Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
図(2)-10 遺伝子 DMR のメチル化インプリントの解析

## 2 ）卵子型インプリント遺伝子の DNA メチル化の解析

次に、卵子型インプリント遺伝子の19領域（DIRAS3, NAP1L5, FAM50B, ZAC（PLAGL1）, GRB10, PEG10, PEG1（MEST）, INPP5F-v2, LIT1（KCNQ1OT1）, RB1, SNRPN, ZNF597, ZNF331, PEG3, PSIMCT-1, NNAT, L3MBTL, NESPAS, GNAS1A）について、DNA メチル化の解析をおこなった。全体でメチル化異常は197例中43例で21.8%であった。その内訳は、図(2)-11右にまとめた。もっとも異常の頻度が高い領域は、PEG3（9.8%）、ついでGRB10（8.8%）、NESPAS（7.2%）であった（図(2)-11右）。また、異常なメチル化パターンを示す43例中20例は、複数のインプリント領域の異常であった。また、19例は、精子型インプリントと卵子型インプリントの両方の異常がみられた。

図(2)-11 精子のメチル化異常の頻度
## 3 ）非インプリント遺伝子の DNA メチル化の解析

精子の DNA メチル化異常が、インプリント遺伝子に特異的であるのか、あるいはゲノム全体のメチル化の異常であるのか検討した。インプリントを受けない反復配列（LINE1とAlu）について、DNA メチル化の解析をおこなった。これまでと同様に、COBRA 法とシークエンス法を用い、LINE1（413-bp、28 の CpG 部位）と Alu（152-bp、12 の CpG 部位）のメチル化について解析した。その結果、全ての症例で、これら反復配列領域のメチル化に有意な差は認められず、メチル化の異常はインプリント遺伝子に特有な現象と考えられた。

図(2)-12 メチル化異常と精子性状

## 4 ）メチル化インプリント異常の特徴

197 例の精子検体のうち、50 例（25.4%）で、1 遺伝子以上の DMR にメチル化異常が確認された（図(2)-11 左）。精子型インプリントの異常は 18%、卵子型は 82% であった（図(2)-11 右）。3 領域以上の DMR でメチル化異常を示す症例は 50 例中 18 例で、このうち乏精子症の症例は 14 例（77.8%）であった。

次に、メチル化異常と精液所見による精子性状との関連性について検討した。メチル化異常の頻度は、「重症型乏精子症」では74.0%（20/27）、「中等度乏精子症」では21.0%（8/38）、「正常精子」では16.7%（22/132）で、メチル化異常と精子濃度に負の相関が認められた（図(2)-12）。同様に、運動率を10%以下、10-40%、40%以上の3群に分類した場合、運動率とメチル化異常との間に負の相関を認めた。さらに奇形率を50%以下、50-65%、65%以上の3群に分類した場合、奇形率とメチル化異常の頻度の間に、正の相関を認めた。メチル化異常の有無と年齢およびBMIに相関は認めなかった。メチル化異常の程度について、「重症型乏精子症」、「中等度乏精子症」、「正常精子」について比較検討した。図(2)-13に示すように、精子所見はメチル化異常の程度にも相関することが示された。
図(2)-13 精子濃度とメチル化率分布

## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

ゲノムインプリンティング（遺伝子刷り込み）とは、特定の親由来の遺伝子が選択的に発現する現象である。哺乳類の場合、父親と母親から由来する一対のゲノムを持ち、通常は両者がともに発現する。ただし、いくつかの遺伝子では、父母のどちらか一方から受け継いだゲノムのみが発現し、機能的な差異を与えることが知られている。この遺伝子を「インプリント遺伝子」という。多くのインプリント遺伝子は胎児、胎盤の発育や神経の発達、行動に影響を及ぼすことが報告されている。

精子形成過程で獲得される精子型インプリント（父由来の遺伝子にメチル化がおこる）と卵子形成過程で獲得される卵子型インプリント（母由来の遺伝子にメチル化がおこる）の確立には、DNAの塩基配列に変化を与えることなく、世代ごとに新たにプログラムされるエピジェネティックな修飾が働き、配偶子の雄雌差を規定している。ほとんどのインプリント遺伝子には、対立遺伝子間でメチル化状態の異なる領域が存在し、ゲノムインプリント機構の重要な役割を担うと考えられている。従って、インプリント遺伝子におけるメチル化の異常は妊娠や出生にも重大な影響を及ぼす。

ART（体外受精などの生殖補助医療）出生児に、DNA のメチル化異常が原因と考えられる先天性疾病の発症頻度増が報告されている。ゲノムインプリントに関わる領域は精子型、卵子型あわせ22あり、我々は精子型インプリント2領域、卵子型インプリント5領域のメチル化異常を指摘し、先天性疾病との関係を報告した。また、ARTを希望する男性の精子の特定遺伝子メチル化異常とART出生児先天性疾病の相関も示唆している。一方、ARTを希望する男性の増加と先天性疾病出生児の増加により、安全なARTの実施が期待されており、
臨床現場での精子メチル化異常の確認のため、簡便かつ低価格な検査法開発が待望されている。精子のメチル化状態は生活環境や食物摂取に依存し変化することがあり、不妊症男性の精子のメチル化異常状態も変動があり、メチル化異常が顕著でなく通常男性の精子に近い時期もある。ARTを希望する男性に対し、この様なメチル化異常の少ない時期を選定し、ARTを行うことで、障害の無い出生児誕生の期待は高くなる。従来メチル化解析はバイサルファイトシーケンス法とCOBRA法が併用された。しかしこれらは煩雑な操作に加えて長時間を要し、結果解析に特殊技能を要求され、臨床診断レベルでの利用に適さない。従って、より簡便で低価格な方法が望まれている。そのため、新規メチル化解析法PCR-Luminex法は、科学的に有益で、臨床現場に即した技術となる。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

