Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
図(3)-13 さらに摩耗が進んでいる（2016年1月28日）

## 【評価】

ハーネス型の装着は、一部個体に脱羽がみられるものの軽度であり、2年ほど経過しても良好な状態を保っている個体もいる。また、1例ではあるが、2年7ヶ月後に自然脱落した個体も確認された。電池寿命が2年間の現在の発信機を用いる場合に適当な期間での脱落と考えられる。これらハーネスへの反応には個体差があることに留意して用いれば、発信機の装着方法としては適していると考えられる。

### ii. 首輪型

## 【発信機の形状】

首輪型発信機は、キジ・ウズラ・ライチョウなど地上性鳥類、オウム等用に開発されたもので、中国ではトキにも使用された実績がある（たとえばHolohil社のRI-2D，SI-2Cなど）。頸部に首輪状に装着し、発信機部分は首の前側に下がり、アンテナは背中側にのびる(図(3)-14)。首輪の太さは頭骨より狭くて脱落しない必要があるが、頸部を締め付けないことも重要である。

図(3)-14 首輪型発信機

【結果】いずれの個体も装着後まもなく首輪部分に下嘴を挟み、自力では首輪型発信機をはずすことができない状態であった(図(3)-15)。以下に各個体の装着後の状況を示す。
## ①SB82（♂） 装着時間：12：10→嘴を挟んだ時間：15：36（約3時間）

実験終了後、舌の先端に小規模の擦過傷が認められた。また、嘴の上下においてズレが認められた。食欲および活力に変化はない。その後、嘴のズレは徐々に改善してきている。

## ②SB80（☐） 装着時間：12：30→嘴を挟んだ時間：14：38（約2時間）

首輪をはずした直後は舌にわずかな傷が見られたが出血は認められなかった。2月7日より日中における食欲低下がみられるが、1日を通しての採餌量に大きな減少は見られない。

③SB84（♀） 装着時間：12：50→嘴を挟んだ時間：16：47から17：50：の間（約4－5時間）

首輪をはずした直後、舌の前方半分に出血を伴う擦過傷が認められた。食欲および活力に異常は見られない。

SB82 $ (\vec{\sigma}) $

SB80 ( $ \vec{\sigma} $ )

SB84 (♀)

図(3)-15発信機首輪に下嘴を挟んだ個体

## 【評価】

今回の形状の首輪型発信機は、装着後間もなく下嘴を首輪部分に挟み込み、自力では外せない状態となった。このことから、ヤンバルクイナへの発信機の装着方法としては適さないと考えられる。

## （３）飼育下で繁殖した個体の野外放鳥実験

## 1 ）野外放鳥実験結果

飼育下で繁殖した個体に発信機を装着し、実際にシェルター（野外エンクロージャー）に放鳥する実験を行った(図(3)-16)。その結果を同時期に周辺地域で実施した安田野生個体の追跡結果および西銘岳で実施した調査結果（2003-2008年、尾崎2010）と比較し、表(3)-3にまとめた。

図(3)-16 シェルターへの野外放鳥実験
表(3)-3 野外放鳥実験と野生個体の生存日数比較

シェルター内実験	安田野生個体	西銘岳野生個体
発信機による追跡個体数	14	10	32
平均生存日数（生存中を含む、2016/1/31までで計算）	82.5日	315.5日	—
平均生存日数（死亡個体、発信機の電池切れも含む）	29.8日	330.5日	399日（電池寿命2年のみの25個体では459）
1ヶ月以内の死亡率	8/14（57.1%）	0/10（0%）	1/32（3%）
死亡原因 カラスなど鳥類	5	7
ハブ	2	2	3
ネコ	1
不明	1	2
その他	1（衰弱水死）	2（電池切れ？）	1（ハーネス）

### a. 生存日数

シェルター内に放鳥した14個体の生存日数は平均82.5日（0-228日、2016年3月31日現在までで計算）となった。他の調査との比較のため、死亡確認個体のみで計算すると、29.8日となる。この値は安田の野生個体（330.5日）や、西銘岳の野生個体（399日）と比較すると、極めて短いことが判明した。

### b. 死因と死亡率

合計8個体の内訳は、カラスや猛禽と推定されるものが5個体、ハブが2個体、溺死が1個体となった。死因としては、野生個体と類似しているが、1ヶ月以内の死亡率が57.1％と高いことも分かった。すなわち、飼育下繁殖個体をシェルター内に放鳥すると、短期間のうちに外敵によって捕食され死亡し、野生個体に比べて生存することが困難であることが確認された。

### c. 長期生存個体

20日以上生存した個体は14羽中6羽であり、42.9％となる。これを放鳥時の年齢別にみると、1歳未満では6羽中4羽（66.7%）であるのに対し、2歳以上では8羽中2羽（25%）であり、長期生存には放鳥時の年齢が関与している可能性がある。また、孵化と育雛形態の違いによる長期生存率は、自然・自然個体が8羽中4羽（50%）、人工・人工個体が6羽中2羽（33.3%）となり、これも関与している可能性がある。

### d. 行動圈

放鳥後数日間は行動圏が安定せず、比較的長距離の移動を繰り返し、その後特定の場所に行動圏を構える個体が多かった(図(3)-17)。このことは放鳥直後には採餌や縄張り行動に費やす時間が多かったことを示すものと考えられ、今後の再導入時の訓練の必要性に関する重要な情報である。
図(3)-17 野外放鳥実験個体の行動圏の一例（点線：全期間、実線：放鳥10日～4ヶ月後）

## 2 ）再導入確率を高める飼育個体群の管理手法（提案）

### a. 初期生存率の向上

シェルター内試験放鳥個体では、平均生存日数が短く、特に初期の死亡率が高い。すなわち初期生存率が極めて低いため、これを高めることが重要である。その主要な死亡原因は捕食であることも判明している。そのために考えられる手法は、以下のものが考えられる。

### i. 放鳥候補の選別の再考

放鳥時の年齢、孵化と育雛形態の違いが、長期生存率に関与する可能性があるので、これらを考慮し、再検討する。具体的には、若齢個体や自然孵化・自然育雛を優先するなど。またこれらと放鳥時期の組み合わせについても様々なパターンを実施し、実証的により効果的な放鳥時期を見つける。

### ii. 野外順化訓練の実施

（捕食）：飼育の一部個体でハブに対する反応実験を行い、反応には個体差があることも判明している。また野外ではハブの出現にたいして、親鳥が威嚇を示すと同時に雛へ危険を教育するような行動が観察されており、ハブからの危険回避には本能に加えて「教育」が必要な可能性がある。このメカニズムを研究解明するとともに、順化訓練の手法を検討、実施する。

