Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
体毛が採取されているのに、映像が得られない事例が5例見られた（表(1)-20）。これには、トラップ全体を撮影するために距離を離した結果フラッシュが届かずに撮影できなかった場合（2例）、カメラの動作不良（3例）があった。体毛採取成功トラップ数よりも映像撮影成功トラップ数の方が低かったことから、機器の不具合がありえる自動撮影よりは、ヘア・トラップの方が安定した試料採取が可能であると考えられた。ヒグマの場合、映像だけから個体識別することは困難であり、カメラトラップだけでヘア・トラップの代替法とするのは現段階では無理であろう。

逆に映像は確認されたが体毛が採取されなかった事例が1例見られた（9.1%、S4−PN）。映像から、当歳子1頭がトラップ内に侵入している様子が確認された。1段張りの有刺鉄線をくぐっていた。また大型個体がトラップ内に侵入した場合、一段張りの有刺鉄線をまたいでしまい、採取された体毛試料数が少ない事例も見られた（S8−PS）。このことから、（前節に示した上ノ国地域における試験結果と同様に）有刺鉄線一段張りでは、小型個体から大型個体までをカバーすることは困難であることが示唆された。

ヘア・トラップ構造として、ツキノワグマの試験と同様に、外周と対角線に有刺鉄線を設置した。体毛が捕捉された延べ15トラップのうち、外周と対角線の両方で捕捉されたのは延べ10トラップ、外周のみで捕捉されたのがのベ4トラップ、対角線のみで捕捉されたのが1トラップ（6.7%）だった（表(1)-21）。試料数で見ると、全112試料のうち、外周で捕捉されたのが77試料、対角線で捕捉されたのが35試料であった。対角線のみで体毛捕捉された割合は小さかったことから、外周のみでも体毛捕捉には支障がないと考えられた。ただし試料数で見ると約3割が対角線で採取された試料となることから、分析成功率を上げるための保険としては、対角線も有効であると考えられる。さらに、以下に示すように1TS内で複数個体が利用することを考えると、対角線にも有刺鉄線を設置するなど有刺鉄線距離を長くした方が試料数が増加し、1頭だけの毛を残した試料が採れる可能性が高くなると考えられる。

表(1)-21 ヘア・トラップにおける体毛捕捉位置

セッション	トラップ	採取サンプル数
外周	対角線
S1	TZ	4	2
S3	LP	5	8
S4	PS	8	0
S5	LP	0	6
PN	2	0
S6	19	3	0
S7	LP	2	0
19	3	1
PS	1	1
PN	1	1
S8	PS	1	1
S9	LP	11	3
19	12	5
TZ	23	5
PS	1	2

HTCで映像が撮影された10トラップ・セッション（TS）のうち、複数個体のトラップ内侵入が確認されたのは、4TS（40%）と高い割合を示した。その内訳は、親子連れが3例、兄弟が1例であ
った（表(1)-22）。複数個体がトラップ内に侵入する際の通過場所は同じことが多かった。ヘア・トラップで採取された体毛を用いてDNA解析による個体識別を行う際には、1TSあたり1試料の分析では、トラップ侵入個体数を過小評価する可能性が高いと考えられる。

今回の試験では、セッション間隔を変えて、誘引期間と体毛捕捉率との関係を検討した。その結果、セッション間隔と体毛捕捉率には有意な関係は見られなかった（r=0.314、P=0.411）。一方セッション回数と体毛捕捉率には有意な正の相関が見られ、9月下旬以降に体毛捕捉率が高くなることが示された（r=0.726、P=0.027）。この原因として、浦幌地域では7-8月にはヒグマが農地や集落付近をよく利用しており、有害捕獲が多く行われていること、秋になると森林内にヒグマが戻ってくることが関係していると思われた。ただし、セッション日数、セッション実施時期を説明変数とした重回帰分析では有意なモデルは得られなかった（ $ R^{2}=0.548 $ 、P=0.092）。この関係を明らかにするためには、セッション日数と実施時期の組み合わせを増やした検討をする必要がある。

表(1)-22 同一TS内における複数個体の訪問数とその内訳

セッション	トラップ	延べ侵入個体数	撮影個体内訳
S3	LP	2	1才兄弟
S4	PS	2	1才1頭連れ親子
S6	19	3	0才2頭連れ親子
S9	TZ	5	0才2頭連れ親子，1才1頭連れ親子

## 4 ）背擦り木トラップ調査の結果

浦幌地域において、2011年4月30日～2011年10月9日の期間に調査を行った。調査対象木として10本を選び、有刺鉄線を巻き付けて背擦り木トラップとした。さらにトラップを訪問し、背擦りしたヒグマを撮影するために自動撮影装置11台を設置した（表(1)-23）。なお、撮影は調査期間中連続して行ったが、カメラ不具合などによる無効撮影期間が生じた。

調査対象木10本で確認された背擦り頻度を、有刺鉄線上の体毛確認回数および自動撮影装置による映像確認回数として示した（表(1)-24）。背擦り木トラップ10本中6本で延べ13回の体毛付着を確認した（図(1)-9）。最も多く体毛付着を確認できたのは、ID3とID0801の3回だった。また自動撮影装置による映像として確認された背擦り行動は、3本の木について延べ6回だった（図(1)-10）。

図(1)-9 背擦り木トラップに付着したヒグマの体毛

図(1)-10 背擦りをするヒグマ
表(1)-23 各撮影対象木における設置期間と撮影機材についてのまとめ.

木ID	樹種	胸高直径(cm)	背擦り確認初年度	設置日	機材名	機材交換日	機材名	回収日	有効撮影期間
ID3	トドマツ	45	1998	4/30	トレイルD-55	10/6	4/30-10/6
ID63	トドマツ	49	1998	5/2	トレイルD-55	10/6	5/2-10/6
ID153	トドマツ	48	1999	4/30	FildNoteDCs700	8/27	TrophycamXLT	10/6	4/30-7/4, 7/17-30, 8/12, 8/27-10/6
ID202	トドマツ	37	2002	4/30	トレイルD-55	8/27	4/30-10/6
ID227	トドマツ	17	2003	4/30	FildNoteDCs700	8/27	TrophycamXLT	10/6	4/30-7/30, 8/12-16, 8/27-10/6
ID205	アカエツマツ	23	2000	5/2	トレイルD-55	9/8	5/2-10/9
ID244	トドマツ	28	2005	4/30	トレイルD-55	8/27	4/30-10/6
ID258	トドマツ	31	2005	6/5	FildNoteⅡ-a	8/27	TrophycamXLT	10/6	6/5-7, 6/19-7/4, 7/16-10/6
ID080	トドマツ	58	2008	6/6	FildNoteDCs700	9/4	TrophycamXLT	10/8	6/6-7/1, 7/18-8/12, 9/4-10/8
ID110	アカエツマツ	21	2011	5/5	FildNoteDCs700	9/9	TrophycamXLT	10/5	5/5-7/2, 7/17-10/5
504B	M-3B	6/6	FildNote□-a	9/9	6/6-10/5

