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14) 粒子含有型スポンジモノリスの開発

安田絃治，加藤啓太，富永雄一，久保拓也，細矢憲，日本分析化学会第60年会，名古屋，2011年9月

15) 分子認識材料の開発と分離・分析への応用～生体応用を夢見て？～

久保拓也，ぶんせき秘帖～巻ノ六～，交野（大阪），2012年8月（依頼講演）

16) 高通水性多孔膜－微粒子ハイブリッド材料を用いた高速分析前処理剤の開発久保拓也，細矢憲，大塚浩二，日本分析化学会第61年会，金沢，2012年9月

17) 分子刺激応答性ヒドロゲルを用いた水溶性化合物の選択的捕捉

富永雄一，久保拓也，細矢憲，大塚浩二，日本分析化学会第61年会，金沢，2012年9月

18) 分離剤設計のためのマテリアルデザインと表面化学

久保拓也，第32回キャピラリー電気泳動シンポジウム，池田（大阪），2012年11月（依頼講演）

19) 機能性高分子多孔体の開発とクロマトグラフィー分析の簡便化

細矢憲，第23回クロマトグラフィー科学会議，岐阜，2012年11月（受賞講演）

20) 油中 PCB の選択的分離を目的としたスルホキシド含有型分子インプリント固相剤の開発

小林厚，富永雄一，久保拓也，細矢憲，第 23 回クロマトグラフィー科学会議，岐阜，2012 年 11 月

21) スポンジモノリスの保持特性及び機能化の検討

谷川哲也，久保拓也，細矢憲，第23回クロマトグラフィー科学会議，岐阜，2012年11月

22) PEG 系ヒドロゲルの分子認識刺激に基づく膨潤・収縮挙動の基礎評価

富永雄一，久保拓也，末吉健志，細矢憲，大塚浩二，第23回クロマトグラフィー科学会議，岐阜，2012年11月

### 7. 研究者略壓

課題代表者:細矢憲

京都大学大学院理学研究科修了，理学博士

現在，京都府立大学大学院生命環境科学研究科 教授

研究参画者

(1): 細矢 憲(同上)

(2):久保 拓也

京都工芸繊維大学大学院工芸科学研究科修了，博士(工学)現在，京都大学大学院工学研究科 准教授

## (3) : 早川 禎宏

現在，(株)島津製作所分析計測事業部グローバルアプリケーション開発センター グループ長

(4): 渡部 悦幸

京都工芸繊維大学大学院工芸科学研究科修了, 博士(工学)

現在, (株)島津製作所分析計測事業部グローバルアプリケーション開発センター 主任

(5):井上健二

京都大学大学院工学研究科修了，工学博士

現在，(株)力ネカR&D企画部 部長
## (1) 高感度分析システムの実用化に関する研究

京都府立大学 大学院生命環境科学研究科 応用生命科学専攻 細矢 憲

京都大学 大学院工学研究科 材料化学専攻 久保 拓也

（株）島津製作所 分析計測事業部グローバルアプリケーション開発センター 早川 禎宏

（株）島津製作所 分析計測事業部グローバルアプリケーション開発センター 渡部 悦幸

平成20～24年度累計予算額：58,135千円

（うち，平成24年度予算額：11,991千円）

予算額は，間接経費を含む。

平成20年度まではナノテクノロジーを活用した環境技術開発推進事業予算にて実施。

## [要旨]

河川水や湖沼水などに普遍的に存在する植物由来のフミン質を除去する効果を付与した表面修飾型ポリマー充てん剤を，ポンプによる大量試料負荷が可能なカラムスイッチング高速液体クロマトグラフ（HPLC）に組み込み，フミン質除去による質量検出計での感度向上効果を河川水中のビスフェノールA（BPA），17β-エストラジオールなど，微量環境化学物質の定量分析においてその効果を確認した。さらにカラムスイッチング用の高压バルブ以外に，前処理流路の洗浄，置換，分析カラムの洗浄等のために多バルブ化したシステムを構築し，その効果を河川水実試料の連続分析において確認した。実用性の見地から2バルブシステムを基本とし，上記環境化学物質やPPCPs（Pharmaceuticals and Personal Care Products）と呼ばれる医薬品等を質量検出計と併せて汎用性が大きく，安価な紫外-可視吸光検出器，蛍光検出器との組み合わせでも微量分析に必要な感度等諸元性能が確保されていることを確認した。さらに，本システムの適用範囲を広げるべく，疎水性の高い発がん性物質である多環芳香族炭化水素（polycyclic aromatic hydrocarbon, PAH）15成分の同時一斉分析を試みた。疎水吸着による回収率低下を回避する別流路を追加することにより，PAHsの分析にも対応可能であることが確認できた。これらの基礎検討を踏まえ，実用上の利便性向上のため，バルブ切換プログラムを簡便に作成する支援ソフトを新たに作製し，周辺技術のパッケージ化を進めて前処理カラムを含め，本システムを製品化し，市販を開始した。

## [キーワード]

カラムスイッチング，自動濃縮，環境化学物質，計測技術，高速液体クロマトグラフィー

### 1. はじめに

最近の報告では，極微量の環境化学物質が生態系に与える影響も懸念されており，特に環境水中の微量化学物質の濃度を精度よく，かつ迅速，簡便に測定することの必要性は非常に大きいと考えられる $ ^{1} $ 。定量下限値の目安としては，1-10 ng/L程度までの濃度が安定して測定できることで
あろうと考えられる。

