Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
標準的な処理方法により最もクロルピクリンと1,3-Dが残留しているクロルピクリン処理直後の濃度を想定し、黒ボク土と砂質土壌を用いて分解促進実験を行った。試験系は、100ml容の褐色バイアルビンを用いて、サンプリング位置を上部空気層、土壌表面層、バイアル底部からサンプリングした。ATSは土壌表層に8倍等量の処理を行った結果を図(1)-30と図(1)-31に示す。以上の結果などにより、残留土壌くん蒸剤、クロルピクリン、1,3-Dを4時間で1/100の濃度に低減化するのに必要なATSの量の評価を行った。

図(1)-30 砂質土壌100g、ATS土壌表面処理後の気相中クロルピクリン濃度変化

図(1)-31 黒ボク土壌100g、ATS土壌表面処理後の気相中クロルピクリン濃度変化

残留土壌くん蒸剤、クロルピクリン、1,3-Dを4時間で1/100の濃度に低減化するのに必要なATSの量の評価を行った結果は、黒ボク土、砂質土壌の各々場合に、残留クロルピクリン量の15倍量、9倍量のATSが必要であるとの評価結果となった(図(1)-32)。また、1,3-Dについては、黒ボク土、砂質土壌の各々場合に、残留1,3-D量の12倍量、18倍量のATSが必要であるとの評価結果となった(図(1)-33)。以上の結果より、日本の種々の条件下、特に黒ボク土の場合にはATSによる分解促進技術は現実的な手法では無く、ガスバリア一性フィルムを用いた場合には可能な限り被覆期間を延ばすことが重要であることが分かった。

クロルピクリンの場合

黒ボク土 CP 指数関数

砂質土壤 CP 指数関数

図(1)-32 クロルピクリン濃度を4時間で1/Xにするために必要なクロルピクリンに対するATSのモル比
砂質土壤 D-D 指数関数

黒ボク土 D-D 指数関数

図(1)-33 1,3-D濃度を4時間で1/Xにするために必要なクロルピクリンに対するATSのモル比

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

これまで土壌くん蒸剤の大気への移行フラックスの測定・評価法など経済的にも労力的にも非常に負担が大きかったが、それらを軽減、緩和する方法が確立できた。このフラックスの推算評価に基づき、各評価対象地域の土壌くん蒸処理圃場周辺での短期間、もしくは園芸地域における長期間での標準的な土壌くん蒸処理条件での大気中土壌くん蒸剤の濃度の評価が可能になった。シミュレーションモデルにより各地域の土壌くん蒸剤処理条件下における土壌くん蒸剤の大気中の動態把握、また、削減技術を適用した場合の低減効果の評価（見える化）が可能となった。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

東京農業大学で実施された「平成25年度農薬部会第93回セミナー」において、大気経由の人健康影響に関する事業の紹介の中で、環境省水・大気環境局土壌環境課農薬環境管理室へ本研究課課題についての資料を提供するなどで貢献した。また、土壌くん蒸剤の諸外国における行政的管理措置に関する情報を収集し、本研究成果で得られた日本での現状と比較し、環境省と農林水産省の関連部局に提供した。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

科学的知見に基づいて、実施可能な土壌くん蒸剤の処理量削減程度やガスバリア一性フィルム等の大気漏洩量低減化技術の適用による土壌くん蒸剤の大気中土壌くん蒸剤濃度、すなわち曝露濃度の把握や濃度管理が可能となったため、行政的な管理措置の策定や対策の優先度の決定が可能となる。また、シミュレーションモデルにより各地域の土壌くん蒸剤処理条件下にお
ける土壌くん蒸剤の大気中濃度の実態評価、また、削減技術を適用した場合の低減効果の評価（見える化）が可能となったため、技術指導の根拠とすることが可能である。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7 ．研究成果の発表状況（※別添.報告書作成要領参照）

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1）野村誠、市原勝、小原裕三：高知県農業技術センター研究報告，25，5-10(2016)

「大気中メチルイソチオシアネートの簡易分析法の検討」

## <査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない。

## くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

## （2） 口頭発表（学会等）

1) Y. Kobara, N. Momma and E. Watanabe, 2013 Annual International Research Conference on Methyl Bromide Alternatives and Emissions Reductions, San Diego, USA (2013) "Regional Scale Evaluation of Atmospheric Fumigants in the Kanto and Shikoku (Japan)"

2) N. Momma, Y. Kobara and R. Sato, 2013 Annual International Research Conference on Methyl Bromide Alternatives and Emissions Reductions, San Diego, USA (2013) "Effect of Soil Disinfestation Techniques on Soil Suppressiveness"

3）米本謙悟・田中昭人・三宅圭・村井恒治・小原裕三：九州病害虫研究会第87回研究発表会(2014)「土壌くん蒸剤の広域大気中濃度の初期評価の試み」

4）小原裕三、渡辺栄喜、門馬法明：日本農薬学会第39回大会（2014）「土壌くん蒸剤の広域大気中濃度の初期評価の試み」

5）山本幸洋、原田浩司、横山とも子、武田藍、小原裕三：日本農薬学会第39回大会（2014）「難透過性フィルム被覆下における黒ボク土気相中の土壌くん蒸剤濃度」

6）野村誠、市原勝、小原裕三：日本農薬学会第39回大会（2014）

「土壌くん蒸圃場周辺でのMITC暴露濃度評価法の検討（1）-捕集、前処理方法の最適化-」

7）市原勝、野村誠、小原裕三：日本農薬学会第39回大会（2014）

「土壌くん蒸圃場周辺でのMITC暴露濃度評価法の検討（2）-捕集、前処理方法の最適化」

8）三宅圭、田中昭人、小原裕三、中島典行、大久保潤：日本農薬学会第39回大会（2014）「農業用マルチフィルムの土壌くん蒸剤クロルピクリン透過速度の評価」

9）小原裕三、渡辺栄喜、中島典行、大久保潤、門馬法明：第23回環境化学討論会(2014)「土壌くん蒸剤の大気放出量低減化技術の適用と大気中濃度への反映について」
10) 米本謙悟、田中昭人、三宅圭、村井恒治、小原裕三：日本植物病理学会（2014）

「ガスバリア一性フィルムを利用したクロルピクリン剤畦内拡散とサツマイモ立枯病に対する防除効果」

11) 三宅圭、田中昭人、米本謙悟、中島典行、小原裕三：日本砂丘学会（2014）「土壌くん蒸剤クロルピクリンの水中および砂質土壌中での分解評価」

12) Yuso Kobara, Noriyuki Nakajima: Annual International Research Conference on Methyl Bromide Alternatives and Emissions Reductions, Florida, USA (2014)

“DEVELOPMENT AND PENENETRATION OF GAS-BARRIER FILMS FOR JAPANESE HORTICULTURE”

13) Noriaki Momma, Yuso Kobara: Annual International Research Conference on Methyl Bromide Alternatives and Emissions Reductions, Florida, USA (2014)

“DEVELOPMENT OF A NEW SOIL DISINFESTATION WHICH WORKS UNDER LOW TEMPERATURE.”

