Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
プE、図(2)-7）。M. aeruginosaが日本国内どころか東南アジアとの間でも自由に移動していることを考えれば、グループEの個体が尖道湖にいないとは考え難い。このことは、sjには塩分濃度耐性に加えて、2010年の尖道湖の環境に高度に適応した未知の生理生態的形質を持っている可能性を示唆する。あるいは逆にグループEの個体が尖道湖で発生できない何らかの形質を持っていた可能性も考えられる。いずれにしても、sjは尖道湖のアオコ発生のキープレーヤーであることは間違いと考えられるため、今後sjについては更に詳細な生理生態特性の解析を行う必要がある。

## （７）総合考察：MLSTを利用した有毒アオコの動態研究の今後の展望

MLST法を利用した分離株の遺伝子タイピングを行った結果、M.aeruginosaという単一の有毒ラン藻種内に大きな遺伝的多様性が保有されていることを明らかにすることができた。MLSTの結果に基づく分子系統樹は、M.aeruginosaの種内に少なくとも11の明瞭な系統が存在することを明らかにした。東南アジア株と日本産株の遺伝的距離は小さく、海を越えた移動分散が少なからぬ頻度で起こっていることが強く示唆された。しかしながら、日本国内・東南アジアにおけるM.aeruginosaの遺伝的変異の分布パターンは、単純な移動分散だけでは説明できない。なぜならば、日本・東南アジア間でアオコの生息湖沼間の距離と遺伝的近縁性に明瞭な相関が見られない一方で、グループGのように霞ヶ浦水系以外からはほとんど分離されない系統群が存在するからである。このパターンを説明するには、種内系統群のそれぞれ（あるいは一部の系統群）に固有の生理生態的な特性があり、それがアオコの移動後の定着や大量発生に際して特定のグループの選択的発生に繋がっている、と考えるのが最も自然であろう。このことは、アオコの大発生は従来考えられていたように栄養塩の過剰供給によって起こる、というような単純な図式で説明できるものではなく、それ以外の複数の要因が関与している、ということを意味する。宍道湖で発見した新規遺伝子型sjはおそらくはその顕著な一例であり、そこでは「複数の要因」のうちの一つは塩分耐性ということになるであろう。グループGについても、限られた時期・場所でのみ大発生したということから、このグループの持つ未知の生態特性が2005-2009年の霞ヶ浦水系に高度に適応した結果と考えるのが自然であり、この特性を現在比較培養実験によって調べているところである。

バクテリアにおいては、（今回のMLST遺伝子のような）中立遺伝子の系統解析で識別された種内系統群は何らかの固有の生理生態的特性を持つ、ということが理論的にも経験的にも示されている $ ^{6} $ 。このような生理生態で纏められる種内系統群のことをエコタイプ(ecotype)と呼ぶ $ ^{2,20} $ 。この観点からM.aeruginosaの種内系統を見直してみると、少なくともグループAとXの二つの系統群は有毒株のみで構成されるため、ミクロシスチン毒性はこれらグループ固有の形質であることは確かである。ミクロシスチンがこのグループの個体に何らかの（有利な）生態的特性を付与しているならば、この二つのグループはそれぞれエコタイプということになる。しかしながら、それ以外の系統群については、その固有の生態的特性が何であるのか、そもそもそのような特性があるのかすら現時点では不明である。このM.aeruginosa種内のエコタイプの同定こそが、今後のM.aeruginosaの時空間動態を探る研究の鍵を握ることになる。なぜならば、系統群固有の生態特性が明らかになれば、発生したアオコをクローンライブリー法で分析して優占する系統群・遺伝子型を同定することでその固有の形質を推定することが可能になり、そこでのアオコの発生要因を推察することができるからである（図(2)-8）。これによって明らかとなったアオコ発生要因は、本プロジェクトの目標であった「オーダーメイドのアオコ対策」への道筋を提示するだろうし、
同時にそれは環境政策への提言にも繋がるであろう。残念ながら、本プロジェクトにおいては全ての系統群固有特性の同定には至らなかったが、「オーダーメイドのアオコ対策」への道筋を明確に提示することができたと思われる。現時点でも、発生したアオコをftsZクローンライブラリー分析し、その結果をMLST系統樹に参照することによってアオコ内の有毒個体の比率を簡便にかつ高精度で推定し、毒性から見たアオコの「危険度」を公に提示することが可能である。これは本研究の大きな成果の一つであることを付け加えておきたい。

図(2)-8：アオコ発生要因の推定スキーム案。クローンライブラリー法とMLST系統樹を相互参照することにより、発生アオコの特性・要因を推定することが可能になる。

## （8） 熱帯系Microcystis属の分類学的研究

Microcystis aeruginosaは古くはコロニー形態の違いからM. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. novacekii, M. viridis, M. wesenbergiiの5種に分けられていたが、コロニー形態の可塑性や遺伝子の類縁性から比較的最近M. aeruginosaの一種に統合されたという分類学的経緯がある $ ^{15} $ 。しかしながら、Microcystis属には上記の5種以外にも、M. bengalensis, M. panniformis, M. protocystis, M. pseudofilamentosa, M. ramosa, M. robustaといった複数の種が熱帯域から記載されている $ ^{3,7} $ 。これらの熱帯系の種はやはりコロニー形態に基づいて記載されたが、熱帯域での採集があまりなされていなかったこと、これらの種とM. aeruginosaとの間の他のコロニーの形態が不明瞭なことなどから、分類学的な検討がほとんどなされておらず、言わば放置された状態であった。本プロジェクトの研究過程において、ベトナムからこれら熱帯系の種を複数単離できたため、これらの種の実体について分子系統解析によって検討を行なってみた。本研究は本プロジェクトの研究の範疇ではあるが、メインテーマからは若干外れるため、研究の詳細の説明は割愛して概略のみを説明したい。系統解析に使用した遺伝子マーカーはバクテリアの種識別マーカーとして汎用されている16S rDNA及び16S–23S ITS領域を用い、既報告のプライマーセット・PCR条件 $ ^{11,12} $ で遺伝子を取得した後、上述のMLSTと同様の方法で塩基配列を取得した。双方の遺伝子データセットを用いて作成した系統樹を示す（図(2)-9）。一見して分かる通り、熱帯系の種はM. aeruginosa（図中では
図(2)-9：熱帯系Microcystis種の系統的位置。a) 16S rDNAの系統樹。b) ITSの系統樹。熱帯系Microcystis種のみをグレーでハイライトして表示。双方の系統樹において他のMicrocystis種（全て現在ではM. aeruginosa）と系統的に混在することに注意。

