Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
苗移動ガイドライン』と題する書籍を出版した³）。この書籍では、遺伝子多様性維持対策の1つとして日本産主要樹木の遺伝的地域性の保全に注目し、そのために必要な遺伝的集団構造（遺伝的地域性）データをとりまとめた（図(9)-2）。これらの情報を用いて、日本産主要樹木について種苗移動制限ガイドラインの提言を行うことで、遺伝子多様性維持政策上の情報提供として貢献できる。例えば、植林等の人為活動の方法を、生物多様性保全のために最適化させるための情報として有効利用することができる。

図(9)-2 オルガネラDNAの解析によるオオモミジの遺伝的集団構造（遺伝的地域性）を示した例（A）と、それらのDNAタイプ間の関係を示すネットワーク図（B） $ ^{3)} $

また、ヨシ個体群の遺伝的多様性が水質浄化と一次生産量に及ぼす影響を調べる操作実験を行った結果、同一クローンのヨシだけを植栽した単植区と、6クローンを混ぜて植栽した混植区を比較すると、遺伝的多様性の高い混植区で生産量が多く、水質浄化機能も高いことが示された $ ^{4} $ 。この成果は、生物多様性（遺伝的多様性）が私たちの生活に直接メリットとなる例を示しており、遺伝子多様性維持政策を進める必要性を説明するための情報源として利用することができる。

## （３）遺伝子多様性評価のための分析手法開発

遺伝子多様性アセスメント手法として広く利用できる次世代シーケンサーを用いた分析方法を開発し、論文発表した（Multiplexed ISSR Genotyping by sequencing（MIG-seq）法 $ ^{5} $ ）。さらに、この手法が広い種群の遺伝子多様性解析に即座に利用可能であることを示すために、微生物・菌類・脊椎動物・無脊椎動物・高等植物を材料として、一般的な集団遺伝学的解析の例を示した。その結果、すべてのサンプルにおいて集団遺伝学的解析が可能な数のSNPマーカーが検出され、それらを用いて2つの異なるサンプルグループを明瞭に識別することができた（図(9)-3）。この手法は、簡便かつ低コストで広い範囲の生物種・サンプルに対して迅速な遺伝的多様性評価が可能なため、国際的な標準的手法として幅広い利用が期待できる。また、空間分布データを取得したサンプルについてこの手法による遺伝子データを取得して両者を統合することで、その生物の地域
集団に関して遺伝的地域性を明らかにすることができる。さらにこのデータを用いて集団動態履歴の解析を行えば、集団サイズの変動や集団分化パターンなど、多様性変動についても解析することができるため、遺伝子多様性の観測・評価・予測研究のための利用価値が高い。

図(9)-3 絶滅危惧植物レブンアツモリソウの試料採取位置（右）と、MIG-seq法によって得られた386座のSNPをもとに解析したそれらの遺伝的集団構造解析図（左）

左図では、各個体内の遺伝的組成を2つの遺伝的要素（想定分集団）の割合として100%積み上げ棒グラフで色分けして表している。この図では、北部と南部の集団が遺伝的に明確に異なることが示されている。また、主要自生地以外で発見された個体（左図の右端の①②③）が、北部あるいは南部の由来なのかについても推定が可能であることを示している。例えば②の株は島の南部で発見されたにも関わらず、遺伝的には島の北部の要素を持っているため、人為的な移動の可能性が疑われる（伏見ら，未発表）。

## （４）過去からの生物多様性変動を対象とした解析手法の開発

Palaeo-ecogenomics（古エコジェノミクス）として、古代花粉DNA試料や湖底堆積物のメタジェノミクス分析によって過去における植物の遺伝子多様性変動解析のためのデータ取得が可能であることを示し、そのアプローチ法について提案した（図(9)-4） $ ^{7)} $ 。また、そのための具体的なデータ取得事例として、湖底堆積物中の花粉 $ ^{8)} $ ， $ ^{9)} $ や、山岳氷河のアイスコア中の花粉 $ ^{10)} $ のDNA分析法に関する基礎技術開発を進め、その成果を論文発表した。さらに、地理情報システム技術を用いて遺伝子データと個体の空間分布データを統合した解析法が可能であることを、この分野の有用な研究アプローチ例として示した $ ^{6)} $ 。これらの手法開発・提案により、特に生物多様性（遺伝的多様性）の将来予測のために有効な情報源となりうる、過去における多様性変動に関する情報取得の道が拓けたと言え、今後のこの分野の発展に寄与することが期待される。
古代堆積物の採取

図(9)-4 遺伝子多様性変動観測に用いることができるアプローチ法の概念図

湖底堆積物等の連続古代堆積試料を採取し、その中に含まれる花粉等の生物試料や堆積物（土壌）自体を試料としてDNAを抽出する。それを次世代DNAシーケンシングにより遺伝的データを取得して、遺伝子多様性の変動解析に用いることができるという発想を示している $ ^{(8)} $ の図を改変）。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究では、アジア産の絶滅危惧植物を対象として、遺伝子データと個体の空間分布データを統合した現状評価の実例を示した。その研究成果の例として、遺伝的集団構造解析によって絶滅危惧植物の分布域内に遺伝的地域性があることを明確に示し、それら異なる地域集団を別の保全単位として保全することの重要性を提示した。このことは、その種に関する保全遺伝学的データとして科学的価値があるだけでなく、この手法を用いることによって、同様のデータが他種においても容易に取得可能であることを示したという意味においても価値がある。

また、日本産主要樹木の遺伝的多様性維持のための情報提供を目的として、『地図でわかる樹木の種苗移動ガイドライン』と題する書籍を出版した。これまでにこのような国内生物の遺伝的地域性情報が一般市民にも理解できる形でまとめられたことはなく、世界的にも類例を見ない先進的な成果だと言える。

