Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
<査読付論文に準ずる成果発表>（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可）特に記載すべき事項はない。

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1) T. Ogata: The Third Workshop Pediatric Andrology, Basel, Switzerland, 2009. "MAMALD1 for hypospadias and 46,XY disorders of sex development."

2) T. Ogata: The Third Workshop Pediatric Andrology, Basel, Switzerland, 2009.

“Backdoor pathway to dihydrotestosterone identified in POR deficiency.”

3) T. Ogata: The Third Workshop Pediatric Andrology, Basel, Switzerland, 2009.

“ESR1 and cryptorchidiam/hypospadias (the susceptibility to environmental disruptors).”

4) T. Ogata: The Seminar for Department of Physiology, Development & Neuroscience, Cambridge, England, 2009.

“(Epi)genetic mechanisms leading to the development of upd(14)pat/mat phenotypes.”

5) T. Ogata: The 9th International Congress of Andrology, Barcelona, Spain, 2009.

“Hypospadias.”

6) T. Ogata: The Seminar for Human Molecular Genetics, Prince Henry's Institute of Medical Research, Monash Medical Centre, Melbourne, Australia, 2009.

“Gentic mechanisms involved in hypospadias.”

7) T. Ogata: Disorders of sex development: underlying molecular causes, clinical management and future strategies, Melbourne, Australia, 2009.

“Clinical and molecular studies on Japanese patients with DSD.”

8) T. Ogata: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

"Gentic causes of hypospadias. Symposium of syndromic DSD."

9) T. Ogata: The 14th Annual Scientific Meeting of Korean Society for Pediatric Endocrinology, Seoul, Korea, 2009.

"Silver-Russell syndrome as a human imprinting disorder. Prenary Lecutre."

10) T. Ogata: The 14th Annual Scientific Meeting of Korean Society for Pediatric Endocrinology, Seoul, Korea, 2009.

11) T. Ogata: The International Ovarian Conference 2009, Tokyo, Japan, 2009. "Pathogenesis of POF."

15) S. Dateki, K. Kosaka, K. Hasegawa, M. Fukami, K. Muroya, M. Adachi, K. Motomura, N. Azuma, H. Tanaka, T. Tajima, H. Moriuchi and T. Ogata: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“Heterozygous OTX2 mutations are associated with variable pituitary hormone deficiency.”

16) K. Matsuo, S. Suzuki, M. Maimaiti, T. Mulai, T. Hamajima, K. Motomura, Y. Naiki, T. Ogata, T. Tajima, T. Hasegawa and K. Fujieda: The 8th Joint meeting, ESPE-LW PES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“Evaluation of sensitive detection methods for somatic mosaicism of GNAS1 mutation in patients with McCune-Albright syndrome.”
31) T. Ogata: The 6th Biennial Scientific Meeting of The Asia Pacific Paediatric Endocrinology, Xi'an, China, 2010.

“Endocrine Disruptors – the environment and its impact on paediatric endocrinology. In: Hot Topic Session.”

34）緒方勤：第249回日本小児科学会東海地方会特別講演（2010）「性分化疾患の発症機序：遺伝-環境相互作用の観点から」

35） 緒方 勤：日本アンドロロジー学会第29回学術大会・第16回精子形成・精巣毒性研究会共同開催学会特別講演(2010)

「性分化疾患研究の最前線」

36) T. Ogata: 6th Copenhagen Workshop on Endocrine Disrupters (COW 2011), Copenhagen, Denmark, 2011.

“Genetic susceptibility to endocrine disrupters: Estrogen receptor polymorphisms.”

37) T. Ogata and M. Fukami: The 13th European Congress of Endocrinology (ECE 2011), Rotterdam, Netherlands, 2011.

“Disorders of Sex Development: Recent Progress.”

38) T. Ogata: Hamamatsu DOHaD Conference, Hamamatsu, Japan, 2011. "Genetic susceptibility to endocrine disrupters: Estrogen receptor polymorphisms."

39) J. Yonemoto, J. Kawahara, H. Sone, T. Hattori, T. Matsumura, Y. Ohya and S. Sugama: 31th International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants, Brussels, Belgium, 2011. "Prenatal Exposure to OH-PCBs in Relation to Body Weight and Neurodevelopment."

40）宮戸真美:第3回領域会議 性差構築の分子基盤(2011)「MamId1遺伝子の胎仔精巣における機能解析」

41）宮戸真美、中村美智子、宮戸健二、緒方勤、深見真紀：第45回日本小児内分泌学会（2011）「精巣におけるMamId1の機能解析」

42）鏡雅代、松岡健太郎、加藤芙弥子、宮戸真美、松原圭子、深見真紀、山中美智子、鈴森伸宏、永井敏郎、緒方勤：第45回日本小児内分泌学会（2011）

「RTL1遺伝子の胎盤における機能の解明：胎盤発育不全、子宮内胎児発育遅延の原因解明をめざして」

43）五十嵐麻希、加藤芙弥子、辻克和、緒方勤、深見真紀：第56回日本人類遺伝学会・第11回東アジア人類遺伝学会共同大会（2011）

「アンドロゲン受容体遺伝子サイレント変異を有する不完全型アンドロゲン不応症の1例」

44）秦咸陽、小島祥敬、水野健太郎、上岡克彦、吉永淳、米元純三、林祐太郎、群健二郎、緒方勤、曾根秀子：第14回日本内分泌攪乱化学物質学会研究発表会（2011）

「尿道下裂男児の皮膚細胞を用いた環境内分泌かく乱化学物質の目的遺伝子の解明」

45）米元純三、河原純子、曾根秀子、服部達也、松村徹、大矢幸弘、洲鎌盛一：第14回日本内分泌攪乱化学物質学会研究発表会（2011）

「保存臍帯中OH-PCB濃度と2歳児の体重、軽度発達障害との関係」

46）宮戸真美、中村美智子、宮戸健二、緒方勤、深見真紀：第34回日本分子生物学会（2011）“MamId1 regulates expression of steroidogenic enzyme genes in mouse fetal testes.”

