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# Evaluation of Effects of Ozone on Japanese Forest Trees Based on Leaf Ozone Uptake

Principal Investigator: Takeshi IZUTA

Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology Fuchu, Tokyo 183-8509, JAPAN

Tel: +81-42-367-5728 / Fax: +81-42-367-5728

E-mail: izuta@cc.tuat.ac.jp

Cooperated by: Central Research Institute of Electric Power Industry,

Hokkaido University, Forestry and Forest Products Research Institute

## [Abstract]

Key Words: Ozone, Transboundary air pollution, Deciduous broad-leaved tree species, Stomatal ozone uptake, Present evaluation of ozone effects on trees

The effects of $ O_{3} $ on leaf $ CO_{2} $ uptake capacity of four Japanese deciduous broad-leaved tree species (Fagus crenata, Quercus serrata, Quercus mongolica var. crispula and Betula platyphylla) were evaluated based on the stomatal $ O_{3} $ uptake. Stomatal conductance models were constructed to estimate stomatal $ O_{3} $ uptake of the 4 tree species. The relationships between leaf $ CO_{2} $ uptake capacity and integrated stomatal $ O_{3} $ uptake were obtained from experimental studies using the seedling and adult trees. In Japanese warm-temperate broadleaf forests, $ CO_{2} $ uptake capacity reduced with increasing integrated stomatal $ O_{3} $ uptake specifically during the late growth season, suggesting an acceleration of leaf senescence. Average annual $ O_{3} $ -induced reductions in the leaf $ CO_{2} $ uptake capacity per unit leaf area of Fagus crenata, Quercus serrata, Quercus mongolica var. crispula and Betula platyphylla distributed in Japan were estimated to be 12%, 10%, 12% and 16%, respectively.
課題代表者名 野尻 幸宏（独立行政法人国立環境研究所地球環境研究グループ上級主席研究員）

研究实施期间 平成24～26年度

累計予算額 132,365 千円（うち 26 年度 44,869 千円）

予算額は、間接経費を含む。

本研究のキーワード 二酸化炭素、海洋酸性化、地球温暖化、沿岸生物、複合影響、サンゴ、水産有用魚種、飼育実験、植物プランクトン、有機炭素生産

研究体制

（1）海洋生物飼育実験用 $ CO_{2} $ 分圧制御と実験管理手法の提供（独立行政法人国立環境研究所）

（２）我が国周辺のサンゴ種の成長への水温と海洋酸性化の影響（独立行政法人産業技術総合研究所）

（３）海洋生物の再生産過程における水温と海洋酸性化の影響（公益財団法人海洋生物環境研究所）

（４）植物プランクトンの増殖における水温と海洋酸性化の影響（一般財団法人電力中央研究所）

## 研究概要

1. はじめに（研究背景等）

CO₂排出量増加は大気CO₂濃度上昇を通して、地球温暖化と海洋酸性化を同時進行させている。海洋生物は、温暖化のみならず人為起源CO₂の直接影響として海洋酸性化影響を受け得るため、同時進行を踏まえた複合影響評価が必要である。技術・設備的実現性と研究ニーズから、日本周辺の北限域サンゴ種、水産有用魚種、珪藻・円石藻等の植物プランクトン種を研究対象とした。参画機関の協力で先駆的なCO₂制御系を活用する飼育・培養実験を行い、地球温暖化と海洋酸性化の近未来影響を評価する実験的研究を行う。成果として、沿岸海洋生態系変化予測、水産資源将来予測、炭素循環将来予測等に活用される基礎的な科学的知見が期待される。水温とCO₂の正確な制御という物理化学面と、対象生物種の入手・維持という生物面双方の技術・設備・経験がない限り、環境制御飼育実験には新たな投資や経験蓄積を他に求めることが必要となる。そこで、参画機関の技術・設備からの実現性と世界的研究ニーズを考慮して研究対象を設定し、世界先端技術を用いた飼育による生物影響評価実験をデザインした。

$$ \mathsf{c o}_{2} $$

図1 研究体制

## 2 ．研究開発目的

わが国沿岸で水温上昇が原因となって急速な分布域北上が確認されているサンゴは、その分布域変化が沿岸生態系変化を引き起こす可能性があるものの、大気CO₂濃度増大による炭酸カルシウム飽和度低下は石灰化を抑制するので北上に制約がかかる可能性がある。ただし、北上サンゴ種自体のCO₂に対する応答性が知られていないためその予測は難しい。北上サンゴ種では、高水温・低水温ともにその生息域を決める要因となるので、本課題では水温とCO₂の複合影響を飼育実験から明らかにする。

一般に生物では再生産プロセスが環境因子の変化に対して脆弱であり、CO_{2}に対する急性毒性レベル
が高い魚類においても、今後予想される大気CO $ _{2} $ 増加レベルでの影響を評価する必要がある。しかしながら、影響評価実験例は飼育実験が容易な極小型魚種に限られている。そこで世界でも例のない大型水槽でのCO $ _{2} $ 制御を行い、有用魚種を対象とする影響評価実験を行う。産卵前から高CO $ _{2} $ 環境に順化させた上で、産卵・受精から稚魚成長段階における水温とCO $ _{2} $ の複合影響を明らかにする。これは、今後の水産資源への海洋酸性化影響を評価するために重要である。

植物プランクトンは、海洋表層の炭素循環の出発点であり、昇温とCO_{2}増大という環境変化が生産に及ぼす影響は、気候フィードバック解明のカギであるが、現実海洋の応答を評価するには、種レベル実験から大規模なメソコスム実験までが必要とされている。ここでは、珪藻と円石藻という石灰化をしない群とする群を対照して、これまでほとんど実験例のない昇温とCO_{2}濃度増加の複合影響を、単離種による実験室レベル実験と自然プランクトン群集による現場型培養実験の両者から評価する。