近年、ART 技術の進歩は著しく、我が国においても、不妊症のために子を持つことができない人々が子を持てる可能性が拡がってきており、ART は着実に広まっている。

患者の病態に応じた多様なART技術の開発が進み、従来から行われていた人工授精に加え、昭和58年には体外受精・胚移植による初めての出生例が、平成4年には顕微受精による初の出生例が、それぞれ報告されている。日本産科婦人科学会は、昭和61年から一定のARTについて実施機関の登録および実施例の報告制度を設け、報告の収集・分析結果を公表している。それによると、体外受精、顕微授精等による出生児数は年間2万人に達したとされており、少子化問題を抱える我が国においては、重要な人的資源を提供している。

一方で、ART を適正に実施するための制度が十分であるとは言えず、ART をめぐり発生する倫理上、健康上の様々な問題に対して適切な対応ができていないのが現状である。さらに、ART の多くは、医療保険が適用されていない自由診療であり、受診者は多額の費用を負担しなければならない。治療にかかる費用や期間に関しては、医療機関によって様々だが、体外授精の場合、1 回の治療にかかる費用は 20 万円から 40 万円程度であり、これを 5 回から 10 回行うという流れが一般的である。したがって、経済的理由により、途中で治療を諦めざるを得ないケースも多い。また、経済上の問題をクリアして ART に臨んだとしても、人工授精や体外受精の実施に伴う薬物療法による副作用や、出生した児の健康に問題があるなどのリスクは避けることはできない。

このような現状を打開し、不妊に悩む人々に対し、身体的、経済的負担の少ない、良質かつ適切な ART を実施するためには、医療保険の適用や公的な補助の対象として検討することはもちろん、現在の ART における技術的な問題をできるだけ排除し、短期間で成功率の高い、より安全な治療システムの構築が重要となる。本研究開発は、ART により出生した児の Beckwith-Wiedermann syndrome や Angelman syndrome など、本来稀なインプリンティング異常症の発症率が高い原因の一つとして報告されている、不妊精子のインプリンティング異常を調べるためのスクリーニング検査システムを構築することである。このスクリーニング検査
を実施することにより、ARTにおける遺伝的安全性は飛躍的に高まり、今後増加するART受診者に対し、より適切な処置を行うことが可能となる。加えて、精子の質を評価することが、人工授精や体外受精、顕微授精に踏み切るべきか否かの判断材料となり、先の見えない治療を長く続けるような身体的、精神的負担を軽減するための一助となる。また、この方法は、新生児のインプリンティング異常症のスクリーニングや次世代型の妊婦検診（母体血から胎児血を分離）、将来的には、成人における癌、精神病、アレルギー疾患など、広く検診に応用することも可能である。現在、ダウン症候群などの新生児の染色体異常を判定するための検査が実施されているものの、この確定診断には、乳児の染色体を検査する必要があり、両親は精神的な、児は採血による身体的な苦痛を伴う。これに対し、本検査は、不妊症検査のルーチンで行う精液検査（顕微鏡による数、運動、形態検査）後の本来破棄される精子を用いるため、受診者の肉体的負担は軽く、受け入れやすいものといえる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

1) H. Hiura, H. Okae, H. Kobayashi, N. Miyauchi, F. Sato, A. Sato, F. Suzuki, S. Nagase, J. Sugawara, K. Nakai, N. Yaegashi, and T. Arima: BMC Med Genomics, 5, 8 (2012)

"High-Throughput Detection of Aberrant Imprint Methylation in the Ovarian Cancer by the Bisulphite Pcr-Luminex Method"

<査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

（2）口頭発表（学会等）

特に記載すべき事項はない

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない
## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) M. A. Surani: Cell, 93, 309-312 (1998)

"Imprinting and the Initiation of Gene Silencing in the Germ Line"

2) S. M. Tilghman: Cell, 96, 185-193 (1999)

"The Sins of the Fathers and Mothers: Genomic Imprinting in Mammalian Development"

3) D. Lucifero, M. R. Mann, M. S. Bartolomei, and J. M. Trasler: Hum Mol Genet, 13, 839-849 (2004) "Gene-Specific Timing and Epigenetic Memory in Oocyte Imprinting"

4) Y. Obata, and T. Kono: J Biol Chem, 277, 5285-5289 (2002)

"Maternal Primary Imprinting Is Established at a Specific Time for Each Gene Throughout Oocyte Growth"

5) T. L. Davis, J. M. Trasler, S. B. Moss, G. J. Yang, and M. S. Bartolomei: Genomics, 58, 18-28 (1999) "Acquisition of the H19 Methylation Imprint Occurs Differentially on the Parental Alleles During Spermatogenesis"

6) T. L. Davis, G. J. Yang, J. R. McCarrey, and M. S. Bartolomei: Hum Mol Genet, 9, 2885-2894 (2000) "The H19 Methylation Imprint Is Erased and Re-Established Differentially on the Parental Alleles During Male Germ Cell Development"

7) T. Ueda, K. Abe, A. Miura, M. Yuzuriha, M. Zubair, M. Noguchi, K. Niwa, Y. Kawase, T. Kono, Y. Matsuda, H. Fujimoto, H. Shibata, Y. Hayashizaki, and H. Sasaki: Genes Cells, 5, 649-659 (2000) "The Paternal Methylation Imprint of the Mouse H19 Locus Is Acquired in the Gonocyte Stage During Foetal Testis Development"

8) J. Y. Li, D. J. Lees-Murdock, G. L. Xu, and C. P. Walsh: Genomics, 84, 952-960 (2004) "Timing of Establishment of Paternal Methylation Imprints in the Mouse"

9) H. D. Morgan, F. Santos, K. Green, W. Dean, and W. Reik: Hum Mol Genet, 14 Spec No 1, R47-58 (2005)

"Epigenetic Reprogramming in Mammals"

10) M. Paulsen, and A. C. Ferguson-Smith: J Pathol, 195, 97-110 (2001) "DNA Methylation in Genomic Imprinting, Development, and Disease"

