Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
前処理による稲藁の化学的な変化を調べるため、リグニンを含まないアビセルを対照としてFTIR解析を行い、稲藁に見られるFTIRスペクトルの主なバンド（波数）と解析結果を表3.1.1と図3.1.4に示した。まず、リグニン構造の芳香環の振動に起因するカルボニル（C=O）伸縮による1745と1732cm⁻¹バンドの変化が観察された。カルボニルはリグニン構造側鎖の重要な官能基であり、特に1732cm⁻¹バンドはリグニン側鎖とヘミセルロースとの連結に関連する。これらのバンドは3回ASC処理では変化しなかったが、SB処理又は（3回ASC+SB）処理によりほぼ完全に消滅した。このことはSB処理による膨潤（繊維束の破砕）によってヘミセルロースに連結した内部リグニンが除去されていることを意味する。次に、リグニン構造の芳香環1606cm⁻¹バンドは3回ASC処理によって消滅したが、SB処理では残っており、芳香環はASC処理によって破壊されることが分かった。プロパノイド1638cm⁻¹バンドはしばしばセルロース吸着水バンドと重なるため、明確な変化は観察されていない。芳香環C-O伸縮に起因する1512cm⁻¹バンドは3回ASC処理でかなりの程度消え、(3回ASC+SB)処理で完全に消滅したが、SB処理では除去されなかった。FTIR解析から、(3回ASC+SB）処理は主に1606と1512cm⁻¹バンドのリグニン構造ユニットを除去し、SB処理は1745と1732cm⁻¹バンドの内部リグニンの除去に関わっていることが分かった。

表 3.1.1 稲藁に対する FTIR スペクトルの主なバンド

Wave number (cm^{-1})	Assignment
3450-3350	O-H stretching
2901-2892	C-H stretching
1745	Carbonyl bonds (associated with lignin side chain removal)
1732	Alkyl ester from cell wall hemicellulose C=O; strong carbonyl groups in branched hemicellulose
1638, 1606	Doublet phenolics of remained lignin
1512	Aromatic C-O stretching mode for lignin; guayacyl ring of lignin; lignocellulose
1430	CO_{2} stretching; carboxylic acids
1373	C-H stretch of cellulose
1247	C-O-H deformation and C-O stretching of phenolics
1165	Antysymmetric stretching C-O-C glycoside; C-O-C $ \beta $ -1,4 glycosil linkage of cellulose
1060, 1035	C-O vibration of cellulose
898	Amorphous cellulose vibration; glucose ring stretch

図 3.1.4 FTIR 解析における稲藁の前処理による化学的変化（波数 2200～760cm⁻¹）

以上の結果を総合すると、稲藁の前処理はASC処理の後段にSB処理を行う必要があり、その逆の処理順では効果が低くなることが明らかになった。亜塩素酸・重曹法による稲藁の前処理は、3回ASC処理により表面リグニン層が破壊・除去（脱リグニン）され、これに続くSB処理により繊維束の膨潤・微細繊維化と内部リグニンの除去が進むことが確認された。

#### 3.1.2 脱リグニン過程で生成される塩素種

亜塩素酸ナトリウムを用いた稲藁の脱リグニン過程(ASC処理)で生成される塩素種は、図3.1.5に示したように亜塩素酸イオン（ClO_{2}^{-}）、塩化物イオン（Cl^{-}）、塩素酸イオン（ClO_{3}^{-}）及び二
酸化塩素（ClO_{2}）であった。二酸化塩素による脱リグニンもいくつか報告されているが、ここでは二酸化塩素の生成量はわずかであり、その脱リグニンへの寄与は低いと推定される。なお、生成される塩素種は脱リグニン反応器が開放系でも密閉系でもほぼ同じ結果であった。

亜塩素酸ナトリウムは水中で pH に応じて解離し、亜塩素酸イオンに転換される。また、pH2以下の酸性条件では亜塩素酸ナトリウムは二酸化塩素や塩化物イオン等を生成する。また、系内に被酸化性物質がある場合、亜塩素酸ナトリウムは被酸化性物質を酸化し、自身は塩化物イオンに還元される。本実験においては、酢酸緩衝系（pH=4.5～4.8）であるために二酸化塩素の生成はわずかに留まり、亜塩素酸イオンによりリグニンが被酸化性物質として酸化されたと考えられる。実際に、コントロール（基質無し）と標準リグニンにおいて生成された塩素種から、リグニンは亜塩素酸イオンにより酸化・除去、すなわち脱リグニンされ、一方、亜塩素酸イオンは塩化物イオンに還元されたと解釈できる。また、このとき塩素酸イオンも生成されていた。

同様に、稲藁においても亜塩素酸イオンによりリグニンが酸化・除去され、塩化物イオンが生成される。但し、ASC処理1回では亜塩素酸イオンが残存していても約36%（図3.1.3(A)の稲藁乾重の5%）のリグニンが残り、ASC処理3回目でも約20%（図3.1.3(A)の稲藁乾重の2.8%）のリグニンが残留した。前述の通り、この残留リグニンは繊維束の内部リグニンであり、ASC処理のみでは亜塩素酸があっても内部リグニンが除去されず、SB処理による膨潤化が脱リグニンを完遂するのに重要な役割を果たすことが確認された。

図3.1.5 亜塩素酸による脱リグニン過程で生成される塩素種 Control：基質無し、標準リグニンとアビセルセルロースは比較対象 ASC：1^{st}は1回目、2^{nd}は2回目、3^{rd}は3回目のASC処理

#### 3.1.3 ミクロフィブリルの結晶性と結晶構造の変化

稲藁のような植物バイオマスは幅3～4nmの微細繊維（ミクロフィブリル）が基本単位となって構成されているが、この微細繊維は高い結晶性を示しており、その結晶型をタイプⅠと呼ぶ。稲藁の難分解性はそのタイプⅠの結晶構造とも深い関係がある。稲藁の分解性を向上させるためには、セルロース繊維束からリグニンやヘミセルロースを分離することに加えて、この微細繊維の結晶構造を改変する必要がある。そこで、前処理による稲藁の結晶性の変化を調べるため、セルロース繊維の結晶性に関してX線回折及び結晶構造に関してFT-IR解析を行った。

