Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## (2) 土壌サンプル

土壌微生物群が多様だと考えられる森林土壌、植物系コンポストを連用している植物公園土壌および牛糞堆肥を連用している農耕地の土壌

## （3） 細菌および真菌のPCRおよびメタゲノム解析

細菌と古細菌については、種の同定に使用されている16SrRNA遺伝子をターゲットにした複数のプライマー（細菌については、5種類、古細菌については1種類，文献5-10）を使用し、PCR法で増幅させた。また、真菌についても種の同定に使用されている18SrRNA遺伝子をターゲットに複数のプライマー（4種類、文献11-17）を選択した。PCR産物についてGS Junior plat form 454 (Life Science 社製)を使用し、メタゲノム解析を行なった。プライマーの選択を検討するためにジェノミックDNAについてもメタゲノム解析を行った。

## （４）イチジク株枯病菌による病徴の軽減効果を示した土壤微生物群の解析

イチジクを定植させた植木鉢の実験系において、土壤病害によるイチジクの病徴発現を緩和した実験系のコンポスト施用土壌について土壌微生物の解析を行った。

また、ガラス瓶に試験土壌と対照土壌を入れ、その土壌中に株枯病菌を接種し、そこにイチジク新梢を挿し木し、容器内で一定期間培養した実験（p5図3を参照）において、イチジク新梢に対して病徴抑制効果のあった牛糞堆肥連用土壌と対照土壌および、イチジク園のバーク堆肥連用土壌と対照土壌について、土壌微生物群の解析を細菌（2種類のプライマー）と真菌（3種類のプライマー）を対象として、メタゲノム解析を行った。

## 3 ．コンポスト原料となる余剰污泥中の病原性微生物に対する熱不活性化の検討

し尿を含んだ污水中には病原性微生物が含まれる危険性があり、それを濃縮した形態の余剰污泥中においても同様に危険性がある。この余剰污泥は濃縮処理や脱水処理後、コンポストとして有効利用される場合もある。近年、污泥を再資源（助燃材）として有効利用するため、含水率を低減化する目的で電気浸透式污泥脱水機が開発されている。当装置は污泥脱水時の生じる電気抵抗により污泥が発熱する特徴を有していることから、今回、その熱を有害微生物の不活化に対し有効利用することに着目した。この電気浸透式污泥脱水機をモデルに、下記に示したさまざまな指標微生物を利用して不活化に重要となる加熱温度と時間の関係を実験室内で検討し、熱不活性化条件を決定したい。

## 1 ）指標微生物：大腸菌およびファージ

汚泥再生処理センター（し尿処理場）に設置された電気浸透式汚泥脱水機が脱水時に高い熱を出すため、この高熱により病原性微生物を不活性化できるのではないかと考えられている。そこで、電気浸透式汚泥脱水機の脱水時における汚泥の温度測定を実施し、その値を参考に指標微生物を用いて、コンポストの安全性を実証する事が可能となる実験系を組んだ。指標微生物として大腸菌（Escherichia coli Castellani and Chaimers 1919）と大腸菌に感染するウイルスであるバクテリアファージ（Escherichia coli phage Qβ）を用いた。
## 2 ）指標微生物：腸球菌および枯草菌

1）の結果を踏まえ、病原性微生物に腸球菌を加えた。また、土壌改良効果が期待できると考えられる枯草菌（文献21-22）については熱抵抗性があるので、熱処理後の残存を期待してこれを選び、実験に供した。

## 3 ）実働施設による指標微生物の不活性化実験

平成22年度末に大阪府内で稼働し始めた電気浸透式脱水機を対象に脱水時に発熱する污泥の温度測定をサーモラベル用いて行った。脱水前の污泥で薄く挿み、これを脱水機の給泥部に挿入し、排泥部で回収した。また、脱水前後の污泥中の大腸菌および大腸菌ファージの濃度変化を測定し、それらの微生物が不活化されているかどうか検討を行った。

## 研究結果

## 1 ．コンポスト施用が植物に与える有効性について

コンポスト施用（バーク堆肥区および牛糞堆肥連用区）の有効性について植物の生育に及ぼす影響と病原菌に対する反応を調査した。

## （1） 生育に及ぼす影響

バーク堆肥、牛糞堆肥を連用することで、土壌が改善されイチジクの生育促進効果がみられた。具体的に土壌の理化学性改善効果として、両コンポストとも腐植含量の増加、透水性および保水性の高まり、pHの中性化、肥料の3要素成分（リン、チッソ、カリウム）の増大が認められた。その結果、コンポストを施用することで、イチジクの生育促進効果が認められた。これは、コンポスト施用により、肥料成分の増加と保水性向上による水分供給量の増大によるイチジクの生育に対する影響の可能性を示唆している。今回設定した試験条件下では、かん水量が半分になることで生育不良となり、イチジクの収穫量や果実品質にも悪影響を及ぼした。しかし、少ないかん水量の条件においても、コンポストの施用により、その影響が軽減される事が示された。施肥量を3分の1にすることで、イチジクの生育に影響はなかったが、果実の収穫量は明らかに減少した。樹体に蓄えた栄養を利用し生育は維持されたが、樹体栄養分が減少した分、果実の収穫量は低下した。果樹栽培において、土壌は毎年耕すことができないため、なにも施さなければ土壌は劣化していくが、コンポストを連用することで、劣化を抑え安定した果実生産が可能になる。上述の纏めとして、コンポスト施用によりイチジクの品質が高くなった事を次の表に示す。
表 1 各試験区におけるイチジク果実品質

試験区	収穫開始日(月/日)	1樹当たりの収穫数(個)	果実重量(g)	1樹当たりの収穫量(g)	糖度(Brix°)
バーク堆肥区	7/31	20.0 a	51.2	1024.8 a	19.1 a
牛ふん堆肥区	8/3	23.0 a	53.5	1231.2 a	18.9 a
し尿污泥区	8/3	13.3 b	65.5	867.5 b	15.7 b
対照区	7/31	19.0 a	52.9	1005.9 a	16.6 b

異なるアルファベット間で5%水準で有意差あり標準的なかん水

(2) 病原菌に対する反応に及ぼす影響

(i) イチジク苗定植後に株枯病菌を接種し、一定期間生育後に株枯病菌接種による地下部の外観的な病徴の発現を観察した。その結果、イチジクの地下部における外観的な病徴発現は、バーク堆肥区および牛糞堆肥連用区において対照区と比べ、軽減される傾向が観察された。図4にバーク堆肥コンポスト区の結果を示す。
地下部の被害指数は地下部の外観、地際部断面および地際部 5 cm 下断面の被害指数：-1～3 までの平均値を表す。

図4．バーク堆肥施用が株枯病菌接種におけるイチジク生育に及ぼす影響

次にコンポスト施用によって、株枯病菌によるイチジクの地下部の外観的な病徴発現が軽減される効果について、その軽減がイチジク（宿主側）の要因によるのか土壌に依存しているのかを調査した。

