Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
法で寄与率の算出をおこなった。

### 4. 結果及び考察

## (1) 水生・底生生物を用いた生活排水および都市河川の総毒性評価と毒性原因物質の同定

サブテーマ(1)では、平成22年度は徳島で4回（のべ18地点）、京都で2回（のべ8地点）、埼玉で2回（のべ8地点）採水し、のべ34試料についてミジンコの繁殖阻害試験や藻類生長阻害試験を中心に実施し、一部は魚類胚・仔魚期毒性試験についても実施した。同様に平成23年度には徳島で3回（のべ5地点、うち2地点は藻類のみ）、京都で1回（2地点）、埼玉で1回（2地点）において採水・採泥し、のべ9試料について水生生物3種（ムレミカツキモ、ニセネコゼミジンコ、ゼブラフィッシュ）とユスリカを用いた毒性試験を実施した。平成24年度は徳島で4回（のべ5地点、うち1地点は藻類のみ）、京都で1回（1地点）、埼玉で3回（のべ3地点）から採水し、のべ7試料について未処理の試料と固相抽出による分画した試料について水生生物3種の試験を実施した一方で、採取した底質についてはユスリカを用いた試験を実施した。その結果、平成22年度は藻類、ミジンコ、魚類についてそれぞれ30試料中2試料、34試料中20試料、12試料中6試料から有害影響が検出された。平成23年度は藻類、ミジンコ、魚類、ユスリカについてそれぞれ9試料中6試料、7試料中3試料、7試料中3試料、6試料中5試料から有害影響が検出された。平成24年度の未処理の試料については、藻類、ミジンコ、魚類、ユスリカについてそれぞれ9試料中6試料、7試料中5試料、7試料中3試料、7試料全てから有害影響が検出された。

藻類については、平成22年度実施時はUSEPAのガイドラインに従ってプランクトンネットによる簡易な固形物除去であったが、平成23・24年度はガラス繊維ろ紙によるろ過を実施したため、この前処理の違いが検出率の大きな違いに寄与しているものと考えられる。この点については、平成23年度にろ過の有無による比較を行ったところ、ろ過による前処理後に有意な有害影響が検出された地点についても、未ろ過の試料については有害影響が検出されないケースが6試料中5試料とほとんどを占めることがわかった。河川水濃度の高い試料では固形物由来の栄養塩やバクテリアの影響を受けた平成22年度は、ブランクよりも生長阻害率は負の値になる（生長が促進される）ことが多く、有害化学物質の影響がマスキングされ、生長阻害が確認されるケースが少なかったものと考えられる。検出された地点や時期についての傾向は確認されず、同じ地点でも有害影響が必ず毎回確認されるというわけではなかった。平成24年度の毒性同定評価のPhase1である毒性原因物質の特徴化を実施したところ、OasisHLBやSep-pakAC-2による固相抽出によって前処理して有機物を除去した試料でも有害性が低減されることはなく、1試料について陽イオン交換処理をしたところ、有害影響は改善されたことから、金属等の陽イオンの影響が大きいものと考えられる。

ミジンコについては、埼玉の鴨川・学校橋や綾瀬川・内匠橋では複数回にわたって繁殖と致死の両方に強い影響が検出された。他にも徳島、京都においても、約半数の試料から有害影響が検出された。なお、平成24年度の毒性原因物質の特徴化では、京都の西高瀬川・天神橋のようにOasis HLBやSep-pak AC-2で有機物を除去した際に有害影響が改善されたのに対し、逆に埼玉の鴨川においてOasis HLBでは有害影響に改善は確認されず、Sep-pak AC-2や陽イオン交換樹脂LC-WCXでは有害影響が改善されるなど、主に有機物が毒性原因物質である場合と有機物と金属等陽イオンの両方の複合的毒性要因による地点があることがわかった。

魚類については、3年間の調査において、今回調査した徳島、京都、埼玉の試料からは強い毒性影響が検出された地点はなかったものの、徳島、京都、埼玉いずれもおよそ半数の試料から有意な有害影響が検出された。有害影響が検出されたエンドポイントは孵化率のケースも仔魚致死率のケースも観察された。平成24年度の毒性原因物質の特徴化では徳島の田宮川ではOasis HLBで前処理を実施した際には有害影響が改善されたが、陽イオン交換処理した際は有害影響が低減されず、有機物が主要な毒性原因であると考えられる。その一方で、埼玉の鴨川では逆にOasis HLBでは有害影響が低減されないなど、地点によって毒性原因物質が異なることが示唆される。

ユスリカについては、ほとんど全ての試料において、高濃度区では羽化に影響が検出された。その一方で、採取した底質からユスリカが大量に観察された地点もあるが、これは今回使用した国立環境研究所で頒布しているセスジュスリカと現地に生息するユスリカの感受性が大きく異なることに起因するものと考えられる。

さらに、実際に検出された濃度の生活関連物質を添加した実験では、生物種によって予測される毒性影響よりも弱く拮抗的に作用する場合と、増強する場合が観察された。主として藻類について観察された金属等の陽イオンとの相乗作用のほか、溶存有機物質の毒性緩和作用など河川水の複合的影響についての問題が新たに明確になったが、これを完全に把握することは今後の課題といえる。また、今後は生活関連物質に限らず、農薬や重金属等を含めた詳細な網羅的化学分析や毒性分画を実施し、原因物質の地点ごとの解明を進めていく必要がある。

## (2) 水・底質試料中の界面活性剤、医薬品類等の濃度測定と総毒性への寄与率の評価

上記のサブテーマ(1)と同時に採取した水試料のうち、平成22年度はのべ28試料、平成23・24年度は各7試料
について固相抽出後、医薬品63種のLC/MS/MSによる分析を京都大学で実施した結果、平成22年度は50物質、平成23年度は49物質、平成24年度は45物質については少なくとも1試料からは検出された。最も高濃度で検出されたのは茶やコーヒーの成分で強心剤としても用いられるcaffeineであり、徳島の田宮川において最大11,000 ng/Lで検出された。次いで高い濃度で検出されたのは鎮痒剤のcrotamitonが徳島の冷田川において最大2,780 ng/Lで、抗精神病薬や消化性潰瘍用剤等として使われるsulpirideも最大1,260 ng/L（徳島、神宮入江川）で検出されるなど、この3種は全ての試料から検出された。他に高濃度検出された物質としては、解熱鎮痛剤のacetaminophen、テトラサイクリン系抗菌剤のclarithyromycin、高脂血症用剤のbezafibrate、気管支拡張剤のtheophyllin、ニューキノロン系抗菌剤のlevofloxacin、サルファ剤（抗菌剤）のsulphamethoxazoleなどが最大で1,000 ng/L程度で検出されている。これらの医薬品類濃度が高かったのは、徳島では田宮川、冷田川、埼玉では古隅田川で、京都の宇治排水路でも特に抗菌剤が高濃度で検出された。一方で下水処理水が大量に流れ込む京都の西高瀬川では、下水処理を受けにくい医薬品類が高濃度で検出された。高濃度で検出された徳島の各地点および埼玉の古隅田川については下水道が未整備であり、未処理の排水がかなりの割合で流れ込んでいることが主要な原因として考えられ、京都の宇治排水路ではそれに加えて病院排水の影響も示唆される。検出された医薬品のうち難除去性のsulpirideに対し、主に台所排水として排出され易除去性のcaffeineと、主にトイレ排水として排出されるacetaminophenの比を算出したところ、徳島の河川水中では概ね流入下水と同レベルであったが、acetaminophen/sulpiride比が流入下水に比べ若干低く、浄化槽（特に単独）または汲み取り方式による処理が示唆された。

