Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
れに対して、蚊類が吸血活動する春から秋の時期にWNV侵淫地から日本に飛来する渡り鳥、たとえばシギやチドリ類のWNV感染状況を知ることは非常に重要である。しかし、これらの鳥類は体格が小さいために抗体測定に供するに充分な量の血液材料を採取することは困難である。また、WNV同様に鳥類に感染するといわれる日本脳炎ウイルスは日本や韓国、中国、東南アジア、オーストラリアまで広く分布し、それらの地域を移動もしくは生息する鳥類も感染している可能性を否定出来ない。WNVとJEVは抗原性が近く、両者の感染を区別するには高い特異性の抗体検査法が求められる。また、北米における流行の経験から、鳥類におけるWNV感染は種によって比較的マイルドな感染と致死的な感染となる。WNVが日本に侵入して自然環を形成してしまった場合、絶滅に瀕しているような希少鳥類に対するWNVの病原性を前もって知っておくことは対策を行う上で重要である。

## 2 ．研究開発目的

本研究では(1)日本に飛来するシギ・チドリ類を捕獲し、それらから得られる微量血液材料について、最も特異性が高い抗体測定法である中和試験で抗体測定を行い、捕獲された鳥類のWNV感染状況を明らかにする。加えて、シギ・チドリ類が飛来する北海道で飼育されたアイガモの血液材料についても同様の抗体測定を行い、ウイルス侵入および循環についても検討する。次に、(2)鳥類由来初代培養細胞におけるWNV増殖について解析し、由来する鳥類個体に対するウイルスの病原性の指標となり得るか否かを検討する。

## 3 ．研究開発方法

## (1) 鳥類の血清材料

2009年から2011年の3年間に北海道東部で捕獲されたシギ・チドリ類（2009年：152個体、2010年：145個体、2011年：110個体）から血液材料が得られた。さらに、2010年には沖縄県に飛来したシギチドリ類77個体からも血液材料が採取された。宮城県では2010年と2011年にオナガガモ(8および4個体)からも検体が取られた。加えて、北海道にて歩哨動物として飼育されたアイガモからも検体が供された。全ての検体は採取後に冷凍され、琉球大学に搬送された後も中和試験に供するまで-20℃で保存された。

## (2) 血液材料の前处理

全ての血液材料は10倍希釈した後に56℃で30分間の熱非働化処理を行い、遠心上清を中和試験に用いた。

## (3) 陽性コントロール血清の作製

サブテーマ2にて市販の精製WNV可溶化抗原および日本脳炎ワクチンをニワトリに接種して得られた抗血清を陽性コントロール血清とした。また、接種前のニワトリから得られた血清を陰性コントロール血清とした。

## （４）間接免疫染色法によるフォーカスアッセイ

細胞培養用の24もしくは96ウエルマイクロプレートに培養した細胞に被検ウイルス材料を接種し、24～30時間培養した後に細胞を固定・免疫染色して、頭微鏡下でウイルス感染細胞のフォーカスを観察・計数した。

## (5) 中和試験
前処理した被検血清とウイルス液を等量混合し、室温で90分間の反応の後に96ウェルマイクロプレートに培養したBHK-21細胞に接種し、上記フォーカスアッセイを行った。被検血清の代わりに血清希釈液とウイルス希釈液の混合液から得られたフォーカス数（コントロール）と被検血清とウイルス液の混合液から得られるフォーカス数を比較し、フォーカス減少率を計算した。上記中和試験にて被検血清におけるフーカス減少率が90%以上ある場合を中和抗体陽性とした。10倍希釈し被検血清でもフォーカス減少率が90%に達しない場合は中和抗体陰性(<10)と判定した。10倍希釈で中和抗体陽性の被検血清については、さらに階段希釈して上記中和試験を行い、フォーカスが90%減少する血清の希釈倍数を中和抗体価として求める。

## (6) 鳥類由来初代培養細胞のWNV感受性試験

サブテーマ2から提供されたニワトリ、ハト、カラスおよびヤンバルクイナ由来細胞を25cm²細胞培養用フラスコでおよそ50～80%位の密度になるように培養し、WNVを接種・吸着させ、経時的に培養上清を採取して培養液中に放出される子孫ウイルスの感染価を上記測定した。

## (7) 鳥類由来細胞のWNV遺伝子導入に関する試験

WNV遺伝子RNAの調整：225cm²の培養フラスコに増殖したヒトスジシマカ由来C6/36細胞株にWNV(NY株)を接種し、28℃にて一週間培養後、細胞を剥離させ、低速遠心にて感染細胞と感染培養上清に分離した。感染細胞はリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)で洗浄後、蒸留水で浮遊させた後に凍結保存した。感染培養上清は70%(v/v)になるようにエタノールを加え-20℃に冷却後、低速遠心し、沈澱をRNA精製に供した。DNase-I含細胞溶解緩衝液を細胞成分もしくは感染培養上清のエタノール沈殿物に加え、固形成分を溶解、RNA吸着用カラムに通導して試料中のRNAを吸着せしめ、カラムに洗浄用緩衝液を通導して夾雑物を除去した後にRNA溶出用緩衝液を通導し、吸着したRNAを溶出した。溶出したRNA画分は使用に供するまで-80℃に保存した。精製したWNV-RNA画分は階段希釈し、リポフェクトアミンと混合してマイクロプレートに培養した哺乳ハムスター腎由来BHK-21細胞、もしくはアフリカミドリザル腎由来Vero細胞の培養液に加え、24時間37℃で培養後に細胞をアルコール固定してWNV抗原の発現を確認し、ウイルスRNA画分の細胞導入に最適な希釈倍数を求めた。

トリ由来細胞へのWNV-RNA導入：超低温で保存してあるニワトリ、カラス、ハト、およびヤンバルクイナ細胞を解凍し、3日間培養して増殖させた。コラーゲン処理マイクロプレート(24well)に上記細胞を一晩培養し、ウイルス遺伝子導入実験に供した。BHK-21およびVero細胞への遺伝子導入で求めた最適希釈倍数でウイルス遺伝子画分を遺伝子導入用無血清培養液で希釈し、同無血清培養液で希釈したリポフェクトアミンを加えてRNA-リポフェクトアミン複合体を形成させ、各トリ由来細胞の培養液に加えた。2から6時間静置した後に増殖用培養液と置換し培養を続けた。各トリ由来細胞を培養したプレートは各々2枚準備し、一枚は遺伝子導入後24時間でアルコール固定して免疫染色法にてウイルス抗原の発現を確認した。残りの一枚は遺伝子導入後も継続して培養を継続し、培養上清中へのウイルス産生を確認した。

