Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## 保険料賦課状況

後期高齢者支援金賦課額	介護納付金賦課額	後期高齢者賦課額
減免等による額	保険料調定額	保険料算定額	減免等による額	保険料調定額	保険料算定額	減免等による額	保険料調定額
千円	千円	千円	千円	千円	千円	千円	千円
64,680	92,570,851	43,346,590	5,040	43,341,550	550,614	4,800	545,814
6,600	11,668,329	5,824,440	4,080	5,820,360	189,444	2,400	187,044
3,840	27,323,210	13,266,420	960	13,265,460	297,000	2,400	294,600
-	6,980,910	3,206,175	-	3,206,175	64,170	-	64,170
-	17,675,520	8,345,760	-	8,345,760	-	-	-
54,240	28,922,882	12,703,795	-	12,703,795	-	-	-

（再掲）国保被保険者ではない組合員の世帯を除く

後期高齢者支援金賦課額	介護納付金賦課額
減免等による額	保険料調定額	保険料算定額	減免等による額	保険料調定額
千円	千円	千円	千円	千円
62,940	92,033,261	43,091,200	5,040	43,086,160
4,860	11,505,249	5,750,850	4,080	5,746,770
3,840	27,108,240	13,191,420	960	13,190,460
-	6,821,370	3,099,375	-	3,099,375
-	17,675,520	8,345,760	-	8,345,760
54,240	28,922,882	12,703,795	-	12,703,795
世帯人数(被保険者数)	組合員数	被保険者数	基礎賦課額
保険料算定額	減免等による額	保険料調定額	保険料算定額
計	1,437,750	3,004,300	千円	千円	千円	千円
346,415,135	208,980	346,206,155	92,635,531
1 人	632,300	632,300	102,151,133	54,540	102,096,593	25,986,975
2 人	367,450	734,900	90,514,840	11,400	90,503,440	23,069,837
3 人	202,050	606,150	64,316,945	-	64,316,945	17,707,005
4 人	163,550	654,200	60,578,684	-	60,578,684	17,408,042
5 人	60,600	303,000	24,231,882	1,920	24,229,962	7,000,952
6 人	9,550	57,300	3,816,271	141,120	3,675,151	1,202,933
7 人	1,750	12,250	686,580	-	686,580	224,220
8人以上	500	4,200	118,800	-	118,800	35,568

注）被保険者には国保被保険者ではない組合員を含んでいる。

世帯人数
(被保険者数)	組合員数	被保険者数	基礎賦課額
保険料算定額	減免等
による額	保険料調定額	保険料算定額
計	1,416,150	2,965,150	千円	千円	千円	千円
345,302,081	207,780	345,094,301	92,096,201
1 人	622,200	622,200	102,138,559	54,540	102,084,019	25,984,285
2 人	359,650	719,300	89,974,258	10,200	89,964,058	22,825,877
3 人	199,750	599,250	64,045,185	-	64,045,185	17,567,385
4 人	162,750	651,000	60,447,824	-	60,447,824	17,332,622
5 人	60,200	301,000	24,124,044	1,920	24,122,124	6,952,232
6 人	9,500	57,000	3,807,871	141,120	3,666,751	1,201,013
7 人	1,600	11,200	645,540	-	645,540	197,220
8人以上	500	4,200	118,800	-	118,800	35,568
## 保険料賦課状況

後期高齢者支援金賦課額	介護納付金賦課額	後期高齢者賦課額
減免等
による額	保険料調定額	保険料算定額	減免等
による額	保険料調定額	保険料算定額	減免等
による額	保険料調定額
千円	千円	千円	千円	千円	千円	千円	千円
64,680	92,570,851	43,346,590	5,040	43,341,550	550,614	4,800	545,814
5,700	25,981,275	10,894,185	5,040	10,889,145	292,512	3,600	288,912
1,740	23,068,097	12,628,483	-	12,628,483	199,422	1,200	198,222
-	17,707,005	8,685,546	-	8,685,546	41,940	-	41,940
-	17,408,042	7,924,445	-	7,924,445	7,560	-	7,560
3,000	6,997,952	2,746,338	-	2,746,338	8,340	-	8,340
54,240	1,148,693	380,294	-	380,294	300	-	300
-	224,220	87,300	-	87,300	540	-	540
-	35,568	-	-	-	-	-	-

（再掲）国保被保険者ではない組合員の世帯を除く

後期高齢者支援金賦課額	介護納付金賦課額
減免等による額	保険料調定額	保険料算定額	減免等による額	保険料調定額
千円	千円	千円	千円	千円
62,940	92,033,261	43,091,200	5,040	43,086,160
5,700	25,978,585	10,894,185	5,040	10,889,145
-	22,825,877	12,564,703	-	12,564,703
-	17,567,385	8,603,226	-	8,603,226
-	17,332,622	7,859,165	-	7,859,165
3,000	6,949,232	2,715,528	-	2,715,528
54,240	1,146,773	377,894	-	377,894
-	197,220	76,500	-	76,500
-	35,568	-	-	-
業種別	組合員数	被保険者数	基礎賦課額
保険料算定額	減免等による額	保険料調定額	保険料算定額
計	1,437,750	3,004,300	千円	千円	千円	千円
346,415,135	208,980	346,206,155	92,635,531
医師	186,850	322,150	39,272,572	16,560	39,256,012	11,158,213
歯科医師	164,050	277,950	31,467,629	49,380	31,418,249	9,923,370
薬剤師	29,950	47,600	6,168,210	-	6,168,210	1,653,300
一般業種	202,150	379,500	37,548,464	-	37,548,464	11,096,426
建設関係	673,150	1,557,900	152,504,490	143,040	152,361,450	37,240,860
全国土木	181,600	419,200	79,453,770	-	79,453,770	21,563,362

