Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
が進んだと考えられた。pH を 4.5 とした場合は殆ど有機酸発酵が起きなかった。これは植種材料中に pH4.5 において糖分資化可能である菌類が存在しないためと考えられた。

でんぷんの対象にオートクレーブによる前処理の影響を比較したところ、オートクレーブ処理の有無が後段の有機酸発酵特性に殆ど影響しておらず、オートクレーブによる効果は低いと考えられた。

栄養源の影響を検討したところ、栄養源が全く存在しないとα-アミラーゼ生成および有機酸発酵いずれも起きないことが示され、有機酸発酵に必要な最低必要量の栄養源が存在すると考えられた。ただし、必要以上の栄養源が存在する場合では、発酵およびα-アミラーゼ生成に大きな影響はなかった。

表2.3 実験条件および実験結果のまとめ

Test No.	1	2-1	2-2	2-3	2-4	3-1	3-2	3-3
グルコース(g/L)	10	5	20	10	0	10	10	10
でんぷん(g/L)	10	5	20	0	10	10	10	10
栄養源(Test1に対して)	1	0.5	2	0.5	0.5	1	1	1
pH(-)	5.5	5.5	5.5	5.5	5.5	5.5	5.5	5.5
温度(℃)	55	55	55	55	55	70	45	37
オートクレーブ
全糖分解率(-)	0.74	0.56	0.66	0.93	0.34	0.10	0.91	0.87
でんぷん分解率(-)	0.41	0.27	0.33	0.00	0.34	0.70	0.81	0.23
最大α-アミラーゼ(Units/L)	277	127	136	14	56	28	381	244

Test No.	4-1	4-2	4-3	5-1	5-2	6-1	6-2	6-3
グルコース(g/L)	10	10	10	0	0	10	10	10
でんぷん(g/L)	10	10	10	10	10	10	10	10
栄養源(Test1に対して)	1	0.5	0.5	0.5	0.5	ミネラル	0.5	なし
pH(-)	7	4.5	6.5	5.5	7	5.5	5.5	5.5
温度(℃)	50	55	55	55	50	55	55	55
オートクレーブ	有	有
全糖分解率(-)	0.73	0.27	0.80	0.46	0.86	0.76	0.88	0.00
でんぷん分解率(-)	0.30	0.01	0.53	0.46	0.86	0.48	0.74	0.00
最大α-アミラーゼ(Units/L)	146	9	193	56	188	197	202	0

図 2.2 グルコースおよびでんぷんを基質とした回分式実験の経時変化（Test1）
## 2 -4 まとめ

α - アミラーゼ生成の能力は、温度については 55℃ および 45℃ とした場合が、pH については 5.5 とした場合が優れていた。でんぷんの対象にオートクレーブによる前処理の影響を比較したところ、オートクレーブによる効果は低いと考えられた。栄養源の影響を検討したところ、栄養源が全く存在しないと α - アミラーゼ生成および有機酸発酵いずれも起きないことが示され、有機酸発酵に必要な最低必要量の栄養源が存在すると考えられた。

## 【第2章参考文献】

APHA, AWWA, WEF (1995) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC. American Public Health Association Publications.

DuBois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith F. (1956) Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Anal. Chem. (Wash.) 28(3): 350-356.

赤尾聡史（2006）生ごみを原料とした高温 L-乳酸発酵法に関する研究, 京都大学博士論文. 赤尾聡史, 宮井公太郎, 堀江匠, 津野洋（2006）高温 L-乳酸発酵におけるバナナ果皮の基質化とその特性, 環境工学研究フォーラム講演集, 43, pp.74-76.

津野洋, 赤尾聡史, 宮井公太郎, 日高平, 堀江匠（2007）生ごみからの各種別 L-乳酸塩の発酵とポリ乳酸の合成に関する研究, 環境工学研究論文集, 44, pp.471-479.
## 第3章 生ごみを基質とした高温有機酸発酵における多糖分解率の向上

## 3 -1 概説

本章では、生ごみを基質とした高温有機酸発酵において、多糖分解率の向上を図るための比較実験を行った。生ごみによる高温有機酸発酵の基本条件に対して、発酵の途中で条件を変更する二段式発酵、および糖化効率の高い発酵液を添加する二系列発酵により、高効率化の検討を行った。また、発酵に用いている生ごみの素材が高温有機酸発酵に及ぼす影響を調査した。

表 3.1 模擬生ごみの材料

項目%	細目%
野菜類	50	キャベツ	10
じゃがいも	10
ニンジン	10
大根	10
白菜	10
果物類	20	りんご	2.5
オレンジの皮	7.5
バナナの皮	10
穀物類	20	米	10
パン	2.5
麺類	7.5
肉類	2.5	挽肉	2.5
魚介類	5	魚	3.5
魚の骨	1.5
卵	2.5	卵	2.5

表3.2 模擬生ごみの性状

测定項目	单位	测定值
全糖	g-glucose/L	115.1
TS	g/L	186
SS	g/L	82.9
pH	-	4.5
COD	g/L	200.7

## 3 -2 実験方法

## (1) 実験材料

本研究では模擬生ごみを基質として使用した。模擬生ごみの材料は、谷川ら（1997）の実生ごみ組成に関する調査結果を参考に表3.1のように決定されたもの（渋ら、2003）を使用した。なお、この生ごみの組成は、本研究室において継続使用されているものである。材料は、細断、混合、続いてスラリー状になるまでミキサー（FMI, R25B）破砕し、使用時まで冷凍庫で保存した。また、培養実験において、生ごみ培地は滅菌操作を行わずに利用した。次に、模擬生ごみの分析値を表3.2に示す。TSは約19%、CODは約200g-COD/Lおよび糖質は約12%であり、TSと糖質については白井（1999；2005）や赤尾（2006）の報告する生ごみ成分とほぼ等しい内容であった。

