Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
図 3-5 SEM EDX（走査型電子顕微鏡）による堆肥表面の元素分布（Mg, Ca, P）

### 3.4 まとめ

逐次抽出法と核磁気共鳴分光法の結果，堆肥化の進行に伴って堆肥中に含まれる水溶性リン酸濃度が低下することが確認された．逐次抽出法の炭酸水素ナトリウム抽出（2段階目，易溶性・有機態リン）の割合が，堆肥化の後期で増加していることから，有機態リンの割合は，堆肥化進行に従って増加することが示唆された．このような水抽出可能な形態のような弱い結合状態のリンが，堆肥化の進行に伴って塩酸で抽出されるような難溶態のリンに形態変化していくことが示された．具体的なリン形態としては，フィチン酸などのリン酸モノエステルは堆肥化の過程でほとんど変化しないことが示された．これらの結果から，堆肥化進行に伴って増加する難溶態のリンは，フィチン酸ならびに水酸アパタイトのようなカルシウム結合態の無機化合物である可能性が高いことが示唆された．粉末X線回折による分析では，堆肥化0，7日目のスペクトルの形状はほぼ同一であり，堆肥化の進行によって堆肥中の水酸アパタイトは変化しなかったことが示唆された．また水酸アパタイトの前駆体であるリン酸オクタカルシウム(OCP)は存在しないことも示唆された．鶏ふんを堆肥化することによって，生物可給性の低いリン化学形態の割合が増加することが明らかになったことから，堆肥化過程において難溶態のリンの生成量を少なくするようなプロセスの構築，すなわちフィチン態ならびに水酸アパタイトを可溶化する酵素を放出する微生物を担持したプロセスの構築が有効であると示唆された．この知見に基づき，次章の研究を計画した．なお本研究成果は，以下
の学会で報告された。

吉川廉, 橋本洋平, 堂本晶子, 村上圭一, 苅田修一. 2011. 鶏ふん堆肥に含まれるリンの化学形態の解明. 日本土壌肥料学会中部支部例会(金沢市 11/10)

● 橋本洋平, 吉川廉, 山口紀子, 北島義典, 村上圭一. 2011. XANES 法による堆肥発酵過程におけるリン化学形態の解明. 第 28 回 PF シンポジウム (つくば市, 7/14-15)
4 鶏ふん堆肥からのフィチン酸分解菌の分離と堆肥化への利用

### 4.1 はじめに

肥料としての家畜ふん中のリンを作物に供給されやすくするために，鶏など単胃動物の飼料にフィターゼを添加し，飼料中に多く含まれるフィチン態リンを無機化（全リンの50%~80％させる技術が開発されている．これによって，無機リン酸塩を飼料に添加しなくても，豚や家畜の成長生産を確保し，リン排泄量も30%~50％削減されることが報告されている（Maguire et al.，2004；Toor et al.，2005）．日本でも，家畜や豚の飼料にフィターゼを添加することで家畜や豚のリン栄養が改善されると同時に，リンの排出量を削減さることが確認されている（武政ら1994，斎藤ら1998）．

日本においては，微生物由来のフィターゼが，1996年に試料添加物として許可されており，飼料へのフィターゼ添加技術は今後さらに普及すると予想される．しかし，フィチン酸のリン酸基にはCaMgZnやCuなどのミネラルが結合しやすく（斎藤ら1998），飼料中に添加されるミネラルの量が多ければ，高レベルのフィターゼを添加したとしてもフィチン態リン酸の分解が不十分になると考えられる（Menz et al.，1999）．それゆえフィターゼを添加すれば，飼料中のフィチン態リンの一部が分解されるものの，なお多くのフィチン態リンがふん中にそのまま排泄され結果的にその無機リン酸の含量が著しく低下するため，作物の養分源としての価値が大きく低下すると考えられる．そこで，ふん尿堆肥の肥料価値を確保するために排泄されたフィチン態リンの無機化を堆肥化過程で促進させることが重要になると考えられる．

過去の研究では，家畜(牛，豚，鶏)ふん堆肥にフィターゼを添加することによって，無機態リンを10%程度増加できることが明らかになっている(那桂玲，2004).しかし，現状ではフィターゼのコストが高く，排泄されたふんへのフィターゼの添加は現実的でないと判断される.薬品のフィターゼを使用する際に生じる費用の問題を回避するために，代替策として，フィターゼを放出する微生物を利用するという方法が有効であると考えられる.先行研究としては，Aspergil/us由来のフィターゼを添加した飼料で飼養した豚の排泄直後のふんを室温で40日間放置したところ，排泄されたフィターゼの活性は，0日目の1070U/kgから40日目には45U/kgと直線的に減衰し，この間に排泄されたフィチン態リンの約半分が分解されることが確認されている(那桂玲，2004).このように，強力なフィチン酸分解菌が分離できれば，堆肥に直接接種して，堆肥中に残っているフィチン態リンを分解させることが可能である.この考え方に基づいて，分離したフィターゼ生成微生物を濃厚飼料に接種して，フィチン態リンを分解される研究が
実施されている(Hirabayashi et al., 1998). 一方，堆肥化過程においてフィターゼ生成微生物を利用する研究はほとんど報告されていない. 堆肥中のフィチン堆肥リンが更に分解できれば，作物に利用可能な無機リン含量が増加し，堆肥の肥料価値を確保できると考えられる.

フィチン酸( $ C_{6}H_{18}O_{24}P_{6} $ )は，myo-イノシトール六リン酸エステル(myo-insitol hexaphosphate)とも呼ばれている.この物質はカルシウム-マグネシウム混合塩として広く植物体に存在し，特に穀物類や豆類ではフィチン態リンは全リンの50%~80%を占めている(van Hartingsveldt et al., 1993).また，イノシトール六リン酸以外の一リン酸(IP1)，二リン酸(IP2)，三リン酸(IP3)，五リン酸(IP5)等のエステル型も土壤や動物に存在している.フィターゼ(Phytase, myo-inositol-hexakisphosphataseなど)は，フィチン酸を加水分解する酵素である.フィターゼは小麦や米ぬかなどの高等植物に存在し，種子中の糊粉粒に結合している.発芽についてフィターゼ活性が上昇し，フィチン酸からリン酸が遊離して生長に利用される.また，多くの微生物もフィターゼを持つが，その中でも最もフィターゼ活性が強いものが分離株Aspergillus ficusumNRRL3135と報告されている(van Hartingsveldt et al., 1993).

