Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
は HA が若干多く、フェノール酸では HA が SWEOM の 1.6 倍も多く含んでいることが分かる。FA と比較すると、FA にはカルボン酸が SWEOM の 4 倍も含まれていることが分かった。一方、フェノール酸は FA と SWEOM は同程度であった。SWEOM は、O/C モル比が FA と同程度であるにもかかわらず酸性官能基量が少ないことから、アルコールやエステル、ケトン等を多く含むと考えられる。

表 4.2.1-2 SWEOM, HA, FA の酸性官能基組成

Sample	Acidity (mmol g $ ^{-1} $ C)
COOH	Phenolic-OH	Total
3.8 ±0.8	3.7 ±0.0	7.5 ±0.8
HA	4.8 ±1.4	5.9 ±0.1	10.7 ±1.5
FA	16 ±0.8	3.6 ±0.3	19.6 ±1.1

## (3) -3 分子量分布

HA や FA のような腐植物質は、様々な高分子化合の混合物であると考えられており、SEC による分子量分布の測定はこれらの特性を評価する上で重要である。HPSEC のクロマトグラムより求めた分子量の結果を表 4.2.1-3 に示す。HA 及び FA は他の土壌や堆肥期限のもので報告されているデータ $ (M_{\mathrm{w}} \mathrm{HA}=0.8\sim35 \mathrm{kDa}; M_{\mathrm{w}} \mathrm{FA}=1.5\sim3.5 \mathrm{kDa}) $ よりは若干低い値であった。SWEOM の重量平均分子量は約 30 kDa であり、HA と比較しても非常に大きい分画であることが分かった。 $ M_{w}/M_{n} $ は HA が約 7.0、FA が約 1.6 であるのに対し、SWEOM は約 18 と大きいことから、SWEOM は様々な構造を有す 1 つの巨大な縮合体というよりはむしろ、様々な分子量分画のものの集合体であると考えられる。
表 4.2.1-3 SWEOM, HA, FA の分子量測定結果

Sample	Molecular weight
Mw	Mw/Mn
28700 $ \pm $ 500	17.7
HA	10900 $ \pm $ 200	7.0
FA	1250 $ \pm $ 20	1.6

## (3) -4 固体 CP-MAS $ {}^{13} $ C NMR による構造解析

固体 CP-MAS $ {}^{13} $ C NMR スペクトルと各帰属部位の占める割合を、それぞれ図 4.2.1-1 と図 4.2.1-2 に示す。本研究においては 0−60 ppm を Alkyl C、105−160 ppm を Aromatic C としてまとめて考察した。HA は芳香族に富んでいることが分かった。これはリグニン由来のフェノール酸類を多く含むためと思われる。FA は HA に比べ芳香族のピークが弱いが、カルボキシル基の 160−180 ppm のピークエリアが大きい。これは、FA に多く含まれているカルボン酸によるものと思われる。これらの特徴は他の研究でも見られている。SWEOM はアルキル鎖を豊富に含み、芳香族は少ないことが分かった。SWEOM は元素分析の結果より O/C モル比が FA と同程度であるのに対し、160−220 ppm に現れるカルボキシル基含量については、FA よりも低く HA と同程度又は若干高くでた。これは元素分析結果や酸性官能基試験の結果と併せて考えると、主にエステルやケトン、アルデヒドによるものと考えられる。一方、脂肪族のアルコールやエーテルは HA や FA と比べ SWEOM では、豊富に含まれていることが分かった。これらから、SWEOM はアルキル鎖や脂肪族のアルコール、エーテルが中心の構造であると考えられる。以上より、SWEOM では多糖類やタンパク等、非 HS による寄与があると考えられる。
図 4.2.1-1 SWEOM, HA, FA の固体 CP-MAS $ ^{13}C $ NMR スペクトル

図 4.2.1-2 $ ^{13} $ C NMR スペクトルから計算した各炭素種の割合
## (3) -5 鉄錯体の熱化学的・速度論的安定性

Fe $ ^{2+} $ を含む SWEOM 等の腐植物質（HS）水溶液中での、Fe(II)-HS 錯体の錯形成反応モデルは以下のような単純なモデルで考えた。

$$ F e^{2+}+H S\leftrightarrow F e(I I)^{-}H S $$

HSと$\mathrm{Fe}^{2+}$の錯形成平衡状態は、HS分子中のリガンドを$L_{i}$と表すと、式(1)より

$$ [Fe^{2+}]+[L_{i}]\quad\leftrightarrow\quad[Fe(II)^{-}L_{i}] $$

と表せられる。すると式(2)より、この錯形成反応の生成定数 $ K_{b} $ は以下のように書ける。

$$ K_{b}=\frac{[Fe(II)^{-}L_{i}]}{[Fe^{2+}][L_{i}]} $$

HS 中に含まれる $ \mathrm{Fe(II)} $ は、 $ \Sigma[\mathrm{Fe(II)-Li}] $ と表せられる。これは、以下の様に考えられる。

$$ \begin{array}{r c l}{[F e(I I)^{-}L_{i}]}&{=}&{[F e(I I)]_{t o t a l}-[F e^{2+}]}\\ \end{array} $$

ここで、 $ [\mathrm{Fe(II)}]_{\mathrm{total}} $ 及び $ [Fe^{2+}] $ はそれぞれ全 $ \mathrm{Fe(II)} $ 濃度とフリーの $ \mathrm{Fe(II)} $ イオンの濃度を表す。さらに、全リガンド濃度を $ C_{L} $ とおいて考えると、これは HS 中の任意の結合サイトの濃度を使って以下の様に表せられる。

$$ \begin{array}{rcl}C_{L}&=&\sum C_{L_{i}}&=&\sum\left([L_{i}]+[Fe(II)^{-}L_{i}]\right)\\\end{array} $$

式(3)、(5)より錯形成したFe(II)の全濃度とフリーのFe(II)イオンの濃度の関係は

$$ \begin{aligned}\sum[Fe(II)^{-}L_{i}]&=\frac{C_{L}K_{b}[Fe^{2+}]}{1+K_{b}[Fe^{2+}]}\end{aligned} $$