界面活性剤については、平成23年度以降の試料について炭素鎖8および10～14について分析を実施した。濃度は最大でC11-LASが埼玉・鴨川で約400 μg/Lという高濃度で検出されるなど、最大で100 μg/L前後と非常に高い濃度で検出された。これらの濃度は新たに設定された水生生物保全のための環境基準値である0.02～0.05 mg/Lを大きく上回っていた。ASは下水処理場での除去率が極めて高いが、本研究課題の調査対象地点のように、下水道が未整備かつ浄化槽による処理区域では、極めて高濃度で排出されていると推定される。

C13-LASが検出され、最大38 μg/gであった。また、triclocarbanが徳島・冷田川で最大87 ng/gで検出された。検出濃度が高いもしくは潜在的生態リスクが高い物質から優先的に個別の医薬品類やLASについて水生生物3種とユスリカの試験を実施した。実施した物質数は藻類について11物質（かつて、徳島大学で実施した物質と合わせると19物質）、ミジンコ18物質、魚類14物質、ユスリカ3物質であり、上記の検出濃度とあわせて、寄与率を推算した。藻類についてはtriclocarbanやclarithromycinなどの寄与が比較的大きく、サブテーマ（3）の対象物質であるtriclosanと合わせると医薬品類で10～40%程度を説明できる一方で、LASの寄与率は最大でも6%程度であった。ミジンコや魚類については、医薬品類の寄与率が比較的高いのはtriclocarbanやlevofloxacin、sulphamethoxazoleなどの抗菌剤・抗生物質であったが、総計でも最大で2%程度に過ぎないことがわかった。その一方でLASの寄与が比較的大きく、地点によるバラつきもあるがミジンコで最大で100%を、魚類では30%を超過する地点があった。サブテーマ（1）の毒性同定評価の結果と合わせると、金属等の陽イオンの効果が大きいと考えられる藻類はともかく、有機物の寄与が大きい地点が存在するミジンコや魚類については、LASなど界面活性剤の寄与が比較的大きいことから、下水道未整備地域などのホットスポットにおけるLASのモニタリングを継続的に実施する必要があるほか、非イオン界面活性剤ほかの本研究の対象物質以外にも同様のアプローチを進めていく必要がある。なお、化学分析では、caffeineやcrotamitonのほかphenoxyethanol、acetaminophenなどの濃度が1 μg/Lを上回る地点があるなど他の物質に比べて極端に高いことが確認されたが、これらの毒性は比較的弱く、寄与率はそれほど大きくないことがわかった。

## (3) 水・底質試料中のパーソナルケア製品等の濃度測定と総毒性への寄与率の評価

上記のサブテーマと同時に採取した水試料のうち、平成22年度はのべ24試料、平成23・24年度はそれぞれのベ7試料について固相抽出後、疎水性ならびに親水性に分けてGC-MSを用いて紫外線吸収剤、香料、抗菌剤などの分析を実施した。最も高濃度で検出されたのは埼玉の古隅田川において14,000 ng/Lで検出された2-phenoxyethanol（防腐剤）であり、ほかにもresorcinol（防腐剤）やbenzyl salycilate（紫外線吸収剤）、HHCB（香料）などが1,000 ng/Lを超える濃度で検出され、ほかにもtriclosan（抗菌剤）やisopropylmethylphenol（防腐剤）なども数百ng/Lで検出された。

なお、サブテーマ(2)同様に平成23年度以降については、採取した底質についても分析を実施したところ、triclosanが徳島・田宮川で最大117μg/kgで、HHCBが徳島・冷田川で212μg/kgで検出されたほか、紫外線安定剤や一部の紫外線吸収剤も数十～百μg/kgで検出された。

サブテーマ(2)と同様にパーソナルケア製品のうち検出濃度が高く生態リスクが高いと考えられる物質から優先的に、上記の水生生物3種（藻類、ミジンコ、魚類）およびユスリカに対する毒性試験を実施した。本研究課題で平成22年～24年度に試験を新たに実施した物質数は藻類14物質、ミジンコ6物質、魚類5物質、ユスリカ3物
質である。これらの毒性試験結果と個別の物質の化学分析による検出濃度とを統合し、総毒性の結果と比較した際の各物質の寄与率の算出をおこなった。

その結果、藻類については抗菌剤のtriclosanの寄与が比較的大きく、最大で30％を占め、抗生物質など医薬品類と合算すると10～40％程度であった。その一方で、紫外線吸収剤や香料の一部は疎水性が非常に高く、水生生物3種を用いた試験を実施するのが困難であった。また、毒性同定評価の結果では金属等陽イオンの寄与が大きいと考えられることから、生活排水の寄与が大きいと考えられる地点であっても金属等陽イオンの化学分析や毒性試験の実施による寄与の評価が今後の課題といえる。ミジンコや魚類についてはパーソナルケア製品の中では、藻類同様にtriclosanの寄与が比較的大きかったものの、サブテーマ（2）に記述したように医薬品類と合算しても最大でも合計2%程度に留まっていた。サブテーマ（2）でLASの寄与率は比較的高いことや、毒性同定評価でも有機物が主たる原因となるケースが多く、PRTRの水域での排出量がLASよりも多い非イオン界面活性剤のアルコールエトキシレート（AE）や、毒性が強く環境基準にも追加された非イオン界面活性剤の中間代謝物であるノニルフェノールなどの寄与の算出も重要な課題といえる。

ユスリカについては、底質から検出されて有害影響が強いと考えられるtriclosan、triclocarban、香料のHHCBやC12およびC13-LASについて個別の試験を実施して寄与率を求めた。しかしながらこれらの生活関連物質の合計でも最大で約9%であり、毒性同定評価を実施していないので原因物質の特徴は不明だが、本研究で対象とした生活関連物質以外の有害物質が主要な毒性原因である可能性が高い。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

