Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
Ni	1	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005
2	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005
3	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005
Pb	1	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005
2	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005
3	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005
Se	1	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01
2	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01
3	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01
Si	1	3.0	1.6	11	1.8	12	1.8
2	3.3	0.4	9.7	3.2	23	0.93
3	4.4	0.4	12	4.0	27	3.1
Sr	1	6.3	6.1	1.7	1.3	1.3	0.73
2	5.4	5.6	1.0	0.69	0.48	0.21
3	5.4	5.4	0.74	0.68	0.27	0.10
V	1	0.016	<0.005	0.050	<0.005	0.052	<0.005
2	0.025	<0.005	0.064	0.014	0.111	<0.005
3	0.030	0.005	0.073	0.024	0.115	0.010
Zn	1	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005
2	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005
3	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005	<0.005

## 4 ．1．1．5　まとめ

純水溶媒の場合、pHは堆肥浸漬液（スラグ投入前）では7.5～7.7であるが、スラグ投入後の溶出液はpH 12前後の高アルカリ性であった。TOC濃度は堆肥量が多いほど高くなる傾向にあった。鉄は、堆肥浸漬液で堆肥量が多いほど高濃度であったが、スラグ投入後は全て定量下限以下（<0.05 mg/L）であった。環境基準設定項目では、ヒ素は堆肥浸漬液で若干検出されたが、スラグ投入後は低下した。ホウ素はスラグ投入で最大2.2 mg/Lに達したが、堆肥によっていずれの条件も低下する傾向が見られた。カドミウム、全クロム、鉛、セレンは微量か定量下限以下であった。以上のことから、純水溶媒においては堆肥とスラグが相補的に溶出を抑制させる方向で働くことが示唆された。次に、海水溶媒の場合、スラグ投入後のpHは11以下で緩衝作用が確認できた。TOCは純水と同様に堆肥量が多いほど高かった。鉄は堆肥浸漬液と3回目溶出液で検出された。環境基準設定項目では、海水由来のホウ素はスラグによって濃度が低下する傾向が見られ、2回目、3回目溶出液でも初期濃度の1/2程度に抑制された。ヒ素、カドミウム、全クロム、鉛、セレンは微量か定量下限以下であった。以上より、海水、堆肥、スラグの相互作用によっても有害物質の溶出を促進する傾向は特に見られなかった。

1 年間の浸漬試験では、海水溶媒での pH は 9.7～11.3 の範囲であり、特に堆肥を混合した場合は 9.7～10.7 で他の条件よりも低い状態を保っていた。このとき重金属類では V の溶出が 0.01 mg/L 前後で見られるのみであった。スラグを限られた溶媒に浸漬すると pH が高アルカリ性になり、実環境とは異なると考えられたことから、酸を添加して pH を 8～10 に調整しながらシリアルバッチ試験を行った。その結果、環境基準の定められている重金属類の溶出濃度は低く、ほとんど確認されないレベルであった。

以上の結果から、スラグを腐植物質と混合して海水中に浸漬する場合のリスクは十分に低いと考えられた。ただし、海水の希釈分析のため定量下限が通常よりも高かった点は留意する必要がある。
## 4 ．1．2　製鋼スラグからの鉄溶出における微生物作用

## 4 ．1．2．1 研究の目的

自然界には鉄還元細菌や鉄酸化細菌などさまざまな微生物が存在している。これら微生物は、腐植物質などの有機物をエネルギーにして活動している。したがって、腐植物質や製鋼スラグを自然環境中に供与した場合、その活動により周辺環境が変化し、スラグからの鉄の溶出を促進する可能性がある。特に、鉄還元細菌は第二鉄を第一鉄に還元する能力を持つため、スラグ中に多く含まれている第二鉄を効率よく第一鉄に還元し、環境中における物質循環に寄与している可能性がある。そこで、河川堆積物などにおける腐植物質の存在形態ならびに棲息する微生物群の鉄還元活性について評価し、自然環境における腐植酸鉄形成との関連性について検討した。また、環境微生物群に有効な炭素源の選定ならびにそれを用いた製鋼スラグからの第一鉄溶出試験を行い、環境微生物、有機炭素および製鋼スラグとの相互作用について検討した。

## 4 ．1．2．2 研究の方法

## (1) 環境中における腐植酸鉄形成と微生物群との相互作用に関する検討

河川堆積物の採取ポイントは図4.1.2-1に示す岩手県および宮城県を流域とする大川の本・支流12地点である。採取した河川堆積物は室温で風乾し、2mm以下のふるいを通過した後に腐植物質の分析を行った。腐植物質の分析では、福島らの方法（図4.1.2-2(A)）によりフルボ酸、フミン酸分画を、Yuanらの方法（図4.1.2-2(B)）により腐植物質中の鉄を分析した。また、河川堆積物中に棲息する微生物群の鉄還元活性評価では、100mLバイアルに50mLのグルコース-アスパラギン培地（表4.1.2-1）を入れ、湿潤河川堆積物約0.5gを添加した。培養条件は窒素雰囲気（嫌気条件）および空気雰囲気（好気条件）の2種類行った。所定時間ごとに約2mLの培養液を採取し、チューブに入れ10000rpmの遠心分離を行った後の上澄み液中の鉄濃度およびpHを測定した。鉄イオン濃度の分析はフェロジン法で行った。

## (2) 環境微生物群に有用な炭素源の選定

微生物群は大川で採取した河川堆積物でもっとも鉄還元活性の大きかった松川1の堆積物を用いた。ガラス製100mLバイアル瓶にグルコース・アスパラギン培地（表4.1.2-1）からグルコース、アスパラギンおよび酵母エキスを除いた培地50mLと0.5gの河川堆積物および炭素源を1g入れ、窒素雰囲気で培養した。炭素源としてはグルコース、酵母エキス、アスパラギン、樹木腐植物質および腐植酸（試薬）を用いた。所定時間ごとに約2mLの培養液を採取し、チューブに入れ10000rpmの遠心分離を行った後の上澄み液中の鉄濃度およびpHを測定した。鉄イオン濃度の分析はフェロジン法で行った。
図 4.1.2-1 大川流域における河川堆積物採取地点

表4.1.2-1 グルコース・アスパラギン培地の組成

化学物質	量
K₂HPO₄	3g
KH₂PO₄	0.8g
KCl	0.2g
MgSO₄·7H₂O	0.2g
酵母エキス	0.5g
アスパラギン	5g
グルコース	20g
Fe₂O₃	1g
蒸留水	1 L
※ Yuan et al. Speciation of heavy metal in marine sediments from the east china sea by ICP-MS with sequential extraction, Environmental International 20, 769-783(2004).

