Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
に180μmメッシュでふるい、メッシュ上の残存物を実体顕微鏡下で観察しミジンコ卵鞘を層毎に採取するとともに得た数を記録した。

各地点のミジンコ（Daphnia）に特異的なプライマーを作成するため、現世の成体ミジンコを採集し、mtDNA上の12SリボソームRNA（12SrRNA）遺伝子配列を決定した。これらの配列決定はDaphnia pulexのmtDNA配列 $ ^{7} $ （GeneBank accession number: AF117817）および予備実験により得たD. dgaleata/dentiferaの配列情報をもとにして行った。これにより決定した現世ミジンコの配列をもとに、各領域に存在する多型を検出可能で且つごく短い領域（164～172 bp）を増幅するプライマー組を設計した（図(1)-3）。フォワード側は各地点（種）に共通配列（12S_BF1）となるものを設計し、リバース側は各地点（種）共通の配列（12S_BR2）であるものと、地点（種）特異的な配列（羅臼湖：12S_raR、ニセコ大沼：12S_niR、ミクリガ池：12S_miR、阿寒湖および木崎湖：12S_akR）であるものの両方を設計した。先行して行った畑谷大沼ミジンコ卵鞘の遺伝子解析と同様に、ミジンコ卵鞘からのDNA抽出、PCR法による各遺伝子領域の増幅を、（1）に記述のPCR3と同様の条件で行った。リバース側を共通配列のプライマーとしたものと特異的なプライマーとしたものの両方でPCRを行い、いずれか一方でも増幅に成功したサンプルを配列決定に用いた。渡島大沼のみ共通配列のプライマーだけでPCRを行った。増幅の有無は2%アガロースゲル電気泳動で確認し、産物をExoSAP-IT $ ^{(R)} $ （USB）を用い精製した後、Big Dye $ ^{(R)} $ Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用いてサイクルシーケンシング反応を行い、ABI PRISM $ ^{(R)} $ 3130-Avant Genetic Analyzer（Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。

## （３）淡水ヒゲナガケンミジンコ休眠卵を種同定するための分子マーカーの開発と、湖沼堆積物試料への応用

ヒゲナガケンミジンコ類（橈脚類）は、ミジンコ類（枝角類）とともに、湖沼生態系の低次生産者として量的に卓越する動物プランクトンである $ ^{8-10} $ 。しかし、古陸水学的な湖沼プランクトン組成の復元においては、生物学的な制約（堆積物中に遺骸が残らない、休眠卵を用いた種同定が極めて困難である、等）のため、群集復元対象生物としては、扱われてこなかった。そこで本研究課題では、今後日本列島の様々な湖沼において行われると期待されるレトロスペクティブ型モニタリングに、ヒゲナガケンミジンコ情報を組み込むことを念頭に置き、湖沼堆積物中に保存されているヒゲナガケンミジンコ休眠卵を種同定するための分子マーカー（DNAバーコード $ ^{11,12} $ ）の開発を行った。

## 1 ）プランクトン個体からの、DNAバーコードライブラリー作成

DNAバーコードライブラリー注 $ ^{*} $ 作成に用いたプランクトン個体は、本研究課題（D-1002）にて採集された試料に加えて、2005年から2010年にかけて日本列島各地（図（1）-4）で採集・エタノール固定し研究室にて保存されていた試料から、それぞれ適宜抜粋した。

水野・高橋 $ ^{13)} $ に従い同定されたヒゲナガケンミジンコ各種について、エタノール固定サンプル中から雌成体を1個体ずつ単離し、ゲノムDNAを抽出したのち、核DNA・28SrRNA遺伝子の部分配列約300bp(以下nc28Sと標記)をBissett et al. $ ^{14)} $ に記載されたプライマー（CopF2とCopR1）とPCR条件により増幅した。このPCR産物をExoSap ITキットにより精製した後、BigDyeターミネーターキッチンを用いることで、
トを用いたサンガー法により塩基配列を決定した。

$ ^{*} $ 注：DNAバーコードは、狭義にはConsortium for the Barcode of Life（CBOL）が主導する、ミトコンドリアDNAのCOI領域の部分配列であり、本研究のバーコードは、厳密には、CBOLの扱いでは二次的DNAバーコード $ ^{11,12} $ と定義される情報である。

## 2 ）ヒゲナガケンミジンコ休眠卵へのnc28Sバーコード適用可能性の吟味

図（1）-4 に示した採集地点のうち合計30カ所について、最表層堆積物に含まれていたヒゲナガケンミジンコ休眠卵を用いて、nc28SDNAバードによる種判別の可能性を検討した。

図（1）-4 nc28Sバーコード作成に用いた試

料の採集地点

ヒゲナガケンミジンコの休眠卵は、ショ糖溶液を用いた遠心分離法 $ ^{15)} $ により堆積物中から単離
した。すなわち、それぞれ堆積物の少量（湿重量で5g程度）を80mLの蒸留水中に移し、80mLのショ糖水（67%溶液）を加えてよく攪拌したのち、遠心分離（900rpm、90秒）に供した。遠心後の上清をプランクトンネット（50μm）で捕集することで、休眠卵を回収した。

休眠卵のゲノムDNAは、前述したUltraSHOT法により抽出し、プランクトン個体の場合と同様にnc28S領域の塩基配列を決定した。そして、休眠卵からの塩基配列が、nc28Sバーコードライブラリー中のいずれかの種の配列と一致するか否かを調べた。

## 3 ）ヒゲナガケンミジンコ過去群集の復元

H22-24年度に採集した山岳湖沼（羅臼湖、ニセコ大沼、ミクリガ池）および低地湖沼（阿寒湖、渡島大沼、木崎湖）の堆積物サンプルを解析することで、各湖沼でのヒゲナガケンミジンコ類の、過去群集の組成復元を試みた。

各湖沼において、採集直後に、1cmごとの深度別にスライス・遮光保存された堆積物から、ショ糖溶液を用いた遠心分離法により、ヒゲナガケンミジンコ休眠卵鞘を単離した。続いて、休眠卵1粒毎に、UltraSHOT法によるDNA抽出を行った。得られた抽出物は、nc28S領域の塩基配列に基づく種判別に供された。この分子解析と同時に休眠卵の出現数も見積もった。

