Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
## Soft-hydrothermal processing

本事業収支より 10.0 ton/日の装置では主要機器価格 98,000 千円を 3.9 年で回収でき、一般的な規模の土木建築附带工事費を含めても 6.2 年で回収できる。5.0 ton/日の装置でも主要機器価格 81,600 千円を 7.1 年で回収でき、一般的な規模の土木建築附带工事費を含めても 10.6 年で回収できる。これらは実用化に対して充分に実現可能な数値である。

さらに、申請者らは主要機器を10年償却として毎年の装置導入利益も算定した。

廃培地の運搬廃棄処理表を考慮しなくても廃培地削減量80.9%、費用削減3,836円/ton、15.7%、栽培瓶1本当たりに換算すると1.69円の削減となり、年間30,000千本栽培する標準的きの二生産業者に対して多大に貢献することができる。

## 1 tonのブナシメジ用きのこ培地の廃培地排出量とコスト

【各種單価計算】
培地原料單価	单位：円/ton
原料種類	乾燥單価	湿重單価
オガコ	27,180	9,060
コーンコブ	40,000
培地添加材	40,000

1.0ton

各原料の水分は66.7％として湿重単価計算

再生培地单価	単位:円/ton
装置の減価償却	4,274	年間処理量
2,340(ton/1年-26日*9月)
電気代	171	kWh
燃料費	5,322	灯油 2
水	751	上下水道代 ㎡
その他費用	0	人件費建物土地
計	10,518

【現状(再生使用なし:シナリオ1)】
水分調整後の培地1tonの価格
原料種類	割合	価格(円)
オガコ新材	50.3%	4,557
コーンコブ	12.7%	5,080
培地添加材	37.0%	14,800
計	100.0%	24,437

【再生培地活用(シナリオ2)】
水分調整後の培地1tonの価格
原料種類	割合	価格(円)
オガコ新材	30.3%	2,745
再生培地	34.0%	3,576
培地添加材	35.7%	14,280
計	100.0%	20,601
### 1. 事業の目的

### 1.1 廃培地の現状

きのこの人工（培地菌床）栽培は、消費者の健康趣向とともに、きのこの種類・生産量ともに年々増加の傾向にある。きのこを収穫後の培地(廃菌床)は、堆肥にする等の再利用方法が広く知られているが、その方法は、事業者が異なる場合や、必要とする時期の違いがあるなどの問題があり、再利用が進んでいないのが実態である。きのこの生産量拡大により現状の再利用だけではもはや飽和状態となってきている。一方、きのこ経営においては、販売価格の低迷、燃料、資材の高騰により、経営環境の厳しさが増している。そのため培地資材コスト低減と、廃培地の有効利用を目的に、きのこ培地資材として再利用の取り組み（肥料化、燃料化、飼料、培地として再使用）が、きのこ生産で始まっているが、有効な再利用処理方法を見出していない。

図.1に示すように長野県は日本一のエノキタケ、ブナシメジ、エリンギ、ナメコ、およびマイタケ等の菌歯栽培のきのこの生産県である。

平成25年全国きの二生産量

図.1 平成25年 全国きのこ生産量（農林水産省農林水産省 特用林産物需給動態調査）

長野県および新潟県が突出して生産量が多いが、北海道、東北、四国、九州の各県においてもそれぞれのキノコの栽培量は合計で10,000 tonを超えている。すなわち、全国で限なく、きのこが相当量生産量されている。そして、廃きのこ培地はきのこ生産量の1.5-2倍の量が排出されている。

日本有数の培地栽培によるきのこ生産地である長野県中野市によると、2008年度に同市内で排出された廃培地は約95,000トン（2013年度は130,000トンを超えた）。近隣の飯山市、山ノ内町、木島平村を含めるとその量は約200,000トンと言われている。うち66％が堆肥向けを中心に利活用されているが、品質および収量が低下するためきのこ培地としての再利用は難しく、ほとんど利活用されていない。また、培地の基材であるトウモロコシの芯を砕いたコーンコブは、現在中国から輸入されているが、中国国内でのバイオ燃料の原料として需要が急増しその価格が高騰している。また、そのコーンコブ自体の品質も遺伝子組替え作物、および重金属汚染の懸念があり、敬遠するきのこ関連業者も多い。代用とし
## Soft-hydrothermal processing

て、きのこ培地の基材に、国内のオガコを使用したいが、精油成分を除去するネカシ（オガコを半年ないし1年間散水して野積みにする）の手間が掛かり近年、エノキタケではほとんど利用されていない。以上より、廃きのこ培地の培地としての再利用が切望され、また、森林木材業者からも国内木材の利活用の促進のためにネカシに代わる有効な木材精油成分の除去技術が期待されている。

申請者らは，150℃以下ないし200℃以下の非常にマイルドな水熱プロセス（以下、ソフト水熱プロセスと記す。）を用いて廃きのこ培地の改質とリサイクルの可能性を示唆した。きのこの人工栽培は、きのこの種類・生産量ともに年々増加の傾向にあり、きのこの生産量拡大により廃きのこ培地は飽和状態となってきている。一方、きのこ経営においては、販売価格の低迷、燃料、資材の高騰により、厳しさが増している。そのため、図.2に示すように培地資材コスト低減と、廃きのこ培地の有効利用を目的に、きのこ培地資材として再利用の取組み（肥料化、燃料化、飼料、培地として再利用）が、きのこ生産業者のなかで試行されているが、未だに有効なり活用技術を見出していない。

乾燥して50％をきのこ生産に再利用する。

有機堆肥として土づくり、有機栽培の促進。

土壤改良材、化学肥料・融雪剤・調湿材等に再利用する。

ペレットにして燃料に再利用する。

家畜の敷き料に再利用する。

広葉樹を中心に家畜飼料として再利用する。

## 廃きのこ培地の有効な利活用の方法は見出されていない。

平成24年度長野県キノコ振興基本方針（抜粋）

長野県キノコ生産の環境面において、キノコ生産に伴う廃培地（使用済み培地）の利用が課題であり、バイオマス資源として燃料化、資源化等の利活用の促進が必要となっている。このため、キノコ農家の経営安定を図るために、地域支援班と圏域支援班の体制を整備し、技術改善、財務改善、労務改善の三位一体の経営改善支援に取組むほか、低コスト生産技術、省エネ・節電対策、廃培地（使用済み培地）の適正利用と新たな培地による地域資源循環システムの構築、放射性物質に対応した安全な原木・培地原料の使用などの生産管理を進める。