11) M. R. DeBaun, E. L. Niemitz, and A. P. Feinberg: Am J Hum Genet, 72, 156-160 (2003) "Association of in Vitro Fertilization with Beckwith-Wiedemann Syndrome and Epigenetic Alterations of Lit1 and H19"

12) E. R. Maher, L. A. Brueton, S. C. Bowdin, A. Luharia, W. Cooper, T. R. Cole, F. Macdonald, J. R. Sampson, C. L. Barratt, W. Reik, and M. M. Hawkins: J Med Genet, 40, 62-64 (2003)

"Beckwith-Wiedemann Syndrome and Assisted Reproduction Technology (Art)"
13) G. R. Dohle, D. J. Halley, J. O. Van Hemel, A. M. van den Ouwel, M. H. Pieters, R. F. Weber, and L. C. Govaerts: Hum Reprod, 17, 13-16 (2002)

"Genetic Risk Factors in Infertile Men with Severe Oligozoospermia and Azoospermia"

14) S. Fernandes, K. Huellen, J. Goncalves, H. Dukal, J. Zeisler, E. Rajpert De Meyts, N. E. Skakkebaek, B. Habermann, W. Krause, M. Sousa, A. Barros, and P. H. Vogt: Mol Hum Reprod, 8, 286-298 (2002)

15) J. Gianotten, F. van der Veen, M. Alders, N. J. Leschot, M. W. Tanck, J. A. Land, J. A. Kremer, L. H. Hoefsloot, M. M. Mannens, M. P. Lombardi, and M. J. Hoffer: Mol Hum Reprod, 9, 587-592 (2003) "Chromosomal Region 11p15 Is Associated with Male Factor Subfertility"

16) J. Qiu: Nature, 441, 143-145 (2006)

"Epigenetics: Unfinished Symphony"

17) M. Manning, W. Lissens, W. Weidner, and I. Liebaers: Urol Int, 67, 151-155 (2001)

"DNA Methylation Analysis in Immature Testicular Sperm Cells at Different Developmental Stages"

18) A. Kerjean, J. M. Dupont, C. Vasseur, D. Le Tessier, L. Cuisset, A. Paldi, P. Jouannet, and M. Jeanpierre: Hum Mol Genet, 9, 2183-2187 (2000)

"Establishment of the Paternal Methylation Imprint of the Human H19 and Mest/Peg1 Genes During Spermatogenesis"

19) C. J. Marques, F. Carvalho, M. Sousa, and A. Barros: Lancet, 363, 1700-1702 (2004) "Genomic Imprinting in Disruptive Spermatogenesis"

20) S. Hartmann, M. Bergmann, R. M. Bohle, W. Weidner, and K. Steger: Mol Hum Reprod, 12, 407-411 (2006)

21) C. Ushijima, Y. Kumasako, P. E. Kihaile, K. Hirotsuru, and T. Utsunomiya: Hum Reprod, 15, 1107-1111 (2000)

"Analysis of Chromosomal Abnormalities in Human Spermatozoa Using Multi-Colour Fluorescence in-Situ Hybridization"

22) B. R. Bahnak, Q. Y. Wu, L. Coulombel, L. Drouet, D. Kerbiriou-Nabias, and D. Meyer: Nucleic Acids Res, 16, 1208 (1988)

"A Simple and Efficient Method for Isolating High Molecular Weight DNA from Mammalian Sperm"
(3) 環境化学物質の測定（末梢血および精漿）・網羅的 TOF-MS 解析に関する研究

（株）いであ・環境創造研究所 松村徹

平成 22～24 年度累計予算額：12,053 千円

（うち、平成24年度予算額：2,727千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

特定の化学物質をターゲットとしてあらかじめ選択し測定分析する方法では、（1）測定対象とする物質の存在量を精確に得ることが可能である、（2）測定対象として設定した化合物以外の存在量に関する情報は通常得られない、（3）測定対象とした化合物と調査したい事象の関係は（関係なしも含めて）わかるが、ターゲットとした化合物が原因かどうかは別問題である、（4）ターゲットの種類やその数によっては膨大な調査分析費用が必要である（例：30万円／検体×2,000人=6億円）、といった特徴が見られる。今回、特定の罹患等に関するグループを作成し、可能な限り多種の化学物質を測定分析するため、ガスクロマトグラフ（GC）（あるいは包括的ガスクロマトグラフ（GCxGC））-飛行時間型質量分析法（TOFMS）による血液中の化学物質分析手法の開発を行った。TOFMSは二重収束型質量分析に比較し、検出感度に劣るが、ターゲットとなる化学物質を決定可能であること、得られる情報量（質量数情報）が多い（約4GB／検体）である利点を有する。さらに、このTOF-MS法を用い、乏精子症患者と正常精子の血液の、脂溶性化学物質濃度の差を網羅的に解析し、有意な差の見られたPCB（ポリ塩化ビフェニル）については、個別に分析した。また、PCB異性体についても分析した。その結果、血中PCBと乏精子症との間に関連性が認められ、PCB異性体との間に高い関連性が示された。

## [キーワード]

脂溶性化学物质、稠羅的解析、2 次元 TOF-MS 法（GC/GCxGC-EI/CI-TOFMS）、PCB、

## PCB 異性体

### 1. はじめに

近年、生体試料中の化学物質の高感度分析法が進歩し、いくつかの化合物に関しては組織内濃度の測定が可能となった。そこで、本サブテーマでは、化学物質測定系としては脂溶性化学物質をターゲットに、飛行時間型質量分析計（TOFMS）に高分解能ガスクロマトグラフ（HRGC）あるいは包括的ガスクロマトグラフを組み合わせ網羅的な解析を行う。包括的ガスクロマトグラフとは、Comprehensive GC、GC x GC とも呼ばれる多次元 GC の一種である。1 次元 GC で分離不可能な化合物を 2 つ目のカラムに導入することによって GC 分離能を高める手法である。MS との組み合わせによって物質分離能を非常に高くすることが可能である。質量分解能の観点からは、二重収束型質量分析計（MS 分解能：10%谷で約 10000）との組合せも考えられるが、
本研究では質量走査速度を速く設定可能な TOFMS と組合せることとした（MS 分解能：半値幅で約 5000）。GCxGC は 2 つのカラムを連結する 2 次元構成とし、一定時間間隔にて低温モジュレーションすることにより GC 分離能を高める方法について検討した。図(3)-1 に GCxGC/TOFMS による網羅的脂溶性化学物質の測定の例を示す。また本方法を用いて、乏精子症患者と正常精子の血液の、脂溶性化学物質濃度の違いを網羅的に解析した。

