Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
集積できれば、SNPのみならずハプロタイプを用いた関連解析が可能であり、さらにエピジェネティク解析について随時進めている。これにより、口蓋裂発症と環境化学物質の関連性を解明したいと考えている。

## （６）ESR1陽性細胞株を用いたバイオマーカーの探索に関する研究

近年、新たな遺伝子間相互作用検出のための手法が提唱されており、multifactor dimensionality reduction（MDR）は代表的な手法の一つである $ ^{8} $ 。これは複数の因子間の相互作用を二元化して捉えるアルゴリズムであり、複数のSNP間で生じる複雑な相互作用が、比較的少数のデータにおいて検出可能であるなど、その有効性が注目されている。

尿道下裂患者（HS）と精巣停留（CO）の発症リスクに関与する環境化学物質の感受性遺伝子の同定を目的とした先行研究において、有意差が認められていたARNT2、CYP17A1およびCYP1A2のSNPについて、MDRによる遺伝子間相互作用解析を行った。その結果、ARNT2 rs2278705、rs5000770およびCYP1A2 rs2069521が、最も疾患リスクに関与していることを見いだした（表(1)−4）。

表(1)–4 尿道下裂患者（HS）と精巣停留（CO）におけるSNPの MDR法による多因子解析

疾患	最適モデル SNPID (遺伝子名)	TBA	CVC	P-value
CO $ ^{a} $	rs5000770 (ARNT2)	0.5318	7/10	0.377
rs4919686 (CYP17A1) rs5000770 (ARNT2)	0.5999	8/10	0.055
rs2472680 (NR1I2) rs4919686 (CYP17A1) rs5000770 (ARNT2)	0.6281	10/10	0.011
HS $ ^{b} $	rs2069521 (CYP1A2)	0.6958	10/10	0.001
rs2069521 (CYP1A2) rs2278705 (ARNT2)	0.6998	9/10	0.001
rs2069521 (CYP1A2) rs2278705 (ARNT2) rs5000770 (ARNT2)	0.6576	10/10	0.001

TBAは testing balanced accuracy。CVCは cross validation consistency。

$ ^{a} $ 検体数=236（141対照及び95CO）。 $ ^{b} $ 検体数=239（141対照及び98HS）。

つぎに、ESR1陽性および陰性のヒト細胞株を用いて、ARNT2遺伝子の発現がESR1に依存しているかどうかを調べた。ESR1陽性ヒト乳癌細胞株（MCF-7細胞）、ヒト卵巢癌細胞株（BG1Luc4E2細胞）およびERs-陰性ヒト前立腺癌細胞株（LNCaP細胞）を用いて、BPA、BBP、o, p'-DDTとE2の暴露実験を行い、リアルタイムRT-PCRによりARNT2遺伝子の発現を解析した。その結果、BPA、BBPおよびo, p'-DDTの暴露は、ESR1陽性株（MCF-7およびBG1Luc4E2E2細胞）において、有意にかつ用量依存的にARNT2遺伝子の発現を抑制し、ERs-陰性株（LNCaP細胞）においてARNT2遺伝子の発現に影響を与えなかった。また、ESR1の特異的拮抗剤であるMPPで前処置を行うと、BPA、BBP、o, p'-DDT暴露によるARNT2遺伝子の発現抑制作用は消失した。さらに、ESR1シグナリングで特異的に発現上昇することが知られているPDZ domain containing 1（PDZK1）
遺伝子の発現はMPPで抑制された。これらの結果から、BPA、BBPおよびo, p'-DDTの暴露は、ESR1を介して、ARNT2遺伝子の発現を抑制することが示唆される。

また、ARNT2遺伝子の特異的阻害プローブであるsiRNAを用いて、同じファミリーでありアリール炭化水素受容体（AHR）とヘテロ二量体を形成することが知られているARNT遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうかを調べた。その結果、ARNT2遺伝子の発現は用量依存的に減少することが認められ、実験系がうまく機能していることは証明された。しかし、その時にARNT遺伝子の発現変動は認められなかった。これまでに、ARNTはAHRとヘテロ二量体を形成すること、ARNT2は低酸素シグナル伝達の転写因子であるHIF1αとヘテロ二量体を形成し、生体影響に関わる様々な遺伝子の転写活性化を引き起こすことが知られている。そこで、ESR1遺伝子の発現が高いヒト細胞株（MCF7）において、ARNT2遺伝子の発現を抑制した場合、HIF1αのシグナル伝達に影響を及ぼすかどうかを調べた。その結果、最も大きな発現変動が確認された遺伝子は、MMP1（matrix metallopeptidase 1）、SAG（S-antigen; retina and pineal gland (arrestin)）、VHL（von Hippel-Lindau tumor suppressor, E3 ubiquitin protein ligase）であった。これらの遺伝子は、細胞外マトリックスの接着や、ホルモン刺激、細胞増殖シグナルに関与する因子であることが知られている。これらの結果から、環境化学物質の暴露が、ESR1を介して、ARNT2遺伝子とHIF1αシグナル伝達系に影響を与えていることが示唆される。今後、さらに外陰部皮膚線維芽細胞を用いて、これらの遺伝子の役割や機能解明に関する研究を行い、化学物質応答に関する指標の有用なバイオマーカーになり得るかの確認を行う必要がある。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究は、内分泌攪乱化学物質にたいして遺伝的に脆弱な個体が存在すること、また、高感受性個体が先天奇形を発症するリスクが暴露量と比例して増加することを示しうる内容である。したがって、小児などの化学物質に脆弱な集団にたいする保護の必要性を再確認した国際化学物質管理会議の趣旨に沿い、2020年までに化学物質の健康や環境への影響を最小限にするという目標の実現化に寄与するものである。

