Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
10) Y. Kobayashi, Y. Hodoki, K. Ohbayashi, S. Nakano: $ 13^{th} $ International symposium on Microbial Ecology (2010)

“Variations in microbial abundance and community structure during Microcystis bloom in an experimental pond”

11) S. Nakano: 2010 Fall Semester “Wednesday Talks on Life Science”, Dept. of Life Science, Hanyang University, Korea, 2010(招待講演)

“Ecophysiology, phylogeography and environmental sociology on water blooms of the globally distributed cyanobacterium Microcystis aeruginosa”

12) Y. Hodoki, K. Ohbayashi, Y. Kobayashi, N. Okuda and S. Nakano: $ 4^{th} $ EAFES Congress (2010) "Genotypic diversity of artificial Microcystis blooms in experimental ponds"

13) S. Nakano, Y. Kobayashi, Y. Hodoki, K. Ohbayashi and N. Okuda: $ 4^{th} $ EAFES Congress (2010) "Grazing on Microcystis with special reference to protistan ecology"

14) T. Homma, T. Kataoka, S. Nakano, and R. Kondo: CER International workshop for New Frontier of Microbial Ecology (2010)

“Assessing the Behaviour of Intra-specific Variations in A Cyanobacterial Species Microcystis aeruginosa”

15）田辺雄彦，加藤将，渡遷信：日本藻類学会第35回大会(2011)

「アオコ形成ラン薬 Microcystis aeruginosaの東南アジア個体群における遺伝的変異」

16) Nanda Kyaw Thu, Y. Tanabe, Syou Kato, M. M. Watanabe: 日本藻類学会第35回大会(2011) "Morphology, phylogeny and gas vesicle gene detection of planktonic cyanobacterium Oscillatoria kawamurae from different geographical regions"

17) Y. Hodoki, Y. Kobayashi, K. Ohbayashi, N. Okuda and S. Nakano: International symposium on Microcystis studies from Asia (2011)

“Genotypic diversity of artificial Microcystis bloom occurred in experimental ponds”

18) S. Nakano, H. Amano, Y. Hodoki, Y. Kobayashi, K. Ohbayashi, T. Tanaka, N. Okuda: International symposium on Microcystis studies from Asia (2011)

“Ecophysiology, phylogeography and environmental sociology on water blooms of the globally distributed cyanobacterium Microcystis aeruginosa”

19) Y. Hodoki, Y. Kobayashi, K. Ohbayashi, N. Okuda and S. Nakano: International Symposium on Microcystis Studies from Asia (2011)

“Genotypic diversity of artificial Microcystis bloom occurred in experimental ponds”

20）天野一葉，須川恒，片岡宣彦，吉岡美佐子，茂田良光，程木義邦，大林夏湖，中野伸一：日本鳥学会2011年度大会(2011)

「多様な水鳥の糞からのアオコ原因藍藻類Microcystis aeruginosaの検出」

21) Y. Kobayashi, Y. Hodoki, K. Ohbayashi, H. Amano, T. Tanaka, N. Okuda, S. Nakano: $ 12^{th} $ Symposium on Aquatic Microbial Ecology (2011)

“Grazing on the cyanobacterium Microcystis aeruginosa by the heterotrophic flagellate Collodictyon triciliatum in an experimental pond”

22）田辺雄彦、渡辺信：日本陸水学会第76回大会（2011）「遺伝子で見るアオコの多様性」

23）中野伸一、奥田昇、天野一葉、大林夏湖、小林由紀、田中拓弥、程木義邦、近藤竜二、廣石伸互、24）高尾祥丈、片岡剛文、本間隆満：日本陸水学会第76回大会（2011）

「アオコの分布拡大に関する分子生態学・環境誌的研究」

25）片岡剛文、本間隆満、中野伸一、近藤竜二：日本陸水学会第76回大会（2011）

「アオコ原因藍藻（Microcystis aeruginosa）の遺伝子型に基づく分子識別と定量PCRを用いた細胞密度の推定」

26）本間隆満、片岡剛文、中野伸一、近藤竜二：日本陸水学会第76回大会（2011）「Microcystis属における遺伝子グループ組成に及ぼす栄養塩濃度の影響」

27）程木義邦、大林夏湖、小林由紀、奥田昇、中野伸一：日本陸水学会第76回大会（2011）「西日本における有毒ラン薬類の分布」

28）程木義邦、大林夏湖、小林由紀、奧田昇、中野伸一：日本陸水学会第76回大会（2011）
「蛍光法によるラン藻類の現存量と光合成活性の評価」

29）小林由紀、程木義邦、大林夏湖、天野一葉、田中拓弥、奧田昇、中野伸一：第27回日本微生物生態学会（2011）

「従属栄養鞭毛虫 Collodictyon triciliatum の Microcystis aeruginosa に対する摂食圧」

30）片岡剛文、本間隆満、中野伸一、近藤竜二：第27回日本微生物生態学会大会（2011）

「遺伝子型の異なるアオコ原因藍藻(Microcystis aeruginosa)の栄養塩濃度に対する増殖応答」

31) H. Amano, Y. Hodoki, K. Ohbayashi, S. Nakano: Joint meeting of the $ 59^{th} $ annual meeting of ESJ and the $ 5^{th} $ EAFES international congress (2012)

“Dispersal of blue-green algae by waterbirds: Retention time of Microcystis aeruginosa in the digestive tract of ducks and its growth ability afterwards”

32) Y. Kobayashi, Y. Hodoki, K. Ohbayashi, H. Amano, T. Tanaka, N. Okuda, S. Nakano: Joint meeting of the $ 59^{th} $ annual meeting of ESJ and the $ 5^{th} $ EAFES international congress (2012)

“Grazing on the cyanobacterium Microcystis aeruginosa by the heterotrophic flagellate Collodictyon triciliatum in experimental pond”

### 7. 研究者略壓

課題代表者: 中野伸一

1966年生まれ、東京農工大学農学部卒業、博士（理学）、現在京都大学生態学研究センター教授

## 研究参画者

(1)1): 中野 伸一 (同上)