## 4 ．結果及び考察

## （１）ニワトリ標準抗血清の評価

サブテーマ2（近畿大学）から提供されたWNVとJEVに対するニワトリ抗血清の抗体価を中和試験で評価した(表(4)-1)。免疫に供されたニワトリは4個体とも免疫前の血清がWNVおよびJEV対
する抗体価が陰性で、両ウイルス抗原に対しては未感作であったことが確認された。可溶化精製WNVで免疫されたニワトリの中和抗体価は90%フォーカス減少法では全て陰性で、50%フォーカス減少法(FRNT)でのみ中和抗体が検出された。このことから、免疫に用いた可溶化WNV抗原の抗原量が少な過ぎたか、抗原が可溶化によって変性していた可能性が考えられた。一方、JEV抗原免疫された2個体のニワトリの免疫後血清は何れも高い中和抗体価を示した。JEV免疫ニワトリ抗血清は50%FRNTでWNVに対する弱い交叉中和も検出されが、90%FRNTで判定すると交叉中和は認められなかった。

表(4)-1. WNVもしくはJEVで免疫されたニワトリ抗血清の中和抗体価

免疫抗原	個体 コード	採血時期	中和抗体価
抗WNV	抗JEV
90%FRNT *	50%FRNT	90%FRNT	50%FRNT
WNV	A1	免疫前	<10	<10	<10	<10
免疫後	<10	26	<10	<10
A2	免疫前	<10	<10	<10	<10
免疫後	<10	17	<10	<10
JEV	C1	免疫前	<10	<10	<10	<10
免疫後	<10	13	48	2,700
C2	免疫前	<10	<10	<10	<10
免疫後	<10	25	720	8000

FRNT：フォーカス減少中和試験

## （２）中和試験における判定基準の決定

2009年に北海道東部で捕獲されたシギ・チドリ類の血液材料152検体について実施された中和試験では二つの基準で判定した。検体に加えたウイルスの感染価を50%以上減少した場合を陽性とする基準で判定すると、152検体中10検体(6.6%)が陽性となった(表(4)-2)。これらの陽性と判定された10検体を中和試験とは測定原理の異なるELISA法で測定すると、10検体すべてが陰性となり、両測定法の結果の間に矛盾が生じた。米国CDCではプラック法で90%以上減少した場合を陽性としていることから、本研究でも加えたウイルスの感染価を90%以上減少した場合を陽性とする基準を採用して再検討した。その結果、全ての検体でWNV中和抗体が陰性となり、ELISA法の結果と一致した。また、JEVに対する中和試験ではいずれの基準でも陰性と判定された。以上の結果と抗JEVニワトリ標準抗血清が90%FRNTでWNVに対する中和抗体価が検出されなかったことから、以降の中和試験では加えたウイルスの感染価が90%以上減少した場合を中和抗体陽性と判定することにした。

表(4)-2. 異なった判定基準によるシギ・チドリ類血清152検体の中和試験

用いたウイルス	陽性率(%)
90%FRNT*	50%FRNT
ウェストナイル熱ウイルス	0	6.6
日本脳炎ウイルス	0	0

$ ^{*} $ FRNT：フォーカス減少中和試験
## （３）渡り鳥およびアイガモ血清の中和試験(2009,2010,2011年度実施)

3年間の調査を通して北海道東部で捕獲されたシギ・チドリ類407個体、および2010年に沖縄で捕獲されたシギ・チドリ類77個体の血液材料は、いずれもWNV(NYおよびEg101株)とJEVを中和しなかった。また、2010年と2011年に宮城県で捕獲されたオナガガモ12個体と、2010年に北海道で飼育されたアイガモ36個体の血液材料もいずれのウイルスも中和しなかった。これらの結果から、媒介昆虫が吸血行動を行う季節に渡ってくるシギ・チドリ類はWNVに感染している可能性が低いと考えられた。また、北海道で飼育されたアイガモが抗体を保有していなかったことも日本へのWNV侵入および循環の否定を支持する結果だと考えられる。

## （４）鳥類由来初代培養細胞のWNV感受性試験(2010年度実施)

ニワトリ、カラス、ハトおよびヤンバルクイナのそれぞれ1個体から調整された初代培養細胞でWNVの増殖を検討したところ、ニワトリ、カラス、およびハトに由来する各々の細胞ではWNVが効率的に増殖した(図(4)-1)。北米における流行で、カラスはニワトリに比べるとWNVに致死的感染しやすいといわれているが、図(4)-1の結果に見られるように、感染後4日目までのカラス由来細胞の培養液のウイルス感染価はニワトリ由来細胞に比べて高い傾向があった。この差は感染後2日目には約100倍近くあり、最も大きかった。一方、ヤンバルクイナ由来細胞ではウイルス抗原と子孫ウイルス両方が全く産生されなかった。ヤンバルクイナ細胞で得られた結果はヤンバルクイナの個体におけるウイルス感受性を反映しているのか否かについては多くの個体から得られた細胞を用いた詳細な解析が必要である。

図(4)-1.トリ由来細胞におけるウェストナイル熱ウイルスの増殖
図(4)-2.ヤンバルクイナ由来細胞とハト由来細胞におけるWNV増殖の比較

図(4)-3.WNV接種したハトおよびヤンバルクイナ由来細胞の免疫染色
図(4)-4. 鳥類由来細胞へのWNV-RNA導入実験

## （５）トリ由来培養細胞への WNV 遺伝子 RNA の導入試験(2011 年度実施)

WNV-RNAを導入したニワトリ、カラス、ハト由来の細胞は遺伝子導入から約24時間後には細胞内にウイルス特異抗原が蓄積し、子孫ウイルスが培養細胞に放出されることが確認された。一方、ヤンバルクイナ由来細胞ではウイルス特異抗原と子孫ウイルスの両方の産生が認められなかった。遺伝子導入から一週間の継続した培養でも前者の3種類の細胞は僅かにしか生残していないにもかかわらず、培養液中に感染価が認められた。ところが、ヤンバルクイナ細胞はほとんどが生残しており、培養液の感染性ウイルス、ウイルス特異抗原を蓄積する細胞ともに全く認められなかった（図(4)-4）。これらの結果は図(4)-2および図(4)-3で得られた実験結果と矛盾しなかった。ヤンバルクイナ由来細胞ではWNV遺伝子が細胞内に導入されてもウイルス蛋白質の翻訳あるいはウイルス遺伝子の複製に何らかの制限がかかっていると思われた。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

