Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## 1 ）バイオ蛍光法によるカーボンナノチューブの観察

カーボンナノチューブとして、多層カーボンナノチューブ（MWCNT、直径：～140nm）と金属型または半導体型単層カーボンナノチューブ（SWCNT、直径：～1.5nm）の3種類を用いた。MWCNTの懸濁液は、10%のデオキシコール酸溶液に1mg/mlとなるように調製した。金属型または半導体型のSWCNTの懸濁液は、0.1%のSDS溶液に0.1mg/mlとなるように調製した。1.5mlのエッペンチューブに、25nMの蛍光標識されたMastoparan-X-Streptavidin-Cy3溶液50μlと、2μlの1mg/mlのMWCNT懸濁液を混合し、1分攪拌した。この混合液をスライドグラスの上にのせ、さらにその上にカバーガラスをのせてプレパラートを作成し、蛍光顕微鏡にて観察を行った。また、1.5mlのエッペンチューブに、200nMの蛍光標識されたMastoparan-X-Streptavidin-Cy3溶液10μlと、10μlの5μg/mlの金属型または半導体型のSWCNT懸濁液を混合し、1分攪拌した。この混合液をスライドグラスの上にのせ、さらにその上にカバーガラスをのせてプレパラートを作成し、蛍光顕微鏡にて観察を行った。蛍光観察には、U-MNGキューブ（ダイクロイックミラー：DM570、励起フィルター：BP-530-550、吸収フィルター：BA590）を用い、画像の取り込みに顕微鏡デジタルカメラDP-70（オリンパス社）を使用した。

## 2 ）バイオ蛍光法によるナノ粒子の観察

作製した蛍光プローブをそれぞれのナノ粒子と結合させ、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡で観察することで機能評価を行なった。ナノ粒子として、酸化チタンナノ粒子はTianium(IV) oxide（mixture of rutile and anatase、平均粒子径150nm、Aldrich社）を、銀ナノ粒子はSilver（dispersion、一次粒子径<21 nm）を用いた。酸化チタンナノ粒子を検出するためのプローブは、HNS-Cy3を用いた。このプローブの調製は、以前報告した論文（Ishida et al. PLoS ONE, 8[9]:e76231[2013]）記載の方法により行なった。作製したHNS-Cy3、EF-Tu-Cy3、GreA-Cy3を10mM Tris-HCl(pH7.5)で100nMに希釈した。同時に酸化チタンナノ粒子も同緩衝液で2.7μg/mlに、銀粒子を400pg/mlに希釈し、10μlずつ混合することで結合させた。2分攪拌後、蛍光顕微鏡にて観察を行なった。蛍光観察には、U-MNGキューブ（ダイクロイックミラー：DM570、励起フィルター：BP-530-550、吸収フィルター：BA590）を用い、画像の取り込みに顕微鏡デジタルカメラDP-70（オリンパス社）を使用した。

ナノ粒子として、酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛ナノ粒子、銀ナノ粒子を用いた。酸化チタンナノ粒子は、シグマ社製の酸化チタンナノ粒子水分散液（製品番号：700347-25G、1.3g/ml）を用い、超純水で1.3mg/mlまで希釈した。酸化亜鉛ナノ粒子は、シグマ社製の酸化亜鉛ナノ粒子水分散液（製品番号：721077-100G、1.7g/ml）を用い、超純水で1.7mg/mlまで希釈した。銀ナノ粒子は、シグマ社製の銀ナノ粒子水分散液（製品番号：730815-25ML、0.02mg/ml）を用いた。

無機材料ペプチドの蛍光プローブをTris緩衝液(10mM、pH7.4)で40nMに希釈した。酸化チタンナノ粒子では、9μlの酸化チタン検出用蛍光プローブ溶液(40nM)に、1μlの酸化チタンナノ粒子（1.3mg/ml）を混合した。酸化亜鉛ナノ粒子では、10μlの酸化亜鉛検出用蛍光プローブ溶液(40nM)に、10μlの酸化亜鉛ナノ粒子（1.7mg/ml）を混合した。銀ナノ粒子では、10μlの銀検出用蛍光プローブ溶液(40nM)に、10μlの銀ナノ粒子（0.02mg/ml）を混合した。混合を1分間行うことで、ナノ粒子に蛍光プローブを結合させた。この混合液をスライドグラスの上にのせ、さらにその上にカバーガラスをのせてプレパラートを作成し、蛍光顕微鏡で観察した。
## 3 ）光電子相関顕微鏡を用いたナノ粒子の観察

蛍光検出されたナノ粒子の粒径を知るため蛍光顕微鏡と同視野を電子顕微鏡で測定できる光・電子相関顕微鏡（カールツアイス社）を用いて観察した。チューブ中でナノ粒子に蛍光プローブを結合させた後、フィルターに固定化し、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で観察することで、蛍光で検出されたナノ粒子のサイズを電子顕微鏡で測定した。具体的には、以下の方法（①～④）で行なった。

## ①ポリリジン固定化フィルターの作製

蛍光染色したナノ粒子をフィルターに固定化するために、フィルターに正電荷を持つポリリジンを固定化した。具体的には、IsoporeTM Membrane Filters、0.2μm GTTP(アイソポア)上に0.01% L-ポリリジン溶液600μlを滴下し、10分静置した。フィルター上のL-ポリリジン溶液をマイクロピペットで吸い取り、蒸留水600μlをフィルターに滴下、吸い取りを2回繰り返すことで定着していないL-ポリリジンを除去した。その後、完全に乾かすことでL-ポリリジン固定化フィルターを作製した。

## ②蛍光染色したナノ粒子のフィルターへの固定化

蛍光染色したナノ粒子溶液を、超純水で1,000倍希釈し、そのうちの0.1mlを上記ポリリジンフィルターに滴下して固定化した。100μlの超純水で2回洗浄した。

## ③マーカーの作製とフィルターへの固定化

ナノ粒子の位置をより正確に把握するために、蛍光標識したアスベストをマーカーとして用いた。10μlのアモサイト懸濁液(10mg/ml)を200μlの蛍光標識したアスベスト結合タンパク質

（HNS60-90-Streptavidin-CF488A、50nM）に添加して、10分間混合した。結合後、250μlの超純水で洗浄を行ない、最終的に100μlの超純水水で再懸濁した。マーカーとして蛍光染色したアモサイトを使う場合には、蛍光染色したアモサイト懸濁液を上記ポリリジンフィルターに滴下して固定化した。100μlの超純水で1回洗浄した。