## (ii) 枝葉への株枯病菌を接種実験

コンポスト施用土壌（牛糞堆肥連用果樹園土壌）およびその対照区で栽培したイチジクの枝や葉に株枯病菌を接種した実験結果については、コンポスト施用したイチジクの枝葉で対照区に比べ、徴発現が拡大した。これは、窒素などの過栄養の影響を受けたのかもしれない(p4実験方法の図1、図2参照)。
## (iii) 試験管内での新梢挿し木による株枯病菌接種実験

牛糞堆肥連用土壤と対照土壤を使用した試験管内での新梢挿し木による株枯病菌接種実験（p5実験方法の図3参照）の結果においては、挿し木の地下部には、黒褐色の壊死が認められたが、その進行程度は、コンポスト区の方が統計的に有意に軽微であった。

この結果を踏まえて、バーク堆肥連用地植えイチジク園土壌と対照土壌を使用して追試試験を行った。その結果、挿し木の地下部には、黒褐色の壊死が認められたが、その進行程度は、コンポスト区の方が統計的に有意に軽微であった。(図5および6を参照)

1. 已知 $ a = \frac{1}{2} $ ， $ b = \frac{1}{2} $ ，求 $ c = \frac{1}{2} $ 的值。

図 5 接種 10 日後のイチジク枝

図6 各被害指数の割合

(左：現地対照区、右：現地コンポスト区)

## 2 ．土壤中の微生物の解析について

ビーズによる細胞破壊法を用いた土壌からの DNA 抽出法を確立し、森林土壌について、細菌、古細菌および真菌について、種の同定に使用されているプライマーを複数使用し、PCR 産物を増幅させ、全ての PCR 産物について解析を行なった。また、プライマーの検討をするためにジェノミック DNA についてもメタゲノム解析したが、プライマーの選択はできなかった。

プライマーの選択をするため、森林土壌に加え、植物系コンポストを連用している植物公園土壌と、牛糞堆肥を連用している農耕地から、確立した方法で土壌微生物群の DNA を抽出し、同様に PCR 産物とジェノミック DNA についてメタゲノム解析検討を行った。その結果、細菌については、2 種類、真菌については、3 種類、古細菌については 1 種類のプライマー（表 2 参照でウグイス色のプライマー）を選択した。それらのプライマーを使用して、土壌病害によるイチジクの病徴発現を緩和したコンポスト施用の土壌微生物の解析を行った。その結果においては、細菌、真菌について門レベルでは顕著な差はなかった。
表２ プライマーの選択

プライマー	ターゲット	1年めの評価コメント	2年め以降のコメント
16S-1	細菌	特異性が高い	特異性が高い
16S-2	細菌	わずかに古細菌を検出	総合的に広範囲の細菌を検出
16S-3	放線菌	約25%は放線菌以外	評価できず
16S-4	細菌	わずかに古細菌を検出	特に問題はなし
16S-5	古細菌	特異性が高い	現時点では次世代シークエンサーの解析には適さない
16S-6	細菌	わずかに古細菌を検出	総合的に広範囲の細菌を検出
18S-1	真菌	特異性が非常に高い	特異性が高い
18S-2	真菌	特異性は、8割以上	特異性は良くない
18S-3	真菌	特異性は9割	特異性は比較的高い
18S-4	真菌	特異性は、8割以上	特異性は良くない
18S-5	菌根菌	真菌の特異性は高いが菌根菌以外の真菌も検出	特異性は高い、菌根菌以外の真菌は検出

土壌中に株枯病菌を接種し、そこにイチジク新梢を挿し木し、容器内で一定期間培養して病斑の拡大を観察調査した結果において、病徴発現が減少した土壌（牛糞堆肥連用土壌との地植えバーク堆肥連用イチジク園土壌とこの2つの対照区の土壌）について、土壌微生物の解析を行った。その結果、細菌および真菌について門レベルでの顕著な差はなかった。

## 3 ．コンポスト原料となる余剰汚泥中の病原性微生物の熱不活性化の検討

## 1 ）指標微生物：大腸菌およびファージ

コンポストの安全性について、汚泥再生処理センター（し尿処理場）に設置された電気浸透式汚泥脱水機が脱水時に高い熱を出すため、高熱により病原性微生物を不活性化できると考えられている。指標微生物として大腸菌（Escherichia coli Castellani and Chaimers 1919）と大腸菌に感染するウイルスであるバクテリアファージ（Escherichia coli phage Qβ）を用いた。その結果、大腸菌を用いた実験結果では、65℃で急激に不活化が進み、この温度で10秒以上、および70～80℃、5秒以上で大腸菌が検出されないことが明らかになった。

大腸菌ファージを用いた試験結果では、大腸菌にくらべ熱耐性を有したが、75℃以上、5秒で生残率は急激に低くなり、短時間で不活化が進んだ。

## 2 ）指標微生物：腸球菌および枯草菌

枯草菌と腸球菌の熱不活化試験結果を行った。腸球菌は、大腸菌と比較し、熱耐性を有してお
り、65℃30 秒の加熱では不十分であったが、75℃では5 秒で10000 分の1以下の生残率になり、電気浸透式脱水機を用いることにより微生物学的な安全性が高まることが期待できた。（図7参照）

一方、環境中で有用と考えられる枯草菌については、80℃、5分の加熱でも不活化されずに残存し、コンポストとして利用する場合において、その有用性が明確になった。（図8参照）

図 7 枯草菌の熱不活化試験結果

図８ 腸球菌の熱不活化試験結果

## 3 ）実働施設による指標微生物の不活性化実験

汚泥再生処理センター（し尿処理場）に設置された電気浸透式汚泥脱水機の高熱による病原性微生物の不活性化を調べる目的で、今回は、大肠菌と大肠菌ファージに着目して、実験を行った。脱水前の大肠菌数は1 g 当たり $ 1.3 \times 10^{5} $ 個であったが、46V (印加電圧) 時では $ 7.1 \times 10^{3} $ 個に減少し、50V (印加電圧) 時では検出されず、-5log 以上の不活化率を示した。

大肠菌ファージ数の変化については、数回、脱水前の污泥に関して大肠菌ファージ数の測定を行ったが、いずれも誘出液1 mL中に10PFU未満しか測定されなかった。今回の実験時では、脱水前の污泥と脱水後の污泥ともにファージは測定されず、不活化効果を評価することはできなかった。参考までに他の2回の測定結果では誘出液1 mL中、脱水前が6 PFUで脱水後がOPFU、脱水前が9 PFUで脱水後がOPFUであった。

## 考察

コンポスト施用の連用により土壌は植物の生長に適した土壌へと改善されていた。コンポスト施用によるイチジクの生育や果実の収穫に及ぼす影響を調査したところ、対照区と比べ、生育においては顕著な差はないものの、果実の収穫量と品質が向上した。

