Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## 第 7 事例

## 1 覚醒剤及び大麻に関する事例

## ○ 密壳事犯

## 【1－1】住吉会傘下組織組員による組織的覚醒剤密売事件（3月、岡山・島根県警察等）

広域的に宅配便を利用して覚醒剤を密売していた住吉会傘下組員（43）ほか28人を覚せい剤取締法違反（営利目的譲渡）等で逮捕するとともに、覚醒剤約0.2キログラムを押収した。

## 【1－2】工藤會傘下組織幹部らによる組織的覚醒剤密売事件（7月、福岡・広島県警察等）

覚醒剤を密売していた工藤會傘下組織幹部（32）ほか10人を覚せい剤取締法違反（営利目的譲渡）等で逮捕するとともに、覚醒剤約1キログラムを押収した。

## ○ 密輸入事犯

## 【1－3】中国人らグループによる覚醒剤密輸入事件（4月、警視庁）

メキシコから香港を経由し、製粉機のローラー内に覚醒剤を隠匿して、船舶コンテナで密輸入した中国人（55）ほか9人を覚せい剤取締法違反（営利目的共同所持）等で逮捕するとともに、覚醒剤約240キログラムを押収した。

## 【1－4】ナイジェリア人を首魁とする組織的覚醒剤密輸入事件（6月、愛知県警察・警視庁）

ナイジェリア人の男（52）ほか2人は、コーヒー豆の袋の中に隠匿した覚醒剤約2キログラムを、情を知らない日本人旅行客を利用して密輸入したことから、覚せい剤取締法違反（営利目的輸入）等で逮捕するとともに、覚醒剤約4キログラムを押収した。

## 【1－5】メキシコ人らグループによる覚醒剤密輸入事件（6月、兵庫県警察）

メキシコから鉄鉱石と称する模造石内に覚醒剤を隠匿して、船舶コンテナで密輸入したメキシコ人（36）ほか2人を覚せい剤取締法違反（営利目的輸入）で逮捕するとともに、覚醒剤約194キログラムを押収した。

## 【1－6】糸巻きの芯内に隠匿したインド来覚醒剤密輸入事件（7月、千葉県警察）

インドから航空機に搭乗し、手荷物品の糸巻きの芯内に覚醒剤を隠匿して密輸入したニュージランド人の男（61）を、覚せい剤取締法違反（営利目的輸入）で逮捕するとともに、覚醒剤約9キログラムを押収した。
## 【1－7】 スーツケース内に隠匿したシンガポール来覚醒剤密輸入事件（8月、千葉県警察）

シンガポールから航空機に搭乗し、スーツケースの側面等に覚醒剤を隠匿して密輸入した同国人の女（39）を、覚せい剤取締法違反（営利目的輸入）で逮捕するとともに、覚醒剤約2キログラムを押収した。

## 【1－8】 国際小包郵便を利用した米国来大麻密輸入事件（12月、神奈川県警察）

米国から国際小包郵便を利用し、液体状の大麻を自転車部品内に隠匿して密輸入した日本人の男（40）を大麻取締法違反（営利目的所持）等で逮捕するとともに、大麻約0.4キログラム及び覚醒剤約7グラムを押収した。

## 【1－9】身体に巻きつけるなどして隠匿した香港来覚醒剤密輸入事件（12月、福岡県警察）

香港から航空機に搭乗し、身体に巻きつけるなどして覚醒剤を隠匿して密輸入した台湾人の男（51）ほか4人を覚せい剤取締法違反（営利目的輸入）等で逮捕するとともに、覚醒剤約1キログラム等を押収した。

## ○ 栽培事犯

## 【1－10】ベトナム人による組織的大麻大量栽培事件（4月、埼玉・群馬県警察）

営利目的で組織的に大量の大麻草を栽培していたベトナム人組織を特定し、同国人の首魁（35）ほか15人を大麻取締法違反（営利目的栽培）等で逮捕するとともに、大麻草約2,800本及び乾燥大麻約69キログラムを押収した。
## 2 「脱法ドラッグ」に関する事例

## ☐ 指定薬物に係る薬事法違反

## 【2－1】「脱法ドラッグ」店経営者等による薬事法違反事件（7月、岐阜県警察）

県内所在の「脱法ドラッグ」店3店舗から押収した商品に指定薬物の成分が含まれていたため、同店経営者の男性（38）や従業員の合計5人を薬事法違反（指定薬物の販売目的貯蔵等）等で逮捕した。

## 【2－2】「脱法ドラッグ」店経営者等による薬事法違反事件（10月、宮崎県警察）

県薬務担当課において県内所在の「脱法ドラッグ」店から入手した商品に指定薬物の成分が含まれていたため、同店経営者の男性（32）及び従業員の合計2人を薬事法違反（指定薬物の販売）で逮捕した。

## 【2－3】指定薬物密輸入に係る薬事法違反事件（10月、大阪府警察）

航空便輸入のD V Dケースに隠匿された粉末や錠剤を発見し、これに指定薬物の成分が含まれていたため、名宛人の男性（44）を薬事法違反（指定薬物の販売目的輸入）等で逮捕した。

## ☐ 麻向法違反

## 【2－4】 ハーブ密輸入に係る麻向法違反事件（6月、山形県警察）

インターネットの「脱法ドラッグ」販売サイトを通じて注文し、航空便で輸入されたハーブに麻薬等の成分が含まれていたため、名宛人の男性（53）を麻向法違反（麻薬の密輸入）等で逮捕、このほか同人からこれらの成分を含むハーブを譲り受けるなどしていた者等合計6人を逮捕した。

## 【2－5】 乱用者による麻向法違反事件（9月、茨城県警察）

危険な運転車両との110番通報により出動した警察官が、当該車両の運転者である男性（48）を職務質問した際、支離滅裂な言動であり採尿したところ、麻薬の成分が含まれていたため、同人を麻向法違反（麻薬の施用）で逮捕した。

## 【2－6】「脱法ドラッグ」製造、卸し業者による麻向法違反事件（11月、警視庁）

別件の「脱法ドラッグ」店における麻向法違反（麻薬の営利目的所持）事件から、同店に対して麻薬成分を含む「脱法ドラッグ」を譲り渡していた事実や「脱法ドラッグ」と称して麻薬成分を含む商品を製造していた事実で会社代表者の男性（41）や従業員の合計4人を麻向法違反（麻薬の営利譲渡及び製剤）で逮捕した。
## ☐ 危險運転致傷罪等交通関係法令違反

## 【2－7】 ハーブ吸引に係る道路交通法違反事件（7月、愛知県警察）

運転開始前に吸引したハーブの影響により、前方信号機に従い停止中の車両に自車両を衝突させた男性（28）を道路交通法違反（過労運転等の禁止）で逮捕した。

## 【2－8】 ハーブ吸引に係る危険運転致傷事件（10月、静岡県警察）

運転中に吸引したハーブの影響により、意識に変調を来して反対車線に進出、対向車両2台に衝突させて同車両の乗員等に軽傷を負わせた男性（26）と同人に車両を貸与の上、同乗し、一緒にハーブを吸引していた男性（25）をそれぞれ危険運転致傷と同幫助で逮捕した。