稲藁の前処理によるセルロース結晶性の変化について、結晶性セルロースのアビセルを比較対象として、X線回折によるスペクトル変化を図3.1.6に示した。結晶性の高いアビセルが示した5つの結晶格子面のピーク（干渉強度）に対して、無処理稲藁は（002）格子面以外の干渉強度はかなり低かったが、これは非晶質のリグニンやヘミセルロースの妨害によるものと考えられる。3回ASC処理によって（002）や（101）格子面の強度が増大したが、これは図3.1.2のSEM観察でも分かるように表面リグニンの除去によりセルロースがある程度出現してきたためであるが、
その他の格子面はあまり変化しなかった。3回ASC処理の後SB処理を施すと、(002)や(101)格子面の強度は増加せず、再び減少した。これは膨潤・微細繊維化によりミクロフィブリルが出現するが、同時にセルロースの非晶質化がある程度起きているためと推測する。これは、図3.4の波数1035と898cm $ ^{-1} $ バンドの変化において、必ずしも十分な変化ではないが、(3回ASC+SB)処理によりセルロースのC-O振動（1035cm $ ^{-1} $ ）が増大し、一方で非晶質セルロース振動（898cm $ ^{-1} $ ）も増大していることからある程度裏付けられる。

図3.1.6 X線回折における稲藁の前処理による結晶性の変化

Ctrl：無処理稲藁、Avicel：比較対象のアビセル

図 3.1.7 FTIR 解析における稲藁の前処理による結晶構造の変化（波数 3800～2200cm⁻¹）

FT-IR 解析によるセルロース繊維の結晶構造（結晶型）の変化を図 3.1.7 に示した。FT-IR 解析の結果は IR スペクトルの変化を 2200～760cm^{-1}（低エネルギー領域）と 3800～2200cm^{-1}（高エネルギー領域）二つの領域に分けて示しており、前出の図 3.1.4 の低エネルギー領域には伸縮振動と変角振動による吸収が現れるため複雑なスペクトルとなり、図 3.1.7 の高エネルギー領域では伸縮振動による吸収のみのため比較的簡単なスペクトルとなる。

セルロースの結晶型はOH伸縮領域(3600～3100cm⁻¹付近)のスペクトル変化から推定できるが、自然界のセルロースはタイプⅠに分類される。稲藁の場合、図3.1.7の無処理稲藁（Ctrl）の波数3352cm⁻¹バンドにタイプⅠの特徴的ピークが現れている。これが3回ASC処理と（3回ASC＋SB）処理を施すことによって、ピークが3352cm⁻¹から3545cm⁻¹に転移しており、結晶型が無処理稲藁のタイプⅠから、混在型を経て、タイプⅡに変化していることが分かる。タイプⅠに比べて、タイプⅡは結晶密度が低く、分解性の高い結晶構造であり、この転移は上述の（3回ASC＋SB）処理によるセルロースの非晶質化と矛盾しない。

#### 3.1.4 CBHI 酵素による稲藁の糖化に対する ASC 処理と SB 処理の相乗効果

稲藁の前処理としてその形状、リグニン含量及び化学構造等の変化から（3回ASC+SB）処理が効果的であることを明らかにした。ここでは、稲藁の糖化に対するASC処理とSB処理の相乗効果を評価するため、セルラーゼのうち結晶セルロース末端からセロビオースを分離するセロビオヒドロラーゼCBHI（Cel7A）用いて、各処理の稲藁の糖化（分解）に対する効果を調べた。セルラーゼには役割の異なる様々な酵素が含まれているので、いわゆるカクテル効果を除き、セルロースの結晶性に対する前処理効果を評価するために、カラムクロマトグラフィにて工業用セルラーゼ（Celluclast 1.5L）からセルロースの結晶部位を攻撃する酵素であるCBHIを分離した。
工業用セルラーゼの粗酵素と分離酵素を SDS-PAGE により分離した結果を図 3.1.8(A) に示す。分子量 62kDa のバンドが CBH I であり、CBH I をほぼ分離することができた (Lane3)。結晶性セルロースであるアビセルに対する糖化活性を調べたところ、分離した CBH I は 1.49U/mg であり、粗酵素 (Lane1) の 1.5 倍高い活性を示した。一方、非晶質の CMC 活性に対しては、粗酵素の 1/4 程度の活性ではあるが、この CBH I は 0.16U/mg の活性を示した。CBH I は概ね分離・精製されたが、非晶質セルロースを攻撃する EG I (Cel7B) も少し混ざっているものと思われる。

図 3.1.8 CBHI 酵素による稲藁の糖化に対する亜塩素酸（ASC）・重曹（SB）処理の相乗効果 A：工業用セルラーゼからのセロビオヒドロラーゼ CBHI の分離・精製；Lane1 は非脱塩の粗酵素、Lane2 は脱塩試料、Lane3 は分離 CBH1

B : CBHI による稲藁の糖化（50℃、24h、pH4.8）；Ctrl は無処理

工業用セルラーゼから分離された CBHI を用いて前処理済み稲藁の糖化を温度 50℃ 行い、DNS 還元糖としての糖化率を示したのが図 3.1.8(B) である。無処理稲藁の糖化率 8% に対して、糖化率が 3 回 ASC 処理により 27% に、(3 回 ASC+SB) 処理により 85% に向上した。一方、SB 処理では 13%、(SB+3 回 ASC) 処理では 39% の糖化率に留まった。3 回 ASC 処理と SB 処理の単純加算の糖化率は 40% であり、(SB+3 回 ASC) 処理の 39% とほぼ同じ率であるのに対して、(3 回 ASC+SB) 処理は 85% という 2.1 倍の相乗効果を示した。ここに、(SB+3 回 ASC) 処理ではその相乗効果は全く出ず、ASC 処理の後に SB 処理を施すという順番が重要であることを再確認した。

#### 3.1.5 前処理済み稲藁の工業用セルラーゼによる糖化

糖化に対する前処理の効果を総合的に評価するため、工業用セルラーゼ（Celluclast 1.5L + Novozym 188）を酵素／基質比＝1/100で添加して温度50℃で稲藁の糖化を行い、その結果を糖化率として図3.1.9及び糖組成を表3.1.2に示した。無処理稲藁は48時間の糖化でも糖化率20％に留まっていたが、3回ASC処理により62％に向上し、さらに（3回ASC＋SB）処理を行うと6時間で86％、12時間で96％に達した。一方、比較対象としたアビセルは48時間で糖化率72％であり、（3回ASC＋SB）処理済み稲藁よりかなり低い糖化率であった。これはアビセルの結晶化度が高く、結晶型がタイプⅠであるためと思われ、逆に言うと、稲藁は（3回ASC＋SB）処理によりある程度の非晶質化が起き、結晶型もタイプⅡに転換されていたためと考える。

前処理の効果を定量的に評価するため、糖組成と糖化速度を調べた結果、表3.1.2に示したように、3回ASC処理はグルコース46％とキシロース10％であるのに対して、(3回ASC+SB)処理はそれぞれ74％と12％であり、より低分子への糖化が進んでいることが分かった。ここに、キシロースはヘミセルロース由来の糖であり、キシロース生成は前処理段階でヘミセルロースが分解・除去されていないことを意味し、エタノール発酵の基質の損失がないことも分かった。また、前処理の効果を最大糖化速度で見ると、(3回ASC+SB)処理が0.22（wt./wt./h）であり、無処理の11倍、3回ASC処理の約5倍及びアビセルの約3倍の糖化速度であった。
図 3.1.9 稲藁の酵素糖化に対する前処理の効果

