Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
図４ 各元素の含有量と発光強度との関係（ひ素、銅、クロム）

表 2 各樹種の定量下限値、感度相関係数

ベイスギ、ベイツガ、カラマツおよびトドマツの各樹種の気乾比重は、それぞれ0.31、0.51、0.54および0.34であり、それに伴い溶液吸収量も600、700、500および600kg/m³と異なっている。そのため、各標準試料の目的濃度に差が生じているため、その影響を調べた。作製した各樹種の標準試料を用いてLIBS測定した場合の定量下限値、感度および相関係数を表2に示す。表2から、ひ素の定量下限はどの樹種も数百mg/kgと高く、感度も低いことが分かった。銅およびクロムの定量下限値はベイツガが他の樹種よりも若干高いが、ほとんど差はないと考えられる。また、検量線から求めた相関係数はすべての元素について、高い値を示し、樹種に関係なく判別できることが分かった。

LIBS法による測定面積は200～300 μmと非常に小さいため、非破壊分析に近く、小さい試料にも対応できる利点を有するが、試料の偏析によるバラツキが大きくなると考えられる。また、測定時間10secの場合、木材試料の測定深さは約500 μmであり、深さ方向の分析が可能となり、表面汚れの影響を軽減できる利点も有する。CCA標準試料をスラリー

樹種	定量下限	感度	相関係数
As	ベイスギ	400	1	0.77
235.0nm	ベイツガ	440	3	0.84
カラマツ	160	12	0.90
トドマツ	770	5	0.85
Cu	ベイスギ	7	8	0.97
324.8nm	ベイツガ	65	12	0.78
カラマツ	11	22	0.86
トドマツ	25	8	0.83
Cr	ベイスギ	6	12	0.97
425.4nm	ベイツガ	18	19	0.94
カラマツ	6	30	0.79
トドマツ	8	20	0.92

* 定量下限: mg/kg

* 感度: 1mg/kg あたりのカウント数

表 3 土壤汚れ CCA 標準試料分析結果

標準試料濃度
(mg/kg)	LIBS法(mg/kg)
Cr	15500	15400±1800
7400	9800±3600
3000	4800±800
Cu	6800	6500±2800
3200	4700±2000
1300	1800±600
As	5200	5600±900
2500	2500±500
1000	1500±500

（30g土壌/100mL）に浸漬して作製した土壌汚れCCA標準試料の分析結果を表3に示す。表からクロム、銅およびひ素の標準試料濃度とLIBS法の分析結果は良く一致しており、LIBS法は表面汚れが激しいCCA処理木材にも十分対応できることが分かった。
実試料を用いて判別試験を行った結果を図5に示す。判別試験に使用したCCA処理木材は、処理施設ならびに家屋解体現場から収集し、針葉樹構造用製材の日本農林規格(旧JAS)の保存処理薬剤の定量法に準じて分析を行った。実試料の統計結

表 4 収集した実試料の統計

クロム	銅	ひ素
試料数(本)	34	34	34
平均値(mg/kg)	1299	919	927
最大値(mg/kg)	6315	4052	5268
最小値(mg/kg)	65	37	40

果を表 4 に示す、各元素ともに数十 mg/kg から約 5000mg/kg までの含有量で、平均値は約 1000mg/kg であった。正確に判別するためには数十 mg/kg の高精度な分析結果が必要となる。銅 324.8nm を用いた判別の場合、CCA 処理木材と無処理の判別精度は良く、無処理の発光強度を下回る CCA 処理木材は無かった。クロム 425.4nm を用いた判別の場合も同様に、無処理の発光強度を下回る CCA 処理木材は無く、発光強度 3000cps で境界線を引くことにより、高い精度で判別できることが分かった。しかし、高いクロムおよび銅含有量にもかかわらず、発光強度が無処理と同程度の発光強度を有する試料も有り、CCA 処理木材が安全な建築廃材として誤判別される可能性もあるため要注意である。樹種、測定部位の形状、バラツキ、表面含有量の偏析等を精査し、実試料の各元素含有量と発光強度の相関係数が良くなるように改善する必要がある。以上の結果から、銅 324.8nm およびクロム 425.4nm ともに判別に適する条件と分かったが、銅は現在使用されている CCA 処理剤以外の防腐剤にも使用されているため、CCA 処理木材の判別方法としてはクロム 425.4nm での測定が最適であることが分かった。ただし、上記の問題もあるため、高い正確性が要求される測定には、銅およびクロムの 2 元素同時測定が望ましいと考えられる。

図 5 実試料を用いた判別試験（銅 324.8nm、クロム 425.4nm）
光ファイバーを使用し、実試料を測定した結果を図6に示す。図から銅325nmおよびクロム425nmの強度の高い発光スペクトルが認められ、光ファイバーを使用しても十分な測定ができることを確認した。遠隔操作を備えた現場仕様装置に応用するため、測定方法については今後検討する必要がある。

図6 光ファイバーを使用した LIBS 測定（銅 324.8nm、クロム 360.5nm）

### 2. CCA 処理木材の糖化原料としての再利用法の確立

常温（30℃）硫酸処理によるCCA成分の残存量と残存率を表5に示す。この結果から、クロムの残存を少なくするには、30℃での処理を考える場合、より高い濃度あるいは長時間処理が必要と考えられる。また、

表5 処理木粉へのCCA成分残存率

硫酸濃度%	温度℃	時間h	重量減少率%	銅	クロム	ヒ素%
0.5	30	48	2.9	1.5	26.7	10.9
1	30	48	3.3	1.1	21.5	5.7
2	30	48	3.4	0.9	17.8	2.1
4	30	48	3.7	0.5	14.8	0.7
30	30	24	5.8	0.4	12.5	0.1
45	30	24	15.4	0.6	9.2	0.0

