Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
ある。甲胄魚の体制は極めて原始的で、顎もなく、歯もなく、体内の骨もまだ軟骨で形成されていたが、外表を覆う装甲（甲皮）は、構造的には象牙質と骨の性格を併せ持つ硬組織で、その主成分はハイドロキシアパタイトであった。甲皮類はやがて棘魚類を経て硬骨魚（=現生の魚類）へと進化するが、この過程で甲皮も形を変え、頭部では膜性骨として残り、体表部では運動性向上と軽量化のためにウロコとなったと考えられている。また、顎では歯が、体内部では硬骨（軟骨性化骨）もできるようになった。このように、ウロコは甲皮の直系の子孫器官である点で、進化的に興味深い硬組織である。魚類のウロコは、直接化骨をする点で哺乳類の頭蓋骨等の膜性骨に似ており、I型コラーゲンからなる線維層と、I型コラーゲンとハイドロキシアパタイトからなる石灰化層の二つを主体とする。そして石灰化層の上に、骨芽細胞と破骨細胞が共存し、添加的石灰化による骨形成や破骨細胞による骨吸収を行っている。このようにウロコには、1）シンプルな構造と石灰化様式を示す、2）破骨細胞はヒトと同様の細胞構造と活性を持つ、といった利点がある。さらにウロコは再生するという特徴を持ち、再生ウロコの骨芽細胞の活性が高く、さらに破骨細胞の活性も高い（図(4)-2）。再生ウロコは骨代謝が亢進している

再生ウロコのALP染色

再生ウロコのTRAP染色

図(4)-2 再生ウロコのアルカリフォスファターゼ染色（ALP染色）及び酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ染色（TRAP染色）。通常ウロコより再生ウロコの方が、骨代謝反応が活発（3－5倍活性が高い）。

骨モデルである。そこで本研究では、この再生ウロコを用いたアッセイ系を開発した。

淡水魚のキンギョ(Carassius auratus)を麻酔した後、両側からウロコを48枚ずつ取り、抗生物質（グリーンFゴールド）入りの水で飼育（26℃、14日、明期12h/暗期12h）する。なお、飼育水は、毎日1/3ずつ交換する。その後、キンギョを再び麻酔して、再生ウロコをとり実験に用いた。HEPES（20 mM）（pH 7.0）及び抗生物質（1%）を含む培地（L-15培地、Invitrogen）に $ E_{2} $ 及び試験物質（ $ 10^{-10} $ から $ 10^{-7} $ M）を添加し、破骨細胞の活性指標として酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ(TRAP)、骨芽細胞の活性指標としてアルカリフォスファターゼ(ALP)を使用し、ウロコの面積当たりの酵素活性を評価した。

## （４）PCB類の魚のカルシウム代謝に対する影響の解析

重油汚染と同様にして、PCB類の汚染が魚の脊柱彎曲を含む奇形を引き起こすことは報告されている $ ^{8} $ 。そこで、PCB-118：2、3',4,4',5-pentachlorobiphenyl（図(4)-3）に対する影響を解析した。

実験材料として，淡水魚のキンギョ(Carassius auratus)を用いてin vivo及びin vitroの実験を行った。

図(4)-3 2,3',4,4',5-pentachlorobiphenyl (PCB-118)の化学構造
PCB-118をDMSOに溶解して10 ppmのPCB-118溶液を作成した。キンギョを麻酔して，イニシャルの採血をした。その後，PCB溶液をキンギョの腹腔内に10 μl/body weight(g)の割合で投与し，DMSOのみ投与したキンギョと比較した。1及び2日後にキンギョを麻酔して，ウロコを採取した。2日後には，ファイナルの採血をした。2日というタイムコースは，副甲状腺ホルモンやエストロゲンに対する応答を解析した時に変化が最も現れるタイムコースなので，2日後にキンギョを解剖した。採取したウロコの破骨細胞活性（TRAP活性）及び骨芽細胞活性（ALP活性）をSuzuki and Hattori (2003)の方法 $ ^{8)} $ に従い測定した。採取した血液は，遠心後，和光のキットで血漿中のCa濃度を測定した。

さらに、ウロコ中のPCBの濃度を測定して、その濃度に基づいてin vitroの実験を行った。キンギョを麻酔下でウロコを採取して，PCB-118を0.025, 0.25及び2.5 ppmのPCB-118を添加した培地(L-15培地，ギブコ）で6及び18時間培養してin vitroの培養実験を行った。培養後，in vivoの実験と同様にして，Suzuki and Hattori (2003)の方法 $ ^{8)} $ に従いTRAP及びALP活性を測定した。

## （５）海産魚の胆汁中に含まれるPAH類の分析

富山湾で採取されたアオミシマ（Xenocephalus elongatus）、アイナメ（Hexagrammos otakii）、オニオコゼ（Lnimicus japonicus）、ウマツラハギ（Thamnaconus modestus）、ナガツカ（Stichaeus grigorjewi）の尿及び胆汁に緩衝液を加えてpH 5に調整した後、β-Glucuronidase / aryl sulfatase（2,600/14 units）とブルーレーヨン(BR)を入れ37℃で3時間インキュベートした。BRに吸着したOHPAHsをメタノール：アンモニア(50:1, v/v)により溶出させ減圧濃縮した後、前述のようにTMS誘導体化し、開発したGC-MS/MS法に適用し、選択反応モニタリング(SRM)モードで分析した。カラムにはDB5-MS (60 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm, J&W)を用いた。定量は、OHPAHsの同位体標識物質を内標準物質とする内標準法または標準添加法で行なった。