図 4.1.2−2(B) 河川堆積物中の鉄溶出形態測定スキーム
## (3) 環境微生物、有機炭素および製鋼スラグとの相互作用に関する検討

微生物群は大川で採取した河川堆積物でもっとも鉄還元活性の大きかった松川1の堆積物を用いた。ガラス製100mLバイアル瓶に30mLのグルコース・アスパラギン培地（表4.1.2-1）から$\mathrm{Fe}_{2}\mathrm{O}_{3}$を除いた培地を入れ、鉄源としてスラグを1.5g添加した。腐植物質を添加する場合には樹木堆肥を1.5g添加し、窒素雰囲気25℃で静置培養した。所定時間ごとに約2mLの培養液を採取し、チューブに入れ10000rpmの遠心分離を行った後の上澄み液中の$\mathrm{Fe}^{2+}$濃度およびpHを測定した。第一鉄イオン濃度の分析はフェロジン法で行った。なお、海水環境を模擬した試験においては表4.1.2-1の蒸留水を人工海水に置き換えた培地を用いた。

## (4) 製鋼スラグおよび腐植物質との相互作用に関与する微生物群の検討

表 4.1.2-2 に示す試料 4 検体について PCR-DGGE 法による微生物相解析を行った。スラグ①、バーク②およびスラグバーク③については後述する屋外水槽試験で使用した試料であり、松川 1 については淡水環境において最も鉄還元活性の高かった試料である。

表 4.1.2-2 本試験に用いた試料

試料名
スラグ①
バーク②
スラグバーク③
松川1

図 4.1.2-3 に PCR－DGGE（変性剤グラジエントゲル電気泳動）法による微生物相解析のフローを示す。試料からの DNA 抽出では試料 0.5 g を UltraClean DNA Isolation kit (MoBio 社) を用いて、添付のプロトコールに従って行った。PCR 反応では表 4.1.2-2 に示したプライマーを用い、バクテリア（細菌）およびアーキア（古細菌）の 16S-rRNA 遺伝子を増幅した。また、それぞれの PCR 条件を表 4.1.2-3 および表 4.1.2-4 に示す。この過程において 1 回目の PCR は、抽出した DNA を鋳型として用いた。2 回目の PCR では、1 回目の PCR 産物を鋳型とし、DGGE ゲルを用いた電気泳動を行うため、GC クランプ付（GC に富む配列）プライマーを用いて行った。2 回目の PCR の後、アガロースゲル電気泳動にて PCR 産物の増幅を確認した。
図 4.1.2-3 PCR-DGGE 法による微生物相解析のフロー

表 4.1.2-2 PCR に用いたプライマーの配列

対象	プライマー	配列
バクテリア	27F	5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1525R	5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'
341FGC	5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'
534R	5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
アーキア	46F	5'-YTAAGCCATGCRAGT-3'
1492R	5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'
340FGC	5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGCGGGGGCACGGGGGCCCTACGGGTGCASCAG-3'
519R	5'-TTACCGCGGCKGCTG-3'
表 4.1.2-3 バクテリアのための PCR 条件

1 回目の PCR (Primer:27F, 1525R)
95℃	5min
95℃	1min
52℃	2min	30 cycles
72℃	2min
72℃	5min
10℃	∞
2 回目の PCR (Primer:341FGC, 534R)
95℃	5min
95℃	1min
55℃	30sec	30 cycles
72℃	30sec
72℃	5min
10℃	∞

表 4.1.2-4 アーキアのための PCR 条件

1 回目の PCR (Primer:46F, 1492R)
95℃	5min
95℃	1min
53.5℃	30sec	35cycles
72℃	1min
72℃	10min
10℃	∞
2 回目の PCR (Primer:340FGC, 519R)
95℃	1min
95℃	1min
65℃	30sec	35cycles
72℃	30sec
72℃	5min
10℃	∞
DGGE 解析では広範囲のバンドが得られるように、ゲル中の DNA 变性剤の濃度勾配を 30-70%（変性剤 100%とは、7M 尿素、40%ホルムアミドに相当）として DGGE 解析を行った（表 4.1.2-5）。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色を行い、脱染色後、UV トランスイルミネーター上でバンドを検出した。検出したバンドを滅菌されたメスで切り出した。切り出したゲルに、TE buffer(pH8.0)を加え、室温で一晩振とうさせた後、エタノール沈殿法により DNA の抽出・精製を行った。なお、分離能が低く、複数のバンドが混在している可能性のあるバンドについては、バンドが単一になるまで GC クランプ付 PCR および DGGE 解析を繰り返した。各バンドから抽出した DNA を鋳型として、シークエンス反応を行うため、GC クランプを外す PCR を行った。GC クランプを外す PCR の条件を表 4.1.2-6 に示す。

アガロースゲル電気泳動により、PCR産物を確認し、次いで、アガロースから目的バンドを切り出して、精製キット（MonoFas；ジーエルサイエンス社製）により、PCR産物を精製した。精製したPCR産物を鋳型として、ダイターミネーター法(Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit；ABI社製）によりシーケンシング反応を行った。シークエンス解析は、ABI Prism310 Genetic Analyzer（ABI社製）を用いた。解読した各バンドのDNAシークエンスを基に、インターネットを利用したFASTA検索によりEMBL（European Molecular Biology Laboratory: 欧州分子生物学研究所）のデータベースから微生物種の同定を行った。
表 4.1.2-5 DGGE ゲル濃度と泳動条件

