Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
表 5 から、1997 年から 2012 年における相対的貧困率と絶対的貧困率の変化を見ると、相対的貧困率は低下し、絶対的貧困率は上昇している。ところが、属性の差による部分を見ると、いずれの結果もマイナスであり、説明変数の変化は、貧困率を低下させるような変化だった。

さらに表 5 の結果から、各変数が貧困率に与えた影響の大きさを知ることができる。表 5 の奇数列は、それぞれの変数の変化が与えた影響の大きさを報告している。(1)列から、世帯主の属性が相対的貧困率に与えた影響の大きさを見ると、女性が世帯主の家計が増加したことで貧困率を引き上げるような効果が働いている。一方で、世帯主の高学歴化が、貧困率を低下させている。就業状況の変化が、貧困率の変化に与えた影響を見ると、非正規雇用の増加は確かに貧困率を上昇させる効果を持っている。しかし、それ以上に、自営業、失業者、非労働力の人数が減少したことによって、貧困率の低下に貢献している。表 5 の(3)、(5)、(7)列の結果を見ても、同様の変化が見られる。

次に、係数の差による部分の結果を見る。(2)、(4)列の結果では、係数の変化による有意な貧困率の変化は見られない。しかし、(6)、(8)列の結果を見ると、非正規雇用、自営業、失業者、非労働力に対する限界効果は、有意に正の影響を表している。すなわち、それぞれの要素が貧困確率に与える、限界効果の変化によって、貧困率が上昇している。

表 5 の(9)〜(16)列では、絶対的貧困率の変化について、相対的貧困と同様の要因分解を行った結果を報告している。属性の差による部分は、相対的貧困の場合と、ほとんど同じ結果を報告している。一方で、係数の差による部分は、世帯主が65歳以上の世帯の貧困率の上昇が見られる。また、世帯人数の限界効果が変化して貧困率が上昇する一方、子どもの人数が与える限界効果の変化は、貧困率を引き下げている。世帯の就業状態が与える限界効果は、自营業の人数に対してのみ有意な影響が見られ、貧困率を上昇させている。

## 【表 5 揮入】

## 【表 6 插入】

表 6 では、世帯データを利用し要因分解を行っている。表 5 で個人データを対象に分析した時と違い、1997年から2012年の間に、相対的貧困率と絶対的貧困率の両方が上昇にしている。ただし、世帯分布の変化による影響は、個人データを対象とした場合と同様に、貧困率を有意に引き下げるように変化している。世帯分布の変化が与えた影響の内訳も個人データを対象にした場合と同様である。限界効果の変化では、世帯主が65歳以上の世帯の貧困率が上昇したほか、自营業の人数が多い世帯の貧困確率も有意に上昇している。この節のまとめとして、近年の貧困率の上昇は、世帯や個人の属性の変化が貧困率に与える影響を見ると、その変化は貧困率を有意に引き下げている。主に、絶対的貧困率で見られる貧困率の上昇は、そのほとんどが同じ属性で直面する、制度や環境の変化から、影響を受けて生じていることが明らかになった。
## （３）貧困リスクと就学・就業との関係

表 7 では、高校生の学齢の子どもが、就学していない確率、就業している確率、そして就業日数が長い確率について、個人データを用い、世帯属性の影響を分析したものである。

第1列と第2列には、高校生の学齢の子どもが就学していない確率の推定結果が示されている。本人が女性であることは、非就学の確率を下げている。つまり、男性の方が、非就学となる可能性が高い。しかし、1997年と比べると2012年の男女差は小さくなっている。世帯主が女性であるという属性は、1997年時点では子どもが高校に就学していない可能性を低めていたが、2012年時点では有意ではない。世帯主の学歴が高いほど、子どもが高校に就学している確率を高めている。世帯人員が多いと高校に就学していない確率が高い。世帯人員の中に失業者が多ければ、高校に就学していない可能性が高い。夫婦と子どもからなる世帯に比べて、ひとり親世帯では子どもが高校に就学していない確率が高い。

第5列目と第6列目に、本人が高校に就学している場合に限った際に、高校生の子どもが就業している確率に関する推定結果を示している。本人が女性の方が男性よりも就業している確率が高い。世帯主の学歴が高い方が、高校生で就業している確率が低い。子どもの数が多いほど、高校生が就業している確率が高い。世帯に非正規雇用の人数が多いほど、高校生が就業している確率は高い。また、夫婦と子どもからなる世帯に比べて、大人一人と子どもからなる世帯の方が、高校生が就業している確率が高い。同様のことは、就業日数が長い確率についても言える。

次に、表 8、表 9 では、高校就学年齢の子どもが就学していない確率、就業している確率、そして就業日数が長い確率の変化について、要因分解をした結果を報告している。最初に、表 9 の非就学率の変化について、要因分解の結果を見る。観察期間中、非就学率は低下しており、その内訳は、属性の差による部分と係数の差による部分の両方から生じている。ただし、係数の差による部分の割合が、大半である。表 8 の偶数列から、係数の差による部分を見ると、世帯主が 35 歳未満、世帯主が専門・短大卒、大卒である場合、世帯人数、大人一人と子どもによる世帯の限界効果が変化し、就学率が上昇している。一方で、非正規雇用の人数や非労働力の人数に対する限界効果が変化し、就学率の低下が生じている。表 10 から高校就学年齢の子どもが就業している割合、年間 100 日以上就業している割合の変化を見ると、いずれの割合も低下している。そして、その要因は、属性の差による部分よりも、係数の差による部分の方が大きい。非正規雇用の人数の増加そのものだけでなく、非正規雇用の限界効果の変化が、子どもの就業確率を上昇させている。

貧困になる可能性が高い世帯の子どもの方が、高校に就学しなかったり、就業したり、年間100日以上の就業をする確率が高いか否かを、図7,8,9に示した。これは、表3の推定結果を用いて、高校生就学年齢の子どもが貧困状態にある確率を予測し、その予測階級別に、非就学の比率（図7）、就業の比率（図8）、100日以上就業の比率（図9）をプロッ
トしたものである。上の図は、1997、2002、2007、2012年に対して、それぞれの貧困リスクと非就学・就業率の関係をプロットしており、経年変化の様子が分かる。下の図は、1997年と2012年を上の図から抜き出し、95%信頼区間を併せて報告しており、統計的に有意な変化が生じているのか判断することができる。

