Silviase/jgov_v1.4_full_ann huggingface dataset:
リットは数多くあると言われている。電子の受容体になる $ ^{18} $ ことや、化学合成独立栄養細菌がエネルギーを獲得できることである。二価マンガンから三、四価のマンガンへの酸化は熱力学的には有意であるが、二価マンガン酸化とエネルギー獲得の間には明確な証拠はない。マンガン酸化物により自らを覆うことで、マンガン酸化細菌は紫外線、捕食者、ウィルスや有害金属から自らを守っている可能性がある。2005年にはParikhらが、Pseudomonas putidaの純菌株でマンガン酸化物がある系の方がない系と比較して増殖が早いと報告をしている $ ^{19} $ 。さらに四価の生物学的マンガン酸化物はフミン酸などの難分解性有機物を分解し、微生物が利用できるよう低分子化することが知られている $ ^{20} $ 。

微生物によるマンガン酸化の機構はよくわかっていない。その理由としてはマンガン酸化酵素である銅酸化酵素（Mlitcopper oxidase）の精製と異種発現に成功していないことである。銅酸化酵素はマンガン酸化において重要な役割を担っており、遺伝学研究により栄養細胞でのマンガン酸化が細胞表面で発生していることが明らかになった。2013年にはKati GeszvainらがPseudomonas Putida GB-1株を用いた研究を行い、銅酸化酵素遺伝子を除去された系ではマンガン酸化が起きないことが確認された。さらに、2つの銅酸化酵素遺伝子のうち片方を除去することでマンガン酸化がどのように変化するかを調べたところ、液体または個体でマンガン除去の速度に顕著な変化が見られたと報告している $ ^{19} $ 。以上のように生物作用によるマンガン酸化には銅酸化酵素が関与しており、その機構が明らかになってきている。

### 2. 研究目的

マンガン酸化細菌をリアクターに集積培養し、コバルト、マンガン、ニッケルの吸着性に優れたバイオMn酸化物を生産することができれば、排水からコバルト、マンガン、ニッケルを同時回収することができる。これは、廃リチウムイオン二次電池からのレアメタル回収に適用でき、省エネで薬品を使わない環境にやさしい方法であるため普及が期待できる。マンガン酸化物によるレアメタルの回収技術の開発においてまずはマンガン酸化細菌の集積培養が必要となる。培養には純菌培養と複合微生物系での培養の2種類が考えられる。マンガン酸化細菌の純菌培養は昔から確立されているが、純菌培養ではレアメタル含有水を滅菌してから流さなければならないことや管理が難しいことから高コストになると考えられ現実的ではない。そのため本研究では複合微生物系でマンガン酸化細菌の集積培養を目指す。しかしながら、開放の環境中でマンガン酸化菌を優占的に培養するのは簡単ではなく、バイオMn酸化物を継続的に生成することは困難である。

図2.1 共培養細菌の代謝物を有機物源としたマンガン酸化細菌の集積培養
Mn を酸化する微生物は数多く報告されており、この能力を有している細菌をマンガン酸化細菌と称していて、すべて有機物を必要とする従属栄養細菌である。このマンガン酸化細菌を培養することでバイオ$\mathrm{MnO}_{2}$を容易に生産することができ、この$\mathrm{MnO}_{2}$を利用してレアメタルの吸着・回収は可能である。しかしながら、レアメタルを含有している排水等からの回収は容易ではない。それはマンガン酸化細菌の培養が困難なためである。実用を想定すると排水を無菌にすることは容易でなく、このためマンガン酸化細菌は他の雑菌との生存競争に負けてしまい、バイオリアクターに生息することができない。すなわち、バイオリアクターにマンガン酸化細菌を定着させて、連続的に$\mathrm{MnO}_{2}$を生産することができない。従って、単純な培養ではなく、マンガン酸化細菌の特性を生かした集積培養方法が必要である。

マンガン酸化細菌は自然や上水処理のろ過池などの貧栄養環境で検出されており、おそらく有機物濃度に対して親和性の高い種であると考えられ、極低濃度の有機物排水を供給すれば、開放系においてもマンガン酸化細菌を培養することが可能と考えられた。そこで、マンガン酸化細菌と硝化細菌との共存微生物生態を構築することを考えた(図2.1)。アンモニア性窒素のみの排水処理において、一般的に硝化細菌だけで構成されていることはなく、全細菌の半分程度に留まる。これは硝化細菌の代謝有機物（低濃度）を利用する好気性細菌が繁殖するためである。この機構を利用して、アンモニア性窒素含有排水にMn(II)が含まれていれば、硝化細菌と共存したマンガン酸化細菌の集積培養が可能ではないかと考えた。その結果、これまでにアンモニア性窒素を唯一の基質とした硝化細菌とマンガン酸化細菌との共培養に成功している。この培養技術を適用した廃二次電池溶解処理液からのレアメタル回収の実用化に向けたバイオMn酸化物の高速生成技術の開発を本研究では目的としている。

バイオリアクター内にマンガン酸化細菌を高濃度に保持できなければ、 $ MnO_{2} $ の高速生成、ひいてはレアメタル回収の実用化には至らない。好気性の細菌を高濃度に保持できるバイオリアクターとして、DHS（Downflow Hanging Sponge）装置は有望である。装置内に生物保持のためのスポンジ担体（あるいは布担体）が投入されていて、水で満たさず、上部より排水を散水し、下部から排出される単純な構造である。エアレーションなしに、気相から酸素がスポンジ・布に供給されて好気状態に保たれる(図2.2)。マンガン酸化細菌によって生産された $ MnO_{2} $ は、比重が大きく、担体表面から滑落し、装置下部に収集されるため、容易に回収できる。

図2.2 共培養細菌の代謝物を有機物源としたマンガン酸化細菌の集積培養
2 バイオリアクターのスタートアップ短縮化方法の確立

省エネ・低コストの好気性処理

図2.3 DHS リアクター原理

マンガン酸化細菌は硝化細菌との共培養により培養可能であり、Mn(II)を酸化してバイオMnO_{2}を生成することに成功している。しかし、技術を適用した廃二次電池溶解処理液からのレアメタル回収の実用化には、①Mn(II)酸化速度は高くない、②スタートアップが遅い、③実際に実二次廃電池溶解液に適用できるか不明である、などの課題がある(図2.4)。そこで本研究では、これらの課題を解決することを目的として、次章に示す7つの研究課題を設定した。

1 バイオMn酸化物の生成速度をさらに高める技術の確立

マンガン酸化速度 1kg Mn/m³/d

3 実廃バッテリー液からマンガン酸化細菌を培養, Mn, Ni, Co 除去の実証（研究(7)）

図2.4 研究テーマと課題
## 3 ．研究方法

本研究では、バイオ Mn 酸化物の生成速度を高める技術の確立、そのためのマンガン酸化菌の同定・分離・培養、レアメタル吸着回収量評価、実バッテリー溶解処理液による実証を目的として、以下の7つの実験を実施した。

