Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
の中の溶液を捨て、何も加えずに空の状態にして15000rpmで1分間の条件で遠心した。遠心後collection tubeは捨て、spin columnを新しい1.5mlマイクロチューブに立て20μlのAE bufferを加え1分間室温で放置しDNAを溶出した。8000rpmで1分間の条件で遠心してDNAを回収し、フリーザ(-25℃)で保存した。PCR反応での特異性や安定性を向上させる事を目的として、QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN社製)で抽出したDNAを鋳型とし、各プライマー63種のアニーリング温度条件の最適化を行った。TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceのグラジエント機能を用いてグラジエントPCRを行った。PCR産物をアガロース電気泳動により確認し、設定温度と照らし合わせることで、各プライマーの最適アニーリング温度を決定した。各プライマーに対して0.2mlのチューブを使用して12サンプルを用意した。1サンプル当たりの反応液量は、DNA溶液0.31μl、プライマー各0.15μl、10×r Taq Buffer 1.50μl、dNTP Mixture 1.20μl、TaKaRa Ex Taq (タカラバイオ社製) 0.08μlおよび滅菌蒸留水 11.60μlを混合し全体で15μlとしたものを反応溶液とした。各試薬の反応液量と濃度は表1-1に示してある。各試薬の反応温度条件は、94℃で3分間の熱変性後、94℃で30秒間、各プライマー当たり※12種類の温度(40,41,42,44,46.4,48.8,51.2,53.6,56,58,59,60℃)で30秒間、72℃で30秒間を35サイクル繰り返し、72℃で7分間の伸長反応を行った。100mlの1×TBE溶液に対して1.2gのアガロース(Genetics 社製)を加えた1.2%アガロースゲルを作成し、1μlのMidori Green Direct (Genetics 社製)と5μlのグラジエントPCR産物をピペッティングした合計6μlをアプライした。その後100V、15分の条件で電気泳動を行い、紫外線照射撮影した電気泳動図から最も鮮明なバンドを選別し、設定温度と照らし合わせ、各プライマーに対して理想の温度を決定した。グラジェントPCRにより決定した最適温度条件下で、DNAマイクロサテライト領域を増幅させた。PCR増幅産物の多型を解析するため、各プライマーに20個体ずつ自動電気泳動装置QIAxcel (QIAGEN)を用いて行い、PCR増幅産物のサイズの測定を行った。

## (5) エゾオオマルハナバチとセイヨウオオマルハナバチの判別プライマーの試験

セイヨウオオマルハナバチと近縁であるエゾオオマルハナバチは、導入直後から種間交雑の可能性が問題となっている。そこで、その影響を明らかにするために両種を識別できるPCR用の判別プライマーの開発を行った。DNA抽出には、セイヨウオオマルハナバチが分布していない奥尻島のエゾオオマルハナバチと、コントロールとして帰化しているセイヨウオオマルハナバチとした。念のため外部形態の同定の他にミトコンドリアDNAを使用して膜翅目DNAバーコーディング用COIの部分配列を増幅するプライマーを使用した。シークエンス解析の結果は、DDBJによる相同性検索を行い種同定を行った。シークエンス方法は、前述に準拠した。判別プライマーの設計には、①で利用したLWRhのシークエンス解析結果から得られた配列をもとにPrimer3で設計を行った。設計したプライマーは、アニーリング温度条件の最適化をTaKaRa PCR Thermal Cycler Diceのグラジエント機能を用いてグラジエントPCRを行った。各プライマーに対して0.2mlのチューブを使用して12サンプルを用意した。1サンプル当たりの反応液量は、DNA溶液0.31μl、プライマー各0.15μl、5×Buffer 1.50μl、dNTP Mixture 1.2μl、Primer Star (タカラバイオ社製) 0.1μlおよび滅菌蒸留水で全体を20μlとしたものを反応溶液とした。各試薬の反応液量と濃度は表1-1に示してある。各試薬の反応温度条件は、94℃で3分間の熱変性後、94℃で30秒間、各プライマー当たり※12種類の温度(40,41,42,44,46.4,48.8,51.2,53.6,56,58,59,60℃)で30秒間、72℃で30秒間を35サイクル繰り返し、72℃で7分間の伸長反応を行った。各プライマーに対して理想の温度を決定す
るために自動電気泳動装置QIAxcel (QIAGEN)を用いた。次に判別能力の判定を行った。

## (6) 累代飼育選抜方法の改良

現在大量増殖に使用されている木製巣箱には、繰返し使用することで病原性微生物が次世代にまで伝播するため衛生上の問題がある。例えば、餌や排泄物で汚染（カビ等が発生）しやすい。滅菌消毒液の使用は、木材の劣化や薬剤残留を引き起こす。暗室内で上部からしか見えないのでデータの収集が難しい。そこで、本研究において改良型アクリル製巣箱による飼育試験を行った。次にミツバチおよびマウスで使用されている人工受精用精子保存液がマルハナバチの人工受精に使用できるのか調査した。マルハナバチ女王蜂への影響を調べるため、ミツバチ用人工受精器をマルハナバチ用に改良し、女王蜂の受精囊内に保存液を1uL注入して、女王蜂の生存日数を調査した。そして同じように雄蜂から解剖して精子を取り出し、保存溶液と等量で混合し、液体窒素中で保存した。約120日後に取り出し、顕微鏡かで精子の生存率を確認した。