前章の研究結果によって, 堆肥化過程で水溶性のリンが減少し, 難溶性のアパタイト態ならびにフィチン態のリンに変化することが確認されている. 本章では, フィターゼ生成細菌を鶏ふん堆肥から単離し, 鶏ふん発酵過程において菌株を添加することによって, 鶏ふん中のリンの溶解性と細菌叢がどのように変化するかを堆肥化過程で追跡した結果を報告する.

### 4.2 材料および方法

(1) 鶏ふん堆肥中からのフィターゼ生産細菌の単離

## (a) 鶏ふん堆肥の採取方法

三重県の有限会社鈴鹿ポートリーが所有しているウィンドウレス（窓なし）鶏舎に隣接する密閉式縦型堆肥化装置内から，発酵中の鶏ふん堆肥を採取した．採取した鶏ふん堆肥は保冷剤入りのクーラーボックス内に保存し，低温状態で実験室に運搬した．この鶏ふん堆肥をフィターゼ生産細菌の単離に用いた．
## (b) 鶏ふん堆肥中のフィターゼ分泌細菌の単離

フィチンを唯一の栄養源とする一般細菌培地を用いて，以下の方法により鶏ふん堆肥中からフィターゼ生産菌を単離した．まず，鶏ふん堆肥 $ 10\mathrm{g}\pm0.2\mathrm{g}(n=1) $ を $ 90\mathrm{ml} $ の生理食塩水で希釈し10分間振とうした．振とう後，上澄み液 $ 100\mu\mathrm{L} $ を $ 900\mu\mathrm{L} $ 生理食塩水で希釈し， $ 10^{-6} $ 倍に希釈したものと $ 10^{-9} $ 倍に希釈したものを寒天培地にスクリーニングした．寒天培地として，フィチン酸カルシウムを含む寒天培地を調製し使用した（Gulati et al.，2007）．植菌した培地を $ 37^{\circ}C $ のインキュベーター内で2日間培養し，フィチン酸カルシウムを溶解したコロニーの周りに白いハローを形成した細菌を選択した．

## (c) PCR 法による目的遺伝子の増幅

PCR 法は PCR Thermal Cycler PERSONAL (TAKARA) と PCR キット KODFX(東洋紡) を使用した。PCR チューブに 2× PCR 緩衝液(東洋紡)，2mM dNTP 混合物(東洋紡)，フォワードプライマー，リバースプライマー，鋳型 DNA，KODFX(東洋紡) を適量ずつ加え，全量 50μL となるように超純水を入れ混合した。PCR の反応は 94℃で 2 分間反応後，98℃で 10 秒間，54℃で 30 秒間，68℃で 1 分 30 秒間を 1 サイクルとして 30 サイクル反応させ，目的の DNA 断片を増幅させた。

## (d) アガロースゲル電気泳動

アガロースゲル電気泳動に DNA 電気泳動装置 Mupi da ミニゲル電気泳動槽(アドバンス)を使用した。アガロース S(ニッポンジーン)とトリス酢酸 EDTA 緩衝液(TAE 緩衝液)を用いて，臭化工チジウム(1μg/ml)を含む 0.8% アガロースゲルを作成した。TAE 緩衝液を満たした電気泳動装置に作成したアガロースゲルをセットした後，試料 DNA と 6× ローディング緩衝液を混合したものをアガロースゲルにセットし，100V で電気泳動を行った(Sanbrook and Russell, 2001)。DNA サイズマーカーとして OneSTEP Marker 6(λ / Sty I digest)(ニッポンジーン)を使用した。電気泳動後，紫外線照射により DNA バンドの確認と，BI Q NS 鶏ふん堆肥は，TRUMENT Print Graph(アトー株式会社)によるゲルの写真撮影を行った。
## (e) DNA 塩基配列の決定

0.2mL 容チューブに 1μM フォワードプライマー(27F) または 1μM リバースプライマー(1492R), 5× シークエンス反応緩衝液, シークエンスプレミックス(Big Dye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits)(アプライド バイオシステムズ) 適量ずつ加え, 全量 10μL となるように超純水を入れ混合した. シークエンスの反応はサーマルサイクラーを用いて, 95℃で 1 分間反応後, 95℃で 10 秒間, 50℃で 5 秒間, 60℃で 4 分間を 1 サイクルとして 30 サイクル反応させた. 反応後, 反応液に 3M 酢酸ナトリウム(pH4.6) 3μL を加え, 99.5% エタノール 62.5μL と超純水 14.5μL と混合し, 15 分間室温で静置した. その後, 15,000rpm で 15 分間遠心分離して上清を取り除いた. 沈殿に 70% 冷エタノールを加え洗浄し, 上清を確実に取り除き, 沈殿を減圧乾燥させた. 塩基配列の決定には, DNAシークエンサー(ABI PRISM8100 Genetic Analyzer) を用いた.

