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課題名 RF-0910 国内移殖による淡水魚類の遺伝子かく乱の現状把握および遺伝子かく乱侵攻予測モデルの構築

課題代表者名 鬼倉 徳雄 （九州大学大学院農学研究院アクアフィールド科学研究室助教）

研究实施期间 平成21～23年度

累計予算額 13,583 千円（うち 23 年度 4,653 千円）

予算額は、間接経費を含む。

研究体制

（１）同一種内における遺伝子かく乱の現状把握（岐阜大学）

（２）遺伝子かく乱魚種の分布、生息条件の特定および遺伝子かく乱侵攻予測モデルの構築（九州大学）

## 研究概要

### 1. はじめに（研究背景等）

侵略的外来生物が及ぼす環境・生態系への負の影響は世界的な問題となっており、日本国内においても外来生物法の特定外来種に指定された種の取り扱いは厳しく制限されることとなった。生態的影響が著しい特定外来種については、在来生物への影響や移入先での生態、駆除方法などが研究され、その管理手法の構築が進みつつある。一方、国内移殖の問題は極めて軽視され、一般的認知にも乏しい。日本の淡水魚は、漁業・遊漁目的で琵琶湖産アユなどが全国の河川に放流されたことで、様々な魚種が生息域外に付随して移殖され定着する機会が非常に多かった。近年の著者らが行った国内移殖に関する研究により（平成19-20年地球環境研究総合推進費革新型RF-075）、九州内におけるそれらの分布の現状、生態的影響や遺伝的かく乱の現状が明らかになり始めた。

日本列島は複雑な地史を経て形成されたことから、比較的小さな地理的スケールの中にも多様な生物相が生じている。特に、日本の淡水魚は、移動範囲が河川水系内に限定されるという特性上、地理的分化が極めて進んでいる。例えば、メダカでは遺伝子レベルでは明瞭に区分される北日本集団と南日本集団に2区分され、両者はそれぞれ異なる遺伝的特性、形態的特性を持っていることが古くより知られていた。そして、近年、これらの2タイプのメダカが別亜種として区別されるようになった。しかしながら、先に述べた国内移殖に伴い、遺伝的に異なる特性を持った同一種が交雑するといった問題が近年報告され始めた。これが本課題で注目する遺伝子かく乱である。九州では、少なくともゼゼラという淡水魚で外来遺伝子の移殖・定着が確認されている。

このような問題は「日本国内における国産の」淡水魚の移殖であるために、生態系に影響を及ぼす重要な外来種問題であることが一般市民に認識されず、特に、同一種、近縁亜種間で起こる遺伝的かく乱については現状把握さえほとんどなされていない。このまま問題を放置すれば、日本列島が形成されてから数百万年の時間をかけて形成された各地域固有の淡水魚類相が、人為的移殖によって均質化し、遺伝的多様性が失われ続けていくと考えられる。したがって、淡水魚の国内移殖が、「生態系に影響を与え」、「希少魚の絶滅を引き起こし」、「何百万年もかけて形成された生物の地理的多様性を失わせている」ことを科学的データによって明示し、国内外来魚問題への対処に関する社会的合意を得ることが必要である。

こういった国内での移殖に伴う生態系・生物多様性かく乱の監視・管理の場で、遺伝子かく乱の最大の問題点は、分類学上、同一種として扱われているケースが大半であることにある。外観上の識別が難しいため、サンプルを収集して遺伝子を解析しない限り、その侵攻状況を把握できない。したがって、早急にその監視手法を構築する必要がある。

## 2 ．研究開発目的

以上のことから、本研究ではこの遺伝子かく乱に着目し、その管理のためのツールを開発することを目的とする。そのプロセスとして、サブテーマ1では、アユ、ゲンゴロウブナ放流などに付随して移殖された可能性が高い魚種、観賞魚として各地に放流された可能性が高い魚種について、ミトコンドリアDNA解析を行い、遺伝子かく乱を受けている魚種を特定するとともに、そのかく乱の
程度を数値化する（遺伝子かく乱度）。サブテーマ2では、九州を対象として淡水魚類の分布情報を網羅的に調査し、分布情報、環境情報のデータベース化をはかり、そのデータベースを使い、各種の出現予測モデルを構築する。また、外来魚類の侵略性簡易評価キット（FISK）を用いて、遺伝子かく乱魚種の侵略性を評価する。そして、最終的には、遺伝子かく乱が侵攻し、FISKによって侵略性が高いと判断された魚種について、サブテーマ1で得られた遺伝子解析に基づく遺伝子かく乱データと各種の出現予測モデルを融合し、遺伝子かく乱の侵攻予測モデルを構築することを目標とする（図1）。

図1. 遺伝子かく乱侵攻予測モデル構築にあたっての研究計画と役割分担.

### 3. 研究開発の方法

## （１）同一種内における遺伝子かく乱の現状把握

九州産および比較用の日本各地の魚類標本は、たも網・投網等を用いて採集し、99.5％エタノールで保存した。入手した標本の中から、九州北部における国内移入魚の影響を解析するのに充分な産地数・個体数が確保できる種類を選定し、優先的にDNAの解析をおこなった。コイ科のオイカワ、モツゴ、ゼゼラ、メダカ科のメダカ、ハゼ科のトウヨシノボリ、カワヨシノボリ、ドンコ科ドンコを解析対象とした。

DNAの抽出はキアゲン社のDNeasy Blood & Tissue Kitを使用し、Ex Taq DNA polymerase（タカラバイオ株式会社）でミトコンドリアDNA（mtDNA）の部分塩基配列の增幅を行った。コイ科魚類については、平成19-20年度の地球環境研究総合推進費（RF-075）の研究で開発したコイ科用プライマーを用いて、Cyt b 遺伝子の全長（1141bp）を含む遺伝子領域の增幅をおこなった。メダカについては既知の報告に基づいて、メダカ用プライマーを用いてCyt b 遺伝子の全長を增幅した。トウヨシノボリについては、著者らは日本産ヨシノボリ属のmtDNAのND5遺伝子の部分塩基配列を既に決定しているため、本研究でも同様にND5遺伝子の部分塩基配列約1000塩基対を增幅した。ドンコとカワヨシノボリについては、Cyt b 遺伝子の增幅用プライマーを新たに開発した。PCRで增幅した産物はExo-SAP ITキット（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）で精製し、Big Dye Terminater Cycle Sequencing Reaction Kit ver. 3.1（アプライドバイオサイエンス株式会社）を用いてシークエンス反応をおこなった。反応産物はClean SEQ（株式会社バイオメディカルサイエンス）で精製した後、ABI3100（もしくは3130）Genetic Analyzerを用いて塩基配列の決定をおこなった。得られた塩基配列はABI社のフリーソフトEdit Viewで波形確認と修正をおこなった後、PAUP*4.0を用いて樹状図を作製した。