図.2 廃きのこ培地再利用システムの方向性

一 平成24年度長野県キノコ基本計画一

そこで、申請者らは、きのこ生産者にメリットのある、廃きのこ培地をソフト水熱プロセスにより、廃培地中の有害物質の抽出・除去、滅菌・きのこ生育阻害酵素の不活化し、同時に、菌株の構成物質となるリグニンを適宜分解し、および適宜乾燥させ、きのこ培地として再生する持続可能な「廃棄物「ゼロ」の循環型きのこ栽培システム」が構築できること、さらにオガコの改質による森林資源の利活用を示唆した。すなわち、ソフト水熱プロセスは廃きのこ培地を改質および再生できるこれまでにはないシステムといえる。
### 2. 開発した技術の詳細

### 2.1 ソフト水熱プロセスとは

水を反応媒体とした超臨界、あるいは亜臨界という反応領域を用いた有機物、無機物の分解、あるいは合成の研究はこれまで数多く実施されてきたが、その反応の激しさ故にあまり実用化が進んでいないのが現実である。

本研究は、図.3に示すように基礎的研究例がほとんどないソフト水熱プロセス(150℃以下ないし200℃以下の高温高压の水、および水蒸気）の加圧熱水領域、乾燥水蒸気領域、飽和水蒸気領域での水の特性を明らかにし、ソフト水熱プロセスを反応媒体として、廃きのこ培地から菌子由来の有機物質（腐敗性物質）の抽出を行い、同時に、菌株の構成物質となるリグニンを適宜分解し、阻害物質（阻害酵素）も加水分解することにより不活化し、さらに高含水率の廃きのこ培地の適宜乾燥も行う。すなわち、ソフト水熱プロセスは、添加栄養物由来の有機物、および菌子を含む高含水率の廃きのこ培地の再生処理に最も適した反応媒体であることを実証した。

図.3 ソフト水熱プロセスの反応特性

申請者らは、ソフト水熱プロセスにより、生命科学研究期間の動物実験施設や繁殖生産会社から膨大な量が排出される、使用済みの床敷から糞尿由来の有害物質を抽出し、乾燥、脱臭および滅菌して再生利用する処理方法を提案している。
## Soft-hydrothermal processing

さらに、ソフト水熱プロセスの水の化学特性を応用して、既存のオートクレープ滅菌では不可能とされた高温耐性の蛋白質あるいは酵素、および細菌内毒素の不活化を可能にし、そのメカニズムを解明して新しい滅菌法の開発を示唆した。

本研究の新規性は反応場が水であり、その反応には特別な化学物質を用いる事はいっさい無い。すなわち、完全無害で副作用も無く、環境保全の理念に合致した技術といえる。

使用済みの床敷と同様に廃きのこ培地のリサイクル、再生利用は、資源の節約となる事は言うまでもなく、ゼロエミッション（資源循環型社会）に基づく社会・環境・生産システムの構築に貢献でき、廃棄量、焼却処理量の減少による温室効果ガス $ CO_{2} $ 削減にも寄与することができる。

反応媒体としての高温高压水は、高い誘電率と高いイオン積の液相領域ではイオン反応（無機反応）の好適場となり、比較的低いイオン積と低い誘電率の気相領域ではラジカル反応（有機反応）の好適場となる。

申請者らは、このような多様な化学反応を起こすソフト水熱プロセス、特に、気相領域である乾燥水蒸気に着目し、150℃以下ないし200℃以下のソフト水熱プロセスの乾燥水蒸気を利用して、高含水バイオマスから、有機化合物の選択的分解、抽出、および脱水、乾燥、縮合、炭化ができることを示唆した。

臨界点より低い温度の乾燥水蒸気は低密度の媒体で、誘電率は10以下になり、イオン積も常温の水より100分の1ほどに低くなる。したがって、無極性あるいは極性の弱い有機物質の抽出に対して利点があると推察される。この性質を利用し、有機物質を分解せず、直接的に天然物質から抽出することが可能となる。本研究は、乾燥水蒸気を反応媒体として、廃きのこ培地から菌子由来の有機物質（腐敗性物質）の抽出を行い、同時に、菌株の構成物質となるリグニンを適宜分解し、阻害物質（阻害酵素）も加水分解することにより不活化し、さらに高含水率の廃きのこ培地の適宜乾燥も行う。

すなわち、ソフト水熱プロセスが、添加栄養物由来の有機物、および菌子を含む高含水率の廃きのこ培地の再生処理に最も適した反応媒体であることを実用規模のプロトタイプにより立証した。

ソフト水熱プロセスによる廃きのこ培地再生処理技術を確立するため、機能、性能を満たした装置の完成およびシステムの構築に向け、次の3項目より検証した。

1. 装置の機構的再現性・信頼性・普遍性を立証すること。

2. きのこの栽培実証により収穫量・品質を立証すること。

3. きのこ培地成分の化学成分分析により再生メカニズムを解明すること。

### 2.2 装置の機構的再現性・信頼性・普遍性の立証

既往の研究より、廃きのこ培地の生物由来の生育阻害物質、および腐敗性有機化合物がその再利用（使い廻し）を妨げ、また木質由来の生育阻害物質がきのこの菌床栽培の収穫量、およびその品質の安定性を妨げていると云われている。そこで、申請者らは，150℃以下ないし200℃以下の非常にマイルドな水熱プロセス（以下、ソフト水熱プロセスと記す）を用いて廃きのこ培地の改質、および再生をまず小型実証機（10 kg/バッチ）で立証し、その再生処理条件の閾値、および最適処理条件を世界で初めて示唆した。

【方法】JA コーン培地を対照区 control (+)、JA コーン培地の使用済みの培地を対照区 control (−)として、ソフト水熱プロセスを施した再生培地を実験区とした。ソフト水熱プロセスの処理条件は、120、130、140、150 ℃ にてそれぞれ 30、60、90 分とした。再生培地の代替率は、乾物重量比で 50% とし、栄養材として、コメヌカ、フスマ、ビート、キノコライムを所定量添加し含水量を調整したうえで、通
## Soft-hydrothermal processing

