Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
図4-1 比色法によるエタノール簡易定量の原理

## 【結果と考察】

## 生育・生産阻害物質の特定

まず、各濃度のギ酸を含むグリセロール基本培地を用いてTB-83D株の生育、消費グリセロールおよびエタノール生産性を調べたところ、2％のギ酸存在下でそれらは著しく減少した。これらの結果から、培養中に蓄積するギ酸が生育と生産における律速因子であることが分かった。

図4-2 TB-84D株のギ酸耐性

## UV処理によるギ酸耐性変異株の取得

UV 照射による変異導入を繰り返し行った結果、First screening で 768 株の変異株が得られた。次に、野生株のギ酸耐性試験と同様に、各ギ酸濃度（3%, 4%, 5%）の寒天培地上に First screening で得られた 768 株をレプリカしてその生育を調べたところ、ギ酸濃度 5%で生育した菌株を 152 株獲得し、その中でも比較的生育の良い 27 株を選抜し以降の実験に用いた。

これら 27 株を、1ml の 2% glycerol basal medium を分注した 24 穴マルチプレートを用いて 25℃で 4 日間静置培養を行った。培養液を遠心し、その上清を 4-アミノアンチピリンを用いたエタノール簡易測定を行ったところ、3B12, 3F12, 4A6, 4A9, 5C11 の 5 菌株が TB-83D 株よりも高い吸光度値を示した (data not shown)。

以上の結果から、3B12, 3F12, 4A6, 4A9, 5C11 の 5 株をギ酸耐性候補株とした。継代培養における復帰細胞の検討を含め、これら 5 株を各ギ酸濃度の寒天培地上で生育を調べたところ、5% ギ酸含有寒天培地上でも良好な生育を示した（図 4-3）。また、親株は同培地上では生育しなかった。取得した変異株が、親株に比べ約 1.3 倍のギ酸耐性を有するという知見は、ギ酸デヒドロゲナーゼもしくはピルビン酸ギ酸リアーゼの酵素活性が増加している可能性、もしくは膜の透過性が変化していることも考えられる。
A

B

C

D

図4-3 ギ酸耐性株の寒天培地上での生育

(A) 羧酸濃度 3%, (B) 羧酸濃度 4%, (C) 羧酸濃度 5%, (D) 羧酸濃度 5.5%. ①: TB-83D, ②: 3B12, ③: 3F12, ④: 4A6, ⑤: 4A9, ⑥: 5C11

ギ酸耐性を示した5菌株について、5％純グリセロールを用いたグリセロール基本液体培地で12日間培養を行ったところ、4A6株において親株と比べて生育およびエタノール生産性の増加が確認された（図4-4）。培養終了時の最終的な菌体生育量とエタノール生産量は、4A6株で親株の約1.4倍増加し、それに伴いギ酸の量も増加した。また、両菌株とも培養3日目に5％のグリセロールをほぼ消費したが、その後添加した5％グリセロールの消費率は4A6株の方が早かった。以上のことから、ギ酸耐性の付与はグリセロール消費量、エタノール生産性および生育量を増加させることが分かった。

A

B

図4-4 ギ酸耐性株と親株の生育およびエタノール生産性 (A) TB-83D. (B) 4A6株.

### 4.2 プロトン自殺法による変異株の取得

UV処理によるギ酸耐性変異株のエタノール生産試験の結果、親株よりも生産性が向上することが明らかとなった。しかしながら、連続培養におけるエタノール生産を試みた場合、更なるギ酸の蓄積が予想されることから、ギ酸の生産そのものを抑制したギ酸生産能欠損株の構築も目指す必要がある。そこで、酸生産能欠損株取得法であるプロトン自殺法 (3)を適応することにより、ギ酸生産能欠損株の取得を試みた。

プロトン自殺法は、発酵に伴い生成される酸による致死効果に基づく手法である。より具体的には、臭素酸(NaBrO_{3})と臭化物(NaBr)の混合物を培地に添加して培養を行うと、発酵に伴い培地が酸性に傾く。
この酸性条件下(プロトン存在下)では、培地に添加した臭素酸と臭化物の混合物は細胞致死に作用する臭素を生成するので、適切な細胞致死条件下で出現するコロニーは自身を致死から守るため酸を生成しない。このことから、出現するコロニーは酸生成能に何らかの欠損を生じていることになる。故にこの方法を用いれば、ギ酸生産能が欠損した変異株を取得できると考えられた。

## 【材料と方法】

## プロトン自殺法を用いた変異

50μg/ml ストレプトマイシン含有 2% グリセロール基本液体培地 (pH 8.0) で生育したTB-83D株 0.1 mlを、pHを変化させ且つNaBr : NaBrO_{3} = 4 : 1となるように様々な濃度で添加した同培地に塗布し、30℃で48～72時間静置培養を行った。また、変異処理を行った場合には、前培養液をEMSにより処理（最終濃度 4%、40分）した後、上記の培地に塗布した。

## 酸生産能欠損株の検出・培養・代謝産物解析

酸生産能欠損株の検出は、得られたコロニーを0.06% BTB含有2%グリセロール基本液体培地(pH8.0)にレプリカし、BTBの色の変化を見る、もしくは酸化還元指示薬(2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド)を含む培地に塗布することで簡易的に酸生産能欠損株の選別を行った。BTB含有培地上でTB-83D株と比較して色の変化が明白であった株については、試験管スケールで培養を行い、代謝産物をHPLCにより調べた。

## 【結果と考察】

## プロトン自殺法によるギ酸生成能欠損株の取得

まず、プロトン自殺法による変異株の取得に先立ち、培地 pH と NaBr および $ NaBrO_{3} $ 濃度の選定を行った。pH を 6.0, 5.5, 5.0, 4.8 に調製し、NaBr : $ NaBrO_{3} $ 濃度を 30 mM づつ増加させて実験を行ったところ、pH 5.5, $ NaBr : NaBrO_{3} = 160 - 190\ mM : 40 - 47.5\ mM $ で生育抑制が見られた（図 4-5）。このことから、pH 5.5, $ NaBr : NaBrO_{3} = 190\ mM : 47.5\ mM $ の培地を選択培地とした。EMS で変異処理を行い選択培地にて変異株を選別したところ、46 株のコロニーを取得することができた。それらについて更に選択を行ったところ、最終的に 30 個の候補株を得ることができた（図 4-5, 表 4-1）。