## ④蛍光染色したナノ粒子固定化フィルターの相関顕微鏡での観察

蛍光染色したナノ粒子固定化フィルターを、カーボンテープを貼付けた試料台に固定し、ステージホルダーに装着した。ステージホルダーを蛍光顕微鏡（Axio Imager、カールツアイス製）にセットし、ステージホルダー上のマーカー3点を登録し、ステージ・キャリブレーションを行った。まず蛍光観察して、蛍光を発したナノ粒子（または、マーカーを入れた場合は、蛍光を発したアモサイト繊維）が検出された視野についてCCDカメラで撮影を行ない画像および位置情報の取得を行った。USBメモリを使って蛍光顕微鏡で取得した画像及び位置情報を電子顕微鏡システムに入力した。次に、ステージホルダーを電子顕微鏡（SIGMA VP、カールツアイス社）の試料室に移し、観察位置を蛍光顕微鏡と同期させるために、ステージホルダー上のマーカー3点を再度登録し、ステージ・キャリブレーションを行った。蛍光顕微鏡で観察された粒子について、記録した位置情報を入力して、電子顕微鏡で蛍光粒子の観察を行なった。

## 4 ．結果及び考察

（１）バイオ蛍光法と公定法（電子顕微鏡法）の比較

1）位相差蛍光法と電子顕微鏡法（公定法）の比較
現在、アスベスト検査の公定法は、まず位相差顕微鏡によって非アスベストを含む総繊維での繊維数濃度を測定し、大気1リットルあたり繊維1本以上（1本/L）の場合、電子顕微鏡とX線分析によるアスベストの同定を行いながらアスベスト繊維数濃度を測定することとなっている（『アスベストモニタリングマニュアル第4.0版』、環境省）。位相差蛍光法は同様にまず位相差モードで総繊維を計測し、次に蛍光モードに切り替えてアスベストかどうかを判定する方法である（1サンプル約1時間で分析）。バイオ蛍光法を普及させるために、位相差蛍光法と、現在の公定法である電子顕微鏡法との相関データを蓄

図3、バイオ蛍光法（位相差蛍光法）による観察画像（上）と電子顕微鏡法（SEM）による観察像及びEDXスペクトル（下）。バイオ蛍光法では、まず位相差モードで繊維を観察する。次いで蛍光モードに切り替えて、蛍光の有無を確認することで、アスペストかどうかを判定する。電子顕微鏡法では、繊維に電子線を当て元素分析を行ってアスペストかどうかを判定する。

積し、有効性を検証した（図3）。実際の大気捕集フィルター64種類（リアルタイムモニターのバックアップフィルター14種類を含む）について位相差蛍光法による測定（図3上）と、公定法（電子顕微鏡法）による測定（図3下）を実施した。合計64サンプルについて比較した結果、両方法による測定は非常に高い相関性を示すことが分かった（相関係数r=0.87）（図4左）。これまでアスベスト濃度と疫学的データとの相関は、位相差顕微鏡による計測によって行われてきたため、アメリカでは、位相差顕微鏡で計測した総繊維数に、電子顕微鏡で判定したアスベストの割合（総繊維中のアスベストの割合）をかけて補正したものが用いられる。位相差蛍光法と補正された電子顕微鏡法のアスベスト濃度は、よりよく相関することがわかった（相関係数r=0.97）（図4右）。

電子顕微鏡法(本/L)

電子顕微鏡法(補正)(本/L)

図4、位相差蛍光法と公定法（電子顕微鏡法）によるアスベスト分析の比較（左）。位相差顕微鏡法で得られた数値で補正したものと比較した（右）。
## 2 ）蛍光法と電子顕微鏡法（公定法）の比較

アスベスト濃度を確定させる手順として、『アスベストモニタリングマニュアル第4.0版』(環境省)では、電子頭微鏡法による検査の際、位相差頭微鏡を意識して、幅0.2μm以上の繊維のみを計数対象とすることになっている。一方、バイオ蛍光法では、電子頭微鏡でしか見えないような幅30nmのクリソタイルの単繊維でも、蛍光頭微鏡下で観察可能になることが分かっている。そこでサンプル中に微細なクリソタイル繊維が多く存在する場合、位相差頭微鏡法をベースとした計測法による結果と比較すると、バイオ蛍光法では感度がより高いために結果が高く出ることが考えられた。そこで、実際の解体現場から採取した試料36種（リアルタイムモニターの

図5、蛍光法と公定法（電子顕微鏡法）によるアスベスト分析の比較

バックアップフィルター20種を含む）を用いて、蛍光法と電子顕微鏡法による計測結果の比較を行い、測定法の違いによる影響を調べた。36種のサンプルについて事前の資料調査から判明した使用アスベストの種類は、クリソタイル（19）、アモサイト（6）、クロシドライト（11）であった。また、蛍光法による測定の実施については現場での検査を想定して、可搬性に優れた小型蛍光顕微鏡（Lumascope、Etaluma社）を用いて行った。結果を検証したところ両方法による計測結果は、非常に相関性が高いことが分かった（r=0.995）（図5）。図4と図5のサンプルは同一ではないので正確には比較できないが、蛍光法と電子顕微鏡法の相関は、位相差蛍光法との比較を上回る結果であった。元来、位相差顕微鏡と電子顕微鏡では検出感度が異なるために、位相差顕微鏡により検出繊維を制限する位相差蛍光法よりも、電子顕微鏡法との測定結果に近くなるのかもしれないと考えられた。

電子顕微鏡は、X線分析装置を付けると1000万円以上の価格となる（アスベスト検査会社に電子顕微鏡による検査を依頼すると一回数十万円必要となる）。一方、蛍光法は消耗品として一回数千円の経費が必要となるが、蛍光顕微鏡は100万円以下でも購入できるため、初期投資が少なく広く普及が期待できる（図6）。特に、アスベストの使用の有無が不明な解体現場、不十分な事前調査で「アスベスト無し」とみなされている疑いのある現場、また災害などで資料調査が困難な事態において、迅速にアスベスト濃度を測る必要がある場合、蛍光法による検査が有力な選択肢となると考えられた。

図6、蛍光法によるアスベスト検査の普及を目指し、アスベスト計測講習会を4回行った（平成26年6月4日、平成26年10月8日、平成27年5月27日、平成27年11月18日、計4回、約40名の参加、環境省環境調査研修所にて）。