常の手順で殺菌した。供試品種SR12を接種した後は、JA中野市施設内で通常生産時と同様の手法で培養、菌掻き、発生管理を行った。ソフト水熱プロセス処理前、処理後、および殺菌前、殺菌後のpH、含水量を測定し、栽培日数（培養、発芽、生育）、栽培状況（菌周り状況、発芽状況、床ハグ状況、抑制状況、接着程度）、および収量を調査した。

【結果および考察】control（−）で栽培した時のきのこの収量は、control（+）と統計学的有意差は認められないものの低下する傾向が見られた。また、品質は、control（+）に比較して不良である。これは、きのこ廃培地中に存在するきのこ生育阻害物質に起因するともの考えられる。ソフト水熱プロセス120°C-30，60分では生育阻害物質の不活化反応のばらつきが大きく、90分では、不活化が安定する。さらに、control（+）の収量と同等となり、130°C以上では120°Cより不活化反応は促進されている。きのこの品質は、control（+）と同等である。140、150°C-30、60分、および90分では、生育阻害物質の不活化反応が充分促進されている。すなわち、何れの反応時間でも、control（+）の収量と同等となる。きのこの品質は、control（+）に比較し優良である。以上より、きのこ廃培地のきのこ阻害物質の不活化は、120°Cでは何れの時間でも不十分であるが、130°Cで亢進され、130°C-30分以上では、control（+）と同等の収量、品質となり、さらに時間、温度を増加させることにより、control（+）以上の収量、品質となる。

以上より、申請者らは、図.4に示すように世界で初めて廃培地の再生処理条件の閾値を明らかにし、きのこ生産者がその処理に苦慮しているきのこ廃培地を、ソフト水熱プロセスにより廃培地中の有害物質の抽出・除去、滅菌・きのこ生育阻害物質の不活化、および適宜乾燥させ、きのこ培地として再生する「廃棄物「ゼロ」の循環型きのこ栽培システム」が構築できること、さらにオガコの改質による森林資源の利活用を示唆した。

図.4 ソフト水熱プロセスの各再生処理条件と収穫量
## Soft-hydrothermal processing

本研究の新規性、独創性は高温高压水蒸気の化学的特性を適用していることにある。申請者らは、小型実証機（φ400×L865 mm、処理能力10 kg/バッチ）ではその有効性を立証しているが、スケールアップした本補助金事業の実用規模のプロトタイプ（φ1,200×L2,900 mm、処理能力500 kg(2 m³)/バッチ）においても、水蒸気の温度、圧力、および流量を制御し、気相、液相および飽和水蒸気圧曲線上の有効性について実証実験を行ってきた。

図.5にプロトタイプの概要図および写真を示す。

図. 5 ソフト水熱プロセスのプロトタイプ外略図

具体的には、廃きのこ培地再生処理装置の新規性、独創性および特許性は、従来の高温高压水蒸気反応装置（既存の「オートクレブ」）とは次事項で相違している。

1. ジャケット、およびリアクターの水蒸気をそれぞれ個別に圧力で制御できること。

2. ジャケット、およびリアクターの水蒸気流量をそれぞれ個別に制御できること。

3. ジャケットの圧力・流量をジャケット上流側、およびジャケット下流側でそれぞれ分離して制御できること。

4. リアクターの圧力・流量をリアクター上流側、およびリアクター下流側でそれぞれ分離して制御できること。

5. ジャケット、リアクターの水蒸気を流通式にできること。

これらは従来の高温高压水蒸気反応装置（既存の「オートクレブ」）と相違している事項である。

また、廃きのこ培地の既往再生処理関連技術と本技術との相違を下記に記す。
## Soft-hydrothermal processing

常圧水蒸気処理方法：水、あるいは蒸気に晒して攪拌した後に自然水切りし培地として調整し再利用する。コーンコブ代替率は50%。(特開 2008-54510)

ソフト水熱プロセスとの違い：60℃の温水、あるいは蒸気と記載されているが、いずれにしても100℃以下の常圧の水蒸気であり、単に廃培地を洗浄するだけで本事業のソフト水熱プロセスの乾燥、抽出、阻害物質の不活化という化学的反应は期待できない。一定のエノキダケでの再生使用効果は、新材コーンコブを同量混合することで、廃培地を希釈するためだと推察されるが、他のきのこ（エリンギ、ブナシメジ）では収穫量、品質とも再利用はできない。

ソフト水熱プロセスの差別化：ソフト水熱プロセスの再生処理培地は、きのこ阻害物質を不活化するため、再生処理培地で栽培したエノキダケを含むあらゆるきのこ種の品質でも、新規培地（フレッシュ培地）と同等、あるいは同等以上となることを実証した。

本廃きのこ培地再生処理装置のメカニズムは、図.6から図.9に提示するように、リアクター内の蒸気飽和度 $ ^{(*1)} $ を制御することにより、加圧熱水、飽和水蒸気、さらに乾燥水蒸気を反応媒体として、廃きのこ培地から菌子・木質由来の有機物質（腐敗性物質）の抽出を行い、同時に、菌株の構成物質となるリグニンを適宜分解し、および菌株の生育阻害物質（阻害酵素）を加水分解することにより不活化し、さらに高含水率の使用済みきのこ培地の適宜乾燥を可能とした。すなわち、水蒸気の化学的最適反応場を選択的に創出できることを立証とした。

$ ^{*1} $ 蒸気飽和度 (%)

{蒸氨密度 $ (\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}) $ / 饱和水蒸氨密度 $ (\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}) $ } × 100

図.6 プロトタイプの制御盤表示部
図.7 プロトタイプの圧力挙動

図.8 プロトタイプの流量挙動
## 最適条件の考察(温度挙動)

図.9 プロトタイプの温度挙動

図.6 に示すように、本プロトタイプの制御盤表示部により、蒸気供給部の温度・圧力・制御状況、ジャケット内部の温度（上部・中間部・下部）・圧力・流量、リアクター内部の温度（上部・中間部・下部）・圧力・流量、および蒸気排出部の温度・圧力・制御状況を適時表示し記録できる。