これら種判別および出現卵数の結果と、サブテーマ2（後述）により求められた、堆積物各層の堆積年代および年代測定から得られた質量堆積速度から、ヒゲナガケンミジンコ種休眠卵のフラックスを、Kerfootら $ ^{16)} $ に従い下式、

$$ ヒゲナガケンミジンコ種休眠卵のフラックス \left(eggs\ cm^{-2}\ yr^{-1}\right) $$

にて、種別に見積もった。

## 4 ．結果及び考察

## （１）堆積物中に含まれるミジンコ卵鞘の遺伝子解析

## 1 ）ミジンコ休眠卵鞘を利用した遺伝子解析法の開発

HotSHOT + PCR 3、UltraSHOT + PCR 1、UltraSHOT + PCR 2、UltraSHOT + PCR 3の4つのDNA抽出方法と増幅方法の組み合わせで実験を行った結果、それぞれ16個中9個、1個、6個、11個のサンプルでDNAの増幅に成功した。どの実験でもネガティブコントロールでは増幅が見られなかった。UltraSHOT + PCR 3が最も成功率が高く（69%）、一般的なPCR増幅方法（Ex Taq）を用いたUltraSHOT + PCR 1の成功率よりも有意（p=0.006）に高かったが、HotSHOT + PCR 3およびUltraSHOT + PCR 2との成功率の違いは有意ではなかった（図(1)-5）。HotSHOT + PCR 3およびUltraSHOT + PCR 3で増幅されたサンプルの塩基配列を調べたところ、予備実験で得られた3つのハプロタイプのいずれかと同一であった。

本研究により初めてミジンコの卵鞘からDNAを抽出する技術が確立した。従来までの研究では湖底堆積物中のミジンコの休眠卵の遺伝解析することで、過去の湖沼環境の変動がミジンコ個体群構造の変遷と一致していることを明らかにしてきた $ ^{17-22} $ 。しかしながら休眠卵の孵化率が高い湖沼
では、休眠卵の入っていない空の卵鞘のみが湖底堆積物中に数多く残されており、休眠卵を用いた遺伝解析を行うことは難しい。孵化率は湖沼間で異なるだけでなく $ ^{23,24} $ 、同じ湖沼でも年ごとに異なる場合がある $ ^{25-27} $ 。光や温度条件がミジンコ休眠卵を孵化させる引き金となっており $ ^{28} $ 、これらの条件が揃いやすい環境であれば孵化率が高くなると考えられる。本研究で開発した手法を用

図(1)-5 HotSHOT + PCR 3、UltraSHOT + PCR 1、UltraSHOT + PCR 2、UltraSHOT + PCR 3の4つのDNA抽出方法と増幅方法での成功率の比較。棒グラフの各棒の上にある文字は、同等の成功率をもつグループを示している（カイニ乗検定、p<0.05（Bonferroni補正））。

いることで、対象となる湖沼での孵化率の大小に関わりなく、過去の環境変動とミジンコの個体群構造の変遷の関係性について再現することができる。

## 2 ）湖沼堆積物から得たミジンコ休眠卵鞘による過去群集の復元

## a）烟谷大沼

堆積物中から採取したミジンコ（Daphnia）卵鞘から抽出した微量DNAを用いた遺伝子解析を畑谷大沼のサンプルを用いて行った。卵鞘から抽出した微量DNAから、PCRによって12SrRNA遺伝子の一部（136bp）を増幅し、増幅に成功したサンプルの遺伝子配列を決定しタイプ組成の変遷を確かめた。12SrRNA遺伝子による種判別の結果、D. pulexが少数検出された他はD.

galeata/dentifera のいずれかであった（図(1)-6）。D. galeata/dentifera は現在生息する 3 タイプと同じく、過去においても D1 型、D2 型、G 型が存在したことが卵鞘の遺伝子配列から示され
た。D1型は19-20cmを除く全ての層で、全体の50％以上を占めていた。一方D2型はいくつかの層から検出されたが、最も多い19-20cmの層でも全体の約10％であった。G型は23cmより上層（1950年代以降）で検出され、その後のほとんどの層で検出された。現在の畑谷大沼におけるD.galeata/dentiferaは、一年を通じて全体の半分以上がD2型の個体で占められていることが過去の研究から確認されている $ ^{29)} $ が、ミジンコ卵鞘を用いた過去群集の調査では、D2型がD1型に比べ非常に少ないという結果であった。通常ミジンコはメスのみの単為生殖を行い、環境条件の変

図(1)-6 畑谷大沼（山形県）で採取されたミジンコ（Daphnia）卵鞘のDNA解析による、過去群集のミトコンドリアDNAの12SrRNA遺伝子に存在する各タイプの頻度変遷。深度は切り出した層の下端の数値（4-5cmの層であれば5cm）で示す。

化などに応じてオス個体が出現し有性生殖による休眠卵を生産する。しかし、D2型は他の2タイプが休眠卵を生産するような条件であっても休眠卵を生産することが少ないことが予想される。

なお、D2型が他の2タイプに対し集団中で優占しているのは、休眠卵を生産する替わりにそのコストを単為生殖に注ぐことで個体群密度を上げる戦略を採っているためではないかと考えられる。このような戦略の違いが存在する原因のひとつとして、休眠卵の生産に関わる遺伝子にD2型とそれ以外のタイプとでは違いが生じている可能性が挙げられる。ミジンコの休眠卵生産は餌条件や光条件など環境の変化に応じて起こることが知られる $ ^{30)} $ が、休眠卵の生産性は遺伝的にも違いが生じ得るものであり、D. pulicariaでは遺伝的に異なる地域集団どうしは互いに休眠卵の生産しやすさの違いが見られることが実験的に示されている $ ^{31)} $ 。畑谷大沼のD.

