Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
クラスターNo.	精11-2/精10-8	精12-2/精10-8	精13-4/精10-8	遺伝子数
①	down	down	92
②	up	up	up	785
③	up	up	201
④	down	down	down	109
⑤	up	up	174
⑥	up	down	down	365

図(3)－30 クラスター解析結果

### c. マイクロアレイのまとめ

マイクロアレイ解析の結果、精巣のエイコサノイド合成に関与するPla2g2aでは中濃度曝露群で増加、高濃度曝露群と除粒子曝露群では減少が見られた。また、Ptgs、Alox15、Ptgis、Tgm2、Ptgs1では中濃度曝露群で増加、Ptgs2では中濃度曝露群と除粒子曝露群で増加が見られた。

精巣のPG合成・制御に関与するS100a10で中濃度曝露群で増加、Pla2g4aでは中濃度曝露群で増加、S100a6では中濃度曝露群での増加と高濃度曝露群での減少が見られた。

また、Anxa1、Ptger3では中濃度曝露群で増加が見られた。

## （9） 全体のまとめと考察

## 1 ）雄マウスの8週間曝露

体重および臓器重量（肝臓、脾臓、腎臓、副腎）については、コントロール群と各曝露群との間で有意な差は認められなかった。血清中のホルモンについては、プロジェステロン、コルチコステロンは、いずれもコントロール群と曝露群との間で有意な差は認められなかった。ペントバルビタール麻酔下での採血がマウスにストレス様刺激（図(3)－31）を与え、すべての群で血中コルチコステロンとプロジェステロン濃度が上昇し、各群間の基底レベルの比較が困難であったものと推察される。

副腎細胞からのコルチコステロンとプロジェステロン分泌量は、全体的な傾向として中濃度曝露群で上昇した。この結果より、NRDEには中濃度で副腎機能を促進することが推察される。しかし、高濃度曝露群と除粒子曝露群ではいずれの群のACTH添加でもこれらのホルモンの分泌量が低下したことから、高濃度のディーゼル排気には、粒子の存在にかかわらずガス成分に副腎皮質機能を抑制する効果があるものと推察される。以前の我々の研究から、ディーゼル排気中から単離したニトロフェノール類に副腎機能を強く抑制する作用があることから $ ^{8,6} $ 、ディーゼル排気のガス成分中に含有するニトロフェノール等の化学物質が副腎機能を抑制した可能性が示唆された。
図(3)－31 ストレス負荷時における生体の内分泌変化。CRF：副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ACTH：副腎皮質刺激ホルモン、LH-RH：性腺刺激ホルモン放出ホルモン、LH：黄体形成ホルモン、FSH：卵胞刺激ホルモン

精巣重量や副生殖腺（精巣上体、前立腺、精のう腺）重量については、コントロール群と各曝露群との間では有意な差が認められず、精子数についても同様の結果であった。

血中ホルモン濃度については、主として精巣から分泌されるテストステロン、下垂体前葉から分泌されるFSHとLH、副腎から分泌されるコルチコステロンとプロジェステロン濃度にもコントロール群と各曝露群との間で有意差は認められなかった。本研究では、マウスをペントバルビタール麻酔下で採血した後に臓器を摘出していることから一定のストレスがかかっていると推察されるが、血中コルチコステロン濃度の結果から、そのストレスの程度は各群間で差は無いものと解釈された。

精巣のライディヒ細胞からのテストステロンの基礎分泌量は、コントロール群と比較して高濃度曝露群では高く、除粒子曝露群では低い結果となった。hCGの刺激に対する反応性については、中濃度曝露群で $ hCG10^{-1} $ モルの投与によりコントロール群よりもテストステロン分泌量が多く、hCGに対する反応後の上昇が認められた。一方、除粒子曝露群では、hCGの刺激に対してはテストステロン分泌反応性は、コントロール群に比較して著しく低く、基礎分泌においても著しく低いことから、テストステロン分泌が著しく抑制されているものと推察された。

下垂体前薬細胞の培養結果については、LHの基礎分泌量には、コントロール群と各曝露群で差は認められないが、GnRH $ 10^{-7} $ モル投与群でいずれの曝露群でもコントロール群よりもLH分泌量が有意に高く、反応性は増加したと解釈された。除粒子曝露群においても反応性の低下は認められず、精巣ライディヒ細胞と対照的な結果であった。

平成21年度に行った副腎細胞の培養結果では除粒子曝露群において、コルチコステロンとプロ
ジェステロン分泌が著しく抑制される結果となったことから、本年度の精巣ライディヒ細胞の結果と類似した結果であった。前年度と本年度の結果を統合して考察するとナノ粒子の曝露濃度により差はあるが、ステロイドホルモン分泌細胞においては、低濃度で促進、高濃度で抑制し、除粒子曝露は著しく抑制作用を有すると解釈された。一方、蛋白ホルモンを分泌する下垂体前葉細胞では、除粒子曝露により分泌抑制は認められないことから、ガス成分には、ステロイドホルモン分泌細胞と蛋白質分泌細胞で明らかに異なった作用があるものと解釈された。

今回曝露実験に用いたガス成分については、現時点においては明らかでは無いが、これまでの研究でガス成分中にニトロフェノール類の含有が確認されている。また、ニトロフェノール類には、ステロイドホルモンの分泌抑制作用や肝臓機能を抑制する作用が認められていることから、ガス成分の中でニトロフェノール類が有力な候補成分の一つと推察される $ ^{1-22)} $ 。