## 3 ）位相差偏光法と位相差蛍光法の比較
偏光顕微鏡法（以下、偏光法）は、鉱物が偏光に対し特有の光学的性質を示すことを利用し、その特徴からアスベストの含有の有無を調べる方法である。偏光法は建材のアスベスト分析法として普及している。しかし空気中に飛散するアスベストは微細であることから偏光法では検出できないことも懸念されている。そこで空気中に飛散するアスベストの検出法として開発したバイオ蛍光法と偏光法の両方法で計測を行い、その特徴を明らかにすることとした。代表的なアスベスト含有建材（ロックウール、吹き付け材、石膏ボード、ケイカル板、スレート板）からフィルター捕集サンプルを作製し、リロケータブルスライブ

図7、位相差蛍光法と位相差偏光法による測定の相関

ドを用いて、同一サンプルの同一視野について計測し、両方法による判定性の比較を行った。その結果、両方法でのアスベストの判定性は非常に一致率が高いことが分かった（図7）。しかし、クリソタイル繊維を含む石膏ボード粉砕サンプルにおいては偏光顕微鏡では判定ができなかった

## と考えられる場合が見られた

（図7中に赤丸で囲んだサンプル）。実際、微細クリソタイルは、偏光顕微鏡で観察しにくいことが分かった（図8）。また、偏光顕微鏡法ではステージの回転や、偏光板の抜き差しなど複雑な操作が必要であるが、位相差蛍光法ではレバーの切り替えによる単純な操作で、位相差モードと蛍光モードの切り替えが可能である。より単純な操作で、かつ微細な繊維まで判定可能な位相差蛍光法が大気飛散アスベストの迅速法としては有利であると考えられる。

図8、バイオ蛍光法と偏光顕微鏡法の比較。微細クリソタイルは偏光法で見落とされる可能性がある。

## （２）解体現場でのアスベスト検査のためのバイオ蛍光法の改良

## 1 ）建材中のアスベスト検出法の開発

建材中に存在するアスベストの分析方法は、偏光顕微鏡法や位相差分散顕微鏡法などが知られている。偏光顕微鏡法では、ステージを回転させ偏光板を抜き差しするなどの複雑な操作が必要
になる。また、位相差分散頭微鏡法では、複数の浸液を用いた試料の調製が必要で、さらに感度があまり良くないため細い繊維の判定ができないなどの問題があった。バイオ蛍光法は、簡便で高感度な検出方法である。そこで、バイオ蛍光法を建材中に存在するアスベストの検出に応用するために検討を行なった。

建材中に存在する浮遊する巨大な粒子を減らすために、ギ酸処理の工程を加えることが有効と考え

図9、HNSタンパク質と改変型TmAFPの角閃石系アスベストへの結合に対するギ酸処理の影響。従来のHNSタンパク質では、ギ酸処理によりアスベストへの結合量が大幅に低下した（左図）。一方で、改変型TmAFPではギ酸処理してもほとんど低下しなかった（右図）。

られた。しかし、ギ酸処理を行うと、従来型のアスベスト結合タンパク質の結合量が大幅に下がってしまう問題があった。ギ酸処理後、NaOH処理と水洗净の工程を加える事で、結合量の低下はある程度抑えられることが分かったが、処理工程が増え複雑になる問題が残った。そこで、別途アスベスト結合タンパク質として開発されていた改变型TmAFPタンパク質（改変型TmAFP）を利用することとした。TmAFPタンパク質は、不凍タンパク質として知られ、氷の表面に結合して、氷の結晶の成長を抑制するタンパク質である。平行なβシートからなる平面性の高い領域をもつ分子で、βシートの両端にあるスレオニン残基が、氷の表面の酸素原子と相互作用することにより氷と強く結合する。このTmAFPの持つ特徴的な平面性の高い構造は、氷の表面だけでなく、様々な無機固体表面に結合する分子骨格として利用できると考えられる。改変型TmAFPは、野生型TmAFPの第37～61番目の中で、第39、41、51、53番目のスレオニン残基をリシンに置換し、第56番目のリシンをグリシンに置換したもので、アスベストに強く結合する。この改変型TmAFPを用いて建材中のアスベストの検出を行なった。模擬建材サンプルとして、10 mgのロックウールと0.1 mgの角閃石系アスベスト（アモサイト）を混合したものを作製した。従来のHNSタンパク質は、ギ酸処理により角閃石アスベストへの結合が低下し、蛍光が大幅に低下することが分かった（図9左）。一方で、今回新しく調製した蛍光標識した改変型TmAFPは、ギ酸処理有無にかかわらず角閃石アスベストに結合し、強い蛍光を観察できることが分かった（図9右）。ロックウール繊維は、ギ酸処理により溶解され、細かい粒子状になった様子が位相差顕微鏡で観察された。従来のHNSタンパク質は、ギ酸処理により発生した細かい粒子に非特異的に吸着されてしまい、その結果、角閃石系アスベ
ストヘ結合する量が大幅に低下したと考えられる。一方で、改変型TmAFPは従来のHNSタンパク質よりも特異性が高いため、ギ酸処理により発生した細かい粒子に非特異的に吸着されず、角閃石系アスベストへ結合する量がほとんど低下しなかったと考えられる。

次に、実際の建材サンプルを用いて評価を行なった。具体的には、12.3％のクロシドライトを含む吹付け材と3.3％のアモサイトを含む建材を用いた。上記と同様に、ギ酸処理後に蛍光標識した改変型TmAFPを結合させた。洗浄後、処理したサンプルを蛍光顕微鏡で観察を行なった。その結果、吹付け材及

(A)吹付け材サンプル

(B)建材サンプル

図10、吹付け材（A）と建材(B)に含まれる角閃石系アスベストの蛍光検出。

び建材サンプルの両方とも、角閃石系アスベストだと思われる繊維に、強い蛍光が観察された（図10）。以上の結果から、改変型TmAFPを用いることで、バイオ蛍光法を建材中の角閃石系アスベストにも応用できることがわかった。また、すでに開発しているDksAを用いれば、クリソタイル（蛇紋石系アスベスト）が検出できる。以上、建材のギ酸処理からプローブ結合まで10分で終了するアスベスト迅速検査法が開発できた。

## 2）現場での計測が可能な小型 蛍光顕微鏡の開

現場で蛍光法をより迅速に実施するためには、携帯型の蛍光顕微鏡が必要である。3Dプリンターによる試作器の製作や、WiFi機能付きカメラ

（DSC-QX100、ソニー社）、タブレットPC(iPad-mini2、アップル社)などの家庭用機器を利用した試作器の製作を試みた（図11）。その中で、iPad-miniを利用すると非常に使いやすく、安価で高性能な蛍光顕微鏡