## ○ その他

## 【2－9】「脱法ドラッグ」服用に係る保護責任者遺棄致死事件（10月、大阪府警察）

ホテルに入室した男性（40）が一緒に居た女性に「脱法ドラッグ」を服用させたところ嘔吐等を繰り返していたが、男性はそのまま退出したもので、その後、女性が死亡したため、男性を保護責任者遺棄致死で逮捕した。

※ 事例中のハーブとは、「脱法ドラッグ」の成分が吹き付けられるなどした植物片をいう。
第 2 章 銃器情勢

平成25年の銃器情勢の特徴としては、

1 銃器発砲事件数は、暴力団等によるとみられるものも含めて、減少基調にはあるが、前年比では増加した。

2 銃器使用事件の認知件数は減少基調にあり、特に強盗事件が前年比で大幅に減少したことで、全体の認知件数が大きく減少した。

3 拳銃の押収丁数は減少基調にある中、前年比で大幅に増加したものの、暴力団からの押収は過去最少となった。

4 拳銃及び拳銃部品に係る銃刀法違反事件の検挙人員は、近年横ばい傾向にあるが、前年比で減少した。

## 等が挙げられる。

平成25年末には、相次いで一般市民が犠牲となる銃器発砲事件が発生するなど、依然として同事件が、平穏な市民生活に対する現実の脅威となっているほか、特に拳銃の押収について暴力団等による組織防衛や隠匿の巧妙化・分散化等潜在化傾向を強めており、非常に厳しい状況が続いている。

これを踏まえ、警察においては、引き続き銃器発砲事件等に対する捜査を推進するとともに、拳銃110番報奨制度等の活用を含めた拳銃情報の収集を強化するほか、様々な捜査手法を駆使して拳銃の摘発を強力に推進する。

## 第 1 銃器犯罪情勢

## 1 銃器発砲事件

## (1) 発生状況

☐ 銃器発砲事件※1の発生件数は、40件（前年比+12件）と増加した。また、死傷者数は8人（-8人）であり、そのうち死者数は6人（+2人）、負傷者数は2人（-10人）であった。

☐ 暴力団等によるとみられる銃器発砲事件は 35 件（+10 件）と増加し、暴力団構成員等の死傷者数は 3 人（-7 人）と減少した。

☐ 銃器発砲事件数は、山梨県下における対立抗争を中心に増加したほか、12月には、京都府及び福岡県において一般市民を対象とした拳銃使用の殺人事件が相次いで発生しており、繁華街、住宅街等市民の身近な場所において発生するこれら
の事件は、依然として社会の大きな脅威であり、予断を許さない状況にある。

図表 2－1 銃器発砲事件及び死傷者の推移

※1：「銃器発砲事件」とは、銃砲を使用して金属性弾丸を発射することにより、人の死傷、物の損壊等の被害が発生したもの及びそのおそれがあったものをいう（過失及び自殺を除く）。

年別
区分	平16	平17	平18	平19	平20	平21	平22	平23	平24	平25
発砲事件数	104	76	53	65	42	34	35	45	28	40
うち暴力団等	85	51	36	41	32	22	17	33	25	35
構成比率(%)	81.7	67.1	67.9	63.1	76.2	64.7	48.6	73.3	89.3	87.5
うちその他・不明	19	25	17	24	10	12	18	12	3	5
死傷者数	38	22	19	39	19	20	17	18	16	8
死者数	17	10	2	21	10	7	11	8	4	6
うち暴力団構成員等	12	6	1	11	8	4	3	2	3	1
構成比率(%)	70.6	60.0	50.0	52.4	80.0	57.1	27.3	25.0	75.0	16.7
負傷者数	21	12	17	18	9	13	6	10	12	2
うち暴力団構成員等	9	3	7	5	4	5	3	5	7	2
構成比率(%)	42.9	25.0	41.2	27.8	44.4	38.5	50.0	50.0	58.3	100.0

注：「暴力団等」の欄は、暴力団等によるとみられる銃器発砲事件数を示し、暴力団構成員等による銃器発砲事件数及び暴力団の関与がうかがわれる銃器発砲事件数を含む。
## (2) 銃種別の発生状況

銃器発砲事件（40件）のうち、拳銃が使用されたのは39件と、そのほとんどを占めており、残り1件は、猟銃等（散弾銃）が使用された。

表2-1 銃器発砲事件の銃種別内訳

年別区分	平21	平22	平23	平24	平25
発砲件数	34	35	45	28	40
拳銃	33	31	40	27	39
猟銃等	1	4	5	1	1
小銃等	0	0	0	0	0
その他・不明	0	0	0	0	0

注1：「猟銃等」とは、散弾銃、ライフル銃、空気銃及び準空気銃をいう。

注2：「小銃等」とは、小銃、機関銃及び砲をいう。

## 2 銃器使用事件

## (1) 銃器使用事件の認知状況

銃器使用事件の認知件数※2は減少傾向で推移しており、平成25年も127件（前年比－26件、－17.0%）と減少した。

罪種別では、殺人は13件（-4件）、強盜は16件（-28件）、その他は98件（+6件、+6.5%）であった。

表2–2 銃器使用事件の認知件数

年別区分	平21	平22	平23	平24	平25
銃器及び銃器様のもの	253	205	180	153	127
拳銃及び拳銃様のもの	162	126	100	91	73
殺人	銃器	14	19	19	17	13
拳銃及び拳銃様のもの	12	16	17	15	11
強盜	銃器	100	60	44	44	16
拳銃及び拳銃様のもの	95	57	37	40	14
その他	銃器	139	126	117	92	98
拳銃及び拳銃様のもの	55	53	46	36	48

注：殺人及び強盗には、未遂及び予備を含む。

※2：「銃器使用事件」とは、犯罪供用物として銃砲及び銃砲様のものを使用した事件をいう。

## (2) 銃器使用事件の検挙状況

銃器使用事件の検挙件数は、102件（前年比－19件、－15.7%）と減少し、そのうち暴力団構成員等の検挙件数は、33件（+9件）であった。

罪種別では、殺人が12件（+9件）、強盜が18件（-13件）、その他は72件（-15件）であった。そのうち暴力団構成員等の検挙件数では、殺人は10件（+7件）、強盜が6件（+2件）、その他が17件（±0件）であった。
表2-3 銃器使用事件の検挙件数

年別	平21	平22	平23	平24	平25
区分
検挙件数	178	152	112	121	102
64	33	31	24	33
検挙率(%)	70.4	74.1	62.2	79.1	80.3
殺人	検挙件数	16	11	7	3	12
暴力団構成員等	14	7	5	3	10
強盜	検挙件数	66	35	29	31	18
暴力団構成員等	21	12	8	4	6
その他	検挙件数	96	106	76	87	72
暴力団構成員等	29	14	18	17	17

