Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## 5 -4 結果および考察

## (1) 生ごみ培地の変化

生ごみ培地の固形物濃度、糖濃度、有機酸濃度、L-乳酸光学純度、アミラーゼ活性およびでんぷん寒天培地生菌数（図5.3）それぞれの変化を示す（繰返し数3回の平均値）。

図 5.4 生ごみ培地中の全糖およびDL-乳酸変化（図 5-3 より加工）

固形物濃度は2日目まで緩やかに減少(減少幅10 g/L)したものの、5日目において34 g/L存在し、可溶化の進展は24％程度に留まった。糖について、全糖濃度は0日目で培養液中に48 g/Lあったのが、2日目までに18 g/Lへと減少した。その間、二糖・単糖は30 g/Lあったものがほぼ0 g/Lとなった一方、でんぷんは8 g/Lのままであった。5日目でもでんぷんは6 g/L残存したことから高温有機酸発酵におけるでんぷんの加水分解は明瞭でない結果となった。

生成物について、培養を通じて生成した有機酸は DL-乳酸と酢酸のみであった（C=1～5 の主だった有機酸を測定）。また、生成した有機酸の大部分が L-乳酸であり、L-乳酸の光学純度は 99% であった。全糖濃度と DL-乳酸濃度の関係をみると（図 5.4）、消費全糖量に対する DL-乳酸収率は 100% 以上となることから L-乳酸発酵が充分に行えたと考えられる。

アミラーゼ活性について、用いた分析キットマニュアルから比べると培養液中の活性値は全般的に極めて僅かであった。アミラーゼ活性が低い点については、酵素至適温度やpHなど活性測定条件に問題がある可能性もある(Bezbaruah et al, 1991; キットでは40℃でpH6.5を採用)。その中で変化に着目すると、活性値は培養開始時に最も高く、2日目前後に再度活性値が上昇している。培養開始時に活性値が高いことは、材料（生ごみ）あるいは植菌由来のアミラーゼ活性が相対的に高いことを意味している。また、培養2日目前後に活性値が上昇し、かつ、でんぷん寒天培地の生菌数も同時期にピークとなることから、菌由来のアミラーゼ活性も僅かながら存在することが推察された。
なお、B. coagulans JCM2258 を中心とする高温有機酸発酵では、DL-乳酸が 40 g/L 付近になると発酵自体が停止することが経験も含めて観察される。一方で、今回の培養では、でんぷんを資化せずとも DL-乳酸濃度がほぼ発酵停止濃度付近に至った。これは、発酵初期に既に加水分解された糖が十分存在したことを意味し、設定した実験条件（人工生ごみを 2 倍希釈）はでんぷん資化を観察するには適切でないとも考えられた。でんぷんの分解が 2 日目以降で若干観察されたこと、アミラーゼ活性値の最大値が 2 日目付近にあったことは、わざわざでんぷんを加水分解する必要がなかったことと関連すると考えられる。そこで、次回の培養では既加水分解糖の濃度を抑え、一方ででんぷんの濃度の変化を明確にするため、人工生ごみを蒸留水で 3 倍希釈し、20 g/L となるように可溶性でんぷんを添加する培地（生ごみでんぷん培地）を用いることとした。

## (2) 培養液からの単離株

2 日目までのでんぷん寒天培地生菌について、コロニー形状を意識した上でランダムにでんぷん寒天培地に再移植し、形成されたコロニーにヨウ素染色を施した際ハロが確認できた株についてその菌種の推定を行った。20 コロニー中 15 コロニーについて菌種推定が行えたが、そのうち 14 コロニーは B. coagulans と推定された。このことから、でんぷん寒天培地で確認される生菌数の大部分は同菌と考えられ、図 5.3 の 2 日目前後で上昇したアミラーゼ活性をもたらす菌種も B. coagulans と考えられた。

一方、15 コロニー中 1 コロニーは Thermosporothrix hazakensis と推定された。単離された T. hazakensis の性質は、既報によると生育条件は温度 31～58℃(最適温度 50℃)、pH5.4～8.7(最適 pH7.0)であり、セルロース、キシラン、キチンを糖化するとあった(Yabe et al, 2010)。培養条件から判断して発酵液中に存在してもおかしくない菌種であり、セルロースやキシランなど食物繊維に該当する部分を糖化するとのことから B. coagulans 以外の糖化菌の存在も確認できた。仮に B. coagulans のアミラーゼ活性が低いとするとそれらを補う菌種の存在、あるいは、セルラーゼなど B. coagulans が持たない糖化活性を有する菌種の存在は、高温有機酸発酵の糖化部分の促進につながり有意義となり得る。単離された B. coagulans 以外の菌種が有機酸発酵にどのような影響を与えるかは不明であるため、負の側面を確認しつつ発酵槽内において共存化の方向性を今後探りたい。

