Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
少なく、熱帯性小型魚類の行動を対象とした研究に偏っており（Wittman and Pörtner, 2013）、水産有用魚種についての情報は限られている。また、海洋酸性化は地球温暖化による水温上昇を伴うものであり、例えばシロギスの再生産過程は高水温の影響を受けやすく（Hotta et al., 2001）、酸性化と高水温の複合条件下では何らかの影響を受けることが危惧される。魚類への高水温と海洋酸性化の複合影響評価には、適切な飼育環境、優れた生物飼育技術、そして水温及びCO₂の精密な同時制御技術が必要とされるため、研究報告例は殆ど無い。

## 2 ．研究開発目的

このような現状を背景に、当研究分担機関がこれまでに培ってきた水産有用魚種の飼育技術と水温制御技術を活用し、未だ研究例の無い水産有用魚種を対象とした再生産過程への影響評価実験を実施し、今後の水産資源への海洋酸性化影響を検討することを本サブテーマの目的とする。また、世界に先駆けたCO₂分圧精密制御装置を用いて、水産有用種を対象とした影響評価実験を行うことで、世界的な影響評価の知見の充実に貢献する。

### 3. 研究開発方法

海洋酸性化の生物影響についての知見は、単一の生活史段階への影響や小型魚類について調べたものが多く、複数の生活史段階を含む魚類の再生産過程や水産有用魚種を対象とした研究例は殆ど無い。また、水産有用種への水温と高CO₂分圧の複合影響を調べた研究例も無い。そこで、これまでに研究例の無い水産有用種であるシロギス（Sillago japonicus）とマダイ（Pagrus major）を用いて、魚類の再生産過程における水温と海洋酸性化の影響評価実験を行った。シロギスは、東アジアに広く分布し、北海道以南の日本各地の沿岸海域に広く分布しており（益田ら，1975）、漁業及び遊漁の主要な対象種の一つとなっている。また、マダイは北海道以南から南シナ海北部までの北西太平洋に分布しており、高級魚として扱われる漁業の主要な対象種の一つとなっている（芹澤ら，2003）。

具体的には、下記の5つの項目についての研究業務を行った。（1）シロギスの産卵適水温を調査した。（2）飼育海水のCO₂分圧を変化させた条件を設け、産卵適水温下において酸性化がシロギスの再生産過程に及ぼす単純影響を調査した。（3）飼育海水の水温とCO₂分圧を個別に変化させた条件及び同時に変化させた条件を設け、温暖化と酸性化がシロギスの再生産過程に及ぼす複合影響を調査した。（4）産卵時の水温とCO₂分圧の違いによるシロギス卵のCO₂に対する耐性変化を調査した。（5）サブテーマ（1）において開発した大型水槽（容量10t）におけるCO₂分圧の制御方法の有効性を、マダイの産卵実験によって検証した。

## （１）シロギスの産卵適水温の調査

シロギスの再生産過程における水温と海洋酸性化の影響を調査するにあたって、予めシロギスの産卵適水温を調査した。

供試魚は、新潟県柏崎市地先にて釣獲後、海洋生物環境研究所実証試験場において1ヶ月以上予備飼育した天然魚を用い、容量5tの屋外実験水槽1基に雄10個体、雌10個体を収容した。予備飼育は、自然海水（ろ過海水）を注水量約42L/分でかけ流して行った（換水率約0.5回転/時間）。予備飼育期間及び実験期間中の光条件は、水槽内に60W白熱灯1基を設置し日長を15時間明期、9時
間暗期の長日条件に調整した。また、給餌は、午前9時に冷凍アミ、午前4時にモイストペレットを、それぞれ魚体重の1％に相当する量を与えた。雌雄の判別は麻酔した個体の下腹部を軽く押し、精液が体外へにじみ出たものを雄、出なかったものを雌とした。

実験水槽（5t、図(3)-1）に自然海水を注水量約8L/分でかけ流し（換水率約0.5回転/時間）、その水温は10分間隔で測温抵抗体センサー（R900-32、チノー）を用いて測定し、水温記録器（DX230、横河電機）によって記録した。

実験期間中、毎日、実験水槽直近に設置した集卵水槽（図(3)-1）において卵の有無を確認した。卵が認められた場合、集卵水槽から全卵を回収して20Lの海水中で均一に分散させた後、50mLのサブサンプルを分取し、その中の沈下卵数（死卵）、浮上卵数及び浮上卵の正常発生卵数を計測した（図(3)-2）。これらの計数值より、産卵数（沈下卵数＋浮上卵数）、浮上卵率（浮上卵数/産卵数×100）及び浮上卵の正常発生率（浮上卵中の正常発生卵数/産卵数×100）を求めた。実験期間中のこれらの値と水温から産卵適水温を明らかにした。実験は約3カ月間実施した。

図(3)-1 シロギスの産卵適水温の調査に用いた実験水槽と集卵水槽。実験水槽には、FRP製の円形水槽（容量5t、直径約2.5m×高さ約2.5m）を用いた。集卵水槽には、FRP製の角形水槽（容量約200L、底面積約4,000cm²×高さ約50cm）を用いた。
図(3)-2 卵の採取方法と希釈方法、浮上卵と沈下卵における正常発生卵と死卵。実験水槽と集卵水槽の写真（左側）。産出された卵は、実験海水を満たした集卵水槽内のネットに集められ、全ての卵を海水と共に回収し希釈した。

## （２）シロギスの再生産に及ぼす高CO $ _{2} $ 分圧の単純影響の調査

高CO $ _{2} $ 分圧条件下におけるシロギスの産卵数、産出卵の正常発生率と正常孵化率、孵化仔魚の脊索長と耳胞の面積を調査した。

サブテーマ（1）と共同で、容量1tの屋内水槽において海水の $ CO_{2} $ 分圧を安定的に制御する方法を新たに検討、開発した（図(3)-3）。この方法は、100%の $ CO_{2} $ ガスを自然海水へ吹き込んで調製した高 $ CO_{2} $ 分圧海水と自然海水を配管内で混合した後に、水槽内へシャワー状に注水するものである。両海水を合計した注水量は約8L/分（換水率約0.5回転/時間）とし、高 $ CO_{2} $ 分圧海水と自然海水の注水量比を変えることで、海水の $ CO_{2} $ 分圧を調製した。海水の $ CO_{2} $ 分圧は二酸化炭素測定装置（ $ CO_{2} $ -09及びSDC-12、紀本電子）により、水槽内に設置した平衡器を介して導出した $ CO_{2} $ ガスを非分散型赤外線吸収法で連続的に測定した。
図(3)-3 新たに開発した大型水槽用のCO₂分圧の制御方法。上：CO₂分圧制御方法模式図、下：実際に制御した実験水槽の写真。実験に使用した自然海水には、予め調温を行ったろ過海水を使用した。CO₂溶解搭（容量約16L）に、自然海水を注水量約4.6L/分で供給すると同時に、マスフローコントローラ（FCST1005LC-4F2-F1L-CO2、フジキン）を用いて100%CO₂ガスを毎分450mLで連続曝気し、高CO₂分圧海水を調製した。調整した高CO₂分圧海水は、高CO₂分圧海水水槽（ポリエチレン製角形水槽、容量約100L）に一時貯水した後、配管内で自然海水と混合してCO₂分圧調製海水を作製した。実験水槽内には、CO₂ガスを二酸化炭素測定装置に導出するための平衡器を設置した。
## 1 ）シロギス親魚の産卵実験

