Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
### iii. 第3回曝露

コントロール群(重量濃度12.5μg/m³)，中濃度曝露群（モード粒径23.2nm、重量濃度47.8μg/m³）、高濃度曝露群（25.0nm、129.0μg/m³）、除粒子群（8.5μg/m³）の4群に分けて、曝露チャンバー内で3カ月（5時間／日，5日／週）曝露した。

神経毒性メカニズムを明らかにするため、海馬における記憶関連遺伝子、神経栄養因子や転写因子、グルタミン酸トランスポーター(GLT1, EAAT4)、GABA合成酵素（GAD65, GAD67）などのmRNA発現レベルをリアルタイムRT-PCR法によって解析した。

海馬におけるグルタミン酸受容体遺伝子の発現をリアルタイムRT-PCR法で調べた結果、記憶関連のグルタミン酸受容体NMDA subunitの発現には各群で差は見られなかったが、CaMKIV遺伝子発現の低下が高濃度曝露群で認められた。ナノ粒子曝露の脳への影響のメカニズムを解明するため、グルタミン酸トランスポーター、GABA合成酵素も調べた。その結果、神経細胞におけるグルタミン酸トランスポーターGLT1に影響が見られなかったが、アストロサイト細胞におけるEAAT4遺伝子発現の低下が明らかになった（図(1)-15A）。グルタミン酸から抑制性神経伝達物質であるアミノ酸GABAを合成する酵素glutamic acid decarboxylase（GAD）65では、発現の増加が高濃度曝露群で認められた。この増加は除粒子群では認められず、粒子による影響と考えられた（図(1)-15B）。

図(1)−15．NRDE曝露したマウスの海馬における（A)グルタミントランスポーターE AAT4量、（B)G A B A合成酵素GAD65量の変化．平均値±標準誤差(n=6). $ ^{*}P<0.05 $ vs. clean air/LTA(−).
## 3 ）病理組織学的檢查

コントロール群(重量濃度12.5μg/m³)，中濃度曝露群（モード粒径23.2nm、重量濃度47.8μg/m³）、高濃度曝露群（25.0nm、129.0μg/m³）、除粒子曝露群（8.5μg/m³）の4群に分けて、曝露チャンバー内で3カ月（5時間／日，5日／週）曝露した。病理組織学的検索で神経成長因子(NGF)やミクログリアの活性化を調べた。

神経新生に関わる神経栄養因子NGFの反応性はコントロール群と曝露群との間に顕著な差は見られなかった。しかし、神経毒性を示すミクログリアの活性化は、高濃度曝露群で有意に増加する傾向が認められた。

## 4 ）まとめと考察

4－3の結果から、NRDEとLTAの複合曝露は、空間記憶学習機能、海馬・嗅球における記憶関連遺伝子の発現、および嗅球でのグルタミン酸レベルに影響を及ぼすことが示唆された。

4－4の結果から、3ヶ月NRDE曝露により海馬依存の非空間学習が影響を受けることが明らかとなった。記憶に関連するNMDA受容体のリガンドであるグルタミン酸に関連した神経伝達経路への影響が、記憶・学習能力への影響として現れていると考えられた。そこで、グルタミン酸の代謝に関する遺伝子を調べたところ、グルタミン酸トランスポーターの発現低下やグルタミン酸デカルボキシラーゼの発現増加が認められたことから、NRDEは、グルタミン酸代謝の異常活性化を介した神経損傷を引き起こしながら空間的学習能力に影響することが推察された。

さらにこれらの影響は、概して除粒子曝露群では認められない場合が多く、ガス成分よりも粒子成分によってもたらされた変化であることも推察された。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

NRDEの亜急性曝露が海馬におけるNMDA受容体を介して空間的および非空間的な認知・記憶学習の障害を引き起こす可能性が推察され、先行研究で観察されていた海馬や嗅球における炎症反応や記憶等に関連する遺伝子発現の影響を行動レベルで検証することができたと考える。

## （２）環境政策への貢献

ディーゼル排ガスの吸入が脳機能に影響をあたえうることを示した研究成果であり、今回使った曝露装置は世界でも類を見ない規模・精度のものであるために重要な科学的成果であると考えられる。今回の結果は、今後のさらなる追試が必要であることを強く示すものであると言える。

### 6. 国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表
## <論文（査読あり）>

1) T. T. WIN-SHWE, S. YAMAMOTO, Y. FUJITANI, S. HIRANO and H. FUJIMAKI: Neurotoxicology, 29(6), 940–947 (2008).

“Spatial learning and memory function-related gene expression in the hippocampus of mouse exposed to nanoparticle-rich diesel exhaust.”

2) T. T. WIN-SHWE, D. MITSUSHIMA, S. YAMAMOTO, A. FUKUSHIMA, T. FUNABASHI, T. KOBAYASHI and H. FUJIMAKI: Toxicol. Appl. Pharmacol., 226(2), 192-198 (2008).

“Changes in neurotransmitter levels and proinflammatory cytokine mRNA expressions in the mice olfactory bulb following nanoparticle exposure.”

3) T. T. WIN-SHWE, D. MITSUSHIMA, S. YAMAMOTO, Y. FUJITANI, T. FUNABASHI, S. HIRANO and H. FUJIMAKI: Inhal. Toxicol., 21(10), 828-3 (2009).

“Extracellular glutamate level and NMDA receptor subunit expression in mouse olfactory bulb following nanoparticle-rich diesel exhaust exposure.”

## 4 ）藤卷秀和：大気環境学会誌，45，49-55（2010）

「健康影響と感受性」

5）藤巻秀和：大気環境学会誌，45，A47-A53（2010）.