本研究の最も大きな科学的成果としては、遺伝子多様性観測のための新たな手法を開発したことが挙げられる。これまで、ある特定の生物種の遺伝子多様性を評価するためには、まず当該対象種に対応する遺伝マーカーを開発する作業から始める必要があるのが一般的であった。その作業には時間と労力がかかるだけでなく、しばしば短期間では十分な数の有効なマーカーが開発できないこともあり、遺伝子多様性の評価が思うように進まない理由の一つとなっていた。本研究ではこれらの問題を解決して、今後遺伝子多様性アセスメント手法として広く利用できる次世代DNAシーケンサーを用いた分析方法を開発した。また、この手法が広い種群の生
物に応用可能であることを示した。本手法は、簡便かつ低コストで、広い範囲の生物種・サンプルに対して迅速な遺伝的多様性評価が可能なため、今後の幅広い利用が期待できる点でその科学的意義は大きい。

最後に、過去に生存していた生物を対象とした遺伝子多様性変動に関わる解析手法については、そもそもこれまでこのようなアプローチについて十分な検討がなされてこなかった。本研究では、古代花粉DNA試料や氷河あるいは湖底堆積物のDNA分析によって、過去における植物の遺伝子多様性変動解析のためのデータ取得が可能であることを示した。これらの研究分野については、本研究分担者らが世界的にも先駆的な立場にあり、今後のこの分野の発展に対する寄与は大きい。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

特に記載すべき事項はない。

## 6 ．国際共同研究等の状況

計画名：East Asia Biodiversity Conservation Network (EABCN)。協力案件：Construction of infrastructure for conservation of rare and endemic plants in Korea。カウンターパート：Hyeok Jae Choi (Changwon National University・韓国)。参加・連携状況：この研究プログラムで対象となる絶滅危惧種のうち、少なくとも3種のデータは本研究の成果を利用している。国際的位置づけ：日本を含む東アジア5カ国が参加。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) F. NAKAZAWA, J. UETAKE, Y. SUYAMA, R. KANEKO, N. TAKEUCHI, K. FUJITA, H. MOTOYAMA, S. IMURA and H. KANDA: Environ. Res. Lett, 8, 1, 014032 (2013), DNA analysis for section identification of individual Pinus pollen grains from Belukha glacier, Altai Mountains, Russia.

2) H-J. CHOI, S. KANEKO, M. YOKOGAWA, G-P. SONG, D-S. KIM, S-H. KANG, Y. SUYAMA and Y. ISAGI: J. Plant Biol, 56, 4, 251-257 (2013), Population and genetic status of a critically endangered species in Korea, Euchresta japonica (Leguminosae), and their implications for conservation.

3) L. PARDUCCI, I. MATETOVICI, S. L. FONTANA, K.D. BENNETT, Y. SUYAMA, J. HAILE, K. H. KJÄER, N. K. LARSEN, A. D. DROUZAS and E. WILLERSLEV: Mol. Ecol, 22, 13, 3511-3524 (2013), Molecular and pollen-based vegetation analysis in lake sediments from central Scandinavia.

4) 陶山佳久、津村義彦：地球環境、18,2,127-136(2013)，日本産針葉樹の遺伝的多様性.
5) H. TOMIMATSU, K. NAKANO, N. YAMAMOTO and Y. SUYAMA: Oecologia, 175, 1, 163-172 (2014), Effects of genotypic diversity of Phragmites australis on primary productivity and water quality in an experimental wetland.

6) S. MORINAGA S, T. IWASAKI and Y. SUYAMA: In: S.-i. Nakano et al. (eds.) Integrative Observations and Assessments, Ecological Research Monographs. 327-337 (2014), Eco-evolutionary genomic observation for local and global environmental changes.

7) 岩崎貴也、阪口翔太、横山良太、高見泰興、大澤剛士、池田紘士、陶山佳久：日本生態学会誌，64，3，183-199（2014），生物地理学とその関連分野における地理情報システム技術の基礎と応用.

8) L. PARDUCCI, M. VÄLIRANTA, J. S. SALONEN, T. RONKAINEN, I. MATETOVICI, S. L. FONTANA, T. ESKOLA, P. SARALA and Y. SUYAMA: Phil. Trans. R. Soc. B, 370, 1660, 20130382 (2015), Proxy comparison in ancient peat sediments: pollen, macrofossil and plant DNA.

9) Y. SUYAMA and Y. MATSUKI: Sci. Rep, 5, 16963 (2015), MIG-seq: an effective PCR-based method for genome-wide single-nucleotide polymorphism genotyping using the next-generation sequencing platform.

10) K. SUGAI, S. WATANABE, T. KUISHI, S. IMURA, K. ISHIGAKI, M. YOKOTA, S. YANAGAWA and Y. SUYAMA: Conserv. Genet, 17, 1, 221-228 (2016), Extremely low genetic diversity of the northern limit populations of Nypa fruticans (Arecaceae) on Iriomote Island, Japan.

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) 津村義彦、陶山佳久(編)：地図でわかる樹木の種苗移動ガイドライン、文一総合出版、176 pp. (2015)

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 伏見愛雄、松木悠、河原孝行、高橋英樹、伊澤岳師、陶山佳久：第46回種生物学シンポジウム（2014）

「絶滅危惧植物レブンアツモリソウのNGS-SNP分析による集団遺伝学的解析」

2) 伏見愛雄、松木悠、河原孝行、高橋英樹、伊澤岳師、陶山佳久：日本生態学会東北地区会第59回大会(2014)

「次世代シーケンシング分析による絶滅危惧植物レブンアツモリソウの集団遺伝学的解析」

3) Y. SUYAMA and Y. MATSUKI: Contribution of Genetics to Plant Conservation: Brazil-Japan International Workshop 2015, Piracicaba, Brazil, 2015

“Development of a novel method for conservation genetics with next-generation sequencing: Multiplexed ISSR (inter-simple sequence repeat) Genotyping by sequencing (MIG-seq).”

