Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## 1 研究背景と目的

### 1.1 研究背景

バイオディーゼル燃料(BDF)は、軽油の代替燃料として用いられるバイオマス液体燃料であり、動植物油脂を原料に作られる。また、含酸素燃料であることから燃焼効率が高く、一酸化炭素や黒煙粒子の低減にも効果的であるうえ、硫黄成分を含まないため、排気ガス中の硫黄酸化物(Sox)を低減し、大気汚染防止、地球温暖化抑制に効果的である。我が国においては、廃食用油を原料とした BDF 生産が自治体やNPOが中心となって実施されている。製造された BDF を市営バスなどの燃料に使用することで、地域内での循環型社会形成を目指した取り組みが行われている(1)。日本国内の廃食用油発生量は年間45万トンであるが、このうち18万トンについては未利用である。この未利用分を BDF 生産に用いることが可能であれば、日本における BDF 生産普及の潜在的可能性はあると考えられる。現在、BDF をディーゼルエンジンに供給するため法整備等が進められているとともに、東南アジアで生産されているパームオイルからの BDF 生産・輸入も検討されている(2)。

BDF の中で現在最も一般的なものは動植物油脂を原料に作られる脂肪酸メチルエステル(FAME)であり、油脂の主成分であるトリグリセライドをアルカリなどの触媒存在下でメタノールとエステル交換反応させる方法が用いられている(3,4)。製造における反応過程を図1-1に示す。この反応において、副生成物としてグリセロールが生じる(5,6)。グリセロールは精製して医薬品の原料として売却することもできるが、精製にかかるコストは莫大であるうえに、グリセロール市場は供給過剰状態であるため、非常に安価でしか取り引きされない。また、国内の BDF 製造は主に廃油を使用しているため、その用途はほとんどない。さらに、アルカリ触媒法による BDF の製造は高温高压条件が不要で簡便なため多用されているが、その廃液は高アルカリ性であるため、廃棄や再利用の妨げとなっている。これらのことから、廃グリセロールは再利用されることなく、コストをかけて焼却処分されているのが現状である。

図1-1 バイオディーゼル燃料の製造過程

BDF の製造において副生される廃グリセロールは、原料油脂に対し約 10% 生産される。全世界の BDF 生産量は、2004 年の 20 億 L から 2012 年には 225 億 L と 10 倍以上も増加しており (7)、この BDF 製造増加に伴い廃グリセロールの世界生産量は年間 200 万トンを超えた。このように国内及び世界各国での BDF 生産は今後さらに拡大すると見込まれているため、廃グリセロールの有効利用は重要な課題である。
### 1.2 研究目的

廃グリセロールの利用方法として、微生物を活用した廃グリセロールからの有用物質生産に関する研究が進められている。現在までに、微生物によるグリセロールからの物質生産として、1,3-プロパンジオール、1,2-プロパンジオール、ブタノール、エタノール、コハク酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、ポリヒドロキシアルカン酸など、様々な物質に関する報告がある(8,9)。なかでも、1,3-プロパンジオール(1,3-PD)に関しては、主に高機能性ポリマーの原料として古くから研究が行われており、BDF廃液を用いたバイオプロセスによる1,3-PDの大量生産が検討されている(8)。しかし、上記に挙げた1,3-PDなどの生産物質の多くはプラスチックなどのポリマー原料としては有用であるが、燃料であるBDFとは流通経路が異なり、BDF生産プラントとの併設は現実的ではない。このため、施設外への危険な高アルカリ性廃液の移動が必要で、安全管理の点から問題が多い。そこで本研究では、BDF廃液からのバイオエタノール生産を試みる。エタノールはBDFと同様、次世代環境調和型燃料として高い需要があり、両者共に自動車の燃料として流通経路も共通している。また、メタノールの代替としてBDF生産にも使用可能である(10)。BDF生産に関して一般的には、国内では廃油等から廃棄物処理業者等が生産しているケースが多い。一方、海外においては主に発展途上国等によって油糧植物から大規模に生産されている。これらの業種では、前者では生ゴミからのエタノール生産やメタン発酵、後者では植物残渣からのエタノール生産が並行して稼働している場合が多い。ここにBDF廃液からのエタノール生産を組込むことは、他の物質を生産させる場合と比較して初期投資や販路の開拓に関わるコスト低減に繋がり、導入の促進が行いやすいことが考えられる。特に、前者の廃棄物処理施設においては地域規模でのゼロエミッション化につながり、廃棄物をほとんど出さない生産現場でのバイオマスエネルギーの低負荷・高効率生産が可能となると考えられる。

本研究では BDF 廃液のエネルギーとしての再生技術の確立を最終目標として、BDF 廃液からのバイオエタノール生産を試みる。研究代表者はこれまでにグリセロール資化性のエタノール生産菌である Klebsiella variicola TB-83D 株を取得しており、本研究ではこの菌株を使用することとした。TB-83D 株は、グリセロールから主生産物としてエタノールを、副生産物として 1,3-PD や乳酸、酢酸、ギ酸などを生産することが分かっている。次に、この菌株の大きな特徴として、弱アルカリ条件下及び実際の BDF 廃グリセロールを用いた場合に高いエタノール生産を示すことが挙げられる。これまでのグリセロールからのエタノール生産の報告を見ると、その多くにおいて培地 pH は中性で行われている (11, 12)。BDF 廃液は高アルカリ性であるため、そのまま使用しては培地がアルカリ性になってしまい、中和に大量のコストが必要となる。それに対して、本菌株はアルカリ条件で高い生産性をもつため、BDF 廃液の中和コストの削減ができるというメリットを持つ。また、基質として純グリセロールと BDF 廃グリセロールを比較すると、一般的に BDF 廃液では生育や物質生産量阻害が見られることが知られている (13, 14)。対して本菌株は、実際の BDF 廃液を用いた場合に高いエタノール生産を示す。これらの理由から TB-83D 株は廃グリセロールからのエタノール生産の実用化に当たり、大きなメリットを持っている。

### 1.3 参考文献

1. 環境省「一般廃棄物に係る新基準策定調査報告書」http://www.env.go.jp/recycle/report/h19-01/
2. 環境省「平成21年度中国における都市交通環境汚染対策コベネフィット CDM 事業化調査業務報告書」

http://www.env.go.jp/air/report/h22-01/index.html

3. Eggersdorfer M, Meyer J, Eckes P. 1992. Use of renewable resources for non-food materials. FEMS Microbiol. Rev. 103, 355-364.