リテンションタイム ( $ 2^{nd} $ カラム)

リテンションタイム (1^{st} カラム)

図(3)-1 GCxGC/TOF-MS による網羅的脂溶性化学物質の測定法（血液）

1）位置情報が判明している特定の脂溶性の有機化学物質（PCB、DDT、DDE、DDD、HCB 等）について、一度に解析できる。

2）同時に非特定化学物質についても、質量スペクトルライブラリーや標準品を用いて同定することが可能である。

3）比較対象群（試料）間において濃度差の検出された化合物を同定し、数値化する研究に適する。

## 2 ．研究開発目的

症例対照研究手法を用い、化学物質曝露との関連性を解析する。試料として、末梢血を用いた。化学物質としては脂溶性化学物質をターゲットとし、飛行時間型質量分析計（TOF-MS）に高分解能ガスクロマトグラフ（HRGC）あるいはGCxGCを組み合わせ網羅的な解析を行う。HRGC/TOFMSあるいはGCxGC/TOF-MSは多くの化合物の同時測定が可能であり、また、未知の化合物が検出されれば、測定後にその物質を同定可能な場合も多い。本研究では以下の項目について検討することを目的とした。研究体制を図(3)-2に示す。

①網羅的化学物質濃度測定系を確立すること
②乏精子症と正常精子患者の化学物質濃度を比較し、濃度差がみられる化学物質を明らかにすること

図(3)-2 研究体制

### 3. 研究開発方法

## （１）網羅的化学物質濃度測定系の確立

①GC-TOF-MS の各種設定条件を検討した。

②キャピラリーGC カラムを選定した。

(GCxGC においては、1st および 2nd カラムの組み合わせ)

③GC 分離条件を検討した。電子衝撃イオン化法（EI; Electron Ionization）及び負イオン化学イオン化法（NCI; Negative Chemical Ionization）の条件の検討も行った。

④存在が予期される化学物質の出現位置を確認した。

⑤実際の血液試料を測定（被験者検体ではない）した。

## （２）乏精子症と正常精子患者の化学質濃度の比較

乏精子症患者と正常精子の患者の血液を用い、網羅的に化学物質濃度について比較した。その結果、いくつかの化学物質に差が認められたが、PCBには特に有意な濃度差を認めたため、その異性体についても全例濃度分析を行った。

## 4 ．結果及び考察

## （１）網羅的化学物質濃度測定系の確立

①GC-EI-TOF-MS、GC-CI-TOF-MS、GCxGC-EI-TOF-MS、GCxGC-EI-TOF-MS の装置条件検討を行い、最適条件を得た。

②化学物質（主に PCB、多環芳香族、農薬、残留性有機汚染物質(POPs)）に関して①の手法における溶出位置アサインを行った。

④何種類かの GC カラム（GCxGC については 1st および 2nd カラムの組み合わせ）につい
て $ ^{①} $ および $ ^{②} $ の検討を行った。

④プールされていた血液 試料及び本研究における被験者試料を用い、上記検討結果から設計した方法を適用し測定分析を行った。その結果いくつかの化学物質が検出された（図(3)-3－図(3)-7 EI（Electron Ionization）法, NCI （Negative Chemical Ionization）法）。特に PCT （ポリ塩化ターフェニル）は PCB より高濃度で検出され、新知見を得た。

⑤ブランク試験ではほとんどの化合物は検出されず、試料採取から前処理における外部汚染は問題ないことを確認した（図(3)-8）。

⑥血液中の化学物質濃度は低く、データ取得が困難である。そのため、前処理工程を追加するか検討する（ただし、前処理を追加すれば測定溶液中に回収できる化合物種類は減少する）。特に NCI 法で検出可能なターゲットに絞るか検討が必要である。（PCB は把握しつつ、PCB 以外の化合物を多く定量したい）。

⑦未同定化合物の定量の精確さ向上をいかに行うか?

測定前に対象化合物が決まっていないので、同位体を事前に添加することができない。また、被験者間濃度レベルの差に対して必要な分析の精度（ばらつき）を把握しなければならない。

図(3)-3 血液試料 トータルイオンクロマトグラムの例

EI 法において検出されたほとんどの化合物は未同定（まだ報告されていない化合物であるという意味になる）横軸はリテンションタイム、縦軸は相対強度
図(3)-4 血液試料の測定分析例 (HCB)

図(3)-5 血液試料の測定分析例 (PCB)
図(3)-6 血液試料の測定分析例 (PCT)

図(3)-7 血液中のポリ塩素化ターフェニル（PCT）成分のスペクトル

標準物質での同定はまだであるが、スペクトル解析の結果から考えてほぼ間違いない。
図(3)-8 ブランク試験におけるトータルイオンクロマトグラム

## （２）乏精子症と正常精子患者血液を用いた網羅的化学物質濃度の比較

末梢血中の化学物質として、脂溶性化学物質をターゲットとし、飛行時間型質量分析計（TOFMS）に高分解能ガスクロマトグラフ（HRGC）あるいは包括的2次元ガスクロマトグラフ（Comprehensive GC:GCxGC）を組み合わせ網羅的な解析を行った。HRGC/TOFMSあるいはGCxGC/TOFMSは多くの化合物の同時測定が可能であり、また、未知の化合物が検出されれば、測定後にその物質を同定可能な場合も多い。症例と対照群の間で濃度差が見られる化学物質を明らかにした。その結果、多数の化学物質の同時検出に成功し、血液中で初めて検出された化合物も多かった（図(3)-1、図(3)-3－図(3)-6）。

