Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
バーコード）、分布・生態、証拠標本情報から成る種情報を、Microsoft Excelを用いて「Ruga」と互換性のある形式でデータベース化した。データの一部は、日本バーコードオブライフ・イニシアティブの「JBOLI-DS」に登録した。この際、システムを管理している東京大学大学院総合文化研究科の伊藤元己教授から適宜助言をもらい作業を進めた。

## 5 ）凍結保存技術の開発

車軸藻類卵胞子の最適な凍結保存法を検討するため、培養実験方法が確立されているシャジクモ（Chara braunii）をモデルに用いた。

## · 凍結手順

シャジクモ（Chara braunii）の単藻培養株より接合子を採取した。単藻培養株は、接合子を1%次亜塩素酸ナトリウム水溶液で5～10分間処理し、4週間の低温処理後、接合子を発芽させることによって作出した。

凍結保存法は、Day et al. (2008) $ ^{15} $ および笠井ら (2009) $ ^{16} $ の方法を基に条件検討を行った。凍害防御剤は多くの生物で実績のあるDMSO（ジメチルスルホキシド）を用いた。接合子については、乾燥に耐えられる壁を持つため、室温に24時間以上置くことで乾燥処理を行ったサンプルを凍結実験に用いた。サンプルはプログラムフリーザー（Kryo 320-1.7, Planer）を用いた2段階凍結法（プログラムフリーザーで徐々に-40℃まで温度を下げたあと、液体窒素で-196℃まで急速凍結させる方法）により凍結させた。冷却速度は、毎分1℃の速度で温度を低下させた。

## · 解凍手順

凍結サンプルを37°Cの恒温槽（サーマルロボ TR-1，アズワン）中で保温し、氷結晶が完全に無くなるまで融解した。解凍した接合子サンプルは、soil-water培地にまき、発芽率を計測した。

## 4 ．結果及び考察

## 1 ）野外調查

平成23年度から24年度に渡り、野外採集調査および提供を受けた車軸藻類を、合計411サンプル（Chara属205サンプル、Lamprothamnium属3サンプル、Nitella属195サンプル、Nitellopsis属8サンプル、総標本数1300点）収集した（巻末資料、表（1）-6）。そのうち、沖縄県本島で採集したNitella tumulosa（日本新産）、沖縄県石垣島で採集したNitella sp.1（日本新産または新種）、愛媛県で採集したChara australis（オーストラリアシャジクモ）、Nitella sp.2（日本新産または新種）、愛知県の休耕田で採集したNitella imahorii（フラスコモダマシ）はこれまでに遺伝子塩基配列が調べられていない種類であった。また、千葉県で採集されたChara sp.1、および神奈川県から採集されたChara sp.2は新種である可能性が示された。他にもrbcL遺伝子塩基配列を用いたDNAバーコーディングにより検出した新規系統(Nitella sp.3～9)を検出した（巻末資料、表（1）-6）。また、徳島県出羽島の集団が国定天然記念物に指定されている絶滅危惧I類のLamprothamnium succinctum（シラタマモ）の新産地を3地点発見した。さらに、過去の種同定結果や形態情報などが不十分であり、実体が良く理解されていなかった琵琶湖産のNitellopsis obtusa（ホシツリモ）および奥日光産のNitella flexilis var. bifurcata（チュウゼンジフラスコモ）を再調査し、詳細な形態観察とDNAバーコーディングを実施した（後述）。
## 2 ）分類学的解析

車軸藻類シャジクモ（Chara）属は、南極大陸を除く世界中の淡水・汽水域に生育し、約200分類群が報告されている。シャジクモ属は輪生枝の皮層細胞、托葉冠（輪生枝の基部から生じるトゲ状の細胞）、主軸の皮層細胞と棘細胞、生殖器官および卵胞子等の特徴によって分類されている。本研究により千葉県および神奈川県からシャジクモ属未記載種（C. sp. 1およびC. sp. 2）と考えられる材料を収集した。

千葉県から見つかった未記載種は部分的に皮層細胞を欠く輪生枝、良く伸長した上下2段の托葉冠、3列性の皮層細胞と良く伸長した棘細胞を持つ主軸を持つことから、Chara globularis（カタシャジクモ）の近縁種と考えられた（図（1）-1,2）。しかし、分子系統解析の結果、本未記載種はC. globularisおよびその近縁種とは系統的に分離しており、C. vulgaris（クサシャジクモ）およびその近縁種に近縁であった（図（1）-3）。本未記載種は、以前に長野県から採集された絶滅危惧種C. vulgaris var. nitelloides（レイセンジシャジクモ）と同一のrbcL遺伝子塩基配列を持っていた。したがって、本未記載種とC. vulgaris var. nitelloidesと同定されていた長野県のサンプルおよびその近縁種の詳細な外部形態比較を行った（表（1）-1）。その結果、本未記載種は、以前にC. vulgaris var. nitelloidesと同定されていた長野県産のサンプルと同一種であり、本未記載種と長野県産のサンプルは「C. vulgaris var. nitelloides」と形態的に異なることが判明した（表（1）-1）。したがって、長野県産のサンプルが「C. vulgaris var. nitelloides」と分類されていることは誤同定と考えられ、本未記載種と長野県産のサンプルは、新種として記載するのが妥当と考えられた。
b

d

e

図（1）-1. 未記載種（C. sp. 1）の栄養形態.

a, 葉状体の全体像 ; b, 葉状体先端部の拡大 ; c, トゲ状の托葉冠 ; d, 生殖器官（上が生卵器、下が造精器） ; e, 主軸の皮層細胞（3 列性） ; f, 輪生枝の終端細胞.
図（1）-2. 未記載種（C. sp.1）の卵胞子形態（SEM）.

a, 卵胞子の全体像 ; b-d, 卵胞子壁. 表面は微細な孔が散在する平滑な構造 ; e, らせん縁から生じるリボン状構造 ; f, リボン状構造の表面構造.

