Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
独暴露によりヒメダカが早く「消耗」してしまったとも考えることができる。また、96時間の時点におけるグルコースをみるとピレン暴露区は24時間から若干の上昇が観察されたことから、糖新生が起こったと考えられた。これらの結果から、暴露濃度は若干異なるものの、フェナントレン暴露の方がピレン暴露よりもヒメダカに短時間で強い影響を与えていたと考えられた。

複合暴露区は96時間の時点でも必須アミノ酸量が増えることはなかった。また、負荷量による解析からこれら必須アミノ酸10種類中7種類の必須アミノ酸がPC1の分離に寄与していた。これは複合暴露区の分離に寄与していたことを意味する。溶媒区が24時間から96時間で必須アミノ酸量を増やし、フェナントレンなどは24時間の時点で大きく量を増やしていたのに対して、複合暴露区は全くと言って良いほど必須アミノ酸量が変動していなかった。この経時変化の比較から、複合暴露区では必須アミノ酸量を増やす必要がなかったのではなく、フェナントレンとピレンの複合暴露を受けて、単独暴露のときとは異なった新たな影響を受けて、増やせなかったのではないかと考察している。必須アミノ酸の化学物質に対する変動については、本研究の解析を確立するために自主的に行った暴露試験でも類似した傾向が観察されている。それをここに挙げると、殺虫剤のマラチオンを暴露して（暴露濃度20 μg/Lと2000 μg/L、2000 μg/Lはほぼ半数影響濃度）、0、24、96時間の必須アミノ酸量を比較したところ、24および96時間にかけて20 μg/L暴露区の必須アミノ酸は上昇し、グルコースの量も増加させる傾向を見せたが、2000 μg/L暴露区の方はほとんどそれらの量に変動はなかった（図(1)-10）。マラチオンの2000 μg/Lという暴露濃度はアセチルコリンエステラーゼ阻害をほとんどの個体が受ける程度の濃度であり、ヒメダカ体内での影響が大きすぎて筋肉中のタンパク質分解が妨げられたか、あるいはタンパク質を分解してもアミノ酸の消費が早くて見かけ上、増えない結果であるかのどちらかであると考えられた。この結果は今回行ったフェナントレンとピレンの暴露試験の結果と類似すると考えている。すなわち、複合暴露はヒメダカが決定的な何らかの打撃を体内で受け、その結果、筋肉中のタンパク質分解とアミノ酸生成の動きを妨げたか、アミノ酸消費が早くて見かけ上増加していないかのどちらかと考えられた。必須アミノ酸を上昇させることができるか否かは、もしかしたらその生体が回復できる程度の軽度のダメージを受けているか、それとも回復不能なほどのダメージを受けているかの指標となる可能性があり、今後さらに研究を進める必要がある。

上記の複合暴露によって必須アミノ酸が増加しない状況は、必須アミノ酸に由来する非必須アミノ酸への代謝変動にも影響を与えており、複合暴露区の非必須アミノ酸のほとんどが24～96時間の間にその量が増えることは無く、これは必須アミノ酸の影響と連動していると考えられた。図(1)-11にその例として、メチオニンおよびトレオニン、あるいはフェニルアラニンといった必須アミノ酸が代謝されて生成される主な非必須アミノ酸の0から24時間の変動率と24から96時間の変動率を示した。これによると変動を示した。これによると一部の例外はあるものの、コントロール区と溶媒区のそれぞれの代謝物が0から24時間にかけてその量を大きく減らしているのに対して、フェナントレン暴露された区のほとんどの代謝物が低、高濃度区ともに軒並み上昇しているのが分かる。このとき、ピレン暴露区では若干の上昇傾向が見られ、複合暴露区ではコントロール区や溶媒区とほとんど変わらない量を示した。これらに対して96時間にはコントロール区、溶媒区ともに24時間と比較すると大きくその量を上昇させているのが分かる。また、フェナントレン区は24時間から96時間にかけて非必須アミノ酸の量を大きく減らし、これは必須アミノ酸の量の減少がそのまま反映していると考えられた。ピレン暴露区に関しては非必須アミノ酸に若干
24時間

96時間

図(1)-11 トレオニン、メチオニンおよびフェニルアラニンに関連した非必須アミノ酸の量の変化 24時間と記した上図が0から24時間の変動率（%）、96時間と記した下図が24から96時間の変動率（縦軸：%）を示す。また、棒グラフの左からC:コントロール区、EtOH:溶媒区、Ph-L、Ph-H：フェナントレン暴露区、Py-L、Py-H：ピレン暴露区、M-L、M-H：複合暴露区
の上昇が認められ、これは絶食に対する糖新生などもある程度関係しているのではないかと予想された。これらに対して、複合暴露区に関しては24から96時間の間もその量を減らしているのが観察された。これは非必須アミノ酸の動きと連動しているために起こる可能性が高い。これらの結果から考えると、PAHs暴露によりまず影響を受けるのは必須アミノ酸である可能性が高い。フェナントレン暴露区のように大量に必須アミノ酸が投入された場合は非必須アミノ酸も一時的に体内中の濃度が上昇する可能性が高い。また、複合暴露区のように必須アミノ酸が上昇することなく減少する場合は非必須アミノ酸も代謝によって生成される量は非常に少ない。このように、ヒメダカ体内ではPAHsの暴露によって、必須アミノ酸および非必須アミノ酸の両者が結果として攪乱される影響が見られた。フェナントレン暴露区は前述したようにこれらの上昇については説明可能である。しかし、複合暴露区のように単独暴露区でのアミノ酸が上昇しているのにも関わらず、同じアミノ酸類が減少し続けるという現象はこれまで知られていなかった影響だと思われる。このような相違がどのような影響メカニズムで起こるかはこれからさらに検証する必要がある。特にタンパク質分解と必須アミノ酸の関係、必須アミノ酸と非必須アミノ酸の関係などを調べたり、場合によっては代謝経路途中の代謝酵素に対する影響なども調べる必要があるかもしれない。