「入門講座 大気環境の健康影響と植物影響—第4講 大気汚染物質による健康影響の分子メカニズム」

6) T. T. WIN-SHWE, S. YAMAMOTO, Y. FUJITANI, S. HIRANO and H. FUJIMAKI: Nanotoxicology, Jun 13. [Epub ahead of print] (2011)

“Nanoparticle-rich diesel exhaust affects hippocampal-dependent spatial learning and NMDA receptor subunit expression in female mice”

7) T.T.WIN-SHWE and H.FUJIMAKI: Int J Mol Sci, 12, 6267-80 (2011) "Nanoparticles and neurotoxicity"

8) T. T. WIN-SHWE, Y. FUJITANI, S. HIRANO and H. FUJIMAKI: Nihon Eiseigaku Zasshi, 66, 628-633 (2011)

<査読付論文に準ずる成果発表>（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可。）特に記載すべき事項はない。

## くその他誌上発表（査読なし）>

1）山元昭二、Tin-Tin-Win-Shwe、藤卷秀和：特集 気道暴露（吸入、気管内投与等）法を用いた動物実験モデル 〜環境ナノ粒子の気道暴露によるマウス呼吸器系および脳神経系への影響〜、アニテックス、21(5):16-21（2009）

## （2） 口頭発表（学会等）

1) T.T.Win-Shwe, S.Yamamoto, Y.Fujitani, S.Hirano and H.Fujimaki: 79th Annu. Meet. Jpn. Soc. Hygiene（第79回日本衛生学会学術総会），Tokyo，2009/03.（Jpn. J. Hyg.,（日衛誌），
64(2): 291

“Targeting in nanoparticle-induced neurotoxicity in mice.”

2）山元昭二、Tin-Tin-Win-Shwe、藤谷雄二、平野靖史郎、藤卷秀和：第36回日本トキシコロジー学会学術年会、2009年7月（盛岡）（J. Toxicol. Sci., 34 Suppl.: S86）

「ナノ粒子画分の多いディーゼル排気ガスを曝露したマウスの肺における炎症反応への影響」

3）Tin-Tin-Win-Shwe、山元昭二、藤谷雄二、平野靖史郎、藤卷秀和：第36回日本トキシコロジー学会学術年会、2009年7月（盛岡）（J. Toxicol. Sci., 34 Suppl.: S165）

「ナノ粒子画分の多いディーゼル排気ガスを曝露したマウスの脳における記憶関連遺伝子発現」

4）山元昭二、Tin-Tin-Win-Shwe、藤谷雄二、古山昭子、藤卷秀和、平野靖史郎：第50回大気環境学会年会、2009年9月（横浜）（同講演要旨集，339）

「ナノ粒子画分を多く含んだディーゼル排気ガスの慢性曝露によるマウス呼吸器の免疫・炎症応答に及ぼす影響」

5) Yamamoto S., Tin-Tin-Win-Shwe, Mitsushima D., Fujitani Y., Hirano S., Fujimaki H.: 13th Congr. Eur. Fed. Neurol. Soc., Florence, Italy, 2009/09. (Abstracts, 325)

“Analysis of neurotoxic effect of nanoparticle-rich diesel exhaust on a mouse brain.”

6）山元昭二,Tin-Tin-Win-Shwe,藤谷雄二,平野靖史郎,井上健一郎,藤卷秀和：第37回日本トキシコロジー学会学術年会(2010)，6月16-18日沖縄県宜野湾市

「ディーゼル排ガス由来ナノ粒子の亜急性吸入曝露によるマウス脳への影響」

7）横田俊二、高島宏昌、宮原敬、吉田由香、根倉司、斉藤義明、平林尚之、渡辺卓穂、太田亮、堀内伸二、藤谷雄二、平野靖史郎、藤卷秀和：第37回日本トキシコロジー学会学術年会(2010)，6月16-18日沖縄県宜野湾市

「ラットの中枢神経系に対するナノ粒子を多く含むディーゼル排気粒子点鼻の影響」

8）黒河佳香, 北條理恵子, 藤谷雄二, 平野靖史郎, 山元昭二：第33回日本神経科学大会(2010)，9月神戸

「ディーゼル排ガス由来ナノ粒子はマウスの学習機能に影響を与えるか？」

9) Y. Kurokawa, R. Hojo, T. Win Shwe, Y. Fujitani, S. Hirano, S. Yamamoto: Neuroscience 2010 (2010), November 12–16, San Diego.

“Influence of sub-acute exposure to nanoparticle-rich diesel exhaust on learning performance in mice”

10) S. Yamamoto, T. Win. Shwe, Y. Kurokawa, Y. Fujitani, S. Hirano, K. Inoue: Neuroscience 2010 (2010), November 12–16, San Diego

“Influence of sub-acute inhalation exposure to nanoparticle-rich diesel exhaust on murine brain”

12) Tin Tin Win Shwe, Yoshika Kurokawa, Yuji Fujitani, Seishiro Hirano, Hiroshi Nitta,
Hidekazu Fujimaki：第52回大気環境学会（2011），9月，長崎.

“Spatial and non-spatial learning performance in mice exposed to nanoparticle-rich diesel exhaust particles”

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

1）2009年9月にイタリアのフィレンツェで開催された第13回欧州神経学会議におけるポスター発表において優秀賞（Investigator Award 2009, Substance abuse and neurotoxicology）を受賞

### 8 \. 引用文献

1) Donaldson K, Stone V.: Current hypotheses on the mechanisms of toxicity of ultrafine particles. Ann Ist Super Sanita 39: 405-10, 2003.

2) Elder A, Gelein R, Silva V, et al: Translocation of inhaled ultrafine manganese oxide particles to the central nervous system. Environ Health Perspect 114: 1172-1178, 2006.

3) Oberdörster G, Sharp Z, Atudorei V, et al: Translocation of inhaled ultrafine particles to the brain. Inhal Toxicol 16: 437-445, 2004.

4) Win-Shwe T.T., Yamamoto S., Ahmed S., et al: Brain cytokine and chemokine mRNA expression in mice induced by intranasal instillation with ultrafine carbon black. Toxicol Lett 163:153-160, 2006.

5) Win-Shwe T.T., Mitsushima D, Yamamoto S, et al: Changes in neurotransmitter levels and proinflammatory cytokine mRNA expressions in the mice olfactory bulb following nanoparticle exposure. Toxicol Appl Pharmacol 226: 192-198, 2008.

6) Bannerman DM, Good MA, Butcher SP, Ramsay M, and Morris RG. (1995). “Distinct components of spatial learning revealed by prior training and NMDA receptor blockade”. Nature 378:182–186.