表（1）-1．未記載種（C. sp. 1）とその近縁種との形態比較

学名	主軸の皮層	棘細胞の長さ	托葉冠	輪生枝の皮層	生殖器官の形成様式	卵胞子の長さ	卵胞子のリボン状構造	卵胞子壁構造
C. vulgaris L. var. vulgaris	規則的、2列性	～120μm	よく発達する	あり	同節性	～675μm	欠くまた1は退化的	顆粒状または乳頭状
C. vulgaris var. inconnexa (T.F.Allen) R.D.Wood	不規則、1-2列性	退化的	～130μm	不完全、まれにすべてを欠く	同節性	～600μm	欠くまた1は退化的	平滑または顆粒状
C. vulgaris var. nitelloides (A. Braun) R.D.Wood	不規則、2-3列性	～120μm	～135μm	不完全、まれにすべてを欠く	同節性	～570μm	欠くまた1は退化的	平滑また1は顆粒状
C. brevabracteata Han, Fu et Zhao	規則的、3列性	～60μm	～235μm	不完全、まれにすべてを欠く	異節性	2-	2-	2-
C. sp. 1	規則的、3列性	～135μm	～200μm	不完全、まれにすべてを欠く	同節性	～580μm	よく発達する	微細な孔が散在

$ ^{1} $ Cáceres (1978) $ ^{17)} $ によるSEM観察結果に基づく；2タイプ標本が卵胞子を欠く
図（1）-3. Chara属のrbcL遺伝子塩基配列（1194bp）に基づく分子系統樹.

PhyML（GTRモデル）により最尤系統樹を構築し、枝にブーツ・ストラップ値（1000回試行）を示した。

さらに本研究により神奈川県から発見されたサンプルは、輪生枝と主軸の皮層細胞を欠き、托葉冠が1段であり、雌雄同株であることから、C. corallina（オオシャジクモ）と考えられた（図（1）-4）。C. corallinaは、生殖器形成位置に加えて苞細胞（輪生枝節部に形成される細胞片）が退化的（~500μm）であることが特徴として知られている。しかしながら、神奈川県産のサンプル
には顕著な苞細胞（500~1000 μm）が見られた（図（1）-4E）。さらに、通常は輪生枝と交互に一つずつ形成される托葉冠（輪生枝基部に形成される細胞片）が不完全であることが確認された（図（1）-4C）。これらの形質はこれまでのいずれの報告とも一致しないものであった。

本種は雌雄同株の種であり、一方で雌雄異株のものは近縁な別種C. australis（オーストラリアシャジクモ）として広く認められているが $ ^{18-20} $ 、これらを同一の種内分類群として扱う見解もある $ ^{3} $ 。しかし、これまでに分子系統解析による分類学的調査はなされていない。そこで本研究では、神奈川県産のC. corallinaサンプルの分類学的位置づけを明らかにするために、日本産のC. corallina計10サンプルと、その近縁種のC. australis計2サンプルを用いて、詳細な形態比較と分子系統解析(rbcL遺伝子:1194 bp, 18S-rRNA遺伝子:1566 bp, ITS領域:747 bp)を実施した（図（1）-5）。

その結果、C. corallina（雌雄同株）またはC. australis（雌雄異株）は高い信頼性でそれぞれが単系統群を構築し、両種における雌雄同株／異株性の分類形質としての妥当性が支持された。C. corallinaの系統内において、今回発見された神奈川県産の系統とその他の系統群は、高い信頼性で支持される姉妹群を構築した。したがって形態観察・系統解析の両結果から、神奈川県産の系統は新規分類群（種または種以下）として扱うことが妥当であると考えられた。

A

図（1）-4. C. corallina 新規系統の栄養形態. A. 全体像、輪生枝節部と基部に成熟した卵胞子が形成されている；B. 藻体頂端部、♀は雌性生殖器、♂は雄性生殖器；C. 輪生枝基部、矢印は不完全な托葉冠；D. 輪生枝末端細胞；E. 顕著な苞細胞（矢尻）.
図（1）-5. C. corallina 新規系統の分子系統解析結果と形態的特徴の対応関係.

また、本研究により、分布が希なホシツリモ (Nitellopsis obtusa)の新産地を発見した。日本におけるホシツリモは、4つの湖沼のみ(野尻湖、河口湖、芦ノ湖、山中湖)に分布が報告されていた希少種であり、現在では河口湖でしか野生集団は見られない。ソウギョの放流等の影響により絶滅した野尻湖では、野尻湖産の培養株が室内で保存され、野生集団復活に向けた保全活動が地域レベルで行われている。昨年度、琵琶湖において沈水植物の植生調査を行ったところ、北湖西岸水深2m付近の沈水植物帯からホシツリモと思われる未成熟藻体の細胞断片が発見された。本研究で琵琶湖において再調査を実施し、高島沖に小規模のホシツリモ集団が存在することを確認した。今回採集した藻体はホシツリモの識別に最も重要な星状体(無性生殖器官)を欠いていたが、本種に特徴的な肥大した節部と長大な苞細胞が確認でき、その他の形質も基本的にホシツリモの原記載と一致した（図（1）-6）。また、琵琶湖産藻体のrbcL遺伝子塩基配列(DNAバーコード領域)は既知のホシツリモの配列と完全に一致し、本藻体がホシツリモであることのより確かな確証を得た（図（1）-7）。さらに、より進化速度が速いDNA領域のatpB-rbcL遺伝子間領域の塩基配列を既報のホシツリモの配列と比較した結果、琵琶湖産ホシツリモは既報のホシツリモと識別することができた（図（1）-8）。このことは、琵琶湖産ホシツリモは、他の日本産ホシツリモとは独立に日本に定着した可能性が示唆された。
C

D

図（1）-6. 琵琶湖産ホシツリモの栄養形態.

A, 葉状体の全体像 ; B, 主軸および輪生枝 ; C, 最終枝先端部分 ; D, 肥厚した節部 ; E, 栄養性欲器官.

矢印は輪生枝の主軸、矢尻は苞細胞を示す。

図（1）-7.rbcL遺伝子塩基配列（1194bp）に基づく分子系統樹.
枝に事後確率/ブーツ・ストラップ値（1000回試行）を示した（左上段：ベイズ法、右上段：最節約法、左下段：近隣結合法、右下段：最尤法）.