本プロトタイプの圧力拳動、流量拳動、および温度拳動をそれぞれ図.6、図.7、および図.8に示す。

温度、圧力拳動よりジャケット内部、およびリアクター内部の水の状態が判ることは言うまでもない。

すなわち、リアクター内部の圧力制御 0.17 MPa（飽和水蒸気温度 130℃）に対して、リアクター下部はその設定圧力に対する飽和水蒸気の温度より若干低い 128℃で推移している。したがって液相である加圧熱水の状態で廃きのこ培地の腐敗物質の分解除去、および培地木質成分のリグニンを適度に分解し結果としてきのこの菌糸および子実体の基となる生育成分の吸収取り込みをしやすくしている。一方で、リアクター中間部はその設定圧力に対する飽和水蒸気の温度より高い 160℃で推移している。したがって気相である乾燥水蒸気の状態で廃きのこ培地より腐敗物質を抽出し、および乾燥している。同様に、リアクター上部はその設定圧力に対する飽和水蒸気の温度と同じ 130℃で推移している。したがって気相一液相の混在する飽和水蒸気の状態で木質成分の分解、および廃きのこ培地の腐敗物質の分解を行い同時にそれらを抽出し、および適宜乾燥している。リアクター内部の温度はリアクター内部温度より高く設定したジャケットの温度の影響を受けリアクター内部の上部の方がより温度が高くなる（昇温工程）が、反応工程においては中間部と上部の温度は逆転している。これはまさしく廃培地から水分を抽出する（乾燥する）時に発生する蒸発潜熱の影響である。このようにリアクター内部ではこれらの廃きのこ培地の腐敗成分あるいは生育阻害物質の分解、および木質成分の分解、そしてそれらの抽出除去、および乾燥脱水が一つの工程において行われていることを見事に立証している。
Soft-hydrothermal processing

### 2.3 栽培実証による収穫量・品質の立証

申請者らは、上述のプロトタイプにより再生処理した廃きのこ培地によりきのこの実証栽培を実施し、次の項目でその栽培実証により収穫量・品質を立証した。

実証栽培に用いたきのこの種類は菌床栽培きのこの中でも一番栽培が難しいといわれるブナシメジにおいて、最初に小ロッド（24本入りコンテナ数コンテナ程度）で実証栽培を行い、そのきのこの収穫量、および品質を確認し、小型実証機（φ400×L865 mm、処理能力10 kg/batch）の再現性を実証した上で、実用規模の1釜単位（16,000本/1釜）にて実証栽培を行った。

また、実用規模の実証栽培はエノキタケにおいても実施した。

1）ブナシメジ廃培地再生培地50%代用による小ロット実証栽培（図10-1から3、図11）

- 収穫量、品質、培養日数とも通常-培地の有意差ないこと、使用済み培地では栽培できないことを確認。

(2) ブナシメジ廃培地再生培地 50%、60%、70% 代用による小ロット実証栽培（図 12、図 13）

- 収穫量、品質、培養日数とも通常-培地の有意差ないこと、使用済み培地では栽培できないことを確認。

(3) ブナシメジ廃培地再生培地 50%代用によるエノキタケ小ロット実証栽培（図 14）

- 収穫量、品質、培養日数とも通常-培地の有意差ないこと、使用済み培地では栽培できないことを確認。

(4) ソフト水熱プロセスオガコ改質処理

- 収穫量、品質、培養日数とも通常-培地の有意差ないこと、廃培地では栽培できないことを確認。

- ネカシの必要性は木質由来の阻害物質の存在によると考えられる。

(5) 第1回、第2回ブナシメジ廃培地再生培地50％代用による）一釜単位-16,000本実用規模の実証栽培（図15）

-収穫量、品質、培養日数とも通常培地の有意差ないことを確認。

(6) 第3回、第4回ブナシメジ実規模実証栽培（図16）-収穫量5-10%減 $ ^{†} $ 。

(7) 第5回ブナシメジ実規模実証栽培。新調合（コーンコブ100%）ブナシメジ培地（図17、図18）-品質良好、収量は5%増収、培養日数過多。

(8) 新調合（コーンコブ 100%）ブナシメジ培地の小ロッド栽培 - コントロールと有意差なし。

(9) 栄養剤無添加ブナシメジ培地実証栽培-収穫量減（参考実験）。

(10)第1回エノキタケ培地実規模実証栽培

- 吸穫量 5-10%減 $ ^{*} $ 。

(11)第2回エノキタケ培地実規模実証栽培（図19）

-コントロールと有意差なし。

注記 $ ^{†} $ ， $ ^{‡} $ ：小型実証機より130℃-30分処理条件が閾値として再生処理を行ったが、後述（2.4 化学成分分析により再生メカニズムを解明）の化学的検証より140℃-30分処理に変更した。また、処理条件変更に対する費用の増加もランニングコスト費用効果にて分析している。
ブナシメジ培養状況 2013年4月23日種菌接種 2013年6月14日現在接種後52日

通常培地

control (+)

菌廻り良好

ソフト水熱プロセス再生

培地(50%代用)

実験区

菌廻り良好

廃きのこ培地

Control (-)

菌廻りにムラが出てきている

図. 10-1 ブナシメジ廃培地再生培地 50%代用による小ロット実証栽培（培養・菌廻り）

ブナシメジ培養状況 2013年4月23日種菌接種 2013年7月5日現在接種後70日(菌掻き後10日)

通常培地

子実体原基良好

ソフト水熱プロセス再生

培地(50%代用)

子実体原基良好

廃きのこ培地

子実体原基液体発生

図.10-2 ブナシメジ廃培地再生培地50%代用による小ロット実証栽培（芽ぶき）
ブナシメジ培養状況 2013年4月23日種菌接種 2013年7月13日現在接種後77日(菌掻き後17日)

通常培地

子美体良好

ソフト水熱プロセス再生

培地(50%代用)