M. aeruginosa, M. icthyoblabe, M. novacekii, M. viridis, M. wesenbergii と 分 け て 表 記 し て あ る こ と に 注 意 ) と 遺 伝 的 な 違 い が ほ と ん ど な か つ た 。 M. aeruginosa と 熱 帯 系 16S rDNA の 配 列 の 違 い は 最大 で も 99.2% で あ つ た 。 これ は バ ク テ リ ア の 分 類 学 の 基 準 で 見 れ ば 同 種 と し て 报 う べ き で あ る こ と を 意 味 し 、 熱 帯 系 の Microcystis は 全 て M. aeruginosa に 統 合 さ れ る べ き で あ る と 結 論 づ け た い が 、 正 式 な 分 類 学 的 提案 は DNA-DNA 交 雑 実 験 等 を 行 つ た 後 に 行 う 予 定 で あ る 。

これまでは熱帯域から熱帯系Microcystisが分離された際に、これらをM. aeruginosaとしてMLST解析に含めるべきか？という問題があった。今回の研究結果はこの問題を解消するものであり、
その意味では今後のアオコ動態研究における影響は少なくない。今後、この研究で用いたこれらの熱帯系Microcystis株のMLST分析を行い、生物地理学解析に役立てると同時に分類学へのフィードバックも行ない。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究のM.aeruginosaの種内グループGのように、バクテリアの特定の種内系統群が「特定の期間・地域で大発生した」事例は病原菌以外では全くなく、微生物の種分化研究一般に大きなインパクトを与えるものである。アオコのような環境微生物が「流行感冒」のような時空間動態を示したことは、本プロジェクト研究のハイライトの一つと言ってよい。アオコが海を越えて移動している可能性を指摘できたことも大きな知見である。

## （２）環境政策への貢献

本研究により、さまざまな遺伝子型のアオコについて、日本国内だけでなく、東南アジア諸国にも渡る分子系統地理が解明された。アオコの各遺伝子型は、それぞれことなる生態学的特性を有していると考えられる。本研究では、例えば、霞ヶ浦水系のごく限られた地域にのみ発生したグループGや、尖道湖で優占したSjがそれにあたる。各遺伝子型の生態学的特性が明らかになれば、それぞれの遺伝子型に応じた防除策も考案可能であろう。アオコと言えど、植物プランクトンなので、アオコ一般には窒素・リンや日光といった全ての植物プランクトンに通用する増殖条件を操作すれば、その発生は防げるかもしれない。しかし、全ての植物プランクトンの増殖を抑制することは、適当ではない。このため、アオコ特有の防除対策が必要であり、他の植物プランクトンの増殖を妨げないためには、優占するアオコの遺伝子型に特化した対策、すなわち「オーダーメイドのアオコ対策」を取ることができれば、他の植物プランクトンへの影響を低減することが可能かもしれない。このためには、各アオコ遺伝子型の生態学的特性が解明される必要がある。残念ながら、本研究においては全ての系統群固有特性の同定や、各遺伝子型の生態学的特性解明には至らなかったが、「オーダーメイドのアオコ対策」への道筋を明確に提示することができた。

さらに、本研究では、発生したアオコの遺伝子型を分析し、その結果をMLST系統樹に参照することによって、アオコ内の有毒個体の比率を簡便にかつ高精度で推定することが可能となった。つまり、本研究によって、我々は毒性から見たアオコの「危険度」を公に広く提示することができるようになった。アオコの危険度が分かりやすい形で公表されることは、アオコのリスクを低減させることにつながる。

以上のように、本研究は基礎的なアオコの分子系統地理学研究であるが、国内外のアオコに関わる環境政策にも十分貢献しうるものである。

## 6 ．国際共同研究等の状況

計画名：アジア・オセアニア地域の有毒アオコ遺伝動態研究

案件名：アジア・オーストラリア地域の遺伝的多様性をMLSTにより解析するため、オーストラリ

ア国立自然科学産業研究機関(CSIRO)・薬類系統保存施設が管理しているM. aeruginosa約100
株の提供を受ける。本来ならば既に菌株を受領し、遺伝子型の分析を研究期間内に完了して

いるはずであったが、震災によって甚大な被害を受けた実験室の復旧等により、本件への取

り組みが保留となっている。また、今後は現在指導中の博士課程留学生（ベトナム1名、ミ

ヤンマー1名）の帰国以降、両名よりM. aeruginosaの同国分離株の継続的な提供を受ける予定である。

カウンターパート名等：Susan Blackburn博士，オーストラリア国立自然科学産業研究機関(CSIRO)

: Nanda Kyaw Thu講師, Loikaw University（ミャンマー）

: Vinh Nguyen Le Ai 講師, Vinh University (ベトナム)

連携状況：今後、さらに多くの国、特にアジア以外の国との連携を模索している国際的位置づけ：特になし

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) Y. Tanabe, M.M. Watanabe : PLoS One, 6, e17085 (2011)

