Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
春季大会、東京（2015）

「海洋酸性化の生物影響－1：ウバガイ稚貝の成長に与える影響」

9) 諏訪僚太、山本雄三、林正裕、吉川貴志、箕輪康、渡遙裕介、野尻幸宏：平成27年度日本水産学会春季大会、東京（2015）

「海洋酸性化の生物影響－2：シロギスの再生産に与える高水温との複合影響」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない。

## （４）「国民との科学・技術対話」の実施

1) 海洋生物環境研究所実証試験場研究所特別公開（2014年10月18日、参加者約330名）にて成果紹介（パネル展示）

2) 海洋生物環境研究所実証試験場 設立30周年記念 海の市民講座 「柏崎の海と生きもの」 （主催：海洋生物環境研究所実証試験場、2014年10月19日、柏崎市市民プラザ波のホール、観客約90名）にて成果紹介（パネル展示）

3) 研究成果報告会「海洋酸性化がわが国周辺の生物に与える影響を評価する」（主催：環境研究総合推進費2A-1203課題、2015年2月21日、TKP市ヶ谷カンファレンスセンター6Aルーム、観客約40名）にて講演

## （５）マスコミ等への公表・報道等

1）「海洋酸性化魚類への影響」日刊水産経済新聞（平成26年7月18日、6頁）

## (6) その他

特に記載すべき事項はない。

### 8 \. 引用文献

1) Baumann, H., Talmage, S. C. and Gobler, C. J. (2012). Reduced early life growth and survival in a fish in direct response to increased carbon dioxide. Nature climate change, 2:38-41.

2) Checkley, D. M., Dickson, A. G., Takahashi, M., Radich, J. A., Eisenkolb, N. and Asch, R. (2009). Elevated $ CO_{2} $ enhances otolith growth in young fish. Science, 324:1683.

3) Frommel, A. Y., Maneja, R., Lowe, D., Malzahn, A. M., Geffen, A. J., Folkvord, A., Piatkowski, U., Reusch, T. B. H. and Clemmesen, C. (2012). Severe tissue damage in Atlantic cod larvae under increasing ocean acidification. Nature Climate Change, 2:42-46.

4) Hotta, K., Tamura, M., Watanabe, T., Nakamura, Y., Adachi, S. and Yamauchi, K. (2001). Changes in spawning characteristics of Japanese whiting Sillago japonica under control of temperature. Fish. Sci., 67: 1111-1118.

5) IPCC (2006). Special Technical Report, Carbon Capture and Storage. IPCC, Geneva.

6) Kikkawa, T., Ishimatsu, A. and Kita, J. (2003). Acute $ CO_{2} $ tolerance during the early developmental stages of four marine teleosts. Environmental Toxicology, 18, 375-382.
7) Kikkawa, T., Kita, J. and Ishimatsu, A. (2004). Comparison of the lethal effect of $ CO_{2} $ and acidification on red sea bream (Pagrus major). Marine Pollution Bulletin, 48:108-110.

8) 熊井英水・中村元水 (1977). キスの自然産卵について. 近大農紀要, 10: 39-43.

9) 益田一・荒賀忠一・吉野哲夫 (1975). 魚類図鑑南日本の沿岸魚. 東海大学出版会, 379pp

10) Miller, G. M., Watson, S. A., Donelson, J. M., McCormick, M. I. and Munday, P. L. (2012). Parental environment mediates impacts of increased carbon dioxide on a coral reef fish. Nature Clim. Change, 2:858-861.

11) Munday, P. L., Gagliano, M., Donelson J. M., Dixson, D. L. and Thorrold, S. R. (2011a). Ocean acidification does not affect the early life history development of a tropical marine fish. Marine Ecology Progress Series, 423:211-221.

12) Munday, P. L., Hernaman, V., Dixson, D. L. and Thorrold, S. R. (2011b). Effect of ocean acidification on otolith development in larvae of a tropical marine fish. Biogeosciences, 8:1631-1641.

13) Pierrot, D., Lewis, E., Wallace, D.W.R. (2006). MS Excel Program Developed for CO $ _{2} $ System Calculations. ORNL/CDIAC-105a. Carbon Dioxide Information Analysis Center, Oak Ridge National Laboratory, U.S. Department of Energy, Oak Ridge, Tennessee.

14) Réveillac, E., Lacoue-Labarthe, T., Oberhänsli, F., Teyssie, J.-L., Jefree, R., Gattuso, J.-P. and Martin, S. (2015). Ocean acidification reshapes the otolith-body allometry of growth in juvenile sea bream. J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 463:87-94.

15) 芹澤正和・飯塚宗雄・武田正倫・成瀬宇平編著 (2003). 日本の食材図鑑 生鮮食材篇. 小学館, 38pp

16) Wittmann, A. C. and Pörtner H. O. (2013) Sensitivities of extant animal taxa to ocean acidification. Nature Clim. Change, 3:995-1001.
## （4） 植物プランクトンの増殖における水温と海洋酸性化の影響

一般財団法人電力中央研究所

環境科学研究所 大気・海洋環境領域 芳村 毅

平成24～26年度累計予算額：28,438千円

（うち、平成26年度予算額：9,419千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

水温と$\mathrm{CO}_{2}$分圧（pH）は植物プランクトンの増殖と密接に関連する環境因子であり、これらの変化は植物プランクトンの動態を変化させる可能性がある。海洋生態系の将来変化を予測するうえでは、生態系の基盤を支える植物プランクトンの増殖に対するこれらの因子の影響を評価する必要がある。ただし、培養実験による影響評価の研究は限られており、特に有機物生産に対する影響を評価した研究例は乏しい。そこで、本サブテーマでは、単離株を用いた室内実験と沿岸海水中の現場プランクトン群集を用いた現場実験により、植物プランクトンの増殖と有機物生産に対する水温と$\mathrm{CO}_{2}$分圧増加の影響を調査した。珪藻および円石藻単離株の培養実験では、水温増加により比増殖速度は直線的に増加し、有機物生産は直線的に減少した。また、有機物生産に占める溶存態画分の割合も水温増加に伴って減少することがわかった。一方、$\mathrm{CO}_{2}$分圧増加の影響は水温増加と比較して小さかった。沿岸海水を用いた培養実験では、水温増加は植物プランクトン群集の増殖速度を促進する傾向があったが、生物量のピーク値を変化させることはなかった。一方、$\mathrm{CO}_{2}$分圧増加の有意な影響は見られなかった。プランクトン群集による有機物生産は粒子態と溶存態画分で異なる応答を示すものの、影響は主に水温増加によりもたらされ、$\mathrm{CO}_{2}$分圧増加の有意な影響はほとんど見られなかった。ただし、秋季の実験ではどの水温実験区においても$\mathrm{CO}_{2}$分圧増加が粒子態有機物の生産を増加させることから、時期によっては酸性化の影響を十分考慮する必要があることがわかった。以上の単離株と現場プランクトン群集を用いた複数の実験結果から、近未来の植物プランクトンの動態は主に水温増加の影響を受け、$\mathrm{CO}_{2}$分圧増加の影響は比較的小さいことが示唆された。