注）被保険者には国保被保険者ではない組合員を含んでいる。

世帯人数
(被保険者数)	組合員数	被保険者数	基礎賦課額
保険料算定額	減免等
による額	保険料調定額	保険料算定額
計	1,416,150	2,965,150	千円	千円	千円	千円
345,302,081	207,780	345,094,301	92,096,201
医師	176,950	307,300	38,887,050	16,560	38,870,490	10,990,325
歯科医師	160,750	271,750	31,282,994	48,180	31,234,814	9,820,530
薬剤師	28,900	45,900	6,113,430	-	6,113,430	1,632,300
一般業種	195,750	365,200	37,099,586	-	37,099,586	10,867,784
建設関係	672,200	1,555,800	152,465,250	143,040	152,322,210	37,221,900
全国土木	181,600	419,200	79,453,770	-	79,453,770	21,563,362
## 保険料賦課状況

後期高齢者支援金賦課額	介護納付金賦課額	後期高齢者賦課額
減免等による額	保険料調定額	保険料算定額	減免等による額	保険料調定額	保険料算定額	減免等による額	保険料調定額
千円	千円	千円	千円	千円	千円	千円	千円
64,680	92,570,851	43,346,590	5,040	43,341,550	550,614	4,800	545,814
2,220	11,155,993	6,207,166	3,000	6,204,166	353,124	3,600	349,524
5,220	9,918,150	4,170,815	2,040	4,168,775	115,410	1,200	114,210
-	1,653,300	783,760	-	783,760	21,600	-	21,600
-	11,096,426	5,018,414	-	5,018,414	45,480	-	45,480
57,240	37,183,620	17,542,320	-	17,542,320	15,000	-	15,000
-	21,563,362	9,624,115	-	9,624,115	-	-	-

（再掲）国保被保険者ではない組合員の世帯を除く

後期高齢者支援金賦課額	介護納付金賦課額
減免等による額	保険料調定額	保険料算定額	減免等による額	保険料調定額
千円	千円	千円	千円	千円
62,940	92,033,261	43,091,200	5,040	43,086,160
2,220	10,988,105	6,151,786	3,000	6,148,786
3,480	9,817,050	4,125,335	2,040	4,123,295
-	1,632,300	767,440	-	767,440
-	10,867,784	4,888,964	-	4,888,964
57,240	37,164,660	17,533,560	-	17,533,560
-	21,563,362	9,624,115	-	9,624,115
年齡階級	総数	組合員
計	男	女	計	男	女
人	人	人	人	人	人
計	3,004,150	1,563,550	1,440,600	1,437,600	1,084,750	352,850
～4歲	139,800	71,050	68,750	-	-	-
5歲～9”	157,100	79,100	78,000	-	-	-
10”～14”	177,400	91,400	86,000	-	-	-
15”～19”	181,850	93,500	88,350	6,750	4,600	2,150
20”～24”	177,450	86,100	91,350	62,350	24,800	37,550
25”～29”	166,300	75,900	90,400	102,750	52,100	50,650
30”～34”	178,450	85,350	93,100	114,700	70,800	43,900
35”～39”	238,900	120,450	118,450	151,550	109,450	42,100
40”～44”	279,100	148,550	130,550	182,100	140,350	41,750
45”～49”	236,750	123,950	112,800	157,700	118,800	38,900
50”～54”	219,400	113,000	106,400	142,050	109,650	32,400
55”～59”	231,950	122,600	109,350	142,900	120,700	22,200
60”～64”	260,300	148,700	111,600	161,150	144,100	17,050
65”～69”	213,250	111,950	101,300	118,100	105,250	12,850
70”～74”	124,800	73,750	51,050	74,150	65,950	8,200
75”～79”	11,250	10,000	1,250	11,250	10,000	1,250
80”～84”	6,000	5,200	800	6,000	5,200	800
85”～	4,100	3,000	1,100	4,100	3,000	1,100
## 年齡階級別分布（5歲階級）