“Local expansion of a panmictic lineage of water bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa”

2) V. L. A. Nguyen, Y. Tanabe, H. Matsuura, K. Kaya, M. M. Watanabe : Phycol. Res. (in press) "Morphological, biochemical and phylogenetic assessments of water-bloom-forming tropical morphospecies of Microcystis (Chroococcales, Cyanobacteria)"

<査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 田辺雄彦，渡遼信：日本藻類学会第34回大会(2010)

「アオコ形成ラン薬Microcystis aeruginosaにおける霞ヶ浦水系固有系統群の発見」

2) 田迈雄彦，加藤将，渡遼信：日本藻類学会第35回大会(2011)

「アオコ形成ラン薬Microcystis aeruginosaの東南アジア個体群における遺伝的変異」

3) L. A. V. Nyuen, H. Matsuura, K. Kaya, Y. Tanabe, M. M. Watanabe : 日本藻類学会第35回大会 (2011)

"Morphological, biochemical and phylogenetic characteristics of 57 strains of water bloom-forming Microcystis collected from water bodies in Vietnam"

4) Nanda Kyaw Thu, Y. Tanabe, Syou Kato, M. M. Watanabe : 日本藻類学会第35回大会(2011) "Morphology, phylogeny and gas vesicle gene detection of planktonic cyanobacterium Oscillatoria kawamurae from different geographical regions"
5) 田辺雄彦，渡遷信：日本陸水学会第76回大会公開シンポジウム(2011)

「遺伝子で見るアオコの多様性」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) Baas Becking, L. G. M. 1934. Geobiologie of inleiding tot de milieukunde. The Hague, the Netherlands: W.P. Van Stockum & Zoon (in Dutch).

2) Cohan, F. M. 2002. What are bacterial species? Annu Rev Microbiol 56: 457–487.

3) Desikachary, T.V. 1959. Cyanophyta. Indian council of Agriculture research, New Delhi.

4) Dittmann, E., and C. Wiegand. 2006. Cyanobacterial toxins--occurrence, biosynthesis and impact on human affairs. Mol Nutr Food Res 50: 7–17.

5) Kasai, F., M. Kawachi, M. Erata, and M. M. Watanabe. 2004. NIES-Collection, List of strains, microalgae and protozoa, 7th edition. Tsukuba, Japan: National Institute for Environmental Studies.

6) Koeppel, A., E. B. Perry, J. Sikorski, D. Krizanc, W. A. Warner, D. M. Ward, A. P. Rooney, E. Brambilla, N. Connor, E. Nevo, R. M. Ratcliff, and F. M. Cohan. 2008. Identifying the fundamental units of bacterial diversity: A paradigm shift to incorporate ecology into bacterial systematics. Proc Natl Acad Sci USA 105: 2504–2509.

7) Komárek, J., J. Komáriková-Legnerová, C. L. Sant'anna, M. T. P. Azevedo, and P. A. C. Senna. 2002. Two common Microcystis species (Chroococcales, Cyanobacteria) from tropical America, including M. panniformis sp. nov. Crypto Algol 23: 159–177.

8) Maiden, M. C., J. A. Bygraves, E. Feil, G. Morelli, J. E. Russell, R. Urwin, Q. Zhang, J. Zhou, K. Zurth et al. 1998. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc Natl Acad Sci USA 95: 3140–3145.

9) Miller, M. A., Kudela, R. M., Mekebri, A., Crane, D., Oates, S. C., Tinker, M. T., Staedler, M., Miller, W. A., Toy-Choutka, S., Dominik, C., Hardin, D., Langlois, G., Murray, M., Ward, K., Jessup, D. A. 2011. Evidence for a novel marine harmful algal bloom: cyanotoxin (microcystin) transfer from land to sea otters. PLoS One 5: e12576.

10) Otsuka, S., S. Suda, R. Li, N. Watanabe, H. Oyaizu, M. Hiroki, A. Mahakhant, Y. Li, S. Matsumoto, and M. M. Watanabe. 1998. Phycoerythrin-containing Microcystis isolated from P. R. China and Thailand. Phycol Res 46 (Suppl. 2): 39–50.
11) Otsuka, S., S. Suda, R. Li, M. Watanabe, H. Oyaizu, S. Matsumoto, and M. M. Watanabe. 1998. 16S rDNA sequences and phylogenetic analyses of Microcystis strains with and without phycoerythrin. FEMS Microbiol. Lett. 164: 119–124.

12) Otsuka, S., S. Suda, R. Li, M. Watanabe, H. Oyaizu, S. Matsumoto, and M. M. Watanabe. 1999. Phylogenetic relationships between toxic and non-toxic strains of the genus Microcystis based on 16S to 23S internal transcribed spacer sequence. FEMS Microbiol Lett 172: 15–21.

13) Otsuka, S., S. Suda, R. Li, M. Watanabe, H. Oyaizu, S. Matsumoto, and M. M. Watanabe. 1999. Characterization of morphospecies and strains of the genus Microcystis (Cyanobacteria) for a reconsideration of species classification. Phicol Res 47: 189–197.

14) Otsuka, S., S. Suda, R. Li, S. Matsumoto, and M. M. Watanabe. 2000. Morphological variability of colonies of Microcystis morphospecies in culture. J Gen Appl Microbiol 46: 39–50.

15) Otsuka, S., S. Suda, S. Shibata, H. Oyaizu, S. Matsumoto, and M. M. Watanabe. 2001. A proposal for the unification of five species of the cyanobacterial genus Microcystis Kützing ex Lemmermann 1907 under the Rule of the Bacterial Code. Int J Syst Evol Microbiol 51: 873–879.

16) Tamura, K., J. Dudley, M. Nei, and S. Kumar. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 24: 1596–1599.

