Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
カーとして使用しうる多型・ハプロタイプの頻度や疾患責任遺伝子の発現量などのプロファイリングを行った後に試料をバンキングして、長期フォローアップを可能とすると共に、今後の遺伝—環境相互作用や遺伝子間相互作用の研究のために役立てることを目標とする。

また、小児先天奇形発症者からの血液の提供は、少量であることが予想されるため、遺伝子多型解析に必要なゲノムDNAサンプルを微量の血液から採取可能かどうか、保存プール血液を用いて調べる。

## 3 ．研究開発方法

## （１）試料およびデータの集積と保存に関する研究

## 1 ）試料およびデータの集積に関する研究

分子生物学的な解析試料として、臍帯血・胎盤からDNA採取、RNA採取、不死化リンパ球作製を行う。また、可能な限り、母親あるいは両親の末梢血からDNA採取、RNA採取、不死化リンパ球作製を行う。

## 2 ）試料およびデータの保存に関する研究

暴露量測定試料を用いて、ビスフェノールやダイオキシンなど代表的化学物質を測定すると共に、残りを凍結保存する。臨床情報として、食事内容、生活環境など詳細な妊娠歴を成育コホート方式に従い記録し、ある程度の暴露量を把握する。また、出生後の新生児所見、臍帯・胎盤所見を連結可能匿名化で記録する。これにより、下記のプロファイリングデータおよび将来のデータとの対応、および、長期フォローアップを可能とする。

## （２）保存試料のプロファイリングと品質管理に関する研究

バイオマーカーとして使用しうる多型・ハプロタイプの頻度や疾患責任遺伝子の発現量などのプロファイリングを行い、データベースとして保存し、今後の遺伝—環境相互作用や遺伝子間相互作用の研究のために公開する。さらに、品質管理は、胎盤・臍帯血を含むこれまでに集積した検体を用いたインプリンティング遺伝子のメチル化パターンと発現量を解析することで実施する。詳細を次に示す。

インプリンティング遺伝子のメチル化は、親由来特異的なゲノムDNAのメチル化可変領域（メチル化を受ける、あるいは受けない領域）のメチル化状態を調べることで解析する。ゲノムDNAのメチル化状態は、親由来の特異的インプリンティング遺伝子の発現パターンと密接に連動する。このメチル化は、ゲノムDNAのCpG配列のシトシンに起こる。そのため、ゲノムDNAにbisulfite処理（非メチル化シトシンのみがチミンへと変換される）を行うと、ゲノムDNAのメチル化可変領域のメチル化と非メチル化状態を識別できるようになる。このようなbisulfite処理により生じたゲノムDNAのメチル化可変領域のメチル化と非メチル化状態は、特異的な制限酵素部位を生じさせる。これを利用して、メチル化されているクローンの比率（methylation index）を求め、定量的評価を行う。具体的に、ゲノムDNAのメチル化可変領域のメチル化と非メチル化状態を区別しないプライマーを設計し、bisulfite処理したDNAを増幅する。得られたPCR産物を制限酵素処理すると、非メチル化DNAとメチル化DNAを区別することができ、Bioanalyzer（Agilent）による定量が可能となる。正常範囲を逸脱するmethylation indexを示した検体につい
て、そのPCR産物をサブクローニングし、直接シークエンスで解析することで詳細なメチル化状態を調べる。

また、環境残留性化学物質の測定やエストロゲン活性およびアリールハイドロカーボン活性などを指標にした毒性等量の測定を行う。

## （３）少量サンプル解析のパイロットスタディに関する研究

特殊血液保存用ろ紙（カード）であるFTA Elute（GE Healthcare）とFTA（GE Healthcare）を用いて血液を保存する。その後、FTA EluteカードからゲノムDNAを抽出してPCRを行い、ゲノムDNA回収量およびPCR産物の濃度より増幅効率を算出する。さらに、これらのサンプルが、SNP解析に利用できるかを検討する。詳細を次に示す。

## 1 ）保存条件の異なる血液のゲノムDNA回収量に関する研究

## a 特殊血液保存用ろ紙FTA EluteとFTAへの血液保存

保存プール血液は、すぐに特殊血液保存用ろ紙FTA Eluteに40 μl、FTAに125 μlをカードに滴下したのち、3時間（FTA Elute）、または1時間（FTA）風乾させる。カードはシリカゲルとともに保存する。

## b FTA Elute保存血液のゲノムDNA抽出

FTA Eluteカードに保存した血液は、専用のマイクロパンチ（GE healthcare）を用いて、カードからディスクをくり抜く。そのディスクは、1.5 mlのマイクロチューブに入れ、500 μlの滅菌水を加え、ただちにボルテックス（3回、計5秒間）する。ディスクを30 μlの滅菌水が入った0.5 mlチューブに移し、完全に沈んだ状態で95℃、25分間加熱する。その後、60回パルスボルテックスで攪拌し、30秒間遠心してディスクを取り除き、ゲノムDNA溶出液を得る。

## c 凍結保存血液のゲノムDNA抽出

-80℃および-20℃にて凍結保存していた血液100 μlより、DNeasy（QIAGEN）を用いてゲノムDNAを抽出する。

## d FTA Elute保存血液のDNeasyを用いたゲノムDNA抽出

FTA Eluteカードに保存した血液は、専用のマイクロパンチ（GE healthcare）を用いて、カードからディスクをくり抜く。そのディスクは、滅菌水で洗い、1.5 mlチューブに移し、滅菌水中に完全に沈んだ状態で95℃、5分間加熱し、ゲノムDNA溶出液を得る。得られた溶出液に、Protenase K、RNase（QIAGEN）を加えて室温で2分反応後、DNeasyのAL bufferを加えて攪拌し、56℃、15分反応させる。つぎに95℃、20分溶出させたのち、ボルテックスとピペッティングによる攪拌を行い、100％エタノールを加えてカラムへ移す。その後、リンス、溶出を行う。

