Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
想されるストレッサーの組み合わせの場合は、PCAにてそれぞれの影響が異なる次元に反映され、複合影響はその和として表すことが可能だろうと思われる（図6）。また、本実験で用いたフェナントレンとピレンは化学的特性が類似しているため、これらの生物への作用機序には共通点が多いと考えられる。実際に本研究のメタボロミクスおよびトランスクリプトミクスのPCAの結果でも、フェナントレン単独暴露区とピレン単独暴露区の個体は分離せず、同一のグループに属すると見なされた。このとき、単独暴露区は対照区に対してPC2方向に分離された一方で、複合暴露区はPC1方向に分離された。以上のことから、作用機序が類似している複数の環境ストレスを与えた場合、各成分の影響は類似しているため同一の次元で表現され、複合影響として特異的に検出される応答は単独影響とは異なる次元で表現されると仮説を立てた（図7）。

図6 主成分分析をベースとした解析法による作用機序が独立している場合の複合影響の表現

図7 主成分分析をベースとした解析法による作用機序が類似している場合の複合影響の表現

### 5. 本研究により得られた主な成果

## （1） 科学的意義

本研究により複合的なストレスを受けたメダカにおける生体影響を、PCAを基本としたオミックスデータの解析法によって、単独のストレッサーによる影響とは分離して評価することが可能となった。これまでに雌雄差を反映した遺伝子群の検出や、単独のストレッサーによって発現量が変化する遺伝子群の検出にPCAが用いられることはあったが、複合影響の検出に応用したのは本研究が初めてである。本試験で与えたような絶食と低温刺激のように作用機序も影響も異なることが予想されるストレッサーを組み合わせた場合、PC1とPC2がそれぞれ単独の影響を反映し、複合影響はPC1とPC2の両スコアの和として表現された。しかしながら、化学的性質が類似したフェナントレンとピレンを暴露した試験においては、それらの化合物の挙動や影響に共通性が多く見られることは容易に予想可能であり、実際に両化合物単独暴露による影響はPC2のみに反映されており、それぞれの化合物の影響は分離されなかった。一方で、複合暴露による影響はPC1に投射され、明らかに単独暴露による影響とは区別された。さらに、本手法を実環境中から採取した底質試料中に含まれる化学物質暴露に対する応答の検出に応用したところ、致死影響が現れるよりも遙かに低濃度であっても生体応答を検出でき、その応答の大きさは致死影響を指標とした時の毒性ポテンシャルと比例関係にあった。つまり、現状では致死影響あるいはそれに準ずるエンドポイントでしか複合毒性は評価されていないが、本手法を用いることで、より高感度で複合毒性を検出することが可能となったと言える。このように本手法は、我々が最終目標として掲げている実環境中に存在する汚染物質の複合影響評価および影響度の数値化のために大いに貢献すると確信している。

PAHsの単独暴露による影響に関する知見は比較的多く存在するが、複合影響に関する知見は乏しい。本試験では、単独暴露区ではまったく影響を受けていなかったアミノ酸代謝や解糖系、コラーゲン合成系が複合暴露区で顕著に抑制されていた。このことは、化学物質の複合作用によって、単独の化学物質を対象とした暴露試験からはまったく推定できない影響が引き起こされることを示しており、複合毒性の優れたモデルケースとなり得ると同時に複合影響評価の重要性を我々に再認識させた。

## （２）環境政策への貢献

化学物質の複合影響についてはその重要性は認識されているものの、作用機序の複雑さ故、研究が遅れているのが現状である。個々の化合物を対象とした化学物質のリスク評価は、毒性物質の初期スクリーニングには重要な役割を持つが、化学物質の環境影響を評価する際には、より複雑な要因を加
味する必要がある。本研究は、個々の化学物質は無作用濃度未満であっても、複合的に作用することで生物に対して悪影響を及ぼすことを示しており、このことは現行の化学物質の環境影響評価手法の有用性を根幹から揺るがすものである。現状では、複合影響の評価手法は確立されておらず、海外ではすでに実施されている工場等の全排水を対象とした生物試験（WET test）についても、我が国では未だ検討段階である。本研究より得られる成果は、化学物質の複合毒性を広く認識させることに貢献するのみならず、将来的に確立すべき複合毒性の影響評価手法の礎となるポテンシャルを有している。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## （１）主な誌上発表

## く査読付き論文>

1) S. Uno, A. Shintoyo, E. Kokushi, M. Yamamoto, K. Nakayama, J. Koyama: Environmental Science and Pollution Research (2012)

“Gas chromatography-mass spectrometry for metabolite profiling of Japanese medaka (Oryzias latipes) juveniles exposed to malathion.” (in press)

## く査読付論文に準ずる成果発表>

「特に記載すべき事項はない」

## （２）主な口頭発表（学会等）

1）國師惠美子、宇野誠一、小山次朗：第19回日本環境化学討論会（2010）

「メタボロミクスによるヒメダカに対する多勧芳香族炭化水素類の影響評価」

2）宇野誠一、國師恵美子、山元優孝、新豊葵、小山次朗：第16回バイオアッセイ・日本環境毒性学会研究会合同研究発表会（2010）

「メダカ稚魚を用いたメタボロミクスによる化学物質影響評価の試み」

3）山元優孝、宇野誠一、小山次朗：第16回バイオアッセイ・日本環境毒性学会研究会合同研究発表会（2010）

「メタボロミクスによる多環芳香族炭化水素のメダカ胚に対する影響評価」

4) E. Kokushi, S. Uno, J. Koyama: International symposium on the formation of research center on control against negative impacts to coastal fisheries resources in Southeast Asia, Kagoshima, Japan, 2010

“Assessment of effects of starvation on freshwater carp by $ {}^{1} $ H-NMR metabolomics approach.”

5) M. Yamamoto, J. Koyama, S. Uno: International symposium on the formation of research center on control against negative impacts to coastal fisheries resources in Southeast Asia, Kagoshima, Japan, 2010

“Toxicity assessment of PAHs on medaka embryo by $ {}^{1} $ H-NMR metabolomics approach.”

6) E. Kokushi, S. Uno, J. Koyama: The international conference on marine pollution and ecotoxicology, Hong Kong, China, 2010.

“Assessment of metabolite variations in starved freshwater carp by $ {}^{1} $ H-NMR metabolomics approach.”

7) K. Nakayama, I. C. Handoh, J. Y. Song and S. I. Kitamura: 6th International Conference on Marine Pollution and Ecotoxicology, Hong Kong, China, 2010.

“Analyzing the effects of multiple environmental stressors by microarray data.”