より高温度での処理でクロム残存量を減少させる可能性も考えられる。

糖化実験については、CCA処理木粉5gに30%硫酸100ml添加、24時間処理後、吸引ろ過、30%硫酸で洗浄後、ろ過残渣の重量を測定して硫酸と木粉の重量割合を求めた（前処理）。この重量割合を目安に、残渣の一部を取り出し、硫酸濃度が75%になるように96%硫酸を添加して、主加水分解（40℃、15分間手動攪拌）を行った。また後加水分解処理として、同様に主加水分解後、水で希釈し硫酸濃度30%として90℃で35分間加熱した。処理後、脱イオン水を添加して反応を停止させた後、ガラスフィルターを用いてろ過し、十分洗浄後、乾燥して重量を測定し可溶化率を算出した。また、ろ液を原子吸光分析するとともに、後加水分解ろ液については構成糖の測定も行った。可溶化率は、主加水分解で約51.7%、前処理による重量減少を含めると約54.5%、後加水分解では約52.5%、前処理による重量減少を含めると約55.3%となった。これは、濃硫酸添加部分が黒くなっている部分に、その部分に気泡が発生しているが、30%硫酸に96%硫酸を加えることにより、希釈熱により発熱し、沸騰する状況が起こったものと考えられ、その結果、過分解反応が起こったためと考えられる。なお、構成糖分析による元のCCA木粉に対する
る収率はグルコース 9.1%、その他の単糖 2.8%と低いものであった。本手法では目的とするグルコースの収率が低く、改善が必要と考える。

蒸煮による CCA 除去の結果を表 6 に示す。重量減少は 2w/w% 硫酸 ≡ 1w/v% 水酸化ナトリウム > 1w/w% 硫酸 > 0.5w/v% 水酸化ナトリウム > 0.5w/w% 硫酸 > 1w/v% リン酸 > 0.5w/v% リン酸 > 2w/v% 酢酸 > 1w/v% 酢酸 > 0.5w/v% 酢酸 > 脱イオン水となった。酸による重量減少はヘミセルロース、アルカリによる重量減少はリグニンとヘミセルロースの溶出によるものと考えられる。

CCA 成分の溶出効率（100－残存率）として、銅は、2w/w% 硫酸 > 1w/w% 硫酸 > 0.5w/w% 硫酸 > 1w/v% リン酸 > 0.5w/v% リン酸 > 2w/v% 酢酸 > 1w/v% 酢酸 > 0.5w/v% 酢酸 > 1w/v% 水酸化ナトリウム > 0.5w/v% 水酸化ナトリウム > 脱イオン水の順であった。クロムは、2w/w% 硫酸 > 1w/w% 硫酸 > 0.5w/w% 硫酸 > 1w/v% リン酸 > 2w/v% 酢酸 > 0.5w/v% リン酸 > 1w/v% 酢酸 > 0.5w/v% 酢酸 > 1w/v% 水酸化ナトリウム > 0.5w/v% 水酸化ナトリウム > 脱イオン水となっている。またひ素は、2～0.5w/w% 硫酸 > 1w/v% リン酸 > 1w/v% 水酸化ナトリウム > 0.5w/v% 水酸化ナトリウム > 0.5w/v% リン酸 > 2w/v% 酢酸 > 1w/v% 酢酸 > 0.5w/v% 酢酸 > 脱イオン水であった。いずれにおいても、薬剤の濃度が高いほど溶出効率は良い結果となっている。ただし、水酸化ナトリウムによる処理においては、重量減少の割にクロムの溶出が小さく、結果として残存木粉中のクロムの濃度は元の木粉より高い値を示しており、0.5%よりも1%処理の方が高い濃度となっている。銅についても、元の木粉より濃度は低いが、クロム同様0.5%よりも1%処理の方が高い濃度となっている。

表6 蒸煮处理结果

残木粉中のCCA mg/g	残存率(%)
規定度(N)	重量減少率(%)	銅	クロ	匕素	銅	クロ	匕素
無処理	1.65	3.73	1.19
脱イオン水	0	2.15	1.29	3.47	1.07	76.3	91.9	90.5
0.5w/v%酢酸	0.083	3.14	0.37	3.30	1.04	21.7	85.9	84.6
1w/v%酢酸	0.167	3.83	0.26	3.03	0.95	15.2	78.1	77.0
2w/v%酢酸	0.333	4.91	0.19	2.26	0.63	10.9	57.6	50.4
0.5w/v%リン酸	0.153	9.90	0.09	2.81	0.16	4.9	67.9	12.0
1w/v%リン酸	0.306	12.30	0.05	1.09	0.06	2.7	25.7	4.4
0.5w/w%硫酸	0.102	17.07	0.03	0.10	0.00	1.7	2.3	0.3
1w/w%硫酸	0.205	20.13	0.03	0.03	0.00	1.4	0.6	0.0
2w/w%硫酸	0.413	21.81	0.01	0.01	0.00	0.4	0.2	0.2
0.5w/v%水酸化ナトリウム	0.125	17.67	0.69	3.98	0.28	34.6	87.8	19.3
1w/v%水酸化ナトリウム	0.250	21.71	1.13	4.06	0.19	53.5	86.2	12.9

粒径による影響について、図7に粒径による各成分の残存量を示す。ひ素は粒径の影響を受けず、1%硫酸であっても99%以上除去されていたが、クロムと銅は、径が大きくなるほど除去しにくい傾向を示した。ただし、グラフから粒径が大きいものも硫酸濃度を上げることで残存量を下げることが可能であることが分かる。
硫酸濃度と蒸煮温度による省エネルギーの可能性について、107℃処理による結果を表7に示す。銅は107℃1時間でもほぼ全量除去することができたと考えられる。ひ素は、107℃1時間でも硫酸濃度を高くすることで、ほぼ全量除去できると推測される。一方、クロムについては、硫酸濃度による溶脱性の違いはひ素ほど見られず、1時間では数％から1割程度の残留があると考えられる。しかし、1.5時間と処理時間を長くすることで、残留量が減る傾向にある。ただし、0.5%硫酸ではクロムの残留が数％あると思われる。

温度条件を107℃と低くしても、クロムを100%近く除去する条件では、重量減少が10%以上で、ヘミセルロースの半分近くが溶出していると考えられる。

図7 粒径別残留量(121℃ 1h)