現在まで、単一遺伝子のメチル化パターンや発現量の観点から、バイオマーカーを開発しようとする試みはなく、環境化学物質が単一遺伝子の作用を妨げることが確認できたとき、これは、新しい視点からのバイオマーカー開発となる。そして、特定の感受性多型やハプロタイプを持たない個人にたいしても環境化学物質悪影響を及ぼすことを認識させる効果を持つ。

## （２）環境政策への貢献

本研究により同定される感受性多型・ハプロタイプは、小児の環境化学物質感受性を評価するバイオマーカーとなる。そして、健常者における感受性因子の頻度を、暴露量が異なると考えられる世代間で比較することで、現在の小児集団が成人集団よりも、暴露量の観点から先天奇形症発症に関してより高いリスクを持つことを認識させる効果を持つと期待される。

このような成果は、一般集団の啓蒙や法令を作成する上においても、重要な役割を果たすと期待され、最終的に高リスク個体（感受性因子陽性小児）を保護しうる暴露量の推定に結びつ
くと思われる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

国際共同研究計画名：

重金属及びダイオキシン類の曝露量と口蓋口唇裂の発生頻度との関連性に関する研究カウンターパート氏名・所属・国名：

賈 光 · 北京大学医学部公衆衛生学研究室 · 中国

参加·連携状況：

張 済主任医師（済南市疾病予防控制中心）や顧依群主任医师（北京市海淀区妇幼保健院）と連携して、検体を収集し、ヒト組織における重金属及びダイオキシン類の負荷量を調べる。また、重金属及びダイオキシン応答遺伝子に着目し、口蓋口唇裂の発生頻度と曝露量との関係を調べる。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) MS. Alam, S. Ohsako, T. Matsuwaki, XB. Zhu, N. Tsunekawa, Y. Kanai, H. Sone, C. Tohyama and M. Kurohmaru: Reproduction, 139, 2, 427–437 (2010)

“Induction of spermatogenic cell apoptosis in prepubertal rat testes irrespective of testicular steroidogenesis: A possible estrogenic effect of di (n-butyl) phthalate.”

2) X.Y. Qin, F. Wei, J. Yoshinaga, J. Yonemoto, M. Tanokura and H. Sone: FEBS Lett. 585, 20, 3310–3315 (2011)

“siRNA-mediated knockdown of aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2 affects hypoxia-inducible factor-1 regulatory signaling and metabolism in human breast cancer cells.”

3) T. Ogata $ ^{*} $ et al.: J. Hum. Genet,

“Haplotype analysis of ESR2 in Japanese patients with spermatogenic failure: Implications for genetic susceptibility to estrogenic environmental endocrine disruptors.” (accepted)

＜查読付論文に準ずる成果発表＞（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可。）特に記載すべき事項はない。

くその他誌上発表（査読なし）>

1) T. Ogata, J. Laporte and M. Fukami: Hormone Research, 71, 5, 245–252 (2009) "MAMLD1 (CXorf6): a new gene involved in hypospadias."

2) 緒方勤：小児科診療、72,1,39–44 (2009)

「エピジェネティクスと遺伝疾患」

3) 緒方 勤：臨床泌尿器科、63, 2, 109–116 (2009)

「男児外陰部異常症」

4） 緒方 勤、佐藤直子：ゲノム医学、9,2,67-70(2009)

「中枢性性腺機能不全：Kallmann 症候群を主として」
6) 緒方 勤：小児内科 増刊号（小児疾患診療のための病態生理）、41,319–321 (2009)「性腺無形成と性腺異形成」

7) 緒方 勤：科学、79, 9, 982–983 (2009)

「小児疾患と環境化学物質：遺伝—環境相互作用の観点から」

8) 緒方 勤：小児内科、41, 7, 1079–1084 (2009)

「SHOX遺伝子異常症：臨床症状発症機序の解明」

9) 緒方 勤、伊達木澄人、山澤一樹：SGA性低身長症のマネジメント（藤枝憲二 監修）、メディカルレビュー社、41,7,57-68 (2009)

「胎内発育に影響する因子：IUGRの遺伝的要因」

10）緒方 勤：小児内分泌学（日本小児内分泌学会 編集）、診断と治療社、305-309 (2009)「性の分化機構」

11）緒方 勤：小児内分泌疾患鑑別診断チャート（藤枝憲二 編集）、診断と治療社、74-75(2009)