## (3) 生ごみでんぷん培地の変化

生ごみでんぷん培地の糖濃度、L-乳酸濃度、アミラーゼ活性およびでんぷん寒天培地生菌数（図5.5）それぞれの変化を示す（繰返し数2回、それぞれを図示）。
図 5.5 生ごみでんぷん培地の変化（左 1 系、右 2 系）
全糖濃度は0日目で培養液中に46 g/Lあったのが、徐々に低下し10日目に16 g/L（平均値）へと減少した。その間、二糖・単糖は24 g/Lあったものが4日目までにほぼ0 g/Lとなり、でんぷんは21 g/Lあったものが初めの0.5日間で13 g/Lまで低下し、以後10日目まで減少を続け8 g/Lとなった。でんぷんの明瞭な減少とその時期を確認した。

生成物について、培養を通じて生成した有機酸はDL-乳酸とギ酸（6日目以降で最大1 g/L未満）のみであった（C=1～5の主だった有機酸を測定）。また、生成した有機酸の大部分がL-乳酸であり、L-乳酸の光学純度は99%であった。全糖濃度とDL-乳酸濃度の関係をみると（図5.5）、消費全糖量に対するDL-乳酸収率は100%以上となることからL-乳酸発酵が充分に行えたと考えられる。

アミラーゼ活性は、培養開始時に既に高く、0.5日目に最大値（平均9.6 U/mL）を示した。以降もアミラーゼ活性値は4 U/mL程度を保ち、関連してでんぷん濃度の継続した減少、生菌数の維持（ $ 10^{7} $ CFU/mL以上）が観察された。

生ごみ培地を用いた培養と比べると、培養初期に高いアミラーゼ活性値およびでんぷんの分解を示した。これは、材料由来のアミラーゼ活性のほか、高いでんぷんの分解活性を有する株を植種に用いたこと、また、植種の際にでんぷん分解酵素が持ち込まれたことによると考えられる。

## (4) 培養液の菌叢変化

生ごみでんぷん培地を用いた発酵液について PCR-DGGE の結果を示す(図 5.6、1 系)。図中 0 日目は生ごみでんぷん培地の菌叢を示している。これらのうち一部（図 5.6 中；バンド 1、2、8、9、10、14）は、培養の序盤（2 日目まで）に消失している。このことから有機酸生成とは関連しない菌種と考えられる。一方で、アミラーゼ活性は 2 日目まで比較的高いことから（1 系）、アミラーゼ生成とは関連が考えられる。バンド 8 については、Bacillus oleronius あるいは Bacillus sporothermodurans（いずれも適合率 142/142）と推測される。いずれも Bacillus firmus に性質は類似していると報告されている菌種であり（Kuhnigk et al, 1995; Pettersson et al, 1996）、B. firmus はアミラーゼ活性を有することが知られている（Sneath 1986）。バンド 8 が培養初期においてアミラーゼ誘導を行った可能性も示唆される。培養開始 1 日後あたりから明瞭なバンド（12）を示す菌種は B. coagulans（適合率 73/73）と推測される。バンドの濃淡は遺伝子量（ここでは 16Sr DNA 量）と関連しており、有機酸発酵の進捗、あるいはでんぷん寒天培地における生菌数は B. coagulans の生長で説明がつくと思われる。一方、一部の菌種（図 5.6 中；バンド 3、4、5、6、13）は、培養初期と培養後半で観察される。バンド 3、4、5、6 は植菌に用いた s2 株にも見られるバンドであり、バンド 6 については A. thermoaerophilus（適合率 147/147）と推測された。これらバンドは、バンド
12 (B. coagulans と推測）が相対的に増加する時期において菌叢電態の相対的な割合を低下させるものの（1～4 日目の期間）、培養後半で相対的な割合を増加させ発酵槽内で存在を示している。A. thermoaerophilus についてはアミラーゼ誘導を目的に発酵に導入した菌種でもあり、培養後半で相対的割合を増加させる菌種もアミラーゼ誘導に関わっている可能性が示唆される。第4章の実験でも、生ごみを多く含む基質の場合に A. thermoaerophilus が検出されている。

図 5.6 培養液の菌叢変化

上部: M, DGGE Maker II; 0~10, サンプル日; Soil, 畑土壌培養液; 58, JCM258; s2, s2 株; s3, s3 株. 35~65%: 変性剤グラジエント. 図中バンド: 6, A. thermoaerophilus; 7, Bacillus smithii; 8, Bacillus sp.; 12, B. coagulans

## (5) Substrate-PAGE の試み

培養液中に存在するアミラーゼの消長を可視化することを目的に、substrate-PAGEを試みた。この方法では、アミラーゼ活性を示すタンパク質バンドの検出を行いつつ、分子量などが異なるアミラーゼを分離することができる。その結果（図5.7）、0日目と0.5日目についてそれぞれ2か所アミラーゼ活性を示す領域が確認できた。アミラーゼ活性値が高い時期（0日目、0.5日目）についてアミラーゼ活性領域を確認できた。
図 5.7 Substrate-PAGE の結果

