Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
個体の筋肉から抽出したDNAを用いた。年ごとの個体数は、それぞれ11（2004年）、22（2005年）、56（2006年）、61（2007年）、27（2008年）である。2004年~2006年の試料については、G1A、G10B、G10L、G10M、G10X、MSUT1、MSUT6のマイクロサテライト7遺伝子座の遺伝子型を決定した。2007年の試料については、G1A、G10L、G10M、MSUT1、MSUT6の5遺伝子座、2008年の試料についてはG1A、G10L、G10M、MSUT1の4遺伝子座について、それぞれ遺伝子型を決定した。PCR等の条件は、それぞれのマーカーを記載した原著論文に従って設定した。全試料について遺伝子型が決定されたので、欠測値を含まないデータセットをNeの推定に用いた。Neの推定は、Temporal method (TM法)とLinkage disequilibrium method (LD法)を用いて行った。TM法 $ ^{28)} $ $ ^{29)} $ は、Neが小さいほど遺伝子頻度の時間的変動が大きくなる関係に基づいてNeを推定する方法で、1世代以上の間隔をおいて複数回、遺伝子頻度を測定する必要がある。本研究で用いた試料は2004年から2008年までの捕獲個体に限られていたので、仮に2005年を第1世代、2008年を第2世代としてNe推定を行った。マイクロサテライト4遺伝子座（G1A、G10L、G10M、MSUT1）のデータセットをもとに、Andersonらの方法 $ ^{30)} $ により、Ne=30からNe=600まで10の増分で、それぞれのNeの尤度を計算した。LD法 $ ^{31)} $ は、小集団ではより連鎖不平衡が生じることを利用した推定方法で、TM法よりも精度が低いとされるが $ ^{32)} $ 、TM法とは異なり1回のサンプリングで推定値が得られる。各年度で分析された遺伝子座数が異なるので、それぞれ別にNeを推定した。

## 4 ．結果及び考察

## （１）DNA分析手法の標準化

## 1 ）ツキノワグマの遺伝マーカーの選択

対立遺伝子サイズが250 bpより小さい2塩基反復配列多型マーカー26種に4塩基反復配列多型マーカー23種を加えた合計49種類のマーカーについて検討を行った結果、 $ Pid^{25} $ 以下となるマーカーが25種類見られた（表(2)-1、表(2)-2）。これまでのヘア・トラップ調査で用いられてきた2塩基反復配列多型マーカーの中には、比較的高い $ Pid^{1} $ 値を示す遺伝子座が見られた一方、4塩基反復配列多型マーカーの中には、 $ Pid^{1} $ 値が0.1以下と特に低いマーカーが4種類確認された（表(2)-1）。

この結果をもとに、multiplex PCRで使用するマーカーの組み合わせを2組（multiplex set 1, 2）作成することとした。片方のmultiplexについては、これまでの各試験研究機関の調査においてデータが蓄積されてきたG、MSUT、UarMU seriesの中から、比較的 $ Pid^{1} $ が低いマーカーの組み合わせを採用した。その結果、 $ Pid^{1} $ が十分に低く、かつ遺伝子増幅が良好でピークの判別が容易な遺伝マーカーの基本セットとして、MU05、MU23、G10Cからなるmultiplex set 1とD2、D103、D118からなるmultiplex set 2を選択した（表(2)-3）。これらのセットは、従来の調査で得られたデータとの継続性を考慮したものである。これらは岩手県における北上個体群の個体識別を行うために $ Pid^{1} $ の低い組み合わせから選択されたものであるため、他地域の個体群では調査地域周辺での有害捕獲個体などで事前に $ Pid^{1} $ が低いことを確認する必要がある。
表(2)-1 ツキノワグマにおける4塩基反復配列多型マイクロサテライトマーカーの対立遺伝子数，対立遺伝子サイズ，PidおよびPid-sib

Marker	No. allele	Allele size	Pid	Pid-sib	Reference*
UT1	1	170	1.000	1.000	1
UT4	6	145-162	0.088	0.387	1
UT29	6	170-214	0.301	0.562	1
UT35	6	198-218	0.124	0.420	1
UT38	10	166-210	0.053	0.350	1
UA-BM3-P1B05U	9	224-250	0.097	0.405	2
UA-BM4-P1H10U	3	258-266	0.203	0.480	2
UA-BM4-P2A03U	6	250-270	0.250	0.542	2
UA-BM4-P2E11U	6	236-256	0.290	0.548	2
UA-RM3-P2H03U	6	108-179	0.202	0.495	2
UamA107	5	156-174	0.317	0.563	3
UamD2	5	212-228	0.188	0.480	3
UamD102	5	190-206	0.150	0.448	3
UamB2	4	173-197	0.319	0.566	3
UamB5	3	148-164	0.262	0.531	3
UamB103	3	115-123	0.334	0.596	3
UamC11	2	160-168	0.729	0.856	3
UamD1a	6	123-144	0.283	0.566	3
UamD3	3	229-237	0.665	0.819	3
UamD103	7	214-238	0.091	0.388	3
UamD112	6	141-160	0.114	0.411	3
UamD113	3	151-159	0.341	0.606	3
UamD118	4	190-202	0.205	0.487	3

$ ^{*} $ 1: Shin et al. 2009 $ ^{15)} $ , 2: Sanderlin et al. 2009 $ ^{16)} $ , 3: Meredith et al. 2009 $ ^{17)} $

