Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## ・変異・融合酵母によるエタノール発酵

細胞融合の前に、S. cerevisiaeのキシロース取込み能を高め、逆にC. intermediaのキシロース取込み能を抑えるために、各野生株をEMS変異処理により改変した。S. cerevisiae変異株は、デオキシグルコース（DOG）を用いたDOG耐性選別により、カタボライト抑制を抑え、グルコース存在下でもキシロース取込み能が野生株の4.5倍高いM2株を獲得した[文献1]。C. intermedia変異株はキシリトール代謝に係るxdh遺伝子を保持しながらも、キシロース取込み能を抑えたm11株を得た。野生株に比べて、M2株はより多くのキシロースを細胞内に取込み、グリセロールの生成は少なく、エタノール生成量が増加した。一方、m11株はキシロースを全く取込まず、グリセロールを少なからず生成することを確認した。また、細胞融合は両変異株の一倍体子囊胞子（a細胞・α細胞又は相当細胞）のプロトプラスト融合を行うが、事前にm11株を酢酸カリウム（KAc）胞子形成培地で培養し、ブリリアントグリーン染色とSEMによる観察で胞子形成を確認した。

M2 株と m11 株の各胞子の一倍体細胞のプロトプラスト融合により、変異・融合酵母を製造し、活性の高い融合細胞を FSC1 株と命名した。DAPI 染色により、FSC1 株は核融合した単一核であることを確認し、細胞形状は楕円状であるが、親株の M2 株と m11 株より大きく、長円軸が $ 10 \mu m $ 程度であった。FSC1 株は M2 株と m11 株の融合酵母であり、M2 株と m11 株の接合ではないことを確認するため、それぞれの株の DOG 耐性とキシロース代謝試験及び接合試験を行った。YMG 培地でいずれの株もコロニーを形成することを確認した上で、YMXDOG 培地で FSC1 株のみが DOG 耐性のキシロース代謝酵母であることを確認した。接合試験では、YMG 培地で（M2 株＋m11 株）の混合培養を行い、その後 MMXDOG 培地で培養した。もし M2 株と m11 株の接合が起きていれば、FSC1 株と同様、接合株もコロニーを形成するはずだが、全く形成されなかった。ここに、FSC1 株が M2 株と m11 株の融合株であり、親株同士の接合は起こらないことを確認した。さらに、FSC1 株胞子形成について、前出の m11 株と同様に、KAc 培地にて培養した結果、ブリリアントグリーン染色と SEM による観察で FSC1 株が胞子を形成することを確認した。

キシロース含有 MMGX 培地でのエタノール発酵試験を行った結果、FSC1 株はグルコースとキシロースの両基質を着実に発酵し、その結果エタノール生成量は M2 株の約 2.7 倍に達し、FSC1 株がキシロース代謝とエタノール生成に優れた酵母であることが確認された。代謝の安定性を調べるため FSC1 株の継代培養を行い、各世代のエタノール発酵能を調べた結果、FSC1 株は 14 世代に亘り安定してキシロース利用とエタノール生成を行うことが確認された。エタノール収率を比較すると、FSC1 株が 0.38（g/g-基質）であり、M2 株の 0.14、野生株 S.c.の 0.1 より約 3 倍高かった。主要アミノ酸 7 種に対して、FSC1 株は要求性はなく、MMG 培地でも十分増殖した。

キシロース代謝遺伝子とアルコール脱水素酵素遺伝子の発現レベルを RT-PCR 法で調べ、さらに抽出タンパクの二次元電気泳動と MALDI-TOF/TOF による一部の同定を行った（図 7）。FSC1 株において、キシロースのキシリトールへの転換に関与する遺伝子は m11 株の xr と M2 株の gre3、キシリトールのキシルロースへの転換遺伝子は m11 株の xdh、キシルロースのキシルロース-5-リン酸への転換遺伝子は M2 株の xks1 が発現しており、また発酵の最終段階で働くアセトアルデヒドのエタノールへの転換に関与するアルコール脱水素酵素遺伝子は M2 株の adh1 が強く発現していた。タンパクの発現については、FSC1 株には M2 株と m11 株の全てのタンパクスポットが見られ、そのほとんどが親株より濃く出ていた。このうち 2 種のタンパクが同定され、FSC1 株に m11 株の XR と M2 株の TDH（グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素）が確認された。

FSC1 株のエタノール発酵能を改良するため、再度 EMS により変異処理し、改良型の FSC3 株を製造した。FSC3 株によるグルコース・キシロース基質からのエタノール発酵試験を行った結果、FSC3 株のキシロース消費速度（g/g-cell.h）が FSC1 株の 0.18 から約 6 倍の 1.07 にまで向上した。FSC3 株のエタノール生成速度は容積当り 0.65（g/L.h）又は菌体当り 0.17（g/g-cell.h）であり、FSC1 株の約 2 倍の速度であった。FSC3 株のエタノール収率（g/g-基質）は FSC1 株の 0.38 から 0.42 に向上し、親株である S. cerevisiae M2 株の 0.14（g/g-基質）の 3 倍であった。FSC3 株のエタノール収率 0.42 は、グルコース・キシロース基質ではあるが、本研究の目標値 0.4（g/g-前処理済み稲藁）を上回る値であった。
本研究で開発した亜塩素酸・重曹法による前処理、T. reesei MT957株が産生する低温性セルラーゼによる糖化及び融合酵母FSC3株による発酵を組み合わせて、稲藁の前処理と並行複発酵の一連の実験を行った。エタノール生成は発酵48時間で頭打ちになり、発酵開始時にあった繊維状の稲藁固形分は48時間後には完全に糖化（可溶化）されていた（図8）。エタノール生成量は最大で16.2g/Lであり、この生成量から計算したエタノール収率は0.324（g/g-前処理済み稲藁）又は液量で0.41（L/kg-前処理済み稲藁）であった。この実験では菌体収率が0.25（g-cell/g-前処理済み稲藁）であり、前出のグルコース・キシロース基質系に比べて約4倍高い。稲藁においては、基質が菌体増殖に使われたためにエタノール収率がやや低くなったと考えられる。エタノール収率0.324（g/g-前処理済み稲藁）は本研究の目標値0.4（g/g-前処理済み稲藁）の81%に相当し、概ね目標値に近いエタノール収率を達成することができたと考える。

B

図7 変異株 S. cerevisiae M2とC. intermedia m11及び融合酵母 FSC1のキシロース代謝遺伝子の発現(A)と抽出タンパクの二次元電気泳動(B) A: RT-PCRによる遺伝子解析

B：2D-PAGE 解析、横軸は等電点、縦軸は分子量（kDa）

図8 前処理済み稲藁の低温性セルラーゼと改良型FSC3株による並行複発酵 前処理：亜塩素酸・重曹法

並行複発酵：T. reesei MT957 株産生の低温性セルラーゼによる糖化と融合酵母 FSC3 株による同時発酵、酵素/基質（E/S）比=1/100、酵母窒素ベース 1.7g/L 添加、前処理済み稲薬 50g/L、初期菌体量 1.6gDW/L、pH5.0、30℃、微好気

