Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
表(2)-1 絶食に対して応答した生物学的プロセスのGO term

GO ID	GO term	Sequence number	p-value
altered	(total)
Down-regulated
iron homeostasis
GO:0006826	iron ion transport	18	(101)	0.001
GO:0006879	cellular iron ion homeostasis	17	(106)	0.005
lipid metabolism
GO:0006629	lipid metabolic process	11	(48)	0.002
GO:0006631	fatty acid metabolic process	11	(36)	<0.001
GO:0006633	fatty acid biosynthetic process	8	(20)	<0.001
GO:0006695	cholesterol biosynthetic process	17	(27)	<0.001
GO:0008299	isoprenoid biosynthetic process	6	(14)	0.002
glycolysis
GO:0006096	glycolysis	16	(61)	<0.001
GO:0006012	galactose metabolic process	6	(8)	<0.001
GO:0006006	glucose metabolic process	5	(24)	0.041
GO:0006086	acetyl-CoA biosynthetic process from pyruvate	3	(9)	0.041
immune system
GO:0042110	T cell activation	3	(5)	0.013
GO:0050900	leukocyte migration	2	(3)	0.039
GO:0006935	chemotaxis	4	(16)	0.040
GO:0006954	inflammatory response	7	(43)	0.047
GO:0006956	complement activation	4	(17)	0.047
Up-regulated
energy
production
GO:0006635	fatty acid beta-oxidation	8	(25)	0.003
GO:0006533	aspartate catabolic process	3	(4)	0.013
GO:0046327	glycerol biosynthetic process from pyruvate	2	(2)	0.032
immune system
GO:0019221	cytokine-mediated signaling pathway	5	(20)	0.039
cell
proliferation
GO:0008156	negative regulation of DNA replication	4	(7)	0.008
GO:0051329	interphase of mitotic cell cycle	3	(3)	0.008
Statistical significance was analyzed by Fisher's exact test: p < 0.05.

素（EC:1.4.1.3）の発現量が、絶食によって約2.5倍増加したことが明らかとなった。これらのことから、絶食によってグルタミン酸の異化を介したTCA回路へのエネルギー源の供給が亢進したと考えられた。

## 3 ）低温刺激による影響

トランスクリプトーム解析の結果、24時間の低温刺激はタンパク質の安定性（protein stabilization [GO:0050821]）や膜の流動性（regulation of mitochondrial membrane permeability）
図(2)-2 絶食によって変動した遺伝子群の生物学的遺伝子オントロジー

[GO:0046902]）、シャペロン活性（protein polymerization [GO:0051258]; protein folding [GO:0006457]）に関連する遺伝子を変動させ、代謝プロセスを抑制した絶食の影響とは異なった。低温刺激はタンパク質の安定性や膜の流動性を低下させることが報告されており $ ^{6} $ 、本研究の結果はそれと矛盾しなかった。これらの影響が結果としてシャペロン活性を上昇させたと考えられ、この応答はおそらく低温刺激に対する防御反応であると推察された。

低温刺激によって最も大きく変動した遺伝子のひとつとして、ステアリン酸CoA脱飽和酵素が挙げられる。同遺伝子は絶食によって約2倍抑制されたが、低温刺激によって17倍に増加した。ステアリン酸CoA脱飽和酵素は細胞膜を構成する脂質の不飽和度を上げることで膜の流動性を上昇させることが知られている。先に述べた通り、低温刺激は膜の流動性を低下させるため、これに対してステアリン酸CoA脱飽和酵素を誘導することで膜の流動性を上昇させる応答が生じたと考えられ、この反応は低温環境への適応の重要なプロセスであることが予想された。

## 4 ）絶食・低温刺激試験のまとめ

ここまで述べてきた通り、本研究にて我々が用いたPCAをベースとしたマイクロアレイデータの解析手法は、二種類の環境ストレスに対する応答をそれぞれ検出したとどまらず、両方のストレスを受けた個体においてはそれぞれのストレスに対する応答が同時に起こっていることを明確に捉えることを可能とした。本実験で採用した絶食や低温刺激のように作用機序が大きく異なることが予想されるストレッサーの組み合わせの場合は、PCAにてそれぞれの影響が異なる次元に反映され、複合影響はその和として表すことが可能だろうと思われる（図(2)-3）。類似の作用機序を有するストレッサーの組み合わせの場合、あるいは化学物質暴露に対する応答を検出する場合
表(2)-2 低温刺激に対して応答した生物学的プロセスのGO term

GO ID	GO term	Sequence number	p-value
altered	(total)
Down-regulated
protein
stability
GO:0050821	protein stabilization	7	(18)	0.039
GO:0022417	protein maturation by protein folding	3	(3)	0.034
membrane
fluidity
GO:0046902	regulation of mitochondrial membrane permeability	3	(3)	0.034
GO:0006656	phosphatidylcholine	biosynthetic	4	(7)
process
Up-regulated
chaperone
activity
GO:0051258	protein polymerization	14	(26)	<0.001
GO:0006457	protein folding	22	(140)	<0.001
GO:0006986	response to unfolded protein	6	(22)	0.007
cell redox
GO:0045454	cell redox homeostasis	7	(32)	0.010
cholesterol
biosynthesis
GO:0008299	isoprenoid biosynthetic process	4	(14)	0.023

Statistical significance was analyzed by Fisher's exact test: p < 0.05.