と表せられる。各 $ Fe^{2+} $ 濃度と錯形成した $ \mathrm{Fe(II)} $ の全濃度は比色法によって求められる。このプロットに式(6)をフィッティングすることで全リガンド濃度 $ C_{L} $ と錯生成定数 $ K_{b} $ が求められる。さらに、HS 中のリガンドと錯形成した $ \mathrm{Fe(II)} $ のモル数を比較するため、以下の式によって錯化容量 N を求めた。

$$ N\ =\ \frac{C_{L}}{[HS]\times\%C/100} $$

なお、フィッティングは Origin Pro 8.1 によって行った。測定は各試料 3 回行い、その各点の平均値をプロットしたものをフィッティングに用いた。

図 4.2.1-3 と表 4.2.1-4 に SWEOM、HA 及び FA の比色検定結果とフィッテイング曲線、錯体安定定数を示す。SWEOM、HA 及び FA のプロットは式(6)でよくフィッテイングできた $ (r^{2}=0.97 $ for SWEOM, $ r^{2}=0.97 $ for HA, $ r^{2}=0.99 $ for FA)。
SWEOM は錯化容量がもっとも小さいが、錯生成定数は高いことから、HA や FA と比較して錯体としての溶存安定性が高いといえる。逆に、HA では錯化容量が最も大きく、錯生成定数は小さい値となった。FA は、リガンドとして働くと思われる酸性官能基量が最も多かったが、錯化容量は比較的小さな値であり、錯生成定数は SWEOM と同様高い値を示した。

FA は SWEOM と比べてカルボン酸量が非常に多かったにもかかわらず、錯化容量は SWEOM より若干大きい程度で、カルボン酸量が中程度であった HA が最も錯化容量が大きくなった。これより、錯化容量には酸性官能基量だけでなく、構造的な要因が深くかかわっていると考えられる。SWEOM 等の構造的特色を考えると、TMAH-py-GCMS の結果等から、HA は最もフェノール酸類を含むと考えられる。リグニン由来のフェノール酸類のようにオルト位にカルボキシル基又はフェノール性水酸基をもつような構造が錯形成により有利に働くため、含有酸性官能基量だけでなく芳香族部位の豊富な構造をとる HA が金属と錯形成しやすくなると考えられている。そのため、芳香族に富み。フェノール酸類が多く検出された HA は図 4.2.1-3 で表したようなフェノール酸類がリガンドとなる錯体を形成しており、構造上錯形成に有利であるため錯化容量が最も大きくなったと考えた。一方、FA ではカルボン酸量は多いが、フェノール性水酸基量は SWEOM と同程度であった。さらに TMAH py-GC/MS ではリグニン由来と思われるフェノール酸類がほとんど検出されなかった。これより、FA では構造中の脂肪酸部位がリガンドとして働いていると考えられる。SWEOM は、脂肪酸中心の構造であるがフェノール酸類も若干検出されており、どちらもリガンドとして働いていると考えられる。以上より、脂肪酸がリガンドとして働く場合は Fe(II)と錯形成しやすく、フェノール酸類では安定定数は低いが構造上錯形成に有利であるため、錯化容量が増加すると考えた。

海水中での溶存安定性、すなわち熱力学的安定性という観点からは錯生成定数は重要なパラメータであるが、Fe(II)-SWEOM 錯体から Fe が植物に取り込まれる場合、シデロフォアなど植物からの分泌物との錯体を介して、或いは直接膜タンパクにより Fe を取り込むメカニズムが一般的に知られている。これら植物への輸送物質との配位子交換がスムーズに行われなければ、Fe が溶存していても植物に対する有用性は低いと考えられる。ゆえに、錯体は生成定数が高く溶存安定で、すぐに解離することが必要である。すなわち、生物利用性を検討するためには Fe-SWEOM 錯体の熱力学的安定性だけでなく、速度論的不安定性についての検討もすることが必要である。そこで、速度論的安定性についても検討した。
本研究で使用した SWEOM、HA 及び FA は、比色試薬として用いた OP $ \left(\log\beta_{3\mathrm{~of~Fe(II)-OP}}=21\right) $ と比較すると、Fe(II) との親和性は弱い。そのため、OP 共存化では、時間経過に伴い式(8)の様に Fe(II)-HS 錯体から Fe(II) が解離し OP と錯体を形成する。

$$ Fe(II)^{-}HS+OP\quad\rightarrow\quad HS+Fe(II)^{-}OP $$

この性質を用いて SWEOM、HA 及び FA の Fe(II) 錯体の解離速度を比較した。その結果を図 4.2.1-4 に示す。錯体濃度の速度式は、擬一次解離速度定数 $ k_{obs} $ を用いて式(9)のように表せられる。

$$ [F e(I I)^{-}L]_{t}\;=\;[F e(I I)^{-}L]_{0}\exp(-k_{o b s}t) $$

実験値のプロットに対し、Origin Pro 8.1 にて式(9)のフィッティングを行ったところ、表4.2.1-4 に示されているように高精度でフィッティングすることができた $ (r^{2}=0.99 $ for SWEOM, $ r^{2}=0.87 $ for HA, $ r^{2}=0.87 $ for FA)。

求めた $ k_{obs} $ から、SWEOM 及び FA は錯形成した Fe(II) を解離しやすいことが分かった。一方、錯化容量が最も大きかった HA は、SWEOM や FA と比較して Fe(II) を解離しにくいことが分かった。HA はフェノール酸類がリガンドとなると考えられるが、このような錯体は解離しにくく、比較的強い結合となると考えられる。SWEOM や FA のように脂肪酸をリガンドとする場合は、解離しやすい錯体を形成すると考えられる。

EDTA（エチレンジアミン三酢酸）や乳酸は、錯配子のモデル化合物として知られており、Fe-EDTA錯体を用いた鉄有機物錯体と植物の鉄摂取との関係が検討されてきた。そこで、本研究において SWEOM 等の解離速度の比較対象として、これらのモデル化合物の o-フェナントロリン共存下での Fe(II)の解離速度についても同実験を行い、検討した。その結果、

Fe(II)-EDTA 錯体からの Fe(II) の解離は確認されなかった（図 4.2.1-4）。一方、Fe(II)-乳酸錯体は速度論的に非常に不安定であり、o-フェナントロリン共存下では即座に解離することが確認された $ (k_{\mathrm{obs}}=2.9\ \mathrm{s}^{-1}) $ 。ここで、海藻への鉄の摂取量と EDTA 濃度の関係を見た研究において、EDTA 濃度の上昇とともに海藻の鉄摂取量が減る傾向にあることが確かめられており、Fe-EDTA 錯体は海藻の鉄摂取において生物的利用性に欠けると考えられる報告もなされている。しかし、海水中に自然に溶存している低分子有機物分画（<1kDa）の鉄錯体が海藻類の鉄摂取に貢献するという報告もなされている。これらより、海藻類の鉄の摂取メカニズムにおいて有機物が鉄との錯形成及び溶存に寄与していると考えられるが、Fe-EDTA 錯体のように速度論的に安定な錯体の場合、海藻からのシデロフォアなどの分泌物が鉄と錯形成でき
ず、その結果海藻の鉄の摂取を妨げてしまうと考えられる。ゆえに、乳酸やSWEOMのように速度論的に不安定であれば、錯形成して溶存鉄濃度を上昇させると同時に、シデロフォア等に鉄を渡すキャリア一として海藻類の鉄の摂取を促すことができると考えられる。