本研究における複合暴露区のように24時間の時点だけ見ていては影響が判断できない（見かけ上影響がないように見える）代謝物変動も多々確認された。これらの代謝物影響は0、24、96時間とデータを並べて初めて判別できる影響であることが多い。このことはメタボロミクスによる影響評価はPCAでは96時間の時点で絶食の影響が見られ影響はぼやけてしまうが、個々の代謝物に対する詳細な影響の評価のために、経時的なサンプルを少なくとも2点以上確保する必要があり、詳細にデータの検証を行う際は96時間のサンプルでも十分に対応が可能であることが分かった。

## （４）実環境における生物影響評価～野外海底質抽出物の暴露試験（平成23年度）

平成22年度と23年度の研究から、ANOVAを行った後、有意差を示す代謝物をピックアップしてPCAにより解析を行う方法は網羅的に大量に得られるデータの2つの次元に集約し、かつ、影響の大きさ（定量化）とその特徴をとらえるのに非常に有効な手段であることが分かった。平成23年度は本解析法を用いて、実環境の底質の抽出物がどの程度ヒメダカに影響を与えるか、また、地域間差などが定量的に示せるかという点を中心に検証した。

メタボロミクス解析のための暴露試験を行う前に、底質抽出液の72時間での急性毒性試験を実施したところ、スービック湾で採取した底質の抽出液を等倍で添加した区（1 g底質/L相当）で75%の致死率がみられた。また、大阪湾にて採取した底質の抽出液では致死影響は観察されず、大阪湾の底質に含まれる化学物質は致死影響をエンドポイントとした場合、ヒメダカに与える影響はスービック湾よりも相対的に低いことが明らかとなった。本試験の結果を受け、メタボロミクス解析は5倍および25倍希釈した抽出液を暴露したメダカにおいて実施することとした。

図(1)-12に底質抽出物に暴露後、代謝物データからPCA解析を行った結果を示した。その結果、コントロールに対してPC1方向に各群が離れていく傾向を示した。このことからPC1がヒメダカの受けた影響を示すと判断して、このPC1のみをピックアップして平均値を求め、グラフにしたものが図(1)-12右図に示したものである。その結果、PC1は大阪湾とスービック湾の底質抽出物ともに5倍希釈の方が25倍希釈の抽出液暴露区よりも大きく、濃度依存的に影響が現れていることを示し
図(1)-12 大阪湾およびスービック湾底質抽出物に暴露したときに得られた代謝物データをPCA解析したもの（左図）と、PCAからPC1の値をピックアップして示した図（右図）

ていた。また、大阪湾とスービック湾を比較するとスービック湾の25倍希釈抽出液を暴露したものが、大阪湾の5倍希釈のものとほぼ同程度の影響を受けていたと考えられた。また24時間の時では、大阪湾の25倍希釈液はほぼヒメダカの代謝には影響を与えていないと考えられた。これらの結果は上述のメタボロミクス解析のための暴露試験前に行った毒性試験の結果と一致していたが、メタボロミクスの感度は致死を指標とした毒性試験と比較すると25倍以上の感度があると考えられた。

このメタボロミクスの環境試料に対する影響評価結果は、本研究で構築した複合毒性の評価手法が一般環境試料に対する影響評価にも適用可能であり、その感度は25倍以上の低濃度暴露でも検出可能であることを示すことができた。また、スービック湾と大阪湾の毒性影響の違いも定量的に示すことに成功した。しかし、本研究では大阪湾とスービック湾間ではPC2に沿った分布の違いは見られず、地域間の影響の特徴がPCAからは見出すのは難しい。これは様々理由が考えられるが、2つ以上のストレスファクター（2種類以上の化学物質暴露）があったときに、複合暴露はどのように説明できるのかといった点や、その影響に拮抗作用や相乗作用が起こったときにどのような表現になるのかと言った点など、さらに本研究で確立した方法を用いて一般環境試料の評価や化学物質暴露の結果のデータを積み重ね、検証を行っていく必要がある。

## （6） その他の適用例

本研究を開始した当初、メタボロミクスは今よりも遙かに認知されていない方法であった。また、メタボロミクスは今現在もトランスクリプトミクスやプロテオミクスと比較すると成熟度の
低さが顕著であり、今後実用までにはさらなる発展が必要である。本研究の1つの使命として、メタボロミクスをまずは使えるものにすることが1つの課題であった。しかし、メタボロミクスのデータを担保するために遺伝子のデータを取ろうとしてトランスクリプトミクスを行うとしても、そのキット等々でかなり費用がかかり、予算の範囲ではできる試験に限界があった。そこでメタボロミクス単独でいくつか暴露物質を選定して、独自にメタボロミクスのための暴露試験を行い、できる範囲で本研究で行う解析法の確立のサブデータとして用いてきた。ここではヒメダカ稚魚だけでなく、胚（卵）や成魚も対象とし、さらには暴露物質もPAHs数種、農薬、クロロフェノール類といくつかの物質の暴露試験を行った。上に示したマラチオンの暴露試験の結果もその1つである。ここでは、このサブデータの1つを例としてヒメダカ胚にクロロフェノール類を暴露して、メタボロミクス解析を行った例を掲げておく。

クロロフェノール類はある種の除草剤を製造する際に副生成物として形成されると言われ、その除草剤散布と同時に環境中に放出されるのが主たる環境汚染ルートである。その他にもトイレの芳香剤などにも使われているようである。クロロフェノール類は比較的古くから毒性影響試験研究で対象とされており、魚類に対する影響試験のデータも散見される。しかし、魚類胚に暴露して影響を調べた例はほとんどない。そこで本研究ではクロロフェノール類数種をヒメダカ卵に暴露し、代謝物を抽出して本研究で開発した方法を用いてメタボロミクス解析を行った。対象としたクロロフェノール類は2,4-ジクロロフェノール（24DCP）、2,6-ジクロロフェノール（26DCP）、3,5-ジクロロフェノール（35DCP）、2,3,4-トリクロロフェノール（234TCP）の4種類である。暴露濃度はメタボロミクスのための暴露試験を行う前に毒性試験を行い、卵の発生などを観察して影響濃度を調べた。その結果、メタボロミクスのための暴露濃度を24DCPと26DCPが6.25μg/L、35DCPが2μg/L、234TCPが160ng/Lと設定した。これらの各濃度では各区ともほとんどの個体に奇形や孵化が早くなる現象が半分以上の個体に現れる濃度であり、このメタボロミクスの結果から将来の化学物質の催奇形性発現メカニズム解明の基礎とすることも狙いの1つであった。

