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## 目次

総合研究報告書概要 …… 1

本文

1．緒論 …… 8
1.1 研究の概要 …… 8
1.2 研究の必要性 …… 9
1.3 先行研究 …… 10
1.4 研究の目的 …… 12

2．日本の畑地土壌におけるリン可給性の現状～今後の土壌管理・堆肥施用に向けて 13
2.1 はじめに …… 13
2.2 材料および方法 …… 13
2.3 結果および考察 …… 16
2.4 まとめ（黒ボク土のリン施肥に関しての考察） …… 17

3．堆肥化過程における鶏ふん中のリンの溶解性と化学形態の同定 …… 18
3.1 はじめに …… 18
3.2 材料および方法 …… 13
3.3 結果および考察 …… 21
3.4 まとめ …… 26

4．鶏ふん堆肥からのフィチン酸分解菌の分離と堆肥化への利用 …… 28
4.1 はじめに …… 28
4.2 材料および方法 …… 29
4.3 結果および考察 …… 35
4.4 まとめ …… 41

5．有用細菌の添加時期と回数の違いによる鶏ふん中のリン酸濃度への影響検討 …… 44
5.1 はじめに（前章の実験条件の課題） …… 44
5.2 材料および方法 …… 44
5.3 結果および考察 …… 45
5.4 まとめ …… 46

6．総括 …… 49

7．参考文献 …… 52

8．研究発表 …… 56

研究概要図 …… 57
英文概要 …… 58
研究課題名 微生物酵素活性の利用による有機性廃棄物からのリン再資源化に関する研究

研究番号 K112020

国庫補助金 13,583,000 円

研究期間 2011-2013 年

研究代表者名 橋本洋平 （東京農工大学）

研究分担者名 苻田修一 （三重大学）

## 研究目的

本研究の目的は，有機性廃棄物中の難溶性リンを，微生物の作用によって改变し，植物の利用度を高めたリン酸肥料資源として回収することにある．生ごみやふん尿はリン濃度が高いが，全体の50％以上は植物が吸収できないフィチン酸やアパタイトの形態で存在する．これらのリン化合物形態ならびにリンの溶解性が，堆肥化過程でどのように変化するのかが明らかになれば，現行の堆肥化システムの根本的な改良につながる．すなわち，有機性廃棄物のリン利用率を高めるためには，堆肥化の段階で難溶性リンを無機化および溶解させておき，植物が利用できる形態に転換する必要がある．難溶性リンは，有機酸による酸性溶解や，微生物のフィターゼ酵素によって分解できることに着目し，これらの有機酸生成能やフィチン分解酵素をもつ微生物の探査を行う．このような微生物の接種がリン形態の変換に及ぼす作用機構を明らかにし，有機性廃棄物のリン資源化における酵素活用の有効性を示す．将来的には，微生物酵素を援用した新しい堆肥化装置の構築を目標としており，本研究はそのために必要となるデータや知見を得るための基礎的研究として位置づけられる．

## 研究方法

本研究では,有機性廃棄物の中でもリンを多く含む鶏ふんを対象とし,堆肥化過程に
おける鶏ふん中のリンの形態を，微生物添加による作用によって改变し，植物に対するリンの利用度が高い（水溶態のリンが多い）堆肥を作成することを目的とした．鶏ふん中のリンの化学形態を，堆肥化の過程で微生物酵素を用いて，作物が吸収しやすいリン形態に改变するという着想である．その研究全体のイメージを図Aに示す．具体的には以下の項目について実験を行った．

図 A 鶏ふん中のリンの化学形態の改変に着目した研究構想と方法

## 1 ) 堆肥化過程における鶏ふんに含まれるリンの化学形態の定性・定量

鶏ふんに含まれるリンは,難溶性のフィチン酸ならびにアパタイトとして存在していることが報告されている。しかし,堆肥化の過程でこれらのリン形態が,どのように変化するのかについては分かっていない。鶏ふん中の難溶性リンを植物が利用できるようにするためには,堆肥化の過程で生物可給性の形態に変化させる必要がある。このような手法を取り入れて,作物に対する肥料効果（肥効）の高い堆肥を製造するためには,堆肥化を迅速に進めることを一義的な目的とした現行の堆肥化システムを改良・再構築する必要性が課題として挙げられる。そのために必要となるのが,現在用いられている堆肥化システムから製造される堆肥中のリンの化学状態（リンがどのような形態で存在しているのか）を明らかにするという研究である。鶏ふんの堆肥化の過程において,リンがどのような形態で存在しているのか,ならびにこれまで推測されているリン形態である難溶態のフィチンや,水溶態のリンなどの各種形態が,確かに存在しているか,また堆肥化期間を通じての変化量を解明することに取り組んだ。

## 2 ）リン形態変化に関わる微生物酵素の探索と機能評価
（1）の研究の結果をふまえ，未熟なふん尿堆肥から，フィチン酸分解能（フィターゼ）ならびにアパタイト溶解能の高い有機酸を生産する菌株を探索する．フィターゼ生産菌はフィチンを含有した寒天平板培地でのハロー形成によるコロニー選択法，有機酸生産菌については，pH指示薬を混合した寒天培地，または炭酸カルシウムを含む寒天培地によるコロニー選択法で単離を行う．単離した菌株については，16S rRNA遺伝子による種の同定を実施し，培養可能性やリン溶解機能を評価した．

## 3 ）堆肥化プロセスにおける有用細菌の添加がリン形態変化に及ぼす効果の解明

（２）で同定した有用菌株を鶏ふんに添加し，実験室の堆肥化装置を用いて，鶏ふん中のリン形態の変化に及ぼす機能を評価する．また，添加菌株についてはDGGE法によって菌の動向をモニターする．堆肥化過程で鶏ふんに含まれるリンの溶解性の変化を追跡し，菌株の添加による効果を明らかにする．また，堆肥化過程における菌株の添加回数や時期についても併せて検討する．

## 結果と考察

## 1 ）堆肥化過程における鶏ふん中のリンの化学形態の定性・定量

三重県内の養鶏施設に隣接する堆肥化装置から，鶏ふん堆肥を堆肥化開始0日目から7日目まで毎日採取し，化学分析に供した．堆肥中におけるリンの化学形態を逐次抽出法によって分析し，それぞれ水抽出態NaHCO₃抽出態，NaOH抽出態，HCl抽出態に4分画した．核磁気共鳴法，X線回折法等を用いて，堆肥中のリン化学形態を分析した．

堆肥化の進行に伴って，鶏ふん堆肥中の水溶性リンが全体の18%（0日目）から7%（7日目）に減少することが確認された．堆肥化が進むにつれて，水抽出されるような弱い結合状態のリンが，塩酸抽出態の難溶態リンに変化していくことが明らかとなった．鶏ふん堆肥中のリンは，カルシウムと結合した形態で存在していることが確認された．NMR法による分析の結果，堆肥化の進行に伴ってフィチン態のリンが増加することが明らかにされた．また，X線回折による分析結果では，水酸アパタイトとしてリンが存在していることも明らかにされた．これらの結果は，堆肥化の過程において鶏ふん中に生物可給性の低い難溶形態のリン（フィチン，アパタイト）が増加することを示唆している．本成果を鑑みて，有用細菌の探査は，アパタイトやフィチン態のリンを溶解する酵素をもつ細菌に限定して実施された（結果2）.
## 2 ）難溶性リンを溶解する機能をもつ有用細菌の探索