## (2) 実験条件

実験条件を表 3.3 に示す。
表 3.3 実験条件

発酵期間(h)	温度(℃)	pH(-)	基質	その他
TEST1-1	96	55	5.5	生ごみ330g/L
TEST1-2-1	120	40→55	8→5.5	生ごみ330g/L	72時間で条件変化
TEST1-2-2	120	40→55	5.5	生ごみ330g/L
(100℃30分加熱)	26時間で条件変化
TEST1-2-3	120	55→40	5.5→8	生ごみ330g/L	72時間で条件変化
TEST1-2-4	72	40→55	8→5.5	生ごみ330g/L
(100℃30分加熱)	26時間で条件変化
TEST1-2-5	72	55→40	5.5	生ごみ330g/L	24時間で条件変化
TEST1-2-6	168	55→40	5.5→8	生ごみ330g/L	120時間で条件変化
TEST1-3-1	120	55	5.5	生ごみ330g/L	開始直前に水素発酵液のろ液250mL
TEST1-3-2	120	55	5.5	生ごみ330g/L	開始直前に水素発酵液のろ液250mL
TEST1-4-1	120	55	5.5	生ごみ330g/L	魚抜き
TEST1-4-2	120	55	5.5	生ごみ330g/L	根菜類抜き
TEST1-4-3	120	55	5.5	生ごみ330g/L	大根抜き
TEST1-4-4	120	55	5.5	生ごみ330g/L	野菜果物抜き
TEST1-4-5	120	55	5.5	生ごみ330g/L	野菜抜き
TEST1-5	120	55	5.5	生ごみ300g/L	開始直前に米発酵液300mL

TEST1-1 では、生ごみを基本条件（温度 55℃、pH5.5、基質非滅菌、10%アンモニア水中和剤）で高温有機酸発酵を行った。

TEST1-2 では、発酵の途中で条件を変更する二段式発酵により多糖分解率の向上を目指した。TEST1-2-1 は、α-アミラーゼの活性に最適な条件で乳酸発酵を行い、α-アミラーゼが十分産出したと考えられる時点で高温有機酸発酵の条件へ変更し、でんぷんの分解を促進させることを目的とした。TEST1-2-2 は、TEST1-2-1 と同様で、40℃でα-アミラーゼの産出の多い菌は高温耐性があるため、それ以外の菌を滅菌するためにあらかじめ生ごみを100℃で30分加熱を行った。TEST1-2-3 は、最初に高温有機酸発酵を行い、発酵が停止した時点で温度およびpHを中温発酵の条件に変更し、残存している多糖を充分に消費することを目的とした。TEST1-2-4 は、α-アミラーゼの産出の多い菌の生育およびα-アミラーゼの活性に最適な条件で乳酸発酵を行い、α-アミラーゼが十分産出したと考えられる時点で高温有機酸発酵の条件へ変更し、でんぷんの分解を促進させることを目的とした。TEST1-2-5 は、最初に高温有機酸発酵の条件で発酵を開始し、発酵が盛んになる時点でα-アミラーゼ活性の最適温度である40℃付近に温度を下げ、でんぷん分解率向上を目的とした。TEST1-2-6 は、最初に高温有機酸発酵を行い、発酵が停止した時点で温度およびpHを中温発酵の条件に変更し、残存していると考えられる多糖を基質として発酵を行うことを目的とした。TEST1-2-3 とほぼ同じ条件であるが、条件を変更する時点を120時間とした。

TEST1-3 では、α・アミラーゼが添加されることを目的として、でんぷんからの水素発酵液(Hidaka et al., 2011)の発酵液をろ過し、そのろ液を添加した実験を2回行った。
TEST1-4 では、発酵に用いている生ごみの素材が高温有機酸発酵に及ぼす影響を調査した。それぞれで生ごみの素材の一部を抜いた条件下で、比較した。

TEST1-5 では、多糖の含有の多い基質で発酵が成功している系の発酵液、すなわち $ \alpha $ -アミラーゼの産出が多いとされる B. coagulans を含有する発酵液を添加することによって、生ごみの多糖の分解率を向上させることを目的とした。第4章での米を基質として発酵を行っている発酵液を添加した。発酵液の添加は、運転開始時のみに行った。

表 3.4 TEST1～3 の全糖分解率、でんぷん分解率、乳酸生成量および乳酸収率

全糖分解率(%)	でんぷん分解率(%)	乳酸生成量(g/L)	乳酸収率(-)
TEST1-1	70.0	46.2	29.6	0.64
TEST1-2-1	5.5	31.7	8.9	0.32
TEST1-2-2	54.4	67.5	11.4	0.39
TEST1-2-3	58.7	67.4	20.1	0.53
TEST1-2-4	73.2	59.8	17.9	0.57
TEST1-2-5	59.9	72.5	13.5	0.62
TEST1-2-6	68.1	83.1	21.1	0.61
TEST1-3-1	87.3	86.6	16.2	0.35
TEST1-3-2	85.4	86.2	31.6	0.86

## 3 -3 結果および考察

## (1) 二段式発酵での高温有機酸発酵

TEST1～3 の全糖分解率、でんぷん分解率、乳酸生成量および乳酸収率を表 3.4 に示す。TEST1-1 で、全糖濃度は、開始直後から急激に減少し始め、それと同時に乳酸濃度が急激に増加し始めた。約 80 時間後に全糖の消費および乳酸の生成が停止した。全糖濃度および乳酸濃度は、それぞれ約 48 g/L から約 13 g/L および約 0 g/L から約 29 g/L となった。またでんぷん濃度は約 15.1 g/L から約 6.9 g/L となった。乳酸以外の有機酸は生成しなかった。この結果は、赤尾（2006）による生ごみの乳酸発酵の結果と概ね一致した。生ごみによる高温有機酸発酵基本条件で行った TEST1-1 では、全糖分解率は約 70％となり、乳酸生成量は約 30 g/L、乳酸収率は 0.64 となった。二段式発酵を行った TEST1-2 の各 TEST では、でんぷん分解率が TEST1-2-1 を除き、TEST1-1 よりも高くなったものの、全糖分解率にはあまり違いは無いか、もしくは減少した。TEST1-2-4 のみ、全糖分解率およびでんぷん分解率が TEST1-1 より高かったが、これは、α-アミラーゼが生成・残存している時期に乳酸発酵に変更した効果とも考えられる。しかし、乳酸の生成量および乳酸収率は、TEST1-1 のほうが TEST1-2 の各 TEST よりも高かった。TEST1-2-1 はほとんど全糖が分解されていないことから、乳酸発酵が十分に生じなかったと考えられる。また、条件によって乳酸以外の有機酸生成状況が異なっていた。これらより、二段式発酵は、α-アミラーゼの利用や
でんぷん分解に適している菌を利用することにより、でんぷんの分解率を向上させることはできる可能性があることなどが示された。

