Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
細菌の情報を用い、ベンゼン分解の制御因子を詳細に調べる。さらに嫌気ベンゼン分解微生物の集積高度化をめざし、その過程においても、ベンゼン分解微生物の制御方法についての情報を得る。より具体的な目的として、以下の3つを掲げる：

メタン生成ベンゼン分解微生物として、モニタリングすべき微生物を特定する

嫌気ベンゼン分解の促進因子を探索し、バイオスティミュレーションによる浄化手法を検討する

ベンゼン分解微生物集積培養系を用いて、汚染地下水のバイオオーグメンテーションが可能かどうかを確かめる

本研究によりベンゼン汚染土壌において、硝酸塩還元条件以外の嫌気的条件下でベンゼン分解を起こす方法を見出すことができれば、ベンゼン汚染土壌の嫌気的バイオレメディエーションによる浄化の、より安心、安全な実用化技術として位置づけることができる。

### 3. 研究開発の方法

## (1) ベンゼン分解微生物の解析

## 1 ) 次世代シーケンサを用いた集積系の微生物群集解析

土浦蓮田由来（別の時期に採取したもの2種類）および新芝川底泥由来、および山口県岩国市の蓮田由来の集積系、千葉県手賀沼底泥由来のベンゼン分解集積系について、微生物群集構造解析を行った。16S rRNA 遺伝子のV4領域を含む部分配列を、Univ519f-802rのプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、次世代シーケンサRoche 454シリーズにて解析した。解析はPCR産物をマクロジェン（株）に送付し、委託解析にて実施した。

## 2 ) 安定同位体プローブ法を用いた微生物解析

70 mL褐色バイアルに20 mLの培養系を入れ、 $ \left[{}^{12}C_{6}\right] $ -ベンゼン添加系（以下 $ \left[{}^{12}C\right] $ 系）と $ \left[{}^{13}C_{6}\right] $ -ベンゼン添加系（以下 $ \left[{}^{13}C\right] $ 系）を各系3連用意した。また、非生物によるベンゼンの分解を考慮するため滅菌系（121℃，20 min × 3）を1連で用意した。ベンゼンを約1.2 mM添加し、25℃で静置培養を行った。培養初日，1/3分解後，2/3分解後，ほぼ完全分解後にサンプルを採取し、土壤用DNA抽出キット（ISOIL for Beads Beading (NIPPON GENE)）を用い、DNAを抽出した。抽出したDNA500 ngについてCsCl密度勾配超遠心分離（45,000 rpm，72 hrs）により分離し、分画したDNAは浮遊密度画分ごとに16S rRNA部分配列をPCR増幅（27f-FAMおよび907r）した。各画分のPCR産物量をHha Iで消化したのち、ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer（Applied Biosystems）によりT-RFLP（Terminal restriction fragment length polymorphism）解析を行った。また、重画分のクローニングを行い、T-RFLP解析において $ \left[{}^{13}C\right] $ 系の重画分のみに多く存在するクローンについて、塩基配列を決定した。さらに、浮遊密度画分ごとに16S rRNA遺伝子配列のV4領域をターゲットとしたプライマーでPCR増幅をおこなったのち、次世代シーケンサーによる遺伝子配列ライブラリを構築した。

## (2) ベンゼン分解条件の検討

## 1 ) 硫酸塩添加試験

嫌気ベンゼン分解微生物集積培養系を用い、硫酸塩、および安息香酸添加のベンゼン分解に与える影響を検討した。硫酸塩添加試験では、35 mL褐色バイアルに10 mLの培養系を入れ、気相を純窒素で置換後、硫酸塩を硫酸イオン濃度にして0,100,250,500mgSO₄/L添加した。それぞれの条件に対して $ \left[^{13}C_{6}\right] $ -ベンゼンを100mg/L投与し、25℃で静置培養を行った。

## 2 ) 有機酸の添加効果

ベンゼン分解培養系にクロトン酸、安息香酸、フマル酸を添加し、ベンゼンの分解速度の相違を観察した。クロトン酸、フマル酸は、それぞれ0.1molをmilliQ水に溶解し2～5M NaOHを加えpHを7付近に調整した後、100mLとした1M水溶液を作製・使用した。安息香酸、酢酸は、それぞれのNa塩0.1molをmilliQ水に溶解し安息香酸、酢酸を用いてpH7付近に調整しmilliQ水を加え100mlとした。それぞれの試薬の調整は嫌気グローブボックス内にて行った。

## 3 ) 汚染地下水を用いた検討

岩手・青森県境産業廃棄物不法投棄現場N地区d-1地点（2012年5月採水）にて採取した汚染地下水に対し、嫌気的ベンゼン分解の有無、および易分解性有機物の添加効果を検討する試験を行った。易分解性有機物として、採取した汚染現場でクロロエチレン類の脱塩素資材として実際に添加されている浄化剤、アクリーンBC（AGCエンジニアリング製）を用いた。分取したそれぞれの地下水に対し、アクリーンBCを0.42％となるよう添加したアクリーンBC添加系、アクリーンBCを添加しないアクリーンBC無添加系、及び地下水をオートクレーブ（121℃、
15分)にて滅菌した滅菌系の3系列を作成した。これらの系に対し、ベンゼンを初期濃度0.5mg/Lとなるように添加し、ベンゼン及びメタン濃度の経時的な変化を測定した。

## (3) バイオオーグメンテーションによる汚染地下水浄化試験

## 1 )集積培養系混合比の検討

(2)3)で採取した実汚染地下水とメタン生成ベンゼン分解集積培養系をそれぞれ体積比にて1:1、5:1、10:1、50:1、100:1となるようそれぞれ混合し、培養系を作成した。初期ベンゼン濃度を0.5mg/L、30℃にて暗所で静置培養した。L-システイン添加系、無添加系、滅菌系を各混合比ごとに作成した。L-システイン添加系ではすべての系の酸化還元電位(ORP)が集積培養系と一致するまで(ORP_{SHE}:−290mV)還元剤としてL-システインを添加した。

## 2 ) 有機電子受容体添加試験

実汚染地下水T1地下水:石炭ガス製造跡地から採水（2012年8月）、T2地下水:揮発性有機塩素化合物との複合汚染サイトから採水（2012年8月）、N-d-1地下水:岩手・青森県境産業廃棄物不法投棄現場N地区d-1地点（2012年5月採水）を用いた。汚染地下水とメタン生成ベンゼン分解集積培養系をそれぞれ体積比にて5:1、10:1となるようそれぞれ混合し、培養系を作成した。さらに、クエン酸3000mg/L添加系、グリシン3000mg/L添加系、フマル酸3000mg/L添加系、無添加系、滅菌系を各混合比ごとに作成した。初期ベンゼン濃度を0.5mg/L、30℃にて暗所で静置培養した。