現在確認された有機物を以下に示す。

ポリ塩化ビフェニル (PCB: polychirrinated biphenyl の内 3～10 塩化物)、HCB (hexachlorobenzen; ヘキサクロロベンゼン)、HCH (hexachlorocyclohexane; ヘキサクロロシクロヘキサン、DDE (dichloro-diphenyl-dichloroethylene; ジクロロジフェニルジクロロエチレン)、DDD (dichloro-diphenyl-dichloroethane; ジクロロジフェニルジクロロエタン)、DDT (dichloro-diphenyl-trichloroethane; ジクロロジフェニルトリクロロエタン, dichloro-diphenyl-trichloroethane)、ヘプタクロル (heptachlor)、クロルデン (Chlordane)、オキシクロルデン (oxychlordane)、ノナクロル (nonachlor)、トキサフェン (toxaphene)、マイレックス (mirex)、ポリ臭化ジフェニルエーテル (PBDE: polybrominated diphenyl ether の内 4～6 塩化物)、ポリ塩素化ターフェニル (PCT: polychlorinated terphenyl の内 8～11 塩化物)

これらの化合物の中から、比較的濃度が高い PCB を選択し、GC-EI-TOFMS にて測定を行った。PCB の測定値は正規分布をしないことも知られていることから、統計学的な解析では母集団の分布などに正規分布などのある特定の分布を仮定しない手法（ノンパラメトリックな方法）を用いるか、または PCB 濃度から 3 群に分割し解析を行った。以上の解析から血中 PCB と乏精子症との間に関連性が予想された（詳細は後述）ことから、PCB 異性体と精子数 x 運動率と
の関連性を検討した（図(3)-9）。運動精子数（精子数 x 運動率）との間に高い関連性が示されたのは PCB#118、#182+187、#180、#170 であったものの、PCB#74 を除きその他の異性体でも有意な関連性が示された。PCB 異性体同士の間でも高い関連性があり（データ示さず）、今回の解析結果から原因となる異性体を推定することは困難と考えられた。以上の結果から、血中 PCB 濃度が増加すると精子数 x 運動率などの指標が減少し、乏精子症の発生が増えることが示唆された。さらに、年齢、喫煙習慣などを調整して、次のサブテーマ 4 で検討した。

図(3)-9 血中 PCB と精子数 x 運動率の関連性

## (3) GC(GCxGC)-TOFMSによる取得データの例

生体試料にGC(GCxGC)-TOFMSを適用した報告例は極めて少ない。そこで、測定結果のアウトプットの例を図化していくつか示す。

図(3)-10は、GCxGC-EI-TOFMSによるトータルイオンクロマトグラム（TIC）で、1stカラム及び2ndカラムの軸は、それぞれのカラムにおけるリテンションタイム（溶出時間）を示す。高さ方向は各クロマトグラムピークのレスポンス（絶対量）を示す（レスポンスは、青→水色→黄色→赤の順に大きい）。従来のGCではカラム1本での測定となるので、本図において1stカラム軸側から水平に見た時の分離状況が従来のGC分離能となる。本測定結果から、高い分離能で多くの化学物質が検出されていることがわかる。本クロマトグラムは、トータルイオンクロマトグラム（TIC）であるので、1stカラム及び2ndカラムの個々の座標について質量数情報が存在する（データ量が多くなる理由）。個々のクロマトグラムピークの帰属を知るためには、標準品等を用いた同定作業が必要である。ほとんどのピークは未同定であることもあり、UCM（Unresolved complex mixture）と表現されることがある。

図(3)-11は、PCBの標準物質を用いて、クロマトグラム出現位置を確認した結果である(2次元表示)。トータルイオンクロマトグラム（TIC）上にアサインした化合物（PCB）を表示してある。また、図(3)-12はPOPs系化合物の標準物質を用いて、クロマトグラム出現位置を確認した結果である（2次元表示）。図(3)-12では、化合物以外の質量数の結果は、フィルタリングにより除いてある。
図(3)-13は標準物質による確認は終了していなが、マススペクトルパターン解析によって構造決定された化合物の例を示す。本研究において、2種類のリン系難燃剤、TCPP（Tris (2-Chloroisopropyl) Phosphate）及びTDCP Tris (1,3-dichloro-2-propyl) Phosphateが検出された。

図(3)-14はイオン化法の違いによる結果の比較を示す。GCxGCでは多くの化合物が気化されイオン化室に導入されるが、複数のイオン化法によって測定することにより、単独のイオン化法に比べて多くの化合物を測定することができる。図(3)-14は同じ試料をEI及びNCIによって測定した結果である。NCIにおいては多くのUCMがイオン化されていないことがわかる。PCB及びPCT等の塩素化合物においては、塩素数の増加に伴い、NCIによる感度がEIによる感度より良い傾向が見られた（低塩素側ではEIの方が感度は良かった）。

図(3)-15及び図(3)-16は、それぞれ正常精子群及び乏精子症群の被験者の血液を測定したクロマトグラムの一例である。POPs系化合物では、HCB、Trans-nonachlor及びp,p'-DDEが検出された。参考資料(4)-1-参考資料(4)-9に血液GCxGC測定結果を記載する。

図(3)-10 GCxGC-EI-TOFMS による血液試料中の化学物質測定トータルイオンクロマトグラム(TIC)
図(3)-11 GCxGC-EI-TOFMS による血液試料中の化学物質測定 3 次元クロマトグラム (PCB)

図(3)-12 GCxGC-EI-TOFMS による血液試料中の化学物質測定 3 次元クロマトグラム (POPs 系化合物)
図(3)-13 GCxGC-TOFMS による血液試料中の化学物質測定 2 および 3 次元クロマトグラムの例

