Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
ため、2010年1月31日～2月6日にかけて、タイ・ベトナムにおいて現地視察と予備的な聞き取り調査を実施した。調査地点には、さまざまなタイプのアオコ発生水域が含まれるよう工夫し、水域とその周辺の写真撮影などの記録と聞き取り調査を行った。

また、2011年2月14日から18日にかけて、オーストラリア・ニューサウスウェールズ州におけるアオコ管理を対象として、文献調査と現地調査を行った。

ケニア・ビクトリア湖（ウィナム湾）におけるアオコと周辺社会の関わりについて明らかにするため、①カウンターパートとのコミュニケーション及び②インタビューから成る下記調査を実施した。2010年9月から2011年7月にかけて、カウンターパートであるケニア海洋水産研究所キスムリサーチ・センターの協力のもとで、同研究所所属のジョン・ギチュキ（John Gichuki）博士、ツマ・ジェンベ（Tsuma Jembe）博士らと情報交換をおこない、現地で聞き取り調査を実施する地域と調査対象者を選択するためのデータを得た。さらに、2011年8月19日から8月24日にかけて、ケニア・ビクトリア湖（ウィナム湾）沿岸及び流域の利害関係者に対する聞き取り調査を実施した（表(1)-1）。調査対象の地域・組織は、アオコによる害を受けている、もしくは、アオコの要因である富栄養化や土壌流出に関わっている関係者から抽出した。具体的には、アオコの害を受ける側として、ビクトリア湖沿岸漁村（7箇所）、リゾート施設（1）、浄水施設（1）、飲料品工場（1）を選んだ。また、ビクトリア湖へ環境負荷をもたらす側として、沿岸にある水産加工工場（1）、下水処理施設（2）、さらに、ビクトリア湖流域上流に位置するサトウキビ農場（1）、砂糖工場（1）、茶農園（1）、茶工場（1）を選んだ。

各々の調査地では1名～20名の情報提供者に対して聞き取り調査を実施した。所要時間は30分～1時間30分であった。インタビューでは、アオコから受ける被害の状況やアオコ問題に対する対応、そして、アオコ問題を含むビクトリア湖の環境問題に関する意見を尋ねた。また、調査地に関する背景理解のため、調査対象組織の歴史や調査地周辺の環境問題について尋ねた。また、流域の農園や工場では環境負荷削減の手法について質問した。用意した質問項目に一定沿う形式で調査したが、状況に応じて項目を適宜省略・追加した。

## 3 ）アオコに関する科学的知識啓発の小冊子作成

2010年度までの研究結果から、アオコについて一般市民と専門家の認識の違いや地域による認知度の違いが見られることがわかった。たとえば、同じ淀川流域内部でも、地域によってアオコに対する認知度は大きく異なっている（図(1)-3）。アオコに対する社会的関心を醸成し、アオコ監視・対策への市民参加を促進するためには、アオコに関する知識の啓発が必要と考えられた。そこで、容易に入手可能な小冊子を作成することを企画した。

## 4 ）アオコ発生GISデータ（Cyanomap Japan）の作成

日本国内で近年シアノバクテリアが採取された水域もしくはアオコが発生した水域の情報を文献・ウェブサイトから収集した（表(1)-2）。続いて、収集した水域の緯度・経度を電子国土ポータル及びGoogle Mapを利用して求め、水域の名称・緯度経度・情報源情報等を表形式（cyanomapjapan.xls）で整理した。最後に、この表データを変換して、シェープファイル（ポイントデータ、cyanomapjapan.shp）を作成した。
表(1)-1：ビクトリア湖周辺での調査対象者と調査実施日

No	date	name of site	memo
1	19-Aug-11	East African Seafood Ltd.	Seafood factory
2	20-Aug-11	Kichinjio B.M.U.	Fishing village
3	Equator Bottlers Ltd. (Coca Cola)	Bottlers
4	Dunga B.M.U.	Fishing village
5	Kiboko Bay Resort	Beach resort (Restaurant and hotel)
6	21-Aug-11	Mitimbili B.M.U.	Fishing village
7	Ngengu B.M.U.	Fishing village
8	22-Aug-11	Koginga B.M.U.	Fishing village
9	Mbita Town B.M.U.	Fishing village
10	Nyagina B.M.U.	Fishing village (Rusinga island)
11	23-Aug-11	Chemelil Sugar Company Ltd.	Sugarcane factory
12	Chemelil location	Sugarcane farmers
13	Taito location teafarmers (Nandi East District, Nandi Hill Division)	Tea farmers
14	Nandi Tea Estates Limited	Tea factory
15	24-Aug-11	Dunga Treatment Plant (KIWASCO) (Kisumu Water and Sewewage Corporation)	Water supplying plant
16	Kisat Treatment Plant (KIWASCO)	Sewage plant
17	Nyalenda Lagoons (KIWASCO)	Pond (Sewage system)

図(1)-3：地域別に見たアオコの認知度。2006年実施の社会調査において、「アオコ」について聞いた経験があると回答した人の割合（田中・坂上・大野，未発表データ）
表(1)-2：資料名及び作業内容とそれぞれの情報源で得られた水域数

資料名及び作業内容	水域数
彼谷邦光（2001）『飲料水に忍びよる有毒シアノバクテリア』裳華房	59
渡邊貞之（2007）『日本アオコ大図鑑』誠文堂新光社	72
水資源機構（2004）『環境報告書2004』	16
水資源機構（2011）『環境報告書2011』	18
都道府県ウェブサイトにおけるサイト内検索	65 *
国立科学博物館の『浮遊性藍藻データベース』	5 *
環境庁の『自然環境保全基礎調査　湖沼調査』（第3回及び第4回）	16
アオコプロジェクト（環境省地球環境総合研究推進費D-0905）における内湖調査	4

