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## （４）安定同位体による生態系機能評価手法の開発

東京大学

大学院農学生命科学研究科 森林科学専攻 森林理水及び砂防工学研究室 大手 信人

<研究協力者>

京都大学大学院農学研究科 徳地直子

平成21～23年度累計予算額：6,500千円

（うち、平成23年度予算額：2,000千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 森林の生態系機能を制御する物質循環機構の定量的記述のための安定同位体比の利用に関し、より実用的で有用な情報を得るためのプロトコルを開発、提案するために、次の3つの課題を設定し、野外観測、試料の収集、安定同位体比の測定、モデルを用いた解析からなる一連の作業を行った。1）日本で地理的（気候的）に広い範囲に分布する単一樹種（ブナ）の葉の炭素・窒素安定同位体比を測定し、その生理生態学的特徴の地理的変異を明らかにする。2）森林土壤中・地下水中の $ NO_{3}^{-} $ の安定同位体比を指標に用い、生態系レベルにおける窒素無機化、硝化量、脱室量を推定する手法を提案する。3）窒素の形態変化の活性がどのような微生物活動によって生じているのかを把握するために、遺伝子情報を用いた土壤微生物の群集構造に関する解析を行う。この結果、1）について、炭素同位体比に表れた情報は、各産地の気候条件に適応した群集ごとの機能（水利用効率）が遺伝的な分化のレベルであることを示していた。intrinsic（固有の）な生理生態的形質が測定できる安定同位体比の利点が確認できた。2）について、土壤水中の硝酸の $ \delta^{18}O $ から、マスバランスモデルを介することによって土壤中での総硝化量が推定可能であることが示された。これまでにも、森林土壤では総硝化量が純硝化量に比べて著しく大きいことは、実験室培養によって示されてきていたが、本研究の結果は、野外の原位置森林土壤においてもその現象があることを実証した最初の例と言える。3）について、脱室に関与する微生物の群集構造や活性を測定した結果、通常酸化的な斜面土層の土壤表層に、十分な量の脱室機能遺伝子を持った細菌群集が存在することが明らかとなり、嫌気条件の成立によって即座に脱室を開始する可能性を示していた。このことは、降雨によって土壤表層が十分に湿潤になることで、基質が十分にある土壤表層では、脱室が生じている可能性があることを示していた。森林生態系の窒素放出という機能について、これまで定量的には調べられていない経路の存在を示唆するものであった。

[キーワード] 森林生態系、物質循環、生態系機能、安定同位体比、微生物群集

### 1. はじめに

森林の生態系機能の定量的な評価の方法として、生元素の安定同位体比を用いる手法は、様々
な局面で開発・利用されてきた。多くの方法では、森林生態系を構成する様々な生物が水や種々の化学物質を吸収、代謝、排出する過程で同位体分別が生じることを利用している $ ^{1)} $ 。例えば、C3植物が大気中の $ CO_{2} $ を吸収し、その炭素から薬内で有機物を合成する過程では、炭素に著しい同位体分別が生じ、合成された有機物の炭素安定同位体比は、大気中の $ CO_{2} $ のそれに比べて低くなる。植物の光合成活動は、環境の変化に対応して刻々と強さや効率が変化するものであるが、合成された有機物は、ある程度時間的に平均化された光合成の状況を記録する。このため、この炭素安定同位体比の情報を用いると、種々の植物の比較的長期平均的な光合成に関わる生理的な特徴や、環境要因に対するレスポンスを評価することができる $ ^{2)} $ 。

また、植物と土壌の間生じている養分、特に窒素の循環の諸過程では、微生物による窒素化合物の形態変化が生じているが、その実態を把握するために、安定同位体比情報は極めて有用なツールである。これまで、フィールドの土壌中の窒素ダイナミクスは、硝酸や $ NH_{3} $ の土壌中の現存量をインキュベーション等によって把握し、その変化量から純無機化速度や純硝化速度を推定するという方法で把握されてきた。1980年代の後半、実験室培養のレベルで $ ^{15}N $ トレーサーを用いた同位体希釈法が提案され $ ^{3),4)} $ 、種々の森林土壌の総無機化速度と総硝化速度が測定され始めた。これらの結果が示していたことは、無機化や硝化の総速度は純速度に比べ著しく大きく、主に微生物による不動化によって、生成された $ NH_{4}^{+} $ や $ NO_{3}^{-} $ の多くが再度有機態に戻されていることであった。こうした土壌中で循環する窒素の動態をin situな条件で把握することは、実際の森林生態系における養分動態を把握する上で極めて重要なことといえる。

### 2. 研究開発目的

そこで、本研究では、硝酸の酸素安定同位体をトレーサーとし、その自然存在比から、実際の硝化速度（総硝化速度）を推定することを試みた。土壤中の硝化菌が $ NH_{3} $ を酸化して硝酸を生成する際に、3つの酸素原子のうち、1つを土壤空気中の酸素分子（ $ O_{2} $ ）から、2つを土壤水（ $ H_{2}O $ ）からとると考えられている $ ^{5)} $ 。酸素分子の $ \delta^{18}O $ は、一般に23‰前後と考えられており、土壤水の $ \delta^{18}O $ は時間的な変異は大きいが年間平均値は、例えば、中部日本の場合、-8‰程度である。これらのことを考慮すると、土壤中で生成される硝酸の $ \delta^{18}O $ の理論的な値は2.3‰前後となる。

つまり、土壌表層から地下水に至る前までの土壌中では、高い$\delta^{18}O$をもった大気降下物由来の硝酸と、低い$\delta^{18}O$をもった硝化由来の硝酸が混合することを物語っている。ところが、Osaka et al. (2010)$^{6)}$が示している森林土壤中の硝酸の$\delta^{18}O$は表層から下層にかけて単調に減少し、高い$\delta^{18}O$をもった大気降下物由来の硝酸が、低い$\delta^{18}O$をもった硝化由来の硝酸によって効率よく置換されていることが示唆されるものであった。このことは、換言すると、大気降下物由来の硝酸を含む硝酸が、微生物によって活発に吸収・不動化されていること、それよりも速い速度で硝化が生じていることを示している。つまり、土壤水中の硝酸の$\delta^{18}O$の低下が、原位置での硝化と不動化の活発さを物語っており、この変化を指標として総硝化速度がいかに純硝化速度よりも大きいかが評価出来るはずである。