背擦り行動は、有刺鉄線上の体毛付着として確認された回数の方が、映像によって確認された回数よりも多かった。以下に体毛付着は確認されたが映像が確認されなかった事例を個別に検討していく（表(1)-24）。調査対象木ID3の1回目、ID258の1回目、ID801の2回目に体毛付着した背擦り行動の3例については、背擦り行動が行われた期間中に背擦り行動以外のクマの映像が撮影されていること、この期間中にカメラのバッテリー切れやメモリーカード容量不足はなかったことから、背擦り行動にいたる以前の活動が撮影された後の待機時間中に背擦り行動が行われた事例と判断した。ID3における2、3回目、ID63における2、3回目、ID801における2回目に体毛付着した背擦り行動については、カメラの動作不良による無効撮影期間であったためである。

背擦り行動を利用したモニタリングとしては、映像による確認よりも体毛付着確認の方が多くのイベントを観察できることが考えられた。ただし、背擦り木トラップ周辺におけるヒグマの確認回数では、背擦り以外の行動を含め47件あり、個体識別はできないものの、ヒグマの存在確認という点では、映像の方が多くのイベントを記録することができた。

映像により確認された6回の背擦り行動は、5～7月に多く確認された（表(1)-24）。この季節はヒグマの繁殖期に一致する $ ^{31} $ 。今回確認された背擦り行動のピークは、先行研究で体毛付着から確認された事例 $ ^{15} $ と一致し、また海外での報告例とも一致する $ ^{32} $ $ ^{33} $ 。この行動は繁殖期の個体間コミュニケーションに役立っていると考えられている $ ^{32} $ 。

撮影された6回の背擦り映像から、ヒグマの後肢立ち時の身長を推定した。その結果6回の全てが2 m以上の大型個体によるものであり、2 m以下の個体の背擦り行動は本研究では撮影されなかった。後肢立ち時の身長が2 mを超えることから、これらは全て成獣オスであると考えられる $ ^{34)} $ $ ^{10)} $ 。なお、背擦り行動以外で撮影された映像からは、2 m以下の小型個体と推定された個体も撮影された(13回中5回)。このことから、背擦り行動はオス成獣に偏った行動であり、個体数推定や個体群動態モニタリングのための体毛回収法としては、従来のヘア・トラップ法よりも劣る可能性がある。ただし、頻度は低下するものの繁殖期以降にも背擦り行動が観察されること、この季節にはメスの体毛付着も確認されているとの報告がある $ ^{35)} $ $ ^{36)} $ 。今回の試験では評価できなかったが、今後の継続試験が必要であろう。
今回の試験では、約1ヶ月間隔での見回りを行った。体毛付着確認ができ、かつ自動撮影装置による撮影が有効だった事例5回のうち、4回は、1回だけ背擦り行動が確認された。しかしID0801の1回目については、6月9日と6月23日の2回の別個体による背擦り映像が確認された。このことは、背擦り木トラップにおいても、複数個体からのサンプルを区別できずに回収してしまう危険があることを示している。繁殖期においては特に高頻度に背擦り行動が行われるため、1ヶ月に1回程度の見回りではコンタミネーションのリスクがあることを考慮しておくべきであろう。見回り頻度を上げるか、または繁殖期以外にサンプリングを行う必要がある。

表(1)-24 背擦り木トラップにおけるヒグマの体毛付着確認事例と自動撮影装置による背擦り行動確認事例，北海道東部浦幌地域，2011年4-10月

背擦り木トラップ	トラップあたり体毛確認イベント数	体毛付着期間	映像による背擦り行動の確認	備考
ID3	1	5/8-6/5	-	背擦り行動以外のクマ画像3回(5/14, 5/21, 5/26)
2	6/5-6/11	-	無効撮影期間(カメラ動作不良)
3	6/11-6/18	-	無効撮影期間(カメラ動作不良)
ID63	1	7/3-7/18	-	無効撮影期間(カメラ動作不良)
2	7/18-7/31	-	無効撮影期間(カメラ動作不良)
ID227	1	5/8-6/18	1回(6/7)	背擦り行動以外のクマ画像1回(6/12)
2	7/5-7/31	1回(7/26)
ID258	1	6/5-6/18	-	背擦り行動以外のクマ画像1回(6/7)
ID0801	1	6/6-7/2	2回(6/9, 6/23)	背擦り行動以外のクマ画像6回(6/12, 6/18, 6/22, 6/23, 6/25, 6/30)
2	8/13-9/4	-	無効撮影期間(カメラ動作不良)
3	9/4-10/8	1回(9/13)	背擦り行動以外のクマ画像1回(9/29)
ID110504BM3	1	5/5-6/3	回(5/31)
2	6/3-6/19	-	背擦り行動以外のクマ画像2回(6/7, 6/8)

## （５）まとめ一本研究で開発したヘア・トラップの評価

## 1 ）ツキノワグマ

北上山地モデル調査地において、ツキノワグマを対象として本研究で開発したヘア・トラップの構造および誘引物は、試料採取率が高いことから今後のヘア・トラップ調査において標準的手法となりうるものと考える。ヘア・トラップ調査に必要な作業量（人日）は、調査地へのアクセス条件、トラップ設置密度および採取試料数に大きく左右されるが、北上山地モデル調査地における、トラップ設置効率は2人1組で作業を行った場合で7基～8基/2人組日、試料採取の見回り効率は8基～10基/2人組日、が標準的な作業効率見積となると考える。調査セッション数は5セッション（1セッション10日）程度でも十分であるが、ツキノワグマの体毛試料を効率的に採取するには、夏期（7-8月）を調査セッションに組み入れることが重要である。また、面積600 km²程度の調査地でも、その内部で生息地利用密度には局所的差があることを前提とした調査設計とする必要がある。一方、ヘア・トラップ設置位置の植生、標高、および設置密度が0.25基/km²（1基/4-km²）以上であれば、これらの要因は試料採取率に影響しないと考えられた。また、ヘア・トラップの空間配置に関しては、個体群モデル班により開発された、ベイズ空間明示標識再捕獲モデルにより、トラップを等間隔で配置しなくても十分な精度をもった推定が可能である。ただし、トラップ
プ設置密度などは、先行調査および調査地における再捕獲個体の捕獲位置から、調査地ごとに検討するのが望ましい。