表(2)-2 ツキノワグマにおける2塩基反復配列多型マイクロサテライトマーカーの対立遺伝子数、対立遺伝子サイズ、PidおよびPid-sib

Marker	No. allele	Allele size	$ P_{id} $	$ P_{id-sib} $	$ ^{*} $ Reference
G1A	7	199-227	0.138	0.432	4
G1D	2	192-196	0.910	0.954	4
G10B	5	147-165	0.277	0.567	4
G10C	5	112-124	0.171	0.457	4
G10J	5	81-97	0.225	0.511	6
G10L	3	134-150	0.531	0.734	4
G10M	5	199-209	0.135	0.432	4
G10P	4	168-188	0.122	0.414	4
G10X	4	186-202	0.211	0.487	4
UarMU05	4	146-156	0.182	0.463	5
UarMU09	3	118-126	0.361	0.587	5
UarMU10	3	137-141	0.373	0.610	5
UarMU15	4	128-138	0.364	0.617	5
UarMU23	6	118-134	0.072	0.371	5
UarMU26	2	186-188	0.442	0.662	5
UarMU50	7	216-232	0.174	0.465	5
UarMU51	4	117-125	0.179	0.459	5
UarMU59	4	249-257	0.211	0.499	5
UarMU61	2	208-212	0.954	0.977	5
UarMU64	3	185-191	0.259	0.527	5
MSUT-1	3	175-179	0.273	0.543	7
MSUT-2	5	86-98	0.212	0.506	7
MSUT-4	4	93-99	0.570	0.765	7
MSUT-5	1	126	1.000	1.000	7
MSUT-6	3	184-190	0.207	0.483	7
MSUT-7	3	110-121	0.484	0.700	7

$ ^{*} $ 4: Paetkau et al. 1995 $ ^{12)} $ , 5: Taberlet et al. 1997 $ ^{14)} $ , 6: Paetkau et al. 1998 $ ^{22)} $ , 7: Kitahara et al. 2000 $ ^{13)} $ .
表(2)-3 ツキノワグマの個体識別に有効なマイクロサテライトマーカーと multiplex PCR を実施する際の適切な組み合わせ例（岩手県北上山地）

Marker 1	Marker 2	Marker 3
Multiplex 1 (dinucleotide)	G10C	UarMU05	UarMU23
Multiplex 2 (tetranucleotide)	UamD118	UamD103	UamD2

## 2 ）ヒグマの遺伝マーカーの選択

今回検討を行った4塩基反覆配列マイクロサテライト23遺伝子座のうち、2遺伝子座（UT38およびUA-BM4-P2E11U）に関しては、増幅が悪く対立遺伝子のサイズを決定することが困難であったため、以降の検討から除外した。また、本来4塩基反覆配列多型であるにもかかわらず、1塩基あるいは2塩基異なるサイズの対立遺伝子が多数確認され、対立遺伝子サイズの決定の際に混乱を招く可能性の高い4遺伝子座（UT1、UT35、UA-RM3-P2H03U、UA-BM4-P1H10U）についても除外した。表(2)-4に、これら6遺伝子座を除く17遺伝子座のマイクロサテライトマーカーについて、対立遺伝子数、対立遺伝子サイズ、PidおよびPid-sibを示した。なお、本研究で用いたプライマーは、すべてテイルドプライマーであり、非蛍光標識側に7塩基のテール配列を付加している。

表(2)-4 ヒグマにおける4塩基反復配列多型マイクロサテライトマーカーの対立遺伝子数，対立遺伝子サイズ，PidおよびPid-sib

Marker	No. allele	Allele size	$ P_{id} $	$ P_{id-sib} $	$ ^{*} $ Reference
UT4	14	136-254	0.031	0.324	1
UT29	4	170-182	0.216	0.495	1
UA-BM3-P1B05U	4	215-231	0.214	0.491	2
UA-BM4-P2A03U	7	239-263	0.090	0.389	2
UamA107	1	109	1.000	1.000	3
UamD1a	7	108-125	0.162	0.462	3
UamD2	5	195-211	0.097	0.397	3
UamD102	6	179-188	0.077	0.374	3
UamD103	5	165-180	0.181	0.478	3
UamD112	8	123-144	0.091	0.393	3
UamB2	3	162-170	0.211	0.485	3
UamB5	3	152-160	0.190	0.468	3
UamB103	3	111-119	0.228	0.507	3
UamD3	4	221-233	0.426	0.667	3
UamC11	3	148-157	0.674	0.826	3
UamD113	5	142-160	0.248	0.536	3
UamD118	3	182-190	0.248	0.522	3

$ ^{*} $ 1: Shin et al. 2009 $ ^{15)} $ , 2: Sanderlin et al. 2009 $ ^{16)} $ , 3: Meredith et al. 2009 $ ^{17)} $

17 遺伝子座のマーカーのうち、 $ P_{id} $ が0.2以下となるマーカーとして8遺伝子座が確認されたが、これらのうち5遺伝子座（UT4、UamD1a、UamD102、UamD103、UamD112）については、1塩基あるいは2塩基異なるサイズの対立遺伝子がいくつか観察されたことから、multiplexの候補から除外し、残りの3座位を以降の検討に用いることとした。

表(2)-5には、これまでのヘア・トラップ調査で用いられてきたGおよびUarMUの各マーカーについて、本研究で用いたものと同じヒグマ試料を用いて分析を行った結果に関する報告を示した $ ^{33)} $ 。18遺伝子座のマーカーのうち、Pidが0.2以下のものが10遺伝子座存在し、これらのうちPidの
低い順に9遺伝子座を選択してmultiplexの検討を実施した。

Multiplexの検討では、先行研究 $ ^{19)} $ 20 $ ^{21)} $ を参考にしてデータの正確性と費用対効果の両面を考慮し、9遺伝子座のマーカーを用いた3つの有効なmultiplexPCRのセット作成を目指した。また、2010年に本研究で実施した、岩手県における大規模ヘア・トラップ調査で得られたツキノワグマ体毛試料の分析過程において、4塩基反覆配列多型のマーカーを用いた場合の対立遺伝子を表すピークの読み取りが、2塩基反覆配列多型マーカーの場合とは異なり、ある程度の習熟が必要であることが明らかになった。このことから、3つめのmultiplexの組み合わせについては、2塩基配列と4塩基反覆配列多型の両方を用意することとし、2塩基配列と4塩基反覆配列多型のマーカーを同一のセットに含めることはしなかった。まず，Pidが最も低いものから順にG10B、G10P、G1AおよびUA-BM4-P2A03U（4塩基反覆配列多型マーカーで最もPidが低い）の4種を選択し、これらを軸に他のマーカーとの組み合わせを検討した。組み合わせを検討する際には、マーカー同士でピークパターンに影響を与えないように、できる限り対立遺伝子サイズの範囲が重複しないように配慮した。その結果、表(2)-6に示した組み合わせによって十分な解析結果が得られることを確認し、ヒグマにおける適切なマイクロサテライトマーカーと、multiplex PCRの組み合わせとして提示した。それぞれのマーカーに使用する蛍光色素によって、ジェネティックアナライザによる分析時に対立遺伝子サイズを表すピークの高さに、マーカー間の大きな差が生じる可能性がある。これはPCRによる増幅のされやすさと蛍光色素の蛍光強度の違いによって起こるので、それぞれの組み合わせを検討し、すべてのマーカーで同等の高さのピークが得られるように調整することが望ましい。