4) Y. SUYAMA and Y. MATSUKI: International Seminar in Jardim Botânico do Rio de Janeiro 2015 "Development of a novel method for conservation genetics with next-generation sequencing: Multiplexed ISSR (inter-simple sequence repeat) Genotyping by sequencing (MIG-seq)."

5) Y. Suyama: Workshop of Young Scientists on Biodiversity and Conservation Biology in Southwest China: Advances in Conservation Genetics. Kunming, China, 2015
“MIG-seq: an effective PCR-based method for genome-wide SNP genotyping using NGS platform.”

6) Y. Suyama and Y. Matsuki: 11th Clonal Plant Workshop, Trbeon, Czech Republic, 2015 "An effective PCR-based method for genome-wide SNP genotyping using NGS platform."

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1) 一般公開シンポジウム「津波防災シンポジウム2015-子どもたちと描く千年希望の未来」（主催：公益財団法人生存科学研究所、一般社団法人日本フィトセラピー協会、一般社団法人森の防潮堤協会、2015年11月5日、TOKYO FMホール、観客約200名）にて講演

2) S9公開講演会「生物多様性観測・評価・予測研究の最前線5～アジアの生物多様性はどこまでわかったか～」（主催：環境省環境研究総合推進費新規戦略型課題S-9「アジア規模での生物多様性観測・評価・予測に関する総合的研究」、2016年3月25日、東北大学片平さくらホール、観客約100名）にて講演

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1) FM仙台（2014年11月30日、植物の遺伝的地域性保全研究の成果について10分ほど紹介）

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) H-J. CHOI, S. KANEKO, M. YOKOGAWA, G-P. SONG, D-S. KIM, S-H. KANG, Y. SUYAMA and Y. ISAGI: J. Plant Biol, 56, 4, 251-257 (2013), Population and genetic status of a critically endangered species in Korea, Euchresta japonica (Leguminosae), and their implications for conservation.

2) K. SUGAI, S. WATANABE, T. KUISHI, S. IMURA, K. ISHIGAKI, M. YOKOTA, S. YANAGAWA and Y. SUYAMA: Conserv. Genet, 17, 1, 221-228 (2016), Extremely low genetic diversity of the northern limit populations of Nypa fruticans (Arecaceae) on Iriomote Island, Japan.

3) 津村義彦、陶山佳久(編)：地図でわかる樹木の種苗移動ガイドライン、文一総合出版、176 pp. (2015)

4) H. TOMIMATSU, K. NAKANO, N. YAMAMOTO and Y. SUYAMA: Oecologia, 175, 1, 163-172 (2014), Effects of genotypic diversity of Phragmites australis on primary productivity and water quality in an experimental wetland.

5) Y. SUYAMA and Y. MATSUKI: Sci. Rep, 5, 16963 (2015), MIG-seq: an effective PCR-based method for genome-wide single-nucleotide polymorphism genotyping using the next-generation sequencing platform.

6) 岩崎貴也、阪口翔太、横山良太、高見泰興、大澤剛士、池田紘士、陶山佳久：日本生態学会
誌，64，3，183-199（2014），生物地理学とその関連分野における地理情報システム技術の基礎と応用.

7) S. MORINAGA S, T. IWASAKI and Y. SUYAMA: In: S.-i. Nakano et al. (eds.) Integrative Observations and Assessments, Ecological Research Monographs. 327-337 (2014), Eco-evolutionary genomic observation for local and global environmental changes.

8) L. PARDUCCI, I. MATETOVICI, S. L. FONTANA, K.D. BENNETT, Y. SUYAMA, J. HAILE, K. H. KJÄER, N. K. LARSEN, A. D. DROUZAS and E. WILLERSLEV: Mol. Ecol, 22, 13, 3511-3524 (2013), Molecular and pollen-based vegetation analysis in lake sediments from central Scandinavia.

9) L. PARDUCCI, M. VÄLIRANTA, J. S. SALONEN, T. RONKAINEN, I. MATETOVICI, S. L. FONTANA, T. ESKOLA, P. SARALA and Y. SUYAMA: Phil. Trans. R. Soc. B, 370, 1660, 20130382 (2015), Proxy comparison in ancient peat sediments: pollen, macrofossil and plant DNA.

10) F. NAKAZAWA, J. UETAKE, Y. SUYAMA, R. KANEKO, N. TAKEUCHI, K. FUJITA, H. MOTOYAMA, S. IMURA and H. KANDA: Environ. Res. Lett, 8, 1, 014032 (2013), DNA analysis for section identification of individual Pinus pollen grains from Belukha glacier, Altai Mountains, Russia.
# （１０）アジア産絶滅危惧植物の全個体ジェノタイピング

京都大学大学院

農学研究科森林生物学研究室 井鷺 裕司

平成23～27年度累計予算額：29,332千円（うち平成27年度：5,367千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

適切な生物多様性保全のためには、個体数の少ない絶滅危惧種の遺伝的状況を適切に把握することが重要である。自然環境に対する人為インパクトの増大に伴って多くの植物種が絶滅に瀕しているが、その中には、野生状態で生育する個体数が数100個体以下にまで著しく減少したものも少なくない。本研究では、アジアに生育する絶滅危惧種10種を対象に野生に生育する全個体の遺伝子型を明らかにする事で、現存するクローン数、遺伝的多様性、遺伝構造、ジーンフロー、集団の遺伝的分化、交配様式等を解析して、遺伝子型の包括的モニタリングに基づく生物多様性保全を行った。その結果、アジアに生育する複数の絶滅危惧種について、遺伝的見地から見た種の状況、遺伝情報に基づく未知の野生個体の存在予測、遺伝的タグ付けによる盗掘防止、域外保全すべき個体の適切な選択、域外保全集団の保全的価値の評価などが可能になった。