(1)2):奥田 昇

1969年生まれ、東京理科大学理工学部卒業、現在京都大学生態学研究センター准教授

## (2) : 渡邊信

1948年生まれ、東北大学理学部卒業、富山大学薬学部助手、現在筑波大学大学院生命環境科学研究科教授

## (3) 1):近藤 竜二

1964年生まれ、近畿大学農学部卒業、福井県立大学生物資源学部助手、現在福井県立大学海洋生物資源学部准教授

## 2 ): 廣石 伸互

1949年生まれ、京都大学農学部卒業、群馬大学医学部助手、現在福井県立大学海洋生物資源学部教授

## 3 ): 高尾 祥丈

1976年生まれ、甲南大学理学部卒業、福井県立大学生物資源学部助手、現在福井県立大学海洋生物資源学部助教
# D-0905 アオコの分布拡大に関する生態・分子系統地理学的研究

京都大学 生態学研究センター 中野伸一・奥田昇

研究協力者

京都大学 生態学研究センター 天野一葉

天野一葉

大林夏湖

小林由紀

田中拓弥

程木義邦

平成21～23年度累計予算額：131,864千円

（うち、平成23年度予算額：42,193千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 世界各地の富栄養化湖沼で環境被害をもたらしてきたアオコ（Microcystis aeruginosa）について、生態学的・系統地理学的解析、実験系における生理生態特性解明、水鳥による輸送、国内外のアオコ発生湖沼周辺における土地利用形態の変遷や周辺住民の生活文化特性の研究を行った。西日本各地の湖沼におけるM. aeruginosaの各遺伝子型および毒素生産性には、地理的な分化が無いことが分かった。アオコの発生する湖沼には、水鳥が高密度で飛来する傾向を明らかにした。国境を越えて渡りを行う鳥の糞から、M. aeruginosaの遺伝子を検出することに成功した。マガモにM. aeruginosaを摂餌させた実験では、4時間以内に糞として排出されたM. aeruginosaが増殖能力を保持していることを明らかにした。大規模野外実験系において、Microcystisの個体群は従来指摘されていたよりも多様な遺伝子型で構成され、かつ優占遺伝子型は短期間のうちに変化することを明らかにした。窒素とリンの供給を変化させた実験では、Microcystisは窒素に対して強く反応することを明らかにした。特記すべき成果として、アオコの発生を事前に予測する方法の開発に成功した。アオコを摂食する鞭毛虫Collodictyon triciliatumによる摂食は、M. aeruginosa現存量の25%を一日に摂食することもあった。魚類の存否によるアオコ発生水域の食物網構造の特性では、ホンモロコ存在下で系内の生物多様性が高くなることを示した。琵琶湖内湖では、漁業活動とアオコ発生の関係が示された。アジア諸国における導水開発や淡水養殖産物の流通経路の知見から、人間活動に伴ってアオコが拡散する実態が明らかになった。ケニアのビクトリア湖では、住民の健康被害、飲料水確保の新たなコスト、家畜のアオコ摂取による健康被害、リゾート施設や水産業での被害が見られた。オーストラリアにおけるアオコ対策の戦略や官民学が連携した運営の現況を把握した。

[キーワード] Microcystis aeruginosa、生態、分子系統地理、発生予測、社会科学
### 1. はじめに

アオコは、湖水中のアオコ原因植物プランクトンが大量に増殖して起こり、世界各地の富栄養化した湖沼に普遍的に見られる。アオコが発生すると景観を悪化させ、腐敗したアオコが悪臭を放ち、さらにはアオコが作る強い毒により海外では人間や家畜等の死亡の被害が報告されている。アフリカや東南アジア諸国ではアオコの発生が深刻化しており、とくにアフリカでは多くの人が良質な水を利用できない状態が続いている。このように、アオコの防除は世界中の富栄養化した湖沼で緊急課題となっているが、未だに問題は解決されていない。我が国では、国連が掲げたミレニアム開発目標のゴール7、ターゲット10に基づき、アジア水環境パートナーシップ事業、日中水環境パートナーシップ、アフリカにおける水環境改善等の、水環境問題についての国際的な取り組みを進めてきた。しかし、アオコの生態には湖沼周辺の人間活動等の地域特性が強く影響するため、その発生機構や防除対策にかかる科学的情報の蓄積が求められている。

### 2. 研究開発目的

アオコは、風気流、鳥類などに運ばれて国内外の湖沼に分布を拡大しており、各湖沼には由来の異なる遺伝的に多様なアオコ群集が存在し、その一部に有害性の高いタイプが含まれると考えられる。湖沼の水質は周辺の人間活動に強く影響されるため、アオコ群集の中でどのタイプが優占となるかは、周辺の人間活動をも含めた湖沼環境総体により決定されていると考えられる。本研究では、最先端のバイオテクノロジーと大型環境解析システムを駆使し、これまで国や民間団体が蓄積してきた環境データベースを活用しながら、「当該湖沼にどのようなアオコがどのように運ばれてくるか」、「湖沼に新たに入ったアオコは生き残れるのか」、「生き残ったアオコ群集はどう多様なのか」、「多様なアオコ群集の中から特定の機能を持ったアオコ（たとえば有毒種）が増殖するのはどういった理由によるものか」について、明らかにする。また、湖沼周辺の人間活動として土地利用形態の変遷や周辺住民の生活文化特性の調査も行い、アオコ群集組成との対応があるか検討する。

### 3. 研究開発方法

### （1） M. aeruginosaの分布拡散・発生状況

### 1 ）M. aeruginosaの採取と単離

西日本の10県18か所の湖沼より、アオコのサンプルを収集した。アオコの採取は、プラスチックバケツで行い、採水後2Lポリプロピレン容器に8割程度入れ、冷暗条件で保存して実験室に持ち帰った。各々のサンプルから、実体顕微鏡下でM. aeruginosaのコロニーを採取し、CT培地を用いて単離培養を行った。2010年は、得られたM. aeruginosa株から、改変CTAB法によりDNA抽出を行った $ ^{8)} $ 。PCRによりミクロキスティン産生遺伝子の一部であるmcyG遺伝子の有無を確認するとともに $ ^{34)} $ 、シアノバクテリアに特異的なプライマーを用い、rDNAの16S-23S内部転写スペーサー領域(internal transcribed spacer region、ITS)を用いて塩基配列を決定し $ ^{16)} $ 、遺伝子型の特定と系統樹の作成を行った。