上記の各クロロフェノール濃度にそれぞれ設定した飼育水にヒメダカ卵を暴露し、6日間飼育した。そしてそれぞれの胚サンプルの代謝物データを解析し、PCAに投じた結果を図(1)-13に示す。ここに示すように、塩素の付加する位置によって、各クロロフェノール暴露区は明らかに異なる群を形成した。このときPC1はクロロフェノール類の共通した毒性影響を表しており、PC2は個々のクロロフェノール類が持つ特徴的な影響を示していると考えられた。コントロール区から離れている距離と暴露濃度から考えると最もヒメダカ胚に与える影響が大きいのは234DCPだと考えられ、以下、35DCP、24DCP、26DCPの順に弱くなると考えられた。これらは今後詳細な解析を行ってさらなるクロロフェノール類のヒメダカ胚に与える影響や塩素付加位置による影響の違いなどを明らかにしていく予定である。

本研究では、いずれのクロロフェノールに暴露されていてもヒメダカの発生はかく乱されると考えられるデータを得ることができた。例えば234TCPを例に取り、暴露後3、4、6日目の代謝物データとコントロール区の代謝物データをPCAに投じた結果を図(1)-14に示す。これによると3から6日目にかけてコントロールはPC2の正の方向に移動していくのに対して、暴露区はコントロールとはPC2方向に全く異なった変動をすることが観察された。このPCAに関してもPC1は234TCPのヒメダカ胚に与える影響をしめしていると考えられる。このように本研究で確立した方法は、塩素基の付加位置の違いによる、ヒメダカ胚に与える影響を明確に区別して表すことができ、さらにはクロ
Control-6day 234TCP-6day 24DCP-6day 26DCP-6day 35DCP-6day

図(1)-13 暴露6日目のコントロール群、234TCP、24DCP、26DCP、35DCPのPCAスコアプロット

▲ Control-3day ▲ Control-4day ▲ Control-6day ● 234TCP-3day ● 234TCP-4day ● 234TCP-6day

図(1)-14 コントロール群と234TCP暴露群のPCAスコアプロット
ロフェノール類がヒメダカ発生中に大きく代謝をかく乱することが示唆される結果を得ることができた。

## （7） メタボロミクスの今後の課題

本研究で行ったGC/MSを用いたメタボロミクス解析は未同定物質が今後、いくつか追加されることはあると思われるが、その大部分は完成したと考えている。しかし、GC/MSで検出している代謝物は主として、トリメチルシリル化して検出できる物質に限られる。現在のところ、これはエネルギー生成に関する有機酸類、糖類、アミノ酸類などに限られ、その数は100種類程度でしかない。ヒメダカ体内に存在する代謝物全体からみるとこの数は数%程度の網羅性しかないと考えられる。今後はさらに定性可能な代謝物を増やし、情報量を増やして、「今、魚の中で何が起こっているか」を詳細に明らかにできるような、詳細解析の部分を発展させる必要がある。そのためにはLC-TOF-MSやGC-TOF-MSなどの導入も検討し、今まで見えてなかった代謝物をピックアップする手法の確立が急がれる。それが確立されたときに、メタボロミクスはヒメダカ1個体が今受けている影響のレベルを総体的に定量し、かつその具体的な影響の種類と部位が網羅的に明らかにできるマルチ影響評価法として完成される。従来行われてきた影響試験法はほとんどが1つの目的しか果たすことができず、見出せる影響もせいぜい数個に過ぎない。メタボロミクスはその網羅性から多くの影響を同時に見出すことができ、かつ、本研究で示したような影響の度合いを数値として表すことができる、非常に多岐な情報を与える影響評価法となり得る。今後、さらに研究を続けて確固たる手法にすれば、万人に受け入れやすい方法になるだろう。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究では、これから広く使用されることがされていながらまだまだ未発達で、確固たる解析法などが確立されていないメタボロミクスにより、化学物質暴露を含めた、生物が受けるストレスをGC/MSを用いたメタボロミクスを確立することを目的としたが、本研究でこれまで述べてきたように、ANOVAにより影響を受けた代謝物質をピックアップし、PCAにより大量に得られたデータを2次元にまでデータを集約して、その影響の定量化までも実現した。メタボロミクスは機器分析により代謝物のデータを取得するが、そこで得られる情報量は非常に多い。また、例えば分析器としてGC/MSを用いた場合、多くの定性不能な代謝物が検出され、これらの未知ピークはこれまでのメタボロミクス研究では対象とされずに、定性可能な代謝物のみを扱うことがほとんどであった。しかし、多くのデータを無視することにより、網羅性というメタボロミクスのメリットは失われ、非常にマクロな評価になりかねない。本研究で確立した解析法は検出できる代謝物は定性の可否に関わらず、できる限りピックアップしてこれをデータ解析に用い、できる限りヒメダカ体内の情報を全て網羅することを目指した。未知の代謝物の変動も恐らく体内では何らかの意味があった可能性が高い。これらの情報全てを集約して最終的にPCAに投影し、そしてPCAに投影した形から、影響の大きさを定量化できることを示した本研究の科学的意義は大きい。本法は複合ストレスも明確に表現でき、そして、化学物質の単独暴露と複合暴露でそれぞれ引き起こされる生物への影響の共通・相違点を、PCAとそこから導かれる負荷量のデータから見出すことができる。
これは従来、検討されてきた様々な複合影響評価法にはない特徴の1つであり今後、化学物質の複合影響研究において重要な情報をもたらすことができる方法である。また、本研究では実環境での適用の可能性も示すことができ、その大阪湾とスービック湾の底質抽出物のヒメダカに与える影響差を定量化して示した。この影響の大きさは、致死を指標とした毒性試験と同様の傾向を見せ、かつ、その毒性試験よりも少なくとも25倍以上感度があることが分かった。今回の結果は、将来、本法を1つの環境診断法として適用するための礎となる。また、化学物質評価、しかも単独と複合の暴露影響のどちらでも同じ手法で評価でき、かつ、環境影響評価も可能にする本研究で示した解析法は、これまでの課題の多くの部分を解決する手法として注目される。