外来遺伝子の分布が確認された魚種について、分析検体数と外来系統検出個体数から、各外来系統による遺伝子かく乱度（検出個体数／分析数）を地点ごとに算出した。
## （２）遺伝子かく乱魚種の分布、生息条件の特定および遺伝子かく乱侵攻予測モデルの構築

遺伝子かく乱魚の分布情報に基づいて、それぞれの生息条件を特定するために、まず、九州北部純淡水魚類分布データベースを構築した。九州北部の広範囲での魚類相調査を実施するとともに、最近の魚類相に関する既知情報を集積し、データベースを構築した。また、サブテーマ1で特定された遺伝子かく乱魚種の侵略性を評価するために、外来魚類の侵略性評価簡易キッド（FISK）を用いてスコアを算出した。そして、遺伝子かく乱度の大小とFISKによる評価結果に基づいて、遺伝子かく乱侵攻予測モデル解析対象魚種（モツゴとバラタナゴ）を選定した。

遺伝子かく乱侵攻予測モデルは、目的変数をサブテーマ1のモツゴの遺伝子かく乱度とし、説明変数を各魚種の分布ポテンシャル、外来魚の種数、外来魚各種の在・不在、各魚種の分布の重心からの距離などを説明変数、生物地理区分をランダム切片とした一般化線形混合モデル（GLMM）を実施してモデル構築を行うパターンと、モツゴの遺伝子かく乱の原因である可能性が高いゲンゴロウブナについて、モツゴの在・不在、ゲンゴロウブナの在・不在の全組み合わせをモデル化し、そのポテンシャルを説明変数としたランダムフォレスト（RF）でモデルを構築するパターンの2つを実施した。

タイリクバラタナゴによる遺伝子かく乱については、ニッポンバラタナゴとタイリクバラタナゴの分布予測モデルを構築し、その選好度の重複に着目したGLMMを行った。目的変数をニッポンバラタナゴの在／不在、説明変数を数値地図から得られる環境情報とし、生物地理区分をランダム切片としてGLMMを実施して、ニッポンバラタナゴの分布予測モデルを構築した。同様の作業をタイリクバラタナゴについても行い、それぞれ各魚種の環境選好度として出現確率を算出した。それに加えて、外来魚類の種数、外来各種の在／不在、ニッポンバラタナゴの分布の重心からの距離を説明変数として準備した。目的変数はタイリクバラタナゴのミトコンドリアDNA出現率（遺伝子かく乱度）とし、生物地理区分をランダム切片とした一般化線形混合モデル（GLMM）を実施してモデル構築を行った。なお、遺伝子かく乱度の算出は、日本水産学会誌に公表済みのデータを使用した。

### 4. 結果及び考察

## （１）同一種内における遺伝子かく乱の現状把握

本研究の中で、九州において外来遺伝子移入が確認されたのは、オイカワ、モツゴ、ゼゼラの3種であった。ゼゼラについては、その詳細を平成19-20年度の地球環境研究総合推進費（RF-075）の研究で報告しているので、オイカワとモツゴについて詳細を記す。

まず、オイカワは、国内では関東地方から九州まで広く分布する淡水魚だが、琵琶湖産アユ種苗への混入によって全国に分布を広げていることが知られている。本研究における琵琶湖由来のオイカワを含めたミトコンドリアDNA解析において、これまでに22都県61地点380個体から105ハプロタイプが検出された。それらは大きく3系統（西日本、東日本、九州）に区分され、さらに西日本系統内に山口・九州北部亜群が認められた。そして、九州北部からは九州系統、西日本系統、山口・九州北部亜群の3タイプが見つかった（図2）。これらは、九州北部で広域に認められる九州系統、筑前海側に流入する河川に見られる山口・九州北部亜群、そして、瀬戸内海流入河川に認められる西日本系統で整理できる。そして、大分県の地点を除けば、それらの多くは九州在来の系統であることが階層クレード分析によって裏付けられた。したがって、オイカワの遺伝子かく乱は九州北部地域ではほとんど認められないと結論付けられた。ただし、一昨年度と昨年度の研究結果では、九州南部地域において不自然な分布拡大が確認されており、九州全域を見たとき、南部地域では琵琶湖産アユ種苗に混入した移殖や九州内での地域間移殖が起こっていることを付記しておく。

モツゴについては、平成19-20年度の地球環境研究総合推進費（RF-075）でゲンゴロウブナの移殖に付随する形で遺伝子かく乱が侵攻している可能性が指摘されている。本研究におけるミトコンドリアDNA解析において、データベースから得られた中国大陸産を含めて33ハプロタイプが検出された。それらは大きく4系統（中国大陸、西日本、東日本、九州）に区分され、九州北部からは全タイプが見つかった（図3）。九州北部においては46地点318個体を解析したが、在来系統のみで構成されたのは10地点に満たず、大陸、西日本、東日本系統の侵入がそれぞれ23、10、14地点で見られた。また、複数系統の外来遺伝子移入が認められた地点は9地点あり、特に、佐賀県の塩田川水系、鹿島側水系からは外来3タイプ全ての移入が確認された。この地域には、フナを食す文化があり、年に1度、在来のギンブナだけでなく、国内外来魚ゲンゴロウブナが大量に生きたまま取引されることなどが関係しているのかもしれない。一級水系の筑後川、遠賀川水系には大陸系統のみの移入が確認され、両水系から西日本系統、東日本系統は確認されなかった。各系統ごとの遺伝子かく乱度は、大陸系統で0.125-0.800、
西日本系統と東日本でともに0.125-1.000であった。全外来系統を加算した全外来遺伝子かく乱度も0.125-1.000であった。熊本県内は西日本系統による遺伝子かく乱度が高いが、この地域は近年まで内水面養殖が盛んであったことと関係しているのかもしれない。なお、遺伝子かく乱度の計算式は次式の通りである。

大陸系統による遺伝子かく乱度 = 大陸系統検出個体数／分析検体数

東日本系統による遺伝子かく乱度＝東日本系統検出個体数／分析検体数

西日本系統による遺伝子かく乱度 = 西日本系統検出個体数／分析検体数

全外来系統による遺伝子かく乱度 =

（大陸系統檢出個体數＋東日本系統檢出個体數＋西日本系統檢出個体數）／分析檢体數

図2. 九州北部地域におけるオイカワのミトコンドリアDNA、4系統（九州、東日本、西日本、山口・九州北部亜群）の分布頻度.

図3. 九州北部地域におけるモツゴのミトコンドリアDNA、4系統（大陸、九州、東日本、西日本）の分布頻度.