表7 107℃処理による重量減少とCCA成分の除去率

硫酸濃度	重量減少率	除去銅	率(%：ろ液ベース)
クロム	ヒ素
107℃1時間	0.5	9.1	103.0	90.9	92.9	%
1	12.9	104.1	95.4	96.9
2	16.1	104.5	95.9	96.6
3	17.4	104.3	96.5	97.9
4	18.9	103.7	96.2	100.0
107℃1.5時間	0.5	9.8	104.6	97.6
1	13.3	105.5	100.5
2	16.8	104.1	100.0
3	18.4	105.5	99.3
4	19.5	106.5	101.3

希硫酸による蒸煮により、CCA成分のほぼ全量を溶脱させることが可能であることが分かった。一方で、それらの条件では、ヘミセルロースの分解を伴った溶出と考えられる重量減少が木粉重量の10%以上から20%強あり、ヘミセルロースのおよそ半分から全量近くが溶出したものと考えられる。仮に、ヘミセルロースを多く残す条件を取ったとしても、半分近くは先の処理で失われているとともに、それを有効利用することを考えると、工程が増えることになる。また、ヘミセルロースの用途として、キシロース等の糖をキシリトールなどの食品用の原料にすると収益性を高めることが考えられる。しかしながら、原料がCCA処理木材となると安全性の面から食品用への用途は期待できない。また、バイオエタノールジャパン関西のように糖として回収してエタノールにする方法も考えられるが、キシロースなどの五炭糖をエタノール変換させる菌の利用はコスト高であるとともに、エタノールの価格も低く、工程増を埋め合わせることは難しいと思われる。これらを考慮し、CCA処理木材からのCCA除去処理方法として推奨するのは、121℃での希硫酸処理で、ヘミセルロースのほぼ全量を溶出させることである。またその回収は、フルフラールやHMF（ヒドロキシメチルフルフラール）などの過分解物がよいと考えられる。その回収方法は、ヘミセルロースを含む希硫酸処理のろ液を高温で短時間加熱するとフルフラールが生成される。それを蒸留し、高純度のフルフラールを捕集する方法がよいと思われる。この場合、CCA成分は液側に残ることになる。各処理条件（硫酸濃度、処理温度等）における重量
減少率の結果を表8に示す。このように、各硫酸濃度、温度および処理時間が増えると重量減少率も増加している。元の木粉の分析結果は、ホロセルロース約73.1%、αセルロース約45.9%となっており、その差約27.2%であった。これはその実験操作からヘミセルロースの量に近い値と考えられる。したがって、ヘミセルロースをほぼ全量溶出させるには、硫酸濃度4%、121℃、1時間より強い条件による蒸煮が必要と考えられる。さらに、その際の溶出物の状態によっては、フルフラール等に変換させるために、更なる加熱が必要となることも考えられる。一方の残木粉の用途としては硫酸を用いており、硫酸糖化原料以外では、水を使って洗浄することも考えられるが、水処理にコストを要する。硫酸糖化原料と考える場合、平成21年度の検討から、加える硫酸濃度とそれによる発熱を考慮した糖化方法が課題となる。

表8 各処理条件ごとの重量減少率

硫酸濃度	107℃1時間	107℃1.5時間	114℃1時間	114℃1.5時間	121℃1時間
0.5	9.1	9.8	12.1	13.5	16.1
1	12.9	13.3	16.1	17.0	20.0
2	16.1	16.8	19.0	19.9	22.2
3	17.4	18.4	20.4	21.1	22.9
4	18.9	19.5	21.7	22.2	24.6

### 3. 拡散透析処理液からの硫酸回収法について（硫酸とひ素の分離法）

拡散透析処理液として、20%（2.33mol/l）又は0.25mol/lの硫酸に、ひ素を20mg/l溶解させた溶液を調整して実験に供した（以後、模擬拡散透析処理液と記す）。イオン排除クロマトグラフィーは、模擬拡散透析処理液に対し、各種濃度の希硫酸を溶離液に用いて室温で行った。図8に、イオン排除クロマトグラフィー処理サンプル中の硫酸イオン、ひ素濃度の各変化（クロマトグラフ）を示した。陽イオン交換体にInertSep PRS(GL Sciences)を用いた実験において、模擬拡散透析処理液中硫酸濃度を2.33mol/l（実験11）から0.25mol/l（実験12）に下げた結果を比較すると、分離度は0.14から0.74へ大幅に向上していた。イオン排除クロマトグラフィーの原理は、ドナン膜平衡に基づく分配に基づいており、溶液中の硫酸濃度が高すぎるとドナン電位が下がって分離効果が低下すると考えられることから、実験11の模擬拡散透析処理液では硫酸濃度(2.33mol/l)が高過ぎて、分離度が低くなったものと考えられる。次に、実験12と同条件で、陽イオン交換体のみイオン交換容量の大きいDOWEX 50W×8-100(SIGMA-ALDRICH)に変更した実験13では、ほぼ実験12と同様の分離度が得られた。また、このイオン交換樹脂を用いて、これまで良好な分離が得られなかった模擬拡散透析処理液硫酸濃度(2.33mol/l)条件による実験14を行った結果、分離度0.49と比較的良好な分離が得られた。イオン交換容量が大きいほどドナン電位が得やすいと考えられることから、高い硫酸濃度でも比較的良好な分離が得られたものと考えられる。次に、重量あたりのイオン交換容量はDOWEX 50W×

8-100(SIGMA-ALDRICH)と等量であるが、樹脂の架橋度が低いために容積あたりのイオン交換容量が小さいDOWEX 50W×2-100(SIGMA-ALDRICH)を用いると、模擬拡散透析処理液硫酸濃度が0.25mol/lの時はRs=0.91（実験15）、2.33mol/lの時はRs=0.48（実験16）と、DOWEX
50W×8-100(SIGMA-ALDRICH)の時(実験13および14)よりも良好か同等の分離が得られた。この結果は、陽イオン交換樹脂の容積あたりのイオン交換容量が単に大きいほど良好な分離が得られるというわけではなく、陽イオン交換樹脂の架橋度、すなわち溶質分子が入り込める樹脂の空隙の大きさも分離効果に大きく関わっていることを示唆するものである。

