Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
タンパク質はケルダール法に準拠して分析を行った。

## 2 ）ビートトップの水、アルコールへ抽出される糖類抽出量試験

ビートトップは有用物質をエタノールで抽出する際に有用物質と共に糖分がエタノール中へ抽出されることが予想されるため、糖類抽出試験を行った。

試験はソックスレー抽出器を用いて行った。その抽出方法を以下に示す。

ビート茎葉部およびビートクラウンをφ28×100の円筒ろ紙に6～8g投入した。蒸留水または100%エタノール150mLを150mL容の平底フラスコに入れた。それらをソックスレー抽出器に取り付け、10～15分に一回サイフォンによる溶媒の循環が起こるようにして、最低12h以上抽出した。

脂溶成分が抽出されたエタノールのうち5～10mLを、予め乾燥し、重量を計測したなすフラスコに入れ、ロータリーエバポレーターでエタノールを蒸発させ、乾固した。なすフラスコをさらに40℃の減圧乾燥機に入れ、乾燥した後、重量を計測し、抽出された脂溶成分重量を計算した。乾固したなすフラスコにヘキサン10mL、蒸留水計20mLを入れ、良く攪拌後、分液ロートに移し、静置した。分液ロート内の水相を分液し、NREL/TP-510-42623 $ ^{6)} $ に従って処理を行った後、液体クロマトグラフィーにてグルコースを定量した。

## （２）アルカリ処理＋蒸煮・爆砕処理

下記に示すアルカリ処理を行った後、アルカリ処理産物全量を蒸煮・爆砕装置に投入し、蒸煮・爆砕処理を行った。

## 1 ）アルカリ処理試験

アルカリ種として水酸化ナトリウム（NaOH）を用いた。250mLのポリプロピレン製の容器に対象物12.5g（乾物）とNaOH 13%（対基質、3.2mol/kg）を投入し、処理温度60℃の場合は振とう培養機（図3.1）、75℃の場合は恒温振とう水槽（図3.2）を用いて、振とう速度150～200rpmで6～24h振とうした。

糖化効率の向上を図ることを目的として、アルカリ処理時の基質とアルカリの混合改善を図るために内容積1 Lのセパラブルフラスコを利用した培養攪拌機（図3.3）を用いて、アルカリ処理を行った。セパラブルフラスコは二重構造となっており、ジャケット部に温水を通して内部を所定の温度に維持できるようになっている。また、高温（90℃）におけるアルカリ処理は容量2 Lのオートクレーブ（図3.4）を用いた。
図 3.1 振とう培養機

図3.2 恒温振とう水槽

図 3.3 培養攪拌機

図3.4 オートクレーブ

## 2 ）蒸煮·爆碎試験

蒸煮・爆砕試験装置のフローシートおよび写真を図3.5、図3.6にそれぞれ示す。装置はおもに、熱源用高压ボイラ、蒸煮・爆砕反応器本体（容量約4L）、爆砕産物受け容器、制御機器から構成される。受け容器本体は爆砕産物の重量などを定量するため、装置から簡単に取り外せる構造とした。爆砕装置の最高温度および最高圧力は、それぞれ255℃、4.4MPaであり、加熱時間の短縮のため、蒸気による直接加熱および間接加熱がともにできる構造とした。

試験方法は以下の通りである。

試験に先立ち、蒸気ボイラを所定の圧力で運転し、反応容器ジャケットに蒸気を導入して反応容器の暖機を行った。次に、反応容器内の金網にアルカリ処理後のバイオマスを全量投入し、反応容器の蓋を閉め、蒸気ボイラから195℃の飽和蒸気を反応容器内に供給し、昇温した。反応容器内の温度が190℃に達した後、2～20分間、その状態を保持し、その後、圧力開放弁にて圧力を開放し、受け容器内あるいは反応容器内に残留した処理産物を回収した。
図 3.5 蒸煮・爆砕装置フロー

図 3.6 蒸煮・爆砕装置
アルカリ処理および蒸煮・爆砕処理の試験条件を併せて、表3.1に示す。

表 3.1 アルカリ処理、爆砕処理試験条件

試験番号	粒度	アルカリ処理	爆砕処理
処理方法	NaOH濃度	NaOH温度	NaOH時間	アルカリ処理TS	攪拌速度	爆砕温度	爆砕時間
mm	—	% (対基質℃	h	%	rpm	℃	min
麦桿1	0.18～0.85	振とう培養機or恒温振とう水槽	13	60	6	10	150	190	2
麦桿2	0.18～0.85	13	60	6	22	200	190	2
大豆1	0.18～0.85	13	60	6	10	150	190	2
大豆2	0.18～0.85	13	60	6	22	200	190	2
大豆3	0.18～0.85	13	60	6	22	200	190	20
大豆4	0.18～0.85	13	60	0	22	200	190	20
大豆5	0.18～0.85	13	75	6	10	150	190	2
大豆6	0.18～0.85	13	60	24	22	200	190	2
大豆7	0.18～0.85	13	60	48	22	200	190	2
大豆8	0.18＞	13	60	6	10	150	190	2
大豆9	0.18～0.85	攪拌培養機	13	75	6	25	50	190	2
大豆10	0.18～0.85	オートクレーブ	13	90	6	10	50	190	2

## 3 ）蒸煮・爆砕産物のマスバランス等の測定方法

蒸煮・爆砕産物の各特性の測定要領を図3.7に示す。受け容器内の蒸煮・爆砕産物を、容器を含めて重量測定した後、内容物をプラスチック容器に移した。固形物を通すことができるように先端をカットしたチップを装着したマイクロピペットによって懸濁、攪拌しながらスラリーをサンプリングし、スラリー濃度測定を行った。回収されたスラリーを硫酸で中和した後、遠心分離機で固形分をペレット状にしてから、予め乾燥し質量を計測した5Aのろ紙を用いてブフナーファンネルによって減圧吸引ろ過した。ろ過後、ろ紙上の固形分をなるべく回収し、そのうち6～10gを水分計測に、残りを酵素糖化試験に用いた。水分計測後の試料を炭化水素、リグニン測定用の試料として供した。ろ紙上に付着した固形分の残りはろ紙ごと乾燥器で乾燥し、重量を計測し、マスバランスを得た。

図 3.7 蒸煮・爆砕産物測定フロー

## （３）前処理産物の糖化試験

アルカリ処理と蒸煮・爆砕処理を施した産物がセルラーゼ等の酵素により糖化され得るかを確認するため、NREL/TP-510-42629に準拠して酵素糖化試験を行った。セルロース 0.1g 相当を 30ml のスクリー高管
瓶に量りとり、クエン酸バッファー5mL、抗生物質（テトラサイクリン：40μL、シクロヘキシミド：30μL）を添加した後、蒸留水を全体で10mLとなるよう入れ、さらに酵素群を投入した。試験に使用したセルラーゼおよびβ-グルコシダーゼの組み合わせは以下の通りである。