4. Chowdury J, Fouky K. 1993. Vegetable oils: from table to gas tank. Chem. Eng. 100, 35-39.

5. Vicente G, Martinez M, Aracil J. 2004. Integrated biodiesel production: a comparison of different homogeneous catalysts systems. Bioresour. Technol. 92, 297-305.

6. Du W, Xu Y, Liu D. 2004. Lipase-catalysed transesterification of soya bean oil for biodiesel production during continuous batch operation. Biotechnol. Appl. Biochem. 38, 103-106.

7. REN21 Renewables Global Status Report 2013(自然エネルギー世界白書) http://www.ren21.net/

8. Clomburg JM, Gonzalez R. 2013. Anaerobic fermentation of glycerol: a platform for renewable fuels and chemicals. Trends Biotechnol. 31, 20-28.

9. Dobson R, Gray V, Rumbold K. 2012. Microbial utilization of crude glycerol for the production of value-added products. J. ind. Microbiol Biotechnol. 39, 217-226

10. Zanin FG, Macedo A, Archilha MV, Wendler EP, Dos Santos AA. 2013. A one-pot glycerol-based additive-blended ethyl biodiesel production: a green process. Bioresour. Technol. 143, 126-130.

11. Choi WJ, Hartono MR, Chan WH, Yeo SS. 2011. Ethanol production from biodiesel-derived crude glycerol by newly isolated Kluyvera cryocrescens. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 1255-1264.

12. Durnin G, Clomburg J, Yeates Z, Alvarez PJ, Zygourakis K, Campbell P, Gonzalez R. 2009. Understanding and harnessing the microaerobic metabolism of glycerol in *Escherichia coli*. Biotechnol. Bioeng. 103, 148-161

13. Sarma SJ, Brar SK, Bihan YL, Buelna G, Soccol CR. 2014. Mitigation of the inhibitory effect of soap by magnesium salt treatment of crude glycerol – A novel approach for enhanced biohydrogen production from the biodiesel industry waste. Bioresour. Technol. 151, 49-53.

14. Nguyen ADQ, Kim YG, Kim SB, Kim CJ. 2013. Improved tolerance of recombinant Escherichia coli to the toxicity of crude glycerol by overexpressing trehalose biosynthetic genes (otsBSA) for the production of $ \beta $ -carotene. Bioresour. Technol. 143, 531-537.
15. Liu X, Jensen PR, Workman M. 2012. Bioconversion of crude glycerol feedstocks into ethanol by Pachysolen tannophilus. Bioresour. Technol. 104, 579-586.

16. Oh BR, Seo JW, Heo SY, Hong WK, Luo LH, Joe MH, Park DH, Kim CH. 2011. Efficient production of ethanol from crude glycerol by a Klebsiella pneumoniae mutant strain. Bioresour. Technol. 102, 3918-3922.

17. Oh BR, Seo JW, Heo SY, Hong WK, Luo LH, Kim S, Kwon O, Sohn JH, Joe MH, Park DH, Kim CH. 2012. Enhancement of ethanol production from glycerol in a Klebsiella pneumoniae mutant strain by the inactivation of lactate dehydrogenase. Process Biochem. 47, 156-159.
## 2 培養方法の検討

### 2.1 休止菌体法による生産の検討

微生物による発酵生産プロセスは発酵法と休止菌体法に大別される。前者は微生物が増殖する過程の機能を利用するため、菌体増殖を伴うのが特徴であり、複雑な代謝経路を利用できる代わりに増殖するための炭素原・エネルギー源を必要とする。一方、休止菌体法では増殖の停止した、いわゆる休止状態にある微生物内部の酵素活性を利用するため、増殖のための原料は不要であるが、複雑な反応は困難である。本研究課題であるグリセロールからのエタノール生産では、その代謝ステップは単純であるとはいえないが、アミノ酸発酵などの発酵生産ほど複雑ではない。そこで、本プロセスに休止菌体法が適用できるか検証を行った。

なお、本研究では当初 Klebsiella variicola TB-83 株、84 株を用いることとしたが、検討の結果、TB-83 株の方が TB-84 株と比較して高い生産速度を示し、かつ乳酸や 1.3-プロパンジオール等の副産物をほとんど生じないため、エタノール生産には最適であると判断した。さらに、本菌株のストレプトマイシン耐性変異株である TB-83D 株が、高いエタノール耐性（7%程度）と、親株に対して若干高いエタノール生産性を持つことが明らかにされている。そこで、今後の検討には特に必要のない限り TB-83D 株を用いることとした。

## 【材料と方法】

## 供試菌株

供試菌株としては Klebsiella variicola TB-83 株のストレプトマイシン耐性株である TB-83D 株を用いた。本菌株は親株（5%）と比較して高いエタノール耐性（7%）を有している。Nutrient Broth (NB) 寒天培地で前培養した TB-83D 株 1 白金耳を、生理食塩水 1mL に入れよく攪拌した。この菌液 500 μL を 1% グリセロール基本培地（表 2-1）200mL の入った三角フラスコに 2 つにそれぞれ移し、25℃で静置培養した。2 日間培養後、50mL 容ファルコンチューブを用いて遠心して上清を除き、菌体を回収した。その後、各種緩衝液で 1 回洗浄し、同緩衝液に懸濁して休止菌体を作成、4℃で保存した。