図（1）-8. atpB-rbcL遺伝子間領域の塩基配列に基づくハプロタイプネットワーク樹. 枝にインデルを示した.

また、本研究により絶滅種とされていたチュウゼンジフラスコモ（Nitella flexilis var. bifurcata）を再発見した。チュウゼンジフラスコモは平成19年に環境省により公表されたレッドリストには、絶滅種として掲載されていた。しかし、その後、奥日光にある湯ノ湖および菅沼から、形態的にチュウゼンジフラスコモと考えられる薬体が採集されたことから、平成24年に環境省により公表された最新のレッドリストには、絶滅危惧I種としてランク変更がなされた。しかし、過去の種同定結果や形態情報などが不十分であり、奥日光産のサンプルの実体が良く理解されていなかった。本研究では、湯ノ湖および菅沼における再調査を実施し、チュウゼンジフラスコモの成熟個体を採集した。本薬体は輪生枝が1～2回分枝し、典型的なチュウゼンジフラスコモの特徴を持っていた（図（1）-9）。さらにチュウゼンジフラスコモの卵胞子形態を初めて走査型電子顕微鏡を用いて詳細に観察した（図（1）-10）。その結果、チュウゼンジフラスコモの卵胞子形態は、近縁なヒメフラスコモと類似するが、卵胞子壁表面構造によって区別できることが明らかになった（図（1）-10）。また、過去の標本および本研究で得たチュウゼンジフラスコモとヒメフラスコモの標本の $ atpB-rbcL $ 遺伝子間領域の塩基配列に基づくDNAバーコーディングを実施した結果、チュウゼンジフラスコモは遺伝的に分化した系統群であることが示唆された（図（1）-11）。
A

B

C

図（1）-9. 菅沼産チュウゼンジフラスコモの栄養形態.

A, 葉状体の全体像（スケールバーは5cm）；B, 葉状体先端部の拡大（スケールバーは5cm）；C, 最終枝先端部分（スケールバーは2mm）。矢尻は分枝部分を示す。

b

図（1）-10. チュウゼンジフラスコモおよびヒメフラスコモの卵胞子形態（SEM）.
a−c, チュウゼンジフラスコモ（菅沼産）：a, 卵胞子の全体像；b, 卵胞子壁；c, 卵胞子壁の拡大.

d−e, ヒメフラスコモ（香川県産）：d, 卵胞子の全体像；e, 卵胞子壁；f, 卵胞子壁の拡大.

FWは卵胞子壁、SRはらせん縁を示す.

図（1）-11. atpB-rbcL遺伝子間領域の塩基配列に基づくハプロタイプネットワーク樹. 枝にインデルをを示した.

1～3, 7～9はヒメフラスコモ、4～6はチュウゼンジフラスコモのハプロタイプを示す.

## 3 ）分子マーカー/DNAバーコードの新規開発

本研究では、種レベルを識別する分子マーカー/DNAバーコードとして、薬緑体のrbcL遺伝子塩基配列548bpを用いた。本遺伝子領域は、DNAバーコードとして国際的に標準化されている遺伝子領域である。平成23～24年度に渡り、国際的に標準化されている遺伝子領域である薬緑体のmatK遺伝子塩基配列の車軸藻類用PCRプライマーを新たに開発し、そのDNAバーコードとしての有効性を検討した。シャジクモ目、シャジクモ属、フラスコモ属ごとに各遺伝子(rbcL、matK)のアライメントファイルを作成し、DNAバーコードの評価指標とされている塩基置換モデル（K2Pモデル）を用いて、PAUP4.0*で分子系統樹および距離行列データを作成し、行列データから、EXCELを用いて頻度分布を作成した。解析には、rbcL遺伝子222配列（決定した配列長1380bp, DNAバーコード領域563bp）、matK遺伝子50配列（決定した配列長1182bp, DNAバーコード領域744bp）を用いた。その結果、車軸藻類において、matK遺伝子領域はrbcL遺伝子領域よりも高い塩基配列多様性を持ち、属レベルではrbcL遺伝子領域単独のデータにより明確に識別可能であることが明らかになった（図（1）-12, 13）。また、matK遺伝子領域とrbcL遺伝子領域において種間での遺伝的距離が明確に認められた（図（1）-13）。これらの結果は、matK遺伝子領域とrbcL遺伝子領域において種を識別するバーコーディングギャップが存在することを示しており、両遺伝子領域を組み合わせることにより種を識別するDNAバーコードとして適用可能であることが明らかになった（図
（１）-13）。したがって、matK遺伝子領域とrbcL遺伝子領域を組み合わせたDNAバーコーディングによる車軸藻類の種同定支援システムを確立することができた。

図（1）-12．車軸藻類のrbcL遺伝子塩基配列（548塩基対）を用いた分子系統樹（近隣結合法）．枝に示した数字は統計的信頼度（ブーツ・ストラップ確立）を示している．枝の長さはスケールバーで示された塩基置換率に比例する．
K2P distanceの度数分布

intraSp=種內、interSp=種間、interGen=屬間 rbcl:OTU=222(Genbank=195) Seq length:total=1380 matK:OUT=50(Genbank=7) Seq length:total=1182

図（1）-13．車軸藻類内での種内、種間、属間におけるrbcL遺伝子とmatK遺伝子領域の多様度の比較.

一方、C. braunii（シャジクモ）のESTデータ（合計3,285 contig）から2塩基モチーフおよび3塩基モチーフのEST-SSRの抽出を実施し、合計248のEST-SSR領域を抽出し、これらのEST-SSR領域のうち、56領域についてPCR増幅用のプライマーを設計し、系統が大きく異なるC. braunii 8サンプルを用いて多型の有無を調査し、2塩基モチーフについては8領域、3塩基モチーフについては20領域において多型を観察した。さらに248領域中71領域についてPCR増幅用のプライマーを設計し、スクリーニングを完了させた（表（1）-2）。系統が異なる8株を用いて、72遺伝子座の有用性を調査した結果、32遺伝子座が安定的にPCR増幅とアリル決定が可能であった（平均アリル数4.0個）（表（1）-3）。集団内レベル（河口湖集団16個体）で、この13遺伝子座の多型性を確認した結果、10遺伝子座で多型性を示した（平均アリル数3.6個）（表（1）-4）。これらの結果は、本研究で開発したEST-SSRマーカーは集団/個体レベルの識別に利用可能なレベルであることを示している。

表（1）-2. 本研究で作成したEST-SSR領域のPCR増幅用プライマー.