酵素群：セルラーゼ；ノボザイム製N50013(84FPU/ml),25FPU/g-セルロース

$$ \beta- グルコシダーゼ；ノボザイム製 N50010(300CBU/ml),\quad42CBU/g- セルロース $$

酵素糖化試験条件は $ 50^{\circ}C $ 、72h、150rpm とし、振とう培養機を用いて振とうした。糖化試験後の溶液を液体クロマトグラフィーで糖類を分析した。

## （４）蒸煮・爆砕処理の連続処理装置の開発

蒸煮・爆砕処理は所定の圧力、温度で保持した後、圧力解放弁を解放して産物を得るため、一般的にバッチ処理となる。高効率化のためには爆砕処理を連続的に処理することが望まれることから蒸煮・爆砕連続処理装置の開発を行った。

初年度に連続前処理装置を設計、製作した。図3.8、図3.9、図3.10に連続前処理装置の写真、フロー図、配置図をそれぞれ示す。装置は主に、スラリータンク、スラリーポンプ、反応器A、B（容量約4.8L）、受け容器、制御機器で構成される。装置の最高使用圧力は2MPa、最高使用温度は212℃とした。処理の流れは以下の通りである。スラリータンク内のスラリーはポンプにより反応器Aへ移送され、余分なスラリーはスラリータンクに戻る。原料供給弁V1が開くと反応器A内にスラリーが供給され、蒸気によって直接加温されて所定の温度になるまで滞留する。反応器A内のスラリーは所定の温度、時間に達した後、原料移送弁V2が開き反応器Bへ送られる。反応器Bでは反応器A同様、蒸気によって設定された温度、時間に達した後スラリーが圧力解放弁V3の解放によって産物受け容器に移送される。反応器Aを予熱、反応器Bを本爆砕処理として運転を行った。

装置の開発にあたっては、連続的な安定運転を目指して、逐次装置の改造を施しながら研究を進めた。

前項で得られた最適と思われる前処理条件を設定（表3.2）し、連続運転の確認と連続爆砕の処理能力を確認した。

图 3.8 連続前処理処理装置（改造前）

図3.9 フロー図

表 3.2 試験条件

条件設定項目	設定値
BM種	コーン茎葉、麦わら
処理回数	3回
BM投入時間	180s
反応器A処理時間	10s
A→B移送時間	3s
反応器B処理時間	120s
排出時間	3s
反応器A設定温度	170℃
反応器B設定温度	190℃
### 3.3 研究結果および考察

## （１）原料特性の解明

## 1 ）各バイオマスの組成

原料の組成分析結果を図3.11に示す。ビート薬部およびビートクラウンともに抽出物質が非常に多く、ビート薬部で55～58%、ビートクラウンで70%強であり、両者ともグルカンが少なく10%弱であった。また、リグニンが10%以下で、ススキなど他の草本類の20%程度 $ ^{8)} $ と比較すると非常に少なかった。ジャガイモ地上部および長いもは、抽出物質が約30%、グルカンが約20%、リグニンが20%程度で、グルカンが他の草本類30%台と比較して少なかった。麦桿および豆殻類は抽出物質が15～20%、グルカンが30%台、リグニンは20%程度で他の草本類と同程度であった。また、キシランについては麦桿が約20%で他の草本類と同様であった他は、10%以下で少なかった。

図 3.11 各種バイオマスの組成

表 3.3 に各種バイオマスの全道の賦存量を示す。ビートトップ、麦わらの賦存量が 42 万トンと多く、次に大豆、小豆などの豆殻類が多いことが分かった。麦わらは、敷料などとして再利用されていることが多いが、最新の報告では麦

わらの賦存量、利用可能量がそれぞれ 73.2、19.3 万トンとの報告がある $ ^{9} $ 。また、大豆殻、小豆殻なども合計で 11 万トンの賦存量があることが分かった。

表 3.3 各種バイオマス賦存量

農業残渣	作付面積あたりの
乾物重量(kg/ha)	作付面積(ha)	賦存量(万t)
北海道	十勝管内	北海道	十勝管内
小豆殻＋茎葉	1107	23200	12500	3	1.4
大豆殻＋茎葉	3141	24400	4160	8	1.3
麦わら(小麦)	3583	116300	45700	42	16.4
スイートコーン茎葉	—	9640	3190	12	3.7
ビートトップ	6800	62600	26800	43	18.2

※スイートコーン茎葉以外は乾物ベース

これらのことから、バイオエタノールの原料としてビートトップ、麦桿、豆殻類が有望であることが分かった。
## 2 ）ビート茎葉部、ビートクラウンの抽出特性

ビートトップの水・エタノール抽出物質が非常に多かったため、抽出物質中のグルカン量を知る目的で、ソックスレー抽出によって水のみ、エタノールのみでの抽出試験を実施した（表3.4）。

表 3.4 グルカン抽出量（水のみ、エタノールのみで抽出）

水抽出	エタノール抽出
グルカン量	グルカン量	抽出率
mg/g-dry	mg/g-dry	%
ビート茎葉部	193	179	34
ビートクラウン	247	664	76

水のみで抽出した場合のグルカン抽出量はビート茎葉部で193mg/g-dry、ビートクラウンで247mg/g-dry、エタノールのみで抽出した場合のグルカン抽出量は前者で179mg/g-dry、後者で664mg/g-dryであった。また、エタノールのみで抽出した場合の抽出率は、ビート茎葉部で34%、ビートクラウンで76%であった。エタノール抽出で抽出した場合の全抽出量に対するグルカン量はビート葉部で5割強、ビートクラウンでは9割弱であった。一方、ビート茎葉部とビートクラウンの重量比は59:41であったことを併せて考えると、ビートトップ（茎葉部+クラウン）に含まれる糖類の存在形態はエタノールに可溶なグルカンであり、これをバイオエタノールの原料として利用すべきであることが示唆された。

## （２）アルカリ処理＋爆砕処理による糖化試験

筆者らは過年度より、数種類の草本系バイオマスのアルカリ処理と蒸煮・爆砕処理を組み合わせた方法について検討を行ってきた。その結果、ススキ、ヨシなどの草本類について酵素糖化効率が90%程度となる良好なアルカリ処理＋蒸煮・爆砕処理条件を見いだした $ ^{8} $ 。その前処理条件を、本研究での対象物のうちバイオエタノール生産に有望であると思われる麦桿および大豆殻について適用して前処理を行い、得られた前処理産物を用いて酵素糖化発酵試験を行った。ススキなどに対する良好な前処理条件を表3.5に示す。また、酵素糖化試験結果を図3.12に示す。