図 7,8,9 のいずれを見ても、非就学率や就業率は減少傾向にある。図 7 を見ると、1997 年においては、相対的貧困では 70% から 80% の確率で貧困であるような子どもの非就学の確率が、絶対的貧困では 40% から 50% の確率で貧困であるような子どもの非就学の確率がそれぞれ最大になり、それ以上の確率で貧困になる場合には、非就学の確率が下がっていた。しかし、2012 年では、相対的貧困でも絶対的貧困でも、貧困確率が高い世帯属性の子どもの非就学率が高くなっている。また、そうした世帯の子どもが就業している確率や年間 100 日以上働いている確率も高くなっている。2010 年に開始された高校授業料無償化等の対策によって、貧困リスクが比較的高い子ども達、相対的貧困リスクで言うと 70% から 80% の程度、絶対的貧困リスクで言うと 40% から 50% 程度の子ども達の就学援助ができるようになったと考えられる。一方で、貧困リスクがより高い世帯属性の子どもの就学機会が、以前より失われている可能性を示唆している。

【図7挿入】

【図 8 挿入】

【図9挿入】

### 5 \. 結論

本研究は、日本の子どもの貧困について、世帯属性の特徴とその変化を明らかにするため、『就業構造基本調査』を用いた分析を行った。その際、貧困指標として「相対的貧困」と「絶対的貧困」の2種類を用いた。この2種類の貧困状態をもとに、どのような特性を持つ世帯が貧困状態にあるのか、また、どのような要因によって貧困率が変化しているのかを明らかにした。さらに、貧困リスクと子どもの高校就学の関係についても分析した。

本研究の結果から、次の三点が明らかにされた。第一に、子どもが貧困になっている確率が高い世帯の特徴は、1歳以下の小さな子どもがいる、世帯主が女性、世帯主の年齢が低い、世帯主の学歴が低い、子どもの数が多い、世帯に大人が一人の場合であった。第二に、1997年と2012年の間で起こった貧困率の変化を要因分解すると、世帯分布の変化は貧困率を下げる方向に寄与していた。貧困率の上昇は、正規就業と比べた非正規就業者の貧困リスクの上昇など、同じ世帯属性における貧困になりやすさの変化によって主に生じていた。第三に、貧困リスクが高い子どもほど、高校就学率が低く、就業率が高い傾向にあった。高校生の年齢層における非就学・就業の割合は、1997年以降低下傾向にあるが、
貧困リスクの高い世帯の子どもが高校に就学しない確率は1997年に比べて2012年の方が高くなっている。こうした貧困率の変化がどのような政策や経済環境の変化によって生じたかについては、今後の研究課題である。
## 【参考文献】

Heckman, James (2012) “Giving Kids a Fair Chance”, Cambridge, MA: MIT Press.

大竹文雄・小原美紀（2011）「貧困率と所得・金融資産格差」岩井克人・瀬古美喜・翁百合編『金融危機とマクロ経済』所収、東京大学出版会、137－153頁（第6章）

Oshio, Takashi, Shinpei Sano, Miki Kobayashi (2010) “Child Poverty as a Determinant of Life Outcomes: Evidence from Nationwide Surveys in Japan”, Social Indicators Research, Vol.99, No.1, pp.81–99.

橘木俊詔・浦川邦夫（2007）『日本の貧困と労働に関する実証分析』、日本労働研究雑誌 49(6), 4－19 頁。

Yun, Myeong-Su (2004) “Decomposing differences in the first moment”, Economics Letters, Vol. 82, No. 2, pp.275–280.

四方理人・駒村康平（2011）「中年齢層男性の貧困リスク——失業者の貧困率の推計」、日本労働研究雑誌53(11), 46－58頁。
表 1：記述統計 $ ^{①} $ （子ども個人及び子どもがいる世帯に限ったサンプルの記述統計）

Variable	1997年	2002年	2007年	2012年
個人データ	世帯データ	個人データ	世帯データ	個人データ	世帯データ	個人データ	世帯データ
子どもの相対的貧困	13.5%	13.6%	14.8%	14.8%	14.2%	14.1%	13.8%	13.4%
子どもの絶対的貧困	8.4%	8.5%	13.0%	12.6%	12.6%	12.2%	16.8%	15.6%
子どもの年齢ダミー
0,1歳	0.08	0.09	0.09	0.09
2,3歳	0.10	0.10	0.09	0.10
4,5歳	0.10	0.10	0.10	0.10
6,7歳	0.09	0.10	0.11	0.10
8,9歳	0.10	0.10	0.11	0.11
10,11歳	0.11	0.11	0.11	0.11
12,13歳	0.11	0.11	0.11	0.12
14,15歳	0.13	0.12	0.12	0.12
16,17,18歳	0.18	0.17	0.16	0.16
世帯にいる子どもの年齢ダミー
0,1歳	0.14	0.15	0.15	0.15
2,3歳	0.17	0.16	0.16	0.16
4,5歳	0.16	0.17	0.17	0.17
6,7歳	0.16	0.17	0.18	0.17
8,9歳	0.17	0.18	0.18	0.18
10,11歳	0.18	0.18	0.19	0.19
12,13歳	0.19	0.19	0.19	0.19
14,15歳	0.21	0.20	0.19	0.20
16,17,18歳	0.30	0.28	0.26	0.26
世帯主の属性
女性	0.08	0.09	0.09	0.10	0.10	0.11	0.11	0.12
35歳未満	0.16	0.19	0.17	0.19	0.17	0.18	0.15	0.16
35歳以上50歳未満	0.58	0.54	0.54	0.50	0.55	0.51	0.58	0.54
50歳以上65歳未満	0.14	0.16	0.16	0.19	0.17	0.19	0.17	0.19
65歳以上	0.12	0.11	0.13	0.12	0.12	0.12	0.11	0.11
中学校卒業	0.23	0.23	0.20	0.20	0.14	0.14	0.12	0.13
高校卒業	0.47	0.47	0.46	0.46	0.44	0.44	0.48	0.47
専門・烜大卒業	0.07	0.07	0.08	0.08	0.13	0.13	0.11	0.11
大学卒業	0.24	0.23	0.25	0.25	0.27	0.27	0.28	0.29
(表1の続き)