イチジク苗を鉢に定植後、株枯病菌を接種し、一定期間生育後の株枯病菌による地下部の病微発現を観察した実験において、病微発現の軽減が観察できたコンポスト2種類（バーク堆肥、牛糞堆肥）とその対照区の土壤について、土壤微生物群のメタゲノム解析を行った。その結果、細菌については、門レベルでの大きな違いは見られなかった。真菌については、鉢植え用土ということで、プライマー検討に使用した土壌サンプルと違い、菌根菌と植物体が多く分布していたが、真菌の門レベルは、子囊菌門が多いという植物公園、農耕地に近いパターンを示した。しかし、株枯病菌を接種した土壌からは、接種後に増殖したと思われる株枯病菌を検出できた。

イチジクの枝葉に株枯病菌を接種し、その病徴発現を観察した実験においては、コンポスト施用で
育成したイチジクにおいて、病徴発現が拡大していた。これに対して、株枯病菌をコンポスト施用土壤中にかん注接種し、挿し木したイチジク新梢の病斑拡大を対照区と比較したところ、病斑の拡大が軽減されていた。コンポスト施用によるイチジクの土壤病害軽減効果は、実験結果より樹体の抵抗性ではなく株枯病菌の繁殖を妨げるなど、土壤の抑止効果に起因したと推察された。そのため、新梢への株枯病菌接種時に使用されたコンポスト連用区土壤である牛糞堆肥連用区と地植えのイチジク園（バーク堆肥連用区）とそれぞれの対照区、合計4区について、土壤微生物群の解析を行った。その結果、細菌および真菌について門レベルでの差はなかった。今回は詳細な解析を行う時間がなかったが、今後詳細な解析を行いたい。

コンポスト利用における病原微生物の危険性については、実際にし尿を濃縮するのに使用される電気浸透式脱水機の熱処理時に想定される温度領域で、大肠菌や腸球菌、大腸菌ファージを病原微生物の指標として利用し、不活化に重要となる加熱温度と時間の関係を実験室内で検討し、熱不活性化条件を決定した。さらに実際の電気浸透式脱水機の処理前後の污泥を採取して、大腸菌と大腸菌ファージにおいて調査した。大腸菌については、脱水前後で50V時において、-5 log以上の不活性率を示し、良い結果を得る事ができた。また、土壤改良効果が期待できると考えられている枯草菌については、電気浸透式脱水機による高熱処理を行っても残存することが判明した。有用な微生物については、電気浸透式脱水機による処理後も余剩污泥中の有害物などの分解に役立つと考えられる。今回の研究報告では、最終目標まではたどり着くことはできなかったが、3年間という短期間において良い結果を出せたと考えている。

## 環境政策への貢献

有機性廃棄物のコンポスト化は、循環型社会構築の一つに位置づけられているが、日本におけるコンポスト利用率は低い。高いコンポスト利用率を目指すには、その安全性と有効性を明確に示すことが重要である。この観点から、本研究では有機性廃棄物コンポストである牛糞堆肥、し尿、バーク堆肥について、科学的に植物に有効であることを示したいと考えた。コンポストについては経験的に使用することにより作物が健やかに生長することが一般的に知られているが、科学的に有効であることを示した報告書はお多くない（文献5、6）。そこで、大阪府の重要な農作物であるイチジクとイチジクの土壤病原真菌を指標に用いた。イチジクは、果樹としては非常に生長が早く、生育だけではなく果実の品質の向上も示せることを考慮して選んだ。結果的にコンポスト施用により、土壤の理化学性は向上した。特に腐植の割合が増加し、透水性、保水性ともに向上した。また、イチジクの生育はもとより果実の収穫量と品質（糖度が上昇）が向上した。コンポストを連用した土壤には、土壤病原真菌によるイチジクの地下部の病徴を軽減する能力があることも判明した。この病徴の軽減は、土壤微生物群が土壌病原真菌の増殖を抑制していると考えられるので、土壌微生物群の種類を膨大なデータを得られる次世代シークエンサーを用いた解析法（メタゲノム解析）を使用して行った。残念ながら、細菌と真菌については、門レベルでの顕著な差は認められなかったが、今後も詳細な解析を続けて行きたいと考えている。以上のことから、有機性廃棄物であるコンポスト施用により、土壌の理化学性が向上し、イチジクの生育とともに果実の収穫量と品質が向上し、土壌真菌によるイチジクの病徴発現を軽減することも科学的に示した。この事により、環境政策として、積極的にコンポストの利用を推奨できるため、貢献度が大きいと考えられる。

また、し尿を含んだ污水中には病原性微生物が含まれる危険性があり、それを濃縮した余
剰污泥もコンポストとして有効利用される時にも危険性が伴う。昨今、この污泥を再資源（助燃材）として有効利用するため、含水率を低減化する目的で電気浸透式污泥脱水機が開発されている。当該装置は脱水時の電気抵抗により高熱を発生することから、その熱を利用することにより余剰污泥中の病原微生物による危険性を回避できる可能性がある。そこで、本研究では大肠菌とその大肠菌に感染するウイルスであるバクテリアファージ及び腸球菌を指標病原微生物として利用して不活化に重要となる加熱温度と時間の関係を実験室内で検討し、熱不活性化条件を決定した。また、実際に大阪府で稼働し始めた電気浸透式脱水機を前提に脱水前後の污泥中の大肠菌および大腸菌ファージの濃度変化を測定し、これらの微生物が不活化されていることを示した。更に土壌改良効果が期待できると考えられる枯草菌については、電気浸透式脱水機による処理後においても不活化されずに残存し、コンポストとして利用する場合においての有用性を明確にした。この事から、し尿を濃縮しコンポストとして安全に利用できることも示せたので、環境政策に貢献できたと考える。

## 研究成果の実現可能性

今回の研究成果として、有機性廃棄物コンポストを農業に使用することが推奨できる。ただし、安定的に品質の良い牛糞堆肥、バーク堆肥などを供給するシステムが必要となる。詳細な解析には至らなかった土壌微生物群のメタゲノム解析については、その解析方法を確立できたので、これから必要に応じて土壌微生物群の診断を可能にする道が開けたと考えている。費用については、高価で1検体あたり数十万円かかる。今後、安価になる可能性はあると考えられるが、そのデータ解析には専門家が必要となる。そのため、バイオインフォマティックスに精通した人材を育成していく必要もあるであろう。一方、し尿濃縮をおこない、安全にコンポスト利用できる候補としての電気浸透式脱水機については、予算や規模および用途に応じて、施設の建設を考慮する必要がある。その価格は流動的ではあるが、資源の乏しい我が国でコンポストとして安全に使用できる廃棄物を作製するのに重要となると思われる。

## 結論

コンポスト連用により土壌は改善され指標果樹としたイチジクにおいて、果実の収穫量・品質を向上させた。

コンポストを連用した土壤には、土壌病菌によるイチジ病徴発現を軽減させる効果があった。今回の実験結果より、この効果は樹体の抵抗性ではなく株枯病菌の繁殖を妨げるなど、土壌の抑止効果に起因していると推察された。この土壌の抑止要因として、土壌微生物群の関与が考えられたが、土壌中の細菌および真菌について、門レベルでの大きな違いは見つけられなかった。