## [キーワード]

二酸化炭素、海洋酸性化、地球温暖化、植物プランクトン、有機炭素生産

### 1. はじめに

植物プランクトンは海洋の物質循環を支配する生物群であり、海洋生態系において重要な役割を果たしている。植物プランクトンが光合成により生産する有機物は食物網への餌（エネルギー）供給源となっている。また、有機物生産は炭素、窒素、リンなどの生元素の循環を駆動し、海洋へのCO₂吸収および物質循環の中心的な役割を果たしている。植物プランクトンは粒子態有機物（POM）を生産し、その一部は細胞外排出や捕食過程により溶存態有機物（DOM）に変換される。POMとDOMは食物網および物質循環において異なる役割を果たしており、海洋生態系を理解するうえでは両者の有機物の動態を定量的に把握する必要がある（Passow and Carlson, 2012）。植物プランクトンの有機物生産の変化
は海洋の生物生産だけでなく海洋炭素循環の変化をもたらす可能性があることから(Falkowski, 2012)、植物プランクトンが海洋環境の変化にどのように応答するかは地球環境の将来を予測するうえで不可欠な知見である。

植物プランクトンの生息する海洋表層の環境は大きく変化しつつある。人為活動に伴う大気CO₂濃度の増加は、地球温暖化をもたらし、海表面水温を増加させている。さらに、海水へのCO₂溶解量の増加に伴い、表層海水のCO₂分圧の増加とpHの低下が進行しており、海洋酸性化として認識されている。水温とCO₂分圧（pH）は植物プランクトンの光合成、呼吸、石灰化などの生理過程と密接に関連する因子であり、これらの変化は植物プランクトンの動態を変化させる可能性がある。ただし、将来の水温とCO₂分圧の増加が植物プランクトンの有機物生産過程に与える影響に関する知見は限られているのが現状である。植物プランクトンの有機物生産の量的な変化あるいはPOMとDOMの生産割合の変化など質的変化は海洋生態系に変化をもたらし得ることから、気候フィードバック解明のカギとなる。現実海洋の将来的な応答を評価するためには、種レベル実験から現場プランクトン群集実験までが必要とされている。

海洋酸性化問題が強く認識されるようになった最近約10年に海洋酸性化の影響評価研究は飛躍的に増加した。研究対象の中心は海水のpHの低下に脆弱であると考えられているサンゴやウニ、貝類などの石灰化する底生動物である（諏訪ら、2010）。植物プランクトンに関しても、細胞の表面に炭酸カルシウムの鱗片である円石を有する円石藻類はpHの低下に脆弱であることが報告されて以降（Riebesell et al., 2000）、円石藻を用いた影響評価実験が多く行われてきた（杉江・芳村、2011）。また、細胞サイズが比較的に大型である珪藻類は細胞が珪酸質の被殻に覆われた単細胞生物であり石灰化生物ではないが、海洋の基礎生産量の約40％を担っており（Sarthou et al., 2005）、海洋生態系で非常に重要な役割を果たしていることから、海洋酸性化影響評価の対象生物として用いられてきた（杉江・芳村、2011）。海洋酸性化は光合成の基質であるCO₂の濃度を増加させるため、植物プランクトンの増殖を促進する可能性がある一方（Riebesell et al., 1993）、阻害するケースも報告されている（Gao et al., 2012）。また、珪藻や円石藻などの単離株を用いた室内実験だけではなく、現場海水のプランクトン群集をボトル内で培養するマイクロコスム実験や数千リットル程度の大型バッグ内で培養するメソコスム実験も実施されてきた（杉江・芳村、2011）。

世界中で実施されている海洋酸性化の影響評価実験によりデータは蓄積されつつあるが、近年はCO $ _{2} $ 分圧増加およびpH低下だけへの応答ではなく、水温増加も合わせて考慮した複合影響を評価する必要性が認識されている（Boyd and Hutchins, 2012）。しかし、水温増加とCO $ _{2} $ 分圧増加を組み合わせた培養実験による植物プランクトンの増殖への影響評価、特に有機物生産量の変化に着目した研究はいくつかの単離株実験（Borchard and Engel, 2012）および現場海水実験（Kim et al., 2011）に限られているのが現状である。将来の海洋生態系の変化を予測するためには、水温とCO $ _{2} $ 分圧の複合影響に関するより多くの実験データを取得して、変化をもたらすメカニズムを解明する必要がある。

### 2. 研究開発目的

植物プランクトンの増殖速度と生産する有機物の量および質が水温とCO₂分圧が増加した環境下においてどのように変化するのかを培養実験により明らかにする。ここでは、珪藻と円石藻という石灰化をしない群とする群を対照して、これまでほとんど実験例のない水温増加とCO₂分圧増加の複合影響を、単離株による実験室レベル実験と沿岸海水（現場プランクトン群集）による現場型培養実験の両
者から評価する。過去の研究（Gao et al., 2012）では、植物プランクトンの増殖に対してCO₂分圧増加は光量が低い場合は促進効果を、光量が高い場合（200 μmol photons/m²/s以上）は阻害効果を示すことが報告されていることから、単離株実験では高光量と低光量において影響評価実験を行って結果を比較する。植物プランクトンが生産した有機物はPOMとDOMに分画し、両者の炭素量を測定する。これにより、粒子態有機炭素（POC）および溶存態有機炭素（DOC）を測定するとともに、粒子態と溶存態の生産比率を明らかにする。また、円石藻および現場プランクトン群集の実験では炭酸カルシウム殻の生産量の変化を明らかにするため粒子態無機炭素（PIC）を測定する。得られた実験的事実に基づき、有機物生産量および炭酸カルシウム生産量が将来の環境下で量的および質的にどのように変化する可能性があるのかを予測・検討する。