$ ^{*} $ の数は新たに抽出した水域の数である。

## 4 ．結果及び考察

## （1） アオコの分布拡散・発生状況

### 1 ）西日本各地におけるM. aeruginosa遺伝子型の分布

国内18か所、235株の39遺伝子型について解析を行った（図(1)-4）。mcy G遺伝子の有無による毒生産遺伝子の有無の検出では、21遺伝子型が毒生産株、18遺伝子型が毒非生産株に区別された。系統樹を作成した結果、毒株は近隣のクラスターにまとまる傾向があった。各クラスターには様々な地点の遺伝子型が混在し、地点ごとにまとまって形成されるクラスターは存在しなかった。また、同一の遺伝子型が地理的に異なる場所から検出された（たとえば、福岡県白水大池SR5番株と、愛媛県古池FR2番株が同一）。このことから、ITS領域を使用した解析では地理的分化は見られず、各地に同じ遺伝子型が存在していることが明らかになった。また採水地点によって、優占している遺伝子型数の傾向が異なり、大きく分けて2タイプが存在した（図(1)-5）。一つは、多様な遺伝子型がだいたい等頻度に混在するタイプ（例えば琵琶湖南湖、諫早調整池など）、もう一つは特定の遺伝子型が全体に占める割合の高いもの（たとえば伊庭内湖、白水大池）であった（図(1)-5）。

## 2 ）アオコ発生時に特異的な細菌群集の検出

2010年10月から11月にかけて西日本各地の24の湖沼から得られた試水について、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（DGGE法） $ ^{24)} $ によりDNA断片のバンドパターンを得た。このバンドパターンを、PRIMER-E (v6.PRIMER-E Ltd, Plymouth, UK)を用いて、非計量的多次元尺度構成法(NMDS法) $ ^{31)} $ と類似度行列分析（ANOSIM法） $ ^{31)} $ を用いて、群集解析を行った。

採水した24湖沼のうち、7湖沼においてM. aeruginosaのブルームが発生していた（図(1)-6）。各湖沼のDGGEバンドパターンをANOSIMにより解析した結果、M. aeruginosaのブルームの発生している湖沼と発生していない湖沼との間に、細菌群集組成に有意な違い $ (p<0.01) $ があることが明らかになった（図(1)-6）。この結果は、アオコの発生が細菌群集組成を変化させていることを示唆しているが、アオコのどのような影響が当該水環境の物理・化学環境あるいは生物環境の変化を起こしているのかは、本研究では解明できなかった。
図(1)-5: 優占遺伝子型の組成の違い (代表例のみ示す)

図(1)-6：ANOSIMによるDGGEバンドパターンに基づく細菌群集構造の違い（p<0.01）。点線で囲まれたプロットの湖沼では、アオコが発生していなかった。番号：1－3、尖道湖；4－11、奈良県の湖沼；12、広沢池（京都）；13－14、琵琶湖；15－17、愛媛県の湖沼；18－24、琵琶湖内湖。

図(1)-4：近隣結合法により作成した系統樹。●は毒保有株を示す。

（２）日本国内におけるその他の有害ラン薬類の分布状況

1）その他の有毒ラン藻類の単離培養と形態・系統・生態学的特性評価、および定量PCRマーカーの開発

6水域から合計60株のC. issatschenkoiを単離した。16S-23S rDNA intergenic spacer (ITS)領域の配列情報から、これらの株は10遺伝子型に分類することが出来た（表(1)-3）。また、形態よりC. issatschenkoiと判断された全ての株はATXが陰性でnifHは陽性を示し、窒素固定能は有するがアナトキシン-a合成能は持たないことが考えられた。一方、形態よりR mediterranea var. grandisと判断された全ての株はATXは陽性、nifHは陰性を示し、これまでに琵琶湖で報告のあったアナトキシン-a生産株のR mediterranea var. grandisの特徴と一致した $ ^{39} $ 。

次に、単離培養した全ての株について、16S-23S rDNA ITS領域の塩基配列に基づき分子系統解析を行ったところ、全てのR mediterranea var. grandisの遺伝子型はC. issatschenkoiの遺伝子型と同一のクラスターに含まれた（図(1)-7）。そのため、アナトキシン-a生産能を持つR. mediterranea var. grandis株は、ヘテロシスト生産能とnifH遺伝子が欠損してるC. issatschenkoiの系統と考えられた。
表(1)-3: 水域から単離した Cuspidothrix issatschenkoi および Raphidiopsis mediterranea var. grandis の特性。a はアナトキシン-a 合成遺伝子、b はニトロゲナーゼリダクターゼ遺伝子を示す。

地点	形態種	単離株	遺伝子型	ATX $ ^{a} $	nifH $ ^{b} $
霞ヶ浦	C. issatschenkoi	5	3	-	+
R. mediterranea var. grandis	1	1	+	-
北浦	C. issatschenkoi	8	3	-	+
平湖	C. issatschenkoi	6	1	-	+
R. mediterranea var. grandis	11	3	+	-
中池	C. issatschenkoi	11	1	-	+
R. mediterranea var. grandis	2	1	+	-
合野池	C. issatschenkoi	5	2	-	+
実験池	R. mediterranea var. grandis	11	3	+	-
Total	60	10

図(1)-7:6 水域から単離した Cuspidothrix issatschenki (CUS)および Raphidiopsis mediterranea var. grandis (RMG)の分子系統学的関係。

次に88湖沼で採取したサンプルをARISAおよび定量PCRを用い解析を行ったところ、24カ所のサンプルでC. issatschenkoiが検出され、このうち、16カ所でアナトキシン-a生産株が検出された（表(1)-4）。そのため、C. issatschenkoiの有毒株と無毒株では分布や環境特性が異なる可能性が示唆された。また、18項目環境要因についてアナトキシン-a生産株が検出された水域と検出されなかった水域の2群に分けブートストラップ検定を行ったところ、pH、溶存体無機リン濃度、全有機炭素/全有機窒素および全有機炭素/全有機リンで有意な差が認められた（表(1)-5）。そのため、C. issatschenkoiのアナトキシン-a生産株はpHが高く栄養塩（窒素・リン）制限がかかりにくい水域で出現していると考えられた。
表(1)-4: Cuspidothrix および Raphidiopsis の出現状況とアナトキシン-a 生産株の C. issatschenkoi の細胞密度。