表 4.2.1-4 SWEOM, HA, FA の鉄(II)錯形成能と錯体の解離速度定数

Sample	Binding abilities	Dissociation rate
$ \log K_{\mathrm{b}} $	$ N (\mu\mathrm{mol}\ \mathrm{g}^{-1}\mathrm{C}) $	$ r^{2} $	$ (\mathrm{s}^{-1}\times10^{-5}) $	$ r^{2} $
5.53	82.89	0.97	6.85	0.99
HA	4.92	272.19	0.97	2.30	0.87
FA	5.30	119.48	0.99	5.79	0.87

図4.2.1-3 遊離の鉄濃度と錯体濃度との関係および錯形成部位の推定構造
図 4.2.1-4 Fe(II)-SWEOM, HA, FA 錯体の解離速度曲線
## (3) -6 鉄(II)-HA, FA, SWEOM 錯体の解離速度に対する活性化パラメータの評価

一般に、溶存有機物と錯形成している鉄(II)は、生体膜に於ける金属受容タンパクと配位子交換することにより、海藻中に取り込まれることが知られている。したがって、鉄(II)-溶存有機物錯体の解離速度が速いほど生物利用性も大きくなると考えられる。前節では、OPを金属受容タンパクのモデルとして、配位子交換速度を評価する手法の開発を行い、HA、FA、そしてSWEOMに対する解離速度定数を求めることができた。確かにFe(II)-SWEOM錯体の解離速度定数は、HAおよびFAのものに比べ小さかったが、オーダーによる大きな変化ではなかった。錯体の速度論的な解離安定性を評価するためには、動力学的パラメータである活性化自由エネルギー( $ \Delta G^{\neq} $ )、活性化エンタルピー( $ \Delta H^{\neq} $ )、活性化エントロピー( $ \Delta S^{\neq} $ )を求める必要がある。したがって、活性化パラメータに関する評価を行った。

鉄(II)-溶存有機物錯体(Fe(II)-DOM)は、OP のような強い配位子共存下では配位子交換により解離する。OP 共存下での Fe(II)-DOM 錯体の解離は、以下の式に示すように活性錯合体である三元錯体[OP-Fe(II)-DOM] $ ^{\neq} $ を経て Fe(II)-OP を形成すると考えられる。

$$ Fe(II)\cdot DOM+OP\xlongequal{\quad}\left[OP\cdot Fe(II)\cdot DOM\right]^{\ddagger}\xlongequal{\quad}DOM+Fe(II)\cdot OP $$

Fe(II)-DOM 錯体の解離は、反応(10)で示したように発色する Fe(II)-OP の生成を吸光光度法でモニターすることにより計測することが可能である。しかし、擬一次速度定数 $ (k_{\mathrm{obs}}) $ は Fe(II)-DOM 錯体の濃度 $ (\Sigma[\mathrm{Fe(II)-DOM}_{i}]) $ の減少速度として、以下の式に従い評価した。

$$ -\frac{\mathrm{d}\Sigma[\mathrm{Fe}(\mathrm{II})-\mathrm{DOM}_{i}]}{\mathrm{d}t}=k_{\mathrm{obs}}\times\Sigma[\mathrm{Fe}(\mathrm{II})-\mathrm{DOM}_{i}] $$

式(11)の積分型は以下のように書ける。

$$ \ln\frac{\Sigma[\mathrm{Fe}(\mathrm{II})-\mathrm{DOM}_{i}]_{t=t}}{\Sigma[\mathrm{Fe}(\mathrm{II})-\mathrm{DOM}_{i}]_{t=0}}=-k_{\mathrm{obs}}\times t $$

ここで、tはOPを加えてからの反応時間を示している。反応(10)において、一時的な化学種 $$ OP-Fe(II)-DOM $$ は、配位子交換でFe(II)-DOMからFe(II)-OPを生成する活性錯合体と見なすことができる。反応(1)に対する活性化パラメータを評価するため、 $ k_{obs} $ の温度依存性を $ 10-40^{\circ}C $ の間で検討した。活性化自由エネルギーは以下のように書くことができる。
$$ k_{\mathrm{o b s}}=\frac{k_{\mathrm{B}}T}{h}\exp(-\frac{\Delta G^{\ddagger}}{R T}) $$

ここで、 $ h, k_{B}, T $ そして R は、それぞれ、プランク定数、ボルツマン定数、絶対温度、そして気体定数を示している。式(4)から、 $ \Delta G^{\neq} $ がある温度での $ k_{obs} $ を用いることにより計算できる。 $ \Delta G^{\neq} = \Delta H^{\neq} - T \Delta S^{\neq} $ より、式(4)は活性化エンタルピー( $ \Delta H^{\neq} $ )と活性化エントロピー( $ \Delta S^{\neq} $ )を用いることにより、以下のように書ける。

$$ \ln\frac{k_{\mathrm{obs}}}{T}=\ln\frac{k_{\mathrm{B}}}{h}+\frac{\Delta S^{\ddagger}}{R}-\frac{\Delta H^{\ddagger}}{R}\times\frac{1}{T} $$

式(14)は、 $ \ln k_{obs}/T $ と 1/T との直線的な相関関係を示しており、アイリングプロットと呼ばれている。 $ \mathrm{Fe(II)-SWEOM, Fe(II)-HA} $ そして $ \mathrm{Fe(II)-FA} $ 錯体に対するアイリングプロットを図4.2.1-5に示す。

図 4.2.1-5 Fe(II)-SWEOM 錯体(●), Fe(II)-HA 錯体(■)そして Fe(II)-FA 錯体(▲)に対するアイリングプロット
$ \Delta S^{\neq} $ と $ \Delta H^{\neq} $ は、それぞれ、y-切片と直線の傾きから評価することができた。また、 $ \Delta G^{\neq} $ は283 Kの条件で計算した。それらの結果を表4.2.1-5に示す。

表4.2.1-5 各錯体に対する錯形成能と活性化パラメータ.

