Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
本文

Bacillus thermolactis R-6488T (AY397764)

図 3−1 6 50℃で単離された油脂分解菌の 16S rRNA 遺伝子による系統学的解析

#### 3.3.4 60℃で生育する油脂分解菌の単離と系統学的解析

50℃ または 60℃ で生育する油脂分解菌として、廃食用油を添加して単離したものは、1種類のみであった。その原因として、スクリーニングの際に酸化が進んだ廃食用油を用いたことでバイアスがかかったと考えられた。そのためスクリーニングの際には新鮮な油脂であるトリオレインや大豆油を廃食用油の代わりに用いて再度単離を試みた。

発酵オカラを単離源として、NB 培地にトリオレイン、大豆油を 2% 添加した培地を用いて集積培養を行い、60℃で生育する油脂分解菌の単離を試みた。その結果、0.5% トリブチリン入りの NB プレート培地において、クリアハローを形成するコロニーが観察された。いくつかのコロニーをピックアップし、再度クリアハロー形成することを確認した（図 3−17）。

16S rRNA 遺伝子による系統学的解析では、60℃で単離された油脂分解菌 NB601、NB602、NB603、および NB604 株は、ファーミキューテス門バシラス綱バシラス目バシラス科に属する Geobacillus galactosidasius CF1B $ ^{T} $ の 16S rRNA 遺伝子配列と 100% の相同性を示したことから、G. galactosidasius と同定した。これまで Geobacillus 属に属するいくつかの種がリパーゼ活性を有するという報告がなされている $ ^{2),12)} $ 。しかし、G. galactosidasius には、これまでリパーゼ活性を有するという報告がないことから、新規なリパーゼを有している可能性が期待される。
図 3−1 7 60℃で単離された Geobacillus galactosidasius NB601, NB603 の 50℃および60℃で形成されたクリアハロー

図 3−1 8 60°C で単離された 2 種類の油脂分解菌の系統学的解析

次に、廃白土混合コンポストを単離源として、TSB 培地に大豆油を 2% 添加した培地を用いて集積培養を行い、60℃ で生育する油脂分解菌の単離を試みた。その結果、トリブチリン入りの TSB プレート培地上において 60℃ で 1 日培養した後、大きなクリアハローを形成するコロニーがいくつか確認された。その中から 7 つのコロニーをピックアップした（図 3-19）。これまでに単離された B. thermoamylovorans NB501 株などや G. galactosidasius NB601 株などが形成するクリアハローよりも、大きなクリアハローを形成した。
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16S rRNA 遺伝子による系統学的解析では、60℃で単離された油脂分解菌 TSB601-TSB607 の 7 株はファーミキューテス門バシラス綱バシラス目バシラス科に属する Geobacillus thermodenitrificans DSM 465 の 16S rRNA 遺伝子配列と 100% の相同性を示したことから、G. thermodenitrificans と同定した （図 3−18）。

近年、G. thermodenitrificans は石油貯蔵タンクから単離され、長鎖のアルカン分解能を有するという報告があり、全ゲノムが解読、公開されている $ ^{13} $ 。そのゲノム情報を基に、短鎖脂肪酸の油脂を分解する酵素（エステラーゼ）をコードする遺伝子を数種有していることが明らかにされており、その内、一部のエステラーゼは新規性が高く、それらの性質解明が行われている $ ^{14,15} $ 。エステラーゼ以外にも長鎖脂肪酸の油脂を分解するリパーゼ活性を有しているという報告があり、実際に大豆油やオリーブ油、パーム油を分解可能であることが明らかにされている $ ^{16} $ 。それらの既知の情報を鑑みると、G. thermodenitrificans は実証試験機内で廃食用油を分解していること期待される。次節では、実際に本研究で単離された G. thermodenitrificans TSB602 株由来のリパーゼ活性を確認した。

図 3−1 9 60℃で単離された Geobacillus thermodenitrificans TSB601-607 株の クリアハロー形成
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#### 3.3.5 单離された油脂分解菌由来の細胞外リパーゼの性質

#### 3.3.5 a 50°C で単離された Bacillus thermoamylovorans NB501 株由来

50℃で単離した B. thermoamylovorans NB501 株が生産するリパーゼの特性を調べた。NB501 株を培養して細胞外に分泌されたリパーゼを含む培養液を限外ろ過膜（Amicon Ultra Centrifugal Filters-30K, ミリポア）で 28 倍に濃縮したものを酵素液としてリパーゼ活性を測定した（図 3−20）。その結果、60℃でリパーゼ活性が最大となり、至適温度は 60℃であることが示された。また、pH は 8 とアルカリ条件で活性が最大となり、至適 pH は 8 であることが示された。さらに耐熱性試験を行った結果、60℃で 48 時間処理後、活性が 57% 残存していることが示された。既知の耐熱性リパーゼは通常 65℃で、たった 30 分処理するだけで 50% 以上の活性が失われるという報告がされている $ ^{17} $ 。それと比較して NB501 株由来のリパーゼは高い耐熱性を有していることが示された。

また、その酵素液を SDS-PAGE に供したところ、およそ 40 k Da の位置に単一のバンドがみられた。B. thermoamylovorans 由来のリパーゼはアミノ酸配列が既に明らかになっており、Accession No. BAH70300 としてデータベース上に登録されている。385 個のアミノ酸からなり、およその予想分子量と SDS-PAGE の位置が一致していることが示された。その詳細なリパーゼの性質や立体構造は未だ明らかにされていないため、今後明らかにする予定である。以上の結果から、NB501 株由来のリパーゼは、耐熱性が高く、60℃が至適温度であることが示された。実証試験機内の温度 60℃前後で油分解酵素として機能している可能性を示した。
(A)

(B)

(C)

(D)

