Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
### 5. 本研究により得られた主な成果

## (1) 科学的意義

本研究の結果から、血中 PCB 濃度が増加すると精子数 x 運動率などの指標が減少し、乏精子症の発生が増えることが示唆された。年齢、喫煙習慣などを調整しても関連性は一貫したものであり、男性不妊において PCB ばく露の重要性が示唆された（図 5）。

図5 共分散構造分析（SEM）

本資料は、曝露回避に必要な行政的な基礎資料として、国民に提示することができ、また、少子化対策、不妊症治療の技術向上と医療行政に貢献できると考えられる。

## (2) 環境政策への貢献

過去に環境中に放出された化学物質は、長期間に渡り環境中に残留し、生物濃縮を経てヒトに取り込まれる。従って、化学物質のヒト生殖細胞への影響は、少子化問題を抱える我が国においては、重要な課題である。PCBが、精子の数、質に影響を及ぼすことが明らかになり、回避する方法を考案し、リスクコミュニケーションとして、市民に伝える事が、求められている。特に強調したい点は、リスクの存在だけでなく、どのようにすればリスクを回避できるのか、そしてその効果はどのくらいあるのかを、実証的なデータを併せて提示することにあると考える。本研究結果は、そのリスクコミュニケーションに必須の実証的なデータを、食を含めた生活習慣の安全性と有効性を含め、準備した。

## ＜行政が既に活用した成果＞

現在のところ行政が活用した成果はない。

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

我が国における化学物質暴露、特にPCB類のヒト男性精子への直接作用について、科学的根拠を基に世界で初めて明らかにした。今後本研究は、化学物質について暴露回避に重要な行政資料となると考えられる。また不妊娠に関するリスクとして、そのリスク情報を公開することに有用である。
### 6. 研究成果の主な発表状況

## (1) 主な誌上発表

## <査読付き論文>

1) Hiura H, Okae H, Kobayashi H, Miyauchi N, Sato F, Sato A, Suzuki F, Nagase S, Sugawara J, Nakai K, Yaegashi N. and Arima T: BMC Medical Genomics, 5, 8-17 (2012)

“High-throughput detection of aberrant imprint methylation in the ovarian cancer by the bisulphite PCR-Luminex method”

く査読付論文に準ずる成果発表＞（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可）

## (2) 主な口頭発表 (学会等)

1) 有馬隆博：第9回統合産婦人科研究合同セミナー（2011）「エコチルについて」

2) 有馬隆博：第6回日本生殖再生医学会（2011）「ARTにおけるエピジェネティック機構」

3) 有馬隆博：第 28 回日本医学会総会（2011）「生殖補助医療とインプリンティング異常」

4) 有馬隆博：第 96 回東北医学会総会（2011）「ゲノムインプリンティングとヒト疾患」

5) 有馬隆博、岡江寛明：第4回生殖系列の世代サイクルとエピゲノムネットワーク会（2011）「胎盤特異的インプリント遺伝子の役割」

6) 卵巣に関する国際カンファレンス 2012 "The International Ovarian Cancer 2012" 「ART and Epigenetic Errors - Abnormal DNA methylation in imprinting disorders after ART」 有馬隆博 2012.3.17 東京

7) 日本生殖再生医学会・第 7 回学術集会 「ART におけるエピジェネティク機構」 有馬隆博 2012.3.25 東京

8) Planet xMAP Japan 2012 「男性不妊娠精子のインプリント遺伝子を標的とした DNA メチル化解析」 有馬隆博 2012.5.16 東京

9) 2012 セント・ルカセミナー「胎盤形成とゲノムインプリンティング」有馬隆博 2012.6.3 大分

10) 第 11 回学術集会日本不姫カウンセリング学会「生殖医療とエピジェネティクス」有馬隆博 2012.6.8 東京

11) 第 5 回生殖系列の世代サイクルとエピゲノムネットワーク「Non-random loss of imprinting in cloned mice」 有馬隆博 2012.11.20-21 京都

12) 第 22 回環境化学討論会「GCxGC-TOF/MS を用いたヒト血液中の有機化学物質測定」有馬隆博 2013.7.31-8.2 東京

### 7. 研究者略壓

課題代表者：有馬隆博

九州大学医学系研究科産婦人科学専攻修了、医学博士、現在、東北大学大学院医学系研究科教授

## 研究参画者

(1): 八重樫 伸生

东北大学医学部卒業、医学博士、現在、東北大学大学院医学系研究科教授

(2): 有馬隆博（同上）

(3): 松村徹

東海大学海洋学研究科海洋科学専攻修了、理学博士、現在、（株）いであ・環境創造研究所副所長

## (4) :仲井邦彦

北海道大学環境科学研究科社会環境学専攻修了、学術博士、現在、東北大学大学院医学系研究科教授
# C-1008 エピゲノム変異に着目した環境由来化学物質の男性精子への影響に関する症例対照研究

(1) 症例対照試験の実施・患者登録に関する研究

東北大学大学院 医学系研究科 有馬隆博・八重樫伸生

研究協力者

セント・ルカ生殖医療研究所 宇津宮隆史・佐藤晶子

平成 22～24 年度累計予算額：2,451 千円

（うち、平成24年度予算額：807千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

ヒト精子濃度や運動率およびエピゲノムに影響を及ぼす環境由来化学物質を同定し、科学的成果を得ることを本研究の目的としている。本サブテーマでは、症例・対照の患者精子および血液のサンプルの収集と患者基本情報、質問票による調査研究を行った。研究を実施する前に東北大学医学部および研究協力機関で倫理委員会に本研究内容に関する資料を提出し、承認を得て研究を開始した。

産婦人科外来を受診された男性患者のうち、採血および精液検査を実施した患者に、本研究内容について説明し、同意を得られた方を対象とした（内分泌異常を示す2例は除外した）。精液検査において精子数が少ない（＜20×10^{6}未満/ml）乏精子症群の患者を症例群として、78名（重症型34例）登録、対照（正常精子）は188例、総計266例を3年間（H22.4～H25.3）で登録した。平均年齢はそれぞれ36.2±5.5（27-52）、35.2±5.6（25-53）で、2群間に有意差は認められなかった。さらに年齢、身長、体重の基本属性と、生活環境（居住地）、職業、習慣、飲酒、喫煙、食事摂取頻度など30項目のアンケート調査を行い、精子減少との関連性について評価した。その結果、喫煙率が高い場合と職業で染料を扱う場合に乏精子症の頻度が高いことが示された。また、炭酸飲料摂取頻度が高いと精子濃度が低い傾向がみられた。

