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# Quantitative Studies on the Cycles of Some Global Warming Gases and Related Materials through Their Isotopomers

Principal Investigator: Naohiro YOSHIDA

Institution: Tokyo Institute of Technology

4259 Nagatsuta, Midori-ku, Yokohama 226-8502, JAPAN

Tel: +81-45-924-5506 / Fax: +81-45-924-5143

E-mail: yoshida.n.aa@m.titech.ac.jp

Cooperated by: National Institute for Environmental Studies, Sophia University, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology

## [Abstract]

Key Words: Methane, Nitrous Oxide, Carbonyl Sulfide, Sulfur dioxide, Isotopomer

This project aims to reduce the uncertainties of sinks and sources of global warming gases by implementing new technologies such as automation of measurement systems, field isotopomeric measurements of methane $ \left(\mathrm{CH}_{4}\right) $ and nitrous oxide $ \left(\mathrm{N}_{2}\mathrm{O}\right) $ and gases related to greenhouse effect, such as carbonyl sulfide (COS), sulfur dioxide $ \left(\mathrm{SO}_{2}\right) $ , determination of isotopomeric fractionation factors by chamber experiments, construction of isotopomer database from the existing literature and from new measurements and construction of $ CH_{4} $ , $ N_{2}O $ and sulfur species related models.

Field measurements for long and short term variations of $ N_{2}O $ in the northern mid-latitude troposphere were carried out for the first time. Isotopomeric characterization of $ N_{2}O $ from several sources was conducted. Global flux-weighted average isotopomer ratios of $ N_{2}O $ emitted from anthropogenic sources were estimated from atmospheric monitoring and compared with those estimated from source observations. These emissions confirm earlier estimates of isotopically light sources from agriculture and industry contribute to the increase of atmospheric $ N_{2}O $ and suggested that $ \delta^{15}N^{bulk} $ of anthropogenic $ N_{2}O $ has recently increased. Mixing and isotopomer ratios of stratospheric $ N_{2}O $ were calculated by a 3D chemical transport model and compared to observational data obtained by balloon sampling. Both models and experiments show that at stratospheric altitudes the photodissociation of $ N_{2}O $ sinks reaction increases with altitude. Based on results obtained from 5 different model calculations we learned that the resolution of the wavelength employed in the calculation plays an important role in the obtained results.

Isotopomeric characterization of $ CH_{4} $ from several sources was conducted. $ CH_{4} $ concentrations and isotopomeric measurements of western Siberia revealed emissions from Siberian wetlands in summer and that its concentration has started to increase from
2005 or 2006. Comparisons between 3D chemical transport model implemented at NIES and observations in Siberia revealed that models overestimate $ CH_{4} $ emissions from wetland in that region.

Theoretically calculated energy surfaces and transition dipole moments have been used in wavepacket dynamics to calculate photodissociation reaction and fractionation factors of $ N_{2}O $ and we did the first of this type of study for the $ SO_{2} $ molecule, these results will be implemented in the calculation of the temperature dependence in absorption cross sections. Sulfur isotopic fractionation factors of OCS and $ SO_{2} $ sink reactions in the atmosphere have been obtained by a combination of theoretical and experimental methods, the obtained results were introduced in a 3D chemical transport model to quantify that sulfur atmospheric isotopomeric budget.
対流圏大気中の$\mathrm{N}_{2}\mathrm{O}$ の窒素同位体比($\delta^{15}\mathrm{N}$ 値)が年々減少していること、人為起源の発生源から放出される$\mathrm{N}_{2}\mathrm{O}$ の$\delta^{15}\mathrm{N}$ 値が低いことが明らかになり、人為発生源が濃度増加に寄与していることが裏付けられた。

$ CH_{4} $

観測空白域の一つであるシベリア地域での CH₄ 濃度データから 2006年以降の濃度増加が確認された。ノボシビルスクの濃度増加が全球での変動に先んじていないことやスルグートの低高度での増加が明確でないことから、湿地からの CH₄ 放出が主因ではないと言える。長期同位体シグナルも得られ、モデルとの比較が可能となった。

観測により得られたデータベースをもとに、 $ N_{2}O $ 放出源の同位体比分布(図はδ $ ^{15}N $ 值)を作成し、全球化学輸送モデル解析に用いた。

第一原理計算による $ N_{2}O $ の光解離反応に伴う同位体濃縮係数は実験結果と良い一致を示した。実験が不可能な他の同位体濃縮係数についても計算による推定が可能であることが示唆した。

## 硫黄化学種

模擬実験と理論計算から同位体濃縮係数を決定して全球アイソトポマーモデルを構築し、成層圈硫酸エアロゾルの起源は従来のモデルよりも$\mathrm{SO}_{2}$由来に対する$\mathrm{OCS}$由来の寄与が小さい可能性を示唆した。
# 平成26年度宮内庁調達改善計画の年度末自己評価(概要)

## 1 随意契約の見直し

(取り組み)

(1)競争性のない随意契約によらざるを得ないと整理しているもののさらなる精査

(2)新たに競争性のない随意契約によろうとするものについて，宮内庁随意契約審査委員会において，その理由の審査

(3)随意契約に係る情報の適切な公表

(効果)

○競争性のない随意契約の割合(件数ベース)は, 平成18年度44%から平成26年度29%に減少

## 2 一者応札の改善

(取り組み)

(1) 発注予定情報をホームページに掲載し, 四半期毎に内容を更新

(2) 公告期間を開庁日12日間以上確保

(3) 一者応札等の案件について業者にアンケートを実施し, 仕様書等の見直しに活用

(効果)

〇1者応札の割合(件数ベース)は, 平成19年度28%から平成26年度17%に減少

## 3 庁費類(汎用的な物品・役務)の調達の見直し

(取り組み)

(1)事務用消耗品(文房具等)の調達内容の精査

(2)共同調達の推進(荷物等の配送業務など2品目を新規に実施)

