Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## 3 ）野外への応用

## a 実験池

京都大学生態学研究センターの屋外実験池にMicrocystis属のアオコを人工的に発生させた試料に、今回開発したPCRプライマーを用いたリアルタイムPCRを応用した。リアルタイムPCRによって各グループのMicrocystis属細胞を計数したところ、“アオコ”の状態になっていた実験池AのMicrocystis属の群集組成はグループ1が主要な構成種で、グループ3は検出されなかった（図(3)-5）。これらの細胞数は時間とともに変化したが、構成比はアオコが発生している期間中、類似した傾向を示した。“アオコ”状態にならなかった実験池Bでも実験池Aと同じようなMicrocystis属の群集組成であったが、56日目のみグループ4が優占種となった。天然の湖沼でMicrocystis属のアオコの群集組成は時間的に変動することが、クローン解析によって明らかにされており $ ^{28} $ 、今回、人工的に発生させたアオコでも群集組成が時間的に変化していることが、今回開発した定量PCR法によってとらえることが可能となった。

図(3)-5：実験池AとBにおける、Microcystis属細胞の経時変化。定量PCR法を用いて推定した遺伝子型別の細胞密度（G1、G3、G4）、ならびにPC、mcyAのコピー数を示す。アスタリスク（*）は検出限界以下を示す。

## b 天然湖沼（下筌ダム、ため池、水月湖、平湖）

アオコが発生している大分県の下筌ダム、静岡県のため池、福井県の水月湖ならびに滋賀県の琵琶湖の内湖である平湖から採取した水試料を用いてMicrocystis属の細胞数をリアルタイムPCR法で計数した。XS法によってDNAを抽出し、PCを標的とした定量PCRでMicrocystis属の細胞密度を見積もったところ、下筌ダムでは $ 2.7\times10^{6} $ cells mL $ ^{-1} $ 、ため池では $ 3.4\times10^{5} $ cells mL $ ^{-1} $ 、水月湖では $ 2.0\times10^{5} $ cells mL $ ^{-1} $ 、平子では $ 2.5\times10^{7} $ cells mL $ ^{-1} $ あった（図(3)-6）。mcyAプライマーセットを用いて有毒個体群数を推定したところ、下筌ダムは $ 1.3\times10^{5} $ cells mL $ ^{-1} $ 、ため池は $ 8.2\times10^{4} $ cells mL $ ^{-1} $ で、水月湖は $ 1.6\times10^{5} $ cells mL $ ^{-1} $ 、平湖は $ 4.2\times10^{6} $ cells mL $ ^{-1} $ であった。全Microcystis属細胞数に占める有毒株の割合は、下筌ダムの4.8%から水月湖の83%と湖によって大きく変化していた。今回開発したプライマーを用いて各グループ別にMicrocystis属を計数した結果、Microcystis属内のグループ構成は試料間で大きく異なっていた。下筌ダムはグループ3が優占していたが、他の湖沼ではグループ1が優
占していた。グループ3は形態的に分類されたM. wesenbergiiのタイプを主とする無毒の株で構成されており（図(3)-1）、下筌ダムでは全Microcystis属に対する有毒個体群の占める割合が低いのは、グループ3が優占していたことと一致する。一方、他の湖沼では有毒株と無毒株が混在するグループ1が優占しており、この内の有毒株の占める割合が高かったと推察できる。

混ざり合うことのない4つの湖沼でのMicrocystis属のアオコの構成種が異なることが、今回開発したリアルタイムPCR法によって明らかにすることが可能となった。隔離され

図(3)-6：下筌ダム（大分県）、ため池（静岡県）、水月湖（福井県）および平湖（滋賀県）のグループ別のMicrocystis属細胞数。定量PCR法を用いて推定した遺伝子型別の細胞密度（G1、G3、G4）、ならびにPC、mcyAのコピー数を示す。アスタリスク（*）は検出限界以下を示す。

た生息環境における優占種の差異は、環境の違いによるものなのか、潜在的に存在する種が異なるのかは不明である。このことについては、ラボスケールでの優占種の遷移過程を調べる実験や、実験池、天然湖沼での経時的なモニタリングを通して詳細に調べる必要がある。