17) Tanabe, Y., F. Kasai, and M. M. Watanabe. 2007. Multilocus sequence typing (MLST) reveals high genetic diversity and clonal population structure of the toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Microbiology 153: 3695–3703.

18) Tanabe, Y., T. Sano, F. Kasai, and M. M. Watanabe. 2009. Recombination, cryptic clades and neutral molecular divergence of the microcystin synthetase (mcy) genes of toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa. BMC Evol Biol 9: 115.

19) Tanabe, Y., F. Kasai, and M. M. Watanabe. 2009. Fine-scale spatial and temporal genetic differentiation of water bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa: revealed by multilocus sequence typing. Environ Microbiol Rep 1: 575–582.

20) 田辺雄彦，渡遡信 2011. 光合成微生物の多様性 生物の科学遺伝：36-41.

21) Tonk, L., K. Bosch, P. M. Visser, and J. Huisman. 2007 Salt tolerance of the harmful cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Aquat Microb Ecol 46: 117–123.
(3) アオコの生残・増殖に関する分子生態学的研究

福井県立大学 海洋生物資源学部 海洋生物資源学科 近藤竜二・廣石伸互・高尾祥丈

研究協力者

$$ \begin{aligned}& 福井県立大学 \quad 海洋生物資源学部 \quad 海洋生物資源学科 \\&\quad\quad\quad\quad 片岡剛文 ( 現 \quad 愛媛大学沿岸環境科学研究センター )\\&\quad\quad\quad\quad 本間隆満 ( 現 \quad( 株 ) 建設環境研究所河川情報部 )\end{aligned} $$

平成21～23年度累計予算額：26,146千円

（うち、平成23年度予算額：8,500千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] アオコと呼ばれるシアノバクテリア（ラン藻）の異常増殖が世界各地の富栄養湖沼で発生し、深刻な環境問題となっている。Microcystis属はアオコを構成する主要なシアノバクテリアの一つであり、肝臓毒のミクロシスチンを生産することからも重要な種類である。形態的な特徴から、Microcystis属は幾つかの“形態種”に分けられているが、分類の指標となる形態形質は培養条件や環境条件によって大きく変化する。本研究では、Microcystis属を識別・計数するための遺伝子プローブと定量PCR法を開発した。この方法を用いることによって、Microcystis属の混合培養、実験池に人工的に発生させたMicrocystis属のアオコあるいは天然の湖沼中のMicrocystis属細胞をグループごとに計数することが可能となった。次いで、数種のMicrocystis属株が混在するなかで、異なる環境下での株間の競争について明らかにするため、窒素とリン濃度を変えた改変BG-11培地ならびに培養温度を変化させて混合培養実験を行った。その結果、培地中の窒素およびリン濃度に対して、Microcystis属の株ごとに増殖特性（比増殖速度、最大細胞密度）が異なることが明らかとなった。一方、温度に関してはMicrocystis属株をそれぞれ単独で培養しても、株間の増殖特性に大きな変化は認められなかったが、混合培養中では株間で競合が起こっていることが示された。これまで、それぞれ単独で調べられていたMicrocystis属株の増殖生理特性に大きな違いは認められなかったが、より天然に近い混合培養系を用いることと、さらに、株ごとを識別・計数する技術が開発されたことにより、窒素やリンなどの栄養塩の濃度や環境温度が、現場のMicrocystis属の群集構造を変化させている要因であることを実験的に示すことができた。

[キーワード] アオコ、Microcystis、16S-23S rDNA ITS、リアルタイムPCR、種内競合

### 1. はじめに

「アオコ」は科学的用語として明確に定義されていないが、①湖沼でシアノバクテリア（ラン藻）が大発生する現象の一つで、特に水面に集積して水の色が濃緑色を呈する場合、②そのような状態を作り出している原因のシアノバクテリア群のことを指す。すなわちアオコとは特定の微
生物の種名ではなく、アオコの原因となる微生物は常に同一であるとは限らない。我が国におけるアオコを形成するシアノバクテリアはMicrocystis属、Anabaena属、Aphanizomenon属、Planktothrix属など多様である $ ^{30} $ 。その中でもMicrocystis属は発生報告例が極めて多く、また藍藻毒素ミクロシスチンを産生することから最も重要なアオコ原因微生物である。

