Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## 3 ) 微生物解析結果

運転216日めに回収したバイオマスの16S rRNA遺伝子に基づくクローニング解析結果を表4.1.1に示す。DHSバイオリアクターにはアンモニア基質のみ供給されているので、スポンジ担体に保持されているバイオマスは主に硝化細菌で構成されると思われるが16S rRNA遺伝子のクローニングによる微生物群集解析ではアンモニア酸化細菌のNitrosomonas属、亜硝酸酸化細菌はNitrobacter属とNitrospira属のクローンが検出されるがその割合は全体の約20％にとどまった。残り80％の細菌は硝化細菌の代謝産物により支えられていることになる。この代謝産物等を利用する従属栄養細菌は多種多様であり、未分類培養に属するクローンも多く検出された。マンガン酸化細菌に関してはマンガン酸化細菌と知られているBacillus属が1クローン検出されたのみであった。このBacillus属のクローンのみがマンガン酸化に関わっているとは考えにくく、未知のマンガン酸化細菌の存在が示唆され、それらがリアクター内でマンガン酸化を担っていると推測された。

表 4.1.3 16S rRNA 遺伝子に基づく系統解析結果

Phylogenetic group	This study
Number of clones	Remarks	Percentage

AOB (Betaproteobacteria)
Nitrosomonas spp.	3	4%
NOB (Alphaproteobacteria)
Nitrobacter sp.	5	6%
NOB (Nitrospira)
Nitrospira spp.	11	Sublineage-I(8)a, Sublineage-II(3)	13%

MnOB (Firmicutes)
Bacillus sp.	1	1%

Other alphaproteobacteria	10	12%
Other betaproteobacteria	8	Burkholderiales(4), MND1(4)	10%
Gammaproteobacteria	6	Xanthomonadales(4), Legionellales(2)	7%
Deltaproteobacteria	2	2%

Actinobacteria	2	2%
Acidobacteria	7	Gp1(1), Gp3(2), Gp4(4)	9%
Bacteroidetes	6	b-17BO(1), PHOS-HE21(4), Saprospirales(1)	7%
Chamydiae	1	1%
Chlorobi	3	OPB56(3)	4%
Chloroflexi	3	Anaerolineae(1), Chloroflexi(1)	4%
Gemmatimonadetes	3	4%
Planctomycetes	7	Pirellulales(1), Planctomycetales(4), Gemmatales(1), Other(1)	9%
Verrucomicribia	2	Gp3(1), Opitutus(1)	2%
WS3	1	1%
OD1	1	1%
OP10
Spirochaetes

Total	82	100%
a() represent the clone number detected

## 4 ) まとめ

・硝化酸化細菌との共生系でマンガン酸化細菌の集積培養が可能であった。
・マンガン除去速度はメタン消費速度と関係があり、本リアクターでは $ 0.6 \, kg/m^{3}/day $ に達した。

・培養が観察されるようになるまでには長期間を要し、Mn(II)処理のスタートアップは遅かった。

硝化反応が進むにつれてマンガン除去速度は高くなっていったが、硝化速度が $ 0.6 \, kgN/m^{3}/day $ 以上になると、pH の低下もしくは亜硝酸阻害によりマンガン除去速度は低下した。

長期間の運転後、スポンジのマンガン酸化物形成、リアクター下部に沈殿が確認された。

・バイオマスを16S rRNAに基づいた系統解析を実施した結果、2割が硝化菌で残りの8割が硝化細菌の代謝産物によって増殖する菌であった。既知のマンガン酸化細菌に近縁なクローンはほとんど検出されなかった。このことから新種のマンガン酸化細菌の存在が示唆された。

## (2) メタン酸化細菌との共培養でのバイオMn酸化物の生成

## 1 ) マンガン酸化細菌の集積培養結果

マンガン濃度の推移を図 4.2.1 に、マンガン除去速度を図 4.2.2 に、マンガン除去速度とメタン消費速度の推移を図 3.5 に示す。

図 4.2.1 マンガン濃度推移

図 4.2.2 マンガン除去速度とメタン消費速度の推移
フェーズ 1 ではメタン消費が起きているがマンガン除去は発生しなかった。その原因をメタン酸化細菌の代謝物が少ないためであると考えフェーズ 2 からガス供給速度を 6 倍にし、メタン酸化細菌のさらなる培養を試みたところメタン消費速度は 2 倍になりメタン酸化細菌の培養に成功した。メタン消費速度の増加に続いてマンガンの除去がみられ、メタン酸化細菌との共生系でマンガン酸化細菌の培養に成功した。メタン消費速度とマンガン除去速度には関係があり（図 4.2.3）マンガン酸化細菌の集積培養にはメタン消費速度が重要であることがわかった。

図4.2.3 メタン消費速度とマンガン除去速度の関係

図 4.2.2 におけるフェーズ 3、5 はメタン供給を止めた期間である。マンガン除去性能はメタンを止めても直ちに悪化することはなく、どちらのフェーズにおいても 2 週間ほど維持できたがその後低下した（図 4.2.3）。代謝物がない環境でもマンガン酸化が起きたことからマンガン酸化細菌は代謝物だけでなく、菌体を摂取できる可能性が示唆された。

図 4.2.4 メタン無供給期間のマンガン除去速度推移（左：フェーズ 3、右：フェーズ 5）

フェーズ 5 のメタンを止めた期間でマンガン除去速度が大きく低下したフェーズ 6 ではメタン供給を開始してもマンガン除去が回復しなかった（図 4.2.5 の②）。このときマンガン濃度はリアクター内で 30 mg/L
以上であり、高濃度マンガン環境がマンガン酸化細菌の培養に適さないことが示唆された。高濃度マンガン環境でマンガン酸化が起こらないことはLeptothrix discophoraを用いた実験で報告されている $ ^{13)} $ 。運転750日目からマンガン濃度の管理に注意して低濃度マンガン環境で運転を行ったところ顕著なマンガン除去の回復がみられ（図4.2.5の③）マンガン除去速度は最高で0.35 kg/m³/dayを記録した。このことからマンガン酸化細菌の培養には低濃度のマンガン環境が適することが示唆された。