+++, confluent growth; ++, +, ±, intermediate levels of growth; -, No growth

図4-5 変異株取得条件とBTB含有培地上で生育した変異株の選択
表4-1 得られた変異株の代謝産物解析結果

Strain numbers	Products (mM)	Final pH
Consumed glycerol	Ethanol	1,3-PD	Lactate	Formate	2,3-BD	Succinate	Acetate
TB-83D	184.3	126.9	18.7	12.0	29.9	14.4	0.8	1.7	6.40
T1	109.3	89.0	0	7.9	51.2	4.5	0.7	1.1	6.4
T2	102.3	50.6	16.4	10.2	58.8	14.7	0.5	0.7	5.9
T3	90.9	46.4	13.7	7.7	53.3	12.7	0.6	1.0	6.0
T4	101.1	45.5	18.3	9.4	50.8	15.6	0.4	0.6	6.2
T5	176.1	114.7	19.0	16.3	40.2	11.0	0.7	0.5	6.4
T6	125.2	88.1	7.4	10.6	47.0	10.4	0.7	0.5	6.2
T7	89.5	47.3	12.1	14.8	61.9	10.5	0.4	0	5.75
T8	150.8	87.2	13.6	10.3	44.7	21.9	1.1	2.1	6.18
T9	86.3	47.8	14.0	15.8	49.3	11.0	0.4	0	5.74
T10	83.7	53.7	12.6	13.1	63.0	8.1	0.7	0	5.26
T11	88.5	54.0	11.4	4.8	57.3	13.4	0.7	0	5.64
L1	132.4	110.0	44.5	32.9	21.7	14.2	0.8	2.8	6.2
L2	126.0	120.5	22.8	12.2	33.4	23.8	1.6	4.0	6.4
L3	116.5	124.1	36.6	13.1	43.7	26.0	1.1	0.6	6.4
L4	103.3	115.0	21.0	15.0	36.8	13.8	0.9	1.2	6.4
L5	127.9	106.1	23.0	13.8	40.9	25.4	1.2	4.4	6.5
L6	83.1	52.1	17.6	10.4	61.7	12.3	0.6	1.1	6.0
L7	83.2	51.7	17.6	9.2	63.1	11.9	0.6	1.1	5.9
L8	83.8	54.5	9.9	17.3	64.1	12.0	0.7	1.0	5.3
A1	147.2	105.7	12.7	15.2	53.2	7.4	0.7	0.5	6.4
A2	144.0	109.8	9.5	11.4	55.0	8.1	0.6	0	6.5
A3	158.8	83.6	35.3	18.2	28.9	16.3	0.9	3.0	6.28
A4	60.1	40.1	7.1	2.3	28.4	0	0.4	1.6	6.54
A5	160.1	130.0	11.4	11.8	34.9	10.5	0.7	0	6.30
A6	124.2	58.1	33.9	23.4	28.4	0	0.9	5.6	6.34
A7	96.2	55.6	15.9	6.0	50.3	15.5	0.6	0.6	5.93
A8	87.7	58.6	9.7	7.9	66.5	8.7	0.5	0.9	5.60
A9	142.0	97.1	17.8	11.8	45.8	13.5	0.7	1.0	6.28
A10	147.7	102.5	18.1	11.7	42.8	13.0	0.8	1.1	6.28
A11	156.7	122.8	8.4	12.6	43.5	8.5	0.8	0	6.31
A12	163.9	125.4	8.4	11.1	72.5	9.2	1.2	0.8	6.26
A13	153.5	100.9	18.7	14.3	45.3	8.1	0.7	2.8	6.35
TB-83D 株と比較して有機酸生産性が低いものは少なかったが、その中でも、約半数は酢酸生産能が低下している株であった。T3 株は乳酸生産能が低下し T6 株は 1,3-PD 生産能が低下していた。しかしながら、ほぼすべての株においてエタノール生産性は TB-83D 株より向上せずむしろ低下していた。A4, A6 株は 2,3-BD 生産能を欠損しており、A4 については乳酸生成能も同時に欠損していた。特筆すべき株としては、T1 株が 1,3-PD が非生産、2,3-BD の生産性が低下し、L1 株は 1,3-PD と乳酸の生産性が増加したにもかかわらず、ギ酸生産性が低下したことが挙げられる。

ギ酸生産量については、T1 株と L1 株が親株よりもギ酸生産量が低かった。これら 2 株のエタノール生産性を詳細に解析したところ、T1 株でエタノール生産性 0.81 mol-ethanol/mol-glycerol、L1 株で 0.83 mol-ethanol/mol-glycerol であり、それぞれ親株比で 1.17 倍、1.2 倍増加していることが分かった (図 4-6)。さらに、経時的にエタノール生産を含む各種生産物の生産性を調べたところ、T1 株は、親株と比較してエタノール生産性が低下しギ酸濃度が増加した。一方、L1 株はギ酸濃度にあまり変化はみられなかったが、エタノール生産性が増加した。

C

図4-6 T1株、L1株およびTB-83D株の代謝産物解析 (A) TB-83D (B) T1株 (C) L1株
プロトン自殺法により有機酸生産能欠損株 (願わくばギ酸生産能欠損) の獲得を試みた。確かに有機酸生産能が欠損（もしくは低下）している株を取得することはできたが、結果的にエタノール生産が向上する株の取得には至らなかった。これらは、菌体内酸化還元バランスによる NADH の隔たりによるものであろう。しかし、これら変異株の代謝産物解析から、エタノール生産に及ぼす酸化還元バランスについての知見を得ることができた。

NADH を要求する反応は、1,3-PD、乳酸、2,3-BD、エタノール生成 (2 分子)、4 反応である。例えば、T1 株は 1,3-PD 非生産、NADH が 1 つ余剰することになるが、NADH を要求する反応において生産性の増加が見られない。また、T3 株は乳酸生成能が TB-83D 株の 1/2 になっているにもかかわらず、ギ酸生成以外全て減少した。

逆に、NADH 生成系に着目すると、NADH を生産する系 (すなわち NAD 要求) はピルビン酸からアセチル CoA を生成する系の 1 反応である (ギ酸から二酸化炭素を生成する系も含めれば 2 反応)。L1 株は TB-83D 株より ギ酸生産能が低下した。すなわち、ピルビン酸デヒドロゲナーゼによる経路 (ギ酸を経由しない反応) にフラックスが流れていることが考えられる。これにより NADH は TB-83D 株より多く生産されていると仮定しても、エタノール生産よりもむしろ 1,3-PD、2,3-BD 生産が増加した。

これらのことから、NADHを余剰させてもエタノール生産性は増加しないということがわかった。

### 4.3 参考文献

1. Suzuki T, Seta K, Nishikawa C, Hara E, Shigeno T, Nalajima-Kambe T. 2015. Improved ethanol tolerance and ethanol production from glycerol in a streptomycin-resistant Klebsiella variicola mutant obtained by ribosome engineering. Bioresour Tech. 176, 156-162.