図8 イオン排除クロマトグラフィー処理サンプル中の硫酸イオン、ひ素濃度の変化
クロマト管に充填した高選択性分子認識ゲルを用いたひ素の捕集について、得られたひ素捕集率を表9に示す。洗浄液(希硫酸)濃度が0.005mol/l、0.1 mol/lと低い場合には、それぞれ98.3%、97.9%という高いひ素除去率が得られたが、洗浄液（希硫酸）濃度が0.5 mol/l、1 mol/l、20%（2.33mol/l）と高くなるにつれ、それぞれ60.0%、15.3%、3.9%とひ素除去率が低下した。本ゲル製造元IBC社のデータシートには、高濃度の硫酸イオン（>1mol/l）がひ素抽出能を妨害する可能性が記されており、その影響と見られる。

表 9 高選択性分子認識ゲルを用いたひ素除去率

硫酸濃度(mol/L)	0.005	0.1	0.5	1.0	2.33
ひ素除去率(%)	98.3	97.9	60	15.3	3.9

### 4. 廃木材有効利用における CCA 処理木材選別の調査

産廃処理業者（A 社 帯広市）：建築廃材は、防腐処理木材や金具が付着した木材、他材料との複合材などリサイクルに適さない木材が搬入されている。CCA 処理木材やタール（クレオソート）が付着した木材は割増料金で受け入れている。実際に解体現場等で CCA 処理木材として分別されたものが搬入されたことは今までない。

産廃木くず(建築廃材)を主原料にボード製造を行う産廃処理業者(B 社 苫小牧市)：建築廃材はパーティクルボード製造の主原料であり、15年以上前から使用している。建築廃材の受入条件として、CCA処理木材など防腐処理された木材はボード原料に適さないので受入対象外としている。また、ボード原料の品質確保の面から搬入された建築廃材を目視で検査し、防腐処理木材を選別・除去している。CCA処理木材については目視による選別が難しい場合があり、市販されている近赤外線型のCCA処理木材判別装置の導入を検討したが、判別精度が悪く導入を断念した。

CCA 処理木材判別装置の製造・販売を行う事業者（C 社 山形市）：建設リサイクル法の施行により解体現場等で CCA 処理木材を分別する必要があるが、罰則規定がない等の問題があり、開発した判別装置が広く普及するには至っていない。CCA 処理木材の分別は、第一に解体現場等の上流側で行う必要があるが、現状は解体された建築廃材を受入れリサイクルしている業者の側に CCA 処理木材の混入に対する懸念が大きく、建築廃材の受入側で効率的・高精度に CCA 処理木材を選別・除去できる装置に対してニーズはかなりあると感じている。

CCA 処理木材に対応したガス化発電施設を有する事業所（D 社 大阪市）：木質廃材を対象としたバイオマス発電設備を設置し、本稼動している。ただし、CCA 処理廃木材の外部からの受入れに関しては廃棄物処理法に基づく許認可が必要であり、現在、協議中である。将来的には外部からの CCA 処理廃木材の受入を目指しているが、関西においても解体現場等での CCA 処理木材の分別が進んでいないため、解体現場から中間処理施設におけるチップ化までの段階における CCA 処理木材の分選別が大きな課題である。
結論＝LIBS 法を用いた CCA 処理木材の判別方法を開発するため、LIBS 測定における最適測定条件を決定し、実試料を用いた判別試験を行い、現場のニーズに応えた判別方法について検討した。減圧加圧処理により CCA 標準試料を作製し、クロム、銅およびひ素の測定を行い、クロムと銅は数 mg/kg まで、ひ素は 200mg/kg まで、正確に測定できることが分かった。さらに、ベイツガ、カラマツ等の樹種による分析値への大きな影響がないことと土壌汚れの影響を受けず正確に測定できることを確認した。実試料を用いたクロム（425nm）および銅（325nm）の LIBS 測定による判別試験を行い、実試料の場合でも、精度良く正確に判別できることが分かった。光ファイバーを用いた装置でも、CCA 標準試料中の銅およびクロムの発光スペクトルが確認されたことから、携帯型、小型化の可能性があることが分かった。

CCA 処理木材の有効利用方法を検討した結果、希硫酸常温（30℃）処理では、銅とひ素はほとんど除去できるが、クロムは溶脱しにくく、30%硫酸で12.5%、45%硫酸で9.2%残留することが分かった。蒸煮処理では、脱イオン水を含めCCA成分の溶脱が起こるが、希硫酸以外は完全に溶脱させるのは難しく、残留量が多いことが分かった。また、希硫酸による蒸煮は比較的容易にCCA成分全てを溶出させることが可能であること、さらに粒径は小さいほど除去が容易であることを確認した。しかし希硫酸による蒸煮処理は重量減少も大きく、これはヘミセルロースの溶出と考えられる。この有効利用も考えると、硫酸濃度4%、121℃、1時間より強い条件による蒸煮が必要と考えられ、CCA成分と同時に溶出するヘミセルロースは、フルフラール等に変換し、蒸留によって回収することで、CCA成分との分離も可能と考えられる。最終的に残存する残木粉は硫酸糖化原料に適しているが、糖化方法は別途検討する必要がある。

硫酸回收における拡散透析後の硫酸とひ素の分離法に関して、高選択性分子認識ゲル（IBC社製MetaSEP AnaLig $ ^{®} $ As-01PA）を用いた砒素の捕集については、想定する拡散透析処理液の硫酸濃度(2.33mol/l)が高過ぎ、大幅な希釈をする必要性があり、回収硫酸濃度が大幅に低下してしまうことから、適用は不可と考えられた。一方、陽イオン交換体を用いたイオン排除クロマトグラフィーであれば、イオン交換容量の大きな陽イオン交換樹脂を用いることにより、想定する拡散透析処理液硫酸濃度(2.33mol/l)でも硫酸とひ素を良好に分離できることを示すことができた。ただし容積あたりのイオン交換容量が単に大きいほど良好な分離が得られるというわけではなく、陽イオン交換樹脂の架橋度、すなわち溶質分子が樹脂の空隙中に入り込める余地も分離効果に大きく関わっていることが示唆されており、硫酸とひ素の場合はどの程度の架橋度が適切であるかといった細かな検討は残された課題である。