現在広く使われている方法は，化学分析法と機器分析法に大別され，前者では酵素結合免疫吸着法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA法）や放射免疫測定（Radioimmunoassay, RIA法）などが用いられている。これらは簡便ではあるが，信頼性，安定性で問題を指摘される場合もある $ ^{2)-7} $ 。ガスクロマトグラフ質量分析計（GC/MS）法は高い選択性と感度を有するものの，試料前処理に多大な手間と時間が必要であり，ともすれば分析のスループットに問題を生じ易い $ ^{8)-13} $ 。一方，HPLCを用いる方法は，簡単な前処理で分析が可能であり，検出法として吸光度，蛍光，電気化学検出，質量分析（MS）等々が利用可能である $ ^{14)15} $ 。しかしながら，感度的には優位な質量検出法を用いても10 ppt（parts per trillion (ng/L)）以下の濃度を定量するためには，試料の濃縮操作が必要である。そのためには，ポンプで水試料を直接注入できる形式のカラムスイッチングHPLCシステムは有効な手段である $ ^{16)17} $ 。本研究では，擬似分子鋳型を用いた高選択性の前処理媒体を利用できるプラットフォームとしての高感度自動濃縮システムの構築と，各種検出器との組み合わせの最適化を図った。組み合わせる検出法の中では，質量検出法は選択性が大きいものの，大気圧イオン化法を選択した場合には，共存成分の影響で目的成分のイオン化効率が変化する，いわゆるマトリックス効果という現象が知られており，この現象が原因のひとつとなって検出感度が低下する場合がある。環境水試料の質量検出で現れるこの現象の原因がフミン質であり，これを前処理濃縮段階で排除する表面修飾法については既報 $ ^{16)} $ している。この効果をさらに詳しく調べて実証データを採取することも重要である。また，分析手法の実用性を高めるために，カラムスイッチング分析で多く見受けられる分析カラムおよび前処理カラムの詰まりによる圧力上昇という問題を回避する手法を確立する必要があり，前処理カラムの妨害除去効果の確認と併せて，本研究の大きな課題である。さらに質量検出よりも汎用性が高く，安価な吸光度検出，蛍光検出との組み合わせ，前処理流路への吸着が予想される高疎水性化合物への適応，操作性を容易にする専用ソフトウェアの開発などが，研究の対象となる課題であると考えられる。

## 2 ．研究開発目的

本研究の目的は以下のようにまとめられる。

・前処理，分析カラムの耐久性向上のため，前処理流路の置換，洗浄を行える流路構成を含むシステムを構築し，その効果を確認する。

・フミン質除去効果を持った表面修飾粒子の前処理カラムの効果を河川水試料中で確認し，この前処理カラムの市販を行う。

・質量検出以外の汎用性の高い検出器との組み合わせでもng/Lレベルの微量分析を実施する。

・本システムの適応範囲を広げるため，発がん性のあるPAHsを例に疎水性の大きな流路吸着の可能性のある化合物の分析方法を確立する。

・本システムを製品化し，市販を開始する。
## 3 ．研究開発方法

## （1） システム構築

通常，システムに1つ組み込まれているバルブを2バルブ（置換，洗浄流路のパージを容易にしたもの）と3バルブ（2バルブの機能に加えて分析カラムの逆転洗浄を可能にしたもの）の比較を行ったが，装置制御の点から2バルブシステムを採用し，1回あたり，50 mLの河川水ポンプ注入を150回以上繰り返し，前処理カラム，分析カラムの圧力変化を確認した。併せて比較のため，前処理カラムの置換洗浄を行わない場合のカラム圧力変化についても確認実験を行った。

図(1)-1に本システムでの流路切換動作の説明を記す。

図(1)-1 カラムスイッチングシステムの流路切換順序

本システムは高压流路切換バルブ2つ，低压流路切換バルブ1つを組み込んだカラムスイッチングシステムである。試料は，あらかじめ0.22μmのメンブレンフィルタでろ過したものを試料導入用ポンプに接続した。試料導入から分析への動作手順を以下に示す。

• 試料濃縮

• 流路残存試料の排除洗浄

前処理カラムの分析前置換

分析

分析中に前処理カラムの洗浄，再生
これらの動きに対応する流路の接続状態を示したものが図(1)-1で，それぞれ，前述の動作説明の見出し番号に対応する。

また，回収率の算出など，標準溶液注入には上記システムの分析流路に試料注入装置を接続して，分析を行った。

採用した分析条件の詳細は，以下の通り。

移動相: 10 mM リン酸(ナトリウム)/acetonitrile=65/35 (v/v)

試料溶出後にacetonitrile70%として分析カラムを洗浄した。

分析用流速: $ 0.8 \, mL/min $

前处理用流速: 2.0 mL/min

試料注入量: 50 mL

前処理力ラム: MASK-ENVカラム (30 mm × 4.0 mm i.d.)

分析カラム: Shim-pack VP-ODS (150 mm × 4.6 mm i.d.)

温度: $ 40^{\circ}C $

流路置换時間: 1 min (2.0 mL)

前処理カラム置換時間：4 min (8.0 mL)

## （２）フミン質除去

吸光度検出法と組み合わせてフミン質の除去を示すデータを採取して，さらに河川水中のビスフェノールA，17β-エストラジオール（E2）を質量検出することにより，前処理カラムの表面修飾の有無によるピーク検出感度の差を確認することで評価を行った。質量検出の際の分析条件は下記の通り。

移動相: water/methanol=40/60-5/95 (v/v) グラジエント溶離（30分，直線）

分析用流速: $ 0.2 \, mL/min $

前处理用流速: 2.0 mL/min

試料注入量: 50 mL

前処理力ラム: MASK-ENV (10 mm × 4.0 mm)

分析カラム: Shim-pack VP-ODS (150 mm × 2.0 mm i.d.)

