Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
課題名 B-0912 化学センシングナノ粒子創製による簡易型オールプリント水質検査チップの開発

課題代表者名 チッテリオ ダニエル （慶應義塾大学理工学部応用化学科）

研究实施期间 平成21～23年度

累計予算額 81,200千円（うち23年度 26,100千円）

予算額は、間接経費を含む。

## 研究体制

(1) 化学センシングナノ粒子創製による簡易型オールプリント水質検査チップの開発（慶應義塾大学）

### 1. はじめに（研究背景等）

水は人間の生活にとって最も重要であり、身近な資源である。そのため、水資源の汚染を抑制し防止することは、環境の改善のための重要な鍵となる。農業用水や飲料水に使われる水の汚染は、人間の健康に重大な影響を与える。このような背景から、水の質と安全性をモニタリングすることは極めて重要である。先進工業国では、水質汚染に伴うリスクが調査されており、汚染の防止や排水の浄化といった対応策が実施されている。水質分析のための高度な研究室レベルの方法が利用できるようになってきており、日々の水質検査に使われている。しかしながら、発展途上国では全く異なる状況に直面している。水質汚染に伴うリスクは知られているが、その防止策に関連する技術や財源が一般化されていない。その結果、世界人口の約61億人の中で、10億人がきれいな水を飲めず、明らかに人間の健康に悪影響を及ぼしている。

これまで利用されてきた高度な水質分析法の多くは、空調を含めた長期の分析試薬の管理や冷蔵保存が必要な試薬の供給、高度にトレーニングされた人材などを必要としていた。このような水質分析法は発展途上国では利用しにくく、特に水の安全性の検査が重要となる現場では利用が難しい。そのため、それらの分析法を簡易化する必要がある。発展途上国では、扱いやすさや測定時間の短さ、安全性と携帯性、そして特にデバイスと試薬の低価格化といった、分析技術の「経済性（安価）・简便性」が必要である。

本研究ではこれらの課題を実現するため、紙ベースのマイクロ流体デバイスとしての水質センシングチップを、インクジェットプリント技術を用いて開発することが目的である。水サンプルを分析するマイクロ流体デバイスは小型化や複雑な機能の融合を可能にし、高度な水分析ツールを発展途上国に提供できる。

## 2 ．研究開発目的

本研究の目的はグローバルに使用可能なペーパーベースの水質センシングチップ(オールプリントケミカル(もしくはバイオ)センサーデバイス)を、インクジェットプリント技術を用いて開発することである。その概要を図1に示す。インクジェットプリント技術の利点と低コスト紙基板の使用により、作製されるセンサーは発展途上国のみならず、先進国における一般家庭などでも利用可能である。このセンサーの実現により、安価かつ簡便迅速に水サンプルの多項目同時定量をすることができる。作製されるセンサーは、色変化あるいは発色を判定するものであり、目視あるいは安価なカラーアナライザーでの定量が可能である。

この研究においては、ケミカルセンシングあるいはバイオセンシングを行うために、インクジェットプリンタを用いて紙基板上に印刷可能なセンシングインクの開発が重要である。コアシェル型のポリマーナノ粒子や、ヘア鎖を表面に有するナノ粒子などをベースとし、それらにセンシング機能試薬を固定化して、ナノ粒子状のセンシングインクとして使用する。開発したそれぞれのセンシングインクを基板上にインクジェットプリンタにより印刷し、固定化することでセンサーデバイスを作製する。このデバイスでは、あらかじめ分析に必要な化学物質を全て紙基板に印刷し、固定化することで追加試薬を加えることなく、試料を滴下するだけで簡便に分析を行うことができる。
具体的には以下の３項目の研究から、ペーパーベースの水質センシングチップの完成を目指した。

（１）ポリマーナノ粒子を用いた化学的および生化学的に応答するインクジェットプリント用センシングインクの開発：

環境検査における水質分析のためのオプティカルケミカルセンシング機能物質のキャリアーとなるポリマー粒子の開発、合成および最適化を行う。また、環境検査に関連する項目分析のための、化学的および生化学的に応答するさまざまなポリマーナノ粒子ベースのインク開発を行う。

（２）水質多検体モニタリングのための “オールインクジェットプリント技術による” ケミカルセンシングペーパーの作製：多項目の水質検査を定量的に行える、インクジェットプリント技術を用いたマイクロ流体ケミカルセンシングペーパーの作製を行う。この場合、紫外線硬化樹脂をインクとして利用することにより、紙基板上にさまざまなマイクロ流路パターンを作製し、さらにセンシングインクを流路内の最適な部分

にプリントすることで、センサー

デバイスを作製する。

（３）環境検査のための安価な水質検査トータルシステムの開発：水質検査項目に従った多項目同時定量が可能なマルチセンシングチップを作製する。これにより、安価かつ簡便、迅速な測定が可能な紙基板水質センシングチップを作製する。また、センサー応答の定量性の確保のため、色情報分析法としてのデジタルカラーアナリシスの適応化と最適化の検討を行い、安価かつ高性能な定量分析システムを構築する。

## 3 ．研究開発の方法

（１）ポリマーナノ粒子を用いた化学的および生化学的に応答するインクジェットプリント用センシングインクの開発

1）pHセンシングインクの作製（コア・シェルナノ粒子）

pHセンシングが可能なインク材料として、ポリスチレンコアとポリビニルピロリドンシェルを持つコアシェル粒子にブロモチモールブルー、チモールブルー、メチルレッドをそれぞれ別々に内包させたポリマーナノ粒子を開発した。その際、ブロモチモールブルーとチモールブルーは、アルキル鎖をつけることによって疎水性を大きくし、ポリビニルピロリドンのシェル内に内包させた。また、メチルレッドはそのままシェルに内包させて、ナノ粒子インクを作製した。

2）亜硝酸イオン(NO_{2}^{-})センシングインクの作製（コア・シェルナノ粒子、ヘアナノ粒子）

NO_{2}^{-}センシングが可能なインク材料として、ポリスチレンコアとポリビニルピロリドンシェルを持つポリマーナノ粒子とヘアナノ粒子から成る二種のセンシングインクを開発した。ヘアナノ粒子は、表面にヘア（髪）のような糸状構造を持つ。このようなセンシングインクを用いることで、検査試薬の安定性の向上やセンシングエリアの色ムラの改善、使用するインク量の減量などが行える。

3）マルチャンシングインクの作製（イオン交換型コア・シェルナノ粒子）

イオン交換法を利用することで、様々な色素の固定化が可能な汎用性の高いナノ粒子インクを開発した。ポリスチレンコアとポリアミノメチルメタクリレートヒドロクロライドシェルを持つポリマーナノ粒子から成るセンシングインクを開発した。作製された粒子は表面に正電荷を持つため、粒子間に静電斥力が生じ、分散安定性が高いナノ粒子である。また、作製にミニエマルション重合を用いる
と小さい粒径に制御することができる。

