Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
た複数の生態系の比較モニタリングが有効である。

第3の問題として、生態系変化の兆しに対して迅速に対応するためには、様々な生態系で生物などを含む重要項目を常にリアルタイムで測定することが望ましいが、高山などの辺境地では実際的に不可能である。限られたコストの中で、社会ニーズに応えられる生態系（湖沼）管理のためには、これら3つの問題を克服する必要がある。しかし、我が国においては、そのようなモニタリング技術の開発は全く行われてこなかった。

## 2 ．研究開発目的

湖沼堆積物には過去の生物群集や環境状態を物語る痕跡として、動植物プランクトンの遺骸や休眠卵、内生性や外来性の多様な有機物が年代ごとの層となって保存されている。この年代ごとに保存されている堆積物の生物・化学情報から過去の生物群集や環境状態を高度に復元することが出来れば、事前データのない湖沼に対しても、過去の状況と現在起こりつつある生態系変化をレトロスペクティブに把握することが可能となる。すなわち、湖沼堆積物の情報をモニタリングし、異なる湖沼間で比較出来るなら、これまでモニタリング対象外であった湖沼や、山岳湖沼のように日常的なモニタリングが困難な湖沼についても、生態系変化とその要因についての事後的なモニタリングが可能となる。本研究は、このような視点から、湖沼堆積物に残る生物・環境情報を高度に利用するレトロスペクティブ型のモニタリング技術を開発することを目的に行う。具体的には、

・最新の化学分析及び分子生物学的手法を古陸水学的アプローチに適用し、湖底堆積物コアが含む時間・化学・生物情報から近過去（100年程度）の湖沼環境と生物群集を復元する技術の開発を行う。その技術を複数の山岳湖沼と近隣の人間活動が盛んな湖沼に適用することで、温暖化など広域的な要因と富栄養化など局所的な要因について湖沼生態系への影響評価を行い、環境モニタリング手法としての有効性を検証する。研究は、集水域の人為的影響のない3つの山岳湖沼（ニセコ大沼、羅臼湖、ミクリガ池）とそれら近隣にあり集水域の人間活動が盛んな3つの低地湖沼（渡島大沼、阿寒湖、木崎湖）を対象に下記の3サブテーマについて解析し、その成果を比較統合する形で推進する。

サブテーマ（1）堆積物の動物プランクトン情報を用いた湖沼生物群集の復元：湖沼食物網の鍵となる生物群である動物プランクトンを対象に、堆積物に残された遺骸の定量解析に加え、休眠卵のDNA解析を行うことで過去の群集構造とその変遷を高精度に復元するとともに、過去の生息環境復元のプロキシとして有効なDNA情報を抽出する。

サブテーマ（2）堆積物の藻類・光合成色素を用いた湖沼の栄養・物理環境の復元：動・植物プランクトン動態の高度復元と食物連鎖情報抽出に対する「SCEs色素」の有効性を検討し、低次生産動態解析の新たなプロキシの開発を行う。さらに湖沼生態系に対する大気由来栄養塩負荷の影響がどの程度の広がりを持つかを明らかにすることを課題目標の一つとし、湖沼特性の異なる北海道4湖沼（ニセコ大沼・羅臼湖・阿寒湖・渡島大沼）及び信州2湖沼（ミクリガ池・木崎湖）において、堆積物の年代を測定するとともに植物・動物プランクトン群集変化の復元と大気由来栄養塩負荷の影響評価を試みる。

サブテーマ（3）堆積物の有機物・安定同位体を用いた湖沼と集水域環境の復元：堆積物が含むリグニンなど陸上起源有機物を分析することで集水域からの有機物供給やその被覆・植生を復元する。また、δ¹⁵Nを用いた人為起源窒素の負荷やδ³⁴Sを用いた大気降下物、δ¹³Cを用いた一次生産の変化、そして動物プランクトン遺骸のδ¹⁵N・δ¹³C分析から過去の食物網の復元やδ¹⁸Oによる温度変化評価など、湖沼生態系の高度復元のために最新の安定同位体科学の手法を開発・適用する。

### 3. 研究開発の方法

（１）堆積物の動物プランクトン情報を用いた湖沼生物群集の復元

湖沼における動物プランクトン群集の集団変遷を調べるため、湖沼堆積物中のミジンコ（Daphnia）休眠卵鞘を利用した遺伝子解析方法（UltraSHOT法）の開発、およびその方法による各地の湖沼堆積物中のミジンコ休眠卵鞘の遺伝的解析を行った。遺伝子解析方法の開発は、生息する動物プランクトンに関する情報が既に得られていた山形県畑谷大沼のサンプルを利用して行った。卵鞘からのDNA抽出方法とPCRによるミトコンドリアDNAの増幅方法を、他の既存の方法と比較しその有用性を検討した。この方法を用いて、各地の山岳湖沼（羅臼湖・ニセコ大沼・ミクリガ池）および低地湖沼（阿寒湖・渡島大沼・木崎湖）の堆積物から採取したミジンコ休眠卵鞘の解析を行った。採取した湖底堆積物を深度別に切り分け、1cm毎に休眠卵鞘を採取した。これにより得た各深度における卵鞘数を用いフラックス（number/cm²/year）を算出した。さらにこれらの卵鞘および休眠卵を用いて、種判別および種内の遺伝子型の判別を行った。遺伝解析にあたっては、各湖沼の堆積物中から得た卵鞘でDNAを抽出し
た後、12SrRNA 遺伝子の増幅および配列決定を行い、遺伝子配列データベース (GenBank) の登録情報をもとに種の判別および現生個体と比較した。これらの解析により過去から現在に至るまでの群集構成の変遷解明を試みた。

ヒゲナガケンミジンコ類（橈脚類）は、ミジンコ類（枝角類）とともに、湖沼生態系の重要な動物プランクトンである。しかし古陸水学的な解析においては、堆積物中に遺骸が残らず、休眠卵を用いた種同定が極めて困難である、等のため、群集復元対象生物として扱われてこなかった。そこで本研究では、湖底堆積物に残存しているヒゲナガケンミジンコ類の休眠卵を、分子マーカーにより種判別する方法を開発した。最初に、日本各地からプランクトンとして採集されたヒゲナガケンミジンコ11種について28SリボソームDNAの部分塩基配列（240bp）を決定し、配列ライブラリを作成した。続いて、日本各地の湖沼堆積物の最表層から単離したヒゲナガケンミジンコの休眠卵について、卵1粒から個別に抽出したDNAを鋳型に、上述の28SリボソームDNA部分配列をシーケンスし、配列ライブラリと比較し、種判別を試みた。