ヘア・トラップに併設したヘア・トラップ・カメラ（HTC）記録と採取試料のDNA分析から、同一個体のトラップ内滞在時間が長い場合により多くの体毛が採取される傾向があること、一方、この時に採取された体毛によるDNA識別個体においても同一個体と判別されたケースが多いことから、同一トラップ・セッションにおいて大量の体毛が採取された場合、全試料分析の必要性は少ないことを示唆している。また、画像撮影はヘア・トラップに入った同一のクマ個体はトラップ内で広い範囲を動くことを示し、トラップ・セクター別に分析対象体毛を抽出する必然性も少ないことを示唆している。サブテーマ1の本研究のみで、ヘア・トラップで採取した試料のうち、サブサンプリングとしてどれだけの試料数どのように選定して分析することが妥当かの明確な結論を示すことは困難である。サブサンプリングの方法は、DNA分析結果とあわせて検討する必要がある。しかし、サブテーマ1の研究からは、同一セッション・トラップにおいて大量の体毛試料が採集された場合、全試料分析の必要性は少ないと結論づけられる。

## 2 ）ヒグマ

ヘア・トラップのヒグマへの適用については、3地域の試験から、基本的にはツキノワグマで用いているヘア・トラップ構造でも良好な結果が得られることが確かめられた。ただし、ヒグマ独自の問題点として、体サイズのバラつきが大きいことから、トラップ内に侵入しているにもかかわらず、体毛が捕捉できない、または採取試料数が少ない例が見られた。体毛捕捉率および採取試料数を上げるためには、有刺鉄線を上下2段張りにするなど構造上の工夫が必要であろう。また調査地域の特性と、それに応じたヒグマの生息地利用パターンにより、ヘア・トラップの利用には季節変化が見られた。調査対象地域のヒグマの生態に関する情報を考慮した調査時期やトラップ設置位置の工夫が必要であろう。カメラトラップに関しては、確実な個体識別ができないためにヘア・トラップの代替法とはなり得ないが、ヘア・トラップにおける訪問個体数の把握、成獣と幼獣の区別、一腹産子数など、DNAによる個体識別では得ることのできない情報を得ることができ、両方の方法を併用することにより、補足的に重要な役割を果たすことができると考えられた。

また、背擦り木トラップに関しては、体毛回収が可能であることは確認されたが、背擦り行動には季節性があり、繁殖期にオス成獣によって行われる例が多いことが確認され、体毛回収トラップとしてはモニタリング対象に偏りが生じる可能性が示唆された。また体毛見回り期間を1ヶ月とすると、1本の背擦り木トラップに複数回の背擦り行動が行われる事例が確認されたことから、見回り頻度を上げるか、繁殖期以外にサンプリングを行うなどの工夫が必要であると考えられた。従来のヘア・トラップ法と比べ設置や維持管理が容易な背擦り木トラップは、これらの欠点を考慮した上で、利用が検討されるべきだろう。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

ツキノワグマを対象とした場合、本研究で開発したハチミツを誘引物とし、内部対角線をもつ有刺鉄線1段張りの簡便なヘア・トラップ体毛試料の採取効率は高く、体毛DNA分析による個体
数推定に必要な試料を採取できることがわかった。トラップ地点ごとに試料採取効率に差があるが、北上山地の事例ではトラップ設置密度が0.25基/km²（1基/4-km²）以上であれば、トラップ密度による試料採取効率に差は少ない。試料採取率は7月下旬から8月下旬が高い。

ヒグマに関する広域的な検討はできなかったが、ツキノワグマで開発されたヘア・トラップで十分な体毛が採取できることが確認された。ただし、ツキノワグマに比べると幼獣から成獣まで体サイズにばらつきが大きいため、体毛捕捉率および採取試料数を上げるためには、有刺鉄線の2段張りなどの工夫が必要であることが分かった。

## （２）環境政策への貢献

本調査で開発したトラップ構造と設置方法は、簡便で試料採取率も高いことから、今後、地方自治体によるツキノワグマのヘア・トラップ調査の標準法となることが期待できる。岩手県におけるヘア・トラップ調査では、本研究の成果が応用されている。

研究成果を自治体等が利用する際の参照とするため、下記のマニュアル・手引きを作成した。統合版マニュアルは、都道府県鳥獣保護部局へ配布した。また、ウェブサイトで電子版マニュアルを提供した。

クマ類の個体数を調べる：ヘア・トラップ法とカメラトラップ法の手引き（統合版）（印刷配布）

URL : http://www.bear-project.org/pdf/Tebiki/tebiki-tougou.pdf

・ ヘア・トラップの設置・見回り・試料回収の手引き（電子版のみ提供）

URL : http://www.bear-project.org/pdf/Tebiki/HTmimawari4th.pdf

クマ生息において安全な調査・作業を進めるために：ヘア・トラップの現場にて（電子版のみ提供）

URL : http://www.bear-project.org/

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) 米田 政明・間野 勉．2011．クマ類の個体数推定および動向把握方法の現状と課題．哺乳類科学 51:79-95.

<その他誌上発表（査読なし）>

1) Yoneda, M. and Mano, T. 2010. Estimating population size of bears in Japan. International Bear News 19(4): 17.

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 間野 勉・佐藤 喜和・米田 政明・釣賀 一二三．2009．クマ類の個体群モニタリング手法の確立にあけて．日本哺乳類学会2009年大会自由集会（2009年11月、台北）
2) 米田 政明・間野 勉. 2010. クマ類の個体数を推定する: DNAマーカ個体識別の有効性と課題. 2010年度日本哺乳類学会自由集会（2010年9月、岐阜）

3) 米田政明．ツキノワグマの大規模ヘア・トラップ調査の実施状況．クマ類の個体数推定法の開発：環境省究総合推進費プロジェクトから．2011年度日本哺乳類学会自由集会（2011年9月、宮崎）

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

1) 「クマの毛からわかること」、岩手県岩泉町町民会館（岩泉町共催）（2010年7月25日）

2) 「ツキノワグマを調べる！～森には何頭のクマさんが？～」、岩手県立博物館（岩手県立博物館共催）（2011年9月25日）

3) 「クマ類の個体数推定法に関するワークショップ」、富山国際会議場（富山県自然保護課・環境省中部地方事務所共催）（2011年10月17日）

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) 環境省自然環境局．2007．クマ類出没対応マニュアル－クマが山から下りてくる．(http://www.env.go.jp/nature/choju/docs/docs5-4a/index.html)

2) 環境省．2010．特定鳥獣保護管理計画作成ガイドライン（クマ類編）．(http://www.env.go.jp/nature/choju/plan/plan3-2c/index.html)

3) 森光 由樹．2008．各都道府県のヘア・トラップ調査の実施状況と長野県における実施例．哺乳類科学 48:133-38.