図(3)－32に各種ホルモン分泌と代謝調節に関する模式図を示した。視床下部で神経分泌されたペプチドホルモン(GnRHや副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH))が下垂体門脈を通って下垂体前葉に到達しそれぞれの分泌細胞から蛋白質あるいは糖蛋白ホルモンの分泌を刺激し、これらの刺激ホルモンが精巣や副腎に作用してステロイドホルモンの分泌を刺激する。分泌されたステロイドホルモンは、各臓器で作用した後、肝臓で最終的に代謝され尿や糞中に排泄される。

今回のナノ粒子曝露のマウスから得られた結果を考察すると、次のような仮説が提唱される。

「ナノ粒子の全身曝露により視床下部・下垂体前薬系の機能に抑制作用はないが、精巣のライディヒ細胞からのテストステロン分泌が著しく抑制される。しかし、血中テストステロン濃度には差がないことから、ナノ粒子が肝臓でのステロイドホルモンの代謝機能を低下させ、結果としてテストステロンが血中に長期間残存したものと推察される。

7週齢の雄マウスを8週間ディーゼル排気ナノ粒子に曝露すると、高濃度曝露群において、(1)血中テストステロン濃度が上昇し、精巣ライディヒ細胞からのテストステロン基礎分泌量およびhCG刺激分泌量の増加が明らかとなった。さらに、精巣内のステロイドホルモン生合成に関連する10個の酵素や関連因子についてPCR法によりそれぞれのmRNA量を定量した結果、高濃度曝露群において9個の関連因子が有意な増加を示すことが明らかとなった。これらの結果を総合すると、ディーゼル排気中に含有されるナノ粒子は、高濃度になると精巣ライディヒ細胞からのテストステロン分泌量を増加させることが判明した。このナノ粒子のテストステロン分泌増加作用は、下垂体からの性腺刺激ホルモン分泌を介するものでは無く、精巣のライディヒ細胞に直接作用してステロイドホルモン生成成酵素や関連因子の発現量を増加させることによると判明された。また、平成22年度の研究において、除粒子曝露群において初代培養ライディヒ細胞からのテストステロン分泌量が基礎分泌量、hCG刺激分泌量共にコントロールよりも低下することが判明した。しかし、除粒子曝露群においては、血中のLH、FSH、テストステロン濃度に精巣のステロイドホルモン分泌関連因子のmRNA発現量にもコントロールとの間で有意差が認められなかった結果から、メカニズムは不明であるがライディヒ細胞からのテストステロン分泌に何らかの抑制作用を有しているものと推察された。

なお、今回明らかにした結果は、8週間のディーゼル排気ナノ粒子曝露による結果であり、曝露期間がさらに長期に渡った場合の影響については、不明である。
図(3)－32 視床下部・下垂体・性腺（精巣・卵巢）軸と視床下部・下垂体・副腎軸におけるホルモン分泌調節と代謝の関係

## 2 ）妊娠ラットの20日間曝露

妊娠期間中にディーゼル排気ナノ粒子曝露を受けた妊娠ラットでは、血中プロジェステロン濃度の低下、血中LH、エストラジオールおよびコルチコステロン濃度の上昇が認められた。また、黄体中の2種類ステロイドホルモン生成酵素(3β-HSDとP450SCC)とLHリセプター数の低下が認められた。これまでの研究から、妊娠中のラットでは、妊娠を維持するための(1)プロジェステロンは、妊娠黄体から分泌され、胎盤はプロジェステロンを分泌しないこと、(2)妊娠中期(15日頃)には、胎盤がテストステロンを分泌し、このテストステロンが妊娠黄体に移行して、エストラジオールに変換され血中に分泌されるが妊娠末期の20日では、エストラジオールの分泌源は、卵胞の顆粒層細胞が主体であること、(3)妊娠黄体からのホルモン分泌は、LH、プロラクチン及び胎盤性ラクトージェンが促進することが明らかになっている。本研究においては、血中LHが高濃度曝露群と除粒子曝露群で上昇していること及び血中プロラクチンは中濃度曝露群と除粒子曝露群で上昇傾向にあることから、中濃度曝露群と除粒子曝露群の妊娠20日の黄体は、プロジェステロン分泌能が低下したと推察される。血中プロジェステロン濃度の低下により、視床下部・下垂体への負のフィードバック作用が減弱して下垂体前葉からのLH分泌が上昇したと推察される。この血中LH濃度の上昇を受けて後分娩排卵に向かう卵胞の成熟が促進された結果血中エストラジオール濃度が上昇したものと推察される。一方、黄体では、LHリセプターの減少により、血中LH濃度が上昇してもプロジェステロン分泌量の増加は認められなかったと推察される。これまでの研究から、エストラジオールは、妊娠後半期には、分娩に備えて子宫筋や膛のオキシトシンリセプターとリラキシンリセプターの発現を促進する事実が明らかにされている。これらの事実と本研究における結果を総合して考察すると、ディーゼル排気ナノ粒子が長期間に渡り妊娠動物に曝露された場合には、流産率が増加する可能性が示唆される。また、本研究の結果から、黄体からのプロジェステロン分泌低下は、ナノ粒子や除粒子ガス成分が視床下部や下垂体前葉に作用するのではなく、卵巣の黄体に直接作用してプロジェステロン分泌に関与する因子の発現を抑制した結果で
あろうと推察された。