## e FTAのディスクの洗浄

FTAカードに保存した血液は、専用のマイクロパンチ（GE healthcare）を用いて、カードからディスクをくり抜く。そのディスクは、200 μlの精製試薬が入ったマイクロチューブに入れ、ピ
ペッティングをしながら、室温で5分間インキュベートする。その後、精製試薬を捨てる。この工程を3回行い、さらにTEバッファー（10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH8.0）200μlで2回洗浄する。PCR直前にディスクを取り出して乾燥させた後、PCR反応液にディスクを入れて使用する。

## f FTA保存血液のゲノムDNA抽出

上記 5）で洗浄したディスクを取り出した後、PBS、Protenase K、RNaseを加え、2分間インキュベートする。AL buffer（QIAGEN, DNeasy）を加え、ボルテックスで攪拌後、56℃で2時間、時々攪拌しながらインキュベートする。DNeasyのプロトコールに従い、ゲノムDNAの溶出を行う。

## g 保存プール血液より抽出したゲノムDNA濃度測定

保存プール血液より抽出したゲノムDNA濃度を測定するため、Picogreen（Molecular Probes）を用いて2本鎖DNAの定量を行う。2本鎖DNAの濃度は、Molecular Imager FX（BIO RAD）およびABI 7700（ABI）を用いて蛍光値を測定して算出する。

## 2 ）保存条件の異なる血液のゲノムDNAの品質確認に関する研究

## a 保存プール血液より抽出したゲノムDNA増幅

保存プール血液は、ごく微量（FTA Elute保存血液40 μl、FTA保存血液125 μl、-80℃および-20℃にて凍結保存血液100 μl）であるため、ゲノムDNAの増幅が必要である。そのため、GenomiPhi（GE Healthcare）のプロトコールに従い、抽出したゲノムDNAの増幅を行う。GenomiPhiは、数ngのゲノムDNAから数μgの高分子量DNAが調製できるwhole genome amplification試薬であり、血液や口腔粘膜など、抽出したゲノムDNAが少量の場合でも検体の解析が十分に行える。

## b ゲノムDNAの抽出確認

保存プール血液よりゲノムDNAが抽出されているか確認するため、ヒトCYP1A2の上流域のプライマー（5'-AACCGAGCCTAACCTCAAACCTT, 5'-GTAGAGAGGAGGTCTTGCCATG）を用いてPCRを行う。

## 4 ．結果及び考察

## （１）試料およびデータの集積と保存に関する研究

## 1 ）試料およびデータの集積に関する研究

本研究では、正常児における臍帯血・胎盤の使用およびバンキングを行った。

これまでに、DNA・リンパ球セルライン検体として、臍帯血1,200、胎盤67、精子形成障害患者150、尿道下裂・停留精巣患者350、早発性卵巣機能不全患者120、口蓋裂患者60例分を集積した。また、組織検体として、胎盤67、尿道下裂・停留精巣患者の外陰部皮膚350、口蓋裂患者の口腔粘膜60例分を集積した（図(2)-2）。
図(2)−2 検体集積システム

## 2 ）試料およびデータの保存に関する研究

提供頂いた検体（臍帯血・胎盤、母親あるいは両親の末梢血）には、固有の研究番号（例：胎盤組織-001、検体の中身と三桁の数字）をつけ、研究者には検体と研究番号、診断名などの診療情報のみを渡している。対象者の氏名・住所などの個人識別情報と、検体に付けられた研究番号を結びつける対応表は、厳重に保管管理している。

## （２）保存試料のプロファイリングと品質管理に関する研究

胎盤・臍帯血を含むこれまでに集積した検体を用いて、発現解析やメチル化解析を種々の遺伝子やインプリンティング遺伝子を対象として行った。インプリンティング領域には、父親由来のときのみ働く遺伝子（父性発現遺伝子、paternally expressed gene: PEG）や母親由来のときのみ働く遺伝子（母性発現遺伝子、maternally expressed gene: MEG）とともに、メチル化可変領域（differentially methylated region: DMR）が存在する（図(2)-3）。
図(2)-3 インプリンティング遺伝子とメチル化可変領域（DMR）

(Horm Front Gynecol、17, 12, 361–368 (2010)) より転載)

その結果、新鮮な胎盤では、種々の遺伝子やインプリンティング遺伝子を対象とする遺伝子発現解析やメチル化解析などの様々な解析が可能であることを見いだした。また、ホルマリン処理したパラフィンブロック中に保存された胎盤を用いた場合でも、200 bp以下のPCR産物は比較的容易に得られ、メチル化解析が可能であることを明らかにした。一方、1年以上経過したパラフィンブロック中に保存された胎盤を用いた場合、遺伝子発現解析は難しいことがわかった。長期間パラフィンブロック中に保存された組織から抽出されるRNAは、新鮮な組織から抽出したものと比較して、RNAの分解が進行していることが知られている。また、RNAの分解の程度は、パラフィンブロックの保存状態に大きく依存することも知られている。そのため、組織から抽出したRNAの18S rRNAがはっきりと確認できるか、あるいは18S rRNAも確認できないほどに分解が進んでいるかを確認することにより、RNA分解の程度の判断は可能である。これまでの経験より、RNAが分解されていても（18S rRNAを確認できない場合でも）、RT-PCRによる遺伝子の検出は可能な場合が多い。さらに、長期間パラフィンブロック中に保存された組織から抽出されるRNAを用いたRT-PCRは、新鮮な組織から抽出したものと比較して増幅効率が低いため、増幅サイズを200 bp以下になるようにプライマーの設定を行うことで、遺伝子発現解析が可能となる。

