Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## 概要

## 結果と考察

## ①実証試験機を用いたシステム開発

## 試験内容

24 年度は安定した運転条件の確立を行い、さらに、予備実験として各種の菌を添加してそれらの効果を調べた。

25年4月から5月にかけて70℃での運転試験を行った。以後は60℃での運転を継続した。

25年6月～26年2月の期間には、以下のとおり、添加試験を行った。

・6月11日～6月25日（2週間）：コントロール条件（菌を添加しない条件）

·6月25日～7月16日（3週間）：NB501株添加1回目（40g）

·7月23日～8月13日（3週間）：NB501株添加2回目（100g）

・11月5日～11月12日（1週間）：コントロール週（廃白土コンポスト添加前週）

・11月12日～12月10日（4週間）：廃白土コンポスト添加

·12月10日～12月24日（2週間）：好熱性油脂分解微生物群集添加1回目（4.7g）

·2月4日～2月18日（2週間）：好熱性油脂分解微生物群集添加2回目（10 g:未分析）

なお、25年3月末（70℃運転前）に Geobacillus zalihae の添加試験を行ったが、良好な結果は得られなかった。

26年3月には、家庭から排出された廃食用油を用いた試験を行った。

## 70 ℃での試験

70℃から 60℃に切り替えて試験を行った結果、70℃では熱効率が高くなるものの、微生物活性が60℃に比べて若干下がることから、60℃が最適温度であると判断した。

## 廃白土混合コンポスト添加での試験結果

他の試験と比べて、もっとも高い油脂分解効果が得られた。添加前週（コントロール週）では油分分解量が3.6 kg/週、乾物分解量が14 kg/週だったのに対し、廃白土混合コンポスト添加後第2週から第4週にかけて、油分分解量は6.6→5.7→8.8 kg/週、乾物分解量は28→24→29 kg/週と、長期にわたって高い活性が維持された。1日当たりの分解率は乾物、油分ともに4%程度であり、既報告事例と比べても乾物では同等か高い結果が、また油分では畜ふん＋生ごみでの事例と比し大幅に高い結果が得られた。

既報では、廃食用油を添加した高温好気法による実験で60℃の高温域では40℃に比べて著しく油分分解率が低下すると報告している。40℃では日当たり4%程度が得られたが、60℃では同2%程度であった。リパーゼなどの油脂分解酵素の生産能が高い菌は中温菌が多いためとされているが、本試験では60℃で高い油脂分解酵素生産能を持つ菌の添加効果により60℃において日当たり4.2%の分解率が得られている。また既報では廃食用油の分解が遅いため蓄積し、粘性を増加させて通気不良になり発酵が停止することを報告している。本試験では全期間を通じてそのようなことは見られなかった。
## 概要

pH は第 3 週を除き 8 前後で推移した。アンモニアも高い濃度で生成した。油脂分解効果が高い高温菌は pH に大きく活性が影響され、活性が高い pH 域は 8 前後で、それより下の中性域、酸性域では急速に活性が低下することが明らかになった。

## 発酵乾燥方式における光熱費の低減効果

廃白土混合コンポスト添加第4週における、本システムでの有機物分解による発酵熱の寄与を計算した。入熱は乾物分解熱＋粗脂肪分解熱＋ヒーター電力とし分析値および測定値から求めた。出熱は排気が持ち去る熱量＋放熱損失とし、排気が持ち去る熱量を排気ガス量、温度、湿度からエンタルピーを算出して求めた。放熱損失は入熱と出熱を等しいとして入熱合計値から排気が持ち去る熱量を差し引いて求めた。発酵による発熱量は全体の39%であり5日間の発酵時間でのシステムとしては大きい値といえる。物理的な乾燥方式では発酵熱の寄与が全くないのでこの分外部熱源を多く必要とすることになる。出熱項目のうち放熱量に関し、用いた実証試験機は断熱材の劣化やはく離がみられ断熱性が十分ではなく放熱損失が大きい。断熱を良くすれば放熱量が低減しヒーター電力がさらに小さくて済む可能性が大きい。分解率は発酵日数に大きく影響されることと、5日間の発酵日数では添加した油の一部しか利用していないことから、倍の10日間とすることで必要熱量のうち70%近くを発酵熱で賄うことができる可能性がある。物理的な乾燥方式では発酵熱の寄与は0であるため、発酵乾燥方式における光熱費の低減効果は大きい。

## 家庭系廃食用油の添加試験

家庭から排出される廃食用油を用いた試験を行った。油揚げ製造時の廃食用油を用いた集積培養菌添加試験での結果と比較したところ、同等の結果が得られた。従って、工場などの業務用廃食用油の他に家庭から排出される廃食用油でも同等の効果が得られることが確認できた。不純物の混入が少ない廃食用油は BDF や灯油混合燃料などに再生利用されているが、本研究で新たに高含水率有機性廃棄物の発酵処理における水蒸発の熱源として利用可能なことが明らかになった。BDF や灯油混合燃料では不純物はできるだけ避けなければいけない。そのために排出側での異物混入防止の配慮や再生利用側でも前処理でそれらを取り除く必要がある。本システムの場合、微生物が分解できる食品カスなどの異物や水分が混入しても影響はないのでそのまま利用することができる。

## 連続安定運転

25 年 9 月 24 日から 12 月 24 日まで安定した運転を継続した。オカラは 100kg/日、廃食用油は油無添加週を除いて 5 kg/日投入した。この間、内容物の塊状化や通気性の不良による嫌気性化は無かった。廃食用油の添加による粘性の増加はなく、高含水率のオカラと廃食用油のみを用いて安定した運転が可能であった。これは攪拌の効果と高温好気性発酵の特長である乾燥速度が速いことによるものと考えられる。なおこの期間以外でも安定した運転が行えた。
## 概要

## メタンガス発生の有無の検討

発酵槽内のメタンガス発生量は検出限界の0.1%（v/v）以下であった。従って、メタン菌によるメタンガスが生成しておらず、爆発限界（5.3～14%）より十分低いため、本装置の発酵による爆発などの危険性はないことが明らかになった。

## 脱臭器の設置と効果

25 年 9 月に脱臭器を設置した。それまでは発酵乾燥物の pH を 7 前後に抑えてアンモニアの発生を抑制する運転を行っていたが、弱アルカリ域での活性が高いと思われる微生物試験には適していなかった。脱臭器設置後はアンモニアが生成しても環境に放出するおそれがないので pH 8 程度の弱アルカリ域での長期試験が可能になった。脱臭方式は微生物脱臭を採用した。11 月中頃から高いアンモニアが生成したが脱臭器出口ではほぼ 0 ppm であった。油脂分解効果の高い微生物は弱アルカリ域で活性が高いことが、NB501 株や廃白土混合コンポストで明らかになった。弱アルカリ域ではタンパク質の分解に伴って必然的にアンモニアが高濃度で生成するので、本システムでは乾燥発酵槽と脱臭器の組み合わせが必要である。脱臭方式はさまざまな方式が用いられているが、本研究で用いた微生物脱臭方式は簡易な構成であり、微生物担体に付着した硝化菌がアンモニアを酸化して硝酸態にするので担体の交換は必要が無く、微生物の乾燥防止と硝酸態窒素の排出のため少量の給水が必要なだけで安価な脱臭装置である。