評価実験に必要なCO_{2}濃度制御については、高度な実験管理技術を共通に利用して実施する。

### 3. 研究開発の方法

## （1） 海洋生物飼育実験用CO $ _{2} $ 分圧制御と実験管理手法の提供

本サブテーマは、図1の研究組織において技術的基盤を提供するものであり、本研究計画が目的とするCO₂分圧と水温の両方を変化させて生物の応答を見る実験に適した海洋生物飼育実験用CO₂分圧制御装置を開発運用することが目的である。水槽の海水CO₂分圧の新しい制御法として、海水に純CO₂ガスを溶解して高濃度のCO₂を含む海水を生成し、それと原海水を定量的に混合する手法を開発し、本研究課題では利用することとした。先行課題では、海洋生物飼育実験用CO₂分圧制御実験装置として、海水を濃度既知のCO₂を含む空気でバブリングして目的CO₂分圧を達成し、合わせて達成度を分析確認するものを開発し（AICAL装置）、国内の連携研究機関で利用してきた。しかし、本研究計画が目的とするCO₂分圧と水温の両方を変化させて生物の応答を見る実験での利用には、2点の問題があった。ひとつは海水の温度を変化させると、同時に海水のCO₂分圧が化学平衡のために変化することである。もうひとつは魚類の再生産実験を行うには少なくとも1tスケールのかけ流し水槽のCO₂分圧を制御する必要がありAICAL装置の数十倍の水量確保が必要なことである。この新制御法を用いるには、海水が目的CO₂分圧に達したかどうかを計測する必要があるが、先行研究の過程で開発した投げ込み平衡器式CO₂分圧計測装置で確認するシステムとした。

図（1）-1に魚類の再生産実験のために海洋生物環境研究所柏崎実証試験場の屋内実験場で組みあげた飼育装置全体構成図を示す。平成24年の実験開始では、先行課題で開発した投げ込み平衡器（5mm径ゴアテックス管5m巻）式二酸化炭素分圧計測装置（赤外分光計1チャンネル：紀本電子工業製C02-09型）

## と平衡器5連自動切り替え装置

を組み合わせ、5台の水槽のCO₂分圧の順次計測を可能とした。平成25年度以降は、上記システムを参考に開発した6チャンネル同時計測装置（紀本電子工業製、SDC-12型）が導入され、魚類の再生産実験、サンゴの飼育実験を効率化した。

また、海洋生物環境研究所柏崎実証試験場ではさらに大型の水槽を用いるCO_{2}分圧制御実験を行った。野外に設置された10t水槽3台のCO_{2}分圧を順次計測できるように可搬型二酸化炭素計を調整し、CO_{2}ガスを海水に溶解して高濃度CO_{2}海水を調整する溶解塔、マスフローコントローラ、海水流量計などの部品の多くを、全体の大容量化に合わせてスケールアップした。平成26年度の実実験においては、3台の10t水槽で、かけ流

図(1)-1 海洋生物環境研究所実証試験場（新潟県柏崎市）施設にセットアップした1t水槽による魚類再生産実験用CO₂分圧制御海洋生物飼育装置の概念図。
し水の流量は0.5回転/h、すなわち約80L/hという大流量とし、光環境は自然日長の飼育環境としてマダイの再生産実験を行った。

## （２）我が国周辺のサンゴ種の成長への水温と海洋酸性化の影響

地球温暖化による海水温上昇の影響により、わが国の九州から本州に掛けての沿岸で急速な分布域北上が確認されているサンゴ種（北上種）があるが、分布域の変化が沿岸生態系の変化をもたらす可能性があるものの、大気CO₂濃度増大による炭酸カルシウム飽和度低下が石灰化を抑制するので分布域移動に制約がかかる可能性がある。ただし、北上種を含め、温帯性サンゴ自体のCO₂分圧に対する応答性が知られていないため確度の高い予測は難しい。温帯性サンゴでは、高水温・低水温ともその生息域を決める要因となるので、水温とCO₂分圧の複合影響を飼育実験から明らかにする。

研究課題初年度の平成24年度には、日本周辺域の北限域サンゴとして代表的なキクメイシモドキと、北上種を含む数種のサンゴについて、海水のCO₂分圧および水温を調整した水槽からの掛け流し配水による長期室内飼育実験系を確立した。各種の飼育環境条件や、照明機器や水槽等の飼育関連装置の検討を進めつつ、現在のCO₂分圧条件下で、多段階に水温設定した飼育実験により、サンゴの石灰化と成長が受ける水温影響を評価した。本州沿岸のサンゴ類のうち、急速に北上している種（北上種）、北限域に分布するが北上していない種（北限種）が知られている。まず、実験に必要な我が国沿岸のサンゴの採取とその長期畜養を行った。2012年6月に静岡県賀茂郡西伊豆町において採取された温帯性サンゴを公益財団法人海洋生物環境研究所（新潟県柏崎市）に輸送して実験に用いた。キクメイシFavia speciosaのほか、サンゴ北限種として代表的なヒメエダミドリイシAcropora pruinosa、北上種として代表的なAcropora solitaryensisとエンタクミドリイシAcropora sp.などの種が採取された。また、2012年10月下旬には、和歌山県東牟婁郡串本町において、ヒメエダミドリイシAcropora pruinosaとスギノキミドリイシAcropora muricata、クシハダミドリイシAcropora hyacinthus、そしてキクメイシモドキOulastrea crispataを採取し、同じく海洋生物環境研究所に移送して実験に用いた。海洋生物環境研究所では、採取されたサンゴについて、200Lアクリル水槽にて長期畜養実験を行なった。蓄養条件として適切な水温、光条件、水質の調整を行うとともに、藻類の発生を防ぐために、サンゴに影響がなく藻類を摂食するサザエ、クボガイ、タツナミガイ等の藻食動物を各水槽内に入れ、サンゴの健康的な維持に努めた。