## 3 ．研究開発方法

## （１）単離株を用いた影響評価実験

## 1 ）藻類種と保存株

海洋生態系における重要性が高い二大藻類グループである珪藻類と円石藻類を実験対象とした。珪藻類は細胞が珪酸質の被殻に覆われ、円石藻類は細胞の表面に炭酸カルシウムの鱗片である円石を有していることを特徴としている。沿岸から外洋に分布する種をモデル藻類として選定した(表(4)-1)。珪藻株はProvasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton (NCMA)から、円石藻株は萩野恭子氏（現岡山大学）から分譲され、f/2培地（Guillard，1975）を用いて17℃および100μmol photons/m²/s（14時間：10時間の明暗周期）の光合成有効放射（photosynthetically active radiation、PAR）の環境条件で継代培養しているものを実験に用いた。

表(4)-1 実験に使用した植物プランクトン種の情報。

藻類
グループ	種	株	株採取時
の水温	特徴
珪藻	Thalassiosira oceanica	CCMP1005	22.7 ℃	外洋性種。
Thalassiosira pseudonana	CCMP1335	不明	沿岸性でブルームを形成しない種。
Thalassiosira weissflogii	CCMP1336	不明	沿岸性でブルームを形成する種（赤潮種）。
円石藻	Gephyrocapsa oceanica	MM4-6	17.0 ℃	沿岸から外洋まで分布する種。日本沿岸において大発生が見られる場合がある。
Emiliania huxleyi	MT0610A	17.7 ℃	沿岸から外洋まで分布する種。

## 2 ）水温および光量に関する増殖特性の把握

水温およびCO₂分圧の増加に対する応答を把握するための影響評価実験を行うのでの培養条件を決定するため、7段階の水温（4、8、12、16、20、24、28℃）において6-7段階のPAR（約25-600μmol photons/m²/sの範囲）条件で比増殖速度の変化を測定した。実験は白色蛍光灯を光源とする植物インキュベータ内で行った。明暗周期は14h：10hに設定した。培地は、あらかじめ実験室内の空気を5mL/minの流量でバブリングすることにより、水温の違いにかかわらず一定のCO₂分圧の条件に調節した後、容量45mLガラス試験管の30mLのf/2培地に保存株を接種した。珪藻は培養期間中もバブリングを継続す
る一方、円石藻はバブリング自体により増殖が阻害されることが先行研究により明らかになっているため、円石藻の培養中はバブリングを停止した。各株を実験条件下で5世代以上培養して馴致させた後、指数増殖を維持しながら新たな培地に植え継ぎ、連続して3回以上の培養でデータを取得した。

毎日の植物プランクトンの生物量の測定結果をもとに、培養時間（日）に対する生物量の自然対数の回帰直線の傾きとして比増殖速度を計算した。倍加時間1日（1日1分裂）の場合、比増殖速度は0.69 $ day^{-1} $ となる。生物量は蛍光光度計（ターナーデザイン社製、10-AU）で測定した生体内クロロフィル蛍光（in vivo蛍光）により把握した（Wood et al., 2005）。10-AUのランプおよび波長調整フィルターはオプティカルキット10-096Rを用いた。In vivo蛍光値は測定直前に受けた光の履歴により変化することが知られているため（Suzuki et al., 2002）、インキュベータの光源が点灯する1時間前の暗期にin vivo蛍光を測定した。

## 3 ）水温およびCO $ _{2} $ 分圧の増加に対する応答の把握

2)の実験で明らかにした各株の増殖特性をもとに、水温は各株の比増殖速度が直線的に増加する水温帯である12、16、20℃の3段階で実施した。PARは、珪藻では高光量として各株の比増殖速度がほぼ飽和する300μmol photons/m²/sおよび低光量として25μmol photons/m²/sを、円石藻では高光量として各株の比増殖速度がほぼ飽和する200μmol photons/m²/sおよび低光量として50μmol photons/m²/sで実施した。実験は白色蛍光灯を光源として恒温実験室で行った。明暗周期は14h：10hに設定した。将来のCO₂排出シナリオによる大気CO₂濃度範囲を考慮し、xCO₂調整済みの空気(400、550、750、1000ppm)を培地に直接バブリングすることによりCO₂分圧を4段階に調節した。xCO₂調整済み空気はゼロガス精製装置（紀本電子社製、ZGG-07C）およびCO₂ガス調整装置（紀本電子社製、CGM-10C）により生成した。すなわち、本実験では高光量と低光量のPAR条件下において水温3段階とCO₂分圧4段階を組み合わせた実験区で珪藻および円石藻を培養して応答を把握した。

IPCC第5次報告書を参考にすると、本実験で設定したCO $ _{2} $ 分圧の400 ppmから1000 ppmへの増加は、水温に関して4℃の増加と大まかに一致すると考えられる。水温4℃分の増加とCO $ _{2} $ 分圧600 ppm分の増加に対する植物プランクトンの応答を比較することによって、水温とCO $ _{2} $ 分圧の相対的な重要性を比較することができる。

## a 垙藻

先行研究で構築したCO₂分圧調節培養実験システムを発展させ、恒温実験室での水温制御を組み合わせた培養システムを構築した（図(4)-1）。培養にはf/2培地を用いたが、培地中のDOCのバックグラウンド濃度が高く、培養中の珪藻が生産したDOCを測定するうえで支障となるため、EDTAを含む微量金属保存溶液の添加量を1/10にした。培養期間中に培地の微量金属栄養塩が不足しないことはあらかじめ確認した。保存株は容量45 mLガラス試験管の実験培地30 mLに接種後、実験条件下で5世代以上培養して馴致させた。その後、実験培地55 mLを含む容量80 mLガラス試験管8本に株を接種し、培養実験を開始した。試験管2本は実験開始時試料としてクロロフィルー（Chl-a）、細胞数、細胞体積、POC、DOC、pHを測定した。また、培養終了後、Chl-a、細胞数、細胞体積、POC、DOC、栄養塩、全アルカリ度（TA）、全炭酸（DIC）、pHを測定した。比増殖速度は毎日測定したin vivo蛍光をもとに算出した。
図(4)-1 恒温培養室におけるガラス試験管を用いた珪藻単離株の培養の様子。