[キーワード]

ヒト精子、乏精子症、症例・対照研究、生活環境調査

### 1. はじめに

最近、我が国の晩婚化、少子化の社会情勢と、医療技術の進歩により、既婚者の15-20%が不姫治療を受けている。その40%は男性不姫(精子異常)で、漸増傾向にある(図(1)-1,表(1)-1)。以前より、エストロゲン様作用を有する環境由来化学物質がヒトの性腺（生殖細胞）に影響を及ぼし、オスのメス化、精子数減少に影響を与え、種の存続に関わることが社会的話題となっ
たが、その関連性については、十分な科学的根拠がないため、未だ明らかにされていない（表(1)-2）。最近、この化学物質は、遺伝子のプロモーター等の後成的（エピジェネティックな）修飾による遺伝子発現に影響を及ぼすという仮説が検証されようとしている $ ^{1} $ 。エピジェネティクス（エピゲノム情報）とは、DNAの塩基配列の変化を伴わない、遺伝子発現制御に関わる後付けの修飾である。主たる現象として、DNAのメチル化、ヒストンのアセチル化やメチル化が知られている。このエピジェネティックな修飾は、生殖細胞形成過程では、『細胞の記憶』として遺伝子刷り込み機構（ゲノムインプリンティング）として知られている $ ^{2)} $ 。このインプリンティングとは、特定の親由来の遺伝子が選択的に発現する現象で、哺乳類の正常な発生、分化に必須な現象である $ ^{3)} $ 。また、この機構の破綻は、先天性疾患に限らず、乳幼児の行動、性格異常、成人疾患にも影響を与える。

図(1)-1 不妊娠治療患者数の年次推移

表(1)-1 不妊娠の原因

1	男性因子	40−50%
2	内分泌因子（排卵因子）	20−25%
3	卵管因子	30−40%
4	子宫因子	15−20%
5	颈管因子	10−15%
6	子宫内膜症
7	免疫学的因
8	原因不明
表(1)-2 環境由来化学物質の生息細胞への影響に関する報告例

化学物質	用途	生殖細胞への影響	生物種
トリブチルスズトリフェニルスズ	塗料	雌の雄化	巻貝類
ノニルフェノール	界面活性剤の分解物	雌雄同体	コイ
DDTディコホル	農薬	生殖器矮小化精巣機能不全	ワニ
ダイオキシンDES	農薬流産防止剤	精子数の減少精巣機能低下	ヒト

(（社）日本化学工業協会、（社）日本化学物質安全・情報センター）

最近、生体試料中の化学物質の高感度分析法が進歩し、いくつかの化合物に関しては精漿内組織濃度の測定が可能となった。少子化社会である我が国では、年間2万人ものART（生殖補助医療技術）出生児が誕生し、今後もART出生児が増加することが予想されるため、化学物質の生殖細胞、とりわけ精子数・量の異常やエピジェネティックな修飾異常に起因するインプリント異常との関連は、次世代社会の最も重要な用件の一つとして、早急な対応が求められている。本研究では環境由来化学物質がヒト精子のエピゲノム異常に関与し、男性不妊娠に影響するのではないかという仮説のもとに研究を実施する（図(1)-2）。

本サブテーマでは、症例・対照の患者精子および血液のサンプルの収集することを目的としている。同時に質問票による調査も行った。参考資料(1)-1に質問票と結果を示す。

図(1)-2 研究仮説
## 2 ．研究開発目的

低用量の環境由来化学物質（以降、化学物質）の長期曝露は、ヒトの生態（生殖細胞）系および性腺に対して深刻な影響を及ぼす危険性をはらんでおり、ヒトへの影響を明らかにすることは環境保全上の重要課題であり、早急な対応が求められている。中でも環境残留性と人体への強い有害性が問題となっているPCBやDDTには内分泌かく乱作用があり、性比や精子数の減少に影響を与えることが議論を呼んでいる。また、臭素化物系の難燃剤も曝露レベルの増加が懸念されている。このような化学物質のヒト健康影響を評価するためには、動物やヒト細胞などを用いた実験の知見に加えて、ヒトそのものを対象とする疫学研究による証拠が不可欠である。しかしながら、現状では父親への曝露や、ヒト精子への影響に関する疫学的研究は世界的にも極めて少ない。ダイオキシン類やPCBではいくつかの報告も散見するが、多様な化学物質を対象とした網羅的な研究はなく、また低用量域における長期間曝露について一般集団を対象に検討した研究は報告されていない。

本研究では、成人男性末梢血内の化学物質濃度とヒト精子形成への影響について、形態と機能の両面から解析を行い、交絡要因を十分考慮しながら関連性を評価することを目的とした。サブテーマ1では、症例・対照試験の実施、患者登録をすることを目的とした。同意に、生活習慣などのアンケート調査を行った。研究体制を図(1)-3に示す。

図1-3 研究体制

### 3. 研究開発方法

不妊症男性精子のうち顕微鏡による精液検査（精子数、運動率、奇形率）を行い、乏精子症患者精子（目標100例）をランダムに抽出する。この症例群に対して、年齢、居住地、生活習慣などをマッチさせた正常精子群（目標200例）を対照とした。同時に以下の項目についても検討した。精液所見による分類を表(1)-3に示す。

対象：産婦人科外来受診時、採血・精液検査を行った患者のうち、本研究の説明を行い、同意を得られた患者。患者基本情報はカルテより転記。

ただし、内分泌疾患などは除外した。

試料：血液（特定の採血管2本に採血）

精液（精液検査後、臨床には使用しない検体）
方法：以下の手順で行う。

1）採血（環境由来化学物質測定用 $ 8ml \times 2 $ 本、ホルモン測定用）

測定したホルモンは LH、FSH、プロラクチン、テストステロン

2）健康と日常生活に関するアンケート

アンケート内容…年齢、身長、体重、生活環境（居住地）、職業、習慣、

飲酒、喫煙、食事摂取頻度など

表(1)-3 精液所見による分類

(1)

正常精液	基準値を満たすもの
乏精子症	精子濃度 20×106/ml 未満
精子無力症	運動率 50% 未満
奇形精子症	形態正常精子 15% 未満

(2)