左；ヨウ素染色後（着色反転、黒く表示）：右；CBB G-250 染色後（点線部分が左図でんぷん分解領域）

曲面は2次近似式を示す（式5-2）。pH；5.5（-1） ～7.5 (+1). 温度；45 (-1)～55 (+1)

図 5.8 でんぷん分解培養における L-乳酸生成量

$$ \left(L- 乳酸生成量 g\right)=7.11-1.47X_{1}-0.78X_{2}+0.55X_{1}X_{2}-2.73X_{1}^{2}+0.083X_{2}^{2} $$

$$ \mathrm{X}_{1} $$

$$ \mathrm{X}_{2} $$

## (6) でんぷん分解の培養条件検討

B. coagulans のでんぷん分解を、pH（5.5、6.5、7.5）、温度（45℃、50℃、55℃）の合計9点の条件にて比べた。評価は L-乳酸生成量で行った。その結果、pH6.5で45℃の条件が最大のL-乳酸生成量（9.1 g）を示した。一方、pH7.5の条件ではL-乳酸生成量は低調であり、3 g/L程度となった。培養実験において添加したグルコース量が3 g/Lであることから、pH7.5の条件ではほとんどでんぷんの資化が進んでいないと思われる。

L-乳酸の生成量を pH と温度を変数とする二次重回帰式にて評価した（式 5-2）。この際、pH と温度は実験巾をそれぞれ 1（-）と 5（℃）と設定し、実験領域を -1 から +1 へとコード
化した。求めた式は重回帰式の検定を行い、危険率0.05で実験データは重回帰モデルに適合していると判断された。実験結果と式(2)をプロットした結果を図5.8に示す。これによると、pHは6.5付近、温度は45℃に近づくにつれてL-乳酸生成量が高まっていることが分かる。B.coagulansを用いたでんぷんからのL-乳酸生成の至適条件は、現在の高温有機酸発酵条件より高pH側、低温側にあると考えられる。

## 5 -5 まとめ

本章では、人工生ごみを用いた高温有機酸発酵（回分培養）を非滅菌条件のもとで行い、糖化の確認、糖化時期の把握および糖化関連菌種の推定を行った。同発酵では、植種に B. coagulans と土壌由来菌培養液を用いた。その結果、でんぷんの糖化は発酵初期（1 日目まで）に起こること、アミラーゼ活性も発酵初期（1 日目まで）が高いことを確認した。材料あるいは植菌由来のアミラーゼが作用したと考えられる。なお、発酵後半（6 日目以降）においてもアミラーゼ活性が維持され、でんぷんの緩やかな減少、有機酸生成の継続と生菌数の維持を観察した。このことは継続したでんぷんの糖化を示すものと考えられる。時期を同じくして A. thermoaerophilus の相対的な増加を観察したことから、高温有機酸発酵槽内で同菌種がでんぷんの糖化を担っている可能性が示唆された。

## 【第5章参考文献】

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## 第6章 リアルタイム PCR 法の有機酸発酵への適用および数理モデル化

## 6 -1 概説

本章では、Bacillus coagulans のみが反応に関わっている非滅菌下での高温乳酸発酵を対象として、リアルタイム PCR の適用性を、異なる増殖相における有機酸発酵の観点から評価した。菌体重量と 16S rRNA 遺伝子との関係を詳細に把握するために、回分式および半連続式実験を行い、グルコースを基質とした異なる条件下で比較検討した。溶解性の基質のみを用いたので、固形性 CODcr よりも正確に測定できる濁度を測定して、菌体重量の評価を試みた。最後に、数理モデルを適用して、得られた結果を再現しうる一般化手法の検証を行った。

## 6 -2 文献考察

嫌気性消化反応は、酸発酵段階およびメタン発酵段階が組み合わされている。酸発酵段階は、乳酸、酪酸、酢酸などの有機酸および水素ガスが生成する複雑な過程であり、種々の微生物群が反応に関わっている。微生物群の構成により、反応動力学や反応生成物は大きな影響を受ける(Batstone et al., 2002; Hidaka et al., 2010a)。これらの特性を議論する上では微生物群の濃度を把握する必要があり、古典的には浮遊性物質（SS）(Michelson, 2006)、化学的酸素要求量（COD）(Batstone et al., 2002)や、濁度(Payot et al., 1999)を指標に用いてきた。しかしながら、これらの指標は、生ごみや食品廃棄物のように固形性有機成分を含む混合液での微生物群の濃度を把握するのには適切でない。近年分子生物学的手法としてリアルタイム PCR 法により、特定の微生物群をターゲットとしたプライマーを作成することで定量する技術が開発されてきた。この手法によるメタン細菌への定量技術が報告されている(Kobayashi et al., 2009)。Furet et al. (2004)は、ミルクの発酵産物を対象に、乳酸生成細菌をリアルタイム PCR 法により定量する技術を開発し、古典的な細菌の定量手法と比較している。しかしながら、数理モデルでより重要であるバイオマス重量としての細菌の定量は行っていない。水素発酵において、微生物の増殖に関するパラメータと、分子生物学的手法による微生物の定量の関係を議論する研究が報告されている(Wang et al., 2008a; 2008b)。しかし、反応器の運転時間は120 h程度に限られている。