Variable	1997年	2002年	2007年	2012年
個人データ	世帯データ	個人データ	世帯データ	個人データ	世帯データ	個人データ	世帯データ
世帯人数の構成
世帯人数	4.68	4.32	4.66	4.31	4.54	4.21	4.46	4.12
子どもの人数	2.11	1.76	2.11	1.77	2.07	1.73	2.08	1.73
18歳以上65歳未満の数	2.34	2.33	2.31	2.31	2.25	2.26	2.20	2.20
高齢者の人数	0.23	0.22	0.24	0.23	0.22	0.21	0.18	0.18
正規社員の人数	1.03	1.04	0.98	0.98	1.00	1.01	1.00	1.00
非正規社員の人数	0.42	0.41	0.50	0.49	0.56	0.55	0.58	0.58
自営業の人数	0.39	0.36	0.32	0.30	0.24	0.23	0.19	0.18
失業者の人数	0.10	0.10	0.11	0.11	0.09	0.09	0.09	0.09
非労働力者の人数	2.75	2.40	2.75	2.41	2.64	2.32	2.59	2.26
家族類型
2世代（夫婦と子ども）	0.59	0.59	0.59	0.59	0.62	0.61	0.66	0.64
3世代（夫婦と親と子ども）	0.25	0.23	0.23	0.21	0.19	0.18	0.15	0.14
大人が一人子どもの世帯	0.05	0.05	0.07	0.07	0.07	0.08	0.09	0.09
その他	0.11	0.12	0.11	0.13	0.12	0.13	0.11	0.12
居住地域
北海道	0.02	0.03	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
東北	0.13	0.12	0.12	0.12	0.12	0.12	0.11	0.11
関東	0.19	0.19	0.18	0.18	0.18	0.19	0.18	0.18
甲信越	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06
北陸	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06
東海	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
近畿	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.14	0.14
中国	0.09	0.09	0.09	0.09	0.10	0.09	0.10	0.09
四国	0.06	0.06	0.07	0.07	0.07	0.07	0.07	0.07
九州	0.17	0.16	0.17	0.16	0.17	0.16	0.17	0.16
Obs.	237057	134356	212519	120139	192921	111201	187369	107995
高校就学年齢の子どもを対象にしたデータ
1997年	2002年	2007年	2012年
相対的貧困率	14.8%	14.7%	14.5%	14.2%
絶対的貧困率	9.6%	12.5%	12.8%	16.1%
非就学	7.0%	6.4%	4.8%	4.2%
就業	8.2%	8.6%	7.8%	6.8%
年100日以上就業	6.5%	6.4%	5.5%	4.7%
Obs.	46447	39241	33671	31816
表 5：貧困率変化の要因分解（個人データを用いた分析）

個人データを用いた分析
表 6：貧困率変化の要因分解（世帯データを用いた分析）

世帯データを用いた分析
表 9：就業率変化の要因分解

高校就学年龄の子どもを対象とした分析
図１：1980年代以降の日本の相対的貧困率

出所:『国民生活基礎調查』
図２：相対的貧困率の定義
図3：相対的貧困線の推移

注：名目値とはその年の等価可処分所得をいい、実質値とはその年の名目値を昭和60年(1985年)を基準とした消費者物価指数(持家の帰属家賃を除く総合指数)で調整したものである。
図4：国民生活基礎調査における貧困率との比較 (A) 個人データ

## (B) 世帯データ
図 5：ロジット分析における限界効果の変化（個人データを用いた分析）

世帯主の性别・年齢： 年齢の基準=35歳以上50歳未満 (個人データ)

世帯主の学歴： 基準となる学歴グループ =高校卒業(個人データ)

世帯の人口構成：基準となる年齢グループ＝18歳以上65歳未満(個人データ)

就業状態: 基準となる就業人数 = 正規雇用労働者の数 (個人データ)

世帯類型：基準となる世帯類型＝夫婦と子ども(個人データ)
図6：ロジット分析における限界効果の変化（世帯データを用いた分析）

世帯主の性别・年齢：年齢の基準=35歳以上50歳未満（世帯データ）

世帯主の学歴： 基準となる学歴グループ =高校卒業(世帯データ)

世帯の人口構成：基準となる年齢グループ＝18歳以上65歳未満(世帯データ)

就業状態: 基準となる就業人数 = 正規雇用労働者の数 (世帯データ)

世帯類型：基準となる世帯類型＝夫婦と子ども(世帯データ)
図7：貧困リスクと非就学の関係
図8：貧困リスクと就業の関係
図9：貧困リスクと年間100日以上就業の関係
1 日時：平成28年11月22日（火）10:30～12:00

2 場所：個人情報保護委員會 委員會室

3 出席者：堀部委員長、阿部委員、嶋田委員、熊澤委員、丹野委員、手塚委員、大滝委員、宮井委員

其田事務局長、福浦総務課長、山本参事官、坂巻参事官、小川参事官

## 4 議事の概要

（１）議題１：東京薬業健康保険組合における適用、給付及び徴収関係事務全項目評価書について

事務局から、特定個人情報保護評価指針に定める「審査の観点」及び「審査の観点における主な考慮事項」に基づき、東京薬業健康保険組合における適用、給付及び徴収関係事務全項目評価書の特定個人情報保護評価指針への適合性及び妥当性について審査した結果に関する説明を行った。

本評価書について承認され、同組合に対し、評価書が承認された旨及び承認後に評価書に記載すべき委員会の審査結果等について通知することとなった。

## （２）議題２：個人情報保護法ガイドライン（案）について

事務局から、資料に基づき説明を行った。

丹野委員から全体について「今回の意見募集では事業者、個人も含め多くの方から1000を超える意見を頂いた。各省庁のガイドラインを一元化し事業者にとっても個人にとっても理解しやすいものとした意義は大きい」、また「通則編」について「要配慮個人情報の取扱いについて、丁寧に回答することで基本的な考え方は御理解いただけると思うが、新しい概念であるため混乱が生じないよう、ガイドラインやQ&Aを見てもらうよう広報していくことが重要である」という旨の発言があった。

嶋田委員から「通則編」について「安全管理措置について、中小規模事業者とそれ以外の事業者とで手法を分けて例示しており分かりやすいが、初めて取り組むこととなる事業者は、何をすればよいか悩むこともあり得る。今後Q & A等の作成に当たっては、説明会等で寄せられる質問等も踏まえ実践的な内容とすることが重要である」という旨の発言があった。

大滝委員から「通則編」について「研究機関におけるゲノムデータの取扱いについて質問が多く見られたが、学術研究機関における学術研究目的での個人情報の取扱いについては個人情報保護法の適用除外とされており、学術研究機関においては懸念もあるようなので周知していくことが必要である。一方、研究の現場において個人情報を適切に扱っていただくことは必要であり、保護と利活用のバランスが重要であるので、その旨も併せて伝え
ていく必要がある」という旨の発言があった。

この点について堀部委員長から「我が国の個人情報保護法は当初より学問の自由に配慮して学術研究機関による学術研究を適用除外としている」旨の発言があった。

熊澤委員から「外国にある第三者への提供編」について「APECのCBPRシステムの認証について、提供先が得ている場合だけでなく、提供元の日本企業が得ている場合についても、同認証の取得要件を勘案すれば提供先において必要な体制を整備していると解されると明示したことは、今後、日本企業が同システムの認証を受けるインセンティブとなる。個人データの円滑な国際的流通を確保するために同システムへの参加を促すよう、当委員会としてもCBPRを推進する立場からアピールしていきたい」という旨の発言があった。