galeata/dentifera でも環境の変化に対する応答に遺伝的な違いがあるタイプが同所的に存在し
ていると考えられる。このことをより詳細に明らかにするためには、休眠卵生産に関すると予想される機能遺伝子などを調べることが必要となる。

図(1)-7 各地の山岳湖沼におけるミジンコ（Daphnia）休眠卵鞘の年間フラックス（実線、number/cm²/year）と、卵鞘内の卵の有無から判断した孵化率（破線、（100×空の卵鞘数/全卵鞘数）%）。それぞれ層の深度1cm毎にひとつの点で示す。矢印は12SrRNA遺伝子により決定したその年代における生息ミジンコ種の略称（E：Daphnia ezoensis、T：Daphnia tanakai）を示す。（a）：羅臼湖（現世種：E）、（b）：ニセコ大沼（現世種：E）、（c）：ミクリガ池（現世種：T）。

## b）各地の山岳・低地湖沼

東日本の山岳湖沼（羅臼湖・ニセコ大沼・ミクリガ池）および低地湖沼（阿寒湖・渡島大沼・木崎湖）の堆積物からミジンコ(Daphnia)休眠卵鞘を採取した。各地点における各年代の休眠卵鞘から算出したフラックスおよび12SrRNA遺伝子による生息種判別の結果を図(1)-7、(1)-8に示す。山岳湖沼では、各地で密度増加傾向は見られたが、ミジンコの生息種や遺伝子型の変化は解析の結果からは現在まで見られなかった。僅かな増加傾向については、共通の広域的な要因の可能性もあるが、生息環境に影響を与え得る各地でのイベントが関係していると考えられる。しかしそれらのイベントでは、有利な遺伝子型の変化をもたらす環境変化に到らず、また外部からの移入は無かったものと考えられる。一方、低地湖沼では現在および過去における急激な個体密度の増減が見られ、また生息種や種内の遺伝子構成が過去と現在とで異なっていることが、遺伝子解析から明らかとなった。急激な増減は魚類等による捕食圧の変化や湖沼の富栄養化が反映された結果であると考えられる。生息種の変化は主に漁業活動に伴う外部からの移入、および環境変化等
による優占するタイプの変化によるものと予想され、生息種の絶滅や移入の時期を調査結果が示している。いずれの低地湖沼でも、ミジンコおよび湖沼環境が各種の人間活動による影響を受け変化してきたことが示されたと考えられる。以下で各湖沼での調査結果について述べる。

羅臼湖（図(1)-7a）は、近年ミジンコが僅かに増加はしているが、過去100年以上にわたり低密度の状態で大きな変動は無いことがわかった。湖の近くでは直接の開発は無いが、1961年に探検が行われた以降 $ ^{32} $ 、現在までに道路開発や世界遺産登録等、人間が訪れる機会が増えた影響が、近年の密度微増として現れている可能性がある。現世種はDaphnia ezoensisであり、12SrRNAの配列からほぼ単一の遺伝子型が優占していることが確認された。これをもとにした12SrRNAによる遺伝子解析から、配列決定に成功したのは2個体のみではあったが、過去ミジンコも現世種と同じ配列であることが確認され、生息種の変化も起きていないことが示された。これらのことからミジンコの生存に影響する変化は現在まで起きておらず、湖沼環境は長期的に安定した状態が続いてきたといえる。

図(1)-8 各地の低地湖沼におけるミジンコ（Daphnia）休眠卵鞘の年間フラックス（実線、number/cm²/year）と、卵鞘内の卵の有無から判断した孵化率（破線、（100×空の卵鞘数/全卵鞘数）%）。それぞれ層の深度1cm毎にひとつの点で示す（木崎湖はタービタイト層を除いて表示しているため一致しない）。矢印は12SrRNA遺伝子により決定したその年代における生息ミジンコ種の略称（E：Daphnia ezoensis、G：Daphnia galeata）を示す。（a）：阿寒湖（現世種：G）、（b）：渡島大沼（現世種：不明）、（c）：木崎湖（現世種：G）。
ニセコ大沼（図(1)-7b）も過去50年以前には個体数に大きな変動は見られなかった。しかし1950年代から現在にかけては、羅臼湖と同じく僅かな増加傾向にあった。また、付近にはかつて硫黄鉱山があったが1937年には閉山している $ ^{33)} $ など周辺地域の利用の変化が環境に影響を与えていた可能性も考えられる。現世種は羅臼湖と同じくDaphnia ezoensisであり、12SrRNAの配列からほぼ単一の遺伝子型が優占していることが確認されたが、羅臼湖とは異なる配列であった。12SrRNAによる遺伝子解析から過去ミジンコも現世の優占するタイプと同じ配列であることが確認され、生息種の変化は起きていないことが示された。

ミクリガ池（図(1)-7c）ではこの約100年間でミジンコが徐々に増加していく傾向にあった。観光開発等に伴う富栄養化の影響があったものと考えられる。また1970年前後は一時的に大きく減少し、他年代ではほぼ全てが卵の無い卵鞘であったのに対しこの時期の卵鞘の半数以上は未孵化のままであった。交通整備等の工事が多く行われていた時期であったため $ ^{34} $ 、付近の環境変化がミジンコの生存や孵化に悪影響を及ぼした可能性がある。現世種はDaphnia tanakaiであり、

12SrRNAの配列からほぼ単一の遺伝子型が優先していることが確認された。また12SrRNAによる遺伝子解析から過去ミジンコも現世の優占するタイプと同じ配列であることが確認され、環境変化による、有利な遺伝子型の変化や外部からの移入は起きていないことが示された。

阿寒湖（図(1)-8a）は、約60年前から続いていた低密度で安定していた状態から、最近の10年程の間に急速な増加が起きていた。阿寒湖では以前からワカサギ養殖等の漁業活動が行われているが、近年はワカサギの漁獲量は減少している $ ^{35)} $ 。また、観光地でもあるため周辺の観光開発 $ ^{36)} $ が湖沼環境にも影響していることが予想される。急速な増加はミジンコに対する魚類の捕食圧の変化（減少）や水質の富栄養化が原因と予想される。さらに、現在の生息種はDaphnia galeataであり、12SrRNAによる遺伝子解析からはほぼ単一の遺伝子型が優占していたが、増加する前の1970年代以前にはD.ezoensisが存在したことが確認された。ワカサギ養殖等の漁業活動に伴い、1970年までにD.galeataが侵入したと予想される。その後、魚類による捕食または他の何らかの生息環境変化によりD.ezoensisが絶滅し、一方D.galeataは現在まで生き残り増加しているという入れ替わりが起きたことが考えられる。