## (7) マルチプレック PCRによる遺伝子型判定法の確立

産卵能力を事前に特定するため1度のPCRにより複数遺伝子座の遺伝子型判定方法を確立することを目的に行った。DNA抽出にはエゾオオマルハナバチの20個体とした。DNA抽出は、エゾオオマルハナバチ成虫の胸部飛翔筋から約200mgを摘出して使用した。DNA抽出キットQIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)を用いて抽出した。抽出方法は、1.5mlマイクロチューブにサンプルを入れ、ホモジナイザーを用いてすり潰した。1.5mlマイクロチューブにATL buffer 180μlを加え、さらにProteinase K溶液を20μl加えた。ボルテックスミキサーを用いて10秒攪拌し、数秒間スピングウンした。その後インキュベーター(55℃)で1日培養した。培養後AL buffer 200μlを加え10秒攪拌し、数秒間スピングウン後インキュベーター(70℃)で10分間培養した。培養後、99％エタノール200μlを加え、30秒間攪拌し、数秒間スピングウンした。QIAamp spin columnを2ml collection tube に立て、マイクロチューブ内の全ての溶液をspin columnの外側に溶液が漏れないよう2回に分け入れた。蓋を閉め、遠心機で4℃ 8000rpm 1分間の条件で遠心した。遠心後collection tubeの中の液を捨て、キムタオルの上で軽く叩き水滴をできる限り取った。spin columnの水滴を取ったcollection tubeに立て、500μlのAW1 bufferを加えた。蓋を閉め、8000rpmで1分間の条件で遠心した。遠心後同様にキムタオルで水滴を取った後、500μlのAW2 bufferを加え、15000rpmで3分間の条件で遠心した。遠心後collection tubeの中の溶液を捨て、何も加えずに空の状態にして15000rpmで1分間の条件で遠心した。遠心後collection tubeは捨て、spin columnを新しい1.5mlマイクロチューブに立て20μlのAE bufferを加え1分間室温で放置しDNAを溶出した。8000rpmで1分間の条件で遠心してDNAを回収し、フリーザ(-25℃)で保存した。57種プライマーのアニーリング温度条件の最適化を行った。TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceのグラジェント機能を用いてグラジェントPCRを行った。PCR産物をアガロース電気泳動により確認し、設定温度と照らし合わせることで、各プライマーの最適アニーリング温度を決定した。各プライマーに対して0.2mlのチューブを使用して12サンプルを用意した。1サンプル当たりの反応液量は、DNA溶液0.2μl、各プライマーを0.15μl、2×MightyAmp Buffer（Mg²⁺, dNTP plus）を7.5μl、MightyAmp DNA polymerase（1.25 U/μl）（Takara）を0.6μlおよび滅菌蒸留水を混合し全体で15μlとしたものを反応溶液とした。PCR実験に使用した57種類のプライマーの配列は、表(1)-2に示した。プライマーはPCRによる増幅サイズが重複しないこと、プライマー
ダイマーの形成可能性しないこと、Tm値が類似していること等を考慮して、前年度のデータから多型頻度が高いアレル座のプライマーから順に増幅が干渉しない組み合わせを対戦形式で組み合わせを設計し、PCRによる試験を行った。PCRの温度条件は、98℃で2分間の熱変性後、98℃で10秒間、12種類の温度(40、41、42、44、46、48、51、53、56、58、59、60℃)で15秒間、68℃で30秒間を35サイクル繰り返し、68℃で5分間の伸長反応を行った。100mlの1×TBE溶液に対して1.2gのアガロース(Genetics)を加えた1.2%アガロースゲルを作成し、1μlのMidori Green Direct(Genetics)と5μlのグラジェントPCR産物をピペッティングした合計6μlをアプライした。その後100V、15分の条件で電気泳動を行い、紫外線照射撮影した電気泳動図からバンドの有無を確認した。次に自動電気泳動装置QIAxcel(QIAGEN)を用いて行い、PCR増幅産物のサイズの簡易測定と最もバンドが鮮明に増幅されているアニーリング温度条件を決定した。その後、蛍光プライマーを利用して最適な条件でPCRを行い、ABI 3130xl Genetic Analyzer（Life technologies）による遺伝子型判定を行った。