確立した容量1t水槽におけるCO $ _{2} $ 分圧の制御方法を用いてシロギス親魚の産卵実験を行った。供試魚は、新潟県柏崎市地先にて釣獲後、海洋生物環境研究所実証試験場において1ヶ月以上予備飼育した天然魚を主に用いた。天然魚の他には、天然魚から種苗生産した1歯魚を、1回目の産卵実験には全個体の半数、2回目の実験には各実験水槽に雌雄1個体、天然魚と混合して実験に用いた。予備飼育は、屋外大型水槽（容量5t）内に自然海水（ろ過海水、水温は自然水温）を注水量約42L/分でかけ流して行った（換水率約0.5回転/時間）。予備飼育期間中の光条件は、水槽内に60W白熱灯1基を設置し日長を15時間明期、9時間暗期の長日条件に調整した。また、給餌は、午前9時に冷凍アミ、午前4時にモイストペレットを、それぞれ魚体重の1％に相当する量を与えた。

実験に先立ち、各実験水槽には、供試魚を（1）と同様の方法で判別し、雌雄各3個体の合計6個体を収容した。実験前に飼育海水の水温を自然水温から26℃へ1日に約1℃の割合で上昇させた。全ての実験水槽で産卵を確認した後、高CO₂分圧区の実験水槽4基において、飼育海水のCO₂分圧を徐々に上昇させて設定 CO₂分圧へ変更した。なお、設定CO₂分圧に達するまでの時間は、最大で75時間であった（4,000 μatm区）。飼育海水のCO₂分圧は、自然海水のCO₂分圧（対照）と高CO₂分圧条件として850、1,400、2,400及び4,000 μatmの5段階に設定した。これらの実験区は、アルカリ度2,258mmol/kgと塩分33.4、26℃の条件下において、供試魚の採集地のCO₂分圧を想定した対照区である550 μatmと高CO₂分圧区である4,000 μatmにおける全炭酸をコンピュータープログラムCO2SYS（Pierrot et al., 2006）を用いて算出し、実験に用いる5つの実験区のCO₂分圧が、全炭酸換算値において等間隔になるように設定したものである（対照区：2,103mmol/kg、850 μatm区：2,176mmol/kg、1,400 μatm区：2,249mmol/kg、2,400区：2,322mmol/kg、4,000 μatm区：2,395mmol/kg）。実験期間中の光条件は、水槽内に40W白熱灯1基を設置し日長を15時間明期、9時間暗期の長日条件に調整した。また、給餌は、午前9時に冷凍アミ、午前4時にモイストペレットを、それぞれ魚体重の1％に相当する量を与えた。

1回の産卵実験の期間はCO $ _{2} $ 分圧が設定分圧になった時から4週間とし、産卵実験は合計3回繰り返して実施し、それぞれ産卵実験①～③とする。実験中は毎日、実験水槽のそばに設置した集卵水槽（図(3)-4）において卵の有無を確認した。卵が認められた場合、集卵水槽から全卵を回収して5Lの海水中で均一に分散させた後、50mLサブサンプルを分取して計測を行い、産卵数、浮上卵率及び浮上卵の正常発生率を求めた（図(3)-2）。

各実験区のCO₂分圧は、6連CO₂分圧計測装置（SDC-12型、紀本電子工業製）を用いて、実験期間中1分間隔で記録した。また、各実験区の水温は10分間隔で測温抵抗体センサー（R900-32、チノー）を用いて、また塩分について誘導型塩分計（MODEL 601Mk1V、YEO-KAL）により補正した電磁誘導率検出器（ISC40GJ、横河電機）を用いて測定し、水温記録器（DX230、横河電機）によって記録した。さらに、対照区において、実験海水の全アルカリ度を全アルカリ度滴定装置（ATT-05、紀本電子）にて測定した。

## 2 ）シロギス卵の孵化実験

産卵実験②及び③において、卵の孵化実験を行った。供試材料は、各実験水槽で回収された産出後およそ14時間経過した受精卵とした。この受精卵10個を、各実験区の実験海水を満たした容量100mLのスクリーチ管瓶にパスツールピペットで移し替えた後、26℃の恒温水槽へ約24時間静置
した。静置後はスクリュー管瓶内の供試材料について、正常孵化個体、奇形孵化個体、孵化後死亡個体、未孵化卵及び死卵を計数し、正常孵化率（正常孵化個体数/供試卵数×100）を求めた。孵化実験は、1つの実験区について5個のスクリュー管瓶を用意し、それぞれの産卵実験で5回繰り返した。

実験海水の水質測定のため、孵化率測定とは別のスクリュー管瓶を用意し、卵収容直後の測定用に実験海水のみを、孵化率の計測終了後の測定用に実験海水と供試卵を収容した。水質測定用スクリュー管瓶内の海水のpHをpHメーター（セブンゴープロSG8、メトラー・トレド）で、酸素飽和度（DO）をDOメーター（HQ30d、HACH）で、卵収容直後と孵化率の計測終了後に測定した。

## 3 ）シロギス仔魚の成長実験

シロギス卵の孵化実験で孵化した仔魚を用いて、仔魚の成長実験を行った。供試材料は、スクリュー管瓶内で孵化した正常孵化個体とした。これらの個体は、孵化後約2日齢の仔魚であり、孵化が行われた実験海水を満たしたスクリュー管瓶に観察時まで収容し、26℃の恒温水槽へ静置した。仔魚はMS222で麻酔を施した後に、体の右側が上向きになるようにパスツールピペットを使ってスライドグラスへ移し、実体頭微鏡（SMZ1500、Nikon）を用いて観察した。そして、仔魚全体と左右の耳胞像をデジタルカメラ（HC-2500、FUJIFILM）で撮影した（図(3)-5）。デジタル画像は、画像解析ソフトウェア（ImageJ 1.2、NIH）に取り込んで解析し、仔魚の脊索長と左右それぞれの耳胞の面積を計測した。成長実験は、1つの実験区について約20個体の仔魚の観察を行い、各実験区について5回繰り返した。