48）須郷慶信、林聡、大石由利子、堀谷まどか、加藤有美、青木宏明、高橋宏典、三浦裕美子、三原慶子、佐々木愛子、左合治彦、名取道也：第62回日本産婦人科学会学術講演会（2011）

「当センターにおける妊娠30週の胎児超音波スクリーニング検査の検討」

49）佐々木愛子、小澤伸晃、林聡、澤井英明、増崎英明、平原史樹、左合治彦：第62回日本産婦人科学会学術講演会（2011）

「日本における出生前診断の動向（2003～2008年）」

### 7. 研究者略壓

課題代表者: 緒方 勤

1956年生まれ、慶応義塾大学医学部卒業、医学博士、現在、浜松医科大学医学部小児科教授、
## 研究参画者

## (1) : 緒方 勤 (同上)

## (2) 1): 曾根 秀子

1958生まれ、東邦大学薬学部大学院修了、薬学博士、現在、独立行政法人国立環境研究所 環境リスク研究センター 健康リスク評価研究室 主任研究員

## 2 ): 深見 真紀

1965生まれ、慶應義塾大学医学部大学院修了、医学博士、現在、独立行政法人国立成育医療研究センター研究所 分子内分泌研究部 部長
# 小児先天奇形発症における環境リスク評価法の基盤整備に関する研究

(1) バイオマーカーの開発に関する研究

浜松医科大学医学部小児科/（独）国立成育医療研究センター研究所分子内分泌研究部 緒方 勤

（独）国立成育医療研究センター研究所分子内分泌研究部 深見真紀

（独）国立環境研究所環境リスク研究センター健康リスク研究室 曾根秀子 <研究協力者>

（独）国立成育医療研究センター研究所分子内分泌研究部 吉田理恵・宮戸真美

（独）国立成育医療研究センター病院周産期センター 左合治彦・中村知夫

（独）国立環境研究所環境リスク研究センター環境リスク研究推進室 青木康展

平成21～23年度累計予算額：44,277千円（うち、平成23年度予算額：14,095千円）

予算額には、間接経費を含む。

[要旨] 本研究は、尿道下裂などの小児先天奇形発症を対象とする環境リスク評価法の基盤整備を行うことを目的とする。このために、評価法の指標となるバイオマーカーの開発を行う。バイオマーカーとしては、相関解析および機能解析で有意と判定された遺伝子多型・ハプロタイプ、および、疾患責任遺伝子のメチル化パターンや発現量を用いる。そして、連結可能匿名化の臨床情報採取とバイオマーカーとして使用しうる多型・ハプロタイプの頻度や疾患責任遺伝子の発現量などのプロファイリングを行い、今後の遺伝—環境相互作用や遺伝子間相互作用の研究のために役立てることを目標とする。

これまでに、バイオマーカーとしての多型・ハプロタイプの解析を行い、エストロゲン受容体α遺伝子（ESR1）の外陰部異常症感受性ハプロタイプと絶対連鎖不平衡を示す2,244 bpの微小欠失を同定し、これが、日本人およびイアタリア人においても外陰部異常症発症のリスク因子であることを見いだした。また、近年、発症頻度の増加が報告されている精子形成障害について、日本人精子形成障害患者と妊よう性陽性男性におけるハプロタイプ関連解析から、ESR2遺伝子の中央から3'領域に存在する約40 kbの連鎖不平衡領域のTGTAGA特定ハプロタイプが、精子形成障害の感受性であることを見いだした。さらに、化学物質応答遺伝子群の網羅的解析として、96個のSNP解析を行った結果、外陰部異常症発症感受性因子をダイオキシンングナル伝達関連遺伝子のAHRで2個とARNT2で1個、ビスフェノールA受容体遺伝子とされるNR1I2で3個検出し、CYP1A1で4個と男性ホルモン産生酵素であるCYP17A1で3個検出した。バイオマーカーとしての単一遺伝子メチル化パターンと発現量変化の同定を行い、尿道下裂患者のSRD5A2遺伝子のメチル化頻度と発現量との相関関係をみたところ、有意に逆相関することがわかった。さらに、口蓋裂は環境化学物質暴露との関係が危惧される疾患の一つであり、外陰部異常症と同様、口蓋組織におけるメチル化は口蓋裂の発症に関与している可能性が推測される。

[キーワード] 小児先天奇形、環境リスク評価、バイオマーカー、エストロゲン受容体α遺伝子（ESR1）、メチル化パターン
### 1. はじめに

近年、停留精巣や尿道下裂などの先天奇形が増加しているという疫学的データが日本や欧米諸国から報告され、大きな社会的問題となっている。同様の現象は、成人における精子形成障害や精巣腫瘍、および、多くの野生動物でも観察されている。そして、これらの現象に共通する原因として、内分泌攪乱物質の影響が推測されている。特に、大部分の内分泌攪乱化学物質が有する女性ホルモン効果は、このような男性化障害を生じる重要な原因の一つであると推測される。さらに、内分泌攪乱物質として作用しうる環境化学物質の生産量・排出量は、近年増加している。したがって近年の小児は、暴露量の観点から、成人よりも高いリスクに曝されていると推測される。

われわれは、このような先天異常の発症が、内分泌攪乱物質の暴露量や暴露時期の他に、個体の遺伝的感受性にも支配されるという作業仮説のもとに、研究を行ってきた。そして、最も重要な成果は、エストロゲン受容体α遺伝子（ESR1）のハプロタイプ解析で得られた $ ^{1,2} $ ）。これは、大部分の内分泌攪乱物質がエストロゲン受容体を介して女性ホルモン様効果を発揮することから、エストロゲン受容体遺伝子多型が遺伝的感受性に強く関与すると考えられることに一致する。さらに、感受性ハプロタイプ領域の構造解析を行い、ESR1遺伝子イントロン内微小欠失は感受性亢進を招く構造変化であることを示唆する結果が得られた。しかし、これらの多型・ハプロタイプをバイオマーカーとして使用するには、機能解析の裏付けが必要である。また、解析された遺伝子多型・ハプロタイプが少数にとどまるために、他の大きな影響を持つ因子が同定されていない可能性がある。