Priemr set	contig in EST data	Forward Primer	Reverse primer
Di001	CharaCL1Contig183	M13-GCGACGTAGTGTGTGCATTT	GAGGAAGCCTTTCACGATTG
Di002	CharaCL824Contig1	M13-TGTTTAGCTATCGGCAGCCT	CAACGAGCTCCTTCACCTTC
Di003	CharaCL188Contig1	M13-TGTGTCTTCCCCTTGCTCTT	CGAAATGGAGAGAGAGAGCG
Di004	CharaCL917Contig1	M13-TCTTCTTCTCCCTGTCCCCT	CGAATGCGCACAAGAGATAA
Di005	CharaCL796Contig2	M13-CTTCTTCTACAGCCATCGCC	CAGAATACGCTCCTTCCACC
Di006	CharaCL1Contig14	M13-TTTGGAGGCGAAACTTATGG	CCTCGAAATCTTCTTCCATCC
Di007	CharaCL428Contig4	M13-GCAAGTGGACGAGAGGAGAG	GTTAAGCCGAGCCACTTCTG
Di008	CharaCL700Contig1	M13-GCAAGTGGACGAGAGGAGAG	GTTAAGCCGAGCCACTTCTG
表（1）-3．系統が異なる8株（異なる地域集団）を用いてスクリーニングしたSSRマーカーと多型性.

2塩基モチーフのSSR (12遺伝子座)

3塩基モチーフのSSR (20遺伝子座)

Locus	Repeat motif	Allele size range (bp)	Na	Locus	Repeat motif	Allele size range (bp)	Na
Di002	(GA)n	194-216	3	Tri002	(TCT)n	155-176	5
Di003	(CT)n	260-278	3	Tri003	(GAG)n	199-211	2
Di011	(TC)n	294-298	3	Tri004	(TGC)n	270-297	5
Di015	(CT)n	204-224	3	Tri006	(TCT)n	155-188	6
Di017	(CT)n	265-342	5	Tri007	(GAG)n	199-211	4
Di021	(AG)n	187-269	7	Tri008	(TCA)n	209-218	3
Di022	(TC)n	250-380	8	Tri009	(AGG)n	261-270	4
Di023	(CT)n	203-217	4	Tri010	(CTC)n	266-272	2
Di027	(TC)n	267-340	4	Tri012	(GGA)n	289-298	4
Di029	(GA)n	171-197	3	Tri013	(GAG)n	262-271	2
Di031	(GA)n	161-171	5	Tri014	(TCT)n	143-156	5
Di033	(CA)n	268-284	5	Tri015	(AAG)n	146-166	5
mean	4.42	Tri016	(CTT)n	188-217	5
SD	1.68	Tri017	(GAA)n	193-198	2
Na: number of observed allele (観測アル数;個)	Tri018	(AGA)n	259-264	3
Tri020	(GAA)n	290-300	4
Tri027	(ATG)n	203-219	4
Tri031	(CTT)n	219-235	4
Tri033	(TCA)n	250-259	4
Tri036	(AGG)n	285-288	2
mean	3.75
SD	1.25

表（1）-4．河口湖集団16個体を用いた13遺伝子座の多型性.

Locus	Repeat motif	Allele size range (bp)	Na
Di002	(GA)n	194-216	8
Di003	(CT)n	260-278	5
Di011	(TC)n	294-298	2
Di015	(CT)n	204-224	5
Tri002	(TCT)n	155-176	6
Tri003	(GAG)n	199-211	1
Tri004	(TGC)n	270-297	1
Tri006	(TCT)n	155-188	6
Tri007	(GAG)n	199-211	3
Tri008	(TCA)n	209-218	2
Tri009	(AGG)n	261-270	1
Tri010	(CTC)n	266-272	2
Tri012	(GGA)n	289-298	3
mean	3.46
SD	2.30
## 4 ）車軸藻類の多様性情報データベース構築とデータの管理、公開手順

これまでに当研究室において遺伝子解析がなされている車軸藻類のさく葉標本および本研究で新たに収集したさく葉標本を用いて車軸藻類の多様性情報データベースの構築を進めた。種情報についてはMicrosoft Excel形式でデータを管理した。DNAバーコードに用いた遺伝子塩基配列情報はFasta形式でデータを管理した。現時点では、本研究で新たに収集したさく葉標本について、標本ラベル情報（標本ID、和名、学名、採集日、採集地、特記事項）の入力が完了した。形態情報と遺伝子塩基配列情報に基づいた種同定が完了したサンプルの一部は、JBOLI-DSによるデータ登録を行い、情報公開の準備を進めた（図（1）-14）。

図（1）-14. JBOLI-DSによる車軸藻類のデータ公開ページ. 左が標本データ用ページ、右が種名リストページ.

## 5 ）凍結保存技術の開発

C. brauniiの卵胞子を用いて凍結保存条件の検討を実施した（表（1）-5）。本研究で検討した条件の中では、乾燥サンプル、凍結防護剤サンプルの両方で凍結保存に成功した。しかし、実験に用いたサンプルのロット間で、コントロール条件での発芽率が3～35%であり安定しない場合が観察された。発芽率を改善するため、実際に車軸藻類が生育する自生地の底土を実験に用いた結果、安定した発芽率を得ることができた（図（1）-15）。したがって、本研究で確立した卵胞子
の凍結保存条件、発芽条件を用いることによって、安定した域外保全が実施できることが明らかになった。

表（1）-5. 検討した車軸藻類卵胞子の凍結保存条件.