また、詳細に代謝物変動を解析した際には必須アミノ酸類とグルコースを指標として、フェナントレンとピレンの複合暴露によりヒメダカが受けた可能性を示した。また、非必須アミノ酸も必須アミノ酸が影響を受けたのに連動して、その代謝が大きく攪乱されているのが観察された。このようなアミノ酸代謝やアミノ酸量が化学物質暴露で影響を受けることはこれまでも研究例があったが、本研究のように必須アミノ酸全てが連動して影響を受けること、ほとんどの非必須アミノ酸が必須アミノ酸と連動しているということを観察している例はほとんどないと考えられる。同様の必須アミノ酸の変動に与える影響は他の物質でも既に我々は確認しており、これは今後、バイオマーカーとして利用できる可能性がある。またPAHsの複合影響の知見はほとんどないことから、本研究の結果は今後、様々な影響研究に発展していくと考えられる。特に、タンカー沈没などの海洋への石油流出事故は後を絶たず、そのもっとも生物に影響を与えるのはPAHs類であると言われる。しかし、その個々のPAHsは構造が類似しているために、毒性も類似していると考えられ、これが複数種集まってもその影響の種類はそれほど大きく変わらないと考えられてきたために、これまで複合影響を詳細に調べた例はほとんどない。しかし、一度石油が環境中に放出されたときには、ただ1種類のPAHが放出されると言うことはなく、必ず複数種のPAHsがまとまった量で一度に放出されるのが一般的である。本研究の結果から考えるとこれは水生生物などには非常に驚異であることに間違いはなく、今後様々なPAHsの複合影響が検証される必要がある。

今回、行った解析法によるPCAの利用、影響の定量化、さらには代謝経路を踏まえた影響の検証はある程度実用できるレベルまで到達した。しかし、今後、メタボロミクスによる詳細な影響の検証は、まだ多くの課題が残っており、さらなる発展が必要となる。この部分は本研究でも行ってきたようにトランスクリプトミクスとデータを照らし合わせながら、今後さらに研究を深めていき、PCAを用いた影響の視覚化、定量化とともに詳細な生体内の今起こっている悪影響の症状の診断までできるようなシステム作りを将来の目標としている。

## （２）環境政策への貢献

現在のところ、本研究では解析法の基礎を築いた段階であり、これからさらに研究を進めて数年後に実際の環境評価や環境政策に貢献できるレベルまで完成度を上げていく必要がある。本解析法は化学物質やストレスの複合暴露影響の評価が明確にでき、さらにその影響の大きさを数値で表すことができる。また、数値で影響の大きさを示すだけでなく、詳細に生体内で起こった影響も検証することができる方法であると言える。GC/MSは今では多くの研究施設が有している機器の1つである。今後ソフト開発などを行い、今は非常に煩雑で時間がかかる定量作業の時短化などを測れば、その感度の良さと情報量の多さ、応用範囲の広さから、かなり広く影響評価に用い
られる可能性があると考えている。

本法の応用範囲は広い。また、トランスクリプトミクスとの組み合わせ、あるいはメタボロミクス単独での使用で用途が変わってくることもある。まずは1つ1つの完成度を上げて、それを完成した段階で順次、学会や論文等で発表していく。今後、再び研究費獲得を目指し、そこで本法の完成を目指し、次の研究機関ではシンポジウムなどの開催をして、その周知に努めることを考えている。また、完成した部分から環境分析会社などに協力を依頼し、実際の影響評価に今回開発した方法の売り込みと周知を図っていき、本法の認知度を上げることも画策している。

また、本研究の最終的な目標は環境診断を我々が形成したトキシコゲノミクスを用いて行うことである。そしてこのような環境診断は直接新たな環境基準作りの基礎データを築くために使用可能なレベルまで、次のステップでは研究を進める予定である。この研究を進める上で、複数の環境基準作りに携わっている先生方のご意見などを伺い、さらには現在の環境行政や政策を常に睨みながら、社会のニーズにあった手法、そしてデータの構築を進めていくことも考えている。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) S. Uno, A. Shintoyo, E. Kokushi, M. Yamamoto, K. Nakayama, J. Koyama: Environmental Science and Pollution Research (2012)

“Gas chromatography-mass spectrometry for metabolite profiling of Japanese medaka (Oryzias latipes) juveniles exposed to malathion.” (in press)

<査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない。

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1）國師惠美子、宇野誠一、小山次朗：第19回日本環境化学討論会（2010）

「メタボロミクスによるヒメダカに対する多勧芳香族炭化水素類の影響評価」

2）宇野誠一、國師恵美子、山元優孝、新豊葵、小山次朗：第16回バイオアッセイ・日本環境毒性学会研究会合同研究発表会（2010）

「メダカ稚魚を用いたメタボロミクスによる化学物質影響評価の試み」

3）山元優孝、宇野誠一、小山次朗：第16回バイオアッセイ・日本環境毒性学会研究会合同研究発表会（2010）

「メタボロミクスによる多環芳香族炭化水素のメダカ胚に対する影響評価」
4) E. Kokushi, S. Uno, J. Koyama: International symposium on the formation of research center on control against negative impacts to coastal fisheries resources in Southeast Asia, Kagoshima, Japan, 2010

“Assessment of effects of starvation on freshwater carp by $ {}^{1} $ H-NMR metabolomics approach.”

“Toxicity assessment of PAHs on medaka embryo by $ {}^{1} $ H-NMR metabolomics approach.”

6) E. Kokushi, S. Uno, J. Koyama: The international conference on marine pollution and ecotoxicology, Hong Kong, China, 2010.

“Assessment of metabolite variations in starved freshwater carp by $ {}^{1} $ H-NMR metabolomics approach.”

7) E. Kokushi, S. Uno, J. Koyama: The 39th scientific symposium of UJNR aquaculture panel meeting, Kagoshima, Japan, 2010

“Assessment of effects of starvation on freshwater carp by $ ^{1} $ H-NMR metabolomics approach.”