本リアクターのメタン消費速度は概ね10 mmol/L/dayを推移した（図4.2.2）。幡本らはDHSリアクターを用いてメタン酸化細菌を集積培養した結果、メタン酸化速度が最大で2.2 kgCOD/m³/dayを記録したと報告している $ ^{14} $ 。単位を換算すると約70 mmol/L/dayとなり、本装置のリアクターよりも6倍ほどメタンを酸化することができる。さらにこれまで報告された知見よりMOBの最大活性として、バイオフィルム形成培養実験系でのMOBのCH₄酸化能力は280 g CH₄/m³/dayと報告されている。これらよりリアクター内でMOBが何らかの活性阻害を受けていることは明瞭であった。また担体に含まれる物質のうちMOBが最も触れる機会を有しているものとして生物生成MnO₂が挙げられる。これについてはマンガン酸化細菌が環境中でMnO₂を生成することで近傍に生息する基質競合従属栄養微生物に対して活性阻害を引き起こし自身にとって優位な環境を創造するような生存戦略を用いていることが考えられる。

本系では上記で示したマンガン酸化細菌の AOB の共培養実験で観察された pH 低下を解決するためメタン酸化細菌(MOB)を用いたマンガン酸化細菌の共培養を試みた実験である。MOB はマンガン酸化細菌と同様に従属栄養細菌に分類される微生物であり、その名称にあるとおり $ CH_{4} $ を酸化して増殖する。また $ CH_{4} $ は気体としてリアクターに供給することが可能で、担体部分でのマンガン酸化細菌の有機基質供給源を MOB の代謝産物のみに限定できる。さらには MOB の代謝が AOB とは異なり pH に影響することはほとんど無いため、リアクターの運転管理をより容易にするものである。

図 4.2.5 マンガン除去速度とリアクター内マンガン濃度の関係 (① : 343-577 日、 ② : 577-695 日、 ③ : 754-903 日)
図 4.2.6 運転 189 日目スポンジの様子

## 2 ) 生成バイオマンガン酸化物のレアメタル吸着

生物学的マンガン酸化物は高い金属吸着能力を持つことが知られているが、本実験でリアクター内に生成されたマンガン酸化物がレアメタルであるニッケル・コバルトを吸着するのかを調査した。そのためフェーズ7からニッケル・コバルトを10 mg/Lの濃度で添加した。図4.2.7にニッケル・コバルトの除去速度を示す。

添加開始時からニッケル・コバルトの除去が起き、リアクター内に生成されたマンガン酸化物の高いレアメタル吸着性能が示された。時間の経過とともに除去性能は低下した。これは供給されるニッケル・コバルトに対してリアクター内で新たに生成されるマンガン酸化物の量が釣り合っていないからである。ニッケル・コバルトの添加開始からマンガン除去速度は下がっているためリアクターの定常的なレアメタル除去性能を調査することはできなかった。生物学的マンガン酸化物ではニッケルよりもコバルトに対して吸着親和性が高いことが知られているが、この実験でも一貫してコバルトの方が吸着されていることがわかった。

図4.2.7 ニッケル・コバルト除去速度の推移

## 3 ) 微生物解析結果

運転189日目のバイオマスに対して細菌の16S rRNA遺伝子配列に基づいたクローン解析を行った結果を表4.2.1に示す。クローニング解析の結果、13門60ファイロタイプに分類される細菌種が検出された。メタン供給を止めて30日程度経過していたが、Methyllocaldum属およびMethylosystis属に分類されるメタン酸化細菌がそれぞれ1クローンおよび10クローン検出された。他に検出頻度の高かったグループとしては、
Hyphomicrobiaceae 科 (9 クローン)、Bacteroidetes 門内 PHOS-HE21 グループ (8 クローン)、MRC17 グループ (6 クローン) などがみられた。既知のマンガン酸化細菌に近縁なクローンは検出されておらず、本リアクター内でマンガン酸化に関与している細菌種を特定することはできなかった。このことから本リアクター内で新種のマンガン酸化細菌がマンガン酸化に関与している可能性が示唆された。

表 4.2.1 16S rRNA 遺伝子に基づく微生物解析結果

Phylogenetic group	Number of clones
MOB (Alphaproteobacteria)
Methylocistaceae	1
MOB (Gammaproteobacteria)
Methylocalcdum	10
Other Proteobacteria	26
Bacteroidetes	16
Chlamydiae	1
Chloroflexi	2
Gemmatimonadetes	2
Acidobacteria	1
OP10	1
Verrucomicrobia	5
Planctomycetes	6
Actinobacteria	6
Unclassified bacteria	4
Total 81

図 4.2.8 DAPI 染色結果
運転 189 日目の沈殿物に対して DAPI 染色を行った。図 4.2.8 では水色に染色されたものが細菌であり、黒色のものはマンガン酸化物と思われる。この画像からマンガン酸化物と微生物は密接に存在していることがわかった。今回の研究では DHS リアクターの下部にマンガン酸化物が自然に堆積することを期待しているが、この画像からはマンガン酸化物だけでなくマンガン酸化細菌を含む細菌も共に剥離・落下していることが明らかになった。このため、マンガン酸化物を回収したい場合は両者を分離するプロセスを開発する必要があると考えられる。

## 4 ) まとめ

・メタン酸化細菌との共生系でもマンガン酸化細菌の集積培養が可能であった。

・DHS リアクターを用いてメタン酸化細菌との共培養によるマンガン酸化細菌の集積培養に成功した。硝化菌では pH の低下などに注意を払わねばならないが、メタン酸化細菌を用いることで容易にマンガン酸化細菌の集積培養ができる。

・マンガン除去速度はメタン消費速度と関係があり、本リアクターでは $ 0.35 \, kg/m^{3}/day $ に達した。

・マンガン酸化細菌はメタン酸化細菌の代謝物だけでなく菌体を摂取できる可能性が示唆された。

・マンガン酸化細菌は高濃度マンガン環境では増殖できないもしくは悪くなること、培養には低濃度マンガン環境が適することが示唆された。

・バイオマスを16S rRNAに基づいた系統解析を実施した結果、メタン酸化細菌は検出されたものの、既知のマンガン酸化細菌に近縁なクローンは検出されなかった。また、多種多様な細菌が検出された。このことから新種のマンガン酸化細菌の存在が示唆された。