徳島・京都・埼玉3府県における生活排水や下水放流水の多く流れ込む生活関連物質のホットスポットと考えられる地点において、3年間の異なる季節にわたる医薬品類・界面活性剤とパーソナルケア製品の河川水および底質中での存在実態が明らかになり、一部では100 μg/Lを超える陰イオン界面活性剤、数μg/Lの防腐剤や抗菌剤、10～100 ng/g-dryレベルのtriclosanやtriclocarbanも検出されることがわかった。特に、これまで世界でも分析事例が報告されていない化粧品由来の防腐剤12種及び親水性紫外線吸収剤4種の底質中の多成分同時分析手法が確立できた点は意義深い。また、このように高濃度の物質に汚染された河川水中の水生生物3種に対する毒性影響について、濃縮などの前処理をほとんどしない米国環境保護庁（USEPA）のWETに準じた短期慢性試験系で調べたところ、6割以上の河川水から毒性影響が検出されることがわかった。このことから、このように生活排水の影響が大きい河川環境では、水が試験水生生物に対して悪影響を及ぼす物質等に汚染されていることが示された。また、同時に調査した底質のほぼ全てについて、人工底質を使って希釈を実施する方法でユスリカの羽化に有害影響を濃度-応答関係をもとに検出できることも明らかになった。

さらに、個別の医薬品類・界面活性剤やパーソナルケア製品の水生生物3種に対する毒性影響試験を実施し、その検出濃度との比から個別物質の影響が加算的であると仮定して毒性影響の寄与率を推算した。その結果、藻類については、抗菌剤のtriclosanや抗生物質のclarithromycinの寄与が比較的大きく、毒性影響の大部分を説明できる地点もあった一方で、その寄与は10～40%程度と推定された。一方でミジンコや魚類については、比較的高濃度で検出された界面活性剤の寄与が医薬品や化粧品に比べて大きく、一部の河川水試料については寄与率がミジンコでは最大で100%を超過、魚類では最大で30%となることから、今回対象とした物質ではC11～C13-LASの寄与がかなり大きいことが推測された。毒性同定評価の最初の段階である毒性原因物質の特徴化によって、本研究で選定した都市河川については、藻類は有機物よりも金属等の陽イオンの影響が大きいことが示唆された一方で、ミジンコや魚類については、生活関連物質を含む有機物の寄与がある程度大きいことが示唆され、金属等陽イオンや他の界面活性剤、農薬等を含む詳細で網羅的な化学分析と組み合わせたアプローチが求められる。一方で、ユスリカについては、国産種のセスジュスリカを用いて河川底質の総毒性に対する寄与率を算出する方法が確立され、底質に蓄積する物質の河川環境中での評価・管理にも重要な役割を果たすと考えられる。

## (2) 環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

環境省では、平成21年度から排水・環境水の生物応答を用いた評価・管理に関する委員会を立ち上げて、USEPAのWET手法を参考に国内での導入に向けた議論を実施している。その中で、平成25年3月1日には環境省から「生物応答を用いた排水評価法（検討案）」が公表された。本研究のほとんどはこの試験法を元にして実施されているが、この試験法作成の取りまとめを担当した研究代表者にとって、重要なテストケースをもたらしたといえる。

また一方で環境省では、「PPCPsによる生態系影響把握研究班」を組織し、その検出情報や、生態系への有
害影響の程度についての検討を実施している。本研究課題の成果の一部である検出データや毒性データが、この研究班会議における貴重な資料として活用されており、ホットスポットでの汚染状況についての重要性が指摘されている。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

これまで、WET手法等の亜慢性試験を排水に適用した例はいくつかあるものの、生活排水によって強い影響を受ける河川水に対する評価はなく、本研究成果は環境省の目指す「今後の水環境保全の在り方」でも「速やかに解決されるべき課題」として挙げられている「（8）生活排水対策」の課題解決に重要な役割を果たすことが期待される。また、上記の通り、「新たな思索の枠組みをつくる取組」の「（2）排水規制のあり方」における「生物応答を利用した排水管理手法の導入」における制度・運用ならびにバイオアッセイ技術検討の両方への寄与は既にある程度あるが、平成25年度以降も継続的な取組が予定されており、重要な知見として活用される可能性が高い。特に、本研究課題では、米国WETの毒性同定評価のPhase1である毒性原因物質の特徴化の実施例も含めて、今後の排水だけでなく環境水への制度設計をしていく中で非常に重要な役割を果たしていくものと考えられる。また、この毒性原因物質の特徴化など毒性同定評価の手法は、生態リスクが高く優先的にリスク管理に取り組むべき物質の絞込みに貢献し、水生生物保全のための環境基準項目の選別や、「化学物質の環境リスク評価」の枠組みなどを効率化・加速することが期待される。さらに、生活関連物質を河川水に添加して生態毒性を評価する取組とその成果は、複合曝露の評価の困難さを改めて浮き彫りにしており、今後の更なる検討の必要性を示唆している。

医薬品類やパーソナルケア製品等のPPCPsによる水環境の汚染についての調査が国内外で行われているが、主な調査は一級河川など大河川や下水道整備の進む大都市圏で行われており、本研究課題のように下水道整備状況が異なる地域を比較した調査はごく一部であり、本研究課題は貴重な知見として上記研究班等でさらなる活用が期待されるほか、生態リスク初期評価の枠組みへの利用も見込まれる。界面活性剤LASについては、平成25年4月より、新たに水生生物保全のための水質環境基準として設定されている。本研究課題の結果により、下水道未整備地域では依然としてその濃度は高く、環境基準を超過しているだけでなく、総毒性への寄与が潜在的に高いことが示唆され、その設定の重要性が改めて裏付けられた。現在、非イオン界面活性剤の中間代謝物のノニルフェノールも合わせて水生生物保全のための水質環境基準が設定されているが、PRTR第一種指定化学物質として水域への排出量が最も多いと考えられる非イオン界面活性剤のアルコールエトキシレートの環境中動態や生態影響についても合わせて検討の必要がある。

また、triclosanについては、過去に環境省の「化学物質の環境リスク初期評価」の生態リスク初期評価においても、「詳細な検討を行なう候補」とされている。今後の全国でのエコ調査等の実態調査への取組において、本研究課題で対象としたような下水道整備率の低いホットスポットなどでの調査・研究が求められる。化学物質のリスク管理の観点からは、triclosanは化審法の旧第三種監視化学物質であるが、優先化学物質やPRTRにおける第一種指定化学物質への指定といった入口側での何らかの施策も求められる。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