また、精子形成障害は、男児外陰部異常症と同様、発症頻度の増加が報告されており、その原因としてエストロゲン様作用を有する環境化学物質との関連性が示唆されている。さらに、口蓋裂も環境化学物質の影響が危惧されている疾患の一つである。環境化学物質はエピジェネティク修飾を介して遺伝子発現を抑制し、疾患発症を招くことが示唆されている。このことを明らかにするためには、当該遺伝子が発現および作用している組織を用いて解析を行わなければならない。そこで、臨床的に採取可能な末梢血や外陰部皮膚組織、あるいは、臨床的に採取できない性腺などはモデル動物（マウス暴露実験等）の検体を用いて解析をすることが必要である。

以上のことから、小児先天奇形発症における環境リスク評価法の基盤整備には、バイオマーカーの開発が重要であると考えられる（図(1)−1）。
## サブテーマ1:バイオマーカーの開発

1. バイオマーカーとしての多型・ハプロタイプの同定

① 既報告の感受性遺伝子多型・ハプロタイプの機能解析

②未知の感受性因子の同定-関連解析、機能解析

③ 感受性因子の世代間頻度解析

2. バイオマーカーとしての単一遺伝子におけるメチル化パターンと発現量変化の同定

①臨床検体（末梢血や外陰部皮膚組織）の解析

② マウス暴露実験

図(1)-1 サブテーマ1

## 2 ．研究開発目的

本研究は、尿道下裂などの小児先天奇形発症を対象とする環境リスク評価法の基盤整備を行うことを目的とする。このために、評価法の指標となるバイオマーカーの開発を行う。バイオマーカーとしては、相関解析および機能解析で有意と判定された遺伝子多型・ハプロタイプ、および、疾患責任遺伝子のメチル化パターンや発現量を用いる。そして、連結可能匿名化の臨床情報採取とバイオマーカーとして使用しうる多型・ハプロタイプの頻度や疾患責任遺伝子の発現量などのプロファイリングを行い、今後の遺伝—環境相互作用や遺伝子間相互作用の研究のために役立てることを目標とする。

### 3. 研究開発方法

## （１）エストロゲン受容体α遺伝子（ESR1）に関する研究

## 1 ）ESR1遺伝子内の特定ハプロタイプに関する研究

日本人男性性機能障害患者（停留精巣患者、尿道下裂患者、小陰茎患者、精子形成障害患者）および日本人正常男性（正常男児、正常成人男性）、さらにイタリア人外陰部異常症男児と正常男児において、ESR1ハプロタイプ解析を行う。

また、感受性ハプロタイププロックを直接シークエンス法で解析、両者の配列を比較し、感受性ハプロタイプ領域の構造解析を行う。微小欠失の5'側、内側、3'側に設計した3種類のプライマーを用いてPCR反応を行う。微小欠失のないアリルは、260 bpのPCR産物（微小欠失の5'側および内側に設計したプライマーによる）が得られ、2,493 bpのPCR産物（微小欠失の5'側および3'側に設計したプライマーによる）は得られない。微小欠失のあるアリルは、239 bpのPCR産物（微小欠失の5'側および内側に設計したプライマーによる）が得られる。PCR産物サイズをフ
ラグメント解析にて測定する。

## 2 ）ESR1遺伝子における微小欠失のin vivo機能解析に関する研究

ESR1遺伝子における微小欠失がエストロゲン効果を増強する機序を解明する。この欠失が、同領域に存在する抑制型マイクロRNAを消失させている可能性、スプライスの量的変化により正常エストロゲン受容体を多く産生している可能性、メッセンジャーRNAの安定化を招いている可能性について解析する。この微小欠失のin vivo機能解析を進めるため、ノックインマウスを作製する。

## （２）エストロゲン受容体β遺伝子（ESR2）に関する研究

## 1 ）ESR2遺伝子内の特定ハプロタイプに関する研究

対象は、日本人精子形成障害患および妊よう性の確認された日本人成人男性とした。症例は、正常男性核型、非閉塞性無精子症、生殖器および生殖器外の合併奇形なし、Y染色体長腕の微小欠失なし、特別な環境要因なし、という条件を満足した。

SNP解析は、全120 kb（ESR2遺伝子プロモーター領域50 kbを含む）に、8.2 kbから17.7 kb間隔で分布する9つをTaqMan法で解析する。解析対象SNPは、データベースに登録されているSNPから、tag SNPを含み、ESR2遺伝子上にほぼ等間隔に分布するSNPのうち、日本人におけるマイナーアリル頻度が15％以上のものを選択する。ハプロタイプ解析は、PENHAPLOを用いて連鎖不平衡係数「D'」を推定し、LD mapを作成し、LD blockにおけるハプロタイプ頻度を推定する。

## （３）男児生殖器疾患における環境化学物質感受性バイオマーカーの開発に関する研究

## 1 ）男児外陰部異常症発症と関連しうる遺伝子の網羅的関連解析に関する研究

数理的および作用機序から男児外陰部異常症発症に関連しうる遺伝子を網羅的にピックアップし、HapMapプロジェクトを基にSNPおよびハプロタイプ関連解析を行う。また、見いだされた多型・ハプロタイプの機能解析、異なる人種間における比較を行う。

## 2 ）外陰部皮膚線維芽細胞を用いた暴露実験に関する研究

外陰部皮膚線維芽細胞を用いたin vitroにおけるbisphenol-A（BPA）、estroadiol（E2）、TCDDの暴露実験を行う。ヒト外陰部皮膚線維芽細胞は、10％牛胎児血（FBS）を含んだDMEM/Ham's F-12培地で37℃、5％CO₂のインキュベーター内で培養する。化学物質曝露の実験時は、ステロイドフリー条件下で培養するために、曝露48時間前に5％charcoal/dextran-treated FBSを含むphenol red-free DMEM/Ham's F-12に培地を交換する。化学物質の曝露は、24時間行う。

## （４）単一遺伝子におけるメチル化パターンと発現量変化の同定に関する研究

## 1 ）男児外陰部異常症検体（手術時外陰部皮膚）を用いた解析に関する研究

環境化学物質はエピジェネティク修飾を介して遺伝子発現を抑制し、疾患発症を招く可能性がある。これは、当該遺伝子が発現し、作用している組織を用いなければ解析できない。本研究では、男児外陰部異常症（停留精巣や尿道下裂患者の手術時外陰部皮膚検体）の治療目的で手術を受けた患者から組織を入手し、メチル化パターンと発現量を解析する（図(1)−2）。
図(1)-2 男児外陰部異常症検体（手術時外陰部皮膚）情報