表 3.5 前处理条件

処理名	処理条件
アルカリ処理	NaOH 13%（対基質、3.2 mol/kg）、60℃、6h
蒸煮・爆砕処理	190℃、2分

酵素糖化効率は麦桿で98％と良好な結果が得られた。また、高効率化のためには蒸煮・爆砕処理時のバイオマス水分は極力低いことが求められるので、固形分濃度（Total Solids:TS）を22％とした場合についても検討を行った結果、酵素糖化効率は98％と良好な結果が得られた。

一方、大豆殻では試験番号：麦桿1と同じ前処理条件における酵素糖化効率は65%であった。大豆殻の酵素糖化効率の改善を図るため、アルカリ処理温度を75℃としたところ（試験番号：大豆5）、酵素糖化効率は77%に上昇した。また、攪拌速度を150rpmから200rpm高めた場合（同：大豆2）、固形分濃度が高いにもかかわらず高糖化効率は上昇した。しかし、爆砕処理時の保持時間を2分から20分に延ばしても（同：大豆3）、アルカリ処理時間を6hから24h、48hと延ばしても（同：大豆6,7）酵素糖化効率に大きな改善は認められなかった。アルカリ処理時の攪拌回転数高と処理温度高で糖化効率の向上が認められたので、より
効率的に攪拌ができる攪拌培養機によるアルカリ処理（同：大豆9）とより高い処理温度で処理ができるオートクレーブによってアルカリ処理（同：大豆10）試験を行った。しかし、酵素糖化効率はほとんど変わらなかった。振とう培養器の装置的制約から他の装置を用いた試験となったため、一概に比較できないかも知れなかった。さらに、原料の粒度を80メッシュ（0.18mm）アンダーとしたとき（同：大豆8）、酵素糖化効率は約90％と良好な値を得た。しかし、原料を80メッシュアンダーまで粉砕するエネルギーは多大であり、エネルギー収支を悪化させる要因となるため現実的ではないと思われた。以上の結果から、大豆殻の最適な前処理条件はアルカリ処理NaOH 13%、75℃、6h、爆砕処理：190℃、2minと判断した。そのときの酵素糖化効率は77%であった。

図 3.12 前処理産物の酵素糖化効率

次に、前処理前後における糖の収支について検討を行った。

最適な処理条件を得るための蒸煮・爆砕処理では、投入する原料バイオマス量は12.5gと少ないため、爆砕後の配管付着物による損失が大きくなった。そこで、産物の損失がなるべく少なくなるよう原料量を6.4倍（バイオマス投入量=80g）、10倍（同125g）に増加させて一連の試験を行った。その結果、投入グルカン量のほぼ全量を回収できることを確認した（表3.6）。また、キシラン、

表 3.6 前処理産物（麦桿）の残存率

残存率(%)
投入量=80g	投入量=125g
グルカン	99	101
キシラン	85	87
リグニン	72	70

リグニンの残存率は平均で86%、71%であった。そのうち、可溶化したグルカン、キシランはそれぞれ、0.6%、7.7%（バイオマス投入量=125g）でほとんど固形分として残存していることが分かった。

## （３）連続爆砕装置の開発

## 1 ）装置の改良

初年度に試作した連続爆砕処置の試運転を行った結果、下記のような改良すべき点が明らかとなり、平成24年度に改造を行った。

①高効率化のため、基質と熱媒（蒸気）の接触改善
②受け容器出口配管の拡大

③背圧弁V5の後段に流量調節用バルブの追加

④蒸気止め弁V4，V6の取り替え、および流量調節バルブの追加工事

⑤原料移送ポンプの発停タイミングの改善

これらの改造の結果、アルカリ処理を施した固形分濃度10%のコーン茎葉を基質として連続運転を行った結果、問題なく運転が可能であることを確認した。しかし、固形分濃度10%程度のスラリーは水分が多くエネルギー的に不利であること、処理する固形分量が少ないことが懸念されたため、高固形分濃度に対応した装置とすること中心とした下記のような改造を平成25年度に行った。

⑥高固形分濃度の原料を投入するため、ホッパ、架台、階段などの設置。

⑦反応器 A への原料投入の際、原料が原料投入弁 V1 から吹き出さないよう V1、原料移動弁 V2 に先行して背圧弁 V5、V7 を開ける（タイマーにより調整可能とする）。

⑧原料移動弁 V2 は、反応器 B の原料が排出された後に開ける(V2、圧力解放弁 V3 を同時に開けない)。

⑨反応器 A,B に原料があるとき、反応器 A,B ともに加熱する。

⑩原料投入弁 V1 が漏れるため、バルブを逆に取り付け直し、加圧面を逆にする。

改造後の写真を図3.13に示す。

これらの改造の結果、固形分濃度30%弱の基質の運転が可能となった。ただし、原料は上部に設けられたホッパから手動で投入した。連続運転時の反応器A、Bの温度履歴を図3.14に、処理能力を表3.7に示す。各反応器に蒸気を供給し、各反応器の温度が所定の温度（190℃）に達し、所定時間（2min）経過後、解放バルブを開けているため、急激に温度が下がっているが、再度蒸気を供給すると速やかに温度が回復した。1回当たりの処理時間は平均で4分半程度であった。装置の単位容積当たりの処理能力は平成24年度の0.43kg-dry/h/Lから0.57kg-dry/h/Lへ33%改善された。蒸気消費量は9.3kg/hで、乾物原料1kg当たりでは3.4kg/kg-dryであり、195℃飽和蒸気として熱量に換算すると消費熱量は9.5MJ/kg-dryであった。装置が小さく、駆動バルブ近傍の保温ができなかったことと容積当たりの表面積が大きいため放熱量が大きくなったと考えられた。装置の大型化が図られ放熱損失を10%程度に抑えられれば、必要熱量は3.5MJ/kg-dry程度に低減できると思われる。

図 3.13 連続爆砕装置（改造後）

図 3.14 各部温度経過
表 3.7 連続爆砕理能力

項目	H24年度	H25年度
BM投入量/回	kg-dry/回	0.15	0.21
総処理時間	min	13	13.85
処理量	kg-dry/h/L	0.43	0.57

### 3.4 結論

原料分析の結果、ビートトップは抽出物質が多く、セルロースが少ないが、抽出物質には糖類が多く含まれ、それをエタノール原料として利用することが重要であることが分かった。また、他のセルロース系バイオマスでは、麦桿と豆殻類がエタノール原料として有望であることが示唆された。