表(1)-2 マルチプレック PCR試験に使用したDNAマイクロサテライトプライマー

アレル座	Primer sequence(5'-3')	サイズ範囲 (bp)	Tm(℃)
BTMS0057	F-TGCTTGAACCGAAATAGAGGG	96-126	60
R-CACCGGCATTTTACACACCA
BTMS0060	F-CGACCACCGGCGCTCCC	215-314	60
R-CCTTCGTCATCGGCACGCAC
BTMS0065	F-CATTAACGCGATCGTAGCCG	212-242	50
R-TAACGAACAGCCGGTGAGAT
BTMS0035	F-CGACGTCGAAGAAAATTGTG	232-272	60
R-GCGAGATTTCCAGACACGA
BTMS0036	F-TTCAACGCACTCTGTAGTCG	200-248	57
R-CACCGGACTTCGTAATCCAC
BTMS0044	F-AGGATCGAGAGAACGAGCTG	273-297	60
R-AGGCCTTGGGAGAGTTCG
BTMS0045	F-GAAATCCCCACGAAATACG	236-287	60
R-GCGGATACAGTTTCGAGCAT
BTMS0047	F-TATAGGGTGACCCAGAGTGC	124-148	60
R-CCACAAACAGAGCACGAAAGT
BTMS0048	F-TTCGCGTTTTCATTCTGCCAT	144-172	57
R-TGAAGCGTATTGAAGCGACG
BTMS0062	F-CTGTCGCATTATTCGCGGTT	259-299	60
R-CTGGGCGTGATTCGATGAAC
BTMS0063	F-GTATCATGCTTTGCCGCACT	121-134	60
R-GGTAGACAATGGAACACGGG
BTMS0066	F-CATGATGACACCACCCAACG	120-174	60
R-TTAACGCCCAATGCCTTTCC
BTMS0082	F-TCGCGATCTTGGTGATAATGA	381-402	60
R-TCAGACAGAAACTGTGGAAAAC
BTMS0113	F-GGGGATGAACGTCGGTTAGA	336-375	57
R-ATCGTCGAGTTGGGTGGAAA
BTMS0064	F-AAGCAGCGAAACAGAAGCTC	253-293	57
R-CGGCATCGCCTTCTTCTTTT
BTMS0043	F-GCCCAAAGATCGTGTCGTAT	138-175	50
R-CTCGCGTTTTCTCCTAGTGG
BTMS0124	F-CGCCGTAATGTTAACTCC	242-324	54
R-ACTCAATCCAAACGCCACC
BTMS0059	F-GGCTAGGAAAGATTAGCACTACC	341-361	60
R-AGTTCGACAGACCAAGCTGT
BTMS0125	F-TTCGGTGGTAAAAGGAAAGCG	101-135	54
R-CAGAAGGAGCGTTAGGACACAAAC
BTMS0061	F-CCGAGGATCTCTAGTAGCCG	209-264	60
R-AGCGCATGCTATTACGATCT
BTMS0071	F-CGCGTAAATTATCCCCCTCCC	213-240	57
R-CCATCTCGCGCAGAATGTTT
BTMS0109	F-AGCTACCACCGAATCGAGAC	134-178	55
R-TCGTATTTCTCCACCGAACGA
BTMS0126	F-GGTGATCGCTTAAAGCTC	164-190	50
R-GCCAACTACGTTCAATATCG
BTMS0132	F-TCTGTCCTCGTTAGACGCATACG	103-135	57
R-GGAGCAACAAACCCTGAAAGC
BTMS0136	F-GCATTCGGGTATTGCGTTCTTTAG	155-185	51
R-CGTTTATCTGCTTCTCTCGTTCG
BTMS0141	F-CCACATCCTCCAACCTCCTTTC	91-173	54
R-GCGAGAGAATGAATGGTAGAACCG
BTMS0152	F-ACTTTTATTGTCGGTTCTTG	166-200	52
R-GGGATATAGTGAACCAGAAA
BTMS0139	F-CGCTCGCTCAGAAAACTTTCC	124-156	55
R-CGACGAGAAAAAATCGGTCTCAAG
BTMS0069	F-GATGCGAGATAAAGCGTCGG	198-254	55
R-GACAAAGCAGCCATCTCCAC
BTMS0133	F-CCACTCATACGCATTTGTGAAG	114-146	51
R-GGACTGAAATTGCCACTATAAGC
BTMS0127	F-TGACTCTCGACGATTACG	207-237	51
R-ACGCTTAAACTCGCATCG
BTMS0148	F-CTCTTTTGTTTCTCGTGTCT	213-267	52
R-TGCATAAAATGTTACAGTGC
BTMS0128	F-GATTTCCGATTCAGCCCTGC	179-208	55
R-TTATGCGACGATTCCCCTGG
BTMS0153	F-ATTTCTGATGACCGACTAAA	241-273	52
R-TATTCCTGATCAGCGTTAAG
BTMS0150	F-CATTTCCCATTTCTTAATCT	223-249	51
R-CTGCAATTGACGTATTGTAA
BT11	F-AAGAGAGAGACAGAGAGAGATAGGG	128-140	52
R-GCGTTTTGACGATTAGATTAGAGCC
BT28	F-TTGCTGACGTTGCTGTGACTGAGG	181-196	53
R-TCCTCTGTGTGTTCTCTTACTTGGC
BL01	F-GCGTCGAGAAACTATCTAGGAGAG	111-117	52
R-CGAAGATTCCCAAAACTGCG
BL08	F-ATGTTGCAGCACCTTCGTGG	142-148	53
R-AATTAAAGGCGTGCGCTCGC
BM5	F-TGCACCAGCAGTGCACGTTA	268-274	60*
R-ACAGCTGTTGGTATCGAGCAAAGG
BM7	F-TGGGAATGTGCAATGGAGGACTGT	159-165	60*
R-ACGCTCGCGAGACTTCGACA
BM12	F-CGAGGCGTTTCAGCCTGGGG	233-239	60*
R-TTGCGAAACTCCGGCACCGA
BA3	F-AGGCAACGTCGGAAGGGGGT	221-225	48
R-GTACACGCAGCCTGCAGACGA
BA9	F-AGCAGCGGAGAAGGGGAGAG	110-126	48
R-GCCACCCTCCTGTAAGCCGGA
BA12	F-ACGCGCTCTTTATTTCCGCGA	158-168	60
R-AACGACCACTACCAGCGGGC
B10	GTGTAACTTTCTCTCGACAG	188-217	52
GGGAGATGGATATAGATGAG
B11	GCAACGAAACTCGAAATCG	143-168	52
GTTCATCCAAGTTTCATCCG
B126	GCTTGCTGGTGAATTGTGC	150-184	57
CGATTCTCTCGTGTACTCC
B131	GATCGCCTATCTCTTCTCGG	117-131	54
GAGGCGCTGTCGAGCTC
B100	CGTCCTCGTATCGGGCTAAC	146-178/130-138*	58
CGTGGAAACGTCGTGACG
B96	GGGAGAGAAAGACCAAG	230-248/228-240*	52
GATCGTAATGACTCGATATG
B119	GATCGTGCTAGAAAAGGAAG	130-136/158-182*	52
CCACAGTGCAAAGTTTCTG
B121	GAACATGTGGAACGACGG	160-170/162-163*	52
GAACAATCGATATGTCACCG
B132	GAAATTCGTGCGGAGGG	151-183/154-168*	58
CAGAGAACTACCTAGTGCTACGC
B116	GAATCAGGAGGCGCACG	172-176	58
CGCAGCCTAAGCCACG
B118	CCTAAGTCGCTATATCTTCG	201-223	58
GAAACACGTATCTACATCTACAG
B101	CGACTGTCGCGGTCTAAG	-	58
GATCGCTATGTCAACAGCAG

## (8) 糞からのDNA抽出方法の確立

女王蜂の産卵能力を遺伝子型判定するために営業初期の女王蜂の糞からDNA抽出方法を確立するための試験を行った。これにより非致死的な手法で早期の遺伝子型判定が可能となる。約1mm³の糞塊をスワブでふき取るように拭い、採集した（図(1)-6）。

スワブの先端部分を解剖用ハサミで切断し、100μlのExtraction Bufferを入った1.5mlチューブに入れて溶出させた。Extraction Bufferは事前に60℃で加温しておいた。Proteinase K (20 mg/ml)を1μlチューブに添加した。60℃で15分間インキュベートした後、98℃で

図1-6. 初期巣.

2分間処理し、室温まで温度を下げた。室温で試料が落ちる程度に軽く遠心し、上清を新しいチュ
一ブに写し、それをExtraction Buffer 抽出液（PCRの鋳型DNA）として使用した。糞からのDNAによるPCR反応を確認するため抽出したDNAを鋳型とし、PCRを行った。PCRには、MightyAmp $ ^{®} $ Genotyping Kit（Takara）を使用した。PCRの反応液条件は、DNA溶液を8段階の希釈系列(0.1μl、0.2μl、0.4μl、0.6μl、0.8μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl）とした。各プライマーを0.15μl、2×MightyAmp Buffer（Mg $ ^{2+} $ 、dNTP plus）を7.5μl、MightyAmp DNA polymerase（1.25 U/μl）を0.6μlおよび滅菌蒸留水を混合し全体で15μlとしたものを反応溶液とした。実験に使用した8種類のプライマーの配列は、表(1)-3に示した。