## 2 ）ダイオキシン（TCDD）暴露マウスの精巣を用いた解析に関する研究

ヒトでは臨床的に容易に採取できない性腺を用いて、環境化学物質暴露効果の指標となるバイオマーカーを同定するために、TCDDをマウスに暴露して解析を行う。妊娠マウス（妊娠12.5日目）にTCDDを1回投与し、出生翌日の精巣を摘出する（図(1)-3）。つぎに、精巣からtotal RNAを抽出後、リアルタイムRT-PCRにより遺伝子の発現を定量する。

図(1)-3 マウスへのTCDD暴露方法

## （５）口蓋裂発症因子に関する研究

口蓋裂は、環境化学物質暴露との関係が危惧される疾患の一つである。口蓋裂は、単一遺伝子疾患としても発症するが、多因子疾患としても発症する。特に、近年種々の感受性因子が同定され、さらに、TCDD暴露が口蓋裂発症を招くことがマウス暴露実験から知られている。したがって、TCDD感受性が高い個体において、口蓋裂が発症しやすいことが推測される。この研究体制の構築ならびに検体集積を行う。

## （６）ESR1陽性細胞株を用いたバイオマーカーの探索に関する研究

ESR1陽性ヒト乳癌細胞株（MCF-7細胞）、ESR1陽性ヒト卵巣癌細胞株（BG1Luc4E2細胞）およびERs-陰性ヒト前立腺癌細胞株（LNCaP細胞）を用いたin vitroにおけるBPA、BBP、o,p'-DDTとE2の暴露実験を行う。化学物質の曝露は24時間行い、total RNAを抽出後、リアルタイムRT-PCRにより遺伝子の発現を定量する。ESR1の特異的拮抗剤として、1,3-Bis(4-hydroxyphenyl)-4-methyl-5-[4-(2-piperidinylethoxy)phenol]-1H-pyrazole dihydrochloride
(MPP) を使用する。

## 4 ．結果及び考察

## （１）エストロゲン受容体α遺伝子（ESR1）に関する研究

1）ESR1遺伝子内の特定ハプロタイプに関する研究

ESR1の特定ハプロタイプが停留精巣と尿道下裂の強い感受性因子であり、その本態が感受性ハプロタイプと絶対連鎖不平衡を示す2,244 bpの微小欠失であることを見いだした（図(1)–4）。

・感受性ハプロタイプは、必ずこの微小欠失を伴う

・非感受性ハプロタイプは、必ずこの微小欠失を伴わない

この微小欠失が感受性の本態であることを強く示唆する

図(1)-4 ESR1感受性ハプロタイプに絶対連鎖する微小欠失の同定

詳細を次に示す。ESR1ハプロタイプ解析の結果、ESR1遺伝子の3'領域に約50 kbの連鎖不平衡領域のAGATA特定ハプロタイプが存在し、このブロック内のAGATA特定ハプロタイプが、停留精巣と尿道下裂の強い感受性因子であることを明らかにした。すなわち、疾患発症との関連は、この特定ハプロタイプが劣性効果を有すると仮定したときに、停留精巣においてP=0.0029（オッズ比7.6）、尿道下裂においてP=0.000073（オッズ比13.8）であることを明らかにした。

また、微小欠失の5'側、内側、3'側に設計した3種類のプライマーを用いてPCR反応を行った結果、ESR1感受性ハプロタイプホモ接合体において、複数のSNP、イントロン内反復配列における数bpの欠失および挿入のほか、イントロン6でSNP14から3'側、22 bp下流に2,244 bpの微小欠失が同定された（図(1)-4）。他のマイナーな構造変化の機能は不明であるが、最も大きい構造変化であったこの微小欠失が機能と関係する可能性が高いと考えられる。PCR産物サイズのフラグメント解析の結果、すべての患者および対照において、微小欠失の有無と感受性ハプロタイプの有無が一致した。このことから、日本人において微小欠失と感受性ハプロタイプが絶対連鎖不平衡状態であることが示唆される。

さらに、近年の暴露量増加を反映して、この感受性因子を有する男児が成人男性よりも高リスクにあることを見いだした。世代間の頻度解析から、環境化学物質の暴露量増加が疾患発症に関与することが示唆される（図(1)-5）。
遣伝子型解析結果
非欠失木モ	ヘテロ	欠失木モ	計
成人男性	201	196	35	432
正常男児	47	33	2	82
欠失頻度の比較
成人男性	P值	OR	95%CI
vs 正常男児	0.034	1.527	1.03-2.26

リスクハプロタイプは、現在の小児において疾患を発症しやすい暴露増加の反映

図(1)−5 ESR1感受性ハプロタイプの世代間頻度解析

また、合成エストロゲン製剤であるdiethylstilbestro1（DES）の使用と男児外陰部異常症発症率増加の関係から、暴露量増加のほかにも疾患発症に関与する要因が考えられる。DESは、内因性エストロゲンの代表であるエストラジオールと比べ、エストロゲン受容体にたいして約2倍の結合親和性を有することが知られている。1940年代から1971年までの間、DESが流産防止薬として妊娠に投与され、その結果、尿道下裂を含む男児外陰部異常症発症率が増加した。また、DES投与を受けた妊娠における流早産の増加、DES胎内曝露を受けた女児における膽癌の増加、Wolff管遺残も認められ、DESの妊娠への投与は禁止された。このうち、DES胎内曝露による男児外陰部異常症発症に関しては、DES胎内曝露を受けた男児のうち、妊娠11週以前に曝露した児は妊娠11週以降に曝露した児に比べて、男児外陰部異常症発症率が2倍高かった。これは、DES胎内曝露が男児外陰部異常症発症のリスク要因であり、その作用が曝露時期に影響されることを示しており、環境化学物質の暴露時期が疾患発症に関与することを示唆するものである。

つぎに、ESR1微小欠失頻度は、イタリア人患者においても高いことを見いだした（P=0.011、オッズ比1.94）（表(1)−1）。これらのデータから、ESR1微小欠失は、イタリア人においても外陰部異常症発症のリスク因子であることが示唆される。