## (1) 硝化細菌との共培養でのバイオMn酸化物の生成

## 1 ) 目的

マンガン酸化細菌は有機物を必要とする従属栄養細菌である。このため、有機物の基質を供給すれば簡単に培養できそうである。しかし、開放系では廃水を無菌にすることはできず、マンガン酸化細菌は他の雑菌との生存競争に負けて培養できない。一方で、マンガン酸化細菌は貧栄養環境で検出されることから、基質親和性の高い種で、極低濃度の有機物排水を供給すれば、開放系においても培養できるのではと考えられた。

## 2 ) 仮説

マンガン酸化細菌は貧栄養環境で検出されることから、基質親和性の高い種で、極低濃度の有機物排水を供給すれば、開放系においても培養できるのではと考えられた。マンガン酸化細菌を培養するための有機基質源を供給するために硝化細菌との共存微生物生態を構築することを考えた(図2.1、2.2)。アンモニア性窒素のみを含んだ排水処理において、硝化細菌だけで構成されていることはなく、硝化細菌の代謝有機物(低濃度)を利用する好気性細菌が共存する。この機構を利用して、Mn(II)とアンモニア性窒素の含有排水処理リアクターでマンガン酸化細菌の集積培養を試みる。

## 3 ) 実験方法

## a 実験装置及び実験条件

実験には樹脂製の円筒形カラム（内径7 cm、全長：110 cm、容積約4.2 L）の中に微生物保持担体として2 cm 角のスポンジ32 個（全容積：0.256 L）を直列に吊るした DHS リアクターを用いた。スポンジ担体には活性污泥とマンガン酸化污泥を植種し、25 ℃で運転を行った。MnCl₂を5～25 mg-Mn/Lに、NH₄Clを5～15 mg-N/Lにそれぞれ調整した無機模擬排水を各リアクターの上部から供給した（表3.1.1）。DHS リアクターの運転開始時は、リアクターにメタンと空気の混合ガスを送った。リアクターは1000 日運転を行った。その運転条件を表3.1.2に示す。

表3.1.1 基質組成

微量元素	mg L^{-1}
MnCl_{2} 4H_{2}O	18～144
NH_{4}Cl	19.1～57.3
NaNO_{3}	30.36
KHCO_{3}	100
NaHCO_{3}	100
Na_{2}HPO_{4} 12H_{2}O	20
CaCl_{2} 2H_{2}O	5
MgSO_{4} 7H_{2}O	20
Fe_{2}SO_{4} 5H_{2}O	0.1
CuSO_{4} 5H_{2}O	0.0025
NaSeO_{4}	0.005
NiCl_{2} 6H_{2}O	0.019
CoCl_{2} 6H_{2}O	0.024
Na_{2}MoO_{4} 2H_{2}O	0.022
H_{3}BO_{3}	0.001
ZnSO_{4} 7H_{2}O	0.043
表3.1.2 運転条件

Phase	Day	Interval of day	$ Mn^{2+} $	$ NH_{4}^{+} $	$ NO_{2}^{-} $	$ NO_{3}^{-} $	$ HRT^{a} $	$ GRT^{b} $	$ O_{2} $
day	(mg/L)	(mg-N/L)	(mg-N/L)	(mg-N/L)	(hour)	(day)	(%)
1	0-48	49	5	5	0	5	3	4	21
2	49-98	50	5	0	0	5	3	4	21
3	99-215	117	10 ~ 20	0	0	5	3	4	21
4	216-314	99	20~15	5	0	5	1.5	4~2	21
5	315-407	93	15~25	0	0	5	1.5	2	21
6	408-448	41	10~15	0	0	5	1.5	2	21
7	449-476	28	15	5	0	5	1.5	2	21
8	477-545	69	7	5	0	5	0.8	2~1	40
9	546-655	110	7~20	10	0	5	0.8	0.6	40
10	656-776	121	20	10 ~ 15	0	5	0.5~0.2	0.3	40~50
11	777-811	35	20	10	5	5	0.2	0.3	50
12	812-883	72	20~15	10	0	5	0.3~0.5	0.3	50

$ ^{a} $ HRT: hydraulic retention time

$ ^{b} $ GRT: gas retention time

## b 測定項目及び測定方法

Mn 除去性能はリアクター流入・流出時の溶存 Mn 濃度を水質分析器 DR-2800(HACK)を用いて測定することで評価した。各イオン態窒素濃度はイオンクロマトグラフ（HPLC10Avp: 島津社製）を用いて測定した。流出・流入水の pH を Horiba Benchtop multi-parameter waters quality meter を用いて測定した。

マンガン酸化に関わる細菌を調査するため汚泥のサンプリングを運転 189 日目に行った。採取はスポンジ表面に付着しているバイオマスを手で搾り取ることで行う。絞りとったスポンジは全20個のうち上・中・下から3個ずつである。なお、各リアクターの運転においてバイオマスの過剰な増加は運転管理に支障をきたすため適宜採取を行った。

## c 微生物解析

運転 206 日目の採取バイオマスに対し、16S rRNA 遺伝子を標的としたクローニング解析を行った。DNA 抽出にはフェノール・クロロホルム法を用いた。PCR 増幅は全細菌を対象とした EUB338Fmix-BAC1389Rm のプライマーセットを用いた。適切なサイクル数を求め、94℃/30sec、52℃/30sec、72℃/1min 30sec の PCR 反応を 23 サイクル行い、最後に伸長反応を 72℃/5min で行った。

## (2) メタン酸化細菌との共培養でのバイオMn酸化物の生成

## 1 ) 目的

硝化菌との共生系によるマンガン酸化細菌の集積培養は成功したが過度の硝化反応によるpHの低下によりマンガン酸化能力が低下するという問題が明らかになった。そこでメタンを唯一の有機炭素源としてメタン酸化細菌を培養しても、硝化細菌と同様に代謝産物を利用する他の細菌群と共存した微生物生態系が構築されのではないかと考えた。本研究ではメタン酸化細菌との共生系によりマンガン酸化細菌の集積培養が可能であるかどうかを調査しマンガン酸化に関与する細菌の調査を目的とした。メタン酸化細菌との共生系ではpHの変動がなく、リアクターの運転管理が容易である。また、処理場等から排出されるメタンを有効利用できることが期待できる。
## 2 ) 実験方法