温度: $ 40^{\circ}C $

流路置换時間: 1 min (2.0 mL)

前処理カラム置換時間：4 min (8.0 mL)

イオン化: APCI (ネガティブ)

モニタリングイオン: m/z 227, 233, 271, 274

本システムの信頼性確認のため，直線性，再現性，検出限界等を2.0-250 ng/Lの濃度の標準品を用いて確認した。さらに河川水中PPCPsの分析を質量検出にて行った。

## （３）汎用検出器への応用

汎用性の高い検出器との組み合わせによる適応範囲の拡大については，蛍光検出器で，質量検
出同様に極微量のBPAの定量分析を行った（使用した分析条件は（1）項と同じ）。蛍光検出器に関しては，RF-20A（Shimadzu）を用い，励起波長（Ex）230 nm，蛍光波長（Em）310 nm，セル温度：30℃という設定で行った。以下の項目について評価を行った。

## ・ 回收率の確認

回収率は200 ng/LのBAPを添加した河川水50 mLと10 mg/L標準溶液1.0 mLの分析結果を比較して求めた。

・再現性は10 ng/LのBPAを添加した河川水の6回繰り返し分析により得られたピーク面性の相対標準偏差として求めた。

・検出限界は1 ng/Lの標準BPA溶液の応答と米国材料試験協会（ASTM）法によるノイズからS/N=3として求めた。

・直線性は1.0，5.0，10，100，1000 ng/Lの標準品を3回ずつ分析し，重み付けなし最小自乗法で得られた検量線の決定係数として求めた。

· 実試料分析

京都市内賀茂川で採取した河川表層水に対して，5.0 ng/Lの濃度になるようにBPAを添加してカラムスイッチング濃縮分析を行った。

## （４）PAHs分析への応用

以下の図(1)-2に示す米国環境保護局（EPA）指定16成分のうちacenaphthylene蛍光検出可能な15成分について，検討した。

図(1)-2 分析対象にしたEPA指定PAHs（蛍光検出可能なものについては番号を付与）

装置の構成は疎水性の大きなPAHsの接液部への吸着を抑制するために，試料の30%のacetonitrileを添加した関係上，容量，保持力の限られたMASK-ENVカラムにトラップさせるために，図(1)-3のように，吸着が予想されるポンプまでの流路以降の水で希釈する流路を設けて回収率の向上を図った。採用した移動相条件は下記。
移動相: water/acetonitrile=60/40 (v/v)

以下の条件でグラジェント溶離を実施

14 分 acetonitrile 60%

22 分 acetonitrile 100%

36 分 acetonitrile 100%

分析用流速: $ 1.5 \, mL/min $

前处理用流速: $ 1.0 \, mL/min $

希积液流速: 4.0 mL/min

試料注入量: 10 mL

前処理力ラム: MASK-EMV(30 mmL × 4.0 mm i.d.)

分析カラム: Restek Pinacle II PAH (250 mmL × 4.6 mm i.d.)

温度: $ 40^{\circ}C $

流路置换時間: 2 min (2.0 mL)

前処理カラム置換時間：2 min (2.0 mL)

検出：以下の励起/蛍光 波長の異なる6つの組み合わせによる波長切換

初期条件 270/330 nm (励起/萤光)

17.5 分 250/370 nm

19.5 分 330/430 nm

21 分 270/390 nm

23 分 290/430 nm

25.5 分 370/460 nm

28 分 270/330 nm
1. 移動相用ポンプ 7. サンプル

2. 移動相 8. 前処理カラム

3. サンプル用ポンプ 9. 分析カラム

4. 低圧バルブ 10. 蛍光検出器

5. リンス溶媒 11. 高圧バルブ

6. 置換溶媒

図(1)-3 希釈流路付き自動濃縮システム

本システムによる分析法バリデーションを行うため，以下の項目を検討した。

## ・試料添加有機溶媒比率および，濃縮前希釈倍率の検討

吸着抑制のための添加溶媒を移動相と同じacetonitrileに固定して，Dibenz[a,h]anthracene標準品溶液（100 ng/L）に対して体積比で10-40%のacetonitrileを添加して，オートインジェクタで注入した標準溶液との比較で回収率を確認した。次に，この検討で得られたacetonitrile比率において試料希釈率は2-7倍変化させ，試料送液速度を1.0 mL/minとして，希釈液速度を変化させた。保持の大小を代表してNaphthareneとDibenz[a,h]anthraceneの回収率をオートインジェクタで注入した標準溶液との比較で確認した。

## ・回收率の確認

30 ng/L（但し図(1)-2の1,2は60 ng/L,3,6,10,14は300 ng/L）になるようPAHs標準品を添加した河川水試料を本システムで分析し,オートインジェクタで注入した標準溶液との比較を行い,回収率の確認を行った。

## ・直線性の確認

5.0, 10, 30, 100, 200 ng/L（但し図(1)-2の1,2は各2倍,3,6,10,14は各10倍濃度）になるようPAHs標準品を添加した河川水試料で直線性の確認を行った。

## ・面積再現性の確認

30 ng/L（但し図(1)-2の1,2は60 ng/L,3,6,10,14は300 ng/L）になるようPAHs標準品を添
加した河川水試料で6回繰り返し分析を行い，ピーク面積の再現性を確認した。

## ・検出限界，定量限界の確認

10 ng/Lになるよう PAHs標準品を添加した河川水試料で検出限界（LOD），定量限界（LOQ）を確認した。算定は波長切換を行ったPAHsを含まない水試料のクロマトグラムの当該ピーク溶出部分のノイズレベルを測定し，その3.3倍相当の濃度をLOD，10倍相当の濃度をLOQとした。

## （５）システム製品化

製品化に関しては，ハードウェア関係では，システムレイアウトの決定，ソフトウェア関連は操作を簡便化するタイムプログラム作成支援ソフトを作成する，取扱説明書，カタログ等の関連資料，文書を準備する，等の作業を行った。