堆肥化過程にある鶏ふん堆肥中より，フィチン酸分解活性をもつ細菌のスクリーニングを行った．鶏ふん堆肥よりフィターゼ活性をもつ細菌をPSM培地で分離した．培地に白いハローを形成し，生育の旺盛だった細菌を単離した．1次および2次スクリーニングにより，7細菌種を分離することができた．これらの細菌種について，16S rRNA遺伝子配列による簡易同定を行ったところ，Sphingomonas属，Burkholderia属，Bacillus属3種，Microbacterium属，Gordonia属に属することがわかった．これらのうち，Sphingomonas属とBurkholderia属の菌種は，不溶性フィチンに対し高い可溶化活性を示し，なおかつ60℃の高温でも，良好な生育を示した．単離したフィチン酸分解菌のDNA塩基配列を同定し，BLAST解析をした結果，Burkholderia gladiolis BSR3（99%）と相同性があった．

## 3 ）有用細菌を添加した鶏ふん堆肥中のリン溶解性に関する研究

（２）で単離培養したフィターゼ生産細菌を添加した結果，添加後２日間の水溶性リン酸濃度が上昇することが確認された．そこで，当該細菌を堆肥化過程で３回添加したところ，当該細菌を添加しない場合，１回添加の場合，ならびに試薬のフィターゼを添加した場合と比較して，堆肥化終了時の水溶性リン酸濃度は，堆肥化終了時に有意に増加した（1500mg/kg増加）.

本研究で単離培養に成功した当該細菌は,おそらくほとんどの鶏ふん堆肥化装置で生育している普遍的な種であると考えられ,類似の菌種も存在していると推察される.本研究の菌株を利用,あるいはそれぞれの堆肥化装置の鶏ふんから単離された菌株を利用することによって,本研究で示された微生物酵素を利用した堆肥化の手法は,実用技術になりうると期待される.また,この手法は他の有機性廃棄物にも応用可能であると考えられる.そのためには,本研究で示されているように,堆肥化をする試料(有機性廃棄物)中のリンの化学状態を詳細に分析し,そのリン形態を分解することができる酵素を生産する細菌類(特に高温耐性を有する)を単離・培養するという手順をとることが合理的である.
## 環境政策への貢献

（１）有機性廃棄物のリン再資源化における微生物酵素利用の有効性について

肥料としての家畜ふん中のリンを作物に供給されやすくするために，鶏など単胃動物の飼料に試薬のフィターゼ（酵素）を添加し，飼料中に多く含まれる難溶態のフィチン態リンを溶解させてふん中に排出させる方法が開発されている．また，家畜ふんの堆肥化の過程で，フィターゼを添加することによって溶解性の高いリンを含む堆肥を作成するという方法も，実験的に行われている．しかし，いずれの方法も，試薬を用いるため費用が高く，元来廃棄物である家畜ふんの堆肥化技術として普及していない．

一方，本研究では鶏ふん堆肥の発酵時に生育している細菌のなかから，フィターゼを放出する種を単離・培養し，それを鶏ふんの堆肥化に添加するという方法を検討した。この方法は，目的の細菌が探査でき，それが培養できることが分かれば，その後の費用は細菌の維持・培養管理のみであることから，費用は初期投資（大学や研究所に委託する菌体探査と，その後の菌体維持のための培養装置の購入）のみで対応できると考えられる。

本研究で単離培養に成功した当該細菌に類似した種は,おそらくほとんどの鶏ふん堆肥化装置で普遍的に生育していると推察される。本研究では,まず鶏ふん中に含まれるリンの化学形態をフィチン酸と水酸アパタイトであることを同定し,その知見からフィチン酸を溶解するフィターゼ酵素をもつ細菌種をターゲットとして,発酵中の鶏ふんから探査した.この細菌種が堆肥化条件の高温環境下で培養可能であることが分かり,堆肥化過程に添加したところ,堆肥化完了後に鶏ふん中の水溶性のリンが有意に増加することが確認された.この結果は,本研究の最終目的である「有機性廃棄物のリン資源化における酵素活用の有効性」を示すものである.

本研究で単離された菌株 ,あるいは各地の堆肥化装置の鶏ふんから単離された菌株を堆肥化過程で添加することによって ,本研究で提案した「微生物酵素を利用した堆肥化技術」は実用技術になりうると期待される .また ,この手法は他の有機性廃棄物にも応用可能であると考えられる .そのためには ,本研究で示されているように ,堆肥化をする試料（有機性廃棄物）中のリンの化学状態を詳細に分析し ,そのリン形態を分解することができる酵素を生産する細菌類（特に高温耐性を有する）を単離・培養するという手順をとることが合理的である .
（２）日本の畑地土壌のリン可給性の評価方法の改良について

リンの土壌蓄積は黒ボク土と呼ばれる土壌において極めて多く，河川へのリン移行を考えるうえで潜在的なリン源となる．黒ボク土は，日本の畑地面積の47％を占めることからも，近年の黒ボク土のリン可給性の調査は，今後のリン施肥に関する指針を決めるうえでの重要な情報を寄与できると考えられる．黒ボク土は，アロフェン鉱物の有無（アロフェン質・非アロフェン質）によって，リンの吸着特性が異なることが，本研究で全国1300地点の土壌データを解析することによって明らかにされた．

国内で広く用いられている土壌リンの診断法は，リン酸吸着能が同じ黒ボク土であっても，アロフェン質と非アロフェン質黒ボク土では，作物に対するリン酸供給量を等しく示さない．それは，両黒ボク土のリン酸吸着機構が異なるためである．リン吸着特性がアロフェン質と非アロフェン質黒ボク土で異なることを示した本研究の知見は，2つの黒ボク土に対してのリン施肥ならびに土壌管理の指針を別々に提示する必要があることを示唆している．このように同じ黒ボク土であってもリンの可給性を評価する土壌診断法や，土壌施肥管理法を区別して評価・設定することによって，より高度な環境保全型の農業が可能になり，農地から流出するリンを制限し，下流域の富栄養化を抑制することに貢献できると考えられる．特に，環境保全に配慮した堆肥の施用法を確立するうえで，本研究の成果は重要な知見を提案するものである．

## 研究成果の実現可能性

これまで報告されている試薬の酵素を添加した堆肥化の手法は，費用が高く，生ごみや家畜ふんなどの廃棄物の処理方法としては不向きである．一方，本研究の有用菌株を利用，あるいはそれぞれの堆肥化装置の鶏ふんから単離された菌株を利用することによって，本研究で示された微生物酵素を利用した堆肥化の手法は，実用技術になりうると期待される．また，本法は培養細菌を添加するという単純な作業であるため，現行の堆肥化設備を変更することなしに，適用することができる．費用は初期投資（大学や研究所に委託する菌体探査と，その後の菌体維持のための培養装置の購入）のみで対応できると考えられる．また，この手法は他の有機性廃棄物にも応用可能であると考えられる．本研究を基礎にしたフィチン酸分解菌を添加した堆肥化システムの構築には，実際の現場試験を行い，堆肥化時間，温度，通気など，堆肥化の環境条件を検討する必要がある．
## 結論