### 4. 結果及び考察

## (1) ベンゼン分解微生物の解析

## 1 ) 次世代シーケンサを用いた集積系の微生物群集解析

土浦蓮田土壌由来の2種類の集積培養系（土浦A,土浦B）、新芝川底泥由来（新芝川）、岩国蓮田土壌由来（岩国）、手賀沼底泥由来（手賀沼）5種類から抽出したDNAをPCR増幅したものを等量混合し、Roche 454高速シーケンサの1/8領域で解析したところ、合計101,149リード、26,330,516塩基対の配列を解析することができ、1リードあたりの平均の塩基配列長は260.314であった。それぞれの試料ごとのリード数は15,741-28,317リードであり、構造解析を行うに十分な数のリード数が得られた。

各リードごとにBLAST解析を行い、系統学的位置を解析し、整理したものをもとに、群集構造を解析した。3年以上にわたりベンゼンのみを有機物源として集積してきた培養系においても、依然多様な微生物群集構造をしていることがわかった。さらに、5種類の集積系に共通して存在する微生物種がきわめて多く、微生物群の構成要素が共通していた。それらの中でも特に存在量が多いAnaerolineaceae, Peptococcaceae,

Peptostreptococcaceae, Syntrophaceae, Clostridiaceaeの群集における割合を示したものが図1である。上記5科の微生物群で、全体の43-60%を占めていた。

図1 各集積系の微生物群集構造

## 2 ) 安定同位体プローブ法を用いた微生物解析

## a）新芝川集積系

添加したベンゼンのうち、 $$ \left[^{12}C\right] $$ - ベンゼン添加系では91.4%、 $$ \left[^{13}C\right] $$ - ベンゼン添加系では97.6%が63日の培養で分解された(図2a)。培養系中のメタン濃度はベンゼン分解とともに増加し、メタン生成条件でベンゼン分解が起
こっていることが確認できた。 $ [^{13}C] $ -ベンゼン添加による $ [^{13}C] $ -メタンの発生も確認された(図2b)。

a) バイアル液相中のベンゼン濃度 b) バイアル気相中の $ \left[{}^{13}C\right] $ -メタン濃度

図2. 安定同位体標識ベンゼンを投与した際のベンゼン分解とメタン生成。S: 滅菌系；A: $ \left[{}^{12}C\right] $ -ベンゼン添加系；B: $ \left[{}^{13}C\right] $ -ベンゼン添加系；C: ベンゼン無添加系。白抜き矢印は安定同位体プローブ法に用いるサンプルを採取した時を示す。

培養64日目のDNAを浮遊密度により分離し、各画分を用いてT-RFLP解析を行った。浮遊密度の低い画分では $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C系列でT-RFプロファイルは類似しており、89 bp、137 bp、175 bp、228 bp、369 bpなどのT-RFが上位の存在率を示した。一方、1.732 g/cm³などの浮遊密度の高い画分においては明確な違いが見られた。そこで、1.732 g/cm³の $ ^{13} $ C-系列中の画分において存在量が上位10位までの各T-RFの各画分中での強度を $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列で比較した。10画分のうち89、280 bpのT-RFの重画分へのシフトが見られ、 $ ^{13} $ Cの取り込みが示された(図3)。このことより、新芝川系では89 bpと280 bpのT-RFを持つ菌がベンゼン分解に関与していることが示された。

89 bpのフラグメントの16S rRNAをクローニングとシーケンシングにより解析したところ、嫌気的に安息香酸を分解するSyntrophus gentianaeと最近縁ではあるものの相同性は88％と低く、Hasda-Aとの相同性が99％以上と極めて近縁であった。系統学的には、Desulfobacteriales目細菌と分類された。異なる環境から集積した系においてもHasda-A類縁の微生物が分解反応の一部を担っている可能性が示された。一方、280 bpのフラグメントに相当する菌の16S rDNA配列を解析した結果、Coriobacteriaceae科の菌Olsenella uliに最近縁であった。Coriobacteriaceae近縁種はメタン生成条件におけるベンゼン分解微生物としての報告はこれまでになく、280

図3 各浮遊密度における89,280 bpのフラグメントの存在割合（矢印は存在割合が最も高い浮遊密度）

bpに相当する菌は新規のベンゼン分解関与菌である可能性が示された。さらに、 $ ^{12} $ Cベンゼン、 $ ^{13} $ Cベンゼン投与の両試料における重画分について、次世代シーケンサによる解析を行った。この解析においても、 $ ^{13} $ Cベンゼン投与の試料においてはSyntrophus属類縁のシーケンスが多く得られ、T-RFLPとクローニングを組み合わせた結果を裏付けるものであった。

## b) 手賀沼集積系、土浦集積系

手賀沼集積系の各T-RFの相対強度を比較すると、1.704~1.729 g/cm³では¹²C-系列と¹³C系列でT-RFプロファイルは類似していた。一方、1.732 g/cm³の画分において¹²C-系と比較して¹³C-系列中で89 bpの存在率が大き
くなっていた。また土浦集積系のT-RFの相対強度を比較すると、 $ ^{12}C- $ 系列では1.726~1.735 g/cm³の範囲では360 bpが優占していたが、 $ ^{13}C- $ 系列では89 bp、373 bpが360 bpよりも多く存在していた。さらに、 $ ^{13}C- $ 系列の重画分(1.734, 1.738 g/cm³)において $ ^{12}C- $ 系と比較して278 bpの存在率が大きくなっていた。

## c)まとめ

新芝川、土浦、手賀沼すべての培養系において、89 bp と280 bpをもつ T-RFが $ ^{13} $ C標識ベンゼン由来の $ ^{13} $ Cを取り込んだことがわかった。これらの微生物は、Syntrophus gentianaeを最近縁種とするDesulfobacteriales目細菌Hasda-Aと、Coriobacteriaceae科の細菌であることが明らかとなった。このように、全く由来の異なる3種類の土壌から集積された微生物系において、同一の微生物がベンゼン分解微生物の最有力候補として検出されたことから、これらの微生物の嫌気ベンゼン分解における役割はかなり普遍的で、極めて重要であることが明らかとなった。嫌気ベンゼン分解においては、これらの微生物を今後モニタリングしたり、解析対象としていけばよいことがわかった。