従来、絶滅危惧種の状況は、種ごとの外部的特徴、すなわち、個体数の多寡や増減にもとづいて評価され、絶滅危惧カテゴリーが決定されてきた。この方法は比較的個体数の多い種においては有効である。これに対して本研究では野生に現存するすべての個体を対象に遺伝子型解析を行うことで、種の保全状況を個体レベルで正しく評価し、より有効かつ適切な生物保全策の実施が可能であることを実証した。

## [キーワード]

遺伝的多樣性、絕滅危惧種、生物多樣性、熱帶多雨林、生育域外保全

### 1. はじめに

自然環境に対する人為インパクトの増大に伴って多くの植物種が絶滅に瀕しているが、その中には、野生状態で生育する個体数が数100個体以下にまで著しく減少したものも少なくない。この様な状態にある絶滅危惧種の保全にあたっては、個体群から一部の個体をサンプリングし、遺伝的性質を評価するという集団遺伝学的な手法に基づく解析に加えて、野生個体の全個体を対象にジェノタイピングを行い、現存するクローン数、遺伝的多様性、遺伝構造、ジーンフロー、集団の遺伝的分化、交配様式等を解析して、遺伝子型の包括的モニタリングに基づいて、きめ細かい生物多様性保全を行うことが有効である。

## 2 ．研究開発目的

本サブテーマでは、人為インパクトの増大が著しいアジア諸国における絶滅危惧植物10種を対
象に全個体ジェノタイピングを行い、適切な生物多様性評価と保全策の構築を行うことを目的とした。

### 3. 研究開発方法

アジア産絶滅危惧種で野生個体数が著しく減少した植物について、1年間に2種を解析対象とし、野生に生育する全個体を対象に繁殖状況の確認と遺伝解析用の試料を採集した（図(10)-1）。

図10-1 解析对象種

解析対象とした種は平成23年度に、ミヤマトベラ(Euchresta japonica、マメ科)の韓国集団、エンゴサク属新種(Corydalis hirtipes、ケン科)、平成24年度に、コガクウツギ(Hydrangea luteovenosa、アジサイ科)の韓国集団、ゴマノハグサ属植物(Scrophularia taksimensis、ゴマノハグサ科)、平成25年に、ルリミノキ(Lasianthus japonicus、アカネ科)の韓国集団、シラカシ(Quercus myrsinifolia、ブナ科)の韓国集団である。平成26年度と27年度は熱帯多雨林の生物多様性を支えるフタバガキ科植物の絶滅危惧種を対象に解析を行った。すなわち、平成26年度に、Vatica bantamensisおよびVatica perakensis、平成27年度に、Dipterocarpus lamellatusおよびShorea kudatensisである(図(10)-1)。次世代シーケンサーを用いてSSR遺伝マーカーを新たに開発し、すべてのサンプルについて、SSR遺伝子型解読あるいは、サプテーマ9で開発されたMIG-seqによるSNPs(一塩基多型)解読を行い、現存するクローン数、遺伝的多様性、遺伝構造、ジーンフロー、集団の遺伝的分化などの解析を行った。

## 4 ．結果及び考察

## （１）ミヤマトベラ(Euchresta japonica、マメ科)

本種は、日本、韓国、中国に生育するが、特に個体数が少ない韓国では、最重要保全対象種として取り扱われている。韓国で生育するすべての野生個体、8個体と、生育域外保全されている個体12個体について遺伝子型を決定したところ、韓国には野生に5クローンのみが生育していることが明らかになった。また、生育域外保全集団には7クローンと、クローン数が野生集団より多いだ
けではなく、野生集団に見いだせない対立遺伝子を持つ個体もあり、韓国産ミヤマトベラの保全のために、生育域外保全集団の活用が重要であることがわかった。

また、韓国のミヤマトベラは残存する個体数は少ないものの、野生個体数が数万オーダーと考えられる日本の集団よりも高い遺伝的多様性を保持しているという、意外な事実が判明した。

## (2) エンゴサク属植物(Corydalis hirtipes、ケシ科)

本種は、最近記載された韓国固有種であり、現存野生に256個体が知られている。本プロジェクトにおいて新たにマイクロサテライトマーカーを開発し、遺伝的多様性の評価を行った結果、ごく少ない個体数にもかかわらず、対立遺伝子数やヘテロ接合度の点から、高い遺伝的多様性が保持されていることが明らかになった。

## (3) コガクウツギ(Hydrangea luteovenosa、アジサイ科)

コガクウツギは西日本では低山に普通に分布している低木であるが、韓国では済州島の渓流沿いに285個体からなる1集団が存在するのみであり、韓国においては、その群落の保全価値が高く認められている。韓国済州島に生育するコガクウツギ全個体の遺伝子型解析を行った結果、韓国のコガクウツギ集団を構成する個体は、単一のクローンであることが判明した。

野生個体数が日本で多く、韓国で極めて少ないという点で、ミヤマトベラとコガクウツギは共通しているが、遺伝的な性質は両者で対照的に異なっていた。IUCNの基準では主に個体数や生育地の広さによって絶滅危惧状況が評価されているが、絶滅危惧種の状況を的確に理解するためには、遺伝的な状況を考慮にいれる必要があることを、韓国産のこれらの希少植物は示している。また、複数の国に分布する分類群においては、国際協力を介した、分布域全体における詳細な比較解析が分類群の状況理解に不可欠であることを示している。

## （４）ゴマノハグサ属植物(Scrophularia takesimensis、ゴマノハグサ科)

本種は韓国鬱陵島のみに生育する多年生植物である。生育地の網羅的調査の結果、1~73の個体からなる個体群が30個認められたが、遺伝的多様性は低く、同一遺伝子型の個体も多かった。創始者効果、あるいはボトルネックによって遺伝的多様性が低下した後に、海流散布によって鬱陵島内でサブ個体群が形成されたことによって、この様な遺伝特性が生じたものと思われる。