乏精子症

中等度乏精子症：精子濃度 $ 5 - 20 \times 10^{6}/ml $

重症型乏精子症：精子濃度 $ 5 \times 10^{6}/ml $ 未満

## 4 ．結果及び考察

東北大学ではセント・ルカ産婦人科から回収した試料を匿名化し、記号にて保管管理を行った。個人情報の保護に関して厳密に行った。

## （１）患者基本情報の比較

対象：セント・ルカ産婦人科にて初診時、採血・精液検査をおこなった。

患者のうち同意を得られた患者

試料：血液（特定の採血管2本に採血）

精液（精液検査後、臨床には使用しない検体）

方法：以下の手順でおこなう。

1 採血（環境由来化学物質測定用 $ 8ml \times 2 $ 本、ホルモン測定用）

測定したホルモンは LH、FSH、プロラクチン、テストステロン（表(1)-4）

2 健康と日常生活に関するアンケート

アンケート内容 年齢、身長、体重、生活環境（居住地）、職業、習慣、飲酒、喫煙、食事摂取頻度など

成果：登录患者数 266 名

乏精子症患者 78 名（中等度：44 名、重症型：34 名）

正常精子の患者 188 名
$$ \begin{aligned}& 平均年龄 \quad 全体 \quad35.5\ (25-53)\\& 乏精子症患者 \quad36.2\pm5.5\ (27-52)\ ( 中等度 :36.1\pm4.2、重症型 :36.4\pm6.9)\\& 正常精子の患者 \quad35.2\pm5.6\ (25-53)\end{aligned} $$

年齢および BMI（ボディマス指数）に関しては、2 群（3 群）間で統計学的に有意な違いは認められなかった（図(1)-4、図(1)-5、図(1)-6）。しかし、加齢とともに乏精子症の頻度が高くなる傾向を示した。症例・対照群のホルモン検査の比較を表(1)-4 に示す。

表(1)-4 症例・対照群のホルモン検査の比較

全体(n=266)	正常精子(n=188)	乏精子症患者(n=78)
LH(mIU/ml)	3.5	3.1	4.2
FSH(mIU/ml)	7.8	5.9	11
プロラクチン(ng/ml)	9.3	8.9	10.1
テストステロン(ng/dl)	460	451	475

(平均值)

図(1)-4 年齢の分布
年龄	正常 n=132	乏精子症 (中等度) n=38	乏精子症 (重度) n=27	全体
平均	35.2	36.1	36.1	35.5
標準偏差	5.6	4.2	6.9	5.2

図(1)-5 年齢と精子所見の関連

図(1)-6 BMI の分布
## （２）生活習慣からみた乏精子症

表(1)-5 生活習慣と乏精子症に関する疫学調査

項目	正常
n=188	乏精子症
(中等度)
n=44	乏精子症
(重度)
n=34
平均年龄
(標準偏差)	35.2
(5.6)	36.1
(4.2)	36.4
(6.9)
身長(cm)	<=165	16.3	22.7	14.7
165-175	60.9	47.7	52.9
>=175	16.3	22.7	14.7
体重(kg)	<=65	37.8	34.1	29.4
65-75	26.5	34.1	44.1
>=75	35.7	31.8	26.5
BMI	<25	64.7	61.4	70.6
>=25	35.3	38.6	29.4
最終学歷	大学、大学院	43.2	60.0	51.9
高校、その他	56.8	40.0	48.1
年収(万円)	<420	57.8	45.7	56.0
>=420	42.2	54.3	44.0
平均睡眠(時間)	<7	37.8	38.9	55.6
>=7	62.2	61.1	44.4
運動	する	50.0	57.1	40.7
しない	50.0	42.9	59.3
タバコ	吸う	25.5	27.8	42.9
吸わない	40.1	44.4	35.7
やめた	34.4	27.8	21.4

生活習慣に関するアンケートの結果と精子所見との関連を表(1)-5に示す。
学歴では、高いほど乏精子症の頻度が高い傾向にあるが、受診する患者の傾向を反映しているのかもしれない。つまり、高学歴の人ほど受診するのかもしれない。あるいは、社会のストレスが多い場合に精子減少と関連するのかもしれない（表(1)-5、図(1)-7）。

<檢定>	N	自由度	$ (-1) $ *对数尤度	R2乘(U)
166	1	0.70538842	0.0069

図(1)-7 学歴_短大=low と乏精子（ロジ解析用）の分割表に対する分析

喫煙の有無に関しては、精子濃度との関連が示された（図(1)-8）

<檢定>	N	自由度	(-1)*对数尤度	R2乘(U)
169	3	2.7892334	0.0267

図(1)-8 タバコと乏精子（精子濃度 x 運動率）の分割表に対する分析
職業では、染料を扱う人に乏精子症の頻度が高い傾向はあるが、対象者数が少ないため、統計学的有意なものではない（表(1)-5、図(1)-9）

<檢定>	N	自由度	$ (-1) $ ^{*}对数尤度	R2乘(U)
114	3	4.6315363	0.0902

図(1)-9 染料と乏精子症の分割表に対する分析

## （３）食物摂取からみた乏精子症

乏精子症との関連がみられたものは、炭酸飲料摂取頻度であった。炭酸飲料頻度が高いほど精子濃度が低くなる傾向がみられた（負の相関）（表(1)-5、図(1)-10）。

図(1)-10 炭酸飲料と精子濃度 x 運動率の二変量の関係
その他の飲料やコーヒーなどで有意な差は認められなかった（図(1)-11）

図(1)-11 その他飲料と精子濃度 x 運動率の二変量の関係
## 5 ．本研究により得られた成果

## （1） 科学的意義

乏精子症と関連する生活習慣および食物摂取について検討した。症例群が十分ではないが、これまでに、喫煙率が高い場合と職業で染料を扱う場合に乏精子症の頻度が高いことが示された。また、炭酸飲料摂取頻度が高いと精子濃度が低い傾向がみられた。

## （２）環境政策への貢献

## ＜行政が既に活用した成果＞

特に記載すべき事項はない

## ＜行政が活用することが見込まれる成果＞

過去に環境中に放出された化学物質は、長期間に渡り環境中に残留し、生物濃縮を経てヒトに取り込まれる。従って、化学物質のヒト生殖細胞への影響は、少子化問題を抱える我が国においては、重要な課題である。いかなる化学物質が、精子の数、質に影響を及ぼすのか、明らかにし、回避する方法を考案し、リスクコミュニケーションとして、市民に伝えることが、求められている。特に強調したい点は、リスクの存在だけでなく、どのようにすればリスクを回避できるのか、そしてその効果はどのくらいあるのかを、実証的なデータを併せて提示することにあると考える。本研究では、そのリスクコミュニケーションに必須の実証的なデータを、食を含めた生活習慣の安全性と有効性を含め、準備できる。

