Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
テリア（アグロバクテリウムなど）、b-プロテオバクテリア（ラルストニアなど）、g-プロテオバクテリア（シュードモナスなど）、G+C%の低いグラム陽性菌（バチルスなのど）、G+C%の高いグラム陽性菌（ロドコッカスなど）の多様な細菌を検出できることがその信頼性の指標となるのであるが（文献31-32）、今回の解析では、これらの細菌をすべて検出した。また、大きな分類の門から、綱、目、科、詳細な分類の属までの各分類項目においてグループ数が多いことも解析の信頼性の指標となる（文献31-32）。表17に細菌および表18に真菌について、その分類項目ごとに検出されたグループ数を示した。論文報告されているデータと比べても遜色ないものと考えられた（文献31-32）。細菌のプライマーとしてグループ数を多く検出できる16S-2と16S-6を選択した。また、真菌については、特異性の高い18S-1、18S-3および18S-5を選択した。この表17において、ジェノミックDNAの解析でのグループ数が少ないのは、分類に使用されている細菌の16S rRNA遺伝子や真菌の18S rRNA遺伝子のような特定の遺伝子に特化せず、ランダムな遺伝子の塩基配列を解析する手法であるため、解析遺伝子のリード数に対して同定された遺伝子数が少ないため、必然的に検出されたグループ数も少なくなっていると考えられる。しかし、土壤微生物群の中では、際立って多い細菌の分布状況を知るために必要であった。（遺伝子増幅による偏りのない方法であるため、プライマーの選択時に役立った。）

今回のコンポスト施用（牛糞堆肥連用区とバーク堆肥連用区）土壌の土壌微生物群については、詳細な解析には至らなかった。今後、指標とできるような微生物に着目できれば、この事業で確立した解析方法と合わせて詳細な解析を行っていきたいと考えている。

表 17 細菌の分類項目ごとに同定されたグループ数を各プライマーごとに表示

土壤サンプル	プライマー	門	綱	目	科	属
森林	16S-1	22	37	83	179	607
16S-2	24	39	80	176	542
16S-4	20	35	75	166	511
16S-6	20	34	78	181	558
ジェノミックDNA	21	37	78	152	302
植物公園	16S-1	23	38	84	190	595
16S-2	25	40	87	195	643
16S-4	22	37	84	189	616
16S-6	24	40	86	192	634
ジェノミックDNA	18	33	70	133	271
農耕地	16S-1	23	36	81	179	583
16S-2	26	41	88	212	757
16S-4	23	40	85	193	654
16S-6	25	42	90	206	647
ジェノミックDNA	16	31	66	128	235
表 18 真菌の分類項目ごとに同定されたグループ数を各プライマーごとに表示

土壌サンプル	プライマー	門	綱	目	科	属
森林	18S-1	6	19	66	166	349
18S-2	7	25	75	170	334
18S-3	7	25	76	201	450
18S-4	9	24	73	154	293
18S-5	2	6	12	21	48
植物公園	18S-1	7	26	67	132	232
18S-2	実施せず	実施せず	実施せず	実施せず	実施せず
18S-3	7	19	53	108	184
18S-4	8	21	52	103	189
18S-5	実施せず	実施せず	実施せず	実施せず	実施せず
農耕地	18S-1	6	21	62	127	216
18S-2	8	24	60	122	215
18S-3	7	23	80	179	382
18S-4	8	23	65	136	251
18S-5	5	9	17	26	47

## 3 ．コンポストの原料となる余剰污泥中の病原性微生物の熱不活化の検討

## 【はじめに】

し尿を含んだ污水中には多くの微生物が含まれているが、時として病原性を有する細菌や、感染症を引き起こすウイルスなどが含まれる。下水処理場での病原性微生物の挙動に関しては多くの報告があり（文献23-25）、これらのほとんどが生物反応槽（活性污泥槽）で除去されていることが示されている。しかし、この除去は生物反応槽内で病原性微生物が不活化されたことよりも、活性污泥に吸着されることにより低減しているとされている。すなわち、余剩污泥として処分される污泥中には病原性微生物が濃縮されている危険性がある。