表(1)−3 使用した蛍光プライマー

プライマ一名	配列(5'-3')	蛍光色素
B11F	GCAACGAAACTCGAAATCG	VIC
B11R	GTTCATCCAAGTTTCATCCG
B96F	GGGAGAGAAAGACCAAG	NED
B96R	GATCGTAATGACTCGATATG
B119F	GATCGTGCTAGAAAAGGAAG	PET
B119R	CCACAGTGCAAAGTTTCTG
B126F	GCTTGCTGGTGAATTGTGC	FAM
B126R	CGATTCTCTCGTGTACTCC
BTMS0045F	GAAATTCCCCACGAAATACG	PET
BTMS0045R	GCGGATACAGTTTCGAGCAT
BTMS0062F	CTGTCGCATTATTCGCGGTT	FAM
BTMS0062R	CTGGGCGTGATTCGATGAAC
BTMS0065F	CATTAACGCGATCGTAGCCG	VIC
BTMS0065R	TAACGAACAGCCGGTGAGAT
BTMS0125F	TTCGGTGGTAAAAGGAAAGCG	FAM
BTMS0125R	CAGAAGGAGCGTTAGGACACAAAC

反応温度条件は、98 ℃で2分間の熱変性後、98 ℃で10秒間、55 ℃で15秒間、68 ℃で30秒間を35サイクル繰り返し、68 ℃で5分間の伸長反応を行った。100mlの1×TBE溶液に対して1.2gのアガロース(Genetics)を加えた1.2%アガロースゲルを作成し、1μlのMidori Green Direct (Genetics)と5μlのグラジェントPCR産物をピペッティングした合計6μlをアプライした。その後100V、15分の条件で電気泳動を行い、紫外線照射撮影した電気泳動図からバンドの有無を確認した。次に自動電気泳動装置QIAxcel (QIAGEN)を用いて行い、PCR増幅産物のサイズの簡易測定と最もバンドが鮮明に増幅されているDNA濃度条件を決定した。その後、蛍光プライマーを利用して同じ条件でPCRを行い、自動シーケンサーABI 3130xl Genetic Analyzer（Life technologies）による最適DNA抽出濃度を確定した。

## (9) 遺伝子汚染リスク評価

アドバイザリーボード会合および中間評価時に指摘されていたエゾオオマルハナバチの実用化後における遺伝子汚染リスク評価について竹内を主として高橋の補佐として追加実験を行った。エゾオオマルハナバチにおける地域間の遺伝的多様度の分析には、膜翅目DNAバーコーディング用ミトコンドリアDNAのCOI部分配列を解析することにした。北海道の32か所からエゾオオマルハ
ナバチ成虫を捕獲し、DNA抽出までエタノールで保存した（図(1)-7）。DNAの抽出は、前述の実験の方法と同じようにした。PCRの1サンプル当たりの反応液量は、DNA溶液3.0μl、2種のプライマー（50μM）0.03μl、10×Ex Taq Buffer 1.5μl、dNTP Mixture 1.2μl、Ex Taq polymerase（タカラバイオ社製）を0.075μlおよび滅菌蒸留水で全体を15μlとしたものを反応溶液とした。実験に使用したプライマーの配列は、表(1)-4に示した。反応温度条件は、94℃で3分間の熱変性後、94℃で30秒間、※12種類の温度(40、41、42、44、46、48、51、53、56、58、59、60℃)で60秒間、72℃で60秒間を35サイクル繰り返し、72℃で5分間の伸長反応を行った。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動法で分離してMidorigreen溶液（0.5μg/ml）で染色し、UV照射下で増幅を確認した。アニーリング温度は、増幅が確認されたサンプルの中で最も高い温度条件とした。その条件でPCR増幅したサンプルは、シークエンス解析まで-20℃で保存した。シークエンス解析は、PCR産物をExoSAP-IT（岩井化学）で精製後、BigDye® Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ）を用いた。サイクルシークエンスの条件は、キットに添付されているプロトコールに従った。反応サンプルは、ABI 3130xl Genetic Analyzer（Life technologies）により塩基配列を決定した。シークエンス解析の結果は、遺伝子解析用ソフトウウェアGenetyx(ジェネティクス)によるアライメントを行った。

図1-7 採集地点

表(1)-4 プライマー配列

Primer name	Sequence (5' to 3')
LCOHym	TATCAACCAATCATAAAGATATTGG
NancyShort	CCCGGTAAAATTAAAATATAAAC
## (10) トマトハウスでの授粉試験

前年度から人工増殖により作成していたエゾオオマルハナバチのコロニーを利用してトマトハウスでの授粉試験による能力評価を行った。試験には、北海道農政局、ホクレン苫小牧、JA平取町等の協力を得て行った。2014年8月に北海道平取町にあるトマト生産者の約100坪のトマトハウスで行った（図(1)-8）。

入り口

集装箱	集装箱	集装箱
6／6	8／8	12／12
9／9	19／19	8／8
12／12	14／14	8／8
16／16	8／8	14／16
10／11	14／14	13／13

図(1)-8 試験で利用した北海道平取町のトマトハウス（左上）、ハウスの内部（右上）、ハウスの見取り図（左下）、ビデオカメラでの調査の様子（右中；数値は花の数を示す）、トマトの花（右下）

試験方法は、紫外線カットフィルムが張られたハウス内での活動能力について観察調査を行った。観察調査の方法は、目視での観察方法と6台のビデオカメラを設置して録画し（図(1)-8）、後で動画を解析した。次に巣箱への定位飛行能力、帰巣能力の試験を行った。次にハウス内でトマトの花を認識できるかどうかの有無について観察による調査を行った（図(1)-8）。その後に、ト
マトの花へのバイトマークの付着率からハウス内におけるトマトの花への探索能力について観察記録から測定した。最後にセイヨウオオマルハナバチとの訪花能力について比較試験を行った。訪花能力には、花上滞在時間と訪花頻度について記録をした。花上滞在時間については、1個の花あたりの花粉収集に要する時間を観察により測定した。訪花頻度については、単位時間あたりの訪花数について観察記録を行った。

最後にセイヨウオオマルハナバチとの訪花能力について比較試験を行った。訪花能力には、花上滞在時間と訪花頻度について記録をした。花上滞在時間については、1個の花あたりの花粉収集に要する時間を観察により測定した。訪花頻度については、単位時間あたりの訪花数について観察記録を行った。

### 4. 結果および考察

## （1） 有用在来種の室内増殖方法の確立と遺伝子解析に関する研究

## 飼育実験による候補種の選定と選抜形質の探索

野外から捕獲してきたマルハナバチの女王蜂は、自然状態であれば数ヶ月間の屋外での活動期間がある。この屋外で活動する期間の中で、どの時期に捕獲した女王蜂の営業成功率が高いのか確認を行い、選抜育種に使用する母集団の捕獲時期の統一を行い、捕獲時期が営業成功率に影響を及ぼさないようにするための調査を行った（図(1)-9）。