(3)関西地区に所在する宮内庁関係の事務所間で一括調達を実施

## 4 その他

(取り組み)

旅行手配業務のアウトソーシングの利用促進
## 東日本大震災復興特別会計

## ☐ 平成25年度補正予算

・歳入歳出予算の概要

(单位: 百万円)

蔵入	蔵出
租税	189,000	内閣府
復興特別所得稅	10,000	警察庁
復興特別法人税	179,000	警察活動基盤整備費	389
他会計より受入	復興庁
一般会計より受入	1,930,777	復興庁	485,374
公債金	復興庁共通費	85
復興公債金	△1,545,700	東日本大震災復興推進費	61,072
公共事業費負担金收入	原子力災害復興再生支援事業費	51,200
公共事業費負担金收入	791	被災者住宅再建支援対策費	25,000
雑収入	106,216	内閣共通費	△24
特別会計整理収入	385	総務省共通費	△1
貸付金等回收金收入	382	法務省共通費	△35
雑納付金	392	文部科学省共通費	△53
雑収入	105,055	厚生労働省共通費	△9
前年度剩余金受入	農林水産省共通費	△26
前年度剩余金受入	237,314	環境省共通費	△274
地域活性化等復興政策費	3,888
生活基盤行政復興政策費	195
法務行政復興政策費	△38
財務行政復興事業費	16,000
教育·科学技術等復興政策費	△457
教育·科学技術等復興事業費	5,128
社会保障等復興政策費	44,746
社会保障等復興事業費	70
農林水産業復興政策費	△1,327
農林水産業復興事業費	759
経済·産業及エネルギー安定供給確保等復興政策費	61,800
経済·産業及エネルギー安定供給確保等復興事業費	36,900
東日本大震災復興独立行政法人産業技術総合研究施設整備費	8,992
環境保全復興政策費	81,697
防衛復興政策費	69
東日本大震災復興事業費	17,052
東日本大震災災害復旧等事業費	55,347
治水事業費等社会資本整備事業特別会計へ線入	621
道路整備事業費社会資本整備事業特別会計へ線入	15,140
港湾整備事業費等社会資本整備事業特別会計へ線入	1,858
財務省	364,664
財務本省	364,689
復興債費	814,689
復興加速化·福島再生予備費	△450,000
国稅庁
国稅庁施設費	△25
文部科学省
文部科学本省	67,621
国立大学法人施設整備費	4,605
公立文教施設整備費	63,016
防衛省
防衛本省	349
武器車両等整備費	△131
航空機整備費	481
合計	918,398	合計	918,398

※百万円未満を切捨てて計算しているため、合計が一致しないことがある。

・一般会計からの繰入金の額及び当該繰入れの理由

(一般会計からの繰入金の額)……1,930,777百万円

(繰入れの理由)

「特別会計に関する法律」の規定に基づき、復興施策及び復興債の償還に要する経費の財源に充てるため。
課題名 4RFd−1202 在来マルハナバチによる環境調和型ポリネーション様式の確立に関する研究

課題代表者名 高橋 純一 （京都産業大学総合生命科学部生命資源環境学科動物分子生態学研究室准教授）

研究实施期间 平成24～26年度

累計予算額 11,400千円（うち26年度3,800千円）

予算額は、間接経費を含む。

本研究のキーワード マルハナバチ、花粉交配、在来種、育種モデル、BLUP、特定外来種、生物多様性、農業、北海道、環境保全、トマト（5～10個以下程度）

## 研究体制

(1) 有用在来種の室内増殖方法の確立と遺伝子解析に関する研究 (京都産業大学)

(2) 育種モデルの確立に関する研究 (大阪府立大学)

## 研究概要

### 1. はじめに(研究背景等)

セイヨウオオマルハナバチは、トマトハウスで授粉昆虫として広く利用されている。しかし、逃げ出した一部の個体が北海道全域や寒冷地で帰化し、生態系に影響を与えるため外来生物法により使用が制限されている。生産現場では、今後使用が全面的に禁止になるとトマト生産に大きな影響を受けるため、代替資材の開発が期待されている。そこで、在来マルハナバチを授粉用生物資材として開発し、生態系保全と農業の両立を研究目的とする。エゾオオマルハナバチの飼育データや遺伝子情報を元にマルハナバチ用に改良した育種モデルBLUP法を利用して、繁殖能力の高い系統の選抜を行う。選抜した系統の中からトマトハウスでの訪花試験により、授粉能力が高い系統を選抜育種により作出する。また、エゾオオマルハナバチにおける安定的かつ効率性の高い累代飼育方法を開発し、トマト生産で利用できる授粉用生物資材を開発し、特定外来種セイヨウオオマルハナバチの帰化問題の解決に寄与する(図1)。

⑤北海道の生態系に適応して帰化・増殖。在来のマルハナバチや植物が減少（地図の灰色は帰化が確認された地域。2010年の調査時点）。

図1 セイヨウオオマルハナバチ問題の概要
### 2. 研究開発目的

在来マルハナバチは、現在実用化されているセイヨウオオマルハナバチと比べて、累代飼育に関連する技術の未確立であることや個体間の変異が大きいため形質の安定化が不十分である。例えば、①室内での女王蜂の交尾成功率の低さ、②女王蜂の産卵能力に起因するコロニー間での個体数（働き蜂）の変異が大きい、③累代飼育個体の休眠期間中の高い死亡率、④累代飼育個体（F1以降）の低い営業成功率、⑤野生種（1世代目）の病原微生物の高い浸潤率等のため繁殖成功率が低く、野生世代は飼育することができても、次世代や次々世代と世代を重ねるごとに飼育可能数が減少し、長期に安定的に系統を維持できない。⑥また、飼育下でのコロニーの大きさ（働き蜂の数）が、セイヨウオオマルハナバチほど安定していない。コロニー大きさが小さい巣をハウスに導入した場合、働き蜂の訪花活動が低く、十分な授粉効果が得られない。これらの問題を解決できなければ、実用化が困難であると考えられる。