一方中濃度曝露群と除粒子曝露群で血中コルチコステロン濃度が上昇したことについて考察すると、両群では副腎皮質機能の上昇が考えられる。本研究では、血中ACTHと副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)濃度を測定していないことから、ナノ粒子や除粒子ガス成分が直接副腎皮質に直接作用した結果があるいは視床下部・下垂体前葉にも作用した結果かについても考察できない。いずれにしても、妊娠ラットの血中コルチコステロン濃度が上昇する結果として雄胎子の脳の性分化への影響が懸念される。これまでの研究から哺乳類の脳の性分化は、性的二型核が基本的には雌型であり、雄では、胎子期に雄胎子自身の精巣から分泌されるテストステロンが脳の性的二型核に移行し、アロマターゼの作用によりエストラジオールに変換され、このエストラジオールが性的二型核の細胞を増殖して雄性化(脱雌性化)を誘導すると解釈されている。また、この脱雌性化の起こる時期は、臨界期と呼ばれ動物種により異なるが、この臨界期の時期に妊娠中の母親に強いストレスがかかり、母親の副腎から多量のグルココルチコイドが分泌されると、そのグルココルチコイドが胎子の体内に移行し胎子精巣からのテストステロン分泌を抑制する結果として、雄胎子の性的二型核の脱雌性化が阻害されることが実験動物や人で報告されている。これらの事実を勘案すると妊娠中の動物が多量のナノ粒子や除粒子ガスに曝露された場合、胎子が雄である場合には、性的二型核の脱雌性化が阻害される可能性が示唆される。

本研究では、胎子については、体重、体長およびペニス(雄)あるいはクリトリス(雌)から肛門までの距離を測定したのみであるが、体重は、中濃度曝露群と除粒子曝露群で雌雄胎子共にコントロール群よりも有意な高値を示し、体長は、中濃度曝露群と除粒子曝露群で雌雄胎子共にコントロール群よりも有意な低値を示した。また、雌胎子では、クリトリスから肛門までの距離が除粒子曝露群でコントロール群よりも有意に長い結果が得られた。これらの変化は、ディーゼル排気ナノ粒子が長期間に渡り妊娠動物に曝露された場合には、母動物に起こった内分泌学的変化が、胎盤を通して、胎子の発達にも影響するものと解釈できる。この点については、今後胎子の脳や様々な臓器の機能への詳細な研究が必要である。

## 3 ）雌マウスの3～12ヶ月間曝露

本研究では、雌マウスを用いて、3ヶ月、6ヶ月および12ヶ月のナノ粒子を多く含むディーゼル排気ガスの吸入曝露を行った。

3ヶ月曝露では、各臓器、各ホルモン濃度において、コントロール群と各曝露群の間に有意差は認められなかった。また、採材当日のみではあるが、膛スメアの観察結果は、休止期の割合がほぼ同率であることから、本実験の曝露濃度の3ヶ月間の曝露では卵巣には際立った影響は起こらなかったと推察された。

6ヶ月曝露では、体重と副腎重量、卵巣重量、子宮重量および膽重量は、コントロール群と比較して各曝露群に有意差は認められなかったが、腸管の長さは、除粒子曝露群でコントロール群と比較して有意に減少していた。膽スメアの結果においても、曝露の影響は認められなかった。腸管の長さの短縮は、潰瘍性大腸炎などが考えられるが、原因は不明である。

12ヶ月曝露では、体重と腎臓重量が、除粒子曝露群でコントロール群と比較して有意に増加していた。副腎重量は、コントロール群と比較して、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群で有意な低値が認められた。しかし、各臓器重量を体重あたりに換算して比較すると、どの臓
器においても、コントロール群と比較して、各曝露群に有意差は認められなかった。プロジェステロン濃度は、コントロール群と比較して各曝露群に有意な差は認められなかったが、各曝露群ともに上昇傾向であった。インヒビン濃度は、コントロール群と比較して、中濃度曝露群で有意な高値を示した。

このことより、本実験の曝露濃度によって、成長に差がでることが判明したが、この影響は、多くの化学物質の曝露によって生じるような体重減少ではなく、体重の増加であった。この体重増加は、ディーゼル排気除粒子ガス自体が成長に毒性を示したというより、卵巣切除をマウスで行うと体重が増加することに類似した、卵巣周期の異常により、エストロジェンなどのホルモンに影響が出て、脂肪蓄積が起こりやすくなったことが原因と考えられる。また、TBTのような脂肪細胞への分化を誘導する働きがある可能性も考えられる。

膠スメアの観察から、高濃度曝露群および除粒子曝露群の休止期の割合が非常に高く、卵巣周期の停止が考えられる。これに加え、プロジェステロン濃度の上昇傾向は、主な分泌源が黄体であることから、黄体退行に働くプロラクチンの分泌が低下している可能性を示唆している。

高濃度曝露群のインヒビン濃度の上昇は、同時期のFSHの低下を示唆しており、これより顆粒層細胞の増殖など、卵胞の成長が促進されていることが考えられる。高インヒビンは、すでにインヒビンを高濃度で分泌する卵胞の存在を示しており、ある程度成長した卵胞が残った状態で維持されていると考えられる。また、インヒビン濃度の上昇は、高濃度群のみで、除粒子群では起こっていないことから、ナノ粒子自体の影響、もしくはナノ粒子存在下での高濃度のガス成分の影響である可能性が示唆された。

卵巣の組織学的観察では、直径300 μm以上の胞状卵胞数が、高濃度曝露群、除粒子曝露群で少ないことが確認された。これはFSH、LHなどの卵胞の発育に関与するホルモンの低下がGnRH濃度の低下により引き起こされた可能性が考えられる。中濃度曝露群では、直径300 μm以上の正常な胞状卵胞数には、大きな変化がないが、閉鎖卵胞数は多かった。これは、ある程度の大きさまで卵胞を発育させるには十分なFSH、LHなどの性腺刺激ホルモンが分泌されているが、排卵前に閉鎖するか、LHサージを受けたあとに排卵されない卵胞が多い可能性が考えられ、上記と同様にGnRH、FSH、LHの濃度低下や、エストラジオールの分泌濃度が低く十分なLHサージが起こっていない可能性が考えられる。