コンポスト利用における病原微生物の危険性については、し尿を濃縮した形態の余剰污泥にターゲットを絞り実験を行った。実際にし尿を濃縮するのに使用される電気浸透式脱水機の熱処理時に想定される温度領域で、大腸菌や腸球菌、大腸菌ファージを病原微生物の指標とし、熱不活性化条件を決定した。その後、実際の電気浸透式脱水機の処理前後の污泥を採取し、大腸菌と大腸菌ファージに的をしぼり調査し、良い結果を得る事ができた。環境中で有害物などの分解に役立つと考えられている枯草菌については、電気浸透式脱水機による高熱処理によっても残存することがわかり、有用な微生物については、污泥中の有害物の分解に役立っていることが分かった。総合的に考えて、今回の研究
報告では、最終目標まではたどり着くことはできなかったが、3年間という短期間に良い結果を出せたと考えている。
## 【研究目的】

有機性廃棄物のコンポスト化は、循環型社会構築の一つに位置づけられているが、その94%をコンポスト化しているオランダ（2005年）に比べると、日本におけるコンポスト利用率は低い。高いコンポストの利用率を目指すためには、コンポストの需要を高めることが必要であるが、そのためにはコンポストの有効性と安全性を客観的視点から明確に示すことが重要である。そこで本研究では、コンポストの安全性の科学的根拠を示すため、コンポスト原料中に含まれる病原微生物の検出、施用土壌の微生物叢の変遷や植物の生育に与える影響（土壌環境や土壌病防除など）を調査し、コンポスト施用における有効性及び安全性を微生物学的解析に基づき科学的に評価する。また、それぞれの農耕土壌に適したコンポスト施用（種類・量）方法を検討する。さらに病原微生物に対する安全性の確保についても検討する。

## 1 ．コンポスト施用が植物に与える有効性について

コンポスト施用の有効性について、植物の生育に及ぼす影響と病原菌に対する植物の応答に及ぼす影響の2点について実験を行った。植物の生育については、新梢の総延長や地下部の乾燥重量だけではなく、果実の総重量や果実の糖度についても計測し、コンポストの有効性を詳細に解析した。また、コンポスト施用による土壌の理化学的な改善についても調査した。

病原菌に対する植物の応答に及ぼす影響については、病原菌の植物体に対する病徴発現の軽減が観察されたが、このコンポストの影響が何に起因しているのかを追跡するため、宿主側（イチジク）の抵抗力と土壌の持つ病原真菌増殖抑制力について実験を行い、機序の解明に取り組んだ。

## 2 ．土壤中の微生物の解析について

コンポスト施用が植物に与える有効性をコンポストが土壤中の微生物群の変遷に影響を及ぼしていると考えて、土壤中の微生物群の解析を行うことを最終目的とした。まず、土壤微生物群のDNA抽出法と土壤微生物群のメタゲノム遺伝子解析法の確立を行った。その後、病原菌に対する植物の応答に及ぼす影響の実験において、病害によるイチジクの病徴発現緩和を示した鉢植え土壤および、試験管内で株枯病菌接種によるイチジク新梢の病徴発現の軽減効果を示した土壤について、同様の手法を用いて土壤微生物群の解析を行った。

## 3 ．コンポストの原料となる余剰汚泥中の病原性微生物の熱不活性化の検討

し尿を含んだ污水中には病原性微生物が含まれる危険性があり、それを濃縮した形態の余剰污泥中においても同様に危険性がある。この余剰污泥は濃縮処理や脱水処理後、コンポストとして有効利用される場合もある。近年、污泥を再資源（助燃材）として有効利用するため、含水率を低減化する目的で電気浸透式污泥脱水機が開発されている。当装置は污泥脱水時の生じる電気抵抗により污泥が発熱する特徴を有していることから、本研究では、その熱を有害微生物の不活化に対し有効利用することに着目し、この電気浸透式污泥脱水機をモデルに、さまざまな指標微生物を利用して不活化に重要となる加熱温度と時間の関係を実験室内で検討し、熱不活性化条件を決定する。また、実働している電気浸透式污泥脱水機による加熱前後に実際のサンプルを使用し、その有効性を調査する。
上記の各項目について研究目的、研究方法、および結果と考察をもうけ、最後に結論でまとめとしたい。

## 1 －1．コンポスト施用が植物に与える有効性について

## 1 ）コンポストの施用による土壤理化学性改善効果とイチジク生育への影響調査

バーク堆肥、牛糞堆肥および污泥の連用により、土壌の透水性、保水性、塩基置換容量（CEC）等土壌理化学性の違いを明らかにし、イチジクの栽培を通じて樹体生育、果実生産（収量および品質）に及ぼす影響を調査する。

## 【材料および方法】

イチジク「桝井ドーフィン」2年生樹を供試した。基本用土としてマサ土（花崗岩風化土）とピートモスを混合した土壌（体積比でマサ土：ピートモス＝4：1）を充填した25Lポットで、市販のバーク堆肥（フジミバーク）、市販の牛糞堆肥（発酵牛糞）、し尿污泥（トミヤマゆうき）を用い（対照区はコンポスト無施用）、2年間連用栽培した。基本的な栽培管理は前年に伸長した枝を3芽残し剪定を行った。発生する新梢は基本的に3本を残して芽欠きし、新梢の葉腋から発生する副梢もすべて除去した。また、伸長著しい新梢は先端を摘心した。

表 3 供試したコンポスト

種類（名称）	窒素(N) (%)	リン酸(P) (%)	カリウム(K) (%)
バーク堆肥（フジミバーク）	0.7	0.4	0.3
牛ふん堆肥（発酵牛ふん）	0.6	0.5	0.4
し尿污泥（トミヤマゆうき）	5.0	5.0	0.3

注）事業者による表示値

バーク堆肥、牛糞堆肥では土壌表面に1鉢あたり800g（2L）施与した。また、し尿汚泥は窒素濃度で施与量を調整し600g（Nで施肥量に合わせる）を土壌表面に施与した。対照区はコンポスト無施用とした。施肥はすべての区に対し、1鉢あたり窒素成分で30g（標準量）を緩効性被覆肥料（ハイコントロール085100日タイプ）で与えた。かん水は井水を使用し、タイマーによるチューブ滙水を朝夕2回1分間ずつ（100mL/回）行った。