図(1)-9 女王蜂の営業成功率と採集時期の関係

その結果、休眠あけ直後（5~6月上旬）の女王蜂の方が、有意に成功率が高いことがわかった。これは、早期に捕獲した個体は、自然下での営業・産卵経験がないため営業成功率が高い可能性があると推測された。

次に野生のマルハナバチは、多種類の内部寄生者による寄生を受けていることが知られている。寄生による影響として、女王蜂の不姫化が報告されているため、採集時期を3つに分けて寄生率を調べた結果を（図(1)-10）に示した。早期に捕獲した女王蜂のほうが、マルハナバチタマセンチュウおよび寄生蜂の一種の寄生率は低い結果となった。
図(1)-10 女王蜂の寄生率と採集時期の関係

これらの結果により基礎集団にする女王蜂は、早期に休眠から開けた個体がよいと判断することができたため、以後の実験には早期に捕獲した個体を使用することにした。

本研究では、北海道産在来種のエヅトラマルハナバチ、エヅマガマルハナバチ、エヅオオマルハナバチの3種を候補種として、営業成功率（造巣と産卵）、働き蜂や次世代の女王蜂および雄蜂の産出成功率とその数について比較実験を行った結果を図(1)-11に示した。比較として、セイヨウオオマルハナバチを利用した。

図(1)-11 候補在来種の飼育成功率（産卵から繁殖個体まで）. エゾオオ（エゾオオマルハナバチ）、エゾトラ（エゾトラマルハナバチ）、エゾナガ（エゾナガマルハナバチ）、セイヨウオオ（セイヨウオオマルハナバチ）を示す．産卵は飼育女王蜂の産卵成功率、働き蜂は飼育コロニーの働き蜂羽化成功率、繁殖虫は、飼育コロニーの新女王蜂または雄蜂羽化の成功率を示す

3種の間で営業成功率が高かったのは、順にエゾオオマルハナバチ、エゾトラマルハナバチ、エ
ブマガマルハナバチとなった。女王蜂の営業成功率は、エゾオオマルハナバチとエゾトラマルハナバチは、90％以上となった。エゾナガマルハナバチの女王蜂の営業成功率は、他の2種に比べて約67％と低い結果となった(図(1)-11)。

働き蜂の産出成功率は、エゾオオマルハナバチ、エゾトラマルハナバチ、エゾマガマルハナバチの順となった。エゾオオマルハナバチは、約91％と産卵成功率とほぼ一緒であった。エゾトラマルハナバチは、約67％と産卵成功率に比べて低くなった。エゾナガマルハナバチは、約49％と同様に産卵成功率から大きく低下した結果となった(図(1)-11)。

繁殖虫（次世代の女王蜂と雄蜂）の産出成功率は、エゾオオマルハナバチ、エゾトラマルハナバチ、エゾマガマルハナバチの順となった。エゾオオマルハナバチは、約82％と産卵成功率から若干低下した。エゾトラマルハナバチとエゾナガマルハナバチは、それぞれ約12％と約7％と極端に低下した結果となった(図(1)-11)。

働き蜂の産出数は、エゾオオマルハナバチ、エゾトラマルハナバチ、エゾマガマルハナバチの順となった（図(1)-12）。エゾオオマルハナバチは、平均43.2個体となった。エゾトラマルハナバチは、平均12.1個体となった。エゾナガマルハナバチは、平均3.5個体となった。最大数は、エゾオオマルハナバチの122個体であった。エゾトラマルハナバチは、最大89個体、エゾナガマルハナバチは、最大43個体であった。産卵成功率とほぼ一緒であった。比較のために飼育したセイヨウオオマルハナバチは、148.7個体、最大254個体となった。エゾオオマルハナバチおよびエゾトラマルハナバチは、働き蜂の産出数は、ポリネーション用として考えた場合、許容範囲内ではあるが、セイヨウオオマルハナバチと比較して低いので、働き蜂の数（コロニーサイズ）の改良が必要であると考えられた。

図(1)-12 候補在来種の働き蜂産出数．エゾオオ（エゾオオマルハナバチ）、エゾトラ（エゾトラマルハナバチ）、エゾナガ（エゾナガマルハナバチ）、セイヨウオオ（セイヨウオオマルハナバチ）を示す
新女王蜂の産出数は、エゾオオマルハナバチ、エゾトラマルハナバチ、エゾマガマルハナバチの順となった（図(1)-13）。エゾオオマルハナバチは、平均34.8個体となった。エゾトラマルハナバチは、平均12.2個体となった。エゾナガマルハナバチは、平均3.2個体となった。最大数は、エゾオオマルハナバチの65.4個体であった。エゾトラマルハナバチは、最大59個体、エゾナガマルハナバチは、最大36個体であった。比較のために飼育したセイヨウオオマルハナバチは、最大78個体となった。エゾオオマルハナバチの新女王蜂の産出数は、人工増殖を行う場合、許容範囲内ではあるが、セイヨウオオマルハナバチと比較して低いので、新女王蜂を増やすような系統の改良が必要であると考えられた。

図(1)-13 候補在来種の新女王蜂産出数．エゾオオ（エゾオオマルハナバチ）、エゾトラ（エゾトラマルハナバチ）、エゾナガ（エゾナガマルハナバチ）、セイヨウオオ（セイヨウオオマルハナバチ）を示す

雄蜂の産出数は、エゾオオマルハナバチ、エゾトラマルハナバチ、エゾマガマルハナバチの順となった（図(1)-14）。エゾオオマルハナバチは、平均143.8個体となった。

エゾオオマルハナバチは、平均143.8個体となった。エゾトラマルハナバチは、平均76.5個体となった。エゾナガマルハナバチは、平均56個体となった。最大数は、エゾオオマルハナバチの209個体であった。エゾトラマルハナバチは、最大121個体、エゾナガマルハナバチは、最大81個体であった。比較のために飼育したセイヨウオオマルハナバチは、平均181.5個体、最大254個体となった。雄蜂の産出数は、新女王蜂の産出数と比較して3種ともに多い傾向があることがわかった。