原料に合わせた前処理条件では、アルカリ処置と蒸煮・爆砕処理を組み合わせた前処理について検討した結果、グルコース収率は麦桿が90%以上、大豆殻は77%となる前処理条件を見いだすことができた。また、アルカリ処理と爆砕処理を組み合わせた方法は糖類の残存率が高く、グルカンではほぼ全量固形分として残ることが明らかとなった。

蒸煮・爆砕処理の連続装置の開発では、装置の改造を行った結果、処理能力は最終的に約30%上昇して0.57kg-dry/h/Lとなり、かつスムーズな連続運転が可能であることが確認されたことにより連続爆砕装置の基本的なシステムが確立された。

### 3.5 参考文献

1)近藤昭彦・上田充美監修、セルロース系バイオエタノール製造技術、NTS 7-11(2010)

2) A. Sluiter, B. Hames, D. Hyman, C. Payne, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton and J. Wolf Determination of Total Solids in Biomass and Total Dissolved Solids in Liquid Process Samples NREL/TP-510-42621(2008)

3) A. Sluiter, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, and D. Templeton Determination of Extractives in Biomass NREL/TP-510-42619(2008)

4) A. Sluiter, B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton and D. Crocker Determination of Carbohydrates and Lignin in Biomass NREL/TP-510-42618(2008)

5) A. Sluiter, B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, and D. Templeton Determination of Ash in Biomass NREL/TP-510-42622(2008)

6) A. Sluiter, B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, and D. Templeton Determination of Sugars, Byproducts, and Degradation Products in Liquid Fraction Process Samples NREL/TP-510-42623(2008)

7) M. Seig, N. Weiss, and Y. Ji Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass NREL/TP-510-42629(2008)

8)北口敏弘、鎌田樹志他、戦略研究報告書「地球温暖化と生産構造の変化に対応できる北海道農林業の構築」 58-61(2014)

9)中辻敏朗他、戦略研究報告書「地球温暖化と生産構造の変化に対応できる北海道農林業の構築」45-47(2014)
### 4. 同時糖化発酵

4．1 進化工学的手法による温度ストレス耐性機能性酵母の最適化

#### 4.1.1 研究目的

化石資源の枯渇や地球温暖化等の環境問題に伴い、農産廃棄物などのセルロース系バイオマスから微生物の発酵によって作られるバイオエタノールが注目されている。しかしながら、セルロース系バイオマスは非常に強固かつ複雑な構造を有しており、バイオエタノールへと変換するためには、前処理工程、酵素生産工程、糖化工程、発酵工程など、多段階のプロセスが必要となり、高コスト型のプロセスとなっている。特に、糖化に必要な酵素量が莫大となる点がボトルネックとなっている。そこで、プロセスを効率化するとともに酵素添加量を低減するために、発酵菌である酵母 Saccharomyces cerevisiae にセルラーゼを発現させ、糖化と発酵を同時に行う技術の開発が進められている。一方で、同時糖化発酵を極力短時間で終わらせ、高収率でエタノールを生産するためには、セルラーゼ発現酵母による糖化速度を向上させることが必要不可欠である。

セルロース分解能を有する糸状菌は

作用機作の異なる複数のセルラーゼ遺伝子を発現し、その発現比率を変化させることにより構造の異なる多様なセルロース基質の分解を可能にしている。結晶化領域の残る実バイオマスを用いる場合、少なくとも3種類のセルラーゼとして、β-グルコシダーゼ(BGL)、エンドグルカナーゼ(EG)、セロビオヒドロラーゼ(CBH)の遺伝子を発現させる必要

図 4.1 カクテル δ-integration 法の概要

がある。しかしながら、セルラーゼ遺伝子を酵母で異種発現させる場合、複数遺伝子の発現は可能であっても発現比率を人為的に調節することは困難である。そこで本研究では、ランダムなコピー数で各セルラーゼ遺伝子を導入した遺伝子組換え酵母の中から、セルロース基質の分解に最適な割合でセルラーゼ遺伝子を発現する酵母をスクリーニングする技術、カクテルδ-integration法（図4.1）を用いて、セルロース分解能を高度化した酵母を創製することとした。一方で、糸状菌由来のセルラーゼはその至適温度が40～50℃程度であり、酵母の至適発酵温度である30℃付近では酵素の比活性が大幅に低下してしまう。従って、酵母に温度ストレス耐性を付与することが出来れば、糖化速度を向上させることが出来ると考えられる。そこで、本研究では進化工学的な変異育種により酵母の高温耐性を高め、高効率な同時糖化発酵プロセスの開発を目指した。

#### 4 \. 1\. 2 研究方法

## （1） 進化工学的手法による温度ストレス耐性酵母の創製

実験室酵母株 YPH499 に対し、UV を照射して変異を誘導し、YPD 培地上、35℃で良好な生育を示した変異株をスクリーニングし、再度 UV を照射した。図 4.2 に示すようにスクリーニング温度を 2℃ ずつ上昇させて高温耐性酵母 YPH499/UV39 を作出した。
実験室酵母株 BY4741 についても、UV を照射して変異を誘導し、YPD 培地上、41℃で良好な生育を示した変異株のシングルコロニーを単離して BY4741/UV41 を得た。

図 4.2 温度ストレス耐性酵母 YPH499/UV39 の作出

## YPD 培地（10 g/L yeast extract, 20 g/L

bacto-peptone, 20 g/L glucose）中、30℃、200 rpm にて 24 時間振とう培養した菌体を、新しい YPD 培地（5～7 mL）に初期 OD600 が 0.05 になるように植菌し、好気条件化での培養を行った。

同様の条件で前培養した菌株を、100 g/L グルコースを含む YP 培地 (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto-peptone) に初期 OD600 が 0.5 になるように植菌し、微好気条件化でのエタノール生産試験を行った。

## （２）温度ストレス耐性酵母へのセルロース分解能力の付与

カクテルδ-integration法を用いて、T. reesei由来エンドグルカナーゼEGIIおよびセロビオヒドロラーゼCBHII、A. aculeatus由来β-グルコシダーゼBGL1を、YPH499/UV39に導入し、YPH499/UV39/cocδBECを作出した。YPD培地中、30℃、200rpmにて24時間振とう培養した菌体を、10g/Lリン酸膨潤セルロース（PASC）と5FPU/g-biomassCelicCtecIIを含むYP培地に初期菌体濃度が50g-wetweight/Lになるように植菌し、微好気条件化でのエタノール生産試験を行った。ワーキングボリュームは20mLとし、39℃での実験を行った。

同様の条件で前培養した菌体を 200 g-wet weight/L の麦わら爆砕処理試料と 1～10 FPU/g-biomass Celic Ctec II を含む YP 培地に初期菌体濃度が 200 g-wet weight/L になるように植菌し、微好気条件化でのエタノール生産試験を行った。ワーキングボリュームは 20 mL とし、30,37,39℃ での実験を行った。