調査は樹体の生育と果実生産について行った。まず、初期生育として新梢の伸長を6月末まで測定した。収穫適期に達したイチジク果実は順次調査を行った。調査項目は果実重量および果実糖度（Brix値）とした。最終的に地上部を切除し、新梢の生長量（全長、基部幅、乾物重）を計測するとともに、地下部は鉢土を丁寧に水洗いし、根部の乾物重を計測した。また、同時に土壌の理化学性調査を実施した。調査項目は透水性（土壌カラム法）、保水性（最大容水量）、pH（ガラス電極法）、EC（1:5水抽出法）、窒素（比色法）、リン酸（比色法）カリウム（比色法）、塩基置換容量（CEC）（セミミクロSchollenberger法）、腐植含量（乾式燃焼法）とした。
透水性は200mlのカラムに供試土壌を充填し、上部から水道水を100ml注いで下部より80ml排出される時間を測定し、対照区を100としたときの時間比を求めた。保水性は濾紙で底をつけた100mlの採土円筒に風乾した供試土壌を入れ、底部を水に浸し毛管飽和させ、円筒ごと炉乾させた時の含水量を100gあたりに換算した値を求めた。pH、EC、塩基置換容量（CEC）、腐植含量は文献7に従い、窒素、リン酸、カリウムは文献8に従い値を求めた。

## 【結果】

## （１）土壌の理化学性への影響

栽培終了後の鉢土を用い、土壌の理化学性について調査した結果、バーク堆肥、牛糞堆肥を施用することで透水性（水はけ）が良くなるとともに保水性が増す結果を得た（図9、図10）。一方、し尿污泥を施用すると保水性向上効果は確認できたが、透水性が若干不良となった（図9、図10）。し尿污泥は細かな粒子から構成されているため、水分を吸収すると泥状になることで透水不良を起こすと考えられた。また、コンポストを施用することで土壌中の有機物含量が増え、腐植含量が高まると推察された（表4）。栽培終了時の土壌を分析したが、pH、EC、窒素、リン酸、カリウムおよび塩基置換容量（CEC）についてはコンポスト施用の有無により大きな違いは見られなかった。

図 9 各用土の透水時間の比

透水比：標準用土を100とした場合の透水時間比

図 10 各用土の乾土 100g に保たれる水分量
表 4 各試験区における土壌理化学性

試験区	pH	EC (dS/m)	土壤 N mg/100g	土壤 P2O5 mg/100g	土壤 K mg/100g	塩基置換容量 CEC (me/100g)	腐植(%)
バーク堆肥区	4.8	0.09	0.1	9.0	5.1	26.5	4.7
牛ふん堆肥区	5.2	0.08	0.1	6.0	4.5	20.2	3.9
し尿污泥区	5.0	0.05	0.1	3.0	2.4	17.7	3.5
対照区	5.5	0.09	0.1	6.0	4.4	24.6	2.6

標準的なかん水

図 11 各コンポスト施用区におけるイチジク新梢伸長の推移

## （２）樹体生育への影響

初期生育については、バーク堆肥、牛糞堆肥を連用した場合で新梢の伸長促進が観察された。し尿汚泥区については新梢の伸長が抑えられた（図11、表5）。

イチジク樹を解体して生育量を調査した結果、対照区に比較して、牛糞堆肥を連用した区で地上部乾物重が有意に増加し、生育促進効果が観察された（表 5）。初期生育が劣っていたし尿汚泥区についても、解体による全乾物重は最終的に対照区と同程度の生育結果となった（表 3）。地下部乾物重については試験区ごとの有意な差は見られなかったが、牛糞堆肥区では全乾物重で有意な生育促進傾向が観察された。
表 5 各試験区におけるイチジク生育量

試験区	地上部乾物重(g)	新梢数	新梢の総延長(cm)	新梢の基部径(cm)	地下部乾物重(g)	全乾物重(g)
バーク堆肥区	335.0 b	3.0	111.7	473.5	17.8	169.3
牛ふん堆肥区	492.0 a	3.0	164.0	617.5	20.1	211.0
し尿污泥区	243.0 b	2.2	110.5	412.4	17.3	174.2
対照区	187.8 b	3.0	62.6	429.6	15.0	149.3

異なるアルファベット間で5%水準で有意差あり(n=4)

平成25年1月8日調査 標準的な施肥

## （３）果実生産への影響

果実の収穫時期については、試験区間で差は認められなかった。果実収量はし尿污泥区では収穫果数が少なく収量が低下したものの、バーク堆肥区、牛糞堆肥区とも対照区と同程度であった。果実の糖度についてはバーク堆肥区、牛糞堆肥区で高くなった（表6）。

表 6 各試験区におけるイチジク果実品質

試験区	収穫開始日(月/日)	1樹当たりの収穫数(個)	果実重量(g)	1樹当たりの収穫量(g)	糖度(Brix°)
バーク堆肥区	7/31	20.0 a	51.2	1024.8 a	19.1 a
牛ふん堆肥区	8/3	23.0 a	53.5	1231.2 a	18.9 a
し尿污泥区	8/3	13.3 b	65.5	867.5 b	15.7 b
対照区	7/31	19.0 a	52.9	1005.9 a	16.6 b

異なるアルファベット間で5%水準で有意差あり

## 標準的なかん水

以上の結果、コンポストの連用により土壌の理化学性が向上し、イチジクの生育が促進される傾向があること、果実生産については、し尿污泥を除き、収量が減少することなく高糖度になるなど高品質化が図れることが見いだされた。し尿污泥については、土壌への施用により物理性が悪くなるため、生育の抑制にともなって収量が低下することが懸念され、施与量を減ずる必要があると考えられた。

## 2 ）コンポストの有無およびかん水量の違いによるイチジク生育への影響調査

コンポストの施用により土壌の理化学性が変化し、イチジクの生育に差が認められるが、かん水量の違いによってもイチジクの生育差が生じる可能性があるため、コンポストの施用およびかん水量の違いによる土壌の理化学性への影響を明らかにする。

## 【材料および方法】

試験材料、その他の条件は先の試験と同様である。バーク堆肥区および対照区に対し、かん水量
を変えて試験を実施した。

かん水はタイマーによるチューブ滙水を朝夕2回1分間ずつ（100mL/回）行う区（標準かん水区）および1/2に減じた区（朝1回1分間）（1/2かん水区）を設けた。なお、標準かん水量でも夏季高温時においては鉢用土が乾燥し、生育への影響が考えられたため、平成24年8月1日～同年9月30日の間は、いずれの区もかん水回数を増やし、標準かん水区では朝夕4回1分間ずつ、1/2かん水区では朝夕2回1分間ずつとした。試験規模は1区4鉢とした。

調査項目は果実重量および果実糖度（Brix値）とした。イチジク樹の生育に関する最終調査は平成25年2月7日に地上部を切除し、地上部の生長量（新梢伸長量）を計測するとともに、地下部は鉢土を丁寧に水洗いし、根量（乾物重）を計測した。また、同時に土壌の理化学性調査を実施した。調査項目は透水性、保水性、pH、EC、窒素、リン酸、カリウム、塩基置換容量（CEC）、腐植含量とした。

## 【結果】

## （１）土壌の理化学性への影響

土壌の理化学性についてはコンポスト施用の有無による違いは認められたが、かん水量の違いによる大きな違いは認められなかった。かん水量が少ないと若干肥料成分が残存する傾向を示した。