現在、われわれは、胎盤を含む組織検体に関して、新鮮な組織検体と同等の遺伝子発現解析結果を得ることが可能な保存法を検討しており、これまでに胎盤を含む組織のRNAlater溶液（Life Technologies）を用いた保存を試みている。RNAlater溶液は、細胞中のRNAを安定化および保護するための試薬であり、組織中に迅速に浸透する水溶性の無毒性組織保存液である。遺伝子発現解析を行った結果、RNAlater溶液に保存した胎盤から抽出したRNAは、新鮮な胎盤から抽出したRNAと同等の品質を保持していることが明らかとなった。これらの結果は、胎盤・臍帯血を用いたバンキングシステムが、実際に有用であることを示唆する。
## （３）少量サンプル解析のパイロットスタディに関する研究

1）保存条件の異なる血液のゲノムDNA回収量に関する研究

保存条件の異なる血液のゲノムDNAの回収量、抽出前処理の違い、およびFTAカードのサイズによるゲノムDNA回収量の検討を行った。

-20℃保存の血液と比較すると、-80℃保存の血液から抽出したゲノムDNA回収量は約2.5倍量多く、血液の保存は-80℃が適していることが明らかとなった。また、FTA Eluteカードを用いて保存した血液からゲノムDNA抽出方法を検討したところ、ボルテックスやピペッティングの作業を追加することにより、ゲノムDNAの回収量が増加した（表(2)-1）。

表(2)−1 保存条件の異なる血液のゲノムDNA回収量

-80℃
凍結保存
DNeasy	-20℃
凍結保存
DNeasy	FTA Elute
(ボルテックス)
+ DNeasy	FTA Elute
(ピペッティング)
+ DNeasy	FTA Elute	FTAカード
→洗浄
→DNeasy
持ち込み血
液量(μl)	100	100	24	24	2
(φ3mm,1枚)	80
-	-	(φ6mm,2枚)	(同左)	-	(φ6mm,6枚)
回収濃度
(ng/μl)	30	8.3	8	4.6	測定不能	3.3
回収量	2.3μg	622ng	約400ng	250ng	測定不能	314ng
泳動量(ng)	66	83	53	46	-	33

さらに、2本鎖DNAを特異的に認識するピコグリーン吸光度法において、カードに保存した血液から抽出したゲノムDNA濃度測定を行った結果、FTA Elute（ピペッティング）+ DNeasy, Pro K→95℃において、高いゲノムDNA回収率が得られることを見いだした。また、FTAカードに保存した血液は、直径の小さなカードから抽出したゲノムDNAを使用した場合、高いPCR増幅効率が得られることを見いだした（表(2)–2）。
表(2)–2 抽出前処理の違い、およびFTAカードのサイズによるゲノムDNA回収量

FTA φ1mm	FTA φ3mm	FTA Elute + DNeasy Pro Kなし	FTA Elute (ピペッティング) + DNeasy Pro K→95℃	FTAカード→洗浄→DNeasy	-80℃凍結保存 DNeasy
持ち込み血液量(μl)	0.4	3.3	30 (φ3mm, 10枚)	40 (φ11mm, 1枚)	80 (φ6mm, 6枚)	100
回収濃度吸光度測定(ng/μl)	-	-	2	4	3.3	30
回収濃度ピコグリーン測定(ng/μl)	-	-	0.056	0.175	0.33	33
回収量	-	-	約100 ng	340 ng	314 ng	2.3 μg
GenomiPhiによる増幅産物濃度(ng/μl)	706	622	760	810	720	740

これらの結果は、少量の血液検体の保存には、血液からのゲノムDNAを多く回収するため、-80℃凍結保存が最も適した保存法であることを示唆する。しかし、今後も集積数が増えていく検体の全てを、-80℃凍結保存で管理することは、凍結保存場所および施設の観点から限界を迎えることは避けられない。そこで、今回使用した特殊血液保存用ろ紙（カード）による微量血液検体の保存は、今後の検体保存に大いに利用できると考える。カードに保存した血液は室温で保存が可能であり、特別な検体の保存場所を用意する必要がない。これは凍結保存場所の確保が困難になるという問題点を解決できる。さらに、研究協力機関において得られた血液検体を、バンキングするために検体の輸送は必須である。そのため、検体を室温で保存することが可能になれば、検体の輸送に関しても大きな利点が出てくる。

また、カードに保存した血液から抽出したゲノムDNA回収の効率は、直径が小さいものを使用した方が良いことを見いだした。しかし、抽出されるゲノムDNAの回収量が少ないという問題点が十分に解決されたとは言い難い。今後、ゲノムDNA抽出法の向上を目指して、さらなる条件検討が必要である。

## 2 ）保存条件の異なる血液のゲノムDNAの品質確認に関する研究

さらに、保存条件の異なる血液から抽出したゲノムDNAの品質を確認するため、イルミナ社のビーズアレイによるSNP解析を行った（表(2)-3）。
表(2)–3 保存条件の異なる血液、外陰部皮膚線維芽細胞および外陰部皮膚組織から抽出したゲノムDNAの品質確認