8) K. Nakayama, S. Uno, E. Kokushi, I. C. Handoh, S. I. Kitamura: SETAC North America 31st Annual Meeting, Portland, USA, 2010.

“Transcriptome and metabolome changes by multiple environmental stressors.”

9) S. Uno, E. Kokushi, M. Yamamoto, T. Niino, Y. Ohori, J. Koyama: SETAC North America 31st Annual Meeting, Portland, USA, 2010.

“Toxicity assessment of dichlorophenols on medaka (Oryzias latipes) embryo by metabolomics approach.”

10) S. Uno, K. Nakayama, E. Kokushi, A. Shintoyo, M. Yamamoto, Y. Murakami, S-I, Kitamura, J. Koyama: 15th International Symposium on Toxicity Assessment (ISTA15), Hong Kong, China, 2011.

“Toxicity assessment of polycyclic aromatic hydrocarbon mixtures in Japanese medaka (Oryzias latipes) based on metabolome data.”

11) S. Uno, A. Shintoyo, E. Kokushi, M. Yamamoto, J. Koyama: 15th International Symposium on Toxicity Assessment (ISTA15), Hong Kong, China, 2011.

“Metabolic profiling of Japanese medaka (Oryzias latipes) exposed to organophosphorous pesticide using gas chromatography mass spectrometry.”

12) K. Nakayama, S. Uno, E. Kokushi, A. Shintoyo, M. Yamamoto, J. Koyama, Y. Murakami, S-I. Kitamura: 15th International Symposium on Toxicity Assessment (ISTA15), Hong Kong, China, 2011

“Toxicity assessment of polycyclic aromatic hydrocarbon mixtures in Japanese medaka (Oryzias latipes) based on transcriptomic data.”

13）宇野誠一、新野竜大、大堀祐司、國師恵美子、小山次朗：第20回環境化学討論会（2011）
「メタボロミクスを用いたメダカ（Oryzias latipes）の胚に対するクロロフェノール類の影響評価」

14）國師 恵美子、宇野誠一、小山次朗：第20回環境化学討論会（2011）

「コイ（Cyprinus carpio）の尿を用いたGC/MSメタボロミクスによるクロルピリホスの有害性評価」

15) S. Uno, K. Nakayama, T. Nino, E. Kokushi, J. Koyama: International Symposium on Advanced Studies by Young Scientists on Environmental Pollution and Ecotoxicology. Ehime, Japan, 2011.

“Metabolomics approach to evaluate effects of environmental contaminants in fish.”

16) 宇野誠一、仲山慶、北村真一、國師恵美子、新豊葵、小山次朗：第17回日本環境毒性学会・バイオアッセイ研究会合同研究発表会（2011）

「PAH類に暴露したヒメダカ稚魚のメタボロームとトランスクリプトームの変動の比較」

17）仲山慶、宇野誠一、國師恵美子、新豊葵、小山次朗、村上安則、北村真一：第17回日本環境毒性学会・バイオアッセイ研究会合同研究発表会（2011）

「多環芳香族炭化水素の単独・複合暴露に対する生体応答の解析」

18）仲山慶、宇野誠一、半藤逸樹、北村真一：フォーラム2011：衛生薬学・環境トキシコロジー，フォーラムIII「フィールドをMolecular Toxicology手法で測る～環境汚染物質の生体・生態影響～」（2011）

19) S. Uno, K. Nakayama, S-I. Kitamura, Y. Murakami, E. Kokushi, A. Shintoyo, K. Ito, J. Koyama: 2011 International Conference on Environmental OMICS, Guangzhou. China. 2011.

“Toxicity evaluations for individual and mixed exposures of phenanthrene and pyrene in medaka (Oryzias latipes) alevin with metabolomics and transcriptomics.”

20) K. Nakayama, S. Uno, E. Kokushi, J. Koyama, I.C. Handoh, S-I. Kitamura: 2011 International Conference on Environmental OMICS, Guangzhou, China, 2011. "Transcriptomic and metabolomic changes caused by the effects of single and combined environmental stressors."

21) K. Nakayama, S. Uno, E. Kokushi, A. Shintoyo, Ito K, J. Koyama, I.C. Handoh and S.I. Kitamura: 6th SETAC World Congress/SETAC Europe 22nd Annual Meeting. Berlin, Germany, May 20–24, 2012.

“Transcriptomic responses in Japanese medaka (Oryzias latipes) exposed to individuals or mixtures of polycyclic aromatic hydrocarbons: mixture toxicities or fasting effects?”（アブストラクト提出済み）

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。
## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない。

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) 渡邊肇：薬学雑誌．127．1967-1974（2007）

「トキシコゲノミクス－転写プロファイルから化学物質影響解析－」

2) C.Y. Lin, B.S. Anderson, B.M. Phillips, A.C. Peng, S. Clark, J. Voorhees, H. Wu, M.J. Martin, J. McCall, C.R. Todd, F. Hsieh, D. Crane, M.R. Viant, M.L. Sowby, R.S. Tjeerdema: Aquatic Toxicology. 95. 230-238 (2009)

“Characterization of the metabolic actions of crude versus dispersed oil in salmon smolts via NMR-based metabolomics.”

3) J.G. Bundy, M.P. Davey, M.R. Viant: Metabolomics. 5. 3–21 (2009)

“Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives.”

4）宇野誠一、國師恵美子、小山次朗：環境毒性学会誌．11．63-67（2008）「魚類血漿を用いた有害化学物質の1H-NMRメタボロミクス影響評価」

5) S. Uno, E. Kokushi, J. Koyama: Interdisciplinary Studies on Environmental Chemistry—Biological Responses to Chemical Pollutants, Eds., Y. Murakami, K. Nakayama, S.-I. Kitamura, H. Iwata and S. Tanabe by TERRAPUB, pp. 281-289 (2008).

“Toxicological effects of heavy oil on carp by NMR-based metabolic profiling of plasma.”