以上の背景を踏まえ、本サブテーマの目的は、森林の生態系機能を制御する物質循環機構の定量的記述のための安定同位体比の利用に関し、より実用的で有用な情報を得るためのプロトコルを開発、提案することである。このために、次の3つの課題を設定し、野外観測、試料の収集、安定同位体比の測定、モデルを用いた解析からなる一連の作業を行ってきた。
1）日本で地理的（気候的）に広い範囲に分布する単一樹種（ブナ）の葉の炭素・窒素安定同位体比を測定し、その生理生態学的特徴の地理的変異を明らかにする。

2）森林土壤中・地下水中の $ NO_{3}^{-} $ の安定同位体比を指標に用い、生態系レベルにおける窒素無機化、硝化量、脱室量を推定する手法を提案する。

3）窒素の形態変化の活性がどのような微生物活動によって生じているのかを把握するために、遺伝子情報を用いた土壌微生物の群集構造に関する解析を行う。このとき、微生物の窒素形態変化に関わる活性を定量的に評価するために、安定同位体比トレーサーを用いた培養実験をおこなった。

### 3. 研究開発方法

## （１）安定同比対比によるブナの生理生態学的特徴の地理的変異の把握

全国22カ所に設置されたブナ調査プロットから採取されたブナの生葉を収集した。このほかに、北海道大学北方生物圏フィールド科学センター苫小牧研究林圃場と東京大学秩父演習林共通圃場において、各地方から収集された実生から栽培されたブナの生葉も試料とした。生葉は、乾燥後粉砕し、炭素・窒素安定同位体比を測定するサンプルを調整した。元素分析計がコンティニュアスフローシステムで接続された質量分析計を用い、各試料の窒素と炭素の安定同位体比を測定した。これらのデータと、各サンプルの産地における環境条件との関係を考察した。

## （２）$\mathrm{NO}_{3}^{-}$安定同位体比を用いた生態系レベルの窒素無機化、硝化量推定

## 1 ）野外调查方法

滋賀県南部に位置する桐生水文試験地（5.99ha）内の原頭部小流域で行われた（以下マツ沢と呼ぶ、図(4)-1）。土壌層の特徴を概説する。マツ沢流域全体の基岩地質は田上花崗岩であり、土壌母材は、一般にマサと呼ばれる花崗岩の風化堆積物である。土壌学的な定義での層位の分化はあまり明瞭でなく、有機物の混入は比較的少ない。O層は斜面上部、斜面下部ともにはっきりとしたH層を欠き、モーダー型に分類される。斜面上部の鉱質土壌層は、2cm以下のA層とAC層からなり、B層は発達していない。斜面下部では10cm弱のA層が発達し、以下30cm前後のB層があるが、いずれも団粒等の明瞭な構造を持たない。全体としては、斜面の上部と流域の下端とで、土壌断面の形態に明瞭な違いは見られない。つまり、森林植生の影響で有機物の供給を受けて形成された土壌層は、表層数10cmに限られ、以下基岩までの土壌層は、風化花崗岩堆積物からなるC層である。土壌分類では褐色森林土(BD(d))に属する。対象小集水域は、植栽後50年を経過したヒノキ人工林、アカマツと落葉広葉樹（コナラ、コシアブラなど）の混交林で覆われている。下層植生はヒサカキが優占する。

## 2 ）サンプルの採取と分析

土壌水はテンションライシメータを用い、地下水は地下水井戸から採取し、化学分析と同位体比の測定に供した。分析用水サンプルは、0.20μmのフィルターでろ過後、Cl⁻、NO₃⁻、SO₄²⁻、Na⁺、K⁺、NH₄⁺、Mg²⁺、Na⁺の濃度をイオンクロマトグラフィー（島津製作所LC-10A）で測定した。

NO_{3}^{-}イオン中のNとOの安定同位体比は、脱窒菌法 $ ^{7,8)} $ を用いて測定した。測定には、山梨大学医学工学総合教育部環境社会創生工学専攻と京都大学生態学研究センターの濃縮装置、質量分析計
を利用した。

サンプル中の $ NO_{3}^{-} $ を、気相がヘリウムで置換されたガラスバイアル中で単離培養された脱窒菌を用いて脱窒し、 $ N_{2}O $ ガスを得る。このガスを安定同位体質量分析計に導入して、NとOの安定同位体比を測定する（図(4)-2）。一般に脱窒菌は嫌気条件で、 $ N_{2}O $ ガスをさらに $ N_{2} $ に還元するが、この方法に用いる脱窒菌は、この反応に必要な酵素を持たない種（Pseudomonas chlororaphis）である。

図(4)-1 京都大学桐生試験地の位置とサンプリングが行われたマツ沢の地形。下段はマツ沢の縦断面と横断面。●は地下水採取のための観測井戸。Sは飽和帯、Uは不飽和帯、Tは両者の遷移帯である(Ohte et al. 1995のゾーン分類による)。
図(4)-2 脱室菌法のコンセプトと分析システム（質量分析器、ガスクロマトグラフ、導入前濃縮装置からなる）。

同位体比は、一般にδ値で表現され、以下の式で計算される。

$$ \delta=\ (R_{sample}/R_{std}-1)\ *1000(\%o) $$

加えて、上記のサイトで、バリードバッグとイオン交換樹脂を埋設する従来の方法によって、in situインキュベーションによる純硝化量の測定を行った。

3）$\mathrm{NO}_{3}^{-}$の$\delta^{18}\mathrm{O}$値からの総硝化量推定手法

土壤中の $ NO_{3}^{-} $ プールを中心にしたマスバランスは、以下のように表される（図(4)-3）。

$$ \mathrm{d}\mathrm{S}/\mathrm{d}\mathrm{t}=\mathrm{Ng}+\mathrm{D}-\mathrm{I}-\mathrm{U}-\mathrm{L} $$

Sは $ NO_{3}^{-} $ のプール、tは時間、Ngは総硝化量、Dは大気降下物での $ NO_{3}^{-} $ の負荷量、Iは $ NO_{3}^{-} $ の不動化量、Uは植物による $ NO_{3}^{-} $ 吸収量、Lは溶脱量である。

