Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## （８）精巣の分子生物学的検査

## 1 ）定量的リアルタイムPCR

以下の物質のmRNAを定量した。

- 精巣内コレステロール生成に関与する①3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A(HMG-CoA)と②HMG-CoA reductase

- 精巣細胞内のコレステロール輸送に関与し、HDLとLDLの取り込みに重要な③Scavenger receptor class B type1（SR-B1）、④LDL receptor（LDL-R）、⑤Peripheral benzodiazepine receptor（PBR）、⑥StAR

- テストステロン生成に関与する⑦cytochrome P450 side-chain cleavage enzyme (P450scc)、⑧3β-hydroxysteroid dehydrogenase/5-4-isomerase (3β-HSD)、⑨cytochrome P450 17α-hydroxylase/C17-20 lyase (P450 17α)、⑩17β-HSD

エイコサノイド合成系で始めに細胞膜脂質二重層のリン脂質にエステル結合したアラキドン酸を遊離させるphospholipase A2, group IIA (platelets, synovial fluid) (Pla2g2a)

・ エイコサノイド系のシクロオキシゲナーゼ経路に関わる遺伝子である、

prostaglandin-endoperoxide synthase 1 (Ptgs1)、prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (Ptgs2)、prostaglandin D2 synthase (brain) (Ptgds)、prostaglandin I2 (prostacyclin) synthase (Ptgis)

エイコサノイド系のリポキシゲナーゼ経路に関わる遺伝子であるtransglutaminase 2, C polypeptide (Tgm2)、arachidonate 15-lipoxygenase (Alox15)

プラスタグランジン合成・制御系に関わる遺伝子である、S100 calcium binding protein A10(S100a10)、S100 calcium binding protein A6(S100a6)、phospholipase A2, group IVA (cytosolic, calcium-dependent) (Pla2g4a)、annexin A1 (Anxa1)、prostaglandin E receptor 3 (subtype EP3) (Ptger3)

- 肝臓のマイクロアレイ解析で変化が認められたhydroxysteroid（17-beta）dehydrogenase 2（Hsd17b2）、peroxisome proliferator-activated receptor beta（PPARb gene）、cytochrome P450, family 26, subfamily a, polypeptide 1（Cyp26a1）

## 2 ）ウェスタンブロット

タンパク濃度はプロテインアッセイキット(Bio-Rad社)を用いて行った。10%か12%のポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った後、PVDF膜に転写をした。3%スキムミルクに1時間室温でインキュベーションした後、それぞれStAR (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), CYP11A (Chemicon Int., Temecula, CA, USA), CYP17α, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Santa Cruz Biotechnology)に対する一次抗体に4℃で一夜反応をさせた。膜はTBSやTBSTバッファーで洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合の抗ウサギ又は抗ヤギ抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)を用いて反応させた。その後膜は再度TBSやTBSTバッファーで洗浄をし、1-StepTM NBT/BCIP (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)で可視化した。Lane and Spot Analyzer version 5.0 (ATTO Corporation, Tokyo, Japan)でバンドの濃度測定を行い、内部標準のGAPDHで補正した。
## 3 ）RNA 抽出

RNeasy Mini kit (QIAGEN)を用いて行った。抽出したRNAは、ナノドロップで収量、波形を確認した後、バイオアナライザー(Agilent)で電気泳動を行い、不純物や分解のないRNAであることを確認した。

## 4 ）DNA マイクロアレイによる網羅的解析

東レ株式会社に委託して実施した。高感度DNAチップ3D-Geneを用いて、1色法で解析を行った。ノーマライゼーションによるデータの標準化ののち、対照群と全ての曝露群を比較し、変動比2倍を閾値にして発現変動のある遺伝子を同定した。抽出された遺伝子をGenMAPPを用いてパスウェイ解析をし、さらに少なくとも1比較以上で閾値を越えた遺伝子2903個からクラスター解析ソフト(Cluster 3.0)で階層クラスター解析を行った。

## （9） 統計解析

統計処理は、Graph Pad Prism5（San Diego、CA、USA）もしくはJMPバージョン5.0（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）を用いて行なった。

臓器重量、血清中の各ホルモン濃度の群間の平均値の有意差検定には一元配置分散分析（one way ANOVA）を使用し、各曝露群と対照群との有意差検定にはDunnetの多重比較検定もしくはTukeyの多重検定を用いた。

培養液中のホルモン濃度については、群間の平均値の有意差検定には二元配置分散分析（two way ANOVA）を使用し、各曝露群と対照群との有意差検定にはBonferroniの多重比較検定を用いた。また、ACTH添加群と、非添加群との有意差検定にはDunnetの多重比較検定を用いた。

## 4 ．結果及び考察

## （１）体重および臓器重量

## 1 ）雄マウスの8週間曝露

図(3)－1に体重、肝臓、脾臓、腎臓、副腎の重量を示した。いずれも各曝露群とコントロール群との間で有意な差は認められなかった。
## 体重と臓器重量

体重(Body weight)

脾臓(Spleen)

副臀(Adrenal glands)

腎臟(Kidney)

図(3)－1 雄マウスへの8週曝露の体重、肝臓、膵臓、副腎、腎臓重量に及ぼす影響。図中のControl、Low、High、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## 2 ）雌マウスの3～12カ月曝露

### a. 3ヶ月目

体重、肝臓重量、右腎重量、左肺重量、脾臓重量は、コントロール群と比較して、各曝露群に有意な差は認められなかった。卵巣重量、子宮重量、腔重量の結果は、腔スメアの観察から、休止期と判断した個体のデータを用いて、検討した。卵巣重量、子宮重量、腔重量は、コントロール群と比較して、各曝露群で有意差は認められなかった。

## b．6ヶ月目

体重と副腎重量は、コントロール群と比較して各曝露群に有意な差は認められなかった。腸管の長さは、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群で、それぞれ52.02±1.52cm、51.75±0.98cm、48.76±0.82cm、47.78±0.34cm（Mean±SEM）で、除粒子曝露群でコントロール群と比較して有意な低値を示した（p<0.05）。卵巣重量、子宮重量、膛重量は、膛スメア観察の結果により、休止期と発情期に分けて比較したが、コントロール群と各曝露群との間に有意な差は認められなかった。