「ミクロペニス」

12）緒方勤：小児内分泌疾患鑑別診断チャート（藤枝憲二 編集）、診断と治療社、80-81(2009)

「性分化異常」

13) 緒方 勤：化学物質と環境、エコケミストリー研究会会報、96, 1-5 (2009) 「小児疾患と環境化学物質」

15）吉田理恵、緒方勤：小児外科、41,2,95–97(2009)「泌尿器生殖洞の発生分化とその異常」

16) H. Sone, S. Imanishi, H. Akanuma, R. Nagano, T. Fukuda, S. Ohsako: The roles of free radicals in biology and medicine", MEDIMOND SRL Publ., 45–52 (2009)

“Gene expression signatures of environmental chemicals in cancer and in developmental disorders.”

18）左合治彦、林 聪、穴見 愛：小児外科（出生前診断の倫理と実際）、41,5,457–460 (2009)「出生前診断と胎児治療—産科の立場から」

19) 左合治彦：日産婦東京地方部会誌、58,3,288–292 (2009) 「一絨毛膜双胎の異常に対する胎児手術」

20） 左合治彦、林 聡、青木宏明：周産期医学（アウトカムからみた周産期管理）、39,10,1381-1385 (2009)

「胎児治療」

21) 緒方 勤 : Pediatric Endocrinology Reviews 抄訳シリーズ. No. 3. ジャパンメディアートパブリッシング、2–3 (2010)
「内分泌攪乱物質：特に性分化・発達にたいする影響について」

22）緒方勤：Horm Front Gynecol（特集：エピジェネティクス・ゲノムインプリンティング）、17, 12, 361–368 (2010)

「生殖補助医療とインプリンティング異常」

23）深見真紀、伊達木澄人、緒方勤：Horm Front Gynecol（目で見る生殖内分泌疾患の診断と治療）、17,2,4-8(2010)

「中枢性性腺機能低下症」

24） 左合治彦、林 聪、杉林里佳、江川真希子、佐々木愛子：産婦人科治療、101,5,538-543(2010)「胎児治療の適応と限界」

25）緒方 勤，位田忍，堀川玲子：臨床泌尿器科、65, 12, 897–902 (2011)「性分化疾患の分類と社会的性の決定について」

26） 緒方 勤：小児内科（ちょっと気になる症候のみかた考え方）、43, 10, 1795–1799 (2011)「外性器の異常（性分化）」

28） 緒方 勤：卵子学（森崇英 総編集）、京都大学学術出版会、88-100 (2011)「性分化疾患」

29) 緒方 勤: 遺伝カウンセリングハンドブック（福嶋義光 編集）、メディカルドゥ、130-131(2011)

30）緒方勤：生殖卵総学：臨床への進展（石塚文平 編集）、医歯薬出版株式会社、17–25 (2011)「減数分裂：基礎知識と臨床の進展」

31） 緒方 勤：Pediatric Endocrinology Reviews 抄訳シリーズ. No. 26. ジャパンメディアートパブリッシング、4–5 (2011)

「多様なヌクレオチド除去修復(NER)とその医学的意義」

32） 緒方 勤: 内分泌・糖尿病内科学 (森昌朋 編集)、シュプリンガージャパン、168-170 (2011) 「性腺機能低下症」

33） 中村美智子、野々村克也、深見真紀、宮戸真美、須川史啓、緒方 勤：日本小児泌尿器科学会雑誌、20,1,33–37(2011)

「Mamld1は、マウスライディッヒ腫瘍細胞において、ステロイド合成酵素遺伝子Cyp17a1の発現調節を介し、テストステロン産生に関わっている」

34）緒方勤：今日の小児治療指針15版、医学書院、244–245 (2012)「原発性性腺機能低下症」

## （2） 口頭発表（学会等）発表年順（古→新）

1) T. Ogata: The Third Workshop Pediatric Andrology, Basel, Switzerland, 2009. "MAMALD1 for hypospadias and 46,XY disorders of sex development."

2) T. Ogata: The Third Workshop Pediatric Andrology, Basel, Switzerland, 2009. "Backdoor pathway to dihydrotestosterone identified in POR deficiency."
3) T. Ogata: The Third Workshop Pediatric Andrology, Basel, Switzerland, 2009. "ESR1 and cryptorchidiam/hypospadias (the susceptibility to environmental disruptors)."

4) T. Ogata: The Seminar for Department of Physiology, Development & Neuroscience, Cambridge, England, 2009.

“(Epi)genetic mechanisms leading to the development of upd(14)pat/mat phenotypes.”

5) T. Ogata: The 9th International Congress of Andrology, Barcelona, Spain, 2009. "Hypospadias."

6) T. Ogata: The Seminar for Human Molecular Genetics, Prince Henry's Institute of Medical Research, Monash Medical Centre, Melbourne, Australia, 2009.

“Gentic mechanisms involved in hypospadias.”