## (3) 活性污泥を唯一の基質としたマンガン酸化細菌の集積培養

## 4 ）実験結果

図 4.3.1 に Mn(II)濃度、Mn 流入負荷・除去速度、酸素除去速度を示す。リアクターは最初、5 mgMn/L、HRT12 時間で開始したが、Mn(II)除去が確認されなかったため、46 日目に硝化細菌共生系を利用した Mn 酸化バイオリアクターのバイオマスを再植種した。その結果、Mn 酸化反応が確認されるようになり、マンガン酸化細菌の培養に成功した。そこで、フェーズ 2 からフェーズ 4 まで徐々に HRT を短縮し、Mn(II)の供給負荷を高めた。その結果 153 日目にはマンガン除去速度は 0.01 kg/m³/day に達した。しかしながら、その後 Mn 除去速度は低下したため有機物供給が必要であると判断し、適時活性污泥を添加した。その結果、Mn 除去速度はフェーズ 3 には 0.044 kg/m³/day、フェーズ 4 には 163 g/m³/day に達した。フェーズ 4 以降、Mn 供給負荷を上げるために、流入の Mn(II)濃度を上げたが Mn 除去速度は低下した。これは Mn(II)イオンがマンガン酸化細菌に対して毒性を有するためであると考えられる。Phaes 5、6、7 でも同様に活性污泥を添加し、その後 Mn 除去のピークが表れ、その後除去速度が低下する傾向が繰り返された。この期間の最大 Mn 除去速度は 0.36 g/m³/day であった。このような間欠的な活性污泥供給を繰り返しながら、流入 Mn 負荷を過剰に上げたフェーズ 8 では Mn 除去速度 1.69 kg/m³/day を達成した。すなわち、Mn 酸化細菌は溶解性有機性基質でなくても、固形性の活性污泥、細菌の死骸を利用することができ、基質として産業廃棄物の活性污泥を用いてマンガン酸化細菌は集積培養でき、しかも Mn(II)除去速度は既存の共培養による方法よりも数倍高く、本研究で目標としている性能を超える成果が得られた。
Mn 除去速度は目標値であった 1 kg/m^{3}/day を大幅に越える、これまでに報告されていない画期的なマンガンの処理速度である。その後、マンガン除去速度が低下したため汚泥を追加で添加した所、マンガン処理速度はある程度維持されたが、Mn 酸化速度が早いためかリアクターの様々な箇所にマンガン酸化物が形成されるトラブルが頻繁に起こるようになり、結果として処理能力は低下した。安定したマンガン処理性能を確保するため、マンガン酸化物が肥大化した後の回収法を検討する必要がある。

酸素の消費量も Mn 除去速度の増加に伴い増えていった。酸素消費量は特に活性污泥添加直後に増加する傾向が得られた。培養期間中にはリアクター下部に大量の Mn 酸化物が沈殿、回収された。組成を調査した結果、重量比で沈殿物乾燥重量の 67% を Mn が占めていた。

## 2 ) 微生物解析結果

657 日目に採取されたバイオマスに対して次世代シーケンサーを用いた 16S rRNA 遺伝子解析を行った結果を表 4.3.1 に示す。運転リアクター中のバイオマスには様々な微生物群集が存在していた。特にマンガン酸化細菌として知られている Hyphomicrobium 及び Pedomicrobium も検出されており本リアクターでマンガン酸化を担っていた有力な微生物群の一つであると考えられる。しかしながらそれぞれ 2%、0.8% と存在割合は低い結果となった。最も検出されたのは、アルファプロテオバクテリア門の unclassified に属する Rhodospirillaseae であったが既往の報告でマンガン酸化グループは報告されていない。マンガン酸化細菌にもマンガン酸化能力の高いグループと低いグループが存在しており、Pedomicrobium sp. ACM3067 といったマンガン酸化細菌は MCO を有しており高速マンガン除去が達成出来る事が報告されている $ ^{22} $ 、 $ ^{23} $ 。マンガン酸化に利用されていると推測されているスーパーオキシドを細胞外で合成する細菌群はほとんど存在していないと考えられていた。しかしながら近年の研究では様々な種および環境条件でスーパーオキシドを生成している事が示されている $ ^{24} $ 。本リアクターでは集積培養されているグループはいなかったと考えられるが、大量に MCO もしくはスーパーオキシドを合成する少数精鋭の微生物グループがマンガン酸化を担っていたと考えられる。

## 3 ) まとめ

・活性污泥を基質として供給する事でマンガン酸化細菌の集積培養が可能であった。

・ マンガン除去速度は $ 1.69 \, kg/m^{3}/day $ で実用化の目標値であった $ 1.0 \, kg/m^{3}/day $ に達した。

・ スタートアップに 200 日以上かかり、その後 1.0 kg/m³/day を超えるまで 2 年以上かかった。
図 4.3.1 汚泥基質リアクターにおける Mn(II)濃度、 Mn 流入負荷・除去速度、 酸素除去速度
表 4.3.1 次世代シーケンサーを用いた 16S rRNA 遺伝子解析

Phylogenetic group	Percentage
Acidobacteria	11.6%
Unclassified_Solibacterales	0.8%
Unclassified_Chloracidobacteria	6.4%
Unclassified_Ellin6075	1.6%
Candidatus Chloracidobacterium	0.8%
Actinobacteria	5.2%
Mycobacterium	3.2%
Rhodococcus	0.8%
Armatimonadetes	0.8%
Unclassified_Fimbriimonadales	0.8%
Bacteroidetes	6.0%
Unclassified_Cytophagaceae	4.4%
Unclassified_Saprospiraceae	0.8%
Chloroflexi	4.4%
Unclassified_A4b	3.6%
Cyanobacteria	5.6%
Unclassified_MLE1-12	2.4%
Unclassified_SM1D11	3.2%
Nitrospirae	3.2%
Nitrospira	3.2%
Planctomycetes	2.0%
Unclassified_Phycisphaerales	0.8%
Planctomyces	1.2%
Proteobacteria	56.2%
Unclassified_Alphaproteobacteria	17.5%
Unclassified_BD7-3	0.8%
Phenylobacterium	1.2%
Unclassified_Rhizobiales	0.8%
Unclassified_Bradyrhizobiaceae	3.2%
MnOB (Hyphomicrobium)	2.0%
MnOB (Pedomicrobium)	0.8%
Unclassified_Rhodospirillaceae	14.7%
Unclassified_Sphingomonadales	2.4%
Sphingomonas	3.6%
Unclassified_MND1	0.8%
Unclassified_Chromatiales	1.2%
Unclassified_Ectothiorhodospiraceae	0.8%
Unclassified_Xanthomonadaceae	0.8%
Verrucomicrobia	1.6%
Unclassified_Opitutaceae	1.6%
Other	4.0%
Total (251 species)	100.0%
## (4) マンガン酸化物の好気性微生物への活性阻害実験