表2-1 グリセロール基本培地

(g/L)
Glycerol	10.0
$ KH_{2}PO_{4} $	10.0
$ NH_{4}Cl $	1.0
Casamino acid	1.0
Yeast extract	0.5
次に、2%のグリセロールを含む100mMの各種緩衝液30mlに上記菌体をOD_{580}で4.0となるように加え、25℃で静置培養した。なお、初期pHはすべて9.0とした。その後、経時的に培養液を1mL採取し、生育量(OD_{580})、pHの測定および上清をHPLC分析に供した。実験は3連で行った。

## 【結果と考察】

緩衝液としてリン酸カリウム、リン酸カリウムーリン酸ナトリウム、MOPS、炭酸緩衝液を用い、休止菌体によるエタノール生産について検討した。また、緩衝液の代わりにグリセロール濃度を2%とした基本培地を用いたものについても同様に検討を行った。

図 2-1 各培養液における生育量、pH、グリセロール残存量、エタノール生産量の経時変化

図2-1に示したように、休止菌体反応によるグリセロール資化およびエタノール生産が確認された。しかし、エタノールの生産は最初の1日で急激に上昇し、その後はあまり増えなかった。なお、これまで行ってきた通常の培養法による生産(グリセロール濃度を2%とした基本培地を用い、植菌量を $ OD_{580}=0.01 $ に調整)では3日目でグリセロール消費量約120mM、エタノール生産量は約90mMとなることが確認されている。このことから、休止菌体法によるエタノール生産性の増大は困難であると考えられた。本菌株によるグリセロールからのエタノール生産はエネルギー生成系であるため、休止菌体ではエネルギーバランスに偏りが生じ、生産が低下したと考えられる。反応初期において生産が認められたのは、おそらく菌体調製時の培地成分の持ち込み、または菌体内の貯蔵物質による増殖が起こったものと思われる。以上の結果より、本プロセスにおいては休止菌体法ではなく、菌体増殖を伴う発酵法が適していると考えられた。
さらに、今回基本培地を用いた系に着目すると、初期$\mathrm{OD}_{580}$を4.0と、植菌量をこれまでの400倍に増大させたにも関わらず、グリセロール消費量・エタノール生産量はむしろ低下した。このことから初期植菌量を増やしても生産は増大しないことが明らかになった。本菌株の増殖には培地成分等の他の要素が律速となっている可能性が考えられる。

### 2.2 固定化菌体法による生産の検討

発酵法による物質生産において微生物を何らかの担体に付着（固定化）させて培養することは、菌体密度の上昇や、発酵終了後の菌体と生産物の分離、連続発酵時におけるwash out防止等、多くのメリットがある。そこで、本プロセスに、固定化菌体法が適用可能か検証した。

## 【材料と方法】

供試菌株としては Klebsiella variicola TB-83D 株を用いた。かご状に成形した金網に固定化担体として不織布をロール状に詰め、その金網を培養器の中に入れた。培養器をオートクレーブ滅菌後、滅菌した5％グリセロール基本培地 900mL を培養器に入れた。その後、NB 寒天培地で生育させた TB-83D 株 1 白金耳を生理食塩水 1mL に懸濁し、菌液全量を培養液に植菌した。次に、pH コントローラーとペリスタポンプを用いて 1N NaOH を培養液に滴下し、培地 pH を 8 付近に保った。そして、マグネチックスターラーで緩やかに攪拌しつつ、25℃で培養した。経時的にシリンジを用いて培養液約 1mL 採取し、生育量の測定と上清の HPLC 分析を行った。

## 【結果と考察】

結果を図2-2に示す。不織布を用いない分散系と比べると、不織布を用いた場合に最終的なエタノール生産量が1.17倍向上した。不織布には菌体が高密度に付着しており、担体上で菌体が増殖していることが確認された。しかし、それ以上の生産性の向上は認められなかった。

### 2.3 浮遊菌体による連続培養法の検討

これまでの結果より、本菌株を用いた BDF 廃液からのエタノール生産には浮遊菌体による発酵法が適すると考えられた。この場合菌体濃度を一定に保つためには、菌体を連続的に除去する必要がある。また、生産を効率的に行うためにも、基質の添加と生産物の回収を連続的に行うことが望ましい。そこで、連続培養法による生産プロセスの適用を検討した。さらに、これまでの検討結果より、本菌株は植菌量を増大させても生産は増大しないことが明らかになっている。これは培地成分等の他の要素が菌体増殖の律速となっている可能性が考えられため、培地成分の添加についても検討を行った。
図 2-2 不織布を用いた培養法によるエタノール生産の経時変化

## 【材料と方法】

供試菌株としては Klebsiella variicola TB-83D 株を用いた。NB 寒天培地で生育させた TB-83D 株 1 白金耳を 1% グリセロール基本培地 50mL に植菌し、25℃で静置培養することで 3 日間前培養を行った。滅菌した培養器に、滅菌済み 2% グリセロール基本培地 850mL と前培養液全量を加えた。pH コントローラーとペリスタポンプを用いて 1N NaOH-12% グリセロール溶液を培養液に滴下し、培地 pH を 7.5, 8.0, または 8.5 に、グリセロール濃度を約 2% に保った。そして、マグネチックスターラーで緩やかに攪拌しつつ、25℃で培養した（図 2-3）。継時的に培養液量が約 900mL になるように培養液を除き、生育量の測定と上清の HPLC 分析を行った。消費グリセロール量の測定は、培養液量を常に 900mL であったと仮定し、除いた培養液量と残存グリセロール量から計算でおおよその値を求めた。

図2-3 ミニジャーを用いた連続培養装置
## 【結果と考察】

運転pH の影響

図2-4に示したように、pH8において、初期の生育量、グリセロール消費量およびエタノール生産量が最も高く、また、1,3-プロパンジオールと乳酸生産量が低かった。このことより、pH8がエタノール生産に最適であると考え、今後の実験でもpH8で行うことにした。