## 4 ．結果及び考察

## （１）質量分析を用いたPAH誘導体（水酸化体及びキノン体）の分析法の開発

GC-MS/MSによるPM中の2～4の母核を有する30種類のOHPAHの分析法を開発した。OHPAH自体の揮発性が低く、また熱的安定性も低いことから、OHPAHのGCでの分析の際には誘導体化が必要となる。ほとんどすべてのTMS誘導体化OHPAHのプロダクトイオンとして、プリカーサーイオン( $ [M]^{+} $ )からのフラグメントイオン[ $ [M-31]^{+} $ ]および[ $ [M-15]^{+} $ ]が観察された。これらのフラグメンテーションは、TMS基の2つのメチル基および1つの水素(=31， $ (\mathrm{CH}_{3})_{2}+\mathrm{H}) $ の開裂およびメチル基(=15、 $ CH_{3} $ )によるものであった。同様のフラグメンテーションパターンは、以前の報告でも観察されている $ ^{9)} $ 。DB5-MSキャピラリーカラムを用いてTMS誘導体化OHPAHを分離したところ、30種類のTMS化OHPAHを検出することに成功した(図(4)-4)。一方、4環のOHPAHについては、同じ保持時間を示すものが多く、9種のOHPAHについて分離できなかった。タンデムMS（MS/MS）は、プリカーサーイオンから生じる特徴的なフラグメントイオン以外のイオンをすべて除外することにより、複雑な試料マトリックスによるバックグラウンドを低減させることが可能となる。これによってGC-MS/MSではGC-MSに比べて優れた検出限界を得ることができる。TMS化OHPAHの検出限界は、0.3 fg～63 pg/injectionの範囲であり、母核の環数が増加するほど感度が低下する傾向にあった。
図(4)-4 GC-MS/MSによるTMS化OHPAHのSRMクロマトグラム

1～5環のPAHQの標準物質26種のうち20種についてマススペクトルからTMS誘導体として同定することに成功した。

ANQ、AAQ、BaP-1,6-Q、BaP-3,6-Q、BaP-6,12-Q、BaP-7,10-Qについては誘導体を確認することができなかった。代表的なマススペクトルとその帰属を図(4)-5に示した。多くのPAHQから[M]⁺、[M-88]⁺、[M-118]⁺等の特徴的なイオンが検出され、[M]⁺イオンをプリカーサーイオンとして、また最も強度の強かったプロダクトイオンを選択し、

図(4)-5 TMS誘導体化9,10-PQのマススペクトル
図(4)-6 GC-MS/MSによるTMS化PAHQのSRMクロマトグラム

SRMモードでの測定条件を設定した。また、同一イオンを検出するPAHQの異性体についても保持時間によりすべてのTMS誘導体化PAHQを分離することに成功した（図(4)-6）。誘導体化反応について、各種のトリメチルシリル化剤を検討した結果、BSA+TMCS+TMSI(3:2:3)の混合試薬を用いることで比較的誘導体化されにくかった9,10-AQや1,2-BAQを誘導体化することができ、他のPAHQに関してもピーク強度が増大した。内部標準物質として用いる1～4環のPAHQの重水素化体（1,4-BQ-d_{4}、1,4-NQ-d_{6}、9,10-PQ-d_{8}、9,10-AQ-d_{8}、5,6-CQ-d_{10}）の5種を合成し、同様にTMS誘導体を同定した。

検出条件を最適化した後、PAHQ混合標品（ $ 10^{-8}\sim10^{-10} $ M）のTMS化体についてSRM測定を行い、検出限界（S/N=3）を求めた。各PAHQ誘導体は完全に分離できており、検出限界は2~200（fg/injection）であった。一方、PAHQを誘導体化せずに直接分析する条件を最適化してSRM測定を行ったところ、TMS誘導体化では測定できないANQ、AAQが測定可能であったが、保持時間が環数に従って近接し、ピークがブロードで同じ質量数かつ同じ開裂（C=Oの脱離）のPAHQが多数存在していることから、異性体の分離が不可能であった。直接分析における検出限界は、約1.0~150（pg/injection）であり、特にオルト位にカルボニル基が存在するPAHQで感度が著しく低く、測定できない化合物が多数存在した。一方、TMS誘導体化ではほとんどすべてのPAHQが網羅されており、また検出限界も直接分析法より1000倍程度優れており、TMS誘導体化法が優位であることが証明された。

開発したOHPAH及びPAHQの分析法を用いて、金沢大学屋上で捕集された大気試料を分析したところ、16種のOHPAH及び15種のPAHQを同定することに成功し、検出されたOHPAHやPAHQに
はこれまで環境中での存在が報告されていない新規化合物も含まれていた（表(4)-1）。大気中PAHQ濃度は、OHPAHに比べて著しく高く、燃焼等の発生源や大気中の二次生成によりPAHQが生成しやすいことが明らかとなった。また、エストロゲン様あるいは抗エストロゲン作用を有する化合物が存在し、大気中から検出されたOHPAHのうち3種がエストロゲン様作用、5種が抗エストロゲン作用を有していた。PAHQについても測定された6種が抗エストロゲン作用を有していた。