宮井委員から「第三者提供時の確認・記録義務編」について「解釈により確認・記録義務が適用されないとした箇所について、基本的な考え方は個々の回答で御理解いただけると思うが、事業特性に即した具体的な質問が多いことを踏まえ、今後Q & A等を通じて、具体的な質問に答えていくことが必要である」という旨の発言があった。

この点について堀部委員長から「一般事業者に過度な負担とならず、全体として適切な取扱いが図られるよう留意していく必要がある」という旨の発言があった。

手塚委員から「匿名加工情報編」について「匿名加工情報の加工方法について最低限必要な基準を明示できた。これまで、安全管理のために加工した場合の取扱いや統計情報に関する質問が見られたが、匿名加工情報との違いについてガイドラインで明確化された。今後、認定個人情報保護団体も指針等の作成を始めることとなるが、当委員会としても事務局レポートやQ&Aを通じて、参考となる情報を示していく必要がある」という旨の発言があった。

阿部委員から全体について「カメラ画像の利活用に関する意見等が、政令・規則に関する意見募集時同様、今回も寄せられた。これまでも防犯カメラについての議論はされてきたが、車載器やドローンなど画像の活用が多様化している状況に対し、いかに対応すべきか当委員会としても何らかの考え方を整理していく必要がある」という旨の発言があった。

堀部委員長から「各省庁において作成していた個人情報保護法に関するガイドラインを原則一元化することは重要な意味がある。なお、カメラ画像、ドローン、AIなど状況が変化してきており、国際的にも議論が行われている中、当委員会としても検討していく必要がある」という旨の発言があった。

個人情報保護法ガイドライン（通則編、外国にある第三者への提供編、第三者提供時の確認・記録義務編、匿名加工情報編）（案）が原案のとおりて
承され、官報公示等の手続を進めていくこととなった。

以上
国の債権に係る情報の公表

歳入金債権の発生額及び消滅額等の推移

(单位:百万円)

平成25年度	平成26年度	平成27年度

※2 百万円未満の計数がある場合には「0」で表示し、該当計数が皆無の場合には「−」で表示している。

※1 計数はそれぞれ単位未満切り捨てによってので、端数において合計とは合致しないものがある。
不納欠損額の内訳

復興庁所管

東日本大震災復興特別会計

(单位：百万円)

区分	本年度発生債権分	前年度以前発生債権分	計	備考
件数	金額	件数	金額	件数	金額
歳入徴収官事務規程第27条第1項第1号の規定によるもの(免除)	0	0	0	0	0	0
歳入徴収官事務規程第27条第1項第2号の規定によるもの(消滅時効の完成)	0	0	0	0	0	0
歳入徴収官事務規程第27条第1項第3号の規定によるもの(滞納処分の停止)	0	0	0	0	0	0
歳入徴収官事務規程第27条第1項第4号の規定によるもの(みなし消滅)	0	0	9	2	9	2	(目)返納金債権2
債権管理事務取扱規則第30条第1号の規定によるもの(消滅時効が完成し、かつ、援用の見込み)	0	0	0	0	0	0
債権管理事務取扱規則第30条第2号の規定によるもの(法人の清算が結了)	0	0	0	0	0	0
債権管理事務取扱規則第30条第3号の規定によるもの(債務者死亡後債務について限定承認があった場合において、相続財産の価額が強制執行費用等を超えない見込み)	0	0	0	0	0	0
債権管理事務取扱規則第30条第4号の規定によるもの(破産法等の規定により債務者が免責)	0	0	9	2	9	2
債権管理事務取扱規則第30条第5号の規定によるもの(債権の存在について法律上争いがある場合において、法務大臣が勝訴の見込みがない旨決定)	0	0	0	0	0	0
課題名 RFd-1102 絶滅危惧種の多様性情報学と域外保全技術開発:車軸藻類を例に

課題代表者名 坂山 英俊 （神戸大学大学院理学研究科生物学専攻生物多様性講座・講師）

研究实施期间 平成23～24年度

累計予算額 21,839千円（うち24年度9,706千円）

予算額は、間接経費を含む。

本研究のキー生物多様性、分類、DNAバーコーディング、凍結保存、域外保全

## 研究体制

(1)絶滅危惧種の多様性情報学と域外保全技術開発:車軸藻類を例に(神戸大学大学院理学研究科)

## 研究概要

### 1. はじめに

近年、多くの野生生物が環境破壊の結果、海洋・森林・淡水の各生態系から急速に失われている。その中でも特に、淡水生態系は最も多くの種が減少した生態系だといわれている。淡水生態系はおもに植物プランクトン、水生昆虫、淡水魚類、水生植物、車軸藻類などによって構成されている。特に車軸藻類は、淡水生態系中で「シャジクモ帯」を形成することによって底泥を覆い、淡水域の透明度維持の「かなめ」となる役割を果たしている。しかしながら、1960年代以降の淡水生態系破壊の結果、急速に車軸藻類の衰退が進行している。平成19年に公表された環境省版レッドリストによると、日本に産する車軸藻類約80種類のうち、4種類が絶滅、1種類が野生絶滅、52種類が絶滅危惧I類として掲載されている。近年、このように生態学的に極めて重要であるが絶滅の危機に瀕している車軸藻類の実体解明に向けた政策や研究が多く行われ始めている。しかしながら、車軸藻類の分類体系は、複数の種を1種として誤ってまとめてしまうlumpingや、1つの種を複数の種に細分化するsplittingなどといった分類学的問題点が多く残されている。したがって、適切な保全単位を明らかにするために、過去に記録された種の分類学的位置づけを詳細な解析によって再検討する必要がある。また、このような分類学的混乱に起因する種同定の難しさが種の保全や淡水生態系保全に向けた政策や研究の進展の大きな妨げとなっている。したがって、信頼性の高い十分な種情報の収集・蓄積と活用によって高精度かつ迅速な種の識別を行い、保護管理のための意志決定を支援する車軸藻類の多様性情報基盤が必要である。

多様性情報データベース構築に向けた研究は、我が国では、日本における遺伝子データベース関連の活動拠点として「日本バーコードオブライフ・イニシアティブ(JBOLI)」が2009年に設立されたばかりである。国際的には、Barcode of Life Data Systems(BOLD)によって主に昆虫類を用いたデータベース整備が進行中である。しかしながら、これらのシステムはまだ実用化が始まったばかりであり、ユーザーの様々な要望に対応可能なシステムが利用可能となるまでにはあと数年は必要である。このような背景の中、本研究は、取得した車軸薬類の遺伝子塩基配列データおよび種情報を独自のデータベースとして管理するとともに、これらのシステムと情報を共有して実用化を推進する基礎研究として位置づけることができる。