渡島大沼（図(1)-8b）では約50年前から現在まではミジンコ休眠卵鞘が少ない状態が続いていた。しかし過去においては1900年頃をピークに密度が大きく増加していた時期があった。この後の1900年以降にマスやワカサギ等が移植され、漁獲量のピークは1930年代であった $ ^{37)} $ 。移植された魚類による捕食圧の増加が、1900年から1950年頃までのミジンコの密度減少の原因であったと考えられる。現世のミジンコ個体が得られなかったため、現在の生息種は不明である。堆積物中の休眠卵鞘を利用した12SrRNAによる遺伝子解析からは、D. ezoensisとD. galeataが存在したことが確認された。現在の種構成と比較できないため過去の変遷履歴も不明であるが、阿寒湖のように魚類の移植とともにミジンコの移入が起きた結果として2種が生息するようになったことも考えられる。

木崎湖（図(1)-8c）は1990年代から2000年にかけてミジンコの急速な増加が起きていたが、以前は休眠卵鞘が非常に少ないまたは得られない層が続いていた。しかし、休眠卵鞘が得られない時期にもミジンコ成体の採集記録は存在する $ ^{38,39} $ ため、非常に低密度ながらミジンコは生息し続けていたはずである。木崎湖は1800年代後半から漁業に利用され $ ^{39} $ 、ワカサギ等の移植は1910年頃に始まっており $ ^{40} $ 、ミジンコが非常に少なかったこの時期には捕食圧が大きかったと考えられる。
1970年代には魚食魚であるバスの密放流があり $ ^{40} $ 、これによりワカサギが減少したことからミジンコへの捕食圧も小さくなったと思われる。また周辺の開発も進んでいたことから、湖沼環境の変化も起きていたと予想される。これらの要因が近年のミジンコ密度の急速な変化をもたらしたことが考えられる。現在の生息種はDaphnia galeataであり、12SrRNAによる遺伝子解析から区別できる2つの遺伝子型であるK1とK2が存在することが確認された。それらの発見された比率はK1:K2=3:1であった。休眠卵鞘を利用した遺伝子解析からは、1950年代から現在にかけてはK1とK2の両方の種内遺伝子型の存在が確認された。さらに古い層である年代未確定（100年以上前）の65cm、66cmの層からはK2のみが確認されている。2つの遺伝子型のうち、K2は長野県・山梨県・鹿児島県から発見されている局所的な分布のタイプであるが、K1はより日本の広い地域に生息する $ ^{41} $ 。遺伝子解析の結果から、局所的に生息するK2が木崎湖本来の遺伝子型であると考えられ、過去に存在しなかったK1は外部からの侵入によるものと予想される。木崎湖には魚類の移植が繰り返し行われているため、K1はそれに伴って外部から侵入し現在K2より多数を占めるに到っていると考えられる。

（２）淡水ヒゲナガケンミジンコ休眠卵を種同定するための分子マーカーの開発と、湖沼堆積物試料への応用

図（1）-9 今回得られたnc28S DNAバーコード配列を用いてベイズ推定された系統樹。各ノードの数値は事後確率を示す。OUT名称のアルファベット2文字でヒゲナガケンミジンコ種名を示す（次ページ表中の表示方法と一致）。またOUT名称は、DDBJに登録の際に用いたisolate名と同一である。
## 1 ）プランクトン個体からの、DNAバーコードライブラリー作成

日本列島各地から採集されたヒゲナガケンミジンコ種は、テモラ科からEurytemora affinis (Poppe 1880)とHeterocope appendiculata(Sars 1862)の2種、ディアプトムス科からAcanthodiaptomus pacificus(Burckhardt 1913)、Eodiaptomus japonicus (Burckhardt 1913)、Heliodiaptomus kikuchii Kiefer 1932、Heliodiaptomus nipponicus (Kokubo 1912)、Neodiaptomus schmackeri (Poppe and Richard 1892)、Neutrodiaptomus formosus (Kikuchi 1928)、Neutrodiaptomus pachypoditus (Rylov 1923)、Sinodiaptomus sarsi (Rylov 1923)およびSinodiaptomus valkanovi Kiefer 1938、の9種、合計11種にのぼった。

これら11種の合計109個体から、合計21パターンにのぼるnc28S領域のハプロタイプが得られた。今回配列決定した領域の塩基長は240bpと決して長くはないが、それでも同一の配列が複数種から得られることはなかった（図（1）-9）。

また、解析に供したヒゲナガケンミジンコ個体が全国各地から網羅的に採集されているため、今回得られたnc28S塩基配列は、種内での配列の地理的変異を、概ね反映しているだろう。よって、今回得られた21パターンのnc28S領域塩基配列をもって、日本淡水産ヒゲナガケンミジンコ類を対象とした、DNAバーコードライブラリーが完成した、と判断された。なお21パターンのnc28S領域塩基配列は、日本DNAデータバンクにおいて、AB699176からAB699196のアクセッション番号で登録されている。