図(2)-3 主成分分析をベースとした解析法による作用機序が独立している場合の複合影響の表現
にも本手法が適用可能なのか次の実験で検証した。

## （２）フェナントレンとピレンの単独または複合暴露試験（平成22年度）

## 1 ）主成分分析によるフェナントレンおよびピレンの単独または複合影響の解析

フェナントレンおよびピレンを単独または複合で24時間または96時間暴露したメダカ稚魚における遺伝子発現プロファイルデータをもとに主成分分析を行った（図(2)-4）。24時間暴露の結果、フェナントレンまたはピレンの単独暴露を受けた個体は、PC2に沿って対照区の個体とは分離され、PC2のスコアは単独のPAHsによる影響を反映しているものと考えられた。フェナントレンに暴露された個体とピレンに暴露された個体が分離しなかったことから、両化合物による影響は類似していると推察された。また、両化合物ともに低濃度区と高濃度区が分離しておらず、濃度依存的な影響は相対的に弱いと考えられた。一方、フェナントレンとピレンの複合暴露を受けた個体はPC1に沿って他の処理区の個体とは分離され、PC1のスコアが複合影響を反映していることが明確に示された。複合暴露区においても低濃度区と高濃度区が分離しておらず、濃度の違いによる影響の差異は小さいと考えられた。96時間暴露試験では、24時間暴露試験ほど処理区間の隔離が明確ではなく、PC1がおそらくは複合影響を反映していると考えられたが、PC2が何を反映しているかを現時点では断定することはできなかった。以上のPCAの結果から、化学物質特異的な影響を検出することを意図する場合には、後述するような絶食などの要因がノイズとなり得るため、24時間以内の比較的短期暴露試験を実施すべきであると考えられた。

## 2 ）フェナントレンおよびピレンによる影響の詳細解析

PC1またはPC2に対して有意な相関関係を示したプローブを抽出した後、フェナントレンおよびピレンの単独または複合暴露によって誘導あるいは抑制された遺伝子群を検出した。それらのGOピレンの単独または複合暴露によって誘導あるいは抑制された遺伝子群を検出した。それらのGO termを用いた解析を行ったところ、誘導を受けた遺伝子群は単独暴露と複合暴露で重複していることが明らかとなった。誘導された遺伝子群は免疫応答（immune response [GO:0006955]）やアポトーシス誘導（induction of apoptosis [GO:0006917]）、脂質代謝（lipid metabolic process [GO:0006629]）、酸化ストレス（response to oxidative stress [GO:0006979]）に対する応答などに関連するものであった。それらの遺伝子群の変動パターンから影響を推察したところ、単独暴露と複合暴露でほぼ同等であるか、複合暴露が単独暴露の和すなわち相加影響として現れていた。一方で、抑制された遺伝子群のほとんどは複合暴露群で特異的であり、単独暴露では影響を受けていなかった。これらの抑制された遺伝子群はリン酸輸送（phosphate transport [GO:0006817]）、コラーゲン異化（collagen catabolic process [GO:0030574]）、酸素輸送（oxygen transport [GO:0015671]）、ヘム合成（heme biosynthetic process [GO:0006783]）、解糖系（glycolysis [GO:0006096]）などに関与するものであった。解糖系に関連する遺伝子のいくつかは複合暴露区で2倍程度抑制されていたにもかかわらず、単独暴露区ではまったく変化していなかった。また、24時間の暴露ではコラーゲン合成および異化に関連する遺伝子群は複合暴露区で2倍から10倍以上抑制されていたが、単独暴露区ではほとんど変化しておらず、コラーゲン合成に対するPAHsの複合影響が劇的であることを示唆していた（図(2)-5）。このように、誘導された遺伝子群から推定されるPAHsの複合影響は相加的あるいはそれ以下であったのに対し、抑制された遺
図(2)-4 フェナントレンとピレンの単独および複合暴露によって変動した遺伝子群の発現量データを用いた主成分分析の結果

伝子群から推定される複合影響は単独暴露による影響から予想できるものではなく、無作用レベルの化合物が混合することではじめて引き起こされるものであった。

## 3 ）絶食による影響

暴露開始時（0時間）と暴露24時間および96時間における対照区の個体の遺伝子発現プロファイルをPCAに供した結果を図(2)-6に示す。その結果、3群の個体はそれぞれ3つのグループに完全に分離し、PC1（50.4%）は絶食による24時間と96時間での共通の影響を、PC2（19.9%）は絶食に対する初期応答と後期応答の違いを反映していると推察された。共通の応答としては、DNA複製（DNA replication [GO:0006260]）や細胞分裂（cell division [GO:0051301]）、ヘム合成（heme biosynthetic process [GO:0006783]）、脂肪酸β酸化（fatty acid beta-oxidation [GO:0006635]）が抑制されていた一方で、グリコーゲンの代謝（glycogen metabolic process [GO:0005977]）が促進されていた。これらに関連する遺伝子群の変化量は24時間と96時間でほぼ同等であった。また、初期応答としてはTCA回路（tricarboxylic acid cycle [GO:0006099]）の亢進が、後期応答としてはグルコースの恒常性維持に関する機能（glucose homeostasis [GO:0042593]）の誘導やコラーゲン異化の抑制（collagen catabolic process [GO:0030574]）が引き起こされていた。