## 4 ）鉛イオンセンシングインクの作製（イオン選択性オプトード型コア・シェルナノ粒子）

イオン交換法をベースにしたイオン選択性オプトードの原理を用いたセンシングインクを開発した。検出目的のイオンと結合する試薬と色変化を生じる試薬を別々に選択して使用することが可能である。本研究では、鉛イオン検出用のセンシングインクを開発した。

## (2) 水質多検体モニタリングのための“オールインクジェットプリント技術による”ケミカルセンシングペーパーの作製

## 1 ）インクジェット技術を用いた亜硝酸イオンセンシングペーパーおよびラテラルフローイムノセンシングペーパーの作製法の開発

紙基盤上でのマイクロ流路の作製法を利用し、亜硝酸イオンセンシングおよびイムノセンシングが同一紙基盤上で行えるセンシングペーパーの開発を行った。ろ紙をポリスチレンートルエン溶液に2時間浸漬し、室温で乾燥した。得られた疎水性のポリスチレン包括ペーパーにインクジェットプリンタからトルエンを吐出することで、親水性のパターンを作製した。1スポットにつき10回トルエン液滴を、150マイクロメートルのスポット間隔を置いて吐出することで、疎水性ペーパーのポリスチレンを除々に溶解・除去し、本来のろ紙としての親水性部位を、トルエンを印刷した部分だけに露出させてパターンニングした。このようにして、マイクロ流路、反応部位、センシングエリアをそれぞれパターンニングした。

インクジェット技術を用いたラテラルフローイムノセンシングペーパーの作製法では、ろ紙に親水性パターンを作製する方法は上記と同様に行い、異なる点としては、まず、免疫反応のテストラインおよびコントロールラインだけを先に作製した。次に、その2つのライン上に、イムノセンシングインクを印刷した。その後、すべてのマイクロ流路をトルエンの印刷により完成させた。完成したマイクロ流路を含むろ紙をアルブミン（BSA）溶液（溶媒はリン酸バッファー）に1時間浸漬することで、ブロッキングを行った。最後に、金ナノ粒子でラベル化したヒトIgG抗体を用いて、作製した流路上のコンジュゲートエリアに抗体をスポットした。このヒトIgGイムノセンサーには、ヒトIgG（コントロールライン）、ヒトIgG抗体（テストライン）、金ナノ粒子でラベル化したヒトIgG抗体（コンジュゲートエリア）をインクとして用いて作製した。

## 2 ）UVインクを利用したインクジェットプリント技術によるマイクロ流路の作製法の開発

上記１）のセンシングペーパーの作製法には揮発性有機化合物であるトルエンが使われており、環境に対して課題があった。そこで、揮発性有機溶媒を用いない環境に優しい流路の作製法（ＵＶインクによる流路の作製法）を考案した。

U V 照射によって重合し、疎水性のバリアを形成できるインク（U V インク）を開発した。開発した U V インクは、疎水性のモノマーと光重合開始剤から構成されるインクである。その構成は、モノマーとしては、アクリル酸オクタデシルと1,10-デカンジオールジアクリレートの混合物を用い、開始剤としてはベンジルジメチルケタールを使用した。このU V インクをろ紙上にインクジェットプリンタにより印刷し、その後U V ランプを照射することでモノマーを重合させる。これにより、疎水性のバリアを形成させ、流路を作製した。

## 3 ）鉛センシングペーパー作製法の開発

上記２）の方法とイオンオプトード型センシングインクを用いて、マイクロ流路をもつ鉛センシングペーパーチップを開発した。インクジェットプリンタを用いてセンシングインクを流路中央付近に線状にプリントし、鉛イオンセンシングチップペーパーを作製した。このセンシングペーパーの性能は、pH 5.2に調整した濃度の異なる鉛試料20マイクロリットルを5回滴下して評価した。

## 4 ）新規蛍光ナノ粒子型ラベル化剤を用いたイムノセンシング技術の開発

高感度なイムノセンシングを実現するために、蛍光ナノ粒子型ラベル化剤を開発した。まず、ポリエチレングリコール鎖を金ナノ粒子表面に修飾した後、テトラエトキシシラン（TEOS）をモノマーとしてシリカシェルを合成した。次にユウロピウムリガンドをアミノ基のついたシラン化剤と結合させ、ユウロピウムイオンを配位させ、ユウロピウム錯体ーシランカップリング剤複合体を得た。その後、これをTEOSと共重合させることで、ユウロピウム錯体内包シリカシェルを合成した。この操作を5回繰
り返すことによって、多量のユウロピウム錯体を固定化した。抗体はナノ粒子表面へ結合させた。この蛍光ラベル化剤の評価は、マウスIgGを測定することにより、一般法である酵素免疫法と比べてセンサーの性能を評価した。

## （３）環境検査のための安価な水質検査トータルシステムの開発

## 1 ）デジタルカラーアナリシスを用いた定量分析法

作製したチップによる半定量測定を目視で行ったほか、より客観的かつ定量的な判定をするためにデジタルカラーアナリシス(DCA)を行った。DCAは、吸光光度分析などの従来の光学的手法に代わる、新しい光学分析手法である。デジタルカラーアナライザーやデジタルカラーメーターを用いることによって色を測定し、色の座標系を用いて数値に変換する。色をデジタル情報として扱うことにより、半定量的な分析しかできなかった比色分析より精度の高い定量測定が可能となる。

## 2 ）イムノケミカルマルチセンシングチップの開発

一つの紙基板上で化学センシングおよび生化学センシングを同時に行えるイムノケミカルセンシングペーパーを開発した。これにより、試料を一度注入するだけで、同時に多項目の検査を行うことができる。ケミカルセンシングの一例としてpHセンシングを、多項目バイオセンシングの一例としてマウスIgGセンシングとヒトIgGセンシングの二種類のセンシングを行った。流路の作製からセンシング試薬の印刷までを、全て同一のインクジェットプリンタで作製した。

## 3 ）多項目水質センシングチップの開発

一つの紙基板上で同時に多項目の化学センシングを行えるマルチセンシングチップを作製した。センシング項目は、 $ Cu^{2+} $ ， $ BO_{3}^{3-} $ ， $ Cd^{2+} $ ， $ Ca^{2+} $ ， $ Pb^{2+} $ ， $ F^{-} $ ，pHの7種類である。チップ中心部から8方向に進む形の流路をインクジェットプリンタにより作製した。その後に7種のイオンに対応した検査試薬を流路エンドに印刷した。使用したセンシング試薬は先に挙げた測定イオン項目の順に、ジンコン、アゾメチン、キシレノールオレンジ、フタレインコンプレキソン、鉛イオノフォア(ETH5418)、アルフソン、ブロモクレゾールパープル・ブロモチモールブルー・クレゾールレッド混合物であり、それぞれの試薬を内包したナノ粒子を調製し、センシングインクとして使用した。