## (2) ベンゼン分解条件の検討

## 1 ) 硫酸塩添加試験

硫酸塩添加条件におけるベンゼンの濃度変化、及び硫酸塩濃度の変化を図4に示す。ベンゼンの濃度減少に硫酸塩添加が影響しているとは結論付けられない。したがっていずれのケースにおいても、硫酸塩無添加の条件に比べ、ベンゼン濃度の変化に大きな違いは見られず、硫酸塩がベンゼン分解を促進も阻害もしない、という結果となった。硫酸塩濃度の推移をみると、硫酸塩を添加したいずれの場合においてもほぼ一定で硫酸塩濃度の減少が見られていた。

a) ベンゼン濃度

b）硫酸塩濃度

図4. 硫酸塩添加試験におけるa)ベンゼン、b)硫酸塩の濃度変化

メタン生成条件と硫酸還元条件におけるベンゼンの分解の化学量論と生成したメタンと二酸化炭素量より、各実験条件におけるベンゼン分解が、メタン生成もしくは硫酸塩還元のいずれによるものかを推定した。初期硫酸塩濃度250, 500mg/Lの場合には硫酸塩還元の寄与が示された。よって、メタン生成条件で集積したベンゼン分解集積培養系においても、硫酸塩を投与することで硫酸塩還元によるベンゼン分解が起こりることが示された。

## 2 )有機酸の添加効果

ベンゼン分解培養系に有機物、特にベンゼン分解経路に関わるような有機酸を添加し、ベンゼン分解活性への影響を観察することで、ベンゼン分解微生物の活性化、安定的な培養条件の検討を行った。有機酸として、ベンゼンの代謝経路に存在すると考えられる安息香酸に加え、クロトン酸、フマル酸を用いた。
(a)ベンゼン濃度の経時変化

(b)メタン生成量の経時変化

図5 ベンゼン濃度とメタン生成の経時変化

図5(a)から有機酸を添加していない系で最もベンゼン分解が進んでいた。この結果より、次のことが推察される。まず、投与した有機酸およびその代謝産物(酢酸などが考えられる)が存在することで、ベンゼン分解の開始が遅れる。有機酸等が分解された後、ベンゼン分解が開始する。安息香酸とクロトン酸、酢酸はベンゼンが経由すると考えられるBenzoyl-CoAの代謝産物であるため、これらが多量に存在することで、ベンゼン分解で得られる自由エネルギーが減少しベンゼン分解を阻害していたと考えられる。ベンゼン分解がはじまると、ベンゼン分解速度自体には大きな違いはない。このことから、本培養系で与えた有機酸を分解しているのはベンゼン分解菌ではない可能性が高い。これらの有機酸が、ベンゼン分解菌を直接増加させる基質としては働かない、もしくは、ベンゼン分解菌による摂取速度が遅い物質であると考えられる。

## 3 ) 汚染地下水を用いた検討

試験開始後50日後以降も、アクリーンBC無添加系と滅菌系は引き続き全く差がなかったのに対し、アクリーンBC添加系のベンゼン濃度は無添加系、滅菌系と比べてより大きく減少し始めた（図6）。その差は有意水準5%で統計的に有意であった。このことから、これらの地点の地下水において、アクリーンBCを添加することでベンゼンの微生物分解が起こりうることが示された。一方で、アクリーンBCを添加しない場合には微生物分解は確認されなかった。

図6 各地点地下水におけるベンゼン濃度の変化(d-1地点)

## (3) バイオオーグメンテーションによる汚染地下水浄化試験

## 1 )集積培養系混合比の検討

ベンゼン濃度は、混合比1:1の滅菌系を除く全ての系、混合比5:1の無添加系で明らかに減少しており、これらの系で微生物によるベンゼン分解が起きた。それ以外の系では実験開始から100日間経過後もベンゼン分解はみられなかった。ベンゼン分解が開始されるまでに要した時間は、1:1混合系で約5日、無添加系で7日、L-システム
イン添加系で16日であり、5:1混合系の無添加系で18日であった。ベンゼン分解が進行した系についてベンゼン濃度が十分減少した後に再度ベンゼンを添加したところ、ラグタイムなしで分解されることが確認された。

## 2 ) 有機電子受容体添加試験

T2地点の地下水を用いた実験結果を図7に示す。試験した地下水全てにおいて、5:1、10:1混合系の無添加系のみでベンゼン濃度は滅菌系と比較して明確に減少しており、微生物による嫌気的ベンゼン分解が進行したことが確認された。クエン酸、グリシン、フマル酸のそれぞれを添加した系では、いずれの有機物を添加した場合においてもベンゼン分解に対する阻害効果が見られた。

a) 5:1系 ベンゼン濃度

b)10:1系 ベンゼン濃度

──滅菌 ──クエン酸 ──グリシン --- フマル酸 ──無添加

図7 T2地点集積培養系添加試験におけるベンゼン・メタン濃度の変化（矢印はベンゼンの再添加を示す）

## (4) ベンゼン分解を起こすための条件についての考察

表1に、有機物を添加した場合のベンゼン分解への影響と、メタン生成の関係についてまとめた。有機酸の添加効果はベンゼン分解に対して促進的に働く場合と、阻害的に働く場合両方があり、本研究で得られた結果のみでは有機酸の添加自体がベンゼン分解に与える影響は確定的ではない。しかし、ベンゼン分解に阻害的に働く場合には、有機酸を添加しない場合に比べてメタン生成量が増大する（＝メタン生成が亢進する）結果が、逆にベンゼン分解に促進的に働く場合にはメタン生成が抑制される結果が得られている。この結果より、ベンゼン分解とメタン生成とに密接な関係があることが示唆された。

表1 有機物添加によるベンゼン分解への影響とメタン生成の関係

実験系（汚染地下水採水年/月）	実験系名称	添加有機酸	ベンゼン分解
促進（+）/阻害（-）	メタン生成
亢進（+）/抑制（-）
集積系	酢酸	—	+
集積系	クロトン酸	—	+
集積系	フマル酸	—	+
集積系	安息香酸	—	+
集積系+汚染地下水(11/10)	5:1混合系	クエン酸	+	—
集積系+汚染地下水(11/10)	5:1混合系	L-システイン	—	+
集積系+汚染地下水(11/10)	10:1混合系	クエン酸	+	—
集積系+汚染地下水(12/5)	5:1混合系	クエン酸	—	+
集積系+汚染地下水(12/5)	10:1混合系	クエン酸	—	+