### c. 12 ヶ月目
体重は、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群でそれぞれ $ 25.24 \pm 0.92g $ 、 $ 27.01 \pm 0.69g $ 、 $ 26.34 \pm 0.42g $ 、 $ 28.00 \pm 0.76g $ であり、除粒子曝露群でコントロール群と比較して有意な高値を示した $ (p < 0.05) $ 。

肝臓の重量には、コントロール群と比較して、有意な高値が認められなかった。

腎臓重量は、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群でそれぞれ 368.9 ±7.0mg、387.2±8.3mg、375.7±9.0mg、406.7±10.6mg であり、除粒子曝露群でコントロール群と比較して有意な高値を示した。副腎重量は、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群でそれぞれ 10.29±0.63mg、8.29±0.47mg、8.29±0.29mg、7.93±0.56mg であり、コントロール群と比較して中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群で有意な低値を示した (p<0.05)。腸管の長さ、膛スメアで休止期と判断した個体の卵巣重量および子宮重量は、コントロール群と比較して有意差は認められなかった。

体重の有意差が認められたため、各臓器重量を体重あたりで比較した。どの臓器においても、コントロール群と比較して各曝露群に有意な差は認められなかった。

## 3 ）妊娠ラットの２０日間曝露

妊娠期間中に、妊娠8日、15日および20日に体重測定を行ったが、いずれの日でも3群間で体重に差は認められなかった（図（3）－2）。また、妊娠期間中に流産する個体も認められなかった。

肝臓重量と脾臓重量が高濃度曝露群と除粒子曝露群でコントロール群と比較して有意な低値を示した。副腎、子宮および卵巣重量には差が認められなかった。

図(3)－2 妊娠ラットへの20日間NR-DE曝露による体重増加に及ぼす影響。図中のClean air、NR-DE、F-DEはそれぞれ、コントロール群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## 4 ）仔ラット（雌）の1ヶ月曝露

体重の変化は、全曝露期間においてコントロール群と曝露群の間に有意差はなかった。
肝臓、脾臓、胸腺、腎臓、副腎の重量に、コントロール群と曝露群で有意差は認められなかった。肺重量は、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群でそれぞれ1.151±0.058g、0.9755±0.017g、1.027±0.026g、0.9895±0.029g、1.032±0.063g（Mean±SEM）であり、正常空気群と比較して中濃度曝露群および除粒子曝露群で有意な低値を示した(p<0.05)。しかし、体重あたりの重量で比較すると、コントロール群と曝露群の間に有意な差は認められなかった。

子宮重量は、休止期で採材した個体で、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群でそれぞれ $ 0.1988 \pm 0.014g $ 、 $ 0.2668 \pm 0.016g $ 、 $ 0.2380 \pm 0.018g $ 、 $ 0.2154 \pm 0.0081g $ （Mean ± SEM）であり、コントロール群と比較して中濃度曝露群で有意な高値を示した $ (p < 0.05) $ 。発情前期と発情期で採材した個体の比較では、子宮重量に有意差は認められなかった。卵巣重量は、休止期で採材した個体、発情前期で採材した個体、発情期で採材した個体ごとの比較において、コントロール群と各曝露群との間で有意差は認められなかった。

## 雄ラットの1～3ヶ月曝露

## （２）血中ホルモン濃度

## 1 ）雄マウスの8週間曝露

図(3)－3に血中プロジェステロン及びコルチコステロンの濃度を示した。血中コルチコステロン及びプロジェステロンの濃度は、いずれも各曝露群とコントロール群との間で有意な差は認められなかった。

図(3)－4に血中FSH、LH、テストステロン及びプロジェステロン濃度を示した。血中テストステロン濃度は、ナノ粒子曝露群がコントロール群に比べて高値を示した。その他のホルモン濃度は各曝露群とコントロール群との間で有意差は認められなかった。
(A)

(B)

図(3)－3 雄マウスへのNR-DE8週曝露の血清中のプロジェステロン（A）及びコルチコステン

（B）濃度に及ぼす影響。図中のClean air、Low、High、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。
図(3)－4 雄マウスへのNR-DE8週曝露の血中卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、テストステロンおよびプロジェステロン濃度に及ぼす影響。図中のClean air、Low、High、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## 2 ）雌マウスの3～12カ月曝露

### a. 3ヶ月目

プロジェステロン及びインヒビン濃度は、コントロール群と比較して各曝露群に有意な差は認められなかった。

### b. 6 ヶ月目

エストラジオール-17β、プロジェステロン、インヒビン濃度のすべてにおいて、コントロール群と比較して各曝露群に有意な差は認められなかった。

### c. 12 ヶ月目

プロジェステロン濃度は、コントロール群と比較して各曝露群に有意差は認められなかった。インヒビン濃度は、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群でそれぞれ $ 2.16 \pm 0.51 ng/ml $ 、 $ 2.31 \pm 0.25 ng/ml $ 、 $ 3.79 \pm 0.26 ng/ml $ 、 $ 2.55 \pm 0.30 ng/ml $ （Mean±SEM）であり、コントロール群と比較して中濃度曝露群で有意な高値を示した (p < 0.05)。

## 3 ）妊娠ラットの２０日間曝露
血中LHとコルチコステロン濃度が高濃度曝露群と除粒子曝露群でコントロール群と比較して有意に上昇し、血中プロジェステロン濃度は逆に有意に低下した。血中エストラジオール濃度は、高濃度曝露群ではコントロール群と比較して高値を示したが、差は有意ではなかった。除粒子曝露群では、コントロール群よりも有意な高値を示した（図(3)－5）。

(G)

(D)

図(3)－5 妊娠ラットへの20日間NR-DE曝露の血中各種ホルモン濃度への影響。図中のClean air、NR-DE、F-DEはそれぞれ、コントロール群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。
## 4 ）仔ラット（雌）の1ヶ月曝露