4) 米田 政明・間野 勉．2011．クマ類の個体数推定および動向把握方法の現状と課題．哺乳類科学 51:79-95.

5) 岩手県．2007．第2次ツキノワグマ保護管理計画（巻末参考资料；ツキノワグマの生息数の推定について）．岩手県.

6) 環境庁自然保護局・アジア航測株式会社. 1999. 第5回自然環境保全基礎調査植生調査報告書. (http://www.biodic.go.jp/reports2/5th/vgt_en/5_vgt_en.pdf)

7) 環境庁．1981．第2回自然環境保全基礎調査（植生調査）現存植生図、岩手県大川（http://www.biodic.go.jp/kiso/fnd_f_vg.html）

8) 世界農林業センサス2000 都道府県別統計書－林業編, 岩手県

(http://www.e-stat.go.jp/SG1/estat/List.do?bid=000001013258&cycode=0)
9) Sato, Y. 2002. An ecological study on human-bear conflicts in Urahoro, Hokkaido. Ph.D thesis. The University of Tokyo. 91pp.

10) Sato, Y., Aoi, T., Kaji, K. and Takatsuki, S. 2004. Temporal changes in the population density and diet of brown bears in eastern Hokkaido, Japan. Mammal Study 29: 47-53.

11) 佐藤 喜和・湯浅 卓. 2008. ヘア・トラップを用いたクマ類の個体数推定法: 概要と注意点. 哺乳類科学 48: 101-107.

12) 湯浅 卓・佐藤 喜和. 2008. ヘア・トラップ法を用いたクマ類の個体数推定法における課題～国内外の事例の比較検討～. 哺乳類科学 48: 109-118.

13) Karamanlidis, A.A., Youlatos, D., Sgardelis, S. and Scouras, Zacharias. 2007. Using sign at power poles to document presence of bears in Greece. Ursus 18: 54-61.

14) Kendall, K.C., Stetz, J. B., Boulanger, J., Macleod, A.C., Paetkau, D. and White, G.C. 2009. Demography and genetic structure of a recovering grizzly bear population. Journal of Wildlife Management 73:3-17.

15) 佐藤 喜和. 2004. ヒグマの背擦り. 浦幌町立博物館紀要、(4): 11-16.

16) 山内貴義．2009．遺伝子解析法を用いたツキノワグマのモニタリング調査手法の開発．岩手県環境保健研究センター年報 第8号（平成20年度）.

17) 環境省自然環境局・生物多様性センター、2009a）環境省自然環境局・生物多様性センター. 2009a．平成20年度自然環境保全基礎調査、種の多様性調査（宮城県）報告書．環境省自然環境局生物多様性センター.

18) 環境省自然環境局・生物多様性センター．2009b．平成20年度自然環境保全基礎調査、種の多様性調査（山形県）報告書．環境省自然環境局生物多様性センター．

19) 環境省自然環境局・生物多様性センター．2009c．平成20年度自然環境保全基礎調査、種の多様性調査（奈良県）報告書．環境省自然環境局生物多様性センター．

20) Miura, S. and Oka., T. 2003. Evaluation of apple bait hair-traps for genetic tagging of Asiatic black bears in the Kitakami Highland, northern Honshu, Japan. Mammal Study 28: 149-152.

21) 野生動物保護管理事務所（WMO）。2007. 平成18年度ツキノワグマ個体数調査報告書（富山県）.

22) 釣賀 一二三．2008．北海道渡島半島地域におけるヘア・トラップ調査の実施例．哺乳類科学 48:119-123.

23) 環境省自然保護局・生物多様性センター．2005．第6回自然環境保全基礎調査、種の多様性調査（岩手県）報告書．環境省自然環境局生物多様性センター．

24) 野生動物保護管理事務所（WMO）。2005. 緊急地域雇用創出特別基金事業（狩猟規制基礎調査）業務委託報告書。（長野県におけるヘア・トラップ調査）

25) 上馬 康生・中谷内 修. 2007. 石川県におけるツキノワグマのヘアートラップ調査（2006年）

石川県白山自然保護センター研究報告 33:33-40 （2006）

26) 福井県野生動物の会．2007．ツキノワグマ生息数調査報告書（ヘア・トラップ調査）．特定鳥獣保護管理計画モニタリング手法調査．

27) Gervasi, V., Ciucci, P., Boulanger, J., Posillico, M., Sulli, C., Focardi, S., Randi, E. and Boitan, L. 2008. A preliminary estimate of the Apennine brown bear population size based on hair-snag
sampling and multiple data source mark-recapture. Ursus 19(2):105-121.

28) Woods, J.G., Paetkau, D., Lewis, D., McLellan, B. N., Proctor, M. and Strobeck, C. 1999. Genetic tagging of free-ranging black and brown bears. Wildlife Society Bulletin 27 (3): 616-627.

29) Robinson, S. J., Waits, L. P., and Martin, I. D. 2009. Estimating abundance of American black bears using DNA-based capture-mark-recapture models. Ursus 20 (1):1-11.

30) Boulanger, J., Proctor, M., Jimmer, S., Stenhouse, G., Paetkau, D. and Cranston, J. 2006. An empirical test of DNA mark-recapture sampling strategies for grizzly bears. Ursus 17 (2):149-158.

31) 坪田 敏男・金川 弘司・高橋 健一・安江 健・福永 重治. 1985. エゾヒグマの飼育条件下における性行動の観察. 家畜繁殖誌 31:203-210.

32) Green, G. I. and Mattson, D. J. 2003. Tree rubbing by Yellowstone grizzly bears Ursus arctos. Wildlife Biology 9:1-9.

33) Puchkovskiy, S.V. 2009. Selectivity of tree species as activity target of brown bear in taiga. Contemporary Problems of Ecology 2:260-268.

34) Maeda, N. and Ohdachi, S. 1994. Growth and body measurement of Hokkaido brown bear in captivity. Proceedings of the Second East Asiatic Bear Conference 68-76.

