度に影響を与えることを示した。また、個性の候補遺伝子であるDRD4遺伝子が、実際に放鳥後のトキの行動や生存率と直結していることを示した。海外では、DRD4多型形質と行動の関連性の研究が始まっているが、国内の野生生物でのDRD4と適応度の関連性を明らかにした研究例はない。

トキの保全および野生復帰事業においては、集団の遺伝的多様性の維持は重要な課題であり、その実現のためには飼育下や放鳥個体のみならず野外で誕生した個体に対してもDNA多型マーカーを利用した遺伝的管理を実施することが望ましい。本研究でえられた解析手法やデータは、トキ集団の遺伝的管理を実施するための基礎を成すものであり、今後の交配計画の策定や放鳥個体の選抜に対しても有用な情報となると期待される。また、トキと同様に日本国内において保全および野生復帰事業が進められているコウノトリのMHCクラスII領域のゲノム構造は、トキのものとほぼ一致しており、ニワトリを含むキジ目のものとは大きく異なっていた。これらのデータは、鳥類のMHC領域の進化の研究に対しても重要な情報になると期待される。

## (2) 環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

1）トキでは自然育雛個体の番い形成確率が高いことから、既に、環境省トキ飼育繁殖小委員会では、飼育下繁殖からの放鳥候補にはなるべく親鳥（里親）が育てた自然育雛個体を供するという方針となっている。今回、自然育雛個体が放鳥後の適応度に与える影響が予想していた以上に大きいことが明らかになったので、今後は、この方針を徹底することが見込まれる

2）野外で標識する幼鳥から羽毛を2−3枚抜くことで、遺伝的多様性の解析に十分なDNAが採取できることが確認されたことにより、既に、放鳥トキのヒナ捕獲時に性別・遺伝子情報を得るためのDNA試料採取に用いられている。
3）環境省の野生生物保護対策検討会トキ保護増殖分科会の野生復帰技術と分散飼育ワーキンググループ、およびシマフクロウ保護増殖事業ワーキンググループの委員会では、先行するコウノトリの再導入の進め方や解析結果を参考に計画の立案がなされている。

4）国土交通省と兵庫県による円山川水系自然再生計画の検討と推進において、事業に対する評価のひとつとしてコウノトリの行動・生態情報が使われている。

5）環境省ヤンバルクイナ保護増殖事業で、小型発信機の装着方法はすでに野生復帰個体の追跡に用いられている。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

1）これまで、トキ野生復帰事業では3歳以上の個体やエンゼルウィング・チアミン欠乏症の発症履歴のある個体も放鳥候補としていた。しかし、今後は、トキの再導入成功率を高めるために、2歳以下の病歴のない自然育雛個体のみを放鳥するのが望ましい。また、DRD4多型ハプロタイプⅣが放鳥後の生存率を低くすることが判明した。このため、将来的にはDRD4多型情報に基づきハプロタイプⅣをホモ接合で持たない個体を放鳥することが望ましい。トキの野生復帰事業において放鳥個体選択の新たな指針作成のための基礎資料となる。

2）日本のトキの飼育個体群の遺伝的多様性は、中国個体群の6割強程度しかないことが確認できた。この研究成果に基づいて、分子マーカーを利用した継続的な遺伝的多様性評価を行っていくことで、繁殖能力や生存能力の低下阻止につながる近親交配の回避および遺伝的多様性の最大限の維持と拡大を目指した遺伝的管理を行うことが可能となる。

3）環境省の種の保存法で国内希少野生動植物種に指定されている絶滅危惧種の保護増殖計画や野生復帰計画において、最も困難な課題は人との共生による保全である。コウノトリやトキの再導入計画は、持続可能な開発の基での絶滅危惧種の保全を目指した取組みであることから、今回、得られたデータや解析結果、および管理の方法は、その参考になると見込まれる。

4）環境省ヤンバルクイナ保護増殖事業で、今後、野生復帰個体の選択に、若齢、自然ふ化、自然育雛個体等を用いる手法、野生順化訓練の実施の参考になる。

5）希少鳥類の再導入事例の比較研究より作成した、希少鳥類の再導入実施方法のフロー図は希少種の再導入施策を立案するための参考資料となる。希少種の再導入事例の比較からいえることは、再導入は、絶滅危惧種に至った減少要因を取り除いてから実施しないと成功しない。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

## <査読付き論文>

1) Y. TANIGUCHI, H. MATSUDA, T. YAMADA, T. SUGIYAMA, K. HOMMA, Y. KANEKO, S. YAMAGISHI and H. IWAISAKI: PLoS One, 8, e72781 (2013), “Genome-wide SNP and STR discovery in the Japanese crested ibis and genetic diversity among founders of the Japanese population.”