## 環境政策への貢献

本研究の成果は、次の応用・実用化レベルの研究・試験につなぎ、将来的に実用化されれば、地球温暖化対策のための再生可能エネルギーとして草木質系バイオマスを原料とするバイオエタノール生産の環境政策に貢献すると考える。その場合、エタノール発酵の障害となるリグニンやセルロース結晶構造、酵素糖化（55℃）と発酵（30℃）の最適温度の違い及び発酵酵母が五炭糖キシロースを利用しないこと等が問題となる。本研究で開発した亜塩素酸・重曹法による前処理、低温性セルラーゼによる糖化及びキシロース利用変異・融合酵母による発酵はこれらの諸問題を解決する新技術であり、賦存量の多い草木質系バイオマスを原料とするバイオエタノール生産による温室効果ガス削減政策の推進に役立つと期待される。

以下に草木質系バイオマスのポテンシャルと本研究で開発した技術との関係を説明する。

## ・草木質系バイオマスの賦存量と環境ポテンシャル

わが国のバイオマス賦存量は約32,200万tであり、このうち未利用分は約7,650万tであるが、その44%に相当する約3,400万tが草木質系バイオマスである。未利用バイオマスのエネルギーとしての利用は、二酸化炭素の排出抑制と再生可能エネルギーの確保の両面で注目されており、また残材や間伐材を利用すれば資源の有効利用と森林保全の推進にもつながる。
エタノールは、ガソリンの代替エネルギーとして利用されると、自動車等からの二酸化炭素排出量の削減に大きく貢献する。エタノールの二酸化炭素の排出量原単位は1.54kg-CO_{2}/L（ガソリンの排出量原単位2.554kg-CO_{2}/L×0.602）であり、わが国の年間ガソリン消費量6,000万kLの10％にエタノール（E10ガソリン）を使えば、単純計算で年間924万tの二酸化炭素が排出されずに済む（エタノールやガソリンの製造・輸送過程での二酸化炭素排出は考慮していない）。

本研究で達成した稲藁からのエタノール収率 0.41（kL/t-前処理済み稲藁）を仮に草木質系バイオマスに適用すると、バイオマスのリグニン含量 20% の場合、エタノール生成量は 1,115 万 kL（=3,400 万 t×0.8×0.41 kL/t）であり、E10 ガソリンに必要なエタノール量 600 万 kL を十分供給できると試算される。

バイオエタノールは経済効果の面でも大きなポテンシャルを有している。わが国のエタノール等バイオ燃料の生産可能量は2030年で原油換算360万kL/年（エタノール換算600万kL）と試算されており（バイオマス・ニッポン総合戦略推進会議、2007）、仮にエタノール価格として100円/L（農林水産研究基本計画における技術開発目標）で販売すると6,000億円市場となる。さらに、アセアン諸国におけるバイオエタノールの生産ポテンシャルは2030年で1億kL以上と試算されている（NEDO、2008）。アセアン諸国とのバイオエタノール関連輸出入を含めると、バイオエタノール製造がわが国の経済に及ぼす効果は極めて大きいと推定される。

## ・亜塩素酸・重曹法による前処理

バイオエタノール製造において、草木質系バイオマスは賦存量が多くかつ食料・飼料の供給と競合しない原料であるが、一方で草木質成分であるリグノセルロースが糖化されにくい構造であるという欠点を持つ。セルロース・ヘミセルロース・リグニンから構成されるリグノセルロースは、まずエタノールに転換されないリグニンを除去する必要がある。これを前処理といい、前処理したバイオマスに対して糖化・発酵という流れでバイオエタノールが製造される。

リグノセルロースを構成する成分の組成は、木質系がリグニン20～30%、セルロース40～50%、ヘミセルロース20～40%であり、草本系がそれぞれ5～20%、35～40%、20～40%である。前処理の第一の役割はリグニンを除去し、リグノセルロースの剛構造を破壊することである。しかし、セルロース繊維は結晶性が高く、リグニン除去だけでは不十分であり、結晶化度の低減や結晶型（天然セルロースは結晶密度の高いタイプⅠ）の改変も重要である。

本研究で開発した亜塩素酸・重曹法は、稲藁に対してリグニンを88％除去し、また結晶化度の低減と結晶型のタイプⅡへの改変を可能にする技術である。さらに、セルロース繊維を膨潤化することにより、糖化工程で酵素が効率よく繊維に吸着できる構造に改変する。その結果、工業用セルラーゼによる50℃糖化の場合、無処理稲藁の糖化率20％に対して、亜塩素酸・重曹法により前処理を行うと、反応12時間で96％の糖化が可能となる。

## ・低温性セルラーゼによる糖化

前処理を施したバイオマスは発酵の前に糖化されるが、代表的な糖化法として酵素法がある。酵素法は特殊な反応器は不要で、発酵に対する阻害物質も生成されないが、使用される工業用セルラーゼの糖化活性や価格が問題となる。また、発酵方式として酵素による糖化と酵母による発酵を同時に行う並行複発酵が効率的であるが、問題は最適な反応温度が工業用セルラーゼの55℃に対して酵母は30℃と異なる点であり、並行複発酵を行うにはこの点も解決する必要がある。

本研究で開発した T. reesei 変異株の MT957 株が産生する低温性セルラーゼは、亜塩素酸・重曹法による前処理済み稲藁に対して、温度 30℃ で工業用セルラーゼの約 1.6 倍の糖化活性を示し、酵素／基質比 = 1/100 という少ない酵素添加量で糖化率 86% を達成した。また、温度が活性に及ぼす影響として、純セルロースろ紙に対する FPU 活性において、工業用セルラーゼの 30℃ 活性が対 50℃ 活性の 20% に低下したのに対して、低温性セルラーゼは 30℃ 活性が 40% を保持し、工業用セルラーゼの約 2.5 倍高い活性を示した。

セルラーゼを生産するにはセルラーゼ産生菌（代表的菌が T. reesei）のための炭素源が必要であるが、炭素源として微結晶セルロースを用いる代わりに、MT957 株はミル粉砕稲藁を炭素源として利用できる。
## ・変異・融合酵母 FSC3 株による並行複発酵

リグノセルロースを原料とするエタノール生成において、前処理と糖化を経て発酵工程に移るが、発酵で一般的に用いられる酵母はリグノセルロースに含まれる五単糖キシロースを利用できない。キシロースは量的にセルロースに次ぐ成分であるヘミセルロースから生成される五炭糖であり、その利用の可否はエタノール収率に大きく影響する。また、前述の通り、並行複発酵における工業用セルラーゼと酵母の反応温度の違いの問題もある。