本研究の主な成果をまとめると，次の３点に集約される．

(1) 堆肥化の進行に伴って，鶏ふん中に含まれる水溶性リン酸濃度が低下することが確認された．具体的なリン形態としては，堆肥化進行に伴って増加する難溶態のリンは，フィチン酸ならびに水酸アパタイトのようなカルシウム結合態の無機化合物である可能性が高いことが示唆された．

(2) 堆肥化の過程でフィチン態リン酸を分解するフィターゼ生産細菌を，鶏ふん堆肥から分離し，その種はBurkholderia sp.と同定された．当該細菌は，堆肥化の高温条件で培養可能であることを確認した．

(3) 鶏ふんの堆肥化過程で単離培養したフィターゼ生産細菌を添加した結果，添加後2日間の水溶性リン酸濃度が上昇することが確認された．そこで，当該細菌を堆肥化過程で3回添加したところ，当該細菌を添加しない場合ならびに試薬のフィターゼを添加した場合よりも，堆肥化終了時の水溶性リン酸濃度は，堆肥化終了時に有意に増加した（1500mg/kg増加）.
### 1. 緒論

### 1.1 研究の概要

有機性廃棄物に大量に含まれるリンの3R促進は，リン原料の国際価格が高騰している現状において，国内消費のリンの全量を輸入している日本の緊急課題である.輸入リン鉱石の80%が肥料用途であることからも，有機性廃棄物のリンを肥料として再資源化する意義は大きい.地球規模で起きている環境問題を炭素，窒素，リンの関係から見てみると，生ごみ，下水污泥，家畜ふん尿などの有機性廃棄物を回収し，メタン発酵後，残渣に濃縮されるリンを肥料として循環させることが解決策として見えてくる.

有機性廃棄物のし尿ならびに家畜ふん尿からのリン回収技術は，一般的に処理過程で固液分離される晶析法が適用されている（白毛2005，鈴木2002）。晶析法は，リン酸マグネシウムアンモニウム（MAP）によるリン回収と，カルシウムアパタイト（HAP）によるリン回収の2つの方式をとることが可能である。MAPによる回収は，アンモニアの存在する生物処理の前段階で行われ，一方，HAPによる回収は，アンモニアの存在しない生物処理後の段階でリン回収が実施される（Doyle and Parsons，2002）。両方式の特徴を表1-1にまとめた。いずれの方法も，マグネシウム塩やカルシウム塩，ならびにpH調整のための試薬を添加して，曝気処理を搭載したリアクターが必要となるが，純度の高いMAPおよびHAPとしてリンを回収することが可能である。また，家畜ふん尿などに含まれる重金属類を，処理過程で除去できることから，回収されたリンを肥料として用いる場合には，有害金属が土壌へ蓄積することのリスクが軽減でき，工業用途への転用も容易になる。一方，これらの方法は，大規模なプラント建設が必要になり，目的の化学形態（MAP，HAP）としてリンを回収するためには，マグネシウムやpH調整の薬剤を添加して反応を進行させる必要がある。また，回収されるMAPおよびHAPの溶解性は低く（溶解度積10^{-13}および10^{-44}M），肥料として農地に施用した際に，作物に吸収される前に，土壤の腐植や粘土鉱物などの構成成分と吸着し，リンの利用度がさらに低下してしまう（Schounans，2000）。すでに日本の農地は，長年の施肥によりリンが過剰状態にあり，作物の根こぶ病などの病害発生の一因（村上ら2004）となっていることを鑑みるとMAPおよびHAP態として回収したリンを肥料用途として農地施用は適さない。したがって，肥料用途として有機性廃棄物を利用する際の条件としては，廃棄物中のリンが作物に吸収されやすい状態，すなわち水溶性リンの割合が多いことが重要であり，そのような堆肥を用いることによって，リン施用量や環境負荷の低減が可能になると考えられる。
既往の有機性廃棄物のリン再利用に関する研究は，廃棄物中からリンを化学的プロセスによって回収するという方法が採用されている．肥料として家畜ふん尿などの有機性廃棄物を利用する場合には，（1）堆肥そのものが安価であるため，必ずしも純度の高いリンを回収する必要はないこと，（2）作物に利用されやすい水溶性リンをを多く含むこと，（3）既存の堆肥化装置に設置可能な技術手法が必要になることの3点が条件として挙げられる．特に有機性廃棄物の再利用を促進・普及するということの重要性を鑑みると，新たなプラントを製造することは現実的な方策ではなく，項目（3）で示したように，畜産農家が所有している既存の堆肥化装置に組み込むことができる技術を検討することが必要になってくる．

表 1-1 MAP 法と HAP 法による有機性廃棄物からのリン回収

回収法	MAPによる回収法	HAPによる回収法
概要	アンモニアとリン酸が共存する場合に, マグネシウムを添加して窒素とリンを同時にリン酸マグネシウムアンモニウムとして回収する.	リン酸が存在する場合に, カルシウム塩を添加してヒドロキシアパタイト(リン酸カルシウム)として回収する.
適応箇所	前凝集処理後, 生物処理の前段階	生物処理後(膜分離後), 高度処理の前段階
反応式	PO43-+NH4++Mg2++6H2O→MgNH4PO4·6H2O	6PO43-+10Ca2++2OH→Ca10(OH)2(PO4)6
処理pH	8.5	7.5

白毛(2005)，Doyle and Parsons(2002)を参考

本研究では，微生物酵素の作用を利用し，有機性廃棄物中の難溶性リン形態を植物が容易に利用できる形態に転換し，肥料資源としてリンを再資源化する方法の確立を目指す．生ごみやふん尿から目的とする微生物を単離し，実際の堆肥化過程におけるリン形態の変化に及ぼす機能を評価し，回収したリンの肥料資源としての有効性を評価する．