## 4 ．結果及び考察

## （1） システム構築

実際の河川水を用いて180回の連続分析を行った。カラム圧力の推移は図(1)-4に示した。分析カラムと前処理カラムの圧力の漸増は見られるが，分析カラムでは150回の分析で圧力増加は約2.0 MPaであった。また前処理カラムの圧力増も1.0 MPa以下で，いずれも実用上は問題ない範囲であると思われる。尚，流路，前処理カラムの置換を行わない単一バルブシステムの場合，20回程度の連続注入で分析カラムの耐圧限界付近まで圧力が上昇し，使用不可能な状態になった。

図(1)-4 河川水による連続分析時のカラム圧力変動

逆相系の分析カラムに関しては150回（7.5 L）までの実試料負荷に関しては実用性が確認できた。

## （２）フミン質除去

実際にMASKによる表面修飾効果を示したものが図(1)-5である。
図(1)-5 河川水分析における前処理用充てん剤のフミン質除去効果

吸光度検出により，フミン質除去効果が視覚化され，その効果が確認できる。さらに実際の分析での利点として，質量検出への適用を確認した。妨害成分がイオン化を阻害するイオンサプレッションはMS検出法の抱える大きな問題で，感度の不安定さが，再現性や直線性などの信頼性の向上の妨げとなっている。図(1)-6に示す選択イオン検出（SIM）モードで測定した各成分の比較クロマトグラムでは，各成分で，MASK修飾した前処理用カラムを用いた分析で得られたピークが未修飾のそれを上回る応答を示し，感度の向上に前処理カラムをMASK修飾することによる実試料中の妨害成分除去が有効であることが示された。また，感度の向上とは別に，各クロマトグラムのベースラインの変化を比較すると，MASK修飾前処理カラムで得られたクロマトグラムの方が持ち上がりの少ないきれいな状態であることがわかる。図(1)-6ではイオンサプレッションの効果はE2よりもBPAで顕著に観察できる。

図(1)-6 河川水中の10 ng/Lの修飾有無の比較SIMクロマトグラム（-dは，重水素置換体）
本カラムスイッチングシステムの回収率は以下の表(1)-1に示す。尚，回収率の計算は(ポンプ注入による500 pg相当のピーク面積)/(マニュアル注入による500 pg相当のピーク面積)として計算し，3回の繰り返し分析で再現性の相対標準偏差（RSD）も求めた。

表(1)-1 システム回収率および標準品での再現性

回收率 (%)

Run	BPA	BPA-d	E2	E2-d
1	89.3	97.5	99.5	100.7
2	89.8	92.6	100.3	100.1
3	93.9	93.0	104.2	103.5
平均	91.0	94.4	101.3	101.4
RSD(%)	2.3	2.6	2.5	1.9

回収率は90-100%で，概ね満足できる値となった。定量の方法として重水素置換体を用いた内部標準法を採用したので，日内および日間再現性として，内部標準品との面積比の再現性を確認しその結果を以下の表(1)-2に示す。

表(1)-2 内部標準法による日間および日内再現性各化合物あたり 10 ng/L の内部標準を含む.

日内	日間
Run	BPA	E2	BPA	E2
1	1.16	1.17	1.18	1.19
2	1.18	1.17	1.17	1.16
3	1.18	1.17	1.17	1.18
4	1.18	1.15	n=5 for each day
5	1.17	1.13
平均	1.17	1.16	1.17	1.18
RSD(%)	0.76	1.54	0.49	1.30

絶対検量線法によるばらつきと比べると内部標準法によるばらつきは小さく，また日内だけではなく，日間再現性も極めて良好であることがわかる。質量検出においては，プローブの状態などから，絶対検量線法での日間再現性は20-30%程度レスポンスがばらつくことがあるため，特に日間再現性，あるいは今回は検討できなかったが，日間再現性では内部標準法の採用は，信頼性向上への寄与が大きいと思われる。BPAとE2の内部標準法による直線性は河川水に添加した試料においても2.0-250 ng/Lの範囲で確認され，相関係数 $ r^{2} $ はそれぞれ，0.9999以上の良好直線性を示した。さらにクロマトグラムのノイズレベルと，2.0 ng/Lのピークレスポンスから算定した検出限界（平均ノイズレベルの3.3倍とした。）は，純水添加でBPAは0.18 ng/L，E2は0.23 ng/Lであった。さらに河川水に添加した場合は，BPAのバックグラウンドが確認できたため，これを元に，添加したBPAのレスポンスの増分から算出した検出限界は0.86 ng/L，E2は0.99 ng/Lで，いずれも，共存
するマトリックスがかなり厳しい条件でも1.0 ng/L以下を検出できることがわかった。さらに医療施設からの排水などにより環境中に放出される，医薬品の7成分（1.ヨヒンビン，βプロッカー心臓病薬，2.アルプレノール，βプロッカー，心臓病，3.ドキセピン，抗うつ剤，4.イミプラミン，抗うつ剤，5.アミトリプチリン，抗うつ剤，6.ジブカシン，鎮痛麻酔，7.イソプロピルアンチピリン，鎮痛麻酔）についても，河川水添加での液体クロマトグラフ質量分析（LC/MS）での分析を行った。図(1)-7に併記したようにいずれも0.5 ng/L以下の極めて良好な検出限界感度を得た。

(detection limit in parentheses) each10 ng/L added in river water

図(1)-7 河川水中医薬品の自動濃縮同時分析（質量検出）

## （３）汎用検出器への応用

高価な質量検出ではなく，汎用性の大きな蛍光検出器でのBPA分析に本システムを適用して得られた諸元を以下の表(1)-3に示す。

表(1)-3 蛍光検出におけるBPA分析の性能諸元

回收率	97%
再現性	1.4%RSD
檢出限界	0.09 ng/L
直線性	R²=0.9999

回収率に関しては，概ね満足できる数値となっている。再現性はn=6として計算を行った。再現性も純水に添加した試料ではなく，実試料(河川水)に標準添加した10 ng/Lとかなり低濃度の試料を用いて得られた結果であるので，これも良好な結果と判断できる。尚，再現性に関しては連続分析によって得られたクロマトグラムを図(1)-8に重ね描きクロマトグラムとして掲載する。良好な再現性が確認できた。
図(1)-8 河川水BPAの繰り返し分析（蛍光検出）