## 4 ）ヒ素センシングペーパーの開発

還元剤である水素化ホウ素ナトリウム(NaBH_{4})の水の還元により水素を発生させ、発生した水素が試料溶液中のヒ素と反応し、水素化ヒ素（アルシンガス、AsH_{3}）を発生させる。AsH_{3}はろ紙に含ませておいた塩化金（Ⅲ）（AuCl_{3}）を還元し、発色する。この原理を用いて、ヒ素を色変化から定量するセンシングペーパーを作製した。

### 4. 結果及び考察

（１）ポリマーナノ粒子を用いた化学的および生化学的に応答するインクジェットプリント用センシングインクの開発

## 1 ）pHセンシングインクの作製（コア・シェルナノ粒子）

pHセンシングが可能なインク材料として、ポリスチレンコアとポリビニルピロリドンシェルを持つコアシェル粒子にブロモチモールブルー、チモールブルー、メチルレッドをそれぞれ別々に内包させたポリマーナノ粒子を作製した。これらの色素をナノ粒子へ含有させるために色素にアルキル鎖を導入し、その効果を確認するために、色素漏れの評価を行った。アルキル化させない場合は溶液に色素漏れが確認された。一方、アルキル鎖を導入して疎水化させたブロモチモールブルーを用いると、ナノ粒子から漏れ出ないことが確認できた。また、同様にアルキル鎖を導入したチモールブルーおよびメチルレッドでも同様な結果を得た。作製した3種類のナノ粒子分散液を混合した結果、緑色になったことを確認した。また、pH変化による変色応答は良好であった。

## 2 ）亜硝酸イオン(NO_{2}^{-})センシングインクの作製（コア・シェルナノ粒子、ヘアナノ粒子）

NO_{2}^{-}センシングが可能なインク材料として、表面にヘア（髪）のような糸状構造を持つヘア粒子が最適であった。得られたヘア粒子の粒子径は約210ナノメートルであり、インクジェットプリンタでの吐出が可能な粒径であった。このコア粒子は粒子表面に官能基を導入し、粒子表面を反応場として使用
するため、本来であれば清浄な表面を有する粒子を作製することが望ましい。しかし、インクジェットプリンタでの吐出を考慮し、必要最小限の界面活性剤を加えることで、小さい粒子径を有し、また表面を反応場として使える粒子を作製した。ヘア粒子表面には、メタクリレート由来のカルボキシル基が存在し、アミノ基を持ったナフチルエチレンジアミン（NEDA）と共有結合させることでヘア鎖にセンシング試薬を固定化させた粒子（SVMN粒子）が作製できた。SVMN粒子は元素分析の結果、反応前後でNEDA由来のN元素の存在比が増加し、NEDAと粒子の結合が確認された。結合された後でも、 $ NO_{2}^{-} $ との反応から生ずるジアゾ色素化合物の生成が確認され、センシングインクが作製された。

## 3 ）マルチャンシングインクの作製（イオン交換型コア・シェルナノ粒子）

ポリスチレンコアとポリアミノメチルメタクリレートヒドロクロライドシェルを持つ約180～300ナノメートルのポリマーナノ粒子センシングインクを開発した。作製された粒子は表面に正電荷を持ち，分散安定性が高い。ジンコン(Zincon)は亜鉛，銅の比色分析試薬であり、酸性溶液中では赤～赤紫色，中性～微アルカリ性で黄～橙黄色となり，強アルカリ性では紫色となる。pH5からpH9の領域で，青色の呈色を確認することで銅の存在を確かめることができる。金属イオンセンシングを行う色素は固定化されるとpKaが変化し，キレート能が低下する場合がある。そのためZinconがナノ粒子に固定化された場合においても，銅への配位能を失わずに，濃度に対応した呈色を示すことを確認する必要がある。その結果、色変化が認められた検量線より求めた検出限界は，48マイクロモル（μM）であった。溶液状態よりは感度が低くなるが、現在販売されているMerck社製鉛検出デバイスMerckoquant®では検出限界が25mg/L=120μMであることから，開発した鉛検出チップは市販の検出キットよりも高感度に鉛を測定できる。開発したナノ粒子インクは、試薬を変えることで、さまざまな物質の検出に使える。

## 4 ）鉛イオンセンシングインクの作製（イオン選択性オプトード型コア・シェルナノ粒子）

イオン交換をベースにしたイオン選択性オプトードの原理を用いたセンシングインクを開発した。インク材料には、ポリスチレンコアとポリビニルピロリドンシェルを持つポリマーナノ粒子を用いたが、エタノールとコアシェル粒子を混ぜるとシェルは膨潤するがコアは膨潤しない。一方テトラヒドロフラン(THF)はシェルもコアも膨潤する。エタノールではシェルのPVPのみが膨潤するため、クロモイオノフォアがシェルのPVPの部位に内包されていた場合、エタノールにクロモイオノフォアは溶け、膨潤して溶け出したクロモイオノフォアによって溶液に色がつくことが予想された。しかし、溶液に色は付かなかった。よって、クロモイオノフォアはコアシェル粒子のコアの部分に内包されていると考えられた。この理由は、本研究で使用した試薬は比較的疎水性が高く、親水性のシェルではなく疎水性のコアの表面付近に内包されたと思われる。

（２）水質多検体モニタリングのための “オールインクジェットプリント技術による” ケミカルセンシングペーパーの作製

1）インクジェット技術を用いた亜硝酸イオンセンシングペーパーおよびラテラルフローイムノセンシングペーパーの作製法の開発

亜硝酸イオンセンシングおよびイムノセンシングが同一紙基盤上で行えるセンシングペーパーの開発を行い、性能を評価した。亜硝酸イオンを含むNaNO_{2}水溶液をサンプルエリアに滴下し、浸透させた。センシングエリアの色変化は目視で10^{-4}Mまで観察できた。色変化はサンプルを滴下して、5分後にスキャナを用いて記録した。その結果、コアシェル粒子に比べ、ヘア粒子の方が、色変化が急激に起こる濃度域が低濃度であり、検出下限が低かった。この原因として、コアシェル粒子と比べ、検査試薬が粒子表面に固定化されているため、色変化が観察されやすい、ということが考えられる。また、ヘア鎖が架橋されておらず、柔軟性を持っているため、検査対象物質が検査試薬に触れ、反応しやすい。WHOのガイドラインによれば、亜硝酸イオンの水質基準は6.5×10^{-5}Mである。即ち、 $ \log\left[NO_{2}^{-}\right] $ が-5から-4で急激に変化しているヘア粒子を用いることで、明確にこの基準を満たすか否かを知ることができる。