## （２）堆積物の藻類・光合成色素を用いた湖沼の栄養・物理環境の復元

北海道の4湖沼（羅臼湖、阿寒湖、渡島大沼、ニセコ大沼）と信州の2湖沼（ミクリガ池、木崎湖）の湖沼堆積物コアから過去100年にわたる動物・植物プランクトン群集の高度復元を行うため、γ線検出器を用いた $ ^{210} $ Pb法による堆積物の年代決定、高速液体クロマトグラフィーによる光合成色素・カロテノイド補助色素の分析、動物プランクトン遺骸の分析を行った。SCEs色素については、液体クロマトグラフ-タンデム型質量分析計による分析を行った。阿寒湖では、魚類の捕食圧についても検討するため、捕食圧の違いに応じて変化するDaphniaの個体サイズ（ここでは堆積物中に残存する尾爪サイズ）を調べた。阿寒湖・羅臼湖について栄養塩状態変遷を復元するため、一般に栄養状態に敏感に応答すると考えられる珪藻群集組成を分析した。Daphniaの尾爪サイズと珪藻の分析は生物顕微鏡下で行った。

## （３）堆積物の有機物・安定同位体を用いた湖沼と集水域環境の復元

過去100年間の人間活動による湖沼内部、集水域、そして広域の生態系の変遷を探るため、山岳湖沼（羅臼湖、ニセコ大沼、ミクリガ池）と低地湖沼（阿寒湖、渡島大沼、木崎湖）を対象とした。採集した堆積物は、凍結乾燥後、以下の分析に用いた。炭素・窒素（C・N）濃度及び同位体比（δ¹⁵N及びδ¹³C）は、元素分析計付き質量分析計によって測定した。炭素濃度及び炭素同位体比は、0.5N塩酸で除炭酸処理した試料について分析した。炭素・窒素濃度は、内部生産量や堆積物中の陸上有機物と内部生産の割合の指標となる。また、それらの同位体比は、プランクトンによる一次生産速度の変化や、窒素の起源や湖内の窒素循環の指標となる。リグニン由来フェノール分析は、窒素雰囲気下で試料の酸化銅酸化分解を行い、ガスクロマトグラフィーによって分離・定量した。リグニン由来フェノールは、堆積物中の有機物に占める陸上有機物の割合や、裸子植物と被子植物の比、リグニンの酸化分解の程度などを指標するバイオマーカーである。重金属元素は、試料を硝酸-フッ酸-過塩素酸によって分解、乾固させたのち、硝酸を加えてICP-MSによって各元素濃度、鉛同位体比を測定した。鉛同位体比は産地によって異なることが知られているため、鉛の由来の指標として用いた。また、酸分解後の試料の一部からクロマトグラフィーによってストロンチウムを分離し、TIMSIによって、ストロンチウム同位体比を測定した。ストロンチウム同位体比は、鉛同様、鉱物に特異的であるため、湖内に流入する鉱物の起源の指標として用いた。周辺の植生を表す花粉の分析は、試料を分解後、水酸化カリウムとフッ化水素酸処理を行い、シリコンオイルに封入した。その後、顕微鏡下で、花粉の同定ならびに計数を行った。また、リグニン由来フェノールや花粉との対応関係を調べるため、各湖沼の周辺の植生をGISを用いて数値化した。

## 4 ．結果及び考察

## （１）堆積物の動物プランクトン情報を用いた湖沼生物群集の復元

動物プランクトンの情報が事前に得られていた畑谷大沼のミジンコ卵鞘を利用し、遺伝子解析方法の開発を行った。4つの条件で卵鞘からDNAが増幅される成功率を比べたところ、UltraSHOT法×PCR条件IIIによる卵鞘からの塩基配列決定が最も成功率が高かった。この手法を用いて、畑谷大沼の約100年前から現在までのミジンコ休眠卵鞘で遺伝子解析を行った。その結果、過去のミジンコは現在とは遺伝子組成が異なっていることが示された。続いて山岳・低地の各湖沼におけるミジンコ個体群動態の復元を行った。山岳湖沼（羅臼湖・ニセコ大沼・ミクリガ池）ではミジンコがやや増加する傾向にあったが、いずれの山岳湖沼でも現在と過去の生息種の遺伝的組成に変化は確認されなかった。一方、低地湖沼（阿寒湖・渡島大沼・木崎湖）のうち、阿寒湖と木崎湖ではミジンコが近年急速に増加して
2 遺伝子型のうち一方は、100年以上前と予想される層からは検出されなかった。渡島大沼では、休眠卵フラックスの年変動が著しく大きく、しかも年代によって種が入れ替わっていることが確認された。

ヒゲナガケンミジンコ類に関しては、11種から21パターンの28SリボソームDNAハプロタイプが得られた。それらの塩基配列は240bpと短いが、同一の配列が複数種から得られることはなかった。よって、この塩基配列を用いて日本淡水産ヒゲナガケンミジンコ類の、二次DNAバーコードライブラリーを作成した。これを堆積物中のヒゲナガケンミジンコ類休眠卵に適用し、ヒゲナガケンミジンコ過去群集解析を試みたところ、山岳湖沼では、過去100年間の種組成に変化は認められなかったが、低地湖沼では、大型種から小型種へと出現種が交代していることが検出された。

## （２）堆積物の藻類・光合成色素を用いた湖沼の栄養・物理環境の復元

動・植物プランクトン動態の高度復元は、レトロスペクティブ型モニタリング技術開発の要の一つである。これらプランクトン変動には、食物連鎖におけるボトムアップ・トップダウン効果の両方が寄与している。しかし、従来の植物色素や動物プランクトン遺骸に基づく指標だけでは上位栄養段階の捕食量の情報が欠落していたために、プランクトン変動に対するボトムアップ・トップダウン効果の影響評価が困難であった。そこで、動物プランクトン捕食量の指標化が期待できる、クロロフィル誘導体ステリルクロリンエステル類、「SCEs色素」の有用性を検討した。ニセコ大沼で検討した結果、SCEs色素と植物色素及び動物プランクトン遺骸から、1)動物プランクトンの餌藻類の特定とその捕食量変化、2)動物プランクトン増加に対するボトムアップ効果の寄与を可視化できることがわかった。近年、越境汚染による大気経由栄養塩負荷の山岳湖沼生態系に対する脅威が懸念されている。そこで、大気由来の栄養塩負荷による生態系シフトが、我が国においてどの程度の広がりを持つかを明らかにする解析を行った。過去100年の動植物プランクトン量を復元した結果、ニセコ大沼とミクリガ池、蓬莱沼の3つの山岳湖沼から、共通する1980年代後半以降の植物・動物プランクトン増加が明らかとなった。プランクトンが増加する時期は、窒素同位体比が減少する傾向にあることから、大気からの栄養塩負荷がプランクトン増加を引き起こした可能性が高いことがわかった。