## ＜査読付き論文＞

1) H. Yamamoto, I. Tamura, Y. Hirata, J. Kato, K. Kagota, S. Katsuki, A. Yamamoto, Y. Kagami, and N. Tatarazako: Sci Total Environ, 410–411, 102–111 (2011)

“Aquatic Toxicity and Ecological Risk Assessment of Seven Parabens: Individual and Additive Approach”

2）安田侑右，米多佐織，田村生弥，駕田啓一郎，中田典秀，花本征也，亀田豊，木村久美子，鑢迫典久，山本裕史：土木学会論文集G(環境)，67，7，III_249-III_256（2011）

「生活排水に汚染された河川水に対する短期慢性毒性試験」

3) I. Tamura, K. Kimura, Y. Kameda, N. Nakada, N., and H. Yamamoto: Environ. Technol., (in press)

4) I. Tamura, K. Kagota, Y. Yasuda, S. Yoneda, J. Morita, N. Nakada, Y. Kameda, K. Kimura, N. Tatarazako, and H. Yamamoto: J. Appl. Toxicol., (in press)

“Ecotoxicity, and screening level ecotoxicological risk assessment of five antimicrobial agents, triclosan, triclocarban, resorcinol, phenoxyethanol and p-thymol”

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1）安田侑右、米多佐織、田村生弥、駕田啓一郎、中田典秀、木村久美子、亀田豊、鑪迫典久、山本裕史：
第20回環境化学討論会(2011)

「水生生物3種とセスジュスリカを用いた河川水・底質に対する短期慢性毒性試験」

2）中田典秀、成宮正倫、花本征也、田中宏明:第20回環境化学討論会(2011)「下水処理および環境輸送過程における残留医薬品類の組成変化」

3）木村久美子、亀田豊、山本裕史、中田典秀、益永茂樹：第20回環境化学討論会(2011)「化粧品に使用される防腐剤及び紫外線吸収剤の河川中における存在実態調査」

4) N. Nakada, M. Narumiya, S. Hanamoto, H. Tanaka: Micropol & Ecohazard 2011, the 7th IWA specialist conference on assessment and control of micropollutants/hazardous substances in water, Sydney, Australia, (2011)

“Application of PPCPs as Water-soluble Molecular Marker of Sewage Contamination and Treatment Level in the Water Cycle”

5）山本裕史、田村生弥、平田佳子、駕田啓一郎、安田侑右、亀田豊、木村久美子、中田典秀、鑢迫典久：第14回日本水環境学会シンポジウム(2011)

「生活関連化学物質の従来型生態リスク評価における課題と展望」

6) H. Yamamoto: Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: What are the Research Priorities in East Asia, Seoul, Korea, (2011)

"PPCP Effect Studies – Japanese Perspectives"

7) H. Yamamoto, Y. Yasuda, S. Yoneda, I. Tamura, K. Kagota, N. Nakada, Y. Kameda, K. Kimura, and N. Tatarazako: SETAC North America 32^{nd} Annual Meeting, Boston, USA (2011)

“Ecotoxicity of Sediments Sampled in Urban Rivers and Streams Dominated by Domestic Sewage: Potential Contributions of PPCPs” (ポスター発表)

8）安田侑右、米多佐織、田村生弥、駕田啓一郎、中田典秀、花本征也、亀田豊、木村久美子、鑢迫典久、山本裕史：第48回環境工学研究フォーラム(2011)

「生活排水に汚染された河川水に対する短期慢性毒性試験」

9）安田侑右、田村生弥、駕田啓一郎、米多佐織、森田隼平、中田典秀、木村久美子、亀田豊、鑪迫典久、山本裕史：第46回日本水環境学会年会(2012)

「水生生物3種の短期慢性毒性試験を用いた都市河川の生態毒性と生活関連物質の寄与の評価」

10) H. Yamamoto, Y. Yasuda, I. Tamura, K. Kagota, N. Nakada, Y. Kameda, K. Kimura, N. Tatarazako: SETAC Europe 22 $ ^{th} $ Annual Meeting, Berlin, Germany (2012)

11) “Contribution of PPCPs and Surfactants on the Sub-chronic Toxicity of Effluent-Dominated Urban Creeks for Aquatic Organisms”（ポスター発表）

12) K. Kimura, Y. Kameda, H. Yamamoto, N. Nakada, M. Miyazaki, S. Masunaga: SETAC Europe 22 $ ^{th} $ Annual Meeting, Berlin, Germany (2012)

“Occurrence and seasonal variations of preservatives and UV filters used in cosmetic products in Japanese rivers”（ポスター発表）

13) 田村生弥、安田侑右、中野太洋、亀田豊、木村久美子、中田典秀、鑢迫典久、山本裕史：第21回環境化学討論会(2012)

「都市河川底質の底生生物に対する生態毒性と生活関連汚染物質の寄与」

14) 木村久美子, 亀田豊, 山本裕史, 中田典秀, 渡部茂和, 益永茂樹: 第21回環境化学討論会(2012)「都市河川における水中及び底質中の防腐剤12種の存在実態」(ポスター発表)

15) Y. Yasuda, S. Yoneda, J. Morita, K. Kagota, I. Tamura, N. Nakada, K. Kimura, Y. Kameda, N. Tatarazako, and H. Yamamoto: SETAC Asia–Pacific Kumamoto (2012)

“Whole river water short-term chronic toxicity of urban streams in Japan and the contribution of PPCPs and surfactants”

16) 村田大起、森田隼平、安田侑右、駕田啓一郎、田村生弥、鑪迫典久、中田典秀、Vimal Kumar、亀田豊、木村久美子、山本裕史: 第47回日本水環境学会年会(2013)

「水生生物を用いた生活関連物質の河川水での複合毒性影響の評価」(ポスター発表)

17) 安田侑右、田村生弥、村田大起、Vimal Kumar、中田典秀、亀田豊、木村久美子、鑢迫典久、山本裕史：第47回日本水環境学会年会(2013)

「水生生物3種の短期毒性試験を用いた都市河川水中のPPCPsと界面活性剤の寄与の評価と毒性同定評価」

### 7. 研究者略壓
## 課題代表者: 山本 裕史

テキサス大学大学院工学研究科卒業、Ph.D.、国立環境研究所環境ホルモン・ダイオキシン研究プロジェクトNIESポスドクフェロー、現在、徳島大学大学院ソシオ・アーツ・アンド・サイエンス研究部准教授