### 1.2 研究の必要性

廃棄物の総排出量の 60%を占める有機性廃棄物は，リンなどの養分に富むことから，肥料として再資源化し農地に還元する措置が，リンの3Rの観点から最も安価に大量に活用できる方法である．リン鉱石の枯渇と価格高騰が懸念される現状において，日本で
は輸入されるリン鉱石の80%が肥料用途であることや，リン酸肥料の施用量が世界1位であること，それによって長年の過剰施肥により水系の富栄養化が引き起こされている状況を鑑みても，肥料資源として有機性廃棄物のリン3Rを促進することは急務である．これまで報告されている廃棄物からのリン回収法（前述のHAP，MAP態）は，新たなプラント建設が必要となるため，既存の堆肥化装置を利用することが難しい．HAPやMAP態として回収されたリンの多くは肥料として用いられているが，すでにマグネシウムやカルシウムと結合しているため，土壤中で溶解しにくいうえ，作物に吸収される前に土壤の構成成分と吸着することによって最終的に土壌へのリン蓄積が促進される可能性が高い．これらの問題点を鑑みると，（1）コスト減を図るため，有機性廃棄物からリンを回収することなく，そのまま堆肥化させて利用することの必要性，（2）そのためには，廃棄物中のリンがHAPやMAP態ではなく，作物に吸収されやすい水溶性のリンを多く含む必要があること，（3）既存の堆肥化装置をそのまま用いて，微生物酵素を利用した（2）の成分改变を行うことができる方法を検討することが必要になる．将来的に，作物にとって有効なリンの多い（=水溶性リンを多く含む）有機性廃棄物の堆肥製造法を確立するためには，主としてこれまで明らかにされていない（1）堆肥化過程におけるリン化学状態（アパタイトフィチン態）と溶解性，（2）リン溶解酵素を放出する細菌の単離・培養，の2点についての基礎的研究が必要になる．

### 1.3 ．先行研究

有機性廃棄物のし尿ならびに家畜ふん尿からのリン回収技術は，一般的に処理過程で固液分離される晶析法が適用されている（白毛2005，鈴木2002）。晶析法は，リン酸マグネシウムアンモニウム（MAP）によるリン回収と，カルシウムアパタイト（HAP）によるリン回収の2つの方式をとることが可能である（表1-1）。MAPによる回収は，アンモニアの存在する生物処理の前段階で行われる。溶液中のリン酸とアンモニウムイオンおよびマグネシウムイオンの反応によって生成するリン酸マグネシウムアンモニウム[MgNH₄PO₄]の晶析現象を利用したものである。本方式はリンとアンモニウムを含む液が対象となる。嫌気性消化槽の脱水分離液にMg²⁺を添加し弱アルカリ領域でMAPを生成させる（田中ら2005，白毛2005）。一方，HAPによる回収は，アンモニアの存在しない生物処理後の段階でリン回収が実施される（Doyle and Parsons，2002）。溶液中のリン酸とカルシウムイオンの反応によって生成するアパタイト[Ca₁₀(OH)₂(PQ₄)₆]の晶析現象を利用したものである。本方式では，リンを含む液にCaおよび水酸化物イオン
を含むアルカリ資材を添加し，過飽和状態（準安定領域）にした後，脱リン槽に導き，槽内の脱リン材と接触させることにより，ろ材表面にアパタイト結晶を析出させ液中のリンを回収する．HAP法では処理水のリン濃度を1 ng/L以下にすることが可能である（田中ら2005，白毛2005）.

これらの方法に対して，有機性廃棄物を堆肥化して，それに含まれるリンを肥料として利用する方法は，廃棄物をより大量に再資源化することが可能になると考えられる．そのためには，これまでの堆肥と同等の製品を製造するのではなく，土壌に添加した際に，作物に吸収されやすい水溶性のリンを多く含む堆肥を製造することによって，現在問題となっている土壌へのリン蓄積，流亡による湖沼の富栄養化，ならびにリン資源の再資源化の課題の解決につながる．有機性廃棄物である家畜ふん尿中に含まれているリンは，有機態のフィチン態で存在していることが報告されている．（Turner，2004；Toor et al.，2005；Seiter et al.，2008）．フィチン態リンは溶解しにくく，分解されて無機化されなければ作物に利用されない．したがって，ふん尿を堆肥化する過程でフィチン態リンを分解させる必要があるが，そのためにフィチン分解酵素であるフィターゼを添加する方法が先行研究として報告されている（Maguire et al.，2004）．しかし，フィターゼ酵素は高額であり（例40000 yen/5g，Signa-Al drich），大量のふん尿に添加して堆肥化を行うことは，費用面において現实的でない．そこで，対象とする有機性廃棄物から，フィターゼ放出細菌を単離・培養し堆肥化過程で接種することができれば，難分解性のフィチン態リンを堆肥化過程で分解することが可能になると考えられる．この方法が確立できれば，既存の堆肥化装置に組み込むことによって，特別な施設が不要でコスト面で有利な有機性廃棄物の堆肥化によるリン再資源化につながる．しかし，堆肥化された有機性廃棄物中のリンの溶解性に関する報告は散見されるが（伊藤ら2010），堆肥化の過程においてフィチンやアパタイトなどのリンの化学形態がどのように変化するのかに関する基礎的な知見は見当たらない．また堆肥化された有機性廃棄物から，フィターゼなどのリン溶解酵素を放出する有用細菌の単離に関する基礎的な研究も報告されていない．したがって堆肥化による有機性廃棄物のリン再資源化を実用レベルにまで到達させるためにはこれらの基礎的知見が不足しており本研究はそのための研究として位置づける．
### 1.4 研究の目的

本研究の目的は，有機性廃棄物中の難溶性リンを，微生物の作用によって改变し，植物の利用度を高めたリン肥料として再資源化することにある．本研究では有機性廃棄物のなかでもリン含有量が多い鶏ふんを対象とした．はじめに，これまで明らかにされていない堆肥化過程の鶏ふんに含まれるリンの化学形態の定性・定量の変化について，実際の堆肥化装置の試料を分析し，明らかにすることを目指した．発酵過程にある鶏ふん堆肥から，フィチン酸分解能（フィターゼ）ならびにアパタイト溶解能の高い酵素を生産する菌株を探索し，種の同定をすることを目的とした．次に，この有用細菌を鶏ふんに添加し，実験室の堆肥化装置を用いて，鶏ふん中のリン形態の変化に及ぼす機能を評価した．ここで，堆肥化過程における菌叢の変化を追跡し，細菌添加の効果をリンの溶解性の挙動と併せて評価することを目指した．具体的には，堆肥化後の鶏ふんに含まれる水溶性リンの割合を増加させることによって，有用細菌の添加による効果を検証することにした．

加えて,現在起こっている日本の農地のリン過剰問題は,本研究で取り組む堆肥開発と併せて早急に対応すべき事項である.リンの土壤蓄積は,日本の黒ボク土において極めて多く,河川へのリン移行を考えるうえで潜在的なリン源となる.黒ボク土は,日本の畑地面積の47％を占めることからも,近年の黒ボク土のリン可給性の調査は,今後のリン施肥に関する指針を決めるうえでの重要な情報を寄与できると考えられる.このような課題を鑑みて,土壌のリンの吸着特性を既存のデータから纏め上げ,現在広く用いられている土壌のリン可給性評価の手法についての提言を行った.
2. 日本の畑地土壤におけるリン可給性の現状～今後の土壤管理・堆肥施用に向けて

### 2.1 はじめに

日本の土壌は，リンを特異的に吸着する酸化アルミニウム・鉄鉱物を多く含むため，作物へのリン供給が制限されやすいという性質をもつ.肥料として施肥されたリンのほとんどは，これらの鉱物と吸着して不溶化される.土壌のリン制限の問題を回避し，作物に対するリンの要求量を満たすためには，リン肥料を土壌に大量に投入し，作物が吸収可能な土壌溶液中のリン濃度を増加させる必要がある.これまで長期間にわたって，土壌への大量のリン肥料の施用が，土壤管理法の指針のひとつとして奨励されてきた.その結果，農地のリンは過剰に蓄積されており，土壌流亡による湖沼の富栄養化や，作物への過剰障害を引き起こしている(村上ら，2004).全国の水田土壌の53%の可給態リン含量は，地力増進基本指針に基づく上限値を超えて蓄積しており，多くの圃場で施肥が過剰となっていることが報告されている（農林水産省，2010）.