2. Gonchar MV, Maidan MM, Pavlishko HM, Sibirny AA. 2001. A new oxidase-peroxidase kit for ethanol assays in alcoholic beverages. Food Technol Biotechnol. 39(1), 37-42.

3. Winkelman JW, Clark DP. 1984. Proton suicide: general method for direct selection of sugar transport- and fermentation-defective mutants. J Bacteriol. 160(2), 687-90.
# 5 エタノール生産に向けたグリセロール代謝プロファイルと代謝フラックス解析

微生物による発酵生産を考えた場合、その物質生産の生産性の向上に向けて代謝レベルでの解析が必要不可欠であるが、一概に代謝といえども細胞の代謝は多くの代謝制御による複雑なネットワークで構成されており、それを包括的に解析することは難しい。また、代謝産物は1つではなく複数の副生産物が生産されるため、酸化還元バランスなどの物質のエネルギー収支を考慮しなければならない。さらに、ある特定の物質生産に着目すると、その物質の高生産に向けての分子育種や遺伝子工学的改変株の構築を行う場合、その解析に向けての足がかりを掴むことは、まずその為の指標を探索する必要があり、非常に多くの労力と時間を要する。そのために、代謝の流れを定量的に、視覚的に理解することでより効率よく分子育種を行うアプローチが重要となってくる。

代謝フラックス解析 (Metabolic Flux Analysis: MFA) とは、ゲノムスケールでの細胞代謝ネットワークをシミュレーションした手法であり、代謝中の個々の反応ではなく代謝全体の物質循環に焦点を当てた近年脚光を浴びている解析手法である(1,2)。フラックス (Flux) は「流れ」であり、まさに細胞内物質代謝における物質循環の流れを表す。代謝フラックス解析は、細胞による物質変換 (発酵や代謝) においての細胞物質変換経路のボトルネックの検出や、細胞における物質循環を視覚的に理解することを可能にしている(3)。この解析は、培養条件や培地組成の検討、代謝に関与する遺伝子の改変、すなわち効率の良い分子育種にも発展できる可能性を秘めている。また、培養のスケールアップや自動化の際に、従来よりも精密な培養制御を行うことが可能となる。

代謝フラックス解析は、代謝マップの各経路に対応する代謝反応を書き下ろし、その化学量論係数とHPLCなどによる測定実測値を組み合わせた「Flux balance analysis: FBA」(4,5)と安定同位体基質を用いた「 $ ^{13} $ C-assisted metabolic flux analysis」(6,7)が挙げられる。前者は、基質の消費・生産物の生成速度を基に細胞内に流入および細胞から流出する代謝産物の流れを表現しており、代謝反応と物質収支に基づく化学量論モデルである。一方後者は、安定同位体基質を細胞に取り込ませ、その培養細胞の菌体（タンパク質）構成アミノ酸の同位体分布を測定する。同位体でラベルされた基質は代謝経路を通じ、最終的に菌体（タンパク質）構成アミノ酸となる。そのアミノ酸は、代謝経路における中間代謝産物の同位体分布を引き継いでいるので、前者の解析に加え、代謝ネットワーク制御機構やバイパス経路を考慮した場合の代謝フラックスも求める事ができる。さらに代謝フラックス解析は、補充経路やバイパス経路による代謝経路の主要な分岐点でのフラックス比を算出する「代謝フラックス比解析」と、代謝全体において物質変換がある経路においてどのくらいの割合で行われているのかを算出する「代謝フラックス分布解析」に分別され、それぞれにおいて実験データと化学量論係数を用いた行列表現で求められる。

このような代謝フラックス解析を本研究に適用し、実際グリセロールがエタノールに微生物変換される際の物質の流れの追跡、各培養条件・経時時間におけるフラックスの分布を調べることで、エタノール変換主要経路を特定し、効率的な分子育種へ発展させる。本実験では、グリセロールからのエタノール生産に向けたエタノール変換プロセスの最適化として、Klebsiella variicola TB-83D株を供試菌体として、上記に示したFBAを用いてグリセロール代謝フラックス分布解析のためのプラットホームを構築し、代謝フラックスと本菌株のグリセロール代謝プロファイルを純グリセロールとバイオディーゼル廃液を用いることで調べた。
### 5.1 純グリセロールを用いた場合の代謝フラックス解析

## 【材料と方法】

## 培養および代謝産物の分析

TB-83D株の培養は、これまで行われていた従来の方法に従い、2％グリセロール基本寒天培地上で生育したTB-83Dのコロニーを、20mlの2％グリセロール基本培地(pH 8.0)で前培養し、同培地に最終 $ OD_{580}=0.01 $ となるように接種した。100mlの5％グリセロール基本培地(各pH)を添加した100ml容ガラスバイアルを用い、ラバーセプタムおよびアルミシールキャップで密栓後、ガスパージのために滅菌した19Gのシリンジをセプタム中央に突き刺し、25℃で静置本培養(微好気培養)を行った。培養は回分培養もしくはpHコントロール下で行い、培養容器はサンプリングの数を用意し各二連で行った。

## サンプリングと乾燥重量およびの代謝産物測定

あらかじめ作製した生育曲線から、サンプリングポイントを設定した。各サンプリングポイントでの100mlの培養液を遠心分離した後、上清をHPLC分析、菌体を乾燥重量測定に用いた。乾燥重量の測定は、遠心分離により得られた菌体を85℃で一晩乾燥させた後に重量を測定した。代謝産物の解析は、Aminex HPX-87H Column (Bio-Rad) を連結したWaters alliance 2695 高速液体クロマトグラフィー (Waters) を用い、移動相に0.01N H₂SO₄を用いて流速0.7 ml/minで行った。