そこで本研究では、トマトの授粉用生物資材として利用できる在来マルハナバチの開発について、現在問題となっている安定生産の阻害要因であるコロニーの営業成功率と交尾率の向上に加えて、コロニーサイズを大きくする選抜育種技術を確立する必要がある。確立した技術をもとにトマトハウスでの授粉試験から授粉能力の高い系統を作出する。累代飼育およびトマト生産に適した形質を改良する事で、このエゾオオマルハナバチを実用化することができると考えている。

今回の申請課題では、在来種による基盤技術の確立により、環境に配慮した授粉様式の確立の過程で在来マルハナバチの実用化が求められており、その実現により外来種の完全規制による生物多様性の保全が実現するための基礎研究となるようにする。

### 3. 研究開発の方法

## (1) 有用在来種の室内増殖方法の確立と遺伝子解析に関する研究

本研究では、北海道に広く分布する在来3種のマルハナバチを新規ポリネーター候補とし、遺伝子情報に基づくDNA育種法による開発を行う。北海道在来のマルハナバチをポリネーター用の生物資材として開発することで、外来種の帰化問題の解決を試みる。DNA育種法を用いた選抜育種により在来種を生物資材として開発する予定である。北海道で広範に分布する3種の在来マルハナバチを実験室内で飼育し、基礎集団を作出する。その集団に対して選抜に必要な女王の産卵数に関する遺伝変異を推定し、マイクロサテライトDNAマーカー情報とBLUP

図2 研究計画の流れ

法から得られる予測育種価への最適な重み付け値を算出し、両者を組み合わせた選抜指数に基づき、実験室内で累代飼育による系統選抜を実施し、コロニーサイズの大きな系統を選抜し、在来種の実用化を試みる。さらに今回作出した系統については、改良効果を評価するためにトマトハウスで試験的に授粉試験を行い、セイヨウオオマルハナバチとの能力についても比較試験を行った。アドバイザリーボード会合および中間評価時に指摘されていたエゾオオマルハナバチの実用化後における遺伝子汚染リスク評価については、追加実験を行った（図2）。

## (2) 育種モデルの確立に関する研究

BLUP法 (best linear unbiased prediction) は、家畜の育種において、個体の育種価を推定するために広く用いられている。BLUP法の特徴は、飼育で得られた個体の形質データから、環境要因を除いて遺伝的要因だけを取り出すことで、個体の育種価を推定できることにある。

農業植物の受粉に広く用いられているマルハナバチ類においても、BLUP法を利用して受粉効率を高めることが期待されるが、そのためには解決しなければならない課題がある。マルハナバチ類では、雌は受精卵から発生するが、雄は未受精卵から発生する半数倍数性の性決定システムのため、他の家畜動物とは遺伝子の伝達様式が異なるので、よく使われているBLUPモデルを適用することはできない。また、マルハナバチ類のように雌が複数の雄と交尾する生物では、個体の正確な血縁関係が分からないので、それに基づいたBLUP法は用いること
ができず、複数の父親を仮想的に1頭の雄で代表させるための相加的血縁行列（以下、A行列と表記）の計算アルゴリズムが必要となる。

ハチ類での育種へのBLUP 法による選抜の導入は、ドイツの研究グループによって試みられている。彼らは、BLUP法の計算に必要なA行列の計算に際して、ハチ類に固有の性決定ならびに繁殖様式から生じる問題を解決するために、いくつかの仮定を設けることを提案している。しかし、それらの仮定は、ミツバチのような大規模な養蜂場で数千から数万群といった大飼育集団を対象としたものであり、1つの試験場や研究機関が実施する小規模なマルハナバチ類の選抜計画には妥当なものではない。

そこで我々は、マルハナバチ類の生態的特性に合わせて小規模な飼育集団にも適用できるA行列の計算法を開発することを試みた。また、飼育実験で得られた結果をもとにしたマルハナバチの育種へのBLUP法の適用について、数値例を用いてモデル解析を行った。

また、実際に育種を行うにあたって、近交弱勢の効果は無視できない。そこで、ある程度外部個体群との交流がある状態での選抜育種を行った際に、近交係数と育種価がどのように変動するかをシミュレーションによって推定した（図2）。

### 4. 結果および考察

## (1) 有用在来種の室内増殖方法の確立と遺伝子解析に関する研究

本研究では、北海道在来のマルハナバチを代替受粉用昆虫として開発することにより、外来種の導入を全面的に制限が可能な状態にすることで、外来種問題の解決の一端となることを目的として研究を行った。北海道に分布する3種の在来マルハナバチで飼育試験をしたところ、エゾオオマルハナバチが最も飼育成功率が高く、次世代個体の産出成功率も高いことがわかった。さらに飼育方法に関しても既存の方法を変更することで増殖可能であり、累代飼育技術の確立に成功した。

実用化の問題点としては、コロニーサイズが小さいことが検出された。そこで今回エゾオオマルハナバチを候補種に選定し、室内飼育による累代増殖技術の開発、系統の遺伝学的解析、サブテーマ(2)との融合によるコロニーサイズの巨大化を目的とした系統選抜およびトマトハウスでの訪花実験を行った。マイクロサテライトDNAマーカーを開発し、11種のマーカーによりコロニーサイズの大型化系統の早期選抜育種が可能であることから、ポリネーションに必要な大きなサイズのコロニーへの選抜は、遺伝情報をもとにしたBLUP育種により可能であることを初めて示される結果を得た。またトマトハウスでの訪花試験により、セイヨウオオマルハナバチと比較して訪花能力は同等以上であることが示唆される結果を初めて得ることができた。これらの結果から、エゾオオマルハナバチは、系統選抜により実用可能な代替在来種である実証データを初めて得ることができた。