Ctrl: 無処理、3xASC:3回ASC処理、3xASC+SB:(3回ASC+SB)処理、Avicel:アビセルセルロース、糖化:(Celluclast 1.5L + Novozym 188)による50℃での糖化

表 3.1.2 前処理済み稲藁の酵素糖化による生成糖の組成（図 3.1.9 の糖組成）

前处理	糖組成（%， wt./wt.）	糖化速度 v max (wt./wt./h)
グルコース	キシロース	その他
無処理(Ctrl)	14.1 ± 2.1	4.2 ± 1.5	3.9 ± 0.6	0.02
3回ASC	45.5 ± 3.6	10.4 ± 2.0	10.4 ± 0.7	0.04
3回ASC+SB	73.6 ± 1.9	11.9 ± 1.8	13.3 ± 1.5	0.22
Avicel	71.3 ± 4.2	n.d.	3.4 ± 0.2	0.08

### 3.2 低温性セルラーゼの産生と糖化活性

##### 3.2.1 糸状菌 T. reesei NBRC31327 の変異処理とセルラーゼ活性

低温（30℃）で高活性のセルラーゼを産生する株を獲得するために、NBRCから入手したT. reesei NBRC31327を野生（WT）株として紫外線（UV）照射による変異処理と選択培地による選別で繰り返し改良し、その変異株のセルラーゼ産生能と活性を調べた。

変異処理の手順は図3.2.1に示した通りであり、まず野生株から増殖の早いコロニーを選別し、スラント培地でその胞子形成を行い、その培地に生理食塩水1mlを注ぎ胞子懸濁液として胞子を回収した。胞子懸濁液をエッペンチューブに移し、生理食塩水で $ 10^{6} $ 倍まで希釈した後、UV照射を行い、その胞子懸濁液を0.5%カルボキシメチルセルロース（CMC）を含むPDA寒天培地に蒔いて30℃で培養・コロニー形成を行った。培地上のコロニーを採取し、それぞれの胞子をエッペンチューブ内の生理食塩水に懸濁・保存し、培地はCongo-Red液に30分間浸してから1M NaCl液で数回洗浄し、培地上のハロー形成を確認した。そのうち最大のハローを形成したMT9株をCMC分解能の高い株として選別した。このMT9株はPDA寒天培地でも最大のコロニーを形成した。次に、MT9株の胞子懸濁液をCMC-PDA培地に蒔きコロニーを形成させ、その最大の（増殖能の高い）コロニーからMT95株を選別し、さらにMT95株に対して亜硝酸添加系でUV変異処理を行い、増殖能と酵素タンパク産生能の高いMT957株を選別した。こうして得られたMT95株とMT957株を低温（30℃）で高活性セルラーゼを産生するT. reesei変異株として、以下の実験に供した。なお、酵素活性を示すユニット（U）は1分間で基質から1μmoleのグルコース（または還元糖）を生成するのに要する酵素量を1（U）として定義した。
セルロース分解活性の最も高い変異株 $ \Rightarrow $ MT9株

図 3.2.1 T. reesei の変異処理による低温高活性セルラーゼ産生株の獲得

変異株のセルラーゼ活性は、セルロースろ紙（Whatman No.1）を基質としてセルラーゼと反応（糖化）させ、生成されたグルコース又は還元糖の量をHPLC法又はDNS法で測定して確認した。糖化は50 mM クエン酸バッファー（pH5.0）で50℃又は30℃で1時間行い、糖測定の前に100℃で5分間煮沸して酵素を失活させた。

まず、セルロースろ紙を基質として MT95 株が産生したセルラーゼの活性は、WT 株と同程度であるが、市販セルラーゼ C1.5L に比べると 50℃ では低かった（図 3.2.2 の左側）。セルラーゼは一般に複数の成分から構成され、セルロースをグルコースにまで転換するには β グルコシダーゼ (BGL) が必要であり、グルコースへの糖化活性が全体的に低かったのは BGL 量の不足であると思われる。そこで、それぞれの糖化液に Novozym188 (BGL) を添加して 50℃ で 1 時間反応させると、いずれも グルコース生成量が増加し、特に MT95 株は、前段のセルロースろ紙糖化が 30℃ の場合、WT 株の 10 倍及び C1.5L の 3 倍量の グルコースを生成した（図 3.2.2 の右側）。

図 3.2.2 MT95株産生セルラーゼと市販セルラーゼの活性比較

## 酵素反応条件

セルラーゼ : WTとMT95は各酵母産生のセルラーゼ、C1.5LはNovozym celluclast 1.5L

BGL無添加系：酵素/セルロースろ紙=1/100、50mMクエン酸バッファー(pH5)、反応時間1h

BGL添加系：BGL無添加系の反応終了後100℃で失活させた後、反応液にNovozym 188を1mg-BGL/mlで添加し、50℃で1時間反応
この結果を踏まえて、MT95株のセルラーゼ産生能（BGL産生能を含む）のさらなる改良を期待して、前述のとおり亜硝酸添加・UV照射による変異処理を行い、亜硝酸存在下でも増殖し（増殖力が強く）かつ酵素タンパク産生能の高いMT957株を選別した。図3.2.3はMT95株に15分、45分、60分、90分の照射時間でUV照射し、CMC含有寒天培地にてコロニー形成を行った結果である。UVは殺菌やDNAを破壊する作用があるので、UV照射時間が長くなるにつれてコロニー数が減少した。UV照射により弱いコロニーは死滅し、強いコロニーが変異株として選別できた。

図 3.2.3 MT95 株の CMC 寒天培地でのコロニー形成 UV 照射 0～90 分

UV 照射後に出現した 9 個のコロニーを用いてセルラーゼ産生を行い、各セルラーゼのタンパク濃度を調べ図 3.2.4 に示した。MT95 株の変異株である m1～m9 株のセルラーゼのタンパク濃度を比較すると、m7 株のタンパク濃度が高いことが確認された。親株である MT95 株と比べてタンパク濃度は約 3 倍の増加が見られ、この m7 株を最優良株として MT957 株とした。