ここで、 $ NO_{3}^{-} $ プールにおける酸素安定同位体比 $ \delta^{18}O-NO_{3}^{-} $ の変動に着目する。不動化や植物による吸収の際には同位体分別は生じないと仮定し、土壤中で硝化が生じるとき、上述のように、必
要な3個の酸素原子は土壌空気中の $ O_{2} $ から1個、 $ H_{2}O $ から2個供給されると仮定する $ ^{5)} $ 。このとき、酸素の $ \delta^{18}O $ は一般的な23‰とし、水の $ \delta^{18}O $ は、観測値から求める。降下物として流入する $ NO_{3}^{-} $ の $ \delta^{18}O $ （D）には林内雨の観測値を用いる。植物による吸収量（U）は成長量データから推定する。溶脱量は別途、土壤に埋設したイオン交換樹脂によって測定された値を参考にする。

これらと、in situインキュベーションで求められた純硝化量Nnを用いて、計算されるNO_{3}^{-}プールのδ^{18}O値が、土壌溶液のδ^{18}O-NO_{3}^{-}実測値と近くなるように、総硝化量Ngと不動化量Iを最適化して求める。ここで、Nn=Ng-Iである。

図(4)-3 土壤中の $ NO_{3}^{-} $ プールを中心にしたマスバランスを示すコンパートメントモデル

## （３）機能遺伝子を用いた脱窒細菌の群集構造の解析と活性評価

## 1 ）野外调查方法

窒素の形態変化の活性と微生物の群集構造との関係に関する調査は、千葉県鴨川市にある東京大学千葉演習林の袋山沢流域（北緯35°12'、東経140°06'）で行った（図(4)-4）。この試験地は北側のA流域（0.802ha）、南側のB流域（1.087ha）という二つの隣り合った流域が存在している。B流域は1999年に皆伐をしたのち、2001年にスギ・ヒノキを植栽した人工林であり、A流域は対象区として残してある。地質は飯島ら（1976）の調査により、新第三紀層三浦層群豊岡層に分類されており、基岩は砂岩泥岩互層である。本調査ではB流域のB2、B6の井戸周辺の土壌を2011年の2月と7月に採取した。また、本研究に先駆けて予備調査として2011年1月にもB6およびB7の土壌を採取した。B6は斜面下部の滯水帯であり、1年を通して常に地下水があるのに対し、B2は斜面上部で水が抜けやすいため、特に地下部(1m以下)の土壌は水分環境が異なると考えられる。

土壌水はテンションライシメータを用い、地下水は地下水井戸から採取し、化学分析と同位体比の測定に供した。分析用水サンプルは、0.20μmのフィルターでろ過後、Cl⁻、NO₃⁻、SO₄²⁻、Na⁺、K⁺、NH₄⁺、Mg²⁺、Na⁺の濃度をイオンクロマトグラフィー（島津製作所LC-10A）で測定した。NO₃⁻イオン中のNとOの安定同位体比は、脱窒菌法 $ ^{7),8)} $ を用いて測定した。測定には、京都大学生態学研究センター所有の濃縮装置、質量分析計を利用した。

B2、B6それぞれの井戸の周辺のリターを除去し、0-5cmの土壌を4反復で採取して混ぜ合わせ、これを表層土壌とした。また、B6井戸の水面は地表から約90cmであったため、オーガーで穴を掘り90-100cmの土壌を4反復で採取して混ぜ合わせ、これを下層土壌とした(図(4)-4)。採取した土壌はあらかじめ滅菌したポリ袋に入れて保冷バッグに入れ、実験室に戻ってから速やかに冷蔵庫に
移し、分析まで4℃で保管した。土壌DNA抽出用のサンプルは速やかに-80℃で冷凍保管した。

図(4)-4 a) 東京大学大学院農学生命科学研究科附属千葉演習林、袋山沢試験流域の位置、b) 袋山沢試験流域の地形、観測井戸 B2、B6、B7、B8、B9 の位置。恒常的な地下水帯は、下流端に存在し、B6~B9 はこの範囲に含まれる。

## 2 ）脱室活性の測定（ $ ^{15} $ Nトレーサー実験）

Katsuyama（2008） $ ^{9)} $ に基づき、各サイト・各層・各季節における脱窒活性を測定した。まず土
壊を1サンプルにつき7本ずつ、30mLガラスバイアルに乾重換算で3.0gとなるように入れた。その後嫌気箱（Arガス充填、DO<0.01）内で合計が15.0gとなるように脱酸素ミリQを加え、ブチルゴム栓をして取り出した。嫌気箱から出したガラスバイアルはアルミキャップをし、ヘッドスペースをHe置換し、内圧を測定した。

調查地の現場温度（地下水温度）を参考に、2月は10℃、7月は20℃で培養した。この7本のサンプルのうち3本には $ ^{15} $ Nで標識した硝酸塩(Na $ ^{15} $ NO $ _{3} $ )を50μL加え、2本はコントロールとして何も加えずに測定を行った。また硝酸塩添加／無添加各一本は初期濃度測定のためにすぐに空けた。硝酸塩を添加したサンプルはHe気流下で速やかにガスタイトシリンジを用いてヘッドスペースガスを75μL抽出・圧縮し、ガスクロマトグラフ(GC-MS; Agilent 6890N/5973GC/MSD system, Agilent

Technologies, CP-Pora-BOND Q Fused Silica $ (25m\times0.32mm) $ キャピラリーカラム; Varian, CA, USA) によって気相の $ N_{2} $ 同位体 $ (28N_{2}, 29N_{2}, 30N_{2}) $ および $ ^{46}N_{2}O $ 同位体 $ (^{44}N_{2}O, ^{45}N_{2}O, ^{46}N_{2}O) $ 濃度を測定した。添加してから約30分おきにGC-MS測定を行い、基質を添加してからの脱室活性の時間変化をみた。すべての測定が終了した後、内圧を測ってからブチルゴム栓をとり、時間とpHを記録し、8000rpmで5分間遠心分離した上澄み液を0.20μmフィルターで濾過し、分析まで-20℃で保管した。

