Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

1) アオコの生態・生理・分子系統地理学的研究の現状（2009年11月14日、京都大学生態学研究センター、参加者33名）

2) CER Mini-workshop on Microcystis bloom studies (2010年2月25日、京都大学生態学研究センター、参加者14名)

3) "Recent progress in researches on ecology, physiology and phylogeny of Microcystis aeruginosa", chaired by Shin-ichi Nakano, Renhui Li and Soon-Jin Hwang, the 4th EAFES International Congress (2010年9月14日、Kyungpook National University、参加者29名)

4) “CER International workshop for New Frontier of Microbial Ecology”, chaired by Yoshitake Takao and Shin-ichi Nakano (2010年12月5日、京都大学生態学研究センター、参加者27名)

5) アオコ研究最前線の多様性（2011年9月24日、島根大学松江キャンパス教養棟2号館、観客72名）

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1) 京都大学総長と京大記者クラブとの定例懇談会に、生態学研究センターの代表的研究プロジェクトとして、F-093（平成22年度よりD-0905）が紹介された。

2) 日刊工業新聞、「アオコ増殖の条件解明」（2010年5月17日、全国版、7頁）。

3) 彦根東高校スーパーサイエンスハイスクール活動（8月20日、高校生（男子2名、女子9名）および教員（男性3名）に対し、アオコ問題の深刻さや研究者や行政の取り組みを説明し、D-0905の成果を紹介すると共に、顕微鏡によるアオコの観察や実験池の見学会を行った

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) 阿部泰隆、中村正久編．1999．湖の環境と法 —琵琶湖のほとりから．信山社出版、東京

2) Ballot, A., J. Fastner, M. Lentz and C. Wiedner. 2010. First report of anatoxin-a-producing cyanobacterium Aphanizomenon issatschenkoii in northeastern Germany. Toxicon 56: 964-971.

3) Bellrose, F. C., R. C. Crompton 1981. Migration speeds of three waterfowl species. The Wilson Bulletin :121-124.

4) 琵琶湖干拓史編さん委員会編．1970．琵琶湖干拓史．琵琶湖干拓史編纂事務局、近江八幡．

5) Davis, T., D. L. Berry, G. L. Boyer, and C. J. Gobler. 2009. The effects of temperature and nutrients on the growth and dynamics of toxic and non-toxic strains of Microcystis during cyanobacteria blooms. Harmful Algae 8: 715-725.

6) Dolan, J. R., K. Šimek 1998. Ingestion and digestion of an autotrophic picoplankter, Synechococcus, by a heterotrophic nanoflagellate, Bodo saltans. Limnor Oceanogr 43:1740-1746.

7) Don, R.H., P.T. Cox, B.J. Wainwright, K. Baker and J.S. Mattick. 1991. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acid Res. 19: 4008.

8) Doyle J. J. and J. L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19 : 11-15.
9) Drakara, S., Liess, A., 2010. Local factors control the community composition of cyanobacteria in lakes while heterotrophic bacteria follow a neutral model. Freshwater Biol. 55, 2447–2457.

10) Gugger, M., S. Lenoir, C. Berger, A. Ledreux, J. C. Druart, J. F. Humbert, C. Guette and C. Bernard. 2005. First report in a river in France of the benthic cyanobacterium Phormidium favosum producing anatoxin-a associated with dog neurotoxicosis. Toxicon 45: 919-928.

11) Hodoki, Y., K. Ohbayashi, Y. Kobayashi, N. Okuda and S.-I. Nakano. 2011. Temporal variation in cyanobacteria species composition and photosynthetic activity in experimentally induced blooms. J Plankton Res 33: 1410-1416.

12) Hodoki Y, Ohbayashi K, Kobayashi Y, Okuda N, Nakano S 2012. Simultaneous detection and identification of multiple toxic cyanobacteria: Ubiquitous distribution of potentially toxic Microcystis aeruginosa and Aphanizomenon issatschenkoi in Japanese lakes. Harmful Algae 16:49-57.

13) Holmes, R. M., A. Aminot, R. Kerouel, B. A. Hooker, B. J. Peterson 1999. A simple and precise method for measuring ammonium in marine and freshwater ecosystems. Can J Fish Aquat Sci 56:1801-1808.

14) Ichimura, T. 1979 2. Isolation and culture methods of algae. 2.5.B. Freshwater algae [2. Sôrui no bunri to baiyôhô. 2.5.B. Tansui sôrui]. In Methods in Phycological Studies [Sôrui Kenkyûhô], Eds. by Nishizawa, K. & Chihara, M., Kyoritsu Shuppan, Tokyo, p. 294-305 (in Japanese without English title).

15) Izydorczyk, K., Carpentier, C., Mro’wczyn’ski, J., Wagenvoort, A., Jurczak, T., Tarczyn’ska, M. 2009. Establishment of an Alert Level Framework for cyanobacteria in drinking water resources by using the Algae Online Analyser for monitoring cyanobacterial chlorophyll a. Wat Res 43: 989-996.

16) Janse, I., M. Meima, W.E.A. Kardinaal and G. Zwart. 2003. High-resolution differentiation of Cyanobacteria by using r-RNA-Internal transcribed spacer denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol 69:6634-6643.

17) Jeong, H. J., J. Y. Park, J. H. Nho, M. O. Park, J. H. Ha, K. A. Seong, C. Jeng, C. N. Seong, K. Y. Lee, W. H. Yih 2005. Feeding by red-tide dinoflagellates on the cyanobacterium Synechococcus. Aquat Microb Ecol 41:131-143.

18) 環境省自然環境局生物多様性センター. 2009. 平成20年度重要生態系監視地域モニタリング推進事業（モニタリングサイト1000）シギ・チドリ類調査業務報告書. 環境省自然環境局生物多様性センター、富士吉田.