## 研究参画者

(1): 山本裕史（同上）

## (2) : 中田 典秀

東京農工大学大学院連合農学研究科卒業、農学博士、土木研究所専門研究員、現在、京都大学大学院工学研究科助教

## 山本 裕史（同上）

## (3) : 亀田豊

北海道大学大学院環境資源工学科卒業、工学博士、土木研究所専門研究員、埼玉県環境科学国際センター主任、現在、千葉工業大学工学部助教

## 木村 久美子

埼玉大学理学部化学科卒業、現在、されたま市健康科学研究センター主査

## 山本 裕史（同上）
# RF-1004 水生・底生生物を用いた総毒性試験と毒性同定による生活関連物質評価・管理手法の開発

(1) 水生・底生生物を用いた生活排水および都市河川の総毒性評価と毒性原因物質の同定

徳島大学大学院ソシオ・アーツ・アンド・サイエンス研究部 山本裕史

平成22～24年度累計予算額：4,910千円

（うち、平成24年度予算額：1,400千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

本研究課題では、米国のWET手法や環境省から平成25年3月に公表された「生物応答による排水試験法（検討案）」に準じた方法に従い、徳島・京都・埼玉の生活排水による汚染が大きいと考えられる河川水のべ50試料を採取し、水生生物3種（ムレミカヅキモ、ニセネコゼミジンコ、ゼブラフィッシュ）を用いた亜慢性試験を実施し、総毒性を調べた。また、13試料については合わせて底質も採取し、底生生物セスジュスリカの幼虫を用いた亜慢性試験を実施した。その結果、水生生物3種については種によって異なるがそれぞれおよそ半数の試料から、ユスリカについてはほぼ全ての試料から統計的に有意な有害影響が確認されるなど、ほぼ全ての地点において少なくとも1種の生物から有害影響が検出され、生活排水による汚染の影響を受ける都市河川で採取した水や底質が水生・底生生物に対して有害影響を示す地点が多いことがわかった。また、複数の水生・底生生物を用いて多様なスペクトルによって感度よく生物応答を調べることが有効な手段であることもわかった。そのうち、単細胞緑藻類のムレミカヅキモを用いた藻類生長阻害試験では、ろ過による前処理を実施しない場合、生活排水等に由来する栄養塩やバクテリアなどの影響もあり、化学物質による有害影響がマスキングされた一方で、固相抽出カートリッジを用いた毒性同定評価の結果、生活関連物質等の有機物よりもむしろ金属等の陽イオンが主要な毒性原因であることが示唆された。一方で、ニセネコゼミジンコやゼブラフィッシュについては、金属等の陽イオンが主要な原因物質である地点も一部はあったものの、ある程度は生活関連物質等の有機物が毒性原因物質として寄与していることがわかった。さらに、実際に検出された濃度の生活関連物質を添加した実験では、生物種によって予測される毒性影響よりも弱く拮抗的に作用する場合と、増強する場合が観察された。今後は、生活関連物質に限らず、農薬や重金属等を含めた詳細な網羅的化学分析や毒性分画を実施し、原因物質の地点ごとの解明を進めていく必要がある。

[キーワード]

生物応答、生活関連物質、生活排水、総毒性、底質

### 1. はじめに

日常生活で大量に使用・排出される医薬品やパーソナルケア製品等(Pharmaceuticals and Personal Care Products: PPCPs)を中心とした生活関連物質が、国内外の下水放流水や河川水から最大でppbレベルで検出されている $ ^{1} $ 。これらの物質は、低濃度で生理活性を持つようにデザインされている
ため、長時間曝露によって強力な有害汚染物質となる可能性が懸念されており $ ^{2} $ 、一般市民の関心も高まっている。また、同様に生活排水中に大量に含まれている物質として、平成25年4月に新たに水生生物保全のための環境基準に追加された陰イオン界面活性剤の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸(LAS)がある。しかしながら、これらの生活関連物質の水生生物などの生態系に対する影響については、個別物質のリスク評価という観点では研究代表者が実施したような研究例 $ ^{3} $ 、製品物質評価機構などによる生態リスク評価書 $ ^{4} $ などが複数あるものの、各物質が全体の毒性にどの程度まで有害影響に寄与しているのかについては不明な点が多い。また、個別の化学物質の影響だけでなく複合的な影響まで評価・管理することは困難である。そこで、生活排水全体の水生・底生生物等に対する毒性影響を生物応答によって直接調べてから、その毒性原因物質群を毒性分画や化学分析によって同定するという新たなアプローチが必要になってきている。

## 2 ．研究開発目的

上記背景を鑑み、欧米や韓国などで既に導入済みで、環境省でも平成21年度から検討開始された米国のWET試験（Whole Effluent Toxicityの略で事業場排水の生物応答を調べてリスク管理する方法）のうち亜慢性毒性試験を主体にした手法と、それをベースにして環境省により作成・公表された「生物応答を用いた排水試験法（検討案）」を、生活排水や下水放流水の寄与が大きい京都・埼玉・徳島の河川の計約10箇所に適用して総毒性を評価することを目的とした。また、底質については底生生物ユスリカに対する直接の亜慢性影響を調べて総毒性を評価することとした。さらに、水試料については、毒性同定として固相抽出による毒性分画を実施するとともに、検出された生活関連物質（PPCPsおよびLAS）を添加した際の水生生物3種への有害影響を調べることで、毒性原因物質群を推定するとともに、生活関連物質の寄与を調べることを目的とした。

## 3 ．研究開発方法

## (1) 試料採取地点

研究代表者の所属機関が近く下水道整備率が全国で最下位の徳島（平成24年3月現在の徳島県の下水道人口普及率15.5%、徳島市：29.0%）、研究分担者の所属機関に近く下水道整備率が比較的高い京都（京都府の同普及率91.7%、京都市：99.3%）、同じく研究分担者・協力者の所属機関に近く下水道整備率が全国平均レベルの埼玉（埼玉県の同普及率77.4%、さいたま市：89.0%）においてそれぞれ生活排水が多く流れ込み、汚染度が高い地点を選定して試料採取をおこなった。平成22年度は各4地点ずつ程度選定し、水試料をそれぞれ2～4回、のべ34試料を採取した。2年目の平成23年度は、各2地点ずつに絞込み、水試料に加えて底質試料を1～2回、のべ9試料を採取した。平成24年度には、各1～2地点ずつに絞込み、水試料および底質試料を1～3回、のべ7試料を採取するとともに、毒性同定評価のPhase1である毒性原因物質の特徴化をおこなった。採取した試料は現地で分配し、研究代表者・共同研究者の所属する機関に速やかに冷蔵で送付した。採集地点については、徳島では当初、今切川河口堰付近、田宮川蔵本公園付近、冷田川川南橋付近、打樋川大神子第二団地付近の4か所を選定したが、より生活排水の影響を大きく受けると考えられる江川の吉野川市鴨島処理場付近、神宮入江川の竜王団地処理施設付近、飯尾川加茂野橋付近の3地点についても追加で検討を実施して、平成22年度については最終的に神宮入江川、飯尾川、田宮川、冷田川の4地点（図(1)-1、写真(1)-1）を選定した。平成23年度はそのうち、水生生物3種に対する
有害影響が概して大きく、未処理の生活排水の寄与が大きいと考えられる徳島市近郊の田宮川、冷田川の2地点に、そして平成24年度は主に田宮川において試料採取をおこなった。京都および埼玉でも平成22年度は各4地点を選定し、平成23年度に2地点、平成24年度に1地点に絞り込んだが、その詳細については、それぞれサブテーマ(2)および(3)の研究成果報告で解説する。