## ゲノムDNAの調製・シークエンス解析および代謝マップ作成

ゲノムDNAの調製は、Marmur法(8)の改良法を用いて行った。Nutrient Broth (NB) 液体培地 100 mlで一晩生育させたTB-83株を集菌し、10.3% Sucrose溶液で二回洗浄した。洗浄後の菌体にTSE-Sucrose溶液(25mM Tris-HCl, 25mM EDTA, 0.3M Sucrose, pH8.0)、40 mg Lysozyme 溶液 (in TSE-Sucrose)と0.5M EDTAを加え、37℃で1時間保温した。そこに、あらかじめ37℃で2時間自己消化させたActinase E溶液 (in TSE 溶液; 25mM Tris-HCl, 25mM EDTA, 75mM NaCl) を加え、37℃で1時間保温した。さらに、10% SDS溶液を加え37℃で30分、5M NaCl溶液を加え37℃で30分保温し、4℃で一晩タンパク質を塩析させた。遠心後の上清に、等量のIsopropanolを添加し穏やかに攪拌した。析出したDNAを、滅菌ガラス棒にて巻き取り、70% エタノール溶液でDNAを洗浄した。遠心後に得られたDNAペレットを、TE-Buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH8.0) に懸濁後、Phenol:Chloroform (Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol=25:24:1) 抽出、再度エタノール沈殿を行い、RNase処理後ゲノムDNAを得た。得られたゲノムDNAを、1×TAE Bufferを用いたアガロースゲル電気泳動に供し、同時に泳動した各濃度のλ-DNAから、おおよそのゲノムDNA濃度を算出した。ドラフトゲノムシークエンスは、Illumina HiSeq 2000 (Illumina, Inc, San Diego, CA) を用いて解析し、54のコンティグで総塩基数約5 Mbのシークエンスデータを得た。得られたドラフトゲノムシークエンス結果とすでに全ゲノム配列が明らかとなっているKlebsiella variicola At-22株のシークエンスデータをふまえ、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)(http://www.genome.jp/kegg/) の代謝マップを参考に、代謝フラックス解析に用いる代謝マップを作成した。
## 【結果と考察】

## pHの影響

まず、代謝フラックス解析を行うに際し使用菌株 TB-83D株の生育曲線を作製した。その結果、菌体は24時間までほぼ指数関数的に増殖し、24時間以降で増殖はほぼ一定になるというデータを得た。これらのことから、生育曲線を3つのPhase (0-12 hour, 12-24 hour, 24-72 hour)に分けた。Phase Iは誘導期および対数増殖期の前半をカバーしており、培養における培地中の溶存酸素の消費を考慮した（すなわち好気培養と同様と仮定）条件とした（レサズリン添加による試験確認済み図5-1）。Phase IIは対数増殖期をカバーしており、Phase Iで培地中の溶存酸素が菌体により消費された後の嫌気条件とした。

図5-1 レサズリン添加による培地中の嫌気度

図 5-2 グリセロール代謝経路

代謝フラックス分布解析は、作製した化学量論式からの量論係数を行列表現化し、HPLCで得られた代謝産物の実測値からの物質収支を用いて求めた。行列計算はMATLAB 7.0 (Mathworks, Inc) を用いて行った。

$$ 計算式は \qquad\boldsymbol{r}^{T}=\mathbf{A}\boldsymbol{\nu}^{T}\qquad で表される。 $$

ここで、 $ r^{T} $ は各代謝産物の比生成速度（mmol/g-CDW/h）(m ×1)、 $ v^{T} $ は各反応のフラックスの要素（ $ n \times 1 $ ）を表し、Aは化学量論係数を含む代謝反応行列を表す（ $ m \times n $ ）。

$$ \begin{aligned}&r^{T}=[r_{1},r_{2},r_{3}\cdot\cdot\cdot\cdot\nu_{7},0,0,0,0]\\ &\\&\nu^{T}=[\nu_{1},\nu_{2},\nu_{3}\cdot\cdot\cdot\cdot\nu_{8},\nu_{9},\nu_{10},\nu_{11}]\\ \end{aligned} $$
下に示した式は、11の代謝経路と11の代謝物質から成るため、Aは正方行列となり逆行列が存在する。

$$ \boldsymbol{r}^{T}=\mathbf{A}\boldsymbol{v}^{T}\ を置き換えると \quad\boldsymbol{v}^{T}=\mathbf{A}^{-1}\boldsymbol{r}^{T}\qquad となる。 $$

また、図5-2に示した11の代謝経路のうち中間代謝産物は3個であるため、自由度は8となる。故に8個の反応速度を測定すれば、他の反応速度は決定できる。測定した代謝産物は、グリセロール比消費速度 $ (r_{1}) $ 、1,3-propanediol生産速度 $ (r_{2}) $ 、ギ酸生産速度 $ (r_{6}) $ 、エタノール生産速度 $ (r_{7}) $ 、酢酸生産速度 $ (r_{8}) $ 、2,3-butanediol生産速度 $ (r_{9}) $ 、乳酸生産速度 $ (r_{10}) $ 、およびコハク酸生産速度 $ (r_{11}) $ である。

これらの測定値を $ v^{T}=A^{-1}r^{T} $ の式を用いて計算することで、他の代謝産物の反応速度を求めた。

結果として、pH制御なしの条件下では、Phase IIで1,3-プロパンジオール、2,3-ブタンジオールおよび乳酸の生成フラックスの増加し、それに伴いギ酸およびエタノールの生成フラックスが減少した。一方、一定pH条件下では、phase IIでpH制御なしと比較すると、エタノールの生成フラックスはほぼ変化がなかったが、乳酸およびギ酸の生成フラックスが、それぞれ約2.5倍、約3倍に増加した。一方、1,3-プロパンジオール、2,3-ブタンジオールの生成フラックスの著しい減少が見られた。

以上のことから、一定 pH 条件下で エタノール生産を行う場合、乳酸の生成を抑えるもしくはギ酸耐性を付与させることが最も効果的であると示唆された。

Metabolic flux distribution of Phase I (0 – 24 hour)

