Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## (2) -2 HA の抽出・精製法

施肥ユニットは、北海道オーシャングリーン開発(株)が任意期間(2、4、6ヶ月)毎に、各水槽から1個ずつ回収した。回収したユニットは研究室に送られ実験室内で冷凍保存(-35℃)した。これらの試料を凍結乾燥機(EYELAFDU-1200型、東京理化)にて完全脱水し、2 mm フルイを通過させ、乾燥土壌試料を得た。

300 mL ポリエチレン三角フラスコに乾燥試料 10 g を秤量し、超純水約 50 g および 1M NaOH 5 mL を加えた後、超純水で 100 g に定容した。よって、本実験における HS は 0.05M NaOH 溶液で抽出されたこととなる。窒素雰囲気下で旋回型振盪機(MMS-51 型、東京理化)に設置し、24 時間振盪した(160 rpm、室温、暗所)。24 時間後、マイクロ冷却遠心機(3740 型、KUBOTA)で遠心分離(1000 0rpm、15 min、5℃)し、その上澄み液を定量分析濾紙(5A、ADVANTEC)により吸引濾過した。この濾液は HS と non-HS を含む溶液である。次に、HS から HA と (FA + non-HS)を分離する作業を行なった。濾液(HS + non-HS)に濾塩酸を加えて pH 調整(pH<1)した後、24 時間攪拌した(室温、暗所)。24 時間後、スラリーを遠心分離(10000 rpm、15 min、5℃)し、上澄み液をガラスフィルター(0.5 μm、ADVANTEC)により吸引濾過した。遠心分離による沈殿物は HA であり、濾液は FA と non-HS を含んだ溶液である。次に HA の精製を行った。沈殿した HA を超純水により回収した後、鉱物類を脱塩するためにフッ化水素酸(6%、v/v)および濃塩酸(4%、v/v)を加え、24 時間攪拌した(室温、暗所)。24 時間後、遠心分離(10000 rpm、15 min、5℃)により再び沈殿物として HA を分離した。沈殿した HA を超純水により回収し、透析膜(nominal molecular weight cut-off 1000 Da、SpectraPore)に入れ、蒸留水入りの 3 L ビーカに吊るした。ビーカ内の蒸留水の導電率は毎日測定し、蒸留水を新しく交換した。ビーカ内の蒸留水の導電率(約 1.2 μS)が変化しなくなった時(約 6 日後)、超純水に切り替えた。透析は超純水の導電率(約 0.8 μS)が変化しなくなった時終了した。透析終了後、凍結乾燥機にて凍結乾燥させ、HA 粉末試料を得た。HA 粉末試料は試料の代表性による誤差を低減するため、瑪瑙乳鉢を用いて粉砕・混合した。HA 粉末試料は、室温・暗室のもと保存した。

一方、乾燥土壌試料(約10 g)に含まれるHA量(以下、収量)を測定した。収量を測定することで、HAの分解過程を半定量的に観察することができるとされる。本研究では、HAを凍結乾燥する前に透析膜の中身を移す容器の空重量を秤量・記録し、凍結乾燥後HA入りの容器を秤量した。凍結乾燥前後の重量を差し引きすることで、HAの収量を測定した。
## (2) -3 HA の分析

元素組成および分子量は、4.2.1 節の方法に従い分析した。

熱分解ガスクロマトグラフィー/質量分析(Pyrolysis Gas Chromatography Mass Spectrometry, py-GC/MS)は、有機分子に関する詳細な構造情報を得る上で有用であることが知られている。この方法は、有機化合物を構成する各種構造部位を熱分解によって断片化し、ガスクロマトグラフィーで分離して、質量分析で検出・同定する方法である。しかしながら、HAはフェノール水酸基やカルボン酸などの揮発性が乏しい極性化合物を多く含むため、それらを検出するのが難しい。この問題を克服するため、熱分解により生成した極性構造断片を揮発性のあるメチル化合物に変換する目的でオンラインメチル化剤である水酸化テトラメチルアンモニウム(Tetramethylammonium Hydroxide、TMAH)が使用される。メチル化誘導剤のさらなる利点は、HAポリマーを形成するエーテル結合やエステル結合をオンラインで熱加水分解後GC/MSへ導入することであり、検出された構造断片から元の構造を推定することができる。特に、HAの腐植化・堆肥化などの続成変化を追跡するのに有用である。よって、本研究ではTMAH-Py-GC/MSの分析手法を用いた。

TMAH 溶液は、TMHA 粉末 400 mg を 10 mL メスフラスコを用いてメタノール(ダイオキシン分析用試薬、ナカライ)で定容した。内部標準液のノナデカン酸溶液は、ノナデカン酸粉末 3 mg を 50 mL メスフラスコを用いて、アセトン/メタノール混合溶液(30/20、v/v)で定容した。HA 約 0.5 mg を試料カップ(50 μL)に秤量し、TMAH 溶液 25 μL とノナデカン酸溶液 10 μL をマイクロピペットで加え、デシゲータ内で 1 時間減圧乾燥させた。測定は、熱分解装置(PY-2020D 型、FRONTIER LAB)と GC/MS システム(GCMS-QP5050A 型、島津製作所)の複合機により測定した。

GC/MS の測定条件は、注入口温度：280℃、検出器温度：280℃、カラム：QUADREX 100% methyl siloxane capillary column 0.25 mm φ 25 m、膜厚 0.25 μm)、温度勾配：50℃ (1 min) → 5(℃ min⁻¹) → 300℃ (5 min)、測定時間：55 min、キャリアガス：高純度へリウムガス、である。熱分解装置の測定条件は、測定モード：シングルショットモード、熱分解温度：550℃、熱分解時間：0.4 min、である。測定後は、質量スペクトルデータベース(National Institute of Standard and Technology、NIST)を用いて質量分析によるピークの帰属を行なった。
## (3) 研究の成果

## (3) -1 HA の収量変化

各ユニットから抽出された HA の収量の変化を図 4.2.4-2 に示す。0 ヶ月から 2 ヶ月の期間に各ユニット中の HA 収量は著しく低下した。この結果は、ユニットを弱アルカリ性 (pH8.1) および移動性が高いといった性質を持つ海水環境に投入したため、ユニット中の堆肥由来の HA など腐植成分が早く溶出および溶脱したと考えられる。また、海水に投与したことで HA が加水分解を受けたため、HA の収量が低下したとも推察できる。