これらの魚種については、濃尾平野においてもその詳細を調査し、それぞれどの外来系統がどの程度、分布を拡大しているのか、そして、それらの遺伝子かく乱度についても算出済みであることを付
図4. 濃尾平野におけるオイカワ（左、緑：東日本、青：西日本）とモツゴ（右、黄：大陸、緑：東日本、青：西日本）のミトコンドリアDNAの分布頻度．共に東日本系統が在来系統．

## （２）遺伝子かく乱魚種の分布、生息条件の特定および遺伝子かく乱侵攻予測モデルの構築

分布情報データベースについては、約1000地点の魚類相を取りまとめ、それを使った予備的な解析の中で、九州の淡水魚類の生物地理区分、河川長一種数曲線、数種の純淡水魚類に関する分布モデルの構築などを行った。また、FISKを使った外来魚類侵略性評価の中で、幾つかの国内・国外外来魚および遺伝子かく乱魚がオオクチバスなどの特定外来魚と同レベルのリスクを持つことなどを特定した。それらについては詳細報告の中で紹介したい。ここでは、本研究の最終目標である遺伝子かく乱侵攻予測モデルについて記述する。

サブテーマ1の結果から、九州北部で遺伝子かく乱の侵攻が著しい魚種としてモツゴとゼゼラが挙げられた。また、FISKによる評価でモツゴを含む数種の魚種が外来生物としての侵略性が高いと判断された。それらのうち、遺伝子かく乱や近縁種との交雑が問題視されているのは、先のモツゴとタイリクバラタナゴであった。したがって、両種を遺伝子かく乱侵攻予測モデル構築の対象魚種として取り扱った。

まず、モツゴについては、ケース1として、GLMMでモツゴの出現予測を行い、それに外来魚類の移殖に関する情報などを重ね、再度、GLMMを実施した。まず、出現予測モデルについては、目的変数をモツゴの在／不在、説明変数を数値地図上から得られた環境要因とし、北西部、北東部といった生物地理区分をランダム切片として解析したところ、ベストモデルには正の変数として河川長、水路網の多様さ、水田面積、都市用地面積が、負の変数として河川勾配と樹林面積が選択された。このベストモデルについて、ROC曲線を描いてAUCを算出したところ、その値は0.896であったことから、このモデルは極めて高い精度でモツゴの出現を予測できることが確認できた（モツゴの分布予測モデル）。

続いて、サブテーマ1で得られた外来各系統の遺伝子かく乱度を目的変数としたGLMMを実施した。説明変数には、上記のモデルで算出したモツゴ環境選好度（モデルで推定される出現確率）、移殖にかかわる情報として外来魚類種数を、また他の要因としてモツゴ分布の重心からの距離を説明変数とした。移殖情報に関しては、特定の外来魚類とのセット放流も想定されるため、外来魚類各種の在・不在も取り扱ったが、ゲンゴロウブナを始めとした多くは、外来魚類の種数との間に正の相関性を示したため、多重共線性に配慮して解析から除外した（ナイルティラピア、コイ、コウライモロコの在・不在を使用）。解析の結果、それぞれの系統に対して次のベストモデルが選択された。

大陸系統:侵入頻度 = 0.0283+0.0731×外來魚種數

西日本系統:侵入頻度 = 0.02549 - 0.475 × モツゴの選好度 + ランダム切片

東日本系統:侵入頻度 = 0.0852 + 0.6469 × ナイルティラピアの在

分布データベースの約1000地点のうち、実際にモツゴが分布する地点、モツゴの分布予測モデルで出現と予測された地点について、それぞれの外来系統の侵入頻度を算出し、それを積算してマップに示した（図5）。遺伝子かく乱度が30％を越える地点が数多く認められ、その中にモツゴの遺伝子かく乱が侵攻せず、在来系統のみで構成される全地点が含まれた。つまり、この侵攻予測結果は、現在、在来系統のみで構成される全地点について今後、外来遺伝子が侵入し、かく乱が侵攻する可能性が高いと判断している。これらの地域では、外来生物が
移殖されないように監視を強化し、また、状況に応じてモツゴの在来系統の保存を行うべきである。また、遠賀川水系の下流域において予測かく乱頻度が10%を下回る地点が見られるが、これらの大半はコンクリートで固められた農業用水路であり、実際にモツゴが分布しているケースはほとんどないことを付記しておく。分布予測モデルが数値地図情報に基づいているため、護岸形状等の微環境構造の影響を反映していないためである。これらの結果から、九州のモツゴの生息域の大半について、外来系統の遺伝子かく乱の侵攻が起こる可能性があると判断できる。なお、予測値と観測値は正の相関性を示しており、予測は妥当であると判断する。

図5. 九州北部のモツゴにおける外来系統遺伝子侵入予測結果.

図6. RFモデルによるモツゴの遺伝子かく乱度と実際の観測結果.

ケース2は、モツゴとゲンゴロウブナとの関連性に着目したRF解析であり、モツゴの在・不在、ゲンゴロウブナの在・不在の全組み合わせについて、数値地図から得られる情報を説明変数としてモデル化したところ、1064地点の分布パターンを完璧に再現できた（正答率100%）。続いて、モデルによって4パターンに出力された①モツゴ・ゲンゴロウブナとも不在、②モツゴのみ在、③ゲンゴロウブナのみ在、④モツゴ・ゲンゴロウブナとも在について、それ
ぞれのパターンへの適合度を説明変数、モツゴの遺伝子かく乱度（全外来系統による遺伝子かく乱度）を目的変数として、再度、RF解析を実施したところ、②と④がモツゴの遺伝子かく乱度に関するRFモデルにとって重要な変数として評価された。元々、外来モツゴはゲンゴロウブナに付随して移殖された可能性が指摘されていることから、④が重要な変数として評価されたものと考えられる。また、ゲンゴロウブナは不在、モツゴは在である②についても重要な変数として評価されたが、これはゲンゴロウブナ以外の外来モツゴ分布拡散要因が存在する可能性を示している。そして、先のGLMMの東日本系統の予測モデルでナイルティラピアが選択されたことからも、一部の外来モツゴはゲンゴロウブナ以外の外来魚類に付随して分布を拡大していることが示唆された。なお、RFモデルによって予測された遺伝子かく乱度と実際の遺伝子かく乱度との関係性を調べたところ（図6）、正の回帰性を示した。

次に、タイリクバラタナゴについては、まず、ニッポンバラタナゴとタイリクバラタナゴの分布予測モデルを構築したところ、ニッポンバラタナゴのベストモデルには正の変数として河川長、水路の連結数、水田面積、都市用地面積が、負の変数として標高が選択された。このベストモデルについて、ROC曲線を描いてAUCを算出したところ、その値は0.872であったことから、このモデルは極めて高い精度でニッポンバラタナゴの出現を予測できることが確認できた（ニッポンバラタナゴ分布予測モデル）。同様に、タイリクバラタナゴについても解析したところ、そのベストモデルには正の変数として水田面積が、負の変数として河川長、標高、川幅が選択された。AUCは0.915であり、さらに高い精度で分布予測が行えることが確認された（タイリクバラタナゴ分布予測モデル）。ここで着目すべき点は、近縁亜種である両種の環境の選好性に違いがみられた点にあり、ニッポンバラタナゴは大水系を好むのに対し、タイリクバラタナゴは小水系を好む点が大きな相違であった。なお、ニッポンバラタナゴは絶滅危惧IA類に指定される希少種であり、その分布を高い精度で予測できるモデルを構築できた点は、その保全に極めて有用な知見を与えるものである。