また、インクジェット技術を用いたラテラルフローイムノセンシングペーパーを作製し、評価した。0.01-5 mg/Lの濃度（溶媒：PBS(pH=7.4)）のヒトIgGサンプル20・1を用いてサンドウィッチイムノアッセイを行った。ヒトIgGのポジティブサンプルおよびネガティブサンプルを用い、試料を滴下して20分後に得られた色変化を測定した。ポジティブサンプルを用いた場合には、テストラインおよびコントロールラインで色変化が確認された。テストラインにおける色変化は、分析対象であるヒトIgGが金ナ
ノ粒子でラベル化された抗体と結合し、その複合体がサンプルの毛細管現象によりテストラインまで流れたことを意味している。しかし、異なるセンシングペーパーにおいて金ナノ粒子によってラベル化された抗体を均一に流すことはできなかった。そのため、テストラインとコントロールラインの色変化の強度の比をとることで、ヒトIgGの濃度に応じた検量線を作製した。この方法により、誤差の小さい検量線を得ることができた。

## 2 ）UVインクを利用したインクジェットプリント技術によるマイクロ流路の作製法の開発

開発したＵＶインクは、アクリル酸オクタデシルと１,１０-デカンジオールジアクリレートが７:３（重量比）の混合物を用い、開始剤としてはベンジルジメチルケタールをモノマー比１５％で使用した場合が最適であった。このＵＶインクをろ紙上にインクジェットプリンタにより印刷し、その後ＵＶランプを照射することで重合させて疎水性のバリアを両岸にもつ流路を作製した。このＵＶインクで作製した流路に、色素（赤色二号）水溶液を流したところ、漏れや詰まりがなく、水溶液が流れることが確認された。色素溶液は流路内のみを流れ、流路外や裏面には漏れでていない。同様のことが断面図からも確認できた。疎水性バリアが紙の内部まで形成されていた。この方法は、有害な有機溶媒を使用せずに、さまざまなパターンの流路をもつペーパーベースのマイクロ流体チップが作製できるため、特許を出願した。

## 3 ）鉛センシングペーパー作製法の開発

作製した鉛イオンセンシングチップペーパーを評価したところ、DCAのRGB法でのR(Red)値で最も良好な相関を得られたため、色情報のR値を用いて鉛イオンセンシングを行った。R値は濃度に応じて変化し、鉛の検出下限は8.1×10⁻⁶ Mとなった。比較実験として粒子ではなくフィルムを用いた場合の検出下限は1.1×10⁻⁵ Mであり、粒子を用いることで感度が向上することがわかった。これは粒子のほうが鉛試料と接触する面積が大きく、より効率的にイオン交換を行えるためである。また、粒子が流されてしまうことはなかった。この理由として、粒子により色素を固定化する上で、インクの粘度調整にグリセリンではなくエチレングリコールを利用した効果があったと考えられる。エチレングリコールはグリセリンよりも沸点が低く、乾きやすい。そのため、余計な水分などが蒸発し、紙と強い物理吸着したことが考えられる。

## 4 ）新規蛍光ナノ粒子型ラベル化剤を用いたイムノセンシング技術の開発

高感度イムノセンシングを可能にする蛍光ナノ粒子型ラベル化剤を開発し、マウスIgGをモデル抗原として、ラテラルフローイムノアッセイを行った。まずニトロセルロース上にテストラインとして抗マウスIgGを、コントロールラインとしてマウスIgGをインクジェットプリンタを用いて印刷した。その後に吸着用パッド、試料用パッド、そしてラベル化抗体を固定化したコンジュゲートパッドを重ねることによってラテラルフローイムノアッセイ用のデバイスを構築した。マウスIgG抗原を流し、UVランプとデジタルカメラ、フィルタを用いて蛍光シグナルを撮影した。その後、色表現法のひとつであるRGBのうち、R（Red）の値を利用することによって蛍光シグナルの数値化を行ったところ、0.57 ng/mLの検出限界を持つ良好な検量線を得た。

## （３）環境検査のための安価な水質検査トータルシステムの開発

## 1 ）デジタルカラーアナリシスを用いた定量分析法

色情報から定量的な測定を行うためにデジタルカラーアナリシス(DCA)を用いた。DCAは、色を構成する3つの値の三刺激値を基本とする。そのうち、RGB法は色スペクトルの赤、緑、青の三原色の組み合わせによる色を数値化する方法である。光のない状態（Black）にR、G、Bの色光を加えていくと、その割合によりあらゆる色が表現できる。RGB法は三刺激値によって色は3次元直交座標の中の1点で表すことが出来る。しかし、三刺激値が装置の特性に依存してしまうという問題点がある。これを改善するために、定義した均等色空間の一つがCIE 1976 L*a*b*である。ある色と他の色の色差は、L*a*b*座標系から算出できる。本研究では、目視定量のほか、定量精度を上げるために、色情報はRGBまたはL*a*b*の数値を使って算出したところ、定量性は高かった。

## 2 ）イムノケミカルマルチセンシングチップの開発

一つの紙基板上で化学センシングおよび生化学センシングを同時に行えるイムノケミカルセンシングペーパーを開発し、評価した。用いた試料は、ヒトIgGとマウスIgGを共に含むpH6.0とpH9.0の溶液、およびヒトIgGとマウスIgGのどちらかしか含まないpH6.0の溶液の計4種類である。いずれもIgGを含
む場合に限り、明瞭な色が観察された。また、同時に測定されたpHは、pH6.0とpH9.0それぞれに対応する色変化を示した。これにより、一台のインクジェットプリンタで簡便に多項目測定ができる汎用性の高いイムノケミカルマルチセンシングペーパーが作製可能であることを実証した。

## 3 ）多項目水質センシングチップの開発

一つの紙基板上で同時に多項目の化学センシングを行えるマルチセンシングチップを作製し、評価を行った。評価用に滴下した試料は、 $ Cu^{2+} $ ， $ BO_{3}^{3-} $ ， $ Cd^{2+} $ ， $ Ca^{2+} $ ， $ Pb^{2+} $ ， $ F^{-} $ ，pHの7種類に対して、それぞれpH： $ Cu(NO_{3})_{2} $ ：1 mM、 $ H_{3}BO_{3} $ ：10 mM、 $ Cd(NO_{3})_{2} $ ：1 mM、 $ CaCl_{2} $ ：100 mM、 $ Pb(NO_{3})_{2} $ ：1 mM、NaF：10 mM、pH=5.2であり、それぞれの測定試料の色変化を目視で確認できた。