Nガス濃度は、

(ラベルした $ N_{2} $ )= $ (\mathrm{^{29}N_{2}}+2\mathrm{^{30}N_{2}})/ $ 標識率)、

(ラベルした $ N_{2}O $ )= $ (^{45}N_{2}O+^{46}N_{2}O) $

として求めた。

## 3 ）系統解析

## a DNA抽出与DNA濃度測定

土壌DNA抽出は土壌を0.5g（生重）とり、ISOIL for Beads Beating (Nippon Gene, Tokyo, Japan）の最大収量プロトコルに従った。Beads BeatingにはBiospec Mini-Bead Beaterを用い、4800ppm、45秒で行った。最後に100μLのTEに溶解し、DNAを得た。得られたDNAは分光光度計(ND-1000, NanoDrop, Wilmington, DE, USA)で濃度を測り、10ng/μLとなるように希釈した。

## b クローニング

PCR反応液は、10×ExTaqバッファー (Takara Bio, Otsu, Japan) 5.0μL、dNTPmix (Takara Bio) 4.0μL、プライマー (nirK : F1aC-R3Cu、nirS : cd3aF-R3cd) 各2.0μL、ExTaq ポリメラーゼ (Takara Bio) 0.25μL、滅菌ミリQ 32.75μL、Template (10ng/μL) 4.0μLとし、各サンプルにつき2連で行った。

PCR条件は、NirKについては初期変性95℃(2min)を行い、続いて95℃(15sec)、63℃(30sec)、72℃(1min)をタッチダウンで6サイクル、95℃(15sec)、58℃(30sec)、72℃(1min)を25サイクル行ったのち、最後に伸長反応72℃(10min)とした。NirSについては初期変性95℃(2min)を行い、続いて95℃(20sec)、57℃(30sec)、72℃(1min)を35サイクル行ったのち、最後に伸長反応72℃(10min)とした。

このPCR増幅産物計100μLをWizard SV Gel and PCR clean-Up system (Promega, Fitchburg, WI,
USA)を用いて精製し、TOPO TA cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) を用いて One shot TOPO10 competent cells にクローニングした。このクローンを LB 培地（LBmix 5g+寒天 3g+RO 水 200ml+アンピシリン 400μL）にそれぞれ 10/20/30/40/50/60μL ずつまき、37℃で 16 時間培養した。

## c シークエンシング

シャーレ上のシングルコロニーを一つずつ反応液(10×バッファー1.0μL、dNTPmix 1.0μL、プライマー（M13F/M13R）各0.3μL、Taq 0.1μL、ミリQ 7.0μL)の入ったPCRチューブに入れ、初期変性95℃(2min)、95℃(20sec)、55℃(30sec)、72℃（1min）を25サイクル、伸長反応72℃(10min)でPCRを行った。

このPCR増副産物を、2％アガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロマイド染色し、目的塩基長のバンドが各サンプルにつき48個得られるまでこれを繰り返した。目的塩基長のコロニーは液体培地（LBmix 10mL+アンピシリン20μL）を80μL入れたプレートに入れ、37℃200rpmで16時間培養し、グリセロール20μLを加えてボルテックスで攪拌し、分析まで冷凍保存した。得られたクローンはTakara Bioに外注しシーケンスデータを得た。

## d 系統解析

シーケンスデータはCLUSTAL W パッケージ (Data Bank of Japan ; DDBJ : http://www.ddbj.nig.ac.jp/) によってアライメントをかけ、PHYLIPパッケージのDNADISTプログラムから、Jukes-Cantorアルゴリズムを使って遺伝距離を計算した。波形データとシーケンスデータから、波形が乱れている、もしくは配列が他と大幅に異なるものは除去した。mothurプログラムのclusterによって95%以上の相同性を示したクローンを一つの操作的分類単位(OTUs)とした。各OTUの代表クローンをTranseq (the European Molecular Biology Open Software Suite ; EMBOSS : http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/transeq/) でアミノ酸に置換したのち、再度CLUSTAL Wの近隣接合法で求め、NJ Plotで描写し、系統樹を作成した。また、Shannon-Index (H=- $ \Sigma $ pi・lnpi pi:出現率)を用いて多様性を評価した。

## 4 ．結果及び考察

（１）安定同比対比によるブナの生理生態学的特徴の地理的変異の把握

生薬の炭素安定同位体比（$\delta^{13}\mathrm{C}$）は、その薬の長期平均的な水利用効率を示す。$\delta^{13}\mathrm{C}$が大きいほど、水利用効率が高い。図(4)-5は、上記ブナ生薬サンプルの$\delta^{13}\mathrm{C}$の測定結果を示している。$\delta^{13}\mathrm{C}$にはブナの原産地の緯度と有意な負の相関関係が見られ、高緯度地方のブナほど水利用効率が低く、低緯度地方のブナほど高かった。このことは、ブナにとっての恒常的な水ストレスが、平均気温の高い低緯度地方でより顕著に現れていることを物語っている。一方、図(4)-6は$\delta^{13}\mathrm{C}$と$\delta^{15}\mathrm{N}$の関係を示している。植物は一般に水利用効率を上げるために気孔開度を低下させるが、これによって光合成速度は低下するので、単位吸収窒素量あたりの光合成量で表される窒素利用効率は、低下する。つまり、この両者の間にトレードオフの関係があることは、これまでにも指摘されている（例えば、DeLucia and Schlesinger 1991$^{10}$）。図(4)-6では、$\delta^{15}\mathrm{N}$が大きいときに$\delta^{13}\mathrm{C}$が低下する傾向が見られる。一般には、土壌中の窒素のステータスやダイナミクスは、森林ごとに異質性があるので、窒素利用効率と$\delta^{15}\mathrm{N}$の間に一義的な関係は仮定できない。しかしな
がら、図(4)-6で示したデータは、共通圃場で採取された原産地の異なる個体についてのものなので、結果は、主には個体の特徴を示すものと考えてよい。水利用効率が低く、窒素利用効率が高い個体では窒素の再利用率が高く、窒素の同位体比が上昇するというメカニズムを示唆するものであった。

