Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## ギ酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子発現

ギ酸濃度の挙動変化から、確かに pH コントロール非制御下では pH 低下と共にギ酸濃度の減少がみられ、制御下ではギ酸濃度は高く減少率も非常に低いことが分かった。前述のとおり、本菌株のゲノム上にはギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のホモログがfdhF1,fdhF2,fdhF3,fF4の4コピー存在していた。実際にギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現に際し、これら4個のホモログの内どの遺伝子を発現させるのか？という問題に行き当たった。このような場合、各培養 phaseで遺伝子の発現みて、どの段階でどの遺伝子が最も発現しているのかどうかを調べる事が常套手段である。そこで、ギ酸濃度の挙動変化 (pH コントロール無) から、5時間 (ギ酸生成開始)、9時間 (ギ酸生成における log phase)、24時間 (ギ酸濃度最大)、48時間 (ギ酸濃度減少段階) の4ポイントをサンプリングポイントとして設定した。

設定した各サンプリングポイントで回収した培養菌体から RNA を抽出し、fdhF1, fdhF2, fdhF3, fdhF4 の mRNA の発現を調べた (図 6-3)。ギ酸濃度上昇段階 (5 時間, 9 時間) では fdhF1 が転写されており、培養が進行し pH が低下し始めると fdhF3 の転写が開始され、ギ酸濃度が最大となる 24 時間で転写量は最大となった。fdhF4 は転写量は低いものの、培養初期から常に発現しており、fdhF2 に関しては全くのサイレント遺伝子であることが明らかとなった。これらの結果から、実際に発現させる遺伝子は、ギ酸濃度が最も高く、pH 減少の log phase に相当する 24 時間で最も転写量の高かった [fdhF3] を用いればよいということがわかった。

図 6-3 各培養 phase から抽出した RNA を用いた時の RT-PCR

## ギ酸脱水素酵素遺伝子アクチベーターの遺伝子発現

ギ酸脱水素酵素遺伝子のアクチベーター (FhlA) は、ギ酸脱水素酵素遺伝子を構成する遺伝子を活性化する。上記で解析した FdhF もそのターゲットの 1 つである。ギ酸から水素生産における論文を調べてみると、数報ではあるが、fhlA の過剰発現により水素生成能が増加したという報告があった。故に、上記の fdhF の発現に次いで、このアクチベーター遺伝子の発現も試みる必要がある。
まず、fhlA の発現 plasmid 構築に当たり、TB-83D 株のドラフトゲノムシークエンスから fhlA の存在数を調べた所、ゲノム上に 1 コピー存在していた。この遺伝子配列から、RT-PCR 用のプライマーを作製した。次に、2% グリセロール基本培地を用いた pH コントロール無しのバッチ培養で TB-83D 株を培養し、逐次 pH をモニタリングしながら、培地中の pH が、pH 8.0、pH 7.5、pH 6.5、pH 6.0 になった時に培養液をサンプリングし、すぐに Total RNA を単離した。得られた Total RNA を用いて mRNA の発現を調べた所、どの pH 段階でも fhlA は発現していた (図 6-4)。このことから、FhlA はアクチベータータンパク質として TB-83D 株内で発現していることが明らかとなった。

図 6-4 各培養 pH における fhlA mRNA 遺伝子の発現

## 乳酸定量

TB-83D 株は嫌気的(微好気的)グリセロール代謝において、副生産物として乳酸を生産する(13)。グリセロールやグルコース代謝において生産される乳酸は、D-型とL-型がある。例えば、Enterococcusなどの乳酸菌はL-乳酸を主として生産する(14)。今後の解析（FBA、転写解析や酵素活性）のため、TB-83DはD-型もしくはL-型のどちらの乳酸を生産するのか？また、その生成比はいくつなのかを調べる必要がある。そこで、得られた遺伝子破壊株の生産する乳酸について調べた。2%グリセロール基本培地で培養を行った各菌体の4日目の培養液を基質に(Filter濾過済み)、D-乳酸およびL-乳酸特異的脱水素酵素を用いて解析を行ったところ、TB-83D株は生成した乳酸の約95%はD-乳酸であり約5%がL-乳酸であった。このことから、遺伝子破壊を行う際は、D-乳酸脱水素酵素遺伝子をターゲットとすればよいことが分かった。

### 6.2 遺伝子増強による生産性の向上

目的遺伝子を持つベクターをプラスミドとして宿主株に導入して発現させる場合、そのプラスミドにコードされた遺伝子が発現しているかどうかの確認は必須であるので、数種類のベクターを構築しFdhFの発現を試みた。それに加え、ギ酸脱水素酵素遺伝子のアクチベーター（fhlA）導入による、ギ酸脱水素酵素遺伝子を構成する遺伝子の活性化も行った。
## 【実験材料と方法】

## ベクターの構築

プロモーターとして pBAD promoter, レポーター遺伝子として GFPuv を保持する発現ベクター pBAD-GFPuv がコードしている Ampicillin 耐性遺伝子の ScaI サイトに、PCR により増幅した pIJ8600 由来の $ aac(3)IV $ 遺伝子(15)を挿入することで、pBAD-GFPuv-aac(3)IV を構築した。以降に構築したプラスミドはこのベクターを基にして作製した。