タブレット利用型試作機

Wi-Fi付きカメラ

1W LED

接眼レンズ

XYメカニカルステージ

ミラーキューブ

(光学フィルター、

ダイクロイックミラー)

対物レンズ

対物レンズ	x20 / 0.4
接眼レンズ	x10 / 20
励起光源	1W型 Blue(470nm) LED
位置調節
機構	XYメカニカルステージ
Z軸精密移動ステージ
カメラ	センサータイプ	1.0型 裏面照射CMOS
画素数	約20M px
ピクセルサイズ	約2.4 x 2.4 um
寸法	183mm(幅) x 160mm(奥行) x 370mm(高さ)
重量	2.6kg

図11、WiFi機能つきカメラを利用した小型蛍光顕微鏡の試作
が開発可能であることが分かった。そこで、iPad-miniを利用した試作器をさらに改良し、現場への携行性と使用感を高めたモデルの試作を行った。その結果、箱型ボディー内部に光学系（レンズ20倍、開口数0.4、LED励起光470nm、蛍光フィルター510nm）を収納し、片手で持てるキャリングハンドルを装備し、モバイルバッテリーで動作可能なiPad蛍光顕微鏡が完成した（図12）。天板にiPadを載せることで、iPadの背面内蔵カメラを光路に接続すると、ディスプレイ上の表示倍率において約300倍、iPadの表示拡大機能を使えば約1,000倍で観察を行うことができた。理論上の分解能は0.7μmであった。完成した顕微鏡でアスベストの蛍光観察を行ったところ、iPadの画面上で明瞭に観察することが可能であった。また、iPadの通信機能を使って、離れた検査室に画像をリアルタイムで送ることができた（図13）。これによって、現場に熟練者がいなくとも、検査室に送る事で、判定のサポートができると考えられた。あるいは、ホストコンピュータで解析して、自動で結果をレポートすることも可能と考えられた。バイオ蛍光法によるアスベスト測定実施のために有力な顕微鏡として利用できると考えられた。

図12、開発した携帯型蛍光顕微鏡。

図13、遠隔地でのサポート。iPadの通信機能を利用して、リアルタムに遠隔地で同一画像を見ることが出来る。

## （３）ナノ材料に結合する蛍光バイオプローブの開発と蛍光検出への応用

## 1 ）カーボンナノチューブの蛍光検出

カーボンナノチューブ（CNT）は、グラフェンシートが単層または多層で繊維状になった物質で、他ではみられない特殊な物性をもつことから、エレクトロニクス分野をはじめさまざまな分野で応用されている。しかし、CNTは、繊維状の形状を持ちアスベストと同じように、悪性中皮腫を引き起こす事が報告された。現在、CNTの観察には電子顕微鏡が用いられており、日常的にCNTの飛散をモニタリングする方法は確立されていない。バイオ蛍光法で観察できる微細クリソタイルの直径は、30-35nmであることがわかっている。ナノマテリアルは、通常の光学顕微鏡では見ることができないくらい小さいが、蛍光でラベルすれば、その存在は可視化できる。そこで、CNTの検出にバイオ蛍光法を応用すれば、手間のかかる電子顕微鏡と比べ、はるかに簡便にCNTを検出できると考えられた。

CNTは非常に疎水性が高いことが知られている。細胞膜も同様に疎水性が高いので、細胞膜に結合するペプチドなら、CNTにも結合するのではないかと考え検討を行なった。細胞膜結合ペプチド
として、哺乳類の細胞膜に結合する事がわかっているMatoparan-X（14アミノ酸から成るペプチド）を用いた。このペプチドをビオチン化し、Cy3で標識されたストレプトアビジン(Streptavidin-Cy3)と混合して蛍光標識し、蛍光検出プローブ

(Mastoparan-X-Streptavidin-Cy3)を作製した。この蛍光検出プローブが、CNTに結合するか確認を行なうために、まず多層カーボンナノチューブ(MWCNT)への結合を観察した。このMWCNTの直径は約140nmという大きさのため、位相差顕微鏡でも観察することができた。蛍

図14、多層カーボンナノチューブ(MWCNT)の蛍光顕微鏡観察

光検出プローブとMWCNTをチューブ中で混合し蛍光顕微鏡で観察を行なったところ、MWCNTが蛍光で光っている様子が観察された（図14）。この事から、細胞膜結合ペプチドはCNTに結合できることが分かった。次に、単層カーボンナノチューブ(SWCNT)を蛍光検出プローブによって検出できるか検討を行なった。その結果、金属型と半導体型の両方のSWCNTを蛍光顕微鏡で検出することができた（図15）。SWCNTの場合、直径が約1.5nmと非常に細いため、位相差顕微鏡では見えないのに対し、蛍光顕微鏡では蛍光で可視化できていた（図15）。

(A)金属型SWCNT

(B)半導体型SWCNT

図15、単層カーボンナノチューブ(SWCNT)の蛍光顕微鏡観察結果。金属型（A）と半導体型(B)の両方のSWCNTを蛍光で可視化することができた。

## 2 ）ナノ粒子（酸化チタン、酸化亜鉛、銀）の蛍光検出

ナノ材料は、100 nm以下の非常に小さいサイズを持つことから、バルク材料にはない特性を有しており医薬品や化粧品などの製品に使用されている。しかし、一方で吸引による生体影響への懸

表3、無機材料と結合ペプチド

材料	結合ペプチド	文献
酸化チタン(TiO₂)	RKLPDAPGMHTW	Sano et al., Langmuir (2005) 21, 3090-3095
酸化亜鉛(ZnO)	EAHVMHKVAPRP	Umetsu et al. Adv. Mater. (2005) 17, 2571-2575
銀(Ag)	IRPAIHIIPISH	Naiki et al., Adv. Funct. Mater. (2004) 14, 25-30
念がされている。酸化チタンでは、発がん性があることが報告されており、また銀のナノ粒子は、神経毒性が報告されている。酸化亜鉛ナノ粒子は、毒性は低いが一時的な肺の炎症作用を持つことが報告されている。ナノ粒子を管理するためには、測定法が必要となるが、ナノ粒子は通常の光学顕微鏡では見えないことから観察や測定を電子顕微鏡に依存しており、簡便な測定法は未だ確立されていない。そこで、これらのナノ粒子を、蛍光で簡便に検出する技術の開発を行なった。