血清中のプロジェステロン濃度は、休止期、発情前期、発情期ともに、コントロール群と各曝露群で有意差は認められなかった。しかし、高濃度曝露群の休止期と発情期で、コントロール群と比較して高い傾向を示した。また、除粒子曝露群の発情前期と発情期で、コントロール群と比較して低い傾向を示した。

血清中のエストラジオール-17β濃度は、発情前期で採血した個体において、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群でそれぞれ157.40±15.57pg/ml、105.00±14.93pg/ml、80.51±8.88pg/ml、130.50±29.52pg/ml（Mean±SEM）であり、コントロール群と比較して高濃度曝露群で有意な低値が認められた(p<0.05)。休止期および発情期では、コントロール群と各曝露群において有意差は認められなかった。

血清中のFSH濃度は、休止期、発情前期、発情期において、コントロール群と各曝露群との間に有意差は認められなかった。

血清中LH濃度は、休止期ので採血した個体において、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群でそれぞれ $ 0.0760 \pm 0.021 ng/ml $ 、 $ 0.3128 \pm 0.071 ng/ml $ 、 $ 0.1910 \pm 0.060 ng/ml $ 、 $ 0.04775 \pm 0.012 ng/ml $ （Mean±SEM）であり、中濃度曝露群で、コントロール群と比較して有意な高値を示した(p<0.05)。発情前期では、コントロール群と各曝露群の間に有意差は認められなかったが、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群は低い傾向を示した。発情期では、コントロール群と各曝露群の間に有意差は認められなかったが、高濃度曝露群で低い傾向を示した。

血清中プロラクチン濃度は、休止期、発情前期、発情期において、コントロール群と各曝露群との間に有意差は認められなかった。

## 5 ）雄ラットの1～3ヶ月曝露

2 か月の曝露後、以前の研究(Li et al., 2009)同様に中濃度曝露群はコントロール群に比べて有意に血漿中のテストステロン濃度を上昇させた(図(3)－6 A)。高濃度曝露群は1か月曝露後血漿中テストステロン濃度を上昇させたが、2、3か月後はこのような変化は見られなかった。除粒子曝露群は2か月後血漿テストステロン濃度を上昇させた。高濃度曝露群と除粒子曝露群間には差は見られなかった。

LHはライディッヒ細胞内でのテストステロン生成の重要な調節因子であり、テストステロンの上昇によりLH放出が抑制される(Hutchison et al., 1975)。中濃度の3か月曝露によりコントロール群と比較してLH濃度を有意に減少した(図(3)－6 A B)。他の群はコントロール群との間に有意な変化は見られなかった。また高濃度曝露群と除粒子曝露群間にも差は見られなかった。
図(3)－6 雄ラットへの1～3ヶ月NR-DE曝露の血中テストステロン濃度に及ぼす影響。図中のclean air、Medium NR-DE、high NR-DE、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## （３）組織中のホルモン含有量

## 1 ）仔ラット（雌）の1ヶ月曝露

## a．下垂体中のFSH、LH及びプロラクチン

下垂体中のFSH含有量は、休止期、発情前期、発情期において、コントロール群と各曝露群との間に有意差は認められなかった。しかし、発情前期の中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群、および発情期の中濃度曝露群で、コントロール群と比較して低い傾向が認められた。

下垂体中のLH含有量は、休止期で採材した個体において、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群でそれぞれ $ 578.2 \pm 80.78 \, ng/ml $ 、 $ 1131 \pm 157.5 \, ng/ml $ 、 $ 893.6 \pm 109.0 \, ng/ml $ 、 $ 967.3 \pm 59.77 \, ng/ml $ （Mean±SEM）であり、中濃度曝露群がコントロール群と比較して有意な高値を示した（p < 0.05）（血清中LH濃度の結果と一致）。発情前期では、コントロール群と各曝露群の間に有意差は認められなかった。発情期においても、コントロール群と各曝露群の間に有意差は認められなかったが、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群で、低い傾向を示した。

下垂体中のプロラクチン含有量は、休止期、発情期において、コントロール群と各曝露群との間に有意差は認められなかった。発情前期で採材した個体において、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群でそれぞれ $ 505.2 \pm 54.0 \, ng/ml $ 、 $ 480.0 \pm 43.6 \, ng/ml $ 、 $ 993.1 \pm 150.6 \, ng/ml $ 、 $ 716.6 \pm 62.7 \, ng/ml $ （Mean±SEM）であり、コントロール群と比較して、高濃度曝露群が有意な高値を示した(p < 0.05)。

## 2 ）雄ラットの1～3ヶ月曝露
### a. 精巣中のテストステロン

精巣のテストステロン濃度(重量濃度)は血漿中(体積濃度)に比べてかなり濃度が高かった(図3)−7). 高濃度1か月曝露により精巣中のテストステロン濃度はコントロール群に比べて有意に上昇していた。3か月曝露では除粒子曝露群の精巣テストステロン濃度はコントロール群に比べて有意に低下していた。高濃度曝露群と除粒子曝露群間には差は見られなかった。

図(3)－7 1～3カ月曝露雄ラット精巣のテストステロン濃度(Mean±SEM, *: P<0.05)。図中のclean air、Medium NR-DE、high NR-DE、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## b．海馬中のステロイド・ホルモン

1 ヶ月曝露ラットの海馬中の濃度は血漿中と同程度であり、精巣中よりも少なかった。1か月の高濃度曝露や除粒子曝露によりプレグネノロン、17OH-プロジェステロン、プロジェステロン、テストステロン、エストラジオール濃度に変化は見られなかった(図(3)-8)。コントロール群に比べ高濃度の曝露のみでアンドロステンジオン濃度が上昇した(図(3)-8)。

図(3)－8 雄ラット海馬中のステロイドホルモン濃度。図中のclean air、Medium NR-DE、high NR-DE、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。
## （４）初代培養細胞におけるホルモン分泌能