表(4)-1 大気粉じん試料中のOHPAH及びPAHQの濃度

OHPAH	濃度
(fg/m³)	OHPAH	濃度
(fg/m³)	PAHQ	濃度
(pg/m³)	PAHQ	濃度
(pg/m³)
1-OHNap	N. D.	11-OHBaA	0.8	1,4-BQ	32	1,2-BAQ	9.6
2-OHNap	1.0	6-OHChr	0.3	1,4-MBQ	9.6	BaP-11,12-Q	0.22
2-OHFle	N. D.	4-OHBcPhe	0.02	1,2-NQ	5.6	BaP-4,5-Q	0.65
4-OHPhe	0.9	5-OHBaA	N. D.	1,4-NQ	2.4	BeP-4,5-Q	3.6
9-OHPhe	N. D.	8-OHBaA	N. D.	1,4-MNQ	3.2	BaP-7,8-Q	N. D.
3-OHPhe	6.3	2-OHBaA	N. D.	9,10-PQ	8.2
1-OHPhe	N. D.	3-OHChr	7.2	9,10-AQ	12
2-OHPhe	N. D.	4-OHBaA	5.5	1,4-PQ	2.5
1-OHBcPhe	N. D.	1-OHChr	0.7	1,4-AQ	N. D.
3-OHFrt	10.3	10-OHBaA	N. D.	Frt-2,3-Q	1.3
1-OHPyr	20.9	3-OHBaA	N. D.	1,2-CQ	N. D.
2-OHBcP	2.2	9-OHBaA	2.5	1,4-CQ	0.32
5-OHBcP	0.2	2-OHChr	3.1	5,6-CQ	1.58
1-OHBaA	N. D.	BcP-5,6-Q	N. D.
4-OHChr	3.1	BcP-1,4-Q	N. D.

## （２）酵母two-hybrid法による多環芳香族炭化水素（PAHQ）キノン体のエストロゲン様/抗エストロゲン活性の解析

酵母two-hybrid法を用いてOHBaPのエストロゲン様／抗エストロゲン様作用を測定すると、活性の強さが母核に対するOH基の位置により著しく異なることを著者らはすでに明らかにしている。そこで2～6環の母核構造を有するOHPAH 64種類についてエストロゲン様/抗エストロゲン活性の有

図(4)-7 OHPAHのエストロゲン様作用/抗エストロゲン作用とL/B ratio及びO-Hdistanceとの関係
無とその強さ、さらに構造と活性の関係を解析した。その結果、強いエストロゲン様活性あるいは抗エストロゲン活性を有するOHPAHは、(1)母核が4環PAH（例えば、4-OHBaA、3-OHBaA）(2)長軸と短軸の長さの比が1.28～1.73の範囲に入る長方形の平面構造、(3)OH基が最も遠い水素原子から8～12Åの範囲、(4)エストロゲン様活性を示す構造条件は、抗エストロゲン活性を示す条件より狭い、ことが判明した（図(4)-7）。

20種のPAHQのうち、3種（1,2-CQ、BaP-3,6-Q、BaP-7,8-Q）がエストロゲン様活性を示し、それぞれ陽性対照の約25%、約47%、約12%のβ-galactosidase産生を誘導した。一方、抗エストロゲン活性は、11種（1,4-PQ、1,2-CQ、1,4-CQ、5,6-CQ、BcP-5,6-Q、BeP-5,6-Q、BaP-1,6-Q、BaP-4,5-Q、BaP-7,8-Q、BaP-7,10-Q、BaP-11,12-Q）が活性を示し、特に強い抗エストロゲン活性を示した1,2-CQ、1,4-CQ、5,6-CQ、BaP-7,8-Qは約50%のβ-galactosidase産生を抑制した。エストロゲン様活性を示す3種のPAHQは、L/B ratio、O-H distance、第1イオン化工ネルギー、双極子モーメント、log Pのパラ

Antiestrogenic activity

図(4)-8 PAHQのエストロゲン様作用/抗エストロゲン作用とL/B ratio及びO-Hdistanceとの関係
メータがそれぞれ1.32～1.80、10.290から11.519 Å、8.526から9.029 eV、4.909から5.556 debye、3.462から3.782の狭い範囲に存在した（図(4)-8、9）。一方、抗エストロゲン活性を示す11種のPAHQでは、第1イオン化工ネルギー、log Pがそれぞれ8.526から9.201 eV、2.459から3.782の比較的狭い範囲に存在（図(4)-8、9）し、これらのパラメータの範囲が活性を示すための要件である可能性が示唆された。

図(4)-9 PAHQのエストロゲン様作用/抗エストロゲン作用とイオン化ポテンシャル、双極子モーメント及びlog Pとの関係
## （３）再生ウロコを用いた高感度評価システムの開発

## 1 ）ウロコの重量または面積と骨芽細胞及び破骨細胞活性の関連

これまで、ウロコの重量当たりの酵素活性値を算出していたため、ウロコ重量測定は乾燥と秤量に多大な時間を要し、また、ウロコが小さいほど骨芽細胞や破骨細胞活性測定値が相対的に大きくなる傾向があり、ウロコの大きさを統一して使用する必要があった。そこで、酵素活性の測定を迅速かつ正確に行うため、ウロコの面積当たりで酵素活性を表す方法を検討した。ウロコの重量と骨芽細胞または破骨細胞活性との関連と、ウロコの面積と骨芽細胞または破骨細胞活性との関連を調べた結果、ウロコ1枚の骨芽細胞総活性及び破骨細胞総活性とウロコの重量の間には、正の相関（r=0.57及びr=0.65、p<0.001）が見られた。また、ウロコ1枚の骨芽細胞総活性及び破骨細胞総活性とウロコの面積の間には、強い正の相関（r=0.91及びr=0.78、p<0.001）が見られた（図(4)-10）。

図(4)-10 ウロコの重量とALP活性（A）、ウロコの重量とTRAP活性（B）、ウロコの面積とALP活性（C）及びウロコの面積とTRAP活性との関係

## 2 ）重量補正法と面積補正法との関連

単位重量当たりの活性値（従来法）と単位面積当たりの活性値（改良法）との間の相関関係を骨芽細胞及び破骨細胞活性のそれぞれについて調べた。その結果、骨芽細胞活性について従来法と改良法との間には、弱い正の相関（r=0.38、p<0.001）が見られた（図(4)-11）。また、破骨細胞活性についても従来法と改良法との間に、正の相関（r=0.67、p<0.001）が見られた。
図(4)-11 ウロコの重量法と面積法との関係