子実体良好

使用済み培地

子実体生育ムラ、不良

図. 10-3 ブナシメジ廃培地再生培地 50%代用による小ロット実証栽培（生育） ブナシメジ培養状況

通常培地

子実体良好

ソフト水熱プロセス再生 培地(50%代用) 子実体良好

廃きのこ培地

子実体生育ムラ、不良

図. 10-4 ブナシメジ廃培地再生培地 50%代用による小ロット実証栽培（生育）
ソフト水熱プロセス再生培地栽培実証

図.11 ブナシメジ廃培地再生培地 50％代用による小ロット実証栽培 子実体重量推移

ブナシメジ栽培状況

2013年4月23日種菌接種 2013年7月16日現在接種後81日(菌搔き後21日)

ソフト水熱プロセス再生培地(60%代用)

ソフト水熱プロセス再生培地

(50％代用)

ソフト水熱プロセス再生培地

(70%代用)

図.12 ブナシメジ廃培地再生培地50%、60%、70%代用による小ロット実証栽培
図. 13 ブナシメジ廃培地再生培地 50%、60%、70%代用による小ロット実証栽培収穫量

ソフト水熱プロセス再生処理培地 50%、60%、70%代用ともに子実体収穫量は通常培地と有意差無い。

エノキタケ培養状況2013年5月16日種菌接種 2013年7月11日収穫(接種後55日)

ソフト水熱プロセス再生

培地(50%代用)

通常培地では各瓶で生育が不均一であるが、「ブナシメジ使用済み培地のソフト水熱プロセス再生処理培地」では各瓶共に生育がほぼ均一でいずれも良好に成長している。すなわち、通常培地中の生育阻害物質を排除して培地としての品質を向上させるだけでなく、さらに培地の均質性も向上させる。

ソフト水熱プロセス再生培地(50%代用)

図. 14 ブナシメジ廃培地再生培地 50%代用によるエノキタケ小ロット実証栽培
ブナシメジソフト水熱オガコ50%・コーン50%代替試験-実用規模：16,000本/1釜-第1、2回

菌系	ON-2G
水分	67.7%
pH	5.7
培養日数	60日
接種日	2013年7月6日
菌搔き日	2013年9月4日
收穫日	2013年9月25日·26日

シンシア試験栽培

収 量	ソフト水熱	コントロール
生育22日目	196.8	203.7
生育23日目	187.7	201.7
平 均	192.3	202.7

JA中野市種菌センター試験栽培

収 量	ソフト水熱	コントロール
生育23日目	199.9	195.1
生育24日目	204.1	204.3
平 均	202.0	199.7

図.15 第1回ブナシメジ廃培地再生培地一釜単位-16,000 本実用規模の実証栽培

ソフト水熱	対照
培養日数	70日	67日
発生日数	23~	22~23
収量	179.1	203.1
STDEV	16.5	17.8
201g以上	8.7%	55.5%
181~200g	32.2%	36.2%
151~180g	53.9%	7.1%
150g以下	2.2%	0.4%

左:ソフト水熱 右:対照

ソフト水熱	対照
培養日数	70日	67日
発生日数	24~	23~
収量	203.4	222.6
STDEV	17.5	19.4
201g以上	58.2%	88.5%
181~200g	34.7%	9.5%
151~180g	5.6%	1.5%
150g以下	0.8%	0.3%

左:ソフト水熱 右:対照

図.16 第3,4回ブナシメジ廃培地再生培地一釜単位-16,000本実用規模の実証栽培
ソフト水熱	対照
培養日数	74日	56日
菌搔日	10月10日	10月10日
収穫日	10月31日	10月31日
発生日数	22~	22~
収量	211.3	200.9
STDEV	17.7	20.3
収穫株数	15254.0	24652.0
201g以上	75.4%	53.8%
181~200g	20.4%	31.8%
151~180g	3.5%	11.5%
150g以下	0.3%	1.7%
種菌C生育試験結果
ソフト水熱	対照
培養日数	74日	56日
菌搔日	10月10日	10月10日
収穫日	10月31日	10月31日
発生日数	23~	23~
収量	227.6	215.1
STDEV	10.0	11.0

左:清水製粉 右:対照

左:清水製粉 右:対照

図.17 第5回ブナシメジ実規模実証栽培-新調合（コーンコブ100%）ブナシメジ培地-一釜単位-16,000本実用規模の実証栽培

図.18 第5回ブナシメジ実規模実証栽培の収穫量の分布
収穫ラインデータ(エノキタケ)
ソフト水熱培地	同日収穫
総数	計量数	A品率	収量(g)	総数	計量数	A品率	収量(g)
2014年8月7日	11,477	2,499	78.20%	208.8	2014年8月7日	472	69	85.4%	209.2
25,268	4,265	83.1%	211.3
7,291	403	94.5%	215.7
平均	87.7%	212.1

総数	計量数	A品率	収量(g)	総数	計量数	A品率	収量(g)
2014年8月8日	4,726	82	98.30%	224.1	2014年8月7日	17,478	3,609	79.4%	210
40,567	6,468	84.1%	211.3
平均	81.8%	210.6
研究収穫分(2コンテナ)
ソフト水熱培地
総数	計量数	A品率	収量(g)	総数	計量数	A品率	収量(g)
2014年8月6日	18	0	100.00%	213.5	2014年8月6日	0	0	-	-
2014年8月7日	18	0	100.00%	220.9	2014年8月7日	0	0	-	-
2014年8月8日	12	0	100.00%	222.4	2014年8月8日	2	0	100.00%	209.5
2014年8月9日	1	0	100.00%	248.0	2014年8月9日	21	0	100.00%	216.0
2014年8月10日	0	0	-	-	2014年8月10日	19	0	100.00%	223.2
2014年8月11日	0	0	-	-	2014年8月11日	5	0	100.00%	217.4
平均	226.2	平均	216.5

図.19 第2回エノキタケ培地実規模実証栽培

ブナシメジ新調合培地（コーンコブ100%）の導入、および既存培地でのブナシメジの第3-4回実証栽培で通常培地より5-10%収穫量が少ないことより、次項「2.4化学成分分析により再生メカニズムを解明」の化学的裏付けに基づき再生処理条件を130℃-30分から140℃-30に改善することにより、第5回実証栽培で収量品質も良好なことを立証した（図.17、図.18）。

これらのソフト水熱プロセスきのこ廃培地再生処理技術による実用規模での実証栽培できのこの収穫量、および品質を実証したことはこれまでに研究例の類がなく、正しく世界初の実証と言える。