図(3)-4 実験水槽（FRP製円形水槽、容量1t）の脇に設置した集卵水槽（容量約50L、底面積約1,500cm²×高さ約40cm）。
左の耳胞

右の耳胞

図(3)-5 シロギス仔魚の全体像と耳胞像。上: 右体側方向から観察した全体像（スケールは1mm）、下：左右の耳胞像（スケールは50μm）。

## （3） シロギスの再生産に及ぼす高水温と高CO $ _{2} $ 分圧の複合影響の調査

高水温と高 $ CO_{2} $ 分圧の複合条件下におけるシロギスの産卵数、産出卵の正常発生率と正常孵化率、孵化仔魚の脊索長と耳胞の面積を調査した。

## 1 ）シロギス親魚の産卵実験

前述の（2）と同様に、確立した容量1t水槽におけるCO₂分圧の制御方法を用いてシロギス親魚の産卵実験を行った。供試魚は、海洋生物環境研究所実証試験場において種苗生産した1歯を用いた。供試魚の予備飼育は、屋外大型水槽（容量5t）内に自然海水（ろ過海水、水温は自然水温）を注水量約2.5t/時間でかけ流して行った（換水率約0.5回転/時間）。予備飼育期間中の光条件は、水槽内に60W白熱灯1基を設置し日長を15時間明期、9時間暗期の長日条件に調整した。また、給餌は、午前9時に冷凍アミ、午前4時にモイストペレットを、それぞれ魚体重の1％に相当する量を与えた。

実験に先立ち、流水式の屋内水槽（容量1t、注水量約8L/分、換水率約0.5回転/時間）6基にシロギス雌雄各3個体を収容し、水温を26℃（産卵適水温）で飼育した。全ての実験水槽で産卵を確認した後、高水温区の実験水槽3基において、飼育海水の水温を1日に約1℃の割合で徐々に上昇させて設定水温へ変更した。続いて、高CO₂分圧区の実験水槽4基において、CO₂分圧を徐々に上昇させて設定CO₂分圧へ変更した。実験条件は、水温が26℃と高水温条件として28℃の2段階、CO₂分圧が自然海水のCO₂分圧（対照）と高CO₂分圧条件として1,000区及び2,200μatm区の3実験区とし、それらの条件を組み合わせた計6実験区を設定した。これらの実験区は、産卵実験①～③におけるアルカリ度、塩分及び水温の平均値を基に、CO₂分圧を全炭酸に換算して等間隔になるように設定した（26℃-対照区：1959mmol/kg、26℃-1,000μatm区：2,066mmol/kg、26℃-2,200μatm区：2,173mmol/kg、28℃-対照区：1959mmol/kg、28℃-1,000μatm区：2,066mmol/kg、28℃-2,200μatm区：2,173mmol/kg）。全炭酸値とCO₂分圧はコンピュータープログラムCO2SYS（Pierrot et al., 2006）
を用いて算出した。各実験区には実験水槽1基を割り当てた（図(3)-6）。実験期間中の光条件は、水槽内に40W白熱灯1基を設置し日長を15時間明期、9時間暗期の長日条件に調整した。また、給餌は、午前9時に冷凍アミ、午前4時にモイストペレットを、それぞれ魚体重の1％に相当する量を与えた。

1回の産卵実験の期間はCO $ _{2} $ 分圧が設定分圧になった時から4週間とし、産卵実験は合計4回繰り返して実施し、それぞれ産卵実験④～⑦とする。実験期間中、毎日、集卵水槽（図(3)-4）から全卵を回収してビーカーに入れ海水容量を5Lとし均一に分散させた後、50 mLを分取して全卵数を計数しその数値の100倍を総産卵数とした。また、併せて浮上正常卵、浮上死卵、沈下卵（全て死卵）の計測を行い、正常発生率（正常発生卵数/産卵数×100）を求めた（図(3)-2）。

各実験区のCO₂分圧は、6連CO₂分圧計測装置（SDC-12型、紀本電子工業製）を用いて、実験期間中1分間隔で記録した。また、各実験区の水温は10分間隔で測温抵抗体センサー（R900-32、チノー）を用いて測定し、水温記録器（DX230、横河電機）によって記録した。さらに、対照区において、実験海水の全アルカリ度を全アルカリ度滴定装置（ATT-05、紀本電子）で、塩分を誘導型塩分計（MODEL 601Mk1V、YEO-KAL）で、定期的に週2回測定した。

図(3)-6 実験装置の写真。左：1t水槽の脇に設置されたCO_{2}溶解塔、右：1t水槽。実験に使用した自然海水には、予め26℃と28℃に調温を行ったろ過海水を使用した。各々のCO_{2}溶解搭（容量約16L）に、各水温の自然海水を注水量約2.4L/分で供給すると同時に、マスフローコントローラ（FCST1005LC-4F2-F1L-C02、フジキン）を用いて100%CO_{2}ガスを毎分60~180mLで連続曝気し、高CO_{2}分圧海水を調製した。調整した高CO_{2}分圧海水は、各高CO_{2}分圧海水水槽（ポリエチレン製角形水槽、容量約100L）に一時貯水した後、配管内で自然海水と混合してCO_{2}分圧調製海水を作製した。実験水槽内には、CO_{2}ガスを二酸化炭素測定装置に導出するための平衡器を設置した。産出された卵は、実験海水を満たした集卵水槽内のネットに集めた。
## 2 ）シロギス卵の孵化実験

産卵実験④～⑦において、卵の孵化実験を行った。供試材料は、各実験水槽で回収された産出後およそ14時間経過した受精卵とした。この受精卵50個を、各実験区の実験海水を満たした容量100mLのスクリュー管瓶にパスツールピペットで移し替えた後、採取した実験区と同じ水温の恒温水槽へ約24時間静置した。静置後はスクリュー管瓶内の供試材料について、正常孵化個体、奇形孵化個体、孵化後死亡個体、未孵化卵及び死卵を計数し、正常孵化率（正常孵化個体数/供試卵数×100）を求めた。孵化実験は、1つの実験区について5個のスクリュー管瓶を用意し、それぞれの産卵実験で5回繰り返した。

## 3 ）シロギス仔魚の成長実験

シロギス卵の孵化実験で孵化した仔魚を用いて、仔魚の成長実験を行った。供試材料は、スクリュー管瓶内で孵化した正常孵化個体とした。これらの個体は、孵化後約2日齢の仔魚であり、孵化が行われた実験海水を満たしたスクリュー管瓶に観察時まで収容し、採取した実験区と同じ水温の恒温水槽へ静置した。仔魚はMS222で麻酔を施した後に、体の右側が上向きになるようにパスツールピペットを使ってスライドグラスへ移し、実体頭微鏡（SMZ1500、Nikon）を用いて観察した。そして、仔魚全体と耳胞像をデジタルカメラ（HC-2500、FUJIFILM）で撮影した（図(3)-5）。デジタル画像は、画像解析ソフトウェア（ImageJ 1.44p、NIH）に取り込んで解析し、仔魚の脊索長と耳胞の面積を計測した。耳胞については左右の区別無く、側面から観察して大きく写った方の耳胞に焦点を合わせてデジタル画像を記録し面積を計測した。成長実験は、1つの実験区について約15個体の仔魚の観察を行い、各実験区について4回繰り返した。