ベンゼンの安息香酸以降の分解では、分解過程で酢酸及び水素を生成する。反応における自由エネルギー変化の関係より、これらの生成物はなるべく除去されることが望ましい。クエン酸を有機物の1例にとると、クエン酸の嫌気的分解では、2通りの分解経路がある。一方はフマル酸等の中間代謝産物（ここでは酸化型の中間代
謝産物と呼ぶ)が酸化還元反応により有機電子受容体として働き得る経路である。他方はピルビン酸から直接酢酸を生成する反応経路であり、酢酸は最終的にメタンへと分解される。この反応経路では酸化還元反応を伴わず、電子の授受は行われない。ここで、クエン酸分解が酸化還元反応を伴う場合、クエン酸からはプロピオン酸が生成する。プロピオン酸は嫌気条件では分解されにくく、メタン生成は起こりにくい。この反応の途中で生成する酸化型の中間代謝産物はベンゼン分解反応によって生成する還元力の消費(＝電子の受容)にも使われ、ベンゼン分解を担う微生物とクエン酸分解を担う微生物が共生関係を作り、ベンゼン分解を進行させることもあり得ると考えられる(図8)。この還元力の消費により、ベンゼン分解は促進される。よって、メタン生成が抑制された条件でベンゼン分解が促進する可能性がある。

図8 推定される嫌気的ベンゼン分解とクエン酸分解の関係の概念図

一方で、クエン酸から直接酢酸を生成する経路で分解が進行した際には、酸化還元反応は起こらないため、ベンゼン分解は促進されない。それだけでなく、酢酸からのメタン生成が何らかの理由で滞り、酢酸の蓄積が起こるような場合は、ベンゼンの分解産物の蓄積によるベンゼン分解の阻害が考えられる。Rakoczy et al. (2011)が示すように、酢酸や水素の蓄積が嫌気的ベンゼン分解を阻害しうる。

このように、メタン生成が抑制された条件にできれば、ベンゼン分解を促進させることができる可能性がある。有機酸分解経路をメタン生成が抑制されるように制御することで、ベンゼン分解促進手法としての活用が期待される。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

本研究では、以下の3つの結論が得られた。

1) ベンゼン分解微生物群集の群集構造には共通点が多く、いずれも Syntrophus属類縁の Desulfobacteriales 目細菌 Hasda-A が主なベンゼン分解微生物として推定された。

2) ベンゼン分解微生物集積培養系を用いて、汚染地下水のバイオオーグメンテーションが可能であることが示された。

3) 嫌気ベンゼン分解の促進因子として、有機電子受容体が有効となる場合があり、なおかつメタン生成が抑制的である時に有効となる可能性が示唆された。

1) については、メタン生成条件でベンゼンを分解できる微生物群集は多様であるものの、その構造には共通点がきわめて大きく、Anaerolineaceae, Peptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Syntrophaceae,

Clostridiaceaeなどを中心とした微生物群集構造となっていることが明らかとなった。また、ベンゼン分解微生物としては、これまでに我々が報告しているベンゼン分解微生物Hasda-Aが、全く異なる3地点由来の集積培養系においてもベンゼン分解微生物として推定された。このことより、Hasda-Aのベンゼン分解微生物としての普遍性が示された。加えて、Coriobacteriaceae近縁種も標識ベンゼン由来の炭素を同化していたことから、あらたなベンゼン分解微生物である可能性も示された。メタン生成条件におけるベンゼン分解微生物については、我々の知る限り現在までに明確な特定がなされていない。よって本研究により得られた成果は、世界的にみても新規性の高い成果である。

2) については、汚染地下水に対して約10%の集積培養系を加えることで、ベンゼン分解を起こすことが可能であることがわかった。今後、この割合を下げることができれば、実際にバイオオーグメンテーション法として汚染地下水の浄化手法として開発できる可能性がある。

3) については、塩素化工チレン類の脱塩素に用いられる有機物資材を汚染地下水に添加し嫌気的に培養したところ、ベンゼンの嫌気分解が観察された。このことより、易分解性有機物の添加によりベンゼン汚染地下水の分解が起こりうることが示された。さらに、さまざまな条件で行った有機物の添加試験の結果を総合することで、
嫌気ベンゼン分解の促進因子として、有機電子受容体が有効となる場合があり、なおかつメタン生成が抑制的である時に有効となる可能性が示唆された。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

ベンゼン汚染土壌・地下水の浄化手法として、既往の好気的生物学的浄化（バイオレメディエーション）手法のみならず、嫌気的バイオレメディエーション手法も今後開発対象として考慮すべきであることが示された。汚染土壌・地下水の浄化が進まないのは、浄化にかかるコストが高いことが原因の1つである。より低コスト、低エネルギー型の汚染土壌・地下水浄化技術として、嫌気的バイオレメディエーションの開発を推進し、実用化していくことで、汚染土壌・地下水の浄化を促進し、安全な国土の保全と創出に寄与できると考えられる。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

## <査読付き論文>

1) 舛本弘毅、栗栖太、春日郁朗、古米弘明（2012）メタン生成嫌気ベンゼン分解集積培養系に及ぼす有機酸と温度の影響．水環境学会誌，197-204.

く査読付論文に準ずる成果発表＞（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可）

特に記載すべき事項はない。

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1) 高橋惇太、栗栖 太、古米 弘明: 第48回環境工学研究フォーラム(2011)「集積培養系によるメタン生成ベンゼン分解及びトリクロロエチレン脱塩素化の同時進行」

2) 野口 愛, 栗栖 太, 春日 郁朗, 古米 弘明: 第46回日本水環境学会(2011)「河川底泥由来メタン生成集積系におけるベンゼン分解微生物の安定同位体プローブ法による検出」

3) Noguchi, M., Kurisu, F., Kasuga, I. and Furumai, H. (2012) The Community Analysis of a Methanogenic Benzene-Degrading Enrichment Culture Using Stable Isotope Probing and Pyrosequencing, Water and Environment Technology Conference 2012, 18.

4) Noguchi, M., Kurisu, F., Kasuga, I. and Furumai, H. (2012) The Detection of Benzene-Assimilating Bacteria in Methanogenic Enrichment Culture Originated from River Sediment Using Stable Isotope Probing, International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen, Denmark.

5) 高橋惇太, 栗栖太, 永井宏征, 岸正博, 春日郁朗, 古米弘明 (2013) 実渓地下水における嫌気的ベンゼン分解に対するメタン生成ベンゼン分解集積培養系の添加効果, 第47回日本水環境学会年会講演集, 83.

6) 舛本弘毅，栗栖太，春日郁朗，古米弘明（2013）メタン生成嫌気ベンゼン集積培養系に及ぼす有機酸添加の影響，第47回日本水環境学会年会講演集，85.