14) 野村誠、市原勝、小原裕三：第37回農薬残留分析研究（2014）「大気中MITCの捕集法の検討（第2報）」

16) 米本謙悟、田中昭人、三宅圭、村井恒治、小原裕三：九州病害虫研究会（2015）

「ガスバリア一性フィルムを用いたクロルピクリンの畦内濃度とサツマイモ立枯病に対する防除効果の範囲」

17) 野村誠、市原勝、小原裕三：日本農薬学会第40回大会（2015）

「ガスバリア一性被覆資材による土壌くん蒸剤 MITC の大気環境負荷低減効果の実証」

18) 山本幸洋、原田浩司、武田藍、國友映理子、塩見崇史、小原裕三：日本農薬学会第40回大会(2015)

「黒ボク土におけるガスバリア性フィルム被覆による土壌くん蒸剤の大気中濃度低減効果」

20) 武田 藍，國友映理子，山本幸洋，原田 浩司，小原 裕三：第59回日本応用動物昆虫学会大会（2015）「黒ボク土におけるクロルピクリン処理時のガスバリア一性フィルム被覆によるサツマイモネコブセンチュウ防除効果の改善」

21) 米本謙悟，田中昭人，三宅圭，村井恒治，小原裕三：日本植物病理学会（2015）

「ガスバリア一性フィルムを用いたサツマイモ立枯病に対するクロルピクリン処理間隔の限界と防除効果」

22) Yuso Kobara, Makoto Nomura, Masaru Ichihara, Noriyuki Nakajima: Annual International Research Conference on Methyl Bromide Alternatives and Emissions Reductions, California, USA (2015)

23) Noriaki Momma, Yuso Kobara: Annual International Research Conference on Methyl Bromide Alternatives and Emissions Reductions, California, USA, 2015

“FUNGICIDAL ACTIVITY OF SOIL FUMIGANTS AND ANAEROBIC SOIL DISINFESTATION UNDER LOW TEMPERATURE.”
24）國友映理子、武田藍、山本幸洋、原田浩司、小原裕三、横山とも子：平成27年度日本植物病理学会関東部会（2015）

「黒ボク土露地畑におけるガスバリア性フィルム適用によるクロルピクリン処理量削減の可能性」

25）市原 勝、野村 誠、小原裕三：第33回農薬環境科学研究会・第38回農薬残留分析研究会合同シンポジウム（2015）

「ガスバリア一性能の異なる被覆フィルムを適用したダゾメット剤処理圃場周辺環境中でのMITCモニタリング」

26）野村 誠、市原 勝、小原裕三：第35回農薬製剤・施用法シンポジウム（2015）

「ガスバリア一性フィルムによるMITCの放出抑制効果の検討－製剤型・施用法の違いによる被覆フィルム直下気相中濃度の差－」

27）米本謙悟，田中昭人，大黒香奈美，村井恒治，小原裕三：九州病害虫研究会第89回研究発表会（2016）

「ガスバリア一性フィルムを用いたクロルピクリン処理の最適化とサツマイモ立枯病に対する防除効果」

28）田中昭人，米本謙悟，村井恒治，大黒香奈美，小原裕三，塩見崇史：平成27年度植物防疫関係試験研究発表会（2016）

「ガスバリア一性フィルムを利用したクロルピクリンの大気中への揮散抑制効果」

30）山本幸洋、原田浩司、武田藍、國友映理子、塩見崇史、小原裕三：日本農薬学会第41回大会（2016）

「黒ボク土露地畑における土壌くん蒸時の大気中くん蒸剤濃度の分布と推移」

31）小原裕三、中島典行、山本幸洋、原田浩司、田中昭人、三宅圭、市原勝、野村誠：日本農薬学会第41回大会（2016）

32）野村 誠、市原 勝、小原裕三：日本農薬学会第41回大会（2016）

「室内試験による土壌くん蒸剤(カーバムナトリウム塩・ダブメット)処理時のガスバリア一性フィルム直下気中MITC濃度減衰期(DT_{50}、DT_{90})の簡易推定」

33）中島典行、小原裕三：日本農薬学会第41回大会（2016）

「チオ硫酸アンモニウム（ATS）を用いたクロルピクリン及び1,3-ジクロロプロペンの化学的分解技術の適用評価」

34）小原裕三、中島典行、山本幸洋、原田浩司、田中昭人、三宅圭、市原勝、野村誠：第24回環境化学討論会（2016）

「土壌くん蒸剤の大気中濃度評価のための大気移行フラックスの変動要因について」

## （3） 出願特許
特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1) 「ガスバリア一性フィルムによる土壌くん蒸剤のリスク削減技術」（平成27年10月9日、10日、高知県農業技術センター第24回高知県農業振興フェア（2015）、観客50名）

2) センターフェア2015 研究成果発表会(平成27年11月8日、徳島県立農林水産総合技術支援センター、観客30名)

3) 「知って納得 食と農のおもしろ講座」において、「土に住む生き物たちのおもしろ小話」（平成27年11月14日、千葉県農林総合研究センター公開デー、観客75名）

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## （6） その他

1）野村誠、市原勝、小原裕三：第36回農薬残留分析研究会 ポスター発表優秀賞

2）野村誠、市原勝、小原裕三：第32回農薬環境科学研究会ベストポスター賞

### 8 \. 引用文献

1) Y. Kobara, Y. Yogo, A. Terada and M. Hosomi Masaaki: Journal of Pesticide Science, 37, 1, 28-36 (2012)

2) “Reregistration Eligibility Decision (RED) for Chloropicrin” EPA 738-R-08-009

3) “Reregistration Eligibility Decision (RED) for 1,3-Dichloropropene” EPA 738-R-98-016

4) “Reregistration Eligibility Decision for Dazomet” EPA 738-R-08-007
（２）土壌微生物学的な観点からの土壌くん蒸管理技術の高度化とリスク削減に関する研究

公益財団法人 園芸植物育種研究所

研究開発部 環境科 門馬 法明

平成25～27年度累計予算額：9,227千円（うち平成27年度：2,715千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨]