## （4） 産卵時の水温と $ CO_{2} $ 分圧によるシロギス卵の $ CO_{2} $ に対する耐性変化

高水温と高 $ CO_{2} $ 分圧の条件下で産出し発生したシロギス卵における $ CO_{2} $ に対する耐性変化を調べた。

自然海水の $ CO_{2} $ 分圧（対照）と2,200μatm区の $ CO_{2} $ 分圧条件下にて生産された卵について、26℃と28℃の各水温別に $ CO_{2} $ に対する耐性実験を行い、異常発生24時間半数影響分圧（EP50）を求めた。耐性実験は、自然海水の $ CO_{2} $ 分圧（対照区）と高 $ CO_{2} $ 分圧条件として30,000、50,000及び100,000μatm区の計4条件で行った。

実験には図(3)-7に示した装置を使用した。この装置は、CO₂溶解筒（容量1L、ポリ塩化ビニル製）、内側恒温水槽（容量4L、ポリプロピレン製）、加温冷却ユニット（WTCA-401H-10、アース）が接続した外側恒温水槽（容量100L、ポリエチレン製）及びガス混合装置（GB-3CS、コフロック）から構成される。実験に使用する自然海水（ろ過海水）は、CO₂溶解筒を通過した後に内側恒温水槽に供給される仕組みになっている。CO₂溶解筒には、ガス混合装置を用いてCO₂（各試験区所定の%）、O₂（21%）及びN₂（不活性ガスとして残余%）からなる混合ガス（対照区は空気）を毎分300mLで連続通気し、CO₂分圧を調製した実験海水を作製した。実験前夜に対照区と2,200μatm区の各条件下にて産出されたシロギス卵を、翌朝11時に、実験海水と共に各10個を110mLスクリーム管瓶（実験海水量100mL、各2本/条件）に入れ、各水温に設定した恒温槽内にて1日ばく露した（図(3)-8）。ばく露後、回収した供試個体を実体顕微鏡（SMZ1500、Nikon）にて観察し、正常発生個体と異常発生個体（死卵や奇形、死亡孵化個体）を計数した（図(3)-9）。計数した値から異常発生個体率
を算出し、プロビット法によりEP50を求めた。EP50を求めるためのCO₂分圧には、実験前後に計測したpH値をアルカリ度と塩分からCO₂分圧値に換算した後に幾何平均した値を用いた。実験は3回繰り返して実施した。

各実験において、実験海水の水温及びpHをばく露前後に測定した。水温はデジタル水温計（SK-1250MCIIIα、佐藤計量器製作所）を、pHはpHメーター（セブンゴープロSG8、メトラー・トレド）をそれぞれ用いて測定した。また、ばく露後の実験海水の酸素飽和度をDOメーター（HQ30d、HACH）にて測定した。さらに、予め実験に使用する自然海水の全アルカリ度を全アルカリ度滴定装置（ATT-05、紀本電子）で、塩分を誘導型塩分計（DIGI-AUTO MODEL.5、鶴見精機）で測定した。

②

4

図(3)-7 実験装置の写真。①外側恒温水槽（A）、②全体像（Bは加温冷却ユニット）、③外側恒温水槽内部（CはCO₂溶解筒（4本）、Dは内側恒温水槽（4基））、④ガス混合装置（3基）。
図(3)-8 シロギス卵の耐性実験の様子。左：実験に用いたパッキン付き110mLスクリュー管瓶、右：内側恒温水槽内に配置したシロギス卵及び実験海水入りのガラス瓶の様子。

図(3)-9 シロギス卵 $ CO_{2} $ 耐性実験後に観察されたシロギスの正常発生個体と異常発生個体。左：正常孵化仔魚、中：死卵、右：奇形孵化仔魚。

## （5） 大型水槽（10t）におけるCO $ _{2} $ 分圧を制御方法の有効性の検証

サブテーマ（1）において開発した大型水槽（容量10t）におけるCO $ _{2} $ 分圧を制御方法の有効性を、マダイを用いた産卵実験により検討した。

供試魚は、新潟県柏崎市地先にて漁獲後、海洋生物環境研究所実証試験場において5年以上飼育した天然魚の雄と、同試験場において種苗生産した3歳魚の雌を混合して用いた。供試魚の予備飼育は、屋外大型水槽（容量5t又は容量10t）内に自然海水（ろ過海水、水温は自然水温）を、注水量約2.5t/時間（5t水槽）又は約5t/時間（10t水槽）でかけ流して行った（換水率約0.5回転/時間）。予備飼育期間及び実験期間中の光条件は、自然日長とした。また、給餌は、午前9時に冷凍アミ、午前4時にモイストペレットを、それぞれ魚体重の2％に相当する量を与えた。

実験に先立ち、流水式の屋外大型水槽（容量10t、注水量約80L/分、換水率約0.5回転/時間）3基にマダイ雌雄各3個体を収容した。実験条件は、 $ CO_{2} $ 分圧が自然海水の $ CO_{2} $ 分圧（対照）と高 $ CO_{2} $ 分圧条件として1,000及び2,000μatmの3段階とし、その条件下で15日間にわたり飼育を試みた（図(3)-10）。実験期間中の水温は、自然水温とした。そして、産卵の有無を観察することで、この
実験環境においてマダイの再生産過程のうち産卵に関する高CO $ _{2} $ 分圧実験が可能であるかを検証した。

各実験区のCO₂分圧は、二酸化炭素測定装置（CO₂-09、紀本電子）を用いて、実験期間中1分間隔で記録した。また、各実験区の水温は10分間隔で測温抵抗体センサー（R900-32、チノー）を用いて測定し、水温記録器（DX230、横河電機）によって記録した。

図(3)-10 実験装置の写真。左：実験水槽（容量10t）の脇に設置されたCO₂溶解塔、右：実験水槽（容量10t）。実験には、ろ過した自然海水を、予め調温して使用した。CO₂溶解塔（容量約50L）に、自然海水を注水量約13~17L/分で供給すると同時に、マスフローコントローラ（FCST1030LC-4F2-F5L-C02、フジキン）を用いて100%CO₂ガスを毎分1.5Lで連続曝気し、高CO₂分圧海水を調製した。調整した高CO₂分圧海水は、高CO₂分圧海水水槽（ポリエチレン製角形水槽、容量約100L）に一時貯水した後、配管内で自然海水と混合してCO₂分圧調製海水を作製した。実験水槽内には、CO₂ガスを二酸化炭素測定装置に導出するための平衡器を設置した。産出された卵は、実験海水を満たした集卵水槽内のネットに集めた。