Stn No.	ARISA	ATX $ ^{a} $	有毒株の細胞密度
Raphidiopsis (399-401bp)	Cuspidothrix (411-413bp)	(467bp)	(±SD) cells L $ ^{-1} $
1	-	+	+	2.5 (±0.3) $ \times $ 10 $ ^{4} $
4	-	+	+	7.4 (±0.2) $ \times $ 10 $ ^{4} $
5	-	+	+	3.5 (±0.5) $ \times $ 10 $ ^{4} $
7	-	-	+	N.D.
8	-	+	-	N.D.
18	-	+	-	N.D.
19	-	+	+	6.4 (±0.4) $ \times $ 10 $ ^{4} $
22	-	+	-	N.D.
24	-	+	+	4.9 (±0.1) $ \times $ 10 $ ^{5} $
39	-	+	+	1.8 (±0.2) $ \times $ 10 $ ^{5} $
41	-	+	+	3.4 (±0.2) $ \times $ 10 $ ^{4} $
43	+	-	-	N.D.
47	+	+	+	2.0 (±0.1) $ \times $ 10 $ ^{5} $
49	+	+	-	N.D.
50	+	+	+	9.8 (±0.9) $ \times $ 10 $ ^{5} $
52	+	-	-	N.D.
61	-	+	+	4.9 (±0.3) $ \times $ 10 $ ^{5} $
62	-	+	-	N.D.
68	-	+	-	N.D.
72	-	+	-	N.D.
75	+	+	-	N.D.
77	+	+	+	2.8 (±0.2) $ \times $ 10 $ ^{6} $
78	-	+	+	6.3 (±0.2) $ \times $ 10 $ ^{4} $
79	-	+	+	2.0 (±0.2) $ \times $ 10 $ ^{5} $
81	-	+	+	5.9 (±0.8) $ \times $ 10 $ ^{4} $
84	-	+	+	9.0 (±1.0) $ \times $ 10 $ ^{4} $
88	-	+	+	5.0 (±0.6) $ \times $ 10 $ ^{6} $
Total	7	24	17	16

琵琶湖で単離されたR. mediterranea var. grandis LBRI48は、Raphidiopsis属でアナトキシン-aおよびホモアナトキシン-a生産能があることが報告されている唯一の株として知られているが $ ^{39} $ 、本種については形態および生態学的研究例が少なく、分類学的根拠が十分でないとの指摘もあった $ ^{38} $ 。本研究により、日本に分布するR. mediterranea var. grandisの多くは窒素固定能を欠いたC.

issatschenkoiの一系統であることが強く示唆された。また、アナトキシン-a生産株のC. issatschenkoiは、R. mediterranea var. grandisとして1970年代に霞ヶ浦（茨城）および天塩川（北海道）で報告があるのみだが $ ^{38} $ 、1990年代には琵琶湖（滋賀）でアナトキシン-a生産株が単離がされており $ ^{39} $ 、本研究を行った2011年には四国（香川県）以東に広く分布していた。チェコ共和国では、C. issatschenkoiは現在も分布を拡大している侵入種と位置付けられている $ ^{12} $ が、日本でも同様の状況と考えられた。

日本ではアナトキシン-a生産能を持つラン薬類が検出されることが少なく、これまで、研究および水源管理上の監視対象となることは少なかった。本研究により、アナトキシン-a生産株のC.issatschenkoiは、海外での報告と同様、近年にその分布が拡大していることが強く示唆された。そのため、水源維持や公衆衛生上、日本でも新たな外来有害藻類の侵入と分布拡大を監視することと共に、分布拡大経路やその要因の解明が必要と考えられる。
表(1)-5: ブートストラップ検定により求めたアナトキシン-a 生産株の C. issatschenkoi 存否間における各環境要因の有意差

環境要因	全データ (N=88)	存在 (N=16)	非存在 (N=72)	有意確率
Mean	SD	Mean	SD	Mean	SD
水温 (°C)	19.2	1.3	19.4	1.1	19.2	1.3	n.s.
pH	7.9	0.8	8.4	0.9	7.8	0.7	<0.001
導電率 (mS/m)	13.5	10.2	14.3	6.8	13.3	10.9	n.s.
濁度 (NTU)	50.8	262.2	26.9	32.8	22.6	52.3	n.s.
Chl.a ( $ \mu $ g L $ ^{-1} $ )	123.5	573.1	78.0	68.0	60.5	115.0	n.s.
TOC (mg L $ ^{-1} $ )	7.4	21.8	6.2	3.9	4.9	3.9	n.s.
TN ( $ \mu $ g L $ ^{-1} $ )	2046.9	8180.4	1260.5	561.3	1164.4	1032.4	n.s.
TP ( $ \mu $ g L $ ^{-1} $ )	187.3	760.2	93.0	63.1	110.6	143.8	n.s.
DIN ( $ \mu $ g L $ ^{-1} $ )	405.5	481.5	294.1	340.7	430.2	506.1	n.s.
DIP ( $ \mu $ g L $ ^{-1} $ )	26.5	48.0	9.9	11.9	30.2	52.1	<0.001
NO $ _{3} $ -N ( $ \mu $ g L $ ^{-1} $ )	363.9	460.0	257.5	331.7	387.5	482.6	n.s.
NO $ _{2} $ -N ( $ \mu $ g L $ ^{-1} $ )	8.6	10.3	9.9	10.1	8.3	10.4	n.s.
NH $ _{4} $ -N ( $ \mu $ g L $ ^{-1} $ )	33.0	55.4	26.7	37.3	34.4	58.8	n.s.
TN/TP	23.6	34.2	16.9	9.5	25.1	37.5	n.s.
TON/TOP	12.3	6.6	12.5	4.7	12.3	7.0	n.s.
TOC/TON	10.1	9.2	7.4	3.5	10.7	9.9	<0.001
TOC/TOP	114.2	86.8	89.3	42.9	119.7	93.1	0.045
DIN/DIP	101.7	298.5	52.0	91.1	112.8	326.7	n.s.

