Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
表1.5 ビートトップ各部のカロテノイド含有量 （単位：wt%、無水ベース）

(Nx: 9cis オキサン、V: ビオラキサン、L: ルテイン)

採取時期	サンプルNo.	根	峯	葉	ビートトップ
Nx	Vx	L	Nx	Vx	L	Nx	Vx	L	Nx	Vx	L
H25.10	1	4	1	15	33	15	163	1041	323	2560	278	89	728
2	4	1	17	56	22	247	1138	301	2396	360	99	826
3	3	1	10	64	27	238	940	334	2092	307	112	737
4	10	3	31	63	23	227	1050	362	2210	366	127	813
5	6	1	20	33	12	147	999	288	2216	286	84	671
6	6	1	20	45	20	215	728	179	1638	212	56	531
7	10	2	30	57	24	235	990	352	2268	278	100	672
8	3	1	10	54	23	227	901	334	2119	295	110	736
9	11	2	37	38	16	178	684	271	1713	257	102	680
平均	7	1	21	49	20	208	941	305	2135	297	98	718
H24.8	1	142	13	287	1168	261	2449
2	135	13	270	1312	306	2708
3	150	16	290
平均	138	13	278	1240	284	2578

## （３）ビートトップの長期保存方法に関する検討

## 1 ）エタノール噴霧での保存試験

長期保存試験時の糖含有量の変化を表1.6に示す。25℃保存では、エタノール濃度が10wt%以下のサンプルでは、3月以降から含有量が減少し始め、9ヶ月で半分程度になったのに対し、90wt%のエタノールを噴霧したサンプルでは、9ヶ月経過後でも初期値と同程度を維持しており、高濃度のエタノールの噴霧は、有効であることがわかった。3℃保存では、10wt%以上のエタノール濃度で9ヶ月経過後も初期値を維持しており、温度を低温にすることで、より低いエタノール濃度でも保存が可能になることがわかった。なお、90wt%エタノール噴霧後のサンプルを搾り、その液のエタノール濃度を測定したところ、265mg/mlであった。エタノールでの抽出については、後述するが、ビートトップからカロテノイドをエタノールで抽出した後に保存することを想定した場合、ビートトップは、それをはるかに上回る高濃度のエタノールに含浸した状態になるので、実システムにおいても糖分は、長期間にわたって問題なく保存できるものと思われる。

カロテノイド含有量（9cisネオキサンチン、ビオラキサンチン、ルテインの合計量）の経時変化を表1.7に示す。保存温度3℃でのカロテノイド含有率の減少は、25℃と比較すると緩やかであり、低温下での保存が有効であることがわかった。しかしながら、保存温度3℃でも、1ヶ月後には、大幅に減少しており、エタノール溶液の噴霧では、長期保存が難しいことがわかった。
表1.6 長期保存試験での糖含有率の変化 （単位：wt%、無水ベース）

保存温度(℃)	噴霧エタノール濃度(wt%)	保存期間
初期値	2日	1週間	2週間	1月	2月	3月	4月	6月	9月
3	0	30	26	27	33	32	33	30	29
1	28	29	32	34	34	30	25	24	23
10	27	28	31	30	27	31	33
90	29	21	27	29	32	30	27	31	34
25	0	28	30	28	0	27	24	17	15	14
1	30	30	27	32	26	20	16	16	13
10	27	24	27	27	22	21	15
90	26	27	29	31	29	29	27	27	31

表1.7 長期保存試験でのカロテノイド含有量の経時変化（ppm、無水ベース）

保存温度(℃)	エタノール濃度(%)	保存期間(カロテノイド含有率(ppm))
0日(初期値)	2日	1週間	2週間	1月
3	0	161	180	112	118	45
1	115	147	105	82	53
10	145	119	39	—
25	0	161	55	24	42	12
1	115	90	—	33	13
10	145	28	19	22	—

## 2 ）エタノール抽出液での保存試験

エタノール抽出後の液（エタノール濃度85wt%）で保存した場合のカロテノイド含有量の経時変化を図1.5に示す。遮光しない3℃、25℃保存サンプルでは、含有率の減少は、著しく速く、3℃でも1ヶ月で初期値の10%程度になった。遮光によりカロテノイド含有量の減少は著しく抑制され、9ヶ月経過後でも、25℃で初期値の約半分、3℃では、初期値と同程度の値を維持していた。以上のことから遮光の有無は非常に大きい因子であり、加えて保存温度を低温にすることで、さらに減少を抑えることができることがわかった。

ビートの収穫は11月上旬から行われるため、ビートトップの排出も同時期となる。ビート生産地は寒冷地であり、例えば特産地である十勝管内芽室町の過去10年の気温を調べると、11月中旬から4月上旬の5ヶ月弱は1日の平均気温は3℃以下であった。雪水など利用すると、さらに長期間3℃以下に保つことも可能であることが想定される。本研究の結果から、寒冷外気などの自然エネルギーを積極的に利用することで、効率よく保存できる可能性があることが示唆された。

図 1.5 加応/イド含有量の経時変化
## 3 ）エタノール抽出条件と保存性に関する検討

前項でカロテノイドの保存には、エタノール溶液で抽出後の液での保存が有効であることがわかった。本章は、保存に関する検討を行う章であるが、抽出工程の後に保存工程があるシステムを検討する場合、抽出条件とその結果得られる抽出液の保存性についても検討が必要と考えられる。そのため、エタノール濃度を様々に変えた場合の抽出状況を調べるとともに、得られた抽出液でのカロテノイドおよび脂質の長期保存性について検討した。

抽出液のエタノール濃度を変えた場合のカロテノイド抽出率の変化を図1.6に、ネオキサンチン抽出率の変化を図1.7に、脂質抽出率の変化を図1.8に示す(いずれも元原料ビートトップの無水ベース重量に対する値、単位：wt%)。カロテノイドも脂質もエタノール濃度の増加に伴い抽出量は増加しており、ネオキサンチンはカロテノイドとほぼ同じ値であった。例えば抽出液濃度が55%程度の時は、抽出率は原料ビートトップ中に含まれるカロテノイドの2%、脂質の15%程度にとどまるが、約76%の時は、カロテノイドの15%、脂質の30%程度を抽出できている。また、抽出された脂質の脂肪酸組成を調べたところ、40%程度のαリノレン酸を含んでいた。ビートトップには茎部、クラウンが入っているため、ビート葉部のみの文献値²と比べてやや低い値であるものの、他のバイオマスと比較しても充分に高いω-3脂肪酸含有量であった。なお、エタノールでの抽出工程での抽出残渣への糖の残存量を調べたところ、原料ビートトップの無水物重量をベースとすると5-8%程度の糖が抽出液に取り込まれ、残りの90%以上は抽出残渣に残存することがわかった。この残存率は、多少のばらつきはあったものの、55-76%の抽出液濃度では、ほぼ一定値で、抽出残存率への抽出液濃度の影響はなかった。このことから、エタノール抽出時の糖の損失は少なく、今回試験を行った範囲のエタノール濃度では、90%以上の糖が抽出残渣に残存しており、効率的に脂質およびカロテノイドなどの有効成分のみを抽出できることがわかった。次にカロテノイドなどを抽出した後の55-76%のエタ