2) K. URANO, K. TSUBONO, Y. TANIGUCHI, H. MATSUDA, T. YAMADA, T. SUGIYAMA, K. HOMMA, Y. KANEKO, S. YAMAGISHI and H. IWAISAKI: Zoolog. Sci, 30, 432-438 (2013), "Genetic diversity and structure in the Sado captive population of the Japanese crested ibis."

3) K. KANEKO, E. UEMATSU, Y. TAKAHASHI, B. TONG, S. TAKINO, Y. WAJIKI, T. KIMURA, H. YAMASHIRO, Y. KANEKO, H. IWAISAKI, T. SUGIYAMA, T. YAMADA and S. YAMAGISHI: Reprod. Domest. Anim, 48, 1001-1005 (2013), “Semen collection and polymerase chain reaction-based sex determination of black-headed and straw-necked ibis.”

4) K. TSUBONO, Y. TANIGUCHI, H. MATSUDA, T. YAMADA, T. SUGIYAMA, K. HOMMA, Y. KANEKO, S. YAMAGISHI and H. IWAISAKI: Anim. Sci. J, 85, 356-364 (2014), “Identification of novel genetic markers and evaluation of genetic structure in a population of Japanese crested ibis.”

5) Y. WAJIKI1, Y. KANEKO, T. SUGIYAMA, T. YAMADA and H. IWAISAKI: Jpn. J. Zoo Wildl. Med, 19, 57-67 (2014), “Demographic Analyses in the Japanese Captive Population of Japanese Crested Ibis (Nipponia nippon).”

6) Y. TANIGUCHI, K. MATSUMOTO, H. MATSUDA, T. YAMADA, T. SUGIYAMA, K. HOMMA, Y.
Asia Pacific Poultry Conference (2014)

“Genomic relatedness among founders assessed using putative SNP data in the Japanese population of the Japanese crested ibis”

7) 永田尚志、中津弘、高橋雅雄：第62回日本生態学会大会（2015）

「放鳥トキの繁殖成功に影響を与える要因について」

8) 永田尚志: 日本鳥学会2015年度大会 (2015)

「再導入されたトキの繁殖成績に影響を与える要因の予備解析」

9) K. NAITO: The 5th NIE Forum: International Symposium on Ecological Research in Consilience, Seocheon (2015)

“Mutli-disciplinary approach to the reintroduction of Oriental White Stork”

10) H. Nagata, H. Nakatsu, N. Yamamura: The 5th International Wildlife Management Congress, Sapporo, (2015).

“Management of Reintroduced Population of Crested Ibis in Sado Island, Japan”

11) 松本啓佑、谷口幸雄、松田洋和、山田宜永、杉山稔恵、本間航介、金子良則、山岸哲、祝前博明：日本畜産学会第 119 回大会（2015）

「トキMHCクラスI領域のゲノム構造の解析」

12) 永田尚志，山田宜永，中津弘，油田照秋：第63回日本生態学会大会（2016）

「何が放鳥トキの生存に影響をあたえるのか？」

13）内藤和明：第63回日本生態学会大会(2016)

「コウノトリの持続的な野外個体群の確立に向けた取り組み」

14) 池秉及智、永田尚志、高橋雅雄、杉山稔恵、金子良則、祝前博明、山田宜永：日本畜産学会第 121 回大会 (2016)

