Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
STR の遺伝子型タイピングでは、3100 Genetic Analyzer ないしは 3130xl Genetic analyzer （Applied Biosystems 社）によるフラグメント分析を行った。実験では、サイズマーカーに GeneScan 400HD ROX Size Standard を利用し、解析にはソフトウェア Genotyper ないしは Gene Mapper （Applied Biosystems 社）を用いた。

## （４）個体群の遺伝学的調査のツール開発 — MHC-STR 検査法の確立

## ・幸島ニホンザルの MHC-STR 研究

2011 度から適応関連遺伝子群が密集する主要組織適合遺伝子複合体の開発をしはじめた。STR 多型解析の手法を改良し、2 ステップマルチプレックス PCR を用いた分析を計画した。川本らの研究室が 1970 年代から収集してきた同個体群の血液試料と人口学的記録を利用することにより、4 期（1972 年、1978 年、1986 年、1996 年）に生存したメンバーが保有していた MHC-STR のプロフィールを評価した（試料数は 1972 年 32、1978 年 50、1986 年 73、1996 年 56 で延べ検体数 211）。遺伝子構成の比較を行うために、MHC 領域の STR 6 座位と MHC 領域以外の領域（non-MHC 領域）の STR 20 座位の多型を比較し、生息環境や発育・出産の変化と遺伝子構成の変化の関係につき分析した（図 3）。

上記の常染色体 STR 標識はいずれも MHC 領域とは別のゲノムサイトに配位する。MHC に関するニホンザルの STR 多型の検討では、アカゲザルゲノムプロジェクトの成果を参考に、主要組織適合性複合体ゲノム領域に配位することがわかっているマイクロサテライト DNA 標識（MHC-STR）でニホンザルに適用できるものを検索した。この結果、6 座位（染色体上の配置順に、D6S2972, D6S2970, D6S2704, D6S2691, MICA, D6S2793）を選び、野生個体群を調査した。個体群の履歴情報が蓄積されている幸島個体群を中心に、幸島 48 検体、宮崎県 220 検体、滋賀県で全頭調査ができた大津 E 群 39 検体、の合計 307 検体を分析した。この実験では、MHC 領域以外（non-MHC）の STR 標識は 20 座位を利用し、多様性の比較を試みた。これらの non-MHC 座位は、D1S533、D1S548、D3S1766、D3S1768、D4S2365、D5S1470、D5S1457、D6S493、D6S501、D7S821、D7S794、D8S1106、D9S921、D10S61、D11S2002、D13S765、D14S306、D17S1290、D19S582、D20S484 である。

図 3 MHC-STR 分析の対象にしたマーカー群。赤丸と赤字で示したものが MHC 関連マーカー
さらに、MHCに関するニホンザルの研究では、個体群が保有する多様性を調べるため、個体群の人口動態とMHC領域の遺伝的変異性の関係に関する検討を進めた。このため、MHC-STRの6座位（染色体上の配置順に、D6S2972, D6S2970, D6S2704, D6S2691, MICA, D6S2793）とnon MHC-STRの20座位をニホンザルの幸島48検体、宮崎県220検体、滋賀県で全頭調査ができた大津E群39検体、の合計26座位307検体につき、遺伝子型判定を行った。なお、これらの分析に利用したDNA試料は血液から調製したものである。個体ごと、座位ごとに遺伝子型を判定し、対立遺伝子の頻度が有意な経時変化を示すかを幸島個体群で調べた。また、遺伝子多様性の指標として、座位当たりの対立遺伝子数とヘテロ接合率を算定し、幸島と他地域で比較した。

## ・ボノボの MHC-STR 研究

過去2年間に確立できた糞からのDNA抽出法により、非侵襲的に適応度関連遺伝子群の多様性をボノボでも分析できるかを検討した。さらに、ゲノムのより広い領域をカバーするマーカーが比較できるよう、ゲノム情報を活用する実験計画を立案し、2段階マルチプレックスPCR法の1次增幅で対象とするMHCマーカーを12種類（D6S2691，D6S2669，D6S2745，D6S2747，D6S2782，D6S2847，D6S2854，D6S2876，D6S2892，D6S2970，C4-2-25，DRA-CA）として、各個体群の反応性を試験した。利用可能なDNA試料が少なかったSalonga個体群以外の6個体群で、対立遺伝子の構成を比較した。

## （５）遺伝標識を利用した地域個体群の遺伝的多様性、地域分化の分析

## ・ニホンザルの集団遺伝学的研究

東北地方で地理的に孤立する4つの地域個体群（下北、津軽、白神、五葉山）を中心に研究を進めた（図4）。この研究において、津軽個体群は未調査だったため、試料を新しく集める必要があり、2010年6月と10月に現地で糞試料を採取した。実際に供試できた試料総数は42検体であった。

図４　孤立する地域個体群の調査で分析した東北北部のニホンザル個体群の分布
津軽半島の検体以外には、以前に入手できていた血液試料、皮膚組織資料、糞試料から抽出した DNA が利用でき、下北 41、白神 13、五葉山 7、宮城県 44、山形県 23、福島県 8 の検体をそれぞれ分析した。東北南部の 3 県のサル生息地は連続していることから、これらは一括して東北南部個体群（検体合計は 75）として扱った。

この研究で検索した STR 遺伝子座は、常染色体 11 種類（D1S533、D1S548、D3S1768、D5S1470、D6S493、D7S821、D10S611、D14S306、D17S1290、D19S582、D20S484）および Y 染色体 3 種類（DYS472、DYS569、DYS645）であった。また、Y 染色体標識については、糞試料の性判別を行い、オスのタイピングを行う必要があった。このため、橋本らの方法 7) を参考に、Amelogenin を標識とする PCR 法を採用し、検体中のオスを特定し、STR 分析に供した。