## (2) 試料の前処理方法

採集した水試料および底質試料については、研究代表者の所属する徳島大学において、速やかに水生生物3種およびユスリカに対する生物応答を調べ、総毒性を求めた。水試料の前処理については、平成22年度は米国環境保護庁(USEPA)のWETのガイドライン $ ^{5)} $ に基づいてプランクトンネットによる固形物の除去のみとしたが、環境省の排水試験法の開発の際にろ過を検討していたことから、平成23年度以降はガラス繊維ろ紙（GF/F，粒子保持能0.7μm，Whatman社製）を用いてろ過した。底質試料については、約2500rpmで5分遠心分離した後、上澄みを除去してから使用した。毒性試験の手法としては、水試料は主として各種のOECDテストガイドラインや米国環境保護庁(USEPA)のWETのガイドライン $ ^{5)} $ に基づき、淡水の水生生物3種（写真(1)-2）の亜慢性試験を実施した。底質試料については、USEPAのOPPTSガイドラインの総底質を用いた試験法 $ ^{6)} $ とOECDテストガイドラインを参考に底生生物のユスリカを用いた試験系を開発した。

図(1)-1 徳島市周辺の試料採取地点の地図

写真(1)-1 徳島市周辺の水および底質試料採取地点周辺の写真（左から神宮入江川、飯尾川、田宮川、冷田川）

藻類は，OECD Test Guideline No. 201 $ ^{7)} $ （藻類生長阻害試験）を参考にして環境省や国立環境研究所などにより開発・検討されて平成25年3月に公表された「生物応答を用いた排水試験法（検討
案）」 $ ^{8)} $ に準じた方法を用い、単細胞緑藻の一種であるムレミカヅキモ(Pseudokirchneriella subcapitata)の生長率に対する影響を調べた。100 mLの三角フラスコ内に3～4濃度区及び対照区，それぞれ3連として，前培養した藻類を5×10³ cells/mLになるように入れ，5,000 lux（連続照射），24±1℃に設定した照明付きインキュベーター内で72時間振とう培養し，0～72時間の生長率を算出し，対照区と比較して生長阻害率を算出して最大無影響濃度(NOEC)を求めた。培地の組成はOECDのガイドラインに記載されたものとし、試験期間中に換水はおこなわなかった。

甲殻類は，USEPA WET Test Method No. 1002 $ ^{5)} $ およびEnvironment Canadaのガイドライン $ ^{9)} $ の試験法に従い，ニセネコゼミジンコ(Ceriodaphnia dubia)の繁殖に対する影響を調べた。あらかじめ，正常に繁殖することを確認した親ミジンコを選別してシングルカルチャーを作成し、その親ミジンコから3～5腹目に産まれた生後24時間以内の仔虫を容量50 mLのスナップカップに1匹ずつ入れた。3～4濃度区及び対照区，それぞれ10連として，25±1℃に調整したインキュベーター（16時間明，8時間暗周期）内で3腹目（7～8日間）までの産仔数を計数し，最大無影響濃度(NOEC)を算出した。また，親ミジンコの死亡率についても記録し，25%致死濃度(LC $ _{25} $ )を求めた。2日に1回、換水を実施した。

魚類については，OECD Test Guideline No. 212 $ ^{10)} $ （魚類胚・仔魚毒性試験）を基本にして環境省において開発・検討されて平成25年3月に公表された「生物応答を用いた排水試験法（検討案）」 $ ^{8)} $ に準じた方法を用いた。魚種は，ゼブラフィッシュ(Danio rerio)とした。試験開始直前に産卵・採取した受精卵を4時間以内に試験に用いた。1～4濃度区及び対照区，それぞれ10ないし15個×3ないし4連（容量約80 mLのガラス製スナップカップ）を用意し，25±1℃に調整した実験室内において5日目までの孵化率および卵黄吸収前（仔魚前期）までの致死率（9日間）を調べた。この結果をもとに，それぞれの最大無影響濃度(NOEC)を算出した。冷蔵保存した水試料を2日に1回、約9割交換した。

なお，上記3種の水生生物を用いた河川水の総毒性について、最終年度の平成24年度にはサブテーマ(2)において固相抽出による前処理で使用されているOasis HLB (Waters社製)カートリッジのほか、AC-2 (Waters社製)やLC-WCX (SPELCO社製)カートリッジによって有機物や陽イオンを除去する前処理した試料についても試験を行い、毒性同定評価の第一ステップである毒性原因物質の特徴化を合わせて実施した。また、水生生物3種の個別の生活関連物質の毒性試験の際は，水中濃度のモニタリングには紫外・可視光吸光検出器付高速液体クロマトグラフィー（HPLC、島津製作所製LD10AVP）を用いて、換水前後（藻類は試験前と試験終了後）に実施し、その幾何平均濃度を曝露濃度とした。なお、上記HPLCで測定不可能な物質については，固相抽出による前処理後，下記の京都大学に濃度測定を依頼した。

コスリカについては、USEPA OPPTS 850.1735 $ ^{6)} $ 及び OECD Test Guideline No.218 $ ^{11)} $ に準拠して、供試生物はセスジュスリカ (Chironomus yoshimatsui) の1齢幼虫を用いた。採取した底質を3～6濃度区になるように人工底質 (石英砂，カオリン，ピートモスの混合物) で希釈し、対照区は人工底質 100% とした。10匹×3連を用意し，25±1℃に調整した実験室（16時間明、8時間暗周期）内で懸濁しないように弱くエアレーションを実施し、約20日間での致死率・羽化率を調べ、最大無影響濃度 (NOEC) を求めた。
写真(1)-2 WET試験に準じた亜慢性試験で使用した水生生物3種（左からムレミカヅキモ、ニセネコゼミジンコ、ゼブラフィッシュ）および底生生物セスジュスリカ