## 第 2 銃器事犯取締状況

## 1 拳銃等の押収状況

## (1) 拳銃の押収状況

☐ 拳銃の押収丁数は、暴力団からの押収を含めて、長期的には減少傾向にあり、平成25年は471丁（前年比+98丁、+26.3%）と増加し、そのうち真正拳銃は332丁（うち密造拳銃13丁（+23丁、+7.4%）、改造拳銃は139丁（+75丁、+117.2%）であった。

☐ 暴力団から押収した拳銃は74丁（－21丁、－22.1%）と減少し、組織別でみると、山口組が37丁（構成比率50.0%）、稲川会が9丁（12.2%）、住吉会が11丁（14.9%）、その他が17丁（23.0%）であった。

☐ 暴力団以外から押収した拳銃 397 丁のうち、真正拳銃は 263 丁であり、そのうち旧軍用拳銃が 172 丁（65.4%）であった。

図表2－2 拳銃の押収状況の推移
年別区分	平16	平17	平18	平19	平20	平21	平22	平23	平24	平25
押収丁數	601	489	458	548	492	407	397	426	373	471
暴力団	309	243	204	231	166	148	98	123	95	74
構成比率(%)	51.4	49.7	44.5	42.2	33.7	36.4	24.7	28.9	25.5	15.7
(組織別)	山口組	142	121	103	83	84	69	45	55	37
同上比率(%)	46.0	49.8	50.5	35.9	50.6	46.6	45.9	44.7	50.0
稲川会	33	24	45	25	22	13	13	17	9
同上比率(%)	10.7	9.9	22.1	10.8	13.3	8.8	13.3	13.8	4.2
住吉会	47	17	24	24	23	29	19	13	14
同上比率(%)	15.2	7.0	11.8	10.4	13.9	19.6	19.4	10.6	14.7
その他	87	81	32	99	37	37	21	38	19
同上比率(%)	28.2	33.3	15.7	42.9	22.3	25.0	21.4	30.9	20.0
その他・不明	292	246	254	317	326	259	299	303	278	397
構成比率(%)	48.6	50.3	55.5	57.8	66.3	63.6	75.3	71.1	74.5	84.3

注：押収丁数に係る「暴力団」の欄は、暴力団からの拳銃押収丁数を示し、暴力団の管理と認められる拳銃の押収をいう。

## (2) 拳銃の真正・改造別、名称別の押収状況

押収した真正拳銃332丁を製造国別でみると、最も多いのがアメリカ製の109丁（構成比率32.8%）で、次いで日本製が72丁(21.7%)、ベルギー製が32丁(9.6%)、ドイツ製が22丁（6.6%）、ロシア（旧ソ連を含む）製が9丁（2.7%）、フィリピン製及びブラジル製が各8丁（2.4%）であった。

表2-4 押収拳銃の真正・改造別内訳

年別区分	平21	平22	平23	平24	平25
押収丁数	407	397	426	373	471
(製造国別)	真正拳銃	379	356	375	309	332
構成比率(%)	93.1	89.7	88.0	82.8	70.5
アメリカ	104	90	134	116	109
中国	23	19	21	9	6
フィリピン	13	12	13	6	8
ロシア(旧ソ連)	14	20	14	12	9
ブラジル	16	13	9	10	8
ベルギー	32	34	32	29	32
イタリア	7	5	2	10	5
ドイツ	22	15	13	9	22
スペイン	10	16	12	6	7
日本	71	77	81	72	72
その他	4	4	10	5	7
不明	63	51	34	25	47
改造拳銃	28	41	51	64	139
構成比率(%)	6.9	10.3	12.0	17.2	29.5

注1：「真正拳銃」とは、拳銃機能（金属性弾丸を発射する機能）を有する目的で製造されたものをいう。

注2：「改造拳銃」とは、模擬銃器や玩具の拳銃等に加工を施すことによって拳銃にしたものをいう。

また、名称別にみると、最も多いのはＳ＆Ｗが28丁（8.4%）、次いでブローニングが25丁（7.5%）、トカレフ型が11丁（3.3%）等であった。
表2-5 押収した真正拳銃の名称別内訳

区分	年別	平21	平22	平23	平24	平25
真正拳銃の押収丁数	379	356	375	309	332
トカレフ型	主に中国製	19	20	29	9	11
S&W	主にアメリカ製	30	27	41	39	28
パルティック	フィリピン製	4	11	8	4	9
ブローニング	ベルギー製	25	32	22	20	25
マカロフ型	主にロシア製	13	19	9	12	8
ロッシ	ブラジル製	5	8	1	5	3
その他	283	239	265	220	248

## (3) 自首減免の対象となった拳銃の押収状況

押収した拳銃471丁のうち、自首減免の対象となったものは21丁(前年比－7丁)であり、全体の4.5%であった。そのうち暴力団提出に係るものは12丁（－5丁）であった。

表2-6 自首減免対象となった拳銃の押収状況

年別区分	平21	平22	平23	平24	平25
押収丁數	407	397	426	373	471
自首	45	35	17	28	21
構成比率(%)	11.1	8.8	4.0	7.5	4.5
暴力団	30	26	9	17
構成比率(%)	66.7	74.3	52.9	60.7

## (4) 小銃等の押収状況

小銃等（小銃、機関銃及び砲）の押収丁数は4丁（前年比－8丁）であった。

表2-7 小銃等の押収状況

年別区分	平21	平22	平23	平24	平25
押収丁數	17	26	12	12	4
暴力団	0	0	3	1	0
構成比率(%)	0.0	0.0	25.0	8.3	0.0

## (5) インターネット関連の拳銃押収状況

インターネットのオークションサイトや掲示板等を端緒として押収した拳銃の押収丁数は132丁（前年比+69丁、+109.5%）であった。

表2-8 インターネット関連の拳銃押収状況

年別区分	平21	平22	平23	平24	平25
押収丁數	12	32	24	63	132
暴力団	0	1	0	0	1
構成比率(%)	0.0	3.1	0.0	0.0	0.8
## (6) 拳銃 110 番報奨制度による拳銃の押収状況

「拳銃110番報奨制度」の架電数は2,662件であり、本通報を端緒とする拳銃の押収丁数は1丁、報奨金額の支払いはなかった。

## 2 拳銃及び拳銃部品に係る銃刀法違反事件の検挙状況

検挙した銃刀法違反事件のうち、拳銃及び拳銃部品に係る検挙件数は175件（前年比＋18件、＋11.5%）、検挙人員は146人（－14人、－8.8%）であった。そのうち、暴力団構成員等が関与する事件の検挙件数は82件（+14件）、検挙人員は66人（－5人）であった。

暴力団構成員等の検挙人員を組織別内訳でみると、山口組が35人（一5人）（構成比率53.0%）、稲川会が5人（一1人）（7.6%）、住吉会が9人（一1人）（13.6%）であり、これらで全体の74.2%を占めている。