（採餌）：自然環境下で、給餌に頼らない餌の探索、摂取の訓練。

（他個体関係）：複数個体との競合、回避、共存などを経験させる必要がある。そのためには、現在の飼育施設のケージでは面積が狭く、十分な効果が期待できない。もう少し広いケージ（必ずしも恒久的でなくても可）が必要である。
### iii. リリース方法の検討

上にあげた捕食、採餌、他個体関係などのストレスを一気にかけることは生存へのプレッシャーとなる危険性がある。したがって、これらを段階的に経験・習得していくために、効果的なリリース方法を検討する必要がある。例えば、前項の順化訓練を兼ねた一時的なケージを設置して、その中からソフトリリースするなども検討してはどうか。

### b. 追跡と放鳥実験の継続

これらまで課題を検証するために、現在追跡中の個体（6個体）の追跡を継続して、データを収集する。また、実験個体数を増やすことにより、より正確なデータを蓄積していくことが重要である。

## （４）国外の近縁クイナの保全と再導入状況についての現地調査

捕食者の生息していない島嶼性のクイナ類では胸筋が発達せず飛翔力がなくなるため、絶滅しやすいことが知られている。太平洋でも11種の無飛力のクイナ類が絶滅している（図(3)-19）。ヤンバルクイナに近縁と考えられる南太平洋に分布するグアムクイナ、ロードハウクイナ、ニュージーランドクイナおよびカラヤンクイナの保全と再導入状況について現地で調査した。ヤンバルクイナと近縁種の保全・再導入状況を表(3)-4にまとめた。

図(3)-19太平洋諸島の無飛力クイナの分布図(Kirchman 2012 4)を改変)

☐：調查対象種、✗：絶滅種
表(3)-4 ヤンバルクイナと近縁種の保全状況

種名	ボトルネック(年)	個体数	増減傾向	保護策
ヤンバルクイナ	720(2005)	野生1,500飼育70	増	外来種、人工増殖
グアムクイナ	21(1983)	野生130飼育170	増	外来種、人工増殖、別の島に放鳥
ロードハウクイナ	30(1980)	250	増減なし	モニタリング(人工増殖は中断)
ニュージーランドクイナ	?	160,000飼育100	増減なし	外来種、人工増殖、再導入
カラヤンクイナ	?	3,000?	減	保護区設定、啓蒙

## 1 ）グアムクイナ

グアムクイナの飼育増殖と再導入状況を、2013年9月～10月に、グアム島（本島とココス島）、ロタ島の現地で調査した。このプロジェクトはグアム政府農業局魚類野生生物部門が主導しており、再導入はグアムクイナの減少の原因となった外来へビがいない、サイパンのロタ島とグアム属島のココス島で実施されている。ロタ島ではこれまで23年間に1,200羽を放鳥しているが、安定した個体数の定着には至っていない。主な原因はネコなどの外敵の存在と好適環境の確保が困難なことと考えられている。これに比べてココス島での移入実験はまだ年数や個体数も少ないが、順調な定着が見られており、この両地域の条件を詳細に比較検討することで、定着の要因が判明する可能性がある。

## 2 ）ロードハウクイナ

オーストラリアの南東に位置するロードハウ島に生息するロードハウクイナに関しては、2013年11月に、ロードハウ島担当局が実施する生息状況モニタリング調査に参加した。この調査はロードハウ島生物多様性管理計画に基づくもので、毎年11月に島の全域ですべての観察個体を捕獲し、カラーリングによる個体識別を実施することにより、正確な個体数の把握を目指している。今回の調査では、216個体を確認し、推定される50個体を加えて、266個体と計算された。これは2012年の280個体よりやや減少したことになる。ロードハウクイナは保護増殖事業を短期間に終了し、個体数は少ないながら綿密なモニタリングを継続することで、保全状況を確認している。万一急激な個体数減少の兆候が認められたら、すぐに対策を講じることとなっている。一方でこれまで遺伝的な解析は行っておらず、今回現地の研究者との情報交換から、ロードハウクイナに関する遺伝的多様性の研究の重要性が認識された。

## 3 ）ニュージーランドクイナ

ニュージーランドクイナの野外生態調査と再導入状況を2014年9～10月に調査した。ニュージーランドクイナは4亜種の合計が11-18万羽と推定されているが、もっとも少ない亜種は8千羽に満
たず、種として絶滅危惧Ⅱ類に指定されている(図(3)-18)。主な減少原因は環境悪化、交通事故、外来哺乳動物による捕食圧等で、ヤンバルクイナの現状に類似している。外来哺乳動物のコントロールを進めるとともに、積極的に好適な環境へ移住するプロジェクトも行われ、効果を上げつつある。なお、ニュージーランドでは、外来種問題の啓蒙が浸透して、一般市民にも広く認識されており、ボランティアベースの駆除等も盛んに実施されている。

これまでニュージーランドクイナの遺伝的な解析は不十分であり、今後亜種間の相違や、個体群毎の遺伝的多様性など解明すべき課題がある。これらに関して、ヤンバルクイナとも比較研究していくことは有意義と考えられた。

図(3)-18 ニュージーランドクイナの亜種ごとの個体数。総数では107,000-177,000羽と推定

## 4 ）カラヤンクイナ

フィリピン・ルソン島の北にあるカラヤン島に生息するカラヤンクイナの生息状況の確認と、保全状態を、2015年9月に調査した。その結果、カラヤンクイナに関しては、分布域や個体数、その他の生態に関する知見も限られており、保全に関しては密猟の取り締まりや啓蒙が重要であることが分った。また、生態や遺伝的な特徴に関して、ヤンバルクイナと比較研究していくことが必要かつ有意義と考えられた。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

1）ヤンバルクイナの主要な減少要因がマングースの存在であることが、ロジスティック回帰分析結果として明確に示された。

2）ヤンバルクイナの誘因に、天敵であるハブの剥製に対するモビング行動が有効なことが明白となった。また、このモビング行動はこれまで記録のない興味深い行動であり、野生個体と飼育下繁殖個体とでは、反応の強さと持続時間、他個体への警戒声等で異なることが、予備的な実験で認められ、ヘビに対する警戒行動の一部が後天的である可能性を示唆した。
〈行政がすでに活用した成果〉

小型発信機の装着方法はすでにヤンバルクイナ保護増殖事業で、野生復帰個体に用いられている。

〈行政が活用することが見込まれる成果〉

野生復帰個体の選択に、若齢、自然ふ化、自然育雛個体等を用いる手法、野生順化訓練の実施。

## （２）環境政策への貢献

1) ヤンバルクイナの主要な減少要因がマングースの存在であることが明確に示された。これはすでに沖縄県や環境省が実施しているやんぼる地域での外来種対策事業（平成18年度以降の環境省事業名は「沖縄島北部地域ジャワマングース等防除事業」）の目的を裏付けると同時に、再導入時に最も注目すべき項目が、マングースの排除であることを示している。

