Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
3）個体のMHC型に関連する遺伝子領域など、個体の生存価に直結する遺伝子領域の多様性を調べる手法を開発する。

4）野生個体の糞試料から、ヒト感染症の病原体特異抗体を検出する方法を開発する。またその手法を用いて、各野生個体群がどういった種類のヒト由来感染症にどの程度の割合で罹患しているのかを調べる。その結果に基づいて、個体群ごとのヒト由来感染症のアウトブレークのリスク評価を行い、感染防止のためのガイドラインを作る。

5）アジア、アフリカの主な絶滅危惧霊長類を対象に、生息地面積、植生、個体数、人口動態等の情報をまとめ、データベース化して公開する。これらの情報と、本研究で得られる遺伝的多様性とヒト由来ウイルスの感染リスクに関する情報をあわせて、各地域個体群の存続可能性分析を行う。

6）霊長類研究所で発生したニホンザルの原因不明の血小板減少症について、人獣共通感染症である可能性も含めて原因を特定する。

7）以上の結果にもとづいて、地域レベルで有効な霊長類保護計画をたて、それを実行に移しつつ効果を検証する。また、本研究の成果をもとに、国際自然保護連合等の国際機関に協力して各種を対象とした保護のマスタープランを作り、行政による保護政策の立案に寄与する。

### 3. 研究開発の方法

## (1) 最小存続可能集団の定義にむけた孤立個体群の生物学的・集団遺伝学的研究

1）広域レベルの生息地評価では、絶滅危惧種であり、生息域全域からの情報と試料の入手ができるボノボを対象に、過去の観察情報をもとにボノボの現在の生息地を割り出した。また、GIS（地理情報システム）を用いて、ボノボの生息に影響を与えると考えられる生息域内各地の伐採地の密度、川からの距離、農地からの距離、人口密度を調べた。これらの情報を総合して、ボノボの生息好適地を割り出し、現在国立公園、学術保護区、コミュニティリザーブ等として保護されている地域と比較した（GAP分析）。

2）詳細レベルの生息地評価では、長期にわたる現地調査が行われてきたルオー学術保護区において、衛星画像（Landsat TM）から分析した植生タイプと、2008年1年間にボノボを追跡しながら1分おきに記録したGPSの位置情報と、採食、休息等の行動データをあわせて分析し、季節ごとにボノボが採食や泊まり場としてそれぞれの植生を利用する頻度を割り出した。これによって、どのような植生がボノボにとって利用価値が高いのか、年間を通じて食物を得るためには、どのような植生が遊動域内になくてはならないのかといった生息地評価を行った。

3）野生個体から採取する糞サンプルは、鮮度が低かったり各種阻害物質の影響を受けたりするため、DNAの抽出が難しい。本研究では、細胞膜を破碎する界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム、DNA分解酵素の阻害剤としてエチレンジアミン四酢酸およびTris-HCl緩衝液を主成分とする溶解液を用いた独自の手法を開発し、効率的にDNAを抽出できるようにした。

4）従来の遺伝的多様性の研究では、生存価に直結しない中立領域の塩基配列を調べることが多かった。本研究ではそれに加えて、免疫系を決めるMHC領域等、個体の生存価に直結する領域の遺伝的多様性を調べる手法を開発した。

5）以上の方法により、地域個体群内の遺伝的多様性、個体群間の遺伝子交流の程度などを解析し、各地域個体群の存続可能性の評価を行った。

## (2) 孤立個体群における人獣共通感染症のリスクアセスメントとサーベイランス

1）野生個体のヒト由来病原体の感染状況を調べるため、糞試料から病原体特異的IgA抗体を検出する方法を開発した。このため、霊長類研究所の飼育チンパンジーの血液で、一般に使われるIgG抗体とIgA抗体がともに検出された個体について、糞中からIgA抗体を検出するプロトコル（ELISA法）を作成し、糞中のIgA抗体の検出で感染状況が調べられることを示した。さらに、野生チンパンジーでアウトブレークが観察されている呼吸器感染症の原因ウイルスについて、それぞれの特異抗体を検出するELISA系を独自に構築した。

2）この方法を用いて、野生ボノボの4つの地域集団から得られた糞試料を分析し、ヒト由来の各ウイルスに対する感染実態を調べた。

3）ニホンザルの血小板減少症については、社団法人予防衛生協会、国立感染症研究所、大阪大学微生物病研究所、京都大学ウイルス研究所等の研究機関との共同研究により、RDV法（Rapid Determination system of Viral RNA sequence method）や次世代シークエンサーによるメタゲノム解析といった網羅的解析法、および病原体特異的なPCRあるいはRT-PCR法を用いて原因病原体の解明を試みた。

## (3) 孤立個体群の現状分析と生息地の維持・回復のための生態学的・社会学的研究

1）生息地に関する基礎的な情報（気候、地形、植生）、個体群の存続に影響を及ぼす人間活動を含めた個体群動態に関連する情報を、既存の文献から該当する記述を抽出、整理しデータベース化した。
2）金華山島および宮城県本土側の個体群から得られたマイクロサテライト8領域の情報を用い、個体群間の遺伝的構造を分析した。これにより、両孤立個体群におけるボトルネック効果の有無や遺伝的な有効集団サイズを推定した。また、下北半島のニホンザル群を例に個体数変動のシミュレーションを行い、過去の個体数データとの比較でモデルの正確性を検証した。

3）ボノボの個体群データを例に、VOLTEXプログラムを用いて存続可能性分析を行った。

### 4. 結果及び考察

## (1) 最小存続可能集団の定義にむけた孤立個体群の生物学的・集団遺伝学的研究

1）ボノボを対象とした広域レベルの生息地分析では、重要な生息好適地の半分程度が国立公園等の保護区として守られていることがわかった。しかし一方、生息好適地とはいいがたくボノボもほとんど生息していない地域が保護区となっている例や、大面積のボノボの生息好適地に保護の網がかけられていない例があることが明らかになった。

2）この分析の結果を用いて保護政策立案に向けた活動を行った結果、2012年4月にイヨンジ・コミュニティ・ボノボ保護区の設立がコンゴ民主共和国環境省に認可された。

3）ボノボの生息域全域をカバーする7つの地域個体群から糞資料を収集して分析し、ミトコンドリアDNAの遺伝子型の分布を明らかにした。この分析で6つのハプログループが分類されたが、このうちの1つは、従来から存在は知られていたがその分布地がわからなかったもの、もう1つは今回新たにその存在が明らかになったもので、この研究によってボノボの遺伝子型の分布様式の理解に大きく寄与した。