試水の一部を500mLビーカーに移し、M. aeruginosaのコロニーを崩して拡散させ、共雑物の少ないコロニーを拾い、洗浄後、滅菌ろ過湖水450μL＋CT培地50μLの培養液中にコロニーを順化させてからCT培地に移し、25℃、光強度40μmol m⁻²s⁻¹で培養を行った。
2）単離M. aeruginosaからのDNA抽出と確認、毒遺伝子有無および16S-23S rDNA ITS領域の増幅

コロニーサイズが十分に大きくなったものについて、DNA抽出を行った。各コロニーは、培地ごとGF/Fフィルターでろ過をし、フィルターはDNA抽出まで-20℃で保存した。DNA抽出は改变CTAB法 $ ^{8)} $ によりおこなった。各サンプルについてDNAの濃度を測定し、PCR反応の鋳型とした。

単離したコロニー株について、Microcystis属に特異的なプライマー対、16S rDNAの184F(5'-GCC GCR AGG TGA AAM CTA A-3')と431R (5'-AAT CCA AAR ACC TTC CTC CC-3')を使用し、Microcystis属であることを確認した $ ^{5)} $ 。また、ミクロキスチン生産遺伝子群の有無を調べるため、mycG遺伝子の有無を調べた。検出には、mcy GF(5'-GGA AAA TTT TAG ACA ATC CCT TGA T-3')とmcy GR(5'-AAT TTC TAA GAA TAG GCG AAT CGT T-3')のプライマー対を使用した $ ^{34)} $ 。PCR産物を、2%アガロース（1×TAE）で電気泳動し、Microcystis属であることを確認したコロニー株について、ITS領域の増幅をおこなった。16S-23S rDNA内部転写スペーサー（internal transcribed spacer, ITS）領域の増幅にはシアノバクテリアに特異的なプライマー対、16S rDNAのCSIF(5'-G(T/C)CACG CCC GAA GTC (G/A)TT AC -3'; forward primer)と23SrDNAのULR(5'-CCT CTG TGT GCC TAG GTA TC -3'; reverse primer)を使用した $ ^{44)} $ 。得られたPCR産物を、2%アガロース（1×TAE）で電気泳動し、非特異的な増幅が見られないコロニー株について、塩基配列を決定した。

## 3 ）アオコ発生時に特異的な細菌群集の検出

2010年10月から11月にかけて西日本各地の24の湖沼から得られた試水について、CTAB法 $ ^{8)} $ によりDNA抽出を行い、真正細菌に特異的な16SrDNAプライマー対を用いてタッチダウン法 $ ^{7)} $ にてPCRを行った。PCR産物について、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（DGGE法） $ ^{24)} $ によりDNA断片のバンドパターンを得た。このバンドパターンを、PRIMER-E (v6.PRIMER-E Ltd, Plymouth, UK)を用いて、非計量的多次元尺度構成法(NMDS法) $ ^{31)} $ と類似度行列分析（ANOSIM法） $ ^{31)} $ を用いて、群集解析を行った。

## （２）日本国内におけるその他の有害ラン薬類の分布状況

## 1 ）Automated rRNA intergenic spacer analysis (ARISA)法とトキシタイピングを用いたラン薬類の群集解析

関東以西の自然湖沼、池及び貯水池の88か所で採取した水で解析を行った（図(1)-1）。10 Lの表層水を採水し、水温、PH,電気伝導度と濁度を測定した。このサンプルを冷暗所において実験室に持ち帰り、セストンを適量（20-150 mL）GF/F filter(420℃で3時間燃焼済み）に捕集し、クロロフィルルa（Chla）濃度測定用、DNA測定用サンプルとした。フィルターは分析まで-20℃で保存した。Chla濃度は、ジメチルホルムアミド10 mLで抽出した抽出液を、Welschmeyer(1994)の萤光法 $ ^{40)} $ を用い分析した。

各サンプリング地点のろ水を使用して、溶存態無機リン（DIP）、溶存態窒素（DIN）を測定し、原水を用いて、TP、TN、TOCの測定を行った。DINは、 $ NH_{4}-NO_{3}+NO_{2} $ からもとめ、アンモニア濃度は、蛍光法 $ ^{13)} $ によって求めた。硝酸、亜硝酸、リン酸態リンについては、AACS II auto analyser (Bran+Luebbe)を使用した比色分析により測定した。また、原水をペルオキソ二硫酸カリウムで酸化させたのち、TNとTPもAACS II auto analyserを使用した比色分析により測定を行った。TOC
濃度は、Shimazu TOC-5000(Shimazu CO. LTD)を使用して行った。

(C)

(B)

図(1)-1: ラン藻類の群集解析及びラン藻毒の検出のためのサンプルを採取した、関東以西の自然湖沼、池及び貯水池88か所（●印）。本研究における調査地点の範囲(A)およびその拡大図(B)と琵琶湖周辺の調査地点(C)。地点番号はQPCRによりアナトキシン-a生産株のC. issatschenkoiが検出された地点。

2）ITS領域とシアノトキシンシンセターゼジーンのPCR増幅による検出

改变CTAB法によりGF/FフィルターからDNAの抽出を行った。ARISAの解析のため、ラン藻類の16S-23S rDNA内部転写スペーサー（internal transcribed spacer ; ITS）領域に特異的なプライマーを用いPCR増幅を行った $ ^{16,26)} $ （CSIF 16S rDNA 及び23S rDNA）。なおULR 23S rDNA primer の5'末端を蛍光標識したプライマーを使用した $ ^{9)} $ 。100 ngの鋳型DNAを含んだ10 μl反応液中に、0.2 mM dNTP、15 mM Tris-HCl (pH 8.0)、50 mM KCl、1.5 mM MgCl₂、2.5 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems)、及び0.5 μM各プライマーで増幅させた。PCRのコンディションは次のとおりである；94℃10分の処理ののち、94℃1分、アニーリング温度(Tₐ)1分、72℃，1分で30サイクル、その後最終伸長として72℃30分の処理を行った。最初の20サイクルではアニーリング温度は各サイクルごとに1℃ずつ下降し、62℃から52℃へタッチダウンにより温度を変化させた。最後の10サイクルのアニーリング温度は52℃であった。PCR産物をつかってFragment解析を行いラン藻類群集の組成を検出した。Microsistinおよびnodularin, anatoxin-a, cylindrospermopsinおよびsaxitoxin合成遺伝子、microcystin synthetase E (mcyE)を標的としたAnabaena, Microcystisおよび
Planktothrixに特異的なプライマーを用いPCR増幅を行った。合計9種類のPCR産物を、12μLの脱塩ホルムアミド溶液にそれぞれ0.2-0.35μLづつ添加し、95℃,2分間の変性処理後、ABI3100Avantジエネティクアナライザー（Applied Biosystem）によりPCR産物断片長の解析を行った。