## 1 ）雄マウスの8週間曝露の場合

### a. 副腎細胞

### i. コルチコステロン

図（3）－9に副腎細胞の培養液中のコルチコステロン濃度を示した。コントロール群のACTH刺激に対するコルチコステロン分泌は、ACTH非添加群から $ 10^{-13} $ M添加群までは変化が認められなかったが、 $ 10^{-12} $ から $ 10^{-10} $ Mにかけては濃度依存的上昇を示し、ACTHを $ 10^{-11} $ 、 $ 10^{-10} $ M添加した群では、非添加群と比較して有意な高値を示した。

コントロール群と中濃度曝露群を比較すると、ACTHを $ 10^{-12} $ 、 $ 10^{-11} $ M添加した群ではコルチコステロンの分泌量は中濃度曝露群が有意な高値を示した。ACTHを $ 10^{-15} $ 、 $ 10^{-14} $ 、 $ 10^{-13} $ M添加した群と、ACTH刺激を行わなかった群では高い傾向を示したが、有意差は認められなかった。ACTHを $ 10^{-10} $ M添加した群の中濃度曝露群と高濃度曝露群では、ACTHで刺激したにもかかわらず、コルチコステロン分泌に変化が認められなかった。

コントロール群と高濃度曝露群を比較すると、ACTHを $ 10^{-11} $ 、 $ 10^{-10} $ M添加した群では、コルチコステロンの分泌量は高濃度曝露群で有意な低値を示し、 $ 10^{-12} $ M添加した群と、ACTH刺激を行わなかった群では低値を示したが有意差は認められなかった。 $ 10^{-15} $ 、 $ 10^{-14} $ 、 $ 10^{-13} $ M添加した群では各群間に差は認められなかった。

コントロール群と除粒子曝露群を比較すると、ACTHを $ 10^{-11} $ 、 $ 10^{-10} $ M添加した群では、コルチコステロンの分泌量は有意な低値を示し、 $ 10^{-12} $ M添加した群と、ACTH刺激を行わなかった群では低値を示したが有意差は認められなかった。 $ 10^{-15} $ 、 $ 10^{-14} $ 、 $ 10^{-13} $ M添加した群では各群間に差が認められなかった。

また、ACTH刺激に対するコルチコステロン分泌反応性は、中濃度曝露群ではACTH非添加群から $ 10^{-13} $ M添加群までは変化が認められなかったが、 $ 10^{-12} $ から $ 10^{-10} $ Mにかけては濃度依存的上昇を示し、非添加群と比較して有意な高値を示した。高濃度曝露群は、ACTH $ 10^{-15} $ M添加群では有意な高値を示したが、その他の群では変化が認められなかった。除粒子曝露群ではACTH非添加群から $ 10^{-12} $ M添加群までは有意な変化が認められなかったが、 $ 10^{-11} $ 、 $ 10^{-10} $ M添加した群では非添加群と比較して有意な高値が認められた。
図(3)－9. 雄マウスへのNR-DE8週間曝露の副腎細胞の培養液中のコルチコステロン濃度に及ぼす影響。それぞれの群に対して0、 $ 10^{-15}\sim10^{-10} $ MのACTHで刺激した。 $ ^{*} $ は各曝露群とコントロール群との有意差を示し（ $ ^{*}*p<0.01 $ ）、 $ ^{#} $ はACTHで刺激した群と、刺激しなかった群との有意差を示す（ $ ^{#}<0.05 $ ）。図中のClean air、NR-DE-Low、NR-DE-High、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

### ii. プロジェステロン

図(3)－10に副腎細胞の培養液中のプロジェステロン濃度を示した。

コントロール群と中濃度曝露群を比較すると、ACTHを $ 10^{-11} $ M添加した群では、プロジェステロンの分泌量は中濃度曝露群が有意な高値を示し、ACTHを $ 10^{-15} $ 、 $ 10^{-14} $ 、 $ 10^{-13} $ 、 $ 10^{-12} $ M添加した群と、ACTH刺激を行わなかった群では有意差は認められなかった。ACTHを $ 10^{-10} $ Mを添加した群では非添加群と比較して有意な低値を示した。

コントロール群と高濃度曝露群を比較すると、ACTHを $ 10^{-13} $ 、 $ 10^{-12} $ 、 $ 10^{-11} $ 、 $ 10^{-10} $ M添加した群では、プロジェステロンの分泌量は中濃度曝露群が有意な低値を示し、 $ 10^{-15} $ 、 $ 10^{-14} $ M添加した群と、ACTH刺激を行わなかった群では低値を示したが有意差は認められなかった。

コントロール群と除粒子曝露群を比較すると、ACTHを $ 10^{-13} $ 、 $ 10^{-12} $ 、 $ 10^{-11} $ 、 $ 10^{-10} $ M添加した群では、プロジェステロンの分泌量は除粒子曝露群が有意な低値を示し、 $ 10^{-15} $ 、 $ 10^{-14} $ M添加した群と、ACTH刺激を行わなかった群では低値を示したが有意差は認められなかった。

また、ACTH刺激に対するプロジェステロン分泌反応性は、コントロール群ではACTH非添加群から1 $ 0^{-12}M $ 添加群までは変化が認められなかったが、 $ 10^{-11} $ から $ 10^{-10}M $ にかけては濃度依存的上昇を示し、 $ 10^{-11} $ 、 $ 10^{-10}M $ では非添加群と比較して有意な増加が認められた。中濃度曝露群では、ACTH非添加群から $ 10^{-12}M $ 添加群までは変化が認められなかったが、 $ 10^{-11} $ から $ 10^{-10}M $ にかけては濃度依存的上昇を示し、 $ 10^{-11} $ 、 $ 10^{-10}M $ 添加群では非添加群と比較して有意な高値を示した。高濃度曝露群では、
ACTH10 $ ^{-14} $ M添加群では、有意な高値が認められたが、その他の群では変化が認められなかった。除粒子曝露群では、ACTH非添加群から10 $ ^{-12} $ M添加群までは変化が認められなかったが、10 $ ^{-11} $ から10 $ ^{-10} $ Mにかけては濃度依存的上昇を示し、10 $ ^{-11} $ 、10 $ ^{10} $ Mでは非添加群と比較して有意な高値が認められた。

