Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
本文

④ボルテックス1min

⑤室温で10 min静置

⑥下層を分取（一回目抽出）

⑦残液にクロホルム2容添加

(溶媒：試薬特級、和光純薬工業)

純水およびLB 培地 5 ml をコントロールとし、それぞれに廃食用油 100 mg を添加した溶液を調製した。各溶液から総脂質を抽出し、添加した廃食用油の重量と、二回の抽出により得られた抽出物重量の和から、回収率を算出した。また、抽出物を TLC により脂質を分析した。

次に、リパーゼを用いて大豆油を加水分解し、総脂質を抽出した後、TLCによる分析を行った。Lipase, from Candida rugosa (Sigma-Aldrich) を50 mM Tris-HCl (pH 8.0 at 40℃) 緩衝溶液に溶解し、0.5、0.05、0.005 mg/ml リパーゼ溶液を調製した。50 mM Tris-HCl 緩衝溶液と各リパーゼ溶液 2 ml に大豆油（和光一級、和光純薬工業）40 mg を添加し、40℃で1 hr インキュベートした後、総脂質を抽出し、回収率を算出した。また、抽出物を TLC により分析し、大豆油の加水分解が評価可能であるかを確認した。

続いて、TLC による脂質分析を用いた、油脂資化菌による廃食用油の分解評価への応用を試みた。培養温度 $ 40\;^{\circ}C $ の条件下で廃食用油を唯一の炭素源として集積培養後に単離された株の中から、Cronobacter 属に属しクリアハローが観察された NB18 株と LB1 株、Acinetobacter 属に属する LB2、LB17 株を検討に用いた。1/5 LB 培地 5 ml に廃食用油 100 mg を添加した培養液を調製し、何も植菌しないネガティブコントロールと、上記菌株を植菌したものを $ 40\;^{\circ}C $ で培養し、その培養液から総脂質の抽出を行い、回収率を算出した。また、抽出物を TLC により分析し、廃食用油が分解されているかを確認した。

#### 2.4.3 GC による分析法の開発

ガスクロマトグラフィー（GC）を用いたアシルグリセロール類および脂肪酸の分析については、東京海洋大学大学院海洋科学技術研究科海洋科学系食品生産科学部門准教授の後藤直宏博士に協力を依頼し、共同研究の形で脂質分析法の開発を行った。

廃食用油含有オカラ好気発酵物からの脂質の抽出は以下の手順に従った。オカラ発酵物0.5 gをガラス製遠沈管に入れ、クロロホルム：メタノール＝2：1（v/v）溶液3 mlを添加し、ボルテックス後1,400 x gで5 min遠心分離した。液相をナス型フラスコに回収した後、残渣に再度クロロホルム：メタノール＝2：1（v/v）溶液3 mlを添加し、同様の手順により液相を回収した。ナス型フラスコに回収した脂質抽出液をエバポレータ一にかけ溶媒を留去し脂質抽出物とした。続いて、脂質抽出物のトリメチルシリル化を以下のように行った。脂質抽出物10から20 mgをバイアル瓶に入れ、Tri-Sil TP溶液（和光純薬工業）を1 ml加え攪拌後、60から70℃で湯せんした。加温後15 secボルテックスし、ヘキサン：水＝1：1（v/v）を加え、再び15 secボルテックスし、静置後に上層を分取してトリメチルシリル化脂質抽出物溶液とした。
## 本文

続いて、アシルグリセロール類および脂肪酸の GC 分析に使用するキャピラリーカラムの検討と、昇温条件などの分析条件の検討を行った。

なお、有機溶媒は全て、国産化学製の特級グレードを用いた。
## 本文

### 3. 結果と考察

### 3.1 実証試験機を用いたシステム開発

#### 3.1.1 試験に用いたオカラの性状

オカラは工場で排出されたものを取出し、その日のうちに用いた。性状を表3−1に示す。含水率は25年11月までは85%前後で推移したがそれ以後は80%程度であった。

表 3−1 オカラの性状

24年	25年
7/30	8/9	11/12	12/13	1/24	3/11	4/5	5/21	7/2	7/16	7/23	7/30
含水率	%	85.7	85.6	84.0	85.2	85.3	83.0	82.0	81.4	83.6	85.9	85.0	83.9
粗灰分(DSあたり)	%	3.7	3.6	3.4	3.5	3.4	3.7	3.4	3.4	3.8	3.8	3.8	3.7
粗脂肪(DSあたり)	%	14.9	14.7	16.1	19.1	17.7	18.3	18.1	17.7	14.1	14.8	13.3	17.0

25年	26年
8/6	11/5	11/19	11/26	12/3	12/10	12/17	3/4	平均
含水率	%	85.2	84.6	77.8	79.4	78.8	78.3	79.3	80.7	84.2
粗灰分(DSあたり)	%	3.9	3.4	3.1	3.1	3.0	3.0	3.3	3.6	3.6
粗脂肪(DSあたり)	%	16.8	16.7	13.8	13.6	15.4	12.9	12.2	13.2	16.3

#### 3.1.2 試験の内容と工程

試験の内容と工程を表3-2に示す。

表 3−2 試験の内容と工程

項目	平成24年度	平成25年	平成26年
4月	5月	6月	7月	8月	9月	10月	11月	12月	1月	2月	3月
試験項目	予備試験	菌添加効果確認試験	家庭系産食用油試験
温度	40～70℃	70℃試験	60℃試験
pH	6～7.5	pH中性域制御	弱アルカリ域pH☆脱臭装置設置(9/17)
添加菌種	市販牛・馬粪堆肥市販牛ふん発酵堆肥Geobacillus zalihae	NB 501株	磨白土混合コンポスト	油脂分解微生物群集
市販高温菌磨白土混合コンポストG. zalihae	○	○	○	○	○	○
GB 501株投入	”投入2回目	(11/12)	(12/10)	投入2回目(2/4)
廃食用油添加率	3～7.5%	5%	3%	5%	5%	0%	5%
## 本文

## 運転条件の概要

24 年度は安定した運転条件の確立を行い、さらに、予備実験として各種の菌を添加してそれらの効果を調べた。

25 年度は本試験として、NB501 株、廃白土混合コンポスト、また 60℃で集積培養した好熱性油脂分解微生物群集の添加試験を行った。

9月中頃まではアンモニアの抑制のため pH が 7.5 を超えるような場合はクエン酸を適宜添加して中性域に制御して試験した。しかし油脂分解活性が高い菌は弱アルカリ域が適性であることから脱臭装置を新たに設置し、それ以降は pH を制御せずに弱アルカリ域での運転とした。