図(4)-5 ブナの原産地の緯度とδ $ ^{13} $ Cの関係

図(4)-6 秩父演習林共通圃場におけるブナサンプルの$\delta^{15}\mathrm{N}$と$\delta^{13}\mathrm{C}$

（２）$\mathrm{NO}_{3}^{-}$安定同位体比を用いた生態系レベルの窒素無機化、硝化量推定

1） $ NO_{3}^{-} $ の窒素・酸素安定同位体比の空間分布

図(4)-7に、 $ NO_{3}^{-} $ 濃度、 $ NO_{3}^{-} $ の窒素・酸素安定同位体比の観測結果を示す。 $ NO_{3}^{-} $ 濃度は表層土壤で高く、土壤層深部ほど低下した。窒素安定同位体比δ $ ^{15} $ Nは、土壌深部から、地下水帯への過程で徐々に上昇する傾向が見られた。大気降下物中の硝酸の酸素の安定同位体比（δ $ ^{18} $ O）の平均値は65‰、地下水のそれは約2‰であり、土壌水が表層から下層に浸透していく過程で低下して
図(4)-7 観測ポイント(マツ沢 G1)における硝酸濃度、窒素・酸素同位体比( $ \delta^{15}N,\ \delta^{18}O $ )の空間的な変動。 RF：林外雨、TF1：林内雨、G1-0～50：深さ0～50cm 土壌水、G1-130～177：深さ130～177cm の地下水、G2-400：G1 に近接したポイントの深さ400cm の地下水、MST：マツ沢の渓流水。
## 2 ） $ A_{0} $ 層、鉱質土層における純無機化速度・硝化速度、総無機化速度・硝化速度

図(4)-8にin situインキュベーションによって測定された純無機化速度・硝化速度、 $ ^{15} $ N同位体希釈法によって測定された総無機化速度・硝化速度の季節変動を示す。純無機化速度は鉱質土層よりも $ A_{0} $ 層で顕著に高く、両者に若干の季節性の違いが見られるが、概ね夏季に高いことが分かる。純硝化量は無機化速度に比べて1オーダー小さいが、夏季に高い傾向は見られた。一方、総無機化速度・硝化速度は、 $ A_{0} $ 層でも鉱質土層でもそれぞれの純速度に比べて数倍から数十倍の大きさであった。総速度の季節変動は純速度と異なり、夏季には低下していた。

図(4)-8 A_{0} 層、鉱質土層における純無機化速度・硝化速度、総無機化速度・総加速度の季節変化。NetMinRate: 純無機化速度、GroMinRate: 総無機化速度、NetNitRate: 純硝化速度、GroNitRate: 総硝化速度

## 3 ） $ NO_{3}^{-} $ の $ d^{18}O $ が示すこと

著しく高い\delta^{18}Oを持つ大気降下物中の硝酸は、土壌中では、\delta^{18}Oの低い硝化由来の硝酸と混合し、次第に低下していく。まず、バリードバッグ法によって求められた年間の純硝化量、大気降下物量を基に、硝酸のマスバランスを考え、\delta^{18}Oの平均的な値を概算する（図(4)-9）。松村ら（2003） $ ^{11)} $ によると、このサイトにおける純硝化量は18 kg/ha/yr、硝酸の降下量は6 kg/ha/yrであった。上で述べたように土壌中での硝化で生成される硝酸の平均的な\delta^{18}Oを2‰、降下物中の硝酸のそれを65‰と仮定すると、両者の混合によって得られる\delta^{18}Oは、約17.8‰となる。一方、図(4)-7に示した
ように、実際の土壌水の中の硝酸のδ^{18}Oは、深さ100cm付近での平均値は、約2‰である。この差は、すなわち、純硝化量が真の硝酸生成量ではなく、明らかに過少な推定値であることを物語っている。このことから、現実の土壌水中の硝酸のδ^{18}Oが再現できるようなマスバランスを成り立たせる総硝化量がどれだけであるかということを逆算できる可能性が示唆される。

図(4)-9 降水の硝酸のδ^{18}O と硝化によって生成される硝酸が混合する場合のマスバランスの検討。純硝化量は18 kg/ha/yr、硝酸の降下量は6 kg/ha/yrであった(松村ら2003)。土壤中での硝化で生成される硝酸の平均的なδ^{18}O を2‰、降下物中の硝酸のそれを65‰と仮定すると、両者の混合によって得られるδ^{8}O は、17.8‰となる。一方、実際の土壤水の中の硝酸のδ^{18}O は、G1の深さ100cmの地下水平均值は、約0‰である。この差は、すなわち、純硝化量が真の硝酸生成量ではなく、明らかに過少な推定値であることを物語っている。

4） $ NO_{3}^{-} $ 同位体マスバランスからの総硝化量の検討

図(4)-3のフローのうち、降下物による硝酸供給量、植物の硝酸吸収、土壌層からの硝酸溶脱量
は、観測値、既往文献等から与えることができる。このサイトにおける先行研究の松村ら（2003） $ ^{11)} $ による観測値を参考にし、純硝化速度を18kgN/ha/year、降下物による硝酸供給が6kgN/ha/yearとなるように、総硝化量と降下物を与えることとする。さらに $ ^{15} $ Nによる同位体希釈法で求められた総硝化速度とその季節変動を参考にし、土壤溶液中のNO $ _{3} $ $ ^{-} $ のδ $ ^{18} $ O値が再現できるかどうかを検討した。

上述したように、微生物による硝化では3つの酸素原子のうち、1つを土壌空気中の酸素分子 $ (\mathrm{O}_{2}) $ から、2つを土壌水 $ \left(\mathrm{H}_{2}\mathrm{O}\right) $ からとると仮定する $ ^{5)} $ 。酸素分子の $ \delta^{18}O $ は23‰、土壌水そのものの $ \delta^{18}O $ はKabeya et al.（2007） $ ^{12)} $ による同じサイトでの観測値を参考に-8‰とする。植物の吸収と、微生物による不動化の過程では同位体分別が生じないと仮定する。計算は日単位で行う。

図(4)-10は、計算された硝酸プールのδ^{18}Oを示している。このときの計算条件を表(4)-1にまとめる。 $ ^{15} $ N同位体希釈法で求められた条件では、夏に総硝化速度は低下しているうえ、一方で夏期には降水によるNO_{3}^{-}の入力が大きくなるため、プールのδ^{18}Oは著しく高くなった（〜30‰）。その後、総硝化速度は秋から冬にかけて回復し、降水量は低下するので、プールのδ^{18}Oは5‰程度に低下する。