7) T. Ogata: Disorders of sex development: underlying molecular causes, clinical management and future strategies, Melbourne, Australia, 2009.

“Clinical and molecular studies on Japanese patients with DSD.”

8) T. Ogata: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“Gentic causes of hypospadias. Symposium of syndromic DSD.”

9) T. Ogata: The 14th Annual Scientific Meeting of Korean Society for Pediatric Endocrinology, Seoul, Korea, 2009.

“Silver-Russell syndrome as a human imprinting disorder. Prenary Lecutre.”

10) T. Ogata: The 14th Annual Scientific Meeting of Korean Society for Pediatric Endocrinology, Seoul, Korea, 2009.

“SHOX haploinsufficiency: lessons from clinical studies. Special Lecutre.”

11) T. Ogata: The International Ovarian Conference 2009, Tokyo, Japan, 2009. "Pathogenesis of POF."

12）緒方 勤：市民提案の循環型社会をめざす会（2009）「化学物質と子どもの体への影響」

13）緒方勤：第2回博多シンポジウム（2009）「性分化異常症（尿道下裂）と内外因子」

14）緒方勤：第18回東海新生児研究会（2009）「胎児成長発達とゲノムインプリンティング」

15) 緒方 勤：第14回鹿児島小児内分泌研究会（2009）

「性分化異常症：分子基盤と臨床的知見」

16) M. Kagami, M. Fukami, M. O'Sullivan, A. Green, S. Takada, F. Kato, A. Ferguson-Smith and T. Ogata: The 24th Naito Conference, Sapporo, Japan, 2009.

“Essential role of the MEG3-DMR in the regulation of the maternally inherited human chromosome 14q32.2 imprinting region.”

17) MP. Brandão, M. Fukami, BB. Mendonça, M. Gerdulo, S. Domenice, IJP. Arnhold, T. Ogata and EMF. Costa: The Endocrine Society’s 91st Annual Meeting, Washington, USA, 2009.

“A Novel Gain of function Mutation in the MAMLD1 gene in patients with Undetermined 46,XY
Disorders of Sex Development."

18) MP. Brandão, EMF. Costa, M. Fukami, MG. Santos, NP. Pereira, S. Domenice, T. Ogata and BB. Mendonça: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“MAMLD1 Homozygous gain-of-function missense mutation causing 46, XX disorder of sex development in a virilized female.”

19) S. Dateki, K. Kosaka, K. Hasegawa, M. Fukami, K. Muroya, M. Adachi, K. Motomura, N. Azuma, H. Tanaka, T. Tajima, H. Moriuchi and T. Ogata: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“Heterozygous OTX2 mutations are associated with variable pituitary hormone deficiency.”

20) K. Matsuo, S. Suzuki, M. Maimaiti, T. Mulai, T. Hamajima, K. Motomura, Y. Naiki, T. Ogata, T. Tajima, T. Hasegawa and K. Fujieda: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“Evaluation of sensitive detection methods for somatic mosaicism of GNAS1 mutation in patients with McCune-Albright syndrome.”

21) MP. Brandão, M. Fukami, BB. Mendonça, MG. Santos, S. Domenice, IJP. Arnhold, T. Ogata and EMF. Costa: The 8th Joint meeting, ESPE-LWPES in association with APEG, APPES, SLEP, JSPE, New York, USA, 2009.

“A gain of function mutation in the MAMLD1 discloses a new pathway in the etiology of 46,XY doseders of sex development.”

22) K. Nakabayashi, W. Yoshida, K. Yamazawa, M. Kusumi, T. Ogata and K. Hata: The 47th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics, Baltimore, USA, 2009.

“MeDIP-chip detection and quantitative DNA methylation analysis of differentially methylated regions in imprinted loci.”

23）和田友香、深見真紀、須川史啓、宮戸真美、緒方勤：第112回日本小児科学会学術集会(2009)

「MAMLD1遺伝子におけるスプライス部位変異（IVS4-2A>G）の検討」

24）和田友香、深見真紀、緒方勤：第54回日本人類遺伝学会（2009）「MAMLD1遺伝子におけるスプライス部位変異（IVS4-2A＞G）の検討

25）宫戸真美、中村美智子、須川史啓、深見真紀、宮戸健二、菊水健史、小川佳宏、緒方勤：第43回日本小児内分泌学会（2009）

「Mamlld1発現異常が引き起こすホルモン産生と摂食調節の解析」

26）加藤芙弥子、深見真紀、和田友香、マイラブランダオ、中村美智子、上松あゆみ、長谷川奉延、宮戸真美、緒方勤：第43回日本小児内分泌学会（2009）

「MAMLD1異常症：新規遺伝子変異の同定と変異陽性患者の表現型」

27) M. Fukami, G. Nishimura, K. Homma, T. Nagai, K. Hanaki, T. Ishii, M. Adachi, T. Tajima, Y. Hasegawa, T. Hasegawa, R. Horikawa, K. Fujieda and T. Ogata: 第32回日本分子生物学会年会(2009)

"Cytochrome P450 Oxidoreductase Deficiency: Identification and Characterization of Biallelic
Mutations and Genotype-Phenotype Correlations in 36 Japanese Patients."