## b 円石藻

先行研究により、円石藻は珪藻とは異なり、バブリングにより増殖が阻害されることが明らかとなっているため、実験培地をバブリングせずにCO₂分圧を調節する実験を行うための半連続培養システムを構築した（図(4)-2）。珪藻実験と同様に、培養に用いる培地中のDOC濃度を低減させるため、f/2培地を1/10に希釈したf/20培地を用いた。培養期間中に培地の栄養塩が不足しないことはあらかじめ確認した。保存株を容量45 mLガラス試験管の実験培地30 mLに接種し、実験条件下で5世代以上培養して馴致させた後、培養実験を開始した。培養は2 Lガラス瓶の培地1600 mLで実施した。並行して、4 Lのポリカーボネート容器内の培地にxCO₂調整済みの空気をバブリングして4段階のCO₂分圧の希釈用培地を調整した。円石藻の増殖は毎日のin vivo蛍光の測定により把握し、細胞が一定量以上に増殖した際、実験培地の一部を採取した後に希釈用培地を加えて実験培地を希釈し、培養を継続した。希釈および培養を3回継続することにより、連続した3回の試料を採取した。培地を希釈する前後に試料を採取し、Chl-a、細胞数、細胞体積、POC、DOC、PIC、栄養塩、TA、DIC、pHを測定した。比増殖速度は培地希釈直後から次の希釈時までの細胞数の増加量から算出した。

図(4)-2 恒温培養室における2 Lガラス瓶を用いた円石薫単離株の培養の様子。攪拌子により緩やかに（50 r/min）培地を攪拌しながら培養し、細胞の増殖に応じて適宜、CO $ _{2} $ 分圧調節済みの培地で希釈しながら培養を継続した。
## （２）現場プランクトン群集を用いた影響評価実験

## 1 ）2013年秋季実験

2013年10月28日から11月6日にかけて、海洋生物環境研究所柏崎実証試験場に実験システムを設置し、種々の動植物プランクトンを含む柏崎沿岸の現場海水を用いた現場型培養実験を実施した（図(4)-3）。本実験では、水温を3段階（現場水温、+2℃、+4℃）、CO $ _{2} $ 分圧を2段階（400 ppm（現場濃度）、1000 ppm）の実験区を設定し、現場プランクトン群集の応答を把握することを目指した。

最初に、試験場の自然海水ラインの海水を250 Lタンクに採取して均一化した。水温、塩分、 $ CO_{2} $ 分圧、pHを測定するとともに、day-1の分析試料を採取した。次に、この海水は20 Lポリカーボネートタンク6個に分注し、2個ずつを現場水温（19.3 ℃）に設定した3つの恒温水槽に配置した。また、 $ CO_{2} $ 分圧の調節に用いる高 $ CO_{2} $ 海水を作成するため、同じ海水を孔径0.2 μmフィルターでろ過して1 Lポリカーボネートボトル2個に分注して現場水温の水槽に配置し、液化 $ CO_{2} $ ボンベから純 $ CO_{2} $ ガスを24時間、50 mL/minでバブリングした。

培養海水の採取にあたっては、大型動物プランクトンが培養ボトル間で不均一に分布することで植物プランクトンへの捕食圧が変化しないよう、海水を目合い200 μmのプランクトンネットでろ過することで大型動物プランクトンを除去した。このため本培養実験では、特に大型植物プランクトンに対する動物プランクトンの捕食圧の低下と、ボトルの効果で細胞が沈降除去されないことにより、植物プランクトンの増殖が促進される可能性がある。一方、200 μm以下の動物プランクトンは除去されていないため、このサイズの植物プランクトンと動物プランクトンの間の被食－捕食関係は維持されていたと考えられる。

3つの恒温水槽のうち、1つの水槽は現場水温を維持する一方、2つの水槽の水温は徐々に2℃もしくは4℃を徐々に昇温させることにより培養中のプランクトンを水温変化に馴致させた。その際、水温増加自体によるCO₂分圧増加を抑制するため、+2℃および+4℃水槽に配置したタンク海水にはあらかじめ水酸化ナトリウム溶液(200 mmol/L)を添加した。24時間後、すべてのタンク海水に硝酸塩5μmol/L、リン酸塩0.3μmol/L、ケイ酸5μmol/Lを添加するとともに、各水槽の1つのタンクに高CO₂海水を添加してCO₂分圧を調節した。調節後のCO₂分圧はpCO₂計により実測した。高CO₂海水および水酸化ナトリウム溶液の添加量はフリーソフトウェアRのseacarbパッケージにより計算した。最後に、各タンクの海水は5Lのポリエチレンバック（ロンテナー）に分注して各水槽に配置し（図(4)-3）、6日間培養した。培養は3連で実施した。水槽に照射される太陽光は遮光フィルターにより50％に減光した。培養期間中、植物プランクトン群集の動態を調査するための試料を採取し、Chl-a、POC、DOC、PIC、栄養塩、TA、DIC、pHを測定した。Chl-aは孔径10μmフィルターにより大型および小型にサイズ分画した。

## 2 ）2014年夏季美験

2014年8月26日から9月10日にかけて、海生研柏崎実証試験場において実験を実施した（図(4)-3）。本実験は柏崎沿岸の水温が年間の最高値に達する時期のプランクトン群集の応答を2回の実験で把握することを目標とした。昨年度の経験をもとに実験区を拡張し、水温を3段階（現場水温、+2℃、+4℃）、CO₂分圧を3段階（400 ppm（現場濃度）、700 ppm、1000 ppm）で実施した。実験は8月28日～9月2日（実験①、5日間、水温27.0℃）および9月4日～9月8日（実験②、4日間、水温27.0℃）にかけて連続で2回実施した。実験方法は2013年の実験と同様である。本実験では、目標のCO₂分圧を達成するため、高CO₂海水を添加しながらCO₂分圧を実測して添加量を調節した。
図(4)-3 柏崎実証試験場における5Lポリエチレンバックを用いた沿岸海水培養実験の様子(2014年)。3段階の水温および3段階のCO $ _{2} $ 分圧の実験区を設定し、各実験区について3連で培養した。