## （３）Microcystis属の増殖におよぼす栄養塩濃度の影響

## 1）MA培地を用いた混合培養の予備的検討 a 単独培養実験

先ず、NIES298、NIES112、およびNIES102を単独培養し、異なる増殖段階でのリアルタイムPCR法による細胞数と直接計数法による細胞数を比較した。単独培養実験における各分離株の直接計数法とリアルタイムPCR法による細胞密度の経時変化を図(3)-7に示す。直接計数法に比べてリアルタイムPCR法によって計数した細胞数のばらつきが大きかった。この結果は、Microcystisの細胞あたりのDNA量が変化していたと考えられる。リアルタイムPCR法によるMicrocystis属細胞の計数値は、培地中の細胞数だけでなく、細胞あたりのDNA量の変化によっても影響を受けることが知られている $ ^{12,18} $ 。Kurmayer and Kutzenberger $ ^{18} $ は対数増殖期から定常期への移行期間におけるリアルタイムPCR法で計数した細胞数は、粒子数

図(3)-7：単独培養実験における直接計数法（DC、●）と定量PCR法（pPCR、○）による細胞密度の経時変化の比較。エラーバーは標準偏差を示す(n=3)。
計測装置による値に比べ、最大で1桁多くなることを報告している。しかし、本実験での対数増殖期と定常期後期における直接計数法とリアルタイムPCR法による計数值の差は殆ど無く、リアルタイムPCR法による計数值を用いた比増殖速度と最大細胞密度の算出には、問題がないと判断できる。

## b 混合培養実験

混合培養実験において、リアルタイムPCR法によって計数された各分離株の細胞密度の経時変化を図(3)-8に示す。培養期間を通して、3株の細胞密度の合計値は直接計数法によって求めた細胞密度とおよそ一致していたことから、リアルタイムPCR法によって個々の分離株の細胞密度を正確に測定できていたと考えられる。全ての分離株は指数関数的に増加した後、培養終了時に最大細胞密度に達した。対数増殖期における各株の比増殖速度はNIES298が0.55 day $ ^{-1} $ と最も高く、NIES112とNIES102はそれぞれ0.43 day $ ^{-1} $ 、0.46 day $ ^{-1} $ と同程度であった（表(3)-5）。これらを単独培養での比増殖速度と比較したところ、明確な差は認められなかった（表(3)-5）。一方、各分離株の最大細胞密度は、混合培養と単独培養では大きく異なっていた（表(3)-5）。このことは、混合培養では株間で栄養塩を巡って競争が起きていたと推察される。3株のうちで比増殖速度が最も高かったNIES298は、有利に栄養塩を取り込めたため最大細胞密度が他の株に比べて大きかったと考えられる。

## 2 ）窒素

2段階の窒素濃度とリン濃度をそれぞれ組み合わせた4種類の改变BG-11培地中のMicrocystis属分離株の細胞密度の経時変化を図(3)-9に示す。全

図(3)-8 : MA培地を用いた混合培養実験における各Microcystis分離株の細胞密度の経時変化。エラーバーは標準偏差を示す（n=3）。

表(3)-5 : MA培地における各Microcystis属分離株の比増殖速度と最大細胞密度の比較

株	比增殖速度 (day $ ^{-1} $ )	最大细胞密度 (cells mL $ ^{-1} $ )
单独培养
NIES298	0.53	3.0×10 $ ^{7} $
NIES112	0.45	1.4×10 $ ^{7} $
NIES102	0.44	1.6×10 $ ^{7} $
混合培养
NIES298	0.55	2.0×10 $ ^{7} $
NIES112	0.43	5.6×10 $ ^{6} $
NIES102	0.46	8.0×10 $ ^{6} $

ての株は接種後から指数関数的に増殖した後、定常期へと移行した。各分離株の細胞密度の合計は同時に測定した直接計数法による細胞密度と一致した。対数増殖期における株ごとの比増殖速度を表(3)-6に示す。各株の比増殖速度は培地間で変動がみられたが、栄養塩濃度に関わらずNIES98が最も高い値を、NIES102が最も低い値を示した。各株の最大細胞密度についても、全ての実験区においてNIES98が最も高く、次いでNIES298とNIES112が同程度、NIES102は他の株と比べて低かった（図(3)-10）。各株の培地間の最大細胞密度を比較した結果、NIES98の最大細胞密度は、高窒素濃度・高リン濃度区（ $ N_{H}P_{H} $ ）で最も高く、他の実験区と有意差（ANOVA、p<0.01）が認められた。高窒素濃度・低リン濃度区（ $ N_{H}P_{L} $ ）のNIES98の最大細胞密度がこれに続き、低窒素濃度区（ $ N_{L}P_{H} $ と $ N_{L}P_{L} $ ）が最も低かった。他の株については、NIES102が $ N_{H}P_{L} $ 区で他の処理区に比べて高い値を
示したことを除き、栄養塩濃度と最大細胞密度の間に明確な関係は認められなかった。これらの結果は、NIES98が他の分離株に比べてより高濃度の栄養塩環境に適応していることを示唆している。一方、他の株については、設定した窒素濃度が高く増殖を制限していないために、最大細胞密度や比増殖速度に違いが認められなかったと考えられた。そこで、窒素濃度をより低濃度に調整した改变BG-11培地（表(3)-2下）を作成し、同様の実験を行った。