3）ウロコの面積と単位面積当たりの骨芽細胞及び破骨細胞活性との関連

ウロコの面積で骨芽細胞または破骨細胞活性値（mmol pNP produced / h）を除して算出した単位面積当たりの骨芽細胞または破骨細胞活性値（mmol pNP produced / （mm² scale×h））とウロコの面積（mm²）との関連から、単位面積当たりの活性に変換した効果を調べた。その結果ウロコの骨芽細胞および破骨細胞活性を単位面積当たりの活性で表すと、ウロコの面積に関係なくほぼ一定の値となった（図(4)-12）。したがって、面積法を用いたアツセインステムを確立できたといえる。このアツセイを用いて、骨芽細胞に受容体があり、破骨細胞の活性を上昇させるホルモンである副甲状腺ホルモン $ ^{10} $ 及びプロスタグランジンE2 $ ^{11} $ に対する作用を解析して、哺乳類の骨と同様に作用することを証明した。

図(4)-12 単位面積当たりの活性に変換したときのALP(A)及びTRAP(B)活性
## 4 ）再生ウロコのアッセイ系を用いた4-OHBaAの解析

普通ウロコ及び再生ウロコに $ 10^{-9} $ M の $ E_{2} $ を曝露させ、TRAP及びALP活性を測定した結果、再生ウロコのほうが $ E_{2} $ に対する応答性がよいことが判明した（図(4)-13）。

図(4)-13 通常ウロコ(ontogenic scale)と再生ウロコ(Regenerating scale)のエストロゲンの応答の比較

$ E_{2}\left(10^{-9}\ mol/L\right) $ 処理した通常ウロコと再生ウロコを6時間培養した。

そこで再生ウロコに $ 10^{-6} $ Mの4-OHBaAを曝露させ、3、6、12、24時間培養して骨芽細胞及び破骨細胞活性を測定した結果、骨芽細胞活性は6時間後に上昇した $ (p=0.021) $ 。また破骨細胞活性も6時間培養で最も上昇し $ (p=0.004) $ 、その後12時間でも上昇し $ (p=0.039) $ 、やがて時間の経過とともに対照群の活性と等しくなった。

活性の変化が最も大きかった 6 時間培養に条件を固定して4-OHBaAを $ 10^{-6}\sim10^{-10} $ Mの濃度で曝露してそれぞれの活性を測定した。その結果、骨芽細胞は $ 10^{-6} $ Mで有意に上昇したが（p=0.003）、 $ 10^{-7} $ Mで対照群と同程度の値になり、濃度を下げるごとに徐々に上昇し $ 10^{-10} $ Mでまた有意に上昇

図(4)-14 4-OHBaAの骨芽細胞及び破骨細胞に対する作用。4-OHBaA（ $ 10^{-10}\sim10^{-6} $ mol/L）を曝露させて6時間培養した。 $ ^{*} $ :P<0.05; $ ^{**} $ :P,0.01
した（p=0.032）（図(4)-14）。一方、破骨細胞は $ 10^{-10} $ Mで活性が上昇した（p=0.022）（図(4)-14）。以上のことから、再生ウロコのアッセイ系を用いて、 $ 10^{-10} $ Mまで検出できた。一方、再生ウロコに $ 10^{-6} $ MのBaAを曝露させ、骨芽及び破骨細胞活性を測定した結果、骨芽細胞活性は上昇傾向にあるものの有意差は認められず、破骨細胞活性は12時間培養で上昇した（p=0.008）（図(4)-15）。従って、培養期間中にウロコに存在するCYP1A1により水酸化体となり破骨細胞の活性を上昇させた可能性がある。

図(4)-15 BaAの骨芽細胞及び破骨細胞に対する作用。BaA（ $ 10^{-6} $ mol/L）を曝露させてタイムコースを調べた。**:P<0.01

## （４）PCB類の魚のカルシウム代謝に対する影響の解析

ポリ塩化ビフェニル（PCB）は生体に対する毒性が高く，一部のPCBは内分泌かく乱作用を有することが報告されている。しかし骨代謝に対するPCBの作用はin vivoの報告が多く，破骨細胞及び骨芽細胞に対する直接的な作用は報告されていない現状である。そこで骨代謝に及ぼすPCBの影響を評価する方法として，魚類のウロコに注目した。魚類のウロコは，骨基質タンパク上に骨形成を行う骨芽細胞と骨吸収を行う破骨細胞が共存しており，シンプルな骨のモデルである。したがってウロコを用いれば，PCBが魚類の骨代謝に与える影響を評価できる可能性が高い。本研究では，PCBに対する作用を調べるため，in vivo及びin vitroの実験を行った。

in vivoの実験：PCB-118をキンギョの腹腔内に投与して、ウロコの破骨細胞及び骨芽細胞の活性を測定した結果,骨芽細胞の活性は、上昇する傾向を示したが、有意な変化はなかった。一方、破骨細胞の活性は、1日目では上昇する傾向を示し、2日目では有意に上昇することが判明した（図(4)-16）。

血液中のカルシウム濃度においても、ウロコの破骨細胞が活性化した結果として、上昇することが判明した（図(4)-17）。

さらに、PCBを投与したキンギョのウロコ中のPCB量を測定した結果、約0.1ppm含まれていることがわかった（図(4)-18）。そこで、in vitroの実験では、0.025, 0.25, 2.5ppmの濃度で解析した。なお、PCBの分解及び水酸化は生じておらず、ウロコにおけるOHPCBの量は検出限界以下であった。したがって、本研究では、PCBに対する作用であると考えて、in vitroの実験を行った。
in vitroの実験：PCB-118を培地に添加して6時間培養した結果、ウロコの破骨細胞の活性は上昇して、0.25ppmで有意差が認められた。一方、骨芽細胞の方は、最も高濃度の2.5ppmでのみ有意に上昇した（図(4)-19）。