ゲル作成のための試薬・泳動温度	濃度・条件
変性剤濃度勾配	30-70%
重合剤濃度（10% Ammonium Persulfate）	0.7%
TEMED	0.07%
泳動温度	60℃

表 4.1.2-6 GC クランプの除去に用いた PCR 反応条件

バクテリア (Primer:341F, 534R)
95℃	5min
95℃	1min
55℃	30sec	30 cycles
72℃	30sec
72℃	5min
4℃	∞
アーキア (Primer:340F, 519R)
95℃	1min
95℃	1min
65℃	30sec	30cycles
72℃	30sec
72℃	5min
4℃	∞
## 4 ．1．2．3 結果と考察

## (1) 環境中における腐植酸鉄形成と微生物群との相互作用に関する検討

表 4.1.2-7 および図 4.1.2-4 に採取した河川堆積物に対するフミン酸を構成する炭素、フルボ酸を構成する炭素および非腐植酸を構成する炭素の割合を示す。多くの河川堆積物で試料中の有機炭素割合は 0.1% 未満であったが、大川支流の松川上流部（松川 1,2）で試料中の有機炭素量が 1% 以上と多くなっていた。また、有機炭素の形態はほとんどの地点でフミン酸態の割合が多くなっていたが、金成沢川ではフルボ酸態の割合が他地点と比べて多くなっていた。

表 4.1.2–7 河川堆積物中の有機炭素の存在割合（単位%）

場所	フミン酸態	フル术酸態	非腐植酸態
松川1	1.1E+00	1.2E-01	2.3E-01
松川2	8.9E-01	8.5E-02	3.0E-01
松川3	3.6E-02	1.2E-03	1.7E-02
大川1	1.6E-02	8.3E-04	1.0E-02
大川4	3.6E-02	2.4E-03	1.4E-02
田茂木川1	4.5E-02	1.4E-03	1.6E-02
田茂木川2	1.3E-02	1.3E-03	6.8E-03
金成沢1	8.5E-03	2.4E-02	2.3E-02
金成沢2	3.6E-02	2.3E-02	3.5E-02
八瀬川1	5.4E-02	2.4E-02	3.4E-02
八瀬川2	2.0E-02	4.2E-03	2.9E-02
二十一川1	3.7E-01	4.4E-02	8.3E-02

図 4.1.2-4 河川堆積物中の有機炭素の存在割合
表 4.1.2-8 および図 4.1.2-5 は河川堆積物中の鉄の存在形態を示したものである。ほとんどの地点で試料中の鉄分は王水抽出態であり、腐植酸鉄は 1% 未満であった。一方、松川上流部では腐植酸鉄が約 0.2-0.3% と他の地点と比較して非常に多く含まれていた。この腐植酸鉄には比較的水溶性の高いフルボ酸鉄も含まれているため、これが溶出し周辺環境への鉄の物質循環に寄与している可能性が示唆された。

表 4.1.2-8 河川堆積物中の溶出鉄の存在割合（単位%）

場所	イオン交換態	酸化物態	腐植態	王水抽出態	合計
松川1	1.9E-03	7.6E-02	2.5E-01	1.5E+00	1.8E+00
松川2	4.2E-04	4.6E-02	3.8E-01	1.3E+00	1.7E+00
松川3	2.4E-04	2.8E-02	4.7E-03	1.8E+00	1.8E+00
大川1	4.1E-04	2.5E-02	3.1E-03	6.4E-01	6.7E-01
大川4	1.2E-03	2.7E-02	7.5E-03	9.2E-01	9.5E-01
田茂木川1	6.0E-05	1.2E-02	1.4E-03	1.5E+00	1.6E+00
田茂木川2	9.1E-05	1.5E-02	2.6E-03	8.4E-01	8.6E-01
金成沢川1	9.8E-06	1.4E-02	1.2E-02	3.3E+00	3.3E+00
金成沢川2	2.9E-05	2.4E-02	1.6E-02	3.6E+00	3.7E+00
八瀬川1	1.4E-06	2.3E-02	2.1E-02	4.3E+00	4.3E+00
八瀬川2	1.7E-04	3.2E-02	2.5E-02	4.0E+00	4.1E+00
二十一川1	5.7E-06	1.7E-02	3.8E-02	2.0E+00	2.0E+00

試料に対する溶出鉄の割合(河川堆積物)[%]

図 4.1.2-5 河川堆積物中の溶出鉄の存在形態
図 4.1.2-6 に河川堆積物中に棲息する微生物群による鉄還元試験（好気的条件）の結果を示す。試験開始 4 日後から松川 1 および松川 2 において、溶液中の鉄イオンが上昇していることがわかる。また、第一鉄イオン濃度と全鉄濃度にほとんど差異がないことから、溶液中の鉄の存在形態はほとんどが第一鉄イオン（Fe^{2+}）であると考えられた。この反応は河川堆積物中に棲息する鉄還元細菌により鉄源である酸化鉄（Fe_{2}O_{3}）が還元されたためである。一方、好気的な条件のため還元生成した Fe^{2+} は鉄還元細菌の活性が低下すると、溶液中に供給された酸素や鉄酸化細菌の働きにより酸化され酸化鉄として再沈殿する。これが溶液中に鉄が溶出しある程度時間がたつと減少する理由である。