## a 実験装置及び実験条件

実験には樹脂製の円筒形カラム（内径40 mm、全長：850 mm、容積約1 L）の中に微生物保持担体として2 cm角のスポンジ20個（全容積：0.16 L）を直列に吊るしたDHSリアクターを用いた（図3.2.1）。スポンジ担体には活性污泥とマンガン酸化污泥を植種し、25℃で運転を行った。 $ MnCl_{2} $ を5～50 mg-Mn/Lに、窒素源として $ NaNO_{3} $ を5 mg-N/Lにそれぞれ調整した無機模擬排水を各リアクターの上部から供給した（表3.2.2）。DHSリアクターの運転開始時は、リアクターにメタンと空気の混合ガスを送った。リアクターは1000日運転を行った。その運転条件を表3.2.3に示す。

図3.2.1 リアクター概要図とリアクター全体写真
表3.2.1 リアクター基質組成

compound	(mg/L)	compound	(mg/L)
MnCl2·4H2O	18-180	NaNO3	30.36
KHCO3	25	CuSO4·5H2O	0.025
NaHCO3	81.5	Na2SeO4	0.005
Na2HPO4·12H2O	11	NiCl2·6H2O	0.019
MgSO4·7H2O	20	CoCl2·6H2O	0.024
CaCl2·12H2O	5	Na2MoO4·2H2O	0.022
FeSO4·7H2O	0.1	H3BO3	0.001
ZnSO4	0.043

表3.2.2 リアクター運転条件

Phase	day	日付	Mn2+(mg/L)	CH4(%)	HRT(hour)	GRT(hour)	ガス循環	基質循環
1	0	2011/04/27	5	1→2→4	4	18	×	×
65	2011/07/01	5	4	4	18	○*1	×
2	76	2011/07/12	5	4	4	3	○	×
97	2011/08/02	5	4	2	3	○	×
106	2011/08/11	10	4	2	3	○	×
133	2011/09/07	15	4	2	3	○	×
3	155	2011/09/29	15	0	2	3	○	×
4	196	2011/11/09	15	4	2	3	○	×
234	2011/12/17	5	4	2	3	○	×
301	2012/02/22	5	4	1	3	○	×
343	2012/04/04	10	4	1.5	3	○	○*2
390	2012/05/21	10	4	1.5	2	○	○
420	2012/06/20	30	4	1.5	2	○	○
512	2012/09/20	50	4	1.5	2	○	○
5	562	2012/11/09	50	0	1.5	2	○	○
6	632	2013/01/18	50	4	1.5	2	○	○
693	2013/03/20	5	4	1.5	2	○	○
722	2013/04/18	50	4	1.5	2	○	○
751	2013/05/17	5	4	1.5	2	○	○
7	951	2013/12/03	*3	4	1.5	2	○	○

1：リアクター内の気相を循環、 $ ^{*} $ 2：リアクター内の基質を循環、 $ ^{*} $ 3：流出マンガン濃度（ $ \div $ リアクター内マンガン濃度）を出来るだけ低くなるように適宜変更
## b 測定項目及び測定方法

Mn 酸化性能はリアクター流入・流出時の溶存 Mn 濃度を水質分析器 DR-2800(HACK)を用いて測定することで評価した。各イオン態窒素濃度はイオンクロマトグラフ（HPLC10Avp: 島津社製）を用いて測定した。酸素とメタン濃度はガスクロマトグラフ（GC-TCD 8A: 島津社製）を用いて測定した。流出・流入水の pH を Horiba Benchtop multi-parameter waters quality meter を用いて測定した。

マンガン酸化に関わる細菌を調査するため汚泥のサンプリングを運転 189 日目に行った。採取はスポンジ表面に付着しているバイオマスを手で搾り取ることで行う。絞りとったスポンジは全 20 個のうち上・中・下から 3 個ずつである。なお、各リアクターの運転においてバイオマスの過剰な増加は運転管理に支障をきたすため適宜採取を行った。

レアメタル除去性能を調査するため運転 950 日目からニッケルとコバルトを 10 mg/L で添加した。金属の濃度は発光分光分析装置(ICPE9000:島津社製)を用いて測定した。

## c 微生物解析

運転 189 日目の採取バイオマスに対し、16S rRNA 遺伝子を標的としたクローニング解析を行った。DNA 抽出にはフェノール・クロロホルム法を用いた。PCR 増幅は全細菌を対象とした EUB338Fmix-BAC1389Rm17mer のプライマーセットを用いた。適切なサイクル数を求め、94℃/30sec、52℃/30sec、72℃/1min 30sec の PCR 反応を 23 サイクル行い、最後に伸長反応を 72℃/5min で行った。

## (3) 活性污泥を唯一の基質としたマンガン酸化細菌の集積培養

## 1 ) 目的

硝化細菌やメタン酸化細菌との共生系により Mn 酸化細菌の培養は可能であったが、Mn 酸化速度は目標値に達しなかった。一方で、Mn 酸化細菌の集積培養は硝化細菌あるいはメタン酸化細菌との共培養による方法以外にも、活性污泥を基質として供給することにより可能であることが示唆された。そこで、Mn 酸化細菌を植種した DHS リアクターに上部より活性污泥を基質として供給して Mn 酸化細菌の集積培養を行った。

## 2 ) 仮説

上記の共培養の結果では、硝化細菌と Mn 酸化細菌との共培養において、アンモニアの供給を停止しても Mn 酸化が 1 ヶ月ほど起こるというおもしろい現象が起きた。さらにメタン細菌との共培養においても基質のメタンを停止しても Mn 酸化が起きることを確認した。これは硝化細菌やメタン酸化細菌の代謝産物だけでなく細菌の死骸等も Mn 酸化細菌は基質として利用できることを示唆しており(図 3.3.1)、廃棄物である下水処理場から発生する余剰活性污泥がマンガン酸化細菌の培養に適していれば、より環境にやさしいレアメタル回収が可能である。
図 3.3.1 マンガン酸化細菌の基質利用特性(仮説)

## 3 ) 実験方法

## a 実験装置及び実験条件

リアクターには透明アクリル製円筒形カラム(内径 40 mm、外径 50 mm、体積約 1.1 L)の中に、微生物保持担体として 2 cm 角のスポンジ 20 個(全容積 0.16 L)を直列に吊るした DHS リアクターを使用した。スポンジには硝化細菌共生系を利用した Mn 酸化バイオリアクターのバイオマスを用いた(図 3.3.2)。200 ml のバイオマス(汚泥濃度約 4000 mgSS L⁻¹)の中にスポンジを浸漬させ、しぼる事でバイオマスを植種した。

基質を $ 0.9\ L\ day^{-1} $ (水理学的滞留時間 HRT では 2 時間) の流量で一定流量にて供給可能なポンプを使用して供給した。また同様のポンプを用いて、リアクターカラム内に空気を供給した。リアクターは $ 25^{\circ}C $ の恒温室内に設置した。