## 4 ．結果及び考察

平成22年度は徳島で4回（平成22年7月20日、9月10日、11月30日、平成23年2月13日ののべ18地点）、京都で2回（平成22年9月22日、平成23年1月25日ののべ8地点）、埼玉で2回（平成22年10月8日と平成23年2月22日ののべ8地点）採水し、合計でのべ34試料についてミジンコの繁殖阻害試験や藻類生長阻害試験を中心に実施し、一部は魚類胚・仔魚期毒性試験についても実施した。同様に平成23年度には徳島で3回（平成23年6月30日、8月8日（藻類のみ）、12月16日、うち2地点は藻類のみ、のべ5地点）、京都で1回（平成23年9月26日、のべ2地点）、埼玉で1回（平成23年10月11日、のべ2地点）において採水・採泥し、合計でのべ9試料について水試料については水生生物3種（ムレミカヅキモ、ニセネコゼミジンコ、ゼブラフィッシュ）を、底質試料についてはセスジュスリカを用いた毒性試験を実施した。平成24年度も同様に、徳島で4回（平成24年6月23日（藻類のみ），7月4日，10月9日，平成25年2月28日、主として田宮川・蔵本公園前、一部は冷田川・川南橋で実施）、京都で1回（平成24年12月19日、西高瀬川・天神橋）、埼玉で3回（平成24年11月5日，平成25年1月21日，2月28日、鴨川・学校橋）から採水・採泥し、のべ7試料について未処理の水試料と固相抽出による分画した試料について水生生物3種の試験を実施するとともに、底質についてはユスリカを用いた試験を実施した。

## (1) 河川水の総毒性試験結果

## 1 ）ムレミカヅキモを用いた藻類生長阻害試験結果

まず、藻類についての試験結果を年度ごとに図(1)-2～4に示す。なお、ここで縦軸は生長阻害率であり、この値が大きいほど有害影響が強く、逆に負の値の場合は栄養塩などの影響により生長が促進されているため有害影響とはいえない。
河川水濃度(%) (a) 徳島、2010年9月

図(1)-2 平成22年度の河川水の藻類生長阻害試験結果；(a)徳島、平成22年9月、(b)徳島、平成22年11月、(c)徳島、平成23年2月、(d)京都、平成22年9月、(e)京都、平成23年1月、(f)埼玉、平成22年10月、(g)埼玉、平成23年2月（次ページに続く）
図(1)-2 続き

図(1)-2に示すように、平成22年度に実施した30試料のうち、有意な毒性影響が検出されたのは9月の徳島の飯尾川および田宮川の2試料のみであった。そのほかについては、生長阻害率が負の数値、つまり生長が促進されるケースが多かった。これは、生活排水に汚染された河川では窒素・リンなどの栄養塩を高濃度で含むことによって生長が促進され、生活関連汚染化学物質等による有害影響（生長阻害）をマスキングしたことが原因として考えられる。研究代表者らが過去に下水放流水を対象に実施した試験においても同様の傾向が見られた $ ^{12} $ 。また、このことから、従来型の藻類生長阻害試験をそのまま実施する際にはこのままでは検出率は十分ではなく、栄養塩濃度を測定して添加する培地の濃度を変化させたり、発光阻害等のほかのエンドポイントを設定して毒性影響を検出したりするなど、試験法の改善に関する課題も浮き彫りになった。

(a)徳島・冷田川、2011年6月

図(1)-3 平成23年度の河川水の藻類生長阻害試験結果；(a)徳島・冷田川、平成23年6月、(b)徳島・田宮川、平成23年12月、(c)徳島・冷田川、平成23年12月、(d)京都・西高瀬川、平成23年9月、(e)京都・宇治排水路、平成23年9月、(f)埼玉・鴨川、平成23年10月、(g)埼玉・古隅田川、平成23年10月（次ページに続く）
(b)徳島・田宮川、2011年12月

(c)徳島・冷田川、2011年12月

(d) 京都·西高瀬川、2011年9月

(e) 京都・宇治排水路、2011年9月

(f) 埼玉・鴨川、2011年10月

(g) 埼玉・古隅田川、2011年10月

図(1)-3 続き

平成23年度については、図(1)-3に示すように生長阻害率が10%を超えるような有意な毒性影響が検出されたのは5試料で、6月の徳島の冷田川、京都では西高瀬川、埼玉の鴨川で比較的強い生長阻害が検出された。これらの結果は、平成22年度と大きく異なる。平成22年度からの変更点は、環境省で検討中であった「生物応答による排水試験法」に準ずる形で、ガラス繊維ろ紙によるろ過のプロセスを入れたことである。ろ過のプロセスによる懸濁物質の寄与が大きく影響していると考えられる。平成22年度の試料については、生長阻害率が負の数値、つまり生長が促進される
傾向が観察されるケースが多かったが、これは、生活排水に汚染された河川では窒素・リンなどの栄養塩を高濃度で含む試料が多いことからそれによって生長が促進され、生活関連汚染化学物質等による有害影響（生長阻害）をマスキングしていたと考えられる。平成24年度に実施した試料についても、ろ過なしで実施した試験では、生長阻害が検出されないか、もしくは生長が促進されていた。このことによって懸濁態由来の栄養塩類の混入がなくなり、溶存体に主に存在する生活関連汚染化学物質等の物質による生長阻害が顕著になったものと考えられる。

(a)徳島、2012年6月

(c)徳島、2012年10月

(d)徳島、2013年1月

図(1)-4 平成24年度の河川水の藻類生長阻害試験結果；(a)徳島・冷田川、平成24年6月、(b)徳島・田宮川および冷田川、平成24年7月、(c)徳島・田宮川、平成24年10月、(d)徳島・田宮川、平成25年2月、(d)京都・西高瀬川、平成24年12月、(e)埼玉・鴨川、平成24年11月、(f)埼玉・鴨川、平成25年1月、(g)埼玉・鴨川、平成25年2月（次〜一ジに続く）
河川水希积濃度(%)

(e)京都、2012年12月

河川水希积濃度(%)

(f) 埼玉、2012年11月

(g)埼玉、2013年1月

(h) 埼玉、2013年2月

図(1)-4 続き

平成24年度については、図(1)-4に示すように実施したのべ9試料のうち、有意な毒性影響が検出されたのは6試料で、特に12月の京都・西高瀬川、1月及び2月の埼玉・鴨川で比較的強い生長阻害が検出された。これらの結果は、平成23年度とほぼ同様である。毒性影響が検出された6試料について，Oasis HLBカートリッジに通水することで低～高極性の有機物を除去した際に毒性影響が明らかに低減したのは1月の埼玉・鴨川の試料のみであり、より有機物の捕捉率が高いAC-2で処理した際にも十分には毒性影響が低減されなかった。それに対して、2月の埼玉・鴨川の試料においては，LC-WCX（陽イオン交換樹脂）によって前処理された試料では、毒性が大きく改善された。そのことから，藻類の有害影響に寄与している成分は界面活性剤やPPCPs等の生活関連物質を含む有機物ではなく、主に無機物・陽イオンの方が毒性影響への寄与率が大きいことが示唆された。今後、このような毒性同定評価として毒性原因物質群の特徴化のデータ蓄積をさらに進めるとともに、主要な毒性原因物質と考えられる金属等陽イオンの化学分析などで物質群の同定を行う必要がある。
## 2 ）ニゼネコゼミジンコを用いたミジンコ繁殖試験結果