2）効果的な誘引方法と、安全な捕獲技術の開発が進んでおり、ハーネス法による発信機装着技術もかなり確立した。これらは再導入個体のモニタリングをするうえで重要な技術である。

3）ヤンバルクイナの再導入には、天敵や新な環境への順化訓練が重要であることを示す結果が得られた。すなわち、トキの野生復帰事業で確認されたような、ハードリリースとソフトリリースの相違、飼育繁殖形態の相違が、放鳥後の生存率に及ぼす影響が、ヤンバルクイナにも存在する可能性があり、そのための順化訓練など環境を整えることが必要と考えられた。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) A. NICOLA, C. Y. CHOI, K. OZAKI, C. A. LEPCZYK. J. Ornithology, Vol. 156, Supplement 1: 199–207. (2015) Invasive species and Pacific island bird conservation: A review of recent research featuring case studies on Swinhoe's Storm Petrel and Okinawa and Guam Rail.

くその他誌上発表（査読なし）>

1)尾崎清明：レッドデータブック2014、環境省自然環境局野生生物課（編）、44-45（2014）「ヤンバルクイナ」

## （2） 口頭発表（学会等）

1）尾崎清明：ジャパンバードフェスティバル、見にレクチャー（2013年11月2日、我孫子市）「ヤンバルクイナとグアムクイナの最新情報」

2）尾崎清明：環境省主催、ヤンバルクイナ保護増殖事業ワークショップ(2013年12月15日、国頭村）「ヤンバルクイナの生態」
3）尾崎清明：東邦大学理学部野生生物保全研究センター設立記念シンポジウム「希少鳥類の未来を考える」（2014年3月8日、習志野市）「飛べない鳥、ヤンバルクイナの保全」

4) K. OZAKI & S. MEDINA: 26 $ ^{th} $ International Ornithological Congress, Tokyo, Japan, 2014 "Impact of Invasive Predators on Okinawa and Guam Rails."

5)尾崎清明・永田尚志:日本鳥学会2015年度大会（神戸）「ヤンバルクイナとその近縁種の保全状況」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

尾崎清明: 日本生態学会2015年度大会（仙台）自由集会: 希少鳥類の再導入生物学、現状と問題点、「ヤンバルクイナの保護増殖と野生復帰試験」

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）山梨日日新聞（2014年1月3日、8ページ、「ヘビ侵入で急減、絶滅の危機、米グアムに飛べない鳥」）

2）長崎新聞（2014年1月3日、9ページ、「ブラックバスやヘビ、退治するのは大変、飛べない鳥守るグアム政府」）

3）岐阜新聞（2014年1月4日、8ページ、「壊れる固有の自然環境、飛べない鳥、絶滅危機－グアムクイナ」）

4）北日本新聞（2014年1月5日、「退治するのは大変、100万匹に増えたヘビ、グアム」）

5）信濃毎日新聞（2014年2月27日夕刊、4ページ、「戻り始めたヤンバルクイナ、沖縄進む天敵の外来種捕獲」）

6）日本経済新聞（2014年3月1日、全国版、34ページ、「絶滅危惧種、沖縄のヤンバルクイナ生息域回復」）

7）熊本日日新聞（2014年3月1日夕刊、3ページ、「ヤンバルクイナ戻る、天敵マングース減少」）

8）西日本新聞（2014年3月4日夕刊、3ページ、「ヤンバルクイナ踏ん張る、沖縄の危惧種個体数回復」）

9）京都新聞（2014年3月7日夕刊、7ページ、「ヤンバルクイナ生息回復、天敵マングース捕獲効奏」

10）琉球新報（2014年9月12日、地方版、「動物・植物の話題、ヤンバルクイナ仲良く寝支度」）

## （6） その他

特に記載すべき事項はない
### 8 \. 引用文献

1）尾崎清明:東邦大学大学院理学研究科博士学位論文，(2010)，ヤンバルクイナの保全生物学的研究.

2）環境省那覇自然環境事務所．2009a.平成20年度ヤンバルクイナ生息状況及び生態等把握調査業務報告書

3）環境省那覇自然環境事務所．2009b.平成20年度沖縄島北部地域ジャワングース等防除報告書

4) J. J. KIRCHMAN: The Auk: January 2012, Vol. 129, No. 1, 56-69. (2012), Speciation of Flightless Rails on Islands: A DNA-Based Phylogeny of the Typical Rails of the Pacific.
# 4-1302 再導入による希少鳥類の保全手法の確立に関する研究

（４）希少鳥類の遺伝子プロファイルと再導入に関する研究

新潟大学

自然科学系 生命・食料科学専攻 山田 宜永

自然科学系 生命・食料科学専攻 杉山 稔恵

<研究協力者>

京都大学

農学研究科 応用生物科学専攻 祝前 博明

平成25～27年度累計予算額：13,854千円（うち平成27年度：4,500千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

希少鳥類の野生下への再導入を成功させるためには、近親交配による遺伝的多様性の消失を阻止することが重要な課題となっている。そこで、飼育個体群と野生個体群において、SNP、マイクロサテライトなどの中立遺伝子とMHC、DRD4等の適応度遺伝子に分けて遺伝子情報を解析し、遺伝子プロファイルの完成、遺伝的多様性の評価、行動形質、繁殖適応形質との関連の解析を行った。本研究では、第1に、野外サンプルを用いた遺伝子解析手法の確立に関する研究を行い、トキの野外出生個体の遺伝的多様性をモニタリングできる高収量DNAを抽出するためのサンプリング法を確立した。第2に、マイクロサイトの多型情報の収集および遺伝的多様性の評価に関する研究を行い、日本産トキ集団において遺伝的多様性のレベルは低く、ボトルネックにより生じた結果であると示唆された。また、始祖個体がもつゲノムが、集団レベルで等しく後代個体に伝わっており、個体レベルでも様々な混合パターンで伝達していると示唆され、計画交配は遺伝的多様性の維持に有効に機能していると考えられた。第3に、MHC領域のゲノム構造の解明、多型情報の収集および遺伝的多様性の評価に関する研究を行い、トキではクラスII領域約40kbの、コウノトリではMHC約160kbのゲノム構造を決定した。多形解析では、トキ始祖5個体でハプロタイプが3種類のみであるのに対し、コウノトリ始祖6個体からは9種類が検出され、トキ集団の多様性が低いことが示された。第4に、DRD4のゲノム構造の解明、多型情報の収集、遺伝的多様性の評価および行動形質や生活史形質との関連に関する研究を行い、日本産トキ集団においてDRD4は4種類のハプロタイプしか保有していないことを明らかにした。また、DRD4は移動分散行動、採餌行動を介して生存率に影響すると示唆された。第5に、SNPの多型情報の収集および遺伝的多様性の評価に関する研究を行い、トキにおいて5万を超えるSNP候補と162のマイクロサテライト候補を得た。トキ集団の遺伝的多様性については、ゲノム全域にわたり各座位でのアリル数は2～3であることが示唆された。