4）ボノボの7個体群は西部、中央部、東部の3つのコホートに分けられ、中央部のコホートはもっとも多様な遺伝子型を保持している点で、東部のコホートは独自のユニークな遺伝子型を保有している点で保護計画上とくに重要であることを示した。また、他の個体群から隔離されている西部、中央部、および東部コホートに属する各1個体群では、個体群内の遺伝的多様性が他の個体群に比べて低く、孤立が遺伝的多様性の低下に結びついていることが示された。

5）東北地方のニホンザルの遺伝子型の分布に関する分析では、下北半島と津軽半島の個体群が他の個体群から遺伝的に孤立していること、地理的隔離からの年数や現存個体数から考えられる以上に遺伝的劣化が進んでいることが確認された。このことは、目標頭数のみに頼る現在の保護管理政策のあり方の再考を促すものとなった。

6）バングラデシュ都市部に生息するアカゲザル、スリランカに生息するトクモンキーについても遺伝子型の分布と個体群内の遺伝的多様性に関する分析を行い、保護計画の立案に資する基礎情報を得ることができた。

## (2) 孤立個体群における人獣共通感染症のリスクアセスメントとサーベイランス

1）霊長類研究所で飼育されている14頭のチンパンジーから得た血清由来試料を用いて、各種病原体に対する特異的IgG抗体の有無を検討した。その結果15種のヒト由来感染症の病原体特異抗体がきわめて高率で確認され、予想以上にヒトからの感染が起こっていることが確認された。

2）野生ボノボの4地域個体群から採取された糞試料を調べたところ、インフルエンザウイルスにおいては21-28%、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウィルス、RSウイルスについては22-27%の抗体陽性率が認められた。また、各ウイルスに対する抗体陽性率は、個体群ごとに大きく異なった。陽性率が高いところについては、過去に頻繁にヒトからのウイルス感染が起こっていることが考えられ、これをもとに感染防止のガイドラインを作成して試験的に実行に移した。一方、陽性率が低いところについては、免疫力のないところに新たにヒト由来感染症のウイルスが入ることで爆発的なアウトブレークが起こる可能性が考えられ、とくに厳しいガイドラインを作成する必要があることがわかった。

3）ニホンザルの血小板減少症については、カニクイザルを自然宿主とするサルレトロウイルス4型がニホンザルに感染することによって致死的な感染症が引き起こされることがわかった。このことは、本研究のテーマのひとつである種の壁を越えた感染の危険性を、改めて認識させることになった。

## (3) 孤立個体群の現状分析と生息地の維持・回復のための生態学的・社会学的研究

1）アジア・アフリカに生息する類人猿とニホンザルについて、各孤立個体群の現状についての情報を集めてデータベース化し、世界に公開した。大型類人猿については、ボッソウ・ニンバ生態圏保護区（ギニア共和国）、カリンズ森林保護区（ウガンダ共和国）、マハレ山塊国立公園・ウガラ森林保護区（タンザニア連合共和国）、カフジ・ビエガ国立公園（コンゴ民主共和国）、ムカラバ・ドゥドゥ国立公園（ガボン共和国）のチンパンジー、ルオー学術保護区（コンゴ民主共和国）のボノボ、カフジ・ビエガ国立公園のヒガシローランドゴリラ、ムカラバ・ドゥドゥ国立公園のニシローランドゴリラ、ダナムバレー保護区（マレーシア）のオランウータンを情報収集の対象とした。またニホンザルについては、下北半島・津軽半島、金華山島、淡路島、小豆島、幸島、および屋久島の孤立個体群を対象
とした。これらのデータは各地の保護計画の立案に大いに活用されるものと期待される。

2）ニホンザルについては、環境収容力の小さな島嶼個体群と本土の個体群における、個体群の縮小と回復の過程でおこる遺伝的影響を検討した。また、個体群動態パラメータの推定に使用したデータの年数や精度によって、存続可能性の評価(個体数変動の予測)の正確性がどのように異なるか検討した。これらの成果は、存続可能性を考慮したニホンザルの保全管理対策を考える際に、有用な参考情報として利用できる。

3）ボノボについては、上記のデータベースのデータを用いて、存続可能性分析を行った。また、その成果とサブテーマ1、2の成果をもとに、国際自然保護連合のワーキンググループの一委員としてボノボの保護のためのマスタープラン“bonobo（Pan paniscus）conservation strategy 2012-2022”を編纂し、出版した。このマスタープランは、コンゴ民主共和国政府によるボノボの保護政策の立案や世界の様々なNGOによる保護活動に大いに活用されるものと期待できる。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

科学的意義としてはまず、野生個体から非侵襲的手法で入手できる糞資料から効率的にDNAと病原体特異的IgA抗体を抽出する方法を開発したことがあげられる。糞資料からDNAを抽出する方法はこれまでにも利用されてきたが、主として利用されている方法が民間企業であるQiagen社が販売するキットを使うもので、単価が高価なことや、仕様が公開されていないために抽出効率の改善ができないことなどの問題があった。本研究で開発した試薬はきわめて安価につくることができ、また仕様を公開することで各研究者が自由に改良に取り組むことができる。抽出効率もQiagen社のキットと同等以上になっている。すでにいくつかの研究グループから問い合わせがあり、今後多くの野外研究で利用されることが期待される。一方糞から病原体特異抗体を抽出して野生個体の感染症罹患歴をさぐるというのは、全く新しい方法である。これまでのような血液試料を用いる方法とはことなり、広域に分布する多くの個体の罹患状況を調べることができ、人獣共通感染症のリスクの研究や罹患状況のモニタリングに、画期的な展開をもたらすことができる。

本研究の主要な対象のひとつである類人猿のボノボについて、世界各国の研究チームとの協力のもとに、ボノボの生息域全体をカバーする7カ所の地域個体群からの糞試料が日本に集まってくるシステムを築き上げたことも、きわめて高い学術的価値をもつ。人にもっとも近く、かつ絶滅危惧種に指定されているボノボについて、これほど広域からの試料を扱える研究チームはほかになく、大きな学術的価値をもつ研究を生み出すことができる。