PCB-118を培地に添加して18時間培養した結果、6時間と同様にしてウロコの破骨細胞の活性は上昇して、全ての濃度で有意差が認められた。一方、骨芽細胞の方は、2.5ppmでのみ有意に上昇した（図(4)-20）。

A) TRAP activity

B) ALP activity

図(4)-16 PCB-118のキンギョのウロコの破骨細胞及び骨芽細胞に対する作用 **: P<0.01

図(4)-17 PCB-118のキンギョのウロコの破骨細胞及び骨芽細胞に対する作用 **: P<0.01

図(4)-18 PCB-118を投与したキンギョのウロコ中のPCB含量
したがって、PCBにおいてもPAH類と同様にして、エストロゲン様作用があることが判明し、多くのPOPsが内分泌かく乱作用を有する可能性を示唆しており、日本海に生息する魚類に対する影響が危惧される。

A) TRAP activity

B) ALP activity

図(4)-19 PCB-118のキンギョのウロコの破骨細胞及び骨芽細胞に対する作用PCB-118を培地に添加して6時間培養したときの結果を示す。

Paired t-test $ ^{*} $ : P<0.05

A) TRAP activity

B) ALP activity

図(4)-20 PCB-118のキンギョのウロコの破骨細胞及び骨芽細胞に対する作用PCB-118を培地に添加して18時間培養したときの結果を示す。

Paired t-test *: P<0.05 ; **: P<0.01; ***: P<0.001

## （５）海産魚の胆汁中に含まれるPAH類の分析

魚類の胆汁及び尿中OHPAHはほとんど抱合体であり、前処理の際にまず抱合体をフリー体に加水分解する必要がある。従来は、加水分解後に逆相充填剤を用いる固相抽出(SPE)を行い、極性の高い物質を除いた後に順相系SPEにてさらに精製する必要があった。そこで本研究では、多環芳香族化合物を特異的に吸着するブルーレーヨン（BR）を利用して加水分解に使用する緩衝液から直接OHPAHを回収する前処理法を検討した。図(4)-21に2種類の固相カートリッジを使用するSPE法
とBRによるOHPAHの回収率を示す。BRでは環数の少ないOHNapの回収率が低かったものの、4環以上のOHPAHについてSPEよりも回収率が高かった。またBRによる処理時間はSPEの1/3以下であった。OHNapは生体試料中の濃度が高く、回収率が低くても内部標準物質により補正することで定量が可能であることから、BR法を魚類の胆汁及び尿中OHPAHの分析の前処理に採用した。したがって、酵素による抱合体の加水分解と得られたOHPAHの吸着を同時に行うことのできる簡便な前処理法の開発に

図(4)-21 固相抽出（SPE）とブルーレーヨン（BR）によるOHPAHの回収率

成功した。開発した前処理を行った胆汁または尿試料は前述のGC-MS/MSにより測定した。

測定対象としたOHPAHのうち、アオミシマの胆汁中から，6種類の2～4環のOHPAHが同定・定量できた（表(4)-2）。一方、アオミシマの尿試料からはいずれのOHPAHについても定量下限以下のピークしか観察されなかったことから、胆汁排泄がアオミシマの主なOHPAHs排泄経路として推定された。ナガツカ以外の胆汁中OHPAH濃度は、0.6～65 ng/mL bileであり、他の海域でこれまでに観察された胆汁中1-ヒドロキシピレン（1-OHPyr）と比較して富山湾の魚類の胆汁中1-OHPyr濃度は極めて低濃度であった。胆汁中1-OHPyr濃度に関する過去の報告では、セーヌ川河口域のヒラメ（工業地域付近：2,782，非工業地域：299 ng/mL bile） $ ^{12} $ 、バルト海のヒラメ（～838 ng/mL bile） $ ^{13} $ 、1999年のErika号の重油流出事故後のロワール川河口の舌平目（事故直後の2000年2月：1,400 ng/g bile，2000年9月：50 ng/g bile） $ ^{14} $ 、北バルト海のスズキ（213～1,149 ng/g bile） $ ^{15} $ が報告されている。魚類の胆汁中からOHPAHを測定できる分析法の開発に成功したことから、今後海水中のPAH濃度と胆汁中PAH代謝物濃度を比較することによりPAHの魚類への影響をより詳細に検証できると考えられる。

表(4)-2 魚類胆汁中のOHPAH濃度（ng/mL bile）

1-OHNap	2-OHNap	2-OHFle	3-OHPhe	2-OHPhe	1-OHPyr
アオミシマ (10/2/22)	2.0	16.2	7.3	30.7	1.5	65.0
アオミシマ(10/4/2)	1.5	8.5	4.8	2.4	0.2	22.9
アオミシマ(10/4/9)	1.1	6.7	4.5	1.4	0.6	19.5
アイナメ (10/04/20)	4.3	2.7	36.7	26.3	8.4	47.2
ウマヅラハギ (10/04/20)	7.0	7.7	3.1	3.8	3.4	51.9
オニオコゼ (10/04/20)	1.4	1.1	5.2	2.4	4.8	29.9
ナガツカ (10/2/12)	11.7	4.6	272	17.5	42.0	2230
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

下記に示す成果を得た。PAH誘導体の分析法の開発は、海水中での物質挙動や海洋生物の代謝物を毒性と関連させて評価する上で重要である。また、酵母やウロコを用いたバイオアッセイの開発は、海洋生物へのPAH誘導体および他の毒物（PCB等）の毒性を評価する第一段階としての意義が大きい。

1）PAH誘導体の質量分析法による分析法を開発し、大気粉じん試料中のOHPAH及びPAHQを同定した。

2）酵母two-hybrid法によりPAH類のエストロゲン様作用及び抗エストロゲン様作用と構造活性相関を明らかにした。

3）魚類のウロコを用いたバイオアッセイシステムを構築した。

4）PAH類はウロコの骨芽細胞と破骨細胞の両方の活性をエストロゲンと同様に上昇させ魚の骨代謝を攪乱しているので、魚の奇形を引き起こしている可能性が高いことがわかった。