次にミジンコについての試験結果を年度ごとに図(1)-5～7に示す。なお、ここで棒グラフは左側の縦軸の目盛の累計産仔数であり、この値がblankに比べてどの程度低減するかによって有害評価をおこなっている。また、プロットは右側の縦軸の目盛の親ミジンコの致死率を表している。

(a) 徳島、2010年7月

(b) 徳島、2010年9月

(c) 徳島、2010年11月

(d) 徳島、2011年2月

(e) 京都、2010年9月

(f) 京都、2011年1月

図(1)-5 平成22年度の河川水のミジンコ繁殖試験結果；(a)徳島、平成22年7月、(b)徳島、平成22年9月、(c)徳島、平成22年11月、(d)徳島、平成23年2月、(e)京都、平成22年9月、(f)京都、平成23年1月、(g)埼玉、平成22年10月、(h)埼玉、平成23年2月（次ページに続く）.
(g) 埼玉、2010年10月

(h) 埼玉、2011年2月

図(1)-5 続き

平成22年度については、図(1)-5に示すようにのべ34試料中の20試料から少なくとも致死もしくは繁殖に影響が検出された。検出頻度は半数を上回っている。特に強い影響が検出されたのは埼玉の綾瀬川・内匠橋付近、鴨川・学校橋などであった。徳島や京都の河川についても影響が検出されるケースもあったが、繁殖はむしろ高濃度では増加する傾向が観察され、致死率がやや上昇したパターンも見られた。この点は、藻類と同様で、河川水中の栄養塩、微量元素等が飼育・希釈用水よりもミジンコの繁殖にポジティブな影響を与えているものと推測される。なお、低濃度で逆に繁殖が減少するようなパターン（徳島の2月の田宮川など）があり、用量一応答関係が明確でないケースが認められたが、これは試験用のミジンコのシングルカルチャーの管理が不充分であり、産仔数が少ない親ミジンコが一部使用されたことによるものと、同様に栄養塩や微量元素等の効果が、生活関連化学物質の有害影響をマスキングしていることに起因するものと考えられる。

(a)徳島・冷田川、2011年6月

図(1)-6 平成23年度の河川水のミジンコ繁殖試験結果；(a)徳島・冷田川、平成23年6月、(b)徳島、平成23年12月、(c)京都、平成23年9月、(d)埼玉、平成23年10月（次ページに続く）.
(c) 京都、2011年9月

(d) 埼玉、2011年10月

図(1)-6 続き

平成23年度については、図(1)-6に示すように今回実施した7試料中では、徳島の冷田川や埼玉の鴨川などの3試料で致死または繁殖への影響が検出され、平成22年度と同様にほぼ半数の試料で致死もしくは繁殖に影響が検出されたことになる。埼玉の鴨川では平成22年度に引き続き影響が確認されたが、古隅田川や京都の2河川（西高瀬川および宇治排水路）では影響が確認できなかった。徳島や京都の河川についても影響が検出されるケースもあったが、繁殖はむしろ高濃度では増加する傾向が観察され、致死率がやや上昇したパターンがあった。この点は、平成22年度も確認された現象で、藻類の増殖にかかわる部分と同様で、河川水中の栄養塩、微量元素等が飼育・希釈用水よりもミジンコの繁殖にポジティブな影響を与えているものと推測される。

(a)徳島、2012年7月

(b)徳島・田宮川、2013年2月

図(1)-7 平成24年度の河川水のミジンコ繁殖試験結果；(a)徳島、平成24年7月、(b)徳島・田宮川、平成25年2月、(c)埼玉、平成24年11月、(d)京都、平成24年12月、(e)埼玉、平成25年1月、(f)埼玉、平成25年2月（次ページに続く）
(c) 埼玉、2012年11月

(d)京都、2012年12月

(e) 埼玉、2013年1月

(f) 埼玉・鴨川、2013年2月

図(1)-7 続き

平成24年度については、図(1)-7に示すように今回実施した7試料中では、徳島・田宮川や京都・西高瀬川、埼玉・鴨川など5試料で致死または繁殖への影響が検出され、全ての結果を合わせるとのべ48試料中28試料で有害影響が検出されたことになる。検出頻度は60%程度であり、平成23年度以降では藻類に次いで高い検出頻度が認められた。固相抽出カートリッジによる前処理の毒性影響の変動への影響については、平成24年12月の京都・西高瀬川や平成25年1月の埼玉・鴨川ではHLBやAC-2で大きく改善された一方で、平成24年7月の徳島・田宮川では変動がなかった。一方、平成25年2月の徳島・田宮川と平成25年2月の埼玉・鴨川では陽イオン交換樹脂であるLC-WCXによる前処理も並列で実施したところ、HLB、AC-2などと同様に毒性の改善が確認された。このことから、界面活性剤やPPCPs等の有機物（農薬等の他の有機物の寄与の可能性もある）と陽イオン等の両方の複合的な毒性影響が総毒性に関与しているものと考えられるが、さらなる検討を加えるとともに、詳細については藻類と同様に網羅的な化学分析との組み合わせが今後の課題となる。

## 3 ） ゼブラフィッシュを用いた魚類胚・仔魚期短期毒性試験結果

次に魚類についての試験結果を薬類・ミジンコと同様に年度ごとに図(1)-8～10に示す。なお、
ここで2種類のプロットがあるが、青色が5日目までの孵化率であり、blankで100％に近いが、有害影響があるとこれが低下する。一方、赤色が孵化後の仔魚致死率を表しており、blankでは逆に0％に近いが有害影響があるとこれが上昇する。

(a) 徳島、2011年2月

(b) 京都、2011年1月

(c) 埼玉、2011年2月

図(1)-8 平成22年度の河川水の魚類胚・仔魚毒性試験結果；(a) 徳島、平成23年2月、(b) 京都、平成23年1月、(c) 埼玉、平成23年2月.

平成22年度については、平成23年1月以降にゼブラフィッシュの飼育状況が改善され、十分な試験実施体制が整って再現性のある試験が実施可能になったため、図(1)-8に示すように実施試料数は12地点の1回ずつに留まっている。このうち、有意な毒性影響が検出されたのは6試料であり、その検出頻度はミジンコ繁殖試験とほぼ同様であった。試料としては、最も強い毒性を示したのは埼玉の綾瀬川・内匠橋であったが、ほかに徳島の4試料全てと、京都の西高瀬川で影響が検出された。