Sample	Binding abilities	Activation parameters
$ \log K' $	N (mmol g $ ^{-1} $ C)	$ \Delta H' $ (kJ mol $ ^{-1} $ )	$ \Delta S' $ (J K $ ^{-1} $ mol $ ^{-1} $ )	$ \Delta G_{fa} $ (kJ mol $ ^{-1} $ )
SWEOM	5.63±0.15	80.0±7.9	18.8±1.1	-267±4	94.3±2.2
HA	5.01±0.26	235±62	26.6±3.4	-243±11	95.5±6.6
FA	5.39±0.10	112±10	27.0±1.6	-236±5	93.8±3.1

$ ^{a} $ $ \Delta G^{\ddagger} $ values were evaluated at 283 K.

ΔSは、活性錯合体の安定性に関わる情報を与える。しかし、ΔGおよびΔSは、いずれの錯体でも大きな違いは見られなかった。この結果は、Fe(II)-DOM錯体の解離反応における反応中間体、すなわち活性錯合体の安定性は大きく変わらず、反応(1)で示した三元錯体であることを示唆している。一方、表4.2.1-5に示したように、Fe(II)-SWEOMのΔHは、Fe(II)-HAやFe(II)-FAに比べ明らかに低くなった。ΔHは、活性錯合体の解離エネルギーであり、錯体の解離安定性が低いほど低くなる。ゆえに、Fe(II)-SWEOM錯体はFe(II)-HA錯体やFe(II)-FA錯体に比べ解離しやすく生物利用性も高いことが示唆された。
## (4) まとめ

従来、腐植物質、特に溶存性の観点から FA が海水中で鉄と錯形成し、溶存鉄濃度の上昇に寄与していると考えられていたが、HA や FA は海水の様な高塩濃度では凝集沈殿し溶存が困難であるので、鉄のキャリア一として作用するか否かが甚だ疑問である。海水という特殊な環境下で溶出する SWEOM は HA 及び FA とは異なる構造的特色をもつことが明らかとなった。SWEOM は、HA 及び FA と比較して、脂肪酸に富み、分子量の大きい分画であることが分かった。FA と同程度の O/C モル比にも関わらず酸性官能基量は少なく、エーテルやアルデヒド、アルコール、ケトンを多く含んでいることが分かった。ステロイド等の脂質も溶出しており、SWEOM 中に多く含まれていることが分かった。多糖類やタンパク等、非 HS も溶出していると考えられ、N 含有量やアミノ酸含有量が高かった。

Fe^{2+} との錯形成能を検討した結果、SWEOM は鉄との錯化容量が最も小さいことが分かった。錯化容量については、HA はフェノール酸類を豊富に含むため構造的に有利で、SWEOM は脂肪酸中心の構造であるために錯化容量が小さくなったと考えた。また、Fe(II)-SWEOM 錯体の解離に関わる活性化パラメータを、OP との配位子交換に基づき測定し Fe(II)-HA, Fe(II)-FA と比較した。Fe(II)-SWEOM 錯体の活性化エンタルピーは、Fe(II)-HA 錯体および Fe(II)-FA 錯体の値に比べて大きく低くなり、解離しやすく生物利用性が高い錯体であることが示唆された。
## 4 ．2．2　海水抽出溶存有機物の分子量分画とそれらの鉄(II)錯形成能

## (1) はじめに

H22 年度には、SWEOM の構造的特色に関する検討を行ってきた。その結果、HA や FA に比べ SWEOM は広い分子量分布を有し、バークに由来するフェノール部位のみだけではなく微生物に起因するアミノ酸や脂質部位など多様な成分からなることがわかった。水圈中の溶存有機物は、微量金属の生物利用性に深く関与しており、分子量サイズによってその有効性が大きく異なることが知られている。そこで、限外濾過法により SWEOM を分子量分画し、各分子量サイズの含有量分布と主要分画に対する構造的特色を検討した。一方、H22 には SWEOM と HA や FA のような腐植物質との鉄(II)に対する錯形成能を OP 発色法により評価し比較検討したが、OP の発色条件が弱酸性であったため、海水の条件(pH 8.1)とは大きく異なった。しかし、SWEOM は、HA や FA と比べ錯化容量が小さいけれど解離しやすく生物利用性が高いことが示唆された。本実験では、OP より発色の pH 反応が広いフェロジン発色試薬を用い海水条件(イオン強度 0.7, pH 8.1)で、SWEOM の各分画に対する鉄(II)錯形成能を評価する手法に関しても検討を行った。実際の海水条件の場合、試薬の発色 pH だけではなく Fe(II)も酸化されて水酸化物となる問題点がある。そこで、系内にアスコルビン酸を抗酸化剤として添加して酸化を防ぐ試みを行った。

## (2) 方法

## (2) -1 SWEOM 試料の分子量分画

市販の完熟バーク堆肥を凍結乾燥し、2mmの篩通過分を抽出に用いた。堆肥粉末と人工海水（pH 8.1）を1:10（w/w）で混合したものを $ N_{2} $ 雰囲気下で3日間振盪抽出後、遠心分離し上澄み液を濾過することで固形物を分離した。先の濾液から限外濾過によって分子量100 kDa以上、100-30 kDa、30-10 kDa、10-5 kDa、5-0.5 kDa、0.5 kDa以下の分画を濾縮、超純水で洗浄し脱塩を行った。各分画の有機炭素量は、全有機炭素(TOC)分析計にて測定した。0.5 kDaの限外濾過膜でのみ濾縮精製した分画をSWEOM-N分画(N)、100 kDaの限外濾過膜上に濾縮された分画をSWEOM-L分画(L)とし、凍結乾燥によって粉末状の試料として得た。0.5 kDa未満の分画は、塩酸によってpH 1.0未満にした後、DAX-8樹脂に吸着させ純水で洗浄し脱塩を行った。吸着分画はNaOH (0.01 M)で溶出し陽イオン交換樹脂によってH⁺型とした後、凍結乾燥を経て粉末試料を得た。これを
SWEOM-S 分画(S)として用いた。各分画の収量は N, L, S それぞれ 0.12, 0.11, 0.13 % (w/w of compost sample) であり、全 SWEOM の約 80% を精製、回収することができた。

## (2) -2 各分画のキャラクタリゼーション

以下の項目に関して、4.2.1 節の方法に従い分析した。

· 元素分析

· 酸性官能基分析

· 分子量分布

· 固体 CP-MAS $ {}^{13} $ C NMR

## ・フーリエ変換赤外吸収(FT-IR)スペクトル

KBr 粉末 100 mg に対して各 SWEOM 分画粉末を 1 mg 添加し、瑪瑙乳鉢上で乳棒を用いて粉砕・混合した。これを一晩真空乾燥した後にペレットとして、FT/IR 600 型フーリエ変換赤外分光光度計(日本分光)により FT-IR スペクトルを測定した。測定におけるピーク分解能は 4 cm^{-1} とした。