コラーゲン異化の阻害に着目すると、96時間の絶食によって最大で4倍程度の発現抑制が起こっ
図(2)-5絶食あるいはフェナントレンとピレンの単独および複合暴露によるコラーゲンの合成・異化に関連する遺伝子群の発現量変化

ていた（図(2)-5）。先に述べた通り、24時間のPAHs複合暴露によってもコラーゲンの発現は阻害されていた。本試験では同一暴露時間の個体同士の発現量比較を行っていたことに加え、PAHsによる影響が絶食による影響よりも遙かに強かったためそれほど大きな問題とはならないが、これは化学物質による影響にも匹敵するものであり、稚魚にとって96時間の絶食状態は代謝物や遺伝子発現プロファイルに与える影響が非常に大きいことが示された。このことが原因で96時間暴露のメダカから明確な化学物質の影響が見出せなかったと考えられ、稚魚を対象とした化学物質の影響試験は24時間程度の暴露試験から評価するべきであると結論づけられた。

## 4 ）PCAによるPAHsの複合暴露の影響評価

本実験で用いたフェナントレンとピレンは化学的特性が類似しているため、これらの生物への作用機序には共通点が多いと考えられる。実際に本研究のPCAの結果でも、フェナントレン単独暴露区とピレン単独暴露区の個体は分離せず、同一のグループに属すると見なされた（図(2)-4）。このとき、単独暴露区は対照区に対してPC2方向に分離された一方で、複合暴露区はPC1方向に分離された。以上のことから、作用機序が類似している複数の環境ストレスを与えた場合、各成分の影響は類似しているため同一の次元で表現され、複合影響として特異的に検出される応答は単独影響とは異なる次元で表現されると仮説を立てた（図(2)-7）。今後、他の化学物質セットを用
図(2)-6 暴露開始時（0時間）と暴露24時間および96時間において発現量が変動した遺伝子群の発現量データを用いた主成分分析の結果

いて本仮説を検証する。

## （3） 底質抽出物暴露試驗

## 1 ）急性毒性试验

底質抽出液の72時間での急性毒性試験を実施したところ、スービック湾にて採取した底質の抽出液を等倍で添加した区（1 g底質/L相当）において75%の致死率がみられた。過去の研究でスービック湾ではPAHsの汚染が進行していることが報告されており、本試験で観察された急性毒性はPAHsによる寄与が大きいと予想された。しかし、底質中に含まれる化学物質の種類や濃度は明らかでないため、今後、化学分析によって原因である化学物質を同定および測定する必要がある。また、大阪湾にて採取した底質の抽出液では致死影響は観察されず、大阪湾の底質に含まれる化学物質は致死影響をエンドポイントとした場合、総量としての毒性ポテンシャルは相対的に低いことが明らかとなった。
図(2)-7 主成分分析をベースとした解析法による作用機序が類似している場合の複合影響の表現

本試験の結果を受け、トランスクリプトーム解析は5倍および25倍希釈した抽出液を暴露したメダカにおいて実施することとした。

## 2 ）トランスクリプトーム解析による抽出液暴露に対する生体応答の検出

先述の（1）および（2）の試験結果を受け、本実験では底質抽出液を24時間暴露した後の遺伝子発現プロファイルの変化をPCAによって検出することを試みた。処理区間で有意な発現量変化が検出された3,523プローブのデータをPCAに供した結果を図(2)-8に示す。PC1（37.8%）に沿って各区の個体が分離されたため、各処理区のPC1スコアの平均値を求めた（図(2)-9）。その結果、PC1のスコアは対照区、25倍希釈区、5倍希釈区の順に濃度依存的な変化を示した。大阪湾とスービック湾を比較したところ、スービック湾の5倍希釈抽出液を暴露した個体のPC1スコアが対照区から最も離れており、スービック湾の25倍希釈区と大阪湾の5倍希釈区がほぼ同レベルであった。このことから、スービック湾の抽出液に対する生体応答の方が大阪湾の抽出液に対するそれよりも大きく、スービック湾の底質に含まれる化学物質の方が総量として生態影響ポテンシャルは高いことが推定された。この結果は、先に実施した急性毒性試験から得られた毒性ポテンシャルの評価結果と一致していた。したがって、本研究にて構築した複合毒性の評価手法は環境試料の生態影響評価にも適用可能であり、致死毒性のような急性毒性が発現するよりも25倍以上低濃度であっても、その毒性ポテンシャルを推定するのに有効であることが示された。

現状としては、底質抽出液暴露に対する応答から大阪湾とスービック湾の違いを検出するには至らなかった。ここまでの解析で地点間の差異が検出されなかった理由として2つの可能性が考えられる。第一に、大阪湾とスービック湾の底質に含まれていた化学物質の複合影響が実際に類似していたことが考えられる。第二に、両地点の底質抽出液暴露による影響には違いが存在するも
図(2)-8 大阪湾またはスービック湾で採取した底質からの抽出液の暴露によって変動した遺伝子群の発現量データを用いた主成分分析の結果