ガラス製の食料保存用容器を用い、各種病原菌を用いた暴露試験を行った。単純曝露試験では、Fusarium oxysporum、Diaporthe sclerotioides、Verticillium dahliae、Sclerotium rolfsiiの菌叢ディスクをクロルピクリン、MITC曝露した。曝露時の温度を5～35℃に設定して試験を行ったところ、いずれの病原菌においても温度が上昇するにつれ、感受性が高まった。また、クロルピクリンでは、1,3-Dが共存することで殺菌作用が高まる傾向が認められた。

汚染土壌曝露試験では、F. oxsyrpoumの厚壁胞子を含む人工汚染土壌を供試した。この場合にも、曝露時の温度が上昇するにつれ、殺菌効果が強くなることは単純曝露試験と同様であったが、汚染土壌を対象とした場合の方が、病原菌の殺菌に必要な薬剤濃度は低いことが明らかとなった。

高知県農業技術センター内圃場、および高知県内のニラ栽培農家圃場において、ポリエチレンフィルムおよびガスバリア一性フィルムを用い、それぞれキルパー、ダゾメットによる土壌くん蒸消毒で実施し、その前後における土壌微生物の群集構造の解析を行った。千葉県農林総合研究センター内の圃場において、ガスバリア一性フィルムとポリエチレンフィルムを用い、クロルピクリンまたは1,3-Dの処理量を変えて、土壌のくん蒸消毒を千葉県内で実施し、その前後における土壌微生物の群集構造を評価した。その結果、非標的微生物群は、MITCを有効成分とする土壌くん蒸剤では被覆資材の種類による影響を受けにくいこと、クロルピクリンの場合には、特に高温期には糸状菌群の密度低下が顕著になるものの、種構成や多様性については大きな影響を受けないことが明らかとなった。

## [キーワード]

曝露試験、MITC、クロルピクリン、1,3-D、微生物群集構造

### 1. はじめに

土壌くん蒸剤の低減化の限界を明らかにするためには、対象とする病原性土壌微生物を殺菌するために必要な暴露条件（濃度、時間、温度など）を明らかにすることが必要である。しかし、土壌を介した暴露評価試験には、土壌くん蒸剤の濃度の維持と評価が困難なため、科学的根拠に基づく知見が全くない。そのため、病原性土壌微生物の土壌を介した土壌くん蒸剤暴露試験を実施するための標準試験法を構築し、本研究課題で防除対象としているモデルとなる作物病原性土
壊微生物を用いて、土壌くん蒸剤の暴露評価試験（単純暴露試験、汚染土壌暴露試験）を行い、殺菌に必要な暴露条件（濃度、時間、温度の関係）を明らかにすることが必要である。また、土壌くん蒸消毒では、他の土壌消毒法と比較して、非標的微生物群への影響が大きく、しばしば微生物群集の単純化、密度の低下が起こる。これにより、病原菌による再汚染のリスクが高くなり、ひどい場合には、消毒前よりも病害の発生が顕著になってしまうこともある。この作用は、ガスバリア一性フィルムを使うことにより、慣行のフィルムを用いた場合よりも強く表れることが懸念される。このため、ガスバリア一性フィルムの普及に際しては、客観的にリスクを評価したデータが必要なると考えられる。

## 2 ．研究開発目的

土壌くん蒸剤の低減化の限界を明らかにするためには、対象とする病原性土壌微生物を殺菌するために必要な暴露条件（濃度、時間、温度など）を明らかにすることが必要である。しかし、土壌を介した暴露評価試験には、土壌くん蒸剤の濃度の維持と評価が困難なため、科学的根拠に基づく知見が全くない。そのため、病原性土壌微生物の土壌を介した土壌くん蒸剤暴露試験を実施するための標準試験法を構築し、本研究課題で防除対象としているモデルとなる作物病原性土壌微生物を用いて、土壌くん蒸剤の暴露評価試験（単純暴露試験、汚染土壌暴露試験）を行い、殺菌に必要な暴露条件（濃度、時間、温度の関係）を明らかにすることを目的とした。また、ガスバリア一性フィルムを使うことにより、慣行のフィルムを用いた土壌くん蒸消毒と比較して、非標的微生物への影響がより強くなり、再汚染の危険性が高くなることが懸念される。ことのため、土壌くん蒸消毒前後の土壌微生物の群集構造の解析を行い、非標的微生物群への影響を調査することとした。

### 3. 研究開発方法

ガラス製の食料保存用容器（容積4Lまたは2L）を試験容器として用いた。容器の気密性を高めるために、バイトン製のゴム板とガラス板を組み合わせたものを容器と蓋の間に挟み込むように設置した。この容器内に、クロルピクリンを所定量投入し、経時的にガスクロマトグラフィーで気中濃度を測定した。

単純曝露試験では、Fusarium oxysporum、Diaporthe sclerotioides、Verticillium dahliaeを用いた。各供試菌をPotato dextrose agar（PDA）上で1週間～3週間培養した。これより10 mmの菌叢ディスクを作成し、滅菌したガラスシャーレ上に3片ずつ置床し、これをガラス容器内に入れた。菌糸体の他に、F. oxysporumでは分生子、V. dahliaeでは微小菌核が確認された。ガラス容器内にクロルピクリン、1,3-ジクロロプロペン（1,3-D）を所定量滴下し、密閉した状態で25、15、5℃で1～6時間培養した後、菌叢ディスクをPDA上に移植し25℃で1週間培養し、菌糸生育の有無により生存を確認した。

汚染土壌の曝露試験では、Fusarium oxysporumで汚染された土壌を用いた。F. oxysporumをpotato dextrose brothで振とう培養し、定法により無菌的にbud cell懸濁液を得た。これをあらかじめ121℃で60分間滅菌処理をしておいた黒ぼく土壌へ添加し、室温で2年間培養した。これにより土壌中のF. oxysporumは全て耐久生存器官である厚壁胞子となっていると考えられる。この汚染土壌を5 gずつ小型のガラスシャーレに取り分け、ガラス容器内に入れた。そこへ、クロルピ
クリン、1,3-Dを所定量滴下し、密閉した状態で25、15℃で6時間培養した後、汚染土壌を回収し、Fo-G1培地を用いた希釈平板法により、生存菌数を測定した。反復は3とした。

キルパー・ダゾメット処理が土壌微生物相におよぼす影響の評価では、高知県の課題において得られた土壌サンプルについて、希釈平板法およびPCR-DGGE法により微生物群集構造の解析を試みた。キルパー処理は、高知県農業技術センター内の温室を半分に区切り、ガスバリアフィルムおよびポリエチレンフィルムを用いて定法により消毒を実施した。ダゾメット処理は、農家圃場の別の温室において、ガスバリアフィルムとポリエチレンフィルムを用いて定法により消毒を実施した。ダゾメットの処理は農家の作業の都合でことなる時期に実施した。