## (2) -3 Fe(II)に対する錯形成能の評価

pH 8.1 に調整した Tris 海水緩衝液を表 4.2.2-1 のような組成で調製した。この緩衝液にアスコルビン酸が 0.01 M となるように添加し、10～30 μL の 5 mM Fe^{2+} 標準液を加えた後、50 mg L^{-1} の濃度になるように SWEOM の各分画を添加した。25℃で 10 min 静置後、250 μL の 50 mM フェロジン(FZ)水溶液を添加し 562 nm の吸光度の時間変化を測定した。実験操作のフロチャートを図 4.2.2-1 に示す。
表 4.2.2-1 Tris 海水緩衝液の組成

Composition of Tris–Seawater in 1000 mL

NaCl	28.0 g
KCl	0.7 g
$ MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O $	7.0 g
$ MgCl_{2} \cdot 6H_{2}O $	4.0 g
$ CaCl_{2} $	1.11 g
Tris	1.0 g

### 0.8 × Tris-Seawater

図4.2.2-1 海水条件下での鉄(II)錯形成能評価方法の標準操作
## (3) 研究の成果

(3)-1 SWEOM 分子量分画の分布

HA、FA と SWEOM(N 分画)のサイズ排除クロマトグラムと数平均(Mn)および重量平均(Mw)分子量の計算値を、それぞれ、図 4.2.2-2 および表 4.2.2-2 に示す。

図 4.2.2-2 HA, FA, SWEOM(N 分画相当)のサイズ排除クロマトグラム

表 4.2.2-2 HA, FA, SWEOM(N 分画相当)の分子量

Sample	Molecular weight
Mw	Mw/Mn
SWEOM	28700 $ \pm $ 500	17.7
HA	10900 $ \pm $ 200	7.02
FA	1250 $ \pm $ 20	1.62

表 4.2.2-2 に示されているように、分子量分布の大きさを示す Mw/Mn 比は SWEOM の方が HA や FA に比べ大きく、様々な分子量分画を含む混合物であることが示唆された。したがって、これら分子量分画を詳細に分画し、各分画の分布と構造的特色を明らかにすることが必要である。
堆肥からの SWEOM 画分に関して、限外濾過を用いて分子量分画した。0.5 kDa 以上の分画は、各限外濾過膜上の残留分を回収し、超純水で 100 mL に定容した溶液の TOC 値で比較した。図 4.2.2-3 に分子量分画の含有量分布を示す。0.5 kDa 未満の分画 S は、以下の式に示すように、N 分画の収量に対する S 分画の収量の比を 0.5 kDa 以上の合計 TOC 値に掛けた値を用いた。

$$ TOC_{S}=TOC_{L}\times\frac{yield of S}{yield of L} $$

これより、SWEOM は 100 kDa 以上の高分子量分画 (L) と 0.5 kDa 未満の低分子量分画 (S) で占められていることが明らかになった。そこで、中心的な L、S と 100 - 0.5 kDa を含めた 0.5 kDa 以上の N の 3 分画について検討した。

図 4.2.2-3 SWEOM 分子量分画の分布
## (3) -2 N, S, L 分画の構造的特色

## ·有機元素組成

表4.2.2-3にN,S,L分画の有機元素組成(C,H,N,S,O含有率)を示す。SWEOM(N分画に相当)は、HAやFAに比較して飽和炭化水素と窒素含有化合物に富む分画であることが明らかとされた。表4.2.2-2からN分画とL分画の元素組成は、ほぼ同様であった。しかし、S分画についてはNおよびL分画に比べH/C原子数比が小さく、N/C原子数比が小さかった。S分画における低いH/C原子数比およびN/C原子数比は、NおよびL分画に比べ飽和炭化水素の割合が小さく、アミノ酸やタンパクなど窒素含有化合物の割合が小さいことを示唆している。一方、O/C原子数比に関してはNおよびL分画とほぼ同等の値となった。SWEOMはHAやFAに比べてO/C原子数比が高いけれど、これら酸素含有化合物は鉄との錯形成に関与するカルボキシル基やフェノール性水酸基のような酸性官能基ではなく、エーテルやエステルに由来する酸素であることが明らかとなっている。各分画に関して酸素含有化合物の種類を明らかにするため、酸性官能基含有量や分光スペクトルによる構造解析を行う必要がある。

表4.2.2-3 N, L, S 分画の有機元素組成

Sample	%C	%H	%N	%S	%O	%ash	H/C	N/C	O/C
N	46.17	6.11	6.53	0.87	37.78	2.54	1.58	0.12	0.61
L	43.49	6.19	5.93	1.11	36.91	6.38	1.70	0.12	0.64
S	45.32	4.74	4.07	1.34	37.38	7.16	1.25	0.08	0.62

## ·酸性官能基组成

N, L, S 分画に関する酸性官能基分析の結果を表 4.2.2-4 に示す。元素組成が類似していた N と L について、カルボキシル基(COOH)含有量は N の方が高く、フェノール性水酸基(Phenol-OH)含有量は L の方が高かった。この結果は、N 分画における 0.5 kDa～100 kDa の分画の寄与を示唆している。したがって、100 kDa 以上の高分子の分画は、カルボキシル基が少なくフェノール性水酸基を多く含むと考えられる。また、S 分画は N と L に比べ、カルボキシル基とフェノール性水酸基の含有量がともに高く、これらの合計値である全酸度(すなわち全酸性官能基含有量)は、3 分画の内最も大きな値となった(N 7.60 mmol g⁻¹ C; L 10.2 mmol g⁻¹ C; L 10.2 mmol g⁻¹ C)
$ g^{-1} $ C; S 16.8 mmol $ g^{-1} $ C)。この結果は、S 分画が他の分画に比べ鉄(II)との錯形成に関与する酸性官能基を多く含むと共に親水性に富むことを示している。

表 4.2.2-4 N, L, S 分画の酸性官能基含有量 (単位 : mmol g $ ^{-1} $ C)