## （３）試料分析およびデータ解析

室内実験および現場実験で得られた試料は表(4)-2の方法により各項目を測定した。実験海水中の $ CO_{2} $ 分圧およびpHは、DICおよびTAの分析結果から、炭酸系計算プログラム（Pierrot et al., 2006）を用いて計算した。水温および $ CO_{2} $ 分圧の単独および複合影響を評価するうえでは、水温および $ CO_{2} $ 分圧を2つの要因として二元配置分散分析（two-way ANOVA）を行い、Tukey-Kramer法により実験区間の平均値の差を危険率5％で検定した。

表4-2 分析项目与方法。

分析項目	省略表記	試料作成/分析方法	計測機器
pH	ガラス複合電極	Mettler Toledo, InLab Routine JP Kimoto, ATT-05
全炭酸	DIC	GF/Fフィルターろ過海水 密閉セル塩酸滴定法	Kimoto, ATT-05
全アルカリ度	TA	GF/Fフィルターろ過海水 密閉セル塩酸滴定法	Kimoto, ATT-05
栄養塩(NH4、NO3、NO2、PO4、Si(OH)4)	Chl-a	0.2μmフィルターろ過海水 空気分節連続流れ分析 GF/Fもしくは10μmフィルターろ過、DMF*抽出 萤光光度法	Bran+Luebbe, AACSII Turner, 10-AU
細胞数密度	電気的検知帯法(コールター原理)	Beckman Coulter, Multisizer 4
細胞体積	電気的検知帯法(コールター原理)	Beckman Coulter, Multisizer 4
粒子態有機炭素	POC	GF/Fフィルターろ過、塩酸蒸気によるPIC除去 高温燃焼、熱伝導度検出法	PerkinElmer, 2400 II
粒子態窒素	PN	GF/Fフィルターろ過 高温燃焼、熱伝導度検出法	PerkinElmer, 2400
粒子態無機炭素	PIC	GF/Fフィルターろ過(全炭素とPOCの差) 高温燃焼、熱伝導度検出法	PerkinElmer, 2400
溶存態有機炭素	DOC	GF/Fフィルターろ過海水 高温燃焼、非分散型赤外線分析法	Shimadzu, TOC-V

$ ^{*} $ DMF: N、N-ジメチルホルムアミド
## 4 ．結果及び考察

## （１）単離株を用いた影響評価実験

## 1 ）水温および光量に関する増殖特性の把握

得られた比増殖速度データをもとに、各水温について珪藻3種および円石藻2種のPAR－比増殖速度曲線を作成することができた。比増殖速度が飽和するPARは水温上昇に伴って増加し、珪藻は300 μmol photons/m²/s、円石藻は200 μmol photons/m²/sではどの水温でも比増殖速度が光飽和し、かつ光阻害を受けていないことを明らかにした。珪藻の結果を図(4)-4～6に、円石藻の結果を図(4)-7～8に示した。各水温で得られた比増殖速度の最大値を水温に対してプロットすると、5種ともに12 ℃から20 ℃の範囲では水温毎の最大比増殖速度が直線的に増加することがわかった（図(4)-9）。本データセットをもとに、水温およびCO₂分圧増加の影響評価実験は水温12～20 ℃で実施することとした。また、比増殖速度に対して光量が飽和の条件と未飽和の条件で影響を比較するため、珪藻は300 μmol photons/m²/s（高光量）および25 μmol photons/m²/s（低光量）、円石藻は200 μmol photons/m²/s（高光量）および50 μmol photons/m²/s（低光量）で実験することが適していると判断した。

図(4)-4 珪藻Thalassiosira weissflogii。水温毎の光合成有効放射(PAR)に対する比増殖速度(SGR)の変化。SGRはどの水温でも300 μmol photons/m²/sでほぼ飽和し、25 μmol photons/m²/sでは低減すると判断した。
図(4)-5 珪藻Thalassiosira pseudonana。水温毎の光合成有効放射（PAR）に対する比増殖速度（SGR）の変化。

図(4)-6 珪藻 Thalassiosira oceanica。水温毎の光合成有効放射（PAR）に対する比増殖速度（SGR）の変化。
図(4)-7 円石藻Gephyrocapsa oceanica。水温毎の光合成有効放射（PAR）に対する比増殖速度（SGR）の変化。SGRはどの水温でも200 μmol photons/m²/sでほぼ飽和し、50 μmol photons/m²/sでは低減すると判断した。

図(4)-8 円石藻Gephyrocapsa oceanica。水温毎の光合成有効放射（PAR）に対する比増殖速度（SGR）の変化。
図(4)-9 珪藻3種（上段）および円石藻2種（下段）における水温毎の最大比増殖速度（Max SGR）のプロット。

本データセットは水温増加に対する植物プランクトンの比増殖速度の応答に関して新たな知見を提供した。これまで、植物プランクトンの比増殖速度は水温増加に対して指数関数的に増加する（Q10値を適用できる）と考えられてきた。一般的に、植物プランクトンの比増殖速度の水温応答のQ10値は1.88になると考えられてきた（Eppley，1972）。しかし本実験で得られた結果は、Thalassiosira属珪藻3種および円石藻2種の比増殖速度が水温増加に対して線形応答することを示した。海洋生態系モデルでは植物プランクトンの比増殖速度は一般にQ10値を与えて計算しているが、計算方法を再検討する必要性を示唆している。Boyd et al.（2013）は環境変化に対する植物プランクトンの応答を予測する研究を推進するうえで、植物プランクトンの増殖特性に関するデータを世界中の研究者が共有できる形でより多く蓄積する必要性を強調しており、本研究で得られたデータセットはデータベースの構築に貢献するものである。さらに多くの種について同様のデータを取得し、植物プランクトンの温度応答に関して検討を進める必要がある。