遺伝子汚染については、ハプロタイプ間はすべて1塩基置換が見られた。個体群間におけるメジャーハプロタイプの頻度には大きな差が見られなかった。マイナーハプロタイプは、地域間で特徴的なタイプが一部見られたが、これはサンプリング数の偏りによるものか、あるいは実際の個体群間の分化を示しているのか確定できなかった。これには追加サンプルの解析が必要になる。これらの結果からは、仮にエゾオオマルハナバチが実用化され、一部の個体が野生個体と交配した場合であっても大きな影響にはならないことが示唆される結果となった。

## (2) 育種モデルの確立に関する研究

本研究によって、マルハナバチ類の育種にもBLUP法は十分に適用できることが明らかになった。BLUP法による選抜は、すでに多くの家畜動物の育種に導入され、目覚ましい成果を上げてきたが、この選抜法は集団の近交度を上昇させる可能性があることが指摘されている。とくに、遺伝率の低い形質を選抜の対象としたとき、家系(family)の情報に大きなウェイトが置かれるため、近交度の急激な上昇を招くことが分かっている。マルハナバチ類において、近交度の上昇は生産性に大きなダメージを与える可能性がある。マルハナバチ類では、半倍数性の性決定に加えて、性決定遺伝子(CSD)が性決定にかかわっている。通常、雌はCSD遺伝子座がヘテロ接合になっているが、ホモ接合となった場合には二倍体の雄となることが知られている。二倍体の雄は、発育初期に死亡するか、あるいは発育しても不姫である。近交度が上昇すると、CSD遺伝子座のホモ接合化が進み、通常はワーカーとして発育するはずの雌の大半が二倍体雄となり、コロニーサイズの小型化を招くが、増殖においては致命的な結果となった。

しかし、本研究によって、不完全な繁殖隔離下で近交係数の上昇を抑制しながらも、実用に耐える程度の形質選抜は可能である可能性が示された。現実的には、マルハナバチ類の選抜飼育は、ある程度の遺伝子流入がある状況で行われる可能性が高いと思われる。極端に近親交配が続けられる状況を避けるように注意すれば、実用的な育種は十分に可能であると考えられた。

### 5. 本研究により得られた主な成果
## (1) 科学的意義

これまで飼育および授粉試験が困難であった北海道産在来マルハナバチの中から候補種の選抜を行い、エゾオオマルハナバチにおいて累代飼育方法を確立した。さらにサブテーマ(2)で開発したBLUP育種モデルを使った方法により、DNA情報をもとに選抜育種を行い、コロニーサイズの大型の(産卵能力の高い)系統が選抜可能であることを実証した。BLUPによるDNA育種は、昆虫でも初めての成功結果である。さらに実践試験として、増殖したエゾオオマルハナバチを利用してトマトハウス内での訪花行動調査を行い、授粉能力があることを初めて確認した。またセイヨウオオマルハナバチとの比較試験でも同等の能力があることを初めて確認することができた。今回の研究成果により、代替種として在来種をBLUPモデルによる育種でコロニーサイズの大型化を行えば、実用化が可能であることを初めて実験的に示すことができた。

エゾオオマルハナバチの実用化後を想定した遺伝子汚染リスク評価を行った。仮にエゾオオマルハナバチが実用化され、一部の個体が野生個体と交配した場合であっても地域個体群の遺伝子構造に大きな影響にはならないことが示唆される結果を得た。

## (2) 環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

2014年3月に一般財団法人自然環境研究センターで開催されたマルハナバチ利用方針検討会で本研究成果である北海道在来マルハナバチ種の実用化までの予定計画を提示し、外来生物法におけるセイヨウオオマルハナバチの取扱いに関する政策判定に貢献した。当会には、オブザーバーとして環境省および農水省も参加して議論が行われた。

また、2014年11月には、北海道庁農政部、ホクレン農業協同組合連合会、JA北海道が参加し、北海道庁で開催されたエゾオオマルハナバチの実用化に向けた検討会において、本研究成果のエゾオオマルハナバチの実用化に関する研究成果を提示し、特定外来種セイヨウオオマルハナバチの利用規制と在来種への転換を進めるための準備体制の策定に貢献した。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

エゾオオマルハナバチがトマト授粉に利用できることが今回初めて科学的データをもとに示すことができた。この結果により、北海道庁農政局では、エゾオオマルハナバチ利用普及検討会の協議会（仮称）を設立し、特定外来種であるセイヨウオオマルハナバチの完全規制とエゾオオマルハナバチの普及に向けた生産現場との連携体制をJA、ホクレン、生産者団体の関係機関と調整を行うための準備協議会の設立準備を進めることに活用されることが見込まれる。

#### 6. 研究成果の主な発表状況（別添.報告書作成要領参照）

## (1) 主な誌上発表

<査読付き論文>

1) T. NOMURA and J. TAKAHASHI: Heredity, 109, 261-268 (2012)

“Effective population size in eusocial Hymenoptera with worker-produced males.”

2）高橋純一：環境と健康、2月号、12-22(2014)

「日本におけるミツバチの減少原因について・本当にミツバチたちは消えたのか-」

## く査読付論文に準ずる成果発表＞

1）中村純、高橋純一、木村澄、佐々木正己：現代化学、12月号、67-68(2013)

「ネオニコチノイドに関する山田論文の問題点について」

2）高橋純一、竹内実、松本耕三、野村哲郎：京都産業大学先端科学技術研究所所報、第12巻、9-68(2013)

「ミツバチおよびマルハナバチにおける微胞子虫の浸潤状況」

3）野村哲郎、高橋純一、竹内剛：京都産業大学先端科学技術研究所所報、第12巻、45-58(2013)

「ハチ類の育種へのBLUP法による選抜の導入」

4）野村哲郎、高橋純一、竹内剛：京都産業大学先端科学技術研究所所報、第13巻：17-23(2014)