## fdhF およびfhlA 発現プラスミドの構築 (GFPuv-fusion)

TB-83D のゲノム DNA を鋳型にして KOD plus DNA polymerase を用いて、fdhF および fhlA を PCR により増幅した。得られた PCR fragment を SacI-XbaI で制限酵素消化し、同制限酵素で消化した pBAD-GFPuv-aac(3)IV に連結することにより、pBAD-GFPuv-fhlA-aac(3)IV, pBAD-GFPuv-fdhF-aac(3)IV を構築した。これらのプラスミドは、GFPuv 融合タンパクとして発現する。

## fdhF およびfhlA 発現プラスミドの構築 (GFPuv-mon-fusion)

TB-83D のゲノム DNA を鋳型にして KOD plus DNA polymerase を用いて、fhlF および fhlA を PCR により増幅した。得られた PCR fragment を NheI-XbaI で制限酵素消化し、同制限酵素で消化した pBAD-GFPuv-aac(3)IV に連結することにより、pBAD-fhlA-aac(3)IV, pBAD-fdhF-aac(3)IV を構築した。これらプラスミドは、GFPuv を欠失しているので、GFP 融合タンパク質としては発現しない。

pACYC 系ベクターによるクローニング

(fhlA のクローニング)

pBAD-GFPuv-fhlA-aac(3)IVを鋳型にしてKOD plus DNA polymeraseを用いて、pBAD-GFPuv-fhlA-aac(3)IV上のGFPuv-fhlA部分を増幅した。得られたPCR fragmentをBglII-NotIで制限酵素消化し、BamHI-NotIで消化したpACACDuet-1のMCS1部分にconvertibleで挿入することで、pACYCDuet-fhlAMCS1を構築した。

(fdhF のクローニング)

TB-83D のゲノム DNA を鋳型にして KOD plus DNA polymerase を用いて、fdhF およびその上流・下流を含む領域を PCR により増幅した。得られた PCR fragment を BamHI-PacI で制限酵素消化し、BglII-PvuI で消化した pACACDuet-1 の MCS2 部分に convertible で挿入することで、pACYCDuet-fhlF-MCS2 を構築した。

(fhlA-fdhF のクローニング)
pBAD-GFPuv-fhlA-aac(3)IV を 鋳 型 に して KOD plus DNA polymerase を 用 いて 、 pBAD-GFPuv-fhlA-aac(3)IV 上の GFPuv-fhlA 部分を 増幅 した 。 得られた PCR fragment を BglII-NotI で 制限酵素消化し、 BamHI-NotI で 制限酵素消化した pACYCDuet-fhlF-MCS2 に convertible で 挿入することで、 pACYCDuet-fhlAF を 構築 した 。 上記に 示 した plasmid は、各種制限酵素で 消化 し、 fragment の 数と サイズ で チェック した 。 また、 pBAD-GFPuv-aac(3)IV 由来 の plasmid は、E. coli JM109 に、 pACYCDuet-1 由来 の plasmid は、発現確認のため エレクトロポレーション法 により E. coli BL21(DE3)および TB-83D に 導入 した 。

## 大腸菌およびTB-83D内での発現解析

pBAD-GFPuv-aac(3)IV 由来の plasmid を保持する大肠菌は、Apramycin、pACYCDuet-1 由来の plasmid を保持する大肠菌は、Chloramphenicol 含有 LB 液体培地で 16 時間培養した。培養後の菌体を、各抗生物質を含む LB 液体培地 100ml に接種し、30℃，200rpm で 9 時間培養を行った。なお、誘導剤として pBAD-GFPuv-aac(3)IV 由来の plasmid を保持する大肠菌には、0.2% Arabinose、pACYCDuet-1 由来の plasmid を保持する大肠菌には 1 mM IPTG を添加した。TB-83D 内での発現は 2% グリセロール基本培地を用いて大腸菌の場合と同様に行った。各培地で生育させた培養後の菌体を、9,000rpm で 10min 遠心することにより回収した。発現チェックは、365nm の UV を照射することで、GFPuv の発色により判別した。

## ギ酸脱水素酵素遺伝子(FDH)のクローニング

使用ベクターについては、プロモーターとして pBAD promoter，レポーター遺伝子として GFPuv を保持する発現ベクター pBAD-GFPuv がコードしている Ampicillin 耐性遺伝子の ScaI サイトに、PCR により増幅した pIJ8600 由来の $ aac(3)IV $ 遺伝子を挿入することで構築した、pBAD-GFPuv-aac(3)IV ベクターを用いた。S. cerevisiae のゲノム DNA を鋳型にして KOD plus DNA polymerase を用いて、FDH を PCR により増幅した。得られた PCR fragment を NheI-EcoRI で制限酵素消化し、同制限酵素で消化した pBAD-GFPuv-aac(3)IV に連結することにより、pBAD-Sc-FDH を構築した。この場合、挿入した FDH の発現はベクター側の SD 配列を使用することになる。一方、Native の SD 配列を用いた場合の発現用プラスミドも同様に操作を行い、pBAD-Sc-SD-FDH を構築した。これらプラスミドは、ベクターに含まれる GFPuv 遺伝子を欠失させているので GFP 融合タンパクとしては発現しない。上記に示した plasmid は、各種制限酵素で消化後 fragment の数とサイズでチェックし、さらにシークエンス解析により配列を確認した。また、plasmid は、E. coli DH5α もしくは TB-83D 株に導入した。