余剰汚泥は濃縮処理や脱水処理を受けたあと、再利用の一つとして堆肥（コンポスト）として有効利用される。堆肥は肥料や土壌改良材の他に、土壌の病害予防にも効果があるとされている（文献26-27）。堆肥化過程で汚泥中の有機物が分解されるとともに、その際の発酵熱（60～65℃）と時間（2日程度）により有害な微生物の死滅が期待されるが、発酵が不十分で温度が上昇しなかったり、不均一な発酵であった場合には残存する危険性がある。

これまで脱水処理技術としては真空脱水、ベルトプレス脱水、遠心脱水、多重円盤型脱水などがあったが、近年、新たに電気浸透式污泥脱水機が開発された。この脱水機は処理過程でジュール熱が発生し污泥が高温になることから、含まれている病原性微生物に対する不活化効果が期待できるのではないかと考えられた。

そこで、これまでに大腸菌、腸球菌、枯草菌、大腸菌に感染するウイルスであるバクテリアファ
一ジを指標微生物として用い、実験室内で不活化に与える加熱温度と時間の関係を明らかにした。これを踏まえ、フィールドテストとして大阪府内のし尿処理場で稼働している電気浸透式脱水機の污泥を採取し、微生物の不活化状況を検討した。

## 1 ）電気浸透式污泥脱水機について

電気浸透式污泥脱水機の基本構造は、金属製の回転ドラム（陽極）と金属ベルト（陰極）、ろ布から構成されており、2つの電極間に40～45Vの電圧が印加される。

原理図を図20に示した。前濃縮された污泥がろ布を介して2つの電極に挟まれ圧搾される間に、負の電荷を持っている污泥粒子は陽極付近に移動し、正の電荷を帯びた水分子はろ布を通して陰極側に移動し脱水される。この時、2つの電極の間には電流が流れ、污泥が抵抗体となり、その結果ジュール熱が発生する。

図 20 電気振盪式汚泥脱水の原理

## 【実験方法】

## （１）脱水污泥の温度測定

脱水時に発熱する污泥の温度測定は、（株）日油技研工業製の以下の不可逆性示温材を用いた。これを5cm四方のガーゼに張り付け、脱水前の污泥で薄く挟み込んだ。これを脱水機の給泥部に挿入し、排泥部で回収した。

サーモラベル 5S-65 : 65～85℃の 5℃刻みで示温

サーモラベル 4E-50 : 50～65℃の 5℃刻みで示温

サーモラベル 4E-70 : 70～85℃の 5℃刻みで示温

## （２）汚泥からの微生物誘出方法

i）細菌の誘出（☐らの方法に準拠，文献28）

50mL遠沈管に脱水污泥1.0g（湿重量）とリン酸緩衝液20mLを加え、ステンレスブレードの付いたホモジナイザーを用いて9,500rpm、30秒間の分散処理を行う

↓

20℃の恒温槽で20分間振盪し細菌を誘出する

↓

この懸濁液を目開き0.3mm（60メッシュ）の金属円筒でろ過し、夾雑物を除去する

↓

ろ液を細菌測定試料とする
ii）大腸菌ファージの誘出（金らの方法に準拠、文献29）

【誘出液】

1 モル $ NaNO_{3} $ 溶液にビーフエキストラクトを 3% 濃度になるよう調製上記混合液を pH 7 に調整

## 【誘出操作】

## （３）細菌の測定

一般細菌の測定は標準寒天培地を用いて行った。大腸菌群及び大腸菌の測定は特定酵素基質培地による測定とし、IDEX社製のコリラートMPNテストキット（以後コリラート法と記載）を用いた方法と、Merck社製のクロモカルトコリフォーム寒天培地（以後クロモカルト法と記載）を用いた方法で測定した。前者は損傷菌の検出率も高いとして販売されており、最確数で菌数を求める。一方、クロモカルト法はろ紙上に増殖したコロニー数をカウントする。
## （４）大腸菌ファージの測定