処理前の土壌、被覆除去直後の土壌の表層5cmを取り除き、その下の約15cmの土壌をサンプリングし、土壌希釈平板法により糸状菌密度、細菌密度、ベルマン漏斗法により線虫密度を測定した。さらにPCR-DGGE法により、糸状菌および細菌群集構造解析を実施した。PCR-DGGE法は農環研の作成した実施マニュアルに従った。得られたバンドパターンより、クラスター解析および多様性指数（Shannon index）の計算を行った。

## 4 ．結果及び考察

試験容器にクロルピクリンを所定量投入し、経時的にガスクロマトグラフィーで気中濃度を測定した結果、24時間経過後も初期濃度の86％のガスが検出された（図(2)-1）。この結果から、単純曝露試験および汚染土壌曝露試験には、この容器を用いることとした。

図(2)-1 試験容器内のクロルピクリン濃度

単純曝露試験において、S. ipomoealは気中曝露下での生存が極めて不安定であり、菌叢ディスク法での評価は不適切であると判断された。S. rolfsiiについては、菌核も用いて気中曝露試験に供試した。しかし、菌核はクロルピクリンおよびMITCに対して極めて耐久性が高く（図(2)-2、3）、その抑制にはより長時間の曝露条件を与える必要があると考えられたため、本研究でも採用した実験系での評価は困難であると判断された。
クロルピクリン濃度 (mg/m³)

図(2)-2 クロルピクリンの Sclerotium rolfsii（菌核）に対する毒性

図(2)-3 MITCの Sclerotium rolfsii（菌核）に対する毒性

F. oxysporum, P. sclerotioides, V. dahliae に対する MITC の毒性を評価した試験では、処理温度が $ 25^{\circ}C $ と $ 15^{\circ}C $ の間では MITC の毒性に大きな差は無かった（表 (2)-1, 2, 3）。しかし、 $ 25^{\circ}C \cdot 15^{\circ}C $ 処理と $ 35^{\circ}C $ 処理を比較すると、前者では MITC の毒性が低下することが示された。同様に、クロルピクリンの毒性を評価した試験でも同様に、処理温度が低下するにつれ、その毒性が低下することが示された（表 (2)-4）。また、クロルピクリンと殺糸状菌作用は無いとされている 1,3-D が共存することにより、クロルピクリンが単独の場合と比較して、病原菌に対する殺菌効果が向上することが明らかとなった。この結果は非常に興味深いものであり、実際の現場における、土壌くん蒸消毒の消毒効果を促進する上で、重要なヒントになるものと考えられた。
表(2)-1 異なる温度条件下におけるMITCのFusarium oxysporumに対する毒性

処理温度	薬剤濃度(μg/L)	培養時間
2h	4h	6h
35℃	0	-	-	3/3
4280	3/3	3/3	3/3
8560	3/3	3/3	0/3
12840	3/3	3/3	0/3
19260	0/3	0/3	0/3
25℃	0	-	-	3/3
14980	3/3	3/3	2/3
19260	3/3	2/3	0/3
21400	2/3	0/3	0/3
23540	2/3	0/3	0/3
27820	2/3	0/3	0/3
15℃	0	-	-	3/3
21400	3/3	2/3	0/3
23540	3/3	0/3	0/3
25680	3/3	0/3	0/3
27820	3/3	0/3	0/3

表(2)-2 異なる温度条件下におけるMITCのPhomopsis sclerotioidesに対する毒性

処理温度	薬剤濃度(μg/L)	培養時間
2h	4h	6h
35℃	0	-	-	3/3
2570	3/3	3/3	0/3
3000	3/3	0/3	0/3
3420	2/3	0/3	0/3
25℃	0	-	-	3/3
4710	3/3	3/3	0/3
5140	3/3	3/3	0/3
5560	3/3	0/3	0/3
15℃	0	-	-	3/3
4710	3/3	3/3	0/3
5140	3/3	0/3	0/3
5560	2/3	0/3	0/3
表(2)-3 異なる温度条件下におけるMITCのVerticillium dahliaeに対する毒性

処理温度	薬剤濃度
( $ μ $ g/L)	培養時間
2h	4h	6h
35℃	0	–	–	3/3
430	3/3	2/3	0/3
860	3/3	0/3	0/3
1280	3/3	0/3	0/3
2570	0/3	0/3	0/3
25℃	0	–	–	3/3
3850	3/3	0/3	0/3
4280	3/3	0/3	0/3
4710	3/3	0/3	0/3
5140	0/3	0/3	0/3
15℃	0	–	–	3/3
4710	1/3	1/3	0/3
5140	1/3	0/3	0/3
5560	0/3	0/3	0/3

表(2)-4 異なる温度条件下におけるクロルピクリンおよび1,3-Dの毒性

暴露温度	薬剤濃度(mg/m³)	Fusarium oxysporum	Diaporthe sclerotioides	Verticillium dahliae
クロピク	1,3-D	3h	6h	3h	6h	3h	6h
25℃	0	4700	3	3	3
1700	0	3	0	3	3	3	3
2600	0	3	0	3	3	3	2
3500	0	2	0	3	3	3	0
1700	2400	3	0	3	3	3	1
2600	3600	3	0	3	2	3	1
3500	4700	0	0	3	0	1	0
15℃	0	5900	3	3	3
3200	0	3	0	3	0	3	2
3700	0	3	0	3	0	3	3
4400	0	3	0	3	1	3	1
3200	4300	3	0	3	0	3	1
3700	5100	3	0	1	1	3	0
4400	5900	3	0	0	0	1	0
5℃	0	9900	3	3	3
5800	0	3	3	3	3	1	0
7300	0	3	3	3	3	1	0
5800	7900	3	1	3	2	0	0
7300	9900	3	1	3	1	0	0

※0:3個体すべて死滅、1:3個体中1個体が生存、2:3個体中2個体が生存、3:3個体中3個体が生存

汚染土壌曝露試験では、まず異なる土壌（黒ボク土壌、砂土、パーライト粉末）および培地とF.oxyporumのbud cellを混合したものを試験に供試した。その結果、処理温度が高くなるほど、
より低濃度のクロルピクリン処理でも病原菌が死滅することが明らかとなった（表(2)-5）。このとき、土壌の種類によって、死滅のために必要な薬剤濃度が異なる事も示された。これには、土壌中の有機物含量や水分などが影響しているものと考えられた。日本国内においては、黒ボク土壤が多いことから、以下の試験では黒ボク土壤を用いることとした。また、F. oxysporumは土壌中では主に厚壁胞子の状態で耐久生存していることから、以降の試験では、厚壁胞子を含む人工汚染土壌を調整し、試験に供試した。