運転開始時において Mn(II)濃度が $ 5 \, mg \, L^{-1} $ となるように 10 L の基質をポリタンク内に作成した。基質には純水を使用し、微生物の代謝活動に必須な微量元素を添加して供給した (表 3.3.1)。

Mn (II)除去能力が低下する毎に有機基質として活性污泥を適宜添加した。具体的には210日目、292日、384日、414日、444日、522日にそれぞれ164 mgCOD、164 mgCOD、132 mgCOD、95.5 mgCOD、94 mgCOD、569 mgCOD相当の活性污泥をリアクター上部から添加する事で供給した。

供給 Mn(II)負荷をリアクターの Mn (II)除去能力に応じて変更した(表 3.3.1)。リアクター流出の Mn (II)濃度が完全に除去されるようになった時点で HRT を短くし、流入基質の Mn(II)濃度を徐々に増やした。

## b 測定項目及び測定方法

両実験系の流入水並びに流出水の水質を経時的に測定した。測定項目を pH、有機物(COD)濃度、Mn(II)濃度として観察を行った。pH は Benchtop multi-parameter waters quality meter(HORIBA 社製)、COD 濃度並びに Mn(II)濃度は吸光光度式水質分析器 DR-2800(HACH 社製)にて定量した。リアクター流入水並びに流出水
から採取したサンプルは全て 0.45 μm のメンブレンフィルター(ADVANTEC 社製)を用いて濾過処理を施した。酸素濃度はガスクロマトグラフ（GC-TCD 8A: 島津社製）を用いて測定した。

## c 微生物解析

運転 657 日目にリアクター上部、中部、下部よりスポンジを絞ってバイオマスを採取した。PBS で洗浄後 Fast DNA spin kit for soil (MP Biomedicals、Irvine、CA、USA) を用いて DNA 抽出を行い、3 種類の DNA を同じ濃度で混合した。得られた DNA に対して 27F-519R のプライマーセットを用いて PCR 増幅を行った。16S rRNA 遺伝子を標的としたクローニング解析を行った。昇温 95℃/5min で 95℃/30sec、58℃/30sec、72℃/1min 30sec の PCR 反応を 30 サイクル行い、最後に伸長反応を 72℃/5min で行った。適当な処理を施した DNA 増幅サンプル (全細菌対象プライマー341F-805R で PCR 済) を北海道システム・サイエンス株式会社に次世代シーケンサー454 (Roche 社製) を用いた微生物群集解析を外注した。得られた塩基配列情報をもとに、微生物群集解析が行われた。解析は概して、得られた配列データから遺伝子情報を OTU 抽出し 16S rDNA データベース上に登録された系統種ごとの遺伝子情報に 97% の相同性を有する OTU ごとに分類分けを行った。このデータベースは、QUIIME Resource サイトよりダウンロードされた Greengenes データベースの配列情報および分類情報を使用した。

図 3.3.2 活性污泥基質による Mn 酸化リアクター
表3.3.1 培养条件

Phase	Day	Period of Time (day)	$ Mn^{2+} $ (mg/L)	COD (mg)	$ HRT^{a} $ (hour)	$ ART^{b} $ (hour)
1	0-46	46	5	$ ND^{c} $	12~8	20
2	47-209	162	5	$ ND^{c} $	8~6	4
3	210-291	81	5	164	6~2	4
4	292-383	91	5~10	164	2~0.8	3~2.3
5	384-412	28	10~15	132	0.8	2.3
6	413-444	31	15~7	95.5	0.8	2.3
7	445-521	76	7~10	94	0.8~0.6	2.3~1.2
8	522-841	319	10~40	569	0.6	1.2
9	842-911	69	40~20	574.5	0.6~1.2	1.2
10	912-938	26	20~30	911	1.2~0.4	1.2~0.4
11	939-974	35	25	1070.5	0.4	0.4

$ ^{a} $ HRT: hydraulic retention time; $ ^{b} $ ART: air retention time

$ ^{c} $ ND: not determined

## (4) マンガン酸化物の好気性微生物への活性阻害実験

## 1 ) 研究背景と目的

硝化菌やメタン酸化細菌との共生系、活性污泥でも Mn 酸化細菌を集積培養することが可能であることが明らかになった。Mn 酸化細菌の培養にはメタン酸化細菌の代謝物が重要であり、代謝物量が多いほど Mn 除去速度が高くなることがわかった。しかし、メタン消費速度は純粋なメタン酸化リアクターと比較すると 1/6 程度の能力しかなく、メタン酸化細菌が $ MnO_{2} $ に阻害されていること示唆された。阻害されていることがわかった。そこで本章ではメタン酸化細菌が何によって阻害されているのかを調査することを目的とした。本実験系では活性污泥に有機基質を添加し $ MnO_{2} $ 存在環境下において培養を行い、回分試験方式にて阻害の有無を検証する目的として実験を行った。獲得した知見より、環境中でのマンガン酸化細菌の $ Mn(II) $ 酸化意義について新たな考察が得られると考えた。 $ MnO_{2} $ は高い化学反応性を有する物質であるが、生物活性阻害に関する知見は未知で、 $ MnO_{2} $ の化学的物性についても新たな知見を獲得できると考えた。

## 2 ) 仮説

マンガン酸化細菌の環境中における Mn(II)酸化意義には諸説あり、概してマンガン酸化細菌は自身を保護し生存戦略的に Mn(II)酸化をすることが強く示唆されている(図 3.4.1)。同時に先行研究で観察された MnO_{2} の活性阻害作用を踏まえ、以下のような仮説を立てた。

1. MnO $ _{2} $ は従属栄養細菌に対して活性阻害を及ぼし、彼らの有機物分解能力を低下させる。

2. MnO $ _{2} $ の影響を全く受けないあるいは影響が少ない耐性菌が存在する。

3. $ MnO_{2} $ は直接的に微生物細胞に阻害作用を及ぼし、 $ MnO_{2} $ による生育必須元素等の吸着収容作用に起因した間接的な影響ではない。
図 3.4.1 Mn 耐性菌の選別

## 3 ) 実験方法

## a メタン酸化細菌のマンガン酸化物阻害実験

マンガン酸化物がメタン酸化細菌に与える影響を調査するため、回分試験方式にて従属栄養細菌の活性阻害作用の有無やその詳細な知見の獲得を目的に実験を行った。実験に適用される従属栄養細菌は下水処理施設より採取した活性污泥を用いた。またその活性阻害の有無については、活性污泥に添加した有機基質消費量の経時的挙動の観察結果と$\mathrm{MnO}_{2}$の添加量とを比較して評価した。実験に際し阻害影響の検証に使用する微生物サンプルは東広島浄化センター(広島県東広島市西条町田口100-1)より採取した。污泥は処理場内最終沈殿池の最上流部より採取した。これは、下水処理施設への流入下水が含む種々の物質等の污泥への影響を最小限に抑え、実験に使用できると考え適用した。また阻害作用の検証に用いた$\mathrm{Mn(IV)}$酸化物は化学合成粉末$\mathrm{Mn(IV)O_{2}}$(キシダ化学)を使用した。実験手順は以下の通りである。