また、0～2 ヶ月間でスラグ入りユニット(C1/S1、C3/S1)とスラグ無しユニット(C1/S0)のHA 収量を比較すると、スラグ入りユニットは8倍程収量が低いことがわかった。さらに、C1/S1およびC3/S1の場合は収量低下が2ヶ月目で終了しているのに対して、C1/S0の場合は収量の低下が4ヶ月目まで続いていた。海水(pH8.3)に堆肥および混合物(スラグ+堆肥)を入れた時、その溶出水のpHはそれぞれ約7.5、8.5-9.0になることが報告されている。よって、投入初期はスラグ入りユニットの内部はスラグ無しユニットと比較してpHが高いためHAの溶出が促進しやすい環境にあり、HAの収量が低下したと推察できる。つまり、投入初期期間(0-2ヶ月)では、海水の影響によりユニット内の堆肥由来HAは溶出・溶脱され、さらにスラグが混入することで溶出が促進されると考えられる。

一方、2~6 ヶ月間では各ユニットともに収量の増加が観察された。特に、4 ヶ月目では C1/S1 および C3/S1 は C1/S0 と比較して収量が増加した。一般的に腐植化が進行すると HA の収量は減少する傾向を示すが、HA の腐植化が初期段階であるならば動植物遺骸等の化合物の縮重合により収量は増加すると考えられる。よって、ユニット内では新しい HA の生成が進行し、さらにスラグが混入していることで早期に HA の生成が生じることが示唆された。しかし、現段階では HA の腐植化に起因する成分が堆肥由来や水生微生物由来であるかはわからない。以上のことから、投入初期期間(0-2 ヶ月間)では HA 収量の著しい低下から、ユニット中の堆肥由来 HA が海水による溶出・溶脱が進行し、さらにスラグが混入することで溶出が促進されることが考えられた。溶出後は、各ユニットで HA の収量増加が観察できたことから、ユニット内で HA の生成が進行していると示唆された。
図 4.2.4-1 各ユニットに於ける HA の収量変化

## (3) -2 HA の元素組成変化

各ユニットから抽出された HA の有機元素組成を表 4.2.4-2 に示す。また、元素組成は重量%よりもモル比として表現し比較したほうが、顕著に差が現れることが多いとされる。モル比は、例えば、H/C モル比を算出する際には(%H/1.01) / (%C/12.01)で算出される。しかしながら、これらのモル比は一種のサポートデータであるため、モル比のみで HA の構造の変化や違いを表す指標とはならないことに注意する。
表4.2.4-2 各 HA 試料の元素組成

HA samples	Fertilization period (month)	Elemental composition (wt%)	Molar ratio
%C	%H	%N	%S	%O	%Ash	H/C	N/C	O/C	S/C
C1/S0	0	49.23	4.66	3.38	1.08	41.41	0.25	1.13	0.06	0.63	0.008
2	44.11	3.68	2.80	1.10	48.16	0.15	1.00	0.05	0.82	0.009
4	45.81	5.61	5.82	1.81	40.95	n.d.	1.47	0.11	0.67	0.015
6	50.11	4.78	4.00	1.14	39.25	0.72	1.14	0.07	0.59	0.009
C1/S1	0	49.23	4.66	3.38	1.08	41.41	0.25	1.13	0.06	0.63	0.008
2	36.78	3.24	3.75	0.97	55.26	n.d.	1.06	0.09	1.13	0.010
4	50.77	5.45	4.27	3.98	34.81	0.72	1.29	0.07	0.51	0.029
6	21.50	2.67	3.47	39.79	32.57	n.d.	1.49	0.14	1.14	0.693
C3/S1	0	49.23	4.66	3.38	1.08	41.41	0.25	1.13	0.06	0.63	0.008
2	38.33	4.01	3.80	5.99	47.87	n.d.	1.25	0.08	0.94	0.059
4	49.89	5.25	4.41	3.15	37.18	0.12	1.26	0.08	0.56	0.024
6	48.67	5.59	4.14	6.52	35.08	n.d.	1.38	0.07	0.54	0.050

施肥期間における HA の H/C を図 4.2.4-2 に示す。各 HA の H/C は投入初期(0～2 ヶ月)おいて一時減少するが、全体的に施肥期間の増加に伴い H/C が増加する傾向が見られた。これらの傾向は%H のみでも確認できる。また、スラグ有無による顕著な差異は見られなかったが、6 ヶ月目の C1/S0 で H/C の大きな減少が見られた。一般的に、腐植化の進行に伴い H/C は増加するとされる。例えば、植物残渣に含まれるフルクトースなどの糖類が脱水縮合反応で芳香族化した場合に水素が減り、不飽和炭素の割合が増加するため H/C が減少するとされる。また、リグニンフェノール由来のメトキシル基および脂肪族成分の分解に伴って脱メチル化や脱メタン化により、相対的に H が減少するので H/C は減少するとされる。対して、H/C の増加は脂肪族成分の蓄積が起因するという報告があり、特に海洋堆積物は藻類の脂肪族成分が見られる。今回の結果では、H/C が施肥期間に伴って増加したことから、HA に堆肥由来や水生微生物由来の脂肪族成分が蓄積されていることが示唆される。
図 4.2.4-2 H/C モル比の経時変化

施肥期間における HA の O/C を図 4.2.4-3 に示す。全体的に各 HA の O/C は 2 ヶ月目で著しく増加し、4 ヶ月目で急激に減少するという傾向を示した。特に、C1/S1 および C3/S1 は O/C の増減が大きい。このことは、%O のみでも同様な結果である。これはスラグが混入したことによる効果だと推察される。しかし、C1/S1 のみ 6 ヶ月目で著しい増加が見られた。この O/C の急激な増加は%C が著しく低下したため、相対的に O/C が増加したのだと考えられる。一般的に、腐植化の増加に伴に O/C は増加するとされる。例えば、酸化反応ではカルボキシル基などの酸素含有官能基量の増加するため O/C は増加するとされる。また、O/C の増加は植物残渣に含まれる糖類を多く含有するためだともいわれている。反対に、嫌気的環境ではタンパク質由来アミノ酸の脱アミノ化に伴う脱炭酸および多糖類の脱炭酸によって O/C の減少が減少するとされる。そして、海水堆積環境における HA は嫌気的環境のため O/C が小さいという報告がある。このようなことから、投入初期(0-2 ヶ月間)における O/C の増加は酸性官能基や植物由来多糖類の増加であり、2-6 ヶ月間における O/C の減少は嫌気的寄与によるものと考えられる。しかしながら、O/C はカルボキシル基、アルコール水酸基、メトキシル期およびフェノール性水酸基といった多様な成分に影響されるため、現段階では O/C がなに起因しているかは明確でない。
図4.2.4-3 O/C モル比の経時変化