7) Tsien JZ, Huerta PT, and Tonegawa S. (1996). “The essential role of hippocampal CA1NMDA receptor-dependent synaptic plasticity in spatial memory”. Cell 87:1327–1338.
8) Win-Shwe TT, Yamamoto S, Fujitani Y, Hirano S, and Fujimaki H. (2008). “Spatial learning and memory function-related gene expression in the hippocampus of mouse exposed to nanoparticle-rich diesel exhaust”. Neurotoxicology 29:940–947.
## C-0901 ディーゼル排気ナノ粒子の脳、肝、腎、生殖器への影響

バイオマーカー創出・リスク評価

(2) ナノ粒子の肝臓、腎臓への影響のメカニズム解析と新たなバイオマーカー創出・リスク評価

名古屋大学大学院

大学院医学系研究科環境労働衛生学 那須 民江、柳場 由絵、林 由美、山岸 希、

ラムダンドニヒクマット

名古屋市立大学大学院

大学院医学研究科

上島 通浩、伊藤 由起

平成21～23年度累計予算額：25,000 千円

（うち、平成23年度予算額：8,000 千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] NRDEの亜急性曝露がマウス・ラットの肝臓・腎臓に与える影響を検証した。中濃度および高濃度NRDEの1カ月曝露により、肝臓に炎症が惹起されていることが明らかとなった。さらに肝臓におけるperoxisome proliferator activated receptor alpha (PPARα)標的遺伝子の蛋白合成が阻害されていることが判明した。さらに調べると、抗炎症作用を持つPPARαの変化が肝毒性に関与していることが示唆された。NRDEの曝露，除粒子曝露ともに中性脂肪、総コレステロールの蓄積が観察され、脂質合成の促進が起こっていることが明らかとなった。NRDE曝露後の雄ラット肝臓を用いてDNAマイクロアレイ解析を行なったところ、アラキドン酸カスケードの変化が観察された。また、血漿・肝臓中の脂肪酸分画の測定を行なったところ、血漿中のリノレイン酸量の減少と肝臓中のEPA上昇が見られた。これらの脂質ホメオスタシスの攪乱は粒子成分よりもむしろガス成分によるものと考えられた。腎臓については、明らかな影響は観察されなかった。

[キーワード] ディーゼル排気ガス、全身吸入曝露、ナノ粒子、肝臓、腎臓

### 1. はじめに

ディーゼル排気微粒子（D E P : diesel exhaust particle）は大気汚染の主要成分であり、これらの中には粒径が50nm以下のナノ粒子も含まれている。この微粒子は非常に微小なために生体内への移行が容易で、重量あたりの表面積が大きいために生物組織への侵害作用が大きいことが懸念されるが、その生体影響の研究は非常に乏しく、わが国において緊急性の高い課題となっている。この研究の必要性に応えるため、（独）国立環境研究所では平成18年度よりナノ粒子を多く含むディーゼル排気（NRDE : nanoparticle-rich diesel exhaust）の曝露実験を開始し、呼吸・循環器系、炎症・免疫系への影響解明に取り組み始めた。このような背景の下、我々は平成19,20年度の環境技術開発等推進費で、ラットにNRDEを曝露し、生殖器・次世代影響とそのメカニズムに関する研究を行った。本研究では、NRDEに曝露した動物における肝臓・腎臓への影響を評価し、さらにそれにとどまらず影響のバイオマーカーを創出し、それらのマーカーを
NRDEの健康リスク評価、環境基準設定の際に参考となる知見として提唱することをめざした。

### 2. 研究開発目的

（独）国立環境研究所に設置されている実験動物用NRDE曝露システムを用いて、マウス・ラットに亜急性にNRDEを全身曝露し、肝臓・腎臓への影響を多角的に調べる。さらに、特に脂質代謝にかかわる各種分子をターゲットとして曝露動物の肝臓標本を用いた分子生物学的検査を行ない、考えられるNRDEの肝臓毒性のメカニズムを明らかにする。

## 3 ．研究開発方法

## （1） 曝露装置

すべての実験において、実験動物のナノ粒子への曝露は、独立行政法人国立環境研究所のナノ粒子健康影響実験棟内で実施した。詳細は、サブテーマ(1)の欄に記載した通りである。

## （2） 実験動物

ラットへの曝露では、7～8週齢の雄F344ラットを使用した。

マウスへの曝露では、①6週齢雄129/Sv（野生型）マウス・ $ P_{para}\alpha-null $ マウス、および②7週齢の雌BALB/cマウスを用いた。

## （3） 曝露方法

## 1 ）ラットへの曝露スケジュール

1 ヶ月、2 ヶ月、3 ヶ月間の曝露を行なった。1 群8 匹で、次の4 群を設定した：コントロール群 $ (89.8 \pm 53.7 \, \text{nm}, 15.5 \pm 2.3 \, \mu\text{g/m}^{3}, 3.36 \pm 0.93 \, \text{個/cm}^{3}) $ 、低濃度曝露群 $ (23.5 \pm 1.0 \, \text{nm}, 23.8 \pm 6.6 \, \mu\text{g/m}^{3}, 2.47 \times 10^{5} \, \text{個/cm}^{3}) $ 、中濃度曝露群 $ (23.1 \pm 1.0 \, \text{nm}, 39.0 \pm 4.0 \, \mu\text{g/m}^{3}, 5.60 \times 10^{5} \, \text{個/cm}^{3}) $ 、高濃度曝露群 $ (27.2 \pm 2.0 \, \text{nm}, 137.6 \pm 19.9 \, \mu\text{g/m}^{3}, 1.61 \times 10^{6} \, \text{個/cm}^{3}) $ 。

## 2 ）マウスへの曝露スケジュール

マウス①：2週間、1、2ヶ月間の曝露を行なった。コントロール群、中濃度曝露群（粒径22～27nm、31.44μg/m³）、高濃度曝露群（128.56μg/m³）、除粒子曝露群の4群に分けた。

マウス②：6ヶ月と12ヶ月の曝露を行なった。コントロール群(3.6 ± 3.2 μg/m³)、中濃度曝露群（36.35 ± 3.3 μg/m³）、高濃度曝露群（168.34 ± 8.4 μg/m³）、除粒子曝露群（3.1 ± 1.9 μg/m³）の4群に分けた。

## （４）摘出臓器の処理

肝臓の一部は、3倍量の0.25 Mスクロースを含む10 mMリン酸緩衝溶液（pH 7.4）を加え、ホモジネートした。ホモジネートサンプルのタンパク濃度はProtein Assay kit (Bio-Rad社製)を用いて測定した。また、肝臓の一部からCelLytic™ NuCLEAR™ Extraction Kit (SIGMA, Tokyo, Japan)を用いて核抽出を行った。
一部の肝臓と腎臓は、4％パラホルムアルデヒドで固定しパラフィン包埋を行った後、切片を作製した。また、一部の肝臓は10％中性緩衝ホルマリン液で固定をした。