人工汚染土壌は、2014年1月に滅菌した黒ボク土壌にF. oxysporumのbud cell懸濁液を添加し、数ヶ月かん培養することにより調製した。この方法で調製した汚染土壌は、数年間は安定した菌密度を維持することが知られている。よって、以降の試験では、2014年1月に作成した汚染土壌を用いた。この汚染土壌をMITCに曝露したところ、処理温度が低くなることでMITCの殺菌作用が低下した（表(2)-6）。クロルピクリンを用いた場合も同様に、処理温度の低下に伴い、殺菌作用の低下が認められた（表(2)-7）。このとき、単純曝露試験の場合とは異なり、クロルピクリンと1,3-Dの混用による殺菌効果の向上は確認されなかった。このことは、単純曝露試験と比較して、汚染土壌曝露試験では、より低濃度の薬剤濃度条件下でも、病原菌に対する殺菌効果が強く表れたことが関係しているものと考えられる。千葉県の実施した水溶液の試験でも、単純曝露試験（気中曝露試験）と比較して、低濃度の薬剤で殺菌効果が現れることが確認されている。土壌くん蒸消毒に対して適湿の土壌では、病原糸状菌の菌体（厚壁胞子）の大半が水に包まれた状態で存在していると推察される。このことから、薬剤の低減化の可能性については、水溶液試験での評価を元に判断すべきであると考えられた。また、過乾燥した土壌でくん蒸消毒の効果が低下する現象についても、病原菌体の近傍の湿度条件が菌体の感受性に影響していることが関与している可能性も考えられた。

単純曝露試験、汚染土壌曝露試験のいずれにおいても、低温条件下において土壌くん蒸剤の殺菌作用が低下することが示されたものの、実際の現場において検出される薬剤濃度よりも遙かに低濃度で病原菌が完全に抑制されることが確認された。このことから、圃場での薬剤使用量の低減は十分可能であるといえる。しかし、薬剤使用量を削減した場合には、これを均一に処理することが困難になること、濃度ムラが生じやすくなることも考えられる。

また、低温期のくん蒸消毒では、ガスの拡散が緩慢になり、高温期よりも土壌中での濃度ムラが生じやすくなり、特に十分な濃度レベルに達しなかった部位において、病原菌が残存することが予想される。土壌くん蒸では、残存した病原菌による再汚染が大きなリスクとなる。このことから、特に低温期では、ガスバリア一性フィルムを使用することにより被覆下のガス濃度を高く維持し、土壌中における濃度ムラを生じにくくさせる工夫が必要であると考えられた。
表(2)-5 異なる温度条件下におけるクロルピクリンのFusarium oxysporumに対する毒性

処理温度(℃)	薬剤濃度(ppm)	土壤の種類
パーライト	黒术ク土	砂土
25℃	0	5.3 (0.0)※	4.2 (0.1)	5.1 (0.0)
31	3.7 (0.1)	1.9 (0.1)	4.1 (0.0)
62	<1.7	<1.8	1.7 (0.0)
93	<1.7	<1.8	<1.7
15℃	0	5.6 (0.0)	5.4 (0.0)	5.5 (0.0)
30	5.0 (0.0)	5.2 (0.0)	5.2 (0.0)
60	4.3 (0.0)	4.4 (0.0)	4.9 (0.0)
90	3.5 (0.0)	4.4 (0.0)	4.8 (0.1)

$ ^{*} $ Log CFU/g dry matter ( $ \pm $ SE)

表(2)-6 MITCによるトマト萎凋病菌汚染土壤の消毒効果

处理温度	萊劑濃度(μg/L)	培養時間
2h	4h	6h
35℃	0	NT¹	NT	6.5(0.0)
535	4.8(0.2)²	5.1(0.0)	4.1(0.0)
1070	NT	3.7(0.0)	1.7(0.1)
1605	NT	2.5(0.2)	<1.48
2140	<1.48	<1.48	<1.48
25℃	0	-	-	6.2(0.0)
1070	5.0(0.0)	3.7(0.1)	2.6(0.0)
1605	4.4(0.0)	2.7(0.1)	1.7(0.2)
2140	4.0(0.1)	1.9(0.3)	<1.48
2675	3.9(0.1)	<1.48	<1.48
15℃	0	6.0
1070	4.3
2140	3.5
3210	3.2
4280	3.3
5350	2.4

1 Not Tested

2 log CFU/g dry soil ( $ \pm $ SE)
表(2)-7 汚染土壌曝露試験によるクロルピクリンおよび1,3-Dの殺菌効果の評価

薬剤濃度(mg/m³)	生存菌数 Log CFU/g dry soil(±S.E.)
クロルピクリン	1,3-D	25℃	15℃
0	0	5.9(0.01)	5.7(0.07)
0	2499	5.8(0.03)	5.7(0.04)
200	0	ND	4.1(0.08)
400	0	ND	4.3(0.05)
900	0	ND	2.6(0.11)
1700	0	ND	ND
200	300	ND	4.6(0.01)
400	600	ND	4.1(0.02)
900	1200	ND	3.1(0.10)
1700	2400	ND	ND

土壤くん蒸消毒が土壌微生物群集構造におよぼす影響について、MITC剤およびクロルピクリン、1,3-Dについて評価した。まず、高知県の試験では、ガスバリア一性フィルムを用いた処理区について、消毒前後の微生物群の密度を測定した。その結果、ダブメット処理により、土壌中の糸状菌、F.oxyporum、線虫密度は有意に低下した（表(2)-8）。一方で、細菌群については統計的に有意な変化は認められなかった。次に、高知県農業技術センター内で実施したキルパー処理、農家圃場で実施したダブメット処理が、土壌微生物におよぼす影響をガスバリア一性フィルムとポリエチレンフィルムとの間で比較した。その結果、微生物群の単純な密度を比較した場合には、被覆資材の違いによる明確な際は認められなかった（表(2)-9）。しかし、PCR-DGGEのバンドパターンに基づいた多様性指数には、ポリエチレンフィルム区で低くなる傾向があった。クラスター解析では、試験場内のキルパーを用いた試験では、圃場内の微生物群集構造が極めて不均一であったため、被覆資材の違いによる影響を評価することができなかった（図（2）-4）。しかし、消毒の前後で異なるクラスターに分類される傾向が認められた。農家圃場で実施したダブメットを用いた試験では、ガスバリアーとポリエチレンフィルム区で消毒の時期が異なるため、純粋に被覆資材の違いを評価することができなかったものの、被覆資材の違いを反映したクラスターに分類される傾向が認められた（図（2）-5）。

表(2)-8 MITC処理が土壌微生物相におよぼす影響

測定項目	消毒前	消毒後
糸状菌	5.1	4.0 $ ^{*} $
細菌	7.3	7.2
Fusarium oxysporum	2.5	1.7 $ ^{*} $
線虫	218	21 $ ^{*} $