Sample	COOH	Phenolic-OH
N	3.85	3.75
L	0.47	9.73
S	5.87	10.9

## · $ {}^{13} $ C NMR スペクトル

図 4.2.2-4 に固体 CP-MAS $ {}^{13} $ C NMR スペクトルを、表 4.2.2-5 にピーク帰属を示す。N と L に関しては 60 - 90 ppm に見られる脂肪族エーテル、脂肪族アルコールの酸素に結合した炭素のピークが強く表れている。また、L に関しては、0 - 50 ppm のメチルおよびメチレン炭素のピークが強く表れた。したがって、これらの分画は脂肪族性が高いものと考えられる。一方、S に関しては N や L で表れた脂肪族炭素のピークは弱く、105 - 160 ppm の芳香族炭素のピークが強く出た。しかし、N や L 分画では芳香族炭素のピークは強く表れなかった。これらの結果は、S 分画が N および L 分画に比べ芳香属性に富むことを示している。また、160 ppm 以上に表れるカルボニル炭素のピークが、L および S で強く表れた。S についてはカルボキシル基含有量が大きかったため、このピークはカルボン酸のカルボニル基に起因すると考えられる。しかし、L の場合カルボキシル基含有量は 3 つの分画の中で最も低かった。したがって、 $ {}^{13} $ C NMR スペクトルで見られた強いカルボニル炭素のピークは、アミドやエステルおよびアルデヒドやケトンに起因すると推測できる。

N と L 分画では、脂肪族炭素のピークが S 分画では芳香族炭素のピークが強く表れた結果は、N と L 分画は脂肪族のような飽和炭化水素に富み、S 分画は芳香族のような不飽和炭化水素分に富むことを示しており、これらの結果は H/C 原子数比で見られた傾向と良く一致した。
Carbonyl C Aromatic C

図 4.2.2-4 N, L, S 分画に対する固体 CP-MAS $ ^{13} $ C NMR スペクトル

表 4.2.2-5 SWEOM 分画に対する $ {}^{13} $ C NMR のピーク帰属

ppm	Carbon species
0-60	Alkyl C
60-90	Aliphatic alcohols & ethers C
90-105	Polysaccharide C
105-160	Aromatic C
160-180	Carbonyl C (acid, esters, amino)
180-220	Carbonyl C (quinone, ketone, aldehyde)
## ・FT-IR スペクトル

図4.2.2-5に各分画のFT-IRスペクトルを示す。N分画とL分画では、2900 cm⁻¹付近にアルキル鎖のメチルおよびメチレンに由来するC-H伸縮振動のピークが強く表れたが、S分画に関してこのピークは弱かった。この傾向は、 $ ^{13} $ C NMRスペクトルおよびH/C原子数比の傾向と良く一致し、NおよびL分画が脂肪族性に富み、S分画が芳香属性に富むことを示している。また、S分画ではカルボキシル基のカルボニルに由来する1760 cm⁻¹付近のC=O伸縮振動のピークが強く表れ、カルボキシル基含有量の結果とも良い一致を示した。また、S分画では表れなかったが、NとL分画では1550 cm⁻¹に強いアミドⅡバンドが見られた。 $ ^{13} $ C NMRスペクトルにおいて、NおよびL分画ではカルボキシル基含有量が少ない割には強いカルボニル炭素のピークを観測した。これは、FT-IRスペクトルの結果からアミドのカルボニルに由来するものと考えられる。

図 4.2.2-5 N, L, S 分画の FT-IR スペクトル

以上の結果から N, L, S 分画の構造的特色を以下のように纏めた。

① 高分子量である L 分画は脂肪族性に富み、低分子量の S 分画は芳香属性に富む。

② S 分画は、鉄(II)との錯形成に関与する酸性官能基を多量に含む。
## (3) -3 海水条件下での鉄(II)錯形成能の評価

鉄(II)との錯形成能を評価する場合、遊離のFe(II)と錯体化学種としてのFe(II)を形態別に分析する必要がある。OP同様、FZも遊離のFe(II)に対して選択的に錯形成し、SWEOMとの錯体に対しては不活性であることが知られている。しかし、FZのFe(II)に対する錯形成能はOPに匹敵するほど大きい。したがって、Fe(II)-SWEOMの溶液にFZを加えると反応(1)と同様な配位子交換反応が起こり、Fe(II)-SWEOM錯体は解離すると考えられる。

$$ \mathrm{Fe}(\mathrm{II})+\mathrm{FZ}\Leftrightarrow\mathrm{Fe}(\mathrm{II})-\mathrm{FZ} $$

$$ \mathrm{Fe(II)-SWEOM_{labile}+FZ\Leftrightarrow SWEOM+Fe(II)-FZ} $$

ここで、Fe(II)-SWEOM_{labile} は、錯体化学種の中でも FZ により交換可能な錯体を示している。実際の溶液中には $ Fe^{2+} $ ， $ FeOH^{+} $ のような Fe(II) の非錯形成化学種が存在しており、これらは反応(16)に従い FZ と錯形成し発色する。しかし、溶存酸素を含み pH が 8.1 と高い条件では、Fe(II) 化学種は容易に酸化され、Fe(III) の水酸化物コロイドを形成し測定が困難になる。実際に、Tris 海水緩衝液に Fe(II) のみを入れ、FZ で発色を行ってみると、入れた瞬間は十分に発色しているが(図 4.2.2-6c)、時間が経つと脱色していく傾向が見られた(図 4.2.2-6a)。これを防ぐために、抗酸化剤としてアスコルビン酸の添加を試みた結果、発色は時間が経っても安定していた(図 4.2.2-6b)。したがって、アスコルビン酸の添加が有効であると考えた。

図 4.2.2-6 Fe(II)-FZ 錯体の発色に及ぼすアスコルビン酸(AsA)の影響
アスコルビン酸を加えた場合、危惧されることは $ \mathrm{Fe(II)} $ とアスコルビン酸が錯形成し、反応 (16) および (17) の速度に大きな影響を及ぼすことである。しかし、アスコルビン酸と $ \mathrm{Fe(II)} $ との錯体の生成定数 $ (\log K_{\mathrm{b}}) $ は -1.16 ~ -2.11 と、 $ \mathrm{Fe(II)-SWEOM} $ の値 (5.5) に比べたら遙かに低いため、反応 (16) および (17) に及ぼす影響は無視されるほど小さいと考えられる。

反応(16)は非常に速く、反応(17)は比較的遅いことが知られている。これらの反応速度差を図示すると図4.2.2-7のようになる。

図 4.2.2-7 SWEOM の共存下、非共存下に於ける Fe(II)-FZ 錯体の生成量の時間変化

SWEOM が共存しない場合、Fe(II)-FZ 錯体の生成(562 nm における吸光度がその量に相当)は、20 s で一定になる。したがって、FZ を加えてから反応(16)が平衡に達するには 20 s かかると言える。一方、SWEOM と Fe(II) の混合している溶液系では、Fe(II)-SWEOM 錯体と非錯形成の Fe(II) が溶存している。ここで、反応(16)が平衡に達する 20 s までは、遊離の Fe(II) と FZ の錯形成による発色が観測され、それ以降、吸光度が一定になるまで FZ と交換可能な Fe(II)-SWEOM $ _{labile} $ 化学種の解離に伴う Fe(II)-FZ による発色が、反応(17)のように観測されると考えた。反応(16)による吸光度の最大値は、全 Fe(II) の濃度に相当する。しかし、SWEOM が共存する場合、吸光度は必ずしも SWEOM が共存しない場合と一致することはなく、それより低い値で一定となった。この差分は、主として解離不活性な Fe(II)-SWEOM 錯体の濃度に相当すると考えた。