## (2) 二系列発酵での高温有機酸発酵

二系列発酵を行った TEST1-3-1 および TEST1-3-2 では、多糖分解率およびでんぷん分解率が TEST1-1 よりも高かった。乳酸の生成量および乳酸収率は、TEST1-3-2 が TEST1-1 よりも多かった。これより、二系列発酵により、水素発酵微生物の産出した α-アミラーゼを利用することで、模擬生ごみ中の多糖を分解し、B. coagulans による高温 L-乳酸発酵における多糖分解率、でんぷん分解率および乳酸収率を向上させることが可能であると考えられた。

## (3) 生ごみ中の各素材の影響評価試験

模擬生ごみの素材から魚および魚の骨を抜いた TEST1-4-1 では、模擬生ごみによる高温有機酸発酵の基本条件で行った TEST1-1 より、乳酸の生成量が少なく、最終的に酢酸が生成した。また、乳酸の生成速度の低下も見られた。TEST1-4-2 では、乳酸が生成した後、乳酸濃度は徐々に減少し、それに伴って酢酸が生成した。TEST1-4-3 では、通常の模擬生ごみで発酵を行った場合と比較してあまり大きな違いは見られなかった。TEST1-4-4 および TEST1-4-5 の両方で根菜類が取り除かれているのにもかかわらず発酵は生じたものの、他の有機酸の生成も非常に多くなったことから、B. coagulans 以外の菌も増殖しており、根菜類が高温有機酸発酵の効率に大きく影響を及ぼしていると考えられる。

模擬生ごみを使用した高温有機酸発酵において、魚や魚の骨は発酵速度等に影響を及ぼしていることがわかった。魚や魚の骨の中で重要な成分であるミネラルは発酵速度を高めているが、乳酸の生成量や多糖の分解率の向上には影響していないことがわかった。また、模擬生ごみの素材のうち、根菜類が不足すると B. coagulans による高温乳酸発酵にならない可能性があることが示された。

## (4) 米発酵液添加の影響

TEST1-5 でのでんぷん分解率を図 3.1 に示す。でんぷんの分解率および乳酸の生成量は徐々に低下していた。全糖分解率は、生ごみ基質による高温 L-乳酸発酵の基本条件で発酵を行った TEST1-1 よりも概ね高い値となっているものの、発酵が進むにつれて少しずつ減少した。これは、α-アミラーゼの産出が多い B. coagulans の働きにより発酵初期は生ごみの全糖分解率、でんぷん分解率が増加するものの、模擬生ごみという多糖の少ない環境で
時間が経過すると、α-アミラーゼの産出能が徐々に失われるからと考えられる。

図 3.1 TEST1-5 におけるでんぷん分解率

## 3 -4 まとめ

異なる温度や pH 条件を組み合わせた二段式発酵を行った結果、α-アミラーゼの利用やでんぷん分解に適している菌を利用することにより、でんぷんの分解率を向上させる可能性があり、生成有機酸種が変化することなどが考えられた。二系列発酵により、他菌の産出したα-アミラーゼを利用することで、模擬生ごみ中の多糖を分解し、B. coagulansによる高温 L-乳酸発酵における多糖分解率、でんぷん分解率および乳酸収率を向上させることが可能であることが示された。

## 【第3章参考文献】

Hidaka, T., Kosaka, Y., Yagi, H., Kusuda, Y., Nishimura, F., Tsuno, H. (2011) Bacterial competition for thermophilic L-lactate and hydrogen fermentation from glucose, 7th International Conference on Environmental Anaerobic Technologies and Bioenergy, Tianjin University, China, 89-99, November 12-13.

谷川昇, 武本敏男, 大木秀男, 川崎照夫 (1997) 生ごみの細組成, 都市清掃, 50, 116-119.

洪鋒, 津野 洋, 日高 平, 千智勲 (2003) 1 日 1 回給餌操作での高濃度高温メタン発酵の生ごみ処理への適用性と操作因子に関する研究, 第 40 回下水道研究発表会講演集, pp1036-1038.

白井義人（2005）都市のゼロエミッションによる生ごみからポリ乳酸の生産, 生物工学, 83, 5, pp.238-241.

白井義人（1999）都市生ごみの工業用乳酸への資源化と環境コンビナート戦略，ECO INDUSTRY, 9, pp.38-45.

赤尾聡史（2006）生ごみを原料とした高温 L-乳酸発酵に関する研究，京都大学博士論文.
## 第4章 米を基質とした高温有機酸発酵の高効率化

## 4 -1 概説

本章では、生ごみに加えて、米も基質として、有機酸発酵の適用を検討した。米はでんぷんを多く含んでおり、でんぷんの糖化効率に焦点を置いた検討を行うため、また主食用ではない新規需要米を意図して、実験材料とした。生ごみおよび米の混合比を変化させた実験により、微生物群集の馴致が糖化効率や有機酸発酵へ及ぼす影響を調査した。微生物群集の解析では、次世代シークエンスであるパイロシークエンス法を用いた。

## 4 -2 実験方法

## (1) 回分式实驗

前章までと同じ反応器を用いて、Run A1～A5 の条件で回分式実験を行った（表 4.1）。それぞれの実験開始時に、植種は行っていない。生ごみは前章までと同様に作成しており、全糖は 0.13 g グルコース/g 生ごみ含まれていた。米は炊いて実験に用いており、全糖は 0.71 g グルコース/g 米含まれていた。また、米のメタン発酵についての回分式実験を、下水污泥を対象とした消化污泥を用いて日高ら（2012）と同様に行い、米の分解特性を調査した。5.5g-wet のご飯および 400 mL の消化液を反応器に投入し、有機酸発酵と同じ 55℃ とした。