9月中頃から12月後半まで連続安定運転期間として安定した運転が継続できることの確認を行った。

## 試験内容

4月から5月にかけて70℃での運転試験を行った。以後は60℃での運転を継続した。

25年6月～26年2月の期間には、以下のとおり、添加試験を行った。

・6月11日～6月25日（2週間）：コントロール条件（菌を添加しない条件）

·6月25日～7月16日（3週間）：NB501株添加1回目（40g）

·7月23日～8月13日（3週間）：NB501株添加2回目（100 g）

・11月5日～11月12日（1週間）：コントロール週（廃白土コンポスト添加前週）

・11月12日～12月10日（4週間）：廃白土コンポスト添加

·12月10日～12月24日（2週間）：好熱性油脂分解微生物群集添加1回目（4.7g）

·2月4日～2月18日（2週間）：好熱性油脂分解微生物群集添加2回目（10 g:未分析）

なお、25年3月末（70℃運転前）に Geobacillus zalihae の添加試験を行ったが、良好な結果は得られなかった。

26年3月には、家庭から排出された廃食用油を用いた試験を行った。

#### 3.1.3 70℃での試験

高温発酵では排気の温度・絶対湿度が高く、したがってエンタルピーも高いが、それ以上に排気量が少なくて済むため排気が持ち出す熱量（排気損失）は中温発酵より少ない。図3－1、表3－3に排気温度が中温発酵領域である40℃の排出熱量を1.0としたときの各温度での排気損失を示す。
図 3−1 单位水分量を排気が持ち出す際の熱量（排気の損失）

単位水分を持ち出すのに必要な排気量（kgDA/kg 水）=1 ÷ （χ 排気－χ 給気）

(kg/kgDA)

$$ 非気のエンタルピ一 \quad(kJ/kgDA)=4.186\times\left\{0.240t+\left(597.3+0.441t\right)\chi\right\} $$

表 3−3 温度と単位水分を持出すのに必要な熱量（排気損失）、排気量、エンタルピー

排気の温度	℃	40	50	60	70	80
排気損失	—	1.00	0.76	0.65	0.59	0.55
排気損失	kJ/kg水	5,198	3,931	3,374	3,068	2,883
排気量	kgDA/kg水	31.7	14.4	7.4	3.9	1.9
排気のエンタルピー	kJ/kgDA	164	273	457	796	1,524

従って微生物活性が高く保てるのであれば高温の方が効率が良いことから、70℃での試験を行った（図3-2）。
本文

図 3−2 70℃での pH 推移とアンモニア生成濃度

70℃試験では pH が 7 を下回り弱酸性域に留まった。アンモニアもほとんど生成せず、微生物活性は低い状態で推移した。その後に行った 60℃試験では pH は 8 前後の弱アルカリ性になり、アンモニアも高い濃度で生成した。さらに、NB501 株由来細胞外リパーゼ活性の至適温度は 60℃であることも判明した（図 3-3：詳しくは次節参照）。以上の結果をまとめたのが表 3-4 である。したがって、以後の試験は 60℃で行った。

図 3−3 NB501 株由来細胞外リパーゼ活性の至適温度

表 3−4 温度による熱効率と微生物活性

50℃	60℃	70℃
熱効率	低ⅱ	高ⅱ
微生物活性※	低ⅱ	最適	低ⅱ

$ ^{※} $ NB501株
#### 3.1.4 廃白土混合コンポスト添加での試験結果

他の試験と比べて、もっとも高い油脂分解効果が得られた（詳細は次節を参照のこと）、廃白土混合コンポスト添加の結果を示す。廃白土混合コンポストとは、油脂の脱色、精製に使用した活性白土（油脂を多く含む）を副資材として作成されたコンポストである。この前々週は油を添加しない週であり、添加前週（コントロール週）から第4週までの結果を一連の添加実験とみなすことができる。

表 3−5 に分解量と分解率（粗分析値による概算）の推移を示す。添加週は分析値に異常があったので示していない。表 3−6 に平均発酵日数を 5 日間として 1 日当たりの分解率を示す。無添加週の油分分解率が高い値を示しているのは、廃食用油を添加していないので見かけ上高いが、分解量では多くない。

表 3−5 廃白土混合コンポスト添加試験の分解量と分解率

油無添加週	コントロール週	廃白土混合コンポスト添加第1週	〃第2週	〃第3週	〃第4週
分解量	乾物分解量	kg/週	14	14	-	28	24	29
油分分解量	kg/週	3.3	3.6	-	6.6	5.7	8.8
分解率	乾物分解率	%/週	19	13	-	21	19	22
油分分解率	%/週	26	10	-	16	15	21

表 3−6 一日あたり 乾物と油分の分解率

油無添加週	コントロール週	廃白土混合コンポスト添加第1週	〃第2週	〃第3週	〃第4週
分解率	乾物分解率 %/日	3.8	2.6	-	4.2	3.8	4.4
油分分解率 %/日	5.2	2	-	3.2	3.0	4.2

したがって、1日当たりの分解率は乾物、油分ともに4%程度であり、既報告事例と比べても乾物では同等か高い結果が、また油分では以下に示すように畜ふん＋生ごみでの事例と比し大幅に高い結果が得られた。