図 4.1.2-7 に河川堆積物中に棲息する微生物群による鉄還元試験（嫌気的条件）の結果を示す。嫌気的条件ではどの地点においても鉄還元が認められた。特に松川1では他地点より3倍程度多くの酸化鉄（$\mathrm{Fe}_{2}\mathrm{O}_{3}$）が2価鉄に還元された。また、還元された$\mathrm{Fe}^{2+}$は溶液中に酸素がないため酸化されることなく安定して溶液中に存在していた。このように河川堆積物中の腐植酸鉄が多い地点において、そこに棲息する微生物群の鉄還元活性が高くなっており、腐植酸鉄の形成に棲息する微生物群が深く関与することが示唆された。
図 4.1.2–6 河川堆積物中に棲息する微生物群による鉄還元挙動（好気的条件）
図 4.1.2–7 河川堆積物中に棲息する微生物群による鉄還元挙動（嫌気的条件）
## (2) 環境微生物群に有用な炭素源の選定

これまで、自然環境中における腐植物質と微生物との作用について検討し、河川堆積物中の腐植酸鉄が多い地点において、そこに棲息する微生物群の鉄還元活性が高くなることが明らかになった。一方、一般環境中において製鋼スラグを用いて上述した反応を促進するためには微生物群に有効な炭素源の選定が重要となる。そこで、腐植物質などさまざまな炭素源を用いて微生物による製鋼スラグからの鐡溶出試験を行い、微生物群に有用な炭素源を検討した。

図 4.1.2-8 に炭素源を変えたときの微生物群による鉄溶出举動（Fe^{2+}）、図 4.1.2-9 に全鉄および図 4.1.2-10 にその場合の pH の変化を示す。なお図中の記号は以下の通りである。

炭素源	記号
微生物接種無し	微生物接種有り
無し	nn	ny
酵母エキス	Yn	Yy
グルコース	Gn	Gy
アスパラギン	An	Ay
樹木腐植物質	Bn	By
腐植酸(試薬)	Hn	Hy

図 4.1.2-8、図 4.1.2-9 より鉄の溶出挙動は炭素源により異なるといえる。酵母エキスやアスパラギンを利用した場合には鉄の溶出はほとんど促進されなかった。もっとも溶出量が大きい炭素源は腐植酸（試薬）を利用した場合であったが、微生物を接種しない場合でもある程度溶出が進行し、その約70％が $ Fe^{2+} $ であることから、比較的溶出しやすい $ Fe^{2+} $ が腐植酸自体に含まれているものと考えられた。

グルコースを炭素源とした場合では実験開始後 pH の低下が認められた。これは微生物を接種した場合のみ確認されることから、微生物群によるグルコースの消費により、乳酸や酢酸などの有機酸が形成されたためと考えられた。また、全鉄イオン濃度は約100時間後には腐植酸を用いた場合の濃度よりも大きくなった。しかし、その約50%以上は $ Fe^{3+} $ であり、微生物群による鉄還元反応が促進されるというよりは、pH の低下により $ Fe_{2}O_{3} $ 中の $ Fe^{3+} $ の溶出が促進されたものと考えられた。250時間後以降経過すると全鉄イオンは減少していくが、これは $ Fe^{3+} $ が再沈殿したものと考えられる。最終的には全鉄イオンのほとんどが $ Fe^{2+} $ となっており、微生物群による鉄還元反応にグルコースは有用であると考えられた。

樹木腐植物質を用いた場合には、その速度は遅いものの鉄の溶出が促進された。また、それ自体に鉄が多く含まれておらず、 $ Fe^{2+} $ への還元反応も進行していることから微生物群による鉄還元反応に有用であると考えられた。また、この腐植物質は廃材を利用しており資材の有効利用という観点からも、本腐植物質を利用する意義は大きいものといえる。
図 4.1.2-8 炭素源を変化させた場合における微生物群による鉄溶出举動 $ \left(\mathrm{Fe}^{2+}\right) $
図 4.1.2-9 炭素源を変化させた場合における微生物群による鉄溶出举動（全鉄）
図 4.1.2-10 炭素源を変化させた場合における微生物群による鉄溶出举動に伴う pH 変化
## (3) 環境微生物、有機炭素および製鋼スラグとの相互作用に関する検討

これまで環境中の腐植酸鉄と鉄還元細菌との作用および環境中への鉄の供給に有用な炭素源について検討してきた。一方、鉄源として製鋼スラグを供与した場合、製鋼スラグから溶出する有害元素等により微生物群による鉄溶出反応が阻害される可能性がある。そこで、様々な種類と性状の製鋼スラグを用いて環境微生物を用いた溶出試験を行った。製鋼スラグについては転炉スラグとそれを炭酸化処理した炭酸スラグの2種類を用いた。また、使用した腐植物質は樹木腐植物質である。

転炉スラグを用いた場合は溶液中の pH が約 13 まで上昇し、微生物による鉄の溶出が阻害された。一方、製鋼スラグを炭酸化処理したものを用いた場合では、溶液の pH が 8 前後と安定し、鉄還元細菌による第一鉄イオンの溶出促進が認められた。図 4.1.2-11 に微生物群による炭酸化スラグからの鉄溶出挙動を示す。なお図中の記号は以下の通りである。

記号	腐植物質添加	微生物接種
HnBn	無	無
HyBn	有	無
HnBy	無	有
HyBy	有	有

本図より、微生物を接種した系ではどちらも鉄の溶出が促進されていることがわかる。また腐植物質を添加した系では、添加しない場合よりも約3倍溶出が促進された。

図 4.1.2-12 に全鉄に対する $ Fe^{2+} $ の割合を示すが、腐植物質を添加した場合では、溶液中の鉄の約 80% 以上が $ Fe^{2+} $ と高濃度で 2 価鉄を維持することが可能であった。一方、腐植物質がない場合、実験開始から 120 時間程度までは高い割合で $ Fe^{2+} $ が存在するものの、それ以降は $ Fe^{3+} $ の割合が上昇してきた。これは、実験開始直後は微生物による鉄還元活性が高く、培養液中の鉄還元細菌に有用な炭素源を全て消費し、活性が低下すると鉄酸化細菌や自然酸化が進行したためと考えられる。一方、腐植物質が存在する場合、長期間鉄還元細菌に有用な炭素源が少しずつ供給されるため、高い鉄還元活性を維持できるものと推定された。