本研究では、細胞融合によりキシロース代謝能を付与した変異・融合酵母と変異処理によりセルラーゼの低温適応性を高めた低温性セルラーゼを製造する技術を開発した。

エタノール生成能の高い S. cerevisae とキシロースを利用する Candida intermedia の変異処理と細胞融合による変異・融合酵母の製造技術を開発し、キシロースを利用しかつエタノール生成能の高い変異・融合酵母 FSC1 株と FSC3 株を製造した。FSC1 株はグルコースとキシロースを着実に発酵し、エタノール収率は 0.38 $ (\mathrm{kg}/\mathrm{kg}- $ 基質 ) に達した。このエタノール生成量は親株の約 2.7 倍に達しており、しかも 14 世代に亘り安定した発酵を行った。

FSC1 株のエタノール発酵能をさらに改良するため、再度変異処理し、改良型の FSC3 株を製造した。FSC3 株によるグルコース・キシロース基質からのエタノール発酵試験を行った結果、FSC3 株のエタノール収率（g/g-基質）は FSC1 株の 0.38 から 0.42 に向上し、グルコース・キシロース基質ではあるが、本研究の目標値 0.4（g/g-前処理済み稲藁）を上回る値を得た。

本研究で開発した亜塩素酸・重曹法による前処理、T. reesei MT957 株が産生する低温性セルラーゼによる糖化及び融合酵母 FSC3 株による発酵を組み合わせて、稲藁の前処理と並行複発酵の一連の実験を行った。エタノール生成は発酵 48 時間で頭打ちになり、発酵開始時にあった繊維状の稲藁固形分は 48 時間後には完全に糖化（可溶化）されていた。エタノール生成量は最大で 16.2g/L であり、この生成量から計算したエタノール収率は 0.324（g/g-前処理済み稲藁）であった。これは液量に換算すると 0.41（L/kg-前処理済み稲藁）であり、これまでに報告されている各種バイオマスの 0.30～0.35（L/kg）に比べて高い収率である。

## 研究成果の実現可能性

本研究は基礎研究であり、パイロットスケールの技術・コスト評価を行った上で、当該技術が実用化され、エタノールがE10ガソリンに利用されると年間924万tの二酸化炭素が排出されずに済み、仮にエタノールを100円/Lで販売すると6,000億円市場を生むと試算される。本研究で得たエタノール収率0.41（kL/t）を草木質系バイオマスに適用すると1,115万kLのエタノールが生成可能であり、E10ガソリンに必要な600万kLを十分供給できる。実用化に当たっては、原料の収集・輸送や排水処理等に対する計画・体制作りが必要であり、また将来の原料価格の高騰が考えられるので、食品廃棄物等幅広いバイオマスを対象とし、アジア諸国からの原料輸入も視野に入れた体制が求められる。

## 結論

亜塩素酸・重曹法において稲藁はASC処理により脱リグニン、SB処理により膨潤化と結晶構造の改変が施され、特に（3回ASC＋SB）処理はリグニン除去率88%、結晶型タイプⅡへの改変などを可能にした。T. reeseiを変異させたMT957株は30℃でも高い活性のセルラーゼを産生し、この低温性セルラーゼは前処理済み稲藁の86%を糖化し、目標値90％に近い糖化率を達成した。S. cerevisiae M2株とC. intermedia m11株との細胞融合によりキシロース利用FSC1株を獲得し、さらに発酵能を改良したFSC3株を製造した。FSC3株は、グルコース・キシロース基質に対してエタノール収率0.42（g/g-基質）という目標値0.4（g/g-前処理済み稲藁）を上回る発酵能を示した。亜塩素酸・重曹法による前処理済み稲藁に対しては、低温性セルラーゼとFSC3株による並行複発酵によりエタノール収率0.324（g/g-前処理済み稲藁）又は液量で0.41（L/kg-前処理済み稲藁）を達成し、目標値の81％相当のエタノール収率を得た。
### 1. 研究背景と目的

### 1.1 研究背景

地球温暖化やエネルギー問題を背景に、カーボンニュートラルで再生可能なエネルギーの需要が拡大している。その一つとして賦存量が多く食料と競合しない草木質系（リグノセルロース系）バイオマスを原料とするエタノール生産が期待されている。しかし、リグノセルロース系バイオマスをエタノール原料として利用するには、まだ解決すべき技術的課題が残されている。

リグノセルロースはそれを構成するリグニンやセルロース結晶構造のために難分解性（糖化されにくい構造）であり、また発酵に用いられる酵母（Saccharomyces cerevisiae）が五炭糖キシロースを利用できないという問題がある。キシロースは量的にセルロースに次いで多いヘミセルロースから生成される糖であり、その利用の可否は発酵収率に大きく影響する[文献2]。さらに、発酵方式として酵素による糖化と酵母による発酵を同時に行う並行複発酵が効率的であるが、問題は最適な反応温度が工業用セルラーゼの55℃に対して酵母は30℃と異なる点であり、並行複発酵を行うにはこの点も解決する必要がある。

リグノセルロースの難分解構造を改良するためには前処理が必要であり、既存の方法に酸処理法、アルカリ処理法、蒸解法、水熱法、超臨界法などがある[文献3]。これらの方法はそれぞれ利点があるが、一方で酸・アルカリや高温・高压に耐える反応器の必要性、糖の一部分解、発酵を阻害するフラン化合物の生成など、いずれかの問題を抱えている。また、バイオマスは発酵の前に糖化されるが、糖化方法としては前処理で糖化を兼ねる方法のほか、代表的なものに濃硫酸法と酵素法がある。濃硫酸法は前出の諸問題のほか、黒液と呼ばれる高濃度有機性廃液の問題がある。酵素法は特殊な反応器は不要で、フラン化合物も生成されないが、一般に使われる工業用セルラーゼの糖化活性やコストが問題となる。

発酵酵母が利用できない五炭糖キシロースに関しては、近年遺伝子組換えや細胞表層（アーミング）技術により酵母にキシロース代謝能を付与する研究がなされ、将来の実用化が期待されているが、特定の遺伝子のみを導入するために起こる代謝の不安定性や発酵収率の低下などの問題が残っている[文献4、5]。発酵方式に関する酵素と酵母の反応温度の違いに対して、酵素の添加量を増やして30℃で同時に発酵する方法、あるいは糖化と発酵を別々に各温度で行う方法があるが、これらは発酵効率やコストの面から必ずしも好ましくない。

このようにリグノセルロースを原料とするエタノール製造においては、リグノセルロースの難分解構造、セルラーゼの糖化活性、五炭糖キシロースの生成及び酵素と酵母の反応温度の違いなどの諸問題を解決する必要がある。