19) 環境省自然環境局野生生物課．2009．ガンカモ類の生息調査．http://www.biodic.go.jp/gankamo/seikabutu/index.html

20) Kardinaal, W. E. A., I. Janse, M. K. Agterveld, M. Medima, J. Snoek, L. R. Mur, J. Huisman, G. Zwart, and P. M. Visser. 2007. Microcystis genotype succession in relation to microcystin concentrations in freshwater lakes. Aquatic Microbial Ecology 48: 1-12.

21）近畿地方建設局琵琶湖工事事務所、水資源開発公団琵琶湖開発事業建設部編．1993．淡海上永遠に一琵琶湖開発事業誌．近畿地方建設局・水資源開発公団、大阪.

22) Legagneux, P., C. Blaize, F. Latraube, J. Gautier, V. Bretagnolle 2009. Variation in home-range size and movements of wintering dabbling ducks. J Ornithol 150:183-193.
40) Welshmeyer, N. A. 1994. Fluorometric Analysis of Chlorophyll a in the Presence of Chlorophyll b and Pheopigments. Limnol Oceanogr 39:1985-1992.

41) Wood, S.A., Rueckert, A., Cowan, D.A., Cary, S.C., 2008. Sources of edaphic cyanobacterial diversity in the Dry Valleys of Eastern Antarctica. ISME J. 2, 308–320.

42) Wood, S.A., Jentzsch, K., Rueckert, A., Hamilton, D.P., Cary, S.C., 2009. Hindcasting cyanobacterial communities in Lake Okaro with germination experiments and genetic analyses. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 252–260.

43) Yamaguchi, N., E. Hiraoka, M. Fujita, N. Hijikata, M. Ueta, K. Takagi, S. Konno, M. Okuyama, Y. Watanabe, Y. Osa, E. Morishita, K. Tokita, K. Umada, G. Fujita, H. Higuchi 2008. Spring migration routes of mallards (Anas platyrhynchos) that winter in Japan, determined from satellite telemetry. Zool Sci 25:875-881.

44) Yoshida, M., T. Yoshida, M. Satomi, Y. Takashima, N. Hosoda, and S. Hiroishi. 2008. Intra-specific phenotypic and genotypic variation in toxic cyanobacterial Microcystis strains. Journal Applied Microbiology 105: 407-415.

45) 財団法人山階鳥類研究所. 2002. 平成13年度環境省請負業務. 鳥類アトラス. 鳥類回収記録解析報告書（1961－1995）. 環境省自然環境局野生生物課・環境省自然環境局生物多様性センター、東京・富士吉田.
# (2) 遺伝的多様性を指標としたアオコの分布拡散機構に関する研究

筑波大学大学院生命環境科学研究科 渡邊信

<研究協力者>

筑波大学大学院生命環境科学研究科 加藤将（平成22年度のみ）

筑波大学大学院生命環境科学研究科 中澤敦（平成23年度のみ）

平成21～23年度累計予算額：26,146千円

（うち、平成23年度予算額：8,500千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 本研究の目的は、国内外の湖沼からアオコ形成ラン薬Microcystis aeruginosaを大量に分離して遺伝子型分析を行い、各地の個体群間の遺伝子型の相違を指標にアオコの移動・分布拡散の実態解明のための生物地理学的考察を行うことである。H21-23年度の間、国内（霞ヶ浦、諏訪湖、石垣島等）及び東南アジア（タイ、ベトナム、ミャンマー）にてアオコを採集した。これら採取サンプルと譲渡により入手したアオコから素培養株を作成した後、M. aeruginosaの単離・培養・クローン（単薬）化作業を行い、計209のクローン株を確立した。これらの株に譲渡により取得した株を併せた計221株について、7つの遺伝子座塩基配列を用いてタイピング（MLST）を行った。その結果、124の遺伝子型が新規であったことから、M. aeruginosaが大きな遺伝的多様性を保有していることが示唆された。これら新規遺伝子型に既知遺伝子型を併せた計280の遺伝子型を用いて分子系統解析を行った結果、M. aeruginosaが少なくとも11の明瞭な種内系統グループを含むことがわかった。また、日本と東南アジアのM. aeruginosaの遺伝的差異が小さいことから、海を越えたアオコの移動分散があることが示唆された。また、MLST系統解析及びPCR検出実験によって、種内系統の1グループが霞ヶ浦水系（茨城県）で近年勢力を拡大した「適応系統」である可能性を見出した。アオコ毒素をつくる有毒株は種内の3グループに偏在したが、宍道湖で2010年にアオコ大発生を起こしたM. aeruginosaがこれらに属さない新規遺伝子型であることを明らかにした。また、クローンライブラリー法とMLST解析を組み合わせることにより、アオコ内のM. aeruginosaの遺伝子型組成を簡便・高精度に推定できる方法を開発した。また、Microcystisを含むアオコ形成ラン薬の分類学的研究も行い、南方系Microcystis種がM. aeruginosaと遺伝的に大きな相違がないことを明らかにした。

[キーワード] アオコ、Microcystis、MLST、生物地理、アオコ毒素

### 1. はじめに

アオコとは富栄養化した湖沼・ため池・ダム等で見られるシアノバクテリア（ラン藻類）の大量発生現象である。アオコは、世界各地の富栄養化した湖沼に普遍的に見られ、景観を悪化させ、腐敗したアオコが悪臭を放ち、さらにはアオコが作る強い毒により海外では人間や家畜等の死亡
の被害をもたらしてきた。アオコの原因となるシアノバクテリアはAnabaena, Oscillatoria, Nodularia, Planktothrixなど様々な属が知られているが、淡水域で最も発生例の多い種が