## （5） 病理組織学的檢查

肝臓はHE染色を、腎臓はPAS染色を行い鏡検した。肝臓は壊死、炎症、脂質蓄積を、腎臓はメサンギウム拡大とメサンギウム細胞増殖を中心に観察した。また、1個の腎臓に対して50個の糸球体を無作為に抽出し、メサンギウム拡大の程度により、5段階に分けてスコア化した（0：0%、1：0～25%、2：25～50%、3：50～75%、4：75～100%）。

10％中性緩衝ホルマリン液で固定した肝臓は、パラフィン包埋を行った後3μm切片を作製し、HE染色を行い鏡検した。肝臓の脂肪滴は、4段階に分けてスコア化した（0：0%、1：5～33%、2：33～66%、3：66～100%）。

## （６）血液および組織の生化学的検査

1）血漿アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AST)、アラニンアミノ基転移酵素（ALT）血漿中のAST、ALT値を和光純薬工業のキットを用いて測定した。

## 2 ）血漿中インターロイキン6 (IL-6)

炎症マーカーであるIL-6をELISAキット(Quantikine ELISA Kits, R&D systems, Inc, MN)で測定した。

## 3 ）血液および肝臓の脂質濃度測定

肝臓の脂質はFolchら（1957）の方法で抽出し、トリグリセライド(TG)、総コレステロール(T-Chol)測定用の試料とした。血漿および肝臓のTG、T-Cholは、トリグリセライドE-テストワコー(WAKO社製)及びコレステロールE-テストワコー(和光純薬工業)を用いて測定した。

## 4 ）肝臓の脂肪酸分画の測定

### a. 前处理

肝臓は50mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ buffer=1:3の割合でホモジナイズし、肝臓ホモジネートサンプルを作成した。エッペンチューブに肝臓ホモジネート10μlと生理食塩水10μl、クロロホルム：メタノール=2:1(v/v)溶液100μlを入れ、空気相を窒素置換した後、10分間ボルテックスした。20℃、12000rpmで10分間遠心した。クロロホルム層(下層)を70μl採取し、ねじ蓋のガラス試験管に入れた。血漿の場合は10μlを採取した。窒素気流中でクロロホルムを蒸発させた後、メタノール1.2ml、塩化アセチル75μl、10μg/100μlトリコサンエチル/メタノール(内部標準)25μlを入れ、空気相を窒素置換した後蓋をした。それをヒートブロックに置き100℃で60分間加熱した後、室温まで冷ました。次に試験管内の溶液中にヘキサンを500μl加え、30秒間ボルテックスし、3000rpmで2分間遠心した後、上層をバイアルに移し空気層を窒素置換した後蓋をした。試験管に残った溶液にヘキサンを250μl加え、30秒間ボルテックスし、3000rpmで2分間遠心した後、上層をバイアルに移し空気層を窒素置換した後蓋をした。得られたヘキサン層1μlをGC/MSに供し、脂肪酸メチルエステル、トリ
コサンエチル濃度を測定した。測定対象物質は、飽和脂肪酸のパルミチン酸、ステアリン酸、n-9系不飽和脂肪酸のパルミトレイン酸、オレイン酸、n-6系不飽和脂肪酸のリノール酸、アラキドン酸、n-3系不飽和脂肪酸のリノレン酸、エイコサペンタエン酸(EPA)，ドコサヘキサエン酸(DHA)の計9種とした。

## b．GC/MS分析システム

## i．カラム

Capillary column $ 15m \times 100\mu m $ DB-FFAP(Agilent社製、特注品)

## ii．分析条件

初期条件： 注入口温度 $ 150^{\circ}C $ ，カラム温度 $ 150^{\circ}C $ ，インターフェース温度 $ 280^{\circ}C $ ，

分離カラム昇温プログラム：150℃ 0～0.25min，150～200℃ 0.25～1.25 min，200℃ 1.25～

5.75min, 200~225℃ 5.75~7.75min, 225℃ 7.75~16.25min, 225~245℃ 16.25~16.5min,

245℃ 16.5~18min

キャリアーガス：ヘリウム（流量 0.2mL/min，圧力 280.6kPa）

サンプル注入量：1μl（スプリット比 200:1）

イオン化工ネルギー：70eV

分析モード : SIM m/z67(18:2n-6) m/z74(16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 23:0(内部標準)) m/z79(18:3n-3, 20:4n-6, 20:5n-3, 22:6n-6)

## （7） 肝臓の分子生物学的検査

## 1 ）定量リアルタイムPCR

RNAは、RNeasy Mini kit (QIAGEN社製)を用いて抽出した。抽出したRNAの量・質をGene Quant II RNA/DNA分光光度計(Pharmacia Biotech社製)で確認した後、バイオアナライザー(Agilent)で電気泳動を行い、不純物や分解のないRNAであることを確認した。

相補的DNA (cDNA)はRNA 1μgからOligo (dT) $ _{20} $ primer、SuperScript III $ ^{TM} $ reverse transcriptase (Invitrogen社製)反応溶液20μlを用いて合成した。プライマーは、Ito et al $ ^{3,4} $ ; Nakamura et al $ ^{5} $ ; Yanagiba et al $ ^{6} $ ; Ramdhan et al $ ^{7} $ に記載してあるものを用いたほか、一部のプライマーはPrimer Express 2.0.0 (Applied Biosystems)を使用して設計した。

それぞれのmRNA発現量は、ABI PRISM 7000 Sequence Detector (Applied Biosystems Japan 社製)で測定した。PCR反応は1×SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)、100 nMプライマー溶液を含む反応液25 μlを用いて行った。50℃で2 min, 95℃で10 minの反応の後、95℃で15 sec, 60℃で1 minのサイクルを40回行った。Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)をハウスキーピング遺伝子として使用してデータ解析に用いた。すべての遺伝子のmRNA発現量はGAPDH発現量によって補正した。

6ヶ月の肝臓を用いて以下の物質由来のmRNAを調べた。

- PPARα、PPARγ、PPARαの標的遺伝子であり脂質代謝に関わるmedium chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD)、very long chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD)