### 1.2 研究目的

本研究の目的は、草木質系バイオマスのうち賦存量が多くかつ未利用分の多い稲藁を原料として、前述の諸問題を解決するための新しい前処理法、30℃で活性の高い低温性セルラーゼの生産と糖化及びキシロース利用酵母による発酵を目指して、各要素技術を研究・開発し、それらを統合した並行複発酵による高度エタノール発酵技術を開発することである。具体的には、①稲藁に対して亜塩素酸塩と重曹を用いた化学処理により脱リグニン、セルロース繊維の膨潤化と結晶構造の改変を行うための技術の開発（亜塩素酸・重曹法による前処理）、②真菌 Trichoderma reesei の変異処理により30℃で活性の高い低温性セルラーゼを産生する変異株の獲得とそのセルラーゼによる糖化を行うための技術の開発（低温性セルラーゼによる糖化）及び③酵母 Saccharomyces cerevisiae と Candida intermedia との細胞融合によりキシロースを利用する変異・融合酵母の獲得とその変異・融合酵母による発酵を行うための技術の開発（変異・融合酵母による発酵）である。以下に、これらの目的の詳細と達成目標を記す。

前処理においては、亜塩素酸塩と重曹による処理条件と効果（脱リグニン、膨潤化、結晶構造の改変、阻害物質の生成など）に関する実験を行い、前処理済み稲藁（稲藁有機分）に対して工業用セルラーゼによる糖化率90%程度を達成する前処理技術を確立する。

糖化においては、低温性セルラーゼの産生とそのセルラーゼによる糖化を目指して、セルラーゼ産生 T. reesei の変異処理を行い、酵素タンパクの分離・解析を行ないながら、30℃で増殖し、
セルラーゼを産生する変異株を獲得する。達成目標としては、前処理済み稲藁の糖化率90%程度を可能にする低温性セルラーゼの産生と糖化条件を確立する。この際、前処理済み稲藁をセルラーゼ産生用基質として利用する実験も行う。タンパク解析は主要成分であるendogluconase(EG)、cellobiohydrolase(CBH)及びβ-glucosidase(BGL)の産生と活性について調べる。

発酵においては、S. cerevisiae とキシロース代謝能を持つ C. intermedia の変異処理とその変異株同士の細胞融合によりキシロース利用変異・融合酵母を獲得し、その変異・融合酵母によるエタノール発酵に関する実験を行う。変異・融合酵母について、キシロース代謝機構をメタボローム解析により明らかにし、またタンパク解析と遺伝子解析により細胞学的特徴を調べる。その上で、前処理、低温性セルラーゼ及び変異・融合酵母をもって、稲藁を原料とする並行複発酵方式でエタノール収率 0.4（kg/kgDW-前処理済み稲藁）程度を達成する高度エタノール発酵技術を開発する。

全体としての最終目標は、亜塩素酸・重曹法により前処理した稲藁に対して、低温性セルラーゼにより糖化率90%程度及び変異・融合酵母によりエタノール収率0.4（kg/kgDW-前処理済み稲藁）程度を達成する要素技術を開発し、それらを統合した並行複発酵による高度エタノール発酵技術を開発することである。ここに、セルラーゼと酵母の温度差を解消する方法として、近年酵母の耐熱性を改良した高熱酵母の研究もなされているが「文献6」、本研究は逆にセルラーゼの低温適応性を高める技術を開発するものである。また、発酵に用いる変異・融合酵母は細胞融合により独自に開発する菌株であり、多くの研究で扱われている遺伝子組換えによる組換え酵母とは全く異なる「文献4、5」。したがって、本研究で開発を目指す低温性セルラーゼと変異・融合酵母による並行複発酵技術は他に類を見ない独創的かつ革新的な技術になるものと考えている。

## 2 ．研究方法

### 2.1 亜塩素酸・重曹法による前処理

実験に用いる稲藁は（有）宮原商店（長野県長野市上高田1371）から購入した新潟コシヒカリの稲藁であり、使用する前に稲藁を水洗し、一週間以上室内で天日乾燥した。天日乾燥後の稲藁の組成は水分5%、無機分10%及び有機分85%であり、リグニン含量は約13%（本研究におけるクラーソン法による定量）である。

稲藁は、酵素による糖化率を高めるために、まず数 cm に裁断した後ブレンダーで 5mm 程度に粉砕し、次に粉砕稲藁に対して脱リグニン処理、セルロース繊維束の膨潤化と結晶構造の改変を行った。脱リグニン処理は酢酸酸性域（pH4.6 程度）で亜塩素酸ナトリウムを用いて行った。処理操作は、まず三角フラスコに乾燥稲藁 2.5g を量り、これに対してイオン交換水 150mL、亜塩素酸ナトリウム 1g、酢酸 200μL の順に入れ、温水浴中で 80℃ の約 1 時間の熱処理（開放状態）を行い、曝気により塩素ガスを除いた後、残渣を水洗した。実験目的によって本操作を 1 回～4 回と繰り返し行い、脱リグニン後の稲藁は 3 日間程度の天日乾燥を行った。

セルロース繊維の膨潤化と結晶構造の改変は、脱リグニン後の稲藁を0.5%重曹（炭酸水素ナトリウム）水溶液200mLに24時間浸し、オートクレーブによる122℃・20分間の熱処理にて行った。熱処理後の反応液のpHは11付近になるため、イオン交換水で水洗・中和し、その後3日間程度の天日乾燥を行ってから前処理済み稲藁をデシケータに保存した。

稲藁に対する前処理の効果を評価するため、リグニンをクラーソン法とカッパー価（κ価：1g 試料が消費する 0.1N-KMnO_{4} の mL 数）による分析、セルロース表面の変化を SEM 観察（Hitachi S-4700 Type II、Hitachi、Tokyo、Japan）、結晶構造の変化を粉末 X 線回折（RIGAKU-D/MAX instrument、Ultima III、Rigaku International Corporation、Tokyo、Japan）と FT-IR 解析（JASCO FT/IR4200 Spectrometer、JASCO、Tokyo、Japan）で調べたが、いずれも一般的方法であるので説明は割愛する。また、前処理済み稲藁に対して、工業用セルラーゼ（Celluclast 1.5L、Novozym 188）による糖化実験を行い、HPLC で分析した糖成分から前処理が糖化に及ぼす影響を評価した。

### 2.2 低温性セルラーゼによる糖化
#### 2.2.1 変異処理とセルラーゼ産生

セルラーゼ産生真菌である T. reesei NBRC31327（製品評価技術基盤機構（NITE）・微生物資源センター（NBRC）より取得）を野生株として、変異処理を施す前に、野生株を PDA スラント寒天培地にて 10 日間 30℃で胞子形成させ、生理食塩水で胞子を回収した後、0.1% TritonX-100 と 0.1% L-sorbose を含んだ PDA 寒天培地（PDATS 寒天培地）にてコロニー形成を行った。単コロニーの形成は希釈倍率 10³～10⁸ の胞子懸濁液のうち 10⁶ 系で最もよく確認できたので、以後は希釈倍率 10⁶ の胞子懸濁液を用いて変異処理を行うことにした。