施肥期間における HA の N/C を図 4.2.4-4 に示す。C1/S1 および C3/S1 の N/C は投入初期 (0～2 ヶ月) に増加し 4 ヶ月目では低下しており、C1/S0 の N/C の増減サイクルと異なっていることがわかった。このことは、%N のみでも確認される。また、6 ヶ月目における C1/S0 の N/C が急激に増加していることがわかった。この N/C の急激な増加は%C が著しく低下したため、相対的に N/C が増加したのだと考えられる。腐植化の初期段階では動植物由来アミノ酸が HA に取り込まれるため窒素含有量は多いが、腐植化の進行と伴に脱窒素反応により減少するとされる。植物残渣という点で推察すると、C1/S1 および C3/S1 の O/C と N/C は 0-2 ヶ月目で両者ともに増加した。よって、堆肥由来の植物残渣であるセルロース、リグニンおよびそれらに付随するタンパク質が HA に取り込まれたことが推察される。
図4.2.4-4 N/C モル比の経時変化

施肥期間における HA の S/C を図 4.2.4-5 に示す。C1/S1 および C3/S1 は C1/S0 と比較して、全体的に S/C が大きいことがわかった。特に、6 ヶ月目における C1/S0 の %S は 39% であり、とても大きな数値を示すことがわかった。また、C3/S1 の %S は 6.% 程であった。このことから、スラグが混入したことで S 含有量が増加する結果が得られた。通常、HA の %S は約 1-2% であり堆積環境でも約 8% ほどである。主に、S が多い理由としては、嫌気的環境において硫酸イオン(SO_{4}^{2-} が硫酸還元菌によって還元され、それによって生じた硫黄化合物(有機硫黄、硫化水素、元素硫黄およびポリスルフィド)が HA に取り込まれるからだとされる。一方、硫酸還元菌が生成する硫化水素は海水中の Fe(II) と反応して黒色の硫化鉄(FeS)を生じる。今回使用したスラグには約 20wt% の鉄分が含まれているため、通常よりも硫化鉄または二硫化鉄(FeS_{2}、パイライト)が形成しやすい環境と考えられる。この一連の反応過程で生成される硫化水素、硫化鉄およびパイライトが還元剤として機能し、還元環境に貢献していると考えられる。実際に、本実験でもスラグを使用した C1/S1 および C3/S1 のユニット内部は黒色であったことは目視している。さらに、硫酸還元菌は硫酸イオンを多く含む海水や pH6-8 の環境を好み、堆積物表面(5 mm - 数 cm)でも生息している。このことは、本実験で試験水槽に施肥ユニットが投入された環境と類似しているため、硫酸還元菌が生息している可能性は高い。よって、スラグ入りユニットの HA の S 含有量が多いのは硫酸還元菌による寄与だと考えられる。
図 4.2.4-5 N/C モル比の経時変化

## (3) -3 HA の分子量変化

施肥期間における各ユニットの HA の HPSEC クロマトグラムを図 4.2.4-6 に示す。各 HA のクロマトグラムは施肥期間の変化に伴って、大きく変化することがわかった。一般に、サイズ排除クロマトグラフィーでは保持時間が短いほど分子量は大きくなり、長いほど小さくなる。全体的に各 HA のクロマトグラムは 12.3 min 付近を中心とした 1 つのピークを示すが、13 min 付近にブロードやピークを示すものも存在した。特に、6 ヶ月目での C1/S1 は 12 min ピークより 13 min 付近に大きなピークを示したため、低分子量物質が多く存在していることがわかった。HA のクロマトグラムが多数のピークを示すということは、その HA は多種多様の分子量物質を持っていることを意味する。よって、13 min 付近でピークやブロードが生じる HA は、その腐植化過程で低分子物質を取り込んでいることが示唆される。これらの結果は、ユニット内で HA が生成および分解が起きていることを意味している。
図 4.2.4-6 各堆肥／スラグ混合比に於ける HA の分子量の経時変化
施肥期間における各ユニットの HA の $ M_{n} $ 、 $ M_{w} $ および $ M_{w}/M_{n} $ を表 4.2.4-3 および図 4.2.4-7 に示す。全体的に、 $ M_{n} $ は増減の変化が大きく、 $ M_{w} $ は変化が小さいことがわかった。しかし、6 ヶ月目の C1/S1 においては、 $ M_{n} $ および $ M_{w} $ は急激に減少した。一般に、 $ M_{n} $ は高分子化合物に含まれる低分子量物質の寄与を敏感にうけ、Mw は高分子量物質の寄与を受ける。よって、 $ M_{n} $ の増減の大きな変化は HA の低分子量物質の増減の影響を敏感に受けており、 $ M_{w} $ の急激な低下は高分子量物質の消失を意味している。また、 $ M_{n} $ においてスラグ無し HA(C1/S0) が増減する際にはスラグ入り HA(C1/S1、C3/S1) が減増するという傾向を示した。よって、スラグは HA の分子量にも寄与することが考えられる。UV-vis 測定の $ E_{280} $ は、堆肥由来リグニンが起因しており、HA の芳香族性、分子量および腐植化の指標となることを前述した。このことから、 $ E_{280} $ と $ M_{n} $ の相関関係を調べた結果、強い正の相関性 ( $ r^{2}=0.916 $ ) があることがわかった。リグニンは HA の腐植化生成する上での基本骨格となるため、HA の分子量の増減は堆肥由来リグニンフェノールの縮合・分解による寄与が大きいことが示唆された。

一方、N/C モル比と $ M_{n} $ の相関性を調べた結果、強い負の相関性 ( $ r^{2}=0.901 $ ) を示した。また、微生物由来 FA は N/C が高く、分子量が低いことが報告されている。これは、動植物由来タンパク質の大きな寄与は (N/C が増加する)、 $ M_{n} $ を減少させると推察することができる。よって、HA の分子量を減少させる要因としては、HA の基本骨格であるリグニンの分解だけではなく、微生物による寄与も考えられる。

表4.2.4-3 各 HA 試料の分子量測定結果

HA samples	Fertilization period (month)	Molecular weight
Mn	Mw	MwMn
C1/S0	0	2242 ± 20	10661 ± 41	4.75
2	2325 ± 26	9863 ± 139	4.24
4	1036 ± 2	9739 ± 10	9.40
6	2378 ± 23	10104 ± 132	4.25
C1/S1	0	2242 ± 20	10661 ± 41	4.75
2	1660 ± 4	9526 ± 2	5.74
4	1923 ± 9	10563 ± 8	5.49
6	614 ± 2	4110 ± 19	6.69
C3/S1	0	2242 ± 20	10661 ± 41	4.75
2	1326 ± 1	9118 ± 11	6.88
4	2121 ± 3	11049 ± 8	5.21
6	1778 ± 1	11170 ± 3	6.28
図 4.2.4-7 各 HA 試料の数平均 $ (M_{\mathrm{n}}) $ および重量平均 $ (M_{\mathrm{w}}) $ 分子量の経時変化
## (3) -4 py-GC/MS による構造解析