(独)製品評価技術基盤機構から譲渡を受けた Escherichia coli (Migula 1895)Castellani and Chaimers 1919（NBRC番号3301）を宿主菌として、RNAファージを測定した。

測定は神子らの方法（文献30）に準拠して行った。

## 【結果】

## （１）脱水時の汚泥温度

脱水機の通常運転時の印加電圧 46V 時と、50V に上昇させた時のサーモラベル写真を図 21、22 に示した。

図 21 46V 印加時のサーモラゾルの示温

図 22 50V 印加時のサーモラゾルの示温

46V時では55～60℃を示しており、50V時では1種類のラベルは60～65℃を、他方は80～85℃を示していた。これは脱水時に板状に排出される污泥中に温度むらがあるのか、サーモラベルの熱応答速度の違いかは不明である。

## （２）汚泥の含水率

脱水前の汚泥の含水率は85.9%であり、46V脱水時で71.8%、50V脱水時で69.2%であった。

## （３）細菌数の変化

脱水前污泥と通常運転時（46V）、および印加電圧を50Vに上昇させたときの污泥誘出液中の菌数と、污泥の含水率から換算した乾重量1g当たりに残存していた菌数を求め、表19に示した。
表 19 汚泥の乾重量 1 g 当たりの細菌数

試料	含水率	一般細菌数	コリラート法	クロモカルト法
大腸菌群数	大腸菌数	大腸菌群数	大腸菌数
脱水前	0.859	2.7E+08	4.7E+05	1.1E+05	2.7E+05	1.3E+05
46 V	0.718	2.9E+08	1.2E+03	偽発色	4.3E+03	7.1E+03
50 V	0.692	1.4E+08	0	偽発色	6.5E+02	0

一般細菌数は脱水前汚泥 1g に $ 2.7 \times 10^{8} $ 個存在していた。印加電圧 50V 時では、汚泥温度が $ 80^{\circ}C $ 前後に上昇したにもかかわらず、菌数は $ 1.4 \times 10^{8} $ 個と、ほとんど不活化されていなかった。そこで、50V 脱水時汚泥の誘出液で、菌数測定時の希釈倍率が最も高いシャーレに形成したコロニーを 5 個釣菌し、これを試験管に入った滅菌リン酸緩衝液に懸濁させた。これをプロックヒーターに差し込み、 $ 80^{\circ}C $ 20 分の加熱処理を行った。この処理液を再度標準寒天培地に塗抹したところ、20 時間培養後に、加熱処理前と同様の形状で、粘性のあるコロニーを形成した（図 23）。このことから、残存した細菌の多くは熱耐性がある枯草菌と考えられた。

図 23 80℃20 分加熱処理液の標準寒天培地に生育したコロニー

コリラート MPN 法は 36℃で 20 時間培養後、図 24 のように試料水が入った溶液が黄色に発色した場合を大腸菌群陽性として、最確数を求める。同じ溶液にブラックライトを照射し、蛍光を発したものを大腸菌陽性として、最確数を求める。
図 24 コリラート MPN 法（左：大肠菌群陽性 右：蛍光を発するのは大肠菌陽性）

大腸菌群数は脱水前が1 g 当たり 4.7×10^{5} 個で 46 V 脱水後で 1.2×10^{3} 個と、-2 \log の不活化率を示していた。50 V 脱水時では、誘出液中で検出されず、-5 \log 以上の不活化率を示した。

一方、大腸菌数は脱水前で1 g 当たり 1.1×10^{5} 個を示したものの（表 19）、脱水後の汚泥は図25に示したように、大腸菌群陰性（黄色に発色せず）にもかかわらず、蛍光のみを発する（大腸菌陽性）という現象が、希釈率の低い上位3段階の各5本すべてで生じた。そのため、コリラート法で大腸菌の不活化を評価することはできなかった。