## [キーワード]

希少鳥類、中立遺伝子、適応度遺伝子、遺伝子プロファイル、遺伝的多様性
### 1. はじめに

希少鳥類の個体数を増加させ、野生復帰を果たすためには、飼育個体群と野生個体群の遺伝的多様性の維持や、近親交配の回避および遺伝的適応の最小化を目指した遺伝的管理を行うことが不可欠である。また、野生下への再導入を成功させるためには、放鳥個体の生存率や定着成功率を向上させる必要もある。このような生活史形質には、行動形質や繁殖適応形質が影響することが知られている。こうして、遺伝的多様性の評価や行動形質、繁殖適応形質との関連の解析を行うためには、SNP、マイクロサテライトなどの中立遺伝子、および生存、繁殖、行動形質に影響するMHC、DRD4等の適応度遺伝子の遺伝子プロファイルを完成させる必要がある。

## 2 ．研究開発目的

飼育個体群と野生個体群において、ハプロタイプ、SNP、マイクロサテライトなどの生存に影響を与えない中立遺伝子とMHC、DRD4等の生存、繁殖、行動に影響する適応度遺伝子に分けて遺伝子情報を解析し、遺伝子プロファイルの完成、さらには遺伝的多様性の評価、行動形質、繁殖適応形質との関連の解析を行う。そのために、（1）野外サンプルを用いた遺伝子解析手法の確立に関する研究、（2）マイクロサイトの多型情報の収集および遺伝的多様性の評価に関する研究、（3）MHC領域のゲノム構造の解明、多型情報の収集および遺伝的多様性の評価に関する研究、（4）DRD4のゲノム構造の解明、多型情報の収集、遺伝的多様性の評価および行動形質や生活史形質との関連に関する研究、（5）SNPの多型情報の収集および遺伝的多様性の評価に関する研究を行う。

### 3. 研究開発方法

## （１）野外サンプルを用いた遺伝子解析手法の確立に関する研究

トキ野外回収サンプルからのDNA抽出法の確立については、当サンプリング法の予備的実験のため、白色レグホーン系採卵鶏（ジュリア）のヒナの雌雄各10羽を自由給水、自由給餌下で飼育した。0、5、10、15、20、25、30日齢時に体重測定を行い、その後ランダムに雌雄各3羽を選び、15、20、25、30日齢時に各個体より3本の胸部の羽髄をもつ幼羽を採取した。予備的実験後、当手法の有効性を確認するため、15～27日齢時のトキヒナ9個体（雄6個体、雌3個体）を用いて、15～21日齢時のトキヒナの胸部および、15～27日齢時のトキヒナの背部より羽髄をもつ幼羽を採取した。また、10か月、21か月および22か月齢時のトキ4個体（雄2個体、雌2個体）を用いて、胸羽を採取した。このように採取された胸部あるいは背部の幼羽、胸羽より、DNeasy Blood&Tissue Kitの改変プロトコールを用いてゲノムDNA抽出を行った後、分光光度計にてA260の吸光度の測定を行い、抽出されたDNAの収量について検討した。また抽出したDNAの品質の確認を行うために、性判定用のコントロールプライマー（ニワトリDNAについては、CPE15F：AAGCATAGAAACAATGTGGGACおよびCPE15R：AACTCTGTCTGGAAGGACTT、トキDNAについては、NNsexicF：GGAGGATGACAACTACATCGTCTおよびNNsexicR：GGAGACAGTCTGGATCCCATT）並びに性判定用のプライマーであるNNsexicFおよびNNsexicRおよび30ng DNAテンプレートを用いたPCR増幅を行った後、3%アガロースゲル電気泳動により、DNA収量の品質の確認を行った。

## （２）マイクロサイトの多型情報の収集および遺伝的多様性の評価に関する研究

中立多型であるマイクロサテライトについての遺伝子プロファイリングについては、2000年～
2012年に生まれた現存集団188個体（雄97個体、雌91個体）の尿漿膜および血液より、DNeasy Blood & Tissue Kitを用いてゲノムDNA抽出を行った。その188個体の集団は、123個体（雄64個体、雌59個体）の飼育下集団および65個体（雄33個体、雌32個体）の放鳥下集団より構成されていた。これらのDNAを用いて、19個のマイクロサテライトマーカー（9個：トキ由来マーカー、8個：クロツラヘラサギ由来マーカー、1個：ベニヘラサギ由来マーカー、1個：アメリカトキコウ由来マーカー）をPCR増幅した。得られたPCR産物について、ABI3730xl DNA analyzer（Applied Biosystems社）を用いて電気泳動を行い、マーカー型タイピングを行った。GeneScan™-500LIZ™ size standard（Applied Biosystems社）30μlとHi Di Formamide 1mlを混合した溶液10μlに、3つのPCR産物をそれぞれ0.7μl加え、泳動サンプルとして用いた。泳動後、Gene Mapperプログラムにより解析し、マーカー型を判定した。シーケンサーABI3730xl DNA analyzerによるタイピングでは3つのマーカーを同時に解析した。3つのマーカーの組み合わせは、Nn26・PM228・Nn17、Nn25・Nn04・Aaju02、Nn21・Wsu13・PM216、Nn18・Nn12・PM220およびPM313・PM229・PM117という5つの組み合わせであった。残りの4つのマーカーNnNF5・Nn01・PM221・PM237は、4つのPCR産物を0.7μlずつ加える方法により併せて解析した。多型が確認されたマーカーについて、マーカー座間の連鎖不平衡（LD）の状態の解析をGENEPOP version 1.2により行った。多重検定における補正のため、Bonferroni法を用いた。遺伝的多様性に関するパラメータとして、アリル多様度（A）、アリル頻度、ヘテロ接合率の観察値(Ho）および期待値（He）、有効アリル数（n_{e}）、多型情報量（PIC）をEXCEL MICROSATELLITE TOOLKIT version 3.11