研究推進期間中に北海道と沖縄の両地域で捕獲されたシギ・チドリ類はWNVとJEVに対する中和抗体を保有しておらず、何れのウイルスにも感染していないことが確認された。また、鳥類由来細胞のWNVに対する感受性を検討したところ、ヤンバルクイナ由来細胞以外の用いた細胞では予測通りWNVが増殖した。ところが、ヤンバルクイナ由来細胞では感染培養上清に感染性ウイルスが全く検出されず、ウイルス接種細胞内にもウイルス特異抗原が検出されなかった。このことは、ヤンバルクイナがWNVに感受性がないことを示唆する。今後、複数のヤンバルクイナの複数個体から採取された細胞について検討する必要があるが、この細胞がWNVの細胞内増殖における宿主側の増殖因子を明らかにするのに役立つツールとなる可能性があり、学術的に極めて重要な
知見である。

## （２）環境政策への貢献

調査研究結果だけでWNVがシギ・チドリ類の渡りに伴って我国に侵入することを強く否定するには例数が少なく、今後データを重ねることによって我国の環境保全対策に貢献することが可能となる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない。

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

（2）口頭発表（学会等）

特に記載すべき事項はない。

（3）出願特許

特に記載すべき事項はない。

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

（6）その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

なし
D-0907-76

# Risk Analysis Study on Infectious Disease Transmission from Migratory Birds to Endangered Japanese Birds.

Principal Investigator: Takashi KUWANA

Institution: Institute of Advanced Technology, Kindai University

14-1 Minami-Akasaka, Kainan, Wakayama, 642-0017 Japan

Tel: 073-483-7887, Fax: 073-483-7717

E-mail: kuwanat@gmail.com

Cooperated by: Ryukyu University, Tokyo University, Core Corporation Kansai Company

[Abstract]

Key Words: West Nile virus, Migratory bird, Endangered bird, Migratory route, GPS transmitter

The West Nile virus (WNV) is a mosquito-borne disease that was found in all over the world including Far East Russia. This region is used by several migratory bird species, including some that spend in Japan during their migration. Our objectives in this project were to: 1) evaluate the likely routes by which WNV may enter Japan, and 2) evaluate the risk of widespread mortalities in wild Japanese bird populations.

We conducted telemetry research on migratory birds, developing an ultra-light GPS transmitter to document the migratory behavior of small migratory birds and collecting blood and oral swab samples from migratory birds to test for the presence of WNV and anti WNV antibody.

To elucidate the migration routes of potential carrier birds of WNV, we caught whimbrels and a bar-tailed godwit at Komuke Lake, Hokkaido, Japan. We used the solar-powered transmitters with GPS that were newly developed in the present project.

And, we captured migratory birds at several wetlands in Japan. We also sampled the northern pintails and examined for WNV antigens and WNV gene. In addition, WNV susceptibility was evaluated using cultured cells obtained from Jungle crow, pigeon, chicken and Okinawa rail. Furthermore, relation between mortality rate and Amino acid sequence of OAS gene which regulated WNV resistance was evaluated.

From the viewpoint of conserving Japan’s biodiversity, predicting and avoiding the extinction risks that emerging infectious diseases pose to Japan’s ecosystems and in particular to endangered bird species are important tasks. There are fears that WNV will in time invade Japan, so predicting infection routes for WNV and assessing risks to endangered bird species are important. This research is aimed at developing an
ultra-compact GPS-based tracking device to enable elucidation of the flight routes of WNV-resistant shorebirds. Striving to reduce the overall size, weight, power consumption of the GPS device by reviewing all of its components including the GPS receiver module, antenna, timer, battery, and casing, we have succeeded to develop a whole new GPS-based tracking device of 11.3 g in weight.

To confirm sensitivity of an endangered Okinawa rail ( $ Gallirallus\ okinawae $ ) to WNV, cells isolated from Okinawa rail were inoculated with WNV. No virus production and no viral antigen were detected in the cell culture, indicating that Okinawa rail have no sensitivity to WNV.
## 渡り鳥による希少鳥類に対する新興感染症リスク評価に関する研究

絶滅危惧鳥類の大量死防止

渡り鳥によるウェストナイル熱の侵入経路の予測法開発
# 平成28年度

# 企業を対象とした反社会的勢力との関係遮断に関するアンケート

(調査結果)

平成28年12月

調査主体 全国暴力追放運動推進センター

日本弁護士連合会民事介入暴力対策委員会

警察庁刑事局組織犯罪対策部暴力団対策課

調查機関　一　般　社　団　法　人　輿　論　科　学　協　会
## はじめに

政府は、平成19年6月に「企業が反社会的勢力による被害を防止するための指針」を策定しました。本資料は、企業における反社会的勢力への対応の実態や、同「指針」の導入状況等を把握するため、平成28年7月に全国の企業10,000社を対象として、反社会的勢力による不当要求の有無やその内容、「指針」に基づいた反社会的勢力との関係遮断の取組状況等についてアンケート調査した結果をとりまとめたものです。