任意の Fe(II)濃度で SWEOM が共存するとき、遊離の Fe(II)は 20 s 後の吸光度で測定することができ、図 4.2.2-7 で一定になる吸光度と 20 s の吸光度の差が解離活性の錯体化学種 Fe(II)-SWEOM $ _{labile} $ の濃度に相当する。したがって、溶液中の全 Fe(II)濃度を種々変化させ、
各々について遊離の $ \mathrm{Fe(II)} $ 濃度 $ \left(\left[\mathrm{Fe}^{2+}\right]\right) $ と $ \mathrm{Fe(II)-SWEOM_{labile}} $ の濃度 $ \left(\left[\mathrm{Fe(II)-SWEOM}\right]_{labile}\right) $ を測定すると図4.2.2-8に示したような関係が得られる。

図 4.2.2-8 $ \left[Fe^{2+}\right] $ と $ \left[\mathrm{Fe(II)-SWEOM}\right]_{labile} $ の関係

この関係は、従来のラングミュア型錯形成の理論に基づき以下のような式で解析できる。

$$ \boldsymbol{\Sigma}[Fe(II)\cdot L_{i}]=\frac{C_{L}K_{b}[Fe^{2+}]}{1+K_{b}[Fe^{2+}]} $$

$$ N=\frac{C_{L}}{[HS]\times\%C/100} $$

ここで、 $ C_{L}, K_{b}, N $ は、それぞれ、配位子の総濃度、解離活性錯体の条件生成定数、そして解離活性錯体の生成に対する錯化容量を示している。式(18)の図4.2.2-8に示したプロットへの非線形最小二乗近似により、 $ C_{L} $ および $ K_{b} $ を求めることができた(フィッティングカーブが図4.2.2-8に示されている)。得られた $ C_{L} $ を式(19)へ代入することにより、N の値を計算した。得
られた $ K_{b} $ および N の値を表 4.2.2-6 に示す。

表4.2.2-6 海水条件における N, L, S 分画の $ K_{b} $ および N

SWEOM	Complexation
$ \log K_{b} $	$ N(\mu \text{ mol } g^{-1} \text{ of } C) $
N	5.11	282
L	5.33	202
S	4.77	520

海水条件において、NおよびLの錯生成定数はSの場合に比べ若干高いが、錯化容量はS分画の方がNやL分画に比べ明らかに大きい値となった。この結果は、SWEOMの中でも分子量の低いS分画の方が、分子量の高いNやL分画に比べ解離活性な錯体を生成しやすく、生物利用性が高くなることを示唆している。

## (4) まとめ

海水抽出性有機物（SWEOM）は、高分子サイズ（>100 kDa）の分画と低分子サイズ（<0.5 kDa）の2分画で占められており、その間の分子量の存在量は極めて低かった。元素分析およびFT-ITや $ ^{13} $ C NMRのような分光学的測定結果から、高分子分画は脂肪族性に富み低分子の分画は芳香属性に富むことが分かった。さらに、低分子量分画の酸性官能基含有量は、高分子分画に比べ遙かに高く親水性に富むことが分かった。また、抗酸化剤としてアスコルビン酸を添加することにより、フェロジン発色試薬との配位子交換反応速度差を利用することにより、海水条件下における解離可能なFe(II)-SWEOM錯体の濃度([Fe(II)-SWEOM]_{labile})の測定を可能にした。この測定により、Fe(II)-SWEOM_{labile}の錯形成能を評価し、低分子量分画の錯化容量が大きいことを明らかにした。ゆえに、低分子量分画と鉄との錯体の生物利用性が高く、コンブの生長に影響するキレートとして貢献すると予測できる。
## 4 ．2．3　海水溶存有機物と鉄(II)との錯体の生物利用性

## (1) はじめに

前節において、SWEOM の低分子分画の鉄(II)錯体は解離活性であるため、生物利用性が高いことが示唆された。図 4.2.3-1 にコンブ(Laminaria Japonica)の生活環を示す。このサイクルの中で、雌雄配偶体の成熟に鉄(II)が関与していることが知られている。配偶体の生育は通常顕微鏡により観察できるが、雌性配偶体の場合、成熟すると卵原細胞を形成するので判別しやすい。これまで、鉄(II)の配偶体成熟に及ぼす影響は、鉄(II)を EDTA キレートとして添加し行われてきた。本実験では、鉄(II)を SWEOM との錯体として添加し、雌性配偶体の成熟に及ぼす影響を顕微鏡観察により評価した。

図4.2.3-1 コンブの生活環
## (2) 方法

雌性配偶体の培養は、10 ℃、光量20 μE m⁻¹ s⁻¹、明14 h/暗10 hの条件で14日間培養した。培養にはオートクレーブで滅菌したASP₁₂培地を用いた。ASP₁₂培地の組成を表4.2.3-1に示す。表中の黄色でマークしたEDTAと鉄(II)については、加えた場合と加えない場合について検討を行った。鉄(II)を添加したときには、その濃度が1 μMになるよう添加した。14日間インキュベータで培養後、雌性配偶体の卵原細胞の有無を倒立頭微鏡で観察することにより配偶体の成熟の有無を評価した。

表 4.2.3-1 ASP $ _{12} $ 培地の組成

$ ASP_{12} $ 培地人工海水

添加剂	量	单位
蒸留水	1	L
NaCl	28	g
MgSO4·7H2O	7	g
MgCl2·6H2O	4	g
KCl	0.7	g
CaCl2	400	mg
Na2SiO3·9H2O	150	mg
ビタミンB12	0.2	μg
ビオチン	1	μg
チアミン	100	μg
PII金属混液	10	mL
S2金属混液	10	mL
Tris	1	g

PII 金属混液

添加剂	量	单位
蒸留水	1	L
$ Na_{2} $ -EDTA	1	g
$ FeCl_{2} $	10	mg
$ H_{3}BO_{3} $	200	mg
$ MnCl_{2} $	40	mg
$ ZnCl_{2} $	5	mg
$ CoCl_{2} $	1	mg