28) M. Miyado, M. Nakamura, M. Fukami, K. Miyado, T. Kikusui, Y. Ogawa and T. Ogata: 第32回日本分子生物学会年会（2009）

“Impaired expression of Mamld1 disturbs production of steroid hormones and feeding regulation.”

29) X. Qin, H. Zaha, R. Nagano, J. Yonemoto, H. Sone and J. Yoshinaga: 第12回日本内分泌攪乱化学物質学会 研究発表会（2009）

“Estrogenic activities of endocrine-disrupting chemicals and their effects on male genital disorders related genes expression.”

30) H. Sone, L. Yang, T. Fukuda, H. Akanuma, R. Nagano and H. Zaha: 21st Cent. Adv. Mol. Toxicol. Environ. Chem. Pathog. Dis., Tokyo, Japan, 2009.

“The effect of low dose BPA on cell proliferation and senescence in human mammary epithelial cells.”

31) H. Sone, S. Imanishi, M. Okura, H. Zaha, H. Shiraishi and H. Fujimaki: PPTOX II : Role of environmental stressors in the developmental origins of disease, Miami, USA, 2009.

“Prenatal exposure to permethrin inhibits brain development via disruption of vascular development in mice.”

32) X. Qin, H. Zaha, J. Yoshinaga, J. Yonemoto and H. Sone: 29th Int. Symp. Halogenat. Persistent Org. Pollut.-DIOXIN, Beijing, China, 2009.

“Association of AHR and ESR1-responsive gene variations with susceptibility to endocrinedisrupting chemicals in risk of male genital disorders.”

33) A. Anami, S. Hayashi, Y. Sugo and H. Sone: 19th World Congress on Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, Hamburg, Germany, 2009.

“The characterization of ultrasound examination to predict twin one fetal demise in monochorionic diamniotic twin pregnancies.”

34) S. Hayashi, K. Ishii, N. Kato, Y. Takahashi, M. Nakata, J. Murotuki, T. Murakoshi, Y. Nanba, Y. Ito and H. Sago: 19th World Congress on Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, Hamburg, Germany, 2009.

“Perinatal outcome of monochorionic twin pregnancies complicated by amniotic fluid discordance without twin-twin transfusion syndrome.”

35) S. Hayashi, H. Sago, M. Hanaoka, M. Horiya, A. Anami, T. Nakamura, Y. Ito, T. Chiba, M. Kitagawa and M. Natori: 19th World Congress on Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, Hamburg, Germany, 2009.

“Postnatal outcome in twin reversed arterial perfusion treated with radiofrequency ablation.”

36) H. Sago, S. Hayashi, N. Kato, Y. Nanba, Y. Ito, H. Hasegawa, H. Kawamoto, M. Saito, J. Murotsuki, Y. Takahashi, M. Nakata, K. Ishii and T. Murakoshi: 19th World Congress on Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, Hamburg, Germany, 2009.

“Risks and the outcome of twin-to-twin transfusion syndrome after fetoscopic laser surgery.”

37) M. Hanaoka, S. Hayashi, M. Horiya, A. Anami, R. Oi and H. Sago: 19th World Congress on Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, Hamburg, Germany, 2009.

“The human chorionic gonadotropin and fetoscopic laser photocoagulation for twin-twin transfusion
syndrome."

38) H. Sago: 11th Korea – Japan Joint Conference of Obstetrics and Gynecology, Soul, Korea, 2009. "The Current State of Fetal Therapy in Japan."

39) T. Ogata: The 14th International Congress of Endocrinology, Kyoto, Japan, 2010.

“Disorders of sex development: Shrinking black box. In: Disorders in gonadal differentiation and development.”

40) T. Ogata, R. Yoshida and F. Massart: The 49th Annual Meeting of European Society for Paediatric Endocrinology, Prague, Czech Republic, 2010.

“Haplotype analysis of the estrogen receptor alpha gene in precocious puberty.”

41) T. Ogata: The 6th Biennial Scientific Meeting of the Asia Pacific Paediatric Endocrinology, Xi'an, China, 2010.

“Endocrine Disruptors – the environment and its impact on paediatric endocrinology. In: Hot Topic Session.”

42）緒方勤：松葉のダイオキシン調査2010実行委員会（2010）「子どもの健康と環境ホルモン」

44）緒方勤：第13回胎児遺伝子診断研究会（2010）「胎児成長発達とゲノムインプリンティング」

45）緒方勤：第249回日本小児科学会東海地方会特別講演（2010）「性分化疾患の発症機序：遺伝-環境相互作用の観点から」

46） 緒方 勤：日本アンドロロジー学会第29回学術大会・第16回精子形成・精巣毒性研究会共同開催学会特別講演（2010）

「性分化疾患研究の最前線」

47）緒方 勤、中村美智子、宮戸真美、深見真紀：第28回内分泌代謝サマーセミナー（2010）「MAMLD1変異とテストステロン産生障害：変異陽性患者およびノックアウトマウスの表現型解析とin vitro機能解析」

48) M. Miyado, M. Nakamura, M. Fukami, K. Miyado and T. Ogata: 第33回日本分子生物学会年会 (2010)

“Impaired expression of Mamld1 disturbs the gene expression of steroidogenic enzymes.”