「不完全な繁殖隔離下におけるハチ類の選抜育種の効率の評価」
## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1）野村哲郎、高橋純一:第72回日本昆虫学会(2012)

「BLUP法を用いた選抜計画のミツバチ育種への導入」

2）高橋純一：第73回日本昆虫学会(2013)

「ミツバチおよびマルハナバチにおける病原性微生物の浸潤状況について」

3）高橋純一、竹内剛、中川修二郎、手塚俊行、野村哲郎：日本昆虫学会近畿支部会(2014)

「エゾオオマルハナバチの室内飼育コロニーによるトマト訪花試験」

4）竹内剛、清拓哉、高橋純一：第59回日本応用動物昆虫学会大会(2015)

「授粉用昆虫としてのエゾオオマルハナバチの適正」

### 7. 研究者略壓

課題代表者:高橋 純一

玉川大学大学院農学研究科博士後期課程修了、農学博士、現在、京都産業大学総合生命科学部准教授および京都産業大学ミツバチ産業科学研究センター研究員（兼任）

## 研究分担者

1）竹内 剛 （サブテーマ2担当）

京都大学大学院理学研究科修了、理学博士、現在、大阪府立大学大学院生命環境科学科研究員
4RFd-1202 在来マルハナバチによる環境調和型ポリネーション様式の確立に関する研究

## (1) 有用在来種の室内増殖方法の確立と遺伝子解析に関する研究

京都産業大学総合生命科学部・高橋純一

平成24(開始年度)～26年度累計予算額：11,400千円

（うち、平成26年度予算額：3,800千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

トマトハウスの受粉用昆虫として1991年に国内にセイヨウオオマルハナバチが輸入されると、ハウスから逃げ出した一部の個体の帰化による在来生態系への影響が問題となり、2006年に特定外来種に指定された。その後、新規就農者は、本種の利用を制限されている。しかしながら、特定外来生物法による使用制限だけではセイヨウオオマルハナバチの帰化への抑制効果は低く、特に北海道においては、ほぼ全域で分布が確認されるようになった。その結果、北海道では生物多様性の保全だけでなく農業生産でも大きな問題となっている。

本研究では、北海道在来のマルハナバチを代替受粉用昆虫として開発することにより、外来種の導入を全面的に制限が可能な状態にすることで、外来種問題の解決の一端となることを目的として研究を行った。北海道に分布する3種の在来マルハナバチで飼育試験をしたところ、エゾオオマルハナバチが最も飼育成功率が高く、次世代個体の産出成功率も高いことがわかった。さらに飼育方法に関しても既存の方法を変更することで増殖可能であることがわかった。実用化の問題点としては、コロニーサイズが小さいことが検出された。そこで今回エゾオオマルハナバチを候補種に選定し、室内飼育による累代増殖技術の開発、系統の遺伝学的解析、サブテーマ(2)との融合によるコロニーサイズの巨大化を目的とした系統選抜およびトマトハウスでの訪花実験を行った。その結果、累代飼育技術の確立に成功し、ポリネーションに必要な大きなサイズのコロニーへの選抜は、遺伝情報をもとにしたBLUP育種により可能であることが初めて示される結果を得た（表(2)-4参照）。またトマトハウスでの訪花試験により、セイヨウオオマルハナバチと比較して訪花能力は同等以上であることが示唆される結果を初めて得ることができた。これらの結果から、エゾオオマルハナバチは、系統選抜により実用可能な代替在来種である実証データを初めて得ることができた。

## [キーワード]

マルハナバチ、特定外来種、花粉交配、環境保全型農業、生態系の保全

### 1. はじめに
トマト生産現場におけるセイヨウオオマルハナバチの導入は、それまで行われていたホルモン剤（植物成長調整剤）散布による授粉（単為結果）作業という重労働からトマト生産者を解放することができた。その結果、国内におけるトマト生産量および品質の向上などの多くのメリットをもたらしている。しかし、外来種であるセイヨウオオマルハナバチが野外に逃亡・帰化し、在来マルハナバチ類と在来植物の減少による在来生態系に与える影響が確認されたことから、2006年に特定外来生物に指定され、以後その利用に厳しい制限がかけられている。しかしながら、使用制限による減少効果は低く、特に北海道では、セイヨウオオマルハナバチはほぼ全域で帰化が確認されている。そのため今後、生物多様性および生態系の保護の視点からセイヨウオオマルハナバチの使用については、全面禁止の厳しい制限が加えられる可能性が高い。現在北海道は、夏秋トマトの一大生産地となっている。授粉作業の効率化の面からは、セイヨウオオマルハナバチ以外の選択肢がないため、使用制限は新規トマト生産者の参入を困難なものとする1つの理由となっている。その他にも既存のトマト生産者は、野生化・定着問題に起因する「心理的」を使いにくさや、今後の全面禁止措置を懸念して設備投資の抑制もあり、潜在的にはさらなる生産拡大が可能であるにもかかわらず、それを困難なものとしている。このことから、生物多様性および生態系の保全に配慮した新しいトマト授粉用生物資材の開発が喫緊の課題となっている（図(1)-1）

現在わが国でトマト授粉用に流通しているマルハナバチには、セイヨウオオマルハナバチの他にクロマルハナバチがある。クロマルハナバチは、在来種であるが本州以南にしか生息していないため、北海道では国内外来種となることから同様の理由で使用することができない。これらの多くは、国外の工場で増殖されているため、輸送コストがかかるのみならず、注文から農家に届くまで1週間近くかかることから(国産は翌日ないし翌々日)、必要なときにすぐ入手することができず、花粉交配に間に合わない場合がある。また、海外からの長期輸送や、空港のコンテナヤードでの積み替え待機中の低温・高温暴露等により、マルハナバチはダメージを受けやすく、その結果、安定した品質の維持が困難で、最もよい状態でトマト生産農家に供給することは容易でない。また、国外で生産された場合、在来マルハナバチや野生の他のハチ類に感染する病原微生物が持ち込まれることが懸念されており、過去にダニ類の侵入が確認されている。海外でも、輸入されたハチに随伴していた病原体が、野生のハチ類に感染し、個体数が減少していることも報告されている。これらのことから、国内で在来マルハナバチを増殖する技術の確立が強く求められている。