図 3.2.4 MT95 株の 9 変異株による産生セルラーゼのタンパク

変異株 m1～m9 のセルラーゼに含まれるタンパクの種類と発現量を確認するため、SDS-PAGE による組成の解析を行い、図 3.2.5 に示した。セルラーゼ中のセルロース分解酵素は触媒機能によって大きくエンドグルカナーゼ(EG)、セロビオハイドロラーゼ(CBH)、β グルコシダーゼ(BGL)に分類され、これらの酵素の働きにより多糖類が単糖であるグルコースへ分解される。したがって、多くのグルコース量を得るためには EG、CBH、BGL の働きが平均的に高くなければならない。本研究ではキシロース代謝能を有する酵母を分子育種するために、キシランをキシロースへ分解するキシラナーゼ(XYN)の産生量が高いことが望ましい。m1～m9 株のセルラーゼを比較すると、m7 株すなわち MT957 株が BGL、CBH I、CBH II、EG、XYN の発現量が多いことが確認された。
図 3.2.5 MT95 株の変異 m1～m9 株による産生粗タンパクの組成

この MT957 株に対してセロビオースを基質とした BGL 活性（CBU）を調べたところ、MT957 株の BGL 活性は 30℃で約 110（CBU/mg）であり、WT 株の 3 倍及び C1.5L の 6 倍高い値を示した（図 3.2.6）。得られた MT957 株のセルラーゼ活性を評価するため、各株が産生するセルラーゼと市販セルラーゼの酵素タンパク量を一定にして、米国 Technical Report NREL/TP-510-42628 の方法に従ってフィルターペーパー活性（FPU）を調べ、比活性（FPU/mg 酵素）を求めた（図 3.2.7）。

図3.2.6 セルラーゼのセロビオースに対するβグルコシダーゼ（BGL）活性（CBU）

図 3.2.7 セルラーゼの Filter Paper 活性 (FPU) 条件 : 酵素/セルロースろ紙=1/20

その結果、MT957 株セルラーゼが最も高い FPU 活性を示し、50℃で 36（FPU/mg）、すなわち WT 株の約 3 倍、MT95 株の約 2 倍及び C1.5L の約 1.1 倍であった。一方、30℃では全体的に低下したが、対 50℃活性で C1.5L が 20% 程度にまで低下したのに対して、MT957 株セルラーゼは 40% 程度に留まっており、結果的に C1.5L の約 2.5 倍の活性を保持していた。
別実験（30℃）で酵素（E）と基質（S）との重量比（E/S）は異なるが、セルロースろ紙の糖化による還元糖のうち単糖（グルコース、キシロース）と二糖（セロビオース）への転換を評価すると、MT957株はキシロース生成量が多く（単糖・二糖量の36%）、またセロビオースのグルコースへの転換能がMT95株より高いことが特徴的である（図3.2.8）。単糖への転換量はMT957株が2.5 g/L（単糖・二糖量の77%）、MT95株は0.5 g/L（同25%）、WT株は0.9 g/L（同60%）及びC1.5Lは1.2 g/L（同76%）であった。

ここに、T. reesei 株の変異処理により、野生株や市販セルラーゼに比べて、低温（30℃）で高活性のセルラーゼを産生する能力をもつ MT957 株を獲得することができた。

図 3.2.8 セルラーゼによる単糖・二糖への転換（30℃）

条件：酵素/セルロースろ紙=1/20

#### 3.2.2 MT957 株産生セルラーゼの分離と精製

セルラーゼには一般に複数の成分が含まれているので、MT957株が産生するセルラーゼを分離し、その組成を詳細に調べた。まず、MT957株を1L容・30℃で10日間培養して十分量のセルラーゼを産生させた（比較のためにWT株とMT95株も行った）。基質はセルロース微結晶（30 g/l）とビーチウッド由来キシラン（5 g/l）を用いた。培養液をガラス繊維濾紙でろ過し、液分を10kDa分子サイズ排除膜のQuixStandによる限外濾過濃縮を行い、その後60%硫安沈殿法で全タンパクを沈殿させた。PD-10脱塩カラムを用いて硫安を除去し、得られた粗タンパク液を10kDa限外濾過コニットで濃縮し、0.02%になるようにアジ化ナトリウムを加え、-80℃で保存した。この保存した粗タンパク液の一部を融解させ、Bradford法によるタンパク定量を行い、SDS-PAGE分析を行った。その結果を図3.2.9に示す。

図 3.2.9 SDS-PAGEによる各セルラーゼ成分の分離
SDS-PAGE 分析の結果、130～95 kDa の間に β-glucosidase (BGL) に相当するバンドが確認され、さらに 72～55 kDa の間に cellobiohydrolase (CBH1 と CBH2)、55～36 kDa の間に endoglucanase (EG)、28～17 kDa の間に xylanase (XYN) に相当するバンドが確認された（図 3.2.9）。WT 株に比べて、MT957 株は明らかに酵素タンパク量が増加しており、MT95 株や C1.5L に対しても同様な傾向が見られた。このうち EG はセルロースの非結晶部位を分解してオリゴ糖に転換、CBH1 と CBH2 はその結晶部位を攻撃してセロビオースに転換、BGL はさらにグルコースに転換する成分であり、先の FPU 試験（図 3.2.7）や BGL 活性試験（図 3.2.6）において MT957 株セルラーゼが最も高い活性を示したことを裏付けている。同様に、キシランのキシロースへの転換に関与する酵素 XYN についても、MT957 株が比較的高い産生能を示しており、単糖・二糖への転換のキシロース生成（図 3.2.8）に見られたように、当該セルラーゼにより稲藁に含まれるキシランの分解が促進されることが期待される。

MT957 株が産生するセルラーゼ成分を精製し、その活性を個々に測定するため、FPLC による粗酵素の分離と精製を行った。まず、BioRad 社 High-Q 強陰イオン交換カラムを用いて、吸着・洗浄を 20 mM Tris/HCl バッファー（pH7.2）及び溶出を 0～500 mM NaCl を含んだ 20 mM Tris/HCl バッファー（pH7.2）にて分離・精製を試みた。その結果、MT957 株セルラーゼの粗酵素液からクロマトグラム上に 4 つのピークが確認され、最初にカラムに吸着しない成分（非吸着分）が溶出し、次に画分 A、B 及び C が分離された（図 3.2.10）。この段階では各画分はまだ十分に精製されていないが、それぞれの酵素タンパクを用いて各種セルロースの分解を予備的に調べた結果、画分 A は CBH2、画分 B は EG と BGL の混在及び画分 C は CBH1 が主成分であることが判明した。

図 3.2.10 陰イオン交換（High-Q）カラムによる MT957 産生セルラーゼ成分の分離

次に、陰イオン交換カラムで分離した画分Aと画分Cの精製をセラミックヒドロキシアパタイトTypeI（CHT-I）を用いて行った。吸着・洗浄は10 mM KPiバファー（pH 6.5）であり、溶出はKPi濃度を10～500 mMまで徐々に上げながら精製を行った。CHT-Iカラムにより各画分から余計な成分が除去され、クロマトグラム上のきれいなピークに見られるように、画分AからCBH2及び画分CからCBH1が精製された（図3.2.11）。

