Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
クロルデン類のtrans-Chlordane以外のすべての農薬において、母体血中の農薬濃度は臍帯血中の農薬濃度と比較し、有意に高い値を示した（図(1)-7）。また、母体血・臍帯血中のクロルデン類であるcis-Nonachlor、trans-Nonachlor、ヘキサクロロベンゼン（HCB）濃度とP1GFは有意な関係が認められた（図(1)-8）。農薬に対する胎盤のバリア機構は強いと考えられたが、胎盤は農薬曝露に対してP1GF産生を増加させる生物活性を有することが示唆された。

## （２）　正常胎盤におけるＳｕｅｍＡアミノ酸輸送活性（図(１)-９：ナトリウム依存性アミノ酸輸送機構）のバリデーションアッセイ（図(１)-１０：分析方法およびタイムコーステスト）

図(1)-9に胎盤合胞体栄養膜細胞におけるSystemAアミノ酸輸送機構を示す。このようにSystemAアミノ酸輸送機構ではアラニン、セリン、プロリン、グリシン、メチルアミノイソブタン酸 {(methylaminoisobutyricacid:MeAIB)：SystemAアミノ酸輸送体の特異的基質}などの低分子量・中性アミノ酸を合胞体栄養膜細胞の母体面に存在する微絨毛膜上の輸送蛋白よりナトリウム依存性に取り込む能動輸送システムである。

図（1）-9：ナトリウム依存性アミノ酸輸送機構
図(1)-9に培養胎盤微絨毛片におけるSystemAアミノ酸輸送活性測定デバイスおよびバリデーションアッセイ（タイムコース試験）の結果を示す。

System A アミノ酸輸送活性:

Na+-dependent Uptake of 14C-MeAIB

1. Net well (74um mesh) 12-well plate with individual removable mesh-bottom wells

2. Time course experiment results

図（1）－10：ネットウェル培養プレート法（アミノ酸輸送活性測定）・タイムコーステスト

「エコチル調査」の症例数に対応する迅速な分析のため、ネットウェル培養プレートを用いたSystemAアミノ酸輸送活性法を確立した。胎盤微絨毛片を用いたナトリウム依存性SystemAアミノ酸輸送活性は、40分間直線性に増加した（n=6）（図（1）-10：タイムコース実験）。培養胎盤微絨毛片の環境化学物質曝露実験において20分間のナトリウム依存性C $ ^{14} $ -MeAIB uptakeをSystemAアミノ酸輸送活性として環境化学物質曝露群と非曝露群の間で比較検討することとした。
## (3) 環境化学物質が SystemAアミノ酸輸送活性に与える影響（図(1)-11,12,13,14）

in vitroにおいてアルデヒド類、金属元素、樹脂原料の胎盤微絨毛片への60分間の曝露によるSystemAアミノ酸輸送活性の変化を調べた（n=12）。

図(1)－11にアルデヒド類曝露によるアミノ酸輸送活性の変化を示す。

$ ^{*} $ P > 0.05 vs. control

アルデヒド類曝露(1 hour)	% decrease in AAT / log $ ^{10} $ increase in chemical expo.*
Glutaraldehyde	44.2
pFormaldehyde	11.5
Acetaldehyde	< 0

$ ^{*} $ Chemical effect was estimated across experimental range graphed here.

図（1）-11：アルデヒド類によるアミノ酸輸送障害

図(1)－11左上部の棒グラフに示すようにグルタルアルデヒドは比較的低濃度より濃度依存性にアミノ酸輸送活性を低下させた。ホルムアルデヒドは高濃度でのみアミノ酸輸送活性を低下させた。アセトアルデヒドは変化させなかった。図(1)－11右上部の棒グラスに示すように全てのアルデヒド類は培養液中の乳酸脱水素酵素を増加させなかった。アルデヒド類添加による細胞障害性が低いことが示された。図(1)－11下部に示すようにグルタルアルデヒドが最も強くアミノ酸輸送活性を低下させた。アルデヒド類のなかで、内視鏡の消毒薬などに利用されるグルタルアルデヒドは胎盤アミノ酸輸送障害を起こす毒性が高く危険であることが示唆された。
図(1)－12に重金属曝露によるアミノ酸輸送活性の変化を示す。

$ ^{*} $ P > 0.05 vs. control

金属曝露(1 hour)	% decrease in AAT / log $ ^{10} $ increase in chemical expo.*
Arsenic	18.3
Cadmium	33.7
Methyl Mercury	< 0

$ ^{*} $ Chemical effect was estimated across experimental ranges graphed here.

図（1）－12：重金属によるアミノ酸輸送障害

図(1)－12左上部に示すようにヒ素は比較的低濃度より濃度依存性にアミノ酸輸送活性を低下させた。カドミウムは高濃度でのみアミノ酸輸送活性を低下させた。メチル水銀は変化させなかった。図(1)－12右上部に示すように全ての金属元素は培養液中の乳酸脱水素酵素を増加させなかった。金属元素添加による細胞障害性が低いことが示された。我々の研究の結果、カドミウムは胎盤通過性が低いが、カドミウムは胎児に直接到達しなくても、間接的に胎盤アミノ酸輸送障害を起こし胎児発育に悪影響を起こす可能性が示唆された。
図(1)－13に樹脂原料曝露によるアミノ酸輸送活性の変化を示す。

樹脂への曝露(1 hour)	% decrease in AAT / 10-fold increase in chemical expo.*
Acrylamide	< 0
Methyl Acrylate	2.2
Phthalic Anhydride	3.1
Toluene Diisocyanate	7.6

$ ^{*} $ Chemical effect was estimated across experimental range graphed here.