## (5) シラカシ(Quercus myrsinifolia、ブナ科)

シラカシは日本では本州以西に広く分布するブナ科の常緑高木であるが、韓国では僅か1ヶ所に集団があるにすぎない。韓国、日本および中国の集団について遺伝子型の比較解析を行った結果、韓国の集団は中国と日本の中間的な性質を示し、3ヶ国の地理的な関係を反映したものとなっていた。また、中国、韓国、日本の3ヶ国の比較では、ヘテロ接合度の観察値や期待値においては大きな差は無いものの、アレリックリッチネスは韓国において低く、固有の対立遺伝子は韓国集団には存在しなかった。これらのことから、韓国におけるシラカシ集団は比較的近年に個体数を著しく減少させたため、ヘテロ接合度は未だ低下はしていないものの、個体数減少に対してより敏感に変化する、アレリックリッチネスやプライベートアリルが有意に低下していると考えられる。現在残されている数百の個体を減少させないことが、韓国のシラカシ保全にとって重要である。
## (6) ルリミノキ(Lasianthus japonicus、アカネ科)

本州静岡県以西、四国、九州、中国南部に分布し、日本では本州の6府県において絶滅危惧種として扱われているが、国レベルではレッドリストにはあげられていない。これに対して、韓国では本種の状況はきわめて深刻であり、済州島に15個体が野生状態で生育しているに過ぎない。韓国に野生生育する全個体の遺伝的多様性を解析・評価するために、韓国1集団（15個体）、日本3集団（20～23個体）、計81個体を対象に遺伝解析を行った。その結果、解析した集団の相互関係をみると、韓国、宮崎、広島それぞれが明瞭に識別できる遺伝的特徴を持つことが明らかになった。STRUCTURE解析では、全サンプルは遺伝的に3個のクラスターからなり、それぞれのクラスターの遺伝的分化を示すF値は0.51, 0.56, 0.46であり、3個のクラスターがそれぞれ祖先集団から大きく分化している事がわかった。PCoA解析によっても、韓国のルリミノキが日本のものとは大きく異なる遺伝的特徴を持っており（図(10)-2）、更に、15個体しか存在しない韓国の集団に高い遺伝的多様性が保持されているという大変興味深い事実も明らかになった。

図(10)-2 PCoAによるルリミノキ4集団の相互関係

JEU: 韓国済州島、OHN: 広島県廿日市市、TAN: 宮崎県宮崎市、SEK: 宮崎県都城市

## ( 7 ) Vatica bantamensis

インドネシア・ジャワ島北部のウジュンクロン国立公園のみに小集団が生育している。生育地はアクセス困難な場所にあり生育状況は不明であったが、2011年に国際研究協力を行っているボゴール植物園の研究者によって生育が再確認された。このような過程から、ウジュンクロン国立公園の自然保護フラッグシップ種という扱いを受けている。また、ボゴール植物園には1869年に採集された個体に由来する実生が3個体ある。この個体は個体群の縮小によって、野生個体群では失われた対立遺伝子を保持している可能性があり、生物保全上興味深い。

遺伝解析の結果、100未満の少数個体のみが生育しているウジュンクロン国立公園の集団では、解析を行ったマイクロサテライト遺伝子座11座中、4座において1個の対立遺伝子で固定されていたが、7座においては遺伝的多様性が保持されていた。一方、1869年に採集されボゴール植物園で栽培されてきた個体に由来する域外保全集団は、11座中10座の遺伝子座で対立遺伝子が固定しており、少数個体の交配による遺伝的多様性の著しい低下が認められた。しかしながら、域外保全集団には、野生集団には見られない対立遺伝子も保持されており、ただ単に遺伝的多様性が低いという理由で域外保全集団の保全価値が低いとするのは妥当ではない。

野生集団の稚樹のゲノム情報を縮約解読することで、現存する唯一の集団は明瞭な遺伝的差異
を示す、少なくとも3個のクラスターから構成されることが明らかになった(図(10)-3)。この情報は、野生残存個体群の保全上の価値を評価し、域外集団創設の際の個体の選別や、近交弱勢のリスクの少ない人工交配の実施などに活用できることが期待される。

(a)

図(10)-3 Vatica bantamensis 野生集団 の遺伝構造

(a) PCA第一軸と第二軸平面上のサンプルの分布。3グループが明確に認識できる。

(c)

(d)

(b) STRUCTURE解析ではΔK値はK=3において最も大きく、サンプルの遺伝的多様性が3個のクラスターによって構成されていることがわかる。(c) STRUCTURE解析の3クラスターの相互関係。(d) 各サンプルに対するクラスターの割り付け。それぞれのサンプルは1個のクラスターに占められており、複数クラスターは殆ど混合しない。

(8)

本種は、IUCNのレッドリストには掲載されていないが、絶滅危惧にある分類群である。インドネシア・北スマトラのMursala島には今回遺伝解析用に入手した3個体が生育するのみである。

ボゴール植物園スタッフの現地踏査によって得られた植物試料の遺伝子型を解読したところ、ほとんどの遺伝子座において複数の対立遺伝子が認められた。本種は現在、集団サイズが著しく縮小しているにもかかわらず、遺伝的多様性が保たれていることから、個体数が減少して以降、ほとんど世代交代を行っていないことが推測された。

(9)

北部および西部サバ州の海岸沿いの丘陵地に分布しているが、すでに本来の自然分布域の90％が失われたと考えられている。（9）および（10）の遺伝解析用サンプルは、共同研究者であるIsmail Sascha博士とChris Kettle博士（チューリッヒ工科大学）らが1ヶ月にわたる現地踏査によって入手し、全個体遺伝子型解析を行うために本プロジェクトへの供与がなされたものであり、4ヶ所の生育地(Melinsung, Sugut, Paitan, Tambilidon)より採集された合計31個体である。（9）および（10）のマレーシア産希少フタバガキ科植物のサンプルについてはサブテーマ9で開発されたMIG-seqにより遺伝子型解読を行った。今回入手したサンプルは高木の樹皮であり、DNA抽出の観点からは厳しい条件であったが、ゲノムを縮約的にPCR増幅させるMIG-seqの特徴により、全てのサンプルで遺伝子型の解読ができた。

