Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## ②ベンゼン分解菌の検出

各画分のT-RFプロファイル比較を行い、また、プロファイルの比較ではDNA量の少ない菌の検出が難しいため、解析対象とした各T-RFの各画分中での強度を $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列で比較した。a）新芝川集積系

培養64日目のDNAを浮遊密度により分離し、PEGによるDNA析出・精製後1.704~1.735 g/cm³の範囲でT-RFLPによる解析を行った。各画分のT-RFをプロファイルを図6に示した。1.714 g/cm³などの軽画分では¹²C-系列と¹³C系列でT-RFプロファイルは類似しており、89 bp, 137 bp, 175 bp, 228 bp, 369 bpなどのT-RFが上位の存在率を示した。一方、1.732 g/cm³などの重画分において89 bp, 280 bpが¹³C-系列でのみ優占した。

また、T-RFプロファイルにおいて $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列の間で差が大きかった1.732 g/cm³の $ ^{13} $ C-系列中の画分において存在量が上位10だった各T-RFの各画分中での強度を $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列で比較した。10画分のうち89,280 bpのT-RFの重画分へのシフトが見られ、 $ ^{13} $ Cの取り込みが示された(図7)。このことより、新芝川系では89 bpと280 bpのT-RFを持つ菌がベンゼン分解に関与していることが示された。

図6 新芝川集積系をa) $ ^{12} $ C-とb) $ ^{13} $ C-ベンゼンで64日培養後のT-RFプロファイル
図7 新芝川集積系を $ ^{12} $ C-ベンゼンと $ ^{13} $ C-ベンゼンで64日培養後の89 bp, 280 bpの断片長を持つT-RFの各画分中の存在率(○: $ ^{12} $ C-系列, ●: $ ^{13} $ C-系列)
## b) 手賀沼集積系

$ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列において約1 mmolのベンゼンを分解した、それぞれ培養11日目と23日目に培養系より3 mLずつ土壌スラリーを採取し、抽出したDNAを密度勾配超遠心にかけ、浮遊密度1.700~1.743 g/cm³の範囲でT-RFLPによる解析を行った。各画分のT-RFプロファイルを図8に示した。

プロファイルを比較すると、1.704~1.729 g/cm³では $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C系列でT-RFプロファイルは類似していた(図8)。1.704~1.714 g/cm³の画分で $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列共通で見られるT-RFとしては213(214)，89 bpがあり、1.726~1.729 g/cm³では361 bp、1.735 g/cm³では26 bpが共通していた。一方、1.732 g/cm³の画分において $ ^{12} $ C-系と比較して $ ^{13} $ C-系列中で89 bpの存在率が大きくなっていた。また、1.742(1.743) g/cm³では $ ^{13} $ C-系列でのピーク数が $ ^{12} $ C-系列のピーク数を上回っていた。

プロファイルの比較ではDNA量の少ない菌の検出が難しいため、解析対象とした各T-RFに対して $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列の各画分中での強度比較を行った。解析対象となった100のT-RFのうち、89,396,572 bpの断片長を持つT-RFのみが $ ^{13} $ C-系列の重画分において存在率を増していた(図9)。このことより、手賀沼集積系においては89,396,572 bpのT-RFを持つ菌が嫌気的ベンゼン分解に関与していることが示された。
図8 手賀沼集積系をa) $ ^{12} $ C-ベンゼンで11日、b) $ ^{13} $ C-ベンゼンで23日培養後のT-RFプロファイル
図9 手賀沼集積系を $ ^{12} $ C-ベンゼンで11日、 $ ^{13} $ C-ベンゼンで23日培養後の89 bp, 396 bp, 572 bpの断片長を持つT-RFの各画分中の存在率(○: $ ^{12} $ C-系列, ●: $ ^{13} $ C-系列)
## c) 土浦 A 集積系

$ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列において、132日目に培養系より抽出したDNAを密度勾配超遠心により分離し、そのうちDNAの分布が見られた1.702~1.741 g/cm³の範囲でT-RFLPによる解析を行った。T-RFプロファイルを図10に示す。

$ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列のT-RFプロファイルを比較すると、89 bpの断片長を持つT-RFが $ ^{12} $ C-系列では1.715 g/cm³の画分において最も存在率が大きいのに対し、 $ ^{13} $ C-系列中では1.728 g/cm³の画分において最も存在率が大きくなっていた。また、 $ ^{12} $ C-系列では1.726~1.735 g/cm³の範囲では360 bpが優占していたが、 $ ^{13} $ C-系列では89 bp, 373 bpが360 bpよりも多く存在していた。さらに、 $ ^{13} $ C-系列の重画分(1.734, 1.738 g/cm³)において $ ^{12} $ C-系と比較して278 bpの存在率が大きくなっていた。

土浦A集積系のDNAに関しても、解析対象とした67のT-RFに対し各T-RFの各画分中での存在率を $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列で比較した。89 bp, 279 bp, 372 bpの断片長を持つT-RFが $ ^{13} $ C-系列の重画分において存在率を増していた(図11)。このことより、土浦A集積系においてはこれらの断片長さをとる細菌が嫌気的ベンゼン分解に関与している可能性が示された。
図１０　土浦Ａ集積系をａ)¹²Ｃ-ベンゼンとｂ)¹³Ｃ-ベンゼンで１３２日培養後のＴ-RFプロファイル
図11 土浦A集積系を $ ^{12} $ C-ベンゼンと $ ^{13} $ C-ベンゼンで132日培養後の89 bp, 279 bp, 372 bpの断片長を持つT-RFの各画分中の存在率(○: $ ^{12} $ C-系列, ●: $ ^{13} $ C-系列)
## ③ $ ^{13} $ C-資化菌の同定

## a) 新芝川集積系

検出されたベンゼン分解菌の候補であるT-RF 89 bpと280 bpの菌の同定を行うため、それらのT-RFの存在割合が高い $ ^{13} $ C-系列の浮遊密度1.729 g/cm³の画分中の16S rRNAを対象としてクローニングを行った。76クローンでベクターへの16S rRNA遺伝子の導入が確認された。得られたクローンに対しT-RFLPによるスクリーニングを行ったところ、76のうち36クローンはT-RF 89 bp、3クローンはT-RF 280 bpの値を取った。

T-RF 89 bpの16S rRNA遺伝子を解析したところ、34クローンが嫌気的に安息香酸を分解するSyntrophus gentianaeと最近縁ではあるものの相同性は85-86％と低く、Hasda-Aとの相同性が99％以上と極めて近縁であった $ ^{1)} $ （図12）。系統学的には、Desulfobacterales目細菌と分類された。異なる環境から集積した系においてもHasda-A類縁の微生物が分解反応の一部を担っている可能性が示された。残り2クローン(SHRa-h17 and SHRa-h36)は嫌気プロピオン酸分解菌Smithella propionicaと93％と99％の相同性を示した。一方、280 bpのフラグメントに相当する菌の16S rDNA配列を解析した結果、Coriobacteriaceae科の菌Olsenella uliに最近縁であったが、相同性は89％と低かった（図13）。