エゾオオマルハナバチは、人工増殖を行う場合、セイヨウオオマルハナバチと比較してもほとんど差がないためエゾオオマルハナバチに関しては、すでに十分な雄蜂生産数を確保していると考えられた。
図(1)-14 候補在来種の雄蜂産出数.エゾオオ（エゾオオマルハナバチ）、エゾトラ（エゾトラマルハナバチ）、エゾナガ（エゾナガマルハナバチ）、セイヨウオオ（セイヨウオオマルハナバチ）を示す

これらの飼育試験の結果を4段階の評価（◎、○、▲、×）でまとめた（表(1)-5）。営業成功率（造巢および産卵）は、3種類とも可能であったが、エゾナガマルハナバチの成功率は低かった。働き蜂の産出数は、エゾオオマルハナバチは高いが他の2種は低かった。繁殖個体である新女王蜂および雄蜂の生産数は、ゾオオマルハナバチは高かったが、他の2種は低い結果となった。候補種3種の中では、エゾオオマルハナバチが第一候補、エゾトラマルハナバチが第2候補となった。エゾナガマルハナバチを系統造成し、ポリネーション用に利用することは、困難であると予測された。

表(1)-5 候補在来種の評価一覧

項目	種類
エゾオオマルハナバチ	エゾトラマルハナバチ	エゾナガマルハナバチ
営業成功率	◎	◎	▲
働き蜂数	◎	○	×
繁殖個体生産数	◎	▲	×

次に第1位候補種のエゾオオマルハナバチの女王蜂を対象に、選抜するときに簡易および迅速に評価するための候補形質の探索を行った。まず初めに、ポリネーションに重要な働き蜂の数（これをコロニーサイズとする）が、女王蜂のサイズに影響を受けるのか否かについて関係性の解析を試みた。女王蜂の形質は、大きさと産卵数に関係性があると仮定し、女王蜂の頭幅と働き蜂の産出数について分析をした結果を示した（図(1)-15）。

女王蜂の大きさとコロニーサイズ（働き蜂数）には、相関関係は見られなかった。女王蜂の体サイズと産卵能力には、関連性がないことがわかった。基本的に女王蜂の平均的なサイズであれば産卵能力には、大きな問題はないこともわかった。次の候補形質として、女王蜂が単独で行う産卵数および育児数とコロニーサイズの関係性の解析を試みた。女王蜂の産卵数および育児能力
の関する形質が、コロニーサイズに関係性があると仮定し、女王蜂が単独で育児をしたときの働き蜂の生産数と最終的な働き蜂の産出数について分析をした結果を示した（図(1)-16）。

図(1)-15 女王蜂の体サイズとコロニーサイズ

図(1)-16 女王蜂の育児数とコロニーサイズ

女王蜂による育児数とコロニーサイズ（働き蜂数）には、正の相関関係が見られた。女王蜂の育児数とコロニーサイズには関連性があるため、早期選抜の指標に使えることがわかった。これらの結果から、コロニーサイズを迅速かつ簡易的に使用することのできる選抜指標として利用することとした。

## (2) 累代飼育選抜方法の改良

アクリル製の巣箱による飼育試験の結果を図(1)-17に示した。比較飼育試験の結果、従来型よりも改良型の巣箱が営巣、産卵、ふ化の成功率が高くなる傾向が見られた。繁殖個体の雄蜂と新女王蜂の生産数の比較試験をしたところ、雄蜂では改良型が生産数の増加が確認されたが、新女王蜂では変化は見られなかった（図(1)-18）。飼育試験の結果からは、利点を総合的にまとめると、①多孔体構造のため汚染が低減する。②カビや病気の発生が抑制された。③アクリル製であることから消毒液の使用が可能であり残留が少ない。④病気の伝播抑制につながる。⑤透明であるため全方面からの観察が可能である。⑥また生分解性素材であるため農家単位での処分も可能であ
る。⑦さらに野外で在来マルハナバチの営巣場所の提供（保護）にも使用できるといった新規巣箱の開発に成功した（図(1)-19）。

図(1)-17 小型アクリル製改良型巣箱における営業成功率

図(1)-18 大型アクリル製改良型巣箱における繁殖個体の生産成功率

図(1)-19 改良型アクリル製巣箱（小型と大型）

次にミツバチおよびマウスで使用されている人工受精用精子保存液を使用して、マルハナバチ女王蜂の受精囊内に保存液を注入して生存日数を調査したところ、ミツバチ用の保存液で生存率が約50%以下であった（表(1)-6）。この結果から、ミツバチ用の保存液をマルハナバチ用に改良する必要があることが示唆された。さらに精子を液体窒素中で保存溶液を使用して保管し、120日後に取り出し、生存率を確認したところ、生存率は約40%以下となったため、長期保存の場合には、ミツバチ用の保存液をベースとして、マルハナバチ用に改良することが必要であることが分かった（表(1)-7）。
表(1)-6 人工受精用精子保存液による女王蜂の生存日数

人工授精用精子注入 溶液	女王蜂の生存率（7日後）
クロマルハナバチ	セイヨウミツバチ
ミツバチ人工授精用 緩衝液	50% (n = 4)	100% (n = 20)
マウス用精子保存液	25% (n = 4)	10% (n = 20)

表(1)-7 人工受精用精子保存液によるマルハナバチ精子の生存率

精子保存用液	精子生存率（120日後）
クロマルハナバチ	セイヨウミツバチ
ミツバチ人工授精用緩衝液	36% (n = 3)	44% (n = 3)
マウス用精子保存液	13% (n = 3)	19% (n = 3)

## (3) 在来マルハナバチの繁殖成功率に影響を及ぼす病原微生物の浸潤状況調査

国内に生息する3種のマルハナバチから220個体をPCR診断法により解析したところ、N. bombiに陽性を示したサンプルは、セイヨウオオマルハナバチのみであった。オオマルハナバチおよびエゾオオマルハナバチからは、N. bombiの寄生を示すPCR産物の増幅は認められなかった。これらの結果は、表(1)-8にまとめて示した。セイヨウオオマルハナバチは、採集した全地域の個体からN. bombiが検出された。調査したセイヨウオオマルハナバチ全体におけるN. bombiの感染率は、7.5%（9/120）であった。また、コントロールとして利用したLWRhは、すべてのDNAサンプルで増幅が確認された。シーケンス解析の結果、セイヨウオオマルハナバチでN. bombi感染が陽性になった6個体から、それぞれ118塩基を決定することができた。この配列を同じようにBLAST検索したところ、イギリスのセイヨウオオマルハナバチから単離された。N. bombiのうちD3タイプの遺伝子型（DQ267533）と100%一致した。