1,3-プロパンジオール（1,3-PDO）生産量

図 2-4 エタノール生産における pH の影響

$$ \begin{aligned}&\xrightarrow{\quad8\quad}\\ &\xrightarrow{\quad7.5\quad}\\ &\xrightarrow{\quad8.5\quad}\\ \end{aligned} $$
これまでの検討結果より、本菌株は植菌量を増大させても生産は増大しないことが明らかになっている。これは培地成分等の他の要素が菌体増殖の律速となっている可能性が考えられため、培地成分の添加についても検討を行った。培養1日目以降のサンプリング時に培養液を900mLまで除いた後、グリセロールを除いた基本培地(NH_{4}Cl 50g/L, Casamino acid 50g/L, yeast extract 25g/L)を10mL添加した。

図2-5 栄養成分の逐次添加の影響

その結果、培養7日目でエタノール生産量502mM (23g/L)に達した（図2-5）。また、生育量が今までの3倍程度上昇し、グリセロール消費量も上昇した。このことから、何らかの培地成分が菌体生育の律速となっている可能性が強く示唆された。

## 不織布を用いた培養の再検討

培地成分を追加することによって、菌体量の大幅な上昇とエタノール生産量の増大が認められたため、この条件を用いて、再度不織布による培養を試みた。かご状に成形した金網に固定化担体として不織布をロール状に詰め、その金網を培養器の中に入れ、同条件で培養した。
図 2-6 栄養成分の逐次添加の影響（不織布を用いて培養）

その結果、図2-6に示したように、不織布系ではエタノール生産量は培養7日で370mM(1.48%)までしか上昇せず、生産性の向上は認められなかった。培養液を観察すると、分散系では大きな菌体の塊はなく菌体は分散していたが、不織布系では不織布全面にべったりと菌の集団が形成されていた。おそらく菌体増殖に伴って不織布が目詰まりしたことによって、基質と菌体との接触が妨げられたため、生産が低下したと考えられる。このことから、生産を連続的、効率的に行うためには、基質との接触が効率よく行われるように、増殖した菌体密度を一定に保つことが必要であり、菌体濃度を上げることが必ずしも生産向上には結びつかないと考えられた。また、実際のBDF廃液は不純物を多く含むため粘度が高く、不織布の目詰まりをさらに助長すると考えられる。そのようなリスクも考慮した結果、最終的に菌体の固定化は本プロセスには適さないと結論づけ、以降の検討には浮遊菌体を用いることとした。
## 3 培地成分の検討

### 3.1 各種栄養源の検討

前章において培地成分の追加が生育、及びエタノール生産量を増大させたことから、培地成分について各々検討を行い、生育の律速となっている成分について検討した。検討に当たっては、操作性の簡便化を考慮に入れて、逐次添加ではなく培養開始時の培地成分濃度を上昇させることによって実施した。

## 【材料と方法】

TB-83D 株 1 白金耳を 2 章に示した 1% グリセロール基本培地(pH 9) 25 mL に植菌し、25℃で 3 日間前培養を行った。その後、ミニジャーファーメンターにオートクレーブ滅菌した 2% グリセロール生産培地(pH 8) 500 mL 及び前培養液全量を植菌し、マグネチックスターラーで緩やかに攪拌しつつ 25℃で培養した。生産培地組成は基本培地組成のうち $ NH_{4}Cl $ 、カザミノ酸、酵母エキス（YE）を 5 倍量添加したものを用いた。なお、コントロールとして基本培地を用いて試験を行った。オートクレーブ滅菌した 1N NaOH 及び 12.5% グリセロール溶液の添加により培地中の pH を 8、グリセロール濃度を 2% におおよそ維持した。経時的に培養液量が 500 mL になるまで除き、生育量と基質及び生産物量の測定を行った。

## 【結果と考察】

NH_{4}Cl、カザミノ酸及びYEのエタノール生産への影響を図3-1に示した。注目すべき点として、YE添加量を増加させるか否かでエタノール生産性が大きく2つのグループに分かれ、YEを添加することで生産性が大きく向上することが示された。また、NH_{4}Clに関しては添加量を増加させても生産性の向上は見られず、むしろ場合によっては阻害効果が見られた。さらに、YEのみを増加させた場合よりもYEとカザミノ酸の両方を増加させた場合に高いエタノール生産が見られた。一方、前章の栄養源の逐次添加培養の結果と比較すると、YE添加量を増加させた場合に初期のエタノール生産性は向上したが、最終的なエタノール生産量は減少した。

以上の結果より、エタノール生産の律速となっている栄養源は主に YE であることが明らかとなり、エタノール生産量は YE とカザミノ酸添加量を同時に増加させた場合に最も高かった。他の YE 添加量を増加させた場合(YE のみ 5 倍量もしくは $ NH_{4}Cl $ と同時に 5 倍量添加)と比べて培養 48 時間くらいまではエタノール生産量に大きな違いはなかったため、TB-83D 株の栄養源の資化性の違いではないかと予想される。おそらく先に YE を資化し、その後カザミノ酸を資化することで 2 段階のエタノール生産様式になったと思われる。このことはカザミノ酸が有効であること、もしくは単に YE 添加量が基本培地の 5 倍量では不十分であったことが考えられた。栄養源としての YE やカザミノ酸は、アミノ酸などの窒素源やビタミン源として有効であるため、TB-83D 株によるエタノール生産にはビタミンやアミノ酸が有効であることが考えられた。
図3-1 各種栄養源のエタノール生産への影響

栄養源の逐次添加培養(sequential)は前章の結果を載せた

本実験結果より YE が栄養源として特に有効であることが示されたが、YE は高価であるため工業生産においてその使用は困難である。しかし、今後 YE の代わりに栄養に富む安価な栄養源の検討を行い、廃グリセロールと安価な栄養源だけでエタノール生産を行うことができれば、培地コストを著しく低下させることができる。このことから、培地成分を簡略化することは、今後の安価な培地成分の検討を考慮すれば実用化において大きなメリットであるといえる。