## 4 ．結果及び考察

## （１）シロギスの産卵適水温の調査

実験期間中毎日測定した、実験に用いた自然海水の塩分は32.1～33.8、pHは8.0～8.2及びDOは77.9～103.2%であった。

実験に用いたシロギスの実験開始時における大きさを表(3)-1に示した。実験開始時における平均体長は154.1±14.8mm（平均値±標準偏差、以下同様）、平均体重は41.8±11.8gであった。
シロギスの飼育水温は1日の平均水温で17.7～28.7℃の範囲にあり、このうち産卵は20.5～28.7℃で確認された。産卵が認められた日の水温の平均値は26.4℃であった。産卵は水温が25℃を下回るとその間隔が長くなりはじめ、また、浮上卵率も60%以下になる傾向が認められた。また、28℃より高くなると浮上卵率が80%以下になる傾向が認められた。浮上卵の正常発生率は、ほとんどの卵で100%であった（図(3)-11）。

飼育水槽において、シロギスの産卵は21.6℃の6月中旬から25℃前後の10月上旬まで続き、特に26℃以上では毎日産卵することが知られている（熊井・中村，1977）。また、産卵適水温の上限は28～29℃付近にあり、それを超えると産卵数と孵化率が低下するようになる（Hotta et al., 2001）。今回の実験及びこれらの既往知見から、シロギスの産卵に適する水温を26℃付近と推定した。

表(3)-1 3回の産卵実験におけるシロギスの大きさ。

全長（mm）	体長（mm）	体重（g）
Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.
産卵実験①	196.8	±	24.5	170.8	±	21.5	59.1	±	19.6
産卵実験②	172.5	±	17.6	149.7	±	15.6	38.5	±	11.3
産卵実験③	158.4	±	7.4	137.3	±	6.8	30.8	±	4.2
図(3)-11 自然水温条件下におけるシロギスの産卵状況と産出された卵の卵質。上：産卵数と水温の推移。中浮上卵率と水温の推移、下：浮上卵の正常発生率と水温の推移。各日付の水温は10分毎に測定し、1日の平均水温として示した。

## （２）シロギスの再生産に及ぼす高CO₂分圧の単純影響の調査

## 1 ）シロギス親魚の産卵実験

CO $ _{2} $ 分圧を850、1,400、2,400及び4,000μatmに設定した各実験区の実測値は、目的のCO $ _{2} $ 分圧に
おおむね維持されていた（表(3)-2）。3回の実験において各実験区の実測値が異なったのは、主に原水とした自然海水が480～600μatmの間で変動したことによった。実験に用いた自然海水のアルカリ度は、2,200μmol/kgの付近で比較的安定しており、その値は塩分が低下すると小さくなる傾向が認められた（表(3)-3）。

3回の産卵実験において、シロギスは対照区、850、1,400、2,400及び4,000μatmのいずれの実験区でも産卵した。各実験区における卵の浮上卵率は60%以上であり、それらの正常発生率は90%以上と高かった。それぞれの実験区間の有意差を検定したところ産卵回数、産卵数、浮上卵率及び浮上卵の正常発生率のいずれについても有意差は確認されなかった（ANOVA、p>0.05、図(3)-12）。

表(3)-2 シロギスを用いた3回の産卵実験における各実験区のCO $ _{2} $ 分圧。

設定分圧	CO₂分圧 (μatm)
対照	850	1,400	2,400	4,000
Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±
産卵実験①	598	±	59	922	±	109	1,488	±	176	2,512	±	332	4,114	±
産卵実験②	495	±	23	810	±	42	1,427	±	58	2,402	±	193	4,032	±
産卵実験③	479	±	27	838	±	28	1,399	±	82	2,435	±	151	4,181	±
(産卵実験①～③の平均と標準偏差)
(524	±	65)	(857	±	58)	(1,438	±	45)	(2,450	±	56)	(4,109	±

表(3)-3 シロギスを用いた3回の産卵実験における対照区の全アルカリ度と塩分。

全アルカリ度 (μmol/kg)	塩分 (psu)
Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.
産卵実験①	2,184	±	42.5	33.255	±	0.780
産卵実験②	2,182	±	12.8	32.906	±	0.245
産卵実験③	2,150	±	6.9	32.256	±	0.106
C

D

図(3)-12 高CO_{2}分圧下に28日間おかれたシロギスの産卵回数。A：産卵回数 B：産出された卵の浮上卵率 C：1回当りの産卵回数 D：浮上卵の正常発生率。棒グラフは3回の産卵実験の平均値、誤差棒はその標準偏差を示す。

## 2 ）シロギス卵の孵化実験

受精卵を収容した海水のpHは卵収容から24時間後まで、ほぼ一定に維持されていた（表(3)-4）。これらpHの実測値はCO₂分圧（表(3)-2）、全アルカリ度と塩分（表(3)-3）及び水温（26℃）から導かれる理論値とほぼ一致した。収容海水の酸素飽和度は、いずれの実験区でも卵収容時の102%から24時間後の98%まで同様に低下した。

卵の孵化実験において、シロギス受精卵は、いずれの実験区でも孵化し、それらの正常孵化率は92%以上であった（図(3)-13）。各実験区の正常孵化率について各実験区間で有意な変化は検出されなかった（ANOVA、p>0.05）。
表(3)-4 シロギス受精卵を収容した海水のpH。

実験区	対照	850μatm	1,400μatm	2,400μatm	4,000μatm
Mean ± S.D.	Mean ± S.D.	Mean ± S.D.	Mean ± S.D.	Mean ± S.D.
産卵実験②	開始時*1	8.088 ± 0.032	7.901 ± 0.019	7.671 ± 0.006	7.456 ± 0.031	7.244 ± 0.035
終了時*2	8.089 ± 0.020	7.882 ± 0.027	7.661 ± 0.009	7.448 ± 0.038	7.251 ± 0.031
計算値*3	8.09	7.91	7.69	7.48	7.26
産卵実験③	開始時*1	8.085 ± 0.002	7.890 ± 0.004	7.672 ± 0.037	7.481 ± 0.017	7.275 ± 0.021
終了時*2	8.064 ± 0.012	7.878 ± 0.013	7.667 ± 0.032	7.494 ± 0.014	7.285 ± 0.029
計算値*3	8.10	7.89	7.68	7.46	7.24

*1: スクリュー管瓶に受精卵を収容した直後のpH、*2: 収容後約24時間経過時のpH、*3: CO₂分圧（表(3)-2）、全アルカリ度と塩分（表(3)-3）及び水温（26℃）から、計算ソフトウェアCO₂SYSを用いて算出したpH。各産卵実験における各実験区において、開始時と終了時のpHには有意差が確認されなかった（ANOVA、p>0.05）。pHはNBSスケールで示す。

図(3)-13 各産卵実験で得られたシロギス受精卵の高CO $ _{2} $ 分圧下における正常孵化率。A: 産卵実験②における正常孵化率の結果 B: 産卵実験③における正常孵化率の結果。棒グラフは5回の繰り返しの平均値、誤差棒はその標準偏差を示す。