「日本産トキ集団におけるDRD4遺伝子と生存率、行動特性との関連解析」

### 7. 研究者略座

課題代表者: 永田 尚志

九州大学理学部卒業、理学博士、国立環境研究所主任研究員、現在、新潟大学・研究推進機構・朱鷺・自然再生学研究センター教授

## 研究分担者

## 1 ) 大迫義人

京都大学理学部卒業、理学博士、福井県自然保護センター企画主査、現在、兵庫県立大学・自然・環境科学研究所、准教授

## 2 ) 内藤和明

広島大学総合科学部卒業、博士（学術）、姫路工業大学講師、現在、兵庫県立大学・自然・環境科学研究所、准教授

## 3 ) 尾崎清明

東邦大学理学部卒業、理学博士、現在、公益財団法人山階鳥類研究所、副所長、保全研究室長（兼務）

## 4 ）山田 宜永

京都大学農学部卒業、医学博士、徳島大学助手、京都大学農学研究科准教授、現在、新潟大学農学部、教授

## 5 ) 杉山 稔恵

新潟大学農学部卒業、博士（学術）、新潟大学農学部助教、現在、新潟大学農学部、准教授
4-1302 再導入による希少鳥類の保全手法の確立に関する研究

（1）トキの繁殖成功に影響を与える要因の解明と希少鳥類の再導入手法の確立に関する研究新潟大学

研究推進機構・朱鷺自然再生学研究センター 永田尚志

<研究協力者>

新潟大学・朱鷺自然再生学研究センター 高橋雅雄（平成25～26年）

新潟大学・朱鷺自然再生学研究センター 中津 弘（平成27年）

新潟大学・朱鷺自然再生学研究センター 油田照秋（平成27年）

平成25～27年度累計予算額：39,423千円（うち平成27年度：14,116千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨]

トキの再導入を成功させるには、まず、野外で放鳥個体が生存定着し、生存個体が番いを形成し、繁殖を成功させて子孫を残し自立的な個体群を形成する必要がある。環境省から提供されたトキの飼育下の情報をもとに個体情報データベース、飼育履歴データベースを構築した。また、

2010-2015年の野生下の生存・繁殖状況をもとに野外繁殖状況データベース、生存状況データベースを構築した。このデータベースを使って、個体特性・飼育履歴が飼育下の放鳥個体の生存率に与える要因を解析した。発信機の装着個体、エンゼルウィング・チアミン欠乏症の発症履歴は放鳥後の生存率が低いのに対して、自然育雛個体、および、若い個体が放鳥後の生存率が高いことが明らかになった。また、自然育雛個体、および、若い個体は、飼育訓練下でもすぐに新しい餌場を利用し、放鳥後、早い時期に既存の群れに参加でき、放鳥後半年間の生存率が高いことが明らかになった。若い自然育雛個体は新規開拓性が強く順応性も高いため、放鳥後の生存率が高いと考えられた。野外・飼育下とも初卵日が早いほど、繁殖成功率が高く、飼育下では巣立ち雛数も多くなっていた。また、雌親が自然育雛の番いでは、人工育雛の番いより繁殖成功率が高まる傾向が見られた。このため、トキの再導入成功率を高めるには、チアミン欠乏症・エンゼルウィングの発症履歴のある個体、3歳以上の個体、人工育雛個体の放鳥を止めて、2歳以下の自然育雛個体を放鳥するのが望ましいといえる。また、グアム、ニュージーランド、モーリシャスで希少鳥類の再導入事例を調査し比較することで、希少鳥類の再導入実施方法の手順をフロー図に整理した。希少種の再導入事例の比較からいえることは、絶滅危惧種に至った減少要因を取り除いてから実施しないと再導入の成功は見込めない。また、フロー図は希少種の再導入の参考にできるが、対象種の生態情報をもとにした調整が必要になる。

[キーワード]

絶滅危惧種、再導入、生存率、飼育履歷、個性
### 1. はじめに

2010年、名古屋で開催された生物多様性条約締結国会議（COP10）で合意された愛知目標では、絶滅危惧種の絶滅や減少を防ぐことが5つの戦略目標のひとつとされている。野外でいったん絶滅した場所に個体を放して野生生物を復活させることを再導入とよんでいる。生物多様性を回復させるために、世界中で最近20年間に約500種の動物で再導入が実施されているが、再導入の成功率は飼育繁殖個体では15％と低く¹）、試行錯誤に頼っているのが現状で、技術として確立されているとはいえない。日本国内でも、種の保存法で国内希少野生動植物種に指定された82種のうち15種の鳥類で保護増殖事業計画が策定されている。希少鳥類の飼育個体群を適切に管理し確実な再導入技術を確立することは、劣化した生物多様性を回復し保全する重要な手法のひとつと考えられ、愛知目標を達成する我が国の主要行動目標の一つとして、希少種の生息域外保全と野生復帰の推進が掲げられている²）。

## 2 ．研究開発目的

2005年に兵庫県豊岡市でコウノトリが、2008年には新潟県佐渡島においてトキの再導入が開始され、2010年にはヤンバルクイナの再導入のための飼育繁殖施設が建設された。コウノトリは野外での近親交配の問題が顕在化し、トキは野外での繁殖成功率が低く放鳥によって個体群がかろうじて維持されている状況にある。そこで、再導入の途上にあるヤンバルクイナ、トキ、コウノトリを対象として、飼育下の個体の履歴、行動・生理状況、遺伝子プロファイルが、放鳥後の個体の定着および繁殖成功にどのように影響を与えているかを明らかにすることで、対象種の再導入を成功に導く最善の手法を提案することを目的としている。さらに、世界中で行われている希少鳥類の再導入事例の比較研究により希少鳥類の再導入の成功率を高める手法の一般性を抽出することで、希少鳥類の再導入の成功確率を高める飼育個体群の管理手法を確立することを目的としている。