セルラーゼ産生能を改良するための T. reesei の変異処理は、紫外線（UV）による変異処理と亜硝酸で処理してから UV 処理する方法で行った。UV 処理は低温（30℃）適応性及び亜硝酸処理は β グルコシダーゼ産生能を改良することを期待して行った。UV 処理は 254nm の UV 灯で 5 分～90 分の範囲で照射時間を変えて行い、亜硝酸 UV 処理法では UV 処理の前に野生株を 0.1% 亜硝酸溶液に浸してから行った。その後、変異株の自己回復を回避するために 10 分間暗室（30℃）で放置した。UV 照射した胞子懸濁液を 10⁶ まで生理食塩水で希釈し、1% カルボキシメチル化セルロース（CMC）を含んだ PDATS 寒天培地上にまき、30℃で 8 日間変異株の胞子形成を行った。形成コロニーから別の PDATS 寒天培地上（CMC 無し）にレプリカを作製し、さらに 3～7 日間胞子形成を行い、胞子を生理食塩水で回収後 4℃ 冷蔵保存した。

変異株によるセルラーゼの産生は3 L容三角フラスコで行い、培地組成（pHは約5.0）は硫酸アンモニウム7.5g/L、酵母エキス0.25g/L、ペプトン0.75g/L、リン酸二水素カリウム2g/L、硫酸マグネシウム七水和物0.3g/L、塩化カルシウム二水和物0.3g/L、Tween-800.2ml/L、硫酸鉄七水和物0.005g/L、硫酸マンガン一水和物0.0016g/L、硫酸亜鉛七水和物0.0014g/L、塩化コバルト六水和物0.002g/Lである。なお、炭素源は前培養（シード用）には乳糖30g/L、本培養（セルラーゼ産生用）にはセルロース微結晶粉30g/L、キシラン（ビーチウッド由来）10g/L、L-Sorbose1g/Lの混合物を用いた。本培養における炭素源を稲藁とする場合、シードの前培養後、稲藁30g/Lを基質として与えた。培養条件は、前培養が100ml、150rpm、37℃、3日間で行い、本培養が1L、150rpm、30℃、10日間とした。

#### 2.2.2 セルラーゼの定量と組成分析

セルラーゼ粗酵素の回収・濃縮は次の手順に従った。まず、変異株の培養終了後、培養液を8,000×gで遠心分離し、上澄液をガラスフィルターで吸引ろ過した。ろ液にアジ化ナトリウムを0.02%になるように添加し、3日間4℃で冷蔵保存すると未分解の残存セルロース微結晶が沈殿した。次に、ろ液の上澄み（残存セルロースを除く）に対して、GEヘルスケア社のQuixStand SystemとXamplerカートリッジ（10kD限界）を用いて限外濾過法による濾縮を行った。この酵素タンパク濾縮液に対して酵素精製用硫酸アンモニウム（硫安）を60％になるように添加し、4℃で一晩静置した後、22,000×gで冷却高速遠心分離し、全酵素を硫安沈殿させた。最後に、脱塩カラムPD-10（GEヘルスケア社）で硫安を除去し、バッファーをMilliQ水に交換し、4℃（分析用）あるいは-80℃（ストック用）にて保存した。

酵素タンパクの定量は標準 Bradford 法によって行った。標準サンプルとして牛血清アルブミン (BSA) を 0.02～0.1 (g/L) でエッペンチューブに 100 μL 入れ、Bradford 試薬 (色素は Coomassie Brilliant Blue : CBB) を 1mL 添加し、ボルテックスミキサーで攪拌後 15 分間反応させ、吸光度 (OD_{595}) を測定して検量線を作成した。実試料も同様に測定した。

セルラーゼの組成はSDS-PAGEにより分析した。SDS-PAGE ゲルのウェルに入れる酵素タンパク量を約10μgに調製し、SDS サンプルバッファーと混合した。なお、SDS-PAGE 分析の前に、阻害物質（アルブミンなど）を除去する目的で、各サンプルに対してマイクロバイオスピンカラム（BioGel 6-DG、バイオラッド社）による脱塩を行った。SDS-PAGE の展開においては1 ゲル当たり約200mV の電圧にて各酵素タンパクの分離を行った。その後、ゲルをMilliQ 水で洗浄し、CBB 溶液で染色した。染色したゲルを脱色液（リン酸とエタノール混合液）で脱色し、ゲルに残ったタンパクのバンドをスキャナで読み取り、画像処理ソフトで解析した。粗酵素に含まれる酵素タンパクの種類を確認するため、脱塩した粗酵素液に対して2 次元電気泳動を行った。2 次元電気泳動はまず等電点（pI）による酵素タンパク成分の分離を行い、その後分子量による分離を行
った。pI による分離は IPGStrip 3-10NL (BioRad 社) を用いて等電点電気泳動 (IEF) システムによって行った。分子量による分離は pI 展開した IPG ストリップを脱塩処理、還元処理及びアルキル化処理した後、SDS-PAGE により行った。

#### 2.2.3 セルラーゼの分離・生成

セルラーゼの分離は、イオン交換とセラミックヒドロキシアパタイトにより行なった。イオン交換では、まず強陰イオン交換HighQカラムにより分離し、その後非吸着分あるいは特定吸着分に対して弱陽イオン交換カラムCMによる分離を行なった。強陰イオン交換HighQカラムによる分離を向上させるため、移動相の検討を行なったところ、20 mM NaPiバッファーでpH7.0よりはpH7.2の方が目的画分を多く分離できることが分かった。強陰イオン交換でタンパクを分離する場合、移動相のpHを目的タンパクの等電点より0.5以上高く設定する必要があるが、産生セルラーゼ等電点はアルカリ側に多く存在していたので、HighQでの分離はpH7.2で行うことにした。次に移動相の種類を確認するために、20mM KPi、20mM NaPi、20mM Tris/HClを用いてセルラーゼ分離（pH7.2）を検討した。その結果、20mM Tris/HCl（pH7.2）で最も良好なピーク分離ができ、非吸着画分よりは高い回収率で目的画分を得ることが可能となった。

イオン交換カラムに吸着したタンパクは塩濃度勾配法で溶出されるので、まず勾配濃度を決定するために疎水性カラム HIC - Phenyl-5PW（Tosoh 社）により溶出実験を行った。硫酸アンモニウム（イオン極性が強い）による塩濃度を1 M（高塩濃度）から徐々に下げていくと、0.6 M H₂SO₄から少しずつ目的タンパクが溶出し、最も溶出するのは低塩濃度域の0.2 M以下であることがわかった。したがって、低塩濃度域で溶出させるため、イオン交換カラムではイオン極性の弱い塩化ナトリウムを用いて、濃度を硫酸アンモニウムの半分程度（0～0.3 M）に設定した。