## 3 ）シロギス仔魚の成長実験

仔魚の成長実験において、各実験区のシロギス仔魚の脊索長は2.84±0.057mm（対照区）、2.87±0.074mm（850μatm区）、2.80±0.089mm（1,400μatm区）、2.84±0.125mm（2,400μatm区）及び2.80±0.099mm（4,000μatm区）であり、各実験区間の脊索長に有意な変化は認められなかった（ANOVA、p>0.05）。各実験条件下で産出された後に発育したシロギス孵化仔魚の耳胞面積は、左右いずれも各実験区間において有意な差は検出されなかった（ANOVA、p>0.05、図(3)-14）。

上述の産卵適水温の調査結果より、シロギスの産卵が安定する条件として、水温を26℃、日長を15時間明期に設定した。この条件でCO₂分圧を850、1,400、2,400及び4,000μatmまで高めた海水にシロギスをばく露すると、いずれの分圧でも対照区と同等に産卵した。また、各分圧で産出さ
れた受精卵は対照区と同等に正常孵化し、それら孵化仔魚の耳胞の面積は対照区と比較して有意な変化は認められなかった。

これまでの研究報告では、現在の通常のCO₂分圧のもとで産まれた受精卵や孵化仔魚を、直ちに高CO₂分圧に移す方法を用いて海水魚の初期生活段階に対する高CO₂分圧の影響を調査している。それによると、卵期におけるCO₂耐性は高くシロギス卵、マダイ卵、ヒラメ（Paralichthys olivaceus）卵の致死濃度は10,000 μatmを大きく超える（Kikkawa et al., 2003；2004）。一方、仔魚期ではCO₂感受性が高くなり、約1,000 μatmでトウゴロウイワシ科の1種Menidia berylliina仔魚の生残や成長が低下（Baumann et al., 2012）、1,800 μatm前後で大西洋マダラ（Godus morhua）仔魚において各器官の発育に悪影響が認められている（Frommel et al., 2012）。高CO₂海水で成長した仔魚の耳胞の面積は、スズメダイ科の1種（Acathochromis polyacanthus）では850 μatmまで変化が認められず（Munday et al., 2011a）、クマノミ類（Amphiprion percula）においては1,078 μatmで変化は無いが1,721 μatmでは対照より大型化し（Munday et al., 2011b）、ヨーロッパシーバス（Atractoscion nobilis）では993、2,558 μatmにおいて濃度の上昇とともに大型化している（Checkley et al., 2009）。

卵に対する海洋酸性化の影響は、海洋へ産み出された段階で突然生じるわけでなく、親魚の体内における卵成熟過程から継続することが予想され、卵への影響実験は産卵前にある親魚の段階から検討する必要がある。しかしながら、海水魚については、その多くの種類で決まった時季にしか産卵しないことや、繁殖行動を可能とする大型水槽が必要なことなどの制約から、産卵を制御する技術がほとんど確立されておらず、親世代から子世代を一貫して扱った実験がほとんど成立していない。今回、水産資源を担う多数の海水魚と同様に分離浮性卵を大量に生産するシロギスについて、親子の世代間で海洋酸性化影響実験が成立し成果が得られたことは、この技術を他魚種へ展開させることはもとより、海水魚に対する酸性化影響を予測評価する上で極めて意義深い。

図(3)-14 各実験条件下において産出された後に発育したシロギス仔魚の耳胞の面積。棒グラフ（白抜き：右側の耳胞、グレー：左側の耳胞）は5回の繰り返しの平均値、誤差棒はその標準偏差を示す。
## （3） シロギスの再生産に及ぼす高水温と高CO $ _{2} $ 分圧の複合影響の調査

## 1 ）シロギス親魚の産卵実験

各実験区におけるCO₂分圧の実測値を表(3)-5に示す。4回の産卵実験におけるCO₂分圧の平均値は26℃-対照区では584±70μatm、26℃-1,000μatm区では1,071±63μatm、26℃-2,200μatm区では2,294±126μatm、28℃-対照区では627±68μatm、28℃-1,000μatm区では1,157±59μatm、28℃-2,200μatm区では2,431±105μatmとなった。表(3)-6に実験期間中の水温を示す。4回の産卵実験における水温の平均値は26℃区の3条件は25.7~26.1℃、28℃区の3条件は27.8~28.0℃の範囲にあった。実験期間中の全アルカリ度と塩分を表(3)-7にまとめた。また、実験に用いたシロギス親魚の全長、体長及び体重を実験終了後に計測値を表(3)-8に示す。シロギス親魚の平均体長は169.6±8.3mm（平均値±標準偏差、以下同様）、平均体重は68.1±10.7gであった。

シロギスは6実験区の全ての水温及びCO₂分圧条件下において産卵した。また、産卵1回あたりの産卵数は6実験区全てにおいて有意な変化は認められなかった（2-way ANOVA、p>0.05、図(3)-15A）。正常発生率は28℃-2,200μatm区において26℃-対照区に比べ13%、26℃-2,200μatm区に比べ12%有意に低下した（2-way ANOVA post hoc Bonferroni、p<0.05、図(3)-15B）。なお、供試魚の性別を実験終了時に開腹して確認したところ、2回目の実験の28℃-対照区において雄1個体、4回目の実験の26℃-1,000μatm区において雌1個体が未成熟であったためこれらの条件から得られた産卵数及び正常孵化率は平均値に含めなかった。また、4回目の実験の28℃-対照区についても、個体間の相性が悪かったことに起因した雄の繁殖への不参加によって産卵日数と受精率の低下が生じたため、この条件の産卵数及び正常孵化率の値は平均値に含めなかった。

表(3)-5 シロギスを用いた産卵実験④～⑦における各実験区のCO $ _{2} $ 分圧。

実験区	CO₂分圧 (μatm)
26℃, 対照	26℃, 1,000μatm	26℃, 2,200μatm	28℃, 対照	28℃, 1,000μatm
Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±
産卵実験④	501	±	34	1,021	±	46	2,205	±	143	553	±	24	1,130	±
産卵実験⑤	608	±	41	1,161	±	145	2,479	±	329	631	±	35	1,225	±
産卵実験⑥	561	±	32	1,036	±	87	2,229	±	294	606	±	32	1,091	±
産卵実験⑦	666	±	45	1,064	±	69	2,263	±	187	716	±	58	1,182	±
(産卵実験④～⑦の平均と標準偏差)
(584	±	70)	(1,071	±	63)	(2,294	±	126)	(627	±	68)	(1,157	±

表(3)-6 シロギスを用いた産卵実験④～⑦における各実験区の水温。

実験区	水温(℃)
26℃, 対照	26℃, 1,000μatm	26℃, 2,200μatm	28℃, 対照	28℃, 1,000μatm	28℃, 2,200μatm
Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.
産卵試験④	26.1	±	0.2	26.0	±	0.2	25.9	±	0.2	27.9	±	0.2	28.0	±	0.2	27.8	±	0.2
産卵試験⑤	25.8	±	0.2	26.0	±	0.1	25.7	±	0.1	28.1	±	0.1	27.8	±	0.1	27.8	±	0.1
産卵試験⑥	25.9	±	0.1	26.0	±	0.1	25.7	±	0.1	28.0	±	0.1	27.9	±	0.1	28.0	±	0.2
産卵試験⑦	26.0	±	0.2	26.0	±	0.2	25.9	±	0.2	27.9	±	0.2	28.1	±	0.1	27.9	±	0.2
表(3)-7 シロギスを用いた産卵実験④～⑦における各実験区の全アルカリ度と塩分。