図１２ 新芝川集積系を $ ^{13} $ C-ベンゼンで６４日培養した浮遊密度１.７２９ｇ/ｃｍ³の画分から得られたクローンのうち、Ｔ-RFLPで８９ｐｐを持つクローンの系統樹。SHRa-h**はクローン名であり、***は今回得られたクローンの番号。
図１３ 新芝川集積系を $ ^{13} $ C-ベンゼンで６４日培養した浮遊密度１.７２９ｇ/ｃｍ³の画分から得られたクローンのうち、Ｔ-RFLPで２８０ｐを持つクローンの系統樹。SHRa-h**はクローン名であり、***は今回得られたクローンの番号。

## b) 手賀沼集積系

T-RF 89 bpをとるクローンを6つ、396 bpを1つ、572 bpを2つ対象として16S rRNA遺伝子配列を解析した。BLASTによる最近縁種は、89 bpを取るクローンの最近縁種は3クローンでDesulfobacterium anilini (相同性87-88%)、2クローンでIgnavibacterium album (85-86%)、1クローンでPelobacter acetylenicus (87%)であった（図14）。396 bpを取るクローンTEPa-h091の最近縁種はThermodesulfovibrio yellowstonii (相同性87%)、572 bpを取るクローンのうち1つはAtopostipes suicloacalis (98%)、もう1クローンはSporotalea propionica (相同性97%)であった（図15）。
図１４ 手賀沼集積系の $ ^{13} $ C-系列重画分より得られたT-RF 89 bpに該当する菌のクローンライブラリ

図 1 5 手賀沼集積系の $ ^{13} $ C-系列重画分より得られたT-RF 396 bp, 572 bpに該当する菌のクローンライブラリ

## c) 土浦 A 集積系

得られたクローンのうち、T-RF 89 bpを取るものを34クローン、280 bpを取るものを1クローン、372 bpを取るものを3クローン対象とし、16S rRNA遺伝子配列を解析した。

T-RF 89 bpを取る34クローンは、大きく4つのグループとその他に分けられた(図16)。それぞ
れのクローンをBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) による相同性解析を行い、国立遺伝学研究所DNAデータベース(DDBJ)のデータベースに登録されている近縁な単離株やクローンとともに系統樹を作成すると、4グループのうち2グループはDeltaproteobacteria下の異なる目に、他の2つはActinobacteriaに属した。グループに含まれなかったTSHa-h013, 016, 067, 090, 091もまたDeltaproteobacteria下に属した。TSHa-h014のみは単独でChlorobiに近縁であった。34クローン中32クローンは最近縁種との相同性が85%~92%と低かった、既報の単離菌と相同性の高いものでは、TSHa-h016がGeobacter lovleyi SZ株と、TSHa-h067はPelobacter propionicus DSM 2379株とGeobacter属の分離株とそれぞれ99%の相同性を持った。

T-RF 280 bpを取るクローンは、新芝川系でみられたものとほとんど同じであった（図17）。T-RF 372 bpを取る2クローン(TSHa-h020, 024)の最近縁種はActinobacteria綱Actinobacteria目に属しており、Frankia alni (相同性86%)と Sporichthya polymorpha (相同性85%)であった。残りの1クローン(TSHa-h042)はProteobacteria綱Deltaproteobacteria目のDesulfobacterium aniline (相同性92%)が最近縁種となっている（図18）。

図１６　土浦A集積系の $ ^{13} $ C-系列重画分より得られたT-RF 89 bpに該当する菌のクローンライブラリ
図 1 7 土浦A集積系の $ ^{13} $ C-系列重画分より得られたT-RF 280 bpに該当する菌のクローンライブラリ。新芝川集積系のクローンも合わせて示してある。
図１８　土浦Ａ集積系の $ ^{13} $ C-系列重画分より得られたＴ-RF３７２bpに該当する菌のクローンライブラリ

## ④ 経時的解析

本実験では収率が低く増殖まで時間のかかる嫌気ベンゼン分解菌を目的としているため、確実に $ ^{13} $ Cの取り込みが見込まれる長い培養時間を選択した。しかし、培養時間が長いと系内にいる微生物がベンゼンそのものではなくその代謝産物やベンゼンを用いて増殖した菌体由来の有機物を摂取する可能性が高くなる。そのため、初発反応を担っている菌以外が本手法で検出される事態が懸念される。そこで、一番初めにベンゼン由来の $ ^{13} $ Cを取り込んでいる菌を同定するため、ベンゼンの分解度に応じて複数回サンプルを採取し、解析を行った。

## a) 新芝川集積系

培養64日目に解析対象とした10のT-RFに関して、培養23日目、38日目、64日目における各画分中での強度を $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列で比較した(図19)。T-RF 89 bp, 280 bpともに培養23日目では $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列間の重画分における存在率に差はない。そしてT-RF 89 bp, 280 bpともに培養
38日目で $ ^{13} $ C-系列での重画分で存在率が増加している。このことより、T-RF 89 bp, 280 bp の菌は23日~38日で検出できる量の $ ^{13} $ Cを取り込んでいることが分かるが、今回の結果ではそのどちらがより早い段階で $ ^{13} $ Cを資化しているかは示されなかった。しかし、T-RF 89 bp, 280 bpが本系において一番初めに $ ^{13} $ Cの取り込みが見られること、さらにT-RF 89 bp, 280 bp以外に $ ^{13} $ Cの取り込みが見られないことより、これら2つのT-RFを持つ菌がベンゼン分解経路のうち上流部分に関与している可能性が高い。

浮游密度(g/mL)

図１９　新芝川集積系の培養２３日目、３８日目、６４日目におけるＴ-RF８９ｐ（上段），２８０ｐｍ（下段）の断片長を持つＴ-RFの各画分中の存在率(○:¹²Ｃ-系列, ●:¹³Ｃ-系列)

さらに、 $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列における重画分の菌叢をより詳細に比較するため、培養23、38、64日目の対応する画分に対し細菌・古細菌の16S rRNA遺伝子のV4領域を対象としたパイロシーケンス解析を行った。解析に用いた画分は、培養64日目において $ ^{12} $ C- $ ^{13} $ C間でT-RFプロファイルの差が大きかったもの( $ ^{12} $ Cでは1.733 g/cm $ ^{3} $ 、 $ ^{13} $ Cでは1.732 g/cm $ ^{3} $ )と、その他の日程においてはその浮遊密度に一番近いものである。