## 2 ）日本国内におけるその他の有害ラン薬類の分布状況

ARISA法の結果、解析を行った88水系のうち60水系でラン藻類が検出された（68%）。それぞれの場所で、1から13の配列長が観察された。このうちMicrocystis属が41水域（68%）、

Cylindrospermopsis属・Raphidiopsis属が7水域（11.7%）、Cuspidthlix属が21水域（35%）、Dolicospermum属・Anabaenopsis属が38水域（63%）、Oscillatoria属が1水域（1.6%）、そしてMerismopedia属が2水域（3.3%）で検出された。その他、配列長で現時点では配列情報がなく種判別が不可能なラン藻類が検出され、この手法の有効性が示唆された。ラン藻類が検出された場所で、UPGMAを使用した類似度とARISAのバンドパターンを解析した（図(1)-8）。UPGMAのクレードとARISAのバンドパターンは同様の傾向を示し、主に①Dolicospermum属・Anabaenopsis属優占するグループ、②Microcystis属が優占するグループ、③他の未知のラン藻類種が優占するグループ、の3つに分類された。各クレード内では、類似度はすべて80%以上と高い数値を示した。

ラン薬類の生残と環境要因との関係を検討した結果について、外れ値1か所を除いた87か所の環境パラメーター値をBox plotにより図(1)-9に示した。ラン薬類群集の存否と環境要因の関連を調べるため、ランダマイゼーションテストを行った結果、pH、濁度、TON、及びDINで有意差がみられた(図(1)-10)。このことから、ラン薬類群集は、相対的に高いPH、高い濁度、高いTONと低いDINを示す場所で発生していることがわかった。また、CAA解析の結果、F1とF2軸により57.1%が説明された(図(1)-11)。また高い濁度の場所でMerismopedia属がみられ、高いクロロフィルとTOPの場所でMicrocystis属が検出された。

トキシタイピングを用いたラン藻毒を検出した結果、microcystinとnodularin (HEP)は58水域で検出され、52水域からMicrocystis由来のmcyE遺伝子が検出された。一方、ARISA法では38水域で
図(1)-8：ARISA法を用いた有害ラン薬類の検出バンドパターン（右）と、UPGMAにより作成した地点間の薬類出現類似度（左）。右：バンド濃淡はその種のその水域での相対存在比率を表し、番号は、採水地点を示す。C&R; Cylindrospermopsis 属と Raphidiopsis属, D&A; Dolicospermum属と Anabaenopsis属, MCR; Microcystis属, OSC; Oscillatoria属, MRS; Merismopedia属。

Dolicospermum属・Anabaenopsis属の存在が検出されたが、これらの水域でAnabaena由来のmcyE遺伝子は検出されなかった。また、16水域でアナトキシン-aとホモアナトキシン-aが検出されたが、cylindrospermopsin合成遺伝子とSaxitoxin-aは検出されなかった。これらの結果から、Hodoki et al (2012) $ ^{12} $ と同様の傾向が見られ、日本ではmicrocystinの主要な生産者はMicrocystis属であり、microcystin生産株のPlanktothrixおよびAnabaena spp.の存在は稀である結果が支持された。

## （３）水鳥によるアオコの拡散

## 1 ）水鳥生息・渡来状況調査

文献調査により、全国的にガンカモ類・ハクチョウ類は主に冬期に毎年約200万羽、シギ・チド
図(1)-9：全国88か所のうち外れ値を除いた87か所の環境パラメータ一値（Box plotによる表記）。

図(1)-10: ランダマイゼーション検定の結果有意差がみられた環境要因。**, p<0.05

図(1)-11：CAA解析の結果。左；サンプリング地点、右：フラグメント長。
リ類は春や秋、冬期に約3〜8万羽が記録されていること、日本は渡り性水鳥の中継地で、ガンカモ類は東南アジアからユーラシア大陸東部・北米大陸、シギ・チドリ類はオーストラリア・東南アジアからユーラシア大陸東部・アラスカ間を渡ること、またサギ類は日本から中国南部・台湾・フィリピンへ渡ることから、水鳥は日本と大陸間の湖沼を頻繁に行き来していることがわかった。

琵琶湖内湖32ヶ所の現地踏査では、35種（家禽のシナガチョウ、アヒルを含む）、7016羽が記録された。2009年7〜9月の調査では、伊庭内湖でのみM. aeruginosaブルームの発生が認められ、翌年冬期に行った水鳥調査では本湖の水鳥の個体数及び密度が最も高かった（図(1)-12）が、次に水鳥の渡来の多かった西の湖や水鳥密度の高い平湖では、M. aeruginosaブルームは見られなかった。

図(1)-12：琵琶湖内湖における水鳥確認個体数とアオコの発生状況

## 2 ）水鳥体表面及び糞からのシアノバクテリアDNAの検出

水鳥がアオコを輸送する科学的証拠を得るため、水鳥の糞からのM. aeruginosa遺伝子の検出を行い、163のサンプルについて分析を行った。検討した糞の73%にシアノバクテリアが含まれており、シアノバクテリアのうちMicrocystis属は16.6%の糞から検出された（表(1)-6）。また、干渦で捕獲したシギ類の糞からMicrocystis属が確認された。シギ類は淡水湿地も利用するため、隣接した淡水池で発生していたアオコを運んだ可能性がある。日本に飛来するカモ類やシギ類の多くは、春に中国北部やロシア東部、アラスカ等へ渡るので、広範囲にアオコを伝播する可能性があるが、水鳥がアオコをどの程度保持するのか、糞として排出されるまでの時間や糞中のアオコの状態について調べる必要が生じた。

## 3 ）水鳥によるアオコの内部散布

マガモから排泄された糞を蛍光頭微鏡で観察すると、完全な形を保っているM. aeruginosaの細胞がみつかった。培養したM. aeruginosaを飼育しているマガモに飲ませると、排泄時間のピークは平均2時間後で、最長で24時間後まで排泄が確認できた（図(1)-13）。M. aeruginosaの回収率は、平均15.9%であった。糞中のM. aeruginosaのDNAは、10日後まで検出された（図(1)-14）。2時間後に排泄された糞に含まれるM. aeruginosaの細胞を拾い出して、1細胞から培養すると、培養成功率はマガモの個体当たりでは33%（2/6個体）、培養細胞当たりでは1.6%（2/126個体）であった。通常は培養株を1細胞から培養するとほぼ100%増殖するので、今回の培養成功率の低さはマガモの消
表(1)-6：水鳥の糞からのシアノバクテリアおよびM. aeruginosaのDNAの検出（検出サンプル数／総サンプル数）。