図 3−2 0 Bacillus thermoamylovorans NB501 株由来細胞外リパーゼ活性の性質 A: 至適温度, pH 8 で測定、B: 至適 pH, 40 mM MES-NaOH (▲), 50 mM Tris-HCl (●) をバッファーとして用いて 60℃ で測定、C: 耐熱性試験, 60 ℃ で各時間処理、D: SDS-PAGE (アクリルアミド 12%)
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3.3.5b 60℃で単離された Geobacillus thermodenitrificans TSB602 株

60℃で単離した Geobacillus thermodenitrificans TSB602 株が生産するリパーゼの性質を調べた。TSB602を培養して細胞外に分泌されたリパーゼを含む培養液を限外ろ過膜（Amicon Ultra Centrifugal Filters-10K，ミリポア）を用いて、16倍に濃縮したものを酵素液として、そのリパーゼ活性を測定した（図3-21）。その結果、70℃でリパーゼ活性が最大となり、至適温度は70℃であることが示された。また、pHは9とアルカリ側で活性が最大となり、至適pHは9であることが示された。さらに耐熱性試験を行った結果、65℃で3時間処理後、53%活性が残存していた。既知の耐熱性リパーゼでは通常65℃で、たった30分処理するだけで50%以上の活性が失われるという報告がされている $ ^{12} $ 。それと比較してTSB602株由来のリパーゼは比較的高い耐熱性を有していることが示された。

(B)

(C)

図 3−2 1 Geobacillus thermodenitrificans TSB602 株由来細胞外リパーゼ活性の性質 A: 至適温度, pH 8 で測定、B: 至適 pH, 40 mM MES-NaOH (▲), 50 mM Tris-HCl (●), 50 mM CAPS-NaOH (◆), をバッファーとして用いて 50℃で測定、C: 耐熱性試験, 65℃で各時間処理
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#### 3.3.6 油脂分解菌の実証試験機への投入

#### 3.3.6 a 50°C で単離された Bacillus thermoamylovorans NB501 株

油脂分解菌として有望な候補株、B. thermoamylovorans NB501 株を油脂分解向上させることを目的として、実証試験機に投入するために、まず、投入に向け、可能な限り菌体量を多く回収するため、至適培養条件などの生育特性を調べた。その結果、培地は TSB 培地を用いたとき、温度は 50℃で培養したときに最も生育が良好であることが示された（図 3−22）。また、50℃だけでなく 60℃においても生育することが確認されたことから、60℃前後で運転されている実証試験機内において生育可能であることが示された。以上の結果から、NB501 株を大量培養する際に、TSB 培地を用いて 50℃で培養するという培養条件が確立された。

図 3−2 2 B. thermoamylovorans NB501 株の至適培養条件の検討

培養条件検討の結果から、NB501 株は $ 50\;^{\circ}C $ だけでなく $ 60\;^{\circ}C $ においても生育可能であり、また上述した NB501 株由来のリパーゼ活性測定結果からも、活性の至適温度が $ 60\;^{\circ}C $ であることが示された。従って NB501 株は $ 60\;^{\circ}C $ で運転している実証試験機において有効に作用すると期待された。

次に NB501 株を実証試験機へ投入するために大量培養を行った。培養条件検討の結果から、培地は TSB 培地を用いて、培養温度は 50℃ で行った。最終的に 10 L にまでスケールアップし、湿菌体重量で約 40 g 回収した。それを少量の培地に懸濁して濃縮し実証試験機
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内に投入した（第1回目の投入）。投入後の油分解に対する効果をモニタリングしたが、油分解の向上効果は観察できなかった（前節）。その原因の一つとして、投入した菌体量が少量であったため効果がみられなかったと考えられた。そこでさらに、投入する菌体量を増加させるために2倍量、つまり20 L規模で大量培養を行い、最終的に2.5倍量の湿菌体重量で約100 g回収した（第2回目の投入）。それを少量の液体培地に懸濁して濃縮し実証試験機内に投入した。第2回目の投入においては、初期に油分解の向上効果は見られたものの、継続的な効果はみられなかった。

NB501 株の添加による継続的な油分解の向上がみられなかった原因として、NB501 という 1 種類の単離菌株のみを添加したからではないかと考えられた。自然環境や排水処理現場において生じている油分解反応は、油脂分解活性を有する 1 種類の微生物によるものではなく、複数種の微生物が共存することによって、効率的に分解されていると考えられる。そこで、次に複数種の微生物が共存して油分解を行っている油脂分解微生物群集を実証試験機へ投入することを試みた。

#### 3.3.6 b 複数種が共存した油脂分解微生物群集

複数種の微生物が共存して油分解を担う油脂分解微生物群集を実証試験機へ投入することを目的とし、実証試験機内の運転温度と同じ60℃において油分解微生物群集の集積を試みた。実証試験機への油分解微生物群集の投入試験は合計2回行った。

1 回目の油脂分解微生物群集の構築では、2 種類の微生物源（発酵オカラ、廃白土混合コンポスト）とし、2 種類の培地（NB と TSB）を用いて集積培養を試みた。油脂分解微生物群集が構築されているという判断の指標として、一般的に油脂分解能の指標として用いられる方法であるクリアハロー形成を用いた。

その結果、発酵オカラを微生物源とし、NB 培地を用いた集積系では、1 回目の植継ぎでクリアハローが見られなくなった。TSB 培地を用いた場合、1 回目の植継ぎでクリアハロー形成が確認されたが、2 回目以降、確認されなかった。一方、廃白土混合ポストを微生物源とした集積系では、NB 培地を用いたとき、3 回の植継ぎに成功し、TSB 培地を用いた時は、4 回植継いでもクリアハローの形成が継続的に観察された（表 3−16、図 3−23）。
本文

表 3−16 集積過程における油脂分解微生物群集のクリアハロー形成の有無

微生物源	培地	植継ぎの回数
1回目	2回目	3回目	4回目
廃白土混合コンポスト	TSB	+	+	+	+
NB	+	+	+	-
発酵オカラ	TSB	+	-	-	-
NB	-	-	-	-

