Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
図(2)－30 リポキシゲナーゼ経路のmRNA

図(2)−31 その他、注目のmRNA

## （５）全体のまとめと考察

本実験では、NRDE曝露により肝臓の炎症が引き起こされることが明らかとなった。ナノ粒子は大きい粒子に比べ血流に入りやすいことや、表面積が大きく様々な毒性物質を凝縮して運べるという性質 $ ^{1} $ などから、肝臓などの全身の臓器に影響を及ぼすと考えられている $ ^{2} $ 。しかし、これまでにディーゼル排気ガス曝露により気道や肺で炎症が観察されるという報告は多数みられるが $ ^{8,9} $ 、肝臓での炎症に着目した論文はほとんどない。その理由の一つは、粒子が凝集しやすくナノ粒子のまま曝露することが難しいことにあると考えられる。国立環境研究所のNRDE曝露施設は、粒子の大部分がナノ粒子の状態で曝露をすることが可能であり $ ^{10} $ 、それにより肝臓に影響が見られたのではないかと考えられる。

本研究では、肝臓での炎症は中濃度群から観察された。ディーゼル使用車ならびにバスからの$\mathrm{PM}_{2.5}$ 曝露は$73\ \mu\mathrm{g}/\mathrm{m}^{3}$ と見積もられている$^{[11]}$。中濃度群はその濃度を下回っており、現実的にヒトの曝露が考えられる濃度である。ただし、実際の環境中でナノ粒子は多く観察されるが、一部は凝集し$\mathrm{PM}_{10}$ 等の比較的大きな粒子も含んだ状態で存在する。したがって、ヒトはナノ粒子として曝露されることは少ないので、今回ラットで観察された肝臓障害がヒトでも観察されるかど
うかは、現時点では結論付けることはできない。しかし重量濃度で現在の環境基準値と同程度のナノ粒子曝露が今まで注目されることがなかった肝障害を誘発するという新たな知見は注目すべきであろう。

本研究の結果から炎症は肝臓の NFκB を介していると考えられる。ディーゼル排気微粒子 (DEP) 曝露後の NFκB の上昇は肝臓では報告されていないが、ヒトの気道等で報告されている $ ^{12)} $ 。DEP 曝露により肺胞マクロファージでは NFκB を介して TNFα を誘導することが報告されているが $ ^{13)} $ 、肝臓でも同様に NFκB の誘導により TNFα が上昇したと考えられる。

ディーゼル排気ガス曝露により肝臓中の PPARα が誘導される報告は初めてである。核内受容体 PPARα は NFκB の核内移行を抑制し抗炎症作用を発揮する $ ^{14} $ 。しかし本研究では PPARα の上昇は見られたが、NFκB も 1 ヶ月曝露時に上昇が見られた。この理由は今のところ不明である。一方ディーゼル排気ガス中には多種類の芳香族炭化水素が含まれているが、今回の結果では芳香族炭化水素の受容体である AhR やその標的遺伝子の発現量には変化は見られなかった。AhR はサイトカインを誘導することによって炎症を引き起こすが $ ^{15} $ 、PPARα は AhR の発現量を増加させるが、AhR の炎症作用を抑える働きを有している $ ^{16} $ 。今回の結果では、AhR の発現量も増えておらず、また抗炎症作用も見られていない。このような観点から考えても、PPARα が機能していないかもしれない。ただ、ベンゾピレンなどの芳香族炭化水素によるサイトカイン TNFα の上昇は AhR ではなく Extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) を介しているとの報告 $ ^{17} $ もあり、今後 ERK についても検討が必要である。

PPARαはβ酸化酵素の誘導を介して脂質代謝を亢進させることが知られている $ ^{18)} $ 。また、PPARαの標的遺伝子はmRNAでは上昇が見られたが、タンパク量では変化が見られなかった。3ヶ月曝露後には血中、肝臓中ともにTGの上昇が見られたが、TG合成酵素であるDgatには変化が見られなかった。db/dbマウスにディーゼル排気ガスを曝露した実験においても新鮮空気を曝露したものに比べ肝臓中の脂肪肝の程度は上昇傾向にあるが統計的に有意ではなかった $ ^{19)} $ 。この実験では血漿中のTGの上昇は見られていないが、肝臓中のTGは測定しておらず、肝臓中の脂肪肝がTGによるものかどうかはわからなかった。