## 1 ) マンガン酸化物がメタン酸化細菌に与える影響調査の結果

図 4.4.1 にメタン濃度の測定結果を示す。Mn 酸化物を添加しなかった系は 8 時間でメタンがほぼなくなっている。Mn 酸化物を 0.5g 添加した系ではわずかにメタン酸化活性が低下した。マンガン酸化物が 2g 以上添加された系はいずれもほぼ同じメタン濃度の推移を示した。この結果からマンガン酸化物がメタン酸化細菌に阻害を与えることが明らかになった。図 4.4.2 は Mn 酸化物の濃度によるメタン酸化活性の変化を示したものである。このグラフからは Mn 酸化物濃度が増えてもメタン酸化活性は 60% 以下にはならないことがわかる。メタン酸化細菌との共培養リアクター運転では長期間運転すると Mn 酸化物がスポンジに蓄積され、Mn 酸化物濃度は高くなっていると考えられるが、メタン消費速度はほぼ一定の値を示した。この結果は Mn 酸化物濃度が増えてもメタン酸化活性は一定以上悪くならないというバッチ実験の結果と一致する。このためメタン酸化細菌共培養リアクターでは Mn 酸化物の阻害の影響によりメタン酸化が定常に達していたと考えられる。

図4.4.1 メタン濃度測定結果

図 4.4.2 メタン酸化活性に対する Mn 酸化物濃度の影響
## 2 ) マンガン酸化物が従属栄養細菌に与える影響調査の結果

$\mathrm{MnO}_{2}$ 濃度を 0、10、50、100 g/L として 4 系列での回分試験を 36 時間培養により行った。本実験系では $\mathrm{MnO}_{2}$ 添加量による有機物分解能力に差異が認められた (図 4.4.3)。$\mathrm{MnO}_{2}$ 濃度が増加するにつれ有機物分解量は減少した。これより高濃度 $\mathrm{MnO}_{2}$ 環境下で微生物活性が低下することが示された。しかしながら、能力に差は認められる一方で全系列での有機物消費が観察された。初期 COD 濃度が設定値である 300 mgCOD/L よりも高い値を示した原因としては、馴致培養で添加した有機基質の持込によるものであると判断した。また、本実験系では $\mathrm{MnO}_{2}$ 添加系 (ろ紙封入) と非添加系で活性污泥の培養し、添加した有機基質消費量の観察を行った (図 4.4.4)。その結果、両系ともに有機物の消費は観察された。加えて、その有機物消費能力は等しかつた。これから $\mathrm{MnO}_{2}$ による微生物の有機物消費量の低下は培地中の基質の $\mathrm{MnO}_{2}$ への吸着作用に起因する必須栄養素の不足に伴うものではなく何らかの直接的な作用であることが明らかになった。

活性污泥の沈降性を粉末$\mathrm{MnO_{2}}$ 添加系と非添加系で比較した結果、$\mathrm{MnO_{2}}$ 添加系(100 g L^{-1})で非常に高い沈降性が観察された(図4.4.5)。評価に際し10分程度両系の沈降性を観察したが、完全混合状態から30秒程度で添加系のフラスコ内は内部物質の沈降が観察されたさらにその詳細な挙動として$\mathrm{MnO_{2}}$ と活性污泥がフロック状のものが形成され沈降していることが観察された(図4.4.5)。これより、$\mathrm{MnO_{2}}$ と生物固体しいては微生物細胞との親和性が非常に高いことも示唆された。

これらの結果より、Mn酸化細菌がMn(II)を酸化する理由は明らかになっていないが、バッチ実験の結果からMn酸化細菌にとってMn酸化物を合成することはメリットになると考えられる。つまり、Mn酸化細菌はMn酸化物を生成することにより基質競争する他の従属栄養細菌を阻害し、自らが有利に生存できると考えられる。この仮説通りであるならばMn酸化細菌自身がマンガン酸化物に阻害されないか阻害の影響を受けにくい必要がある。

また、共培養リアクターの実験では Mn 酸化細菌の培養において低濃度 Mn 環境が適していることが示唆された。Mn を酸化することと、生成された Mn 酸化物が Mn イオンを吸着することにより周囲の Mn イオン濃度を下げるため、マンガン酸化細菌は戦略的にマンガン酸化物を生成している可能性も考えられる。

図 4.4.3 從属栄養細菌阻害実験結果
図 4.4.4 Mn 酸化物非接触系実験結果

図 4.4.5 Mn 酸化物添加による活性污泥凝集沈殿
## 3 ) まとめ

・メタン酸化細菌の阻害にマンガン酸化物が関わっていることが明らかになった。

・ マンガン酸化物はメタン酸化細菌だけでなく多種多様な微生物に対して阻害の影響を与えることが明らかになった。

・ マンガン酸化細菌がマンガン酸化する理由として、他の基質競合する従属栄養細菌を阻害して有利な環境を作るためである可能性が考えられる。

## (5) マンガン酸化細菌の分離・培養

## 1 ) 培養方法の検討

固形培地組成として Agar とリン酸バッファー (リン(P)濃度: 0.02 mM) を使用した培養より、培地性能の検証を開始した。しかしながら、\mathrm{MnO}_{2} プレートでの安定的なコロニーの獲得には至らなかった。さらに低 pH 環境を至適として増殖する真菌(カビ)によるコンタミネーションが生じるなど、獲得したコロニーの生態を検証が不可能な状態となった(図 4.5.1)。Agar とリン酸バッファーを併用する場合基質の安定性が低下するとの報告もあり $ ^{25} $ 、Agar から GellunGum、リン酸バッファーから HEPES バッファーへと基質の変更を行った。

図 4.5.1 $ MnO_{2} $ プレートへのカビの混入

## b 培養効率調査

GellunGum を用いる事で安定的なコロニーの獲得が可能となった。24 時間培養で $ MnO_{2} $ プレートならびに Blank プレート両系からコロニーの獲得が可能であり、同時に発現コロニーが他の発現コロニーの重合しない植種菌体濃度を決定した。これはブラックメンブレン上での DAPI 染色を施したセルカウンティングにより、採取した活性污泥の初期菌体数を計上した。採取活性污泥中の初期菌体数は総じて平均 $ 1.0 \times 10^{9} $
cell mL $ ^{-1} $ であった。各種菌体濃度環境で培養を両系で行いその傾向を観察した結果に基づいて、プレート上で発現したコロニーが重合しない菌体濃度は2.0×10^{7} cell per plateと決定した。