さらに微量の5.0 ng/Lを河川水に添加して蛍光検出器で分析して得られたクロマトグラムを以下の図(1)-9に示す。

図(1)-9 BPAを5.0 ng/L添加した河川水のカラムスイッチング蛍光検出分析
検出限界に関しては，エムポアディスクでバックグラウンドのBPA濃度を抑えた標準溶液を作製した場合，0.1 ng/Lという極めて希薄な濃度であっても，検出可能であることが示された。実試料では適当な濃度の添加試料を調製できなかったため，推測になるが1.0 ng/L程度の濃度が実試料中での検出限界であろうと推察される。これが効果は質量分析計や電気化学検出器などではなく汎用性の大きな蛍光検出器で達成された検出限界であることが，大きな意味を持つ。

## （４）PAHs分析への応用

## 1 )通常のカラムスイッチング分析における問題点と希釈濃縮流路追加による効果

PAHs の中でも環数が多く，疎水性の大きなものは，ポンプ濃縮を行う際にサクションパイプや送液ポンプ内の樹脂部品に化学的に吸着してしまい，大幅に回収率が劣化する現象が見られる。実例として，純水に PAHs 標準品を添加してポンプ濃縮して得られたクロマトグラムと，オートインジェクタで注入した標準溶液のクロマトグラムの比較を以下に示す（図(1)-10 は標準品インジェクタ注入，図(1)-11 は標準品ポンプ濃縮注入）。

図(1)-10 オートインジェクタ注入による PAHs 標準品のクロマトグラム

図(1)-11 ポンプ濃縮による PAHs 標準品のクロマトグラム

図(1)-11 の囲み部分を図(1)-10 と比較すると, ポンプ濃縮の場合は保持の強い PAHs の成分のピークは殆ど確認できない。これは疎水性の大きな PAHs が流路に吸着して回収率が大きく低下したためだと思われる。一般には移動相送液ポンプはオートインジェクタのように疎水的な成分の吸着抑制をするような特別の設計がなされていないのが普通である。従って疎水性の大きな化合物の樹脂部分への吸着による回収率の低下は充分に考えられる事象である。対策としては試料そ
のものが水であるため，これに吸着を抑制するために有機溶媒を一定量添加すれば，この回收率不良は改善されるものと思われた。そのため，疎水的な保持の大きなDibenz[a,h]anthraceneを対象成分として，100 ng/Lの標準水溶液試料を作製し，同溶液に体積比で10，20，30，40%の含有率となるようにacetonitrileを添加して回収率の変化を確認した結果を図(1)-12に示す。この結果30%添加の場合に回収率が最大になった。

図(1)-12 acetonitrile 添加濃度による Dibenz $$ a,h $$ anthoracene の回収率変化

15 成分の PHAs 標準溶液に 30%（v/v）となるよう，acetonitrile を添加して，本システムによる自動濃縮分析を行って得られたクロマトグラムを以下の図(1)-13 に示す。図(1)-11 で喪失していた溶出の遅い PAHs のピークが確認できるが（右の囲み），今度は溶出の早いピークの形状劣化，あるいはピークそのもの大きさが，図(1)-11 のクロマトグラム中のピークと比較して小さくなっており，回収率の低下が見られた（左の囲み）。逆相保持モードにおいて大きな溶出力を持つ acetonitrile の効果により，保持の小さな試料が本来の保持時間よりも部分的に早く溶出する結果となった。これは濃縮カラムのサイズが小さいため，成分バンドが拡がり，濃縮段階で保持しきれずに漏出していることが原因であると考えられた。

図(1)-13 acetonitrile を 30% 添加した PAHs 標準品のポンプ濃縮によるクロマトグラム

この現象の解決策として，図(1)-3に示した試料送液ポンプの後，濃縮用の前処理カラムの前で試料溶液を純水と混合して，前処理カラム導入時の実質的なacetonitrile濃度を低下させる流路系を付与したシステムを本分析に適用した。試料希釈によるカラムスイチングHPLCでの回収率向上については，先例もある $ ^{20)} $ が，希釈率の最適化は必要である。また，流路の構成上，なるべく
単純な流路構成が望ましいことから，当初希釈流路は図(1)-3 の 11 番左側高压バルブ下流，前処理カラム直前での接続を試みたが，得られた結果は予想に反して回収率が悪かった。これは，希釈液も含めて，比較的大きな流速設定に対して，移動相との充分な混合に必要な容量が前処理カラム直前になく，移動相中の有機溶媒濃度に不均一性があるためだと考えられた。そのため，希釈流路接続位置は図(1)-3 のようにして，混合に使用可能な容量を前処理カラム前に確保することで所期の回収率向上が確認できた。図(1)-14 には保持の弱い PAH として Naphtharene，保持の強い PAH として Dibenz[a,h]anthracene を対象として希釈率を 3, 4, 5, 6, 7 倍と変化させた際の回収率との関係を示す。