49） 宮戸真美、中村美智子、深見真紀、宮戸健二、緒方勤：第44回日本小児内分泌学会（2010）「ステロイドホルモン産生におけるMamld1の機能解析」

50） 中村美智子、深見真紀、宮戸真美、須川史啓、緒方 勤、野々村克也：第19回日本小児泌尿器科学会（2010）

「Mamld1は、マウスライディッヒ腫瘍細胞において、ステロイド合成酵素遺伝子の発現調節を介し、テストステロン産生に関わっている」
52）須郷慶信、林 聡、大石由利子、堀谷まどか、加藤有美、青木宏明、高橋宏典、三浦裕美子、三原慶子、佐々木愛子、左合治彦、名取道也：第62回日本産婦人科学会学術講演会（2010）「当センターにおける妊娠30週の胎児超音波スクリーニング検査の検討」

53）佐々木愛子、小澤伸晃、林聡、澤井英明、増崎英明、平原史樹、左合治彦：第62回日本産婦人科学会学術講演会（2010）

「日本における出生前診断の動向（2003～2008年）」

54) T. Ogata: 6th Copenhagen Workshop on Endocrine Disrupters (COW 2011), Copenhagen, Denmark, 2011.

“Genetic susceptibility to endocrine disrupters: Estrogen receptor polymorphisms.”

55) T. Ogata and M. Fukami: The 13th European Congress of Endocrinology (ECE 2011), Rotterdam, Netherlands, 2011.

“Disorders of Sex Development: Recent Progress.”

56) T. Ogata: Hamamatsu DOHaD Conference, Hamamatsu, Japan, 2011. "Genetic susceptibility to endocrine disrupters: Estrogen receptor polymorphisms."

58）緒方勤：第1回乳幼児発達指導研究会（2011）「乳幼児期および思春期の性について」

60）緒方勤：第81回京都内分泌同好会（2011）「性分化疾患研究の進歩」

61）緒方勤：第3回岐阜小児内分泌学術講演会（2011）「性分化疾患の分子基盤」

62）緒方勤：第12回山陰内分泌研究会（2011）「性分化疾患の分子基盤:update」

63）緒方勤：第40回Medical Photonics Seminar（2011）「子どもを取り巻く環境と小児の健康」

64）緒方勤：第2回生殖医療研究会（2011）

「先天奇形症候群とゲノムインプリンティング」

65) J. Yonemoto, J. Kawahara, H. Sone, T. Hattori, T. Matsumura, Y. Ohya and S. Sugama: 31th International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants, Brussels, Belgium, 2011. "Prenatal Exposure to OH-PCBs in Relation to Body Weight and Neurodevelopment."

66）宮戸真美：第3回領域会議 性差構築の分子基盤（2011）「Mamld1遺伝子の胎仔精巣における機能解析」

67） 宮戸真美、中村美智子、宮戸健二、緒方勤、深見真紀：第45回日本小児内分泌学会（2011）「精巣におけるMamld1の機能解析」

68）鏡雅代、松岡健太郎、加藤芙弥子、宮戸真美、松原圭子、深見真紀、山中美智子、鈴森伸宏、永井敏郎、緒方勤：第45回日本小児内分泌学会（2011）
「RTL1遺伝子の胎盤における機能の解明：胎盤発育不全、子宮内胎児発育遅延の原因解明をめざして」

69）五十嵐麻希、加藤芙弥子、辻克和、緒方勤、深見真紀：第56回日本人類遺伝学会・第11回東アジア人類遺伝学会 共同大会（2011）

「アンドロゲン受容体遺伝子サイレント変異を有する不完全型アンドロゲン不応症の1例」

70） 秦咸陽、小島祥敬、水野健太郎、上岡克彦、吉永淳、米元純三、林祐太郎、群健二郎、緒方勤、曾根秀子：第14回日本内分泌攪乱化学物質学会研究発表会（2011）

「尿道下裂男児の皮膚細胞を用いた環境内分泌かく乱化学物質の目的遺伝子の解明」

71）米元純三、河原純子、曽根秀子、服部達也、松村徹、大矢幸弘、洲鎌盛一：第14回日本内分泌攪乱化学物質学会研究発表会（2011）

「保存臍帯中OH-PCB濃度と2歳児の体重、軽度発達障害との関係」

72）宫戸真美、中村美智子、宮戸健二、緒方勤、深見真紀：第34回日本分子生物学会（2011）“Mamld1 regulates expression of steroidogenic enzyme genes in mouse fetal testes.”