図 4.5.2 24 時間後の活性汚泥プレート培養(左:ブランクプレート、右:MnO_{2}プレート)

これより培養を行い、本実験系で使用する培地で増殖したコロニー数を培養20時間で計上した。$\mathrm{MnO}_{2}$ プレート及びBlankプレートはそれぞれ20枚ずつ任意の微生物量で植種し、培養を行った。$\mathrm{MnO}_{2}$ プレートで発現したコロニー数は$\mathrm{MnO}_{2}$ 非含有プレートに比べ劣る培養効率であった。

$\mathrm{MnO}_{2}$ プレートから発現したコロニー数が30コロニーとなるように植菌濃度を変更した$\mathrm{MnO}_{2}$ プレートを培養した結果、24個のコロニーを獲得した。これに対して、$\mathrm{Mn(II)}$ 添加/非添加したK-mediumを与えた液体培地中で培養を行った。24時間培養の結果$\mathrm{Mn(II)}$酸化反応が生じ$\mathrm{MnO}_{2}$が発現したコロニーは2/24コロニーであった(図4.5.3)。

図 4.5.3 LBB 染色によるマンガン酸化細菌の検出
得られた結果より活性污泥中のコロニーを形成する細菌群のうち約98%が$\mathrm{MnO}_{2}$に対して耐性を持っておらず、更にその耐性を有する細菌群のうちおよそ8%がマンガン酸化能力を有する結果となった(図4.5.4)。よって、活性污泥中に存在するコロニーを形成する微生物群集のうちマンガン酸化能力を有する種は0.2%のみである事が示された。これは既往の知見である有機物が豊富に存在する環境でマンガン酸化細菌が優占化出来ずほとんど存在しない結果と一致する。

$\mathrm{MnO}_{2}$ プレートでの培養は培養基質やその組成がコロニーの発現に大きく影響をおよぼすことが明らかになった。固形培地組成に GellumGum ならびに HEPES バッファーを使用することでより容易にコロニーの獲得が可能となった。これは K-medium を使用した本培地組成での培養では Agar より GellumGum 培養がより適しているためであると考えた。実際の $\mathrm{MnO}_{2}$ 高含有リアクターでの培養は、担体中において微生物間の相互作用等が生じることが考えられ、$\mathrm{MnO}_{2}$ による微生物活性阻害が確実に生じている環境とは断定できない。一方、$\mathrm{MnO}_{2}$ プレート上での培養は植種された微生物は 1 細胞ごとに隔離された状態での培養となる。そのため、微生物の休眠等を考慮しない場合、$\mathrm{MnO}_{2}$ による従属栄養細菌活性への阻害作用の影響をより直接的に受けることが推察できる。よって、$\mathrm{MnO}_{2}$ プレート上で発現したコロニーは完全なマンガン耐性菌であると言及できる。以上から、今後 $\mathrm{MnO}_{2}$ プレートより獲得したマンガン耐性菌と考えられる微生物の系統学的解析等を行うことで、マンガン耐性菌の $\mathrm{MnO}_{2}$ 耐性機構を明らかにすることが可能であると考える。

$$ \mathrm{MnO}_{2} $$

図 4.5.4 活性污泥中に存在するマンガン耐性菌とマンガン酸化細菌のポピュレーションサイズ

## 5 ) まとめ

・MnO_{2} プレート培養では培地組成として、固化成分に GellumGum、pH 緩衝液に HEPS バッファーを使用することで安定的に活性污泥を植種源としたコロニーの獲得が可能であることが明らかになった。

・活性污泥中の約90％が$\mathrm{MnO}_{2}$非耐性菌で残りの10％が$\mathrm{MnO}_{2}$耐性菌であった。更にその約1割がMn酸化能力を有する事が示唆された

・ MnO_{2} プレート上で従属栄養細菌活性阻害が菌体に作用していることが明らかになった。

・ マンガン酸化細菌の培養とマンガン酸化のスタートアップは非常に遅かったが、運転の開始時に $ MnO_{2} $ を塗布しておけば、従属栄養細菌群を排除する事でスタートアップが早まることが予測される。
(6) DHS リアクターを用いた $ MnO_{2} $ の有無による Mn(II)酸化のスタートアップ比較

## 1 ) リアクター培養結果

本実験では約80日間リアクターの運転を行った(図4.6.1)。また前項で観察されたpH低下にともなうリアクター性能の破綻を防ぐため、培地作成時に添加するpHバッファーならびに微量栄養素濃縮液を短期間での作り替えを行った。これら濃縮液の更新は培地性能にお大きく影響しうるため、短期間での定期的な更新を行った。RUN1～3は培養期間中一貫して有機物除去が観察された。

RUN 1 は運転開始から Mn(II) の際立った除去は観察されなかった。1 mgMn(II)/L 程度の除去は運転開始 28 日まで観察されているが、この期間における Mn(II) の消費はリアクター内のスポンジ担体並びに生物膜への吸着さらには Mn(II) 測定の誤差等を考慮すると生物的な Mn(II) 酸化に伴う Mn(II) 除去とは断定できない。これは除去速度が経時的に一定であることからも推察できる。運転開始 30 日以降から経時的な Mn(II) の除去速度の増加が確認され始めた。これはリアクター内で微量ながらもマンガン酸化細菌の増殖したことに伴うものと考える。というのは、RUN 1 におけるスポンジ担体 20 個のうち上部 1、2 個の色が活性汚泥植種直後の茶色からやや黒味がかった茶色へと変化したことからも十分推察される $ \left(\mathrm{MnO}_{2}\right. $ の色は黒)。しかしながら、42 日以降から除去速度が $ 0.013\ \mathrm{mgMn(II)}\ \mathrm{m}^{-3}\ \mathrm{d}^{-1} $ 程度から除去速度の増加が見られず一定値を示すようになった。これはスポンジ担体中に含まれるマンガン酸化細菌と他の従属栄養細菌との基質競合の関係により、これ以上のマンガン酸化細菌の増殖しいては Mn(II) 除去性能の向上はさらなる培養期間を要するものと考えられる。