## (2) 鶏ふん堆肥の実験装置および発酵方法

## (a) 鶏ふん堆肥発酵実験装置

堆肥の発酵槽として縦16cm横24cm高さ12cm（内寸）の発砲スチロールを用いた。発砲スチロールの底に通気口を作り外部から空気を送るシステムの発酵装置を作成した。実験装置の写真を図4-1示した。以下の装置ならびに堆肥化条件は，繰り返し予備実験の結果決定された。鶏ふんが反応槽に占める体積割合が90%（4150cm³）になるように充填した。また，予備実験では毎分2Lの通気を行ったが，鶏ふんの乾燥が過剰に進むことや，堆肥温度が低下することによって堆肥化が進行しないという問題が確認された。したがって，本実験では通気を行わず，毎日堆肥を十分に攪拌することによって，この問題に対応することにした。堆肥温度の計測は，発酵装置のほぼ中央（縦10cm，横12cm，高さ8cm）の位置で行った。

## (b) フィターゼ生産細菌の培養方法ならびに添加方法

単離したフィターゼ生産菌を 0.5× LB 培地で 1L 培養した．0.5× LB 培地組成は，1% のポリペプトンを 0.5g（w/v），0.5% 乾燥酵母エキス 0.25g（w/v），1% 塩化ナトリウム 0.5g（w/v），pH7.0 である．培養する際，37℃，180rpm の条件下で 18 時間培養した．培養後，遠心分離機を用いて集菌し，50ml の蒸留水で希釈してスプレーで堆肥に接種し（細菌数 6.4× 10^{8}cfu/g），その後均一になるようによく混合した．
## (c) 鶏ふんの堆肥化条件

三重県の有限会社鈴鹿ポートリーが所有しているウィンドウレス（窓なし）鶏舎より採取した鶏ふんを発酵に用いた.堆肥発酵の区分として,細菌添加区と対照区を設けた.鶏ふん重量(kg)は対照区2kg,細菌添加区1.5kgとし,鶏ふん堆肥発酵装置の中で発酵させた.細菌添加区について,発酵開始1日前に鶏ふん500gを高温加圧処理（オートクレーブ処理,温度121℃15min）で滅菌し,0.5×LB液体培地で1L培養した細菌を混合した.常温で1日放置し,発酵装置内の細菌添加区に添加した.堆肥化は30日間で行い,55℃のインキュベーター内で保温した.堆肥の温度はThermo Recorder TR-71U（T&D社製）で測定し,鶏ふんを発酵過程の温度をデータロガーでモニターした.好気条件で発酵を進行させるために1日1回鶏ふん堆肥を攪拌し酸素供給を行った.また,堆肥の水分含有を保つため,鶏ふん堆肥の重量の減少によって水分を補充した.

実験開始前に鶏ふん堆肥をオートクレーブすることの目的は，鶏ふん中の菌相を均一にし，フィターゼ放出菌がリン溶解に及ぼす効果を確認するためである．予備実験の段階で，オートクレーブ処理の有無によって鶏ふんの水抽出態リン酸濃度を測定した（図4-2）.オートクレーブ処理をしなかった鶏糞の水溶性リン濃度は4625 ng kg⁻¹であった．一方オートクレーブ処理をした鶏ふんのリン酸濃度は，4440 ng kg⁻¹であった．その差は約185 ng kg⁻¹であり優位差はなかった．したがって，オートクレーブによる菌相の均一化の処理は，水溶性リン濃度に影響しないことが判明したことから，フィターゼ放出菌の効果を適正に評価するための本処理が適切であるといえる．

図 4-1 堆肥化装置の写真
図 4-2 オートクレーブ処理の前後の鶏ふん中の水溶性リン濃度

## (3) 鶏ふん堆肥の分析

## (a) 水抽出態リン酸の分画

サンプリングの精度を高めて均一な試料を得るため，試験区からランダムに10か所サンプリングをし，縮分した20gの試料について各種計測を行った．試料の採取は，堆肥化日数0日目～7日目，11日目，17日目，20日目，30日目に実施した（各12時ころ）.採取した10gについては含水率を測定した(105℃，24時間).一部の試料は-80℃の冷凍庫(SANYOで保存し，その後菌相変化を最小限にするため，試料を凍結乾燥した．凍結乾燥後に粉砕された鶏ふん堆肥0.20±0.01g(n=3)を50ml容ファルコンチューブに秤量し，純粋40mlをチューブに注ぎ，ボルテックスで数分攪拌したのちに恒温室(20℃)で18時間振とうを行った．振とう後，遠心分離機(8,000rpm,5min)を行い，上澄み液をろ紙(5B,ADVANTEC)で濾過した．濾液は分析を行うまで-低温室(4℃)で保存した．

溶媒抽出した溶液中のリンは，モリブデンブルー法により無機態リン酸の定量を行った．調製した2.5M硫酸100mlにモリブデン酸アンモニウム液(40g/L)30mlを加えて混合した後，アスコルビン酸液60mlと酒石酸アンモニルカリウム液10mlを加えて混合発色溶液を作成した．50mlのファルコンチューブに抽出液1ml混合発色溶液1mlを加えて1時間放置し，発色させた．蒸留水8mlを発色させた抽出液に供し希釈した．分光光度計を用いて波長710nmの吸光度を測定した検量線をリン酸濃度0ppm,1ppm,2ppm,4ppm,5ppmから作成し，抽出液に含まれるリン酸の濃度を求めた．
## (b) 鶏ふん堆肥の細菌分析実験

堆肥中の微生物 DNA の精製には QIAampDNAstool（QIAGEN）を使用して溶菌した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法による目的遺伝子の増幅は次の条件で実施した。10× PCR 緩衝液(TAKARA)，dNTP 混合物(TAKARA)，GC357F，517R，rTaq を加え PCR の反応は，95℃で30秒間，65℃で30秒間，72℃で2分間を10サイクル，95℃で30秒間，60℃で30秒間，72℃で2分間を10サイクル，95℃で30秒間，55℃で30秒間，72℃で2分間を10サイクル最後に72℃で5秒間1サイクル反応させ目的のDNA断片を増幅させた。（図4-1）

堆肥化過程における細菌叢の変化を追跡することを目的として，DGGE法(denaturing gel gradient electrophoresis，变性剤濃度勾配ゲル電気泳動法)を実施した．表4-1に従い，变性剤20%のゲル溶液を作成した．尿素4.2gをビーカーに測りとり，ホルムアミド4mlを入れて尿素が溶解するまで混合した．40%アクリルアミドを7.5mlと50×TAE1mlを加えてさらによく混ぜた．それぞれのゲル溶液にTEMEDを50μL加えた．濃度80%のゲル溶液には，D-CODEDYE50μLを加えて染色した．