保全目標となる生物相や栄養塩環境の過去から現在に至る変化情報は自然再生やそのための環境政策にとって必須である。近過去復元の結果、阿寒湖では、珪藻群集組成から1950年に富栄養化が始まり、同時に動物プランクトンは大型のミジンコ Daphniaから小型種であるBosminaへ推移していることがわかった。阿寒のでは2000年以降も、珪藻群集からは富栄養化の改善の兆しは見えず、Daphniaの堆積量も1950年以前のレベルにまで増加していなかった。また、渡島大沼でも、藻類全般に増加の一途をたどり、現在もなお富栄養化が進行していることがわかった。木崎湖は、1990年代以降、クロロフィルや珪藻・渦鞭毛藻由来色素、緑藻由来色素の堆積量は1960年以前と同程度にまで低下し、富栄養化が収束する傾向にあることがわかった。

## （３）堆積物の有機物・安定同位体を用いた湖沼と集水域環境の復元

羅臼湖では、測定項目の多くで過去100年間に大きな変動を示さなかった。一方、ニセコ大沼では、炭素・窒素濃度やその同位体比の変動、1910年以降の鉛などの重金属濃度の上昇などの変化が見られた。また、重金属濃度の変化と同時にストロンチウム同位体比の減少が見られた。ミクリガ池では、1960年以降に有機物の供給が一旦増加し、その後安定していた。また、鉛濃度の1980年以降の増加が確認された。これら山岳湖沼では、表層に窒素同位体比の減少が見られた。阿寒湖では、1910年頃から全有機炭素濃度や炭素窒素同位体比の増加、重金属濃度の増加、リグニン由来フェノール濃度の低下が見られた。渡島大沼では、1910年頃に窒素同位体比や重金属濃度の増加、1960年に炭素・窒素比の減少が見られた。木崎湖では、1930年頃に重金属濃度の増加やリグニン由来フェノール濃度の低下、1960年頃に炭素・窒素比の低下や窒素同位体比の低下が見られた。これら6湖沼に共通するパターンとして、鉛同位体比( $ ^{206} $ Pb/ $ ^{207} $ Pb、 $ ^{208} $ Pb/ $ ^{206} $ Pb)が1910年頃から減少を始め、1970年頃から一定であった。植生のパラメーターであるリグニン由来フェノールの組成はこれら湖沼では大きな変化はなかったが、花粉分析から低地湖沼である渡島大沼や木崎湖でスギやカラマツの花粉の増加が見られた。

## 考察：

堆積物の動植物プランクトンや化学物質には、湖沼に対する集水域の人間活動の高まりによる富栄養化の影響、内水面漁業の影響、大気効降下物の影響など、湖沼の過去の生物群集とその変化ドライバーを特定する重要な情報が含まれていることが明らかとなった。例えば、ミジンコ類やヒゲナガケンミジンコ群集組成の時空間的変動には様々な人為的影響が関与しており、その影響の強さは山岳湖
沼と低地湖沼では異なっていた。特に、調査したすべての低地湖沼で、植物プランクトンの捕食者であり魚類の餌となる動物プランクトンが、生物量だけでなく過去から現在に至る種や遺伝子型の入れ替わりが生じていたことは、人間活動による湖沼食物網の影響が我が国全域にわたって生じていたこと、高度経済成長期とともに集水域の人間活動により多くの湖沼で富栄養化が進行したこと、しかし湖沼の生物群集変化は富栄養化によるものだけでなく、ワカサギ等の魚類の放流といった内水面漁業も強く関与していることが、今回の調査で明瞭に示された。一般に集水域の人間活動の高まりによる湖沼の水質悪化は、アオコなど植物プランクトンの繁茂によるとされてきた。しかし、今回調べた湖沼の過去復元で明らかになったように、魚類の放流とともに動物プランクトンが大型種から小型種へと変化したことは、動物プランクトンによる植物プランクトンへのグレージング圧が低下したことを示している。低地湖沼の水質悪化の一因には、これまで見過ごされがちであった、魚類放流による動物プランクトン群集の変化を介したトップダウン効果の影響も関与していたと考えられる。

このように、プランクトン群集の変動を年代測定とともに高度復元したところ、上述した魚類の放流や集水域人間活動による富栄養化の影響の他に、山岳湖沼では北陸から北海道西部までの広範囲にわたって、大気経由の栄養塩負荷に生態系シフトが1980年代後半に起こった可能性が示唆された。特に、日本海に近い地域の山岳湖沼が、アジア大陸起源の大気経由栄養塩負荷の影響を強く受けていることが伺われた。一方、北海道東部の羅臼湖では、生態系や栄養状態の変化はほとんど無くよく保全されていることがわかった。

上述した山岳湖沼の現況と変化は重金属の堆積速度からも裏付けられた。例えば、羅臼湖では、過去100年間、各種重金属濃度の堆積速度に変化はなかったが、同じ山岳湖沼のニセコ大沼やミクリガ池では、1910年頃から重金属濃度の増加し、1980年頃から窒素同位体比が低下するなど、大気降下物によると考えられる人為影響が確認された。重金属負荷の要因として、鉱山開発や観光地化の影響や、アジア大陸からの長距離輸送の可能性が考えられる。阿寒湖や渡島大沼、木崎湖などの低地湖沼では、その地理的違いにもかかわらず1960年頃から富栄養化していが、山岳湖沼と同様、平地湖沼でも1910年頃に近代化工業化の影響によると思われる鉛や亜鉛などの重金属濃度の増加が確認された。また、対象とした6湖沼において見られた鉛同位体比の変化は、近年日本で観測された乾性湿性大気降下物に含まれる鉛の同位体比を反映している。これら降下物の主体の由来は現時点では断定出来ないが、日本の焼却炉起源の他に、日本海側ではアジア大陸からの長距離輸送による影響が考えられるため、西日本の湖沼での解析などを含めたさらなる監視が必要である。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## （1） 科学的意義

## 湖沼環境の近過去復元方法の開発に関して：

本研究で開発したミジンコ類の卵鞘から微量DNAを抽出する方法は、堆積物の生物遺骸から種の同定や遺伝子型の変遷を把握することを可能にするもので、湖沼の近過去復元精度を大きく向上させるものである。実際、この方法を適用し、これまで復元が困難であったミジンコの遺伝子型の変遷を堆積物から復元することが出来たことは、大きな成果と考えている。この分子生物学的手法により、さらなる展開、例えば生物遺骸そのものからのDNA情報の抽出や機能に関与する遺伝子をマーカーとすることで遺伝子を用いた環境モニタリングへの道筋が開けた。さらに本研究では、既存の研究ではほぼ不可能とされていた、ヒゲナガケンミジンコ類の過去の群集組成を復元する手法を開発し、湖のプランクトン群集の復元過程に、新しい効果的なツールを提供することができた。