RUN 2 では運転開始直後より生物的 Mn(II) 除去が観察された。運転開始 12 日から RUN 2 において供給 Mn(II) 濃度を増加させた $ (5 \rightarrow 10 \, \text{mgMn(II)/L}) $ 。その結果、運転開始 35 日の培養で $ 0.2 \, \text{kgMn(II)/m}^{3}/\text{d} $ の Mn(II) 除去性能が観察された。そこから約 2 週間程度の継続的な Mn(II) 除去が確認された。これは、塗布した $ MnO_{2} $ による Mn(II) の吸着ではないことは上記に記した吸着処理からも明瞭であり、生物的な Mn(II) 除去である。生物的な Mn(II) 除去プロセスの複合微生物系 (活性污泥) から約 2 週間で確立させた報告はこれまでなく、本研究室で過去に行ったものと比較すると 200 日程度短縮化することに成功した。

培養60日まで培養担体への$\mathrm{MnO_{2}}$が塗布された状態で、$\mathrm{Mn(II)}$非供給運転がなされてきたRUN3に$\mathrm{Mn(II)}$供給を行った(培養60日)。結果として供給直後から、$\mathrm{Mn(II)}$除去が観察された。同時に$\mathrm{Mn(II)}$供給負荷を増加させると、RUN3への$\mathrm{Mn(II)}$供給開始およそ10日程度でRUN2で確認された最大$\mathrm{Mn(II)}$除去速度である0.2kg$\mathrm{Mn(II)/m^{3}/d}$を達成した。

仮説通り $ MnO_{2} $ 塗布ならびに低負荷での有機基質、Mn(II)を供給した培養系列で短期間での生物的 Mn(II)除去リアクターの立ち上げに成功した。本実験系で確認された最大 Mn(II)除去速度は $ 0.35\ kg\ Mn(II)\ m^{-3}\ d^{-1} $ であった。これはメタン共培養系で 600 日間の培養で得られた最大除去速度と同様の能力であったが、培養期間に鑑みると本系で獲得した性能は相当量の Mn(II)除去性能であると評価した。この短期間での Mn(II)除去性能の獲得は短期間での Mn(II)酸化微生物の集積培養に成功したと言及できる。有機基質ならびに Mn(II)供給していたにも関わらず $ MnO_{2} $ の非塗布系では培養期間中一貫して Mn(II)除去は発現しなかった。環境微生物群(活性污泥)からのマンガン酸化細菌集積培養が 200 日以上の培養でも立ち上がらなかった結果と同様であった。これは自然環境下における Mn(II)酸化微生物の基質競合能力が乏しいことを示唆しており $ MnO_{2} $ を高濃度で塗布した環境で培養することで、自然環境中では基質の競合能力に乏しいと Mn(II)酸化能を有する微生物が、 $ MnO_{2} $ による競合従属栄養細菌の活性阻害にともない優化したと考えた。
図 4.6.1 マンガン酸化速度及びバイオマス回収ポイント

## 2 ) 電気泳動による微生物解析結果

獲得した培養サンプルから DNA を抽出し、種々のプライマーを用いて PCR にて DNA を増幅させ獲得した PCR 精製産物に対して電気泳動実験を行った(図 4.6.2)。全細菌対象プライマーである 341F-805R を使用して電気泳動を行った結果、所定の塩基数でバンドが発現した。全古細菌対象プライマー arc109F-915R を用いた結果、バンドは発現しなかった。加えて全真菌対象プライマー2 種類(EF4-EF3 & EF4-fung5)を用いた場合、すべてのサンプルからバンドが発現した。

各ドメインそれぞれに対応した DNA プライマーによる PCR ならびに電気泳動実験の結果、本リアクターで培養された微生物群集は真正細菌(Bacteria)と真菌(Fungi)に分類される微生物群によって構成されていることが示された。しかしながら、本培養系で使用した基質は Bacteria による資化が可能な基質として知られる培地を使用したため、このポピュレーションとしては真菌の優占化は考えにくいと推察した。

図 4.6.2 (A) 真正細菌、(B) 古細菌、(C) 真菌に特異的なプライマーを用いた電気泳動結果 (1: RUN 1、2: RUN 2、3: RUN 3.1、4: RUN 3.2、L: Ladder)
## 3 ) 次世代シーケンサーによる微生物解析結果

Illumina MiSeq による微生物群集解析の結果を以下に示す(図 4.6.3)。すべての系列で多様な微生物群集の培養がなされてきたことは明瞭であった。門レベルでの微生物コミュニティの比較を行うと、 $ MnO_{2} $ 塗布により Firmicutes 門に属する微生物群の割合が減少していた。属レベルでは、Mn(II)酸化が行われたリアクター系列でマンガン酸化細菌分離培養例の多い Psuedomonas 属の優化が確認された。

各サンプルのリード数は R1 : 233、470、R2 : 230、886、R3.1 : 227、548、R3.2 : 225、128 であった。これより得られた塩基配列に QUIME を用いた群集解析を行うにあたり、インデックス配列に依る各リードデータの検体識別ならびにデータの Cleanup が施された。その後抽出されたリードについて QUIME の OTU 生成プログラムを用いて、similarity threshold(しきい値) 97％の条件で分類し、OTU が生成された。さらに各 OTU より代表配列を抽出し、これをインプットとして QUIME のアノテーションプログラム(デフォルト設定)を用いて、16SrDNA データベースについて similarity 90％以上の条件にて相同性検索を行い各 OTU にて各階層(Kingdom / Phylum / Class / Order / Family / Genus / Species) の Taxonomy 情報を取得した。16SrDNA データベースは、QUIME Resources サイトよりダウンロードされた Greengenes データベースの配列情報および分類情報使用した。

微生物群集解析の結果より、キメラを除いたOTU群でデータの精査を行った。全OTU数ならびに各OTUで検出されたリード数等の基本情報を以下の表4.6.1にまとめて記載した。検出OTUのうち、リードカウント数が1のみだったOTU数はすべての系列で50％程度占めていた。これに対応して、ポピュレーションの各系列％が0.1％を下回るものが全OTUの90％を上回っていた。上記より、本実験で培養された微生物群集に多様であることが明らかである。

各Phylumの色 Phylum名 各Phylumのシーケンス数と割合

図 4.6.3 Illumina MiSeq による微生物群集解析結果
表 4.6.1 各条件におけるリード数及びOTU 数

R1	R2	R3.1	R3.2	total
Read total	81539	74926	77692	74240	308397
Total OTU number	2784	2179	2769	2473	7052
Average (read / OTU)	29	34	28	30	43
Average %	0.035	0.045	0.036	0.040	0.014
count = 1	1296	1068	1431	1145	3607
count > ave	305	239	273	278	633
count < ave	2479	1940	2496	2195	6419
% > 0.1 %	160	142	143	158	—
% <0.1 %	2624	1940	2496	2195	—
% > 0.01 %	603	511	539	617	—
% < 0.01 %	2181	1668	2230	1856	—