ご多用の中、調査に快くご協力いただきました各企業関係者の皆様に厚くお礼申し上げます。

## I 調査の概要

## 1 調査の方法、対象等

本アンケート調査の方法、対象等は次のとおり。

① 調查方法 郵送法

② 調査対象 全国の企業 10,000 社に対して調査票を送付して調査を行った。

③ 調査時期 平成28年7月

## 2 回收結果

調査票の回収数は、3,210 通（回収率 32.1%）であった。

## Ⅱ 回答企業のプロフィール

## 表 1 業種（複数回答）

1. 建設業	444 ( 13.8 %)
2. 製造業	290 ( 9.0 %)
3. 運輸・通信業	373 ( 11.6 %)
4. 不動産業	342 ( 10.7 %)
5. 卸売・小売業（商社を含む）	390 ( 12.1 %)
6. 銀行業	120 ( 3.7 %)
7. 証券・保険業	114 ( 3.6 %)
8. その他金融業	183 ( 5.7 %)
9. 飲食業	206 ( 6.4 %)
10. 電気・ガス・水道・熱供給業	62 ( 1.9 %)
11. その他サービス業	881 ( 27.4 %)
12. その他	297 ( 9.3 %)
13. 無回答	30 ( 0.9 %)
全 体	3,210 ( 100.0 %)

※1 社で複数の業種を回答している企業もあるため、合計は100％にならない。

## 表 2 所在地

1. 北海道	240 ( 7.5 %)
2. 東北地方	121 ( 3.8 %)
3. 東京都	1,225 ( 38.2 %)
4. 関東地方（東京都を除く）	269 ( 8.4 %)
5. 中部地方	290 ( 9.0 %)
6. 近畿地方	546 ( 17.0 %)
7. 中国地方	146 ( 4.5 %)
8. 四国地方	61 ( 1.9 %)
9. 九州地方	235 ( 7.3 %)
10. 不明および無回答	77 ( 2.4 %)
合計	3,210 ( 100.0 %)

## 表 3 壳上高

1. 1,000万円未満	132 (4.1%)
2. 1,000万円以上3,000万円未満	178 (5.5%)
3. 3,000万円以上5,000万円未満	146 (4.5%)
4. 5,000万円以上1億円未満	273 (8.5%)
5. 1億円以上3億円未満	597 (18.6%)
6. 3億円以上5億円未満	285 (8.9%)
7. 5億円以上10億円未満	335 (10.4%)
8. 10億円以上100億円未満	653 (20.3%)
9. 100億円以上	540 (16.8%)
10. 無回答	71 (2.2%)
合計	3,210 (100.0%)

## 表 4 從業員数

1. 5人未满	545 ( 17.0 %)
2. 5人以上10人未满	407 ( 12.7 %)
3. 10人以上50人未满	972 ( 30.3 %)
4. 50人以上100人未满	336 ( 10.5 %)
5. 100人以上500人未满	528 ( 16.4 %)
6. 500人以上1,000人未满	108 ( 3.4 %)
7. 1,000人以上	312 ( 9.7 %)
8. 無回答	2 ( 0.1 %)
合計	3,210 ( 100.0 %)
表 5 企業特性

1. 上場企業（新興市場を除く）	171 ( 5.3 %)
2. 新興市場（ジャスダック、マザーズ等）上場企業	45 ( 1.4 %)
3. その他の有価証券報告書提出企業	47 ( 1.5 %)
4. 上記以外の株式会社	2,229 ( 69.4 %)
5. 有限、合名、合資、合同会社	326 ( 10.2 %)
6. 相互会社、信用金庫、信用組合等	71 ( 2.2 %)
7. 個人事業主	113 ( 3.5 %)
8. その他の法人	203 ( 6.3 %)
9. 無回答	5 ( 0.2 %)
合計	3,210 ( 100.0 %)

表 6 団体等への加盟の有無

1.加盟している2.加盟していない3.無回答	2,020 ( 62.9 %)1,095 ( 34.1 %)95 ( 3.0 %)
合計	3,210 (100.0 %)

表 7 関連する官公庁（複数回答）

1. 公安委员会	442 ( 13.8 %)
2. 金融厅	344 ( 10.7 %)
3. 消费者厅	28 ( 0.9 %)
4. 総務省	78 ( 2.4 %)
5. 国土交通省	919 ( 28.6 %)
6. 法務省	96 ( 3.0 %)
7. 外務省	9 ( 0.3 %)
8. 財務省	144 ( 4.5 %)
9. 文部科学省	20 ( 0.6 %)
10. 環境省	168 ( 5.2 %)
11. 厚生労働省	531 ( 16.5 %)
12. 農林水産省	99 ( 3.1 %)
13. 防衛省	16 ( 0.5 %)
14. 経済産業省	395 ( 12.3 %)
15. 地方自治体	883 ( 27.5 %)
16. その他	13 ( 0.4 %)
17. 無回答	309 ( 9.6 %)
全 体	3,210 ( 100.0 %)

※1 社で複数の関連する官公庁を回答している企業もあるため、合計は100％にならない。

## Ⅲ 設問ごとの調査結果

## 1 不当要求等の実態について

### 1.1 不当要求の有無について

過去5年間に反社会的勢力からの不当要求を受けた経験がある企業の割合は、全体の2.8% (89社)であった。

### 1.2 不当要求の頻度について（過去5年間）

過去5年間に不当要求を受けたことがある企業89社についてその頻度をみると、「4～5年に1回程度」が20.2％と最も多く、全体の57.3％の企業が、1年に1回以上の不当要求を受けていた。

### 1.3 不当要求の頻度について（過去1年以内）

過去5年間に不当要求を受けたことがある企業89社のうち、不当要求を受けた期間を過去1年以内に限定すると、その頻度は「1年に1回程度」が25.8％と最も多く、次いで「6ヶ月に1回程度」（15.7％）が多い。
### 1.4 不当要求の相手方の属性について（複数回答）

過去5年間に不当要求を受けたことがある企業89社が、その相手方をどのように認識したかをみると、「社会運動標ぼうゴロ（えせ同和等）」が34.8％と最も多く、以下「政治活動標ぼうゴロ（えせ右翼等）」（29.2％）、「相手が何者かわからなかった」（27.0％）、「暴力団員ではないが、暴力団（暴力団員）と何らかの関係を有する者」（24.7％）、「暴力団員」（15.7％）と続く。

### 1.5 不当要求の相手方の自称について（複数回答）

過去5年間に不当要求を受けたことがある企業89社について、その相手方がどのように名乗ったかをみると、「同和団体」が29.2％と最も多く、以下「社会的、政治的な活動家」（22.5％）、「右翼構成員」（16.9％）