図 25 脱水後の汚泥誘出液のコリラート写真（左：20 時間培養後、右：左にブラックライト照射）

この黄色に発色せず、蛍光のみを発した培養管液を標準寒天培地に塗抹し、1晩培養した。翌日粘りのあるコロニーが形成されたため、これを釣菌して同じコリラート法で測定したが、黄色の発色も蛍光も発しなかった。すなわち、枯草菌と考えられる菌が発色に関与したとは考えられなかった。

脱水後の汚泥誘出液をオートクレーブで滅菌処理したのち測定したところ、滅菌前では蛍光を発したが、滅菌処理後では発色しなかった。すなわち、誘出液に含まれている無機物や金属塩の影響でもないと考えられた。
クロモカルト法では脱水前の大腸菌群数は1 g当たり2.7×10^{5}個であったが、46 V時では4.3×10^{3}個と、-2 \log の不活化率を示した。50 V時でも6.5×10^{2}個残存し、不活化率は約-3 \log であった。この結果はコリラートMPN法と異なるところがあり、測定方法による差がどのような菌種によってもたらされるか、今後の検討課題である。

脱水前の大腸菌数は1 g 当たり $ 1.3 \times 10^{5} $ 個であったが、46 V 時では $ 7.1 \times 10^{3} $ 個に減少し、50 V 時では検出されず、-5 log 以上の不活化率を示した。

## （4） 大腸菌ファージ数の変化

これまで数回、脱水前の汚泥に関して大腸菌ファージ数の測定を行ったが、いずれも誘出液1 mL中に10PFU未満しか測定されなかった。今回の実験時では、脱水前の汚泥と脱水後の汚泥ともにファージは測定されず、不活化効果を評価することはできなかった。参考までに他の2回の測定結果では誘出液1 mL中、脱水前が6 PFUで脱水後が0 PFU、脱水前が9 PFUで脱水後が0 PFUであった。

## 【まとめ】

脱水時に污泥が発熱する電気浸透式污泥脱水機を対象に、脱水前後での微生物の不活化状況を検討した。

通常、脱水機の運転は脱水後の污泥の含水率が70％になるよう、印加電圧を40～45Vに調整している。施設によってはこの状態で污泥の温度が75℃まで上昇したことを確認しているが、今回対象とした施設では55～60℃程度にしか上昇しなかったため、一時的に50V前後まで上昇させ、併せて測定を行った。

標準寒天培地を用いた一般細菌の測定では、脱水前と脱水後とも乾重量1 g当たり10^{8}個オーダー存在し、菌数の大きな変化は認められなかった。その原因の一つとして、耐熱性の枯草菌がほとんどを占めていたからと考えられた。

大腸菌群と大腸菌は、特定酵素基質培地を用いたコリラートMPNキットと、クロモカルトコリフォーム寒天培地の2つを用いて測定した。

脱水前の大肠菌群数はいずれの測定方法とも1 g当たり10^{5}個存在しており、60℃程度の発熱で10^{3}個まで減少し、-2 $ \log $ 程度の不活化率を示した。しかし、80℃程度の発熱では、コリラート法では検出されなかったが（-5 $ \log $ 以上の不活化率）、クロモカルト法では10^{2}個残存（-3 $ \log $ の不活化率）した結果となった。

脱水前の大腸菌数は、いずれの測定方法とも1 g当たり10^{5}個存在した。脱水後試料のコリラート法では、大腸菌群の存在を示す黄色の発色を呈しないにもかかわらず、大腸菌の存在を示す蛍光を発した。この発色が何に起因するかは不明であったが、残存している主な菌は耐熱性の枯草菌であった。クロモカルト法でも、80℃程度の発熱では検出されなかった（-5log以上の不活化率）。

大腸菌ファージは脱水前污泥でも誘出液1 mL中に10PFU未満しか測定されず、不活化効果を評価することはできなかった。この原因の一つに、污泥からの誘出率が低かったのかも知れないが、それを評価することはできなかった。
## 【考察】