## ・バングラデシュの都市に孤立するアカゲザルの集団遺伝学的研究

バングラデシュのアカゲザル都市個体群については、これまでに存在を確認した群れから、糞DNA分析に必要な試料を得るため、溶解液に綿棒で回収した腸管由来細胞を溶かし、試料収集を行った。アカゲザルが生息する都市や集落の14地点（Kolargaon、Chandpur、Satchari、Madhupur、Fenchuganj、Karamjal、Charmuguria、Kalenga、Jaintapur、Wajirpur、Chashnipeer、Jahan、Bormi、Chunati）から糞試料を採集し、mtDNAの第1可変域の塩基配列を解読して、地域間の遺伝的分化と地域内の遺伝的多様性を調査した。

## ・ スリランカのトクモンキーの集団遺伝学的研究

スリランカのトクモンキーでは、調査地に生息する個体群の系統地理的な関係を評価するために、mtDNAの非コード領域（339塩基）と16S rRNA（393塩基）の配列を解読し比較した。前者では全島を網羅する19地点、後者では24地点を比較した。これらの試料は、現地の観察調査により、亜種の区別、標高や植生などの生息地の情報がわかっており、孤立や遺伝子以外の地域分化と遺伝分化の関係を解析するのに有効なものである。常法に従って遺伝子の系統解析を行い、クラスター分析などからトクモンキーの地域分化の性質を調査した。また、生態や形態から区別されている3亜種とmtDNA地域遺伝分化の関係につき検討し、特に高所に孤立する亜種のopistomelasの遺伝的性格に注目した。

アカゲザルとトクモンキーを対象にした研究では、mtDNAの非コード領域の塩基配列を解読する際に、以下のプライマーを利用してPCRを行った。

$$ \begin{aligned}&LqqF\ ( フォワードプライマ一 )\quad&5^{\prime}\ -&TCCTAGGGCAATCAGAAAGAAAG-3^{\prime}\\&saru5\ ( リバースプライマ一 )\quad&5^{\prime}\ -&GGCCAGGACCAAGCCTATTTG-3^{\prime}\end{aligned} $$

PCR で得られた産物は、Promega 社製の Wizard SV Gel and PCR Clean-up System によるカラム処理でプライマー除去と洗浄ののち、ダイレクトシーケンシング法で塩基配列を解読した。

## ・ コンゴ民主共和国のボノボの集団遺伝学的研究

確立した糞 DNA 分析法の実用化を目指し、海外研究者の協力も得て、長期観察が行われているボノボ個体群の主要調査地 7 カ所（Malebo、Lac Tumba、Salonga、Lomako、Wamba、Iyondji、T12）で糞試料を収集した。採取した試料を用い、改良した STR 分析法（2 段階マルチプレックス PCR による STR 分析法）の実用性を検証した。少量試料を効率的に分析できるかを検討した。さらに、オス特異的な Y 染色体 DNA の分析でも同様の検索を進めて、ハプロタイプ分類を行った。ミトコ
ンドリア DNA 分析では、非コード領域の全塩基配列を解読する方法を確立し、調査へ応用した。分析に供した検体総数は 376 で、個体の重複や検査に不適なため除外した残り検体数は 136 であった。調製した DNA 試料から、最初に非コード領域の全体を増幅するために、以下のプライマーを用いた。

$$ outF\ ( フォワードプライマ一 )\qquad5^{\prime}\ -ACCATCAGCACCCAAAGCTA-3^{\prime} $$

$$ outR\ ( リバースプライマ一 )\quad5^{\prime}\ -GTGTGGCTAGGCTAAGC GTC-3^{\prime} $$

PCR で得られた産物は、Promega 社製の Wizard SV Gel and PCR Clean-up System によるカラム処理でプライマー除去と、回収 DNA 産物の洗浄ののち、ダイレクトシーケンシング法で塩基配列を解読した。全長が 1 キロ塩基対を超えるシーケンシングのため、ラベリングでは以下のインターナルプライマーを利用して、解読した配列に誤りがないことを確認した。

$$ 53F\ ( フォワードプライマー )\qquad5^{\prime}\ -GCCACCATCCTCCGTGAAAT-3^{\prime} $$

$$ inF1\ ( フォワードプライマ一 )\qquad5^{\prime}\ -CGACATCTGGTTCCTACCTC-3^{\prime} $$

$$ inF2\ ( フォワードプライマ一 )\qquad5^{\prime}\ -CCTATGTCGCAGTATCTGTC-3^{\prime} $$

$$ inR2\ ( リバースプライマ一 )\qquad\ 5^{\prime}\ -AGGAACCAGATGTCGGATAC-3^{\prime} $$

## 4 ．結果及び考察

## （１）広域レベル、詳細レベルのボノボの生息地評価

広域レベルの分析では、重要な生息好適地の半分程度が国立公園等の保護区として守られていることがわかった（図5）。一方、かねてからその存在意義が疑われていたサンクル保護区は生息好適地とは言いがたくボノボもほとんど生息していないこと、ルオ一保護区の南東、およびサンクル保護区の北の地域は大面積のボノボの生息好適地となっているにもかかわらず保護の網がかけられていないことがあきらかになった。この結果をもとにして、かねてから進めていたイヨンジ・コミュニティ・ボノボ保護区の設立にむけた働きかけを強めた結果、2012年の4月にこの保護区の設立が正式に認可された（図2）。

詳細レベルの分析では、衛星画像を元にして作成した植生図と、ルオ一保護区に生息するボノボのE1集団の2008年の遊動記録を用いて分析を行った（図6） $ ^{8)} $ 。その結果、この集団が、乾燥一次林だけでなく南を流れるルオ一川の両側に広がるスワンプ林（雨期には水で満たされる湿地林。ルオ一川は図の下方（南）のスワンプ林の中を蛇行して東から西に流れる）を頻繁に利用していること、スワンプ林では、乾燥一次林とほぼ同頻度で採食地や泊まり場として利用していること、この年の6月に見られるようにスワンプ林がきわめて重要な採食場所になっている時期があることなどがわかった（図7）。このことは、ボノボの遊動域が一次林とスワンプ林の両方を含むような遊動域をもって生活しているという従来の指摘 $ ^{8)} $ を具体的に裏付けるものとなった。また、採食にはスワンプを用いるものの夕方には一次林にもどって泊まるという従来の考えとは異なって、スワンプ林に多くの食物がある時期には、スワンプ林も泊まり場として利用していることがわかった。これらの分析結果から、一次林から遠く離れたスワンプ林にもボノボが生息している可能性があることがわかり、観察の行えないスワンプ林の奥地にはボノボはいないという前提で考えられていたボノボの分布や推定生息数を見直す必要があることを示唆するものとなった。
図５　ボノボの生息好適地と既存の保護区（Jena Hickey 他投稿中の論文の図を改変）。