表(1)−1 イタリア人男児外陰部異常症患者および対照男児におけるESR1微小欠失

遺伝子型解析結果	欠失あり
ヘテロ	ホモ	欠失なし
尿道下裂患者	(n=13)	7	0	6
停留精巣患者	(n=80)	22	3	55
対照男児	(n=150)	30	1	119

## 2 ）ESR1遺伝子における微小欠失のin vivo機能解析に関する研究

われわれが見いだしたESR1微小欠失のin vivo機能解析を行った。ESR1遺伝子の発現は、外陰部皮膚由来の線維芽細胞および血液由来の不死化リンパ球細胞で低いため、これらの細胞を用いた機能解析には限界があることがわかった。そこで、モデル動物を用いた機能解析を行うこ
とにした。微小欠失の相同領域はマウスには存在しないため、ノックインマウスの作製に着手し、現在のところキメラ率（ES由来細胞の比率）が30–50％とやや低いが、キメラマウスの作製に成功した。ES細胞由来の次世代個体を得るため、このマウスを野生型マウスと交配し、観察を続けているが、ES細胞由来の個体は現在のところ得られていない。また、よりキメラ率が高く、ES細胞由来の次世代個体が得られる確率の高いキメラマウスを得るため、8細胞期胚との融合実験を繰り返したが、キメラ率が50％を超えるキメラマウスは得られていない。これは、何らかの機構（エストロゲン受容体遺伝子機能喪失など）により、ヒト感受性ハプロタイプを持つイントロンを組み込まれた細胞は、正常なマウス個体発生に関与できない可能性が考えられる。目的のノックインマウスは、イントロン領域とはいえ、比較的長い配列がヒト由来のものに置き換わっている。そのため、表現型を野生型マウスと直接比較することが妥当か否か、判断に困難を伴う。したがって、感受性ハプロタイプではないと考えられる、欠損を伴わないヒト由来配列を導入したマウスを作製し、比較に用いる必要がある。のちに、ESにおける相同組換えの確認に成功し、比較的キメラ率の高い（80％）キメラマウスが得られたが、ES細胞由来の子マウスは現在のところ得られていない。これらの結果から、当該イントロンの改変自体が、マウス個体の正常な発生を妨げる等の可能性も考えられる。

## （２）エストロゲン受容体β遺伝子（ESR2）に関する研究

## 1 ）ESR2遺伝子内の特定ハプロタイプに関する研究

精子形成障害は、男児外陰部異常症と同様、近年、発症頻度の増加が報告され、その原因としてエストロゲン様作用を有する内分泌攪乱物質の影響が危惧されている。われわれは、精子形成障害患者におけるエストロゲン受容体β遺伝子（ESR2）ハプロタイプ解析を行った。日本人精子形成障害患者と妊より性陽性男性におけるハプロタイプ関連解析から、ESR2遺伝子の中央から3'領域に存在する約40 kbの連鎖不平衡領域のTGTAGA特定ハプロタイプが、精子形成障害の感受性であることを見いだした（図(1)–6）。

ESR2遺伝子は生殖細胞で発現

ESR2特定ハプロタイプと精子形成障害発症の関連

約60 kbのハプロタイプブロック

TGTAGA	TACGGA	CGCGAG	TGCGGA
<優性樣式>	P值	0.0063	0.078	0.92
オッス比	2.08	0.63	0.98
95%信賴区間	1.23–3.54	0.38–1.05	0.59–1.62
<劣性樣式>	P值	0.026	0.34	0.55
オッス比	2.16	0.58	0.75
95%信賴区間	1.09–4.46	0.17–1.79	0.28–1.96
<遺伝子型様式>	P值	0.0098	0.19	0.83
<Trend test>	P值	0.0029	0.071	0.75

現在、特定ハプロタイプに特有の配列変化を解析中

図(1)-6 精子形成障害患者におけるESR2ハプロタイプ解析
詳細を次に示す。 $ |D'|>0.9 $ の強固なLD blockが、患者＋対照、対照、患者いずれにおいても、SNP2-SNP7を包含する約59.2 kbの領域に見いだされた。上記のLD blockにおけるハプロタイプ頻度を推定した結果、4つの主要なハプロタイプにより構成されていることが明らかとなった。これら4つのハプロタイプ推定頻度の合計は、患者、対照男性ともに99％以上であった。また、患者、対照者間におけるハプロタイプ頻度比較の結果、TGTAGAハプロタイプ頻度は患者で高かった（P=0.0028）。このP値は、ボンフェローニ補正後の有意水準（0.05/4=0.0125）を下回った。特定ハプロタイプと疾患発症の関連を検討した結果、最も低いP値は、TGTAGAハプロタイプに関するtrend testにおいて得られた。このP値（0.0029）は、ボンフェローニ補正後の有意水準（0.05/16=0.003125）を下回った。以上の結果から、TGTAGAハプロタイプは、量的効果を有する精子形成障害発症感受性ハプロタイプであることが示唆される。

## （３）男児生殖器疾患における環境化学物質感受性バイオマーカーの開発に関する研究

## 1 ）男児外陰部異常症発症と関連しうる遺伝子の網羅的関連解析に関する研究

これまでの研究から、AHR、ARNT2、CYP1A2、CYP17A1、およびN1RI2（PXR）の5遺伝子の多型が男児外陰部異常症の発症と関連することが示唆されている。日本人における男児外陰部異常症患者（停留精巣患者、尿道下裂患者およびマイクロペニス患者）および正常者について、前記の5遺伝子とその関連性を調べた。塩基の型は、ゴールデンゲートアレイ（イルミナ社）を用いて測定した。多型解析には、Haploview、SAS（version9.0）およびGenespringを用いた。統計的有意差は、トレンド解析（FischerおよびArmitage）、カイ2乗およびオッズ比により検出した。カイ2乗検定による患者対対照の二群比較を行い、いずれかの疾患においてP値が0.05で有意差が認められたSNPを含む5遺伝子AHR、ARNT2、CYP17A1、CYP1A2、NR1I2の合計32個のSNPについて、さらに、トレンド解析およびオッズ比を求めた。