最後に、陰イオン交換カラムで分離した画分BからのEGとBGLの精製をBioRad社Macro-Prep CMカラム（陽イオン交換カラム）を用いて行った。吸着・洗浄は20mM 酢酸バッファー（pH4.8）であり、溶出は0～500mM NaClを含んだ酢酸バッファー（pH4.8）を用いた。EGはCMカラムに吸着せず、最初に非吸着分として溶出し、溶出バッファーの塩濃度を上げるにつれてブロードなピークではあるがBGLが溶出された（図3.2.12）。クロマトグラムにはBGLに3つのピークが現れ、MT957株が産生するBGLには数種類のBGLが含まれていることが伺える。
図 3.2.11 セラミックヒドロキシアパタイト Type I (CHT-Ⅰ) カラムによる CBH1 と CBH2 の分離精製

図 3.2.12 陽イオン交換（CM）カラムによる EG と BGL の分離精製
これらの精製過程で得られたセルラーゼの各成分を再び SDS-PAGE 分析にかけ、さらに分離の確認を行った。SDS-PAGE ゲル上のレーン 1 は分子量マーカー、2 は粗酵素液、3～5 はそれぞれ陰イオン交換カラムで得られた画分 A（CBH2）、画分 B（EG と BGL の混在）及び画分 C（CBH1）、6 は CHT- I で得られた CBH2、7 と 8 はそれぞれ陽イオン交換カラムで得られた EG と BGL、9 は CHT- I で得られた CBH1 である（図 3.2.13）。ゲル上のレーン 6～9 により、先の 3 種類のカラムを用いた方法で CBH2、CBH1、EG 及び BGL が分離・精製されたことを再確認し、さらにレーン 7 の EG には数種類の EG が含まれていることが判明した。

図3.2.13 SDS-PAGEによるMT957産生セルラーゼ成分の確認

レーン 1：分子量マーカー；2：粗酵素液；3：陰イオン交換のA画分；4：陰イオン交換のB画分；5：陰イオン交換のC画分；6：CHTのCBH2画分；7：陽イオン交換のEG画分；8：陽イオン交換のBGL画分；9：CHTのCBH1画分

タンパク量 100 μg

図3.2.14 二次元電気泳動による MT957 株産生セルラーゼ成分の分離

さらに、二次元電気泳動による MT957 株セルラーゼの分離を行ったところ、WT 株に比べて、MT957 株は特に高分子量域（37～130kDa）の酵素タンパクが増加しており、また 20kDa 付近の XYN と思われる酵素タンパクの増加もはっきりと見て取れた（図 3.2.14 の楕円部分）。ゲル上のスポットを MALDI-TOF 質量分析計により同定・確認する必要があるが、二次元電気泳動の結果からも MT957 株はセルラーゼ成分の BGL、CBH 及び EG の発現量が WT 株よりかなり増加していた。

#### 3.2.3 MT957 株セルラーゼの各成分の糖化活性

MT957 株が産生するセルラーゼ (粗酵素) に対して各種セルロースを使った α セルロース活性、アビセル活性及び CMC 活性を温度 50℃ と 30℃ にて測定した。ここに、α セルロースは不要性セルロースであり、その活性は前処理済み稲藁に対する全体的な糖化活性を見ることになり、一方アビセルは結晶性セルロースであり、その活性は CBH の糖化活性を、また CMC は可溶性の非結晶性セルロースであり、その活性は EG の糖化活性を示すものとみなせる。α セルロース活性とアビセル活性は、30 mg の α セルロース又はアビセル粉末を 990 μL の 0.1M 酢酸バファーに浸し、CMC 活性は 0.5% CMC 溶液（0.1M 酢酸バファー）を用意し、それぞれ 10 μL の酵素液を添加して 50℃ と 30℃ で 1 時間反応させ、残存酵素を不活化してから、生成された還元糖を DNS 法により定量することにより測定した。

温度 50℃ では、MT957 株セルラーゼは WT 株に比べて α セルロース活性が 3 倍、アビセル活性が 2.5 倍及び CMC 活性が 2 倍程度高くなっており、さらに C1.5L に比べるとそれぞれ 4 倍、2.5 倍及び 3 倍高い活性を示すことがわかった（図 3.2.15）。同様に、温度 30℃ では、MT957 株セル
ラーゼは WT 株に比べて α セルロース活性が 3.6 倍、アビセル活性が 5.4 倍及び CMC 活性が 2 倍高くなっており、C1.5L に比べるとそれぞれ 3.3 倍、3.5 倍及び 4 倍高い活性を示した。このように、MT957 株セルラーゼは CBH と EG の活性が高く、結果的に全体的な糖化活性は WT 株や C1.5L より 3～4 倍高くなった。さらに、糖化温度が 50℃ から 30℃ に低下すると、WT 株と C1.5L のセルラーゼ活性は 40% 程度にまで低下するのに対して、MT957 株セルラーゼの活性は約 70% を保持しており、低温（30℃）域でも高活性を持つセルラーゼを生産するという本研究の目標を達成していることを再確認した。

図 3.2.15 セルラーゼの各種セルロースに対する活性（IU）

次に、先に分離・精製した各セルラーゼ成分のセルロース糖化に対する関与（寄与）の程度を解析するため、全体的な糖化活性を示すαセルロースの分解に対して、各成分のうちEG無添加系のCBH1、CBH2及びCBH1+CBH2、EG添加系のEG+CBH1、EG+CBH2及びEG+CBH1+CBH2の組み合わせで糖化速度を調べた（図3.2.16）。実験は30mgのαセルロース粉末を1mLの0.1M酢酸バッファー（pH4.8）に浸し、これに0.3mgの各セルラーゼ成分を添加して50℃と30℃で1時間反応させ、1分間で生成されるセロビオースの量（μM）で評価した。

図3.2.16 MT957株セルラーゼの各成分によるαセルロースの糖化速度

図 3.2.17 糖化速度に及ぼす EG 添加の影響
まず、EG 無添加系でも α セルロースの糖化が少し起こっており、CBH1 と CBH2 はセルロースの非結晶部位を分解する EG の機能もわずかながら有していることを確認し、また CBH2 の EG 機能は 50℃ より 30℃ の方が高かった。CBH1 と CBH2 を同時に加えると、30℃ で相加的な糖化活性が見られたが、50℃ では変化がなかった。CBH1 と CBH2 に EG を添加すると、活性はそれぞれ高くなり、特に CBH1 の活性が 50℃ で約 10 倍、30℃ で約 7 倍にまで向上した。EG + CBH1 + CBH2 の系では、糖化速度が 50℃ で 112（μM/min）、30℃ で 62（μM/min）であり、EG 無添加系に比べてそれぞれ 14 倍と 3.5 倍にまで活性が向上した。α セルロースの糖化に対して、CBH1 と CBH2 のみでは活性が低く、糖化の初期段階で関与する EG の存在が重要であることが分かった。