場所	鳥種	シアノバクテリア	Microcystis
霞ヶ浦(茨城)	コブハクチョウ	22/33	1/33
千波湖(茨城)	コブハクチョウ・コクチョウ	24/32	12/32
谷津干潟(千葉)	コオバシギ	1/2	1/2
キアシギ	0/1	0/1
ソリハシシギ	4/5	3/5
ハマシギ	1/1	0/1
タシギ	0/1	0/1
メダイチドリ	0/1	0/1
ダイゼン	1/1	0/1
オバシギ	1/1	1/1
トウネン	4/5	1/5
イソシギ	1/1	0/1
木浜内湖(滋賀)	ヒドリガモ	18/18	0/18
琵琶湖南湖(滋賀)	オナガガモ	12/13	2/13
コリカモメ	6/9	0/9
コサギ	0/1	0/1
マガモ	1/1	1/1
アオサギ	0/1	0/1
ゴイサギ	0/1	0/1
京大実験池(滋賀)	ヨシガモ	17/18	2/18
昆陽池(兵庫)	オナガガモ	3/7	2/8
ヒドリガモ	1/2	1/2
カワウ(ひな)	2/8	0/8
合計	119/163	27/163
%	73.0%	16.6%

図(1)-13：マガモ糞中から検出されたMicrocystis aeruginosa細胞の生残率
化管によって細胞が損傷を受けていることを示唆する。

複数の細胞から培養すると、最長4時間後に排泄された糞からM. aeruginosaの増殖が確認された。また、糞を培地で懸濁したものをそのまま培養するとうまく培養できなかったが、10日後の細胞の残存率は滞留時間が短いほど高く、長いほど短くなる傾向がみられた。これは長い時間腸内環境にいるほど、M. aeruginosaの生存力が低下することを示唆する（図(1)-14）。

図(1)-14：糞懸濁液を培養したときのMicrocystis aeruginosaの生存率と腸内滞留時間の関係

本研究の結果より、マガモが飲み込み、少なくとも4時間以内に糞として排出されたM. aeruginosaは、少ない割合であるが増殖能力を保っていることが明らかになった。マガモは60-80km/h程のスピードで移動する³)ので、連続して飛翔すると4時間では300km前後の移動が可能である。本研究から、マガモは少なくとも半径300km圏内でのM. aeruginosaの受動的散布に貢献可能なことが示唆された。

日本に飛来するマガモは、主に中国北部やロシア極東部、北部日本で繁殖し、途中2～3カ所の中継地に滞在しながら $ ^{43} $ 、日本や中国南部などへ渡って越冬する。日本では冬期に200万羽前後の水鳥が記録されており $ ^{23} $ 、水鳥はフライウェイ（渡り鳥の移動経路）内での移動を繰り返しながら、頻繁にM. aeruginosaの散布を行っていると考えられる。カモ類の越冬期のねぐらから採食場所までの距離は1～48.8kmで $ ^{22} $ 、渡りの時期以外でも水鳥は地域の閉鎖水系間のM. aeruginosaの移動分散に寄与していると考えられる。特にアオコが発生している湖沼やダムでは、水鳥を介して周辺水系へアオコ原因藍藻類の移動分散が起こっていることを念頭に置いて、アオコの環境対策を進めることが必要である。

今回は無菌培養細胞を用いたので、細胞は単体で存在していたが、野外のアオコでは群体を形成しているため、腸管通過時の消化により長い時間耐えられる可能性がある。今後は食性の異なる水鳥に対する調査や野生の群体状の細胞を用いた同様な飼育実験を行うことで、M. aeruginosaの野外での散布の実態がより明らかになるだろう。

## （４）アオコ群集の生存と増殖に関する生態学的研究

## 1 ）野外実験池を用いたアオコ増殖実験

野外メソコスムを用いた実験では、元々M. aeruginosaのブルームが発生していないメソコスム中
で人為的にブルームを発生させることは極めて難しく、成功例が無い。本研究では、平成21年度に、京大の野外実験池を用いて、メソコスム・レベルの水体で人為的にアオコを発生させることに成功し、このことについてのノウハウを蓄積した。

クロロフィルα濃度は、全ての実験池で実験開始後の一週間で急激に増加し、その後、12日後までに減少した。また、2週間おきの栄養塩類の再添加に同調して増減を繰り返した（図(1)-15）。濃縮湖水を最も多く添加した実験池Aでは、実験開始20日後以降に水面へのMicrocystis属の集積も確認された。Microcystis属の細胞密度は、濃縮湖水を添加したAおよびB池で実験開始1日後から42日後まで上昇し、その後、80日後まで緩やかに低下した（図(1)-15）。一方、細胞密度の変化と栄養塩類再添加の周期には一定の傾向は見られず、水温が20℃を下回る頃から細胞密度の低下が始まったことから、むしろ水温の影響が強いと考えられた。濃縮湖水を添加していないC池では63日後のみMicrocystis属の細胞が検出された。

図(1)-15：実験池におけるクロロフィルルa濃度（上図）とMicrocystisの細胞密度（下図）の変化。矢印は栄養塩類添加を示す。A、B、Cは、それぞれ実験池を示す。

実験池Aからサンプリングごとに96個から625個のMicrocystisコロニーを採取、103のMicrocystisの遺伝子型が検出された（図(1)-16）。決定した塩基配列に基づき遺伝子型の特定を行ったところ、遺伝子型：クローン比は80%から100%であった。既往研究では、多くの自然湖沼のMicrocystisのブルームは数個の遺伝子型が優占し、年間を通し5-6個の遺伝子型がみられると報告されている $ ^{20} $ 。一方、本研究ではクローニングによる遺伝子型の定量も行った。その結果、Microcystisの個体群はこれまで指摘されていたよりも多様な遺伝子型で構成され、短期間のうちに優占するアオコの優占遺伝子型が変化することが明らかとなった（図(1)-16）。

## 2 ）アオコ増殖に対する栄養塩類供給比の影響

野外実験池において、窒素とリンの栄養塩類環境がM. aeruginosaの増殖に及ぼす影響を検討した。窒素とリンの栄養塩類供給比（N:P比）の影響については、N:P=80:1（モル比）および200:1の区画でMicrocystis細胞密度の増加が認められたが、N:P=19:1および20:1の区画では実験期間を通し、
Microcystis細胞密度の増加が認められなかった（図(1)-17）。すなわち、窒素：リン比が19から80の間に、M. aeruginosaの増殖を決定する栄養塩類環境が存在することが明らかとなった。

図(1)-16：実験池に発生したアオコの優占遺伝子型の経時変化。白い部分は実験期間中に一度しか出現しなかった遺伝子型であり、その他の色は実験期間中に複数回出現した遺伝子型を示す。異なるアルファベットは、異なる遺伝子型を示す。