### 2.4 化学成分分析による再生メカニズムの解明

菌床きのこ栽培のメカニズムは未だに判っていない。

これまで経験的に廃培地の使い廻しができないことは知られていた。ましてや再生培地を再利用して使うことは、これまで多くのものにより試行錯誤されてきたが誰一人として成功しなかった。そして、膨大な量の廃培地は再利用もできず、またほかの用途への利活用も進んでいない。

申請者らは菌床栽培きのこの通常培地、廃培地、および精製培地の化学成分分析により世界で初めて廃きのこ培地再生処理のメカニズムを解明した。

申請者らは、前述したように $ 150^{\circ} $ C 以下ないし $ 200^{\circ} $ C 以下の非常にマイルドな水熱プロセス（以下、ソフト水熱プロセスと記す）を用いてきのこ廃培地の再生処理に成功し、その再生培地による実用規模での祭場実証にも成功している。廃きのこ培地の再生処理、利活用が進んでいないこのような背景において、上述のソフト水熱プロセス実証機による実証栽培、すなわち実用規模で確かに廃培地が再生培地として通常品質、収穫量できのこ栽培できたことは正しくエポックメーキングである。

申請者らは長野工業技術総合センター材料技術部門（GC/MS）、同食品技術部門（HPLC）、近畿大学農学部応用生命化学科、および独立行政法人海洋研究開発機構と連携して、木質由来、あるいは栄養添加物
## Soft-hydrothermal processing

由来の生育阻害物質の検証、生物由来の生育阻害物質の検証、および通常培地、廃培地および再生培地の化学成分分析により世界で初めてブナシメジ、エノキタケ廃培地の再生メカニズムを示唆した。

2.4.1 ブナシメジ培地の成分分析 申請者らは、ブナシメジ廃培地および条件の異なるソフト水熱プロセスによって再生させた培地、未使用培地から得られた温水可溶性画分を LC/MS 分析に供した。得られた網羅的 MS ピークデータのプロファイルを得るために多変量解析の一手法である主成分分析（PCA）およびクラスター解析を行った。LC/MS 分析では、Negative と Positive の両モードで分析・検出を行い、得られた網羅的質量分析データに対し、主成分分析およびクラスター解析によるグルーピング、各グループに特徴的なイオンピーク（マーカー）の抽出およびそれらの組成式、構造式の推定を行った。併せて上記統計解析によって抽出されたマーカーの定量解析を行った。

その結果、ソフト水熱プロセスの処理強度によって各サンプルの成分が連続的に変化していく傾向が見出された。NegativeとPositiveモード各MS測定における固有マーカー候補が検出された。また両モードに共通する分子量を持つピークも含まれていた。また、各モードで検出されたマーカー候補すべてについて処理による変化をグラフ化するとともに、NegativeとPositive両モードに共通して検出された固有マーカー候補についてその組成の解析を試みた。それぞれのマーカーについてヒットした組成式から構造を検索したところ、きのこ栽培により減少しソフト水熱処理によって再生した成分ではバニリンやフェルラ酸、シナピン酸に良く似た構造の物質が見出された。また、きのこ栽培により減少しソフト水熱処理でも再生しなかった成分の検索結果は主に脂肪酸であった。

これらのマーカー分子の変化を指標にすることにより、キノコの増殖、ソフト水熱処理によって生じるバイオマスの変化を特徴づけることができる可能性が示唆された。

## 测定条件：

サンプル調製

未接種培地、廃培地、およびソフト水熱処理した各サンプル（下表）を90℃で6時間乾燥後パウダー状に粉砕、10倍量のMQ水を加えて60℃で3時間静置することにより温水抽出した。これを8000rpmで5分間遠心分離し、上澄を固相抽出カラム（OASIS WAX: waters 社製）で前処理後、溶離液を窒素乾固し、20%のアセトニトリル水溶液に再度溶解し、下記条件でLC/MS分析に供した。

LC/MS 条件

移動層 A 液：2mM 酢酸アンモニウム、0.05% ギ酸 B 液：95% アセトニトリル

分析カラム 逆相モード ACQUITY UPLC C18 1.7μm

検出 飛行型精密質量分析装置 Xevo G2 Qtof ESI Negative/Positive モード

測定用サンプル名/解析用サンプル名：

処理前(廃培地)	30分処理	60分処理
10/23付 未接種培地	1/NEW(通常培地)	-	-
10/15付 (120℃処理)	2/120-0	3/120-30	4/120-60
10/15付 (130℃処理)	5/130-0	6/130-30	7/130-60
10/15付 (140℃処理)	13/140-0	8/140-30	9/140-60
10/15付 (150℃処理)	10/150-0	11/150-30	12/150-60
# LC/MS ソフト水熱処理比較(120℃) (Negative mode)

LC/MS ソフト水熱処理比較(130℃) (Negative mode)
# LC/MS ソフト水熱処理比較(140℃) (Negative mode)

# LC/MS ソフト水熱処理比較(150℃) (Negative mode)
図. 21 S-plot 両端のピークを解析 (Negative mode)-ソフト水熱処理培地と廃培地の比較-

図. 20 主成分分析とクラスター解析に基づき 3 グループに分けて比較(Negative mode)

2.4.1.1 ブナシメジ培地の成分分析 再生培地と廃培地

※ 信頼性の高い方から2.5％のピークをマーカー候補として抽出した。

「未接種培地」「廃培地」「ソフト水熱処理培地」に属する検体をローディングプロットで比較、S-plotによる可視化をした後に各グループに特徴的な固有MSピークを相関確率pcorr；p＞0.975で抽出した。
## Soft-hydrothermal processing

再生培地側で抽出したマーカーについては、ネガとポジ多量成分の構造検索結果の両方で一致したピーク（赤文字）についてさらに解析を進めた（表2(1)，(2)～表5参照）。また、廃培地側マーカーについては、全抽出ピーク（緑網掛け）についてさらに解析を進めた（表6～表13参照）。

表.1 マーカー候補(Negative mode)