## 大腸菌での発現・SDS-PAGE

pBAD-Sc-FDH もしくは pBAD-Sc-SD-FDH を保持する大肠菌は、Apramycin 含有 LB 液体培地で 16 時間培養した。培養後の菌体を、50 μg/ml Apramycin 含有 LB 液体培地 100ml に接種し、30℃, OD_{600}=0.3 程度になるまで培養を行った。その後、誘導剤として最終濃度 0.2% となるように Arabinose を添加し更に約 5 時間培養を行った。培養後の菌体を、6,000rpm で 10min 遠心することにより回収し、10 mM Sodium
phosphate Buffer (pH 7.5)で菌体を洗浄した。SDS-PAGE は、Laemmli らの方法(16)に従い、Stacking gel 4.5%、Resolving Gel 12.5%のアクリルアミド濃度で泳動を行った。

## 代谢产物解析

前培養として、Apramycin 含有 2%GB 液体培地に、各種 plasmid を保持する TB-83D 株を接種し 30℃で 48 時間培養を行った。この前培養液を、同培地 100 ml に $ OD_{600}=0.01 $ になるように接種してブチルゴム栓とアルミシールキャップでフタをし、ガスパージ用に 9G のシリンジを突き刺し、25℃でマグネチックスターラーを用いて穏やかに攪拌しながら本培養を行った。1 日ごとにサンプリングを行い、HPLC にて代謝産物の解析を行った。なお、誘導剤および抗生物質は培養開始時から添加した。

## 【結果と考察】

## 発現確認

各種ベクターを用いて作製した plasmid の詳細と遺伝子マップを図 6-5 に示す。

図 6-5 各種ベクターを用いて作製した plasmid の遺伝子マップ
上記の plasmid を保持する大肠菌を用いて、in vivo での発現を調べたところ、GFPuv 融合のものは発光が確認できた (図 6-6)。

図 6-6 各 plasmid を保持する大腸菌での in vivo 発現解析

次に、各 plasmid を TB-83D にエレクトロポレーションにより導入し、2%グリセロール基本液体培地で培養することにより発現を調べた。その結果、pBAD-GFPuv 由来のものは GFPuv の発光が検出されたが、pACYCDuet-1 由来のものは検出されなかった。この結果に関して、pACYCDuet-1 由来の plasmid を保持する TB-83D 株は、IPTG で誘導がかかっていない事が示唆されたが、寒天培地で発現を調べてみると、発色は弱いものの発現が見られた (図 6-7)。

図 6-7 2％グリセロール基本寒天培地上での in vivo 発現解析
結果として、pACYC由来のプラスミド導入に関しては、寒天・液体の両培地におけるGFPの発現確認からも、発現量は非常に低かったので、発現の効果はほとんど見ることができなかった。しかし、pBAD-GFPuv由来の発現プラスミドを有するTB-83D株については顕著な変化が見られた。

GFP を融合した FdhF 発現株については消費グリセロール, 1,3-PD, エタノール生産量が減少し、乳酸, ギ酸生産量が増加した。一方 GFP 非融合の FdhF 発現株については全てのプロファイルにおいてコントロールと変化がなかった (図 6-8)。

図 6-8 pBAD プロモーターを用いた FdhF 発現株の代謝産物解析

以上の結果をまとめると、まず GFP 非融合の FdhF 発現株においては、コントロールと比較してほとんど変化がなかったので、これは TB-83D 株内で作用していないことを示している。

これらのことより、FdhF は TB-83D 株内で（ギ酸分解に）機能しているとは言い難い。今回導入した遺伝子は、ギ酸-水素リアーゼ（FHL）複合体を構成する酵素遺伝子の1つであるため、これだけを発現させてもギ酸の減少効果は得られないということが分かった。また、TB-83D （Klebsiella 属や Escherichia 属全般）は、染色体上にヒドロゲナーゼ （オペロン）を有しており、今回導入した FdhF と複合体を形成することで FHL 複合体として機能する。従って、これらを総括的に制御（機能）させることは困難であるため、他菌株の NAD 依存性ギ酸脱水素酵素を導入する系も行っていく必要がある。

FhlA 発現株については、GFP 融合・非融合共に 1,3-PD, 乳酸, 酢酸生産量が増加し、ギ酸生成量が大きく減少し親株(TB-83D)と比較してギ酸濃度を約 60%減少させた (図 6-9)。しかしながら、一見ギ酸濃度が減少したように見えるが、それに伴いエタノール濃度も減少しており、それらの濃度はエタノール濃度と同調しているのが分かる (本菌株のグリセロール代謝はピルビン酸ギ酸リアーゼによる経路が主経路であるためエタノールとギ酸濃度はほぼ同じになる)。すわなち、実際は fhlA の導入はギ酸分解に影響していない。以上の結果から、グリセロール代謝中におけるギ酸分解には、異なるアプローチが必要となることが考えられた。
Consumed glycerol

Ethanol production

Formate production

図 6-9 pBAD プロモーターを用いた FhlA 発現株の代謝産物解析

他菌株由来のギ酸脱水素酵素遺伝子のクローニングと発現

ギ酸分解アプローチの1つとして、他菌株由来のギ酸脱水素酵素遺伝子(FDH)の発現によるグリセロール代謝中のギ酸分解を試みた。遺伝子供与体としてFDHを保持するS. cerevisiaeを用いた。まず始めに、PCRにてFDH(1.1 kb)を増幅し、BAD promoterを有しアンピシリン耐性遺伝子をaac(3)IVに置き換えたpBAD-GFPuv-aac(3)IVにクローニングし、「pBAD-Sc-FDH」を構築した。この際GFPuv遺伝子を欠失させ、SD配列はVector側のものを用いるように作製した（図6-10）。