この期間の試験結果の詳細を表3-7に示す。
## 本文

表 3−7 廃白土混合コンポスト添加試験結果

25年11月～12月	10/29	30	31	11/1	2	3	4	週計	5	6	7	8	9	10	11	週計	12	13	14	15	16	17	18	週計
火	水	木	金	土	日	月	kg	火	水	木	金	土	日	月	kg	火	水	木	金	土	日	月	kg
おから投入量	kg	100	100	100	100	0	0	500	100	100	100	100	100	0	0	500	100	100	100	100	100	0	0	500
廃食用油投入量	kg	0	0	0	0	0	0	0	5	5	5	5	5	0	0	25.0	5	5	5	5	5	0	0	25.0
おから含水率	%	84.6	84.6	84.6	84.6	84.6	84.6	84.6	84.6	84.6	84.6	85.8	77.8	77.8	77.8
おから	おから乾物量	kg	15.4	15.4	15.4	15.4	77	15.4	15.4	15.4	15.4	15.4	0	0	77	14.2	22.2	22.2	22.2	22.2	103
”粗灰分（湿物あたり）	%	0.52	0.52	0.52	0.52	0.52	0.52	0.52	0.52	0.52	0.52	0.52	0.69	0.69	0.69	0.69
”粗脂肪（“）	%	2.58	2.58	2.58	2.58	2.58	2.58	2.58	2.58	2.58	2.58	2.58	3.07	3.07	3.07	3.07
”粗灰分（DSあたり）	%	3.4	3.4	3.4	3.4	3.4	3.4	3.4	3.4	3.4	3.7	3.1	3.1	3.1	3.1
”粗脂肪（“）	%	16.7	16.7	16.7	16.7	16.7	16.7	16.7	16.7	16.7	16.7	18.2	13.8	13.8	13.8	13.8
廃（投食お入用から）+料	全乾物量	kg	15.4	15.4	15.4	15.4	77	20.4	20.4	20.4	20.4	102	19.2	27.2	27.2	27.2	128
全油分量	kg	2.6	2.6	2.6	2.6	2.6	12.9	7.6	7.6	7.6	7.6	7.6	37.9	7.6	8.1	8.1	8.1	39.9
投入原料灰分(DSあたり)	%	3.4	3.4	3.4	3.4	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.7	2.5	2.5	2.5	2.5
投入原料粗脂肪(DSあたり)	%	16.7	16.7	16.7	16.7	16.7	37.1	37.1	37.1	37.1	37.1	39.5	29.7	29.7	29.7	29.7
発酵後	”含水率	%	13.1	32.6	39.0	39.5	43.6	44.0	20.2
”粗灰分（湿物あたり）	%	3.6	2.8	2.3	2.3	2.0	2.0	2.8
”粗脂肪（“）	%	29.5	17.7	17.4	17.7	17.3	17.5	26.0
”粗灰分（DSあたり）	%	4.1	4.1	3.8	3.7	3.6	3.6	3.5
”粗脂肪（“）	%	33.9	26.3	28.5	29.3	30.6	31.2	32.6
取出し量	kg	80	92	86
”乾物量	kg	70	62	68
”油分量	kg	24	16	22
残存量	kg	105	126	97
”乾物量	kg	91	85	77
”灰分量	kg	3.7	3.5	2.7
”油分量	kg	30.8	22.3	25.1
発酵槽内累積灰分量	kg	3.7	4.2	4.8	5.3	5.8	6.3	6.3	6.3	6.3	3.5	4.0	4.5	5.1	5.6	6.1	6.1	6.1	6.1	2.7	3.2	3.9	4.6	5.3	6.0	6.0	6.0
発酵槽内乾物量計算値	kg	91	154	85	174	77	138
”油分量”	kg	31	40	22	57	25
分解量	乾物分解量	kg	14	14
油分分解量	kg	3.3	3.6
分解率	乾物分解率	%	19	13
油分分解率	%	26	10
水分蒸発量	kg	363	420
ヒーター電力量	KWh	52	47	52	64	76	61	59	411	66	69	64	52	61	52	51	415	49	45	52	58	61	46	41
ヒーター電力量/蒸発量	KWh/kg	1.13	0.99	352

25年11月～12月	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30	12/1	2	2011	2012	2013	2014	2015	2016	2017	2018	2019	2020	2021	2022	2023	2024	2025	2026	2027	2028	2029	2030	2031	2032	2033	2034	2035	2036	2037	2038	2039	2040	2041	2042	2043	2044	2045	2046	2047	2048	2049	2050	2051

注：分解率は投入原料に対する分解量の比として算出している。
## 本文

オカラを用いた乾物分解率の既報告事例では神奈川県農政部が密閉型発酵槽を用いて温度70℃程度、10日間で50%であったとしている $ ^{3)} $ 。(日当たりに換算すれば5%/日)。

生ごみ（食堂残飯）を用いたコンポスト化試験で野呂瀬らは温度60～70℃、pHを7.5～8程度の条件で10日間での乾物分解率が35%、pHが5～6では同5％と報告している $ ^{4} $ 。（日当たりに換算すればpH7.5～8の時3.5%/日、pH5～6の時0.5%/日となる）

オカラを用いた粗脂肪分分解の既報告事例は見当たらないが、畜ふん＋生ごみでの事例を図3－4に示す $ ^{5} $ 。本事例では6週目で60～80％の減少を示している（日当たりに換算すれば1.4～1.9％程度）。

図3-4 畜ふんに生ごみを混合した堆肥化試験での粗脂肪分の変化 $ ^{5)} $

松田らは廃食用油を添加した高温好気法による実験で60℃の高温域では40℃に比べて著しく油分分解率が低下すると報告している（図3-5） $ ^{6)} $ 。40℃では日当たり4%程度が得られたが、60℃では同2%程度であった。リパーゼなどの油脂分解酵素の生産能が高い菌は中温菌が多いためとされているが、本試験では60℃で高い油脂分解酵素生産能を持つ菌の添加効果により60℃において日当たり4.2%の分解率が得られている。

図 3−5 40℃と 60℃における油脂分解率 $ ^{6)} $
## 本文

また松田らは廃食用油の分解が遅いため蓄積し、粘性を増加させて通気不良になり発酵が停止することを報告している。本試験では全期間を通じてそのようなことは見られなかった。

分解量と水蒸発量当たりヒーター電力量の推移を表3-8、図3-6に示す。乾物分解量、油分分解量とも第3週を除いて週ごとに増加した。水蒸発量当たりヒーター電力量も分解量と一致して増減している。第3週に一時分解量が下がったのは、排気弁を絞って排気量を少なくしたためで異常に気づき排気弁開度を元に戻したところ第4週は回復した。この事例では高温発酵菌は一時的に活性が低下しても条件が良ければ回復が速いことを示唆している。

表 3−8 廃白土混合コンポスト試験中の分解量と水蒸発量当たりヒーター電力

油無添加週	コントロール週	産白土混合コンポスト投入週	〃第2週	〃第3週	〃第4週
乾物分解量	kg/週	14	-	28	24	29
油分分解量	kg/週	3.3	3.6	-	6.6	8.8
ヒーター電力/蒸発量	kWh/kg	1.13	0.99	-	0.94	0.98

図3-6 廃白土混合コンポスト試験中の分解量とヒーター電力/蒸発量
## 本文

図3－7に pH、アンモニアの推移を示す。pH は第3週を除き8前後で推移した。アンモニアも高い濃度で生成した。油脂分解効果が高い高温菌は pH に大きく活性が影響され、活性が高い pH 域は8前後で、それより下の中性域、酸性域では急速に活性が低下することが明らかになった。

図 3−7 廃白土混合コンポスト試験中の pH、NH_{3} の推移

図 3−8 に廃白土混合コンポスト第 4 週の物質収支を示す。(発酵乾燥物の取出し量は一定でないため投入物と取出し物の収支は厳密には一致していない)