平均で7307リード(最小1904、最大17723)の配列を得られた。配列はお互いに97%以上の相同性を持つものを1つのoperational taxonomic unit (OTU)にまとめ、OTUごとに各日程における割合を比較した。 $ ^{13} $ C-系列の23、38、あるいは64日目において、重画分での存在率が0.5%以上のOTUを対象として、各日程における存在率を比較した。

T-RFLP解析において、 $ ^{13}C $ 取り込みの確認されたT-RFを、パイロシーケンス解析において検出された配列と比較したところ、89 bpのうちHasda-Aと近縁のクローンの配列とOTU_5466の代表
配列が同じクラスターに属した。同様に、280 bpのクローン配列とOTU_14329が同じクラスターに属していた。いずれも、時系列でみたときに $ ^{13} $ C添加系の重画分における存在割合が上昇しており、パイロシーケンス解析においても、これらの株の13C取り込みを確認することができた（図20）。よって、Hasda-A近縁種とCoriobacteriaceae科近縁種の菌がベンゼン分解集積系において重要な菌であることが強く示された。一方で、Hasda-A近縁種以外のクローンと近縁のOTUについては $ ^{13} $ C添加系の重画分における存在割合の増加はみられず、T-RFが89bpを持つクローンの中でも、Hasda-A近縁種以外のものについては $ ^{13} $ C基質の取り込みを行っていない可能性が高い。

## b) 手賀沼集積系

手賀沼集積系において、 $ ^{13}C $ の取り込みが示されたT-RFのクローンとパイロシーケンス解析の結果を比較した。その結果、重画分のパイロシーケンス解析では $ ^{13}C $ の取り込みが示されたT-RFのクローンと同一のものを見つけることができなかった。これは、手賀沼集積系においては重画分へのシフトが小さく、よって重画分においても当該シーケンスの存在割合が小さいことが原因と考えられた。

## c) 土浦 A 集積系

31日目あるいは82日目において、 $ ^{13} $ C-系列の重画分においてリード数が0.5%以上OTUを対象として、 $ ^{13} $ C-系列と $ ^{12} $ C-系列の各日程(0,31,82)の重画分における存在率を比較した。T-RFLP解析において、 $ ^{13} $ C取り込みの確認されたT-RFを、パイロシーケンス解析において検出された配列と比較したところ、新芝川集積系と同じく89bpのクローンの一部とOTU_5466の代表配列同じクラスターに属し、同様に、280bpのクローン配列とOTU_14329が同じクラスターに属した。それぞれ、時系列で比較すると明確に $ ^{13} $ Cの取り込みが見られており、パイロシーケンス解析においても、これらの株の $ ^{13} $ C取り込みを確認することができた（図21）。新芝川集積系同様、Hasda-A近縁種以外のクローンと近縁のOTUについては $ ^{13} $ C添加系の重画分における存在割合の増加はみられず、T-RFが89bpを持つクローンの中でも、Hasda-A近縁種以外のものについては $ ^{13} $ C基質の取り込みを行っていない可能性が高い。
0 23 38 64 23 38 64

0 23 38 64 23 38 64

図２０　新芝川集積系のＴ-RF８９bpおよび２８０bpに対応する塩基配列を持つOTUの、 $ ^{12} $ C-系列中と $ ^{13} $ C-系列中の培養２３,３８,あるいは６４日目における重画分中での相対存在量

図2 1 土浦A集積系のT-RF 89bpおよび280bpに対応する塩基配列を持つOTUの、 $ ^{12} $ C-系列中と $ ^{13} $ C-系列中の培養23,38,あるいは64日目における重画分中での相対存在量

## ⑤ ベンゼン分解微生物の同定

新芝川系、手賀沼系、土浦A系を安定同位体プローブ法・T-RFLP法で解析した結果、89 bpのT-RFを持つ菌が3つの集積系すべてで、280 bpを持つ菌が新芝川系と土浦A系で共通して検出された。89 bpのT-RFを持つ菌は各系でそれぞれ多様性を見せたが、手賀沼系の1クローン以外はすべてDeltaproteobacteria綱に属し、新芝川系のクローン34個と土浦Aの1クローンは16S rRNA遺伝子配列がHasda-Aと99%以上一致していた。それらは、Desulfobacterales目細菌と分類された。280 bpのT-RFを持つ菌はすべてCoriobacteriaceae科の菌Olsenella uliを最近縁種にとり、同じクラスターに属した。さらに、④の解析により、重画分の時系列でのパイロシーケンス解析によっても、新芝川と土浦A集積系においては、これら2種の微生物が安定同位体プローブ解析により検出されていることを裏付ける結果が得られた。このことより、本研究で使用された3系のうち、すくなくとも新芝川系と土浦A系でDesulfobacterales目細菌Hasda-A類縁菌とCoriobacteriaceae科類縁菌がベンゼン分解に寄与している可能性が示された。

Desulfobacterales 目細菌のHasda-A類縁菌は過去に嫌気的ベンゼン分解系で見られたクローンが見られている。たとえばクローンSHRa-h11の16S rRNA配列はメタン生成ベンゼン分解集積系で主
なクローンであるOR-M2の16S rRNA部分配列とほぼ一致していた $ ^{4} $ 。Ulrich and Edwards はOR-M2 は嫌気的にアニリンやフェノールを分解する Desulfobacterium anilini と近縁であるため、報告された系においてベンゼン分解菌である可能性があるとしている。また、OR-M2は硫酸塩還元条件下のベンゼン分解集積系で報告されている SB-21 とも近縁である。

一方、Olsenella uliはグルコースの発酵を担うが、水素生成菌ではない。Coriobacteriaceae近縁種はメタン生成条件におけるベンゼン分解微生物としての報告はこれまでにないが、同科の多くの菌は糖を発酵し有機酸を生成し、硝酸塩還元菌や水素生成菌も含まれる。

いずれのクローンにおいても、最近縁種との相同性は90%以下と低く、新規の未分離微生物であるといえる。したがって、分離株の性質とは異なる性質を持つ可能性も十分に考えられる。

## 3 ）汚染地下水のベンゼン分解微生物の定量

各地点のHasda-Aコピー数は、e-2地点で2.8x10¹ copies/mL、c-6地点では1.9x10⁻² copies/mLと定量された。しかし、いずれの場合においてもネガティブコントロールよりは大きな値であるものの、定量下限を下回っていた。d-1地点の試料はネガティブコントロールと全く変わらないものであり、不検出であった。いずれにしても汚染現場の地下水中では、Hasda-A数はきわめて少ないことが明らかとなった。