Microcystis aeruginosa（ミクロシスティス・エルギノーザ）であり、その発生は日本のみならず世界各地で報告されている。アオコの発生は3つの大きな水環境問題を引き起こすことが知られている。一つ目はアオコ発生時、とくに後期に見られる腐敗に伴う悪臭であり、漁業等で湖沼で生産活動を行なう人のみならず、アオコ発生湖沼沿岸に居住している人にたいへんな被害をもたらす。二つ目の問題は発生したアオコの衰退期に湖底に沈降したアオコ死骸の分解に際してバクテリアが大量の酸素を消費するために起こる低層の酸素欠乏であり、これは湖沼生態系の破壊を引き起こす。三つ目の、そして最も深刻な問題はアオコによるアオコ毒素（シアノトキシン）の産生・放出である。様々なアオコ形成ラン薬が多様な神経毒・肝臓毒等を産生するが、本研究で対象とするM. aeruginosaは、急性肝炎を引き起こす肝臓毒であるミクロシスチンを生産することで悪名高く、実際に本種は世界各地で散発的に家畜・人の中毒事故を起こしている $ ^{4} $ 。最近では、ミクロシスチンが蓄積された貝を食べた希少絶滅危惧大型動物（ラッコ）が急性肝炎によって大量に死んで打ち上げられた例がアメリカ西海岸から報告されており $ ^{9} $ 、ミクロシスチンの食物連鎖による生物濃縮が引き起こす被害についても、今後被害実態を広く調査する必要性が指摘されている。

M. aeruginosaは遺伝子の均一性に基づき、バクテリア分類のルール（16S rDNAの配列の相同性が97%以上は同種と扱う）上、現在では一種に纏められているが $ ^{15} $ 、この種に属する各個体の特徴は決して均質ではなく、形態的・生理的にヴァリエーションに富んでいる。コロニーの形態が多様であることは古くから知られており、実際に最近まではコロニーの形態の違いに基づいて複数の種（M. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. novacekii, M. viridis, M. wesenbergii等）に分けられていた $ ^{13-15} $ 。M. aeruginosaには生理的な違いも幾つか知られている。毒性の違いはその代表例であり、M. aeruginosaの種内にミクロシスチン毒素をつくる個体（有毒）とつくらない個体（無毒）の双方が存在すること $ ^{18} $ 、さらに有毒の個体は毒性の異なる様々な種類のミクロシスチン誘導体をつくること $ ^{18} $ 、が知られている。これら以外にも光合成色素組成 $ ^{10} $ や塩分耐性 $ ^{13,21} $ にもヴァリエーションがあることも明らかになっている。これらの個体間の生理の違いは異なる生態系への適応、すなわち異なる環境変化への応答を可能にすると推察され、その結果、同じM. aeruginosaがつくるアオコであっても、生理生態的特性やそれを特徴づける遺伝子型が発生する場所や時期、環境条件によって異なっていると予測される。実際、M. aeruginosaによるアオコは世界各地の湖沼で普通に見られるものの、場所や季節によって異なる特徴を持ったアオコが発生している。例えば、同じM. aeruginosaがつくるアオコであっても無毒のアオコと有毒のアオコがあり、また有毒のアオコであっても毒性の弱いアオコと強いアオコがあり、さらには個体密度の低い「軽度のアオコ」もあれば、個体密度の高い「重度のアオコ」もある。

それぞれの湖沼におけるアオコの特徴の違いを生み出す一つの大きな原因として、何らかの運び手による湖沼間の「アオコの移動」が考えられる。例えば、最近建設されたダム湖などでは、本来その場にいなかったはずのM. aeruginosaによるアオコの速やかな発生が見られるが、これはダムへの「アオコの移動」と移動先のダムでの「アオコの適応」の二つのファクターが揃う必要がある。このため、アオコの移動の動態を理解することは、アオコの発生を制御する上での第一課題である。アオコの移動分散の動態を理解するための研究手法として最も適当であるのは、各地のアオコの遺伝子型配列の違いを分析する生物地理学・集団遺伝学によるアプローチである。こ
の手法においては、湖沼から採取されたアオコ個体群の遺伝子変異を様々な地理スケールで比較し、その結果から「何がアオコを運ぶのか？」「アオコはどのぐらいの距離を移動するのか？」「運ばれたアオコの定着を決める因子は何か？」について考察を加えることができる。遺伝子型分析は同時にもう一つの重要なアオコ発生要因「アオコの適応」の研究のための土台を提供する。なぜなら、アオコを含むバクテリア一般においては、「特定の遺伝子型」には「特定の生理生態的特性」が付随する可能性が高いことが実証されているからである $ ^{6} $ 。

### 2. 研究開発目的

本研究の目的は、国内外の湖沼からM. aeruginosaを大量に分離して遺伝子型分析を行い、各地の個体群の遺伝子型やその組成の相違を指標にアオコの移動・分布拡散の実態解明のための生物地理学的考察を行うことである。この目的のため、日本国内及び東南アジアの湖沼をモデル地域として設定し、アオコ形成ラン藻M. aeruginosaを対象に遺伝子型分析・培養実験・アオコ毒素ミクロシスチンの化学分析等の手法を用い、M. aeruginosaの遺伝・生理生態・毒性の多様性を調べる。重点的に取り組むべき問題の具体例を以下に列挙する。1）日本産と東南アジア産のM. aeruginosaは遺伝的に違うか？2）M. aeruginosaの種内に地域固有系統群は存在するか？3）特定の遺伝子型を持つアオコの地理分布を生態系適応（環境応答）と関連付けて考察することが可能か？4）アオコの遺伝子型の地理的な違いを簡単に分析できる方法を新たに開発できないか？

## 3 ．研究開発方法

## （１）Microcystis aeruginosaの採集と単離

本研究においては日本国内・東南アジアからアオコを大量に採集し、それらの遺伝子型を調べることによって、遺伝的変異の地理分布を調べてアオコの移動について考察を行う。この目的のため、国内のモデル湖沼として霞ヶ浦、諏訪湖、宍道湖を、外国のモデル地域としては東南アジア諸国（タイ、ベトナム、ミャンマー、カンボジア）を選択した。これら地域に実際に赴きアオ

図(2)-1：東南アジア株の分離地（分離地点を菱形で示す）
コを採集した。東南アジアの採集地については図(2)-1に示す。一部のアオコサンプルは他の研究者からの譲渡によっても入手した。特に霞ヶ浦の土浦港については重点モデル地に選定し、2009年以降、アオコが見られる夏季は1週間毎、それ以外の季節では月毎のアオコを採集した。