表2-9 拳銃及び拳銃部品に係る銃刀法違反事件の検挙状況

年別区分	平21	平22	平23	平24	平25
檢举件数	215	178	164	157	175
暴力団構成員等	129	85	94	68	82
構成比率(%)	60.0	47.8	57.3	43.3	46.9
檢举人員	209	158	160	160	146
暴力団構成員等	130	77	99	71	66
構成比率(%)	62.2	48.7	61.9	44.4	45.2

年別区分	平21	平22	平23	平24	平25
検挙件数	129	85	94	68	82
山口組	55	42	45	37	41
構成比率(%)	42.6	49.4	47.9	54.4	50.0
稲川会	11	10	10	5	7
構成比率(%)	8.5	11.8	10.6	7.4	8.5
住吉会	35	16	13	12	14
構成比率(%)	27.1	18.8	13.8	17.6	17.1
その他	28	17	26	14	20
構成比率(%)	21.7	20.0	27.7	20.6	24.4
検挙人員	130	77	99	71	66
山口組	54	41	51	40	35
構成比率(%)	41.5	53.2	51.5	56.3	53.0
稲川会	16	7	9	6	5
構成比率(%)	12.3	9.1	9.1	8.5	7.6
住吉会	37	9	14	10	9
構成比率(%)	28.5	11.7	14.1	14.1	13.6
その他	23	20	25	15	17
構成比率(%)	17.7	26.0	25.3	21.1	25.8
## 3 密輸入事件の摘発状況

拳銃及び拳銃部品等の密輸入事件の摘発状況は、4件（前年比－1件）、5人（－1人）であった。

表2-10 拳銃等密輸入事件の摘発状況

年別
区分	平21	平22	平23	平24	平25
檢举件數	4	4	0	5	4
暴力団構成員等	0	0	0	0	0
構成比率(%)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
拳銃密輸入事件	1	1	0	1	1
構成比率(%)	25.0	25.0	0.0	20.0	25.0
檢举人員	4	4	0	6	5
暴力団構成員等	0	0	0	0	0
構成比率(%)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
拳銃密輸入事件	1	1	0	1	2
構成比率(%)	25.0	25.0	0.0	16.7	40.0
拳銃押収丁數	1	0	0	1	1
暴力団	0	0	0	0	0
構成比率(%)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0

注：検挙件数及び検挙人員には、挙銃密輸入事件（予備を含む。）のほか、挙銃部品及び実包のみの密輸入事件を含む。
## 第 3 参考资料

銃器発砲事件数及び拳銃押収丁数の推移(平成6～25年)

年次
区分	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25
銃器発砲事件数	249	168	128	148	154	162	134	215	158	139	104	76	53	65	42	34	35	45	28	40
拳銃押収丁数	1,747	1,880	1,549	1,225	1,104	1,001	903	922	747	785	601	489	458	548	492	407	397	426	373	471
うち暴力団からの拳銃押収丁数	1,242	1,396	1,035	761	576	580	564	591	327	334	309	243	204	231	166	148	98	123	95	74
## 第 4 事例

## ○ 発砲事件

## 【3－1】温泉ホテルにおける拳銃使用の殺人事件（1月、北海道警察）

温泉ホテル内において、飯島会傘下組織幹部が、同会との間でトラブルのあった男性の顔面を拳銃で撃って殺害した事件で、逃走した同人（48）を銃刀法違反で逮捕の上、所持していた拳銃1丁を押収した。更に、同会幹部（65）ほか5人を殺人等で逮捕した。

## 【3－2】 山梨県内における暴力団対立抗争による発砲事件（3月、山梨県警察）

山梨一家と山梨侠友會の対立抗争に伴う発砲事件において、報復攻撃を予測して張込み捜査中の捜査員が、発砲事件の発生直後に現場から逃走した山梨侠友會傘下組織幹部（61）ほか1人を追跡し、同人らを銃刀法違反（発射）で逮捕した。その後、逃走経路で拳銃1丁を押収した。

## 【3－3】 山梨侠友會理事長等に対する拳銃使用の殺人未遂等事件（4月、山梨県警察）

車両に乗車中の山梨侠友會理事長等に対し拳銃が発砲された殺人未遂等事件において、その後の捜査により、対立抗争中の山梨一家傘下組織幹部（69）ほか1人を殺人未遂等で逮捕した。

## 【3－4】 会社社長に対する拳銃使用の殺人事件（12月、京都府警察）

会社敷地内において、会社社長（72）が拳銃で胸部等を撃たれ死亡した。

## 【3－5】漁業組合長に対する拳銃使用の殺人事件（12月、福岡県警察）

北九州市内の路上において、漁業組合長（70）が拳銃で胸部等を撃たれ死亡した。

## ☐ 拳銃所持事件

## 【3－6】 浪川睦会（旧九州誠道会）傘下組織にかかる拳銃等大量押収事件（2月、福岡県警察）

浪川睦会（旧九州誠道会）傘下組織の関係者宅を捜索したところ、拳銃3丁及び実包62個を押収し、同人（32）を銃刀法違反（加重所持）で逮捕した。また、その後の捜査により、同組織幹部（33）ほか2人を銃刀法違反（加重所持）等にて逮捕した。

## 【3－7】 会社役員による改造拳銃等大量所持事件（5月、警視庁・熊本県警察）

ガンマニアである会社役員宅を捜索したところ、拳銃 87 丁（うち真正拳銃 1 丁、改造拳銃 86 丁）、実包 62 個等を押収し、同人（73）を銃刀法違反（所持）で逮捕した。
## 【3－8】 山口組傘下組織に係る拳銃等大量押収事件（9月、大阪府警察）

山口組傘下組織が契約するレンタルルームを捜索したところ、拳銃7丁、実包558個等を押収し、同組織会長（65）ほか4人を銃刀法違反（加重所持）で逮捕した。

## 【3－9】自動車整備工に係る複数拳銃所持事件（12月、警視庁）

自動車整備工(59)が経営する会社の車両置き場に駐車中の自動車内から、拳銃2丁、実包121個等を押収し、その後の捜査により、同人を銃刀法違反（加重所持）等で逮捕した。

## ○ 密輸入事件

## 【3－10】米国捜査機関からの情報を端緒とした拳銃密輸入（予備）事件（9月、警視庁）

米国捜査機関からの情報を端緒に、同機関と協力して、航空小包郵便に拳銃等を隠匿して米国からの密輸入を図った会社役員（41）及びサッシェ（39）を銃刀法違反（密輸の予備）で逮捕した。
平成 26 年度