従来用いられてきた植物色素や遺骸に基づく近過去復元では、変動の詳細を記述することは出来ても、その変動がボトムアップ効果とトップダウン効果のどちらの効果によるものなのか解明が困難であった。本研究では、植物色素と動物プランクトン遺骸とともにSCEs色素の情報と併用することで、植物プランクトン群集へのボトムアップ効果とトップダウン効果を解析できる手法について目処をつけることが出来た。さらに、微量金属類や従来的窒素・炭素安定同位体とともに鉛やストロンチウムなどの安定同位体を詳細に解析することで、湖沼への大気降下物への影響が把握できることも分かった。

これらの手法を組み合わせることにより、「富栄養化以前」から現在に到る生物群集や栄養塩環境の変遷を復元するとともに、その変化要因をも解明出来るようになった。例えば、日本の湖沼生態系への人為攪乱としては、高度経済成長期の富栄養化がよく引き合いにだされてきたが、今回の研究の結果、いくつかの湖では日本の近代化が本格化する1910年頃から既に重金属の流入や窒素源の変化などの人為影響が生じている可能性が示された。本研究で得られた近過去データは、現在の湖の情況との比較することで、湖沼生態系回復へ向けての指標を提供し、ひいては、どのような生態系を取り戻
すことが望ましいのか、保全目標を具体化する上で重要な役割を果たすと期待される。

また、頻繁な調査が困難な山岳湖沼においても、本研究で開発した手法を適用することで、近過去から現在に至る環境変遷を、高い精度で解析できるようになった。人為影響がない、これまで手つかずの生態系と考えられてきた山岳湖沼で、大気降下物による窒素負荷や重金属による汚染の進行が北米やヨーロッパで示唆されているが、我が国においても例外ではないことが判った。本研究で対象とした山岳湖沼のうち、羅臼湖を除く湖沼で大気降下物由来の汚染影響が現れていた（次項参照）。この人為影響は、各種元素分析、同位体分析、リグニン由来フェノールの分析など、多項目を測定する、複数生態系の比較モニタリングによって検出されるものであり、本研究手法の有効性を示すものである。なお、幸いなことに、世界遺産地域でもある知床の羅臼湖が大気降下物の影響を受けず、生物群集は良く保存されていた。羅臼湖は太平洋・オホーツク海に面しているため、大陸からの影響が小さいのであろう。

## 大気降下物の長期影響に関して：

アジア大陸からのエアロゾルの飛来は日本や周辺海域を含む広域で起こっているにもかかわらず、それに由来する窒素やリンの大気降下物の湖沼生態系への影響は全く判っていなかった。本研究では、湖沼に対する大気由来の栄養塩負荷の影響が、我が国においてどの程度の広がりを持つかを調べることが出来た。今回及び我々の以前の研究から、調査したニセコ、立山、八幡平の3つの山岳域の湖沼で、1980年代からの植物・動物プランクトンが共通して増加していることが明らかとなった。この増加は、堆積物の窒素同位体比の減少と一致することから大気経由の栄養塩負荷に起因する。このことは、北陸から北海道西部までの広範囲にわたって、大気経由の栄養塩負荷による山岳湖沼の生態系シフトが起こっている可能性を示唆している。特に、日本海に近い地域の山岳湖沼が、アジア大陸起源の大気経由栄養塩負荷の影響が強く出ている可能性がある。ただし、本研究では手法の開発に主眼をおいたため、西日本や九州など、より大陸の影響を受けやすい地域の湖沼調査は行っていない。集水域を超えた大気降下物による湖沼生態系への影響は、今後ますます深刻になる懸念があることから、今回調査出来なかった湖沼での研究展開が必要である。

なお、本研究の学術的成果のうち、方法論に関する事項はすでに学術論文として国際誌に発表している。調査湖沼に関する環境変化に関する事項は、年代測定の見直しを行ったため、論文での発表が遅れているが、逐次国際誌に発表する予定である。また、本プロジェクト研究で開発した手法やアプローチは、他の多くの研究者やコンサルタント、調査機関でも容易に利用できるように、事例集を含めたマニュアルとして一般書籍「湖沼近過去調査法－環境評価と保全目標設定のために－（仮題）」として共立出版社よりH25年度中に出版を予定している。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

## 特に記載すべき事項はない

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

本課題で開発されたレトロスペクティブ型モニタリング手法の開発により、モニタリグが出来なかった湖沼での環境変化を検出出来るようになった。一般に、生物モニタリングは時間や予算などの高いコストが必要となるため、限られた湖沼でしか実施されていない。今回開発した一連の手法は、過去に生じた生物群集の変化だけでなく、その変化要因をも解析することが可能である。これまで、過去の経緯がわからないために、例えば土地利用改変などによる影響評価や保全目標の設定が困難であったが、本手法によりそれら事業に対する影響評価や保全に際しての具体的な目標設定を行うことが可能となった。すなわち、レトロスペクティブ型モニタリング技術による湖沼の生態系監視を行うことで、モニタリグデータのない湖沼でも、集水域の土地利用変化やその他の人間活動に際して影響評価を行い環境行政に役立てることが出来る。今後、監視対象外である多くの湖沼の生態系についても、積極的にレトロスペクティブ型モニタリングを用いることで現状把握と生態系保全の目標設定が可能となるだろう。特に、本課題では対象としなかったが、アジア大陸に近い西日本の湖沼や、ダム湖における現状把握が急がれる。なお、本研究のデータの具体的な活用例を以下に示す。

低地湖沼での活用例としては、例えば阿寒湖は、周辺の観光地化に伴う湖の富栄養化が進んでいる湖沼である。近年の栄養塩負荷制限の取り組みにより富栄養化が一旦収束するものの、2000年以降再び藻類・動物プランクトンがこれまでになく増加傾向にあることが我々の成果から明らかとなった。
これは、排水処理など湖への栄養塩負荷対策が一定の効果があったものの、まだ十分ではないことを示している。

湖沼を保全していくためには、個々の湖沼ごとに望ましい姿を明らかにし、環境行政として具体的な保全目標をたてる必要である。しかし、我が国のほとんどすべての湖では富栄養化以前のモニタリングが実施されていなかったために、目標設定が不十分であった。本研究が開発したレトロスペクティブ型モニタリングを適用することで、それらの目標設定に不可欠な過去の生物相を把握することが可能となった。また、現在の生物相までに到る生態系変化の長期的なプロセスを明らかにすることで、具体的な保全対策の立案することが可能になるだろう。