次に、公表済みデータから得られたタイリクバラタナゴによる遺伝子かく乱度を目的変数としたGLMMを実施した。説明変数には、上記のモデルで算出した両種環境選好度（モデルで推定される出現確率）、移殖にかかわる情報として外来魚類種数を、また他の要因としてニッポンバラタナゴ分布の重心からの距離を説明変数とした。移殖情報に関しては、特定の外来魚類とのセット放流も想定されるため、外来魚類各種の在・不在も取り扱ったが、ゲンゴロウブナを始めとした多くは、外来魚類の種数との間に正の相関性を示したため、多重共線性に配慮して解析から除外した（ワタカ、コウライモロコ、カムルチー、オオクチバスの在・不在を使用）。解析の結果、次のベストモデルが選択された。

侵入頻度 = -0.398 + 0.346 × タイリクバラタナゴ選好度

+0.168×ニッポンバラタナゴ分布重心までの距離+0.275×オオクチバスの在＋ランダム切片

実際のタイプ遺伝子頻度

図7. GLMMによるタイリクバラタナゴ遺伝子かく乱度と実際の観測結果（青枠は、タイリクバラタナゴは観測されていないが、かく乱度の予測値が高いプロット）

この結果は、九州北部においてタイリクバラタナゴは本種の環境選好度の高い場所で、ニッポンバラタナゴの分布の縁辺部から侵入することを示している。本州地方で壊滅的に交雑が侵攻した両種であるが、九州で本州よ
りも交雑の侵攻が遅い理由の一つと言える。オオクチバスの在との関係性についてはタイリクバラタナゴとオオクチバスのセット放流の可能性を示しているが、これまでそういった知見は皆無に近く、現状はその理由について明らかではない。オオクチバスの在／不在と相関性を示す別の魚種の可能性も含めて検討の余地を残す。

本モデルによって予測されたタイリクバラタナゴ遺伝子かく乱度と実際の遺伝子かく乱度との関係性を調べたところ（図7）、正の回帰性を示し、モデルの正当性が支持された。そして、実測では遺伝子かく乱されていないにもかかわらず、予測値で高い値を示した地点が数地点存在した。これらの地点は、タイリクバラタナゴ遺伝子侵攻に対するポテンシャルを持つ場所であり、タイリクバラタナゴ侵入を防ぐために、厳重に監視しておく必要がある。

次に、分布データベースの約1000地点のうち、実際に両亜種が分布する地点、分布予測モデルで出現と予測された地点について、タイリクバラタナゴ侵入頻度を予測してマップに示したところ（図8）、遺伝子かく乱侵攻の可能性が低い地点が筑後川、矢部川、菊池川、遠賀川水系の下流域に集中することが明らかとなった。ニッポンバラタナゴの積極的な保全策を講じるのに、極めて適したエリアであることをここに付記しておく。

図8. 九州北部のタイリクバラタナゴによる遺伝子かく乱予測結果.

### 5. 本研究により得られた主な成果

## （1） 科学的意義

目に見えない形で侵攻する同一種の別個体群による遺伝子かく乱問題に関して、数種の魚種でその現状を解明した。特に、九州北部地域のモツゴに関しては、在来系統のみで構成されるエリアが極めて少なく、危機的状況にあることが明らかとなった。本種は、環境省や各県版のRDBで取り上げられない、いわゆる「普通種」であるが、そういった普通種に関しても個体群レベルで見たとき、保全的措置の必要性があり、今後の生態系保全施策に対して保全単位等を再検討する必要性を示すものと言える。また、本研究で解析された遺伝子情報に関しては、「淡水魚遺伝的多様性データベースGEDIMAP」に登録することで、保全分野のみならず、生態学を始めとする学問領域においても広く活用されることが期待される。

また、遺伝子かく乱に対してその侵攻を予測するモデルを構築できたことは極めて画期的である。遺伝子かく乱の問題は近年注目され始めたばかりの事象で、生物多様性を損なわせる要因として問題提起されることは多いが、その監視技術まで示した事例は皆無である。この侵攻予測モデルは、遺伝子かく乱が数値地図情報と移殖に関連する幾つかの情報の組み合わせによって評価でき、またモデル化することができることを示した点で、この問題解決に向けた技術を飛躍的に前進させたと言える。その他、本研究で構築した淡水魚類分布データベースは、現在、環境研究総合推進費・平成23年度新規採択課題S-9の中でも活用されていることを追記しておきたい。

## （２）環境政策への貢献

国内学会等での発表、学術論文ほかでの成果の公表、新聞報道を通して、国内移殖に関する種レベ
ルから遺伝子レベルまでの多様な問題を、主として九州を事例とした科学的知見に基づいて提示し、成果の普及に努めた。現在のところ、環境政策へ直接的に反映されていないが、環境省RDBの絶滅危惧IA類ニッポンバラタナゴが外来生物法要注意外来生物タイリクバラタナゴにどの程度遺伝子浸透されるかについて予測マップを示し、そのリスクを視覚的に示した結果は、今後の国レベルでの法施策に反映されるものと期待する。また、モツゴの地域レベルでの遺伝子かく乱侵攻予測についても、保全すべきエリア等の選定が容易に可能となる成果であり、現在、各地方行政で進められる生物多様性地域戦略等に反映されるものと考える。

### 6. 研究成果の主な発表状況

## （１）主な誌上発表

## く査読付き論文>

1) N. Onikura, J. Nakajima, T. Miyake, K. Kawamura, S. Fukuda: Ichthyological Research, 59, 124–133 (2012)

"Predicting the distribution of seven bitterling species inhabiting northern Kyushu Island, Japan."

2）大畑剛史、乾隆帝、中島淳、大浦晴彦、鬼倉徳雄：魚類学雑誌，59，1-10（2012）「熊本県緑川水系におけるイチモンジタナゴAcheilognathus cyanostigmaの分布パターン」

3）向井貴彦、池谷幸樹、大仲知樹、古屋康則、高木雅紀、塚原幸治、寺町茂、吉村卓也：日本生物地理学会会報，66，203-209（2011）

「岐阜県におけるスナヤツメ北方種と南方種の分布」

4）向井貴彦、梅村啓太郎、高木雅紀：日本生物地理学会会報，66，85-92（2011）「岐阜県におけるカラドジョウの初記録と中国系ドジョウの侵入」

7) S. Fukuda, B. De Baests, A.M. Mouton, W. Waegeman, J. Nakajima, T. Mukai, K. Hiramatsu, N. Onikura: Ecological Modelling, 222, 1401-1413 (2011)

"Effect of model formulation on the optimization of a genetic Takagi-Sugeno fuzzy system for fish habitat suitability evaluation."