図(3)-14 GCxGC-TOFMS による血液試料中の化学物質測定 ーイオン化方法の違いによるー
図(3)-15 GCxGC-TOFMS による血液試料中の化学物質測定 Sample-No.244 (正常精子群)

図(3)-16 GCxGC-TOFMS による血液試料中の化学物質測定 Sample-No.573 (乏精子症群)
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

本研究では、化学物質測定系としては脂溶性化学物質をターゲットに、飛行時間型質量分析計（TOFMS）に高分解能ガスクロマトグラフ（HRGC）あるいは包括的2次元ガスクロマトグラフ（Comprehensive GC:GCxGC）を組み合わせ網羅的な解析を行うことである。本法の開発は、不妊，特に男性不妊に関連する環境由来化学物質の関与について実証的なデータを提出することができる。不妊に関連する化学物質が明らかになった場合、そのリスク情報を提出する。また、包括的2次元TOFMS法による網羅的な化学物質の測定法は、他の生体試料にも適応が拡大できる。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

特定の化学物質の同定は、曝露回避に必要な行政的な基礎資料として、国民に提示することができ、このことにより、行政はリスク管理が可能となる。また、少子化対策、不妊娠治療の技術向上と医療行政に貢献できる。また、化学物質曝露回避のための食行動について、実証的なデータを添えて国民に提示可能となる。不妊娠および、成人男性への食育に有用な情報を提供できる。

## 6 ．国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

### 7. 研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない

## <査読付論文に準ずる成果発表>

特に記載すべき事項はない

くその他誌上発表（査読なし）>

特に記載すべき事項はない

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 松村 徹：第 22 回環境化学討論会（2013）

「GCxGC-TOF/MS を用いたヒト血液中の有機化学物質測定」
## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

## （４）シンポジウム、セミナーの開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

(6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

特に記載すべき事項はない
# (4) 症例対照試験の評価・解析とリスク要因の評価に関する研究

東北大学大学院 医学系研究科 有馬隆博・仲井邦彦

平成 22～24 年度累計予算額：423 千円

（うち、平成24年度予算額：205千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

本研究では、乏精子症の症例群と対照群の化学物質ばく露量と精子性状（精子形態学的およびエピゲノムによる質的評価）について、その関連性を多変量解析法で行った。その際、年令、喫煙、BMI、教育歴、栄養素、食物摂取頻度、生活習慣といった交絡要因について補正を行った。化学物質ばく露の評価は網羅的解析手法を応用したが、そのうちポリ塩化ビフェニル（PCB）に着目して解析を行った。

その結果、精子正常群と乏精子群では、乏精子群では喫煙するものが多く、年齢、BMI、教育歴に統計学的有意義な差は認められなかった。インプリント異常数は乏精子群でやや高い傾向が観察されたものの、統計学的に有意ではなかった。「インプリント異常」をインプリント異常が2つ以上観察された場合と定義した場合、精子正常群と乏精子群の分類との間に、有意ではないものの関連性（p=0.0667）が観察された。血中PCB濃度は、年齢、奇形率と正に関連し、精子数、運動率、精子数x運動率との間に負の関連性が示された。共変量として年齢と喫煙習慣（Model2）、年齢、喫煙習慣、教育歴（Model3）、年齢、喫煙習慣、教育歴およびインプリント異常の別（Model4）でも同様な傾向が認められた。PCBと精子性状との間には負の関連性が観察されることは先行研究で一致した見解であるが、本研究での解析からも、血中PCBと乏精子症との間に関連性があることがあらためて確認された。またPCB異性体同士の間には高い関連性が認められ、今回の解析結果から原因となる異性体を推定することは困難と推測された。

[キーワード] 症例・対照試験、リスク評価、精子減少、環境化学物質、PCB

### 1. はじめに

低用量の環境由来化学物質（以降、化学物質）の長期ばく露は、ヒトの生態（生殖細胞）系および性腺に対して深刻な影響を及ぼす危険性をはらんでおり、ヒトへの影響を明らかにすることは環境保全上の重要な課題であり、早急な対応が求められている。中でも環境残留性とヒトへの強い有害性が問題となっているPCBやDDTには内分泌かく乱作用があり、性比や精子数の減少に影響を与えることが議論を呼んでいる。また、臭素化物系の難燃剤もばく露レベルの増加が懸念されている。このような化学物質のヒト健康影響を評価するためには、動物やヒト細胞などを用いた実験の知見に加えて、ヒトそのものを対象とする疫学研究による検証が不可欠と考えられる。PCBと精子性状の関連性については、多くの先行研究が報告されており、PCBばく露に伴い、
精子数の現象、運動率の低下等多くの報告がある $ ^{1-7)} $ 。ただし、これらはPCBなどの単一の化学物質に着目した報告であり、多様な化学物質を対象とした網羅的な研究はない。また低用量域におけるばく露影響に関する報告は胎児期や新生児期を対象としたものが多い。その理由として胎児期および新生児期は中枢神経系が発達する時期であり、化学物質ばく露に対して感受性が高いことが挙げられる。また、妊娠女性や妊娠を予定している女性についての研究はあるが、男性や父親を対象に検討した研究は報告数も少ない。そのため、父親へのばく露やヒト精子への影響に関してはまだ明確ではない部分が多く、それらを明らかにするために男性やヒト精子を対象とした疫学的研究が求められている。

## 2 ．研究開発目的

本研究では、成人男性末梢血内の化学物質濃度とヒト精子形成への影響について、形態と機能の両面から解析を行い、交絡要因を十分考慮しながら関連性を評価することを目的とする。

本サブテーマでは、（1）症例対照試験の実施・患者登録に関する研究、（2）エピゲノム解析（精子）に関する研究、（3）環境化学物質の測定・網羅的 TOF-MS 解析の結果をもとに（4）症例対照試験の評価・解析とリスク要因の評価に関する研究を行った。研究体制を図(4)-1に示す。