## 生成飼料の家畜への供与試験

24 年度に鶏・豚への発酵乾燥飼料の供与試験を行った。5%、10% 混合区では対照区と大差なかった。20% 混合区では鶏の場合やや産卵量が低下し、豚ではと畜日齢が長くなる傾向があった。

## 副資材の不要化

すべての試験期間中において、従来水分調整や通気性改良材として必要とされた木質チップ、もみ殻などの副資材は用いていない。飼料化の場合に乾材として必要であった米ぬか、小麦ふすま、パンくずなどの副資材も使用していない。内容物の塊状化や通気性の不良による嫌気性化は無かった。廃食用油の添加による粘性の増加も無かった。高含水率のオカラと廃食用油のみを用いて安定した運転が可能であった。これは攪拌の効果と高温好気性発酵の特長である乾燥速度が速いことによるものと考えられる。

副資材は従来必須のものとされていたが、木質系の副資材を用いれば飼料としては使えず、また木質は分解しにくいので減量効果も低い。副資材を用いずに発酵乾燥することで、本システムは飼料化の他に減量化、乾燥の用途にも適用できる。熟成工程を付加すれば堆肥化用途にも適用できる。

## 廃食用油を添加した高温好気性発酵乾燥システムのメリット

本研究において次に示すメリットを確認できた。
概要

(1) 短期間の発酵日数で乾物、油脂ともに高い分解効果が得られた。

(2) 廃食用油の添加でヒーター等の外部入熱を少なくすることができた。

(3) 高含水率のオカラの発酵乾燥処理において副資材が不要であった。

(4) 副資材を用いないので発酵日数を長くとれた。

(5) 乾燥速度が速く、内容物の塊状化や嫌気性化はなかった。

(6) 60℃で油脂分を分解する高温好気性菌によりオカラを発酵乾燥させ飼料として用いることができた。減量化、乾燥等に用いることも可能である。

(7) 添加する廃食用油は家庭などから排出されるものでも同等の効果であった。家庭やレストランなどでは不純物が混入しやすいのでそれらの再利用に適する。

また一般的に次に示すメリットもある。

(8) 生肉が混入した生ごみ等の飼料化においてはエコフィードガイドラインに定める70℃30分間以上の加熱処理が必要であるが、高温発酵では常時60℃程度での発酵温度なのでガイドラインは容易に達成できる。

(9) 熟成工程を付加すれば堆肥に利用できる。

(10) 必要な水分を蒸発させる際に排気が持ち出す熱量は中温発酵より少ない。

(11) 病原菌や雑草の種子が死滅、不活化する。

(12) ハエや小虫が発生しない。

## ②微生物添加効果の検証

実証試験装置に各種の微生物を添加した結果の検証として、以下の5回の投入試験において、高精度の分析を行った。

（1）コントロール条件

（2）NB501 株添加 1 回目（40 g）

（3）NB501 株添加 2 回目（100 g）

（４）廃白土コンポスト添加（コントロール週も含めた５週間のモニタリング）

（5）好熟性油脂分解微生物群集添加

コントロール条件においては1週間で約4kg程度の脂質と、20kg弱程度の差分基質（脂質以外の有機物：前項で「乾物」としたものにあたる）が分解されており、高温好気発酵において、微生物による分解が起こっていることが確認された。本研究で単離したリパーゼ生産菌B.thermoamylovoransNB501株を添加した結果、1回目（40g）では効果が見られなかったのに対し、湿菌体重量で2倍以上の100gを投入した2回目では、2週間の間、脂質分解量が5.6～5.8kgと上昇し、CO₂発生量も増加した。しかし、3週目では逆に脂質分解量が低下し、微生物活性が低下した。好熱性油脂分解微生物群集（60℃で油脂を炭素源として集積培養を行った微生物資材）を4.7g添加した場合も、1週目は脂質分解量（6.6kg）とCO₂発生量の増加が見られたが、やはり2週目から活性が低下した。

しかし、微生物資材として、廃白土混合コンポストを7.1 kg投入した結果、脂質分解量は6.6 kg（2週目）→8.5 kg（4週目）と持続的に上昇し、 $ CO_{2} $ 発生量も継続的に高くなった。約1ヶ月の間、高活性が維持されたことから、廃白土混合コンポストの投入が本システム
## 概要

ムの高機能化に有用であったことになる。

廃白土混合コンポスト添加における微生物群集解析を、次世代シークエンサーを用いて行った結果、B. thermoamylovorans NB501 株にごく近縁の B. thermolactis が増加していたことが分かった。

本研究で添加した NB501 株や好熱性油脂分解微生物群集の量は、湿菌体重量で 100 g 以下であり、廃白土混合コンポストの添加量より大幅に少ない。実験室レベルの培養で kg 単位の菌体の添加を行うことは難しいが、廃白土混合コンポストの添加において効果を示している（リパーゼの生産に寄与している）微生物は、NB501 株に近縁の微生物である可能性が高いといえる。

## ③好熱性油脂分解菌の探索と性質解明

実証試験機の発酵オカラまたは廃白土混合コンポストを単離源として、廃食用油、トリオレイン、大豆油など多様な油脂をNBやTSBなどの培地をそれぞれ組み合わせたことにより、40℃、50℃さらには60℃で生育する5種類の好熱性油脂分解菌の単離に成功した。40℃ではAcinetobacter baumanniiとCronobacter sakazakii、50℃ではBacillus thermoamylovorans、60℃ではGeobacillus galactosidasiusとGeobacillus thermodenitrificansを単離した。また、B. thermoamylovoransとG. thermodenitrificansについては、そのリパーゼの性質を調査し、それぞれ60℃と70℃が至適温度となることと、どちらも高い耐熱性を有することを明らかにした。上記の微生物の中でも特に高温域60℃で生育可能であり、生産するリパーゼの至適温度が60℃以上の油脂分解酵素活性を示す微生物に関しては、実証試験機内において廃食用油の分解に関与していると考えられる。次世代シークエンサーを用いた群集解析からは、60℃における集積培養において、Geobacillus属に属するいくつかの種が多く集積されていることが示された。