アオコのが見られた採取地では、アオコを直接（掬うことによって）採取したが、発生が見られない場所・時期においては、プランクトンネット（孔径41μm）によってアオコを濃縮採集した。これらの環境水サンプルから倒立頭微鏡下でM. aeruginosaのコロニーを選抜し、マイクロピペットを用いてコロニー単位で分離培養を行った。分離コロニーをMA液体培地 $ ^{5)} $ の入ったマイクロプレートに移し、25℃、12:12時間の明暗周期で培養を行い、1.5ヶ月内に増殖が見られたコロニーを同培地10mLの入った試験管に移し、これらを素培養株として以降のクローン化作業に供した。また採取したアオコサンプルはPCRによるグループG検出及びクローンライブラリー解析にも用いた。

## （２）Microcystis aeruginosaのクローン化（単薬化）

素培養株した株はコロニーからの分離株であるが、これには複数の異なった個体が混在している可能性があり、本研究で採用したMLSTのように複数の遺伝子座でタイピングを行うに際しては、異なる遺伝子座の配列が別個体に由来する、というように間違ったデータを取得する危険が生じる。この危険を回避するため、素培養株のクローン（単薬化）化作業を行った。倒立頭微鏡下で素培養株のコロニーをマイクロピペットを用いて吸引分解した後、同様にマイクロピペットで単一細胞を分離し、新しいMA液体培地の入ったマイクロプレートに移し、25℃、12:12の明暗周期で培養を行い、2.5ヶ月内に増殖が見られたコロニーをMA培地10mlの入った試験管に移し、安定な生育が見られたものをクローン株として、以降の遺伝子タイピング実験に供した。

## （３）高分解能マーカーによる遺伝子タイピング（Multilocus Sequence Typing [MLST]）

本研究ではバクテリアの高分解能マーカーとして知られているMLST法によりアオコの分離株の遺伝子変異の解析を行った。MLST法はゲノム中の数箇所の遺伝子座をPCR法により取得して遺伝子配列を決定し、その配列の違いに基いて個体や個体群間の遺伝的組成の違いから生物地理学的な考察を行うものである $ ^{8)} $ 。筆者らは本プロジェクト研究に先立ち、M. aeruginosaのMLST法をftsZ, glnA, gltX, gyrB, pgi, recA, tpiの7つの遺伝子座（各約450bp）の配列を取得して解析する遺伝子タイピングシステムとして既に確立しており $ ^{17)} $ 、本研究でもこのシステムを用いて遺伝子の取得を行った。アオコ菌株からFastDNA kit (Q-biogene)を用いて全ゲノム抽出を行なった。各遺伝子座を増幅するPCR反応はExTaq（Takara）を用い、初期変性94℃3分の後、94℃1分、60～65℃1分、72℃30秒を40サイクル繰り返すという反応条件で行なった。取得された遺伝子断片はExoSAP-IT（USB）を用いて酵素的に精製後、PCR増幅反応に用いたプライマーとBigDye1.1を用いてダイレクト・シークエンス反応を行ない、ABI3130 Genetic Anlayzer (Applied Biosystems)を用いて塩基配列を解読した。シークエンス反応による誤読を極力避けるため、5'及び3'側双方から塩基配列を読むことによって最終的な遺伝子配列を決定した。

## （４）クローンライブラリー法の開発

上述のMLST法は分離株を用いた遺伝子解析手法であるため、個体群の遺伝的多様性の推定に際しては、単離の不成功・継代培養時の喪失等による偏りが生じてしまう恐れがある。この欠点を
克服するため、上記MLSTに用いた遺伝子座の一つであるftsZを用いたクローン・ライブラリー法を開発し、クローン・ライブラリーデータとMLST解析のデータが相互参照できるようなシステムを開発した。まず単離・培養を経ずに直接アオコサンプルからFastDNA kitを用いて全ゲノムを抽出し、これを銷型として上述のPCR反応でftsZ遺伝子を取得した。MLSTとは異なり、クローニング実験に際してはPCR反応におけるエラー（間違った塩基を取り込んでしまうこと）が致命的な問題となりうる。この問題を回避するため、高精度PCR反応酵素であるPyrobest(Takara)を用いて増幅を行なった。反応条件は、初期変性94℃1分の後、98℃10秒、63℃1分、72℃1分を30サイクル繰り返すという反応条件で行なった。増幅産物はTOPO cloning kit (invitrogen)を用いて平滑末端で大腸菌にクローニング後、ランダムに32コロニーをピックアップしてM13Forward/reverseプライマーを用いたPCRで挿入を確認した後、positive cloneのPCR産物をExoSAP-IT（USB）を用いて酵素精製を行ない、M13 forwardあるいはreverseプライマーのいづれかとBigDye1.1を用いてMLSTと同様にシークエンス反応を行なった。決定した塩基配列はftsZ遺伝子のみで系統樹を作成し、取得配列がどの種内グループに相当するかを推定した。

## （5） 分子系統解析

新たに取得した新規MLST遺伝子型（124個）に既報告の遺伝子型 $ ^{17-19} $ （155個）とDNAデータベースから取得したPCC7806株の遺伝子型を加えた計280遺伝子型について、系統解析ソフトウェアMEGA $ ^{16} $ を用いて分子系統樹を作成し、各菌株間の系統関係を調べた。系統解析に際しては、7つの遺伝子型を連結した計2,992塩基によるアラインメントを用いた。ギャップはtpi遺伝子座に1コードン相当の3塩基の挿入がある株が1株存在したため、この3塩基については系統解析の前に除去した。その他の遺伝子座にはギャップが存在しなかっため、アラインメント作業は容易であった。