組合員	その他被保険者
(再掲) 国保被保険者ではない組合員を除く	計	男	女
計	男	女	計	男	女
人	人	人	人	人	人
1,416,150	1,066,450	349,700	1,566,550	478,800	1,087,750
-	-	-	139,800	71,050	68,750
-	-	-	157,100	79,100	78,000
-	-	-	177,400	91,400	86,000
6,750	4,600	2,150	175,100	88,900	86,200
62,350	24,800	37,550	115,100	61,300	53,800
102,750	52,100	50,650	63,550	23,800	39,750
114,700	70,800	43,900	63,750	14,550	49,200
151,550	109,450	42,100	87,350	11,000	76,350
182,100	140,350	41,750	97,000	8,200	88,800
157,700	118,800	38,900	79,050	5,150	73,900
142,050	109,650	32,400	77,350	3,350	74,000
142,900	120,700	22,200	89,050	1,900	87,150
161,150	144,100	17,050	99,150	4,600	94,550
118,050	105,200	12,850	95,150	6,700	88,450
74,100	65,900	8,200	50,650	7,800	42,850
-	-	-	-	-	-
-	-	-	-	-	-
-	-	-	-	-	-
年齡階級	総数	組合員
計	男	女	計	男	女
計	人	人	人	人	人	人
0 歲	3,004,300	1,563,550	1,440,750	1,437,750	1,084,750	353,000
1 11	23,700	10,050	13,650	-	-	-
2 11	29,900	13,550	16,350	-	-	-
3 11	26,800	14,800	12,000	-	-	-
4 11	32,900	15,050	11,450	-	-	-
5 11	26,750	14,450	12,300	-	-	-
6 11	34,050	17,150	16,900	-	-	-
7 11	32,600	15,200	17,400	-	-	-
8 11	31,700	17,550	14,150	-	-	-
9 11	32,000	14,750	17,250	-	-	-
10 11	36,100	19,050	17,050	-	-	-
11 11	36,950	20,100	16,850	-	-	-
12 11	36,400	18,750	17,650	-	-	-
13 11	29,700	13,950	15,750	-	-	-
14 11	38,250	19,550	18,700	-	-	-
15 11	39,600	20,650	18,950	-	-	-
16 11	32,400	18,150	14,250	50	50	-
17 11	36,750	18,450	18,300	100	-	100
18 11	35,750	15,900	19,850	1,400	700	700
19 11	37,350	20,350	17,000	5,200	3,850	1,350
20 11	38,200	18,550	19,650	7,150	3,800	3,350
21 11	37,600	19,800	17,800	8,200	3,200	5,000
22 11	35,350	17,350	18,000	13,250	4,900	8,350
23 11	32,350	14,400	17,950	14,350	4,300	10,050
24 11	33,950	16,000	17,950	19,400	8,600	10,800
25 11	29,400	12,600	16,800	16,300	6,350	9,950
26 11	30,450	12,850	17,600	19,050	8,750	10,300
27 11	33,900	16,150	17,750	21,450	11,900	9,550
28 11	36,850	16,950	19,900	22,550	12,400	10,150
29 11	35,700	17,350	18,350	23,400	12,700	10,700
30 11	34,700	17,650	17,050	24,600	15,250	9,350
31 11	30,900	14,600	16,300	19,700	11,700	8,000
32 11	36,500	16,250	20,250	23,500	13,300	10,200
33 11	37,100	17,050	20,050	23,200	14,100	9,100
34 11	39,250	19,800	19,450	23,700	16,450	7,250
35 11	38,900	18,350	20,550	24,200	16,350	7,850
36 11	42,900	19,250	23,650	25,550	17,500	8,050
37 11	48,050	25,300	22,750	30,750	22,800	7,950
38 11	51,800	25,250	26,550	32,150	22,500	9,650
39 11	57,250	32,300	24,950	38,900	30,300	8,600
40 11	59,150	30,400	28,750	36,950	28,650	8,300
41 11	51,200	28,850	22,350	34,350	26,150	8,200
42 11	56,800	27,950	28,850	35,100	26,700	8,400
43 11	57,000	33,150	23,850	39,650	31,650	8,000
44 11	54,950	28,200	26,750	36,050	27,200	8,850
45 11	53,650	27,500	26,150	35,450	25,950	9,500
46 11	48,450	25,500	22,950	33,450	24,250	9,200
47 11	40,550	20,550	20,000	26,100	20,050	6,050
48 11	50,050	27,750	22,300	33,900	26,550	7,350
49 11	44,050	22,650	21,400	28,800	22,000	6,800
50 11	44,950	22,300	22,650	27,900	21,000	6,900
## 年齡階級別分布（各年齡別）

組合員	その他被保険者
(再掲) 国保被保険者ではない組合員を除く	計	男	女
計	男	女
人	人	人	人	人	人
1,416,150	1,066,450	349,700	1,566,550	478,800	1,087,750
-	-	-	23,700	10,050	13,650
-	-	-	29,900	13,550	16,350
-	-	-	26,800	14,800	12,000
-	-	-	26,500	15,050	11,450
-	-	-	32,900	17,600	15,300
-	-	-	26,750	14,450	12,300
-	-	-	34,050	17,150	16,900
-	-	-	32,600	15,200	17,400
-	-	-	31,700	17,550	14,150
-	-	-	32,000	14,750	17,250
-	-	-	36,100	19,050	17,050
-	-	-	36,950	20,100	16,850
-	-	-	36,400	18,750	17,650
-	-	-	29,700	13,950	15,750
-	-	-	38,250	19,550	18,700
-	-	-	39,600	20,650	18,950
50	50	-	32,350	18,100	14,250
100	-	100	36,650	18,450	18,200
1,400	700	700	34,350	15,200	19,150
5,200	3,850	1,350	32,150	16,500	15,650
7,150	3,800	3,350	31,050	14,750	16,300
8,200	3,200	5,000	29,400	16,600	12,800
13,250	4,900	8,350	22,100	12,450	9,650
14,350	4,300	10,050	18,000	10,100	7,900
19,400	8,600	10,800	14,550	7,400	7,150
16,300	6,350	9,950	13,100	6,250	6,850
19,050	8,750	10,300	11,400	4,100	7,300
21,450	11,900	9,550	12,450	4,250	8,200
22,550	12,400	10,150	14,300	4,550	9,750
23,400	12,700	10,700	12,300	4,650	7,650
24,600	15,250	9,350	10,100	2,400	7,700
19,700	11,700	8,000	11,200	2,900	8,300
23,500	13,300	10,200	13,000	2,950	10,050
23,200	14,100	9,100	13,900	2,950	10,950
23,700	16,450	7,250	15,550	3,350	12,200
24,200	16,350	7,850	14,700	2,000	12,700
25,550	17,500	8,050	17,350	1,750	15,600
30,750	22,800	7,950	17,300	2,500	14,800
32,150	22,500	9,650	19,650	2,750	16,900
38,900	30,300	8,600	18,350	2,000	16,350
36,950	28,650	8,300	22,200	1,750	20,450
34,350	26,150	8,200	16,850	2,700	14,150
35,100	26,700	8,400	21,700	1,250	20,450
39,650	31,650	8,000	17,350	1,500	15,850
36,050	27,200	8,850	18,900	1,000	17,900
35,450	25,950	9,500	18,200	1,550	16,650
33,450	24,250	9,200	15,000	1,250	13,750
26,100	20,050	6,050	14,450	500	13,950
33,900	26,550	7,350	16,150	1,200	14,950
28,800	22,000	6,800	15,250	650	14,600
27,900	21,000	6,900	17,050	1,300	15,750
年齡階級	総数	組合員
計	男	女	計	男	女
51 歲	47,400	24,050	23,350	30,350	23,350	7,000
52 11	41,000	21,550	19,450	27,400	21,000	6,400
53 11	44,100	23,000	21,100	29,200	22,300	6,900
54 11	41,950	22,100	19,850	27,200	22,000	5,200
55 11	42,450	21,950	20,500	25,950	21,650	4,300
56 11	42,650	21,950	20,700	26,000	21,450	4,550
57 11	46,950	25,900	21,050	29,700	25,650	4,050
58 11	49,050	26,850	22,200	30,750	26,400	4,350
59 11	50,850	25,950	24,900	30,500	25,550	4,950
60 11	49,900	28,750	21,150	32,150	28,500	3,650
61 11	48,750	28,150	20,600	30,850	26,800	4,050
62 11	48,350	29,500	18,850	31,800	28,700	3,100
63 11	54,650	30,950	23,700	32,950	30,000	2,950
64 11	58,650	31,350	27,300	33,400	30,100	3,300
65 11	58,450	29,050	29,400	30,950	27,550	3,400
66 11	55,350	29,550	25,800	30,900	28,200	2,700
67 11	32,000	18,100	13,900	19,650	17,200	2,450
68 11	29,500	14,850	14,650	16,000	13,600	2,400
69 11	37,950	20,400	17,550	20,600	18,700	1,900
70 11	32,600	19,700	12,900	20,300	18,500	1,800
71 11	27,850	16,450	11,400	16,450	14,050	2,400
72 11	25,100	14,250	10,850	14,050	12,850	1,200
73 11	23,000	13,350	9,650	13,450	11,650	1,800
74 11	16,250	10,000	6,250	9,900	8,900	1,000
75 11	3,000	2,600	400	3,000	2,600	400
76 11	2,500	2,300	200	2,500	2,300	200
77 11	2,400	2,050	350	2,400	2,050	350
78 11	2,100	1,950	150	2,100	1,950	150
79 11	1,250	1,100	150	1,250	1,100	150
80 11	1,400	1,150	250	1,400	1,150	250
81 11	1,750	1,600	150	1,750	1,600	150
82 11	850	850	-	850	850	-
83 11	1,200	950	250	1,200	950	250
84 11	800	650	150	800	650	150
85 11	600	350	250	600	350	250
86 11	1,200	950	250	1,200	950	250
87 11	600	500	100	600	500	100
88 11	300	300	-	300	300	-
89 11	850	450	400	850	450	400
90 11	200	200	-	200	200	-
91 11	100	-	100	100	-	100
92 11	-	-	-	-	-	-
93 11	-	-	-	-	-	-
94 11	-	-	-	-	-	-
95 11	200	200	-	200	200	-
96 11	-	-	-	-	-	-
97 11	50	50	-	50	50	-
98 11	-	-	-	-	-	-
99 11	-	-	-	-	-	-
100 11	-	-	-	-	-	-
101歲以上	150	-	150	150	-	150
## 年齢階級別分布（各年齢別）（続き）