- 脂質合成に関与するfatty acid synthase（FAS）、microsomal triglyceride transporter protein（MTP）、diglyceride acyltransferase（DGAT）1, 2

コレステロールの動態に関与するLDL receptor（LDL-R）、Sterol Regulatory Element-Binding
## Protein (SREBP)

• 過酸化脂質の除去に関与するsuperoxide dismutase (SOD)1,2

- DNAマイクロアレイにおけるパスウェイ解析の結果ランキング上位であったもの（エイコサノイド合成、PG合成・制御、脂肪酸生成、コレステロール生成、概日リズム、アンドロゲン受容体シグナル、細胞周期、G1→S期細胞制御、ヘッジホッグシグナル、脂質代謝や毒性に関与する核内受容体、ステロイド生成合成経路）のうち、精巣のマイクロアレイの結果でも上位に挙がっていたエイコサノイド合成、PG合成・制御の部分に関わる物質

## 2 ）ウェスタンブロット

肝ホモジネートの泳動用サンプルを用い、10%SDS-PAGEを行った後、ニトロセルロース膜0.45μm (Bio-Rad Laboratories 社製)に転写した。3%スキムミルクでブロッキングした後、各膜をそれぞれ1次抗体でインキュベーションした。50 mM Tris-HCl緩働溶液 (pH 7.8)、0.05%Tween含有 50 mM Tris-HCl緩働溶液 (pH 7.8)で洗浄後、2次抗体（アルカリフォスファターゼ標識goat anti-rabbit IgG (Jackson Immuno Research社製))と反応させた。一次抗体はbifunctional protein (hydrase + 3-hydroxylacyl-CoA dehydrogenase) (PH) (Osumi T et al., 1980)、Peroxisomal thiolase (PT) (Furuta et al., 1981)、medium chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) (Miyazawa et al., 1980)、very long chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD) (Izai K et al., 1992)を使用しその他の一次抗体はSanta Cruz社より購入した。発色は1-Step™NBT/BCIP (PIERCE社製)を用いた。それぞれのバンドはLane & Spot Analyzer version 5.0 (ATTO社製)を用いて検出し、数値化した。

## 3 ）PPARα/PPRE 結合試驗

PPARα は核内で peroxisome proliferator-activated receptor response element (PPRE) に結合し、転写が行われる。そこで、肝臓中の PPARα の PPRE への結合能を PPARα transcription factor assay kit (Cayman chemical, Ann Arbor, MI) を用いて測定した。20 μg の核タンパクをサンプルとし、マニュアルに従って測定した。

## 4 ）DNA マイクロアレイによる網羅的解析

DNAマイクロアレイは東レ株式会社に委託し実施した。高感度DNAチップ3D-Geneを用いて、1色法で解析を行った。ノーマライゼーションによるデータの標準化ののち、変動比2倍を閾値にして発現変動のある遺伝子を同定した。抽出された遺伝子をGenMAPPを用いてパスウェイ解析を、また少なくとも1比較以上で閾値を越えた遺伝子2903個からクラスター解析ソフト(Cluster 3.0)で階層クラスター解析を行った。

## （8） 統計解析

脂質蓄積のスコアに関してはFisherの正確検定を行い、定量リアルタイムPCRの結果についてはDunnetの多重比較を行った。それ以外のデータに関しては、一元配置の分散分析の後、Dunnetの多重比較を行った。P<0.05を有意とした。

## 4 ．結果及び考察
## （１）曝露条件ごとの曝露空気質

曝露期間中にモニタリング計測した曝露空気質（粒子の粒径モード値、質量濃度、およびNOガス/NO_{2}ガス濃度）では、概ね、曝露空気中のナノ粒子の粒径はモード値にして20数nmであった。またナノ粒子の質量濃度は、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群でそれぞれ4～5、40～45、120～150μg/m^{3}であり、除粒子曝露群ではコントロールと同程度の値が得られていた。またガス成分の濃度に関しては、中濃度および高濃度曝露群では粒子の濃度と同じ傾向の大小関係にあり、さらに除粒子曝露群では高濃度群と同程度であった。

## （2） 病理組織学的檢查

## 1 ）2週～2か月曝露マウス

肝臓では、 $ Ppar\alpha-null $ マウスで曝露により脂質の蓄積が促進している傾向が見られた（図2）−1）。一方野生型では除粒子曝露群で軽い壊死が観察された他は、曝露依存的な顕著な傾向は見られなかった。

腎臓では、糸球体、尿細管ともに形態学的に顕著な変化は見られなかった（図 $ ^{(2)} $ -2）。高濃度曝露群とコントロール群に関してはメサンギウムの拡大、細胞増殖のスコア化を行ったが、曝露依存的な変化は見られなかった（表 $ ^{(2)} $ -1）。

図(2)－1 野生型と $ P_{para} $ -null マウスの肝臓病理所見。図中の control、Medium、High、Filtered-High はそれぞれ、対照群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。
図(2)－2 腎臓の病理組織（弱拡大、強拡大）。図中のcontrol、High、F-Highはそれぞれ、コントロール群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

表(2)−1 腎臓のメサンギウムの病理変化スコア

個体No.	1	2	3	4	5	スコア	個体No.	1	2	3	4	5	スコア
Wild type	1	11	5	5	5	4	1.53	1	5	11	3	2	6	1.74
2	8	7	4	2	8	1.83	2	10	3	7	7	4	1.74
3	9	5	8	3	10	2.00	3	9	4	6	4	7	1.87
4	5	7	7	10	8	2.24	4	6	6	6	6	14	2.42
5	7	5	10	8	7	2.08	5	6	7	10	8	12	2.30
6	6	7	4	6	7	2.03	6	7	7	8	20	8	2.30
7	6	4	4	2	7	2.00	7	1	7	9	4	11	2.53
8	12	5	9	10	5	1.78	8	3	5	7	8	9	2.47
Wild type	1	8	5	5	11	10	2.26	1	7	7	3	10	12	2.33
2	12	10	10	5	7	1.66	2	7	5	3	6	7	2.04
3	12	10	7	7	3	1.46	3	4	4	7	11	5	2.29
4	2	8	8	7	4	2.10	4	4	4	7	8	6	2.28
5	7	4	7	4	7	2.00	5	9	3	17	18	5	2.13
6	8	10	8	4	8	1.84	6	7	5	9	10	6	2.08
7	3	4	5	5	6	2.30	7	3	7	4	5	4	2.00
8	6	8	7	6	8	2.06	8	9	4	7	9	3	1.78