以上をまとめると、NRDE曝露により肝臓で炎症と脂質の蓄積が見られた。NRDE曝露はAhRではなくPPARαを誘導した。しかしPPARαの抗炎症作用は見られなかった。

続いて、マイクロアレイの結果では、全ての組み合わせで1.2-1.5倍程度の軽度の上昇であった。しかし、 $ P_{para-null} $ ウスを用いた実験結果より、NRDEの肝毒性においてPPARαは曝露期間により反応が異なる（1又は3か月後はNRDEやF-DE曝露により誘導しているが、2か月では抑制されている）。しかしながら、野生型で見られた影響が $ P_{para-null} $ ウスでは観察されておらず、PPARαは重要であることが示唆される。

今回パスウェイ解析で抽出されたエイコサノイド合成経路やPG合成経路、脂肪酸生成は内因性のPPARのリガンドの生成経路であり、長鎖脂肪酸やエイコサノイドはPPARのすべてのサブタイプのアゴニストとして働くことが報告されている $ ^{8)} $ 。ラットにNRDEを1,2,3ヶ月曝露したところ、1ヶ月では炎症が観察されたが、2ヶ月以降は炎症が抑えられている（22年度報告書）。今回のマイクロアレイはこの1ヶ月の肝臓を用いており、このような内因性のPPARのリガンドの合成が炎症を抑えるのに働いた可能性がある。今後はNRDE曝露の内因性のリガンドへの影響を測定を行う必要がある。また、アラキドン酸からPGH2の合成が促進していること、アラキドン酸合成酵素
を抑制するannexinが減っていることからアラキドン酸が一つのマーカーになる可能性が考えられる。

F-DE曝露においてもNRDE同様PPARαが1又は3か月後誘導、2か月後は抑制されていることから、ガス成分にPPARαに作用する物質が存在することが示唆される。このような外因性のPPARのリガンドに加え、内因性のPPARのリガンド生成の攪乱により、脂質の代謝が抑えられ、長期曝露時の脂質の蓄積につながったと考えられる。

また、血中のテストステロンの上昇の結果と照らし合わせた際、肝臓でのコレステロール生合成は低下していたが、プロジェステロンから17αOHプロジェステロンへの変換酵素CYP17a1の上昇が見られたことが、精巣だけではなく、血中のテストステロン上昇につながっているかもしれない。エストロンとエストラジオールの間の変換酵素であるHSD17β2が強く誘導されていたことも注目される。

以上から、NRDE曝露、除粒子曝露ともに脂質ホメオスタシスを攪乱させ、TGやT-chol濃度を上昇させることが明らかとなった。今後マイクロアレイで変化のあった他の経路についても検討が必要である。

DEP 曝露によって PG が産生されることは、過去にいくつか in vitro での報告がある。ヒト肺胞上皮細胞 A549 で Cox, $ PGE_{2} $ の上昇 (Ahn et al., 2008)、肺のマクロファージでアラキドン酸、 $ PGE_{2} $ の産生上昇 (Beck-Speier et al., 2005) というように炎症に関与しているという報告がある一方、ヒトの単球での $ PGE_{2} $ 産生を引き起こし LPS 刺激による炎症に対して抗炎症作用を示す (Hofer et al., 2004) との報告もある。 $ PGE_{2} $ , $ PGJ_{2} $ は TNFα を抑制する (Spengler et al., 1989; Petrova et al., 1999) ことから、NR-DE 曝露 1 か月では見られた炎症が 2、3 か月曝露後では見られなかったところに PG が関与しているかもしれない。

このように、DEP との関係が示唆されている PG は主に $ PGE_{2} $ である。しかし今回は $ PGE_{2} $ の合成酵素の mRNA 発現は個体差が大きく、NR-DE による誘導は観察されなかった。一方、PGE の受容体が中濃度で有意に上昇していた点は注目される。NR-DE によるこれらの PG 合成・制御への影響は今後も検討する必要があると思われる。