本研究室では、ビオチンで標識したペプチドを蛍光標識されたストレプトアビジンの1分子上に4つ提示させたプローブは、単一のペプチドに比べ飛躍的に結合力を向上することを見出している。

この技術を無機材料結合ペプチドに

応用することを試みた。ナノ粒子に結合するペプチドには、すでに報告されている無機材料結合ペプチドを利用した（表3）。例えば、酸化チタン結合ペプチドでは、結合ペプチドの配列（RKLPDAPGMHTW）の後にGGGSGGGSのリンカー配列を付加し、C末端にビオチンを修飾したペプチドを作製した。このペプチドとCy3で標識されたストレプトアビジンを混合することで、酸化チタン検出用蛍光プローブを作製した。また、酸化亜鉛と銀の可視化にも同様にビオチン標識ペプチドを合成し、検出用蛍光プローブを作製した。

まず、酸化チタンのナノ粒子の蛍光検出を行なった。酸化チタン検出用蛍光プローブと酸化チタンナノ粒子とをチューブ中で反応させた後、位相差と蛍光顕微鏡で観察を行なった。位相差顕微鏡では、粒子の形態はほとんど観察できないのに対し、蛍光顕微鏡では酸化チタンのナノ粒子を可視化すことができた（図16A）。同様に、酸化亜鉛ナノ粒子と銀ナノ粒子についても蛍光検出を行なったところ、位相差顕微鏡では、粒子の形態はほとんど観察できないのに対し、蛍光顕微鏡では酸化亜鉛ナノ粒子と銀ナノ粒子をそれぞれ可視化することができた（図16B、C）。

(A) 酸化チタンナノ粒子

(B) 亜鉛ナノ粒子

(C) 銀ナノ粒子

図16、酸化チタンナノ粒子(A)、酸化亜鉛ナノ粒子(B)、銀ナノ粒子(C)の位相差及び蛍光顕微鏡の観察結果
以上の結果から、どのナノ粒子も蛍光で可視化することに成功したが、どの程度の大きさのナノ粒子を検出できているのかは分からなかった。そこで、蛍光で検出されたナノ粒子の粒子径を調べるために、光電子相関顕微鏡を用いた検討を行なった。この顕微鏡は、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で共通した試料台を用いて位置情報を共有することで、蛍光で観察した同じ視野を、電子顕

(A) 電子頸微鏡観察 (4650 倍)

(B) 電子頻微鏡観察（17600 倍）

図17、蛍光検出できた酸化チタンナノ粒子の電子顕微鏡観察結果。蛍光顕微鏡（400倍）とほぼ同じ位置に酸化チタンナノ粒子が確認できた（A）。ナノ粒子の位置を推測し、拡大していくと約17,600倍の倍率ではっきりとナノ粒子を観察する事ができ、165nm、98nmのナノ粒子であることが分かった（B）。
微鏡でも観察することができる。まず、蛍光染色した酸化チタンナノ粒子をフィルター上に固定化し、蛍光顕微鏡で観察後、電子顕微鏡で同じ視野を観察した(図17)。蛍光とほぼ同じ位置に酸化チタンナノ粒子が確認できたが、電子顕微鏡画像（倍率4,650倍）では、粒子が見えづらく、蛍光画像の方が観察しやすいことが分かった（図17A）。電子顕微鏡での倍率を約17,600倍まで上げて観察すると、ナノ粒子をはっきりと観察することができた（図17B）。これらの粒子サイズを測定した結果、165 nmと98 nmであることが分かった（図17B）。

次に、酸化亜鉛ナノ粒子について同様な検討を行なった。蛍光とほぼ同じ位置に酸化亜鉛ナノ粒子が確認できた（図18A）。さらに、電子顕微鏡での倍率を約8,600倍まで上げて観察すると、ナノ粒子をはっきりと観察することができ、粒子のサイズを測定した結果、168 nmと218 nmであることが分かった（図18B）。次に、銀ナノ粒子について検討を行なった。蛍光とほぼ同じ位置に銀ナノ粒子が確認できた（図19A）。さらに、電子顕微鏡での倍率を約11,000倍まで上げて観察すると、ナノ粒子をはっきりと観察することができた。この粒子サイズを測定した結果、190 nmであることが分かった（図19B）。

以上の結果から、3種類のナノ粒子は、いずれも100 nm～200 nm程度の大きさであった。ナノ粒子の一次粒子は100 nm以下なので、蛍光で観察できた粒子は、いくつかの粒子が集まったものであると推測される。そこで、一次粒子を検出するためさらに検討を行なった。具体的には、高輝度蛍光色素であるBrilliant Blue 515が標識されたストレプトアビジンを利用することで検出感度を向上させることができるのではないかと考え検討を行なった。この蛍光色素（Brilliant Blue 515）は、最も一般的な蛍光色素であるFluoresceinの約7倍の蛍光強度を持つことが知られている。酸化チタン結合ペプチドとBrilliant Blue 515で標識されたストレプトアビジンを利用して、高輝度の酸化チタン検出用蛍光プローブを作製した。この高輝度蛍光プローブで、酸化チタンナノ粒子を蛍光染色し、光電子相関顕微鏡で解析を行なった。上記の光電子相関顕微鏡で評価した際、ナノ粒子を光電子相関顕微鏡で見つけ出すことが非常に困難であった。具体的には、蛍光で観察した視野（400倍）の位置情報の誤差は、電子顕微鏡でナノ粒子を観察する際（数万倍）には非常に大きくなり、電子顕微鏡でナノ粒子の位置を特定するのは容易ではなかった。そこで、あらかじめ蛍光で染色したアスベスト繊維をマーカーとして用いて、マーカーの位置情報からナノ粒子の位置を特定することで、複数の視野でナノ粒子の位置を特定し観察を行えるようにした。上記の蛍光染色した酸化チタンナノ粒子を固定したフィルターに、蛍光で染色したアスベスト繊維をマーカーとして固定化した。このように調製したサンプルを蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で観察を行なった（図20）。電子顕微鏡で、マーカーであるアスベスト繊維は観察しやすいが、一方でナノ粒子は非常に見つけにくい様子が分かる（図20A）。マーカーの位置から、これによりナノ粒子の位置の特定も容易にできた。電子顕微鏡で観察された酸化チタンナノ粒子のサイズを測定したところ、約44 nmであることが分かった（図20B）。使用した酸化チタンの一次粒子のサイズが21 nm程度あることから、これは一次粒子ではないと推測された。そこで、さらに別の視野を観察したところ、サイズが約28 nmの酸化チタンナノ粒子を観察することができた（図21A）。これは、酸化チタンナノ粒子の単粒子を観察できたと考えている。さらに、蛍光画像と電子顕微鏡画像を重ねあわせると、両者がよく一致した（図21B）。ナノ粒子の蛍光が電子顕微鏡の粒子サイズより大きく観察された。光学顕微鏡の分解能は250 nm程度であるので（回折限界）、蛍光は実際のナノ粒子よりも大きく観察されたと考えられる。蛍光法では、分解能の限界でナノサイズの正確な計測
は出来ないものの、ナノ粒子を簡便に検出することが可能であることが分かった。