実際ボノボの遺伝子型の研究では、ボノボの生息域全域にわたるミトコンドリアDNAのハプロタイプの分布と各地域個体群の遺伝的多様性を明らかにする世界ではじめてとなる研究成果をあげた。Y染色体の遺伝子の多様性や常染色体のマイクロサテライトの遺伝子の多様性に関する分析も進めており、近い将来さらに多くの研究成果をあげることができると期待される。また、野生ボノボの病原体特異抗体の研究では、野生ボノボが20～30パーセントというきわめて高い率で各種病原ウイルスに対する特異抗体を持っていることを、はじめて明らかにした。また、病原抗体の保有率は地域個体群によって大きく異なることも明らかにし、それぞれの地域の実情に即した感染防止のガイドラインの作成に寄与することができた。

ニホンザルを対象として行った、生存や繁殖に関係が深い遺伝子群をもつMHC領域の多様性についての研究も、保全生物学上きわめて大きな価値をもつ。これまでの遺伝的多様性に関する研究は、個体の生存価に直接関係のない中立的な染色体部位を用いて行われてきたが、それでは検出された遺伝的多様性が地域個体群の存続可能性とどのような関係を持つかがわからない。この研究の成果は、霊長類のみならず多くの動物種について、孤立個体群の適応度や存続可能性に関する研究に活用されるものと期待される。

霊長類研究所で発生したニホンザルの致死性の血小板減少症の原因を究明したことも、高い学術的価値をもつ。カニクイザルを宿主とするほぼ無害なSRV4型ウイルスが、ニホンザルに感染するときわめて重篤な感染症を引き起こすことは、鳥インフルエンザやSARSなど、種の壁を越えた病原体感染の危険性を改めて認識させることになった。また、複数の研究機関が密接に協力して異例ともいえる速さで原因ウイルスを特定したことは、将来の未知のウイルスの発生に対応する体制を作り上げたという点で大きな意義がある。

## (2) 環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

本研究のサブテーマ1では、コンゴ民主共和国にのみ生息するボノボについて、過去の観察例のデータベース、衛星画像、地理情報システムを活用して生息適地を割り出し、国立公園等の既存の保護区とのずれを検討するGAP分析を行った。その結果、ボノボの生息域内に保護の網のかかっていない広大な生息適地が2か所あることがわかった。このうちのひとつであるイヨンジ村南部地域では、かねてから本研究チームが、同地区の住人がつくるNGO、コンゴ民主共和国生態森林研究所、国際的NGOであるAfrican Wildlife Foundation等と協力して保護区化への取り組みを進めていたが、本研究の成果も大きな力の一つとなって、2012年4月に同国環境省によ
ってイヨンジ・コミュニティ・ボノボ保護区の設立が正式に認められた。

日本人研究者がイニシアティブをとる形でボノボの保護区が設立されたのは、1989年に設立されたルオー学術保護区に次いで2つ目になる。人にもっとも近い絶滅危惧種であるボノボの保護に貢献することで、日本の環境行政の世界におけるプレゼンスを大いに高めることができた。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

ボノボについては、研究代表者の古市が委員として参加する国際自然保護連合のワーキンググループで向こう10年間の保護に関するアクションプランを作成し、「Bonobo Conservation Strategy 2012-2022」として2013年1月に出版した。このアクションプランでは、本推進費プロジェクトが遺伝的多様性と人獣共通感染症の調査、分析を担当した。このワークグループにはコンゴ民主共和国環境省および科学研究省のメンバーも参加しており、同国政府によるボノボの保護政策の立案に際しては、保護すべきプライオリティ・ポピュレーションの選定や実際の保護計画の策定という点で、この提案書の内容が活用されると期待できる。また、類人猿各種の長期調査で圧倒的なプレゼンスをもつ日本が遺伝的多様性の劣化と人獣共通感染症という今日的問題の研究に先頭に立って取り組むことで、生物多様性の保全にむけた国際的な取り組みにおける日本の環境行政のプレゼンスを大いに高めることができる。

ニホンザルについては、個体群の大幅な縮小を経験した島嶼および本土の個体群について、遺伝的特性を明らかにすることができた。とくに、下北半島と津軽半島の個体群では、現存頭数から推定される以上に遺伝的多様性の低下が進んでいることが確認できた。分析できたのは一部の個体群に過ぎないが、同様の歴史を持つ各地の個体群について、遺伝的特性を考慮した保全管理対策を行う際に参考となる情報を提供できた。さらに、下北のニホンザル個体群の長期データを用いることで、調査の年数や精度と個体数シミュレーションの正確性について一応の基準を示すことができた。現在各地のニホンザル個体群の保護管理は、個体数管理の権限を地方自治体にゆだねて駆除等を行う形で進められている。本研究の結果は、こういった現場レベルの頭数のみによる保護管理では重要な地域個体群の将来にむけた存続が保証できない可能性があることを示しており、学術的エビデンスに基づいた環境省等による国レベルの管理が強く求められる。

野生動物の糞資料を用いた病原体特異抗体の検出技術の開発は、人獣共通感染症のサーベイランスや感染症発生のモニタリング、感染防止のガイドラインの作成に大いに活用されるものと期待できる。また、本研究では社団法人予防衛生協会、国立感染症研究所、大阪大学微生物病研究所、京都大学ウイルス研究所、長崎大学熱帯医学研究所が協力してニホンザルのウイルス感染症の解明にあたったが、ここで築きあげた協力体制は、今後起こりうる新興感染症のリスク評価、原因解明、対策立案といった点で、日本の環境・厚生行政に寄与するものと考える。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

## <查読付論文>

1) Furuichi T (2011) Female contributions to the peaceful nature of bonobo society. Evolutionary Anthropology 20: 131–142

2) Furuichi T, Idani G, Ihobe H, Hashimoto C, Tashiro Y, Sakamaki T, Mulavwa BN, Yangozene K, Kuroda S (2011) Long-term studies on wild bonobos at Wamba, Luo Scientific Reserve, D.R. Congo: towards the understanding of female life history in a male-philopatric species. In: Kappeler P, Watts D (eds) Long-term field studies of primates. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 413-433.

3) Tsuji Y (2011) Seed dispersal by Japanese macaques (Macaca fuscata) in western Tokyo, Japan: a preliminary report. Mammal Study 36: 165–168.

4) Tsuji Y (2011) Sleeping site preferences of wild Japanese macaques (Macaca fuscata): the importance of nonpredatory factors. Journal of Mammalogy 92: 1261-1269.

5) 辻大和、和田一雄、渡邊邦夫（2011）野生二木ンザルの採食する木本植物 付記:二木ンザルの食性研究の今後の課題. 霊長類研究 27:27-49.

6) Adenyo C, Hayano A, Inoue E, Kayang BB, Inoue-Murayama M (2012) Development of microsatellite markers for grasscutter (Thryonomys swinderianus, RODENTIA) using next-generation sequencing technology. Conservation Genetics Resources, 4(4): 1011–1014.