黄体数は、除粒子曝露群で増加しており、黄体の退行が遅れていることが示唆された。この原因としては、プロラクチンの分泌の低下による可能性が挙げられる。一部の個体は、これにより周期が停止していることが予想される。これらの多くの黄体が存在することより、周期が停止している個体であったとしても曝露終了に比較的近い時期まで排卵が行われていた可能性が考えられる。

これらの卵巣の組織学的観察結果から、前述した膛スメア像の休止期の増加は、除粒子群で多くの黄体が観察されたことより、PRL分泌が関係している可能性がより支持された。しかし、高濃度群での血清中インヒビン濃度の増加につながる卵巣の組織学的変化は認められなかった。

以上の結果より、ナノ粒子を多く含むディーゼル排気ガスの曝露は6ヶ月曝露まではマウスの卵巣機能に目立った影響を及ぼさないが、12ヶ月の曝露では、卵巣機能へ大きな影響があると推察された。
## 4 ）仔ラット（雌）の1ヶ月曝露

本研究では、外部因子の影響を受けやすい離乳直後のラットを用いて、NR-DEの曝露実験を行った。

本研究の結果から、1か月間のNR-DE曝露期間で、曝露による体重増加への影響は認められなかった。しかし、膛開口日齢が、除粒子曝露群で有意に遅延した。これより、除粒子曝露群のラットでは、性腺刺激ホルモン分泌の低下が起きていることが推察された。除粒子曝露群のガス成分の中に含まれるいかなる化学物質が原因であるかは、不明であるが、抗エストロジェン作用を持つ成分が含まれている可能性が示唆された。作用機序としては、エストロジェンレセプターに結合能を有する外部因子がエストロジェンレセプターを塞ぎ、内因性のエストロジェンの作用を妨害している可能性、視床下部や下垂体に影響を及ぼしている可能性、核内受容体ではなくGPCR（G protein coupled receptor）の一種のGPR30などの細胞膜上レセプターを介して抗エストロジェン作用を及ぼしている可能性が考えられる。GPR30を介した反応としては、抗エストロジェン作用をもつタモキシフェンの投与によりエストロジェン作用が阻止されたという報告がある(Thomas et al.2005)。また、tributyltin（TBT）で見られるようなステロイドホルモン合成に関わる酵素（アロマターゼなど）の活性を下げている可能性もある。

本研究で抗エストロジェン作用を起こした物質として、ニトロフェノール類が有力と考えられる。DEPから抽出したニトロフェノールのPNMC、PNMPPは、組み換え酵母スクリーンアッセイと未成熟雌ラットを用いた実験で、エストロジェン作用があること（1）や、PNMC、PNMPP、PNP、PNOCは、human androgen receptor(hAR)-yeast screen assayにより、抗アンドロゲン作用を持つなどの内分泌攪乱物質が確認されている $ ^{22)} $ 。日本ウズラにPNMCを筋肉注射した研究では、LH濃度と濃エストラジオール-17β濃度の減少が確認されている $ ^{3)} $ 。本研究では、除粒子群で膛開口が遅れたことより、内因性のエストラジオール-17βが出ていないことが考えられ、これはエストラジオール-17βを分泌する卵胞が少ないことと推察される。卵胞の発育に影響を及ぼすものとして、GnRHによるLHの分泌が抑制されていることが考えられるため、前述のウズラの研究のようにLHの分泌にニトロフェノールが影響した可能性が考えられる。

また、エストロジェン受容体を発現させた組み換えイースト菌を用いた実験で、ある種の多環芳香族炭化水素（PAHs）はエストロジェン受容体を介した遺伝子発現に影響を与えることが報告され、ベンゼン、ジクロロメタンおよびメタノールにより抽出されたDEP抽出物が抗エストロジェン様作用を有していることも報告されている $ ^{21} $ 。PaHの一つである、ベンゾピレンは、子宮のERαに変化を与え、子宫の機能を変化させる抗エストロジェン作用も確認されている。しかし、本研究では除粒子群と同濃度の高濃度ガス成分が含まれている高濃度群では、膛開口の遅延は見られず、早まる傾向を示していることから、高濃度のガス成分には抗エストロジェン作用があることが示唆されるが、ナノ粒子自体にはエストロジェン作用がある可能性、もしくはナノ粒子存在下では除粒子曝露群で膛開口の遅延を引き起こした成分が異なる挙動を示す可能性が考えられる。近年、除粒子中に、多量のPNPが含有されていることを示すデータがあることから、ガス成分に混在するニトロフェーノール類が原因の1つとして考えられる。

50日齢から観察した膽スメアは、4～7日間のみの観察であったが、コントロール群に比べ、曝露群で異常周期が増えたという結果はなく、春機発動の指標である膽開口時に見られたような内
分泌への影響は、性成熟後には回復して発情周期に影響を及ぼすレベルではなくなっていると考えられる。

肝臓、胸腺、腎臓、副腎、脾臓の重量においては、曝露による影響は認められなかった。肺の重量は、中濃度暴露群と除粒子曝露群で有意な減少が認められたが、体重あたりの重量に換算して比較すると、有意差はなかったことと、肉眼のな異常はなかったことより、肺に対しても大きな影響は認められないといえる。

子宮重量は、休止期1日目の中濃度曝露群で有意な増加が見られたが、他の発情周期で採材した個体については、有意差は認められなかった。また、卵巣重量においても、有意な差は認められなかった。

血中プロジェステロン濃度についても、コントロール群と曝露群の間に有意な差は認められなかった。休止期での高濃度群の上昇傾向および発情期での高濃度曝露群の上昇傾向や、除粒子曝露群の低下傾向は、排卵数の影響を受けていると考えられる。