図 4.1.2-13 は本実験における pH 変化を示す。微生物を接種した 2 系統については、どちらも溶液中に有機酸が放出されたため pH が低下している。腐植物質を添加しない場合では鉄還元活性が低下したあたりから pH の再上昇が認められた。これは有機酸を形成する微生物の活性が低下し、製鋼スラグからアルカリ成分の溶出が加速されたためと考えられる。一方、腐植物質が存在する場合には、pH が 5 前後と弱酸性を維持していることから、有機酸形成と鉄還元反応を長期間継続できるものと推定された。以上の結果から鉄還元細菌などの環境微生物に適切な製鋼スラグと腐植物質を供与することにより、環境中への鉄溶出がさらに促進され、生態系修復に大きく寄与する可能性が示唆された。
図 4.1.2-11 微生物群による炭酸化スラグからの鉄溶出挙動（上： $ Fe^{2+} $ 、下：全鉄）
図-4.1.2-12 微生物群による炭酸化スラグからの鉄溶出举動、全鉄に対する $ Fe^{2+} $ の割合変化

図 4.1.2-13 微生物群による炭酸化スラグからの鉄溶出举動、pH 変化
図 4.1.2-14 に微生物群による炭酸化スラグからの二価鉄溶出に及ぼす腐植物質および海水の影響を示す。摂取した微生物群は昨年度の成果により最も鉄還元活性の大きかった松川1の微生物群である。微生物群を供与することいよりスラグからの二価鉄溶出が促進された。一方、図では示していないが微生物群を摂取しない場合ではスラグからの鉄の溶出がごく微量であり、この二価鉄の溶出は微生物による活動によるであるといえる。淡水と海水の系とを比較すると溶出速度は淡水の方が速いものの、全溶出量は海水の方が多くなった。これは、本試験で用いた微生物群は淡水から採取したものであり、海水に順応するのに時間を要したためと考えられる。また、海水の場合で全溶出量が多くなったのは、海水によりスラグ中の金属が腐食し、溶出しやすくなったためと推測される。さらに腐植物質の有無による溶出举動について比較すると、腐植物質を供与した場合では淡水、海水とも全溶出量が供与しない場合の2-3倍多くなった。図4.1.2-15に全鉄に対する二価鉄の割合を示すが、腐植物質を添加した場合では、溶液中の鉄の約80%以上が二価鉄と高濃度で維持することが可能であった。一方、腐植物質がない場合、実験開始からある程度の時間までは高い割合で二価鉄が存在するものの、それ以降は三価鉄の割合が上昇してきた。これは、実験開始直後は微生物による鉄還元活性が高く、培養液中の鉄還元細菌に有用な炭素源を全て消費し、活性が低下してくると鉄酸化細菌や自然酸化が進行したためと考えられる。一方、腐植物質が存在する場合、長期間鉄還元細菌に有用な炭素源が少しずつ供給されるため、高い鉄還元活性を維持できるものと推定された。
図 4.1.2-14 微生物群による炭酸化スラグからの鉄溶出举動に及ぼす腐植物質および海水の影響（二価鉄）

図 4.1.2-15 微生物群による炭酸化スラグからの鉄溶出举動に及ぼす腐植物質および海水の影響（全鉄に対する二価鉄の割合）
## (4) 製鋼スラグおよび腐植物質との相互作用に関与する微生物群の検討

微生物は、腐植物質を電子受容体や電子供与体として利用する。また、図4.1.2-16に示すようにエレクトロンシャトリング（電子往復）によって不溶性Fe(III)鉱物の還元を仲介することが知られており、その際に、腐植物質は電子のメディエターとして利用される。これらの腐植物質を利用する微生物を表4.1.2-9にまとめ、DGGE解析結果の解釈に用いた。

図 4.1.2-16 エレクトロンシャトリングの模式図
表 4.1.2-9 腐植物質を利用する微生物

分類	腐植物質の利用方法	その他の微生物学的特徴	種名	備考
腐植物質還元菌	電子受容体	金属還元菌	Geobacter metallireducens	Geobacteraceae 科に属する	腐植物質酸化も行うことが可能
Desulfitobacterium metallreducens	Geobacteraceae 科に属する	腐植物質酸化も行うことが可能
Desulfitobacterium 属菌	Geobacteraceae 科に属する	腐植物質酸化も行うことが可能
Shewanella alga	腐植物質酸化も行うことが可能
Wolinella succinogenes	腐植物質酸化も行うことが可能
Geothrix fermentans	腐植物質酸化も行うことが可能
脱ハロゲン微生物	Desulfitobacterium dehalogenans	Geobacteraceae 科に属する
硫酸還元菌	Desulfovibrio 属菌
メタン生成菌	Methanospirillum hungatei
発酵菌	Propionibacterium freudenreichii
Lactococcus lactis
Enterococcus cecorum
トルエン分解菌	種名不明
塩化ビニルおよびジクロロエタン分解菌	種名不明
超高熱菌	Thermotoga maritima
Corynebacterium humireducens	フミン酸還元菌
Pyrobaculum islandicum	アーキア
Pyrodictium abyssi	アーキア
次ページに続く
Pyrococcus furiosus	アーキア
Archaeoglobus fulgidus	アーキア
Thermococcus celer	アーキア
超高熱菌 メタン生成菌	Methanopyrus kandleri アーキア
高熱菌 メタン生成菌	Methanococcus thermolithitrophicus Methanobacterium thermoautotrophicum
腐植物質酸化菌	電子供与体	脱窒菌	Pseudomonas 属菌
脱窒菌 鉄還元菌	Paracoccus denitrificans
過塩素酸還元菌	Dechloromonas 属菌
その他	Azoarcus 属菌 Myxobacteria
腐植物質還元菌	エレクトロンシャトリング	鉄還元菌	Geobacteraceae 科細菌
超高熱菌	Pyrobaculum islandicum アーキア
バクテリアおよびアーキアの DGGE のバンドパターンと塩基配列を解読したバンドを図4.1.2-17に示す。なお、青字で記載したバンドについては、腐植物質に関連のある微生物であることを示している。また、相同性解析結果を表4.1.2-10および表4.1.2-11に示す。