## 環境研究総合推進費

## 研究開発の最重要課題

★在来マルハナバチの増殖技術の開発とポリネーションへの利用化

施設栽培作物のポリネーション用生物資材として北海道で使用することができる在来マルハナバチの系統造成および増殖方法の開発

★在来マルハナバチおよび在来生態系との環境調和型農業の実践

北海道の施設栽培（トマト）において、北海道産在来マルハナバチを利用したポリネーションの効果の実践的研究の推進

図1-1 研究計画
また、現在本州以南のトマトハウスでは、在来種クロマルハナバチの増殖技術が確立し、市販されている。しかし、セイヨウオオマルハナバチと比較すると、ハウス内で定着が失敗する確率が高く、ハウスに貼られている紫外線除去フィルムにより色覚に影響を受け飛翔して授粉することができない、花の状態や種類によっては訪花しない等の欠点をもつことから、本州での普及も頭打ちで、ホルモン剤との併用が普通となっている。そのため、労働コストの削減および生産量の増産には、別の在来マルハナバチの実用化が求められている。今回の研究対象はエゾオオマルハナバチであるが、本州以南にはエゾオオオマルハナバチの別亜種オオマルハナバチが分布している。エゾオオマルハナバチの実用化研究で得られた知見と技術は、その後の展開として、本州以南で使用できるオオマルハナバチの実用化に向けて非常に重要な研究成果となることが期待できる（図(1)-1および(1)-2）。

図1-2 研究実施体制

### 2. 研究開発目的

わが国における農作物の授粉は、ほとんどがセイヨウミツバチ等の授粉生物資材が利用されている。しかし、トマトなどの花蜜を分泌しない植物にはミツバチが訪花しないため、代替授粉用生物資材としてヨーロッパ原産のセイヨウオオマルハナバチが輸入されている。セイヨウオオマルハナバチは、従来使われてきた単為結果を促すホルモン剤に替わる新たな授粉用生物資材として1991年に輸入が開始され、トマトの品質向上やホルモン処理にかかる労働力の削減により、生産量の増加とコスト削減など多大な恩恵をもたらした。また、ハウス（栽培施設）内に昆虫を入れるため化学農薬の使用が制限され、これがわが国における総合的害虫管理技術（Integrated Pest Management: IPM）、生物農薬利用、減農薬栽培への取り組みの強いきっかけとなり、消費者にと
っても安心できる農作物生産の先駆けとなった。しかし、セイヨウオオマルハナバチは、野外へ逃亡した個体が帰化し、在来生物や生態系に大きな影響を与えることが問題とされてきた。そこで、2005年6月から施行された「特定外来生物による生態系等に係る被害の防止に関する法律」において、指定第三次指定種として2006年7月に特定外来生物に指定し、飼育・保管・運搬などを規制するとともに、園芸農家にはハウス（施設）外への逸脱防止のための適切な施設の整備と管理の義務付けを行った。その結果、トマト生産農家の新規参入者数や生産量の増加は当初予測されていたよりも伸び悩んでいる。さらに外来生物法の施行後もセイヨウオオマルハナバチは分布を拡大させ、生態系に影響を与えているため早急な対策が必要である。セイヨウオオマルハナバチの帰化問題で見られる自然保護と農業生産の両立は、21世紀の持続可能な社会を形成する上でも大きな課題となっている。さらに世界的な規模で発生した原因不明のミツバチ大量死は、授粉用ミツバチの不足問題を引き起こし、農作物の安定生産にも大きな影響を及ぼしたことから、ミツバチに代わる代替授粉生物資材の確立は重要な課題となっている。そのような状況の中、マルハナバチはミツバチに代わる代替授粉用生物資材としても大きく注目されており、生態系の影響が少ない在来マルハナバチの国内での実用化は、社会的・国民的観点から見ても非常に重要であると考える。

今回候補種としたエゾオオマルハナバチ、エゾトラマルハナバチ、エゾナガマルハナバチは、北海道固有のマルハナバチで北海道全域に普通種として分布している。セイヨウオオマルハナバチと近縁で類似した送粉生態を持つことからセイヨウオオマルハナバチに替わる花粉媒介昆虫の候補種として期待されている。我々のグループは、在来マルハナバチ類を対象にこれまで行ってきた一連の研究成果により、今回この在来種3種をトマト授粉における新規生物資材の候補種として研究計画を立案した。この3種が候補となる理由としては、①北海道に生息する他の在来種と比較して野生種の1世代のみであるが飼育成功率が高い、②野外巣の調査によれば、繁殖能力に関係する形質（コロニーサイズ）に変異が大きく、選抜による育種効果が期待できる、③野外の路地栽培においてトマトの花に対して授粉行動が発現する、④セイヨウオオマルハナバチに比べて性質が温和であるため農家の刺傷被害のおそれが少ない、⑤別亜種が本州やアジアに分布しているため、将来的に同じ手法でこれらの亜種の増殖が可能である等があげられる。一方、これら3種の在来マルハナバチをトマト授粉に利用する場合の問題点としては、現在実用化されているセイヨウオオマルハナバチやクロマルハナバチと比べて、累代飼育に関連する技術の未確立であることや個体間の変異が大きいため形質の安定化が不十分である。例えば、①室内での女王蜂の交尾成功率の低さ、②女王蜂の産卵能力に起因するコロニー間での個体数（働き蜂）の変異が大きい、③累代飼育個体の休眠期間中の高い死亡率、④累代飼育個体（F1以降）の低い営巣成功率、⑤野生種（1世代目）の病原微生物の高い浸潤率等のため繁殖成功率が低く、野生世代は飼育することができても、次世代や次々世代と世代を重ねるごとに飼育可能数が減少し、長期に安定的に系統を維持できない。⑥また、飼育下でのコロニーの大きさ（働き蜂の数）が、セイヨウオオマルハナバチやクロマルハナバチほど安定していない（働き蜂数：セイヨウオオマルハナバチは120匹前後、クロマルハナバチは60～70匹前後であるが、これら3種は20～100匹と種およびコロニー間の変異が大きい）。コロニー大きさが小さい巣をハウスに導入した場合、働き蜂の訪花活動が低く、十分な授粉効果が得られない。これらの問題を解決できなければ、現在流通している2種類と同等の商品サイズ・品質のものを継続的に生産することができないと考えられる。
⑤北海道の生態系に適応して帰化・増殖。在来のマルハナバチや植物が減少（地図の灰色は帰化が確認された地域。2010年の調査時点）。