Read total: リードされたカウント値

Total OTU number: OTU 合計値

Average (read / OTU): 1 OTU あたりのリード数

Average %: 全リード数に対する Average の割合

count = 1: 1 だけリードされた OTU 数

count > ave: Average(%)のリード数より大きいリードをカウントしたOTU数

count < ave: カウントされた OTU のうち Average(%)よりも小さい OTU 数

%>0.1: カウントされたOTUのうち全リード数に対する割合が0.1を上回るOTU数

% < 0.1: カウントされた OTU のうち全リード数に対する割合が 0.1 を下回る OTU 数

%>0.01: カウントされたOTUのうち全リード数に対する割合が0.01を上回るOTU数

% < 0.01: カウントされた OTU のうち全リード数に対する割合が 0.01 を下回る OTU 数

各系列でのポピュレーション(%)に鑑みて、微生物群集の生理特性の推察を行い考える分類群ならびにその意義を以下に列挙する。これらを分類する上で、しきい値を設定した。しきい値は各系列における全リード数に対する各OTUで検出されたリード数の割合で0.1％に設定した。これは各系の検出OTUのうちリードカウント数が1のみであったOTUは全系で共通して50％程度を占めていた。これに対応して、ポピュレーションである各系列%が0.1％を下回るものが全OTU90％以上であった。以上より。本リアクターで培養された微生物群集が多様であることが明らかになった。これより、0.1％をしきい値として設定することにより、リアクターで活動的に生育していた微生物群集の生態特性の分類決定を行えると考えた。

既知の Mn 酸化細菌グループには Bacillus、Pseudomonas、Hyphomicrobium、Pedomicrobium、Rhodoplanes、Cytophaga 等が報告されている。また、それぞれの培養条件により微生物群集を $ MnO_{2} $ 非耐性菌や $ MnO_{2} $ 非耐性菌といったカテゴライズ、特性を特定できると考えた。表 4.6.2 に微生物群集のカテゴライズを示す。また、それにより得られた各リアクターの微生物群集に占める各微生物の割合を表 4.6.3 に示す。これにより、どの微生物グループがどのような $ MnO_{2} $ 耐性の性質を持っているか大まかな予測が可能となった。しかしながら、これらの結果より $ MnO_{2} $ がどの様な微生物種の共通項に影響を及ぼしているのか等の $ MnO_{2} $
の従属栄養細菌活性に阻害を及ぼす機構について推察するには不十分であるため、実証には各微生物の分離株を用いて調査する必要がある。

表 4.6.2 微生物群集のカテゴライズ例

MnO2非耐性菌	MnO2による従属栄養細菌活性への阻害影響を受ける細菌群(RUN1で優化するがRUN2、RUN3.1、RUN3.2のどの系よりも50%以下のグループを選択)
MnO2耐性菌	MnO2による従属栄養細菌活性阻害の影響を受けない(が少ない)細菌群(RUN2、RUN3.1、RUN3.2は全てここに属する)
Mn(II)酸化反応発現系増殖菌	Mn(II)酸化反応発現リアクターで増殖し、コミュニティを保持している細菌群(RUN2、RUN3.2全てがRUN1、RUN3.1の20倍のグループを選択、Mn(II)酸化反応に寄与している微生物種を含む可能性がある)
Mn(II)阻害菌	Mn(II)の存在により阻害影響を受ける菌(RUN3.1からRUN3.2で5%以下に減少したグループを選択)

表 4.6.3 各微生物群集の割合

グループ	R1	R2	R3.1	R3.2
既知 Mn 酸化細菌
Bacillus, Pseudomonas, Hyphomicrobium, Pedomicrobium, Rhodoplanes, Cytophaga のみをソート	0%	11.9%	1.2%	2.5%
MnO2 耐性菌	100%	100%	100%
Pseudomonas 等	Nitrospira 等	Lysobacter 等
MnO2 非耐性菌	21.1%
Ferruginibacter 等
Mn 酸化で活性化	15.7%	8.9%
Chthonomonadales 等	Planctomycetes 等

## 5 ) まとめ

・高濃度 $ MnO_{2} $ 塗布担体に対して K-medium を供給し培養した結果(RUN 2、RUN3)、リアクター運転開始直後から生物的 Mn(II)除去が観察された。これより、短期間での Mn(II)酸化細菌の集積培養ならびにその Mn(II)酸化能力の発現に成功した。

・非塗布系(RUN 1)では本実験系における培養期間中に生物的 Mn(II)酸化は観察されなかった。

・本系列で培養された Mn(II)酸化能を有する微生物群集は有機物を利用し、Mn(II)を除去していることが示された。

・分生物学的手法より、本系で培養された微生物のうち微生物群集のポピュレーションが減少するような$\mathrm{MnO}_{2}$による従属栄養細菌活性阻害の影響を受ける微生物種が明らかになった。

(7) 実二次電池廃液からの金属回収

1) リアクター運転結果
流入水中の各金属濃度測定した結果、実廃二次電池溶解処理液の各金属の組成はマンガン:10.6 mg/L、ニッケル:1.70 mg/L、コバルト1.25 mg/Lであった。これにHEPESバッファーとK-mediumを加えた基質をリアクターに通水した。得られたマンガン除去速度を図4.7.1に、ニッケル、コバルト除去速度を図4.7.2に示す。運転開始直後よりマンガン除去が確認された。そこで、運転初期ではHRTを4.2時間に設定していたが、流出水中でマンガンが完全に除去されていたのが確認されたため、徐々にMn供給負荷を上げていった。最終的に運転3週間以降のHRTは0.2時間に達した。その結果、すぐに目標値であったマンガン除去速度1 kgMn/m³/dに1ヶ月もしないうちに到達した。また、マンガン除去と同時にニッケル、コバルトも除去されており、マンガン除去に対する金属除去比はそれぞれNi/Mn=0.10、Co/Mn=0.15であった(図4.7.2)。運転期間中、ニッケルとコバルトはマンガン除去速度に比例して除去されており連続廃水処理が可能である事が示された。