図(3)-11に示すように全ての株は接種後から指数関数的に増加した。対数増殖期は初期窒素濃度が低い程、短くなる傾向が認められた。初期窒素濃度が0.49 mgN L⁻¹と0 mgN L⁻¹の場合、NIES98は約400時間以降から急速に細胞密度が減少した。このような現象は、他の分離株では観察されなかった。NIES98は高濃度の窒素を含む培地では他の株よりも有利に増殖する一方で、増殖が維持できない窒素濃度以下では他のMicrocystis属株によって淘汰されやすいのかもしれない。このことは、現場環境における窒素濃度が株間の増殖競争だけではなく、その生残競争にも影響を与えていると考えられる。

NIES98は高い初期窒素濃度（2.45～49 mgN L^{-1}）では他の株よりも高い比増殖速度であったが、0.98 mgN L^{-1}以下では、NIES298およびNIES112と同程度か低い比増殖速度であった（表(3)-7）。この結果は、NIES98は、他の株に比べて窒素による増殖制限を受けやすいことを表している。

実験培地中の初期窒素濃度が0～4.9 mgN L^{-1}までの範囲において、初期窒素濃度と最大細胞密度の間に正の相関関係が示された（図(3)-12）。NIES98は初期窒素濃度に対する最大細胞密度

図(3)-9：定量PCR法による実験培地ごとのMicrocystis分離株の細胞密度の経時変化。エラーバーは標準偏差を示す（n=3）。培養条件は表2を参照。

表(3)-6：各栄養塩処理区におけるMicrocystis 分離株ごとの対数増殖期の比増殖速度 (day⁻¹)

栄養塩処理
$ N_{H}P_{H} $	$ N_{H}P_{L} $	$ N_{L}P_{H} $	$ N_{L}P_{L} $
NIES98	0.52	0.56	0.67	0.59
NIES298	0.43	0.42	0.56	0.56
NIES112	0.49	0.48	0.52	0.58
NIES102	0.33	0.38	0.41	0.35

の傾きが大きく、窒素濃度に対する増殖応答が他の株と異なっていた。現場環境では硝酸態室素濃度によって有毒株の細胞密度が変化することが報告されており $ ^{22,27} $ 、窒素濃度の変化によってNIES98のような特定の株が増減するために、Microcystis属アオコの群集構造や有毒株の割合が変動していると考えられる。
図(3)-10：各実験培地における分離株ごとの最大細胞密度の比較。エラーバーは標準偏差を示す（n=3）。横軸は表2を参照。

図(3)-11：初期窒素濃度の異なる実験培地における分離株ごとの細胞密度の経時変化。エラーバーは標準偏差を示す（n=3）。図左上は初期窒素濃度を示す。

図(3)-12: 改变BG-11培地中の初期窒素濃度と各分離株の最大細胞密度との関係。エラーバーは標準偏差を示す(n=3)。

表(3)-7：各実験培地におけるMicrocystis分離株ごとの対数増殖期の比増殖速度（day⁻¹）

株	培地中の初期窒素濃度（mgN L^{-1}）
49	4.9	2.45	0.98	0.56	0
NIES98	0.52	0.67	0.46	0.42	0.41	0.29
NIES298	0.43	0.56	0.44	0.43	0.40	0.32
NIES112	0.49	0.52	0.38	0.42	0.40	0.33
NIES102	0.33	0.41	0.31	0.28	0.28	0.28