一方、車軸藻類の生息域は防災、水利、漁業、稲作を目的とした湖沼、河川、ため池、水田が中心である。したがって、車軸藻類の保護のためだけに人間活動を制約することは非常に困難であり、生息域外での保全技術開発は必要不可欠である。
### 2. 研究開発目的

・本研究では、これまでに日本での生育が報告されたことのある絶滅危惧植物車軸藻類の分類学的問題を解決し、その証拠となるサンプルの形態、遺伝子（DNAバーコード）、分布・生態、証拠標本情報から成る種情報をデータベース化し、日本産車軸藻類の多様性情報基盤を構築する。

・ 車軸藻類の遺伝子配列情報に基づく種および集団レベルの同定・識別支援システムを構築する。そのために、種レベルの識別用に実績のあるrbcL遺伝子をDNAバーコードに選定し、証拠標本からDNAバーコードを取得する。さらに、集団レベルの識別に有効な遺伝子領域を探索し、新たなDNAバーコードを開発する。

・将来的に車軸藻類のバイオリソース化およびより低コスト、小スペースの域外保全を実施するために、車軸藻類を域外で長期保存するための凍結保存技術における最適な凍結と解凍手順の確立を目指す。

### 3. 研究開発の方法

## 1 ）野外調查

過去の文献および研究協力者から得た車軸藻類の生育分布情報に基づき、平成23年度は、愛知県（8月、3月）、群馬県（8月）、石川県（9月）、大分県（10月）、愛媛県（10月）、広島県（10月）、平成24年度は、兵庫県（6月）、滋賀県（7月）、高知県（8月）、愛媛県（8月、10月）、栃木県（8月）、群馬県（8月）、静岡県（8月）、島根県（9月）、鳥取県（9月）、石川県（10月）、沖縄県（3月）において野外採集調査を実施した。車軸藻類は淡水域の湖底に繁茂するので、岸またはボート上から舗型の採集器具を水中に投入して、底から引き上げるようにして採集した。また、日本各地にいる研究協力者から車軸藻類サンプルの提供を受けた。採集品はさく葉標本にするとともに、その一部

は-80℃で凍結保存し、さらにシリカゲルまたは70%エタノールで固定して遺伝子解析に用いた。また、

各採集地点での緯度経度（GPS）情報を記録し、車軸藻類の生育状態と生育地の状態をデジタルカメラにより画像情報として記録した。

## 2 ）分類学的解析およびDNAバーコーディング

適切な保全単位を明らかにするために過去に記録されている種を詳細な形態学的解析と分子系統学的解析によって分類学的再検討を実施した。本研究では、Sakayama et al. (2005)に準じて、種レベルの分類形質として重要な卵胞子の走査型電子顕微鏡（SEM）による詳細な観察を実施した。また、種レベルの同定結果は、2009年に国際的に標準化されたDNAバーコード領域の1つであり、これまでに最も多くの種類で調べられている葉緑体のrbcL遺伝子の約600bpの塩基配列の比較を行い、形態に基づく種同定結果を確認した。一部のサンプルに関しては、必要に応じて、複数の葉緑体と核のDNA塩基配列（rbcL遺伝子、matK遺伝子、atpB-rbcL遺伝子間領域、ITS領域等）に基づく分子系統解析によって種同定を正確に行い、従来の分類体系と照らし合わせることにより、分類学的問題の解決と種の保全単位の決定を試みた。

## 3 ）分子マーカー/DNAバーコードの新規開発

DNAバーコード領域としてrbcL遺伝子とmatK遺伝子が国際的に標準化されているが、matK遺伝子については、車軸藻類に特異的なPCRプライマーが報告されていないため、本研究で車軸藻類に特異的なPCRプライマーのデザインを行った。

種レベルのDNAバーコードで識別ができない集団を識別するため、研究代表者がこれまでの研究で構築した独自のEST（網羅的な発現遺伝子のタグ配列）データベースから新規にEST-SSRマーカー（EST配列上に存在する単純反覆配列）を開発し、集団間および集団中の個体間の遺伝的変異を検出可能なマーカーの探索を進めた。ESTデータベースは、車軸藻類の中で日本に最も多くの集団が分布するシャジクモ（Chara braunii）のものを用いた。EST-SSR領域の探索には、MISAプログラム

（MIcroSAtellite identification tool, http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）を用いた。MISAプログラムによって抽出したEST-SSR領域をPCR増幅するために、PRIMER3プログラム

（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）を用いてプライマーを設計した。抽出したEST-SSR領域がシャジクモ集团間で多型的かどうかを検証するため、Kato et al. (2008, 2011)によって系統がことなることが明らかになっている複数のシャジクモ集团を用いて、集団間のEST-SSR領域の比較を行った。

EST-SSR領域の比較は、アガロースゲルを用いた電気泳動法で増幅を確認した後、Guichoux et al. (2011) 等を参考にし、通常のPCR法および蛍光標識プライマーを用いたマルチプレックスPCR法によ
り増幅反応を行いオートシーケンサーでアリルの決定を行った。

## 4 ）車軸藻類の多様性情報データベース構築とデータの管理、公開手順

日本バーコードオブライフ・イニシアティブ（JBOLI）のデータベースシステム「Ruga」とデータを共有することを前提として、DNAバーコードを取得した標本に由来する、形態、遺伝子（DNAバーコード）、分布・生態、証拠標本情報から成る種情報を、Microsoft Excelを用いて「Ruga」と互換性のある形式でデータベース化した。データの一部は、日本バーコードオブライフ・イニシアティブの

「JBOLI-DS」に登録した。この際、システムを管理している東京大学大学院総合文化研究科の伊藤元己教授から適宜助言をもらい作業を進めた。

## 5 ）凍結保存技術の開発

車軸藻類卵胞子の最適な凍結保存法を検討するため、培養実験方法が確立されているシャジクモ（Chara braunii）をモデルに用いた。シャジクモ（Chara braunii）の単藻培養株より接合子を採取した。単藻培養株は、接合子を1%次亜塩素酸ナトリウム水溶液で5～10分間処理し、4週間の低温処理後、接合子を発芽させることによって作出した。凍結保存法は、Day et al. (2008)および笠井ら (2009)の方法を基に条件検討を行った。凍害防御剤は多くの生物で実績のあるDMSO（ジメチルスルホキシド）を用いた。接合子については、乾燥に耐えられる壁を持つため、室温に24時間以上置くことで乾燥処理を行ったサンプルを凍結実験に用いた。サンプルはプログラムフリーザー（Kryo 320-1.7, Planer）を用いた2段階凍結法（プログラムフリーザーで徐々に-40℃まで温度を下げたあと、液体窒素で-196℃まで急速凍結させる方法）により凍結させた。冷却速度は、毎分1℃の速度で温度を低下させた。凍結サンプルを37℃の恒温槽（サーマルロボ TR-1，アズワン）中で保温し、氷結晶が完全に無くなるまで融解した。解凍した接合子サンプルは、soil-water培地にまき、発芽率を計測した。