表(2)-5 ヒグマにおける2塩基反復配列多型マイクロサテライトマーカーの対立遺伝子数，対立遺伝子サイズ，PidおよびPid-sib

Marker	No. allele	Allele size	$ P_{id} $	$ P_{id-sib} $	$ ^{*} $ Reference
G1A	6	175-187	0.086	0.384	4
G1D	4	171-179	0.561	0.760	4
G10B	6	138-165	0.069	0.367	4
G10C	3	95-103	0.318	0.574	4
G10H	6	212-248	0.216	0.508	6
G10J	2	76-90	0.715	0.848	6
G10L	6	157-167	0.191	0.481	4
G10M	4	199-211	0.214	0.491	4
G10P	7	132-163	0.073	0.373	4
G10X	4	131-139	0.165	0.453	4
UarMU05	4	125-131	0.214	0.490	5
UarMU09	5	122-138	0.174	0.459	5
UarMU10	2	117-129	0.388	0.609	5
UarMU23	8	111-125	0.123	0.428	5
UarMU50	9	191-217	0.099	0.399	5
UarMU51	5	104-112	0.154	0.444	5
UarMU59	5	99-117	0.175	0.468	5
UarMU61	4	199-205	0.303	0.583	5

$ ^{*} $ 4: Paetkau et al. 1995 $ ^{12)} $ , 5: Taberlet et al. 1997 $ ^{14)} $ , 6: Paetkau et al. 1998 $ ^{22)} $ .

釣賀ら（2011）より引用、一部データを追加して改変
表(2)-6 ヒグマの個体識別に有効なマイクロサテライトマーカーと multiplex PCR を実施する際の適切な組み合わせ例

Marker 1	Marker 2	Marker 3
Multiplex 1 (dinucleotide)	G10B	UarMU09	UarMU59
Multiplex 2 (dinucleotide)	G1A	G10P	UarMU51
Multiplex 3 (dinucleotide)	G10X	UarMU23	UarMU50
Multiplex 4 (tetranucleotide)	UA-BM4-P2A03U	UamD2	UamB5

本研究において選択されたマーカーは、個体識別に十分な多型を示しており、今回分析対象とした石狩西部地域のヒグマがほぼ隔離された個体群で生息密度が低いことを考慮した場合 $ ^{34)} $ $ ^{35)} $ 、道内各地のヒグマに対して有効であると考えられる。マイクロサテライトマーカーの示す多型の程度は、北海道内のいくつかの地域において同じ傾向を示すことがわかっている $ ^{36)} $ 。したがって、調査対象地域の遺伝的多様性に関する背景が不明な場合は、表2-(6)に示した組み合わせは初期の選択肢になり得ると考えられる。浦幌地区や渡島半島地域では、これらのマーカー以外にUarMU05が高い多型性を示しており $ ^{11)} $ $ ^{33)} $ 、過去に得られたデータとの比較を考慮した場合は、UarMU05をmultiplexのセットに加えることも有用であると考えられる。

## 3 ）遺伝子増幅反応の最適化

ツキノワグマ試料のsingle PCRにおいては、TaKaRa Ex TaqおよびQiagen microsatellite kitの増幅成功率が最も高く、PrimeSTAR、TaKaRa Ex Taq HS、Blend Taq-Plus-がそれに次ぐ結果となった。また、multiplex set2を用いて行ったmultiplex PCRでは、PrimeSTARの成績が最も良く、次いでTaKaRa Ex Taq、KOD FX、Blend Taq-Plus-の成績が良かった。TaKaRa Ex Taqの増幅成功率は高いが、非特異的増幅（スメア）が確認されることから、必ずしもマイクロサテライト分析に適するとは結論づけられなかった。一方、PCR開始時に94℃5分以上の熱変性を行うことで抗体が非活性化して反応が開始されるTaKaRa Ex Taq HSでは、PCR産物にスメアは確認されないが、PrimeSTARと比較した場合、増幅成功率は低かった。本研究の結果では、ヘア・トラップ調査で得られるクマ類の微量DNAの増幅には、single PCRとmultiplex PCRのいずれでも、PrimeSTAR、Blend Taq-Plus-が安定した結果を与えることが明らかになった。

## 4 ）複数機関での分析手法・条件の標準化

標準試料を用いて、遺伝子座ごとに対立遺伝子サイズの補正を行った結果、機関間で最大9bpのサイズの差が確認された。この結果をもとに、岩手県環境保健研究センターの対立遺伝子サイズに統一することとした。