図(3)－10 雄マウスへのNR-DE8週間曝露の副腎細胞の培養液中のプロジェステロン濃度に及ぼす影響。それぞれの群に対して0、 $ 10^{-15} $ ～ $ 10^{-10} $ MのACTHで刺激した。 $ ^{*} $ は各曝露群と対照群との有意差を示し（ $ ^{*} $ p＜0.05、 $ ^{**} $ p＜0.01）、 $ ^{#} $ はACTHで刺激した群と、刺激しなかった群との有意差を示す（ $ ^{\#} $ ＜0.05）。図中のClean air、Low、High、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## b．精巣ライディヒ細胞

図(3)－11に精巣ライディヒ細胞の培養液中のテストステロン濃度を示した。基礎分泌量については、高濃度曝露群がコントロール群に比較して有意に高く、除粒子曝露群が有意に低い値を示した。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）に対するテストステロン分泌反応性は、コントロール群ではhCG $ 10^{-2} $ モル投与群から有意な上昇が認められたのに対して、中濃度曝露群と高濃度曝露群ではhCG $ 10^{-1} $ モル投与群から有意な上昇が認められた。除粒子曝露群では、hCG $ 10^{-3} $ モル投与群から有意な上昇が認められた。一方培養液中のテストステロン分泌量を比較すると高濃度曝露群において、hCG $ 10^{-1} $ モル投与群では、コントロール群と比較して有意な高値を示した。除粒子曝露群では、いずれのhCG投与群においても培養液中テストステロン分泌量はコントロール群と比較して有意な低値を示した。
精巣ライデイ化細胞培養液中のテストステロン濃度

図(3)－11 雄マウスへのNR-DE8週間曝露の精巣ライディヒ細胞の培養液中のテストステロン濃度に及ぼす影響。図中のClean air、NR-DE-Low、NR-DE-High、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

### c. 下垂体前葉細胞

図(3)-12に下垂体細胞の培養液中のLH濃度を示した。

LHの基礎分泌量は、各曝露群とコントロール群で差が認められなかった。コントロール群では、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）の容量依存的LH分泌量の増加が認められなかったが、高濃度曝露群では、GnRH10 $ ^{-1} $ モルでLH分泌量がコントロール群よりも有意な高値を示した。また、GnRH10 $ ^{-7} $ モル投与群では、中濃度曝露群、高濃度曝露群及び除粒子曝露群がコントロール群と比較してLH分泌量が有意な高値を示した。
下垂体前葉細胞培養液中のLH濃度

図(3)－12 雄マウスへのNR-DE8週間曝露の下垂体前葉細胞の培養液中の黄体形成ホルモン（LH）濃度に及ぼす影響。図中のClean air、NR-DE-Low、NR-DE-High、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## （５）生殖器系の検査

## 1 ）雄マウスの8週間曝露の場合

## a．精巣・副生殖腺の重量と精子数の測定

図(3)－13に精巣と副生殖腺（精巣上体、前立腺、精囊腺）重量と精子数を示した。精巣、精巣上体、前立腺、精囊腺重量は、いずれも曝露群とコントロール群の間で有意差は認められなかった。精子数は、いずれの曝露群でもコントロール群との間で有意差は認められなかった。
## 副生殖腺重量と精子数

図(3)－13 雄マウスへのNR-DE8週間曝露の精巣、精巣上体、前立腺、精囊腺重量と精子数に及ぼす影響。図中のClean air、Low、High、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## b．精巣の検査

中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群では、精細管内における始原生殖細胞の欠落が認められた（図（3）－14）。
Clean air

Low NR-DE

High NR-DE

F-DE

図(3)－14 各曝露群と対照群マウスの精巣組織像。図中のClean air、Low NR-DE、High NR-DE、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## 2 ）雌マウスの3～12カ月曝露

### a. 膛スメア

採材時の膽スメアの結果を、表(3)－4に示した。3ヶ月曝露実験では、全ての群で、66.67%が休止期であった。6ヶ月曝露実験では、コントロール群、中濃度曝露群では55.33%、高濃度曝露群では66.67%、除粒子曝露群では、45.45%が休止期を示した。12ヶ月曝露実験では、コントロール群、中濃度曝露群では71.43%、高濃度曝露群では92.86%、除粒子曝露群では100%の動物が休止期を示した。

表(3)－4 各曝露実験の採材時の膽スメアの結果。表中のclean air、NR-DE-M、NR-DE-H、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

3ヶ月曝露

clean air	NR-DE-M	NR-DE-H	F-DE
休止期	8	8	8	8
発情前期	3	4	2	4
発情期	1	0	2	0
休止期の割合	66.67%	66.67%	66.67%	66.67%
6ヶ月曝露

clean air	NR-DE-M	NR-DE-H	F-DE
休止期	7	7	8	5
発情前期	1
発情期	5	5	4	5
不明	1
休止期の割合	58.33%	58.33%	66.67%	45.45%

１２ヶ月曝露

clean air	NR-DE-M	NR-DE-H	F-DE
休止期	10	10	13	14
発情前期	2	1
発情期	2	4
休止期の割合	71.43%	71.43%	92.86%	100%

## b．卵管・卵巢の検査

表(3)－2に、卵巣の組織学的観察の結果を示した。二次卵胞数および直径100～300μmの小型の胞状卵胞数に有意な差は認められなかった。直径300μm以上の胞状卵胞数は、除粒子曝露群で2個体とも少なく、高濃度曝露群においても、非常に少ない個体が認められた。直径300μmまでの大きさの閉鎖卵胞数は、コントロール群と比較して大きく増加している曝露群はなかった。直径300μm以上の大きさの閉鎖卵胞数は、中濃度曝露群の2個体で多く、高濃度曝露群と除粒子曝露群にも多い個体が認められた。黄体は、コントロール群と比較して除粒子曝露群で多くの黄体が観察された。図(3)－15に、各群の卵巣の全体像を示した。

表(3)－2　12ヶ月曝露のマウスの卵巣観察結果。図中のclean air、NR-DE-M、NR-DE-H、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