図3-8 廃白土混合コンポスト添加第4週の物質収支図
## 本文

#### 3.1.5 油無添加週と比較した廃白土混合コンポストの効果

原料が持ち込む熱量と取出し物が持ち去る熱量は小さく無視できるので入熱と出熱は以下により示される。

入熱：乾物分解熱＋粗脂肪分解熱＋ヒーター電力

出熱：排気が持ち去る熱量＋放熱損失

期間中の出熱を一定とみなせばヒーター電力の減少は分解熱の増加に等しい。

表 3−9 オカラ乾物と粗脂肪分の発熱量

粗タンパク質	粗脂肪	NFE	粗繊維	粗灰分	合計
おからの成分割合	%	26	11	43	16	4	100
成分ごと発熱量	kJ/kg	23,500	40,400	18,300	21,200	0
おから発熱量	kJ/kg	6,100	4,500	7,800	3,400	0	21,800
〜(粗脂肪分を除く)	kJ/kg	6,100	0	7,800	3,400	0	17,300

※日本標準飼料成分表(2001年)より作成

表 3−10 油無添加週と第 4 週における分解量とヒーター電力の差

油無添加週	〃第4週	差
乾物分解量 kg/週	14	29
うち油分を除く乾物分解量 kg/週	10.7	20.2	9.5
油分分解量 kg/週	3.3	8.8	5.5
ヒーター電力量 kWh/週	411	304	-108

分解量から算出した油無添加週と第4週の発熱量の差

$ 9.5~kg/週 \times 17,300~kJ/kg + 5.5~kg/週 \times 40,400~kJ/kg = 386,550~kJ/週 = 107~kWh/週 $

ヒーター電力量の差 108 kWh/週とほぼ合致する。

廃食用油の投入と廃白土混合コンポストの添加によりヒーター電力を油無添加週と比較して26%低減できた。

108 kWh/週 ÷ 411 kWh/週 × 100 = 26%
本文

#### 3.1.6 本システムでの有機物分解による発酵熱の寄与

廃白土混合コンポスト添加第4週における入出熱内訳を表3-11、図3-9に示す。

入熱は乾物分解熱＋粗脂肪分解熱＋ヒーター電力とし分析値および測定値から求めた。出熱は排気が持ち去る熱量＋放熱損失とし、排気が持ち去る熱量を排気ガス量、温度、湿度からエンタルピーを算出して求めた。放熱損失は入熱と出熱を等しいとして入熱合計値から排気が持ち去る熱量を差し引いて求めた。

発酵による発熱量は全体の39%であり5日間の発酵時間でのシステムとしては大きい値といえる。物理的な乾燥方式では発酵熱の寄与が全くないのでこの分外部熱源を多く必要とすることになる。

出熱項目のうち放熱量に関し、用いた実証試験機は断熱材の劣化やはく離がみられ断熱性が十分ではなく放熱損失が大きい。断熱を良くすれば放熱量が低減しヒーター電力がさらに小さくて済む可能性が大きい。

表 3−11 廃白土混合コンポスト投入第4週の入出熱内訳

分解量
kg/週	分解量
kg/日	单位発熱量
MJ/Kg	発生熱量
MJ/日	比率
%
油分	8.8	1.3	40.4	51	20
乾物	20.2	2.9	17.3	50	19
ヒーター	使用電力量
kWh/週	使用電力量
kWh/日	単位発熱量
MJ/kWh	発生熱量
MJ/日
304	43.4	3.6	156	61
合計	257	100

出熱内訳

排出熱量MJ/日	比率%
排気が持ち去る熱量	219	85
放熱量	38	15
合計	257	100

図3−9 廃白土混合コンポスト投入第4週の入出熱内訳比率
## 本文

#### 3.1.7 発酵日数 10 日としたときの予想熱収支

分解率は発酵日数に大きく影響されることと、5日間の発酵日数では添加した油の一部しか利用していないことから、倍の10日間とすることで必要熱量のうち70％近くを発酵熱で賄うことができる可能性がある（図3-10）。物理的な乾燥方式では発酵熱の寄与は0であるため、発酵乾燥方式における光熱費の低減効果は大きい。

図3−10 発酵日数を10日間としたときの予想熱収支

#### 3.1.8 家庭系廃食用油の添加試験

家庭から排出される廃食用油を用いた試験を行った。廃食用油は千葉県柏市のNPO法人が主に家庭から収集したものをそのまま用いた。油揚げ製造廃食用油は使用終了時点からかなり日数が経ており色相は黒褐色であった。家庭系はそれよりやや薄く、劣化の程度はより少ないとみられた。微小粒子状の混入物が見られた。添加試験ではそのまま用いたが、性状分析に際しては45μmのメッシュを通したものを用いた。廃食用油の性状として劣化の一指標であるカルボニル価を測定した。表3-12に示す。

表 3−1 2 廃食用油の性状

カルボニル価※-	水分%
油揚げ廃食用油	20	< 0.1
家庭系廃食用油	18	< 0.1

$ ^{*} $ 基準油脂分析試験法

参 1.29–2013（日本油化学会編）

図3-11 左 油揚げ製造廃食用油

右 家庭系廃食用油
## 本文

表 3−1 3 に試験結果の詳細を示す。比較のため油揚げ製造時の廃食用油を用いた集積培養菌添加試験での結果と合わせて示す。表 3−1 4 にまとめたように同等の結果が得られた。

工場などの業務用廃食用油の他に家庭から排出される廃食用油でも同等の効果が得られることが確認できた。不純物の混入が少ない廃食用油は BDF や灯油混合燃料などに再生利用されているが、本研究で新たに高含水率有機性廃棄物の発酵処理における水蒸発の熱源として利用可能なことが明らかになった。

表 3−1 3 家庭系廃食用油を用いた試験結果

25年12月～26年2月	12/10	11	12	13	14	15	16	週計	17	18	19	20	21	22	23	週計	24	3/4	5	6	7	8	9	10	週計	11
火	水	木	金	土	日	月	kg	火	水	木	金	土	日	月	kg	火	火	水	木	金	土	日	月	kg	火
おから投入量	kg	100	100	100	100	100	0	0	500	100	100	100	100	0	0	500	100	100	100	100	0	0	500
廃食用油投入量	kg	5	5	5	5	5	0	0	25	5	5	5	5	5	0	0	25.0	5	5	5	5	0	0	25.0
おから含水率	%	78.3	78.3	78.3	78.3	78.3	79.3	79.3	79.3	79.3	79.3	80.7	80.7	80.7	80.7
おから油+原～廃+用+油+原～廃+用+油+原～廃+用+油+原～