図 6-10 FDH 発現用プラスミド
得られた、pBAD-Sc-FDHをE. coli DH5αに導入し、Arabinose誘導によりE. coli中での発現をSDS-PAGEにより調べた。その結果、FDHに由来する41 kDaを示すバンドはTotal cell，上清，沈殿の全てにおいて検出されなかった(図6-11)。これは恐らくVector側のSD配列を用いたことが原因であると考えられた

図 6-11 SDS-PAGE による FDH の発現確認

pBAD-Sc-FDH を用いたところ発現が確認されなかったので、次に新たに SD 配列を付与したプラスミド pBAD-SC-SD-FDH を構築した。また、シークエンスで配列を確認したところ問題なく FDH が組み込まれていることを確認した (図 6-12)。

図 6-12 新たに SD 配列を付加したプラスミド pBAD-Sc-SD-FDH

このプラスミドも同様に $ E.\ coli\ DH5\alpha $ に導入し、Arabinose 誘導により $ E.\ coli $ 中での発現を SDS-PAGE により調べたところ、Total cell，上清，沈殿に FDH 由来の 41 kDa のバンドを検出することができた(図 6-13)。しかし、発現タンパク質の大部分は不溶性画分(沈殿)に存在していた(恐らくインクルージョンボディ)。酵素活性による FDH の活性は上清画分で見られた(data not shown)ことから(活性は低いが)、この pBAD-Sc-SD-FDH を $ S.\ cerevisiae $ 由来 FDH 発現プラスミドとして以降の実験に用いた。
図 6-13 SDS-PAGE による FDH の発現確認 (新たに SD 配列を付加した場合)

## pBAD-Sc-SD-FDH 導入 TB-83D でのグリセロール代謝中のギ酸分解

上記で作製した pBAD-Sc-SD-FDH を、エレクトロポレーションにより TB-83D 株に導入した。導入菌株を 2% GB 培地にて培養を行い、経時的にサンプリングして代謝産物を解析した (100 ml スケール; バッチ) (図 6-14)。結果として、プラスミドを導入した場合でも Control と比較して最終的な (培養 5 日後) ギ酸の分解に変化は見られなかった。また、乳酸、コハク酸の生産速度が減少したが、これらについても最終的な生産量に変化はなかった。一方興味深いことにプラスミドを導入した場合、最終的なエタノール生産量は増加した。消費グリセロールに関しても、親株と FDH 発現株で変化は見られなかった。これに関しては、通常 TB-83D 株を用いた 100 ml スケール pH 8.0 でのバッチで培養を行うと、培養 72 時間でほぼ半分のグリセロールを消費するが、今回の実験では、通常のグリセロール消費に比べて著しく少なかった。これは、発現誘導剤として添加した Arabinose が原因であると思われる。
図 6-14 Control と FDH 発現株の代謝産物解析

○は TB-83D/pBAD-GFPuv-aac(3)IV、●は TB-83D/pBAD-Sc-SD-FDH を示す

新たに他菌株由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を発現させることでギ酸の分解を試みた。グルコースやグリセロールを基質としてギ酸から水素および二酸化炭素を生産させる場合（すなわちギ酸分解）、一般的によく利用されるのが「Formate-hydrogene lyase (FHL)」もしくは「Formate dehydrogenase (FDH)」の2種類が挙げられる(5)。前者は、E. coliやKlebsiella属細菌をはじめとするグラム陰性細菌が保持しており、酵素はFormate dehydrogenase H(FdhF)およびHydrogenase3 operonと複合体を形成している(5)。酵素反応に関しては、酸性・嫌気条件下で反応が進行する。一方後者は、酵母(Saccharomyces, Candida)などが保持しており1個のFDH単独で作用する。酵素反応に関しては、中性条件下で反応が進行し、含酸素条件下でも反応する(17)。

Formate dehydrogenase H(FdhF) もしくはその活性化因子 FhlA の発現を試みたが、ギ酸の減少は確認されなかった。またこれらの発現は上記に示した通り、酸性条件下で反応が進行するため、実際の pH 制御
下での適応は難しいと思われる（pH制御はアルカリ条件下）。TB-83Dを宿主として発現を試みる際の注意点がいくつかあるが、その中でも本菌株はIPTGによる誘導が効かない点が挙げられる。そのため、必然的にT7やLacといったIPTG誘導型のプロモーターが利用できない。本実験で使用したpBADプロモーターはArabinose存在下で働くプロモーターであるが、このプロモーターを用いた場合、TB-83Dでも問題なく発現する。故にTB-83Dでの発現は、pBADプロモーターが最適であるということがわかった。