## 4 ．結果及び考察

## 1 ）野外調查、分類学的解析

平成23年度から24年度に渡り、野外採集調査および提供を受けた車軸藻類を、合計411サンプル（Nitella属195サンプル、Chara属205サンプル、Nitellopsis属8サンプル、Lamprothamnium属3サンプル、総標本数1300点）収集した。そのうち、沖縄県本島で採集したNitella tumulosa（日本新産）、沖縄県石垣島で採集したNitella sp. 1（日本新産または新種）、愛媛県で採集したChara australis（オーストラリアシャジクモ）、Nitella sp. 2（日本新産または新種）、愛知県の休耕田で採集したNitella imahorii（フラスコモダマシ）はこれまでに遺伝子塩基配列が調べられていない種類であった。また、千葉県で採集されたChara sp. 1、および神奈川県から採集されたChara sp. 2は新種である可能性が示された。他にもrbcL遺伝子塩基配列を用いたDNAバーコーディングにより検出した新規系統を複数検出した。また、徳島県出羽島の集団が国定天然記念物に指定されている絶滅危惧I類のLamprothamnium succinctum（シラタマモ）の新産地を3地点発見した。さらに、過去の種同定結果や形態情報などが不十分であり、実体が良く理解されていなかった琵琶湖産のNitellopsis obtusa（ホシツリモ）および奥日光産のNitella flexilis var. bifurcata（チュウゼンジフラスコモ）を再調査し、詳細な形態観察とDNAバーコーディングを実施した。

## ２）分子マーカー/DNAバーコードの新規開発

本研究では、種レベルを識別する分子マーカー/DNAバーコードとして、葉緑体のrbcL遺伝子とmatK遺伝子の塩基配列を用いた。シャジクモ目、シャジクモ属、フラスコモ属ごとに各遺伝子(rbcL、matK)のアライメントファイルを作成し、DNAバーコードの評価指標とされている塩基置換モデル（K2Pモデル）を用いて、PAUP4.0*で分子系統樹および距離行列データを作成し、行列データから、EXCELを用いて頻度分布を作成した。解析には、rbcL遺伝子222配列（決定した配列長1380bp, DNAバーコード領域563bp）、matK遺伝子50配列（決定した配列長1182bp, DNAバーコード領域744bp）を用いた。その結果、matK遺伝子領域はrbcL遺伝子領域よりも高い塩基配列多様性を持つことが明らかになった。また、matK遺伝子領域とrbcL遺伝子領域において種間での遺伝的距離が明確に認められた。これらの結果は、両遺伝子領域を組み合わせることにより種を識別することが可能であることを示している。したがって、matK遺伝子領域とrbcL遺伝子領域を組み合わせたDNAバーコードイングによる車軸藻類の種同定支援システムを確立することができた。

一方、C. braunii（シャジクモ）のESTデータ（合計3,285 contig）から2塩基モチーフおよび3塩基モチーフのEST-SSRの抽出を実施し、合計248のEST-SSR領域を抽出し、これらのEST-SSR領域のうち、
56領域についてPCR増幅用のプライマーを設計し、系統が大きく異なるC. braunii 8サンプ

ルを用いて多型の有無を調査し、2塩基モチーフについては8領域、3塩基モチーフについては20領域において多型を観察した。さらに248領域中71領域についてPCR増幅用のプライマーを設計し、スクリーニングを行った。系統が異なる8株を用いて、72遺伝子座の有用性を調査した結果、32遺伝子座が安定的にPCR増幅とアリル決定が可能であった（平均アリル数4.0個）。集団内レベル（河口湖集団16個体）で、この13遺伝子座の多型性を確認した結果、10遺伝子座で多型性を示した（平均アリル数3.6個）。これらの結果は、本研究で開発したEST-SSRマーカーは集団/個体レベルの識別に利用可能なレベルであることを示している。

## 3 ）車軸藻類の多様性情報データベース構築とデータの管理、公開手順

これまでに当研究室において遺伝子解析がなされている車軸藻類のさく葉標本および本研究で新たに収集したさく葉標本を用いて車軸藻類の多様性情報データベースの構築を進めた。種情報についてはMicrosoft Excel形式でデータを管理した。DNAバーコードに用いた遺伝子塩基配列情報はFasta形式でデータを管理した。現時点では、本研究で新たに収集したさく葉標本について、標本ラベル情報（標本ID、和名、学名、採集日、採集地、特記事項）の入力が完了した。形態情報と遺伝子塩基配列情報に基づいた種同定が完了したサンプルの一部は、JBOLI-DSによるデータ登録を行い、情報公開の準備を進めた。

## 4 ）凍結保存技術の開発

C. brauniiの卵胞子を用いて凍結保存条件の検討を実施した。検討した条件の中では、乾燥サンプル、凍結防護剤サンプルの両方で凍結保存に成功した。しかし、実験に用いたサンプルのロット間で、コントロール条件での発芽率が3～35%であり安定しない場合が観察された。発芽率を改善するため、実際に車軸藻類が生育する自生地の底土を実験に用いた結果、安定した発芽率を得ることができた。したがって、本研究で確立した卵胞子の凍結保存条件、発芽条件を用いることによって、安定した域外保全が実施できることが明らかになった。

## 5 ．本研究により得られた主な成果

## （1） 科学的意義

・野外調査によって車軸藻類サンプルを合計411サンプル得たことにより、車軸藻類の現在の生育分布状況がより明確になった。また、野外調査によって得られたサンプルの中に、新規分類群と考えられるサンプルを複数見いだすことができた。これらの成果は、車軸藻類の分類学・生態学上の基礎的理解の底上げにつながる。

・ matK遺伝子領域はrbcL遺伝子よりも高い塩基配列多様性を持ち、種を識別するDNAバーコードとして適用可能であることが明らかになった。したがって、matK遺伝子領域とrbcL遺伝子領域を組み合わせたDNAバーコードイングシステムを確立することができた。

・C. brauniiのESTデータ（合計3,285 contig）から車軸藻類の集団を識別する32遺伝子座のマーカーを確立できた。この結果は、車軸藻類においてEST-SSRを集団レベルの血統登録用DNAバーコードとして初めて導入するものである。