図(2)-9 各底質抽出液の暴露区における遺伝子発現プロファイルの変化から求めた第一主成分のスコア
のの、一部の限られた遺伝子の発現のみにしか生じなかった可能性が挙げられる。今後は、底質中に含まれている化学物質を同定および測定するとともに、上記の可能性について検証する予定である。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究により複合的なストレスを受けたメダカにおける生体影響を、PCAを基本としたオミックスデータの解析法によって、単独のストレッサーによる影響とは分離して評価することが可能となった。これまでに雌雄差を反映した遺伝子群の検出や、単独のストレッサーによって発現量が変化する遺伝子群の検出にPCAが用いられることはあったが $ ^{4)} $ 、複合影響の検出に応用したのは本研究が初めてである。本試験で与えたような絶食と低温刺激のように作用機序も影響も異なることが予想されるストレッサーを組み合わせた場合、PC1とPC2がそれぞれ単独の影響を反映し、複合影響はPC1とPC2の両スコアの和として表現された。しかしながら、化学的性質が類似したフェナントレンとピレンを暴露した試験においては、それらの化合物の挙動や影響に共通性が多く見られることは容易に予想可能であり、実際に両化合物単独暴露による影響はPC2のみに反映されており、それぞれの化合物の影響は分離されなかった。一方で、複合暴露による影響はPC1に投射され、明らかに単独暴露による影響とは区別された。さらに、本手法を実環境中から採取した底質試料中に含まれる化学物質暴露に対する応答の検出に応用したところ、致死影響が現れるよりも遙かに低濃度であっても生体応答を検出でき、その応答の大きさは致死影響を指標とした時の毒性ポテンシャルと比例関係にあった。つまり、現状では致死影響あるいはそれに準ずるエンドポイントでしか複合毒性は評価されていないが、本手法を用いることで、より高感度で複合毒性を検出することが可能となったと言える。このように本手法は、我々が最終目標として掲げている実環境中に存在する汚染物質の複合影響評価および影響度の数値化のために大いに貢献すると確信している。

PAHsの単独暴露による影響に関する知見は比較的多く存在するが、複合影響に関する知見は乏しい。本試験では、単独暴露区ではまったく影響を受けていなかった解糖系やコラーゲン合成系が複合暴露区で顕著に抑制されていた。このことは、化学物質の複合作用によって、単独の化学物質を対象とした暴露試験からはまったく推定できない影響が引き起こされることを示しており、複合毒性の優れたモデルケースとなり得ると同時に複合影響評価の重要性を我々に再認識させた。

## （２）環境政策への貢献

化学物質の複合影響についてはその重要性は認識されているものの、作用機序の複雑さ故、研究が遅れているのが現状である。個々の化合物を対象とした化学物質のリスク評価は、毒性物質の初期スクリーニングには重要な役割を持つが、化学物質の環境影響を評価する際には、より複雑な要因を加味する必要がある。本研究は、個々の化学物質は無作用濃度未満であっても、複合的に作用することで生物に対して悪影響を及ぼすことを示しており、このことは現行の化学物質の環境影響評価手法の有用性を根幹から揺るがすものである。現状では、複合影響の評価手法は確立されておらず、海外ではすでに実施されている工場等の全排水を対象とした生物試験（WET
test）についても、我が国では未だ検討段階である。本研究より得られる成果は、化学物質の複合毒性を広く認識させることに貢献するのみならず、将来的に確立すべき複合毒性の影響評価手法の礎となるポテンシャルを有している。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況※【別添】H23研究等報告書作成要領参照

## （1） 誌上発表

<論文（査読あり）>

1) S. Uno, A. Shintoyo, E. Kokushi, M. Yamamoto, K. Nakayama and J. Koyama: Environmental Science and Pollution Research (2012)

<査読付論文に準ずる成果発表>（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可。）該当せず。

## くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1）仲山慶、半藤逸樹、北村真一：平成22年度日本水産学会春季大会 水産環境保全委員会主催シンポジウム「水産環境における化学物質汚染の現状・評価・対策」（2010）「複合的環境ストレスに対する生体影響評価」

2) K. Nakayama, I. C. Handoh, J. Y. Song and S. I. Kitamura: 6th International Conference on Marine Pollution and Ecotoxicology, Hong Kong SAR, China, 2010.

“Analyzing the effects of multiple environmental stressors by microarray data.”

3) K. Nakayama, I. C. Handoh, J. Y. Song and S. I. Kitamura: The 8th International Symposium on Advanced Environmental Monitoring, Sapporo, Japan, 2010.

"Evaluation of binary effects of environmental stressors using transcriptomic data."

4）仲山慶：日本環境毒性学会特別セミナー「環境・健康分野へのOMICSの活用」（2010）「トランスクリプトームデータを用いた複合影響評価」

5) K. Nakayama, I. C. Handoh, J. Y. Song, and S. I. Kitamura: SETAC North America 31st Annual Meeting, Portland, OR, USA, 2010.

“Evaluation of the binary effects of environmental stressors using transcriptomic data.”

6) K. Nakayama, S. Uno, Y. Murakami and S. I. Kitamura: 15th International Symposium on
Toxicity Assessment, Hong Kong SAR, China, 2011.

“Toxicity assessment of polycyclic aromatic hydrocarbon mixtures in Japanese medaka (Oryzias latipes) based on transcriptome data.”

7) S. Uno, K. Nakayama, E. Kokushi, A. Shintoyo, M. Yamamoto, Y. Murakami, S.I. Kitamura and J. Koyama: 15th International Symposium on Toxicity Assessment, Hong Kong SAR, China, 2011.