### 3.2 グリセロールの逐次添加濃度及び酵母エキス (YE) 添加量の検討

エタノール生産の栄養源として YE が最も適することが示されたため、次に最適な YE 添加量の検討を行うことにした。合わせて、基質であるグリセロールの添加方法の検討をつた。
## 【材料と方法】

## グリセロールの逐次添加濃度の検討

TB-83D 株 1 白金耳をオートクレーブ滅菌した 1% グリセロール基本培地(pH 9) 25 mL に植菌し、25℃ で 3 日間前培養を行った。その後、ミニジャーファーメンターにオートクレーブ滅菌した生産培地(pH 8) 500 mL 及び前培養液全量を植菌し、マグネチックスターラーで緩やかに攪拌しつつ 25℃ で培養した。生産培地組成は基本培地の内力ザミノ酸と YE を 5 倍量添加したものを用い、初期グリセロール量をそれぞれ 2, 3, 4, 5, 15% とした。経時的に培養液を採取し、生育量と基質及び生産物量の測定を行った。培地中のグリセロールがなくなりそうになったら 50% グリセロール溶液を 50 mL 添加することで基質の補充を行った。6N NaOH により培地中の pH を 8 に維持した。

## YE 添加量の検討

## (ミニジャーファーメンターにおける YE 添加量の検討)

TB-83D 株 1 白金耳をオートクレーブ滅菌した 1% グリセロール基本培地(pH 9) 25 mL に植菌し、25℃ で 3 日間前培養を行った。その後、ミニジャーファーメンターに YE 添加量を変えたオートクレーブ滅菌した 5% グリセロール生産培地(pH 8) 500 mL 及び前培養液全量を植菌し、マグネチックスターラーで緩やかに攪拌しつつ 25℃ で培養した。6N NaOH により培地中の pH を 8 に維持した。経時的に培養液を採取し、生育量と基質及び生産物量の測定を行った。培地中のグリセロール濃度が約 1% 以下になったら 50% グリセロール溶液を 50 mL 添加することで基質の補充を行った

## (YE 資化性の確認)

TB-83D 株をオートクレーブ滅菌した基本培地(グリセロール非添加、YE 濃度 0 から 15 g/L、pH 9) 30 mL に終濃度が $ OD_{580} $ で約 0.01 になるように植菌し、25℃で静置培養を行った。経時的に培養液 1 mL 採取し、生育量、培地 pH、基質及び生産物量の測定を行った。実験は 3 連で行った。

## 【結果と考察】

## グリセロールの逐次添加濃度の検討

他の研究におけるグリセロールからの物質生産の報告を見ると、基質の添加方法としては一般的に回分または逐次添加方法が採用されている(1-3)。特に高濃度の生産物を得る場合にはその分多くの基質が必要となり、運転コストを考えると初めに必要な全ての基質を反応槽に添加することが望ましい。しかし、高濃度グリセロール下では菌の生育阻害が生じ、また、pH電極のような低コストで容易に使用できるグリセロールバイオセンサーが無いことから培養中のグリセロール濃度の制御が難しいため、逐次添加法を行うこととした。そこで、基質の最適な逐次添加濃度の検討を行った。

グリセロールの逐次添加濃度によるエタノール生産への影響について図3-2に示した。グリセロール濃度2から4%まではエタノール生産量に大きな違いは無く、5%で若干の低下が見られた。また、グリセロール濃度5%以上では濃度依存的なエタノール生産阻害が見られた。今後、TB-83D株の基質耐性を向上させ高濃度グリセロール存在下で高エタノール生産を行うことができれば、さらに実用性が増すと考えられる。以上の結果から、以降の実験ではグリセロール濃度を5%とした。
図3-2 グリセロール逐次添加濃度によるエタノール生産への影響

## YE 添加量の検討

これまでの実験では窒素源として $ NH_{4}Cl $ やカザミノ酸を添加していたが、その後の検討の結果 (data not shown)、これらを YE で代用できることが予想されたため、基質としてのグリセロール、リン源としての $ KH_{2}PO_{4} $ 、そして栄養源としての YE に絞った培地において、YE 添加量の検討を行った。

YE 添加量によるエタノール生産性への影響を図3-3に示した。YE 15 g/L までは添加量依存的にエタノール生産量が増加し、最大でYE 15 g/L の時にエタノール生産量697 mM(32g/L)に達した。しかし、さらにYE 添加量を増やしてもそれ以上のエタノール生産は見られなかった。また、KH₂PO₄を除いた場合においても同程度の生産量が確認された。以上のことよりYE の最適添加量は15 g/L であり、エタノール生産の栄養源としてYE のみで十分であることが示された。この時点での生産物を見ると、エタノールの他にギ酸が3%程度生産されており、ギ酸によるエタノール生産阻害の可能性が考えられた。また、KH₂PO₄を添加しなくても問題ないことが示され、リン源としてはYE に含まれる量で十分であることが考えられる。
図 3-3 YE 添加量によるエタノール生産への影響

一般的なグリセロールからの物質生産には、一般的に栄養源として YE が使用されるが、その添加量は 1 から 2 g/L 程度であり (1, 4)、多い場合でも 5 g/L 程度である (7)。本菌株においても YE の添加量の増加によりエタノール生産量の向上が見られたが、最適 YE 添加量は 15 g/L と非常に大量の栄養源を必要とすることが示された。栄養源の使用量の増加は原料コストの増加を招くため実用生産では好ましくない。さらに、YE は栄養源としては高価であるため、今後 YE に代わる安価な栄養源の探索は必須とされる。また、エタノール生産の律速となる栄養成分について詳細な検討を行い、YE に含まれる有効な成分を特定することで栄養源使用量を低減できると考えられる。YE 使用量が多量であることに関してさらに、YE は炭素源も含まれており、その使用量が増加することは YE を基質とした物質生産が考慮される (4)。そこで、YE を唯一炭素源とした培地において TB-83D 株の培養を行ったところ、生育は見られたがエタノールを含めた物質生産はほとんど確認されなかった (data not shown)。