## ④脂質の分析手法の開発

廃食用油の主成分であるトリアシルグリセロールの分解過程を経時的に定量することを目的として、HPLC、TLC、GCを用いた分析法の開発を検討した。HPLCを用いた定量に関しては、予備検討の段階で困難であることが明らかになり、検討を終了した。TLCを用いた脂質の分析法に関しては、展開溶媒の安全性を向上させつつ、高分解能で、廃食用油の主成分であるトリアシルグリセロールと、その分解生成物であるモノ、ジアシルグリセロールおよび遊離脂肪酸のスポットが形状よく、良好に分離する条件を確立した。さらに、脂質の抽出法を組み合わせることで、単離した油脂分解菌の廃食用油分解能の評価や、オカラの好気高温性発酵システムにおける廃食用油処理能の評価への応用が可能である。GCを用いた脂質の定量分析においては、共同研究の形で開発を行った。カラムの選定においては、耐熱性に優れる金属キャピラリータイプのカラムを含め検討を行い、汎用性の高い微極性溶融石英キャピラリーカラムの中でも耐熱性の高いカラムを用いることで、沸点の高いトリアシルグリセロールを良好に検出する条件を確立した。また、ジアシルグリセロールについても誘導体化することで検出が可能であった。しかし、モノアシルグリセロールおよび遊離脂肪酸の誘導
## 概要

体を同定するには至らなかった。

## 環境政策への貢献

本システムは、廃食用油への水や不純物の混入に強く、廃食用油の回収率の向上につながる点が最大のメリットである。焼酎粕、果汁搾り粕、澱粉粕、調理残渣などの、様々な食品加工残渣の飼料としての再利用や、生ごみの飼料化・堆肥化、減量・乾燥への適用の可能性が広がる。水や不純物の混入に強い低コストの発酵乾燥システムが普及すれば、現状で回収利用に適さないような廃食用油も回収できるようになる。よって、生活排水への廃食用油の流入が減少し環境負荷が低減される、発酵乾燥に用いる外部熱源の低減によりエネルギー使用量が減るなどの波及効果も期待できる。

他の処理方法に対する優位性：

・家庭やレストランなどからの廃食用油には水や揚げカスなどの不純物が混入しやすく、BDF（バイオディーゼル燃料）などの回収再利用に適さないものがある。しかし、本システムはそれらが混入しても大きな影響はないため、回収率の向上が見込める。

・攪拌しながら熱風を通気するために乾燥速度、処理速度が早い。

・熱に弱い病原菌は死滅し雑草種子も不活化するので飼料およびコンポストとしての利用の安全性が高まる。生肉が混入した生ゴミなどの飼料化においてはエコフィードガイドラインに定める70℃30分以上の加熱処理が必要であるが、高温発酵では常時60～70℃なのでガイドラインは容易に達成できる。

多くの発酵乾燥システムでは、飼料化の場合には乾材として米ぬか、小麦ふすま、パンくずなどが、堆肥化の場合には水分調整および通気性改良材として木材チップ、おがくず、もみ殻などの副資材の投入を必要とするが、本システムでは、連続的に攪拌を行なって高温好気性発酵をさせるため、必要ない。

・物理的乾燥法では発酵熱の寄与が 0 であるのに対し、本システムでは必要熱量の約 4 割を発酵熱により賄うことができる。

また、本研究で確立した脂質の抽出・分析手法は、危険性の高い溶媒や健康に悪影響のある溶媒の使用量を減少させつつ良好な結果が得られる方法であり、環境負荷の低減に貢献できると期待される。

## 研究成果の実現可能性

高含水率の食品加工残渣や生ごみなどを飼料化・堆肥化・減量化および乾燥ができる好熱性油脂分解菌を利用した廃食用油添加型高温好気性発酵処理システムを開発できたことにより、食品加工残渣を排出する食品メーカー等においては再生利用設備として飼料化等、スーパーやホテル・レストランなどにおいては業務用生ごみ処理機として飼料・堆肥としての再生利用や減量・乾燥を目的とした適用が可能である。
## 概要

排出事業者にとっては廃棄物としてでる廃食用油を発酵乾燥の熱源の一部として利用でき、外部熱源も低減できることからコスト低減のメリットがある。

豆腐と油揚げの製造で同時に排出される、オカラと廃食用油を同時に処理するシステムは、オカラを産業廃棄物として有料で処理している中規模以上の工場で導入される可能性がある。

実証試験機では 100kg/日の小型装置を用いているが、1,000kg/日のような大型機、20t/日のようなプラント型も可能であると考えており、大型化による費用低減効果も期待できる。特に、廃食用油への水や揚げカスなどの不純物の混入に強いため、家庭やレストランなどから排出されるもののなかで、BDF などの回収再利用に適さないような廃食用油も利用可能な点が重要であり、廃食用油の回収率の向上につながることが期待できる。

## 結論

実証試験機を用いたシステム開発では、

(1) 廃白土混合コンポストを添加して発酵日数 5 日間で油分分解率は 21% であった。これは従来にない高い値であった。

(2) 廃食用油を添加することでヒーター電力を 26% 低減できた。

(3) 乾物と油分の分解熱で必要熱量の 39% を賄うことができた。

(4) 油分分解効果が高い高温菌は活性が pH に大きく影響され、活性が高い pH 域は8前後であり、それより下の中性域、酸性域では急速に活性が低下することが明らかになった。

(5) 油分の分解は弱アルカリ域で効果が高く、そのためアンモニアも高濃度で生成する。簡易な構成の微生物脱臭器を用いて高い効率でアンモニアを除去できた。

(6) 副資材を用いずに高含水率のオカラと廃食用油を5%添加して3ヶ月間安定した運転が可能であった。

(7) 家庭から排出される廃食用油を用いても同等の効果が得られた。

(8) 発酵槽内は連続通気と連続攪拌により好気的な条件が保たれているが、念のためメタンガスの分析をしたところ検出限界の $ 0.1\% \, (\text{v/v}) $ 以下であった。

以上のことから高含水率の食品加工残渣や生ごみなどを飼料化・堆肥化・減量化および乾燥ができる好熱性油脂分解菌を利用した廃食用油添加型高温好気性発酵処理システムを開発できた。

概要版：ここまで
## 本文 総合研究報告書 本文

### 1. 研究背景と目的

### 1.1 研究背景

高含水率の食品加工残渣はビール粕、馬鈴薯澱粉粕、オカラ、果汁絞り粕等として約500万トン/年が排出されているが、飼料としての再生利用率は50%程度に留まっている。これは食品加工残渣が高い含水率により腐敗しやすく、乾燥や輸送のコストもかかるためである。従って、高温好気性発酵処理を用いて高含水率の食品加工残渣を乾燥させれば腐敗が防止でき、大幅に減量するので輸送コストも低減できる。高温好気性発酵は菌体増殖が速いため発酵日数が短くて済む、乾燥速度が速い、病原菌が死滅して安全性が高まり、雑草種子も不活化されるのでコンポスト利用においても有利、などの特徴がある。