サンプル名	否検出数(#No_Calls)	SNP測定数(#Calls)	解析成功率(Call_Rate)	配列一致率	DNA使用量ng
-20℃
凍結保存	0	96	1.00	100	201.8
-80℃
凍結保存	0	96	1.00	100	296.1
FTA
Pro K	1	95	0.9896	97.92	1.6
FTA Elute
Pro K	0	96	1.00	SNP	5.4
ヒト細胞株A	0	96	1.00	SNP	547.3
ヒト細胞株B	0	96	1.00	SNP	406.2
ヒト細胞株C	0	96	1.00	SNP	275.7
ヒト細胞株D1	0	96	1.00	100	533.3
ヒト細胞株D2	0	96	1.00	100	276.7
ヒト組織F	0	96	1.00	SNP	19.1
ヒト組織M1	0	96	1.00	100	240.9
ヒト組織M2	0	96	1.00	100	354.9

その結果、FTAカードで保存した血液から、Protenase K処理の工程を加えて抽出した1.6 ngのゲノムDNAを用いた場合、SNP解析成功率は98％であった。また、FTA Eluteカードで保存した血液から、Protenase K処理の工程を加えて抽出した5.4 ngのゲノムDNAを用いた場合、SNP解析成功率は100％であった。これらの結果から、カードで保存した微量な血液は、Protenase K処理の工程を加えてゲノムDNAを抽出する方法を用いた場合、SNP解析に使用できるゲノムDNAを得ることが可能な検体であることが明らかとなった。さらに、今回得られた高いSNP解析成功率は、カードに保存した血液から抽出したゲノムDNAが、多くの実験に使用できる高い品質を保持していることを示している。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義
臨床情報が取得され、感受性多型や関連遺伝子のプロファイリングと品質管理がなされた試料をバンキングすることは、同一集団において暴露量評価と遺伝子解析を可能とし、遺伝—環境相互作用や遺伝子間相互作用を含め、今後の多くの研究に役立つ。また、連結可能匿名化で臨床情報を取得することで長期フォローアップが可能となり、バイオマーカーの妥当性の検証や新たなバイオマーカーの検出が可能となる。

試料の保存は、この点において極めて有用である。また少量サンプル解析の結果は、大規模小児疫学調査における貴重な血液を可能な限り少ない量でゲノム解析を可能にすることを示した基礎データである。

## （２）環境政策への貢献

これまで、ゲノムDNA・RNAおよび不死化リンパ球を保存するという体制は見られない。また、小児検体（特に正常検体）の採取・保存は、倫理的に極めて困難であるため、臍帯血・胎盤などの胎児付属物が保存の対象となると考えられるが、本邦には環境リスク評価を目的とする臍帯血・胎盤バンキングシステムは存在しない。本研究の環境リスク研究に広く貢献できる臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備は、先天奇形のなかでも尿道下裂など、生殖と密接に関連する領域の研究において、遺伝因子と環境因子の相互作用で出現する先天奇形の表現型の適切な解析を可能とする。尿道下裂など生殖と密接に関連する領域の研究は、少子化対策の観点から、強いインパクトを持つと考えられる。また、バンキングシステムの整備により、精神発達障害、発癌性、催奇形性など、環境化学物質との関連が危惧される疾患の発症機序解明にも貢献する。

## 6 ．国際共同研究等の状況

国際共同研究計画名：

重金属及びダイオキシン類の曝露量と口蓋口唇裂の発生頻度との関連性に関する研究カウンターパート氏名・所属・国名：

賈光·北京大学医学部公衆衛生学研究室·中国

参加·連携状況：

張 済主任医师（济南市疾病予防控制中心）や顧依群主任医师（北京市海淀区妇幼保健院）と連携して、検体を収集し、ヒト組織における重金属及びダイオキシン類の負荷量を調べる。また、重金属及びダイオキシン応答遺伝子に着目し、口蓋口唇裂の発生頻度と曝露量との関係を調べる。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) MS. Alam, S. Ohsako, T. Matsuwaki, XB. Zhu, N. Tsunekawa, Y. Kanai, H. Sone, C. Tohyama and M. Kurohmaru: Reproduction, 139, 2, 427–437 (2010)

“Induction of spermatogenic cell apoptosis in prepubertal rat testes irrespective of testicular steroidogenesis: A possible estrogenic effect of di (n-butyl) phthalate.”

2) X.Y. Qin, F. Wei, J. Yoshinaga, J. Yonemoto, M. Tanokura and H. Sone: FEBS Lett. 585, 20,
3310–3315 (2011)

“siRNA-mediated knockdown of aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2 affects hypoxia-inducible factor-1 regulatory signaling and metabolism in human breast cancer cells.”

3) T. Ogata $ ^{*} $ et al.: J. Hum. Genet,

“Haplotype analysis of ESR2 in Japanese patients with spermatogenic failure: Implications for genetic susceptibility to estrogenic environmental endocrine disruptors.” (accepted)

<査読付論文に準ずる成果発表>（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可。）特に記載すべき事項はない。

くその他誌上発表（査読なし）>

1) T. Ogata, J. Laporte and M. Fukami: Hormone Research, 71, 5, 245–252 (2009) "MAMLD1 (CXorf6): a new gene involved in hypospadias."