個体が持つ行動様式や性質が、生存や繁殖成功などの個体差は、飼育下繁殖における育ち方の違いや、個体が有する遺伝子型の差異によって個体差が生じ、再導入の成功に大きく影響すると考えられる。本サブテーマでは、トキにおいて、既放鳥個体の飼育下の情報（飼育履歴）、および、放鳥後の生存日数、繁殖状況のデータベースを構築した。また、新規放鳥個体の放鳥訓練中の行動、放鳥直後の行動を定量的に評価し、これらの個体差の検出を試み、個体差が再導入の成功に与える影響を解明した。また、飼育下および放鳥個体群の個体差を生み出す遺伝的変異を解析するために、放鳥直後の行動を定量化し、中立なマイクロサテライトDNA多型多型のプロファイルとの関連を解析し、適応性形質であるDRD4遺伝子に関わる行動・生態的形質を整理した。

## 3 ．研究開発方法

## 1 ) トキの再導入成功に影響を与える要因解析

トキの飼育増殖を行っているトキ保護センターでは、飼育管理カード、個体管理カード、繁殖ペアモニタリング記録、自然孵化・育雛記録、孵卵記録・人工育雛記録、飼育日誌など様々な種類の記録がとられている。このうち、個体管理カード、繁殖状況概要は電子データであるが、その他の大部分の情報は紙ベースで蓄積されている。放鳥トキについての情報について、環境省佐渡自然保護官事務所を通して入手し、トキの再導入個体の飼育情報を個体情報データベース、飼
育履歴データベースを、トキ保護増殖事業報告書（2004-2015年）をもとに飼育繁殖データベースを構築した。また、2010-2015年の繁殖状況をもとに放鳥個体の繁殖成績データベースとサブテーマ4から提供されたマイクロサテライト多型情報をもとに遺伝子データベースを構築した。発信機の有無、放鳥年齢、性別、体重、跗蹠長、嘴峰長などの個体情報のほか、育雛形態、孵化形態、一腹雛数、クラッチ順、クラッチ内孵化順、エンゼルウィングとチアミン欠乏症の発症履歴、傷病履歴、捕獲回数などの飼育履歴情報をデータベース化した。野外の繁殖成績情報としては、巣ごとに、雌雄の情報、クラッチ順、初卵日、巣位置、一腹卵数、一腹雛数、失敗日、受精卵の有無、失敗要因等をデータベースに組み込んだ。各データベースは、Filemaker Pro™を用いてリレーショナル構造で結びつけることで、放鳥したトキの飼育履歴と野外での生存率、繁殖成績を結びつけることができる（図(1)-1）。

図(1)-1 データベース間のリレーションナル構造例

トキの再導入の成功には、まず、放鳥個体の生存し、次に、生存個体が繁殖に成功することが重要である。そこで、構築したデータベースを用いて、最初に、放鳥トキの飼育履歴、家系や遺伝特性が野外での生存率に与える要因を統計モデルで解析し、次に、繁殖成績に与える要因を統計モデルで解析した。個体の飼育履歴では、親鳥が抱卵して孵化させた個体を「自然孵化」、同様に親鳥（または、里親）が巣立ちまで育て上げた個体を「自然育雛」とした。逆に、孵卵器で孵化させた個体を「人工孵化」個体、飼育員が育て上げた個体を「人工育雛」個体とした。育雛途中で保護された個体の場合、巣立ち時に親鳥（里親も含む）が育てていたか、人の手で育てていたかで人工育雛か自然育雛かを判別した。

## 2 ）放鳥訓練中の行動特性の解析

放鳥訓練中の個体の行動特性を評価するために、3ヶ月の訓練期間（10～13回放鳥、表(1)-1）に、赤外線センサー付の自動撮影装置（センサーカメラ）（SG560P-8M）計8台を順化ケージ内に設置して、本研究期間に実施された第9回～第13回放鳥個体の3ヶ月の訓練期間中の採餌行動を記録した。順化ケージに配置された計9つの池のうち放鳥口から近いG池及びA池にセンサーカメラを設置した（図（1）-2）。

9つの池のうちA、B1/B2、Cの各池には、餌のドジョウが訓練初期から投入されるのに対して、