#### 2.2.4 セルラーゼ活性

植物由来セルロースは結晶性のセルロースと非結晶性のヘミセルロースからなるホロセルロース構造になっている。これらを糖に分解するためには、それぞれに分解能をもつセルロース分解酵素（セルラーゼ）が必要である。T. reeseiが産生するセルラーゼは複数の酵素タンパクから構成されており、主要成分はエンドグルカナーゼ(EG、エンド型)、セロビオヒドロラーゼ(CBH、エキソ型)、βグルコシダーゼ（BGL）の3種類であり、その他にヘミセルロースのキシランを分解しキシロースを遊離するキシラナーゼ（XYN）も含まれている。さらに、各酵素には幾つかの異なる種類が存在する。本研究では分子量を参考にしてEG、CBHⅠ、CBHⅡ、BGL及びXYNの5種類を扱うことにした。

酵素活性は基質として Whatman ろ紙、アビセル（微結晶セルロース）粉末、カルボキシメチル化セルロース（CMC）、pNPG（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside）などから1分間で1μmoleのグルコース（もしくは還元糖）を生成するのに要する酵素量を1ユニット（U）として測定した。酵素の全体的なセルラーゼ活性は Whatman ろ紙（No.1）を用いて測定した。まず、エッペンチューブにろ紙10mg入れて、酵素タンパク量0.1mg、酢酸 buffer 50mM、MilliQ 水を加え、全量1mLとして混合後、50℃又は30℃で、1000rpm、1時間の糖化を行った。糖化後、温水浴で5分間煮沸により酵素を失活させた後、遠心分離で残存ろ紙を沈殿させ、上澄液中の糖を HPLC あるいは DNS 法（還元糖）で分析した。低濃度セルラーゼの場合は、フィルタペーパーアッセイ（FPA）法（米国 Technical Report NREL/TP-510-42628）に基づき、粗酵素液の希釈系列を作製し、それぞれに対して前出と同様な操作を行い、上澄液中の糖を DNS 法で測定して FPU 活性とした。

CBH 活性は、アビセル粉末を基質として、アビセル粉末 30mg を 990 μL の 0.1M 酢酸バッファーに浸し、10 μL の酵素液を添加し（全体量 1ml）、50℃ 又は 30℃ で 1 時間反応し、5 分間煮沸した後、DNS 法により 還元糖量を測定した。EG 活性は、CMCase 測定法に基づき、基質を 0.5% CMC 溶液とした全体量 1mL に対して CBH 活性と同様な操作で測定した。BGL 活性は、pNPG 測定法に基づき、25 μL の酵素液、25 μL の pNPG (10mM)、50 μL の 0.1M 酢酸バッファーを用意し、50℃ 又は 30℃ で 30 分間反応させた後、100 μL の 0.4M NaOH-glycine 緩衝液（pH10.8）で反応を停止し、波長 405nm で吸光度を測定した。サンプルから遊離した pNP 量は絶対検量線により読み取った。
前処理済み稲藁に対する糖化活性を評価するために、亜塩素酸・重曹法で前処理した稲藁に対して30℃で産生セルラーゼによる糖化を行なった。前処理済み稲藁を0.1M 酢酸バッファー（pH4.8）に一晩浸し、その稲藁20mgDW（乾重）に対して酵素/基質（E/S）比が1/100になるよう産生セルラーゼを添加し、18～24時間の糖化を行ない、酵素を5分間煮沸による失活後、液中の糖をHPLC法及びDNS法により測定し、糖化率を算出した。

### 2.3 変異・融合酵母による発酵

#### 2.3.1 菌株と培地

キシロース利用変異・融合酵母を製造するに当たって、エタノール発酵能の高いSaccharomyces cerevisiae NBRC2114とキシロース代謝能を持つCandida intermedia NBRC10601（Synonym: Kluyveromyces cellobiovorous）（両酵母ともNITE-NBRCより取得）を野生株として用いた。現時点ではS. cerevisiaeとC. intermediaは異なる分類学上の科に属する酵母であることが想定されたので、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」に基づき、細胞融合実験に当たっては事前に拡散防止措置（P1相当）に関して本学及び文部科学大臣の確認を得た。

細胞融合では両酵母の一倍体子囊胞子のプロトプラストによる融合を行うため、C. intermedia の胞子形成能を事前に確認した。酢酸カリウム寒天培地にて C. intermedia を 30℃で 7 日間培養し、形成された胞子を 0.05%Tween80 を含む生理食塩水で洗い出し、遠心分離（3,000×g、10 分）した。採取した胞子をスライドグラスに乗せ、5%ブリアントグリーン溶液を垂らしてゆるく火炎で焼いた後、水洗して、胞子を緑色に染色した。また、栄養細胞を赤く対比染色するために 0.5%サフラニン液に 10 秒程度浸漬し、再度水洗した。染色した胞子は顕微鏡にて確認し、加えて胞子の形状を SEM により観察した。

培養に使用した培地は、その目的によってYM培地（ペプトン5g/L、酵母エキス3g/L、麦芽エキス3g/L）、YMG液体培地（YM+グルコース10g/L）、YMG培地（YM+グルコース10g/L+寒天20g/L）、YMGX培地（YM+グルコース10g/L+キシロース10g/L）、YMXDOG培地（YM+キシロース10g/L+2-デオキシグルコース（DOG）5g/L+寒天20g/L）、YMFDOG培地（YM+フルクトース10g/L+DOG適量+寒天20g/L）、さらにMM培地（酵母窒素ベース1.7g/L（アミノ酸無し）+硫酸アンモニウム5g/L+寒天20g/L）、MMGX培地（MM+グルコース20g/L+キシロース20g/L）、MMXDOG培地（MM+キシロース10g/L+DOG5g/L）を用意した。また、細胞融合における変異株の胞子形成はSPO培地（酢酸カリウム10g/L+グルコース0.5g/L+酵母エキス1g/L+寒天20g/L）を使用した。

#### 2.3.2 変異処理とプロトプラスト融合

細胞融合の前に、異なる表現型（phenotype）の様々な株を確保するために、S. cerevisiaeとC. intermediaに対してメタンスルホン酸エチル（EMS）を変異原とする変異処理を施した。変異処理後、それぞれの変異細胞を0.1Mリン酸バッファーで3回洗浄し、細胞懸濁液100μLを3g/LのDOGを含むYMFDOG培地とレプリカとしてのYMG培地（DOG無し）に分散させ、それぞれを30℃で培養した。その後、YMFDOG培地上のS. cerevisiae変異細胞のコロニーを採取し、5g/LのDOGを含むYMFDOG培地に30℃で再生培養後、DOG耐性変異株を選択し、M2株と命名した[文献1]。一方、C. intermedia変異細胞はYMFDOG培地では全く増殖せず、YMG培地のレプリカからDOG感受性変異株を選択し、m11株と命名した。