## 図（1）-13：プラスチック樹脂原料によるアミノ酸輸送障害

図(1)－13左上部に示すようにトリレンジイソシアネート、無水フタル酸は比較的低濃度より濃度依存性にアミノ酸輸送活性を低下させたが、メチルアクリレートは高濃度でのみアミノ酸輸送活性を低下させた。アクリルアミドは変化させなかった。図(1)－13右上部に示すように全ての樹脂原料は培養液中の乳酸脱水素酵素を増加させなかった。これらの樹脂原料添加による細胞障害性が低いことが示された。図8下部に示すように樹脂原料のの中でトリレンジイソシアネートが最も強力にアミノ酸輸送活性を低下させた。樹脂原料は近代社会では一般的に多用され胎児発育を修飾する環境化学物質として重要であると考えられた。
図(1)－14にグルタルアルデヒド曝露による糖・アミノ酸輸送蛋白の定量（ウェスタンブロット法）結果を示す。

Glutaraldehyde(100μM), 18hr曝露

図（1）－１４：グルタルアルデヒド曝露による糖・アミノ酸蛋白分子構造の評価 胎盤絨毛を18時間グルタルアルデヒドに曝露したが、図(1)－14右のウェスタンブロットで示すようにアミノ酸輸送蛋白（L型、B°型）、糖輸送蛋白（SNAT2）の発現（分子構造）に変化は認められなかった。図(1)－14左に示すようにいずれの濃度においても培養液中のLDH（乳酸脱水素酵素）の上昇は認められなかった。
## (4) 妊娠の職業歴と胎盤基礎データおよび機能の相関性（図(1)-15）

有職者群：妊娠中も職業に従事している有職者（n=15）と非有職者群：専業主婦（n=30）との間おいて胎盤基礎データおよび胎盤機能について比較検討した。有職者群においては、胎盤重量と栄養膜細胞容積が減少傾向にあった。今後症例を増やして再検討する予定である。両郡間に分娩週数や出生児体重に有意差は認められなかった。また、両郡間に胎盤低酸素指標であるPlGF(Placental Growth Factor)やsFlt-1(Soluble-VEGF-Receptor1)の発現にも有意差を認めなかった。胎盤におけるPlGFやsFlt-1は、胎盤蛋白1mg当りの蛋白量（pg/mg）として算出した。

date are expressed as mean $ \pm $ SD

図（1）－１５：有職者と非有職者における胎盤機能の比較

## (5) 考察

Polychlorinated biphenyls(PCBs)は母体血で臍帯血より有意に高い傾向にあり、分子量が大きいPCBほど胎盤を通過し難い傾向にあった。母体・臍帯血液中のPCBs濃度上昇に伴い、胎児栄養化を担う合胞体栄養膜細胞が減少することを世界で先駆けて発見し、PCBs曝露による胎児発育制限機構の1つの可能性を見出した。また、PCBs濃度上昇に伴い胎盤血管新生に寄与するP1GF産生は亢進していることを発見した。これは正常妊娠における胎盤の適応機能を反映していると考えられた。今回分析を行った農薬と胎盤機能や胎児発育障害に関する過去の報告は少ない。今回測定されたクロルデン類のtrans-Chlordane以外の農薬において、母体血中の農薬濃度は臍帯血中の農薬濃度と比較し、有意に高い値を示した。また、母体血・臍帯血中のクロルデン類であるcis-Nonachlor、trans-Nonachlor、ヘキサクロロベンゼン（HCB）濃度とP1GFは有意な関係が認められた。これら結果より、農薬に対する胎盤のバリア機構は比較的強いと考えられたが、胎盤は母体の農薬曝露に対してP1GF産生を増加させる生物活性を有することが示唆された。通常、特発性の子宮内発育遅延症例では、P1GFとsFlt-1は変化がないか共に減少するとする報告が多い。しかしながら、今回の我々の研究結果から喫煙に伴うP1GFとsFlt-1の変化と同じように妊婦のPCBsや農薬曝露によって、胎盤においてP1GF産生亢進およびsFlt-1産生低下という特有の変化（プロファイル）を有する可能性があり化学物質曝露に関与する子宮内発育遅延発症の診断に臨床応用できることも期待される。
平成22年度、原子吸光法を用いた結果、妊娠末期の9症例中7例の母体・胎児試料において水銀が検出された。水銀においては母体血中よりも胎児血中で濃度が高く、世代間で濃縮傾向が認められた。カドミウムは母体試料で検出されたが、臍帯静脈血では検出されず、胎盤通過性の低さが確認された。鉛、ヒ素、農薬は、全ての生体試料において測定限界以下であった。ヒ素分析は、生体試料採取後（採血後）、4時間以内に検査に提出したが、検体不良による測定不能との結果が多く、採血から測定までのプロセスについて特に注意を要すると考えられた。水銀やカドミウムはin vivoでの測定が可能であり、実際の生体内レベルを知ることができ、in vitroにおける至適濃度としての指標となると考えられた。平成23年度、金属測定法をICP-Ms法に変更し、妊婦・胎児（臍帯血）9例（内1例は子宮内胎児死亡、1症例は重症妊娠悪阻のため人工妊娠中絶）の金属濃度ついて分析した。水銀においては母体血中よりも胎児血中で常に濃度が高く、やはり世代間で濃縮傾向があった。カドミウムも同様に母体試料で検出されたが、臍帯静脈血では検出されず、胎盤通過性の低さが確認された。今回測定した農薬や重金属濃度は全て基準値以下であった。しかしながら、in vivo或いはin vitro実験においてマンガン、鉛、ヒ素、カドミウムはアミノ酸輸送活性を減少させた。これらの結果は、過去の文献でヒ素や鉛曝露により子宮内胎児発育制限を発症するという報告に一致しておりその発症メカニズム解明に本研究成果は貢献している。

図(1)-16に過去の文献による重金属の実験に用いられた分析濃度、人体への曝露経路、健康リスクを示す。

金属元素	分析濃度	曝露源	健康リスク	参考文献
ヒ素	2-50uM	Contaminated drinking water, foods, mining, agriculture	Carcinogen, Neurotoxin, FGR	Dakeishi M et al. 2006 McCarty KM et al. 2011 Xu L et al. 2011
カドミウム	10-250uM	Agriculture, Dietary intake (rice, shellfish), Smoking	Carcinogen, Kidney, Bone dis-function	Ikeda M et al. 2004 Sikorski R et al. 1988 Satarug S et al. 2011
メチル水銀	0.2-5uM	Fish associated with industrial release to ocean; MeHg (fungicide)-treated grains, etc.	Developmental Neurotoxin	Murata K et al. 2007 Tohoku JEM Grandjean P et al. 2010 Env Health Prospectives
鉛	10-250uM	Wide variety occupational and environmental sources associated with combustion fuels, mining	FGR, Pregnancy Complications, Hypertension, Neurocognitive deficits	Vigeh M et al. 2011 Kosnett MJ et al. 2007