S. kudatensisには産地間に遺伝的分化が認められた(図(10)-4)。また、産地ごとの遺伝的多様性にも差異があった。急速に開発が進み生育地が減少しつつある現状において、保全対象集団の優先度を設定するに際して本アプローチは有効と考えられる。
図(10)-4 Shorea kudatensisの産地間における遺伝的変異

(10)

Dipterocarpus lamellatusは、フタバガキ科の中でも最も個体数が少なく、絶滅に瀕した種の一つとして知られている。野生より採集された個体はD. lamellatusが繁殖個体12個、若齢個体22個であった。S. lamellatusとS. kudatensis双方のサンプル全体で遺伝的変異を評価したところ、2種に対応した2つのグループではなく、3つのグループにわかれた(図(10)-5)。

図(10)-5 D. lamellatus及びS. kudatensisサンプル間の遺伝的変異

DL: D. lamellatusの繁殖個体、DLP: D. lamellatusの若齢個体、MKT, MPAI, MSU, Skk: S. kudatensisの産地略号。

S. kudatensisは図の右下に一つのグループとしてまとまったのに対して、D. lamellatusは図の左と、中央上部に2分される明瞭なパターンが見出された。このうち、繁殖個体と若齢個体が混在する左のグループが、S. lamellatusを代表するものと考えられる。図(10)-5において、左下のD. lamellatusと右のS. kudatensisの2種の差異よりも、図中央のD. lamellatus若齢サンプルは遺伝的差異が大きいことから、供与を受けたサンプルには全く異なる種が混在していたものと考えられる。

熱帯林の中にあって、繁殖個体は葉の形態などから採集時に種同定が比較的正確に行えるが、若齢個体に関してはその形態に関して正確な記述がなされておらず、種同定は未だに困難である。また、野外調査時に種同定のための形質を得ることは必ずしも可能ではないし、高木種では葉が
採集できないことも多い。今回のD. lamellatusの採集に際しては現地専門家も同行したが、他種のサンプルが混在していたことが縮約ゲノム解析によって明らかになった。熱帯林における希少植物のセンサスにおいて、全個体サンプリングと次世代シーケンサーを活用した効率的解析は有効であろう。

## （１１）解析対象種全体に共通する知見

本研究では10種のアジア産希少植物について、次世代シーケンサー等の技術革新などを活用しつつ、野生に生育する全個体の遺伝子型解読を行った。従来、絶滅危惧種の状況は、種ごとの外部的特徴、すなわち、個体数の多寡や増減にもとづいて評価され、絶滅危惧カテゴリーが決定されてきた(図(10)-6)。この方法は比較的個体数の多い種においては有効である。これに対して本研究では野生に現存するすべての個体を対象に遺伝子型解析を行い、種の置かれた保全生物学的状況を明らかにすることを目的とした。その結果、これまで日本と韓国で共通種が分布すると考えられていた植物が、遺伝的に大きく分化していたこと、熱帯多雨林の厳しい条件下で採集された希少植物の試料に複数種が混在していたことなど、保全対象種の範囲を検討すべき事例が多く見られた。

図(10)-6 従来法による「絶滅危惧」状態の判定と本プロジェクトによる評価と利点

個体数が多くてもクローン数が著しく少ない例や（最も極端なのは、2004年に韓国済州島で発見された約300個体のコガクウツギが1クローンであった例）、逆に、20個体にも満たない集団内の遺伝的多様性が、10,000個体以上からなる集団が保持している多様性よりも高いという種、更に、野生に僅かに残された個体が明確な複数の遺伝的グループに別れる例なども見出された。これらの事例は、絶滅危惧種の遺伝的多様性は、個体数と必ずしも相関するわけではなく、種や個体群がたどってきた個別の歴史が大きく影響していることを示唆している。また、ごく少数が残存する希少植物にとって極めて大きな意味を持つ未知野生個体の検出や盗掘個体の種同定・産地特定
なども可能であった(図(10)-6)。この様に、種の保全状況を個体レベルで正しく評価し、有効な生物保全策を実施する上で、全個体ジェノタイピングによる詳細な遺伝解析が有効であることが示された。

全個体ジェノタイピングを実施するためには（1）生育地におけるサンプリングと（2）個体レベルの詳細な遺伝解析が必要である。後者に関しては、本プロジェクト実施中にも遺伝子解読技術の進展があり、実施はより容易になりつつある。従って、パイロット研究的に始めた全個体ジェノタイピングによる生物保全は、今後、野生で多数生育する絶滅危惧種に関しても実行可能になるものと考えられる(図(10)-6)。

野生生育個体数が100を下回るようになった絶滅危惧植物について全個体ジェノタイピング法行うことで、様々な生物保全上適切な提言・技術提供を行うことが可能であり(図(10)-7)、今後、技術の進展とともにより多数の個体が野生に残存している種に関しても、より適切な生物保全策が構築できると思われる。

図(10)-7 生物保全活動に対する本研究の成果の活用

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

絶滅危惧種の状況は、これまで個体数や生育面積など外部的特徴によって評価されてきたが、全個体の遺伝子型を明らかにする本研究によって、デモグラフィックな解析のみではわかり得ない、各生物種の状況を知ることができた。次世代シーケンサーを活用することで、事前に遺伝情報の無い野生生物でも大量の遺伝情報を低コストで解読可能であり、そのような情報を用いれば、本研究の手法により、科学的根拠に基づく、より合理的かつ効率的な生物保全策を構築する事が可能になる。
## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