8) E. Kokushi, S. Uno, J. Koyama: The 39th scientific symposium of UJNR aquaculture panel meeting, Kagoshima, Japan, 2010

“Assessment of effects of starvation on freshwater carp by $ ^{1} $ H-NMR metabolomics approach.”

9) K. Nakayama, S. Uno, E. Kokushi, I. C. Handoh, S. I. Kitamura: SETAC North America 31st Annual Meeting, Portland, USA, 2010.

“Transcriptome and metabolome changes by multiple environmental stressors.”

10) K. Nakayama, I. C. Handoh, J. Y. Song, and S. I. Kitamura: SETAC North America 31st Annual Meeting, Portland, OR, USA, 2010.

“Evaluation of the binary effects of environmental stressors using transcriptomic data.”

11) S. Uno, E. Kokushi, M. Yamamoto, T. Niino, Y. Ohori, J. Koyama: SETAC North America 31st
### 7. 研究者略历

課題代表者：宇野 誠一

1968年生まれ、東京水産大学大学院海洋生産学専攻博士後期課程修了、博士（水産学）、現在、鹿児島大学 水産学部 准教授

## 研究参画者

(1) : 宇野 誠一 （同上）

(2) : 仲山慶

1974生まれ、九州大学大学院生物資源環境科学府博士後期課程修了、博士（農学）、現在、愛媛大学沿岸環境科学研究センター化学汚染・毒性解析部門 講師
# RF-0909 実環境の複合汚染評価を目的としたトキシコゲノミクス解析法の開発と現場への適用に関する研究

(1) メタボロミクスによる影響評価法の確立に関する研究

鹿児島大学 宇野 誠一

平成21～23年度累計予算額：4、822千円

（うち、平成23年度予算額：1、595千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 現在、世界では数多くの化学物質が作り出され、地球上の生物は多かれ少なかれこれらの化学物質に暴露されている。既に個々の毒性を調べるというのは困難であり、化学物質が複数存在したときの生物への影響評価法もほとんど確立されていない。また、現在の日本の環境中化学物質濃度はかなり低く、従来法では影響評価が難しい。よって今後どのように環境汚染影響評価を行うかは早急に検討されるべき課題である。メタボロミクスは生体内代謝物変動を網羅的にとらえ、生物の今の体調を知る方法である。本法は発展途上の方法であり、確固たる解析法も確立されてはいないが、遺伝子情報を必要としない、生物種を選ばない、体内の出来事を鋭敏に代謝物変動として示す、といった特徴を持ち、生物に対する実環境レベルでの化学物質影響評価の有効な手段となり得る。そこで本サブテーマは、ヒメダカを対象とし、①メタボロミクスの手法を確立するための基礎を築くこと、②複合ストレスに対する影響評価を行うこと、③①と②の過程を経て、実際の環境試料に対する定量的な影響評価を行うこと、を主たる目標として掲げた。これらを達成するためにメタボロミクスのデータを一元配置分散分析と主成分分析により処理して、平成21年度はヒメダカに与える影響が全く異なる複合ストレスとして絶食と低温、22年度は影響が類似するフェナントレンとピレンの各々の複合暴露がヒメダカに与える影響を明確に評価できるか検討した。その結果、確立した手順と評価法でヒメダカが受ける複合的な影響が評価できることが分かった。そこで23年度は海底質試料の全抽出物にヒメダカを暴露してその影響評価を行った結果、生死を基準とした評価法の25倍以上の感度で影響が検出可能であった。これらの結果より本研究で確立したメタボロミクスによる影響評価法は今後の環境影響評価に非常に有効な手段であることを示した。

[キーワード] メタボロミクス、複合影響、ヒメダカ、海底質、主成分分析

### 1. はじめに

現在、世界では年間数千にも及ぶ化学物質が作り出されている。しかし、これらの物質の生物に対する影響評価は十分に行われているとは言えない。これまでの環境汚染研究はある特定の物質についてその環境動態や生物影響を調べるという手法が取られてきた。しかし現在のように多種多様な化学物質が地球上に存在し、かつ、実環境に放出される危険性も懸念される中、個々の化学物質の環境動態や生物影響を調べるには限界が来ていると言え、今後は視点を変えた環境汚染評価を行ってく必要があると言える。さらに、主たる環境汚染物質に対して厳格なる規制が行
われている現在、これまで目を向けられていなかったような濃度レベルでしか存在しない化学物質の環境汚染に目を向ける時代が間もなくやってくると考えられる。さらには複合的に化学物質に暴露された際の生物影響の評価も厳密に求められつつある。実際、現在、これら全てを網羅して評価できる影響評価法はない。従来、行われている生物の化学物質に対する影響評価は、その生物の生死や成長を基準とするものがほとんどである。しかしこの従来法では現在の環境基準以下の濃度で潜在する化学物質の生物に対する影響は見出すことが難しいこと、さらに複合的に化学物質が存在して生物がそれらに暴露されたときには個々の物質を対象とした影響試験では見出せなかった、物質が複合されることにより全く予想されなかった生物影響があったとしても見逃す可能性が高い。そこで感度が良く、精度の高い、さらには複合的な化学物質暴露の影響さえも的確に評価可能である、といった全てを網羅する新しい影響評価法の開発が急務となる。

トキシコゲノミクスは生体が持つ分子情報を、遺伝子、タンパク質、代謝物などの様々な動きや変動を階層ごとで網羅的にとらえて解析する手法である。これら網羅的に生物内の情報をとらえる手法を総称してオミックスと呼ぶ。メタボロミクスはオミックスの中でも代謝物を対象とするものであるが、遺伝子やタンパク質を扱う手法と比較すると遙かに未成熟な手法であり、確固たる方法が確立されているわけではない。しかし、遺伝子やタンパク質の誘導はそのときの生体内で行う命令形であり、実際に体内でどのような対応が行われたかは明らかにできないのに対して、代謝物はその命令が施された結果を示すため、生体内の対応やそのときの状態をオミックスの中でも最も良く反映すると言える $ ^{1} $ 。メタボロミクスは医薬分野で盛んに研究が進められているが、魚類などを初めとする水生生物への適用はまだ少なく、さらに環境汚染物質影響評価法としての適用例はさらに少ない $ ^{2,3} $ 。しかし、先行する医薬分野の哺乳類を対象とした研究から、メタボロミクスは従来の毒性影響評価法よりも何倍も感度良く生体内毒性影響が見出せることが知られている。しかも複数の臓器に毒性影響が同時に起こった場合でも、それらの毒性影響を網羅的に見出せる可能性が高い。