図4-1 研究体制

### 3. 研究開発方法

PCB の測定値は正規分布をしないことが知られていることから、統計学的な解析ではノンパラメトリックの手法を用いるか、または PCB 濃度から 3 群に分割し解析を行った。血中 PCB 濃度と乏精子との関連性については、名義ロジスティック回帰分析により解析を実施した。パラメトリックな解析を行う場合は、対数変換を行って解析に使用した。血中 PCB 濃度とヒト精子（連続変数）との関連性については、共分散分析、重回帰分析ならびに共分散構造分析等の手法を用いて解析した。共分散構造分析では、単回帰分析や重回帰分析で得られた結果を参考にモデルを作成し、血中 PCB がヒト精子に及ぼす影響を調べた。以上の多変量解析に際しては、年齢、教育歴、BMI、喫煙や生活習慣などの交絡要因について補正を行った。統計学的な有意差は 5% 危険率を採用した。
## 4 ．結果及び考察

精子正常群と乏精子群について、血中 PCB の分析を実施した 90 名分について、基本属性を表(4)-1 に示した。乏精子群では喫煙するものが多く、一方で年齢、BMI、教育歴には両群間に統計学的に有意義な差は認められなかった。インプリント異常数は乏精子群でやや高い傾向が観察されたものの、統計学的に有意ではなかった。

GC-TOFMS による PCB 分析は半定量的な分析と考えられる。表(4)-2 で「PCB 検出率」とはいずれかの PCB 異性体で検出下限値よりも大きなデータが得られた場合の割合を示した。乏精子群では 53 件中 52 件で検出されたのに比較して、精子正常群では 37 件中 26 件であり、PCB の値について統計学的にも有意な差が認められた（p=0.0001）。また、仮に検出下限値以下について下限値の半値を代入して計算しても同様に乏精子群で高い値が観察された（表(4)-1）。

表(4)-1 血中 PCB とその他の属性との関連性

精子正常群	乏精子群
人数	37	53	p
年龄(year)	36.1±5.5	37.1±5.6	0.42
BMI(kg/m2)	24.8±3.7	24.1±31	0.37
喫煙習慣あり*	18.8%	40.9%	0.048
教育歴(大学卒業以上)	46.0%	41.5%	0.68
精子数(単位)	111.7±77.3	25.4±22.5	<0.0001
運動率(%)	57.1±13.9	36.1±18.4	<0.0001
精子数x運動率(単位)	62.5±43.9	7.9±6.0	<0.0001
奇形率	54.5±9.2	64.5±10.8	<0.0001
インプリント異常数	1.8±3.2	3.4±5.0	0.090
PCB(ng/g-fat)	35.5±46.5	72.7±43.2	0.0002
PCB検出率	70.3%	98.1%	0.0001

平均±SD。n=90、喫煙データについては n=76。

PCB 分析で、検出下限値（=0.1）以下はその半値（=0.05）を代入して計算した。PCB 検出率は、検出下限値以上となるデータが得られた検体数の割合を示した。統計解析は t-test または χ 二乗検定による。

なお、インプリント異常群をインプリント異常数から定義したが、インプリント異常が1つでも観察された場合を「インプリント異常」と定義した場合、インプリント異常群は90名中54名であり、精子正常群と乏精子群の分類との間（2x2のx二乗検定）に有意な関連性は認められなかった。一方、「インプリント異常」をインプリント異常が2つ以上観察された場合と定義した場合、インプリント異常群は37名であった。精子正常群と乏精子群の分類との間に、有意ではないものの関連性（p=0.0667）が観察された。以後、インプリント異常群は「インプリント異常が2つ以上観察された場合」とした。

血中 PCB 濃度とその他の属性との関連性について、まずパラメトリックな解析を実施し、概要を表(4)-2にまとめた。PCB は、年齢、奇形率と正に関連し、精子数、運動率、精子数 x 運動率との間に負の関連性が示された。喫煙については、喫煙歴から Brinkman index を計算し検討してみたが、PCB との間には関連性は見られなかった。インプリント異常数についても関連性は認められなかったが、インプリント異常数と精子数または精子数 x 運動率との間には高
い相関が観察された（データ示さず）。

表(4)-2 血中 PCB 濃度とその他の属性との関連性（Spearman の順位相関係数）

相関係数	p
年齢 (year)	0.35	0.0008
BMI (kg/m2)	0.11	0.32
Brinkman index	0.041	0.73
精子数 (単位)	-0.35	0.0007
運動率 (%)	-0.42	< 0.0001
精子数 x 運動率 (単位)	-0.43	< 0.0001
奇形率	0.24	0.03
インプリント異常数	0.029	0.79

Brinkman index は、喫煙期間（年）と一日当たりの喫煙本数から算出した。過去に喫煙していて、検査時は喫煙していなかった場合は、喫煙期間で計算した。

調査協力者を PCB 濃度から 3 群に分割し、正常精子群・乏精子症群との関連性について解析を行った。なお、喫煙習慣の変数を共変量として用いた場合に、質問票データの欠損から解析に用いるサンプル数が減少した。このため解析モデルごとに結果を示した。まず表(4)-3 上段に示すように、共変量として年齢のみを投入した場合（Model1）、血中 PCB 濃度が増加すると乏精子症の発生が増加した。さらに、共変量として年齢および喫煙習慣（Model2）、年齢、喫煙習慣および教育歴（Model3）、年齢、喫煙習慣、教育歴およびインプリント異常の別（Model4）を加えて解析を行っても、同様な傾向が認められた。

次に、インプリント異常の有無を目的変数とし、血中 PCB 濃度との関連性を検討したが、喫煙習慣を共变量として投入すると、PCB とインプリント異常との関連性は認めることができなかった。

表(4)-3 血中 PCB 濃度と乏精子群との関連性（名義ロジスティック回帰分析）

血中 PCB
低值群	中等度群	高濃度群	P-trend
人数	30	30	30
乏精子者数	8	19	26
Model1	1.00 (reference)	4.81 (1.65-15.2)	22.4 (5.78-111.5)	< 0.001

人数	血中 PCB
低值群	中等度群	高濃度群	P-trend
25	25	26
乏精子者数	7	15	22
Model 2	1.00 (reference)	3.78 (1.15-13.5)	16.1 (3.91-82.4)	< 0.001
Model 3	1.00 (reference)	4.10 (1.20-15.1)	17.5 (4.13-95.1)	< 0.001
Model 4	1.00 (reference)	3.22 (0.89-12.5)	17.3 (3.95-98.7)	< 0.001

Model1：年齢による補正

Model2：年齢、喫煙習慣による補正

Model3：年齢、BMI、喫煙習慣、教育歴による補正.