本研究課題で可能としたCO₂の精密制御技術を生かし、温帯性サンゴ類の骨格成長速度の温度依存性を検討するために、長期飼育が容易と判断されたエンタクミドリイシ等を対象に、2つの段階恒温飼育実験を実施した。最初の実験では、温度を5段階（13℃，17℃，21℃，25℃，29℃）として、さらに各温度区の二酸化炭素分圧（pCO₂）をほぼ一定にすることとした。原海水から、冷却および加熱により温度を調整された海水は、その温度に応じてCO₂分圧が変化するが、低温区ではCO₂分圧が低下するため、CO₂ガスを添加してCO₂分圧を一定化させた。この結果、低温度区において炭酸塩（アラゴナイト）の飽和度（Ω）の低下が生じる。そこで、この第1の実験を「Ω調整実験」とした。第2の実験では、各温度区の炭酸系には操作を施さなかった。原海水から、冷却および加熱により得られた水温区は、その温度差に応じてCO₂分圧が変化するが、CO₂ガスを添加しないため、低温度区においてもΩ値の低下は大きくない。結果としてΩ値は高温区から2.4，2.4，2.3，2.2，2.1と比較的狭い範囲に保たれた。この第2の実験を「Ω未調整実験」とした。

平成25年度には、前年度の検討結果を踏まえ、北上種を含む温帯性サンゴのうち飼育の容易なものを選定し、サンゴの成長期を想定した複合影響評価実験を行なうことを目標とした。具体的にはCO_{2}分圧を、現状の値を含め3段階以上に、さらに水温を現状と2℃程度上昇させた2段階の実験条件を設定してサンゴを飼育し、海水のアラレ石飽和度が石灰化量に与える影響を評価した。また、これまでの飼育実験で、期間中に成長した骨格について走査型電子顕微鏡観察を行って、骨格微細構造への影響の有無を検討した。

平成26年度には、実験対象種を拡大して長期飼育実験を行い、水温上昇と高CO₂の複合効果による石灰化と成長への影響を評価した。23℃および26℃の水温2条件において将来のCO₂排出シナリオによる大気CO₂濃度範囲を考慮しCO₂分圧を400, 750, 1200 μatmの3条件に変えて飼育実験を行った。

## （３）海洋生物の再生産過程における水温と海洋酸性化の影響

海洋酸性化の生物影響についての知見は、単一の生活史段階への影響や小型魚類について調べたものが多く、複数の生活史段階を含む魚類の再生産過程や水産有用魚種を対象とした研究例はほとんどない。また、水産有用種への水温と高CO₂分圧の複合影響を調べた研究例もない。そこで、これまでに研究例のない水産有用種であるシロギス（Sillago japonica）とマダイ（Pagrus major）を用いて、
魚類の再生産過程における水温と海洋酸性化の影響評価実験を行った。シロギスは、東アジアに広く分布し、北海道以南の日本各地の沿岸海域に広く分布しており、漁業及び遊漁の主要な対象種の一つとなっている。また、マダイは北海道以南から南シナ海北部までの北西太平洋に分布しており、高級魚として扱われる漁業の主要な対象種の一つとなっている。

具体的には、下記の5つの項目についての研究を行った。（1）シロギスの産卵適水温を調査した。（2）飼育海水のCO₂分圧を変化させた条件を設け、産卵適水温下において酸性化がシロギスの再生産過程に及ぼす単純影響を調査した。（3）飼育海水の水温とCO₂分圧を個別に変化させた条件及び同時に変化させた条件を設け、温暖化と酸性化がシロギスの再生産過程に及ぼす複合影響を調査した。（4）産卵時の水温とCO₂分圧の違いによるシロギス卵のCO₂に対する耐性変化を調査した。（5）開発した大型水槽（容量10t）におけるCO₂分圧の制御方法の有効性をマダイの産卵実験によって検証した。

ここでは、中心的な実験である(2)の実験法をまとめる。確立した容量1t水槽におけるCO₂分圧の制御方法を用いてシロギス親魚の産卵実験を行った。供試魚は、新潟県柏崎市地先にて釣獲後、海洋生物環境研究所実証試験場において1ヶ月以上予備飼育した天然魚を主に用いた。各実験水槽には、供試魚を雌雄各3個体の合計6個体として収容した。実験前に飼育海水の水温を自然水温から26℃へ1日に約1℃の割合で上昇させた。全ての実験水槽で産卵を確認した後、高CO₂分圧区の実験水槽4基において、飼育海水のCO₂分圧を徐々に上昇させて設定CO₂分圧へ変更した。飼育海水のCO₂分圧は、自然海水のCO₂分圧（対照）と高CO₂分圧条件として850、1,400、2,400及び4,000 μatmの5段階に設定した。実験期間中の光条件は、水槽内に40W白熱灯1基を設置し日長を15時間明期、9時間暗期の長日条件に調整した。1回の産卵実験の期間はCO₂分圧が設定分圧になった時から4週間とし、産卵実験は合計3回繰り返して実施した。実験中は毎日、実験水槽のそばに設置した集卵水槽において卵の有無を確認した。卵が認められた場合、産卵数、浮上卵率及び浮上卵の正常発生率を求めた。産卵があった場合、卵の孵化実験を行った。供試材料は、各実験水槽で回収された産出後およそ14時間経過した受精卵とした。この受精卵10個を、各実験区の実験海水を満たした容量100 mLのスクリュー管瓶にパスツールピペットで移し替えた後、26℃の恒温水槽へ約24時間静置した。静置後はスクリュー管瓶内の供試材料について、正常孵化個体、奇形孵化個体、孵化後死亡個体、未孵化卵及び死卵を計数し、正常孵化率を求めた。シロギス卵の孵化実験で孵化した仔魚を用いて、仔魚の成長実験を行った。供試材料は、スクリュー管瓶内で孵化した正常孵化個体とした。これらの個体は、孵化後約2日齢の仔魚である。仔魚は麻酔を施した後に、パスツールピペットを使ってスライドグラスへ移し、実体顕微鏡を用いて観察した。そして、仔魚全体と左右の耳胞像をデジタルカメラで撮影した。デジタル画像は、画像解析ソフトウェアに取り込んで解析し、仔魚の脊索長と左右それぞれの耳胞の面積を計測した。成長実験は、1つの実験区について約20個体の仔魚の観察を行い、各実験区について5回繰り返した。