## 3 ）リン

リン濃度を7段階に変化させた培地中での、各株の増殖をモニターした。何れのリン濃度でも全ての株は増殖したが、培地中の初期リン濃度によって各株の増殖のパターンは異なった。増殖曲線の傾きから算出した比増殖速度を表(3)-8に示す。また、最大細胞密度を図(3)-13にまとめた。リン濃度が0.050 mgP L⁻¹以上では、株によって増殖速度と最大細胞収量は異なるものの、何れの株も良好に増殖した。一方、0.020 mgP L⁻¹以下のリン濃度では良好に増殖する株と増殖しない株が明確に分かれた。グループ1に属する無毒株のNIES98はリン濃度に関係なくMicrocystis属株が混在するなかで、最も良く増殖した。これに対し、有毒株であるNIES102株はリン濃度が高い場合にはNIES98と同等程度の増殖を示したが、低濃度の場合は他の株よりも増殖が抑制された。この結果は、現場環境中のリン濃度によって優占するMicrocystis属の種類が異なることを示唆しており、リ
濃度の上昇に伴ってMicrocystis属によるアオコが増大するだけではなく、アオコ中に含まれる有毒株の相対的な比率が増加するために、毒の生産・蓄積にも影響をおよぼすかもしれないことを意味している。

表(3)-8：混合培養系におけるリン濃度の異なる培地中での各Microcystis属株の比増殖速度(day $ ^{-1} $ )

株	培地中の初期リン濃度（mgP L^{-1}）
0.002	0.005	0.010	0.020	0.050	0.100	0.200
NIES98	0.11	0.11	0.25	0.22	0.37	0.40	0.36
NIES298	0.09	0.13	0.28	0.20	0.29	0.28	0.30
NIES112	0.12	0.14	0.27	0.29	0.28	0.29	0.24
NIES102	0.07	0.06	0.07	0.11	0.27	0.31	0.33

図(3)-13：各リン濃度における混合培養でのMicrocystis属株ごとの最大細胞密度の比較。エラーバーは標準偏差を示す（n=3）。

## （４）Microcystis属の増殖におよぼす温度の影響

水温を5段階に変化させた条件下での、全菌数計測に基づく最大細胞収量と比増殖速度を図(3)-14に示す。20°C以上では温度に関係なく最大細胞収量は $ 10^{7} $ cells mL $ ^{-1} $ 前後であったが、比増殖速度は30°Cが最も大きな値であった。ここから、培養温度はMicrocystisのブルームの規模ではなく、Microcystis群集の比増殖速度に影響を与えると考えられた。次に、混合培養と単培養中での各株の最大細胞収量を算出した結果を図(3)-15に示す。混合培養では培養温度が25°C以下の条件では、各株の最大細胞収量の違いは10倍程度であるが、30°C以上ではグループ3と4がグループ1の増殖と比べて抑制された。特にグループ3の無毒株は殆ど増殖せず、全細胞数の1/1000以下程度まで抑制された。単培養では30°C以上においてグループ3と4の最大細胞収量はグループ1に属するNIES298株と同一であったことを考えると、混合培養中では単培養と異なり、株間で何らかの競合が起こっ
ていると考えられた。一方で、混合培養中の各株の比増殖速度は、30°C以上で大きく異なり、最大細胞収量と同様にグループ1に含まれる2株の増加が顕著であったが、グループ3は顕しく減少した（図(3)-16）。以上の実験より、混合状態でのMicrocystis属の増殖は25°Cで遺伝子タイプ間の違いが顕著となり、高い比増殖速度を有する遺伝子タイプが、最終的に大きな最大細胞収量を獲得することが示唆された。すなわち、環境の温度によって増殖の応答が遺伝子タイプ毎に異なっており、現場温度が群集組成に影響をしていることが示唆された。

図(3)-14: 各培養温度での混合培養中の全Microcystis属の最大細胞収量(A)と比増殖速度(B)。エラーバーは標準偏差を示す(n=3)。

図(3)-15：各培養温度での混合培養中のMicrocystis属株ごとの最大細胞収量（A）と単培養中の最大細胞収量（B）の比較。エラーバーは標準偏差を示す（n=3）。
図(3)-16：各培養温度での混合培養中のMicrocystis属株ごとの比増殖速度。エラーバーは標準偏差を示す(n=3)。