## （２）ベンゼン分解条件の検討

## 1 ）硫酸塩·安息香酸添加試驗

## a) 硫酸塩添加の影響

硫酸塩添加条件におけるベンゼンの濃度変化、二酸化炭素とメタンの生成、及び硫酸塩濃度の変化を図22に示す。まずベンゼン濃度の変化（図22a）に着目すると、実験開始後31日後で初期硫酸塩濃度250mg/Lの場合を除き、投与したベンゼンはすべて消費されていた。これ以前の分解の経緯をみると、初期硫酸塩濃度100mg/Lにおいては硫酸塩無添加の場合とまったく同一の举動を示し、硫酸塩添加による影響は確認されなかった。初期硫酸塩濃度250mg/L、500mg/Lの場合には、硫酸塩無添加の場合に比べ常に高いベンゼン濃度を示したが、実験開始時の初期ベンゼン濃度もわずかに高く、ベンゼンの濃度減少に硫酸塩添加が影響しているとは結論付けられない。したがっていずれのケースにおいても、硫酸塩無添加の条件に比べ、ベンゼン濃度の変化に大きな違いは見られず、硫酸塩がベンゼン分解を促進も阻害もしない、という結果となった。

次に、各条件におけるベンゼン分解の最終生成物であるメタンと二酸化炭素の変化（図22b,c）をについて述べる。二酸化炭素の生成量は、初期硫酸塩濃度250mg/Lの場合にのみ硫酸塩無添加の条件に比べて少なかったほかは、まったく同じ挙動を示した。メタンの生成量については、硫酸塩無添加の条件にくらべ、初期硫酸塩濃度100mg/Lでわずかに少なく、初期硫酸塩濃度250、500mg/Lでおよそ1/3の生成量であった。

硫酸塩濃度の推移をみると、硫酸塩を添加したいずれの場合においてもほぼ一定で硫酸塩濃度の減少が見られていた。初期硫酸塩濃度100、250 mg/Lでそれぞれ15日後、22日後までは少なくとも硫酸塩は残存しており、初期硫酸塩濃度500 mg/Lでは実験期間を通じて硫酸塩が残存している条件であったことが分かる。
a) ベンゼン濃度

b)二酸化炭素濃度

c) メタン濃度

d) 硫酸塩濃度

図２２　硫酸塩添加試験におけるa)ベンゼン、b)二酸化炭素、c)メタン、d)硫酸塩の濃度変化

実験終了時におけるベンゼン分解量とメタン、二酸化炭素生成量の収支を取ったものを図23aに示す。硫酸塩無添加、初期硫酸塩濃度100mg/Lの場合には、消費されたベンゼンのうち7割強がメタンもしくは二酸化炭素に分解されているのに対し、初期硫酸塩濃度250、500mg/Lの場合には4割程度にとどまっている。残りはベンゼン分解の中間産物として残存しているか、測定時等に実験装置から消失したり、装置壁面への不可逆的吸着によるもの損失と考えられる。装置からの消失や吸着はすべての実験条件で同一であると考えられることから、初期硫酸塩濃度の多寡による違いはベンゼン分解の中間産物の差であると考えることが妥当である。

メタン生成条件と硫酸還元条件におけるベンゼンの分解は、以下の式に従うと考えられる。

メタン生成条件：
$$ {}^{13}C_{6}H_{6}+{}^{12}CO_{2}+H_{2}O\rightarrow3{}^{13}CH_{4}+3{}^{13}CO^{2}+{}^{12}CH_{4} $$

硫酸還元条件：

$$ 4^{13}C_{6}H_{6}+15SO_{4}^{2-}+12H_{2}O\rightarrow24H^{13}CO_{3}^{-}+15HS^{-}+9H^{+} $$

この仮定をもとに、生成したメタンと二酸化炭素量より、各実験条件におけるベンゼン分解が、メタン生成もしくは硫酸塩還元のいずれによるものかを推定したものが図23bである。硫酸塩無添加、初期硫酸塩濃度100mg/Lにおいて硫酸塩還元の寄与が負となっているのは、メタン生成量より二酸化炭素生成量が大きくなっていることに起因する。これは分析誤差以外に、集積培養系内に残っているベンゼン以外の電子供与体からの電子が、二酸化炭素還元に用いられている可能性がある。一方初期硫酸塩濃度250、500mg/Lの場合には硫酸塩還元の寄与が示され、特に初期硫酸塩濃度500mg/Lの場合においては4割程度が硫酸還元によってベンゼンが分解されていることが分かる。

以上の結果より、メタン生成条件で集積したベンゼン分解集積培養系においても、硫酸塩を投与することで硫酸塩還元によるベンゼン分解が起こりうることが示された。ただし、硫酸塩還元がおこるものの、ベンゼン分解に対する促進効果を認めることができなかった。

a) メタン、二酸化炭素の発生量

b) 推定されるメタン生成と硫酸塩還元の割合

図２３ 各硫酸塩濃度段階におけるa)ベンゼン分解量に対するメタン、二酸化炭素の発生量、b)推定されるメタン生成と硫酸塩還元の割合。

## b) 安息香酸添加の影響

ベンゼン分解集積培養系において、安息香酸の添加がベンゼン分解微生物の集積に及ぼす効果を調べた。まず、ベンゼン分解微生物の増殖効果があるかどうかをみるため、集積培養系を用いて希釈列を作成した。希釈列の様子を図24に示す。
図 2 4 希釈列の様子（ベンゼン40 mg/L添加系）

培養開始より100日経過した頃より、ベンゼンを炭素源とする系の $ 4\times10^{4} $ 、 $ 4\times10^{6} $ 系においてバイアル内に白色のもやが観察された。しかし、遠心分離(15,000 rpm、3 min)上澄みを可能な限り除去したが、頭微鏡下では土壌粒子以外のものは観察できなかった。培養開始より170日目に $ 4\times10^{3} $ 、 $ 4\times10^{4} $ 、 $ 4\times10^{6} $ の系に関して同様の処置を行ったところ、視野下において一様に粒状物質を観察することができた（図25は $ 4\times10^{4} $ のサンプル）。

a）位相差顕微鏡による観察視野(×1500)

b) DAPI 染色を行った培養サンプル (×1000)

図 2 5 40mg/Lベンゼン添加後170日目における培養系の顕微鏡写真

粒状物質が菌であるかどうかを確認するため、Syntrophus属類縁菌に特異的にハイブリダイズするプローブBD437 (Cy3)を用いたFISH (Fluorescence in situ hybridization)を適用した後、DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole)でカウンター染色を行った $ ^{1)} $ 。DAPI染色により、多数存在している粒状物質が菌である（DNAを持っている）ことは確認できたが、BD437による蛍光と重ならず、Syntrophus属類縁菌の存在は確認できなかった。