7) Imai H, Suzuki N, Ishimaru Y, Sakurai T, Yin L, Pan W, Abe K, Misaka T, Hirai H (2012) Functional diversity of bitter taste receptor TAS2R16 in primates. Biology Letters 8: 652–656.

8) Hayakawa T, Sugawara T, Go Y, Udono T, Hirai H, Imai H (2012) Eco-Geographical Diversification of Bitter Taste Receptor Genes (TAS2Rs) among Subspecies of Chimpanzees (Pan troglodytes). PLOS
animals. The 15th Kyoto University International Symposium, Nagoya.

20) Kanamori T, Kuze N, Bernard H, Malim TP, Kohshima S (2010.9) Feeding ecology of Bornean orangutans (Pongo pygmaeus morio) in Danum Valley, Sabah, Malaysia: A 3-year record including two mast fruitings. The 15th Kyoto University International Symposium, Nagoya.

21）鈴村崇文、冠地富士男、杉浦秀樹、松沢哲郎、伊谷原一（2010.11）幸島野生二木ンザルにおける58年間の人口統計学的解析、第13回SAGAシンポジウム、横浜

22）鵜殿俊史、谷川和也、鈴木幸一、石井則久、藤澤道子、伊谷原一（2010.11）チンパンジーに見られたハンセン病の1例、第13回SAGAシンポジウム、横浜

23）吉田友教、岡本宗裕、明里宏文、今井啓雄、松井淳、早川敏之、生駒智子、伯川美穂、齊藤波子、渡邊朗野、兼子明久、宮部貴子、鈴木樹理、平井啓久（2011.5）京大霊長研に見られたニホンザル血小板減少症（4）：疫学調査．第58回日本実験動物学会総会、東京

24）明里宏文、鈴木樹理、岡本宗裕、宮部貴子、渡邊朗野、兼子明久、熊崎清則、阿部政光、鎌中慶朗、前田典彦、森本真弓、渡邊祥平、須田直子、平井啓久、松沢哲郎（2011.5）京大霊長研に見られたニホンザル血小板減少症（1）：概要報告. 第58回日本実験動物学会総会、東京

25) Kawamoto Y (2011.6) Genetic diversity of macaques in Sri Lanka. "International Symposium Integrative Research on Monkeys, Man and Malaria in Asia", University of Sri Jayewardenepura, Sri Lanka.

26）橋本千絵、安岡宏和、手塚賢至、古市剛史（2011.7）ウガンダ共和国における森林保護区周辺の地域住民による森林資源の利用の実態．第27回日本霊長類学会大会、犬山

27）金森朝子、久世濃子、山崎彩夏、Bernard H、Malim PH、幸島司郎（2011.7）ボルネオ島ダナムバレー森林保護地域における野生オランウータンの個体群密度と果実生産量 -3回の一斉結実を含む5年間の季節変化 - ポスター発表．第27回日本霊長類学会大会、犬山

28）川本芳、三戸幸久、樋口翔子、川本咲江（2011.7）津軽半島個体群の遺伝的特徴からみた北限のニホンザルの成立．第27回日本霊長類学会大会、犬山

29）風張喜子、井上英治、川本芳、中川尚史、井上-村山美穂（2011.7）金華山の二ホンザルの遺伝的多様性．第27回日本霊長類学会大会、犬山

30）久世濃子、金森朝子、山崎彩夏、Henry Bernard、Titol Peter Malim、幸島司郎（2011.7）ボルネオ島ダナムバレー森林保護区において5年間に観察されたオトナ雄の移出入．第27回日本霊長類学会大会、犬山

31）中村美知夫、ナディア・コープ、藤本麻里子、藤田志歩、花村俊吉、早木仁成、保坂和彦、マイケル・A・ハフマン、稲葉あぐみ、井上英治、伊藤詞子、川中健二、沓掛展之、清野（布施）未恵子、郡山尚紀、リンダ・F・マーシャント、松本晶子、松阪崇久、ウィリアム・C・マックグルー、ジョン・C・ミタニ、西江仁徳、乗越皓司、坂巻哲也、島田将喜、リンダ・A・ターナー、上原重男、ジェームズ・V・ワキバラ、座馬耕一郎、西田利貞（2011.7）マハレのチンパンジーの遊動域—16年間のデータから．第27回日本霊長類学会大会、犬山

32）吉川翠、小川秀司、小金澤正昭、伊谷原一（2011.7）疎開林に棲息するチンパンジーの泊まり場の植生と地形．第27回日本霊長類学会大会、犬山

33）今井啓雄、郷康広、平井啓久（2011.9）霊長類ゲノムスクリーニングによる自然発生的遺伝子変異モデルの探索．第34回日本神経科学会大会、横浜

34）辻大和（2011.9）金華山島における二木ンザルの生態研究－長期調査からみえてきたこと－．日本哺乳類学会奨励賞記念講演．日本哺乳類学会、宮崎

35) Yoshida T, Okamoto M, Akari H, Suzuki J, Miyabe-Nishiwaki T, Hayakawa T, Imai H, Matsui A, Watanabe A, Kaneko A, Hirai H (2011.9) Simian retrovirus-4-associated infectious thrombocytopenia in Japanese macaques. The Unlimited World Microbes International Union of Microbiological Societies 2011 Congress XV International Congress of Virology. Sapporo.

36）明里宏文、鈴木樹理、岡本宗裕、宮部貴子、渡邊朗野、兼子明久、阿部政光、釜中慶朗、前田典彦、森本真弓、渡邊祥平、須田直子、平井啓久、松沢哲郎（2011.9）二木ンザル血小板減少症の発生に関する経過概要. 第152回日本獣医学会学術集会、大阪

37）明里宏文（2011.10）霊長類モデル動物を用いたウイルス感染症研究. 東京医科歯科大学・難治疾患共同研究拠点研究集会、東京

38）古市剛史（2011.11）ボノボ: 水がボノボを生んだ～コンゴ盆地のボノボの進化と生活．第14回SAGAシンポジウム，熊本市動物園、熊本

39）古市剛史（2011.11）ボノボの住むコンゴ盆地の大熱帯雨林：その現状と将来．第56回プリマーテス研究会日本モンキーセンター、犬山
### 7. 研究者略壓