予備実験

乾燥(常温)	滅菌処理	凍結	凍結防護剤
10%DMSO	ヒートショック処理	発芽率
条件A(control)	-	-	-	-	+	3% (n=600)
条件B	+	-	-	-	+	1.5% (n=600)
条件C	+	-	+	-	+	1% (n=600)
条件D	-	-	+	+	+	0% (n=600)
条件E	-	+	-	-	+	0% (n=300)
条件F	+	+	-	-	+	1.3% (n=300)
条件G	+	+	+	-	+	0.7% (n=300)
条件H	-	+	+	+	+	0.3% (n=300)

発芽条件を再検討(生育地の土を使用)

乾燥(常温)	滅菌処理	凍結	凍結防護劑10%DMSO	ヒートショック処理	発芽率
条件B (control)	+	-	-	-	+	25-52.5% (n=600)
条件C	+	-	+	-	+	21.5-23.5% (n=600)

+は処理を行ったこと、-は未処理を示す。

図（1）-15. 発芽した車軸藻類の卵胞子（条件C）.

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

・野外調査によって車軸藻類サンプルを合計244サンプル得たことにより、車軸藻類の現在の生育分布状況がより明確になった。また、野外調査によって得られたサンプルの中に、新規分類群と考えられるサンプルを複数見いだすことができた。これらの成果は、車軸藻類の分類学・生態学上の基礎的理解の底上げにつながる。
・matK遺伝子領域はrbcL遺伝子よりも高い塩基配列多様性を持ち、種を識別するDNAバーコードとして適用可能であることが明らかになった。したがって、matK遺伝子領域とrbcL遺伝子領域を組み合わせたDNAバーコーディングシステムを確立することができた。従来の先行研究において、網羅性の高い情報基盤の構築、種および集団を明確に識別する同定支援システム、遺伝的多様性を反映した域外保全を十分に実現できていなかった。その原因は、種類数の多さや利用する遺伝子領域の選定の難しさによる影響が大きい。本研究の対象である車軸藻類は種類数が非常に少ないグループ（全86種類）であり、また本グループの起原が古いため変異に富む遺伝子領域を多くもつ。したがって、網羅性の高いDNAバーコーディングを、高精度で、かつ短期間で構築することが容易なので、多様性情報基盤と域外保全技術研究を結合させた保全システムの実用化に向けた有意義なモデルとして有望である。また、車軸藻類は、絶滅の危険度が極めて高い分類群であり、かつ、分類・識別に熟練した知識と経験が必要である種同定が非常に困難なグループである。したがって、多様性情報基盤と域外保全技術研究を結合させた保全システムを構築する意義が非常に大きい。さらに、本研究をモデルケースに用いて、より種数の多い複雑な分類群への応用、発展が期待される。

・C. brauniiのESTデータ（合計3,285 contig）から2塩基モチーフおよび3塩基モチーフのEST-SSRの抽出および系統が大きく異なるC. brauniiサンプルを用いて多型の有無を調査し、248領域中71領域についてPCR増幅用のプライマーを設計し、系統が異なる8株を用いて、72遺伝子座の有用性を調査した結果、32遺伝子座の安定的にPCR増幅とアリル決定が可能なマーカーを確立できた。この結果は、EST-SSRを集団レベルの血統登録用DNAバーコードとして初めて導入するモデル研究になり得る。さらに、国内集団をDNAバーコードによって血統登録することによって、新規に侵入してくる外来集団を容易に識別し、迅速に排除するための対策を講じることが可能となる。また、海外での多様性情報基盤の充実、情報の共有化が進めば、DNAバーコード塩基配列を用いた分子系統解析を実施することにより、集団間の系統関係と遺伝的距離から、外来種の由来と侵入経路を特定することが出来ると期待される。

・これまで凍結保存技術が確立されていない絶滅危惧植物の車軸藻類の卵胞子における凍結保存法を確立した。新規凍結保存法による車軸藻類の長期保存技術が確立されることにより、種の絶滅、種内の遺伝的多様性の喪失を防ぐことができる。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

環境省の第3次絶滅のおそれのある野生生物の選定・評価検討会、植物II分科会におけるレッドリストの検討において、本研究成果の一部である車軸藻類の現在の生育分布に関するデータを提示し、レッドリストの見直しに貢献した。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

• 本研究で、日本に生育する車軸藻類の種および集団レベルを識別するDNAバーコーディングを用いた種同定システムが構築されたことによって、車軸藻類の種および集団レベルの同定、保全範囲の決定が、容易に、かつ高精度で可能となるので、環境保全政策の意思決定や環境研究の進展に大きく寄与するものと見込まれる。
- 本研究で収集した車軸藻類の分布情報は、今後、車軸藻類の生育に適した環境条件の解析を進めることにより、対象地域の環境情報と相互利用することにより、生態ニッチモデリング（環境情報から生物分布を説明するモデルを作成し、対象種の生育に適した環境条件の分布から、ある場所での対象種の分布確率を推定する方法）等に活用することが見込まれ、対象種がどのような地域に潜在的に分布し、どの地域に定着可能か等を推定可能になると見込まれる。

- 本研究で構築した車軸藻類多様性研究の方法論は、将来のレッドリストの見直しにおいて、車軸藻類サンプルの種同定を支援することによって、絶滅危惧種のランク評価に直接貢献すると見込まれる。

- 本研究で構築された、学名、形態、生態、生理的特徴、分子情報、文献、分布情報、環境情報等の車軸藻類の多様性情報基盤は、地球規模生物多様性情報機構（GBIF）、日本バーコードオブライフ・イニシアティブ (JBOLI)、Barcode of Life Data Systems (BOLD)、および世界分類学イニシアティブ（GTI）と情報を共有することにより、だれもが情報にアクセス可能になるため、環境政策を進める上で、様々な行政機関、自治体で活用されることが見込まれる。

• 車軸藻類の接合子の凍結保存技術が確立されたことによって、車軸藻類の域外保全に活用されることが期待される。また、本技術は、車軸藻類を1.5mLチューブ程度のサイズで半永久的に保存できるため、低コスト、小スペースの域外保全が行える。また、得られた保存試料は、環境資料のタイムカプセル化事業、バイオリソースプロジェクト、里地里山の保全などに直接的に貢献できる。