一方、天ぷら油などの食用油は年に237万トン消費されており、そのうち45万トンが廃食用油として回収され、飼料や燃料などに再利用されているが、18万トンが未利用で埋め立てなど処分されている。

これまで、廃食用油を添加した食品加工残渣の好気性発酵処理は、発酵温度の上昇や有機物の分解率向上などの有効性が示されているものの、高温域で分解効率が低下する点が問題点として残っていた。また、40℃程度の中温でのリパーゼ生産能が高い菌は多く見出されているが、60℃以上の高温でリパーゼ生産能が高い菌は見出されておらず研究事例も少ない。高温好気性発酵温度の60℃程度で油脂分解酵素の生産能が高い好熱菌が見出されれば、廃食用油を微生物発酵の炭素源として添加することで有機物分解率の向上による外部熱源量の低減が見込まれる。併せて未利用処分されている廃食用油の再利用が可能になる。

### 1.2 研究目的

本研究では、廃棄物として大量に排出されている高含水率の食品加工残渣や生ごみに廃食用油を添加し、高温で生育する油脂分解酵素生産好熱菌を利用した発酵により外部熱源を低減させつつ乾燥させ、飼料や燃料へと再生利用する、費用対効果の優れた新規なシステムの構築を目指した。60℃以上で生育する新規な油脂分解酵素生産好熱菌をスクリーニングにより取得し、その特性の解明を行うとともに、実際の発酵乾燥飼料化装置にて実証を行い、廃食用油を用いてエネルギー回収効率を高度化した新規な好気性発酵システムを構築することを目的とする。本研究は以下の4項目からなる。

## ① 実証試験機を用いたシステム開発

実証試験機を用いて、オカラに、油揚げ製造時に発生する廃食用油を添加した、高温発酵と好熱菌による高温好気性発酵のシステムを確立する。
本文

・長期間安定して好気性発酵が持続するシステムを開発する。

・高温好気性発酵に適した温度条件を検討する。

・廃白土混合コンポストや項目③で得られた油脂分解微生物群集およびNB501株など、各種微生物資材を添加した運転を行い、その効果を検証する。

・本システムでの有機物分解による発酵熱への寄与（熱収支）を算出する。

・油揚げ製造食用油以外にも、家庭系廃食用油を用いた運転を行い、その効果を検証する。

## ② 微生物添加効果の検証

項目①のデータは、粗脂肪分と粗灰分の委託分析値を元にして得られたものであり、各種の添加運転のうち、最も高い性能が得られたと判断した廃白土混合コンポストの添加結果を中心に分析を行っている。そこで、本項目では、油脂分解微生物群集およびNB501株なども含めて数回の添加運転の結果について、当研究室の実験室において総脂質、灰分、含水率を高精度で再分析を行う。さらに、水分の蒸発や有機物の分解により変動しない数値である灰分測定値を元にして全体の収支を計算しなおし、油脂分解、乾物分解、CO $ _{2} $ 発生量、pH変化などの各種の分析値から多面的な検証を行う。さらに、廃白土混合コンポストの添加実験における微生物の群集構造の変遷を調べるために次世代シークエンサーを用いて群集構造解析を行う。

## ③ 好熱性油脂分解菌の探索と性質解明

高温域（60℃以上）での微生物による油脂分解活性は、中温域（40℃）と比較して分解効率が低下する。油脂分解酵素（リパーゼ等）を生産する微生物は中温で生育するものが多く報告されており、高温で生育するものは中温のものに比べて極めて少ないことがその原因の一つとして考えられる。そこで本研究では、60℃以上で生育する新規な好熱性油脂分解菌の取得およびその微生物が生産する油脂分解酵素の性質を解明することを目的とした。併せて、実証試験機内への投入実験のために、単離した油脂分解菌NB501株および複数種の微生物が共存する油脂分解微生物群集の大量培養条件を確立した。さらに、集積過程における微生物の群集構造の変遷を調べるために次世代シークエンサーを用いて群集構造解析を行う。

## ④ 脂質の分析手法の開発

本研究において油脂分解過程を評価する為には、添加した廃食用油の主成分であるトリアンルグリセロール(TG)と、その加水分解物であるジアシルグリセロール(DG)およびモノアシルグリセロール(MG)、そして遊離脂肪酸(FA)を経時的に定量する必要がある(図1−1)。
本文

図1－1 トリアシルグリセロールの加水分解反応の模式図

しかし、上記化合物群を総合的に定量、評価するためには、下記に示す問題点がある。

(1)各化合物群の沸点が非常に高い

(2)主成分と分解物の極性が大きく異なる

(3)各化合物群により、水酸基の数が異なる

(4)構成する脂肪側鎖の二重結合の数の組み合わせが複雑である

(5)同じ化合物群においても、構成する脂肪側鎖の構造が多種多様であり、複雑な混合物である

以上のような問題点から、機器分析による各化合物群の一斉定量は困難であり、オカラ固体培養のような複合培地を用いた好気発酵における、トリアシルグリセロールの分解過程を経時的に追跡した報告例はない。そこで、廃食用油の主成分であるトリアシルグリセロールの分解過程を経時的に定量する分析法を開発する。
## 本文

### 2. 研究方法

### 2.1 実証試験機を用いたシステム開発

千葉県豆腐商工組合は千葉県内豆腐製造販売者 約 200 名の組合員で構成され、あぶら揚げなどの豆腐関連商品の生産と販売を行っている。同組合工場敷地に設置済みの実証試験機を用いた。

#### 2.1.1 実証試験機の概要

場所：千葉市稲毛区長沼原町656-1 千葉県豆腐商工組合内

環清技研エンジニアリング(株) 実証試験室

方式：発酵と通気乾燥の併用方式

計画能力：オカラ 100 kg/日（豆腐 800 丁程度を生産する際のオカラ量とされる）

装置寸法：長さ 2280mm 幅 1200mm 高さ 1870mm

発酵乾燥槽有効容量： $ 0.9m^{3} $

動力：攪拌機 3.7 kW 通気循環ファン 0.75 kW 加熱ヒーター 4.5 kW

図 2−1 試験機の外観（左上）、試験室（右上）、

試験機のフロー図（左下）、発酵乾燥槽内の様子（右下）
## 本文

#### 2.1.2 オカラと廃食用油の受け入れ

工場からは1～2 t/日程度のオカラが排出され、現状では産業廃棄物として委託処分しているが、絞り機から排出されるオカラの一部を1箱10 kg入りの容器に入れて毎日取り出し、試験に用いた。また油揚げ製造時に使用された廃大豆油を試験に用いた。