以上の結果より、YEはTB-83D株に対して生育促進効果が高く、それ自体からのエタノール生産は見られないため、グリセロールからのエタノール生産に対して非常に有効であることが示された。エタノール生産の律速としてギ酸などの生産物阻害が考えられ、今後更なるエタノール生産量の向上には、使用菌株の生産物耐性の向上が必要であると考えられる。
### 3.3 安価な栄養源の探索

これまでの結果より YE がエタノール生産に特に有効であることが示された。しかし、YE は高価であるために工業生産の現場で使用することは困難である。そこで次に、YE に代わる安価な栄養源の探索を試みた。

## コーンスティープリカーの検討

コーンスティープリカー(以下 CSL)とは、トウモロコシ粒から溶出した可溶性成分を含む浸漬液を濃縮したもので、アミノ酸、糖類、ビタミン類などの多様な成分を含む。また、YE と比べて安価であるため、高価な栄養源の代替剤としての利用価値がある(8,9)。

## 【材料と方法】

TB-83D 株 1 白金耳をオートクレーブ滅菌した 1% グリセロール基本培地(pH 9) 25 mL に植菌し、25℃ で 3 日間前培養を行った。その後、ミニジャーファーメンターにオートクレーブ滅菌した 5% グリセロール生産培地(pH 8、各濃度の CLS 含有) 500 mL 及び前培養液全量を植菌し、マグネチックスターラーで緩やかに攪拌しつつ 25℃ で培養した。CSL は ROQUETTE(株) 製の SOLULYS® AST を用いた。6N NaOH により培地中の pH を 8 に維持した。経時的に培養液を採取し、生育量と基質及び生産物量の測定を行った。培地中のグリセロール濃度が約 1% 以下になったらオートクレーブ滅菌した 50% グリセロール溶液を 50 mL 添加することで基質の補充を行った。

## 【結果と考察】

CSL のエタノール生産量への影響を表 3-1 に示す。CSL の添加量によるエタノール生産への影響は YE と比べると低いものとなったが、YE に CSL を添加することで YE 単体よりはエタノール生産量が向上した。YE と CSL を 15g/L の濃度で添加した場合、エタノール生産量は 732.1mM (34g/L) に達し、これまでの最高値である 32g/L を上回った。

表 3-1 YE と CSL の添加効果

YE (g/L)	CSL (g/L)	Product concentrations (mM)	Consumed glycerol (mM)	Ethanol productivities (ethanol-mol/glycerol-mol)	Final OD580
Ethanol	1,3-P D	Lactate e	Format e	Acetate
30	-	700.4	99.6	107.8	639.9	38.1	901.0	0.79	10.1
15	15	732.1	91.4	148.1	482.8	64.8	998.1	0.74	18.4
5	5	427.8	117.5	97.9	215.6	63.9	704.4	0.61	8.9
5	10	459.8	108.8	80.7	239.3	73.2	726.1	0.63	12.3
5	15	455.4	113.9	127.4	183.5	59.2	744.2	0.61	12.7
-	30	321.5	71.0	75.4	167.8	40.4	434.2	0.77	13.0
これまでのグリセロールからのエタノール生産に関する報告におけるエタノール生産量としては、野生株を用いた場合においては、細菌ではKluyvera cyocrescens S26によるエタノール生産量27.0 g/L (4)、酵母ではPachysolen tannophilus CBS4044によるエタノール生産量28.1 g/L (5)がそれぞれ最高値となっている。また、組換え菌を用いた場合では、Klebsiella属においてK. pneumoniaeの組み換え体を用いた場合にエタノール生産量31.0 g/Lを達成しており、さらに組み換え大腸菌においてエタノール生産量46.5 g/Lが報告されている (6)。この値はこれまでの報告の中では最高値となっている。しかし、これら遺伝子組み換え体の使用は、環境への安全性の観点から生産プロセス全体を厳密に管理しなければならず、生産コストの増大につながる。特にエタノールのような原価が低い生産物の場合は、実用化に際して生産コストの影響は大きく、組み換え菌の使用はエタノールの工業生産には不向きであると考えらえる。これに対して、本研究において組み換え菌を使用しない場合においてエタノール生産量34 g/Lと、これまでの世界最高値を超えることができ、本技術の実用化に当たり大きな進展と言える。

## メタン消化液の検討

アミノ酸やビタミンを含む別の安価な栄養源としてメタン消化液の使用を検討した。メタン消化液とは、メタン発酵において生じる液状の残渣のことを指す。窒素やリン、カリウムといった肥料成分を多量に含んでいるため液肥としての有用性が知られている(10,11)。また、有機物の分解産物及びメタン発酵に関わる細菌・メタン生成菌由来のアミノ酸やビタミンなどを多量に含んでいると考えられる。メタン消化液は基本的には廃棄物であるため、日本においては二次処理後に公共用水域に排水することが多いが、欧州では液状肥料として農地還元することが一般的である(11)。これらのことから、メタン消化液は栄養に富み、基本的に廃棄物であるため安価であることから、YEに代わる安価な栄養源としての有用性が考えられた。そこで次に、メタン消化液のエタノール生産への影響を調べることにした。

## (試験管培養)

メタン消化液は有限会社鳥栖環境綜合開発センターより頂いたものを用い、実験にはオートクレーブ滅菌した後のそのままの原液、もしくは13,000 rpm、10分遠心分離した後の上清を使用した。また、使用したメタン消化液は水分を多量に含んでいるため、添加量の検討に当たり総窒素量(TN)で評価することにした。TNの測定には島津製作所(株)製のTOC-V CSH及びTNM-1を用いた。培養試験は基本培地または表3-2に示した栄養培地を用いて行い、それぞれについてYEをTN等量のメタン消化液(原液または上清)に置き換えたものについても試験した。TB-83D株をオートクレーブ滅菌した各培地(pH 9)30 mLに菌体終濃度が$\mathrm{OD}_{580}$約0.01になるように植菌後、25℃で静置培養を行った。経時的に培養液1 mL採取し、生育量、培地pH、基質及び生産物量の測定を行った。実験は3連で行った。