## 4 ）ヒ素センシングペーパーの開発

還元剤で水素化ヒ素（アルシンガス、 $ AsH_{3} $ ）を発生させ、ろ紙に含ませておいた塩化金（Ⅲ） $ \left(\mathrm{AuCl}_{3}\right) $ を還元して、発色する色変化を測定した。ヒ素を含む試料の色変化を目視で確認したところ、目視での検出下限はおよそ1mg/Lであった。ヒ素が含まれない試料でもわずかな色が変化が観察されたため、デジタルカラーアナリシス（DCA）を用いてろ紙の色変化の評価を行った。CIEL*a*b*を利用し、色変化を解析したところ、L*の値とAs（Ⅲ）の濃度の関係では、検出下限は約0.1mg/Lで、目視での判断より高感度でヒ素を検出できた。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

1）環境中の水質検査チップにおける検査試薬としてのポリマーナノ粒子状化学センシングインクを数種開発できた。

2）安価で高性能の水質検査チップのマイクロ流路を、市販のインクジェットプリンタで、有機溶媒を用いずに作製する方法が確立できた（紫外線硬化インクが開発された）。

3）金コア・ユウロピウム錯体内包シリカシェル複合体の設計と合成を行い、新規高感度ラベル化剤が開発できた。その有用性を確かめたところ、極めて高感度な測定が可能であるとされる化学発光ELISAよりも高感度で測定が行えることが確かめられた。

4）マルチセンシングチップとして、一度にケミカルセンシング（色変化のケミカルセンサー）とバイオセンシング（ラテラルフローイムノセンサー）の多項目の同時センシングが可能な安価な紙ベースのセンサーが作製できた。

5）目視およびスキャナーを用いたデジタルカラーアナリシスにより、定量が可能な水質検査センサーが1台のインクジェットプリンタにより作製できることを実証した。

## (2) 環境政策への貢献

研究結果は、ペーパーを用いる安価なマイクロ流体センサーデバイスの大量生産を可能にする。また、このような安価なセンサーデバイスを用いることで、その場で簡便に水質検査や排水検査を行うことが可能になるため、グローバルな利用が期待できる。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

## く査読付き論文>

1) K. Abe, K. Kotera, K. Suzuki, D. Citterio: Anal. Bioanal. Chem., 398, 885–893 (2010).

“Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device”

2) D. Citterio, K. Maejima, K. Suzuki: Proc. MicroTAS 2011, 2099–2101 (2011).

“VOC-free inkjet patterning method for the fabrication of paperfluidic sensing devices”

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1) D. Citterio, K. Abe, K. Kotera, Y. Kameoka, T. Ii, and K. Suzuki: Pittcon 2010, Orlando, USA, 2010.

“Chemical sensors and immunosensors fabricated by inkjet printing”

2) D. Citterio, K. Suzuki: Pacifichem 2010, Honolulu, USA, 2010.

“Chemical sensors and immunosensors fabricated by inkjet printing”

3) D. Citterio, K. Abe, T. Ii, K. Kotera, Y. Katayama, S. Imoto, K. Maejima, K. Suzuki: Pittcon 2011,
Atlanta, USA, 2011.（招待講演）

“Nanoparticle-based (bio)chemical sensing inks for inkjet printed paperfluidic devices”

4) 前島健人・伊井智明・鈴木孝治・Citterio Daniel: 日本化学会第91春季年会、神奈川大学横浜キャンパス、2011.

「UVインクを用いた紙ベースマイクロ流体チップの作製」

5) D. Citterio, K. Abe, T. Ii, K. Kotera, Y. Kameoka, Y. Katayama, K. Maejima, S. Imoto, A. Morita, K. Suzuki:

International Conference on Analytical Sciences (ICAS), Kyoto, Japan, 2011. (招待講演)

“(Bio)chemical sensing inks and inkjet printers: an approach to low-cost (bio)chemical sensors”

6) D. Citterio, K. Maejima, K. Suzuki: MicroTAS, Seattle, USA, 2011.

"VOC-free inkjet patterning method for the fabrication of paperfluidic sensing devices"

7) D. Citterio: Society for Chemistry and Micro-Nano Systems (CHEMINAS), Osaka, Japan, 2011. （招待講演）

“Inkjet printing and paper: a different approach to microfluidic devices”

8) D. Citterio: 産総研第6回ナノバイオデバイスワークショップ, つくば, 2012.(招待講演) "Inkjet-printed microfluidic devices made from paper"

9) D. Citterio, K. Maejima, B. Guirao, N. Komuro, S. Imoto, Y. Katayama, K. Suzuki: Pittcon 2012, Orlando, USA, 2012.

“Inkjet printing for simple and rapid fabrication of microfluidic paper-based analytical devices ( $ \mu $ PADs)”

10) D. Citterio: 電気化学会第79回大会、第53回化学センサー研究発表会、浜松、2012.(招待講演) “Microfluidic paper-based analytical devices (microPADS) fabricated by inkjet printing technology.

11) D. Citterio: Asia-Pacific Conference on Analytical Sciences, Manila, Philippines, 2012.（招待講演）“Inkjet printing: a versatile approach to low-cost microfluidic (bio)chemical sensors”

### 7. 研究者略壓

課題代表者: チッテリオ ダニエル

1967年生まれ。スイス連邦工科大学(ETH)大学院薬学部博士課程修了、自然科学工学博士。

神奈川科学技術アカデミー研究員などを経て、現在慶應義塾大学理工学部准教授。

## 研究参画者

(1): チッテリオ ダニエル （同上）

(2)1): 鈴木 孝治

1954生まれ。慶應義塾大学大学院工学研究科博士課程修了、工学博士。

慶應義塾大学理工学部助手、スイス連邦工科大学(ETH)客員教授、慶應義塾大学理

工学部助教授を経て、現在慶應義塾大学理工学部教授。
## B-0912 化学センシングナノ粒子創製による簡易型オールプリント水質検査チップの開発

＜研究代表者＞

慶應義塾大学理工学部 チッテリオ ダニエル

＜研究協力者＞

慶應義塾大学理工学部 鈴木孝治

平成21～23年度累計予算額：81，200千円

（うち、平成23年度予算額：26,100千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 本研究の目的は、グローバルに使用可能な紙ベースの水質センシングチップを、インクジェットプリント技術を用いて開発した。インクジェットプリンタのインクとしての利用を考慮し、ポリスチレンからなる疎水性コア、ポリビニルピロリドンからなる親水性シェルを持つ200ナノメートル径のコアシェル型粒子に、分析試薬を内包し、センシングインクを開発した。さらに、光リビングラジカル重合により、機能性高分子鎖を持った高分子微粒子である“ヘア粒子”を作製し、この粒子に検査試薬を共有結合により固定化することで新規ケミカルセンシングインクを開発した。作製したヘア粒子は、このコアシェル型粒子に比べ、ヘアが柔軟性を持っており分析対象が検査試薬と反応しやすく、また検査試薬が粒子表面に露出しているため色変化が見やすいことなどから、大幅に検出感度を向上させることができた。その例としては、グリース反応により亜硝酸イオンに対して色変化を示す検査試薬をヘア部分に固定化し、それを用いて亜硝酸イオンの定量が可能なセンシングペーパーを開発した。