図2-2 投入オカラと試験機（左上）、投入の様子（右上）、廃大豆油（左下）、発酵生成物一時保管（右下）

オカラは容器ごとに 10 kg 充填した。廃食用油はオカラに対して 3～7.5% 投入し、投入重量を測定し、記録した。

なお、本装置では副資材は用いない。従来の発酵乾燥装置に必要とされた小麦ふすま、米ぬか、パンくずなどの乾燥材料および木質チップ、もみ殻なども用いない。

内容物に分散性と通気性を発現させるために、発酵乾燥物をすべて取出さずに一部を残しオカラ投入後の槽内物含水率を概ね50%以下に維持した。

#### 2.1.3 計測器

温度 : 発酵槽内温度計 T1、T2 およびヒーター出口熱風温度 T3、排気温度 T5 を熱電対温度計により測定

含水率：赤外線加熱式含水率計 OHAUS 社 MB23

pH : ガラス電極式 ライン精機 EH-1000

排氖風量：熱線式風速計 AIRFLOW 社 TA410
本文

排気 CO₂ 濃度：非分散型赤外線式（NDIR） E&E 社 EE85

排気アンモニア濃度：ガス検知管

ヒーター電力計：オムロン 電力ロガー ZN-CTX21

記録：温度、 $ CO_{2} $ 濃度はデータロガーにて記録した。

#### 2.1.4 実証試験機の処理工程と運転方法

## 处理工程

投入 : 槽上部の投入口より行う。1回の作業時間は10分間程度である。

発酵乾燥：攪拌機、通気循環ファン、加温ヒーターを作動し所定の温度を維持して発酵と乾燥を促進させる。

乾燥：投入を停止して乾燥を促進させる。含水率が低下するので発酵は徐々に低下して最終的に停止する。機械の作動は発酵乾燥工程と同じである。

排出：槽側壁に設けた排出口を開けて行う。排出は内容物をすべて排出するのではなく含水率調整のため一部を残す。残存量は目視にてできるだけ毎回同じ程度になるようにした。

1 回の作業時間は 20 分間程度である。 排出終了後は投入工程に戻る。

## 運転方法

火曜日から土曜日までオカラの投入量を 100 kg/日とし、発酵乾燥を行った。日曜日、月曜日は投入せず乾燥運転とし、火曜日の朝に排出した。週の2日間は原料の投入をせず乾燥工程としたため、平均発酵日数は5日間となる。

オカラは午前中3回1時間毎に各20kg投入し、午後は2回1時間程度の間隔で各20kg投入した。廃食用油はオカラに所定の比率を混合したうえ投入した。攪拌機、通気循環ファンは発酵乾燥工程、乾燥工程中は連続運転。攪拌機の回転数は1回転/分程度とした。加温ヒーターは温度調節計により自動ON・OFF運転。

pH は朝オカラの投入前に発酵物を 5 g 採取し、100 g の純水を加え 30 分間攪拌後に測定した。内容物の含水率は朝（オカラ投入前）、昼（午前中のオカラ投入後 1.5 時間後）、午後（全オカラ投入後 1.5 時間後）の 3 回測定した。

発酵槽内の温度は約 $ 60^{\circ}C $ となるようにヒーターを制御し、微生物脱臭装置を設置する前は、10%クエン酸溶液の添加により、発酵オカラの pH が 7.0-7.5 となるように調整した。微生物脱臭装置の設置後は、クエン酸の添加による pH のコントロールは行っていない。

アンモニアは朝、排気管の測定口で検知管により測定した。

生成物は $ 20 \, kg $ 入り袋に充填し、室内常温で一時保管した。
本文

#### 2.1.5 槽内乾物量の算定

槽内の乾物量は、午前中の3回目投入終了後の含水率と5回目投入終了後の含水率および投入オカラ、投入廃食用油の重量から物質収支を算定して求めた。収支式内で必要な蒸発水分量は5回目投入後の含水率測定時から翌朝の含水率測定時までの含水率変化と槽内乾物量から時間当たり蒸発水分量を算出した。

実証試験機では構造上、槽内に残る発酵物量を毎回同じ量にはできない。槽内残存物量が初期投入物として分解量などの算出に必要なため、槽内の乾物量を午前中の3回目投入終了後の含水率と5回目投入終了後の含水率および投入物の重量から物質収支により求めた。

## 5 回目投入後の物質収支

$$ A1/(1-w1)+(P-V+F)=(A1+F+P((1-w0))/(1-w2) $$

A0:1回目投入前の乾物量(kgDS)

A1:3 回目投入後の乾物量 (kgDS)

A2:5回目投入後の乾物量 (kgDS)

w1:3 回目投入後の含水率 (%)

w2:5 回目投入後の含水率 (%)

w3:翌朝の含水率 (%)

w0: オカラの含水率 (%)

P:4～5 回目投入オカラ量 40 kg

F:4～5 回目投入廃食用油 2.0 kg

V:w1～w2 の経過時間における水分蒸発量 (kg)

t1:w1～w2 の経過時間 (h)

t2:w2～w3 までの経過時間 (h)

※1: w1～w2 間での乾物分解量は無視した

※2: Vは t2 間の時間当たり水分量が t1 間で同じとして算出した

表2−1 発酵槽内初期乾物量 A0 の算出例

11/26	27
火	水
おから投入量	kg	100
廃食用油投入量	kg	5
おから含水率 w0	%	80.4
内容物含水率(朝) w3	%	14.0	33.9
攪拌混合後含水率 w1	%	36.9
経過時間 t1	h	2.48
水分蒸発量(仮置き)	kg/h	1.8
攪拌混合後含水率 w2	%	43.8
廃食用油投入量 F	kg	2.0
発酵槽内 乾物量 A0	kgDS	88
発酵槽内 乾物量 A1	kgDS	103
作業終了後 乾物量 A2	kgDS	112
経過時間 t2	h	16.5
水分蒸発量(計算値)	kg/h	1.8

#### 2.1.6 オカラおよび発酵乾燥物の性状分析

粗脂肪、粗灰分を必要に応じて分析した。分析は外部機関（千葉県農林総合研究センター）に委託し、分析方法は飼料分析基準（平成20年4月1日・19消安第14729号 農林水産省消費・安全局長通知）に準拠し、粗脂肪はジェチルエーテル抽出法、粗灰分は加熱灰化法により行った。

#### 2.1.7 廃白土混合コンポストについて

今回、油脂分解微生物群の資材および分離源として千葉県Ⅰ酪農由来の廃白土混合コンポ
## 本文

ストを用いた。廃白土とは、油脂の脱色、精製に使用した活性白土の残渣（廃棄物）であり、脂質を多く含む。また、コンポスト化の副資材として用いられる。これはコンポスト化の過程で集積培養により構築された微生物群集とみなすことができる。本研究では、このコンポストを、廃白土混合コンポストとした。