## （3） 温度ストレス耐性二倍体酵母へのセルロース分解能力の付与

カクテルδ-integration 法を用いて、T. reesei 由来エンドグルカナーゼ EGII およびセロビオヒドロラーゼ CBHII、A. aculeatus 由来 β-グルコシダーゼ BGL1 を、YPH500 に導入し、YPH500/cocδBEC を作出した。YPH500/cocδBEC と YPH499/UV39/cocδBEC を接合法により掛け合わせ、二倍体酵母 YPH499-500/UV39/cocδBEC を作出した。

一方、これまでに作出したセルラーゼ提示二倍体酵母 MNII/cocδBEC に対し、進化工学的手法により温度ストレス耐性を付与し、温度ストレス耐性二倍体セルロース資化性酵母 MNII/cocδBEC/UV39 を作出した。創製した酵母株を用い、麦わら爆砕処理試料から同時糖化発酵試験を実施した。
## 4 ．1．3 研究結果および考察

## （１）進化工学的手法による温度ストレス耐性酵母の創製

YPH499 と YPH499/UV39 の好気条件下における培養試験の結果を示す（図4.3）。30℃では YPH499 の方が高い細胞増殖能を示したが、39℃では YPH499/UV39 の方が優れた細胞増殖能を示した。微好気条件下でのグルコース発酵能を比較した結果を図 4.4 に示す。39℃において、YPH499/UV39 は親株と比べてわずかに高いグルコース資化能とエタノール生産能を有することが明らかとなった。

これまでの研究から、同じ実験室酵母であるが、BY4741 株は YPH499 株よりも高い高温耐性能を有することが分かってきた。そこで、BY4741 に変異育種を導入し、41℃で生育可能な BY4741/UV41 を作出した。図 4.5 に好気条件下での増殖能を示す。#1 から #3 のシングルコロニーを単離して親株との比較を行ったところ、いずれの株においても 41℃で増殖能の向上が見られた。YPH499/UV39 株が生育可能な 39℃での好気培養を行ったところ（図 4.6）、BY4741/UV41 株は優れた高温耐性能を有していることが明らかとなった。一方で、高温耐性能の付与は 30℃での増殖能を低下させる傾向があることが明らかとなった。

図 4.3 好気条件下の細胞増殖能の比較

図 4.4 微好気条件下におけるエタノール生産能の比較

図 4.5 好気条件下における BY4741 系統株の細胞増殖能の比較

図 4.6 YPH499 系統株と BY4741 系統株の好気条件下の細胞増殖能の比較
（２）温度ストレス耐性酵母へのセルロース分解能力の付与

野生酵母 YPH499 および変異育種酵母 YPH499/UV39 に対し、カクテルδ-integration 法によりセルラーゼ (A. aculeatus BGL, T. reesei CBHII, T. reesei EG) 遺伝子群を導入した遺伝子組換え酵母 YPH499/cocδBEC および YPH499/UV39/cocδBEC を用いて、高温条件 (42℃) におけるリン酸膨潤セルロース (PASC) からの発酵試験を実施した (図 4.7)。発酵の際にはセルラーゼ剤は添加しなかった。

図 4.7 PASC 発酵におけるエタノール生産

## YPH499/cocδBEC 株では 30℃では微量のエタ

ノールしか生産せず、37℃および42℃では最大で約1.3g/Lのエタノールを生産した。これに対し、高温耐性を有するYPH499/UV39/cocδBEC株では、温度を上昇させる毎にエタノール生産性が向上し、42℃では約3.1g/Lのエタノールを生産した。これはYPH499/cocδBEC株と比較して、約2.4倍のエタノール生産量となった。各温度におけるエタノール収率およびエタノール生産速度を表4.1に示す。この結果から、PASCからの同時糖化発酵において、高温耐性能の効果が示された。

表 4.1 PASC 発酵におけるエタノール収率とエタノール生産速度

酵母	発酵温度(℃)	仕込み糖に対するエタノール収率(%)	エタノール生産速度(g/L/h)
YPH499/cocδBEC	30	-	-
37	11.9	0.043
42	9.4	0.034
YPH499/UV39/cocδBEC	30	22.2	0.055
37	22.6	0.082
42	33.3	0.120

次に、前述の2種類の酵母株を用いて、麦わら爆砕処理試料からの同時糖化発酵試験を行った。本試験では、セルラーゼ剤として、CelicCTec2を用いた。酵素剤添加量を変化させた同時糖化発酵試験における、24時間後のエタノール生産量を図4.8に示す。いずれの条件においても温度ストレス耐性酵母YPH499/UV39/cocδBECを用いた方が通常のセルラーゼ提示酵母YPH499/cocδBECよりも高いエタノール生産性を示すことが確認された。また、YPH499/UV39/cocδBECにおいて、発酵温度を37℃まで上昇させるとエタノール生産性は向上するが、39℃まで上昇させると低下することが確認された。この結果から、実バイオマスである麦わら爆砕処理物[38.8%グルカン、18.4%キシラン、1.7%アラビナン、16.6%リグニン（以上無水ベース）、含水率は75.2%]からの同時糖化発酵においても、高温耐性能の付与が有用であることが示された。39℃におけるYPH499/UV39/cocδBECの発酵結果を図4.9に示す。
高温耐性機能性酵母

YPH499/UV39/cocδBEC

図 4.8 温度ストレス耐性酵母による麦わらからの同時糖化発酵

## （３）進化工学的手法による機能性二倍体酵母への温度ストレス耐性付与

セルラーゼ資化性二倍体酵母に高温耐性能を付与したMNII/cocδBEC/UV39を作出した（図4.10）。次に、b)で用いた麦わら爆砕試料からの同時糖化発酵試験を実施した（図4.11）。30℃における発酵ではセルラーゼ添加量1FPU/g-biomassにおいて、開始24時間で約8g/L程度のエタノールを生産したのに対し、37℃における発酵では約16g/Lと約2倍のエタノール生産性を示した。この結果から、温度耐性を付与することにより低いセルラーゼ添加量でも高いエタノール生産性を達成することに成功した。

図 4.9 温度ストレス耐性型セルロース資化性酵母による、39℃における麦わらからのエタノール生産

図 4.10 温度ストレス耐性酵母 MNII/cocδ BEC/UV39 の作出
図 4.11 温度ストレス耐性酵母 MNII/cocδ BEC/UV39 による麦わらからの同時糖化発酵

（1）で作出した YPH499/UV39/cocδBEC と YPH500/cocδBEC を掛け合わせて作出した二倍体酵母、YPH499-500/UV39/cocδBEC についても PASC からの発酵試験を行ったが、親株である YPH499/UV39/cocδBEC のエタノール生産能を上回ることはできなかった。