本研究で高濃度NRDEによる低下が観察されたAnnexin 1は細胞質ホスホリパーゼA2(cPLA2α)に直接結合して活性を阻害すると考えられている(Kim et al., 1994)。また、炎症細胞のアポトーシスを促進することが報告されているため(Parente and Solito, 2004)、Annexin 1の低下は1カ月曝露後に観察された肝臓の炎症に寄与していると思われる。本研究で調べたAnnexin 1はs100a6とs100a11に結合するが、s100a10はAnnexin 2に結合することから(Streicher et al., 2009)、Annexin 2も変化しているかもしれない。

脂肪酸への影響については、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、α-リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸とDHAが、1日5時間、週1回、16週間、2mg/m³のDEPを曝露した雄Wistar Kyotoラットの心臓のミトコンドリア画分中で報告されているのみである(Kodavant et al., 2011)。この研究では、酸化ストレスにより心臓ミトコンドリア膜の不飽和脂肪酸の組成が変わったのではないかと考察している。一方、DE曝露により、肺組織のホスファチジルコリンへのパルミチン酸の取り込みが促進することが報告されている(Wright, 1986)。本研究でも、血漿中の脂肪酸はNRDE曝露により低下を示したのに対して、肝臓中での脂肪酸量が増加傾向であったことは、このような肝臓への取り込みの促進によるものかもしれない。
また、DE ではないが、DE に含まれる 1-ニトロピレンは stearoyl-CoA desaturase 1 の活性を低下させ、脂質ホメオスタシスを攪乱していることが示唆されている (Podechard et al., 2011)。本研究でも、stearoyl-CoA desaturase 1 の代謝物であるオレイン酸は血漿中で低下している。

本研究で最も大きく低下していた脂肪酸は $ \alpha- $ リノレン酸であった。 $ \omega-3 $ 系／ $ \omega-6 $ 系の比率が低下すると、アラキドン酸カスケードで炎症に進むことが明らかになっている (Valenzuela and Videla, 2011)。また、魚油摂取による $ \omega-3 $ 系の EPA と DHA の補給が浮遊粒子状物質による心拍変動を予防するということが報告されている (Romieu et al., 2005) ことから、NRD E 曝露による $ \omega-3 $ 系の $ \alpha- $ リノレン酸、EPA の低下が、TNF $ \alpha $ や IL-6 の上昇をもたらしていたかもしれない。

その他本研究では、 $ Hsd17\beta2 $ はマイクロアレイ同様の上昇が中濃度、高濃度で観察された。 $ Hsd17\beta2 $ は肝臓や胎盤などに存在し、テストステロンからアンドロステンジオンへ、またエストラジオールからエストロンへ酸化し、性ステロイドを生理的に不活性化させる酵素である(Labrie et al., 1997)。NRDEの曝露による血中のテストステロンの上昇に伴い増加したのではないかと考えられるが、高濃度でも上昇しており、更なる検討が必要である。

以上から、NRDE曝露は脂質恒常性を攪乱させることが明らかになった。22年度の研究において、NRDE、F-DEともに、TGやT-chol濃度を上昇させることが明らかとなっていることから、ガス成分が脂質恒常性を攪乱することが示唆される。また、血漿中のα-リノレン酸は、NRDE曝露すべてで低下をしており、NRDEの影響バイオマーカーになる可能性が考えられる。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究の結果、これまでほとんど注目されてこなかった、NRDE曝露による肝臓への影響の一端が明らかになった。今回使った曝露装置は世界でも類を見ない規模・精度のものであるために重要な科学的成果であると考えられる。

## （２）環境政策への貢献

ディーゼル排ガスの吸入が肝臓機能に影響をあたえることを示した研究成果であり、環境基準値よりはるかに低い15 μg/m³の曝露相当の曝露でも肝臓の脂質量に変化をもたらすことが明らかとなった。同濃度は先行研究においてテストステロン濃度の有意な上昇が確認されているものと同じレベルのものであり、また今回の研究では粒子を除去したガス成分のみの曝露においても高濃度NRDE曝露群同様に肝臓の脂質の蓄積が観察されている。これらのことから、環境基準値と粒子規制を主とする排気ガス規制の見直しの検討が必要となるかもしれないが、その際の科学的知見として貢献できると考えられる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

Dr. Frank J Gonzalez（米国NIH）核内受容体に関する専門知識の提供

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>
1) DH.RAMDHAN, Y.ITO, Y.YANAGIBA, N.YAMAGISHI, Y.HAYASHI, C.LI, S.TANEDA, AK.SUZUKI, G.WATANABE, K.TAYA, M.KAMIJIMA, T.NAKAJIMA: Toxicology Letters. 1(2-3):103-8 (2009).