一方で、安息香酸を添加した系では目視において懸濁物は見られず、顕微鏡下においても土壌
粒子以外のものは確認できなかった。炭素源として安息香酸を200 mg/Lになるよう添加した系では $ 4 \times 10^{3} $ から $ 4 \times 10^{7} $ の系において培地がわずかに黄色に呈色していた。このことより、安息香酸の環構造の開裂が示唆され、安息香酸の分解が起こっていた可能性が示された。しかしながら、懸濁が見られなかったことから、安息香酸の分解による明確な菌の増殖があったとは結論できなかった。

ベンゼン添加系において培養液中に何らかの菌の増殖が観察されたので、培養液中ベンゼンの分解の有無をGC-FIDによる測定で確認した。この結果を図26に示す。希釈倍率が $ 4\times10^{1} $ の系（この系のみベンゼン濃度が20 mg/L、40 mg/Lの2段階設定）においては培養後半においてベンゼンの減少が見られている。しかし、培養開始時と比べると減少分は小さく、ベンゼン分解があったかどうかは結論できなかった。

図２６　培養系中のベンゼン濃度

## 2 ）有機酸の添加効果

有機物がベンゼン分解を促進する際に考えられる役割として、次の二点が挙げられる。まず、ベンゼン分解微生物がベンゼン以外の有機物を生育基質として利用し増殖できる可能性である。ベンゼンの代謝産物である安息香酸、クロトン酸などが有力な候補として考えられる。次に、ベンゼン分解反応において利用される物質である。ベンゼン分解の推定代謝産物であるトルエンを分解する際、メチル基にフマル酸が付加する反応が知られ、同様に安息香酸の分解にもクロトン酸が用いられる反応が知られている。

これらのことから、ベンゼン分解培養系に有機物、特にベンゼン分解経路に関わるような有機酸を添加し、ベンゼン分解活性への影響を観察することで、ベンゼン分解微生物の活性化、安定的な培養条件の検討を行った。有機酸として、ベンゼンの代謝経路に存在すると考えられる安息香酸に加え、クロトン酸、フマル酸を用いた。
(a) ベンゼン濃度の経時変化

(b) メタン生成量の経時変化

図２７ ベンゼン濃度とメタン生成の経時変化

(a) クロトン酸

(b) フマル酸

(c)安息香酸

図２８ 有機酸濃度の経時変化

表 7 添加有機酸のメタン生成分解反応式と生成メタン量

メタン生成分解反応式	投与化合物あたり発生メタン量(mol/mol)	投与量(μmol)	想定メタン発生量(μmol)	実測メタン発生量(31日目)(μmol)
安息香酸	4C_{6}H_{5}COOH+31H_{2}O→15CH_{4}+13HCO_{3}^{-}+13H^{+}	3.75	22.5	84.375	88.2
クロトン酸	C_{4}H_{5}O_{2}^{-}+4H_{2}O→2CH_{4}+2HCO_{3}^{-}+H_{2}+H^{+}	2	67.5	135	149.5
フマル酸	2C_{4}H_{2}O_{4}^{2-}+7H_{2}O→3CH_{4}+5HCO_{3}^{-}+3H^{+}	1.5	45	67.5	73.4
酢酸	C_{2}H_{3}O_{2}^{-}+H_{2}O→CH_{4}+HCO_{3}^{-}	1	50.625	50.625	61.9

図 2 7(a)から有機酸を添加していない系で最もベンゼン分解が進んでいることが観察される。それぞれ添加した有機酸の分解とベンゼン分解、メタン生成の関連について以下でまとめ、考察
を与える。安息香酸、クロトン酸、フマル酸がメタンへと分解されるメタン生成反応式と投与した有機酸の量から想定されるメタン生成量と、実際に測定したメタン生成量を表7に示した。

酢酸は表7に示した反応式のように、酢酸資化性メタン生成細菌により、メタンと二酸化炭素へ分解される。酢酸を添加した系において、メタンは0日目から直線的に生成し、10日目以降はメタン生成速度が鈍化した（図27(b)）。このことから、11日目には全てがメタンへと分解されていると考えられる。ベンゼンの濃度は、酢酸が残存していると考えられる11日目まではほぼ横ばいであり、11日目以降で、ベンゼン分解速度が向上していることが観察される。これにより、ベンゼン分解は酢酸の存在によって阻害を受ける可能性が示唆された。

クロトン酸は2～5日の間に不検出となった（図28(a)）。クロトン酸を投与した量から想定されるメタン生成量と、メタン生成量の実測値のバランス、メタンの生成速度を観察すると、17～20日目にはメタンへと完全に分解されていると考えられる。メタンの生成速度は酢酸添加系とほぼ同じであり、クロトン酸2～5日の間に速やかに酢酸まで分解され、その後酢酸として蓄積し、メタン生成に用いられていた可能性が考えられる。

フマル酸は、実験開始後、2日目までには不検出（図28（b））であり、8日目に再添加したのも、次の測定を行った11日目にはすでに不検出となった。クロトン酸を投与した量から想定されるメタン生成量と、メタン生成量の実測値のバランス（表7）、メタンの生成速度（図27(b)）を観察すると、フマル酸は19～22日にはメタンへと変換されていると考えられる。ベンゼン濃度は、フマル酸の全てがメタンへと分解された22日前後までほぼ横ばいであり、ベンゼン分解に大幅な遅延が見られた。これは、Coatesら $ ^{5)} $ が硝酸還元条件での純粋分離株Dechloromonas strain RCBに対してフマル酸を添加したところ、ベンゼン分解にはなんらの影響も見られなかったことに反する結果であり、本研究で得られたベンゼン分解がDechloromonas strain RCBの行うベンゼン分解とは異なる機構によっていることを示唆している。

嫌気環境下でのファル酸の反応には、トルエンへの付加反応だけではなく、自身が分解される反応も存在する。特に、電子受容体として働き、コハク酸(Succinate)に還元されるファル酸呼吸が起こることが知られている。コハク酸は、プロピオン酸生成細菌のコハク酸—プロピオン酸経路によって、嫌気的にプロピオン酸へと変化する。プロピオン酸は嫌気環境下で難分解性であるが、最終的には酢酸へと代謝される（図29）。そして、酢酸がメタン生成に用いられることになる。

図２９ フマル酸嫌気代謝経路

フマル酸が実験開始直後に不検出となったにもかかわらず、メタンがゆっくりとしか生成しなかったこと（図27(b)）から、コハク酸、プロピオン酸といったフマル酸分解の中間代謝産物が
蓄積し、メタン生成が遅延していたと考えられる。また、メタン生成条件でプロピオン酸がベンゼン分解を阻害するという報告 $ ^{6} $ もあり、これらの中間代謝産物の存在がベンゼン分解を阻害していた可能性が示唆される。

安息香酸は、実験開始後11日目から分解が始まり、23日目には検出限界と同程度の値であった（図28(c)）。安息香酸はメタンの増加分（図27(b)）から、25日目にはメタンへと変換されていることが推測される。ベンゼン濃度は、クロトン酸と同じような推移を示し、ベンゼン分解に若干の遅延が認められた。