電気浸透式污泥脱水機では、余剰污泥の脱水時に発生する熱によって、大肠菌群や大肠菌が不活化されることが明らかとなった。感染症の流行等により、余剰污泥中に病原性を有する微生物が高濃度に含有する恐れがある場合には、脱水機への印加電圧を調整し発熱温度をあげることにより、さらなる不活化効果を得ることができ、脱水污泥を再利用する際の安全性が高まることが期待される。

## 【全体の結論】

コンポスト連用により土壌の理化学性（透水性、保水性および腐植含有量の増加など）が、改善された。そのため、指標果樹としたイチジクにおいて、果実の収穫量・品質は、向上した。

コンポストを連用した土壤には、土壤病菌による地下部のイチジク病徴発現を軽減させる効果があった。実験結果より、この効果は樹体の抵抗性ではなく株枯病菌の繁殖を妨げるなど、土壤の株枯病菌増殖抑制効果に起因していると推察された。この土壤の抑制要因として、土壤微生物群の関与が考えられたため、イチジク病徴発現を軽減させる効果のあったコンポスト施用土壤とその対照区の土壤微生物群のメタゲノム解析を行った。しかし、土壤中の細菌および真菌について、門レベルでの大きな違いは明らかにできなかった。

コンポスト利用における病原微生物の危険性については、し尿を濃縮した形態の余剰污泥にターゲットを絞り実験を行った。実際にし尿を濃縮するのに使用される電気浸透式脱水機の熱処理時に想定される温度領域で、大腸菌や腸球菌、大腸菌ファージを病原微生物の指標とし、熱不活性化条件を決定した。また、実際の電気浸透式脱水機の処理前後の污泥を採取し、大腸菌と大腸菌ファージに的をしぼり調査した。その結果、電気浸透式脱水機の熱処理後には、これらの有害微生物は検出せずに良い結果を得る事ができた。環境中で有害物などの分解に役立つと考えられている枯草菌については、電気浸透式脱水機による高熱処理によっても残存することが明らかになり、有用な微生物については、污泥中の有害物の分解に役立っていることが分かった。今回の研究報告では、最終目標まではたどり着くことはできなかったが、3年間という短期間に良好な結果を出せたと考えている。

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## <研究発表>

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11. 飯田哲也：次世代シーケンサーを用いた細菌感染症のメタゲノミック診断. Medical Technology (2010) 38: 227-229

12. 中村昇太、中屋隆明、飯田哲也：次世代シーケンサーを用いた感染症の診断と解析 メタゲノム解析技術の最前線 シーエムシー出版 p.160-168, 2010

13. Nakaya, T., Nakamura, S., Okamoto, Y., Nagai, Y., Kawai, J., Hayashizaki, Y., Iida, T., and Horii, T.: Direct Metagenomic Detection of Viral Pathogens in Human Specimens using an Unbiased High-throughput Sequencing Approach. In: Handbook of Molecular Microbial Ecology II: Metagenomics in Different Habitats, Ed. Frans J. deBruijin. Wiley-Blackwell (an imprint of John Wiley & Sons Ltd), Hoboken, NJ, USA. 2011

## 2 ）学会発表

1. 三輪由佳・磯部武志・細見彰洋：コンポスト施用土壌におけるイチジク株枯病抑制要因の究明、園芸学会平成24年度秋季大会、福井2012年9月

1. 中村昇太：感染症メタゲノミクス、NGS現場の会 第二回研究会、2012年5月

2. 中村昇太：次世代シーケン サーを用いたメタゲノミクスによる病原微生物探索、第15回日本水環境学会シンポジウム、2012年9月

3. 中村昇太：メタゲノミック 診断法のハイスループット化、生命情報科学若手の会第4回研究会、2013年3月

4. 中村昇太：感染症のメタゲノミック解析、次世代シークエンンサー現場の会 第1回研究会、静岡2011年5月

6. 中村昇太：次世代シークエンサを用いた臨床検体からの病原体探索、Roche ゲノムコンファレンス、東京 2011 年 6 月

7. 中村昇太：次世代シークエンサーを用いた臨床検体からの病原体探索、Roche DNA シークエンサー最先端セミナー、大阪 2011 年 7 月

8. 三輪由佳：コンポスト施用がイチジク株枯病防除に及ぼす影響、第30回研究会近畿土壌肥料研究協議会、2011年7月

9. 依田知子、山崎謙治、青山幾子：Analysis of amino acid sequence of HBGA-binding sites in Norovirus GII.4 ORF2 from six patients including a weak-secretor in the same region within the period of one month (International Union of Microbiological Societies 2011 Congress) 札幌 2011 年 9 月