一方 Akao et al. (2007)は、pH 5.5 および 55℃ の条件下で生ごみの発酵を行うと、非滅菌下で Bacillus coagulans が優占し、L-乳酸発酵になり、他の微生物群は増殖しないことを示している。乳酸発酵の動力学的解析として、基質や生成物の阻害影響、最大生成物濃度、微生物群集の増殖などを含めて、リアルタイム PCR による B. coagulans の定量と組み合わせ
た解析がなされている(Hidaka et al., 2010a)。非滅菌下での高温乳酸発酵はB. coagulansのみが反応に関わっているので、リアルタイムPCRの適用性を議論する上で都合がよい。さらに、L乳酸発酵自身も、生分解性プラスチックの原料として注目されている。しかしながら、既往研究での議論において、菌体重量の測定はCODcrの減少および菌体収率から算出したそれほど正確でない固形性CODcrの間接的な測定に基づいており、この方法では、自己分解による菌体重量の減少を把握できないことや、異なる増殖相の評価を行えない点で課題が残っている。さらに、菌体重量と16S rRNA遺伝子との関係を、長期的なかつ負荷率が異なる連続運転条件下で正確には評価されていない。

そこで本章では、リアルタイム PCR による B. coagulans の定量について、異なる増殖相における有機酸発酵の観点から評価を試みた。正確に菌体重量と 16S rRNA 遺伝子との関係を把握するために、回分式および半連続式実験を行い、グルコースを基質とした異なる条件下で比較した。溶解性の基質のみを用いたので、固形性 CODcr よりも正確に測定できる濁度を測定することで、菌体重量の評価を試みた。最後に、数理モデルを適用して、包括的に得られた結果を再現しうるかの検証を行った。

## 6 -3 実験方法

## (1) 反応器および実験条件

酸発酵実験を、有効容積1 Lのガラス製三角フラスコで作成した反応器で行った。反応器は嫌気性条件として、完全混合状態を攪拌機により確保した。回分式実験 (Run A1–Run A5)および半連続式実験 (Run B1–Run B3)を行った。実験条件はそれぞれ表6.1および表6.2に示すとおりである。恒温水槽により55℃を維持し、pHは10 N NH₄OHおよびpHコントローラー（NPH-660、日伸理化製）を用いて5.5に制御した。反応器のヘッドスペースは、それぞれの発酵実験開始前に窒素ガスによりパージした。反応器は121℃および20分のオートクレーブ操作により滅菌したものの、基質については滅菌操作を行わず、反応は基質に含まれている雑多な微生物群が元になり行われていることを示した。Run A1–Run A5では、異なる初期グルコース濃度を設定し、乳酸発酵における基質阻害や生成物阻害の影響を把握した。栄養塩の必要性を確認するために、ポリペプトンおよび酵母抽出液の添加割合をRun A2では減らした設定とした。植種汚泥は、事前にpH5.5および55℃にて2日間、非滅菌下で培養して確保した。培養液の組成は以下の通りである：グルコース(20 g/L)、酵母抽出液(2.5 g/L)、 $ (\mathrm{NH}_{4})_{2}\mathrm{HPO}_{4} $ (0.25 g/L)、 $ MgSO_{4}\cdot7H_{2}O $ (0.05 g/L)、 $ MnSO_{4}\cdot4H_{2}O $ (0.01 g/L)、 $ FeSO_{4}\cdot7H_{2}O $ (0.01 g/L)、L-lactate (10 g/L)、および発酵させた人工生ごみ(Akao et al., 2007)である。この植種液をそれぞれ10 mLずつ、1 Lの反応器に、実験開始時に投入した。植種液
に含まれる L 乳酸は 28.1 g/L であり、光学純度（OP）はほとんど 100% であった。

半連続式実験（Run B1–Run B3）では、2/3 L の消化液を引き抜き、同様の基質を投入する操作を3日ごとに行った。これは水理学的滞留時間（HRT）4.5 d に相当する。基質のグルコース、ポリペプトンおよび酵母抽出液は Run A1 と同様である。Run B1、Run B2 およびRun B3 では、有機物負荷率（OLR）をそれぞれで11.1、22.2、および5.55 g/(L·d) にした。この際には、投入基質の濃度を変化させることで対応した。半連続式実験は2,088 時間（87 日間）行った。Run B1 では実験開始時に植種污泥を10 mL 添加した。