図6 植生タイプと E1 集団の遊動ルート。毎分の1が1ドットで示されている。赤は直接観察、黄色は足跡を追跡しているときの位置情報。
図7 目的ごと（左）、月ごと（右）の各植生タイプの利用

## （２）個体群の遺伝学的調査のツール開発 — 糞 DNA による野外調査法の確立

独自に開発した溶解液を利用した試料採取と保存法は、特に熱帯地域の気温や湿度が高い調査地でも操作性に優れ、常温保存がきく点で従来の方法より優れていた。分析への利用に問題がないかをSTR標識のタイピング結果で既存の方法とくらべた例を図8に示した。これは、同一の糞試料を3つの方法で採取・保存してDNA抽出し、特異的プライマーでPCRを行い、蛍光ラベルできた反応産物をフラグメント解析して得たパターンをくらべた結果である。

まず A の比較では、反応強度に方法による違いが認められる。ASL 法ではシグナルが弱く、ノイズレベルにあるため、タイピングができなかった。一方、間接シリカゲル乾燥法と独自開発した方法では、強度は得られたが、異なるタイピング結果となった。前者では弱いシグナルを示す別の低分子ピークが認められ、判定に影響を与えたが、後者では明瞭な単峰性のピークが検出され、ホモ接合体の可能性を強く示唆した。つぎに B の比較では、ASL 法と間接シリカゲル乾燥法で 4 検体が同じ 3 つのピークを示し、タイピングができなかった。しかし、独自に開発した方法では、2 種類のヘテロ接合体に 4 検体が区別でき、判定に問題がなかった。以上の結果から、本研究で考案した溶解液を利用した糞試料の採取法は、野外調査に有効な方法と考えられた。

しかし、実際に野外調査に利用する際に注意が必要なこともしだいに明らかになってきた。それは綿棒を利用した糞からの試料採取に関する問題である。本研究ではマカクとボノボを対象とした。このうちマカクでは初夏の水分含量の高い草本を主食とする時期に、またボノボでは果実を主食とする採食生態によりほぼ周年にわたり、軟便を排泄する。こうした軟便では、乾燥した綿棒を初回に糞表面に当てることで、大量に異物を含む試料が採取されてしまう。硬い糞であれば、新鮮な糞表面を擦ればあまり着色しない状態で溶液に細胞が回収できる。着色原因のひとつは胆汁色素（ビリルビン）と考えられ、これはPCRを阻害することが知られている。従って、糞採取では着色を抑えて、細胞を多く採ることが肝要といえる。こうした経験から、軟便を材料にする場合は、乾燥した綿棒を直接糞に当てることは避け、はじめに綿棒を溶解液に浸してから擦る方がよいと判断し、採取するようになった。
A 反応強度と反応パターンの比較

B 複数反応ピークの出現の比較

図８ 異なる DNA 採取・保存・調製法で得た糞 DNA の STR 分析結果の比較

図9 c-mycの増幅産物の染色強度判定による調製DNA試料の判定例。
図9は定量PCRに代わる調製DNA試料の収率判定を電気泳動で行った例を示す。ここでは、市販の精製したヒト胎盤由来のDNAから希釈系列を作り、Morinらが報告したc-mycを増幅するプライマーでPCRを行った $ ^{2)} $ 。下から2番目のレーンは京都大学霊長類研究所に飼育されているアカゲザル個体から採取した糞を材料に、開発したDNA調製法で得た試料のPCR産物である。比較したのは、濃度が100から1000ピコグラムのDNA試料で、濃度が高くなるほどc-mycに特異的なバンドの染色強度が高くなっている。この希釈系列のバンドの色とくらべることにより、調製した試料は300ピコグラム以上の収率をもつと判断できる。比色による定性的な定量法だが、十分に利用でき、コストは大幅に軽減できた。また、電気泳動装置とPCR機（現在では小型で海外でも利用可能な機種が販売されている）が用意できれば、原産国でも判定できるという利点がある。

図9の実験結果では、本来期待される約90塩基対のバンド以外に高分子領域にも別のPCR産物が認められた。この余剰産物はPCR反応条件や試料混入物に由来する可能性があり、定量PCRにも影響する場合が予想された。泳動パターンとしてバンドが区別できる利点から、万一こういう余剰産物が強く影響するような場合には、今回考案した定性的な簡便定量法の方が原法より正しい判断を下すことになるとも考えられる。なお、最終的に実用段階では、既知濃度のコントロールとして100、300、500ピコグラムのDNA溶液を利用し、300ピコグラム試料の産物を染色したときの蛍光強度より高いDNA試料なら、検体に利用できると判断することにした。

## （３）個体群の遺伝学的調査のツール開発 — 多標識検索方法の確立

マルチプレックス PCR 法は、法医学、獣医学、生物学の分野で集団遺伝学研究に汎用される技術のひとつである。プライマーの親和性があるため、通常のマルチプレックス PCR では、予めプライマーの相性を試験し、互いの増幅を妨害しない組み合わせを決める必要がある。今回の分析では、第1段階の PCR において異なるプライマー間でダイマー形成などによる PCR 阻害効果を心配した。しかし、得られた結果では親和性の影響は第2段階でのみ考えられ、第1段階の PCR では深刻ではなかった（データの詳細は省略）。