(A) 電子頸微鏡観察 (6760 倍)

(B) 電子顕微鏡観察 (8670 倍)

図18、蛍光検出できた酸化亜鉛ナノ粒子の電子顕微鏡観察結果。蛍光顕微鏡（400倍）とほぼ同じ位置に酸化亜鉛ナノ粒子が確認できた（A）。ナノ粒子の位置を推測し、拡大していくとはっきりとナノ粒子を観察する事ができ、168nm、218nmのナノ粒子であることが分かった（B）。
(A) 電子頸微鏡觀察 (4280 倍)

(B) 電子頸微鏡觀察（11130 倍）

図19、蛍光検出できた銀ナノ粒子の電子顕微鏡観察結果。蛍光顕微鏡（400倍）とほぼ同じ位置に酸化チタンナノ粒子が確認できた（A）。ナノ粒子の位置を推測し、拡大していくと約11000倍の倍率ではっきりとナノ粒子を観察する事ができ、190nmのナノ粒子であることが分かった（B）。
(A) 電子顕微鏡観察（11600倍）

(B) 電子顕微鏡観察 (28960 倍)

図20、高輝度蛍光色素を用いて検出できた酸化チタンナノ粒子の電子顕微鏡観察結果。マーカーであるアスベスト繊維は観察しやすいが、一方でナノ粒子は非常に見えにくい（A）。マーカー（蛍光標識したアスベスト）の位置からナノ粒子の位置を推測し、拡大していくと約29000倍の倍率ではっきりとナノ粒子を観察する事ができ、44nmのナノ粒子であることがわかった（B）。
(A) 電子顕微鏡觀察（27780 倍）

(B) 電子顕微鏡観察画像と覚光顕微鏡画像の重ねあわせ

図21、高輝度蛍光色素を用いて検出できた酸化チタンナノ粒子の電子顕微鏡観察結果。マーカー（蛍光標識したアスベスト）の位置からナノ粒子の位置を推測し、拡大していくと約28000倍の倍率ではっきりとナノ粒子を観察する事ができ、28nmのナノ粒子であることがわかった（A）。電子顕微鏡と蛍光顕微鏡の観察を重ね合せた結果、両者がよく一致している様子がわかる（B）。
## 3 ）銀ナノ粒子結合タンパク質の探索と蛍光検出

さらにアスベスト結合タンパク質と同様の手法を用いて、新たに銀ナノ粒子に結合するタンパク質の探索を行った。大腸菌の中には、約4,000種類のタンパク質が存在する（タンパク質ライブするタンパクを探した(図22）。MALDI-TOF質量分析によってタンパク質の解析を行なったところ、45 kDa付近のものはelongation factor Tu（EF-Tu）、21.5 kDa付近のものはTranscription elongation factor（GreA）であると同定することができた。

同定されたEF-Tu及びGreAについて結合能の評価を行うために、それぞれのタンパク質の発現と精製を行なった。EF-Tuタンパク質の発現にはpET-tufBベクターを用い、GreAタンパク質の発現にはpET-GreA-AviTagを用いた。これらのプラスミドを大腸菌BL21(DE3)に導入することでタ

図22、銀結合タンパク質の電気泳動

ンパク発現を行ない、HisTagを用いたアフィニティクロマトグラフィによりタンパク質を精製した。その結果、全ての発現条件で、タンパク質の可溶性で発現しており精製する事ができた。その中でもEF-Tuは15℃培養、GreAは37℃培養の条件で発現及び精製したサンプルの純度が高かったため、これらの精製タンパク質を用いて蛍光標識を行なった。

精製したEF-Tu、GreAタンパク質をCy3で蛍光標識し、蛍光検出プローブを作製した。蛍光標識率（タンパク質に結合する蛍光分子のモル数を全タンパク質のモル数で割ったもの）は、EF-Tu-Cy3は0.79、

(A) EF-Tu-Cy3 を用いた銀ナノ粒子の蛍光顕微鏡観察

(B) Gre-A-Cy3 を用いた銀ナノ粒子の蛍光顕微鏡観察

図23、EF-Tu-Cy3(A)とGre-A-Cy3(B)を用いた銀ナノ粒子の蛍光顕微鏡観察結果。
GreA-Cy3は0.59であった。作製したEF-Tu-Cy3，GreA-Cy3を終濃度50 nM、銀ナノマテリアルを終濃度200 pg/mlとなるように10 mM Tris-HCl (pH7.5)条件下で混合し、蛍光頭微鏡により観察を行なった。その結果、EF-Tu-Cy3とGreA-Cy3のどちらでも、位相差頭微鏡では見えない銀ナノ粒子を蛍光可視化できることが分かった(図23)。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

バイオ蛍光法は、蛍光で修飾したアスベスト結合タンパク質によって、アスベストを蛍光で可視化する世界で初めての技術である。バイオイメージングの世界を無機物質の検出に広げたことは、科学的に大きな意義がある。バイオ蛍光法では、これまで電子顕微鏡でしか見えなかった微細なアスベスト繊維が「低倍率」で見えることが分かった。また、環境ナノ粒子や工業用ナノ材料の観察には透過型電子顕微鏡や原子間力顕微鏡などが用いられているが、これらの方法は装置自体が非常に高価であるうえ、高倍率の観察であるため時間がかかる。バイオ蛍光法は、広い視野でも電子顕微鏡なみの感度と位相差顕微鏡なみの手軽さで見えるため、現場などの日常的なアスベストやナノ材料の検出法として有望である。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

平成26年環境省水大気環境局大気環境課による「建築物の解体等に関わる石綿飛散防止マニュアル」にバイオ蛍光法が記載され（p.146）、石綿飛散防止に貢献した。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