表 3-2 栄養培地組成

成分	g/L
Glycerol	20
$ KH_{2}PO_{4} $	10
$ NH_{4}Cl $	1
YE	2
メタン消化液は試験管培養と同じものを用い、今回はオートクレーブ滅菌したものに加えて、滅菌していない原液も用いた。また、培養装置として1.5 L容のジャーファーメンターを用いた(M-1000A、EYELA 東京理化学器械(株)製)。TB-83D 株1白金耳をオートクレーブ滅菌した1％基本培地(pH 9)50 mLに植菌し、25℃で3日間静置による前培養を行った。その後、前培養液全量をオートクレーブ滅菌した生産培地950 mL(Glycerol:50 g/L、メタン消化液：TNでYE 15 g/L相当)に植菌した。pHコントローラーとペリスタポンプを用いて6N NaOHを滴下することで培地pHを8に維持した。経時的に培養液約1 mLをサンプリングし、上清をHPLC分析に供した。培地中のグリセロールがなくなりそうになったら培地を100 mLまたは60 mL抜いて同量のオートクレーブ滅菌した50％グリセロール溶液を添加することでグリセロールを補充した。実験にはTB-83D株を植菌しない系も作成し、その場合は前培養液50 mL分の滅菌蒸留水を加えた。

## 【結果と考察】

## 試験管培養

まず、メタン消化液の TN の測定結果を表 3-3 に示す。これを見ると YE と比べて著しく小さい値となり、水で薄まっていることが原因であると考えられる。次に、試験管培養におけるメタン消化液のエタノール生産性への影響を図 3-4 に示す。メタン消化液原液、上清共に YE と同等もしくはそれ以上のエタノール生産量を示し、メタン消化液のエタノール生産への有用性が示唆された。栄養培地と基本培地を比べると、基本培地において YE と比較してメタン消化液のエタノール生産性が大きく向上した。

表 3-3 メタン消化液と YE の全窒素量(TN)

TN (mg/g)
YE	95.9
メタン消化液原液	2.25
メタン消化液上清	1.67
図3-4 試験管培養におけるメタン消化液のエタノール生産性への影響 エラーバーは3連の結果における標準偏差を示す
## ジャーファーメンターによる培養

試験管培養において、メタン消化液のエタノール生産への有用性が示されたため、次にジャーファーメンターを用いたスケールアップを試みた。その結果を図3-5に示す。まず、滅菌しないメタン消化液を用い、TB-83D株を植菌しなかった系において、グリセロールの消費が確認された。生産物を見ると1,3-PDや酢酸の生産量が高く、これらの生産菌がメタン消化液中に存在することが示唆された。一方、エタノール生産はほとんど見られなかった。次に、TB-83D株植菌系において、メタン消化液を滅菌した場合と滅菌しない場合を比べると、エタノール生産は非滅菌系において初期の生産量が低下したが、最終的な生産量は両系とも約500mM (2.2%)程度となった。前節のYE単独の結果と比べると、生産量は低下したが、比較的高い値が確認された。

非滅菌-TB-83D 植菌

滅菌-TB-83D 植菌

図3-5 小型ジャーファーメンター培養におけるメタン消化液のエタノール生産への影響
本技術の実用化のためには、生産量を上げることはもちろん、それと同時に生産コストを下げることも重要である。一般的にバイオプロセスにおける主要な生産コストとしては、材料コストや運転コスト、回収コストが挙げられる(12)。グリセロールからの物質生産においては、廃グリセロールを用いることが原料コストの削減となっている。その他にも、多くの報告において生産量の向上と共に原料コストや滅菌コストなどの生産コストの低減が試みられている(4, 13-15)。

本研究においては、今回の結果より、YE の代わりにメタン消化液を使用することで比較的高いエタノール生産量を達成したこと、及び、滅菌・非滅菌共に最終的なエタノール生産量は同程度であることが確認された。まず前者に関して、メタン消化液の使用により、YE には及ばないものの、グリセロールとメタン消化液のみから2%以上の比較的高いエタノール生産量を達成でき、原料コストを著しく削減できることを示した。先に述べたように、特に日本においてはメタン発酵を行っている廃棄物処理業者が BDF の製造も同時に行っている場合が多い。このことから、将来的にこれらの施設で BDF 廃液とメタン消化液という廃棄物のみから高エタノール生産を行うことで、原料コストをほぼ無くすことができる。今後、詳細な栄養成分の検討を行い、メタン消化液においても YE と同等以上のエタノール生産を達成することで、本技術の実用化に向けて大きな進歩となると考えられる。次に後者に関して、非滅菌のメタン消化液においても滅菌のものと同程度のエタノール生産量を示したことから、メタン消化液の滅菌コストを削減できることが示された。滅菌が不要であることは、特に工業スケールにおいては、高価な滅菌装置の設置や大規模な滅菌操作に係るコストを削減できる。しかし、非滅菌のメタン消化液においては、在来菌による初期のエタノール生産性の低下が見られたため、今後 TB-83D 株が優先化する条件を検討することで、滅菌コストを削減しつつ生産性の向上が見込まれる。以上のことより、栄養源として YE の代わりにメタン消化液を使用することは、原料コスト及び滅菌コストの削減という観点から、本技術の実用化において非常に大きなメリットであることが示唆された。

### 3.4 参考文献

1. Oh BR, Seo JW, Heo SY, Hong WK, Luo LH, Kim S, Kwon O, Sohn JH, Joe MH, Park DH, Kim CH. 2012. Enhancement of ethanol production from glycerol in a Klebsiella pneumoniae mutant strain by the inactivation of lactate dehydrogenase. Process Biochem. 47, 156-159.

2. Mu Y, Teng Hu, Zhang DJ, Wang W, Xiu ZL. 2006. Microbial production of 1,3-propanediol by Klebsiella pneumoniae using crude glycerol from biodiesel preparations. Biotechnol. Lett. 28, 1755-1759.