施肥期間における各ユニットのHAのTMHA-py-GC/MSクロマトグラムを示す(図4.2.4-8a～c)。各クロマトグラムに記載している「ISTD」とは内部標準物質(nノナデカン酸、 $ \tilde{n}C_{19:0} $ )のことである。クロマトグラムの結果から、NIST質量スペクトルデータベースを用いてピークの同定を行い、そのピーク面積と内部標準物質のピーク面積との比（各ピーク/内部標準物質、ピーク比）を算出した。その後、図4.2.4-9に示すグループに従い、ピーク比を合計した(表4.2.4-4)。図4.2.4-9は、各HAに共通する代表的な物質とその保持時間を記載している。主に、タンパク質やアミノ酸の熱分解生成物であるピロールやインドールに由来する窒素化合物(A)、植物の芳香族成分を由来とする(B)・(C)・(D)、植物および微生物の細胞脂質に由来する飽和脂肪酸(E)と飽和脂肪酸(F)、ステロール系化合物(G)、硫黄化合物(H)、シクロ系炭化水素化合物(I)、アルコール化合物(K)のグループ分け(計11個)を行なった。各HAのクロマトグラムを比較すると、フェノール酸(D)と飽和・不飽和脂肪酸の(E・F)ピークが、各期間で著しく変化していることがわかった。特に6ヶ月目におけるC1/S1は、飽和・不飽和脂肪酸(E・F)のピークが非常に多く、フェノール酸(D)のピークが消失した。フェノール酸と脂肪酸の関係性を調べるために、施肥期間におけるフェノール酸(D)と脂肪酸(E+F)のピーク比の比率(D/(E+F))を算出した(図4.2.4-10)。さらに、HA中に含まれるフェノール酸(D)と脂肪酸(E+F)の割合を算出し相関性を調べたところ、負の相関性が得られた( $ r^{2}=0.66 $ )。つまり、HA中に含まれるフェノール酸および脂肪酸の存在割合の変化が、HAの構造変化を支配している因子であることが結論付けられた。フェノール酸は、バニリン酸、p-クマル酸およびシリンジ酸が多く含まれていることから、HA中の芳香族成分はリグニンフェノール酸が支配的であることが明らかとなった。これらの化合物は、植物細胞壁中に含まれるリグニンを構成する化合物であることが知られており、実際に堆肥中に存在している木片をTMAH-Py-GC/分析した結果、リグニンフェノール酸が検出された。リグニンフェノール酸は、土圈のHAおよび堆肥由来のHAに多く含まれているが、海水および河口水は植物残渣の供給が少ないためリグニンフェノール酸の存在量は少ない。よって、本研究でHA中に含まれるリグニンフェノール酸は、使用した堆肥が供給源であることが明らかとなった。

脂肪酸は、パルミチン酸(C_{16:0})、ミリスチン酸(C_{14:0})およびステアリン酸(C_{18:0})の飽和脂肪酸(E)と、パルミトレイン酸(C_{16:1} $ \omega $ 7)の不飽和脂肪酸(F)が顕著に現れた。なお、()内は(炭素数：二重結合数)を示している。特に、HA中にはC_{16:0}とC_{16:1}の多く含まれていた。C_{16}およびC_{18}の飽和・不飽和脂肪酸は、微生物の細胞膜を形成するリン脂質、および、植物細胞壁の表面保護成分(クチン)とコルク組織(スベリン)に存在していることから、自然界に多く分布しているため、HAに蓄積される。特に、微生物と植物が多く存在する土壤由来HAは多くのC_{16}およびC_{18}を含むが、C_{16}およびC_{18}が微生物由来か植物由来なのかは研究者によって意見が分かれている。本研究におけるHAも、堆肥由来の植物脂肪酸および微生物由来の動物脂肪酸の両者の寄与が考えられる。よって、両者の寄与を検討するために、6ヶ月
目におけるスラグ単体(C0/S1)粉末の TMAH-py-GC/MS 分析を行った。その結果、図 4.2.4-11 に示すように、C_{16:0} および C_{16:1} の飽和・不飽和脂肪酸が顕著に出現した。つまり、スラグ単体(無機物)にもかかわらず脂肪酸が存在したことは、この脂肪酸が微生物由来の動物脂肪酸であることを示唆している。さらに、6 ヶ月目における C1/S1 は微生物由来脂肪酸とともに硫黄化合物(H)が顕著に現れている。これらの結果は、ユニット内部で硫酸還元菌の微生物活動を行なっていることを支持する結果である。つまり、硫酸還元菌が海水中の硫酸イオンを還元して生じる硫化物および硫酸還元菌の死骸に起因する脂肪酸が、HA に取り込まれていることが明らかとなった。

以上の結果から、HA 中に含まれる堆肥由来リグニンフェノール酸と硫酸還元菌由来飽和・不飽和脂肪酸の存在割合の変化が、HA の構造変化を支配していることがわかった。特に、6 ヶ月目において、スラグ入り(C1/S1・C3/S1)とスラグ無し(C1/S1)を比較すると顕著な差が現れた。スラグ無しユニットでは、硫酸還元菌が還元状態の生息場(FeS_{2})を作る上でのスラグ(鉄分)が少ないため生息が困難なのか、HA 中に脂肪酸が多く含まれていない。よって、堆肥リグニンフェノール酸を主体とした「芳香族性HA」が生成されている。一方、スラグ入りは、硫酸還元菌が還元状態の生息場(FeS_{2})を作る上で適したスラグ(鉄分)があるためか、ユニット内部で微生物活動を行い、その活動で生じた硫化物および死骸(脂肪酸)がHA に取り込まれると思われる。よって、硫酸還元菌由来脂肪酸を主体とした「脂肪性HA」が生成されていると考えた。
図 4.2.4-8a HA のパイログラムの経時変化(C1/S0)
図 4.2.4-8b HA のパイログラムの経時変化(C1/S1)
図 4.2.4-8c HA のパイログラムの経時変化(C3/S1)
図 4.2.4-9 主な熱分解生成物の帰属とグループ分け