10. 中村昇太：メタゲノミクスを応用した病原体検出システムの開発、生命情報科学若手の会 2011 沖縄セミナー、沖縄 2011 年 9 月

11. 三輪由佳・細見彰洋（2011）コンポスト施用がイチジク株枯病に及ぼす影響．園芸学研究10別2:395
12. 中村昇太: Metagenomic Analysis of Bacterial Infections、IUMS 2011 Sapporo、札幌 2011 年 9 月

13. 中村昇太：次世代シーケンシングを活用した感染症診断：メタゲノミック診断法、Genaris 次世代ゲノム解析セミナー、大阪 2011 年 10 月

14. 中村昇太：感染症におけるメタゲノミック診断法の研究開発、生命情報科学若手の会 第3回研究会、愛知2011年10月

15. 中村昇太：Databases for metagenomics of unexplored fields、第34回日本分子生物学会年会、横浜2011年12月

16. 中野 仁、足立 伸一：污泥脱水工程での発熱による病原性微生物の不活化の検討、第46回日本水環境学会年会、東京2012年3月

17. 依田知子、左近直美、中田恵子、加瀬哲男：RT-LAMP 法を用いたノロウイルス検出キットの再評価、第 51 回日本臨床ウィルス学会、高松 2010 年 6 月

18. 安達史恵、高木総吉、吉田仁、上堀美知子、清水武憲、園井一行：大阪府内に勤務する人の血清中有機フッ素化合物について、第19回環境科学討論会、名古屋2010年

19. 飯田哲也：次世代シーケンサーを用いた微生物・感染症解析、メインシンポジウム 4 「口腔と関連器官の感染症 5W1H なぜ私はこの研究をしているのか」、第 52 回歯科基礎医学会学術大会 2010 年 9 月

20. 飯田哲也：次世代シーケンサーの細菌感染症への応用、日本細菌学会中国四国支部総会（特別講演）2010年10月

21．中屋隆明、中村昇太、飯田哲也、堀井俊宏：次世代シーケンサーを用いた臨床検体からの病原体探 索、Roche Genomics conference（招待講演）2010年9月

22. 奥崎大介、中村昇太：細胞生物学者の視点でみるマイクロアレイと次世代シーケンス、第62回日本細胞生物学会（招待講演）2010年5月

23. 中村昇太、中屋隆明、飯田哲也、安永照雄、堀井俊宏：感染症メタゲノミクスの現状と挑戦、第4回ゲノム微生物学会若手の会、2010年10月

24. 中村昇太、中屋隆明、飯田哲也、堀井俊宏、安永照雄：メタゲノミクスを応用した病原体検出システムの開発、第2会生命情報若手の会、2010年10月

25. 中村昇太: GS Junior とはじめるバイオインフォマティックス、BMB2010 (Roche バイオテクノロジーセミナー)2010 年 12 月

26. Shota Nakamura, Naohisa Goto, Takaaki Nakaya, Tetsuya Iida, Toshihiro Horii, Teruo Yasunaga: Development of metagenomic diagnosis system for infectious disease、日本バイオインフォマティックス学会年会（ポスター）2010年12月

・知的財産権の取得および特許の実用新案登録なし
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## ·英文概要

· 研究課題名：Establishment of microbiological assessment for safe and available compost application

· 代表研究者名及び所属：Shinichi Adachi （Osaka Prefectural Institute of Public Health）

• 共同研究者名：Tomoko Yoda · Hitoshi Nakano · Shinya Yonogi · Fumie Adachi (Osaka Prefectural Institute of Public Health), Yuka Miwa · Takeshi Isobe · Makoto Tatsumi · Akihiro Hosomi (Research Institute of Environment, Agriculture and Fisheries), Shota Nakamura (Osaka University)

要旨：Use of compost is still very low in Japan. In order to increase its use it is necessary to show both the safety and availability of compost.