Arandjelovic らの提案した方法では、第2段階のPCRを個々の標識座位ごとに行っている $ ^{6)} $ 。しかし、今回の研究により、第1段階だけでなく、プライマーの親和性を考慮すれば、第2段階でもマルチプレックス PCR を適用できた。第1段階のPCRでは、調製DNA試料を消耗するものの、第2段階では原試料を使わないため、大幅に試料の消耗が節約でき、さらに第2段階でもマルチプレックス PCRを利用すれば、コストや手間が節約できる。一方、当然ながら再現性試験の効率は原試料の質や量に影響される。本研究では、最終的に3回の反復試験を行う系を標準として、第1段階のPCRは最大10標識のプライマーセットを混合した20マイクロリッターの反応液の形で設計した。KOD FXを増幅酵素に利用して、35サイクルの反応でDNA増幅を行えば良好と判断した。第2段階のPCRは最大4標識のプライマーセットを混合する12.5マイクロリッターの反応に設計した。同じくKOD FXにより、45サイクルの反応でDNAをラベリングし、標識により1～30倍に水で希釈した反応産物をフラグメント解析に供した。多くの反応では、3回の反復試験を行えば、遺伝子型の判定が可能であった。
## （４）個体群の遺伝学的調査のツール開発 — MHC-STR 検査法の確立

## ・ニホンザルの MHC-STR 研究

2 ステップマルチプレックス法は MHC 領域の STR 多型の検査でも有効であった。各 STR 座位の遺伝子につき、調査年の頻度推定値と誤差を計算し、座位ごと対立遺伝子ごとに頻度が調査時期間で有意に変化したかを検定した結果を図 10 にまとめた。non-MHC の 20 座位では時間の経過とともにしだいに有意な頻度変化が増える傾向が認められた。一方、MHC の 6 座位では異なる傾向が認められ、1996 年と他の 3 期の間で有意な変化が認められたのに対して、他の期間の間では認められなかった。これが発育・出産の遅延の発生以降に現れていることに注目が必要である。しかし、分析結果から MHC 関連領域の遺伝子構成変化を適応と関わる変化だと断定することには問題が残った。サンプリングした座位の母数が異なる点、急激な個体数の変化による突然変異消失の影響、などについて今後さらに検討する必要がある。前者については、MHC-STR マーカーを増やし non-MHC に匹敵するサンプル座位を確保して比較すること、後者についてはボトルネックや集団拡大に関係した遺伝子数とヘテロ接合率の関係変化を解析して判断する必要があると考えている。なお、遺伝子多様性を他の個体群と比較した結果では、幸島個体群がやや低い傾向を示した（結果の詳細は省略）。

期間の頻度変化が有意と判定された遺伝子の割合

MHC 座位

図 10 幸島個体群に認められた MHC 座位と non-MHC 座位の遺伝子構成変化の比較。

## ・ボノボの MHC-STR 研究

6つの調査個体群全体で検出した対立遺伝子の総数を MHC 領域の STR 座位ごとに集計した（図11）。座位ごとに多様性は異なり、座位により対立遺伝子数は2個から22個まで変化した（図11の右図）。また、MHC領域中の位置と多様性の程度の関係を見ると、多様性が大きい座位は、クラスIAやクラスIIIの領域内の方が領域間より多い傾向が認められた（図11の左図）。さらに、個体群別にSTR座位の多様性を比較すると、座位により多様性の程度に違いが認められ、特定の
個体群が常にどの座位でも大きな多様性を示す傾向は認められなかった（データは表示せず）。以上の結果から、開発した手法を利用すれば、ボノボでも野生個体群を対象にMHC領域の遺伝的多様性調査が可能と判断した。今回の予備調査で、個体群やマーカー座位により、多様性の分布が異なるという知見を得た。今後さらに試料数を増やし、non-MHCのSTRマーカーの多様性や、サブテーマ2が問題にする個体群の感染履歴等の結果を参考にすると、適応に関係した自然選択を考える情報になる可能性がある。

## （５）遺伝標識を利用した地域個体群の遺伝的多様性、地域分化の分析

## ・ニホンザルの集団遺伝学的研究

津軽半島での2回の糞試料採取により、2010年度に考案した糞DNAを利用する遺伝学調査の方法を検証することができた。考案した溶解液から抽出法で得たDNA試料を使い、常染色体とY染色体のそれぞれ11座位、3座位のSTR標識につき遺伝子型タイピングを実施した。表4はその試験結果を要約したものである。

図11 ボノボの調査個体群全体でMHC座位に検出できた対立遺伝子（allele）の総数。右図は座位間のallele数の比較結果。左図はMHC領域の各座位の位置を示す。allele数を3つに区分し、MHC領域の場所による多様性の違いを別色で示した。
表 4 津軽半島個体群の糞試料による STR 試験の結果要約

試料総数	42
重複試料（同一個体試料）	5
判定不能試料	4
糞以外の試料	1（皮膚試料）
分析成功率（全体）	90.2%（=37/41）
試料重複率	12.2%（=5/41）
分析実質成功率	78.0%（=32/41）

糞以外に入手した皮膚試料の結果を除外して、糞分析の効率を判断してみると、同一個体からの重複サンプリングと試験に失敗した試料による情報の欠損が、全体の22パーセントと見積もられた。つまり、開発したシステムを利用すると、5つ糞試料のうち約4つでSTR分析が可能となった。無論、こうした成功率は個体群サイズ、採集時の糞性状、サンプリングにかかるその他のバイアスの影響により、容易に変化することが予想できる。しかし、本研究が目的とする非侵襲的手法で野生霊長類の個体群に関する遺伝情報を得る方法としては、従来の同様の試みに匹敵あるいはそれを超えた実効性のある研究手法が提供できる判断した。実際、研究対象に選んだ津軽半島に孤立するニホンザル個体群については、断片的な生息地の情報があるくらいで、遺伝学的情報についてはmtDNAの少数例について塩基配列情報が報告されているだけだった $ ^{3)} $ 。今回の調査により、常染色体やY染色体の遺伝子に関する情報が初めて得られたことは、貴重な成果となった。

津軽を加えて下北、白神、五葉山、東北南部の5つの地域個体群につき、遺伝子多様性と個体群間分化を検討した。まずSTR座位に認めた対立遺伝子の構成と分布の特徴では、座位による性格に違いもあるが、概ね北限に位置する下北と津軽の半島部で孤立する個体群で、対立遺伝子数の減少や他地域と異なる対立遺伝子構成が認められた。図12には常染色体STR遺伝子座の