5）PCB-118には、PAH類と同様にして、内分泌かく乱作用があることが判明し、多くのPOPsが内分泌かく乱作用を有する可能性を示唆しており、日本海に生息する魚類に対する影響が危惧される。

6）魚類の胆汁中のPAH代謝物の分析法を開発し、富山湾で採取した魚類の胆汁中のOHPAHを測定することに成功した。

## （２）環境政策への貢献

本研究成果に関しては、今後、学会発表や国際学術誌を通じ、広報・普及に努める。

### 6. 国際共同研究等の状況

（1）国際共同研究計画名：タイにおける環境汚染物質の曝露調査

協力案件：タイにて大気汚染の状況と地域住民の曝露量を把握するための環境調査を実施する。カウンターパート：Thaneeya Chetiyanukornkul 助教・チェンマイ大学・タイ

連携状況及び国際的な位置づけ：チェンマイ大学との共同研究により、大気汚染調査を継続的に実施している。

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) N. SUZUKI, K. HAYAKAWA, K. KAMEDA, A. TORIBA, N. TANG, M.J. TABATA, K. TAKADA, S. WADA, K. OMORI, A.K. SRIVASTAV, H. MISHIMA and A. HATTORI: Life Sci., 84, 482-488 (2009)

“Monohydroxylated polycyclic aromatic hydrocarbons inhibit both osteoclastic and osteoblastic activities in teleost scales.”

2) N. SUZUKI, K. KITAMURA, K. OMORI, T. NEMOTO, Y. SATOH, M.J. TABATA, M. IKEGAME, T. YAMAMOTO, K. IJIRI, Y. FURUSAWA, T. KONDO, I. TAKASAKI, Y.
TABUCHI, S. WADA, N. SHIMIZU, Y. SASAYAMA, M. ENDO, T. TAKEUCHI, M. NARA, M. SOMEI, Y. MARUYAMA, K. HAYAKAWA, T. SHIMAZU, Y. SHIGETO, S. YANO and A. HATTORI: Biol. Sci. Space, 23, 211-217 (2009)

“Response of osteoblasts and osteoclasts in regenerating scales to gravity loading.”

3) K. HAYAKAWA, N. SUZUKI, K. KITAMURA, K. BEKKI, J. NAKANO, M. YOSHIDA, A. TORIBA, T. KAMEDA and N. TANMOLG: WIT Transactions on Ecology and the Environment, 135, 231-241 (2010)

“Toxic effect of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolites on fish bone metabolism.”

4) K. KAMEDA, A. AKIYAMA, A. TORIBA, N. TANG and K. HAYAKAWA: Intern. J. Environ. Anal. Chem., 90, 976-987 (2010)

“Determination of particle-associated hydroxynitropyrenes with correction for chemical degradation on a quartz fibre filter during high volume air sampling.

5) X.-Y. YANG, K. IGARASHI, N. TANG, J.-M. LIN, W. WANG, T. KAMEDA, A. TORIBA and K. HAYAKAWA: Mutation Res., 695, 29-34 (2010)

“Indirect- and direct-acting mutagenicity of diesel, coal and wood burning-derived particulates and contribution of polycyclic aromatic hydrocarbons and nitropolycyclic aromatic hydrocarbons”

6) J. P. MILLER-SCHLZE, A. TORIBA, N. TANG, K. HAYAKAWA, K. TAMURA, L. DONG, C. D. SIMPSON: Environ Sci. Technol., 44, 216-221 (2010)

“Exposures to particulate air pollution and nitro-polycyclic aromatic hydrocarbons amongst taxi drivers in Shenyang, China”

7) N. SUZUKI, J.A. DANKS, Y. MARUYAMA, Y. SASAYAMA, A. HATTORI, M. IKEGAME, M. NAKAMURA, M.J. TABATA, T. YAMAMOTO, R. FURUYA, K. SAIJOH, H. MISHIMA, A.K. SRIVASTAV, Y. FURUSAWA, T. KONDO, Y. TABUCHI, I. TAKASAKI, V.S. CHOWDHURY, K. HAYAKAWA and T.J. MARTIN: Bone, 48, 1186-1193 (2011)

8) N. SUZUKI, K. YACHIGUCHI, K. HAYAKAWA, K. OMORI, K. TAKADA, M.J. TABATA, K. KITAMURA, M. ENDO, S. WADA, A.K. SRIVASTAV, V.S. CHOWDHURY, Y. OSHIMA and A. HATTORI: J. Fac. Agr., Kyushu Univ., 56, 47-51 (2011)

“Effects of inorganic mercury on osteoclasts and osteoblasts of the goldfish scales in vitro”

9) H. SATONE, J.M. LEE, Y. OBA, T. KUSAKABE, E. AKAHOSHI, S. MIKI, N. SUZUKI, Y. SASAYAMA, M. NASSEF, Y. SHIMASAKI, S. KAWABATA, T. HONJO and Y. OSHIMA: Aquatic Toxicol., 103, 79-84 (2011)

“Tributyltin-binding protein type 1, a lipocalin, prevents inhibition of osteoblastic activity by tributyltin in fish scales”

10) 片山裕規、後藤知子、亀田貴之、唐寧、松木篤、鳥羽陽、早川和一：大気環境学会誌、46,1,20-29(2011)

「日本および中国における大気粒子中多環芳香族炭化水素キノンの観測－濃度レベルの把握と発生要因の検討－」

11）北村敬一郎、中野淳、川部季美、早川和一、根本鉄、大嶋雄治、島崎洋平、服部淳彦、
鈴木信雄：日本海域研究、42, 27-34 (2011)