図1.6 カロテノイド抽出率の変化

図1.7 ネオキサンチン抽出率の変化

図1.8 脂質含有量の変化

ノール濃度の抽出液で保存試験を行った結果を表1.8に示す。抽出液濃度が高いほどカロテノイドの保
存後の残存率は高かった。また、表には示さなかったが、脂質量はどの濃度でも51日後も初期値と同程度であった。

実システムにおける保存期間は、ビートトップからどの程度有用成分の回収を行い、また、それをどれだけの期間をかけて製品を製造するかによって変わってくるものと思われる。保存は、長期間可能なほうが好ましいのだが、現時点で想定している有用部物質の市場規模はそれほど大きくなく、後段のプロセスの章で検討を行うが、実際の処理量はかなり少ないものと思われる。

50日の保存期間が、抽出後の有用成分の製造工程に十分なものかどうかは議論が必要なところであるが、表の51日時点での残存率で判断すると、抽出液濃度はより高い方が望ましく、少なくとも75%程度より高いことが望ましいものと思われる。

表1.8 いくつかのエタノール抽出液での保存試験結果（3℃、遮光）

抽出液エタノール濃度(wt%)	76	71	65	61	55	参考 85%60 日
51 日後の加応ノイド残存率(wt%)	76	52	49	59	44	87

### 1.4 結論

本章では、麦わら、豆殻、ビートトップ、スイートコーン茎葉等の農産廃棄物の収集・運搬方法および農産廃棄物の長期保存方法について検討を行った。

まず、農産廃棄物の北海道内、十勝管内での賦存量の推計を行い、道内では、多量の農産廃棄物が排出されていることを確認した。

次に、農産廃棄物の収集運搬について、既存の収集・運搬方法の調査を行い、それらが本課題でも適用可能であることがわかった。麦わら、小豆殻、スイートコーン茎葉の収集運搬については、概ね方法が確立されており、本研究の場合にも適用可能である。ビートトップの収集については、現在市販の収集装置はないが、過去に装置を製造し、現在新たな装置の試作も行っているメーカもあり、若干の改良は必要なものの、それらの装置で収集は可能であると思われる。ビートトップの運搬についても通常のトラック輸送で問題ないものと思われる。

各種バイオマスの保存については、麦わら、小豆殻、スイートコーン茎葉は、既往の研究成果であるアルカリ浸漬保存を適用可能と想定されるので、ビート茎葉部の保存に重点を置き試験を行った。ビート茎葉部の糖類の保存については、高濃度のエタノール水溶液を噴霧した状態で、低温下で保存すれば、9ヶ月間経過後も初期値と同程度の糖含有量を維持することができた。このことから、ある程度の濃度のエタノールを共存させた状態で保存すれば、長期間保存することは可能であることがわかった。

カロテノイドおよび脂質の保存については、高濃度のエタノール抽出液で、低温下で遮光保存することで、長期間にわたり初期値と同程度の含有量を維持できることがわかった。また、エタノール濃度が低下すると保存性は悪くなるため、少なくとも75%程度より高い濃度での保存が望ましく、より長期間の保存のためには85%以上が好ましいことがわかった。

カロテノイドなどの保存には、エタノール抽出した液の状態が好ましいことがわかったので、エタノール抽出条件についても基礎検討を行った。エタノール濃度が高いほど脂質およびカロテノイドの抽出率は高くなり、75%では、原料ビートトップの15%のカロテノイド、30%の脂質を抽出することができた。
また、抽出時の糖の損失は少なく、90%以上の糖が抽出残渣に残存しており、エタノール溶液で抽出することで効率的に脂質およびカロテノイドなどの有効成分のみを抽出できることがわかった。

以上のことから実プロセスでは、少なくとも75%以上のエタノール濃度で抽出し、抽出液をそのままの状態で保存するのが好ましいことがわかった。

### 1.5 参考文献

1) 北口敏弘、近藤昭彦、山田敏彦、秋葉隆ほか，地球温暖化対策技術開発事業資源用トウモロコシを利用した大規模バイオエタノール製造拠点形成推進事業成果報告書，2010

2) 加茂川寛之，陸上植物由来カロテノイドに分析方法の確立とその応用，

3) A. Sluiter, B. Hames, D. Hyman, C. Payne, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton and J. Wolfe, Determination of Total Solids in Biomass and Total Dissolved Solids in Liquid Process Sample, NREL/TP-510-42621, National Renewable Energy Laboratory (2008)

4) A. Sluiter, B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton, and D. Crocker, Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass, NREL/TP-510-42618, National Renewable Energy Laboratory (2008)

5)建部雅子，花井雄次，テンサイ各部位における糖の消長，てん菜研究会報，24，pp.57-63 (1982)

6)北海道十勝地域の規格外農産物および農産化工残渣物利用におけるバイオエタノール変換システムに関する事業化可能性調査報告書，財団法人十勝圈振興機構，平成17年3月

7) 小川和夫，竹内豊，片山雅弘，北海道の耕草地におけるバイオマス生産量および作物による無機成分吸収量，北海道農業試験場研究報告，149号，pp.57-91 (1988)