73）五十嵐麻希、加藤芙弥子、辻克和、緒方勤、深見真紀：第34回日本分子生物学会（2011）「アンドロゲン受容体遺伝子サイレント変異を有する不完全型アンドロゲン不応症の1例」

74）須郷慶信、林聡、大石由利子、堀谷まどか、加藤有美、青木宏明、高橋宏典、三浦裕美子、三原慶子、佐々木愛子、左合治彦、名取道也：第62回日本産婦人科学会学術講演会（2011）「当センターにおける妊娠30週の胎児超音波スクリーニング検査の検討」

75）佐々木愛子、小澤伸晃、林聡、澤井英明、増崎英明、平原史樹、左合治彦：第62回日本産婦人科学会学術講演会（2011）

「日本における出生前診断の動向（2003～2008年）」

76) 緒方 勤：第42回九州小児内分泌懇話会（2012）

「ゲノムインプリンティングと個体・胎盤成長発達」

77) 緒方勤：JCR研修会（2012）

「小児内分泌関連疾患におけるインプリンティングにかかわる最近の話題」

## （3） 出願特許

1) 緒方 勤：（独）国立成育医療研究センター研究所；「Estrogen receptor alpha gene, genomic DNA, and diagnosis marker」、米国特許出願 Patent No: US 7,601,828 B2、2009年10月13日.

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

1) 緒方勤：Certificate of Excellent Reviewer, Human Reproduction, Oxford University Journals. 2009年6月11日.
### 8 \. 引用文献

1) R. Yoshida, M. Fukami, I. Sasagawa, T. Hasegawa, N. Kamatani and T. Ogata: The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 90, 8, 4716–4721 (2005)

“Association of cryptorchidism with a specific haplotype of the estrogen receptor alpha gene: implication for the susceptibility to estrogenic environmental endocrine disruptors.”

2) M. Watanabe, R. Yoshida, K. Ueoka, K. Aoki, I. Sasagawa, T. Hasegawa, K. Sueoka, N. Kamatani, Y. Yoshimura and T. Ogata: Human Reproduction, 22, 5, 1279–1284 (2007)

“Haplotype analysis of the estrogen receptor 1 gene in male genital and reproductive abnormalities.”

3) XY. Qin, H. Zaha, R. Nagano, J. Yoshinaga, J. Yonemoto and H. Sone: Toxicol Lett., 206, 2, 152–157 (2011)

“Xenostrogens down-regulate aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator 2 mRNA expression in human breast cancer cells via an estrogen receptor alpha-dependent mechanism.”

4) DW. Singleton, Y. Feng, J. Yang, A. Puga, AV. Lee and SA. Khan: Environ Res., 100, 1, 86–92 (2006)

“Gene expression profiling reveals novel regulation by bisphenol-A in estrogen receptor-alpha-positive human cells.”

5) Y. Gibert, S. Sassi-Messai, JB. Fini, L. Bernard, D. Zalko, JP. Cravedi, P. Balaguer, M. Andersson-Lendahl, B. Demeneix and V. Laudet: BMC Dev Biol., 11, 4 (2011)

“Bisphenol A induces otolith malformations during vertebrate embryogenesis.”

6) M. Fukami, Y. Wada, K. Miyabayashi, I. Nishino, T. Hasegawa, A. Nordenskjöld, G. Camerino, C. Kretz, A. Buj-Bello, J. Laporte, G. Yamada, K. Morohashi and T. Ogata: Nat Genet., 38, 12, 1369–1371 (2006)

7) M. Fukami, Y. Wada, M. Okada, F. Kato, N. Katsumata, T. Baba, K. Morohashi, J. Laporte, M. Kitagawa and T. Ogata: J Biol Chem., 283, 9, 5525–5532 (2008)

“Mastermind-like domain-containing 1 (MAMLD1 or CXorf6) transactivates the Hes3 promoter, augments testosterone production, and contains the SF1 target sequence.”

8）MD. Ritchie, LW. Hahn, N. Roodi, LR. Bailey, WD. Dupont, FF. Parl and JH. Moore: Am J Hum Genet., 69, 1, 138–147 (2001)

“Multifactor-dimensionality reduction reveals high-order interactions among estrogen-metabolism genes in sporadic breast cancer.”
(2) 臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備に関する研究

浜松医科大学医学部小児科/（独）国立成育医療研究センター研究所分子内分泌研究部 緒方 勤

（独）国立成育医療研究センター研究所分子内分泌研究部 深見真紀

（独）国立環境研究所環境リスク研究センター健康リスク研究室 曾根秀子 <研究協力者>

（独）国立成育医療研究センター研究所分子内分泌研究部 吉田理恵・宮戸真美

（独）国立成育医療研究センター病院周産期センター 左合治彦・中村知夫

（独）国立環境研究所環境リスク研究センター環境リスク研究推進室 青木康展

平成21～23年度累計予算額：3,322千円（うち、平成23年度予算額：1,204千円）

予算額には、間接経費を含む。

[要旨] 本研究は、尿道下裂などの小児先天奇形発症を対象とする環境リスク評価法の基盤整備を行うことを目的とする。近年、停留精巣や尿道下裂などの先天奇形が増加しているという疫学的データが日本や欧米諸国から報告され、大きな社会的問題となっている。そして、これらの現象に共通する原因として、内分泌攪乱物質の影響が推測されている。さらに、内分泌攪乱物質として作用しうる環境化学物質の生産量・排出量は、近年増加している。また、このような先天異常の発症が、内分泌攪乱物質の暴露量や暴露時期の他に、個体の遺伝的感受性にも支配されるという作業仮説のもとに、研究を行ってきた。上記のような遺伝因子と環境因子の相互作用で出現する表現型を適切に解析するためには、同一集団において両者を解析することが重要である。