## （５）アクアトロン実験

## 1 ）Microcystis属2種の混合培養

MA増地を添加したアクアトロンにおいて人工的にアオコを発生させることができた。直接計数法によるNIES298とNIES112の細胞密度の推移は、NIES112が培養期間を通して増加し、906時間後に最大値4.4±1.6×10^{5} cells mL^{-1}に達した。これとは対照的に、NIES298は接種直後から細胞数が減少し、475時間以降は、顕微鏡を用いた直接計数法では計数が不可能であった（図(3)-17A）。一方、リアルタイムPCR法によって全ての試料からNIES298とNIES112にそれぞれ由来する16S-23S ITSを定量できた（図(3)-17B）。NIES112は接種から856時間後に最大値に達した。NIES298は直接計数法と同様に、培養開始直後からの細胞が減少した。このNIES298の減少とNIES112の増加は、株間の排他的競争を示唆している。しかし、アクアトロン内は無菌状態ではなく、その原因を推定することは困難であった。

直接計数法とリアルタイムPCR法で計数した細胞数は良く一致していた（図(3)-18）。この結果

は、リアルタイムPCR法によって複数の遺伝子グループのMicrocystis属が混在する試料からでも株ごとに細胞数を計数できることを示している。さらに、リアルタイムPCR法は、直接計数法では定量できなかったNIES298の低密度での推移を計測することができた。従来の頭微鏡による直接計数法では低密度で存在するMicrocystis属の計数が難しく、「アオコ」状

図(3)-17 : Microcystis属2株（NIES298とNIES112）の直接計数法(A)と定量PCR法(B)によるアクアトロン中の細胞密度の経時変化。エラーバーは標準偏差を示す(n=6)。アスタリスクは計数できなかったことを示す。
熊のMicrocystis属を対象にその細胞密度や形態種組成が観察されていた $ ^{4} $ 。しかし、近年の分子生物学的手法により、アオコが形成されない季節でも湖水中にMicrocystis属の細胞が僅かに存在していることが明らかになっている $ ^{12} $ 。したがって、形態学的特徴、およびミクロシスチン産生能と密接に関係する遺伝子グループを識別・計数できるリアルタイムPCR法は、アオコの発達過程での遺伝子グループ間の競争だけでなく、アオコ形成以前や衰退時などの低密度で推移するMicrocystis属をモニタリングする上でも有効な手法といえる。

図(3)-18：直接計数法と定量PCR法による Microcystis属細胞数の関係。図中の直線は y=1.00x の一次回帰直線を示す。

## 2 ）アクアトロンを用いた天然アオコの増殖

## と消滅過程

アクアトロンに添加したMicrocystis属の細胞数は4日後にかけて、初期の添加細胞数の約8.9～17.0倍に増加し、その後不規則な増減を繰り返した（図(3)-19）。最終的にアオコは消滅へ向かった

が、アオコを保持できる期間は、「高窒素・低リン」、「低窒素・高リン」、「高窒素・高リン」の順に長かった。この結果は、栄養塩濃度およびそのバランスがアオコを保持できる期間に影響を及ぼしていると考えられた。図(3)-20にアオコ試料そのものをアクアトロンで保持した際の、各遺伝子コピー数と各遺伝子型の細胞密度の推移並びに、ラン藻類の群集組成を表すDGGEバンドパターンを示す。栄養塩を添加していない“アオコ”の状態では、培養開始後から徐々に細胞数が減少し、アオコが崩壊してく過程が観察できた（図(3)-20A）。このアオコの群集組成をDGGE解析によって調べたところ、培養期間を通して出現するバンド（b1、b2、b4、b5、b6）、培養初期に出現するバンド（b3、b7）、培養後期に出現するバンド（b11）が存在した。Microcystis属の株によって崩壊する速度が異なることが

培養時間(週)

培養時間(週)

図(3)-19：各アクアトロンの遺伝子コピー数および各遺伝子型の細胞数の推移。高窒素・高リン（AとB）、高窒素・低リン（CとD）、低窒素・高リン（EとF）の比較。PCとmcyAはフィコシアニンとmycA遺伝子コピー数を、G1、G3、G4は各遺伝子型の細胞密度を示す。
示唆された。

図(3)-20：アクアトロンで培養した天然アオコ中の各遺伝子コピー数および各遺伝子型の細胞密度の推移（A）とMicrocystis属の組成を表すDGGEバンドパターン（B）。*はDGGEバンドパターンの日付に対応する。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