表(4)-1 図(4)-10 のシミュレーションにおける計算条件

パラメータ
総硝化速度に対する不動化速度の割合	0.6
降下物中の硝酸のd18O	65 %o
硝化由来の硝酸のd18O	0 %o
入力データ
年間総硝化量	25.4 kgN/ha/year
降下物による硝酸の年間総量	6.6 kgN/ha/year
植物による年間吸収量	11.0 kgN/ha/year
土壤層から溶脱する硝酸の年間総量	4.6 kgN/ha/year
計算結果
硝酸プールのd18Oの年間平均値	15.2 %o

この計算例では、$\delta^{18}O$ の年間平均値は約15‰で、土壌水の$\mathrm{NO}_{3}^{-}$ の同位体比のデータ（図(4)-7）を参照すると、深さ10cmにおいて、平均値は17‰であり、計算結果はばらつき範囲に概ね一致している。このことから、深さ0-10cmの範囲では、$\mathrm{NO}_{3}^{-}$ は硝化由来、降水由来が季節ごとに大きく変動し、夏季は降水由来の割合が5割程度になることが推測された。

次に総硝化量に対する不動化量の割合を変化させた場合に、硝酸プールのδ¹⁸Oの計算値がどのように変化するかを検討する。割合が大きい方が大きくなる。図(4)-9に示したようにマスバランスにおける両者の差は、約15‰である。図(4)-11に示すように、純硝化量を用いて計算した値と総硝化量を用いて計算した値との差は、不動化の間の平均値がこれに近いδ¹⁸Oとなるときの計算における、総硝化量に対する不動化量の割合は0.6前後であった。この値は、¹⁵Nトレーサーによる同位体希釈法によって示された値の範囲に入る値であった。
図(4)-10 総硝化量に対する不動化量の割合(Im)を変化させた場合における硝酸プールのδ^{18}O 計算値。純硝化量を用いて計算した値と総硝化量を用いて計算した値との差は、不動化の割合が大きい方が大きくなる。
— Estimate using net nitrification rate

— Estimate using gross nitrification rate

図(4)-11 総硝化量に対する不動化量の割合(Im)を変化させた場合における硝酸プールの$\delta^{18}O$ 計算値。純硝化量を用いて計算した値と総硝化量を用いて計算した値との差は、不動化の割合が大きい方が大きくなる。
## 3 ）機能遺伝子を用いた脱窒細菌の群集構造の解析と活性評価

a 脱室活性测定 $ \left(^{15}\mathrm{N}\right) $ トレーサー実験

硝酸を加えてから発生した $ N_{2} $ と $ N_{2}O $ の生成速度を表(4)-2に示した。下層に比べ表層の活性が有意に高かった $ (P<0.01) $ 。表層では温度の高い7月の活性の方が高かったが、下層では逆に2月の方が高かった。硝酸濃度は2月の表層を除き、検出限界 $ (0.001\mu g-NO_{3}^{-}/g dry soil) $ 以下であった。

表(4)-2脱室活性と系統解析の結果

NO_{3}^{-}浓度(mg/L)	含水率(%)	DNA浓度(ng/g dry soil)	N_{2}+N_{2}O生成浓度(mg/g dry soil/h)	n_{4}K(n=338,1100TU)	n_{5}K(n=350,1420TU)
灌水带	表层	2月	1.487	66.2	16.4	31.7	43	32	25.6	3.31	46	29	28.3	3.18
7月	ND.	58.5	22.9	48.9	43	26	27.9	3.10	42	33	21.4	3.40
下限	2月	ND.	63.1	2.8	11.4	39	23	38.5	2.87	45	34	20.0	3.41
7月	ND.	63.3	1.4	2.5	43	21	48.8	2.84	46	27	43.5	2.90
斜面上	表层	2月	3.529	65.1	15.1	45.8	40	28	25.0	3.25	40	24	32.5	3.01
7月	0.278	62.9	14.1	45.0	42	31	26.2	3.30	44	34	22.7	3.41
下限	2月	0.439	46.5	2.9	8.6	43	20	58.1	2.33	42	25	33.3	2.99
7月	ND.	46.4	3.0	1.4	45	27	40.0	2.78	45	25	28.9	3.01

## b 微生物系统解析

系統解析の結果から nirS を持つOTUの構成比をサンプル別に示す（図(4)-12）。表層のDNA濃度(13.1-22.9 (mg/g dry soil))は下層(1.44-2.97 (mg/g dry soil))の約10倍であったが、試料採取地点・季節による差は小さかった。nirKは110OTUs、nirSは142OTUsに分類された。表層のnirKの多様性指数は下層より有意に高かった（P<0.05）が、nirSでは差は見られなかった。各試料採取地点における上位3つのOTUがその地点全体に占める割合は、特にnirKの下層で高く、下層に特徴的と見られる。

図(4)-12 nirS を持つOTUの構成比
れるOTUが現れた。一方nirSでは滯水帯の下層の群集組成が他に比べて特徴的であった(b、d、g、h、等がなく、代わりにc、f等が優占)。さらに、同じサイトでも季節によって優占するOTUが異なるものも見られ、この傾向はnirK/nirSいずれにおいても滞水層で顕著に現れた。（例:図(4)-12・f）

## 4 ）活性評価と系統解析結果から示される土壤中での脱窒の特徴

表層に比べて嫌気的な環境になりやすい下層で脱窪活性が高くなることを想定したが、十分に基質を加え嫌気的な環境におけるポテンシャルとしては、表層の活性の方が約10倍高かった。表層で活性が高い理由として微生物のエサである有機物の供給が多く、下層と比べて菌数が高いことが考えられる。脱窪菌は通性嫌気性菌であるため、好気的な環境では好気呼吸を行い生育するが、降雨後など、土壌含水率が高い時に土壌構造の内部などが嫌気的環境になることがあれば、表層土壌でも脱窪が起きる可能性がある。

系統解析の結果から、nirKとnirSは異なった傾向を示した。nirKの多様性指数と土壌含水率の間には有意ではないが相関が認められた。また、nirK/nirSともに季節によって優占種が異なる可能性が示唆された。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