“Toxicity assessment of polycyclic aromatic hydrocarbon mixtures in Japanese medaka (Oryzias latipes) based on metabolomic analyses.”

8) S. Uno, K. Nakayama, T. Nino, E. Kokushi and J. Koyama: International Symposium on Advanced Studies by Young Scientists on Environmental Pollution and Ecotoxicology, Matsuyama, Japan, 2011.

“Metabolomics approach to evaluate effects of environmental contaminants in fish.”

9）仲山慶、宇野誠一、國師恵美子、新豊葵、小山次朗、村上安則、北村真一：第17回日本環境毒性学会・バイオアッセイ研究会合同研究発表会（2011）

「多環芳香族炭化水素の単独・複合暴露に対する生体応答の解析」

10) 宇野誠一、仲山慶、北村真一、國師恵美子、新豊葵、小山次朗：第17回日本環境毒性学会・バイオアッセイ研究会合同研究発表会（2011）

「PAH類に暴露したヒメダカ稚魚のメタボロームとトランスクリプトームの変動の比較」

11) 仲山慶、宇野誠一、半藤逸樹、北村真一：フォーラム2011：衛生薬学・環境トキシコロジー、フォーラムIII「フィールドをMolecular Toxicology手法で測る～環境汚染物質の生体・生態影響～」（2011）

12) K. Nakayama, S. Uno, E. Kokushi, J. Koyama, I.C. Handoh and S.I. Kitamura: 2011 International Conference on Environmental OMICS, Guangzhou, China, 2011.

“Transcriptomic and metabolomic changes caused by the effects of single and combined environmental stressors.”

13) S. Uno, K. Nakayama, S. I. Kitamura, Y. Murakami, E. Kokushi, A. Shintoyo, K. Ito and J. Koyama: 2011 International Conference on Environmental OMICS, Guangzhou, China, 2011. "Toxicity evaluations for individual and mixed exposures of phenanthrene and pyrene in medaka (Oryzias latipes) alevin with metabolomics and transcriptomics."

14) K. Nakayama, S. Uno, E. Kokushi, A. Shintoyo, Ito K, J. Koyama, I.C. Handoh and S.I. Kitamura: 6th SETAC World Congress/SETAC Europe 22nd Annual Meeting, Berlin, Germany, 2012.

“Transcriptomic responses in Japanese medaka (Oryzias latipes) exposed to individuals or mixtures of polycyclic aromatic hydrocarbons: mixture toxicities or fasting effects?”（アブストラクト提出済み）

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。
## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

1）日本環境毒性学会特別セミナー「環境・健康分野へのOMICSの活用」（2010年7月2日、北海道大学農学部、観客20名）

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## （6） その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) K. Nakayama, Y. Oshima, K. Nagafuchi, T. Hano, Y. Shimasaki and T. Honjo: Environmental Toxicology & Chemistry, 24, 591-596 (2005)

“Early-life-stage toxicity in offspring from exposed parent medaka, Oryzias latipes, to mixtures of tributyltin and polychlorinated biphenyls”

2) K. Nakayama, N. Sei, Y. Oshima, K. Tashiro, Y. Shimasaki and T. Honjo: Marine Pollution Bulletin, 57, 460-466 (2008)

“Alteration of gene expression profiles in the brain of Japanese medaka (Oryzias latipes) exposed to KC-400 or PCB126”

3) K. Nakayama, S. I. Kitamura, Y. Murakami, J. Y. Song, S. J. Jung, M. J. Oh, H. Iwata and S. Tanabe: Marine Pollution Bulletin, 57, 445-452 (2008)

“Toxicogenomic analysis of immune system-related genes in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)”

4) K. Nakayama, N. Sei, I. C. Handoh, Y. Shimasaki, T. Honjo and Y. Oshima: Marine Pollution Bulletin, 63, 366–369 (2011)

“Effects of polychlorinated biphenyls on liver function and sexual characteristics in Japanese medaka (Oryzias latipes)”

5) A. Conesa, S. Götz, J. M. García-Gómez, J. Terol, M. Talón and M. Robles: Bioinformatics, 21, 3674-3676 (2005)

“Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research”

6) H. A. Thieringer, P. G. Jones and M. Inouye: BioEssays, 20, 49-57 (1998) "Cold shock and adaptation"
# Development and Application of Toxicogenomics for Toxicity Evaluations to Complex Pollutions in the Field

Principal Investigator: Seiichi UNO

Education and Research Center for Marine Resources and Environment, Faculty of Fisheries, Kagoshima University

50-20 Shimorata 4-Chome, Kagoshima 890-0056, Japan

Tel: +81-99-286-4262/ Fax: +81-99-286-4296

E-mail: uno@fish.kagoshima-u.ac.jp

Cooperated by: Ehime University

## [Abstract]

Key Words: Metabolomics, Transcriptomics, Principal Component Analysis, Japanese Medaka, Combined Effect