次に、筋肉試料および体毛試料の分析によって、マイクロサテライト6遺伝子座に共通する基本波形を定めた。遺伝子型がホモ接合の場合、基本波形に合致するもののみを対象として遺伝子型を決定・記録し、合致しない試料は再分析を行うこととした。再分析を実施しても基本形に合致する波形が得られない場合は、記録できるデータは得られないため、そのデータを破棄することとした。遺伝子型がヘテロ接合で、その2つの対立遺伝子同士が隣り合っていない（2塩基配列反復の場合は4塩基以上、4塩基配列反復の場合は8塩基以上離れている）場合は、ホモ接合の場合と
同じ手順で遺伝子型の決定・記録を行った。隣り合った遺伝子型の場合で、基本波形との照合に迷う場合には以下の2つのパターンが考えられた：①サイズの小さい対立遺伝子のピーク（A）が、サイズの大きい対立遺伝子のピーク（B）より低いケース、②サイズの大きい対立遺伝子のピーク（B）が極端に低いケース（図(2)-1）。①の場合は、サイズの小さい対立遺伝子（A）の高さがサイズの大きい対立遺伝子（B）の80％以上の場合のみヘテロ接合として遺伝子型を決定・記録し、80％未満の場合はホモ接合として記録することとした。②の場合は、サイズの大きい対立遺伝子のピーク（B）がサイズの小さい対立遺伝子のスタッターピーク（s）よりも大きく、サイズの小さい対立遺伝子のピーク（A）の50％以上である場合には遺伝子型の決定・記録を行うこととした。サイズの大きい対立遺伝子のピーク（B）がサイズの小さい対立遺伝子のスタッターピーク（s）よりも小さい場合には、このピーク（B）は記録せず小さい対立遺伝子（A）のホモ接合として遺伝子型の決定・記録を行うこととした。これらの条件に合致しない場合は再分析を実施し、それでも結果が変わらなければ、明確に記録できるデータは得られないためその試料のデータを破棄することとした。

図(2)-1 基本波形と異なる場合のヘテロ接合のパターン

このようにして決定・記録したすべての遺伝子型データについてGeneCapを用いて遺伝子型を照合した。照合の結果、分析した全遺伝子座のうち1対立遺伝子のみ不一致である組み合わせ（1MM）および2対立遺伝子のみ不一致である組み合わせ（2MM）についてデータの精査を行った。ミスマッチを生じている試料のうち、遺伝子型の判読に迷う試料は再分析を実施し、再分析後も迷う状況に変化が無ければ、そのデータを破棄した。ミスマッチを生じている試料の双方について、その信頼性が高いと考えられる場合（波形が明確、同一の遺伝子型が他に複数存在するなど）は、どちらのデータも破棄せずそれぞれ別個体とした。ミスマッチの精査をした後、再びすべてのデータについて遺伝子型の照合を行い、新たに1MM,2MMが生じた場合はさらにデータを精査することとした。以降、新しく1MM,2MMが生じなくなるまで同様の作業を続けた。新しくMMが生じなくなった時点で、1試料のみから検出された遺伝子型のフィルタリングを行うこととした。フィルタリングのルールは、体毛試料の分析結果を精査することにより決定することとした。最後に、再度遺伝子型の照合を実施し、識別された個体にそれぞれIDをつけて最終データセットとした（図(2)-2）。

このルールに従い2010年度の北上山地大規模へア・トラップ調査によって回収された体毛試料を分析した。ホモ接合数の多い遺伝子型データは分析エラーによって生じた可能性が高いことが明らかとなった（後述の図(2)-8,9参照）こと、再分析を繰り返した後に得られた遺伝子型は信頼性が低いと考えられたことから、1試料でのみ検出された遺伝子型のうち、4～6遺伝子座でホモ接
合であったデータおよびミスマッチのチェック以外で再分析歴のある試料のデータを最終的なデータセットから除外することをフィルタリングのルールとした。これらのルール策定前の分析結果における1MMおよび2MMのペア数は、それぞれ1,057および2,231ペアだったのに対し、ルール策定後ではそれぞれ447および1,236ペアとなった（表(2)-7）。遺伝子分析に用いた6遺伝子座は多様性の高い遺伝子座の組み合わせであり、1MMや2MMの生じる確率は統計上非常に低い。つまり、ミスマッチのペアのうちいくつかのペアには分析エラーが含まれる可能性がある。厳密な分析ルールを策定したことで、ミスマッチのペア数が大幅に減少したことが示唆され、本研究で定めた遺伝子型判定ルールによって、より精度の高い分析結果を得ることができたと考えられた。

図(2)-2 遺伝子型判定ルールに従った作業の流れ

表(2)-7 遺伝子型判定ルール策定前後の分析結果 $ ^{*} $

ルール策定前	ルール策定後
分析成功率	67.4%	53.7%
(成功数/分析総数)	(1,245/1,845)	(991/1,845)
識別個体数	295	202
1MM	1,057 ^ 〜 ア	447 ^ 〜 ア
2MM	2,231 ^ 〜 ア	1,236 ^ 〜 ア

*2010年北上山地ツキノワグマのヘア・トラップ調査採取試料

## （２）ヘア・トラップ試料の個体識別

北上山地モデル調査地において、2010年6月から8月にかけて設置された245基のヘア・トラップから、2,048のツキノワグマ体毛試料が採取された。このうち1本以上の体毛で毛根が確認された
1,845試料すべてを対象として実施した遺伝子分析結果を表(2)-8に示した。1試料/TS区分では、413試料中258試料で遺伝子分析に成功し、155個体が識別された。10本以上区分では、769試料中561試料で分析に成功した結果、157個体が識別され、これら2つの分析区分間では識別個体数に大きな差は生じなかった。しかし、それぞれの識別個体数にはそれぞれの分析区分でのみ識別された個体が含まれていることから、1試料/TSと10本以上試料のデータとを合わせて新たに集計したところ、939試料中625試料で個体識別に成功し、182個体が識別された。したがって、1試料/TS区分のみ、および10本以上区分のみでは、それぞれ約25個体を識別できなかったことになる。全試料区分では1,845試料のうち991試料で個体識別に成功し、202個体が識別された。これらすべての遺伝子分析結果について、分析エラーが含まれる可能性を完全に排除することはできないが、表(2)-7で示したとおり、厳しい遺伝子型判定ルールを定めたことによって、これらの識別個体数は一定の信頼性があるものと考えられた。これらの結果をサブテーマ1「ヘア・トラップ法による個体数推定の確立に関する研究」、サブテーマ4「個体群モデルによる生態数および生息動向分析法の確立に関する研究」へ提供した。