上記のようにメタボロミクスは様々な場面に適用可能であり、その応用範囲はきわめて広いと考えられているが、他のオミックス法と比較するとピックアップできる情報量が遙かに少なく、1つの代謝物が複数の役割を兼ねていることが多いため、その解析は難しい。メタボロミクス研究が開始された当初から、網羅的に代謝物をとらえる手法としてNMRを適用するものが最も多い。その理由として、NMRは簡単に代謝物情報が得ることができ、その数の多さから先行研究として参照しやすいことも挙げられよう。しかし反面、NMRは感度が低く、検出可能な代謝物種数が少ないという問題があり、十分な代謝物情報が得られない。そこで、近年ではキャピラリー電気泳動や液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーなどと質量分析装置を組み合わせた分析機器を用いてその分析情報をとらえる研究が行われるようになってきた。このような質量分析装置を用いた場合にはNMRとは比べものにならないくらい多くの情報が得られる反面、代謝物の定性が難いため、代謝物情報のほとんどが未知代謝物で占められてしまう。そこで、多くの研究は定性可能な代謝物をとらえて、その情報のみから生体内情報を探るという手段をとることが一般的である。現在の質量分析装置を用いたメタボロミクス研究のあり方は個々の研究の考え方にもよるが、網羅的に代謝物変動をとらえる、というメタボロミクスの大きなメリットを捨てていると言っても過言ではないし、未知の重要な生体応答情報に対しては目を向けていない。

我々は本研究を行うに先立ってメタボロミクス研究を始めた当初はやはり NMR を用いて魚類の
化学物質やストレスに対する影響を調べてきた $ ^{4-7)} $ 。しかし、やはりNMRでは代謝物の情報があまり多くなく、より詳細な情報を扱って影響評価を行うことは困難であった。そこで、GC/MSに注目した。GC/MSは現在では多くの研究機関が所有する分析機器の1つである。このGC/MSによるメタボロミクスを用いた環境汚染評価法が確立し、解析の手順と方法を示し、その有用性を示していけば、多くの研究機関でも導入しやすい可能性が高い。しかし、未知の代謝物も網羅するようなGC/MSを用いたメタボロミクスはほとんど研究例がなく、特に環境汚染物質の生体影響評価などを行う場合はどのような方法が最適でどのような流れで解析を進めるのが最も良いか、という段階から始めなければならないというのが現状であった。

## 2 ．研究開発目的

上記のような現状や背景を踏まえ、本サブテーマでは、実験魚として非常に扱いやすくこれまでの毒性影響評価法でも対象生物として広く用いられているヒメダカを対象として、①GC/MSを用いたメタボロミクスを確立するためのデータの構築と手法を確立すること、②複合ストレスに対する影響評価を行うこと、③①と②の過程を経て、実際の環境試料に対する定量的な影響評価を行うこと、を主たる目標GC/MSを用いたメタボロミクスによる影響評価を進める上でどのような方法で、どのように解析を進めるべきかを確立することを目的とした。メタボロミクスを評価ツールとして、しかも定量的に影響評価を行うことに用いる研究例はこれまで皆無であると考えられる。本法を確固たるものとするために、同じ条件でストレス暴露したヒメダカを対象として、遺伝子を対象としたトキシコゲノミクスによる評価も同時に行って、メタボロミクスの結果と詳細に照らし合わせた。オミックスの中ではトキシコゲノミクスは最も発達した方法であり、メタボロミクスよりも完成度が高い。また、遺伝子発現と代謝物誘導は密接な関係を持つため、遺伝子の発現データを組み合わせることにより、これまで1つの代謝物が複数の機能を持つために解析が難しいというのが1つの難点であったメタボロミクスによる生体内評価が、従来よりも容易に解析できる多くの手掛かりを得ることができる可能性が高い。さらに考え方を進めて、両者の手法を併せて化学物質の影響評価を行えばそれらの欠点の多くを互いにカバーでき、分子メカニズムを念頭に置いた網羅的かつ定量的な化学物質の複合影響評価を感度良く、しかも迅速に行える可能性を秘めているため、本研究で得られる成果の意義は非常に大きいと考える。

## 3 ．研究開発方法

## （１）試験開発の概要

本研究では主として2つのストレスが複合的に存在しているときと、単一で存在しているときとのヒメダカに対する影響を、明瞭に区別してメタボロミクスにより検出できるか、そのためにはどのような解析を行えば良いかを検討し、1つ1つデータを構築していった。

平成21年度はヒメダカに与える影響が全く異なると考えられる、絶食および低温暴露という2つのストレスを個々、あるいは複合的にヒメダカに与えて、それぞれの影響がメタボロミクスによってどのように見出せるかを検証した。ここでの主たる目的は、①本研究の暴露試験は絶食下で行うため、絶食自体の影響を把握すること、②全く異なったストレスに複合的に暴露されたときに、本研究で用いる解析法が影響をどのように表現できて、さらにどのように定量化できるかを検証すること、③②で得られた結果、およびさらに絶食および低温に対するヒメダカの影響をさ
らに詳細に解析した結果から具体的にヒメダカ体内の代謝にこれらのストレスがどのような影響を与えたかを検証する、等である。

平成22年度は多環芳香族炭化水素類（PAHs）の一種のフェナントレンおよびピレンを対象物質とした。PAHsは複数個のベンゼン環から構成される物質の総称である。燃焼により発生したり、石油中に含まれており、石油流出時に環境中に放出されることが知られ、陸水域間わずに広く存在する。またベンゾ(a)ピレンのように変異原性を有する物質がいくつか存在しているために、これまで水生生物に対して数多くの影響試験が行われてきた。しかし、変異原性に関しては多くを調べられているものの、それ以外の影響に関して実際はあまりしられていないのが現状である。PAHsは多種存在するが、その構造はベンゼン環の数と構造がわずかに異なるだけであり、それぞれのPAHsの生物影響はほぼ共通していると考えられているが、PAHsによる複合影響に関してはほとんど調べられていない。本研究では、PAHsの中でも水環境から比較的高濃度で検出されるフェナントレンおよびピレンを暴露物質として選択し、それぞれの単独暴露、あるいは複合暴露を行って、それぞれの暴露時の影響の相違がメタボロミクスで検出できるか検討を行った。ここでの主たる目的は、①影響が類似しているストレスの複合影響を、本研究で確立する解析法でどのように表現でき、どのように定量化できるかを検証する、②類似した影響をヒメダカに与えると考えられるフェナントレンとピレンの複合暴露を行ったときに、単純に複合暴露の影響の度合いが大きくなるだけなのか、それとも全く異なった影響が見出せるか、などを中心に詳細に両者の代謝物暴露がヒメダカにどのような影響を与えるかを検証する、等である。