図3-23 集積された油脂分解微生物群集によるクリアハロー形成能の確認

さらに、TSB 培地を用いて集積された微生物群集構造を次世代シークエンサーによって解析した。その結果、Geobacillus 属に属するいくつかの種が多く集積されていることが示された（表 3−17）。最終的に投入した微生物群集では、G. thermodenitrificans, G. thermoglucosidasius に高い相同性を示すクローン配列が多く検出された。G. thermodenitrificans および G. thermoglucosidasius について、単離に成功しておりクリアハロー形成能が確認されていることから、油脂分解能を有していると考えられる。G. thermodenitrificans に関しては油脂分解酵素リパーゼの性質も明らかにしている。それらが油脂分解を行うことが大いに期待される。

その集積培養液をスケールアップして 10 L の大量培養を行った際に、2 L のフラスコ 4 本中、3 本で培地の酸性化が見られ、微生物の増殖がみられなくなった。油添加し、60 ℃という高温で培養したことで、油の熱酸化により生成された短鎖脂肪酸などが pH の低下を引き起こしたと考えられる。このような影響によって、中温よりも高温での油分解微生物の報告が少ない原因なのではないかと考えられた。最終的に 2 L のフラスコ 1 本分の湿菌体重量 4.7 g を回収し、少量の液体培地に懸濁して濃縮し実証試験機に投入した。
表 3−1 7 TSB 培地を用いて集積した微生物群集構造解析結果

OUT	植継ぎ1回目	植継ぎ4回目	スケールアップ後投入したもの	Family	Genus	Species	Identity (%)
1	13	1289	962	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70	100
2	24	3	26	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus thermoglucosidasius	100
3	20	0	1	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus thermodenitrificans	100
4	4	0	109	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. GHH01	93
5	19	0	0	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus thermodenitrificans	89
6	1	0	18	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70	96
7	8	1	10	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. GHH01	91
8	5	0	38	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus thermoglucosidasius	93
9	0	0	16	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70	95
10	0	0	10	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. Y412MC52	91
11	0	2	13	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70	95
12	0	3	33	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70	95
13	0	1	24	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70	96
14	2	0	0	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus thermodenitrificans	91
Total	96	1299	1260

1 回目の集積系をスケールアップする際、熱による油の酸化で培地中の pH が酸性になり、微生物の増殖が悪化した。培地の酸性化を防ぐための改善点として、2 回目の集積では、表2-3 のそれぞれの培地組成に加えリン酸バッファーをさらに添加し集積を行った。6 種類の培地（NB, 1/2 NB, TSB, 1/2 TSB, LB, 1/2 LB）にリン酸バッファーを添加した培地を用いて、2% 大豆油を添加したものを集積培地とした。微生物源として、1 回目の集積で良好な結果が得られた廃白土混合コンポストを接種し、1 回目と同様の培養条件で集積培養を行った。油分解微生物群集が構築されているという判断の指標として、1 回目に用いた方法であるクリアハロー形成の有無に加え、2 回目では培養上清のリパーゼ活性を経時的に測定し、新鮮培地への植継ぎのタイミングをはかった。

培養上清のリパーゼ活性を経時的に測定した結果から、3日目以降にリパーゼ活性が高くなり、1日や2日間という短期間の培養では、まだ培養上清のリパーゼ活性が低いことが示された（図3-24）。このことから集積する際に、新鮮培地に植継ぐタイミングとして3日~5日培養した後に新鮮培地への植継ぎを行うべきことが示された。

TSB と 1/2 TSB を用いた 2 つの集積培養条件で、継続的にリパーゼ活性とクリアハロー形成が観察された（図 3−2 5）。その内、1/2 TSB では TSB よりも高いリパーゼ活性がみられた。TSB 培地には、Tryptone が 17 g/L 含有されており、栄養に富んだ組成をしている。そのため、微生物が TSB 培地由来の栄養と同等に油脂を栄養源として資化するように、TSB を 2 倍希釈した 1/2 TSB 培地を用いた。その 1/2 TSB 培地を用いた条件において TSB 培地を用いた条件よりも高いリパーゼ活性が検出されたことから、油脂分解群集が構築されていることが示唆される。
図3−24 様々な培地を用いた集積過程における培養上清のリパーゼ活性とクリアハロー形成の有無

図3-25 集積した油脂分解微生物群集によるクリアハロー形成能の確認
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1/2 TSB 培地を用いて集積された微生物群集構造を次世代シークエンサーによって解析した。その結果、Geobacillus 属に属するいくつかの種が多く集積されていることが示された（表 3−18）。G. thermoglucosidasius に高い相同性を示すクローン配列が検出されており、さらに、1 回目の集積では検出されなかった Symbiobacterium thermophilum が検出されていた。S. thermophilum はコンポストから発見されており、好熱性共生細菌として報告されている $ ^{13} $ 。二酸化炭素やペプチドなどの低分子化合物を生育に要求し、それらを供給する Bacillus sp. と共培養することで、初めて増殖可能となる。S. thermophilum は、今回の解析で多く検出されている Geobacillus 属の種と共生関係を構築していることが考えられる。しかしながら S. thermophilum の存在比率は全体の 5% 程度と少ないことから、油脂分解への寄与は不明である。一方、検出されている G. thermoglucosidasius は単離に成功しておりクリアハロー形成能が確認されていることから、油脂分解能を有していると考えられる。また、他の Geobacillus 属に属するいくつかの種も油分解能を有している可能性があり、それらを主とした油脂分解群集が構築されたことが示された。