本研究において、補完法・代替法班によってカメラトラップがヘア・トラップ近傍に設置されていたが、1トラップ・セッション中に複数個体が同一のカメラトラップで確認される事例があった。このことから、1トラップ・セッション中に複数個体によって利用された同一のヘア・トラップが存在する可能性は十分に考えられ、1試料/TS区分ではその複数個体を識別しきれないことが示唆された。また、クマがうまく有刺鉄線をすり抜ける場合や、有刺鉄線にクマが触れたとしても体毛が十分に採取されない場合があることは、これまでの調査から明らかとなっている⁹³⁷。本研究でも、クマ体毛がヘア・トラップに付着していたことから、クマがトラップを利用したと確実に判断できた場合であっても、分析区分を10本以上とすると1試料も分析されないトラップ・セッションが生じた。このことから、10本以上区分もヘア・トラップを利用した全個体を識別しきれないことが示された。一方、全試料区分では、1試料/TSと10本以上区分とを合わせた区分（182個体）よりもさらに30個体多い202個体が識別された。1試料/TS区分や10本以上区分では、すべての個体を識別しきれないことが明らかとなったため、識別個体数をより実際にトラップを利用した個体数に近づけるためには、全試料分析が望ましいと考えられる。しかしながら、遺伝子分析に供する体毛本数と分析成功率には高い相関があることがわかっている（図(2)-3、後述）。全試料区分には体毛10本未満の試料が多く含まれることから、分析作業コストや労力の制限があるなど、採取した全試料を分析できない場合には、1試料/TSと10本以上区分とを合わせた区分となるようサブサンプリングをした上で遺伝子分析をすることが選択肢の一つとして示された。

表(2)-8 2010年度试料分析结果

分析区分	分析試料数	分析成功試料数	識別個体数
1 試料/トラップ/セッション	413	258	155
毛根 10 本以上	769	561	157
1 試料/トラップ/セッション + 毛根 10 本分以上	939	625	182
全試料	1,845	991	202

北上山地調査地において2011年7月から8月にかけて設置された80基のツキノワグマのヘア・トラップから、1,120の試料が採取された。2010年度試料の分析結果を受け、2011年度試料に関して
は1試料/TSおよび10本以上区分についてのみ遺伝子分析を行うこととし、その結果を表(2)-9に示した。1試料/TS区分では163試料中109試料で遺伝子分析に成功し、60個体が識別された。毛根10本以上区分では399試料中312試料から64個体が識別された。1試料/TSと10本以上区分とを合わせたデータを集計したところ、449試料中324試料で分析に成功し、70個体が識別された。これらの結果をサブテーマ1および4へ提供した。

表(2)-9 2011年度试料分析结果

分析区分	分析試料数	分析成功試料数	識別個体数
1 試料/トラップ/セッション	163	109	60
毛根 10 本以上	399	312	64
1 試料/トラップ/セッション + 毛根 10 本分以上	449	324	70

## （３）DNA分析成功率と誤判定率の検討

## 1 ）ツキノワグマのDNA分析成功率に影響を及ぼす要因の調査

2010年北上山地モデル調査地において採取した体毛試料の遺伝子分析結果のうち、体毛の本数情報が記録されていた1,831試料分のデータを統計解析に用いた。なお、1,831試料中の分析成功試料数は986であった。体毛本数別の分析成功率は1本の試料で最も低く、10本以上の試料で最も高かった。体毛本数と分析成功率の相関係数は0.97であり、強い正の相関が見られた（図(2)-3）。遺伝子分析に供する体毛本数は多いほど得られるDNAも多くなると推測され、この結果と矛盾しない。体毛本数の多い試料では、効率的に遺伝子分析を行えることが示された。

図(2)-3 体毛本数別遺伝子分析成功率

全分析試料を体毛本数によって1～3本、4～6本および7本以上のグループに分け、それぞれのグループの試料数が全分析試料中に占める割合を図(2)-4に示した。調査時期が遅くなるにつれて、試料数割合は体毛7本以上試料で減少、1～3本試料で増加した（図(2)-4）。4～6本試料は期間を
通して顕著な変動は見られなかった。調査季節区分と体毛7本以上および1～3本試料数割合との相関係数はそれぞれ0.82および0.90であり、ともに強い相関が見られた。このことから、効率よく遺伝子分析を行うことのできる体毛本数の多い試料は6月から8月にかけて徐々に減少していくことが示唆された。

図(2)-4 体毛本数別試料数の推移（体毛1-3本、4-6本、7本以上の3グループに分けて示した）

図(2)-3の結果から、ツキノワグマ体毛試料の遺伝子分析成功率は体毛本数の影響を強く受けることが明らかとなったため、調査季節区分と分析成否との関係性については、10本以上試料のデータのみを利用してGLMによって解析した。6月下旬を基準にした場合、各調査区分の回帰係数はすべてマイナスの値をとり、7月以降の調査区分では6月下旬と比較してすべて分析成功率は低いという結果になった（表(2)-10）。特に、8月中旬の回帰係数は他の調査季節区分の2倍近く低い値であった（図(2)-5）。このことから、同じ体毛本数であっても、調査季節区分によって分析成否には差があり、分析成功率は8月中旬において特に低下することが明らかとなった。このことについて現時点で明確な理由は不明であるが、効率良く遺伝子分析を行うことのできる体毛本数の多い試料は6月から8月にかけて確保しにくくなること、およびツキノワグマの換毛は8月頃に起こる $ ^{38} $ ことを考慮すると、クマの体毛状態の変化が遺伝子分析の成否に何らかの影響を及ぼしている可能性がある。また、6月から8月にかけて気温および湿度は上昇し、一年の中で8月頃に最高値となる。DNA分解酵素の至適温度は37度であること、湿度の高い条件下ではDNAの断片化が起こりやすいことから、春から夏にかけての外部環境の変化も分析成功率を低下させる要因のひとつであるだろう。遺伝子分析を効率よく行うためには、8月上旬までに体毛の回収を終える調査デザインが最適であると考える。
表(2)-10 10本以上試料データにおける調査季節区分別の分析成功率

coefficient	Estimate	Pr(>|z|)
Intercept	2.06	1.88 $ \times $ 10 $ ^{-11} $
late June	0.00	-
early July	-1.21	1.43 $ \times $ 10 $ ^{-3} $
mid-July	-0.90	2.32 $ \times $ 10 $ ^{-2} $
late July	-0.83	2.13 $ \times $ 10 $ ^{-3} $
early Aug.	-0.95	7.25 $ \times $ 10 $ ^{-3} $
mid-Aug.	-1.79	2.78 $ \times $ 10 $ ^{-7} $