シアノバクテリアは二界説に基づく古い分類体系では植物として扱われ、藍色植物として主に形態学的特徴に基づき分類がなされてきた。シアノバクテリアは原核生物であり、その細胞は本質的には細菌と同様の構造をとっている。植物に広く分布するクロロフィルαと薬類が持つフィコビリプロテインが細胞周辺部に存在し、酸素発生型の光合成を行うことから、シアノバクテリアの分類は薬類の1門として扱われてきた。原核生物であるため、本来は細菌の一つとして分類・整理されるべきシアノバクテリアであるが、この属や種レベルでの同定にはGeitler $ ^{6-8)} $ の分類が長年にわたって用いられてきた。その後、新しい多くの分類群が追加され、Anagnostidis and Komárek $ ^{2-4)} $ およびKomárek and Anagnostidis $ ^{14,15)} $ によって新しい分類体系が提案された。Geitler $ ^{7)} $ の分類体系では、Microcystis属は細胞の形状、群体の形状・大きさおよび群体を取り巻く粘質体の状態、さらには細胞の大きさとガス胞の有無に従い、分類に再検討を要する8種を含む32種が記載されていた。その後、Komárek and Anagnostidis $ ^{14)} $ はガス胞を有する種のみをMicrocystis属として再定義し、ガス胞を持たない種を他の分類群へと移行した。日本国内には、顕微鏡による形態観察によって、M. aeruginosa、M. ichthyoblabe、M. wesenbergii、M. viridis、M. novacekii、およびM. flos-aquaeの6種が存在すると報告されている $ ^{13)} $ 。しかし、これらのMicrocystis属の種の分類基準となる形態学的特徴は培養条件下で大きく変化する $ ^{20)} $ 。また、殆どの無菌株は群体を形成せずに単細胞で増殖するため $ ^{30)} $ 、形態識別による分類の妥当性について多くの議論がなされてきた。原核生物であるMicrocystis属分類の混乱を解決するために、細菌分類規定に従い16S rDNAの塩基配列やゲノムDNA相同性が調べられた $ ^{16,17,21)} $ 。その結果、Microcystis属は形態学的特徴に関わらず、DNAの相同性が70%以上を示したことから、細菌命名規約に従ってM. aeruginosaの1種に統合することが提案された $ ^{15)} $ 。しかしながら、M. aeruginosaは細菌分類指標から見れば1種類であるが、ミクロシスチン合成遺伝子（mcy）を持つ有毒株と持たない無毒株が存在するだけでなく、様々な遺伝子の塩基配列を解析するによって遺伝的に多様であることが明らかになってきた $ ^{11,24,26)} $ 。その中でも、16S-23S rRNA遺伝子間領域（以下、16S-23S ITS）の塩基配列で識別したMicrocystis属の遺伝子グループは、有毒株と無毒株の組成がグループ毎に違っていることから、現場の群集構造を調査する上で良く利用されている $ ^{5,11,12,22)} $ 。クローンライブラリー法 $ ^{5)} $ や変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（DGGE） $ ^{12)} $ による調査で、同一の湖沼でも複数の16S-23S ITS遺伝子タイプが存在し、Microcystis属の群集構造は時空間的に変動することが報告されている $ ^{5,11,12,22)} $ 。さらに、優占する遺伝子タイプの遷移が個体群中の有毒株の割合やミクロシスチン濃度と密接に関係していることが明らかにされている $ ^{5,12)} $ 。さらに、これらの変動が環境中の硝酸塩濃度に依存していることが明らかにされてきた $ ^{27)} $ 。しかし、現場におけるMicrocystis属の群集構造や優占グループの遷移に影響をおよぼす環境要因やそのメカニズムについては十分に解明されていない。

## 2 ．研究開発目的

本研究課題では、Microcystis属の遺伝的に異なる個体群を識別する遺伝子マーカーとして、16S rDNAや他の機能遺伝子よりも変異速度の速い16S-23S ITS領域にPCRプライマーを作成し、そのマ
一カーを用いた識別計数方法の開発を行った。この遺伝子マーカーを用いて、遺伝的特性の異なったMicrocystis属の増殖過程を、実験室内での混合培養と大規模培養実験（アクアトロン）および天然のアオコ群集を解析することによって明らかにし、アオコの増殖におよぼす生物的、化学的、物理的要因を解明することを目的とした。

### 3. 研究開発方法

## （1） Microcystis属株と培養条件

国立環境研究所（NIES）および筑波薬類コレクション（TAC）から表(3)-1に示した培養株を入手した。これらの株をCB培地 $ ^{23)} $ もしくはMA培地 $ ^{10)} $ を用いて、24°C、12:12時間の明暗周期で培養し、Microcystis属株を継代保存し、実験に使用した。

表(3)-1：本研究で用いたMicrocystis属培養株

番号	形態種	株¹	毒性²	グループ³
1	Microcystis ichthyoblabe	TAC48	-	1
2	M. flos-aquae	NIES98	-	1
3	M. aeruginosa	NIES298	+	1
4	M. aeruginosa	NIES1070	+	1
5	M. aeruginosa	NIES101	-	1
6	M. aeruginosa	NIES87	-	1
7	M. wesenbergii	NIES604	-	3
8	M. wesenbergii	NIES112	-	3
9	M. wesenbergii	NIES111	-	3
10	M. wesenbergii	NIES1062	-	3
11	M. aeruginosa	NIES44	-	3
12	M. viridis	NIES102	+	4
13	M. viridis	TAC17	+	4
14	M. viridis	NIES103	+	4
15	M. aeruginosa	NIES90	+	4
16	M. wesenbergii	NIES107	+	4

$ ^{1} $ TAC::筑波藻類コレクション、NIES:国立環境研究所

$ ^{2} $ mcyA遺伝子の有無を+-で示した。

$ ^{3} $ 図(3)-1の系統グループを示す。

## （２）Microcystis属の系統解析とPCRプライマーの設計

DNAデータベースに登録されているMicrocystis属のITS領域全長の塩基配列を選出した。その中で、毒素遺伝子（mcyA）の有無について情報がある株の塩基配列は71種類あり、これらをプライマー設計に用いた。先ず、これら71種の塩基配列を用いて近隣接合法による系統樹を作成した。次いで、71株の塩基配列を、CLUSTAL W $ ^{25)} $ を用いて多重アラインメントを行った。その変異サイトを検索し、系統グループに特異的な配列からPCRプライマーを作成した。それぞれのプライマーは、Microcystis属の16S-23S ITS領域の全長を増幅する既存のプライマー（MITS-F/R） $ ^{26)} $ と組み合わせてPCR反応を行い、それぞれのPCRプライマーセットの特異性を調べた。

## （3） DNA抽出
DNA抽出にはキサントゲン酸（XS）バッファーを用いたXS法 $ ^{19)} $ を用いた。手順は以下の通りである。菌体懸濁液あるいは菌体を捕集したGF/Fフィルターに、XSバッファー（最終濃度：1%エチルキサントゲン酸カリウム、100 mM Tirs-HCl、1 mM EDTA、1%SDS、800 mM酢酸アンモニウム水溶液）600 μLを加えボルテックスで懸濁した。70℃で1時間処理した後、10秒間ボルテックスで激しく懸濁し、30分間氷上に静置した。室温で10,000×g、15分間遠心分離し、上澄みを新しい1.5 mLエッペンドルフチューブに移し、等量の100%イソプロパノールを用いたアルコール沈殿法によりDNAを精製した。100 μLのTEバッファーにDNAを再懸濁した後に、等量のPCI（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝25：24：1）によりタンパク質を除去し、再び、100%エタノールを用いたエタノール沈殿法でDNAを精製した。最後に57.5 μLのTEバッファーに再懸濁した。