## 3 ）ARISA法を使用したラン薬類群集組成解析

すべての手法はHodoki et al (2012) $ ^{12)} $ に従った。蛍光標識したプライマーで増幅したPCR生成物のFragment解析をABI3100でおこない、≤2bpのフラグメント長の違いを異なる種とした $ ^{41,42)} $ 。500蛍光ユニット以上のピークエリアを検出し、350 bpから1032 bpで合計100サイズクラスのフラグメントを検出した。トータルのピークエリアに占める各ピークエリアの値を計算し、<5%, <25%, <50%, ≥50%で表記した。ARISAバンドのフラグメントサイズをらん藻類の種として定義し、サイズ長については以下の範囲で定義した(Hodoki et al 2012); Cylindrospermopsis属とRaphidiopsis属, 398-400 bp (ITS1), 554-564 bp (ITS2); Dolicospermum属とAnabaenopsis属, 420-433 bp (ITS1), 656-666 bp (ITS2); Microcystis属, 520-538 bp (ITS1); Oscillatoria属, 676 bp; Merismopedia属, 856 bp (ITS1). これ以外のサイズフラグメントについてはUAF (unassigned fragment)で表した。合計100フラグメントとクラスが検出され、そのうち30が対象種として絞られ、70が未知の藻類であった。統計検定のために、未知のフラグメントは下記のようにまとめて統計検定を行った; 372-396 bp, UAF 1; 404-418 bp, UAF2; 446-516 bp, UAF3; 548bp, UAF4; 576-648 bp, UAF5; 670-672 bp, UAF6; 684-854bp, UAF7; 864-1132bp, UAF8。

88か所でデータを採取したが、1か所で非常に高く外れ値の栄養塩濃度の数値を示した地点があり、この地点は省いて87か所でデータ解析を行った（UPGMA以外）。ARISAによるPCRベースの有害藻類検出では、28か所でラン藻類が検出されず、60か所でラン藻類が検出された。これらの違いをもたらす説明変数として、pH、電気伝導度、濁度、クロロフィルa濃度、TN、DIN、DIP、TON、TOP、TOC/TON、TN/TP、TOC/TOPを選抜し、ランダマイゼーションテストを行った。それぞれの変数の平均値の差分（非検出一有検出）を使用してランダマイゼーションテストを行ない、両側検定を行った。またそれぞれの環境要因についてはRを用いてBox plot解析を行った。

## 4 ）ラン藻類群集構造解析

ARISA法により、ラン薬類が検出された60か所のデータを使用した。バンドパターンの類似性検定にはPeason's correlation coefficientを使用し、デンドログラムはunweighted pair-wise group method with arithmetic means (UPGMA)によって構築した。ARISAバンドのフラグメントサイズは、ラン薬類として定義し、前述の方法でフラグメントサイズと種名を一致させた。Canonical correspondence analysisを使用して、検出されたラン薬類と、環境パラメータの間の関連を検証した(XLSTAT, 2011). pH, conductivity, turbidity, Chl a concentration, TN, DIN, DIP, TON, TOP, TOC/TON, TN/TP, TOC/TOPを説明変数として使用した。スケールの違いによる影響を避けるために、説明変数はすべて標準化した後（平均0, 分散1）、解析に使用した。

#### 5 ）Cuspidothrix issatschenkoiおよびR. mediterranea ver. grandisの単離培養

C. issatschenkoiの単離培養は計6湖沼で行った（図(1)-1）。倒立頭微鏡と滅菌したパスツールピペットを用い、単一のトリコームを無作為に拾い上げ、GF/Fフィルターで作成したろ液で3回洗浄
後、滅菌したCT培地 $ ^{14)} $ に移し培養を行った。全ての株は25°C, 30 μmol m $ ^{-2} $ s $ ^{-1} $ の条件下で培養を行った。なお、C. issatschenkoiとRaphidiopsis mediterranea ver. grandis Hillは形態が似ているため、単離の段階では両種を区別することが出来ない。そこで、単離培養株の確立後に顕微鏡下でヘテロシストの有無を確認し、全てのトリコームにヘテロシストが見られない株はR. mediterranea ver. grandisとした。

## 6 ）単離培養株の分子系統解析

全ての単離培養株について16S-23S rDNA内部転写スペーサー（ITS; internal transcribed spacer）領域の塩基配列を決定し遺伝子型の特定を行った。また、アナトキシン-a合成遺伝子(ATX) $ ^{2)} $ およびニトロゲナーゼリダクターゼ遺伝子(nifH) $ ^{10)} $ に特異的なプライマーを用い、PCRによりナトキシン-aの合成能および窒素固定能の有無を調べた。

## 7 ）環境サンプルの採取と分析

先行研究により C. issatschenkoi は秋季に優占することが報告されているため $ ^{11,38} $ 、2011年10月に88水域よりサンプルを採取し、アナトキシン-a生産株の C. issatschenkoi の分布と環境特性について解析を行った（図(1)-1）。HORIBA U-22多項目水質系を用い表層水の水温、導電率およびpHを測定後、2Lの湖水を採取、冷暗所に保管し C. issatschenkoi および栄養塩濃度等の分析に用いるため、研究室に持ち帰った。

湖水は Whatman GF/F filters (420°C, 3時間燃焼)を用いる過を行い、フィルター上に濃縮したセストンをクロロフィルa濃度の測定、ARISA （automated rRNA intergenic spacer analysis）と定量PCR解析用のDNA抽出に用いた。また、ろ液を溶存体無機窒素(DIN: dissolved inorganic nitrogen)および溶存態無機リン(DIP: dissolved inorganic phosphorus)濃度の分析に、原水は全有機炭素（TOC: total organic carbon）、全窒素（TN: total nitrogen）および全リン(TP: total phosphorus)濃度の測定に用いた。