## （6） グループG 特異的PCR検出実験

アオコ環境サンプルからM. aeruginosaの種内系統グループGのみを特異的にPCR増幅するプライマーセットを開発するため、各MLST遺伝子座のアラインメントを精査した結果、ftsZ遺伝子座にグループGが特異的に保存されている領域を見出した。この領域を増幅するPCRプライマーftsGF(5'-AGGGGTRCAGGGGATT-3')を設計し、既報告のMLSTプライマーftsRとセットでPCR実験に用いた。PCR実験の鋳型には、クローンライブラリー法と同様の方法でアオコから直接抽出したゲノムDNAを用いた。

## （7） アオコ毒素分析

分離したM. aeruginosaのアオコ毒素（ミクロシスチン）の分析のため、アオコ毒素遺伝子分析及び毒素の化学分析の両方を行なった。遺伝子分析はミクロシスチン毒素の生成遺伝子クラスターの一部(mcyG)をターゲットとした既報告 $ ^{18)} $ のPCR検出系を採用した（PCR反応条件はアニーリング温度を60℃とした以外はMLSTと同様である）。アオコ毒素分析は十分に増殖した培養液10mlを酢酸とメタノールで処理後、Inertsep RP-1カートリッジを用いて80％メタノールで抽出した画分をAgilent 6224 TOF/LCMS (Agilent Technologies)を用いて高速液体クロマトグラフィー分析することによって毒性を判定した。
## （8） 塩分濃度耐性実験

尖道湖で取得した株、及びグループG（後述）に属する菌株の塩分耐性を調べるため、塩分濃度を変数とした培養実験を行った。10mlのMA液体培地にNaClをそれぞれ終濃度2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 g/lになるように加え、20 mlキャップつき試験管で培養を行なった。各株を初期濃度OD660=0.01（7x10^{5} cell/ml）になるように接種し、2日ごとに10日までOD660の値を測定した。実験は各濃度につき5連（n=5）で行なった。尖道湖株はSjs10Sj03株、グループGの株はKs09TS27株を用いた（表(2)-1）。

## （9） 南方系Microcystisの分類学的研究

本研究で扱ったM. aeruginosaはコスモポリタンに分布しているため有名であるが、Microcystis属においては熱帯域のみから記載された複数の種が存在する $ ^{3,7} $ 。しかしながら、これらの種については分離されることも稀な上、M. aeruginosaとの形態的差異が明瞭でないことから、ほとんど分類学的な観点での研究例がなかった。本プロジェクト研究の過程において、ベトナムから複数のM. bengalensis, M. panniformis, M. protocystis, M. pseudofilamentosa, M. ramosa, およびM. robustaを単離したため、形態観察、16S rDNA、ITS領域の解析を行い、これらの熱帯系Microcystisのアイデンティティについて検討を行なった。

## 4 ．結果及び考察

## （１）クローン株の取得

本プロジェクト期間に分離した素培養株、及び本プロジェクト開始以前に取得していた素培養株の双方から併せて209株のクローン株を確立した。取得したクローン株のうち、原著論文で未発表の株について表(2)-1に示す。

（注1）リスト表記の培養株以外にも、本プロジェクト研究において日本・東南アジアから分離した非クローン素培養株を数十株維持している。これらについては、今後順次クローン化作業を行ない、MLST解析に供する予定である。

（注2）カンボジアで採集したアオコサンプルを帰国直後の震災被害により紛失してしまっため、菌株の確立ができなかった。

## （２）MLST遺伝子タイピング

取得した209のクローン株及び譲渡によって取得した12株、計221株についてMLST遺伝子タイピングを行った結果、このうちの124遺伝子型は新規であった。これは2株遺伝子を調べると1株は新規遺伝子型を示すという計算になる。筆者らはこれまでにすでに155の遺伝子型を報告しており $ ^{19} $ 、本プロジェクト開始時は、新たな遺伝子型の発見は頭打ち傾向になると予想していた。実際は、M. aeruginosaが想像を超える大きな遺伝的多様性を保持していることを示す結果が得られたことになる。本研究で含めた株はほとんど日本及び東南アジア産の株であるため、地球規模では途方もない数の遺伝子型が存在している可能性が高い。現時点ではM. aeruginosaの種内変異の全容解明には程遠い可能性が高く、これを明らかにするためには今後、諸外国でのアオコ採集・収集に多くの労力を割く必要がある。
表(2)-1 取得したクローン株のリスト $ ^{a)} $

株名	採取地	採取日時	毒性b)	毒素遺伝子c)
Ks09TS02	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/8/13	-	-
Ks09TS11	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/8/13	-	-
Ks09TS16	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/8/13	+	+
Ks09TS22	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/8/13	-	-
Ks09TS25	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/8/13	-	-
Ks09TS26	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/8/13	-	-
Ks09TS27d)	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/8/13	-	-
Ks09TS46	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/8/27	+	+
Ks09TS50	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/8/27	-	-
Ks09TS59	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/8/27	+	+
Ks09TS72	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/9/4	-	-
Ks09TS80	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/9/4	-	-
Ks09TS142	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/9/15	+	+
Ki09TS152	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/9/15	NA	+
Ki09TS161	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/9/20	-	-
Ki09TS162	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/9/20	-	-
Kn09TS162	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/9/20	NA	-
Kw09TS121	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/9/10	-	-
Kw09TS151	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/9/15	-	-
Kw09TS152	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2009/9/15	-	-
Ks11TS72	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2011/8/30	NA	-
Ks11TS74	土浦港,霞ㄅ浦,茨城県	2011/8/30	NA	+
Si09Km02	釜口水門,諏訪湖,長野県	2009/10/23	-	-
Si09Km03	釜口水門,諏訪湖,長野県	2009/10/23	-	-
Si09Km04	釜口水門,諏訪湖,長野県	2009/10/23	-	-
Ss09Mb03	みずべ公園下,諏訪湖,長野県	2009/10/23	+	+
Ss09Mb05	みずべ公園下,諏訪湖,長野県	2009/10/23	-	-
Rs10SH04	底原ダム,石垣島,沖縄県	2010/3/2	-	-
Ra10MS01	前栄里ダム,石垣島,沖縄県	2010/2/28	NA	-
Ra10MS10	前栄里ダム,石垣島,沖縄県	2010/2/28	-	-
Ra10MS14	前栄里ダム,石垣島,沖縄県	2010/2/28	-	-
Rs10MS03	前栄里ダム,石垣島,沖縄県	2010/2/28	+	+
Ba10Og04	雄琴港,琵琶湖,滋賀県	2010/8/17	NA	+
Bs10Ki03c	北沢沼,滋賀県	2010/10/19	+	+
Sjs10Sj02	宍道駅下,宍道湖,島根県	2010/10/20	+	+
Sjs10Sj03d)	宍道駅下,宍道湖,島根県	2010/10/20	+	+
Sjs10CH02	千鳥南公園下,宍道湖,島根県	2010/10/20	+	+
Sjs10CH03	千鳥南公園下,宍道湖,島根県	2010/10/20	+	+
Sjs10CH04	千鳥南公園下,宍道湖,島根県	2010/10/20	+	+
Thi10Bk04	Weera Farm (Fish pond), Bangkok, タイ	2010/2/2	-	-
Thi10Bk05	Weera Farm (Fish pond), Bangkok, タイ	2010/2/2	+	+
Thi10Bk06	Weera Farm (Fish pond), Bangkok, タイ	2010/2/2	NA	+
(http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0017085) を参照。