リンの土壌蓄積は黒ボク土において極めて多く，河川へのリン移行を考えるうえで潜在的なリン源となる．黒ボク土は，日本の畑地面積の47％を占めることからも，近年の黒ボク土のリン可給性の調査は，今後のリン施肥に関する指針を決めるうえでの重要な情報を寄与できると考えられる．黒ボク土は，アロフェンの有無（アロフェン質・非アロフェン質）によって，リンの吸着特性が異なることが知られている（Wada and Higashi, 1976; Wada and Gunj i gake, 1979; Wada and Wada, 1985）.しかし，日本全国の土壌を対象としたデータは多く存在するものの，それらを統合してアロフェン質と非アロフェン質黒ボク土におけるリン吸着挙動が明らかにされていない．そこで本研究では，既報のリン吸着量の土壌データを用いて，アロフェン質ならびに非アロフェン質黒ボク土のリン吸着特性について統計手法を用いて明らかにした．

#### 2.2. 材料および方法

## 1 ）土壤分析とパス解析

本研究では，日本全国のアロフェン質および非アロフェン質黒ばく土671地点のデータについて，リン吸着と最も関係している土壌特性をパス解析によって特定することを目的とした．土壌データは，松山(1994)から引用した．松山(1994)は，沖縄県を除くすべての都道府県に分布する黒ボク土の基本性質を網羅的にまとめており，データベースとして適していると判断した．

土壤はすべて 2mm以下に篩別したものを分析した．土壌のリン酸吸着量は，2.5%のリ
ン酸ニアンモニウム溶液(pH7)に，土壌・溶液の比が1:2になるように混合し，24時間後に溶液中のリン酸濃度を測定することによって求めた(Blakenore et al., 1987). 溶液中のリン酸濃度は，モリブデンブルー法によって定量した．0.2Mのシュウ酸溶液を用いて，土壌中の非晶質画分に属するアルミニウム，鉄，ケイ酸を抽出した（シュウ酸可溶画分）(Blakenore et al., 1987). 0.1Mのピロリン酸ナトリウム溶液を用いて，腐植結合の画分に属しているアルミニウムと鉄を抽出した（ピロリン酸可溶画分）(Weaver et al., 1968). 抽出された溶液中の元素は，原子吸光光度計（Al, Fe）ならびに比色法（Si）で測定した．土壌の有機物含有量は550度の灰化後に減少した質量を測定して求めた(Hopkins, 1996). その他の土壌分析法については，松山(1994)に記載されており，本報告では関連する土壌分析法について記述した．

土壤のリン酸吸着量は，非晶質および腐植結合態のアルミニウムと鉄，有機物および粘土含有量，土壤pHなどと相関があることが知られている（Wada and Higashi, 1976; Wada and Gunj i gake, 1979; Wada and Wada, 1985; Sai gusa et al., 1991; Hiradate and Uchida, 2004; Takahashi et al., 2007）。しかし，これらの土壤特性は，いずれもリン酸吸着量と強い相関を示すことが多く，どの特性がリン酸吸着量に対して本質的な因果関係となっているのかは，単相関係数を比較するだけでは分からない。このようなリン吸着に及ぼす土壤特性の複雑な因果関係の連鎖は，パス解析と呼ばれる統計手法（複数の重回帰分析の組合せ）によって，どの土壤特性が最も重要で，しかも直接的あるいは別の要因を介して間接的にリン吸着に関係しているのかをパス係数（Pc）を比較して明らかにすることができる（Williams et al., 1990; Kang et al., 2009）。パス解析の構成を図2-1に示す。大文字のPはパス係数，小文字のrが土壤特性間の単相関係数を示している。例えば，パス係数を加味したAl ox（シュウ酸可溶性Al）とPRC（リン酸吸着量）の相関係数（ $ r_{16} $ ）は， $ r_{16} = P_{16} + r_{12}P_{26} + r_{13}P_{36} + r_{14}P_{46} + r_{15}P_{56} $ のように表現される。

パス解析を実行する前に，アロフェン質および非アロフェン質黒ボク士におけるリン吸着量に対して，いずれの土壌性質が強い相関をもつのかを解析した（単相関解析）.その結果，シュウ酸可溶性Al，Fe（=非晶質Al，Fe），ピロリン酸可溶性Al，Fe（=腐植結合態Al，Fe），腐植含有量の5つの特性が，アロフェン質および非アロフェン質黒ボク士のリン吸着量と高い相関を示した（図2-2，表2-1）.したがって，これらのパラメターをパス解析に用いた.
図 2-1 パス解析の構成 . Al ox , Feox: シュウ酸可溶性 Al , Fe(=非晶質 Al , Fe), Al p , Fep: ピロリン酸可溶性 Al , Fe(=腐植結合態 Al , Fe), QM: 腐植, PRC: リン酸吸着量, U: 残さ

図2-2 アロフェン質（赤）および非アロフェン質（白）黒ボク土のリン吸着（リン酸吸収係数）に対するシュウ酸可溶性 Al・Fe（Al ox, Feox），ピロリン酸可溶 Al・Fe（Al p, Fep）の関係
### 2.3 結果および考察

アロフェン質黒ぼく土のリン酸吸着量は，酸性シュウ酸溶液で抽出された非晶質アルミニウム（ $ Al_{ox} $ ，r=0.72）および鉄（ $ Fe_{ox} $ ，r=0.56）の濃度と相関が見られた（図2-2，表2-1）。しかし，パス解析の結果は， $ Al_{ox} $ がリン酸吸着量の増加に最も直接的に関わっている土壌特性であり（ $ Pc=0.71 $ ）， $ Fe_{ox} $ （ $ Pc=0.01 $ ）との直接的な効果は認められなかった。非アロフェン質黒ぼく土についての単相関解析では， $ Al_{ox} $ （r=0.77）， $ Fe_{ox} $ （r=0.60）ならびにピロリン酸で抽出された腐植結合態のアルミニウム（ $ Al_{p} $ ，r=0.76）と有機物含有量（r=0.55）が，それぞれリン酸吸着と高い相関を示すことが確認された。一方，パス解析では， $ Al_{p} $ の増加がリン酸吸着量の増加に対して最も直接的に関係している土壌特性であり（Pc=0.60），有意な単相関を示した $ Al_{ox} $ が，リン酸吸着量に対して直接的に作用している要因であるとは認められなかった（Pc=0.24）。非アロフェン質黒ぼく土の有機物含有量は，リン酸吸着量の増加に対しての直接的な効果が見られなかったが， $ Al_{p} $ の増加を伴って間接的にリンの吸着量を増加させていることが分かった。このような有機物含有量の間接効果によるリン吸着量の増加は，アロフェン質黒ぼく土では見られなかった。