表5-1 代謝フラックス解析結果

反応	代謝フラックス
pH 7.0	pH 8.0	pH 9.0
制御みし	制御あり	制御みし	制御あり	制御みし	制御あり
v1	100 (4.53)	100 (4.88)	100 (4.47)	100 (5.96)	100 (4.55)	100 (5.91)
v2	7.8	9.4	8.1	10.2	7.8	8.7
v3	92.1	90.6	91.9	89.8	92.2	91.3
v4	89.3	89.6	89.6	88.5	89.3	89.9
v5	48.3	-27.0	48.4	3.79	48.6	-50.2
v6	36.6	103.3	38.4	69.7	41.4	125.4
v7	84.5	62.6	87.4	72.1	89.8	64.8
v8	0	4.1	0.2	3.3	0.2	4.2
v9	0	0	0	0	0	0
v10	4.3	9.3	2.5	11.6	3.1	10.5
v11	2.9	1.0	2.4	1.4	1.0	1.4

Metabolic flux distribution of Phase II (24–72 hour)

反応	代謝フラックス
pH 7.0	pH 8.0	pH 9.0
制御みし	制御みり	制御みし	制御みり	制御みし	制御みり
v1	100 (2.43)	100 (6.42)	100 (2.23)	100 (9.35)	100 (2.86)	100 (15.7)
v2	24.9	18.8	26.0	15.4	18.1	15.6
v3	75.1	81.1	73.9	84.6	81.9	84.4
v4	74.2	80.6	73.0	83.9	81.2	83.3
v5	49.8	53.0	37.7	17.5	51.9	15.2
v6	4.3	6.7	17.1	51.9	16.0	48.9
v7	55.7	61.9	69.5	64.5	71.5	61.2
v8	0	0.5	0	4.6	0	3.0
v9	15.2	11.0	14.3	0.32	7.8	0
v10	4.8	9.4	4.0	9.5	4.8	16.2
v11	0.9	0.5	0.9	0.6	0.7	0.1

各代謝産物の前駆体（エタノールならアセトアルデヒド）やグリセロールからホスホエノールピルビン酸に至る中間体は、(擬)定常状態と仮定される。フラックス算出の際に、要素「0」として扱われるため、省略して記載した。フラックス値は、グリセロールの比消費速度を「100」とした時の相対値で表記してある。また、表記した値は、実験は2連もしくは3連で行ったものの平均値で示してある。
これまでに求めてきた代謝フラックス分布解析に、バイオマス生成量も考慮してフラックスの再算出を行うために、従来の化学量論行列の見直しと、実測値を用いての代謝フラックス分布解析を行った。

前項で算出した代謝フラックス分布解析は、代謝量論行列が正方行列となるようにマトリックスを構築して算出しているので、その逆行列と実測値から計算できたが、バイオマス生成量を加えての算出となると、代謝量論行列が正方行列とならず、逆行列がとれないという問題に行き当たった。そこで、化学量論行列を再構築するために、再度化学量論式を書き下ろした。(図5-3)

図 5-3 新たに構築したバイオマス生成を考慮した場合のグリセロール代謝経路

グリセロール代謝における化学量論式は多数報告されているが、その殆どが簡略化モデルであり、詳細なモデルは少なかった。そこで、同位体を用いず詳細な化学量論式および化学量論行列を報告しているSanchezらの方法を参考にした。なお、Sanchezらの報告(9)は、基質がグルコースであるため、基質をグリセロールとしてモディファイした。書き下ろした化学量論式は、20の代謝物質と18の代謝経路を考慮し、NADHの収支を制約条件として加えて作製した。故に20×38の化学量論行列となり、物質収支式はAr=0の式となった。
変数の数=38であり、式=20であるので、自由度は18になり、モデル中に含まれる11の中間代謝産物の比速度は、擬似定常状態であると仮定すると、比速度は0になるので、最終的に自由度は7となった。しかし、測定可能な代謝産物は8個であり、このシステムは冗長な状態（Over-determined）になった。これは、従来行っていた方法のように、逆行列がとれないので、 $ v(t)=(A^{\mathrm{T}}A)^{-1}A^{\mathrm{T}}r(t) $ のMoore-Penrose型の擬似逆行列を用いて算出した。

表 5-2 バイオマス生成を考慮したフラックス解析結果

Metabolic flux distribution of Phase I (0 – 24 hour)

反応	代謝フラックス
pH 7.0	pH 8.0	pH 9.0
制御みし	制御あり	制御みし	制御あり	制御みし	制御あり
v1	100 (4.53)	100 (4.88)	100 (4.47)	100 (5.96)	100 (4.55)	100 (5.90)
v2	2.8	6.9	3.4	3.3	2.8	3.7
v3	3.5	13.5	3.4	9.9	2.9	14.6
v4	94.3	78.5	94.0	87.0	95.4	80.5
v5	95.0	77.4	94.8	87.1	96.5	79.2
v6	95.7	76.4	95.7	87.3	97.6	78.0
v7	69.9	90.7	70.6	83.6	72.9	101.9
v8	19.4	-9.3	18.5	3.5	18.5	-16.1
v9	2.9	-2.0	2.9	1.4	2.6	-3.3
v10	7.2	7.4	5.3	11.6	5.6	7.3
v11	53.4	90.3	55.9	70.4	58.4	105.6
v12	-2.1	6.2	-2.1	3.2	-2.2	7.1
v13	74.8	71.4	77.0	71.6	79.0	77.6
v14	-8.6	5.4	-8.4	-2.1	-8.0	9.0
v15	21.5	-9.6	20.3	5.4	20.2	-17.3
v16	10.1	-2.3	9.1	3.2	9.6	-5.1
v17	44.9	97.3	47.0	70.1	49.7	116.3
v18	2.2	2.0	1.5	1.2	2.7	2.7

Metabolic flux distribution of Phase II (24 – 72 hour)

反応	代謝フラックス
pH 7.0	pH 8.0	pH 9.0
制御なし	制御あり	制御なし	制御あり	制御なし	制御あり
v1	100 (2.44)	100 (6.42)	100 (2.28)	100 (9.35)	100 (2.86)	100 (15.73)
v2	2.4	1.0	2.3	1.4	2.2	0.5
v3	20.0	14.1	17.7	14.6	12.7	15.0
v4	78.5	85.5	81.7	83.8	86.2	84.3
v5	79.4	86.2	83.5	83.5	87.3	84.1
v6	80.2	86.9	85.3	83.3	88.3	83.9
v7	55.5	59.4	65.0	72.1	62.4	73.5
v8	17.9	20.4	13.9	8.9	18.6	8.6
v9	18.1	14.2	16.4	1.6	10.8	1.0
v10	7.8	12.5	6.4	10.8	8.7	17.3
v11	22.7	25.6	35.6	57.5	35.6	53.4
v12	-2.4	-1.8	-3.0	4.2	-2.6	2.7
v13	45.2	51.4	57.0	62.2	59.9	59.4
v14	-8.9	-10.9	-7.7	-4.3	-9.5	-4.2
v15	20.0	24.1	15.1	10.9	20.8	10.9
v16	8.1	10.0	5.0	5.4	8.1	5.7
v17	13.5	16.1	26.2	54.8	25.7	51.2
v18	0.1	0.0	-0.9	0.9	-0.3	1.3