2) 緒方 勤：小児科診療、72,1,39–44 (2009)

「エピジェネティクスと遺伝疾患」

4) 緒方 勤、佐藤直子：ゲノム医学、9,2,67-70(2009)

「中枢性性腺機能不全：Kallmann 症候群を主として」

5) 緒方勤：細胞工学、28, 6, 572–577 (2009)

「先天性疾病患のエピジェネティクス: 第14染色体ダイソミ一表現型発症機序をモデルとして」

6) 緒方 勤：小児内科 増刊号（小児疾患診療のための病態生理）、41,319–321 (2009)「性腺無形成と性腺異形成」

7) 緒方勤：科学、79, 9, 982–983 (2009)

「小児疾患と環境化学物質：遺伝—環境相互作用の観点から」

9) 緒方 勤、伊達木澄人、山澤一樹：SGA性低身長症のマネジメント（藤枝憲二 監修）、メディカルレビュー社、41,7,57-68 (2009)

「胎内発育に影響する因子：IUGRの遺伝的要因」

10) 緒方 勤：小児内分泌学（日本小児内分泌学会 編集）、診断と治療社、305–309 (2009)「性の分化機構」

11）緒方 勤：小児内分泌疾患鑑別診断チャート（藤枝憲二 編集）、診断と治療社、74-75(2009)

「ミクロペニス」

12）緒方 勤：小児内分泌疾患鑑別診断チャート（藤枝憲二 編集）、診断と治療社、80-81(2009)

「性分化異常」

13) 緒方勤：化学物質と環境、エコケミストリー研究会会報、96, 1–5 (2009)
「小児疾患と環境化学物質」

14）深見真紀、和田友香、緒方勤：小児科、50,7,939–945 (2009)

「小児疾患における臨床遺伝学の進歩（日本人が発見にかかわった遺伝子）：尿道下裂（CXorf6）」

15）吉田理恵、緒方勤：小児外科、41,2,95–97(2009)「泌尿器生殖洞の発生分化とその異常」

16) H. Sone, S. Imanishi, H. Akanuma, R. Nagano, T. Fukuda, S. Ohsako: The roles of free radicals in biology and medicine", MEDIMOND SRL Publ., 45–52 (2009)

“Gene expression signatures of environmental chemicals in cancer and in developmental disorders.”

17）左合治彦、林聡、穴見愛：産婦人科治療、98,5,846–853 (2009)「胎児超音波スクリーニングの実際」

18）左合治彦、林 聪、穴見 愛：小児外科（出生前診断の倫理と実際）、41,5,457–460 (2009)「出生前診断と胎児治療—産科の立場から」

19）左合治彦：日産婦東京地方部会誌、58,3,288-292(2009)「一絨毛膜双胎の異常に対する胎児手術」

20） 左合治彦、林 聡、青木宏明：周産期医学（アウトカムからみた周産期管理）、39,10,1381-1385(2009)

「胎児治療」

21） 緒方 勤：Pediatric Endocrinology Reviews 抄訳シリーズ. No. 3. ジャパンメディアートパブリッシング、2–3 (2010)

「内分泌攪乱物質：特に性分化・発達にたいする影響について」

22）緒方勤：Horm Front Gynecol（特集：エピジェネティクス・ゲノムインプリンティング）、17, 12, 361–368 (2010)

「生殖補助医療とインプリンティング異常」

23）深見真紀、伊達木澄人、緒方勤：Horm Front Gynecol（目で見る生殖内分泌疾患の診断と治療）、17,2,4-8(2010)

「中枢性性腺機能低下症」

24） 左合治彦、林 聪、杉林里佳、江川真希子、佐々木愛子：産婦人科治療、101,5,538-543(2010)「胎児治療の適応と限界」

25）緒方 勤，位田忍，堀川玲子：臨床泌尿器科、65, 12, 897–902 (2011)「性分化疾患の分類と社会的性の決定について」

26）緒方勤：小児内科（ちょっと気になる症候のみかた考え方）、43,10,1795-1799(2011)「外性器の異常（性分化）」

27) 緒方勤：Fetal & Neonatal Medicine、3, 3, 101–102 (2011)

「エピジェネティクス・インプリンティングと胎児・胎盤の成長・発達」

28） 緒方 勤：卵子学（森崇英 総編集）、京都大学学術出版会、88-100 (2011)「性分化疾患」

29) 緒方 勤: 遺伝カウンセリングハンドブック（福嶋義光 編集）、メディカルドゥ、130–131 (2011)

「性分化疾患における遺伝カウンセリング」
30）緒方勤：生殖卵総学：臨床への進展（石塚文平 編集）、医歯薬出版株式会社、17–25 (2011)「減数分裂：基礎知識と臨床の進展」

31）緒方勤：Pediatric Endocrinology Reviews 抄訳シリーズ．No.26．ジャパンメディアートパブリッシング、4–5 (2011)

「多様なスクレオチド除去修復(NER)とその医学的意義」

32） 緒方 勤: 内分泌・糖尿病内科学 (森昌朋 編集)、シュプリンガージャパン、168–170 (2011) 「性腺機能低下症」

33） 中村美智子、野々村克也、深見真紀、宮戸真美、須川史啓、緒方 勤：日本小児泌尿器科学会雑誌、20,1,33–37(2011)

「Mamldlは、マウスライディッヒ腫瘍細胞において、ステロイド合成酵素遺伝子Cyp17a1の発現調節を介し、テストステロン産生に関わっている」

34) 緒方勤：今日の小児治療指針15版、医学書院、244–245 (2012)

「原発性性腺機能低下症」

## （2） 口頭発表（学会等）

1) T. Ogata: The Third Workshop Pediatric Andrology, Basel, Switzerland, 2009. "MAMALD1 for hypospadias and 46,XY disorders of sex development."