## 2 ）水温およびCO $ _{2} $ 分圧の増加に対する応答の把握

## a 垙藻

本実験は珪藻を培養している海水に $ xCO_{2} $ 調整済みの空気をバブリングすることによって $ CO_{2} $ 分圧を調節した。TAおよびDICの測定結果からの理論計算により、水温の違いにかかわらず、Thalassiosira weissflogiiを高光量で培養した際の4つの $ CO_{2} $ 分圧実験区間で大きく異なるpHおよび $ pCO_{2} $ 環境を確立できていたことがわかる（表(4)-3）。低光量での実験でも、また他の珪藻2種についても同様の結果が得られた。このような実験条件のもとで、水温3段階と $ CO_{2} $ 分圧4段階を組み合わせた培養実験により、珪藻Thalassiosira weissflogii（図(4)-10）、Thalassiosira pseudonana（図(4)-11）、Thalassiosira oceanica（図(4)-12）の比増殖速度と有機炭素生産に与える水温と $ CO_{2} $ 分圧の複合影響のデータセットを得た。

3種ともに比増殖速度は水温増加に伴って増加する一方で、 $ CO_{2} $ 分圧増加の影響は小さかった。光量の違いにかかわらず同様の結果が得られた。全ての種について、 $ CO_{2} $ 分圧は比増殖速度を有意に変化さ
表(4)-3 珪藻Thalassiosira weissflogiiを高光量で培養した際の実験終了時の炭酸系の測定および計算結果。

水温	CO₂分压実験区	TAμmol/kg	DICμmol/kg	pHtotal scale	pCO₂ppm
12℃	400 ppm	1885	1743	7.89	480
550 ppm	1858	1765	7.73	705
750 ppm	1859	1805	7.59	1004
1000 ppm	1873	1841	7.50	1247
16℃	400 ppm	1770	1642	7.81	558
550 ppm	1783	1694	7.67	785
750 ppm	1777	1722	7.55	1067
1000 ppm	データなし	データなし	データなし	データなし
20℃	400 ppm	2465	2179	8.03	435
550 ppm	2465	2251	7.90	624
750 ppm	2466	2314	7.76	892
1000 ppm	2475	2372	7.64	1217

せたが、その影響は水温毎に異なり（有意な交互作用があり）、水温と $ CO_{2} $ 分圧が複合的に影響していることが示された。Gao et al.（2012）は植物プランクトンの増殖に対する $ CO_{2} $ 分圧増加は低光量では促進効果を、高光量では阻害効果を示すことを報告したが、本研究の比増殖速度の結果はそのような傾向を示さなかった。逆に、Thalassiosira weissflogiiでは $ CO_{2} $ 分圧増加は低光量で阻害効果を、高光量で促進効果を示した。一方、外洋域に生息するThalassiosira oceanicaでは、光量の違いにかかわらず $ CO_{2} $ 分圧増加は増殖を阻害する傾向が見られた。 $ CO_{2} $ 分圧増加が比増殖速度に与える影響は種毎に異なることが示された。水温が4℃増加した場合と、 $ CO_{2} $ 分圧が400 ppmから1000 ppmへ増加した場合の比増殖速度の変化を比較すると、どの種においても水温増加の効果のほうが大きいことがわかった。これらの結果は珪藻類の比増殖速度に与える影響は $ CO_{2} $ 分圧増加よりも水温増加の方が卓越することを示している。

細胞体積はThalassiosira weissflogiiにおいて水温増加に伴って減少したが、どの種においても細胞体積当りのChl-a量は水温およびCO₂分圧による顕著な変化が見られず安定していたことから、珪藻による有機物生産の変化を評価するうえで、Chl-a当りのPOCおよびDOC量を指標として解析することとした。

有機炭素生産も主に水温増加により変化することが実験的に示された。高光量ではChl-a当りのPOC量は3種ともに水温増加に伴って減少した。3種のうち、全水温でDOCが生産されたのは高光量のT. weissflogiiのみであり、POCと同様にChl-a当りのDOC生産は水温増加に伴って減少する一方、CO₂分圧の有意な影響は認められなかった。また、T. weissflogiiの生産する全有機炭素（POC+DOC）に占めるDOCの割合は水温増加に伴い減少した。DOC放出率はCO₂分圧によっても有意な影響を受けたが影響の仕方は水温によって異なっており、水温とCO₂分圧による複合影響が認められた。珪藻のPOCおよびDOC生産は水温増加に対しては直線的に応答するのに対し、CO₂分圧増加の影響は水温との間で複合的作用を示すことがわかった。

以上の結果から、珪藻の比増殖速度および有機炭素生産量が水温増加に対して直線的に応答することが明らかとなった。一方、 $ CO_{2} $ 分圧の増加に対する応答は水温増加への応答と比較して小さく、種特異的かつ水温特異的であり、応答の一般化は難しいことがわかった。
光条件

比增殖速度

細胞体積

細胞体積当りのChl-a量

Chl-a当りPOC量

Ch1-a当りDOC量

有機炭素生産に占めるDOCの 割合

図(4)-10 珪藻Thalassiosira weissflogiiの比増殖速度、細胞体積、Chl-a含量、有機物生産の変化。二元配置分散分析（Tukey-Kramer法）により有意水準5％で検定した結果を図中の右上に示した。水温実験区間もしくはCO₂分压实験区間に有意差が認められた場合は、a>b>cの序列で示した。Interaction（交互作用）が有意である場合は、水温とCO₂分圧の複合影響が認められたことを示す。
光条件

比增殖速度

細胞体積

細胞体積当りのChl-a量

Chl-a当りPOC量

図(4)-11 珪藻Thalassiosira pseudonana。図(4)-10と同様。本種では培養中の正味のDOC生産が検出できなかったため、Chl-a当りDOC量および有機炭素生産に占めるDOCの割合は示していない。

細胞体積当りのChl-a量

Chl-a当りPOC量

図(4)-12 珪藻 Thalassiosira oceanica。図(4)-10と同様。本種では培養中の正味のDOC生産が検出できなかったため、Chl-a当りDOC量および有機炭素生産に占めるDOCの割合は示していない。
## b 円石藻

本実験では円石藻の増殖を妨げないために培養中の培地へのバブリングは行わず、ただし細胞密度の増加によるDIC消費を抑えるため、半連続培養システム構築した。培養中の培地への新たなCO₂供給がないために培養中にDICが減少したが、pHおよびpCO₂の変化は小さく抑えられた（表(4)-4）。また、pCO₂は設定したCO₂分圧値とよく一致した。このような比較的安定したCO₂環境での培養条件下で、水温3段階とCO₂分圧4段階を組み合わせた培養実験により、円石藻Gephyrocapsa oceanica（図(4)-13）およびEmiliania huxleyi（図(4)-14）の比増殖速度、POC、DOC、PIC生産に与える水温とCO₂分圧の複合影響のデータセットを得た。