CCA 処理木材の選別状況を把握するため関係者へのヒアリング調査を行った。その結果、建設リサイクル法では解体現場において CCA 処理木材を分別する必要があるものの罰則規定がないことや現状の判別方法における精度の問題などから、分別が進んでいないものと推定された。一方、解体木材を受け入れる処理業者側では CCA 処理木材の混入を懸念しており、効率的・高精度に CCA 処理木材を選別・除去できる装置に対してニーズがあると考えられた。
## 英語概要

# 研究課題名=「Study of Utilization and Method for Automatic Distinction of CCA Treated Wood from House Demolition.」

代表研究者=Touru TAKAHASHI (Hokkaido Research Organization Industrial Research Institute)

共同研究者=Keiichi TOMITA（Hokkaido Research Organization Industrial Research Institute）

Motoomi WAKASUGI (Hokkaido Research Organization Industrial Research Institute)

Kozo YOSHIKAWA (Hokkaido University)

Michifumi YAMAZAKI (Hokkaido Research Organization Forest Products Research Institute)

Sin'ichi SEINO (Hokkaido Research Organization Forest Products Research Institute)

Ryo HIYAMA (Hokkaido Research Organization Forest Products Research Institute)

Hirohide AGA (Hokkaido Research Organization Institute of Environmental Sciences)

## 要旨=

It is necessary to distinguish the CCA treated wood from building debris, in order to recycle them as safe woody biomass. The emission spectrum of Chromium, Copper and Arsenic are detected through analysis of the CCA standard wood, by using the Laser Breakdown Spectroscopy (LIBS) method. The content determination limits of Chromium, Copper were about 10 mg/kg, which are sufficient value to distinguish CCA treated woods accurately. And, the analysis result by using the LIBS method was not affected by wood species nor dirt deposits. The real samples of building debris were also able to be distinguished accurately by optimum determined LIBS method. It is found that LIBS method using optical fibers could also determine the contents of Chromium and Copper.

We could exclusively eliminate the 97% of CCA from CCA treated wood by 2% diluted sulfuric acid pretreatment with steam at $ 121^{\circ} $ C to utilize them as saccharification material.

Arsenic could be satisfactorily separated from sulfuric acid by a cation exchanging ion excluder that has large exchange retention volume.

However, in the chip manufacturing process from waste woods, intermediate treatment process with high efficiency and accuracy would be necessary.

At present, CCA treated wood meets full-scale discharge stage.

キーワード＝CCA Treated Wood、LIBS（Laser Induced Breakdown Spectroscopy）、House Demolition、Saccharification Materials、Toxic Metals Separation
課題名 C-0905 小児先天奇形発症における環境リスク評価法の基盤整備

課題代表者名 緒方 勤 （浜松医科大学医学部小児科 教授、独立行政法人国立成育医療研究センター研究所分子内分泌研究部 客員部長）

研究实施期间 平成21～23年度

累計予算額 47,599千円（うち23年度 15,299千円）

予算額は、間接経費を含む。

## 研究体制

(1) バイオマーカーの開発に関する研究 (（独）国立成育医療研究センター研究所、（独）国立環境研究所、浜松医科大学大学）

(2) 臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備に関する研究

(（独）国立成育医療研究センター研究所、（独）国立環境研究所、浜松医科大学大学）

## 研究概要

### 1. はじめに(研究背景等)

近年、停留精巣や尿道下裂などの先天奇形が増加しているという疫学的データが日本や欧米諸国から報告され、大きな社会的問題となっている。同様の現象は、成人における精子形成障害や精巣腫瘍、および、多くの野生動物でも観察されている。そして、これらの現象に共通する原因として、内分泌攪乱物質の影響が推測されている。特に、大部分の内分泌攪乱化学物質が有する女性ホルモン効果は、このような男性化障害を生じる重要な原因の1つであると推測される。さらに、内分泌攪乱物質として作用しうる環境化学物質の生産量・排出量は、近年増

図1 小児先天奇形発症における環境リスク評価法の基盤整備の背景

加している。したがって近年の小児は、暴露量の観点から、成人よりも高いリスクに曝されていると推測される。

われわれは、このような先天異常の発症が、内分泌攪乱物質の暴露量や暴露時期の他に、個体の遺伝的感受性にも支配されるという作業仮説のもとに、研究を行っており、最も重要な成果は、エストロゲン受容体α遺伝子（ESR1）のハプロタイプ解析で得られた。遺伝因子と環境因子の相互作用で出現する表現型を適切に解析するためには、同一集団において両者を解析することが重要である。

以上のことから、小児先天奇形発症における環境リスク評価法の基盤整備には、バイオマーカーの開発と臍帯血・胎盤バンキングシステムの構築が重要であると考えられる。

### 2. 研究開発目的
本研究は、尿道下裂などの小児先天奇形発症を対象とする環境リスク評価法の基盤整備を行うことを目的とする。このために、評価法の指標となるバイオマーカーの開発、および、環境リスク研究に広く貢献できる臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備を行う。バイオマーカーとしては、相関解析および機能解析で有意と判定された遺伝子多型・ハプロタイプ、および、疾患責任遺伝子のメチル化パターンや発現量を用いる。臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備では、分子生物学的解析試料と暴露量測定試料の両者を対象とする。そして、連結可能匿名化の臨床情報を採取、またバイオマーカーとして使用しうる多型・ハプロタイプの頻度や疾患責任遺伝子の発現量などのプロファイリングを行った後に試料をバンキングし、長期フォローアップを可能とすると共に、今後の遺伝ー環境相互作用や遺伝子間相互作用の研究のために役立てることを目標とする。

### 3. 研究開発の方法

## (1) バイオマーカーの開発に関する研究

## 1 ) エストロゲン受容体α遺伝子 (ESR1) に関する研究

ESR1遺伝子における微小欠失がエストロゲン効果を増強する機序を解明する。このため、この欠失が、同領域に存在する抑制型マイクロRNAを消失させている可能性、スプライスの量的変化により正常エストロゲン受容体を多く産生している可能性、メッセンジャーRNAの安定化を招いている可能性について解析する。この微小欠失のin vivo機能解析を進めるため、ノックインマウスの作製に着手する。