Model4：年齢、BMI、喫煙習慣、教育歴、インプリント異常による補正
次に、パラメトリックな解析を実施した。PCB濃度について、検出下限値以下の場合を検出下限値（=0.1μg/g）の半値を代入して、重回帰分析を行った結果を参考までに図(4)-2に示した。目的変数は精子数x運動率、説明変数は血中PCBとし、いずれも対数変換して用いた。共変量として、年齢、BMI、喫煙習慣を投入した。PCBと精子数x運動率の間には負の関連性が認められ（B=-0.19、調整β=-0.327、p=0.005）、PCB濃度が増加すると、精子数が減少した。図には示さないが、喫煙習慣の有無でも精子数x運動率の間に差が認められ（B=0.23、調整β=0.264、p=0.026）、PCB（血中濃度が10倍となる影響）と喫煙習慣（非喫煙と喫煙の2群間）の影響の大きさを比較すると、PCBばく露の影響の方が大きいことが示唆された。

図(4)-2 血中 PCB と精子数 x 運動率の関連性

共変量として年齢、BMI、喫煙習慣（喫煙/非喫煙）、学歴（大学卒以上）として重回帰分析を行った。

以上のように血中 PCB と乏精子症との間に関連性が認められたことから、精子の性状と最も密接に関連する PCB 異性体を検討する目的で、PCB 各異性体と精子数 x 運動率との関連性を検討した（表(4)-4）。解析は、Spearman の順位相関係数によった。精子数 x 運動率との間に高い関連性が示されたのは PCB#118、#182+187、#180、#170 であったものの、PCB#74 を除きその他の異性体でも有意な関連性が示された。PCB 異性体同士の間でも高い関連性があり（データ示さず）、統計学的な共線性も指摘された。いずれかの PCB 異性体が原因物質であると推測されるものの、生体中では PCB の物性から多くの異性体が類似した体内動態を示すと考えられ、今回の結果から原因となる異性体を推定することは困難と考えられた。
表(4)-4 PCB 異性体と精子数 x 運動率との関連性（Spearman の順位相関係数）（n=90）

相関係数	p
PCB#74	-0.120	0.26
PCB#66,80	-0.251	0.017
PCB#99	-0.397	0.0001
PCB#118	-0.461	< 0.0001
PCB#153	-0.392	0.0001
PCB#163,164	-0.284	0.007
PCB#138	-0.287	0.006
PCB#182,187	-0.524	< 0.0001
PCB#180	-0.420	< 0.0001
PCB#170	-0.486	< 0.0001
Total	-0.426	< 0.0001

以上の結果から、血中 PCB 濃度が増加すると精子数 x 運動率などの指標が減少し、乏精子症の発生が増えることが示唆された。年齢、喫煙習慣などを調整しても関連性は一貫したものであり、男性不妊において PCB ばく露の重要性が示唆された。また、この知見は、PCB と精子性状に関する先行研究の結果ともよく一致するものと考えられた。

なお、精子数 x 運動率は他の分担研究報告書で触れられているように、メチル化異常とも密接と推測される。PCB とメチル化異常との関連性について検討が必要である。さらに、年齢について、加齢そのものが精子の性状を低下させる要因と考えられる一方で、PCB は脂溶性化学物質であることから、PCB も年齢とともに体内蓄積量は増加することが知られている。このように共線性が想定されることから、共分散構造分析による総括的な検討を試みた（図(4)-3）。

血中 PCB 濃度が精子数 x 運動量に及ぼす影響を検証するために、いくつかのモデルを構成し、共分散構造分析を行った。単回帰分析や重回帰分析の結果から、仮説的なモデルを幾通りか想定し分析を行った。図(4)-3 のモデルは、メチル化異常という構成概念（潜在変数）が外生変数としてあり、血中 PCB 濃度、精子数 x 運動量、喫煙等の潜在変数から構成される。これまでに血中 PCB が精子数 x 運動量に、喫煙が精子数 x 運動量に、年齢および BMI が PCB に、教育歴が喫煙の有無にそれぞれ影響することがわかっている。そこで、先行研究の結果も踏まえ図(4)-3 のようなモデルを作成した。これらの潜在変数はそれでは説明しきれない残差からなるとするモデルである（図中では残差については削除した）。まず、モデルの適合度についてみると、 $ χ^{2} $ 乗値は 14.636 で確率は 0.478 であり、仮説となるモデルを棄却しないとする値が得られた。また、GFI（goodness-of-fit、飽和モデルでの全分散が推定モデルでの分散でどれだけ説明できたか）および AGFI（Adjusted Goodness of Fit Index、自由度調整済み決定係数）は基準となる 0.85 以上の数値が得られた。また、AGFI よりも GFI の方で数値が 1 に近かった。RMSEA（Root Mean Square Error of Approximation）も基準となる 0.05 よりも小さい値が得られた。RMR（残差平方平均平方根）は 0 に近いほど良いとされるが、十分に小さい値であった。赤池情報量規準（AIC）は他の仮定されたモデルと比較することが多いが、図(4)-3 が最も小さな値であった。以上より、仮説として立てたモデル（図(4)-3）は適合していると判断できる数値を示した。次に、変数間の関連性についてみると、血中 PCB 濃度は精子数 $ χ^{2} $ 運動量との間