図（1）-16：重金属の人体への影響
in vitroにおいてヒ素は比較的低濃度より濃度依存性にアミノ酸輸送活性を低下させた。カドミウムは高濃度でのみアミノ酸輸送活性を低下させた。メチル水銀は変化させなかった。全ての金属元素は培養液中の乳酸脱水素酵素を増加させなかった。

図(1)-17に過去の文献によるアルデヒド類の実験に用いられた分析濃度、人体への曝露経路、健康リスクを示す。

アルデヒド類	分析濃度	曝露源	健康リスク	参考文献
グルタル アルデヒド	0.00001-0.001%	Medical occupation, Chemical production, General indoor air	Irritation, Allergy, Spontaneous abortion	Takigawa T and Endo Y 2006
ホルム アルデヒド	0.00001-0.001%	Internal combustion engine exhaust; Cigarettes; Furniture, carpet, fabric, and particle wall board; Metabolism of Ethanol, drugs and Xenobiotics.	Fetal neural-degeneration, carcinogenesis, skin and lung damage	O'Brien PJ et al. 2005 Nielson GD et al. 2010 Naya M and Nakanishi J 2005
アセト アルデヒド	0.00001-0.001%

図（1）-17：アルデヒド類の人体への影響

in vitroの実験においてグルタルアルデヒドは比較的低濃度より、濃度依存性にアミノ酸輸送活性を低下させ、ホルムアルデヒドは高濃度でのみアミノ酸輸送活性を低下させた。アセトアルデヒドは変化させなかった。全てのアルデヒド類は培養液中の乳酸脱水素酵素を増加させなかった。グルタルアルデヒドが最も強くアミノ酸輸送活性を低下させた。これらの結果は、過去の文献でのグルタルアルデヒドやホルムアルデヒド曝露による胎児毒性の報告に一致しておりその発症メカニズム解明に本研究成果は貢献している。
図(1)-18に過去の文献による樹脂原料の人体への曝露経路や濃度を示す。

樹脂原料	特徴および使用用途	分析濃度	曝露源	健康リスク	参考文献
トリレンジイシアネート	Highly reactive molecules used to generate large polymers	0.1-100uM	Urathane foams, Occupational TDI production or use	Allergy, Asthma, Hypersensitivity pneumonia, contact dermatitis.	Ogawa H, et al. 2006 Chiung YM, et al. 2009 Mori T, et al. 2012
フタル酸	Reactive organic molecule used in plastic production	0.1-100uM	Occupations associated with plastic production, recycling and waste processing.	Dermatitis, Allergen sensitizer	Mori T, et al. 2012 Pakarinen P, et al. 2002
メチルアクリレート	Small organic molecule used in polymer production	0.1-100uM	High volume chemicals used in producing coatings, building materials, furniture, prosthetics, cosmetics.	Contact dermatitis, Maternal and fetal toxicity observed in rats.	Saillenfait AM et al. 1999 Kanerva L, et al. 1996
アクリルアミド	Reactive, low molecular weight, vinyl compound. Used in construction, oil, paper manufacturing.	0.1-100uM	Found in cosmetics, water treatment and pesticide formulas. Produced with cooking at high temperatures. Found in sugar, potato, bread, snacks and coffee products, as well as cigarette smoke.	Carcinogen, neurotoxin, and reproductive toxin. In animals acrylamide led to decreased litter size and reduced pup weight.	Friedman M, et al. 2003 Exon JH, 2006

図（1）-18：樹脂原料の人体への影響

in vitroの実験においてトリレンジイソシアネート、無水フタル酸は比較的低濃度より、濃度依存性にアミノ酸輸送活性を低下させたが、メチルアクリレートは高濃度でのみアミノ酸輸送活性を低下させた。アクリルアミドは変化させなかった。全ての樹脂原料は培養液中の乳酸脱水素酵素を増加させなかった。過去の文献ではトリレンジイソシアネートやフタル酸の生殖毒性の報告はあまりないため、本研究成果はこれらの化学物質の胎児毒性に関する新たな知見提供に貢献している。

これらの結果からアルデヒド類ではグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、金属元素ではヒ素、カドミウム、樹脂原料ではトリレンジイソシアネート、無水フタル酸、メチルアクリレートはアミノ酸輸送活性を低下させ、胎児発育を修飾する環境化学物質として重要であると考えられた。カドミウムは胎盤通過性が低く、直接胎児に到達しなくても、高濃度では胎盤機能を修飾し間接的に胎児発育を制限する可能性が示唆された。樹脂は近代社会では一般的に多用され胎児発育を修飾する環境化学物質として重要であると考えられた。胎盤絨毛を18時間グルタルアルデヒドに曝露したが、アミノ酸輸送蛋白（L型、B°型）、糖輸送蛋白（SNAT2）の発現（分子構造）に変化は認められずこれらの環境化学物質が糖・アミノ酸輸送蛋白の分子構造の変化をしたり発現を抑制したりしている可能性は否定的であった。これらの環境化学物質によるアミノ酸輸送機能を修飾するメカニズムについてはさらなる検討が必要である。

また、妊娠中も職業に従事している妊娠群では、非有職者群に比較して胎盤重量と単位胎盤当りの栄養膜細胞容積が減少傾向であった。両群間に胎盤低酸素の指標である胎盤増殖因子PlGF(Placental Growth Factor)、可溶性血管内皮増殖因子タイプ1
sFlt-1(Soluble-VEGF-Receptor1)の差はなく、胎盤への母体血供給不足は有職者妊婦における胎盤機能障害の要因として否定的であり、労働環境に胎盤機能を修飾する因子が存在する可能性が示唆されさらなる検討が必要と考えられた。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