## 2 )エストロゲン受容体β遺伝子(ESR2)に関する研究

対象は、日本人精子形成障害患および妊よう性の確認された日本人成人男性とした。症例は、正常男性核型、非閉塞性無精子症、生殖器および生殖器外の合併奇形なし、Y染色体長腕の微小欠失なし、特別な環境要因なし、という条件を満足した。

SNP解析は、全120 kb(ESR2遺伝子プロモーター領域50 kbを含む)に、8.2 kbから17.7 kb間隔で分布する9つをTaqMan法で解析する。解析対象SNPは、データベースに登録されているSNPから、tag SNPを含み、ESR2遺伝子上にほぼ等間隔に分布するSNPのうち、日本人におけるマイナーアリル頻度が15％以上のものを選択する。

## 3 ) 男児生殖器疾患における環境化学物質感受性バイオマーカーの開発に関する研究

数理的および作用機序から男児外陰部異常症発症に関連しうる遺伝子を網羅的にピックアップし、HapMapプロジェクトを基にSNPおよびハプロタイプ関連解析を行う。また、見いだされた多型・ハプロタイプの機能解析、異なる人種間における比較を行う。また、外陰部皮膚線維芽細胞を用いたin vitroにおけるbisphenol-A (BPA)、estroadiol (E2)、TCDDの暴露実験を行う。

## 4 )単一遺伝子におけるメチル化パターンと発現量変化の同定に関する研究

環境化学物質はエピジェネティク修飾を介して遺伝子発現を抑制し、疾患発症を招く可能性がある。これは、当該遺伝子が発現し、作用している組織を用いなければ解析できない。本研究では、男児外陰部異常症（停留精巣や尿道下裂患者の手術時外陰部皮膚検体）の治療目的で手術を受けた患者から組織を入手し、メチル化パターンと発現量を解析する。

また、ヒトでは臨床的に容易に採取できない性腺を用いて、環境化学物質暴露効果の指標となるバイオマーカーを同定するために、TCDDをマウスに暴露して解析を行う。妊娠マウス（妊娠12.5日目）にTCDDを投与し、出生翌日の精巣における遺伝子発現量の変動を調べる。

## 5 ) 口蓋裂発症因子に関する研究

口蓋裂は、環境化学物質暴露との関係が危惧される疾患の一つである。この研究体制の構築ならびに検体集積を行う。

## 6 ) ESR1陽性細胞株を用いたバイオマーカーの探索に関する研究

ESR1陽性ヒト乳癌細胞株（MCF-7細胞）、ESR1陽性ヒト卵巢癌細胞株（BG1Luc4E2細胞）およびERs-陰性ヒト前立腺癌細胞株（LNCaP細胞）を用いたin vitroにおけるBPA、BBP、o，p'-DDTとE2の暴露実験を行う。

## (2) 臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備に関する研究

## 1 ) 試料およびデータの集積と保存に関する研究

分子生物学的な解析試料として、臍帯血・胎盤からDNA採取、RNA採取、不死化リンパ球作製を行う。また、可能な限り、母親あるいは両親の末梢血からDNA採取、RNA採取、不死化リンパ球作製を行う。暴露量
測定試料を用いて、ビスフェノールやダイオキシンなど代表的化学物質を測定すると共に、残りを凍結保存する。臨床情報として、食事内容、生活環境など詳細な妊娠歴を成育コホート方式に従い記録し、ある程度の暴露量を把握する。また、出生後の新生児所見、臍帯・胎盤所見を連結可能匿名化で記録する。これにより、下記のプロファイリングデータおよび将来のデータとの対応、および、長期フォローアップを可能とする。

## 2 ) 保存試料のプロファイリングと品質管理に関する研究

バイオマーカーとして使用しうる多型・ハプロタイプの頻度や疾患責任遺伝子の発現量などのプロファイリングを行い、データベースとして保存し、今後の遺伝—環境相互作用や遺伝子間相互作用の研究のために公開する。さらに、品質管理は、インプリンティング遺伝子のメチル化パターンと発現量を解析することで実施する。また、環境残留性化学物質の測定やエストロゲン活性およびアリールハイドロカーボン活性などを指標にした毒性等量の測定を行う。

## 3 ) 少量サンプル解析のパイロットスタディに関する研究

特殊血液保存用ろ紙（カード）であるFTA Elute（GE Healthcare）とFTA（GE Healthcare）を用いて血液を保存する。その後、FTA EluteカードからゲノムDNAを抽出してPCRを行い、ゲノムDNA回収量およびPCR産物の濃度より増幅効率を算出する。さらに、これらのサンプルが、SNP解析に利用できるかを検討する。

### 4. 結果及び考察

## (1) バイオマーカーの開発に関する研究

## 1 ) エストロゲン受容体α遺伝子 (ESR1) に関する研究

ESR1の特定ハプロタイプが停留精巣と尿道下裂の強い感受性因子であり、その本態が感受性ハプロタイプと絶対連鎖不平衡を示す2,244 bpの微細欠失であることを見いだした。

詳細は、ESR1ハプロタイプ解析の結果、ESR1遺伝子の3'領域に約50 kbの連鎖不平衡領域のAGATA特定ハプロタイプが存在し、このプロック内のAGATA特定ハプロタイプが、停留精巣と尿道下裂の強い感受性因子であることを明らかにしたことである。さらに、近年の暴露量増加を反映して、この感受性因子を有する男児が成人男性よりも高リスクにあることを見いだした。また、このデータがイタリア人においても外陰部異常症発症のリスク因子であることを見いだした。さらに、世代間の頻度解析から、環境化学物質の暴露量増加が疾患発症に関与することが示唆される。ESR1の発現は外陰部皮膚由来の線維芽細胞および血液由来の不死化リンパ球細胞で低いため、この微小欠失の相同領域ノックインマウスを作製し、in vivoにおける機能解析を進めた。現在のところキメラ率（ES由来細胞の比率）が30-50％とやや低いが、キメラマウスの作製に成功した。