図(1)-3 セイヨウオオマルハナバチ問題の概要

そこで、トマトの授粉用生物資材として利用できる在来マルハナバチの開発について、現在問題となっている安定生産の阻害要因であるコロニーの営巣成功率と交尾率の向上に加えて、コロニーサイズを大きくする選抜育種技術を確立する必要がある。確立した技術をもとにトマトハウスでの授粉試験から授粉能力の高い系統を作出する。累代飼育およびトマト生産に適した形質を改良する事で、このエゾオオマルハナバチを実用化することができると考えている。

今回の申請課題では、在来種による基盤技術の確立により、環境に配慮した授粉様式の確立の過程で在来マルハナバチの実用化が求められており、その実現により外来種の完全規制による生物多様性の保全が実現するための基礎研究とする（図(1)-3）。

### 3. 研究開発方法

## (1) 有用在来種の室内増殖方法の確立と遺伝子解析に関する研究

## 選抜のための基礎集団の作成

選抜により十分な遺伝的改良量を得るためには、基礎集団（選抜開始時の集団）に多量の遺伝変異が含まれる必要がある。そこで、春に北海道の広域にてエゾトラマルハナバチ、エゾオオマルハナバチ、エゾオオマルハナバチの女王蜂を採集し（図(1)-4）、女王蜂を専用の飼育用巣箱に導入して営業試験を行った（図(1)-5）。営業試験は、女王蜂の営業（産卵）成功率、働き蜂の羽化までの成功率、次世代の繁殖個体（新女王蜂やオス蜂）の羽化成功率を測定・比較し、在来3種の中から候補種の選定をおこなった。

候補種が決まったら飼育条件下で成熟した巣のうち、働き蜂の個体数が平均よりも高い営巣規模の大きなもの上位のコロニーを予備選抜し、そこから次世代の新女王蜂と雄蜂を取り出して人
工授精法により交尾させた後、人工休眠処理を行い3～6ヶ月程度の休眠処理を行った。2世代目以降は、飼育下で人工繁殖・休眠処理をおこなった個体を利用した。野外のマルハナバチ類では、新女王蜂と雄蜂が秋に交尾し、交尾後の新女王蜂は翌年の春季まで休眠する。しかし、本研究においては、既存の女王蜂の休眠を短縮して周年飼育する技術を用いて、次世代の巣の創設を早めることが可能か検証をした。この方法によって、予備選抜を1～2世代（約半年間）にわたって実施し、系統造成のための基礎集団を作出することができるか、さらに選抜をするときに使用することができる形質の評価を行った。

在来種の中から

候補となる3種を選択した。

エゾトラマルハナパチ

エゾオオマルハナバチ

エゾナガマルハナバチ

図(1)-4 在来マルハナバチの中から代替候補3種の選定

①春に北海道で女王緯を捕獲する。

②捕獲した女王蜂を果箱に入れ、花粉と砂糖液を与える。

③女王蜂は産卵、果作りなどを行う。

④衝き蜂が次々に生まれ巣は大きくなる。

図(1)-5 野生種の捕獲から飼育までの流れ
## (2) 在来マルハナバチの繁殖成功率に影響を及ぼす病原微生物の浸潤状況調査

欧米では在来マルハナバチが、外来花蜂類に随伴して持ち込まれた外来性の病原体の感染により大量死が起こり、大きな影響を受けている。そこで国内に生息するマルハナバチ3種におけるノゼマ微胞子虫N. bombiの寄生状況を調べるため候補種のエゾオオマルハナバチ、オオマルハナバチと外来種のセイヨウオオマルハナバチを対象種として浸潤状況について遺伝子検査を行った。捕獲は、2012年から2013年にかけて訪花中の個体を捕虫網により女王蜂または働き蜂を採集した。

採集した個体は、PCR法を利用して寄生の有無を判別するため、採集後、直ちに99%エタノールの液浸標本とし、DNA抽出実験まで冷蔵保存した。オオマルハナバチは、長野県諏訪市および長野市で採集した40個体を使用した。エゾオオマルハナバチは、北海道札幌市、釧路市、浜中町、根室市、中標津町、利尻島から各10個体ずつ採集し、合計60個体を使用した。セイヨウオオマルハナバチは、北海道札幌市、帯広市、釧路市、浜中町、根室市、中標津町から各20個体ずつ採集し、合計120個体を使用した。成虫の腹部を解剖用ハサミで開腹し、腸および卵巣組織を摘出し、それを試料としてDNAの抽出を行った。