模擬水槽にスラグ単体を投与した場合では、1〜9の9バンドの塩基配列を解読したが、腐植物質に関連のある微生物種は検出されなかった。

バーク単体を投与した場合では、10～17の8バンドについて塩基配列を解読することができ、バンド11、12および17の3バンドが腐植物質と関連のある微生物種と考えられた。バンド11は金属還元菌Shewanella putrefaciensに近縁な微生物（相同性95.4%）であり、同属他種のShewanella algaは腐植物質を還元することが報告されている。そのため、バンド11は腐植物質に関連のある微生物と考えられた。バンド12は硫酸還元菌Desulfocapsa sp.に近縁な微生物（相同性95.5%）であった。近縁の硫酸還元菌Desulfovibrio属菌が腐植物質を還元することが報告されていることから、バンド12は腐植物質に関連のある微生物と考えられた。バンド17は硫酸還元菌Desulfobacterium aniliniに近縁な微生物（相同性93.6%）であった。バンド12と同様に、近縁の硫酸還元菌Desulfovibrio属菌が腐植物質を還元することが報告されていることから、バンド17は腐植物質に関連のある微生物と考えられた。

スラグおよびバークを投与した場合では、18～26の9バンドについて塩基配列を解読することができ、バンド25が腐植物質と関連のある微生物種であると考えられた。バンド25に最も近縁な微生物種はFusibacter sp.（相同性95.4%）であったが、その次に近縁な微生物種は硫酸還元菌Desulfobacterium aniliniに近縁な微生物（相同性93.6%）であった。バンド12およびバンド17と同様に近縁の硫酸還元菌Desulfovibrio属菌が腐植物質を還元することが報告されていることから、バンド25は腐植物質に関連のある微生物である可能性が考えられた。

松川では、バンド27～31の5バンドについて塩基配列を解読することができ、バンド27、29、30の3バンドが腐植物質と関連のある微生物種であると考えられた。バンド27はPseudomonas aeruginosa、P. stutzeriおよびP.otitidisと相同性が100%であることから、Pseudomonas属菌であると考えられた。Pseudomonas属菌には、腐植物質を酸化する種が存在することが報告されていることから、バンド27は腐植物質に関連のある微生物と考えられた。バンド29はAzoarcus sp.に近縁な微生物（相同性91%）であった。Azoarcus属菌には、腐植物質を酸化する種が存在することが報告されていることから、バンド29は腐植物質に関連のある微生物と考えられた。バンド30に最も近縁な微生物種はAlcaligenaceae科細菌（相同性91.6%）であったが、その次に近縁な微生物種はトルエン分解菌であるGeorgfuchsiatoluolica（相同性90.1%）であった。トルエン分解菌の中には、腐植物質を還元する種が存在することが報告されている。また、GtoluolicaはFe（III）を電子受容体とし
て利用し、鉄還元能を有する。腐植物質を還元する微生物には、鉄還元菌が含まれている。これらのことから、バンド30は腐植物質に関連のある微生物である可能性が考えられた。

一方、アーキアでは A1～A5 の 5 バンドについて塩基配列を解読した。その結果、腐植物質に関連するアーキアは検出されなかった。A2 は相同性が 89.3%と低かったが、メタン生成菌 Methanolobus oregonensis に近縁な微生物と推定された。腐植物質を利用するメタン生成菌に関しては、Methanococcus 属菌、Methanobacterium 属菌、Methanopyrus 属菌および Methanospirillum 属菌の報告例がある。これらのメタン生成菌は水素と二酸化炭素を利用してメタン生成を行う（Methanospirillum 属菌はギ酸や酢酸も利用し、メタン生成を行うことが可能である）。一方、A2 の近縁メタン生成菌である Methanolobus 属菌は、メタノールやメチルアミンを利用してメタン生成を行う。Methanococcus 属菌、Methanobacterium 属菌、Methanopyrus 属菌および Methanospirillum 属菌と Methanolobus 属菌は、同じメタン生成菌であるが資化性が大きく異なることから、微生物的な特徴が異なるものと推察される。そのため、A2 は腐植物質に関連のある微生物である可能性は低いものと考えられた。

以上の結果より、模擬水槽中に腐植物質であるバーク堆肥あるいは製鋼スラグとの混合体を設置した場合では、腐植物質を利用する微生物が存在しており、これらの微生物群がエレクトロンシャトリングによって製鋼スラグ中に存在する不溶性 Fe(III)の還元を仲介す可能性が示唆された。また、松川1についても同様の微生物群が存在する他、鉄還元細菌が存在しておりそれらの微生物群の働きにより二価鉄への還元速度が促進されるものと推測された。
図 4.1.2-17 バクテリアおよびアーキアの DGGE 画像
表4.1.2-10 バクテリアの相同性解析結果