## （４）植物プランクトンの増殖における水温と海洋酸性化の影響

本サブテーマでは、植物プランクトンの増殖速度と生産する有機物の量および質が水温とCO₂分圧が増加した環境下においてどのように変化するのかを培養実験により明らかにする。海洋生態系における重要性が高い二大藻類グループとして珪藻類と円石藻類があげられるが、珪藻類は細胞が珪酸質の被殻に覆われ、円石藻類は細胞の表面に炭酸カルシウムの鱗片である円石を有していることを特徴としている。ここでは、珪藻と円石藻という石灰化をしない群とする群を対照して、これまでほとんど実験例のない水温増加とCO₂分圧増加の複合影響を、単離株による実験室レベル実験と沿岸海水（現場プランクトン群集）による現場型培養実験の両者から評価する。過去の研究では、植物プランクトンの増殖に対してCO₂分圧増加は光量が低い場合は促進効果を、光量が高い場合は阻害効果を示すことが報告されていることから、単離株実験では高光量と低光量において影響評価実験を行って結果を比較する。植物プランクトンが生産した有機物はPOMとDOMに分画し、両者の炭素量を測定する。これにより、粒子態有機炭素（POC）および溶存態有機炭素（DOC）を測定するとともに、粒子態と溶存態の生産比率を明らかにする。また、円石藻および現場プランクトン群集の実験では炭酸カルシウム殻の生産量の変化を明らかにするため粒子態無機炭素（PIC）を測定する。得られた実験的事実に基づき、有機物生産量および炭酸カルシウム生産量が将来の環境下で量的および質的にどのように変化する可能性があるのかを予測・検討する。

単離種の培養実験では、沿岸から外洋に分布する種からモデル藻類を選定した。選定した培養株の増殖特性をもとに、水温は各株の比増殖速度が直線的に増加する水温帯である12、16、20℃の3段階で実施した。光条件は、珪藻、円石藻のそれぞれについて高光量条件と低光量を選んだ。将来のCO₂排出シナリオによる大気CO₂濃度範囲を考慮し、珪藻の培養ではxCO₂調整済みの空気（400、550、750、1000 ppm）を培地に直接バブリングすることによりCO₂分圧を4段階に調節した。円石藻の培養においては、
バブリングにより増殖が阻害されることが明らかとなっているため、実験培地をバブリングせずにCO₂分圧を調節する実験を行うための半連続培養システムを構築した。

現場プランクトン群集を用いた影響評価実験では、2013年10月と2014年8月に、海洋生物環境研究所柏崎実証試験場において実験を実施した。2013年の実験では、CO₂濃度段階が400 ppmと1000 ppmの2段階であったが、2014年の実験では、400, 700, 1000 ppmの3段階とした。水温は現場水温、+2℃、+4℃の3段階とした。実験では、目標のCO₂分圧を達成するため、高CO₂海水を添加しながらCO₂分圧を実測して添加量を調節した。

### 4. 結果及び考察

## （１）海洋生物飼育実験用CO_{2}分圧制御と実験管理手法の提供

魚類の再生産へのCO₂影響評価実験に用いた装置の概念は図(1)-2に示した。本実験の場合は、CO₂を加えない対照水槽に対し、4つの水槽の海水の全炭酸が等間隔で高まるように設定し、CO₂分圧として約500（対照）、850、1400、2400および4000 μatmになった。実験期間中のCO₂分圧変動の例を図3に示す。CO₂分圧の異なる各濃度区の実測値は3回の繰り返し実験において860±60、1400±50、2500±60および4100±80 μatm（Mean±SD、n=3）となり、目標とする分圧の範囲に制御・維持することができた。

$$ CO_{2} $$

$$ CO_{2} $$

$$ CO_{2} $$

装置（紀本電子工業製、MOG-501型）と比較する実験を、平成24年12月から平成25年2月にかけて実施した。冬季の低水温期であったため、CO $ _{2} $ 分圧は290～350 μatmの範囲で変動し、典型的な日内変動は10～20 μatmであった。高精度装置との平均的な偏差は±3 μatm程度であった。この実験から、本装置が生物飼育実験での制御に求められる正確さを十分に満たしていることが確認された。また、長期連続運付着藻類が付くことの影響が懸念されたが、目視で著しく汚れているように見える平衡器であっても、水槽内の水流の強い場所に置くことにより±3 μatmの正確さに影響を及ぼさないことが分かった。