培養株については、対数増殖期の細胞溶液10mLを抜き取り、ガス胞を取り除くために47Hz,300W下で超音波処理した後に、14,400×gで10分間遠心分離して細胞を集めた。集めた細胞は50μLのTE溶液に懸濁した後にDNA抽出まで-20℃で保存した。この培養株から抽出したDNA溶液については、吸光光度計（Pharma Spec UV-1700，島津）を用いて、260nmの吸光値からDNA濃度を算出し、全サンプルの濃度を50ngμL $ ^{-1} $ に調節した。

## (4) PCR

PCR反応は20 μLの反応系（200 μM dNTP、1xTaq buffer、0.25 μM 各プライマー、0.5U Taqポリメラーゼ（Qiagen）、MgCl₂濃度はプライマーセットによって異なる）で行った。鋳型となるゲノムDNAは100 ngを反応に用いた。温度条件は、初期変性温度を94°Cで1分間行った後、変性反応を94°Cで30秒、アニーリング反応を30秒（反応温度はプライマーセットにより異なる）、伸長反応を72°Cで30秒として、30回繰り返した。最後に72°Cで3分間伸長反応を行った。PCR産物は3%あるいは5%アガロースゲル電気泳動を行った後、臭化エチジウムで染色して紫外線照射下で確認した。

## （5） 定量PCRと細胞計数

## 1 ）リアルタイムPCR

リアルタイムPCRによるプライマーセットの特異性を、表(3)-1に示した培養株から抽出したDNAを用いて調べた。リアルタイムPCR反応は20 μLの反応液（4.0 mM MgCl₂、0.25 μM プライマー、1x QuantiTeck SYBR Green PCR Master Mix（QuantiTec SYBR Green PCR Kit, Qiagen））で行った。反応条件は、初期変性温度を94°Cで15分間行った後、変性反応を94°Cで30秒、アニーリング反応を55°Cで30秒、伸長反応を72°Cで30秒として、45回繰り返した。定量性については、NIES298、NIES111、NIES103から抽出したDNAを用いて調べた。

フィコシアニンのIGS領域（PC）およびミクロシスチン合成酵素遺伝子（mcyA）の定量についてはYoshida et al. $ ^{27} $ の方法に従った。

## 2 ）リアルタイム PCR による DNA の定量と細胞密度の算出

抽出した DNA 試料を鋳型にリアルタイム PCR によって、遺伝子グループごとの 16S-23S ITS のコピー数から細胞密度を求めた。異なる濃度の既知量の DNA 溶液を標準溶液として用いて遺伝子グループごとのコピー数の定量を行った。標準溶液または XS 法で抽出した DNA 試料 1 μL を鋳型として用いて、上述と同じ方法でリアルタイム PCR 反応を行った。標準溶液の閾値サイク
ル数（Ct値）から作成した検量線を用いて、試料中の遺伝子のコピー数を求めた。分離株ごとに作成したコピー数と細胞数の回帰直線式を用いて、細胞密度に換算した。

後述の混合培養実験において、グループ1に属するNIES98とNIES298の細胞数は、16S-23S ITS領域を標的としたPCRに加えて、Yoshida et al. $ ^{27)} $ の方法によるmcyAを標的とした有毒株のリアルタイムPCR法による計数值から算出した。すなわち、mcyAを標的としたリアルタイムPCR法により有毒株（NIES298とNIES102）の細胞数を計数し、この計数值からグループ4を標的としたリアルタイムPCR法により求めたNIES102の細胞数を差し引くことで、NIES298の細胞数を算出した。さらに、グループ1を標的としたリアルタイムPCR法により求めたNIES98とNIES298の総細胞数からNIES298の細胞数を差し引くことでNIES98の細胞数を算出した。

## （6） 混合培養実験

## 1 ）MA 培地を用いた単独・混合培養実験

NIES298、NIES112およびNIES102をMA培地 $ ^{10)} $ で25℃、16時間明（34±5μmol m $ ^{-2} $ s $ ^{-1} $ ）・8時間暗の明暗周期で10日間前培養した後、400 mLのMA培地に単独培養実験では細胞密度が1.0×10 $ ^{4} $ cells mL $ ^{-1} $ となるように、混合培養実験では各株の細胞密度がそれぞれ1.0×10 $ ^{4} $ cells mL $ ^{-1} $ （計3.0×10 $ ^{4} $ cells mL $ ^{-1} $ ）となるように接種した。前培養と同じ条件で培養し、培養液を一週間に1～3回の頻度で採取した。採取した培養液中のMicrocystis細胞を超音波処理（47 Hz、300 W）した後、フックス・ロイゼンタール血球計数盤を用いた直接計数によって細胞数を計数した。1.5 mL容エッペンチューブに培養液1 mLを採取し、遠心分離（20,400×g、15分間、室温）により細胞を回収した後、TEバッファー50μLに懸濁し、-25℃でDNA抽出まで凍結保存した。

## 2 ）改変 BG-11 培地を用いた混合培養実験

BG-11 培地 $ ^{1)} $ に含まれる硝酸ナトリウムとリン酸水素ニカリウムの量を変え、異なる栄養塩濃度に改変した培地（改变 BG-11 培地）を用いて遺伝子タイプの異なる Microcystis 属株を混合培養した。実験に用いた改変 BG-11 培地中の窒素とリンの濃度を表(3)-2 に示す。グループ 1 の NIES98