## 8 ）ARISA法と定量PCRによる環境サンプルの解析

環境サンプル中のC. issastchenkoi およびR. mediterraneaの検出はARISA法を用いて行った。ろ過で濃縮した懸濁粒子から改变CTAB法によりDNAを抽出、30μLのTE緩衝液に溶解し鋳型DNAとしたCSIFおよび5'末端を6-FAMで標識した23SULRプライマーを用いPCRにより16S-23S rDNA ITS領域の増幅を行った $ ^{9,12} $ 。増幅したDNA断片長の決定はABI3100-Avant キャピラリーシーケンサー(Applied Biosystems)とGeneScan $ ^{TM} $ 1200LIZサイズスタンダード（Applied Biosystems）を用いて行った。得られたピークデータをGeneMapper ver 4.0 (Applied Biosystems)により解析を行い、各ピークのサイズを求めるとともに、それぞれのピーク面積を求めた。C. issastchenkoiおよびRaphidiopsis spp.のDNA断片長はそれぞれ411 bpおよび399 bpであることが既に報告されているため $ ^{12} $ 、本領域に検出された蛍光面積50以上のピークを陽性として評価した。

次に、アナトキシン-a生産株のC. issatschenkoiの定量を行うために、C. issatschenkoiのATXの配列に特異的なプライマーセットとプローブを設計した。設計には、既知のC. issatschenkoiのATXの配列と共に、近縁種のanatoxin-a生産株の計12配列を用いた。ClustalW $ ^{35)} $ による各塩基配列のアラインメントの後、Primer3Plus $ ^{36)} $ を用い、TaqMan $ ^{®} $ プローブ(Applied Biosystems)とプライマーの設
計を行った。

## （３）水鳥によるアオコの拡散

## 1 ）水鳥生息・渡来状況調査

全国的な水鳥の渡来数及び既存の鳥類の移動経路について、環境省により毎年1月中旬に全国で一斉調査が行われているガンカモ類の生息調査及び標識調査の結果をまとめた鳥類アトラスからデータを引用した $ ^{18,19,45} $ 。水鳥の渡来状況の現地調査を2010年1月13～27日に行った。琵琶湖では、双眼鏡及び望遠鏡を用いて、琵琶湖内湖に渡来している水鳥の個体数を数え、地図に観察地点及び観察範囲を記録した。

## 2 ）水鳥体表面及び糞からのシアノバクテリアDNAの検出

水鳥によるアオコの外部散布（動物の体表等に付着して輸送される）および内部散布（動物に摂食され、未消化のまま排泄されることにより輸送される）について検討した。2010年8月から2011年3月に、日本各地の湖沼や干潟において水鳥の糞を採取した。遠方より各種の水鳥を観察し、糞をした時点でその場へ行き、できるかぎり新鮮な状態の糞を採取してその日時と場所を記録するとともに、糞をした水鳥の種を記録した。また、水鳥を無双網又は手取りで捕獲した個体及び琵琶湖岸の漁港の網に絡まった個体について、体の表面を歯ブラシで軽くこすりながら蒸留水で流し、70～140mLのサンプルを採取した。また、鳥をしばらく袋へ入れておき、糞のサンプルを収集した。また、陸上で休息又は採食している水鳥から新鮮な糞を採集した。体を洗った水、ペレットのままの糞、糞を水で溶かしたもの、培養したミクロキスティスを一緒にいれた糞ペレットを、それぞれGF/Fフィルターでろ過した。採取した糞サンプルおよびサンプルを保持したフィルターから、抽出キット(ZR Fecal DNA Kit (Zymo Research))を用いてDNAを抽出し、藍藻類の16S rRNA遺伝子に特有のプライマー対CYAN 108F $ ^{37} $ 及び16S CYR $ ^{32} $ を用いてPCRを行い、さらにこのPCR反応液を100倍希釈したものを鋳型DNAとして、Microcystis属の16S rRNA遺伝子に特有のプライマー対（MICR 184F、MICR 431R） $ ^{25)} $ を用いてNested PCRを行った。PCR産物は、2%アガロースゲルで電気泳動し、Microcystis属のDNAが糞に含まれていることを確認した。

## 3 ）水鳥によるアオコの内部散布

飼育実験は、2011年8月に、京大生態学研究センターの圃場にて、1歳以上の飼育されていたマガモ(Anas platyrhynchos)8羽を用いてMicrocystis aeruginosa培養株の給餌実験を行った。マガモは紗と動物よけネットを張った農業用ハウス(10×5×3m)に防水シートの屋根をつけて飼育した。ハウス内には自由に水浴びができるようにプラスチックケースの小さな水場を設置した。日中はハウス内で放し飼いにして、餌は1日一回以上与え、自由に食べられるようにした。餌は水鳥用ペレット、草及び水道水を与えた。夜間と実験初日は、ハウス内の飼育ゲージ(54×75×69cm)に個別に入れた。

10日以上飼育した後に、M. aeruginosaの培養株10 mlを細長いスポイドを用いて、朝10時にマガモに飲ませ、糞を決められた時間（最長10日まで；0-1,1-2,2-3,3-4,4-6,6-10,23-24,47-48,95-96,
191-192, 239-240 時間後）に回収した。上記の時間内に排出された糞を全て回収し、CT培地に懸濁して、200 mLにメスアップした。メスアップした糞の懸濁液50 mLを25％グルタルアルデヒド溶液で固定（最終濃度1%）後に冷蔵保存して、排出されたM. aeruginosaの細胞数の計数用サンプルとした。また、DNA抽出用のサンプルは、回収した糞をそのまま用いるか、または培養実験に用いた残りの75 mLの懸濁液を3,000 rpm, 15分間遠心により上澄みを除去後、糞のペレットを回収して用いた。4羽を用いた実験を2回行った。

培養株M. aeruginosa NIES-111は、CT培地500 mLを用いて、25℃、30 μmol m⁻² s⁻¹、エアレーションの条件下で培養を行い、対数増殖期の細胞を実験に用いた。糞から回収したM. aeruginosaの培養については、以下の2通りの方法で行った。まず、CT培地に懸濁した糞7 mLを20mL試験管2本にそれぞれ分注して、25℃、30 μmol m⁻² s⁻¹の条件下で21日間培養を行った。また、倒立頭微鏡（Olympus CKX47）を用い、CT培地に懸濁した糞からM. aeruginosaの細胞を直接拾い出し、新しいCT培地で2回洗浄後800 μLのCT培地に1細胞ずつ添加した後、25℃、30 μmol m⁻² s⁻¹の条件下で1カ月間培養を行った。