表(4)-4 円石藻Gephyrocapsa oceanicaを20 ℃、高光量で培養した際の炭酸系の測定および計算結果。

CO2分压	TA、μmol/kg	DIC、μmol/kg	pH(total)	pCO2、ppm
实験区	培養前	培養後	培養前	培養後	培養前	培養後	培養前	培養後
400 ppm①	2263	2269	2026	1988	8.01	8.09	434	347
400 ppm②	2265	2266	2043	2015	7.98	8.04	470	405
400 ppm③	2267	2268	2041	2016	7.99	8.04	463	404
550 ppm①	2267	2272	2065	2031	7.94	8.02	527	428
550 ppm②	2266	2268	2077	2063	7.91	7.94	570	521
550 ppm③	2269	2268	2092	2067	7.88	7.93	614	534
750 ppm①	2261	2270	2123	2099	7.79	7.87	778	637
750 ppm②	2264	2274	2134	2131	7.77	7.80	824	765
750 ppm③	2266	2271	2141	2118	7.75	7.82	856	719
1000 ppm①	2265	2269	2162	2148	7.69	7.74	994	883
1000 ppm②	2265	2271	2173	2174	7.67	7.68	1071	1044
1000 ppm③	2266	2268	2177	2164	7.65	7.70	1101	991

比増殖速度は2種ともに光量の違いにかかわらず、水温増加に伴って増加する一方で、CO₂分圧増加の有意な影響は見られなかった。水温が4℃増加した際と、CO₂分圧が400 ppm から1000 ppmへ増加した際の比増殖速度の変化を比較すると、水温増加の効果のほうが大きいことがわかった。円石藻類の比増殖速度に与える影響はCO₂分圧よりも水温増加が卓越することが示された。

2種ともに光量の違いにかかわらず、細胞体積は水温増加に伴って大きく減少したが、両種ともに細胞体積当りのCh1-a量は水温およびCO₂分圧の変化に対して比較的安定していたことから、円石藻による有機物生産の変化を評価するうえで、珪藻と同様にCh1-a当りのPOCおよびDOC量を指標として解析することとした。

円石藻の有機炭素生産は、比増殖速度と同様に、水温に依存して変化する傾向が明らかとなった。高光量条件では、Ch1-a当りのPOCおよびDOC量は水温増加に伴って有意に減少する一方、CO₂分圧の有意な影響は認められなかった。Gephyrocapsa oceanicaのDOC放出率も同様の傾向を示しており、高光量
では水温増加に伴いDOCとして細胞外に放出される有機炭素の割合が減少した。一方、両種とも光量の強弱にかかわらず、DOC放出率に対するCO₂分圧の有意な影響は見られなかった。円石藻の有機物生産についてはCO₂分圧による有意な影響は一切認められず、その動態は水温に依存して変化することが示された。

PIC量の測定結果からは、両種の炭酸カルシウム殻の生産が海洋酸性化により阻害される傾向は見られなかった。高光量での細胞当りのPIC量は水温毎に値が変化することに加えて、1000 ppmでPIC量が増加する傾向が見られた。CO $ _{2} $ 分圧の増加に伴うpHの低下は円石藻炭酸カルシウム殻の生産を低下させる可能性が懸念されているが、本実験に用いた2株に関しては1000 ppmまでの範囲のCO $ _{2} $ 分圧の増加が殻の生産に与える影響は小さいものと推測された。CO $ _{2} $ 分圧増加に対する円石藻の応答は種毎に異なることに加えて(Langer et al., 2006)、同一種においても株毎に異なることが明らかにされており(Langer et al., 2009)、本研究においても円石藻の応答の多様性を支持する結果が得られた。

図(4)-13 円石藻Gephyrocapsa oceanica。図(4)-10と同様。
比增殖速度

高光量

細胞体積

## 細胞当りのPIC量

Ch1-a当りPOC量

Ch1-a当りDOC量

有機炭素生産に占めるDOCの 割合

高光量

図4-14 円石藻Emiliania huxleyi。図4-10と同様。

## c 珪藻および円石藻で得られた結果の比較

本研究では珪藻と円石藻の2大藻類グループの複数種を水温3段階、CO₂分圧4段階、光量2段階の組合せで培養することにより、これまでに例のない規模の影響評価データを獲得できた。全ての結果を俯瞰するため、水温増加とCO₂分圧増加に対する応答を増加、減少、凸凹型に分類するとともに、水温およびCO₂分圧の交互作用（複合影響）が認められるか否かをまとめた（表(4)-5）。比増殖速度や有機物生産への影響はCO₂分圧よりも主に水温によってもたらされることがわかる。POC生産は高光量では全5種で水温増加により低下する一致した結果を示したが、低光量では水温増加に対する応答は種特異的だった。DOC生産についても同様の結果が得られた。一方、CO₂分圧増加は有意な影響をもたらすものの、全種が同様の応答を示すことはなかった。さらに、CO₂分圧増加が有意な影響をもたらした場合のほとんどのケースで水温との間の交互作用が認められたことは、CO₂分圧増加への応答が水温毎に異なることを示している。このことは、海洋酸性化の影響を評価する際、選択する試験水温によって、影響の評価結果が異なることを示す。CO₂分圧増加への応答が多様であるという培養実験的事実は、将来の海洋生態系の変化を予測しようとする際に十分考慮されなければならない、非常に重要な知見である。
表(4)-5 单離株実験での、水温およびCO $ _{2} $ 分圧が増加した際の影響と交互作用の有無のまとめ。