### 6.3 遺伝子破壊技術の構築

遺伝子組換えの主たる手法である遺伝子破壊は、代謝改変や物質生産においての強力なツールであるが、適応する微生物によりその手法は異なる。ほとんどの遺伝子組換え技術が確立されている大腸菌の場合、多くの手法が適応可能であり、高い効率で遺伝子破壊が可能である(18)。本菌株を含む一部のKlebsiella属細菌は、遺伝子導入効率と遺伝子破壊の為の組換え効率が著しく低く、遺伝子改変が非常に困難であることが知られている(19)。また、一部のKlebsiella属細菌は、培養過程において多量のLPSを菌体外に生産することが知られている(20)。このLPSは菌体自身をカプセルのように包み込むことで、抗生物質など様々な外部因子に抵抗性を示す(20)。この特徴が、Klebsiella属細菌の遺伝子導入や遺伝子破壊を困難にしていた。K.variicolaに関しても同様にLPSを生産し、遺伝子操作方法が確立されていないことから遺伝子操作は非常に困難であった。このことから、遺伝子破壊によるエタノール生産性の向上に際し、まずこの遺伝子破壊方法を構築する必要がある。そこで、代謝フラックス解析により導き出された乳酸生成に関与するL-乳酸脱水素酵素遺伝子(ldhA)をターゲットとして、遺伝子破壊法の構築を目指した。

## 【実験材料と方法】

## 遺伝子破壊用線状DNA 断片の構築

TB-83D のゲノムシークエンスから、破壊したい遺伝子配列を調べ、破壊したい遺伝子を含む領域を制限酵素サイトを導入したプライマーを用いて PCR により増幅し、反応溶液の一部をアガロースゲル電気泳動により増幅をチェックした。次に、制限酵素消化後 pUC18 に組込み、遺伝子破壊用テンプレートを構築した。構築したプラスミドを鋳型に PCR を行った。その後、反応溶液の一部をアガロースゲル電気泳動により増幅をチェックした。増幅を確認した後、残りの反応溶液に DpnI を加えてテンプレートのプラスミドを除去した後、アガロースゲル電気泳動により再度増幅をチェックした。その後、目的 DNA をゲルから抽出し遺伝子破壊用 PCR 断片とした。全ての PCR は、KOD-plus-DNA polymerase を用いて行った。

## Recombinase 発現プラスミド (pRedET-Tet) の導入

Recombinase 発現プラスミド, pRedET (Tet $ ^{r} $ ) をあらかじめ作製した TB-83D 株のエレクトロコンピテントセルに加え、0.1 cm ギャップのキュベットを用いて、2.0 kV, 5 ms の条件でエレクトロポレーションを行った。パルスをかけた後、直ちに氷冷した LB を加え、30℃ で 3 時間回復培養を行った。その後、20
μg/ml Tetracycline 含有 LB 寒天培地に塗布し、直ちにアルミホイルでシャーレを包み、遮光状態にて 30℃ で一晩培養を行うことにより、TB-83D/pRedET を得た (Tetracycline は光分解を受けるので遮光)。

## 遺伝子破壊用 PCR 断片の導入

あらかじめ 10 μg/ml Tetracycline 含有 LB 液体培地で生育させた TB-83D/pRedET を、同培地 1.4 ml に 30 μl 植菌し、OD580 が 0.2～0.3 程度になるまで 30℃ で培養した (本菌株の場合は 2 時間)。そして、10% L(+)-Arabinose 50 μl を添加し、37℃ で 2 時間 培養を行った。

培養液を、氷上にて5分冷却し、1 mlの冷却滅菌水で3回洗浄後、10% glycerol 50 μlに再懸濁しコンピテントセルを調製した。作製したコンピテントセル50 μlに遺伝子破壊用PCR産物を加え、0.1 cmギャップのキュベットを用いて、2.0 kV, 5 msの条件でエレクトロポレーションを行った。パルスをかけた後、直ちに水冷したLB液体培地を1 ml加え、37℃で激しく攪拌しながら2時間培養し、発現させたRecombinaseによる相同組換えを促した。その後培養液を、任意の濃度で添加した抗生物質を含むLB寒天培地に塗布し、37℃で培養を行い、pRedETを欠落させた。

## 遺伝子破壊の確認

培養後のコロニーを50μlのLB培地に懸濁後、その上清を用いてPCRを行うことにより変異のチェックを行った。またそれと同時に、コロニー懸濁液を任意の濃度で添加した抗生物質を含むLB液体培地に接種して37℃で一晩培養を行い、ゲノムDNAの単離を行った。ゲノムシークエンスから任意の制限酵素サイトを選別し、制限酵素処理を行い、DIG-ELISA法に基づいたサザンハイブリダイゼーションにより変異部分を解析した。

## 【結果と考察】

## ホモロジーアームの影響

組換えに必要なホモロジーアーム (相同領域) の長さは、組換え効率に関係する重要なファクターである(18, 19)。大腸菌の組換えの場合、そのホモロジーアームの長さは10 bp～50 bp程度で効率よく組換えが可能である(21)。しかし、Klebsiella属細菌の場合、ホモロジーアームを100 bpにしても組換えがほぼ起こらない(19)。

遺伝子破壊に際し、ホモロジーアーム長の影響をより詳細に調べるために、ldhA の左断片 (BamHI-PstI)、aac(3)IV (PstI-HindIII)、ldhA の右断片 (HindIII-EcoRI) を PCR によって獲得した後、Multi fragment ligation により pUC18 に連結し、「pUC-ldhAaac(3)-BE」を得た。このプラスミドを鋳型に ldhA の両側のホモロジーアームを 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp となるように DNA 断片を調製した（図 6-15）。それら得られた断片を電気泳動して増幅を確認した後（図 6-16）、DpnI 消化を行うことで残存するプラスミド DNA を完全に除去した。
図 6-15 ホモロジーアーム長の検討のための増幅した PCR 断片の模式図