組合員	その他被保険者
(再掲)国保被保険者ではない組合員を除く
計	男	女	計	男	女
人	人	人	人	人	人
30,350	23,350	7,000	17,050	700	16,350
27,400	21,000	6,400	13,600	550	13,050
29,200	22,300	6,900	14,900	700	14,200
27,200	22,000	5,200	14,750	100	14,650
25,950	21,650	4,300	16,500	300	16,200
26,000	21,450	4,550	16,650	500	16,150
29,700	25,650	4,050	17,250	250	17,000
30,750	26,400	4,350	18,300	450	17,850
30,500	25,550	4,950	20,350	400	19,950
32,150	28,500	3,650	17,750	250	17,500
30,850	26,800	4,050	17,900	1,350	16,550
31,800	28,700	3,100	16,550	800	15,750
32,950	30,000	2,950	21,700	950	20,750
33,400	30,100	3,300	25,250	1,250	24,000
30,950	27,550	3,400	27,500	1,500	26,000
30,900	28,200	2,700	24,450	1,350	23,100
19,650	17,200	2,450	12,350	900	11,450
16,000	13,600	2,400	13,500	1,250	12,250
20,550	18,650	1,900	17,350	1,700	15,650
20,300	18,500	1,800	12,300	1,200	11,100
16,400	14,000	2,400	11,400	2,400	9,000
14,050	12,850	1,200	11,050	1,400	9,650
13,450	11,650	1,800	9,550	1,700	7,850
9,900	8,900	1,000	6,350	1,100	5,250
-	-	-	-	-	-
-	-	-
平成27年3月27日 印刷

平成27年3月31日 発 行

平 成 25 年 度

国民健康保険実態調査報告

編集・発行 厚生労働省保険局

印刷 大和綜合印刷株式会社
課題名 RF-0909 実環境の複合汚染評価を目的としたトキシコゲノミクス解析法の開発と現場への適用に関する研究

課題代表者名 宇野 誠一 （鹿児島大学水産学部海洋資源環境行く研究センター 准教授）

研究实施期间 平成21～23年度

累計予算額 9,900千円（うち23年度 3,250千円）

予算額は、間接経費を含む。

## 研究体制

(1)メタボロミクスによる影響評価法の確立に関する研究(鹿児島大学)