表2-1 パス解析によるアロフェン質と非アロフェン質黒ボク土のリン吸着に及ぼす土壌特性の直接・間接効果．下線の数値がリン吸着量に及ぼす各土壌特性の直接効果（相関係数），それ以外は間接効果．各行の数値の総和が単相関係数(r)となる．

Variable†	Alox	Feox	Alp	Fep	OM	r	R²	U‡
Allophanic soils (n = 394)
Alox	0.71*	0.01	-0.04	0.00	0.04	0.72*	0.57	0.66
Feox	0.54	0.01	-0.02	0.00	0.03	0.56*
Alp	0.28	0.00	-0.10	0.18	0.10	0.46*
Fep	-0.01	0.00	-0.08	0.23*	0.08	0.22*
OM	0.24	0.00	-0.09	0.16	0.12	0.43*
Non-allophanic soils (n = 277)
Alox	0.24*	0.13	0.52	-0.08	-0.05	0.77*	0.65	0.59
Feox	0.13	0.25*	0.28	-0.10	-0.02	0.53*
Alp	0.21	0.12	0.60*	-0.10	-0.07	0.76*
Fep	0.14	0.18	0.45	-0.14	-0.05	0.60*
OM	0.16	0.07	0.48	-0.08	-0.08	0.55*

* Significant at p < 0.05.

$\pm \mathrm{Al}_{\mathrm{ox}}$ and $\mathrm{Fe}_{\mathrm{ox}}$, oxalate-extractable Al and Fe, respectively; $\mathrm{Al}_{\mathrm{p}}$ and $\mathrm{Fe}_{\mathrm{p}}$, pyrophosphate-extractable Al and Fe, respectively; $\mathrm{OM}$, organic matter. $\pm$Uncorrelated residue.
### 2.4 まとめ（黒ボク土のリン施肥に関しての考察）

本研究では,同じ黒ボク士であってもアロフェン質と非アロフェン質ではリンの吸着に関係している土壌コロイドが異なることが,650地点の日本の黒ボク土データの統計解析によって網羅的に明らかにされた.本研究の結果は,リンの吸着メカニズムを明らかにするために,限定された数種類の黒ボク土試料を用いて実施された研究結果と一致した(伊藤ら,2011).このことは,日本各地に分布している畑地の黒ボク土について,それらの作物へのリン可給性が異なることを意味している.

リンの吸着挙動は，アロフェン質黒ボク土ではシュウ酸抽出のAl（非晶質Al），非アロフェン質黒ボク土ではピロリン酸抽出のAl（腐植結合Al）と密接に関係していたことから，これらの抽出法を使い分けることによって，それぞれの黒ボク土のリン吸着がより適切に評価できると考えられる．リン吸着に関係している土壌コロイドが，アロフェン質と非アロフェン質黒ボク土で異なることは，それぞれの土壌に対してのリン施肥ならびに土壤管理の指針を提示する必要があることを示唆している．このように同じ黒ボク土であってもリンの可給性を評価する土壌診断法や，土壌施肥管理法を区別して評価・設定することによって，農地から流出するリンを制限し，下流域の富栄養化を抑制することに貢献できると考えられる．特に，環境保全に配慮した堆肥の施用法を確立するうえで，本研究の成果は重要な知見を提案するものである．本研究の成果は以下の論文等で発表されている．

Hashimoto, Y., Kang, J., Matsuyama, N., and Saigusa, M. 2012. Path analysis of phosphorus retention capacity in allophanic and non-allophanic Andisols. Soil Science Society of America Journal. 76:441-448

● 橋本洋平, Jihoon Kang, 松山信彦, 三枝正彦. 2012. アロフェン質と非アロフェン質黒ぼく土のリン酸吸着機構に直接的に関係している土壌化学性の特定: 全国 671 地点データのパス解析. 日本ペドロジー学会 (首都大学 3/6)
3 堆肥化過程における鶏ふん中のリンの溶解性と化学形態の同定

#### 3.1. はじめに

現在リン酸の年間生産量は $ P_{2}O_{5} $ 換算で約 4000 万トンである．これは，約 1 億 4000 万トンのリン鉱石に相当する．しかし，過去のリン消費量の増加率に従って，リン肥料の消費が年間 3 % ずつ増加すると仮定すると，2060 年代には現在の約 5 倍に当たる年間消費量 2 億トンを超えることとなり，経済的に採掘できるリン鉱石はすべて枯渇すると考えられている（Matsubae-Yokoyama et al.，2009; Doolette and Snernik，2011）また，日本がリン資源の 100% を海外から輸入していることから，国内の農作物の価格は，海外の需給状況に左右されやすいことがいえる．前述したように，日本の土壤が高い吸着特性を有するため，作物へのリン供給を満たすために，長期的にリン肥料を大量に投入することが行われてきた．それに伴って，過剰なリンが農地に蓄積され，土壤流亡による湖沼の富栄養化や，作物への過剰障害を引き起こしている（村上ら，2004）．リン資源の欠乏と農地のリン過剰の問題は，肥料の製造ならびに施用と密接に関係している．営農の経営費における肥料費の割合は，水田経営で 8%，畑作経営で 16% であり（農林水産省 2009），リン酸の施用量と肥料単価を鑑みると，今後のリン原料の価格上昇によって，経営費に占める肥料費の割合はさらに増加することが予想される．

世界的なリン資源枯渇の問題を解決するための対策の一つとしては，家畜ふん堆肥等の国内の有機資源に豊富に含まれるリンを有効に利用し，肥料自給率を向上させ，海外資源の需給状況などによる影響を低減させることが挙げられる．堆肥の平均的なリン酸含有量は，牛ふん堆肥が20600 ng kg⁻¹，豚ふん堆肥が41100 ng kg⁻¹，鶏ふん堆肥が51300 ng kg⁻¹であることが報告されている（塩崎，2008）．本研究では，最もリン酸含有量の高く，潜在的なリン利用の可能性を有している鶏ふんに着目した．

これまで様々な家畜の堆肥製品に含まれるリンの可溶性や，逐次抽出法による溶出分画についての知見は報告されている．例えば，伊藤ら(2010)は様々な家畜に含まれているリンを逐次抽出法(Frossard et al.，1994)で分画した結果をまとめている．この報告によると，採卵鶏ふん堆肥中に含まれる易溶性リン酸(作物に吸収されやすいリン)の割合は，全リン酸含有量の30.7%であることが分かった．また，牛ふん堆肥の易溶性リン酸は約70%，豚ふん堆肥の易溶性リン酸は約50%であった．つまり，鶏ふん中のリン酸含有量は牛ふんや豚ふんと比較して高いにも関わらず，生物に利用されやすい形態のリンの割合が少ないことが明らかにされた．この理由の一つとしては，飼料中の植物由来のリンがフィチン酸の形態で存在しているため，フィターゼ等の消化酵素を持たない鶏などの単胃動物のふん中にはフィチン酸のような難溶態リンが多く含まれること
が挙げられる．したがって，鶏ふん中の難溶性リンを植物が利用できるようにするためには，堆肥化の過程で生物可給性の形態に変化させる必要があり，将来的なリンの有効活用のための方向性としては，既往の堆肥化プロセスの改良，ならびに新しい堆肥化システムを構築することが課題として挙げられる．そのためには，鶏ふん中や，堆肥化の過程におけるリンの化学形態の変化の時期や変化量を解明することが重要であると考えられる．