#### 4.1.4 結論

YPH499/UV39 にセルラーゼを提示させた高温耐性型セルロース資化性酵母 YPH499/UV39/cocδBEC を作出した。YPH499/UV39/cocδBEC は高温における PASC および爆砕処理麦わらからの同時糖化発酵において高いエタノール生産性を示した。さらにセルラーゼ提示二倍体酵母 MNII/cocδBEC に対して温度ストレス耐性を付与し、機能性温度ストレス耐性二倍体酵母 MNII/cocδBEC/UV39 を作出した。MNII/cocδBEC/UV39 は YPH499/UV39/cocδBEC よりもさらに高いエタノール生産性を示した（図 4.12）。この結果から、実バイオマスである麦ワラ爆砕処理物からの同時糖化発酵において、セルラーゼを細胞表層に提示した二倍体酵母がエタノール生産を効率化することを明らかにした。
図 4.12 麦ワラ爆砕処理物からのエタノール生産性の酵母間比較

#### 4.1.5 参考文献

Yamada R, Taniguchi N, Tanaka T, Ogino C, Fukuda H, Kondo A. (2011) Direct ethanol production from cellulosic materials using a cellulolytic enzymes expression optimized diploid Saccharomyces cerevisiae strain. Biotechnol Biofuel. 4: 8

Hasunuma T, Kondo A. (2012) Consolidated bioprocessing and simultaneous saccharification and fermentation of lignocellulose to ethanol with thermotolerant yeast strains. Process Biochem. 47(9), 1287-1294

Hasunuma T, Kondo A. (2012) Development of yeast cell factories for consolidated bioprocessing of lignocellulose to bioethanol through cell surface engineering. Biotechnol. Adv. 30(6), 1207-1218

Hasunuma T, Okazaki F, Okai N, Hara KY, Ishii J, Kondo A. (2013) A review of enzymes and microbes for lignocellulosic biorefinery and the possibility of their application to consolidated bioprocessing technology. Bioresour. Technol. 135, 513-522

Yamada R, Hasunuma T, Kondo A. (2013) Endowing non-cellulolytic microorganisms with cellulolytic activity aiming for consolidated bioprocessing. Biotechnol. Adv. 31(6), 754-763
## 4 ．2 酵素生產、同時糖化発酵の裝置的課題の抽出、対策方法

#### 4 \. 2\. 1 研究目的

農産廃棄物等ソフトセルロース系原料からのバイオエタノール製造では、前処理により脱リグニンした二次原料中の多糖類（セルロースやヘミセルロース）を酵素および酵母により糖化・発酵し、生成したエタノールを蒸留により90%以上にする。ここで糖化・発酵工程におけるエタノール終濃度を数%以上にする必要があり、濃度が高いほど蒸留工程における設備コストや投入エネルギー量が低減する。高いエタノール終濃度を得るためには、二次原料の投入濃度を高くする必要があり、例えば二次原料固形物中のセルロース含量を40%とすると、糖化・発酵工程におけるエタノール終濃度2%を得るためには、二次原料を固形分10%以上で投入する必要がある。しかし、農産廃棄物からの二次原料は吸水し易く、固形分10%以上では塊状となるため混合不足による糖化・発酵速度の低下が懸念される。

そこで、糖化・発酵工程におけるエタノール終濃度の増加を目的として、同時糖化発酵における二次原料の固形分増加による影響を調査し、高固形分で高い糖化発酵効率が得られる方法を検討した。

#### 4 \. 2\. 2 研究方法

## (1) 固形分増加による同時糖化発酵への影響

同時糖化発酵における固形分濃度の糖化・発酵に対する影響を調査するため、図4.13に示す小型糖化発酵試験を用いて、固形分5-10％に対する同時糖化発酵試験を行い、エタノール等の生成物濃度を測定して糖化発酵状況を判断した。

同時糖化発酵試験はNRELのSSF Experimental Protocolsに準拠して行った。原料は、トウモロコシ薬薬の粉砕物（20-80mesh）をアルカリ処理(1.4%NaOH, 60℃, 6hr. 浸漬)および爆砕処理(190℃, 2min)により前処理し、これを硫酸により中和し、固形分約30%まで圧搾脱水して準備した。100mL小型糖化発酵容器に原料を5,7.5,10%-dry相当、YP培地、クエン酸緩衝液を一定量入れ蒸留水で全量100mLに調整後、高压蒸気滅菌した。セルラーゼ(Novozymes, NS50013)製剤を5FPU/g-Celluloseで添加後、ただちにOD600=1相当で機能性酵母(神戸大学)を接種した。温水浴中においてマグネティックスター

ラーで攪拌しながら、30℃、168h 糖化発酵試験を行い、所定時間ごとに発酵容器を振盪により均一化した後、試料の一部を採取して高速液体クロマトグラフ（日立ハイテクノロジー製LaChrom Eliteおよび東ソー製LC-8020）により糖類、有機酸、エタノール濃度を測定した。

(2) 高固形分での同時糖化発酵における装置的課題の抽出とその対策方法

高固形分での同時糖化発酵における酵素・酵母液との混合方法について、以下の3方式による効果を糖化発酵状況から判断し、同時糖化発酵装置に関する基礎検討を行った。

図 4.13 小型糖化発酵試験装置

## ①酵素製剤量の増加

高固形分での同時糖化発酵が液化（酵素糖化）により進行することを確認するとともに、発酵阻害物質の生成について検討する
②培地・緩衝液・酵素・酵母混合液への原料の浸漬

原料の投入時に混合液を吸水させることで塊状となる前に酵素・酵母と接触させることをねらいとする③振盪攪拌

塊状となる二次原料全体を揺動し、酵素・酵母との接触を促進し、糖化発酵速度を向上させることをねらいとする

同時糖化発酵試験は前項と同様に、トウモロコシ薬葉を粉砕、アルカリ処理および爆砕処理後に中和、脱水した原料を用いて、NREL の SSF Experimental Protocols に準拠して行なった。

## 試験方法

①酵素製剤量の増加：100mL 小型糖化発酵容器に二次原料を 10%-dry 相当、YP 培地、クエン酸緩衝液を一定量入れ蒸留水で 100mL に調整後、高压蒸気滅菌した。セルラーゼ (Novozymes, NS50013) 製剤を 10FPU/g-Cellulose で添加後、ただちに OD600=1 相当で機能性酵母 (神戸大学) を接種した。温水浴中においてスターラーで攪拌しながら、30℃、168h 糖化発酵試験を行った。