35) Karamanlidis, A. A., Drosopoulou, E., de Gabriel Hernando, M., Georgiadis, L., Krambokoukis, L., Pllaha, S., Zedrosser, A. and Scouras, Z. 2010. Noninvasive genetic studies of brown bears using power poles. European Journal of Wildlife Research 56:693-702.

36) Stetz, J. B., Kendall, K. C. and Servheen, C. 2010. Evaluation of bear rub surveys to monitor grizzly bear population trends. Journal of Wildlife Management 74:860-870.
## (2) 個体数推定に関わる効果的な DNA 分析法の確立に関する研究

山形大学理学部

地方独立行政法人 北海道立総合研究機構

玉手 英利

釣賀 一二三

近藤 麻実

岩手県環境保健研究センター

株式会社野生動物保護管理事務所

山内 貴義

湯浅 卓

<研究協力者>

慶應義塾大学（ポスドク研究員）

財団法人自然環境研究センター 第一研究部

鵜野 レイナ

諸澤 崇裕

平成21～23年度累計予算額：45,998千円（うち、平成23年度予算額：15,450千円）予算額は、間接経費を含む。

[要旨] ヘア・トラップ法によるクマ類の個体数推定における最重要の技術的課題は、体毛から得られる微量DNAを効率的に利用した高精度な個体識別法を確立することである。この課題を解決するために、本研究では、ツキノワグマおよびヒグマを対象として、先ず、体毛試料の処理方法、遺伝マーカーの種類、遺伝子増幅反応条件、遺伝子型判定基準等の分析工程について、最適条件を網羅的に検討し、効率的に個体識別を行う標準的分析法を確立した。次に、同分析法を用いて平成22・23年度の実地調査で採取した体毛試料の遺伝子型判定を行い、得られた個体識別データを、本推進費サブテーマ1「ヘア・トラップ法による個体数推定の確立に関する研究」とサブテーマ4「個体群モデルによる生息数および生息動向分析法の確立に関する研究」に提供した。同データの統計学的解析によって、分析成功率を高めるサンプリング条件が明らかになった。さらに、遺伝子型の誤判定率の最冊推定によって、使用する体毛の本数が分析精度に影響を及ぼすことが示された。DNA分析の別法である「有害捕獲個体を利用した有効集団サイズの推定法」のツキノワグマ集団への適用可能性を検討する遺伝子分析を行った結果、調査対象集団の有効集団サイズは100以下となり推定値幅が大きいことが示された。以上の結果を基に、日本産クマ類のDNA分析による個体数推定における分析精度管理の方法として、個体識別の効率的な再分析手順を定め、誤判定データを検出する新たな方法を開発した。以上の成果を基に、ツキノワグマとヒグマの個体数推定に用いる標準的DNA分析法をマニュアル化し、誤判定データ検出方法等と共にウェブで公開した。

[キーワード] 遺伝子分析、ヘア・トラップ、分析効率、分析精度、マイクロサテライト

### 1. はじめに

## （１）研究背景：個体数推定に関わるDNA分析法の技術的課題

野生動物の個体数推定を目的としたヘア・トラップ法は90年代に欧米で開発され、最近ではわが国でも導入が進み、環境省の種の多様性調査 $ ^{1)} $ $ ^{2)} $ $ ^{3)} $ $ ^{4)} $ $ ^{5)} $ や自治体が行うクマ類の生息調査等で利
用されている。日本のツキノワグマやヒグマを対象種とするヘア・トラップ法については様々な方法論的検討がなされてきたが $ ^{6)} $ 7 $ ^{8)} $ 9 $ ^{10)} $ 11)、信頼性の高い生息調査方法として実用化するためには、未だ、以下のような課題が残されている。

(i) 各試験研究機関で用いる遺伝マーカー（遺伝子座）の種類や分析条件が異なるので、各道府県の調査で得られた遺伝子データの互換性が保証されない。そのため、メタ解析を行うことが困難で、複数の自治体にまたがる広域的な個体数推定ができない。

(ii) サンプリング時期や遺伝子増幅反応の条件の違いにより、遺伝子分析の成功率が大きく左右されることが経験的に知られているが、最適な分析条件が定まっていない。

(iii) 多数の試料を効率的に処理して精度管理を適切に行う方法が確立されていない。

わが国では既に20件を超えるヘア・トラップ調査が実施されているにもかかわらず、いずれの調査においても、分析効率や分析精度を検証するためにはサンプル数が不十分で、上述の課題を検討することができなかった。そこで本研究では、先ず、多数の遺伝子マーカーを対象として網羅的な分析条件の検討を行い、大規模実地調査で採取した多数の分析試料を使用して、統計学的解析により分析成功率や分析精度に影響を及ぼす要因を特定し、開発手法の有効性を検証することを計画した。

## （２）研究の年度進行

本研究では、平成21年度にツキノワグマのサンプリング時期、DNA抽出方法、遺伝子増幅反応の条件、遺伝マーカーの種類、精度管理方法について、室内実験と野外実験とを行って分析効率を比較検討し、標準的な分析条件を定めた。遺伝マーカーの選択では49種類の2～4塩基反覆配列多型を示す候補遺伝子について、ツキノワグマ42個体の組織試料を材料とした分析を実施した。ヒグマに関しては、既報の遺伝マーカーに関する分析結果のレビューと、新規に報告のあった遺伝マーカーの分析試行による評価を行い、マーカー選択のための情報収集を行った。

平成22年度は、前年度に確立したDNA分析方法を用いて、岩手県北上山地における大規模ヘア・トラップ調査により得られた、大量のツキノワグマの体毛試料を分析し、サブテーマ1「ヘア・トラップ法における個体数推定法の確立に関する研究」とサブテーマ4「個体群モデルによるモニタリング手法および生息数推定法の確立に関する研究」のための識別個体データを提供した。また、大規模調査で得られる多数の試料を効率的に分析するために、複数の試験研究機関が分担して分析を行う体制を整備した。ヒグマについては、北海道札幌市において小規模な野外調査を実施して、DNA分析効率の季節性に関する検討を行った。