7) E. Kokushi, S. Uno, T. Harada, J. Koyama: Environmental Toxicology. (2012)

“ $ ^{1} $ H-NMR based metabolomics approach to assess toxicity of bunker A heavy oil to freshwater carp.” (in press)

8) htTCP://maps.google.co.jp/maps
(2) トランスクリプトミクスによる影響評価法の確立に関する研究

愛媛大学 仲山慶

平成21～23年度累計予算額：5、078千円

（うち、平成23年度予算額：1、655千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 環境中には様々な化学物質が存在しており、生物はそれらに複合的に暴露されている。複数の化学物質による複合毒性はその重要性は認識されているものの、評価手法の確立には至っていない。本サブテーマでは2種の異なるストレッサーによる複合的な影響を遺伝子発現プロファイルの変化に基づいて、それぞれ単独による影響とは分離して評価する手法を構築することを初期目標とし、メダカを対象に①絶食・低温刺激試験と②PAHsの単独および複合暴露試験を実施した。さらに、①と②で構築した手法を用いて、実際に環境中に存在する化学物質の複合影響を、港湾域にて採取した底質からの抽出液を暴露することによって評価した。①の結果、作用機序も影響も異なることが予想されるストレッサーを組み合わせた場合、PC1とPC2がそれぞれ単独の影響を反映し、複合影響はPC1とPC2の両スコアの和として表現された。また、化学的性質が類似したフェナントレンとピレンを暴露した②の試験においては、両物質の化学的性質における類似性から予想された生体への作用機序の共通性を反映して、各化合物単独暴露による影響はPC2に反映され、それぞれの影響は分離されなかった。一方で、複合暴露による影響はPC1に投射され、明らかに単独暴露による影響とは区別された。このように、複合的なストレスを受けたメダカにおける生体影響を、PCAを基本とした解析法によって、単独のストレッサーによる影響とは分離して評価することが可能となった。また、実際に環境中に存在する化学物質の複合影響を、港湾域にて採取した底質からの抽出液を暴露することによって評価した結果、致死毒性が生じるよりも25倍以上低濃度の抽出液への暴露に対しても明確な生体応答が検出され、その応答の大きさは致死影響を指標とした時の毒性ポテンシャルと比例関係にあった。本研究で構築したトランスクリプトーム解析手法は、実環境中に存在する化学物質の複合影響の検出および評価に有効な手段になると思われる。

[キーワード] トランスクリプトミクス、複合毒性、メダカ、多環芳香族炭化水素、主成分分析

### 1. はじめに

環境中には様々な化学物質が存在しており、生物はそれらに複合的に暴露されている。複数の化学物質による影響、いわゆる複合影響はその重要性は認識されているものの、作用機序の複雑さ故、研究が遅れているのが現状である。個々の化合物を対象とした化学物質のリスク評価は、毒性物質の初期スクリーニングには重要な役割を持つが、化学物質の環境影響を評価する際には、より複雑な要因を加味する必要がある。我々は化学物質の複合影響に関する研究を継続して行っており、個々の化学物質は無作用濃度未満であっても、複合的に作用することで生物に対して悪影響を及ぼす事例を示してきた $ ^{1} $ 。このような事例の積み重ねにより、複合影響の評価法を確立す
る必要性が高まっている。実際、我が国においても総排水毒性（WET）試験を導入するべく、試験法の検討が進められている。このように、排水中に含まれる化学物質による複合影響の評価手法は確立されつつあるが、環境中に存在する化学物質の複合影響を評価する手法は存在しないのが現状である。

複合影響評価手法の確立にあたり、化学物質の特性が多様でありその影響も多岐に渡ることから、影響の有無を判別する際の観測項目（エンドポイント）の選定が困難であるという問題点が挙げられる。現状では共通の尺度として致死影響あるいはそれに準ずるものが用いられている。しかしながら、近年の様々な化学物質の排出に関する法規制が奏功し、現在の環境中の濃度レベルで化学物質のみが原因で生物を死に至らしめることは、極端なケースを除いて考えにくい。したがって、環境中に存在するレベルでの化学物質の複合影響を評価する場合には致死影響をエンドポイントとして採用することができず、致死以前に起こる事象を観察する必要がある。

生体内で起こった変化を網羅的に検出する手法としてオーム解析手法が確立され、近年では環境毒性学の分野においても一般的に使われるようになった。具体的には遺伝子（トランスクリプトーム）やタンパク質（プロテオーム）、代謝物（メタボローム）の変動をそれぞれ網羅的に検出し、生体機能の変化や、特定の臓器や組織が受けた影響などを詳細に解析することができる手法である。中でもマイクロアレイ技術を用いたトランスクリプトーム解析、すなわちトランスクリプトミクスは、近年めざましい発展を遂げ、数万種類の遺伝子の発現レベルを精度良く検出することを可能としている。我々の研究グループでもメダカ $ ^{2)} $ やヒラメ $ ^{3)} $ などの魚類を対象にプラットフォームを開発し、毒性学や免疫学、発生学研究に応用している。このようにマイクロアレイ技術の発展に伴い、トランスクリプトミクス解析はきわめて汎用性の高い実験技術となり、分子メカニズムを念頭に置いた網羅的かつ定量的な化学物質暴露に対する生体応答の検出を可能としている。本技術が化学物質の複合影響の評価においても有効なツールとなると期待される。

## 2 ．研究開発目的

前章で述べた通り、マイクロアレイ技術は広く利用されるようになったものの、同技術を用いた研究の多くは発現量が変化した遺伝子を羅列するにとどまり、そのデータ解析法は十分に成熟しているとは言えない。また、生体応答の理解には機能が既知な遺伝子の定量値のみが解析に使用され、機能が未知な遺伝子の発現量データは利用されないのが一般的である。我々の研究グループでは機能に関する情報が得られていない遺伝子であっても、それらの発現変動はその時生物が受けた外的刺激に対する応答反応であると考え、変動した全ての遺伝子の発現量データから応答の大きさとその生物学的意義を推定する手法を構築した。同手法を用いて、PCBsを暴露したメダカのオスにおける遺伝子発現プロファイルがメスのそれと類似していたこと、すなわちオスの脱雄性化が起こっていることを示した $ ^{4} $ 。そこで我々は、同データ解析手法が化学物質の複合影響評価にも応用可能ではないかと考えた。以上のことから、本研究では実験魚として一般的なメダカを対象として、トランスクリプトミクスによる複合影響評価をする方法を確立することを初期目標とした。さらに同手法を用いて実環境中に存在する化学物質の混合物の生態影響を評価することを最終目標とし、本研究ではそのための礎となるデータ解析手法の確立とシステムの構築を目的とした。