血中エストラジオール-17β濃度については、発情前期の高濃度曝露群でコントロール群と比較して有意な低下が認められた。この発情前期でのエストラジオール-17β濃度の低下は、十分な数と十分な大きさの卵胞が発育していないことによると予想されたが、後に述べる卵巣組織の観察の結果から、胞状卵胞の成長はコントロール群と差がないことから、卵胞の成熟度が低いことからエストラジオール-17βを分泌する能力が低い可能性が考えられる。

血清中FSH濃度は、コントロール群と曝露群の間に有意差は認められなかった。下垂体FSH含有量は、曝露による有意な影響は認められなかったが、発情前期の中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群で低下傾向であった。

血清中LH濃度は、休止期で採血した個体の中濃度暴露群で、有意な上昇が認められた。また、発情前期の中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群では減少傾向であった。下垂体中LH含有量は、休止期の中濃度曝露群でコントロール群と比較して有意な増加があり、発情期では、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群で低下傾向であった。これより、休止期の中濃度曝露群では、エストラジオール-17βおよびGnRHの濃度が低く、LHのパルス状分泌の幅が大きいことが考えられる。

血清中PRL濃度は、コントロール群と各曝露群の間に有意差は認められなかった。下垂体中PRL含有量は、コントロール群と比較して、発情前期の高濃度曝露群で有意な上昇が認められた。この高値は、発情期や休止期で高濃度曝露群でプロジェステロン濃度が上昇傾向であったため、黄体退行を促すPRLが多く作られたと考えられる。

排卵数は、高濃度曝露群で増加傾向が見られたが、コントロール群と曝露群との間に有意差は認められなかった。また、卵胞数の結果では、100μm以上の総正常卵胞数および総閉鎖卵胞数も、コントロール群と曝露群で有意差はなかった。100～200μm、200～400μm、400μm以上の卵胞に分けて、正常卵胞数と閉鎖卵胞数を確認しても、有意差はないことから、曝露による卵胞発育には影響はないと考えられる。卵胞数が変化する原因としては、エストラジオール-17β、LH、FSH、インヒビンなどの濃度変化が考えられ、前述のように本研究でもこれらのホルモンにいくつかの変化は認められたが、これらの変化が卵胞の発育を阻害するレベルには至っていないと推察された。他の研究では、ディーゼル排気ガスに胎生7日目から曝露された雌胎仔の卵巣では、原始卵胞の形成が阻害されたという報告や（23）、胎仔期に高濃度の排出ガス（粒子状物質1.71mg/m³、NO
$ _{2} $ 濃度は0.79ppm）もしくは除塵排出ガス（粒子状物質0.01mg/m³以下で50μm以上の粒子を除去、NO $ _{2} $ 濃度は0.80ppm）に曝露されたラットの生後28日後の卵巢で、原始、一次、二次卵胞が少なく、退行した卵胞が多く見られ、胎仔期・哺乳期に高濃度ガスおよび除塵排出ガス曝露を受けた個体の生後90日後の卵巢では、発育段階にある卵胞が少なく、閉鎖卵胞と大きな黄体が目立ったという報告がある（24）。これらの研究は、本研究のナノ粒子とは粒径などに違いはあるが、曝露時期や曝露期間によっては卵巢機能に大きく影響する可能性を示唆している。

## 5 ）雄ラットの1～3ヶ月曝露

研究目的の1つは、NRDE曝露がラットにおいて精巣だけではなく、海馬のステロイド合成に影響を与えるのかを明らかにすることである。1か月の高濃度曝露(149±8μg/m3)と2か月の中濃度曝露により有意に血漿及び精巣のテストステロン濃度の上昇が見られた。この結果はLiら(2009)の同一条件で曝露を行った時の結果に似ている。1か月高濃度曝露の海馬において、コントロール群に比べ有意なアンドロステンジオンの上昇と、統計的に有意ではないがテストステロンの上昇傾向が見られた。高濃度の1か月曝露後、海馬ではStAR mRNAやタンパク量に変化は見られなかったが、精巣ではmRNAの若干の上昇がみられたことから、NRDEは精巣のステロイド合成は影響を与えるが、海馬のステロイド合成に影響を与えないかもしれない。実際、Hojo(2009)は海馬のテストステロンはほぼすべて精巣に由来することを報告している。以上から、血漿中と海馬中のテストステロンは直線関係にあり、これらはNRDE曝露ラットの精巣でのステロイド合成を反映していることが示唆される。

Wistarラットの海馬細胞のステロイド合成酵素の発現量は、17β-HSDが精巣の1/100、アロマターゼとCYP17αが1/500、3β-HSDとCYP11Aが1/5000、StARが1/100～1/1000であることが報告されている(Kimoto et al., 2001)。今回の研究ではStAR mRNA量は前述の論文と同程度であるが、CYP11A, aromatase, and 17β-HSD mRNA量は約2.5-から20-fold高く、CYP17αは1/10であった。ステロイド合成酵素はグリア細胞にも存在することが報告されている(Kimoto et al., 1997)。そのため、この違いは動物の系統の違いか、サンプルの細胞種の違いによると思われる。以上から、海馬のステロイド合成分子の発現量は精巣に比べてかなり低いと言える。このことからも海馬のテストステロンは精巣での産生に依存していることが示唆される。