子宮内胎児発育遅延児では正常児に比べ周産期死亡率は8倍に上り、さらに精神経発達障害、小児の肥満、耐糖能異常、脂質代謝異常、また成人後の心血管疾患や糖尿病発症のリスク因子を有する。胎盤は母体胎児間の物質交換を担い、正常な胎児発育・発達は胎盤の栄養素輸送に大きく依存している。

本研究の成果により①PCB s は低濃度曝露でも胎盤の栄養素輸送機能を担う合胞体栄養膜細胞数を減少させ胎盤機能を修飾し非常に高い生物活性を有し胎児毒性があり危険であること。また、喫煙時のようにPCB s 曝露に対する胎盤産生蛋白（Placental growth factor, sFlt-1）の修飾には特有のプロファイルが存在すること。②農薬に対して胎盤のバリア機構は比較的強いと考えられたが、クロルデン類であるcis-Nonachlor、trans-Nonachlor、ヘキサクロロベンゼン（HCB）濃度とP1GFは有意な関係が認められ、胎盤はこれらの農薬曝露に対してP1GF産生を増加させる生物活性を有することが示唆された。③多種多様な環境化学物質のなかでアルデヒド類、重金属、プラスチック樹脂が胎盤アミノ酸輸送機能を低下させることが判明した。

環境化学物質は、胎盤栄養素輸送活性を修飾することにより、胎盤通過性がなくとも間接的に胎児毒性を生じることが示された。また、労働環境には、胎盤機能を修飾する因子が存在することが示唆された。本研究の成果により胎盤の栄養素輸送障害を引き起こすような環境化学物質が抽出されたため、生殖期・妊娠女性への曝露を軽減し、子宮内胎児発育遅延を減少させることが期待される。その結果、周産期死亡率のさらなる減少による社会貢献、また生活習慣病減少による医療経済への多大な貢献も期待される。さらに、エコチル調査では、児の身体発達、先天異常、性分化の異常、精神神経発達障害、免疫アレルギー系の異常、代謝・内分泌系異常の有無を出生時から12歳まで追跡調査する。本研究により、胎児期の栄養素の獲得障害（胎盤栄養素輸送障害）と前述した胎児・小児期に起こる疾患との因果関係についても明らかになる可能性がある。本研究の成果は、これらの疾患の早期発見・早期治療に貢献することも期待される。

## (2) 環境政策への貢献

妊娠女性の鉛、水銀、ヒ素などの金属や有機塩素系農薬、有機リン系農薬、PCBsなどの環境由来化学物質への曝露と新生児出生体重の減少については、その関連性が疫学的調査により示唆されている。しかしながら、これらの環境由来化学物質がどのように子宮内でヒト胎児発育を制限するのかについては未解決である。さらに、どのようなレベルの曝露が危険であるのかについてはほとんどデータがないのが現状である。

本研究により、多種多様な金属、農薬、ダイオキシン類のような環境由来化学物質の中の一体ど
のような物質が生物活性を有して胎盤機能栄養素輸送障害を介して胎児発育制限を起こし得るのかin vivo或いはin vitro実験において抽出することができた。また、どのようなレベル（濃度）でその悪影響が発現するのかin vivo或いはin vitroで予測することができる。その結果、母体が過剰に曝露されると胎盤の栄養素輸送活性を障害することによって胎児発育を制限する環境化学物質を特定することができる。得られたデータは生殖年齢の女性における環境化学物質の許容摂取基準の作成に貢献すると思われ、周産期医療においても適切なリスク管理体制を構築できると期待される。

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

①PCB s は低濃度曝露でも胎盤の栄養素輸送機能を担う合胞体栄養膜細胞数を減少させ胎盤機能を修飾し非常に高い生物活性を有し胎児毒性があり危険であること。

⇒行政は胎児健常性を守るため、妊娠のPCB s 曝露を最小限にすることを産科婦人科学会などを通じて国民に知らせることが必要であるかもしれない。

②喫煙時のようにPCB s 曝露に対する胎盤産生蛋白（Placental growth factor, sFlt-1）の修飾には特有のプロファイルが存在すること。

⇒行政は特発性胎児発育制限が化学物質で惹起される場合、胎盤産生蛋白（Placental growth factor, sFlt-1）の特有のプロファイルが存在し、内因性の原因による胎児発育制限との区別に活用できる可能性がある。

③多種多様な環境化学物質のなかでアルデヒド類、重金属、樹脂原料が胎盤アミノ酸輸送機能を低下させることが判明した。

⇒行政はアルデヒド類ではグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、金属元素ではヒ素、カドミウム、樹脂原料ではトリレンジイソシアネート、無水フタル酸、メチルアクリレートはアミノ酸輸送活性を低下させ、胎児発育を修飾する可能性が存在することに留意すべきであると思われた。

## 6 ．国際共同研究等の状況

定量的胎盤栄養素輸送活性の実験系は世界的に行える施設が少なく、研究代表者は平成15年7月一平成17年7月：米国ピッツバーグ大学、Magee-Womens Research Instituteに博士研究員として勤務中「培養小絨毛片を用いた定量的糖・アミノ酸輸送の実験手技」について学んだ。同研究所のJames M. Roberts博士とCarl A. Hubel博士は妊娠高血压症候群、子宮内胎児発育遅延、妊娠・胎盤生理学の世界的第一人者で、研究代表者は本研究課題遂行のため多くのアドバイスを彼らから得ることができる。申請者は、現在も「環境化学物質と胎児発育制限」、「妊娠高血圧症候群における子宮内胎児発育制限のメカニズムの検討」の共同研究を行っている。平成25年3月16日～平成25年3月22日：Magee womens research institute, Department of Obstetrics and Gynecology, University of Pittsburghを訪問し、環境化学物質の胎盤栄養素輸送機能障害について講演を行い質疑・応答を行った。また子宮内胎児発育不全、妊娠高血圧症候群、妊娠糖尿病における胎盤アミノ酸輸送機能障害についての講演を行い質疑・応答を行った。3名の有識者と上記内容に関し
て個別にディスカッションしフィードバックを得た。今後、環境化学物資がどうのように胎盤栄養素輸送機能を修飾するのか彼らとの継続的な共同研究を行い解明して行く。