平成21年度は、本研究の主要な目的である複合毒性の評価を行うためのトランスクリプトーム
データ解析手法の構築および最適化を実施した。2種のまったく異なるストレッサーに対するメダカの生体応答を、遺伝子発現量の変化として捉え、各ストレッサー単独による影響と両者による複合的な影響をそれぞれ検出することを試みた。本試験では2種のストレッサーとして絶食および低温刺激を選択した。一般的に、生物が化学物質の毒性影響を受けた場合、生体内で様々な機能低下が引き起こされることが知られており、これは代謝の低下に他ならない。絶食による飢餓状態に陥った生物は代謝を低下させ、生命活動の維持に必要な最低限のエネルギーを産生・消費すると考えられている。また、低温条件下における生体内代謝経路に関わる酵素群の触媒効率が著しく低下することは容易に推察できる。このように代謝低下を引き起こす2種のストレッサーをモデルケースとして選択し、本研究で提案するデータの解析手法の妥当性評価を行った。

平成22年度は、上述のデータ解析手法によって化学物質の複合的な影響の検出が可能かを検証するとともに、影響の大きさの数値化を試みた。本試験では多環芳香族炭化水素（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: PAHs）を対象物質とした。PAHsは主に化石燃料あるいはバイオマスの燃焼由来で発生するため、現在では環境中に遍在している。また、近年頻発している海難事故による重油あるいは原油の流出もPAHsによる環境汚染の一因である。環境中には多様な形態のPAHsが同時に存在していることがよく知られているにもかかわらず、PAHsによる複合毒性に関する情報は乏しいのが現状である。したがって、本試験ではPAHsの中でも比較的環境中の濃度が高く、魚類の体内に取り込まれやすいピレンおよびフェナントレンを暴露化合物として選択した。

平成23年度は、前年度までに構築した評価手法が、実際の環境中に存在する化学物質の複合暴露による生態影響の評価に適用可能かを検証した。港湾の底質には陸上および沿岸域にて使用された化学物質が蓄積・残留しているため、本研究では港湾より採取した底質に含まれる化学物質の複合影響を評価することとした。これまでの研究で、人間活動由来の化学物質による汚染が比較的進行していることが報告されている大阪湾およびスービック湾（フィリピン）を対象地域とした。それぞれの港湾域にて採取した底質に含まれる化学物質をメダカに暴露し、応答の大きさや応答した生体機能を検出し、各地点における化学物質の混合物が有する生態影響ポテンシャルを推定し、地点間の比較を行うことを目的とした。

## 3 ．研究開発方法

## （1） 絶食・低温刺激試験（平成21年度）

ガラス水槽にメダカ4匹を収容した。これらを1週間絶食状態においた（絶食区）。一方、対照区として、1週間、毎日餌（アルテミア）を飽食まで与えた個体4匹を収容した水槽も用意した（対照区）。1週間後、絶食区および対照区の水槽1つずつから、すべての個体をサンプリングした。さらに、残りの絶食区の水槽を10℃に設定したインキュベータに1日収容して飼育を継続した（絶食－低温区）。同様に対照区の水槽1つも同じインキュベータに1日収容した（対照-低温区）。24時間後、インキュベータ内に放置した後、すべての個体をサンプリングして、直ちに肝臓を摘出した。肝臓は液体窒素にて凍結し、使用するまで-80℃で保存した。

（２）フェナントレンとピレンの単独または複合暴露試験（平成22年度）
オミックス解析のための暴露試験濃度を決定するために、数段階の濃度のフェナントレン $ \left(\mathrm{C}_{14}\mathrm{H}_{10}\right. $ ，MW：178，CAS：85-01-8）あるいはピレン（C16H10，MW：202，CAS：129-00-0）を飼育水に溶存させ、そこで月齢1ヶ月のヒメダカ稚魚の96時間毒性試験を行った。この毒性試験の結果からフェナントレンの暴露濃度を5および50 μg/L、ピレンの暴露濃度を3および50 μg/Lと決定した。さらに複合暴露試験濃度はフェナントレン5 μg/L＋ピレン3 μg/Lおよびフェナントレン50 μg/L＋ピレン30 μg/Lとした。

ガラス水槽に2 Lの飼育水を用意した。水温は25℃に保ち、酸欠を防ぐために緩やかなエアレーションを施した。この飼育水に上記の濃度になるようにフェナントレン、ピレン、あるいは両物質を添加した。これらの飼育水槽に加えて、すべてのPAHsを含まないコントロール区も設けた。これらすべての水槽に25匹ずつのヒメダカ稚魚を収容した。暴露は96時間行い、0（暴露試験直前）、24、96時間目にそれぞれの水槽から12匹ずつのヒメダカを採取した。暴露試験期間中、稚魚に餌を与えなかった。飼育水は毎日完全に交換する反止水式水槽で試験を行った。採取したヒメダカは直ちに液体窒素で凍結し、代謝物分析まで-80℃の冷凍庫で保存した。

## （3） 底質抽出物暴露試驗（平成23年度）

底質試料は2004年に大阪湾より、2005年にフィリピンのスービック湾よりそれぞれ採取した。10 gの底質試料に含まれる化学物質をアセトン／ヘキサン（1:1）およびトルエンを用いて抽出した。有機溶媒をロータリーエバポレータで蒸発させた後に、1 mLのアセトンに転溶したものを抽出液とした。

抽出液の急性毒性を調べるために、抽出液をアセトンで等倍、5倍、25倍、125倍希釈したものを準備した。試験水はアセトンの終濃度が0.01%となるように段階希釈した抽出液を添加して調製した。等倍の抽出液を添加した試験水において、1 Lあたりに1 gの底質から抽出された化学質が含まれていることになる。1.7 L容ガラス製水槽に1 Lの試験水を入れ、各水槽にふ化後2.5週齢のメダカ稚魚を20個体ずつ入れた。暴露期間は72時間とし、試験水は毎日交換した。暴露終了まで死亡個体数を計数した。