平成23年度は、同年度に採取された新たな体毛試料を分析し、サブテーマ1とサブテーマ4のための識別個体データを提供した。また、平成22年度調査で個体識別を行った試料の分析精度を検証するために再解析を行い、遺伝子型誤判定率の最も推定を行った。さらに、識別個体の遺伝子型頻度から、誤判定データの存在を検出する新たな方法を開発した。また、遺伝子型判定の成功率に影響を与える諸要因を明らかにするために、PCR成功率を応答変数、環境要因等を説明変数とする一般化線形モデルによる解析を行った。ヒグマを対象とした研究では、23種類の4塩基反復配列多型を示す候補遺伝子について、ヒグマ45個体の組織試料を材料とした分析を実施した。既報の遺伝マーカーと今回分析を実施したマーカーに関する分析結果をもとに、Probability of Identity (Pid)、PCR増幅率および対立遺伝子サイズの判定の容易さ等を評価基準として、有効なマ
一カーを選択した。また、北海道上ノ国町にて平成22年度と同様に小規模な野外調査を実施し、DNA分析効率の季節性に関する検討を行い、調査実施に最適な時期を明らかにした。最後に、研究成果である精度管理の技術情報と標準分析試料をウェブ上で提供し、標準的分析法を記載した標準工程マニュアルを公開した。

## 2 ．研究開発目的

クマ類の個体数推定に関わる遺伝子分析法の効率と精度管理を向上させるための諸条件を検討し、標準的分析法を確立することを上位目的とした。

研究開発の第1段階として、DNA分析条件の標準化を行うため、(i)ツキノワグマおよびヒグマの個体識別を効率的に行う遺伝マーカーの選択、(ii)遺伝子増幅反応条件の最適化、(iii)複数機関での分析手法・条件の標準化を具体的な目的として標準的分析法を開発した。第2段階では、北上山地の実地調査で採取された試料を分析して、サブテーマ1および4に識別個体データを提供することを目的とした。第3段階では、DNA分析成功率に影響を及ぼす要因の調査と、遺伝子型の誤判定の検討とを具体的な目的とし、効率的な精度検証方法を開発した。

上述の各分析と並行して、有害捕獲や狩猟で得られる組織試料から個体数に関する情報を得ることを目的として、有効集団サイズ（Ne: effective population size）を推定する方法の有効性を検討した。

## 3 ．研究開発方法

## （１）DNA分析手法の標準化

## 1 ）ツキノワグマの遺伝マーカーの選択

国内でヘア・トラップ調査が始められた90年代は、利用できる遺伝マーカーがPaetkauらのG series $ ^{12} $ ；KitaharaらのMSUT series $ ^{13} $ ；TaberletらのUarMU series $ ^{14} $ などに限られていた。そのため現在でも多くの自治体では、これらの90年代に開発されたマーカーが主に用いられている。しかし、これらの遺伝子座の変異は2塩基反覆配列多型であるため、対立遺伝子の判別を注意深く行う必要がある。それに対し、対立遺伝子の読み取りがより容易な3塩基および4塩基反覆配列多型のUT series $ ^{15} $ 、UA series $ ^{16} $ 、Uam series $ ^{17} $ が、新たなクマ類のマイクロサテライトマーカーとして開発された。そこで本研究では、新たに開発されたUT、UAおよびUamの各マーカーから、原報で多型性が高いことが記載されている遺伝子座で対立遺伝子サイズが250 bpより小さいものを選び、従来用いられてきたG、UarMUおよびMSUTマーカーと合わせて、個体識別効率を比較する基準となる対立遺伝子数およびPidとPid-sibを測定した。Pidは調査対象集団が大集団で任意交配している場合に、任意に抽出された異なる2個体が偶然に同一の遺伝子型を持つ確率を表す指標である。一方、Pid-sibは血縁個体の存在を考慮したPidで、小集団ではPidに比べてより実用的な指標とされる $ ^{18} $ 。試料として、2003年から2008年の間に岩手県で捕獲されたツキノワグマ42個体の筋肉から抽出したDNAを用いた。PCR等の条件は、それぞれのマーカーを記載した原著論文に従って設定した。

個体数推定のために遺伝子分析を行う場合、どれくらいの数の遺伝子座を用いるべきかについては、データの正確性と費用対効果の両面から論議されている $ ^{19} $ $ ^{20} $ $ ^{21} $ 。使用する遺伝子座の数が少ない場合には異なる個体を同一個体と誤判定する可能性が増える。一方、遺伝子座の数が多い
場合には、遺伝子型の読み取り間違いによって同一個体を異なる個体と誤判定する可能性が増え、分析コストも増加する。本研究では上述の先行研究を参考にして、国内のヘア・トラップ調査で使用されている遺伝子座が6～9種類であること、一調査当たり数百以上の試料を処理することを考慮して、使用する遺伝子座数を6と定めた。さらに、調査対象地域の遺伝的多様性が低く6遺伝子座では個体識別が困難な場合には、必要に応じて3種類の遺伝子座を追加で分析することとした。

最初に分析する6遺伝子座としては、地域集団において $ P_{id} $ が低い遺伝子座から順に選び、3遺伝子座を1セットとするmultiplex PCRにより遺伝子型を判定する手順とした。Multiplexの構成については、すべての遺伝子座が良好に増幅される組み合わせを選択し、調査地域の地域個体群内で一定の個体識別精度を確保できる数値（概ね $ 1.0\times10^{-5} $ ）よりも低い $ P_{id} $ が得られるように、遺伝マーカーのセットを設定した。

## 2 ）ヒグマの遺伝マーカーの選択

これまで、国内におけるヒグマの個体識別には、Paetkauらの提唱するG series $ ^{12)} $ やTaberletらのUarMU series $ ^{14)} $ などが用いられてきた。これらの2塩基反復配列多型マーカーに対して、対立遺伝子の読み取りがより容易と考えられる4塩基反復配列多型のUT series $ ^{15)} $ 、UA series $ ^{16)} $ およびUam series $ ^{17)} $ が、新たなクマ類のマイクロサテライトマーカーとして開発された。そこで、本研究ではツキノワグマの場合と同様に、新たに開発されたUT、UAおよびUamの各マーカーから、原報で高い多型性が記載されている遺伝子座のうち対立遺伝子サイズが250 bpより小さい23遺伝子座を選び、個体識別効率を比較する基準となる対立遺伝子数およびPidと $ Pid-sib^{18)} $ の測定を試みた。それぞれの数値の測定には、1996年から2008年の間に北海道石狩西部地域で採取された捕獲個体等45個体の組織試料を用いた。ここで選択されたマーカーは、multiplexの検討に供されることから、PCR反応はすべて同一の条件で行うこととし、DNA polymerase（AmpliTaq Gold, ABI）に添付の反応液組成で、基本的に30サイクルのPCR反応（95℃30秒、50℃20秒、72℃20秒）を実施した。