D20S484 と Y 染色体ハプロタイプの例を示した。Y 染色体標識では 3 つの STR 座位を別々にタイピングしたが、これらは完全に連鎖し相同染色体がないために組み換えが起こらず、常にセットの形でオスの世代間で伝達される。

図 12 の B に示した Y 染色体ハプロタイプにみられる変異の分布は、現在の個体群間にオスを介した遺伝子流動がどの程度あるかを判断するのに、直接的な証拠を与えるデータである。例外的に黄緑色で示したハプロタイプは調査したすべての個体群に検出された。この結果を地域間の遺伝的交流と見なすことも可能だが、別の可能性として共通祖先に由来するタイプが残存し現在は交流がないと解釈することもできる。このタイプ以外では、津軽と下北は他の個体群とかけ離れた構成を示し、オスを介した外部との交流が乏しいことを示した。

常染色体については11種類のSTR座位を標識とした。この結果をもとに、座位当たりの対立遺伝子数の平均値、および平均ヘテロ接合率（任意交配を仮定した場合の期待値）で各個体群の遺伝的多様性を比較した結果を図13に示した。いずれの場合も、遺伝子多様性は下北と津軽で他地域の個体群より低い傾向が認められた。また、下北では対立遺伝子数の平均値に比して平均ヘテロ接合率が低いのに対して、津軽では逆の関係が認められた。北限に孤立するこれら地域個体群
とは対象的に、分布が連続し生息個体数が多い東北南部個体群では、いずれの指標でも高い値となり、多様な遺伝子が保有されていた。

A

B

図 12 東北地方のニホンザル個体群に検出された遺伝子タイプの分布例。Aは常染色体のSTR座位D20S484の対立遺伝子を、BはY染色体上に連鎖している3つのSTR座位 DYS472-DYS569-DYS645に検出された対立遺伝子の組み合わせで定義できたハプロタイプを色分けして示した。

A

B

図 13 東北地方のニホンザル個体群の遺伝的多様性の比較。Aは調査した11種類の常染色体STR座位当たりにみられた対立遺伝子数の平均値を、Bは平均ヘテロ接合率（任意交配を仮定したときの期待値）を表す
検体から得た遺伝子型セット情報をもとに、ソフトウェア STRUCTURE $ ^{9)} $ を使い任意交配と連鎖平衡を前提に仮想した分集団に個体を割り当てるアサインメント解析を行った結果を図14に示した。統計的に最も強く支持された分集団数Kは2となり、この場合には図14で上のプロットが示すように下北が他所から区別された。次に支持されたK値は3で、この場合には図14で下のプロットが示すように下北と津軽が他所から区別された。以上の結果から、調査した5つの地理的に孤立した東北地方の個体群の遺伝的構造が解明でき、下北が最も他から分化し、次いで津軽も分化していると判断できた。

図 14 11 種類の STR 座位で得た遺伝子型データからの東北地方 5 地域個体群の比較。

この分化の原因には、少なくとも1）オスを介した現在の交流が制限されている影響、2）歴史的な孤立の影響、のふたつが考えられる。1）の可能性は、図12に示したオスのY染色体ハプロタイプの変異分布からも示唆される。一方、2）については、下北も津軽も半島部に生息する個体群であることから、孤立の歴史を地理的な要因と重ねて考えることも必要である。時間的に古くから他から切り離されたと考えると、個体群のサイズ減少の影響、つまりボトルネック効果の兆候を検証することは、意味があると考えられる。

ボトルネック効果はその初期とそれに続く時期で対立遺伝子数とヘテロ接合率の関係に特徴的な変化を導くと考えられている $ ^{10),11} $ 。この変化は、効果の及ぶ初期には遺伝的浮動に伴いマイナーな（頻度の低い）対立遺伝子を個体群から急速に消去するのに対し、ヘテロ接合率はそれに準じた低下が遅れるため、過渡的に対立遺伝子数にくらべてヘテロ接合率が高く見える状態を生み出す。ソフトウェアBottleneck $ ^{12} $ を利用し、中立突然変異と遺伝的浮動の平衡を仮定してこの検定を行った結果を図15に示した。この検定では、5個体群ごとに、ヘテロ接合体の過剰の有無を検定する目的で、突然変異モデルにTP（two-phase model）を仮定した。このモデルは無限対立遺伝子モデル（infinite allele model）と段階突然変異モデル（step-wise mutation model）の混合モデルを想定しており、両者の割合により結果が変動する。図中の横軸ではこのうち段階突
然変異モデルで説明する割合をSM比率としてゼロパーセント（無限対立遺伝子モデルに従う突然変異のみ）から100パーセント（段階突然変異モデルに従う突然変異のみ）まで変動させたときの、検定結果をまとめている。縦軸は過剰を判定する確率を表し、5パーセント以下なら、有意に過剰と判定する。この検定では、遺伝子多様性がともに低いと判定された下北と津軽の個体群に違いが認められた。つまり、下北の場合には条件を変えてみると他の3個体群と同様の変動傾向を示し、SM比率が高いと有意ではない。しかし津軽の場合には、条件を変えても常に有意にヘテロ接合体が過剰と判定され、ボトルネック効果の兆候を強く示唆した。

TPモデルにおけるSM比率

図 15 ソフトウェア Bottleneck によるヘテロ接合体過剰で測ったボトルネック効果。

以上の結果は、北限の半島個体群に作用している孤立の影響が遺伝的に異なることを意味する。いずれの個体群でも遺伝的多様性が低下しているが、下北ではボトルネックの初期相を超えてヘテロ接合体が見かけ上過剰になる状態を経過していると解釈できる。一方、津軽ではまだ初期相にあり、ヘテロ接合体の過剰が認められる。従って、ボトルネックが関与した歴史的な時間に翻訳すると、下北の方が古くから孤立していて、津軽はそれよりあとに孤立した、と考えることが可能である。三戸は明治以降の狩猟圧が東北地方のニホンザル生息地を急激に縮小させたと指摘している $ ^{13} $ 。この予想は、長谷部のニホンザル分布調査 $ ^{14} $ からも支持できる。しかし、今回の遺伝学調査により、これ以前から北限のサルたちは地理的に孤立していたことが理解でき、現在の交流を阻害する生態的あるいは地理的な隔離以外に、古環境変遷の影響で歴史的にも隔離されてきたことが確認できた $ ^{1} $ 。
・バングラデシュの都市に孤立するアカゲザルの集団遺伝学的研究