山岳湖沼に関して、北海道東部の羅臼湖で得られた「過去100年間にわたり環境が保全されている」という今回の結果は、世界自然遺産である知床の希少性を強く支持するもので朗報と言える。一方、ニセコ大沼（北海道南西部）・ミクリガ池（北陸）と先行研究における蓬莱沼（東北）の結果から、我が国の貧栄養山岳湖沼では過去100年の間に大気経由の栄養塩等の負荷が高まり、生態系が大きく変化したことが示された。この事実は、湖沼生態系の保全には、集水域の対策だけでなく、地域や国際的な対策の必要性を意味している。集水域に人間活動のない山岳湖沼での生態系変化は、東アジアの越境汚染問題解決に向けた国際的コンセンサスを得る材料となりうるだろう。今後、排出量やモニタリングシステムのアジア地域について、環境政策として国が取り組むべき契機になると考えられる。なお地域や自治体などでの保全事業の立案にもレトロスペクティブ型のモニタリングが容易に利用出来るように、本研究で開発した手法・アプローチは、上述したように、一般書籍としての出版を予定している。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## （１）主な誌上発表

## く査読付き論文>

1）林 竜馬、兵藤不二夫、占部城太郎、高原光：日本花粉学会会誌，58（1），5-17（2012）．「琵琶湖湖底堆積物に記録された過去100年間のスギ花粉年間堆積量の変化」

2) S. Ishida, H. Ohtsuki, T. Awano, N. K. Tsugeki, W. Makino, Y. Suyama and J. Urabe: Limnology, 13, 261–267 (2012) “DNA extraction and amplification methods for ephippial cases of Daphnia resting eggs in lake sediments: a novel approach for reconstructing zooplankton population structure from the past”

3) N. K. Tsugeki, T. Agusa, S. Ueda, M. Kuwae, H. Oda, S. Tanabe, Y. Tani, K. Toyoda, W-L. Wang and J. Urabe: Ecol. Res., 27, 1041–1052 (2012) “Eutrophication of mountain lakes in East Asia due to increasing deposition of anthropogenically-produced dust” [日本生態学会2013年度 Ecological Research 論文賞]

4) M. Kuwae, N. K. Tsugeki, T. Agusa, K. Toyoda, Y. Tani, S. Ueda, S. Tanabe and J. Urabe: Sci. Tot. Environ., 442, 189–197 (2013) “Sedimentary records of metal depositions in Japanese alpine lakes for the last 250 years: Recent enrichments of airborne Sb and In in East Asia”

5) W. Makino, H. Ohtsuki and J. Urabe: Limnology, in press (2013) "Finding copepod footprints: a protocol for molecular identification of diapausing eggs in lake sediments"

## く査読付論文に準ずる成果発表>

1）石田聖二、牧野渡：吉田丈人、鏡味麻衣子、加藤元海（編）シリーズ現代の生態学 第9巻 淡水生態学のフロンティア．共立出版（2012）“1章：淡水動物プランクトン種の地理的構造を形成した歴史的プロセス”

2）槻木玲美：吉田丈人、鏡味麻衣子、加藤元海（編）シリーズ現代の生態学 第9巻 淡水生態学のフロンティア．共立出版（2012）“18章：古陸水学的手法による近過去の湖沼生態系変動の解析”

3) N. K. TSUGEKI, J. URABE: In: Goldman C., Kumagai M., Robarts R. (eds) Effects of Climate Change and Variability on Inland Water Systems of the World: what can be done to reduce negative impacts? Wiley Blackwell (2013) "Chapter 7: Eutrophication, warming and historical changes of the plankton community in Lake Biwa during the 20th century"

## （２）主な口頭発表（学会等）

1）槻木玲美、王婉琳、谷幸則、上田真吾、阿草哲郎、小田寛貴、田辺信介、占部城太郎：地球惑星科学関連学会2010年合同大会（2010）「八幡平湖沼のプランクトン長期動態とその変動要因：山岳湖沼で何が起きているか？」
2）槻木玲美、占部城太郎、谷幸則、上田真吾、阿草哲郎、小田寛貴、王婉琳、田辺信介：

日本生態学会第58回全国大会（2011）「アジア大陸起源の大気降下物は日本の湖沼へどのような影響を与えているか？」

3) N. K. Tsugeki, T. Agusa, S. Ueda, M. Kuwae, H. Oda, S. Tanabe, Y. Tani, K. Toyoda, W-L. Wang and J. Urabe: ASLO Aquatic Sciences Meeting, Japan, 2012. “Eutrophication and increasing metal deposition of mountain lakes in East Asia due to anthropogenically-produced dust”

4）占部城太郎：第60回日本生態学会（2013）企画集会T02 湖沼生態系のレトロスペクティブ型モニタリング技術の開発「イントロダクション－湖沼生態系のレトロスペクティブ型モニタリング」

5）槻木玲美、加三千宣：第60回日本生態学会（2013）企画集会T02 湖沼生態系のレトロスペクティブ型モニタリング技術の開発「堆積物の色素・遺骸を用いた湖沼の植物プランクトン動態の復元」

6）牧野渡、大槻朝、石田聖二、占部城太郎：第60回日本生態学会（2013）企画集会T02 湖沼生態系のレトロスペクティブ型モニタリング技術の開発「動物プランクトン情報を用いた湖沼生物群集の復元」

7）佐々木尚子、林竜馬：第60回日本生態学会（2013）企画集会T02 湖沼生態系のレトロスペクティブ型モニタリング技術の開発「堆積物中の花粉を用いた湖沼・集水域植生の復元」

8）兵藤不二夫、大元皓平：第60回日本生態学会（2013）企画集会T02 湖沼生態系のレトロスペクティブ型モニタリング技術の開発「堆積物の有機物・安定同位体を用いた湖沼と集水域環境の復元」