“Nanoparticle-rich diesel exhaust may disrupt testosterone biosynthesis and metabolism via growth hormone.”

2) N. YAMAGISHI, Y.ITO, DH.RAMDHAN, Y.YANAGIBA, Y.HAYASHI, D.WANG, CM.LI, S.TANEDA, AK.SUZUKI, K.TAYA, G.WATANABE, M.KAMIJIMA, T.NAKAJIMA: Inhal Toxicol, accepted

“Effect of nanoparticle-rich diesel exhaust on testicular and hippocampus steroidogenesis in male rats.”

3）伊藤由起、ラムダンドニヒクマット、柳場由絵、山岸希、上島通浩、那須民江：日本衛生学雑誌 66(4)：638-642（2011）

「ナノ粒子を多く含むディーゼル排気ガス曝露による肝臓への影響」

4) 山岸 希、伊藤由起、ラムダンドニヒクマット、那須民江: 日本衛生学雑誌 66(4):634-637(2011)「ディーゼル排気ナノ粒子のステロイド合成系への影響とメカニズム」

<査読付論文に準ずる成果発表>（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可。）特に記載すべき事項はない。

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 伊藤由起、柳場由絵、山岸希、李春梅、種田晉二、鈴木明、上島通浩、那須民江：第 79 回日本衛生学会学術総会、北里大学、2009.3.29-4.1.

「ナノ粒子を多く含むディーゼル排気曝露による PPARα を介した肝臓への影響」

3）山岸希、伊藤由起、ラムダン・ドニヒクマット、柳場由絵、河野泰秀、李春梅、鈴木明、種田晋二、上島通浩、那須民江：第79回日本衛生学会学術総会、北里大学、2009.3.29-4.1.「ディーゼル排気ナノ粒子の精巣テストステロン合成系への影響除粒子との比較」

4）Ramdhan Doni Hikmat、伊藤由起、柳場由絵、岡村愛、林由美、李春梅、種田晋二、鈴木明、上島通浩、那須民江：第79回日本衛生学会学術総会、北里大学、2009.3.29-4.1.「成長ホルモンを介したディーゼル排気ナノ粒子のテストステロン合成への影響」

5) Doni Hikmat Ramdhan, Yuki Ito, Yukie Yanagiba, Nozomi Yamagishi, Yumi Hayashi, Akira K. Suzuki, Tamie Nakajima: XII International Congress of Toxicology, Barcelona, Spain,
2010.

“Nanoparticle-rich diesel exhaust-disrupted testosterone biosynthesis and metabolism might be mediated by growth hormone”

6) 山岸希、伊藤由起、Ramdhan Doni Hikmat、柳場由絵、林由美、内藤久雄、鈴木明、井上健一郎、那須民江：第80回日本衛生学会学術総会 2010/5/9-11（仙台）.

「ディーゼル排気ナノ粒子の海馬ステロイド合成系への影響」

7) Ito Y, Yanagiba Y, Ramdhan DH, Hayashi Y, Li Y, Suzuki AK, Kamijima M, Nakajima T: XII International Congress of Toxicology. July 19-23, 2010. Barcelona, Spain.

“Mechanism analysis of nanoparticle-rich diesel exhaust induced liver damage in F344 rats”.

8）伊藤由起、ラムダン ドニヒクマット、柳場由絵、山岸希、上島通浩、那須民江：第81回日本衛生学会総会若手プロジェクト研究助成ミニシンポジウム「ディーゼル排気ガス中のナノ粒子による健康影響－動物実験の知見から－」誌上発表(2011/3/26-28).