## （２）主な口頭発表（学会等）

1）向井貴彦、古田莉奈、古橋芽：日本生態学会・EAFES大会（2012）「岐阜市のため池における魚類相」

2) S. Fukuda, B. De Best, Y. Nomiyama: International Workshop on Advanced Computational Intelligence and Intelligent Informatics, Suzhou, China (2011)

"Comparing predictive accuracy of a genetic Takagi-Sugeno fuzzy model and random forests for fish habitat modelling."

## 3 ）向井貴彦：日本魚類学会年会（2011）

「岐阜県長良川におけるヨシノボリ類のmtDNA系統と色斑的特徴の不一致」

4) S. Fukuda: 2011 IFSA World Congress and the 2011 AFSS, Surabaya, Indonesia (2011) "Application of a fuzzy neural network model to evaluate habitat preference of Japanese medaka (Oryzias latipes)."

5) S. Fukuda: 2011 IEEE International Conference on Fuzzy Systems, Taipei, Taiwan (2011) "Assessing the effects of zero abundance data on habitat preference modelling using a genetic Takagi-Sugeno fuzzy model."

6) S. Fukuda, W. Waegeman, A. Mouton, B. De Baets: EUROFUSE 2011, Douro, Portugal (2011) "Modelling fish habitat preference with a genetic algorithm-optimized Takagi-Sugeno model based on pairwise comparisons"

7) S. Fukuda, W. Waegeman, A. M. Mouton, B. De Baets: European Conference on Ecological Modelling, Riva del Garda, Italia (2011)
"Modelling spawning habitat for European grayling (Thymallus thymallus L.) using a support vector machine and a genetic Takagi-Sugeno fuzzy model.

8) S. Fukuda, B. De Baets, W. Waegeman, A. M. Mouton, J. Nakajima, T. Mukai, N. Onikura: IEEE SSCI 2011 GEFS, Paris, France (2011)

"A Discussion on the accuracy-complexity relationship in modelling fish habitat preference using a genetic Takagi-Sugeno fuzzy system."

## 9 ）鬼倉徳雄，中島淳，向井貴彦，福田信二：日本魚類学会年会（2010）

10）福田 信二，Bernard De Baets，鬼倉 徳雄，中島 淳，向井 貴彦：応用生態工学会（2010）「ファジイ生息場選好性モデルを用いた九州北西部におけるモツゴの生息環境評価」

11) S. Fukuda, N. Onikura, B. De Baets, W. Waegeman, A. M. Mouton, J. Nakajima, T. Mukai: Second World Congress on Nature and Biologically Inspired Computing (NaBIC2010) (2010) "A Genetic Takagi-Sugeno Fuzzy System for Fish Habitat Preference Modelling"

12）鬼倉徳雄，中島淳，杉本芳子，河野宏美，兼頭淳：日本魚類学会（2009）「九州北部におけるモツゴの分布と生活史」

13）早川明里，高村健二，中島淳，河口洋一，鬼倉徳雄，向井貴彦：日本魚類学会（2009）「日本列島におけるオイカワの系統地理」

14）向井貴彥，小西繭，渡辺勝敏，武內陽佑，中島淳，河口洋一，鬼倉徳雄，高田啓介：日本魚類学会（2009）

「日本産モツゴにおけるmtDNAの地理的変異」

15）鬼倉徳雄，中島淳，佐藤真弓，河口洋一，向井貴彦：日本魚類学会（2009）

「国内外来種による生態系・群集の変化：有明海沿岸域のクリーク地帯における国内外来魚の分布パターン」

### 7. 研究者略壓

課題代表者：鬼倉徳雄

1971生まれ、九州大学農学部卒業、農学博士、現在、九州大学大学院農学研究院助教

研究参画者

（1）: 向井 貴彦

1971生まれ、静岡大学理学部卒業、博士（理学）、現在、岐阜大学地域科学部准教授

（2）：鬼倉徳雄（同上）

：福田信二

1978生まれ、九州大学農学部卒業、農学博士、現在、九州大学熱帯農学研究センター助教
RF-0910 国内移殖による淡水魚類の遺伝子かく乱の現状把握および遺伝子かく乱侵攻予測 モデルの構築

(1) 同一種内における遺伝子かく乱の現状把握

岐阜大学地域科学部 向井 貴彦

平成21～23年度累計予算額：6,040千円

（うち、平成23年度予算額：2,100千円）

予算額は、間接経費を含む。

[要旨] 九州北部と東海地方をモデル地域として、日本国内における淡水魚の地域間での移殖の影響と実態の解明を試みた。西日本に広く分布する淡水魚を主な対象として選定し、ミトコンドリアDNAの部分塩基配列の解析をおこなった結果、観賞魚由来の国内移殖が想定されるメダカ、ドンコ、カワヨシノボリについては、自然分布域内における遺伝的かく乱を示すデータは得られなかった。一方、琵琶湖産アユの放流に混入して国内移殖が生じていると考えられるオイカワとゼゼラ、コイやフナ類といった養殖魚の放流に混入して分布を拡大していると考えられるモツゴについては、他地域から持ち込まれた非在来ミトコンドリアDNAの分布が広範囲にわたって確認された。こうした外来遺伝子の分布は、種としての分布域が広く個体数の多い「普通種」においても、各地域固有の遺伝的特徴を持つ在来個体群が存続の危機にあることを示している。

また、岐阜県岐阜市の長良川水系と三重県鈴鹿市のため池におけるヨシノボリ類について、外部形態とミトコンドリアDNAの解析を行った。その結果、これらの地域では国内外来種と考えられるトウヨシノボリやシマヒレヨシノボリが、在来種のシマヨシノボリやトウカイヨシノボリと交雑していることが示唆された。特に、鈴鹿市においては東海地方固有のトウカイヨシノボリがトウヨシノボリと交雑しつつ分布が置き換えられ、危機的状況にあることが示唆された。こうした結果は、生物多様性保全における遺伝的解析の重要性と、遺伝的多様性を残すために早急な対策が必要なことを示している。