### 7. 研究者略壓

課題代表者：占部城太郎

東京都立大學大學院理學研究科博士課程單位取得中退、理學博士（都立大學）、

現在、東北大學大學院生命科學研究科教授

## 研究参画者

（1）1）：占部城太郎（同上）

2）：牧野渡

北海道大学水産学部卒業、博士（水産学）、現在、東北大学大学院生命科学研究科助教（2）：加三千宣

大阪市立大学理学部卒業、博士（理学）、現在、愛媛大学上級研究員センター准教授

（３）：兵藤 不二夫

京都大学理学部卒業、博士（理学）、現在、岡山大学異分野融合先端研究コア准教授
## D-1002 湖沼生態系のレトロスペクティブ型モニタリング技術の開発

(1) 堆積物の動物プランクトン情報を用いた湖沼生物群集の復元

東北大学

大学院生命科学研究科

占部 城太郎

牧野 渡

<研究協力者> 東北大学大学院生命科学研究科 石田 聖二・大槻 朝

平成22～24年度累計予算額：30,426千円

（うち、平成24年度予算額：10,272千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

本サブテーマは、分子生物学的手法を用いて過去の動物プランクトン群集を高精度で復元する手法を開発し、その有用性を実証することを目的とした。ミジンコ類（Daphnia）では生息に不適な時期を乗り越えるために産出する休眠卵が湖底泥に堆積するが、多くは孵化しており、休眠卵を包んでいる鞘（卵鞘）だけが残されている場合が多い。そこで本サブテーマでは、まずこの卵鞘に残されている微量DNAを抽出・増幅する手法を探索した。その結果、UltraSHOT法という方法を開発し、休眠卵だけでなくこれまで困難とされてきた卵鞘からもDNAを抽出することに成功し、ミジンコ種や遺伝子型を同定することを可能にした。この手法は、他の動物プランクトン休眠卵や遺骸全般にも適用することが出来るため、これまで大雑把な復元しか出来なかった過去のプランクトン生物群集や個体群を種や遺伝子型といった高解像なレベルで復元を可能にすると考えられる。その具体例としてケンミジンコ類（Copepoda）についても解析を行った。ケンミジンコ類はミジンコ類とならんで湖沼の主要な動物プランクトンであるが、遺骸が容易に分解するため、従来の群集復元では無視されてきた。そこでケンミジンコ類の休眠卵に注目し、UltraSHOT法によるDNA抽出を行い、遺伝解析を行うことで過去の個体群の変遷を復元することに成功した。これらの手法を自然湖沼に適用したところ、山岳湖沼（阿寒湖、ニセコ大沼、ミクリガ池）では、どの湖沼においても、湖沼毎に単一のDaphnia種の単一の遺伝子型、および単一のヒゲナガケンミジンコ種が継続して出現したのに対し、低地湖沼（阿寒湖、渡島大沼、木崎湖）では、ミジンコ類でもヒゲナガケンミジンコ類でも、過去100年の間に優占する出現する種や遺伝子型が変化したことが判明した。このように、本サブテーマは、分子生物学的手法を適用する手法を開発し、それにより過去のプランクトン群集を高精度に復元することを可能にした。

湖沼生態系、近過去復元、生物モニタリング、分子生物学的手法、動物プランクトン

## [キーワード]
### 1. はじめに

過去100年の人間活動の高まりによる生態系変化は、人間社会の持続性に対する脅威になりつつある。この脅威を回避・緩和するために、生態系変化の迅速な検出と対策のための生態系モニタリングが必要である。しかし、高山など貴重な自然が残されている生態系は辺境地であるため、それら生態系を常日頃からモニタリングすることは出来ない。また、我が国では、生物に関するモニタリングは、対象とする生態系の深刻な変化やその兆しが顕在化されてから開始されることが多く、事前データがないため、変化前のその生態系の様相や変化を引き起こした生態系過程がどのようなものであったかを確かな精度で把握できないことが多い。この現実的な問題を克服するためには、変化前の生態系を復元することで変化の様相とその過程を迅速かつ的確に把握するためのレトロスペクティブ（事後回顧的）なモニタリング技術が必要である。

湖沼堆積物には過去の生物群集や環境状態を物語る痕跡として、動植物プランクトンの遺骸や休眠卵、内生性や外来性の多様な有機物が年代ごとの層となって保存されている。この年代ごとに保存されている堆積物の生物・化学情報から過去の生物群集や環境状態を高度に復元することが出来れば、事前データのない湖沼に対しても、過去の状況と現在起こりつつある生態系変化を復元し把握することが可能となる。すなわち、湖沼堆積物の情報をモニタリングし、異なる湖沼間で比較出来るなら、これまでモニタリング対象外であった湖沼や、高山湖沼のように日常的なモニタリングが困難な湖沼についても、生態系変化とその要因についての事後的なモニタリングが可能となる。

しかし、堆積物のプランクトン遺骸や生物情報を用いたこれまでの生態系・生物群集復元、すなわち古陸水学的アプローチは解像度の点で大きく劣っている。第一に生物の遺骸は断片化されており、多くの場合その同定には経験と高度な熟練が必要であり、それでも限界があるため、定量的データとして問題が多い。第二に、堆積物に遺骸として残される分類群は限られており、遺骸が容易に分解されてしまうような分類群は復元対象として扱うことが出来ない。第三に、干上がりや越冬などプランクトン生物が生息に不適な時期を乗り越えるために生産するシストや休眠卵も湖底堆積物によく保存されるが、形態的な特徴がないため、およその分類群はわかっても種レベルでの同定が不可能な場合が多い。プランクトン生物は同じ分類群でも種によって、また同じ種でも系統や遺伝子型によって生息に適した環境や環境変化に対する耐性や応答が異なっている。したがって、属や科レベルでの大まかな分類群構成が同じでも、それら生物群集をとりまく生息環境は異なっている可能性がある。すなわち、生物遺骸や分類群を指標するシストや休眠卵の情報をもとに復元される生物群集は極めて大雑把であり、過去の変遷において重要な環境変化を見落とす可能性がある。

堆積物の生物情報を利用して生態系応答を高精度に解析するためには、過去の生物群集を高精度に復元するための新たな技術が必要である。

## 2 ．研究開発目的

本サブテーマは、上述したこれまでの古陸水学的アプローチの問題点を克服するため、最新の分子生物学的手法を適用して過去の生物群集復元を高精度化することを目的とする。具体的には、湖沼食物網の鍵となる生物群である動物プランクトンを対象に、堆積物に残された休眠卵やそれ
を保護している卵鞘のDNA解析を行うことで、種レベルよりも詳しい解像度で生物個体群や群集の変遷を復元する技術を開発する。さらに、その技術を山岳湖沼や低地湖沼の堆積物に適用することで本技術の過去復元の有用性を検証するとともに、過去100年レベルの変遷を調べることで湖沼生態系に及ぼす集水域の人間活動の影響や、近年特に懸念されている温暖化や大気降下物の影響を把握する。

本研究は3年を研究期間としており、初年度にあたる平成22年度は分子生物学的手法の開発と検討を中心に研究を行った。この手法の検討は、平成22年春に山形県の山地湖沼（山辺町・畑谷大沼）で採集した試料を用いて行った。次いで本調査として、北海道と北陸地方の山岳湖沼（羅臼湖、ニセコ大沼、ミクリガ池）と、それら山岳湖沼に近隣の低地湖沼（阿寒湖、渡島大沼、木崎湖）を対象に、湖底堆積物を平成22-24年度にかけて採取し、新たに開発した手法を適用して動物プランクトン群集の過去から現在に至る変遷の復元とその変化要因の解析を行った。