M2 株と m11 株をそれぞれ SPO 培地に植種し、胞子形成のため 24 時間培養を行った。各株の一倍体の子囊胞子を含む子囊を採取し、一倍体の二倍体化を抑制することを期待して添加した α ファクター（Sigma-Aldrich）2mg/L を含む YMG 液体培地にてそれぞれ 30℃ で 2 世代培養した。それぞれの対数増殖期の細胞を遠心分離（5,000×g、10 分）し、細胞ペレットを 20mM Tris/HCl バッファー（1%β-メルカプトエタノールと 10mM EDTA を含む）で 10 分間処理した。再び遠心分離後、細胞ペレットを 20mM リン酸バッファー（0.6M ソルビトール、0.6M KCl、10mM β-メルカプトエタノールを含む）（pH6.5）に分散させ、各細胞のプロトプラストを得るためにザイモリアーゼ 20-T を濃度 20mU/mg-cell にまで添加して 30℃・1h で反応させた。その後、同量のプロ
トプラストをそれぞれ20mMリン酸・クエン酸バッファー（30%MgSO_{4}、20mM Tris/HCl バッファー（pH7.5）（1Mソルビトールと0.1M EDTAを含む）（pH6.5）に分散させ、精製した。両変異株のプロトプラスト融合を行うため、各精製プロトプラストを1:1の割合で1mL融合バッファー（1.2Mソルビトール、30%PEG4000、0.1Mリン酸カルシウム、10mM Tris/HCl バッファー（pH7.2）、1g/L BSA、15%DMSOを含む）に混合し、1時間反応させ、その後核融合を確実にするため電気泳動装置にて50Vの直流電流に2秒間さらした。

次に、融合プロトプラスト細胞の細胞壁等の再生のために、再生培地（1.2Mソルビトール、5倍濃縮のYM培地、2%グリセロール、0.6M塩化カリウム、1mg/mLコルヒチン、5g/LDOGを含む）にて30℃で6～8時間培養した。ここに、DOGはDOG耐性細胞を選択するために添加した。コルヒチンは多倍数性（polyploidy）の指示薬として用いられるが、体細胞分裂（mitosis）の抑制剤としても知られており、ここでは後者の効果を期待して融合していない変異細胞（α細胞、a細胞）の接合を避けるために添加した。部分再生した融合細胞を遠心分離（3,000×g、10分）し、その細胞を0.4Mのリン酸カルシウムを含む1.5%寒天に分散させ、直ちに0.6Mのリン酸カルシウムを含むMMXDOG培地に塗布し、融合細胞を完全に再生させて変異・融合酵母を製造した。

#### 2.3.3 シード培養と発酵実験

変異・融合酵母のシード培養は二段階で行い、まず当該酵母をYMGX培地に30℃で3日間のコロニー形成を行い、そのうち最大の単コロニーを100mLのYMG液体培地に植種し、150rpmで攪拌しながら30℃で12～18時間の培養（前々培養）を行い、次にその10mLをそれぞれ4系列の100mLのYMGX液体培地に植種し、同様に18～24時間の培養（前培養）を行った。集菌後、リン酸バッファ一食塩水（PBS）で2回洗浄し、再び50mLのPBS液に分散させた（シード液）。

発酵実験は、ジャーファーメンタを用いて1.3～1.6gDWの融合細胞を含む50mLシード液を950mLのMMGX培地に植種し、温度30℃で行い、5N-NaOHにより反応液をpH5付近に設定することにより雑菌の繁殖を抑えた。反応液を微好気に保つため、液中の溶存酸素（DO）を飽和濃度の5%程度に維持するよう空気量を調節した。また、稲藁の並行複発酵実験では、イオン交換水800mLに基質として前処理済み稲藁50gDWと硫酸アンモニウム5gを添加し、オートクレーブにかけた後、酵母窒素ベース1.7gを添加し、pHを調整した上で、低温性セルラーゼ0.5g（S/E=1/100）を含む液60mLを添加し（全液量は概ね1Lとなる）、MMGX培地発酵と同様な条件（30℃、pH5、微好気）で発酵を行った。なお、発酵液の糖成分はHPLCで分析した。

#### 2.3.4 遺伝子・タンパク解析

ジャーファーメンタの培養（反応）液中の炭素源が無くなった直後に細胞を採取し、滅菌水で2回洗浄した後、細胞を凍結乾燥した。凍結乾燥細胞100mgをプロテアーゼ阻害剤5μLを含む酵母タンパク抽出剤（Y-PER、和光純薬）250μLに懸濁させ、60分間反応後、遠心分離（14,000×g、10分）した。上澄液の余分な塩類を除去するため、10mM Tris/HCl（pH7.4）で緩衝された脱塩カラム（Bio-Gel P-6、BioRad）を用いて脱塩し、溶出液をタンパク解析の試料とした。

キシロース代謝に関与する遺伝子（xr、xdh、xk）とアセトアルデヒドのエタノール転換に関与する遺伝子（adh1）の発現レベルを調べるため、M2株、m11株及び変異・融合酵母に対して各株の全mRNAに基づくRT-PCR解析を行った。各細胞を微好気条件で18時間培養した後、遠心分離（5,000×g、4℃、10分）し、細胞を滅菌水で2回洗浄して直ちに凍結乾燥した。全RNAは、細胞30mgDWを粉砕キット（GE Healthcare）で粉砕後、NucleoSpin RNAII（Macherey-Nagel GmbH）を用いて抽出した。mRNAはOligotex-dT30mRNA精製キット（TakaraBio）を用いて全RNAから精製分離した。設計されたPCRプライマーは以下の通りであり、精製mRNAの増幅をOne Step PrimeScript RT-PCR Kit（TakaraBio）を用いて行った。RT-PCR遺伝子産物はTAEバッファーの1％アガロースゲル電気泳動で分離した。

Sc-gre3 : (forward) 5' -CCATCCAGGGCAGTACCACTT-3'、(reverse) 5'-TACCATCCAACCAGGTCCAT-3'
Sc-xks1 : (forward) 5' -GGCTCAATTAACAGGGTCCA-3'、(reverse) 5'-ACAGGCATCTGCCTCCTCTA-3'
Sc-adh1 : (forward) 5' -AGGCCAACGAATTGTTGATCA-3'、(reverse) 5'-GTGTCAACAACGTATCTACCA-3'
Ci-xr : (forward) 5' -CCTGCTGTTTTGCAAGTTGA-3'、(reverse) 5'-CTCTTTGAGCGGACCATCTC-3'
Ci-xdh : (forward) 5' -AATGGTCTTGGGTCACGAATCC-3'、(reverse) 5'-GCTCTGACCAAGTCGTAGGCTTC-3'
$$ \begin{array}{l}Ci-xk\quad:\left(forward\right)5^{\prime}\quad-GGATTCGACTTATCCACCCAACAA-3^{\prime}\quad,\left(reverse\right)5^{\prime}\quad-CCAGTACACGGATCCATGTTG-3^{\prime}\\ Ci-adh1:\left(forward\right)5^{\prime}\quad-CACTCACGATGGTTCATTCG-3^{\prime}\quad,\left(reverse\right)5^{\prime}\quad-AAGATGGTGCGACATTGG-3^{\prime}\end{array} $$