① 東広島下水処理場から採取した活性汚泥(2000 mgSS/L)を 25℃恒温室内のビン(1L)に入れる。

② 4％濃度のメタンをビンに 0.1L/h で供給し続ける。

③ 3日、7日目に上澄み0.5Lを捨て、表3.4.1の基質を等量入れる。

④ 7日間馴養を行い、十分にメタン酸化細菌を増やす。

⑤ 122mL バイアルビンにマンガン酸化物（市販品パウダー）を 0、1.5、6、12、18、24、30 g/L となるよう 7 系を用意する。

⑥ 汚泥を7つのバイアルビンに40 mLずつ入れる。

⑦ バイアルビンのフタを閉め、タン濃度を4％に調整する。
⑧メタン濃度を0、2、4、6、8時間ごとに計測する。計測の間は振とう機にて25℃で振とうする。

表3.4.1 メタン酸化細菌回分試験基質

compound	(mg/L)	compound	(mg/L)
MnCl2·4H2O	18-180	NaNO3	30.36
KHCO3	25	CuSO4·5H2O	0.025
NaHCO3	81.5	Na2SeO4	0.005
Na2HPO4·12H2O	11	NiCl2·6H2O	0.019
MgSO4·7H2O	20	CoCl2·6H2O	0.024
CaCl2·12H2O	5	Na2MoO4·2H2O	0.022
FeSO4·7H2O	0.1	H3BO3	0.001
ZnSO4	0.043

## b 従属栄養細菌のマンガン酸化物阻害実験

採取した活性污泥を実験室内で、回分試験で使用する上記基質と污泥との馴致を行った。本実験系で使用する培地にはK-mediumを適用した。本培地の主たる構成成分であるPeptoneならびにYeast Extractは多くの従属栄養細菌が基質として利用可能な基質である。これより広義的に従属栄養細菌の有機物の消費量評価への本培地の適用は適切であると考えた。加えて、本培地を使用した多種多様なマンガン酸化細菌の培養が報告されていることから、 $ MnO_{2} $ による活性阻害影響を受けにくい耐性菌の存在証明を検証するに鑑みて適切な培地とした(表3.4.2)。また阻害作用の検証に用いたMn(IV)酸化物は化学合成粉末Mn(IV) $ O_{2} $ (キシダ化学)を使用した。実験の手順は以下の通りである。

実験に使用する Mn 酸化物もバイオ Mn(IV)酸化物同様に金属元素に対する吸着収容性を有している。そのため、 $ MnO_{2} $ と基質が混合させた際に表 3.4.2 に記載した必須栄養元素の $ MnO_{2} $ への吸着が考えられる。そこで、 $ MnO_{2}(50\ g) $ を孔径 0.22 μm のろ紙中に封入しフラスコ内で有機質を添加した活性污泥(馴致済)の培養を行った。培地ならびに污泥の体積や、曝気量等の培養条件は回分試験と等しく行った。この場合活性污泥と $ MnO_{2} $ との直接的な接触は無く、培養液内の化学基質と $ MnO_{2} $ の接触は可能である。活性污泥の培養を有機基質添加条件下(K-medium: 600 mgCOD/L)で行い、 $ MnO_{2} $ 添加系ならびに非添加系の 2 系列にて 25℃で 15 時間培養した。これにより $ MnO_{2} $ の微生物活性阻害の機構について検証を行った。

① 東広島下水処理場で採取した活性污泥をしばらく静置し上澄み液を捨てる。

② K-medium をそれぞれ加え、全体で 300mgCOD/L にする。

③ 汚泥 10 L を 25℃ の恒温室内でエアレーション(Air: 0.3 L/min) しつつ一日放置し順応させ、従属栄養細菌を増やす。

④ 500 mL フラスコを 3 つ準備する。

⑤ 24 グラムの Mn 酸化物（市販品、パウダー）を 2 つ量り取る。

⑥ フラスコに 0～100 g/L の Mn 酸化物を入れる。

⑦ Mn 酸化物が接触しない系では円筒形ろ紙にマンガン酸化物 50 g を入れフラスコに固定する(図 4.4)。

⑧ 培養液の上澄みを捨て汚泥 100 mL、基質 400 mL、計 500 mL に調整する。
⑨ 25℃で培養し、時間経過毎に測定する。計測の間はエアレーションしておく。

表 3.4.2 從属栄養細菌回分試驗基質

K-medium	mg·L^{-1}
Yeast extract	60
Peptone	240
Nutrient elements
mg·L^{-1}
K_{2}HPO_{4}	29.9
NaH_{2}PO_{4} 2H_{2}O	223.23
CaCl_{2} 2H_{2}O	5
MgSO_{4} 7H_{2}O	20
Ferrum Sol.
mg·L^{-1}
Fe_{2}SO_{4} 5H_{2}O	0.1

Trance Element	mg·L^{-1}
CuSO_{4} 5H_{2}O	0.0025
NaSeO_{4}	0.005
NiCl_{2} 6H_{2}O	0.019
CoCl_{2} 6H_{2}O	0.024
Na_{2}MoO_{4} 2H_{2}O	0.022
H_{3}BO_{3}	0.001
ZnSO_{4} 7H_{2}O	0.043

図 3.4.2 活性污泥の馴養
図 3.4.3 活性污泥阻害実験

図 3.4.4 Mn 酸化物非接触系実験
## c 測定方法ならびにサンプル処理について

回分試験サンプルは全て孔径 $ 0.45 \mu m $ のメンブレンフィルター(ADVANTEC 社製)を用いてろ過処理を施した。メタン濃度はガスクロマトグラフ（GC-TCD 8A: 島津社製）を用いて測定した。従属栄養細菌阻害実験条件では全炭素濃度(TOC)をTOC-V CSH/CSN(SHIMADZU 社製)にて測定した。

## (5) マンガン酸化細菌の分離・培養

## 1 ) 背景と目的

マンガン酸化速度を高めるには、マンガン酸化細菌を同定して生理学的特性を把握し、特性に適した運転をする必要がある。そこで、 $ MnO_{2} $ が従属栄養細菌を活性阻害することを利用した新規の方法でマンガン酸化細菌の分離・培養の実験を開始した。生物学的Mn酸化において、上記の研究成果よりMn酸化物耐性菌ならびに非耐性菌に分類が出来ると考えた。Mn酸化物耐性菌の培養を行うにあたり、固形培地上での高濃度 $ MnO_{2} $ 環境を作成するため、固形培地に $ MnO_{2} $ を添加し固化させることで $ MnO_{2} $ プレートを作成した。これとBlankプレート( $ MnO_{2} $ 非含有プレート)の培養から獲得した培養結果から、環境微生物中のマンガン酸化細菌あるいはMn酸化物耐性菌ならびに非耐性菌の分類が可能かどうかを調査した。