(http://animalgenomics.ucd.ie/sdepark/ms-toolkit/)により計算した。また、ハーディー・ワインベルグ平衡（HWE）の検定をGENEPOP version 1.2により行った。検定はマルコフ連鎖モンテカルロアルゴリズムに基づいて行い、パラメーターセットをdememorization:1000、Batches:100、Iteration per batch:1000のように設定した。多重検定での補正を行う上ではBonferroni法を用いた。さらに、個体レベルでの遺伝的類縁関係を推定するために、MICROSATELLITE ANALYZER version 4.05により、共有アリル率に基づく個体間の遺伝距離（Dps）を計算し、PHYLIP version 3.69（http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html）のNEIGHBORプログラムにより樹形図を作成した。作成された樹形図はMEGA6 version6.0のTREE EXPLORERプログラムにより編集を行った。

## （３）MHC領域のゲノム構造の解明、多型情報の収集および遺伝的多様性の評価に関する研究

多型性が高く、抗病性・交配相手の選択に関わる主要組織適合遺伝子複合体（MHCクラスII遺伝子多型）の遺伝子プロファイリングについては、はじめにトキMHCクラスII領域のゲノム構造の解析を実施した。ラムダファージベクターを利用してトキゲノムライブラリーを作製し、MHC-IIB遺伝子のエクソン2を増幅するプライマー（2F_pen1:AACGGCACCGAGCGGGTGAGGTおよびintron2-01R:GGGCTTGGCTTGTGCCCATCC）を用いてPCR法によるスクリーニングを行った。得られた陽性クローンの両端の配列を基に新たなプライマーを合成し、ゲノムウォーキングによりコンティグを作製した。次に、MHCクラスII遺伝子について全塩基配列の決定を行った。トキMHCクラスII領域の多様性については、中国政府から寄贈された始祖5個体(A-E)を対象として、サザンブロット法およびPCR-RFLP法による解析を実施した。これらの解析結果に基づき、各トキ個体のMHCクラスII領域のハプロタイプ型を決定するためのPCR-RFLP法を開発した。
コウノトリ主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII領域のゲノム構造の解析では、1羽の個体(始祖個体B)の血液サンプルよりゲノムDNAを精製し、ラムダファージベクターを使用してゲノムライブラリーを作製した。他の鳥類の配列を基に作製したMHC-IIB遺伝子（IIBexon4-F1：

(TAP1exon7-F1: GCCCAGGGTAGGAGAACCAおよびTAP1exon7-R1: GCCCAGGGTAGGAGAACCA) およびTNXB 遺伝子 (TNXB-S1: GTGCACCTCCACCCGGTACAおよびTNXB-A1: GTGGCCCGTGCCATCCTCTC) を増幅するプライマーを用いて、PCR法によるスクリーニングを行った。各遺伝子を含む陽性クローンの末端配列を基に新たなプライマーを合成し、ゲノムウォーキングによりMHC領域をカバーするコンティグを作製した。コンティグを構成する各ファージクローンについては、制限酵素地図の作製およびプラスミドベクターへのサブクローニングを実施した。さらにサブクローンの両端の塩基配列を決定し、ホモロジー検索により遺伝子の検出およびアノテーションを行い、ゲノム構造を決定した。次に、日本コウノトリ集団に対して寄与の大きな始祖6個体(A-E)を対象として、MHCクラスII領域の多様性についての解析を実施した。

## （４）DRD4のゲノム構造の解明、多型情報の収集、遺伝的多様性の評価および行動形質や生活史形質との関連に関する研究

トキ死亡個体の脳から抽出されたRNAを用いて、RT-PCRを行った後、ダイレクトシーケンスによりcDNA配列を決定した。DRD4の塩基配列は鳥類では、キジ目に属するニワトリおよびスズメ目に属するシジュウカラでのみ明らかにされている。シブリー・アールキストの鳥類分類によると、トキが属するコウノトリ目とキジ目、あるいはコウノトリ目とスズメ目の類縁関係よりもキジ目とスズメ目の類縁関係のほうが遠縁にある。そこで、ニワトリとシジュウカラの間で相同、つまり保存されている配列はトキでも保存されていると予想される。こうして、PCR増幅には、ニワトリとシジュウカラのDRD4のエクソン領域上で保存されている配列に基づき設計されたプライマーを用いた。また、cDNAの5'末端および3'末端の配列は、本研究で得られたcDNA配列から設計されたプライマーを用いたRACE法により決定した。さらに、当該個体の脳から抽出されたゲノムDNAを用いたPCRおよびダイレクトシーケンスによりイントロン2およびイントロン3の配列を決定した。このようなイントロン領域のPCR増幅には、本研究で得られたcDNA配列とニワトリ・シジュウカラのDRD4ゲノム構造に基づき設計されたプライマーを用いた。

トキDRD4のプロモーター領域およびイントロン1領域の配列を決定するにあたり、ニワトリとシジュウカラの保存配列および、これまでの研究で得られたトキDRD4の部分ゲノム配列より、PCRプライマーを設計し、PCR増幅を行った。その後、PCRプライマー、プライマーウォーキングによって得られたプライマーを利用し、ダイレクトシーケンスにより配列を決定した。

シーケンスによって得られたエクソン領域、転写領域、プロモーター領域およびイントロン領域の解析結果に基づき、GENETYX ver.10を用いたアライメントを行った。このアライメントにより、DRD4ゲノム配列および全長cDNA配列が決定された。また、このように決定された全長cDNA配列とシジュウカラ、ニワトリDRD4 cDNA配列との相同性解析をGENETYX ver.10により、またそれらの配列を利用した系統樹解析をCLUSTALおよびPHYLIPにより行った。さらに、GENETYX ver10を用いてニワトリ・トキ・シジュウカラ3種間でのDRD4のプロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域の相同性解析を行い、保存配列領域を決定した（図(4)-1）。
佐渡島トキ集団の始祖個体である、友友、洋洋、美美、華陽、溢水の5個体におけるDRD4の塩基配列を調べることとした。トキDRD4の塩基配列において、ニワトリ、シジュウカラ、トキの3種間で保存されているDRD4配列は進化の過程で重要な役割を持っていることが予測される。そこで、本研究ではこの保存配列に基づきシーケンス解析を行っていくこととした。この保存配列領域に基づきGENETYX10を用いてPCRプライマーを設計し、ダイレクトシーケンスにより配列を決定した。シーケンスにより得られた波型配列データを用いて、Sequencer ver5.0による多型検出を行った（図(4)-1）。さらに、始祖5個体のシーケンスによりえられた多型タイピングデータに加えて、後代個体の多型タイピングを行い、それらのデータと家系図を用いることで、始祖5個体が有するDRD4ハプロタイプを解析した。