絶滅危惧植物種では野生生育個体の盗掘が絶滅リスクを高めている。絶滅危惧種の全野生個体の遺伝子型を解読するという本プロジェクトのアプローチは、「絶滅の恐れのある野生動植物の種の保存に関する法律」が指定する国内希少野生動植物種の保全に活用された。具体的には群馬県に数十クローンのみが生育するカッコソウの違法売買に関してその同定を遺伝情報を元に行うことで捜査協力し、2015年12月に10名の書類送検に至った。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

「絶滅の恐れのある野生動植物の種の保存に関する法律」は2013年6月に改正され、2020年までに300種を国内希少野生動植物種として追加指定することが目的とされている。2015年より、本プロジェクトで開発・改良した手法により野生前個体の遺伝子型を解読することを始めた。2015年は5種の国内希少野生動物種について解析を行ったが、今後も継続する。本プロジェクトのアプローチを国内希少野生動植物種に適応することで、これらの国内希少野生動物種の適切かつ効果的な保全策の構築が期待できる。

### 6. 国際共同研究等の状況

1) 韓国との国際共同研究：韓国に生育する希少種の全個体遺伝子型解析に基づく生物保全の共同研究を行っている。ミヤマトベラは野生個体は日本には数万個体以上あるのに対して、韓国に10個体未満が生育しているに過ぎないが、韓国の野生集団に日本より高い遺伝的多様性が保持されていたこと、韓国の域外保全集団には野生集団が保持していないユニークな遺伝的多様性があることなどが本プロジェクトを通して明らかになった。現在、本プロジェクトで明らかになった遺伝子型を元に増殖させた個体の野生への植え戻しが韓国のWarm-Temperate Forest Research Centerで行われている。カウンターパート：Hyeok Jae Choi博士（Changwon National University）

2) インドネシアとの国際共同研究：東南アジアの生物多様性保全センターの一つであるインドネシア・ボゴール植物園と、全個体遺伝子型解読による絶滅危惧種の遺伝的な現状把握と多様性保全を目指して、学術交流協定を結び(2013年5月)、共同研究を行っている。絶滅危惧種の全個体ジェノタイピングによって得られた情報はボゴール植物園が実施する生物多様性保全活動に活用する。カウンターパート：ボゴール植物園 Siti Roosita Ariati博士 (Head of Collection Registration Subdivision), Yayan Wahyu Kusuma研究員 (植物保護センター), Rosniati Risna研究員（植物保護センター）

3) ニューカレドニアとの国際共同研究：固有率が極めて高く、また多くの絶滅危惧種が生育するニューカレドニアにおける生物多様性保全研究を、本プロジェクトで開発・改良した解析手法で、2014年4月より行っている。2015年11月には、現地の行政関係者、現地生物保全団体を対象に研究成果発表会を行った。その様子は新聞、TVで報道された。また、詳細な遺伝構造解析結果は今後、ニューカレドニアにおける希少植物の保全活動に活用される予定である。カウンターパート：Gildas Gâteblé 研究員(Institut Agronomique Neo-Caladonien)、Dominique Fleurot (Province Nord et Association Endemia)

4) スイスとの国際共同研究：熱帯多雨林構成樹種は分布状況が不明なものが多いが、2015年度の解析に用いたフタバガキ科の希少植物はスイスの共同研究者から供与を得た。本プロジェクトでは集団遺伝学的な解析を行ったが、今後、少数個体のみが残存するフタバガキ科の適切な管理手法をゲノムレベルの解析により明らかにする予定である。カウンターパート：Chris Kettle博士(チューリッヒ工科大学)，清水健太郎教授(チューリヒ大学)
## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（查読あり）>

1) 井鷺裕司、兼子伸吾、水谷未耶、加藤慶子、伊津野彩子、高宮正之、志賀隆、増本育子、大竹邦明：DNA多型, 20、148-152 (2011)，全個体遺伝子型解析による絶滅危惧植物の保全

2) H.-J. CHO, H. D. JANG, Y. ISAGI and BU OH: Oryx, 46, 399-402 (2012), Distribution and conservation status of Scrophularia taksimensis (Scrophulariaceae), a critically endangered endemic species on Ulleung Island, Republic of Korea

3) H.-J. CHOI, S. KANEKO, BU OH and Y. ISAG: Conservation Genetics Resources, 4, 407-409 (2012), Development of eight microsatellite markers for Corydalis hirtipes (Fumariaceae), a narrow endemic species of Korea

4) T. ITO, S. KANEKO, M. YOKOGAWA, G.-P. SONG, H.-J. CHOI and Y. ISAGI: Korean Journal of Plant Taxonomy, 43, 30-33 (2013), Isolation and characterization of microsatellite markers for Hydrangera luteovenosa (Hydrangeaceae), an endangered species in Korea

5) H.-J. CHOI, S. KANEKO, M. YOKOGAWA, G.-P. SONG, D.-S. KIN, S.-H. KANG, Y. SUYAMA, and Y. ISAGI: Journal of Plant Biology, 56, 251-257 (2013), Population and genetic status of a critically endangered species in Korea, Euchresta japonica (Leguminosae), and their implications for conservation

6) J.-H. LEE, D.-H. LEE, H.-J. CHOI, Y. SUYAMA, T. KONDO, Y. ISAGI and B.-H. CHOI: Korean Journal of Plant Taxonomy, 44, 165-170 (2014), The distribution and population status of Quercus myrsinifolia (Fagaceae) on the Korean peninsula

7) 小熊宏之，井出玲子，井鷺裕司：リモートセンシング学会誌 (印刷中) (2016)、UAV 観測画像を用いた絶滅危惧植物の花の自動検出手法

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) 志賀隆、横川昌史、兼子伸吾、井鷺裕司、Nature Study 58、2-4 (2012) 「全個体遺伝子型解析で絶滅危惧種を守る」

2) 井鷺裕司、地球環境 18, 153-158 (2013)

「全個体遺伝子型解析による絶滅危惧植物の保全」

3) Y. ISAGI and S. KANEKO: Integrative Observations and Assessments. Springer, 311-325 (2014) "Ubiquitous genotyping for conservation of endangered plant species"