The goal of this study was to develop an optimized method using metabolomics and/or transcriptomics to evaluate the effect of combined stressors to fish. The risks associated with exposure to contaminated marine sediments were also investigated using the optimized method. The present method of both omics was applied the handling of One-way analysis of variance (ANOVA) and principal component analysis (PCA) were used to evaluate characteristic responses in Japanese medaka (Oryzias latipes) left under the starvation and cold shock. In PCA analysis, the group left only in starvation plotted in one dimension, and the group only subjected to cooling plotted in another dimension on the PCA score plot. Medaka exposed to the combination of starvation and cooling plotted as the sum of vectors from the individual effects of starvation and cooling. These results suggest that the group left in the combined stress simultaneously exhibited the symptoms induced with starvation and cooling. Similar effects were observed with metabolomics and transcriptomics. Additional experiments using both omics methods were used to evaluate the combined effects of two polycyclic aromatic hydrocarbons, phenanthrene and pyrene, in medaka. In this case, the data from combined exposures with phenanthrene and pyrene were not clearly clustered on the PCA score plot between both groups, suggesting that both compounds caused similar effects. The combined exposure group were clustered in the entirely other dimension from single exposure groups. This result suggests that the combined exposure of phenanthrene and pyrene produced different and unexpected effects in fish. Finally, the risks to fish from exposure to contaminated marine sediments from Osaka, Japan and Subic Bays, Philippines were evaluated with the optimized evaluation method. Both omics methods indicated that the extract from Subic Bay seriously affected medaka compared with Osaka Bay. The present method with
metabolomics or transcriptomics appears to be about 25 times more sensitive in detecting differences between groups as assessment based on mortality, indicating the enhanced usefulness of this approach.
1）異なる影響を与える、あるいは類似した影響を与える2つのストレスを与えたときの、本研究で開発した定量化法による解析結果とその概念図

## 2 ) 類似した影響を与える2つのストレスに暴露された場合の複合影響

例）絶食、低温状態下のヒメダカのトランスクリプトミクスの主成分分析結果

●各ストレッサーの影響が異なる次元で表現される

●複合影響は各成分のベクトルの和となる

例）フェナントレン及びビレンに単独・混合暴露されたヒメダカのトランスクリプトミクスの主成分分析結果

2）大阪湾およびフィリピン・スービック湾で採取された底質抽出物にヒメダカを24時間暴露したときのトランスクリプトミクスとメタボロミクスの主成分分析結果と、定量化した影響の比較

A)トランスクリプトミクス

B) メタボロミクス

●急性毒性試験ではスービック湾のみ影響あり。

●急性毒性試験で影響があった濃度の1/5と1/25の濃度にヒメダカを暴露。大阪湾もスービック湾と同様の濃度で暴露。

● トランスクリプトミクスーメタボロミクスとも急性毒性試験の結果と一致。

●急性毒性試験よりも25倍以上の高感度で影響を検出
課題名 A-0903 大気環境に関する次世代実況監視及び排出量推定システムの開発

課題代表者名 岩崎 俊樹 （東北大学大学院理学研究科地球物理学専攻 教授）

研究实施期间 平成21～23年度

累計予算額 84,795千円（うち23年度 28,533千円）

予算額は、間接経費を含む。

研究体制

(1) 総括および4次元データ同化結果の検証 (東北大学大学院理学研究科)

(2)二酸化炭素およびエアロゾル地表面フラックス推定に関する研究(国土交通省気象庁気象研究所)

(3) 大気環境再解析システムの開発（独）海洋研究開発機構）

(4) データ同化情報を活用したモデルの改良（独）国立環境研究所）

## 研究概要

### 1. はじめに（研究背景等）

地球環境保全のために、大気微量成分（二酸化炭素、エアロゾル、オゾンなど）のグローバルな実況監視に対する関心が高まっている。最近では、様々な衛星観測が実施されるようになった。二酸化炭素については2009年、OCO衛星(Orbiting Carbon Observatory)は打ち上げ失敗に終わったがものの、温室効果ガス観測衛星（GOSAT衛星）の打ち上げは成功し貴重な観測データを送り続けている。また、GOSAT-IIやOCO-IIの打ち上げが計画されており、二酸化炭素の衛星観測は大幅な精度向上とデータ量の増加が期待される。エアロゾルについては、CALIPSO衛星(Cloud-Aerosol Lidar and Infrared Pathfinder Satellite Observations)によるライダー観測データが得られるようになった。将来、ライダー観測は雲エアロゾル放射ミッション(Earth CARE 衛星)によって一段と強化される見込みである。オゾンに関しては、OMI(オゾン全量観測)やMLS(鉛直分布)などの精度の高い衛星観測データが得られている。また、亜酸化窒素や一酸化炭素など、様々なオゾン関連化学種の観測も行われている。大気微量成分の衛星観測は急速に進展している。しかしながら、衛星観測はある断面の情報に限定される。加えて、衛星観測はそれぞれの測器に起因する誤差を含んでいる。大気微量成分について、多くの観測情報を統合し、グローバルな3次元分布を再現するために、化学輸送モデルによる4次元データ同化システムの構築が期待されている。

データ同化とは観測データと予測モデルによる第一推定値を融合し、実況値を得るものである。特に、初期条件を得る目的で、数値予報分野で発達した。現在、数値予報分野では、4次元変分法に基づくデータ同化手法が主流である。しかし、4次元変分法によるデータ同化は、大気化学輸送モデルなどの複雑な予測式への適用は困難である。近年、いわゆる汎用性に優れたアンサンブルカルマンフィルター（EnKF）によるデータ同化スキームが開発された。数値予報分野のデータ同化実験でも、EnKFは4次元変分法と遜色ない精度を達成した。EnKFを用いれば、複雑な大気化学輸送モデルに対しても、比較的容易に4次元データ同化スキームを構築できる。そこで、本研究では、二酸化炭素、ダストエアロゾル、オゾンの実況監視・予測のために、EnKFを用いた化学輸送モデルの4次元データ同化システムを開発することにした。