「ナノ粒子を多く含むディーゼル排気ガス曝露による肝臓への影響」．

9) ラムダンドニヒクマット、伊藤由起、柳場由絵、山岸希、山元昭二、藤卷秀和、那須民江：第81回日本衛生学会総会誌上発表(2011/3/26-28)

「ナノ粒子を含んだディーゼル排気ガスのマウス脂質恒常性への影響」．

10) Ramdhan DH, Ito Y, Yanagiba Y, Yamagishi N, Hayashi Y, Suzuki AK, Nakajima T: XII International Congress of Toxicology. July 19-23, 2010. Barcelona, Spain.

“Nanoparticle-rich diesel exhaust-disrupted testosterone biosynthesis and metabolism might be mediated by growth hormone.”

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

(4) シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

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## C-0901 ディーゼル排気ナノ粒子の脳、肝、腎、生殖器への影響

バイオマーカー創出・リスク評価

(3) ナノ粒子曝露のホルモン系への影響と新たなバイオマーカーの創出・リスク評価

東京農工大学

共生科学技術研究院 田谷 一善、渡辺 元

名古屋大学大学院

大学院医学系研究科環境労働衛生学 那須 民江

名古屋市立大学大学院

大学院医学研究科 伊藤 由起

平成21～23年度累計予算額：12,499 千円

（うち、平成23年度予算額：4,001 千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 二十数nm付近の粒径のナノ粒子を多く含んだディーゼル排気（Nanoparticle-rich Diesel Exhaust Particle: NRDE）の亜急性および3～12カ月曝露がマウス・ラットの生殖・内分泌系に与える影響を検証した。NRDEは、実験動物の精巣ライディヒ細胞・下垂体前葉細胞のホルモン分泌機能に影響する内分泌攪乱作用を有することがうかがわれた。またナノ粒子と除粒子ガス成分では、ステロイドホルモン分泌細胞と蛋白質ホルモン分泌細胞への作用が異なるものと推察された。NRDEに曝露された雄マウスで精巣ライディヒ細胞からのテストステロン分泌量が増加するメカニズムを調べた結果、分泌増加作用は下垂体からの性腺刺激ホルモン分泌を介するものでは無く、精巣のライディヒ細胞への直接作用であると推察された。いっぽう、ライディヒ細胞からのテストステロン分泌抑制メカニズムは不明であった。さらに、NRDE曝露後の雄ラット精巣を用いてDNAマイクロアレイ解析を行なったところ、アラキドン酸カスケードの変化が観察された。

[キーワード] ディーゼル排気ガス、全身吸入曝露、ナノ粒子、性腺、副腎

### 1. はじめに

ディーゼル排気微粒子（DEP）は大気汚染の主要成分であり、これらの中には粒径が50nm以下の粒子も含まれている。これらのナノ粒子は非常に微小なために生体内への移行が容易で、重量あたりの表面積が大きいために生物組織への侵害作用が大きいことが懸念されるが、その生体影響の研究は非常に乏しく、わが国において緊急性の高い課題となっている。この研究の必要性に応えるため、（独）国立環境研究所では平成18年度よりナノ粒子を多く含むディーゼル排ガス（Nanoparticle-rich Diesel Exhaust: NRDE）DEの曝露実験を開始し、呼吸・循環器系、炎症・免疫系への影響解明に取り組み始めた。このような背景の下、我々は平成19,20年度の環境技術開発等推進費で、ラットにNRDEを曝露し、生殖器・次世代影響とそのメカニズムに関する研究を行った。本研究では、これまで研究してきた生殖・次世代影響の研究をさらに深めるための詳細な内分泌学的・分子生物学的検査を実施し、さらにそれにとどまらず影響のバイオマーカ
一を創出し、それらのマーカーをNRDEの健康リスク評価、環境基準設定の際に参考となる知見として提唱することをめざした。

### 2. 研究開発目的

マウス・ラットを中濃度～高濃度NRDEに亜急性に曝露させて、雌雄別に内分泌・生殖器系機能への影響を調べる。階層的な支配関係にある内分泌・生殖器系の機能変化を系統だて検証するために、マクロ観察から分子生物学的手法にいたるまでの各種検査を行なう。