異なる遺伝子グループのMicrocystis属株が混在する試料からでも、各グループに特異的なプライマーを用いたリアルタイムPCR法によって株ごとの細胞数を正確に計数することが可能となった。栄養塩濃度の異なる条件下ならびに培養温度の異なる条件下で数種の株を混合培養したところ、栄養塩濃度に対する増殖特性が株によって異なることが明らかとなった。また、温度に対する増殖特性も単独での培養と株が混在する培養では、増殖特性が異なることが示された。この結果は、現場における栄養塩の濃度がMicrocystis属の群集構造を変化させる要因の一つであるとともに、環境の温度によって優占するMicrocystis属の種類が変化すると考えられた。本研究の成果は、天然湖沼におけるMicrocystis属のアオコの形成・消滅過程を理解する上で重要な知見で、その学術的な意義は大きい。

## （２）環境政策への貢献

従来、アオコの分類については、細胞の形状、群体の形状・大きさおよび群体を取り巻く粘質体の状態、さらには細胞の大きさとガス胞の有無を、顕微鏡観察により行っていた。わが国
ではMicrocystis aeruginosa、M. wesenbergii、M. viridis、M. ichthyoblabe、M. flos-aquae、M. novacekiiなどの種類が観察されている。しかしながら、これらの種識別の基準となる形態形質は培養条件によって大きく変化する。湖沼における環境条件は時々刻々と変化するが、湖沼で発生したアオコの形態形質も環境変化に応じて変化すると考えられる。また、アオコの生理状態によっては、細胞が群体を形成せずに単細胞で湖水中に存在しており、このような場合は形態的特性が失われるので、形態形質による種の識別は不可能となる。さらに、有毒アオコの発生は公衆衛生上極めて重要な環境項目であるが、先述の形態形質が確認できたとしても、アオコが有毒であるかどうかまで判別することは不可能である。

すなわち、これまでの富栄養化に関わる環境対策においては、どんなアオコが発生しているのかを知ることが重要であったにもかかわらず、時として不安定なアオコ種の同定が行われていたであろうし、毒素生産の検討については時間と労力のかかる毒素分析を外部委託等によって行うことで対応せざるを得なかった。

本研究では、各遺伝子型のアオコに特異的に対応可能な遺伝子プライマーの開発に成功した。これにより、たとえ単細胞状態で浮遊しているアオコであっても、それがどの種で毒素生産するかについて、簡便に確実に特定することが可能となった。また、本研究の方法では、大量の試水をろ過することができれば、かなり低密度でしか存在しないアオコであっても検出可能である。従来、顕微鏡観察では、観察できる試水量が限られていたが、本研究の方法はこれを上回る量の試水を対象とした検査が可能である。

以上のように、本研究で開発した方法を使えば、まだ増殖が十分でない低密度のアオコをより早期に検知できるだけでなく、そのアオコがどんな種であり、かつ毒素生産の可能性まで、従来よりもはるかに短時間でかつ効率よく突き止めることができる。

また、本研究では、窒素の供給がアオコの増殖に特に強く作用することを明らかにした。従来、水域の窒素負荷については多くの情報がある。すなわち、既存の情報を利用すれば、現段階でアオコの発生が見られない湖沼であっても、窒素負荷状況によってはアオコの発生が将来起こるかもしれない。すなわち、本研究では、「いずれアオコが発生するのか？」の問いに応える成果が得られた。

環境問題は、ある日突然起こるように思われがちであるが、本研究の成果により、少なくともアオコ問題については、より早い段階での対策やリスク回避が可能となった。このことは、環境政策上大きな貢献と言える。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない
## <査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 近藤竜二、片岡剛文：アオコの生理・生態・分子系統地理学的研究の現状（京都大学生態学研究センター共同利用事業（セミナー））（2009）

「アオコ原因微生物Microcystis属の分子識別」

2) T. Homma, T. Kataoka, S. Nakano, and R. Kondo: CER International workshop for New Frontier of Microbial Ecology (2010)

“Assessing the Behaviour of Intra-specific Variations in A Cyanobacterial Species Microcystis aeruginosa”

3) 片岡剛文、本間隆満、中野伸一、近藤竜二：日本陸水学会第76回大会（2011）

「アオコ原因藍藻（Microcystis aeruginosa）の遺伝子型に基づく分子識別と定量PCRを用いた細胞密度の推定」

4) 本間隆満、片岡剛文、中野伸一、近藤竜二：日本陸水学会第76回大会（2011）

「Microcystis属における遺伝子グループ組成に及ぼす栄養塩濃度の影響」（ポスター）

5) 片岡剛文、本間隆満、中野伸一、近藤竜二：第27回日本微生物生態学会大会（2011）

「遺伝子型の異なるアオコ原因藍藻（Microcystis aeruginosa）の栄養塩濃度に対する増殖応答」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