本研究で使用する化学輸送モデルは、いずれも大気のデータ同化出力により駆動される。したがって、大気微量成分のデータ同化出力の精度は、大気の再解析の精度に影響される。とりわけ、平均子午面循環は、大気微量成分のグローバル輸送を支配する。その精度は大気微量成分の分布に大きく影響する。下部成層圏のブリューワー・ドブソン循環（BDC）について、気象要素の再解析（気象庁（JRA-25）、米国気象局（NCEP/NCARおよびNCEP/DOE）、ヨーロッパ中期予報センター（ERA40、ERA-Interim））の精度に関心が高まっている。

## 2 ．研究開発目的

本研究では、二酸化炭素、ダストエアロゾル、オゾンの大気微量成分の実況監視・予測のために、
EnKFによる4次元データ同化スキームを開発する。特に、EnKFによるデータ同化スキームが大気微量成分のデータ同化に使えることを確認する。

二酸化炭素については、疑似観測データを用いた観測システムシミュレーション実験(OSSE)によりEnKFによるデータ同化スキームの動作を確認し、地上、航空機、GOSATおよびAIRS(Atmospheric Infrared Sounder)の衛星観測データの同化の有効性を確認する。実際の観測データを用いた実験では、衛星データの前処理システムを作成し、4次元データ同化のインパクトを調べる。エアロゾルについては、CALIPSOのライダー観測データの同化試験(観測システム実験)を行う。エアロゾル分布に関するデータ同化結果を、黄砂の測候所等の独立観測データを用いて検証する。地表面フラックスに関する同化結果をモデル出力と比較する。EnKFによるオゾンの4次元データ同化システムでは、OMI（全量データ）やMLS（鉛直プロファイル）などの衛星観測データについての観測システム実験を行い、それぞれの衛星データのインパクトを調べる。オゾン関連化学種の衛星観測データの同化が与えるインパクトを調べる。

大気微量成分輸送の計算精度に大きな影響を与えるブリューワー・ドブソン循環について、大気の再解析（気象庁（JRA-25）、米国気象局（NCEP/NCARおよびNCEP/DOE）、ヨーロッパ中期予報センター（ERA40、Era-Interim））を比較検証する。また、気象庁では現在作成中の再解析JRA-55とJRA-25の速報的な比較解析を実施する。

### 3. 研究開発の方法

## （１）総括および４次元データ同化結果の検証

各サブプログラム担当者と協議のうえ研究計画を策定した。各サブプログラムの進捗を確認し、相互の情報交換を促進する。EnKFを用いた大気微量成分のデータ同化スキームについて、課題を体系的に整理する。特に、大気化学輸送モデルのデータ同化について発生した共通の課題については、協力して解決に当たる。同時に、それぞれの成分固有の問題を明らかにして、将来の課題として提起する。質量加重付温位面帯状平均法（MIM: Mass-weighted Isentropic zonal Mean）に基づいて、気象要素のおもな再解析（気象庁（JRA-25）、米国気象局（NCEP/NCARおよびNCEP/DOE）、ヨーロッパ中期予報センター（ERA40、Era-Interim））のブリューワー・ドブソン循環（BDC）を解析する。年々変動や経年変化などの比較解析を通じて、再解析間の共通性とばらつきを評価する。また、気象庁では現在、新しい再解析JRA-55を実施中である。JRA-25の速報的な比較解析を通じて再解析の精度向上を評価する。再解析を用いた化学輸送モデルの長期積分から、BDCとオゾン分布の関係を明らかにする。

4次元データ同化の精度は利用する大気輸送モデルの性能に依存する。大気輸送モデルの性能を検証するため、再現された二酸化炭素の帯状平均場の季節変化を、他の解析や数値モデルの結果により比較・検証する。特に、輸送モデルの大きな不確定要因である鉛直拡散を調整する。

## （２）二酸化炭素およびエアロゾル地表面フラックス推定に関する研究

EnKFを用いた二酸化炭素フラックス解析システムを構築した。OSSEを行い、地上、航空機、衛星の観測データの有効性について調べる。実際の観測データを扱うデータ同化実験を実行するために、必要な技術開発（観測データ整備、輸送モデル改良、データ同化システム開発）を行なう。可能な限り多くのデータを収集し、品質管理を行なう。4次元データ同化実験の結果を、独立な観測データや他の解析結果と比較し、性能を評価する。特に、GOSATの観測データの同化手法を開発し、そのインパクトを明らかにする。

ダストエアロゾルの4次元データ同化システムを構築した。動作検証のために、双子モデル実験によって衛星搭載ライダー（CALIPSO）の観測値を擬似的に作成し、OSSEを行なう。データ同化結果を気象官署の黄砂観測データにより検証する。EnKFによるデータ同化システムを利用して、黄砂の大気中濃度分布を解析し、黄砂の地表面フラックス強度（放出量）の最適推定を行なう。データ同化により推定されたダストの地表面フラックスを、エアロゾルの化学輸送モデルの予測結果と比較し、数値モデルのパラメータ化の妥当性を調べる。