注：分解率は投入原料に対する分解量の比として算出している。

表 3−1 4 家庭系廃食用油添加試験と集積培養菌添加週との比較

油分分解率%	ヒーター電力量/蒸発量kWh/kg
家庭系廃食用油	10.0	0.83
集積培養菌添加第1週	17.3	0.84
集積培養菌添加第2週	6.041	0.92
本文

BDF や灯油混合燃料では不純物はできるだけ避けなければならない。そのために排出側での異物混入防止の配慮や再生利用側でも前処理でそれらを取り除く必要がある。本システムの場合、微生物が分解できる食品カスなどの異物や水分が混入しても影響はないのでそのまま利用することができる。

#### 3.1.9 連続安定運転

25 年 9 月 24 日から 12 月 24 日まで安定した運転を継続した。オカラは 100kg/日、廃食用油は油無添加週を除いて 5 kg/日投入した。この間、内容物の塊状化や通気性の不良による嫌気性化は無かった。廃食用油の添加による粘性の増加はなく、高含水率のオカラと廃食用油のみを用いて安定した運転が可能であった。これは攪拌の効果と高温好気性発酵の特長である乾燥速度が速いことによるものと考えられる。

なおこの期間以外でも安定した運転が行えた。

#### 3.1.10 メタンガス発生の有無の検討

発酵槽内は連続通気と連続攪拌により好気的な条件が保たれているが、部分的にデッドスペースもあるので念のためメタンガスの発生の有無について検討した。

サンプリングは排ガスラインから行った。分析機器はGC-MS（GC-17A-QP5050；Shimadzu, Japan）を用いた。結果は検出限界の0.1%（v/v）以下であった。攪拌羽根の周辺で嫌気性の部分があったとしてもメタン菌によるメタンガスが生成していないことが確認できた。メタンガスの爆発限界は5.3～14%であり、本装置の発酵による爆発などの危険性はないことが明らかになった。

#### 3.1.11 脱臭器の設置と効果

25 年 9 月に脱臭器を設置した。それまでは発酵乾燥物の pH を 7 前後に抑えてアンモニアの発生を抑制する運転を行っていたが、弱アルカリ域での活性が高いと思われる微生物試験には適していなかった。脱臭器設置後はアンモニアが生成しても環境に放出するおそれがないので pH 8 程度の弱アルカリ域での長期試験が可能になった。脱臭方式は微生物脱臭を採用した。11 月中頃から高い濃度のアンモニアが生成したが脱臭器出口ではほぼ 0 ppm であった。

図3−12 脱臭器の効果
本文

図 3−1 3 脱臭器の構成（左）と外観（右）

油脂分解効果の高い微生物は弱アルカリ域で活性が高いことが、NB501株や廃白土混合コンポストで明らかになった。弱アルカリ域ではタンパク質の分解に伴って必然的にアンモニアが高濃度で生成するので、本システムでは乾燥発酵槽と脱臭器の組み合わせが必要である。脱臭方式はさまざまの方式が用いられているが、本研究で用いた微生物脱臭方式は図に示すように簡易な構成であり、微生物担体に付着した硝化菌がアンモニアを酸化して硝酸態にするので担体の交換は必要が無く、微生物の乾燥防止と硝酸態窒素の排出のため少量の給水が必要なだけで安価な脱臭装置である。留意点としては硝化菌の温度活性は38℃程度が上限であり、高温発酵では60℃程度の排ガスが排出されるので、冷却が必要である。高温発酵方式は排ガス量が少ないので試験機では最も簡便な外気で希釈冷却する方式とした。

#### 3.1.12 生成飼料の家畜への供与試験

24 年度に鶏・豚への発酵乾燥飼料の供与試験を行った。5%、10% 混合区では対照区と大差なかった。20% 混合区では鶏の場合やや産卵量が低下し、豚ではと畜日齢が長くなる傾向があった。

#### 3.1.13 副資材の不要化

すべての試験期間中において、従来水分調整や通気性改良材として必要とされた木質チップ、もみ殻などの副資材は用いていない。飼料化の場合に乾材として必要であった米ぬか、小麦ふすま、パンくずなどの副資材も使用していない。内容物の塊状化や通気性の不良による嫌気性化は無かった。廃食用油の添加による粘性の増加も無かった。高含水率のオカラと廃食用油のみを用いて安定した運転が可能であった。これは攪拌の効果と高温好気性発酵の特長である乾燥速度が速いことによるものと考えられる。

副資材は従来必須のものとされていたが、木質系の副資材を用いれば飼料としては使えず、また木質は分解しにくいので減量効果も低い。副資材を用いずに発酵乾燥することで、本システムは飼料化の他に減量化、乾燥の用途にも適用できる。熟成工程を付加すれば堆肥化用途にも適用できる。
## 本文

#### 3.1.14 廃食用油を添加した高温好気性発酵乾燥システムのメリット

本研究において次に示すメリットを確認できた。

(1) 短期間の発酵日数で乾物、油脂ともに高い分解効果が得られた。

(2) 廃食用油の添加でヒーター等の外部入熱を少なくすることができた。

(3) 高含水率のおからの発酵乾燥処理において副資材が不要であった。

(4) 副資材を用いないので発酵日数を長くとれた。

(5) 乾燥速度が速く、内容物の塊状化や嫌気性化はなかった。

(6) 60℃で油脂分を分解する高温好気性菌によりおからを発酵乾燥させ飼料として用いることができた。減量化、乾燥等に用いることも可能である。

(7) 添加する廃食用油は家庭などから排出されるものでも同等の効果であった。家庭やレストランなどでは不純物が混入しやすいのでそれらの再利用に適する。

また一般的に次に示すメリットもある。

(8) 生肉が混入した生ごみ等の飼料化においてはエコフィードガイドラインに定める70℃30分間以上の加熱処理が必要であるが、高温発酵では常時60℃程度での発酵温度なのでガイドラインは容易に達成できる。

(9) 熟成工程を付加すれば堆肥に利用できる。

(10) 必要な水分を蒸発させる際に排気が持ち出す熱量は中温発酵より少ない。

(11) 病原菌や雑草の種子が死滅、不活化する。

(12) ハエや小虫が発生しない。
## 本文

### 3.2 微生物添加効果の検証

前節で用いたデータは、粗脂肪分と粗灰分の委託分析値を元にして得られたものであり、各種の添加運転のうち、最も高い性能が得られたと判断した廃白土混合コンポストの添加結果を中心に分析を行っている。そこで、本項目では、本研究で行った他の添加運転の結果についても、当研究室の実験室において総脂質、灰分、含水率を高精度で再分析を行った。本節では、水分の蒸発や有機物の分解により変動しない数値である灰分測定値を元にして全体の収支を計算しなおし、油脂分解、乾物分解、CO $ _{2} $ 発生量、pH変化などの各種の分析値から多面的な検証を行った。さらに、廃白土混合コンポストの添加実験における微生物の群集構造の変遷を調べるために次世代シークエンサーを用いて群集構造解析を行った。