課題代表者:古市 剛史

京都大学理学部卒業、理学博士、現在、京都大学霊長類研究所 社会進化分野教授

## 研究参画者

(1): 川本芳

東北大学理学部卒業、理学博士、現在、京都大学霊長類研究所 ゲノム多様性分野准教授

(2): 明里 宏文

鹿児島大学農学部卒業、獣医学博士、現在、京都大学霊長類研究所 人類進化モデル研究センター教授

(3): 伊谷 原一

酪農学園大学酪農学部卒業、理学博士、現在、京都大学野生動物研究センター教授
## D-1007 高人口密度地域における孤立した霊長類個体群の持続的保護管理

(1) 最小存続可能集団の定義にむけた孤立個体群の生態学的・集団遺伝学的研究

京都大学 霊長類研究所

社会進化分野 古市剛史

ゲノム多様性分野 川本芳

社会進化分野 ハフマン・マイケル

遺伝子情報分野 今井啓雄

生態保全分野 半谷吾郎

生態保全分野 橋本千絵

思考言語分野 林美里

社会進化分野 辻大和

社会進化分野 竹元博幸

平成22～24年度累計予算額：89,103千円

（うち、平成24年度予算額：28,634千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

絶滅が危惧される野生霊長類の地域個体群を対象に、類人猿による利用実態にもとづいた生息地評価と、各個体群の遺伝的多様性および遺伝的多型の分布様式に関する研究を行った。

広域レベルの生息地評価では、ボノボの生息確認地のGPS（汎地球測位システム）情報と、農地からの距離等のGIS（地理情報システム）情報をあわせて分析してボノボの生息好適地を割り出し、国立公園や保護区として守られていない地域については保護の網をかぶせるようつとめた。一方詳細レベルでは、1年間にわたって蓄積されたボノボの遊動の毎分のGPS情報と、ランドサット衛星画像から割り出した植生タイプを比較して植生タイプごとの利用度を割り出し、ボノボの生息地の環境許容度に関する分析を進めた。

遺伝子に関する研究では、ニホンザル、アカゲザル、トクモンキー、ボノボの野生個体群を対象に、糞資料を用いた非侵襲的方法で地域個体群内の遺伝的多様性や個体群間の交流について調べた。まず糞 DNA による調査法の検討を行い、溶解液によるサンプリング法を考案し、簡便な DNA 調製法を確立した。また、調製 DNA の質と量を判定する独自の検査系も考案し、実用化した。つぎに、糞で得た少量の DNA で多種の遺伝標識を反復試験する方法として、2 段階マルチプレックス PCR を改良し実用化した。さらに、繁殖や生存に関係する MHC 領域の遺伝的多様性を検査するため、MHC-STR 検査法を導入し、研究に応用した。

これらの方法を用いて、東北地方に孤立するニホンザル個体群の遺伝的多様性とその原因、長期観察から繁殖や生存の記録が豊富なニホンザル幸島個体群のMHC多型の特徴、バングラデシュの都市に孤立するアカゲザル個体群の遺伝的特徴と成立過程、スリランカの固有種トクモンキーの亜種分化と遺伝分化の関係および系統地理、コンゴ民主共和国のボノボ個体群のmtDNA変異からみた遺伝的多様性と地域分化等、保全計画の立案に資する基礎情報を把握できた。
[キーワード]

孤立個体群、生息地評価、植生利用、非侵襲的遺伝子分析、遺伝的多樣性

## 1 はじめに

## （１）背景について

ヒト以外の霊長類はすべて赤道から中緯度の地域、すなわち人口密度の高いところにいる。そのため、人間とそれ以外の霊長類は共存することを余儀なくされ、農地の拡大や森林伐採等によって生息地が「分断化」され、「孤立化」している。将来にわたって霊長類個体群の存続を保証しようと考えた場合、大面積の自然林とそこに住む霊長類を保護するということでは、もはや対応できない。このような分断された個体群をいかに守り、いかに次世代に伝えるかが、霊長類を次世代にまで残そうとする場合の最重要課題となっている。日本は、アフリカだけでも10年～50年間も続く類人猿の長期調査地を6カ所も有し、類人猿の研究においては世界でも並外れた存在感を示している。また、野生霊長類が生息する唯一の先進国として、ニホンザルをどのように保護・管理して共存を維持していくのかという点が、常に世界の注目を集めている。本研究プロジェクトで、類人猿とニホンザルを中心として保護管理上の重要問題に先頭に立って取り組むことは、生物多様性の保全にむけた世界の動きの中で、日本の取り組みのプレゼンスを大いに高めることになる。

この目的のためには、まずそれぞれの霊長類種ついて、現在どこに生息しているか、どこが生息に適した地域か、その地域は保護政策によって守られているかどうかといった、広域レベルでの分析を行う必要がある。GAP 分析ともよばれるこの分析は、生息現況の把握とともに、今後保護活動を展開すべき地域の選定にも役立つ。さらに、それぞれの生息地について、その霊長類種が採食、休息等にどのような植生をどの程度利用しているのか、年間を通じて生息を保証するにはどういった植生の組み合わせが必要かなどといった詳細レベルの分析を行い、各地域の生息可能頭数を評価する必要がある。これらの情報にもとづいて、地域レベルでの有効な保護計画を立案することができる。

一方、孤立個体群の保護には、遺伝的多様性の評価も欠かせない。個体群の孤立を理解するには、まず問題となる個体群の構成個体について遺伝子情報を集め、質的および量的な評価をすることが先決となる。また、生存や絶滅に関する研究は遺伝学的な情報だけでは成り立たず、遺伝子構成や遺伝子多様性と個体群パラメータの照合が必要になる。

孤立個体群や絶滅に瀕する個体群から遺伝子情報を得るとき、捕獲に頼る試料採取は現実的でない。このため、本サブテーマにおける集団遺伝学的研究では、捕獲によらない、非侵襲的試料採取法（non-invasive sampling method）を採用する必要があった。実際には、個体の遺伝子を調査するため、糞に含まれる腸管由来の細胞をDNA分析の試料とすることになった。

多様な社会構造をもつ霊長類の野生個体群を対象にこのような集団遺伝学的調査を実施するとき、利用する遺伝子ツールの選択に配慮すべき問題として、標識遺伝子の遺伝様式がある。表1には調査に利用可能な遺伝子ツールとその遺伝様式の違いをまとめた。
表 1 霊長類の野生個体群を対象にした集団遺伝学研究で利用可能な遺伝子ツール

標識となる遺伝子ツール	遺伝様式
ミトコンドリア DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)	母性遺伝
常染色体 DNA (autosomal DNA)	両性遺伝
X 染色体 DNA (X chromosomal DNA)	両性遺伝
Y 染色体 DNA (Y chromosomal DNA)	限性遺伝