### 1.6 不当要求の内容について（複数回答）

過去5年間に不当要求を受けたことがある企業89社について、不当要求行為の内容をみると、「機関紙(誌)、書籍、名簿等の購読（入）を要求する行為」が44.9％と最も多く、以下「因縁を付けて金品や値引きを要求する行為」（20.2％）、「寄附金、賛助金、会費等を要求する行為」（13.5％）と続く。
### 1.7 不当要求の際の具体的な脅しの内容について（複数回答）

過去5年間に不当要求を受けたことがある企業89社について、不当要求を拒否した場合にどのような危害を加えられると認識したかをみると、「不安になるような漠然とした危険」が50.6％と最も多く、以下「営業の妨害」(29.2％)、「会社に対する経済的被害」(20.2％)と続く。

### 1.8 不当要求を受けた場所について（複数回答）

過去5年間に不当要求を受けたことがある企業89社について、不当要求を受けた場所をみると、「本社（主たる営業場所）」が67.4％と最も多く、以下「支社、支店、出張所等常設の施設」（36.0％）、「現場事務所、営業所等仮設の施設や業務の現場」（13.5％）と続き、多くが自社の関係施設において不当要求を受けている。

### 1.9 不当要求の手段について（複数回答）

過去5年間に不当要求を受けたことがある企業89社について、どのような手段で不当要求を受けたかをみると、「固定電話」が57.3％と最も多く、以下「反社会的勢力との直接の接触（面会等）」（38.2％）、「郵便、宅配便等」（23.6％）と続く。

### 1.10 不当要求への対応状況について（複数回答）

過去5年間に不当要求を受けたことがある企業89社について、不当要求に対してどのように対応したかをみると、「警察、暴力追放運動推進センター、弁護士等の外部の専門機関と連携し対応した（法的措置も含む）」が39.3％と最も多く、以下「代表取締役等のトップ以下、組織として対応した」（37.1％）、「反社会的勢力対応部署が対応した」（33.7％）と続く。
### 1.11 不当要求への措置結果について

過去5年間に不当要求を受けたことがある企業89社について、どのように対処したかをみると、「不当要求には一切応じなかった」企業が72社（80.9%）となっている。

一方、「不当要求の一部に応じた」が14社、「不当要求に全て応じた」が3社となっている。

### 1.12 不当要求に応じなかった時の相手の対応について（複数回答）

「不当要求には一切応じなかった」と答えた企業72社について、不当要求に応じなかった時の相手の対応をみると「特に行動を起こさなかった」が41社と最も多く、以下「大声を出すなど言動や態度で威圧してきた」が24社、「事業所に現れたり、迷惑電話をかけてくるなどの嫌がらせ行為をしてきた」が13社、「不当要求の内容又は態様を変えてきた」が6社と続く。

### 1.13 不当要求に応じた理由について（複数回答）

「不当要求の一部に応じた」、「不当要求に全て応じた」と答えた企業17社について、不当要求に応じた理由をみると、「トラブルの拡大を恐れたから」、「以前から応じており、断るのが困難だから」がともに6社と最も多く、以下「報復、糾弾等を受けることを恐れたから」、「対応に不慣れであったから」、「要求金額が少額であったから」がいずれも5社と続く。

### 1.14 過去5年間の不当要求に応じた頻度について

「不当要求の一部に応じた」、「不当要求に全て応じた」と答えた企業17社について、過去5年間に不当要求に応じた頻度をみると、「数年に1回」が7社と最も多く、以下「年に6回以上」が4社、「年に2～5回」、「毎年1回」がともに2社と続く。
### 1.15 過去5年間に応じた要求額について

「不当要求の一部に応じた」、「不当要求に全て応じた」と答えた企業17社について、過去5年間に応じた不当要求の合計金額をみると、「1万円以上10万円未満」が7社と最も多く、10万円未満の要求に応じた企業が11社と過半数を占めた。

一方、1000 万円以上の要求に応じた企業は 2 社である。

### 1.16 不当要求に応じないための方策について（複数回答）

「不当要求の一部に応じた」、「不当要求に全て応じた」と答えた企業17社について、不当要求に応じないための方策を聞いたところ、「警察、暴力追放運動推進センター、弁護士等の外部の専門機関と連携する」が13社と最も多く、次いで「不当要求対応マニュアルを策定する」が4社と続く。

## 2 「企業防衛対策の取組状況」について

### 2.1 「企業が反社会的勢力による被害を防止するための指針」について

「企業が反社会的勢力による被害を防止するための指針」について、「知っている」とした企業の割合は59.1%（1,896社）、「知らない」は40.0%（1,283社）となっている。

### 2.2 「指針」に沿った取組みについて

本アンケートにおける全回答企業3,210社でみると、「指針」に沿って「取り組んでいる」とした企業の割合は48.7%（1,562社）、「取り組んでいない」は10.1%（325社）となっている。

【アンケート全回答企業】

「指針」を知っている企業1,896社のうち、「指針」に沿って「取り組んでいる」とした企業の割合は82.4％、「取り組んでいない」は17.1％となっている。

【「指針」を知っている企業】
### 2.3 反社会的勢力への各種対応を実施しない理由について（複数回答）

「指針」に沿った取組みを行っていない企業 325 社について、その理由をみると、「反社会的勢力による不当要求の被害を受けたことがない」が 60.9％と最も多く、以下「取引相手が限定されている」（33.2％）、「具体的に何をすればよいのかわからない」（23.1％）と続く。

### 2.4 反社会的勢力による被害を防止するための

## 取組内容について（複数回答）

「指針」に沿った取組を行っている企業 1,562 社について、その取組内容をみると、「契約書・取引約款等に暴力団排除条項を盛り込んでいる（又は盛り込む予定である）」が 79.6%（1,244 社）と最も多く、以下「反社会的勢力対策の基本方針を示し、社内外に宣言した」（46.4%）、「反社会的勢力との関係遮断について、社の内規に明文規程を設けている」（45.1%）と続く。
### 2.5 暴力団排除条項の導入時期について

「契約書・取引約款等に暴力団排除条項を盛り込んでいる（又は盛り込む予定である）」と答えた企業1,244社について、暴力団排除条項の導入時期をみると、「平成23年」が17.8％と最も多く、「指針」が公表された平成19年から平成24年までの5年間に導入した企業が約6割以上を占める。