• 本研究の多様性情報基盤と域外保全技術に基づく成果は、生物多様性国家戦略および生物多様性基本法の目的達成に大きく貢献できる。

また、多様性情報基盤は、自然環境保全基礎調査（緑の国勢調査）およびレッドリスト改訂のための基礎データになる他、絶滅のおそれのある野生動植物の種の保存に関する法律の運用をサポートすることにも繋がる。

さらに本研究の成果は、将来的に野生生物の絶滅リスク評価、保全管理のための意思決定支援へと発展することが期待される。

## 6 ．国際共同研究等の状況

1) 日本・オーストラリアにおける車軸藻類の分類学的研究

将来的に、本研究の成果を生かし、環太平洋地域の車軸藻類の多様性に関する研究を実施するための準備段階として、日本とオーストラリアに生育する車軸藻類の関係性に関する共同研究を進めている。(Adriana García博士, University of Wollongong, Australia)

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない

<査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない
## くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1）柴田葵、加藤将、川井浩史、坂山英俊：第36回日本藻類学会（2012）

「車軸藻類Chara fibrosa群の分子系統学的解析」

2）加藤将、川井浩史、坂山英俊：第36回日本藻類学会（2012）

「シャジクモの保全遺伝学に向けたSSRマーカーの新規開発」

3）坂山英俊：第34回水草研究会（2012）

「日本産車軸藻類の分類と生育分布の現状」

4）加藤将：第34回水草研究会（2012）

「最も絶滅が危機される車軸薬類ホシツリモの歴史と現在」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（4）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）京都新聞（2012年7月6日、朝刊、滋賀県版、1面、「ホシツリモ琵琶湖で発見」）

2) 中日新聞（2012年7月6日、朝刊、滋賀県版、22面、「「ホシツリモ」琵琶湖で発見」）

3）読売新聞（2012年7月6日、朝刊、滋賀県版、「希少水草を西日本初確認」）

4) 朝日新聞（2012年7月6日、朝刊、全国版、35面、「絶滅危惧の藻 琵琶湖で発見」）

5) 成果の記者発表（2012年7月6日、於水資源機構琵琶湖開発総合管理所、「西日本初 琵琶湖でホシツリモを発見-学術上の貴重な発見として植物学会で発表-」

6) NHKニュース（2012年7月6日、琵琶湖でホシツリモを発見した成果について1分ほど紹介）

7) 中日新聞（2012年8月17日、朝刊、滋賀県版、32面、「琵琶湖に「清湖」の薬」）

8) 毎日新聞（2012年8月21日、朝刊、社会26面、「琵琶湖に「幻の藻類」」）

9) 毎日新聞（2012年8月27日、夕刊、社会10面、「琵琶湖に幻のホシツリモ」）

## (6) その他

## <ポスター発表（学会等）>

1）加藤将、坂山英俊：第33回水草研究会全国集会（2011）

「シャジクモ（Chara braunii）に見られる生態的2型の進化生物学的解析」

2）加藤将、柴田葵、坂山英俊：第33回水草研究会全国集会（2011）

「絶滅危惧種の多様性情報学と域外保全技術開発に向けて〜シャジクモ類を例に〜」
3) 坂山英俊、加藤将、樋口澄男、佐野郷美、野崎久義、川井浩史：第11回日本植物分類学会（2012）

「長野県および千葉県に生育するシャジクモ属（シャジクモ目、シャジクモ科）の未記載種について」

4) 加藤将、川井浩史、柴田葵、坂山英俊：第11回日本植物分類学会（2012）

「オオシャジクモ種内(シャジクモ目シャジクモ科)の新規系統に関する分類学的研究」

5）比嘉敦、坂山英俊、加藤将、香村真徳、熊野茂：第36回日本藻類学会（2012）

「沖縄本島における車軸藻類と淡水産大型紅藻類の産地報告」

6) 加藤将、須賀瑛文、養田勝則、堀家健司、滝本雅之、川井浩史、坂山英俊：第76回日本植物学会（2012）

「絶滅危惧車軸薬類ホシツリモの新産地発見」

7) 加藤将、永野萌、鳥田智、川井浩史、坂山 英俊：第37回日本藻類学会（2013）

「シャジクモ (Chara braunii) における EST-SSRマーカーの開発」

## ＜本研究による受賞等＞

1) ポスター発表賞：

加藤将、川井浩史、柴田葵、坂山英俊：第11回日本植物分類学会（2012）

「オオシャジクモ種内(シャジクモ目シャジクモ科)の新規系統に関する分類学的研究」

### 8 \. 引用文献

1) Imahori, K. 1954. Ecology, phytogeography and taxonomy of the Japanese Charophyta. Kanazawa University Press, Kanazawa, Japan, 234 pp.

2) Kasaki, H. 1964. The Charophyta from the lakes of Japan. J. Hattori Bot. Lab. 27: 215–314.

3) Wood R.D. 1965. Monograph of the Characeae. In: A revision of the Characeae (Ed. by R.D. Wood & K. Imahori), vol. 1. J. Cramer, Weinheim. 904 pp.

4) Sakayama, H., Nozaki, H., Kasaki, H. and Hara, Y. 2002. Taxonomic re-examination of Nitella (Charales, Charophyceae) from Japan, based on microscopical studies of oospore wall ornamentation and rbcL gene sequences. Phycologia 41: 397–408.

5) Sakayama, H., Miyaji, K., Nagumo, T., Kato, M., Hara, Y. and Nozaki, H. 2005. Taxonomic re-examination of 17 species of Nitella subgenus Tieffalenia (Charales, Charophyceae) based on internal morphology of the oospore wall and multiple DNA marker sequences. J. Phycol. 41: 195–211.

6) Sakayama, H., Kasai, F., Kawachi, M., Watanabe, M. M., Nozaki, H., Nishihiro, J., Washitani, I., Shigyo, M., Krienitz, L. and Ito, M. 2009. Taxonomic reexamination of Chara globularis (Charales, Charophyceae) from Japan based on oospore morphology and rbcL gene sequences, and the description of C. leptospora sp. nov. J. Phycol. 45: 917–927.