8)北海道バイオマス利活用マスタープラン，北海道，平成18年3月

9)平成22年度農林水産省作物統計，http://www.maff.go.jp/j/tokei/kouhyou/sakumotu/index.html

10)2011 十勝の農業、北海道十勝総合振興局、平成 23 年 12 月

11)「十勝圈資源循環型社会形成檢討調查」、帯広開発建設部、平成16年1月

12)農産物収穫残渣燃料化新システム協議会平成19年度事業実績報告書、平成20年3月

13) 農業残さからのエネルギー！豆殻、ながいもつる・ネットペレットプロジェクト報告書、北海道芽室町、平成21年3月

14) 芽室町の公共施設を活用したバイオマス資源の町内循環推進事業報告書，北海道芽室町，平成22年3月

15) 平成 22 年度 産学連携道産低炭素化技術振興モデル事業委業務報告書、

「地域に賦存する畑作関連バイオマス由来のペレットボイラの開発・実証」，畑作関連バイオマスペレットボイラ研究開発コンソーシアム,平成23年2月

16)村井信仁、齊藤亘、高畑英彦，ビートトップの飼料化に関する試験，てん菜研究会報，21号，pp.155-170 (1980)

17)高橋潤一，ビートトップの飼料化の取り組みについて，独立行政法人農畜産業振興機構 HP, http://www.alic.go.jp/joho-s/joho07_000487.html (2012)

18)十勝毎日新聞社 Web ニュース, 平成 22 年 9 月 14 日,

http://www.tokachi.co.jp/news/201009/20100914-0006610.php
### 2. 原料に含まれる有用成分評価

### 2.1 研究目的

ビートトップなどの農産物の葉部中にも脂質は少なからず存在（例えばビートトップで乾燥重量あたり5～10%）する。これらの葉部脂質には、カロテノイドや糖脂質などといった機能性成分が含まれており、これらの機能性脂質は中性脂肪と比較して高極性のため、エタノールを用いることで効率良く抽出できる。したがって、本事業で農業廃棄物から得たエタノールを、これら機能性脂質の抽出に活用し、付加価値の高い抽出物を得ることができれば、ビートトップからのバイオエタノール製造コストの低減化を図ることができる。こうした背景のもと、本事業では、北海道で毎年大量に発生する農業廃棄物のうち、特にビートトップに着目し、ビートトップから有価物を回収して廃棄物のカスケード利用を図り、市場競争力の高いバイオエタノール製造技術体系を確立することを目的とする。

### 2.2 研究方法

## 1 ）ビートトップエタノール抽出物(BT-EtOH)の成分分析

BT-EtOH に含まれる脂肪酸の組成や色素成分（カロテノイド）などについて分析した。また、この際、BT-EtOH の脂溶性成分組成を、他の植物薬部からのエタノール抽出物中のそれと比較した。

①試料：用いたビートトップは十勝農業試験場から得た。また、比較のため用いた各種野菜は函館市内のストアで購入した。

②エタノール抽出：試料は冷凍庫にて一晩凍結させた。凍結後粉砕し、これを解凍後に、試料重量の10倍量のエタノールに浸漬し、一晩放置することで抽出を行った。抽出液をろ過後、残渣に再び試料重量の10倍量のエタノールを加え一晩抽出した。2回の抽出で得られたろ液を濃縮し、エタノール抽出物を得た。また、このエタノール抽出物中の脂質含量を分析するために、以下の方法 $ ^{1} $ で脂質を分離し、重量を測定した。すなわち、エタノール抽出物に蒸留水を加え、クロロホルム/メタノール/蒸留水(10:5:3, v/v/v)の混合比とした後、よく振り混合した。混合液は一晩遮光静置して2層に分離させた後に、下層を回収し、脂質成分を得た。

③HPLCによるエタノール抽出物中のカロテノイド分析 $ ^{2)} $ ：HPLCのカラムには逆相系のODS(DevesoilODS-UG-5，野村化学(株)を用いた。カラム温度は25℃に設定した。移動相には、A溶媒（アセトニトリル/メタノール/水（84:9:7,v/v/v）とB溶媒（メタノール/酢酸エチル（68:32,v/v））を用意し、0-8分はA溶媒のみで、8-28分はB溶媒のみで、また、28-29分はA溶媒のみで試料を流出させた。なお、流量は1.2ml/min、検出波長は440nmとした。予備分析により、各エタノール抽出物には3種のカロテノイド（ルテイン、9'-シス-ネオキサンチン（ネオキサンチン）、ビオラキサンチン）が主として含まれていたことが分かったので、これら3種のカロテノイドを購入し、それぞれのカロテノイドの検量線を作成した後、試料中のカロテノイドの定量を行った。なお、内部標準物質としてパラレッドを用いた。

④脂肪酸組成分析：エタノール抽出物中に含まれる脂肪酸の組成分析にはガスクロマトグラフィー(GC)を用いた。脂肪酸を定法 $ ^{3)} $ によりメチルエステルとし、キャピラリーカラム(Fused Silica Capillary Column Omegawax320, Supelco)に導入した。なお、キャリアガスにはヘリウムを用い、流量は1mL/s、カラム温度は200℃、試料導入温度は250℃、検出器温度は260℃とした。

2）ビートトップエタノール抽出物(BT-EtOH)の肥満/糖尿病病態マウス(KK-A)に対する投与実験
BT-EtOH の脂質代謝改善作用を明らかにするために、糖尿病・肥満病態マウスを用いた検討を行った。

①動物と飼料：動物には日本クレア(株)より購入したⅡ型糖尿病・肥満モデルマウス（KK-Aマウス、4週齢、雄）を用いた。試験飼料はAIN-93G組成 $ ^{4)} $ に従って調製した。なお、コントロール群用の飼料中の大豆油は14%(w/w)とした。BT-EtOH投与群では大豆油14%のうち、4%をBT-EtOHで置換した。また、各飼料から脂質を抽出し、その脂肪酸組成を上述の1）の④により分析した。

②動物の飼育：動物実験は北海道大学動物実験委員会による北海道大学動物実験指針に基づいて行った。室温 $ 23 \pm 1^{\circ}C $ 、湿度 $ 45 \sim 60\% $ 、明暗周期 12 時間の条件下で滅菌ウッドチップを入れたプラスチックケージに、1 ケージあたり 1 匹となるように飼育した。固形試料 MF 試料を用いて 1 週間予備飼育を行った後、平均体重および体重の標準偏差が同等となるよう、各群 6 匹に群分けし、26 日間上述の実験飼料を与えて飼育した。③採血および臓器の摘出と血清成分の分析：飼育期間中の体重、摂餌量を測定した。血糖値は 26 日間の実験飼育最終日に、非絶食状態で尾静脈より採血を行い、血液中の血糖値を自己検査用グルコースキット・サイクリック GB センサーにより測定した $ ^{5)} $ 。飼育期間終了後、12 時間の絶食を行い、その後、エーテル麻酔下で大静脈より採血を行い、血液中の各成分の分析に供した。採血終了後直ちに頸椎脱臼により安楽死させ、その後臓器を摘出した。摘出した臓器は $ -20^{\circ}C $ で保存した。また RNA の分析に用いたサンプルは RNA later(シグマアルドリッチジャパン)を用いて保存した。