表(3)-2：改変BG-11培地中の窒素とリンの濃度

実験区
$ N_{H}P_{H} $	$ N_{H}P_{L} $	$ N_{L}P_{H} $	$ N_{L}P_{L} $
窒素濃度（mgN L $ ^{-1} $ ）	49	49	4.9	4.9
リン濃度（mgP L $ ^{-1} $ ）	7.13	0.713	7.13	0.713
N:Pモル比	15.4	154	1.54	15.4

実験区
N-1	N-2	N-3	N-4	N-5	N-6
窒素濃度（mgN L^{-1}）	49	4.9	2.45	0.98	0.56	0
リン濃度（mgP L^{-1}）	7.13	7.13	7.13	7.13	7.13	7.13
N:Pモル比	15.4	1.54	0.76	0.3	0.15	-
（無毒株）と NIES298（有毒株）、グループ3のNIES112とグループ4のNIES102を、窒素49 mgN L⁻¹、リン7.13 mgP L⁻¹を含む改変BG-11培地で前項と同じ条件で10日間前培養した後、各栄養塩濃度条件に調整した改変BG-11培地400 mLに各株の細胞密度が1.0×10⁴ cells mL⁻¹（計4.0×10⁴ cells mL⁻¹）となるように接種した。前培養と同じ条件で培養し、前述したMA培地を用いた混合培養実験と同様に顕微鏡による直接計数とMicrocystis細胞の回収を行った。

## （7） アクアトロン実験

## 1 ）混合培養実験

MA培地 $ ^{5)} $ 70 Lを添加したアクアトロン6基にグループ1に属するNIES298、およびグループ3に属するNIES112をそれぞれ初期細胞密度が3.5×10 $ ^{3} $ cells mL $ ^{-1} $ になるように接種し、25℃、12：12時間の明暗周期で38日間培養した。培養期間中、混合培養液の一部を直接計数用、および定量PCR用試料として1週間に1回から3回の頻度で適量採取した。直接計数用試料はグルタルアルデヒド（最終濃度2%）で固定した後、メンブレンフィルターで適量濾過した。フィルター上のMicrocystis細胞を小型細胞（NIES298）と大型細胞（NIES112）ごとに蛍光頭微鏡を用いて計数した。リアルタイムPCR用試料は培養液中のMicrocystis細胞をGF/Fフィルター（直径25 mm）上に集めて2 mL容エッペンチューブに入れ、-25℃で凍結保存した。

## 2 ）天然アオコの増殖と消滅

2011年10月12日に、琵琶湖の内湖である平湖のアオコ試料水を採取した。試料水を京都大学生態学研究センターに持ち帰り実験に供した。70 L容のアクアトロン6基に、窒素とリンの最終濃度が表(3)-3になるように改変BG-11培地の濃縮液と全量の1/100量のアオコ試料水を添加し、蒸留水で全量を70 Lとした。25°C、12：12時間の明暗周期（アクアトロン表面の光量子量を40-45 μmol m⁻² sec⁻¹）で培養した。培養期間中、培養液の一部を適当な間隔で採取した。培養液中のMicrocystis細胞をGF/Fフィルター（直径25 mm）上に集めて2 mL容エッペンチューブに入れ、-25°Cで凍結保存した。この他、アオコ試料水をそのままアクアトロンに添加し、アオコの崩壊過程をモニターした。

表(3)-3：アクアトロン実験の栄養塩濃度

アクアトロン タンク番号	N濃度 (mgN L^{-1})	P濃度 (mgP L^{-1})
1および2	49	7.13
3および4	49	0.0049
5および6	0.49	7.13
7	平湖の湖水

## 4 ．結果及び考察

## （１）PCRプライマーの特異性

DNAデータベースから選んだ71の塩基配列を用いて近隣接合法による系統樹を作成したところ、4つのグループに分けられた（図(3)-1）。グループ1の56.3%（18/32）はM. aeruginosaであり、毒素遺伝子を有する株と有さない株が含まれていた。グループ2は三方湖から単離された株のみで構成された。グループ3の90.0%（9/10）がM. wesenbergiiであり、無毒株のみで構成されていた。グループ4は、71.4%（10/14）がM. viridisで構成され、全ての株が有毒株であった。
Microcystis属の16S-23S ITS領域は約360 bpであり、CLUSTAL W $ ^{25)} $ を用いて塩基配列の多重アラインメントを行ったところ、52ヶ所に変異サイトが存在していた。この内、変異の大きい領域に、上述の系統グループを特異的に検出できる3つのPCRプライマーを作成した（図(3)-2）。これらのPCRプライマーはMicrocystis属の16S-23S ITS領域に特異的なプライマーMITS-FあるいはMITS-R $ ^{26)} $ と組合せて用いた。

図(3)-1：16S-23S rDNA ITS領域全長を用いた近隣接合法による系統樹。図中の●はミクロシスチン合成酵素遺伝子（mcyA）を有し、○は有さない株を示す。

表(3)-1に示す16株から抽出したゲノムDNAを鋳型として

用い、各PCRプライマーセットの特性について調べたところ、図(3)-3に示すように、グループ1に特異的なG1rとMITS-Fのプライマーセットを用いた時にグループ4に属するTAC17株の非特異的増幅が認められた場合を除き、全てのプライマーセットはそれぞれのグループに属する株に特異的であることが示された。同様に、リアルタイムPCR反応での各プライマーセットの特異性を検証し

A

プライマ一名	塩基配列（5'→3'）	文献
G1r	CGGAG	CGAGG	CGAAA	TT	本研究
G3f	GACGA	AAAAA	TAGTA	GTCGA	AA	本研究
G4r	CAGCA	CCTTA	TCTTA	TATAC	ATATA	本研究
MITS-F	AAGGG	AGACC	TAATT	CVGGT	Yoshida et al.26)
MITS-R	TTGCG	GTCYT	CTTTT	TTGGC	Yoshida et al.26)