## [キーワード] 遺伝的多様性、ミトコンドリアDNA、外来遺伝子、交雑、淡水魚

### 1. はじめに

日本列島は複雑な地史を経て形成されたことから、比較的小さな地理的スケールの中にも多様な生物相が生じている。特に、淡水魚は水系ごとに隔離される傾向にあるため、地域ごとに異なる種が分布し、あるいは同種であっても地域固有の遺伝的特徴を持つ個体群に分化している（渡辺ほか 2006）。しかし、国内での人為的な移殖によって、その地域に分布していなかった淡水魚の侵入・定着や、同種の地域個体群の遺伝的かく乱が引き起こされている（Sato et al. 2010）。
この問題は「日本国内における国産の」淡水魚の移殖であるために、生態系に影響を及ぼす重要な外来種問題であることが一般市民に認識されておらず、さらには遺伝的かく乱についての現状把握は、ほとんど行われていない。このまま問題を放置すれば、日本列島が形成されてから数百万年の時間をかけて形成された各地域固有の淡水魚類相が、人為的移殖によって均質化し、遺伝的多様性が失われ続けていくと考えられる。海外においても、アメリカ合衆国などでは魚類相の均質化の問題が主張されつつあるが（Rahel 2000）、多くの国では自国内における淡水魚の移殖が、魚類の地理的多様性と遺伝的多様性の大きな損失を引き起こすことは、ほとんど問題視されていない。したがって、淡水魚の国内移殖が、「生態系に影響を与え」、「希少魚の絶滅を引き起こし」、「何百万年もかけて形成された生物の地理的多様性を失わせている」ことを科学的データによって明示し、国内外来魚問題への対処に関する社会的合意を得ることは、日本国内の問題としてのみならず、国際的な生物多様性の保全のためにも重要である。

### 2. 研究開発目的

本サブテーマ1では、豊富な淡水魚が分布し、希少魚種なども多く残っている九州北部を中心に、国内移入魚による遺伝的かく乱の現状を解明し、サブテーマ2における予測モデルと連携させることを目的とした。さらに、九州以外のモデル地域として、東海地方の淡水魚における遺伝的かく乱の現状について解明することを目的とした。東海地方は九州北部と同様に、多くの絶滅危惧種を含む豊富な淡水魚が分布している地域であり、複数地域の比較は国内移殖の問題の一般性を示す上で重要と考えられる。特に、日本における国内外来魚の拡散の主要なソースと考えられるのは琵琶湖産アユの種苗放流への様々な魚種の混入であり、琵琶湖から地理的に近い東海地方における遺伝的かく乱の現状を、地理的に遠い九州北部と比較することも重要である。したがって、こうしたモデル地域における国内外来魚の影響の現状を解明し、生物多様性保全のために社会的な啓発をおこなうことを研究開発目的とする。

### 3. 研究開発方法

国内外来魚による遺伝的かく乱の現状解明のために、次の4つの調査をおこなった。

（１）基礎情報としての淡水魚の遺伝子データの取得

（２）モデル地域における外来遺伝子侵入状況の調査

（３）系統地理学的解析による分布かく乱の解明

（４）外部形態の変異などを指標にした交雑の実態解明

以下に、それぞれの方法の詳細を述べる。

## （１）基礎情報としての淡水魚の遺伝子データの取得

国内外来魚による種内の遺伝子かく乱の現状把握のためには、対象とする種の地理的変異を明
らかにする必要がある。国内のさまざまな地域の遺伝子データがなければ、国内移殖による外来遺伝子の侵入を検出することはできない。そこで、本研究では、西日本に広く分布し、国内移殖による影響が予想される魚種としてコイ科のモツゴ、オイカワ、ゼゼラ、メダカ科のメダカ南日本集団、ドンコ科のドンコ、ハゼ科のカワヨシノボリを主な対象として選定し、遺伝子データを収集した。ゼゼラとメダカ南日本集団は、公表されている既存のミトコンドリアDNAの塩基配列データ(Takehara et al. 2003；堀川ほか 2007)を利用した。モツゴとオイカワは、平成19-20年度の地球環境研究総合推進費「国内移入魚による生態系攪乱メカニズム究明とその監視手法の構築」（課題番号RF-075）においておこなったミトコンドリアDNAの解析データを使用した。ドンコとカワヨシノボリは、アロザイム分析によって推定された地理的グループ（Sakai et al. 1998；Shimizu et al. 1998）を網羅するように西日本各地で採集し（図(1)-1、(1)-2）、ミトコンドリアDNAの部分塩基配列の決定を行った。

図(1)-1 ドンコの採集地点。

色の違いはアロザイム分析で分けられた地域グループ $ ^{6)} $ に対応している。

図(1)-2 カワヨシノボリの採集地点。 色の違いはアロザイム分析で分けられた 地域グループ $ ^{7)} $ に対応している。

ただし、ミトコンドリアDNAの解析だけでは、採集した個体が他地域から移殖された個体と交雑しているかどうか（遺伝子かく乱が生じているかどうか）判断できないという問題がある。しかし、既存の研究によって蓄積されたデータが利用可能であり、地理的分化が明瞭で、外部形態では判別できない外来遺伝子の当該地域への侵入の検出が可能という点で、極めて有用なマーカーである。今後の応用を前提とした場合、予算や人員、技術に制限のある研究機関や教育機関においても、比較的簡易に実験可能で、当該地域の個体から得たデータをデータベース上の他地域産データと照合するだけで外来遺伝子の侵入がモニタリングできるという点もミトコンドリアDNAの著しい利点である。そこで、本研究課題では、遺伝子かく乱の前提となる同一種の国内移殖の現状を広くモニタリングするために、主として外来のミトコンドリアDNAの侵入状況を明らかにすることとした。

DNAの抽出はキアゲン社のDNeasy Blood & Tissue Kitを使用し、Ex Taq DNA polymerase（タカ
ラバイオ株式会社）でミトコンドリアDNA（mtDNA）の部分塩基配列の増幅を行った。ドンコとカワヨシノボリについては、Cyt b遺伝子の増幅用プライマーを新たに開発し、Cyt b遺伝子のほぼ全長である約1000塩基対を増幅した。PCRで増幅した産物はExo-SAP ITキット（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）で精製し、Big Dye Terminater Cycle Sequencing Reaction Kit ver.3.1（アプライドバイオサイエンス株式会社）を用いてシークエンス反応をおこなった。反応産物はClean SEQ（株式会社バイオメディカルサイエンス）で精製した後、ABI3100（もしくは3130）Genetic Analyzerを用いて塩基配列の決定をおこなった。得られた塩基配列はABI社のフリーソフトEdit Viewで波形確認と修正をおこなった後、PAUP*4.0を用いて樹状図を作製し、各種のミトコンドリアDNAの地理的分化を調べた。

## （２）モデル地域における外来遺伝子侵入状況の調査

上述の対象魚種については、同様の手法でミトコンドリアDNAの部分塩基配列を九州および東海地方（主として岐阜県の濃尾平野地域）で採集した個体について決定し、解析した。コイ科魚類のPCRおよびシークエンスには、平成19-20年度の地球環境研究総合推進費（RF-075）で開発したコイ科用プライマーを用いてCyt b遺伝子の全長（1141bp）を含む遺伝子領域の増幅をおこなった。メダカはTakehana et al.（2003）のメダカ用プライマーを用いて同様にCyt b遺伝子の全長を増幅した。得られた塩基配列については、上述の方法で得られた日本各地の同種の塩基配列データとともにPAUP*4.0を用いて樹状図を作製し、どの地域集団に由来するものかを判断した。