#### 2.1.8 生成飼料の家畜への供与試験

C 県畜産総合研究センターのご協力により鶏、豚への給与試験を行った。

### 2.2 微生物添加効果の検証

#### 2.2.1 各種分析法

オカラおよび発酵乾燥物の pH、含水率、灰分、総脂質の値を、実験室において精密に再分析した。分析方法は堆肥分析法に準拠した。

pH 測定法：サンプリングした試料約 10 g をガラスビーカーにとり、蒸留水 200 ml を添加した後、30 分間攪拌し、pH メーターにより測定した。

含水率測定法: 灰皿に試料を約 3 g 取り、オーブンを用いて $ 100^{\circ}C $ で 5 時間加熱し、重量の減少分を水分とした。

灰分測定法（加熱灰化法）：灰皿に試料を約3 g取り、オーブンを用いて100℃で約2時間加熱乾燥した後、電気炉（ヤマト科学株式会社 F0310 型）にて700℃で4時間以上加熱し十分に灰化させ、残分を灰分とした。

総脂質測定法：Bligh-Dyer 法をベースとし、有機溶媒の使用量を減らすために改変を加えた以下の方法を用いた（クロロホルム：メタノールによる2回抽出の後、重量測定）。

・ガラス試験管 A に試料を採取（湿润重量 0.2 g 以下）

・メタノール1.5ml添加

・ガラス棒で試料の塊をくずす

・ボルテックスミキサーにより攪拌（1分）

・クロロホルム 3.0 ml 添加（抽出1回目）

・ボルテックスミキサーにより攪拌（1分）

· 遠心（ $ 4000 \times g $ 、 $ 20^{\circ}C $ 、20 分）

・上清を試験管 B に移す

· 試験管 B に純水 $ 0.9 \, ml $ 添加

・ボルテックスミキサーにより攪拌（5分）

· 遠心（ $ 4000 \times g $ 、 $ 20^{\circ}C $ 、20 分）
本文

・上清を試験管 C に移す

・試験管 A にクロロホルム：メタノール = 2:1(v/v) 混液 4.5 ml 添加（抽出 2 回目）

・同様の手順で分液し、上層を試験管Cに、下層を試験管Bに混合

・試験管 C を遠心し、下層を試験管 B に混合

・試験管 B を遠心し、上層を除去

・遠心エバポレーターにより溶媒を留去

・抽出物の重量測定、分析

オカラおよび発酵乾燥物の重量から、下記の分析値に基づく水分量、灰分量、総脂質量を引いた値を差分基質（脂質を除く有機物）とした。

$$ \begin{aligned} オカラおよび発酵乾燥物量 \quad&=\\ 水分量 \quad+\quad 灰分量 \quad+\quad 差分基質量 ( 脂質を除く有機物 )\quad&+ 総脂質量 \end{aligned} $$

#### 2.2.2 微生物群集解析

微生物群集解析は、東京大学大学院新領域創成科学研究科・服部正平教授および須田亘博士に依頼し、次世代シークエンサー（ロシュ 454 GS Junior）を用いた V1-2 領域アンプリコン解析を行った。16S rRNA 遺伝子の V1、V2 領域を含む配列を PCR により増幅して（図 2-3）16S 解析パイプライン解析に用いた。シークエンシングで得られたリードから、F&R プライマ一配列を正確に持ち、平均 Quality value が 25 以上のリードをその後の解析に供与した。菌種の多様さの指標になる Operational Taxonomic Unit (OTU) は、上記の Quality check を経たリード（各サンプル 1,300 リード）を用いて、id = 96% でクラスタリングし OTU を作製した。その後、作成された OTU を既知の 16S データベースと照会して、菌種帰属を行い、さらに Phylum、Genus の帰属を行った。

図 2−3 16S rRNA 遺伝子の V1−2 領域アンプリコン解析
## 本文

### 2.3 好熱性油脂分解菌の探索と性質解明

#### 2.3.1 廃食用油を炭素源とした集積培養からの油脂分解菌の単離

60～70℃で運転を行っている実証試験機内の発酵オカラを単離源とし、このオカラを、廃食用油を唯一の炭素源とした液体集積培養培地に添加し集積培養を行うことにより、油脂分解菌の獲得を目指した。集積培養培地の組成を表2-2に示す。

表 2−2 廃食用油を唯一の炭素源とした液体集積培養培地の組成

培地組成
廃食用油 2%, NaCl 0.2%, MgSO_{4}·7H_{2}O 4.0×10^{-2}%, MgCl_{2}·6H_{2}O 7.0×10^{-2}%, CaCl_{2}·2H_{2}O 5.0×10^{-2}%, KH_{2}PO_{4} 3.0×10^{-2}%, K_{2}HPO_{4} 3.0×10^{-2}%, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5.0×10^{-2}%, FeSO_{4}·7H_{2}O 1.0×10^{-3}%, FeCl_{3}·6H_{2}O 1.0×10^{-3}%, ZnSO_{4}·7H_{2}O 2.0×10^{-4}%, CuSO_{4}·5H_{2}O 4.0×10^{-4}%, NaMoO_{4}·2H_{2}O 5.0×10^{-5}%, MnCl_{2}·4H_{2}O 1.0×10^{-5}%, H_{3}BO_{4} 1.0×10^{-5}%, Na_{2}SeO_{3} 2.0×10^{-5}%

培養には振とうにより油と水溶液が混合しやすいように 27 ml 容 L 字試験管を用い、L 字試験管に培地を 5 mL 入れ、培養温度は 40°C または 50°C または 60°C、振とう速度は 200 rpm で培養を行った。液体集積培養での油脂分解菌の増殖の確認方法として、濁度やビクトリアブルーやブロモチモールブルー等の指示薬の添加を検討したが、それらは有用な方法とはいえず、最終的に、L 字試験管をブチルゴム栓で密閉して、気相部に存在する酸素の減少と二酸化炭素の増加をガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）により経時変化を測定することで油脂分解菌の存在の有無を確認した。試験管の気相部の酸素がほとんど消費されたことを確認したのち、新しい集積培養培地に培養液の 1% 分（50 μL）を植菌して次の集積培養を行った。この操作を 5 回繰り返した。5 回目の集積培養時には、コントロールとして、廃食用油を添加していない集積培養培地に 4 回目の集積培養液を植菌して同時に培養を行い、同様に GC-MS で気相部の酸素の減少と二酸化炭素の増加をモニタリングした。

続いて、5 回目の集積培養液を Luria-Bertani (LB) プレート培地と Nutrient broth (NB) プレート培地（表 2−3）に塗布して 40°C または 50°C または 60°C で培養して油脂分解菌の単離を行った。