表(1)-1. 表層堆積物から単離した、ヒゲナガケンミジンコ休眠卵へのnc28Sバーコード適用結果。

湖沼名	都道府県	解析した休眠卵数	休眠卵から增幅したnc28Sの塩基配列パターン	nc28Sパーコードに基づくヒゲナガケンミジンコ種名!
つつじ沼	北海道	3	AP28S01	AP
羅臼湖	北海道	2	AP28S01	AP
阿寒湖	北海道	8	EA28S01	EA
ニセコ大沼	北海道	8	AP28S01	AP
渡島大沼	北海道	8	EA28S01	EA
横津岳の池	北海道	2	AP28S01	AP
伊豆沼	宮城県	3	EJ28S01	EJ
荒砥堤ため池	宮城県	3	AP28S01	AP
安達下沼	宮城県	3	EJ28S01	EJ
荒井堤ため池	宮城県	2	SV28S02	SV
1	SV28S02+04	SV
猫ため池	宮城県	2	SV28S01	SV
1	SV28S02	SV
1	SV28S01+02	SV
畑谷大沼	山形県	3	AP28S02	AP
1	AP28S02	AP
荒沼	山形県	3	EJ28S01	EJ
ウソポ沼	山形県	2	AP28S02	AP
駒ノ大池	福島県	3	AP28S02	AP
刈羽村のため池	新潟県	2	SV28S02	SV
1	SS28S01	SS
3	SS28S01	SS
平標山の池	新潟県	3	AP28S02	AP
四十八池	長野県	3	AP28S02	AP
木崎湖	長野県	4	EJ28S01	EJ
赤兔山の池	福井県	2	AP28S02	AP
琵琶湖	滋賀県	3	EJ28S01	EJ
小女郎が池	滋賀県	3	AP28S02	AP
古市大池	鳥取県	5	AP28S04	AP
3	NS28S01	NS
福崎のため池	兵庫県	4	NF28S01	NF
小野町のため池	兵庫県	3	SV28S02	SV
中の池	兵庫県	2	HN28S03	HN
2	HN28S02+03	HN
しだの下ため池	愛媛県	3	AP28S04+01	AP
甑岳の水たまり	宮崎県	1	AP28S04	AP
山田ため池	宮崎県	3	HK01+02	HK
清武町のため池	宮崎県	3	HK01+02	HK

$ ^{1)} $ , AP: Acanthodiaptomus pacificus species complex, EA: Eurytemora affinis,

EJ: Eodiaptomus japonicus, HK: Heliodiaptomus kikuchii, HN: Heliodiaptomus nipponicus,

NF: Neutrodiaptomus formosus, NS, Neodiaptomus schmackeri, SS: Sinodiaptomus sarsi,

SV: Sinodiaptomus valkanovi.
## 2 ）ヒゲナガケンミジンコ休眠卵へのnc28S DNAバーコード適用可能性の吟味

次に、全国各地の30湖沼から得られた合計112個のヒゲナガケンミジンコ休眠卵に、nc28S DNA バーコードを適用した結果を、前ページの表（1）-1に示した。

すべての休眠卵についてシーケンスに成功したので、DNAバーコードライブラリーの塩基配列情報から種同定を行ったところ、決定された種名はその採集地でプランクトンとして出現していたヒゲナガケンミジンコ種の種名と一致した。ゆえに、今回開発したnc28S DNAバーコードを用いてジェのタイピングを行うことで、日本各地の湖沼堆積物中のヒゲナガケンミジンコ休眠卵から、その湖沼に棲息するヒゲナガケンミジンコ種を同定できることが、明瞭に示された。

図(1)-10. 山岳湖沼（上段）と低地湖沼（下段）における、ヒゲナガケンミジンコ休眠卵フラックスの経年変化。低地湖沼では出現種が交代していることに注意。
また新潟県刈羽村のため池と鳥取県・古市大池の堆積物中からは、プランクトン試料中に出現したヒゲナガケンミジンコ種（それぞれS. valkanoviとN. schmackeri）の休眠卵に加えて、プランクトン試料中には出現しなかったヒゲナガケンミジンコ種（それぞれS. sarsiとA. pacificus）の休眠卵も発見されたが、後者は、採集時期以前に卓越していたが、採集時期には何らかの理由により消滅していた種なのだろう。

## 3 ）ヒゲナガケンミジンコ過去群集の復元

得られた結果は図(1)-10のとおりである。山岳湖沼の羅臼湖とニセコ大沼では、現世種であるAcanthodiaptomus pacificusが、過去100年間、継続して出現していたことが分かった。これらの湖沼では、表層堆積物中では外形上「正常な」休眠卵（図（1）-11）ばかりであったが、堆積層が深くなるに伴い「死卵」と判断される卵が増えた。この「死卵」は、1）外形上「正常な」休眠卵と同型・径であること、2）「死卵」を分解・単離した「中身」を用いたnc28S DNAバーコード解析によりA. pacificusと同定できたこと、3）実験室にてA. pacificusのみを単離・飼育した場合にも、この「死卵」と酷似するものが、外形上「正常な」休眠卵とともに発見されること、からA. pacificusと種判別して差し支えない。

図（1）-11 堆積物中から回収した、A. pacificusの休眠卵。左）正常な卵、中央）死卵、右）死卵を分解・中身を単離した状況。いずれも倍率200倍にて撮影。

低地湖沼である阿寒湖、渡島大沼および木崎湖では、山岳湖沼の場合とは異なり、現世種（阿寒湖と渡島大沼ではEurytemora affinis、木崎湖ではEodiaptomus japonicus）の出現は比較的最近であり、過去には別の種（A. pacificus）が分布していたことが分かった。

阿寒湖においては、1950年代以前にはA. pacificusが出現していたと報告 $ ^{42-44} $ されているが、今回の結果はそれとよく一致した。一方、渡島大沼と木崎湖では、第二次世界大戦以前にはDiaptomus sp.の出現が記録されているが $ ^{45-47} $ 、これはヒゲナガケンミジンコ種同定に関する文献資料が、当時は充実していなかったため、日本には出現しないDiaptomus属と記述したもので、実際にはDiaptomus属ではなくA. pacificusが出現していた、と考えるべきである。

これらの低地湖沼において、過去種休眠卵が減少した時期に、湖内での基礎生産量が減少したことを示すデータは、本研究課題では得られていない（サブテーマ2の結果を参照）。他方、ヒゲナガケンミジンコ過去種の休眠卵が減少した時期は、内水面漁業にかかる魚の放流量が増加し
た時期と概ね一致する。例えば、北海道南西部の渡島大沼周辺では、表(1)-2に示すような変化が、過去100年間の間に起こった事が知られている $ ^{33,37,48} $ 。