研究の最終目標は，有機性廃棄物中の難溶性リンを，微生物の作用によって改变し，植物の利用度を高めたリン肥料として再資源化することである．この目標を達成するために，リンの含有量が多い有機性廃棄物（鶏ふん）を対象として，堆肥化過程のリンの化学形態を詳細に定性・定量して，リンの存在形態を明らかにすることを目的とした．

### 3.2 材料および方法

## (1) 鶏ふん堆肥の採取

鶏ふん堆肥は，三重県の有限会社鈴鹿ポートリーが所有しているウインドウレス（窓なし）鶏舎に隣接する密閉式縦型堆肥化装置内から，堆肥化過程0日目から7日目まで毎日採取した．これらの試料を-80℃で凍結したのち，凍結乾燥機で乾燥させ，めのう乳鉢を用いて微粉砕し分析に供した．

## (2) 堆肥中に含まれる元素の分析

グラファイトプロックを用いた分解法(Kovar and Pierzynski, 2009)により，堆肥中の元素を定量した．乾燥させた試料0.100±0.005g(n=3)をテフロン容器に秤量した．ドラフト内でテフロン容器に過酸化水素(12%を10ml添加した後，静かに濃硫酸を1ml加えてよく混合した．10分後，グラファイトプロックを200℃に加熱して溶液を蒸発させた．次に，濃硝酸を10ml加えて再び200℃で加熱して溶液を蒸発させた．蒸発後に5mlの蒸留水と濃硝酸，1ml濃塩酸を加えた．また上蓋を取り付けた後，捕集溶液として希硝酸(2%を5ml加えて，グラファイトプロックで加熱分解(180℃，2時間)を行った．分解後，一晩放冷させた．テフロン容器中の溶液をろ紙(5B, ADVANTEC)でろ過した．ろ液は50mlメスフラスコで希釈し，ICP-CESによってリン，カルシウム，マグネシウム濃度を測定した．
## (3) 逐次抽出法による無機態リンの分画

堆肥には，工業的に生産されたリン肥料と異なり，様々な形態のリン酸塩が含まれている．逐次抽出法(Frossard et al.，1994)では，有機物を各種抽出液で順次抽出することによって，有機物中のリンを，①水溶性リン，②易溶性リン（有機態），③酸化アルミニウム・酸化鉄に吸着したリン，④難溶態リンの4種類に分画することが可能である．乾燥させた鶏ふん堆肥0.20±0.01g(n=3)を50ml容ファルコンチューブに秤量し，純水40mlをチューブに注ぎ，ボルテックスで数分攪拌した後に恒温室(20℃)で18時間振とうを行った．振とう後，遠心分離(8,000rpm5min)を行い，上澄み液をろ紙(5B,ADVANTEC)でろ過した．ろ液は分析まで低温室(4℃)で保存した．同様にして，易溶性リンは0.5M炭酸水素ナトリウム溶液，酸化アルミニウム・酸化鉄に吸着態のリンは0.1M水酸化ナトリウム溶液，アパタイト態リンは1.0M塩酸によって抽出した．いずれの段階についても，振とう後に遠心分離(8,000rpm5min)を行い，採取したろ液を分析まで低温室で保存した．リン酸の定量にはモリブデンブルー法を用いた．

## (4) 核磁気共鳴分光法による堆肥中のリンの化学形態の同定

核磁気共鳴分光法( $ ^{31} $ P-NMR法)は，スペクトルから得られる分子構造に関する情報量の多さから，有機・無機化合物の構造解析・同定に広く用いられている．今回は堆肥中のリンの化学形態を， $ ^{31} $ P-NMR法を用いて明らかにすることを目的とした．このための準備として，堆肥中に含まれるリンを抽出し，さらに堆肥中に含まれる常磁性のイオンなどを除外する必要がある．そこでTurner et al.（2004）の論文を参考にして，CaならびにAlの除去に有効であるNaOH・EDTA抽出液を用いて，鶏ふん堆肥中のリンの抽出を行った．

堆肥化 0, 1, 2, 4, 7 日目の鶏ふん堆肥 1.00±0.005g(n=2) を 50ml 容ファルコンチューブに量りとり，NaOH EDTA(0.50MNaOH+50mM EDTA) 溶液を 20ml 加えた．ボルテックスでよく攪拌した後，恒温室(20℃)で 4 時間振とうを行った．振とう終了後，遠心分離（9,000rpm,30min）を行い，上澄み液を 0.45μm 孔のメンブレンフィルターでろ過し，50ml ファルコンチューブに保存した．全リン濃度に対する NaOH EDTA 溶液によるリンの抽出率を求めるため，る液を 1ml 採取し，ICP-CES 用の 15ml 容ファルコンチューブに入れて，分析まで低温室で保存した．残りの溶液はチューブに薬包紙を被せて，12時間以上凍結させ，その後凍結乾燥機を用いて乾燥させた．乾燥試料はめのう乳鉢を用いて粉砕し，50ml 容ファルコンチューブに常温保存した．
$ ^{31} $ P-NMR 分析は，三重大学機器分析センターのフーリエ変換核磁気共鳴分析装置（日本電子(株)，EX-270型，FT-NMR）を用いて行った．凍結乾燥後，めのう乳鉢で微粉砕した堆肥を2.0mL容エッペンチューブに0.100±0.005g秤量した．1.0MNaCHを1.0mL添加し，試料が完全に溶解するまでボルテックスを用いて攪拌した．試料が溶解したら，D₂Oを100μL採取し，エッペンチューブに加え，再びボルテックスで数分攪拌した．この溶液をNMR試料管の底から4cmの高さまで入れて分析に供した．長時間1.0MNaCHに溶解させておくと，試料の分解が進行すると考えられたので，これらの作業を1サンプル測定する毎に行った．scan回数は500に設定した．

## (5) 粉末 X 線回折による堆肥中のリンの化学形態の同定

粉末 X 線回折は，粉末 X 線回折装置（リガク（株），試料水平型多目的 X 線回折装置 U tima IV）を用いて行った．堆肥化 0,7 日目の試料を 550℃ で 18 時間灰化させ，めのう乳鉢で微粉砕した．試料をガラス試料板のくりぬき部分に載せ，ガラス試料板を利用し，試料を充填部にはぼ均等に分布させた．装置の測定条件は 40V，40mA，scan 回数 1，scan スピード 0.500 s，測定角度範囲は 2θ = 10～60 とした．比較試料として水酸アパタイトを測定した．