25 年 6 月～12 月の期間に行った以下の添加試験について分析した結果を示す。

（１）６月１１日～６月２５日（２週間）：コントロール条件（菌を添加しない条件）

（2）6月25日～7月16日（3週間）：NB501株添加1回目（40 g）

（3）7月23日～8月13日（3週間）：NB501株添加2回目（100 g）

（４）１１月５日～１１月１２日（１週間）：コントロール週（廃白土コンポスト添加前週）

11月12日～12月10日（4週間）：廃白土コンポスト添加

（5）12月10日～12月24日（2週間）：好熱性油脂分解微生物群集添加（1回目のみ）

#### 3.2.1 分解・蒸発量の分析

## 脂質分解量の計算法

コントロール条件第1週（6月11日～6月18日）の結果を用いて説明する（図3-14）。

実証試験機の槽内には、前週からの持ち越し量に加え、廃食用油を5回にわたって添加するため、脂質量が累積していく（図左：赤実線）。その値から、槽内からサンプリングした試料の脂質分析値（図左：青点線）を引いた値を累積していったものを、1週間の間に分解された脂質の総量とした。

図 3−14 分解・蒸発量の分析例（コントロール条件第1週）
## 本文

## 差分基質分解量、水分蒸発量の計算法

装置から取り出した産物は、水分、灰分、有機物からなるが、有機物のうち脂質以外のものを「差分基質」とする。これは微生物の炭素源として分解され $ CO_{2} $ などとして排出される有機物（脂質を除く）であり、前節で「乾物」とした部分をより精密に分析した値となる。

オカラおよび発酵乾燥物重量（産物総量）=

$$ 水分量 \quad+\quad 灰分量 \quad+\quad 有機物量 ( 差分基質量 + 脂質量 ) $$

高温好気性発酵処理によって、水分は乾燥により蒸発して重量が大幅に減り、さらに有機物（差分基質＋脂質）も微生物分解（発酵）により減少する。そのため、量の増減がない灰分量を基準として計算した。水分蒸発量は含水率測定より、差分基質（脂質以外の有機物）の分解量は、その他の分析値の差分より、それぞれ計算した。

## 差分基質量 = 產物総量 - 水分量 - 灰分量 - 脂質量

## コントロール条件

菌を添加しない条件として2週間の運転を行った。油脂分解量は3.6～4.2kgであり、差分基質の分解量は19～18kgであった。pHは7.0～7.5の間を推移し、微生物活動の指標となるCO_{2}発生量は、オカラと油脂の投入が行われ発酵が活発となる1日目～5日目では0.4～0.6%の値を示したが、乾燥期間である6，7日目では低下した。

コントロール条件第1週（6/11-6/18）

コントロール条件第2週（6/18-6/25）

図3-15 コントロール条件の分析結果
## 本文

#### 3.2.3 NB501 株添加 1 回目

本研究で単離したリパーゼ生産性好熱菌 B. thermoamylovorans NB501 株を湿菌体重量で 40 g 添加し、その効果を 3 週間モニタリングした。油脂分解量は 4.2～4.4 kg であり、コントロール条件と比べてわずかに上昇したが、差分基質の分解量は 3 週目で大幅に低下して 9 kg となった。CO₂ 発生量も 0.4～0.6% であり、コントロール条件と比較しても大きな差は見られなかった。

NB501株添加1回目第1週（6/25-7/2）

NB501株添加1回目第2週（7/2-7/9）

NB501株添加1回目第3週（7/9-7/16）

図 3−1 6 NB501 株添加 1 回目の分析結果
## 本文

#### 3.2.4 NB501 株添加 2 回目

NB501 株の添加量を湿菌体重量で 100 g と増加させ、その添加効果を再び検証した。油脂分解量は当初 5.8～5.6 kg となり、CO₂ 発生量も 0.6% を超えたが、3 週目には油脂分解量が 2.6 kg と急激に落ち込み、CO₂ 発生量も 0.5% 程度に抑えられていた。微生物活性が高くなると一般的に pH は上昇する傾向にあるが、この添加条件では pH がさほど上がらず、7.0 付近を推移していた。すなわち、NB501 株の添加においては、2 週間ほどまではある程度の添加効果が見られたが、継続的な微生物活動が見られず、その後終息したと考えられる。

NB501株添加2回目第1週（7/23-7/30） NB501株添加2回目第2週（7/30-8/6） NB501株添加2回目第3週（8/6-8/13）

図 3−1 7 NB501 株添加 2 回目の分析結果
## 本文

#### 3.2.5 磨白土混合コンポスト添加

廃白土混合コンポストを、11月12日に7.1 kg投入した。その前週はコントロール週として位置づけ、添加後は4週間のモニタリングを行った。コントロール週、添加後第2週、添加後第4週の分析結果を示す。コントロール週では油脂分解量は3.5 kg、差分基質の分解量は9 kg、 $ CO_{2} $ 発生量は0.6%付近であり、3.1.4のコントロール条件とほぼ同程度であった。ここに廃白土混合コンポストを添加したところ、油脂分解量は2週間目には6.6 kg、4週間目には8.5 kgまでと大幅に向上した。また、差分基質の分解量も20～22 kgと高い水準を維持し、 $ CO_{2} $ 発生量も1%をしばしば超えるほど高かった。pHの変化も7.5～8.0と高くなっており、微生物活動が活発になり、高い油脂分解も約1ヶ月間の間、持続したことになる。

添加前コントロール週（11/5-11/12） 曉白土混合コンポスト添加第2週（11/19-11/26） 添加第4週（13/3-12/10）

図 3−1 8 廃白土混合コンポスト添加の分析結果
## 本文

#### 3.2.6 好熱性油脂分解微生物群集の添加

本研究（次節）では、NB501株のように単離された単一の菌株だけでなく、60℃で油脂を炭素源として集積培養を行った好熱性油脂分解微生物群集も用意して、添加試験を行った。添加量は湿菌体重量で4.7 gであった。第1週では油脂分解量が6.6 kg、差分基質の分解量も20～23 kgと高い水準を維持し、CO₂発生量も1%を超えたことから、添加効果が見られたと考えられた。しかし、2週目には油脂分解量も差分基質の分解量も急激に落ち込んだことから、油脂分解微生物群集の添加も、NB501株の添加と同様、継続的な効果が得られなかったといえる。