全タンパクの発現については各株のタンパクを CBB 染色二次元電気泳動（2D-PAGE）で解析した。まず、IPG ReadyStrip pH3-10 NL（BioRad）を用いて脱塩タンパク試料の等電点電気泳動を行った。次に、IPG ストリップをアルキル化溶液（0.375mM Tris/HCl（pH8.8）中に100mM 酢酸ヨード、6M 尿素、2%SDS、20%グリセロールを含む）で処理した後、15%非グラジュントSDS-PAGE 電気泳動にかけ、最後にゲルを CBB 溶液で染色して全タンパクの発現の変化を調べた。

タンパクスポットを MALDI-TOF/TOF 解析により同定するため、スポットを 50% アセトニトリルで洗浄して SDS や塩分等を除去した後、洗浄済み試料を Genomine 社に委託して分析した。その概要を記すと、溶媒を完全に除去するためスポットを真空乾燥し、50mM 重炭酸アンモニウム中の trypsin（8～10ng/μL）（pH8.7）で再び水和させ、37℃で 8～10 時間反応後、スポット試料を Applied Biosystem 4700 proteomics analyzer を用いて分析（Genomine 社）する、という手順である。シーケンスタグ検索は MASCOT（http://www.matrixscience.com）プログラムで行った。

### 3. 結果と考察

### 3.1 亜塩素酸・重曹法による前処理

#### 3.1.1 亜塩素酸・重曹処理による稲藁の脱リグニンと膨潤化（形状と化学的な変化）

稲藁の前処理は、酢酸酸性域での亜塩素酸ナトリウム（ASC）処理による脱リグニン、及び重曹（SB）処理による膨潤化と結晶構造の改変を行った。図3.1.1に示したように、無処理の稲藁（J）に対して、ASC処理を1回～3回と繰り返すにつれて漂白され（A、B、C）、この後にSB処理を加えることによりパルプ状になり（D、E、F）、拡大すると膨潤した微細繊維に変化していることがわかる（K、L）。特に（3回ASC＋SB）処理において稲藁の漂白と膨潤・微細繊維化の効果が大であった（F、L）。

図 3.1.1 稲藁の亜塩素酸(ASC)・重曹(SB)法による前処理における形状変化

A、B、C：順に ASC1 回、2 回、3 回

図 3.1.2 前処理済み稲藁の SEM 写真

A: 無処理、B: 3 回 ASC 処理、C: SB 処理

D : $ (SB+3 $ 回 ASC $ 处理、E : $ (3 $ 回 $ ASC+SB $ ) 处理

D、E、F：順に ASC+SB、2 回 ASC+SB、3 回 ASC+SB

F: E の 拡大 （ミクロフィブリル）

G、H、I：順に SB、SB＋ASC、SB＋3 回 ASC

J、K、L：順に無処理、Eの拡大、Fの拡大
これに対して、前段で SB 処理を行ってから ASC 処理を施しても、漂白はある程度進むが、形状はほとんど変化しなかった（G、H、I）。SB 処理による膨潤・微細繊維化は ASC 処理した稲藁に対して効果があり、逆の処理順（SB→ASC）ではほとんど効果がなかった。

前処理済み稲藁の形状変化を SEM で観察すると、図 3.1.2 に示したように、表面をリグニン層で覆われた無処理稲藁に対して（A）、3 回 ASC 処理は表面リグニンの除去は見られるが繊維束のままであり（B）、SB 処理は繊維束がある程度破砕されたが表面リグニンが残っており（C）、（SB + 3 回 ASC）処理は表面リグニンの除去と繊維束の破砕は見られたが十分とは言えない（D）。これに対して、（3 回 ASC + SB）処理を施すと、表面リグニンが除去され、繊維束は膨潤・微細繊維化が進み、ミクロフィブリルがバラバラになっていることが確認された（E、F）。また、繊維束の破砕は内部リグニンの除去にも寄与していることが推測される。これらの結果は図 3.1.1 の形状変化をよりミクロ単位で裏付けており、また ASC 処理による漂白は脱リグニン（特に表面リグニンの除去）の結果であることも分かった。

前処理による稲藁のリグニン含有量の変化を調べるため、図3.1.3にクラーソン法とκ価により定量した結果（A）と前処理済み稲藁の熱処理後の色の変化（B）を示した。図3.1,3(A)に示したようにクラーソンリグニンとκ価の間には強い相関がみられ、無処理の稲藁のリグニン含有率14.1%（乾重%）に対してκ価は約16.0であった。稲藁のASC処理（β）はリグニン含有率を4.9～2.7%にまで低下させるが、SB処理（α）は12.0～10.6%程度に留まった。ASCとSBを組み合わせた処理の場合、ASC処理後にSB処理を施す（ε）とリグニン含有率は3.8～1.7%にまで低下するが、SB処理後にASC処理を行う（γ）と6.3～3.7%であり、リグニン除去率が低下した。リグニン除去率の最も高いのは（3回ASC+SB）処理であり、リグニンを88%除去できることが分かった。

図 3.1.3(B) は無処理（a）、3 回 ASC 処理（b）、（SB+3 回 ASC）処理（c）及び（3 回 ASC+SB）処理（d）を施した稲藁をオートクレーブで熱処理し、稲藁の色の変化を調べたものである。リグニン除去率の最も高い（3 回 ASC+SB）処理により稲藁はきれいに漂白されていたが、3 回 ASC 処理や（SB+3 回 ASC）処理では漂白が不十分であり、先のリグニン量の変化を視覚的にも確認できた。稲藁のリグニンはその表面を覆うリグニン層に多く存在するが、繊維束の内部にも存在している。（SB+3 回 ASC）処理は図 3.1 の（I）では一見完全漂白されているように見えたが、表面リグニンは除去されても内部リグニンが残っているため、図 3.1.3(B) の（c）の通り熱処理すると漂白（脱リグニン）が十分ではないことがわかる。SB 処理は ASC 処理済み稲藁の膨潤・微細繊維化を促進することにより、内部リグニンを除去する効果があると言える。

B

図 3.1.3 稲藁の前処理によるリグニン量の変化 (A) と熱処理後の色の変化 (B)

A: クラーソンリグニン量（乾重%）の変化と $ \kappa $ 価の変化；Ctrl は無処理、 $ \alpha $ （白菱形）は SB 処理、

β（白円）はASC処理、γ（黒菱形）は（SB+ASC）処理、ε（黒円）は（ASC+SB）処理、1～3は処理回数

B: 前処理済み稲藁の熱処理（122℃、20分）後の色の変化；aは無処理、bは3回ASC処理、cは（SB+3回ASC）処理、dは（3回ASC+SB）処理