しかし、現在までの研究（特に小児を対象とする研究）は、遺伝因子と環境因子を異なる集団で解析しているという弱点を有する。特に、暴露量の検討に際し、ゲノムDNA・RNAおよび不死化リンパ球を保存するという体制は見られない。また、小児検体（特に正常検体）の採取・保存は、倫理的に極めて困難であるため、臍帯血・胎盤などの胎児付属物が保存の対象となると考えられるが、本邦には環境リスク評価を目的とする臍帯血・胎盤バンキングシステムは存在しない。

そこで、本研究では、正常児における臍帯血・胎盤の使用およびバンキングを行った。これまでに、DNA・リンパ球セルライン検体として、臍帯血1,200、胎盤67、精子形成障害患者150、尿道下裂・停留精巣患者350、早発性卵巣機能不全患者120、口蓋裂患者60例分を集積した。また、組織検体として、胎盤67、尿道下裂・停留精巣患者の外陰部皮膚350、口蓋裂患者の口腔粘膜60例分を集積した。胎盤・臍帯血を用いた発現解析やメチル化解析を行い、新鮮な胎盤では様々な解析が可能であることが判明した。さらに、確実にSNP配列の解析が可能であるゲノムDNAを抽出するために、微量な血液の保存条件の詳細な検討を行った。

[キーワード] 小児先天奇形、環境リスク評価、バンキングシステム、臍帯血・胎盤、長期フォローアップ

### 1. はじめに

近年、停留精巣や尿道下裂などの先天奇形が増加しているという疫学的データが日本や欧米諸
国から報告されている。これらの現象に共通する原因が内分泌攪乱物質の影響であると推測されており、さらに内分泌攪乱物質として作用しうる環境化学物質の生産量・排出量は近年増加傾向にあると報告されている。われわれは、このような先天異常の発症が、内分泌攪乱物質の暴露量や暴露時期の他に、個体の遺伝的感受性にも支配されるという作業仮説のもとに、研究を行ってきた。その結果、遺伝因子（感受性）と環境因子（化学物質）の相互作用によって出現する先天異常の表現型を適切に解析するために、同一集団において両者を解析することが重要であることがわかった。

しかし、これまでの研究（特に小児を対象とする研究）は、遺伝因子と環境因子を異なる集団で解析を行っていた。特に、小児検体（特に正常検体）の採取・保存は倫理的に極めて困難であり、現在まで本邦には環境リスク評価を目的とする臍帯血・胎盤バンキングシステムは存在していない。

このような遺伝因子と環境因子の相互作用で出現する表現型を適切に解析するためには、同一集団において両者を解析することが重要である。特に、臨床情報が整備され、かつ、バイオマーカーのプロファイリングが終了した試料のバンキングがなされれば、長期フォローアップや遺伝—環境相互作用および遺伝子間相互作用の解析を行う上で極めて有用と考えられる。

以上から、小児先天奇形発症における環境リスク評価法の基盤整備には臍帯血・胎盤バンキングシステムの構築が重要であると考えられる（図(2)−1）。

## サブテーマ2:臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備

### 1. 試料およびデータの集積と保存

対象: 胎盤、臍帯、臍帯血由来の組織

DNA、cDNA (RNA)、セルライン樹立

感受性と暴露量を同一試料で解析

① 遺伝因子解析：同定されたバイオマーカーの解析

② 暴露量測定：バイオマーカー関連環境化学物質の測定

③臨床情報：長期コホートスタディの基盤

2. 保存試料のプロファイリングと品質管理

① プロファイリング: 同定されたバイオマーカー

② 品質管理：インプリンティング遺伝子のメチル化パターンと発現量、環境残留性化学物質の測定、毒性等量の測定など

3. 少量サンプル解析のパイロットスタディ

① 保存条件の異なる血液のゲノムDNA回収量

②保存条件の異なる血液のゲノムDNAの品質確認

図(2)-1 サブテーマ 2

## 2 ．研究開発目的

本研究は、尿道下裂などの小児先天奇形発症を対象とする環境リスク評価法の基盤整備を行うことを目的とする。このために、環境リスク研究に広く貢献できる臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備を行う。臍帯血・胎盤バンキングシステムの整備では、分子生物学的解析試料と暴露量測定試料の両者を対象とする。そして、連結可能匿名化の臨床情報を採取し、またバイオマー