Band No.	Access No.	Source	Identity (%)	Overlap (nt)	分離源	腐植物質との関連	引用文献
1	L40809	Thiomicrospira pelophila 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gene	99.2	131	深海熱水噴出孔	関連性は確認できず	Muyzer et al.(1995)
AF016046	Thiomicrospira thyasirae 16S ribosomal RNA gene	99.2	131	記載なし	関連性は確認できず	Brinkhoff and Muyzer (1997)
AF013976	Thiomicrospira sp. JB-A1F 16S ribosomal RNA gene, partial sequence	99.2	131	干渦	関連性は確認できず	Brinkhoff and Muyzer (1997)
2	JQ083334	Vibrio cyclitrophicus strain WA54 16S ribosomal RNA gene, partial sequence	98.5	131	アワビの腸管	関連性は確認できず	EMBL データベース
JN128262	Vibrio kanaloae strain HNS028 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.	98.5	131	カイメン	関連性は確認できず	EMBL データベース
AJ515224	Vibrio splendidus partial 16S rRNA gene, strain PMV18	98.5	131	イタヤガイ	関連性は確認できず	Le Roux et al. (2004)
3	AY387858	Pseudoalteromonas aliena 16S ribosomal RNA gene	99.2	131	海水	関連性は確認できず	Ivanova et al. (2004)
EU864261	Pseudoalteromonas sp. p31 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.	99.2	131	玄武岩 (深度2253m)	関連性は確認できず	EMBL データベース
AF200216	Psychrophilic marine bacterium PS39 16S ribosomal RNA gene	99.2	131	海水	関連性は確認できず	EMBL データベース
Band No.	Access No.	Source	Identity (%)	Overlap (nt)	分離源	腐植物質との関連	引用文献
4	EU091332	Vibrio splendidus isolate PB1-10rrnH 16S ribosomal RNA gene	100	131	アメリカ産ヒラメ (Atlantic halibut) の稚魚	関連性は確認できず	Jensen et al. (2009)
HE584774	Vibrio tasmaniensis 16S rRNA gene, isolate AP16	100	131	フクトコブシ	関連性は確認できず	EMBL データベース
DQ923441	Vibrio sp. W-7 16S ribosomal RNA gene	100	131	Qingdao Fushan 湾の海洋性細菌に関連	関連性は確認できず	EMBL データベース
5	EU839359	Roseobacter sp. Bo10-20 16S ribosomal RNA gene	100	106	糸状性の海洋細菌に関連	関連性は確認できず	Hube et al. (2009)
HQ852039	Roseovarius sp. MA1-10 16S ribosomal RNA gene	100	106	ホヤに関連のある細菌	関連性は確認できず	EMBL データベース
FJ869041	Rhodobacterales bacterium CB1005 16S ribosomal RNA gene	100	106	チェサピーク湾深度13mの海水	関連性は確認できず	EMBL データベース
6	AB518880	Litoreibacter janthus gene for 16S ribosomal RNA,	100	106	沿岸海洋環境	関連性は確認できず	Romanenko et al. (2011)
AB518881	Litoreibacter albidus gene for 16S ribosomal RNA	100	106	沿岸海洋環境	関連性は確認できず	Romanenko et al. (2011)
DQ167247	Octadecabacter orientus strain KOPRI 13313 16S ribosomal RNA gene	100	106	海洋由来の成熟したバイオフィルム	関連性は確認できず	EMBL データベース
7	AY654818	Mucus bacterium 80 16S ribosomal RNA	100	106	地中海産の被覆状のサ	関連性は確認できず	EMBL データベース
Band No.	Access No.	Source	Identity (%)	Overlap (nt)	分離源	腐植物質との関連	引用文献
gene	ンゴの1種
AB518881	Litoreibacter janthinus gene for 16S ribosomal RNA	99.1	106	沿岸海洋環境	関連性は確認できず	Romanenko et al. (2011)
AB518881	Litoreibacter albidus gene for 16S ribosomal RNA	99.1	106	沿岸海洋環境	関連性は確認できず	Romanenko et al. (2011)
8	AB302385	Alpha proteobacterium B27 gene for 16S rRNA	97.2	106	海水	関連性は確認できず	Harwati et al. (2007)
DQ640643	Wenxinia marina strain HY34 16S ribosomal RNA gene	96.2	106	油田堆積物	関連性は確認できず	Ying et al. (2007)
EU346606	Marine sponge bacterium PLATEactino+(2)-11 16S ribosomal RNA gene	96.2	106	カイメン	関連性は確認できず	Sipkema et al. (2011)
9	EU817498	Alishewanella jeotgali strain MS1 16S ribosomal RNA gene,	93.1	131	韓国伝統的発酵食品	関連性は確認できず	Kim et al. (2009)
FJ595485	Alteromonas sp. H17 16S ribosomal RNA gene	93.1	131	関連性は確認できず	EMBL データベース
HQ439519	Algicola bacteriolytica strain MR32e 16S ribosomal RNA gene	93.1	131	ハワイカネオへ湾の岩礁表面のバイオフィルム	関連性は確認できず	EMBL データベース
10	AY167327	Bacteroidetes bacterium ANT9285 16S ribosomal RNA gene	85.8	127	ウェッディル海の南極の叢水	関連性は確認できず	Brinkmeyer et al. (2003)
Band No.	Access No.	Source	Identity (%)	Overlap (nt)	分離源	腐植物質との関連	引用文献
FN997637	Bacteroidetes bacterium TRS1-A1 partial 16S rRNA gene, strain TRS1-A1	85.2	128	イギリス北東部の河口堆積物	関連性は確認できず	Zhang et al. (2012)
AJ786088	Cytophaga sp. N05VI partial 16S rRNA gene, isolate N05VI	85	127	干潟表面堆積物	関連性は確認できず	Koepke et al. (2005)
11	CP000681	Shewanella putrefaciens CN-32	95.4	65	近縁種のShewanella algaは腐植物質を還元する	EMBL データベース
CP002767	Shewanella baltica BA175	95.4	65	バルト海由来微生物に関連	関連性は確認できず	Caro-Quintero et al. (2012)
CP001616	Tolumonas auensis DSM 9187	95.4	65	スイス淡水湖堆積物	関連性は確認できず	EMBL データベース