なお、バーク堆肥施用区で腐植含量が高まり、塩基置換容量（CEC）が高まる傾向を示した（表7）。

表 7 各試験区における土壌理化学性

試験区	pH	EC (dS/m)	土壤 N mg/100g	土壤 P2O5 mg/100g	土壤 K mg/100g	塩基置換容量 CEC (me/100g)	腐植(%)
バーク堆肥+標準かん水区	4.8	0.09	0.1	9.0	5.1	26.5	4.7
+ 1/2かん水区	4.8	0.36	0.2	10.5	8.2	27.1	5.0
無施用	+標準かん水区	5.5	0.09	0.1	6.0	4.4	24.6
+ 1/2かん水区	4.9	0.09	0.1	9.0	4.5	18.9

標準的な施肥

## （２）樹体生育への影響

初期生育についてはかん水量に影響し、1/2 かん水区では新梢の伸長が押さえられた。また、バーク堆肥を施用した区で伸長が促進される傾向を示した（図 12）。

イチジク樹を解体して生長量を調査した結果、かん水量による生育差が大きく、かん水量が制限されると生長が抑制される傾向を示した（表8）。しかし、1/2 かん水条件下でもバーク堆肥を連用することで生長量の減少量を低減する効果が見いだされた（表8）。
図 12 コンポスト（バーク堆肥）施用の有無およびかん水量の違いがイチジクの初期生育に及ぼす影響

表 8 各試験区におけるイチジク生育量

試験区	地上部乾物重(g)	新梢数	新梢あたりの乾物重(g)	新梢の総延長(cm)	新梢の基部径(cm)	地下部乾物重(g)	全乾物重(g)
バーク堆肥+標準かん水区	335.0 a	3.0	111.7	473.5	17.8	169.3 a	504.3 a
+ 1/2かん水区	234.6 b	3.0	78.2	364.6	15.4	148.6 a	383.1 ab
無施用	+標準かん水区	187.8 b	3.0	62.6	429.6	15.0	149.3 a
+ 1/2かん水区	130.7 b	2.7	48.4	337.6	13.7	96.1 b	226.9 b

異なるアルファベット間で5%水準で有意差あり(n=4)

平成25年1月8日調査 標準的な施肥

## （３）果実生産への影響

果実については、生長量と同様にかん水量による差が大きく、かん水量を制限することで収量が減少し、果実糖度も減少した（表9）。
表 9 各試験区におけるイチジク生育量

試験区	収穫開始日(月/日)	1樹当たりの収穫数(個)	果実重量(g)	1樹当たりの収穫量(g)	糖度(Brix°)
バーク堆肥+標準かん水区	7/31	20.0 a	51.2 a	1024.8 a	19.1 a
+ 1/2かん水区	7/31	7.3 b	33.8 b	245.9 b	14.6 b
無施用	+標準かん水区	7/31	19.0 a	52.9 a	1005.9 a
+ 1/2かん水区	7/31	6.6 b	32.2 b	211.6 b

異なるアルファベット間で5%水準で有意差あり

標準的な施肥

以上の結果、イチジクの生育および果実収量、品質にはかん水量が大きく影響することが明らかとなったが、コンポスト施用により、低かん水条件下でも生育、収量を維持する傾向が認められた。

## 3 ）コンポストの有無および施肥量の違いによるイチジク生育への影響調査

コンポストの施用により土壌の保肥力向上効果が期待され、慣行の肥料よりも少ない施用でも栽培が可能かどうか見極めるため、減肥によるイチジクの生育に及ぼす影響を調査する。

## 【材料および方法】

試験材料、その他の条件は先の試験と同様である。バーク堆肥区、牛ふん堆肥区および対照区に対し、施肥量を変えて試験を実施した。

施肥は慣行に従い、1 鉢あたり窒素成分で30 g（標準）または10 g（1/3 施肥）を緩効性被覆肥料（ハイコントロール0 8 5 100 日タイプ）で与えた。また、かん水はタイマーによるチューブ滻水を朝夕2回1分間ずつ（100 mL/回）行った。なお、標準かん水量でも夏季高温時においては鉢用土が乾燥し、生育への影響が考えられたため、平成24年8月1日～同年9月30日の間は、いずれの区もかん水回数を増やし、標準かん水区では朝夕4回1分間ずつ、1/2かん水区では朝夕2回1分間ずつとした。

## 【結果】

## （１）土壌の理化学性への影響

土壌の理化学性についてはコンポスト施用の違いは認められたが、施肥量の違いによる差は認められなかった（表7）。施肥量が少ない区で残存肥料成分が少なかった。バーク堆肥、牛糞堆肥いずれも施用することで腐植含量が高まり、塩基置換容量（CEC）が高まる傾向を示した（表10）。
表 10 各試験区における土壌理化学性

試験区	pH	EC (dS/m)	土壤 N mg/100g	土壤 P2O5 mg/100g	土壤 K mg/100g	塩基置換容量 CEC (me/100g)	腐植(%)
バーク堆肥区	4.8	0.09	0.1	9.0	5.1	26.5	4.7
+1/3施肥	5.4	0.05	0.1	2.6	0.9	16.4	3.7
牛ふん堆肥区	5.2	0.08	0.1	6.0	4.5	20.2	3.9
+1/3施肥	5.6	0.06	0.1	2.6	1.1	18.2	3.3
対照区	5.5	0.09	0.1	6.0	4.4	24.6	2.6
+1/3施肥	5.6	0.06	0.1	4.5	1.6	16.8	3.0

標準的なかん水

## （２）樹体生育への影響

初期生育について、施肥量の違い、コンポストの施用の有無による差は認められなかった(図13)。イチジク樹を解体して生長量を調査した結果、施肥量の違いによる生育差が見られた。地上部乾物重については牛糞堆肥標準施肥区で最も重かった。地下部乾物重はコンポストの施用による一定の傾向が認められなかったが、バーク堆肥区と対照区では施肥量を削減した試験区において地下部乾物重が増大した（表11）。

図 13 コンポスト（バーク堆肥）施用の有無および施肥量の違いがイチジクの初期生育に及ぼす影響
表 11 各試験区におけるイチジク生育量

試験区	地上部乾物重(g)	新梢数	新梢あたりの乾物重(g)	新梢の総延長(cm)	新梢の基部径(cm)	地下部乾物重(g)	全乾物重(g)
バーク堆肥区	335.0 b	3.0	111.7	473.5	17.8	169.3 b	504.3 b
+1/3施肥	340.3 b	2.7	126.0	500.1	18.9	270.4 a	610.7 ab
牛ふん堆肥区	492.0 a	3.0	164.0	617.5	20.1	211.0 a	703.0 a
+1/3施肥	307.0 b	3.0	102.3	567.0	17.7	220.0 a	527.0 b
対照区	187.8 b	3.0	62.6	429.6	15.0	149.3 b	337.0 c
+1/3施肥	266.0 b	3.0	88.7	527.7	17.0	257.9 a	523.9 b

異なるアルファベット間で5%水準で有意差あり(n=4)