表(1)-8 国内に生息する3種のマルハナバチにおけるNosema bombiの寄生状況

地域	種類
セイヨウオオマルハナバチ	エヅオオマルハナバチ	オオマルハナバチ
北海道	札幌市	10% (2/20)	0% (0/10)	-
帯広市	5% (1/20)	-	-
釧路市	10% (2/20)	0% (0/10)	-
浜中町	5% (2/20)	0% (0/10)	-
根室市	5% (1/20)	0% (0/10)	-
中標津町	10% (2/20)	0% (0/10)	-
利尻町	-	0% (0/10)	-
長野県	諏訪市	-	-	0% (0/20)
長野市	-	-	0% (0/20)
合計	7.5% (9/120)	0% (0/60)	0% (0/40)

括弧内は、分析した個体数のうち寄生が確認された個体数を示している。
今回初めて国内における在来種および農業分野で生物資材として利用されているマルハナバチ類の微胞子虫の浸潤状況をPCR診断法で、さらに系統をシークエンス解析により明らかにすることができた。

本調査により、国内で帰化したセイヨウオオマルハナバチにN. bombiが寄生していることがはじめて確認された。今回、在来マルハナバチ類からN. bombiは検出されなかったが、その原因は、寄生率が低いことや、今回解析した個体数が少ないことによると推測された。マルハナバチに寄生するN. bombiは、日本を除いたマルハナバチ類の分布域全域で確認されている。

今後、調査地域や解析個体数および種数を増やせば本種の寄生個体を発見する可能性は高いと思われる。本調査によるセイヨウオオマルハナバチの結果は、過去に日本に持ち込まれたセイヨウオオマルハナバチのコロニーからNosema様の寄生が報告されているが、それを支持する結果となった。花粉交配用に大量に海外から輸入されたセイヨウオオマルハナバチのコロニーから一部の女王蜂が逃げ出し、北海道において帰化が急速に進んでいる状況にある。既に地域によっては、セイヨウオオマルハナバチが優占種となっている所も数多く見られる。今回単離されたN. bombiのシーケンス解析の結果からは、イギリスのセイヨウオオマルハナバチに寄生していたN. bombiと同じ遺伝子型であることがわかった。在来マルハナバチ類で検出されなかったが、野生化したセイヨウオオマルハナバチの分布域全てで寄生が確認された。

これらの結果を総合的に判断すると、国内で帰化したセイヨウオオマルハナバチに寄生しているN. bombiの起源は、原産国の欧州から輸入されたセイヨウオオマルハナバチのコロニーに随伴して持ち込まれ、その後国内で逃げ出した個体に付随して寄生が拡大した可能性が高いと予測された。本調査では、在来のオオマルハナバチおよびエゾオオマルハナバチからは、N. bombiの寄生は確認されなかった。しかし、N. bombiは、マルハナバチ類での宿主範囲が広いためセイヨウオオマルハナバチと同併属である2種は、水平感染により伝播する可能性がある。今回の調査では、在来マルハナバチ2種からは、N. bombiの感染個体は見つかっていないが、分布している可能性が高いと思われる。また、海外から持ち込まれたN. bombi系統には、在来マルハナバチ類は抵抗性を持っていない可能性もあるため、今後も定期的に浸潤状況の調査とともに在来マルハナバチへの感染実験による影響を調べる必要があると思われる。

近年欧州およびアメリカ大陸では、ミツバチやマルハナバチの輸出入に随伴する形でノゼマをはじめとする病原性微生物類が分布を広げていることが指摘されている。本来分布していなかった地域に新たな病原性微生物が侵入すると、抵抗性を持たない在来生物に甚大な被害をもたらすことが過去に多数報告されている。ミツバチやマルハナバチでも同様で、これまで存在しなかった病原体が侵入すると、それが大量死の原因になることも危惧されている。実際に海外では、ミツバチやマルハナバチにおいて、外来のウイルスや寄生性ダニ類の浸潤による大量死が大きな問題となっている。

今回国内で見つかったミツバチのノゼマ病は、大量死を引き起こすような系統ではなかったが、非意図的に強病原性型のノゼマが侵入する可能性もある。実際に2008年には、オーストラリアからの輸入ミツバチから本種が検出されている。国内でノゼマ病による大量死を防ぐためにも、今後も継続してミツバチおよびマルハナバチ類における浸潤調査を行いながら、防御体制を構築していく必要があることが示唆される結果を得た。
## (4) エゾオオマルハナバチの大量増殖を目的とした飼育コロニーにおける死亡要因の調査

飼育実験中に死亡したエゾオオマルハナバチ女王蜂の死亡要因の調査結果を図(1)-20に示した。セイヨウオオマルハナバチは、コマユバチが33%、タマセンチュウが31%、ノゼマが6%、トリパノソーマが3%、シヘンチュウが1%、不明が26%であった。エゾオオマルハナバチでは、コマユバチが35%、タマセンチュウが25%、ノゼマが5%、トリパノソーマが5%、縮翅病が1%、不明が27%であった。今回マルハナバチで確認されたノゼマも、本来はマルハナバチ類を宿主としていなかったN. ceranaeの寄生であった。

本来新型と言われているN. ceranaeは、中国原産のトウヨウミツバチを宿主としていたが、セイヨウミツバチの輸出入に伴って世界各地に分散していったと考えられている。北海道にはニホンミツバチが生息していないため、セイヨウミツバチ群から在来マルハナバチに水平感染した可能性が高いことが示唆された。今回の調査により、在来マルハナバチの初期コロニーの死滅要因の解明を試みた結果、少なくとも80%を超えるエゾオオマルハナバチコロニーは、病原微生物の感染により死亡している可能性が高いことがわかった。特にこれまで注目されていなかった新規病原体が海外からもたらされた可能性が高く、海外から輸入されたミツバチから、在来のマルハナバチに浸潤していることが示唆される結果を得た。人の経済活動と輸送手段の発達により、人やさまざまな物が国境を越えているため、新しい病害虫が侵入するリスクも当然以前よりも高くなっている。

マルハナバチは、自然環境の保全や農業にとって欠かすことのできない生物である以上、今後も新たな病原体が海外から侵入するリスクに対して防衛計画を構築する必要がある。病原微生物の海外からの持ち込みを注意深く監視することで、国内における感染拡大による大量死や減少を未然に防ぐことができると思われる。