## 2 ）6～12カ月曝露マウス

肝臓の病理学的変化を観察したところ、6ヶ月、12ヶ月曝露ともに除粒子曝露をふくめた曝露によって肝臓の脂質の蓄積がおこることが明らかとなった（表(2)－2、Fisher正確検定でp<0.01）。6ヶ月曝露後の肝臓の中性脂肪濃度はコントロール群に比べて全ての曝露群で上昇していたが、12ヶ月曝露後では高濃度曝露群と除粒子曝露群のみで上昇していた（図(2)－3）。肝臓のコレステロール(T-chol)濃度は、コントロール群に比べて、6ヶ月曝露後では高濃度曝露群と除粒子群で、12ヶ月曝露後では全ての曝露群で上昇していた。

表(2)－2 NRDE 6、12ヶ月曝露後の肝臓病理組織学的脂質の蓄積。図中の Control、Medium NR-DE、High NR-DE、F-DE はそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除
粒子曝露群を表す。

Steatosis
n	0	1	2
6M	12	Control	75%	25%	0%
12	Medium NR-DE	58%	33%	8%
12	High NR-DE	42%	58%	0%
12	F-DE	75%	17%	8%

n	0	1	2
12M	14	Control	57%	29%	14%
13	Medium NR-DE	15%	46%	38%
14	High NR-DE	29%	57%	14%
14	F-DE	29%	71%	0%

図(2)－3 NRDE 6、12 ヶ月曝露後の肝臓中のトリグリセライド、コレステロール量。図中のControl、Medium、High、F-highはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## （３）血液および組織の生化学的検査

1）血漿アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AST)、アラニンアミノ基転移酵素（ALT）a．1～3ヶ月曝露ラット

血漿中の AST、ALT は 1 ヶ月曝露の中濃度曝露群、高濃度曝露群で上昇していた（図(2)－4）。しかし、2 ヶ月、3 ヶ月曝露後では変化は見られなかった。
図(2)−4 血漿中の AST と ALT 値。グラフは平均 ± 標準偏差を示す。白がコントロール、薄い灰色が低濃度、濃い灰色が中濃度、黒が高濃度群を示す。 $ ^{*}p<0.05 $ （同曝露期間のコントロールと比較）

## b．2週～2ヶ月曝露マウス

血漿 ALT 活性には曝露による変化は見られなかった（図(2)−5）。

図(2)−5 血漿中の ALT 活性

## 2 ）血漿中インターロイキン6 (IL-6)

## a．1～3ヶ月曝露ラット

血漿中の IL-6 は 1 ヶ月曝露後の高濃度曝露群で有意に上昇していた (図(2)－6)。

AST や ALT 同様、2 ヶ月、3 ヶ月曝露後には変化は見られなかった。
図(2)−6 血漿中IL-6濃度。グラフは平均 ± 標準偏差を示す。白がコントロール、薄い灰色が低濃度、濃い灰色が中濃度、黒が高濃度群を示す。*p<0.05 （同曝露期間のコントロールと比較）

## 3 ）血液および肝臓の脂質濃度測定

## a．1～3ヶ月曝露ラット

血漿中の T-chol は 1 ヶ月、2 ヶ月、3 ヶ月ともに変化が見られなかった（図(2)－7）。血漿中の TG は 3 ヶ月曝露の高濃度曝露群で有意に増加していたが、1 ヶ月、2 ヶ月曝露後では変化は見られなかった。

一方、肝臓中の T-chol は 2 ヶ月曝露の中濃度曝露群のみ有意に低下していたが、曝露濃度依存的な変化は見られなかった（図(2)－8）。肝臓中の TG は血漿中の TG 同様 3 ヶ月の高濃度曝露群で有意に増加していたが、1 ヶ月、2 ヶ月曝露後では変化は見られなかった。

図(2)－7 血漿中T-cholとTG濃度。グラフは平均 ± 標準偏差を示す。白がコントロール、薄い灰色が低濃度、濃い灰色が中濃度、黒が高濃度群を示す。 $ ^{*}p<0.05 $ （同曝露期間のコントロールと比較）
図(2)−8 肝臓中T-cholとTG濃度。グラフは平均±標準偏差を示す。白がコントロール、薄い灰色が低濃度、濃い灰色が中濃度、黒が高濃度群を示す。 $ ^{*}p<0.05 $ （同曝露期間のコントロールと比較）

## b．2週～2ヶ月曝露マウス

肝臓中の TG 量、T-chol 量ともに $ P_{para}-null $ マウスの方が野生型マウスに比べ多かったが、NRDE 曝露により、TG 量は 2 ヶ月曝露の野生型で上昇し、T-chol 量は両遺伝子型で上昇していた（図 $ (2)-9 $ ）。

*曝露期間が同一のコントロールと比較して$p<0.05$

TG、T-cholともに、Ppara-nullマウスで有意に高値を示した。

図(2)−9 肝臓の TG、T-chol 值

## 4 ）肝臓の脂肪酸分画の測定

### a. 1～3ヶ月曝露マウス

血浆中脂肪酸分画の結果を図(2)-10、肝臓中脂肪酸分画の結果を図(2)-11に示す。

飽和脂肪酸であるパルミチン酸とステアリン酸、パルミチン酸の代謝物であるω-9系不飽和脂肪
酸のパルミトレイン酸は血漿中、肝臓中ともに統計学的に有意な結果は見られなかった。しかし、低濃度曝露により血漿中のパルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸ともに減少する傾向が見られた。一方、肝臓中では曝露濃度依存的に上昇する傾向が観察された。ステアリン酸の代謝物であるω-9系不飽和脂肪酸オレイン酸の血漿中濃度は低濃度曝露群で有意な減少が観察された。肝臓中のオレイン酸はパルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸同様に曝露濃度依存的に上昇する傾向が見られたが、有意差は見られなかった。