## 2 )エストロゲン受容体β遺伝子(ESR2)に関する研究

日本人精子形成障害患者と妊よう性陽性男性におけるハプロタイプ関連解析から、ESR2遺伝子の中央から3'領域に存在する約40 kbの連鎖不平衡領域のTGTAGA特定ハプロタイプが、精子形成障害の感受性であることを見いだした。

## 3 ) 男児生殖器疾患における環境化学物質感受性バイオマーカーの開発に関する研究

これまでの研究から、AHR、ARNT2、CYP1A2、CYP17A1、およびN1RI2（PXR）の5遺伝子の多型が男児外陰部異常症の発症と関連することが示唆されている。日本人について患者248名（停留精巣116名、尿道下裂98名およびマイクロペニス34名）および正常者141名について、前記の5遺伝子とその関連性を調べた。

その結果、疾患によって異なる遺伝子のSNPを検出した。日本人における停留精巣において、CYP17A1 rs4919686およびARNT2 rs5000770を検出したが、尿道下裂では、CYP1A2 rs2069521およびARNT2 rs2278705、rs5000770が検出され、CYP17A1のSNPは検出されなかった。さらに、ARNT2 rs5000770は、停留精巣においても検出された。

日本人およびイタリア人男児集団において、HapMapデータをもとに、男性ホルモン効果関連遺伝子群やダイオキシン関連遺伝子を主とする96個のtag SNPの相関解析を行った。その結果、男性ホルモン産生酵素であるCYP17A1、ダイオキシンシグナル伝達に関わるAHRとARNT2、bisphenol-A受容体とされるNR1I2における多型が、男児外陰部異常症と関連していることを見いだした。さらに、日本人とイタリア人に共通する感受性SNPがAHRで2個、ARNT2で2個、NR1I2で4個検出された。

さらに、外陰部皮膚線維芽細胞を用いたin vitroにおけるbisphenol-A (BPA)、estroadiol (E2)、TCDD暴露実験は、DMSO暴露を比較対照として行い、各群1.2倍以上の発現変化が見られた遺伝子の抽出を行った。その結果、BPA暴露では71遺伝子（42発現減少と29発現上昇）、E2暴露では814遺伝子（371発現減少と443発現上昇）、TCDD暴露では824遺伝子（344発現減少と480発現上昇）の発現変化を見いだした。これ
らについて、さらに化学物質に特異的、あるいは共通の遺伝子を調べると、BPA特異的応答は43遺伝子、E2と共通な遺伝子は17個、TCDDと共通な遺伝子は10個であった。

## 4 ) 単一遺伝子におけるメチル化パターンと発現量変化の同定に関する研究

停留精巣や尿道下裂患者の手術時外陰部皮膚検体を用いて解析した。外陰部男性化に必須であるジヒドロテストステロン産生を担い、外陰部皮膚組織において発現していることが知られているARとSRD5A2遺伝子について解析を行った。ARおよびSRD5A2の遺伝子は、内部標準としてCP遺伝子の発現量で補正を行い、それぞれの遺伝子の発現量とした。外陰部皮膚で発現しているARとSRD5A2のプロモーター領域において、過剰メチル化が少数の患者で認められた。尿道下裂患者のSRD5A2遺伝子のメチル化頻度とSRD5A2遺伝子発現量との相関関係をみたところ、有意に逆相関（P=0.0085）することが示された。さらに、SRD5A2遺伝子プロモーターのトータルのCpGメチル化頻度とCYP1A1およびCYP1B1遺伝子発現量との間には、各々有意な負の相関関係があることを見いだした。

つぎに、尿道下裂患者の外陰部皮膚検体を用いて、埋没陰茎の外陰部皮膚検体を比較対照とし、1.2倍以上の発現変化が見られた遺伝子の抽出を行った。その結果、尿道下裂患者の外陰部皮膚検体は、埋没陰茎の外陰部皮膚検体に比べて、1,066遺伝子（370発現減少と696発現上昇）の発現変化を見いだした。

ヒトでは臨床的に容易に採取できない性腺を用いて、環境化学物質暴露効果の指標となるバイオマーカーを同定するために、TCDDをマウスに暴露して解析を行った。妊娠マウス（妊娠12.5日目）にTCDDを1回投与し、出生翌日の精巣を摘出した。摘出した精巣からtotal RNAを抽出後、リアルタイムRT-PCRにより遺伝子発現を解析した。その結果、男性ホルモン産生酵素であるCyp17a1遺伝子の発現減少など、多数の遺伝子発現量が変動していることが明らかとなった。

## 5 ) 口蓋裂発症因子に関する研究

口蓋裂は、単一遺伝子疾患としても発症するが、多因子疾患としても発症する。特に、近年種々の感受性因子が同定され、さらに、TCDD暴露が口蓋裂発症を招くことがマウス暴露実験から知られている。したがって、TCDD感受性が高い個体において、口蓋裂が発症しやすいことが推測される。また、外陰部異常症と同様、口蓋組織におけるメチル化（エピジェネティク修飾）が口蓋裂の発症に関与している可能性が推測される。

われわれは、この仮説を検討するため、口蓋裂患者の血液および手術時の口蓋組織（皮膚線維芽細胞）の集積を開始し、現在、60例の検体を集積した。感受性因子については、45例以上集積できれば、SNPのみならずハプロタイプを用いた関連解析が可能であり、さらにエピジェネティク解析について随時進めている。これにより、口蓋裂発症と環境化学物質の関連性を解明したいと考えている。