12	AJ511275	Desulfocapsa sp. Cad626 partial 16S rRNA gene	95.5	132	スイスCadagno湖の化学的変水層	近縁種のDesulfovibrio属菌は腐植物質を還元する	Peduzzi et al. (2003)
HE600778	Desulfobulbaceae bacterium PR3_F05 partial 16S rRNA gene,	93.9	132	フランスアドゥール川河口堆積物	EMBL データベース
AJ237602	Desulfobacterium catecholicum 16S rRNA gene, partial, strain DSM 3882	93.2	132	ニュージーランドデラウェア湾	EMBL データベース
13	AY918928	Prolixibacter bellariivorans strain F2 16S ribosomal RNA gene	85.4	123	海底に堆積した燃料電池	関連性は確認できず	Holmes et al. (2007)
EU252507	Sphingomonas sp. AM19 16S ribosomal RNA gene	85.4	123	東シナ海由来の光合成細菌に関連	関連性は確認できず	EMBL データベース
Band No.	Access No.	Source	Identity (%)	Overlap (nt)	分離源	腐植物質との関連	引用文献
AF121885	Bacterium Phenol-4 16S ribosomal RNA gene	85.4	123	フェノール分解コンソーシアム	関連性は確認できず	Knight et al. (1999)
14	AJ229236	Bacteria from anoxic bulk soil 16S rRNA gene (strain PB90-2)	89.4	123	冠水した嫌気的な水田土壤	関連性は確認できず	Chin et al. (1999)
CP002455	Weeksella virosa DSM 16922	89.4	123	人の尿	関連性は確認できず	EMBL データベース
U87101	Ornithobacterium rhinotracheale 16S ribosomal RNA gene	89.3	122	鳥類の気道	関連性は確認できず	Vandamme et al. (1994)
15	FR872932	Clostridium sp. AN-AS6C partial 16S rRNA gene, strain AN-AS6C	99	105	ギリシャ地中海に面したAtalante流域(嫌気的な高塩流域)の堆積物	関連性は確認できず	EMBL データベース
FR872934	Clostridium sp. AN-AS8 partial 16S rRNA gene, strain AN-AS8	98.1	105	ギリシャ地中海に面したAtalante流域(嫌気的な高塩流域)の堆積物	関連性は確認できず	EMBL データベース
AJ786046	Bacterium G100VIII partial 16S rRNA gene	98.1	105	干渓深部堆積物	関連性は確認できず	Koepke et al. (2005)
16	AB377124	Coralibacter albidoflavus gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: 04OKA-3-121	88.2	127	不動サンゴ	関連性は確認できず	EMBL データベース
EF040559	Marine bacterium CS-47 16S ribosomal RNA gene	88.2	127	カイメン	関連性は確認できず	EMBL データベース
Band No.	Access No.	Source	Identity (%)	Overlap (nt)	分離源	腐植物質との関連	引用文献
AY654756	Mucus bacterium 113 16S ribosomal RNA	87.4	127	サンゴ虫 (Oculina patagonica) の粘液	関連性は確認できず	EMBL データベース
17	AB237495	Desulfobacterium anilini gene for 16S rRNA	93.6	109	ペンタクロロフェノールを脱塩素するマイクロコズムの堆積物	近縁種の Desulfovibrio 属菌は腐植物質を還元する	EMBL データベース
FR851323	Fusibacter sp. BELH1 partial 16S rRNA gene	93.6	109	嫌気的リアクターのスラッジ	関連性は確認できず	EMBL データベース
AF491333	Fusibacter sp. SA1 16S ribosomal RNA gene	92.7	109	南アフリカ金鉱山	関連性は確認できず	EMBL データベース
18	AF013972	Thiomicrospira sp. JB-B2 16S ribosomal RNA gene	97	132	ドイツの干渦	関連性は確認できず	Brinkhoff and Muyzer (1997)
AF069959	Thiomicrospira crunogena 16S ribosomal RNA gene	96.2	132	北大西洋中央海嶺の熱水噴出孔	関連性は確認できず	Wirsen et al. (1998)
AF064544	Thiomicrospira sp. L-12 16S ribosomal RNA gene	96.2	132	ガラパゴスリフトの熱水噴出孔 (深度2550m)	関連性は確認できず	Ahmad et al. (1999)
19	AB470958	Clostridiales bacterium r41 gene for 16S rRNA	97.2	107	沖縄のコモンサンゴ属	関連性は確認できず	EMBL データベース
EF117250	Firmicutes symbiont of Osedax sp. 16S ribosomal RNA gene	94.5	109	環形動物 (Osedax sp.) の共生菌	関連性は確認できず	Goffredi et al. (2007)
AJ786047	Bacterium N5IX partial 16S rRNA	91.7	108	ドイツ北海の干渦堆積	関連性は確認できず	Koepke et al. (2005)
Band No.	Access No.	Source	Identity (%)	Overlap (nt)	分離源	腐植物質との関連	引用文献
gene, isolate N5IX	物
20	DQ788794	Colwellia sp. SLW0516S ribosomal RNA gene	94.5	128	南極海の海水の細菌に関連	関連性は確認できず	Raymond et al. (2007)
FJ889567	Colwellia sp. K3B-616S ribosomal RNA gene	94.5	128	北極海海水から分離した細菌に関連	関連性は確認できず	EMBL データベース
AF388391	Vibrio sp. 3d clone 3d2 16S ribosomal RNA gene	94.5	128	記載なし	関連性は確認できず	EMBL データベース
21	AY387858	Pseudoalteromonas aliena 16S ribosomal RNA gene	99.2	131	海水	関連性は確認できず	Ivanova et al. (2004)
FN377707	Pseudoalteromonas sp. M12-4 partial 16S rRNA gene	99.2	131	粘土のように粘着性のある堆積物	関連性は確認できず	Srinivas et al. (2009)
AF200216	Psychrophilic marine bacterium PS39 16S ribosomal RNA gene	99.2	131	海水生息細菌に関連	関連性は確認できず	EMBL データベース
22	AB362265	Rikenellaceae bacterium JAM-BA0501 gene for 16S rRNA,	100	123	下北半島の堆積物コア	関連性は確認できず	Kobayashi et al. (2008)
GU112991	Rikenellaceae bacterium 4-1-11 16S ribosomal RNA gene	97.6	123	泥火山土壤	関連性は確認できず	EMBL データベース
GQ863485	Bacteroidales bacterium APP1 16S ribosomal RNA gene	94.3	123	アルカリ性湖生息細菌に関連	関連性は確認できず	EMBL データベース