## 3 ．研究開発方法

## (1) サンプリング

平成22年度は、夏季に道東の羅臼湖と阿寒湖及び道南のニセコ大沼で、また冬季に結氷を利用して阿寒湖と渡島大沼で、経12 cmの重力式コアサンプラーを用い、以下の湖底堆積物コアを採集した。

・平成22年7月13日 羅臼湖 堆積物コア5本（深さ12-18cm）

・平成22年7月14日 阿寒湖 堆積物コア7本（深さ25-28cm）

・平成22年7月16日 ニセコ大沼 堆積物コア8本（深さ26-43cm）

・平成23年2月22日 渡島大沼 堆積物コア5本（深さ43-53cm）

平成23年度は、夏季にミクリガ池で、経12 cmの重力式コアサンプラーを用い下記に示す湖底堆積物コアを採集し、また木崎湖にてダイバーを雇用してコア採集を行い、以下の湖底堆積物コアを採集した。

・平成23年9月9日 ミクリガ池 堆積物コア6本（深さ23.5-33cm）

・平成23年9月12日 木崎湖 堆積物コア5本（深さ100-105cm）

平成24年度は、前年度までに採集した堆積物コアの解析を行いつつ、データの補足を目的として、平成24年9月3日に、阿寒湖にてダイバーを雇用してコア採集を行い5本の湖底堆積物コア（いずれも直径は12cm、長さは80-100cm）を採集した。なお北海道南西部のニセコ神仙沼でも、9月6日に、経12cmの重力式コアサンプラーを使用して、ゴムボート上から堆積物の採集を試みたが、湖底一面に水生植物類が繁茂していたため、高精度な解析に耐える柱状堆積物を採取することができなかった。

いずれの年度においても、採集した堆積物試料は現場で1cm層ごとにスライスし遮光性の袋に入れ、クーラーボックスへ入れた状態で実験室に持ち帰り、各サブテーマに分与した。本サブテーマでは、各層に含まれる動物プランクトン休眠卵や卵鞘の抽出を行うとともに、その形態やDNA塩基配列からの同定を行った。またいずれの湖沼においても、プランクトンネットによる動物プランクトン採集を、堆積物採集とあわせて行った。得られた動物プランクトン試料は、直ちにエタ
ノールで固定して実験室に持ち帰った。各堆積物の年代については、いずれの湖沼についても、サブテーマ2のデータを用いた。

## （２）堆積物中に含まれるミジンコ卵鞘の遺伝子解析

## 1 ）ミジンコ休眠卵鞘を利用した遺伝子解析法の開発

## a）検討に用いた試料の採集

現世の動物プランクトン種組成及び遺伝的組成に関する情報が既に得られている畑谷大沼（山形県東村山郡山辺町）のサンプルを用いた実験により、休眠卵鞘を用いた遺伝子解析法の検討を行った。エクマン採泥器を用いて採集した湖底堆積物を180μmのメッシュでふるい、実体顕微鏡下で残存物を観察してミジンコ（Daphnia）卵鞘を集めた。この沼には2グループのミジンコが存在する。一つはDaphnia pulexで、その卵鞘の大きさは約0.7mmである。もう一つのグループはD. dentifera、D. galeataおよびその雑種で、これらの卵鞘の大きさは約0.5mmである。今回の実験では卵鞘を実体顕微鏡下で区別し、D. dentiferaとD. galeataのグループの卵鞘を用いた。

図（1）-1 畑谷大沼（山形県）に生息するミジンコ（Daphnia dentifera/galeata）のミトコンドリアDNAの12SrRNA遺伝子の部分配列。3タイプの識別に使用した領域のみを示す。枠で囲まれた部分は畑谷大沼で確認された3タイプ（hataya12S_D1：D1、hataya12S_D2：D2、hataya12S_G：G）の識別部位、灰色部分はPCRに用いたプライマー（d5f、d7r）の部位を示す。

## b）プライマー設計

予備実験から、この湖沼に生息するD. deintiferaとD. galeataのグループのミジンコは12SリボソームRNA（rRNA）遺伝子で識別される3つのミトコンドリアDNA（mtDNA）のハプロタイプを持つことが分かっている。2つのD. dentiferaのハプロタイプと1つのD. galeataのハプロタイプである。これら3つのハプロタイプの塩基配列をもとに、OLIGO 7 Primer Analysis Software $ ^{1)} $ を用
いてmtDNA・12SrRNA遺伝子の136塩基対（bp）の断片を増幅するプライマーセット（d5f：5'－CTC TAT ATA AAC TGC ACC TTG-3'、d7r：5'－CCC TTA ATC GAT AGT CCC C-3'）を設計した（図(1)-1）。

## c) DNA抽出

ミジンコ卵鞘からのDNAを抽出する方法として、従来から様々な生物種のDNA抽出に用いられてきたHotSHOT法 $ ^{2-5)} $ と、今回我々が開発したUltraSHOT法 $ ^{6)} $ の二つを用いた（図(1)-2）。卵鞘内に休眠卵が残っていた場合は、ピンセットで卵を抜き取ってから以下の実験に使用した。

HotSHOT 法の手順は次の通りである。実体顕微鏡下で卵鞘を一個ずつ50μLのアルカリ溶解バッファー(25mM NaOHと0.2mM disodium EDTAの溶液、pH12.0)の入ったチューブに入れる(図(1)-2 A.1)。それらのサンプルを95℃で30分間過熱した後に3分間以上氷上に置く(図(1)-2 A.2)。軽く遠心をかけて50μLの中和バッファー（40mM Tris-HCl溶液、pH5.0）を加える(図(1)-2 A.3)。さらに軽くボルテックスと遠心をかけてから、DNA増幅に使用するまで-20℃で保存する。

UltraSHOT法の手順は、HotSHOT法の手順に熱ショックと超音波破砕のステップを付け加えたもので、次の通りである。実体頭微鏡下で卵鞘を一個ずつ50μLのアルカリ溶解バッファーの入ったチューブに入れる(図(1)-2 B.1)。それらのサンプルに対して5分間-80℃で凍結させ20秒間70℃で溶解させる熱ショックのサイクルを5回繰り返す(図(1)-2 B.2)。軽くボルテックスと遠心をかけた後に、超音波破砕機(USP-50、島津製作所)を用いて水中で20kHz 25Wの出力で1分間超音波をかける(図1-2 B.3)。95℃で30分間過熱して3分以上氷上に置く(図(1)-2 B.4)。軽く遠心をかけて、50μLの中和バッファー（40mM Tris-HCl溶液、pH5.0）を加える(図(1)-2 B.5)。軽くボルテックスと遠心をかけてから、DNA増幅に使用するまで-20℃で保存する。