表 4-1 变性剤溶液の調製

ゲル溶液	50mL
变性剤(%)	20%	80%
ホルムアミド	4mL	16mL
尿素	4.2g	16.8g
ゲル濃度(%)	6%	16%
40%アクリルアミド	7.5mL	20mL
50× TAE	1mL	1mL

電気泳動層に 7L の蒸留水と 50× TAE 140ml を加え，温度コントロールモジュールを利用して 60℃ まで温め，保温した．ゲル板を組み立てた．90μL の 10%APS をそれぞれの ゲル溶液に加え攪拌した後，15ml をシリンジで吸い上げた．ゲルの入ったシリンジを モデル 475 デリバリーシステムに装着し，均一な速度で ゲル溶液が落下するようにカムをゆっくり回した．予めセットしたガラスに ゲルを注入し，ガラスサンドイッチの段差上端まで溶液を入れた．コームガスケットをゆっくりと差し込み，ガラスサンドイッチのガラスの段差と コームガスケットが密着するように取り付け，ゲルが固まるまで 1 時
間放置した．ガラスサンドイッチをコアの両側に取り付け，60℃で保温した電気泳動層に入れた．コームガスケットをゆっくりと抜いた．DNAサンプル10μL，6×Loading Buffer 10μLを1.5mLチューブに入れてピペッティングにより混合し，作成したゲルのウェルにDNAサンプルを入れた．電圧200Vで6時間電気泳動をした．この間電気泳動層の温度を60℃に保った．

### 4.3 結果および考察

## (1) フィターゼ活性を有する細菌の単離と塩基配列の同定

堆肥化過程にある鶏ふん堆肥中より，フィチン酸分解活性をもつ細菌のスクリーニングを行った．鶏ふん堆肥よりフィターゼ活性をもつ細菌をPSM培地で分離した．培地に白いハローを形成し，生育の旺盛だった細菌を単離した(図4-3)．1次および2次スクリーニングにより，7細菌種を分離することができた．これらの細菌種について，16SrRNA遺伝子配列による簡易同定を行ったところ，Sphingomonas属，Burkholderia属，Bacillus属3種，Microbacterium属，Gordonia属に属することがわかった．これらのうち，Sphingomonas属とBurkholderia属の菌種は，不溶性フィチンに対し高い可溶化活性を示し，なおかつ60℃の高温でも，良好な生育を示した．単離したフィチン酸分解菌のDNA塩基配列を同定し，BLAST解析をした結果，Burkholderia gladiolis BSR3(99%)と相同性があった．以後，堆肥に添加するフィチン酸分解菌をBurkholderia sp. QM14とした(図4-5)．また，決定した16S rRNA遺伝子の塩基配列を図4-4に示した．Burkholderiaは，β-プロテオバクター科に属する好気性細菌である．この細菌による培地上のフィチンの溶解は，フィターゼ酵素の放出による作用機構が考えられる．同様に，乳酸などの有機酸放出によってフィチン酸が溶解された可能性も考えられる．どちらの作用機構が卓越して起こっているのかは確認できていないが，Burkholderiaはフィチンを溶解する機能を有する細菌であることが確認された．
図4-3 鶏ふん堆肥からフィターゼ活性をもつ細菌を培地で分離した際の写真

CTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACAGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCCACGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGATGGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGA GACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCC GGAAAGAAATCCTGAGGGCTAATATCCTTCGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACC TGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGT GTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGG CCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCACGCCCTAAACGATGTCAACCTAGTTGTTGGGGATTCATTTTCCTTAGTAACGTAGCTAA CGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACC TACCCTTGACATGGTCGGAATCCTAGAGAGATCTGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGATACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC GAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACA AACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACAC CGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGGAGCTAATCCCAGA AAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGCTGGAATCGCTAG TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGT

図 4-4 单離したフィチン酸分解菌の DNA 塩基配列
図 4-5 16S rRNA の増幅．M: マーカー，①：増幅した遺伝子 sp. QM14，②～④については①と同じ塩基配列をもつ細菌であることが判明した．

## (2) 鶏ふん堆肥の堆肥化

単離・培養に成功した Burkholderia sp. QM14 の細菌を添加して，堆肥化実験を実施した．コントロール区（細菌添加なし）ならびに細菌添加区の鶏ふん堆肥の発酵過程の様子を図4-6および7に示した．鶏ふん発酵0日目は羽毛や鶏ふんの団粒が多く存在していた．発酵経過17日目は羽毛が分解されているのが写真から読み取れた．発酵経過30日目は鶏の羽毛や鶏ふんの団粒が見られず，完全に分解されていた．堆肥の発酵は色や臭いに加えて，30日目の堆肥を用いたコマツナ発芽試験（藤原ら1996）により，発芽障害が見られなかったことから腐熟度を判断し，発酵経過30日目で堆肥が完成したと判断した．

鶏ふん堆肥の含水率は，採取試料を105℃で24時間乾燥させた後の質量を計測することで測定した．試験区からランダムに10か所サンプリングをし，縮分した10gの試料について，含水率を求めた．コントロールにおける含水率は50%～60%であったため，鶏ふん堆肥発酵期間中の水分の供給は十分であったと判断した．一方，細菌添加区においては，17日目の含水率(図4-8)が42%と低く，この間の水分供給が十分でなかった．原因としては，細菌添加区の実験装置がインキュベーターの発熱装置に近かったため水分の蒸発が促進されたものと考えられた．また，水分の供給不足によって細菌の生育が良好でなかった可能性がある．細菌の生育状況については後のDGGE法で確認した．
図4-6 堆肥化直前の鶏ふんの状況（左：コントロール区，右：細菌添加区）