②酵素・酵母希釈液へ原料の浸漬：所定量のYP培地、クエン酸緩衝液および蒸留水の混合液をろ過滅菌(孔径0.2μm)に100mL小型糖化発酵容器に入れ、セルラーゼ(Novozymes, NS50013)製剤を5FPU/g-Cellulose、OD600=1相当で機能性酵母(神戸大学)を添加して混合した。この混合液に高圧蒸気滅菌した原料を10%-dry相当で浸漬し、温水浴中においてスターラーで攪拌しながら、30℃、168h糖化発酵試験を行った。

③振盪攪拌：200mL ポリ瓶(PP 製)に原料を 10%-dry 相当、YP 培地、クエン酸緩衝液を一定量入れ蒸留水で 100mL に調整後、高压蒸気滅菌した。セルラーゼ(Novozymes, NS50013)製剤を 10FPU/g-Cellulose で添加後、ただちに 0D600=1 相当で機能性酵母(神戸大学)を接種した。恒温振盪培養器を用いて 150rpm で振盪攪拌しながら、30℃、168h 糖化発酵試験を行った。

同時糖化発酵試験では所定時間ごとに発酵容器を振盪により均一化した後、試料の一部を採取して高速液体クロマトグラフ（日立ハイテクノロジー製 LaChrom Elite および東ソー製 LC-8020）により糖類、有機酸、エタノール濃度を測定した。

## （３）酵素製剤による高温糖化と糖化発酵効率への影響

酵素の反応速度は、温度とともに上昇し、至適温度で最大となることから、高温で糖化を行うことにより早期に液化が進行することが期待できる。そこで、高固形分での高温糖化による糖化発酵効率への効果を検討した。

至適温度は高温であるため酵母の活性が低下することから、試験は一定時間の高温糖化後に36℃まで冷却し、酵母を添加して行った。原料はトウモロコシ薬薬の粉砕物(20-80mesh)をアルカリ(1.4%NaOH,60℃,6hr.)+爆砕(190℃,2min)により前処理して用いた。図4.14に示す小型試験容器に前処理後の原料を10%-dry相当、YP培地、クエン酸緩衝液を一定量入れ蒸留水で60mlとした。高压蒸気滅菌後、室温まで冷却し、セルラーゼ(Novozymes,NS50013)製剤を5FPU/g-Celluloseで添加した。同酵素製剤の至適温度は50℃であることから50℃、24hr.で図4.15に示す回転攪拌により糖化させた後、36℃に冷却してOD600=1相当で機能性酵母(神戸大学)を接種した。恒温槽内で回転攪拌しながら、36℃で同時糖化発酵試験を行い、所定時間ごとに発
図 4.14 小型試験容器

図 4.15 回転攪拌

酵容器を振盪により均一化した後、試料の一部を採取して高速液体クロマトグラフ（日立ハイテクノロジー製 LaChrom Elite および東ソー製 LC-8020）により糖類、有機酸、エタノール濃度を測定した。エタノール等の生成物濃度を測定して糖化発酵状況から判断した。

## （４）効率的な攪拌による同時糖化発酵への影響

高固形分の原料で酵素、酵母を効果的に原料に接触させるため、ジャケット式セパラブルフラスコ（内容量1L）を用いて、上部から攪拌機で攪拌する反応装置を用いた検討を行った。通常の攪拌羽根ではフラスコ内で空回りすることから、フラスコ内壁との隙間が数mm以下となる攪拌羽根を製作した。

この反応装置を用いて、原料として麦わら（アルカリ処理＋爆砕処理）、ビートトップについて同時糖化発酵試験を行った。

同時糖化発酵はこれまでと同様にNRELのSSF Experimental Protocolsに準拠して行った。セパラブルフラスコに所定量の原料（10～15%-dry相当）、YP培地、クエン酸緩衝液を入れ蒸留水で濃度調整後、高压蒸気滅菌した。セルラーゼ(Novozymes, Cellic CTec2)製剤を10FPU/g-Celluloseで添加後、ただちにOD600=1相当で機能性酵母(神戸大学)を接種した。80～100rpmで攪拌するとともに、ジャケットに36℃の温水を循環し発酵温度制御した。所定時間ごとに試料の一部を採取して高速液体クロマトグラフ（日立ハイテクノロジー製LaChrom Eliteおよび東ソ一製LC-8020）により糖類、有機酸、エタノール濃度を測定した。

## 4 ．2．3 研究結果および考察

## （１）固形分増加による同時糖化発酵への影響

投入多糖類量から算出される理論エタノール量に対する生成エタノール量を糖化発酵効率とし、その経時変化を図4.16に示す。固形分5%では24hr.後からエタノールが生成しており、120hr.で糖化発酵効率が65%に達している。固形分の増加に従い、同時間での糖化発酵効率が低く、エタノール生成速度が低下していることが認められる。原料固形分5、7.5、10%の初期外観性状はそれぞれスラリー状、泥状、塊状であり、10%ではほとんど流動性が見られなかった。これは固形分の増加により原料が自由水を吸水したためと考えられる。固形分の増加による糖化発酵速度の低下は、流動性の低下による混合不足により①原料中の多糖類と酵素および酵母との接触が不十分であったため見かけの比活性が低下した、あるいは②局所的に多糖類と酵素および酵母が多く接触することで高糖圧迫または発酵阻害物質による阻害などの生産物阻害により活性が低下したことが要因と思われる。
（２）高固形分での同時糖化発酵における装置的課題の抽出とその対策方法

固形分の増加による糖化発酵速度の低下は混合不足が要因と思われるが、スターラーを用いた混合方法ではトルクや回転数等の回転力を増強しても回転体が空転するのみで混合されない。これは処理規模を大きくするとより顕著となり、30L規模の三連回転翼式混合攪拌槽を用いて同時糖化発酵試験を試みたが、図4.17に示すように回転翼がいずれも空転し、糖化発酵速度が固形分5%時の1/4以下まで低下した。

図 4.16 固形分に対する糖化発酵効率

高固形分での同時糖化発酵における糖化発酵速度を向上させるためには、塊状である原料に酵素・酵母を効率的に混合させる方法を検討する必要がある。そこで、酵素・酵母との混合方法に関し以下の基礎検討を行った。

## ① 酵素製剤量の増加

本研究で用いる機能性酵母はセルラーゼ、β-グルコシダーゼを含む酵素を生産するが、酵母増殖に必要な基質を得るために酵素製剤を少量添加する必要がある。セルロース量に対して添加しているが、高固形分での同時糖化発酵で糖

図 4.17 混合搅拌槽

化による液化が進行しなかったことから、添加量を2倍に増加して液化を進行させる方法を試みた。

同時糖化発酵試験の結果を図4.18に示す。試験容器中の原料は一時期塊状となっているが、24hr.後から液化の進行が目視で確認できた。糖化発酵効率が高く推移し、168hr.時は固形分5%の試験では糖化発酵効率65%以上に達するなど、糖化発酵効率の向上に対する