遺伝子ツールの遺伝様式の違いと同様に、霊長類では種に特有な雌雄の生活史に注意することも本サブテーマの集団遺伝学的研究では重要である。ニホンザルや多くの旧世界ザルで顕著な母系社会をもつ種では、メスが出生群に残るのに対してオスは移住し、個体群間の遺伝子交流の担い手となる。一方、チンパンジーやボノボでは、メスが移住しオスが出生グループに残る逆の生活史をもつ。従って、遺伝様式の違いと生活史の違いによる性差を組み合わせることにより、対象種の個体群に関する遺伝的特徴の調査方法の設計が変わってくる。実際、本プロジェクトではマカク（ニホンザル Macaca fuscata、アカゲザル M. mulatta、トクモンキー M. sinica を含む分類単位）とボノボ Pan paniscus という異なる生活史をもつ対象につき、同じ遺伝子を別の意味をもつツールとして利用することになった。

## （２）ツール開発の経緯

本サブテーマの集団遺伝学的研究では2つの重要な技術を考案し、応用できた。第一は糞試料による多様性研究手法の確立、第二は個体群の適応性評価との関連付けが期待できる主要組織適合遺伝子複合体（MHC = major histocompatibility complex）にあるDNAの反復配列多型の分析方法の確立である。

前者は1年目の研究で糞から独自のDNA抽出と分析法を開発し、2年目の研究で更にその方法を改良した2段階マルチプレックスPCR法を考案、利用することで達成できた。この開発により、本サブテーマで目標に掲げた種や個体群を対象にした遺伝学的調査は順調に進み、ほぼ当初の目的を満たす結果を得ることに成功した。それらの内容については、以下の節で詳しく説明する。

後者は2年目の研究で基本的なデザインを考案し、ニホンザル下北個体群で試験研究を行った。そのあと3年目の研究でニホンザル幸島個体群を対象に応用研究を行うとともに、ボノボの研究にも試験的に応用することで達成できた。このツール開発は、1年目の1月に行われたアドバイザリーボード会議で、アドバイザーから受けたアドバイスが発端となっている。糞DNA分析の目処がたったことを報告した際に、いわゆる自然選択に対して中立と考えられる遺伝子標識以外に、孤立する個体群の生存や繁殖に関係深い適応関連遺伝子を加えることを求められたのが契機である。結果的には当時進めていた反復配列（STR = short tandem repeat）多型の検索をMHC領域へ拡張する形となったが、こうした発想と技術的な開発は本研究プロジェクトの成果の中でも当初計画を超える内容を生み出した。

以上の新しいツール開発とともに、川本らにより検査法が確立できていた mtDNA および Y 染色体 DNA も個体群調査の標識として利用した $ ^{1)} $ 。
## 2 研究開発目的

## （１）広域レベル、詳細レベルの生息地評価

本研究では、1）絶滅危惧種に指定されており、2）種の生息域全域にわたって情報や試料の収集が可能で、3）各地域での詳細な研究が行われている種として、ボノボ（Pan paniscus）を取り上げて生息地評価を行った。この分析ではまず、衛星画像とGIS（地理情報システム）による情報を活用して、ボノボの生息地、生息好適地、保護政策によって守られている地域を割り出して比較した。また、同じく衛星画像を用いた植生タイプの分類と、長年観察対象としてきたボノボの追跡データを組み合わせて、ボノボによる植生利用のパターンを割り出し、生息地の環境許容力を評価した。これらの研究は、ボノボの保護計画の立案に寄与するだけでなく、他の霊長類種の生息地評価にも応用できる手法の開発につながる。

## （２）個体群の遺伝学的調査のツール開発 — 糞 DNA による野外調査法の確立

遺伝子分析法を考案し、実用化の目処をつけることを目的とした。糞に含まれる細胞から調査個体の遺伝子情報を調査する際、妨げになる要因が主に3つある。第1は糞に含まれる細菌等からのDNA混入、第2は低いDNA収量、第3は胆汁酸塩やビリルビン（胆汁色素）などのPCR阻害物質の影響、である。これらに関する対策なしには、安定で信頼性のある遺伝子情報を得ることは不可能である。従来は、市販の高価なキットを利用する研究が多かった。絶滅が危惧される霊長類は熱帯を中心に生息しており、野外での試料採取の方法や、採取した試料の保存に関しても、キットが求める条件を満たせないという問題も生じやすい。こうした問題の解決も含めて、広沢な野外調査に利用できる研究手法を開発することが、本サブテーマの第一の課題となった。

## （３）個体群の遺伝学的調査のツール開発 — 多標識検索方法の確立

糞試料から得られる DNA 量は少ない。少量の DNA から効率的に多様な遺伝標識に関する個体情報を得るための技術開発を目標にした。細胞当たりの DNA コピー数が多い mtDNA はタイピングが容易であるが、シングルコピーの DNA 標識である多くの STR 標識や性染色体性の DNA 標識のタイピングは難しい。DNA を多量に回収することには限界があることから、ここでは分析の可否を判断する基準を設けることを目的とした。先行研究では、癌原遺伝子の一種 c-myc を利用したリアルタイム PCR により、調査個体由来の DNA を定量するアイデアが報告されていた $ ^{2)} $ 。このアイデアを参考に、安価で簡便に試料の利用価値を選別する検査系を設計した。次に、選別した試料につき、シングルコピーの標識遺伝子を多数調べる方法を検討した。こうした検討は、糞試料に含まれる遺伝情報を効率的に利用するフィールド研究の基礎技術になるもので、第二の課題として重要な開発目標になった。