### 7. 研究者略壓

## 課題代表者:栗栖太

東京大学工学部卒業、博士（工学）、現在東京大学大学院工学系研究科附属水環境制御研究センター准教授

## 研究参画者

(1):栗栖 太 (同上)

(2): 春日 郁朗
東京大学工学部卒業、博士（工学）、現在東京大学大学院工学系研究科都市工学専攻講師
RFb-1101-1

# RFb-1101 ベンゼン汚染土壤・地下水の嫌気的生物浄化技術の開発

# (1) ベンゼン汚染土壌・地下水の嫌気的生物浄化技術の開発

東京大学大学院工学系研究科

栗栖 太・春日 郁朗

平成23～24年度累計予算額：20,286千円

（うち、平成24年度予算額：9,016千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

ベンゼンによる低濃度広範囲の地下水・土壌浄化には、揚水曝気法などの物理的処理のみでなく微生物を用いたバイオレメディエーションが有効である。好気的な浄化手法は実用化されているものの、低コスト・低エネルギーでの浄化が可能な嫌気的な条件下では、ベンゼンは分解が進みにくく、浄化技術の開発は進んでいない。本研究では、ベンゼン汚染土壌・地下水の低コスト低負荷型浄化技術として、嫌気的バイオレメディエーション技術を開発することをめざし、ベンゼンを分解する技術の開発を行った。なかでも、ベンゼン分解を制御するための因子を見出すことを中心に行った。本研究の結果、ベンゼン分解微生物群集の群集構造には共通点が多く、いずれもSyntrophus属類縁でDesulfobacterales目細菌Hasda-A、およびCoriobacrteriaceae科の微生物が主なベンゼン分解微生物として推定された。次に、ベンゼン分解微生物集積培養系を用いて、汚染地下水のバイオオーグメンテーションが可能かどうかを確かめ、汚染地下水に対して約1/10量以上のベンゼン分解集積培養系を加えることで、汚染地下水のベンゼンを分解することが可能であることを示した。さらに、嫌気ベンゼン分解の促進因子を探索し、バイオスティミュレーションによる浄化手法を検討したところ、嫌気ベンゼン分解の促進因子として、有機電子受容体が有効となる場合があり、なおかつメタン生成が抑制的である時に有効となる可能性が示唆された。本研究により、ベンゼン汚染土壌において硝酸塩還元条件以外の嫌気的条件下でベンゼン分解を起こす方法についての知見が得られた。硝酸塩を用いないベンゼン汚染净化方法として、より安心、安全な技術の開発が可能であることを示すことができた。

## [キーワード]

ベンゼン、バイオレメディエーション、土壌汚染、地下水汚染、嫌気

### 1. はじめに

ベンゼンによる地下水・土壌汚染は日本、そして世界において深刻である。現状でベンゼンの汚染は、揚水曝気法などの物理的処理を中心に行なわれている。しかしながら、ベンゼンの環境基準は地下水で0.01mg/Lと非常に厳しく、物理的な処理法では、環境基準の濃度まで低減させる
ことは大変難しい。こうした低濃度広範囲の汚染には一般に、微生物を用いたバイオレメディエーションが有効である。

ベンゼンは、好気的な環境下では生物分解が比較的容易に進むため、好気的な浄化手法は実用化されている。反面嫌気的な条件下では、ベンゼンは一般に安定であって分解が進みにくいことが知られており、浄化技術の開発は進んでいない。嫌気的な条件下で分解が可能となれば、地中への酸素供給が必要となる好気的な処理に比べ、低コスト・低エネルギーでの浄化が可能となる。また汚染現場は嫌気的環境である場合が多い。嫌気的条件でのベンゼン分解機構が明らかになれば、現場における分解を予測することができ、自然減衰を利用した浄化対策を立てることも出来る。

嫌気的条件のなかでも、比較的酸化還元電位の高い硝酸塩還元条件においては純粋分離株の報告もあり、比較的研究が進んでいる。しかしながら硝酸塩還元では環境基準のある硝酸塩を地中に加えることになるため、その制御が難しい。より還元的な条件でのベンゼン分解の研究も必要となっている。鉄還元条件では近年になり純粋分離株の報告がなされたが、硫酸還元条件、およびメタン生成条件では純粋分離株もない。メタン生成条件や硫酸塩還元条件でも、ベンゼン分解の現象は確認されてきているものの、ベンゼン分解を起こす集積培養系であっても研究例が極めてそしく、ベンゼン分解を起こさせるための因子についてはほとんどわかっていない。

これまでに研究代表者らは、茨城県土浦市の蓮田土壌より、メタン生成条件下でベンゼンを分解する集積培養系を確立することに成功している。集積培養系の微生物群集を解析し、ベンゼン分解微生物としてDesulfobacterales目細菌Hasda-Aを推定している。さらに国内4か所の土壌からベンゼン分解集積培養系を獲得してきている。

### 2. 研究開発目的

本研究では、ベンゼン汚染土壌・地下水の低コスト低負荷型浄化技術として、嫌気的バイオレメディエーション技術を開発することをめざし、硫酸塩や有機物を地中に導入することによりベンゼンを分解する技術を開発しようとするものである。これまでに研究代表者が開発した嫌気ベンゼン分解微生物集積培養系と、ベンゼン分解細菌の情報を用い、ベンゼン分解の制御因子を詳細に調べる。さらに嫌気ベンゼン分解微生物の集積高度化をめざし、その過程においても、ベンゼン分解微生物の制御方法についての情報を得る。より具体的な目的として、以下の3つを掲げる：

メタン生成ベンゼン分解微生物として、モニタリングすべき微生物を特定する

嫌気ベンゼン分解の促進因子を探索し、バイオスティミュレーションによる浄化手法を検討する

ベンゼン分解微生物集積培養系を用いて、汚染地下水のバイオオーグメンテーションが可能かどうかを確かめる
本研究によりベンゼン汚染土壌において、硝酸塩還元条件以外の嫌気的条件下でベンゼン分解を起こす方法を見出すができれば、ベンゼン汚染土壌の嫌気的バイオレメディエーションによる浄化の、より安心、安全な実用化技術として位置づけることができる。

### 3. 研究開発方法

## （1） ベンゼン分解微生物の解析

## 1 ）次世代シーケンサを用いた集積系の微生物群集解析

土浦蓮田由来（別の時期に採取したもの2種類）および新芝川底泥由来、および山口県岩国市の蓮田由来の集積系、千葉県手賀沼底泥由来のベンゼン分解集積系について、微生物群集構造解析を行った。16S rRNA遺伝子のV4領域を含む部分配列を、Univ519f-802rのプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、次世代シーケンサRoche 454シリーズにて解析した。解析はPCR産物をマクロジェン（株）に送付し、委託解析にて実施した。