図 6-16 遺伝子破壊に用いた各 Homology arm を含む PCR 断片と増幅確認

各 PCR 断片はゲルから精製し、DpnI 処理したものを使用した。

得られた各 DNA 断片をコンピテントセルに各 100 ng となるように加え、Red/ET 法による遺伝子破壊を行った。それに加え、培地成分の検討も同時に行った。ldhA はグリセロール代謝に関連している酵素遺伝子であるので、培地中にグリセロールを添加することで、組換え効率の向上を狙った。結果的に、ホモロジーアームの長さを変えた全ての場合において組換えが正確になされていることを PCR およびサザン解析により確認した (図 6-17)。得られた株を「TB-83D ΔldhAApr」とした。
M: Smart ladder (0.2 – 10 kb) ①: Homology arm length 50 bp (Primers: ldhA-up-F + aac(3)IV-Hind-R) ②: Homology arm length 100 bp (Primers: ldhA-up-F + aac(3)IV-Hind-R) ③: Homology arm length 200 bp (Primers: ldhA-up-F + aac(3)IV-Hind-R) ④: Homology arm length 300 bp (Primers: ldhA-up-F + aac(3)IV-Hind-R) ⑤: Homology arm length 400 bp (Primers: ldhA-up-F + aac(3)IV-Hind-R) ⑥: Homology arm length 500 bp (Primers: ldhA-up-F + aac(3)IV-Hind-R)

M: Smart ladder (0.2 – 10 kb) ①: Homology arm length 50 bp (Primers: aac(3)IV-Pst-F + ldhA-down-R) ②: Homology arm length 100 bp (Primers: aac(3)IV-Pst-F + ldhA-down-R) ③: Homology arm length 200 bp (Primers: aac(3)IV-Pst-F + ldhA-down-R) ④: Homology arm length 300 bp (Primers: aac(3)IV-Pst-F + ldhA-down-R) ⑤: Homology arm length 400 bp (Primers: aac(3)IV-Pst-F + ldhA-down-R) ⑥: Homology arm length 500 bp (Primers: aac(3)IV-Pst-F + ldhA-down-R)

図 6-17 サザン解析による変異の確認
このことから TB-83D 株の遺伝子破壊は 50 bp のホモロジーアームで可能であることがわかった。これまでに Klebsiella 属細菌の遺伝子破壊において、約 100 bp のホモロジーアームでの組換え率はゼロ (すなわち組換えは起こらない) であると報告されている (19)。それと比較しても、本菌株は 50 bp のホモロジーアームで充分な組換えを生じさせることを立証することができた。また、培地中へのグリセロールの添加については、いずれの場合も添加に影響はなかった (表 6-1)。

表6-1 各ホモロジーアーム・グリセロール添加におけるコロニー数 (培地1枚あたり)

Homology arm length (bp)
50	100	200	300	400	500
LB·Apr(10)	364	1212	>1,500	>1,500	>1,500	>1,500
LB·Apr(20)	352	1296	>1,500	>1,500	>1,500	>1,500
LB·Gly·Apr(10)	492	960	>1,500	>1,500	>1,500	>1,500
LB·Gly·Apr(20)	295	748	>1,500	>1,500	>1,500	>1,500

コンピテントセルに各 DNA 断片 100 ng を加えて TB-83D 株に導入後、1 ml の LB 培地で回復培養を行い、寒天培地 1 枚あたりその内の 100 μl を塗布して検出できたコロニー数を示している。

本研究で確立した遺伝子組換え法のポイントを以下に列記する。

・本菌株は多量のリポ多糖(LPS)様物質を細胞外に生産するため、コンピテントセル作製は非常に難しい。これまでに、本菌株のコンピテントセル調製はE. coliの場合と同様に100 ml スケールの培養液から低速回転で集菌操作を行っていたが、菌体が沈殿せず、洗净の段階でLPS様物質除去と共に菌体も一緒に無くなってしまう。そこで、数々の条件を試したところ、13,000 rpmの高速回転で遠心時間8 minとすることが最適である（すなわち、若い細胞をなるべく集めることが良い）。

・本菌株は、E. coli と比較して細胞倍加時間が長いため、ある程度の培養時間が必要である。これは、上記に示したように遠心・洗浄操作中に菌体が消失してしまうために、ある程度菌体を増やして行っていたためである。何とかコンピテントセルを調製し、エレクトロポレーションにより DNA を導入してみたが、得られるコロニーはごく僅かであった (形質転換効率が非常に低い)。そこで、若い細胞を効率よく集めるという方法に発想を転換させた。様々な培養条件により実験を試みたところ、Arabinose 誘導時間も含めて約3時間が効率よく形質転換体を得られた(初期培養2時間+誘導剤添加後1時間)。

・ ホモロジーアームの長さと Arabinose 誘導後の培養時間についても実験を行った結果、ホモロジーアームの長さ 50 bp～100 bp の時は、Arabinose 添加後の培養を 2 時間にしないと組換えは全く起こらない
(コロニーが1つも出現しない)。200 bp以上のホモロジーアームの長さならば、Arabinose添加後の培養は1時間で充分であった。