次に、EG 添加の効果を調べるため、一定量の CBH1 と CBH2 に対して（E/S）比を変えた糖化実験を行った（図 3.2.17）。温度 50℃と 30℃のいずれの系でも、EG 添加によって糖化速度が向上し、30℃系では $ E_{EG}/S $ 比が 0.02～0.05 の範囲で EG 添加の相乗効果が期待できることが分かった。しかし、EG 添加の効果は $ E_{EG}/S $ 比 0.05 以上になると頭打ちになり、特に CBH2 は 30℃系で 0.02 以上になると逆に活性が低下する傾向を示した。

T957 株が産生するセルラーゼは各成分（CBH、EG、BGL）ともに低温（30℃）で高い糖化活性を持ち、野生株に比べて各成分の発現量も増加していることが明らかになった。また、各成分の組み合わせ（セルラーゼカクテル）によって糖化活性の更なる向上が期待できることが分かった。さらに、低温（30℃）での糖化の場合、セルラーゼ活性が50℃の場合より長く保持されること（酵素添加量の節減）が期待される。

#### 3.2.4 MT957 株セルラーゼによる稲藁の糖化

MT957 株セルラーゼによる稲藁の糖化を調べるため、本研究で昨年度開発した亜塩素酸・重曹法で前処理した稲藁を用いた糖化実験を行った。実験は天日乾燥した前処理済み稲藁を20mg/mlの濃度でエッペンチューブに入れ、E/S比を1/100に設定して、pH4.8（0.1M NaAcで調整）、温度30℃で18時間の糖化を行った。その結果、18時間という比較的短い糖化時間でも、MT957株セルラーゼは稲藁に対して約82%の糖化率（還元糖ベース）を達成しており、これはWT株セルラーゼの2.5倍及びC1.5Lの1.6倍高い糖化率であった（図3.2.18）。糖化率を前処理済み稲藁の水分量5%を差し引いた乾燥重量当りで求めると、MT957株セルラーゼの稲藁に対する糖化率は86%となる。ここに、本研究の目標値90%が概ね達成できていると言える。

図 3.2.18 亜塩素酸・重曹法で前処理した稲藁のセルラーゼによる糖化

条件：温度 $ 30^{\circ}C $ 、0.1M 酢酸 Na バッファー（pH4.8）DNS 還元糖測定、酵素添加量は基質の 1/100 （mg/mg）

図 3.2.19 前処理済み稲藁の糖化液中の糖組成（HPLC 分析）

glc: グルコース、xyl: キシロース、cell: セロビオース、cel3, cel4, cel5: セロオリゴ糖
生成された還元糖の組成を調べると、WT株とC1.5Lはグルコースとセロビオースが生成されていたが、MT957株の糖化液にはそのほか20%程度（還元糖からHPLC定量糖を差し引いた分）のセロオリゴ糖が含まれていた（図3.2.19）。発酵段階でのエタノール転換率を上げるためには、このセロオリゴ糖を単糖にまで糖化する必要がある。そのためには、セルラーゼ成分のうちCBH及びBGLの働きが重要であり、MT957株の更なる改良等を行う必要がある。

#### 3.2.5 稲藁を炭素源とするセルラーゼ産生

MT957 株を使ったセルラーゼ生産において、稲藁を炭素源として利用するための諸条件を検討した。まず、稲藁を洗浄・天日乾燥させた後、ブレンダー粉砕、ブレンダーミル粉砕、30mmボールミル粉砕、5mmボールミル粉砕した稲藁を用意し、加えて標準セルロース（microcrystalline cellulose）を比較として用意した。稲藁はホロセルロース含有量が76%であるため、その含有量を合わせて稲藁6gに対して標準セルロース4.56gをセルラーゼ産生に供与した。培養条件は全量200mL、30℃、130rpmである。回収した産生セルラーゼに対して、Bradford法によるタンパク定量を行い、酵素量10μgで合わせてSDS-PAGEで組成分離を行った。また、産生酵素の糖化活性を調べるため、基質としてα-celluloseを用いて酵素／基質(E/S)比=1/100に設定し、50℃と30℃で1時間の酵素糖化（pH4.8）を行い、DNS法で還元糖の定量を行い、結果は酵素（mg）当たりの活性値（Unit）で表される比活性（Unit/mg）で示した。

粉砕稲藁4種と標準セルロースのSEM写真を図3.2.20に示した。稲藁は長さ3000～20μmに粉砕され、5mmボールミル粉砕では標準セルロースよりやや小さいサイズに粉砕されていた。ブレンダー粉砕は繊維表面を覆っているリグニン層を残しているが、ボールミル粉砕では微粒子状に粉砕され、その表面のリグニン層も破砕されているように見える。

プレンダー粉牌

#33000μm

ブレンダーミル粉砕 約1000μm

30mmボールミル粉砕 約300～80μm

#320μm

標準セルロース約40μm

図 3.2.20 SEM 観察による各粉砕法での稲薫の粉砕状態（スケール 200 μm）

粉砕稲藁と標準セルロースを炭素源として、MT957株によるセルラーゼ産生量を酵素タンパク量で示したのが図2.2.21である。培養11日間でのタンパク生成において、5mmと30mmのボールミル粉砕で約1.10g/Lのタンパクが生成され、標準セルロースの0.92g/Lと比較すると1.2倍のセルラーゼが得られた。一方、ブレンダーとブレンダーミル粉砕は標準セルロースよりタンパク生成量が大幅に少なかった。これは稲藁が繊維状のままで、表面のリグニン層も残っていることにより、MT957株が炭素源として利用しにくいためと考えられる。セルラーゼ産生用炭素源としての稲藁の粉砕は30mmボールミル粉砕が適していることが明らかになった。

稲藁の粉砕法による産生酵素の成分の違いを明確にするため、各粉砕稲藁と標準セルロースを基質として産生させた酵素をSDS-PAGEで分離した結果を図3.2.22に示した。粉砕稲藁の産生酵素は、CBHを除き、標準セルロース産生酵素よりEGとBGLとXYNのバンドがより濃く現れていた。酵素の糖化活性は各成分の混合比によって異なるが、粉砕稲藁の産生酵素のEGとBGLが多く、さらにキシランをキシロースに糖化するキシラナーゼ（XYN）が多いことは、単糖への糖化が促進され、後段のエタノール発酵に有利に働く可能性が示された。
図 3.2.21 各種粉砕法による稲藁を基質とした MT9-7 株による酵素タンパクの生成