### 2.6 暴力団排除条項を盛り込んだ理由について （複数回答）

「契約書・取引約款等に暴力団排除条項を盛り込んでいる（又は盛り込む予定である）」と答えた企業1,244社について、その理由をみると、「暴力団排除条例に対応した」が51.4％と最も多く、以下「所属する業界団体等からの働きかけがあった」（40.8％）、「指針の趣旨に賛同した」（38.7％）と続く。

### 2.7 暴力団排除条項の活用について

「契約書・取引約款等に暴力団排除条項を盛り込んでいる（又は盛り込む予定である）」と答えた企業1,244社のうち、「活用して契約等を解約（解除）した」企業は11.0％であった。

### 2.8 データベースの構築状況について

前記 2.4 で「反社会的勢力情報を集約したデータベースを構築している（又は構築する予定である）」と答えた企業 282 社について、情報の蓄積件数をみると、「1 万件以上 5 万件未満」が 33.0％と最も多く、1 万件以上の情報の蓄積件数を有する企業が全体の 6 割以上を占める。
### 2.9 「指針」を知らない企業の反社会的勢力による

## 被害を防止するための取組について（複数回答）

「指針」を知らない企業 1,283 社について、反社会的勢力による被害を防止するための取組をみると、「取り組んでいない」が 38.7％と最も多く、以下「契約書・取引約款等に暴力団排除条項を盛り込んでいる」（27.3％）、「反社会的勢力による不当要求に備えて、警察、暴力追放運動推進センター、弁護士等外部の専門機関の連絡先や担当者を確認している」（16.6％）と続く。なお、「今後取り組みたい」は 19.5％となっている。

### 2.10 反社会的勢力との関係遮断について

全都道府県で暴力団排除条例が施行された平成23年10月以降、個別の契約や取引において、相手方が反社会的勢力であることを理由に関係遮断（契約の解除等）を検討したことが「あった」とする企業は7.2%（231社）であった。

### 2.11 関係を遮断した件数について

関係遮断を検討したことがある企業 231 社のうち、実際に関係を遮断した件数をみると、契約締結前では「1 件」が 27.0％と最も多く、以下「2 件」(19.7%)、「5～9 件」(13.1%)と続く。

※関係を遮断した件数が判明した企業

また、契約締結後では「1件」が27.8％と最も多く、以下「10～49件」（26.1％）、「5～9件」（13.0％）と続く。

※関係を遮断した件数が判明した企業

### 2.12 関係遮断を検討したことがある相手方の

## 属性について（複数回答）

関係遮断を検討したことがある企業231社について、相手方をどのように認識したかをみると、「暴力団員」が63.6％と最も多く、以下「暴力団員ではないが、暴力団(暴力団員)と何らかの関係を有する者」(58.4%)、「暴力団関係企業の役員や従業員」（19.0%）と続く。
### 2.13 関係を遮断しなかった理由について （複数回答）

関係遮断を検討したが遮断しなかった事例がある企業についてその理由をみると、契約前では「調査の結果、相手方が反社会的勢力ではなかった」が71.7％と最も多く、以下「調査の結果、相手方が反社会的勢力であるか否か不明であった」（37.0％）、「相手方は反社会的勢力であったが、関係を遮断する根拠がなかった」（8.7％）と続く。

※関係遮断を検討したが遮断しなかった事例がある企業

また、契約後でも契約前と同様に「調査の結果、相手方が反社会的勢力ではなかった」が56.5％と最も多く、以下「調査の結果、相手方が反社会的勢力であるか否か不明であった」（35.2％）、「相手方は反社会的勢力であったが、関係を遮断する根拠がなかった」（24.1％）と続く。

【契約後の事例】

※関係遮断を検討したが遮断しなかった事例がある企業

### 2.14 暴力団情報の入手方法について（複数回答）

取引先が反社会的勢力に該当するかどうかの「情報を入手したことはない」とする企業は37.6％であった。

一方、入手する方法について、「警察から情報提供を受ける」が24.1％と最も多く、以下「加盟している業界団体等から情報提供を受ける」（23.9％）、「無料のインターネット検索を利用する」（19.1％）、「暴力追放運動推進センターから情報提供を受ける」（15.1％）と続く。

### 2.15 警察の暴力団情報提供について

警察の暴力団情報の提供について、「情報提供の依頼をしたことがある」とする企業の割合は10.4%（333社）、「知っており該当する事例もあったが、情報提供を依頼しなかった」は1.7%、「知っていたが、該当する事例がないので依頼したことがない」は43.6％となっている。これらを合計すると、警察の暴力団情報の提供を知っていた割合は55.7％であった。
### 2.16 警察の暴力団情報提供の回数について

警察に暴力団情報の提供を依頼したことがある企業333社の依頼回数をみると、「1回」が21.9％と最も多く、以下「3～5回」（12.6％）、「2回」（10.2%）と続く。

| 1回 | 2回 | 3～5回 | 6～9回 | 10～19回 | 20～49回 | 50回以上 | 回数不明
(N=333) | 21.9 | 10.2 | 12.6 | 3.6 | 5.7 | 4.2 | 7.2 | 34.5

全国暴力追放運動推進センター

日本弁護士連合会民事介入暴力対策委員会

警察庁刑事局組織犯罪対策部暴力団対策課

調查機関　一　般　社　団　法　人　輿　論　科　学　協　会
RF-0908 南西諸島のマングースの水銀濃縮解明に関する研究

（２）水銀濃縮機構の解析と重金属解毒系遺伝子の発現評価系の作製と個体での発現評価

$$ 鹿児島大学 \quad 大学院 \quad 医菌学 総合研究科 $$

山本雅達

<研究協力者>

$$ 愛媛大学 ( 平成 23 年 4 月 より 鳥取大学 ) $$

平田（宝来）佐和子

平成21～22年度累計予算額：7,215千円（うち、平成22年度予算額：3,315千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] アジアを中心とする重工業地帯の無秩序な拡充は、今や世界規模の深刻な水銀汚染を引き起こしている。海洋における水銀汚染は食物連鎖高次に位置する大型魚類・海生哺乳類に生態濃縮によってさらに蓄積される。これらは外洋を回遊することから世界各地で水揚げされること、また近年の国際的物流の活性化によって世界中で消費される海洋資源となったが、我が国において水俣病に代表されるように、これら魚肉摂取による水銀中毒の対症療法はいまだ確立されておらず、社会的にも未解決な問題が多い。人々の健康被害に加え、海洋生態系への影響はより深刻化しているように思われるが、実はマグロや一部の鯨類では局所的な水銀汚染に匹敵する濃度を示しながらもその生命活動に影響を受けていない種が存在するという報告が相次いでなされた。このことは、種特有の水銀解毒機構の存在を示唆するが、海洋生物であるが故その試料獲得や研究手法の困難さから水銀蓄積、解毒機構などの解明には至っていない。