# 環境研究総合推進費補助金 研究事業 総合研究報告書

# 微生物によるバイオディーゼル廃グリセロールからの 燃料生産 (3K123007)

平成27年3月

筑波大学 中島 敏明
補助事業名 環境研究総合推進費補助金研究事業（平成24年度～平成26年度）

所管 環境省

国庫補助金 75,625,000 円（複数年度の総計）

研究課題名 微生物によるバイオディーゼル廃グリセロールからの燃料生産

研究期間 平成24年6月1日～平成27年3月31日

研究代表者名 中島敏明（筑波大学）

研究分担者 なし
## 目次

総合研究報告書概要

本文

1 研究背景と目的 ..... 10
1.1 研究背景 ..... 10
1.2 研究目的 ..... 11
1.3 参考文献 ..... 11

2 培養方法の検討 ..... 14
2.1 休止菌体法による生産の検討 ..... 14
2.2 固定化菌体法による生産の検討 ..... 16
2.3 浮遊菌体による連続培養法の検討 ..... 16

3 培地成分の検討
3.1 各種栄養源の検討 ..... 21
3.2 グリセロールの逐次添加濃度及び酵母エキス(YE)添加量の検討 ..... 22
3.3 安価な栄養源の探索 ..... 26
3.4 参考文献 ..... 31

4 変異処理による菌株の機能向上 ..... 33
4.1 UVによる変異株の取得 ..... 33
4.2 プロトン自殺法による変異株の取得 ..... 35
4.3 参考文献 ..... 39

5 エタノール生産に向けたグリセロール代謝プロファイルと代謝フラックス解析 ..... 40
5.1 純グリセロールを用いた場合の代謝フラックス解析 ..... 41
5.2 BDF廃液を用いた場合の代謝フラックス解析 ..... 46
5.3 純グリセロールと BDF を用いた場合でのフラックス分布の比較 ..... 48
5.4 参考文献 ..... 50

6 遺伝子組み換え手法による高生産変異株の創出 ..... 51
6.1 代謝フラックス解析に基づく代謝キーポイントの策定 ..... 52
6.2 遺伝子増強による生産性の向上 ..... 56
6.3 遺伝子破壊技術の構築 ..... 66
6.4 遺伝子破壊による生産性の向上 ..... 71
6.5 参考文献 ..... 73

7 フィージビリティースタディー ..... 76
7.1 調査方法と前提条件 ..... 76
7.2 試算方法 ..... 80
7.3 ヒアリング調査結果 ..... 80
7.4 各種条件の経済性に与える影響 ..... 85
7.5 基本となる運転条件での試算と目標値 ..... 92

8 パイロットスケール試作発酵槽による実証試験 ..... 93
8.1 発酵槽の設計と試作 ..... 93
8.2 回分培養による生産試験 ..... 97
8.3 逐次添加培養による生産試験 ..... 100
9 結論 …… 104

10 研究発表 …… 106

11 知的財産権の取得状況 …… 108

12 研究概要図 …… 109

13 英文概要 …… 110
研究課題名：微生物によるバイオディーゼル廃グリセロールからの燃料生産

研究番号 : 3K123007

国庫補助金清算所要額：75,625,000 円（複数年度の総計）

研究期間：平成24年6月1日～平成27年3月31日

研究代表者名：中島敏明（筑波大学）

研究分担者：なし

## 研究目的

バイオディーゼル燃料(BDF)は、軽油の代替燃料として用いられるバイオマス液体燃料であり、動植物油脂を原料に作られ、カーボンニュートラルな特性をもつ。また、硫黄成分を含まないため、排気ガス中の硫黄酸化物(Sox)を低減し、大気汚染防止、地球温暖化抑制に効果的である。油脂を原料とした BDF の生産過程では、副生成物としてグリセロールが必ず生じる。このグリセロールは市場で供給過剰状態であるため用途がない。加えて現在 BDF のほとんどがアルカリ触媒法によって製造されるため、その廃液も高アルカリ性で、廃棄や再利用の妨げとなっている。

本研究ではバイオディーゼル燃料(BDF)廃液のエネルギーとしての再生技術の確立を最終目標として、研究代表者によって自然界から新たに分離された微生物、Klebsiella variicola TB-83D 株による BDF 廃液からのバイオエタノール生産を試みる。このための最適生産条件と微生物の育種を行うことを目的とする。

## 研究方法·結果

(培養方法の検討)

微生物による発酵生産プロセスは発酵法と休止菌体法に大別される。前者は微生物が増殖する過程の機能を利用するため、菌体増殖を伴うのが特徴であり、複雑な代謝経路を利用できる代わりに増殖するための炭素原・エネルギー源を必要とする。一方、休止菌体法では増殖の停止した、いわゆる休止状態にある微生物内部の酵素活性を利用するため、増殖のための原料は不要であるが、複雑な反応は困難である。本研究課題であるグリセロールからのエタノール生産では、その代謝ステップは単純であるとはいえないが、アミノ酸発酵などの発酵生産ほど複雑ではない。そこで、本プロセスに休止菌体法が適用できるか検証を行った。
検討の結果、休止菌体反応においてもグリセロール資化およびエタノール生産が確認された。しかし、エタノールの生産は最初の1日で急激に上昇し、その後はあまり増えなかった。このことから、休止菌体法によるエタノール生産性の増大は困難であると考えられた。本菌株によるグリセロールからのエタノール生産はエネルギー生成系であるため、休止菌体ではエネルギーバランスに偏りが生じ、生産が低下したと考えられる。以上の結果より、本プロセスにおいては休止菌体法ではなく、菌体増殖を伴う発酵法が適していると考えられた。

発酵法による物質生産において微生物を何らかの担体に付着（固定化）させて培養することは、菌体密度の上昇や、発酵終了後の菌体と生産物の分離、連続発酵時におけるwash out防止等、多くのメリットがある。そこで、本プロセスに、固定化菌体法が適用可能か検証した。かご状に成形した金網に固定化担体として不織布をロール状に詰め、その金網を培養器の中に入れた。その後、TB-83D株を植菌し、培養を行った。

不織布を用いない分散系と比べると、不織布系ではエタノール生産量は培養7日で370mM(1.48%)までしか上昇せず、生産性の向上は認められなかった。培養液を観察すると、分散系では大きな菌体の塊はなく菌体は分散していたが、不織布系では不織布全面にべったりと菌の集団が形成されていた。おそらく菌体増殖に伴って不織布が目詰まりしたことによって、基質と菌体との接触が妨げられたため、生産が低下したと考えられる。このことから、生産を連続的、効率的に行うためには、基質との接触が効率よく行われるように、増殖した菌体密度を一定に保つことが必要であり、菌体濃度を上げることが必ずしも生産向上には結びつかないと考えられた。また、実際のBDF廃液は不純物を多く含むため粘度が高く、不織布の目詰まりをさらに助長すると考えられる。そのようなリスクも考慮した結果、最終的に菌体の固定化は本プロセスには適さないと結論づけ、以降の検討には浮遊菌体を用いることとした。