バングラデシュの各地から収集したアカゲザルの糞試料42検体につきmtDNAの第1可変域の塩基配列を比較した結果、15種類のハプロタイプが区別できた（図16）。人口が密集する都市や集落に孤立するアカゲザル個体群には、それぞれに特徴的なハプロタイプが区別でき、母系の分断隔離を反映した地理的な構造が予想された。

図 16 バングラデシュのアカゲザル孤立個体群に検出した mtDNA ハプロタイプの分布。紫色の数字は各地点のハプロタイプに対応する番号を示す。

アカゲザルはアジア大陸の広域に分布し、実験動物として利用されているため、周辺地域から輸出された個体のmtDNA分析結果をデータベースから利用できる。相同配列から分子系統樹を構築した結果を図17に示した。この結果から、バングラデシュのアカゲザルはミャンマーのタイプと同じクラスターを形成すること、ミャンマー国境に近い東部の個体群に認められたハプロタイプ15以外は単系的な独立クラスターからなること、が明らかになった。従来の研究から、アカゲザルでは系統的に中国に代表されるアジア東部個体群とインドに代表されるアジア西部個体群の存在が議論されてきた $ ^{15} $ 。しかし、今回の研究により、バングラデシュのアカゲザルはこれらと
は明らかに異なる系統として成立しており、ベンガル湾岸地域の広大な氾濫原に生存する遺伝的に特徴的なアカゲザルの個体群と評価できた。さらに、ミャンマー隣接地域の東部山岳地帯の個体群を除く平野部の孤立個体群は、系統樹に現れたクラスターの凝集性から判断して、共通祖先から短期間に拡大したのちに人口増加や狩猟圧等の人為的要因で現在の生息地へ分断隔離された成立の歴史をもつことが予想できた。

図 17 バングラデシュのアカゲザル個体群に検出した mtDNA ハプロタイプの分子系統関係を示す枝分かれ図。バングラデシュタイプは赤字で示した。比較に利用した他地域のタイプは Smith らの研究 $ ^{15)} $ を参照した。

## ・ スリランカのトクモンキーの集団遺伝学的研究

スリランカ全域に分布するトクモンキーの代表的生息地24地点から採集した試料につき、遺伝子分析を行った。これらの調査地は3種類の亜種（sinica、aurifrons、opisthomelas）の生息地を含んでいる。13地点は血液試料 $ ^{16)} $ から、11地点は糞試料から、試料を調製してmtDNAの非コード領域第1可変域339塩基と16SrRNA領域393塩基を比較した。島嶼内の系統地理的な構造の解析結果は両領域で基本的に同様と判断できたので、ここでは非コード領域第1可変域の結果を説明する。

mtDNA ハプロタイプのクラスター分析結果を図 18 に示した。島内には明瞭に区別できる二つのクラスター（A と B）が検出できた。野外観察ないしは生息分布から判定した亜種タイプとくら
べると、mtDNA のクラスターは亜種分類に一致せず、複数の亜種を同じクラスターに包含する結果となった。つまり、個体群の成立過程を反映する母性遺伝標識から考えると、形態や生態で区別される亜種の違いは、群分裂を介したこの種の分布変遷の歴史に対応していないと解釈できる。この形質の不一致の原因としては、亜種のメルクマールとみなされる形態や生態の形質には、進化過程の適応が強く反映され、この変化が進化時間に同調していない可能性が考えられる。

図 18 mtDNA ハプロタイプのクラスター分析により描いた枝分かれ図。図中には試料個体の亜種の違いを示した。

二つの mtDNA クラスターのタイプの島内分布を図 19 に示した。ハプロタイプのグループの分布には明瞭な地理的構造が認められ、A クラスタータイプの個体群は地史的にみて島内の浸食面台地（peneplane）の高層に生息するのに対して、B クラスタータイプの個体群は低層に生息していた。この結果は、トクモンキーの成立過程が地理的構造変化と相関する環境変動に影響されてきた歴史をもつことを示唆する。近縁種との分子系統解析から、トクモンキーの成立は単系的と判断できた（データの詳細は省略）。さらに詳細に検討すると、mtDNA の塩基多様度から、B クラスター内では島嶼の南部地域が北部地域より古くに成立した兆候が認められた。このことから、南部の比較的湿润な生息環境から北部の乾燥化した生息地への拡大が起きたことが考えられる。この結果は、更新世に繰り返されたスリランカ島嶼とインド亜大陸間の陸橋形成が祖先の成立に
影響せず、現存個体群はそれ以前に種分化し、種全体が島嶼に孤立した形を維持しながら、環境変動とともに地理的には標高帯と相関する進化を遂げていることを示唆する。今後の研究では、高所に孤立するとみなされてきた亜種 opisthomelas をはじめとして、現存個体群の地域間交流を調査し、個体群の繁殖構造や保全を考える必要がある。

図 19 左図は島内に区別できる標高帯の違いを示す。右図は mtDNA 分析で区別できた 2 系統のサル生息地を示す。赤と紫はそれぞれ A と B クラスターに対応する。

## ・ コンゴ民主共和国のボノボの集団遺伝学的研究

7 地域個体群由来の 136 試料は、54 ハプロタイプに区別できた。分子系統樹を構築し、クラスター解析を行ったところ、6 つのハプログループが分類できた（図 20）。これらのうち、A1 と A2 は従来の研究で A クレード、B1 と B2 は B クレードと認められていたものである。また、C クレードのタイプは 3 年前に海外に輸出されたボノボで発見された出自不明のハプロタイプに一致あるいは類似するものであった $ ^{17} $ 。今回の調査では、Wamba と Iyondji の個体群だけに C クレードのハプロタイプが確認できた。さらに、これら以外のタイプで構成される新しいハプログループが検出でき、これを D クレードと命名した。このクレードを構成するハプロタイプはすべて分布東端の TL2 由来の個体で検出された。ボノボ生息域の mtDNA ハプロタイプ分布は、メスによる拡散が予想されたにも関わらず、局在傾向が著しかった。個体群ごとに他個体群とのハプロタイプ共有率を測ると、最大が Wamba の 67% で、TL2 では 0% を記録した。この結果は、現在地域間ではメスによる遺伝的交流が乏しく、個体群の孤立が強いことを意味する。実際、図 20 の右にまとめた分布では、特定地域個体群ないしは近隣にある複数の個体群に特徴的なハプロタイプが目立ち、この傾向は性差を区別しても同様に認められた。
図20 ボノボに検出した mtDNA の 54 ハプロタイプの分布、ならびにクラスター分析から区別できたハプログループ。表中の数字はカウント数を表し、丸中が白字はオス、白丸中の数字はメス、丸なし数字は性不明を意味する。