図 4-7 堆肥化完了直後（30 日目）の鶏ふんの状況（左：コントロール区，右：細菌添加区）
図 4-8 堆肥化過程の鶏ふん中の含水率

## (3) 堆肥中の水溶性リン酸濃度の推移

図4-9に無機態リンの中でも最も生物可給性の高い水溶性（水抽出態）のリン酸濃度を示す。堆肥化の進行に伴い，コントロール区（細菌添加なし）では，鶏ふん中の水溶性リンが微増し，堆肥化終了の30日目には，約3600 ng kg⁻¹に変化した。細菌添加区における水抽出態リン酸濃度は，堆肥化開始の時点で3640 ng kg⁻¹であり，ここから堆肥化2日目にかけて4210 ng kg⁻¹まで増加した。しかし，堆肥化2日目から3日目にかけて3690 ng kg⁻¹にまで減少し，その差は約525 ng kg⁻¹であった。その後，堆肥化経過日数によるリン酸濃度に大きな変化は見られず，堆肥が完成した堆肥化30日目のリン酸濃度は3390 ng kg⁻¹であり，堆肥化0日目の3640 ng kg⁻¹とほとんど変わらなかった。
図 4-9 堆肥化過程における鶏ふんの水溶性リン酸濃度

## (4) PCR - DGGE 法を用いた堆肥化過程における細菌群の遷移

堆肥化過程における細菌叢の変化を追跡することを目的として PCR-DGGE 法を,それぞれの堆肥化期間から採取した鶏ふんに適用した.堆肥化過程の鶏ふん中の細菌の遷移をバンドに示した.図4-10は,堆肥化0日目~7日目,11日目,17日目,20日目,30日目の鶏ふん堆肥中に存在する細菌を溶菌して,そのDNAを鋳型としてPCR法によって増幅させたバンドである.図4-10におけるコントロール区鶏ふん（細菌添加なし）①~⑨と細菌添加鶏ふん①'~⑨'の増幅させた16S rRNAを用いてDGGE法を行った.

図4-11（左）は,DGGE法によって得られた堆肥化過程のコントロール区（細菌添加なし）の鶏ふん中の細菌の遷移を示したものである.DGGE法によって,堆肥中に棲息していた細菌の遺伝子が個別のバンドとして検出されており,バンドの強度の増減は,それぞれのバンドに対応する細菌の消長を端的に表している.その中でも棲息期間が長い,または濃いバンドが出ている4つの細菌群に着目した(図4-11).コントロール区の鶏ふんのDGGE画像について,特に棲息期間が長かったのはaの細菌群であった.細菌群aのバンドを堆肥化0日目から堆肥化11日目まで検出した.堆肥化3日目に出現した細菌群bの濃いバンドは,堆肥化3日目から堆肥化11日目まで検出された.細菌群cについては,堆肥化0日目から出現し,濃いバンドが堆肥化8日目まで検出できていたが,堆肥化11日目にはその存在を確認できなかったことから,この細菌群は堆肥化8日目と堆肥化11日目の間で消滅したと考えられた.細菌群cについても,堆肥化4日目に出現し,濃いバンドが堆肥化8日まで検出できたが,堆肥化11日以降は確認することができなかった.
図4-11（右）に，細菌添加処理した堆肥化過程の鶏ふんのDGGEのバンドを示した．無処理鶏ふんのDGGEバンドと比較して細菌群の種類は多く，特にバンドが濃く棲息期間が長かったa'～h'の細菌群に着目した(図4-11右)．細菌添加した鶏ふんのDGGEにおいて，最も棲息期間が長かったのはb'の細菌群であった．この細菌群b'は，無処理鶏ふんの細菌群aと同じ細菌群であると考えられた．また，細菌群d'，f'，g'についても，それぞれ無処理鶏ふんのDGGEに出現していた細菌群b，c，dと同じ細菌群であると考えられた．細菌添加区に限定的に見られたのは，a'，c'およびe'の細菌群であった．細菌群a'は堆肥化0日目から薄いバンドが検出でき，堆肥化0日目から堆肥化8日目にかけて徐々に濃いバンドが検出できた．細菌群c'のバンドは，堆肥化0日目から堆肥化3日目まで検出できたことから，添加したフィターゼ生産細菌が検知された可能性が高いことが示唆された．しかし，仮に細菌群c'が添加細菌であるsp.QM14である場合，細菌群の棲息期間の短さ，またバンドの薄さから細菌の定着，ならびに生育条件の最適化が十分でなかったことを意味する．細菌群e'は，堆肥化0日目から堆肥化8日目まで比較的長い期間棲息し，堆肥化3日目から堆肥化5日目にかけて最も濃いバンドを示した．この細菌群e'もまた，堆肥化0日目から棲息し，コントロール区の鶏ふんのバンドに見られなかったことから，添加したフィターゼ生産細菌である可能性が高い．これらのバンドの消長から判断し，堆肥化過程で添加したフィターゼ生産細菌の増殖と定着が適切に行われたことが推察された．

### 4.4 まとめ

本研究では，堆肥化過程の鶏ふんから，フィチン酸分解菌「Burkholderia sp. CM14」を単離し培養することに成功した。DGGE法による菌相解析の結果から，この細菌は，一部が堆肥化過程で消滅せずに堆肥化に寄与していることが確認された。これらの結果は，本研究で同定されたフィチン酸分解菌が，堆肥化の過程で増殖可能であり，実際の堆肥化システムにおいて適用可能であることを示唆している。この細菌を鶏ふんに添加し堆肥化実験を実施し，細菌添加なし（コントロール区）の場合と水溶性リンの違いを比較した。細菌添加処理した鶏ふんについて，堆肥化0日目から2日目にかけての水溶性リンは4210 ng kg⁻¹に増加した。しかし，堆肥化30日目のリン酸濃度（3390 ng kg⁻¹）は，堆肥化0日目（約3640 ng kg⁻¹）とほぼ変わらないリン酸濃度であった。また，コントロール区では，堆肥化終了の30日目の鶏ふん中の水溶性リンが約3600 ng kg⁻¹であり，この値は細菌添加区よりもやや高い。鶏ふんへのフィターゼ分解細菌の添加は，
水溶性リンの濃度を堆肥化の初期過程で増加させるが，堆肥化終了時までその効果が持続しないことが示唆された．しかし，当該細菌は鶏ふん中のリンを溶解する機能を有していることが確認されているため，堆肥化過程における細菌の添加時期を検討することによって，この問題は解決できる可能性があると考えられた（次章）.