図(1)-17：窒素とリンのバランスを変化させた実験池におけるMicrocystis細胞密度の経時変化

## 3 ）ラン藻類の光合成活性の評価

DCMU蛍光法で求めた全植物プランクトン（440 nm）および緑藻と珪藻（485 nm）の光合成最大量子収率は、クロロフィルルa濃度の変化と同様、概ね栄養塩再添加の周期と同調した変動を示し、栄養塩添加後に光合成活性が上昇、その後低下した（図(1)-18）。一方、シアノバクテリア（590 nm）の光合成最大量子収率は、栄養塩再添加との関係は見られず、Microcystis属の細胞密度が上昇した42日後までは0.25以上あり、細胞密度が低下した50日後から76日後にかけ0.06まで低下した。

Microcystis属の細胞密度が低下した80日後以降、シアノバクテリアの光合成最大量子収率は再び上昇したが、これは秋期のプランクトンであるAphanizomenon issatschenkoiが優占したためと考えられた。このように、本研究で新たに試みたフィコシアニン励起によりDCMU蛍光法で求めた光合成最大量子収率の変動は、実験池におけるラン藻類の変動と概ね一致したことから、多くの分類群が混在する植物プランクトン群集の中からフィコシアニンをもつシアノバクテリアの光合成活性を分離し評価するのに有効であると考えられた。
図(1)-18：実験池における植物プランクトン(440 nm)、緑藻＋珪藻（485 nm）およびラン藻（590 nm）の光合成最大量子収率の変化。矢印は栄養塩類再添加を示す。

そこで、DCMU蛍光法の信頼性について、実験池を用いて確認した。Microcystis細胞密度は、実験開始から30日目まで変動を伴いながら高く保たれ、それ以降は低下した（図(1)-19）。シアノバクテリアの光合成最大量子収率は、細胞密度とほぼ一致した変動パターンを示し、かつ栄養塩類添加に対して反応した（図(1)-19）。これらの結果は、本方法がリアルタイムにシアノバクテリアの生理活性状態をモニター可能であることを示している（図(1)-19）。

図(1)-19：実験池におけるMicrocystis細胞密度（白菱形）と光合成最大量子収率（黒丸）の経時変化

## （５）アオコ発生時の微生物群集の応答

## 1 ）細菌と原生生物の現存量および組成の動態

アオコの発生が認められたA池では、全細菌細胞密度はブルーム中は徐々に増加し、ブルーム衰退期（76日目）に顕著に増加した（図(1)-20）。実験期間中、細菌・原生生物（繊毛虫と鞭毛虫）のいずれも栄養塩類添加にわずかながらに応答した。開始から18日目にPenardochlamys属様のアメーバの大量発生が観察され、アメーバの衰退期（35日目）にM. aeruginosaのブルームが認められた（図(1)-20）。CARD-FISH法による細菌群集組成については、アオコ添加前（0日目）のA池ではβ-proteobacteriaが優占し、76日目以降はα-proteobacteriaが優占した（図(1)-21）。ブルーム期間中
は検出率が低下した（図(1)-21）が、この理由は今回使用したプローブでは検出できない系統分類群の細菌が優占したと考えられる。

図(1)-20：アオコが発生した実験池における細菌およびM. aeruginosaの細胞密度の経時変化。囲いの部分は、Penardochlamys属様のアメーバ現存量が増大した期間を示す。

図(1)-21：アオコが発生した実験池における、FISHによる細菌群集組成の経時変化

## 2 ）アオコに対する原生生物による摂食圧の評価

水温は実験開始から74日目まで30°C近辺を示していたが、その後下降した。クロロフィル濃度は、28日目に155.3 μg L⁻¹、70日目に138.3 μg L⁻¹と高い値を示した（図(1)-22）。C. triciliatum数は105－119日目の間は比較的安定しており22－35 cells ml⁻¹、28日目に最大値291cells ml⁻¹を示した（図(1)-22）。C. triciliatumの食胞内M. aeruginosa数は84日目に10.8 cells flagellate⁻¹で、M. aeruginosa数の最大と同日となった（図(1)-22）。消化速度を求めた結果、0.72% cell contents min⁻¹であった。C. triciliatumの捕食圧を調べるため、この消化速度を用いてC. triciliatumによるM. aeruginosaに対する一日当たりの摂食圧を算出した結果、0.0－25.3% standing stock day⁻¹となった。

実験室内でのC. triciliatumの摂食の餌密度依存性を調べた結果、摂食速度は餌密度とともに増加し、Michaelis-mentenの式が適用可能であった。最大摂食速度は、6.2 cells flagellate $ ^{-1} $ h $ ^{-1} $ 、半飽和餌密度は、 $ 1.2 \times 10^{5} $ cells ml $ ^{-1} $ ( $ r^{2} = 0.873, p < 0.001 $ ) であった（図(1)-23）。
図(1)-22: 実験期間中の、クロロフィルタ濃度（左上）、M. aeruginosa細胞密度（左下）、C. triciliatum細胞密度（右上）、およびC. triciliatum食胞内のM. aeruginosa数（右下）の経時変化。

図(1)-23 : C. triciliatumによるM. aeruginosa摂食に対する餌密度依存性

以上の結果より、原生生物によるアオコの摂食は、ときとして現場のアオコのかなりの部分を摂食しうることが示された。この結果は、原生生物による摂食が野外のアオコの現存量低下に重要であることを定量的に示した、世界的に貴重な例である。

（６）アオコ発生水域の食物連鎖構造の特性：動物プランクトン食魚の有無がMicrocystis属のブルームと食物網構造に及ぼす影響解析

## 1 ）ホンモロコの体サイズ変化

実験開始時のホンモロコは2つの体サイズクラスがあり大きさにより2分した。実験に使用した個体重は、相対的に大きいサイズが平均7.6g (n=35)，当年魚と思われる小個体が平均1.1g (n=65)であり、合計では大サイズ55匹、小サイズ265匹であった。これらをA池に80匹(大14、小66匹)、
B池に240匹（大41匹、小199匹）を入れて2ヶ月後、一部を回収した（図(1)-24）。実験終了時の個体重は、大個体は約2倍、小個体は約6倍の重さであった。