油脂分解微生物群集添加第1週（12/10-12/17）

添加第2週12/17-12/24

図 3−9 油脂分解微生物群集添加の分析結果

以上の結果より、各種の添加実験においては、廃白土混合コンポストの添加が最も効果が高く、持続性も高かったことが明らかとなった。
## 本文

#### 3.2.7 次世代シークエンサーによる群集解析

廃白土混合コンポスト添加における、（1）コントロール週（添加前週）、（2）添加1週間後、（3）添加4週間後（最も活性の高かった週）から採取したサンプルに対して、次世代シークエンサー（ロシュ454 GS Junior）による16S rRNA遺伝子のV1-2領域アンプリコン解析を通じた科(Family)、属(Genus)、種(Species)レベルまでの同定を行った結果に関して、上位25までのOperational Taxonomic Unit(OTU)を示す。なお、本解析には、オカラ由来と思われる、大豆（Glycine max）の遺伝子も検出されたが、その他は全て微生物（細菌）由来であった。

表 3−15 廃白土混合コンポスト添加における群集解析

OTU	添加前	添加1	週間後	添加4	週間後	Family	Genus	Species	Identity (%)
1	815	1069	1048	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus thermolactis	100
2	49	44	49	Bacillaceae	Virgibacillus	Virgibacillus sp.	90
3	95	4	1	Planococcaceae	Ureibacillus	Ureibacillus suwonensis	100
4	29	24	10	Corynebacteriaceae	Corynebacterium	Corynebacterium sp.	97
5	52	6	1	Streptococcaceae	Streptococcus	Streptococcus thermophilus	100
6	40	7	2	Planococcaceae	Kurthia	Kurthia gibsonii	97
7	5	9	29	Fabaceae	Glycine	Glycine max	100
8	1	19	20	Bacillaceae	Gracilibacillus	Gracilibacillus sp.	91
9	17	1	21	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus coagulans	100
10	29	2	1	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus sp.	96
11	10	10	10	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus sp.	93
12	13	5	10	Bacillaceae	Cerasibacillus	Cerasibacillus quisquiliarum	99
13	15	4	1	Planococcaceae	Kurthia	Kurthia gibsonii	98
14	4	10	3	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus sp.	92
15	6	4	2	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus sp.	95
16	9	3	0	Streptococcaceae	Streptococcus	Streptococcus equinus	100
17	2	2	6	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus sp.	98
18	3	4	2	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus methanolicus	93
19	3	4	1	Corynebacteriaceae	Corynebacterium	Corynebacterium nuruki	99
20	5	0	2	Paenibacillaceae	Aneurinibacillus	Aneurinibacillus thermoaerophilus	100
21	2	0	5	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus coagulans	95
22	4	1	1	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus sp.	94
23	2	3	1	Bacillaceae	Virgibacillus	Virgibacillus sp.	88
24	1	3	2	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus methanolicus	91
25	2	0	3	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus thermoamylovorans	98
Total	1213	1238	1231

添加前には群集の多様性が高かったのに対し、添加後は低下している。特に、添加前には豊富に存在していた Ureibacillus suwonensis、Streptococcus thermophilus、Kurthia gibsonii などが減少していることが分かる。本システムにおいては Baciliacae 科が常に優占的に存在しているが、その中でも特に、Bacillus thermolactis が多い。B. thermolactis は、廃白土混合コンポスト添加後に増加し、4 週間後にも減少していなかった。本研究では、実証試験機の発酵乾燥産物から、好熱性リパーゼ生産菌として Bacillus thermoamylovorans 501 株を単離している（次節参照）。群集解析においては、B. thermoamylovorans の占める割合は低いが、添加前で 2 リード、添加 4 週間後に 3 リード検出されている。大豆油添加条件において 60℃ で集積培養した油脂分解微生物群集では Geobacillus 属細菌が多数を占め
## 本文

ていたが（次節）、今回は検出されなかった。

B. thermolactisは2011年に提案された新しい種であり、40℃～50℃で生育する中度好熱菌として主に牛乳などから単離されている $ ^{7} $ 。リパーゼ生産の報告は今のところはないが、B. thermoamylovoransと最も近縁の種であるため（16S rRNA遺伝子のid = 93%）、ここでB. thermolactisと同定された株にリパーゼ生産株が含まれている可能性は高いと考えられる。また、全期間を通じて種レベルで新規な微生物（既知の配列と95%以下の低い相同性を示すもの）も一定の割合で存在するため、これらの微生物が脂質分解に寄与している可能性もある。
## 本文

### 3.3 好熱性油脂分解菌の探索と性質解明

#### 3.3.1 廃食用油を唯一の炭素源とした集積培養

廃食用油を唯一の炭素源とした培地を用いた集積培養における気相部の酸素と二酸化炭素のモニタリングでは、40℃での培養に関しては1~5回目を通して一貫して酸素の減少とそれに伴う二酸化炭素の増加が確認された(図3-10)。しかし、50℃と60℃に関しては、1回目の集積培養においては酸素の減少とそれに伴う二酸化炭素の増加は確認されたが、2回目の集積培養以降は酸素の減少は確認されたものの、二酸化炭素の増加はほとんど確認されなかった。

図 3−10 40°C での 1~5 回目の集積培養における気相部のモニタリング結果

コントロールは廃食用油を添加していない集積培養培地に4回目の集積培養液を植菌した際の気相部の状況
## 本文

廃食用油を唯一の炭素源とした培地を用いた集積培養において、40℃では気相部の酸素の減少とそれに伴う二酸化炭素の増加が確認され、微生物の生育が示唆された。特に、5回目の集積培養においてコントロールでは酸素の減少と二酸化炭素の増加がほとんどみられないことは、集積培養において、廃食用油を利用して生育する微生物が集積していることを意味するものである。しかし、50℃と60℃においては気相部の酸素の減少はみられるものの、二酸化炭素量の増加はみられず、最終的にこの培地を用いた油脂分解菌の獲得には至らなかった。酸素の減少は、おそらく酸素が廃食用油の酸化に利用されたことによると考えられる。酸化した油脂は有毒であり生育に影響を大きく与えるとされ、高温になればなるほど廃食用油の酸化は進むとされる。50℃と60℃で油脂分解菌を獲得できなかった理由の1つに廃食用油の酸化が進んだことが挙げられる。また、そもそもこの培地の成分では好熱菌の生育には足りない可能性も挙げられる。このような理由もあり、50℃と60℃に関しては培地を変更して油脂分解菌の単離を試みた。