## 2 ) 仮説

有機基質の主組成として K-medium として添加した 2 種類の固形培地を作成し活性汚泥の培養を行った (図 3.5.1)。一つは高濃度 $ MnO_{2} $ を添加した $ MnO_{2} $ プレートと、非添加系の Blank プレートを使用した。もし Mn 酸化物が Mn 酸化細菌以外の微生物の成長を阻害するのであれば、下記のように Mn 酸化細菌のみが増殖できると考えた。また $ MnO_{2} $ プレートで発現したコロニーの一部は Mn(II)酸化能を有している。生物的 Mn(II)酸化では微生物にとってエネルギーの獲得可能な代謝経路ではないことが示唆されていることから、Mn(II)酸化微生物は環境中に多く存在していることが考えにくいためである。

$$ MnO_{2} $$

図 3.5.1 $ MnO_{2} $ プレートによる Mn 酸化物耐性菌及び Mn 酸化細菌培養
## 3 ) 実験方法

## a 植種源

本実験系で培養を行う培養微生物は全て東広島浄化センター(広島県東広島市西条町田口100－1)より採取した活性污泥を使用した。

採取した微生物サンプルは污泥中のフロックを分散させ、微生物菌体をシングルセル状に均一化を行った。これには物理的に分散させるガラス製ホモジナイザーで処理を施した後、超音波ホモジナイザーにてフロックの超音波破碎を施した。未処理の活性污泥と処理後の活性污泥にDAPI染色を行った(図3.5.2)。処理を行った活性污泥を $ MnO_{2} $ プレートとBlankプレート上に植種し、培養を行った。

(A)

(B)

図 3.5.2 DAPI 染色による活性污泥観察((A)未処理、(B)超音波及びホモジナイザー処理後)

## b プレート作成方法ならびに培養

上記処理を行った活性汚泥の培養は固形培地を用いて培養を行った(表 3.5.1)。固形培地の主要構成成分として Agar ならびに Gellumgum を使用した。pH 調整としてリン酸バッファーならびに HEPES バッファーを使用した。これらの成分の培養への影響は適正実験の結果にて記述した。有機物源としてこれまでの実験同様に K-medium を使用し 溶存 COD 濃度が 300 mgCOD/L となるように添加した。また植種後のプレートは恒温室内暗所にて 30 ℃ の温度条件にて培養を行った。さらに MnO_{2} プレート作成時には培地内に 100 g/L となるように化学合成 MnO_{2}(キシダ化学) を添加した。

固形培地の作成方法は以下の手順で行った。

① 超純水ならびに基質等を添加し、全量が 300 mL となった溶液に固形培地成分を Agar 8 g/Gellungum 7 g を添加し、オートクレーブ(高压蒸気滅菌)処理を施す。

② オートクレーブ中に包装ビニールへのエタノール消毒を行ったプラスチック製培養プレート(シャーレ)をクリーンベンチ(無菌実験台)上で殺菌灯(紫外線殺菌)にて滅菌処理を施す。

③ オートクレーブ後の培地(60～70℃で保温)は適当な回転数で攪拌し、容器内の基質が均一化を行う。

④ そのプレートに 15〜20 mL ずつ培地を添加し、クリーンベンチ内で遊離水の乾燥、培地の冷却を行う。

発現したコロニーに対して、Mn(II)酸化能力の有無について検証する目的で液体培養を行った。培養基質には、これまで通り K-medium を使用し有機物濃度を 300 mgCOD/L とした。Mn(II)濃度を添加した培地では Mn(II)濃度を 10 mgMn(II)/L となるように添加した。発現したコロニーをそれぞれの培地に同じ菌体量で、Mn(II)添加 K-medium 系ならびに非添加系に植種し 96 well plate で培養を行った。培養 24 時間後全 well に
Mn(IV)に反応して青色に呈色する Leuco Berbelin Blue (LBB)染色液を添加した。これにより、発現したコロニーの Mn(II)酸化能力の有無を検証した。

プレート上での培養後、プレート上の発現コロニーをコンラージ棒で集積し微生物サンプルを採取した。集積したサンプルは回収し、遠心分離処理を行った。

表 3.5.1 培養条件及び基質組成

Cultivation conditions	Substrates(mg L^{-1})
Main solid comp.	Agar → Gellum Gum (7 g 300 mL^{-1})	K_{2}HPO_{4}	0.4
pH Buffer (pH 7.8)	Phosphate Buffer (P conc. 0.02 mM) →HEPES Buffer 20 mM	CaCl_{2} 2H_{2}O	0.1
MgSO_{4} 7H_{2}O	0.4
CuCO_{4} 5H_{2}O	0.005
Organic Conc.	300 mgCOD L^{-1}	NaSeO_{4}	0.01
Conc. of MnO_{2}	100 g L^{-1}	NiCl_{2} 6H_{2}O	0.038
Organic Compounds	K-medium(Peptone, Yeast Extract)	CoCl_{2} 6H_{2}O	0.048
Na_{2}MoO_{4} 2H_{2}O	0.044
Temp.	30 ℃	H_{3}BO_{3}	0.002
Inocula	Activated Sludge, Reactor samples	ZnSO_{4} 7H_{2}O	0.083
Fe_{2}SO_{4} 5H_{2}O	0.2

$ MnO_{2} $ containing plate ( $ MnO_{2} $ Plate)

図 3.5.3 $ MnO_{2} $ プレートと Blank プレート

(6) DHS リアクターを用いた $ MnO_{2} $ の有無による Mn(II)酸化のスタートアップ比較

## 1 ) 研究背景と目的

Mn 酸化物が環境中に存在すると多くの微生物の活性を低下させる結果が得られた。そして、Mn 酸化細菌は Mn 酸化物を生成することで他の微生物の代謝活性を阻害することで、環境中で優占的に増殖するという仮説を立てた。一方、人工模擬排水からの生物的 Mn(II)除去を活性汚泥基質や硝化細菌及びメタン酸化細菌との共培養にて試みたが、Mn 除去が観察されるまで長期間（1 年以上）を要した。ここで先の実験で示した $ MnO_{2} $ による従属栄養細菌の活性阻害作用を利用する事で短縮できるのではないかと考えた。すなわち、微生物培養担体への $ MnO_{2} $ 塗布を施すことで優先的に Mn 酸化に寄与する微生物群のみを培養させて、
スタートアップの短縮が可能となると考えた。そこで、本研究ではリアクターに $ MnO_{2} $ 塗布した系としない系を用意し、Mn除去のスタートアップにどのような差が見られるか調査した。さらに培養した微生物群を分子生物学的手法により明らかにした。