図(1)-14 希釈倍率による Dibenz[a,h]anthracene, Naphtharene の回収率変化

図(1)-13 からは 5 倍程度の希釈率で疎水性に大きな差のある PAHs の回収率の差がやや小さくなることがわかる。しかし，この検討は最初に添加有機溶媒濃度を固定して，希釈倍率を動かしており，それぞれの操作が，独立であった場合は妥当な結果が得られるが，それぞれの操作に交差反応がある場合には，条件変化のマトリックスに沿った多数回の分散分析による妥当性評価が必要になる。今回の検証範囲は前処理カラム耐圧，あるいは常識的な分析所用時間の範囲内で検討を行っている。例えば前処理流速 1.0 mL/min の状態で 20 倍希釈を行えば，前処理カラムに負荷される流速は合計 20 mL/min となり，カラム耐圧に問題が生じる。またこの対応として，流速を 1/5 とすれば，10 mL の試料量を処理するために 50 分を要することになる。そのため，実用上検討できる範囲は限られるが，その範囲内においては容認できる程度の回収率を示す条件が，30% の acetonitrile 添加と 5 倍希釈後濃縮という組み合わせであった。この条件で得られた，標準 PAHs 溶液のクロマトグラムを以下の図(1)-15 に示す。濃度は 10 ng/L（ただし 1，2 は 20 ng/L，3，6，10，14 は 100 ng/L）である。その他条件は（3）項に記載の通り。
図(1)-15 30%acetonitrile 添加，5 倍希釈後，濃縮分析により得られた PAHs のクロマトグラム

試料環境水試料に対して，有機溶媒である acetonitrile を添加することによって，試料送液系に吸着する疎水性の大きな PAHs を効率よく回収し，濃縮前に希釈流路を設けて疎水性の比較的小さな PAHs を良好なピーク形状で回収でき，それらが両立できることが図(1)-15 の結果から見てとれる。次に実際の河川水に PAHs を 30 ng/L（ただし 1,2 は 60 ng/L,3,6,10,14 は 300 ng/L）の濃度で添加して本システムで分析を行った結果，得られたクロマトグラムを以下の図(1)-16 に示す。

図(1)-16 賀茂川より採取した河川水に PAH 添加（30-300 ng/L）

河川水実試料に PAHs を添加した場合でも，ng/L レベルの濃度において良好な分離，ピーク形状が得られることを確認した。

## 2 )本システムの性能評価結果

実験項で説明した方法によって得られた性能評価結果を以下に検討項毎に示した。

- 回収率に関しては 15 成分で 70-98%と良好であった。回収率そのものは，前項で記述したように，条件を選べば更に，良好な結果を得られる可能性はあるものの，実用的な範囲での検討結果としては概ね，信頼に足る回収率が得られたと思われる。

・ 直線性は 15 成分で $ r^{2} $ が 0.9991-0.9999 と良好であった。

再現性は，ピークの面積 RSD で 0.2-12.7%，分離に難のある最後の溶出順である Indeno $$ 1,2,3-cd $$ pyrene 以外は 5%以下であった。概ね，良好といえる。
検出限界は 0.1-2.8 ng/L，定量限界は 0.4-9.11 ng/L となり，殆どの成分で 1.0 ng/L 程度の検出限界と 5.0 ng/L 以下という実用上充分な定量限界が得られた。

## · 耐久性

分析カラム，前処理カラムの河川水試料に対する耐久性については，前項記載のように，今回の5倍量に相当する1分析あたり50 mLの河川水試料の100回以上の連続分析において確認されており，今回のPAHs分析においても同様の初期の性能が発揮されているものと考えられる。

## （５）システム製品化

フミン質除去のための表面修飾を行った充てん剤を用いた前处理カラムは，MASK-ENVという名前で（株）ケムコプラスより発売された。ポンプ注入による自動濃縮システムは設置レイアウト検討，分析の留意点などを収載した取扱説明書を作成し，これを島津製作所より自動濃縮システムという名称で発売した。尚，報告書の別添資料として，MASK-ENVカラムおよび自動濃縮システムのカタログを添付する。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究の成果である，表面修飾型前処理カラムと，自動濃縮システムの組み合わせにより，従来，煩雑かつ所要時間の長い前処理を必要とした環境水中の極微量化学物質の分析が試料のろ過のみで自動分析が可能になった。またその適応範囲は選択性の大きな質量検出においては，フミン質除去による感度の向上という成果が，カラム耐久性の向上とともに，取得できた。さらに，質量検出よりも感度の低い汎用検出器においても，微量分析に必要な感度が得られることが確認でき，さらに濃縮流路への吸着が懸念される化合物についても，適切な吸着抑制の方法を発見した。これにより適用範囲の広い，簡便で信頼性の大きな環境水中化学物質の定量分析が可能になった。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

公定法，通知法などで，環境水試料の前処理/分析の方法としてポンプ濃縮によるカラムスイッチング分析が採用候補となる可能性がある。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。
### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) 多バルブカラムスイッチング液体クロマトグラフィー/質量分析計を用いる河川水中ビスフェノール A および $ 17\beta- $ エストラジオール分析における前処理の自動化

小倉泰朗，渡部悅幸，藤田登美雄，細矢憲，久保拓也，彼谷邦光，分析化学，58,293–299,2009

2) Retention Properties of Macroporous Spongy Monolith and its Application for Concentration of Polyaromatic Hydrocarbons

T. Tanigawa, K. Kato, Y. Watabe, T. Kubo, K. Hosoya, J. Sep. Sci., 34, 2193–2198, 2011

3) Determination of Bisphenol A with Effective Pretreatment Medium Using Automated Column Switching HPLC with Fluorescence Detection

T. Tanigawa, Y. Watabe, T. Kubo, K. Hosoya, J. Sep. Sci., 34, 2840–2846, 2011

4) Trace Level Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in River Water with Automated Pretreatment HPLC