## （４）個体群の遺伝学的調査のツール開発 — MHC-STR 検査法の確立

ヒト、チンパンジー、ボノボでは第6染色体、マカクでは第4染色体にあるMHC領域には罹患性、抗病性、免疫など、生存や繁殖を司る機能的に重要な多数の遺伝子が配位することが知られている。近年のゲノム研究の発展により、この領域にある機能遺伝子群やその関連部位では、遺伝子重複、組み換え、逆位改変など複雑なDNAの構造変化があることがわかっている。また、顕著に認められる遺伝的多型の維持には自然選択が強く関与する場合があることも知られている。
他方、生物がもつ MHC 領域の遺伝的多型は、DNA 構造変化が著しいために、時として相同領域の判定が難しく、個体変異を集団レベルで比べる際に問題がつきまとう。多くの先行研究は MHC 領域の多型を検出しながら、相同性比較の難しさから個体群、特にここで問題にする野生動物の個体群の遺伝的特性を確たる基準で定量し議論することができていない。塩基配列解読や免疫学的手法による個体比較は行われてきたが、類人猿やマカクの野生個体群を体系的に調査するには至っていない。しかし、MHC 領域の遺伝的多型を比較することは、個体群レベルで生存維持を研究するのに重要な情報であることは明らかで、この検査法を確立することは今後の保全遺伝学に重要な意味をもつと考えた。そこで、本研究では MHC 領域にあって機能的には重要性が低いと予想される STR に検出できる多型を遺伝標識に利用することを検討した。言うまでもなく、この標識自体には適応的意義を付与できるわけでないが、近傍にある機能的に重要な遺伝子群と連鎖し、ハプロタイプとして連動する性格（ヒッチハイク効果）を念頭に標識開発を計画した。アドバイザリーボード委員のアドバイスが引き金となり、この課題に注目し、目標に加えることになった。

## （５）遺伝標識を利用した地域個体群の遺伝的多様性、地域分化の分析

ニホンザルでは各地の個体群を対象にした mtDNA の比較 $ ^{3)} $ や、東北地方の個体群（津軽半島個体群を除く）を対象にした常染色体と Y 染色体の STR 多型の比較 $ ^{1)} $ が報告されている。これらは血液や皮膚組織から得た DNA 試料を利用して行われている。本サブプログラムでは糞由来の DNA 試料を研究利用することが目標になったことから、ニホンザルでは新たに津軽半島に孤立するニホンザル個体群を対象に糞试料を採取し、遺伝学調査が可能かを試験した。また、スリランカのトクモンキー、バングラデシュのアカゲザル都市個体群、およびボノボでは糞由来の DNA 試料を中心に調査を試み、開発した非侵襲的調査法の実用性を検証することを目標にした。

## 3 研究開発方法

## （１）広域レベル、詳細レベルのボノボの生息地評価

広域レベルでは、コンゴ民主共和国コンゴ川左岸のボノボ生息地全域を対象に、過去の観察情報をもとにボノボの現在の生息地を割り出した（図1）。また、GIS（地理情報システム）を用いて、ボノボの生息に影響を与えると考えられる生息域内各地の伐採地の密度、川からの距離、農地からの距離、人口密度を調べた。これらの情報を総合して、ボノボの生息好適地を割り出し、現在国立公園、学術保護区、コミュニティリザーブ等として保護されている地域と比較した（GAP分析）。

詳細レベルでは1973年以来ボノボの生態学的研究が行われてきたルオー学術保護区(図1、2) $ ^{4)} $ において、衛星画像（Landsat TM）から分析した植生タイプと、2008年1年間にボノボを追跡しながら1分おきに記録したGPSの位置情報と、採食、休息等の行動データをあわせて分析し、季節ごとにボノボが採食や泊まり場としてそれぞれの植生を利用する頻度を割り出し、どのような植生がボノボにとって利用価値が高いのか、年間を通じて食物を得るためには、どのような植生が遊動域内になくてはならないのかといった生息地評価を行った。
図１ コンゴ盆地中央部のボノボの生息域（白線で囲まれた地域）。生息域内の右上に位置する白く塗られた地域は、ルオー学術保護区とイオンジ・コミュニティ保護区。

図２ ルオー学術保護区と本研究期間に新たに設立されたイヨンジ・コミュニティ・ボノボ保護区。

## （２）個体群の遺伝学的調査のツール開発 — 糞 DNA による野外調査法の確立

糞を材料に遺伝子分析用の試料を調製する方法として、野外での採取・保存には二つの異なるアプローチが考えられる。実際、既存の方法はこれらのいずれかを採用して行われてきた。第一は、細胞を破壊せずに固定させる方法で、乾燥保存法である。この方法ではシリカゲルが利用され、採取した糞を無処理で直接乾燥させる直接シリカゲル乾燥法と、いったんアルコールで固定
させてから乾燥させる間接シリカゲル乾燥法がある。第二は、糞採取の直後に細胞膜を破壊させ細胞内容物を溶液に保存する液浸保存法である。市販の製品を利用するこの方法には、RNAlater 法（Applied Biosystems 社製など）や ASL 法（Qiagen 社の stool kit に添付されている組成不明の溶解液）がある。本研究では、乾燥保存法より液浸保存法が優れていると判断し、既存の製品に頼らずに採集地で溶解液により細胞を破壊し保存する液浸保存法を独自に考案した。この判断理由は、1）乾燥法では乾燥状態でも微生物の増殖による DNA 試料の劣化の怖れがある、2）液浸法では採取直後に細胞内容物を浮遊させ、DNA の分解阻害薬を加えておくことにより、長期にしかも常温保存できる、3）高温多湿の調査地でシリカゲルの劣化を心配しながら頻繁に交換する必要がない、からである。

自家製の保存液は、細胞膜を破砕する界面活性剤として SDS（ドデシル硫酸ナトリウム、sodium dodecyl sulfate）、DNA 分解酵素の阻害剤として EDTA（エチレンジアミン四酢酸、ethylenediaminetetraacetic acid）および Tris-HCl 緩衝液（pH 8.0）を主成分とする溶解液とした。この溶液は White らが他の目的で有核赤血球をもつ爬虫類に利用したもの $ ^{5)} $ を参考に考案したもので、表 2 にその内容を示した。

表 2 糞採取に利用した溶解保存液の内容

成分	容量
1M Tris-HCl 緩衝液 (pH 8.0)	50 ml
0.5M EDTA 溶液 (pH 8.0)	100 ml
5M NaCl 溶液	1 ml
SDS	2.5 g
蒸留水	全量が 500 ml になるように添加

野外調査のサンプリングでは、上記の溶解液をオートクレーブ後に2ミリリッターの滅菌セラムチューブに（容量2ミリリッター）に分注して携行した。滅菌綿棒を使い、糞表面を擦って付着する腸管細胞を採り、溶解液に棒端を浸けて付着物を溶かし込んだ。この擦り取り作業は綿棒当たり4回、2本使って計8回採取した。採取後はチューブキャップを閉めて、常温で実験室まで保存した。この方法で、少なくとも試料は2年間保存できることを確認している。