表 4.1 回分式实驗条件

時間(h)	基質	全糖(g/L)
生ごみ(g/L)	米(g/L)
Run A1	120	150	20	34
Run A2	96	100	50	49
Run A3	96	100	70	63
Run A4	120	50	50	42
Run A5	120	50	60	49

## (2) 半連続式実験

5 日に一度、混合液 1 L のうち 700 mL を引き抜き同量の基質を投入する半連続式実験を行った（表 4.2）。水理学的滞留時間は 7.1 d に相当する。Run B1～B8 では、生ごみと米の混合割合を変化させることで、基質濃度や馴致が糖化に及ぼす影響を調査した。徐々に米の混合割合を増加させ、Run B8 では米だけを基質とした。Run B7 の最後には、別に 2 系列の反応器を用意し、Run C1～C3 および Run D1～D3 の運転を開始した。その際には、それ
それ 300 mL の引き抜き混合液を植種材料とした。Run E では、でんぷんからの水素発酵液 (Hidaka et al., 2011) 300 mL を植種材料として運転を開始した。これは、もともと中温の畜産廃棄物を対象とした嫌気性消化槽汚泥に由来しており、Clostridium が含まれていた。Run F1 は、グルコース、ポリペプトンおよびイーストエクストラクトのみを基質とした。運転開始時には、B. coagulans を含む L 乳酸発酵液 (Hidaka et al., 2010a) 300 mL を植種した。

表 4.2 半連続式実験条件

Run No.	期間
(h)	微生物
群集
解析	基質(g/L)	全糖
(g/L)
生
ごみ	米	グルコ
ース	ポリペ
プトン	イーストエク
ストラクト
Run B
Run B1	0-96	150	35	45
Run B2	96-696	M1	150	20	34
Run B3	696-816	150	35	45
Run B4	816-1176	100	50	49
Run B5	1176-1896	50	50	42
Run B6	1896-2376	30	60	47
Run B7	2376-2736	M2	15	60	45
Run B8	2736-2976	60	43
Run C
Run C1*	2736-3096	60	43
Run C2	3096-3456	45	32
Run C3	3456-3816	30	21
Run D
Run D1*	2736-3096	60	3	3	43
Run D2	3096-3456	45	3	3	32
Run D3	3456-3816	30	3	3	21
Run E
Run E1**	0-720	60	2	2	43
Run E2	720-960	M3	45	2	2	32
Run E3	960-1320	30	2	2	21
Run F
Run F1***	0-72	M4	50	5	5	50

* Run B8 から植種；**Hidaka et al. (2011) から植種；***Hidaka et al. (2010a) から植種

## (3) 微生物群集解析

次世代シークエンスの一つであるパイロシークエンス法を用いて、Run B2、B7、E2およびF1(以下、それぞれM1、M2、M3、M4とする)を行った。解析では、PowerSoil DNA isolation
kit (MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA)を用いて抽出し、PCR増幅を行った(FastStart High Fidelity PCR System and PCR Nucleotide Mix, Roche, Germany)。プライマーは、Primer A-Key-MID-27FおよびPrimer B-Key-519Rを用いた。Genome Sequencer FLX Titanium system (454 Life Sciences, Branford, CT, USA)を用い、96%の相同性により操作的分類単位(OTU)を整理し、DNA Data Bank of Japan (DDBJ)のBLASTで検索した。

## 4 -3 結果および考察

## (1) 回分式实驗

回分式実験での有機酸濃度およびでんぷん分解率を図4.1に示す。全糖の減少濃度に対する全糖の初期濃度の割合で算出した糖化率や同様に算出したでんぷん分解率は、設定条件により異なっていた。Run A1およびA4でのみ、糖化が進行し乳酸が生成していた。全糖濃度49 g/L以上で、糖化が進行しにくい傾向が見られた。Hidaka et al. (2010a)は高濃度のグルコースで乳酸発酵が阻害されることを示しており、本研究では高濃度の糖でも乳酸発酵が阻害されることを示した。米を対象とした回分式のメタン発酵実験でのメタン発生経時変化を図4.2に示す。COD基準のメタン転換率は0.75程度であり、メタン発酵を行う場合には、でんぷん分解率が高いことが確認できる。

図4.1 回分式実験での有機酸濃度およびでんぷん分解率

図 4.2 米のメタン発酵回分式実験におけるメタンガス発生経時変化

## (2) 半連続式実験

Run B1～B8 の有機酸濃度経時変化を図 4.3 に示す。実験期間中、ガスの生成は見られな
かった。Run B1 では乳酸濃度が 21 g/L まで増加した後、徐々に減少し、酢酸の生成が見られた。基質濃度を変化させた Run B2 以降、乳酸濃度が増加し、酢酸濃度は低下した。糖化率は 50% 以上であり、回分式実験より高い値であった。

図 4.3 Run B1～B8 の有機酸濃度経時変化

図 4.4 Run C～E の有機酸濃度および標準偏差

Run C～E の有機酸濃度および標準偏差を図 4.4 に示す。Run C1～C3 では、主として乳酸が生成し、濃度は 13～36 g/L であった。ギ酸および酢酸がそれぞれ 0.7～3.5 g/L および 1.5～3.6 g/L 生成した。Run D では、ポリペプトンおよびイーストエクストラクトを添加し、Run C よりも乳酸濃度および n-酪酸が高かった。Run E では、水素および二酸化炭素がそれぞれ毎 5 日間の運転で 1～6 L および 1.2～5.4 L 生成した。有機酸では、乳酸が 6.3～35 g/L、ギ酸が 0.3～15 g/L、酢酸が 1.5～5.1 g/L、および n-酪酸が 1.5～10 g/L 生成した。Run C および
び D より乳酸濃度が低く、ギ酸や酪酸濃度が高いのは、水素発酵条件であったことに合致している。回分式実験では、でんぷんの分解効率が不安定であったのに対して、半連続式実験では微生物の馴致後に安定した。2736 時間の馴致後の植種材料を用いた Run C および D では、米のみを添加した運転で、60%以上のでんぷん分解率が得られた。でんぷんからの有機酸発酵やエタノール発酵ではアミラーゼを添加するのが一般的であるものの（Lin and Tanaka, 2006）、廃棄物利用の場合低コストでの発酵が望ましく、分解率がある程度得られれば、酵素の添加が不要な手法も有用であると考えられる。