表(2)-1 取得したクローン株のリスト（続き）

株名	採取地	採取日時	毒性b)	毒素遺伝子c)
Tha10Bk04	Weera Farm (Fish pond), Bangkok, タイ	2010/2/2	NA	-
Tha10Bk05	Weera Farm (Fish pond), Bangkok, タイ	2010/2/2	-	-
Tha10Bk06	Weera Farm (Fish pond), Bangkok, タイ	2010/2/2	+	+
Tha10Bk07	Weera Farm (Fish pond), Bangkok, タイ	2010/2/2	-	-
Tha10Bk13	Weera Farm (Fish pond), Bangkok, タイ	2010/2/2	+	+
Tha10Bk14	Weera Farm (Fish pond), Bangkok, タイ	2010/2/2	+	+
Tha10Bk19	Weera Farm (Fish pond), Bangkok, タイ	2010/2/2	-	-
Thw10Bw13	Bangprha Water Treatment Plant 1, Chonburi, タイ	2010/2/1	NA	-
Thw10Bw16	Bangprha Water Treatment Plant 1, Chonburi, タイ	2010/2/1	NA	-
Vi10Bn01	Boc Nguyen Reservoir, Ha tinh, ベトナム	2010/2/4	-	-
Vi10Bn03	Boc Nguyen Reservoir, Ha tinh, ベトナム	2010/2/4	-	-
Vi10Bn04	Boc Nguyen Reservoir, Ha tinh, ベトナム	2010/2/4	-	-
Vs10Bn05	Boc Nguyen Reservoir, Ha tinh, ベトナム	2010/2/4	-	-
Va10HL05	Pond, Hung Long, ベトナム	2010/2/5	-	-
Va10HL07	Pond, Hung Long, ベトナム	2010/2/5	-	-
Va10HL12	Pond, Hung Long, ベトナム	2010/2/5	-	-
Va10HL19	Pond, Hung Long, ベトナム	2010/2/5	-	-
Va10HF3	Fish Pond, Hung Long, ベトナム	2010/2/5	NA	+
Va10HF20	Fish Pond, Hung Long, ベトナム	2010/2/5	+	+
Va10HF22	Fish Pond, Hung Long, ベトナム	2010/2/5	NA	+
Mi10Kp04	Kandawmingalar Park, Yangon, ミャンマー	2010/5/19	-	-
Mi10Kp06	Kandawmingalar Park, Yangon, ミャンマー	2010/5/19	NA	-
Mi10Kp08	Kandawmingalar Park, Yangon, ミャンマー	2010/5/19	-	-
Mi10Kp22	Kandawmingalar Park, Yangon, ミャンマー	2010/5/19	-	-
Mi10Kp24	Kandawmingalar Park, Yangon, ミャンマー	2010/5/19	-	-
Ms10Kd02	Kandawgyi Lake, Yangon, ミャンマー	2010/5/17	-	-
Ms10Kd03	Kandawgyi Lake, Yangon, ミャンマー	2010/5/17	-	-
Mw10Kd01	Kandawgyi Lake, Yangon, ミャンマー	2010/5/17	-	-
Mw10Kd02	Kandawgyi Lake, Yangon, ミャンマー	2010/5/17	-	-
Mw10Kd03	Kandawgyi Lake, Yangon, ミャンマー	2010/5/17	-	-
Ms10Kd02	Kandawgyi Lake, Yangon, ミャンマー	2010/5/17	NA	-

## 脚注

a) 本プロジェクト開始以降に採集した株から確立したクローン株のみを示す。それ以外の新規クロ

一ン菌株情報については誌上発表(1)の論文のSupplementary InformationのTable 1

$ ^{b)} $ NA，毒素分析が完了していない株。

c) アオコ毒素ミクロシスチン遺伝子の一部であるmcyG遺伝子のPCR検出結果。

d) 塩分耐性実験に用いた株。
## （3） 分子系統樹を用いた生物地理解析

取得された124の新規遺伝子型に既報告の155の遺伝子型とDNAデータバンクから入手したPCC7806株の遺伝子型を加えた計280遺伝子型を用いて分子系統解析を行った。その結果、これまでに同定されていた8つの種内グループ（A-H, X） $ ^{19)} $ に加えて、新たに3つの明瞭な種内グループ（H, I, J）の存在が明らかとなった（図(2)-2）。