表 3−1 8 1/2 TSB 培地を用いて集積した微生物群集構造解析結果

OUT	植継き回数	スケール アップ	投入した もの	Family	Genus	Species	Identity (%)
1回目	2回目	3回目	5回目
1	6	2	0	1	31	235	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70
2	0	24	3	28	87	558	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. GHH01
3	109	36	1	391	302	2	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70
4	242	0	3	0	0	0	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus thermodenitrificans
5	3	363	8	97	1	44	Clostridiales	Symbiobacterium	Symbiobacterium thermophilum
6	0	0	0	6	0	0	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus sp. HYC-10
7	3	29	0	21	87	45	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. GHH01
8	3	45	0	53	271	174	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus thermoglucosidasius
9	0	2	0	2	12	33	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. GHH01
10	0	51	0	94	175	0	Bacillaceae	Caldalkalibacillus	Caldalkalibacillus thermarum
11	0	0	0	0	0	0	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus thermodenitrificans
12	0	0	0	1	1	13	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70
13	0	3	0	5	10	48	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. Y412MC52
14	37	3	1	91	76	0	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70
15	1	0	1	0	23	15	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus thermoglucosidasius
16	1	1	0	4	4	14	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70
17	0	0	0	0	1	14	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. WCH70
18	5	389	4	84	0	20	Clostridiales	Symbiobacterium	Symbiobacterium thermophilum
19	0	0	0	0	3	0	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus thermodenitrificans
20	0	4	0	3	36	21	Bacillaceae	Geobacillus	Geobacillus sp. Y4.1MC1
Total	410	952	21	881	1120	1236

廃白土混合コンポストを微生物源として、1/2 TSB で集積した群集をスケールアップして大量培養を行った。最終的に湿菌体重量で 10 g 回収し、少量の液体培地に懸濁して濃縮し実証試験機に投入した。今回の集積では、改善点である、バッファー添加を行ったことで、急激な pH の低下はみられなかった。

今回、油脂分解微生物群集が構築されているという判断の指標として上記の２つの方法、クリアハロー形成の有無と培養上清のリパーゼ活性を用いた。容易な指標を用いることで、迅速に植次ぎを行うかどうかの判断が可能となる。それ以外の指標として、実際の油分解量を測定する必要があるが、振とう培養中に添加した油がシリコンキャップに付着して定量の際に抽出が困難であること、液体培養液からの抽出効率の問題が残された。培養上清のリパ
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一ざ活性は簡易に測定可能であるため、一つの指標として有用であると考えられる。今後、油分解量の定量に関するそれらの問題を克服し、油分解の定量結果も合わせて指標とすることで、高効率な油脂分解微生物群集の構築を評価することが重要だと考えられる。
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### 3.4 脂質の分析手法の開発

#### 3.4.1 HPLC による分析法の開発

まず、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分析法の開発を目指した。移動相としてアセトンとアセトニトリルを用い、その比率を変えた際の、波長210 nmにおける吸光により試料を検出したクロマトグラムを図3-26に示す。アセトンとアセトニトリルの比を50:50（v/v）とすることで1-0leoyl-rac-glycerol（モノアシルグリセロールの一種）とオレイン酸（脂肪酸の一種）のピークが分離したが、トリオレイン（トリアシルグリセロールの一種）の保持時間が長くなることでピークがブロードになり、検出感度が大きく低下した。ここで、波長210 nmにおける吸光を各試料の検出に用いているが、これは化合物中の二重結合の数によりその強度が変化してしまうため、二重結合数の組合せが複雑な廃食用油およびその加水分解物の定量には用いることができない。それに対し、示差屈折計による検出は、感度が劣るものの化合物の構造による影響を受けにくい特徴を有する。

図3−26 移動相の比率を変えた際のHPLCクロマトグラム

試料濃度：500 ppm（アセトン溶液）、検出：UV 210 nm

そこで、移動相をアセトン：アセトニトリル＝50：50として示差屈折計により測定した結果を図3-27に示す。示差屈折計を用いた結果、大きな問題点が生じた。まず、夾雑物質に由来すると考えられるピークが現れ、これが1-0leoyl-rac-glycerolおよびオレイン酸のピークと重なってしまい、本条件が定量に適さないものとなった。さらに、検出感度の低下により、試料濃度を先の210 nmにおける吸光測定の条件の3倍にしているにも関わらず、トリオレインが検出限界以下となった。
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図3-27 検出器として示差屈折計を用いた際のHPLCクロマトグラム

試料濃度：1,500 ppm（アセトン溶液）、移動相：アセトン：アセトニトリル=50:50（v/v）

HPLC を用いたアシルグリセロール類および脂肪酸の定量分析については、分析前処理が必要ないという利点があるものの、予備的な検討において下記に示す問題点が明らかとなった。

・イソクラティックモード（移動相の組成を一定の値に固定して分析する手法）では、アシルグリセロール類および脂肪酸の保持時間に大きな差があり、一斉検出が難しい

・検出器として示差屈折計を用いなければならないが、示差屈折計はイソクラティックモードでしか利用できない

・示差屈折計を用いると、感度が著しく低下するのみならず、夾雑物に由来すると思われるピークにより、定量能が失われる

以上の問題点より、HPLC を用いた廃食用油およびその加水分解物の一斉定量は困難であることが明らかとなった。よって HPLC を用いたアシルグリセロール類および脂肪酸の定量分析に関する検討を終了とした。

#### 3.4.2 TLC による分析法の開発

#### 3.4.2 a TLC によるアシルグリセロール類および脂肪酸の分離分析条件の確立

薄層クロマトグラフィー(TLC)のプレートとして TLC Silica gel 60 F_{254} を用い、展開溶媒をヘキサン（Hex）：ジイソプロピルエーテル（IPE）：酢酸（AA）=60:40:1（v/v/v、以下同じ）として、100 mg / ml ジアシルグリセロール（DG）油 1 μl、同 0.5 μl、20 mg / ml DG 油 1 μl、同 0.5 μl をプレートに着点し展開した。結果を図 3-2 8 に示す。DG に由来す
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るスポットに加え、DG 油に含まれるトリアシルグリセロール（TG）およびモノアシルグリセロール（MG）に由来するスポットも確認できた。しかし、DG の二つの構造異性体である1,2-DG と 1,3-DG のスポットが十分に分離せず重なっていた。また MG についてはほとんど展開されなかった。TLC プレートへの試料の供与量については、脂質濃度 20 mg / ml の溶液を 0.5 μl 着点した条件において、スポットの形状、大きさ、濃度が適当であると判断した。