エゾオオマルハナバチ

セイヨウオオマルハナバチ

図(1)-20 飼育下のマルハナバチコロニーの死亡要因

## (5) マイクロサテライトDNAマーカーの開発

エゾオオマルハナバチからDNAライブラリーを作成し、多型解析に利用できるマイクロサテライトDNAマーカーの探索・開発を行った。自動電気泳動装置QIAxcelにより分析した結果を示した（図(1)-21）。
図(1)-21 マイクロサテライトDNAの解析結果

PCRの増幅は120種類のうち102種で成功した。さらにこの102種類の中から、多型を示す遺伝子座の探索を行ったところ、39種類で多型が存在することがわかった（高橋ら、投稿中）。

## (6) エゾオオマルハナバチにおけるDNAマイクロサテライトマーカーの試験

マルハナバチ各種で開発されたマイクロサテライトDNAマーカーの各遺伝子座の解析結果を表(1)-9に示した。表では、エゾオオマルハナバチでPCR増幅に成功し、グラジェントPCRにより決定したアニーリングの最適温度とアレルサイズ範囲を示している。これらの結果から、合計63種類のマイクロサテライトDNAマーカーを試験した結果、57個のマイクロサテライトDNAマーカーが適用できることが示された。

表(1)-9 エゾオオマルハナバチにおけるマイクロサテライトDNAプライマーの増幅結果

アレル座	Primer sequence(5'-3')	サイズ範囲(bp)	Tm(℃)	エゾオオマルハナバチでの增幅
BTMS0057	F-TGCTTGAACCGAAATAGAGGG	96-126	60	+
R-CACCGGCATTTTACACACCA
BTMS0060	F-CGACCACCGGCGCTCCC	215-314	60	+
R-CCTTCGTCATCGGCACGCAC
BTMS0065	F-CATTAACGCGATCGTAGCCG	212-242	50	+
R-TAACGAACAGCCGGTGAGAT
BTMS0035	F-CGACGTCGAAGAAAATTGTG	232-272	60	+
R-GCGAGATTTCCAGACACGA
BTMS0036	F-TTCAACGCACTCTGTAGTCG	200-248	57	+
R-CACCGGACTTCGTAATCCAC
BTMS0044	F-AGGATCGAGAGAACGAGCTG	273-297	60	+
R-AGGGCCTTGGGAGAGTTCG
BTMS0045	F-GAAATTCCCCACGAAATACG	236-287	60	+
R-GCGGATACAGTTTCGAGCAT
BTMS0047	F-TATAGGGTGACCCAGAGTGC	124-148	60	+
R-CCACAAACAGAGCACGAAAGT
BTMS0048	F-TTCGCGTTCATTCTGCCAT	144-172	57	+
R-TGAAGCGTATTGAAGCGACG
BTMS0062	F-CTGTCGCATTATTCGCGGTT	259-299	60	+
R-CTGGGCGTGATTCGATGAAC
BTMS0063	F-GTATCATGCTTTGCCGCACT	121-134	60	+
R-GGTAGACAATGGAACACGGG
BTMS0066	F-CATGATGACACCACCAACG	120-174	60	+
R-TTAACGCCCAATGCCTTTCC
BTMS0082	F-TCGCGATCTTGGTGATAATGA	381-402	60	+
R-TCAGACAGAAACTGTGGAAAC
BTMS0083	F-CGACTCGTTCGAGCGAAATTA	288-324	60	-
R-GTTTTTGCCAGGCTCCGAAT
BTMS0114	F-CCATCCGTGATCTTATCGTCG	137-179	50	-
R-GAAACGTTACGCGTTATTCGG
BTMS0119	F-GTGCGAGCTTCTCGAGGATA	334-372	60	-
R-GCGCATGCATAAGTCTCGTT
BTMS0056	F-GCGTGACATCGCTAATCTG	271-297	60	-
R-TCCGGCCGTAATTGGTAGAG
BTMS0113	F-GGGGATGAACGTCGGTTAGA	336-375	57	+
R-ATCGTCGAGTTGGGTGGAAA
BTMS0064	F-AAGCAGCGAAACAGAAGCTC	253-293	57	+
R-CGGCATCGCCTTCTTCTTTT
BTMS0043	F-GCCCAAAGATCGTGTCGTAT	138-175	50	+
R-CTCGCGTTTTCTCCTAGTGG
BTMS0104	F-TCCTCTGTTCAGCACACGAT	271-292	50	-
R-TTCGAAGCCTCGATGTCGT
BTMS0124	F-CGCCGTAATGTTAACTCC	242-324	54	+
R-ACTCAATCCAAACGCCACC
BTMS0059	F-GGCTAGGAAAGATTAGCACTACC	341-361	60	+
R-AGTTCGACAGACCAAGCTGT
BTMS0125	F-TTCGGTGGTAAAAGGAAAGCG	101-135	54	+
R-CAGAAGGAGCGTTAGGACACAAAC
BTMS0061	F-CCGAGGATCTCTAGTAGCCG	209-264	60	+
R-AGCGCATGCTATTACGATCT
BTMS0071	F-CGCGTAAATTATCCCCCTCCC	213-240	57	+
R-CCATCTCGCGCAGAATGTTT
BTMS0109	F-AGCTACCACCGAATCGAGAC	134-178	55	+
R-TCGTATTTCTCCACCGAACGA
BTMS0126	F-GGTGATCGCTTAAAGCTC	164-190	50	+
R-GCCAACTACGTTCAATATCG
BTMS0132	F-TCTGTCCTCGTTAGACGCATACG	103-135	57	+
R-GGAGCAACAAACCCTGAAAGC
BTMS0136	F-GCATTCGGGTATTGCGTTCTTTAG	155-185	51	+
R-CGTTTATCTGCTTCTCTCGTTCG
BTMS0141	F-CCACATCCTCCAACCTCCTTTC	91-173	54	+
R-GCGAGAGAATGAATGGTAGAACCG
BTMS0152	F-ACTTTTATTGTCGGTTCTTG	166-200	52	-
R-GGGATATAGTGAACCAGAAA
BTMS0139	F-CGCTCGCTCAGAAAACTTTCC	124-156	55	+
R-CGACGAGAAAAATCGGTCTCAAG
BTMS0069	F-GATGCGAGATAAAGCGTCCGG	198-254	55	+
R-GACAAAGCAGCCATCTCCAC