表4.2.4-4 各熱分解生成物グループの内標準物質に対する相対ピーク強度

Compounds (Remarks)	(C1/S0)0	(C1/S0)2	(C1/S0)4	(C1/S0)6	(C1/S1)0	(C1/S1)2	(C1/S1)4	(C1/S1)6	(C3/S1)0	(C3/S1)2	(C3/S1)4	(C3/S1)6
Nitorogen-containing compounds (A)	1.53	1.99	1.91	1.81	1.53	0.82	1.05	34.18	1.53	1.20	1.74	1.88
Methoxy phenol derivatives (B)	3.32	3.51	1.04	2.21	3.32	1.02	1.14	16.83	3.32	0.84	3.11	2.80
Aromatic ketones and aldehydes (C)	2.22	1.13	0.38	1.57	2.22	0.50	1.08	0.00	2.22	0.42	1.50	1.38
Phenolic acids (D)	10.80	9.01	2.78	7.98	10.80	3.96	6.17	0.00	10.80	3.98	8.08	7.20
Saturated fatty acids (E)	2.52	1.74	6.36	2.71	2.52	1.98	3.39	91.02	2.52	3.52	3.96	16.32
Unsaturated fatty acid (F)	0.66	0.47	3.84	1.41	0.66	1.15	1.70	23.47	0.66	1.72	1.90	15.52
Sterols (G)	0.89	1.53	0.17	0.52	0.89	0.26	0.37	1.00	0.89	n.d.	0.42	0.70
Sulfur compounds (H)	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	121.83	0.00	0.00	0.00	0.25
Cyclic compounds (I)	0.36	0.49	0.92	0.14	0.36	0.72	1.09	30.78	0.36	2.08	0.70	1.69
Phoshate compounds (J)	0.38	0.84	1.12	1.41	0.38	1.05	2.71	4.52	0.38	1.12	2.29	2.35
Alcohols (K)	0.00	0.00	1.68	0.07	0.00	3.59	2.16	9.81	0.00	3.45	0.12	1.20
図 4.2.4-10 HA 中のフェノール酸／脂肪酸比の経時変化

図4.2.4-11 6ヶ月埋設後のスラグのパイログラム(堆肥無し)
## (4) まとめ

本研究では、施肥期間のおけるユニット中の腐植酸の化学組成変化に及ぼすスラグの影響を明らかにすることを目的とした。ゆえに、磯焼け海域である舎熊海岸(北海道增毛町)に設置した試験水槽に混合比を変化させた転炉系製鋼スラグ一堆肥施肥ユニットを2、4および6ヶ月間埋設した。そして、ユニット中の腐植酸の量的変化および構造的变化を追跡した。

施肥ユニット投入後、スラグ有とスラグ無における腐植酸の量を比較すると、それぞれ2ヶ月目および4ヶ月目で、HA量が最低となった。この短期間におけるHA量の減少は、海水の溶出・溶脱効果であると示唆された。ゆえに、ユニット中のHAが長期に渡りスラグからFe(II)を溶出し続けるとは考え難い。また、スラグ有とスラグ無におけるHA量減少の時期なズレは、スラグ無HAと比較してスラグ有HA中に多くの微生物由来脂肪酸が含まれていたことから、微生物による腐植酸の分解が腐植酸の溶出と同時に進行していると考えられた。スラグ有とスラグ無で共通することは、HA量が最低な時期の2月後には、HA量が増加することである。これは、ユニット内部で新しく堆肥由来リグニンフェノール酸を基本骨格とした腐植酸が形成されていることが明らかとなった。6ヶ月後のスラグ有(C1/S1)のHAには、リグニンフェノール酸がほとんど含まれていない代わりに多くの微生物脂肪酸と硫黄化合物が存在したことから、硫酸還元菌の微生物活動の寄与が示唆された。反対に、6ヶ月後のスラグ無(C1/S0)のHAはリグニンフェノール酸を主体とした芳香族性に富む腐植酸であった。このような結果から、スラグ有ユニット内部では、硫酸還元菌が還元状態の生息場(FeS、FeS_{2})を作る上で適した鉄分と電子供与体として作用する有機物(堆肥またはリグニンフェノール酸)があるため、硫酸還元菌が活動しやすい生活環境が構築され、その微生物活動によって生じた硫化物と微生物死骸が腐植酸に取り込まれていることが示唆された。また、このような硫酸還元菌の微生物活動で代謝される低分子の有機酸(乳酸、酢酸など)は、長期的な供給および鉄との親和性が高いという観点から、本技術における長期的な溶存鉄供給という役割を担っていると考えられる。
## 4 ．2．5　腐植物質の解析に関する総括

施肥ユニット中の堆肥の海水抽出物である SWEOM は HA 及び FA とは異なる構造的特色をもつことが明らかとなった。SWEOM は、HA 及び FA と比較して、脂肪酸に富み、分子量の大きい分画であることが分かった。FA と同程度の O/C モル比にも関わらず酸性官能基量は少なく、エーテルやアルデヒド、アルコール、ケトンを多く含んでいることが分かった。ステロイド等の脂質も溶出しており、SWEOM 中に多く含まれていることが分かった。多糖類やタンパク等、非 HS も溶出していると考えられ、N 含有量やアミノ酸含有量が高かった。

Fe $ ^{2+} $ との錯形成能を検討した結果、SWEOMは錯との錯化容量が最も小さいことが分かった。錯化容量については、HAはフェノール酸類を豊富に含むため構造的に有利で、SWEOMは脂肪酸中心の構造であるために錯化容量が小さくなったと考えた。また、Fe(II)-SWEOM錯体の解離に関わる活性化パラメータを、OPとの配位子交換に基づき測定しFe(II)-HA, Fe(II)-FAと比較した。Fe(II)-SWEOM錯体の活性化エンタルピーは、Fe(II)-HA錯体およびFe(II)-FA錯体の値に比べて大きく低くなり、解離しやすく生物利用性が高い錯体であることが示唆された。

しかし、SWEOM の分子量範囲は極めて広くどのような分子量分画が錯形成に関与しているのかが疑問である。そこで、SWEOM を限外濾過により分画下結果、高分子サイズ (>100 kDa) の分画と低分子サイズ (<0.5 kDa) の2分画で占められていることが明らかとなり、その間の分子量の存在量は極めて低かった。元素分析およびFT-IT や $ {}^{13} $ C NMR のような分光学的測定結果から、高分子分画は脂肪族性に富み低分子の分画は芳香属性に富むことが分かった。さらに、低分子量分画の酸性官能基含有量は、高分子分画に比べ遙かに高く親水性に富むことが分かった。また、抗酸化剤としてアスコルビン酸を添加することにより、フェロジン発色試薬との配位子交換反応速度差を利用することにより、海水条件下における解離可能な $ \mathrm{Fe(II)-SWEOM} $ 錯体の濃度([ $ \mathrm{Fe(II)-SWEOM} $ ]_{labile}) の測定を可能にした。この測定により、 $ \mathrm{Fe(II)-SWEOM}_{labile} $ の錯形成能を評価し、低分子量分画の錯化容量が大きいことを明らかにした。ゆえに、低分子量分画と鉄との錯体の生物利用性が高く、コンブの生長に影響するキレートとして貢献することが示唆された。SWEOM の分画の鉄(II)錯体の相違で、コンブへの利用性が異なるか否かを確かめるため、コンブの配偶体生育に及ぼすこれら錯体の添加効果を調べた。SWEOM の低分子分画と鉄(II)を添加したとき、コンブの雌性配偶体の成熟が確認された。この結果は、コンブの生育に利用される鉄(II)のキレート剤として低分子分画（すなわち SWEOM における分子量 500 Da 以下の分画）が有用であることを示している。以上の結果から、SWEOM と鉄(II)との錯体はコンブの生育に対する利用性があることが実証され、各分画に対して labile な錯体の錯化容量の傾向とよく一致した。