図 3−2 8 TLC を用いた脂質の分離分析

続いて、展開溶媒の組成を極性が高くなるよう変化させ、分離分析条件の改善を試みた。検討の結果、図3-29に示すように、Hex:IPE:AA=50:50:1とした時に1,2-DGと1,3-DGのスポットが分離し、MGもわずかに展開された。MGの移動度はわずかであるが、これにより、リン脂質や糖脂質といった極性の高い脂質が抽出液に混入した場合でも分離分析が可能となる。また、異なる試料として、DG油の他に大豆油とモノオレインも同時に分析した。その結果、大豆油の主成分であるTGや、モノオレイン中のMGも良好なスポットを形成した。

図 3−2 9 最適化条件における脂質の TLC 分析
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さらに、TLC プレートとして HPTLC Silica gel 60 F_{254} を用い、先の図と同じ条件にて、DG 油、大豆油、廃食用油、モノオレインの分析を行った（図 3−30）。その結果、移動度の大きい TG のスポット形状が大きく改善され、1,2-DG と 1,3-DG のスポットの分離も良くなった。また、廃食用油の分析においても良好な分離を示し、遊離脂肪酸の含有も確認された。

図 3−30 最適化条件における脂質の HPTLC を用いた分析

以上の検討により、TLC によるアシルグリセロール類および遊離脂肪酸の分離分析において、スポットの形状がよく、良好に分離する条件を確立し、廃食用油の分析にも適用が可能であることを確認した。

#### 3.4.2 b 油脂資化菌による廃食用油の分解評価への応用

培養液からの脂質の抽出法を確立するための予備検討として、純水および培養前のLB培地を用いて脂質抽出の検討を行った。総脂質の抽出は、もっとも汎用されている抽出方法の一つであるBligh-Dyer法をベースとし、有機溶媒の使用量を減らすために若干の改変を加えた。通常はメタノールとクロロホルム、そして水を添加して脂質を抽出するが、水の添加を行わないことにより、メタノールの使用量を1/3に、クロロホルムの使用量を4/5に減少させた。その他は定法に従い、脂質をクロロホルム層に抽出し分取した後、再度クロロホルムを添加して二回目の抽出を行い、抽出効率、回収率を確認した。脂質抽出の結果を表3.1に、抽出した脂質のTLCによる分析結果を図3-31に示す。純水、あるいはLB培地に廃食用油を添加した系における回収率は、ともにほぼ100%と良好な結果であった。さらに、各抽出とも、一回目の抽出において添加した廃食用油がほぼ回収されていた。また、LB培地からの脂質抽出においては、抽出量にわずかな正の誤差を与えたが、TLCによる分析には影響を与えないことを確認した。
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図3−31 廃食用油を添加した純水およびLB培地からの脂質抽出物のTLC分析

次に、確立した TLC による脂質の分析法を用いることで、廃食用油の主成分であるトリアシルグリセロール（TG）の加水分解を評価することが可能であるかを確認した。市販されている Candida rugosa 由来のリパーゼを用いて大豆油を加水分解した後、総脂質を抽出し、TLC により脂質の分析を行った。結果を表3-19および図3-32に示す。図より、リパーゼの濃度が高くなるに従い、抽出物中の TG が減少し、加水分解により生成されるジアシルグリセロール（DG）、モノアシルグリセロール（MG）および遊離脂肪酸（FA）の濃度が増加することを確認した。なお、表3.2より、リパーゼを添加していない系を含め、脂質の回収率は102から103%とわずかに正の誤差を示した。これは、リパーゼによる加水分解反応を安定化させるために用いた緩衝溶液の成分であるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが、脂質抽出液にごく微量混入したためである。

表 3−19 実験条件と抽出物の重量（単位：mg）および回収率（丸数字は図に対応）

条件	油添加量	1回目抽出量	2回目抽出量	総抽出量	回收率(%)
0.5 mg/mlリパーゼ溶液2 ml	46	44	①	2	47
0.05 mg/mlリパーゼ溶液2 ml	39	39	②	1	40
0.005 mg/mlリパーゼ溶液2 ml	37	37	③	1	38
50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 2 ml	39	39	④	1	40
図3−32 リパーゼを作用させた大豆油からの脂質抽出物の TLC 分析

以上の検討の結果を踏まえ、廃食用油を添加した培養液からの脂質の抽出と、TLC分析を用いた油脂資化菌による廃食用油の分解を評価した。油脂資化菌のスクリーニングにおいて単離された菌株の中から、Cronobacter属に属し、プレートアッセイにおいて最もクリアハローが観察されたNB18株と、同じ属に属するLB1株、そしてAcinetobacter属に属するLB2およびLB17株を用い、廃食用油を添加したLB培地で培養し、脂質の抽出およびTLCによる分析により、廃食用油の分解を確認した。脂質を抽出するために、菌体培養液にメタノールおよびクロロホルムを添加し攪拌したところ、予備検討では見られなかったエマルジョン層が形成され、二層に分離しなかった。そこで遠心分離を行うことにより上層および下層が形成されたが、生育活性の高かったLB2およびLB17株の培養液においては、タンパク質の凝集塊と思われる中間層が、他に比べより多く確認された。脂質抽出の結果を表3.3に示す。LB培地に菌を植菌していないネガティブコントロールにおいて、脂質の回収率が91%と約1割減少した。これはインキュベート中に脂質の一部が過酸化された結果であると考えられる。さらにLB2、LB17株を培養した系において回収率がそれぞれ70%、63%となり、明らかにネガティブコントロールの値よりも低くなったことから、添加した廃食用油の分解が期待された。しかし、TLCの分析（図3-33）においてスポットのパターンが他と同じであったことから、TGが分解したとは考えにくく、脂質の抽出工程においてタンパク質の凝集塊と思われる中間層が形成されたことによって、抽出効率が低下した結果であると判断した。しかし、単離菌を培養したすべての系において、廃食用油に含まれる遊離脂肪酸を示すスポットが消失しており、単離菌の培養により資化されていた。
図3−33 脂質資化菌の廃食用油含有培地の培養液からの脂質抽出物の TLC 分析