・これまで凍結保存技術が確立されていない絶滅危惧植物の車軸藻類の卵胞子における凍結保存法を確立した。新規凍結保存法による車軸藻類の長期保存技術が確立されることにより、種の絶滅、種内の遺伝的多様性の喪失を防ぐことができる。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

環境省の第3次絶滅のおそれのある野生生物の選定・評価検討会、植物II分科会におけるレッドリストの検討において、本研究成果の一部である車軸藻類の現在の生育分布に関するデータを提示し、レッドリストの見直しに貢献した。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

• 本研究で、日本に生育する車軸藻類の種および集団レベルを識別するDNAバーコーディングを用いた種同定システムが構築されたことによって、車軸藻類の種および集団レベルの同定、保全範囲の決定が、容易に、かつ高精度で可能となるので、環境保全政策の意思決定や環境研究の進展に大きく寄与するものと見込まれる。
・本研究で収集した車軸藻類の分布情報は、今後、車軸藻類の生育に適した環境条件の解

析を進めることにより、対象地域の環境情報と相互利用することにより、生態ニッチモデリング（環境情報から生物分布を説明するモデルを作成し、対象種の生育に適した環境条件の分布から、ある場所での対象種の分布確率を推定する方法）等に活用することが見込まれ、対象種がどのような地域に潜在的に分布し、どの地域に定着可能か等を推定可能になると見込まれる。

・本研究で構築した車軸藻類多様性研究の方法論は、将来のレッドリストの見直しにおいて、車軸藻類サンプルの種同定を支援することによって、絶滅危惧種のランク評価に直接貢献する。

本研究で構築された、学名、形態、生態、生理的特徴、分子情報、文献、分布情報、環境情報等の車軸薬類の多様性情報基盤は、地球規模生物多様性情報機構（GBIF）、日本バーコードオブライフ・イニシアティブ（JBOLI）、Barcode of Life Data Systems (BOLD)、および世界分類学イニシアティブ（GTI）と情報を共有することにより、だれもが情報にアクセス可能になるため、環境政策を進める上で、様々な行政機関、自治体で活用されることが見込まれる。

• 車軸藻類の接合子の凍結保存技術が確立されたことによって、車軸藻類の域外保全に活用されることが期待される。また、本技術は、車軸藻類を1.5mLチューブ程度のサイズで半永久的に保存できるため、低コスト、小スペースの域外保全が行える。また、得られた保存試料は、環境資料のタイムカプセル化事業、バイオリソースプロジェクト、里地里山の保全などに直接的に貢献できる。

### 6. 研究成果の主な発表状況

（１）主な誌上発表

く査読付き論文>

特に記載すべき事項はない

く査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない

## （２）主な口頭発表（学会等）

1）柴田葵、加藤将、川井浩史、坂山英俊：第36回日本藻類学会（2012）

「車軸藻類Chara fibrosa群の分子系統学的解析」

2）加藤将、川井浩史、坂山英俊：第36回日本藻類学会（2012）

「シャジクモの保全遺伝学に向けたSSRマーカーの新規開発」

3) 坂山英俊：第34回水草研究会（2012）

「日本産車軸藻類の分類と生育分布の現状」

4）加藤将：第34回水草研究会（2012）

「最も絶滅が危機される車軸藻類ホシツリモの歴史と現在」

### 7. 研究者略壓

課題代表者:坂山 英俊

東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻博士課程修了、博士（理学）、

現在神戸大学学院理学研究科·講師
# RFd-1102 絶滅危惧種の多様性情報学と域外保全技術開発：車軸藻類を例に

(1) 絶滅危惧種の多様性情報学と域外保全技術開発：車軸藻類を例に

神戸大学

大学院理学研究科 生物学専攻 坂山 英俊

平成23～24年度累計予算額：21,839千円

（うち、平成24年度予算額：9,706千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

車軸藻類は淡水域の透明度維持の「かなめ」となる役割を果たしている。しかし近年、急速に車軸藻類の衰退が進行している。一方、車軸藻類の種同定の難しさが種の保全や淡水生態系保全に向けた政策や研究の進展の大きな妨げとなっている。また、車軸藻類の生息域は人間活動の影響を受けやすい環境であり、生息域外での保全技術開発は必要不可欠である。

本研究では、車軸藻類の信頼性の高い十分な種情報・遺伝子情報の収集・蓄積を行い車軸藻類の多様性情報基盤を構築するため、野外調査により車軸藻類を、合計411サンプル（Chara属205サンプル、Lamprothamnium属3サンプル、Nitella属195サンプル、Nitellopsis属8サンプル、総標本数1300点）収集し、データベース化した。収集したサンプルからDNAバーコードを取得し、種レベルの同定支援システムを構築した。さらに、集団/個体レベルの識別を行うため、EST-SSRマーカーを新規に開発し、車軸藻類の集団/個体レベルの識別を行った。また、車軸藻類の域外保全に必要な凍結保存技術を新規に開発した。

本研究で確立した車軸藻類の多様性情報基盤とバイオリソースは淡水生態系保全の環境政策へ貢献することが期待される。

[キーワード]

生物多様性、分類、DNAバーコーディング、凍結保存、域外保全

### 1. はじめに

近年、多くの野生生物が環境破壊の結果、海洋・森林・淡水の各生態系から急速に失われている。その中でも特に、淡水生態系は最も多くの種が減少した生態系だといわれている。淡水生態系はおもに植物プランクトン、水生昆虫、淡水魚類、水生植物、車軸藻類などによって構成されている。特に車軸藻類は、淡水生態系中で「シャジクモ帯」を形成することによって底泥を覆い、淡水域の透明度維持の「かなめ」となる役割を果たしている。しかしながら、1960年代以降の淡水生態系破壊の結果、急速に車軸藻類の衰退が進行している。平成19年に公表された環境省版レッドリストによると、日本に産する車軸藻類約80種類のうち、4種類が絶滅、1種類が野生絶滅、52種類が絶滅危惧I類として掲載されている。近年、このように生態学的に極めて重要であるが絶滅の危機に瀕している車軸藻類の実体解明に向けた政策や研究が多く行われ始めている。しかし
ながら、車軸藻類の分類体系 $ ^{1-3)} $ は、複数の種を1種として誤ってまとめてしまうlumpingや、1つの種を複数の種に細分化するsplittingなどといった分類学的問題点が多く残されている $ ^{4-6)} $ 。したがって、適切な保全単位を明らかにするために、過去に記録された種の分類学的位置づけを詳細な解析によって再検討する必要がある。また、このような分類学的混乱に起因する種同定の難しさが種の保全や淡水生態系保全に向けた政策や研究の進展の大きな妨げとなっている。したがって、信頼性の高い十分な種情報の収集・蓄積と活用によって高精度かつ迅速な種の識別を行い、保護管理のための意志決定を支援する車軸藻類の多様性情報基盤が必要である。