平成26年2月に10t水槽のCO₂分圧制御予備実験を行った上で、平成26年6月には大容量(10 t)の屋外設置型水槽のCO₂分圧制御の本実験を行った。15日間にわたり対照区（無制御）、高CO₂分圧条件の1,000および2,000μatmの実験設定を行い、それぞれ508±27.4、1,060±60.7μatm、2,140±129μatm（平均値±SD、n=54、53、53）という安定的なCO₂分圧の制御を行なうことができた。また、各実験区に収容したマダイについて、全ての水槽で産卵が観察され、大型水産有用魚種の再生産過程における海洋酸性化を評価する実験に本課題で開発したCO₂分圧手法が有効であることが実証された。

図（1）-2 シロギスの産卵実験における海水CO $ _{2} $ 制御結果。平成24年度実験の2回目の結果を例示。

## （２）我が国周辺のサンゴ種の成長への水温と海洋酸性化の影響

温帯性サンゴの骨格性成長速度の温度依存性を「Ω非調整実験」の結果から評価した。炭酸系の調整を行なわない「Ω非調整実験」では、アラレ石飽和度Ωaragは13℃区から29℃区にかけて約10%しか変化せず、骨格性成長速度の温度依存性を検討するのには適当である。6週間の水中重量の変化では、温帯性サンゴは25℃区で最大骨格成長を示すものが多かった。一方、白化度は25℃区で最低を示したので、温帯性サンゴの最適水温は25℃に近いと考えられる。温帯性サンゴの中で、ヒメエダミドリイシのみ13℃区でも骨格成長が確認された。他のサンゴ種では、斃死し骨格の溶解が進行していた。北限種のヒメエダミドリイシが他の温帯性サンゴと異なっている点は、骨格成長速度が25℃から29℃にかけて、統計的に有意に減少することである。これは、水温の上昇が継続すると、むしろ石灰化量が減少する可能性を示唆している。北上種3種はいずれも25℃から29℃の骨格成長速度に有意な差はなかった。
エンタクミドリイシについて、「Ω調整実験」と「Ω非調整実験」の2つの実験結果を比較したところ、同一温度区での骨格成長速度が、アラレ石の飽和度（Ωarag）に対応していることがわかった（図(2)-1）。「Ω調整実験」の29℃区では6週間で14％の成長を示したエンタクミドリイシの骨格成長速度は、「Ω非調整実験」の29℃区では2.8％に大きく減退するが、同じ水温であってもアラレ石の飽和度（Ωarag）が「Ω調整実験」の3.1から「Ω非調整実験」の2.4に低下することに対応すると思われる。すべての実験区のデータをプールして相関を検討すると、エンタクミドリイシの骨格成長速度は、アラレ石の飽和度と水温の両方に統計的に有意な正相関関係を示すが（図(2)-1D）、アラレ石の飽和度の方がより高い相関係数を示し、危険率は極めて小さい。この結果は、エンタクミドリイシの骨格成長速度が海水のアラレ石の飽和度の変動敏感に反応していることを示唆する。海洋酸性化による炭酸塩の飽和度（アラレ石の飽和度：Ωarag）の低下が、サンゴの成長量に負の影響を与えることが明らかになった。

$$ \left(\Omega_{arag}\right) $$

水温 $ (^{\circ}C) $

$$ \left(\Omega_{\mathrm{a r a g}}\right) $$

水温(℃)

水温(℃)

図（2）-1 2つの5段階水温飼育実験におけるエンタクミドリイシの骨格成長速度。（A）Ω調整実験（pCO₂一定実験）、（B）Ω非調整実験、（C）骨格成長量の水温との相関（R=0.78, P=0.0075）（D）骨格成長量のアラレ石飽和度との相関（R=0.96, P<0.0001）。

平成26年度には海水温の上昇と海水の酸性化が、本州南岸に分布する温帯性サンゴに与える影響について、水温およびCO₂分圧を同時に調整した環境で飼育する実験から評価した。温帯性サンゴの代表的な生息地紀伊半島串本の年平均水温に近い約23℃と、今世紀末に予測される水温上昇約3℃を加えた26℃区の2つの温度区を設定し、また、CO₂分圧は、対照区として現在の約400 μatm、代表的炭素パス（RCP）6.5相当の750 μatm、>RCP8.5相当の1200 μatmの3段階を設定した。長期飼育実験は、北上種のスギノキミドリイシとクシハダミドリイシを対象に、2014年7月から11月の約15週間と、北上種のスギノキミドリイシと北限種のヒメエダミドリイシ等を対象に、2014年11月から2015年1月の約8週間の2回にわたって実施した。

北上種のスギノキミドリイシとクシハダミドリイシを対象にした飼育実験の結果を図(2)-2に示す。現在の海洋条件に相当する400 μatm区では、3℃の昇温は、北上種のスギノキミドリイシとクシハダミドリイシの

## 骨格成長を促進させ

る効果が見られた。一方、CO₂分圧の増加に伴い、26℃区ではこれらの北上種の骨格成長率が低下した。今後、水温の上昇によるサンゴの骨格成長促進と、海洋酸性化による抑制がちょうど釣り合うような状態を経由して、それ以上の海洋酸性化の進行はサンゴの骨格成長を現在よ