## (培地成分の検討)

これまでの検討結果より、本菌株は植菌量を増大させても生産は増大しないことが明らかになっている。これは培地成分等の他の要素が菌体増殖の律速となっている可能性が考えられため、培地成分について各々検討を行い、生育の律速となっている成分について検討した。検討は、基本培地組成のうちの $ NH_{4}Cl $ 、カザミノ酸、酵母エキス（YE）について行った。培養にはミニジャーファーメンターを用い、培地中のpHを8、グリセロール濃度を2%におおよそ維持した。YE添加量を増加させるか否かでエタノール生産性が大きく2つのグループに分かれ、YEを添加することで生産性が大きく向上することが示された。また、 $ NH_{4}Cl $ に関しては添加量を増加させても生産性の向上は見られず、場合によっては阻害効果が見られた。続いてYE添加量の検討を行った。YE15g/Lまでは添加量依存的にエタノール生産量が増加し、最大でYE15g/Lの時にエタノール生産量697mM(32g/L)に達した。しかし、さらにYE添加量を増やしてもそれ以上のエタノール生産は見られなかった。この時点での生産物を見ると、エタノールの他にギ酸が3%程度生産されており、ギ酸によるエタノール生産阻害の可能性が考えられた。また、 $ KH_{2}PO_{4} $ を添加しなくても問題ないことが示された。

これまでの結果より YE がエタノール生産に特に有効であることが示された。しかし、YE は高価であるために工業生産の現場で使用することは困難である。そこで次に、YE に代わる安価な栄養源の探索を試みた。コーンスティープリカー(以下 CSL)とは、トウモロコシ粒から溶出した可溶性成分を含む浸漬液
を濃縮したもので、アミノ酸、糖類、ビタミン類などの多様な成分を含む。また、YE と比べて安価であるため、高価な栄養源の代替剤としての利用価値がある。CSL のエタノール生産量への影響を下表に示す。CSL の添加量によるエタノール生産への影響は YE と比べると低いものとなったが、YE に CSL を添加することで YE 単体よりはエタノール生産量が向上した。YE と CSL を 15g/L の濃度で添加した場合、エタノール生産量は 732.1mM (34g/L) に達した。

YE (g/L)	CSL (g/L)	Product concentrations (mM)	Consumed glycerol (mM)	Ethanol productivities (ethanol-mol/glycerol-mol)	Final OD580
Ethanol	1,3-P D	Lactate e	Format e	Acetate
30	-	700.4	99.6	107.8	639.9	38.1	901.0	0.79	10.1
15	15	732.1	91.4	148.1	482.8	64.8	998.1	0.74	18.4
5	5	427.8	117.5	97.9	215.6	63.9	704.4	0.61	8.9
5	10	459.8	108.8	80.7	239.3	73.2	726.1	0.63	12.3
5	15	455.4	113.9	127.4	183.5	59.2	744.2	0.61	12.7
-	30	321.5	71.0	75.4	167.8	40.4	434.2	0.77	13.0

これまでのグリセロールからのエタノール生産に関する報告におけるエタノール生産量としては、組換え菌を使用しない場合においては、細菌ではKluyvera cyocrescens S26によるエタノール生産量27.0 g/L、酵母ではPachysolen tannophilus CBS4044によるエタノール生産量28.1 g/Lがそれぞれ最高値となっている。本研究においてにおいてエタノール生産量34 g/Lと、これまでの世界最高値を超えることができた。

さらに、別の安価な栄養源としてメタン消化液の使用を検討した。メタン消化液とは、メタン発酵において生じる液状の残渣のことを指す。窒素やリン、カリウムといった肥料成分を多量に含んでいるため液肥としての有用性が知られている。また、有機物の分解産物及びメタン発酵に関わる細菌・メタン生成菌由来のアミノ酸やビタミンなどを多量に含んでいると考えられる。メタン消化液は基本的には廃棄物であるため安価であることから、YEに代わる安価な栄養源としての有用性が考えられた。そこで次に、メタン消化液のエタノール生産への影響を調べることにした。

その結果、メタン消化液を使用することで、YEには及ばないものの、グリセロールとメタン消化液のみから2%以上の比較的高いエタノール生産量を達成できた。また、非滅菌のメタン消化液においても滅菌したものと同程度のエタノール生産量を示した。以上のことより、栄養源としてYEの代わりにメタン消化液を使用することは、原料コスト及び滅菌コストの削減という観点から、本技術の実用化において非常に大きなメリットであることが示唆された。

## (変異処理による菌株の機能向上)

栄養成分の検討の結果から、確かにエタノール生産の増加が確認された。しかし、栄養源の初期添加量を増加させた場合、急激に生育が起こることによって培地中の阻害物質（エタノールもしくはギ酸）濃
度が急上昇し、その後の生産を阻害している可能性が考えられた。本菌株(TB-83D株)は、親株であるTB-83株のストレプトマイシン耐性変異株であり、高いエタノール耐性(約7%)を持つ。現時点でのエタノール生産量は4%を下回っているため、エタノールが原因であるとは考えにくい。そのため、この原因物質はエタノール生産に同調して生産される「ギ酸」であることが強く示唆された。そこで、各濃度のギ酸を含むグリセロール基本培地を用いてTB-83D株の生育、消費グリセロールおよびエタノール生産性を調べたところ、2％のギ酸存在下でそれらは著しく減少した。これらの結果から、培養中に蓄積するギ酸が生育と生産における律速因子であることが分かった。

そこで、ギ酸による生育・生産阻害を軽減するために、TB-83D株に変異処理を施すことで「ギ酸耐性変異株」および「ギ酸生産能低下変異株」の取得を試みた。UV照射による変異導入を繰り返し行った結果、ギ酸濃度5%下で比較的生育の良い27株を選抜し、その中から3B12,3F12,4A6,4A9,5C11の5菌株をギ酸耐性候補株とした。継代培養における復帰細胞の検討を含め、これら5株を各ギ酸濃度の寒天培地上で生育を調べたところ、5%ギ酸含有寒天培地上でも良好な生育を示した。また、親株は同培地上では生育しなかった。5%純グリセロールを用いたグリセロール基本液体培地で培養を行ったところ、4A6株において親株と比べて生育およびエタノール生産性の増加が確認された。今後本菌株を使用することにより、さらなる生産性の増大が期待できる。

UV処理によるギ酸耐性変異株のエタノール生産試験の結果、親株よりも生産性が向上することが明らかとなった。しかしながら、ギ酸の生産そのものを抑制したギ酸生産能欠損株の構築も目指す必要がある。そこで、酸生産能欠損株取得法であるプロトン自殺法を適応することにより、ギ酸生産能欠損株の取得を試みた。プロトン自殺法は、発酵に伴い生成される酸による致死効果に基づく手法である。より具体的には、臭素酸(NaBrO_{3})と臭化物(NaBr)の混合物を培地に添加して培養を行うと、発酵に伴い培地が酸性に傾く。この酸性条件下(プロトン存在下)では、培地に添加した臭素酸と臭化物の混合物は細胞致死に作用する臭素を生成するので、適切な細胞致死条件下で出現するコロニーは酸を生成しない。このことから、出現するコロニーは酸生成能に何らかの欠損を生じていることになる。故にこの方法を用いれば、ギ酸生産能が欠損した変異株を取得できると考えられた。