図 4-10 rTaq による目的遺伝子の増幅

M: マーカー，①～⑧コントロール区（細菌添加なし）堆肥化 0 日～8 日目，⑨コントロール区 堆肥化 11 日目，⑩コントロール区 堆肥化 17 日目，⑪コントロール区 堆肥化 20 日目，⑫コントロール区堆肥化 30 日目．

①' ~ ⑫' は，細菌添加処理区の菌相で，堆肥化日数の番号は，コントロール区と同様
図 4-11 DGGE 法による堆肥化期間中の菌相変化

左図：「コントロール区（細菌添加なし）」①～⑧コントロール 堆肥化 0 日～8 日目，⑨コントロール堆肥化 11 日目，⑩コントロール堆肥化 17 日目，⑪コントロール 堆肥化 20 日目，⑫コントロール 堆肥化 30 日目

右図：「細菌添加処理」①'～⑫'の期間は無処理区と同じ
5 有用細菌の添加時期と回数の違いによる鶏ふん中のリン酸濃度への影響検討

### 5.1 はじめに（前章の実験条件の課題）

前章では，堆肥化0日目にフィターゼ生産細菌を添加して，堆肥化終了時点において鶏ふん中の水溶性リン酸濃度が高い堆肥の完成を目指した．しかし，堆肥化0日目から堆肥化2日目にかけてリン酸濃度が増加したものの，堆肥化30日目のリン酸濃度（3390ng kg $ ^{-1} $ ）は堆肥化0日目（約3640ng kg $ ^{-1} $ ）とほぼ変わらない結果となった．そこで，堆肥化過程でフィターゼ生産細菌の添加時期を検討することによって，堆肥化完了時点の鶏ふん中の水溶性リン酸濃度を増加できるという着想に至った．

本研究では,前回の堆肥化の結果を受けて,添加するフィターゼ生産細菌の添加時期,添加回数に着目した.前回の堆肥化では,堆肥化0日目にフィターゼ生産細菌を添加したところ,堆肥化3日目にかけて鶏ふん中の水溶性リン酸濃度が上昇するという結果が得られた(図4-1).そこで,今回はフィターゼ生産細菌の添加を堆肥化16日目に行い,フィチン態リン酸の分解と水溶性リン酸の増加を試みた.また,前回の鶏ふん堆肥化では,堆肥化0日目から堆肥化3日目にかけてリン酸濃度が上昇したものの,堆肥化4日目以降リン酸濃度は低下した.この結果から,鶏ふんの堆肥化過程でフィターゼ生産細菌を断続的に添加することで,増加した分の水溶性リン酸濃度を保持することができるかを試みた.

### 5.2 実験方法および材料

## (1) 鶏ふんの堆肥化条件

堆肥化条件は，コントロール区（細菌添加なし），試薬のフィターゼ添加区，細菌1回添加区，細菌3回添加区の4つを設けた．試験区の数は各1である．堆肥化システムの温度，通気条件ならびに用いた鶏ふん重量は前章と同じに設定した．堆肥化開始から16日目に，細菌1回添加区と細菌3回添加区にそれぞれ培養した細菌を添加して，鶏ふんと混合した．フィターゼ添加区には，堆肥化開始から16日目に鶏ふん重量の0.1％に相当する2.0gのフィターゼ試薬を少量ずつ均一に添加して，十分に混合した．細菌3回添加区については，鶏ふん発酵経過19日目と21日目にも細菌を添加した．細菌の添加方法（調製等）は前章と同様である．
## (2) 堆肥化期間中の鶏ふん試料の採取

サンプリングの精度を高めて均一な試料を得るため，試験区からランダムに10か所サンプリングをし，縮分した20gの試料について各種計測を行った．試料の採取は，堆肥化日数1，10，15～23，27，30日目に実施した（各12時ころ）．採取した10gについては含水率を測定した（105℃，24時間）．一部の試料は-80℃の冷凍庫(SANYO)で保存し，その後菌相変化を最小限にするため，試料を凍結乾燥した（前章と同様）．

## (3) 鶏ふん堆肥の水溶性リンの分析

前章と同様に採取した鶏ふんに蒸留水を添加し,溶出したリンをモリブデンブルー法により定量することによって,水溶性リンとして定めた（前章と同様）.

### 5.3 結果および考察

## (1) 鶏ふん堆肥の含水率と温度

堆肥化期間中の鶏ふん堆肥の含水率を図5-1に示す．堆肥化開始直後の含水率が，43-55％と処理区によってばらつきがみられた．この要因としては，鶏ふんが団粒を形成しており，サンプリングが適切にできなかった可能性が挙げられる．堆肥化12日目の細菌添加区の含水率が38.2％と低かった．堆肥化開始後15日目に，すべての区の含水率が45％付近まで低下したため，滙水したことにより，それ以降の鶏ふんの含水率が上昇した．いずれの試験区の含水率も，堆肥化17日目以降は概ね50％を維持しており，前章の堆肥化実験と一致していることから，堆肥の水分条件に関しては，前章の実験を再現できているといえる．堆肥化期間中の鶏ふんの発酵温度は，含水率と同様に堆肥化開始直後ではばらつきが見られたのは，鶏ふんの初期水分状態と関係があると考えられた．堆肥温度が16日の滙水後に上昇がみられ，堆肥化20日から終了時にかけて60℃を維持していた（図5-2）.