B

図(3)-2：本研究で作成したPCRプライマーの塩基配列（A）とMicrocystis属ユニバーサルプライマーとの組合せ（B）。
た。G1rとMITS-FのプライマーセットのみTAC17に非特異的増幅が見られたが、作成したプライマーは各グループに特異的であった（表(3)-4）。

表(3)-4：リアルタイムPCRによるプライマーの特異性試験。

プライマーセット	株番号
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
MITS-F～G1r	+	+	+	+	+	+	+	+	—	—	—	—	+	—	—	—
G3f～MITS-R	—	—	—	—	—	—	—	—	+	+	+	+	—	—	—	—
MITS-F～G4r	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	—	+	+	+	+

株番号は表(3)-1に示した番号の株を表す。

図(3)-3：培養株から抽出したDNAを用いて、作成したプライマーセットの特異性試験。上段はG1、中段はG3、下段はG4のプライマーセットを用いて増幅したPCR産物を供した。各レーンの番号は表(3)-1に示した番号の株を表す。Mは100bp DNAサイズマーカー。

## （２）定量PCRによるMicrocystis属細胞の計数

## 1 ）培養細胞を用いた計数

既知量のDNA溶液を10倍ずつ段階的に希釈し、リアルタイムPCR用の標準溶液を作成した。この標準溶液を反応液に添加してリアルタイムPCR反応を行ったところ、DNAのコピー数とCt値には直線関係が得られた。精製したDNAを用いた場合、 $ 10^{2}\sim10^{10} $ 程度のコピー数の定量が可能であった。

次に、Microcystis属細胞の計数方法について検討した。NIES298、NIES111およびNIES102をそれぞれ培養し、およそ $ 10^{6} $ cells mL $ ^{-1} $ の細胞を得た。この細胞を段階的に希釈し、XS法でDNAを抽出した。この抽出したDNAを鋳型にリアルタイムPCRに共したところ、NIES298株は $ 10^{2}\sim10^{5} $ 細胞の範囲で直線関係が得られた。NIES111株では $ 10^{2}\sim10^{4} $ 細胞の範囲、NIES102株では $ 10^{3}\sim10^{5} $ 細胞の範囲で直線関係が得られた（データ未記載）。これらの結果からPCR一反応当たりと一試料当たりの検出限界細胞数を算出したところ、グループ1とグループ3に特異的なプライマーセットでは一反応あたり2～5× $ 10^{1} $ 以上のMicrocystis属細胞があれば検出可能であった。一方、グループ4に特異的なプライマーセットを用いた場合、 $ 10^{3} $ 程度のMicrocystis属細胞が必要であった。XS法でMicrocystis属細胞からDNAを抽出する場合、細胞を遠心分離で濃縮することが可能で、現場の水試料1 Lを用いると仮定すると、検出感度が最も低かったグループ4のMicrocystis属でも $ 1.2\times10^{2} $ cells mL $ ^{-1} $ 程度の細胞密度で検出可能であり、アオコを形成する以前のMicrocystis属を検出できることが示された。
## 2 ）混合培養中のMicrocystis属細胞の識別計数

グループ1、3、4にそれぞれ属するNIES298、NIES112およびNIES102をCB培地で24°C、12:12時間の明暗周期で約1週間前培養し、これを400 mLのCB培地に各株の細胞密度が約1.0×10³ cells mL⁻¹となるように接種し、前培養と同じ条件下で、約7週間混合培養した。一週間に1回から3回の頻度で、培養液を抜取り、直接計数によってMicrocystis属の細胞数を計数するとともに、XS法でDNAを抽出した。抽出したDNAを鋳型に定量PCRによって、16S-23S rDNA ITS、PC、mcyAの遺伝子量を定量した。その結果を図(3)-4に示す。直接計数法で計数したMicrocystis属細胞は指数関数的に増殖し、4週間目に定常期に達した。この直接計数で得られた細胞数とPCを標的としたリアルタイムPCRによる計数値は対数増殖期では概ね一致していた。また、今回作成したグループ特異的プライマーを用いてリアルタイムPCRによってそれぞれの株を計数したところ、NIES298とNIES112は同じように増殖していることが確認された。一方、NIES102は混合培養中からは検出されなかった。同時に各株を別々に培養したが、NIES102は培養開始約17日後までは増殖が認められず、その後、増殖は認められたものの41日後の細胞密度は低く、4.8±2.9×10⁶ cells mL⁻¹までにしか達しなかった。混合培養においては、NIES102は順応力の高い他の株と同所的に存在したために、淘汰されたと考えられる。

ところで、定常期に達すると直接計数值がリアルタイムPCRで算出した細胞数より大きくなる傾向にあった。実際の蛍光顕微鏡による観察では自家蛍光が薄く、死滅過程の細胞も計測している可能性がある。これらの細胞ではDNAの分解が起こるので、細胞の形は留めているがリアルタイムPCRによるDNAの検出に十分な質と量を持たない細胞（ゴースト） $ ^{29)} $ であると考えられ、いわゆる“生きた”Microcystis属細胞を計数する場合には、直接計数よりもリアルタイムPCR法によるDNAコピーからの推定値のほうが優れているかもしれない。

図(3)-4 : Microcystis属3株（NIES298、NIES112、NIES102）の混合培養液中の細胞密度の経時変化。直接計数法により計測した細胞密度を丸印（○）で示す。棒グラフはリアルタイムPCR法を用いて推定した遺伝子型別の細胞密度（G1、G3、G4）、ならびにPC、mcyA のコピー数を示す。*は検出限界以下を示す。エラーバーは標準誤差（n=3）を示す。