必須脂肪酸の1つであるω-6系不飽和脂肪酸のリノール酸は低濃度曝露群で血漿中の濃度が減少していたが、その代謝物であるアラキドン酸に変化は見られなかった。ω-3系の必須脂肪酸であるα-リノレン酸は血漿において曝露群全てで有意な低下を示したが、その代謝物エイコサペンタエン酸（EPA）は低濃度群のみ低下、ドコサヘキサエン酸（DHA）はどの群でも有意差は見られなかった。一方、肝臓中では、中濃度曝露のEPA群で有意に上昇をしていたが、それ以外有意差は見られなかった。

測定した脂肪酸全ての合計をみると、有意ではないが、血漿中で低濃度曝露群が低下傾向、肝臓中では濃度依存的に増加傾向を示した。

図(2)-10 血漿脂肪酸分画。平均±標準偏差（単位はμg/ml）*Significant different from control group (p<0.05)
図(2)-11 肝臓中脂肪酸分画。平均±標準偏差(单位はμg/g)*Significant different from control group (p<0.05)

## （４）肝臓の分子生物学的検査

## 1 ）定量リアルタイムPCR

## a．1～3ヶ月曝露ラット

## i．肝臓のPPARαとその標的遺伝子、およびTNFαのmRNA発現量

1 ヶ月の高濃度曝露群で PPARα の上昇が認められた。また、PPARα の標的遺伝子であり、脂質代謝に関与する酵素 VLCAD、PH も同様に 1 ヶ月の高濃度曝露群で上昇していた。2 ヶ月、3 ヶ月後は変化が見られなかった。PPARα による抗炎症作用の標的となる NFκB に関しては、p50, p65 の両サブユニットともに 1 ヶ月の高濃度曝露群で上昇が見られたが、2 ヶ月、3 ヶ月曝露後は変化が見られなかった。炎症マーカーである TNFα は 1 ヶ月の中濃度、高濃度曝露群で有意に上昇していたが、2 ヶ月、3 ヶ月曝露後は変化が見られなかった（図(2)－12）。
図(2)−12 肝臓の PPARα とその標的遺伝子と TNFα の mRNA 発現量。グラフは平均 ± 標準偏差を示す。白がコントロール、薄い灰色が低濃度、濃い灰色が中濃度、黒が高濃度群を示す。 $ ^{*}p<0.05 $ （同曝露期間のコントロールと比較）。1 ヶ月曝露 Control 群の発現量を 1.0 として表した。

## ii．肝臓の TG 合成と運搬に関わる物質の mRNA 発現量

3 ヶ月曝露後に血中ならびに肝臓中の TG 量が増加していることから、TG 合成に関わる Dgat1,2 と、TG の運搬に関わる MTP の mRNA 量を 3 ヶ月曝露後の肝臓を用いて調べた。いずれも有意な変化は認められなかった（図(2)－13）。

図(2)−13 3カ月曝露ラットの肝臓中の TG 合成と運搬に関わる物質の mRNA 発現量。グラフは平均 ± 標準偏差を示す。白がコントロール、薄い灰色が低濃度、濃い灰色が中濃度、黒が高濃度群を示す。Control 群の発現量を 1.0 として表した。

### iii. AhR とその標的遺伝子の mRNA 量

ディーゼル排気ガス中には芳香族炭化水素が多く含まれるため、その標的となる AhR, について炎症の観察された 1 ヶ月曝露の肝臓で調べた（図(2)−14）。AhR とその標的となる CYP1A1,
CYP1A2 ともに変化が見られなかった。

図(2)−14 1ヶ月曝露ラットの AhR とその標的遺伝子の mRNA 発現量。グラフは平均 ± 標準偏差を示す。Control 群の発現量を 1.0 として表した。

## iv．酸化ストレス関連遺伝子の mRNA 量

炎症の見られた1ヶ月曝露の肝臓で酸化ストレス関連遺伝子について調べた（図2）－15）。好中球走化因子であるCINCが高濃度曝露群で有意に増加していた。スーパーオキサイドジスムターゼ（SOD）1,2については変化が見られなかった。
図(2)−15 一ヶ月曝露ラットの酸化ストレス関連遺伝子の mRNA 発現量。グラフは平均 ± 標準偏差を示す。コントロール群の発現量を 1.0 として表した。*p<0.05 （コントロールと比較）

## b．2週～2ヶ月曝露マウス

野生型マウスのPPARαは2週間と2ヶ月の除粒子曝露群で有意に上昇していたが、1ヶ月では有意に減少していた(図(2)−16)。PPARαの脂質代謝の標的遺伝子であるPTは2ヶ月の除粒子曝露群で上昇し、 $ Ppar\alpha-null $ マウスの除粒子曝露群では減少していた。炎症に関わるNFκB p50, p65は2ヶ月曝露の野生型の除粒子曝露群でのみ有意に上昇していた。一方 $ Ppar\alpha-null $ マウスでは、2ヶ月曝露のp50を除いたすべての曝露期間において、除粒子曝露群でNFκB p65とp50 mRNAが有意に減少していた。
* 曝露期間が同一のコントロールと比較して$p<0.05$

* 曝露期間が同一のコントロールと比較して$p<0.05$

図(2)－16 2 週間～2 ヶ月曝露マウスの PPARα とその関連遺伝子発現の変化

### c. 1～3ヶ月曝露マウス

PPARα、PPARγ、そしてPPARαの標的遺伝子のMCAD、VLCAD-mRNAはNRDE、F-DE曝露による統計学的に有意な変化は見られなかったが、PPARαは除粒子曝露群で、PPARγは高濃度曝露群、除粒子曝露群で上昇傾向が見られた(図(2)－17)。中濃度、高濃度曝露により脂肪酸合成に関わるFAS-mRNAが上昇し、中濃度曝露群のみで肝臓から血中にTGを排泄するMTPとTGの合成に係るDGAT1-mRNAが上昇していた。LDL-R、SREBPには変化は見られなかった。SOD1は中濃度曝露、除粒子曝露により上昇していたが、SOD2-mRNAは変化が見られなかった。
図(2)−17 1 ヶ月曝露ラットの定量リアルタイム PCR の結果