## (3) 微生物群集解析

半連続式実験における微生物群集解析の結果を表4.3に示す。Run B2 (M1)、Run B7 (M2)、Run E2 (M3)およびRun F1 (M4)で、それぞれ21,626、22,991、60,999および20,274の配列を解読し、96%の相同性でそれぞれ468、1,007、746および247のOTUに分類した。Run F1では、グルコースを基質としており、98.1%がB. coagulansに近縁であった。これは、過去の研究におけるランダムクローニング法による結果Hidaka et al. (2010a)と一致しており、L乳酸発酵におけるB. coagulans近縁種の関与が確認された。Kim et al. (2012)も、パイロシークエンスにより、同様の条件下でB. coagulans近縁種を報告している。しかし、Run B2、B7およびE2ではそれぞれ52.8、16.7および17.8%にまで低下していた。Run B2では、生ごみおよび米からの乳酸発酵が進行しており、Aneurinibacillus spp.近縁種が29.5%検出された。Aneurinibacillus spp.は高温細菌でαアミラーゼを生産するという報告がある(Farahmand et al., 2009)ので、でんぷんの糖化に係わっていた可能性が考えられる。その後、Run B7では基質に占める米の割合を増加しており、Alcaligenes spp.、Citrobacter spp、Enterobacter spp.およびPantoea spp.近縁種の割合がそれぞれ26.5%、34.1%、5.8%および4.0%であった。Kumar and Das (2000)により、Enterobacter spp.はαアミラーゼを生産という報告がある。Run E2では、水素発酵条件下で、Clostridium spp.およびThermoanaerobacterium spp.近縁種がそれぞれ54.9%および25.3%検出された。これは、水素発酵での過去の微生物群集解析に一致している(Taguchi et al., 1992；Akutsu et al., 2008)。このように従来のランダムクローニング法よりも詳細な菌相解析が、基質条件や生成有機酸の違いとともに示された。
表 4.3 パイロシークエンス法による微生物群集解析結果

Phylum	Class	Order	Family	Genus	Species	Detected (%)
M1	M2	M3	M4
Firmicutes	Bacilli	Bacillales	Bacillaceae	Bacillus	Bacillus coagulans	52.8	16.7	17.8	98.1
[others]	[others]	4.9	0.6	0.3	0.8
[others]	[others]	0.7	0.3
Paenibacillaceae	Aneurinibacillus	29.5	0.4	0.7
[others]	[others]	1.6	1.5	0.1
Lactobacillales	4.9	1.2	0.2
Clostridia	Clostridiales	Clostridiaceae	Clostridium	0.1	54.9	0.1
[others]	[others]	0.1	0.4
Thermoanaerobacterales	Thermoanaerobacterales	Thermoanaerobacterium	25.3	0.1
Family III. Incertae Sedis
[others]	0.4
Proteobacteria	Alphaproteobacteria	1.7	3.0	0.2
Betaproteobacteria	Burkholderiales	Alcaligenaceae	Alcaligenes	26.5	0.1
[others]	0.5
Gammaproteobacteria	Enterobacteriales	Enterobacteriaceae	Citrobacter	Citrobacter	34.1
Enterobacter	Enterobacter	0.3	5.8	0.1
Pantoea	Pantoea	4.0
[others]	[others]	0.1	0.6
Pseudomonadales	Moraxellaceae	Acinetobacter	2.5
[others]	0.6	0.1
[others]	0.8
[others]	3.3	0.8
## 4 -4 まとめ

米に含まれるでんぷんの糖化および有機酸発酵は、生ごみを添加すること、もしくは長期間の馴致を行うことで向上することが示された。パイロシークエンス法による菌相解析で、従来のランダムクローニング法よりも詳細な菌相解析が、基質条件や生成有機酸の違いとともに示された。でんぷんの糖化率はClostridiaが含まれる水素発酵条件下で高く、乳酸発酵にはB.coagulansが係わっている可能性が示された。

## 【第4章参考文献】

Akutsu Y, Li Y, Tandukar M, Kubota K, Harada H., 2008. Effects of seed sludge on fermentative characteristics and microbial community structures in thermophilic hydrogen fermentation of starch. International Journal of Hydrogen Energy 33(22), 6541–6548.

Farahmand, M., Mozaffari, N. A., Mehrabian, S., and Khavarinejad, R., 2009. Characterization of a-amylase produced by thermophilic bacteria isolated from Iranian hot spring waters. In Animal and Fisheries Sciences, v. 21(4).

Hidaka, T., Horie, T., Akao, S., and Tsuno, H., 2010a. Kinetic model of thermophilic L-lactate fermentation by Bacillus coagulans combined with real-time PCR quantification. Water Res. 44(8), 2554–62.

Hidaka, T., Kosaka, Y., Yagi, H., Kusuda, Y., Nishimura, F., Tsuno, H., 2011, Bacterial competition for thermophilic L-lactate and hydrogen fermentation from glucose, 7th International Conference on Environmental Anaerobic Technologies and Bioenergy, Tianjin University, China, 89-99, November 12-13.

Kim, D.-H., Lim, W.-T., Lee, M.-K., and Kim, M.-S., 2012. Effect of temperature on continuous fermentative lactic acid (LA) production and bacterial community, and development of LA-producing UASB reactor. Bioresour. Technol. 119, 355–61.

Lin, Y. and Tanaka, S., 2006. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Applied Microbiology and Biotechnology 69(6), 627–42.

Kumar, N. and Das, D., 2000. Production and purification of $ \alpha $ -amylase from hydrogen producing Enterobacter cloacae IIT-BT 08. Bioprocess Biosyst. Eng. 23, 205–208.

Taguchi, F., hang, J. D., Takiguchi, S., and Morimoto, M., 1992. Efficient hydrogen production from starch by a bacterium isolated from termites. Journal of Fermentation and Bioengineering 73(3), 244–245.