解体現場等が我が国におけるアスベスト繊維の主要な発生源であることに鑑み、公定法とは別に新たな迅速計測法が求められている（環境省アスベストモニタリングマニュアル第4版）。しかしながら、現場でのアスベスト飛散のモニタリングに対応する技術は未だ確立されておらず、バイオ蛍光法の実証と普及が求められている（第10回中央環境審議会大気・騒音振動部会石綿飛散防止専門委員会、資料1、p.6）。バイオ蛍光法は、平成25年6月21日に改正された大気汚染防止法（アスベストのモニタリングを強化）への対応に貢献できる。

一方、近年技術開発が進んでいるナノ材料については、環境中への放出による人の健康や環境への影響が懸念されているが、生体・環境毒性評価に関する試験手法の確立、環境・生体中の動態等に関する知見の集積、ナノサイズの粒子の特性を踏まえた環境リスクの評価方法の確立等が課題となっている。特にナノ材料による環境影響防止に向けた検討の基盤として、一般環境中及び生体内におけるナノ材料の動態解析ツールの開発が不可欠とされている。バイオ蛍光法はナノ材料の検出にも応用可能であり、リスク管理・評価手法の高度化を図る行政ニーズに貢献する。
## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) M. Alexandrov, E. Ichida, T. Nishimura, K. Aoki, T. Ishida, R. Hirota, T. Ikeda, T. Kawasaki, A. Kuroda: Environ Monit Assess, 187, 4166-4167 (2015)

“Development of an automated asbestos counting software based on fluorescence microscopy”

2) A. Kuroda, M. Alexandrov, T. Nishimura, T. Ishida: Biotechnology Journal, in press (2016) "Rapid on-site detection of airborne asbestos fibers and potentially hazardous nano materials using fluorescence microscopy-based biosensing"

3）黑田章夫、石田丈典、西村智基、M. Alexandrov、市田越子、青木功介、松田俊寛、河崎哲男、関口潔：作業環境、36(2)、53-58（2015）

「蛍光顕微鏡法によるアスベスト検査と自動化ソフトウェアの開発」

## くその他誌上発表（査読なし）>

1）黒田章夫、石田丈典、西村智基、アレキサンドロフマキシム：化学工業、65(7), 524-531(2014)「バイオ技術を駆使したアスベストの検出技術」

2）黒田章夫、石田丈典、西村智基、アレクサンドロフ・マクシム：環境バイオテクノロジー学会誌、印刷中

「スマートバイオセンシングによるアスベスト検出」

3）黒田章夫：建築設備と配管工事、印刷中

「アスベスト検知装置」

## （2） 口頭発表（学会等）

1）黑田章夫、石田丈典、西村智基、M. Alexandrov、神山宣彦：日本労働衛生工学会、2014年11月14日

「蛍光顕微鏡法によるアスベスト分析とその利用について」

2) A. Kuroda: The Francis Crick Institute Seminar, United Kingdom, May 5, 2015

"Design of protein interface to inorganic materials and its application to nanomaterial-monitoring"

3）黒田章夫：第14回国際バイオテクノロジー展アカデミックフォーラム、2015年5月14日「アスベスト萤光染色用バイオプローブ開発」

4）黑田章夫：第67回日本生物工学会、2015年5月28日

「アスベストバイオプローブ開発とスマートバイオセンシングへの展開」

5）石田 丈典、池田 丈、廣田 隆一、黒田 章夫：第67回日本生物工学会、2015年5月28日「カーボンナノチューブ結合ペプチドを用いた蛍光検出技術の開発」

6）黒田章夫、石田丈典、土井奨平、西村智基、Maxym Alexandrov、神山宣彦：日本労働衛生工学会、2015年10月21日、「ナノマテリアルの蛍光検出技術開発」
## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1）環境省環境調査研修所セミナー、「蛍光顕微鏡法によるアスベスト繊維の検出の原理」、（主催：環境省環境調査研修所（所沢市）、平成26年6月4日、受講者10名）

2）広島大学公開講座、「バイオでアスベストを検出する」（主催：広島大学、平成26年8月30日、広島県民文化センター、観客60名）にて講演

3）環境省環境調査研修所セミナー、「蛍光顕微鏡法によるアスベスト繊維の検出の原理」、（主催：環境省環境調査研修所（所沢市）、平成26年10月8日、受講者10名）

4）環境省環境調査研修所セミナー、「蛍光顕微鏡法によるアスベスト繊維の検出の原理」、（主催：環境省環境調査研修所（所沢市）、平成27年5月27日、受講者10名）

5）広島大学公開講座、「バイオでアスベストを検出する」（主催：広島大学、平成26年8月30日、広島県民文化センター、観客100名）にて講演

6）研究100連発、「バイオ蛍光法で観る！世界」（主催：科学技術振興機構、日本科学未来館、平成27年11月14日、観客約60名）にて講演

7）環境省環境調査研修所セミナー、「蛍光顕微鏡法によるアスベスト繊維の検出の原理」、（主催：環境省環境調査研修所（所沢市）、平成27年11月18日、受講者10名）

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1) 日本経済新聞（2016年1月25日、全国版、13頁）

## (6) その他

1）平成28年度、「環境賞」環境大臣賞、

「携帯型蛍光顕微鏡による微細アスベスト迅速検査法の開発」

### 8 \. 引用文献

特に記載すべき事項はない
# Practical Application of Biofluorescence Method to Asbestos Detection and Nanomaterial Visualization and Tracking

Principal Investigator: Akio KURODA

Institution: Hiroshima University, Graduate School of Advanced Sciences of Matter