## 6 ) ESR1陽性細胞株を用いたバイオマーカーの探索に関する研究

ESR1陽性および陰性のヒト細胞株を用いて、ARNT2遺伝子の発現がESR1に依存しているかどうかを調べた。ESR1陽性ヒト乳癌細胞株（MCF-7細胞）、ヒト卵巢癌細胞株（BG1Luc4E2細胞）およびERs-陰性ヒト前立腺癌細胞株（LNCaP細胞）を用いて、BPA、BBP、o，p'-DDTとE2の暴露実験を行い、リアルタイムRT-PCRによりARNT2遺伝子の発現を解析した。その結果、BPA、BBPおよびo，p'-DDTの暴露は、ESR1陽性株（MCF-7およびBG1Luc4E2E2細胞）において、有意にかつ用量依存的にARNT2遺伝子の発現を抑制し、ERs-陰性株（LNCaP細胞）においてARNT2遺伝子の発現に影響を与えなかった。

## (2) 臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備に関する研究

## 1 ) 試料およびデータの集積と保存に関する研究

正常児における臍帯血・胎盤の使用およびバンキングを行った。

これまでに、DNA・リンパ球セルライン検体として、臍帯血1,200、胎盤67、精子形成障害患者150、尿道下裂・停留精巣患者350、早発性卵巣機能不全患者120、口蓋裂患者60例分を集積した。また、組織検体として、胎盤67、尿道下裂・停留精巣患者の外陰部皮膚350、口蓋裂患者の口腔粘膜60例分を集積した。

## 2 ) 保存試料のプロファイリングと品質管理に関する研究

胎盤・臍帯血を用いた発現解析やメチル化解析を種々の遺伝子やインプリンティング遺伝子を対象として行った。その結果、新鮮な胎盤では、種々の遺伝子やインプリンティング遺伝子を対象とする遺伝子発現解析やメチル化解析などの様々な解析が可能であること、また、ホルマリン処理したパラフィンブロック中に保存された胎盤をもちいた場合でも、200 bp以下のPCR産物は比較的容易に得られ、メチル化解析も可能であることが判明した。

## 3 ) 少量サンプル解析のパイロットスタディに関する研究
FTA Eluteカードを用いて保存した血液からDNA抽出方法を検討したところ、ボルテックスやピペッティングの作業を追加することにより、ゲノムDNAの回収量が増加した。

FTAカードで保存した血液から、Protenase K処理の工程を加えて抽出した1.6 ngのゲノムDNAを用いた場合、SNP解析成功率は98％であった。また、FTA Eluteカードで保存した血液から、Protenase K処理の工程を加えて抽出した5.4 ngのゲノムDNAを用いた場合、SNP解析成功率は100％であった。カードで保存した微量な血液は、Protenase K処理の工程を加えてゲノムDNAを抽出する方法を用いた場合、SNP解析に使用できるゲノムDNAを得ることが可能な検体であることが明らかとなった。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

本研究は、内分泌攪乱化学物質にたいして遺伝的に脆弱な個体が存在すること、また、高感受性個体が先天奇形を発症するリスクが暴露量と比例して増加することを示しうる内容である。したがって、小児などの化学物質に脆弱な集団にたいする保護の必要性を再確認した国際化学物質管理会議の趣旨に沿い、2020年までに化学物質の健康や環境への影響を最小限にするという目標を実現化に寄与するものである。このような成果は、一般集団の啓蒙や法令を作成する上においても、重要な役割を果たすと期待され、最終的に高リスク個体（感受性因子陽性小児）を保護しうる暴露量の推定に結びつくと思われる。

また、本研究は、先天奇形のなかでも尿道下裂など、生殖と密接に関連する領域の研究であり、少子化対策の観点から、強いインパクトを持つと考えられる。内因性疾患感受性研究の促進では、エストロゲン受容体における感受性因子の同定は、内分泌攪乱物質反応性のみならず、思春期成長障害、骨そしょう症、更年期うつ病、乳癌、高血圧など、内因性エストロゲン効果関連疾患の発症機序解明に貢献する。他の環境化学物質関連疾患の感受性因子同定の促進では、精神発達障害、発癌性、催奇形性など、環境化学物質との関連が危惧される疾患の発症機序解明を促進する。

さらに、本研究は、大きな社会的および学術的関心を呼び、高いインパクトファクターの雑誌における掲載や高いサイテーションインデックスを獲得すると期待される。

## (2) 環境政策への貢献

## 1 ) バイオマーカーの開発に関する研究

本研究により同定される感受性多型・ハプロタイプは、小児の環境化学物質感受性を評価するバイオマーカーとなる。そして、健常者における感受性因子の頻度を、暴露量が異なると考えられる世代間で比較することで、現在の小児集団が成人集団よりも、暴露量の観点から先天奇形症発症に関してより高いリスクを持つことを認識させる効果を持つと期待される。

## 2 ) 臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備に関する研究

本研究の環境リスク研究に広く貢献できる臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備は、先天奇形のなかでも尿道下裂など、生殖と密接に関連する領域の研究において、遺伝因子と環境因子の相互作用で出現する先天奇形の表現型の適切な解析を可能とする。尿道下裂など生殖と密接に関連する領域の研究は、少子化対策の観点から、強いインパクトを持つと考えられる。また、バンキングシステムの整備により、精神発達障害、発癌性、催奇形性など、環境化学物質との関連が危惧される疾患の発症機序解明にも貢献する。

6. 研究成果の主な発表状況（別添.作成要領参照）

## (1) 主な誌上発表

## く査読付き論文>

1) MS. Alam, S. Ohsako, T. Matsuwaki, XB. Zhu, N. Tsunekawa, Y. Kanai, H. Sone, C. Tohyama and M. Kurohmaru: Reproduction, 139, 2, 427–437 (2010)

“Induction of spermatogenic cell apoptosis in prepubertal rat testes irrespective of testicular steroidogenesis: A possible estrogenic effect of di (n-butyl) phthalate.”

2) X.Y. Qin, F. Wei, J. Yoshinaga, J. Yonemoto, M. Tanokura and H. Sone: FEBS Lett. 585, 20, 3310–3315 (2011)

“siRNA-mediated knockdown of aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2 affects hypoxia-inducible factor-1 regulatory signaling and metabolism in human breast cancer cells.”

3) T. Ogata $ ^{*} $ et al.: J. Hum. Genet.

“Haplotype analysis of ESR2 in Japanese patients with spermatogenic failure: Implications for genetic susceptibility to estrogenic environmental endocrine disruptors.” (accepted).