曝露群\数	正常卵胞	阴鎖卵胞	黄体
二次卵胞	100～300μm
の胞状卵胞	300μm以上
の胞状卵胞	300μmまで
の閉鎖卵胞	300μm以上
の閉鎖卵胞
clean air 1	37	16	6	5	2	23
clean air 2	38	19	14	4	4	35
NR-DE-M 1	39	18	11	8	9	42
NR-DE-M 2	49	37	12	2	10	25
NR-DE-H 1	28	22	11	4	4	19
NR-DE-H 2	17	13	1	4	7	24
F-DE 1	29	19	6	3	1	50
F-DE 2	29	22	5	1	7	54
図(3)－15 コントロール群と各曝露群の卵巣組織像（×40） AFは正常な胞状卵胞、AtFは閉鎖卵胞、CLは黄体を示した。図中のclean air群、NR-DE-M群、NR-DE-H群、F-DE群はそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## 3 ）妊娠ラットの２０日間曝露

### a. 胎子の検査

妊娠20日（分娩前日）に摘出した胎子の体重、体長およびペニス(雄)あるいはクリトリス(雌)から肛門までの距離を測定した。体重は、高濃度曝露群と除粒子曝露群で雌雄胎子共にコントロール群よりも有意な高値を示した。体長は、高濃度曝露群と除粒子曝露群で雌雄胎子共にコントロール群よりも有意な低値を示した。雌胎子では、クリトリスから肛門までの距離が除粒子曝露群でコントロール群よりも有意に長かった。雄胎子では、3群間に差は認められなかった。

## 4 ）仔ラット（雌）の1ヶ月曝露

## a．探材个体数
各曝露群での休止期、発情前期、発情期に採材した個体数を表(3)−3に示した。

表(3)－3 各群での各発情周期の採材個体数。表中のClean air、NR-DE-L、NR-DE-H、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

Clean air	NR-DE-L	NR-DE-H	F-DE	room control
休止期1日目	4	4	5	5
発情前期	5	6	5	5	5
発情期	5	5	3	4
除外個体	1	2	1	1

## b．膛開口日齢

膠開口日齢は、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群でそれぞれ、35.13±0.52日、34.47±0.62日、33.33±0.61日、37.33±0.43日（Mean±SEM）で、コントロール群と比較して、除粒子曝露群で膠開口日齢が有意に遅れた（p<0.05）（図（3）－16）。

図(3)－16 清浄空気群と各曝露群の膠開口日齢。図中のclean air、NR-DE-L、NR-DE-H、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## c．排卵数
発情期の卵管内の観察では、全ての群の全個体で排卵が確認できた。コントロール群と各曝露群で、有意差は認められなかったが、高濃度曝露群で多い傾向が認められた。

## d．膣スメア

50日齢からの膣スメアの観察で、休止期2日間、発情前期1日、発情期1日の4日間以外の異常周期を示した個体は、コントロール群で33.33%、中濃度曝露群で13.33%、高濃度曝露群で26.67%、除粒子曝露群で20.00%、room control群で33.33%であった。コントロール群では、連続休止期が1個体、延長周期が4個体で認められた。延長周期が中濃度曝露群では1個体、高濃度曝露群では4個体、除粒子曝露群では1個体、room control群では2個体で見られた。

## e．卵巣の組織学的観察

発情前期の卵巣の観察による直径100μm以上の正常な卵胞数と閉鎖卵胞数は、コントロール群と比較して、各曝露群に有意差は認められなかった。

直径100～200 μm及び直径200～400 μmの二次卵胞数と閉鎖卵胞数は、コントロール群と比較して各曝露群に有意差は認められなかった。また、400 μmの胞状卵胞数と閉鎖卵胞数も、コントロール群と比較して各曝露群に有意差は認められなかった。

## (6) リアルタイムPCR

## 1 ）雄マウスの8週間曝露

## a．精巣内ステロイドホルモン生成成酵素

### i. コレステロール生成

精巣内コレステロール生成に関与する①3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A(HMG-CoA)と②HMG-CoA reductase mRNA量を定量した。いずれも高濃度曝露群でコントロール群よりも有意な高値を示した（図(3)-17）。中濃度曝露群と除粒子曝露群は、コントロール群と差が認められなかった。

### ii. コレステロール輸送

精巣細胞内のコレステロール輸送に関与し、high-density lipoprotein (HDL)とlow-density lipoprotein (LDL)の取り込みに重要な③Scavenger receptor class B type1 (SR-B1)と④LDL receptor (LDL-R)、⑤Peripheral benzodiazepine receptor (PBR)、⑥StARのmRNA量を定量した。SR-B1、LRL-R、PBR共に高濃度曝露群でコントロール群と比べて有意な高値を示した（図3）-17）。StARは、高濃度曝露群がコントロール群よりも高値を示したが有意差は認められなかった。中濃度曝露群と除粒子曝露群においては、SR-B1、LDL-R、PBR、StAR mRNA量共にコントロール群と差は認められなかった。

## Ⅲ．テストステロン生成

テストステロン生成に関与する⑦cytochrome P450 side-chain cleavage enzyme (P450scc)、⑧3β-hydroxysteroid dehydrogenase/5-4-isomerase (3β-HSD)、⑨cytochrome P450 17α-hydroxylase/C17-20 lyase (P450 17α)、⑩17β-HSD mRNA量を定量した。P450scc、3β-HSD、
P450 17α、17β-HSDの全てにおいて、高濃度曝露群がコントロール群に比較して有意な高値を示した。中濃度曝露群では、P450sccと17β-HSD mRNA量がコントロール群よりも高値を示したが有意差は認められなかった。除粒子曝露群では、全ての項目においてコントロール群と差が認められなかった（図(3)－17）。

図(3)－17 雄マウスへのNR-DE8週間曝露のの精巣テストステロン生成成酵素および関連因子mRNA発現に及ぼす影響。図中のClean air、Low、High、F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃
度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## 2 ）妊娠ラットの20日間曝露