④肝臓脂質の抽出と分析：-40℃で保存した肝臓中の脂質を、クロロホルム/メタノール(2:1,v/v)を用いて抽出した $ ^{6} $ 。得られた肝臓脂質中のコレステロールとトリアシルグリセロール(TAG)の測定には、コレステロール:E-テストワコーとTAG:E-テストワコー(和光純薬工業)を用いた。

⑤肝臓脂質中の脂肪酸分析：肝臓脂質中の脂肪酸のメチルエステル化はアルカリ触媒下で行った。得られたメチルエステルをケイ酸カラムクロマトグラフィーにより精製し、上述の1）の④で示した条件にてGC分析した。

⑥血清インスリン濃度の測定：血清中のインスリン濃度の測定には、ELISA キットを用いた $ ^{7)} $ 。血清(原液)と標準インスリン溶液を96穴抗体固相化プレートのウェルに分注し、あらかじめ各ウェルに添加してあるビオチン結合抗インスリン抗体と反応させた。反応終了後、反応液を捨て、洗浄後、ペルオキシダーゼ・アビジン結合物と反応させ、マイクロプレート用分光光度計を用いて450nmでの吸光値を測定した。試料検体の吸光値から検体ブランクの吸光値を引いた値を検量線に当てはめ、検体のインスリン濃度を算出した。

⑦統計計算：得られた数値から、各群の平均値および標準誤差を算出した。数値の比較には多重比較法のシェッフェを用い、有意水準はp<0.05 およびp<0.01 とした。

## 3 ）ネオキサンチンの肥満/糖尿病病態マウスに対する投与効果

BT-EtOH には薬部脂質に特徴的なカロテノイド、ネオキサンチンが含まれている。ネオキサンチンは分子内にアレン構造を有する特殊なカロテノイドで、これまでその生理作用については知られていなかった。本事業では、BT-EtOH の栄養機能性を理解する上で、ネオキサンチンが鍵となると推測し、動物を用いたネオキサンチンの生理作用に関する検討を行った。

①ネオキサンチンの調製：ネオキサンチンを動物に投与できる量分別した例はこれまでにない。ネオキサンチンは光合成を活発に行う陸上植物葉部や緑藻類に多く含まれている。幾つかの素材について検討したところ、市販のクロレラ粉末がネオキサンチンを分別するのに最も適した原料となることが分かった。そこで、クロレラ粉末からの有機溶剤抽出、液-液分配分画、カラムクロマトグラフィー分画を用いたネオキサンチン
ン分別法をまず確立した。この方法により、純度75%以上のネオキサンチン濃縮物（残りの25%は糖脂質）を得た。

②動物実験とその解析方法：動物実験は、上述2）の項で述べた方法と同じとした。飼料中のネオキサンチン添加量は0.2wt%とした。また、ネオキサンチンの投与実験では、エネルギー制限食を用いた検討も行った。

## 4 ）BT-EtOH の酸化安定性の分析

BT-EtOH などの植物薬部脂質には酸化されやすい $ \alpha- $ リノレン酸が多く含まれる。一方で、薬野菜などの植物薬部は、乾燥粉末などで流通することも多いが、この場合、特に、不活性化ガスの充填や冷凍保存などの酸化防止措置は行わなくても酸化劣化は見られない。この高い酸化安定性の原因として、植物薬部脂質の主要クラスがグリセロ糖脂質(GL)であることに起因している可能性を考え、BT-EtOH 中の GL の酸化安定性について検討した。

①酸化に用いた脂質：BT-EtOH からの GL と比較に用いたコンブ GL、イワシ油トリアシルグリセロール (TAG)、大豆油 TAG、サケ卵ホスファチジルコリン(PC)は、各原料から複数の方法を用いて分別・精製した。いずれの試料油にも、トコフェロール、カロテノイド、ポリフェノールなどの抗酸化物質やクロロフィル、酸化物、金属などの酸化促進物質が含まれていないことを確認した。

②酸化実験：各脂質 20mg をバイアル瓶に入れブチルセプタムゴムおよびアルミシールバイアルで栓をし、37℃、暗所にてインキュベートした。バイアル瓶中の脂質の酸化は、酸化に伴うバイアル瓶上部空気中の酸素の減少速度、過酸化物の増大および高度不飽和脂肪酸(PUFA)の減少速度などにより比較した。

## 5 ）ビートトップ脂質素材の開発

BT-EtOH には特徴的な機能性のあることを本事業で明らかにできた。しかし、BT-EtOH にはクロロフィルが含まれているため、素材の色は暗褐色となり、食品素材への応用が難しい。また、クロロフィルは油脂の安定性に悪影響を及ぼす。そこで、ビートトップからのクロロフィルの除去法について検討した。

①吸着剤を用いたクロロフィルの除去: 活性炭や合成吸着剤(ダイヤイオン HP-20)などの各吸着剤をカラムに充填し、BT-EtOH をこのカラムで処理した。得られた処理物中のクロロフィル a、クロロフィル b、クロロフィル c の含量を、400～800nm での吸光値を測定することにより定量した。また、処理物中のカロテノイド含量を HPLC により定量した。

②濾過助剤を用いたクロロフィルの除去：図2.1に示したように、まず水を50%以上含むBT-EtOHを濾過助剤で処理する（バッチ式）。同じ操作をさらに2回行った後、次に100%のエタノールで抽出後、濾液を活性炭で処理した。
図 2.1 ビートトップ油素材の製造工程

### 2.3 研究結果および考察

## 1 ）BT-EtOH に含まれる栄養成分の特徴

ビートトップを始め各種野菜の葉部からは6〜10%のエタノール抽出物が得られた。これらの抽出物について、さらに、クロロホルム/メタノールを用いて脂質を分離し、重量を測定したところ、エタノール抽出物の80%以上が脂質であることが明らかになった。通常、油糧種子中の脂質含量は25%以上であり、こうした場合に比べれば陸上植物葉部の脂質含量は少ないとはいえ、他の植物性食品（きのこ類：1%以下、果実類：1%以下、大豆以外の豆類：2.5%以下）と比べ、葉部の脂質含量は決して少ない量ではなかった。また、陸上植物葉部中の主な脂質クラスはグリセロ糖脂質(GL)であり、油糧種子や動物性油脂素材のように、中性脂肪(TAG)が脂質の主体ではなかった。これは光合成に必須となる薬緑体チラコイド膜中の脂質の約90%がGLであるためによる。なお、ビートの茎や実野菜（シントウやササゲ）からのエタノール抽出物含量は葉部のそれと比較して少なかった。