一方、我々は陸生哺乳類の中でもマングースが水銀高蓄積種であることを見出し、水銀解毒機構の解明に有用なツールとなることを示してきた。そこで実験動物であるラットと野生マングースに由来する肝初代培養細胞を作製し、細胞の重金属感受性試験を行った。その結果、ラット肝細胞は安定した重金属感受性を示すが、マングースに由来する肝細胞はその生育環境が様々で個体差があり、捕獲時に水銀蓄積が高い個体では、それに由来する肝細胞も水銀の耐性および水銀の取り込み量が高いことから、水銀耐性を示すマングースはその個体に由来する肝細胞そのものが水銀耐性に寄与している可能性の有無、水銀暴露応答性遺伝子の同定を目的として、マングースGCS、GRおよびTRX2遺伝子について発現解析を行なった結果、水銀暴露に対してこれらの遺伝子の発現量に変化はなかったことから、機能的には関与していないことが示された。

[キーワード] 水銀、ジャワマングース、初代培養肝細胞、重金属感受性試験、水銀暴露応答性遺伝子

### 1. はじめに

水銀は近代工業化の拡大に伴ってわが国では50～70年代にその汚染が社会問題となった。近年、アジアを中心とした新興国の工業生産能力の向上に従ってそれは世界規模で被害が拡大しつつある。水銀中毒は多くの場合その個体の生命維持に甚大な影響を及ぼすが、いまだその治療法や解毒剤の開発には至っていないのが現状である。これまでにマグロや海生哺乳類であるクジ
うは局所的な水銀汚染に匹敵する濃度を有する個体が確認されながらも、その生命活動に影響を受けていないという報告が相次いでなされ、このことは、種特有の水銀解毒機構の存在が示唆されたが、海洋生物であるが故その試料獲得や研究手法の困難さから水銀蓄積、解毒機構などは明らかにされていない。

一方で東京農工大・渡邊を中心とした研究グループは独自に沖縄、奄美大島において野生動物種の金属類蓄積調査を広範に行なった結果、そこに生息するマングースは肝臓において水銀を海生動物レベルに濃縮していることを明らかにした $ ^{1)2)3} $ 。マングースはその地域において食物連鎖の高次に位置する陸生哺乳類であり、また特定外来種として精力的に捕獲処分が遂行されている動物種である。このことに注目し、マングース由来肝細胞とラット由来肝細胞を用いて、重金属暴露試験、同取込排泄試験、重金属応答遺伝子の発現解析法など、我々は水銀代謝機序解析のツールとしてマングースに由来する肝細胞が有用であることを示した $ ^{4)5} $ 。

### 2. 研究目的

マングースにおける重金属耐性機構機序と耐性責任分子の同定を目的として（1）マングースとラット肝初代培養細胞の金属取り込み一排泄試験を行ない、（2）同条件下における重金属暴露に対する金属解毒の代謝に関与する遺伝子の発現変化を観察した（概要を図1に示す）。

図1. マングース初代培養肝細胞を用いた重金属耐性機構機序と耐性責任分子の同定へのアプローチ

## 3 ．研究方法

（１）マングースおよびラット肝初代培養細胞の金属取り込み一排泄試験
$ HgCl_{2} $ （WAKO 138-01152）

山本、柳らの方法 $ ^{4)} $ に従って、マングースおよびラット初代培養肝細胞を調製した。

## 1 ）準備

細胞培養用コラーゲンコート96ウェルディッシュ（イワキ）

Williams' medium E (SIGMA W4128)

CO_{2}インキュベーター (ASTEC)

MeHg (Stream Chemicals 80-2250)

Se (WAKO 194-10842)

Tetrazolium (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide、以下MTT) (sigma M2128-5G)

DMSO (Dimethyl sulfoxide) （関東化学 2950-1B）

シェーカー (SANKYOU JUNYAKU MX-4)

マルチプレートリーダー (Bio Rad model 550)

RF-085-3

## 2 ）試薬調製

Williams' medium E

以下の試薬を記載濃度になるように加える。

胎児牛血清（10%：GIBCO #12483-020 Lot 356833）、インスリン（1 μM：Sigma #16634）、

デキサメタゾン（1 μM: Sigma #D4902）、カナマイシン（100 μg/mL: Sigma #K1876）

ファンギゾン（0.5 μg/mL：GIBCO #15290-018）

Tetrazolium

PBSで5mg/mLに調整後、濾過滅菌をストック溶液とする。

## 3 ）手順

## a 重金属毒性试验

↓マングースおよびラットの肝細胞を96ウェルのディッシュの各ウェルに細胞数を2000に合わせて播く。

↓ 5% CO_{2} 存在下、37℃ 下一晚培養

↓ 培地を交換して

MeHg (1, 5, 10, 15, 20, 30, 50 $ \mu $ M)

$ HgCl_{2} $ （5，10，40，100，200，300，500 $ \mu $ M）

Se (5, 10, 40, 100, 200, 300, 500 $ \mu $ M) を培地に加え24時間培養。

↓各ウェルにMTTを終濃度0.2mg/mLになるように加える。

↓さらに3時間培養。

↓培養上清を捨て、各ウェルにDMSOを50μl加えてシェーカーにて30秒攪拌し、細胞を溶解する。

↓マルチプレートリーダーを用いてOD570nmの吸収波長を測定して以下のように解析。

黄色色素のMTTは生細胞の酵素で還元されてOD570nmの吸収波長をもつ紫色のFormazanへと変化する。この時金属を含まないウエルの吸光度を生存率100%として、金属暴露を受けた細胞の生存率を評価した。細胞数の半分が死滅する際の重金属濃度をIC_{50}（50%が致死の重金属濃度）として算出し、各細胞の重金属に対する感受性とした。
## b 金属取り込み—排泄試験