最も研究協力関係にあるCarl A Hubel博士の所属について下に記す。

Carl A. Hubel, PhD
Associate Professor
Magee-Womens Research Institute;
Dept. Obstetrics, Gynecology & Reproductive Sciences,
University of Pittsburgh School Of Medicine;
Dept. Environmental and Occupational Health, University of Pittsburgh
Graduate School of Public Health
hubelca@upmc.edu | Tel: 412-641-6130 | Fax: 412-641-1503

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) Mayumi Tsuji; Yukiyo Aiko; David J Askew; Toshiro Kawamoto; Tohru Hachisuka; Chihaya Kooriyama; Mai Myoga; Chiharu Tomonaga; Fumio Matsumura; Ayumi Anan; Masayuki Tanaka; Hsu-Sheng Yu; Yasuko Fujisawa; Reiko Suga; Eiji Shibata, PLACENTA 2013 In press "Polychlorinated Biphenyls (PCBs) decrease the Placental Syncytiotrophoblast Volume and increase Placental Growth Factor (PlGF) in the placenta of normal pregnancy"

## く査読付論文に準ずる成果発表＞（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可。）

特に記載すべき事項はない

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) Eiji Shibata, Toshihiro Kawamoto, Yukiyo Aiko, David J Askew, Rei Suga, Mai Myoga, Toru Hachisuga: The official Journal of the Society for Gynecologic Investigation, vol. 19, no. 3 (supplement), 380A, March (2012)
-Investigation for the Effect of the Environmental Contaminants Exposure on the Placental Amino Acid Transport Activity-

## （2） 口頭発表（学会等）

1）愛甲悠希代、柴田英治、David J. Askew、蜂須賀徹、菅礼子、阿南あゆみ、田中政幸、辻真弓、川本俊弘：日本産業衛生学会九州地方会（2011）

「妊娠中の労働が胎盤機能に与える影響の検討」

「妊娠中の母体の体重変化と胎盤栄養素輸送機能についての検討」

2) Eiji Shibata, Toshihiro Kawamoto, Yukiyo Aiko, David J Askew, Rei Suga, Mai Myoga,
Toru Hachisuga: 59 $ ^{th} $ Annual Meeting Society for Gynecologic Investigation, March (2012)

-Investigation for the Effect of the Environmental Contaminants Exposure on the Placental Amino Acid Transport Activity-

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

特に記載すべき事項はない
# (2) 胎盤のアミノ酸・糖輸送活性および低酸素障害に関する研究

産業医科大学医学部

$$ 柴田英治 \cdot 蜂須賀 \ 徹 $$

平成22(開始年度)～24年度累計予算額：19,031千円（一括使用）

（うち、平成24年度予算額：4,838千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

エコチル調査「パイロット調査」55症例の妊娠・分娩・胎盤基本情報、胎盤低酸素指標、分子生物学的胎盤機能（栄養素輸送）データを得た。ヘマトキシレン・エオジン(H.E.)染色の画像解析による胎盤栄養膜細胞容積の定量は可能であり、胎盤機能を反映する因子として重要であると考えられた。ラパマイシンの哺乳類標的：Mammalian target of rapamycin(mTOR)シグナリングは、環境化学物質などのストレスに反応する因子と考えられ、胎盤におけるmTOR定量とその活性化について分析した。

妊娠高血压症候群および子宮内胎児発育遅延の胎盤では胎児低栄養に適応し、合胞体栄養膜細胞においてアミノ酸輸送蛋白およびmTORシグナリング発現が亢進していることが示唆された。胎盤にはストレス（環境化学物質・低酸素・低栄養など）に反応し、mTORシグナリング修飾を介してアミノ酸輸送蛋白発現などのレギュレーションを行い、胎児栄養障害に適応するメカニズムが存在することが示唆された。化学物質による胎児発育制限のメカニズムを解明する上で交絡因子となる疾患における栄養素輸送機能の修飾機構の一部が解明された。

[キーワード] 子宮内胎児発育遅延、妊娠高血圧症候群、妊娠糖尿病、胎盤栄養素輸送、アミノ酸輸送、mTOR

### 1. はじめに

近年、病的に胎児発育が制限されている子宮内胎児発育遅延児は、将来様々な疾患（先天性奇形・周産期死亡率の上昇・胎児機能不全・学習障害・多動・注意欠陥障害・神経学的異常・生活習慣病）の有病率が高いことが報告されている $ ^{1} $ 。胎児期に低栄養にさらされた児は子宮内発育遅延ばかりか、将来の生活習慣病のリスクにもさらされていると考えられている。子宮内胎児発育遅延は、胎盤機能障害（栄養素輸送障害）が主病態と考えられており、環境化学物質が与える胎児・小児疾患を論じる場合、総合的な胎盤機能評価が極めて重要であり、本研究は、我が国の「エコチル調査」においても重要な役割を果たすと考えられる。

胎児発育を病的に制限する疾患である子宮内胎児発育遅延や妊娠高血圧症候群の基本病態は、母体から胎盤へ供給される血液循環不全（子宮螺旋動脈再構築障害）である。この循環不全に伴う胎盤低酸素障害は、胎児発育を制限する因子として重要である。そこで我々は、胎盤低酸素に反応して変化する胎盤増殖因子：PIGF(Placental Growth Factor)や可溶性血管内皮増殖因子タイプ1：sFlt-1(Soluble-VEGF-Receptor1)の発現について検討し、環境化学物質が胎盤低酸素に起因しない胎児発育制限メカニズムを有するか否か検討することとした。
また近年、化学物質や低酸素などの環境ストレスに反応して細胞内におけるタンパク合成を修飾するmTOR（mammalian target of rapamycin 哺乳類ラバマイシン標的蛋白質）シグナリングが注目されている $ ^{2)} $ $ ^{3)} $ 。さらに胎盤におけるmTORシグナリングは、胎児発育にも関与していることが報告されている $ ^{4)} $ $ ^{5)} $ 。