図（2）-2 温帯性サンゴの北上種のスギノキミドリイシとクシハダミドリイシを対象にした水温2段階、CO₂分圧3段階の長期飼育実験による骨格成長速度の変化。
リも低下させてしまうことが示唆された。一方、北限種のヒメエダミドリイシではこのような傾向は認められなかった。沖縄に分布する熱帯・亜熱帯性の造礁サンゴ類には、海水のpHの低下、あるいはCO_{2}分圧の上昇に伴って、骨格成長速度が低下する種があることが知られている。生息に好適な水温の上限に近い熱帯・亜熱帯性のサンゴの場合は、地球温暖化による高水温化は、大きなストレスとなると考えられている。しかし、温帯域にあたる日本周辺では今後、地球温暖化によってサンゴ分布域が北上し、また、海洋酸性化による成長抑制から南下が予想されており、今回の実験結果は、基本的にこの傾向を支持する。しかし、北上種と北限種ではその傾向に違いが見られることが示唆された。

## (3) 海洋生物の再生産過程における水温と海洋酸性化の影響

CO $ _{2} $ 分圧を850、1,400、2,400及び4,000 μatmに設定した実験区での3回の産卵実験において、シロギスは対照区、850、1,400、2,400及び4,000 μatmのいずれの実験区でも産卵した。各実験区における卵の浮上卵率は60%以上であり、それらの正常発生率は90%以上と高かった。それぞれの実験区間の有意差を検定したところ産卵回数、産卵数、浮上卵率及び浮上卵の正常発生率のいずれについても有意差は確認されなかった（ANOVA, p>0.05、図(3)-1）。卵の孵化実験において、シロギス受精卵は、いずれの実験区でも孵化し、それらの正常孵化率は92%以上であった。各実験区の正常孵化率について各実験区間で有意な変化は検出されなかった（ANOVA, p>0.05）。仔魚の成長実験において、各実験区のシロギス仔魚の脊索長は2.84±0.057 mm（対照区）、2.87±0.074 mm（850 μatm区）、2.80±0.089 mm（1,400 μatm区）、2.84±0.125 mm（2,400 μatm区）及び2.80±0.099 mm（4,000 μatm区）であり、各実験区間の脊索長に有意な変化は認められなかった（ANOVA, p>0.05）。各実験条件下で産出された後に発育したシロギス孵化仔魚の耳胞面積は、左右いずれも各実験区間において有意な差は検出されなかった（ANOVA, p>0.05）。

B

C

図(3)-1 高CO₂分圧下に28日間おかれたシロギスの産卵回数。A: 産卵回数、B: 産出された卵の浮上卵率、C: 1回当りの産卵回数、D: 浮上卵の正常発生率。棒グラフは3回の産卵実験の平均値、誤差棒はその標準偏差を示す。

水温と酸性化の複合影響実験においては、4回の実験の結果、産卵好適水温（26℃）における高CO₂分圧条件下では同水温の対照区と比較して、産卵数、正常卵率、正常発生率、浮上卵の正常孵化率、孵化仔魚の背索長及び耳胞の面積には有意な変化はみられず、好適水温下でのシロギスの再生産過程は海洋酸性化に対して強い耐性を持つことが示唆された。これは海洋酸性化の単純影響のみを調査した上述の実験結果と同様であり、実験結果の再現性が確認されたといえる。高水温（28℃）においては産卵数、孵化率、孵化仔魚の背索長及び耳胞の面積について好適水温の場合と同様の傾向が認められ、高水温下においても酸性化に対して耐性を持つことが推察された。しかしながら、正常発生率は、28℃-2,200 μatm区において26℃-2,200 μatm区と比較すると有意な低下がみられた。これらの結果より、2,200 μatmという極端な海洋酸性化環境下ならば、シロギスの再生産において、さらに+2℃の高水温の影響が加わるとシロギス卵の正常発生率が低下する複合影響が生じる可能性が示唆された。

卵に対する海洋酸性化の影響は、海洋へ産み出された段階で突然生じるわけでなく、親魚の体内における卵成熟過程から継続することが予想され、卵への影響実験は産卵前にある親魚の段階から検討する必要がある。しかしながら海水魚については、その多くの種類で決まった時季にしか産卵しないことや、繁殖行動を可能とする大型水槽が必要なことなどの制約から、産卵を制御する技術がほとんど確立されておらず、親世代から子世代を一貫して扱った実験がほとんど成立していない。今回、水産資源を担う多数の海水魚と同様に分離浮性卵を大量に生産するシロギスについて、親子の世代間で海洋酸性化影響実験が成立し成果が得られたことは、この技術を他魚種へ展開させることはもとより、海水魚に対する酸性化影響を予測評価する上で極めて意義深い。
## (4) 植物プランクトンの増殖における水温と海洋酸性化の影響

本研究では珪藻と円石藻の2大藻類グループの複数種を水温3段階、CO₂分圧4段階、光量2段階の組合せで培養することにより、これまでに例のない規模の影響評価データを獲得できた。全ての結果を俯瞰するため、水温増加とCO₂分圧増加に対する応答を増加、減少、凸凹型に分類するとともに、水温およびCO₂分圧の交互作用（複合影響）が認められるか否かをまとめた（表(4)-1）。