(2)トランスクリプトミクスによる影響評価法の確立に関する研究(愛媛大学)
## 研究概要

### 1. はじめに（研究背景等）

現在、世界では年間数千にも及ぶ化学物質が作られている。これまでの環境汚染研究ではある特定の物質について、その環境動態や生物影響を調べるという手法が取られてきた。しかし現在のように多種多様な化学物質が地球上に存在し、実環境に放出される危険性がある状況で、個々の化学物質の環境動態や生物影響を調べるには限界が来ている。近年、我が国では厳格な規制が功を奏して、主たる環境汚染物質の汚染レベルは非常に低い状況にある。反面、個々の化学物質は無影響濃度未満であっても、そのいくつが複合的に生物に作用して悪影響を及ぼす複合影響が懸念されるようになってきた。現在の化学物質の影響評価は主として生物の致死が指標として用いられているが、今の日本の環境中では化学物質が生物を死に至らせるような濃度で存在することは特殊な場合を除いて考えにくい。しかし、ごく微量で死に至らないまでも生物に何らかの影響を与えたり、複合的に化学物質が存在して初めて生物に影響を与える、などの事象は一般環境でも十分起こり得る。またその影響がこれまで未知の症状である可能性もある。このような状況に対応するためには従来の致死を指標とした影響評価法では不十分であり、今後は鋭敏に影響をとらえ、複合影響にも適用可能で、症状を網羅的検出可能な新たな影響評価法の開発が急務である。

トキシコゲノミクスは遺伝子、タンパク質、代謝物などの変動を網羅的に検出して、生体機能の変化や特定の臓器や組織が受けた影響などを詳細に解析する手法である。中でもトランスクリプトミクスは遺伝子を対象とするが、近年の発展はめざましいものがある。数万種類の遺伝子の発現レベルを精度良く検出でき、魚類などにも適用され、毒性学や免疫学などに応用されている。メタボロミクスは代謝物を対象とするが、トキシコゲノミクスの中でも最も未発達な手法である。魚類の適用は少なく、さらに環境汚染物質影響評価法としての適用例はほとんどない。現在の技術では一般の研究施設で調べることができる代謝物はせいぜい数十程度で、得られる情報も少ない。しかしメタボロミクスは遺伝子情報を必要とせず、また、生物に現れる症状をもっとも良く表現できる手法として注目されている。メタボロミクス、トランスクリプトミクスとも従来の毒性影響評価法よりも何倍も感度良く生体内毒性影響が見出せ、複数の臓器に毒性影響が同時に起こった場合でも、それらの毒性影響を網羅的に見出せる可能性が高い。メタボロミクスとトランスクリプトミクスにはそれぞれ欠点もあるが、両者の手法を併せて毒性影響評価を行えばそれらの欠点の多くを互いに力バーでき、分子メカニズムを念頭に置いた網羅的かつ定量的な化学物質の複合影響評価を感度良く、しかも迅速に行える可能性を秘めており、また化学物質の複合影響評価などにも有効なツールとなり得ると期待されている。

### 2. 研究開発目的

本研究では実験魚として非常に扱いやすく、これまでの毒性影響評価法でも一般的に用いられているヒメダカを用いて、研究を進めていった。そして上記の状況を踏まえ、①メタボロミクスとトランスクリプトミクスを同時に行い、これらの手法を用いた複合影響評価の方法を確立すること、さらに、②実環境の環境診断を①で確立した評価法を用いて行うために礎となるデータの構築とシステムを作ることを目的とした。これまでのトキシコゲノミクスでは機能が未知な遺伝子発現や代謝物変動の情報は利用されないのが一般的であるが、我々の研究グループでは、機能に関する情報が得られていない遺伝子や代謝物であっても、それらの変動はそのときの生物が受けた外部刺激に対する応答反応であると考え、変動した全ての遺伝子および代謝物のデータから応答の大きさ（数値化）とその生物学的意義を推定する手法の構築を目指し、この手法を用いて化学物質の複合影響評価に適用することを試みた。

さらには①で確立した手法を用いて、実際の海底質が生物にどの程度の影響を与えるかという汚染影響評価を行い、その影響度を数値で表して影響度比較を行うことを達成目標とした。ここでは実際の現場で汚染評価を行うのではなく、発想を転換して、「現場を実験室に持ってくる」という考えをもとに、実際の海底から採取した底質を実験室に持ち込み、底質に含まれる化学物質を全抽出して暴露を行うという手法を試みた。これにより、天候などの自然に由来する各地の条件の違いを排除した同一条件下で影響評価が行うことができ、さらにコントロール（対象）区と暴露区の比較も容易に行うことが可能になる。

## 3 ．研究開発の方法

## （１）サブテーマ（１）と（２）の共通事項

本研究では、メタボロミクスおよびトランスクリプトミクスの両結果を照らし合わせながら評価法を確立していくという手順を取った。両試験の間の誤差をなるべくなくすため、本研究ではほとんどの試料をサブテーマ（1）と（2）でシェアして解析を行った。よって、以下に両サブテーマでの共通する部分の方法を記した。
## 1 ）絶食および低温暴露試験(平成21年度)

平成21年度はヒメダカに与える影響が全く異なると考えられる、絶食および低温暴露という2つのストレスを単独あるいは複合的にヒメダカに与えて、それぞれの影響がメタボロミクスおよびトランスクリプトミクスによってどのように見出せるかを検証した。本試験ではサンプルを得るまでは同様の手法を取った。本試験では1週間餌を飽食に与えて25℃の水温で飼育するコントロール区、1週間水温は25℃に保つが餌を全く与えない絶食区、1週間飽食に餌を与えて25℃で飼育を行うがそれから付加的に1日だけ10℃の低温下において低温区、1週間絶食区と同条件で飼育した後付加的に1日だけ10℃の低温下におく絶食一低温区をそれぞれ設け、ヒメダカを採取した。採取した個体から肝臓を摘出し、メタボロミクスおよびトランスクリプトミクス解析に供した。

本試験の主たる目的は、①本研究の暴露試験は絶食下で行うため、絶食自体の影響を把握すること、②全く異なったストレスに複合的に暴露されたときに、本研究で用いる解析法が影響をどのように表現できて、さらにどのように定量化できるかを検証すること、③②で得られた結果、およびさらに絶食および低温に対するヒメダカの影響をさらに詳細に解析した結果から具体的にヒメダカ体内の代謝にこれらのストレスがどのような影響を与えたかを検証する、等である。