$ ^{*} $ P < 0.05 で有意差有り
表(2)-9 キルパー・ダゾメット処理が土壌微生物におよぼす影響

試験場所	消毒方法	被覆の種類	線虫	糸状菌	細菌
前	後	前	後	前	後
試験場内	キルパー	バリア	71	0	4.6(3.5)	3.6(3.0)	6.7(4.1)	7.3(4.3)
ポリエチ	197	0	4.5(3.0)	3.6(2.7)	6.8(4.2)	7.6(4.1)
太陽熱	バリア	-	25	-	3.7	-	6.7
ポリエチ	-	2	-	4.0	-	6.7
農家圃場	ダゾメット	バリア	74	7	5.1(3.3)	4.0(3.1)	7.4(3.1)	7.3(4.0)
ポリエチ	88	3.3(1.7)	7.5(3.6)

单位 線虫:頭/土20g、糸状菌·細菌:Log CFU/g dry soil、（）內は多様性指数
図(2)-4 キルパー処理前後の土壌微生物群集構造
図(2)-5 ダゾメット処理前後の土壌微生物群集構造解析

次に、千葉県試験では、希釈平板では、高温期にはガスバリア一性フィルムを使用することで、糸状菌密度がより顕著に低下する傾向が認められた（表(2)-10）。一方、低温期には、被覆資材の違いが微生物密におよぼす影響は高温期ほど顕著ではなかった（表(2)-11）。高温期のサンプルについて、PCR-DGGEのバンドパターに基づいた多様性解析を行った。その結果、糸状菌、細菌ともに反復間のバラツキが大きく、一定の傾向を見いだすことはできなかった（表(2)-12）。バンドパターンのクラスター解析では、糸状菌、細菌についてそれぞれ3反復を個別に解析したところ、一定の傾向が認められなかった（データ不掲載）。そこで、3つの反復を統合して解析を行った。その結果、糸状菌については、ガスバリア一性フィルムの高濃度処理区（3μl/穴）をのぞき、薬剤添加量を反映したグループが形成された（図(2)-6上）。細菌については、薬剤を処理しない区は1つのグループに収まったが、それ以外は一定の傾向は認められなかった（図(2)-6下）。1,3-Dを用いた試験では、被覆資材の種類や薬剤処理量に関係なく、全ての処理区で同程度の糸状菌密度、細菌密度が維持されていた（データ未掲載）。
## （）内の数値は標準誤差

表(2)-10 クロルピクリン消毒後の土壌微生物群密度（高温期）

薬量（μl）	糸状菌	細菌
ポリ	バリア	ポリ	バリア
0	4.1 a	4.0 b	6.8 a	6.7 a
1	2.9 bcd	3.0 bc	6.8 a	6.9 a
2	2.2 cde	1.7 e	6.8 a	6.8 a
3	1.9 cde	1.7 e	6.7 a	6.5 a

異なる文字間に有意あり $ (p < 0.05) $

表2−(11) クロルピクリン消毒後の土壌微生物群密度（低温期）

薬量（μl）	糸状菌	細菌
ポリ	バリア	ポリ	バリア
0	4.4 a	4.5 a	6.8 ab	7.0 a
1	2.4 b	2.2 b	6.6 abc	6.5 bc
2	2.3 b	2.3 b	6.5 bc	6.4 c
3	2.4 b	2.0 b	6.5 bc	6.5 bc

異なる文字間に有意あり $ (p < 0.05) $

表(2)-12 クロルピクリン消毒後の土壌微生物群多様性指数（H）

薬量（μl）	糸状菌	細菌
ポリ	バリア	ポリ	バリア
0	2.3 (0.1)	2.2 (0.0)	2.1 (0.2)	2.6 (0.1)
1	0.4 (0.1)	1.7 (0.1)	1.7 (0.0)	2.1 (0.4)
2	1.5 (0.4)	1.1 (0.8)	2.0 (0.6)	1.1 (0.6)
3	1.5 (0.8)	2.2 (0.2)	1.2 (0.5)	1.4 (0.3)

高温期の試験において採取した土壌サンプルを供試。
図(2)-6 微生物群集構造の類似度解析（上：糸状菌群、下：細菌群） 同一処理区の同一バンドの輝度の平均値を用い、ユークリッド 距離を用いたward法によりクラスター解析を行った。

土壌くん蒸消毒が土壌微生物相にあたえる影響については、ガスバリア一性フィルムとポリエチレンフィルムとの間に大きな差はないと判断された。ただし、薬剤無処理区とは明らかに微生物群集構造が異なっていることが明らかになった。このような群集構造の変化、特に微生物相の単純化や密度の低下が土壌の発病抑止性へ影響していることを示す報告も多い。本プロジェクトで実施したでは、ガスバリア一性フィルムとポリエチレンフィルムを使った場合とで、微生物群集構造に明確な差が認められなかったことから、ガスバリア一性フィルムを使うことで慣行のフィルムと比較して土壌の発病抑止性が極端に低下するといった問題は生じないと考えられた。このことは、ガスバリア一性フィルムの普及を進めていく上で重要な情報となると考える。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

土壌を介した土壌くん蒸剤の曝露評価試験の方法として、ガラス容器を用いた簡便な試験法を構築した。この試験法を用いた試験により、対象とする病原性土壌微生物を殺菌するために必要な暴露条件については、単純曝露試験よりも、汚染土壌曝露試験や水溶液系での曝露試験の方がより適していることが示された。また、ガスバリア一性フィルムと慣行のフィルムを用いた土壌
くん蒸消毒が非標的微生物へおよぼす影響を比較した試験結果より、ガスバリア一性フィルムを使った場合にも、非標的微生物の密度低下や多様性への影響については、慣行のフィルムと大きな差はないことが明らかとなった。

## （２）環境政策への貢献

＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

ガスバリアー性フィルムの適用した場合にも、慣行のフィルムと比較して極端に微生物群の多様性や密度低下が起こることが無いことが示された。このことは、土壌くん蒸消毒後の病原菌による再汚染のリスクが、慣行のフィルムと比較して極端に高まるようなことはないことを示唆するものである。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

### 7 ．研究成果の発表状況（※別添.報告書作成要領参照）

（1）誌上発表

<論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない。

<査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない。

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない。

（2）口頭発表（学会等）

1) Noriaki Momma, Yuso Kobara, Ryoma Sato: Annual International Research Conference on Methyl

Bromide Alternatives and Emissions Reductions, California, US, 2013

“Effects of soil disinfestations on soil suppressiveness”

2) Noriaki Momma, Yuso Kobara: Annual International Research Conference on Methyl Bromide

Alternatives and Emissions Reductions, Florida, US, 2014

“Development of a new soil disinfestation which works under low temperature.”