TB-83D株 0.1 mlを、pHを変化させかつNaBr:NaBrO_{3}=4:1となるように様々な濃度で添加した同培地に塗布し、30℃で48～72時間静置培養を行った。EMSで変異処理を行い選択培地にて変異株を選別した
ところ、最終的に30個の候補株を得ることができた。しかしながら、ほぼすべての株においてエタノール生産性はTB-83D株より向上せず、むしろ低下していた。

## (エタノール生産に向けたグリセロール代謝プロファイルと代謝フラックス解析)

代謝フラックス解析 (Metabolic Flux Analysis: MFA) とは、ゲノムスケールでの細胞代謝ネットワークをシミュレーションした手法であり、代謝中の個々の反応ではなく代謝全体の物質循環に焦点を当てた近年脚光を浴びている解析手法である。フラックス (Flux) は「流れ」であり、まさに細胞内物質代謝における物質循環の流れを表す。代謝フラックス解析は、細胞による物質変換 (発酵や代謝) においての細胞物質変換経路のボトルネックの検出や、細胞における物質循環を視覚的に理解することを可能にしている。この解析は、培養条件や培地組成の検討、代謝に関与する遺伝子の改変、すなわち効率の良い分子育種にも発展できる可能性を秘めている。また、培養のスケールアップや自動化の際に、従来よりも精密な培養制御を行うことが可能となる。

このような代謝フラックス解析を本研究に適用し、実際グリセロールがエタノールに微生物変換される際の物質の流れの追跡、各培養条件・経時時間におけるフラックスの分布を調べることで、エタノール変換主要経路を特定し、効率的な分子育種へ発展させることとした。本実験では、代謝マップの各経路に対応する代謝反応を書き下ろし、その化学量論係数とHPLCなどによる測定実測値を組み合わせた「Flux balance analysis: FBA」法を用いて、フラックス分布解析のためのプラットホームを構築した。FBAは基質の消費・生産物の生成速度を基に細胞内に流入および細胞から流出する代謝産物の流れを表現しており、代謝反応と物質収支に基づく化学量論モデルである。これを用いて、本菌株のグリセロール代謝プロファイルを純グリセロールとBDF廃液を用いることで調べた。解析の結果、BDF廃液を用いた場合、乳酸生産がエタノール生産に最も関与している可能性を示唆したため、ピルビン酸における乳酸フラックス比を調べたところ、pH制御・非制御条件下ともに、純グリセロールの場合と比較して、乳酸生成フラックス比は約3倍高かった。(非制御下:10.6%(純グリセロール)→31.3%(BDF廃液) 制御下:6.5%(純グリセロール)→22.9%(BDF廃液)。このことから、pH制御下でBDF廃液からエタノール生産を行う場合、乳酸生産の抑制が必要であることがわかった。

## (遺伝子組み換え手法による高生産変異株の創出)

代謝フラックス解析により、TB-83D株のグリセロールからエタノール生産についての鍵となる物質は「ギ酸」と「乳酸」であることが強く示唆された。そこで、まず遺伝子発現による特定酵素機能の増強として、ギ酸デヒドロゲナーゼの発現によるエタノール生産中でのギ酸分解を試みた。TB-83Dのギ酸代謝遺伝子は、ギ酸・水素リアーゼとして染色体上に存在しており、制御遺伝子も遺伝子の発現に関与している。その中でも特に、転写活性化因子FhlAは、ギ酸分解に重要であるHydrogenase3オペロンおよびギ酸デヒドロゲナーゼFdhFの転写を活性化する。このことから、これらの発現強化はギ酸の分解に効果的であると期待できる。

まず TB-83D 株のドラフトゲノムシークエンスから、ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の存在数を調べたところ、ゲノム上にギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のホモログが4コピー存在していた (fdhF1, fdhF2, fdhF3, fdhF4)。発現プラスミドを構築するにあたり、まずどのギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が発現しているのか
を調べる必要があった。その結果、実際に発現させる遺伝子は、ギ酸濃度が最も高く、pH減少のlog phaseに相当する24時間で最も転写量の高かった「fdhF3」を用いればよいということがわかった。しかし、FdhF3発現株においては、コントロールと比較してほとんど変化がなく、TB-83D株内で活性を持たないことが示唆された。FhlA発現株については、一見ギ酸濃度が減少したように見えるが、それに伴いエタノール濃度も減少しており、それらの濃度はエタノール濃度と同調していた。すわなち、実際はfhlAの導入はギ酸分解に影響していない。以上の結果から、グリセロール代謝中におけるギ酸分解には、異なるアプローチが必要となることが考えられた。

そこで、他菌株由来のギ酸分解酵素遺伝子のクローニングと発現を試みた。S. cerevisiae由来のギ酸脱水素酵素遺伝子をTB-83D株に導入したところ、発現は確認できたものの、ギ酸の分解に変化は見られなかった。しかし、最終的なエタノール生産量は増加した。続いて、乳酸生成に関与するL-乳酸脱水素酵素遺伝子(ldhA)をターゲットとして、遺伝子破壊株の構築を目指した。しかし、Klebsiella属細菌は遺伝子導入効率と遺伝子破壊の為の組換え効率が著しく低く、遺伝子改変が非常に困難であることが知られていたため、まずは高効率な遺伝子破壊法の構築を行った。構築した手法を元に乳酸脱水素酵素遺伝子破壊株を作成した結果、破壊株はグリセロール消費率が増加し、エタノール生産性が向上するということが明らかとなった。

## (フィージビリティースタディー)

これまでの各種検討結果より、Klebiella variicola TB-83D 株による BDF 廃液からのグリセロール生産性の向上に関しては、一定の成果が得られた。今後実用化を視野に入れた検討を行うには、実際にビジネスとして立ち上げた場合のプロジェクトの実現可能性を事前に調査・検討する必要がある。さらに、一定のモデルを設定し、プロジェクトの妥当性を評価することによって、研究目標を具体的数値（生産量等）として設定することが望ましい。

BDF は、一般的に国内では廃油等から廃棄物処理業者等が生産しているケースが多い。一方、海外においては主に発展途上国等によって油糧植物から大規模に生産されている。これらの業種では前者では生ゴミからのエタノール生産やメタン発酵、後者では植物残渣からのエタノール生産が並行して稼働している場合が多い。パイロットスケールの実証試験を行った（有）鳥栖環境開発綜合センターは、廃棄物処理業を主体とし、廃油からの BDF 生産及びメタン発酵による廃棄物処理を既に行っている。そこで、まずはここに BDF 廃液からのエタノール生産を組み込むことを想定してフィージビリティスタディーを行い、その結果を基に当研究の目標について明確にしておくこととした。

本事業の経済性を、製造コスト（設備建設費、運転人件費、転換コスト）、エタノール販売売上および廃グリセロール受け入れ費用から試算した。黒字化するための条件を検討した結果、設備建設費を抑えたままで収益を上げるには、①エタノール生産速度の向上、②廃グリセロールの希釈率の低下、が効果的と考えられた。試算結果では、エタノール生産速度は2倍程度、廃グリセロールの希釈率は約1/2（グリセロール濃度で約2倍）にすることができれば、収益性への影響が大きいと推定された。