7) Sakayama, H., Hara, Y., Arai, S., Sato, H. and Nozaki, H. 2004a. Phylogenetic analyses of Nitella subgenus Tieffalenia (Charales, Charophyceae) using nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences. Phycologia 43: 672–81.

8) Sakayama, H., Hara, Y. and Nozaki, H. 2004b. Taxonomic re-examination of six species of Nitella
(Charales, Charophyceae) from Asia, and phylogenetic relationships within the genus based on rbcL and atpB gene sequences. Phycologia 43: 91–104.

9) Sakayama, H., Arai, S., Nozaki, H., Kasai, F. and Watanabe, M. M. 2006. Morphology, molecular phylogeny and taxonomy of Nitella comptonii (Charales, Characeae). Phycologia 45: 417–21.

10) Sakayama, H. 2008. Taxonomy of Nitella (Charales, Charophyceae) based on comparative morphology of oospores and multiple DNA marker phylogeny using cultured material. Phycol. Res. 56: 202–15.

11) CBOL Plant Working Group. 2009. A DNA barcode for land plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:12794–97.

12) Kato, S., Sakayama, H., Sano, S., Kasai, F., Watanabe, M. M., Tanaka, J. and Nozaki, H. 2008. Morphological variation and intraspecific phylogeny of the ubiquitous species Chara braunii (Charales, Charophyceae) in Japan. Phycologia 47: 191–202.

13) Kato, S., Misawa, K., Takahashi, F., Sakayama, H., Sano, S., Kosuge, K., Kasai, F., Watanabe, M. M., Tanaka, J. and Nozaki, H. 2011. Aquatic plant speciation affected by diversifying selection of organelle DNA regions. J. Phycol. 47: 999–1008.

14) Guichoux, E., Lagache, L., and Wagner, S. 2011. Current trends in microsatellite genotyping. Molecular Ecology Resources 11: 591–611.

15) Day, J. G., Harding K., Nadarajan, J. and Benson E. E. 2008. Cryopreservation: conservation of bioresources at ultra low temperatures. In Walker J. M. and Rapley R. [Ed.] Molecular Biomethods Handbook, 2nd Edition. Humana Press, Totowa, NJ, pp. 915–945.

16）笠井文絵・河地正伸・恵良田真由美 [他] 2009. NIESコレクション保存株リスト第8版. 国立環境研究所微生物系統保存株評価委員会 (The Japanese journal of phycology 57: 1–350).

17) Cáceres, E. J. 1978. Contribucion al conocimiento de los Carofitos del Centro de Argentina. Bol. Acad. Nac. Cienc. Cordoba 52: 315–372.

18) Zaneveld, J. S. 1940. The Charophyta of Malaysia and adjacent countries. Blumea 4: 1–224.

19) Imahori, K. and Kasaki, H. 1977. Class Charophyceae. In Hirose, H. and Yamagishi, T. [Ed.] Illustrations of the Japanese fresh-water algae. Uchida Rokakuho Publishing, Tokyo, pp. 761–829 (in Japanese).

20) Proctor, V. W. 1980. Historical biogeography of Chara (Charophyta): An appraisal of the Braun-Wood classification plus a falsifiable alternative for future consideration. J. Phycol. 16:218–233.
卷末资料. 表（1）- 6