## 2 ）フェナントレンおよびピレンの単独または複合暴露試験（平成22年度）

平成22年度は多環芳香族炭化水素類（PAHs）の一種のフェナントレンおよびピレンを対象物質とした。PAHsは複数個のベンゼン環から構成される物質の総称である。PAHsは物質間でベンゼン環の数と構造がわずかに異なるだけであり、それぞれのPAHsの生物影響はほぼ共通していると考えられているが、PAHsによる複合影響に関してはほとんど調べられていない。本研究では、PAHsの中でも水環境から比較的高濃度で検出されるフェナントレンおよびピレンを暴露物質として選択した。ヒメダカ稚魚に対して毒性試験を行い、両物質の暴露濃度を設定した後、メタボロミクスおよびトランスクリプトミクス解析のための暴露試験を行った。本試験では1回の暴露試験を行ってそこから採取したヒメダカ試料をテーマ（1）と（2）でシェアした。

フェナントレンの5（フェナントレン低濃度区）および50（フェナントレン高濃度区）μg/L、ピレンの3（ピレン低濃度区）および30（ピレン高濃度区）μg/L、フェナントレン5μg/L+ピレン3μg/L（複合低濃度区）およびフェナントレン50μg/L+ピレン30μg/L（複合高濃度区）のそれぞれの暴露水槽を用意し、そこに生後1ヶ月のヒメダカを投入して96時間暴露した。同時にコントロール区と溶媒のエタノールだけを添加した溶媒区も設けた。サンプリングは暴露直前、24、96時間に行い、メタボロミクスおよびトランスクリプトミクス解析に供した。

ここでの主たる目的は、①影響が類似しているストレスの複合影響を、本研究で確立する解析法でどのように表現でき、どのように定量化できるかを検証する、②類似した影響をヒメダカに与えると考えられるフェナントレンとピレンの複合暴露を行ったときに、単純に複合暴露の影響の度合いが大きくなるだけなのか、それとも全く異なった影響が見出せるか、などを中心に詳細に両者の代謝物暴露がヒメダカにどのような影響を与えるかを検証する、等である。

## 3 ）実環境における生物影響評価～野外海底質抽出物の暴露試験（平成23年度）

平成23年度は、21年度から22年度に検討、確立してきたメタボロミクスによる解析方法を用いて、実際に環境から採取された海底質の影響評価を試みた。底質を採取した地点は人口密集域に近接していて、様々な化学物質が底質中に残留していると考えられる大阪湾とフィリピンスービック湾である。風乾した底質をアセトン/ヘキサン（1:1）およびトルエンにより抽出液を得た。この抽出液を合わせ、ロータリーエバポレータで乾個した後、残渣に1 mLのアセトンを加えて抽出液とした。本試験ではこの抽出液を底質からの全抽出物を含むものとして扱った。まず、メタボロミクス解析のための暴露試験（本試験）の暴露濃度を決定するために、数段階の濃度を用意して、ふ化後2.5週齢のメダカ稚魚を20個体ずつ入れ、72時間の毒性試験を行った。上記抽出液から、等倍、5倍希釈、25倍希釈、125倍希釈した溶液をそれぞれ用意した。1Lの試験水に抽出物濃度を1g底質/L相当量になるように抽出液0.1 mLを添加したもの（等倍希釈）を初めとして、この濃度よりも5,25,125倍希釈した試験水をそれぞれ用意して毒性試験を行い、その結果から大阪湾、スービック湾ともに等倍希釈（1 g底質/L）およびその25倍希釈（0.04 g底質/L）の濃度でそれぞれ本試験を行った。暴露は24時間行った。また、コントロールと溶媒のアセトンのみを添加した溶媒区も設けた。本試験でも1回の暴露試験から得られた試料をテーマ（1）と（2）でシェアした。暴露試験終了後得られたサンプルはメタボロミクスおよびトランスクリプトミクス解析に供した。

本試験の主たる目的は、海底質の全抽出物をヒメダカに暴露して、①その影響の地域間差などが検出できるか、②実環境レベルの汚染評価に本研究で確立した方法は適用可能か、などを中心に検証した。
## （２）メタボロミクスによる影響評価法の確立に関する研究の解析方法

各ヒメダカを個体ごとにマイクロチューブに収容し、そこにクロロホルム/メタノール/水混合溶液（1:2:0.8, v/v/v）を加えて、直径5 mmのジルコニアボールを入れ、高速振とう粉砕器により6分間振とうして代謝物を抽出した。その後、12000gで5分間遠心分離して、メタノール/水相を採取した。液体を乾固し、代謝物をメトキシム化、さらにトリメチルシリル化した。この誘導体化物をGC/MSに導入し、スキャンモードによりメダカ肝臓中の代謝物を測定した。得られたクロマトグラムからAMDIS（Ver.2.69、NIST）によりピークの重なりなどを調べて、S/N比が15以上のピークを選別した。全ての定量可能ピークから定量に最適だと考えられるイオンを1つずつ選び、この面積値を求めた。この面積値を内部標準物質ピーク面積で普遍化した。得られたデータをまず個々のピークごとに一元配置分散分析（ANOVA）により処理して、各群間で有意差（p<0.05）があるものを選別した。さらに、選別された代謝物のデータを主成分分析（PCA）により処理した。

## （３）トランスクリプトミクスによる影響評価法の確立に関する研究の解析方法

ヒメダカ試料をトリゾール試薬（インビトロジェン(株））に浸漬し、全RNAを抽出した。抽出したRNAはDNase処理を行った後にRNeasy Mini Kit（キアゲン）を用いて精製した。全RNAにOne Color Spike Mix（アジレントテクノロジー(株））を加えた後、Quick Amp Labeling Kit（アジレントテクノロジー(株））を用いて相補的RNA（cRNA）を合成・増幅し、cRNAをCy3で蛍光標識した。Cy3標識されたcRNAは精製した後に36,460プローブからなる4×44のマイクロアレイに65℃で17時間ハイブリダイズさせた。その後、マイクロアレイを洗浄し、DNA Microarray Scanner（アジレントテクノロジー(株））によりスキャンした。画像データを基に各プローブの蛍光強度を数値化し、GeneSpring GX 7.3（アジレントテクノロジー(株））により正規化および対数変換した。全ての検体で共通して検出可能であったプローブのみを選択し、グループ間の遺伝子発現の変動を調べた。