これらのことから、安息香酸のメタンへの分解は、安息香酸自身の変換が律速段階となり、メタン生成が緩やかに生じたと考えられる。クロトン酸と酢酸では、酢酸からのメタン生成段階が律速段階、フマル酸ではフマル酸の中間代謝産物（プロピオン酸などが候補として考えられる）の分解、安息香酸は安息香酸自身の分解が律速段階となっていたと考えられる。

ベンゼン分解とメタン生成、投与有機酸の分解を見ると次のことが推察される。まず、投与した有機酸およびその代謝産物(酢酸などが考えられる)が存在することで、ベンゼン分解の開始が遅れる。有機酸等が分解された後、ベンゼン分解が開始する。安息香酸とクロトン酸、酢酸はベンゼンが経由すると考えられるBenzoyl-CoAの代謝産物であるため、これらが多量に存在することで、ベンゼン分解で得られる自由エネルギーが減少しベンゼン分解を阻害していたと考えられる。ベンゼン分解がはじまると、ベンゼン分解速度自体には大きな違いはない。このことから、本培養系で与えた有機酸を分解しているのはベンゼン分解菌ではない可能性が高い。これらの有機酸が、ベンゼン分解菌を直接増加させる基質としては働かない、もしくは、ベンゼン分解菌による摂取速度が遅い物質であると考えられる。

## 3 ）汚染地下水を用いた検討

表8に、採水した各地点における地下水の水質分析結果を示す。$\mathrm{ORP}_{\mathrm{SHE}}$、$\mathrm{DO}$から各地点の地下水の嫌気度をみると、$\mathrm{ORP}_{\mathrm{SHE}}$はc-6地点で最も低く約4.5mVであるが、d-1地点では約120mV、e-2地点では約67mVになっており、$\mathrm{DO}$も全ての地点において0.7mgO/L以上であった。$\mathrm{ORP}_{\mathrm{SHE}}$、$\mathrm{DO}$の測定は、地下水井から採水した直後に行ったが、採水操作中に酸素の混入が生じた可能性が考えられる。本研究では、採水後にL-システインを還元剤として添加しているため、分解試験に用いた地下水については実験開始時の$\mathrm{DO}$は全ての地点において約0.1mgO/Lであった。

また、TOC濃度はc-6地点では約20mgC/L、d-1、e-2地点では約10mgC/Lと、高い値を示している。バイオレメディエーションのために投入された有機物資材がこの高い有機物濃度に影響を与えているものと考えられる。各地点のイオン濃度をみると、c-6地点ではClが、d-1地点ではSO_{4}が多く、同じN地区であっても地点によって地下水の水質は大きく異なっていることがわかる。

表 8 地下水の水質分析結果

地点名	ORPSHE(mV)	DO(mgO/L)	TOC(mgC/L)	Cl(mg/L)	Br(mg/L)	NO2(mg/L)	NO3(mg/L)	SO4(mg/L)
c-6	4.5	1.07	22.5	120	1.87	<0.01	<0.01	<0.01
d-1	120	0.71	13.5	<0.01	1.13	0.53	0.91	68
e-2	67	0.84	11.7	<0.01	1.33	<0.01	<0.01	1.18

次に、図30にベンゼン分解試験における各地点の地下水中のベンゼン・メタン濃度の経時変
化を示す。試験開始直後からアクリーンBC添加系、無添加系ともにベンゼン濃度は減少したが、滅菌系と比べて全く差は見られなかった。よってこの期間におけるベンゼンの減少は微生物分解によるものではなく、ベンゼン濃度測定時における損失などであると考えられた。滅菌系を除くいずれの試験系においても、試験開始直後からメタンの生成は確認されていることから、試験系がすべて嫌気的な環境にあることが確認された。

更に観察を続けたところ、e-2地点の地下水では試験開始後80日後、d-1地点の地下水では試験開始後50日後以降も、アクリーンBC無添加系と滅菌系は引き続き全く差がなかったのに対し、アクリーンBC添加系のベンゼン濃度は無添加系、滅菌系と比べてより大きく減少し始めた。e-2地点、d-1地点いずれの地下水の場合においてもその差は有意水準5%で統計的に有意であった。このことから、これらの地点の地下水において、アクリーンBCを添加することでベンゼンの微生物分解が起こりうることが示された。c-6地点でもアクリーンBC添加系のベンゼン濃度が80日後ごろから他と比べて若干低く推移したが、有意差は見られなかった。

一方で、アクリーンBCを添加しない場合には全ての地点の地下水において微生物分解は確認されず、汚染現場でベンゼン濃度の減少が観測されているという知見や現場試料を持ち帰っての回分分解試験の結果を裏付けるものとはならなかった。本研究では地下水に対し還元剤であるL-システインを添加することで完全に嫌気的な条件とし、またそのことがメタンの生成から確認できている。一方、今回採水した地下水の現地でのD0は約1mg0/Lであり、ベンゼンの好気的分解に十分な量である。このため、汚染現場やトリータビリティテストにおいては、好気的な分解が起こっていた可能性もある。また汚染現場においては、ベンゼン濃度は微生物分解以外にも地下水の移流による影響も受けている。

また、メタン濃度に着目すると、今回の実験では全ての地点の地下水において、メタン濃度はアクリーンBC添加系で最も高い値を示している。アクリーンBCの主成分は有機酸であり、この有機酸は嫌気的条件下において酢酸、二酸化炭素、水素へと分解され、最終的にメタンにまで分解されると考えられている。このことから、地下水中に添加したアクリーンBC中に含まれる有機酸がメタンまで分解を受けていることが明らかになった。
a) e-2 地点

b) c-6 地点

c) d-2 地点

図30 各地点地下水におけるベンゼン濃度の変化
アクリーンBCによるベンゼン分解への影響には主に2つの可能性が考えられる。一つは、ベンゼン分解を担う微生物がアクリーンBC中に含まれる有機酸等の有機物を分解して増殖できる可能性である。もう一つは、有機酸がベンゼン分解微生物とは異なる微生物により分解されることで、培養系がより還元的な状態となり、ベンゼン分解が進行しやすい環境が作られる、というものである。いずれの場合でも、有機酸の分解が多く見られた地点の地下水においてベンゼン分解が進行したことから、今回のベンゼン濃度の減少にはこの有機酸が関わっている可能性が示唆された。このほか、アクリーンBCに含まれる炭酸水素ナトリウムによる炭酸の供給やpH緩衝能なども影響する可能性は否定できない。今後いずれかの物質を加えて試験を行うなど、さらに検討が必要である。