図(2)-2：近隣結合法(NJ法)で作成したMLST系統樹。種内グループを閉曲点線で示す。本プロジェクトで発見した新規グループは*で示す。東南アジアから分離された遺伝子型を色つき丸で示し、丸印のない遺伝子型は日本産株を示す。東南アジアの遺伝子型が複数のグループに分かれて日本産株に混在していることに注意。霞ヶ浦水系で大量発生が観察されたグループGを横縞で、有毒株を含む3グループを灰色で示す。この3グループ以外から2株見出された有毒株の（図中▲）うち、本年度実道湖から発見した遺伝子型をsjと表記。枝の数値はブートストラップ法により算出された各枝の信頼確率である。スケールバーはサイト当りの塩基置換数を示す。
本系統樹上に菌株の分離地をマッピングしたところ、東南アジア株と日本株が複数のグループ内に混在したことから（図(2)-2）、東南アジアと日本のM.aeruginosaの間に大きな遺伝的な違いがないことがわかった。その一方、東南アジア産株の中にはこれまでに取得された日本産株と完全に同一なMLST遺伝子型を持つものはなかった。この結果は、少なからぬ頻度で日本と東南アジアの間で海を超えたアオコの移動があることを示唆する。ただし、日本と東南アジアではアオコ発生環境が同じではないため、高頻度のアオコの移動と自然選択（生態系適応）のバランスによって現在の遺伝的変異のパターンが形成されているという可能性もある。その意味では、「少なからぬ頻度」のアオコの移動というのは過小評価である可能性もありうる。海を越えた移動の運び手は風・鳥等が考えられるが、移入魚等を介した人為的な移動の可能性も考えられる。これについてはサブテーマ(1)の研究成果を参照されたい。

## （４）謎の系統群「グループＧ」の解析

系統樹上で明瞭な東南アジア固有系統群が見つからなかった一方、グループGは大量に遺伝子型が分離されているのにもかかわらず（>40）、例外的な2株（ネパールと八郎潟からそれぞれ分離された株）を除いて全て霞ヶ浦水系（霞ヶ浦と北浦、茨城県）という非常に狭い地域からの分離株であった。この結果はグループGが霞ヶ浦水系固有の系統群である可能性を示唆した。アオコ形成ラン薬のような自由生活性のバクテリアにおいては、地域固有系統群は存在しないというのがこれまでの微生物学における定説であり $ ^{1} $ 、もしこれが本当であるならば大発見である。しかしながら、MLST法は分離株を用いた遺伝子タイピング法であるため、分離培養時にグループGが選択されてしまった可能性も捨てきれない。

グループGの地理的分布を詳細に検討するため、培養を経ずに直接アオコサンプルからグループGを特異的に検出するPCR検出システムを開発した（図(2)-3）。プライマーセットftsGF/ftsRを用いた検出実験の結果、霞ヶ浦・北浦のみならず、霞ヶ浦水系に近接する印廃沼（千葉県）、千波湖（茨城県）のアオコからも強いグループGのシグナルが検出されたが、赤池（北海道）、宍道湖、石垣島からは検出されなかった。一方、諏訪湖や琵琶湖内湖からも弱いシグナルが得られたこと、グループGは霞ヶ浦水系固有の系統群ではなく、霞ヶ浦周辺で発生する傾向が大きいグループと推察された。興味深いことにH22-23年度の東南アジアのサンプルについて調べてみると、カンドージ湖（ミャンマー）とトンレサップ湖（カンボジア）からは比較的強いシグナルが得られた。以前にネパールでグループG株が取得されたことを考えると（図(2)-4）、アジアの大陸部では比較的珍しくないグループであり、それが近年日本に入ってきて霞ヶ浦で大発生したとすれば面白いが、現時点では想像の域を出ない。

興味深いことに、グループGに属する株は2004年以前は霞ヶ浦どころか日本ではどこからも全く分離されていない（図(2)-4）。さらに興味深いことに、アオコは多くの種内系統群のM. aeruginosaで構成されることが一般的であるが、グループGが分離されるアオコではグループGが高度に優占する傾向があることがわかった（図(2)-5）。しかしながら、これら二つの傾向「2005年以降に出現」と「アオコ内で高度に優占」は分離株を用いたMLST分析によって得られた結果であるため、分離培養時にグループGを選択的に分離してしまうような偏りが導いた傾向である恐れがある。この問題を検討するため、アオコサンプルから直接MLST遺伝子をPCR増幅するクローンライブラリー法の開発を行なうことにした。
図(2)-3：グループG特異的PCR検出実験。ゲル写真上のアルファベットはM. aeruginosaの種内グループ（図(2)-2参照）を示す。各グループ毎に2レーンをとり、左側はftsZ（コントロール）、右側はftsZG（グループG特異的PCR）を示す。グループGのみ右レーンに増幅バンドが確認できることに注意。各地からのアオコサンプルについてPCR実験で得られたグループGのシグナル強度を地図上に示す。地図では示されていないが、2010年のカンドージ湖（ミャンマー）と2011年のトンレサップ湖（カンボジア）のアオコから強いグループGのシグナルが検出された。

図(2)-4：MLST法によるアオコ種内系統群の経年変動。分離株のMLSTタイピングを年度別に分けて頻度グラフで表示。同一の遺伝子型も数に含めて（遺伝子型ではなく分離株数に基づき）頻度グラフで表現。グループGは2005年以降に大量に分離されていることに注意。例外的に2004年以前に分離されたグループG株（ネパール株）を示す。
図(2)-5 : MLST法による利根川水系におけるアオコ種内系統群の頻度分布。図(2)-4と同様に同一の遺伝子型も数に含めてグラフで表現。円の直径は株数に比例するように描く。グループGが分離されないアオコは遺伝的に多様なグループで構成されるのに対し、グループGが分離されるアオコはグループGが優占する傾向があることに注意。