表(4)-1 单離株実験での、水温およびCO₂分圧が増加した際の影響と交互作用の有無のまとめ

∀: 増加 ↘: 減少 凸: 中間域で増加 凹: 中間域で減少 ○: 有意な影響あり ×: 有意な影響なし

項目	種	水温增加	CO2分压增加	交互作用
高光量	低光量	高光量	低光量	高光量	低光量
比增殖速度	T. oceanica	↗	↗	↘	↘	○	○
T. pseudonana	↗	↗	↗	凹	○	○
T. weissflogii	↗	↗	↗	↘	○	○
G. oceanica	↗	↗	×	×	×	×
E. huxleyi	↗	↗	×	×	×	×
POC生產	T. oceanica	↘	凹	×	↗	×	○
T. pseudonana	↘	凸	↗	↗	○	○
T. weissflogii	↘	↗	凸	×	○	×
G. oceanica	↘	×	×	×	○	×
E. huxleyi	↘	↘	×	×	×	×
DOC生產	T. oceanica	—	—	—	—	—	—
T. pseudonana	—	—	—	—	—	—
T. weissflogii	↘	凸	×	凹	○	○
G. oceanica	↘	×	×	×	○	×
E. huxleyi	↘	×	×	×	×	×
DOC割合	T. oceanica	—	—	—	—	—	—
T. pseudonana	—	—	—	—	—	—
T. weissflogii	↘	凸	凹	×	○	○
G. oceanica	↘	×	×	×	×	×
E. huxleyi	×	×	×	×	×	×
PIC生產量	G. oceanica	↘	×	↗	×	×	×
E. huxleyi	凸	×	凹	↘	×	×

比増殖速度や有機物生産への影響はCO₂分圧よりも主に水温によってもたらされることがわかる。POC生産は高光量では全5種で水温増加により低下する一致した結果を示したが、低光量では水温増加に対する応答は種特異的だった。DOC生産についても同様の結果が得られた。一方、CO₂分圧増加は有意な影響をもたらすものの、全種が同様の応答を示すことはなかった。さらに、CO₂分圧増加が有意な影響をもたらした場合のほとんどのケースで水温との間の交互作用が認められたことは、CO₂分圧増加への応答が水温毎に異なることを示している。このことは、海洋酸性化の影響を評価する際、選択する試験水温によって、影響の評価結果が異なることを示す。CO₂分圧増加への応答が多様であるという培養実験的事実は、将来の海洋生態系の変化を予測しようとする際に十分考慮されなければならない、非常に重要な知見である。

すべての現場実験の実験結果も合わせて考慮すると、水温およびCO₂分圧の増加に対する現場プランクトン群集の応答は実験実施時の水温などの環境条件により変化することがわかった。ただし、変化をもたらす要因は圧倒的に水温増加であることがわかった。CO₂分圧増加の影響はChl-a濃度の増加速度の抑制、POC生産量の促進とPOC:PN比の上昇にのみ認められた。交互作用がほとんど認められないことも特徴である。すなわち、現場プランクトン群集の増殖や有機物生産にかかわる過程はもっぱら水温に依存して変化することを示している。一方、海洋酸性化の影響が懸念される炭酸カルシウム殻生産への阻害作用は本実験からは明確でなかった。

本サブテーマで実施した単離株を用いた室内実験と沿岸海水を用いた現場実験からは、将来の植物プランクトンの動態は主に水温増加に依存して変化し、CO₂分圧増加の影響は比較的小さいことがわかった。植物プランクトンの増殖速度が水温増加に伴って促進される様子は室内および現場実験の両者で一致し、普遍的な結果と考えられる。一方、水温増加に伴う有機炭素生産量の応答は室内実験では減少傾向、現場実験では増加傾向であり、相反する結果となった。これは、室内実験では指数増殖期のみを測定対象としたのに対し、現場実験では増殖期から衰退期までを測定対象としたため、測定期間が異なることに起因したと考えられる。2013年秋季の実験ではCO₂分圧増加が増殖衰退期のプランクトン群集による有機炭素生産にプラス効果をもたらす様子が
捉えられたことから、増殖衰退期の有機炭素生産を詳細に把握することが将来の有機炭素生産量の変化を解明するうえでカギとなることがわかった。また、現場実験では植物プランクトン以外に動物プランクトンや細菌類が有機炭素生産にかかわっていることも結果の違いをもたらしたと推測され、今後はこれらの生物の役割とそれに対する水温とCO₂分圧増加の複合影響を解明することが課題と考えられる。

### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

先行研究で実施してきた海洋生物飼育において精密にCO₂分圧を調整する技術を発展させることにより、従来行うことが難しかった条件下での生物飼育実験が可能になった。具体的には、海水の水温とCO₂分圧の両者を調整したうえでそのCO₂分圧を計測し、将来の高CO₂と温暖化の両方が現れる条件で海洋生物の飼育を行う技術が確立した。研究課題最終年度までに、日本周辺のサンゴへの温暖化と海洋酸性化の複合影響評価および小型から大型に至る水産有用魚種への温暖化と海洋酸性化の複合影響評価を可能にした。その結果、近未来の日本沿岸のサンゴについては、水温上昇が熱帯性サンゴの北上を進めるが、今世紀後半など二酸化炭素分圧がさらに高まる場合において海洋酸性化影響が北上を抑制する可能性が示唆された。このような実験的研究例は世界で初めてであり、実際に北上サンゴが確認されているわが国でしかできない貴重な研究である。シロギスの再生産過程は、高CO₂による海洋酸性化の単純影響に対しては高い耐性がある。しかし、高水温との複合影響下では正常孵化率の低下に伴うシロギス個体数の低下が引き起こされる可能性が明らかとなった。ただし、このようなCO₂分圧影響が起こりうるのは将来予測される大気CO₂分圧よりはるかに高いレベルであることが分かった。水産有用魚種を用いて、魚類の再生産過程への高水温と海洋酸性化の複合影響評価を行った研究例はこれまでに無く、容量の大きな水槽において流水式でCO₂分圧制御が可能となったことで、従来よりも多様な魚種についての影響評価が可能になったことに意義がある。本研究はこれまでに報告例が少ない、植物プランクトンに対する水温とCO₂分圧増加の複合影響を評価する実験を、単離株を用いた室内培養実験と沿岸海水を用いた現場型培養実験の両者により実施したことから、植物プランクトンに対する水温増加とCO₂分圧増加の影響を相対的に比較することが可能になった。結果として、植物プランクトンの応答はCO₂分圧増加よりも水温増加に依存するものであることが明らかとなった。本研究ではこれに加えて、光量の違いが水温とCO₂分圧の複合影響にもたらす効果も考慮することができた。これら、各サブテーマの成果は本課題で実験的な基盤を整備したことによってはじめて得られた価値の高い科学的成果である。