さらに、施肥期間のおけるユニット中の腐植酸の化学組成変化に及ぼすスラグの影響を明らかにすることを目的とした。磯焼け海域である舎熊海岸(北海道增毛町)に設置した試験
水槽に混合比を変化させた転炉系製鋼スラグ一堆肥施肥ユニットを2、4および6ヶ月間埋設した。そして、ユニット中の腐植酸の量的変化および構造的变化を追跡した。

施肥ユニット投入後、スラグ有とスラグ無における腐植酸の量を比較すると、それぞれ2ヶ月目および4ヶ月目で、HA量が最低となった。この短期間におけるHA量の減少は、海水の溶出・溶脱効果であると示唆された。ゆえに、ユニット中のHAが長期に渡りスラグからFe(II)を溶出し続けるとは考え難い。また、スラグ有とスラグ無におけるHA量減少の時期なズレは、スラグ無HAと比較してスラグ有HA中に多くの微生物由来脂肪酸が含まれていたことから、微生物による腐植酸の分解が腐植酸の溶出と同時に進行していると考えられた。スラグ有とスラグ無で共通することは、HA量が最低な時期の2月後には、HA量が増加することである。これは、ユニット内部で新しく堆肥由来リグニンフェノール酸を基本骨格とした腐植酸が形成されていることが明らかとなった。6ヶ月後のスラグ有(C1/S1)のHAには、リグニンフェノール酸がほとんど含まれていない代わりに多くの微生物脂肪酸と硫黄化合物が存在したことから、硫酸還元菌の微生物活動の寄与が示唆された。反対に、6ヶ月後のスラグ無(C1/S0)のHAはリグニンフェノール酸を主体とした芳香族性に富む腐植酸であった。このような結果から、スラグ有ユニット内部では、硫酸還元菌が還元状態の生息場(FeS、FeS₂)を作る上で適した鉄分と電子供与体として作用する有機物(堆肥またはリグニンフェノール酸)があるため、硫酸還元菌が活動しやすい生活環境が構築され、その微生物活動によって生じた硫化物と微生物死骸が腐植酸に取り込まれていることが示唆された。また、このような硫酸還元菌の微生物活動で代謝される低分子の有機酸(乳酸、酢酸など)は、長期的な供給および鉄との親和性が高いという観点から、本技術における長期的な溶存鉄供給という役割を担っていると考えられる。

以上の検討結果から、施肥ユニットから海水により溶出する有機成分の中で低分子の分画や硫酸還元菌など微生物の作用により堆肥が分解することにより生成する低分子の有機酸が、解離安定性が低く生物利用性の高い鉄(II)との錯体を形成し、磯焼け海域の薬場再生に寄与していると結論づけた。
## 4 ．3 腐植酸鉄の生成機構および実海域での実証的検討

製鋼スラグと腐植様物質を利用した生態系修復技術は、北海道日本海側（增毛町）における実証試験によりその効果が確認されており $ ^{1)} $ 、その後全国各地で実証試験・事業が実施され $ ^{3)} $ 、実用化に向けた取り組みが産学連携で行われている $ ^{4)} $ 。本技術の特長は海藻群落の衰退の原因の一つとして海水中の溶存鉄不足を考えていることであり、産業副産物と未利用バイオマスの有効活用の観点からも期待の大きい技術である。この修復技術では、製鋼スラグから溶出する鉄イオンと腐植物質が錯形成することによって溶存態鉄となり、海藻が取り込める鉄の量を増加させるとの原理が考えられてきた。これまで錯形成能評価 $ ^{5)} $ をはじめとした基礎研究が行われてきたが、実用化に向けては鉄溶出メカニズムや海藻生育への鉄添加効果をはじめとした課題に対する更なる基礎的知見の集積やフィールドに近い条件での実験的検討が必要である。

本研究の目的は、製鋼スラグと腐植様物質を利用した生態系修復技術について、腐植物質－鉄錯体生成メカニズムの解明と藻場再生促進に向けた化学的・生物学的検討に基づき、循環型社会に適合した技術を確立することにある。本研究は、(1) 製鋼スラグと腐植物質の相互作用と環境リスク評価、(2) 腐植物質の構造解析に基づく共存金属の環境挙動、(3) 腐植酸鉄の生成機構および実海域での実証的検討の3 テーマにより成り立つが、東京大学においては(3) の課題の担当として研究を行った。

実際の研究では、①製鋼スラグと腐植様物質の海水への溶出特性評価、②海藻生育試験による鉄添加効果の検討、③実海域での実証的検討の3項目に分けて研究を実施した。「腐植酸鉄の生成機構」の部分については、実質的には(1)，(2)の知見を基に検討するものであるため、本課題では特に製鋼スラグと腐植様物質を混合した際の溶出特性について検討することにした。そして(1)，(2)で得られる知見と合わせることで腐植酸鉄の生成機構ならびに薬場再生技術への利用の有効性を評価することとした。②については「実証的検討」につながる項目として、特に海藻生育への鉄添加効果に関して実際に海藻培養を行って明らかにすることとした。そして③については生態系修復技術がこれまで効果が確認されているコンプ場以外への適用に関して実海域での実証試験に基づいて検討することと、特に生態系修復技術の確立に向けて、海藻以外の生物種も含めて海域調査を実施しながら検討・評価することを試みた。
## 4 ．3．1 製鋼スラグと腐植様物質の海水への溶出特性評価

## (1) 背景と目的

ここでは、腐植酸鉄の生成メカニズムの解明および腐植様物質の鉄溶出促進への役割を検討するために、海水を用いた鉄分供給ユニット（製鋼スラグと腐植様物質の混合物）からの鉄溶出特性に関して評価することを目的とした。実際には、室内溶出試験および磯焼け海域の実海水を用いた屋外水槽試験（北海道増毛町に設置）を行い、腐植様物質混合による鉄溶出促進についての評価と効果継続性についての検討、そして栄養塩や重金属の溶出についても考察し、環境影響評価を実施することとした。