糞の計数用にグルタルアルデヒド固定したサンプルを、ポアサイズ0.8μmのポリカーボネートフィルターを用いてろ過し、糞に含まれる懸濁物をフィルター上に濃縮した。イマージョンオイルを用いてフィルターをスライドガラス上に固定・油浸し、蛍光頭微鏡（Olympus BX60）を用いて、G励起下で自家蛍光を持つM. aeruginosaの細胞の計数を行った。細胞の計数は100視野以上行い、単位時間当たりに排出された全細胞数に換算した。

また、CT培地に懸濁した糞をそのまま培養した実験では、10日後と21日後に培養サンプルの一部を回収し、蛍光顕微鏡を用い細胞密度を求めた。2~4時間後に排泄された糞から、倒立顕微鏡下で細胞を拾い出し、一細胞ずつ培養した実験では、一か月後の増殖情況を倒立顕微鏡下で観察し、増殖があったものを生存、増殖が見られなかった細胞を死亡細胞として評価した。一細胞を拾いだすために、あらかじめ20から30細胞を1セルにプールしたが、そのセルの一か月後の増殖情況も確認した。

糞サンプルからのDNA抽出、PCR増幅、Nested PCT、およびMicrocystis属DNAの確認は、すでに先述の通りである。

## （４）アオコ群集の生存と増殖に関する生態学的研究

## 1 ）野外実験池を用いたアオコ増殖実験

研究は京都大学生態学研究センターの敷地に設置されている10m四方、最大水深1.7m、容積約70 $ m^{3} $ の四角すい形の野外実験池3基を用いて行った。実験は2009年8月20日より開始した。シアノバクテリアのブルーム形成を促進するため、3基の実験池にMA培地を1/50濃度となるよう添加した。MA培地 $ ^{14)} $ は窒素：リン比が低いため（N:P=2.8:1）、無機窒素 $ Ca(NO_{3})_{2}\cdot4H_{2}O $ 、 $ KNO_{3} $ および $ NaNO_{3} $ については3倍量添加した。また、Microcystis属の細胞および自然湖沼の微生物群集を添加する処理として、3.6 $ m^{3} $ の琵琶湖湖水を5μmメッシュサイズのプランクトンネットで濃縮したものを、3基の実験池にそれぞれA:B:C=5:1:0の割合で添加した。また、栄養塩の枯渇を防ぐため、2週間おきに無機窒素 $ \mathrm{(Ca(NO_{3})_{2}\cdot4H_{2}O、KNO_{3}} $ および $ NaNO_{3}) $ とリン酸 $ \mathrm{(KH_{2}PO_{4})} $ の再添加を行った（DIN:415μg $ L^{-1} $ 、DIP:50μg $ L^{-1} $ ）。
採水は、1週間に2回の頻度で行った。表層の水温およびpHの測定と共に、栄養塩濃度、クロロフィルa濃度、顕微鏡観察およびDNA解析のため採水を行った。栄養塩およびクロロフィルa濃度、DNA解析用のサンプルは、420℃で3時間燃焼したGF/Fフィルターを用いる過処理を行い、フィルターおよび原水とろ液を-20℃で冷凍保存した。顕微鏡観測用サンプルはグルタルアルデヒド（最終濃度1%）で固定し保存した。栄養塩類の分析はAACSⅡオートアナライザー(BRAN+ LUEBBE)を用いて行った。クロロフィルa濃度の測定は、水サンプルを燃焼したGF/Fフィルターを用いてろ過し、フィルター上に保持された植物プランクトンについて蛍光法で求めた $ ^{40} $ 。

## 2 ）アオコ増殖に対する栄養塩類供給比の影響

70 m³の3基の実験池を4区画に仕切り、それぞれを繰り返しとして実験に用いた。Microcystis属を含む琵琶湖湖水を5μmメッシュサイズのプランクトンネットで濃縮したサンプルを作成し、各区画に添加した。実験は、窒素とリンの比（N:P）を、N:P=10:1（1,660μg L⁻¹:400μg L⁻¹）、19:1（1,660μg L⁻¹:200μg L⁻¹）、80:1（33,200μg L⁻¹:200μg L⁻¹）、200:1（166,200μg L⁻¹:200μg L⁻¹）の4段階に設定したMA培地 $ ^{14)} $ を添加することにより開始し、その後、これらの培地を各区画に2週間おきに添加した。採水は、各区画より1週間に1回の頻度で行い、栄養塩濃度、クロロフィルタ濃度、顕微鏡観察およびDNA解析を行った。サンプルは、420℃で3時間燃焼したGF/Fフィルターを用いろ過処理を行い、フィルターおよび原水とろ液を-20℃で冷凍保存した。顕微鏡観測用サンプルはグルタルアルデヒド（最終濃度1%）で固定し保存した。栄養塩類の分析はAACSⅡオートアナライザー(BRAN+ LUEBBE)を用いて行い、クロロフィルタ濃度の測定は蛍光法で行った $ ^{40)} $ 。Microcystis属の細胞密度は、定量PCR法により求めた $ ^{11)} $ 。

## 3 ）Microcystis属の細胞密度の推定と遺伝子型の多様性の評価

DNAの抽出はCTAB法 $ ^{8)} $ を一部改変して行った。Microcystis属の細胞密度の推定は16S rDNAを標的としたMicrocystis属に特異的なプライマーとTaqMan $ ^{®} $ プローブを用いΔΔCT法で行った $ ^{5)} $ 。25 μLの反応液に12.5 μLのTaqMan Universal Master Mix II(Applied Biosystems社)、0.9 μMプライマー0.2 μM TaqManプローブおよび1/25に希釈したDNAサンプルを2.5 μL加え、ABI 7300 Real Time PCR instrument (Applied Biosystems社)により解析を行った。

Microcystis属の遺伝子型の評価のため、16S-23S rDNA ITS領域の塩基配列多型の解析を行った。サンプルよりDNAを抽出し、シアノバクテリアに特異的なCSIFプライマー及び23S rDNAプライマー ULRを用いITS領域の増幅を行った $ ^{5)} $ 。その後、pT7 Blue Perfectly Blunt Cloning Kit (Novagen)を用いクローニングを行った。ポジティブなコロニーを100個採取、Microcystis属に特異的なプライマーセット(MITS-F(5'-AAG GGA GAC CTA ATT CVG GT-3')，MITS-R(5'-TTG CGG TCY TCT TTT TTG GC-3')) $ ^{34)} $ を用いコロニーPCRを行い、2%アガロースゲル電気泳動により、PCRによる増幅の有無を確認し、Microcystis属のDNA断片を含んでいるコロニーのみ塩基配列の決定を行った。