薬物野菜の脂質中の脂肪酸について分析したところ（表2.1）、主な構成成分はオメガ3系高度不飽和脂肪酸(PUFA)（メチル末端から数えて3番目に最初の二重結合を含む脂肪酸のこと）に属するα-リノレン酸(18:3n-3)であった。一方、ピーマン（実）やアスパラガス（茎＋蕾）では、リノール酸(18:2n-6)含量の方が、α-リノレン酸含量よりも高かった。これまでに、オメガ3系PUFAの摂取が特定の疾患予防と密接な関係のあることが、様々な疫学調査やヒト介入試験などで明らかにされている $ ^{8} $ 。オメガ3系PUFAの生理作用は、動物実験などを用いて科学的な検証が行われ、特に、心筋梗塞などの冠動脈疾患の予防効果についてはその有用性が確認されている。したがって、BT-EtOH中のオメガ3系のα-リノレン酸含量の高さは、この抽出物を機能性栄養素材として用いる際の大きな利点といえる。

表2.2にビートトップと各種野菜のエタノール抽出物中のカロテノイド含量を示した。ビートトップや薬物野菜に見られるように、陸上植物の薬部の主なカロテノドはルテイン、ネオキサンチン、ビオラキサンチンであった。一方、実（シシトウ、ササゲ）、蕾（ブロッコリー）中のカロテノイド含量は低く、
表 2.1 ビートトップおよび各種野菜可食部から得たエタノール抽出物中の主要脂肪酸組成

誌料名	脂肪酸（重量%）
16:0	18:0	18:1n-9	18:2n-6	18:3n-3
ビートトップ	13.3	0.8	2.5	9.3	64.6
小松菜	10.5	1.3	0.6	4.3	52.5
水菜	12.1	1.3	0.8	5.5	50.8
大葉	12.4	1.3	1.6	9.1	52.3
バジル	13.0	1.7	1.9	10.4	56.8
ミツバ	10.5	0.5	1.4	18.7	35.0
パセリ	11.8	0.8	0.6	0.6	30.5
シュンギク	8.2	0.4	0.3	7.9	68.3
ニラ	17.6	1.3	0.8	23.2	48.6
長ネギ	13.8	1.5	1.9	26.0	47.2
ピーマン	16.2	4.3	1.7	46.2	22.9
ササゲ	17.1	3.3	1.9	20.0	49.5
アスパラガス	23.1	1.3	1.1	51.5	16.4

表 2.2 ビートトップおよび各種野菜可食部のカロテノイド含量（μg/g 抽出物）

試料名	9'-シス-ネオキサンチン	ビオラキサンチン
ビートトップ	1320.0	400.0
小松菜	2048.6	679.0
水菜	1917.9	430.1
大葉	2191.7	842.8
バジル	1461.3	331.5
ミツバ	2543.3	623.9
パセリ	1425.2	352.0
シュンギク	1748.7	462.0
ニラ	1167.2	157.0
長ネギ	1225.2	201.4
シントウ	193.1	47.9
ササゲ	107.1	未検出
ブロッコリー	105.0	4.2

特に、ネオキサンチンとビオラキサンチンの含量の低さがピーマン、ササゲやブロッコリーなどで際立っていた。これは、ルテインやネオキサンチンの主な役割が光合成の補助色素であり、これらのカロテノイドは主として葉緑体に存在しているが、実や蕾は光合成を行う器官ではないためにこれらのカロテノイドが少なかったためと考えられる。

BT-EtOHに含まれるカロテノイドとして含量の最も多いルテインの栄養学的な意義としては、網膜に対する酸化ストレスからの防御が良く知られている $ ^{9} $ 。ただ、次に多いネオキサンチンについては、その生理作用はこれまでほとんど研究がなされていない。しかし、類似の構造を有する褐藻由来のカロテノイド、フコキサンチンが独特の分子機構に基づく抗肥満作用や血糖値低下作用を示す $ ^{10} $ ことから、ネオキサンチンの機能性にも興味が持たれる。

以上、ビートトップが脂質素材原料として活用できること、そのエタノール抽出物の特徴として、オメガ3PUFAに富むこと、主なカロテノイドとしてルテインやネオキサンチンを含むことが明らかになった。オメガ3PUFAは脂質代謝改善作用を有することが知られている。また、ネオキサンチンについてはin vitro系の実験ではあるが、脂肪細胞における脂肪蓄積の抑制作用が見出されている $ ^{11} $ 。そこで、次に、BT-EtOHを肥満/糖尿病病態マウスに投与した場合の栄養機能について検討した。

## 2 ）BT-EtOHの肥満/糖尿病病態マウス(KK-A)に対する効果

肥満/Ⅱ型糖尿病・肥満モデルマウス（KK-A $ ^{y} $ マウス）に BT-EtOH を 4% 投与した場合について種々の検討を行った。総摂餌量は BT-EtOH 投与群の方がコントロール群よりも高かったにもかかわらず、体重は BT-EtOH 投与群で若干低下傾向を示した。また、内臓白色脂肪組織(WAT)重量も BT-EtOH 投与群で、コントロール群と比較して低下傾向を示した（図 2.2(A)）。一方、筋肉重量はビートトップ脂質投与で、コントロール群と比較して有意に増加した（図 2.2(B)）。こうしたことからビートトップ脂質中には、肥満病態マウスに対して、脂肪減少効果を示す成分の含まれている可能性が考えられた。

一方、血中脂質には BT-EtOH 投与群とコントロール群とで大きな違いは見られなかったが、血糖値（図2.2(C)）とインスリンが、BT-EtOH 投与群でコントロールと比較して低下傾向を示した。また、肝臓について分析したところ、肝臓重量には BT-EtOH 投与群とコントロール群で違いがなかったにもかかわらず、肝臓中
の脂質含量は、ビートトップ脂質投与群でコントロール群に比べて低下傾向を示した（図2.3(A)）。これに伴い、肝臓中のトリアシルグリセロール(TAG)（図2.3(B)）とコレステロール含量（図2.3(C)）が低下し、特にコレステロール含量には有意な低下が見られた。