紫外線を照射し、硬化するインク（UVインク）を用いて、オフィス用インクジェットプリンタを利用し、紙基板上に微細な流路を作成する方法を確立した。インクジェットプリンタで吐出可能な特性を持ったUVインクを作製し、そのインクをインクジェットプリンタで吐出し紙基板上にパターンを描き、UVを照射しインクを硬化させ、微細な流路を作製する技術を確立した。この方法を利用することによって、環境に悪影響を与えず、センサーチップ作製の全行程をインクジェットプリンタ1台で作ることが可能になる。

開発したナノ粒子センシングインクを用いて、ペーパーベースマイクロ流体デバイス上に複数のセンシング部位をインクジェットプリンタで印刷し、簡易かつ高性能の水質検査チップの作製技術を確立した。

[キーワード]

インクジェットプリントセンサー、ポリマーナノ粒子インク、マイクロ流体デバイス、ペーパーイムノクロマトグラフィー、水質検査チップ
### 1. はじめに

水は人間の生活にとって最も重要であり、身近な資源である。そのため、水資源の汚染を抑制・防止することは、環境の改善のための重要な鍵となる。農業用水や飲料水に使われる水の汚染は、人間の健康に重大な影響を与える。このような背景から、水の質と安全性をモニタリングすることは極めて重要である。先進工業国では、水質汚染に伴うリスクが調査されており、汚染の防止や排水の浄化といった対応策が実施されている。水質分析のための高度な研究室レベルの方法が利用できるようになってきており、日々の水質検査に使われている。しかしながら、発展途上国では全く異なる状況に直面している。水質汚染に伴うリスクは知られているが、その防止策に関連する技術や財源が一般化されていない。その結果、世界人口の約61億人の中で、10億人がきれいな水を飲めず、明らかに人間の健康に悪影響を及ぼしている。これまで利用されてきた高度な水質分析法の多くは、空調設備を含めた長期の分析試薬の管理や冷蔵保存が必要な試薬の供給、高度にトレーニングされた人材などを必要としている。このような水質分析法は経済的余裕がなく十分なインフラが確立されていない発展途上国では利用しにくく、特に水の安全性の検査が重要となる現場では利用が難しい。そのため、扱いやすさや測定時間の短さ、安全性と携帯性、そして特にデバイスと試薬の低価格化といった、分析技術の「経済性（安価）・簡便性」が必要となる。そのうえで感度と定量性などの信頼できる分析法が求められる。

しかしながら、そのような要求を満たす携帯用分析デバイスは、まだ開発されていない。そのため、本研究では環境検査における簡便な水質分析を目的とした、低コストで発展途上国でも使用できるような信頼性の高いセンサーチップの開発を目指している。これにより、実用のための要求に応え、発展途上国での使用を実現できる。

水などのサンプルを分析するマイクロ流体デバイスは小型化や複雑な機能の融合を可能にし、高度な分析ツールを発展途上国に提供できる可能性を秘めている¹。様々な化学的機能を有したマイクロ流体デバイスは多項目のセンシングに適したツールとして考えられている²,³)。しかしながら、発展途上国で使用する場合には、かなり低価格化する必要がある。紙は利用できる基板の中で最も低コストであり、近年、従来のディップスティック試験紙の性能を超える分析ツールとなり得るという研究成果が見られるようになってきた。これに関連して、米国ハーバード大のWhitesidesらの研究グループは、簡易的バイオアッセイを目的としてフォトリングラフィーによりパターン形成された紙のマイクロ流体化学センサーデバイスを開発している⁴,⁵)。ディップスティック型試験紙と比較して、マイクロ流体チャンネルが形成された紙を使えば、微量なサンプルで多項目を同時に測定することができ、そのため高価な試薬の使用量も少なく抑えることができる。一方、このデバイスでは基板に使う材料が低コストであっても、マイクロ流体デバイスを大量生産する方法が低コストでなければ、十分ではないという欠点がある。そこで本研究では、チャンネルが形成された紙を使って水質分析をするために必要となる化学試薬を同時に使用することができる技術として、フレキシブルかつ精度の高いインクジェットプリント技術が適していると考えている。これまでに我々は、オランダ・アイントホーフェン工大のSchubertら⁶)の研究グループが提案した「インクジェットポリマーエッチング」を利用することで、インクジェットプリント技術で紙にマイクロ流体パターンを形成できるということを確認している⁷)。本研究では、試薬の印刷とパターンの形成を組み合わせることで、マイクロ流体化学センサーデバイスの全ての製造プロセスにインクジェットプリント技術を適用させた「オールプリント化学センサーデバイス」
ス」を開発し、今まで他の技術では成しえなかったフレキシビリティー（様々な化学センサーが作製可能）と低コスト化を実現する $ ^{7} $ 。

## 2 ．研究開発目的

本研究の目的はグローバルに使用可能な紙ベースの水質センシングチップ（オールプリントケミカル、バイオセンサーデバイス）（図(1)-1）を、インクジェットプリント技術を用いて開発することである。インクジェットプリント技術の利点と低コスト紙基板の使用により、作製されるセンサーは発展途上国のみならず、先進国における一般家庭などでも利用可能である。このセンサーの実現により、安価かつ簡便迅速に水サンプルの多項目同時定量をすることができる。作製されるセンサーは、色変化あるいは発色を判定するものであり、目視あるいは安価なカラーアナライザーでの定量が可能である。

図(1)-1 オールプリントセンサーデバイス

この研究においては、バイオセンシングもしくはケミカルセンシングをするために、インクジェットプリンタを用いて紙基板上に印刷する、インクの作製が主題となる。ケミカルセンシングは、図(1)-2のような構造をもつポリマーナノ粒子に機能性試薬を固定化したものを作製し、インクとして利用することで行う。