#### 3.3.2 40°Cで生育する油脂分解菌の単離と系統学的解析

40℃における集積培養液をLB培地とNB培地に塗布して40℃で1日培養を行ったところ、多くのコロニーを形成した（図3-11）。しかし、50℃と60℃に関しては3回目の集積培養液を用いて単離を試みたが、全くコロニーを形成しなかった。

図 3−1 1 40°C で単離された油脂分解菌の単離

(左図：LB 培地での単離、右図：NB 培地での単離)

集積培養と同じような培養方法で廃食用油を唯一の炭素源とした培地を用いて気相部の経時変化を追ったところ、全ての単離株において集積培養の時と同じように、酸素の減少とそれに伴う二酸化炭素の増加が確認された。また、一般的に油脂分解能の指標として用いられる方法であるクリアハロー形成においては、廃食用油を含んだプレート培地を用いて行ったところ、単離株64株中、10株程度の単離株でクリアハローの形成が確認された、その中でも、NB培地で単離されたNB32株のクリアハローは非常に大きく（図3-12）、強い油
## 本文

脂分解能を有することが示唆された。クリアハローを形成した単離株は、図3−13、図3−14の系統樹の赤字で示す。

16S rRNA 遺伝子による系統学的解析では、40℃で単離された油脂分解菌は大きく2つのグループに大別された。1つはガンマプロテオバクテリア綱腸内細菌目腸内細菌科に属するクロノバクター属のグループ（図3-13）、もう1つはガンマプロテオバクテリア綱シュードモナス目モラクセラ科に属するアシネトバクター属のグループ（図3-14）である。クロノバクター属に属する単離株はすべてCronobacter sakazakii ATCC 29544の16S rRNA遺伝子配列と99.0%以上の相同性があり、アシネトバクター属に属する単離株はすべてAcinetobacter baumannii DSM30007の16S rRNA遺伝子配列と99.5%以上の相同性があった。Acinetobacter baumanniiの2株（NB6、NB9）は特に大きなクリアハローを形成し（図3-12）、強い油脂分解能を有することが示唆された。クリアハローを形成した単離株は、図3-13、図3-14の系統樹に赤字で示した。

図 3−1 2 40℃で単離された油脂分解菌 Acinetobacter baumannii と Cronobacter sakazakii のクリアハロー形成

40℃で単離した油脂分解菌は、廃食用油を利用して生育することが確認された。16S rRNA遺伝子による系統学的解析からは、これらの単離株はクロノバクター属のグループとアシネトバクター属のグループに大別されたが、アシネトバクター属のグループに属する単離株と非常に近縁な関係にあった Acinetobacter baumannii においてはリパーゼに関する報告は非常に多い。Acinetobacter baumannii DSM 30007 はゲノムが解読されておりリパーゼ遺伝子を有することが分かっている $ ^{8} $ 。また、Acinetobacter baumannii のある株ではリパーゼに関してクローニング・精製・機能解析はすでに行われている $ ^{9} $ 。このことは、アシネトバクター属グループに属する単離株でクリアハローを形成するものは少なかったも
## 本文

のの、クリアハローを形成しなかった株も含めて油脂分解能を有する可能性を大きく示唆する。

クロノバクター属のグループに属する単離株と非常に近縁な関係にあった Cronobacter sakazakii に関しては現在のところリパーゼの研究報告はされていないが、2010 年に Cronobacter sakazakii のある株のゲノムが解読され、リパーゼと推測される遺伝子を有していることが分かっている $ ^{10} $ 。実際に、本研究では、クロノバクター属のグループに属する単離株でクリアハローを形成する株が多かったことや、なかでも NB32 株のような大きなクリアハローを形成した株もあることから、クロノバクター属グループのリパーゼの機能に関する研究は非常に興味が持たれる。

図 3−1 3 40℃で単離された油脂分解菌の 16S rRNA 遺伝子による系統学的解析（1） 赤字はクリアハローを形成した単離株
本文

図 3−1 4 40℃で単離された油脂分解菌の 16S rRNA 遺伝子による系統学的解析（2） 赤字はクリアハローを形成した単離株
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#### 3.3.3 50°Cで生育する油脂分解菌の単離と系統学的解析

これまで廃食用油を唯一の炭素源とした培地を用いて単離を行ってきた。しかし、40℃で単離に成功していたが、50℃と60℃では単離に至っていなかった。その原因の一つとして、培地成分の不足が考えられた。そこで、8種類の培地（LB、1/5LB、NB、1/5NB、トリプトソーヤ、1/5トリプトソーヤ、ペプトン、トリプトンーイースト）を用いて廃食用油2%を添加して集積培養を行い、50℃と60℃で生育する油脂分解菌の単離を試みた。その結果トリブチリン入りのNBプレート培地において、周囲に大きなクリアハローを形成している2種類のコロニーが確認された（図3-15）。NBプレート培地上で単一のコロニーになるように何度も植菌を繰り返すことで純化し、再度トリブチリン入りのNBプレートにおいてクリアハローを形成するかどうか確認した。

16S rRNA 遺伝子による系統学的解析（図 3−16）では、50℃で単離された油脂分解菌NB501株とNB502株は、ファーミキューテス門バシラス綱バシラス目バシラス科に属する Bacillus thermoamylovorans LMG 18084 の16S rRNA 遺伝子配列と99%以上の相同性があったことから、Bacillus thermoamylovoransと同定された。

50°C または 60°C で生育する油脂分解菌に関しては、廃食用油入りの様々な培地を用いてスクリーニングした結果、トリブチリン入りの NB 培地において 50°C で生育する油脂分解菌の獲得に成功した。50°C だけでなく 60°C で数日培養しただけで大きなクリアハローを形成したことからも（図 3−15）、この 2 株は peptone や yeast extract に含まれている炭素源と同等なレベルで油脂を資化しやすいと考えられる。16S rRNA 遺伝子による系統学的解析では、Bacillus thermoamylovorans LMG 18084 と最も近縁な関係にあることが分かったが、Bacillus 属、そして B. thermoamylovorans のリパーゼの研究は多くなされ、応用への期待のもてるリパーゼ特性を有しているという報告もされている $ ^{11} $ 。NB501 株と NB502 株への期待は高いといえる。

図 3−1 5 50℃で単離された油脂分解菌 Bacillus thermoamylovorans NB501 株と NB502 株の 50℃および 60℃で形成されるクリアハロー