今回の実験のNRDE群にはガス成分と粒子成分の両方が含まれる。そこで、本研究のもう1つの目的はどちらの成分が精巣や海馬のステロイド合成に影響を与えるかを明らかにすることである。1か月の高濃度曝露群はコントロール群に比べて精巣中のテストステロン濃度が高いが、除粒子曝露群はこのような変化が見られない。高濃度NRDE曝露は海馬においてアンドロステンジオンを上昇させているが、除粒子曝露では影響が見られない。一方、2,3か月の除粒子曝露はそれぞれ血漿中のテストステロンの上昇または精巣中のテストステロンの減少を引き起こしているが、高濃度NR-DEではこれらの変化は見られていない。加えて、どの項目においても中濃度曝露群と除粒子曝露群間には有意な変化は認められていない。サンプル数による統計の検出力の問題があるが、ガスと粒子の両方がNRDEによるステロイド合成の影響をもたらしていると思われる。この点に関してはさらなる研究が必要である。

PM10に比べて小さい粒子の方がより有害影響をもたらす可能性があることから、2009年9月にPM2.5の環境基準値は設定された(Ministry of the Environment, 2009; USEPA, 2006)。この環境基準値
は平均15 μg/m³/年、平均35 μg/m³/日以下である。本研究の中濃度NR-DEは38 μg/m³、5 時間/日、5日/週で行ったものである。この濃度は日本のPM2.5の環境基準値とほぼ同程度であり、24時間平均にすると9.3 μg/m³と明らかに環境基準値よりも低い濃度となる。興味深い事に、さらに低い低濃度NRDE曝露(推定24時間平均値:5.1 μg/m³)でも精巣中と血漿中のテストステロン濃度を上昇させている(Ramdhan et al., 2009; Li et al., 2009)。このことから、本研究はPM2.5の環境基準値の見直しの必要が示唆される。

DNAマイクロアレイの結果、ヘッジホッグシグナル、ヌクレオチドGタンパク質共役受容体、脂質生成、補体活性化、エイコサノイド合成、接着斑、炎症反応、PG合成・制御、ペプチドGタンパク質共役受容体経路が抽出された。特に、PG合成・制御、エイコサノイド合成は肝臓でも変化しておりNR-DEによる影響マーカーとして注目される。

PGは一般的に、男性生殖器の雄性化に関わるとされている $ ^{8} $ 。GnRHのライディッヒ細胞のテストステロンへの直接の上昇作用に、PGF2やシクロオキシナーゼ1が必要との報告があり $ ^{9} $ 、ライディッヒ細胞でのテストステロン合成亢進に加え、PG合成が促進したことがテストステロンの上昇につながっていた可能性が考えられる。さらに、PGの中にはPPARγのリガンドとなるものが存在する $ ^{10} $ 。PPARγはStARの発現を上昇させることが報告されており $ ^{11} $ 、この内因性のPGの合成亢進が精巣のStARの発現上昇をもたらし精巣のテストステロン合成を促進させていた可能性もある。その他ピックアップされた経路のうち、補体の活性化は肺胞での報告がある $ ^{11} $ 。標準濃度曝露群では炎症反応経路も促進されており、好中球を遊走させるケモカインとして作用している可能性がある。その他の経路はディーゼル排気ガスとの関連に関する報告は乏しく、また精巣での役割がはっきりしないため、今後の検討課題である。