全アルカリ度（μmol/kg）	塩分（psu）
Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.
産卵実験④	2,152	±	20.6	32.205	±	0.088
産卵実験⑤	2,151	±	25.4	31.999	±	0.452
産卵実験⑥	2,160	±	15.1	32.812	±	0.245
産卵実験⑦	2,116	±	15.3	31.769	±	0.304

表(3)-8 産卵実験④～⑦に用いたシロギス親魚の大きさ。

全長（mm）	体長（mm）	体重（g）
Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.
産卵実験④	177.2	±	8.8	156.3	±	8.4	48.0	±	8.5
産卵実験⑤	183.4	±	8.5	160.5	±	8.5	51.0	±	8.4
産卵実験⑥	190.5	±	8.8	169.6	±	8.3	68.1	±	10.7
産卵実験⑦	195.5	±	8.7	182.1	±	11.5	70.8	±	12.4

A

B

図(3)-15 高水温及び高CO₂分圧の複合条件下においたシロギスの1日当りの産卵数と産出された卵の正常発生率。A：シロギスの1日当りの産卵数 B：産出された卵の正常発生率。実験は28日間にわたり行った。棒グラフ（白：26℃、グレー：28℃）は4回（26℃-対照区、28℃-対照区、28℃-1,000μatm区については3回）の繰り返し実験の平均値、括弧内は28日間の実験期間中の産卵回数、誤差棒はその標準偏差を示す。異なるアルファベット間では有意差が認められた（2-way ANOVA post hoc Bonferroni、p<0.05）。
## 2 ）シロギス卵の孵化実験

浮上卵の正常孵化率は6実験区全てにおいて有意な変化は認められなかった（2-way ANOVA、p>0.05、図(3)-16）。

図(3)-16 各産卵実験で得られたシロギス浮上卵の高CO₂分圧下における浮上卵の正常孵化率。棒グラフ（白：26℃、グレー：28℃）は4回の繰り返し実験の平均値、誤差棒はその標準偏差を示す。

## 3 ）シロギス仔魚の成長実験

孵化仔魚の脊索長は6実験区全てにおいて有意な変化は認められなかった（2-way ANOVA、p>0.05、図(3)-17A）また、孵化仔魚の耳胞の面積は、CO₂分圧に関わらず26℃区の値よりも28℃区の値が有意に大きくなった（2-way ANOVA、p>0.05、図(3)-17B）。
A

B

図(3)-17 各実験区において産出された後に発育したシロギス1日齢仔魚の脊索長と耳胞面積。A：シロギス1日齢仔魚の脊索長 B：シロギス1日齢仔魚の耳胞面積。棒グラフ（白：26℃、グレー：28℃）は4回の繰り返し実験の平均値、誤差棒は標準偏差を示す。異なるアルファベット間では有意差が認められた（2-way ANOVA post hoc Bonferroni、p<0.05）。

4回の実験の結果、産卵好適水温（26℃）における高CO₂分圧条件下では同水温の対照区と比較して、産卵数、正常卵率、正常発生率、浮上卵の正常孵化率、孵化仔魚の脊索長及び耳胞の面積には有意な変化はみられず、好適水温下でのシロギスの再生産過程は海洋酸性化に対して強い耐性を持つことが示唆された。これは海洋酸性化の単純影響のみを調査した上述の実験結果と同様であり、実験結果の再現性が確認されたといえる。高水温（28℃）においては産卵数、孵化率、孵化仔魚の脊索長及び耳胞の面積について好適水温の場合と同様の傾向が認められ、高水温下においても酸性化に対して耐性を持つことが推察された。しかしながら、正常発生率は、28℃-2,200μatm区において26℃-2,200μatm区と比較すると有意な低下がみられた。これらの結果より、2,200μatmという西暦2300年に到達すると予測されている海洋酸性化環境下では、シロギスの再生産において、さらに+2℃の高水温の影響が加わるとシロギス卵の正常発生率が低下する複合影響が生じる可能性が示唆された。

また、高水温区の全ての $ CO_{2} $ 分圧において好適水温区と比較して、孵化仔魚の耳胞の大型化が認められた。高 $ CO_{2} $ 分圧条件下で飼育された仔稚魚の耳石の大型化は数多く報告されており、例えばヨーロッパシーバス（Atractoscion nobilis）仔魚、カクレクマノミ（A. percula）稚魚、ゴウシュウマダイ（Sparus aurata）稚魚の耳石が大型化することが報告されている（Checkley et al., 2009、Munday et al., 2011b、Reveillac et al., 2015）。本実験では、両水温区ともに正常卵
を実験海水に1日間ばく露した。一般的に高水温条件下では卵は短時間で孵化するため、28℃区の方が孵化後の経過時間が長い。従って、26℃と28℃区における孵化後の経過時間の違いが28℃区における仔魚の耳胞の大型化の主な要因である可能性が考えられる。

以上より、シロギスの再生産過程において、高水温と高 $ CO_{2} $ 分圧の複合条件下では正常発生率への負の影響が生じること、及び水温上昇はシロギス仔魚の耳胞の大型化を引き起こすことが示唆された。

## （４）産卵時の水温と$\mathrm{CO}_{2}$分圧によるシロギス卵の$\mathrm{CO}_{2}$に対する耐性変化

実験終了時のD0はいずれの実験区においても98%以上であった。また、26℃区の実験における全アルカリ度は2,124±18.2 μmol/kg、塩分は32.116±0.667、28℃区の実験における全アルカリ度は2,252±132 μmol/kg、塩分は32.578±2.09であった。各実験区の実験開始時と実験終了時のpHを表(3)-9に、計算ソフトウェアCO2SYSを用いて算出したCO₂分圧を表(3)-10に示す。図(3)-18に、対照区と2,200 μatm区のCO₂分圧条件区にて生産された卵の正常孵化について、26℃と28℃の各水温別に調べた結果を示す。そして、正常孵化数と実験期間中のCO₂分圧の平均値より異常発生24時間半数影響分圧（EP50）を前述の手法により算出した。いずれの条件においてもEP50は約50,000 μatmとなり、シロギス卵の耐性に有意な変化は認められなかった（2-way ANOVA、p<0.05、図(3)-19）。クマノミの1種（A. melanopus）においては親個体から次世代の仔魚への、産卵後から稚魚期までの期間を除く、連続した高CO₂分圧環境へのばく露が、1ヶ月齢の仔魚の成長や生残率におけるCO₂耐性を高める（Miller et al., 2012）との報告がある。シロギスにおいても今後、より長期のばく露によるCO₂に対する耐性変化を調べる必要があると考えられる。