平成25年1月8日調査 標準的な施肥

## （３）果実生産への影響

果実については、生長量と同様に施肥量による差が大きく、施肥量を減らすことで収量が減少した（表12）。糖度については一定の傾向が認められなかったが、標準的な施肥を行う条件下では、コンポスト施用により糖度が高まる傾向を示した。

表 12 各試験区におけるイチジク生育量

試験区	収穫開始日(月/日)	1樹当たりの収穫数(個)	果実重量(g)	1樹当たりの収穫量(g)	糖度(Brix°)
バーク堆肥区	7/31	20.0 a	51.2 a	1024.8 a	19.1 a
+1/3施肥	7/31	18.4 ab	40.8 b	750.4 b	17.2 b
牛ふん堆肥区	8/3	23.0 a	53.5 a	1231.2 a	18.9 a
+1/3施肥	8/3	17.0 b	37.8 b	642.6 b	18.1 a
対照区	7/31	19.0 a	52.9 a	1005.9 a	16.6 b
+1/3施肥	7/31	16.1 b	39.5 b	636.3 b	17.4 b

異なるアルファベット間で5%水準で有意差あり

標準的なかん水

以上の結果、イチジクの生育および果実生産性は、施肥量の削減によって減退することが示された。コンポスト施用による増収効果は認められなかったが、標準的な施肥を行う条件下では果樹糖度が高まる効果が認められた。
## 【まとめ】

バーク堆肥、牛糞堆肥では連用することにより、土壌の理化学性（物理性、化学性）が改善される傾向を示し、イチジクの生育促進効果が見られた。このことは土壌の理化学性の改善によって生育が促進されることを示すものである。また、今回設定した試験条件下では、かん水量の差が生育差に大きく影響を及ぼし、かん水量が少ないと生育不良となり、イチジクの収穫量や果実品質にも悪い影響を及ぼした。しかし、低かん水条件においても、コンポストの施用によりその影響が軽減されることが示された。コンポスト施用は保水性向上効果にもつながるため、これらの要因によって生育が維持された可能性がある。また、施肥量を減じることでイチジクの生育には大きく影響を及ぼさないように見えたが、果実生産は明らかに低肥料区で劣る傾向を示した。このことは、樹体に蓄えた栄養を利用して成長は維持されたが、樹体栄養が消耗した分、果実の生産力低下につながったと考えられた。

耕作地とポット栽培では環境条件が異なるため、圃場レベルでの試験を実施する必要があるが、ポット栽培において、土壌表面にコンポストを施用することでも、耕耘をしなくても土壌改良効果が見られた。

果樹栽培において、土壌は毎年耕耘できないため、何も施さなければ経年劣化していくが、コンポストを連用することで劣化を抑え、安定した果実生産が可能になると考えられた。

## 1 −2．コンポスト施用によるイチジク株枯病の抑止効果

## 【目的】

平成22年度および23年度の研究において、コンポスト施用による株枯病抑止効果が確認された。しかし、これらの研究はポット土壌を用いて行っていたもので、一般的な農耕地土壌での検討は行っていない。また、現地農家で使用されているコンポストは牛糞堆肥、バーク堆肥、剪定枝堆肥であるが、剪定枝堆肥の効果は検討していない。そこで平成24年度は、剪定枝堆肥を連年施用したイチジク園の土壌を用い、株枯病抑止効果について確認した。なお、本試験におけるイチジク品種は枠井ドーフィンである。

## 【材料および方法】

大阪府内の農家のイチジク園において、約 $ 0.4m^{3}/m^{2} $ のコンポスト（剪定枝堆肥）を平成17、18年の2回に分けて地表に施用された土壌（現地コンポスト区）と、無施用の土壌（現地対照区）を用いて試験に供した。供試土壌は平成24年11月19日にそれぞれ採取し、以下のようポテトデキストロース寒天培地上で予め培養した株枯病菌Ceratocystis fimbriataを混和した。この土壌に、野外の同一条件で生育した健全なイチジク新梢を挿し木し、バーク堆肥を施用しなかった土壌に挿し木した場合と病斑の拡大を比較した（図14）。
図 14 土壌への株枯病菌接種および新梢の挿し木試験

## 【結果および考察】

各土壌の土壌分析の結果を表 13 に示す。現地対照区では土壌 pH が 4.9 と低かったが、現地コンポスト区では堆肥の緩衝能の効果で土壌 pH は 6.7 と適正範囲になった。また肥料成分については両区とも大きな差はなかったと考えられる。

各区土壌の挿し穂の地下部には黒褐色の壊死が認められたが、その進行程度はコンポスト区の方がマン・ホイットニーのU検定（P<0.05）によって有意に軽微であった（図15、図16）。現地イチジク園の土壌でもコンポスト施用することで株枯病を抑制する効果が認められた。

表 13 各土壌の理化学性

試験区	pH	EC (dS/m)	土壤 N m g/100g	土壤 P2O5 m g/100g	土壤 K+ m g/100 g
現地コンポスト区	6.7	0.27	10.5	4.5	1.9
現地対照区	4.9	0.25	9.5	7.2	1.9
図 15 接種 10 日後のイチジク枝

(左：現地対照区、右：現地コンポスト区)

図 16 各被害指数の割合

## 2 ．土壤中の微生物の解析について

## 【目的】

コンポスト施用が植物に与える有効性は、コンポストが土壌微生物群の変遷に影響を与えている可能性が高いと考え、土壌微生物群のメタゲノム解析を最終目標とした。そのため、土壌からの土壌微生物群のDNA抽出法およびそのメタゲノム解析法の確立を行う。その後、コンポスト施用により、株枯病菌接種後にイチジク地下部の病徴発現軽減を示した土壌および試験管内で土壤中に接種した株枯病菌による新梢に対する病徴発現軽減を示した土壌について、土壌微生物群の解析を行った。

## 【材料および方法】

土壤からの土壌微生物群の DNA 抽出法

ビーズを使用した方法（文献4）を改良して、下記に示した方法を確立した（図17）。

## DNA抽出の工程

1. 土壤サンプル0.25gを2mlの強化チューブ（タングステンビーズとジルコニアシリカビーズ入り）3本に入れる。

2. 土壤サンプルにライシスバッファー*0.7mlを加え、シェイクマスター(BMS)にて5分間振盪し、12000rpm, 4°Cにて5分間遠心し、上清を15mlのチューブに集める。この操作を3回繰り返す。
3. 上記で集めた上清に最終濃度が500mMとなるように酢酸ナトリウム液を加え、氷上に10分間置き、水冷したイソプロピルアルコールを等量加えて攪拌し、3000rpm，4°Cにて20分間遠心する。（イソプロピルアルコール沈殿）遠心後、上清を捨て水冷した70%エタノールで沈殿物を洗浄し、風乾してTEバッファー0.5mlを加えて4°Cに静置。

4. 抽出物が十分溶けた事を確認して、Montage-PCR Centrifugal Filter Deviceを使用してTEバッファーを加えながら、洗浄濃縮する。この過程が終了したら、アガロースゲルにて電気泳動を行ない、PCR時の希釈倍率の指標とする。