↗：增加

☑：减少

凸：中間域で増加

凹：中間域で減少

○：有意な影響あり

×：有意な影響なし

項目	種	水温增加	CO2分压增加	交互作用
高光量	低光量	高光量	低光量	高光量	低光量
比增殖速度	T. oceanica	↗	↗	↘	↘	○	○
T. pseudonana	↗	↗	↗	凹	○	○
T. weissflogii	↗	↗	↗	↘	○	○
G. oceanica	↗	↗	×	×	×	×
E. huxleyi	↗	↗	×	×	×	×
POC生產	T. oceanica	↘	凹	×	↗	×	○
T. pseudonana	↘	凸	↗	↗	○	○
T. weissflogii	↘	↗	凸	×	○	×
G. oceanica	↘	×	×	×	○	×
E. huxleyi	↘	↘	×	×	×	×
DOC生產	T. oceanica	—	—	—	—	—	—
T. pseudonana	—	—	—	—	—	—
T. weissflogii	↘	凸	×	凹	○	○
G. oceanica	↘	×	×	×	○	×
E. huxleyi	↘	×	×	×	×	×
DOC割合	T. oceanica	—	—	—	—	—	—
T. pseudonana	—	—	—	—	—	—
T. weissflogii	↘	凸	凹	×	○	○
G. oceanica	↘	×	×	×	×	×
E. huxleyi	×	×	×	×	×	×
PIC生產量	G. oceanica	↘	×	↗	×	×	×
E. huxleyi	凸	×	凹	↘	×	×
## （２）現場プランクトン群集を用いた影響評価実験

## 1 ）2013年秋季実験

水温増加によるCO₂分圧増加を抑えるために水酸化ナトリウム溶液を添加することにより、現場濃度実験区のCO₂分圧は水温の違いにかかわらず非常によく一致した（表(4)-6）。一方、理論計算により高CO₂海水を添加した1000 ppm実験区のCO₂分圧の実測値は目標値に達せず、800 ppm程度までしか増加しなかった。高CO₂海水の添加量の理論計算はCO₂飽和海水を想定して行ったため、高CO₂海水のCO₂分圧が飽和に達していなかった可能性がある。また、タンク海水に高CO₂海水を添加、混合する過程で相当量のCO₂が損失してしまったことも考えられる。ただし、TAおよびDIC測定値から計算したpCO₂はかなり1000 ppmに近く（表(4)-7）、CO₂分圧の実測値と矛盾する。一つの可能性として、pCO₂計測時にガス透過膜を静置海水中に固定したために、効率的なガス透過が達成できず、計測値が過小評価されたことが考えられる。

Day 0では、1000 ppm実験区のCO₂分圧は現場濃度に比べて大きく増加したが、植物プランクトンの増殖に伴いCO₂分圧は急速に低下し、Day 5には300 ppm以下まで低下した（表(4)-7）。これは電極で測定したpH（NBSスケール）の時系列変化でも確認できる（図(4)-15）。ただし、電極測定pHの時系列から判断して400 ppmと1000 ppm実験区間でのCO₂分圧の差は実験終了時まで維持されていたと考えられる。

表(4)-6 各実験区の CO_{2} 分压の実測値。

実験	水温区	Day #	水温℃	400 ppm(現場濃度)	700 ppm	1000 ppm
2013	自然海水	Day -1	19.3	371
±0 ℃	Day 0	19.3	359	742
+2 ℃	Day 0	21.3	362	766
+4 ℃	Day 0	23.3	362	844
2014実験①	自然海水	Day -1	27.0	544
±0 ℃	Day 0	27.0	524	698	1071
+2 ℃	Day 0	29.0	516	700	1031
+4 ℃	Day 0	31.0	518	697	1030
2014実験②	自然海水	Day -1	27.0	500
±0 ℃	Day 0	27.0	449	675	1101
+2 ℃	Day 0	29.0	428	688	1047
+4 ℃	Day 0	31.0	426	698	1124
表(4)-7 2013年沿岸海水実験の炭酸系の測定および計算結果。

Day 0はタンク海水1連試料の計測値、Day 3およびDay 5は3連培養ボトルの平均値。

Day #	水温	CO2分压	TA	DIC	pH	pCO2
寒験区	寒験区	μmol/kg	μmol/kg	total	ppm
0	±0℃	400 ppm	2106	1891	8.05	372
1000 ppm	2106	2021	7.71	908
+2℃	400 ppm	2123	1892	8.05	375
1000 ppm	2123	2030	7.71	926
+4℃	400 ppm	2140	1891	8.06	374
1000 ppm	2140	2042	7.69	972
3	±0℃	400 ppm	2110	1836	8.17	269
1000 ppm	2111	1950	7.93	524
+2℃	400 ppm	2129	1806	8.22	231
1000 ppm	2128	1929	7.98	454
+4℃	400 ppm	2142	1761	8.28	194
1000 ppm	2144	1933	7.98	465
5	±0℃	400 ppm	2110	1702	8.39	139
1000 ppm	2110	1811	8.22	236
+2℃	400 ppm	2125	1677	8.42	127
1000 ppm	2125	1803	8.23	231
+4℃	400 ppm	2143	1683	8.40	134
1000 ppm	2142	1826	8.18	264

Ch1-a 濃度は培養開始直後から増加し、Day 2 から Day 4 の間でピークに達したと考えられる（図(4)-15）。濃度の立ち上がりは+4℃実験区で速かった。ただし、+4℃の1000 ppm 実験区の増殖速度は400 ppm と比較して抑制されており、CO₂ 分圧増加の影響と考えられる。一方、大型 Ch1-a の割合は実験期間を通じて水温および CO₂ 分圧実験区間に差が認められず、サイズから見た植物プランクトンの群集組成は水温および CO₂ 分圧の影響を受けなかったと考えられる。

秋季の有機物生産は80％程度が粒子態として行われた（図(4)-16）。5日間でのPOC生産量は水温増加の影響が見られない一方、 $ CO_{2} $ 分圧増加により有意に増加した。このため、粒子態有機物のC:N比も $ CO_{2} $ 分圧増加により有意に増加した。植物プランクトンブルームによる有機物生産での炭素固定量が $ CO_{2} $ 分圧増加によって促進される結果は過去にも報告されている（Riebesell et al., 2007; Yoshimura et al., 2014）。この現象は $ CO_{2} $ 分圧増加が植物プランクトンによる過剰な炭素固定を誘引した結果であると推測されている（Arrigo, 2007）。本研究や過去の実験の結果はブルームの発達から衰退までを考慮した実験により得られた知見であり、ブルームのピーク時までを解析した場合はPOC生産量の違いは見られていない（Yoshimura et al., 2014）。このことから、 $ CO_{2} $ 分圧増加は栄養塩が枯渇した後のブルーム衰退期における植物プランクトンのPOC生産に影響を与えていることが推察される。一方、DOC生産量は2℃の増加で有意に増加したが、 $ CO_{2} $ 分圧増加の影響は認められなかった。結果的に、