## （2） 口頭発表（学会等）

1) H.-J. CHOI, S. KANEKO, M. YOKOGAWA, G.-P. SONG, S.-H. KANG, Y. SUYAMA, Y. ISAGI, Y. and D.-S. KIM: The 5th EAFES International Congress, Ohtsu, Japan 2012

"Genetic status and its conservative implications of a critically endangered species in Korea, Euchresta japonica (Leguminosae), based on ubiquitous genotyping"

2) T. ITO, H.-J. CHOI, Y. SUYAMA, S. KANEKO, G.-P. SONG, S.H. KANG, C.-S. KIMS and Y. ISAGI: The 5th EAFES International Congress, Ohtsu, Japan 2012
“Ubiguitous genotyping on critically endangered Hydrangea luteovenosa in Korea”

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1) 広島市植物公園シンポジウム「ふるさとの植物を守ろうー植物多様性保全を考えるー」（主催：広島市動植物園：公園協会、平成23年10月23日、広島市植物公園展示資料館、聴衆約50名）にて講演

2) 平成24年度京都大学森林科学公開講座「里山のいま」（主催：京都大学大学院農学研究科森林科学専攻、平成24年10月28日、京都大学農学部総合館、聴衆約150名）にて講演

3) 岐阜県立恵那農業高校における特別授業「遺伝子情報を利用した絶滅危惧種の保全」（平成24年11月13日、岐阜県立恵那農業高校、聴講者約150名）

4) 琉球大学公開講演会で講演「全個体遺伝解析による絶滅危惧種の保全」（主催：琉球大学理学部、平成24年12月17日、琉球大学理学部、聴衆約50名）

5) カッコソウンンポジウム「カッコソウを守るために」で基調講演「最新の遺伝解析技術を活用した希少植物の保全」（主催：桐生市、平成25年6月23日、桐生市立中央公民館市民ホール、聴衆約250人）

6) つくば蘭展シンポジウムで講演「遺伝的多様性の評価と保全への利用」（主催：国立科学博物館筑波実験植物園、平成26年3月21日、国立科学博物館筑波実験植物園、聴衆約50人）

7) 第32回福山大学グリーンサイエンスセミナーで講演「遺伝情報を活用した生物多様性保全(主催：福山大学グリーンサイエンス研究センター、平成27年12月8日、福山大学、聴衆約50人)

8) 平成27年京都産業大学度総合生命科学部シンポジウムで講演「最新遺伝学からせまる生物資源の利用と保全」（主催：京都産業大学総合生命科学部、平成28年3月2日、京都産業大学図書館ホール、聴衆約50人）

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1) 朝日新聞（2011年9月26日、全国版、28ページ、「群落保全 遺伝子型カギ 多様性の意義適応力強める」

2) Les Nouvelles Caledoniennes (2015年11月14日、ニューカレドニアの全国紙、20頁、「Les espèces a la loupe」本プロジェクトで開発した遺伝解析手法をニューカレドニアの希少種保全に活用している事が紹介された）

3) NCTV（2015年11月17日、本プロジェクトで開発した遺伝解析手法をニューカレドニアの希少種保全に活用している事が2分30秒ほど紹介された）

## (6) その他

平成23年度日本DNA多型学会優秀研究賞「全個体遺伝子型解析による絶滅危惧植物の保全」

### 8 \. 引用文献

特に記載すべき事項はない。
## （１１）気候変動に対する植物の適応力評価

日本大学生物資源科学部 森長 真一

<研究協力者>

日本大学生物資源科学部 久保田 涉誠

平成23～27年度累計予算額：29,157千円（うち平成27年度：5,327千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

気候変動に対する野生生物の応答は、種間はもとより、種内の集団間でも大きく異なると考えられる。それゆえに、気候変動に対する生物の分布変化や絶滅リスクを予測するためには、種内における適応力の多様性を把握する必要がある。そこで本研究開発では、モデル植物シロイヌナズナに最も近縁な野生植物ハクサンハタザオを対象に、次世代シーケンサーを利用して、様々な時空間スケールでの全ゲノム解析をおこなった。それに基づいて、適応遺伝子に着目した遺伝的多様性の評価手法や、種内における適応力の差異を加味した上での将来予測手法の確立を目的とした。

気候変動の影響が予想される標高差に着目し、標高適応に関与する遺伝子を探索したところ、山間での適応遺伝子の種類の多様性と共通性が明らかとなった。また、博物館等に収蔵されている標本試料のゲノム解析手法を確立し、過去から現在に至るゲノムレベルでの遺伝的多様性の変化や適応遺伝子の動態を復元することに成功した。さらに、日本全域の集団を対象にしたゲノム解析により、生育地の環境情報と遺伝子情報との相関解析から、降水量や気温の変化への適応を担う適応遺伝子を明らかにした。この適応遺伝子を用いて生態ニッチモデリングをおこなう新たな手法を確立し、従来の「種内の全個体が同一の適応力を持つ」と仮定した将来予測に対して、種内における適応力の多様性を考慮した上でのより現実的な将来予測が可能となった。これら一連の成果からは、適応遺伝子に着目して遺伝的多様性の把握を行うことの重要性が示された。

今後、これまで以上に遺伝子解析コストが低下することが予想されている。近い将来、様々な生物種において、本研究開発により確立した評価手法や予測手法が適用できるようになることが期待される。

## [キーワード]

環境適応、気候変動、ゲノム、適応遺伝子、ニッチモデリング

### 1. はじめに

18世紀の産業革命以降、大気二酸化炭素濃度は上昇を続け、特に近年の上昇速度の増加は著しい。それとともに、気温も上昇しており、この傾向は今後も続くことが予測されている。そして、これらの気候変動は、我々人類の生活に影響を及ぼすとともに、人類以外の生物に対しても大き