Y. Watabe, T. Kubo, T. Tanigawa, Y. Hayakawa, K. Otsuka, K. Hosoya, J. Sep. Sci., 36, 1128–1134, 2013

## くその他誌上発表（査読なし）>

## 著書

1) ベーシック機器分析化学，第0章

渡部悦幸，細矢憲，久保拓也，化学同人，2008年

## 解說記事

1) カラムスイッチング LCMS を用いる河川水中微量化学物質の自動前処理分析法について

渡部悦幸，私立大学環境保全学会会誌10号，2010年

## （2） 口頭発表（学会等）

$ ^{*} $ 下線は発表者

## <国際学会>

1) Improved technique of pretreatment method for environmental water analysis using column switching LC-MS

Tairo Ogura, Yoshiyuki Watabe, Tomio Fujita, Takuya Kubo, Ken Hosoya, Kunimitsu Kaya, HPLC2008 Kyoto, Kyoto (Japan), December 2008 (Poster)

2) Analysis of trace components in environmental water by automated column-switching LC-MS system

Tairo Ogura, Yoshiyuki Watabe, Hirohisa Mikami, Tomio Fujita, Takuya Kubo, Ken Hosoya, Kunimitsu Kaya, PITTCON 2009, Chicago (USA), March 2009 (Poster)
3) Automated determination of bisphenol A, 17- $ \beta $ estradiol and wasted drugs in river water with multi-valve column switching LC-MS in river water with multi-valve column switching LC-MS

Yoshiyuki Watabe, Tairo Ogura, Tomio Fujita, Takuya Kubo, Ken Hosoya, Kunimitsu Kaya, HPLC2009, Dresden (Germany), June 2009 (Poster)

4) Ultra low level determination of bisphenol A in river water using column-stitching HPLC with fluorescence and mass-spectrometry detection

Y. Watabe, T. Hine, H. Mikami, T. Kubo, K. Hosoya, T. Tanigawa, International Symposium on Separation Science, Rome (Italy), September 2010 (Poster)

5) Ultra low level determination of bisphenol A in river water using column-switching HPLC with fluorescence and mass-spectrometry detection

Y. Watabe, T. Hine, T. Tanigawa, T. Kubo, K. Hosoya, ICAS2011, Kyoto (Japan), May 2011 (Poster)

6) Ultra low level determination of bisphenol A and poly aromatic hydrocarbons in river water using column-stitching HPLC with fluorescence detection

Y. Watabe, T. Hine, T. Tanigawa, T. Kubo, K. Hosoya, HPLC2011, Budapest (Hungary), June 2011 (Poster)

7) Ultra low level determination of bisphenol A, $ 17-\beta $ estradiol and poly aromatic hydrocarbons in river water using fully automated column-stitching HPLC

Y. Watabe, Y. Hayakawa, T. Tanigawa, T. Kubo, K. Hosoya, SETAC2012, Berlin (Germany), May 2012 (Poster)

8) Easy and high sensitivity determination of chemical pollutants in river water by using fully automated column-switching HPLC

Y. Watabe, A. Nomura, Y. Hayakawa, T. Tanigawa, T. Kubo, K. Hosoya, HPLC2012, Anaheim (USA), June 2012 (Poster)

9) Trace level determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in river water with automated pretreatment HPLC

Y. Watabe, Y. Hayakawa, T. Kubo, T. Tanigawa, K. Hosoya, ISC2012, Toruń (Poland), September 2012 (Poster)

10) Trace Level determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in river water with automated pretreatment HPLC

Y. Watabe, Y. Hayakawa, T. Kubo, T. Tanigawa, K. Hosoya, SETAC Asia Pacific 2012, Kumamoto (Japan), September 2012 (Poster)
## <国内学会>

1）カラムスイッチング LC-MS による河川水中微量成分分析-堅牢性評価

小倉泰郎，渡部悦幸，三上博久，藤田登美雄，久保拓也，細矢憲，彼谷邦光，第15回クロマトグラフィーシンポジウム，静岡，2008年5月（ポスター）

2) 多バルブカラムスイッチング LCMS を用いる河川水中環境化学物質および医薬品廃棄物の自動分析

渡部悦幸，小倉泰朗，三上博久，日根隆，久保拓也，細矢憲，彼谷邦光，みちのく分析科学シンポジウム 2009，仙台，2009 年 7 月（ポスター）

3) 多バルブカラムスイッチング LCMS を用いる河川水中環境化学物質および医薬品廃棄物分析における前処理の自動化

渡部悦幸，小倉泰朗，三上博久，谷川哲也，日根隆，久保拓也，細矢憲，彼谷邦光，日本分析化学会第 58 年会，札幌，2009 年 9 月（ポスター）

4) 表面修飾型前処理カラムと多バルブカラムスイッチング LCMS を用いる河川水中環境化学物質分析における前処理の自動化

渡部悦幸，小倉泰朗，三上博久，日根隆，久保拓也，細矢憲，彼谷邦光，谷川哲也，第20回クロマトグラフィー科学会議，東京，2009年11月（ポスター）

5) 蛍光検出法を用いた河川水中微量環境化学物質の HPLC 自動濃縮分析

渡部悦幸，三上博久，日根隆，久保拓也，谷川哲也，細矢憲，日本分析化学会第59年会，仙台，2010年9月（ポスター）

6) 蛍光検出法による河川水中ビスフェノール A および多環芳香族炭化水素の超微量カラムスイッチング HPLC 分析

渡部悦幸, 日根隆, 谷川哲也, 久保拓也, 細矢憲, 日本分析化学会第 60 年会, 名古屋, 2011 年 9 月 (ポスター)

7) カラムスイッチング HPLC を用いた河川水中の芳香族炭化水素の高感度蛍光検出分析法の開発

渡部悦幸, 日根隆, 谷川哲也, 久保拓也, 細矢憲, 第 22 回クロマトグラフィー科学会議, 仙台, 2011 年 11 月 (ポスター) (2011)