本研究で用いたマイクロアレイに搭載されたプローブが検出する遺伝子に関する情報は，それぞれの塩基配列を基に実施した相同性検索（BlastX）より得た。また、それぞれの遺伝子に対してBlast2GOを用いて生物学的プロセスの遺伝子オントロジーのターム（GO term）を付加し、各遺伝子産物の機能情報を得た。定量可能であった遺伝子の全データを用いて、24時間および96時間暴露試料においてそれぞれ暴露群とコントロール群すべてを対象として、等分散を仮定しないANOVAを行った。処理区間で有意差（p < 0.05）が検出されたプローブのみを選別し、これらのプローブから得られたデータのみを主成分分析（PCA）に投入した。主成分1（PC1）あるいはPC2依存的に発現が変動した遺伝子をスクリーニングした後、有意に影響を受けている生物学的プロセスの遺伝子オントロジーをフィッシャーの正確確率検定によって検出した。

### 4 \. 結果及び考察

本研究では概念自体がわかりにくいメタボロミクスおよびトランスクリプトミクスの2つのオミックスの手法から得られたデータを数値化するために、コントロール区とストレスを加えた区の間で代謝物量および遺伝子発現に差があったものをANOVAによって選別した。ここで各区間に差があったものだけを選別したのは、次に行うPCA処理を行う際に、各区の違いをよりデフォルメすることが主目的である。ANOVAで処理した後、PCA処理を行った。ここでPCAを行った際には、一般的には主成分1（PC1）が最も影響の特徴を表しており、次にその影響の特徴を示すものが主成分2（PC2）として表現される。このPC1とPC2の2つの数値を平面にプロットすると、影響の大きさの視覚的判別が容易になる。すなわち、平面上でストレス暴露区のプロットがコントロール区のプロットから大きく離れれば離れるほど、その影響は大きいことになり、コントロール区とあまり大差ない場所、あるいはごく近い場所にプロットされた場合はその影響がほとんど無い、あるいはごく小さいということを意味する。これらのコ

Control ■Fasted ▲Cold shock ●Fasted + Cold shock

図1 メタボロミクス解析より得られたコントロール区、絶食区、低温区、および絶食-低温暴露のPCA解析結果

ントロールからの距離はその影響の大きさを示している。このようにデータをPCAにより示し、さらにコントロールとの距離=影響の大きさという概念で本研究では影響の大きさを数値化した。

## （１）メタボロミクスによる影響評価法の確立に関する研究

## 1 ）絶食および低温暴露試験(平成21年度)

PCAで処理した結果から得られたPC1とPC2をプロットしたものを図1に示す。それぞれの同一区ではごく近い場所に群を形成し、さらに4つの群はそれぞれ明らかに異なった位置に分布した。すなわちコントロール区から見ると絶食区はPC1の正の方向に、低温区はPC2の負の方向に離れて分布した。また、絶食一低温区は絶食区および低
温区のベクトルの和にあたる位置の近辺に分布した。

## 2 ）フェナントレンおよびピレンの単独または複合暴露試験（平成22年度）

本研究では単独および複合暴露ともに低濃度と高濃度の間には10倍の暴露濃度差を設けたが、メタボロミクスにより影響解析を行ったところ、フェナントレンとピレンの単独および複合暴露ともに、濃度依存的な影響の差異は見られず、それはPCA解析の結果でも判別することができなかった（図2）。24時間の時点における代謝物データをPCAにより解析したところ、PCA解析によってフェナントレンとピレンの影響の差異もほとんど見られなかった。このことは両暴露の影響が非常類似していることが

原因であると考えられたが、PC1方向に大きく広がるような分布を示した。このことからPC1が単独影響を示すものと考えられた。また、複合暴露は溶媒区および単独暴露区と比較するとはPC2の方向に離れて分布した。これは複合暴露区が単独暴露区とは多少異なった影響を受けていた可能性を示唆するものである。96時間の時点ではフェナントレンとピレン単独暴露区はPC2方向で分離をしており、フェナントレンの影響がピレン暴露区よりも多少強い可能性を示した。また、複合暴露群はPC1方向に離れて分布する傾向を示したが、24時間ほどクリアな分離を示すものではなく、絶食の影響が疑われた。

図2 フェナントレンとピレンの単独および複合暴露から得られた代謝物データのPCA解析結果

今回のフェナントレンとピレン、それぞれがヒメダカに与える影響は類似していると考えられるが、作用機序が似ている場合の複合影響を我々が行ったANOVA→PCA解析による影響評価では単独暴露は暴露物質が異なってもほぼ同じベクトル上に示されると考えられる。そして、これらが複合して暴露されたときには2つのパターンが考えられ、その1つは個々の単独暴露のベクトルと同じ方向に位置し、そのベクトルの大きさのみが変化するものであり、もう1つはベクトルの方向が単独暴露とは全く異なって向く場合である。前者は類似している暴露物質故に影響が単純に増強されるパターンであり、後者は両者の暴露物質の生物に与える影響が類似していても複合暴露により、単独暴露のときとは全く異なった影響を与えるパターンである。今回の24時間の時点でのフェナントレンとピレンの複合暴露群はPCA解析の結果、コントロール（溶媒区）と比較するとPC2の方向に位置し、単独暴露群はPC1方向に分離する傾向をみせたために、後者に当てはまるパターンであると言える。