図(1)-24：実験に用いたホンモロコの個体体重。実験開始時及び実験終了時の値を示した(Box plot による表記)

図(1)-25：実験池での環境要因変化。横軸が実験開始からの日数を表し、縦軸が各環境パラメーターの単位を表す。点線は、栄養塩の再添加を表す。A池：80匹、B池：240匹、D池：魚なし（コントロール区）。
## 2 ）実験池のクロロフィルタ濃度、Microcystis細胞密度及び栄養塩濃度変化

クロロフィルα濃度は、すべての池で実験開始8日前後に最大値を示しその後減少した（図(1)-25）。一方、Microcystis属の最大細胞密度は、実験処理区によって異なり、A池（魚60匹）で35日目、B池(魚240匹）で25日前後、D池（control魚なし）で10日前後であった（図(1)-25）。DIPはホンモロコ密度が最も高かった処理区が他の二処理区より高い傾向を示した（図(1)-25）。

## 3 ）安定同位体比の分析によるホンモロコの餌資源推定

9月7日、9月29日、10月21日の3回の動物プランクトンを区分けし、安定同位体比解析を行って実験期間中のホンモロコの餌資源を推定した。図(1)-26に示す通り、Ceriodaphnia（トガリネコゼミジンコ）、Bosmina（ゾウミジンコ）、Moina（スカシタマミジンコ）、カイアシ類、フクロワムシ、Keratella, Brachionus等の動物プランクトンが観察された。ホンモロコの安定同位体比から、動物プランクトンやユスリカを摂食していたと考えられた。

図(1)-26：9月7日、9月29日、10月21日の3回の3魚処理区ごとの動物プランクトン組成と安定同位体比解析結果。

$ \delta^{13} $ C \%

図(1)-27：9月7日、9月29日、10月21日の3回のサイズ分画処理と、その安定同位体比の解析結果。

## 4 ）実験期間中のPOCの安定同位体組成変化

9月7日、9月29日、10月21日にサイズ分画処理を行い、さらに安定同位体解析を行った（図(1)-27）。ホンモロコがいる処理区では、すべての分画サイズのプランクトンがまんべんなく見られたが、コントロール区(魚なし）では、<20μmのプランクトンは多くみられるものの、大型サイズのプ
ランクトンが少なかった（図(1)-27）。これは、動物プランクトン食のホンモロコがいることにより、大型プランクトンが減っているにもかかわらず、ホンモロコがいる方が系内の多様性が高い可能性を示唆している。既存の論文では、栄養塩回帰に魚類が及ぼす正の影響も指摘されており、本研究結果も同様の結果を支持していると考えられる。また、本研究では3倍のホンモロコの密度差をつけたが、この規模の実験池ではこの程度では、魚の個体密度差は検出されにくく、魚の存否の方が食物網構造を決定するうえで重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

## （7） アオコ発生水域の社会科学調査

## 1 ）日本国内における土地利用形態の変遷や周辺住民の生活文化特性の調査

琵琶湖内湖に対する人為的改変を空間区分にしたがって分類すると、a)内湖内部に対する作用（浚渫、真珠養殖、魚類養殖、干拓、干拓地嵩上げ工事）、b)内湖周辺に対する作用（公園化、市街地化）、c)内湖集水域に対する作用（土地利用の変化、灌凝システム、上水道、下水道、養魚場、内水排除施設）、d)水系ネットワークに対する作用（堰状構造物の建造、川エリの設置）が見られた。各内湖では、a)～d)にある人為的作用がさまざまな強度で累積してきた。

aからdの中の細目においても人為的作用の多様性や重層性が観察できる。たとえば、水系ネットワークに対する人為的作用について見ると、内湖と琵琶湖を結ぶ水路は堰状構造物の有無とその規模・仕組みによっていくつかのタイプに分けられ、琵琶湖と内湖の連続性の違いを認識する指標と捉えることができる。今後、上述のような内湖を取り巻く属性の相違を、継続的な自然科学的調査で把握されているアオコ生息状況と比較し、関連性を検討する必要がある。

なお、滋賀県・琵琶湖の内湖の一つである伊庭内湖では、平成21年度にアオコの発生が確認されたが、その要因に関する現段階での予想は次のとおりである：①伊庭内湖岸に規模の大きな揚水機場が複数あり、その用水供給域からの農業排水等が内湖に流入する（つまり、内湖の水は反復利用されている）；②伊庭内湖は隣接干拓地への灌溉用水源でもあり、内湖水位を一定に保つために下流可動堰で水を留めておく必要がある。①と②の条件が灌漑期（夏期）に揃っているため、高い栄養塩類濃度や水温といったアオコの増殖を促進する要因に影響したと考えられる。

2）東南アジア、オーストラリアおよびアフリカ（ケニア）におけるアオコと人間社会の関係

## 1 ）タイ東部地方の貯水池

タイ東部のチョンブリ県のBangphra貯水池（表(1)-7のID.2）やラヨン県のNongPlalai貯水池（表(1)-7のID.3）では、アオコがしばしば発生していた。双方の貯水池は、開発の進むタイ東部地方の飲用水・灌溉用水・工業用水として利用されているが、中でも飲用水として利用する住民や水道施設からアオコ（臭い・濁り）に関する苦情が寄せられていた。具体的なアオコ対策として、硫酸銅投入（Bangphra貯水池）と国・県に対する貯水池流域の土地利用規制の要望（NongPlalai貯水池）が挙げられた。また、チョンブリ県の上水道施設（表(1)-7のID.1）はBangphra貯水池に近いため、独自にサンプル採取して研究者に依頼し、ミクロシスチンの検査をおこなっていた。

## 2 ）タイ・バンコク郊外の養魚場

タイ・バンコク郊外の養魚池(表(1)-7のID.4)では,購入したナマズ稚魚(Pradook、Pradook bigouy)に朝夕1回給餌し，6ヶ月間育てた成魚（1kg以上）をバンコク・チャチュンサオ県・チョンブリ
表(1)-7：東南アジアでの調査地の概要