## 3 ．研究開発方法

## （1） 曝露装置

すべての実験において、実験動物のナノ粒子への曝露は、独立行政法人国立環境研究所のナノ粒子健康影響実験棟内で実施した。詳細は、サブテーマ(1)の欄に記載した通りである。

## （2） 実験動物

## 1 ）マウス

6 週令のマウスを用いた。雄マウスはC57BL/Jclマウス（Charles River Japan、東京、日本）、雌マウスはBALB/cマウス（SLC）を使用した。

## 2 ）ラット

雌ラットは、妊娠したFischer系ラット(F344/DuCrlCrli)と離乳直後の21日齢の雌ラット（Wistar今道系）を使用した。

雄ラットは、7～8週齢のFischer系ラット(F344)を使用した。

## （3） 曝露方法

## 1 ）マウス

マウスは、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群の4つの群に分けた。

### a. 雄マウス

8 週間の曝露を行なった。各群、8～9 匹を用いた。

## b．雌マウス

曝露期間は3ヶ月、6ヶ月、12ヶ月とした。3か月曝露実験では、各群12匹（計48匹）、6か月曝露では各群12匹（計48匹）、12か月曝露では各群14匹（計56匹）を用いた。

## 2 ）ラット

## a．妊娠ラット

発情前期の夜に雄と交配して、膽スメア内に精子を認めた日を妊娠0日として、Ⅰと同様の条件で、妊娠0日から20日間曝露を行った。コントロール群、高濃度曝露群、除粒子曝露群の3群に分け、各群6匹のラットを使用した。

## b．仔ラット（雌）
1 ヶ月の曝露を行なった。コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群の4つの群に分け、各群15匹づつ用いた。Room control群は、チャンバーには入れずに同条件下で飼育した。曝露終了1日後に、東京農工大学に輸送した。輸送後は、プラスチックケージ（日本クレア、大阪、日本）に移動し、餌（日本農産工業、神奈川、日本）と水は自由摂取として飼育を継続させた。東京農工大学に到着後4日目～8日目で動物の処理を行なった。

### c. 雄ラット

ラットはランダムにコントロール群（新鮮空気）、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群の4群に分け（8又は9匹/群）、1、2、3カ月の曝露を行った。

## （４）生体試料の処理

## 1 ）臓器の摘出および処理

曝露終了後、ペントバルビタール麻酔下で心臓採血し、肝臓、脾臓、腎臓、副腎を採取し、重量を測定した。さらに雄動物の場合は、精巣、精巣上体、前立腺、精囊腺を採取して重量を測定した。雌動物の場合は、卵巣、子宮、副腎、膠を採取し、重量を測定した。

採取した血液は、1700×gで15分、4℃の条件で遠心分離し、ホルモンアッセイまでの間-20℃で保存した。精巣、卵巣と子宮は、重量測定後、10%ホルマリン液に保存した。下垂体は、生理食塩水1mlが入ったプラスチックチューブに入れ、ホルモンの測定まで-20℃で保存した。一部のラットでは海馬を摘出し、冷凍保存した。

副腎細胞および精巣ライディヒ細胞、下垂体前葉細胞は、直ちに初代細胞培養を行った。

## 2 ）膣スメアおよび性周期判定

仔ラット（雌）の場合は、解剖前に膛スメアを採取した。膛スメアは、2000倍希釈をしたオスバン液を用いて、採取した。ステージの分類は、休止期は、上皮細胞の数が減り白血球があるもの、発情前期は、有核で円形の上皮細胞と角化細胞が存在し白血球がないもの、発情期は、多くの不整で核がない角化上皮細胞が多くあるものとした（Armenti et al. 2008）。発情周期は、正常周期、持続発情、持続休止期、発情周期の延長したものに分類した（Franczak et al. 2006）。正常発情周期は、休止期2日間と発情前期1日間と発情期1日間の4日間で周期が回帰するもの、持続発情は、発情期が5日間以上続くもの、持続休止期は休止期が5日間以上続くもの、発情周期の延長は、持続発情や持続休止期でなく5日間以上で1周期になるものとした。