## 3 ）実環境における生物影響評価～野外海底質抽出物の暴露試験(平成23年度)

暴露試験を行う前に、底質抽出液の72時間での急性毒性試験を実施したところ、スービック湾で採取した底質の抽出液を等倍で添加した区（1 g底質/L相当）で75%の致死率がみられた。また、大阪湾にて採取した底質の抽出液では致死影響は観察されず、大阪湾の底質に含まれる化学物質は致死影響をエンドポイントとした場合、ヒメダカに与える影響はスービック湾よりも相対的に低いことが明らかとなった。図3に底質抽出物に暴露後、代謝物データからPCA解析を行った結果を示した。その結果、コントロールに対してPC1方向に各群が離れていく傾向を示した。このことからPC1がヒメダカの受けた影響を示すと判断して、このPC1のみをピックアップして平均値を求め、グラフにしたものが図3右

図に示したものである。その結果、PC1は大阪湾とスービック湾の底質抽出物ともに5倍希釈の方が25倍希釈の抽出液暴露区よりも大きく、濃度依存的に影響が現れていることを示していた。また、大阪湾とスービック湾を比較するとスービック湾の25倍希釈抽出液を暴露したものが、大阪湾の5倍希釈のものとほぼ同程度の影響を受けていたと考えられた。また24時間の時点では、大阪湾の25倍希釈液はほぼヒメダカの代謝には影響を与えていないと考えられた。これらの結果は上述のメタボロミクス解析のための暴露試験前に行った毒性試験の結果と一致していたが、メタボロミクスの感度は致死を指標とした毒性試験と比較すると25倍以上の感度があると考えられた。

図3 大阪湾およびスービック湾底質抽出物に暴露したときに得られた代謝物データをPCA解析したもの（左図）と、PCAからPC1の値をピックアップして示した図（右図）
## （２）トランスクリプトミクスによる影響評価法の確立に関する研究

## 1 ）絶食および低温暴露試験(平成21年度)

マイクロアレイ実験より、絶食あるいは低温刺激によって発現量が変化した遺伝子群のデータをPCAに供し、各個体におけるPC1およびPC2スコアを得た（図4）。PCAの結果、対照区、低温刺激区、絶食区、絶食十低温刺激区の4群はそれぞれ個別のグループを形成し、PC1が低温刺激の影響を、PC2が絶食による影響を明確に反映した。低温および絶食の複合ストレスを与えた区は、PC1およびPC2の両方に得点を得て、単独ストレスによる影響と分離された。以上のことから、絶食に対するメダカの生体応答は低温刺激に対するそれとは大きく異なっており、それぞれ独立していると考えられた。また、絶食と低温刺激の両方のストレスを受けた個体においては、それぞれのストレスに対する応答が同時に起こっていると推察された。

## 2 ）フェナントレンおよびピレンの単独または複合暴露試験（平成22年度）

フェナントレンおよびピレンを単独または複合で24時間または96時間暴露したメダカ稚魚における遺伝子発現プロファイルデータをもとに主成分分析を行った（図5）。24時間暴露の結果、フェナントレン

図4 絶食および低温刺激によって変動した遺伝子群の発現量データを用いた主成分分析の結果

またはピレンの単独暴露を受けた個体は、PC2に沿って対照区の個体とは分離され、PC2のスコアは単独のPAHsによる影響を反映しているものと考えられた。フェナントレンに暴露された個体とピレンに暴露された個体が分離しなかったことから、両化合物による影響は類似していると推察された。また、両化合物ともに低濃度区と高濃度区が分離しておらず、濃度依存的な影響は相対的に弱いと考えられた。一方、フェナントレンとピレンの複合暴露を受けた個体はPC1に沿って他の処理区の個体とは分離され、PC1のスコアが複合影響を反映していることが明確に示された。複合暴露区においても低濃度区と高濃度区が分離しておらず、濃度の違いによる影響の差異は小さいと考えられた。96時間暴露試験では、24時間暴露試験ほど処理区間の隔離が明確ではなく、PC1がおそらくは複合影響を反映していると考えられたが、PC2が何を反映しているかを現時点では断定することはできなかった。

## 3 ）実環境における生物影響評価～野外海底質抽出物の暴露試験（平成23年度）

暴露試験の結果、PC1（37.8%）に沿って各区の個体が分離されたため、各処理区のPC1スコアの平均値を求めた（図5）。その結果、PC1のスコアは対照区、25倍希釈区、5倍希釈区の順に濃度依存的な変化を示した。大阪湾とスービック湾を比較したところ、スービック湾の5倍希釈抽出液を暴露した個体のPC1スコアが対照区から最も離れており、スービック湾の25倍希釈区と大阪湾の5倍希釈区がほぼ同レベルであった。このことから、スービック湾の抽出液に対する生体応答の方が大阪湾の抽出液に対するそれよりも大きく、スービック湾の底質に含まれる化学物質の方が総量として生態影響ポテンシャルは高いことが推定された。この結果は、先に実施した急性毒性試験から得られた毒性ポテンシャルの評価結果と一致していた。したがって、本研究にて構築した複合毒性の評価手法は環境試料の生態影響評価にも適用可能であり、致死毒性のような急性毒性が発現するよりも25倍以上低濃度であっても、その毒性ポテンシャルを推定するのに有効である

ことが示された。

## （３）サブテーマ１および２から得られた結果のまとめと複合影響の解釈

ここまで述べてきた通り、本研究にて我々が用いたPCAをベースとした代謝物および遺伝子の解析手法は、二種類の環境ストレスに対する応答をそれぞれ検出したとどまらず、両方のストレスを受けた個体においてはそれぞれのストレスに対する応答が同時に起こっていることを明確に捉えることを可能とした。本実験で採用した絶食や低温刺激のように作用機序が大きく異なることが予

図5 各底質抽出液の暴露区における遺伝子発現プロファイルの変化から求めた第一主成分のスコア