2) T. Ogata: The Third Workshop Pediatric Andrology, Basel, Switzerland, 2009.

“Backdoor pathway to dihydrotestosterone identified in POR deficiency.”

3) T. Ogata: The Third Workshop Pediatric Andrology, Basel, Switzerland, 2009. "ESR1 and cryptorchidiam/hypospadias (the susceptibility to environmental disruptors)."

4) T. Ogata: The Seminar for Department of Physiology, Development & Neuroscience, Cambridge, England, 2009.

“(Epi)genetic mechanisms leading to the development of upd(14)pat/mat phenotypes.”

5) T. Ogata: The 9th International Congress of Andrology, Barcelona, Spain, 2009. "Hypospadias."

6) T. Ogata: The Seminar for Human Molecular Genetics, Prince Henry's Institute of Medical Research, Monash Medical Centre, Melbourne, Australia, 2009.

“Gentic mechanisms involved in hypospadias.”

7) T. Ogata: Disorders of sex development: underlying molecular causes, clinical management and future strategies, Melbourne, Australia, 2009.

“Clinical and molecular studies on Japanese patients with DSD.”

8) T. Ogata: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“Gentic causes of hypospadias. Symposium of syndromic DSD.”

9) T. Ogata: The 14th Annual Scientific Meeting of Korean Society for Pediatric Endocrinology, Seoul, Korea, 2009.

“Silver-Russell syndrome as a human imprinting disorder. Prenary Lecutre.”

10) T. Ogata: The 14th Annual Scientific Meeting of Korean Society for Pediatric Endocrinology,
Seoul, Korea, 2009.

“SHOX haploinsufficiency: lessons from clinical studies. Special Lecutre.”

11) T. Ogata: The International Ovarian Conference 2009, Tokyo, Japan, 2009. "Pathogenesis of POF."

12）緒方勤：市民提案の循環型社会をめざす会（2009）「化学物質と子どもの体への影響」

13）緒方勤：第2回博多シンポジウム（2009）「性分化異常症（尿道下裂）と内外因子」

14）緒方勤：第18回東海新生児研究会（2009）「胎児成長発達とゲノムインプリンティング」

15）緒方 勤：第14回鹿児島小児内分泌研究会（2009）「性分化異常症：分子基盤と臨床的知見」

16) M. Kagami, M. Fukami, M. O'Sullivan, A. Green, S. Takada, F. Kato, A. Ferguson-Smith and T. Ogata: The 24th Naito Conference, Sapporo, Japan, 2009.

“Essential role of the MEG3-DMR in the regulation of the maternally inherited human chromosome 14q32.2 imprinting region.”

17) MP. Brandão, M. Fukami, BB. Mendonça, M. Gerdulo, S. Domenice, IJP. Arnhold, T. Ogata and EMF. Costa: The Endocrine Society's 91st Annual Meeting, Washington, USA, 2009.

“A Novel Gain of function Mutation in the MAMLD1 gene in patients with Undetermined 46,XY Disorders of Sex Development.”

18) MP. Brandão, EMF. Costa, M. Fukami, MG. Santos, NP. Pereira, S. Domenice, T. Ogata and BB. Mendonça: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“MAMLD1 Homozygous gain-of-function missense mutation causing 46,XX disorder of sex development in a virilized female.”

19) S. Dateki, K. Kosaka, K. Hasegawa, M. Fukami, K. Muroya, M. Adachi, K. Motomura, N. Azuma, H. Tanaka, T. Tajima, H. Moriuchi and T. Ogata: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“Heterozygous OTX2 mutations are associated with variable pituitary hormone deficiency.”

20) K. Matsuo, S. Suzuki, M. Maimaiti, T. Mulai, T. Hamajima, K. Motomura, Y. Naiki, T. Ogata, T. Tajima, T. Hasegawa and K. Fujieda: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“Evaluation of sensitive detection methods for somatic mosaicism of GNAS1 mutation in patients with McCune-Albright syndrome.”

21) MP. Brandão, M. Fukami, BB. Mendonça, MG. Santos, S. Domenice, IJP. Arnhold, T. Ogata and EMF. Costa: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“A gain of function mutation in the MAMLD1 discloses a new pathway in the etiology of 46,XY dosoeders of sex development.”
22) K. Nakabayashi, W. Yoshida, K. Yamazawa, M. Kusumi, T. Ogata and K. Hata: The 47th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics, Baltimore, USA, 2009.

“MeDIP-chip detection and quantitative DNA methylation analysis of differentially methylated regions in imprinted loci.”

23）和田友香、深見真紀、須川史啓、宮戸真美、緒方勤：第112回日本小児科学会学術集会(2009)

「MAMLD1遺伝子におけるスプライス部位変異（IVS4-2A>G）の検討」

24）和田友香、深見真紀、緒方勤：第54回日本人類遺伝学会（2009）「MAMLD1遺伝子におけるスプライス部位変異（IVS4-2A＞G）の検討

25）宫戸真美、中村美智子、須川史啓、深見真紀、宮戸健二、菊水健史、小川佳宏、緒方勤：第43回日本小児内分泌学会（2009）

「Mamlld1発現異常が引き起こすホルモン産生と摂食調節の解析」

26）加藤芙弥子、深見真紀、和田友香、マイラブランダオ、中村美智子、上松あゆみ、長谷川奉延、宮戸真美、緒方勤：第43回日本小児内分泌学会（2009）

「MAMLD1異常症：新規遺伝子変異の同定と変異陽性患者の表現型」

27) M. Fukami, G. Nishimura, K. Homma, T. Nagai, K. Hanaki, T. Ishii, M. Adachi, T. Tajima, Y.