表(3)-9 産卵時の水温と $ CO_{2} $ 分圧によるシロギス卵の $ CO_{2} $ に対する耐性変化査定実験における各実験区の実験開始時と実験終了時のpH。

実験開始時pH	実験終了時pH
Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.
26℃, 対照区	8.2	±	0.05	8.1	±	0.04
26℃, 3%区	6.5	±	0.03	6.6	±	0.07
26℃, 5%区	6.2	±	0.03	6.4	±	0.06
26℃, 10%区	5.9	±	0.04	6.1	±	0.08
28℃, 対照区	8.2	±	0.04	8.2	±	0.05
28℃, 3%区	6.4	±	0.14	6.7	±	0.82
28℃, 5%区	6.3	±	0.12	6.5	±	0.02
28℃, 10%区	5.9	±	0.12	6.1	±	0.07
表(3)-10 産卵時の水温と $ CO_{2} $ 分圧によるシロギス卵の $ CO_{2} $ に対する耐性変化査定実験における各実験区の全アルカリ度と塩分、pH及び水温から計算ソフトウェアCO2SYSを用いて算出した実験開始時と実験終了時の $ CO_{2} $ 分圧及びその平均値。

実験開始時CO₂分圧	実験終了時CO₂分圧	平均値
Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.	Mean	±	S.D.
26℃, 対照区	376	±	56	498	±	61	437	±	85
26℃, 3%区	24583	±	2430	17424	±	3205	21003	±	4674
26℃, 5%区	42074	±	3657	27450	±	4202	34762	±	8750
26℃, 10%区	83560	±	8931	58683	±	10598	71122	±	16202
28℃, 対照区	397	±	10	442	±	35	420	±	34
28℃, 3%区	28865	±	1535	16056	±	2558	22461	±	7265
28℃, 5%区	45403	±	2269	27070	±	3134	36236	±	10335
28℃, 10%区	94585	±	4215	57220	±	8639	75903	±	21349

単位:μatm

A

B

図(3)-18 対照区と2,200μatm区のCO₂分圧条件下にて生産されたシロギス卵10個について、26℃と28℃の各水温別に対照区と高CO₂分圧条件30,000、50,000、100,000μatmに24時間ばく露した際の正常孵化数。A:26℃の正常孵化数 B:28℃の正常孵化数。棒グラフ（白：対照区産生卵、グレー:2,200μatm区産生卵）は3回の繰り返し実験の平均値、誤差棒は標準偏差を示す。
図(3)-19 各実験区（対照区及び2,200 μ atm区）において産出されたシロギス受精卵の26℃と28℃下における異常発生24時間半数影響分圧（μ atm）。棒グラフは各実験区3回の繰り返し実験の平均値、誤差棒は標準偏差を示す。

## （5） 大型水槽（10t）におけるCO $ _{2} $ 分圧を制御方法の有効性の検証

実験に用いたマダイの実験後の平均体長は35.6±6.1cm、平均全長は46.1±8.4cm、平均体重は1.46±0.67kgであった。

15日間にわたる実験水槽の制御の結果、実験海水の $ CO_{2} $ 分圧はそれぞれ508±27.4（対照区、n=54）、1,060±60.7μatm（1,000μatm区、n=53）、2,140±129μatm（n=53）という高精度かつ安定的な $ CO_{2} $ 分压制御を行なうことができた（図(3)-20）。また、全ての実験区で産卵が観察され、マダイの再生産過程のうち産卵に関する高 $ CO_{2} $ 分压实験が可能であることが実証された。

今後は、これらの結果を基に、マダイへの海洋酸性化影響の定量化実験を前述のシロギスの再生産への影響評価実験と同様に行なう必要がある。
図(3)-20 各実験区における実験海水のCO $ _{2} $ 分圧の経時変化。

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究の結果、シロギスの再生産過程は海洋酸性化の単純影響に対しては耐性があるが、高水温との複合影響下では正常孵化率の低下に伴うシロギス個体数の低下が引き起こされる可能性が明らかとなった。水産有用魚種を用いて、魚類の再生産過程への高水温と海洋酸性化の複合影響評価を行った研究例はこれまでに無い。また、容量1t及び10tの大型水槽において流水式でCO₂分压制御が可能となったことで、従来よりも多様な魚種についての影響評価が可能になったことは意義深い。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

本研究から得られた多くの新しい知見は、今後の地球温暖化に伴う海洋酸性化の進行が魚類及び海洋生態系に及ぼす影響を予測する上で必要性が高いものであり、今後この結果を論文等で広く公表するとともに、IPCC第6次評価報告書のための議論においても、このような結果が反映されるよう努力したい。本研究に用いられた方法は飼育に大型水槽を必要とする魚種への海洋酸性化の影響評価に適したものであり、水産技術への応用が期待できる。
### 6. 国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない。

## 7 ．研究成果の発表状況※【別添】H26年度研究等成果報告書作成要領参照

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない。

## <査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない。

## くその他誌上発表（査読なし）>

1）「海洋酸性化と魚類の産卵」電気評論（平成26年10月号、52－53頁）

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 山本雄三、林正裕、磯野良介、堀田公明、渡邊裕介、野尻幸宏：日本海洋学会2014年度春季大会シンポジウム、東京（2014）「海洋酸性化がシロギス再生産に与える影響」

2) 山本雄三、林正裕、磯野良介、堀田公明、渡邊裕介、野尻幸宏：平成26年度日本水産学会春季大会、北海道（2014）「海洋酸性化がシロギス再生産に与える影響」

3) 林 正裕、山本雄三、諏訪僚太、吉川貴志、渡邊裕介、西田 梢、鈴木 淳、野尻幸広：第9回バイオミネラリゼーションワークショップ、千葉（2014）

「水産有用種への海洋酸性化影響」

4) Ryota Suwa, "Effects of ocean acidification on marine organisms", 2nd International JAMBIO Symposium", "Aquatic Ecosystems: Past, Present and Future", Japan, 2014.

5) 林 正裕：環境省環境研究総合推進費一般向け研究成果報告会「海洋酸性化がわが国周辺の生物に与える影響を評価する」、東京（2015）

「魚類への海洋酸性化影響評価のこれまでと将来展開」

6) 山本雄三：環境省環境研究総合推進費一般向け研究成果報告会「海洋酸性化がわが国周辺の生物に与える影響を評価する」、東京（2015）

「魚類の再生産への海洋酸性化影響評価実験」

7) 諏訪僚太：環境省環境研究総合推進費一般向け研究成果報告会「海洋酸性化がわが国周辺の生物に与える影響を評価する」、東京（2015）

「海産無脊椎動物への海洋酸性化影響」

8) 林正裕、岸田智穂、箕輪康、渡邊裕介、西田梢、鈴木淳：平成27年度日本水産学会