## 2 ）ウェスタンブロット

## a．1ヶ月曝露ラット

mRNA 量に変化のあった 1 ヶ月曝露後の肝臓を用いてタンパク発現量を測定した。mRNA 同様、PPARαは高濃度曝露群で有意な増加が見られた。また、核内の NFkB p50, p65 の発現に関しても p50 では中濃度、高濃度曝露群で、p65 では高濃度曝露群で有意な増加が見られた。一方 PPARα の標的遺伝子であり、脂質の β 酸化に関わる PH, PT, VLCAD はいずれも変化が見られず、mRNA とは異なっていた（図(2)－18）。
図(2)−18 1ヶ月曝露ラットの肝臓の PPARα とその標的遺伝子のタンパク発現量。グラフは平均 ± 標準偏差を示す。白がコントロール、薄い灰色が低濃度、濃い灰色が中濃度、黒が高濃度群を示す。 $ ^{*}p<0.05 $ （同曝露期間のコントロールと比較）Control群の発現量を1.0として表した。

## 3 ）PPAR $ \alpha $ /PPRE 結合試驗

## a．1ヶ月曝露ラット

1 ヶ月曝露ラットの肝臓中の PPARα の PPRE への結合を測定した。中濃度、高濃度曝露群で有意に結合が増加していた（図(2)−19）。

図(2)−19 1ヶ月曝露ラットの肝臓中の PPARα の PPRE 結合能。グラフは平均 ± 標準偏差を
示す。白がコントロール、薄い灰色が低濃度、濃い灰色が中濃度、黒が高濃度群を示す。 $ ^{*}p<0.05 $ （コントロールと比較）

## 4 ）DNAマイクロアレイによる網羅的解析

### a. 1～3ヶ月曝露マウス

## i．パスウェイ解析、クラスター解析

Z score値を基にパスウェイのランキング化を行った結果、エイコサノイド合成、PG合成・制御、脂肪酸生成、コレステロール生成、概日リズム、アンドロゲン受容体シグナル、細胞周期、G1→S期細胞制御、ヘッジホッグシグナル、脂質代謝や毒性に関与する核内受容体、ステロイド生成成経路が抽出された(表(2)−3)。脂肪酸やコレステロール、ステロイドの合成、エイコサノイド合成、PG合成・制御、それらに関与する核内受容体といった脂質ホメオスタシスの攪乱が見られていることが注目される（図(2)−20～26）。その他の注目遺伝子としては、これまでにNRDE曝露によって上昇が確認され、脂質代謝や抗炎症作用に関与するペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体(PPAR)αは、本実験の結果は1.2−1.5倍程度の軽度の上昇であった。

表(2)−3 パスウェイ解析により抽出された経路

13-3/10-1	13-5/10-1	13-3/10-4	13-5/10-4
Up	·脂肪酸生成	·アンドロゲン受容体シグナル·細胞周期·G1→S期細胞制御·ヘッジホッグシグナル	·細胞周期·ステロイド生成	なし
Down	·エイコサノイド合成·PG合成·制御	·コレステロール生成成·概日リズム·PG合成·制御	·脂質代謝や毒性に関与する核内受容体	·コレステロール生成

高濃度 NRDE 曝露群 13−3，5 と 対照群 10−1，4 と を 比し た 結果 である。

図(2)－20 パスウェイ解析結果の見かた（高濃度曝露群：13-3，13-5とコントロール群：10-1，10-4の比）
図(2)-21 肝臓PG合成・制御経路

図(2)－22 肝臓ステロイド合成経路
図(2)−23 エイコサノイド合成経路

図 $ (2) $ -24 脂肪酸合成経路

図(2)－25 肝臓コレステロール合成

脂質代謝や毒性に関与する核内受容体

図(2)−26 脂質代謝や毒性に関与する核内受容体経路
クラスター解析を行い、上昇した遺伝子は3つに、低下した遺伝子は4つに大別された（図2）−27）。機能がまだ解明されていない遺伝子も含まれているが、クラスタリングされた結果から同じ挙動を示す遺伝子であるとの推測が可能となった。

図(2)－27 クラスター解析の結果

## ii．総合的解析

定量的リアルタイムPCRの結果をDNAマイクロアレイの結果と共に以下、図(2)－28～31に示す。DNAマイクロアレイの結果は、高濃度NR-DE群2匹と新鮮空気群2匹の4通りの組み合わせを示している。

リン脂質からのアラキドン酸産生に関与するホスホリパーゼA2 group 4aは中濃度曝露群で上昇していた（図2）−28）。同様に、アラキドン酸からPGH2を合成するPtgs−1は高濃度群で、Ptgs−2は中濃度群で上昇していた。一方、アラキドン酸合成酵素を抑制するannexinと相互作用するs100 proteinは中濃度群で上昇していたが、Annexin1は高濃度曝露群で減少していた。

PGH_{2}からPGI_{2}, D_{2}, E_{2}の合成酵素は、DNAマイクロアレイの結果では一定の結果が見られなかったが、定量的リアルタイムPCRの結果、I2の合成酵素Ptgis、D2の合成酵素Ptgds、E2の合成酵素Ptgesともに有意な変化は見られなかった（図(2)－29）。しかし、PGE受容体サブタイプ3は中濃度曝露群で上昇していた。

アラキドン酸からシクロオキシゲナーゼ系ではなくリポキシゲナーゼへの経路はDNAマイクロアレイの結果、ほとんど動いていなかったが、精巣で変化のあった一部のmRNAの測定を行った（ $ 2)-30 $ ）。Alox15, Tgm2ともに変化は見られなかった。

DNAマイクロアレイの結果、N R D E 曝露により肝臓で非常に強い変化が見られたのは、Cyp26a1とHsd17β2であったため、これらのmRNA発現量の測定を行った（図2）－31）。Cyp26a1はDNAマイクロアレイのように強い減少は観察されなかったが、高濃度群で低下傾向を示した。一方、Hsd17β2は、中濃度、高濃度曝露群で有意に上昇していた。また、これまでにNR-DEおよび除粒子曝露で誘導が確認されているペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体の、他のサブタイプであるPparβ-mRNA
は変化が見られなかった。

以上をまとめると、定量リアルタイムPCR解析の結果、Pla2g4a, S100a10, S100a6, Ptgst1が中濃度群で上昇、Ptgst2は高濃度で上昇、Annexin A1が高濃度で減少、Hsd17β2が中濃度、高濃度で上昇していた。肝臓ではリン脂質からPGH_{2}の産生する経路が亢進していることが明らかになったが、その下流の明らかな変化は見られなかった。

図(2)－28 phospholipase A2とその制御に関わるmRNA

図(2)－29 PG産生に関わるmRNA