図(2)-5 10本以上試料データにおける各調査季節区分の回帰係数（推定値±SE）

## 2 ）ヒグマのDNA分析成功率に影響を及ぼす要因の調査

2010年に定山渓地域において実施したヘア・トラップ調査では、全8セッションでクマ体毛176試料が採取された。体毛1本以上で毛根が確認された125試料すべてについて遺伝子分析を行い、分析に成功した56試料から28個体が識別された。2011年に上ノ国地域において実施されたヘア・トラップ調査では、全10セッションで157試料が採取された。体毛1本以上で毛根が確認された100試料すべてについて遺伝子分析を行い、分析に成功した53試料から21個体が識別された。

2010年、2011年ともに調査実施時期を7月下旬、8月上・下旬、9月上・下旬、10月の6つに区分して時期区分ごとに分析成功率を求めた。10月下旬に採取された試料は両年ともに数試料のみであったため、10月は上下旬に区切らないこととした。2010年に定山渓地域にて採取された試料の分析成功率を図(2)-6(a)に示した。分析成功率は8月上旬が最も高く、次いで10月および7月下旬で高かった。8月上旬から下旬にかけて分析成功率は急激に低下し、8月下旬～9月下旬まで20%前後で推移した。また、2011年に上ノ国地域にて採取された試料の分析成功率については図(2)-6(b)に示した。分析成功率は10月で最も高く、7月下旬は2番目に高い結果となった。7月から9月上旬にかけて成功率はしだいに低下し、9月上旬で20%を切った。一方、9月下旬には急激に上昇した。2010年と2011年ではやや傾向は異なるものの、8月下旬から9月上旬にかけて分析成功率が低下する。
ることは共通していた。このことから、ヒグマにおいても分析成功率に季節的な変化が生じることが示唆された。

図(2)-6 定山渓地域(a)および上ノ国地域(b)において実施されたヘア・トラップ調査で採取された体毛試料の月別遺伝子分析成功率.調査月の下のカッコ内は分析に供した試料数を示す.8月および9月はそれぞれ上旬・下旬に分けて試料数を示した.

## 3 ）ツキノワグマの遺伝子型誤判定率の推定

ツキノワグマ6遺伝子座全てのPCRが成功し、遺伝子型判定を行った1,245試料のみを扱って遺伝子座誤判定率の推定を行った。

マーカーG10Cは本数が少なくなると、ADO率が高くなっている（図(2)-7(a)(b)）、また図(2)-7(c)(d)からは、UamD2ではFA率が高いことが示される。全てに共通の傾向として、遺伝子分析に供した体毛本数により、誤判定率に違いが見られる。10本以上の体毛を用いた場合、誤判定率は低く抑えられることがわかる。このことから、多くの試料が得られた場合や予算が限られている場合など、10本以上の体毛が含まれる試料を選択的に分析した方が結果的にPCRエラーは少なく抑えられ、個体数推定時のエラーによる過大評価の影響が少ないことが示された。
図(2)-7 遺伝子座ごとの誤判定率

各遺伝子頻度から算出される ADO 率(a)，ADO による誤判定率の最も推定値(b)，各遺伝子頻度から算出される FA 率(c)，FA による誤判定率の最も推定値(d)

## 4 ）ツキノワグマDNA試料の適合度検定：遺伝子型誤判定の検出方法の開発

遺伝子型の誤判定率が生じている可能性を検証するために、ツキノワグマ42個体の筋肉試料によって算出されたホモ接合体の期待値と、体毛試料によって得られた実測値を比較した（図(2)-8）。6遺伝子座すべてがホモ接合体である個体は北上山地の集団内で存在し得ないと算出され、6遺伝子座中5遺伝子座でホモ接合となる個体の期待値は1個体であった。しかし、実際の体毛からの遺伝子型判定の結果では5および6遺伝子座がホモ接合であった個体は合計13個体となっていた。これらはADOの可能性が高いと考えられる。図(2)-9に期待値（筋肉試料個体遺伝子頻度）と実測値（体毛試料個体遺伝子頻度）を割り算した値を示す。1.0のラインが「期待値＝実測値」を表している。

ホモ接合の遺伝子座が0～3遺伝子座の場合は、観察値は期待値とほぼ同じであった。6遺伝子座全て、もしくは5遺伝子座がホモ接合となる期待値は著しく低いにもかかわらず、実際の体毛分析では数個体確認された。このことから、ホモ過剰な遺伝子型は分析エラーによる誤判定の可能性が高いと考えられた。これら誤判定の可能性である遺伝子型データに対しては、期待値では少ない5および6遺伝子座がホモ接合となった個体をフィルタリングして排除するなどの方法がある。さらにPCR時に使用する体毛本数が少ないほどADOが生じやすいことが示された。試料が多く手に入る場合は、体毛本数の多い試料を選択的に利用することで、効率的かつエラーの生じにくい結果が得られると考えられる。
The number of homozygotic loci in each individual

図(2)-8 全体の遺伝子型決定後に個体ごとの適合度検定 体毛試料（観察値：斜線）と筋肉試料（期待値：黒）

The number of homozygotic loci in each individual

図(2)-9 試料の体毛本数ごとにサブグループ化した適合度検定．期待値（筋肉試料個体遺伝子頻度）と実測値（体毛試料個体遺伝子頻度）を割算した値を示す。On/En ratio =1.0 の太実線が「期待値と実測値の完全一致」を表す。