### 6. 国際共同研究等の状況

特に記載すべき事項はない

## 7 ．研究成果の発表状況

## （1） 誌上発表

## <論文（査読あり）>

特に記載すべき事項はない

<査読付論文に準ずる成果発表>（「持続可能な社会・政策研究分野」の課題のみ記載可。）特に記載すべき事項はない

## くその他誌上発表（査読なし）>

1) 有馬隆博、樋浦仁、岡江寬明、佐藤晶子、宮内尚子、阿部千鶴、林千賀：産婦人科の実際、金原出版株式会社, 741-750 (2011)

「ART におけるエピジェティクス異常」

2) 有馬隆博、樋浦仁、岡江寬明、佐藤晶子、宮內尚子：卵子學，京都大學學術出版會，122-131 (2011)

「ヒト卵子・精子・胚のエピジェティクス」

3) 有馬隆博、樋浦仁、岡江寬明、佐藤晶子、宮內尚子：助產雜誌，医学書院，62, 11 (2011)
「母子の健康と環境影響」

## （2） 口頭発表（学会等）

1) 佐藤晶子、城戸京子、大津英子、有馬隆博、宇津宮隆史：第 17 回遺伝性疾患に関する出生前診断研究会（2010）

「流産後の胎盤絨毛におけるインプリント遺伝子の解析と精液性状・患者背景との関係」

2) 佐藤晶子：第 69 回日本生殖医学会九州支部会（2010）

「ART 後の流産における絨毛染色体検査結果が正常の絨毛と対応精子のメチル化解析」

3) 佐藤晶子、大津英子、長木美幸、熊迫陽子、後藤香里、城戸京子、小池恵、金子奈央、有馬隆博、宇津宮隆史：第 53 回日本哺乳動物卵子学会総会学術講演会（2012）

「ART後の流産における絨毛染色体検査結果が正常核型の絨毛と対応精子のメチル化解析」

4) 佐藤晶子：第 30 回日本受精着床学会総会学術講演会（2012）

「ART 後の流産の絨毛染色体検査結果が正常核型の絨毛と対応精子のメチル化解析」

## （3） 出願特許

特に記載すべき事項はない

（４）シンポジウム、セミナー等の開催（主催のもの）

特に記載すべき事項はない

## （５）マスコミ等への公表・報道等

特に記載すべき事項はない

## (6) その他

特に記載すべき事項はない

### 8 \. 引用文献

1) Away MD, Cupp AS, Uzumcu M, Skinner MK: Science, 308(5727), 1466-9 (2005)

"Skinner MK. Epigenetic transgenerational actions of endocrine disruptors and male fertility"

3) McGrath J, Solter D: Cell, 37(1), 179-83 (1984)

“Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes”
## (2) エピゲノム解析（精子）に関する研究

東北大学大學院 医学系研究科 有馬隆博

研究協力者

東北大学大学院 医学系研究科 樋浦仁・岡江寛明・千葉初音

（株）G&G サイエンス 阿部由紀子

平成 22～24 年度累計予算額：39,771 千円

（うち、平成24年度予算額：12,934千円）

予算額は、間接経費を含む。

## [要旨]

インプリント遺伝子の DNA メチル化は、エピジェネティックな修飾として、外的な変化（環境由来化学物質）に影響を受けやすい特徴がある。本サブテーマでは、新規メチル化解析法（PCR-Luminex 法）を改良し、インプリント遺伝子を標的としたエピゲノム（DNA メチル化）解析を行うことおよび、精子サンプルを用い、メチル化異常の頻度・程度・影響を受けやすい遺伝子について明らかにした。197 例の精子 DNA を用いた解析では、25.4%（50/197）に異常を認めた。その内訳は、精子型インプリント異常 18%、卵子型インプリント異常 82% であった。また、重症型乏精子症患者精子では 74.1%（20/27）にメチル化異常がみられた。このメチル化異常の頻度、程度は、精子数、精子運動率と負の相関を示し、精子奇形率とは正の相関を示した。メチル化異常と精液所見には強い関連は、精子形成がメチル化の獲得に重要であることを意味していると示唆された。

[キーワード] エピジェネティクス、DNA メチル化、インプリンティング、PCR-Luminex 法

### 1. はじめに

ゲノムインプリンティング（遺伝子刷り込み）とは、一方の親から継承した遺伝子が選択的に機能し、他方の遺伝子は機能しないユニークな遺伝子発現様式を示す現象で、哺乳類の胎児の正常な発生、胎盤機能あるいは神経の発達等に重要な役割を果たす $ ^{1,2)} $ 。このゲノムインプリントを受ける遺伝子（インプリント遺伝子）は、2本ある対立遺伝子（アレル）がそれぞれ母由来か、または父由来かを識別し、特定の親由来のアレルの発現（片親性発現）を示す（図(2)-1）。この遺伝子発現調節には、アレル特異的なDNAメチル化が必須であることが、マウスを使ったこれまでの研究で明らかとなっている $ ^{3,4)} $ 。このような領域は、アレル特異的メチル化領域（DMR、Differentially methylated regions）と呼ばれている。このDMRのメチル化は、始原生殖細胞（Primordial germ cells: PGC，精子、卵子の元になる細胞）で消去され、配偶子形成過程では、精子型または卵子型のインプリント（メチル化インプリント）が確立する（精子では精子型インプリント、卵子では卵子型インプリント）。卵子型インプリントは未熟卵から
成熟卵にかけて確立し、遺伝子ごとに原始卵胞期から胞状卵胞期の間に、メチル化獲得の時期が異なっている（図(2)-2 右）。一方、精子形成過程でメチル化を獲得するマウスインプリント遺伝子（精子型インプリント）は、これまでに4つのDMR（H19、Gtl2、Rasgrf1、Zdbf2）が報告されている（図(2)-2 左） $ ^{5-8} $ 。また、ヒトではRasgrf1を除く3種類のインプリント遺伝子が報告されている。マウス雄の生殖細胞の詳細な解析により、4つの遺伝子のDMRは、いずれも有杀分裂期にある前精原細胞でメチル化が確立することが示されている。また、確立したメチル化インプリントは、受精後の着床初期にみられるリプログラミング（ゲノム全体の脱メチル化）の影響を受けることなく、安定に維持される $ ^{9} $ 。また、これらのインプリント遺伝子のメチル化の異常は、様々な疾患や児の発育、発達異常、悪性腫瘍とも関連することも数多くの報告がある $ ^{10} $ 。

図(2)-1 インプリント遺伝子のDNAメチル化による発現調節

インプリント遺伝子には、父由来、母由来のアレルを区別するアレル特異的メチル化領域（DMR）が存在する。この DMR のメチル化は、精子あるいは卵子形成過程で受精前に確立する。
図(2)-2 生殖細胞成長過程における DNA メチル化の獲得