トレンド解析の結果、0.01以下のP値を示したSNPは、停留精巣は、CYP17A1 rs4919686（P=0.011）およびARNT2 rs5000770（P=0.00073）であった。尿道下裂は、CYP1A2 rs2069521（P=2.29E-6）およびARNT2 rs2278705（P=0.00039）、rs5000770に有意な差が認められた。マイクロペニスは、CYP1A2 rs2069522（P=0.014）、rs2069526（P=0.014）、rs762551（P=0.012）、rs4646425（P=0.00557）、rs4646427（P=0.00443）、ARNT2 rs5000770（P=0.012）に有意差が認められた。

オッズ比の解析の結果、2.0以上の値が認められたものは、停留精巣は、NR1I2 rs1403526、rs2472680、CYP17A1 rs4919686、rs6163、rs2278705、ARNT2 rs2278705、rs5000770、rs7183507、rs7178949、rs11072922であった。尿道下裂は、NR1I2 rs2461823、CYP17A1 rs17115149、CYP1A2 rs2069521、rs2069522、ARNT2 rs2278705、rs5000770、rs1107922であった。マイクロペニスは、CYP1A2 rs2069521、rs2069522、rs2069526、rs762551、rs4646425、rs4646427、ARNT2 rs4778597、rs7183507、rs7178949、rs11072922であった。

今回の解析結果から、疾患によって異なる遺伝子のSNPを検出した（表(1)–2）。
## 表(1)–2 男児外陰部異常症の発症と関連するSNP解析

日本人とイタリア人の男児外陰部異常症患者と対照者において、アンドロゲン効果関連遺伝子(CYP17A1)およびダイオキシン効果関連遺伝子群（AHR, AHRR, ARNT, CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP17A1, CYP19A1, CYP2B6, CYP3A4, NR1I2など）を含む96個のSNP解析を行った。

両人種に共通する感受性SNPがダイオキシンシグナル伝達関連遺伝子のAHRで2個とARNT2で2個、bisphenolA受容体遺伝子とされるNR1I2で4個検出された。

日本人特有の感受性SNPが男性ホルモン産生酵素であるCYP1A2で6個とCYP17A1で3個検出された。

遺伝子	P< 0.001	P< 0.05	両人種で有意	日本人のみ
AHR	rs3757824	rs2158041	rs3757824, rs2158041	rs7811989
ARNT2	rs1374213, rs8024819, rs10851935	rs2278705, rs1020397	rs8024819, rs10851935	rs10431813, rs5000770, rs1374213
NR1I2(PXR)	rs2461823, rs2472680	rs13059232, rs2472682, rs6784598	rs2461823, rs13059232, rs2472682, rs6784598	rs2472680
CYP1A2	rs2069522	rs2069521, rs2069526, rs762551, rs4646425, rs4646427	rs2069522, rs2069521, rs2069526, rs762551, rs4646425, rs4646427
CYP17A1	rs6163	rs3740397, rs4919686	rs6163, rs3740397, rs4919686

日本人における停留精巣において、CYP17A1 rs4919686およびARNT2 rs5000770を検出したが、尿道下裂では、CYP1A2 rs2069521およびARNT2 rs2278705、rs5000770が検出され、CYP17A1のSNPは検出されなかった。さらに、ARNT2 rs5000770は、停留精巣においても検出された。マイクロペニスでは、CYP1A2で5つのSNP、ARNT2で1つのSNPの検出が示され、停留精巣、尿道下裂やマイクロペニスの疾患の発症や進展に、環境化学物質の曝露などにたいする感受性要因が関わっていることが示唆される。NR112は核内受容体の一つであるPXRであり、BPAがこの受容体のリガンドである可能性が考えられている。NR112は、日本人とイタリア人の両人種とも停留精巣より、むしろ尿道下裂において、有意差が多く認められた。また、CYP1A2およびARNT2は、いずれも15q24.1に位置している遺伝子である。最近の論文では、この領域の微小欠失がダウン症様の発達遅延に関係していることが示唆されており、今回の疾患患者におけるSNP頻度の差は、病態の進展に関与していることが示唆される。

日本人およびイタリア人男児集団において、HapMapデータをもとに、男性ホルモン効果関連遺伝子群やダイオキシン関連遺伝子を主とする96個のtag SNPの相関解析を行った。その結果、男性ホルモン産生酵素であるCYP17A1、ダイオキシンングナル伝達に関わるAHRとARNT2、BPA受容体とされるNR1I2における多型が、男児外陰部異常症と関連していることを見いだした。さらに、日本人とイタリア人に共通する感受性SNPがAHRで2個、ARNT2で2個、NR1I2で4個検出された。これらの遺伝子のSNPは、人種間共通のSNPとして、男児外性器障害の疾患発症や病態の進展に関与していることが示唆される。

## 2 ）外陰部皮膚線維芽細胞を用いた暴露実験に関する研究
外陰部皮膚線維芽細胞を用いて、in vitroにおけるBPA、E2、TCDD暴露実験を行った。DMSO暴露を比較対照とし、各群1.2倍以上の発現変化が見られた遺伝子の抽出を行った。その結果、BPA暴露では71遺伝子（42発現減少と29発現上昇）、E2暴露では814遺伝子（371発現減少と443発現上昇）、TCDD暴露では824遺伝子（344発現減少と480発現上昇）の発現変化を見いだした。これらについて、化学物質に特異的、あるいは共通の遺伝子を調べると、BPA特異的応答は43遺伝子、E2と共通な遺伝子は17個、TCDDと共通な遺伝子は10個であった（図(1)-7A）。

図(1)–7 BPA、E2およびTCDD暴露にたいする遺伝子発現プロファイル

A: BPA、E2およびTCDD暴露にたいして特異的な発現変動をする遺伝子数

B: 発現変動した遺伝子の主成分分析

つぎに、1.2倍以上発現変動した遺伝子について主成分分析を行った結果、全分散の33.9％を示す第1主成分（PC1）では、DMSOとTCDDが類似し、それらにたいしてBPAとE2が類似して2分した形を示した。一方、全分散の22.5％を示す第2主成分（PC2）では、DMSOとE2が類似し、それらにたいしてBPAとTCDDが類似して2分した形を示した（図(1)-7B）。このことは、BPAを基準に考えた場合、E2とTCDDのそれぞれに共通もしくは発現パターンの類似した遺伝子があることを示唆する。この結果は、われわれの先行研究におけるESR1陽性細胞（BG1Luc4E2 human ovarian cancer cells）におけるBPA曝露によるESR1転写活性化の結果と一致した $ ^{3} $ 。また、BPAとE2曝露による転写活性の違いは、ESR1陽性ヒト細胞で報告されている $ ^{4,5} $ 。