その他の淡水魚についても、随時サンプル採集とミトコンドリアDNAの解析を行い、情報を集めた。

## （３）系統地理学的解析による分布かく乱の解明

日本国内において明瞭な地理的分化が見られる種においても、九州内での移殖などの遺伝的に類似した集団間での分布かく乱の特定は容易ではない。しかし、野生生物の遺伝的変異から過去の分布変遷を推定する手法が考案されており、そうした手法を応用することで不自然な遺伝的変異の分布が検出可能と考えられる。そこで、九州産モツゴのミトコンドリアDNAの在来系統を対象にフリーソフトTCS1.21を用いてハプロタイプネットワークを推定し、採集地点の緯度経度とハプロタイプネットワークからフリーソフトGeoDis2.6で階層クレード分析（Nested clade phylogeographical analysis）をおこなった。

## （４）外部形態の変異などを指標にした交雑の実態解明

遺伝子かく乱の解明のためには、国内移殖によって他地域由来の個体との交雑が生じていることも示す必要がある。本研究課題では、さまざまな魚種を対象とすることから外来遺伝子の個体群への侵入の概要を知るためにミトコンドリアDNAを指標として現状把握をおこなったが、ヨシノボリ類については各地域固有の近似種間での色斑の相違とミトコンドリアDNAの系統をもとにして交雑の推定をおこなった。交雑についての調査は、岐阜県岐阜市の長良川と、三重県鈴鹿市のため池におけるヨシノボリ類を対象に行った。

東海地方には、琵琶湖からアユなどの種苗放流に混入して侵入したと考えられるトウヨシノボリ、瀬戸内海周辺地域からヘラブナ（ゲンゴロウブナの改良品種）などの放流に混入したと考え
られるシマヒレヨシノボリ、伊勢湾周辺の平野部に固有の在来種のトウカイヨシノボリといった止水性の近縁なヨシノボリ類が分布しており、それらは外部形態の色斑で識別されている（鈴木ほか 2010）。これらの分布概要は、岐阜市については「岐阜市自然環境基礎調査」、鈴鹿市については鈴鹿市の「重要生態系地域の自然環境調査」で調べられていることから、それぞれの地域内での代表的な生息地を選定し、採集を行った。採集した個体の色斑的特徴はデジタルカメラで記録し、ミトコンドリアDNAの部分塩基配列を決定した。これらのヨシノボリ類については、Mukai et al. (2005)で公表済みの日本産ヨシノボリ属のND5遺伝子の部分塩基配列と比較するため、本研究でもミトコンドリアDNAのND5遺伝子の部分塩基配列約1000塩基対を解析した。

## 4 ．結果及び考察

## （1） 基礎情報としての淡水魚の遺伝子データの取得

モツゴ、オイカワ、ゼゼラ、メダカの4種については、データベース上に公表されているデータや、本研究課題に先立って行った研究のデータを利用したが、ドンコとカワヨシノボリについては、本研究課題で新たにミトコンドリアDNAの地理的変異の概要を明らかにした。

ドンコは西日本の39地点から採集した129個体についてCyt b遺伝子1107塩基対の塩基配列を決定した。その結果、43種類のハプロタイプが見いだされ、それらは地理的にまとまりのあるグループを形成した（図(1)-3）。Sakai et al.（1998）のアロザイム分析では、「山陰・琵琶・伊勢」「東瀬戸」「西瀬戸」「西九州」の4グループに分けられていたが、ミトコンドリアDNAの系統樹もほぼ同様の地理的分化を示していた。ただし、アロザイム分析でまとめられていた「山陰・琵琶・伊勢」のミトコンドリアDNAは山陰地方（ハプロタイプ14-18）とそれ以外の地域（ハプロタイプ1-13）で大きく遺伝的に分化しており、「東瀬戸」と「西瀬戸」のミトコンドリアDNAは明確に分化していなかった。ドンコは関東地方に国内外来種として侵入定着した水系があることが知られているが（向井・西田 2003）、今回の調査範囲ではすべての個体が地理的にまとまりのある系統に含まれており、外来遺伝子の侵入は見いだされなかった。

カワヨシノボリは50地点から採集した268個体についてCyt b遺伝子1115塩基対の塩基配列を決定した。その結果、62種類のハプロタイプが見いだされ、それらは地理的にまとまりのあるグループを形成した（図(1)-4）。中部地方から瀬戸内地方においては、Shimizu et al.（1993）のアロザイム分析の結果と比較的よく一致したが、中国地方西部から九州、四国太平洋側の個体のミトコンドリアDNAは著しく分化しており、アロザイム分析によって推定された集団構造とは大きく異なっていた。ただし、アロザイム分析の結果とは異なるものの、ミトコンドリアDNAの系統の地理的まとまりは非常に明確であり、移殖による外来遺伝子の侵入は見られなかった。カワヨシノボリにおいても関東地方に国内外来種として侵入定着した水系があることが知られているが（樋口・福嶋2007；斎藤ほか2010）、今回の調査地点における外来遺伝子の侵入は見いだされなかった。
図(1)-3 ドンコのミトコンドリアDNAハプロタイプ間の近隣結合法による系統樹。外群はインドンコ（Odontobutis hikimius）とKim et al.（2008）によるコウライドンコ（O. platycephala）。
図(1)-4 カワヨシノボリのミトコンドリアDNAハプロタイプ間の近隣結合法による系統樹。外群はトウヨシノボリ（Rhinogobius kurodai）とトウカイヨシノボリ（R. sp. TO）。

## （２）モデル地域における外来遺伝子侵入状況の調査

主な調査対象とした6魚種（モツゴ、オイカワ、ゼゼラ、メダカ南日本集団、ドンコ、カワヨシノボリ）のうち、ドンコとカワヨシノボリについては、国内移殖と考えられるものは見出されなかった。メダカ南日本集団は、Takehana et al.（2003）において九州本島から40地点153個体のミトコンドリアDNAが調査されており、本研究でも6地点36個体追加解析したものの、国内移殖に由来すると思われるミトコンドリアDNAは発見されなかった。これら3魚種の国内移殖は観賞魚店等で販売された個体に由来すると考えられているが（向井・西田 2003；樋口・福嶋 2007；斎藤ほか 2010；竹花・北川 2010）、自然分布域内での遺伝的かく乱は、今のところ限定的であ
ると考えられる。

一方、コイやフナ類、アユなどの水産有用魚種への混入による国内移殖が生じていると考えられるモツゴ、オイカワ、ゼゼラについては、自然分布域においても広域にわたって外来遺伝子の侵入が見られた。各魚種の結果を以下に示す。