表6.1 回分式実験の実験条件および結果

RunA1	RunA2	RunA3	RunA4	RunA5
Glucose (g/L)	50	100	100	150	200
Polypeptone (g/L)	5	5	10	15	20
Yeast extract (g/L)	5	5	10	15	20
Starting time of lactic acid production (h)	7	12	10	17	18
Final concentrations	16S rRNA gene (copies/L)	4×1011	5×1011	1×1012	9×1012	2×1011
Turbidity (kaolin mg/L)	2000	2400	4500	5000	4600
L-lactate (g/L)	48	60	78	82	63
Remaining glucose (g/L)	2	28	5	32	115
Lactate conversion ratioa(%)	95	72	84	52	28
OP (%)	100.0	99.9	99.7	98.7	98.1

$ ^{a} $ produced lactate (g) / consumed glucose (g) × 100(%)

表6.2 半連続式実験の実験条件

Run B1	Run B2	Run B3
Experimental time (h)	0-864	864-1512	1512-2088
HRT (d)	4.5	4.5	4.5
Glucose (g/L)	50	100	25
Polypeptone (g/L)	5	10	2.5
Yeast extract (g/L)	5	10	2.5
OLR (g/(L·d))	11.1	22.2	5.55

## (2) 分析方法

それぞれの回分式実験の途中で、定期的にサンプリングを行い、分析を行った。濁度は、吸光度（600、630および660nm）（UV-1650PC，島津）により測定した。その他の項目の分析方法は、第2章～第4章と同様である。
## (3) リアルタイム PCR による定量

DNA 抽出は、DNeasy Tissue Kit（QIAGEN）を利用し Lysis 法に基づいてサンプリング直後に行った。定量プライマーは、B.coagulans を特定しうるよう設計された BACO186F (gcatggaggaaaaaggaa)および BACO447R (cccggcaacagagtttta) を使用した。16S rRNA 遺伝子の定量は、蛍光色素（SYBR Green I、Roche）によるリアルタイム PCR で行った（Light Cycler 1.2、Roche）。PCR 条件は、95℃×10 分 + (95℃×10 秒 + 60℃×10 秒 + 72℃×30 秒) ×30 サイクルとした。外部標準 DNA 溶液は混合液より抽出された DNA 溶液を用いて PCR によって DNA を増幅することで作成し、その DNA 濃度は吸光度の測定により決定した (ND-1000、NanoDrop)。これにより作成された検量線を用いて、サンプル中に含まれる DNA 濃度を決定した。

## 6 -4 結果および考察

## (1) 回分式宾驗

表 6.1 に Run A1–Run A5 の結果をまとめて示す。これらの実験中にギ酸や酢酸は生成されず、乳酸の OP はほぼ 100% であった。Run A1 では、グルコースの消費および L 乳酸の生成が 7 時間後に開始した。そして、20 時間後には減少した。濁度は急速に増加し、そのタイミングは L 乳酸の生成時期と同じであった。16S rRNA 遺伝子濃度は、5 時間後より急速に増加し始めた。これは、濁度の増加開始よりも早い。遺伝子の増幅は、細胞重量の増加以前に観察されたことを示している。細胞増殖初期段階において、16S rRNA 遺伝子濃度の指数的な増加は、細胞重量よりも急速に進行していた。濁度および 16S rRNA 遺伝子の増加は 12 時間後に停止し、その後は、徐々に減少した。ポリペプトンおよび酵母抽出液のグルコースに対する割合は、Run A2 で Run A3 の半分とした。その結果、Run A2 では Run A3 よりも乳酸生成量が少なかった。Run A4 では、82 g/L の乳酸が生成され、32 g/L のグルコースが残存していた。これは、本反応器で得られる最大乳酸濃度を示している。この値は、Payot et al. (1999)や Akao et al. (2007)が示した 50 g/L 程度の値よりも高濃度である。Run A5 では、63 g/L の乳酸生成が観察された。これは、Run A4 よりも低い値である。さらに、濁度および 16S rRNA 遺伝子濃度も Run A5 では、Run A4 よりも低かった。これは、高濃度のグルコースによる阻害影響によるものと考えられる。同じグルコース、ポリペプトンおよび酵母抽出液の割合であった Run A1、Run A3、Run A4 および Run A5 を比較して、初期グルコース濃度の増加は、乳酸生成開始時期の遅延につながっている。
図 6.1 Run A1 および Run A3 での対数増殖相における細胞増殖に使用されたグルコース量と濁度増加の関係