## （３）バイオオーグメンテーションによる汚染地下水浄化試験

## 1 ）集積培養系混合比の検討

ベンゼン濃度の変化を図31に示す。ベンゼン濃度は、混合比1:1の滅菌系を除く全ての系、混合比5:1のアクリーンBC添加系及び無添加系、混合比10:1のアクリーンBC添加系で明らかに減少しており、これらの系で微生物によるベンゼン分解が起きたことが確認された。それ以外の系では実験開始から100日間経過後もベンゼン分解はみられなかった。

ベンゼン分解が開始されるまでに要した時間は、1:1混合系のアクリーンBC添加系で約5日、無添加系で7日、L-システイン添加系で16日であり、5:1混合系のアクリーンBC添加系で12日、無添加系で18日であり、10:1混合系のアクリーンBC添加系で25日であった。ベンゼン分解が進行した系についてベンゼン濃度が十分減少した後に再度ベンゼンを添加したところ、遅滞なく分解されることが確認された。また、5:1, 10:1, 50:1, 100:1混合系では、明らかなベンゼン減少がみられなかった系においても、滅菌系と比較したときにベンゼン濃度が低くなるということが確認された。

混合比1:1の滅菌系を除く全ての系、混合比5:1のアクリーンBC添加系及び無添加系、混合比10:1のアクリーンBC添加系で微生物による嫌気的分解が進行することが確認された。また、この時に系内はメタン生成条件であったこと（図32）から、この嫌気的ベンゼン分解がメタン生成条件下で進行したことが明らかになった。集積培養系の混合比率を下げるほど、ベンゼン分解は進行しにくくなり、ベンゼン分解進行のためには集積培養系に含まれる微生物群集、または有機物や無機物等が一定割合以上必要であることが示唆された。また、微生物の解析結果から考えると、集積培養系の添加量を上げることで、Hasda-Aの存在比率を一定以上に保ちやすくなり、ベンゼン分解が進行しやすくなるのではないかと考えられる。

集積培養系を添加した系では、ベンゼン分解が明らかでない系においても滅菌系と比べ他の系でベンゼン濃度が減少しており、培養初期には集積培養系による嫌気的ベンゼン分解が進行し、その後何らかの理由でベンゼン分解が停止したと考えられる。分解が進行しなくなる理由としては、系内の微生物がベンゼン以外の有機物を利用することで、Hasda-A等のベンゼン分解微生物の存在比率が低下するということが考えられる。

1:1混合系、5:1混合系、10:1混合系ではアクリーンBC添加系においてベンゼン分解開始までのラグタイムは最も短くなった。このことより、アクリーンBCがベンゼン分解を促進した可能性が示唆された。アクリーンBCがベンゼン分解を促進した可能性としては、アクリーンBCに含まれる
クエン酸が嫌気的に分解され有機電子受容体を生成し、ベンゼン分解における電子受容体として働いた可能性と、クエン酸及びその分解産物自体がHasda-A等のベンゼン分解微生物によって基質として利用されたという可能性の2つが考えられる。

a)1:1混合系

b) 5:1 混合系

c) 10:1 混合系

d) 50:1 混合系

e) 100:1 混合系

f) 地下水系

☑ L-システイン添加系 → アクリーンBC添加系 → 無添加系 → 滅菌系

図 3 1 各混合比におけるベンゼン濃度の経時変化。
a) 1:1 混合系

b) 5:1 混合系

c) 10:1 混合系

d) 50:1 混合系

e) 100:1 混合系

f) 地下水系

☐ L-システイン添加系 ☐ アクリーンBC添加系 ☐ 無添加系 ☐ 滅菌系

図 3 2 各混合比におけるメタン濃度の経時変化。

## 2 ）有機電子受容体添加試驗

表9に汚染地下水の水質を示す。本試験で用いた地下水は、全地点においてORP $ _{SHE} $ が100mV以上、
DOが0.3mgO/L以上と高い値を示している。これは、今回の試験に用いたT1、T2地点の地下水は、前節の結果を踏まえて還元剤L-システインを添加してないことに起因していると考えられる。また、陰イオンの測定結果をみると、硫酸イオン濃度がT1地点では166mg/L、T2地点では986mg/Lであり、ともに高い値を示している。このことから、T1、T2地下水を用いた試験では系内が硫酸還元的雰囲気になる可能性がある。

表 9 実験直前の地下水の水質

地点名	ORPSHE (mV)	DO (mgO/L)	TOC (mgC/L)	Cl (mg/L)	Br (mg/L)	NO2 (mg/L)	NO3 (mg/L)	PO4 (mg/L)	SO4 (mg/L)	ベンゼン (mg/L)
T1	324	0.72	11	937	<0.1	<0.1	<0.1	<0.1	166	0.3
T2	340	0.54	7	1392	<0.1	<0.1	<0.1	<0.1	968	<0.05
N-d-1	131	0.36	50	<0.1	<0.1	<0.1	<0.1	<0.1	<0.1	<0.05

T1、T2、N-d-1地点それぞれの地下水を用いた実験結果を図33-35に示す。試験した地下水全てにおいて、5:1、10:1混合系の無添加系のみでベンゼン濃度は滅菌系と比較して明確に減少しており、微生物による嫌気的ベンゼン分解が進行したことが確認された。分解開始までに要した時間は、T1地点では5:1、10:1系ともに約20日、T2地点では5:1系では約10日、10:1系では約20日、N-d-1地点では実験開始直後からであった。

ただし、T1地点では、一旦ベンゼン分解の進行がみられたものの、その後ベンゼン分解の停止がみられた。T1地点では実験開始時に系内に硫酸塩が残存していたため、集積培養系が硫酸還元条件でベンゼン分解を行い、その後硫酸塩の枯渇によりベンゼン分解が停止したという可能性が考えられた。ベンゼン分解が止まった時点の硫酸濃度を測定したところ、検出下限値（5mg/L）以下であったため、硫酸塩の添加（ $ Na_{2}SO_{4} $ 40mg/L、ベンゼン分解の必要量の約10倍）を行ったが、ベンゼン分解は進行しなかった。一方でT2、N-d-1地点では、ベンゼンは検出下限値以下まで下がり、その後ベンゼンを再添加した後もラグタイムなしでベンゼン分解は進行したことが確認された。

メタンは、集積培養系及び易分解性有機物を添加した全ての系において生成が確認された。図では確認しづらいものの、無添加系においてもT1地点の5:1、10:1系、T2地点の5:1系、N-d-1地点の5:1系においてもメタンは生成しており、これらの系でメタン生成条件が作られたことが確認された。