多様性情報データベース構築に向けた研究は、我が国では、日本における遺伝子データベース関連の活動拠点として「日本バーコードオブライフ・イニシアティブ(JBOLI)」が2009年に設立されたばかりである。国際的には、Barcode of Life Data Systems(BOLD)によって主に昆虫類を用いたデータベース整備が進行中である。しかしながら、これらのシステムはまだ実用化が始まったばかりであり、ユーザーの様々な要望に対応可能なシステムが利用可能となるまでにはあと数年は必要である。このような背景の中、本研究は、取得した車軸藻類の遺伝子塩基配列データおよび種情報を独自のデータベースとして管理するとともに、これらのシステムと情報を共有して実用化を推進する基礎研究として位置づけることができる。

一方、車軸藻類の生息域は防災、水利、漁業、稲作を目的とした湖沼、河川、ため池、水田が中心である。したがって、車軸藻類の保護のためだけに人間活動を制約することは非常に困難であり、生息域外での保全技術開発は必要不可欠である。

## 2 ．研究開発目的

・本研究では、これまでに日本での生育が報告されたことのある絶滅危惧植物車軸藻類の分類学的問題を解決し、その証拠となるサンプルの形態、遺伝子（DNAバーコード）、分布・生態、証拠標本情報から成る種情報をデータベース化し、日本産車軸藻類の多様性情報基盤を構築する。

・車軸藻類の遺伝子配列情報に基づく種および集団レベルの同定・識別支援システムを構築する。そのために、種レベルの識別用に実績のあるrbcL遺伝子をDNAバーコードに選定し、証拠標本からDNAバーコードを取得する。さらに、集団レベルの識別に有効な遺伝子領域を探索し、新たなDNAバーコードを開発する。

・将来的に車軸藻類のバイオリソース化およびより低コスト、小スペースの域外保全を実施するために、車軸藻類を域外で長期保存するための凍結保存技術における最適な凍結と解凍手順の確立を目指す。

### 3. 研究開発方法

## 1 ）野外調查

過去の文献 $ ^{1-2} $ および研究協力者から得た車軸藻類の生育分布情報に基づき、平成23年度は、愛知県（8月、3月）、群馬県（8月）、石川県（9月）、大分県（10月）、愛媛県（10月）、広島県（10月）、平成24年度は、兵庫県（6月）、滋賀県（7月）、高知県（8月）、愛媛県（8月、10月）、栃木県（8月）、群馬県（8月）、静岡県（8月）、島根県（9月）、鳥取県（9月）、石川県（10月）、沖縄県（3月）において野外採集調査を実施した（巻末資料、表（1）-6）。車軸藻類は淡水域の湖底に繁茂するので、岸またはボート上から錨型の採集器具を水中に投入して、底から引き上げ
るようにして採集した。また、日本各地にいる研究協力者から車軸藻類サンプルの提供を受けた。採集品はさく葉標本にするとともに、その一部は-80℃で凍結保存し、さらにシリカゲルまたは70%エタノールで固定して遺伝子解析に用いた。また、各採集地点での緯度経度（GPS）情報を記録し、車軸藻類の生育状態と生育地の状態をデジタルカメラにより画像情報として記録した。

## 2 ）分類学的解析およびDNAバーコーディング

車軸薬類の分類体系 $ ^{1-3)} $ は、複数の種を1種として誤ってまとめてしまうlumpingや、1つの種を複数の種に細分化するsplittingなどといった分類学的問題点が多く残されている $ ^{4-10)} $ 。したがって、適切な保全単位を明らかにするために過去に記録されている種を詳細な形態学的解析と分子系統学的解析によって再検討する必要がある。本研究では、Sakayama et al. (2005) $ ^{5)} $ に準じて、種レベルの分類形質として重要な卵胞子の走査型電子頭微鏡（SEM）による詳細な観察を実施した。また、種レベルの同定結果は、2009年に国際的に標準化されたDNAバーコード領域 $ ^{11)} $ の1つであり、これまでに最も多くの種類で調べられている薬緑体のrbcL遺伝子の約600bpの塩基配列の比較に基づいて、形態に基づく種同定結果を確認した。一部のサンプルに関しては、必要に応じて、複数の薬緑体と核のDNA塩基配列（rbcL遺伝子、matK遺伝子、atpB-rbcL遺伝子間領域、ITS領域等）に基づく分子系統解析によって種同定を正確に行い、従来の分類体系と照らし合わせることにより、分類学的問題の解決と種の保全単位の決定を試みた。

## 3 ）分子マーカー/DNAバーコードの新規開発

DNAバーコード領域としてrbcL遺伝子とmatK遺伝子が国際的に標準化されているが $ ^{[11]} $ 、matK遺伝子については、車軸藻類に特異的なPCRプライマーが報告されていないため、本研究で車軸藻類に特異的なPCRプライマーのデザインを行った。

種レベルのDNAバーコードで識別ができない集団を識別するため、研究代表者がこれまでの研究で構築した独自のEST（網羅的な発現遺伝子のタグ配列）データベースから新規にEST-SSRマーカー（EST配列上に存在する単純反復配列）を開発し、集団間および集団中の個体間の遺伝的変異を検出可能なマーカーの探索を進めた。ESTデータベースは、車軸藻類の中で日本に最も多くの集団が分布するシャジクモ（Chara braunii）のものを用いた。EST-SSR領域の探索には、MISAプログラム（MIcroSA tellite identification tool, http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）を用いた。MISAプログラムによって抽出したEST-SSR領域をPCR増幅するために、PRIMER3プログラム

(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) を用いてプライマーを設計した。抽出したEST-SSR領域がシャジクモ集団間で多型的かどうかを検証するため、Kato et al. (2008, 2011) $ ^{12,13} $ によって系統が異なることが明らかになっている複数のシャジクモ集団を用いて、集団間のEST-SSR領域の比較を行った。EST-SSR領域の比較は、アガロースゲルを用いた電気泳動法で増幅を確認した後、Guichoux et al. (2011) $ ^{14} $ 等を参考にし、通常のPCR法および蛍光標識プライマーを用いたマルチプレックスPCR法により増幅反応を行いオートシーケンサーでアリルの決定を行った。

## 4 ）車軸藻類の多様性情報データベース構築とデータの管理、公開手順

日本バーコードオブライフ・イニシアティブ (JBOLI) のデータベースシステム「Ruga」とデータを共有することを前提として、DNAバーコードを取得した標本に由来する、形態、遺伝子（DNA