TLC は脂質の分離や分析を行う上で有用な手段として用いられてきた。しかし、TLC プレートと展開溶媒の組合せは、研究の目的に応じて慎重に選択する必要がある。これまで、アシルグリセリド類および脂肪酸の分離分析においては、石油エーテル、ジェチルエーテル、酢酸の組合せが展開溶媒として用いられてきた。しかし、石油エーテルはペンタン、イソペンタン、ヘキサンを主成分とした混合物であり，再現性に問題があるだけではなく、大きな割合を占めるペンタン、イソペンタンは沸点が非常に低く引火しやすいことから、特殊引火物に指定されている。同様に、ジェチルエーテルも特殊引火物であり、さらに経時変化により爆発性の過酸化物を生成することから、東京大学においては排出が制限されている。そこで、展開溶媒の組合せをより沸点が高いヘキサン、ジイソプロピルエーテル、酢酸とし、脂質のTLCによる分離条件を検討した。また、試料の濃度および分析に供する液量についても検討を行った。その結果、希釈濃度を抽出物20 mg/ml希釈溶媒、分析に供する液量を0.5 μlとし、展開溶媒をヘキサン：ジイソプロピルエーテル：酢酸=50:50:1 (v/v/v)にすることで、アシルグリセリド類および遊離脂肪酸のスポットが形状よく、良好に分離する条件を確立した。さらにTLCとして、粒子径が小さく特殊なシリカゲルでコーティングされている高分解能TLC (high-performance TLC:HPTLC)を用いることで、分離分解能およびスポット形状が改善された。そして、確立した条件において、廃食用油およびその加水分解物の分析が可能であることを確認した。次に、培養液からの総脂質の抽出法を検討した。総脂質の抽出は、もっとも汎用されている抽出方法の一つであるBligh-Dyer法をベースとし、改変を加えることでメタノールの使用量を1/3に、クロロホルムの使用量を4/5に減少させた。有機溶媒の使用量は、その廃棄量だけでなく大気への蒸発量へも直接関係するため、昨今の有機溶媒の使用に関する環境を鑑みると、有用な改変であると考えられる。続いて、培養液からの総脂質の抽出法とTLCによる脂質の分析法を組合せることで、大豆油の主成分であるトリアシルグリセロールのリパーゼによる分解の評価を試みた。その結果、酵素の添加量に応じて、トリアシルグリセロールに対応するスポットが減少、縮小し、分解生成物であるモノ、ジアシルグリセロールおよび遊離脂肪酸のスポット濃度が増加した。この結果から、培養液に添加した廃食用油の分解を評価できることを確認した。なお、TLC上の脂質スポット
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トの検出には、リンモリブデン酸試薬を用いた染色法を用いており、デンシトメトリ定量（スポットの大きさと濃度の比較による定量法）により、廃食用油の主成分であるトリアシルグリセロールの分解を追跡することができる。以上の検討結果をもとに、油脂資化菌のスクリーニングにより単離された菌を用いて、廃食用油の分解評価を行った。残念ながら、単離菌の液体培養による検討では、廃食用油は分解されていなかった。しかし、廃食用油に含まれる遊離脂肪酸が資化されていることが明らかとなった。これは新たな知見であり、油脂分解菌の集積培養法とスクリーニング法を構築するにあたり、非常に重要なものである。本検討において確立したTLCによる脂質の分析法は、展開溶媒の安全性を向上させつつ、高分解能でアシルグリセロール類および遊離脂肪酸の分離分析が可能であり、培養液からの総脂質の抽出法と組み合わせることにより、単離した油脂分解菌の廃食用油分解能の評価や、オカラの好気高温性発酵システムにおける廃食用油処理能の評価に、大いに活用できる。

#### 3.4.3 ガスクロマトグラフィー（GC）による定量法の開発

廃食用油含有オカラ好気発酵物中の脂質は、最も一般的なクロロホルム：メタノール＝2：1（v/v）溶液を用いて抽出した。また、抽出を二回繰り返すことで脂質は十分に抽出された。抽出した脂質には、トリアシルグリセロールの加水分解により生成されるモノ、ジアシルグリセロールおよび遊離脂肪酸が含まれるが、これらは分子内に水酸基を有するため、そのままではGCによる分析は難しい。そこで、トリメチルシリル（TMS）化試薬であるTri-Sil TP溶液を用いて誘導体化した。

GC 分析に使用するカラムについては、耐熱性に優れる金属キャピラリータイプのカラムを含め検討を行った。その結果、耐熱性では金属キャピラリータイプのカラムには劣るものの、扱いやすさの点から溶融石英キャピラリータイプを選択し、その中でも耐熱性に優れるSLB-5ms Capillary GC Column（Sigma-Aldrich）を用いることとした。さらに、カラムの昇温条件についても種々検討を行い、表3—20に示す条件において、沸点が高いトリアシルグリセロールを良好に検出した。なお、検出にはC-H結合を持つ化合物に対して高い感度を有する水素炎イオン化検出器（Flame Ionization Detector：FID）を用いた。