さらに平成23年度は、21年度から22年度に検討、確立してきたメタボロミクスによる解析方法を用いて、実際に環境から採取された海底質の影響評価を試みた。海底質の全抽出物をヒメダカに暴露して、①その影響の地域間差などが検出できるか、②実環境レベルの汚染評価に本研究で確立した方法は適用可能か、などを中心に検証した。

## （２）絶食および低温暴露試験(平成２１年度)

2Lのガラス水槽を2つ用意し、これに生後8週間のヒメダカ4尾をそれぞれに収容した。用いたヒメダカは全て雄の個体を選別した。これらのヒメダカを1週間絶食状態（全く餌をやらない状態）においた（絶食区）。一方、コントロールとして、1週間、毎日餌（アルテミア）を飽食に与えた個体4尾を収容した水槽も2つ用意した（コントロール区）。各飼育水の水温は25℃に保ち、弱いエアレーションを施した。また、それぞれの飼育水槽の水は毎日全量を交換し、毎日タイマーにより14時間明状態、10時間暗状態を繰り返した。1週間後、絶食区およびコントロール群の水槽1つずつから、全ての個体をサンプリングし、直ちに肝臓を摘出して液体窒素により凍結した。さらに、残りの絶食区の水槽を10℃に設定したインキュベータに1日収容して飼育を継続した（絶食一低温区）。同様にコントロール区の水槽1つも同じインキュベータに1日収容した（低温区）。これらの水槽を24時間、インキュベータ内に放置した後、全ての個体をサンプリングして、直ちに肝臓を摘出し、液体窒素により凍結した。摘出した肝臓は分析まで-80℃で保管した。

## 1 ）暴露試驗

（３）フェナントレンおよびピレンの単独または複合暴露試験（平成２２年度）
メタボロミクス解析のための暴露試験（本試験）の暴露濃度を決定するために、数段階の濃度のフェナントレンあるいはピレンを飼育水に添加して、月齢1ヶ月のヒメダカ稚魚の96時間毒性試験を行った。この毒性試験の結果から、本試験ではフェナントレンの暴露濃度を5（フェナントレン低濃度区）および50（フェナントレン高濃度区）μg/L、ピレンの暴露濃度を3（ピレン低濃度区）および30（ピレン高濃度区）μg/Lのそれぞれ2濃度区を設置することにした。さらに複合暴露試験濃度はフェナントレン5 μg/L＋ピレン3 μg/L（複合低濃度区）およびフェナントレン50 μg/L＋ピレン30 μg/L（複合高濃度区）の組み合わせでそれぞれ添加したものの2濃度区とした。

本試験の暴露はガラス水槽を用い、2Lの飼育水で行った。水温は25℃に保ち、緩やかなエアレーションを施した。この飼育水に上記の設定濃度になるようにフェナントレン、ピレン、あるいは両物質を添加した。このとき、助剤としてエタノールを用いた。これらの飼育水槽に加えて、ピレンとフェナントレン、およびエタノールのいずれも添加しないコントロール区と、エタノールのみを添加した溶媒区も設けた。これら全ての水槽に25尾ずつの生後4週齢のヒメダカ稚魚を収容した。暴露は96時間行い、0（暴露試験直前）、24、96時間目にそれぞれの水槽から12尾ずつのヒメダカを採取した。暴露試験期間中、稚魚に餌を与えなかった。飼育水は毎日完全に交換する反止水式水槽で試験を行い、毎日タイマーにより14時間明状態、10時間暗状態を繰り返した。採取したヒメダカは直ちに液体窒素で凍結し、代謝物分析まで-80℃の冷凍庫で保存した。

## 2 ）ヒメダカ体内中フェナントレンおよびピレンの濃度測定

上記のフェナントレンとピレンの単独および複合暴露区からそれぞれ採取したヒメダカ稚魚を、1尾ずつ2 mLのポリプロピレン（PP）製マイクロチューブに収容し、そこにヘキサンを1 mLを加えて、高速振とう粉砕器（TissueLyser II，キアゲン）により6分間振とうした。振とう後、12,000 gで遠心分離し、ヘキサンを集めてクリーンアップを行った。クリーンアップには160℃で12時間加熱した後、3%の含水量になるように調製したシリカゲルを9インチのガラスパスツールピペットに詰めた簡易カラムを用いた。このカラムをヘキサン10 mLで洗浄した後、ヘキサン抽出液を負荷した。その後、ヘキサンと3%アセトン含有ヘキサンを10 mLずつ流してこれを合わせた。その後、内部標準物質として、100 ng/mLのフェナントレン- $ d_{10} $ およびピレン- $ d_{10} $ を100 μLずつ添加し、100 μLまで窒素ガスを吹き付けて濃縮した。これをバイアル瓶に詰め、GC/MSにより分析した。

GCの注入口温度は280℃、検出器温度は270℃に設定した。また高温槽温度は60℃で1分間保持した後、30℃/minで200℃まで昇温して1分間保持した。さらに3℃/minで225℃まで昇温し1分間保持し、30℃/minで300℃まで昇温して15分間保持した。カラムはDB-5ms（内径0.25 mm × 長さ30 m、膜厚0.25 μm；J&W Scientific）を使用した。注入量は1 μLとした。

分析は各区3サンプルずつ行い、それぞれの濃度は平均した $ (n=3) $ 。

## （４）実環境における生物影響評価～野外海底質抽出物の暴露試験(平成23年度)

平成21～22年度に確立したメタボロミクスによる影響評価法により、平成23年度は実環境から採取した海底質抽出物の影響評価を行った。底質を採取した地点は人口密集域に近接していて、様々な化学物質が底質中に残留していると考えられる大阪湾とフィリピンスービック湾で（図

図1-1 底質採取地点 $ ^{8)} $
(1)-1）、大阪湾で2004年、スービック湾で2005年に採取した。

風乾した底質をアセトン/ヘキサン（1:1）およびトルエンにより抽出液を得た。この抽出液を合わせ、ロータリーエバポレータで乾固した後、残渣に1 mLのアセトンを加えて抽出液とした。本試験ではこの抽出液を底質からの全抽出物を含むものとして扱った。

まず、メタボロミクス解析のための暴露試験（本試験）の暴露濃度を決定するために、数段階の濃度を用意して、ふ化後2.5週齢のメダカ稚魚を20個体ずつ入れ、72時間の毒性試験を行った。上記抽出液から、等倍、5倍希釈、25倍希釈、125倍希釈した溶液をそれぞれ用意した。1Lの試験水に抽出物濃度を1g底質/L相当量になるように抽出液0.1mLを添加したもの（等倍希釈）を初めとして、この濃度よりも5.25、125倍希釈した試験水をそれぞれ用意して毒性試験を行い、その結果から大阪湾、スービック湾ともに等倍希釈（1g底質/L）およびその25倍希釈（0.04g底質/L）の濃度でそれぞれ本試験を行うことにした。ふ化後3.5週齢のメダカ稚魚に対して、アセトンの終濃度が0.01%となるように上記の希釈率に水中濃度がなるように調製した抽出液を添加した。