## a．ステロイドホルモン合成関連因子およびLHリセプター

黄体中3β-HSDとP450SCCmRNAは、高濃度曝露群と除粒子曝露群でコントロール群よりも有意な低値を示したが、StARmRNAは、3群間で差が認められなかった。LHリセプターmRNAは、高濃度曝露群と除粒子曝露群がコントロール群よりも有意な低値を示した（図(3)-18）。

図(3)－18 妊娠ラットへのNR-DE20日間曝露のステロイドホルモン生成関連因子mRNAとLHレセプターmRNA発現に及ぼす影響。図中のClean air、NR-DE、F-DEはそれぞれ、コントロール群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## 3 ）雄ラットの1～3ヶ月曝露

## a．精巣のステロイド合成関連物質

ライディッヒ細胞のテストステロン合成は2つのステップ（コレステロールの合成およびミトコンドリアへの輸送のステップとテストステロンやエストラジオールの生成のステップ）に分けられる。最初のステップでは、コレステロールはHMG-CoA synthase and HMG-CoA reductaseの触媒反応によって合成され、これがコレステロール生成の律促段階と考えられている(Goh and Heimberg, 1976)。2か月高濃度曝露群によりHMG-CoA reductaseが低下したほかは、NR-DEやF-DEによるこれらの合成酵素、還元酵素への影響は見られなかった（図(3)－19A、B）。フリーのコレステロールはミトコンドリア膜にあるStARやPBRによって運ばれる(West et al., 2001)。1か月高濃度曝露や2、3か月中濃度曝露はコントロール群と比べてStAR mRNAを上昇させたが、除粒子曝露群
では変化が見られなった(図(3)−19C)。PBR mRNA濃度はいずれの条件下でも変化が見られなかった図(3)−19D)。

2番目のステップでは、コレステロールの側鎖がミトコンドリアのCYP11Aにより切断される(Payne, 1990)。その後3β-HSDやCYP17αの作用を受けて、プロジェステロンやdehydroepiandrosterone(DHEA)からアンドロステンジオンに変換される。その後17β-HSDによってアンドロステンジオンからテストステロンが合成される。アンドロステンジオンはアロマターゼによってエストラジオールに変換される(Payne, 1990)。中濃度の2,3か月曝露によりCYP11A mRNA濃度は上昇したが、高濃度曝露や除粒子曝露による変化は見られなかった(図(3)−19E)。いずれの条件下でもCYP17α,3β-HSD,17β-HSD mRNAは変化が見られなかった(図(3)−19F, G, H, I)。

図(3)－19 雄ラットへのNR-DE 1～3ヶ月曝露の精巣のステロイド合成関連物質への影響。図中のまとまった四色のバーはそれぞれ、（左より）コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## b．海馬のステロイド合成関連物質

1か月の時点において、コントロール群の海馬と精巣のテストステロン合成に関わる因子の発現量を比較した。海馬のHMG-CoA synthaseと17β-HSD mRNA量は精巣に比べ約4分の1であったが、HMG-CoA reductase濃度は約2倍であった(表(3)－4)。海馬のアロマターゼ、StAR, CYP11A,
CYP17α, and 3β-HSD mRNA量は精巣に比べてそれぞれ約1/30, 1/75, 1/2000, 1/3500, 1/35000であった。海馬のPBR mRNAは精巣と同程度であった。興味深い事に、高濃度曝露と除粒子曝露は海馬におけるこれらのmRNA発現量に全く影響を与えなかった(data not shown)。

表(3)－4．清浄空気に曝露されたラットの精巣・海馬中のmRNA発現レベル

Gene	Testis	Hippocampus
HMG-CoA reductase ( $ \times 10^{-3} $ )	10 ± 3	20 ± 20
HMG-CoA synthase ( $ \times 10^{-3} $ )	30 ± 8	8 ± 5
StAR ( $ \times 10^{-3} $ )	60 ± 10.0	0.8 ± 0.6
PBR ( $ \times 10^{-3} $ )	7 ± 2	9 ± 8
CYP11A ( $ \times 10^{-3} $ )	80 ± 20	0.04 ± 0.02
CYP17 $ \alpha $ ( $ \times 10^{-3} $ )	7 ± 4	0.002 ± 0.0006
3 $ \beta $ -HSD ( $ \times 10^{-3} $ )	70 ± 30	0.002 ± 0.001
17 $ \beta $ -HSD ( $ \times 10^{-3} $ )	0.3 ± 0.1	0.07 ± 0.07
Aromatase ( $ \times 10^{-3} $ )	0.2 ± 0.1	0.006 ± 0.006
GAPDH ( $ \times 10^{5} $ )	7 ± 3	40 ± 20