左図）精子形成と精子型インプリントの確立

a：精細管断面の模式図。b：精子形成過程。c：精子型インプリントの確立。有糸分裂期である前精原細胞（胎生14.5日目から出生時）でメチル化が確立する。右図）卵子形成と卵子型インプリントの確立

a：卵胞形成過程。b：卵子形成過程。c：卵子型インプリントの確立。第一減数分裂の複糸期で、分裂がいったん停止して卵子が成熟している間に、段階的に遺伝子毎にメチル化が確立する。

配偶子および初期胚は、DNA メチル化などのエピジェネティックな修飾が、ダイナミックに変動する時期である $ ^{11,12} $ 。環境化学物質は、この時期に非常に脆弱な配偶子のエピジェネティクスに影響を及ぼす可能性が十分ある。不妊症の原因のおよそ半数は男性因子（精子に原因がある）であり、近年増加傾向にあることが報告されている（平成20年日本産婦人科学会不妊登録）。また、精子数が少ない乏精子症では、環境やストレスなどが原因となることも報告されており $ ^{13-16} $ 、乏精子症の精子では、エピジェネティックな異常を有することが予想される。

ヒト精子のメチル化インプリントについては、これまでに報告が少ない。正常なヒト精子では、減数分裂に入る以前に SNRPN（卵子型インプリント）のメチル化が消去され $ ^{17} $ 、H19（精子型インプリント）のメチル化が獲得されると報告されている $ ^{18,19} $ 。Marques らは、乏精子症の患者と少数であるが正常形態を示す精子にも、インプリント遺伝子 H19 にメチル化異常があることを報告している $ ^{16} $ 。一方で、不妊症男性の精子では、インプリント遺伝子のメチル化が全て正
常であったとの報告もある $ ^{20)} $ 。いずれにしても、これらの報告は限られたインプリント遺伝子の解析にすぎず、ヒト精子のゲノムインプリンティングに関する詳細な研究は、まだ十分ではない。

そこで、本研究では、多数例の男性精子のインプリント遺伝子の DNA メチル化について解析するため、簡便な DNA メチル化診断法として PCR-Luminex 法を改良すること、および PCR-Luminex 法を用い精子のメチル化、異常の頻度、程度、影響を受けやすい領域について明らかにすることを目的とした。

## 2 ．研究開発目的

本研究は、ヒト精子への影響を及ぼしうる環境由来化学物質を同定し、科学的成果を得ることを目標としている。そのため本研究の、サブテーマは、以下の2項目である。研究体制を図(2)-3に示す。

## （１）新規DNAメチル化診断法の改良

PCR-Luminex 法を応用し、インプリント領域の異常を判定する診断システムを構築、精子検査法として、従来法との比較検討を行い、測定系を確立させる。

## （２）ヒト男性精子におけるメチル化インプリント異常の解析

PCR-Luminex法を用い、多数例の男性精子におけるインプリント異常の頻度・程度・影響を受けやすい遺伝子について解析する。また、精子のインプリント異常を示す症例の特徴についても検討する。

患者登録に関する研究

テーマ3 いであ(株)環境創造研究所 松村徹

GCxGC/TOF-MSによる網羅的脂溶性化学質の測定

精子のエピゲノム

解析に関する研究

テーマ4 東北大学医学系研究科 仲井邦彦

解析とリスク要因の評価に関する研究

図(2)-3 研究体制

## 3 ．研究開発方法

## （１）新規DNAメチル化診断法の改良

PCR-Luminex 法による、メチル化の測定系を確立させるため、以下の工程について検討を加えた。

1）精子 DNA のバイサルファイト処理

《目標》
バイサルファイト処理工程の安定化と供試検体中の必要 DNA 量および供試精子量を決定する。

使用キット：

①EpiTect Bisulfite Kit（QIAGEN 社）

②EZ DNA Methylation Kit (ZYMORESEARCH 社)

③EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMORESEARCH 社)

健常人検体を 500ng 準備し、各キットのプロトコールにしたがってバイサルファイト処理を行った。

各キットを用いた場合、処理に要する時間は、下記の通りである。

①EpiTect Bisulfite Kit : 6 時間程度

②EZ DNA Methylation Kit : 13～17 時間

③EZ DNA Methylation-Gold Kit : 3 時間程度

各キットにて処理を行ったバイサルファイト DNA（以下、BS-DNA）は、(1)バイサルファイト処理後の DNA 量、精製度の測定、(2)回收率の算出、(3)PCR 増幅反応を行い、バイサルファイトの効率を評価した。

## 《檢討內容》

①バイサルファイト処理工程の検討

市販キットの性能、試薬構成および文献等の情報をもとに、検査に十分な質と量の DNA を安価、簡便に得るためのバイサルファイト処理方法を検討した。バイサルファイトの原理を図(2)-4 に示す。

①市販キットの性能確認

②バイサルファイト工程の検討

図(2)-4 バイサルファイトの原理

②供試検体中の必要 DNA 量および供試精子量の決定

バイサルファイト処理を施した DNA を PCR にて増幅し、得られた結果より測定に必要な DNA 量を決定した。
## 2 ）ビオチン化プライマーによる Multiplex PCR 検討

## 《目標》

Multiplex PCR による増幅で、対象遺伝子領域が同等の増幅量を示し、かつ非特異的増幅がない増幅を示す条件設定を行う。

## 《檢討內容》

## ①プライマー設計

バイサルファイト後の DNA を鋳型とし、複数領域を同時に増幅可能なプライマーの配列、Tm 值、GC 含量について検討を行った（図(2)-5）。

## ②反応液組成

反応に使用する DNA 合成酵素を決定し、これに最適化した試薬組成を検討した。

## ③反応温度、反応時間および増幅サイクル数

プライマーの Tm 值、試薬組成をもとにアニーリング温度、PCR の各工程の反応時間および反応サイクル数を検討した。

図(2)-5 ビオチン化プライマーの検討

## 3 ）ハイブリダイゼーション検討

## 《目標》

メチル化配列に対応したプローブ、非メチル化配列に対応したプローブを作製し、増幅産物のメチル化の有無およびメチル化率測定に適したハイブリダイゼーション反応、SA-PE 反応の条件を選定する。