ID	地点	訪問の形式	備考	県・省・地域	国	調査日
1	Bangphra Water Treatment Plant 1	Office1 箇所と現地	上水道施設	Chomburi県	タイ	1-Feb
2	Bangphra 貯水池	Office2 箇所と現地	1の上水道施設の水源
3	NongPlalai 貯水池	Office1 箇所	2をサポートする池	Rayong県
4	Weera Farm	Office1 箇所と現地	Cat fish 養殖場	Bangkok近郊	2-Feb
5	Ke Go 貯水池	Office1 箇所と現地	Ha Tinh市の水道水源	Ha Tinh省	ベトナム	4-Feb
6	Boc Nguyen 貯水池	Office1 箇所と現地	Ha Tinh市の水道水源
7	Turtle Farm	Office1 箇所と現地	すっぽん養殖場. Ha Tinh市内
8	Lam JI	現地のみ	Nghe An省	5-Feb
9	養魚池①	現地のみ	集落の養魚場(25m四方). Xuan Hoa commune, Nam Dan dist.
10	養魚池②	現地のみ	4箇所の池(20m四方)でスッポンを中心に養殖. Nam Anh commune, Nam Dan
11	住宅地の池	現地のみ	Hung Long commune, Hung Nguyen dist.

県・サムットプラーカーン県の市場に卸している。養魚池で与えられる餌は、海産小魚の粉末・豆・とうもろこし・米・穀殻・ミネラル・ビタミンの混合飼料と鶏肉工場からの廃棄物（肉以外の部位）である。以前は、フィリピンの仲介業者を経由してヨーロッパに輸出していたことがある。養魚池には、アオコがよく発生しているが、周辺住民や消費者からのアオコに関わるクレームは養魚場オーナーに対してなかった。

## 3 ）ベトナム（貯水池、スッポン養殖池、ファーミングシステム、集落・公園の池）

カウンターパート研究者との調査対象地域に関する情報交換の結果、アオコ（ミクロシスチン）が生じる場所やアオコによって引き起こされる問題として、以下のような項目がわかった。

はじめに、飲用水、灌溉用水の水源である調査対象貯水池（表(1)-7のID.5、ID.6）では、今のところアオコ発生の報告はない。しかし、今後考えられるリスクに対処するために、地元当局及び科学者がアオコや有毒藻類に関する認識を深めておく必要があると考えられた。また、貯水池より流れる灌溉用水路からの直接利用（特に夏季の洗濯・水浴びと飲用）に留意する必要がある。

続いて、スッポンの養殖池（表(1)-7のID.7）である。養殖されたスッポンは、地元レストランで消費されるほか、中国へ輸出されている。また、幼亀（hatchling turtles）としてベトナム中部の養殖場へ供給されている。この養殖池におけるアオコにともなう問題として、池からの排水による周辺環境への負荷、排水流出や幼亀流通を介した有毒藍藻類の拡散が指摘された。食品の安全性の観点から、スッポンへの有毒物質の蓄積の有無について監視が必要である。

第三番目は、魚類養殖池（表(1)-7のID.9、ID.10）である。ベトナムでは、畑・養魚池・家畜飼育の複合システム（farming system）が発達しており、さまざまなタイプが見られる。豚・牛・鶏・アヒルなどの家畜の排泄物を養魚池に流し、魚類の餌としている。排泄物と余剰の餌により富栄養化が進み、アオコがしばしば生じる。この養魚池の水は、畑への用水や水あらいのために利用される場合がある。スッポン養殖池と同様に、魚類養殖池からの排水による環境負荷、有毒藍藻の拡散、食品安全性の低下が問題として考えられる。

アオコが発生すると考えられる第四の場所は、集落や公園の池である。市街地・集落の家屋から生活排水が流入して富栄養化し、アオコが発生している場合がある。臭気や景観悪化が問題と
して考えられる。

現地カウンターパートの研究者との情報交換の結果、インタビューのための質問票を、a）飲用水用貯水池、b）灌溉用ため池、c）養魚池、d）公園等の池に即して作成した。この調査票は、タイでの調査においても一部改変して活用した。

## 4 ）ベトナムにおけるアオコと人間社会の関係

ベトナムでは，中部地方北部のゲアン省・ハティン省の域内で，貯水池（2箇所），スッポン養殖場（2箇所），河川（1箇所），集落（2箇所）を訪問した。各地点での滞在時間が短かったため質問票によるインタビューは実施しなかったが、視察より以下のことが指摘できる。

まず，タイと同様にベトナムにおいてもさまざまなタイプの養魚池と流通システムの存在がうかがえる。食品の安全性を考える上では，多様な生産・流通システムの理解とそれぞれのシステムに対する安全性の評価が必要だと思われた。

続いて，ベトナムの集落の一部では人びとの非常に身近な水域でアオコがよく発生していた（表(1)-7のID.11）。ベトナム集落における水域と人びとの接触（飲用・水浴・洗濯・）を見ると、これまでのようなアオコの飲用水や食品を介した健康影響に加えて、日常的にアオコ発生水域と接するライフスタイルの健康への影響を検討する必要があると考えられた。

## 5 ）ケニアにおけるアオコと人間社会の関係

調査をおこなったBMU（漁村）の概要を表(1)-8に示した。なお、BMU（Beach Management Unit）

表(1)-8：調査対象のBeach Management Unitの概要

name of site	Number of people registered in the BMU	Water source in BMU (village)	Species of fish treated in the BMU	F(Number of people working for fishery in the village), P(Population of the village)
Kichinjio B.M.U.	400-500	Tap water, Lake Victoria	Nile perch, Tilapia, omena
Dunga B.M.U.	480	Lake Victoria, Rainfall, Tap water	Nile perch, Tilapia, omena	F(2000), P(5000)
Mitimbili B.M.U.	120	Rainfall, Lake Victoria	Nile perch, Tilapia, okoko, kamongo, fulu, malfish(?)	F(220), P(2500)
Ngengu B.M.U.	78	Lake Victoria, other source	Nile perch, Tilapia, kamongo, mumi, okoko(?)	P(1500-2000)
Koginga B.M.U.	189	Lake Victoria, other source	Nile perch, Tilapia, Kamongo, mumi	F(320), P(500)
Mbita Town B.M.U.	300	Lake Victoria, Tap water	Nile perch, Tilapia, omena, okoko(?) , fulu(?)	F(350-360), P(5000)
Nyagina B.M.U.	350	Lake Victoria, Rainfall, (Tap water)	Nile perch, Tilapia, omena, mumi, okoko	F(450), P(600)