### 3.3 結果と考察

## (1) 堆肥中に含まれる元素の分析

堆肥化 0 および 7 日目の鶏ふん堆肥に含まれるリン酸(PQ)，カルシウム(Ca)，マグネシウム(Mg)，カリウム(K)の濃度を表 3-1 に示した。これらの平均値は，リン酸が 40600 ng kg⁻¹，カルシウムが 79700 ng kg⁻¹，マグネシウムが 5680 ng kg⁻¹，カリウムが 15950 ng kg⁻¹ であった。平均的な採卵鶏乾燥ふんのリン酸含有量は 51900 ng kg⁻¹，カルシウムが 78400 ng kg⁻¹，マグネシウムが 8640 ng kg⁻¹，カリウムが 31000 ng kg⁻¹ であった（塩崎，2008）。これらの値と本研究で供試した鶏ふん堆肥の値はほぼ一致した。牛ふん堆肥と比較して豚および鶏ふん堆肥の全リン含有量が高い理由として，豚および鶏植物が牛に比べて，植物の主要なリン酸形態であるフィチン酸の利用効率が低いことや，リン酸カルシウムなどのリン酸化合物が飼料に添加されていることなどが挙げられる。また，リン酸カルシウムの添加に付随して，カルシウム含有量も多くなると考えられる。
表 3-1 堆肥化開始 0 および 7 日目の鶏ふん中の主要元素濃度

day	PO4	Ca	Mg	K
0	41900 (±4230)	75300 (±6160)	5600 (±280)	15300 (±650)
7	39300 (±940)	84100 (±1670)	5760 (±100)	16600 (±200)
Average	40600 (±1840)	79700 (±3110)	5680 (±110)	15950 (±920)

()は標準偏差を表す。

## (2) 形態別リン濃度の変化

図3-1は，水抽出態・炭酸水素ナトリウム抽出態・水酸化ナトリウム抽出態・塩酸抽出態の無機リン酸濃度を示している．堆肥化0日目の鶏ふん堆肥に含まれる無機リン酸の形態別割合は，水抽出態が18.4%，炭酸水素ナトリウム抽出態が8.9%，水酸化ナトリウム抽出態が1.1%，塩酸抽出態が13.8%であり，これらの割合が堆肥化の進行に伴って変化した．最も顕著な変化は，堆肥化0日目から7日目において，水抽出態リンの割合が18.4%から6.9%まで減少した点である．一方，塩酸抽出態リンは13.8%から18.7%に増加していた．また塩酸抽出態は2日目でリン酸濃度が最大値に達するが，3,4日目に減少し，日数が経過するにつれて再び18.7%まで増加した．以上より，堆肥化進行において，水抽出されるような弱い結合状態のリンが，塩酸抽出態の難溶態リンに変化していくことが明らかとなった．

Kleinnan et al. (2005) は採卵鶏ふん(生ふん)の全リン酸に占める水抽出態リン(振とう時の水：堆肥の混合比1:200，振とう時間1時間)の割合が20%であることを報告した。これは，本研究の堆肥化0日目の全リン酸に占める水抽出態リンの値とほぼ一致している。一方，伊藤ら（2010）は密閉型発酵方式の採卵鶏ふん堆肥の全リン酸に占める水抽出態(振とう時の水：堆肥の混合比，1:200，振とう時間：16時間)を15.7%と報告しており，本研究の堆肥化7日目の全リン酸に占める水抽出態リンよりも高い数値を示していた。これらの結果は，堆肥化に用いた鶏ふんや堆肥化システムによって，最終的に生産される堆肥中のリン濃度や化学形態が変わることを示唆している。
図 3-1 堆肥化過程におけるリン分画の変化

## (3) $ ^{31} $ P-NMR法による堆肥化過程のリン化学形態の分析

図3-2は，堆肥化0,1,2,4,7日目鶏ふん堆肥の $ ^{31} $ P-NMRスペクトルの一部を拡大し，オルトリン酸に相当するピーク(5.84ppm)を示している．オルトリン酸の化学シフトの値はTurner et al.(2003)の論文を参考にした．0日目のピークの高さを100%とすると，1日目は90%,2日目は81%,4日目は65%,7日目は73%と減少する傾向が見られた．このことは，鶏ふん堆肥中のオルトリン酸が堆肥化の進行に伴って減少することを示しており，逐次抽出法の水抽出態の減少(図3-2)と同様の傾向がみられた．水酸アパタイトはアルカリ溶液に不溶であるため，NaOH-EDTA溶液では抽出することが不可能であると考えられる． $ ^{31} $ P-NMR法による測定では，堆肥化の進行に伴って塩酸抽出態で増加したオルトリン酸は加味されず，水抽出態の減少を主に捉えていると考えられる．図3-3は，堆肥化0日目のP-NMRスペクトルのうち，フィチンに相当するピークを抽出したものである．矢印で示したピークの面積の総和が，フィチンの濃度に相当することが知られている(Turner et al., 2003b)．分析の結果，堆肥化0日目ですでに堆肥中にフィチンが存在していることが確認された．フィチンはリン全体の16-20%に相当するとみられる．このピーク強度は堆肥化の進行に伴って増加し，7日目に堆肥中のリンの25-28%を占めていることが分かった．
図 3-2 P-NMR 法による堆肥化過程のオルトリン酸ピークの変化（0日から7日目）

図 3-3 堆肥の P-NMR スペクトルにおけるフィチン酸に相当するピーク

(4) 粉末 X 線回折法と走査型電子顕微鏡による堆肥中のリンの化学形態の同定

標準物質である水酸アパタイトと,堆肥化0,7日目の堆肥を粉末X線回折によって分析した（図3-4）.堆肥試料のスペクトルのピークが現れた回折角は，全体的に水酸アパタイトのピークと一致していたことから,水酸アパタイトが堆肥中の主要なリン形態
の一つであることが明らかになった．水酸アパタイトのXRDスペクトルに着目すると，2θ = 30～35の間のピークに特徴づけられる．XRDによる分析では，堆肥化0，7日目のスペクトルの形状はほぼ同一であり，堆肥化の進行によって堆肥中の水酸アパタイトは変化しなかったことが示唆された．また，水酸アパタイトは堆肥化0日目(生ふん)の時点で存在することが明らかとなった．他のリン化合物のピークは，堆肥試料中に同定されなかった．堆肥試料には，水酸アパタイトの他にカルサイト(CaCO_{3})の存在が確認された．

図3-5は走査型電子顕微鏡による，堆肥表面の元素分析結果を示している．このイメージでは，堆肥中のカルシウム，リンが同位置に分布していることが確認できることから，堆肥中のリンはカルシウムと結合した形態で存在していることがいえる．すなわち，前述のX線回折ならびにNMR分析の結果と併せて解釈すると，堆肥中のリンはアパタイト態ならびにフィチン酸カルシウムの形態で存在していることが特定された．一方，堆肥中のリンはアンモニウム（イオン）とマグネシウムと結合したMAP態で存在するという報告もなされているが(Hunger et al., 2008; Baugé et al., 2013)，本研究ではX線回折ならびに走査型電子顕微鏡の結果から，MAP態の存在は認められなかった．

図 3-4 堆肥化 0 および 7 日目の堆肥の XRD スペクトル