BT-EtOH 中の脂肪酸の主要構成成分は、α-リノレン酸(18:3n-3)であったため(表2.1)、BT-EtOH を添加した餌脂質中のα-リノレン酸含量はコントロールの約1.7倍となった（表2.3）。その結果、BT-EtOH を4%投与した動物の肝臓脂質においても変化が見られ、BT-EtOH 投与群でコントロール群に比べ、オメガ3系PUFAのα-リノレン酸(18:3n-3)、EPA(20:5n-3)、DHA(22:6n-3)の有意な増大が見られた（表2.4）。BT-EtOH を投与したマウス肝臓脂質中のα-リノレン酸の増加は餌中に含まれるα-リノレン酸の影響を受けたものと考えられる。また、DHAの有意な増加は、α-リノレン酸からの生体内変換反応に起因していると考えられた。

以上のように、BT-EtOH を肥満/糖尿病病態マウスに投与すると、脂質代謝の改善と糖代謝の改善傾向が見られた。また、肝臓中の DHA 含量の有意な増大も見られ、BT-EtOH はオメガ 3PUFA の優れた供給源であることも分かった。

図 2.2 コントロール群と BT-EtOH 投与群の内蔵 WAT 重量 (A)、筋肉重量 (B)、血中グルコース含量 (C) *コントロールと比較して有意差あり。(P<0.05)

図 2.3 コントロール群と BT-EtOH 投与群の肝臓脂肪 (A)、TAG (B)、コレステロール含量 (C) **コントロールと比較して有意差あり。(P<0.01)
表 2.3 飼料脂質の脂肪酸組成

脂肪酸 (wt%)	コントロール	BT-EtOH
16:0	9.91	11.12
18:0	4.06	3.67
18:1n-9	22.85	22.47
18:2n-6	52.23	48.02
18:3n-3	6.81	11.74

表 2.4 マウス肝臓脂質の主な脂肪酸組成

脂肪酸 (wt%)	コントロール	BT-EtOH
16:0	18.22±2.20	20.32±0.87
18:0	8.65±1.67	11.68±1.92
18:1n-9	19.06±2.61	14.53±2.62
18:2n-6	32.28±5.64	27.92±2.85
18:3n-3	1.60±0.50	2.49±0.57 $ ^{*} $
20:4n-6	7.23±1.62	8.49±1.51
20:5n-3	0.38±0.08	0.60±0.06 $ ^{**} $
22:6n-3	4.48±0.41	6.52±1.13 $ ^{**} $

*,**コントロールと比較して有意差あり。(*P<0.05, **P<0.01)

## 3 ）ネオキサンチンの効果

ネオキサンチンは、ビートトップのような植物薬部に特徴的に含まれているカロテノイドである。ネオキサンチンの栄養機能性についての報告例はこれまでにないが、構造的に褐藻カロテノイド、フコキサンチンと似ていること、フコキサンチンには抗肥満効果と抗糖尿病効果がこれまでに認められていることなどから $ ^{10} $ 、ネオキサンチンにもこうした作用があり、これが、本事業で見出されたBT-EtOHの栄養機能性に影響を及ぼしている可能性が考えられた。そこで、ネオキサンチンを分別し、その機能性について検討した。

ネオキサンチン濃縮物を用いて動物実験を行ったところ、ネオキサンチンにはフコキサンチンと同等の抗肥満効果および抗糖尿病作用が見られた。すなわち、肥満・糖尿病病態マウスにネオキサンチンを投与すると、体重増加が抑制され、その抑制度合いは内臓WATの有意な低下（図2.4(A)）と一致した。また、実験飼料投与後19日（図2.4(B)）と29日後（図2.4(C)）の血糖値も、ネオキサンチン投与によりコントロールと比較して有意な低下が見られ、ネオキサンチン投与で糖尿病の病態が改善されることが示された。

図 2.4 ネオキサンチン投与の内臓 WAT 重量 (A)、19 日飼育後 (B) と 29 日飼育後 (C) の血中グルコース濃度に及ぼす影響

*, ***コントロールと比較して有意差あり。(*P<0.05, **P<0.001)
KK-A^{y} のような肥満マウスでは、内臓 WAT から過剰な遊離脂肪酸が血中に分泌され、様々な悪影響を生体に及ぼす。しかし、ネオキサンチン投与により、血中の遊離脂肪酸と中性脂肪(TAG)の顕著な減少も見られた（図 2.5）。こうした効果は褐藻由来カロテノイドのフコキサンチンにはなく、ネオキサンチン独特の作用といえた。

図 2.5 ネオキサンチン投与の血清 TAG 濃度 (A) と血清遊離脂肪酸濃度 (B) に及ぼす影響 ***コントロールと比較して有意差あり。(P<0.001)

ネオキサンチンの抗肥満作用と血糖値改善作用は、コントロール群とネオキサンチン群のエネルギー摂取量を厳密に同等とした制限食においても見られた。図2.6に示したように、ネオキサンチンを肥満・糖尿病病態マウスに投与し、エネルギーを一定量とした場合にも、内臓WAT重量の減少傾向、血糖値と血中TAG（中性脂肪）の有意な減少が確認できた。制限食としたため、コントロール群の血糖値(B)は飼育と共に減少したが、ネオキサンチン投与群では7日目から低値を示した。

図 2.6 制限食下における肥満・病態マウスに対するネオキサンチン投与の内蔵 WAT 重量(A)、血糖値(B)、血清 TAG 含量に及ぼす影響

*コントロールと比較して有意差あり。(P<0.05)

さらに、ネオキサンチンの脂質・糖代謝改善作用の分子機構を知るために、主として脂質・糖代謝の主要器官
である肝臓と骨格筋中の関連遺伝子の発現について検討したところ（図 2.7）、肝臓での糖新生の抑制と骨格筋における糖代謝の促進がネオキサンチンにより遺伝子レベルで制御されていることが示された。

図 2.7 制限食下における肥満・病態マウスに対するネオキサンチン投与の肝臓での Glucose-6-Phosohatase 遺伝子発現(A)と骨格筋でのインスリンレセプター基質の遺伝子発現(B)に及ぼす影響*コントロールと比較して有意差あり。(P<0.05)