日高 平, 内田 勉, 浅井圭介, 新井小百合, 岡本誠一郎, 戸苅丈仁 (2012) 下水污泥と有機
性廃棄物の嫌気性消化に関する基礎的検討，第 49 回下水道研究発表会講演集，pp.145-147.
## 第5章 生ごみおよびでんぷんの高温有機酸発酵における糖化機構の解析

## 5 -1 概説

前章までの検討により、高温有機酸発酵菌である Bacillus coagulans 以外の菌による糖化の可能性が示された。本章では、有機性廃棄物を原料とする高温有機酸発酵において糖化を担う菌種を推定することを目的に、生ごみの糖化から有機酸発酵に至る過程の菌叢変化を観察した。また、B. coagulans によるでんぷん分解における培養条件の検討も行った。

## 5 -2 文献考察

## (1) 有機性廃棄物の加水分解

下水污泥など有機性廃棄物の嫌気性発酵は、大きく加水分解（disintegration/hydrolysis）、有機酸発酵およびメタン発酵の各過程から成り立つとされ、一連の反応をモデル化したものとして ADM1 あるいは類似のモデルが提案・利用されている（Batstone et al, 2002; Siegrist et al, 2002）。これらモデルでは、加水分解（hydrolysis）は分解される物質（多糖、タンパク質、脂質）自身の1次反応として記述され、非常に簡略化された形であるものの運用上充分であるとされている（Batstone, 2006; Batstone et al, 2009）。でんぷんを基質として利用した最近の検討事例においても、多糖加水分解は1次反応として記述されている（Donoso-Bravo et al, 2011）。ただし、加水分解過程の1次反応による表記は、加水分解過程が全体プロセスの中で律速過程と考えられるという前提が必要となる（Vavilin et al, 2008）。このような前提が崩れる場合、例えば、易分解性の有機性廃棄物を材料とする、あるいは、分解者であるバクテリアが基質量に対して相対的に多いなどといった状況では、必ずしも加水分解過程の1次反応による表記が充分であるとは言い切れない。実際、加水分解はその分解を担うバクテリア量に依存するとの報告があり（Fernandez et al, 2001）、分解物の表面積（つまりは粒子サイズ）も重要とされ（Sanders et al, 2000）、活性污泥モデル（Henze et al, 2000）と同じように分解物の分解しやすさに基づく分画を提案する報告もある（Yasui et al, 2008）。また、加水分解過程を1次反応から分解者および分解物の濃度に依存するContois modelで表現することも提案されている（Vavilin et al, 2008; Ramirez et al, 2009）。以上から、加水分解過程のモデル化は、発酵状況や対象有機物によっては詳細に検討する余地が残っていると言える。

また、提案されている Contois model による加水分解モデルでは、分解者は 1 種類とされている。しかし、複雑な材料と菌種が絡み合う有機性廃棄物の嫌気性発酵において、分解者が加水分解に係る形質として 1 種類に代表されるとは言い難い。そこで、登場する分解
者とその遷移に関する検討が行われている。Cirne et al（2007）は、ビート（でんぷん質）とクローバー（セルロース質）の嫌気性発酵を行い、可溶化・加水分解の進展した培養開始から10日間にかけてビートではアルファプロテオバクテリア綱のバクテリアが、クローバーではフィルミクテス門のバクテリアが出現・遷移したことを報告した。また、Kim et al（2010）は、食品廃棄に伴う排水の嫌気性発酵（pH5.7、44.5℃）において、その加水分解過程の菌叢から発酵初期に酪酸やプロピオン酸を生成するClostridium thermopalmariumとClostridium novyiが加水分解過程の主役であり、それらが遷移する様子を報告した。確かに、いたずらに分解者（変数）を増加させることはパラメータ数の増加と相まって嫌気性発酵モデルをより複雑なものへと導くが、上述した通り発酵状況や対象有機物によってはモデルの有効性を高めることにもつながる。例えば、メタン発酵と比べて発酵に係わる登場者の少ない有機酸発酵の場合、あるいは、易分解性の有機物を多く含む生ごみを対象とする場合、加水分解過程と有機酸発酵過程を精緻化することは有効と考えられる。

## (2) 菌叢変化の観察方法

種々の細菌が存在するサンプルに対してその存在菌種を推定する方法としてリボソームRNA遺伝子(リボソームDNA: rDNA)を利用する方法が一般化されている。細菌の場合、16S rDNAについて塩基配列データベース（RDP、DDBJなど）が整備されおり、サンプル中に存在する細菌の16S rDNAを解読することにより菌種を推定することができる。ただし、種々の細菌が混在するサンプルでは、菌種ごとに16S rDNAを分ける必要がある。この菌種ごとに16S rDNAを分ける方法として、クローニング法とDGGE法（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis：変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）が一般によく用いられている。

クローニング法は、抽出した DNA から 16S rDNA をクローン化し、その塩基配列を解析する手法である。比較的長い塩基配列を解読できるが、菌叢を知るためには複数（例えば 96 穴プレート分）のクローンを解析する必要があり、手間と費用がかかることから時系列に比較するような複数サンプル解析には向かない。一方、DGGE 法は、種々存在する 16S rDNA をその塩基配列の違いにより先に分け、その後 1 つずつの塩基配列を解析する方法である。DNA 変性剤(尿素とホルムアミド)の濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行うことにより、塩基配列の違いにより DNA を分離できる。塩基配列の違いにより目的ゲノムを分けられることから、それらを染色することにより複数のサンプルの微生物群集構造を視覚的に比較することができる。しかし、この電気泳動法の都合から比較的短い部位(一般的には 16S rDNA の最も特異的な塩基配列を示すとされる V3 領域を標的)を比較・解析することとなり、得られる系統学的情報が限られる（五十嵐ら、2002；野田
ら、2003)。本章では菌叢変化の観察をまずもっての目的としたことから、DGGE法によるアプローチを採用した。なお、先のKim et al（2010）による報告もDGGE法によるものである。