図 6.1 に、Run A1 および Run A3 での対数増殖相における細胞増殖に使用されたグルコース量と濁度増加の関係を示す。ここでは乳酸濃度が、最大蓄積可能乳酸濃度よりも低い状況のものとして選んでいる。収率として、0.120 g-B. coagulans-COD/g-consumed-glucose-COD (Hidaka et al., 2010a)を用いて、細胞増殖に使用されたグルコース量 (X 軸) を算出した。COD と濁度の相関関係は、816 mg-kaolin/g-B. coagulans-COD で表された。濁度の増加は、固形性COD の増加で示される菌体重量の増加に対応していると考えられる。

Run A4 の結果より、乳酸の蓄積は乳酸生成に対する阻害効果があることが分かる。阻害影響 $ f_{L}(-) $ は、式（6-1）(Hidaka et al., 2010a) で表される。

$$ f_{_{L}}=\frac{K_{_{EI}}}{K_{_{EI}}+S_{_{L}}}\cdot\left(1-\frac{\max(0,\ S_{_{L}}-S_{_{Lct}})}{S_{_{L\max}}-S_{_{Lct}}}\right) $$

ここで、 $ K_{EI} $ は最初の乳酸阻害に関する半飽和定数（gCOD/L）、 $ S_{L} $ は乳酸濃度（gCOD/L）、 $ S_{Lct} $ は二段目の乳酸阻害開始濃度（gCOD/L）、 $ S_{Lmax} $ は最大蓄積乳酸濃度（gCOD/L）である。基質阻害については、Monod 型の式(Lin et al., 2004)や、Haldane 型の式(Haldane, 1930)で表される。ここでは、Haldane 型の式を用いて、微生物増殖に伴う 16S rRNA 遺伝子濃度の増加の観点での評価を試みた。16S rRNA 遺伝子濃度の比増殖速度に対するグルコースの阻害は以下の式で表される。

$$ \frac{\mu}{f_{L}}=\mu_{max}\cdot\frac{Sg}{Ks+Sg\cdot\left(1+\left.\frac{Sg}{K_{rES}}\right)\right.} $$

ここで、μは16S rRNA遺伝子の比増殖速度（1/h）、μmaxは16S rRNA遺伝子の最大比増
殖速度（1/h）、 $ K_{S} $ はグルコースに対する半飽和定数（gCOD/L）、 $ K_{rES} $ はグルコースの16S rRNA 遺伝子に対する阻害影響についての半飽和定数（gCOD/L）、および Sg はグルコース濃度（gCOD/L）である。

微生物重量（ここでは濁度を利用）あたりの乳酸生成に対するグルコースの阻害は以下の式で表される。

$$ \frac{V_{t}}{f_{L}}=V_{t\max}\cdot\frac{Sg}{Ks+Sg\cdot\left(1+\left.\frac{Sg}{K_{tES}}\right)\right.} $$

ここで、 $ V_{t} $ は微生物重量あたりの乳酸生成速度（mg-lactate/(mg-kaolin·h)）、 $ V_{tmax} $ は微生物重量あたりの最大乳酸生成速度（mg-lactate/(mg-kaolin·h)）、および $ K_{tES} $ は濁度に対するグルコースの阻害影響についての半飽和定数（gCOD/L）である。

ここでは、以下の値を用いた： $ K_{EI}=5.11\quad(\mathrm{gCOD/L}) $ 、 $ S_{Lc}=40\quad(\mathrm{gCOD/L}) $ 、 $ \mu_{\max}=1.54\quad(1/h) $ 、 $ K_{s}=3.1\quad(\mathrm{gCOD/L}) $ 、 $ V_{\max}=0.013\quad(\mathrm{mg-lactate}/(\mathrm{mg-kaolin}\cdot\mathrm{h})) $ (Hidaka et al., 2010a)、および $ S_{Lmax}=87.5\quad(\mathrm{gCOD/L}) $ （本研究で求めた値）。そして、 $ K_{rES}=1.1\times10^{3}\quad(\mathrm{gCOD/L}) $ （図6.2a）および $ K_{tES}=1.2\times10^{2}\quad(\mathrm{gCOD/L}) $ （図6.2b）を、誤差の二乗和が最小となるようにして求めた。 $ f_{L} $ の値が変動していたことから、これらの図での値は変動が大きいものの、グルコースが高濃度の場合の阻害影響がはっきりとモデル式により示されている。算出したHaldane式の値は、リアルタイムPCRおよび濁度で全く異なっていた。Burgos-Rubio et al. (2000)およびHidaka et al. (2010a)は、同様の阻害影響値をそれぞれ127 gCOD/Lおよび180 gCOD/Lと報告している。これらは、本研究での $ K_{tES} $ の値に近く、 $ K_{rES} $ の値とは異なっていた。

(A) 16S rRNA 遺伝子に対する阻害; Hidaka et al. (2010a) のデータを含む;