Hasegawa, T. Hasegawa, R. Horikawa, K. Fujieda and T. Ogata: 第32回日本分子生物学会年会 (2009)

“Cytochrome P450 Oxidoreductase Deficiency: Identification and Characterization of Biallelic Mutations and Genotype-Phenotype Correlations in 36 Japanese Patients.”

28) M. Miyado, M. Nakamura, M. Fukami, K. Miyado, T. Kikusui, Y. Ogawa and T. Ogata: 第32回日本分子生物学会年会（2009）

“Impaired expression of Mamld1 disturbs production of steroid hormones and feeding regulation.”

29) X. Qin, H. Zaha, R. Nagano, J. Yonemoto, H. Sone and J. Yoshinaga: 第12回日本内分泌攪乱化学物質学会 研究発表会（2009）

“Estrogenic activities of endocrine-disrupting chemicals and their effects on male genital disorders related genes expression.”

30) H. Sone, L. Yang, T. Fukuda, H. Akanuma, R. Nagano and H. Zaha: 21st Cent. Adv. Mol. Toxicol. Environ. Chem. Pathog. Dis., Tokyo, Japan, 2009.

“The effect of low dose BPA on cell proliferation and senescence in human mammary epithelial cells.”

31) H. Sone, S. Imanishi, M. Okura, H. Zaha, H. Shiraishi and H. Fujimaki: PPTOX II : Role of environmental stressors in the developmental origins of disease, Miami, USA, 2009.

“Prenatal exposure to permethrin inhibits brain development via disruption of vascular development in mice.”

32) X. Qin, H. Zaha, J. Yoshinaga, J. Yonemoto and H. Sone: 29th Int. Symp. Halogenat. Persistent Org. Pollut.-DIOXIN, Beijing, China, 2009.

“Association of AHR and ESR1-responsive gene variations with susceptibility to endocrinedisrupting chemicals in risk of male genital disorders.”

33) A. Anami, S. Hayashi, Y. Sugo and H. Sone: 19th World Congress on Ultrasound in Obstetrics
and Gynecology, Hamburg, Germany, 2009.

“The characterization of ultrasound examination to predict twin one fetal demise in monochorionic diamniotic twin pregnancies.”

34) S. Hayashi, K. Ishii, N. Kato, Y. Takahashi, M. Nakata, J. Murotuki, T. Murakoshi, Y. Nanba, Y. Ito and H. Sago: 19th World Congress on Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, Hamburg, Germany, 2009.

“Perinatal outcome of monochorionic twin pregnancies complicated by amniotic fluid discordance without twin-twin transfusion syndrome.”

35) S. Hayashi, H. Sago, M. Hanaoka, M. Horiya, A. Anami, T. Nakamura, Y. Ito, T. Chiba, M. Kitagawa and M. Natori: 19th World Congress on Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, Hamburg, Germany, 2009.

“Postnatal outcome in twin reversed arterial perfusion treated with radiofrequency ablation.”

36) H. Sago, S. Hayashi, N. Kato, Y. Nanba, Y. Ito, H. Hasegawa, H. Kawamoto, M. Saito, J. Murotsuki, Y. Takahashi, M. Nakata, K. Ishii and T. Murakoshi: 19th World Congress on Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, Hamburg, Germany, 2009.

“Risks and the outcome of twin-to-twin transfusion syndrome after fetoscopic laser surgery.”

37) M. Hanaoka, S. Hayashi, M. Horiya, A. Anami, R. Oi and H. Sago: 19th World Congress on Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, Hamburg, Germany, 2009.

38) H. Sago: 11th Korea – Japan Joint Conference of Obstetrics and Gynecology, Soul, Korea, 2009. "The Current State of Fetal Therapy in Japan."

39) T. Ogata: The 14th International Congress of Endocrinology, Kyoto, Japan, 2010.

“Disorders of sex development: Shrinking black box. In: Disorders in gonadal differentiation and development.”

40) T. Ogata, R. Yoshida and F. Massart: The 49th Annual Meeting of European Society for Paediatric Endocrinology, Prague, Czech Republic, 2010.

41) T. Ogata: The 6th Biennial Scientific Meeting of the Asia Pacific Paediatric Endocrinology, Xi'an, China, 2010.

“Endocrine Disruptors – the environment and its impact on paediatric endocrinology. In: Hot Topic Session.”

42）緒方勤：松葉のダイオキシン調査2010実行委員会（2010）「子どもの健康と環境ホルモン」

44）緒方勤：第13回胎児遺伝子診断研究会（2010）「胎児成長発達とゲノムインプリンティング」

45) 緒方 勤：第249回日本小児科学会東海地方会特別講演（2010）
「性分化疾患の発症機序：遺伝-環境相互作用の観点から」

46） 緒方 勤：日本アンドロロジー学会第29回学術大会・第16回精子形成・精巣毒性研究会共同開催学会特別講演（2010）

「性分化疾患研究の最前線」

47）緒方 勤、中村美智子、宮戸真美、深見真紀：第28回内分泌代謝サマーセミナー（2010）「MAMLD1変異とテストステロン産生障害：変異陽性患者およびノックアウトマウスの表現型解析とin vitro機能解析」

48) M. Miyado, M. Nakamura, M. Fukami, K. Miyado and T. Ogata: 第33回日本分子生物学会年会 (2010)

“Impaired expression of Mamld1 disturbs the gene expression of steroidogenic enzymes.”