## 5 -3 実験方法

## (1) 人工生ごみ

本章では前章まで同じ人工生ごみを用いた。高温有機酸発酵で使用する際は、冷凍保存された人工生ごみを室温（26℃）にて時々攪拌しながら解凍し、蒸留水で2倍希釈した（以下、生ごみ培地とする）。同培地は、滅菌操作を行わずに用いた。生ごみ培地の糖組成を表5.1に示す。全糖4.8%（うち溶存する二糖・単糖3.0%）およびでんぷん0.8%（全糖などと比較する際は、加水分解後で比較する必要から180/162を乗じる）であった（表5.2）。

表 5.1 生ごみ培地の糖組成

全糖 (%)	二糖・单糖 (%)
Maltose	0.1	1.4
Glucose	3.9	0.9
Galactose	0.1	0.0
Arabinose	0.1	0.0
Fructose	0.6	0.7

表 5.2 生ごみでんぷん培地の糖組成

全糖(%)	二糖·单糖(%)
Maltose	0.1	1.5
Glucose	4.1	0.5
Galactose	0.0	0.0
Arabinose	0.0	0.0
Fructose	0.4	0.4

表 5.1 の生ごみを 2 倍希釈した生ごみ培地を高温有機酸発酵に用いた際、有機酸生成量の上限と培養開始時の糖量の関係から、でんぷんの消費が明瞭とならなかった。そこで、人工生ごみを蒸留水で 3 倍希釈し、可溶性でんぷん（和光純薬、一級）を 20 g/L となるように添加した培地（以下、生ごみでんぷん培地とする）を用意した。同培地は、滅菌操作を行わずに用いた。生ごみでんぷん培地の糖組成を表 5-2 に示す。全糖 4.6%（うち溶存する二糖・単糖 2.4%）およびでんぷん 2.1%（全糖などと比較する際は、加水分解後で比較する必要から 180/162 を乗じる）であった。

## (2) 植種源

生ごみ培地を用いた培養では、前培養された B. coagulans JCM 2258 を有機酸発酵菌として利用した。前培養では、LB 培地に JCM 2258 株を植種し、55℃で 24 時間振とう培養した。前培養済みの菌液を生ごみ培地へ 1% 量添加した。また、B. coagulans 以外の植種源として、市販されている腐薬土（苗一番）を用いた。上記土 1 g に 0.9% 食塩水 30 ml を加え、振と
う機(アズワン、ASCM-1)で5分間（2000 rpm）攪拌し腐葉土液とした。腐葉土液を生ごみ培地へ0.1%量添加した。

生ごみでんぷん培地を用いた培養では、B. coagulans JCM 2258 のほか、土壌より単離した s2 株（Aneurinibacillus thermoaerophilus と推定）および s3 株（Geobacillus caldoxylosilyticus と推定）を植菌した。s2 株と s3 株は、高温有機酸発酵条件で高いアミラーゼ活性を示す菌株である。また、畑土壌を前培養に用いた菌液も用意した。いずれの前培養も、表 5.3 に示すでんぷん培地を用いた。前培養条件は、55℃で 24 時間振とうとした。植菌量は、いずれも生ごみでんぷん培地に対して 0.5% 量とした。なお、B. coagulans 以外の植種源は、でんぷん分解の促進とともに発酵に対するコンタミネーションの目的で用いた。

表 5.3 でんぷん培地/でんぷん寒天培地の組成

(単位：g/L)
Yeast extract	Difco	0.5
KCl	和光純薬	特級	0.1
MgSO_{4}·7H_{2}O	和光純薬	特級	0.5
(NH_{4})_{2}SO_{4}	和光純薬	特級	0.1
NaH_{2}PO_{4}	和光純薬	特級	0.1
Starch	和光純薬	特級	20
Agar（寒天培地のみ）	和光純薬	特級	8

図 5.1 実験装置の概略図

表 5.4 実験条件

生ごみ 培地	生ごみでん ぷん培地
培養温度(℃)	55	55
pH(-)	5.5	5.5
反応器の容積(L)	1	1
実施期間(日)	5	10
培養繰り返し数(回)	3	2

## (3) 生ごみ培地/生ごみでんぷん培地を用いた培養装置および条件

実験装置も前章までと同様である。図5.1に本章で用いた実験装置の概略図を示す（反応器、有効容積1 L；反応器内攪拌機、アズワンSM-104；温度制御、ウォーターバス、アズワンTM-1；pH制御、pHコントローラー、日伸理化NPH-680D/NPH-690D、ローラーポンプ、東京理科器械MP-1000；中和剤、5 mol/Lの水酸化ナトリウム）。反応器内を嫌気状態に保つため、反応器の上部を窒素ガスで充填した。また、窒素ガスを充填したガスパックを取り付け、引き抜きなど操作時の容積バッファーとした。
表 5.4 に実験条件を示す。培養温度と pH は B.coagulans の非滅菌下での優占比化に最適な 55℃、pH5.5 に設定した。

## (4) でんぷん分解条件の検討における培養装置と条件

でんぷん分解の回分培養を、pH（5.5、6.5、7.5）、温度（45℃、50℃、55℃）の合計9点で行った。培養期間は5日間とした。植菌は、B. coagulans JCM2258をLB培地にて前培養されたストックソリューションを用いた。ストックソリューションの培地に対する添加量は1％量とした。培地について、グルコース3 g、溶性でんぷん13.5 g、蒸留水150 mLを300 mLフラスコに加え、別途、yeast extract（Difco）2.88 gと蒸留水150 mLを加えた300 mLフラスコに用意した。それぞれを121℃、20分でオートクレーブした後、yeast extract溶液を糖液へ添加し培地とした。pHや温度の制御は(3)と同様である。

## (5) 分析方法

表 5.5 に分析項目と分析方法を示す。溶解性成分の分析には、0.45 μm シリンジフィルターを用いてろ過した試料を用いた。一般的でない分析項目について、以下に詳細を示す。

①全糖

全糖は、図 5.2 に示す実験フローに従って分析を行った（赤尾、2006）。ただし、フルクトースは酸性触媒の存在で脱水され熱分解されるおそれがあることから（Román-Leshkov et al., 2006）、二糖・単糖分析で得たフルクトース量を加水分解後のフルクトースとした（スクロースは検出されず）。