3) Noriaki Momma, Yuso Kobara: Annual International Research Conference on Methyl Bromide Alternatives and Emissions Reductions, California, US, 2015
“Fungicidal activity of soil fumigants and anaerobic soil disinfestation under low temperature.”

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1) 第24回農業振興フェア「土壌病害防除におけるガスバリア一性フィルムの有用性」（主催：高知県農業技術センター、2015年10月9日、高知県農業技術センター、参加者約50名）にて講演

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない。

## （6） その他

特に記載すべき事項はない。

### 8. 引用文献

1）特に記載すべき事項はない。
平成 24 年度

環境研究総合推進費補助金 研究事業

# 総合研究報告書

# 変異・融合酵母による稲藁の高度エタノール発酵技術の開発

（K2411、）K2339、K22027

平成25年3月

明星大学 田中 修三
補助事業名 環境研究総合推進費補助金研究事業（平成22年度～平成24年度）

所管 環境省

国庫補助金 44,257,000 円（3 年度の総計）

研究課題名　変異・融合酵母による稲藁の高度エタノール発酵技術の開発

研究期間 平成22年4月1日～平成25年3月31日

研究代表者名 田中修三 (明星大学)

研究分担者 なし
## 目次

総合研究報告書概要
- 1

本文
- 1. 研究背景と目的
- 1.1 研究背景
- 1.2 研究目的

2. 研究方法
- 2.1 亜塩素酸・重曹法による前処理
- 2.2 低温性セルラーゼによる糖化
- 2.3 変異・融合酵母による発酵

3. 結果と考察
- 3.1 亜塩素酸・重曹法による前処理
- 3.2 低温性セルラーゼの産生と糖化活性
- 3.3 細胞融合による変異・融合酵母の獲得
- 3.4 融合酵母 FSC1 株の改良と改良酵母による稲藁の並行複発酵

4. 結論
- 5. 参考文献
- 6. 研究発表
論文発表
学会等発表

7. 知的財産権の取得状況
- 研究概要図
- 英文概要
研究課題名：変異・融合酵母による稲藁の高度エタノール発酵技術の開発

研究番号 :(K2411、) K2339、K22027

国庫補助金清算所要額：44,257,000 円（3 年度の総計）

研究期間：平成22年4月1日～平成25年3月31日

研究代表者名：田中修三（明星大学）

研究分担者：なし

## 研究目的

稲藁を原料として、前処理によるセルロース結晶構造（以下結晶構造という）の改変、低温性セルラーゼによる糖化及び変異・融合酵母による発酵を行う高度エタノール発酵技術を開発する。具体的には、エタノール発酵の障害となる稲藁のリグニンや結晶構造、酵素糖化（55℃）と発酵（30℃）の最適温度の違い及びSaccharomyces酵母がキシロースを利用しないこと等の問題に対して、本研究では亜塩素酸塩による脱リグニンと重曹による結晶構造の改変、Trichoderma変異株による低温性セルラーゼの産生・糖化及びSaccharomyces変異株とCandida変異株によるキシロース利用変異・融合酵母の獲得・発酵を行い、技術的な解決を図る。全体目標として、前処理済み稲藁の糖化率90%、30℃活性の高いセルラーゼの産生及びエタノール収率0.4（kg/kg前処理済み稲藁）をめざし、これらの要素技術を統合した並行複発酵方式の高度エタノール発酵技術を開発する。

## 研究方法

前処理：ブレンダー粉砕した稲藁に対して、亜塩素酸 Na と酢酸の反応で生成する塩素種により弱酸性域でリグニンの可溶化・除去を行い、その後重曹水溶液に浸けた熱処理で繊維束の膨潤と結晶構造の改変を行う。この亜塩素酸・重曹法の処理条件と効果（脱リグニン、弛緩処理、結晶構造改変、副産物生成、糖化率など）に関する実験を行い、前処理済み稲藁の糖化率90％を目指した前処理プロセスを確立する。また、SEM 観察、X 線回折及び FT-IR 解析等により前処理による脱リグニンと結晶構造の改変を解析する。

低温性セルラーゼによる糖化：セルラーゼ産生 T. reesei を野生株（以下 WT 株という）として紫外線により変異処理し、並行複発酵方式のためのセルラーゼを産生する変異株を獲得・育種する。具体的には、T. reesei の亜硝酸添加・紫外線処理により得た変異株が産生する酵素タンパクをドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下 SDS-PAGE という）等による分離・解析を行ない、30℃で十分な活性を保持する低温性セルラーゼの生産技術を開発する。目標は前処理済み稲藁の糖化率 90% を可能にするセルラーゼの産生と糖化条件を確立することであり、また稲藁を炭素源としたセルラーゼ産生も検討する。酵素タンパクとしては β グルコシダーゼ（BGL）、セロビオヒドロラーゼ I（CBH I）、セロビオヒドロラーゼ II（CBH II）、エンドグルカナーゼ（EG）及びキシラナーゼ（XYN）について解析した。

変異・融合酵母による発酵：酵母 S. cerevisiae と C. intermedia をメタンスルホン酸エチル（EMS）で変異処理し、キシロース取込み能を向上させた S. c. 変異株とキシロース代謝遺伝子を持つ C. i. 変異株とのプロトプラスト融合を行い、キシロース利用変異・融合酵母を獲得する。メタボローム解析により変異・融合酵母のキシロース代謝機構を解析し、さらにタンパク・遺伝子
解析により遺伝学的特徴も調べる。その上で、前処理、低温性セルラーゼ及び変異・融合酵母をもって、稲藁を原料とする並行複発酵方式でエタノール転換率0.4（kg/kg前処理済み稲藁）を達成することを目指す。流入負荷50（g稲藁/L）で、プロセスの効率や運転条件等を検討し、稲藁に対する前処理、低温性セルラーゼ及び変異・融合酵母による並行複発酵方式の高度エタノール発酵技術を開発する。

## 結果と考察

本研究により、稲藁を原料とするエタノール発酵において、前処理、低温性セルラーゼ及び融合酵母に関して得られた知見と技術は以下の通りである。

## ・亜塩素酸・重曹法による前処理

稲藁の前処理は、酢酸酸性域での亜塩素酸 Na（ASC）処理による脱リグニンと重曹（SB）処理による膨潤化とセルロース結晶構造の改変を行った。稲藁はASC処理により脱リグニンされ、SB処理により膨潤した微細繊維（ミクロフィブリル）に変化し、特に（3回ASC＋SB）処理が最大の効果を発揮した（図1）。稲藁のリグニン量は約14%（乾重%、クラーソン法）、κ価は約16であり、（3回ASC＋SB）処理によりリグニン除去率88%（処理後リグニン量1.7%）を達成した（図2）。FTIR解析から、ASC処理は主にリグニン構造コニットを除去し、SB処理は内部リグニンの除去に関与することが分かった。稲藁の前処理はASC処理の後にSB処理を行う必要があり、その逆順では効果が低い。