-再生培地（ソフト水熱プロセス）と廃培地の比較-

再生培地側	廃培地側
Selected Peak	Retention Time (min)	Measured MW (m/z)	Retention Time (min)	Measured MW (m/z)
1	2.7458	135.0445	2.4871	281.1385
2	3.2818	163.0395	2.6786	327.1444
3	2.7632	151.0394	4.5135	521.3473
4	2.6828	163.0393	3.8089	509.3474
5	2.1717	165.0184	3.6491	537.3413
6	2.4027	167.0342	4.1308	523.3632
7	3.1175	177.0548
8	2.8489	179.0341
9	3.3753	193.05
10	2.4494	197.0447
11	2.6303	209.0451
12	2.6512	225.04
13	3.4029	223.0612
14	2.493	237.0762
15	2.6052	237.0763
16	2.3209	261.0876
17	2.7114	267.0866
18	3.7327	343.0822

表.2(1) 再生培地マーカー候補の構造検索結果 (Nega, Posi に共通の成分)

Selected Peak	Retention Time(min)	Measured m/z	Possible Elemental Composition (Mass difference/mDa)	Hit compound searched by measured mass	Possible structure
3	2.7632	151.0394	(1)	C8H7O3 (-0.1)	(1)	(4-Hydroxyphenyl)acetic acid
(2)	C6H8O3Na (2.3)	(2)	Hydroxy(phenyl)acetic acid
(3)	C4H3N6O (2.6)	(3)	3-Hydroxyphenyl acetate
7	3.1175	177.0548	(1)	C10H9O3 (-0.4)	(1)	(Dimethylamino)methyl dimethylcarbamodithioate
(2)	C5H9N2O5 (3.7)	(2)	Diethyl fluoromalonate
(3)	C8H10O3Na (2.0)	(3)	Ethyl oxo(phenyl)acetate
表.2(2) 再生培地マーカー候補の構造検索結果 (Nega, Posi に共通の成分)

Selected Peak	Retention Time(min)	Measured m/z	Possible Elemental Composition (Mass difference/mDa)	Hit compound searched by measured mass	Possible structure
15	2.6052	237.0763	(1)	C12H13O5 (0.0)	(1)	1,8-Diamino-9,10-anthraquinone	\(\ce{C6H5CH2CH2CH2CH2

これらの解析は、抽出したピークに対し、精密分子量、同位体比を基に元素組成推定を行うとともに、ChemSpider化合物データベースを対象とした検索を行った。またさらに、抽出したMSピークに対しMSクロマト面積値を基に各サンプルの定量解析を行った。一部のピークを対象としたMSMS分析を行い、標準品とのMSスペクトルフラグメントパターンの比較を行った。

表.3 再生培地マーカー候補の構造検索結果（151.0394 m/z）

Fragment Pattern 解析 151.0394m/z Mass differenceの小さい組成式 C8H7O3 について
Possible structure	daughter	intensity	mass	rank	mass error	bonds	h	score	formula	formula diff
H3C	152.0439	641	152.0473	1	-3.4	0	2	0	C8H8O3	none
151.0397	8174	151.0395	1	0.2	0	1	0	C8H7O3	none
137.0194	908	137.0239	1	-4.5	1	2	0.5	C7H5O3	CH2
136.0159	7565	136.016	1	-0.1	1	1	0.5	C7H4O3	CH3
135.0469	677	135.0446	1	2.3	1	1	2	C8H7O2	0

Possible structure	daughter	intensity	mass	rank	mass error	bonds	h	score	formula	formula diff
HO	152.0439	641	152.0473	1	-3.4	0	2	0	C8H8O3	none
151.0397	8174	151.0395	1	0.2	0	1	0	C8H7O3	none
135.0469	677	135.0446	1	2.3	1	2	0.5	C8H7O2	0
135.0469	677	135.0446	2	2.3	1	1	2	C8H7O2	0

Possible structure	daughter	intensity	mass	rank	mass error	bonds	h	score	formula	formula diff
OH	152.0439	641	152.0473	1	-3.4	0	2	0	C8H8O3	none
151.0397	8174	151.0395	1	0.2	0	1	0	C8H7O3	none
135.0469	677	135.0446	1	2.3	1	2	0.5	C8H7O2	0
135.0469	677	135.0446	2	2.3	1	2	0.5	C8H7O2	0
135.0469	677	135.0446	3	2.3	1	1	2	C8H7O2	0
表.4 再生培地マーカー候補の構造検索結果（177.0548 m/z）

Fragment Pattern 解析 177.0548m/z Mass differenceの小さい組成式 C10H9O3 について

Possible structure	daughter	intensity	mass	rank	mass error	bonds	h	score	formula	formula diff
HO	177.0549	20042	177.0552	1	-0.3	0	1	0	C10H9O3	none
162.0315	18783	162.0317	1	-0.2	1	1	0.5	C9H6O3	CH3

Possible structure	daughter	intensity	mass	rank	mass error	bonds	h	score	formula	formula diff
OH	177.0549	20042	177.0552	1	-0.3	0	1	0	C10H9O3	none

Possible structure	daughter	intensity	mass	rank	mass error	bonds	h	score	formula	formula diff
CH3	177.0549	20042	177.0552	1	-0.3	0	1	0	C10H9O3	none
162.0315	18783	162.0317	1	-0.2	1	1	1	C9H6O3	CH3