## 2 ) 仮説

$\mathrm{MnO}_{2}$ による従属栄養細菌への活性阻害作用を微生物培養担体への $\mathrm{MnO}_{2}$ 塗布により、人為的に生じる環境下での培養を行った。3系列の詳細な運転初期条件は表3.6.1に示す。

1) RUN 1 では多種多様な従属栄養細菌が、RUN 2 では $ MnO_{2} $ 耐性菌およびマンガン酸化細菌、RUN 3 では $ MnO_{2} $ 耐性菌が優先的に培養される(図 3.6.1)。

2) 一定期間 RUN 3 を初期条件下で培養した後 Mn(II) 供給を開始すると、直ちに生物的 Mn(II) 除去が観察される。

3) RUN1、2 と も に マ ン ガ ン 酸 化 細 菌 が 培 養 可 能 な 条件 で あ る が 、 RUN2 で は 生物 的 Mn(II) 除 去 の 早 期 発 现 が 観 察 さ れ 、 RUN1 で 短 期 間 で の 発 現 は 見 込 ま れ な い 。 こ れ は MnO_{2} 耐 性 菌 の 優 占 化 に 伴 う も の で あ る ( 図 6.2)。

4) $ MnO_{2} $ 塗布と非塗布系の微生物群集を系統学的に明らかにすることで $ MnO_{2} $ 耐性菌あるいは非耐性菌の菌叢同定が可能になる。

5) リアクターで培養した微生物群の生態特性を明らかにすることにより、未だ示唆されたことのない新たな微生物の分類群の提案が可能となる(図3.6.3)。

表 3.6.1 初期運転条件

MnO2 塗布	Mn(II) 供給	有機物
RUN 1	無し	有り	K-medium
RUN 2	有り	無し	K-medium
RUN 3	有り	有り	K-medium

図 3.6.1 Mn 酸化物塗布による優占種の変化(仮説)
図 3.6.2 Mn 酸化物塗布によるスタートアップ、MnO₂ 耐性細菌の変化(仮説)

図 3.6.3 Mn 酸化物耐性菌グループと Mn 酸化細菌グループ

## 3 ) 実験方法

## a 実験装置

リアクターには透明アクリル製円筒形カラム(内径 50 mm、外径 60 mm、体積約 1.6 L)の中に、微生物保持担体として 2 cm 角のスポンジ20 個(全容積 0.16 L)を直列に吊るした DHS リアクターを使用した。リアクターで培養を行う微生物の植種源として、東広島浄化センター(東広島市西条町田口 100-1)の活性污泥反応槽より採取した活性污泥を使用した。

リアクターは3台同時に運転し、RUN2、3の系には化学合成された$\mathrm{MnO}_{2}$（キシダ化学010-47295、1級、500g）をリアクターに塗布した。粒径はmesh100で、150μmのふるいを使用されたものである。$\mathrm{MnO}_{2}$
は金属元素の吸着能力に優れており Mn(II) も吸着されるものの 1 つである。予め塗布する $ MnO_{2} $ に吸着しうる Mn(II) を吸着させてなければ、リアクターで観察を行う Mn(II) の動態が生物的なものか、あるいは塗布した $ MnO_{2} $ への吸着であるのか判断が不可能となる。 $ MnO_{2} $ の塗布は $ 100\ g\ L^{-1} $ の濃度で行う。つまり担体中には $ 16\ g $ の $ MnO_{2} $ が存在することになる。また $ MnO_{2} $ への Mn(II) の吸着は $ 5\ mg/g\ [Mn(II)/MnO_{2}] $ で生じることを実験的に確認した。これより、 $ 16\ g $ の $ MnO_{2} $ に吸着し得る Mn(II) 量は $ 80\ mg $ と算出できた。

$\mathrm{MnO}_{2}\wedge\mathrm{O}$ の $\mathrm{Mn(II)}\wedge\mathrm{O}$ 吸着は、1 L の超純水に $\mathrm{MnO}_{2}$ を 100 g を添加し攪拌した完全混合液を使用する。完全混合液 (1 L) に $\mathrm{Mn(II)}$ を 100 mg 添加させ、10 分程度攪拌させる。上記の算出量よりも多めに $\mathrm{Mn(II)}$ を添加させた理由は完全に $\mathrm{MnO}_{2}\wedge\mathrm{O}$ 吸着を完了させるためである。攪拌後、リアクター運転で採用する $\mathrm{Mn(II)}$ 供給濃度 5 mg/L となるように作成した $\mathrm{Mn(II)}$ 水溶液 1 L に完全混合液から遠心分離処理によって分離した $\mathrm{MnO}_{2}$ 100 g を添加し、10 分程度攪拌した。これにより $\mathrm{Mn(II)}$ 濃度変化に伴う $\mathrm{Mn(II)}$ の漏出ならびに活性污泥添加に際する $\mathrm{Mn(II)}$ の活性阻害等の影響を未然に防ぐものとした。 $\mathrm{Mn(II)}$ 水溶液 (5 mg $\mathrm{Mn(II)/L}$) への添加作業を 3 度繰り返し、遠心分離処理を行い $\mathrm{MnO}_{2}$ 100 g を採取した。

Mn(II)の吸着完了後の$\mathrm{MnO}_{2}$を活性污泥(1 L)に100 g/Lの濃度になるように添加した。添加に際し活性污泥は完全混合する様に適当な回転数にて攪拌した(図3.6.4)。

RUN 1 のスポンジ担体には $ MnO_{2} $ の塗布は行わない。攪拌により完全混合となった状態で RUN 1 のスポンジ担体を 1 個ずつスポンジの空隙全てが活性污泥で満たされるように手で揉むようにして植種した。

図 3.6.4 スポンジへの Mn 酸化物塗布表
表3.6.2 リアクターの運転条件

K-medium	RUN 1	RUN 2	RUN 3
MnO2 担体塗布	☑ 無し	☑ 塗布	☑ 塗布
Mn(II) 供給濃度	5 mg L-1	5→10 mg L-1	0→10 mg L-1
供給 COD 濃度	50 mgCOD L-1 (Peptone, Yeast Extract)
pH	7.8 (リン酸バッファー (0.2mM) により調整)
担体全体積	0.16 L
HRT & GRT	4.3 h, 0.3 h

## b リアクター運転方法

基質を 0.9 L/day (水理学的滞留時間 HRT では 4.25 時間) の流量で一定流量にて供給可能なポンプを使用して供給した。また同様のポンプを用いて、リアクターカラム内に 0.5 L/min の速度で空気を供給した。