## （４）有効集団サイズ（Ne）を推定する方法の検討

山形県で2004年から2008年までに有害捕獲されたツキノワグマ117頭の筋肉から抽出したDNAに基づくTM法による推定では、Ne=90が最尤値となった（log likelihood=-149.3）。TM法による推定値は、各世代のNeの平均値（調和平均）と考えられる。一方、LD法では表(2)-11の結果が得
られた。TM法とLD法のいずれでもNe推定値は100以下となった。TM法は不連続世代からのサンプリングを前提としているが、連続世代でも齢査定が可能な場合やサンプリング間隔が長い場合には適用可能とされている $ ^{29} $ 。したがって、TM法により中長期のNe変動を記録するためには、有害捕獲個体の齢査定を必ず行い、数年間隔でサンプリングを行うことが望ましいと考えられる。LD法については、試料数が少ない場合に精度が大きく低下することが指摘されている $ ^{39} $ 。本研究においても試料数や遺伝子座が少ない場合に信頼区間の上限が定まらなかった。また、TM法とLD法のいずれもランダムサンプリングを前提としているが、有害捕獲個体は比較的狭い地域で集中的に捕獲されることがあるので $ ^{40} $ 、この前提条件が満たされない可能性もある。これらの問題に対しては、捕獲個体の齢査定や有害捕獲個体の組織試料の提出を義務づけるなどの対処が必要と考えられる。

表(2)-11 LD法で推定したツキノワグマの有効集団サイズ

Year	2004
(n=11)	2005
(n=22)	2006
(n=56)	2007
(n=61)	2008
(n=27)
7loci data	20.7
(9.9-171.8)	32.0
(19.1-74.4)	33.1
(24.1-48.4)	ND	ND
5loci data	24.2
(8.0-infinity)	58.3
(20.5-infinity)	26.2
(17.8-41.4)	26.3
(18.6-38.8)	ND
4loci data	12.4
(9.2-infinity)	59.7
(16.7-infinity)	35.2
(19.4-81.9)	22.6
(14.9-36.3)	95.3
(22.6-infinity)

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

## 1 ）ヘア・トラップ調査の分析精度を初めて実証的に検証した

日本のツキノワグマおよびヒグマを対象としたヘア・トラップ調査は既に多くの自治体で実施されており、環境省の「種の多様性調査」でも採用されている。しかし、得られたデータの精度を検証する研究は行われていない。一般に、ヘア・トラップを用いた個体数（個体密度）推定法では、直視法や痕跡調査法等の従来法よりも、より大きい推定値が得られる傾向がある。例えば、平成20年度環境省自然環境保全基礎調査（山形県）のヘア・トラップ調査では、従来法の2倍以上の推定値が得られている。そのためDNA分析を用いたクマ類の個体数推定では、過剰推定の可能性を検証することが研究上の課題となっていた。それに対して、本研究では大規模調査で多数のサンプルを得ることにより、これまで実現できなかった分析精度の推定と、誤判定データ（エラーデータ）の検出を統計学的に行ない、過剰推定がどのように生じるのかを実証データを用いて示した。以上の成果は、個体群生態学および分子生態学上の新知見として、ヘア・トラップ調査の分析技術の信頼性向上に大きく資するものである。

## 2 ）ツキノワグマとヒグマの生態研究の新展開をもたらす標準的分析法を確立した

わが国のクマ類の調査・研究では、研究機関によって遺伝マーカーや分析条件が異なり、データの互換性がないために、大規模な共同研究や複数の地域個体群を対象としたメタ解析ができないという問題点があった。この問題を解決するために本研究では、標準的分析手法を確立し、複
数機関でのデータ較正用の標準分析サンプル（標準DNA）を無償で供与する体制を整備した。これにより、過去の研究も含め国内各研究機関が所有するクマ類の遺伝子データを統合的に利用する新たな研究展開が可能となった。

## （２）環境政策への貢献

## 1 ）クマ類生態調査における費用対効果の改善

ヘア・トラップを用いた個体数推定は多くの場合、1 調査あたり数百万円以上の費用を要するので、コスト削減が大きな課題となっている。本研究では、特にDNA分析の工程に関して、費用対効果を改善する次のような具体的方策が得られた。

改善策として、先ず、分析試料数が予算上で制限される場合には、10本以上の試料を選択的に分析することが推奨される。実際に、本研究の平成22年度の北上山地におけるヘア・トラップ調査では、10本以上の試料は全体の約30%であったことを考慮すると、10本以上の試料を優先的に分析することによるコスト低減効果は大きいと考えられる。ただし、その場合でも標識捕獲法の前提となる無作為抽出の条件に抵触しない選択方法を採用することが望ましい。

二番目の改善策として、試料採取を遅くても8月上旬までに終えることが、成功率の上昇につながり、分析費用の削減に効果的であることが示された。自治体が実施するフィールド調査は予算執行の時期が年度後半になることが多い。しかし、本研究の結果は、ヘア・トラップ調査は初夏には着手すべきであることを明確に示す事例として、自治体が調査計画を策定する際に参考となると考えている。

以上の改善策に加えて、DNA分析の費用が増加する一因である再分析の回数を最小にするための効率的分析手順をマニュアル化して公開した（事項参照）。

## 2 ）“公定法”の役割を果たす標準的分析法の公開

本研究では、自治体等がヘア・トラップ調査を実施する際のガイドラインとなる標準的分析法を定めた。特に、個体数推定のためのDNA分析に関して、遺伝マーカーの選択方法、遺伝子増幅反応条件、遺伝子型の判定基準、分析精度の検証方法について、本研究で具体的な指針が提示された。以上の成果をクマ類のヘア・トラップ調査におけるDNA分析に関する技術情報と共に、ウェブ上の共有プラットフォームとして一般に公開した。

クマ類の個体数を調べる：ヘア・トラップ法とカメラトラップ法の手引き（統合版）（印刷配布）URL：http://www.bear-project.org/pdf/Tebiki/tebiki-tougou.pdf