さらに、BPA曝露により最も発現が変動した遺伝子から、POMZP3、WDR3、NEK10、MMP11の4遺伝子を選び、リアルタイムRT-PCRにより遺伝子発現量の変動を解析した。その結果、10 nMおよび100 nMのBPA曝露により、POMZP3とWDR3の遺伝子発現は有意に上昇し、NEK10とMMP11の遺伝子発現は有意に減少した（図(1)-8）。
図(1)-8 BPA暴露による遺伝子発現量の変化

これらの結果のうち、“Cell Death, Cellular Growth and Proliferation, Cancer”生物機能グループに属しているMMP11遺伝子の発現量が、BPA曝露により用量依存的に減少したことは興味深い。このMMP11は、亜鉛依存的なペプチド内部加水分解酵素であるmatrix metalloproteinase（MMPs）ファミリーの一つである。この酵素ファミリーは、細胞外マトリックスを分解する働きを持っており、癌の転移だけでなく発生過程や生殖機能において重要な働きを示すことが知られている。これまでに、男児外陰部異常症の発症とMMP11との関連性は報告されていない。MMP11の機能を阻害した場合、乳腺上皮細胞のリモデリングや分枝化の間に細胞の遊走、アポトーシスが亢進することが報告されている。尿道下裂発症の要因の一つとして、尿道形成過程における上皮細胞の封着形成の障害が寄与すると考えられている。したがって、今回見いだしたMMP11遺伝子の発現抑制は、発達中の尿道および外陰部皮膚の細胞接着能の低下に結びつき、尿道下裂を引き起こす可能性、あるいはその病態の進展の促進に関与していることが示唆される。

そこで、最も顕著に、かつ用量依存的に発現変動が認められたMMP11遺伝子について、尿道下裂患者（HS）（n=22）と精巣停留（CO）（n=12）の外陰部皮膚線維芽細胞における遺伝子発現をリアルタイムRT-PCRにより検討した。その結果、MMP11遺伝子の発現量は、HSグループで0.0015、COグループで0.0054であり、HSグループが有意に低かった（0.27-fold, P=0.006）。この結果は、MMP11遺伝子が尿道下裂の発症に関与するかもしれないという我々の仮説を支持するものである。以上の結果より、MMP11は、細胞外マトリックスの制御を介して尿道下裂発症に関与する可能性が考えられ、バイオマーカー因子の候補となり得ることが示唆される。

患者外陰部皮膚より樹立した線維芽細胞を用いて、環境化学物質の濃度依存的に応答する遺伝子を探索を行っており、環境化学物質への応答性が高い遺伝子の発見は、生物学的な男児外陰部異常症の発症との関連性を解明することにつながる。
## （４）単一遺伝子におけるメチル化パターンと発現量変化の同定に関する研究

環境化学物質はエピジェネティク修飾を介して遺伝子発現を抑制し、疾患発症を招く可能性がある。これは、当該遺伝子が発現し、作用している組織を用いなければ解析できない(図(1)–9)。

遺伝子の構造は正常であるが、プロモーターのメチル化などのために働きが悪くなる状態：環境化学物質暴露は重要な原因

尿道下裂患者の手術時外陰部皮膚検体を用いたメチル化および発現解析

・外陰部皮膚で発現している性分化遺伝子SRD5A2 (5α-reductase)とAR (アンドロゲン受容体)を対象

ダイオキシン胎仔期暴露マウスを用いた精巣および外陰部皮膚検体を用いたメチル化および発現解析

·SRD5A2、ARの他に、われわれが発見した尿道下裂責任遺伝子MAMLD1を対象・暴露マウスの精巣と外陰部からDNAを抽出し、解析中。

図(1)−9 内分泌攪乱化学物質とエピジェネティク変化

## 1 ）男児外陰部異常症検体（手術時外陰部皮膚）を用いた解析に関する研究

尿道下裂患者の手術時に得られる外陰部皮膚検体を用いて解析を行った。外陰部男性化に必須であるジヒドロテストステロン産生を担い、外陰部皮膚組織において発現していることが知られているARとSRD5A2遺伝子について解析を行った（図(1)−10）。

• AR, CYP1A1の過剰メチル化は認められなかった。

• SRD5A2の過剰メチル化が少数の患者に認められた。

環境化学物質はエピジェネティク変化を介して尿道下裂を生じる

図(1)-10 尿道下裂患者の外陰部皮膚検体におけるエピジェネティク変化
ARは男性ホルモン受容体であり、SRD5A2は男性ホルモンであるテストステロンをジヒドロテストステロンに変換する酵素である。ARおよびSRD5A2の遺伝子は、内部標準としてCP遺伝子の発現量で補正を行い、それぞれの遺伝子の発現量とした。また、外陰部皮膚で発現しているARとSRD5A2のプロモーター領域において、過剰メチル化が少数の患者で認められた。尿道下裂患者のSRD5A2遺伝子のメチル化頻度とSRD5A2遺伝子発現量との相関関係をみたところ、有意に逆相関（P=0.0085）することが明らかとなった。さらに、SRD5A2遺伝子プロモーターのトータルのCpGメチル化頻度とCYP1A1およびCYP1B1遺伝子発現量との間には、各々有意な負の相関関係があることを見いだした。

男児外陰部異常症の発症の要因は、一つの遺伝子に起因するとは限らない。しかし、われわれは、尿道下裂責任遺伝子としてCXorf6（MAMLD1）を同定しており、これまでにその機能について解析を行った $ ^{6、7} $ 。このMAMLD1遺伝子は、RT-PCRによる発現解析により、ヒトのほとんどの組織で発現していることを確認している。さらに、そのプロモーターにはダイオキシン反応性リピートとCpG islandが存在する（図(1)-11）。