## 4 ）ラン藻類の光合成活性の評価

励起光として440 nm（クロロフィルa）、485 nm（クロロフィルb & c）および590 nm（フィコシアニン）の三種を用い、それぞれの励起光下での680 nm（クロロフィルa）の蛍光強度の測定を行った $ ^{15} $ 。その後、DCMU (3'-(3,4-dichlorophenyl)-1',1'-dimethyl urea)を最終濃度15 μMとなるよう添加
し再び蛍光強度の測定を行った $ ^{(29)} $ 。DCMU添加前 $ (F_{0}) $ および後 $ (F_{m}) $ の各励起光下での蛍光強度より、光化学系Ⅱの光合成最大量子収率 $ (Fv/Fm) $ を求めた。この方法によるラン薬類の光合成活性の評価を、DCMU蛍光法とした。

DCMU 蛍光法の有効性を確認するために、以下の実験を行った。琵琶湖湖水を $ 5 \mu m $ メッシュサイズのプランクトンネットで濃縮したものを、8基の実験池にそれぞれに添加して実験を開始した。2週間おきに無機窒素 $ (\mathrm{Ca}(\mathrm{NO}_{3})_{2} \cdot 4\mathrm{H}_{2}\mathrm{O}, \mathrm{KNO}_{3}) $ および $ NaNO_{3} $ とリン酸 $ (\mathrm{KH}_{2}\mathrm{PO}_{4}) $ を添加（無機窒素を $ 415 \mu g \cdot L^{-1} $ 、リン酸を $ 50 \mu g \cdot L^{-1} $ ）し、各区画より1週間に1回の頻度で採水を行い、栄養塩濃度、クロロフィルルa濃度、DCMU 蛍光法による光合成最大量子収率を測定した。

## （５）アオコ発生時の微生物群集の応答

## 1 ）細菌と原生生物の現存量および組成の動態

アオコ発生時の細菌と原生生物の動態を把握するために、2009年8月から2010年1月にかけて、野外実験池より週一回の頻度でサンプルを採取した。細菌の現存量測定に用いるサンプルは、ホルムアルデヒド（最終濃度2%）にて固定した後、DAPI (4', 6'-diamidino-2-phenylindole)により、落射蛍光顕微鏡を用いて、紫外線励起光下で、1サンプル当たり400細胞以上あるいは20視野以上の細菌を計数した。また、上記固定サンプルを用いて、細菌群集組成をCARD-FISH法(Catalyzed reporter deposition fluorescence in situ hybridization) $ ^{30)} $ にて求めた。プローブは、細菌全体についてはEUB338のI, II, IIIを混合して用い、αプロテオバクテリアはAlfa968、βプロテオバクテリアはBeta42、γプロテオバクテリアはGam42a、Cytophaga-FlavobacteriumはCF319、ActinobacterialはHGC69aを、それぞれ用いた。1サンプル当たり400細胞以上あるいは20視野以上の細菌を計数し、DAPIで染色された細菌細胞数に対する各プローブで蛍光を示した細胞の割合（% DAPI）を算出した。

原生生物は、従属栄養鞭毛虫と繊毛虫の細胞密度を求めた。サンプルをグルタールアルデヒド（最終濃度1%）にて固定した後、プリムリンで染色後、落射蛍光顕微鏡を用いて、紫外線励起光下で、1サンプル当たり100視野について観察される鞭毛虫細胞を計数した。計数の際、自家蛍光のある細胞は独立栄養鞭毛虫として計数した。繊毛虫は、500mLのサンプルを、最終濃度1%で酸性ルゴール液にて固定した後、固定サンプル中のプランクトンを自然沈殿により濃縮し、濃縮したサンプルをBurker-Turk型血球計算盤を用いて、光学顕微鏡下で繊毛虫細胞を計数した。

## 2 ）アオコに対する原生生物による摂食圧の評価

京都大学生態学研究センターの敷地内に設置してある野外実験池（ $ 10m \times 10m \times 1.7m $ ; 容積約 $ 70m^{3} $ ）において、2010年7月1日から12月28日の期間、週1回サンプリングを行った。水温は、現地で測定した。クロロフィルα濃度は、試水をGFフィルターにてろ過した後、Welschmeyer (1994)の蛍光法 $ ^{40)} $ を用い分析した。またM. aeruginosa数、Collodictyon triciliatum数、C. triciliatum内M. aeruginosa数をカウントするために、それぞれ500mlのサンプル水をルゴール固定（最終濃度1%）後、自然沈殿させ、Burker-TurkまたはFuchs-Rosenthal計算盤にてカウントを行った。

国立環境研究所より購入したM. aeruginosa NIES-843株を、滅菌した300−500 mL NalgenボトルにCT培地を入れて培養した。C. triciliatum を実験池より単離するため、倒立頭微鏡下で観察しながらパスツールピペットでC. triciliatumを1細胞採取し、CT培地を入れた24well マイクロプレートに入れた。翌日、増殖したC. triciliatumを再度ピペットで1匹採取し、同様に新しいCT培地の入っ
たマイクロプレートウェルに入れた。数日これを繰り返し、C. triciliatum以外の生物が含まれていないことを確認後、ウェル内の培地をCT培地に低濃度のM. aeruginosaの入った500mlボトルに入れ培養した。M. aeruginosa、C. triciliatumのいずれも、25°C、52 μEm^{-2}s^{-1}の条件下でCT培地^{14)}にて培養した。

C. triciliatumのM. aeruginosaに対する消化速度を調べるために、C. triciliatumにM. aeruginosaを12時間摂食させた後、培地をCT培地にて10倍希釈し摂食を止めた $ ^{6)} $ 。その後30分間隔で150分までサンプリングを行い、ルゴール固定後、M. aeruginosa、C. triciliatum、C. triciliatum内M. aeruginosa数をカウントし、消化速度を算出した。この消化速度を、 $ Q_{10}=2.1 $ を用い、温度補正した消化速度として求めた。これを用いて、C. triciliatumの摂食速度 $ (G_{\mathrm{c}}; M.\ aeruginosa \ \mathrm{cells \ flagellate^{-1} \ h^{-1}}) $ 、ろ過速度(nl flagellate $ ^{-1} \ h^{-1} $ )、一日当たりの摂食圧 $ (G_{\mathrm{i}};\ \%\ \mathrm{standing\ stock\ day^{-1}}) $ について、それぞれ算出した $ ^{27)} $ 。