表(1)-2 渡島大沼およびその集水域の、近過去における出来事 $ ^{36,37,48} $ 。

年代(西暦)	イヘクト
内水面漁業関連	集水域開発	その他
1871	湖内へ初の魚類(コイ・フナ)
放流	-	-
1896	-	硫黄・褐鉄鉱の採掘始まる	-
1900	初のヒメマス放流	-	-
1900-1920頃	-	湖周辺の開発整備(鉄道・工場・発電所)…第一次世界大戦では工場好況	-
1927	初のワカサギ放流	-	-
1936	漁獲高・過去最高値	-	-
1939-1944頃	-	金の採鉱	-
1950-60年代	各年のワカサギ放流量が1930年代の5-10倍	-	-
1958	-	-	国定公園指定
1965	-	湖水放水先を函館湾へ変更	-
1974	-	-	湖沼環境保全のため協議会設置
1980年代	アオコ発生
以降	-	牛の放牧急増	水生植物の増加→駆除・刈取り

すなわち、渡島大沼において A. pacificus の休眠卵フラックスが低下する時期は、湖内へのワカサギの放流が始まり、漁獲高が増加した時期と、概ね、良く一致する。湖底への休眠卵フラックスが、当時の湖内のヒゲナガケンミジンコ個体の現存量を反映している $ ^{49} $ と仮定すれば、湖内での漁獲増加以降、A. pacificus の現存量が減少したことが推察される。興味深い事に、この時期には A. pacificus だけでなくミジンコ類（Daphnia）も減少したとこが、前項のデータ（図(1)-8）から推察される。A. pacificus と Daphnia は、我が国の淡水動物プランクトンの中では大型の部類に入る。とりわけサイズの大きな抱卵個体は、いずれもワカサギやヒメマスといった、我が国の湖沼に繰り返し放流されてきた、プランクトン食性魚類に選択的に捕食されるため、A. pacificus と Daphnia の個体群は、魚類捕食によるトップダウン制御を受けやすい $ ^{50-52} $ 。また、渡島大沼でのヒゲナガケンミジンコ現世種 E. affinis は、A. pacificus よりも小型である $ ^{53} $ ため、魚類捕食によるトップダウン制御の影響は、A. pacificus の場合よりも小さいだろう。以上のことから、渡島湖沼におけるヒゲナガケンミジンコ種交代は、ポトムアップ制御ではなく、トップダウン制御により説明できると推察され、ゆえに人為的な影響が色濃く反映されていると判断された。阿寒湖と木崎湖でも、ヒゲナガケンミジンコ種は大型種から小型種へと変化していたが、この種遷移も、渡島大沼の事例と同様に解釈できると思われる。

今回調査した山岳湖沼においても、若干の富栄養化や大気降下物の影響など、人為影響の兆し
が検出されている（サブテーマ2の結果を参照）が、幸いなことに、長期にわたる継続的な魚類の放流は行われていない。例えばニセコ大沼では、武田 $ ^{36)} $ によれば、昭和7年度にワカサギ（公魚）卵九百万粒が渡島大沼より移植され、また元田 $ ^{54)} $ によれば、コイが放養されたこともある、と記録されているが、いずれも湖内に定着しなかった模様である。上記の低地湖沼での事例をもとに考えると、羅臼湖とニセコ大沼では、人為的なトップダウン制御圧の増加が無視できるほど小さかったことが、現世種であるA. pacificusが、過去100年間継続して出現していた主要な原因として挙げられるだろう。

## 4 ）世界自然遺産「知床」のヒゲナガケンミジンコ

本研究では、羅臼湖堆積物中のヒゲナガケンミジンコ休眠卵を解析するにあたり、羅臼湖にプランクトンとして出現するA. pacificusについて、nc28S DNAバーコードに加えて、ミトコンドリアDNA・COI領域の塩基配列（部分配列630bp、以後はmtCOIと記す）についても解析を行い、羅臼湖周辺の湖沼に出現するA. pacificusのデータ $ ^{55)} $ と比較した。

図（1）-12 羅臼湖およびその周辺の湖沼に分布するA. pacificusのmtCOIハプロタイプ組成。狭い範囲に湖沼が点在するにも関わらず、湖ごとに得られるハプロタイプには違いが認められる。点線内には、それぞれの湖で認められるmtCOIハプロタイプ同士の関係を、ネットワーク系統樹にて示した（白丸はミッシングハプロタイプ）。

羅臼湖から得たA. pacificus24個体のmtCOI塩基配列は、23個体が既報のハプロタイプA08 $ ^{55)} $ と一致し、残り1個体は新規配列（ただしA08とは1塩基違い）を示した（図（1）-12）。羅臼湖周辺には狭い範囲に湖沼が点在しているが、ハプロタイプA08は、羅臼湖から300m程度東に位置する「羅臼五の沼」から報告されたものである $ ^{55)} $ 。しかし羅臼湖周辺のその他の湖沼からは、距離的に近接するにもかかわらず、ハプロタイプA08は発見されておらず、また羅臼湖からもハプロタイプA06とA07は発見されなかった。このことから、A. pacificusの自然分散能力が極めて小さいことがわかる。
## 5 ）阿寒湖と渡島大沼のEurytemora affinisの遺伝的分化について

阿寒湖と渡島大沼のヒゲナガケンミジンコ現世種であるEurytemora affinisは沿岸・汽水域が元来の生息地であるが、北海道の淡水湖沼の本種は、網走湖等の汽水湖からのワカサギ移植にもない侵入した可能性が指摘されている $ ^{56} $ 。ただし、この可能性は未だ詳細に検討されていない。渡島大沼へのワカサギ移植は1927年にまで遡るが、最初の移植は網走湖からであった $ ^{36} $ 。以後も網走湖や阿寒湖から、ワカサギの移植が繰り返されてきた $ ^{36,48} $ 。ワカサギの移植がE. affinisのベクターとなるならば、阿寒湖と渡島大沼のE. affinis個体群は、遺伝的に互いに類似しているだろう。