表 3−20 GC による脂質抽出物の分析条件

カラム	:SLB-5ms Capillary GC Column (Sigma-Aldrich) (L x I.D. 30 m x 0.25 μm、df 0.25 μm)
キャリアガス	:ヘリウム
試料注入量	:1 μl
検出器	:水素炎イオン化検出器 (FID)
注入口温度	:355 °C
カラム温度	:200 °C (5 min)→3 °C/min→350 °C→1 °C/min→365 °C (10 min)
検出器温度	:355 °C
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次に、確立した抽出法およびGCによる分析法を用いて、廃食用油含有オカラ好気発酵物からTMS誘導体化脂質抽出物を調製し、GC-FID法により分析した（図3-34）。その結果、トリアシルグリセロールと、TMS誘導体化されたジアシルグリセロールを検出することができた。しかし、モノアシルグリセロールおよび遊離脂肪酸を同定するには至らなかった。

図3−34 オカラ好気発酵物から調製した脂質抽出物のトリメチルシリル誘導体化物のGC-FIDクロマトグラム

DG-TMS：ジアシルグリセロールトリメチルシリル誘導体、TG：トリアシルグリセロール

GC による分析は、原則として分析対象物が気化する物質で無ければ分析出来ない。そのため、廃食用油の主成分であるトリアシルグリセロール(TG)といった沸点の高い化合物の、GC による分析は非常に困難である。しかし近年、超耐熱性のキャピラリーカラムが開発され、高温条件下でのGC 分析が検討されつつある。そこで本検討においては、耐熱性に優れる金属キャピラリータイプのカラムを含め検討を行った。検出器については、近年、高感度な質量分析計を用いた分析が、脂質分析に限らず多く報告されている。しかし、TG を構成する脂肪酸側鎖中の二重結合の数が異なるとイオン化強度も異なる。そのため、本検討において、質量分析計は検出器として適さない。これに対し、水素炎イオン化検出器（Flame Ionization Detector:FID）はC-H 結合を持つ化合物に対して高い感度を有するだけでなく、類似化合物に対し二重結合の数に依存せず同等のイオン強度を示すため、本検討において有効的な検出器である。GC-FID による分析条件検討の結果、TG およびジアシルグリセロール（DG）のトリメチルシリル（TMS）誘導体化物を示すピークを検出することが可能となった。なお、TG を示すピークが複数現れているのは、TG を構成する脂肪酸の炭素鎖長の総和に由来している。最も大きなピークは、炭素鎖長が18（C18）の脂肪酸3本により構成されているTG を示しており、これは、大豆油に含まれる脂肪酸の50%以上がリノール酸（C18）であることに関係している。DG-TMS のピークがさらに複雑に分離しているのは、上記のTG と同様の理由に加え、1,2-DG と1,3-DG でさらにピークが分かれることに由来する。以上のように、TG およびDG-TMS を検出することが可能となったが、モノアシルグリセロール（MG）および遊離脂肪酸（FA）のTMS 誘導体を同定するには至らなかった。
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### 4. 結論

### 4.1 実証試験機を用いたシステム開発

(1) 廃白土混合コンポストを添加して発酵日数 5 日間で油分分解率は 21% であった。これは従来にない高い値であった。

(2) 廃食用油を添加することでヒーター電力を 26% 低減できた。

(3) 乾物と油分の分解熱で必要熱量の 39% を賄うことができた。

(4) 油分分解効果が高い高温菌は活性が pH に大きく影響され、活性が高い pH 域は 8 前後であり、それより下の中性域、酸性域では急速に活性が低下することが明らかになった。

(5) 油分の分解は弱アルカリ域で効果が高く、そのためアンモニアも高濃度で生成する。簡易な構成の微生物脱臭器を用いて高い効率でアンモニアを除去できた。

(6) 副資材を用いずに高含水率のオカラと廃食用油を5%添加して3ヶ月間安定した運転が可能であった。

(7) 家庭から排出される廃食用油を用いても同等の効果が得られた。

(8) 発酵槽内は連続通気と連続攪拌により好気的な条件が保たれているが、念のためメタンガスの分析をしたところ 0.1% (v/v) 以下であった。

以上のことから、高含水率の食品加工残渣や生ごみなどを飼料化・堆肥化・減量化および乾燥ができる好熱性油脂分解菌を利用した廃食用油添加型高温好気性発酵処理システムを開発できた。

### 4.2 微生物添加効果の検証

実証試験装置に各種の微生物を添加した結果の検証として、以下の5回の投入試験において、高精度の分析を行った。

（1）コントロール条件

（2）NB501 株添加 1 回目（40 g）

（3）NB501 株添加 2 回目（100 g）

（４）廃白土コンポスト添加（コントロール週も含めた５週間のモニタリング）

（5）好熟性油脂分解微生物群集添加

コントロール条件においては1週間で約4 kg程度の脂質と、20 kg弱程度の差分基質（脂質以外の有機物）が分解されており、高温好気発酵において、微生物による分解が起こっていることが確認された。本研究で単離したリパーゼ生産菌B. thermoamylovorans NB501株を添加した結果、1回目（40 g）では効果が見られなかったのに対し、湿菌体重量で2倍以上の100 gを投入した2回目では、2週間の間、脂質分解量が5.6～5.8 kgと上昇し、CO₂発生量も増加した。しかし、3週目では逆に脂質分解量が低下し、微生物活性が低下した。
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好熱性油脂分解微生物群集（60℃で油脂を炭素源として集積培養を行った微生物資材）を4.7 g添加した場合も、1週目は脂質分解量（6.6 kg）とCO $ _{2} $ 発生量の増加が見られたが、やはり2週目から活性が低下した。

しかし、微生物資材として、廃白土混合コンポストを7.1 kg投入した結果、脂質分解量は6.6 kg（2週目）→8.5 kg（4週目）と持続的に上昇し、CO2発生量も継続的に高くなった。約1ヶ月の間、高活性が維持されたことから、廃白土混合コンポストの投入が本システムの高機能化に有用であったことになる。

廃白土混合コンポスト添加における微生物群集解析を、次世代シークエンサーを用いて行った結果、B. thermoamylovorans NB501 株にごく近縁の B. thermolactis が増加していたことが分かった。