## (2) 環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

研究代表者は、IPCCの第5次評価報告書の執筆（第1作業部会第3章RE、第2作業部会第6章LA）に加わった。2014年に公開されたIPCC第5次評価報告書第2作業部会報告において、海洋酸性化影響に関するメタ分析がなされ、本課題と関連する先行課題（2008年～2010年度）の発表論文6件（先行課題期間中および終了後に印刷出版したもの）が引用された。ただし、本課題の直接の成果論文は、第5次評価報告書に引用されるには時間的な制約で困難であった。

また、研究代表者は中央環境審議会地球環境部会気候変動影響評価等小委員会の検討作業に加わり、海洋生態系への気候変動影響について専門的立場から貢献した。

平成27年2月21日には、本研究課題が主催し「海洋酸性化がわが国周辺の生物に与える影響を評価する」と題する一般向け研究成果報告会を実施した。平成27年3月16日には、那覇市で開催されたIPCC公開シンポジウム「地球温暖化問題について考えよう！最新の科学と温室効果ガス排出量監視の取りくみ」において、研究代表者と分担者の鈴木淳が本課題の成果に関連する講演を行った。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

本研究課題は、わが国の沿岸海洋環境にとって重要であるサンゴが温暖化と海洋酸性化で受ける影響予測に関わる研究であり、自然環境保全に意義が大きい。また、温暖化と海洋酸性化で水産有用魚種が受ける影響の評価は社会的意義がある。海洋酸性化の生物影響評価は、海洋への地球温暖化影響を評価する上で極めて重要な観点であるので、次期IPCC評価報告書でも第5次評価報告書と同様に海洋酸性化の生物影響に関してメタ分析がなされると考えられる。メタ分析には、生物種ごとの詳細な評価結果をあまねく収集して解析するので、本課題の成果である生物種毎に影響評価する研究成果が必要であり、今回同様に引用されるものと思われる。

一方で、温暖化と海洋酸性化が海洋生態系に及ぼす影響評価が今後重要性を増すので、植物プランクト
ンに対する水温とCO₂の影響評価結果は、将来予測モデルにぜひ必要となり、次期IPCC評価報告書に寄与することが期待される。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

## <査読付き論文>

1) A. Kato, M. Hikami, N. H. Kumagai, A. Suzuki, Y. Nojiri, and K. Sakai, "Negative effects of ocean acidification on two crustose coralline species using genetically homogenous samples", Marine Environmental Research, 94, 1-6, 2013. doi:10.1016/j.marenvres.2013.10.010

2) T. Onitsuka, R. Kimura, T. Ono, H. Takami, and Y. Nojiri,

“Effects of elevated $ pCO_{2} $ on the early developmental stages of the horned turban, Turbo cornutus”, Marine Biology, available on line 18 February 2014. doi:10.1007/s00227-014-2405-y

3) S. Ohki, T. Irie, M. Inoue, K. Shinmen, H. Kawahata, T. Nakamura, A. Kato, Y. Nojiri, A. Suzuki, K. Sakai, and R. van Woesik,

“Calcification responses of symbiotic and aposymbiotic corals to near-future levels of ocean acidification,

Biogeosciences, 10, 6807-6814, 2013. doi:10.5194/bg-10-1-2013

4) R.Suwa, Y. Nojiri, T. Ono, and Y. Shirayama,

“Effects of low pCO $ _{2} $ conditions on sea urchin larval size,

Marine Ecology-An Evolutionary Perspective, 34, 443-450, 2013. doi: 10.1111/maec.1204

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1）鈴木 淳、林 正裕：第12回環境研究シンポジウム、東京（2014）

「海洋酸性化がサンゴの成長に与える影響についての飼育実験研究」

2) Yukihiro Nojiri: Human Impacts on Oceanic Environment, Ecosystem, and Fisheries, Nagasaki University International Symposium, Nagasaki, Japan (2014)

“Collaboration of Japanese maritime laboratories for $ CO_{2} $ manipulation experiments assessing impact of ocean acidification on coastal ecosystem”

3）野尻幸宏：気候変動に関する政府間パネル(IPCC）公開シンポジウム、那覇（2015）

「気候変動に関する新たな科学的知見:IPCC第5次評価報告書」

4）鈴木 淳、山野博哉：気候変動に関する政府間パネル(IPCC）公開シンポジウム、那覇(2015)「日本周辺域で見られるサンゴの生息域変化と海洋酸性化」

5）鈴木 淳：日本地球惑星科学連合大会スペシャルレクチャー、千葉（2015）

「サンゴ、サンゴ礁と地球環境－生物学と地球科学の連携研究－」

### 7. 研究者略壓

課題代表者:野尻幸宏

東京大学理学部卒業、理学博士、現在、独立行政法人国立環境研究所地球環境研究センター上級主席研究員

## 研究分担者

## 1 ) 鈴木 淳

東北大学理学部卒業、現在、独立行政法人産業技術総合研究所海洋環境地質研究グループ研究グループ長

## 2 ）林正裕

長崎大学水産学部卒業、現在、公益財団法人海洋生物環境研究所実証試験場主査研究員

## 3 ）吉村毅

北海道大学水産学部卒業、現在、一般財団法人電力中央研究所環境科学研究所主任研究員