## 2 ）安定同位体プローブ法を用いた微生物解析

嫌気条件下で3年以上にわたりベンゼンのみを炭素源として与えて培養したメタン生成ベンゼン分解集積系(植種源：埼玉県川口市新芝川底泥、茨城県土浦市蓮田土壌、千葉県手賀沼底泥)を用いた。70 mL褐色バイアルに20 mLの培養系を入れ、 $ \left[{}^{12}C_{6}\right] $ -ベンゼン添加系(以下 $ \left[{}^{12}C\right] $ 系) $ \left[{}^{13}C_{6}\right] $ -ベンゼン添加系(以下 $ \left[{}^{13}C\right] $ 系)を各系3連用意した。また、非生物によるベンゼンの分解を考慮するため滅菌系 $ (121^{\circ}\mathrm{C},20\mathrm{~min}\times3) $ を1連で用意した。気相を純室素で置換後、それぞれの条件に対してベンゼンを約1.2 mM添加し、25°Cで静置培養を行った。

サンプル採取日(培養初日, 1/3分解後, 2/3分解後, ほぼ完全分解後の4点)に各バイアルから1.5 mLずつディスポーザルシリンジによりサンプルを採取し、土壌用DNA抽出キット(ISOIL for Beads Beading (NIPPON GENE))を用い、DNAを抽出した。同一系のDNAサンプルは3連を1本に統合した。

抽出したDNAのうち500 ngを密度勾配遠心分離緩衝液およびCsCl溶液と混合し5 mLにし、CsCl密度勾配超遠心分離(45,000 rpm, 72 hrs)により浮遊密度ごとに分離した。新芝川系では1.700~1.764 g/cm³の範囲で22画分ずつ、手賀沼系では1.696~1.761 g/cm³の範囲で23画分ずつ、土浦A系では1.702~1.761 g/cm³範囲で21と23画分を回収した。密度ごとに22画分(200~250 μL)を回収した。分画したDNAは浮遊密度画分ごとにPCR増幅(27f-FAM: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 907r: CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)をし、各画分のPCR産物量を150 ngに調整後Hha Iで酵素消化した。ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems)によりT-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism)解析を行った。解析には20~600 bpのフラグメントを用いた。サンプル中でピークとして検出されたもののうち分析用のブランク(サイズスタンダードのみを同じランで測定したもの)でピークとして検出された面積を下回るものは解析対象から除外した。さらに、検出された画分が $ ^{12} $ C-あるいは $ ^{13} $ C-系列で1しかないT-RF(Terminal restriction fragment)は $ ^{12} $ C-系列と $ ^{13} $ C-系列での増減が評価できないため解析対象から除外した。
また、重画分のクローニングを行い、T-RFLP解析において $ ^{[13]} $ C系の重画分のみに多く存在するクローンについて、塩基配列を決定した。さらに、浮遊密度画分ごとに16S rRNA遺伝子配列のV4領域をターゲットとしたプライマーでPCR増幅をおこなったのち、次世代シーケンサーによる遺伝子配列ライブラリを構築した。PCR産物をマクロジェン（株）に送付し、委託解析にて実施した。

## 3 ）汚染地下水のベンゼン分解微生物の定量

2011年6月9日に、図1に示す岩手・青森県境産業廃棄物不法投棄現場N地区の3地点の井戸(c-6、d-1、e-2）から採水を行った。地点の選定にあたっては、各地点の酸化還元電位(ORP)とベンゼン濃度の経時的な測定結果を参考とし、嫌気的な雰囲気下でベンゼン度の減少が起こっているとみられる地点を選定した。地下水の採水直後に、pH、ORP、溶存酸素(DO)濃度を測定した。ベンゼン分解試験に用いる地下水は、試験開始まで還元状態を保つため、現地で還元剤としてL-システインを0.3g/Lとなるように添加した。また、水質分析用の地下水として、L-システインを添加しない地下水を別途採水した。

地下水試料100mLを0.2umのメンブレンフィルターでろ過し、土壌DNA抽出キットISOIL for Beads Beating(ニッポンジーン製)を用いた。抽出したDNA溶液は，使用するまでの間-20℃で保存した。Sakai et al.(2008) $ ^{1)} $ によってメタン生成条件ベンゼン分解微生物として推定された菌の16S rDNA, Syntrophobacterales 目細菌Hasda-Aを対象とした定量PCRは，QPrimer法を用いた。

図１a 岩手側汚染現場の概要図

(青森・岩手県境不法投棄現場の原状回復対策協議会資料 $ ^{2} $ )より一部改変)
図1 b 岩手側汚染現場のうち、N地区のベンゼン濃度（2011年6月時点）と今回のサンプリング地点

(青森・岩手県境不法投棄現場の原状回復対策協議会資料 $ ^{2} $ )より一部改変)

## (2) ベンゼン分解条件の検討

## 1 ）硫酸塩·安息香酸添加試驗

茨城県土浦市の蓮田土壌より集積された嫌気ベンゼン分解微生物集積培養系を用い、硫酸塩、および安息香酸添加がベンゼン分解に与える影響を検討した。硫酸塩添加試験では、硫酸塩をベンゼン集積培養系に添加することで、硫酸塩を電子受容体としたベンゼンの酸化反応が起こるかどうかを調べた。一方で、安息香酸の影響については、これまでに集積培養系に対し直接安息香酸を加えた場合ではベンゼン分解が促進も阻害もしなかった結果がある $ ^{3)} $ 。したがって本研究では、集積培養系を希釈した場合に、安息香酸を投与することによりベンゼン分解微生物の集積が促進するかどうかを確認する試験を行った。

硫酸塩添加試験では、35 mL 褐色バイアルに10 mL の培養系を入れ、気相を純窒素で置換後、硫酸塩を硫酸イオン濃度にして0,100,250,500 mg SO₄/L 添加した。それぞれの条件に対して $ \left[^{13}C_{6}\right] $ -ベンゼンを100 mg/L 投与し、25°C で静置培養を行った。

安息香酸添加試験では、ベンゼン集積培養系を $ 4 \times 10^{1} \sim 4 \times 10^{7} $ まで10倍ずつ段階的に希釈したものを用いた。希釈には下水污泥処理水からの嫌気的フタレート分解菌の分離にて用いられたWiddel培地を用いた。この希釈列を35 mL褐色バイアルに20 mL入れ，安息香酸を20, 200, 1000mg/Lとなるよう添加した。また比較対象として、安息香酸の代わりにベンゼンを40mg/L添加したものも用意した。気相を純窒素で置換後、25℃で静置培養を行った。

## 2 ）有機酸の添加効果

ベンゼン分解培養系にクロトン酸、安息香酸、フマル酸を添加し、ベンゼンの分解速度の相違を観察した。クロトン酸、フマル酸は、それぞれ0.1molを超純水に溶解し2～5M NaOHを加えpH
を7付近に調整した後、100mLとした1M水溶液を作製・使用した。安息香酸、酢酸は、それぞれのNa塩0.1molを超純水に溶解し安息香酸、酢酸を用いてpH7付近に調整し超純水を加え100mlとした。それぞれの試薬の調整は嫌気グローブボックス内にて行った。それぞれの有機酸の添加量や実験連数等は表1にまとめた。