表 5-2 に示した通り、バイオマス生成量を加えて化学量論行列を細分化した場合も同様に、バイオマスを加味しないフラックスの算出（前出）とほぼ同様な結果を得ることが出来た。Phase II において v14 の値がほぼ負となっており、v15 の値が正になっていることが分かる。これは、コハク酸生産はアセチル CoA からではなく、補充経路からであると考えることができる。また、これに伴い v8 のフラックス（すなわち補充経路）が負になっている場合は、v14 の値が正になっているので、コハク酸生産はアセチル CoA 経由で生産されているということがわかる。さらに、補充経路を経てコハク酸生成に至る場合とアセチル CoA を経てコハク酸生成に至る場合を見ると、アセチル CoA 経由でコハク酸生成に至る場合は、ホスホエノールピルビン酸からピルビン酸に至るフラックス（v7）が増大していた (Phase I の pH 7.0 および 9.0 の pH 制御条件下)。

また、酢酸生成フラックス（一部コハク酸も）の値が負になっているのは、生産量が 0（もしくはほぼ 0）であるために計算上みかけのフラックスは負となっていると思われる。

pH 制御条件下の全ての場合において、エタノール生産に重要であると思われるピルビン酸からアセチル CoA へのフラックス (vII) が増加していることもわかった。
- pH 制御におけるエタノール生産の場合 -

・ ギ酸生成フラックス (v17)、乳酸生成フラックス (v10) の増加

・ピルビン酸からアセチル CoA へのフラックス (vII) の増加

・ エタノール生成フラックス (v13) はほぼ変化なし

→ エタノール生産最適 pH 8.0 の場合は pH 7.0 もしくは pH 9.0 と比べてその増加率は顕著。

(1,3-PD 生成フラックス (v3) および 2,3-BD 生成フラックス (v9) は培養進行と共に減少)

以上の結果から、やはり乳酸生成を抑えることが効果的であるとわかった。

### 5.2 BDF廃液を用いた場合の代謝フラックス解析

【材料と方法】

前項に準じた

## 【結果と考察】

基質をグリセロールに代えて、鳥栖環境開発綜合センターの BDF 廃液を用いた。この場合、初期 pH 8.0 では、培養経過に伴い phase II (24 hr – 72 hr) でバイオマス生成量が phase I (0 hr – 24 hr) より減少していた。これは、再度実験を行ったが (バイオマス生成のみの検証)、同様に phase II ではバイオマス生成量が減少するという結果が得られた。一方、pH 9.0 ではこのような現象はみられず、phase I でのバイオマス生成量は pH 8.0 の phase I と比べて 2.3 倍に増加していた (表 5-3)。このことから、バイオマス生成量のみに関しては、pH 8.0 よりも pH 9.0 の方が高いということがわかった。

表 5-3 各初期 pH における微分菌体収量

Differential cell yield (Yx/s) [-]	Biomass (g/L)
pH 8.0	pH 9.0	pH 8.0	pH 9.0
Phase I (0 - 24 hour)	0.038	0.084	0.290	0.175
Phase II (24 - 72 hour)	ND	0.030	0.263	0.428

ND., Not determined
基質消費速度に関しては、phase I で pH 8.0 は pH 9.0 よりも 1.7 倍増加したが、phase II では逆に pH 9.0 が 4 倍増加するという現象が見られた (表 5-4)。今回の BDF を用いた培養により得られた代謝プロファイルのまとめを図 5-4 に示す。

表 5-4 各初期 pH におけるグリセロール消費速度

Substrate consumption rate ( $ r_{S} $ ) [g-substrate/L/h]
pH 8.0	pH 9.0
Phase I (0 - 24 hour)	0.314	0.194
Phase II (24 - 72 hour)	0.077	0.291

A

B

図 5-4 BDF 廃液を用いたバイオマス生成量と、各 phase における主要生成物の生産量

(A) 初期 pH 8.0 (B) 初期 pH 9.0. 生成量のグラフは、上段が phase I、下段が phase II を示し、矢印横の値は実際の生産量 (mmol/L) を表す。

最終的な消費グリセロール量、エタノール生成量、1,3-PD生成量 (72時間後) は pH 8.0 が最も高かったが、ギ酸生成量は pH 9.0 の方が高かった。
### 5.3 純グリセロールと BDF を用いた場合でのフラックス分布の比較

【材料と方法】

前項に準じた

## 【結果と考察】

前項で構築した TB-83D 株のグリセロール代謝マップは、ピルビン酸からアセチル CoA に至る経路でギ酸を生成する経路のみで作製していたので、今回はギ酸を生成しない経路も新たに付け足したものを再構築した (図 5-5)。これにより、化学量論式および化学量論行列も変化するため、これに対応するように再度書き直した。

図 5-5 K. variicola TB-83D 株の再構築したゲノムスケールレベルでのグリセロール代謝マップ
また、従来の計算方法では発酵の各種副生産物が生成されない場合、その比生成速度 (mmol/g-CDW/h) は 0 (ゼロ) として計算を行っていた。今回、各種副生産物が生成されない場合についてはその生産経路を化学量論式から省き (例えば、酢酸を生成しない場合は、酢酸の生成経路を省いて、化学量論行列も酢酸の生成を省いたものを作製) 計算を行った。純グリセロールを用いた場合と BDF を用いた場合では、それぞれの基質の各 Phase で、ある副生産物が生成されないといういくつかのパターンがあり、それらも上記に示した通り生成しないものについては、その生産経路を化学量論式から省いて計算を行った。