図(4)-1 保存配列領域およびシーケンス領域

トキDRD4遺伝子多型と行動形質との関連性を調べるために、極端な定性的表現型データを用いた解析を行った。日本産トキ飼育個体の雌において、極端に警戒心が強い6個体と極端に警戒心が弱い9個体を用いた。これらの極端な警戒心形質の表現型を持つ個体は、ほぼ同時期（2004～2006年）に生まれ、個体の選択は佐渡トキ保護センターで収集された行動学的観察データに基づき行われた。これら個体について、DRD4遺伝子のPCR増幅領域のシーケンスにより得られた波形配列データを用いた、SNP3092、SNP13425、indel14077-14085の3ヶ所の多型タイピングを行った。始祖5個体の保有する4種類のハプロタイプのアルパターンに基づき、得られたシーケンスデータからハプロタイプの決定を行った。極端に警戒心が強い6個体と極端に警戒心が弱い9個体の間において、2群間でのハプロタイプ頻度分布の比較をフィッシャーの直接確率検定とカイニ乗検定により解析することで、警戒心形質とDRD4多型との関連性について検討を行った。

また、トキDRD4遺伝子多型と行動形質との関連性を調べるために、定量的表現型データを用いた解析を行った。日本産トキ放鳥個体の雌において、行動特性である新規開拓性、採餌行動性、分散定着性、生活史形質である生存性についての定量的表現型を決定した。表現型を決定したトキ個体はすべて雌であった。

新規開拓性については、放鳥前の順化ケージでの3ヶ月の訓練期間に、小型のビデオカメラをG池およびA池に複数台設置し、G池およびA池に来訪する個体を調査した。順化ケージ内には、放鳥ゲートから近い順番に、G、A、B1/B2、C、D1/D2、E、F池の9つの池が設置されている。そのうち、A、B1/B2、C池には訓練初期から餌（ドジョウ）を入れ、G池には放鳥直前まで餌を入れないこと
にした。また、訓練中期まで飼育員はC池よりも奥へは立ち入らないようにし、訓練中のトキを放鳥ゲートから遠い順化ケージの奥側で生活させるようにした。こうして、放鳥ゲートに最も近く訓練初期に餌が無いG池、放鳥ゲートに次に近いA池に採餌に訪れる早さ（順化ケージへの搬入からの日数）および利用頻度（確認回数）を調査することにより、新規開拓性の表現型を評価した。

採餌行動性については、放鳥後の個体において、早朝、埼から飛び立つ個体を追跡または生息域を広範囲に探索することで、採餌場所を特定した後、発見した採餌個体について双眼鏡または望遠鏡を用いて採餌行動を観察し、1回の観察につき3分間あたりの飲込み回数を記録した。この採餌行動の観察は、1日あたり各個体につき最大8回に制限した。放鳥後3-4週目の個体について、採餌回数をカウントし、採餌回数が2.5回以下の個体を低採餌、採餌回数が3.5回以上の個体を高採餌として表現型を評価した。

現在、環境省を中心としたモニタリングにより、放鳥個体の生存確認と生息地・繁殖行動に関する情報が継続的に収集されている。このような情報を基に、各個体の放鳥後1年の生存状況と月ごと（放鳥後1ヶ月は半月ごと）の生息場所が集計されている。そこで、分散定着性については、放鳥地点から定着地点までの距離として、国仲平野東部・中央部に定着した個体を短距離分散、国仲平野西部および佐渡島内外に定着した個体を長距離分散として表現型を評価した。

モニタリング情報に基づき、生存性については、放鳥直後から1年の間での生存の有無により表現型を評価した。

表現型を評価した放鳥個体について、DRD4遺伝子のPCR増幅領域のシーケンスにより得られた波形配列データを用いた、SNP3092、SNP13425、indel14077-14085の3ヶ所の多型タイピングを行った。始祖5個体の保有する4種類のハプロタイプのアルパターンに基づき、得られたシーケンスデータからハプロタイプの決定を行った。

DRD4ハプロタイプと採餌行動性、分散定着性、生存性との関連性について、表現型が異なる個体群間におけるハプロタイプ頻度の比較により、フィッシャーの直接確率検定とカイニ乗検定を用いて解析を行った。

## （５）SNPの多型情報の収集および遺伝的多様性の評価に関する研究

日本トキ集団の始祖5個体からゲノムDNAを精製し、制限酵素HaeIIIあるいはMboIで完全消化した後、1.5％アガロースゲル電気泳動により分離し、250-350bpのサイズを持つ制限酵素断片をゲルから精製して、Reduced Representation Library（RRL）を作製した。各始祖個体から作製したRRLは異なるタグ配列を持つシークエンス用アダプターを付加した後、混合し、イルミナ社HiSeq2000次世代シークエンサーの1レーンを使用して、各断片の両端101塩基の配列を決定した。得られた101塩基の配列データに対し、データ処理を実施し、一塩基多型(SNP)候補および1マイクロサテライト(STR)候補の検出を実施した。なお、次世代シークエンシングおよび基礎的なデータ処理は北海度システムサイエンス社に委託して行った。
## 4 ．結果及び考察