C. triciliatumのM. aeruginosaに対する摂食速度の実験の前準備として、培養中のC. triciliatumの食胞内M. aeruginosaを減少させるため、C. triciliatumの培地をCT培地にて2倍希釈し、12時間暗室において食胞内M. aeruginosaを減少させた。M. aeruginosaの濃度（初期濃度； $ 1.0 \times 10^{4} - 2.1 \times 10^{6} $ cells ml $ ^{-1} $ ）培地に、一定数の捕食者C. triciliatum（初期濃度； $ 2.0 \times 10^{3} $ cells ml $ ^{-1} $ ）を添加し、25℃暗所で摂食させた。0、15、30、45分後サンプリングを行い $ ^{17)} $ 、ルゴール固定後、(1)同様に、M. aeruginosa数、C. triciliatum数、C. triciliatum内M. aeruginosa数のカウントをした。摂食速度は、Michaelis-Mentenの式に適用した。

Michaelis-Mentenの式： $ IR=\frac{I_{\max}(x)}{K_{IR}+(x)} $

$ I_{max} $ ；最大摄食速度（cells flagellate $ ^{-1} $ h $ ^{-1} $ ）、 $ K_{IR} $ ; $ I_{max} $ の1/2の速度時のM. aeruginosa密度

## （６）アオコ発生水域の食物連鎖構造の特性

実験は2011年8月26日から10月28日まで行った。ラン薬のブルーム形成を促進するため、3基の実験池にMA培地 $ ^{14)} $ を1/50濃度となるよう添加し、自然湖沼の微生物群集及びMicrocystis属の細胞を添加するため、約2m³の琵琶湖湖水（山田漁港で採取）を>150μmメッシュサイズのプランクトンネットで濃縮したものをそれぞれに添加した。また、栄養塩の枯渇を防ぐため、2週間おきに無機窒素 $ Ca(NO_{3})_{2}\cdot4H_{2}O $ ， $ KNO_{3} $ および $ NaNO_{3} $ とリン酸 $ (KH_{2}PO_{4}) $ の再添加を行った(DIN:415μg L $ ^{-1} $ 、DIP:50μg L $ ^{-1} $ )。2011年9月7日にホンモロコを実験区に投入（A：80匹、B:240匹、D:0匹（コントロール区））した。モニタリングおよびサンプリングは1週間に2回、栄養塩濃度、クロロフィルルa濃度、顕微鏡観察およびDNA解析のため採水を行った。

魚処理区（密度2種類）およびコントロール区で、2週間ごとにサイズ分画によるPOM（懸濁態有機物）のサンプリングを行い、安定同位体比及びバイオマス量（CN含量）を測定した。網目サイズの異なるプランクトンネットを用い（mesh size: >300μm、>150μm）、約100 Lの表層水をろ過した。さらにろ水10Lを、重ねたプランクトンネット（mesh size >70μm, >40μm, >20μm）でろ過した。各メッシュ上にトラップされたセストンはポリ瓶に回収後、300mLにメスアップし、20μm以下のろ水についてはそのままサンプル処理を行った。各サイズフラクションのセストン及びろ水は、450℃，2時間で燃焼しあらかじめ秤量したGF/C filter(D:47mm)に50-190mLろ集し（安定同位
体比及びCN含量測定用）、各10mLをGF/F filter(D:25mm)に2枚ろ過し（クロロフィルa濃度とPOP測定用）、GF/Fでろ過したろ水を栄養塩分析用に採取し、分析まで-20℃で保存した。残りすべてをBiovolume換算用及び種組成の同定のためにホルマリンで固定した。実験開始時及び終了時に、ホンモロコの体重を測定し、終了時の5匹を安定同位体比解析のために凍結保存した。また魚処理区にみられたアカムシュスリカPropsilocerus akamusiも採集し、解析まで-20℃で保存した。また、9月7日、9月29日、10月21日の計3回、魚処理区にみられた動物プランクトン（枝角類、カイアシ類、ワムシ類）を種ごとにソーティングし、安定同位体比解析のサンプルとした。各サイズフラクションのGF/Cフィルターサンプルは、60℃で72時間乾燥させ、乾燥重量を測定後、フィルターを錫箔で包み、安定同位体測定用とした。ホンモロコは解凍後筋肉部分を、アカムシュスリカは個体すべてを、60℃で72時間乾燥させた後、クロロホルム：イソアミル=2：1で脱脂処理を行い、メノウ鉢で粉砕した後、適量（0.5mg前後）を錫箔で包埋した。サンプルはElemental Analyzer (EA, Thermo Electron Corporation)とIsotope Ratio Mass Spectrometer (Delta V Plus, 同)をConflo (ConFlo IV, 同)で結合したEA-IRMSで解析しδ13C or δ15N(‰)およびCN含量を求めた。

## （7） アオコ発生水域の社会科学調査

## 1 ）日本国内における土地利用形態の変遷や周辺住民の生活文化特性の調査

琵琶湖周辺の内湖（図(1)-2）では文献調査と現地踏査をおこなった。前者は、内湖に関わる代表的文献 $ ^{1,4,21,28,33} $ から地図・空中写真・統計にいたる資料を用いて、内湖及び内湖周辺の現況の概要を把握した。後者は、灌瓶期（2009年8月～9月）と非灌溉期（2009年12月～2010年1月）に主要地点で行った。必要な場合には、聞き取り調査（非構造化インタビュー）も行った。

また、利根川流域についても、同様の文献資料調査、現地踏査、聞き取り調査を行い、導水開発等の人間活動に伴ってアオコが拡散する実態の解明を行った。

図(1)-2：調査対象とした琵琶湖内湖

2）東南アジア、オーストラリアおよびアフリカ（ケニア）におけるアオコと人間社会の関係

東南アジアにおける地域固有の生活様式（食文化等）とアオコによるリスクの関係を解明する