「自動面積測定法によるキンギョのウロコを骨のモデルとしたアッセイ法の改良」

12) 戸次加奈江、滝上英孝、鈴木 剛、唐 寧、鳥羽 陽、亀田貴之、早川和一：環境化学、21,1,27-33(2011)

「中国・北京及び日本・金沢の大気が示すAhR活性化作用へのPAH類及びダイオキシン類の寄与」

14）鈴木信雄、関あずさ、染井正徳、中村正久、矢野幸子、大森克徳、池亀美華、三島弘幸、早川和一、服部淳彦：比較内分泌学、37,194-203(2011)

「メラトニンの新規作用：骨に対する作用とその誘導体を用いた骨疾患治療薬の開発」

16) C. HOSOZUMI, A. TORIBA, T. KAMEDA, N. TANG and K. HAYAKAWA: J. Chromatography. B, 893-894, 173-176 (2012)

“Analysis of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in human urine using hydrophilic interaction chromatography with tandem mass spectrometry”

17) N. SUZUKI, N. and T. SAKAMOTO: Virtual special issues in Zoological Science (2012)

“Comparative and general aspects of calcium homeostasis and its hormonal regulations. In Evolution of calcium homeostasis and its hormonal regulation in vertebrates” (in press)

18) T.A. THAMAMONGOOD, R. FURUYA, S. FUKUBA, M. NAKAMURA, N. SUZUKI and A. HATTORI: Bone, 50, 1240-1249 (2012)

“Expression of osteoblast-specific genes during spontaneous goldfish scale regeneration and role of cell-to-cell contact in controlling the onset of resorption/regeneration process found in intra-scale pocket autotransplantation of modified scales”

19) K. OMORI, S. WADA, Y. MARUYAMA, A. HATTORI, K. KITAMURA, Y. SATO, M. NARA, H. FUNAHASHI, K. YACHIGUCHI, K. HAYAKAWA, M. ENDO, R. KUSAKARI, S. YANO, A.K. SRIVASTAV, T. KUSUI, S. EJIRI, W. CHEN, Y. TABUCHI, Y. FURUSAWA, T. KONDO, Y. SASAYAMA, T. NISHIUCHI, M. NAKANO, T. SAKAMOTO and N. SUZUKI: Zool. Sci., 29499-504 (2012)

“Prostaglandin E2 increases both osteoblastic and osteoclastic activities in the scales of goldfish and participates in the calcium metabolism in goldfish”

<査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない。
くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1) N. Suzuki: Busan Symposium in Pukyong National University (JSPS’s Asia and Africa Science Platform Program), Busan, Korea, 2009

“Fish scale is a good model for the evaluation of the bone metabolism in fish: The effects of heavy metals and endocrine disruptors on osteoblasts and osteoclasts in the scales” （アブストラクト提出済み）

2) N. Suzuki: JENESYS-POMRAC-Kanazawa University Joint Symposium 2009, Kanazawa, Japan, 2009

“The toxicity of bisphenol A and polycyclic aromatic compound in osteoblasts and osteoclasts of teleosts” （アブストラクト提出済み）

3) 鈴木信雄、早川和一、服部淳彦：第80回日本動物学会（2009）

「ウロコのアッセイ系を用いた水酸化多環芳香族炭化水素類の魚類の骨代謝に及ぼす影響評価」

4) 大場由美、鈴木信雄、島崎洋平、佐藤根妃奈、笹山雄一、大鳴雄治：平成21年度日本水産学会秋季大会（2009）

「ヒラメトリブチルスズ結合タンパク質タイプ1（TBT-bp1）はTBTと結合しその毒性を抑制する」

5) 鈴木信雄：宇宙生物科学会第23回大会（2009）

「魚類のカルシウム代謝におけるウロコの生理学的役割：副甲状腺ホルモンに対する作用」

6) 佐藤根妃奈、李在萬、日下部宣宏、川畑俊一、大場由美、島崎洋平、大鳴雄治、鈴木信雄、笹山雄一：第15回日本環境毒性学会・バイオアッセイ研究会（2009）

7) N. Suzuki: 2009 Korea-Japan Joint Research Project Symposium. “Aging, Radiation and Environment” Busan, Korea, 2009

“Development and application of a fish scale in vitro assay system: Fish scale is a suitable model for analysis of bone metabolism” （アブストラクト提出済み）

8) 丸山雄介、鈴木信雄、服部淳彦：第34回日本比較内分泌学会大会（2009）「繁殖期の雌キンギョにおける破骨細胞の活性化と血漿カルシウム濃度」

9) 川合美緒、鳥羽 陽、亀田貴之、唐 寧、早川和一：日本分析化学会第58年会（2009）「活性酸素種を生成する9,10-phenanthrenequinoneのヒト尿中代謝物の分析法の開発」

10）吉田壮男、太刀川千裕、細井信造、鳥羽陽、亀田貴之、唐寧、早川和一：日本薬学会北陸支部第121回例会（2009）

「多環芳香族炭化水素キノン体の内分泌かく乱作用」

11）鈴木信雄，早川和一：第44回日本水環境学会（2010）

「水酸化多環芳香族炭化水素は魚の骨芽細胞及び破骨細胞の活性を抑制し、魚の骨代謝を攪
## 乱する」

12）中野 淳、鈴木信雄、鳥羽 陽、早川和一：第130回日本薬学会年大会（2010）

「多環芳香族炭化水素類を魚に投与後の血中Ca濃度、胆汁組成と骨芽・破骨細胞活性の変化」

13) M. Maeda, A. Hayashi, S. Nakamura, T. Serino, K. Kitamura and N. Suzuki: 58 th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Utah, USA, 2010

“Scale metabolite profiling reveals differential changes in response to gravitational stress” （アブストラクト提出済み）