同時に水銀暴露された細胞を回収し、細胞内に取り込まれたMeHg量、および培養液からMeHgを除いて時間ごとに回収した細胞からMeHg量を定量した値を、それぞれ取り込み量および排泄量として解析した。元素分析は細胞にRIPAバッファー1mLを添加し溶解した後、硝酸3.5mLを加えてマイクロウェーブ分解し、Hgは微量水銀測定装置(CV-AAS)を用いて、SeはICPイオン源質量分析計（ICP-MS；ICP-MS 7500cx，Agilent Technologies，Tokyo，Japan)を用いて測定した。分子イオンによる干渉を回避するため、水素モードでSeを測定した。また、内部標準試料としてスカンジウム(Sc)とロジウム(Rh)をオンラインで導入した。Hgは総Hg（T-Hg)の濃度を指す。

## （２）マングース肝細胞の重金属暴露時の遺伝子発現変化

1) マングース gamma-glutamylcysteine synthetase の触媒ユニット（GCS）とGlutathione reductase（GSR）のmRNAを検出するプライマーの作製

マングースの遺伝子発現を検討するためにプライマーを作製するには、マングースの遺伝子情報は皆無に等しいため、現在既知となっているネコの遺伝子配列を元にして、プライマーを設計した。ネコGCSについてはGene No. ENSFCAT00000014356より、同様にGSRについてはENSFCAT00000001476によりその一次構造を得た。図2にネコGCSおよび図3にGSRの一次構造を示す。

EXON	bp	ENSFCAT00000014356より
2F	12	82	GTTGATGAAAACATGAAAGTTGCACAGAAACGAGATGCTGTCTTGCGGGGAATGTTTTATTTTCAGGAAAGATATTTGCAAAG
intro n	300	gtattcattctcttggatttctagg........gctcctccatcctttcatctggcag
1F	13	104	GTGGGAACACTGTGGTGGATGGCTACGGGAAGGTCCAGAACACCTCGGAACTGACCACGGAGGACTACACCCTGATGAGCATAGACACCATCATCAACGGGAAG
intron	76	gtagacgccctgccattgcacctc........taattatgtgtcccgcttctcctag
1R2R	14	121	GAGGGTGTGTTCCTGGGCTGATCCCGATTCTGAACTCTTACCTTGAAAACATGGAGGTGGATGTGGACACTAGATGTAGTATTCTGAACTACCTAAAGCTAATTAAGAAGAGAGCATCTG

図2. ネコのGCSのDNA配列とプライマー位置
ネコGCSは15個のエクソンからなり、その転写産物の長さは1761ベース、587アミノ酸をコードする遺伝子である。この遺伝子のエクソン12と13の間に位置するイントロンは300ベース、それに対して13－14間のイントロンは76ベースと短いことから、今回マングースGCSのプライマーセットとしてエクソン12とエクソン13にGCS-1FとGCS-2Fを、エクソン14にGCS-1RとGCS-2Rを作製した。一方、ネコGSRは11個のエクソンからなり、その転写産物は1236ベース、411アミノ酸をコードする遺伝子である。この遺伝子のエクソン1とエクソン2の間にあるイントロンは1164ベース、また、エクソン2－3間のイントロンは2646ベースと比較的短いことから、マングースGSRのプライマーセットとしてエクソン1にGSR-1F、エクソン2と3にGSR-1RとGSR-2Rを作製した。それぞれのプライマーのシーケンスを図4に抽出して示す。

Exons: 11 Transcript length: 1,236 bps Translation length: 411 residues

1F	EXON	bp	ENSFCAT00000001476より
1	89	GTAATGTGGAACACGGCTGTCCATTCTGAATTCATGCACGATCATGTTGATTATGGCTTTCAAAGTTGTGAGAGTAAATTCAATTGGCG
1,164	gtaagtgttaatgcttagaggttct......agtactgacttaagtttcattacag
1R	2	70	TGTTATAAAGGAAAAGCGTGATGCCTATGTGAGCCGCCTGAATACCATCTATCAAAATAACCTAACCAAG
2,646	gtgagtgtgctgggaactctgaaga......gtcgatgtcacggttcctttttccag
2R	3	148	TCCCATATAGAAATCATCCATGGCCATGCAGCATTACAAAGTGATCCCAAGCCCACAGTAGAAGTCAGTGGGAACAAATACACTGCTCCTCACATCCTGATTGCCACTGGTGGCGTGCCCTCTCGTCCCTCAGGAGAGCGAGATCCCTG

図3. ネコのGSRのDNA配列とプライマー位置
GCS-1F	ACACTGTGGTGGATGGCTACGGGA
GCS-1R	CGGGATCAGCCCAGGAAACACACC
GCS-2F	CGAGATGCTGTCTTGCGGGGA
GCS-2R	ACATCTAGTGTCCACATCCACCTCCA

### 図4. プライマーの配列

## 2 ) 逆転写物の同定

マングースGCSとGSRのmRNAを検出するために、マングース繊維芽細胞に由来するgenome DNAおよび全RNAからcDNAを調製し、これらを鋳型として図5に示す条件でPCR反応を行なった。

PCR反応 (μL)
反応液組成
10x Blend Taq Buffer	2.5
2mM NTP	2.5
DDW	16.75
cDNA (1μg)	1.0
Foward Primer (10pmol)	1.0
Reverse Primer (10pmol)	1.0
Blend Taq	0.25 / Total 25
cDNAのPCR条件	genome DNAのPCR条件
step1	1サイクル	step1	1サイクル
94℃	2 min	94℃	2 min
step2	30サイクル	step2	30サイクル
94℃	30sec	94℃	30sec
57℃	30sec	57℃	30sec
72℃	40sec	72℃	90sec
step3	1サイクル	step3	1サイクル
72℃	1min	72℃	2min

図5. PCRの反応条件

genome DNA、cDNAおよびPCR反応はそれぞれ、TOYOBO社 Mag Extracker、同revatora A cDNA合成キット、Blend Taq またはタカラ社Ex Taqを用いてそれぞれのプロトコールに準じて行なった。cDNAを用いてPCR反応（上段）、genome DNAを用いて反応した生成物（下段）をTAEアガロースゲ