## 4 ）BT-EtOH に含まれるグリセロ糖脂質の酸化安定性

BT-EtOH 脂質の主な構成成分である GL には酸化されやすい 18:3n-3（α-リノレン酸）や 16:3n-3 が多く（表 2.5）、酸化安定性の目安となるビスアリル位数（この値が高いほど酸化安定性が低くなる）から判断すると、BT-EtOH 中の脂質は極めて酸化されやすいと考えられる。酸化により脂質の栄養機能性は失われるばかりか毒性成分が生成し、風味の劣化も引き起こされるため、脂質の酸化はその利用を図る上で大きな問題点といえる。一方、BT-EtOH を実験室で取り扱った経験からは、特別な酸化防止策を講じなくても、BT-EtOH は常温で極めて酸化されにくいことが推測できた。もし、BT-EtOH が、何らかの理由で高い酸化安定性を示すことを実験的に証明できれば、BT-EtOH を活用する上で大きな利点といえる。そこで、BT-EtOH の主要クラスであり、酸化されやすいオメガ 3PUFA が多く存在するグリセロ糖脂質(GL)の酸化安定性について、他の脂質（表 2.5）と比較した。表 2.5 示したビスアリル位数から、試験に供した脂質の中では、サケ卵 PC が最

表 2.5 酸化実験に用いた各種脂質の高度不飽和脂肪酸組成

脂肪酸(重量%)	大豆油TAG $ ^{a} $	イワシ油TAG $ ^{a} $	サケ卵PC $ ^{a} $	ビートトップGL $ ^{a} $	コンブGL $ ^{a} $
16:3n-3	ND	ND	1.3	12.2	ND
18:2n-6	46.2	1.5	2.0	7.0	7.8
18:3n-3	3.2	0.7	ND	69.0	2.9
18:3n-6	ND	ND	ND	ND	8.1
18:4n-3	ND	2.0	0.1	ND	18.0
20:4n-6	ND	1.6	1.9	ND	7.8
20:5n-3	ND	19.5	10.3	ND	12.8
22:6n-3	ND	12.3	29.4	ND	ND
ビスアリル位数
1分子あたり:	0.55	1.71	2.11	1.83	1.60

$ ^{a} $ TAG, トリアシルグリセロール; PC, ホスファチジルコリン; GL, グリセロ糖脂質

も酸化されやすく、ついで、ビートトップ GL、イワシ油 TAG、コンブ GL、大豆油 TAG の順となると推測された。実際、図 2.8 に示したように、サケ卵 PC とイワシ TAG では、一定温度でインキュベートすること
により、反応容器上部の酸素は脂質との反応により時間とともに直線的に減少し（図2.8(A)）、また、含まれる総PUFA含量も酸化劣化を受けたため明らかに減少した（図2.8(B)）。これに対して、ビスアリル位数の低い大豆油TAGでは、この酸化条件では比較的安定であり、酸化に伴う酸素やPUFAの減少はほとんど起こらなかった。一方、ビートトップGLとコンブGLでは、ビスアリル位数が高いにもかかわらず、酸化安定性に優れており、大豆油TAGと同様に、酸素やPUFAの減少はなかった。これらの結果は、GLが分子構造的にTAGやPCよりも酸化安定性が高い構造をとることを示唆しており、GLを主要構成成分とするビートトップ脂質は、酸化されやすいオメガ3系の18:3n-3（α-リノレン酸）や16:3n-3を多く含むにもかかわらず、酸化劣化を受けにくいことが初めて明らかになった。

図 2.8 酸素吸収速度(A)と総PUFA含量の測定(B)による各種脂質の酸化安定性の分析

## 5 ）ビートトップ脂質素材の開発

以上のように、BT-EtOH には脂質代謝改善作用などの機能性があり、また、オメガ 3PUFA の供給源としても活用できることが分かった。オメガ 3PUFA を含む油脂としては、魚油やアマニ油などが知られている。しかし、これらの油脂は極めて酸化安定性が低く、サプリメントのようにカプセル化して用いることはできても、食用油として利用することは難しい。一方、BT-EtOH の場合には、オメガ 3PUFA が主としてグリセロ糖脂質として存在することで、酸化安定性が格段に高くなり、一般の食用油として利用できることも本事業で明らかになった。ただ、BT-EtOH はクロロフィルを含むために暗褐色をしており、食用油としてそのまま利用しにくいため、クロロフィルの除去を試みた。

まず、活性炭や合成吸着剤(ダイヤイオン HP-20)などを充填したカラムを用いた BT-EtOH からのクロロフィル除去法について検討したところ、クロロフィルは吸着除去できたが、同時にネオキサンチンや糖脂質などの極性の高い機能性脂質も一部除去されてしまうことが明らかになった。そこで、次に、珪藻土を主体とした濾過助剤を用いた精製を検討した。この場合、エタノールを比較的自由に使用できるという本事業の利点に着目し、濾過助剤の濾過性ではなく、その適度な吸着能力を活用した精製法を開発した。すなわち、本事業で開発した方法（図2.1）では、まず水を50%以上含む BT-EtOH を濾過助剤で処理する（バッチ式）。こうすることで、脂溶性成分は水を多く含む濾液に移行せず、濾過助剤にそのほとんどが吸着されることが分かった。一方、濾液には水溶性成分が移行し、これらの不純物を除去することができた。同じ操作をさらに2回行った後、次に100%のエタノールで処理することで、ネオキサンチンを始め、糖脂質などの脂質成分を溶液
中に回収できた。しかし、クロロフィルなどはその高い極性のために、濾過助剤に吸着された状態で残渣に残っていた。以上の操作により、クロロフィルなどの不純物は除去され、必要な機能性脂質成分のみを濃縮する方法を開発できた。濾過助剤は食品工業を始め工業的に広く用いられており、ビートトップ脂質素材の工業的な生産に応用できると考えられる。

### 2.4 結論

本事業では、ビートトップが機能性脂質素材原料として活用できること、そのエタノール抽出物（BT-EtOH）の特徴としてオメガ3PUFAが多いこと、ルテインやネオキサンチンなどのカロテノイドが含まれていることを明らかにした。BT-EtOHは、肥満/糖尿病病態マウスに対する脂質・糖代謝改善作用や、肝臓中のDHA含量の増大効果を示し、これらの作用が、含まれるネオキサンチンなどのカロテノイドやオメガ3PUFAに起因することも明らかにした。特に、植物の薬に特徴的に含まれるカロテノイド、ネオキサンチンの機能性とその分子機構の一端を解明し、ネオキサンチンがBT-EtOHの栄養機能性を特徴づける重要な機能性成分であることを示した。また、BT-EtOHにはオメガ3PUFAが主要構成成分として含まれているが、これらのPUFAが主としてグロセロ糖脂質(GL)として存在するために、酸化安定性が格段に高くなることを見出し、BT-EtOHが酸化されやすいオメガ3PUFAを多く含むにもかかわらず、安定性の高い機能性脂質素材として活用できることを示した。さらに、BT-EtOHに含まれるクロロフィルなどの不純物の除去法を確立し、ビートトップからの工業的な機能性脂質素材の製造法を確立した。

以上より、本事業で得られるエタノールを利用し、ビートトップから機能性素材を効率的に生産できることが分かった。得られる素材は、脂質代謝制御作用を示す他、オメガ3PUFAの新たな供給源となるため、市場価値は高く、こうした素材の製造工程を本事業でのエタノール製造システムに組み込むことで、本事業で目的とする農業廃棄物からのエタノール製造のコストダウンが期待できた。

### 2.5 参考論文

1) Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Biophysiol., 37, 911-917 (1959).