図(1)-2 DNA抽出方法の流れ図。A: HotSHOT法 $ ^{2)} $ 、B: UltraSHOT法 $ ^{6)} $ 。

## d）DNA增幅

前述のd5fとd7rのプライマーを用いたmtDNA 12SrRNA遺伝子のDNA断片（136bp）の増幅を、次の3つの方法で行った。PCR 1: Takara Ex Taq $ ^{(R)} $ Hot Start Version（以下Ex Taq、タカラバイオ）を用いた方法。PCR 2: Type-it $ ^{(R)} $ Microsatellite PCR Kit（以下Type-it、キアゲン）を用いた方法。PCR 3: Type-itとEx Taqの両方を使った方法。HotSHOT法とUltraSHOT法のそれぞれで16サンプルずつ卵鞘からDNAを抽出し、得られたDNA抽出物でPCRを行った。HotSHOT法で抽出したサンプルについてはPCR 3の方法で増幅した。UltraSHOT法で抽出したサンプルについてはPCR 1-3の全ての方法で増幅した。それぞれのPCRに対してネガティブコントロールのためにDNA抽出物を含ま
ない8サンプルでもPCRを行った。

## PCR 1: Ex Taqを用いた方法

1μLのDNA抽出物、0.5μMの各プライマー、1×PCR buffer、0.2mMのdNTPs、0.25 UnitのEx Taqが含まれた10μLの溶液でPCRを行った。温度条件は、95℃で1分間を1サイクル行った後に、95℃で30秒間・54℃で30秒間・72℃で30秒間を35サイクル行い、72℃で10分間を1サイクル行った。

## PCR 2: Type-itを用いた方法

1μLのDNA抽出物、0.15μMの各プライマー、0.8x Type-it Multiplex PCR master mix、0.5x Q-Solution（キアゲン）が含まれた10μLの溶液でPCRを行った。温度条件は、95℃で1分間を1サイクル行った後に、95℃で30秒間・52℃で90秒間・72℃で30秒間を35サイクル行い、72℃で10分間を1サイクル行った。

## PCR 3: Type-itとEx Taqの両方を用いた方法

次の条件でType-itを用いたPCRを行った。1μLのDNA抽出物、0.15μMの各プライマー、0.8x Type-it Multiplex PCR master mix、0.5x Q-Solutionが含まれた10μLの溶液でPCRを行った。温度条件は、95℃で1分間を1サイクル行った後に、95℃で30秒間・52℃で90秒間・72℃で30秒間を25サイクル行い、72℃で10分間を1サイクル行った。さらに次の条件でEx Taqを用いたPCRを行った。0.02μLのType-itによるPCR産物、0.05μMの各プライマー、1x PCR buffer、0.2mMのdNTPs、0.25UnitのEx Taqが含まれた10μLの溶液でPCRを行った。温度条件は、95℃で1分間を1サイクル行った後に、95℃で30秒間・54℃で30秒間・72℃で30秒間を25サイクル行い、72℃で10分間を1サイクル行った。

それぞれの方法で最終的に得られたPCR産物4μLを1 x TBE バッファーの泳動槽中の2.0% アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動したゲルをGelRed™ Nucleic Acid Gel Stain（Biotium）で染色しUVトランスイルミネーターを用いて DNA増幅の有無を確認した。HotSHOT + PCR 3およびUltraSHOT + PCR 3で増幅されたサンプルをBig Dye(®) Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用いてサイクルシーケンシング反応を行い、ABI PRISM(®) 3130-Avant Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて塩基配列を決定した。

## 2 ）湖沼堆積物から得たミジンコ休眠卵鞘による過去群集の復元

## a）烟谷大沼

湖沼におけるミジンコ（Daphnia）群集の遺伝的変遷を調べるため、堆積物中から採取したミジンコ休眠卵鞘のミトコンドリアDNA配列による解析を行った。現世の動物プランクトン種組成及び遺伝的組成に関する情報が既に得られている畑谷大沼のサンプルを用いた調査を最初に行った。畑谷大沼の堆積物は2010年4月22日に、重力式コアサンプラー（半径5.5cm）を用いて採取したものを用いた。採取した堆積物はその場で速やかに表層から最深部まで1cmごとに切り出し、遮光袋に分けて4℃で保存した。これらの各層から約60-130gの泥を取り出し180μmメッシュでふるい、メッシュ上に残った堆積物を実体顕微鏡下で観察しミジンコ卵鞘を採取した。
畑谷大沼の調査には表層（1cm）から最深部（30cm）まで1cmごとの層から得たミジンコ卵鞘を任意に16個（得られた卵鞘がそれ以下の場合は全て）選び用いた。卵鞘内に卵が入っていた場合は除去してからDNA抽出を行った。前述した卵鞘の微量DNA解析方法でDNA抽出、PCR法でmtDNA・12SrRNA遺伝子領域の136 bpの増幅を行い、2%アガロースゲル電気泳動で増幅産物の有無を確認した。増幅が確認できたサンプルはシークエンスを行い、各個体の配列を決定した。解析によって得られた各サンプルの配列はデータベース検索により種を判別すると共に、D. longispina種群（D. galeata/dentifera）は畑谷大沼で確認されている3タイプ（図(1)-1）のいずれであるか判別を行った。

図(1)-3 各地の湖沼のミジンコ（Daphnia）のミトコンドリアDNAの12SrRNA遺伝子の部分配列（渡島大沼を除く）。種間または種内の違いを識別するために使用した領域のみを示す。12S-ra：羅臼湖、12S-ni：ニセコ大沼、12S-mi：ミクリガ池、12S-ak：阿寒湖、12S-ki：木崎湖。羅臼湖の配列（12S-ra）を基準として、そのサイトが同じ塩基であれば点（.）で、異なる塩基であればA、T、G、Cのいずれかで各地点の配列を示す。灰色部分は全ての地点（種）に共通のプライマー（12S_BF1、12S_BR2）の部位を、線で囲んだ部分はその地点（種）に特異的なプライマー（12S_raR、12S_niR、12S_miR、12S_akR）の部位を示す。

## b）各地の山岳・低地湖沼

これに続いて、各地の山岳湖沼（羅臼湖、ニセコ大沼、ミクリガ池）および低地湖沼（阿寒湖、渡島大沼、木崎湖）で採取した堆積物から得たミジンコ休眠卵鞘を用いた調査を行った。採取した各地点の堆積物コアは、1cmごとに切り出した層を休眠卵鞘採取に使用した。堆積物は水ととも