## (2) 実験方法

## · 室內溶出試驗

北海道增毛町で2004年10月より実施された藻場再生実証試験1)，2)で用いられたものと同じ製鋼スラグ（新日鐵、表面を炭酸化処理済）と腐植様物質（堆肥）6）（以下、腐植物質）を用いて、製鋼スラグのみ、腐植物質のみ、製鋼スラグ＋腐植物質の3種類の試料に関して、鉄溶出試験を行った。具体的には、表4.3.1-1の条件で試験を行った。人工海水は市販のもの（マリンテック、SEALIFE）を用い、固液（試料と海水）比を1：10として、試料の重量は各条件とも等しくした。また実証実験では製鋼スラグと腐植物質の混合比は体積比で1：1で行っているため、今回の溶出試験においても製鋼スラグ＋腐植物質の試料においては体積比で1：1とした。なお、今回の溶出試験で用いた製鋼スラグと腐植物質の比重は、20：9（製鋼スラグ10gと腐植物質4.5gが同体積）であった。試験では2日ごとに人工海水を交換し海水中の全鉄濃度の測定を行った。一方で表4.3.1-1の条件では50mLの遠沈管を用いているが、溶質と試料が少量であることから測定誤差が大きい可能性がある。したがって溶出特性の再現性を確認するために、250mLのポリ瓶を用いて溶媒10g、溶液100mLとして表4.3.1-1と同条件（3試料）で溶出実験を行った。ここでは鉄濃度測定のほかに溶出液中のpHについても測定を行った。海水の分析方法としては、フェロジンを用いた分光光度法（フェロジン法）を用いて全鉄測定を行った。フェロジン法自体は、腐植酸鉄を含む有機態鉄の測定は困難であるが、全鉄測定を行うために試料溶液を塩酸酸性として煮沸し、ポリマー熊の鉄を分解した後に塩酸ヒドロキシルアミンで全鉄を二価へ還元して分析を行った。また溶出試験の期間については、14日間として行った。
表 4.3.1-1 鉄溶出試験における溶媒・溶質の条件

体積比
Slag : HS	溶質	溶媒
ml
Slag / g	HS / g	合計 / g
1 : 0	4.00	0	4.00	40
0 : 1	0	4.00	4.00	40
1 : 1	2.76	1.24	4.00	40

$ ^{※} $ HS（Humic substance）：腐植物質

## · 屋外水槽試験

図 4.3.1-1 に今回の実験で使用した北海道增毛町の屋外水槽の写真を示す。この水槽は今回の実験を行うにあたって、現地漁業協同組合、(株北海道オーシャングリーン開発、そして新日本製鐵(株)の協力を得ながら新たに設置をしたものである。水槽の容量は 300L である。本実験は北海道大学と共同で行い、この水槽を用いてユニットからの鉄溶出特性（東大担当）とユニット（固体試料）中の腐植物質の変化（北大担当）について検討を行った。なお、この実験で使用する腐植様物質としては、実証実験や室内溶出試験と同様に（株）エコ・グリーン製の堆肥（腐植物質）を用いることとした。本試験は平成 21 年と平成 23 年

図 4.3.1-1 実験に利用した増毛町の屋外水槽
度の2回実施している。平成21年度の試験においては腐植物質側の変化に関しては有用な知見が得られたが、海水側についてはより有意なデータが得られたのは平成23年度の試験であった。したがってここでは平成23年度の実験条件および結果に関して述べる。

図 4.3.1-1 の水槽のうち平成 23 年度は 4 つの水槽を用いて、海水容量 300L、海水流量 2.1L/min で試験を開始し、定期的に行った試料（固体）サンプリング後には滞留時間が一定となるように海水量と流量を変化させた。また試料条件は以下の①～④とし、製鋼スラグ 3kg の体積を基準体積（ $ V_{0} $ ）として、①～④の全てで体積が一定（ $ V_{0} $ ）となるようにして、個別に水槽に設置した。今回の試験では、実験室内で検討を実施してきた①～③に加えて④を新たに実験条件として加えている。これは腐植物質の添加効果に関してより多くの知見を得るためである。

① 製鋼スラグのみ

② 腐植物質のみ

③ 腐植物質：製鋼スラグ＝1：1

④ 腐植物質：製鋼スラグ＝2：1

実験期間は、平成23年5～11月の6カ月間行った。分析については、最初の一カ月は半月に1度採水し、以後は月に一度海水を採水し、以下の項目について検討・評価を行った。

## <分析項目>

1） 溶存鉄濃度：溶存鉄濃度を分光光度法によって分析した。分析は有明工業高等専門学校の劉教授に依頼した。

2）栄養塩濃度：全窒素（T-N）、全リン（T-P）について、それぞれ紫外吸光光度法、ペルオキソ硫酸カリウム分解法によって分析を行った。また溶存無機態栄養塩については、窒素（ $ NO_{2}^{2}-N $ , $ NO_{3}^{3}-N $ , $ NH_{4}^{+}-N $ ）、リン（ $ PO_{4}^{3-}-P $ ）の分析を栄養塩自動分析装置を用いて行った。

3）重金属濃度：ICP-MS を用いて、Cd, Pb, Cr, Cu, Zn, Mn の 6 種類について分析を行った。

## (3) 結果と考察

· 室內溶出試驗

図 4.3.1-2 に表 4.3.1-1 の条件で行った溶出実験における全鉄濃度の変化を示す。溶出試験期間中の鉄濃度はほぼ「腐植物質（HS）＞製鋼スラグ＋腐植物質＞製鋼スラグ」の順に推移していることがわかる。この結果より、製鋼スラグに腐植物質を混合することによって、鉄溶出量が増大することが示された。一方で、今回用いた製鋼スラグに含まれる全鉄
量は22.2wt%、腐植物質に含まれる全鉄量は2.55wt%であるが、実験結果からは腐植物質からの鉄溶出量が特に多いことがわかる。表4.3.1-2は、図4.3.1-2に示した14日間の鉄濃度から計算した3条件（試料）の鉄溶出速度、そして製鋼スラグと腐植物質に含まれる鉄含有量のうち1%が溶出すると仮定 $ ^{7} $ して計算した鉄溶出寿命である。まず鉄溶出速度については、製鋼スラグに腐植物質を混合することによって約1.2倍速度が増加することが示された。製鋼スラグ＋腐植物質の場合、製鋼スラグだけの時よりもスラグ量が半分になっているにも関わらず溶出速度が増加していることから、腐植物質との混合により鉄溶出速度が増加したと考えられる。一方で腐植物質だけの時には、製鋼スラグだけの場合よりも溶出速度が約3.8倍になっていることが示されている。この結果だけから考えると、鉄溶出速度の観点では腐植物質だけの場合が最も有利であると言える。しかし表4.3.1-2の寿命を見てみると、製鋼スラグだけ、製鋼スラグ＋腐植物質と比較して極端に短くなっており、実海域で利用することを考えると最適であるとは言い難い。以上のことから、製鋼スラグと腐植物質との混合は、鉄溶出速度促進と鉄溶出の寿命の両方の観点から、優位であることが示唆された。なお今回求めた溶出速度は、真の溶出速度ではなくみかけの溶出速度であると言える。海水40mLに対して2日間溶出させて海水を交換していることから、鉄酸化・沈殿も同時に起こっていると考えられるためである。みかけの溶出速度は、以下の関係から導出されるものと推測される。