和名,学名	サンプル名	採集地(生育環境)	採集日	標本枚数
[環境省版レッドリストランク]	[緯度経度]
アメリカシャジクモ,Chara sejuncta[絶滅危惧I類(CR+EN)]	KGW002-3	香川県東かがわ市川東 原間池近くの池(ため池)N34°13'46.84"E134°19'53.83"	2012.10.18	5
イトシャジクモ,C. gymnopitys (= C. fibrosa subsp. gymnopitys)[絶滅危惧I類(CR+EN)]	MRMT002	兵庫県たつの市揖西町龍子(ため池)	2011.08.27	2
KDN002	岡山県高梁市龍王池(ため池)	2011.09.02	2
ISKW004-1	石川県珠洲市三崎町伏見(ため池)N37°27'14.30"E137°20'57.35"	2011.09.21	3
OITA-001-2	大分県別府市枝郷 神楽女湖(ため池)N33°15'18.15"E131°27'54.13"	2011.10.07	3
OITA-002-1	大分県別府市枝郷 神楽女湖(近接の湿地)N33°15'22.39"E131°27'48.56"	2011.10.07	3
EHM019-1	愛媛県今治市朝倉南(ため池)N33°59'30.85"E133°02'02.36"	2011.10.19	2
EHM020-1	愛媛県今治市朝倉南(ため池)N33°59'30.98"E133°01'59.75"	2011.10.19	3
HRSM001-2	広島県東広島市鏡山 鏡山公園 奥田大池(ため池)N34°24'23.36"E132°43'43.05"	2011.10.25	3
HRSM012	広島県三原市久井町坂井原(ため池)N34°28'49.10"E133°01'39.88"	2011.10.26	1
HRSM016-1	広島県三次市島敷町(ため池)N34°49'19.54"E132°53'18.82"	2011.10.27	3
HRSM020	広島県三次市島敷町(ため池)N34°49'19.34"E132°53'43.06"	2011.10.27	5
EHM109-1a	愛媛県大洲市戒川 戒川一番池(ため池)N33°35'10.88"E132°31'59.76"	2012.08.27	7
EHM109-5b	愛媛県大洲市戒川 戒川一番池(ため池)N33°35'11.93"E132°31'58.17"	2012.08.27	3
TTR012-2	鳥取県鳥取市大塚(ため池)N35°28'57.86"E134°09'40.20"	2012.09.19	5
MRMT008	愛知県日進市藤島町長塚 岩藤新池(近接の湿地)	2012.10.08	1
EHM305-3	愛媛県南宇和郡愛南町増田(ため池)	2012.10.16	3
オオシヤジクモ,C. corallina[絶滅危惧I類(CR+EN)]	EHM013	愛媛県今治市長沢(ため池)N34°00'17.18"E133°02'03.79"	2011.10.19	5
HRSM001-1	広島県東広島市鏡山 鏡山公園 奥田大池(ため池)N34°24'23.36"E132°43'43.05"	2011.10.25	5
HRSM011	広島県三原市久井町坂井原(ため池)N34°28'46.09"E133°01'36.26"	2011.10.26	4
HIGA002	沖縄県国頭郡国頭村奥川(砂防ダム直上)N26°49'19.09"E128°16'58.98"	2012.03.25	5
HIGA301-2	沖縄県うるま市石川嘉手苅(用水路)N26°25'28.09"E127°48'30.67"	2012.05.03	0
HIGA302-2	沖縄県国頭郡恩納村富着(用水路)N26°27'10.91"E127°49'25.14"	2012.05.03	5
HIGA601	沖縄県国頭郡国頭村奥川(砂防ダム直上)N26°49'19.09"E128°16'58.98"	2012.09.14	5
TTR011	鳥取県鳥取市滝山(ため池)N35°30'05.34"E134°17'08.38"	2012.09.19	10
EHM317	愛媛県今治市長沢(ため池)N34°00'17.29"E133°02'04.02"	2012.10.18	9
オーストラリアシャジクモ,C. australis[情報不足(DD)]	EHM201	愛媛県南宇和郡愛南町増田(ため池)N32°58'58.22"E132°38'44.38"	2012.09.01	4
EHM202	愛媛県南宇和郡愛南町増田(ため池)N32°58'44.40"E132°38'51.58"	2012.09.01	1
EHM304-1	愛媛県南宇和郡愛南町増田(ため池)N32°58'58.22"E132°38'44.38"	2012.10.16	5
EHM305-1	愛媛県南宇和郡愛南町増田(ため池)N32°58'46.46"E132°38'49.71"	2012.10.16	7
カタシャジクモ,C. globularis[絶滅危惧I類(CR+EN)]	HGCH007	長野県上水内郡飯綱町浅川大池(ため池)	2011.08.25	1
KDN003	兵庫県加東市山国王子が池(ため池)	2011.09.13	1
KDN004	兵庫県加東市山国王子が池(ため池)	2011.09.13	2
HGCH006	長野県北安曇郡小谷村鉈池(ため池)	2011.09.18	3
HGCH003	長野県信濃町御鹿池(ため池)	2011.09.25	3
HGCH004	長野県信濃町御鹿池(ため池)	2011.09.25	3
KG001	山梨県南都留郡富士河口湖町河口湖(湖沼)N35°30'25.28"E138°44'06.37"	2011.10.16	3
KG009-4	山梨県南都留郡富士河口湖町(湖沼)N35°30'36.64"E138°44'23.89"	2011.10.17	1
EHM024	愛媛県今治市宅間(ため池)N34°04'38.54"E132°56'50.15"	2011.10.19	5
EHM026-1	愛媛県今治市波方町波方(ため池)	2011.10.19	5
SPR011	N34°07'04.07"E132°56'56.71"	2012.07.17	8
北海道千歳市幌美内支笏湖(湖沼)
SPR012-1	N42°46'55.77"E141°18'47.55"	2012.07.17	7
北海道千歳市幌美内支笏湖(湖沼)
SPR013	N42°48'02.29"E141°19'37.62"	2012.07.17	8
北海道白老郡白老町虎杖浜俱多楽湖(湖沼)
MYG001_5	N42°29'37.94"E141°10'12.19"	2012.07.27	1
宮城県亘理郡山元町坂元磯沼下水神沼(ため池)
KG114-2	N37°54'05.27"E140°55'04.55"	2012.08.04	1
山梨県南都留郡富士河口湖町勝山河口湖(湖沼)
YNK001-1	N35°30'25.48"E138°44'06.39"	2012.08.16	1
栃木県日光市湯元湯ノ湖(湖沼)
YNK004-1	N36°48'09.15"E139°25'17.76"	2012.08.16	6
栃木県日光市湯元湯ノ湖(湖沼)
YNK007-1	N36°47'48.73"E139°25'33.83"	2012.08.16	5
栃木県日光市湯元湯ノ湖(湖沼)
N36°48'02.87"E139°25'32.84"
クサシヤジクモ,C.vulgaris[情報不足(DD)]	HIGA001-2	沖縄県国頭郡宜野座村漢那(用水路)	2012.03.24	5
N26°28'47.06"E127°57'29.88"
HIGA201	沖縄県名護市田井等(水田)	2012.04.07	5
N26°36'59.26"E128°00'42.30"
HIGA301-3	沖縄県うるま市石川嘉手苅(用水路)	2012.05.03	0
N26°25'28.09"E127°48'30.67"
HIGA302-3	沖縄県国頭郡恩納村富着(用水路)	2012.05.03	5
N26°27'10.91"E127°49'25.14"
HIGA303	沖縄県国頭郡恩納村富着(用水路)	2012.05.03	5
N26°27'16.24"E127°49'21.29"
HIGA305	沖縄県宜野湾市大山(タイモ畑水溜まり)	2012.05.06	5
N26°16'41.77"E127°44'30.55"
KIN005	沖縄県国頭郡金武町屋嘉水田横の水路(水田側溝)	2012.10.07	5
N26°27'21.42"E127°51'04.32"
HS-130306-02	沖縄県国頭郡恩納村富着	2013.03.06	液*
N26°27'11.30"E127°49'25.30"
HS-130309-02	沖縄県国頭郡恩納村	2013.03.09	液
N26°26'58.40"E127°49'13.00"
HS-130309-03	沖縄県国頭郡恩納村	2013.03.09	液
N26°26'58.70"E127°49'12.10"
HS-130309-04	沖縄県国頭郡恩納村富着	2013.03.09	液
N26°27'07.20"E127°49'25.10"
HS-130309-05	沖縄県国頭郡恩納村富着	2013.03.09	液
N26°27'14.90"E127°49'22.30"
コイトシヤジクモ,C.fibrosa(=C.fibrosa subsp. gymnopitys var.flaccida)	HIGA003-2	沖縄県国頭郡東村平良(用水路)	2012.03.25	5
N26°38'08.09"E128°09'01.01"