本試験は1.7Lのガラス水槽を用い、1Lの飼育水を用いて行った。水温は25℃に保ち、緩やかなエアレーションを施した。この飼育水に上記の設定濃度になるように大阪湾およびスービック湾底質の抽出物をそれぞれ添加した。このとき、助剤としてアセトンを用いた。これらの飼育水槽に加えて、底質抽出物とアセトンのいずれも添加しないコントロール区と、アセトンのみを添加した溶媒区も設けた。これら全ての水槽に20尾ずつの生後3.5週齢のヒメダカ稚魚を収容した。暴露は24時間行い、暴露後直ちに水槽からヒメダカを採取した。暴露試験期間中、稚魚に餌を与えなかった。飼育水は毎日完全に交換する反止水式水槽で試験を行った。採取したヒメダカは直ちに液体窒素で凍結し、代謝物分析まで-80℃の冷凍庫で保存した。
## （５）代謝物の抽出および測定

全ての暴露試験で採取した肝臓あるいはヒメダカ稚魚を個体ごとに2 mLのPP製マイクロチューブに収容し、そこに内部標準物質として2,2-ジメチルコハク酸を添加し、クロロホルム/メタノール/水混合溶液（1:2:0.8, v/v/v）を加えた。

平成21年度はこのマイクロチューブを氷を敷き詰めた水中に入れ、15分間超音波照射して代謝物を抽出した。抽出後、12000gで5分間遠心分離し、メタノール/水相を集めた。

平成22と23年度には上記マイクルチューブに直径5 mmのジルコニアボールを入れ、高速振とう粉砕器により6分間振とうして代謝物を抽出した。その後、12000gで5分間遠心分離して、メタノール/水相を採取した。

上記メタノール/水相を採取後、窒素ガスを吹き付けて完全に乾固した。この溶液に塩酸メトキシアミン-無水ピリジン溶液を添加して、30℃で90分間ゆるやかに振とうして代謝物をメトキシム化した。メトキシム化後、全てのマイクロチューブに1%TMCA－MSTFA溶液を添加し、38℃で45分間ゆるやかに振とうして代謝物をさらにトリメチルシリル（TMS）化した。TMS化後、ヘキサンを添加し、これをGC/MSにより測定した。

GC/MS測定にはカラムにDB-5ms（内径0.25 mm × 長さ30 m、膜厚0.25 μm；J&W Scientific）を用いた。注入口温度は250℃、検出器の温度は290℃に設定した。恒温層の温度は以下のように昇温条件は、60℃で1分間保持した後、325℃まで10℃/minで昇温し、325℃で12分間保持した。サンプル注入はスプリットレスモードで行い、注入量は1 μLとした。

## （6） データ処理

GC/MSクロマトグラム上の個々の代謝物データはAutomated Mass Spectral Deconvolution & Identification System (AMDIS ver. 2.1、NIST)を用いてピークの選別と認識（デコンボリューション）を行った。デコンボリューション後、S/N比が15以上のものをピークと見なし、全てのピーク面積を求めた。検出されたピークは内部標準物質の面積値との比率（ノーマライジング）を求め、それに10^{6}を掛けたものを定量値とした。これらの定量値を用いて次の（6）に示す統計処理を行った。

また検出された代謝物ピークの全てをNIST05ライブラリーから、あるいは実際に市販されている代謝物標準品を誘導体化後GC/MSに注入し、マスパターンを得ることにより、できる限りピークの定性を行った。

## （7） 統計処理

（6）で得られたデータをまず個々のピークごとに一元配置分散分析（ANOVA）により処理して（p<0.05）、各群間で有意差があるものを選別した。さらに、選別された代謝物のデータを主成分分析（PCA）により処理した。これらの統計処理は統計ソフトR（htTCP://www.r-project.org/）により行った。

上記（4）～（6）項の処理の流れを図(1)-2に示す。
図(1)-2 代謝物抽出から解析までの流れ

## 4 ．結果及び考察

## （1） 数値化に関する手順と考察

本研究ではその概念自体がわかりにくいメタボロミクスおよびトランスクリプトミクスの2つのオミックスの手法から得られたデータを数値化する方法を開発することを1つの目的とした。メタボロミクスでは代謝物の変動を網羅的にとらえ、非常に多くのデータを得ることができる。そのデータの多さゆえにこれまで行われてきたメタボロミクス研究では統計処理を行うことが多い。しかし、確固たる方法は確立されておらず、また、その統計的意味が曖昧なものも多いのが現状である。そこで我々は従来行われている統計処理をさらに発展させて、その手法を確固たるものにし、この統計処理によって得られたデータをもとに数値化、そしてヒメダカに対するストレス影響（化学物質暴露なども含む）を視覚化する手法の検討を行った。

メタボロミクスの代謝物データはGC/MSを用いた場合、クロマトグラム上で1つ1つの代謝物がピークとして検出される。そのため、個々のピーク面積が容易に得ることができる。すなわち面積値が大きいときにはその代謝物がヒメダカ体中に多く存在し、その値が小さいときには体中にあまり存在していないことを意味する。本研究はこの面積値＝代謝物濃度と見なしてこれを個々の代謝物データとした。

この代謝物データを用いて、コントロール区とストレスを加えた区の間で代謝物量に差があったものをANOVAによって選別した。ここで各区間に差があったものだけを選別したのは、次に行うPCA処理を行う際に、各区の違いをよりデフォルメすることが主目的である。さらに、各区間で影響があったものだけをふるいにかけることにより、影響を定量化した後に行うパスウェイなどを用いた詳細な影響評価を行う際に、どの部分の代謝経路に影響が現れるかが明瞭になるため、影
響の特徴をとらえるのが容易になる。ANOVAで処理した後、PCA処理を行った。ここでPCAを行った際には、一般的には主成分1（PC1）が最も影響の特徴を表しており、次にその影響の特徴を示すものが主成分2（PC2）として表現される。このPC1とPC2の2つの数値を平面にプロットすると、影響の大きさの視覚的判別が容易になる。すなわち、平面上でストレス暴露区のプロットがコントロール区のプロットから大きく離れれば離れるほど、その影響は大きいことになり、コントロール区とあまり大差ない場所、あるいはごく近い場所にプロットされた場合はその影響がほとんど無い、あるいはごく小さいということを意味する。これらのコントロールからの距離はその影響の大きさを示している。また、平面上にプロットされる上で、個々の代謝物データがPC1方向およびPC2の方向にそれぞれ位置させるために、どの程度の寄与があったかを示すものとして負荷量というデータがPCAで処理する際には算出できる。この負荷量により、ANOVAで選別した代謝物から、さらにヒメダカ体内のどの代謝物が主として影響を受けたがピックアップできることになり、PCA後のさらに詳細な解析なデータ処理を行う上で重要な情報となる。このようにデータをPCAにより示し、さらにコントロールとの距離=影響の大きさという概念で本研究では影響の大きさを数値化した。