本研究の現在までの実績と、フィージビリティスタディーの初期設定条件を比較すると、設定条件である BDF 廃グリセロール 20 倍希釈（初期グリセロール濃度 2%）、4 日間の滞留時間に対して、ラボスケールにおいて初期グリセロール 5% を約 2 日間でほとんどエタノール(約 2.5%)に変換できる。さらに逐
次添加においては4日程度まで維持可能であり、その場合の最終エタノール濃度（3.4%）から逆算すると、原料グリセロール約7%を4日間でエタノールに変換したことになる。蒸留段階を考慮するとぎりぎりの濃度であるが、少なくともラボスケールでは上記の試算をほぼクリアすることができた。設備投資においては、既存遊休設備の有効利用等を考慮すれば、さらに公的資金に頼らずとも収益をあげることが可能であると思われた。

## (パイロットスケール試作発酵槽による実証試験)

最後に、これまでの研究成果を元に実証試験用のプラントを制作し、パイロットスケールでの実証試験を行った。エタノール生産用試作発酵槽は、有限会社鳥栖環境開発綜合センター（佐賀県鳥栖市轟町）敷地内に設置した（幅4 m × 奥行き1.5 m）。この試作発酵槽と同敷地内に BDF 製造装置およびメタン発酵槽が設置してあることから、培養に用いる BDF 廃液およびメタン消化液をすぐ供給することができる。

フィージビリティースタディーにおける初期設定値を念頭に、ラボスケールで検討した酵母エキス(YE)培地を用いて回分培養によるエタノール生産を行った。その結果、消費グリセロール、エタノール生産ともに、ラボスケールと比較すると若干低下したものの、ほぼ同様の生産性を有していたことから、ラボスケールの検討結果がプラントスケールにおいても応用可能であることが示唆された。しかし、培養基材として非滅菌のメタン消化液を用いる場合、使用する消化液のロットによっては深刻な雑菌汚染を引き起こすことも明らかになり、この点については今後十分に検討する必要があると結論づけた。
## 環境政策への貢献

バイオディーゼル燃料(BDF)は、軽油の代替燃料として用いられるバイオマス液体燃料であり、動植物油脂を原料に作られ、カーボンニュートラルな特性をもつ。しかし、油脂を原料とした BDF の生産では、副生成物としてグリセロールが生じる。この反応は通常、アルカリ触媒法によるため、その廃液も高アルカリ性であり、有害かつ危険な廃棄物となる。

一般的にバイオマスエネルギーは再生可能であるだけでなく、環境に優しいというイメージで認知されており、その生産、利用においては危険な廃棄物を生じることは好ましくない。このため、その中間生産物、廃棄物の安全な有効利用法（ゼロエミッション化）が求められる。本研究では代表者が新たに自然界から取得した Klebsiella variicola TB-83D 株による BDF 廃液からのバイオエタノール生産を試みた。本研究の成果より、その生産性は最高で研究開始時の約 2 倍（34 g/L）と、同様の研究では世界最高の生産量を持つに至った。また、生産性は劣るものの、培地を廃棄物であるメタン消化液のみで作成することにも成功した。これは、BDF 生産のゼロエミッション化に大きく貢献すると考えられる。

## 研究成果の実現可能性

フィージビリティスタディーを行った結果では、本研究の現在までの実績と、フィージビリティスタディーの初期設定条件を比較すると、蒸留段階を考慮するとぎりぎりの濃度であるが、少なくともラボスケールでは上記の試算をクリアすることができた。設備投資においては、既存遊休設備の有効利用等を考慮すれば、さらに公的資金に頼らずとも収益をあげることが可能であると思われる。今回は親株を用いて検討したが、現在UV変異によりギ酸耐性を持ち、エタノール生産性の向上した株の取得に成功している。さらに本研究にて構築した高効率な遺伝子破壊法を元に乳酸脱水素酵素遺伝子破壊株を作成した結果、グリセロール消費率が増加し、エタノール生産性が向上した破壊株を得ている。この成果は遺伝子組換え技術によるものであるので、直ちに実用化できるものではないが、変異株等の取得等、今後の育種のターゲット設定において重要な意味を持っている。なお、Klebsiella属細菌はエタノール生産だけではなく、種々の嫌気代謝産物の発酵生産に広く用いられており、その効率的な遺伝子破壊法の確
立は、Klebiella 属細菌を扱う研究者にとって極めて有用な手法であると考えられる。最後に、本研究において、パイロットスケールとラボスケールの結果はほぼ一致したことから、今後はラボスケールの検討のみでも、ある程度大規模培養のシミュレーションが可能であると考えられる。

## 結論

本研究ではバイオディーゼル燃料(BDF)廃液のエネルギーとしての再生技術の確立を最終目標として、研究代表者によって自然界から新たに分離された微生物、Klebsiella variicola TB-83D 株による BDF 廃液からのバイオエタノール生産を試みた。本菌株の培養方法について検討した結果、酵母エキス(YE)とコーンスティープリカーの添加によりエタノール生産量は 34g/L に達し、研究開始時の 2 倍の生産量を達成した。この生産量は非組換え菌によるグリセロールからのエタノール生産では現時点での世界最高値であり、同分野では最も実用化に近いものであった。また、さらに安価な栄養源としてメタン消化液を用いたところ、ある程度の生産が認められ、その一部は YE と代替可能であることが示された。さらに、UV 変異により、ギ酸耐性を持ちエタノール生産性の向上した株を得ることができた。今後はこれらの変異株による生産性の向上が期待される。

続いて、代謝フラックス解析を行い、本菌株におけるグリセロール代謝とエタノール生産に関する代謝フローを明らかにした。これはグリセロールを出発物質とした代謝フラックス解析における世界初の実施例であり、これに用いた技法は今後様々な物質（廃棄物等、一般的ではない原料）を出発点とした発酵生産における代謝フラックス解析に応用可能な手法としての利用が期待される。なお、Klebsiella属細菌はエタノール生産だけではなく、種々の嫌気代謝産物の発酵生産に広く用いられており、その効率的な遺伝子破壊法の確立は、Klebsiella属細菌を扱う研究者にとって極めて有用な知見であると考えられる。

これまでに BDF 廃グリセロールからのエタノール生産において、数 100L 規模のスケールでの検討は報告されておらず、今回のデータは今後の同分野の研究において貴重なものである。本研究において、パイロットスケールとラボスケールの結果はほぼ一致したことから、今後はラボスケールの検討のみでもある程度大規模培養のシミュレーションが可能であると考えられる。本研究では培養条件の検討のみで初期の 2 倍の生産量を達成している。今後の育種方針についても代謝フラックス解析からそのターゲットが絞られているので、効率の良い改良が可能であると思われ、更なる生産性の向上も期待できる。