・ ヘア・トラップ試料のDNA分析マニュアル（電子版のみ提供）

URL : http://www.bear-project.org/

- 遺伝子分析データの精度管理と標準化のためのデータ解析環境：共有プラットフォームURL：http://www.bear-project.org/DNA/platform/PlatformTop.html

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。
## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) Uno, R., Kondo, M., Yuasa, T., Yamauchi, K., Tsuruga, H., Tamate, H.B., and Yoneda, M. 2012. Assessment of genotyping accuracy in a non-invasive DNA-based population survey of Asiatic black bears ( $ Ursus\ thibetanus $ ): lessons from a large-scale pilot study in Iwate prefecture, northern Japan. Population Ecology, DOI: 10.1007/s10144-012-0328-3. (in press, online first)

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1) Uno, R., Higashi, H., Tamate, H.B. Parentage analysis revealed solitary life of an orphaned cub of the black bear (Ursus thibetanus). International Symposium on Conservation of Asian Black bear. Taipei, Taiwan, 2009年11月.

2) 近藤麻実・山内貴義：DNAマーカーによる個体識別法 分析成功率に何が影響するか．日本哺乳類学会2010年度大会、岐阜大学.2010年9月.

3) 鵜野レイナ・玉手英利・釣賀一二三・湯浅卓・山内貴義・近藤麻実：DNAマーカーによる個体識別法 精度管理をどうするか．日本哺乳類学会2010年度大会、岐阜大学.2010年9月.

4) 齊藤正恵・青井俊樹：食痕からのDNA採取 加害個体判別の課題．日本哺乳類学会2010年度大会、岐阜大学.2010年9月.

5) 近藤麻実・鵜野レイナ: DNA分析における精度管理と効率化. クマ類の個体数推定法の開発環境省究総合推進費プロジェクトから. 日本哺乳類学会2011年度大会、宮崎. 2011年9月.

（3）出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

1）「クマの毛からわかること」、岩手県岩泉町町民会館（岩泉町共催）（2010年7月25日）

2）「ツキノワグマを調べる！～森には何頭のクマさんが？～」、岩手県立博物館（岩手県立博物館共催）（2011年9月25日）

3）「クマ類の個体数推定に関するワークショップ」、富山国際会議場（富山県自然保護課・環境省中部地方事務所共催）（2011年10月17日）

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。
### 8 \. 引用文献

1）環境省. 2005. 平成17年度 自然環境基礎調査 種の多様性調査（岩手県）報告書. 環境省自然保護局生物多様性センター, 富士吉田. 43pp.

2）環境省.2009a. 平成20年度 自然環境基礎調査 種の多様性調査（宮城県）報告書. 環境省自然保護局生物多様性センター，富士吉田.100pp.

3) 環境省. 2009b. 平成20年度 自然環境基礎調査 種の多様性調査（山形県）報告書. 環境省自然保護局生物多様性センター, 富士吉田. 73pp.

4) 環境省. 2009c. 平成20年度 自然環境基礎調査 種の多様性調査（山梨県）報告書. 環境省自然保護局生物多様性センター, 富士吉田. 111pp.

5) 環境省. 2009d. 平成20年度 自然環境基礎調査 種の多様性調査（奈良県）報告書. 環境省自然保護局生物多様性センター, 富士吉田. 76pp.

6) 森光由樹. 2008. 各都道府県のヘア・トラップ調査の実施状況と長野県における実施例 哺乳類科学 48:133-138.

7) 佐藤喜和・湯浅卓. 2008. ヘア・トラップを用いたクマ類の個体数推定法：概要と注意点 哺乳類科学 48：101-107

8) 釣賀一二三・間野勉. 2008. 北海道渡島半島におけるヒグマ保護管理計画とモニタリング 哺乳類科学 48:91-100.

9) 山内貴義・齊藤正恵. 2008. 岩手県におけるヘア・トラップの実施状況と今後の課題. 哺乳類科学 48 : 125-131.

10) 湯浅卓・佐藤喜和. 2008. ヘア・トラップを用いたクマ類の個体数推定法における課題—国内外の事例の比較検討— 哺乳類科学 48:109-118.

11) Itoh, T., Sato, Y., Mano, T. and Iwata, R. 2009. Estimating a suitable microsatellite marker set for individual identification and parentage tests of brown bear ( $ Ursus\ arctos $ ) in the Akan-Shiranuka region, eastern Hokkaido, Japan. Journal of Forest Research 14: 117-122.

12) Paetkau, D., Calvert, W., Stirling, I. and Strobeck, C. 1995. Microsatellite analysis of population structure in Canadian polar bears. Molecular Ecology 4: 347-354.

13) Kitahara, E., Isagi, Y., Ishibashi, Y. and Saitoh, T. 2000. Polymorphic microsatellite DNA markers in the Asiatic black bear Ursus thibetanus. Molecular Ecology 9: 1661-1662.

14) Taberlet, P., Camarra, J. J., Griffin, S., Uhres, E., Hanotte, O., Waits, L. P., Dubois-Paganon, C., Burke, T. and Bouvet, J. 1997. Noninvasive genetic tracking of endangered Pyrenean brown bear population. Molecular Ecology 6: 869-876.

15) Shih, C. C., Huang, C. C., Li, S. H., Hwang, M. H. and Lee, L. L. 2009. Ten novel tetranucleotide microsatellite DNA markers from Asiatic black bear, Ursus thibetanus. Conservation Genetics 10:1845-1847.

16) Sanderlin, J. S., Faircloth, B. C., Shamblin, B. and Conroy, M. J. 2009. Tetranucleotide microsatellite loci from the black bear (Ursus americanus). Molecular Ecology Resources 9: 288-291.

17) Meredith, E. P., Rodzen, J.A., Banks, J. D. and Jones, K. C. 2009. Characterization of 20 tetranucleotide microsatellite loci in black bear (Ursus americanus) for used in forensic and population applications. Conservation Genetics 10: 693-696.