表 1 有機酸添加効果試験の実験系設定

連数	反応式	物質量比	モル濃度(mM,mmol·L^{-1})
滅菌系	3	0.3(Bz)
無添加系	1
ベンゼンのみ	5	0.3(Bz)
ベンゼン+安息香酸(Ba)	3	C_{7}H_{7}O_{2}^{-}+3C_{4}H_{5}O_{2}^{-}+6H_{2}O→C_{7}H_{11}O_{2}^{-}+6C_{2}H_{3}O_{2}^{-}+HCO_{3}^{-}+3H^{+}	Bz(Ba):Cr=1:3	0.3(Bz)+1.5(Ba)
ベンゼン+クロトン酸(Cr)	3	0.3(Bz)+4.5(Cr)
ベンゼン+フマル酸(Fa)	3	C_{7}H_{8}+C_{4}H_{2}O_{4}^{2-→}C_{11}H_{10}O_{4}^{2-}	1:1	0.3(Bz)+1.5(Fa)

## 3 ）汚染地下水を用いた検討

1）にて採取した汚染地下水に対し、嫌気的ベンゼン分解の有無、および易分解性有機物の添加効果を検討する試験を行った。易分解性有機物には様々なものが考えられるが、採取した汚染現場でクロロエチレン類の脱塩素資材として実際に添加されているバイオ浄化剤、アクリーンBC（AGCエンジニアリング製）を試みた。この理由として、汚染現場のモニタリング結果より、ベンゼンの減少傾向が見られていることなどから、本バイオ浄化剤の中の有機物成分がベンゼン分解に寄与する影響が考えられたためである。

嫌気グローブボックス内で、滅菌済み72mLバイアル瓶に各地点の地下水を40mLずつ分取した。ヘッドスペースを窒素ガスで置換し、ブチルゴム栓とアルミシールで蓋をした。分取したそれぞれの地下水に対し、アクリーンBCを0.42%となるよう添加したアクリーンBC添加系、アクリーンBCを添加しないアクリーンBC無添加系、及び地下水をオートクレーブ（121℃、15分）にて滅菌した滅菌系の3系列を作成した。これらの系に対し、ベンゼンを初期濃度0.5mg/Lとなるように添加し、ベンゼン及びメタン濃度の経時的な変化を測定した。実験は全て3連で行った。

## （3） バイオオーグメンテーションによる汚染地下水浄化試験

## 1 ）集積培養系混合比の検討

嫌気グローブボックス内にて、実汚染地下水（岩手・青森県境産業廃棄物不法投棄現場岩手側N地区より2011年10月に採水）とメタン生成ベンゼン分解集積培養系（茨城県土浦市蓮田の非汚染土壤より培養）をそれぞれ体積比にて1:1、5:1、10:1、50:1、100:1となるようそれぞれ混合し、培養系を作成した。培養容積は27mLバイアル瓶（液相10mL、気相17mL）とし、初期ベンゼン濃度を0.5mg/L、30℃にて暗所で静置培養した。
アクリーンBC0.42%添加系、L-システイン添加系、無添加系、滅菌（オートクレーブにて121℃,15min）系を各混合比ごとに作成した。L-システイン添加系ではすべての系のORPが集積培養系と一致するまで（ORP $ _{SHE} $ :-290mV）還元剤としてL-システインを添加した。

## 2 ）有機電子受容体添加試驗

嫌気グローブボックス内にて、下記の実験条件に示す実済地下水とメタン生成ベンゼン分解集積培養系（茨城県土浦市蓮田の非汚染土壌より培養）をそれぞれ体積比にて5:1、10:1となるようそれぞれ混合し、培養系を作成した。さらに、クエン酸3000mg/L添加系、グリシン3000mg/L添加系、ファル酸3000mg/L添加系、無添加系、滅菌（オートクレーブにて121℃,15min）系を各混合比ごとに作成した。また、それぞれについてWiddel培地添加系を3連、Widdel培地無添加系を1連で作成した。

実験に用いた汚染地下水は、T1地下水：石炭ガス製造跡地から採水（2012年8月）、T2地下水：揮発性有機塩素化合物との複合汚染サイトから採水（2012年8月）、N-d-1地下水：岩手・青森県境産業廃棄物不法投棄現場N地区d-1地点（2012年5月採水）である。培養容積は27mLバイアル瓶（液相10mL、気相17mL）とし、初期ベンゼン濃度を0.5mg/L、30℃にて暗所で静置培養した。

## （4） 化学分析

ベンゼン及びメタンは、バイアル瓶のヘッドスペースガスを100μLサンプリングし、GC-FID(島津製作所GC-2010、カラム：GL science InertCap-624)を用いて測定した。ヘッドスペースガスの濃度からベンゼンのヘンリ一定数を用いて液相濃度を求め、さらに総物質量を計算した。メタンは水への溶解度が無視できるため、全量が気相に存在するとして計算した。また、13C標識化合物から生成する13Cメタン及び13C二酸化炭素は、40μLのヘッドスペースガスをGC-MS（島津製QP-2010、カラムAgilent technology HP-PLOT/Q）を用いて測定した。

ORPはORP計（TOA-DKK ORP METER RM-20P）、pH、DOはpH/DO計（HORIBA pH/DO METER D-55）を用いてそれぞれ測定した。全有機炭素(TOC)、各種陰イオンは地下水を0.45μmのPTFEフィルター（DISMIC）でろ過した後、TOCはTOC-V CSA（島津製作所）、硫酸塩を含む各種陰イオンはイオンクロマトグラフ（Metrohm 761 Compact IC、カラム：SHODEX SI-90 4E）にてそれぞれ測定を行った。

## 4 ．結果及び考察

## （１）ベンゼン分解微生物の解析

## 1 ）次世代シーケンサを用いた集積系の微生物群集解析

土浦蓮田土壌由来の2種類の集積培養系（土浦A, 土浦B）、新芝川底泥由来（新芝川）、岩国蓮田土壌由来（岩国）、手賀沼底泥由来（手賀沼）5種類から抽出したDNAをPCR増幅したもの等量混合し、Roche 454高速シーケンサの1/8領域で解析したところ、合計114,504リード、30,075,049塩基対の配列を得ることができた。これから、各試料を判別するためにつけたタグ配列を持たないものを除き、101,149リード、26,330,516塩基対の配列を解析することができた。
したがって、1 リードあたりの平均の塩基配列長は260.314であった。それぞれの試料ごとのリード数は15,741-28,317リードであり、構造解析を行うに十分な数のリード数が得られた。