クエン酸、グリシン、フマル酸のそれぞれを添加した系では、グリシンが最も早くメタンへと分解され、次いでクエン酸、フマル酸の順にメタンへの分解を受けやすいことが確認された。しかしながら、いずれの有機物を添加した場合においてもベンゼン分解に対する阻害効果が見られた。
a）5:1系 ベンゼン濃度

b) 5:1 系 メタン濃度

c）10:1系 ベンゼン濃度

d) 10:1 系 メタン濃度

e）地下水系 ベンゼン濃度

f) 地下水系 メタン濃度

一□一滅菌一◆一クエン酸一—グリシン---フマル酸一※一無添加

図3 3 T1地点集積培養系添加試験におけるベンゼン・メタン濃度の変化（矢印は硫酸塩の添加を示す）
a）5:1系 ベンゼン濃度

b) 5:1 系 メタン濃度

c）10:1系 ベンゼン濃度

d) 10:1 系 メタン濃度

e）地下水系 ベンゼン濃度

f) 地下水系 メタン濃度

— 滅菌 ◆ クエン酸 ── グリシン ⋯ フマル酸 ⋯ 無添加

図 3 4 T2地点集積培養系添加試験におけるベンゼン・メタン濃度の変化（矢印はベンゼンの再添加を示す）
a）5:1系 ベンゼン濃度

b)5:1系 メタン濃度

c）10:1系 ベンゼン濃度

d) 10:1 系 メタン濃度

e）地下水系 ベンゼン濃度

f) 地下水系 メタン濃度

一—滅菌 ♦ クエン酸 ▏ グリシン ⋯ フマル酸 ✗ 無添加

図 3 5 N-d-1 地点集積培養系添加試験におけるベンゼン・メタン濃度の変化（矢印はベンゼンの再添加を示す）
## （４）ベンゼン分解を起こすための条件についての考察

表 1 0 に、本研究で実施ったすべての試験結果において、有機物を添加した場合のベンゼン分解への影響と、メタン生成の関係についてまとめた。なお、アクリーンBC添加系については、アクリーンBCの主成分がクエン酸であることから、クエン酸としてまとめてある。有機酸の添加効果はベンゼン分解に対して促進的に働く場合と、阻害的に働く場合両方があり、本研究で得られた結果のみでは有機酸の添加自体がベンゼン分解に与える影響は確定的ではない。しかし、ベンゼン分解に阻害的に働く場合には、有機酸を添加しない場合に比べてメタン生成量が増大する（＝メタン生成が亢進する）結果が、逆にベンゼン分解に促進的に働く場合にはメタン生成が抑制される結果が得られている。この結果より、ベンゼン分解とメタン生成とに密接な関係があることが示唆された。

表 1 0 有機物添加によるベンゼン分解への影響とメタン生成の関係

実験系（汚染地下水採水年/月）	実験系名称	添加有機酸	ベンゼン分解
促進（+）/阻害（-）	メタン生成
亢進（+）/抑制（-）
集積系	酢酸	-	+
集積系	クロトン酸	-	+
集積系	フマル酸	-	+
集積系	安息香酸	-	+
集積系+汚染地下水(11/10)	5:1混合系	クエン酸	+	-
集積系+汚染地下水(11/10)	5:1混合系	L-システイ
ン	-	+
集積系+汚染地下水(11/10)	10:1混合系	クエン酸	+	-
集積系+汚染地下水(12/5)	5:1混合系	クエン酸	-	+
集積系+汚染地下水(12/5)	10:1混合系	クエン酸	-	+

この結果を踏まえ、クエン酸を例にとって、ベンゼンの分解とメタン生成の関係について考察する。ベンゼンの安息香酸以降の分解では、分解過程で酢酸及び水素を生成する。反応における自由エネルギー変化の関係より、これらの生成物はなるべく除去されることが望ましい。対して、クエン酸の嫌気的分解では、2通りの分解経路がある。一方はフマル酸等の中間代謝産物（ここでは酸化型の中間代謝産物と呼ぶ）が酸化還元反応により有機電子受容体として働き得る経路である。他方はピルビン酸から直接酢酸を生成する反応経路であり、酢酸は最終的にメタンへと分解される。この反応経路では酸化還元反応を伴わず、電子の授受は行われない。ここで、クエン酸分解が酸化還元反応を伴う場合、クエン酸からはプロピオン酸が生成する。プロピオン酸は嫌気条件では分解されにくく、メタン生成は起こりにくい。この反応の途中で生成する酸化型の中間代謝産物はベンゼン分解反応によって生成する還元力の消費（＝電子の受容）にも使われ、ベンゼン分解を担う微生物とクエン酸分解を担う微生物が共生関係を作り、ベンゼン分解を進行させることもあり得ると考えられる（図36）。この還元力の消費により、ベンゼン分解は促進される。よって、メタン生成が抑制された条件でベンゼン分解が促進する可能性がある。
図36 推定される嫌気的ベンゼン分解とクエン酸分解の関係の概念図

一方で、クエン酸から直接酢酸を生成する経路で分解が進行した際には、酸化還元反応は起こらないため、ベンゼン分解は促進されない。それだけでなく、酢酸からのメタン生成が何らかの理由で滞り、酢酸の蓄積が起こるような場合は、ベンゼンの分解産物の蓄積によるベンゼン分解の阻害が考えられる。酢酸や水素の蓄積が嫌気的ベンゼン分解を阻害することは、硫酸還元条件下において示されている $ ^{7} $ 。

このように、メタン生成が抑制された条件にできれば、ベンゼン分解を促進させることができる可能性がある。有機酸分解経路をメタン生成が抑制されるように制御することで、ベンゼン分解促進手法としての活用が期待される。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究では、以下の3つの結論が得られた。

Desulfobacterales 目細菌Hasda-Aが主なベンゼン分解微生物として推定された。

2）ベンゼン分解微生物集積培養系を用いて、汚染地下水のバイオオーグメンテーションが可能であることが示された。

3）嫌気ベンゼン分解の促進因子として、有機電子受容体が有効となる場合があり、なおかつメタン生成が抑制的である時に有効となる可能性が示唆された。

1）については、メタン生成条件でベンゼンを分解できる微生物群集は多様であるものの、その構造には共通点がきわめて大きく、Anaerolineaceae, Peptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Syntrophaceae, Clostridiaceaeなどを中心とした微生物群集構造となっていることが明らかとなった。また、ベンゼン分解微生物としては、これまでに我々が報告しているベンゼン分解微生物Hasda-Aが、全く異なる3地点由来の集積培養系においてもベンゼン分解微生物として推定された。このことより、Hasda-Aのベンゼン分解微生物としての普遍性が示されたと思われる。加えて、Coriobacteriaceae近縁種も標識ベンゼン由来の炭素を同化していたことから、あらたなベンゼン分解微生物である可能性も示された。メタン生成条件におけるベンゼン分解微生物については、我々の知る限り現在までに明確な特定がなされていない。よって本研究により得られた成果は、世界的にみても新規性の高い成果である。