図(1)-11 CXorf6（MAMLD1）プロモーター領域のダイオキシン反応性リピートとCpG island

環境化学物質の暴露が様々な遺伝子のメチル化パターンや発現量の異常を招きうることから、MAMLD1遺伝子は単一遺伝子効果と環境化学物質の関連を検討する上でよい候補因子となる。また、マウス相同遺伝子（Mamld1）は、胎生期精巣の男性ホルモン産生細胞において強く発現している。われわれは、既にMamld1遺伝子欠損マウスを作製している。Mamld1遺伝子欠損マウスは、環境化学物質のMAMLD1/Mamld1遺伝子にたいする影響を評価する上でよいコントロールとなる。

つぎに、尿道下裂患者の外陰部皮膚検体を用いて、埋没陰茎の外陰部皮膚検体を比較対照とし、1.2倍以上の発現変化が見られた遺伝子の抽出を行った。その結果、尿道下裂患者の外陰部皮膚検体は、埋没陰茎の外陰部皮膚検体に比べて、1,066遺伝子（370発現減少と696発現上昇）の発現変化を見いだした（表(1)-3）。
表(1)-3 尿道下裂患者の外陰部皮膚検体における遺伝子発現変化

## 尿道下裂男児と埋没陰茎の外陰部皮膚検体で遺伝子発現量を比較

尿道下裂群では、埋没陰茎群に比べて、370遺伝子の発現が減少し、696遺伝子の発現が上昇した（Fold Change 2.0以上）

Gene Symbol	Fold Change	発現変動	遺伝子の詳細	3焼体とも変動
FLG	8.97	↓	filaggrin
表皮の角化に必要、遺伝子変異はアトピ一性皮膚炎の発症に関与
MSMB	8.09	↓	microseminoprotein, beta
前立腺癌のバイオマーカー(血中に高濃度で存在する)	○
ACTG2	4.73	↓	actin, gamma 2, smooth muscle, enteric
平滑筋アクチン
SPRR3	23.87	↑	small proline-rich protein 3
表皮バリアーの形成に関与	○
SOX2	14.48	↑	SRY (sex determining region Y)-box 2
遺伝子変異は無眼球症と低コナドトロビン性性腺機能低下症に関与、
iPS細胞作製に必要な因子の一つ、in vitroにてfilaggrinの発現を抑制	○
KRT4	9.71	↑	keratin 4
粘膜に発現、遺伝子変異は白色海綿状母斑(口腔)の発症に関与

手術時に得られる外陰部皮膚は間質がない状態である。そこで、これらの検体を用いた解析は、間質のARが男性ホルモンのシグナルを受け、その後の上皮へのシグナルがどうなっているかを見ることになる。これまでに、マウスを用いた実験では、外生殖器の雄性化過程で男性ホルモンシグナルの下流にWnt/β-cateninシグナルが位置することが示唆されている。そのため、Wnt/β-cateninシグナルは、今後、患者の外陰部皮膚検体で検討していく候補因子となり得る。また、患者の外陰部皮膚検体を用いた網羅的遺伝子発現解析では、疾患発症の直接の原因となる遺伝子を探索することは難しい。しかし、疾患を発症した患者の検体を用いた解析により、変動する共通の遺伝子の存在が確認されれば、バイオマーカーの候補を絞る上での参考になると考えられる。さらに、発現解析を行った後には、樹状図を用いたアプローチを含むデータへの様々な解析法を用いることが必要である。

## 2 ）ダイオキシン（TCDD）暴露マウスの精巣を用いた解析に関する研究

ヒトでは臨床的に容易に採取できない性腺を用いて、環境化学物質暴露効果の指標となるバイオマーカーを同定するために、TCDDをマウスに暴露して解析を行った。妊娠マウス（妊娠12.5日目）にTCDDを1回投与し、出生翌日の精巣を摘出した。摘出した精巣からtotal RNAを抽出後、リアルタイムRT-PCRにより遺伝子発現を解析した。その結果、男性ホルモン産生酵素であるCyp17a1遺伝子の発現減少など、多数の遺伝子発現量が変動していることが明らかとなった（図(1)-12）。
CYP17A1におけるSNPのアル頻度は、外陰部異常症患者と正常男児で有意に異なる（前述の相関解析データ）

図(1)-12 胎仔期TCDD暴露マウスの精巣における遺伝子発現変化

また、Ahr、Mamld1、Hsd3b1、Wnt4の遺伝子発現の上昇、およびAmhの遺伝子発現の減少が認められた。TCDDは、ダイオキシン類の中でも、受容体型転写因子であるaryl hydrocarbon receptor（Ahr）との結合能が最も高く、アゴニストとして遺伝子の発現を修飾することにより、催奇形性などの毒性を示すことが知られている。Ahr遺伝子欠損マウスへのTCDD暴露により、これらの毒性のほとんどが見られなくなることから、AHRはTCDDの毒性発現に必須のタンパク質であると考えられている。さらに、TCDD暴露により、Ahr、Cyp1a1、Cyp1a2遺伝子の発現が誘導されることが知られている。今回、われわれはTCDD暴露により出生翌日の精巣において、Ahr、Cyp1a1、Cyp1a2遺伝子の発現が誘導されたことを認めており、これらの結果は実験系がうまく機能していることを示している。しかし、遺伝子の発現量に変動があった遺伝子をバイオマーカーとして確立するためには、遺伝子の発現量の変動のみならず、タンパク質レベルでの変動も確認することが必要である。これまでに、それぞれの遺伝子およびタンパク質について、精巣における発現および局在部位を確認している。今後は、遺伝子発現量の変動の再現性と発現部位の検討およびタンパク質の変動を検討していく。

## （５）口蓋裂発症因子に関する研究

口蓋裂は、単一遺伝子疾患としても発症するが、多因子疾患としても発症する。特に、近年種々の感受性因子が同定され、さらに、TCDD暴露が口蓋裂発症を招くことがマウス暴露実験から知られている。したがって、TCDD感受性が高い個体において、口蓋裂が発症しやすいことが推測される。また、外陰部異常症と同様、口蓋組織におけるメチル化（エピジェネティク修飾）が口蓋裂の発症に関与している可能性が推測される。

われわれは、この仮説を検討するため、口蓋裂患者の血液および手術時の口蓋組織（皮膚線維芽細胞）の集積を開始し、現在、60例の検体を集積した。感受性因子については、45例以上