表 2−3 油脂分解菌の単離に用いた培地の組成

培地	組成
LB 培地	Tryptone 1%, Yeast extract 0.5%, NaCl 1%
本文

1/2LB 培地	Tryptone 0.5%, Yeast extract 0.25%, NaCl 0.5%
1/5LB 培地	Tryptone 0.2%, Yeast extract 0.1%, NaCl 0.2%
NB 培地	Peptone 0.5%, Yeast extract 0.3%
1/2NB 培地	Peptone 0.25%, Yeast extract 0.15%
1/5NB 培地	Peptone 0.1%, Yeast extract 6.0×10^{-2}%
トリプトソーヤ培地	Peptone 1.5%, Soy peptone 0.5%, NaCl 0.5%
1/5 トリプトソーヤ培地	Peptone 0.3%, Soy peptone 0.1%, NaCl 0.1%
ペプトン培地	Peptone 0.2%, NH_{4}H_{2}PO_{4} 0.1%, NaCl 0.25%, MgSO_{4}·7H_{2}O 4.0×10^{-2}%, CaCl_{2}·2H_{2}O 4.0×10^{-2}%
トリプトン-イ-スト培地	Tryptone 0.8%, yeast extract 0.4%, NaCl 0.3%
TBS 培地	Bacto^{TM} Tryptic Soy Broth 3%
1/2TBS 培地	Bacto^{TM} Tryptic Soy Broth 1.5%

40℃ に関して LB 培地や NB 培地において多くのコロニーを形成したので、LB 培地・NB 培地各々から 32 個のコロニーを選んだ。単離株計 64 株に関して油脂分解能の有無を確認した。確認方法として、集積培養方法と同じく、廃食用油を唯一の炭素源とした培地を用いた培養を行い、気相部の酸素の減少と二酸化炭素の増加をモニタリングすることと、廃食用油を含んだプレート培地におけるクリアハロー形成、の 2 つを行った。

#### 2.3.2 50°C と 60°C で生育する油脂分解菌の単離

廃食用油を唯一の炭素源とした培地での集積培養で獲得に至らなかった $ 50^{\circ}C $ と $ 60^{\circ}C $ の油脂分解菌に関しては、廃食用油を 2% 添加した LB 培地や NB 培地など 12 種類の培地を用いて集積培養を行った。12 種類の培地の組成は上の表に示した。単離源として、実証試験機内の発酵オカラだけでなく廃白土混合コンポストを用いた。また、廃食用油だけでは単離される分解菌が限られる可能性があるため、廃食用に加え、大豆油またはトリオレインを添加した集積も同様に行った。集積培養方法は上記に記載した方法と概ね同じで、異なる点として、ブチルゴム栓で密閉せずに好気条件で 4~5 日培養を行い、新しい集積培養培地に培養液の 1% 分（50 μL）または 10% 分（500 μL）を植菌して次の集積培養を行うという操作を 5 回繰り返した。
本文

この集積培養液を各々の集積培養で用いた培地に2%トリブチリンを加えたプレート培地に塗布し、50℃または60℃で1日培養し、周囲に透明なクリアハローを形成したコロニーを油脂分解菌として単離した。単離株に関しては再度同じ培地でクリアハロー形成の確認を行った。クリアハローの有無を判別し易くするために、培地作製の際に特開2006-230303の方法を参考にした $ ^{1)} $ 。1.5%の寒天の入った培地組成をオートクレーブした後、50mLのファルコンチューブに培地を25mL、トリブチリンを125μL加え、蓋をしめ、トリブチリンの粒が見えなくなるまで振り、シャーレに注いで固まったものを使用した。トリブチリン含有プレートは均一に白く濁っており、分解微生物の周辺はトリブチリンの分解により透明となるためクリアハロー形成の確認が容易となった。純化した単離株に関しては再度同じ培地でクリアハロー形成の確認を行った。

#### 2.3.3 单離された油脂分解菌の 16S rRNA 遺伝子による系統学的解析

40℃、50℃、60℃でそれぞれ単離した油脂分解菌の菌体からDNA抽出を行った。抽出したDNAをテンプレートとして、16S rRNA遺伝子配列を増幅するために2つのユニバーサルプライマー（27F-1541R）を用いて以下の温度条件にてPCRを行った。

95°C 2 min

$$ \left(95^{\circ}C\;40\;sec,\;52^{\circ}C\;30\;sec,\;72^{\circ}C\;90\;sec\right)\;\times25\;cycle $$

$$ 72^{\circ}C7min $$

PCR 産物を精製し、増幅した 16S rRNA 遺伝子配列を DNA シーケンサーにより決定した。BLAST から得られた近縁種の 16S rDNA 配列とともにアラインメントを行い、近隣結合法を用いて系統樹を作成し、その系統学的位置を調べた。

#### 2.3.4 单離された好熱性油脂分解菌由来のリパーゼの酵素学的性質解析

単離した好熱性油脂分解菌を油無添加の培地で2日間培養して、細胞外に分泌されたリパーゼを含む培養液を遠心して上清のみを回収した。その上清を限外ろ過膜（ミリポア）を用いて濃縮し、それを酵素液としてリパーゼ活性の測定に供した。リパーゼ活性の測定方法は50 mM Tris-HCl（pH8）を400 μL、20 mM pNP-palminate（C16）を50 μL、酵素液を50 μL添加し混合し、反応液とした。反応液を60℃または様々な温度で反応させた後、10 mM Na₂CO₃を125 μL添加して反応を止めた。反応後、残存している沈殿物が吸光度測定に影響を及ぼさないように遠心して沈殿物を除いた後に、その上清を吸光度測定に供した。酵素反応によって遊離したpNP（4-nitrophenol）を410 nmの吸光で検出した。また、SDS-PAGEは12%アクリルアミドゲルを用いて行った。
#### 2.3.5 油脂分解菌の実証試験機への投入

## ・好熱性リパーゼ生産菌 Geobacillus zalihae NBRC101842 $ ^{T} $

近年、パーム油廃液を単離源としてオリーブオイルを唯一の炭素源として60℃で集積培養したのちに単離された、強い好熱性リパーゼ活性を有すると報告されている Geobacillus zalihae NBRC101842 $ ^{T} $ $ ^{2)} $ を、実際に実証試験機へ投入して発酵オカラの油脂分解能の効果を検証した。

培養には表 2－4 で示した培地を用い、試験管 5 mL に Geobacillus zalihae NBRC101842T を植菌し、50℃で 1 日振とう培養を行い、500 mL 容フラスコに入っている新しい培地 200 mL にその量の 1% 分の培養液（2 mL）を植菌して同じく 50℃ で 1 日培養を行った。さらに、5 L 容フラスコを 4 本用いて、培地 10 L に 1% 分の培養液（100 mL）を植菌し、50℃ で 1.5 日培養を行った。培養液を遠心して約 300 mL に濃縮して、実証試験機に投入した。