図 3.2.22 各粉砕基質に対する MT9-7 株産生酵素の SDS-PAGE による組成分離 酵素量：10μg

各粉砕稲藁と標準セルロースを炭素源としてMT957株が産生した酵素によるα-celluloseの糖化活性を50℃と30℃で調べ、単位酵素量当たりの比活性を比較したのが図3.2.23である。高い比活性を示したのはいずれの温度でも30mmボールミル粉砕稲藁を炭素源とした産生セルラーゼであり、50℃で1.37Unit/mg、30℃で0.82Unit/mgという標準セルロースに対して10～20%高い活性であった。炭素源として30mmボールミル粉砕稲藁を用いた産生酵素は30℃でも50℃の約60%の比活性を保持しており、低温性セルラーゼとして30℃での並行複発酵に利用できる可能性が示された。これらの結果から、稲藁を30mmボールミルで粉砕することにより、酵素産生の炭素源として使用可能であることが分かった。

図 3.2.23 各種粉砕稲藁を炭素源とした MT957 株産生酵素による α セルロースの糖化活性

標準：対照としての標準セルロース

### 3.3 細胞融合による変異・融合酵母の獲得

#### 3.3.1 野生株の変異処理による代謝改変

細胞融合の前に、S. cerevisiaeのキシロース取込み能を高め、逆にC. intermediaのキシロース取込み能を抑えるために、各野生株をEMS変異処理により改変した。S. cerevisiae変異株はヘキソーストランスポータ（HXT）でのカタボライト抑制を抑えるためにDOG耐性で選別し、グル
コース存在下でもキシロース取込み能が野生株の4.5倍高い変異株M2を獲得した（詳細は後出の論文に記載）。C. intermediaはキシリトール代謝に係るxdh遺伝子を保持しながらも、キシロース取込み能を抑えた変異株m11を得た。それぞれの野生株と変異株による発酵能をMMGX培地で調べた結果を図3.3.1に示した。

S. cerevisae 野生株に対して、M2 株はより多くのキシロースを細胞内に取込み、グリセロールの生成量が少なく、エタノール生成量が増加した。発酵液中にキシリトールは存在しなかったが、キシロースの細胞内蓄積を確認した。グルコースの消費は HXT を通したキシロースの同時取込みのためやや遅れた。一方、C. intermedia においては、野生株がグルコースとキシロースを取込み、キシリトールを生成しているが、m11 株はキシロースを全く取込まないことを確認した。いずれの株もエタノール生成は少なく、グリセロールを少なからず生成した。

細胞融合では両変異酵母の一倍体子囊胞子（a細胞・α細胞又は相当細胞）のプロトプラストによる融合を行うが、カンジダ属は分類学上ヘテロジーニアスであり、様々な性状の菌が存在するので、事前にC. intermedia m11株の胞子形成能を酢酸カリウム（KAc）胞子形成培地で確認することにした。その結果、図3.3.2に示したように、ブリリアントグリーン染色（A、B）とSEM（C）による観察でm11株が胞子を形成することを確認した。別途行ったサフラニン染色では栄養細胞（赤く染まる）は全く見られず、ブリリアントグリーンにより青緑色に染まった胞子が確認された（A）。この胞子を生理食塩水で膨潤させて染色したところ、S. cerevisiaeがそうであるように、m11株は子囊中に複数の子囊胞子を形成しているものと思われる（B）。これらの子囊はSEM観察により2μm程度の球状であることを確認した。

A

図 3.3.1 S. cerevisae と C. intermedia の野生株と変異株によるグルコースとキシロースの発酵 A : S. cerevisae（左は野生株、右は変異株 M2）、B : C. intermedi（左は野生株、右は変異株 m11） シンボル : 〇グルコース、□キシロース、●エタノール、■キシリトール、△グリセロール、◇乳酸
図 3.3.2 変異株 C. intermedia ml1 の KAc 培地での胞子形成

A: 胞子のブリリアントグリーン染色、B: 生理食塩水中で膨潤させた胞子の染色、C: 胞子のSEM写真

#### 3.3.2 変異株（M2株とm11株）のプロトプラスト融合によるハイブリダイゼーション

DOC 耐性 M2 株とキシロース代謝 m11 株の胞子から得られた一倍体細胞のプロトプラストをソルビトール・PEG バッファーにて混合・プロトプラスト融合し、さらに核融合を確実にするため電流を 2 秒間流した。その後、融合プロトプラストをコルヒチン添加の MMXDOG 再生培地で培養し、融合細胞の再生を行った。得られた融合細胞を FSC1 と命名した。図 3.3.3 に変異株 M2（A）と m11（B）及び融合株 FSC1（C、D）の顕微鏡写真を示す。DAPI 染色により、FSC1 株は核融合した単一核であることを確認した（D）。細胞形状はいずれの株も楕円状であるが、FSC1 株は親株である M2 株と m11 株より大きく、長円軸が 10 μm 程度であった。細胞融合においては融合細胞が親細胞より大きくなるのが一般的であり、FSC1 株も明らかにその特徴を示した。

A

B

C

D

図 3.3.3 変異株 S. cerevisiae M2 (A) と C. intermedia m11 (B) 及び融合酵母 FSC1 (C、D) の顕微鏡写真（スケールバー10 μ m） D : FSC1 株の核融合を示す DAPI 染色

FSC1 株は M2 株と m11 株の融合酵母であり、また M2 株と m11 株の接合は起きないことを確認するため、それぞれの株の DOG 耐性とキシロース代謝試験及び接合試験を行った。図 3.3.4 に示したように、まず YMG 培地（A）でいずれの株もコロニーを形成することを確認した上で、YMFDOG 培地（B）では m11 株が DOG 非耐性であり、YMXDOG 培地（C）では M2 株がキシロースを利用できず、最終的に FSC1 株のみが DOG 耐性のキシロース代謝酵母であることを確認した。接合試験では、YMG 培地で（M2 株 + m11 株）の混合培養を行い、その後 MMXDOG 培地で培養した。もし接合が起きていれば、FSC1 株と同様、DOC 耐性 M2 株とキシロース代謝 m11 株の接合株もコロニーを形
成するはずであるが、コロニーは全く形成されなかった (D)。ここに、FSC1 株が M2 株と m11 株の融合株であり、親株同士の接合は起こらないことが確認された。

A

B

C

D

図 3.3.4 変異株 m11、M2 と融合株 FSC1 のコロニー形成及び（M2 + m11）混合培養による接合試験 コロニー形成：A = YMG 培地、B = YMFDOG 培地、C = YMXDOG 培地、接合試験：D = MMXDOG 培地での M2 と m11 の接合試験