各リードごとにBLAST解析を行い、系統学的位置を解析し、整理したものをもとに、群集構造を解析した。各集積系ごとに、科レベルで微生物種をまとめ、表に示したものが表2～6である。この結果を見ると、3年以上にわたりベンゼンのみを有機物源として集積してきた培養系においても、依然多様な微生物群集構造をしていることがわかる。ほかの嫌気的有機物分解の例にみられるように、嫌気的ベンゼン分解においても、多様な種による共生によって行われていることが分かった。さらに、5種類の集積系に共通して存在する微生物種がきわめて多く、微生物群の構成要素が共通していることが見て取れる。それらの中でも特に存在量が多いAnaerolineaceae, Peptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Syntrophaceae, Clostridiaceaeの群集における割合を示したものが図2である。上記5科の微生物群で、全体の43-60%を占めていた。

以上の結果より、メタン生成条件でベンゼンを分解できる微生物群集は多様であるものの、その構造には共通点がきわめて大きく、Anaerolineaceae, Peptococcaceae,

Peptostreptococcaceae, Syntrophaceae, Clostridiaceaeなどを中心とした微生物群集構造となっていることが明らかとなった。

表 2 集積系の群集構造（土浦A）

科名	リード数	%
Anaerolineaceae	1,997	17%
Peptococcaceae	1,134	10%
Peptostreptococcaceae	1,040	9%
Syntrophaceae	919	8%
Clostridiaceae	893	8%
Spirochaetaceae	883	7%
Caldilineaceae	845	7%
Bacillaceae	628	5%
Geobacteraceae	449	4%
Syntrophobacteraceae	418	4%
Helicobacteraceae	196	2%
Syntrophorhabdaceae	182	2%
Thermaceae	164	1%
Desulfarculaceae	154	1%
Others	1,959	17%

表 3 集積系の群集構造（土浦B）

科名	リード数	%
Peptostreptococcaceae	2,394	15%
Anaerolineaceae	2,091	13%
Coriobacteriaceae	1,051	6%
Peptococcaceae	1,048	6%
Syntrophaceae	1,022	6%
Spirochaetaceae	964	6%
Caldilineaceae	873	5%
Pseudomonadaceae	865	5%
Clostridiaceae	737	4%
Geobacteraceae	435	3%
Syntrophobacteraceae	419	3%
Bacillaceae	413	3%
Syntrophorhabdaceae	380	2%
Planctomycetaceae	245	1%
Others	3,500	21%
表 4 集積系の群集構造（新芝川）

科名	リード数	%
Peptostreptococcaceae	3,922	38%
Anaerolineaceae	1,038	10%
Chlorobiaceae	664	6%
Syntrophaceae	634	6%
Helicobacteraceae	545	5%
Spirochaetaceae	489	5%
Clostridiaceae	428	4%
Geobacteraceae	388	4%
Desulfarculaceae	207	2%
Caldiilineaceae	203	2%
Syntrophorhabdaceae	194	2%
Peptococcaceae	185	2%
Bacillaceae	181	2%
Syntrophobacteraceae	160	2%
Others	1,080	10%

表 5 集積系の群集構造（手賀沼）

科名	リード数	%
Peptostreptococcaceae	2,029	25%
Anaerolineaceae	554	7%
Spirochaetaceae	532	7%
Syntrophaceae	450	6%
Geobacteraceae	405	5%
Veillonellaceae	350	4%
Gemmatimonadaceae	307	4%
Nitrosomonadaceae	306	4%
Clostridiaceae	255	3%
Peptococcaceae	231	3%
Planctomycetaceae	190	2%
Caldiineaceae	163	2%
Bacillaceae	161	2%
Desulfarculaceae	156	2%
Others	2,074	25%

表 6 集積系の群集構造（岩国）

科名	リード数	%
Anaerolineaceae	2,242	23%
Syntrophaceae	849	9%
Caldilineaceae	723	8%
Peptococcaceae	534	6%
Pseudomonadaceae	525	5%
Clostridiaceae	515	5%
Spirochaetaceae	465	5%
Bacillaceae	360	4%
Syntrophorhabdaceae	357	4%
Geobacteraceae	350	4%
Syntrophobacteraceae	232	2%
Planctomycetaceae	196	2%
Desulfarculaceae	186	2%
Methanobacteriaceae	158	2%
Others	1,860	19%
図２ 各集積系の微生物群集構造

2）安定同位体プローブ法を用いた微生物解析

①各集積系のベンゼン分解とメタン生成

## a）新芝川集積系

2011年5月30日に試験を開始し、同年8月2日に試験が終了した(64日)。添加したベンゼンのうち、 $ ^{12} $ C-系列では91.4%、 $ ^{13} $ C-系列では97.6%が分解された(図3a))。図3b)に気相中の $ ^{13} $ C-メタン濃度を示す。分解されたベンゼンはほぼ1:1の割合でメタンと二酸化炭素に分解された。
図3 新芝川集積系における培養期間中のa) ベンゼン濃度とb) $ ^{13}C-メタン濃度 $ 。●: $ ^{13}C- $ 系列, ○: $ ^{12}C- $ 系列。エラーバーは3連の系における標準誤差。
## b) 手賀沼集積系

2011年8月26日に試験を開始し、同年9月18日に試験が終了した(24日)。添加したベンゼンのうち、 $ ^{12} $ C-系列では18日目で92.5%、 $ ^{13} $ C-系列では95.8%が分解された(図4a))。図4b)に気相中の $ ^{13} $ C-メタン濃度を示す。

図4 手賀沼集積系の培養試験中におけるa) ベンゼン濃度とb) $ {}^{13} $ C-メタン濃度。●: $ {}^{13} $ C-系列, ○: $ {}^{12} $ C-系列。エラーバーは3連の系における標準誤差。
## c) 土浦 A 集積系

ベンゼンは53日目まではほぼ一定の速度で分解( $ [^{12}C] $ -系、 $ [^{13}C] $ -系ともに1.2 mg/L/d)で分解されており、 $ [^{13}C] $ -メタンの生成も確認されている(図5)。しかし、53日目で分解速度が低下し、132日目で添加したベンゼンの分解がほぼ完了した( $ [^{12}C] $ -系で0.3 mg/L/d、 $ [^{13}C] $ -系で0.4 mg/L/d)。ベンゼンの分解量とメタンの発生量は新芝川系と同オーダーである。

図5 土浦A集積系の培養試験中におけるa) ベンゼン濃度とb) $ {}^{13} $ C-メタン濃度。●: $ {}^{13} $ C-系列, ○: $ {}^{12} $ C-系列。エラーバーは3連の系における標準誤差。