表 2−4 Geobacillus zalihae NBRC101842 $ ^{T} $ 培養用の培地組成

培地組成
Polypeptone 1.0%, Yeast extract 0.2%, MgSO_{4}·7H_{2}O 0.1%

## ・単離された好熱性油脂分解菌 Bacillus thermoamylovorans NB501 株

50℃で単離した Bacillus thermoamylovorans NB501 株を実証試験機への投入に向けて、生育良好な培地組成の検討および生育至適温度を調べた。培地は表2に記載してある2種類（NB培地とTSB培地）を用い、培養温度は40℃から60℃までの条件下で培養した。試験管5mLに前培養した培養液を10％分（500μL）植菌し、振とう培養を行い、660nmの吸光度で濁度をモニタリングした。

NB501 株を発酵槽に投入するため大量培養を行った。まず、培地 500 mL にその量の 5% 分の培養液（25 mL）を植菌して 60°C で 2 日培養を行った。さらに、5 L 容フラスコ 4 本用いて、培地 10 L に 5% 分の培養液（500 mL）を植菌して、60°C で 2 日培養を行った。その培養液を遠心して約 300 mL に濃縮して、廃食用油添加型好気性発酵システムの実証試験機に投入した。それに加え、培養液量を 2 倍に増やし、菌体回収量を 2 倍に増加させた投入実験も同様に行った。

## ・好熱性油脂分解微生物群集の構築（1回目）
本文

2 種類の培地（NB と TSB）および 2 種類の微生物源（発酵オカラと廃白土混合コンポスト）を用い、2%の大豆油を添加し、実証試験機内と同じ温度である 60℃ で培養し、油分解微生物群集の構築を試みた。油分解微生物群集が構築されている指標として、一般的に油脂分解能の指標として用いられる方法であるクリアハロー形成を用いた。クリアハローを形成する微生物とクリアハローを形成しない微生物が共存する油脂分解微生物群集の構築を試みた。また、集積過程でどのような微生物群集が構築されているのかを調べるために次世代シークエンサーを用いて群集構造解析を行った。

集積した油脂分解微生物群集を実証試験機に投入するため大量培養を行った。まず、培地800 mL（200 mL×4）にその量の10％分の培養液（20 mL×4）を植菌して60℃で3日培養を行った。さらに、5 L容フラスコ4本用いて、培地8 L（2 L×4）に10％分の培養液800 mL（200 mL×4）を植菌して、60℃で3日培養を行った。その培養液を遠心して約300 mLに濃縮して、廃食用油添加型好気性発酵システムの実証試験機に投入した。

## ・好熱性油脂分解微生物群集の構築（2回目）

6 種類の培地（TSB, 1/2TSB, NB, 1/2NB, LB, 1/2LB）にリン酸バッファー（KH₂PO₄, 0.3 g/L; K₂HPO₄, 1 g/L）を添加した集積培地を用いて、廃白土混合コンポストを微生物源として用い、2%の大豆油を添加して、油分解微生物群集の構築を試みた。集積を構築する際に、上記のクリアハローの形成の有無とリパーゼ活性が高いことを指標とした。その微生物群集を発酵槽に投入するため大量培養を行った。その培養液を遠心して培養液を約300 mLに濃縮して、廃食用油添加型好気性発酵システムの実証試験機に投入した。また、集積過程における微生物の群集構造の変遷を調べるために次世代シークエンサーを用いて群集構造解析を行った。

### 2.4 脂質の分析手法の開発

#### 2.4.1 HPLC による分析法の開発

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いたアシルグリセロール類および脂肪酸の分析については、株式会社資生堂フロンティアサイエンス事業部 LC アプリケーションセンターに予備的な検討を依頼した。標準試料として、トリオレイン標準品（食品分析用、和光純薬工業）、オレイン酸（生化学用、和光純薬工業）、1-Oleoyl-rac-glycerol（Sigma-Aldrich）を用い、表 2−5 に示す条件を基本として検討が行われた。
表 2−5 HPLC を用いた検討における基本的な条件

カラム	: CAPCELL PAK C18 UG120 S3 (2.0 mm×150 mm)
流速	: 200 $ \mu $ l/min
カラム温度	: 40 $ {}^\circ $ C
試料注入量	: 5 $ \mu $ l

#### 2.4.2 TLC による分析法の開発

#### 2.4.2 a TLC によるアシルグリセロール類および脂肪酸の分離分析条件の確立

薄層クロマトグラフィー（TLC）による分離分析条件の検討には、TLC Silica gel 60 F_{254}（Merck KGaA）およびHPTLC Silica gel 60 F_{254}（Merck KGaA）を用い、オーブンにて110℃で60 min加熱し活性化した後、デシケーター内で冷却、保存したものを使用した。展開溶媒には、ヘキサン、ジイソプロピルエーテル、酢酸を、脂質の希釈にはクロロホルム：メタノール＝2：1（v/v）溶液を用いた。脂質の標準試料として、ジアシルグリセロール油（花王）、大豆油（和光一級、和光純薬工業）、モノオレイン（東京化成工業）を用いた。また、千葉県豆腐商工組合において油揚げの製造により排出された廃大豆油を試料として用いた。

展開槽内に深さがおよそ 1 cm になるように展開溶媒を入れ、厚手のろ紙を展開溶媒に浸るように内壁に貼り付け、蓋をして 1 hr 静置することにより展開槽内に溶媒蒸気を充満、安定化させた。そこに、試料を着点した TLC プレートを静かに入れ、蓋をして 7.5 cm 展開後に取り出し、ドラフト内で風乾した。

脂質スポットの検出にはリンモリブデン酸法を用いた。12 モリブド(VI) りん酸 n 水和物 10 g を 200 ml のエタノールに溶かし、過塩素酸（60%）を 2 ml 加え、リンモリブデン試薬を調製した。この試薬溶液に展開後の TLC を浸した後、余分な試薬溶液を除去し、オーブンを用いて 110 ℃ で 8 min 加熱しスポットを発色させた。

なお、特に記載のない試薬は全て、和光純薬工業製の試薬特級グレードを用いた。

#### 2.4.2 b 油脂資化菌による廃食用油の分解評価への応用

純水および培養前の Luria-Bertani (LB) 培地 (Difco LB Broth, Miller、Becton、Dickinson and Company) を用いて、脂質抽出の検討を行った。総脂質の抽出には Bligh-Dyer 法をベースとし、有機溶媒の使用量を減らすために改変を加えた方法を用いた。総脂質の抽出法を以下に記す。

$$ \begin{aligned}& \textcircled{1}溶液 1 容に対しメタノール 0.8 容を添 \quad \textcircled{8}同様の手順で下層を分取 ( 二回目抽出 )\\& 加 \end{aligned} $$

$$ \textcircled{9}各抽出液 \approx2,000\ x\ g、10\ min 遠心 $$

③クロロホルム 2 容添加 ⑩上層を除去