## 《檢討內容》

## ①検出プローブの設計

対象 8 遺伝子について、各 1～3 箇所、計 14 箇所のメチル化領域にプローブを設計し、検討を行った。

## ②反応溶液検討

これまでハイブリダイゼーションに用いてきた溶液の組成をもとに検討を行った。

## ③反応条件の検討

プローブの Tm 值（2 本鎖 DNA が熱変性して 1 本鎖になる温度）に加え、増幅の状況も考慮し、反応に用いる増幅産物量の検討、ハイブリダイゼーションおよびプローブとの反応に SA-PE （Streptavidin phycoerythrin）反応温度の検討を行った。
図(2)-6 PCR-Luminex 法を用いた簡便、迅速なハイスループット DNA メチル化診断システムの改良

## （２）ヒト男性精子におけるメチル化インプリント異常の解析

## 1 ）精子サンプルの採取

形態学的な精液検査（量、精子濃度、運動率、奇形率）を受けた不妊症検査のため（およそ半数は男性不妊症ではない）男性に、本研究内容の説明を行い、同意が得られた男性197名を対象にした。精子は、精液検査後の、本来廃棄される精子細胞を用い、本研究に使用した。収集した精子は、スイムアップ法 $ ^{21)} $ により、リンパ球、上皮細胞を除去した。精液検査では、197例のうち、132例は「正常精子」を示した。残りの65例の患者は、「乏精子症」（「中等度乏精子症」は38例、「重症型乏精子症」は27例であった。精子細胞はPBS液で繰り返し洗浄し、0.1mM 2-メルカプトエタノール $ ^{22)} $ を用いた標準的抽出方法によりDNAを抽出した。ヒト正常白血球DNAを、体細胞のコントロールとして使用した。

## 2 ）DNAメチル化の解析

DNA メチル化の解析は、22 領域のヒトインプリント遺伝子（H19、GTL2、ZDBF2、DIRAS3、NAP1L5、FAM50B、ZAC（PLAGL1）、GRB10、PEG10、PEG1（MEST）、INPP5F-v2、LIT1（KCNQ1OT1）、RB1、SNRPN、ZNF597、ZNF331、PEG3、PSIMCT-1、NNAT、L3MBTL、NESPAS、GNAS1A）の DMR について、DNA メチル化の解析をおこなった。まず、精子 DNA は、EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research）を用い、バイサルファイト処理をおこなった。バイサルファイト処理により、メチル化していないシトシンは、ウラシルへ変換するのに対し、メチル化したシトシンは、メチルシトシンのまま残る。バイサルファイト処理後、22 領
域のインプリント DMR を、以下の条件で PCR（Polymerase chain reaction）にて増幅した。PCR 反応液は、各 0.5 □M プライマー、200 □M dNTPs、1x PCR Buffer、1.25 U の EX Taq Hot Start DNA Polymerase（TaKaRa Bio）、20 μl スケールに調整した。各遺伝子 DMR の遺伝子マップとプライマー情報は、参考資料(2)-1 に記した。また、その他の遺伝子情報を参考資料(2)-2 にまとめた。

## （３）PCR-Luminex法を用いたメチル化の解析

## 1 ）人工プラスミドの作成

メチル化の検出には、最適なプライマー、プローブ、ハイブリダイゼーション、反応温度、反応時間などの条件を設定する必要がある。まず、PCRを用いて非メチル化人工プラスミドを作成した。メチル化プラスミドは、メチル化酵素を用いて作成した（SssI methylase, New England Biolabs）。

## 2 ）オリゴプローブによるハイブリダイゼーション

オリゴプローブは、5'端をビオチンでラベルし、100 oligobeads/μl 濃度に調整した。メチル化および非メチル化を認識するオリゴプローブの塩基配列を参考資料(2)-3 に示した。ハイブリダイゼーションは、96 穴のプレートで 50 μl のスケールでおこなった（オリゴプローブ 5 μl、PCR 反応液 5 μl、40 μl の反応液（3.75 M TMAC、62.5 mM TB（pH 8.0）、0.5 mM EDTA、0.125% N-lauroylsacosine）。ハイブリダイゼーション反応は、95℃ 2 分、48℃ 30 分でおこなった。その後、PBS-Tween を 100 μl 加えて、3,300 rpm で 1 分間遠心し、上清を除去し、ペレットを PBS-Tween で洗浄した。測定は、Luminex 100 flow cytometer 装置でおこない、測定値は定量化した。PCR-Luminex 法を用いた簡便、迅速なハイスループット DNA メチル化診断システムを図(2)-6 に示す。

## （4） 統計学的解析

測定した 2 群間の比率データの有意差検定には、STATISTICA を用いた。COBRA 法と PCR-Luminex 法を用いたメチル化値の 2 群間の比較には、Spearman と Pearson の相関係数式を用いた。

## （5） 倫理審査

東北大学医学系研究科倫理委員会に本研究計画を提出し、承認を得て研究を開始した（受付番号 2009-145）。その後、研究の継続と一部内容の変更を追加した申請をおこない、研究の承認を得た（受付番号 2010-120）。また、協力医療機関においても、院内倫理委員会にて、承認を得て研究を実施した。
## 4 ．結果及び考察

## （１）新規 DNA メチル化診断法の改良

新規開発のメチル化解析法の性能評価を行った。3つのプロセスから評価と多数例のヒト精子検体を用いて、従来法と比較検討した。

## 1 ）精子 DNA のバイサルファイト処理

バイサルファイト処理工程の安定化と供試検体中の必要 DNA 量および供試精子量を決定した。

(結果)

## ①バイサルファイト処理後の精製度

BS-DNA の吸光（260nm、280nm）を測定し、回収量および精製度（260nm/280nm の値）を算出した。結果を表(2)-1 に示す。

表(2)-1 バイサルファイトキットの精製度

檢体1	檢体2	檢体3	檢体4
回收量	精製度	回收量	精製度	回收量	精製度	回收量	精製度
①EpiTect Bisulfite	2.12 $ \mu $ g	3.150	1.99 $ \mu $ g	3.169	2.20 $ \mu $ g	3.246	2.11 $ \mu $ g	3.050
②Methylation	325ng	1.694	315ng	1.658	390ng	1.770	413ng	1.800
③Methylation-Gold	336ng	1.843	328ng	1.630	455ng	1.805	399ng	1.714

$ ^{*} $ 精製度

通常の DNA 検体の場合、精製度（吸光値 260nm/280nm）の値が 1.6～1.8 であれば良好な状態である。

これらの結果より、回収量は①EpiTect Bisulfite Kitが最も多いが、バイサルファイト処理前のDNA量が500ngであること、精製度が3.0前後であることから、本キットの性能には疑問が残るため、②EZ DNA Methylation Kit、③EZ DNA Methylation-Gold Kitが妥当な状態であると推察する。