図(2)-1に環境化学物質曝露による胎盤の生物反応を示す。図のように母体循環（maternal circulation）から胎盤に到達した化学物質は合胞体栄養膜細胞のmTORC1シグナル活性化を活性化を介して栄養素輸送体発現のコントロールを行い胎児発育を制御していることが示唆されている。

図（2）－1 化学物質曝露による胎盤合胞体栄養膜細胞の反応

環境化学物質が胎盤のmTORシグナルに与える影響を明らかにするため、正常妊娠と胎児発育が病的に変化している疾患群（子宮内胎児発育遅延、妊娠高血圧症候群、妊娠糖尿病）の胎盤におけるmTORシグナル発現について検討した。

### 2. 研究開発目的

子宮内胎児発育制限は、先天奇形、学習障害、多動、注意欠陥障害、神経疾患、将来の生活習慣病などのリスク因子であり、エコチル調査のアウトカムそのものに一致するものが多い。子宮内発育遅延の基本病態は胎盤機能障害（栄養素輸送障害）であり、エコチル調査本調査においても胎盤機能評価を行うことは重要であると考えられる。今回、エコチル調査「パイロット調査」55症例の妊娠・分娩・胎盤基本情報、胎盤低酸素指標、分子生物学的胎盤機能（栄養素輸送）データを取得・蓄積し、「エコチル調査」パイロット調査において測定される母体が曝露を受けた環境化学物質濃度との間に相関性について検討することを目的とした。さらに、胎盤低酸素に反
応して変化する胎盤蛋白であるPlGF(Placental Growth Factor)、

sFlt-1(Soluble-VEGF-Receptor-1)の発現について検討し、環境化学物質が胎盤低酸素に起因しない胎児発育制限メカニズムを有するか否か検討することとした。

また、胎児発育に胎盤のmTORシグナルやアミノ酸輸送蛋白がどのように関与しているのか詳細に知るため、正常妊娠と胎児発育が病的に変化している疾患群（子宮内胎児発育遅延、妊娠高血圧症候群、妊娠糖尿病）の胎盤におけるmTORシグナルとアミノ酸輸送蛋白の発現を比較検討した。

## 3 ．研究開発方法

## (1) 胎盤採取・保存・基本データ管理・胎盤形態学的分析

エコチル調査「パイロット調査」において分娩となった55症例の胎盤の試料採取及び形態学的検討を行った。

## 1 ）試料採取・保存方法

a. 妊娠・分娩・胎盤の基礎データ取得【母体年齢、分娩週数、分娩方法、出生児体重、妊娠週数で補正された出生体重パーセンタイル値、胎盤重量、胎盤体積（面積、厚み）、臍帯付着部位など】

b．分娩後、直ちに採取し液体窒素で凍結した胎盤組織2つ（3×3×3cm）を-70℃で保存。

c．ホルマリン固定した胎盤片 {胎盤組織2つ（3×3×3cm）} 及びそのパラフィン包埋（薄切切片作成）。

2）胎盤のヘマトキシリン・エオジン（H.E.）染色標本の画像解析による形態学的分析（n=55）。検討項目は以下である。

a. 合胞体栄養膜細胞（Syncytiotrophoblast）の定量化：胎盤栄養素輸送を担う栄養膜細胞層容積の分析

b. 胎盤血栓・梗塞範囲の定量化

c. 胎盤絨毛間腔（胎盤内の母体血流スペース）の定量化（添付資料4参照）

d. 末梢絨毛の発達度の評価

e. 絨毛膜羊膜炎の有無

f. 螺旋動脈再構築障害の評価

## （２）胎盤におけるMammalian target of rapamycin（mTOR）シグナリングおよびアミノ酸輸送蛋白発現の検討（n＝55）

エコチル調査「パイロット調査」において分娩となった55症例の胎盤のL型アミノ酸輸送蛋白（4F2hc、LAT1）、B°型アミノ酸輸送蛋白（ASCT2）、およびmTORングナリング（mTOR、p-70 S6K、リン酸化-p-70 S6K：mTORングナル活性化）の胎盤における発現の程度をWestern blot法で分析した。また、妊娠における基本データとmTORングナリングの相関について分析した。

（3）胎盤におけるPlGF(Placental Growth Factor)、sFlt-1(Soluble-VEGF-Receptor 1)の発現の検討（n=55）

胎盤低酸素の指標として、胎盤中の胎盤産生蛋白であるPlGF、sFlt-1の発現を、エコチル調査「パイロット調査」において分娩となった55症例についてELISA法（R&D systems）で測定定量し
た。胎盤におけるPlGFやsFlt-1は、胎盤より抽出された胎盤総蛋白1mg当りに含まれる蛋白量（pg/mg）として算出した。

## （４）正常・妊娠高血圧症候群（PE）・子宮内胎児発育遅延（IUGR）・妊娠糖尿病/糖尿病合併妊娠（GDM/DM）胎盤におけるmTORシグナリング、アミノ酸輸送蛋白発現、および画像解析による病理学的検討の検討

胎盤機能障害に基づき胎児発育が制限されている子宮内胎児発育遅延(IUGR)や妊娠高血圧症候群(PIH)、また逆に胎児発育が異常に更新した妊娠糖尿病（GDM/DM）の胎盤におけるmTORシグナリングについて分析した。アミノ酸輸送蛋白の胎盤における発現についてはIUGRとの関連が深いL型アミノ酸輸送蛋白（4F2hc、LAT1）およびB°型アミノ酸輸送蛋白（ASCT2）について免疫組織学的に分析し比較検討した。また正常群と疾患群における画像解析による胎盤の病理学的解析を行った。妊娠末期に分娩に至った正常胎盤（10例）、PIH胎盤（10例）、IUGR胎盤（10例）、GDM/DM胎盤（10例）を研究対象とした。

## （５）エコチル調査本調査における総合的胎盤栄養素輸送機能機能評価

平成24年度より北九州市八幡西区においてエコチル調査本調査でリクルートされた参加者（約600例：詳細調査対象者は約30人の見込み）の胎盤絨毛のアミノ酸輸送活性などの胎盤総合的栄養素輸送機能評価を行いそのデータを蓄積する。今後本調査のデータ固定がなされ妊娠・分娩時の臨床データや小児疾患との関連性を解析する。