14) K. Hayakawa, N. Suzuki, K. Kitamura, K. Bekki, J. Nakano, M. Toshiba, A. Toriba, T. Kameda, N. Tang: Water Pollution 2010, Bucharest, Romania, 2010

“Toxic effect of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolites on fish bone metabolism”（アブストラクト提出済み）

15）鈴木信雄、中野淳、北村敬一郎、田渕圭章、高崎一朗、古澤之裕、近藤隆、服部淳彦、笹山雄一、鳥羽陽、早川和一：平成22年度日本動物学会中部支部大会（2010）「重油に含まれる多環芳香族水素類の魚の骨代謝に対する作用」

16) K. Kawabe, N. Suzuki, K. Hayakawa: 2010 Korea-Japan Joint Research Project Symposium. "Aging and Environment", Pusan, Korea, 2010

“Effect of polycyclic aromatic hydrocarbons on fish bone metabolism”（アブストラクト提出済み）

17) J. Nakano, N. Suzuki, K. Hayakawa: 2010 Korea-Japan Joint Research Project Symposium. “Aging and Environment”, Pusan, Korea, 2010

“Development of the high sensitive bioassay system for analysis of bone metabolism using the regenerating scales” （アブストラクト提出済み）

18）細住智恵美、鳥羽陽、T. Chetiyanukornkul、唐寧、亀田貴之、早川和一：フォーラム2010：衛生薬学・環境トキシコロジー（2010）

「親水和相互作用クロマトグラフィー／タンデム質量分析法による尿中8-hydroxy-2'-deoxyguanosineの分析」

19）奈良雅之、服部淳彦、大西晃宏、赤塚陽子、鈴木信雄、松田准一：日本分光学会年次講演会（2010）

「再生ウロコの振動分光学研究」

20）中野 淳、鈴木信雄、北村敬一郎、鳥羽 陽、早川和一：平成22年度日本薬学会北陸支部第122回例会

「多環芳香族水素類の魚の骨代謝に対する作用」

21）谷内口孝治、鈴木信雄、早川和一：第45回日本水環境学会（2011）「無機水銀は魚のウロコの骨芽細胞と破骨細胞の活性を抑制する．」

22）川部季美、中野淳、鈴木信雄、北村敬一郎、亀田貴之、鳥羽陽、早川和一：第131回日本薬学会年大会（2011）

「多環芳香族炭化水素類がキンギョの再生ウロコに及ぼす影響のin vivo解析」

23) K. Kawabe, N. Suzuki, K. Hayakawa: The $ 52^{nd} $ Meeting of Korean Society for Atmospheric Environment (2011), Seoul, Korea, 2011

“in vivo study of the effect of polycyclic aromatic hydrocarbons on the regenerating
scales in goldfish”（アブストラクト提出済み）

24) 中野 淳、川部季美、鈴木信雄、北村敬一郎、笹山雄一、服部淳彦、鳥羽 陽、早川和一：平成23年度日本動物学会中部支部例会（2011）

「多環芳香族炭化水素類の内分泌かく乱作用：魚類のウロコを用いたバイオアッセイによる解析」

25) 谷内口孝治、鈴木信雄、服部淳彦、早川和一：平成23年度日本動物学会中部支部例会（2011）

「キンギョのウロコにおける無機水銀の作用：in vitroのアッセイによる解析」

26) 松本典子、川部季美、中野淳、早川和一、鳥羽陽、北村敬一郎、服部淳彦、笹山雄一、鈴木信雄：平成23年度日本動物学会中部支部例会（2011）

「エストロゲン及び多環芳香族炭化水素類のキンギョの骨代謝に及ぼす影響評価

27) 川部季美、Mohamed Nassef、大鳩雄治、鈴木信雄、笹山雄一、服部淳彦、鳥羽陽、早川和一：平成23年度日本動物学会中部支部例会（2011）

「メダカの胚発生における多環芳香族炭化水素の影響：ナノインジェクション法による解析」

28) K. Bekki, A. Toriba, H. Takigami, G. Suzuki, T. Ning, T. Kameda, K. Hayakawa: 23rd International Symposium on Polycyclic Aromatic Compounds (ISPAC 23), (2011). Munster, Germany, 2011

“Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Hydroxides in the Airborne Particles using Gas Chromatography/Tandem Mass Spectrometry” （アブストラクト提出済み）

29）戸次加奈江、鳥羽 陽、滝上英孝、鈴木 剛、唐 寧、亀田貴之、早川和一：フォーラム

2011：衛生薬学・環境トキシコロジー（2011）

「GC-MS/MSによる大気粉塵中水酸化多環芳香族炭化水素類の一斉分析」

30) 川部季美、Mohamed Nassef、大鳩雄治、鈴木信雄、笹山雄一、服部淳彦、中野淳、鳥羽陽、亀田貴之、早川和一：フォーラム2011：衛生薬学・環境トキシコロジー（2011）

「多環芳香族炭化水素類のメダカの胚発生に及ぼす影響．」

31) 奈良雅之，服部淳彦，大西晃宏，赤塚陽子，鈴木信雄，松田准一：医用分光学研究会，島根県（2011）

「赤外・ラマン分光によるキンギョのウロコの状態分析．」

32) 川部季美、Mohamed Nassef、大鳩雄治、鈴木信雄、笹山雄一、服部淳彦、中野淳、鳥羽陽、亀田貴之、早川和一：日本薬学会北陸支部第123回例会（2011）「水酸化多環芳香族炭化水素のメダカとウニの胚発生に及ぼす影響」

33）鈴木信雄、松本典子、川部季美、中野淳、鳥羽陽、早川和一、北村敬一郎、田淵圭章、高崎一朗、古澤之裕、近藤隆、服部淳彦：第46回日本水環境学会（2012）

「魚類の骨代謝に及ぼす多環芳香族炭化水素類の作用」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。