1) アオコの生態・生理・分子系統地理学的研究の現状（2009年11月14日、京都大学生態学研究センター、参加者33名）

2) "CER International workshop for New Frontier of Microbial Ecology", chaired by Yoshitake Takao and Shin-ichi Nakano (2010年12月5日、京都大学生態学研究センター、参加者27名)

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) Allen, M. M., and R. Y. Stanier. 1968. Growth and division of some unicellular blue-green algae. J
Gen Microbiol 51: 199-202.

2) Anagnostidis, K. and J. Komárek. 1985. Modern approach to the classification system of cyanophytes 1-Introduction. Arch Hydrobiol/Suppl 71 (Algorithcal Studies 38/39): 327-472.

3) Anagnostidis, K. and J. Komárek. 1988. Modern approach to the classification system of cyanophytes 3-Oscillatoriales. Arch Hydrobiol/Suppl 80 (Algorithmic Studies 51-53): 291-302.

4) Anagnostidis, K. and J. Komárek. 1990. Modern approach to the classification system of cyanophytes 5-Stigonematales. Arch Hydrobiol/Suppl 86 (Algorithmic Studies 59): 1-73.

5) Briand, E., N. Escoffier, C. Straub, M. Sabart, C. Quiblier, and J. F. Humbert. 2009. Spatiotemporal changes in the genetic diversity of a bloom-forming Microcystis aeruginosa (cyanobacteria) population. The ISME Journal 3: 419-429.

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# Ecophysiology, Phylogeography and Environmental Sociology on Water Blooms of the Globally Distributed Cyanobacterium Microcystis aeruginosa

Principal Investigator: Shin-ichi NAKANO

Institution: Center for Ecological Research, Kyoto University

Hirano 2-509-3, Otsu 520-2113, Shiga, JAPAN

Tel: +81-77-549-8239 / Fax: +81-77-549-8201

E-mail: nakano@ecology.kyoto-u.ac.jp

Cooperated by: Tsukuba University, Fukui Prefectural University

## [Abstract]

Key Words: Microcystis aeruginosa blooms, Ecology, Phylogeography, Genetic diversity, Environmental sociology

The present study aims to elucidate the following issues on Microcystis aeruginosa blooms in eutrophic lakes: dispersal of M. aeruginosa into various lakes, ecology and phylogeography of particular genotypes of M. aeruginosa, and the relationship between human activity and Microcystis bloom. We identified the genotypes of 221 M. aeruginosa strains of Japanese lakes and Southeast Asian lakes, using a multilocus sequence typing (MLST). We found 124 new MLST genotypes out of 155 ones. Population genetic and phylogenetic analyses showed negligible differences among the genotypes, suggesting the transport of M. aeruginosa among those countries. A specific strains belonging to a panmictic cluster was found only in Lake Kasumigaura of 2009. We also found a halotolerance strain of M. aeruginosa in brackish Lake Shinji. Using 16s-23s rDNA ITS region, high genotypic diversity of M. aeruginosa collected in Western Japan was also found without geographical differentiation. There were significant differences in heterotrophic bacterial composition between lakes with and without M. aeruginosa blooms. In outdoor mesocosms, we successfully had artificial M. aeruginosa blooms with diverse, ephemeral dominant genotypes. We developed the method which predicts massive growth of cyanobacteria, using autofluorescence with or without DCMU (3’-(3,4-dichlorophenyl)-1’, 1’-dimethyl urea). We also developed PCR primers for enumerating cells of each M. aeruginosa genotype using RT-PCR. We successfully detected M. aeruginosa ITS region DNA in bird fecal pellets collected in various Japanese waters. We also found some Microcystis colonies digested and excreted within four hours of ingestion by mallards (Anas platyrhynchos) were still alive with growth ability. The flagellate Collodictyon triciliatum had grazing impact on M. aeruginosa as up to 25% standing stock day $ ^{-1} $ , suggesting the high potential of protistan grazing on Microcystis blooms. We conducted experiments to see the effects of nutrients on growth
of M. aeruginosa strains in the systems with various nitrogen:phosphorus ratios. The results suggested that nutrient supply ratio was one of the important environmental parameters which determine dominant genotype(s) of M. aeruginosa. The relationship between fisheries activity and M. aeruginosa bloom in the lagoons around Lake Biwa, the dispersal of M. aeruginosa through water conveyance development in Tone River water system and the dispersal of M. aeruginosa through the distribution of fisheries products in Southeast Asia were found, and some of the results have been uploaded using Google maps and GIS system. We also studied the risk management of M. aeruginosa bloom in Australia. We distributed a free-of-charge, downloadable primer of Microcystis bloom.
## アオコが増える前に 対策を取る