次に、検討を行った23遺伝子座のうちPidおよび $ Pid-sib $ の低いもので、かつ対立遺伝子のサイズを表すピークの判読が困難でないものを12遺伝子座程度選択し、 $ Pid $ の低い3～4遺伝子座を軸にmultiplex PCRにおける組み合わせの相性を検討した。MultiplexPCRの反応条件は、ツキノワグマと同様の条件で行った。

## 3 ）遺伝子増幅反応の最適化

体毛から得られるDNAは微量であり、回収状況によっては劣化している場合もある。そのため、PCRに使用する耐熱性DNA polymeraseの種類によって、遺伝子型判定の成功率は大きく左右される可能性がある。現在、国内のヘア・トラップ調査で用いられている耐熱性DNA polymeraseは、Ex Taq (TaKaRa)、Ex Taq HS (TaKaRa)、PrimeSTAR GXL (TaKaRa)、KOD FX (TOYOBO)、Ampli Taq Gold (Applied Biosystem Inc)などであるが、それらの酵素の性能に関する網羅的な比較は行われていなかった。そのため本研究では、上述の6種類の酵素に加えて、Blend Taq-Plus- (TOYOBO)、AccuPrime GC-Rich (Invitrogen)の酵素と、マイクロサテライト分析用試薬キットとして市販されているQIAGEN Multiplex PCR Kit (QIAGEN)の合計8種類の酵素を用いて、微量DNAを分析対象試料にした場合のPCR成効率を比較した。PCR増幅効率を調べるための標準DNA試料として、山形県で捕獲されたツキノワグマ8個体の筋肉から抽出したDNAを用いた。ヘア・トラップでは、PCR
に用いる試料のDNAの量が数pgのオーダーになることを考慮して、標準DNA試料を1反応あたり10 ng、1 ng、100 pgの3段階に希釈したものを用いた。PCR成功率の比較は、マイクロサテライトマーカーG1Aのsingle PCRによる増幅と表(2)-3（後述）に示したmultiplexセットを用いたPCRによって実施した。全試料のPCR産物を対象として2% Ultra low range agarose gel（BioRad社）を用いた電気泳動を行い、PCR反応産物の有無を確認して増幅成功率を求めた。

## 4 ）複数機関での分析手法・条件の標準化

ヘア・トラップ試料の遺伝子分析を複数の試験研究機関で分担する場合、分析機関によって読み取られる対立遺伝子サイズが異なることがある。この原因としては、各分析機関で使用しているサーマルサイクラーやジェネティックアナライザ、サイズスタンダードの違いなどが考えられる。同じ対立遺伝子を複数の分析機関で異なるサイズとして読み取った場合には、正しく個体識別が行われない。そのため本研究では、分析機関間の読み取りサイズの違いについて、標準試料を用いた較正を行った。標準試料は、ツキノワグマ8個体（2006年から2009年にかけて山形県鶴岡市および酒田市で捕獲されたオス3個体、メス5個体）の筋肉から抽出したDNAを使用した。この標準試料を用いて、後述の表(2)-3で定めたマイクロサテライト6遺伝子座（G10C、UarMU23、UarMU05、UamD103、UamD2、UamD118）すべてについて、分析機関ごとに増幅およびフラグメント解析を実施し、機関間で生じた対立遺伝子サイズの差を記録した。この後のすべての遺伝子分析作業では、対立遺伝子サイズ較正後のデータを使用した。

体毛から抽出したDNAの量は乏しいことが多く、allelic dropout（片側対立遺伝子の欠落；以下、ADO）やfalse allele（偽対立遺伝子；以下、FA）といった分析エラー $ ^{23)} $ が一定の確率で生じる。信頼性の低いデータを個体数推定に用いた場合は、推定精度も低いものとなるため、信頼性の高いデータのみを抽出することが重要である。本研究では分析精度を一定に保つため、また、分析機関間および年度間での分析結果の比較を可能にするため、明確な遺伝子型判定ルールを定めることとした。岩手県北上山地周辺で有害捕獲されたツキノワグマ42個体分の筋肉および2010年度北上山地にて実施された大規模ヘア・トラップ調査によって採集された体毛試料を対象とし、遺伝子分析を実施した。筋肉試料からのDNA抽出にはDNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN）を用いた。体毛試料については10本程度を上限として毛根部のみを切り取り、DNA extractor FM kit（和光純薬株式会社）を用いてDNAの抽出を行った。上述の6つの遺伝マーカーを用いてDNAを増幅しフラグメント解析を行った。フラグメント解析によって得られた波形を精査して、典型的な波形を基本波形とし、基本波形と異なる波形の取り扱いについて定めた。分析にかける努力量を一定にするため、再分析を行う基準や再分析回数の上限を定めた。併せて、GeneCap $ ^{24)} $ を用いて遺伝子型を照合した際に生じるミスマッチ（6遺伝子座分析のうち1あるいは2遺伝子座のgenotypeが異なることで別個体として扱われる試料）および1試料のみから得られた遺伝子型の取り扱いについても定めた。これらを総合して遺伝子型判定ルールとして整理した。このルールに従って2010年度試料の分析を行い、その結果を用いてルールの妥当性について評価した。評価は、ルール策定前後でミスマッチを生じたデータ数の比較によって行った。