$$ \begin{aligned}&( みかけの溶出速度 )=( 真の鉄溶出速度 )-( 鉄酸化 \cdot 沈殿速度 )\\&\quad-( 微生物による鉄吸收速度 )\end{aligned} $$

但し、今回は人工海水を利用していることから、海水中のプランクトンの影響は考慮しなくてよいため、微生物による鉄吸収速度の影響は小さいと考えられる。また算出した寿命については、全鉄量の1%が溶出と仮定していることや、長期間経過後の溶出速度を考慮せずに溶出試験開始14日間の平均鉄溶出速度から計算していることから、溶出特性については今回の実験結果をもとに、更なる検討が必要であると考えられる。
図 4.3.1-2 各試料における鉄濃度の変化

表 4.3.1-2 溶出試験結果より算出した鉄溶出速度と寿命

slag	HS	slag + HS
Fe elution rate [mg-Fe/g-sample/day]	0.74	2.84	0.88
Lifetime [year]	5.1	0.15	3.1

再現性確認のために試料 10g、海水 100mL の条件行った実験では、3 試料からの溶出特性は定量的には完全に一致はしていないものの、定性的には図 4.3.1-2 と一致する結果が得られた。このことから、製鋼スラグと腐植物質の混合効果は鉄溶出促進と長寿命化であることが裏付けられた。その一方で図 4.3.1-3 に示す様に、更に pH の面から新たな知見を得ることができた。実証試験で使用している製鋼安定化スラグは、未処理のスラグに比べてアルカリ溶出が少ないと言えるが、それでも pH が 9.5 程度まで上昇していることがわかる。一方で腐植物質だけの場合には pH が 7.5 程度に抑えられていることがわかる。そして製鋼スラグ＋腐植物質の場合、腐植物質の存在により pH が 8.8 程度に抑えられていることが示されている。このことから、腐植物質との混合は、鉄溶出と寿命に加えて、海水の pH 上昇を抑える効果もあることが示唆された。
図 4.3.1-3 各試料における pH の経時変化

## · 屋外水槽試験

図 4.3.1-4 に溶存鉄濃度の実験開始後 2 カ月後までの経時変化について示す。まずブランクの鉄濃度が変動しているが、これは季節変動や気象条件などの影響と考えられる。一方で、試料③（製鋼スラグ：腐植物質＝1：1）における溶存鉄濃度はブランク値よりも高く、試料④（製鋼スラグ：腐植物質＝1：2）では試料③よりも溶存鉄濃度が高いことから、製鋼スラグに腐植物質を混合することにより、鉄溶出速度が増加することが示された。

但し、この結果は室内溶出試験結果とは腐植物質の挙動の部分が異なるものとなった。室内実験においては腐植物質だけ（試料②）の場合が最も鉄溶出量が多い結果となったが、この試験においては腐植物質と製鋼スラグの混合物の方が濃度は高くなっている。一方で、今回の屋外水槽試験と室内実験では実験条件について異なる点もあり（海水中のプランクトン量なども異なると予想される）、この結果の理由については今後の検討課題である。また60日以降においては、ブランクと試料①～④の鉄濃度に明確な差が見られなくなる結果が得られた。この結果に関しては、過去の研究で示された実験室内で250日間、あるいは90日間の溶出実験を行った際の結果と異なっている。この実験では、溶出試験開始直後は溶出量が多く、次第に溶出量が減少し一定となる様子が示されている。このことを考えると、屋外水槽試験開始直後は各試料からの鉄溶出量が多いが60日経過後からは溶出量の差が少なくなり、今回の試料と海水量の比、また滞留時間では溶出速度が安定した後は差が出なかった可能性がある。いずれにしても、より詳細な検討を行うためには、今後海水量に対する試料の量を増やして検討する必要性が考えられる。
図 4.3.1-4 4 試料（製鋼スラグ，腐植物質，腐植物質：製鋼スラグ＝1：1，腐植物質：製鋼スラグ＝2：1）からの鉄の溶出特性

次に栄養塩 (N, P) の挙動について示す。本章では、栄養塩について検討した全窒素 (T-N)、全リン (T-P) および無機態栄養塩 (NH₄-N, NO₂-N, NO₃-N, PO₄-P) の中で、ある程度の傾向性が示された T-N と T-P について記載する。図 4.3.1-5 に試験期間中の T-N 濃度変化についての図を示す。ブランクと製鋼スラグ (試料①)、腐植物質 (試料②) を比較すると実験開始直後は若干の差が見られるものの、全体を通しては大きな差が無いことが示された。試料②の条件では N, P などの栄養塩溶出が予想されたが、実際には、今回の実験条件の場合ではそれほど栄養塩の溶出はないとの結果が示された。一方で、製鋼スラグに腐植物質を混合した場合には、栄養塩溶出量が増えることが示された。また試料④ではブランクに比べて 2 倍近くの T-N 濃度が得られており、腐植物質量が増えることによって T-N 濃度も増加することが示された。図 4.3.1-6 はリン (T-P) 濃度の挙動について示したグラフである。T-P についても T-N と同様に腐植物質の割合が増えると (試料④)、リンの溶出量も増加していることが確認された。一方で T-N の場合とは異なり、試料②はブランクと比較して T-P 濃度が上昇しており、更に試料①は試料②よりも T-P 濃度が高いことが示された。スラグからのリンの溶出に関しては既往の研究でも研究例があるが $ ^{8} $ 、リンの場合には腐植物質だけでなく、製鋼スラグからもリンが溶出していることが示された。
図 4-3-1-5 4 種類の試料における T-N 濃度の変化

図 4.3.1-6 4 種類の試料における T-P 濃度の変化