溶解液に保存し実験室に搬入した試料は、遠心処理、阻害物質除去処理、DNA 精製処理の3段階を経て調製した。はじめに、溶液に残る糞内容物やその他の大きな混入物を除去するため、1,5000回転/分で15分間の遠心を行い、粗分画を分別した。2 ミリリッターのチューブを用意し、上清を1.5 ミリリッター移し替えた。この中に、加水分解したジャガイモデンプン600マイクログラムを加え、ボルテックスミキサーで約1分混合し、試料中のPCR阻害物質と考えられるビリルビンや胆汁酸塩の除去を図った。遠心後、36度の恒温機に10分静置し、ふたたびボルテックスミキサーで攪拌したのち、15,000回転/分で10分間遠心した。上清700マイクロリッターを別のチューブ（容量1.5 ミリリッター）に移した。続いて、Promega社製のWizard SV Gel and PCR Clean-up Systemを利用し、シリカ膜によるDNA精製処理を行った。等量のMembrane Binding溶液を試料液に加え攪拌してカラムに充填し、10,000回転/分で1分の遠心処理により
カラムに DNA を吸着させた。そのあと 700 マイクロリッターの Washing 液で 10,000 回転／分で 1 分の遠心による洗浄を 2 回行い、最後に 500 マイクロリッターの Washing 溶液で 10,000 回転／分で 10 分の遠心処理を行い、水分をカラムから除去した。カラムを滅菌済みの 1.5 ミリリッターのチューブに装填し、50 マイクロリッターの純水をシリカ膜へ滴下したのち、10,000 回転／分で 1 分の遠心処理により DNA を膜から溶出させた。得られた DNA 調製試料はマイナス 30 度で凍結保存し、分析に利用した。

本研究では、糞 DNA の STR 分析への利用につき、考案した方法と既存の方法を比較するため、ASL 法と間接シリカゲル法（いったんエタノール固定してから乾燥保存）との成績の違いを検討した。

調製 DNA が遺伝子分析に利用できるかの判断については、Morin らが詳細な検討を行っている $ ^{2)} $ 。この中では、糞に混入する微生物由来の DNA と被検体となるホスト霊長類の DNA を区別するため、霊長類特異的なゲノム因子を利用した定量 PCR を行っている。ここで使われた標識因子は霊長類に特異的な癌原遺伝子（oncogene）の c-myc である。彼らはリアルタイム PCR 機による定量から、安定した結果が得られる STR 分析には一反応あたり 200 ピコグラム以上のホスト DNA が必要と結論している。そこで、この検査系を参考に、調製 DNA に含まれるホスト DNA 量の測定を試みた。この検査では検量線を描くため、ヒト胎盤由来の精製 DNA で濃度既知のコントロール試料を調製して利用する。さらに本研究では、この検査系を改良して、簡便かつ安価にホスト DNA を定量するため、電気泳動後の PCR 産物の染色強度を利用した方法を考案した。

この簡便定量法では、定量 PCR 法と同様に濃度既知のコントロール試料ともども、c-myc プライマーを利用して検体から調製した DNA の PCR を行う。得られた PCR 産物を適量用いて（通常は 3～5 マイクロリッター）、2 パーセントのアガロースゲルにより 100 ボルト定圧の条件で 30～40 分の電気泳動を行う。この際には TAE 緩衝液系を利用した。泳動後、臭化エチジウムで染色し、トランスイルミネーターで紫外線照射したときに観察できる蛍光発色を直接観察あるいは写真撮影した。コントロールにした既知濃度の DNA 試料の発色強度と比較して、200 ピコグラムのコントロールより弱い発色しかないものは、遺伝子分析（特に STR 多型検索）には不適と判断した。また、考案した簡便定量法が定量 PCR 法による判定結果と相関するかを、ニホンザルの糞から調製した DNA 検体により確認した。

## （３）個体群の遺伝学的調査のツール開発 — 多標識検索方法の確立

試料に含まれる DNA 量が少ないことから、糞由来の DNA 試料の再現性試験回数を飛躍的に増加させる方法の開発は本サブテーマの中で、重要な課題となった。ここで考えた方法は、2 段階マルチプレックス PCR 法である。この方法の特徴は 1 段階目の PCR で蛍光標識をつけないマルチプレックス PCR を多数座位で行い、予め標的座位を選択的に DNA 増幅したあと、2 段階目の PCR で蛍光標識をつけたプライマーで再度増幅し多型を検索することである。2 段階目の PCR を座位ごと行う既報 $ ^{6)} $ とは違う 2 重マルチプレックス PCR を試みた。この実験の意図するところは、少ない収量の糞 DNA 試料を部分増幅し、分析可能な原試料を増やした上で、再現性試験を繰り返し、信頼性の高い結果を多くの DNA 標識で得るところにある。

1 段階目の PCR では、検索対象に複数の標識に対応した蛍光ラベルしないプライマー対を 20 ピコモルに調製し、反応液を調製した。通常の実験では、初回に増幅対象とする標識数を最大 10
までとし、検索対象をこれ以上にする場合には、10以内になるように分割してプライマーの混合を調整した。表3に2段階マルチプレックス増幅に利用する反応液の組成とPCR条件をまとめた。

表 3 改良した 2 段階マルチプレックス PCR の反応液組成と反応条件 第 1 PCR 反応（10 標識の場合）

成分	1 検体当たりの容量（総量 20μl）
調製した DNA 試料	1.0 μl
緩衝液（2倍濃縮液）	10.0 μl
dNTP 液	4.0 μl
20pM プライマー（非標識フォワード）	0.15μl×10 種類 = 1.5 μl
20pM プライマー（非標識リバース）	0.15μl×10 種類 = 1.5 μl
DNA ポリメラー（KOD FX）	0.4 μl
純水	1.6 μl

反応	条件
初期熱変成	94度 2分間
サイクル増幅	35サイクル
サイクル変成反応	98度 10秒間
サイクルアニーリング反応	58度 30秒間
サイクル伸長反応	58度 30秒間

第 2 PCR 反応（3 標識の場合）

成分	1 検体当たりの容量（総量 12.5μl）
第1 PCR 反応産物	0.5 μl
緩衝液（2倍濃縮液）	6.25 μl
dNTP 液	2.5 μl
5 pM プライマー（標識フォワード）	0.375μl×3種類 = 1.125μl
5 pM プライマー（非標識リバース）	0.375μl×3種類 = 1.125μl
DNA ポリメラー（KOD FX）	0.25 μl
純水	0.75 μl

反応	条件
初期熱変成	94度 2分間
サイクル増幅	45サイクル
サイクル変成反応	98度 10秒間
サイクルアニーリング反応	58度 30秒間
サイクル伸長反応	58度 30秒間