8) 河川水中微量多環芳香族炭化水素の HPLC 自動前処理分析

渡部悦幸，早川禎宏，谷川哲也，細矢憲，久保拓也，第 23 回クロマトグラフィー科学会議，岐阜，2012 年 11 月（ポスター）
9) HPLC を用いた多環芳香族炭化水素のオンライン濃縮分析

渡部悦幸，早川禎宏，谷川哲也，細矢憲，久保拓也，第20回環境ホルモン学会，東京，2012年12月（ポスター）

## （3） 出願特許

1) 渡部悦幸，小倉泰郎：島津製作所；「試料前処理装置及び液体クロマトグラフ装置」，登録番号 04946647 2012-03-16

（４）シンポジウム，セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

（５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## （6） その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) Identification of Estrogenic Chemicals in STW Effluent. 1. Chemical Fractionation and in Vitro Biological Screening

C. Desbwow, E.J. Routledge, G.C. Brighty, J.P. Sumper, M. Waldock, Environ. Sci. Technol., 32, 1549–1558, 1998

2) Analysis of estrogenic hormones in municipal wastewater effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry

C.H. Huang, D.L. Sedlak, Toxicol. Chem., 20, 133–139, 2001

3) Combination of automatic HPLC-RIA method for determination of estrone and estradiol in serum

T. Yasui, M. Yamada, H. Kinoshita, H. Uemura, N. Yoneda, M. Irahara, T. Aono, S. Sunahara, Y. Mito, F. Kurimoto, K. Hara, J. Clin. Lab. Anal., 13, 266–272, 1999

4) 浜田，田口，後藤，藤田，中村，日本分析化学会第47年会講演要旨集 p.164, 1998

5) Estrone and estradiol- $ 17\beta $ concentration in tissue of the scleractinian coral, Montipora verrucosa

A.M. Tarrant, S. Atkinson, M.J. Atkinson, Comp. Biochem. Physiol. A, 122, 85–92, 1999

6) Biological measurement of estrogenic activity in urine and bile conjugates with the in vitro ER-CALUX reporter gene assay

J. Legler, A. Jonas, A. Brouwer, A.J. Murk, Environ. Toxicol. Chem., 21, 473–479, 2002

7) The fate and behaviour of human estrogens in a night soil treatment process

H. Takigami, N. Taniguchi, T. Matsuda, M. Yamada, Y. Shimizu, S. Matsui, Water Sci. Technol., 42, 45–51, 2000
10) Trace analysis of estrogenic chemicals in sewage effluent using liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry

A. Lagana, A. Bacoloni, G. Fago, A. Marino, Rapid Commun. Mass Spectrom., 14, 401–407, 2000

11) Assessment of estradiol and its metabolites in meat

D. Manue, Y. Deceuninck, K. Pouponneau, A. Paris, B. Le Bizec, F. Andre, Microbiol. Immunol. Scand., 109, 365–372, 2001

12) Determination of estrone and $ 17\beta $ -estradiol in human hair by gas chromatography–mass spectrometry

M.H. Choi, K.R. Kim, B.C. Chung, Analyst, 125, 711–714, 2000

13) Analysis of steroids in environmental water samples using solid-phase extraction and ion-trap gas chromatography–mass spectrometry and gas chromatography–tandem mass spectrometry

C. Kelly, J. Chromatogr. A, 872, 309–314, 2000

14) Sensitive method for the determination of bisphenol-A in serum using two systems of high-performance liquid chromatography

J. Sajiki, K. Takahashi, J. Yonekubo, J. Chromatogr. B, 736, 255–261, 1999

15) Determination of bisphenol A in blood using high-performance liquid chromatography-electrochemical detection with solid-phase extraction

J. Sajiki, J. Chromatogr. B, 775, 9–15, 2001

16) Improved Detectability with a Polymer-based Trapping Device in Rapid HPLC Analysis for Ultra-low Levels of Bisphenol A (BPA) in Environmental Samples

Y. Watabe, T. Kondo, H. Imai, M. Morita, N. Tanaka, J. Haginaka, K. Hosoya, Anal. Sci., 20, 133–137, 2004

17) Fully automated liquid chromatography-mass spectrometry determination of 17beta-estradiol in river water.

Y. Watabe, T. Kubo, T. Nishikawa, T. Fujita, K. Kaya, K. Hosoya, J. Chromatogr. A, 1120, 252–259, 2006

18) Monodisperse polymer beads as packing material for high-performance liquid chromatography. Synthesis and properties of monidisperse polystyrene and poly(methacrylate) latex seeds

V. Smigol, F. Svec, K. Hosoya, Q. Wang, J.M.J. Frechet, Angew. Macromol. Chem., 195, 151–164, 1992

19) Influence of the seed polymer on the chromatographic properties of size monodisperse polymeric separation media prepared by a multi-step swelling and polymerization method

K. Hosoya, J.M.J. Frechet, J. Polym. Sci. Part A, Polym. Chem., 31, 2129–2141, 1993
20) Reducing Bisphenol A Contamination from Analytical Procedures To Determine Ultralow Levels in Environmental Samples Using Automated HPLC Microanalysis

Y. Watabe, T. Kondo, H. Imai, M. Morita, N. Tanaka, K. Hosoya, Anal. Chem., 76, 105–109, 2004

21) Novel surface modified molecularly imprinted polymer focused on the removal of interference in environmental water samples for chromatographic determination

Y. Watabe, K. Hosoya, N. Tanaka, T. Kubo, T. Kondo, M. Morita, J. Chromatogr. A, 1073, 363–370, 2005

22) LC/MS determination of bisphenol A in river water using a surface-modified molecularly-imprinted polymer as an on-line pretreatment device

Y. Watabe, K. Hosoya, N. Tanaka, T. Kondo, M. Morita, T. Kubo, Anal. Bioanal. Chem., 381, 1193–1198, 2005