In this study we focused in the following categories:

1. Effect of compost application on the growth of Ficus and its response to pathogenic organisms.

2. Analysis of soil microbial communities in the composted soil compared to the control soil (bacteria and fungi)

3. Assessment of heat inactivation for pathogenic microorganisms and heat survival for effective microorganisms in excess sludge (one of the materials of compost).

Soil microbial community increases its diversity as well as quantity by the application of compost. In this study, we showed the application of compost improved soil conditions, such as water permeability, water retentiveness, and increased total nitrogen content, phosphorus compound and humus. This improvement of the soil condition increased the growth of the Ficus tree as well as the quality and quantity of the fruit.

We also showed the application of compost provided a palliative effect on the symptoms of the Ficus disease Ceratocystis fimbriata (C. fimbriata) that occurs when ficus is grown in a flowerpot. C. fimbriata was inoculated into the leaves or branches of the Ficus in non-composted soil or composted soil. After inoculation of C. fimbriata in vitro and incubated for several days, the size and severity of the lesions was the same. When C. fimbriata was inoculated into the branches that were put into the composted soil, the necrotic lesion of the branches after incubation became smaller than that of the branches in control soils. This suppression of the lesions was considered to be due to inhibition of C. fimbriata growth in the soil and not to resistance of the Ficus trees. The same suppression of underground lesion areas in the Ficus branches was observed using different types of compost soils including cattle manure or bark compost. One of the composted soils was obtained from the farm where the farmer has cultivated Ficus trees with bark compost application for more than seven years.

The soil microbial communities that showed the suppression of the lesion in the Ficus branches were analyzed by the high-throughput sequencer using 16S rRNA genes as well as 18S rRNA genes.

Regarding bacteria, there was not a clear difference in levels between the two different composted
soils and the compared control soils. For fungi analysis, the most abundant phylum was Ascomycota in all of the soils and there was no difference between the composted soils and control soils. We have not finished our detailed analysis, however, we have established the confidential analysis of the soil microorganism communities using the high-through put sequencer from this project. For example C.fimbriata was found in the inoculated soils, and when the species level analysis was conducted, the microorganisms that were reported to be suppressive for the plant pathogens, such as Pseudomanadaceae, Burkholderiaceae, and Trichoderma were detected. We need to improve the method for future research.

An electro-osmotic sludge extractor of excess sludge in the resource-recycling center (night soil treatment plant) produces high temperature during the dehydration process. It was considered that inactivation of the pathogenic microorganisms might be possible using this high temperature. Investigation of the temperature and the heating time effectiveness for inactivation using the indicator microorganisms was carried out. Results showed thermal inactivation treatment for pathogenic microorganisms such as Escherichia coli (E. coli), E. coli phage, and Enterococcus using this equipment appeared to be sufficient enough while Bacillus subtilis (considered to be one of the effective bacteria for compost) survived after thermal inactivation treatment of the under same conditions.

Further study was conducted using the electro-osmotic sludge extractor in Osaka prefecture. $ E.\ coli $ and $ E.\ coli $ phage inside the sludge was focused and the sludge was sampled before and after treatment by the electro-osmotic sludge extractor. Neither of the pathogens was detected after heat-treating the sludge. The results indicated the electro-osmotic sludge extractor increased the safety of the treated sludge. The temperature during the electro-osmotic sludge extractor operation was measured. It was between 60-85°C. a temperature at which the useful bacteria, Bacillus subtilis in the environment can survive.