## (2) 堆肥化に伴って変化する水抽出態リンの挙動

図 5-3 は「コントロール区」(無処理)と，試薬のフィターゼを堆肥化 16 日目に添加した「フィターゼ添加区」の水抽出態リン酸濃度を示している．フィターゼ添加区における堆肥化 16 日目のリン酸濃度は 3729 ng kg⁻¹ であり，堆肥化 17 日目にかけて 4772 ng kg⁻¹ まで 1043 ng kg⁻¹ 増加した．また，堆肥化 17 日目のリン酸濃度が 3748 ng kg⁻¹ であったコントロール区と比較しても，その差は 1023 ng kg⁻¹ で，添加した試薬のフィタ
一ゼは，鶏ふん中の水抽出態のリン酸を大きく増加したことが確認された．しかし，堆肥化17日目の最大ピークを計測した後は，リン酸濃度を保つことができずに減少の一途をたどった．

同じく図5-3に，堆肥化16日目にフィターゼ生産細菌を添加した「細菌1回添加区」の水抽出態リン酸の濃度を示している。堆肥化16日目の細菌添加後リン酸濃度は徐々に増加し，堆肥化20日目のリン酸濃度が，4953mg kg $ ^{-1} $ で最大であった。細菌添加前の堆肥化15日目との差は683mg kg $ ^{-1} $ ，コントロール区の堆肥化21日目との差は1290mg kg $ ^{-1} $ であり，大幅にリン酸濃度を高めることができた。また，フィターゼ添加区の最大リン酸濃度が，堆肥化17日目に4772mg kg $ ^{-1} $ であったのに対して，細菌1回添加区の堆肥化20日目の最大リン酸濃度は4953mg kg $ ^{-1} $ であったことから，堆肥中にフィターゼ生産細菌を添加することで，フィターゼ添加よりも効果があることがわかった。しかし，フィターゼ添加区と同様に最大リン酸濃度のピークを迎えた後，リン酸濃度は減少し，堆肥化12日目のリン酸濃度は4218mg kg $ ^{-1} $ まで減少した。堆肥化21日目以降は，平均4355mg kg $ ^{-1} $ のリン酸濃度を保持し続けた。

堆肥化 16 日目，19 日目，21 日目に細菌を添加した「細菌 3 回添加区」の水溶性リン濃度を図 5-3 に示した。堆肥化 16 日目に細菌を添加した後，徐々に水溶性リン酸の濃度は高くなり，堆肥化 19 日目でリン酸濃度 4847 mg kg $ ^{-1} $ のピークを迎えた。その後，堆肥化 20 日目に一度濃度が 4442 mg kg $ ^{-1} $ と減少したが，堆肥化 21 日目に 2 回目のピークを迎え，リン酸濃度が 5156 mg kg $ ^{-1} $ まで上昇した。堆肥化 23 日以降は，平均約 4814 mg kg $ ^{-1} $ で水溶性リン濃度が推移し，他の処理区よりも堆肥化完了時点での水溶性リン酸濃度が高い結果となった。

### 5.4 まとめ

各処理区の30日目の水溶性リン濃度を比較すると（図5-3拡大），コントロール区<71ターゼ区=細菌1回添加区<細菌3回添加区の順に，値が有意に増加していることが確認された．前章（4章）の堆肥化実験と今回のデータを比較してみると，細菌添加後の水溶性リン酸の挙動が似ている傾向が見られた．特に細菌を添加した後，約2日間かけてリン酸が上昇し，一旦水溶性リン酸の濃度が最大に達すると，その後は減少するという傾向が顕著に類似していた．細菌一回添加区ならびにフィターゼ添加区では，それぞれ添加後一定期間が経過すると，水溶性リン濃度が低下するという共通の現象が観察された．この傾向は，細菌が放出するフィターゼ，ならびに試薬のフィターゼによって
て，鶏ふん中のフィチン態リン酸から遊離したオルトリン酸が，カルシウム・アルミニウムなど別の元素と結合して不溶化した可能性が高いと考えられた．逐次抽出法の結果，細菌3回添加区における塩抽出態のリン酸濃度を見てみると，確かに堆肥化0日目(35mg kg $ ^{-1} $ )と比較して堆肥化30日目(270mg kg $ ^{-1} $ )の塩抽出態リン酸に増加が見られた．堆肥化終了時に塩酸抽出分のリンが5%程度増加していることが分かり，フィターゼによって溶解したリンの一部は，水溶態以外の形態に変化したと推察された．鶏ふんの堆肥化によって，水抽出されるような弱い結合状態のリンが，塩酸抽出態の難溶態リンに形態変化する現象は，現場の堆肥化システムから採取された試料の分析結果でも確認されている(3章)．生物可給性の高い水溶性リン酸をより多く含む堆肥を創造するには，フィターゼによって加水分解されたリン酸を堆肥化の進行中で他のリン酸に形態変化をさせずに保持することが，今後の研究課題となる．

図 5-1 堆肥化過程の鶏ふん中の含水率
図 5-2 堆肥化過程の鶏ふんの温度

図 5-3 堆肥化過程の鶏ふん中の水溶性リン濃度．図中の棒グラフは30日目の水溶性リン濃度を示している．異なるアルファベットは有意水準 p=0.05 で各平均値に差があることを示す(Tukey HSD法，n=3)．
### 6. 総括

有機性廃棄物に含まれるリンの有効利用の開発において，省資源化や低コスト化などが重要な課題となっている．本研究では，家畜ふん堆肥中に高濃度に含まれるリンに着目し堆肥資源としてリンを有効利用する着想に基づいて実験を実施した具体的には，鶏ふんならびにその堆肥中に含まれるリンの化学状態を明らかにし堆肥化過程で微生物酵素の作用を援用し作物に吸収されやすいリン形態に改变するという手法を用いた先行研究によって，鶏ふん中に含まれるリンは，その多くがフィチン酸として存在していることが指摘されている(Toor et al.，2005)．その理由は，鶏に給餌する植物性飼料に含まれるリンの50%~70%は，フィチン態リンとして存在しているためである（例，ダイズ粕）．鶏などの単胃家畜は，フィターゼ分解酵素を持たないため，飼料中のフィチン酸は消化されずにふんとして排泄される．鶏ふん堆肥中のフィチン態リンを堆肥化過程で分解し，水溶性のリンの割合を多く含む堆肥が創出できれば，有機性廃棄物の有効利用を促進するための一助となるだけでなく，土壌のリン過剰による水系などの環境汚染の解決にもつながる．リン肥料は土壌に施用しても，植物にリン源として吸収利用されずに，土壌中のアルミニウムや鉄鉱物に吸着されて蓄積される．土壌中の有機態リンの50%を占めていることが報告されている(Turner et al.，2003a)．特に日本の畑地の約50%の面積を占める黒ボク土では，リンの吸着作用が著しく，リンが過剰に蓄積されている．黒ボク土の中でも，アロフェンと含むものと含まないものでは，リンの吸着特性が異なるため，それぞれについてリンの施肥管理を設定する必要があるにも関わらず，これまで取り組まれていない．