図 21 調査個体群の塩基多様度比較。バーは誤差を表す。
孤立に伴う多様性の低下を考えるために定量した遺伝的多様性では、個体群による違いが明らかになった（図 21）。3 種類の多様性指標による定量は概ね一致する結果となったので、図 21 には塩基多様度による比較結果を示した。コンゴ盆地中央に生息する個体群にくらべて西端の Malebo と東端の TL2 は多様性が低かった。ただし、中央部でも例外的に Wamba では低い多様性が認められた。

$ F_{ST} $ 距離を求めクラスター分析により個体群間の遺伝分化を調べた結果、7個体群は西部（Malebo, Lac Tumba）、中央部（Salonga, Lomako, Wamba, Iyondji）、東部（TL2）の3グループに区別できた（図22）。他個体群への平均遺伝距離ではTL2が最大値を示し、孤立による遺伝的分化が大きいことを示唆した。区別した3グループ間の遺伝距離を比較すると、地理的な位置関係に反して東部と中央部（ $ F_{ST} $ 平均距離0.5334）が東部と西部（ $ F_{ST} $ 平均距離0.4731）や西部と中央部（ $ F_{ST} $ 平均距離0.4281）を上回っていた。

図22 遺伝距離 $ F_{ST} $ を用いて個体群間の遺伝分化を定量した結果。地図中の数値は、各個体群と他の6個体群との平均遺伝距離を示す。左下の樹形図はクラスター分析から区別した3コホートを示す。右下の図は3コホート間の平均遺伝距離を示す。

以上の結果は、個体群間の遺伝分化は河川障壁による隔離を含めた単純な距離による隔離を反映するものでないことを意味する。比較した7つの地域個体群では、分布の辺縁に位置するものの多様性が低い。この関係は現在の交流の程度で説明可能だが、個体群の成立や分断の歴史を反映している可能性も考えられる。

AMOVA により、7 個体群とクラスターとして区別できた 3 コホートのそれぞれの場合で、分集団間の分散成分比率を計算すると、前者で 41%、後者で 48% であった。つまり、現存する遺伝的
多様性を分集団として区別するとき、3コホートを仮定した分割で7個体群の保有する遺伝的多様性の分布構造を大きく損ねることはない。今後の保全では、西部、中央部、東部の3区分を意識することが重要であろう。遺伝的多様性を最も保有するものを優先するか、固有遺伝子を最も保有するものを優先するか、判断基準により選択は異なるが、ここで区別した3コホートを管理単位とすることには意義があると考える。

個体群間の遺伝分化に及ぶ河川による隔離障壁の影響を検討した結果では、河川を迂回した距離と遺伝距離の相関が最も強く、河川を無視した直線距離と遺伝距離の相関がこれに次ぐ値を示したが、両方の値は近接していた。一方、特定個体群から他の個体群に向けた両距離の相関を求めると、TL2が異なる性質をもち、極端に相関が低かった。そこで、この個体群を除外した6個体群だけで相関を比較しなおしたところ、迂回距離よりも直線距離が強く遺伝距離と相関する結果を得た。従って、TL2に関しては河川による強い隔離の影響が考えられるものの、他のコンゴ盆地の生息地間ではそのような隔離障壁の影響は認めにくいと判断した。地理的距離に比例する遺伝分化の構造を説明する方法にはいくつか考えられる。気候変動など古環境の変動でボノボの生息環境が変化したことも重要な説明要因である。また、Wambaで認めた低いmtDNA多様性は、戦火や開発により比較的短期間に局所隔離が人為的に誘導された可能性を示唆し、攪乱も遺伝分化の原因のひとつだと考えられる。今回の研究により、ボノボの保有する多様性や地域分化は単純に河川による隔離だけで説明できるものではなく、それ以外の原因が関与する複合的要因により派生したものと結論する。今後の研究では、過去の環境変動とボノボ生息域変化の関係、人為攪乱による個体群動態とそれに付随する遺伝的特性の変化、を調査する必要がある。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

非侵襲的手法で野生霊長類の遺伝的多様性や地域分化を定量する方法の開発に成功し、これまで調査が困難だった個体群の基礎研究や保全計画への道を開拓した。

生存や繁殖に関係が深い遺伝子群をもつ MHC 領域について、ニホンザル地域個体群で遺伝的多様性の経時変化をはじめて分析できた。また、幸島個体群で MHC 領域以外と異なる変動を検出し、発育や出産の遅延に付随する変化との示唆を得た。さらに、開発した手法をボノボの野生個体群に応用する展望をつけ、野生個体群の予備調査で座位や個体群により多様性の性格が異なるとの新知見を得た。

コンゴ盆地で絶滅が危惧されるボノボについて、広域をカバーする国際共同研究を実現し、mtDNA からみた地域分化の構造を解明した。さらに、河川障壁だけでなく、個体群の歴史や環境変動が遺伝分化に影響することを初めて明らかにし、保護に向けた個体群単位を提案した。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

本研究チームが、コンゴ民主共和国のイヨンジ地区住民、コンゴ民主共和国生態森林研究所、African Wildlife Foundation 等と協力して進めてきたイヨンジ村南地区の保護区化への努力が実り、2012年4月に同地区が同国環境省によって正式にコミュニティ・リザーブとして認められ
た。この決定には、前述の広域レベルの生息地評価で同地区がきわめて重要なボノボの生息域であることを示したことが、大きく貢献した。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