純グリセロールを用いた場合、pH非制御条件下で1,3-PDおよび2,3-BDのフラックスの増加が見られ、ホスホエノールピルビン酸からピルビン酸へのフラックスが減少した(表5-5)。一方、pH制御下では非制御下とは逆の現象が見られ、ピルビン酸生成フラックスが著しく増加した。

表 5-5 純グリセロールと BDF を用いた場合でのフラックス分布の比較

Reaction	Flux
without pH control	pH control
Pure-glycerol	BDF-waste	Pure-glycerol	BDF-waste
Phase I	Phase II	Phase I	Phase II	Phase I	Phase II	Phase I	Phase II
r1	100 (4.47)	100 (2.28)	100 (9.49)	100 (6.36)	100 (5.96)	100 (12.22)	100 (5.39)	100 (15.21)
r2	4.3	4.2	1.3	0.8	3.4	0.9	5.0	0.4
r3	8.1	24.1	7.5	23.2	10.2	11.8	9.5	12.1
r4	87.6	71.8	91.2	76.0	86.5	87.4	85.5	87.5
r5	87.6	71.8	91.2	76.0	86.5	87.4	85.5	87.5
r6	87.6	71.8	91.2	76.0	86.5	87.4	85.5	87.5
r7	80.4	53.8	90.5	63.8	78.6	113.3	84.2	84.3
r8	7.2	17.9	0.7	12.1	7.8	-	1.4	3.1
r9	0.0	14.3	0.0	9.0	0.0	0.2	0.0	0.0
r10	2.5	4.2	9.9	17.1	11.6	7.3	10.5	19.3
r11	39.4	18.3	12.5	16.8	-	66.0	-	22.2
r12	38.5	17.1	68.1	20.8	69.8	39.8	77.9	42.8
r13	0.2	0.0	1.9	0.0	3.3	3.5	2.0	0.8
r14	87.5	69.5	77.7	60.8	76.7	49.3	72.0	68.9
r15	-	-	0.5	-	-	26.5	-	-
r16	12.1	35.0	0.2	23.7	14.3	-	1.5	5.4
r17	7.2	17.9	0.7	12.1	7.8	-	1.4	3.1
r18	38.5	17.1	68.1	20.8	69.8	39.8	77.9	42.8
r19	2.3	0.9	1.2	0.5	1.4	0.5	1.2	0.8

Values indicate the average from three independent experiments.

Values given in parentheses indicate specific consumption rate (mmol/g-CDW/h).

BDF 廃液を用いた場合、純グリセロールと比較してフラックス分布は明らかに変化していた。純グリセロールの場合と同様に、pH 非制御下では 1,3-PD および 2,3-BD の生成フラックスの増加に加え、乳酸およびアセチル CoA の生成フラックスの増加が見られた。pH 制御下では、測定した条件のうち培養期間中でのエタノール生成フラックスの減少率は最も低かったが、培養後期には乳酸およびギ酸生成フラックスが、非制御下と比較して約 2.5 倍と約 3.0 倍に増加した。

以上の結果は、BDF 廃液を用いた場合、乳酸生産がエタノール生産に最も関与している可能性を示唆しているため、ピルビン酸における乳酸フラックス比を調べたところ、pH 制御・非制御条件下ともに、純グリセロールの場合と比較して、乳酸生成フラックス比は約3倍高かった。(非制御下：10.6% (純グリセロール) → 31.3% (BDF) 制御下: 6.5% (純グリセロール) → 22.9% (BDF)。このことから、pH 制御下で BDF からエタノール生産を行う場合、乳酸生産の抑制が必要であることがわかった。
### 5.4 参考文献

1. Shimizu H. 2002. Metabolic engineering--integrating methodologies of molecular breeding and bioprocess systems engineering. J Biosci Bioeng. 94(6), 563-73.

2. Stephanopoulos G, Vallino JJ. 1991. Network rigidity and metabolic engineering in metabolite overproduction. Science. 252, 1675–1681.

3. Feng X, Page L, Rubens J, Chircus L, Pakrasi HB, Tang YJ. 2010. Bridging the Gap between Fluxomics and Industrial Biotechnology. J Biomed Biotechnol. 460717.

4. Orth JD, Thiele I, Palsson BØ. 2010. What is flux balance analysis? Nature Biotech. 28, 245-248.

5. Blank LM, Kuepfer L. 2010. Metabolic flux distributions: genetic information, computational predictions, and experimental validation. Appl Microbiol Biotechnol. 86(5), 1243-55.

6. Nanchen A, Fuhrer T, Sauer U. 2007. Determination of metabolic flux ratios from $ {}^{13} $ C-experiments and gas chromatography-mass spectrometry data: protocol and principles. Methods Mol Biol. 358, 177-97.

7. Fischer E, Zamboni N, Sauer U. 2004. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography–mass spectrometry derived $ {}^{13} $ C constraints. Anal Biochem. 325(2), 308–16.

8. Marmur J. 1961. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J Mol Biol. 3, 208-218.

9. Sanchez AM, Bennett GN, San KY. 2006. Batch culture characterization and metabolic flux analysis of succinate-producing Escherichia coli strains. Metab Eng. 8, 209–226
## 6 遺伝子組換え手法による高生産変異株の創出

物質生産において、ある特定の代謝産物の生産量を特異的に増加させたい場合、「開始物質(基質)がどのような代謝経路を経るか？」「それらの物質が最終的にどれくらいの割合で目的産物に変換されるか？」という点を調べ(代謝フラックス解析)、様々な培養条件を調べることにより生産性の増加を目指す。これらは、使用菌株の最適条件(pH・培地成分・酸素の有無)に依存し、菌の増殖と生産を包括的に制御することによる。物質生産性を増加させるにあたり、「副生産物生産性の増加」や「副生産物による生産阻害」といった問題が浮上し(本菌株の場合ギ酸)、それらをピンポイントで抑制させることには限界がある。代謝といえども、実際は酸化還元バランスや遺伝子制御など複雑な要因が関わっており、それらを制御するには遺伝子操作による代謝改変が必要になってくる。

代謝改変（前述のギ酸分解も含めて）を行うにあたり、2つのアプローチがある。1つ目は遺伝子発現による特定酵素機能の増強（遺伝子の足し算）。もう一つは、遺伝子破壊による特定酵素機能の欠失（遺伝子の引き算）がある。前章の代謝フラックス解析により、TB-83Dのグリセロールからエタノール生産についての鍵となる物質は「ギ酸」と「乳酸」であることが強く示唆された。そこで、まず遺伝子発現による特定酵素機能の増強として、ギ酸デヒドロゲナーゼの発現によるエタノール生産中でのギ酸分解を試みた。