ブナのように、比較的広い気候帯に分布する種では、生薬細胞の炭素安定同位体比から読み取れる個体の水利用効率の評価は有用で、平均気温や降水量に反応した多様性が表れることがわかった。用いた試料は産地の異なる種子を同一の圃場で生育させた個体から採取したものであるから、同位体比に表れた差は、各産地の気候条件に適応した群集ごとの機能（水利用効率）が遺伝的な分化のレベルであることを示している。こうしたことは、intrinsic（固有の）な形質が測定できる安定同位体比の利点であると言える。

土壤水中の硝酸の酸素安定同位体比（$\delta^{18}\mathrm{O}$）から、マスバランスモデルを介することによって土壤中での総硝化量が推定可能であることが示された。同じ観測サイトの土壤試料を対象に行った、$^{15}\mathrm{N}$トレーサーを用いた同位体希釈法による培養実験の結果から、土壤中での総無機化速度、総硝化速度ともに、それぞれの純速度に比べて著しく大きく、両方の過程で不動化が活発に生じていることが明らかになった。このことは、上記の原位地における硝酸の$\delta^{18}\mathrm{O}$から読み取れる、総硝化が純硝化量よりも大きいと考えられること、すなわち活発な硝酸の不動化も生じていることを支持することであった。これまでにも、森林土壤では総硝化量が純硝化量に比べて著しく大きいことは、実験室培養によって示されてきていたが、本研究で示した結果は、野外の原位置森林土壤においてもその現象があることを実証した最初の例と言える。

脱窒に関与する微生物群集の群集構造や活性を測定した結果、以下の様な非常に示唆的なことが明らかになった。従来、森林生態系では脱窒は、地下水帯が頻繁に生じている場所や、渓流の周辺のライパリアンゾーンなどの嫌気的環境が維持されるところで主に生じていると考えられてきた。しかし、本研究で示されたことは、通常酸化的な斜面土層の土壌表層に、
十分な量の脱室機能遺伝子を持った細菌群集が存在することを示しており、嫌気条件の成立によって即座に脱室を開始する可能性を示していた。このことは、降雨によって土壌表層が十分に湿潤になることで、基質が十分にある土壌表層では、脱室が生じている可能性があることを示しており、森林生態系の窒素放出という機能について、これまであまり調べられていない経路の存在を示唆するものである。今後、原位置での土壌表層の水分条件の変化に対する脱室活性の応答に関する調査を進める必要があることが分かった。

今後、以上のこの研究で得られた新たな知見を、学術雑誌に公表するばかりでなく、一般向けの図書での出版や講演会での公表などを通じて、成果の普及に努める。

## （２）環境政策への貢献

現時点では、環境政策への直接的な貢献となる成果をあげるに至っていないが、本サブテーマの研究成果は、過剰な窒素降下物の環境下での森林生態系保全、水資源管理を考える上で不可欠な情報を得るために有用な方法論を提示するものであると考えている。今後、生態系管理の計画に資する調査手法の中で活用されるよう、実装可能なプロトコルへの改良を行っていく。

## 6 ．国際共同研究等の状況

## （1） 国際共同研究計画

以下のように、共同研究を計画している。JSPS日本学術振興会から助成を得て、平成24年度二国間交流事業共同研究・セミナー「環境変動に対する森林集水域・生態系の応答に関する日米合同セミナー」（US-Japan joint seminar on responses of catchment hydrology and forest biogeochemistry to environmental changes）を、来年1月に行う予定である。米国側の代表研究者は、Kevin J. McGuire (Assistant Professor, Department of Forest Resources and Environmental Conservation Virginia Polytechnic Institute and State University)である。

本セミナーによって、この分野の研究の世界におけるイニシアティブをとれるネットワーク体制の構築について具体的な計画策定を目指す。加えて、情報共有のために両グループが持っているデータベースのネットワーク化を進める。これには現在運用されている両国のLTER（Long Term Ecological Research、長期生態学研究）ネットワークのリソースを活用する。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) N. OHTE, N. TOKUCHI, and K.OSAKA: In, Ohkouchi, N., et al., (eds) Earth, Life and Isotope. Kyoto: Kyoto University Press. (2010).

“Hydrologic controls on the nitrogen dynamics of forested ecosystems investigated using water and nitrate isotope signatures”.

2）徳地直子、大手信人、臼井伸章、福島慶太郎：日本生態学会誌,61,3,275-290(2011)

“窒素負荷に伴う森林生態系の窒素循環過程の検討”
3) N. OHTE: Ecological Research, (2012)

“Tracing sources and pathways of dissolved nitrate in forest and river ecosystems using high-resolution isotopic techniques: A review” (in press)

4) N. OHTE, M. NAKAOKA and H. SHIBATA: in Biodiversity Observation Network in Asia-Pacific region: Towards further development of monitoring activities, (2012) Springer “ILTER and JaLTER: Their Missions and Linkage to Database Development in the Asia-Pacific Region” (in press)

5) N. TOKUCHI, N. OHTE, K. OSAKA and M. KATSUYAMA: Environmental Monitoring and Assessment, (2012)

“Separate estimation of N export into baseline N leakage without disturbance and N loss due to insect defoliation in a pine forest watershed in central Japan” (in press)

6) N. OHTE: Ecological Research, (2012)

“Implications of seasonal variation in nitrate export from forested ecosystems: A review from the hydrological perspective of ecosystem dynamics” (in press)

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) 大手信人、仲岡雅弘、日本生態学会編 エコロジー講座 4 地球環境と生態系の関係を解き明かす. 東京: 文一総合出版 34-45 (2011)

「森林の水と物質の循環からわかる生態系の変化」

2) 大手信人、渡辺彰（土壌肥料学会編）,土壌—河川—海生態系における溶存有機炭素の動態と機能. 東京: 博友社 (2011)

「森林からのDOMの流出機構とフラックス」

## （2） 口頭発表（学会等）

1）大手信人：第58回日本生態学会（2011）公開講演会講演「森林の水と物質の循環からわかる生態系の変化」（招待）

2) N. Ohte, N. Tokuchi, and M. Fujimoto: AGU (American Geophysical Union) Fall Meeting, San Francisco, USA, Dec., 2011

“Seasonal variations of nitrate discharge from forested catchments: Suggestions from Japanese Case Studies (Invited)”

3) N. Ohte: Symposium on sustaining forest resources in a changing climate, Taipei, Taiwan, March, 2012

“Global comparisons on seasonal patterns of nitrate discharge from forested catchments” (Invited)

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

1) 第59回日本生態学会自由集会「森が大気を変える - 微量大気成分を支配する森林生態系」
(2012年3月17日、大津、30人)

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

大手信人 日本生態学会大島賞 2011年3月

「森林と河川生態系における窒素循環と窒素の流出過程に関する研究」

### 8 \. 引用文献

1) Michener R. & Lajtha K. (2007) Stable Isotopes in Ecology and Environmental Science, Second Edition. Blackwell Publishing, Oxford, UK.