(B) 微生物重量あたりの乳酸生成速度に対する阻害

図 6.2 Haldane 型の式による阻害影響の比較
A

B

(A)回分式宾験; (B) 半連続式実験

図 6.3 Run A1、Run A3、Run A4、Run B1、Run B2 および Run B3 での 16S rRNA 遺伝子濃度と濁度の関係

(2) リアルタイム PCR による定量と微生物重量の関係

図 6.3 に、Run A1、Run A3、Run A4、Run B1、Run B2 および Run B3 での 16S rRNA 遺伝子濃度と濁度の関係を示す。ポリペプトンおよび酵母抽出液の割合が少なかった Run A2 および初期グルコース濃度を高く設定した Run A5 の実験結果は除外している。Run A の結果（図 6.3a）より、以下に示すとおり 16S rRNA 遺伝子濃度の変動にあわせて 5 つの相に分類した。

相１（遅滞相）：増殖開始前の段階

相 2 （初期対数増殖相）：最大増殖速度に達する前の段階

相 3 （対数増殖相）: 最大増殖速度に達してから増殖終了まで

相４（定常相）：増殖終了から６時間まで

相 5 （死亡相）：相 4 の後実験終了まで

相1および相2では、16S rRNA遺伝子濃度の増加速度は、濁度の増加速度よりも速かった。相3では、濁度も16S rRNA遺伝子濃度もいずれを同程度の速度で増加した。相4では、グルコースがほとんど残存していないので、濁度は減少し始めた。相5では16S rRNA遺伝子濃度が濁度よりも速く減少した。これは、細胞そのものは、16S rRNA遺伝子に比べて分解されにくいためと考えられる。これらの結果は、よく知られた、単位体積あたりの細胞数および細胞重量の、二つの細胞増殖曲線の違いに一致しており、細胞の大きさや細胞内物質の合成は細胞重量に大きく影響を与えるものの、細胞数とは異なるので、細胞数および細胞重量は互いに単純な換算ができない(Gray, 2004)。Run Aの相3および相4の結果を、Run Bの結果とあわせて比較すると（図6.3b）、互いの点は比較的一致している。Run Bでは、濁度および16S rRNA遺伝子濃度を、基質投入直前で乳酸発酵およびB. coagulansの増
殖がほぼ完了している段階、すなわち対数増殖相の後で測定している。高い有機物負荷条件下では、より高い濁度および16S rRNA遺伝子濃度が得られている。濁度（kaolin mg/L）と16S rRNA遺伝子濃度（copies/L）の比率は、Run Bでおおむね10^{-9}（mg/copies）程度である。これより、16S rRNA遺伝子濃度は、半連続運転において、異なる有機物負荷条件下で、古典的な微生物量把握指標であるMLSSと同様に、微生物量を把握する指標となり得ると考えられる。

exp は実験値を、曲線は計算値を示す

図 6.4 数理モデルの計算結果

Hidaka et al. (2010a) が提示した数理モデルを、本研究の半連続式実験に当てはめた。ほとんどの定数の値は変更しなかったものの、いくつかの定数値は本研究で得られた値を用いた。阻害定数 $ (K_{ES}) $ は 119 gCOD/L、最大蓄積乳酸濃度 $ (S_{L\mathrm{max}}) $ は 87.5 gCOD/L とした。測定した 16S rRNA 遺伝子濃度は、図 6.3b および図 6.1 に示す関係を用いて順に濁度および gCOD/L に換算した。実測値と計算値の比較は、図 6.4 に示すとおりである。上の図は、全期間の包括的な比較結果であり、下の図は同じデータを元にしたものであり、各 Run の前後で分析をより細かに行った際の部分を拡大したものである。全体を通して、グルコースの消費や乳酸の生成が、異なる有機物負荷条件下で、また条件を変更した直前直後を含めて、精度よく再現されている。B. coagulans の増殖および自己分解も同様に精度よく再現されている。16S rRNA 遺伝子濃度から gCOD/L への換算では多少の誤差が生じているものの、
全体としてはおおむね状態変数それぞれの挙動が再現されている。さらに、半連続式実験におけるリアルタイム PCR による 16S rRNA 遺伝子濃度測定の適用性が、包括的な数理モデルにより、古典的な手法と比較しながら、示されている。