1-3-1 Kagamiyama, Higashi-Hiroshima, Hiroshima

739-8530, JAPAN

Tel: +81-82-424-7758 / Fax: +81-82-424-7047

E-mail: akuroda@hiroshima-u.ac.jp

## [Abstract]

Key Words: Asbestos, Rapid detection, Fluorescence, Bioprobe, Nanomaterials

Biofluorescence method is an analytical method that uses fluorescently labelled proteins or peptides specifically binding to target inorganic materials in order to visualize them under fluorescence microscopy. Using asbestos-binding protein, we found that single asbestos fibrils with a diameter of approximately 30 nm could be observed under fluorescence microscope. Asbestos fibers that are stained using biofluorescence method glow against the dark background, making it possible to visualize even those fibers that are thinner than the resolution limit of optical microscopy (and could be previously observed only using electron microscopy). A notable advantage of biofluorescence method is that by observing the fibers under fluorescence microscope, it is possible to simultaneously confirm if they are asbestos by the presence of fluorescent staining. On the other hand, when using the official method of asbestos analysis, elemental composition of each fiber has to be individually analyzed using specific X-rays emitted under electron beam. Since this method requires highly skilled analysts and is extremely time-consuming, it is considered unsuitable for asbestos risk monitoring at demolition sites. In order to obtain official approval for the application of biofluorescence method to the analysis of airborne asbestos fibers and to facilitate its practical use, this research seeks to accumulate data on statistical correlation between the test results obtained by biofluorescence method and the currently approved (electron microscopy-based) method. Our data for 64 field samples demonstrated high correlation between the test results by biofluorescence method and the officially approved (electron microscopy-based) method (r=0.87). We also succeeded in developing a portable fluorescence microscope for use in rapid on-site testing by biofluorescence method. Seeking to promote wider use of biofluorescence method beyond asbestos analysis, we have obtained binding peptides for titanium and zinc oxides, carbon nanotubes and silver nanoparticles, and developed
fluorescent bioprobes that bind to these potentially toxic nanomaterials. All of the target materials were successfully visualized under fluorescence microscopy, expanding the application of biofluorescence method to detection and tracking of toxic nanomaterials.
## 資料集

解体現場大気サンプルを用い、萤光法（位相差萤光法）と公定法（電子頭微鏡法）で計測したアスベスト濃度の比較を行った（図3、図4）。本資料集では、その際の位相差画像と萤光画像、電子頭微鏡の画像とEDX分析を行った結果を掲載している。位相差萤光法では、位相差頭微鏡で観察した繊維が蛍光を持つ場合には、アスベストと判定した。ただし、ロックウールなどは、繊維の回りに薄く蛍光を持つものが存在するので、その場合は「蛍光なし」と判定した。また、蛍光粒子が繊維の回りに付着している様な場合も「蛍光なし」と判定した。
EDXスペクトル

SEM像(倍率：1600倍)

電子頸微鏡法

アスベスト測定結果（位相差蛍光法：36本/L、電子顕微鏡法：26本/L）

位相差蛍光法（対物40倍＋デジタル）

試料：No.01 解体現場
EDXスペクトル

アスベスト

アスベスト測定結果（位相差蛍光法：36本/L、電子顕微鏡法：26本/L）

SEM像 (倍率:1600倍)

電子頸微鏡法

位相差蛍光法（対物40倍＋デジタル）

試料：No.01 解体現場
EDXスペクトル

アスベスト

アスベスト測定結果（位相差蛍光法：8.7本/L、電子顕微鏡法：5.9本/L）

SEM像（倍率：1600倍）

電子頸微鏡法

位相差蛍光法（対物40倍＋デジタル）

試料：No.02 解体現場
EDXスペクトル

アスベスト測定結果（位相差蛍光法：8.7本/L、電子顕微鏡法：5.9本/L）

SEM像(倍率：1600倍)

電子頸微鏡法

位相差蛍光法（対物40倍＋デジタル）

試料：No.02 解体現場
EDXスペクトル

SEM像（倍率：1600倍）

電子顕微鏡法

アスベスト測定結果（位相差蛍光法：2.4本/L、電子顕微鏡法：4.4本/L）

位相差蛍光法（対物40倍＋デジタル）

試料：No.03 解体現場
EDXスペクトル

アスベスト測定結果（位相差蛍光法：27本/L、電子顕微鏡法：31本/L）

電子頸微鏡法

位相差蛍光法（対物40倍＋デジタル）

試料：No.04 解体現場
# （３）アマモ場生態系生物多様性の時空間的変動の定量評価と将来予測

東京大学大気海洋研究所

$$ 小松輝久 \cdot 西田周平 \cdot 木暮一啓 $$

<研究協力者>

東京大学大気海洋研究所

阪本真吾・佐々修司・佐野雅美・澤山周平・

宮本洋臣

平成23～27年度累計予算額：66,422千円（うち平成27年度：11,831千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

沿岸域の生物多様性保全を検討する上で重要であるアマモ場生態系を対象として、日本沿岸および東南アジア域における分布情報の収集を行った。日本沿岸については約4,000件、東南アジア域については約3,000件の情報を収集した。これらの分布情報を中心に、そのほかの関連する情報と合わせてアマモ類の生物学的生態学的に重要な海域（EBSA）候補地の選定を行なった。EBSAの評価基準については、他の沿岸域のサブグループと連携して適切かつ類似する基準を選ぶように努めた。その結果、アマモ類のEBSA候補地の基準として、アマモ類の唯一の生息地・遺伝的に特異なアマモの分布地・絶滅危惧のアマモ類の分布・海草藻場の減少率・海草藻場の生産性・アマモ類の種数・自然海岸率を用いた。評価は緯度経度1度グリッドで行い、各基準の評価値をもとに各グリッドでその合計値を求めた場合のEBSA候補地と、各基準の評価値をMarxanを用いて行った相補性解析した場合のEBSA候補地について、それらの比較を行なった。その結果、両方法で選定された候補地はほぼ同一であった。このことは、抽出されたアマモ類のEBSA候補地が、EBSAとして適当である可能性が高いことを示唆している。気候変動シナリオに基づく予測水温から、温帯と亜寒帯のアマモ類の2090-2100年における生息地の将来予測を行った。Maxentを用いた将来予測の結果、多くの種で分布域は大きく減少すると予測され、東北・北海道沿岸が重要な分布域になるという結果が得られた。また、アマモ場生物群集の迅速な生物多様性評価およびアマモ場生物群集間のコネクティビティの評価の手法として次世代シーケンサーによる解析の検討を行ない、迅速な多様性およびコネクティビティの評価手法であり、またEBSA選定の上でも有用な手法であることが認められた。さらに航空写真および衛星画像を用いて局所的スケールにおける人為的な環境改変がアマモ場の分布に与える影響の検討を行い、その結果EBSA選定の上で人為的影響によるアマモ場の分布変動についても慎重に考慮する必要があると考えられた。

## [キーワード]

アマモ場生物群集、EBSA、気候変動シナリオ、遺伝子解析、リモートセンシング

### 1. はじめに

アマモ場生態系は沿岸域において、生物多様性および生物生産力が特に高い生態系のひとつであり、我が国を含むアジア周辺海域の海洋保護区を検討する上で重要度が高い。またアマモ場は沿岸