2) Farquhar G. D., Ehleringer J. R. & Hubick K. T. (1989) Carbon isotope discrimination and photosynthesis. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 40:503-537.

3) Davidson EA, Hart SC, Shanks CA, Firestone MK (1991) Measuring gross nitrogen mineralization, immobilization, and nitrification by $ ^{15} $ N isotope dilution in intact soil cores. Journal of Soil Science 42: 335-349

4) Davidson EA, Hart SC, Firestone MK. (1992) Internal cycling of nitrate in soils of a mature coniferous forest. Ecology 73: 1148-1156.

5) Kendall C (1998) Tracing nitrogen sources and cycling in catchments, in Isotope Tracers in Catchment Hydrology, edited by C. Kendall and J. J. McDonnell, pp. 519–576, Elsevier, Amsterdam.

6) Osaka K, Ohte N, Koba K, Yoshimizu C, Katsuyama M, Tani M, Tayasu I, Nagata T (2010) Hydrological influences on spatiotemporal variations of d15N and d18O of nitrate in a forested headwater catchment in central Japan: Denitrification plays a critical role in groundwater. Journal of Geophysical Research 115, G02021, doi: 10.1029/2009JG000977.

7) Sigman, D. M., K. L. Casciotti, M. Andreani, C. Barford, M. Galanter, and J. K. Böhlke (2001), A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater, Anal. Chem., 73, 4145–4153, doi:10.1021/ac010088e.

8) Casciotti KL, Sigman DM, Hastings MG, Böhlke JK, Hilkert A (2002), Measurement of the oxygen isotopic composition of nitrate in seawater and freshwater using the denitrifier method, Anal. Chem., 74, 4905–4912, doi:10.1021/ac020113w.

9) Katsuyama, C., Kondo, N., Suwa, Y., Yamagishi, T., Itoh, M., Ohte, N., Kimura, H., Nagaosa, K., and Kato, K. (2008). Denitrification activity and relevant bacteria revealed by nitrite reductase gene fragments in soil of temperate mixed forest. Microbes and Environments 23, pp. 337-345

10) DeLucia E. H. & Schlesinger W. H. (1991) Resource-Use Efficiency and Drought Tolerance In Adjacent Great Basin and Sierran Plants. Ecology 72: 51-58

11) 松村光子, 大手信人, 小杉緑子, 徳地直子, 高梨聡, 松尾奈緒子, 勝山正則 (2003), ヒノキ人工林における土壌－植物間の無機態窒素の移動プロセス, 日本緑化工学会誌, 29, 301-304.
12) Kabeya N, Katsuyama M, Kawasaki M, Ohte N, Sugimoto A (2007) Estimation of mean residence times of subsurface waters using seasonal variation in deuterium excess in a small headwater catchment in Japan. Hydrological Processes 21, 308-322, doi: 10.1002/hyp.6231.
# (5) 土壌無脊椎動物の地理分布と機能解析データベースの構築

横浜国立大学

大学院環境情報研究院 金子 信博

<研究協力者>

横浜国立大学大教育人間科学部付属高度理科教員養成センター 橋本 みのり

横浜国立大学大学院環境情報研究院 南谷 幸雄

横浜国立大学大学院環境情報研究院 斎藤 昌幸

埼玉県立自然の博物館 中村 修美

平成21～23年度累計予算額：3,000千円

（うち、平成23年度予算額：1,000千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 土壤動物は陸域生態系の全動物群集の5割から9割程度のバイオマスを占めており、陸域の物質循環の大きなフローを制御するだけでなく、地上動物の餌として分解系と生食連鎖系を結びつけている。日本列島における環境変動が生態系に与える影響を明らかにするには土壌動物の地理分布を明らかにし、環境変動に対する応答を予測する必要がある。そこで、大型ミミズ類の地理分布に関する整理を行い、地上部食物網との関係を評価するための基礎データを得た。さらに、詳細で精度の高い既存の地理分布データがあるカマアシムシ類（原尾目、Protura）の地理分布と環境条件との関係を解析した。モニ1000のコアサイト6地点周辺のミミズ分布を調べ、生活型に基づく機能データベースを構築した。モニ1000のピットホール調査で得られた地表徘徊性甲虫群集とミミズとの連結度を求めたところ、日本では高緯度ほど連結度が高くなる傾向が見られ、ミミズ群集との関係が高緯度ほど高くなる可能性が示された。モニ1000における甲虫調査が、森林の食物網構造の指標として重要であることを確認できた。日本産カマアシムシ類は3103地点から71分類群が確認された。1箇所の森林で6種以上採集されたカマアシムシ類の群集をTwinspan法で解析したところ、北海道から本州中部まで分布するグループⅠと、本州から九州にかけて分布するグループⅡ、Ⅲに分けることができた。G-Ⅰは、最低気温の低さと相関がありシベリア経由で日本に定着したグループと推測した。G-Ⅱは降水量と負の相関を、G-Ⅲは最低気温の高さと相関があった。これらは、朝鮮半島経由で日本に定着したグループと推測した。カマアシムシ類の分布は森林タイプとの相関は低く、気温と降水量に強く影響されることが予測できることを、世界で初めて明らかにした。土壌生物の移動が地上生物に比べてより制約を受けると考えると、気候変動により植物、地上部の動物と土壌生物の地理的分布が同じペースで変化しない場合、種間相互作用が大きく攪乱される可能性を指摘できる。

[キーワード] ミミズ、カマアシムシ、食物網、土壌構造、環境指標