## ② 回收率

各検体の DNA 回収率をバイサルファイト処理前の DNA との比較により算出した。結果を表(2)-2 に示す。

表(2)-2バイサルファイトキットの回収率

検体1	検体2	検体3	検体4
①EpiTect Bisulfite	424.0%	398.0%	440.0%	422.0%
②Methylation	65.0%	63.0%	78.0%	82.6%
③Methylation-Gold	67.2%	65.6%	91.0%	79.8%

①では回収率が異常に高い。DNA 溶液には、DNA 以外に 260nm の吸光を持つ物質の存在が疑われる。測定の際、これらの影響が懸念される。
## ③PCR 增幅反応

作製したバイサルファイト処理済み DNA（以下、BS-DNA）を鋳型とし、リアルタイム PCR 反応を行い、増幅状況を確認した。

下記に PCR 条件を示す。

· BS-DNA 使用量：5ng, 10ng, 50ng

・増幅に使用したプライマー：H19増幅用プライマー

$$ F プライマー \quad5^{\prime}-TATATGGGTATTTTTGGAGGTTTTT-3^{\prime} $$

$$ R プライマー \quad5^{\prime}-ATAAATATCCTATTCCCCAAATAACCCC-3^{\prime} $$

・増幅プログラム

$$ 95^{\circ}C,2 分 \rightarrow(95^{\circ}C,20 秒 \rightarrow60^{\circ}C,30 秒 \rightarrow72^{\circ}C,30 秒 )\times50 サイクル $$

· 融解曲線分析

PCR 増幅産物の融解温度によって、非特異的増幅産物やプライマーダイマーと分別するため、増幅反応終了後 72℃から 100℃まで温度を上げ、2 本差 DNA の解離温度を特定した。

反応を行った結果、各 BS-DNA にてほぼ良好に増幅が確認された。（A）増幅曲線および（B）融解曲線分析を図(2)-7 に示す。

①EpiTect Bisulfite Kit：検体 2

5ng,10ng,50ng

②EZ DNA Methylation Kit : 檢 体 2 5ng,10ng,50ng
③EZ DNA Methylation-Gold Kit : 検体 2 5ng,10ng,50ng

図(2)-7 各キットにより作成した BS-DNA の増幅状況（上記①、②、③） 5～50ng の BS-DNA 量で測定した結果、どの濃度でも増幅が確認され、この範囲で増幅が可能であった。

(考察)

A の増幅曲線より、増幅の開始（曲線立ち上がり点）が①EpiTect Bisulfite Kit が 24 サイクルと、他の 2 キットが 21 サイクル程度であるのに比べ、やや遅れていることが確認された。

また B の融解曲線分析より、増幅産物の 2 本鎖が解離する温度を確認した結果、②、③はメチル化された配列を持つ産物と非メチル化の配列の 2 種類の増幅産物を示す 2 つのピークが確認されたが、①はこれらの 2 ピークが判別しにくいことに加え、低温度域にもう一つのピークが確認された。これはプライマー同士が結合して生成されるプライマーダイマーのピークであると考えられる。

①EpiTect Bisulfite Kit の回収率が異常に高い。本キットでバイサルファイト処理を行った DNA 溶液には、DNA 以外に 260nm の吸光をもつ物質が含まれている可能性が否定できず、測定の際、これらの影響が懸念される。また、5～50ng の BS-DNA で良好な増幅が可能であったが、感度についてはさらにデータを取得する必要がある。また、EpiTect Bisulfite Kit にて処理を行った検体については、他のキットに比べ、増幅しにくい状態であることが判明したため、市販のキットを用いて処理を行う際には EZ DNA Methylation Kit または EZ DNA Methylation-Gold Kit を推奨する。

## 2 ）ビオチン化プライマーの設計

反応液組成、反応温度、反応時間および増幅サイクル数の観点から検討を行なった。

## (結果)

## ①プライマー設計

Multiplex 増幅のためのプライマーは、各領域フォワード、リバースプライマーを各々2から5本ずつ設計した。これらは長さ20～28塩基、Tm値60～72℃に設定し、検討を行った。GC含量については、バイサルファイト処理により「C」が「T」に変換されているため、各プライマーの値をそろえることは難しく、18～58％となっている。
## ②反応液組成

DNA 合成酵素として、FastStart DNA Polymerase および AptaTaq DNA Polymerase（いずれも Roch 社）を検討した。これらの酵素にあわせ、溶液組成も検討し、下記 2 種類にてデータを取得した。

③反応温度、反応時間および増幅サイクル数

プライマーの Tm 值、長さをもとに下記プログラムを設定し検討した。

95℃,2min.

95℃,20sec.→58℃または60℃,30sec.→72℃,30sec.×45または50サイクル72℃.7min.

図(2)-8 プラスミドを用いた Multiplex PCR 増幅産物

全7遺伝子（H19、GTL2、ZAC、PEG1、PEG3、LIT1、SNRPN）のメチル化プラスミド、非メチル化プラスミド、50%メチル化プラスミドすべてにおいて増幅開始（曲線立ち上がり点）は同じであり、良好な増幅が確認された。

(考察)

上記 1,2,3 の検討の結果、現時点では、溶液 1、アニーリング温度 58℃、サイクル数 45 サイクルにて良好な結果が得られている。ただし、対象領域によっては、Multiplex にて検出が難しいものもあり、引き続きプライマーの Tm 値などを調整し、設計する必要がある。

## 3 ）ハイブリダイゼーション検討

対象遺伝子領域のメチル化識別、メチル化率の測定を Luminex 法により実施するため、検出プローブ設計、反応液組成、反応条件の検討を行い、適正化を図った。

(結果)