* ライシスバッファー:100mM Tris-HCl (pH8.0)/EDTA/NaCl, 3%SDS

図 17 土壌米生物群の解析（イメージ図）

プライマーについては、細菌、古細菌、真菌ともに種の同定、解析に使用されたものを選択した（下記に細菌と古細菌および真菌用のプライマーの一覧を表14および15に示した）。

表 14 細菌（16S-1, 2, 3, 4, 6）と古細菌（16S-5）のプライマー

プライマー	名前	sequence (5'-3')	文献番号	PCR産物 [bp]	備考
16S-1	F984	AACGCGAAGAACCTTAC	9	395	V6-8
R1378	CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG
16S-2	F967	CAACGCGAAGAACCTTACC	10,11	272	V6-7
R1238	GTAGCRCGTGTGTMGCCC
16S-3	AcF243	GGATGAGCCGCGGCCTA	12	271	V2-3 Actinomycetes specific
AcR513	CGGCCGCGGCTGCTGGCACGTA
16S-4	Com1	CAGCAGCCGCGGTAATAC	13	408	V4-5
Com2	CCGTCAATTCCTTTGAGTTT
16S-5	Arch21F	TTCCGGTTGATCCYGCCGGA	14	938	V1-6 Archaea
Arch958R	YCCGGCGTTGAMTCCAATT
16S-6	784F	AGGATTAGATACCCTGGTA	15	278	V5-6
1061R	CRRCACGAGCTGACGAC
表 15 真菌のプライマー

プライマー	名前	sequence (5'-3')	文献番号	PCR産物 [bp]	備考
18S-1	NS1	GTAGTCATATGCTTGTCTC	16,17	390
Fung	ATTCCCCGTTACCCGTTG	18
18S-2	NS7	GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC	17	342	V8-V9
NS8	TCCGCAGGTTCACCTACGGA	17
18S-3	NS7	GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC	17	400	V8-V9
F1Ra	CTTTTACTTCCTCTAAATGACC	19
18S-4	SR7R	AGTTAAAAAGCTCGTAGTTG	20	510
SR5	GTGCCCTTCCGTCAATT	20
18S-5	NS31	TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC	17,21,22	600	V3-V4
AM1	GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA
AM2	GTTTCCCGTAAGGTGCCAAA
AM3	GTTTCCCGTAAGGTGCCGAA

PCR の条件は、プライマーのアニーリング温度と PCR 産物の大きさを基にできるだけ同一条件で行えるように下記のように設定した。

Pre denature $ 94^{\circ} $ C, 3 min, denature $ 94^{\circ} $ C/annealing $ 55^{\circ} $ C /extension $ 72^{\circ} $ C (0.5//0.5/1 min)

35 cycles, final extension $ 72^{\circ} $ C, 1 min. 16S-5 および 18S-5 のみアニーリング温度を次の様に変更した。

16S-5: annealing temp. $ 62^{\circ} $ C

18S-5: annealing temp. 60°C

試験土壤として、森林土壤、植物コンポストのみ連用の植物公園土壤、牛糞堆肥連用農耕地土壤を用いて、ジェノミック DNA と上記のプライマー11 種類で増幅させた PCR 産物について、GS Junior platform 454 (Life Science 社製) を使用してメタゲノム解析を行った。その結果、細菌については、2 種類のプライマー (16S-2, 16S-6)、真菌については、3 種類のプライマー (18S-1, 18S-3, 18S-5) を選択した（研究概要の表 2 に選択理由記載、参照）。

試験管内で、株枯病菌を培養後にイチジク新梢を挿入し、一定期間培養後に株枯病菌によるイチジクの地下部の病徴発現判定で、病徴発現抑止効果が確認された土壌2種類、牛糞堆肥連用区とバーク堆肥連用イチジク園とそれそれの対照区の土壌を材料として、同様に土壌微生物群のメタゲノム解析を行った（実験系については、図14、実験結果については、図15および16を参照）。

## 【結果および考察】

それぞれの土壌微生物群を GS Junior plat form 454 (Life Science 社製) を使用して解析した結果の遺伝子配列が判明した数（リード数）を表 16 に示した。
表 16 各土壌微生物の明らかになったリード数

プライマー	PCRプロダクト[bp]	牛糞堆肥区	牛糞堆肥無し	バーク堆肥区	バーク堆肥無し
16S-2	272	117576	34213	104906	110092
16S-6	278	261029	111312	285877	8046
18S-1	390	5181	5450	5072	5606
18S-3	400	15755	9004	5051	6568
18S-5	600	2603	9287	764	1212

この結果、細菌についてのリード数については、特に問題なかったが、PCR産物が得られにくかったプライマー18S-5のリード数が少なかった。

次に細菌の門レベルでの解析グラフを図18に示す。

図 18 各土壌における細菌の門レベルの解析図

本事業のプロジェクトでさまざまな土壌における（森林土壌、植物コンポスト連用植物公園土壌、牛糞連用農耕地土壌、イチジク定植鉢土壌）土壌微生物群を解析してきたが、プライマーの種類により、最も頻度が高く検出された細菌の門が異なる事はなかった。今回の結果では、プライマー16S-2と16S-6による解析でバーク堆肥連用区と牛糞連用区でプロテオバクテリアと放線菌の占有率が異なる。
なっていた。すなわち、バーク堆肥連用区と牛糞連用区の両方において、16S-2のプライマーを使用した解析では、プロテオバクテリア門が最も多く検出されたが、16S-6のプライマーを使用した解析では、プロテオバクテリア門よりも、放線菌門が多く検出された。データベース上に分類の不明な細菌の遺伝子が多く登録されており、今回の解析で不明細菌の割合が多くなったことも影響しているのかもしれない。今後、より詳細な検討を行って解析を続けて行きたいと思う。上記の事実にこだわらず、広い視野で見ると、すべての土壌について最も頻度が高く検出されたのは、プロテオバクテリアと放線菌であり、今まで得たデータと一致した。コンポスト連用区（牛糞堆肥とバーク堆肥）に比べて対照区においては、グラム陽性菌の頻度が高く検出された。（図18）コンポスト連用区と対照区に共通した特徴は、細菌の門レベルでの解析では見いだせなかった。

次に真菌について門レベルの解析グラフを図19に示した。若干プライマーによる違いはあるが、すべての区において子囊菌門の分布が多かった。バーク堆肥とその対照区においては、担子菌門の割合が対照区で多かった。またプライマー18S-5について、リード数は少ないものの（表16）特異性は高いことが明確になった。真菌の門レベルの解析からは、コンポスト連用区と対照区に共通の特徴は、見いだせなかった。

細菌についても真菌についても門レベルの解析では顕著な差が得られなかったが、今後、より詳細に解析を進めていきたい。

図 19 各土壌についての真菌の門レベルでの解析図

メタゲノム解析についてであるが、土壌微生物群を構成する細菌については、a−プロテオバク