有機物濃度が50 mg/L、Mn(II)濃度が5 mg/Lとなるように10 Lの基質をポリタンク内に作成した(表3.6.3)。基質には純水を使用し、微生物の代謝活動に必須な微量元素を添加して供給した。さらに、リン源としてまたはpH緩衝液としてリン酸バッファー液(リン最終濃度0.2 mM)を溶解させた。これにより基質のpHを7.8に保持させた。上記の基質を溶解させた水溶液は全て窒素ガスによる曝気を40分行うことで、水溶液中に含まれる溶存酸素による基質性状の変化を防いだ。

RUN 1 の運転条件並びに基質組成は一貫して変更を行わなかった。RUN 2 において Mn 除去性能に応じて供給 Mn(II) 濃度を変更した。RUN 3 は運転 90 日以降 Mn(II) 添加を行い Mn 除去性能のスタートアップの再現性を確認した。

表 3.6.3 K-medium 基質組成

Organic Substrates	mg L^{-1}
Yeast extract	40
Peptone	10
Ferrum Sol.	mg L^{-1}
Fe_{2}SO_{4} 5H_{2}O	0.1

Trace Element	mg L^{-1}
K_{2}HPO_{4}	29.9
NaH_{2}PO_{4} 2H_{2}O	223.23
CaCl_{2} 2H_{2}O	0.05
MgSO_{4} 7H_{2}O	0.2
CuSO_{4} 5H_{2}O	0.0025
NaSeO_{4}	0.005
NiCl_{2} 6H_{2}O	0.019
CoCl_{2} 6H_{2}O	0.024
Na_{2}MoO_{4} 2H_{2}O	0.022
H_{3}BO_{3}	0.001
ZnSO_{4} 7H_{2}O	0.043
図 3.6.5 リアクター写真(左から RUN1、RUN2、RUN3)

## c リアクター運転方法

両実験系の流入水並びに流出水の水質を経時的に測定した。測定項目を pH、有機物(COD)濃度、Mn(II)濃度として観察を行った。pH は Benchtop multi-parameter waters quality meter(HORIBA 社製)、COD 濃度並びに Mn(II)濃度は吸光光度式水質分析器 DR-2800(HACH 社製)にて定量した。リアクター流入水並びに流出水から採取したサンプルは全て 0.45 μm のメンブレンフィルター(ADVANTEC 社製)を用いて濾過処理を施した。

## d 微生物群集解析

リアクターより採取した微生物サンプルは適当な処理を施して培養サンプルとして保存した。このサンプルはDNA抽出用サンプルならびに顕微鏡観察用サンプルに分けてそれぞれ処理を施した。前者はエタノールPBS溶液に培養サンプル中の液相を置換し-20℃で冷蔵保存した。後者では細胞の固定を行うため、パラホルムアルデヒド(PFA)での浸漬処理を施した後、エタノールPBS溶液にて液相を置換し-20℃で冷蔵保存した。

DNA 抽出用サンプルを FastDNA $ ^{®} $ SPIN Kit For Soil(Qbiogene 社製)を用いて行った。その後、2 ng/L に調整した抽出 DNA 精製液を DNA Template として以下の組成で PCR 反応液を作成した。それぞれのリアクタ
一からバイオマスを回収して、微生物群集解析を行った。RUN 1、RUN 2 からは運転 43 日目、RUN 3 からは運転 43 日目と 74 日目にバイオマスを回収した。以降、それぞれのサンプルを RUN 3.1、RUN 3.2 とする。

抽出 DNA 增幅プライマーとして全細菌対象プライマーである 341F-805R を使用した。PCR にて 95℃/3 min の後、95℃/30sec、55℃/30sec、72℃/30sec の PCR 反応を 35 サイクル行い、最後に伸長反応を 72℃/5min で行った。

上記条件で PCR を行い、PCR 精製液を AMPure XP による精製を行った。これより獲得した PCR 精製産物は濃度測定、電気泳動、クローニング、冷凍保存が可能となる。増幅の有無を確認するために電気泳動実験を行った。これは電気泳動装置(Mupix-ex: Advance 社製)を使用した。

リアクター培養サンプルから上記手法に得た DNA 抽出液を全真菌対象プライマー(EF4-EF3 & EF4-fung5)ならびに全古細菌対象プライマー(arc109F-915R)を用いて PCR を行った。EF4-EF3 & EF4-fung5 は 94℃/3 min の後、94℃/90sec、48℃/1 min、2℃/3 min の PCR 反応を 40 サイクル行い、最後に伸長反応を 72℃/5min で行った。arc109F-915R は 95℃/2 min の後、95℃/30sec、52℃/30sec、72℃/90 sec の PCR 反応を 25 サイクル行い、最後に伸長反応を 72℃/3min で行った。

適当な処理を施した DNA 増幅サンプル(全細菌対象プライマー341F-805R で PCR 済)を北海道システム・サイエンス株式会社に次世代シーケンサーIllumina MiSeq (Illumina 社製)を用いた微生物群集解析を外注した。得られた塩基配列情報をもとに、微生物群集解析が行われた。解析は概して、得られた配列データから遺伝子情報をOTU抽出し16S rDNAデータベース上に登録された系統種ごとの遺伝子情報に97%の相同性を有するOTUごとに分類分けを行った。このデータベースは、QUIIME ResourceサイトよりダウンロードされたGreengenesデータベースの配列情報および分類情報を使用した。

## (7) 実二次電池廃液からの金属回収

## 1 ) 研究背景と目的

人工模擬排水からの生物的 Mn(II)除去について、様々な知見を得る事が出来た。実廃二次電池溶解処理液を用いて実際に最終目標である金属回収、マンガン酸化がこれまでの実験の通りに実証できるかを実施する。数種類のリチウム電池を解体し、強酸の液に溶かしたリチウム、ニッケル、コバルト、マンガンを含む溶液を用いて実験を行う(図 3.7.1)。この溶液を希釈した後、マンガン酸化細菌を培養した DHS リアクターに供給する。

## 2 ) 仮説

これまでの研究成果をもとに実廃二次電池溶解処理液からの金属回収を実証する。(1)Mn除去の早期スタートアップ、(2)高速Mn除去実証(3)ニッケル・コバルト回収をについて同時に達成する。

## 3 ) 実験方法

## a 実験装置

リアクターには透明アクリル製円筒形カラム(内径 50 mm、外径 60 mm、体積約 1.6 L)の中に、微生物保持担体として 2 cm 角のスポンジ 20 個(全容積 0.16 L)を直列に吊るした DHS リアクターを使用した。リアクターで培養を行う微生物の植種源として、東広島浄化センター(東広島市西条町田口 100-1)の活性污泥反応槽より採取した活性污泥を使用した。