本研究ではこのPCAを用いて、2つの複合ストレスがあった場合、そのストレスが全く異なった性質を持つ場合（平成21年度行った絶食と低温暴露試験）と、類似した性質を持つ場合（平成22年度行ったフェナントレンとピレンの暴露試験）の2つの複合暴露のパターンを以下（2）および（3）に示すように表現することができた。また、距離=影響という影響の定量法を用いて、平成23年度には実際の野外底質試料から得た抽出物をヒメダカに暴露し、2つの場所の影響の地域間差が見出せるかなどを検証した。

## （２）メダカの絶食および低温暴露試験（平成２１年度）

## 1 ）PCAによる定量、視覚化

メタボロミクス解析によって得られたデータを用いて、ANOVAによりコントロール区、絶食区、低温区、絶食－低温区のそれぞれの群間で有意差があった代謝物を選別した。さらにその選別された代謝物をPCAによって処理した。PCAで処理した結果から得られたPC1とPC2をプロットしたものを図(1)-3に示す。図(1)-3に示すように、それぞれの同一区ではごく近い場所に群を形成し、さらに4つの群はそれぞれ明らかに異なった位置に分布した。すなわちコントロール区から見ると絶食区はPC1の正の方向に、低温区はPC2の負の方向に離れて分布した。また、絶食－低温区は絶食区および低温区のベクトルの和にあたる位置の近辺に分布した。詳細はサブテーマ2の報告書に譲るが、同様の試料をトランスクリプトミクスにより解析したところ、PC1とPC2の軸が逆になったものの、両者の平面上における分布パターンは一致しており、さらに絶食－低温区は絶食区および低温区のベクトルの和にあたる部分に位置するなども一致していた。

平成21年度にストレスとして選択した絶食と低温は全く性質を異としたものであり、それぞれヒメダカに与える影響はかなり異なることが考えられた。このようにそのストレス因子の作用機序が独立している場合、本研究で行ったようなANOVAでデータ処理し、さらにPCA処理する方法を行うことにより、以下のような表現ができると考えられた。すなわち、各成分（各ストレスによる影響、ここでは絶食と低温から受けた影響）が図(1)-3のFactor#1および#2のように異なった次元のベクトルにより表現される。そしてこのベクトルの大きさが影響の強さとして示される。ま
図(1)-3 コントロール区、絶食区、低温区、および絶食－低温暴露をPCA処理し、PC1とPC2をプロットしたもの。水色の菱形はコントロール区、赤い四角は絶食区、緑の三角は低温区、黄色い丸は絶食－低温区を示す。

た、2つの成分の複合影響（ここでは絶食と低温の複合影響）はFactor#1と#2のベクトルの和として表すことができる。2つのストレス因子の作用機序が独立している場合の複合影響は、そのストレス因子がどのようなものであっても本研究で行ったデータの処理を行えば同じように表現できると考えられた。

## 2 ）個々の代謝物に対する影響

個々の区における特徴を詳細にとらえるために、定性可能であった代謝物を対象としてさらにその変動などを調べた。その中から生物が生きる上で欠かせないエネルギー生成の場であるTCA回路に関わる代謝物とその大まかな代謝経路を示したものを図(1)-4に示した。

絶食区ではその量を減らすものと、7日間の絶食であまりその量が変動しないものの2つに大別された。特に、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、リジンなどは必須アミノ酸であり、その摂取の大半は餌からの直接取り込みに依存しているものである。しかし、これらは絶食区では7日間の絶食があったにも関わらず、その量はコントロールとあまり変わらないものであった。これら必須アミノ酸の外部からの取り込みの経路は他にはないことから、これはおそらく筋肉中などに保持されているタンパク質を分解して必須アミノ酸を作り出していると考えられた。また、必須アミノ酸と同様に、餌からの取り込みにその量が大きく依存し
図(1)-4 TCAに関連する代謝物とその代謝経路の概略図 赤字の代謝物は必須アミノ酸、青地の代謝物はグルコースを示す。グラフは左の赤いものがコントロール区、2番目の青いものが絶食区、3番目の紫のものが低温区、4番目の緑のものが絶食-低温区を示す。縦軸はGC/MSのデータをノーマライジングしたもので単位はない。
ているグルコースもコントロールとほとんど量が変わりなかった。別に行った試験により、この週齢のヒメダカを絶食させたときに10～12日目にほとんど死に至ることを確認している。必須アミノ酸とグルコースが絶食区でコントロール区とほとんど変わらぬ量であったのは、ヒメダカ体内で糖新生が起こっていた可能性が高いと考えられた。糖新生が起こった場合、グルタミン酸などのアミノ酸の炭素骨格を用いてグルコースを生成しようという代謝が発生するが、本研究ではグルタミンやグルタミン酸、2-オキサロ酢酸（2-0G）の変動から考えても、糖新生が起こっていた可能性が高いことが示唆される結果であった $ ^{6} $ 。糖新生は本来、体内のエネルギー生成を維持するために起こる現象であるが、絶食区のTCA回路内のクエン酸やコハク酸などの量がコントロールとさほど変わらない量となっているのは、糖新生が起こっている結果によりこのような状態になっていると考えられた。糖新生は結果的に身体に保持されていたタンパク質を放出して、分解してしまうので、生物にとっては消耗が激しく長い期間、この糖新生の状態を維持することは難しい。上述したように、絶食を続けると10日目あたりから死に至るのはこの消耗がきっかけになっていることは間違いない。本研究で見られたような絶食区の代謝物変動はこの消耗する過程を良く反映している結果だと言える。

絶食区では3-ヒドロキシ酪酸（3-HB）がコントロールと比べると大きく増加していた。これは、やはり絶食時にエネルギー生成のために起こる脂肪酸のβ酸化のときに生成される代謝物であり $ ^{6} $ 、この量の増加はヒメダカ体内でのエネルギー生成量が、通常のTCA回路の働きだけでは足りなくなり、体内に蓄積している脂質を分解して脂肪酸を得て、それを利用してエネルギーを得ていることを示唆するものである。