## （１）野外サンプルを用いた遺伝子解析手法の確立に関する研究

ふ化後15、20および25日齢でのニワトリヒナの胸部幼羽は棒状羽毛であることが観察され、DNAを抽出できる羽髄をもつことが示唆された。15、20、25日齢時では典型的な棒状羽毛の形状を示しているが、一方、30日齢時では羽が広がっている形状を示しており、棒状羽毛の典型的な形状ではないことも明らかにされた。この結果より、15～25日齢時では有効なDNAサンプリングが行われる可能性が考えられるが、一方、30日齢以降では棒状羽毛ではなくなると考えられ、胸部より羽髄をもつ幼羽が得られにくくなり、高収量のDNAを抽出することが困難になると予想された。図(4)-2より、雄についてのDNA収量は、幼羽1本あたり、15日齢で20.3±1.2μg、20日齢で19.9±1.9μg、25日齢で9.9±1.8μg、30日齢で13.8±5.4μgという結果が得られた。雌についてのDNA収量は、15日齢で15.1±4.2μg、20日齢で23.3±6.4μg、25日齢で16.3±4.6μg、30日齢で10.0±3.5μgという結果が得られた。よって、雌雄いずれにおいても幼羽1本あたり10～20μgの高収量なDNAが抽出されることが示された。さらに散布図を見ても同性で同日齢のヒナの個体間にDNA収量についての大きなバラツキは観察されなかった。以上の結果より、ふ化後15、20、25および30日齢でのニワトリヒナの胸部幼羽を実験試料とした場合のDNAの収量に問題がないことが示された。詳細にみると、DNA収量は雌雄ともに20日齢が最も多く、25日齢、30日齢では減少する傾向がみられることから、ニワトリヒナにおいて胸部の幼羽から高収量のDNAを得るのに最も適している日齢は、ふ化後～20日齢であることが推測された。雌雄ともに15、20、25、30日齢の胸部幼羽に由来するDNAのいずれにおいても期待長の明瞭なバンドが検出された。このことから、ニワトリヒナの胸部の幼羽～3本に対して本サンプリング法を適用した場合、1000回以上のPCR反応に利用できる高品質DNAが得られることが示され、DNAの品質に問題がないことが証明された。以上の予備的検討の結果から、本サンプリング法においてニワトリヒナの胸部の幼羽から高収量の高品質DNAが得られることが示された。この結果より、実際にトキヒナにおいても同様の手法により高収量かつ高品質なDNAが得られるのではないかと予測することができた。10～22か月齢でのトキ成鳥の胸羽をみると、明確に筆毛様の棒状羽毛の形状を呈しておらず羽髄をもたないと考えられた。一方、15～21日齢時のトキヒナの胸部の幼羽および15～27日齢時の背部の幼羽では典型的な棒状羽毛の形状を示しており、羽髄をもつと考えられた。よって、ヒナに比べると成鳥では羽髄の量が少なくなってしまい、胸部あるいは背部の幼羽においては充分なDNA収量が得られるが、胸羽からは充分なDNA収量が得られないと予想された。図(4)-3より、胸羽1本あたりのDNA収量をみると雄では0.4±0.2μg、雌では0.2±0.0μgという結果が得られた。一方、胸部の幼羽1本あたりのDNA収量をみると雄では9.6±2.2μgとなり、これまでのニワトリヒナを用いた雌雄での結果より、雌でも同じくらいの収量が得られると考えられた。背部の幼羽1本あたりのDNA収量をみると雄では9.73±3.30μg、雌では10.7±1.24μgという結果が得られた。また散布図をみても同性で同齢のトキヒナの個体間にDNA収量についての大きなバラツキは観察されなかった。ここで注目すべき点として、トキヒナの胸部あるいは背部の幼羽はニワトリヒナの幼羽で得られた結果と同様な高収量のDNAが抽出されるが、一方、トキ成鳥の胸羽ではニワトリやトキのヒナの幼羽に比べ、顕著に低いDNA収量しか得られないということが示された。胸羽ならびに胸部および背部の幼羽に由来するDNAのいずれにおいても期待長の明瞭なバンドが検出された。よって、トキヒナの胸部あるいは背部の羽髄をもつ幼羽を～3本用いた場合、本サンプリング法により1000回以上のPCR反応に利用できる高品質DNAが得られることが示さ
れ、本サンプリング法はDNA品質の点でも、野生下で生まれたトキの遺伝的多様性のモニタリングに利用できることが明らかになった。これらの結果を総合的に考え合わせると、ふ化後～20日齢のヒナの2～5本の胸部あるいは背部の羽髄をもつ幼羽を用いてDNA抽出を行うというサンプリング法は1本あたり10μg（1000回以上のPCRに利用可能）という高収量かつ充分なDNA長のPCR増幅が可能な高品質のDNAが得られることから、野性下で生まれたトキの遺伝的多様性のモニタリングに利用できる有効なものであることが明らかにされた。

図(4)-2 ふ化後15、20、25および30日齢でのニワトリヒナの胸部の幼羽（1本）からのDNA収量

図(4)-3 胸羽ならびに胸部および背部の幼羽（1本）からのDNA収量
## （２）マイクロサイトの多型情報の収集および遺伝的多様性の評価に関する研究

後代188個体からなる全集団について解析を行ったところ(表(4)-1)、Aは始祖5個体にも関わらず全集団の最大値は3であった。また、始祖5個体と後代188個体からなる全集団におけるAは同値（始祖個体におけるすべてのマーカーの平均：2.16、全集団におけるすべてのマーカーの平均：2.16）を示し、始祖個体で検出されるアリルのすべてが後代に伝達されていることが判明した。全集団におけるne、HE、HoおよびPICの平均はそれぞれ1.704、0.367、0.471および0.302であった。ne、HE、HoおよびPICは3つのアリルを持つNn01、Nn12およびPM221で高い値を示した。一方、Nn17およびPM237ではそれぞれ2007年に導入された華陽および溢水が持つ1コピーの希少アリルのためne、HE、HoおよびPICは低い値を示した。A、ne、HE、HoおよびPICはbottle neckを受けた動物と同様なレベルの低値を示したことから遺伝的多様性は低いと考えられた。ハーディー・ワインベルグ平衡の検定にて5%水準で有意を示した平均を含めた7個のケースのうち6個でHeよりHoが高い値を示した。つまりheterozygote excessの状態であることが観察された。残りの1個のケースであるPM2-20はクロツラヘラサギにおいてZ染色体上にのみ存在し、W染色体上に存在しないことが報告されている。実際に、トキにおいても雌では必ずホモ接合体であるとタイピングされた。

表(4)-1 後代188個体からなる全集団における遺伝的多様性に関するパラメーター

マーカー名	始祖個体	A	後代全集団
遗伝子型	n	アリル頻度	A	ne	He	Ho	PIC	HWE
友	洋	美	華	溢	水	1	2	3
Nn01	12	12	13	12	11	3	186	0.664	0.231	0.105	3	1.979	0.496	0.532	0.437	※
Nn04	22	12	12	12	12	2	168	0.452	0.548	0.000	2	1.982	0.497	0.512	0.373
Nn12	23	13	23	12	13	3	172	0.297	0.328	0.375	3	2.972	0.666	0.802	0.590	※
Nn17	22	22	22	22	12	2	187	0.011	0.989	0.000	2	1.022	0.021	0.021	0.021
Nn18	12	22	12	22	12	2	180	0.169	0.831	0.000	2	1.392	0.282	0.283	0.242
Nn21	11	12	12	22	12	2	163	0.525	0.475	0.000	2	1.995	0.500	0.571	0.374
Nn25	12	12	22	22	12	2	176	0.378	0.622	0.000	2	1.887	0.472	0.506	0.360
Nn26	12	11	12	12	12	2	184	0.682	0.318	0.000	2	1.766	0.435	0.516	0.340	※
NnNF5	22	12	12	22	12	2	187	0.233	0.767	0.000	2	1.555	0.358	0.465	0.293	※(※)
PM117	12	11	12	12	12	2	175	0.703	0.297	0.000	2	1.717	0.419	0.446	0.331
PM216	12	11	11	22	22	2	160	0.800	0.200	0.000	2	1.471	0.321	0.325	0.269
PM220	12	11	11	12	11	2	162	0.830	0.170	0.000	2	1.393	0.283	0.191	0.242	※(※)
PM221	12	13	11	12	13	3	165	0.476	0.185	0.339	3	2.662	0.626	0.636	0.549	※(※)
PM228	12	11	12	12	12	2	179	0.757	0.243	0.000	2	1.582	0.369	0.374	0.300
PM229	22	12	12	22	22	2	144	0.406	0.594	0.000	2	1.932	0.484	0.549	0.366
PM237	22	22	22	12	22	2	184	0.008	0.992	0.000	2	1.017	0.016	0.016	0.016
PM313	22	12	22	22	22	2	188	0.114	0.886	0.000	2	1.254	0.203	0.228	0.182
Aaju02	12	22	12	22	12	2	184	0.255	0.745	0.000	2	1.614	0.381	0.402	0.308
Wsu13	11	11	12	12	11	2	117	0.919	0.081	0.000	2	1.175	0.15	0.162	0.138
平均	2.16	2.16	1.704	0.367	0.471	0.302	※(※)