## （２）ヘア・トラップ試料の個体識別

北上山地へア・トラップ試料を対象として、6つのマイクロサテライトマーカー（G10C、UarMU23、
UarMU05、UamD103、UamD2、UamD118）を用いて個体識別を行った。体毛10本程度を上限として毛根部のみを切り取り、DNA extractor FM kit（和光純薬株式会社）を用いてDNAを抽出した。抽出したDNAを増幅しフラグメント解析を行い、後述の図(2)-2に示した方法で波形を読み取ることによって遺伝子型を決定した。また、個体識別の際の補足的なデータとして、性判別も併せて実施した。遺伝マーカーを用いたクマ類の性判別では、SRY遺伝子、ZF遺伝子、アメロゲニン遺伝子を用いる方法がある $ ^{25)} $ $ ^{26)} $ 。本研究では、PCR産物のサイズがマイクロサテライトマーカーとほぼ同じ範囲にあり、フラグメント長の違いで雌雄が区別できるという点に着目し、アメロゲニン遺伝子を採用した。DNA polymerase（TaKaRa Ex Taq, AmpliTaqGold等）に添付の反応液組成を全量15μlになるように調整し、30サイクルのPCR反応（97℃30秒、55～65℃90秒、72℃30秒）を実施した。ジェネテツイクアナライザを用いてPCR産物のフラグメント解析を行い、大小2つのフラグメントサイズの波形が得られたものをオス、フラグメントサイズが大きい方の波形のみが得られたものをメスとし、それ以外は性別不明とした。マイクロサテライト6遺伝子座すべての遺伝子型が決定したデータのみを抽出し、GeneCap $ ^{24)} $ によって識別個体の照合を行った。2010年度試料の分析の結果1試料のみから得られた遺伝子型については、4～6遺伝子座でホモ接合であったものとミスマッチのチェック以外で再分析歴のあるものとをデータセットから除去した。分析試料のサブサンプリングによって識別個体数にどの程度の違いが出るのか検証することを目的として、2010年度試料のデータセットを(i)1試料/トラップ/セッション（以下、1試料/TS）、(ii)体毛10本以上試料（以下、10本以上試料）および(iii)全試料の3つの分析区分に分け、個体識別結果を比較することとした。(i)1試料/TSのデータセットは各トラップ・セッションの中で最も体毛本数の多い試料のデータを抽出して作成した。最も体毛本数の多い試料で個体識別結果が得られなかった場合は、個体識別ができるまで体毛本数の多い試料から順に遺伝子分析を行ったこととした。2011年度の試料については、2010年度の結果を受け、(i)1試料/TSおよび(ii)10本以上試料の2つの分析区分のみ遺伝子分析を行った。2011年度試料は全試料分析を実施せずサブサンプリングによって遺伝子分析を実施したため、1試料のみから得られた遺伝子型については、5・6遺伝子座でホモ接合であったもののみをデータセットから除外した。

## （３）DNA分析成功率と誤判定率の検討

## 1 ）ツキノワグマのDNA分析成功率に影響を及ぼす要因の調査

2010年の北上山地モデル調査におけるヘア・トラップ調査により採取された体毛試料の遺伝子分析結果のうち、体毛の本数情報が記録されている1,831試料分のデータを用いて、体毛本数および調査の実施時期と分析成功率との関係について解析を行った。遺伝子分析に供した試料（以下、分析試料）のうち、個体識別に至ったものを遺伝子分析成功試料（以下、成功試料）とし、成功試料数を分析試料数で除したものを遺伝子分析成功率とした。まず各分析試料について、その体毛本数別に遺伝子分析成功率を算出し、体毛本数との相関係数を求めた。次に、全分析試料数に対する体毛本数別分析試料数の割合を調査季節区分ごとに算出した。調査季節区分は、体毛試料の回収日を元に、6月下旬、7月上・中・下旬、8月上・中旬の6区分とした。最後に、応答変数には分析結果を成功（1）、失敗（0）とした二値データを、説明変数には調査季節区分を用いて、一般化線形モデル（GLM）によって調査時期と分析成否との関係について検討した。リンク関数はlogit link、誤差構造は二項分布とした。
## 2 ）ヒグマのDNA分析成功率に影響を及ぼす要因の調査

2010年7月から10月にかけて札幌市定山渓地域の国有林（以下、定山渓地域）において、2011年7月から10月にかけて上ノ国町内の道有林（以下、上ノ国地域）において、それぞれへア・トラップ調査を実施した（調査地域の概要および調査方法については、ヘア・トラップ班報告参照）。各ヘア・トラップから回収された体毛試料のうち、1本以上の体毛で毛根が確認された試料を対象として、遺伝子分析および個体識別を行った。2010年に採取された試料の分析には、それまで北海道で一般的に用いられてきたマイクロサテライト8遺伝子座（G1A、G10B、G10P、G10X、UarMU05、UarMU23、UarMU50、UarMU51）を、2011年に採取された試料の分析には、後述する表(2)-6で選択したマイクロサテライト9遺伝子座（G1A、G10B、G10P、G10X、UarMU09、UarMU23、UarMU50、UarMU51、UarMU59）を用いた。個体識別できた試料を分析成功試料として、分析成功試料数を遺伝子分析に供した試料数で除して調査実施時期ごとに分析成功率を求めた。

## 3 ）ツキノワグマの遺伝子型誤判定率の推定

微量DNAを用いてマイクロサテライトDNAを増幅する場合にはADOやFAなどの遺伝子型の誤判定が生じる場合がある。このことを検証するために、同一試料について2回、独立したPCRを行って得た2組の遺伝子型データを比較することによって、遺伝子型の誤判定率を推定することができる。ADOとFAそれぞれの誤判定率を推定するプログラムとして、PEDANT $ ^{27)} $ を用いた。PEDANTにより誤判定率を求めるため、PCRから遺伝子型の決定までの作業を北上山地で2010年に採取したツキノワグマの1,245試料を対象に2回行った。1回目と2回目のデータを比較して、遺伝子型が異なる試料をもとに、遺伝子座と各対立遺伝子の誤判定率を推定した。遺伝子分析に供した体毛本数をもとに4つのサブグループに分類した（全試料、10本以上、5～9本、1～4本）うえで、遺伝子座ごとに誤判定率を推定した。

## 4 ）ツキノワグマDNA試料の適合度検定：遺伝子型誤判定の検出方法の開発

ヘア・トラップでは、ADOのためヘテロ接合の遺伝子座を誤ってホモ接合として判定し、別個体としてしまうことから個体数を過剰に見積もる場合がある。このような誤判定が生じている可能性を検証するために統計学的検定（適合度検定）を用いた。適合度検定を行うためには、調査対象地域集団の対立遺伝子頻度のデータが必要となる。そのため、北上山地における有害捕獲や狩猟で集められた組織試料から十分な量のDNAを得て、遺伝子分析により42個体の遺伝子型を決定し、母集団の対立遺伝子頻度を推定した。適合度検定では、母集団の対立遺伝子頻度から求めたサンプル集団におけるホモ接合体の出現数の期待値に対して、サンプル集団におけるホモ接合体の出現数（観察値）を比較するχ²検定を行った。帰無仮説（適合性）が棄却された場合には、ホモ接合となった個体の遺伝子データを再確認して、誤判定の有無を個別に検証した。ADOの可能性を検証するため、同個体群内で有害捕獲された個体の筋肉試料の遺伝子頻度を期待値とし、体毛試料の遺伝子頻度を実測値として両者の比較を行った。

## （４）有効集団サイズ（Ne）を推定する方法の検討

分析対象試料として、山形県で2004年から2008年までに有害捕獲で捕獲されたツキノワグマ117