増加している代謝物に対して、減少している代謝物はおそらく絶食による消耗によるものと考えられた。このように絶食という緊急事態にヒメダカ体内では必要なものを積極的に作り出してそれを供給しており、その利用に緊急性の小さいものはあまり積極的に作り出すことはない、と予想される結果となった。

低温区は絶食区と同程度か、あるいは絶食区よりも量を少なくする代謝物がほとんどであった。これは低温状況下でヒメダカ体内の代謝速度を低下させてエネルギー消費を抑えた結果か、ヒメダカが変温動物であり低温のために代謝の速度が遅くなった可能性が考えられる。この区では低温暴露直前まで餌を飽食に与えられており、この後、もし低温暴露を続けたとしても急速に代謝物量が減るとは考えにくい。

低温区と絶食-低温区は、ほぼ絶食区および低温区で見られた代謝物変動が同時に連動して起こっていると考えられる結果となった。これは上記1）のPCAの結果を良く反映しており、絶食区-低温区は絶食区と低温区の代謝物に対する影響が併せて起こっているということの証明でもある。また、絶食は上記1）のPCAでもコントロール区に対してPC1方向に離れて位置していた。このPCAの結果はコントロール区-絶食区間の代謝物変動がコントロール区-低温区よりもかなり大きいことを示している。このことは、今まで述べたように定性可能であった代謝物をピックアップして詳細に変動を調べても、その影響は一目瞭然であり、ヒメダカの代謝が絶食の影響を低温暴露よりも大きく受けていたということを意味するものであった。

（３）フェナントレンおよびピレンの単独または複合暴露試験（平成22年度）

１）フェナントレンおよびピレンのヒメダカ体内中濃度変動
図(1)-5 ヒメダカ体内中フェナントレンおよびピレン濃度

左のPhenanthreneはフェナントレン単独暴露区、真ん中のPyreneはピレン単独暴露区、右のMixはフェナントレン-ピレン混合暴露区を示す。

図(1)-5に24および96時間におけるフェナントレン、ピレン各単独および複合暴露区のヒメダカ中の両PAH濃度を示した。各高濃度区のヒメダカ中PAH濃度は低濃度区の10倍程度の濃度となっており、暴露濃度依存的に体内中に各PAHが取り込まれたと考えられた。特に高濃度区はフェナントレン、ピレン共にppmのレベルでヒメダカに蓄積されていた。

ピレンに関しては低濃度区では24および96時間の体内濃度がフェナントレン単独暴露区よりも低かったが、高濃度区ではフェナントレン暴露区よりも同等か若干濃度が高くなる傾向が見られた。本研究では取り込みや蓄積に関しては詳細に検証するものではないので、これ以上確認しておらず、本研究で見られた蓄積の傾向に関する理由は良く分からない。また、混合暴露区でもピレンは同様の傾向を示し、低濃度区ではフェナントレン濃度の方が高かったものの、高濃度区ではピレン濃度の方が同等、あるいは若干高い傾向にあった。混合暴露と単独暴露のヒメダカ中濃度を比較すると、フェナントレン、ピレンともそれほど大きく値が変わるものではなかった。

## 2 ）PCAによるフェナントレン、ピレンの単独および複合暴露時の影響評価

本研究では単独および複合暴露ともに低濃度と高濃度の間には10倍の暴露濃度差を設けた。その結果上記1）で示したように、体内濃度も濃度依存的に増加しているのが観察された。しかし、メタボロミクスにより影響解析を行ったところ、フェナントレンとピレンの単独および複合暴露ともに、濃度依存的な影響の差異は見られず、それはPCA解析の結果でも判別することができなかった（図(1)-6）。本研究で設定した暴露濃度は、暴露試験前に行った毒性試験をもとに設定しており、高濃度区は半数致死濃度の約3～5倍低い濃度に設定した。よって、低濃度区は半数致死濃度の30～50倍低い濃度に設定されている。この低濃度区と高濃度区がどの暴露でも影響差異が見られなかったということは死に至るよりもかなり低い濃度で、実際にはヒメダカが代謝物質の変動に影響を受けていたことを示唆しており、ヒメダカは本研究で対象として暴露したPAHsにはか
図(1)-6 フェナントレンとピレンの単独および複合暴露から得られた代謝物データのPCA解析結果

なり低い濃度で影響を受ける可能性が高いと考えられた。これらの事実はメタボロミクスの影響検出感度の良さを示すものである。

24時間の時点における代謝物データをPCAにより解析した。その結果、PCA解析によってフェナントレンとピレンの影響の差異もほとんど見られなかった。このことは両暴露の影響が非常類似していることが原因であると考えられたが、PC1方向に大きく広がるような分布を示した。このことからPC1が単独影響を示すものと考えられた。また、複合暴露は溶媒区および単独暴露区と比較するとはPC2の方向に離れて分布した。これは複合暴露区が単独暴露区とは多少異なった影響を受けていた可能性を示唆するものである。このようにフェナントレンとピレンの各単独暴露群があまり明瞭な分離を示さなかったこと、さらには暴露濃度による影響の違いがあまり見られなかったのはトランスクリプトミクスの結果と良く一致した。

96時間の時点ではフェナントレンとピレン単独暴露区はPC2方向で分離をしており、フェナントレンの影響がピレン暴露区よりも多少強い可能性を示した。また、複合暴露群はPC1方向に離れて分布する傾向を示したが、24時間ほどクリアな分離を示すものではない。これは絶食の影響が大きいと考えられる。稚魚のレベルで96時間の絶食というのはかなり限界に近い期間であり、我々が行った別の試験ではこの後数時間絶食を続けると稚魚が死に始めることを観察している。絶食というファクターは平成21年度の試験でも述べたようにヒメダカの代謝にとっては特に大きな影響を示すものである。96時間の時点では絶食の影響が大きくて、各暴露の影響の特徴をぼかして
図(1)-7 コントロールの代謝物データによるPCA解析結果