研究の最終目標は，有機性廃棄物中の難溶性リンを，微生物の作用によって改变し，植物の利用度を高めたリン肥料として再資源化することである．この目標を達成するために，現行の鶏ふん堆肥化装置から採取した鶏ふん中のリンの溶解性や化学状態を明らかにし，その知見に基づき単離・培養した有用細菌を添加した堆肥化実験を実施した．これに並行して，全国650か所の黒ボク土のデータを用いて，アロフェン質および非アロフェン質黒ボク土のリン吸着特性を明らかにし，リン肥料施用に関する土壤管理・評価について検討した．研究結果として得られた知見は，次のとおりである．

(1) 全国 650 地点の土壌データの統計解析によって，リンの吸着挙動は，アロフェン質黒ボク土ではシュウ酸抽出の Al（非晶質 Al），非アロフェン質黒ボク土ではピロリン酸抽出の Al（腐植結合 Al）と密接に関係していたことが分かった。したがって，
これらの土壌リン酸抽出法を，双方の黒ボク土で使い分けることによって，それぞれの黒ボク土のリン吸着がより適切に評価できると考えられる．このように同じ黒ボク土であってもリンの可給性を評価する土壌診断法や，土壌施肥管理法を区別して評価・設定することの必要性が示唆された．

(2) 堆肥化の進行に伴って，鶏ふん中に含まれる水溶性リン酸濃度が低下することが確認された．水抽出可能な形態のような弱い結合状態のリンが，堆肥化の進行に伴って塩酸で抽出される難溶態のリンに形態変化していくことが示された．具体的なリン形態としては，堆肥化進行に伴って増加する難溶態のリンは，フィチン酸ならびに水酸アパタイトのようなカルシウム結合態の無機化合物である可能性が高いことが示唆された．これらの結果は，堆肥化過程において難溶態のリンの生成量を少なくするようなプロセスの構築，すなわちフィチン態ならびに水酸アパタイトを可溶化する酵素を放出する微生物を担持したプロセスの構築が有効であると示唆された

(3) 堆肥化の過程でフィチン態リン酸を分解するフィターゼ生産細菌を，鶏ふん堆肥から分離し，その種はBurkholderia sp.であることを同定した．当該細菌は，堆肥化の高温条件で培養可能であることを確認した．

(4) 鶏ふんの堆肥化過程で単離培養したフィターゼ生産細菌を添加した結果，添加後2日間の水溶性リン酸濃度が上昇することが確認された．そこで，当該細菌を堆肥化過程で3回添加したところ，当該細菌を添加しないコントロール区（4020 ng/kg）ならびに試薬のフィターゼ添加区（4515 ng/kg）よりも，堆肥化終了時の水溶性リン酸濃度は，堆肥化終了時に4870 ng/kgまで有意に増加した．

本研究では,堆肥化の過程で鶏ふん中のリンの溶解性と化学状態がどのように変化するのかについて解明した点は,これまでにない新規な点である.この成果によって,フィチン態リンが堆肥化過程で増加している可能性が示唆され,堆肥化の高温環境でフィチンおよび有機酸を放出する有用細菌を単離・培養する必要性を見出すことができた.フィチン態リンを無機化する作用を有する細菌を単離し,簡易的な堆肥化装置を用いて鶏ふんの堆肥化過程で接種した.鶏ふん堆肥中に作物可給性の高い水溶性リン酸を増加させるためには,堆肥化の過程で当該菌種を複数回に分けて接種することが有効であることが確認された.

本研究によって，フィチン分解機能を有する細菌を利用した鶏ふんの堆肥化は，堆肥中のリン溶解性を増加させるうえで有効であることが実験室レベルで明らかになった。
本研究は，堆肥化過程の鶏ふん中のリンの化学形態・溶解性の解明，ならびに有用細菌による鶏ふん中のリン溶解作用を検討し，基礎的な知見を得ることに重点を置き研究を進めた．そのため，今後現場レベルで本研究の有用細菌を添加した堆肥化システムの構築には，堆肥化時間，温度，通気など，堆肥化における各種環境条件も検討する必要がある．現場の堆肥化機構を再現できる実験系を用いた実験が今後の課題として挙げられる．加えて，堆肥化の期間中，有用細菌のフィターゼ活性をコントロールすることも重要であると考えられる．細菌が放出するフィターゼによって，一旦加水分解されたオルトリン酸を，堆肥化過程でそのまま維持し，できるだけ他の難溶態（フィチンやアパタイト態）に変化させないという工夫も，今後の課題として重要な検討事項である．今後同様の実験を実施し，有用細菌による鶏ふん中のリンの溶解効果について再現性の確認を行う．

本研究で単離培養に成功した当該細菌は,おそらくほとんどの鶏ふん堆肥化装置で生育している普遍的な種であると考えられ,類似の菌種も存在していると推察される.本研究の菌株を利用,あるいはそれぞれの堆肥化装置の鶏ふんから単離された菌株を利用することによって,本研究で示された微生物酵素を利用した堆肥化の手法は,実用技術になりうると期待される.また,この手法は他の有機性廃棄物にも応用可能であると考えられる.そのためには,本研究で示されているように,堆肥化をする試料(有機性廃棄物)中のリンの化学状態を詳細に分析し,そのリン形態を分解することができる酵素を生産する細菌類(特に高温耐性を有する)を単離・培養するという手順をとることが合理的である.

## 謝辞

本研究全般のご指導を頂きました村上圭一博士（三重県）に深謝いたします。鶏ふん試料の提供は，近藤博信氏ならびに近藤拓弥氏（有限会社鈴鹿ポートリー）のご協力を頂きました。本研究成果の一部は，吉川廉氏ならびに大場マリア氏の貢献によりなされた。ここに記して感謝申し上げます。
## 7 参考文献

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