• DNA 断片挿入後の選択培地に関して、プラスミド挿入による相同組換え(Homologous recombination)の場合、添加する抗生物質濃度は非常に弱いレベルで選択する。本菌株の場合、抗生物質濃度は通常使用するレベルの濃度で問題ない。また、培地は常に要時調製するべきで、古い培地を使用するべきではない。

以上の結果から、本菌株の遺伝子破壊が可能となり、代謝改変を的確に迅速に行えるようになった。今後、代謝改変によるエタノール以外の有用物質生産も可能となったことは大きな意味を持つ。

### 6.4 遺伝子破壊による生産性の向上

得られた L-乳酸脱水素酵素遺伝子破壊株（TB-83DΔldhAApr）を用いてエタノール生産性と代謝変化をTB-83D株と比較することで評価した。

## 【材料と方法】

菌株·培地·培養条件

使用菌株は、K. variicola TB-83D を親株として用いた。培地は、グリセロール(BDF)基本培地を用い、必要に応じて Apramycin もしくは Kanamycin を最終濃度 50 mg/L となるように添加した。

代謝産物解析は 100 mM グリセロール(BDF)基本培地 20ml であらかじめ 48 時間 前培養を行った菌体を遠心により回収後、0.85% NaCl で洗浄したものを、100 ml の同培地に最終 OD600=0.05 になるように接種した。微好気(嫌気)培養の場合は、125 ml 容バイアル瓶を用いてテフロンコートラバーセプタムおよびアルミキャップで密栓し、25℃で穏やかに攪拌しながら培養した。好気培養は、500 ml 容バッフル付き三角フラスコを用いてシリコンキャップで蓋をし、30℃, 200 rpm で激しく攪拌しながら培養を行った。

## 代谢产物解析

TB-83D および乳酸脱水素酵素遺伝子破壊株の代謝産物解析は、HPLC により行った。また、生成された D-乳酸および L-乳酸量は F-kit を用いた。

## 【結果と考察】

これら乳酸を生成しない破壊株がグリセロール代謝およびエタノール生産にどのような影響を及ぼすか調べるため、微好気もしくは好気条件で代謝産物を調べた。TB-83D 株の生育・pH 変化・代謝産物について、生育は培養24時間で急激に増加しそれ以降はプラトーになり(培養が進むにつれて減少していつ
た)、それに伴い pH も同様に生育と共に減少し、培養 24 時間で 6.1 まで減少した後にプラトーになった。これは、微好気(嫌気)および好気条件でも差はなかったが、BDF を用いた方が純グリセロールを用いた場合より ldhA 破壊株で最も生育が良かった (図 6-18)。

図 6-18 純グリセロールと BDF で培養した TB-83D と ldhA 破壊株の微好気・好気条件下での生育と pH

上記のように ldhA 破壊株に関しては、生育・pH については TB-83D 株と同様の挙動を示したが、最終代謝産物に違いが見られた (図 6-19)。まず、純グリセロールを用いた場合、ldhA 破壊株では、乳酸生産量が TB-83D と比較して著しく低く、最終代謝産物は 1,3-PD であった。特にエタノール生産量については、TB-83D よりも増加した。グリセロール消費については、TB-83D 株は培養 48 時間までに全グリセロールを消費できなかったのに対し、ldhA を破壊株は培養 32 時間で全てのグリセロールを消費した。このことから、乳酸脱水素酵素遺伝子の破壊は、グリセロール消費には影響を与えずむしろ消費量が促進していることが分かった。

図 6-19 純グリセロールで培養した TB-83D と ldha 破壊株の代謝産物解析
一方、BDF を用いた場合も純グリセロールと同様な変化が見られた（図 6-20）。グリセロール消費量に関して TB-83D 株は培養 48 時間までにグリセロールを完全消費できなかったが、ldhA を破壊は 48 時間で完全消費した。エタノール生産性も純グリセロールの場合と同様に増加した。

図 6-20 BDF で培養した TB-83D と ldha 破壊株の代謝産物解析

以上の結果から、乳酸脱水素酵素遺伝子を破壊することで、グリセロール消費率が増加した結果エタノール生産性が向上するということが明らかとなった。

### 6.5 参考文献

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## 7 フィージビリティースタディー

これまでの各種検討結果より、Klebiella variicola TB-83D 株による BDF 廃液からのグリセロール生産性の向上に関しては、一定の成果が得られた。今後実用化を視野に入れた検討を行うには、実際にビジネスとして立ち上げた場合のプロジェクトの実現可能性を事前に調査・検討する必要がある。さらに、一定のモデルを設定し、プロジェクトの妥当性を評価することによって、研究目標を具体的数値（生産量等）として設定することが望ましい。

BDF は、一般的に国内では廃油等から廃棄物処理業者等が生産しているケースが多い。一方、海外においては主に発展途上国等によって油糧植物から大規模に生産されている。これらの業種では前者では生ゴミからのエタノール生産やメタン発酵、後者では植物残渣からのエタノール生産が並行して稼働している場合が多い。パイロットスケールの実証試験を行った（有）鳥栖環境開発綜合センターは廃棄物処理業を主体とし、廃油からの BDF 生産、及びメタン発酵による廃棄物処理を既に行っている。そこで、まずはここに BDF 廃液からのエタノール生産を組み込むことを想定してフィージビリティスタディーを行い、その結果を基に当研究の目標について明確にしておくこととした。