本研究では、阿寒湖およびニセコ大沼堆積物中のヒゲナガケンミジンコ休眠卵を解析するにあたり、プランクトンとして出現するE. affinisについて、nc28S DNAバーコードに加えて、nc28Sよりも進化速度の速いmtCOI（部分配列、630bp）についても解析を行い、阿寒湖と渡島大沼のE. affinisの間の遺伝的交流について検討を加えた。

図（1）-13 阿寒湖（赤色）、渡島大沼（青色）においてプランクトンネット採集で得られたE. affinis のmtCOIハプロタイプネットワーク系統樹。白丸はミッシングハプロタイプを示す。丸印のサイズは出現個体数を反映している。ハプロタイプos1とak4は、両方の湖で発見された。また阿寒湖では、配列のやや（12%）異なるハプログループ（as5、as9、as21）も観察された。

前項では、世界自然遺産「知床」の湖沼のA. pacificusでは、距離的に近接した湖沼間ですら、遺伝的交流が殆ど認められないことを示したが、直線距離で322km離れている阿寒湖と渡島大沼から採集されたE. affinisのmtCOI塩基配列には、両湖に共通して出現するハプロタイプ（図1-13のos1とak4）が見られ、どちらの湖でも、それらは個体群中で優占するハプロタイプであった。ま
たnc28S領域の配列も両湖で一致した。これらの結果は、両湖個体群間での遺伝的交流を強く示唆した。

つまり、E. affinisの分散は、A. pacificusよりも顕著であることが示された。上述のとおり、北海道の湖沼間でワカサギの移植を介したE. affinisの移動分散の可能性が指摘されていたが $ ^{56} $ 、実際に遺伝子流動を検出した本解析結果は、この論議を支持するだろう。つまりE. affinisの顕著な分散の要因として、人為的な影響を指摘することができよう。

またどちらの湖でも、解析に供したE. affinis個体数は上述のA. pacificusと同じ24個体であるが、E. affinisでは各湖から5個以上のハプロタイプが得られた。つまり渡島大沼と阿寒湖のE. affinis個体群の遺伝的多様性は、A. pacificusの場合よりも大きいことが示された。ただし、どちらの湖のE. affinis個体群も、ネットワーク系統樹が星形を示すことから、近年ボトルネックを受けたことがわかる。一般に移入個体群は強い遺伝的ボトルネックを受けることが多いが、E. affinisも移入種であるとされている。すなわち、元来沿岸性・汽水性種であるE. affinisが、我が国においては、ワカサギの移植にともない、汽水湖から淡水湖へと移入したと類推されている $ ^{56} $ 。実際に遺伝的ボトルネックの兆候を検出した本解析の結果からも、その可能性は支持される。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

ミジンコ（Daphnia）は環境変化に応答して急速に進化する性質をもつため $ ^{18,20,57-60} $ 、湖底堆積物中から収集できるミジンコ休眠卵は過去の湖沼環境変動を読み解く材料として有用である。休眠卵が孵化する条件が整いやすい湖沼では堆積物中から休眠卵を採集することは困難であるが、休眠卵の入っていない空の卵鞘を採集することは容易である。本研究により卵鞘から遺伝情報を得る手法が確立したことにより、休眠卵の孵化率に関わらずに、どの湖沼でも堆積物に含まれるミジンコ卵鞘を用いて湖沼環境変動を読み解くことが可能になった。

実際、この方法で過去群集の遺伝子組成を調査したところ、山形県の畑谷大沼では、現在のDaphnia群集で優占していると考えられる遺伝子のタイプが過去集団の卵鞘の遺伝子組成の中では少ないことが明らかとなった。これは遺伝的な違いにより異なる繁殖戦略が存在すること、現在と過去ではDaphniaにとっての環境が異なることを示唆しており、これまで検出が困難であった過去に生じた小さな環境イベントをも抽出できる道筋を示すものである。また山岳湖沼（羅臼湖、ニセコ大沼、ミクリガ池）と低地湖沼（阿寒湖、渡島大沼、木崎湖）を比較することで、湖沼への人為影響の濃淡が、Daphnia群集組成の時空間的安定性に強い影響を与えるという、大きな環境イベントの影響をも抽出できた。山岳湖沼では比較的安定した環境が続いていると考えられるが、各地で過去の人間活動の影響と思われる増減が生じていたことが示された。特に、人間の生活圏に比較的近い低地湖沼では、増減だけでなく種または遺伝子のタイプが現在と過去で異なることが明らかとなった。同様の調査は堆積物中からミジンコ卵鞘を得られるならば他の湖沼でも可能であり、過去から現在までの環境変動を解明するために利用できると期待される。

また本サブテーマでは、既存の研究ではほぼ不可能とされていた、ヒゲナガケンミジンコ類の過去の群集組成を復元することにも成功し、湖のプランクトン群集の復元過程に、新しい、効果
的なツールを提供することができた。その結果本研究では、湖沼への人為影響の濃淡が、Daphnia類だけでなく、ヒゲナガケンミジンコ群集組成の時空間的安定性にも強い影響を与えることを見出した。湖沼の動物プランクトンとして量的に卓越するDaphnia類とヒゲナガケンミジンコ類とで、同様の結果が得られた事は、我が国の低地湖沼にかかってきた人為影響が、湖沼の食物網構造を極めて強い形で変質させていたことを、強く示唆するものである。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

本研究が開発したレトロスペクティブ型モニタリング手法を用いることで、同種個体群の遺伝型の変化といった小さな環境変化をも検出できるようになり、過去の湖沼環境の変動を高解像度で読みとくための道筋がひらけた。本サブテーマで開発した方法は、時間や予算などの高いコストが必要となる継続的モニタリングが行われてこなかった湖沼でも、過去の生物群集の組成情報だけでなく、遺伝的情報を得ることを可能にする。したがって、これら一連の手法は、現在および将来の環境変動に対する生物群集の影響予測にも繋がり、土地利用改変などの政策にあたっての目標設定に科学的な情報を提供することができる。