## c．精巣のエイコサノイド合成関連物質

エイコサノイド合成系において、Pla2g2aは最初に生体膜リン脂質からアラキドン酸の遊離させる酵素である。また、別の生理活性脂質であるリゾリン脂質の産生反応や、生体膜構成成分としてのリン脂質分子の再編成(remodeling)でも中心的に働く。Pla2g2aでは、除粒子曝露群のmRNA発現量に有意な増加が認められた。（図(3)－20）。Ptgs1は構成型の酵素、Ptgs2は誘導型の酵素で、それぞれエイコサノイド合成系のシクロオキシゲナーゼ経路で働き、アラキドン酸からのPGの合成に関与する。これらのmRNA発現量に、曝露による影響はみられなかった（図(3)－21A,B）。PtgisはPGからPGI2の合成に、PtgdsはPGからPGD2の合成に関与し、それぞれシクロオキシゲナーゼ経路で働く酵素である。これらのうち、Ptgisの高濃度曝露群のmRNA発現量に有意な減少が認められた。（図(3)－21C,D）Alox15とTgm2はエイコサノイド合成系のリポキシゲナーゼ経路で働く。Alox15はアラキドン酸に1分子の酸素を添加してヒドロペルオキシドを合成する酵素である。このうち、中濃度曝露群、除粒子曝露群のmRNA発現量に有意な増加が認められた（図(3)－22A）。Tgm2はロイコトリエンC4からのロイコトリエンD4の合成に働く酵素である。このうち、中濃度曝露群と除粒子曝露群のmRNA発現量に、有意な減少が認められた（図(3)－22B）。S100a10、S100a6、Pla2g4a、Anxa1、Ptger3はPG合成・制御系で働く酵素である。S100a6はCa2+依存性インスリン分泌の刺激やプロラクチン分泌の刺激、開口分泌において機能すると考えられている酵素であり、S100a10は開口分泌と飲食作用において機能すると考えられている酵素である。これらのmRNA発現量において、中濃度曝露群と除粒子曝露群のmRNA発現量に、有意な減少が認められた（図(3)－23A,B）。Pla2g4aはPla2g2aと同様に生体膜リン脂質からアラキドン酸の遊離させる酵素である。また、別の生理活性脂質であるリゾリン脂質の産生反応や、生体膜構成成分としてのリン脂質分子の再編成
(remodeling)でも中心的に働く。Pla2g4aのmRNA発現量に曝露による影響はみられなかった(図3)−23 c)。Anxa1は、ホスホリパーゼA2阻害活性を示す酵素である。このmRNA発現量に、曝露による影響はみられなかった(図3)−23 D)。Ptger3はPGE2に関して特定されている4つの受容体の1つであり、消化系、神経系、腎臓の再吸収、子宮収縮活性にかかわる多くの生物学的機能があると考えられている。このうち、除粒子曝露群のmRNA発現量に有意な増加が認められた(図3)−23 E)。Hsd17b2は、ステロイド系で働く酵素であり、アンドロステンジオンからエストロンへの合成や、テストステロンからのエストラジオール合成に関与している酵素である。このmRNA発現量に、曝露による影響はみられなかった(図3)−24)。また、PPARβは生体内に広く分布し脳内脂質代謝、HDL代謝や脂肪生成、前脂肪細胞分化を調節する酵素である。このうち、除粒子曝露群のmRNA発現量に有意な減少が認められた(図3)−25 A)。Cyp26a1は生体内の脂質代謝に関与する酵素である。このmRNA発現量では、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群において有意な減少が認められた(図3)−25 B)。

図(3)－20 エイコサノイド合成系の遺伝子発現。図中のclean air、standard NR-DE、high NR-DE、high F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

A Ptgs1(COX-1)

C PGIS

D Ptgds
図(3)－21 エイコサノイド合成系・シクロオキシゲナーゼ経路の遺伝子発現。図中のclean air、standard NR-DE、high NR-DE、high F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

図(3)－22 エイコサノイド合成系・リポキシゲナーゼ経路の遺伝子発現。図中のclean air、standard NR-DE、high NR-DE、high F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。
A S100a6

図(3)－23 PG合成・制御系の遺伝子発現。図中のclean air、standard NR-DE、high NR-DE、high F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

図(3)－24 ステロイド系の遺伝子発現。図中のclean air、standard NR-DE、high NR-DE、high F-DE はそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。
図(3)－25 PPAR、CYPの遺伝子発現。図中のclean air、standard NR-DE、high NR-DE、high F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## (7) ウェスタンブロット

## 1 ）雄ラットの1～3ヶ月曝露

## a．精巣中タンパクのウェスタンブロット解析

前述の通り、2か月後中濃度の曝露によりコントロール群と比較してStARとCYP11A mRNAが上昇したが、CYP17α mRNAには変化が見られなかった。そこで、ウェスタンブロットでタンパクレベルを確認した。2か月後中濃度のNR-DE曝露はStARとCYP11Aのタンパク量を有意に増加させた(図(3)−26 A,B)。2か月曝露後ではコントロール群に比べて有意にCYP11Aタンパク量が減少したが、高濃度曝露群と除粒子曝露群間には差は見られなかった。コントロール群に比べて除粒子曝露群ではCYP17α量が有意に減少していた(図(3)−26C)。

図(3)－26 精巣中タンパクのウェスタンブロット解析。図中のclean air、Medium NR-DE、high NR-DE、
high F-DEはそれぞれ、コントロール群、中濃度曝露群、高濃度曝露群、除粒子曝露群を表す。

## （8） DNA マイクロアレイによる網羅的解析

## 1 ）雄ラットの1～3ヶ月曝露

## a．パスウェイ解析結果

Z score値を基にパスウェイのランキング化を行った結果、ヘッジホッグングナル、ヌクレオチドGタンパク質共役受容体、脂質生成、補体活性化、エイコサノイド合成、接着斑、炎症反応、PG合成・制御、ペプチドGタンパク質共役受容体経路が抽出された。過去のテストステロンの結果同様、中濃度曝露群でのみ変化している遺伝子が多数抽出された。肝臓で変化の見られたエイコサノイド合成、PG合成・制御が精巣でも変化が見られた点が注目される。これまでに曝露によって精巣での上昇が確認されていたStARは本実験の結果では2.6倍の上昇がみられた（表(3)－5、図(3)－27～29）。

表(3)−5 パスウェイ解析により抽出された経路

11-2/10-8	12-2/10-8	13-4/10-8
Up	·脂質生成·補体活性化·エイコサノイド合成·接着斑·炎症反応·PG合成·制御	·ペプチドGタンパク質共役受容体	·ペプチドGタンパク質共役受容体·ロドプシン様クラスAGタンパク質共役受容体
Down	·ヘッジホッグシグナル·ヌクレオチドGタンパク質共役受容体	·脂質生成	·炎症反応

図(3)－27 パスウェイ解析結果の見かた（標準濃度曝露群：11-2、高濃度曝露群：12-2、高濃度除粒子群13-4とコントロール群：10-8の比）
精巣プロスタグランジン合成・制御

図3-28 精巣PG合成系

精巣エイコサノイド合成

図(3)−29 精巣エイコサノイド合成系

## b．クラスター解析結果

クラスター解析を行い、6つに大別された（図(3)−30）。機能がまだ解明されていない遺伝子も含まれているが、クラスタリングされた結果から同じ挙動を示す遺伝子であるとの推測が可能となった。