本研究で添加した NB501 株や好熱性油脂分解微生物群集の量は、湿菌体重量で 100 g 以下であり、廃白土混合コンポストの添加量より大幅に少ない。実験室レベルの培養で kg 単位の菌体の添加を行うことは難しいが、廃白土混合コンポストの添加において効果を示している（リパーゼの生産に寄与している）微生物は、NB501 株に近縁の微生物である可能性が高いといえる。

### 4.3 好熱性油脂分解菌の探索と性質解明

実証試験機の発酵オカラまたは廃白土混合コンポストを単離源として、廃食用油、トリオレイン、大豆油など多様な油脂をNBやTSBなどの培地をそれぞれ組み合わせたことにより、40℃、50℃さらには60℃で生育する5種類の好熱性油脂分解菌の単離に成功した。40℃ではAcinetobacter baumanniiとCronobacter sakazakii、50℃ではBacillus thermoamylovorans、60℃ではGeobacillus galactosidasiusとGeobacillus thermodenitrificansを単離した。また、B. thermoamylovoransとG. thermodenitrificansについては、そのリパーゼの性質を調査し、それぞれ60℃と70℃が至適温度となることと、どちらも高い耐熱性を有することを明らかにした。上記の微生物の中でも特に高温域60℃で生育可能であり、生産するリパーゼの至適温度が60℃以上の油脂分解酵素活性を示す微生物に関しては、実証試験機内において廃食用油の分解に関与していると考えられる。次世代シークエンサーを用いた群集解析からは、60℃における集積培養において、Geobacillus属に属するいくつかの種が多く集積されていることが示された。

### 4.4 脂質の分析手法の開発

廃食用油の主成分であるトリアシルグリセロールの分解過程を経時的に定量することを目的として、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、ガスクロマトグラフィー（GC）を用いた分析法の開発を検討した。HPLCを用いた定量に関しては、予備検討の段階で困難であることが明らかになり、検討を終了した。TLCを用いた脂質の分析法に関しては、展開溶媒の安全性を向上させつつ、高分解能で、廃食用油の主成分で
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あるトリアシルグリセロールと、その分解生成物であるモノ、ジアシルグリセロールおよび遊離脂肪酸のスポットが形状よく、良好に分離する条件を確立した。さらに、脂質の抽出法を組み合わせることで、単離した油脂分解菌の廃食用油分解能の評価や、オカラの好気高温性発酵システムにおける廃食用油処理能の評価への応用が可能である。GCを用いた脂質の定量分析においては、共同研究の形で開発を行った。カラムの選定においては、耐熱性に優れる金属キャピラリータイプのカラムを含め検討を行い、汎用性の高い微極性溶融石英キャピラリーカラムの中でも耐熱性の高いカラムを用いることで、沸点の高いトリアシルグリセロールを良好に検出する条件を確立した。また、ジアシルグリセロールについても誘導体化することで検出が可能であった。しかし、モノアシルグリセロールおよび遊離脂肪酸の誘導体を同定するには至らなかった。

### 4.5 研究期間終了後の展開の可能性

#### 4.5.1 スケールアップについて

本システムはオカラだけでなく他の食品加工残渣（ビール粕、焼酎粕、果汁絞り粕など）や生ごみにも適用できる。ただし醤油絞り粕は含水率が低く塩分が高いため検討が必要である。

オカラの場合は年間70万トンが排出されている $ ^{18)} $ 。豆腐製造業者は小～中規模事業者が多いとみられるが、大規模事業者も存在している。神奈川県の豆腐製造業者のアンケート $ ^{19)} $ では図4-1に示すように50～100kg/日程度のオカラ量の事業者が最も多く、これらは実証試験機の規模に相当する。1t/日程度の大規模事業者もおられるので、スケールアップにより対応する。

本システムは密閉構造の発酵乾燥方式で、横軸の攪拌機構を備えているので軸長軸径の制約から装置ユニットとしてはスケールアップに限界がある。現在のところ1 t/日程度までスケールアップ可能であると考えており、それ以上は多軸の横型攪拌機を設けた現地組み立て型（プラント型）で対応できる。

図4－1 神奈川県における事業者毎オカラ発生量と処分料金 $ ^{19)} $
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#### 4.5.2 生ごみへの応用について

生ごみは成分変動が大きい原料であるが易分解性の有機物が多く含まれており、多くの実験報告や堆肥化施設での運転データ等から好気性微生物によって分解しやすい性状であることが明らかなので、本システムにおいても問題はないと考えられる。ただし有機酸が生成して低pHになり易い特性もあることから、アルカリを添加してpHコントロールすることが必要とみられ、本システムを適用するには実証により確認することも必要である。

分別が良い調理残渣などは発酵処理後に飼料として用いることができる。分別が不十分なものは発酵処理後の異物除去と熟成工程を付加させることで堆肥に使用できる。最終的に焼却処分するとしても乾燥と発酵による減量効果が大きく、常温保管ができ、輸送コストが低減でき、焼却炉のインフラ建設コストも低減できる。

一方、従来の生ごみ処理機には問題が多く、発火事故や悪臭・発酵不良などのトラブルがしばしば報告されている。本システムでは発火しやすい廃食用油を用いても発火せず安全に稼働し、アンモニアによる悪臭の発生は微生物脱臭器で解消している。発酵不良は低 pH 時に活性が低下することと高含水率による通気性の悪化が主な原因なので、pH 制御をおこない、高温発酵で乾燥を促進することで解消される。このように、従来の生ごみ処理機で問題が多かった発火事故や悪臭・発酵不良が解決できていることから、生ごみへの応用についても十分に可能である。スケールアップについても前項で記載したように対応可能である。

本システムを用いたときの再資源化ルートの可能性を図4−2に示す。このことにより循環型で低炭素化社会の実現に貢献できると考えている。
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図 4−2 生ごみ等食品廃棄物の新しい再資源化ルート $ ^{20)} $