S2 金属混液

添加剂	量	单位
蒸留水	1	L
Na2MoO4	50	mg
KBr	1	g
SrCl2	200	mg
RbCl	20	mg
LiCl	20	mg
I	1	mg
## (3) 研究の成果

(3)-1 ETDA キレートによる雌性配偶体の観察結果

図 4.2.3-2 上段に EDTA をキレート剤として 28 μM 添加して、Fe(II)を 1 μM 共存させた場合とさせない場合における雌性配偶体の顕微鏡写真を示す。EDTA 共存下でも Fe(II)が共存しなければ卵原細胞は見られなかった。しかし、EDTA 鉄を共存させると明らかに卵原細胞を確認することができた。一方、下段にキレート剤無しで鉄(II)を添加した場合としない場合の雌性配偶体の顕微鏡写真を示す。キレート剤が共存しないと鉄(II)が含まれていても配偶体は成熟しないことが明らかとなった。また、鉄(II)が共存するときにはコロイドのような沈殿が配偶体に付着しているのが確認され、これら水酸化物コロイドの生物利用性の低さが示唆された。以上の結果から、鉄(II)はキレート剤により溶存状態に保たれていなければコンブの生育に対して利用され得ないことがわかった。

図4.2.3-2 鉄(II)-EDTA錯体共存下および非共存下で二週間培養した雌性配偶体の顕微鏡観察
## (3) -2 キレート剤として SWEOM 分子量分画を用いた培養試験

図 4.2.3-3 に SWEOM の N 分画と S 分画を EDTA に替わるキレート剤として添加し、鉄(II)を添加した場合としない場合に対して培養した配偶体の顕微鏡観察結果を示す。いずれも場合も、鉄(II)が共存しない場合には配偶体の成熟が観測されなかった。N 分画を添加した場合、鉄を共存させると卵原細胞らしきものが見られるが判別が困難であった(図 4.2.3-3，赤色点線)。しかし、S 分画をキレート剤として用い鉄(II)を添加すると明らかな卵原細胞の出現を観測することができた(図 4.2.3-3，赤色実線)。

$ [Fe(III)_{Ladir} = 0 $

1 μm

SW-ONE落机大培地では、

He遺加上て成息が定

また。

→ re-SWTO49の為限上有

元与和。

図 4.2.3-3 鉄(II)共存下でキレート剤として SWEOM の N 分画(上段)あるいは S 分画(下段)を添加し二週間培養した雌性配偶体の顕微鏡観察

## (4) まとめ

SWEOM の S 分画と鉄(II) を添加したとき、コンブの雌性配偶体の成熟が確認された。この結果は、コンブの生育に利用される鉄(II)のキレート剤として S 分画（すなわち SWEOM における分子量 500 Da 以下の分画）が有用であることを示している。以上の結果から、SWEOM と鉄(II)との錯体はコンブの生育に対する利用性があることが実証され、この結果は 4.2.2 節で検討した labile な錯体の錯化容量の傾向とよく一致した。
## 4 ．2．4 埋設ユニットにおける腐植酸の構造変化

## (1) はじめに

本研究では、磯焼け海域(北海道增毛町)の植生復元を目的として、鉄(FeO、Fe₂O₃)を含む転炉系製鋼スラグと DOM を含む堆肥の混合物をヤシ繊維の袋に詰めた「施肥ユニット」を海中に埋設し、磯焼け沿岸海域への溶存鉄(Fe-DOM 錯体)の供給を図る技術の開発を目指している。我々が行ってきたこれまでの実証海域に於ける試験から、ユニット埋設後の海域において溶存鉄濃度は増加し藻場の再生も確認できた。しかしながら、溶存鉄濃度の増加と藻場再生との因果関係および溶存鉄が長期に渡り供給され続けるメカニズムは明らにされていない。ユニットによる施肥期間中に、製鋼スラグ、海水および微生物などとの相互作用により、堆肥中の DOM の化学組成が変化・変質すると考えられる。このような、DOM の構造変化は Fe に対する親和性も大きな影響を及ぼすと考えられる。よって、施肥期間における DOM の構造変化を知ることは、長期的・安定的に Fe 磯焼け海域に供給されるメカニズムを解明する上で重要であるが、これに関する検討例は報告されていない。

また、沿岸域の DOM の研究については HA に関する研究がされてきた。FA はいずれの pH に対しても易溶であるため、ユニット中からすぐに流出してしまうと考えられ堆肥効果の持続性に寄与するとは言い難い。また、HA は FA や小さな有機酸の前駆体と考えられ、施肥期間中に微生物作用や加水分解を受け、そのような小さな分子へ変遷していくと考えられる (Tan, 2003)。さらに、FA に比べれば HA は収量が多いため (HA/FA、0.32.6)、実験研究における構造解析が行いやすい利点を有する。そこで、本年度は施肥期間のおけるユニット中の HA の化学組成変化に及ぼすスラグの影響について検討した。本研究では、磯焼け海域である舎熊海岸 (北海道增毛町) に設置した試験水槽に混合比を変化させた転炉系製鋼スラグ一堆肥施肥ユニットを 6 ヶ月間埋設し、ユニット中の HA の量的変化を収量測定および TOC 測定、構造変化を元素分析、分子量測定、および熱分解 GC/MS (Py-GC/MS) により追跡した。

## (2) 方法

## (2) -1 水槽試験

屋外水槽は増毛漁協協同組合、(株)北海道オーシャングリーン開発および新日本製鐵(株)の協力のもと、磯焼け海域である北海道増毛町に設置した(図4.2.4-1)。水槽寸法は上部寸法：700×900 mm、下部寸法：600×800 mm、高さ：550 mm、水槽容量：300 Lであり、海水容量は200 Lとした。海水は、海からポンプで導入された海水をタンク上部から海水流入量4.1
L min $ ^{-1} $ でかけ流した。また、流出口はタンク下部に装着されており、垂れ流しの状態とした。

スラグ一堆肥施肥ユニットは水槽に投入する直前に作製した。スラグと堆肥を表 4.2.4-1 に示す体積比で混合し、3 個の木綿袋に入れた。なお、体積はスラグ 1.5kg を基準体積 V とした。V における堆肥重量は約 430 g である。同一混合比の施肥ユニット 3 個を 1 つの水槽に埋設した。試験期間は 2009 年 10 月～2010 年 3 月の計 6 ヶ月間である。

図4.2.4-1 試験水槽

表4.2.4-1 堆肥とスラグの混合割合

堆肥：製鋼スラグ = 1 : 0 $ (C1/S0) $

堆肥：製鋼スラグ = 0.75 : 0.25 (C3/S1)

堆肥：製鋼スラグ = 0.5 : 0.5 $ (C1/S1) $