プローブの Tm 值に加え、増幅の状況も考慮し、反応に用いる増幅産物量の検討、ハイブリダイゼーションおよび SA-PE 反応温度の検討を行った。プローブの Tm 値より、ハイブリダイゼーションおよび SA-PE 反応を 48℃、52℃ に設定し検討した。また、反応に用いる増幅産物を原液、2 倍希釈液、5 倍希釈液、10 倍希釈液にて検討し非特異的な検出がなく良好に検出される増幅産物の量を特定した。図(2)-8 に示す。
対象遺伝子
メチル化領域	H19	GTL2	ZAC	PEG1
領域1	領域2	領域1	領域2	領域1	領域2	領域1	領域2
メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ	メチル化
対応プ
ローブ
メチル化プラスミド	H19	1229	62	689	129	61	89	105	83	97	64	79	74	87	46
メチル化プラスミド	H19	37	560	54	512	30	74	99	75	71	59	81	75	61	39
50%メチル化プラスミド	H19	1063	325	529	309	62	94	137	104	111	82	138	103	119	73
メチル化プラスミド	GTL2	22	58	44	72	1598	131	986	247	77	45	70	60	66	46
メチル化プラスミド	GTL2	47	69	61	100	61	1121	173	1285	77	60	89	78	86	59
50%メチル化プラスミド	GTL2	33	74	85	130	1263	607	822	767	83	56	90	79	82	50
メチル化プラスミド	ZAC	12	55	51	91	41	65	95	71	1752	55	69	50	49	34
メチル化プラスミド	ZAC	21	62	63	97	42	77	85	92	75	802	71	76	60	38
50%メチル化プラスミド	ZAC	30	74	75	116	54	66	114	99	1139	442	119	93	105	53
メチル化プラスミド	PEG1	19	40	56	74	39	54	56	56	62	42	1135	71	4054	53
メチル化プラスミド	PEG1	6	25	41	68	27	48	63	58	63	32	83	1946	238	346
50%メチル化プラスミド	PEG1	49	75	94	125	65	89	95	85	87	55	940	1348	4221	215
メチル化プラスミド	PEG3	14	45	52	48	51	73	76	81	69	35	76	55	38	32
メチル化プラスミド	PEG3	41	43	41	97	35	52	91	73	60	55	84	70	60	62
50%メチル化プラスミド	PEG3	72	84	107	141	83	102	134	95	114	81	140	89	130	71
メチル化プラスミド	LIT1	14	49	48	98	38	75	96	63	62	47	90	75	74	43
メチル化プラスミド	LIT1	49	64	95	148	63	70	127	87	85	71	116	84	112	45
50%メチル化プラスミド	LIT1	30	78	80	166	54	85	122	88	77	67	112	85	117	67
メチル化プラスミド	SNRPN	33	48	58	66	39	71	87	67	80	39	74	61	65	50
非メチル化プラスミド	SNRPN	36	58	48	101	50	67	83	68	70	51	65	103	66	52
50%メチル化プラスミド	SNRPN	31	67	68	105	59	82	108	71	64	61	78	85	109	36
陰性コントロール	30	39	56	76	34	71	92	71	66	37	67	72	66	38

図(2)-9 メチル化および非メチル化プローブによる定量解析

(考察)

上記 1,2,3 の検討の結果、現時点では、反応溶液を変更する必要はなく、ハイブリダイゼーション、SA-PE 反応温度を 48℃ で行うことで、良好な結果が得られている（図(2)-9）。ただし、対象領域によっては、蛍光値が低く、実際の検体を用いた場合に陽性、陰性の判別が困難になる可能性が高いため、引き続きプローブの Tm 値などを調整し、設計する必要がある。

## 4 ）Luminex システムによる蛍光値測定検討

蛍光強度により、メチル化の有無および率の測定が可能な測定系を検討した。

①開発した測定系の蛍光値の妥当性確認

②別法との比較検証

別法（バイサルファイトシークエンス法/COBRA 法）のデータを比較検証し、結果に乖離がないことを確認

③ヒト精子検体を用いた検証：

対象：精液（精液検査後の検体）・血液

登録：

· 不妊娠男性（337 名）

・顕微鏡検査：数、運動率、奇形率の測定

症例：・乏精子症と診断された患者（精子数×運動率＜ $ 5 \times 10^{6}/mL $ ）61例・中間群（ $ 20 - 5 \times 10^{6}/mL $ ）67例・正常精子を有する男性（＞ $ 20 \times 10^{6}/mL $ ）209例

(結果)

従来法（COBRA）と比較し、COBRAが90％以上の場合、Luminexが90％以上の割合95.5％で比較的安定な値が得られた。また、乏精子症患者に異常を認める割合が多い傾向
が見られた。成果は論文発表した。

## (まとめ)

精子 DNA のバイサルファイト処理においては、EpiTect Bisulfite Kit の回収率が異常に高い。本キットでバイサルファイト処理を行った DNA 溶液には、DNA 以外に 260nm の吸光をもつ物質が含まれている可能性が否定できず、測定の際、これらの影響が懸念される。また、5～50ng の BS-DNA で良好な増幅が可能であったが、感度についてはさらにデータを取得する必要がある。また、EpiTect Bisulfite Kit にて処理を行った検体については、他のキットに比べ、増幅しにくい状態であることが判明したため、市販のキットを用いて処理を行う際には EZ DNA Methylation Kit または EZ DNA Methylation-Gold Kit を推奨する。

## （２）ヒト男性精子におけるメチル化インプリント異常の解析

## 1 ）精子型インプリント遺伝子の DNA メチル化の解析

ヒト精子型インプリント遺伝子 DMR は 3 領域で、H19 領域は 220-bp（18 の CpG 部位）、GTL2 領域は 259-bp（15 の CpG 部位）、ZDBF2 領域は 220-bp（18 の CpG 部位）のメチル化について解析した（参考資料(2)-1）。

DMR のメチル化の解析には、制限酵素を用いる COBRA 法と、シークエンス法を併用した。バイサルファイト処理後の精子 DNA を、各 DMR に特異的なプライマーで PCR 増幅し、H19 は制限酵素 TaqI あるいは MluI を、GTL2 は TaqI あるいは NruI、ZDBF2 は TaqI を用いて消化した。メチル化された PCR 産物は制限酵素で切断され、メチル化されない PCR 産物は切断されない。体細胞 DNA では、およそ半分の PCR 産物がメチル化され、残り半分はメチル化されなかった。このことより、PCR によるバイアスがないことを確認した（図(2)-10；血液）。さらに PCR-Luminex 法を用いた大多数の精子検体では、メチル化されたパターンを示した。しかし 10 例は、メチル化パターンに加え、非メチル化バンドも認めた。これらの PCR 産物は、更に、シークエンス法で、各 CpG 部位のメチル化状態について解析した。その結果、COBRA 法と同等のメチル化比率を示した（図(2)-10；Case C） $ ^{22)} $ 。メチル化異常を示した 10 例のうち、7 例は重症型乏精子症患者であった。次に、GTL2 および ZDBF2 のメチル化の解析を行った。GTL2 では 16 例、ZDBF2 では 9 例に、異常な非メチル化精子を認めた（参考資料(2)-4）。これらの検体についてもシークエンス法で解析をおこなった。メチル化異常のうち乏精子症は、GTL2 で 8 例、ZDBF2 で 4 例であった。