2) Terasaki, M., Narayan, B., Kamogawa, H., Nomura, M., Nimish Mol Stephen, N.M., Kawagoe, C., Hosokawa, M., and Miyashita, K. Carotenoid profile of edible Japanese seaweeds: an improved HPLC method for separation of major carotenoids. J. Auat. Food Prod. Tech., 21, 468-479 (2012).

3) Prevot, A.F., Mordret, F.X. Utilisation des colonnes capillaries de verre pour l’analyse des corps gras par chromatographie en phase gazeuse. Rev. Fse. Corps. Gras., 23, 409-423 (1976).

4) Reeves, P.G., Nielsen, F.H., Fahey, G.C. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition and Hoc Writing Committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J. Phycol., 123, 1939-1951 (1993).

5) Hosokawa, M., Miyashita, T., Nishikawa, S., Emi, S., Tsukui, T., Beppu, F., Okada, T., Miyashita, K. Fucoxanthin regulates adipocytokine mRNA expression in white adipose tissue of diabetic/obese KK-Ay mice. Arch. Biochem. Biophys., 504, 17-25 (2010).

6) Folch J., Lees M., Stanley G.H.S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
7) Maeda, H., Hosokawa, M., Sashima, T., Miyashita, K. Dietary combination of fucoxanthin and fish oil attenuates the weight gain of white adipose tissue and decreases blood glucose in obese/diabetic KK- $ A^{y} $ mice. J. Agric. Biol. Chem. 55, 7701-7706 (2007).

8) 宮下和夫. 脂肪酸およびカロテノイド. 「マリンバイオテクノロジーの新潮流」(伏谷伸宏監修), シーエムシー出版, 東京. pp. 109-128 (2011).

10) Miyashita, K., Nishikawa, S., Beppu, F., Tsukui, T., Abe, M., Hosokawa, M. Allenic carotenoid, fucoxanthin, as a novel marine nutraceutical from brown seaweed. J. Sci. Food Agric., 91, 1166-1174 (2011).

9) Ma, L., Lin, X.-M. Effects of lutein and zeaxanthin on aspects of eye health. J. Sci. Food Agric. 90, 2-12 (2010).

11) Okada, T., Nakai, M., Maeda, H., Hosokawa, M., Sashima, T., Miyashita, K. Suppressive effect of neoxanthin on the differentiation of 3T3-L1 adipose cells. J. Oleo Sci., 57, 345-351 (2008).
## 3 原料の前処理

### 3.1 研究目的

バイオエタノールの原料はサトウキビやビートなどから生産される糖類、米や麦などのでんぷん類、稲わらやコーンストーバーなどのセルロース類である。バイオエタノールは主にグルコースなどの糖類を酵母やバクテリアなどの発酵作用によって生産されるが、セルロースやでんぷんなどからバイオエタノールを生産する際には、原料を酵母などが代謝しやすい単糖類に予め変換する必要がある。でんぷん類は蒸煮処理後、アミラーゼなどの酵素によって比較的短時間に糖に変換することが容易であるが、セルロースは水素結合による強固な結晶構造を有しており、でんぷん類に比べて糖への変換が容易ではない。

以上のことから、セルロース系バイオマスをバイオエタノール生産の原料として利用する際には、何らかの前処理が必要となる。現在、前処理方法としては濃硫酸法、希硫酸法、アルカリ蒸解・酵素糖化法、湿热メカノケミカル粉砕・酵素糖化法など $ ^{1)} $ が検討されているが、どの方法も一長一短があり決め手を欠いているのが現状である。

筆者らは、前処理方法として構造、制御が簡便で微粉砕工程が必要のない蒸煮・爆砕方法を中心として、アルカリ処理を組み合わせた方法について、過年度より検討を加え、数種の草本類について高い糖化効率の得られる処理条件を見いだしてきた。

本研究では、上記の成果を踏まえ、以下の項目について検討を加え、さらに前処理の高効率化を図ることを目的とする。

①原料特性の解明

②前処理条件の最適化

③蒸煮・爆砕処理の連続処理装置の開発

### 3.2 研究方法

## （1） 原料特性の解明

## 1 ）試料調製および原料分析

農産廃棄物として地方独立行政法人北海道立総合研究機構農業技術研究本部十勝農業試験場の圃場から採取されたビートトップ（葉部＋茎部）（以後ビート茎葉部と称する）、ビートトップ（根部）（以後ビートクラウンと称する）、麦桿、ジャガイモ地上部、大豆殻、小豆殻、長いも茎を対象とした。なお、ビートトップについては9月および10月の2回サンプリングを行った。

ビートトップは当場に到着後、冷凍室で保存した。その他の試料については水分が10%台であったため、そのまま常温で保存した。

ビートトップ以外の水分の少ない試料はφ5mmスクリーンのカッターミルで一次粉砕し、さらにφ2mmスクリーンとして二次粉砕した。粉砕された試料をふるいで20～80メッシュに分級したものを供試試料とした。

ビートトップは解凍、洗浄後、70℃で衡量になるまで乾燥した。ビートトップの一部は薬部＋茎部と根部に切り分けて乾燥前後の重量を測定し、水分およびビート茎葉部とビートクラウンの重量比を計算した。乾燥した試料の粉砕、分級については、上記の粉砕方法と同様とした。

これらの原材料について特性を把握するため、固形分はNREL/TP-510-42621 $ ^{2)} $ 、水・アルコール抽出物質はNREL/TP-510-42619 $ ^{3)} $ 、炭化水素およびリグニンはNREL/TP-510-42618 $ ^{4)} $ 、灰分はNREL/TP-510-42622 $ ^{5)} $ 、