## (3) 微生物群集解析から数理モデル化へ

COD は、嫌気性消化過程において保存されるため、微生物重量の収支を議論する上で、有用である。実際、IWA の ADM1 モデル(Batstone et al., 2002)でも、微生物重量は COD で議論している。しかしながら、COD、MLSS、濁度などでは、異なる微生物群集および固形性基質を区別して測定するのが難しい。Cicek et al. (2001)は、中程度の強度の人工都市下水を処理するために開発した膜分離生物処理反応器において、異なる滞留時間で gVSS あたりの酵素活性を比較したところ、劇的には変化しないことを報告している。生物学的硝化において、硝化活性測定試験は、硝化反応の結果生じる生成物である硝酸性窒素を測定する手法であり、硝酸性窒素は消費されないので、硝化細菌の定量に有用な手法である(Tsuno et al., 2002; Hidaka et al., 2003)。メタン発酵におけるメタン生成速度の測定も同様である(Angelidaki et al., 2009)。もし特定の反応を評価するのであれば、その反応に関する遺伝子濃度の測定も、評価手法としての可能性がある。Wang et al. (2008b)は、水素発酵の回分式実験において、16S rRNA 遺伝子濃度と水素生成との直接的な関係はなく、水素生成遺伝子(hydA)の濃度が直接水素生成と比例していたことを報告している。16S rRNA 遺伝子濃度の結果は本研究での回分式実験と一致する一方、本研究での半連続式実験では、反応器の処理特性や微生物濃度の指標として 16S rRNA 遺伝子濃度の有用性を実証している。硝化反応に係わる amoA 遺伝子(Harms et al., 2003)や、ミクロシスチンの生成に係わる mcyA 遺伝子(Ha et al., 2011)は、環境工学における他のリアルタイム PCR 法の適用の例である。しかしながら、嫌気性有機酸発酵はより複雑な反応であり、実有機性廃棄物の有機物組成は複雑で数多くの種類の反応が連続して起こっている。全微生物濃度ですら、COD などで簡単に測定することはできない。本研究では、濁度が微生物濃度や COD と関連していることが示されたものの、濁度も同様に、固形性有機物を基質に含む系では実用上適用が難しい。

本研究では、反応器の処理特性や微生物濃度の指標として、16S rRNA 遺伝子濃度の有用性を実証している。16S rRNA 遺伝子濃度と古典的な測定方法との関係は、増殖相によって異なっていた。この相違点は、Haldane 阻害式の係数値がリアルタイム PCR での定量と、濁度や COD での定量とで異なっていたことからも説明できる。これは、リアルタイム PCR での相 1 および相 2 の測定結果が、Haldane 阻害式の係数値を求める際に含まれていたからである。しかしながら、対数増殖相以降のリアルタイム PCR の測定値と濁度の関係が明確
であったことは、半連続式実験で、異なる有機物負荷条件下を16S rRNA 遺伝子濃度が反映していたことを説明している。Furet et al. (2004) は、乳酸発酵における対数増殖相の後期での乳酸細菌の定量について、PCR による定量手法が、colony forming units (CFU) よりも正確であると結論づけている。回分式実験では、16S rRNA 遺伝子濃度と微生物濃度の関係が増殖相によって異なるものの、連続運転条件下における定常状態では、この効果はそれほど影響せず、リアルタイム PCR による16S rRNA 遺伝子濃度の定量手法は微生物濃度の把握に適用可能である。実際、16S rRNA 遺伝子濃度は、半連続式実験での数理モデルの検討でもその適用性が示された。

乳酸および水素の両発酵を含む系では、少なくとも2種類以上の微生物群を把握する必要があり、リアルタイムPCR法の複雑な有機物を対象とした嫌気性有機酸発酵への適用性が示されている(Hidaka et al., 2010b)。ただし、古典的な微生物濃度測定との比較は十分に評価されているとはいえない。Ramirez et al. (2009)は、ADM1モデルを拡張し、複数の微生物種を各反応に当てはめ、それぞれの動力学的定数値も微生物種によってランダムに与えることを提案しているものの、特定の微生物種に対応しているわけではない。実施設の運転においては、投入基質の組成が日々変動し、処理特性や微生物群集も常に変化し続ける(Cheon et al., 2008)。本研究で提示しているリアルタイムPCRの手法は、微生物の生死を区別できないものの、この欠点は古典的な微生物濃度測定方法でも同じである。本手法の古典的手法に対する長所は、特定の微生物種に対応したプライマーを設計することで生死を区別するよりも簡単に適用でき、実施設の現場での酸発酵において異なる微生物群集を管理するのに有用である点である。

## 6 -5 まとめ

反応器の処理特性や微生物濃度の指標として、16S rRNA 遺伝子濃度の有用性を実証した。本研究で提示しているリアルタイム PCR の手法は、微生物の生死を区別できないものの、この欠点は古典的な微生物濃度測定方法でも同じである。本手法の古典的手法に対する長所は、特定の微生物種に対応したプライマーを設計することで、生死を区別するよりも簡単に適用でき、実施設の現場での有機酸発酵において異なる微生物群集を管理するのに有用であると考えられる。

## 【第6章参考文献】

Akao, S., Tsuno, H., Horie, T., Mori, S. (2007) Effects of pH and temperature on products and bacterial community in L-lactate batch fermentation of garbage under unsterile condition. Water