これらの試料はDNeasy blood & Tissue kit（QIAGEN）を使用した。抽出の方法は、キットに添付されているプロトコールに従った。DNA 抽出溶液は、PCR 実験に使用するまで一20℃で保存した。N. apis およびN. bombi の検出には、PCR 診断用に開発されたSSU rRNA プライマーを使用した。コントロールとして、マルハナバチの核DNA のlong wave rhodopsin（LWRh）領域を増幅するプライマーを使用した。実験に使用したプライマーの配列は表(1)-1に示した。PCR は、1 サンプルあたり全量20 μl で行った。反応液の組成はTakara Ex Taq ポリメラーゼ（5 units/μl）を0.1 μl 使用し、添付の100 μMの2.5mM dNTP mixを1.6 μl、10X緩衝液を2 μl、100 μMの各プライマーを0.02 μl、鋳型DNA 溶液（約50 ng/μl）を3 μl 加えて、滅菌水で20 μl とした。PCR反応は、プログラムサーマルサイクラー（TaKaRa）を用いた。N. bombi のプライマーは、94℃で30 秒、50℃で30 秒、72℃で1 分間のサイクルを35 回繰り返した後、72℃で5 分間の伸長反応を行った。LWRh は、94℃で1 分間、46 oCで1 分間、72℃で1 分間のサイクルを35 回繰り返した後、72℃で5 分間の伸長反応を行った。ノゼマ判定の陽性コントロールには、名古屋大学の門脇准教授から提供されたN. apis に感染したセイヨウミツバチから抽出したDNA サンプルを使用した。増幅したDNA は、アガロースゲル電気泳動法で分離してエチジウムブロマイド溶液（0.5 μg/ml）で染色し、UV 照射下で増幅を確認した。陽性を示したDNA サンプルは、シークエンス解析まで-20℃で保存した。

PCR診断法により N. bombi に陽性反応を示したサンプルのうち、宿主ごとに各地域から1 個体を選択し、そのDNA をもとにシークエンス解析を行った。解析した遺伝子領域は、16S rDNA と 23S rDNA 間のinternal transcribed spacer（ITS）領域を含んだ部分配列を使用した。実験に使用したプライマーの配列は、表(1)-1に示した。PCR 条件は、前述と同じとした。PCR 産物をExoSAP-IT（GE ヘルスケアサイエンス）で精製後、BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ）を用いた。サイクルシークエンスの条件は、キットに添付されているプロトコールに従った。反応サンプルは、ジェネテックアナライザー3500（アプライドバイオシステムズ）により塩基配列を決定し、GenBank（DDBJ）を利用したBLAST の相同性検索によって遺伝子型の解析を行った。
表(1)-1 PCR診断法およびシーケンス解析で使用したプライマー

名前	遺伝子	配列（5' to 3'）	PCR product
Nbombi-SSU-Jf1	rRNA small subunit (SSU)	CCATGCATGTTTTGAAGATTATTAT	323bp
Nbombi-SSU-Jr-1	CATATATTTTAAAATATGAAACAATAA
LWRhF	Long wave rhodopsin (LWRh)	AATTGCTATTAYGARACNTGGT	700bp
LWRhR	ATATGGAGTCCANGCCATRAACCA
ITS-f2	rRNA internal transcribe spacer region	GATATAAGTCGTAACATGGTTGCT	114-122 bp
ITS-r2	CATCGTTATGGTATCCTATTGATC

## (3) エゾオオマルハナバチの大量増殖を目的とした飼育コロニーにおける死亡要因の調査

本研究でも問題となっている初期コロニーの高い死滅要因を解明するために、病原微生物の感染状況を調査して死亡要因の解明を試みた。調査の対象種は、セイヨウオオマルハナバチと在来種で本研究の候補種であるエゾオオマルハナバチとした。マルハナバチは、春に北海道で訪花中の個体を捕虫網により女王蜂または働き蜂を採集し、室内飼育中に死亡した個体を使用した。検体は、解剖による寄生種の顕微鏡観察とPCRによる遺伝子判定を併用した。PCR関連試験の方法は、①に準拠している。分析対象には、マルハナバチでも判別法が確立されている病原微生物の縮翅病、ノゼマ病、ポリプダニ、原虫、寄生性の双翅目、膜翅目、センチュウとした。マルハナバチは、北海道の札幌市、旭川市、帯広市、釧路市、浜中町、根室市、中標津町で総計258個体とした。

## (4) エゾオオマルハナバチにおけるDNAマイクロサテライトマーカーの試験

基礎集団の造成過程において、各コロニーの女王蜂と働き蜂を対象として、マイクロサテライトDNAマーカーによる遺伝子型解析を行った。遺伝子解析に先立ち120個のマイクロサテライトDNAマーカーがエゾオオマルハナバチの系統選抜育種の遺伝子型情報として適用可能かどうかPCRテストを行った。

DNA抽出にはセイヨウオオマルハナバチが分布していない奥尻島のエゾオオマルハナバチの20個体と、コントロールとして帰化しているセイヨウオオマルハナバチを20個体とした。DNA抽出は胸部飛翔筋から約200mgを摘出して使用した。DNA抽出キットQIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN社製)を用いて抽出した。抽出方法は、1.5mlマイクロチューブにサンプルを入れ、ホモジナイザーを用いてすり潰した。1.5mlマイクロチューブにATL buffer 180μlを加え、さらにProteinase K溶液を20μl加えた。ボルテックスミキサーを用いて10秒攪拌し、数秒間スピンダウンした。その後インキュベーター(55℃)で1日培養した。培養後AL buffer 200μlを加え10秒攪拌し、数秒間スピンダウン後インキュベーター(70℃)で10分間培養した。培養後、99%エタノール200μlを加え、30秒間攪拌し、数秒間スピンダウンした。QIAamp spin columnを2ml collection tubeに立て、マイクロチューブ内の全ての溶液をspin columnの外側に溶液が漏れないように分け入れた。蓋を閉め、遠心機で4℃ 8000rpm 1分間の条件で遠心した。遠心後collection tubeの中の液を捨て、キムタオルの上で軽く叩き水滴をできる限り取った。spin columnの水滴を取ったcollection tubeに立て、500μlのAW1 bufferを加えた。蓋を閉め、8000rpmで1分間の条件で遠心した。遠心後同様にキムタオルで水滴を取った後、500μlのAW2 bufferを加え、15000rpmで3分間の条件で遠心した。遠心後collection tube