## 1 ）モツゴ

平成19-20年度の地球環境研究総合推進費（課題番号RF-075）において、東北地方から九州まで日本各地のモツゴを採集してミトコンドリアDNAの解析を行った結果、日本産モツゴには「東日本」「西日本」「九州」「大陸」の4系統があることが明らかとなった。本研究課題では、九州北部における現状を詳細に把握するため、新たに46地点から採集した318個体についてCytochrome b遺伝子の塩基配列を決定した（図(1)-5）。その結果、37地点に九州系統のミトコンドリアDNAが分布していたが、九州系統のみ確認されたのは9地点だけであり、残りの28地点（九州系統の分布地点の76%）には外来遺伝子が侵入していることが明らかになった。モツゴはモデル地域である九州北部での十分なサンプリングと解析ができたため、サブテーマ2において遺伝子かく乱侵攻予測モデルに使用した。外来遺伝子の分布についての考察はサブテーマ2で詳述する。

図(1)-5 九州北部におけるモツゴの4系統のミトコンドリアDNAの分布。円グラフで各系統の割合を示している。

九州北部において著しい外来遺伝子の侵入が見られたため、東海地方（岐阜県と愛知県）における現状の調査も行った。29地点230個体のミトコンドリアDNAの系統判別を行った結果、在来と考えられる東日本系統が24地点に分布しており、そのうちの13地点（東日本系統の分布地点の54%）で外来遺伝子の侵入が確認できた（図(1)-6）。東海地方のモツゴの外来遺伝子の分布を図示する
と愛知県において外来遺伝子の頻度が高く、岐阜県では東日本系統のみが分布する地点が多いと考えられた。このことから、東海地方のモツゴの外来遺伝子侵入状況は、九州と比較すると相対的に軽微であり、特に岐阜県においては在来個体群が比較的多く残されている可能性が示された。

図(1)-6 岐阜県と愛知県におけるモツゴの3系統のミトコンドリアDNAの分布。円グラフで各系統の割合を示しており，緑は在来と考えられる東日本系統，青は西日本系統，黄は大陸系統。

## 2 ）オイカワ

オイカワについても、平成19-20年度の地球環境研究総合推進費（課題番号RF-075）において日本各地で採集を行い、ミトコンドリアDNAに「東日本」「西日本」「九州」の3系統があることが明らかとなっている。本研究課題では、九州北部と東海地方における現状を調査した。その結果、九州北部と東海地方では、琵琶湖産アユの種苗放流に混入したと考えられる琵琶湖由来の外来ミトコンドリアDNAの侵入率に大きな違いがあった。九州北部における琵琶湖由来の外来遺伝子はわずかであり、国内移殖が生じているのは明らかだが、その頻度は少ないと考えられた（表(1)-1）。

表(1)-1 九州北部におけるオイカワの在来および外来ミトコンドリアDNAの分布

琵琶湖系統	九州在來	合計個体数	侵入率(%)
福岡一貢山川	14	14	0.0
福岡遠賀川	1	10	11	9.1
福岡黒川	12	12	0.0
福岡ずいぼし	1	1	0.0
福岡太刀洗川	2	2	0.0
福岡釣川	1	12	13	7.7
福岡長野川	6	6	0.0
福岡西川	1	1	0.0
福岡祓川	4	5	9	44.4
福岡二ッ川	7	7	0.0
佐賀牛津川	15	15	0.0
熊本菊池川	2	2	0.0
熊本緑川	11	11	0.0
熊本明辰川	13	13	0.0
大分山南	2	2	0.0
大分湯布院	5	5	0.0

一方、東海地方においては多くの地点で琵琶湖由来の外来遺伝子の侵入が確認されており、水
系ごとにまとめた場合、庄内川水系以外の主要な河川で琵琶湖産のオイカワのミトコンドリアDNAが確認された（表(1)-2）。また、同一水系内でも地点ごとに差があり、ダム湖において外来遺伝子の頻度が高いことが示された（図(1)-7）。

表(1)-2 東海地方におけるオイカワの在来および外来ミトコンドリアDNAの分布

琵琶湖系統	在來	合計個体數	侵入率(%)
木曾川水系	7	11	18	38.9
長良川水系	11	97	108	10.2
揖斐川水系	7	17	24	29.2
庄内川水系	51	51	0.0
矢作川水系	2	7	9	22.2
豊川水系	1	14	15	6.7

図(1)-7 岐阜県におけるオイカワの在来（東日本系統）および外来（西日本系統：琵琶湖由来）ミトコンドリアDNAの分布

## 3 ）ゼゼラ

ゼゼラについては、オイカワと同様に琵琶湖産アユの種苗放流に混入して分布を拡大したと考えられており、九州北部（堀川ほか 2007）と東海地方（堀川・向井 2007）における琵琶湖由来の外来ミトコンドリアDNAの侵入が報告されている。本研究課題では佐賀市の北山ダムの個体群（6個体）と自然分布かどうか不明だった山陽地方の個体群（18個体）のデータを追加して解析した。その結果、佐賀市の北山ダムは1個体のみ琵琶湖由来のmtDNAであり、残り5個体は九州在来型mtDNAであった。北山ダムにおける在来／非在来mtDNAの比率は佐賀平野の個体群（堀川ほか2007）と同様であり、国内移殖された琵琶湖型mtDNAが優占することはなかった。山陽地方のゼゼラについては、琵琶湖産と非常に近縁だが、固有のハプロタイプのみ分布していたため、ゼゼラ
の自然分布域に山陽地方も含まれることが明らかになった（Watanabe et al. 2010）。

## （３）系統地理学的解析による分布かく乱の解明

九州北部において国内移殖の影響が顕著なモツゴについて、8地点から得られた9種類の九州在来系統のハプロタイプ（表(1)-3）について、ハプロタイプネットワークを推定し（図(1)-8）、階層クレード分析を行った（図(1)-9）。その結果、一部のmtDNAハプロタイプが不自然な分布をしており、それらを除くと地形に対応した地理的隔離と分布拡大を示す結果が得られた。このことは、九州内部での移殖による遺伝的かく乱が生じていることを示唆しており、過去の歴史を示す遺伝的証拠が、九州内での国内移殖によって失われつつあるものと考えられる。

表(1)-3 階層クレード分析に用いたモツゴ九州在来系統のミトコンドリアDNAハプロタイプの分布.

九州系統ハブロタイプの分布	N	K1	K2	K3	K4	K5	K6	K7	K8	K9
福岡県 水崎川	5	5
福岡県 遠賀川水系穂波川	4	1	3
福岡県 遠賀川水系遠賀川	7	2	2	2	1
福岡県 遠賀川水系山田川	3	1	1	1
福岡県 筑後川水系大刀洗川	4	4
福岡県 二矢部川水系ニツ川	9	2	7
佐賀県 牛津川	3	3
熊本県 菊地川	6	1	3	2

丸で囲ったものは地理的に離れた場所に分布している

図(1)-8 モツゴの九州在来系統のmtDNAハプロタイプ間のネットワーク。各ハプロタイプは3段階の階層（1,2,Total）にまとめられる。地理的分布に有意な偏りのあるクレードは*で示した。