## （５）ホルモン・アッセイ

コルチコステロン及びプロジェステロン濃度の測定は、 $ ^{125} $ Iで標識したリガンドを使用した二抗体ラジオイムノアッセイ法を用いて行った。ステロイドホルモン、黄体形成ホルモン（LH）・卵胞刺激ホルモン（FSH）の測定は、 $ ^{125} $ I標識ホルモンを用いた二抗体法ラジオイムノアッセイ、もしくはEIAキット（Cayman社製）により行った。血清中のインヒビン測定には、当研究室で開発したbovineインヒビンのラジオイムノアッセイ系を用いて測定した。海馬中のプレグネノロン、プロジェステロン、17OH-プロジェステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、エストラジオールは、あすか製薬に測定を依頼し、液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー(LC/MS/MS)によって定量した。
## （6） 初代細胞培養

副腎細胞の培養は、Jaroenpornら（2007）の方法によった。培養副腎細胞に、副腎皮質刺激ホルモン（adrenocorticotropic hormone ; ACTH）を0、 $ 10^{-15}\sim10^{-10} $ M加えた培養液を添加し、4時間培養した後、培養液を回収し、コルチコステロンとプロジェステロンのアッセイまで-20℃で保存した。

ライディヒ細胞と下垂体前葉細胞の初代細胞培養は、常法に従って行った。

## （7） 生殖器系の検査

## 1 ）精子数の測定

片側精巣を生理食塩水中でホモジナイズし、スパームヘッドカウント法により精子数を測定した。

## 2 ）卵管・卵巢の検査

発情期で採材した個体の卵管を、2枚のスライドグラスで挟み、実体顕微鏡を用いて、卵管内の卵の数を確認した。

常法でパラフィン包埋した卵巣は、回転式ミクロトーム(大和光機工業、埼玉、日本)で、厚さ10μmで薄切し、スライドグラス（松浪硝子工業、大阪、日本）に載せ、連続切片を作製し、一晩37℃で伸展させた。

発情前期で採材した個体の卵巣を各群3匹分（計6卵巣）ずつ用い、1個体が所有する胞状卵胞、閉鎖卵胞を観察した。各卵胞は、卵の核が見られたところで、長径と短径を測定し、その平均値をその卵胞の大きさとした。卵胞は、100μm以上の二次卵胞、胞状卵胞、閉鎖卵胞を数えた。直径400μm以上の卵胞を大型卵胞とした。また、閉鎖卵胞は、過去の研究（Anne et al. 1978、Fernanda et al. 2008、Quinto et al. 1983、Andreu et al. 1998）を参考に、顆粒層細胞と卵細胞が残っているもので、200μm以下で卵胞腔があるもの、卵胞が早期黄体化を起こしているもの、卵胞腔内に5個以上の単独の顆粒層細胞が落下しているもの、顆粒層細胞層がうすくなっているもの、卵細胞が変形もしくは変性しているものとした。

休止期で採材した個体の卵巣を各群2匹分ずつ用い、1個体が所有する二次卵胞、胞状卵胞、閉鎖卵胞、黄体の数を観察した。各卵胞は、卵の核が見られたところで、長径と短径を測定し、その平均値をその卵胞の大きさとした。

卵胞の分類は、原始卵胞は卵母細胞のみで周りを囲む上皮細胞がないもの、一次卵胞は卵母細胞を一層の卵胞上皮細胞が囲んでいるもの、二次卵胞は上皮細胞が重層化し、卵胞腔が形成されていないもの、胞状卵胞は卵胞腔が形成されているもの、成熟卵胞は卵丘が形成されているものとした。閉鎖卵胞は、顆粒層細胞と卵細胞が残っているもので、卵胞が早期黄体化を起こしているもの、卵胞腔内に10個以上の単独の顆粒層細胞が落下しているもの、顆粒層細胞層がうすくなっているもの、卵細胞が変形もしくは変性しているものとした。

## 3 ）胎子の検査

妊娠20日（分娩前日）に摘出した胎子について、体重、体長およびペース(雄)あるいはクリトリス(雌)から肛門までの距離を計測した。