図(1)-2 作製した機能性ポリマーナノ粒子インク
また、バイオセンシングインクは、ラテラルフローイムノアッセイにおいて、農薬や殺虫剤などの検査対象を分析できるインクを作製する。作製したそれぞれのインクは紙基板上にインクジェットプリントにより印刷し、固定化することで、紙上にセンシングを行う場を提供する。この時、あらかじめ分析に必要な化学物質は全て紙基板に印刷し、固定化することで追加試薬を加えることなく、試料を滴下するだけの簡便さで分析を行うことができる。

具体的には3年間で、以下の3項目の研究から、図(1)-1に示すような紙ベースの水質センシングチップの完成を目指した。

（１）ポリマーナノ粒子を用いた化学的および生化学的に応答するインクジェットプリント用センシングインクの開発：

水の汚染の原因としては有機物、重金属、細菌など多様な物質が挙げられる。したがって水質検査において、その水が安全かどうかを調べるためには、さまざまな物質を検出する必要がある。このため、マルチセンシングを行うことのできるセンシングインクを開発する。

（２）水質多検体モニタリングのための “オールインクジェットプリント技術による” ケミカルセンシングペーパーの作製：

図(1)-3 オールインクジェットプリントケミカルセンシングペーパーの作製法

多項目の水質検査を定量的に行える、インクジェットプリント技術を用いたマイクロ流体ケミカルセンシングペーパーの作製を行う。この場合、紫外線硬化樹脂をインクとして利用することにより、紙基板上にさまざまなマイクロ流路パターンを作製し、さらにセンシングインクを流路内の最適な部分にプリントすることで、図(1)-3に示すような方法からセンサーデバイスを作製する。

一方、免疫センサーについては、これまでにインクジェットプリント技術を用いて、一枚のろ紙上に流路を作製、試薬を固定化し、シングルパッドでラテラルフローイムノアツセイを行える技術を開発してきた $ ^{8)} $ 。しかしながら、その検出感度には未だ課題が残り、水中に微少量存在する農薬や細菌などを測定するためには感度が不足している。そこで、イムノアツセイに利用するラベル化剤の改良という観点から、感度の向上を目指す。そこで、高感度かつラテラルフローイムノアツセイに応用可能なラベル化剤として、蛍光色素内包シリカナノ粒子が着目されているが、図(1)-4に示すような金ナノ粒子をコアとして、ユーロピウム蛍光材料をシリカシェルに使った新規高輝度蛍光・吸光ラベル化剤の開発を行い、簡便かつ高感度の免疫センサーを作製する。
図(1)-4 金ナノ粒子コアとユーロピウム蛍光材料内包シリカシェルから成る新規高輝度蛍光・吸光ラベル化剤

（３）環境検査のための安価な水質検査トータルシステムの開発：

水質検査項目に従った多項目同時定量が可能なマルチセンシングチップを作製する。これにより、安価かつ簡便、迅速な測定が可能な紙基板水質センシングチップを作製する。また、センサー応答からの定量性の確保のため、色情報分析法としてのデジタルカラーアナリシスの適応化と最適化の検討を行い、安価かつ高性能な定量分析システムを構築する。図(1)-5に、本研究の水質センシングチップ開発のまとめ図を示す。

図(1)-5 本研究の水質センシングチップ開発のまとめ図
### 3. 研究開発方法

（１）ポリマーナノ粒子を用いた化学的および生化学的に応答するインクジェットプリント用センシングインクの開発

1）pHセンシングインクの作製（コア・シェルナノ粒子）

本研究ではpHセンシングのためのインクとして、ポリスチレンコア/ポリビニルピロリドンシェルを持つコアシェル粒子にブロモチモールブルー(BTB)、チモールブルー(TB)、メチルレッド(MR)をそれぞれ別々に内包させたものを開発した。その際、チモールブルーとブロモチモールブルーは、アルキル鎖をつけることによって疎水性を大きくし、ポリ(1-ビニルピロリドン)のシェル内に内包させた。また、メチルレッドはそのままシェルに内包させた。

### a. BTBのナノ粒子への含有

BTBへのアルキル鎖の導入

① BTB-Na（147.85 mg、0.229 mmol、1 eq）とトリメチルステアリルアンモニウムクロリド（79.51 mg、0.228 mmol、1 eq）をmilli-Qに溶解した。

② ①の溶液を、連続抽出装置を用いて終夜でクロロホルム層へ抽出した。

③ 翌日、クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥剤をろ別した。クロロホルムを減圧除去し、さらに真空ポンプで乾燥させた。収量136.6 mg、収率64.0 %で得られた。

アルキル鎖を導入したBTBを含むナノ粒子の作製

②☐ アルキル化したBTB 17.7 mgをエタノール 20 mLに溶解した。

② ポリスチレンコア/ポリビニルピロリドンシェルを持つコアシェル粒子(38% w/w、水中粒径245nm)エマルション1.05 g、milli-Q 40 mL、ethanol 80 mLを300 mLナスフラスコに取って攪拌し、(1)を徐々に滴下した。

③ エタノールおよび水を減圧除去し、得られた濃縮液にmilli-Qを加えて10 gとした。

④ ③で得られた分散液100 μLをマイクロチューブに取り、マイクロチューブ用遠心分離機でフィルターを用いて遠心分離(RCF=10,000、Time=30 min)した。
b. TBのナノ粒子への含有

TBへのアルキル鎖の導入

① TB-Na（49.12 mg、0.101 mmol、1 eq）とトリドデシルメチルアンモニウムクロリド（58.24 mg、0.102 mmol、1 eq）をmilli-Qに溶解した。

② ①の溶液を、分液漏斗を用いて3回抽出を行い、クロロホルム層を取り出した。

③ 得られたクロロホルム層に飽和塩化ナトリウム水溶液を加えてもう一度抽出した。

④ 無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥剤をろ別した。クロロホルムを減圧除去し、さらに真空ポンプで乾燥させた。収量92.5 mg、収率67.6 %で得られた。

アルキル鎖を導入したTBを含むナノ粒子の作製

① アルキル化したTB 18.63 mgをエタノール 20 mLに溶解した。

② ポリスチレンコア/ポリビニルピロリドンシェルを持つコアシェル粒子(38% w/w)エマルション1.05 g、milli-Q 40 mL、ethanol 80 mLを300 mlナスフラスコに取って攪拌し、(1)を徐々に滴下した。