生成される塩素種の分析から、リグニンは亜塩素酸イオンにより酸化・除去、すなわち脱リグニンされ、亜塩素酸イオンは塩化物イオンに還元されることが分かった。ASC処理のみでは亜塩素酸があっても内部リグニンが除去されず、SB処理による膨潤化が脱リグニンを完遂するのに重要な役割を果たすことが確認された。

稲藁の結晶構造の変化について X 線回折と FTIR 解析を行った結果、3 回 ASC 処理による表面リグニンの除去により結晶性が見かけ上増加し、その後 SB 処理を施すと再び減少するが、これは膨潤・微細繊維化と共にミクロフィブリルの非晶質化が起きているためと推測された。セルロースの結晶型は、(3 回 ASC＋SB) 処理を施すことによって、無処理稲藁のタイプ I から、結晶密度が低くかつ分解性の高いタイプ II に変化した。

結晶セルロース末端からセロビオースを分離する CBHI（Cel7A ともいう）用いて糖化に対する前処理効果を調べたところ、3 回 ASC 処理と SB 処理の単純加算の糖化率は 40% であり、(3 回 ASC＋SB）処理は 85% という 2.1 倍の相乗効果を示した。糖化に対する前処理の効果を工業用セルラーゼによる糖化で調べたところ、無処理稲藁は 48 時間でも糖化率 20% に留まったが、(3 回 ASC＋SB）処理を行うと 6 時間で 86% に達した（図 3）。糖化速度では、(3 回 ASC＋SB）処理が 0.22（wt./wt./h）であり、無処理の 11 倍の糖化速度であった。

図1 前処理済み稲薫の SEM 写真

A：無処理、B：3回ASC処理、C：SB処理

D：(SB+3回ASC)処理、E：(3回ASC+SB)処理、F：Eの拡大（ミクロフィブリル）

図2 稲藁の前処理によるリグニン量の変化

Ctrlは無処理、α（白菱形）はSB処理、β（白円）はASC処理、γ（黒菱形）は（SB+ASC）処理、ε（黒円）は（ASC+SB）処理、1～3は処理回数

図3 稲藁の酵素糖化に対する前処理の効果

Ctrl：無処理、3xASC：3回ASC処理、3xASC+SB：(3回ASC+SB)処理、Avicel：アビセルセルロース、糖化：(Celluclast 1.5L+Novozym 188)による50℃での糖化
・低温性セルラーゼによる糖化

低温（30℃）で十分な活性を有するセルラーゼを産生する株を獲得するために、T. reeseiをWT株として亜硝酸添加・UV照射による変異処理と選択培地による選別で改良し、その変異株MT957のセルラーゼ産生能と糖化活性を調べた。セロビオースに対するBGL活性（以下CBU活性という）では、MT957株は30℃で約110(CBU/mg)であり、WT株の3倍及び工業用セルラーゼC1.5Lの6倍高い値を示した。フィルターペーパーユニット活性（以下FPU活性という）では、30℃活性が対50℃活性でC1.5Lが20％に低下したが、MT957株セルラーゼは40％を保持し、C1.5Lの約2.5倍の活性を示した。MT957株セルラーゼは単糖への転換量が2.5 g/L（単糖・二糖量の77%）であり、WT株とC1.5Lに比べて2倍以上であった。MT957株が産生するセルラーゼをSDS-PAGEで分離した結果、BGL、CBH1、CBH2、EG及びXYNに相当するバンドが確認された（図4）。二次元電気泳動解析によると、MT957株はセルラーゼ成分のBGL、CBH及びEGの発現量がWT株よりかなり増加していた。

MT957 株セルラーゼの各種セルロースに対する糖化活性を調べたところ、温度 30℃で WT 株に比べて α セルロース活性が 3.6 倍、アビセル（微結晶セルロース）活性が 5.4 倍及びカルボキシメチル化セルロース（CMC）活性が 2 倍高く、C1.5L に比べるとそれぞれ 3.3 倍、3.5 倍及び 4 倍高い活性を示した（図 5）。温度が 50℃から 30℃に低下すると、WT 株と C1.5L の活性が 40%程度に低下するのに対して、MT957 株セルラーゼは約 70%を保持しており、低温（30℃）域で十分な活性を持つ低温性セルラーゼを生産できることを確認した。

精製・分離したセルラーゼ成分のαセルロース糖化への寄与を解析したところ、EGを添加するとCBH1とCBH2の活性は高くなり、特にCBH1の活性が約7倍に向上した。（EG+CBH1+CBH2）系では糖化速度がEG無添加系に比べて3.5倍に向上し、糖化の初期段階で関与するEGの存在が重要であることが分かった。一定量の酵素（E）CBH1とCBH2に対して基質（S）との重量比（E/S比）を変えた結果、30℃で $ E_{EG}/S $ 比が0.02～0.05の範囲でEG添加の相乗効果が見られた。

亜塩素酸・重曹法で前処理した稲藁を用いて MT957 株セルラーゼによる糖化を調べたところ、MT957 株セルラーゼは乾燥稲藁に対して約 86% の糖化率であり、本研究の目標値 90% に近い糖化率を達成できた（図 6）。

稲藁をセルラーゼ産生の炭素源として利用するため、各種粉砕稲藁に対してMT957株が産生する酵素タンパク量を調べたところ、ボールミル粉砕で標準セルロースの1.2倍のセルラーゼが得られた。酵素成分をSDS-PAGEで分離した結果、粉砕稲藁の産生酵素は標準セルロース産生酵素よりEGとBGLとXYNのバンドがより濃く現れ、キシランをキシロースに糖化するXYNが多いことは、単糖への糖化が促進され、後段のエタノール発酵に有利に働く可能性が示された。稲藁炭素源のMT957株セルラーゼによる糖化活性において、高い比活性を示したのは30mmボールミル粉砕稲藁であり、酵素産生の炭素源として利用できることが分かった。

図4 SDS-PAGEによるセルラーゼ成分の分離

図5 セルラーゼの各種セルロースに対する活性

図6 亜塩素酸・重曹法で前処理した稲藁のセルラーゼによる糖化 条件：温度30℃、pH4.8、DNS 還元糖測定、酵素添加量は基質の1/100（mg/mg）