抽出液の暴露に対するメダカの生体応答を検出するために、上記と同じ条件で暴露試験を実施した。ふ化後3.5週齢のメダカ稚魚に対して、アセトンの終濃度が0.01%となるように5倍および25倍希釈した抽出液を添加した試験水を24時間暴露した。暴露終了後、メダカ全魚体をトリゾール試薬（インビトロジェン（株））に浸漬し、使用するまで-80℃で保存した。

なお、すべての暴露試験は照明時間14時間、飼育水温25℃で行った。

## （４）マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析（トランスクリプトーム）

トリゾール試薬を使用し、試料より全RNAを抽出した。抽出したRNAはDNase処理を行った後にRNeasy Mini Kit（キアゲン）を用いて精製した。全RNAにOne Color Spike Mix（アジレントテクノロジー(株)）を加えた後、Quick Amp Labeling Kit（アジレントテクノロジー(株)）を用いて相補的RNA（cRNA）を合成・増幅し、cRNAをCy3で蛍光標識した。Cy3標識されたcRNAは精製した後に36,460プローブからなる4×44のマイクロアレイに65℃で17時間ハイブリダイズさせた。その後、マイクロアレイを洗浄し、DNA Microarray Scanner（アジレントテクノロジー(株)）によりスキャンした。画像データを基に各プローブの蛍光強度を数値化し、GeneSpring GX 7.3（アジレ
ントテクノロジー(株) により正規化および対数変換した。すべての検体で共通して検出可能であったプローブのみを選択し、グループ間の遺伝子発現の変動を調べた。

本研究で用いたマイクロアレイに搭載されたプローブが検出する遺伝子に関する情報は，それぞれの塩基配列を基に実施した相同性検索（BlastX）より得た。また、それぞれの遺伝子に対してBlast2GO $ ^{5)} $ を用いて生物学的プロセスの遺伝子オントロジーのターム（GO term）を付加し、各遺伝子産物の機能情報を得た。

定量可能であった遺伝子の全データを用いて、24時間および96時間暴露試料においてそれぞれ暴露群とコントロール群すべてを対象として、等分散を仮定しない一元配置分散分析（ANOVA）を行った。処理区間で有意差（$p<0.05$）が検出されたプローブのみを選別し、これらのプローブから得られたデータのみを主成分分析（PCA）に投入した。主成分1（PC1）あるいはPC2依存的に発現が変動した遺伝子をスクリーニングした後、有意に影響を受けている生物学的プロセスの遺伝子オントロジーをフィッシャーの正確確率検定によって検出した。すべての統計解析はR（Ver.2.12.2）により行った。

## 4 ．結果及び考察

## （1） 絶食・低温刺激試験（平成21年度）

## 1 ）主成分分析による絶食および低温刺激の単独または複合影響の抽出

マイクロアレイ実験より、すべての試料で共通して定量可能であった19,920プローブのデータを抽出した。これらのデータに対して一元配置分散分析を行い、群間で有意に異なる発現量を示した11,161プローブの発現量データを得た。これらの絶食あるいは低温刺激によって発現量が変化した遺伝子群のデータをPCAに供し、各個体におけるPC1およびPC2スコアを得た（図(2)-1）。PCAの結果、対照区、低温刺激区、絶食区、絶食＋低温刺激区の4群はそれぞれ個別のグループを形成し、PC1（30.9%）が低温刺激の影響を、PC2（21.7%）が絶食による影響を明確に反映した。低温および絶食の複合ストレスを与えた区は、PC1およびPC2の両方に得点を得て、単独ストレスによる影響と分離された。以上のことから、絶食に対するメダカの生体応答は低温刺激に対するそれとは大きく異なっており、それぞれ独立していると考えられた。また、絶食と低温刺激の両方のストレスを受けた個体においては、それぞれのストレスに対する応答が同時に起こっていると推察された。

PCAは、数万遺伝子の発現量を表す数値として得られるきわめて高次元なマイクロアレイデータの次元を減少させ、遺伝子発現量における分散の特徴を抽出するのに有効な手法である。我々が行った別の研究でも、マイクロアレイデータをPCAにて解析することにより、メダカにおけるPCBs暴露に対する応答の特徴を抽出することに成功している $ ^{4} $ 。本手法は単に環境ストレスに対して応答する遺伝子群のスクリーニングだけでなく、数千～数万種類の遺伝子の発現データをもとに、生物が受けている影響のレベルを数値化し、少なくとも二種類のストレスによる複合的な影響を二次元の指標として導き出すことを可能とした。

## 2 ）絶食による影響

GO termを用いたデータ解析の結果、絶食によって脂質代謝が劇的に影響を受けていることが明
低温刺激に対する応答

図(2)-1 絶食および低温刺激によって変動した遺伝子群の発現量データを用いた主成分分析の結果

らかとなった。脂肪酸の合成（fatty acid biosynthetic process [GO:0006633]）とコレステロールの合成（cholesterol biosynthetic process [GO:0006695]）は抑制されたが、脂肪酸のβ酸化（fatty acid beta-oxidation [GO:0006635]）は亢進された（表(2)-1、図(2)-2）。これは絶食に対する典型的な応答であり、脂質の生成や輸送を抑制させることでエネルギー消費を減少させる一方で、β酸化によって体内に蓄積していた脂肪酸からアセチルCoAを合成させてエネルギー産生を促す。このとき、解糖系（glycolysis [GO:0006096]）の抑制も引き起こされていたことから、絶食条件下のメダカにおいてはアセチルCoAの合成経路が解糖系からβ酸化へとシフトすることが示された。

本試験と並行して実施したメタボローム解析によって、TCA回路における代謝物のひとつである2-オキソグルタル酸の誘導が検出された。2-オキソグルタル酸はTCA回路内で合成および代謝されることに加え、グルタミン酸の異化によっても合成されることが知られている。トランスクリプトーム解析においても、グルタミン酸を2-オキソグルタル酸へと代謝するグルタミン酸脱水素酵