今回個々の遺伝子のmRNA発現量の測定を行ったが、上記のマイクロアレイ解析の結果と個々の遺伝子のmRNA解析の結果には相違があった。理由としては、マイクロアレイ解析では各群から1匹ずつを選出し、コントロールとの比で値を出しているのに対し、定量リアルタイムPCRでは各群8匹全てを解析して、平均の値を用いていることから、個体差によるばらつきが大きかったことが考えられる。今回は、肝臓と精巣双方に変化の見られたエイコサノイド合成系について特に注目して解析を行った。Pla2g2aはエイコサノイド系において最初に生体膜リン脂質からアラキドン酸の遊離させる酵素である。今回はhigh F-DEでのみmRNA発現量に有意な増加が認められたので。Pla2g2aの発現量の増加に関与するのは粒子ではなくガス成分であるのかもしれない。Pla2g2aはホスホリパーゼA2の中でも分泌型であり、前立腺癌のバイオマーカーとしても知られている⁶。しかし、グループⅡ型のホスホリパーゼA2の身体内作用は未だに明らかにされていないため、今後の検討課題である。エイコサノイドのシクロオキシゲナーゼ経路で働くPGISにおいては中濃度曝露で顕著な減少が認められたが、アラキドン酸からPGD2を経由し、PGI2が合成される間のCOX-1には有意な差は認められなかったので、経路全体ではなくPGISが単独で減少しており、PGISの減少に関与するのは粒子成分であるかもしれないと考えられる。PGISは、炎症のメディエーターとして働くこと、血管平滑筋の増殖抑制作用や虚血障害からの心筋保護に関与することなどが報告されている。しかし精巣でのPGISの役割については、未だ報告が少ない。また、エイコサノイドのリポキシゲナーゼ経路で働くAlox15のmRNA発現量において高濃度曝露群、除粒子曝露群で上昇が確認された。中濃度曝露群でも増加していたが有意ではなかった。アラキドン酸代謝酵素の一つであるリポキシゲナーゼには、アラキドン酸への酸素添加部位の違いによって、5-LOX・8-LOX・
12- LOX・15- LOXなど多くのアイソフォームが知られている。リポキシゲナーゼ産物が、ライディッヒ細胞のステロイド合成に強く関与することが報告されている $ ^{7)} $ 。昨年度までの研究で、2ヶ月間曝露のラットで精巣テストステロンが有意に増加していたのは中濃度曝露群のみだったが、今回PCR解析の結果で高濃度曝露群・除粒子曝露群でAlox15の発現量の増加が見られたことから、少なくともAlox15に対してはNR-DEが容量反応的に作用していること、また両者に有意差がなかったことから、Alox15の発現量に影響するのは粒子成分でなくガス成分であるかもしれないこと、テストステロン以外のステロイド合成系の新たなバイオマーカーになるかもしれないことなどが考えられた。Alox15と同様に、エイコサノイドのリポキシゲナーゼ経路で働くトランスグルタミナーゼ（Tgm2）においてもstandard NR-DEとhigh F-DEで有意な減少が認められているが、これも経路全体ではなくTgm2が単独で減少しており、Tgm2の発現減少に関わるのは粒子成分ではなくガス成分であるかもしれない。トランスグルタミナーゼは全組織に存在し、セルトリ細胞での卵胞刺激ホルモン抑制に関与することが指摘されている $ ^{8)} $ 他、細胞膜の修復や死細胞の処理、細胞外マトリクスの強化などにも関与していることが知られている。また、PG合成・制御系で働くS100a6とS100a10のmRNA発現量は、ともにstandard NR-DEとhigh F-DEで減少していた。このことから、S100A6とS100A10の発現量に影響しているのは、粒子成分ではないかもしれない。S100A6とS100A10はともに10−14kDaの小さなカルシウム結合タンパクで、さまざまな細胞内外のプロセスに関与することが知られている $ ^{9)} $ 。特にS100A10はマクロファージ上の重要なプラスミノミノゲン結合部位であり、S100A10減少マクロファージではプラスミノゲン依存性侵襲能力が減退し、プラスミン生成やMMP-9活性化を減退させるという報告もある $ ^{10・11)} $ 。S100A6については細胞周期や細胞骨格形成に関与しているという報告もある $ ^{12)} $ 。また、S100aA10、S100A6はAnnexin A2に結合することが知られている。今回の実験ではAnnexin A2のmRNA量は測定していないので断定できないが、中濃度曝露と除粒子曝露がAnnexin A2とS100A6、S100A10の複合体の減少に関与しているのかもしれない。中濃度曝露によってS100A10の減少が引き起こされ、マクロファージ侵襲能力の減退による免疫能の低下が起こっている可能性がある。また、CYP26A1ではコントロール群と比較して中濃度曝露、高濃度曝露、除粒子曝露のいずれにおいても著名な減少が認められた。このことから、CYP26a1の発現量にはガス成分であると考えられる。CYP26A1は細胞内のRA（retinoic acid）濃度や細胞増殖、主要RA標的遺伝子の転写規制、体腔内内胚薬へのES細胞の分化の調節に関わると報告されている $ ^{13)} $ 。CYP26A1の低下による生殖毒性が生じる可能性が示唆されたこと、また中濃度のNR-DE曝露によって精巣内でCYP26A1の低下が生じたことは重要であり、今後更なる研究が必要であると考えられる。PPARγはStARの発現を上昇させることが報告されている $ ^{17)} $ 。そのため、内因性のPGの合成亢進が精巣のStARの発現上昇をもたらし精巣のテストステロン合成を促進させていた可能性を考え、PG合成・制御系の中のPPARγ（PPARβ）の測定を行ったが、PPARβはhigh F-DEでむしろ減少していた。このことからPPARβの発現量の減少に関与するのは、粒子ではなくガス成分であるかもしれないと考えられた。また、昨年度の研究から、2ヶ月曝露のラットの除粒子曝露群ではテストステロン・StARの著名な変化は認めらなかったが、PPARβの減少がStARの発現量減少・精巣テストステロン濃度減少を引き起こしていた可能性も考えられ、更なる研究が必要であると言える。以上をまとめると、PCR解析の結果から、エイコサノイド系で最初に働くPla2g2a、エイコサノイドのシクロオキシゲナーゼ経路で働くPGIS、エイコサノイドのリポキシゲナーゼ経路で働くAox15・Tgm2、PG合成・制御系で働くS100a6・S100a10の他、CYP26a1
でNR-DE、F-DEによる発現量の変化が認められたことから、テストステロン以外のバイオマーカーになる可能性が考えられた。しかし、各々の精巣での役割が未だ明確にされていないため、今後の更なる研究が必要であると考えられる。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究により、NRDEの亜急性曝露によるテストステロンの上昇が精巣への直接作用（精巣ライディヒ細胞におけるステロイドホルモン生合成酵素と関連因子の活性上昇、エイコサノイド合成系の関与）である可能性が示唆された。また、妊娠ラットの高濃度NRDE曝露により黄体機能の低下が認められることから、曝露による流産率増加の可能性が示唆された。さらに妊娠ラットのコルチコステロン分泌が増加することから、雄胎子の脳の脱雌性化が阻害される可能性も示唆された。

## （２）環境政策への貢献

ディーゼル排ガスの吸入が生殖器系機能に影響をあたえうることを示した研究成果であり、今回使った曝露装置は世界でも類を見ない規模・精度のものであるために重要な科学的成果であると考えられる。曝露により雄の精巣機能に影響のあることが判明したことから、本研究は、ヒトを含めた都市部で生活する雄動物の生殖機能への作用メカニズムをさらに研究する必要性を提示した。また、ナノ粒子曝露により妊娠動物の卵巣機能が抑制されることが判明したことから、本研究は、都市部で生活する妊娠への影響について新たな研究を実施する必要性を提示した。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況 ※【別添】H23研究等報告書作成要領 参照

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) CM. LI, S. TANEDA, K. TAYA, G. WATANABE, Y. FUJITANI, T. NAKAJIMA & AK. SUZUKI. Toxicology Letters 185, 1-8, 2009.

“Effects of in utero exposure to nanoparticle diesel exhaust on testicular function in immature male rats.”

2) CM.LI, S.TANEDA, K.TAYA, G.WATANABE, Y.FUJITANI, Y.ITO, T.NAKAJIMA & AK.SUZUKI. Inhalation Toxicology 21, 803-811, 2009.