## 4 ．結果及び考察

（1）胎盤採取・保存・基本データ管理・胎盤形態学的分析・職業歴・分子生物学的分析の完遂

1） 妊娠・分娩・胎盤の基礎データ取得（母体年齢、分娩週数、分娩方法、出生児体重、妊娠週数で補正されたBirthweight Centile、胎盤重量、胎盤体積（面積、厚み）、臍帯付着部位など

2） 胎盤の病理学的（画像解析による形態学的分析：ヘマトキシリン・エオジン（H.E.）染色）

検討（n=55）。検討項目における考察・問題点を下に記す。

### a. 合胞体胎盤栄養膜細胞の定量化

胎盤栄養素輸送を担う合胞体栄養膜細胞数の評価は胎盤機能評価において重要であり、今回行った手法により実行可能である。

### b. 胎盤血栓・梗塞範囲の定量化

胎盤の無機能部位である血栓・梗塞巣範囲の定量化は胎盤機能評価において重要であり、今回行った手法により実行可能である。

### c. 絨毛間腔（胎盤内の母体血流スペース）の定量化

胎盤の母体血流スペースの定量化は胎盤機能や発達の評価に有用であり、今回行った手法により実行可能である。

### d. 末梢絨毛の発達度の評価

主観評価となる傾向にあり、評価法を再検討する必要がある。

### e. 絨毛膜羊膜炎の有無

胎盤の感染は妊娠予後や胎盤機能を修飾する因子として重要であり評価は重要である。今回の
胎盤生検では胎盤胎児面の欠損が目立ち、絨毛膜羊膜炎の評価困難な症例が多かった。今後、①胎盤生検においては胎児面も確実に行うこと、②パラフィン切片でも確実に胎盤母体面から胎児面を切り出す必要性があることが認識された。

### f. 螺旋動脈再構築障害の評価

胎盤母体面上り評価することは困（子宮壁のPlacental bet biopsyが妥当）であり、子宮内胎盤着床部の生検が必要である。本研究の検討項目からは除外する必要があった。

## （２）胎盤におけるMammalian target of rapamycin（mTOR）シグナリングおよびアミノ酸輸送蛋白発現の検討

エコチル調査「パイロット調査」において分娩となった55症例の胎盤のsystemAおよびLアミノ酸輸送蛋白（ASCT2、4F2hc）、およびmTORシグナリング（mTOR蛋白およびmTOR活性化シグナリング）であるp-70 S6Kとリン酸化-p-70 S6Kの発現の程度をWestern blot法で分析した。胎盤においてアミノ酸輸送蛋白（ASCT2、4F2hc）は、検出・定量された。またmTOR蛋白およびmTORターゲットであるp-70 S6Kとリン酸化-p-70 S6Kも検出・定量された。胎盤におけるmTORシグナリング活性化が確認された。データは同一実験におけるβ-アクチン量との比で算出した。胎盤におけるアミノ酸輸送蛋白（4F2hc）とmTORシグナリング系には正の相関性があった（図(2)-2）。

相関係数0.512 P<0.001

相関係数0.612 P<0.001

図（2）－2：胎盤におけるアミノ酸輸送蛋白発現とmTORシグナルの相関性
また、妊娠中の体重増加が多いほど胎盤重量は重くなり、それに従い胎盤1つあたりの合胞体栄養膜細胞容積は大きくなる傾向にあったが、単位胎盤あたりのL型アミノ酸輸送蛋白の発現は低い傾向にあった（図(2)-3,4）。

◆正常分娩55症例について、妊娠期間中の体重増加の程度により3群に分類。

a群:プラス0～4.9kg(12人)/b群:プラス5～9.9kg(29人)/c群:プラス10kg以上(13人)【解析方法】ANOVA with post hoc(Fisher's PLSD)

母体·新生见基本情報

a群(n=12)	b群(n=29)	c群(n=13)
年龄	31.7±4.4	30.3±4.7	30.1±4.6
非妊娠时体重(kg)	61.2±7.7	54.8±8.0	57.6±9.0
分娩时体重(kg)	62.7±7.4	62.2±8.0	71.2±8.8 $ ^{*} $
分娩次数	39w1d±1.7	39w5d±0.9	40w2d±1.5
出生体重(g)	2,950±833	2,967±338	3,282±352 $ ^{*} $
出生体重(centile)	18.8±15.4	20.3±16.1	30.4±24
分娩方法(帝王切開)	0/12(0%)	1/29(3%)	3/13(23%)

※1例は欠測値のため、除外

・ 妊娠中の母体体重増加が大きいほど、胎盤重量、児の出生体重が重くなる傾向にあった。

図（2）－3：母体の体重変化が胎児胎盤機能に与える影響 1

②合胞体栄養膜細胞容積の比較(画像解析)

③アミノ酸輸送蛋白の発現の検討(4F2hc)

合胞体栄養膜細胞容積は母体体重増加が大きい群において、平均値が最大となった。

L型アミノ酸輸送蛋白は、母体体重増加が不良な程、高発現する傾向にあった。

妊娠中の母体体重増加によって胎盤機能が修飾され、児の出生体重が変化することが示唆された。

妊娠中に適切な体重管理を行うことが、母児の健康において重要であると考えられた。

図（2）－4：母体の体重変化が胎児胎盤機能に与える影響
## （３）胎盤におけるPIGF(Placental Growth Factor)、sFlt-1(Soluble-VEGF-Receptor １)の発現の検討

胎盤低酸素の指標として、胎盤中の胎盤産生蛋白であるP1GF、sFlt-1の発現を、エコチル調査「パイロット調査」において分娩となった55症例についてELISA法で測定定量した。胎盤におけるP1GFやsFlt-1は、胎盤のホモジェネートより抽出された総蛋白1mg当りに含まれる蛋白量（pg/mg）として算出した。胎盤における単位蛋白あたりのP1GFは172±53（pg/mg）、sFlt-1は7836±3177（pg/mg）：mean±S.D.であり過去の報告に述べられている正常妊娠における測定結果と一致していた。