表.5 再生培地マーカー候補の構造検索結果（237.0763 m/z）

Fragment Pattern 解析 237.0763m/z Mass differenceの小さい組成式 C12H13O5 について

Possible structure	daughter	intensity	mass	rank	mass error	bonds	h	score	formula	formula diff
H3C	238.0791	54468	238.0841	1	-5	0	2	0	C12H14O5	none
237.0759	388685	237.0763	1	-0.4	0	1	0	C12H13O5	none
164.0424	3996	164.0473	1	-4.9	3	3	2	C9H8O3	C3H5O2
164.0424	3996	164.0473	2	-4.9	3	3	2	C9H8O3	C3H5O2
163.039	39439	163.0395	1	-0.5	3	2	2	C9H7O3	C3H6O2
163.039	39439	163.0395	2	-0.5	3	2	2	C9H7O3	C3H6O2
Possible structure	daughter	intensity	mass	rank	mass error	bonds	h	score	formula	formula diff
H3C	238.0791	54468	238.0841	1	-5	0	2	0	C12H14O5	none
237.0759	388685	237.0763	1	-0.4	0	1	0	C12H13O5	none
164.0424	3996	164.0473	1	-4.9	3	3	2	C9H8O3	C3H5O2
164.0424	3996	164.0473	2	-4.9	3	3	2	C9H8O3	C3H5O2
164.0424	3996	164.0473	3	-4.9	3	3	2	C9H8O3	C3H5O2
164.0424	3996	164.0473	4	-4.9	3	3	2	C9H8O3	C3H5O2
164.0424	3996	164.0473	5	-4.9	3	3	2	C9H8O3	C3H5O2
164.0424	3996	164.0473	6	-4.9	3	3	2	C9H8O3	C3H5O2
164.0424	3996	164.0473	7	-4.9	3	3	2	C9H8O3	C3H5O2
164.0424	3996	164.0473	8	-4.9	3	3	2	C9H8O3	C3H5O2
164.0424	3996	164.0473	9	-4.9	3	3	2	C9H8O3	C3H5O2
164.0424	3996	164.0473	10	-0.5	3	2	2	C9H7O3	C3H6O2
163.039	39439	163.0395	1	-0.5	3	2	2	C9H7O3	C3H6O2
163.039	39439	163.0395	2	-0.5	3	2	2	C9H7O3	C3H6O2
163.039	39439	163.0395	3	-0.5	3	2	2	C9H7O3	C3H6O2
表.6 廃培地マーカー候補の構造検索結果 $ ^{①} $

廃培地側マーカー候補の構造検索結果 $ ^{①} $

Selected Peak	Retention Time(min)	Measured m/z	Possible Elemental Composition (Mass difference/mDa)	Hit compound searched by measured mass	Possible structure
1	2.4871	281.1385	(1)	C12H25O5S (-3.8)	(1)	1,2,3,4-Tetrahydrobenzo[k]tetraphene
(2)	C8H21N6O3S (-1.1)	(2)	3-Fluoro-9-[2-(1-pyrrolidinyl)ethyl]-9H-carbazole
(3)	C15H21O5 (-0.4)	(3)	(3S)-2,3-Dimethyl-6-nitro-4-phenyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline
2	2.6786	327.1444	(1)	C9H23N6O5S (-0.7)	(1)	3-(2-Methoxy-10H-phenothiazin-10-yl)-N,N,2-trimethyl-1-propanamine
(2)	C13H27O7S (-3.3)	(2)	5-[2-Hydroxy-3-[(2-methyl-2-propanyl)amino]propoxy]-3,4-dihydro-2(1H)-quinolinone hydrochloride (1.1)
(3)	C16H23O7 (0.0)	(3)	N,N'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenyldiyl)diacetamide

表.7 廃培地マーカー候補の構造検索結果②

廃培地側マーカー候補の構造検索結果 $ ^{②} $

Selected Peak	Retention Time(min)	Measured m/z	Possible Elemental Composition (Mass difference/mDa)	Hit compound searched by measured mass	Possible structure
3	4.5135	521.3473	(1)	C30H49O7 (-0.5)	(1)	4,4',4''-(1,3,5-Triazine-2,4,6-triyl)tris(N,N-diethylaniline)
(2)	C24H45N10OS (-2.6)	(2)	N,N'-Bis[3-(triethoxysilyl)propyl]-1,2-cyclohexanediamine
(3)	C26H50N4O3NaS (-2.8)	(3)	(6aR,10aR)-3-(6-Cyano-2-methyl-2-hexanyl)-6,6,9-trimethyl-6a,7,10,10a-tetrahydro-6H-benzo[c]chromen-1-yl 4-(4-morpholinyl)butanoate
4	3.8089	509.3474	(1)	C23H45N10OS (-2.5)	(1)	2,5,7,8-Tetramethyl-2-(4,8,12-trimethyltridecyl)-3,4-dihydro-2H-chromen-6-yl dihydrogen phosphate
(2)	C25H50N4O3NaS (-2.7)	(2)	N-[(1-Tridecanoyl-2-piperidinyl)methyl] lysinamide dihydrochloride	No Result
(3)	C33H49O2S (2.1)	(3)	N-[1-Hydroxy-3-(4-morpholinyl)-1-phenyl-2-propanyl]hexadecanamide hydrochloride (1:1)
表.8 廃培地マーカー候補の構造検索結果③

廃培地側マーカー候補の構造検索結果 $ ^{③} $

Selected Peak	Retention Time(min)	Measured m/z	Possible Elemental Composition (Mass difference/mDa)	Hit compound searched by measured mass	Possible structure
5	3.6491	537.3413	(1)	C25H50N6ONaS2 (2.8)	(1)	(11E,13E)-6-(4,5-dihydroxy-4,6-dimethyl-tetrahydropyran-2-yl)oxy-7,16-diethyl-4-hydroxy-5,9,13,15-tetramethyl-1-oxacyclohexadeca-11,13-diene-2,10-dione
(2)	C26H53N2O5S2 (1.7)	(2)	No Result
(3)	C27H49N6OS2 (0.4)	(3)	No Result
6	4.1308	523.3632	(1)	C26H47N6O5 (2.4)	(1)	No Result
(2)	C28H52O7Na (2.1)	(2)	No Result
(3)	C29H48N4O3Na(0.8)	(3)	No Result

表.9 廃培地マーカー候補の構造検索結果（281.1385 m/z）

Fragment Pattern 解析 281.1385m/z Mass differenceの小さい組成式 C15H21O5について

Possible structure	daughter	intensity	mass	rank	mass error	bonds	h	score	formula	formula diff
281.1391	33162	281.1389	1	0.2	0	2	0	C15H21O5	none

Possible structure	daughter	intensity	mass	rank	mass error	bonds	h	score	formula	formula diff
281.1391	33162	281.1389	1	0.2	0	2	0	C15H21O5	none
163.1128	1895	163.1123	1	0.5	3	2	2	C11H15O1	C4H5O4

Possible structure	daughter	intensity	mass	rank	mass error	bonds	h	score	formula	formula diff
282.1412	5296	282.1467	1	-5.5	0	2	0	C15H22O5	none
281.1391	33162	281.1389	1	0.2	0	1	0	C15H21O5	none