頭著な効果が認められた。また、HMF（ヒドロキシメチルフルフラール）や有機酸等の発酵阻害物質は2mg/ml以下であった。

酵素製剤量の増加による糖化・液化の進行がさらに酵素・酵母との接触を高め、糖化発酵効率が向上したと考えられる。しかし、酵素製剤コストが高いことから、添加量を低く抑えることが必要であり、添加量の最適化および他方法との組合わせによる低減化が必要である。また、高固形分における糖化発酵効率の低下が局所的な糖化発酵による高糖圧迫や発酵阻害物質の増加が要因ではないことが明らかになった。

図 4.18 酵素量 2 倍における糖化発酵効率
## ②培地・緩衝液・酵素・酵母混合液への浸漬

糖化発酵工程では培地および緩衝液、原料を装置に投入後、乳酸菌などの雑菌による汚染を防ぐため高圧蒸気滅菌後に酵素と酵母を添加する。しかし、高固形分では酵素・酵母を添加する前に原料が塊状となることから、原料を培地・緩衝液・酵素・酵母の混合液に浸漬させることにより、原料に酵素・酵母を接触させる方法を試みた。同時糖化発酵試験の結果を図4.19に示す。原料の性状は浸漬後数時間以内に塊状となっていたが、初期（24hr.）で糖化発酵効率の向上が見られ、液

図 4.19 液浸漬方法に対する糖化発酵効率

浸漬方法により原料と酵素・酵母との接触面積が増加したことを示した。その後も糖化発酵効率は増加し、液浸漬法による効果が認められたが、168hr.後の糖化発酵効率は55%程度であり、5%固形分での糖化発酵効率65%には達しなかった。

原料と酵素・酵母は塊状となる前に接触しており、塊状物の内部に酵素・酵母は存在していると思われるが、液浸漬法単独での糖化発酵効率の向上に対する顕著な効果は得られなかった。

## ③振盪攪拌を用いた処理物の揺動による効果

高固形分における糖化発酵効率の低下は、流動性の低下による混合不足により酵素および酵母の見かけの比活性が低下したことが要因である可能性が高いことから、塊状である原料を含む処理物全体を揺動し、酵素・酵母との接触を促進させる方法を試みた。

同時糖化発酵試験の結果を図4.20に示す。試験容器中の原料を含む塊状の処理物は往復振盪により容器内部で移動し、容器内面に衝突を繰り返す状態で経過し、72hr.後にはスラリー状まで液化していることを目視で確認した。糖化発酵効率も72hr.後から高く推移し、168hr.時は約60%となり、糖化発酵効率の向上に対する効果が認められた。処理物全体を揺動させることで糖化発酵効率が向上しており、高固形分における糖化発酵効率の低下は、流動性の低下による混合不足が要因であると推察される。しかし、工業装置として振盪機構を有する工業装置は設備コストが高く、振盪に要するエネルギーコストも高いことから、他の揺動手法を検討する必要がある。

図 4.20 振盪法における糖化発酵効率

## （３）酵素製剤による高温糖化と糖化発酵効率への影響

投入多糖類量から算出される理論エタノール量に対する生成エタノール量を糖化発酵効率とし、その経時変化を図4.21に示す。高温糖化(5FPU、50℃糖化)のほか、比較としてControl(5FPU,36℃糖化)の結果を同時に示した。高温糖化では196時間後の糖化発酵効率が60%であり、Controlの49%に比べ高く、高温糖化による糖化発酵効率の向上が認められた。図4.22に高温糖化24時間後の原料外観をControlと比較して示した。
Control で容器内面全体に原料が付着しているのに対し、高温糖化では内面に付着する原料が少なく、容器下面に液状化が進行していることが認められる。高温糖化により早期に液状化が進行し、Control に比べ混合状態が改善したことから酵素や酵母と原料との接触効率が高まったことで、糖化発酵効率が高くなったものと考えられる。

図 4.21 高温糖化による糖化発酵効率

高温糖化

Control

図 4.22 試料容器外観（高温糖化時）

## （４）効率的な攪拌による同時糖化発酵への影響

ジャケット式セパラブルフラスコを用いて行った同時糖化発酵試験の様子を図4.23に示す。試験初期にはフラスコ内壁面に薄く原料が付着したが酵素による液化が進むにつれて解消した。

この反応装置を用いて、麦わら、ビートトップを原料とし、原料10%-dry、酵素10FPU/g-cellose、機能性酵母0D600 1相当の条件で同時糖化発酵を行った時の発酵効率を図4.24に示す。攪拌の効果により初期の酵素による液化が速やかに進むのが観察され、これまでより短時間で発酵が進むことが分かった。またどちらの原料も発酵効率70%以上を示した。
次に原料濃度を高めた試験として麦わらで、原料 15% - dry、酵素 10

SFPU/g - cellulose、機能性酵母 0D600 1 相当の条件で同時糖化発酵を行ったところ、固形物濃度 10% - dry 時と変わらず、同時糖化発酵が進行した (図 4.25)。これらのことから攪拌の効率を高めることで高濃度の原料に対応できることが確認できた。

図 4.24 攪拌反応装置による糖化発酵効率 (10%−dry)

図 4.23 攪拌反応装置

図 4.25 攪拌反応装置による糖化発酵効率 (15%-dry)

#### 4.2.4 結論

蒸留工程におけるエネルギー消費量低減および糖化発酵工程における設備コスト低減のため、高固形分での糖化発酵方法を検討した。農産廃棄物を原料として前処理した後の原料を高固形分で糖化発酵させる場合、原料が吸水して自由水が減少して塊状となり、一般的な混合攪拌装置では糖化発酵効率が低下することが認められた。そこで基礎検討として①酵素製剤量、②培地・緩衝液・酵素・酵母混合液への浸漬、③振盪攪拌による糖化発酵効率の向上に対する効果を調査した。その結果、高固形分における糖化発酵効率の低下は、塊状により流動性が低下して混合不足となり、原料中の多糖類と酵素および酵母との接触が不十分であったため見かけの比活性が低下したことが要因であると推察された。

混合状態を改善する手法として酵素の至適温度における高温糖化を行い、その後機能性酵母による同時糖化発酵を検討した。その結果、高温糖化により液化が早期に進行し、高固形分での混合状態が良好となり、糖化発酵効率が向上することが認められた。

攪拌混合方法として試料全体を攪拌できるような攪拌羽根を製作し同時糖化発酵を行ったところ、初期の酵素による液化が進行し、糖化発酵効率が向上した。