## （4） 正常・妊娠高血压症候群（PIH）・子宫内胎児発育遅延（IUGR）・巨大児を伴う糖尿病合併妊娠・妊娠糖尿病（GDM/DM）の胎盤におけるMammalian target of rapamycin（mTOR）シグナリング、アミノ酸輸送蛋白発現および画像解析による胎盤の病理学的検討

近年、胎盤におけるmTORシグナリングが胎児発育に深く関与していることが報告されている $ ^{4)} $ 。我々は、胎盤機能障害に基づき胎児発育が制限されている子宮内胎児発育不全(IUGR)や妊娠高血压症候群(PIH)、また逆に胎児発育が異常に更新した妊娠糖尿病の胎盤におけるmTORシグナリングについて分析した。アミノ酸輸送蛋白の胎盤における発現についてはIUGRとの関連が深いL型アミノ酸輸送蛋白（4F2hc、LAT1）およびB°型アミノ酸輸送蛋白（ASCT2）について免疫組織学的に分析し比較検討した。妊娠末期に分娩に至った正常胎盤（10例）、PIH胎盤（10例）、IUGR胎盤（10例）、GDM/DM（10例）を研究対象とした。

1）正常群とPE群およびIUGR群との比較（図(2)-5に研究対象を示す）

Normal(n=10)	PIH(n=10)	IUGR(n=10)
Maternal age	31.0±6.4	34.0±4.3	31.6±6.0
Maternal BMI(kg/m2)	21.3±6.6	23.8±5.0	17.8±1.2
Percent nulliparous	70	30	70
Blood pressure at delivery(mmHg)
Systolic(mmHg)	121±9	162±19	122±24
Diastolic(mmHg)	73±9	97±10	77±22
Blood pressure <20weeks GA
Systolic(mmHg)	118±7	141±11	105±21
Diastolic(mmHg)	77±11	87±6	64±12
Gestational weeks at delivery	39.2±1.5	33.6±2.0	34.5±3.1
Birth weight(g)	2835±435	1446±333	1465±335
Birth weight centile	28.0±18.5	8.3±5.17	5.4±5.1
Placental weight(g)	558±141	348±91	332±82
Smoking(%)	0	0	10
Route of delivery(C/S/total)	90	80	60

図（2）-5：対象：母体・新生児情報
正常および症例胎盤においてL型アミノ酸輸送蛋白である4F2hcは合胞体栄養膜細胞の核及び細胞質に局在していた。正常および症例胎盤においてL型アミノ酸輸送蛋白であるLAT1は合胞体栄養膜細胞の細胞質に局在していた。正常および症例胎盤においてB°型アミノ酸輸送蛋白であるASCT2は合胞体栄養膜細胞の基底膜に局在していた。L型アミノ酸輸送蛋白（4F2hc、LAT1）およびB°型アミノ酸輸送蛋白（ASCT2）は正常胎盤に比較してPIH、IUGR、GDM/DMの胎盤において発現の程度が強い傾向にあった。mTORシグナル蛋白も同様の傾向を認めた。合胞体栄養膜細胞数は正常群と疾患群において有意差を認めなかったが、出血・壊死などの無機能領域はPE、IUGRで広い傾向があった（結果を図(2)-6～(2)-10に示す）。

L型アミノ酸輸送蛋白4F2hc(heavy chain)

図（2）－6：胎盤における4F2hcの発現と局在
L型アミノ酸輸送蛋白LAT1(light chain)
Normal
PE	IUGR	200 μm

図（2）－7：胎盤におけるLAT1の発現と局在
B°型アミノ酸輸送蛋白ASCT2
Normal
PE	IUGR	200 μm

図（2）－８：胎盤におけるASCT2の発現と局在
$ ^{*} $ P<0.05 by ANOVA (N=10)

図（2）－9：PIHとIUGRにおけるアミノ酸輸送蛋白・mTORの発現の定量化

図（2）－10：画像解析による胎盤組織分析
2）正常群とDM/GDM群との比較（図(2)-11に研究対象を示す）

GDM/DM群(n=10)	正常群(n=10)
母体年龄	32.6±6.3	31.0±6.4
非妊娠时BMI	27.0±4.3 $ ^{*} $	21.0±6.6
非妊娠时体重(kg)	68.6±12.6 $ ^{*} $	51.0±14
分娩时体重(kg)	76.0±12 $ ^{*} $	61.0±10
妊娠中の体重增加量(kg)	8.2±4.7	10.0±5.0
分娩週数(週数±日)	37.6±1.4	39.2±1.5
児の出生体重(g)	3039±486	2835±435
出生体重(SD換算)	+0.5±1.2	-0.5±0.84
胎盤重量(g)	621±125	558±141
分娩方法(帝王切開数/total)	2/10(20%)	9/10(90%)
インスリン治療あり	6/10(60%)	(一)
初診時のHbA1c(%)	6.3±1.1
分娩時のHbA1c(%)	5.5±0.3

図（2）-11:母体・新生児情報

正常および症例胎盤においてL型アミノ酸輸送蛋白である4F2hcは合胞体栄養膜細胞の核及び細胞質に局在していた。正常および症例胎盤においてB°型アミノ酸輸送蛋白であるASCT2は合胞体栄養膜細胞の基底膜に局在していた。L型アミノ酸輸送蛋白（4F2hc、LAT1）およびB°型アミノ酸輸送蛋白（ASCT2）は正常胎盤に比較してPE、IUGR、GDM/DMの胎盤において発現の程度が強い傾向にあった。mTORシグナル蛋白も同様の傾向を認めた。合胞体栄養膜細胞数は正常群と疾患群において有意差を認めなかった（結果を図(2)-12～(2)-16に示す）。

図（2）－１２：胎盤における4F2hcの発現と局在
図（2）－１３：胎盤におけるASCT2の発現と局在

Negative control

GDM/DM

Cytokeratin7

図（2）－１４：胎盤におけるｍＴＯＲの発現と局在
図（２）－１５：４F2hc, ASCT2, mTORの発現の定量化

図（2）-16：合胞体栄養膜細胞数