環境に応じて、違うタイプの

アオコが増える
課題名 S-11-1 資源環境制約下の開発・成長の方向性と目標及び効果的ガバナンスの提示

課題代表者名 蟹江 憲史 （慶応義塾大学）

研究实施期间 平成25～27年度

累計予算額 289,243 千円（うち平成27年度：98,349 千円）

予算額は、間接経費を含む。

本研究のキーワード 持続可能な開発目標（SDGs）、目標設定によるガバナンス、データベース、二重の負荷、提案書『SDGs達成に向けた日本への処方箋』、持続可能な発展指標、ネクサス

## 研究体制

(1) 総合的に国際的動向の分析及びこれに基づいた目標や指標の提示 (学校法人慶應義塾慶應義塾大学 SFC研究所)

(2) 事例研究によるボトムアップの目標の検討 (国立大学法人東京工業大学)

(3) 目標や指標の定量的オプションやシナリオの提示 (株式会社イー・コンザル)

(4)複合的な目標及び指標の検討（国立研究開発法人国立環境研究所）

## 研究協力機関

Utrecht University, University of California, Santa Barbara, University of Massachusetts Amherst, University of Oslo, Fridtjof Nansens Institut, Stockholm Environment Institute, University of Amsterdam, University of Toronto, Columbia University, PBL Netherlands Environmental Assessment Agency, Central European University, Sciences Po, Lund University, IISD, Monash University, The New School

## 研究概要

### 1. はじめに(研究背景等)

2012年に開催された国連持続可能な開発会議において、持続可能な開発目標（SDGs）の設置に向けた議論を開始すること、またSDGsはミレニアム開発目標（MDGs）の達成期限となっている2015年以降の国際開発目標として議論されてきた「ポスト2015年開発アジェンダ」に統合されていくものであることが決まった。

2013年から3年間の交渉を経て、2015年9月に、国連総会においてSDGsを含む合意文書「持続可能な開発のための2030アジェンダ」が採択された。SDGsは、先進国と途上国の双方に摘要される目標であり、MDGsの未達成課題を含む形で、貧困、保健、教育やジェンダーなどの開発に関する目標と、国内外の不平等の是正、平和、エネルギーアクセス、気候変動の対策、生態系の保護、持続可能な消費と生産などの17の目標を包括的に含んでいる。そして、2030アジェンダは、持続可能な開発の環境、経済、社会という三つの側面が統合していること、ターゲット間の相互関連性（インターリンケージ）を認識していること、多様なステークホルダーの参加を求めているなどの特徴がある。今後、グローバルレベルでの目標に基づいて、各国がそれぞれの状況に鑑みてターゲットを策定し、実施することが求められている。

本研究は、国連での交渉が開始した2013年から3年間、持続可能な開発目標（SDGs）設定へ向けた国際論議に貢献すること、またその国際論議に貢献するための知識基盤を構築することを通じ、国際社会及び日本が持続可能な社会へと移行するための方策を研究した。

### 2. 研究開発目的

本研究S-11-1(1)では、資源環境制約下の開発・成長の方向性と目標及び効果的ガバナンスの提示、ならびに戦略課題全体の司令塔として、研究プロジェクトを総括し、戦略的政策提言を行うためのテーマ間の調整・連携促進ならびに課題全体の進行管理の役割を担いながら、各テーマが生み出す研究成果を総合化し、国際的・国内的に成果の発信を行うことを目的とした。

各サブテーマでは、各テーマが提供する知見を総合し、本研究プロジェクト成果の統合に資するための研究を実施した。サブテーマ1は、国際的動向の情報収集及び分析、これに基づいて研究成果を総合した成果の公表や提案を行い、また、成果は広くわかりやすく国民や国際社会に周知するようなアウトリーチ活動等を主導した。サブテーマ2は、事例研究によるボトムアップ手法によるSDGsの検討、サブテーマ3はMDGsなど既存の目標に