絶滅危惧種のリストを作成する国際自然保護連合が策定したボノボの保護のアクションプランで、日本の環境省のプロジェクトが遺伝的多様性と人獣共通感染症の調査、分析を担当した。

国内（千葉県）の外来種交雑問題の影響評価で、本プロジェクトで開発した遺伝子分析技術が応用され、野生ニホンザルの交雑実態を明らかにした。この結果をもとに、平成25年度の対策事業が県で検討されている。

## 6 ．国際共同研究等の状況

国際自然保護連合種生存委員会霊長類専門家グループ大型類人猿セクションに代表者の古市が執行委員として参加し、本研究プロジェクトサブテーマ1～3の成果を提供して、Bonobo（Pan paniscus）Conservation Strategy 2012-2022を作成。2013年1月に出版された。

コンゴ民主共和国イヨンジ村のローカル NGO の Forest de bonobos、同国科学研究省生態森林研究所、国際 NGO の African Wildlife Foundation との共同プロジェクトとして、イヨンジ村南部地域をボノボのための保護区とする活動を展開。2012 年 4 月に、イヨンジ・コミュニティ・ボノボ保護区として同国環境省に設立が正式に認可された。

コンゴ民主共和国では、ボノボの生態情報および分析用試料の収集のため、さまざま研究グループと協力して調査をおこなった。以下に調査地域と協力者（所属）を列挙する。

TL2: John A. Hart, Terese B. Hart (Lukuru Wildlife Research Foundation, Kinshasa, Democratic Republic of Congo)

Wamba: Monkengo-mo-Mpenge Ikali, Mbangi N. Mulavwa (Research Center for Ecology and Forestry, Ministry of High Education and Scientific Research, Mabali, Democratic Republic of Congo)

Iyobdji: Monkengo-mo-Mpenge Ikali, Mbangi N. Mulavwa (Research Center for Ecology and Forestry, Ministry of High Education and Scientific Research, Mabali, Democratic Republic of Congo); Jef Dupain (African Wildlife Foundation, Kinshasa, Democratic Republic of Congo)

Lomako: Jef Dupain, Amy K. Cobden (African Wildlife Foundation, Kinshasa, Democratic Republic of Congo)

Salonga: Gay E. Reinartz, Patrick Guislain (Bonobo and Congo Biodiversity Initiative, Zoological Society of Milwaukee, Milwaukee, Wisconsin, United States of America)

Lac Tumba: Mbangi N. Mulavwa, Kumugo Yangozene (Research Center for Ecology and Forestry, Ministry of High Education and Scientific Research, Mabali, Democratic Republic of Congo)

Malebo: Serge Darroze, Céline Devos (World Wide Fund for Nature, Kinshasa, Democratic Republic of Congo)

調查出発前に、各調査協力者と連絡を取ってボノボの生息情報を聞き、調査計画を検討した。現地においては調査許可発行省庁との話し合い等事務手続きから実際の野外調査まで助力をいただいた。調査中に現地スタッフに資料のサンプリング方法を詳細に伝え、試料採取に習熟しても
らった。したがって複数のパーティーでボノボの痕跡を探すことができ、試料採取の効率が上がった。我々が現地を離れた後も、DNA試料の拡充、人獣共通感染症感染率の経時的変化を追跡するため、試料採取を継続するよう依頼し、機会がある度に試料とその他ボノボに関する情報をいただいた。なお、上記7地域のうちSalongaについては、キンシャサで試料調査方法を調査協力者に詳細に伝えたのち、現地調査を依頼した。これらの研究グループとは現在も緊密な連携を保っており、今後の研究および保護活動においても協力してあたることができる。この連携は、本研究プロジェクトで得られたきわめて大きな資産だといえる。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) Hirata S, Yamamoto S, Takemoto H, Matsuzawa T (2010) A Case Report of Meat and Fruit Sharing in a Pair of Wild Bonobos. Pan Africa News 17: 21-23.

2) Sugawara T, Go Y, Udono T, Morimura N, Tomonaga M, Hirai H, Imai H (2010) Diversification of bitter taste receptor gene family in western chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 28: 921-931.

3) Suzuki N, Sugawara T, Matsui A, Go Y, Hirai H, Imai H (2010) Identification of non-taster Japanese macaques for a specific bitter taste. Primates 51: 285-289.

4) Furuchi T (2011) Female contributions to the peaceful nature of bonobo society. Evolutionary Anthropology 20: 131-142

5) Furuichi T, Idani G, Ihobe H, Hashimoto C, Tashiro Y, Sakamaki T, Mulavwa BN, Yangozene K, Kuroda S (2011) Long-term studies on wild bonobos at Wamba, Luo Scientific Reserve, D.R. Congo: towards the understanding of female life history in a male-philopatric species. In: Kappeler P, Watts D (eds) Long-term field studies of primates. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 413-433.

6) Tsuji Y (2011) Seed dispersal by Japanese macaques (Macaca fuscata) in western Tokyo, Japan: a preliminary report. Mammal Study 36: 165-168.

7) Tsuji Y (2011) Sleeping site preferences of wild Japanese macaques (Macaca fuscata): the importance of nonpredatory factors. Journal of Mammalogy 92: 1261-1269.

8）辻大和、和田一雄、渡邊邦夫（2011）野生ニホンザルの採食する木本植物 付記：ニホンザルの食性研究の今後の課題．霊長類研究 27：27-49.

9) Imai H, Suzuki N, Ishimaru Y, Sakurai T, Yin L, Pan W, Abe K, Misaka T, Hirai H (2012) Functional diversity of bitter taste receptor TAS2R16 in primates. Biology Letters 8: 652-656

10) Hayakawa T, Sugawara T, Go Y, Udono T, Hirai H, Imai H (2012) Eco-Geographical Diversification of Bitter Taste Receptor Genes (TAS2Rs) among Subspecies of Chimpanzees (Pan troglodytes). PLOS ONE 7, e43277.

11) Hayashi M, Ohashi G, HeungJin R (2012) Responses toward a trapped animal by wild bonobos at Wamba. Animal Cognition 15: 731-735.