融合株 FSC1 について、前出の C. intermedia m11 株と同様に、KAc 培地にて胞子形成能を調べた。その結果、図 3.3.5 に示したように、ブリリアントグリーン染色（A、B）と SEM（C）による観察で FSC1 株が胞子を形成することを確認した。別途行ったサフラニン染色では栄養細胞（赤く染まる）は全く見られず、ブリリアントグリーンにより青緑色に染まった胞子が確認された（A）。この胞子を生理食塩水で膨潤させて染色したところ、S. cerevisiae がそうであるように、FSC1 株は子囊中に複数の子囊胞子を形成しているものと思われる（B）。これらの子囊は SEM 観察により 2～3 μm 程度の球状であることを確認した。

図 3.3.5 融合酵母 FSC1 株の KAc 培地での胞子形成

A: 胞子のブリリアントグリーン染色、B: 生理食塩水中で膨潤させた胞子の染色、C: 胞子の SEM 写真

#### 3.3.3 キシロース利用融合酵母 FSC1 による代謝

融合酵母 FSC1 株によるキシロース含有 MMGX 培地でのエタノール発酵試験を行い、その結果を図 3.3.6（A）に示した。FSC1 株はグルコースとキシロースの両基質を着実に発酵し、その結果エタノール生成量は M2 株の約 2.7 倍に達した（図 3.3.1（A）右の M2 株との比較）。キシリトールも野生株 C. intermedia（図 3.3.1（B）左）の半分程度の生成が見られたが、グリセロールは微量であった。FSC1 株がキシロース代謝とエタノール生成に優れた酵母であることが確認された。変異や融合を施した細胞においては代謝の安定性が重要な評価因子となるので、FSC1 株の継代培養を行い、各世代のエタノール発酵能を調べた。図 3.3.6（B）に示したように、FSC1 株は 14 世代に亘って安定したキシロース利用とエタノール生成を行い、代謝の安定性が確認された。

FSC1 株とその親株のエタノール収率（g/g-基質）を比較すると、図3.3.7の通り、FSC1株が0.38であり、変異親株M2の0.14や野生親株S.c.の0.1より約3倍高い収率を示した。これは理論収率の約75%であり、まだFSC1株の改良の余地があることが示唆された。
図 3.3.6 融合株 FSC1 によるグルコース・キシロースの発酵とエタノール生成の安定性 A：グルコース・キシロースの発酵、B：エタノール生成の安定性 シンボル：○グルコース、□キシロース、●エタノール、■キシリトール、△グリセロール

図 3.3.7 S. cerevisae と C. intermedia の野生株と変異株（M2、m11）及び融合株 FSC1 によるグルコース・キシロースからのエタノール収率

主要アミノ酸7種に対する要求性を調べたところ、表3.3.1に示したように、M2株は全アミノ酸を合成することができたが、m11株はウラシル要求性が高く、ヒスチジンに対しても弱い要求性が見られた。FSC1株は、M2株と同様に、これら7種のアミノ酸に対して要求性はなく、MMG培地でも十分増殖することができた。

表 3.3.1 変異株 S. cerevisiae M2 と C. intermedia m11 及び融合株 FSC1 のアミノ酸要求性（MMG 培地、30℃）

Media	Growth (+ , grow; -, not grow)
S. c. M2	C. i. m11	FSC1
Minimal (MMG)	+++	-	+++
Enriched with amino acids	+++	+++	+++
Deficient in	Adenine	+++	++	+++
Uracil	+++	-	+++
L-Tryptophan	+++	+++	+++
L-Histidine	+++	+	+++
L-Methionine	+++	+++	+++
L-Lysine	+++	+++	+++
L-Leucine	+++	+++	+++
#### 3.3.4 遺伝子とタンパクの発現

キシロース代謝遺伝子とアルコール脱水素酵素遺伝子の発現レベルをRT-PCR法で調べ、さらに抽出タンパクの二次元電気泳動とMALDI-TOF/TOFによる一部の同定を行い、その結果を図3.3.8に示した。同図（A）のFSC1株において、キシロースのキシリトールへの転換に関与する遺伝子はm11株のxrとM2株のgre3、キシリトールのキシルロースへの転換遺伝子はm11株のxdh、キシルロースのキシルロース-5-リン酸への転換遺伝子はM2株のxks1が発現しており、また発酵の最終段階で働くアセトアルデヒドのエタノールへの転換に関与するアルコール脱水素酵素遺伝子はM2株のadh1が強く発現していた。このように細胞融合によるキシロース代謝に係る遺伝情報のFSC1株への伝達が遺伝子レベルで確認された。

タンパクの発現については、図3.3.8（B）の通り、FSC1株にはM2株とm11株の全てのタンパクスポットが見られ、そのほとんどが親株より濃く出ていた。このうち2種のタンパクが同定され、FSC1株にm11株のXRとM2株のTDH（グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素）が確認された。このTDHは等電点が6.3であり、MASCOT検索よりTDH2又はTDH3であると思われる。

A

B

図 3.3.8 変異株 S. cerevisiae M2 と C. intermedia m11 及び融合酵母 FSC1 のキシロース代謝遺伝子の発現（A）と抽出タンパクの二次元電気泳動（B）

A : RT-PCR による遺伝子解析、B : 2D-PAGE 解析、横軸は等電点、縦軸は分子量（kDa）

### 3.4 融合酵母 FSC1 株の改良と改良酵母による稲藁の並行複発酵

#### 3.4.1 融合酵母 FSC1 株の改良と発酵特性

融合酵母 FSC1 株のエタノール発酵能を改良するため、再度 EMS により変異処理し、改良型の FSC3 株を製造した。FSC3 株によるグルコース・キシロース基質からのエタノール発酵試験を行い、その結果を発酵特性として表 3.3.2 に FSC1 株とその親株を含めて整理した。FSC3 株は 30 時間で基質をすべて消費し、キシロースの比消費速度（g/g-cell.h）が FSC1 株の 0.18 から約 6 倍の 1.07 にまで向上した。FSC3 株のエタノール生成速度は容積当り 0.65（g/L.h）又は菌体当り 0.17（g/g-cell.h）であり、FSC1 株の約 2 倍の速度であった。FSC3 株のエタノール収率（g/g-基質）は FSC1 株の 0.38 から 0.42 に向上し、親株である S. cerevisiaeM2 株の 0.14（g/g-基質）の 3 倍であった。FSC3 株のエタノール収率 0.42 は、グルコース・キシロース基質ではあるが、本研究の目標値 0.4（g/g-前処理済み稲藁）を上回る値であった。なお、これはグルコース・キシロースからの理論エタノール収率の 82% に相当する。