A：アリル多様度、ne：有効アリル数、He：ヘテロ接合率の期待値、Ho：ヘテロ接合率の観察値、PIC：多型情報量、HWE：ハーディー・ワインベルグ平衡検定、始祖個体の遺伝子型における数値(1、2あるいは3)はア

リルを示す。HWEにて5%水準で有意なものは※、Bonferroni補正後でも有意なものは※(※)で示す

こうしてこのマーカーでheterozygote deficiencyが確認されたが、この点については、このマーカーがトキにおいてもZ染色体上にのみ存在し、雌では必ずへミ接合体になってしまうことに起因すると考えられた。平均を含めた6個のケースでHoがHeより高くなったことから佐渡島トキ集団はbottle neckを受けた集団であるかもしれない。一方、始祖5個体のアルルがすべて後代個体に伝達していること、平均を含めた6個のケースでheterozygote excessの状態を示したということは遺伝的多様性を維持していくための計画交配がうまくいっていることを反映していると考えられた。次に現存個体を飼育下集団、放鳥下集団に分け同様の解析を行った。123個体からなる飼育下集団におけるAは、始祖5個体のAと同値を示し、始祖個体で検出されるアリルのすべてが後代に伝
達されていることが判明した。また、飼育下集団は全集団と似たような傾向の遺伝的多様性に関するパラメーターの値を示した。放鳥下集団は、始祖5個体のAよりも低値を示した(始祖個体におけるすべてのマーカーでの平均:2.16、放鳥下集団におけるすべてのマーカーでの平均:2.05)。これはNn17、PM2-37のマーカーにおいて始祖個体のAはそれぞれ2であるのに対し、放鳥下集団ではそれぞれ1となっていることに起因していた。つまり、2007年に導入された華陽、溢水が保有していた1コピーのアリルが伝達されていないことを示している。また、Nn17およびPM2-37のマーカーを除く17個のマーカーについてハーディー・ワインベルグ平衡の検定を行ったところ放鳥下集団ではNn01、NnNF5、PM2-20ならびにすべてのマーカーでの平均が5%水準有意であり、そのうちすべてのマーカーでの平均はBonferroni補正後でも有意であった。しかし、heterozygote excessの状態にあるのはすべてのマーカーでの平均を含め3ケースだけであり、全集団や飼育下集団と比較してもケースは少なかった。これらのことから、遺伝的多様性を維持するための放鳥個体の選定が今後必要であると考えられた。トキ由来の17個のマーカー(本研究で用いたNn01、Nn04、Nn12、Nn17、Nn18、Nn21、Nn25、Nn26およびNnNF5マーカーに加えてNn03、NnAF4、NnBF7、NnCE11、NnCG3、NnDD9、NnEB12およびNnHB12マーカーを用いた)に関しては、文献情報から中国トキ集団における遺伝的多様性に関するパラメーターが得られ、42個の対立遺伝子が検出されている。そこで、解析した佐渡島トキ集団と中国トキ集団の間で遺伝的多様性に関するパラメーター値の比較を行った(表(4)-2)。

表(4)-2 佐渡島トキ集团と中国トキ集团の遺伝的多様性に関するパラメーターの比較

マーカー名	佐渡集团	中国集团
A	Ne	He	Ha	A	Ne	He	Ha
Nn01	3	1.978	0.496	0.532	5	3.356	0.702	0.704
Nn03	1	1.000	0.000	0.000	2	1.443	0.307	0.222
Nn04	2	1.982	0.497	0.512	2	1.592	0.409	0.333
Nn12	3	2.972	0.566	0.802	3	3.012	0.568	0.370
Nn17	2	1.022	0.021	0.021	2	1.905	0.475	0.444
Nn18	2	1.392	0.282	0.283	2	2.028	0.507	0.778
Nn21	2	1.995	0.500	0.571	2	1.938	0.484	0.630
Nn25	2	1.887	0.472	0.506	4	3.333	0.700	0.926
Nn26	2	1.766	0.435	0.516	2	1.298	0.230	0.259
NnAF4	1	1.000	0.000	0.000	2	1.010	0.010	0.010
NnBF7	1	1.000	0.000	0.000	3	1.019	0.019	0.019
NnCE11	1	1.000	0.000	0.000	2	2.008	0.502	0.980
NnCG3	1	1.000	0.000	0.000	2	1.019	0.019	0.000
NnDD9	1	1.000	0.000	0.000	2	1.019	0.019	0.000
NnEB12	1	1.000	0.000	0.000	2	1.010	0.010	0.010
NnHB12	1	1.000	0.000	0.000	2	1.019	0.019	0.000
NnNF5	2	1.555	0.358	0.485	3	1.590	0.371	0.463
平均	1.547	1.444	0.219	0.248	2.471	1.747	0.321	0.362

A：アリル多様度、ne：有効アリル数、He：ヘテロ接合率の期待値、Ho：ヘテロ接合率の観察値

佐渡島トキ集团では8個のマーカーで単型であり、合計で28個のみの対立遺伝子が見つかった。佐渡島集団では平均のAは中国集団と比べて低くなっていた。平均のne、HE、Hoはそれぞれ中国集団と比較して、佐渡島集団で低い値を示した。Nn04、Nn21、Nn26の3ケースでのみne、HE、Hoは中国集団と比べて佐渡島集団で高い値を示したが、それ以外のたいていのケースにおいて低い値を示した。この結果から佐渡島トキ集団において遺伝的多様性のレベルは低く、ボトルネックより生じた結果と考えられた。トキDNAにおいてPCR増幅が確認された66個のマーカー（本研究でもちいた19個のマーカーに加えてNn03、NnAF4、NnBF7、NnCG3、NnLF11、NnDD9、NnEB12、NnHB10、NnEA9、NnAD10、NnEH10、NnGF4、Wsu03、Wsu09、Wsu17、Wsu19、Wsu23、Wsu24、Eru02、Eru03、Eru04、