## （３）大気環境再解析システムの開発

本研究では、対流圏のオゾン分布と窒素酸化物の排出量を同時に推定する高度なデータ同化システムを開発した。データ同化手法にはEnKFを採用する。更に衛星搭載センサによる二酸化窒素の観測情報から日々の窒素酸化物の排出量を2.8度格子の分解能で推定することを可能とする。この手法を利用することで、（1）時間とともに観測情報を蓄積し、（2）化学輸送モデル（CTM）のアンサンブルシミュレーションにより動的に見積もられる背景誤差共分散情報を利用し排出量と濃度の間接的な関連
性を反映することが可能となる。モデル格子に対する観測データの時空間代表性を高めるためにスーパーオブザーベーション法を採用する。更に、成層圏オゾンの高度な実況監視を目指して、最先端のデータ同化手法であるEnKFと大気中の複雑なオゾン化学・輸送過程を取り入れた全球化学気候モデルを用いた4次元データ同化システムを構築する。

## （４）データ同化情報を活用したモデルの改良

EnKFを環境研の化学気候モデルに適用して、東西風速、南北風速、気温、オゾン濃度の同化を行った。研究開発の手順は以下のとおりである。

1）CCSR/NIES（気候システム研究センター/国立環境研究所）気候モデルに対してこれらの変数のモデルのアウトプットをそのまま入力データとして使う完全実験（したがって、同化入力データに対しモデルのバイアスはないと見なされる）を行ってEnKFによる同化がうまく働いているかどうかの確認を行う。

2）実際の観測データを使った同化実験をCCSR/NIES化学気候モデルを使って行い、モデルの風速、気温、オゾン濃度のバイアスが同化結果に及ぼす影響を調べる。

3）同じ同化条件を用いた同様な実験を、CCSR/NIES気候モデルMIROC3.2、気象研化学気候モデル、および化学輸送モデルCHASERを使って共通の期間について行う。これらの異なるバイアスをもつ複数のモデルによる同化の結果を解析し、それぞれのモデルのもつバイアスが同化にどのような影響を与えるかについて解析を行う。また、これらの現有モデルのバイアスおよび同化に使用するデータの種類と同化性能との関係を明らかにする。

### 4. 結果及び考察。

## （１）総括および４次元データ同化結果の検証

本サブプログラムは本研究全体を総括した。本研究では、二酸化炭素、エアロゾル及びオゾンの3成分について、4次元データ同化システムを開発した。特に、EnKFに基づくデータ同化スキームは、大気微量成分の実況監視・予測に大変有効であることが実証された。観測データをEnKFスキームにより大気化学輸送モデルへ同化する基本フレームは共通である。異なる大気微量成分のデータ同化システムを並行して開発することにより、大気微量成分のデータ同化に関する一般的な手法の確立を目指した。輸送モデルの精度、背景誤差相関を計算する際の局所化の考え方などについては、共通する課題として検討された。研究が進展するにつれて、それぞれの化学種に固有の問題が顕在化した。二酸化炭素では、GOSATのバイアスを修正する前処理がたいへん重要であった。エアロゾルの場合は、数値モデルで予測した地表面フラックスはデータ同化による推定との相違が顕著となり、モデルのパラメータ化に対する課題を提示した。オゾンの場合は、複雑な反応をする関連化学種の観測データの同時同化の手法の開発が興味ある課題となった。

本サブプログラムの2番目の課題では、代表的な大気再解析、気象庁（JRA-25）、米国気象局（NCEP/NCAR & NCEP/DOE）、ヨーロッパ中期予報センター（ERA40、Era-Interim）について、ブリューワー・ドブソン循環（BDC）を比較した。化学輸送モデルの精度は、それを駆動するのに用いる大気再解析の精度に依存する。とりわけ平均子午面循環のBDCは、大気微量成分の分布に大きな影響を与える。比較解析の結果、BDCは最も基本的な循環であるにもかかわらず、再解析間に相当大きな相違があることが分かった。さらに、気象庁の新しい再解析、JRA-55の速報的な比較研究も行った。

3番目の課題としては、気象研究所で開発された二酸化炭素のデータ同化システム出力の検証を行った。詳細な検証から、化学輸送モデルの鉛直拡散係数を調整した。GOSATの観測データは、大きな季節変化を示す陸上の植生による二酸化炭素フラックスの解析には有効であることが分かった。ただし海洋上のフラックス推定や人間活動の影響を評価するためには、データ同化スキームをさらに改良するとともに、衛星データの精度向上およびデータ量の増加に期待するところが大きい。

## （２）二酸化炭素およびエアロゾル地表面フラックス推定に関する研究

二酸化炭素に関しては、地上観測データ、航空機観測データ、衛星観測データ（GOSATおよびAIRS）を一体的に同化し、二酸化炭素濃度と二酸化炭素フラックスを一体的に解析するシステムを構築した。OSSEでは、地上、航空機、衛星の観測はそれぞれ相互に補完する傾向があり、すべてを使用したときに最も地表面フラックスの推定精度が高くなることが示された。実データの同化では、観測データの品質管理に輸送モデルと逆解析を組み合わせる客観的な手法を考案して実装した。現時点では衛星観測データに無視できないバイアスが残っていることが判明したため、輸送モデルと逆解析を用いた衛星観測データのバイアス補正システムを構築した。その結果、GOSATでは8ppm程度の、AIRSは3ppm程度