例えば、本調查地の一つである羅臼湖周辺の知床国立公園は、ユネスコの世界遺産に選ばれた、文字通り世界的に貴重な生態系であるが、本研究からケンミジンコ類では他湖との間の遺伝子交流が制限されよく保存されていることがわかった。この結果は、阿寒湖など集水域の人間活動が大きな湖沼での結果とは対照的である。我が国では重要な自然生態系について過去のデータがないため現状評価がしにくい場合が多いが、本研究はそれら問題の克服に大きく貢献出来るだろう。

また本研究で得られた手法を多様な湖沼で比較することにより、各湖沼特有の環境変化要因を特定することが可能となった。例えば、低地湖沼と山岳湖沼とを比較すると、低地湖沼では集水域の人為的な負荷（なかでも魚類の放流）が、山岳湖沼は大気降下物（サブテーマ2と3を参照）が、それぞれ重要な生態系変化要因である。このように、生態系の環境変化要因は湖沼によって異なっており、その違いに応じた環境改善策を講じて行く上で、本研究の手法は有効となるだろう。

個別の湖沼について、具体的な保全目標を設定する際には、保全目標を正しく設定することが必要である。しかし、湖沼モニタリングが殆ど行われてこなかった湖沼では、保全目標を正しく設定することが困難である。本研究が開発したレトロスペクティブ型モニタリング手法は、比較的少ない予算で、保全目標の設定に必要なデータを得る事を可能とする。また、生態系変化の長期的なプロセスを解明できるので、どの時代の生態系を取り戻すのが望ましいのかといった、保全目標決定の際に極めて重要な科学的根拠を積み上げることができる。特に人為影響の大きな低地湖沼においては、保全目標の設定に際して、レトロスペクティブ型モニタリングを行い、生物相の経年変化を把握しておくことは、今後の保全や集水域の改変などの上でも役立つだろう。
## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) S. Ishida, H. Ohtsuki, T. Awano, N. K. Tsugeki, W. Makino, Y. Suyama and J. Urabe: Limnology, 13, 261–267 (2012) “DNA extraction and amplification methods for ephippial cases of Daphnia resting eggs in lake sediments: a novel approach for reconstructing zooplankton population structure from the past”

2) W. Makino, H. Ohtsuki and J. Urabe: Limnology, in press (2013) "Finding copepod footprints: a protocol for molecular identification of diapausing eggs in lake sediments"

## <査読付論文に準ずる成果発表>

1）石田聖二・牧野渡：吉田丈人・鏡味麻衣子・加藤元海（編）シリーズ現代の生態学 第9巻 淡水生態学のフロンティア．共立出版（2012）「1章：淡水動物プランクトン種の地理的構造を形成した歴史的プロセス」

## くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1）石田聖二・大槻朝・陶山佳久・占部城太郎 第58回日本生態学会大会 2011.3 札幌「湖底に堆積する動物プランクトン遺骸（ミジンコ休眠卵鞘）の遺伝解析手法の開発」

2）槻木玲美、王婉琳、谷幸則、上田真吾、阿草哲郎、小田寛貴、田辺信介、占部城太郎：地球惑星科学関連学会2010年合同大会（2010）

「八幡平湖沼のプランクトン長期動態とその変動要因：高山湖沼で何が起きているか？」

3) Tsugeki, N.K., Urabe, J., Tani, Y., Ueda, S., Agusa, T., Oda, H., and Tanabe, S.: ASLO Aquatic Sciences Meeting (2011) [Does atmospheric dust transported from the Asian continent influence oligotrophic lakes in Japan?]

4）槻木玲美、占部城太郎、谷幸則、上田真吾、阿草哲郎、小田寛貴、王婉琳、田辺信介：日本生態学会第58回全国大会(2011）「アジア大陸起源の大気降下物は日本の湖沼へどのような影響を与えているか？」

5) W. Makino and J. Urabe: 日本生態学会第59回全国大会(2012)「Finding copepod footprints: DNA barcoding for the resting eggs in lake sediments」

6) N. K. Tsugeki, T. Agusa, S. Ueda, M. Kuwae, H. Oda, S. Tanabe, Y. Tani, K. Toyoda, W-L. Wang and J. Urabe: ASLO Aquatic Sciences Meeting, Japan, 2012. “Eutrophication and increasing metal deposition of mountain lakes in East Asia due to anthropogenically-produced dust”
7) 占部城太郎：第60回日本生態学会（2013）企画集会T02 湖沼生態系のレトロスペクティブ型モニタリング技術の開発「イントロダクション－湖沼生態系のレトロスペクティブ型モニタリング」

8）牧野渡、大槻朝、石田聖二、占部城太郎：第60回日本生態学会（2013）企画集会T02 湖沼生態系のレトロスペクティブ型モニタリング技術の開発「動物プランクトン情報を用いた湖沼生物群集の復元」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) Rychlik W (2007) OLIGO 7 primer analysis software. Methods Mol Biol 402: 35–60.

2) Truett G, Heeger P, Mynatt RL, Truett AA, Walker JA, Warman ML (2000) Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). BioTechniques 29: 52-54.

3) Alasaad S, Rossi L, Maione S, Sartore S, Soriguer RC, Pérez JM, Rasero R, Zhu XQ, Soglia D (2008) HotSHOT Plus ThermalSHOCK, a new and efficient technique for preparation of PCR-quality mite genomic DNA. Parasitol Res 103: 1455-1457.

4) Meeker N, Hutchinson S, Ho L, Trede N (2007) Methods for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques 43: 610-614.

5) Montero-Pau J, Gómez A, Munoz JN (2008) Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction methods for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs. Limnol Oceanogr: Methods 6: 218-222.

6) Ishid, S, Ohtsuki H, Awano T, Tsugeki NK, Makino W, Suyama Y, Urabe J (2012) DNA extraction and amplification methods for ephippial cases of Daphnia resting eggs in lake sediments: a novel approach for reconstructing zooplankton population structure from the past. Limnology 13: 261-267.

7) Crease TJ (1999) The complete sequence of the mitochondrial genome of Daphnia pulex (Cladocera: Crustacea). Gene 233: 89-99.