MLSTの7つの遺伝子それぞれ個別で作成した系統樹とMLST系統樹とを比較した結果、ftsZ遺伝子を指標とすることによって、取得された遺伝子がおおよそどのMLST種内系統に属するかを判断できることがわかった。グループGを含むアオコ株をこれまでに大量分離している土浦港（霞ヶ浦）をモデル地域に設定し、定期的に同地点からアオコをサンプリングしてクローンライブラリー分析を行なった。その結果、2009年のアオコにおいてはグループGが優占していたことがわかったが、驚くべきことに2010年、2011年になるとグループGがほとんど検出されなくなった（図(2)-6）。これらの結果を総合すると、グループGは霞ヶ浦近辺で2005-2009年という限定された期間に大量発生したグループであることが示唆される。このような非常に限られた期間・地域でのみ特定の種内系統群が大発生するというパターンは、例えば病原菌のアウトブレイク時にはよく見られるパターンであるが、アオコ形成ラン薬のような環境微生物では前例がない。おそらくはグループGの持つ未知の生理生態的特性が2005-2009年の霞ヶ浦水系の生態系に高度に適応した結果、グループGの大量発生が起こったと考えられる。実際、2005年以降に霞ヶ浦の植物プランクトン相が劇的に変わったことは他の研究者からも指摘されており（本間隆満博士、私信）、この
年を境に何らかの大きな環境変化があった可能性は高い。このグループGの持つ未知の生理生態的特性を特定することは残された課題である。

図(2)-6：クローンライブラリー法による土浦（霞ヶ浦）におけるアオコ種内系統群の頻度分布。2010年、2011年ではグループGがほとんど検出されなくなっていることに注意。 $ ^{*} $ はアオコ発生時のサンプル，それ以外はアオコ非発生時にプランクトンネットでM.aeruginosaを濃縮したサンプル。2011年には6-9月にもアオコは継続して発生しており、現在このサンプルについて分析を行なっている。

## （５）アオコ毒性と遺伝子型の関係

分離したクローン株については、アオコ毒素ミクロシスチン産生能を化学分析とミクロシスチン生成成遺伝子（mcyG）のPCR検出によって調べた（表(2)-1）。双方の分析の結果は完全に一致しており、mcyG遺伝子が検出された株で無毒の株は見つからなかった。ミクロシスチン毒性を系統樹上にマッピングしてみたところ、有毒株はグループA、B、Xの三系統にのみ現れたが、例外的に尖道湖から分離された遺伝子型sjのみが前述の三系統のどれにも属さず、もう一つの例外的な有毒株であるPCC7806株の近縁に位置した（図(2)-2）。遺伝子型sjが分離された2010年の尖道湖においては、近年稀に見るアオコ大発生が起こっていた。このため、この珍しい新規遺伝子型sjについてより詳細な解析を行うこととした。

## （６）宍道湖で分離された新規有毒遺伝子型「sj」の解析

2010年の夏季から秋季にかけて、宍道湖では史上稀に見るアオコ大発生が観察され、悪臭の発生等でたいへんな問題となった。2010年の10月に宍道湖のアオコサンプルをサブテーマ（1）を担当する京都大学のグループからの譲渡により入手し、顕微鏡観察を行なったところ、ほぼM. aeruginosa単一種から構成されるアオコであることがわかった。一般的には同一アオコの中に多様なコロニー形態を持つM. aeruginosaが混在する場合が多いのであるが、このサンプルについてはコロニー形態も均一であった。このサンプルから5株のクローン株を確立し（表(2)-1）、MLST解析を行ってみたところ、全て同一の新規遺伝子型sjを示し、また分子系統樹上で非常にユニークな位置を占めた（図(2)-2）。意外なことに、この株は既知の有毒株系統A, B, Xのいずれにも属さない
のにも関わらず、ミクロシスチンが検出された（表(2)-1）。系統樹上でsjと最も近縁に位置したPCC7806株は同様にA, B, Xに属さない株であるが、この株はM.aeruginosaの分子生物学の基礎研究を行う際のモデル株として利用されており、多くの知見が蓄積されている。興味深いことに、PCC7806株はオランダの汽水湖から分離された株であり、実際に高塩分濃度耐性を持つことが知られている $ ^{21} $ 。sjとPCC7806株との遺伝的近縁性、及び尖道湖が汽水湖であるという二点は、sjも塩分濃度耐性を持つ可能性を示唆する。この点について検討するために、sj株の塩分耐性を調べることにした。

Sj遺伝子型を示す株の一つであるSjs10Sj03を用いた培養実験の結果、確かにsjは2010年のアオコ発生時の宍道湖湖水表面相当の塩分濃度に耐性を持つことがわかった（図(2)-7A）。2011年の宍道湖では2010年ほどのアオコ発生は見られなかったが、2011年の9月に宍道湖で採取したアオコを用いてクローンライブラリー分析を行ってみたところ、実に30クローン中の29クローンがsjの遺伝子型を示した（図(2)-7B）。

A

B

図(2)-7：尖道湖で分離された新規遺伝子型sjの特性。Aは、sjと他の種内系統群の塩分耐性比較。 尖道湖表層の塩分濃度データ（2010年10月は4.8psu, 2011年11月は1.2psu）は島根県のホームページより引用。グループA, B, D, Eに属する株の塩分耐性は一様ではないため、各グループ内で最高の塩分耐性を持つ株のデータを棒グラフに示した。sjについては非無菌株を塩濃度耐性実験に用いたためか結果にばらつきがあり、今回の結果以上の塩分耐性を示す可能性もある。Bは、2011年9月の尖道湖尖道大橋下で採取したアオコサンプルのftsZを指標としたクローンライブラリー解析の結果。ほとんど単一の遺伝子型sjで占められている点に注意。

残念ながら2010年のアオコサンプルを入手できなかったため、決定的な証拠を提示することはできないものの、2010年の尖道湖のM.aeruginosaが均一なコロニー形態を示したこと、単離したM.aeruginosa株が全てsj遺伝子型を示したこと、sj遺伝子型を持つ株が当時の尖道湖表層の塩分濃度を受容可能な高い塩分耐性を示したことなどから、2010年の尖道湖の空前のアオコ大発生は、新規遺伝子型sjにより引き起こされた可能性が高いと言っていいと思われる。しかしながら、sjに匹敵する塩分耐性を持つM.aeruginosaは、sj以外にも存在することには注意したい（例えばグループの塩分耐性を持つM.aeruginosaは、sj以外にも存在することには注意したい）。