ギ酸はグリセロール以外にも、グルコースなどの糖類を発酵原料にした時にも必ず生産される(図6-1)。基本的に発酵は嫌気条件で行われるため、ピルビン酸から生産される代謝産物はほとんどの場合がピルビン酸・ギ酸リアーゼ（PFL）によりギ酸生産を伴って生産されるためである(1,2)。これまでギ酸分解に関しては、ギ酸脱水素酵素もしくはギ酸・水素リアーゼ（FHL）の発現によるギ酸の分解がよく研究されている(3-5)。しかし、これらは菌体（もしくは酵素）を触媒として水素を生産させる研究がほとんどであり(6-8)、阻害効果の抑制といった、培養過程中に目的生産物を生産させながらギ酸を分解させるという試みはなされていない。TB-83Dのギ酸代謝遺伝子は、ギ酸・水素リアーゼとして染色体上に存在しており、制御遺伝子も遺伝子の発現に関与している(9,10)。その中でも特に、転写活性化因子FhlAは、ギ酸分解に重要であるHydrogenase3オペロンおよびギ酸デヒドロゲナーゼFdhFの転写を活性化する(10)。このことから、これらの発現強化はギ酸の分解に効果的であると期待できる。

図 6-1 ギ酸分解関与遺伝子群
2つ目のアプローチである遺伝子破壊に関しては、乳酸脱水素酵素遺伝子をターゲットとすることで、その遺伝子破壊を試み、エタノール生産性を評価する。しかしながら、現段階においてTB-83D株における効率的な遺伝子破壊方法は見いだされていない。遺伝子破壊技術の構築は、代謝改変による目的物質生産性の向上における重要なファクターである。このことから、TB-83D株の遺伝子破壊法を構築し、その技術を適応することで乳酸脱水素酵素遺伝子破壊を試み、得られた遺伝子破壊株のエタノール生産性について評価した。

### 6.1 代謝フラックス解析に基づく代謝キーポイントの策定

本菌株のエタノール生産条件 (pH 8.0 一定条件) でエタノール生産を行うと、エタノールとほぼ等量のギ酸が蓄積することが明らかとなっている。この理由は、ピルビン酸からギ酸を経由してアセチル CoA に変換するピルビン酸-ギ酸リアーゼ活性はアルカリ条件で高く、ギ酸を二酸化炭素と水素に変換するギ酸デヒドロゲナーゼ (ギ酸-水素リアーゼ) 活性は酸性条件で高いことに由来する(11,12)。すなわち、pH 8.0 の一定条件での培養でギ酸の影響を回避するには、アルカリ条件下でギ酸を分解させることが最も効率がよいと思われる。そこで、ギ酸デヒドロゲナーゼを発現させる、すなわち遺伝子増強によるアプローチとして、経時的代謝産物解析によるギ酸濃度の変化挙動を調べ、各培養 Phase でのギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を調べることで、代謝キーポイントの策定を行った。また、遺伝子破壊のアプローチとして乳酸脱水素酵素遺伝子破壊について遺伝子の策定も行った。また、本菌株におけるグリセロール代謝とエタノール生産に関する代謝フローを明らかにした結果から、エタノール生産を最大にするには、乳酸の生成を抑えることが最も有効であるということが分かった。このため、乳酸生成系に関与する遺伝子の破壊を試みることとした。

## 【実験材料と方法】

## TB-83D 株の培養

本培養は1.5 L用ジャーファーメンターを用いた。20 mlの50 μg/mlストレプトマイシン含有2％グリセロール基本培地（pH 8.0）で前培養を行った菌体を、初期OD_{580}=0.01になるように、同培地1 Lに接種し、pHコントロール有と無しの場合で培養を行い、経時的に培養温度、pH、代謝産物解析を行った。

## Total RNA の単離

あらかじめ測定したギ酸濃度のグラフからサンプリング時間を設定し、培養液をサンプリングした。サンプリングした培養液をすぐさま RNAprotect Bacteria Reagent で処理し、RNA の安定化を行った。得られたサンプルを RNeasy mini kit を用いて Total RNA の単離を行い、DNase I で on column digestion を行うことで残存 DNA を分解させた。
## RT (Reverse transcription) -PCR

各 RNA 溶液 1 μg を Random hexamer を用いて Random priming を行い、更に PrimeScript RTase を用いて逆転写を行うことで cDNA を合成した。得られた cDNA をテンプレートに Ex Taq HS DNA polymerase を用いて PCR を行った。また、ゲノム DNA のコンタミネーションのチェックとして、逆転写を行わない RNA サンプルを用いた。

## 乳酸の定量

2％ グリセロール基本培地で培養した培養液を、遠心 (13,000 rpm, 10 min) 後、その遠心上清を基質として、F-kit D-lactate/L-lactate により乳酸定量を行った。

## 【結果と考察】

ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現プラスミドの構築として、まずTB-83D株のドラフトゲノムシークエンスからギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の存在数を調べた所、ゲノム上にギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のホモログが4コピー存在していた(fdhF1, fdhF2, fdhF3, fdhF4)。発現プラスミドを構築するにあたり、まずどのギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が発現しているのかを調べる必要があった。そこで、最初にTB-83D株をpHコントロールなしと有りの条件で培養し、細かく経時的にサンプリングすることでギ酸濃度の挙動を調べた。まず、pHとDCWの挙動を調べたところ(図6-2)、pHコントロール無し(A)ではpHは培養72時間まで減少し、DCWは培養24時間でほぼプラトーに達した。一方、pHコントロール下では、DCWは培養約72時間以降減少する傾向が見られた(B)。さらに、ギ酸濃度はpHコントロール非条件下では培養5時間後から生産し始め、その後約21時間〜30時間後(pH6.5〜6.2)で最大となった(31mM)。その後減少した。一方、pHコントロール制御下では、培養7時間後から生産され始め、48時間前後で最大となったが(100mM)その後の減少率は非制御下と比較して著しく低かった。
B

図 6-2 pH コントロール有と無の場合の、DCW および pH の挙動 A) pH コントロール無 B) 有 C) pH コントロール非制御下でのギ酸濃度 D) pH コントロール条件下でのギ酸濃度