49） 宮戸真美、中村美智子、深見真紀、宮戸健二、緒方勤：第44回日本小児内分泌学会（2010）「ステロイドホルモン産生におけるMamld1の機能解析」

50） 中村美智子、深見真紀、宮戸真美、須川史啓、緒方 勤、野々村克也：第19回日本小児泌尿器科学会（2010）

「Mamld1は、マウスライディッヒ腫瘍細胞において、ステロイド合成酵素遺伝子の発現調節を介し、テストステロン産生に関わっている」

51）左勝則、青木宏明、宮田あかね、三井真理、池谷美樹、渡辺典芳、小澤伸晃、塚原優己、久保隆彦、村島温子、左合治彦、北川道弘：第62回日本産婦人科学会学術講演会（2010）「妊娠初期ならびに中期血压値による妊娠高血压症候群の発症予測」

52）須郷慶信、林聡、大石由利子、堀谷まどか、加藤有美、青木宏明、高橋宏典、三浦裕美子、三原慶子、佐々木愛子、左合治彦、名取道也：第62回日本産婦人科学会学術講演会（2010）「当センターにおける妊娠30週の胎児超音波スクリーニング検査の検討」

53）佐々木愛子、小澤伸晃、林聡、澤井英明、増崎英明、平原史樹、左合治彦：第62回日本産婦人科学会学術講演会（2010）

「日本における出生前診断の動向（2003～2008年）」

54) T. Ogata: 6th Copenhagen Workshop on Endocrine Disrupters (COW 2011), Copenhagen, Denmark, 2011.

“Genetic susceptibility to endocrine disrupters: Estrogen receptor polymorphisms.”

56) T. Ogata: Hamamatsu DOHaD Conference, Hamamatsu, Japan, 2011. "Genetic susceptibility to endocrine disrupters: Estrogen receptor polymorphisms."

57） 緒方 勤：国際医療福祉大学熱海病院学術講演会（2011）

「子どもの成長と成熟」

58）緒方勤：第1回乳幼児発達指導研究会（2011）「乳幼児期および思春期の性について」

59）緒方勤：浜松小児科医会（2011）「子どもを取り巻く環境と健康」
60）緒方勤：第81回京都内分泌同好会（2011）「性分化疾患研究の進歩」

61）緒方勤：第3回岐阜小児内分泌学術講演会（2011）「性分化疾患の分子基盤」

62）緒方勤：第12回山陰内分泌研究会（2011）「性分化疾患の分子基盤:update」

63）緒方勤：第40回Medical Photonics Seminar（2011）「子どもを取り巻く環境と小児の健康」

64）緒方勤：第2回生殖医療研究会（2011）

「先天奇形症候群とゲノムインプリンティング」

65) J. Yonemoto, J. Kawahara, H. Sone, T. Hattori, T. Matsumura, Y. Ohya and S. Sugama: 31th International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants, Brussels, Belgium, 2011. "Prenatal Exposure to OH-PCBs in Relation to Body Weight and Neurodevelopment."

66）宮戸真美：第3回領域会議 性差構築の分子基盤（2011）「Mamld1遺伝子の胎仔精巣における機能解析」

67） 宮戸真美、中村美智子、宮戸健二、緒方 勤、深見真紀：第45回日本小児内分泌学会（2011）「精巣におけるMamld1の機能解析」

68）鏡雅代、松岡健太郎、加藤芙弥子、宮戸真美、松原圭子、深見真紀、山中美智子、鈴森伸宏、永井敏郎、緒方勤：第45回日本小児内分泌学会（2011）

「RTL1遺伝子の胎盤における機能の解明：胎盤発育不全、子宮内胎児発育遅延の原因解明をめざして」

69）五十嵐麻希、加藤芙弥子、辻克和、緒方勤、深見真紀：第56回日本人類遺伝学会・第11回東アジア人類遺伝学会 共同大会（2011）

「アンドロゲン受容体遺伝子サイレント変異を有する不完全型アンドロゲン不応症の1例」

70） 秦咸陽、小島祥敬、水野健太郎、上岡克彦、吉永淳、米元純三、林祐太郎、群健二郎、緒方勤、曾根秀子：第14回日本内分泌攪乱化学物質学会研究発表会（2011）

「尿道下裂男児の皮膚細胞を用いた環境内分泌かく乱化学物質の目的遺伝子の解明」

71）米元純三、河原純子、曾根秀子、服部達也、松村徹、大矢幸弘、洲鎌盛一：第14回日本内分泌攪乱化学物質学会研究発表会（2011）

「保存臍帯中OH-PCB濃度と2歳児の体重、軽度発達障害との関係」

72）宫戸真美、中村美智子、宮戸健二、緒方勤、深見真紀：第34回日本分子生物学会（2011）“Mamld1 regulates expression of steroidogenic enzyme genes in mouse fetal testes.”

73）五十嵐麻希、加藤芙弥子、辻克和、緒方勤、深見真紀：第34回日本分子生物学会（2011）「アンドロゲン受容体遺伝子サイレント変異を有する不完全型アンドロゲン不応症の1例」

74）須郷慶信、林聡、大石由利子、堀谷まどか、加藤有美、青木宏明、高橋宏典、三浦裕美子、三原慶子、佐々木愛子、左合治彦、名取道也：第62回日本産婦人科学会学術講演会（2011）「当センターにおける妊娠30週の胎児超音波スクリーニング検査の検討」

75）佐々木愛子、小澤伸晃、林聡、澤井英明、増崎英明、平原史樹、左合治彦：第62回日本産婦人科学会学術講演会（2011）