### 7.1 調査方法と前提条件

## 調査方法

実際の調査は（有）エル・シー・エーに依頼した。文献およびインターネット上の各種情報を調査して、基本的な各種の値を求めた。またこれらの数値をもとに本事業の収益を試算した。廃食用油と廃グリセロールの回収範囲の拡大の拡大については、有限会社鳥栖環境開発綜合センターへのヒアリング調査を行った。さらに関東近辺の廃棄物処理業者へのヒアリング調査も行って、廃食用油と廃グリセロールの委託処理費の実態も把握した。

## 前提条件

本事業の経済性評価にあたって、いくつかの前提条件を定めた。本事業を行う主体は、実証試験での協力者である有限会社 鳥栖環境開発綜合センター（佐賀県鳥栖市）とした。有限会社 鳥栖環境開発綜合センターは廃食用油の回収と BDF 製造を行っている。またメタン発酵装置、活性污泥処理槽も有しており、原料である廃グリセロールと培地となるメタン発酵の消化液の調達が容易である。

BDF 製造およびメタン発酵を含めた本事業のプロセス概要は図7-1に示すものと仮定した。現在、有限会社鳥栖環境開発綜合センターでの廃グリセロール処理量は年間12kLであり（年間廃食用油処理量80kL、この15％が廃グリセロール）、グリセロール濃度を40％として、年間4,800kgのグリセロールを処理するものとした。エタノールへのモル変換効率は100％として、エタノール2,400kg(=3,038L、比重0.79)生産される計算となる。グリセロールからはエタノールの他にギ酸が副成する。ギ酸はメタン発酵の良い基質となるので、エタノールを蒸留した後の残渣はメタン発酵槽に添加する。
## 基本的な数値

前提条件の処理量をもとに、装置の概略を図7-2のように仮定した。年間廃グリセロール処理量12kLを20倍希釈して処理を行う。年間稼働日数を200日、発酵槽の滞留時間を4日とした。また1日の稼働時間は6時間とした。製品であるエタノールの販売価格は、化学工業統計月報（経済産業省、添付資料参照）の2008-2012年の平均値では、130円/L程度である。ただし生産されたエタノールをガソリンへ混合することを前提とした場合には、ガソリンの税抜き価格である96-106円/L（2013当時）を参考にする必要がある。これらを踏まえて、本報告書では100円/Lを基本とした。

なお、資源エネルギー庁の資料によるとでは、バイオエタノールの価格は現状（2012年）で100-150円/Lであり、将来的（2015年）な目標値を40円/Lとしている。この資料ではセルロースを原料とするエタノール生産が検討されており、内訳は原料コスト14-40円/L、酵素（セルラーゼ）の製造コスト44-60円/L、転換コスト（プラント運転費、設備投資は含まれていないと考えられる）40-50円/Lとなっている。本事業では原料である廃食用油は無償回収、廃グリセロールは処理委託費を受け取っての回収を前提としている。また培地成分は、メタン発酵の消化液をそのまま用いるので、コストにならない。当然のことながら酵素（セルラーゼ）の製造コストも不要である。従って本事業においては、転換コストも0円/Lとなる可能性が高いが、試算においては資源エネルギー庁資料と同等の40円/Lを用いた。
図7-1 本事業のプロセス概要
図 7-2 基本的な装置概要
廃食用油および廃グリセロールについて、関東近郊の廃棄物処理業者を対象にヒアリング調査を行った。廃棄物の委託処理費は処理量や回収地域などの諸条件によって大きく異なる。全体的な傾向を把握するため、大手の処理業者のみを対象として調査した。

有限会社 鳥栖環境開発綜合センターに対してもヒアリングを行い、①鳥栖市近郊での廃食用油および廃グリセロールの委託処理費用、②同社で回収可能と考えられる地域、について調査を行った。また廃油回収業者の団体として、全国油脂事業協同組合連合会の情報も紹介された。

### 7.2 試算方法

製造にかかるコストとしては、設備建設費、運転人件費、転換コスト（運転にかかる電気、水道等）を想定した。

設備建設費は培養槽メーカーである株式会社プリスに初期的な見積もり作成を依頼した。設備規模に対応した設備建設費は0.7乗則を適応した。また設備建設費については、一定割合の公的な資金援助があるものとした。

運転人件費は年収4,000千円（保険等の会社負担を考慮して年間8,000千円）の運転員1名分とし、寄与率は10％とした。

転換コストは資源エネルギー庁資料（2012年）の40円/Lとした。ただし本事業では原料である廃食用油は無償回収、廃グリセロールは処理委託費を受け取っての回収を前提としているので、原料費は考慮する必要がない。また培地に掛かる費用についても、廃グリセロールをメタン発酵消化液で希釈したものをそのまま培地として用いるので、これも考慮しない。従って転換コストはほとんど0になる可能性もある。

収入は、廃グリセロールの委託処理費、生産物であるエタノールの販売売上とした。

### 7.3 ヒアリング調査結果

## 全国的な廃食用油の回收状況

国内の食用油の消費や廃油回収について調査した。

国内では年間約241万tの植物油が消費されている。これは国民1人当たり19.1kgとなる。全国油脂事業協同組合連合会の調査によると使用後の食用油は年間約37-41万t排出されており、内訳は事業系が約27-29万t、一般家庭からの排出量は約10-12万tである。国内での年間の植物油消費量約241万tに対