3. Yen HW, Li FT, Chang JS. 2014. The effects of dissolved oxygen level on the distribution of 1,3-propanediol and 2,3-butandiol produced from glycerol by an isolated indigenous Klebsiella sp. Ana-WS5. Bioresour. Technol. 153, 374-389.

4. Choi WJ, Hartono MR, Chan WH, Yeo SS. 2011. Ethanol production from biodiesel-derived crude glycerol by newly isolated Kluyvera cryocrescens. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 1255-1264.

5. Liu X, Jensen PR, Workman M. 2012. Bioconversion of crude glycerol feedstocks into ethanol by Pachysolen
tannophilus. Bioresour. Technol. 104, 579-586.

6. Wong MS, Li M, Black RW, Le TQ, Puthli S, Campbell P, Monticello DJ, 2014. Microaerobic conversion of glycerol to ethanol in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 80, 3276-3282.

7. Ito T, Nakashimada Y, Senba K, Matsui T, Nishio N. 2005. Hydrogen and Ethanol Production from Glycerol-Containing Wastes Discharged after Biodiesel Manufacturing Process. J. Biosci. Bioeng. 100, 260-265.

8. Maddipati P, Atiyeh HK, Bellmer DD, Huhnke RL. 2011. Ethanol production from syngas by Clostridium strain P11 using corn steep liquor as a nutrient replacement to yeast extract. Bioresour. Technol. 102, 6494-6501.

9. Xi YL, Chen KQ, Dai WY, Ma JF, Zhang M, Jiang M, Wei P, Ouyang PK. 2013. Succinic acid production by Actinobacillus succinogenes NJ113 using corn steep liquor powder as nitrogen source. Bioresour. Technol. 136, 775-779.

10. 中村 真人、2011、メタン発酵消化液の液肥利用とその環境影響に関する研究、農村工学研究所報告、第50号、1-57

11. 遠藤 はる奈、中村 修、力武 真理子、2008、行政主導によるメタン発酵施設の事例調査、長崎大学綜合環境研究、第10巻、第2号、25-35

12. Pauline MD. 2012. Bioprocess Engineering Principles, Second Edition. Academic Press. 762-764.

13. Tarek D, Ake S, Stefan L, Rajni HK. 2013. An economical biorefinery process for propionic acid production from glycerol and potato juice using high cell density fermentation. Bioresour. Technol. 135, 504-512.

14. Dan DV. Francisc VD, Oana LP, Carmen S. 2013. L (+)-lactic acid production by pellet-form Rhizopus oryzae NRRL 395 on biodiesel crude glycerol. Microb. Cell Fact. 12, 92.

15. Afroditi C, Seraphim P, David D, Agapi ID, George-John EN, An-Ping Z. 2011. Production of 1,3-propanediol by Clostridium butyricum growing on biodiesel-derived crude glycerol through an non-sterilized fermentation process. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91, 101-112.
## 4 変異処理による菌株の機能向上

栄養成分の検討の結果から、確かにエタノール生産の増加が確認された。しかし、栄養源の初期添加量を増加させた場合、急激に生育が起こることによって培地中の阻害物質（エタノールもしくはギ酸）濃度が急上昇し、その後の生産を阻害している可能性が考えられた。本菌株(TB-83D株)は、親株であるTB-83株のストレプトマイシン耐性変異株であり、高いエタノール耐性(約7%)を持つ(1)。現時点でのエタノール生産量は4%を下回っているため、エタノールが原因であるとは考えにくい。そのため、この原因物質はエタノール生産に同調して生産される「ギ酸」であることが強く示唆された。そこで、ギ酸による生育・生産阻害を軽減するために、TB-83D株に変異処理を施すことで「ギ酸耐性変異株」および「ギ酸生産能低下変異株」の取得を試みた。

### 4.1 UVによる変異株の取得

## 【材料と方法】

## ギ酸による生育阻害試験

TB-83D株の培養は、2％グリセロール基本寒天培地上で生育したTB-83Dのコロニーを、各濃度のギ酸を含む20 mlの2％グリセロール基本培地で前培養し、同培地に最終OD_{580}=0.01となるように接種し、25℃で培養を行った。

## UVによる変異

TB-83D 株を 25 μg/ml ストレプトマイシン含有 LB 液体培地 (5 ml) で 30℃、16 時間培養し、定常期に達するまで培養を行った。集菌後、0.1 M MgSO₄ 溶液で菌体を洗浄し、5 ml の同溶液に再懸濁した。この原液および希釈系列に従い、 $ 10^{-2} $ , $ 10^{-3} $ , $ 10^{-4} $ , $ 10^{-5} $ , $ 10^{-6} $ 倍に希釈した溶液 50μL をストレプトマイシン含有 LB 寒天培地に塗布した。クリーンベンチ内の殺菌ランプ (東芝製 GL-15) の光源から 25 cm の距離で、シャーレの蓋を開けて 30 秒間 UV を照射した。Photolyase による光回復を遮るために、直ちに UV 照射したシャーレをアルミ箔で包み、さらにキムタオルで包み遮光して 30℃ で 24 時間培養を行った。

## 変異株の選択

死滅率 98%で生育の認められたコロニーを、96 穴マルチプレートに分注した 50 μg/ml Streptomycin 含有 LB 液体培地に接種し、30℃遮光状態で 16 時間培養を行った (First screening)。

First screening で生育の認められた菌株を、各濃度でギ酸を添加した2％グリセロール基本培地 (pH 7.0) にレプリカした (Second screening)。

## エタノールの簡易定量

得られたギ酸耐性株のエタノール生産性を、4-アミノアンチピリンを用いたGoncharらの方法(2)を参考に行った（図4-1）。A solutionとB solution溶液等量混合し、そこに遠心後の上清を加え30℃で15分反応を行った。反応後のサンプルを吸光度515 nmで測定した。