・キーワード : compost, Ficus carica, Ceratocystis fimbriata, soil microbial communities, heat inactivation of pathogenic microorganisms
## 4 ．結果と考察

## (1) 硝化細菌との共培養でのバイオMn酸化物の生成

## 1 ) マンガン酸化細菌の集積培養結果

リアクターのマンガン酸化速度を図4.1.1に硝化反応とマンガン酸化反応との関係を図4.1.2に示す。実験開始直後には硝化反応が確認されたが、Mn酸化は見られなかった。しかし、アンモニア性窒素負荷を上げながら根気強く運転したところ約100日と長期間を要したが、Mn酸化反応が確認できるようになり、Mn酸化細菌と硝化菌の微生物生態系が構築された。その後も窒素負荷、マンガン負荷を上げながら実験を継続（約2年）するとマンガン除去速度は、安定的に処理された。マンガン除去速度はアンモニア酸化速度と強い関係が見られた。これは、マンガン酸化細菌の増殖に硝化細菌の代謝有機物が利用され、その活性化には代謝量が重要であることを示唆している。マンガン酸化細菌は硝化細菌の代謝産物を利用して増殖することができるという仮説を証明することができた。

DHS リアクターにアンモニアと Mn (II)を含む人工排水を連続供給することで、マンガン酸化細菌の培養と $ MnO_{2} $ の生成に成功した。ただし、培養が観察されるようになるまでには長期間を要し、Mn (II)処理のスタートアップは遅かった。マンガン酸化細菌の増殖速度は遅く、Mn 酸化速度の向上には長期間を要した。Mn (II)の除去とマンガン酸化速度は、アンモニアの供給負荷と正の関係が見られた。しかし、アンモニアの供給負荷に限界があった。負荷を高め過ぎると不完全硝化により亜硝酸塩が生成され、これが Mn 酸化速度を阻害していると推察され、のため最大 Mn 酸化速度は $ 0.6 ~kg~Mn/m^{3}/d $ であった。この速度は目標の約 1/2 であり、速度を高めるための運転方法の改善が必要である。

スポンジ担体は生成されたマンガン酸化物で覆われ黒くなっていた。また DHS リアクターの下部には沈殿物ができる。沈殿物を顕微鏡で観察するとバイオマンガン酸化物の集合体の中に細菌が埋もれているように見えマンガン酸化物と細菌が共に落下している。このことはバイオマンガン酸化物の回収において細菌との分離プロセスが必要であり、またマンガン酸化細菌がリアクターからウォッシュアウトして高速処理を阻む要因になることを示唆している。さらに、生成したバイオマンガン酸化物は完全には下部から回収できず、流出水にわずかではあるが混入しており実用化への課題が見えた。

図 4.1.1 硝化細菌共存での Mn(II)除去速度
図4.1.2 硝化速度との関係

## 2 ) 生成バイオマンガン酸化物のレアメタル吸着

運転 360 日目よりニッケルとコバルトを流入基質に添加し、金属除去性能を観察した(図 4.1.3)。DHS バイオリアクターで生成したバイオマンガン酸化物は過酸化水素との反応で市販のマンガン酸化物よりも非常に高い触媒活性を示し、比表面積の大きい構造である事がわかる。レアメタル吸着の特性を調べるために人口排水にニッケルとコバルトを添加して連続処理を行った。添加の直後にニッケルとコバルトは完全に除去されバイオマンガン酸化物に吸着されたことが察せられる。一方流出水のマンガンは流入よりも高い濃度で検出される。これはリアクター内で除去されるマンガンの全てがマンガン酸化物に吸着されるのではなく、一部は生成マンガン酸化物に吸着されていて吸着親和性の高いニッケルやコバルトが流入すると吸着しているマンガンと交換することによってマンガン流出してくると考えられる。定常での除去マンガンに対するニッケルとコバルトの除去量の比はそれぞれ 10、50% であり、吸着の選択制について報告されているようにコバルトのほうが優先的に除去された。DHS リアクターにマンガンとレアメタル含有水を通水するだけでバイオマンガン酸化物生成とレアメタル吸着が同時に起きてマンガンとレアメタルの回収が可能である。

図 4.1.3 硝化細菌共培養リアクターにおけるニッケル・コバルト除去性能