## ②菌叢変化

菌叢変化は PCR-DGGE 法により観察した。植種源、生ごみでんぷん培地および発酵液からの DNA 抽出では PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories) を用いた。PCR では、プライマーセット EUB341f-GC および UNI518r を用い、温度条件は、94℃×5 分 + (94℃×30 秒 + 53℃×30 秒 + 72℃×1 分) ×35 サイクル + 72℃×5 分とした（堆ら、2008）。得られた PCR 産物を DGGE に供した。DGGE（DCode ユニバーサルミューテーション検出システム、Bio-Rad）では、ポリアクリルアミドゲル中の変性剤の濃度勾配が 35%－65%となるように調製し、15 μL の PCR 産物をアプライ後 60℃、130V および 5 時間の条件で電気泳動を行った（大坊ら、2008）。電気泳動終了後、SYBR Green I 染色液で 30 分間染色した後、UV トランスイルミネーターにてバンドを確認した。DGGE マーカーとして、DGGE Makker II（ニッポンジーン）を用いた（15 μL アプライ）。

## ③Substrate-PAGE
培養液中に存在するアミラーゼの消長を可視化することを目的に、substrate-PAGE（Native-PAGE、Martinez et al, 2000）を試みた。遠心力 $ 15,000 \times g $ 、5分間で遠心分離した培養液上澄みを1mL回収し、これを遠心濃縮して固形物を得た。ここに、20μLの蒸留水を添加して攪拌後、7.5μLを採取しサンプルバッファーと混合した。サンプルバッファーは参考文献の通り用意し、7.5μLをサンプルと混合して合計15μLを電気泳動へアプライした。ゲル作成条件、電気泳動条件および染色条件は基本的には参考文献と同じとしたが、電気泳動の加電圧のみ100V（濃縮ゲル）および200V（分離ゲル）とした。電気泳動時のマーカーは、プレシジョンPlusデュアルスタンダート（250kDa～10kDa、Bio-rad）を使用した。④アミラーゼ活性

アミラーゼ活性値は、生ごみ培地を用いた培養時は CERALPFA KIT を用いた。しかし、検出される活性値が僅かであった。そこで、生ごみでんぷん培地を用いた培養では、培養条件に即した pH と温度条件を採用するためヨウ素でんぷん反応を用いた測定方法に変更した(Fitter et al., 2001)。

活性測定試験は、pH5.5で55℃の条件で実施した。サンプルの0.45μmシリンジフィルターろ過液を酵素溶液とした。表5.6の組成物をpH5.5に合わせた50mMリン酸緩衝液で溶解させた基質溶液を5mLと、酵素溶液を55℃で10分間保温した。10分後、酵素溶液を0.5mL加えて5分間保温した。5分後に反応停止試薬である0.1Mの塩酸を5mL添加し、反応を停止させた。5mLのiodine-iodide solution（表5.7）に反応停止した溶液を0.5mL添加し、懸濁させた。混合後、分光光度計(日立，U-2800)を用いて620nmで吸光度を測定した。求めた吸光度より式(5-1)を計算することで、アミラーゼ活性値を算出した。

α-アミラーゼ生成菌の単離では、でんぷん寒天培地(表 5.3)に発酵液を植菌し、55℃で培養した。出現したコロニーについてヨウ素ヨウ化カリウム溶液で染色し(Mishra and Behera, 2008)、ハロ形成したコロニーを別途 LB 培地で培養した。単離株の菌種推定では、DNeasy Blood&Tissue Kit（QIAGEN）を用いて DNA 抽出を行い、16S rDNA の一部を増幅するプライマー10F および800R（厚生労働省、2006）を用いて PCR 後、BigDye Terminator Ready Mix（Applied Biosystems）を用いてシークエンス反応を行った。塩基配列の解読は、鳥取大学生命機能研究支援センターに委託した。
表 5.5 分析项目与分析方法

分析項目	単位	分析方法	使用機器・メーカー
固形物濃度	%	MLSS 法（下水試験法）
(3500rpm×2 回)	遠心分離機：KOKUSAN, H-103n
全糖, 单糖	%	塩酸による加水分解（全糖）
HPLC	HPLC（溶離液, 脱気水, 1 mL/min ; カラム, SUGAR-SP0810, 80℃ ; 検出器, RI）
でんぷん	%	Fキットスターチ
Roche (2007748)	分光光度計：HITACHI, U-2800
HPLC（溶離液, 5mM p-トルエンスルホン酸, 0.8 mL/min ; 反応試薬, 5mM p-トルエンスルホン酸・20mM Bis-tris・0.1mM EDTA 2NA, 0.8 mL/min ; カラム, Shim-pack SCR-102H, 43℃ ; 検出器, CDD）
有機酸	%	HPLC
DL-乳酸	%	HPLC	HPLC（溶離液, 5% 2-プロパノール・1mM CuSO4, 1 mL/min ; カラム, OA-5000, 43℃ ; 検出器, UV-VIS, 254 nm）
アミラーゼ活性	U/mL	α-アミラーゼ活性キット
CERALPHA KIT (110308-8)	分光光度計：HITACHI, U-2800
U/mL	ヨウ素でんぷん反応
(Fitter et al, 2001)	分光光度計：HITACHI, U-2800
菌叢変化	-	PCR-DGGE	BIO RAD, DCode System
生菌数	CFU/mL	希釈平板法	でんぷん寒天培地
α-アミラーゼ生成菌	-	単離	でんぷん寒天培地

表 5.6 基質溶液の組成

(g/L)
NaCl	2.9
CaCl₂	0.1
可溶性でんぷん	10

表 5.7 iodine-iodide solution の組成

(g/L)
ヨウ素	0.05
ヨウ化カリウム	0.5

$$ Activity(unit/mL)=D[(R_{0}-R)/R_{0}]\times100 $$

$ R_{0} $ : 酵素を加えていない溶液の値
R：酵素を加えた溶液の値

D: 酵素溶液の希釈倍率

図 5.2 全糖実験フロー

図 5.3 生ごみ培地の変化

(3 回の平均、bar は標準偏差を示す、0.5 日目と 1.5 日目は 2 回の平均)