しまった可能性が高い。このことは我々が本研究のメタボロミクスを確立させるために独自に行った、様々な暴露物質を対象として行った試験でも同様のことを観察している。実際、コントロール区の0、24および96時間の代謝物データをANOVA→PCA解析を行うと図(1)-7のような結果が得られ、96時間の間の絶食により、かなり大きく代謝物変動が起こっていることが示された。特に、この図のPCAの結果から考えると96時間目では無視できないくらい絶食の影響は大きいと考えられる。よって96時間のPCAのみによる影響評価は的確であるとは言えず、絶食下で暴露試験を行う場合、本研究で扱うANOVA→PCA解析による影響評価は24時間の結果を対象として行う方が精度が高いと言える。詳細はテーマ2の報告書に譲るが、このような絶食の影響はトランスクリプトミクスの方が顕著であり、96時間のデータではメタボロミクスよりもさらにPAHs暴露の影響を不明瞭にしていた。メタボロミクスは96時間の時点ではある程度、各暴露区の影響がPCA解析の結果から判断できることから、代謝物に対する影響は遺伝子に対する影響よりも遅れて現れると考えられた。これはPAHsがヒメダカ体内に取り込まれ、それが異物として認識されて遺伝子が発現するのと比較すると、遺伝子からタンパク質誘導、そして異物混入のストレスの対応があって代謝物が生成されるという順序を体内では大まかに経ていると考えられるが、遺伝子誘導から代謝物生成までのステップに至るまでにはある程度時間差があるために起こるのではないかと考えられた。

今回のフェナントレンとピレン、それぞれがヒメダカに与える影響は前述したように非常に類似していると考えられる。このように作用機序が似ている場合の複合影響を我々が行ったANOVA→PCA解析による影響評価では単独暴露は暴露物質が異なってもほぼ同じベクトル上に示されると考えられる。このベクトルの大きさがその影響の強さを示すが、その方向はほぼ同じだと考えられる。そして、これらが複合して暴露されたときには2つのパターンが考えられる。その1つは、
個々の単独暴露のベクトルと同じ方向に位置し、そのベクトルの大きさのみが変化するものであり、もう1つはベクトルの方向が単独暴露とは全く異なって向く場合である。前者は類似している暴露物質故に影響が単純に増強されるパターンであり、後者は両者の暴露物質の生物に与える影響が類似していても複合暴露により、単独暴露のときとは全く異なった影響を与えるパターンである。今回の24時間の時点でのフェナントレンとピレンの複合暴露群はPCA解析の結果、コントロール（溶媒区）と比較するとPC2の方向に位置し、単独暴露群はPC1方向に分離する傾向をみせたために、後者に当てはまるパターンであると言える。

平成21、22年度で示したように本研究で行った、メタボロミクスのデータをANOVA→PCAで処理する解析は、全く性質が異なった、あるいは性質が類似した複合影響のどちらも説明可能であった。このような解析を行うためにはできる限り、得られたGC/MSのクロマトグラム上から代謝物情報を拾い上げることが重要となってくる。そのためのポイントとしてはAMDISによるデコンポリューションとデコンポリューション後に精度良くピーク面積を個々のピークについて取っていくこと、そして、精度の良い内部標準物質の選定が必要となってくる。メタボロミクスのGC/MS上で検出されるピーク数は、その都度サンプルによって異なり、ヒメダカ稚魚だと300～600本程度であり、ヒメダカ胚を用いた場合は発生日数によって異なるが、多い時には800を越える。これらのピーク1つ1つのピーク面積値を個々のサンプルについて求めるのは非常に時間がかかり大きな労力を必要とする。今後、このような作業の自動化などを行うためのソフト開発なども視野に行い、GC/MSのメタボロミクスを完成させていくことが、本解析法を広めていくための1つの条件となってくると考えている。

## 3 ）個々の代謝物に対する影響

個々の代謝物でまず注目されるのは必須アミノ酸の変動である。魚類の必須アミノ酸は一般的に図(1)-8に示すバリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、トレオニン（Thr）、フェニルアラニン（Phe）、メチオニン（Met）、ヒスチジン（His）、リジン（Lys）、トリプトファン（Trp）およびアルギニン（Arg）の10種類とされているが、PCAの負荷量を解析したところ、24時間ではトリプトファンを除き他の9種類の必須アミノ酸がPC1の分離に大きく関与していた。これはフェナントレン単独暴露区で必須アミノ酸が上昇していたが、溶媒区と複合暴露区では単独暴露と比較するとかなり低い結果となった。24時間の時点ではフェナントレンの単独暴露区ではグルコースの上昇が観察された（図(1)-9）。このように必須アミノ酸の上昇とグルコースの上昇という連動した動きは前述したように絶食時に観察される変動の特徴であるが、単独暴露区では24時間の時点で類似した変動が観察された。24時間という短時間の絶食が原因となり、糖新生が起こっているとは考えにくく、これの上昇は生体外異物をヒメダカが取り込んだことにより、この異物を体外に排出するためにかなりのエネルギーが必要となったか、あるいは既に暴露により何らかの影響を体内で受け、それを治癒させるためにエネルギーやアミノ酸類が必要になり、過剰に投入する必要があるのではないかと考えられた。このように、化学物質暴露により、糖新生に類似した代謝物変動が起こることは、いくつかの研究で知られており、この必須アミノ酸産生の源は筋肉中のタンパク質だと考えられている。この点も絶食のときの状況と良く似ている。ピレンに関しては24時間の時点ではフェナントレンの動きに類似していたが、溶媒区との差はフェナントレンよりも小さく、また96時間の時点では溶媒区の変動と比較的一致していた。このこ
図(1)-8 各暴露群における必須アミノ酸量の比較(上が24時間、下が96時間)
Glucose variation ratios from 0 to 24hr (%)

Glucose variation ratios from 24 to 96hr (%)

* : PC1に対して有意な相関を持つ

図(1)-9 グルコースの量の比較とその時間経過に伴う変動

とから、96時間の時点では絶食の影響がピレン暴露の影響よりも大きく出ていたと考えられた。

24時間の時点では溶媒区と複合暴露区ではほとんど差が見られず、一見したところ複合暴露の影響はほとんどないのではないかと思われる結果となった。この件については後で詳細に考察する。

96時間では溶媒区の必須アミノ酸は上昇していた。これに伴いグルコースの上昇が観察されたことから、絶食によりエネルギー生成量が足りなくなり、糖新生が起こったためにアミノ酸量を増やす必要があったと考えられた。これは平成21年度に行った絶食試験と同様の現象であると考えられ、その由来はタンパク質であると考えられた。

96時間の時点ではフェナントレンとピレンの暴露群の必須アミノ酸は24時間よりも大きく量を減らすものが多かった。本来、絶食の影響が出てきてもおかしくないこの時間で溶媒区と同様に必須アミノ酸の量を増やせない理由として、溶媒区よりも早い時期に筋肉中タンパク質を分解して必須アミノ酸を投入したために、さらなる分解すべきタンパク質が不足してさらなる必須アミノ酸の投入が難しくなりつつあるのではないかと予想された。このことは、フェナントレンの単