③ エタノールおよび水を減圧除去し、得られた濃縮液にmilli-Qを加えて10 gとした。

④ ③で得られた分散液100 μLをマイクロチューブに取り、マイクロチューブ用遠心分離機でフィルターを用いて遠心分離(RCF=10,000、Time=30min)した。

c. MRのナノ粒子への含有

MRは前二者に比べて脂溶性が高く、MRナトリウム塩が有機層に溶解してしまうため、アルキルの無い状態でナノ粒子に内包させた。

① MR 8.1 mgをエタノール 20 mLに溶解した。

② ポリスチレンコア/ポリビニルピロリドンシェルを持つコアシェル粒子(38% w/w)エマルション1.05 g、milli-Q 40 mL、エタノール 80 mLを300 mLナスフラスコに取って攪拌し、(1)を徐々に滴下した。

③ エタノールおよび水を減圧除去し、得られた濃縮液にmilli-Qを加えて10 gとした。

④ 減圧除去の過程で(3)から、ナノ粒子に収まりきらなかったMRの沈殿物が生成した。これらを1.2μmシリンジフィルターで取り除いた。
⑤ ④100 μLをマイクロチューブに取り、マイクロチューブ用遠心分離機でフィルターを用いて遠心分離(RCF=10,000、Time=30 min)した。

d. pHセンシングインクの調整

① a節、b節、c節で作製した分散液を、BTB：TB：MR=120：60：240（μL）の割合で混合した。

② インクのpH応答性を明確にするため、①の分散液：0.1M NaOH溶液=420：12.6（μL）で混合した。

③ ②のインク：グリセリン：milli-Q=432.6：200：1367.4（μL）の割合で混合し、粒子の固形分率が1%（w/w）になるように調整した。また、グリセリンは粘度調整のために加えた。

## 2 ）亜硝酸イオン(NO_{2}^{-})センシングインクの作製（コア・シェルナノ粒子、ヘアナノ粒子）

本研究では、高分子微粒子ベース（ポリスチレンコア/ポリビニルピロリドンシェルポリマー粒子とヘア粒子）のセンシングインクを開発した。このようなセンシングインクを用いることで、検査試薬の安定性の向上やセンシングエリアの色ムラの改善、使用するインク量の少量化などを行える。なお、本研究では、高分子微粒子ベースのセンシングインクの一例として亜硝酸イオンセンシングインクを開発した。

### a. 亜硝酸イオン分析メカニズム

本研究では、亜硝酸イオンの分析に最もよく用いられているグリース反応（Griess Reaction）を採用することとした（図(1)-6）。亜硝酸イオンの存在下でSulfanilamideは亜硝酸イオンと結合し、さらにその化合物とN-1-naphthylethylenediamine（N-1-ナフチルエチレンジアミン）（NEDA）が結合することで、540 nm付近に吸収をもつ化合物を生成する。その吸収の強さで亜硝酸イオンを定量する。

図(1)-6 亜硝酸イオン定量メカニズム
b. ポリスチレンコア/ポリビニルピロリドンシェルポリマー粒子

グリース反応を用いた亜硝酸イオンの比色分析を目的とし、この反応で用いられる検査試薬（N-1-ナフチルエチレンジアミン）のポリマーナノ粒子への内包を行った。まず、N-1-ナフチルエチレンジアミンを1-ブロモオクタデカンにより、アルキル化させた。

Ar気流下、NEDA 25.1 mg（0.097 mmol）、炭酸セシウム127.1 mg（0.390 mmol）、1-ブロモオクタデカン73.8 mg（0.221 mmol）をDMF 5 mLに溶かし、150 ℃にて2 時間加熱還流を行った。冷却後、減圧乾燥し、クロロホルム/ヘキサン＝2/1にてシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーを行い、分離精製し、16.9 mg（収率25.2%）を得た。

アルキル化により疎水化させたN-1-ナフチル-N,N-ジオクタデシルエチレンジアミンをナノ粒子に内包させる手順は以下の通りである $ ^{9)} $ （図(1)-7）。ポリスチレンコア/ポリビニルピロリドンシェルを持つコアシェル粒子をTHFと水の混合溶媒に加える。この時、

疎水性であるポリスチレンコアが膨潤する。疎水化させた検査試薬をTHFに溶解させ、これをナノ粒子の分散液に滴下し、加えることで、膨潤したナノ粒子のコアに検査試薬が導入される。最後にTHFを減圧によって除去すると、THFによって膨潤していたコアは元の状態に戻り、検査試薬はナノ粒子に内包される。このよう作製した、検査試薬を内包したナノ粒子の分散液である、ナノ粒子インクを以下ではN-1インクと表記する。

図(1)-7 コアシェルポリマー粒子の疎水性コアへの試薬

また、検査試薬のナノ粒子への内包の効果を調べるため、N-1-ナフチルエチレンジアミンをそのままクエン酸水溶液に溶解させたインクを作製し(N-1bインク)、比較を行った。

さらに、グリース反応に必要な検査試薬であるスルファニルアミドをクエン酸水溶液に溶解させたインクも作製した(N-2インク)。

### c. ☐ ☐

Kawaguchiらは、graft-from法によって微粒子表面から温度応答性ポリマーであるpoly(N-isopropylacrylamide)（PNIPAM）をグラフトし、粒子表面にブラシ状のシェルを持つ“ヘア粒子”を創製した $ ^{10)-13)} $ （図(1)-8）。
図(1)-8 ヘア粒子の作製

この粒子のヘア鎖は髪の毛のように1本1本独立しており、通常のコア/シェル粒子における架橋されたシェルよりも高感度な環境応答性を示すことが明らかになっている。また、ヘア鎖の重合方法に、リビングラジカルグラフト重合を適用することによって、グラフト鎖の構造設計が可能になり、複数の機能を併せ持った機能性微粒子としてその有用性が認められている。

図(1)-9 ヘア粒子を用いたケミカルセンシングインクの作製

本研究では図(1)-9のようにヘア粒子のヘア鎖に検査試薬を共有結合させ、固定化させることで、ケミカルセンシングインクを作製した。

この方法の利点として、

1）検査試薬をそのまま固定化させることができる（疎水化などの必要がない）

2) 検査試薬が粒子の表面に固定化されている

⇒呈色が粒子表面でおこるため、目視で確認しやすい

3）へア鎖は架橋されておらず、柔軟性を持っている

⇒サンプルが検査試薬に届きやすい

## 4 ) 有機溶媒が不要

⇒酵素や抗体などの生体分子の固定化が可能

などが挙げられる。

グリース反応を用いた亜硝酸イオンの比色分析を目的とし、この反応で用いられる検査試薬(N-1-ナフチルエチレンジアミン）の“ヘア粒子”への固定化を行った。

ヘア粒子インクの作製は、i. コア粒子の作製、ii. 光iniferter基の導入、iii. ヘア鎖の導入、iv. 試薬の固定化という4ステップからなる（図(1)-8,9）。以下、ステップごとに詳細を述べる。