“Effects of inhaled nanoparticle-rich diesel exhaust on regulation of testicular function in male rats.”

3) CM.LI, X.LI, AK.SUZUKI, Y.FUJITANI, J.JIGAMI, K.NAGAOKA, G.WATANABE & K.TAYA. Toxicology Letters 209,277–281, 2012

“Effects of exposure to nanoparticle-rich diesel exhaust on adrenocortical function in adult male mice.”
＜查読付論文に準ずる成果発表＞（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可。）特に記載すべき事項はない。

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1) Li XZ, Li CM, Suzuki AK, Watanabe G, Fujitani Y, Nakajima T, Taya K. The 3rd Asia-Pacific Forum on Andrology, 10-13 October 2009, Nanjing, China.

“Exposure to inhaled nanoparticle-rich diesel exhaust disrupts regulation of testicular function in adult male rats.”

2) Li CM, Suzuki AK, Li XZ, Taneda S, Fujitani Y, Watanabe G, Nakajima T, Taya K. The 3rd Asia-Pacific Forum on Andrology, 10-13 October 2009, Nanjing, China.

“Prenatal exposure to nanoparticle-rich diesel exhaust suppressed testicular function in immature male rats.”

3) 地紙順子、李春梅、潘玲梅、李雪征、曹文、種田晋二、鈴木明、渡辺元、田谷一善. 第12回環境ホルモン学会、2009年12月7日（東京）

「ナノ粒子を多く含むディーゼル排気(NR-DE)が雄マウスの精巣・副腎皮質・下垂体前葉機能に及ぼす影響。」

4) Xuezheng Li, ChunMei Li, Lingmei Pan, Junko Jigami, Wen Cao, Akira K. Suzuki, Gen Watanabe, Tamie Nakajima, Kazuyoshi Taya, 14th International Congress of Endocrinology, Kyoto, 2010.3 "Effects of nanoparticle-rich diesel exhaust on adrenal and testicular steroid secretion in male mice"

5) 長谷川千紗、李春梅、鈴木明、渡辺元、田谷一善．第13回日本畜産学会、2011年3月27日(神奈川)

「ナノ粒子を多く含むディーゼル排気ガスが雌マウスおよび雌ラットの卵巣機能に及ぼす影響に関する研究。」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

(6) その他

特に記載すべき事項はない。
### 8 \. 引用文献

1) Furuta, C., Suzuki, A.K., Taneda, S., Kamata, K., Hayashi, H., Mori, Yoki, Li, C., Watanabe, G. & Taya, K. Estrogenic activities of nitrophenols in diesel exhaust particles. Biology of Reproduction 70, 1527-1533, 2004.

2) Furuta, C., Li, C.M., Taneda, S., Suzuki, A. K., Kamata, K., Watanabe, G. & Taya, K. Immunohistological study for estrogenic activities of nitrophenols in diesel exhaust particles. Endocrine 27, 33-36, 2005.

3) Li, CM., Takahashi, S., Taneda, S., Furuta, C., Watanabe, G., Suzuki, A.K. & Taya, K. Impairment of testicular function in adult male Japanese quail (Coturnix japonica) after a single administration of 3-methyl-4-nitrophenol in diesel exhaust particles. Journal of Endocrinology 189, 555-564, 2006.

4) Li CM, Taneda S, Suzuki AK, Furuta C, Watanabe G & Taya K. Anti-androgenic activity of 3-methyl-4-nitrophenol in diesel exhaust particles. European Journal of Pharmacology 543, 194-199, 2006.

5) Li CM, Taneda S, Suzuki AK, Furuta C, Watanabe G & Taya K. Estrogenic and anti-androgenic activities of 4-nitrophenol in diesel exhaust particles. Toxicology and Applied Pharmacology 217, 1-6, 2006.

6) Li CM, Taneda S, Suzuki AK, Furuta C, Watanabe G & Taya K. Effects of 3-methyl-4-nitrophenol in diesel exhaust particles on the regulation of testicular function in immature male rats. Journal of Andrology 28, 252-258, 2007.

7) Li CM, Takahashi S, Taneda S, Furuta C, Watanabe G, Suzuki AK & Taya K. Effects of 3-methyl-4-nitrophenol in diesel exhaust particles on the regulation of reproductive function in immature female Japanese quail (coturnix japonica). Journal of Reproduction and Development 53, 673-678, 2007.

8) Li CM, Taneda S, Suzuki AK, Furuta C, Watanabe G & Taya K. Effects of 3-methyl-4-nitrophenol on the suppression of adrenocortical function in immature male rats. Biol. Pharm. Bull. 30, 2376-2380, 2007.

9) Izawa H, Watanabe G, Taya K & Sagai M. Inhibitory effects of foods and polyphenols on activation of aryl hydrocarbon receptor induced by diesel exhaust particles. Environmental Science 14, 149-156, 2007.

10) Mi Y, Zhang C & Taya K. Quercetin protects spermatogonial cells from 2,4-D-induced oxidative damage in embryonic chickens. Journal of Reproduction and Development 53, 749-754, 2007.

11) Izawa H, Kohara M, Watanabe G, Taya K & Sagai M. Diesel exhaust particle toxicity on spermatogenesis in the mouse in arylhydrocarbon receptor dependent. Journal of Reproduction and Development 53, 1069-1078, 2007.

12) Izawa H, Kohara M, Watanabe G, Taya K & Sagai M. Effects of diesel exhaust particles on the male reproductive system in strains of mice with different aryl hydrocarbon receptor responsiveness. Journal of Reproduction and Development 53, 1191-1197, 2007.

13) Izawa H, Kohara M, Aizawa K, Suganuma H, Inakuma T, Watanabe G, Taya K & Sagai M.