## 2 ) まとめ

これらの知見を基に実廃二次電池の溶解処理液を用いたニッケル、コバルト、マンガンの連続リアクター運転を行った結果、3週間のスタートアップでそれぞれ1.69 kg Mn/m³/d、0.17 kg Co/m³/d、0.12 kg Ni/m³/dの除去速度に到達し、本研究の目標を達成した。マンガン酸化物を塗布する事により実廃二次電池溶解処理液からのMn除去の早期スタートアップおよび高速Mn除去、金属イオンの同時回収が実証され、実用化に大きく前進した。

図 4.7.1 マンガン除去速度
図4.7.2 ニッケル、コバルト除去速度

## (8) 本研究のまとめ

マンガン酸化細菌は貧栄養環境で検出されることから、基質親和性の高い種で極低濃度の有機物排水を供給すれば、開放系においても培養できるのではと考えられた。そこで、マンガン酸化細菌と硝化細菌との共存微生物生態を構築することを考えた。研究(1)の結果、アンモニア酸化細菌と共生培養において、最大マンガン酸化速度は0.6 kg Mn/m³dを達成したが、硝化反応によって生じたpH低下によってマンガン酸化反応は安定しない結果となった。そこで、アンモニアの次に目を付けたのがメタンである。メタン酸化細菌も硝化細菌同様に代謝産物を生成する事が知られている。研究(2)のメタンを単一の基質としてリアクターに供給した結果、マンガン酸化反応を確認し、pHの低下もみられ無かったが、マンガン酸化速度は0.35 kg Mn/m³dであり目標のマンガン酸化速度1 kg Mn/m³dに到達しなかった。一方で、これらの実験中に興味深い知見が得られた。一つは、どちらのリアクターともアンモニアやメタンの供給基質を突然停止しても、そこから長期間マンガン酸化反応が確認された事である。この結果から、マンガン酸化細菌は代謝産物のみならず細菌の死骸も利用できる事が示唆された。次に、リアクターのスポンジ担体にマンガン酸化物が形成されると共存細菌であるメタン酸化細菌の活性が著しく低下する傾向が得られた。実際に研究(4)では、活性污泥やメタン酸化細菌を用いたバッチ実験で確認を行ったが、マンガン酸化物が他の従属栄養細菌を阻害している事を発見した。他にも、負荷を上げる目的で供給マンガン濃度を上げた結果、急激にマンガン酸化速度が低下した事から、マンガン酸化細菌はマンガン(II)に阻害を受ける事が示された。

我々はここで、基質を供給しなくともマンガン酸化細菌が継続的に観測された事に着目した。マンガン酸化細菌は他の細菌を分解して増殖できる、すなわち活性污泥を基質として供給する事でマンガン酸化細菌を培養できるのではないかと考えた。そこで、研究(3)では、活性污泥を唯一の基質として連続処理を行った結果、マンガン酸化は最大1.69 kg Mn/m³dと微生物による世界最速のマンガン除去速度を達成した。ただし、硝化細菌及びメタン酸化細菌との共培養実験も同様であるが、リアクターのマンガン除去のスタートアップには2年以上と長期間を要した。このような時間がかかると、実用化は不可能である。そこで、
マンガン酸化のスタートアップさせるアイディアが必要となってくると考えた。そこで次に着目したのがマンガン酸化物の従属栄養細菌への活性阻害である。マンガン酸化物に従属栄養細菌が阻害を受けるのであればリアクターにマンガン酸化物を塗布することで、競合する他の従属栄養細菌の増殖を抑制、マンガン酸化反応のスタートアップ期間を短縮できるのではないかと考えた。研究(6)では、リアクター担体にマンガン酸化物を塗布し、スタートアップ期間への影響を観察した。その結果、リアクターにマンガン酸化細菌の優占的な培養に成功し、マンガン酸化細菌の培養を2週間程度に短縮することができた。このように、マンガン酸化物は他従属栄養細菌の増殖を抑制できる事がしめされた。そこで、研究(5)では、微生物を培養するプレート培地にマンガン酸化物を添加する事で、マンガン酸化物耐性細菌、マンガン酸化細菌に選別できるのではないかと考えた。その結果、活性汚泥から微生物群を分離する事ができた。さらに、活性污泥中に存在するマンガン耐性菌は全体の2%である事、マンガン酸化細菌は全体の0.2%程度であった。

これら(1)～(6)の実験結果を用いて、実際に実廃二次電池の溶解処理液を用いたニッケル、コバルト、マンガンの連続リアクター運転を行った。その結果、3週間のスタートアップでそれぞれ1.69 kg Mn/m³/d、0.17 kg Co/m³/d、0.12 kg Ni/m³/dの除去速度にそれぞれ到達し、本研究の目標を達成した。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

リチウムイオン二次電池のリサイクルは、無機化学的にレアメタルを溶解処理および電解処理して金属原料に再生しようとしている。しかし、現状の一般的な無機化学的手法では経済的に採算が合わない。一方、生物学的手法は一般的に化学的手法よりも低コストであることから、有機性排水処理においては主流である。レアメタルの回収に対しても生物学的手法はランニングコストが低く、費用面での課題はないと言える。

マンガン酸化細菌は、開放系の混合微生物群集では培養しづらい。これは基質親和性の高い細菌であり、貧栄養環境において検出される。すなわち、極低濃度の有機物排水を供給すれば培養できる。硝化細菌あるいはメタン酸化細菌を培養して、その代謝物である低濃度の有機物を供給する方法を考案して、マンガン酸化細菌は開放系でも共培養できることを明らかにした。また、マンガン酸化細菌は細菌の死骸を資化できることを発見し、DHSリアクターを用い、活性污泥を基質にして集積培養できることを示した。そのマンガン酸化速度は目標の1.0 kgMn/m³dを超える能力である。さらに、多くの従属栄養細菌はMn酸化物に活性阻害を受けることを発見した。この現象を利用し、予めMn酸化物をDHSリアクターに塗布することで、マンガン酸化のスタートアップを早くすることに成功した。

これらの知見を基に、実廃二次電池溶解液に適用して、3週間のスタートアップでバイオ$\mathrm{MnO}_{2}$の高速生成$1.0\ \mathrm{kg}\ \mathrm{Mn}/\mathrm{m}^{3}\ \mathrm{d}$が可能であり、Mn、Ni、Coの同時回収できることを実証した。

## （２）環境政策への貢献

レアメタルの内レアアースは、大部分を中国から輸入しているが、中国との軋轢で継続的な輸入が心配されている。また、インドネシアにおいてもマンガンの輸出規制を検討していると報道されている。今後は世界的にレアメタルの需給バランスの逼迫が懸念されており、中国等の諸外国に依存しない早急な対策